Acta Biologica et Medica Germanica: Band 4, Heft 3 [Reprint 2021 ed.] 9783112518502, 9783112518496

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ACTABIOLOGICA ETMEDICA GERMANICA HERAUSGEBER: u

A. G R A F F I • H. G U M M E L • F. J U N G • A. K R A U T W A L D S. M. R A P O P O R T S C H R I F T L E I T U N G : W. S C H E L E R U N D H. B I E L K A

A K A D E M I E - V E R L A G - BERLIN

• B A N D 4 - HEFT 3

- SEITE

223-324

1 y6c

AUFNAHMEBEDINGUNGEN 1. E s werden n u r Arbeiten angenommen, die nicht an anderer Stelle mit demselben I n h a l t veröffentlicht oder zur Veröffentlichung angeboten werden. Der Autor verpflichtet sich nach Annahme, die Arbeit an keiner anderen Stelle zu veröffentlichen. 2. Die Arbeit m u ß wissenschaftlich wertvoll sein. Bestätigungen bekannter T a t sachen, Versuche u n d Beobachtungen ohne positives Ergebnis werden, wenn überhaupt, nur in kürzester F o r m aufgenommen. Nicht aufgenommen werden Arbeiten referierenden Charakters, Polemiken und rein spekulative Arbeiten, falls sie nicht ganz wesentliche neue Gesichtspunkte enthalten. 3. Kurzmitteilungen über experimentelle Ergebnisse werden bei der Drucklegung zeitlich bevorzugt. F ü r ihren Inhalt ist ausschließlich der Autor verantwortlich. 4. Die Arbeiten müssen kurz und klär geschrieben u n d gegliedert sein. Problematik (Einleitung), Methodik, Befunde u n d Diskussion, evtl. Schlußfolgerungen sollen deutlich in Erscheinung treten. Der Arbeit soll ein Kurzreferat der wesentlichsten Ergebnisse vorausgestellt werden (Zusammenfassung von höchstens einer Druckseite). Neben einer anderssprachigen erscheint auf jeden Fall eine deutsche Zusammenfassung. Die Arbeiten werden in folgenden Sprachen angenommen: Deutsch, Russisch, Englisch und Französisch. 5. Besonders wertvolle längere Arbeiten können als Beihefte veröffentlicht werden. 6. Von jeder Versuchsart bzw. jedem Tatsachenbestand oder jeder Krankengeschichte ist nur je ein Beispiel in knappester F o r m (Telegrammstil) zulässig. Weiteres Material ist als Tabelle oder grafisch darzustellen. Beobachtungen an biologischem oder medizinischem Material sollen mit Zahlenangaben über die Signifikanz der Ergebnisse belegt werden. 7. Literaturangaben müssen u n t e r Verwendung der Abkürzung des Chemischen Zentralblattes und in der dort üblichen F o r m erfolgen: N a m e und Vorname des Autors, Band-, Seiten- u n d Jahreszahl. Bücher werden mit Titel, Verlag, E r scheinungsjahr u n d Seitenzahl zitiert, -z. B. B. X. Y. naoh M. N-. Biochem. Z., 222, 45 (1951). Am E n d e der Arbeit wird die Literatur in der Reihenfolge aufgenommen, wie sie im T e x t zitiert ist mit entsprechender Numerierung. 8. Doppeltitel sind zu vermeiden, ebenso Zerlegung einer Arbeit in mehrere Mitteilungen. 9. Das Manuskript m u ß a m Kopf den H e r k u n f t s o r t der Arbeit tragen. Am E n d e des Manuskriptes wird der N a m e und die Anschrift des Verfassers bzw. des in erster Linie f ü r den I n h a l t verantwortlichen Verfassers wiedergegeben. Einsendungen von Arbeiten aus Kliniken und Instituten ist eine E r k l ä r u n g des Direktors oder Abteilungsleiters beizulegen, d a ß er mit der Veröffentlichung einverstanden ist und dem Verfasser auf die Aufnahmebedingungen hingewiesen hat. 10. Das Manuskript ist einseitig u n d möglichst mit Maschine weitzeilig zu schreiben. Die Abbildungsvorlagen sind auf besonderen Blättern einzureichen. 11. Werden im T e x t wortgeschützte Bezeichnungen (z. B. Warenzeichen) benutzt, so ist nach Möglichkeit daneben eine international anerkannte und verständliche Bezeichnung (z. B. die chemische Zusammensetzung) anzugeben. 12. Von jeder Originalarbeit werden kostenlos 80 Sonderdrucke geliefert. Darüber hinaus können bis zu 100 Sonderdrucke gegen Berechnung bezogen werden. Die Herausgeber Manuskripte sind an die Herausgeber zu senden oder direkt an die Redaktion der Acta biologica et medica germanica, B e r l i n - B u c h , Lindenberger Weg 70

ACTA BIOLOGICA ET MEDICA GERMANICA Herausgeber: A. G r a f f i • H. G u m m e l • F. J u n g • A. K r a u t w a l d • S. M. R a p o p o r t Band 4

I960

Heft 3

Acta biol. med. germ., Band 4, Seite 223—232 (i960) Aus dem Institut für Kortiko-Viszerale Pathologie und Therapie der Deutschen Akademie der Wissenschaften zu Berlin-Buch (Direktor: Prof. Dr. med. R. BAUM A N N ) und der Abteilung für Pathophysiologie der höheren Nerventätigkeit der Humboldt-Universität Berlin (Direktor: Doz. Dr. med. habil. G . M I S G E L D )

Der Einfluß des Zeitintervalls zweier unbekräftigter Reize auf' Ausbildung und Festigung bedingter motorischer Nahrungsreak-' tionen II. Ordnung bei Ratten K. HECHT und

G.

MISGELD

(Eingegangen am 29. 9. 1959) Zusammenfassung In der Herausbildung der Fähigkeit zur Bildung bedingter Reaktionen höherer Ordnung wird eine wichtige Eigenschaft der Lebewesen mit dem Ergebnis individueller Lebenserhaltung in einer veränderlichen Umwelt gesehen. Deshalb war die These P A W L O W S ZU überprüfen, daß die Bildung einer bedingten Reaktion II. Ordnung nur bei zeitlichem Vorangehen des neuen, indifferenten Reizes möglich sei und bei einem Zeitintervall von 10—15sec und weniger zwischen den beiden Reizen eine bedingte Hemmung entstehe. Zu diesem Zweck wurden an 8 Kollektiven frei beweglicher Ratten in gewohnter Umgebung bedingte motorische Nahrungsreaktionen I. und II. Ordnung sowie eine Differenzierungsreaktion im Stereotyp ausgebildet. Der einzige methodische Unterschied zwischen den Kollektiven bestand in der Verschiedenheit des Zeitintervalls zwischen dem zunächst indifferenten Tonreiz (2000 Hz, 90 dB) und dem bedingten Lichtreiz I. Ordnung (250 Lx). Bei 7 Kollektiven wurde ein Tonreiz vor dem Lichtreiz mit jeweils geringerem Intervall (15; 10; 7.5; 5,5; 3; 1,5 und 0,5 sec) angewandt, während beim 8. Kollektiv der positive bedingte Lichtreiz I. Ordnung dem indifferenten Tonreiz um 5 sec voranging. Unabhängig von Reizfolge und Zeitintervall ergaben sich bei allen Rattenkollektiven statistisch homogene Ausbildungswerte, Latenzzeiten und ein hoher Erregungsanteil in der E-H-Quote der bedingten motorischen Nahrungsreaktion II. Ordnung. Auch die spätere Veränderung des betreffenden Zeitintervalls ließ keine Erscheinungen der bedingten Hemmung hervortreten. Demnach stimmen unsere mittels der motorischen Nahrungsmethode an Ratten gewonnenen Ergebnisse nicht mit den von P A W L O W mit der Speichelmethode bei im Gestell fixierten Hunden erhobenen Befunden überein. Inwieweit diese Divergenz methodisch oder phylogenetisch bedingt ist, muß in weiteren Untersuchungen geklärt werden. 16

A c l a biol. med. germ., Heft 3

224

K . HECHT,

G.

MISGELD

Das „zielgerichtete" oder „situationsentsprechende" Verhalten frei lebender Tiere ist eines der Probleme, in dessen Deutung entgegengesetzte weltanschauliche Auffassungen zum Ausdruck kommen. Zweifellos hat die Aufdeckung des prinzipiell bedingtreflektorischen Wesens der tierischen und menschlichen Verhaltensweisen durch P A W L O W [16], [17] und seine Schule [3], [4], [11], [19] für die große Bedeutung der materialistischen Theorie. Der Beweis jedoch für den bedingtreflektorischen Charakter von Kettenreaktionen im Verhalten der Lebewesen steht zur Zeit in den experimentellen Ergebnissen u. W. noch aus. Zwar wurde von P A W L O W selbst bereits relativ früh die Entstehung bedingter Reaktionen höherer Ordnung beobachtet, doch sah er unter Laborbedingungen bei Hunden beständige bedingte Reaktionen höherer als II. Ordnung lediglich in Verbindung mit einer Abwehrreaktion entstehen. Bei Anwendung der Speichelmethode an im Gestell fixierten Hunden ließ die Kombination eines bedingten Nahrungsreizes I. Ordnung mit einem neuen indifferenten Reiz — ohne diesen zu bekräftigen — nur gelegentlich eine bedingte Nahrungsreaktion II. Ordnung, häufiger jedoch eine bedingte Hemmung entstehen. Die aufmerksame Beobachtung frei beweglicher oder dressierter Hunde bzw. von Hunden im Polizei- oder Blindenführdienst läßt jedoch immer wieder ein Verhalten erkennen, das nur im Bestehen auch positiver bedingter Nahrungsreaktionen höherer Ordnung gedeutet werden kann. Wir sehen in der Herausbildung der Fähigkeit zur Bildung positiver bedingter Reaktionen höherer Ordnung ganz allgemein eine wichtige Eigenschaft der Organismen mit dem Ergebnis der individuellen Lebenserhaltung in einer veränderlichen Umwelt. Deshalb kommt der Klärung dieses offensichtlichen Gegensatzes zwischen den Beobachtungen unter adäquaten und inadäquaten Bedingungen u. E. große praktische Bedeutung zu. P A W L O W vermutete die Ursache des Auftretens entweder einer bedingten Reaktion II. Ordnung oder einer bedingten Hemmung im unterschiedlichen Zeitintervall zwischen den beiden Reizen. Dabei nahm er an, daß nur das zeitliche Vorangehen des neuen, indifferenten Reizes vor dem bereits bedingten Reiz die Bildung einer bedingten Reaktion II. Ordnung ermögliche und die Verkürzung des Zeitintervalls unter 10—15 sec das Auftreten bedingter Hemmungserscheinungen begünstige. Auch soll sich bei Wiederholung der einmal ausgearbeiteten bedingten Reaktion II. Ordnung nach kurzer Zeit eine bedingte Hemmung zeigen. Wir konnten bekanntlich an Ratten relativ leicht beständige positive bedingte Nahrungsreaktionen bis zu III. Ordnung bei einem Zeitintervall von 10 sec zwischen den Reizen I. und II. Ordnung ausbilden [6]. H E C H T und Mitarbeiter [8] erreichten mit einem Intervall von 5 sec bei Anwendung der Flucht- und Nahrungsmethode bedingte Reaktionen II. Ordnung. K U N C [9] konnte an Ratten ebenfalls mit einem Intervall von 5 sec bedingte Fluchtreaktionen II. Ordnung erzielen, und M A L I N O W S K I [12] erhielt bei Kanin-

Einfluß des Zeitintervalls auf Nahrungsreaktionen

225

chen, B A R U [ 1 ] bei Vögeln und P R A S D N I K O W A und FIRSOVV [18] bei Fischen bereits ohne Zeitintervall vorübergehend eine bedingte Reaktion II. Ordnung. Darüber hinaus konnten wir bei Ratten, im Gegensatz zu der Bemerkung P A W L O W S von der Notwendigkeit des Vorangehens des neuen indifferenten Reizes, beständige bedingte Reaktionen II. Ordnung auch bei „rückwärtiger" Reizfolge ausbilden [7]. Den gleichen Erfolg vermuten wir bei genauer Analyse der angewandten Versuchsmethoden, zumindest in Andeutung, in den Ergebnissen von D O S T A L E K und F I G A R [2] bei Affen und Menschen. Bevor wir deshalb der Frage nach dem Entstehungsmechanismus der bedingten Hemmung und der Ursache des genannten Gegensatzes näherkommen konnten, mußten wir überprüfen, ob die Verminderung des Intervalls zwischen den Reizen I. und II. Ordnung die Ausbildung und Festigung einer positiven Nahrungsreaktion II. Ordnung beeinflußt, und ob sich dabei proportional zur Verkürzung des Intervalls stärkere Erscheinungen der bedingten Hemmung zeigen. Diese Untersuchungen führten wir zunächst an Ratten durch, um sie später unter möglichst gleichartigen Bedingungen mit Hunden zu wiederholen.

Ergebnisse und Diskussion Wir arbeiteten mit 80 bei Versuchsbeginn 5—6 Monate alten, 150—200 g schweren Albinoratten unseres gemischten Eigenzuchtstammes, die wir wahllos in Gruppen zu je 10 Tieren einteilten. Die Ausbildung bedingter Reaktionen I. wie höherer Ordnung und ihre Festigung im Stereotyp mit minütlicher Reizfolge unter Einbau von Differenzierungsreizen an solchen Stellen, die das Auftreten von Generalisationserscheinungen ausschließt, wurde zusammen mit den Bedingungen unserer Tierhaltung und Fütterung bereits früher ausführlich beschrieben [6]. Unserer Fragestellung entsprechend unterschieden sich die Versuchsbedingungen der 8 Kollektive lediglich im Zeitintervall zwischen dem zunächst indifferenten Tonreiz (2000 Hz, 90 dB) und dem bedingten Reiz I . O r d n u n g (Lichtreiz 1 , 250 Lx). Während wir bei 7 Rattenkollektiven (Gruppe I—VII) den Tonreiz vorher und den unbekräftigten bedingten Reiz I. Ordnung nach unterschiedlichem Zeitintervall applizierten, gaben wir bei der Gruppe V I I I zuerst den unbekräftigten bedingten Reiz I. Ordnung und ließen nach einem Intervall von 5 sec den indifferenten Tonreiz folgen (Abb. 1).

Die Ergebnisse dieses Teils der Versuche sind in Tab. 1 zusammengefaßt. Bei allen 80 Versuchstieren bildeten sich auf den Lichtreiz 1 (250 Lx) bedingte motorische Nahrungsreaktionen I. Ordnung, auf den Lichtreiz 2 (10 Lx) Differenzierungsreaktionen und auf den Tonreiz (2000 Hz, 90 dB) völlig unabhängig vom angewandten Zeitintervall zwischen den bedingten Reizen II. und I. Ordnung bedingte motorische Nahrungsreaktionen II. Ordnung. Bei völlig gleichartiger Ausbildungsweise der betreffenden Reaktionen in den genannten Kollektiven trat bei Vergleich der mittleren Ausbildungsdauer der bedingten motorischen Nahrungsreaktion I. Ordnung zwischen der Gruppe I I I , als dem Kollektiv mit der längsten mittleren Ausbildungsdauer und den Gruppen V, VI und VIII mit kür16*

226

K . HECHT,

G.

MISGELD

zeren mittleren Ausbildungswerten eine Überschreitungswahrscheinlichkeit von > 99,73% auf. Der Vergleich der mittleren Ausbildungswerte der Differenzierungsreaktion der Gruppe VII einerseits und der Gruppen III und IV andererseits ergab signifikante Unterschiede. Dagegen zeigt der Vergleich der mittleren Ausbildungsdauer der bedingten motorischen Nahrungsreaktion II. Ordnung bei unterschiedlichem Zeitintervall zwischen dem bedingten Reiz II. und I. Ordnung nur bei den Grupden IV und VI eine Überschreitungswahrscheinlichkeit von > 99.75%. i i i i i i i i i i i i | m I i l Licht, fZSOLx)

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Abb. 1. K y m o g r a m m e d e r s t e r e o t y p e n Reizfolge bei R a t t e n k o l l e k t i v e n I — V I I I m i t jeweils unterschiedlichem,. Z e i t i n t e r v a l l zwischen b e d i n g t e m Tonreiz I I . Ordn u n g u n d b e d i n g t e m Lichtreiz I. O r d n u n g u n d i h r e r B e a n t w o r t u n g d u r c h je eine R a t t e des b e t r e f f e n d e n K o l l e k t i v s m i t N a h r u n g s r e a k t i o n e n I. u n d I I . O r d n u n g ; x = R e a k t i o n s e f f e k t (Öffnung d e r F u t t e r k l a p p e )

Diese statistische Differenz läßt sich jedoch als Zufallsbefund deuten, da sich bei Anwendung der Homogenitätsprüfung mittels des ^-Testes (.12 = 0.297; Fg = 14) eine Zugehörigkeit aller 8 Kollektive zu einer gemeinsamen Wahrscheinlichkeit errechnen ließ. A n den K r i t e r i e n d e r m i t t l e r e n L a t e n z z e i t (Lz) u n d d e r E r r e g u n g s - H e m m u n g s Q u o t e (E-H) l ä ß t sich, wie wir f r ü h e r d a r l e g t e n [14], das A u f t r e t e n m e h r oder weniger s t a r k e r E r s c h e i n u n g e n d e r b e d i n g t e n H e m m u n g nachweisen. D e s h a l b k o n t r o l l i e r t e n wir n a c h d e r A u s b i l d u n g d e r b e d i n g t e n m o t o r i s c h e n N a h r u n g s r e a k t i o n I I . O r d n u n g in täglichen V e r s u c h e n m i t j e d e m Tier 4 W o c h e n lang (1.—4. Festigungswoche) alle R e a k t i o n s a b l ä u f e u n d errechneten, wie f r ü h e r beschrieben [6], i m W o c h e n d u r c h s c h n i t t die m i t t l e r e L a t e n z z e i t d e r positiven bed i n g t e n N a h r u n g s r e a k t i o n I I . O r d n u n g u n d d a s V e r h ä l t n i s des A u f t r e t e n s v o n E r r e g u n g s - u n d H e m m u n g s e r s c h e i n u n g e n ( E - H - Q u o t e ; p = 1,0 = 100% E r r e g u n g s reaktionen), u m d a m i t u. U., d u r c h die B e o b a c h t u n g d e r V e r l ä n g e r u n g d e r m i t t l e r e n

Tabelle Durch Latenzzeit (Lz) und Erregungs-Hemmungs-Quote (E-H) gekennzeichnetes mitttleres Verhalten de zwischen bedingtem Reiz II. und I. Ordnung in der 1.—

(Oberhalb der Begrenzung: Ergebnisse des ¿-Testes im Versuch der mittleren Latenzzeiten, unterhalb c

Kollektiv

Zeitintervall in sec

X ± p

s

± J

¿-Test

1 1

±0,09 Lz in sec 1,5 E/H Quote 0,823 ± 0,0655 !

t—!—1 —

15,0

II

10,0

E/H

1,3 0,25 0.67S ± O.OSOO

III

7,5

Lz E/H

1,3 ± 0,29 0,625 ± 0,0868

IV

5,0

Lz E/H

0,8 ±0,11 0,548 ± 0,0904

3,0

Lz E/H

1,8 ±0,46 0,514 ± 0,0790

VI

1,5

Lz E/H

1,8 ± 0,26 II,763 ± 0,0671

—

—

—

VII

0,5

Lz E/H

1,5 ±0,21 0,803 ± «',0673

—

—

+ +

Lz E/H

2,2 ± 0,43 0,700 ± 0,0797

VIII

5,0 rückwärtig

]./.

—

•

1

§

1,2 ±0,02 0,692 ± 0,0582

—

—

0,8 ±0,11" 0,709 ± 0,0572

—

—

—

—

0,8 ± 0,21 0,908 ± 0,0364

—

+ +

— -

1,2 ±0,28 0,732 ± 0,0557

—

—

-----

1,3 ±0,24 ",7 59 ± 0,0539

—

—

—

+

1,4 ±0,25 0,733 ± 0,0556

—

—

—

+

—

—

—

—

—

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—

—

—

1,2 ±,002 0,800 ± 0,0504

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für die Hb(3)-Rückbildung verantwortlich zu machen. Da als Reaktionsprodukte des HoRECKER-Zyklus sowohl Hexosephosphat als auchTriosephosphat auftreten können, machte es sich notwendig, die Reaktionen 1 bis 4 einzeln zu untersuchen. Die Reaktionen 1 und 2, die TPN als Coferment benötigen, spielen im allgemeinen bei der Hb(3)-Rückbildung in Erythrocyten nur eine untergeordnete Rolle. Durch Zusatz von Methylenblau als Elektronenüberträger kann diese Reaktionskette aber stark katalysiert werden (WARBURG [ 1 6 ] , K I E S E [9]). Demgegenüber sind die Reaktionen 3 und 4 DPN-spezifisch und werden nicht wesentlich durch Methylenblau gesteigert [1]. Auf Grund der fehlenden Methylenblausteigerung bei Ribose als Substrat, im Gegensatz zu Glukose, scheint der Anteil des imHoRECKERZyklus gebildeten Hexosephosphates gering zu sein, sodaß die Reaktionen 1 und 2 für die Rückbildung von Hb(3) in keinem nennenswerten Umfang in Erscheinung treten. Durch Anwendung von NaF und Pyruvat läßt sich auch die Reaktion 4 als bevorzugter Protonendonator ausschließen. Bekanntlich bewirkt NaF eine Blockierung der Enolasereaktion und BTS erweist sich als kompetetiver Hemmstoff bei der Milchsäuredehydrierung. Mit beiden Substanzen war es nicht möglich, die Hb(3)-Rückbildung oder den Substratverbrauch wesentlich zu verringern. Die sich daraus ergebende Schlußfolgerung, daß die Rückbildungsbeschleunigung durch Ribose vorwiegend von der Dehydrierung des 3-Phosphoglyzerinaldehyds ab-

252

L. LACHHEIN,

H.

MATTHIES

hängig ist, wird durch die Tatsache unterstrichen, daß sich J E S als kräftiger Hemmstoff erweist. E s ist aber durchaus möglich, daß unter Einwirkung von J E S eine vermehrte Bildung von Hexosephosphat zustande kommt. Damit würden sich die Befunde, wonach sowohl unter Ribose als auch unter Adenosin durch J E S nach anfänglicher, fast völliger Hemmung ein Wiederanstieg der Rückbildung auftritt, zwanglos erklären lassen. Da J E S zwar die Hb(3)-Rückbildung, nicht aber den Ribosidverbrauch von Adenosin wesentlich beeinflußt, können wir die Ergebnisse von H U E N N E K E N S , N U R K und G A B R I O [ 1 7 ] hinsichtlich der Hemmbarkeit der Nucleosidphosphorylase durch J E S im Rahmen unserer Versuchsbedingung nicht bestätigen. Dagegen erscheint die Annahme berechtigt, daß die Einschleusung von D-Ribose entweder durch J E S direkt oder aber durch aufgestaute Metaboliten gehemmt wird. Wie aus der Tab. 2 hervorgeht, sind auch normale Kaninchenerythrocyten in der Lage, Ribose zu verstoffwechseln. Obgleich in diesem Falle keine „Stoffwechselleistung" wie die Hb(3)-Rückbildung vorliegt, ist der Riboseverbrauch größer als an Hb(3)-haltigen Erythrocyten. Dagegen senkt Methylenblauzusatz den Riboseverbrauch auf minimale Werte. Auch die BTS-Bildung unter Methylenblauzusatz wird durch Ribose kaum beeinflußt, sodaß die so entstandene B T S sicherlich aus dem Depot der endogenen Phosphatester stammt. Ob lediglich der verstärkte Abbau des Hexosephosphates auf den Riboseverbrauch einwirkt oder inwieweit noch ein direkter Hemmeffekt des Methylenblaus auf die Einschleusung der Ribose eine Rolle spielt, ist nach den vorliegenden Untersuchungen nicht zu entscheiden. Auf Grund der Hemmung der Hb(3)-Rückbildung durch Methylenblauzusatz bei Ribose als Substrat ist diese Möglichkeit immerhin in Erwägung zu ziehen. Literatur [1] [2] [3]

[4] [5]

[6]

[7] [8]

[9] [10]

[11] [12] [13] [14]

[15]

H . : Wissenschaftliche Zeitschrift der H u m b o l d t - U n i v e r s i t ä t zu Berlin VI, 489 (1956/57)L A C H H E I N , L . U . H . M A T T H I E S : 2 4 . T a g u n g der Deutschen Pharmakologischen Gesellschaft in Berlin; in Arch. exp. P a t h o l . P h a r m a k o l . 236 (1959). M A T T H I E S , H . U . L . L A C H H E I N : A c t a biol. med. germ. 2, 4 4 6 (1959). M A T T H I E S , H . U. L . L A C H H E I N : N a t u r w i s s e n s c h a f t e n 46, 264 (1959). N O S S A L , P. M.: Austrat. J . exp. Biol. 26, 1 2 3 (1948). J A F F E , E . R . : Clinical Research. 7, 12 (1959). B R U N S , F . H . , E . N O L T M A N N u. E . V A H L H A U S : Biochem. Z . 330, 4 S 3 ( 1 9 5 8 ) . B R U N S , F . H . , D Ü N W A L D , E . U . E . N O L T M A N N : Biochem. Z . 330, 4 9 7 ( 1 9 5 8 ) . K I E S E , M.: Biochem. Z. 316, 264 (1944). K I E S E , M. U. W. S C H W A R T Z K O P F F : Arch. exp. P a t h o l . P h a r m a k o l . 204, 2 6 7 (1947)B R U N S , F . H . u. E . V A H L H A U S : N a t u r w i s s e n s c h a f t e n 43, I S O ( 1 9 5 6 ) . W A R B U R G , O. U. W. C H R I S T I A N : Biochem. Z . 238, 1 3 1 (1931). D I S C H E , Z.: N a t u r w i s s e n s c h a f t e n 26, 2 5 2 ( 1 9 3 8 ) . D I S C H E , Z . : Phosphorus Metabolism 1, 1 7 1 (1951). R U B I N S T E I N , D . U . O . F . D E N S T E D T : Canad. J . Biochem. Physiol 34, 9 2 7 (1956).

MATTHIES,

Methämoglobinrückbildung durch D-Ribose [16]

WARBURG,

[17]

HUENNEKENS,

O.,

F.

KUBOWITZ

F. M „

E.

U. W .

CHRISTIAN:

253

Biochem. Z . 227, 2 4 5 ( 1 9 3 0 ) . J. biol. Chemistry 221, 9 7 1

N U R K U. B . W . G A B R I O :

(1956).

F ü r die verständnisvolle technische M i t a r b e i t sei a n dieser Stelle Frl. S C H M I D T gedankt.

CHRISTA

Anschrift der Verfasser: Prof. Dr. med. habil. H . M A T T H I E S U. Dr. med. L O T A R L A C H H E I N , Pharmakologisches I n s t i t u t der Med. Akademie Magdeburg, Magdeburg, Leipziger Str. 44.

Summary 1. T h e action of ribose u p o n H b (3)-reduction was studied manometrically b y using inhibitors of glycolysis a n d adding methylene blue.. 2. T h e addition of methylene blue does not increase t h e H b (3)-reduction caused b y ribose in r a b b i t erythrocytes b u t inhibits this action of ribose. I n c o n t r a s t with this observation t h e a p p r o p r i a t e effect of glucose is increased under equal conditions. 3. On t h e base of experiments, in which iodine-acetic acid, N a F and pyruvic acid were used as inhibitors it could be assumed t h a t 3-phosphoglycerinaldehyde is t h e favoured d o n a t o r of protones in t h e reduction of H b (3) caused b y D-ribose a n d nucleosidoribose. 4. T h e consumption of ribose is greater in normal r a b b i t erythrocytes t h a n in cells containing methemoglobine.

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Acta biol. med. germ., Band 4, Seite 283—296 (i960) Aus dem Pharmakologischen I n s t i t u t der Universität Halle/Saale Prof. Dr. K. P O H L E )

(Direktor:

Ein prophylaktischer Röntgen-Test zur biologischen Bestimmung von Vitamin D 1 H.

BEKEMEIER

(Eingegangen am 6. 11. 1959)

Zusammenfassung Der im Pharmakologischen I n s t i t u t Halle entwickelte prophylaktische Röntgent e s t zur biologischen Bestimmung von Vitamin D wird beschrieben. Neben den b e k a n n t e n Vorteilen der prophylaktischen Methoden weist diese Modifikation eine den therapeutischen Verfahren ebenbürtige Präzision auf. Die beschriebene Methode wurde bereits f r ü h e r zur Aufnahme in das DAB 7 vorgeschlagen (Vgl- [2]). Das benutzte statistische Verfahren k a n n zur Auswertung bei ähnlichen biologischen und pharmakologischen Versuchen empfohlen werden.

In einer früheren Arbeit wurden Vor- und Nachteile der verschiedenen Modifikationen des zur biologischen Bestimmung von Vitamin D an Ratten benutzten prophylaktischen Röntgentests erörtert [2]. Das dort besonders empfohlene, von uns ausgearbeitete Verfahren wird hier ausführlicher beschrieben. Versuchsbedingungen

Die Muttertiere der Zucht werden ständig in einem gegen Tageslicht abgedunkelten Raum gehalten. Bei der Fütterung ist auf Vitamin-DFreiheit der Nahrung zu achten. Das beste Zuchtalter liegt für die Mütter in der Zeit vom 6. bis 12. Monat. In diesem Lebensabschnitt findet sich die regelmäßigste Ovarialfunktion; die Wurfzahl ist entsprechend hoch. Böcke werden in einem anderen Raum bei vollwertiger Diät gehalten und nur 4 Tage zu den Weibchen gesetzt. 1 Bock kommt dabei auf 4—6 Weibchen. Entsprechend dem Ovarialcyclus ist in den 4 Tagen die Möglichkeit gegeben, daß nahezu alle Tiere belegt werden. Die Wurftermine verteilen sich etwa auf die gleiche Zeitspanne mit hohem Maximum am 21.—22. Tag. Nur 6—8 Jungtiere werden pro Mutter belassen, um ein schnelles und gleichmäßiges Wachstum zu gewährleisten. Nach 1 Erweiterte Fassung eines zum Lehrgang für biologische Statistik der Akademie f ü r Ärztliche Fortbildung, Berlin-Lichtenberg, am 13.11. 1959 gehaltenen.Vortrages.

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H.

BEKEMEIER

3—3 x h Wochen sind die Tiere mit einem Körpergewicht von durchschnittlich 40—45 g versuchsreif und werden einzeln in MERCKsche Gläser gesetzt (vgl. [10]). Die Versuchsräume haben Doppelfenster mit gewöhnlichem UV-undurchlässigem Glas; Fensterseite nach Norden, so daß direkter Sonneneinfall vermieden wird. Das früher übliche Abdunkeln der Räume hat sich als nicht notwendig erwiesen. Eine Klimaanlage sorgt für konstante Temperaturen zwischen 20 und 23° C. Streu ist für Mutter- und Jungtiere Torfmull. Bei kleineren Versuchen werden die Würfe gleichmäßig auf die zu bildenden Versuchsgruppen verteilt, jedoch geht das nur, solange die Zahl der Gruppen gleich oder kleiner ist als die Zahl der Jungtiere pro Wurf. Je nach Größe des Versuches erfolgt auch die Auswahl einer mehr oder weniger engen Gewichtsklasse, z. B. mit maximaler Differenz von 5 oder 10 g. Bei größeren Versuchen mit mehreren Hundert Tieren ist die Verteilung zufällig. Das Geschlecht bleibt dabei unberücksichtigt. Als rachitogene Kost dient McCollum-Diät Nr. 3143 [11]. 1 k g der Diät wird mit 1 % 1 Wasser kurz aufgekocht, dann in Schalen gegossen und nach dem Erkalten in Würfel von 25—30 g Gewicht geschnitten. Die Jungtiere erhalten täglich einen solchen Würfel zusammen mit einer Scheibe Mohrrübe. Zusätzliche Tränkung erfolgt nicht. Unter diesen Bedingungen verzeichnen die Ratten eine Gewichtszunahme von durchschnittlich 25—3O g in 14 Tagen. Am 2. Tag nach dem Ansetzen der Versuchstiere beginnt die Verabreichung der Versuchslösungen. Eine Gruppe zu 10 Tieren erhält nur das zur Herstellung aller Lösungen benutzte Öl (sogenannte negative Kontrolle). 2 Stunden auf 200° C erhitztes Pflanzenöl hat sich hierfür gut bewährt. 3—5 Gruppen (bei sehr großen Versuchen auch Doppelgruppen) erhalten 0,005; 0,01; 0,02; 0,04 und 0,08 y Vitamin D 3 bzw. nur die 3 mittleren Dosen täglich. Wir benutzen entsprechend den internationalen Gepflogenheiten Vitamin D 3 als Standard, möchten aber darauf hinweisen, daß in der Wirksamkeit von Vitamin D 2 und Vitamin D 3 an der Ratte wohl kein Unterschied besteht [3]. Die Untersuchungschargen werden ebenfalls in öliger Lösung verabreicht; bei festen Substanzen sind vorher Extrakte herzustellen, evtl. ist dabei zu verseifen. Auf letztere Weise wird praktisch der reine Vitamin-D-Gehalt der Untersuchungschargen bestimmt, da Störsubstanzen weitestgehend ausgeschaltet sind. Soll die antirachitische Wirksamkeit des Gesamtpräparates ermittelt werden, so verfüttern wir die Substanz feinst verteilt in einer Tylose-Suspension. Die Verabreichung der öligen Lösungen erfolgt mittels eigens hierfür abgewandelten Pipetten mit knopfartig erweiterten Spitzen und zwar werden grundsätzlich 0,1 ml pro Tag und Tier in die Schnauze pipettiert. Die aufgetriebene Pipettenspitze vermeidet Verletzungen und erleichtert das Herunterdrücken der Zunge der Tiere. Wir haben auch die Verabreichung mit Schlundsonde und aufgesetzter Spritze versucht, sahen jedoch hierin keinen Vorteil; insbesondere wurde die Versuchsgenauigkeit nicht erhöht, während andererseits die Handhabung umständlicher

Röntgen-Test zur Bestimmung von Vitamin D

285

erschien. Wir pipettieren z. Z. noch täglich und können auf Grund laufender Versuche auch zunächst keine Änderung vornehmen, meinen aber wie andere, daß die Reduzierung der Zahl der Gaben eine Verbesserung darstellen dürfte. Sonnabend wird für Sonntag mitpipettiert. Am 14. Tag erfolgt die letzte Gabe, am darauffolgenden Tag wird geröntgt. Hierzu werden die narkotisierten oder getöteten Ratten auf einen Röntgentisch gespannt, wie das in Abbildung 1 dargestellt ist. Dabei ist darauf zu achten, daß die Volarseite der von einer Klammer gehaltenen rechten Hinterpfote aufwärts zeigt; dann projizieren sich nämlich Tibia und Fibula nebeneinander. Die Pfote ist unter leichtem Zug festzuklammern, damit das Bein gestreckt wird. Ein Druckbügel drückt am Ober-

Abb. 1. Röntgentisch mit aufgespannter R a t t e

Schenkel das Bein auf die Unterlage, die durch einen Röntgen-Zahnfilm 3 X 4 cm gebildet wird, auf dem Metallnummern festgesteckt sind. Nur die eine Hälfte des Filmes bildet die Unterlage, die andere steckt in einer Bleitasche. Nach Belichtung der ersten Seite wird der Film umgedreht, so daß nunmehr die belichtete Seite von der Bleitasche verdeckt wird und die noch unbelichtete für eine weitere Aufnahme zur Verfügung steht. Auf diese Weise benötigen wir für 2 Ratten nur einen Film von 3 X 4 cm. Wir erwähnen dies, weil Filmmaterial teuer ist und sich die Kosten mit der Tierzahl summieren. Das Hauptargument gegen die Röntgenmethoden ist bekanntlich ihre technische Kostspieligkeit. Vor oder nach dem Röntgen werden die Tiere gewogen. Zur Belichtung verwenden wir eine Röntgen-Kugel, die in einem durch Blei abgeschirmten Kasten eingebaut ist (Modell Perkeo II, V E B Röntgenwerk Gera). Durch eine Klappe wird in diesen Kasten der zwischen zwei Schienen laufende Röntgentisch geschoben und erst nach Schließen der Klappe wird belichtet. Wir haben so idealen Strahlenschutz, wie Überprüfungen durch Rö-Dosimeter ergaben,

286

H.

BEKEMEIER

so daß wir auf das Tragen von Bleischützen verzichten können. Belichtungszeit 0,6 sec. bei einem Röhrenfenster-Objekt-Abstand von 35 cm. Die Fixierung der Ratte und des Beines auf dem Röntgentisch gewährleistet, daß das Kniegelenk stets ziemlich genau im Zentralstrahl der Röhre liegt.

Auswertung

Die röntgenmäßige Auswertung erfolgt in der Weise, daß jedes Bild dem ihm entsprechenden Rachitisschutzgrad einer Vergleichsskala (Abb. 2) zugeordnet wird. Beurteilt wird nur der Epidiaphysenspalt der Tibia.

Abb. 2. Rachitisschutzgrade Praktisch geschieht das so: A m oberen Rand einer pultartig angeordneten, beleuchteten Milchglasscheibe sind die Bilder der Vergleichsskala von 0—1 0 der Reihe nach angeordnet (Abb. 3). Mit der zu beurteilenden Röntgenaufnahme fahren wir an der Skala entlang bis zu dem Bild, das der Aufnahme entspricht. Die Beurteilung erfolgt also rein visuell; trotzdem ist es möglich und bei uns üblich, noch Zwischenwerte der Vergleichsskala zu verwenden (siehe Protokoll). Zu bemerken ist, daß wir nur den mittleren Bereich der Skala zur Auswertung verwenden und zwar von Rachitisschutzgrad 2 bis. 8. Außerhalb dieser Grenzen ergibt

Röntgen-Test zur Bestimmung von Vitamin D

287

sich keine befriedigende Linearität mehr zwischen log-Dosis und Wirkung. Unter Mitberücksichtigung der Zwischenwerte steht also eine Zahl von Rachitisschutzgraden zur Verfügung, die größenordnungsmäßig der in therapeutischen Verfahren verwendeten Graden entspricht (vgl. [7], [8]).

Zur weiteren statistischen Auswertung wird ein Protokoll angelegt, wie es das Beispiel der Tabelle 1 veranschaulicht, doch ist es vor der eigentlichen rechnerischen Bearbeitung zweckmäßig, die Brauchbarkeit des durchgeführten Versuches anhand einer graphischen Darstellung (Abb. 4) abzuschätzen. Wir ordnen hierzu die durchschnittlichen Rachitisschutzgrade der einzelnen Gruppen (yg) nach dem Logarithmus der entsprechenden Dosen (x).

Abb. 3. Röntgenauswertegerät

In der graphischen Darstellung sollen 1. die Punkte für Standard und Unbekannt jeweils möglichst wenig von der Anordnung in geradliniger Reihe abweichen, so daß die Dosiswirkungsgeraden sich ohne Zwang zeichnen lassen. Aus der stärkeren Abweichung einzelner Punkte wäre auf Uneinheitlichkeit des Tiermaterials oder auf unsachgemäße Herstellung der entsprechenden Öllösung zu schließen. Bei ordnungsgemäßem Versuchsverlauf darf im Bereich der mittleren Standarddosen unter den genannten Versuchsbedingungen Linearität angenommen werden. 2. die Geraden von Standard und Unbekannt parallelen Verlauf erkennen lassen. Nichtparallelität ließe den Schluß zu, daß Charge und Standard im Wirkungsmechanismus unterschiedlich sind. 3. die Wirkungsgeraden möglichst steil verlaufen. Schwacher Anstieg könnte durch unzureichende Einwirkungszeit der Prüfstoffe, verfehlten Dosenansatz oder mangelhafte rachitogene Bedingungen verursacht sein; Steilheit deutet dagegen auf eine starke Dosis-Wirkungsbeziehung hin; ein Zeichen für gute, mit einem relativ kleinen Versuchsfehler behaftete V ersuchsbedingungen. 20

Acta biol. med. germ. Heft 3

288

H.

BEKEMEIER-

4. die Parallelen möglichst geringen Abstand haben; ein Beweis für einen guten Versuchsansatz. Die zunächst der Orientierung dienende Abbildung 4 k a n n ohne weiteres auch zur graphischen Auswertung benutzt werden: 0,018 mg Hefe entspr. d. Wirksamkeit von 0,027 y (Schnittlinie 5) , TTT. , , 0,027 • 1000 r 1000 mgb Hefe entspr. d. Wirksamkeit von y r 0,018 Mithin enthielte die mit 1 mg = 40000 i. E. Vitamin D/g deklarierte Hefe unseres Beispiels etwa 60000 i. E./g.

Die vorstehende graphische Auswertung gestattet jedoch noch nicht die Berechnung des Versuchsfehlers. Dieser ist aber zur Ermittlung exakter Ergebnisse unerläßlich. Daher ist die rechnerische Auswertung vorzuziehen. Sie erfordert im allgemeinen einen nicht unbeträchtlichen Rechenaufwand. Haben die GrupUnbekannt 71Durchschnittlicher pen von Standard und Unbekannt Rachitisschutzgrad Standard jedoch gleiche Tierzahl und entsprechen bei gleicher Anzahl die Dosen für Standard und Unbekannt einander, so ist ein von B L I S S [8] empfohlenes, relativ einfaches, auf der linearen Regression basierendes Rechenverfahren anwendbar. Es geht davon aus, daß nach Abbildung 4 der durch1 schnittliche Konzentrationsunterschied von Standard und Unbe0.04-? Vitamin D, 0,01 r 0,02 J kannt sich errechnen läßt aus OMmg bestr. Hefe 0.02 mg 0,01 mg

Abb. 4

Vu — y s

M'

Hierin sind yu und ys die Generalmittel aller Rachitisgrade von Unbekannt bzw. Standard; bc stellt den aus den Geraden für Standard und Unbekannt kombinierten Tangens dar; b wird nach B L I S S mittels codierter Dosen errechnet. Zur Ermittlung der einzusetzenden mathematischen Größen empfiehlt sich folgendes Schema: Standard Dosis inyD3

log Dosis

0,01 0,02 0,04

0,0000—2 0,3010—2 0,6020—2

•

cod. Dosen

*

x1

Gruppenreaktion

—1 0 +1 S(*,) = 0

1 0 1 S(*î) =

31,0 43,5 59,0 S[GR)

xx • GR

GR

S(y)9

—31 + 55

= 133,5 S(*i GR)

= 28

Röntgen-Test zur Bestimmung von Vitamin D

289

S t a • GR) y s = S (GR) :n s = 133,5:30 = 4,45 f

&s =

r

\

f

.

= 10

. 0,30102 8- 1 0 - 2

*=3

6i =

I' = Dosenabstand

bs = 4,65

ns = 30

Codierte Dosen lassen sich verwenden, wenn die zur Darstellung der Geraden benutzten Dosen, hier die log-Dosen, gleiche Abstände aufweisen. Summe aller = 0. Bei ungerader Dosenzahl (im Beispiel) ist die Folge... —2; —1; 0; + 1 ; + 2 . . bei gerader . . . — 3 ; — 1 ; + 1 ; +3.... / ' i s t dasVerhältnis des Dosenabstandes i (hier log des geometrischen Faktors) zu dem Abstand der codierten Dosen. Bei gerader Dosenzahl erscheint I' als i/2, bei ungerader als i.

Für Unbekannt bc =

4,65

4,07

ergibt sich entsprechend yu = 5,20 und bu = 4,07. = 4,36. Aus den nunmehr zur Verfügung stehenden

Größen folgt M' = 0,1720. M' stellt einen Logarithmus dar, der vom Logarithmus der Deklaration (40000 i . E . / g Hefe) abgezogen oder zu ihm hinzugezählt werden muß, um den ermittelten Vitamin-D-Gehalt zu erhalten. Der Versuchsfehler von M' errechnet sich nach B L I S S aus 1 , 1 , M = — s y/ — nu H' ns

S

{yu — y,)* B% — s2-t2

Hierin sind fast alle Größen bekannt. B\, die Streuung der Regressionsgeraden bc in der y-Richtung, ergibt sich für codierte Dosen aus ß2

=

und

J S ^ ! • GR), + S(Xl • GÄ) J* 2 • / • S(*I) S(y2)u -

~

B

u + S(y*)s -

-

B\

wobei B2

=

S*(Xl • GR) f-S(x\) '

jeweils für Standard und Unbekannt. Wir errechneten B*c = 68,91, s 2 = 0,6832, B\ = 30,01 und B\ = 39,20. sM ergab sich schließlich zu + 0 , 0 5 1 2 entsprechend 12,5%-

Endergebnis Die untersuchte Hefe enthält 59440 i. E. Vitamin D/g (Vertrauensintervall 52830 bis 66880 für p = 0,32) Auch bei Nichterfüllung der hier zugrundegelegten Bedingung (gleiche Tierzahl in den Gruppen usw.) ist das BLISS'sehe Verfahren anwendbar. Z. B. k a n n Unbekannt aus nur 1 Dosis bestehen. D a n n ist bc durch bs, B\ durch B\ und s 2 durch s 2 zu ersetzen. 20*

290

H.

BEKEMEIER

Rechnerische Überprüfung des Versuches E x a k t e r als die graphische Beurteilung des Versuches hinsichtlich seiner Brauchbarkeit, d. h. auf Erfülltsein der Voraussetzungen für die Anwendung des ausgeführten statistischen Verfahrens, ist eine rechnerische Bewertung: 1. P r ü f u n g a u f L i n e a r i t ä t ( h i e r f ü r S t a n d a r d d u r c h g e f ü h r t ) : Variationsgebiet

Summe der Quadrate der Abweichungen (SAQ)

insgesamt zwischen den Gruppen innerhalb der Gruppen

?

5 ( y S

{ G

p

)

s

s

/

- - p = "s s w

60,175

S(GR2)s

20 825

'

Varianz

ns— 1 = 2 9 ks— 1 =

«s

•S(y2)s

Freiheitsgrade FG

ns—ks

2

= 27

SAQ

= 0,7713 = s j

Von der Variation zwischen den Gruppen wird die durch die Regressionsgerade bedingte Variation der y-Werte (B2) abgezogen; wir erhalten dann als Rest die Variation der Gruppenmittel um die Gerade: Variationsgebiet Zwischen den Gruppen P u n k t e der Regressionsgeraden um Gesamtmittel Gruppenmittel um die Regressionsgerade

SAQ S(GR% t B2 —

_

39_35

ns

S2 (x, • GR)S

=2

ks—1

— 39,20

1

R e s t = 0,15

1

/ • SM)

Varianz

FG

SAO ^ = 0,15 =

4

Die Prüffrage ist, ob die Variation der Gruppenmittel größer ist, als die Variation innerhalb der Gruppen. Wir prüfen die entsprechenden Varianzen im F-Test: F =

0,7713

< 1,0

.F(-errechnet) wird im allgemeinen mit einem entsprechenden .F(-Tafelwert) verglichen. Das erübrigt sich hier, da aus der Größe der Varianzen ohne weiteres ersichtlich ist, daß die Variation der Gruppenmittel um die Regressionsgerade (Sp) kleiner ist als die Variation innerhalb der Gruppen (s2). H ä t t e sich im .F-Test als signifikant größer erwiesen als s|, so wäre daraus zu entnehmen, daß die Gruppenmittel s t a r k über der Geraden streuen, entweder als Ausdruck heterogenen Tiermaterials der Gruppen oder dadurch bedingt, daß die Dosis-Wirkungskurve von N a t u r aus in diesem Falle keine Gerade ist. Schließlich könnte die Ursache auch noch in der unsachgemäßen Herstellung einer Versuchslösung (falsche Konzentration) zu suchen sein.

Röntgen-Test zur Bestimmung von Vitamin J3

291

Wie der Standard wurde auch Unbekannt auf Linearität und Heterogenität geprüft und hierbei ebenfalls als den Anforderungen genügend befunden. Auch die Streuungen um die Geraden von Standard und Unbekannt sollten noch gegeneinander auf Homogenität geprüft werden. Nur wenn beide Streuungen nicht signifikant voneinander abweichen, also als aus einer gemeinsamen Grundgesamtheit entnommen angesehen werden dürfen, ist es erlaubt, sie zu einer gemeinsamen Streuung zusammenzufassen (wie im Beispiel). Wir errechnen die Streuungen entsprechend

o

s (y2)s — — 'fre

S

B

o

S (y«), — —— — B\

ns — 2

'Vu

nu — 2

und prüfen die beiden Varianzen im F-Test auf Signifikanz. Im Beispiel ist F (er0,7491 rechnet) =

Q6

g 3 2 ~ 1,096. Im Vergleich mit dem Tafelwert für p = 0,05 und

einem Freiheitsgrad von 28 für beide Varianzen ergibt sich kein echter Unterschied. 2. P r ü f u n g a u f P a r a l l e l i t ä t : Lösungen einer Substanz mit unterschiedlichen Konzentrationen ergeben Dosiswirkungskurven, die durch Parallelverschiebung auseinander hervorgehen. Verlaufen sie nicht parallel, so unterscheiden sich entweder die Lösungen nicht nur in ihrer Konzentration, sondern in einem weiteren den Kurvenverlauf beeinflussenden Faktor oder es könnte auch das Tiermaterial heterogen reagiert haben. Parallelität darf angenommen werden, wenn die Variation zwischen den Geraden nicht größer ist als die Variation der Einzelpunkte um die Gerade. Als Ausdruck der Variation zwischen den Geraden gilt B\ + B\ — B\

(mit 1 Freiheitsgrad)

Er errechnet sich hier zu 0,30. s 2 wurde zu 0,6832 ermittelt. Die Prüfung der Varianzen im F-Test ergibt F =

°' 3 0

0,6832

Vergleich mit einem F-Tafelwert erübrigt sich hier, da die Variation zwischen den Geraden kleiner ist als die Streuung der Einzelpunkte. 3. P r ü f u n g auf V o r l i e g e n e i n e r R e g r e s s i o n : Bei sehr stark im Koordinatensystem streuenden Punkten ist zu klären, ob überhaupt echte Beziehungen zwischen Dosis und Wirkung vorhanden sind. Echte Beziehungen liegen dann vor, wenn die auf die Punkte der Regressionsgeraden bezogene Streuung größer ist als die Versuchsstreuung. Die entsprechenden Varianzen werden geprüft nach:

Dabei ergibt sich hier 100,86. Ein Vergleich mit F-Tafelwerten (bei Wj = 1 und n2 = 56 Freiheitsgraden) läßt hohe Signifikanz (p < 0,001) erkennen, d.h. die DosisWirkungsbeziehungen sind echt. Der rechnerische Nachweis eines echten Anstiegs

292

H.

BEKEMEIER

der Geraden gelingt wohl immer, wenn sich in der graphischen Darstellung ein solcher deutlich ergibt, wie allgemein der geübte Untersucher im Diagramm den Zweifelsfall erkennt, für den die rechnerische Überprüfung des Versuches notwendig ist. 4. S i g n i f i k a n z d e s A b s t a n d e s d e r G e r a d e n : Die Frage, ob der gefundene Wert in signifikanter Weise von der Deklaration abweicht, kann nach B L I S S durch [S(y), -

S(y) J»

geprüft werden. Überschreitet dieses F, hier errechnet zu 25,76, den F-Tafelwert für p = 0,05 sowie nl = 1 und n, = nu + ns — 4 Freiheitsgrade, so darf die Differenz als echt angesehen werden. Die Prüfung kann auch im /-Test erfolgen. Dazu sind yu, ys sowie s\ (von Standard und Unbekannt) zu verwenden. 5. E r r e c h n u n g f e h l e n d e r W e r t e : Da ein Teil der verwendeten Formeln nur Gültigkeit hat, wenn Anzahl und Umfang der Gruppen gleich groß ist, kann — was wohl selten vorkommt — ein fehlender Wert nach B L I S S aus , _ k • Td' + / • Tg' — T y

=

errechnet werden. y' = GR' fehlender Wert Td' = = Gruppenreaktion ohne den fehlenden Wert Tg' = Summe der Rachitisschutzgrade aller Tiere, die die gleiche Tiernummer in ihrer jeweiligen Gruppe haben wie der fehlende Wert. T' = S(y)' = Summe aller Rachitisschutzgrade von Standard und Unbekannt ohne den fehlenden Wert. Diskussion

Trotz der in den letzten Jahren erfolgten Verbesserung der c h e m i s c h e n Vitamin-D-Bestimmung sind die b i o l o g i s c h e n Verfahren keineswegs überflüssig geworden. Einmal, weil die chemische Bestimmung von Vitamin D bisher nicht überall anwendbar ist, z. B. bei Lebertran, zum anderen, weil die Reproduzierung der veröffentlichten, zum Teil sehr guten Ergebnisse nicht immer gelingt [4]. Schließlich ist die biologische Bestimmung unentbehrlich, wenn nicht der reine Vitamin-D-Gehalt, sondern die tatsächliche antirachitische Wirksamkeit einer Untersuchungssubstanz ermittelt werden soll. Nur im biologischen Test ist der wirkliche Wert eines Präparates abschätzbar; denn nur er berücksichtigt Resorptionsverhältnisse, beigemischte vitaminisch oder antivitaminisch wirksame Substanzen u. a.

Röntgen-Test zur Bestimmung von Vitamin D

293

Als biologische Methode hat sich in Deutschland der prophylaktische Röntgentest (p. R.) weitgehend eingeführt [2]. Gegenüber therapeutischen Verfahren besitzt er folgende Vorteile: 1. Es werden jüngere Tiere verwendet, so daß sie bei Versuchsende statt 45—65 erst 37—40 Tage alt sind. Der p. R. erscheint aus diesem Grunde ö k o n o m i s c h e r , und — vorausgesetzt, daß es sich nicht um Routinebetrieb handelt — die kürzere Anlaufzeit bedingt eine s c h n e l l e r e Versuchsdurchführung. 2. Tiere mit relativ hohen D-Dosen machen keine Rachitis durch; für wenig subtile Versuche erscheint die s p ä t e r e V e r w e n d u n g d i e s e r R a t t e n möglich (vgl. 3). 3- Gegenüber dem Line-Test ist in den Röntgenbildern eine b e s s e r e K o n s e r v i e r u n g und D o k u m e n t a t i o n des V e r s u c h s r e s u l t a t e s gegeben. 4. Im Vergleich zum therapeutischen Röntgentest entfällt beim p. R. die Anfangskontrolle der Rachitis; der p. R. kommt also mit w e n i g e r R ö n t g e n a u f n a h m e n aus. Bei Anerkennung dieser Vorteile wird jedoch dem p. R . nachgesagt, daß er weniger empfindlich und zuverlässig sei als der therapeutische Test, so daß er keinen vollwertigen Ersatz für den Line- oder therapeutischen Röntgen-Test darstelle ([8] p. 121). Das mag für den p. R. in seinen bisherigen Modifikationen zutreffen [2] und wohl | auch noch für das von B Ä H R E C K E und G E B A U E R [-1] vorgeschlagene Verfahren; denn in dem dort mitgeteilten Beispiel errechnet sich X = — als Maß für die Präzision zu 0,3 3 \ während Co W A R D [6] für den Line-Test an über 8000 Rattenpaaren ein durchschnittliches X von 0,22 findet und einer Zusammenstellung von B L I S S und G Y Ö R Y ([8] p. 116) ein X von im Mittel 0,24 zu entnehmen ist. Für den therapeutischen Röntgentest wird X zu 0,175 angegeben [5]. Wir glauben jedoch, daß die hier beschriebene Modifikation des p. R. auch hinsichtlich Präzision mit den therapeutischen Methoden durchaus konkurrieren kann: In dem Beispiel dieser Arbeit beträgt X — 0,19, und auf Grund von 1500 Tieren der Standardgruppen unserer in den letzten 3 Jahren durchgeführten Versuche ergibt sich X zu 0,22 ± 0,02. 1 Statt der von B Ä H R E C K E und G E B A U E R [1] irrtümlicherweise zur Berechnung des Versuchsfehlers benutzten S t r e u u n g i n n e r h a l b der G r u p p e n wurde hier zur Ermittlung von X die Gesamtstreuung um die Gerade s errechnet und zugrundegelegt. — Die zitierte Arbeit enthält darüberhinaus statistische Unrichtigkeiten.

H.

BEKEMEIER

Tabelle 1 Standard Tagesdosis O

a ö «

P

^

o o

TierNr. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 . / = 10

Rachitisschutzgrad y

y

2 3,5 3 3 3,5 3 3 2,5 3,5 4

4 12,25 9 9 12,25 9 9 6,25 12,25 16

S(y) g = Gi? = 31,0

S(y 2 ) g = 99,0

yg = Tagesdosis O

l

S

Q ^

o o

3,i

TierNr.

Rachitisschutzgrad

y

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

3 3 3 6 5 6 5,5 4 5 3

9 9 9 36 25 36 30,25 16 25 9

/ = 10

S(y) g = GR = 43,5

y

S(y 2 )g

= 204,25

y g = 4,35 Tagesdosis

TierNr.

Rachitisschutzgrad

-1,2

6 7 8 9 10

6 6,5 6 6,5 6 5 5,5 6,5 6 5

36 42,25 36 42,25 36 25 30,25 42,25 36 25

/ = 10

S(y) g = GR = 59,0

S( y 2 ) g = 3 5 1 , 0

1

ß Q a

p

«

o o

2 3 4

5

y

ys =

5,9

Röntgen-Test zur Bestimmung von Vitamin D

Tagesdosis

TierNr.

Rachitisschutzgrad y

y2

0,01 mg bestrahlte Hefe (entspr. 0,01 y D3 bei Ann. 40000 i. E./gHefe)

Unbekannt

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

3,5 4 5 4 4 5 2,5 3,5 4 4,5

12,25 16 25 16 16 25 6,25 12,25 16 20,25

/ = 10

S{y)g = GR = 40,0 y g = 4,0

S(y2)g = 165,0

0,02 mg bestrahlte Hefe

Tagesdosis

Tier' Nr. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

y2

6,5 6 4 4,5 5 6 4 5 4 6,5

42,25 36 16 20,25 25 36 16 25 16 42,25

S{y)g = GR = 51,5 Vi = 5,15 '

S(y2)Ä = 274,75

Tagesdosis

TierNr.

Rachitisschutzgrad y

y2

0,04 mg bestrahlte Hefe

/ = 10

Rachitisschutzgrad y

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

6 6 5,5 7 6 6.5 6,5 7 7 7

36 36 30,25 49 36 42,25 42,25 49 49 49

S(y) e = GR = 64,5 y« = 6,45

S(y 2 ) s = 418,75

! / = io

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H.

BEKEMEIER

Literatur H . G E B A U E R . P h a r m a z i e 13, 5 9 2 (1957); A c k e r m a n n , H., N a h r u n g 2, 583 (1958). [2] B E K E M E I E R , H., G . P F E N N I G S D O R E U . W . P O N S O L D : P h a r m a z i e 12, 685 (1958). [3] B E K E M E I E R , H . : A c t a biol. m e d . germ. 3, 109 (1959). [ 4 ] B E K E M E I E R , H., U . W. P O N S O L D : P h a r m a z i e (im Druck). [1]

B Ä H R E C K E , G . , U.

[ 5 ] B O U R D I L L O N , R . B . , H . M . B R U C E , C . F I S C H M A N N U. T . A . W E B S T E R : M e d .

Res.

Counc., Spec. R e p t . Ser. No. 158, L o n d o n 1931. Zit. nach (8) p. 120. [6] C O W A R D , K. H . : T h e Biological Stand, of t h e Vitamins. I I . Auflage, L o n d o n 1947, P- 224 zit. n a c h (8) p. 115[7] F R I E D M A N , L . : J . Assoc. Off. Agric. Chem. 29, 1 4 1 ( 1 9 5 6 ) ; S H U E , G . M . , L . F R I E D M A N U . £ H . D . T O L L E : A n a l y t . Chem. 24, 1 8 4 1 ( 1 9 5 2 ) . [ 8 ] in G Y Ö R G Y , P., V i t a m i n Methods, Bd. II., N e w Y o r k 1 9 5 1 . [ 9 ] H O L T Z , F., G. P F E N N I G S D O R F U . W . P O N S O L D : A r z n e i m i t t e l f o r s c h u n g 5, 557 (1955). [10] K O C H , W. U . G. H E I M : Die H a l t u n g u n d Zucht von Versuchstieren, S t u t t g a r t 1955, p. 17[ 1 1 ] M C C O L L U M , E . V . , N . S I M M O N D S , P . G . S H I P L E Y U . E . A . P A R K : J . biol. Chem i s t r y 47, 507 (1921).

Summary A description is given of t h e prophylactic x - r a y t e s t for biological estimation of V i t a m i n D which was developed in t h e Pharmacological I n s t i t u t e of Halle. I n addition t o t h e k n o w n a d v a n t a g e s of prophylactic m e t h o d this modification offers t h e same precision like therapeutical procedures. I t was already formerly suggested t o a d m i t t h e m e t h o d described t o t h e D A B 7 (German Pharmocopeia). T h e employed statistical procedure can be recommended for evaluation in similar biological a n d pharmacological experiments.

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Acta biol. med. germ., Band 4, Seite 297—313 (i960) Aus dem Institut für Kortiko-Viszerale Pathologie und Therapie der Deutschen Akademie der Wissenschaften zu Berlin, Berlin-Buch (Direktor: Prof. Dr. med. R.

BAUMANN)

Veränderungen der bioelektrischen Aktivität des Gehirns durch niedrige Dosen von Na-Aethylcrotylbarbiturat und ihre Beeinflussung durch Elektroreiz LIESELOTTE SIEKE u n d

ELFRIEDE

SCHEER

(Eingegangen am 19. 11. 1959)

Zusammenfassung 1. Der Einfluß von 5 und 25 mg/kg Na-Aethylcrotylbarbiturat s. c. auf die bioelektrische Aktivität der Katze wird dargestellt. 2. Zum Vergleich dient Na-Phenylaethylbarbiturat. Die qualitativen EEGYeränderungen sind identisch, jedoch in ihrem zeitlichen Auftreten unterschiedlich. 3. 5 mg/kg Na-Aethylcrotylbarbiturat verhindern während des optimalen Barbiturat-Effekts nach 90 Minuten die Schädigung durch Elektroreiz. 60 Minuten nach Injektion ist noch keine Schutzwirkung vorhanden. 4. 25 mg/kg Na-Aethylcrotylbarbiturat lösen gleiche Anzahl und Dauer von Verlangsamungen der bioelektrischen Aktivität aus wie 5 mg/kg. 90 Minuten nach Injektion wird der schädigende Effekt des Elektroreizes ebenfalls verhindert. Zusätzlich verursacht die gesteigerte Dosis — für die sedierende Wirkung unerwünschte — Ataxie und auch starke Betaaktivierung im Hirnstrombild. 5. Der Elektroreiz nach 90 Minuten unterbricht in allen Gruppen kurzfristig die Barbiturat-Wirkung. 6. Das Experiment am nichtnarkotisierten, frei beweglichen Tier macht es möglich, die Veränderungen der bioelektrischen Aktivität durch das Barbiturat und den Elektroreiz dynamisch zu erfassen. 7. Es wird eine Methode zur quantitativen Auswertung der Veränderungen der bioelektrischen Aktivität vorgelegt, die auch eine statistische Sicherung der Ergebnisse gestattet. 8. Auf die Bedeutung des Effektes kleinster Dosen von Na-Aethylcrotylbarbiturat für die klinische therapeutische Zielsetzung wird hingewiesen.

Elektroencephalographische Untersuchungen über verschiedenste Barbiturate, ihre zentralen Angriffspunkte und ihre narkotische Wirkung liegen in großer Zahl vor [1]—[9]. Wir untersuchten den Einfluß des Na-Aethylcrotylbarbiturats auf die bioelektrische Aktivität des Gehirns. Diese Substanz ist seit einigen Jahren unter dem Handelsnamen „Kalypnon" bei uns in die Therapie

298

L. SlEKE,

E.

ScHEER

eingeführt. Uns interessierte hierbei die sedative Wirkung, wie sie in der Klinik therapeutisch zur Unterstützung der Schlaftherapie Anwendung findet. Diese Fragestellung veranlaßte uns, im Gegensatz zu der Mehrzahl der Untersucher, die einen Dosisbereich von 25—120 mg/kg Körpergewicht verwendet haben, eine sehr niedrige Dosis von 5 mg/kg zu untersuchen und sie zu 25 mg/kg in Vergleich zu setzen. Wir konnten diesen Dosisbereich auch deshalb benutzen, weil wir im pharmakologischen Tierexperiment sichere Zeichen für die zentrale Wirkung dieser niedrigen Dosis von 5 mg/kg erhalten haben [i2]. Desgleichen hat T O M A N [2] bei dieser niedrigen Dosis bereits eine antikonvulsive Wirkung beschrieben. Uns interessierte der Einfluß dieser Substanz in der von uns gewählten Dosierung auf die bioelektrische Aktivität bei veränderter Ausgangslage des ZNS. Zur Veränderung der Ausgangslage des ZNS benutzten wir den Elelctroreiz. Darüber hinaus untersuchten wir die Schutzwirkung des Barbiturats auf die durch den Elektroreiz hervorgerufenen Schädigungen des ZNS. Um den dynamischen Wirkungsablauf zu erfassen, wählten wir den chronischen Versuch am nichtnarkotisierten Tier. Für die Auswertung der registrierten bioelektrischen Veränderungen legen wir im folgenden eine für diesen Zweck ausgearbeitete Methode vor. Methodik Als Versuchstiere dienten Katzen männlichen und weiblichen Geschlechts im Alter von 2—3 Jahren mit einem Körpergewicht von 2,5—3 kg. Zur EEG-Ableitung und Reizapplikation implantierten wir unter Äthernarkose 6 Elektroden. Diese wurden frontal, parietal und occipital symmetrisch zur Mittellinie eingesetzt. Die Elektroden bestanden aus einem 1 mm starken Silberstift, isoliert mit Plexiglas, aus Schraubgewinde, Sockel und Schutzhaube (Abb. 1 a u. 1 b). Die Elektroden wurden nach Trepanation der Schädeldecke eingeschraubt. Die nicht isolierten Spitzen der Elektroden saßen unmittelbar auf der unverletzten Dura. Das Verhalten der Tiere wurde über längere Zeit vor der Elektrodenimplantation beobachtet und im Protokoll festgehalten. Die elektroencephalographischen Vorkontrollen erstreckten sich über mindestens 8 Tage, und zwar vom ersten Tage nach der Operation an. Die Ableitungen erfolgten in allen Fällen bipolar mit einem achtkanaligen Direktschreiber der Fa. W T B . Die einzelnen Sitzungen wurden immer im gleichen Raum, zur gleichen Tageszeit und von den gleichen Personen vorgenommen. Unsere Ableitungszeiten wählten wir in den folgenden Versuchen nach gleichbleibendem Schema: Vorkontrolle 15 min Injektion u. unmittelbare Kontrolle 15 min 60 Min nach Injektion 15 min Ableitung 90 Min nach Injektion 15 min Ableitung 3 Std. nach Injektion 15 min Ableitung 5 Std. nach Injektion 15 min Ableitung 6 Std. nach Injektion 15 min Ableitung 24 Std. nach Injektion 15 min Ableitung

Veränderungen der bioelektrischen Aktivitöt des Gehirns

299

Danach täglich einmalige Kontrolle des E E G ' s über 15 min kontinuierlich. In diesen Versuchsserien applizierten wir Na-Aethylcrotylbarbiturat und Na-Phenylaethylbarbiturat subcutan. Zur Kontrolle dienten in allen Serien Injektionen vonTyrode-Lösung. Zur Reizung verwendeten wir Gleichstromimpulse von 0,05 msec

Abb. 1a. implantierte Silberelektroden frontal, parietal u. occipital

Breite und einer Folge von 15/sec, wobei die Keizintensität von 1—10 mA Spitzenstrom variiert wurde. Die Keizdauer erstreckte sich über 5 Sekunden. Die Reizung erfolgte bipolar abwechselnd über der rechten und der linken Hemisphäre. Die Ableitungselektroden dienten gleichzeitig als Reizelektroden. Die elektrische Reizung wurde 60 bzw. 90 Minuten nach der Injektion vorgenommen.

300

L. SlEKE,

E . ScHEER

Bei der Auswertung des bioelektrischen Kurvenmaterials gingen wir folgendermaßen vor: Wir zählten die Verlangsamungen der bioelektrischen Aktivität gegenüber dem durchschnittlichen Normalbild, wenn ihre Spannungshöhe über 120 ßV hinausging. Nach Verabreichung unserer Barbiturate konnten wir Abweichungen von der Ausgangsaktivität beobachten, die sich in verschiedene Schweregrade einteilen ließen, und zwar: 1. in eine Alpha-Aktivierung mit fehlender oder leichter Tendenz zur Verlangsamung, 2. in eine streckenweise auftretende Dysrhythmie, d. h. unregelmäßige langsame Abläufe im. Theta- und Deltawellenbereich mit und ohne steile Abläufe oder Gruppen von spikes, 3. in ein kontinuierliches Deltawellenstadium. Es zeigte sich ferner, daß diese drei Schweregrade durch eine graduelle Zunahme der Frequenzverlangsamung und Spannungshöhe gekennzeichnet waren, die wiederum in guter Korrelation zur Dauer dieser Abweichungen standen. Wir teilten diese Abweichungen in zwei Gruppen ein, und zwar 1. unter 5 Sekunden Dauer und 2. über 5 Sekunden Dauer. Diese Abweichungen zählten wir aus einem 300 Sekunden fortlaufend registrierten Kurvenmaterial zu jedem Ableitungszeitpunkt aus. Die so erhaltenen Zahlenwerte dienten uns zur graphischen Darstellung des zeitlichen Wirkungsablaufes der von uns untersuchten Substanzen und gestatteten darüber hinaus eine statistische Bearbeitung des Materials. Ergebnisse

Zunächst untersuchten wir die normale bioelektrische Aktivität bei 67 Katzen. In den meisten Fällen zeigte sich ein sogenanntes aktives EEG, in dem sich die einzelnen Abläufe als Betawellen zwischen 25—40/sec differenzieren ließen. Die Spannungshöhe dieser Abläufe war innerhalb eines Wach-EEG's bei den einzelnen Tieren gleichbleibend, sie zeigte beim Vergleich untereinander eine Variation zwischen 30—100 /¿V. Gelegentlich beobachteten wir den Übergang in langsame Abläufe von 5—10/sec mit einer Spannungshöhe von 80—120 ,ttV bei noch vorherrschenden Betawellen. Beim Auftreten der langsamen Aktivität war auch im Verhalten der Tiere eine Veränderung in Richtung der Entspannung zu beobachten, wenn auch ein Zustand völliger Entspannung wie beim Menschen oder trainierten Tier nicht erreicht werden konnte (Abb. 2 u. 3). Diese Tatsache, zusammen mit dem Nachweis, daß die Vorkontrollen eines jeden Tieres eine immer gleichbleibende Aktivität erkennen ließen, die wiederum mit dem Verhalten des Tieres in guter Übereinstimmung stand, gab uns die Berechtigung, die in den Vorkontrollen gesehene bioelektrische Aktivität als echte bioelektrische Ausgangsaktivität bei einer normalen Katze anzusehen. Diese Feststellung gab uns ferner die Möglichkeit, alle von dieser Ausgangsaktivität in den folgenden Versuchen abweichenden Abläufe als Antwort auf exogene Einwirkungen zu be-

Veränderungen der bioelektrischen Aktivität des Gehirns

301

trachten. Während der mehrmaligen Vorkontrollen zeigte sich bei allen Tieren eine gute Gewöhnung an die Versuchsbedingungen. Die Tiere wurden im Arm gehalten und waren verhältnismäßig ruhig. Nach Beendigung der Versuchsserien, z.T. nach 55—60 Tagen, wurden die Tiere getötet und der Elektrodensitz kontrolliert. Die Operationswunden waren zu diesem Zeitpunkt restlos verheilt. Die Schädelkalotte wurde Normales Ausgangsbild t-3

2-b

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I - lOO^V Abb. 2. waches, aufmerksames Tier

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Abb. 3. entspanntes Tier

entfernt. Die Gehirnoberfläche zeigte makroskopisch keinerlei entzündliche oder traumatische Veränderungen. Die Dura war in keinem Falle verletzt. a) Der E i n f l u ß von 5 m g / k g N a - A e t h y l c r o t y l b a r b i t u r a t s u b c u t a n auf die b i o e l e k t r i s c h e A k t i v i t ä t u n d das V e r h a l t e n bei Katzen Die ersten Veränderungen im EEG zeigten sich nach 9—14 Minuten post injectionem. Sie bestanden aus generalisiert auftretenden spannungshohen Alphawellen, die zahlenmäßig gering die spontane Aktivität unterbrachen und durch Einwirkung exogener Reize, die beim Tier mit Aufmerksamkeit und Bewegung gekoppelt waren, verschwanden. Diese Veränderungen nahmen zwischen der 60. und der 90. Minute nach Injektion an Dauer und Ausprägung zu. Sie enthielten jetzt neben aktivierten Alphawellen unregelmäßige Verlangsamungen im Zwischenwellenbereich gleicher Spannungshöhe und entsprachen fast dem EEG-Bild einer paroxysmalen Dysrhythmie. Das Optimum der EEG-Veränderungen lag — wie die graphische Darstellung (Abb. 6) zeigt — zwischen 1—3 Stunden. Innerhalb dieser Zeit traten als höchster Grad der Abweichungen im EEG streckenweise generalisierte Deltawellen und Spindelgruppen auf. Die weiteren Kontrollen nach 5 und 6 Stunden ließen bereits eine deutliche Tendenz zur Normalisierung erkennen.

L. SrKKK, Ii. St'HKKR

302

Zwischen EEG-Veränderungen und Verhalten der Tiere bestand zum Zeitpunkt der stärksten Abweichungen im bioelektrischen Bild eine gute Korrelation. Die ersten Veränderungen im EEG waren noch nicht von Veränderungen des Verhaltens begleitet, während ein dämpfender Effekt auf das Verhalten der Tiere noch über das Abklingen der EEGVeränderungen hinaus zu beobachten war. EEG-Veränderungen und Änderung im Verhalten der Tiere im Sinne einer Dämpfung waren in jedem Falle reversibel und nach 24 Stunden abgeklungen (Abb. 4).

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Abb. 4. 5 mg/kg Na-Aethylcrotylbarbiturat s. c. a): vor Injektion b): 90 min nach Injektion — tiefes Deltawellenstadium c): 6 Std. nach Injektion - • fast normalisiert

b) Der E i n f l u ß von 5 mg/kg N a - P h e " y l a e t h y l b a r b i t u r a t subc u t a n auf die b i o e l e k t r i s c h e A k t i v i t ä t und das V e r h a l t e n bei K a t z e n Im Gegensatz zum Na-Aethylcrotylbarbiturat ließ Xa-Plienylaethylbarbiturat eine Stunde nach der Injektion noch keine Verlangsamungen im EEG erkennen, die auf einen dämpfenden Effekt hinwiesen. Es war lediglich eine leichte Betaaktivierung zu beobachten. Im Verhalten waren die Tiere bis zu diesem Zeitpunkt entweder unverändert oder zeigten vermehrte Unruhe und Nervosität. Zwischen 90 Minuten und 5 Stunden nach der Injektion traten im Hirnstrombild, ähnlich wie nach Na-Aethylcrotylbarbiturat, streckenweise aufklingende Verlangsamungen auf, die aber häufiger durch ein aktives EEG oder leichte Beta Aktivierung unterbrochen wurden.

Veränderungen der bioelektrischen Aktivität des Gehirns

303

Zwischen der 5- und 6. Stunde war erst eine volle Ausprägung der Veränderungen im EEG und im Verhalten der Tiere im Sinne einer Dämpfung vorhanden. Die Verlangsamung der bioelektrischen Aktivität war in der EEG-Kontrolle 24 Stunden nach Injektion noch nicht deutlich abgeklungen. Die Kontrolle nach 48 Stunden zeigte dagegen ein vollkommen normalisiertes Bild (Abb. 5 u. 6). c) D e r E i n f l u ß v o n 25 m g / k g N a - A e t h y l c r o t y l b a r b i t u r a t s u b c u t a n auf d i e b i o e l e k t r i s c h e A k t i v i t ä t u n d d a s V e r h a l t e n bei K a t z e n Bei der höheren Dosis beobachteten wir bereits 8—10 Minuten nach der Injektion die ersten Verlangsamungen im EEG. Die Verlangsamungen glichen in der graduellen Ausprägung im weiteren Verlauf denen, die wir nach 5 mg/kg beschrieben haben. Zusätzlich zeigte das Kurvenbild von der 30. Minute nach der Injektion über 5 Stunden eine deutliche Betaaktivierung, die zunächst spontan vorhanden war. Im Stadium der überwiegenden Verlangsamungen lösten exogene — besonders akustische -— Reize erneut eine Betaaktivierung aus, während solche Reize nach 5 mg/kg in diesem Stadium ein normales Ausgangs-EEG hervorriefen. In Übereinstimmung mit den Verlangsamungen im EEG trat ein dämpfender Effekt im Verhalten der Tiere früher ein als bei 5 mg/kg. Mit der Betaaktivierung im EEG traten ausgeprägte pathologische Zeichen von Ataxie auf. In der 5. Stunde beherrschten langsame Deltawellen das EEG-Bild, die bei dieser Dosierung häufiger von Spindelgruppen (Barbiturat-spikes) unterbrochen waren. Die Verlangsamungen im EEG klangen nach 6 Stunden bereits ab, waren aber in geringem Maße nach 24 Stunden noch nachweisbar. Das Verhalten der Tiere war zu diesem Zeitpunkt noch nicht normalisiert. Innerhalb der folgenden 8 Tage traten in den Nachkontrollen lokalisierte Veränderungen auf. Sie bestanden aus Verlangsamungen und steilen Entladungen von spikeähnlichem Charakter, die zuvor weder in den Vorkontrollen noch während des Versuchs beobachtet wurden. Diese Veränderungen zeigten eine sehr langsame Rückbildungstendenz. Im Verhalten zeigten die Katzen zu diesem Zeitpunkt keine Auffälligkeiten (Abb. 7). d) D e r E i n f l u ß e i n e s e l e k t r i s c h e n R e i z e s v o n 1—2,5 m A auf das E E G u n d das V e r h a l t e n bei K a t z e n Reize von 1—2,5 mA zeigten in keinem Falle einen Einfluß auf das Verhalten der Tiere, unabhängig davon, ob sie auf die rechte oder linke Hemisphäre appliziert wurden. Desgleichen zeigten sich auch im EEG unmittelbar nach dem Reiz keine Abweichungen vom Ausgangsbild. In der Folgezeit traten Verlangsamungen auf, die vom Ausgangsbild abwichen und für einen dämpfenden Effekt in Frage kommen könnten. Diese Abweichungen waren unabhängig vom Ort des Reizes und stets generalisiert. Im Verhalten der Tiere war auch bei Beobachtung über längere Zeit keine Veränderung festzustellen. 21

Acta biol. med. germ., Heft 3

L. SlEKE, K. ScHKER

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Abb. 5. 5 mg/kg Na-Phenylaethylbarbiturat s. c. vor Injektion 60 min nach Injektion — leichte Betaaktivierung 90 min nach Injektion — Barbituratspikesu. beginnende Verlangsamungen 6 Std. nach Injektion — Deltawellenstadium .18

16

-1 Tag 2 Tage * nacfc Inj . Abb. 6. 5 mg/kg Na-Aethylcrotylbarbiturat s. c. 5 mg/kg Na-Phenylaethylbarbiturat s. c. ] >as Optimum der Wirkung zeigt sich beim Na-Aethylcrotylbarb. zwischen der 90. Minute und der 3- Stunde und beim Na-Phenylaethylbarb. zwischen der 5. u. 6. Stunde. Der abfüllende Schenkel 60 min nach Injektion von Na-Phenylaethylbarbiturat entspricht einer leichten Betaaktivierung 3 Std. 5 Std.

E r l ä u t e r u n g zur K u r v e n d a r s t e l l u n g : Die Zahlen auf der Senkrechten bedeuten die Mittelwerte, die durch Auszählen der EEG-Veränderungen jeweils in einem Zeitabschnitt von 300 sec kontinuierlicher Registrierung erhalten worden sind. Die untere Kurve stellt die Mittelwerte der Anzahl der EEG-Veränderungen innerhalb dieses Zeitraumes dar, die länger als 5 sec angehalten haben. Die obere Kurve stellt die entsprechenden Mittelwerte aller vorhandenen Abweichungen insgesamt (von unter und über 5 sec Daner) dar.

Veränderungen der bioelektrischen Aktivität des Gehirns

305

b)

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7 24,5

3

15

6,8

16

24

13

7,0

33

27

14

4,5 3.8 7,0 4,0 4,4 4,8 2,0 2,4 3,0 3,6

33 33 33 16 33 16 65 16 0,2 m

11 8 22

15

9 7 11 —

4 •

7 -

29 52 13 70 68 28 1 Std. (toxisch) > 100 27 1 Std. (toxisch)

2,5 2,5 2,6

1 X 33 4 x 33 5 X 10

8 22 23

50 13 13

1,8 1,8

4 X 8,5 4 X 8,5

18 26

15 13

2,9 2,9

4 X 33 1 x 33

26 18

11 13

15 29

12 14

1,0

3 X 0,5ml 3 X 0,5ml physiol. NaCl-Lsg.

— — 15 27 p H - W e r t : p H -Wert der verdünnten Ascitessuspension mit der gelösten Substanz; im 4. Abschnitt pg-Wert der in physiologischer Kochsalzlösung gelösten Substanz. Dosis: mg pro Tier in 0,5 ml verdünntem Ascites bzw. im Abschnitt 4 in 0,5 ml physiologischer Kochsalzlösung gelöst. Gewichtszunahme: Nach 10 Tagen in % vom Ausgangsgewicht; Durchschnitt von je 18 Tieren (3 Versuche). Überlebenszeit: In Tagen; Durchschnitt von je 18 Tieren (3 Versuche).

Kurzmitteilungen

317

Wie die Tabelle ferner zeigt, war eine nachträgliche Beeinflussung mit den von uns untersuchten Verbindungen nicht möglich. Lediglich wenn die Behandlung sofort nach der Tumorimpfung einsetzte, konnte ein gewisser Effekt erzielt werden. Alle anderen Versuche sowohl mit intraperitonealer als auch subcutaner Behandlung, die ein oder zwei Tage nach der Tumorimpfung begann, hatten keinen Erfolg. Beachtlich ist die gute Verträglichkeit dieser sauren Substanzen, die in vitro die Tumorzellen schon innerhalb von 30 Minuten stark schädigen. Literatur [1]

K A T C H A L S K I , E . , L . B I C H O V S K I - S L O M N I T Z K I U. B . E . V O L C A N I : (1952).

[2]

— Biochem.

STAHMANN,

M. A.,

J.

55,

L. H.

671

Nature 169,

1095

(1953).

GRAF,

E. L.

PATTERSON,

J. C.

WALKER

U.

D.

W.

biol. Chemistry 189, 4 5 ( L 9 5 1 ) . [3] KovAcs, K., G. D £ N E S , A. K Ö T A I U. L. P O L G Ä R : Naturwissenschaften 42, 628 WATSON: J. (1955). [4]

NEVO,

A., A.

DE VRIES

U.

A.

KATCHALSKY:

Biochim. Biophysica Acta 17,

536

Tetrahedron 2,

211

(1955). [5]

B R U C K N E R , V . , M . K A J T A R , J . KOVACS, H . N A G Y U . J . W E I N :

[6]

(1958). Mix, H . U . J . K O V A C S :

[7]

COLLIER, W . A . : Z .

Naturwissenschaften 43, 447 (1956). Krebsforschung 40, 5 8 5 ( 1 9 3 4 ) .

Anschrift der Verfasser: Prof. Dr. W . L A N G E N B E C K und Dr. H E R M A N N für organische Katalyseforschung Rostock, Buchbinderstr. 5—6.

MIX,

Institut

Acta biol. med. germ., Band 4, Seite 318—321 (1960) Aus den Instituten für Tierernährungslehre und Veterinärpathologie der HumboldtUniversität Berlin (Direktor: Prof. Dr. A. H O C K )

Na-Selenit als Schutzstoff gegen die ernährungsbedingte Lebernekrose der Ratte ANDREAS

HOCK,

DIETRICH MATTHIAS

und

KLAUS

STRUNZ

(Eingegangen am 26. 1. i960)

Gegen die ernährungsbedingte Lebernekrose der Ratte waren zuerst Zystin, Methionin und Vitamin E als absolut schützende Substanzen gefunden worden [ 1 3 ] - Vor etwa 10 Jahren gelang S C H W A R Z die Entdeckung eines weiteren Schutzprinzips, das er als Faktor 3 bezeichnete [3], [4], [5]. S C H W A R Z erkannte dann 1957 das Selen als integrierenden Teil des Faktor 3 und konnte anschließend mit einer Reihe anorganischer und organischer Selenverbindungen (3—10 mcg% Se in der Diät) die Schutzwirkung erzielen [6]—[10]. Bei einer mittleren Überlebenszeit von 21 Tagen beurteilte S C H W A R Z den Schutzeffekt der Selenverbindungen in der Regel am 30. Versuchstag. In letzter Zeit gelangte dieser Autor zu der Ansicht, daß die Schutzwirkung von Zystin und Methionin auf deren Gehalt an Selen, welches in diesen Verbindungen an die Stelle des Schwefels treten kann, zurückzuführen sei [11], [12]. Über eine volle Schutzwirkung bei Zulage von 100 mcg% Se als Na-Selenit berichteten K E L L E HER und Mitarbeiter [2], ohne jedoch die Beobachtungsdauer bekanntzugeben. Eine Erhöhung der mittleren Überlebenszeit von 35,4 auf 120,5 Tage gelang A T E R M A N [1] mit etwa 700 mcg% Se als Na-Selenit, bei einer I8%igen nekrogenen Backhefediät. Hierbei zeigten die Lebern der gestorbenen Selentiere makroskopisch keine Veränderungen. Da die bisher bekannt gewordenen Befunde nicht einheitlich sind und ausreichende Berichte über eine längere Versuchsdauer fehlen, haben wir die Selenwirkung bei Ratten in einem 130-tägigen Versuch und vergleichsweise auch die Wirkung anderer nekrotroper Stoffe geprüft. Die Lebern sämtlicher Versuchstiere wurden histologisch untersucht; eine derartige histologische Kontrolle ist unseres Wissens bisher bei keinem Versuch dieser Art mitgeteilt worden. Unserer nekrogenen Torulahefediät (15% R P in Trs.) setzten wir folgende Substanzen zu: Na-Selenit (Angabe der Dosis in mcg% Se) oder 0,5% 1-Zystin oder 1 % d,l-Methionin oder 2 mg/Tier/Tag d,l-a-Tokopherylazetat. Wie Tabelle 1 zeigt, wurden 65 Ratten in 13 Gruppen zu je

Kurzmitteilungen

3I9

5 Tieren eingeteilt und mit der nekrogenen Hefediät einschließlich der angegebenen Zusätze gefüttert. Die überlebenden Tiere wurden am 130. Versuchstag getötet. Tabelle 1 Die Wirkung von Na-Selenit-Zulagen zur nekrogenen Torulahefediät

Gruppe Nr.

Zulage Versuchsbeginn 112. Versuchstag zur nekrogenen Hefediät mittl. Gew. mittl. Gew. Tierzahl g g (Se = m c g % ) Tierzahl

1

0

5

2

2 Se

5

3 4 5' 6 7 8 9 10 11 12 13

4 Se 6 Se 8 Se 10 Se 50 Se 100 Se 250 Se 500 Se Zystin Methionin Vitamin E

S 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5

40,2 ± 0,8 39,8 ± 1,4 39,4 ± 0,9 39,4 ± 0,8 39,3 ± 0,7 39,3 ± 0,6 39,0 ± 0,5 39,7 ± 0,7 38,3 ± 0,3 38,7 ± 0,5 39,4 ± 0,6 41,0 ± 0,4 39,2 ± 1,1

bis zum 130. Versuchstag gestorbene Tiere 5

3 5 4 4 4

± ± ± ± ± ±

5

±

5 ± 5 ± 5 ± 5 5

± ±

211,0 11,0 209,2 16,7 218,5 21,9 222,7 9,7 219,8 5,3 196,0 10,9 202,6 10,4 185,8 10,7 173,87,7 276,8 9,9 287,0 8,1 213,8 14,1

2 —

1 1 1 —

—

—

— —

—

—

Die mittlere Überlebenszeit der nichtsupplementierten Tiere (Gruppe 1) betrug 29,6 ± 3 » ! Tage bei einem mittleren Endgewicht von 75,2 i 3>2 g. Bei Zulage von 2 mcg% Se (Gruppe 2) starb je 1 Tier nach 52 bzw. 64 Tagen mit Lebernekrose. Bei Zulage von 6, 8 bzw. 10mcg% Se (Gruppen 4, 5 bzw. 6) starb je 1 Tier-nach 72, 48 bzw. 63 Tagen. Die Untersuchung der Lebern der in den Gruppen 1 und 2 gestorbenen Ratten ergab eine blaßgrau-gelbe Verfärbung des Pärenchyms, das von zahlreichen, verschieden umfangreichen, dunkelroten bis schwarzroten Gebieten durchsetzt war, die sich gegenüber ihrer Umgebung nur unscharf abgrenzten. Hierdurch erhielten die im übrigen brüchigen Lebern ein auffallend buntscheckiges Aussehen. Bei der mikroskopischen BeA c t a bio] med. germ., H e f t 3

Kurzmitteilungen

320

trachtung derart veränderter Lebern zeigte sich ein teilweise sehr erheblicher Untergang von Lebergewebe, ohne daß sich jedoch eine bestimmte Lokalisation dieser Nekrosen innerhalb der Leberläppchen erkennen ließ. Bei dem unveränderten Lebergewebe war es entweder zu einer Umwandlung der Leberzellen in einen Detritus gekommen oder die Leberzellen zeigten Zerfallserscheinungen mit vorwiegend Karyorrhexis. Hierbei fielen zuweilen Leberzellkerne auf, deren Membran noch deutlich erkennbar war, deren Chromatin sich dagegen völlig aufgelöst hatte, so daß vakuolenartige Gebilde entstanden, die einen tiefdunkelblau gefärbten Nukleolus enthielten. Dort, wo das Lebergewebe in größerem Umfange verändert war, traten Blutungen auf, wobei ganze Teile der Läppchen in Blutseen umgewandelt waren. Die noch erhalten gebliebenen Leberkapillaren in oder an der Peripherie derartiger Gebiete waren strotzend mit Blut gefüllt. Die meisten Leberzellen, sowohl die intakten als auch die bereits geschädigten, zeigten sehr beträchtliche tropfige Fetteinlagerungen, die vorzugsweise perivaskulär angeordnet schienen. Sudanophiles Fett fand sich auch in einem Teil der meist geschwollenen Kapillarendothelien. Die Leber des gestorbenen Tieres der Gruppe 4 erwies sich makroskopisch als nicht verändert. Bei der histologischen Untersuchung zeigte jedoch ein großer Teil der Leberzellkerne sog. Marginierung, ferner Kernwandhyperchromatose und -sprossung. Ganz vereinzelt waren auch Leberzellen nekrotisch zugrunde gegangen. Bei den gestorbenen Tieren der Gruppen 5 und 6 ließen sich mit der Diät in einem Zusammenhang stehende Veränderungen nicht nachweisen. Die getöteten Tiere der Gruppen 3—13 hatten sämtlich Lebern, die weder makroskopisch noch mikroskopisch Veränderungen erkennen ließen. Es fiel lediglich auf, daß bei den Tieren der Versuchsgruppen 8—13 die Leberzellen fast frei von sudanophilem Fett waren. Der vorliegende Versuch hat gezeigt, daß eine Zulage von mindestens 4 mcg% Se als Na-Selenit zu einer lebernekroseerzeugenden Torulahefediät unter unseren Versuchsbedingungen makro- und mikroskopisch sichtbare Schädigungen der Leber wenigstens 130Tage lang vermeiden kann. Die günstigste Selendosis (Na-Selenit) liegt zwischen 4 und 10mcg% Se. Höhere Dosierungen (50—500mcg% Se) bewirken ebenfalls vollen Leberschutz, scheinen jedoch eine Depression des Wachstums zu verursachen. Wie aus Tab. 1 hervorgeht, liegen die Gewichtszunahmen in den Gruppen 2—6 (2—10 mcg% Se) in der Höhe der Zunahmen der Vitamin E-Tiere (Gruppe 13), während bei 50—500mcg% Se (Gruppen 7—10) zunehmend geringeres Wachstum beobachtet wurde. . Literatur

[1]

ATERMAN,

[2]

KF.LLEHER, MANN: J.

K . : Brit. W . J.,

J. C.

Nutrit. 13, 38 (19459). GITLER,

M. L.

SUNDE,

M. J.

JOHNSON

N u t r i t . 67, 433 (1959).

[ 3 ] SCHWARZ, K . : P r o c . soc. e x p . biol. m e d . 7 8 , 8 5 2 ( 1 9 5 1 ) .

U.

C. A .

BAU-

Knrzmitteilungen

321

[4] SCHWARZ, K . : loc. cit. 80, 319 (1952). [5] SCHWARZ, K . : Ann. N. Y. Acad. Sei. 57, 878 (1954). [6] SCHWARZ, K . , J . G . B I E R I , G . M . BRIGGS U. M . C . SCOTT: P r o c . s o c . e x p . [7]

[8] [9] [10]

biol.

med. 95, 621 (1957). SCHWARZ, K. U. C. M . F O L T Z : J. amer. Chem. See. 79, 3 2 9 2 ( 1 9 5 7 ) SCWARZ, K., C. M. FOLTZ U. G. B E R G S O N : A c t a chem. Scand. 12, 1330 (1958). SCHWARZ, K . U. C . M . F O L T Z : Feder, proc. 17, Nr. 1, 1 9 2 9 ( 1 9 5 8 ) . SCHWARZ, K. U. C. M. FOLTZ: J. biol. Chemistry 233, 245 (1958).

[ 1 1 ] SCHWARZ, K . , J . A . S T E S N E Y , C . M . F O L T Z : M e t a b o l i s m 8 , 8 8 ( 1 9 5 9 ) -

[12] SCHWARZ, K . : Vitalstoffe 1959, Nr. 4, 1 (13). [13] STRUNZ, K . U. A . H O C K : Die experimentelle diätetische Lebernekrose, Steinkopff, D a r m s t a d t (1959).

Acta biol. med. germ., Band 4, Seite 322—324 (i960) Aus dem Institut für Pharmakologie und Toxikologie der Humboldt-Universität zu Berlin (Direktor: Prof. Dr. F. J U N G )

Beeinflussung des Pentetrazolkrampfes durch N-p-Clorphenyl-2,4-diamino-s-triazin H. LÖWE,

E . GÖRES

und

F.

JUNG

(Eingegangen am 4. 1. 1960)

Bekanntlich besitzen einige der Carbanhydratase-hemmenden Sulfonamide eine klinisch verwertbare krampfhemmende Wirkung. Ohne im Besitz einer spezifischen Konzeption zu sein, prüften wir daher bei dem in den letzten Jahren gleichfalls als kräftiges Diuretikum eingeführten N-p-Chlorphenyl-2,4-diamino-s-triazin (Triazurol, Orpidan) den Einfluß auf den Pentamethylentetrazolkrampf. Unser Wissen über den physiologischen Mechanismus dieses klinisch bereits viel gebrauchten Diuretikums ist mehr als dürftig; der nachfolgend kurz dargestellte Versuch trug daher orientierenden Charakter. Es war uns indessen bekannt, daß viele und sehr verschiedenartig wirkende Mittel Einfluß auf den angezogenen experimentellen Krampf besitzen. Tabellarische Zusammenstellung der Deumacard-Krämpfe

Tierzahl

1. 2. 34. 56. 78. 910.

Deumacard.

Triazurol

mg/kg

mg/kg

10 10 5 25 9 S S 28 23 17

Deumacard Deumacard plus Triazurol

51 60 71,4 84,3 51 71,4 84,3 71,3 0 0

0 0 0 0 4 4 4 4 4 4 u. 0,5 V E HHI. s. c. Tierzahl 50 47

Anzahl d. Tiere, die innerhalb 3 Tagen nach dem stark schwach keine Krampf starben Krämpfe

8 8 5 23 8 4 5 28 0 0

1 1 0 0 1 1 0 0 0 0

1 1 0 2 9 0 0 0 0 0

starke Krämpfe 44 45

0 0 0 0 5 4 5 19 0 4

0 33

Kurzmitteilungen

323

Als Versuchstiere dienten Albinoratten. Das Triazurol wurde oral in einer recht hohen Dosis (4 mg/kg) verabreicht und zwei Stunden später Pentamethylentetrazol (Deumacard) subkutan gegeben. Das Ergebnis ist in der Tabelle zusammengestellt. Der Versuch zeigt eindeutig, daß Triazurol keine sichere Wirkung auf den Krampfablauf besitzt. Indessen läßt sich eine zu vermutende fördernde Wirkung auf Grund der ungünstig gewählten Deumacard-Dosis nicht belegen. Von Bedeutung ist aber, daß die zusätzlich Triazurolbehandelten Tiere zu 70% innerhalb der drei folgenden Tage zugrunde gingen. Der Tod trat nicht im Krampf ein, sondern erst viel später. Alle Triazurol-behandelten Tiere zeigten die zu erwartende Diurese. Im Versuch 8 und 9 ergab die flammenfotometrische Bestimmung eine erhöhte Na-Ausscheidung und eine verminderte K-Ausscheidung gegenüber den Kontrollen. Das Urin-pH der Kontrollen betrug 6,1, das der Triazurol-behandelten Tiere dagegen ca. 7,3- Die Deumacardgabe hatte darauf keinen Einfluß. Bei der Gruppe 8—10 und bei einer unbehandelten Kontrollgruppe wurde das Serum-K bestimmt. Dabei ergab sich in Gruppe 8 ein erhöhter Wert. Da alle diese Werte an gesammeltem Material aus der ganzen Gruppe gewonnen wurden, haben sie kein großes Gewicht. Indessen entsprechen sie den aus anderen Versuchen bekannten und gesicherten Ergebnissen — bis auf den Wert für das Serum-K. Das histologische Bild der Nieren der Triazurol-behandelten Tiere war eindeutig verändert. Genauere Daten hierzu vgl. bei K U P K E , [2], der anschließend die Frage einer Nierenschädigung an größerem Material und systematischer verfolgt hat. Das Ergebnis des Versuches veranlaßte uns zur Weiterführung der Studie in zwei Richtungen: Der Tod der Tiere wurde zunächst als Folge einer Störung im K-Stoffwechsel aufgefaßt. Damit ergab sich die Frage, ob die Empfindlichkeit Triazurol-behandelter Tiere gegenüber einer vermehrten KCl-Zufuhr verändert ist. Diese Frage wird in einer nachfolgenden Mitteilung positiv beantwortet. Dann wurde als ein möglicherweise an Transportvorgängen beteiligtes Fermentsystem die alkalische Phosphatase der Niere wie der Leukozyten histochemisch bei massiv mit Triazurol behandelten Tieren dargestellt. B A C H [ 1 ] hatte nämlich für das chemisch nah verwandte Formoguanamin eine Hemmung der Nierenphosphatase mitgeteilt. Tatsächlich ergab sich bei den laufend gegebenen sehr hohen Dosen von ca. 10 mg/kg und Tag eine Abnahme der Darstellbarkeit des Enzyms in den proximalen Tubuli. Eigentümlicherweise wurde parallel die Reaktion in den Glomeruli und im Mark positiv. Wird die histochemische Phosphatasereaktion in einem Triazurol-gesättigten Medium angestellt, so ergibt sich keine Störung. Die Phosphatasehemmung bildet sich indessen nicht parallel zum diuretischen Effekt aus, und wir halten es für möglich, daß sie nicht direkt mit der Triazurolwirkung zusammenhängt (im einzelnen vgl. bei L Ö W E [ 3 ] ) .

Kurzmitteilungen

324 Literatur [1] [2] [3]

BACH: KUPKE, LÖWE,

Persönliche Mitteilung. D. : Dissertation, Humboldt-Universität, Berlin 1960. H. : Dissertation, Humboldt-Universität, Berlin 1959-

E r r a t u m . Acta biol. med. germ., Band 4, H e f t 1, Seite 117: in der Überschrift m u ß es heißen Mykobacterium a n s t a t t Mycobacterim. 2. Absatz, 2. Zeile: Mykobakterien a n s t a t t Mycobakterien. 2. Absatz, 5. Zeile: 169 a n s t a t t 196. Seite 118, 7. Zeile: 100 ml a n s t a t t 900 ml. 2. Absatz, 1. Zeile. 180 a n s t a t t 980. In der Literaturstelle [4] muß es heißen Naturwissenschaften.

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.

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and H . M A T T H I E S : On t h e mode of action of retrogression of methemoglobin caused by D-Ribose 247—253

L. LACHHEIN

K. J.

G. M I S G E L D a n d K. T R E P T O W : On t h e différenciation of types of higher nervous activity in r a t s 254—268

HECHT, H . KRAUSE,

On t h e kinetics and t h e paper-electrophoretic behaviour of t h e Leucinaminopeptidase of t h e eyelens 269—277

METHFESSEL:

and O. K Ü C H E L : On t h e action of Pituitrin and synthetic Oxytocin applied intracerebrally 278—282

J . VANECEK

H . B E K E M E I E R : A prophylactic x-ray t e s t of biological estimation of vitamin D * 283—296

and E. S C H E E R : Changes of cerebral bioelectric activity caused by small doses of N a - E t h y l c r o t y l b a r b i t u r a t e and t h e influence of electric stimuli upon these changes 297—313

L. SIEKE

Short W.

A.

communications

a n d R . - D . F R A N Z : Influence of a-/?-poly-L-aspartic acid and of subtilis polypeptide on Ehrlich ascites carcinoma cells . . . . 314-—317

LANGENBECK, H . MIX

D. M A T T H I E S a n d K. S T R U N Z : Protecting action of N a selenite against nutritional liver necrosis of t h e r a t 318—321

HOCK,

a n d J . J U N G : Influence of N-p-chlorophenyl-2,4-diamino-striazine on pentatetrazole convulsion 322—324

H . LÖWE, E . GÖRES

COflEP)KAHHE JI. JIaxrefiH H R. M a n n e : O MexaHiiaivie aeftCTBiin BoccTaiioBJiemm MeTrcMorjioômia D-piiôoaort K. TexT, r . K p a y a e , 1\ Miicrejibfl n K. TpeiiTOB: O «n4iepeiimipoBaniiii THIIOB Bbicmeft HepBHoü aeHTejibiiocTii y Kpuc H. BaneneK ii O. Kioxejife: O «eiicTBHH miTyiirpHna u cmiTeTimecKoro OKCiiTomma npH BHyTpiIM03r0B0M BBeAeHHH r . BeKeMeiiep: npo$HjiaKTimecKaH pemrenoBCKaH iipoöa AJIH OuoJiorimecKoro onpeJIEJICHHH BHTAMHIIA D+

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