Acta Biologica et Medica Germanica: Band 20, Heft 4 [Reprint 2021 ed.] 9783112544723, 9783112544716

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ACTABIOIOGICA ETMEDICA GERMANICA HERAUSGEBER:

R. BAUMANN, H. DUTZ, A. G R A F F I , H. GUMMEL, F. JUNG, L.-H. K E T T L E R , S.M. R A P O P O R T UNTER MITARBEIT

VON:

W. B E I E R , H. D R I S C H E L , H. F R U N D E R , M. G E R S C H , E. G O E X Z E , H . H A N S O N , F. H A U S C H I L D , G . H O L L E , F. M A C H , H. M A T T H I E S , G. M O H N I K E f , O . P R O K O P , K . S C H U B E R T , F . S C H W A R Z , G. S T E R B A , A. W O L L E N B E R G E R S C HiR I F T L E I T U N G :

W. S C H E L E R ,

AKADEMIE-VERLAG

• BERLIN

H. B I E L K A

• B A N D 20 • H E F T 4

• S E I T E 421-534 • 1968

AUFNAHMEBEDINGUNGEN 1. E s werden nur Arbeiten angenommen, die nicht an anderer Stelle mit demselben Inhalt veröffentlicht oder zur Veröffentlichung angeboten werden. Der Autor verpflichtet sich nach Annahme, die Arbeit an keiner anderen Stelle zu veröffentlichen. 2. Die Arbeit muß wissenschaftlich wertvoll sein. Bestätigungen bekannter Tatsachen, Versuche und Beobachtungen ohne positives Ergebnis werden, wenn überhaupt, nur in kürzester Form aufgenommen. Nicht aufgenommen werden Arbeiten referierenden Charakters, Polemiken und rein spekulative Arbeiten, falls sie nicht ganz wesentliche neue Gesichtspunkte enthalten. 3. Kurzmitteilungen für experimentelle Ergebnisse werden bei der

Drucklegung

zeitlich bevorzugt. F ü r ihren Inhalt ist ausschließlich der Autor verantwortlich. 4. Die Arbeiten müssen kurz und klar geschrieben und gegliedert sein. Problematik (Einleitung), Methodik, Befunde und Diskussion, evtl. Schlußfolgerungen sollen deutlich in Erscheinung treten. Der Arbeit soll ein Kurzreferat der wesentlichsten Ergebnisse vorausgestellt werden. Neben einer anderssprachigen erscheint auf jeden Fall eine deutsche Zusammenfassung. Die Arbeiten werden in folgenden Sprachen angenommen: Deutsch, Russisch, Englisch und Französisch. 5. Die Arbeiten werden im Sofortumbruch gesetzt; größere Korrekturen in Form von Streichungen bzw. Zusätzen sind daher in der Umbruchkorrektur nicht mehr möglich. 6. Genaue Hinweise zur Manuskriptgestaltung sind von der Redaktion der Zeitschrift anzufordern und sind unbedingt einzuhalten. 7. Manuskripte sind an die Herausgeber zu senden oder direkt an die Redaktion der A c t a biologica et medica germanica, 1 1 1 5 Berlin-Buch, Lindenberger Weg 70. 8. Von jeder Originalarbeit werden kostenlos 80 Sonderdrucke geliefert.

Darüber

hinaus können bis zu 100 Sonderdrucke gegen Berechnung bezogen werden.

Die Herausgeber

ACTA BIOLOGICA ET MEDICA GERMANICA Herausgeber : R. B a u m a n n

Band

• H. D u t z

• A. G r a f f i • H . G u m m e l • F . J u n g • L . - H . K e t t l e r S. M. R a p o p o r t

20

1968

Heft 4

A c t a biol. m e d . g e r m . , B a n d 20, Seite 421 —426 (1968) Aus der Medizinischen Universitätsklinik Rostock ( D i r e k t o r : P r o f . D r . M. G Ü L Z O W )

Zur ß-Galaktosidase-Aktivität des Rattendünndarms H . J. HÜTTER u n d

K.

DIWOK

( E i n g e g a n g e n a m 26. 5- 1967) 1

Zusammenfassung E s w u r d e die A k t i v i t ä t d e r jS-Galaktosidase i m M u k o s a h o m o g e n a t v e r s c h i e d e n e r Intestinalabschnitte der R a t t e untersucht. Das />H-Optimum und der Einfluß vers c h i e d e n e r E f f e k t o r e n w u r d e n e r m i t t e l t . N a c h Z e n t r i f u g a t i o n bei 105 000 g b e f a n d sich n o c h ein e r h e b l i c h e r Teil d e r e n z y m a t i s c h e n A k t i v i t ä t i m N i e d e r s c h l a g . D i e s e Aktivität konnte durch Behandeln mit oberflächenaktiven Stoffen nicht abgelöst w e r d e n . F ü r d a s V e r t e i l u n g s m u s t e r einzelner I n t e s t i n a l a b s c h n i t t e w u r d e n f ü r J e j u n u m u n d I l e u m a n n ä h e r n d gleiche spezifische A k t i v i t ä t e n e r m i t t e l t . Einleitung

Die Aktivität der ß-Galaktosidase wurde von C O H E N et al. [ 1 ] in 19 Organen von Mensch, Hund, Maus, Meerschweinchen und Ratte untersucht. Ein Verfahren zur Darstellung dieses Enzyms aus Escherichia coli ML 309 wurde von W A L L E N F E L S et al. [ 2 ] ausgearbeitet. W A L L E N F E L S und F I S C H E R [ 3 ] haben außerdem die Isolierung von Laktase aus Kälberdarm beschrieben. Nach W A L L E N F E L S et al. unterscheiden sich das aus Escherichia coli und aus Kälberdarm isolierte Enzym sowohl im ^>H-Optimum als auch in Temperaturbeständigkeit und Einfluß von Aktivatoren und Inhibitoren. Das aus Kälberdarm isolierte Enzym hat eine höhere hydrolytische Aktivität gegenüber Laktose als gegenüber o-Nitrophenyl-/3-D-Galaktosid (o-NPG). Bei Fraktionierungsuntersuchungen an Kaninchen und Ratten ergab sich nach den Befunden von D O E L L und K R E T C H M E R [ 4 ] eine vorwiegend partikelgebundene /?-Galaktosidase-Aktivität gegenüber Laktose, während die 1

28

X a c h R e v i s i o n a m 30. 11. 1967 Acta biol. med. germ., Bd. 20, H e f t 4

ACTA BIOLOGICA ET MEDICA GERMANICA Herausgeber : R. B a u m a n n

Band

• H. D u t z

• A. G r a f f i • H . G u m m e l • F . J u n g • L . - H . K e t t l e r S. M. R a p o p o r t

20

1968

Heft 4

A c t a biol. m e d . g e r m . , B a n d 20, Seite 421 —426 (1968) Aus der Medizinischen Universitätsklinik Rostock ( D i r e k t o r : P r o f . D r . M. G Ü L Z O W )

Zur ß-Galaktosidase-Aktivität des Rattendünndarms H . J. HÜTTER u n d

K.

DIWOK

( E i n g e g a n g e n a m 26. 5- 1967) 1

Zusammenfassung E s w u r d e die A k t i v i t ä t d e r jS-Galaktosidase i m M u k o s a h o m o g e n a t v e r s c h i e d e n e r Intestinalabschnitte der R a t t e untersucht. Das />H-Optimum und der Einfluß vers c h i e d e n e r E f f e k t o r e n w u r d e n e r m i t t e l t . N a c h Z e n t r i f u g a t i o n bei 105 000 g b e f a n d sich n o c h ein e r h e b l i c h e r Teil d e r e n z y m a t i s c h e n A k t i v i t ä t i m N i e d e r s c h l a g . D i e s e Aktivität konnte durch Behandeln mit oberflächenaktiven Stoffen nicht abgelöst w e r d e n . F ü r d a s V e r t e i l u n g s m u s t e r einzelner I n t e s t i n a l a b s c h n i t t e w u r d e n f ü r J e j u n u m u n d I l e u m a n n ä h e r n d gleiche spezifische A k t i v i t ä t e n e r m i t t e l t . Einleitung

Die Aktivität der ß-Galaktosidase wurde von C O H E N et al. [ 1 ] in 19 Organen von Mensch, Hund, Maus, Meerschweinchen und Ratte untersucht. Ein Verfahren zur Darstellung dieses Enzyms aus Escherichia coli ML 309 wurde von W A L L E N F E L S et al. [ 2 ] ausgearbeitet. W A L L E N F E L S und F I S C H E R [ 3 ] haben außerdem die Isolierung von Laktase aus Kälberdarm beschrieben. Nach W A L L E N F E L S et al. unterscheiden sich das aus Escherichia coli und aus Kälberdarm isolierte Enzym sowohl im ^>H-Optimum als auch in Temperaturbeständigkeit und Einfluß von Aktivatoren und Inhibitoren. Das aus Kälberdarm isolierte Enzym hat eine höhere hydrolytische Aktivität gegenüber Laktose als gegenüber o-Nitrophenyl-/3-D-Galaktosid (o-NPG). Bei Fraktionierungsuntersuchungen an Kaninchen und Ratten ergab sich nach den Befunden von D O E L L und K R E T C H M E R [ 4 ] eine vorwiegend partikelgebundene /?-Galaktosidase-Aktivität gegenüber Laktose, während die 1

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422

H . J. HÜTTER, K .

DIWOK

Hauptaktivität gegenüber synthetischen Substraten in der zytoplasmatischen Fraktion festgestellt wurde. Von ZOPPI et al. [5] wurde ebenfalls bei Biopsieproben aus menschlichem Jejunum eine deutliche Trennung zwischen einer partikelgebundenen Aktivität des Enzyms für Laktose als natürlichem Substrat und einer auf 6-Brom-2-naphthyl-/S-D-Galaktosid gerichteten zytoplasmatischen Aktivität beschrieben. Im Rahmen der experimentell erzeugten Pankreatitis der Ratte waren für uns Untersuchungen über die /?-Galaktosidase-Aktivität des Dünndarms von Interesse. Da in der Literatur die Berichte über ^>H-Optimum und Effektorwirkung teilweise different sind, erschienen für unsere Untersuchungen einige grundlegende Fragen, die Charakteristik des Enzyms betreffend, von Wichtigkeit, über deren Ergebnisse wir hier berichten. Methodik 1.

Protein-X-Bestimmung

I m Homogenat erfolgte die Protein-X-Bestimmung nach K J E L D A H L , ebenso in den Partikelfraktionen. I m zytoplasmatischen Überstand wurde der Protein-N nach einer von G L Ä S S E R und K L E I N E [ 6 ] modifizierten L o w R Y - M e t h o d e [ 7 ] , teilweise auch nach W E I C H S E L B A U M [ 8 ] bestimmt. Durch Multiplikation mit dem F a k t o r 6 , 2 5 wurde der Protein-X in Protein umgerechnet. 2.

Substrat

Als Substrat diente a-Laktosehydrat(4-0-/?-D-Galaktopyranosido-D-Glukopyranosehydrat) D A B 7 vom V E B Berlin-Chemie. 3. Bestimmung

der

Aktivität

Die A k t i v i t ä t wurde in E / m g Protein errechnet. 1 E = 1 (xMol umgesetztes Substrat pro min. Zusammensetzung der Inkubationsansätze: Gesamtvolumen = 3 ml, Substratkonzentration = 0,046 M, Enzymmenge = 1 ml. Die Bebrütungstemperatur betrug 40 die Bebriitungszeit 1 Std. Zur Unterbrechung der Enzymreaktion wurden die Ansätze für 3 min in einem kochenden Wasserbad erhitzt. Nach Zentrifugation bei 1 500 g für 1 5 min erfolgte die Messung der durch das E n z y m aus dem Substrat freigesetzten Glukose mit der Glukoseoxydasereaktion. Hier benutzten wir die von D A H L Q V I S T [9] angegebene Modifizierung der Methode von H U G G E T T und X I X O N . Glukoseoxydase und Peroxydase waren handelsübliche Produkte vom V E B Arzneimittelwerk Dresden. 4. Beschreibung

der

Versuche

F ü r die Versuche wurden männliche und weibliche W i s t a r - R a t t e n von einem durchschnittlichen Gewicht von 250 g verwendet. I n Urethannarkose erfolgte nach Eröffnung des Bauchraums Entfernung von Magen, unterem Duodenum, oberem J e j u n u m und unterem Ileum. Die isolierten Organteile wurden in eisgekühlter 0 , 9 % i g e r NaClLösung gewaschen, bis die Waschflüssigkeit klar blieb. Danach wurde die Mukosa vorsichtig abgekratzt und pro Organteil gewogen, anschließend in 10 ml eisgekühlter 0 , 9 % i g e r NaCI-Lösung bei 4 °C mit einem Glashomogenisator homogenisiert. Das Homogenat wurde 2 Std. bei 1 0 5 0 0 0 g zentrifugiert, die E n z y m a k t i v i t ä t e n wurden in Niederschlag und Überstand bestimmt und mit der Aktivität des Gesamthomogenats verglichen. Der gewonnene Niederschlag wurde zweimal mit 0 , 9 % i g e r NaCl-Lösung reextrahiert und erneut bei 1 0 5 0 0 0 g zentrifugiert.

/S-Galaktosidase des D ü n n d a r m s

423

Ergebnisse

Verteilung und Differenzierung der Enzymaktivität Die Ergebnisse sind in Tab. 1 und 2 dargestellt. Durch Homogenisieren in eisgekühltem Wasser, in 4%iger Tween- und in 4%iger Triton-X-LOO^Lösung wurde versucht, die Enzymaktivität von den Partikeln zu lösen. Die ermittelte Restaktivität der Partikelfraktion betrug jedoch nach Behandlung mit Tween 40%, nach Triton 3 6 % und nach Homogenisieren in Wasser 48% der Gesamtaktivität. In allen weiteren Versuchen wurde daher die Enzymaktivität lediglich im Gesamthomogenat untersucht. Eine Differenzierung in Aktivitäten einzelner Organabschnitte wurde hierbei vorgenommen. Tab. 2 stellt die Aktivitäten der einzelnen Organfraktionen, Tabelle 1 Verteilung der E n z y m a k t i v i t ä t e n im G e s a m t h o m o g e n a t u n d nach Zentrif u g a t i o n bei 105000 g E / m g Protein

Fraktion Rohhomogenat Überstand Waschwasser Partikel fraktio n

0,0177 0,0038 0,0085 0,0113

Tabelle 2 Differenzierung der yS-Galaktosidase-Aktivität (E/mg Protein) nach Organabschnitten des I n t e s t i n a l t r a k t e s (FRTIEDMAN-Test [12]) Tier

Magen

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

0,0071 0,0200 0,0203 0,0119 0,0084 0,0083 0,0086 0,0165 0,0122 0,0340

Summe

Rangzahl 1 3 4 2 1 1 1 2 1 4 20

12

Duodenum 0,0310 0,0154 0,0138 0,0116 0,0119 0,0165 0,0150 0,0092 0,0254 0,01 58

Rangzahl 3 1 2 1 2 2 2 1 2 1

Rangzahl

0,0348 0,0229 0,0135 0,0140 0,0289 0,0186 0,0160 0,0286 0,0306 0,0216

4 4 1 3 4 3 3 3 3 2

Ileum 0,0158 0,0159 0,0180 0,0145 0,0168 0,0358 0,0220 0,0298 0,0380 0,0262

30

17

- (20 2 + 172 + 30 2 + 332) 10 : 4 . 1

Jejunum

3 • 10 • 5 =

10 68

.

-

Rangzahl

2 2 3 4 3 4 4 4 4 3 33

x\0,05(3) = 7,81

Tween-20 (Polyoxyäthylensorbitanmonolaurat), Dr. T. H. SCHUCHARDT, G m b H München. Triton-X-100 (Oktylphenol-dekaäthylen-glykoläther), Serva-Entwicklungslabor Heidelberg. 28»

424

H.

J.„HÜTTER,

K.

DIWOK

ausgedrückt als E/mg Protein, vergleichend gegenüber und gibt über deren Signifikanzprüfung mit dem FiiiEDMAx-Test Auskunft. Demnach ist ein Unterschied hinsichtlich der Laktaseaktivität zwischen den untersuchten Darmabschnitten im Sinne der höchsten Aktivität in Ileum und Jejunum gegenüber Duodenum und Magen statistisch auf dem 5%-Niveau gesichert. Die Anwendung des gleichen Tests zur Prüfung auf mögliche Unterschiede zwischen den einzelnen Versuchstieren ergab keine signifikante Differenz (x; = 8,99 bei einem Sollwert von xlm(a} = 16,9). Charakteristik der ß-Galaktosidase-Aktivität des Rattenjejitniims

im

Mukosahomogenat

^>H-A b h ä n g i g k e i t : Das nach oben beschriebener Weise präparierte Homogenat hat gegenüber Laktose als Substrat ein ^>H-Optimum zwischen 4,1 bis 4,6 — ein etwas geringer ausgeprägter Gipfel ist zwischen />H 3,4 und 3,8, eine kleine Schulter bei 5,5 feststellbar (siehe Abb. 1).

Abb. 1. pH-Abhängigkeit der Enzymaktivität im Rohhomogenat. Zitroncnsäure-Na 2 HP0 4 -Puffer, 0,4M. Die £>H-Werte wurden vor und nach Bebrütung der Enzymansätze am />H-Meßgerät überprüft. Der />H-Wert des Glukoseoxydasepuffers betrug 7,0 und wurde während der Reaktion eingehalten

Zur weiteren Charakterisierung der Enzymaktivität wurden die Schwermetallionen Co + + , Ni + + , Mn + T , Cu + + in einer pro Versuchsansatz von 3,3 mal 1CT5 bis 3,3 • 10~2 M ansteigenden Konzentration eingesetzt. Co + + hemmt in allen eingesetzten Konzentrationen 14%, Ni + + 9 . 8 % der Gesamtaktivität. Die Hemmung durch Cu + + beträgt in den Konzentrationen 3,3 • 10" 2 M und 3,3 • 10" 3 M 1 8 % und bei 3,3 • 10" 5 M 1 5 % der Gesamtaktivität. Mn + + wirkt in einer Molarität von 3,3 • 10~2 um 1 1 , 7 % aktivierend. Hemm- und Aktivierungseffekt obiger Ionen wurden im F R I E D I I A X Test untersucht und auf dem 1%-Niveau gesichert (x'j = 16,0, xlfll(i) = = 11,3). Diskussion

Die Aktivität der hier beschriebenen ß-Galaktosidase ist im Homogenat der Mukosa des oberen Jejunums und des unteren Ileums annähernd gleich verteilt. A U R I C C H I O et al. [10] geben für menschliche Intestinalmukosa eine ähnliche Beziehung an. Nach Zentrifugation des Homogenats bleiben etwa

/3-Galaktosidase des D ü n n d a r m s

425

6 0 % der spezifischen Gesamtaktivität im Niederschlag erhalten. Diese Aktivität ist durch oberflächenaktive Stoffe nicht voll ablösbar. Das Homogenat wird durch einen Zusatz von 3,3 • 10~ 2 M Mn + + im Ansatz gering aktiviert und durch Zusatz von Co + + , Ni + + , Cu + + in Konzentrationen bis 3,3 mal 1 0 ~ 5 M im Ansatz geringfügig gehemmt. Das von uns ermittelte pHOptimum liegt zwischen 4,1 und 4,6, ein etwas geringer ausgeprägter Gipfel ist zwischen pH 3,4 und 3,8 feststellbar. Das von A U R I C C H I O et al. [10] für Homogenate aus menschlicher Intestinalmukosa gefundene Optimum liegt indessen bei pH 5 , 8 . C O H E N et al. [ 1 ] geben für die Maximalaktivität einen />H-Wert von 3,7 an, verwenden allerdings o-NPG als Substrat. Von K O L D O V S K Y et al. [11] wurde die optimale Aktivität gegenüber o-NPG bei pH 3,5 gefunden, wenn ein Rohhomogenat aus jejunaler Mukosa eingesetzt wurde. Nach Isolierung der Bürstensäume ließ sich jedoch eine zweite ß-Galaktosidase-Aktivität mit einem ^>H-Optimum von 5,5 darstellen, wobei für die Zellrestaktivität der optimale Wirkungsbereich bei pH 3,5 erhalten blieb. Zur weiteren Klärung der durch K O L D O V S K Y et al. nachgewiesenen unterschiedlichen /S-Galaktosidase-Aktivität im Jejunalbereich halten wir die Isolierung dieser Enzyme in möglichst hochangereicherter Form sowohl aus Bürstensäumen als auch aus Zellrestpartikeln für notwendig. Über diese Ergebnisse, besonders unter Einsatz synthetischer Substrate neben Laktose als natürlichem Substrat, wird demnächst berichtet. Literatur [ 1 ] COHEN, R . B . , K . C . T s o u , S . H . R U T E N B U R G U. A . IM. SELIGMAN: J . b i o l . C h e m .

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Z O P P I , G . , B . H A D O R N , R . G I T Z E L M A N N , H . K I S T L E R U. A . 1 ' R A D E R :

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DAHLQVIST, A . : B i o c h e m . AURICCHIO,

S.,

A.

J. 80,

RUBINO,

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XOACK,

G.

SCHENK,

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JIRSOVÄ, A .

HERINGOVÄ,

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5. Aufl.

V F B Gustav Fischer

A n s c h r i f t der V e r f a s s e r : D r . med. H . J . HÜTTER und D r . m e d . K . DIWOK, 25 R o s t o c k , Medizinische U n i v . - K l i n i k , E r n s t - H e y d e m a n n - S t r .

426

H . J . HUTTER,

K.

DIWOK

Summary H . J . H U E T T E R and K . D I W O K : About /3-galactosidase activity on the small intestine

of the rat

The activity of /S-galactosidase in the mucosa homogenate of different intestinal sections has been followed up. Optimal pH and the influence of different effectors were determined. After centrifugation at 105 000 g a considerable part of the enzymic activity is still present in the sediment. This activity could not be detached by treatment with surface-active substances. Approximately the same specific activities are registered for the distribution pattern of individual intestinal sections for jejunum and ileum. Pcaioine r . M. TiOTTep H K.,H,HBOK: K Bonpocy 06 aKTHBiioc™ /?-rajiaKT03H,ia3bi NIL TOHKOM i;iimewiiin;e upbicbi MccJienoBaaacb aKTHBHOCTb /?-ranaHT03Haa3bi B roMoreiiaTe CJIH3HCTOH OGOJIOHKII pa3Hbix oTpesKOB TOHKoro KHiueMHHKa i;pbicbi. OnpeaejifljiHCb onTHMajibiiaji BejTHMHHa pH H BJIHHHHe pa3HbIX 3(|)({)eKT0p0B. IlOCJie UeiITpHlj)yrHpOBaHHH npil 1 0 5 0 0 0 g B ocanne 0Ka3ajiaci> eme 3Ha4HTejii.naH nacrb 3H3mvraTHqecKoii aKTHBHOCTH. y U . l J T H T b 3Ty a K T H B H O C T b o6pa60TH0H IIOBepXHOCTHOaKTHBHblMH BelUeCTBaMH He y.ia.iocb. yjxejibiiwe r>H3HMaTHieci;He aKTHBiiocTH B ornejibiibix ynacTKax ToiiKoro H iioaB3jioiiJHoro KHLIIBHIIHKA fibiJiH NOMTH oflHiiaKOBO pacnpeaejienbi.

Acta biol. med. germ., B a n d 20, Seite 427 — 436 (1968) Aus dem I n s t i t u t f ü r Kreislaufforschung der Deutschen Akademie der Wissenschaften zu Berlin (Direktor: Prof. Dr. A. W O L L E N B E R G E R )

Zur Frage der Kompartmentierung des N a t r i u m s in menschlichen Erythrozyten R.

GLASER

(Eingegangen a m 31. 7. 1967) 1

Zusammenfassung Die Ergebnisse kontinuierlicher Messungen der 2 2 Na-Ausscheidung aus menchliche E r y t h r o z y t e n in vitro werden dargelegt. I m elektrostatischen Feld des Oberflächenpotentials der E r y t h r o z y t e n wird eine gewisse Menge X a t r i u m i o n e n festgehalten, deren A u s t a u s c h k o n s t a n t e abhängig von der Suspensionsdichte der Zellen ist. I n der Erythrozytensuspension ist das N a t r i u m in zwei K o m p a r t m e n t s e n t h a l t e n . Ob diese parallel oder in Serie geschaltet sind, k o n n t e auf G r u n d der vorliegenden Versuche nicht entschieden werden. Aus diesem G r u n d w u r d e n beide Möglichkeiten berechnet, die e r m i t t e l t e n P a r a m e t e r beider Systeme werden dargestellt. Der N a t r i u m g e h a l t eines Eiters E r y t h r o z y t e n z e n t r i f u g a t b e t r ä g t bei Parallelschaltung 1 5,2 mMol und bei Serienschaltung der K o m p a r t m e n t s 14,6 mMol. Einleitung

In einer früheren Arbeit wurden bereits erste Ergebnisse über den 22 NaAustausch menschlicher Erythrozyten in vitro mitgeteilt [1], Die Befunde stützen sich auf kontinuierliche Messung der Abnahme der Radioaktivität von Erythrozyten, die nach verschiedener Inkubationszeit in 22 Na-haltiger RINGER-Lösung mit inaktiver RIXGER-Lösung durchspült wurden. Es stellte sich heraus, daß dieser Austauschvorgang einer Kinetik höherer Ordnung folgt. Eine Lagerung der Erythrozyten vor dem Versuch bis zu 24 Std. hat keinen signifikanten Einfluß auf die Ausscheidungskurve. Folglich mußte angenommen werden, daß es sich nicht um artifizielle physiologische Veränderungen der Austauschgeschwindigkeit während des Versuches, sondern um eine Kompartmentierung des Na + in der Erythrozytensuspension handelt. Eine mathematische Analyse der 22 Na-Ausscheidung ergab eine Summe aus 4 Exponentialtermen. Wurde Erythrozytenzentrifugat aus der 22 Na-Inkubationslösung direkt in die Durchflußkammer eingebracht, so konnte zunächst als technisches Kompartment der Ausfluß der überschüssi1

Nach Revision a m 2. 10. 1967

Acta biol. med. germ., B a n d 20, Seite 427 — 436 (1968) Aus dem I n s t i t u t f ü r Kreislaufforschung der Deutschen Akademie der Wissenschaften zu Berlin (Direktor: Prof. Dr. A. W O L L E N B E R G E R )

Zur Frage der Kompartmentierung des N a t r i u m s in menschlichen Erythrozyten R.

GLASER

(Eingegangen a m 31. 7. 1967) 1

Zusammenfassung Die Ergebnisse kontinuierlicher Messungen der 2 2 Na-Ausscheidung aus menchliche E r y t h r o z y t e n in vitro werden dargelegt. I m elektrostatischen Feld des Oberflächenpotentials der E r y t h r o z y t e n wird eine gewisse Menge X a t r i u m i o n e n festgehalten, deren A u s t a u s c h k o n s t a n t e abhängig von der Suspensionsdichte der Zellen ist. I n der Erythrozytensuspension ist das N a t r i u m in zwei K o m p a r t m e n t s e n t h a l t e n . Ob diese parallel oder in Serie geschaltet sind, k o n n t e auf G r u n d der vorliegenden Versuche nicht entschieden werden. Aus diesem G r u n d w u r d e n beide Möglichkeiten berechnet, die e r m i t t e l t e n P a r a m e t e r beider Systeme werden dargestellt. Der N a t r i u m g e h a l t eines Eiters E r y t h r o z y t e n z e n t r i f u g a t b e t r ä g t bei Parallelschaltung 1 5,2 mMol und bei Serienschaltung der K o m p a r t m e n t s 14,6 mMol. Einleitung

In einer früheren Arbeit wurden bereits erste Ergebnisse über den 22 NaAustausch menschlicher Erythrozyten in vitro mitgeteilt [1], Die Befunde stützen sich auf kontinuierliche Messung der Abnahme der Radioaktivität von Erythrozyten, die nach verschiedener Inkubationszeit in 22 Na-haltiger RINGER-Lösung mit inaktiver RIXGER-Lösung durchspült wurden. Es stellte sich heraus, daß dieser Austauschvorgang einer Kinetik höherer Ordnung folgt. Eine Lagerung der Erythrozyten vor dem Versuch bis zu 24 Std. hat keinen signifikanten Einfluß auf die Ausscheidungskurve. Folglich mußte angenommen werden, daß es sich nicht um artifizielle physiologische Veränderungen der Austauschgeschwindigkeit während des Versuches, sondern um eine Kompartmentierung des Na + in der Erythrozytensuspension handelt. Eine mathematische Analyse der 22 Na-Ausscheidung ergab eine Summe aus 4 Exponentialtermen. Wurde Erythrozytenzentrifugat aus der 22 Na-Inkubationslösung direkt in die Durchflußkammer eingebracht, so konnte zunächst als technisches Kompartment der Ausfluß der überschüssi1

Nach Revision a m 2. 10. 1967

428

R.

GLASER

gen 22 Na-RiNGER-Lösung beobachtet werden (/e = 0,388 m i n 1 ) . (In der Arbeit [1], Tab. 1, ist dieser Wert infolge eines Druckfehlers als 0,338 angegeben. Im Text S. 52 steht der richtige Wert 0,388.) Danach erschienen noch Kompartments mit Austauschkonstanten von 4,56 Std. - 1 , 0,335 S t d . - 1 u n d 0,0362 Std." 1 . In folgendem soll über weitere Ergebnisse berichtet werden, die Aufschlüsse über die Charakteristik dieser drei Kompartments geben. Gleichzeitig interessiert das Problem des Na + -Gehaltes menschlicher Erythrozyten. Messungen, die bereits von verschiedenen Autoren durchgeführt worden sind, differieren beträchtlich [2—10, 22], Methodik A n a n d e r e r Stelle w u r d e b e r e i t s ü b e r die a n g e w e n d e t e M e t h o d i k a u s f ü h r l i c h b e r i c h t e t [1], H i e r sei d e r V e r s u c h s a b l a u f n u r k u r z u m r i s s e n : H e p a r i n i s i e r t e s B l u t a u s d e r A r m v e n e w u r d e u n t e r s c h i e d l i c h e Zeit in 2 2 N a - h a l t i g e r RINGER-Lösung i n k u b i e r t . N a c h B e e n d i g u n g d e r I n k u b a t i o n w u r d e n die Zellen a b z e n t r i f u g i e r t , eine b e s t i m m t e M e n g e d e s Z e n t r i f u g a t e s (meist 0,05 nil) in eine t r i c h t e r f ö r m i g e M e ß k a m m e r e i n g e b r a c h t (Volum e n 1 ml) u n d o b e n m i t e i n e m M i l l i p o r e - F i l t e r ( P o r e n w e i t e 1,2 [im) a b g e d e c k t . V o n u n t e n h e r w u r d e die M e ß k a m m e r n u n m i t i n a k t i v e r KIXGER-Lösung d u r c h s t r ö m t . Mit H i l f e eines S z i n t i l l a t i o n s z ä h l e r s k o n n t e die 2 2 N a - A k t i v i t ä t d e r E r y t h r o z y t e n k o n t i nuierlich g e m e s s e n u n d auf e i n e m B a n d s c h r e i b e r r e g i s t r i e r t w e r d e n . E i n T h e r m o s t a t s o r g t e f ü r k o n s t a n t e T e m p e r a t u r e n w ä h r e n d des V e r s u c h e s (37 °C). F ü r einige V e r s u c h e erwies es sich als g ü n s t i g , die r a d i o a k t i v e E r y t h r o z y t e n s u s p e n s i o n z u v o r m i t i n a k t i v e r RIXGER-Lösung e i n m a l zu w a s c h e n . I n t e r e s s i e r t e die M e n g e des a u s g e t a u s c h t e n N a t r i u m s n a c h b e s t i m m t e r I n k u b a t i o n s z e i t , so w u r d e v o n e i n e m Teil d e s Z e n t r i f u g a t e s d e r H ä m a t o k r i t w e r t b e s t i m m t . D e r N a + - G e h a l t d e r RixGKR-Lösung w u r d e m i t einem F l a m m e n f o t o m e t e r ü b e r p r ü f t . Ergebnisse

Die Charakteristik

der

Kompartments

Es soll an dieser Stelle auf das bereits erwähnte technische Kompartment der Meßanordnung nicht näher eingegangen werden. Als Kompartment 1 wurde in der oben zitierten Arbeit der 22 Na-Anteil bezeichnet, der mit einer Halbwertszeit von 9,-16 i 1,85 min eine Austauschkonstante von 0,076 ± 0,015 m i n - 1 ( = 4,56 ± 0,90 Std." 1 ) aufweist [1], (Die Fehler sind Standardabweichungen der Einzelwerte.) Dieser Wert wurde bei Füllung der Meßkammer mit 25 M-l Erythrozyten gewonnen. Es zeigte sich (Abb. 1), daß die Austauschgeschwindigkeit dieses Kompartments mit zunehmender Erythrozvtendichte abnimmt. Diese Tatsache legt den Gedanken nahe, daß hier kein echtes Kompartment entsprechend der Definition von SOLOMON [ 1 1 ] vorliegt, sondern daß offenbar Na-Ionen im elektrostatischen Feld des Oberflächenpotentials der Erythrozyten (siehe [12]) fixiert sind. Bei genügend dichter Packung der Erythrozyten bilden diese ein geschlossenes Ladungsgitter. Es erscheint zunächst unvorstellbar, daß dies bei einer Suspensionsdichte von nur 1 bis 5 Volumen-% auftreten soll. S H A ' A F I et al. [21] wiesen kürzlich

Kompartmentierung des Erythrozyten-Natriums

429

min

13

12 11

10

Abb. 1. Die Abhängigkeit der Halbwertszeit des K o m p a r t m e n t 1 (absorbiertes Xatrium) von dem Erythrozytenvolumen in der Durchfhißkammer. ( + = Mittelwerte)

9

a 7

0

10

20

30

W

50/ul

nach, daß Erythrozyten mit einer undurchmischten Wasserhülle von 5,5 ± 0,8 fxm Stärke umgeben sind. Betrachtet man die Blutzelle als Scheibe (Radius 4 fi.m, Dicke 2 ¡im), so würde diese Hülle den Radius derselben um 5,5 und ihre Dicke um 11 [xm vergrößern. Unter diesen B e dingungen kann der Anteil des effektiven Zellvolumens am Gesamtvolumen des Solvat-Zylinders berechnet werden. Unter Beachtung des Fehlerfortpflanzungsgesetzes ergibt sich 2,73 ± 1,02 Volumen-%. Dies zeigt, daß die in unseren Versuchen verwendeten Suspensionsdichten von 1 bis 5 VolumenProzent in den Streubereich dieser Größe fallen. Diese Erörterungen sollen nicht nachweisen, daß die auf Abb. 1 dargestellten Halbwertszeiten die Austauschgeschwindigkeit des N a + im Wassermantel der Erythrozyten bedingen. Es sind vielmehr Größen, die als Funktionen der Dichte des Erythrozyten-Netzes zu betrachten sind. Der in der vorausgegangenen Arbeit [1] als Kompartment 2 bezeichnete Na + -Anteil der Erythrozyten, der im 2-Std.-Experiment mit einer Halbwertszeit von 125 ± 18,8 min (k = 0,335 ± 0,050 Std." 1 ) austauscht, kann wie bereits vermutet wurde, im Sinne der Arbeiten von SOLOMON et al. [13], G L Y N N [ 1 4 ] u n d SCHATZMANN [3] a l s a k t i v t r a n s p o r t i e r t e s N a t r i u m b e t r a c h -

tet werden. Durch Strophanthin-Zugabe wird die Dekorporationskurve, die nach zweistündiger Inkorporation normalerweise in den ersten 5 Std. bei halblogarithmischer Darstellung linear verläuft (s. Abb. 3), deutlich verändert (s. Abb. 2). Dieser Prozeß ist reversibel. Glukosemangel führt eben% 100

20 0

2

3

Abb. 2. Die Einwirkung von g-Strophanthin auf die Ausscheidung von 2 2 Na nach 2stündiger Inkubation. (Die gestrichelte Linie gibt den Normalverlauf der K u r v e ohne Strophanthinzugabe wieder)

430

R.

GLASER

falls zu einer Abflachung dieser Kurve, allerdings erst nach längerer Zeit, da offenbar zuvor noch ATP-Reserven verbraucht werden. Nach H e m m u n g des aktiven Transportes setzt ein passiver Austausch ein, der sehr langsam erfolgt. Eine Berechnung dieser Austauschkonstanten ist sehr schwierig, da die Fließgleichgewichtsbedingung des Na + -Austausches in diesen Fällen nicht gewährleistet ist. Über die Art des langsamen Kompartments mit der Halbwertszeit von 19,3 ± 5.9 S t d = 0,0362 ± 0,011 Std. - 1 ) können keine näheren Angaben gemacht werden. Die Bestimmung der im Verlaufe der Inkorporationszeit ausgetauschten Natrium-Menge in Kompartment 2 und 3 In der vorausgegangenen Veröffentlichung [1] wurde auf Abb. 2 (A—C) bereits dargestellt, wie nach der üblichen Methode der Extrapolation der Kurven bis zu t = 0 (Beginn der Dekorporation) der Anteil der Radioaktivit ä t der einzelnen Kompartments an der Gesamtaktivität zu ermitteln ist. Legt man zugrunde, daß nur die Kompartments 2 und 3 Zellkompartments sind, so kann der Anteil der Radioaktivität der Zelle von dem der Lösung getrennt werden. Die Radioaktivität der Zellen zum Zeitpunkt t = 0 soll mit Nzo u n d die Radioaktivität der RiNGER-Lösung mit NR0 bezeichnet werden. Der prozentuale Anteil (q) der Erythrozytenaktivität an der Gesamtaktivität läßt sich dann wie folgt definieren:

Außerdem ist die Na + -Konzentration in der RixGER-Lösung ([Na]Ä) und der Hämatokritwert (H) der in die Durchflußkammer einpipettierten Erythrozytensuspension bekannt, der die Beziehung zwischen Erythrozytenvolumen (Vz) und dem Volumen der radioaktiven RiNGER-Lösung {VR) ausdrückt. H =

-100.

(2)

Aus diesen Werten läßt sich die ausgetauschte Na + -Menge zum Zeitpunkt des Dekorporationsbeginnes in den Erythrozyten, bezogen auf das Erythrozytenvolumen, bestimmen. Diese Größe soll als [Na]^ bezeichnet werden, obgleich sie streng genommen keine echte Konzentration ist. Die Ableitung dieser Beziehung sei hier dargestellt: (3) (S ist die spezifische Aktivität der RiNGER-Lösung, die gleich der des aufgenommenen Natriums der Erythrozyten ist.) Aus (1) ergibt sich: i—

• S • [Na] R • V R

•

(4)

Kompartmentierung des Erythrozyten-Natriums

431

Aus (2) resultiert: H

Vz

=

• rA>

100 -

(5)

H

(4) und (5) eingesetzt in (3) ergibt: q (100 -

[NaJ z = [Na] ß

H)

(6)

(100 — q)

H

Auf diese Weise kann die Menge des ausgetauschten Natriums nach verschiedenen Inkorporationszeiten durch Analyse der Dekorporationskurven bestimmt werden. E s ist jedoch zu beachten, daß naturgemäß das Kompartment 1 (absorbiertes Natrium) mit Sicherheit den übrigen beiden vorgelagert ist.

D u r c h G l e i c h u n g (16) d e r A r b e i t v o n GLASER u n d WOLLEN-

BERGER [1] ist die Korrektur errechenbar, die dabei notwendig wird. Zu diesem Zweck muß die Austauschkonstante des gesamten Erythrozytensystems (k ZK ) bekannt sein (k ZK ist eine komplizierte Funktion der Austauschkonstanten und der Radioaktivität der Kompartments 2 und 3 und folglich abhängig von der Inkorporationszeit). Aus Abb. 3 sind die anfäng% 100

• 8.6 0.9Std (H)

¿j-3.V-0.3steten)

50 40 30

Abb. 3- Ausscheidungskurven nach unterschiedlicher Inkubationszeit in 2 2 Na-haltiger RixGER-Lösung. Die Halbwertszeiten charakterisieren den Anfangsverlauf der Kurven

20

-

/

\

^

^

ÄSW.

^

^

SStd.

10

1

15 Std

liehen Halbwertszeiten der Summenkurven der Erythrozyten nach 2 Std., 6 Std. und 24 Std. Inkorporationszeit dargestellt, aus denen sich kZK jeweils ermitteln läßt. Die errechneten Korrekturfaktoren betrugen für 2 Std. Inkorporation 0,922, für 6 Std. 0,946 und für 24 Std. 0,981. In Tab. 1 sind die nach Gleichung (6) errechneten und entsprechend korrigierten Werte der Menge des ausgetauschten Natriums nach verschiedenen Inkorporationszeiten, bezogen auf das Erythrozytenvolumen dargestellt. Tabelle 1 Menge des ausgetauschten X a * nach verschiedenen Inkubationszeiten in 2 2 Xa-haltiger RixGER-Lösung Inkubationszeit rstd.i

Anzahl der Messungen

2

17 11

6 24

10

Svmbole

Menge des ausgetauschten Na* [mMol/1 Zellen] 3,23 ± 0,19 6,93 ± 0,58 10,7 ±0,90

432

R.

GLASER

Diskussion

Modellvorstellungen

des

Austauschsystems

Aus der vorausgegangenen Darstellung geht hervor, daß der Na + -Austausch einer Suspension menschlicher Erythrozyten der Kinetik eines Zweikompartmentsystems folgt. (Es sind dabei die Kompartments 2 und 3 gemeint. Die ursprünglich als Kompartment 1 bezeichnete absorbierte Natriummenge soll unberücksichtigt bleiben. Der Einfluß desselben auf Kompartment 2 und 3 wurde durch die getroffenen Korrekturen eliminiert.) Ferner sind die Austauschkonstanten dieser Kompartments bekannt, falls diese parallel geschaltet sind, und die Menge des ausgetauschten Natriums des gesamten Systems nach verschiedenen Zeiten (Tab. 1). Zu erörtern wären folgende Fragen: 1. Kann durch die vorliegenden Versuche die Schaltung der Kompartments entschieden werden ? 2. Wie groß ist der gesamte Natriumgehalt in den einzelnen Kompartments und letzten Endes in den Erythrozyten ? 3. Wie groß sind die Austauschkonstanten im Falle einer Serienschaltung? Zunächst zur zweiten Frage: Aus Tab. 1 sind die Werte [Na] 22 , [Na] Z6 und [Na] 724 zu entnehmen, die sich folgendermaßen zusammensetzen: [Na] Z2 = [ N a ] „ + [ N a ] „ , ' [Na] z 6 = [ N a ] „ + [Na] 3 6 ,

•

(7)

[ N a ] Z 2 4 = [Na] 224 + [Na] 324 . . (Der erste Index dieser Werte bezieht sich jeweils auf das Kompartment, der zweite auf die Inkorporationszeit). Diesem Gleichungssystem mit 6 Unbekannten können 6 weitere Gleichungen hinzugefügt werden: m-,

=

[Xa]22

2

Na ä«

6

[Xa]22

X a _3 2 X a o 04

24

m, =

[Xa]28 ; X a] 2 24

n3

=

(8)

r Xa1,

Die W'erte mlt m2, m3 und nlt n2, n3 sollen zunächst als bekannt vorausgesetzt werden. Aus (7) und (8) ergeben sich für jede der 6 Unbekannten je drei unabhängige Lösungen. Z. B . : m2 ; Xa]z24 — [Na] 324 = m, — n„

[Na] 324 = [Na]3 24 = -

mz - n3 nii [Xa]z6 — [^"a]z2 n3 [m1 — Wj)

(9)

Kompartmentierung des Erythrozyten-Natriums

433

S i n d die 6 U n b e k a n n t e n des G l e i c h u n g s s y s t e m s (7), die A u s t a u s c h k o n s t a n t e n u n d die S c h a l t u n g der K o m p a r t m e n t s e r m i t t e l t , so l ä ß t sich der G e h a l t a n a u s t a u s c h b a r e m N a t r i u m in den beiden K o m p a r t m e n t s ([Na] 2 c o u n d [Na] 3 o o ) bestimmen. E s sei z u n ä c h s t eine P a r a l l e l s c h a l t u n g der K o m p a r t m e n t s 2 u n d 3 a n g e n o m m e n . W e n n j e t z t willkürliche A n n a h m e n über die W e r t e von [Na] 2 o o u n d [ N a ] j o o g e t r o f f e n werden, d a n n lassen sich m i t Hilfe der e x p e r i m e n t e l l erm i t t e l t e n A u s t a u s c h k o n s t a n t e n , die zu b e s t i m m t e n Z e i t p u n k t e n a u s g e t a u s c h t e n N a + - M e n g e n der einzelnen K o m p a r t m e n t s u n d n a c h G l e i c h u n g (8) die W e r t e von m1, m2, m3 u n d n2, n3 e r r e c h n e n . D a s G l e i c h u n g s s y s t e m (7) u n d (8) ist d a n n n a c h (9) lösbar. (Die drei u n a b h ä n g i g e n L ö s u n g e n für j e d e U n b e k a n n t e k ö n n e n u n t e r e i n a n d e r g e m i t t e l t werden. D a d u r c h wird ein besserer Ausgleich erzielt.) D i e auf diese W e i s e e r m i t t e l t e n E r g e b n i s s e s i n d j e d o c h f e h l e r h a f t , denn es wurden zwar die M e ß w e r t e [ N a ] Z 2 , [ N a ] z 6 , [ N a ] Z 2 t sowie k2 u n d k3, gleichzeitig a b e r auch die z u n ä c h s t willkürlich g e s c h ä t z e n W e r t e für [Na] 2 o o u n d [Na] 3 o o eingegeben. A u s den z u n ä c h s t f e h l e r h a f t erm i t t e l t e n W e r t e n von [Na] 2 2 , [Na] 3 2 , [Na] 2 6 , [Na] 3 6 , [Na] 2 2 4 u n d [Na] 3 2 4 l a s s e n sich a b e r neue W e r t e v o n Wj, m2, m3 u n d nx, n2, n3 e r r e c h n e n , die b e r e i t s g e n a u e r als die ursprünglich eingegebenen sind. J e t z t k a n n der R e c h e n prozeß m i t diesen g e n a u e r e n W e r t e n wiederholt werden. D i e s f ü h r t wieder u m zu v e r b e s s e r t e n N ä h e r u n g s l ö s u n g e n . N a c h 3 f a c h e r W i e d e r h o l u n g dieses I t e r a t i o n s p r o z e s s e s ä n d e r t e n sich die e r m i t t e l t e n G r ö ß e n in den G r e n z e n der a n g e w e n d e t e n R e c h e n g e n a u i g k e i t n i c h t m e h r u n d k o n n t e n folglich als a u s r e i c h e n d g e n a u a n g e s e h e n werden. J e t z t ließen sich a u c h zuverlässige W e r t e für [Na] 2 o o u n d [Na] 3 o o e r m i t t e l n . E s ist an dieser S t e l l e n o t w e n d i g , einige B e m e r k u n g e n zur B e s t i m m u n g der A u s t a u s c h k o n s t a n t e k2 e i n z u s c h a l t e n . W i e b e r e i t s a n a n d e r e r S t e l l e v e r m e r k t , ließ sich k2 am g ü n s t i g s t e n a m D e k o r p o r a t i o n s v e r s u c h n a c h 2 S t d . I n k o r p o r a t i o n e r m i t t e l n . D i e s e r W e r t ist j e d o c h u n g e n a u , da das s c h w a c h a k t i v e K o m p a r t m e n t 3 den W e r t geringfügig v e r f ä l s c h t . A m 2 S t d . - V e r s u c h wird s t r e n g g e n o m m e n n i c h t k2 sondern kZK e r m i t t e l t . D e r S u m m e n f l u x zu B e g i n n des V e r s u c h e s l ä ß t sich auf zweierlei W e i s e d a r s t e l l e n :

Jo = kzii • NZO = KZK{N20 + N30)

(10)

30 30 lo = K • N20 + ks • N

(11)

( / 0 - F l u x der R a d i o a k t i v i t ä t zu B e g i n n der D e k o r p o r a t i o n , NZO, A r 20 , N30R a d i o a k t i v i t ä t e n zu B e g i n n der D e k o r p o r a t i o n in d e m g e s a m t e n S y s t e m , in K o m p a r t m e n t 2 u n d in K o m p a r t m e n t 3 e n t s p r . ) . A u s d i e s e m S y s t e m v o n Gleichungen b e r e c h n e t sich k2 z u :

K

h ZIKHbie npocTpancTBeHHbie KOMOwnanHH 3aMecTHTejieii n a 3 acmvuvieTpHMecKHx C-aTOMax iiHpaiio3iioro KOJibiia aaioT Majio 3(|k|)CKTHBIII>I6 I1JIH HIiaKTHBHbie COeaHHeHHH. ripHIia;iJie?KHOCTb aHOMepHblX HyKJie03HaoB k a - hjth /J-pfigy HrpaeT BTopocTenemiyio pojn> jjiji Ka^ecTB hhi-hShpoBaHHH. H h 03HII H3 8 B03M0JKHMX CTepe0H30MepHbIX HyKJie03HH0B T0pM03HT THMH3;HH(J)OC({)OpHJia3y.

Acta biol. med. germ., Band 20, Seite 443 — 447 (1968) Aus dem Physiologisch-chemischcn Institut der Friedrich-Schiller-Universität Jena (Direktor: Prof. Dr. H. F R U N D E R )

Veränderungen des Lebergewichtes sowie des E i w e i ß - , Fett- und D N S - G e h a l t e s der CC1 4 -geschädigten Leber K.

STAMMBERGER1, G. RICHTER2 u n d

Herrn Prof. Dr. Dr. E.

STRACK

zum

H.

70.

FRUNDER

Geburtstag gewidmet

(Eingegangen am 2. 12. 1967)

Zusammenfassung 6 bis 48 Std. nach einer CCl 4 -Schädigung wurden Lebergewicht sowie Fett-, Eiweißund DNS-Gehalt der Leber bestimmt. 1. Bis 9 Std. nach der Schädigung sind die untersuchten Parameter — abgesehen von einer Fettinfiltration — kaum verändert. 2. Zwischen 9. und 18. Std. nehmen Lebergewicht und Eiweißgehalt um etwa 25% ab, der DNS-Gehalt bleibt normal. Die Eiweißverluste sind offenbar Folge einer Lysosomenschädigung, wodurch vor allem Material des endoplasmatischen Retikulums aus der Leber eliminiert wird. 3. Nach 18 Std. steigen die untersuchten P a r a m e t e r als Ausdruck der beginnenden Leberregeneration wieder an. 4. Nach 48 Std. ist trotz erhöhten Lebergewichtes und DNS-Gehaltes der Eiweißgehalt der Gesamtleber noch unter dem Ausgangswert. Einleitung

Bei einer experimentellen Leberschädigung durch CC14 kommt es zunächst zu degenerativen Prozessen in der Leber. Die ersten destruierenden Veränderungen sind eine Schädigung des endoplasmatischen Retikulums [1], verbunden mit einer Ablösung von Ribosomen [2]. Die abgelösten Ribosomen werden zum Teil zerstört [2], ihre RNS bleibt jedoch relativ lange in polymerer Form in der Zelle liegen [1, 3]. Neben dem endoplasmatischen Retikulum werden durch die Schädigung auch die Kerne [4, 5], die Mitochondrien [4, 6, 7] und später die Lysosomen betroffen. Im weiteren Ver1

Jetzige Anschrift: Medizinische Klinik der Medizinischen Akademie E r f u r t . Jetzige Anschrift: Institut für medizinische und allgemeine Mikrobiologie, Virologie und Epidemiologie der Humboldt-Universität Berlin, Abt. Biochemie. 2

Acta biol. med. germ., Band 20, Seite 443 — 447 (1968) Aus dem Physiologisch-chemischcn Institut der Friedrich-Schiller-Universität Jena (Direktor: Prof. Dr. H. F R U N D E R )

Veränderungen des Lebergewichtes sowie des E i w e i ß - , Fett- und D N S - G e h a l t e s der CC1 4 -geschädigten Leber K.

STAMMBERGER1, G. RICHTER2 u n d

Herrn Prof. Dr. Dr. E.

STRACK

zum

H.

70.

FRUNDER

Geburtstag gewidmet

(Eingegangen am 2. 12. 1967)

Zusammenfassung 6 bis 48 Std. nach einer CCl 4 -Schädigung wurden Lebergewicht sowie Fett-, Eiweißund DNS-Gehalt der Leber bestimmt. 1. Bis 9 Std. nach der Schädigung sind die untersuchten Parameter — abgesehen von einer Fettinfiltration — kaum verändert. 2. Zwischen 9. und 18. Std. nehmen Lebergewicht und Eiweißgehalt um etwa 25% ab, der DNS-Gehalt bleibt normal. Die Eiweißverluste sind offenbar Folge einer Lysosomenschädigung, wodurch vor allem Material des endoplasmatischen Retikulums aus der Leber eliminiert wird. 3. Nach 18 Std. steigen die untersuchten P a r a m e t e r als Ausdruck der beginnenden Leberregeneration wieder an. 4. Nach 48 Std. ist trotz erhöhten Lebergewichtes und DNS-Gehaltes der Eiweißgehalt der Gesamtleber noch unter dem Ausgangswert. Einleitung

Bei einer experimentellen Leberschädigung durch CC14 kommt es zunächst zu degenerativen Prozessen in der Leber. Die ersten destruierenden Veränderungen sind eine Schädigung des endoplasmatischen Retikulums [1], verbunden mit einer Ablösung von Ribosomen [2]. Die abgelösten Ribosomen werden zum Teil zerstört [2], ihre RNS bleibt jedoch relativ lange in polymerer Form in der Zelle liegen [1, 3]. Neben dem endoplasmatischen Retikulum werden durch die Schädigung auch die Kerne [4, 5], die Mitochondrien [4, 6, 7] und später die Lysosomen betroffen. Im weiteren Ver1

Jetzige Anschrift: Medizinische Klinik der Medizinischen Akademie E r f u r t . Jetzige Anschrift: Institut für medizinische und allgemeine Mikrobiologie, Virologie und Epidemiologie der Humboldt-Universität Berlin, Abt. Biochemie. 2

444

K.

STAMMBERGER, G. RICHTER, H .

FRUNDER

lauf schließen sich der degenerativen Phase Regenerationsprozesse an, die schließlich zur Wiederherstellung der normalen Leberfunktion führen [3]. In der vorliegenden Arbeit sollte geklärt werden, wie degenerative Veränderungen und Regenerationsprozesse Leberfrisch- und Trockengewicht, Eiweiß-, Fett- und DNS-Gehalt verändern. Methodik Versuchstiere waren weiße Mäuse des Stammes A G N E S - B L U H M mit einem Gewicht von 14—16 g. Zur Erzeugung der Leberschädigung erhielten die Tiere 0,45 ml einer Mischung aus 1 ml CC14 und 7 ml sterilem Pflanzenöl i.p. injiziert. Die Präparation der Lebern erfolgte unter leichter Äthernarkose. Zur Bestimmung des Trockengewichtes wurden die Lebern im Trockenschrank bei 70 — 80° bis zur Gewichtskonstanz getrocknet und bis zum Wiegen im E x s i k k a t o r über P 2 O s aufbewahrt. Die Lipidextraktion erfolgte mit Äther in der SoxHLET-Apparatur. Stickstoff wurde nach K J E L D H A L , D N S mit p-Nitrophenylhydrazin nach W E B B und L E V Y [8] bestimmt. Der Blutgehalt der Leber wurde nicht berücksichtigt. W i e früher bereits gezeigt werden konnte, wird er durch die CCl 4 -Schädigung nicht wesentlich beeinflußt [9]. Die Signifikanzberechnung erfolgte mit dem t-Test nach F I S H E R - S T U D E N T . Ergebnisse und Diskussion 1. Degenerative

Phase

Frisch- und Trockengewicht der Gesamtleber bleiben bis 9 Std. nach der Schädigung unverändert und sinken zwischen der 9. und 12. Std. um etwa 20% (siehe Tab. 1). Feucht- und Trockengewicht sind jedoch wegen der massiven Neutralfetteinlagerung kein ausreichendes Maß für die Menge des funktionellen Lebergewebes [9, 10]. Aus der Tab. 1 ist ersichtlich, daß der Fettgehalt der Leber bereits nach 6 Std. mehr als verdoppelt ist und im weiteren Verlauf der Schädigung erhöht bleibt. Daraus folgt, daß das fettfreie Trockengewicht ein besseres Kriterium für die Masse an funktionellem Lebergewebe ist als Frischgewicht bzw. Gesamttrockengewicht. Das fettfreie Trockengewicht der Gesamtleber sinkt innerhalb der ersten Stunden um etwa 20% und zwischen 9 und 24 Std. kontinuierlich weiter bis auf 2 / 3 des Normalwertes. Der Gesamteiweißgehalt bleibt dagegen 9 Std. konstant und sinkt später um 30%. Der erste Gewichtsverlust ist durch den frühzeitigen Glykogenverlust zu erklären. Eiweiße beginnen erst nach 9 Std. aus der Leber auszufließen. In anderen Versuchsreihen konnte gezeigt werden, daß auch der RNS- und Phospholipidgehalt der Gesamtleber in den ersten Stunden nach der Schädigung konstant bleiben (siehe Tab. 1), obwohl es zu dieser Zeit zu einer ausgedehnten Zerstörung von endoplasmatischem Retikulum gekommen ist [1], Hieraus ergibt sich, daß das Material des zerstörten endoplasmatischen Retikulums in der ersten Phase der Schädigung in der Zelle liegen bleibt. Zu wesentlichen Substanzverlusten kommt es erst nach 9 bis 18 Std. Auffällig ist, daß die Verluste an Eiweiß, RNS und Phospholipiden nahezu parallel gehen. Dieser Verlust betrifft in seinem Maximum nach 18 bis 24 Std.

Lebelschädigung nach CC14

etwa 30% des fettfreien Trockengewichtes der Gesamtleber. Er ist offenbar ausgelöst durch die Lysosomenenzyme, die erst etwa 8 Std. nach der Schädigung aktiviert werden [11], Der parallele Verlust von Protein, Phospholipid und RNS weist auf ein bevorzugtes Ausfließen von Material aus dem endoplasmatischen Retikulum hin. Es handelt sich hierbei offenbar um den Anteil, der in der ersten Phase der Schädigung zerstört wird und zunächst in der Zelle liegen bleibt. Im Gegensatz zu den Eiweiß-, RNSund Phospholipidverlusten bleibt der DNS-Gehalt der Leber bis 24 Std. nach der Schädigung normal. Für dieses Verhalten gibt es zwei Erklärungsmöglichkeiten: Eine Ursache hierfür könnte sein, daß zwar ganze Leberzellen zerstört werden und ein DNS-Verlust etwa parallel zu den Eiweiß- und Phospholipidverlusten auftritt, dieser DNS-Verlust aber im Gegensatz zum Eiweiß- und Phospholipidverlust wieder kompensiert wird. Das könnte durch Neusynthese von DNS oder durch Einwanderung von Zytoplasma-armen Leukozyten erfolgen. Bis 18 Std. nach der Schädigung sind jedoch weder DNS-Synthese noch stärkere Leukozyteninfiltration zu beobachten [12]; infolgedessen scheidet diese Möglichkeit aus. Die Leberzellen müssen vielmehr in ihrer Mehrzahl erhalten bleiben und zunächst nur extranukleäres Material verlieren. 2.

Regenerationsphase

Im Verlauf der sich anschließenden Regenerationsphase steigt das Leberfrischgewicht an und hat nach 36 Std. den Ausgangswert wieder erreicht. 48 Std. nach der Schädigung ist die Leber schwerer als bei Normaltieren.

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Acta biol. med. germ., B a n d 20, Seite 449 — 456 (1968) Aus der Abteilung f ü r Pathologische Anatomie und Histopathologie (Chefarzt: Dr. G. L U S Z T I G ) des K o m i t a t k r a n k e n h a u s e s , Bäcs-Kiskun, Kecskemet, U n g a r n

Über die Wirkung protrahierter Cholesterinfütterung auf den Mukopolysaccharidgehalt einiger Organe L . JÖZSA, G Y . S Z E D E R K E N Y I u n d G .

LUSZTIG

(Eingegangen am 22. 3. 1967) 1

Zusammenfassung E s w u r d e n die Beziehungen zwischen p r o t r a h i e r t e r Cholesterinfütterung u n d d e m Mukopolysaccharidgehalt verschiedener Organe u n t e r s u c h t . Folgende Ergebnisse wurden e r h a l t e n : 1. I m Herzen ist der Chondroitinsulfatgehalt w ä h r e n d der ganzen B e h a n d l u n g erh ö h t ; der H e p a r i n - H e p a r i t i n - G e h a l t zeigt nach einer anfänglichen E r h ö h u n g eine bedeutende A b n a h m e ; die Menge an H y a l u r o n s ä u r e bleibt u n v e r ä n d e r t . 2. I n der Lunge n i m m t der Hyaluronsäure- und H e p a r i n g e h a l t ab, der Chondroitinsulfatgehalt steigt an. 3. Der Heparingehalt der Leber n i m m t nach einer anfänglichen Z u n a h m e bedeutend ab, der Chondroitinsulfatgehalt zeigt eine E r h ö h u n g . 4. In der H a u t vermindern sich alle Mukopolvsaccharidfraktionen bei Cholesterinf ü t t e r u n g allmählich. 5. I n der Niere n i m m t der Chondroitinsulfatgehalt zu, die Menge a n H y a l u r o n s ä u r e bleibt u n v e r ä n d e r t . 6. Der Chondroitinsulfatgehalt der Milz zeigt einen Anstieg, der H e p a r i n g e h a l t keine nennenswerte Veränderungen. Einleitung

Sowohl bei der experimentellen als auch der menschlichen Atherosklerose ist neben dem Lipidstoffwechsel auch der Polysaccharidhaushalt verändert. Der Natur der Erkrankung entsprechend wurden die Veränderungen der Gefäße bisher in erster Linie mit histochemischen und biochemischen Methoden untersucht. Bezüglich des Mukopolysaccharidgehaltes der übrigen Organe sind unsere Kenntnisse noch mangelhaft. Einige Autoren halten hinsichtlich der Pathogenese der G e f ä ß v e r k a l k u n g V e r ä n d e r u n gen im Stoffwechsel der Mukopolysaccharide (MPS) f ü r p r i m ä r u n d die lipidbindende Fähigkeit der angereicherten Mukoidsubstanz als pathognomonisch. N a c h Ansicht der 1

Nach Revision a m 15. 11. 1967

450

L. Józsa, Gy, S z e d e r k é n yi, G. L u s z t i g

Vertreter dieser Theorie ist die Vermehrung von Heparin-Heparitin primär, welche durch die Bindung der Lipoproteine die charakteristischen Gefäßveränderungen bei Gefäßverkalkung hervorruft. Diese Theorie berücksichtigt nicht die Tatsache, daß bei der Arteriosklerose nicht nur eine Lipoidose, sondern auch eine Fibrose, Verkalkung usw. der Gefäßwand vorhanden sind, für deren Entstehung das Heparin-Heparitin keine bedeutende Rolle spielt. Andere Autoren verwenden den Ausdruck ,,Systemsklerose" und versteht unter dieser Bezeichnung die auf verschiedene Wirkungen entstehenden chemischen und morphologischen Veränderungen der mesenchymalen Gewebe. Zu diesem ausgedehnten Begriffskreis gehört auch die Atherosklerose, obzwar die in diesem Zusammenhang entstehenden organischen Veränderungen noch nicht geklärt sind. Wenn letztere Theorie richtig ist, so müßten die in der Gefäßwand beobachteten l'olysaccharid-Veränderungen — abgesehen von den charakteristischen individuellen funktionellen Eigenschaften der Organe — auch in den übrigen Organen bestehen. Die Isotopenuntersuchungen von J u n g e - H ü l s i x g et al. [7] haben gezeigt, daß die verschiedensten Einflüsse — Infektion, Eiweißinjektion, Hypoxie, Eettfütterung — die Sulfomukopolysaccharidproduktion des Herzens erhöht. Ähnlich ist als Folge äußerer und innerer Einflüsse auch eine Zunahme des Sulfomukopolysaccharidgehaltes der H a u t zu beobachten. Diese nicht spezifische Reaktion des Mesenchyms kann als Abwehrreaktion betrachtet werden, welche in der Resistenzphase der Stressreaktion abläuft [5],

In unseren früheren Untersuchungen [6] konnten wir durch Analyse der bei experimenteller Cholesterinsklerose entstehenden Gefäßwand-MPS-Veränderungen feststellen, daß der MPS-Gehalt der Aorta nach Cholesterinapplikation zuerst ansteigt und nach 3monatiger Cholesterinfütterung wieder abnimmt, wobei die Verminderung von Heparin-Heparitin und der Chondroitinsulfat-B-Fraktion am auffallendsten ist. Ferner konnten wir nachweisen, daß die Abnahme des MPS-Gehaltes der Gefäßwand gleichzeitig mit der Entstehung von Gefäßveränderungen eintritt. Außer der Untersuchung des MPS-Gehaltes der Gefäßwand hielten wir Analysen der MPS-Veränderungen in anderen Organen für notwendig, um so ein genaueres Bild über den Polvsaccharidstoffwechsel des Organismus zu erhalten. In der vorliegenden Mitteilung möchten wir über die Veränderung des MPS-Gehaltes verschiedener Organe berichten. Material und Methoden Für unsere Experimente verwendeten wir 32 Kaninchen beiderlei Geschlechts im Alter von weniger als 1 Jahr und mit einem Durchschnittsgewicht von 2,5 bis 3 kg. Die Versuchstiere erhielten täglich 1 g Cholesterin in wäßriger Suspension per Magensonde. Die Tiere wurden entsprechend der Dauer der Cholesterinfütterung in folgende Gruppen eingeteilt: Gruppe I : Nicht behandelte Tiere (Kontrollen, 5 Tiere); Gruppe I I : 1 Monat behandelt (6 Tiere); Gruppe 111:2 Monate behandelt (5 Tiere); Gruppe IV: 3 Monate behandelt (5 Tiere); Gruppe V: 4 Monate behandelt (6 Tiere); Gruppe VI: 5 Monate behandelt (5 Tiere). Die Tiere gehörten zu einer größeren Versuchsserie, in der wir die MPS-Veränderungen an mehr als 100 Kaninchenaorten mit histochemischen und biochemischen Methoden untersuchten. (Über diese Versuche wurde in einer vorangehenden Arbeit [6] berichtet.)

Organmukopolysaccharide bei Cholesterinfütterung

451

Die bei Cholesterinfütterung e n t s t a n d e n e n G e f ä ß v e r ä n d e r u n g e n wurden nach d e m Schema von B Ö T T C H E R et al. [1] gewertet u n d die Tiere so selektiert, d a ß in der zur gleichen Behandlungsperiode gehörenden G r u p p e auch die G e f ä ß v e r ä n d e r u n g e n die gleichen waren. D e m g e m ä ß war bei den Kontrolltieren und bei den 1 u n d 2 Monate lang behandelten Tieren keine G e f ä ß v e r ä n d e r u n g (Stadium 0) vorhanden. Bei den 3 Monate lang behandelten Tieren w a r die A o r t e n v e r ä n d e r u n g v o m Grad 1, bei den 4 Monate lang behandelten I I . Grades und bei den 5 Monate lang b e h a n d e l t e n Tieren I I I . Grades. Die Tiere wurden durch E n t b l u t e n getötet und sofort seziert. Nach der Sektion w u r d e n die Organe in 5 bis 8 m m große Stücke zerlegt u n d in abs. Azeton 2mal 24 Std. lang e n t f e t t e t u n d entwässert. N a c h der Azetonbehandlung wurden die Organe im E x s i k k a t o r bis zur Gewichtskons t a n z getrocknet und d a n n in einer Schlagmühle grob gemahlen. Die Organe w u r d e n vollständig aufgearbeitet. Die E x t r a k t i o n der M P S erfolgte nach B U D D E C K E 2] mit 0.5 n N a O H f ü r 24 Std. N a c h der E x t r a k t i o n w u r d e die Lösung mit 2 n Essigsäure neutralisiert und die M P S mit Alkohol gefällt. N a c h der Fällung wurde die rohe M PSMasse in 2mal destilliertem Wasser gelöst und m i t Alkohol repräzipitiert. D a n a c h w u r den die M P S m i t Alkohol und d a n n mit Chloroform gewaschen. Die F r a k t i o n i e r u n g der M P S erfolgte nach dem Verfahren von S C H I L L E R et al. [9], Der MPS-Gehalt der einzelnen F r a k t i o n e n wurde auf G r u n d des Uronsäuregehaltes mit der DiscHE-Keaktion [4] b e s t i m m t . Die zweite Fraktion, in welcher Chondroitinsulfat A + B + C. vork o m m t , enthielt n u r in Spuren I d u r o n s ä u r e (bestimmt nach C H A I N und P F O B [3]); daher k o n n t e ihr Chondroitinsulfat-B-Gehalt vernachlässigt werden. Deshalb werden im folgenden einheitlich Chondroitinsulfat-Werte angegeben. W i r h a b e n den MPS-Gehalt von Leber, Milz, Niere, H a u t , H e r z und Lunge sowie der B a u c h w a n d m u s k u l a t u r und des Glaskörpers sämtlicher Tiere u n t e r s u c h t . Der GesamtMPS-Gehalt bzw. die Menge der Einzelnen F r a k t i o n e n werden in ¡¿g/100 m g Trockensubstanz angegeben. Ergebnisse

Bei Cholesterinfütterung veränderte sich der MPS-Gehalt der Organe nicht gleichförmig. Der Hyaluronsäuregehalt des Glaskörpers zeigte keine Veränderung, obwohl in den übrigen Teilen des Auges (Retina, Gefäße, Kammer, usw. [10]) histochemisch eine MPS-Zunahme nachweisbar war. Über die Augen- und Glaskörperuntersuchungen berichten wir ausführlicher an anderer Stelle. In der quergestreiften Bauchwandmuskulatur findet sich eine nur so geringe Menge an MPS, daß wir diese mit unserer Methode nur insgesamt, nicht jedoch die einzelnen Fraktionen bestimmen konnten. Herz I m Herzen fanden wir in jedem Fall Hyaluronsäure, Chondriotinsulfat und Heparin-Heparitin. Während der experimentellen Cholesterinsklerose änderte sich die Hyaluronsäuremenge nicht wesentlich. Der Chondroitinsulfatgehalt des Herzens zeigte während des Experiments eine gleichmäßige geringe Zunahme. Der Heparin-Heparitin-Gehalt des Herzens steigt im 1. und 2. Behandlungsmonat an; dann kommt es wieder zu einer allmählichen Verminderung, und zwar ist er im u n d 4. Monat annähernd wie bei den Kontrolltieren, im 5. Behandlungsmonat um 25% niedriger. Der saure MPS-Gehalt des Herzens nimmt also bei Cholesterinsklerose zu (Tab. 1).

L . Józsa, Gy. S z e d e r k é n y i , G. L u s z t i g

452

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Acta biol. med., germ. B a n d 20, Seite 473 — 481 (1968) Aus dem Physiologischen I n s t i t u t der H u m b o l d t - U n i v e r s i t ä t D i r e k t o r : Prof. Dr. med. habil. W . R Ü D I G E R )

(Geschäftsführender

Der Einfluß von Chlorpromazin auf viszero-viszerale Reflexe der Gallenblase der Katze unter Berücksichtigung der bioelektrischen Aktivität der Hirnrinde (ECG) 1 W . RÜDIGER, M . LIXDE.MAXN, \Y. LAIII. u n d K . - D .

NOLL

(Eingegangen a m 24. 7. 1967) 2

Zusammenfassung I n chronischen Versuchen an K a t z e n wurde die W i r k u n g von Chlorpromazin auf viszero-viszerale Reflexe geprüft, wobei auch die kortikalen Makropotentiale registriert wurden. Bei allen Tieren wurden Eistelröhren in den Gallenblasenfundus eingesetzt und Oberflächenelektroden im Bereich der regio p r a e m o t o r i c a u n d occipitalis implantiert. Zunächst w u r d e an der pharmakologisch unbeeinflu(3ten K a t z e der E i n f l u ß der mechanischen Reizung der Gallenblase (Dehnung) auf die Herz- und A t e m f r e quenz, das E E G und Verhalten des Tieres u n t e r s u c h t . Nach I n j e k t i o n von Chlorpromazin wurden die vorher bei Gallenblasendehnung b e o b a c h t e t e n vegetativen Veränderungen und die der bioelektrischen A k t i v i t ä t der H i r n r i n d e g e h e m m t oder sogar vollkommen blockiert. N a c h Abklingen der Chlorprömazinwirkung waren die u n t e r Kontrollbedingungen gefundenen Erscheinungen wieder v o r h a n d e n . Einleitung

Die Frage, inwieweit viszero-viszerale Reflexe durch höhere Ebenen der Neuraxis einschließlich der Hirnrinde beeinflußt werden, gewinnt mehr an Bedeutung, da das Verhalten des Organismus außer durch exterozeptive Afferenzen auch durch Reize aus dem inneren Milieu bestimmt wird. Klinische wie experimentelle Untersuchungen h a b e n i m m e r wieder bestätigt, d a ß viszero-viszerale Verbindungen zwischen verschiedenen Organen zustande k o m m e n . Das gilt auch für die Wechselbeziehungen zwischen den Abdominalorganen u n d der Herzund A t e m t ä t i g k e i t [1 — 4 ] . L E W I S [ 5 ] und E E I G I X [6] stellten bei E K G - U n t e r s u c h u n g e n an K a t z e n und H u n d e n fest, d a ß von den Mechano- und Chemorezeptoren ausgehende Reflexe bei pathologischen Z u s t ä n d e n der Organe auf das Herz in s t ä r k e r e m Maße in Erscheinung treten. T S C H E R N I G O W S K I [2] fand bei Reizung sämtlicher Teile des Verd a u u n g s t r a k t e s ausgeprägte Reflexe auf Blutkreislauf und A t m u n g . 1

Ein Teil der Ergebnisse wurde auf der A r b e i t s t a g u n g der Arbeitsgemeinschaft Physiologie in Leipzig 1964 u n d auf dem Weltkongreß f ü r Psychiatrie in Madrid 1966 vorgetragen. 2 Nach Revision a m 15. 11. 67

Acta biol. med., germ. B a n d 20, Seite 473 — 481 (1968) Aus dem Physiologischen I n s t i t u t der H u m b o l d t - U n i v e r s i t ä t D i r e k t o r : Prof. Dr. med. habil. W . R Ü D I G E R )

(Geschäftsführender

Der Einfluß von Chlorpromazin auf viszero-viszerale Reflexe der Gallenblase der Katze unter Berücksichtigung der bioelektrischen Aktivität der Hirnrinde (ECG) 1 W . RÜDIGER, M . LIXDE.MAXN, \Y. LAIII. u n d K . - D .

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(Eingegangen a m 24. 7. 1967) 2

Zusammenfassung I n chronischen Versuchen an K a t z e n wurde die W i r k u n g von Chlorpromazin auf viszero-viszerale Reflexe geprüft, wobei auch die kortikalen Makropotentiale registriert wurden. Bei allen Tieren wurden Eistelröhren in den Gallenblasenfundus eingesetzt und Oberflächenelektroden im Bereich der regio p r a e m o t o r i c a u n d occipitalis implantiert. Zunächst w u r d e an der pharmakologisch unbeeinflu(3ten K a t z e der E i n f l u ß der mechanischen Reizung der Gallenblase (Dehnung) auf die Herz- und A t e m f r e quenz, das E E G und Verhalten des Tieres u n t e r s u c h t . Nach I n j e k t i o n von Chlorpromazin wurden die vorher bei Gallenblasendehnung b e o b a c h t e t e n vegetativen Veränderungen und die der bioelektrischen A k t i v i t ä t der H i r n r i n d e g e h e m m t oder sogar vollkommen blockiert. N a c h Abklingen der Chlorprömazinwirkung waren die u n t e r Kontrollbedingungen gefundenen Erscheinungen wieder v o r h a n d e n . Einleitung

Die Frage, inwieweit viszero-viszerale Reflexe durch höhere Ebenen der Neuraxis einschließlich der Hirnrinde beeinflußt werden, gewinnt mehr an Bedeutung, da das Verhalten des Organismus außer durch exterozeptive Afferenzen auch durch Reize aus dem inneren Milieu bestimmt wird. Klinische wie experimentelle Untersuchungen h a b e n i m m e r wieder bestätigt, d a ß viszero-viszerale Verbindungen zwischen verschiedenen Organen zustande k o m m e n . Das gilt auch für die Wechselbeziehungen zwischen den Abdominalorganen u n d der Herzund A t e m t ä t i g k e i t [1 — 4 ] . L E W I S [ 5 ] und E E I G I X [6] stellten bei E K G - U n t e r s u c h u n g e n an K a t z e n und H u n d e n fest, d a ß von den Mechano- und Chemorezeptoren ausgehende Reflexe bei pathologischen Z u s t ä n d e n der Organe auf das Herz in s t ä r k e r e m Maße in Erscheinung treten. T S C H E R N I G O W S K I [2] fand bei Reizung sämtlicher Teile des Verd a u u n g s t r a k t e s ausgeprägte Reflexe auf Blutkreislauf und A t m u n g . 1

Ein Teil der Ergebnisse wurde auf der A r b e i t s t a g u n g der Arbeitsgemeinschaft Physiologie in Leipzig 1964 u n d auf dem Weltkongreß f ü r Psychiatrie in Madrid 1966 vorgetragen. 2 Nach Revision a m 15. 11. 67

474

W.

RÜDIGER, M. LINDEMANN,

W.

LAHL,

K.-D.

NOLL

Noch nicht eindeutig geklärt ist das Problem der afferenten Leitungsbahnen, der Rezeptoren und ihre Umschaltstellen auf zentrifugale Wege. D u r c h Ausarbeitung bedingter Reflexe von der Gallenblase konnten P E T R O W S K I [ 7 ] und N I K I T I N A [ 8 J das Vorhandensein zentralnervös vermittelter Verbindungen der inneren Organe feststellen. Sie sahen dies als Beweis f ü r die „ K o r t i k a l i s i e r u n g " der vom Viszerum auslösbaren Reflexe an. Auch d u r c h die Methode der „evoked p o t e n t i a l s " k o n n t e nachgewiesen werden, d a ß eine R e p r ä s e n t a t i o n der inneren Organe in der Großhirnrinde v o r h a n d e n ist [9—12]. Bei Reizung der inneren Organe k a n n es zur Desynchronisation im E E G k o m m e n [13 — 17]. E i n e besondere B e d e u t u n g bei der Leitung viszeraler Impulse k o m m t dem aufsteigenden retikulären System als Modulator f ü r den Erregungszustand der H i r n r i n d e zu [18, 19]. Bei Reizung von Interorezeptoren k o m m t es nicht nur zur V e r ä n d e r u n g der elektrischen A k t i v i t ä t des Kortex im Sinne einer Desynchronisation oder „arousal reaction", sondern auch zu gleichsinnigen Veränderungen in der F o r m a t i o reticularis. D u r c h Ausschaltung dieses Gebietes k o n n t e n die P o t e n t i a l ä n d e r u n g e n der Großhirnrinde bei interorezeptiver Reizung ebenfalls u n t e r d r ü c k t werden. Pharmakologisch k a n n die F o r m a t i o reticularis durch Chlorpromazin g e h e m m t werden [20, 21], Von besonderem Interesse sind seine Auswirkungen auf die A t m u n g , die Pulsfrequenz und das ZNS. Man beobachtete F r e q u e n z m i n d e r u n g und Amplitudenvergrößerung der A t m u n g [22]. D u r c h sehr hohe Dosen w u r d e das A t e m z e n t r u m g e d ä m p f t [23], Kreisl a u f a n a h ' s e n ergaben einen Pulsfrequenzanstieg, dessen Grad von der gegebenen Dosis abhängig sein sollte [23 — 29]. Die W i r k u n g des Chlorpromazins zeigte sich in einer U n t e r d r ü c k u n g der motilitätssteigernden W i r k u n g zentralerregender P h a r m a k a sowie in einer H e m m u n g bedingter Reflexe [30, 31]. Die F o r m a t i o reticularis s t e h t über B a h n v e r b i n d u n g e n zur gesamten Großhirnrinde in Verbindung. Chlorpromazin bewirkt d u r c h Blockade der F o r m a t i o reticularis eine E r h ö h u n g der Intensitätsschwelle f ü r die W a h r n e h m u n g sensibler Reize [32]. Bei Reizung viszeraler Rezeptoren und Nerven k o m m t es infolge der U n t e r b r e chung von Verbindungen zwischen der F o r m a t i o reticularis und der Großhirnrinde bei hinreichender Dosierung des P h a r m a k o n s zu keinerlei Veränderungen der kortikalen Makropotentiale [33 — 35]. In zahlreichen Versuchen, teilweise mit direkter elektrischer Reizung der F o r m a t i o reticularis b e o b a c h t e t e m a n die depressive W i r k u n g des Chlorpromazins auf die F o r m a t i o reticularis und die U n t e r b r e c h u n g seiner Verbindungen zum Kortex ( [ 3 6 - 4 3 ] u. a.).

Insofern keine Korrelation zwischen viszero-viszeralen Reflexabläufen und den Veränderungen der bioelektrischen Aktivität der Hirnrinde bei Reizung innerer Organe besteht [16], interessierte die Frage, welche Ebene des ZNS zur Realisierung viszero-viszeraler Reflexe erforderlich sind. Da zahlreiche Literaturhinweise dafür sprechen, daß Chlorpromazin nicht nur bei intraventrikulärer [3 7] oder intrazerebraler [44] Verabreichung, sondern auch bei i.m. [33, 34, 37, 45], i.p. [37, 46, 47] oder i.v. [36, 37] Injektion eine dämpfende Wirkung auf das unspezifische aktivierende System der Formatio reticularis ausüben kann, erschien uns das Vorgehen berechtigt, den Einfluß von intramuskulär appliziertem Chlorpromazin auf viszeroviszerale sowie viszero-zerebrale Reaktionsabläufe zu überprüfen, die unter Beteiligung zentralnervöser Strukturen einhergehen. Methodik An 8 K a t z e n wurden in chronischen E x p e r i m e n t e n 38 Versuche d u r c h g e f ü h r t . 142 mechanische Einzelreize der Gallenblase dienten als Kontrollen, 232 Reize w u r d e n u n t e r der W i r k u n g von Chlorpromazin gegeben.

Viszero-viszerale Reaktionen, E E G u n d Chlorpromazin

475

Bei allen Tieren w u r d e zunächst eine Fistelröhre aus Plexiglas in den Gallenblasenf u n d u s eingenäht u n d bei zwei Tieren Oberflächenelektroden in der prämotorischen u n d Okzipitalregion implantiert. Die ableitenden D r ä h t e wurden an einen Miniatursockel gelötet, der m i t Duracryl (Spofa, Prag) a m Schädel befestigt wurde. Bei allen Versuchstieren w u r d e das E K G oder das T a c h o g r a m m u n d bei zwei K a t z e n das ECG aufgezeichnet. Die Atembewegungen w u r d e n mittels eines D e h n u n g s m e ß streifens registriert. Die D e h n u n g der Gallenblase wurde durch Einblasen von L u f t in einen in die Blase eingeführten d ü n n w a n d i g e n Gummiballon vorgenommen, wobei L u f t m e n g e n von 1 — 7 ml eingegeben w u r d e n . In anderen Versuchen w u r d e der gewünschte D r u c k in eine 10-Liter-Flasche vorgegeben, so d a ß dieser relativ u n a b h ä n g i g v o m Ballon- u n d Hg-Manometervolumen blieb. Die angewandten Drucke lagen zwischen 20 und 1 50 m m Hg. Die Reizdauer b e t r u g 30 sec. Bei allen Tieren wurde zunächst der Einfluß der mechanischen Reizung der Gallenblase auf die Herz- u n d Atemfrequenz, die motorische R e a k t i o n u n d bei zwei Tieren auf die kortikalen Makropotentiale ü b e r p r ü f t und d a n a c h P r o p a p h e n i n ® (Chlorpromazin) in einer Dosis von 2 m g / k g Körpergewicht i.m. injiziert. Die Versuchszeit nach der I n j e k tion des P h a r m a k o n s erstreckte sich von 20 min bis m a x i m a l 20 Std. Die statistische B e a r b e i t u n g der Ergebnisse w u r d e mittels des t-Testes v o r g e n o m m e n .

Ergebnisse

Nach Feststellung, welche Veränderungen der Herz- und Atemtätigkeit, der Motorik und des ECG bei Dehnung der Gallenblase an der pharmakologisch unbeeinflußten Katze in Erscheinung traten, wurden die gleichen Experimente unter Chlorpromazin durchgeführt. Die Reizintensitäten waren unter Kontrollbedingungen und unter dem Einfluß des Pharmakons gleich. Betrachtet man die einzelnen Parameter, so läßt sich bezüglich der Chlorpromazinwirkung folgendes feststellen. Die Ruhe-Herzfrequenz nahm um 30 Schläge und mehr pro min zu. Diese Frequenzsteigerung trat also unabhängig von dem bei mechanischer Reizung der Gallenblase zu beobachtenden Frequenzanstieg auf. Jedoch ging die Ruhe-Herzfrequenz nach 90—120 min wieder auf ihren Ausgangswert zurück. Gallenblasendehnung hatte unter 2 mg/kg Chlorpromazin keine Herzfrequenzveränderungen mehr zur Folge. In einem Teil der Fälle wurde lediglich ein initialer Abfall der Herzfrequenz auf den interozeptiven Reiz bemerkt (Abb. 1). Die Aufschlüsselung nach Reizstärken ergab bei steigender Reizintensität eine prozentuale Zunahme der Versuche, die ohne Auswirkung auf den Herzschlag blieben (Abb. 2). Die Atmung war in den ersten 60 min nach der Chlorpromazininjektion gegenüber den Nullwerten häufig etwas vertieft und beschleunigt, ging aber schnell wieder auf die Ruhewerte zurück. Die unter Kontrollbedingungen feststellbaren Veränderungen der Atemtätigkeit bei mechanischer Reizung der Gallenblase traten nur in geringem Maße in Erscheinung (Abb. 1, 3)Es zeigten sich unregelmäßige In- und Exspirationen, die vertieft oder auch flacher als die Ausgangswerte sein konnten.

476

W . RÜDIGER, M . LIXDEMAXX, W . LAHL, K . - D . NOLL I Katze • pharmak

unbeeinflußt 30

Frequenz

sec

190 3.Reiz

180-

2ml(50mm

Hg)

170 160150 140 130 120110-

Atmung

b)

Katze Reiz

Frequenz

4 noch

Injektion

von

Propophenin - 60

I 2.Reiz

2,5ml

(70 mm

sec Hg)

170 ISO 150140-

Atmung

Abb. 1. Herz- und Atemfrequenz bei Gallenblasendehnung unter Kontrollbedingungen (oben) und 60 min naeh i.m. f n j e k t i o n von 2 mg/kg Körpergewicht Chlorpromazin (unten)

Abb. 2. Reizbeantwortung der Herztätigkeit in % vor (O-Wert) und nach Chlorpromazin (2 mg/kg), n keine R e a k t i o n ; III schwache R e a k t i o n ; !' starke R e a k t i o n

Viszero-viszcrale Reaktionen, E K G u n d Chlorpromazin

477

Die Registrierung des EEG zeigte, daß durch Chlorpromazin die Anzahl der Weckreaktionen deutlich abnahm. Der Zustand des EEG-Kurvenbildes blieb in der Mehrzahl der Fälle unverändert (Abb. 3 . 4 ) . Eine Analyse der Korrelation zwischen E K G und E E G ergab, daß in 62,7% (37 Reize) der Fälle, die unter Chlorpromazineinfluß durchgeführt wurden und eine Reaktion des E E G oder der Herzfrequenz zeigten, diese Reaktion isoliert auftrat, ohne die andere Komponente zu beeinflussen. Die Veränderungen von E E G und Atmung traten in 62,4% isoliert voneinander auf. Unter pharmakologischer Beeinflussung bestand zwischen E E G und E K G bzw. E E G und Atmung in bezug auf ihre Häufigkeit bei Veränderungen keine wesentliche Bevorzugung einer der drei Komponenten (Abb. 5). Lediglich eine Herzbeeinflussung wurde in 4 % häufiger als Reaktionen des E E G oder der Atmung gefunden. ind- V.Ys£k

\ 1l!5 4.Reiz 3,5ml

Occ.re.-Ind

EKG

•

i i

mÜ

Resp. A b b . 3. A u s s c h n i t t der R e g i s t r i e r k u r v e 2 Std. 13 min n a c h i.m. I n j e k t i o n v o n 2 m g / k g K ö r p e r g e w i c h t Chlorpromazin. Von oben n a c h u n t e n : E E G , E K G , E E G , A t m u n g . R e i z s t ä r k e : 80 m m H g ; 3,5 ml L u f t im B a l l o n ; R e i z d a u e r : 28 sec.

Abb. 4. V e r ä n d e r u n g der kortikalen M a k r o p o t e n t i a l e in % bei der schlafenden K a t z e bei mechanischer R e i z u n g der Gallenblase vor u n d nach G a b e v o n C h l o r p r o m a z i n . schwachc R e a k t i o n ; • keine R e a k t i o n ; : 777 s t a r k e R e a k t i o n

478

\Y. Rüdiger, M. Lixdf.mann, W. Lahl, K.-D. Noll

Abb. 5

Abb. 6

Abb. 5- Prozentualer Anteil der einzelnen K o m p o n e n t e n an der S u m m e aller aufgetretenen Veränderungen in % vor und nach I n j e k t i o n von 2 mg/kg Körpergewicht Chlorpromazin. • E E G ; Jjij Herzfrequenz; UJ_ A t m u n g Abb. 6. Motorische R e a k t i o n e n bei Gallenblasendehnung vor und nach G a b e von Chlorpromazin. • keine R e a k t i o n ; ||J starke R e a k t i o n

Das Verhalten der Versuchstiere war unter Chlorpromazineinfluß wechselhaft. Sie lagen ruhig, konnten aber plötzlich in starke motorische Unruhe verfallen. Später gerieten die Tiere in einen schlafähnlichen Zustand. Sie zeigten dann auf mechanische Reize der Gallenblase kaum noch motorische Reaktionen (Abb. 6). Diskussion

Die Ergebnisse bestätigen die früheren Beobachtungen [16] sowie die anderer Autoren [2, 4], daß eine Gallenblasendehnung unter Normalbedingungen zu einer Zu- oder Abnahme der Herz- und Atemfrequenz führen kann. Diese vegetativen Veränderungen können sowohl bei aktivierter wie desaktivierter Ausgangslage des ECG auftreten [16]. Unter Chlorpromazin kam es zu einer Herzfrequenzsteigerung, die unabhängig von interozeptiven Reizen auftrat. Diese Beobachtung wurde von zahlreichen Autoren gemacht [23—27]. Der beschleunigende Effekt auf die Herztätigkeit läßt sich schwer erklären, da Chlorpromazin peripher sowohl parasympatholytisch als auch sympatholytisch wirkt [48] und zentral zu einem Überwiegen des Hemmungszentrums der Formatio reticularis führen soll [18, 49]- In bezug auf die viszero-viszeralen Reflexmechanismen unter Chlorpromazinwirkung ließ sich folgendes feststellen. Die Atmung zeigte bei Gallenblasendehnung in nahezu 7 5 % aller Versuche keine Reaktion. Die Reizschwelle war deutlich heraufgesetzt. In einem gegenüber der Atmung

Viszero-viszerale R e a k t i o n e n , E E G u n d C h l o r p r o m a z i n

479

geringeren Prozentsatz (57,6%) blieb die Herzfrequenz ohne Reaktion auf den interozeptiven Reiz. Sie behielt unter Chlorpromazin ihre höhere Ansprechbarkeit. In 72% der Versuche konnte keine Veränderung des EEGBildes beobachtet werden. Diese Ergebnisse sprechen für den hemmenden Effekt des Chlorpromazins auf die Erregbarkeit des aktivierenden retikulären Systems und die Unterbrechung der Verbindung zum Kortex. Die Abschwächung bzw. Unterbrechung der interozeptiven Reflexe durch Chlorpromazin weist auf die von mehreren Autoren angegebene enge Verbindung der Formatio reticularis mit dem vegetativen System hin [50—53]Man kann vermuten, daß die Hirnrinde indirekt in die viszero-viszeralen Reflexe eingeschaltet ist, indem ihr Funktionszustand durch die Formatio reticularis beeinflußt wird. Infolge der oben erwähnten Verbindungen der Formatio reticularis zum Kortex widerspiegelt sich die Reizung interozeptiver Gebiete in der Großhirnrinde auch über eine Aktivierung des aufsteigenden retikulären Systems. Da vegetative Veränderungen auch ohne EEG-Weckreaktionen auftreten können, scheint die ausschließlich spinale Umschaltung der ausgelösten Reaktionen möglich. Ob die auf Chlorpromazin eintretende Hemmung durch absteigende inhibitorische Einflüsse seitens der bulbopontinen Formatio reticularis erklärt werden kann, läßt sich aus den Versuchen nicht ermitteln. Literatur [1]

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J\I. V E R E Z E A X O

U.

Summary a n d K . - D . N O L L : T h e i n f l u e n c e of c h l o r p r o m a z i n e on viscero-visceral reflexes f r o m t h e g a l l - b l a d d e r of cats, c o n s i d e r i n g t h e bioelectrical a c t i v i t y of t h e c e r e b r a l c o r t e x (ECoG) W . RUEDIGER, M. LINDEMANN, W . LAHL

I n c h r o n i c e x p e r i m e n t s w i t h c a t s t h e a c t i o n of c h l o r p r o m a z i n e w a s t e s t e d on viscerovisceral reflexes, considering t h e cortical m a c r o p o t e n t i a l s . I n all a n i m a l s f i s t u l a e were o p e r a t e d i n t o t h e f u n d u s of t h e g a l l - b l a d d e r . E p i d u r a l electrodes were i m p l a n t e d in t h e p r e m o t o r i c a n d occipital region. I n t h e n o r m a l s t a t e t h e i n f l u e n c e of t h e m e c h a n i c a l s t i m u l a t i o n of t h e g a l l - b l a d d e r o n the h e a r t rate and on respiratory movements, on the ECoG and behavioral concomit a n t s w a s s t u d i e d . A f t e r a d m i n i s t r a t i o n of c h l o r p r o m a z i n e t h e c h a n g e s of t h e v e g e t a t i v e r e a c t i o n s a n d of t h e cortical electrical a c t i v i t y , w h i c h could b e o b s e r v e d b e f o r e a d m i n i s t r a t i o n of t h e d r u g , w e r e i n h i b i t e d or v a n i s h e d c o m p l e t e l y . W h e n t h e a c t i o n of c h l o r p r o m a z i n e w a s gone, t h e i n f l u e n c e of t h e d i s t e n t i o n of t h e g a l l - b l a d d e r on t h e vegetative functions and the ECoG reappeared. PoaioMc B . P i o ; t n r e p , ¡VI. . I H H J E M A N I I , B . J l a j i i . H K . - J I . H o j i b : B J I H H H H C x j i o p r i p o Ma3Hiia Ha BHCnepo-BHcnepa;ibiibie pe(|wieKCbi c »«ejmHoro riy3bipH y K O I H K H , ymiTbiBan 6Ho;)jieHTpHMecKyio aKTMBiiocTi. n o p b i r o j i o B H o r o M03ra

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nyshipn.

Acta biol. med. germ., B a n d 20, Seite 4 8 3 - 4 8 7

(1968)

Aus dem I n s t i t u t f ü r Pharmakologie und Toxikologie (Direktor: Prof. Dr. der Karl-Marx-Universität Leipzig

HAUSCHILD)

Untersuchungen über die Wirkung von Dimethylsulfoxyd auf die experimentelle Hypercholesterinämie des Hähnchens E.

HERZMANN

(Eingegangen a m 10. 10. 1967)

Zusammenfassung An H ä h n c h e n w u r d e durch F ü t t e r u n g einer cholesterinhaltigen Diät eine H y p e r cholesterinämie erzeugt. Zusatz von 1 % D i m e t h y l s u l f o x y d zum Trinkwasser f ü h r t e zu einer Senkung des Plasmacholesterinspiegels u m etwa 50%. Der Cholesteringehalt der Aorta blieb unbeeinflußt. Einleitung

Zweifellos haben die klinischen Beobachtungen von J A C O B et al. [ 1 ] über die Wirkungen von Dimethylsulfoxyd (DMSO) am Menschen der experimentellen Medizin neue Impulse zu einer intensiveren Beschäftigung mit diesem durch zahlreiche interessante biologische und pharmakologische Eigenschaften ausgezeichneten Lösungsmittel verliehen. Der Rausch von therapeutischem Optimismus, in den das „Wundermittel" DMSO nicht nur die Laienpresse versetzte, fordert andererseits direkt zu einer tierexperimentellen Überprüfung der Vielzahl an recht heterogenen Indikationsstellungen (Übersichten bei [2—4]) heraus. In diesen Rahmen fallen auch die im folgenden von uns vorgelegten Untersuchungen, die sich auf die therapeutische Anwendung von DMSO bei arteriosklerotisch bedingten Durchblutungsstörungen [5—7] beziehen. Wir führten unsere Untersuchungen am Modell der experimentellen Hypercholesterinämie des Hähnchens durch. Methoden 25 Stück 6 Wochen alte, weiße Leghornhähnchen wurden in zwei G r u p p e n zu je 12 (Kontrollgruppe) bzw. 13 Tiere (Versuchsgruppe) eingeteilt. Beide G r u p p e n erhielten ein käufliches K ü k e n a u f z u c h t f u t t e r (Zusammensetzung wie bei [8]) mit einem Zusatz von 2% Cholesterin und 5% Sonnenblumenöl. F u t t e r u n d Trinkwasser wurden ad libit u m gegeben. D e m Trinkwasser der Versuchsgruppe w u r d e 1 % DMSO ( V E B L E U N A W E R K E „W'alter Ulbricht") zugesetzt. Die täglich pro Tier a u f g e n o m m e n e DMSOMenge lag d a m i t etwa zwischen 0,5 und 1 g. Von der zweiten Versuchswoche an w u r d e 2 bis 5mal wöchentlich die täglich a u f g e n o m m e n e F u t t e r m e n g e ermittelt. Weiterhin

Acta biol. med. germ., B a n d 20, Seite 4 8 3 - 4 8 7

(1968)

Aus dem I n s t i t u t f ü r Pharmakologie und Toxikologie (Direktor: Prof. Dr. der Karl-Marx-Universität Leipzig

HAUSCHILD)

Untersuchungen über die Wirkung von Dimethylsulfoxyd auf die experimentelle Hypercholesterinämie des Hähnchens E.

HERZMANN

(Eingegangen a m 10. 10. 1967)

Zusammenfassung An H ä h n c h e n w u r d e durch F ü t t e r u n g einer cholesterinhaltigen Diät eine H y p e r cholesterinämie erzeugt. Zusatz von 1 % D i m e t h y l s u l f o x y d zum Trinkwasser f ü h r t e zu einer Senkung des Plasmacholesterinspiegels u m etwa 50%. Der Cholesteringehalt der Aorta blieb unbeeinflußt. Einleitung

Zweifellos haben die klinischen Beobachtungen von J A C O B et al. [ 1 ] über die Wirkungen von Dimethylsulfoxyd (DMSO) am Menschen der experimentellen Medizin neue Impulse zu einer intensiveren Beschäftigung mit diesem durch zahlreiche interessante biologische und pharmakologische Eigenschaften ausgezeichneten Lösungsmittel verliehen. Der Rausch von therapeutischem Optimismus, in den das „Wundermittel" DMSO nicht nur die Laienpresse versetzte, fordert andererseits direkt zu einer tierexperimentellen Überprüfung der Vielzahl an recht heterogenen Indikationsstellungen (Übersichten bei [2—4]) heraus. In diesen Rahmen fallen auch die im folgenden von uns vorgelegten Untersuchungen, die sich auf die therapeutische Anwendung von DMSO bei arteriosklerotisch bedingten Durchblutungsstörungen [5—7] beziehen. Wir führten unsere Untersuchungen am Modell der experimentellen Hypercholesterinämie des Hähnchens durch. Methoden 25 Stück 6 Wochen alte, weiße Leghornhähnchen wurden in zwei G r u p p e n zu je 12 (Kontrollgruppe) bzw. 13 Tiere (Versuchsgruppe) eingeteilt. Beide G r u p p e n erhielten ein käufliches K ü k e n a u f z u c h t f u t t e r (Zusammensetzung wie bei [8]) mit einem Zusatz von 2% Cholesterin und 5% Sonnenblumenöl. F u t t e r u n d Trinkwasser wurden ad libit u m gegeben. D e m Trinkwasser der Versuchsgruppe w u r d e 1 % DMSO ( V E B L E U N A W E R K E „W'alter Ulbricht") zugesetzt. Die täglich pro Tier a u f g e n o m m e n e DMSOMenge lag d a m i t etwa zwischen 0,5 und 1 g. Von der zweiten Versuchswoche an w u r d e 2 bis 5mal wöchentlich die täglich a u f g e n o m m e n e F u t t e r m e n g e ermittelt. Weiterhin

484

E.

HERZMANN

erfolgten Gewichtskontrollen sowie nach 2 und öwöchiger Versuchsdauer B l u t e n t nahmen aus der Flügelvene zur Cholesterinbestimmung. Nach einer Gesamtdauer von 11 Wochen wurde der Versuch beendet. Die Tiere wurden durch Dekapitation getötet, die Aorten herauspräpariert und bis zur weiteren Aufarbeitung über Trockeneis aufbewahrt. Chemische Analyse: Nach vollständiger Abpräparation der Adventitia erfolgte die Cholesterinextraktion aus dem thorakalen Anteil der Aorten entsprechend [9] durch Homogenisierung in Azeton/Alkohol (1:1). Die Cholesterinbestimmung in Aortenextrakt und Plasma führten wir nach SCHÖNHEIMER und SPERRY [10] durch. Die statistische Signifikanz wurde mit dem parameterfreien x - T e s t nach VAN DER W AER 1)EX berechnet. Ergebnisse

Körpergewicht Wie aus Tab. 1 hervorgeht, war von Beginn an bei der Versuchsgruppe die Tendenz zu einer verzögerten Gewichtszunahme erkennbar. In der 10. und 11. Versuchswoche wurden die Gewichtsdifferenzen zwischen beiden Gruppen statistisch signifikant. Entsprechend Tab. 2 kommt eine unterschiedliche Futteraufnahme nicht als Ursache für die Gewichtsdifferenz in Frage. Wir befinden uns damit in Übereinstimmung mit ARSCOTT [11], der bei ZuTabelle 1 Körpergewicht

(in g)

Zeit

Kontrolle

Versuchsbeginn nach 2 Wochen nach 3 Wochen nach 6 Wochen nach 10 Wochen nach 11 Wochen

430 740 800 1040 1430 1560

Versuch

± 50 ± 90 ± 70 ± 90 ± 140 ± 50

430 690 770 1000 1280 1420

± ± ± ^ i ±

50 80 90 70 70 80

P I i ' j

Tabelle 2 Tägliche Futteraufnahme pro Tier

(in g)

Zeit 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11.

Wochc Woche Woche Woche Woche Woche Woche Woche Woche Woche

Kontrolle 67 71 84 99 93 85 96 99 101 100

± ± ± ± ± ± ± ± ± ±

8 5 6 4 5 8 2 4 7 4

(2) (5) (4) (5) (4) (4) (2) (3) (4) (5)

Versuch 74 76 I 84 ; 100 1 100 ! 81 ! 84 1 91 . 87 ' 97 1

± 3 (2) ± 2 (5) ± 7 (4) ± 8 (5) ± 4 (4) ± 10 (4) ± 3 (2) ± 8 (3) ± 11 (4) ± 5 (5)

>0,05 >0,05 >0,05 >0,05 MC H . K . ^ a n a , l'I. H . K a p K y n h A m b a E . K a p : M c c j i e a o B a H i i f i o (J)H3H0Ji0rHH h 6 h o x h m h h iiiew. H3MeiieiiHH b rnee o6e3i>Hii P e 3 y c BO BpeMH UHiwia M e i i c T p y a UHH. B.lHHime OBapH3KTOMHH H 3CTp0reiIH0H TepanHH H 3 y i a j i H C b BecoBbie, a Tan>Ke rHCToaorHMecKue h fiHOXHMimecKiie H3MenenHH iì m e e o6e3T>nn P e 3 y c bo BpeMH UHK.ia MencTpyauHH h n o c j i e 0BapH3KT0MHH h a c T p o reHHOìi TepaiiHH. B o BpeMH n u t r i a b o p r a n e ne o G n a p y i K e n o 3aMeTin>ix KOJie6aHHii B e c a , o a n a n o H3MeiiHjiacb rHCTOJiorHiecKan KapTHua b OTHomeniiH c t p o m u , n p y r o B o r o Mbinicmioro c j i o j i h KOjnmecTBa uepBHKajii.iibix Bbiae>ienHii. Ha6jiio;iajioci» yBejinqeHHe KonnenTpauHH nyi;«ieHnoBbix k h c j i o t , r j i H K o e r e n a , KHc.ioTopacTBopnMoro (J)octl)opa h oc(I)ojihiih;iob bo BpeMH ({>a3bi BbinejieHHH ; aKTHBHOCTb m e j i o ' i Hott ({)0C(J)aTa3bi, o j i n a i i o , 6buia iioiiHH>eHa. BBejieHHe ocTporeHa oBapH3KT0MHpoBannbiM JKHBOTHWM npHBejio K BecoBoii H rHCT0JT0rHMecK0ii cTHMyjiHUHH nepBHHca. B c e GHOXHMHMCCKHe n a p a M e T p w , BHJiioiaH cojiepHtanHe 6e„iKOBoro h neóejiKOBoro a30Ta o p r a H a , noBbicnjiHci. n o c j i e a c T p o r e m i o i i TepanHH.

Acta biol. med. germ., Band 20, Seite 509—516 (1968) Aus dem I n s t i t u t f ü r Pharmakologie und Toxikologie der Medizinischen Akademie Magdeburg (Direktor: Prof. Dr. med. habil. H . M A T T H I E S )

Einfluß von Phenelzin und Aminooxyessigsäure auf die y-Aminobuttersäure, Glutaminsäure-Dekarboxylase und y-Aminobuttersäure-a-Ketoglutarsäure-Transaminase in verschiedenen Regionen des Rattenhirns N . POPOV, W .

POHLE u n d

H.

MATTHIES

(Eingegangen a m 8. 11. 1967) Zusammenfassung Phenelzin f ü h r t in allen Hirnregionen zum GABA-Anstieg d u r c h H e m m u n g der GABA-Transaminase, ohne die A k t i v i t ä t der G l u t a m i n s ä u r e - D e k a r b o x y l a s e zu beeinflussen. Aminooxyessigsäure h e m m t zwar ebenfalls die GABA-Transaminase, v e r m i n d e r t aber zugleich in wechselndem A u s m a ß die A k t i v i t ä t der G l u t a m i n s ä u r e - D e k a r b o xylase, so d a ß differenzierte Wirkungen auf den GABA-Gehalt zustande k o m m e n , je nach der Relation der erreichten H e m m u n g beider E n z y m e . Die s t ä r k s t e n GABAE r h ö h u n g e n t r e t e n deshalb im allgemeinen dort auf, wo die H e m m u n g der GABATransaminase besonders ausgeprägt ist. Einleitung

Versuche an Mäusen und Ratten wiesen darauf hin, daß Hydrazin[l], Hydroxylamin [2, 3] und AOAA [4, 5] den Gehalt an GABA im Gehirn erhöhen, die Aktivitäten der GAD und GABA-T aber unterschiedlich stark beeinflussen. Nach der Auffassung von R O B E R T S und E I D E L B E R G [6] soll unter normalen Bedingungen die GAD-Aktivität als Regler des GABA-Fließgleichgewichts (steady state) betrachtet werden. In früheren Untersuchungen [7, 8] haben wir nachweisen können, daß Phenyläthylhydrazin (Phenelzin) zu einer dosisabhängigen Erhöhung des GABA-Gehaltes im Rattenhirn führt. Der GABA-Gehalt in den einzelnen Regionen zeigt aber unterschiedliche Konzentrationen [2, 9] und auch die Aktivität der GAD und GABA-T weist eine unterschiedliche Verteilung im Affenhirn auf [10, 11]. Wir prüften deshalb, ob die Wirkung von Phenelzin und AOAA auf den GABA-Gehalt und auf die Aktivitäten der GAD und GABA-T in den verschiedenen Regionen des Rattenhirns Unterschiede erkennen läßt. A b k ü r z u n g e n : GABA = y-Aminobuttersäure, GAD = Glutaminsäure-Dekarboxylase, GABA-T = y - A m i n o b u t t e r s ä u r e - a - K e t o g l u t a r s ä u r e - T r a n s a m i n a s e , AOAA = Aminooxyessigsäure.

510

X . POPOV, W .

POHLE,

H.

MATTHIES

Methodik Alle Versuche sind an W i s t a r - R a t t e n männlichen Geschlechts mit einem Gewicht von 100— 1 50 g aus eigener Koloniezucht d u r c h g e f ü h r t worden. 4 Std. nach I n j e k t i o n von 21 5 [¿Mol/kg = 50 m g / k g Phenelzin-Sulfat (AW'D Dresden) i.p. und 185 .nAIol/kg 20 mg/kg Aminooxyessigsäure-Hemihydrochlorid (AOAA-U-7524, U p j o h n Co., Kalamazoo, Mich.) s.c. wurden die Gehirne nach der schon beschriebenen Methode [9] präpariert. Die GABA wurde in alkoholischen E x t r a k t e n nach hochspannungselektrophoretischcr T r e n n u n g b e s t i m m t [17]. F ü r die E n z y m a k t i v i t ä t s b e s t i m m u n g e n wurde das Gewebe in 0,25 M Saccharose im gekühlten Glashomogenisator homogenisiert u n d in einer Kühlzentrifuge bei 500 g 20 min zentrifugiert. Der Ü b e r s t a n d diente zur manometrischen B e s t i m m u n g der GAD in Anlehnung a n die Methode von B A L Z E R u n d Mitarb. [12], aber in Gegenwart von 0,5 |iM Pyridoxal-5-Phosphat pro W a r b u r g - G e f ä ß . Die B e s t i m m u n g der GABA-T erfolgte in der sog. Mitochondrienfraktion (10000 g p r o 20 min) nach der Methode von R O U K E M A et al. [13]. Die Eiweißbestimmung w u r d e nach der Methode von LOWRY et al. [14] d u r c h g e f ü h r t . Gleiche Hirnregionen von 5 bis 10 Tieren wurden gemeinsam verarbeitet. Die Kontrolltiere erhielten entsprechende I n j e k t i o n e n mit 0,85%iger XaCl-Lösung. Die Streuung der Meßwerte ist mit dem m i t t leren Fehler des Mittelwertes angegeben; die varianzanalytische B e a r b e i t u n g der Ergebnisse erfolgte nach W I N N E [ 1 5 ] , Ergebnisse

Abb. 1 zeigt eine Gegenüberstellung zwischen GABA-Gehalt und GAD-Aktivität 1 in 11 Regionen des Rattenhirns. Die mit 100% gekennzeichnete Linie ist der errechnete Mittelwert sämtlicher Regionen ohne Berücksichtigung der prozentuallen Gewichtsverteilung, die in Tab. 1 angegeben ist. Wie aus

Abb. 1. Gegenüberstellung des G ABA-Gehaltes und der G A D - A k t i v i t ä t pro g Gewebe in 11 verschiedenen Regionen des R a t t e n h i r n s . Die Darstellung erfolgte in % des Mittelwertes aller 11 Regionen ohne Berücksichtigung der Gewichtsanteile. I m Gegensatz zu Tab. 1 (Bestimmung der E n z y m a k t i v i t ä t in subzellulären Fraktionen) wurde hier die G A D - A k t i v i t ä t im G e s a m t h o m o g e n a t b e s t i m m t 1 Bei diesen Versuchen wurde die GABA-Bildung aus N a t r i u m g l u t a m a t in nicht f r a k tioniertem Gewebehomogenat gemessen. Auch an dieser Stelle möchten wir dem V E B Arzneimittelwerk Dresden und der F i r m a U p j o h n Co. Kalamazoo, Mich, f ü r die Überlassung der Substanzen unseren D a n k aussprechen.

E i n f l u ß v o n Phenelzin u n d AOAA auf G A B A , G A D u n d G A B A - T

5\\

der Abb. 1 zu entnehmen ist, zeigen die Verteilung des GABA-Gehaltes und der GAD-Aktivität im Gesamthirnhomogenat eine gute Korrelation. Bei den Versuchen mit gleichzeitiger Bestimmung der GAD und GABA-T in subzellulären Hirnfraktion (GAD im Überstand der Kernfraktion, GABA-T in der sog. Mitochondrienfraktion) wurden die verhältnismäßig kleineren Hirnregionen (Thalamus + Hypothalamus, Colliculi mesencephali + Tegmentum mesencephali, Pons + Medulla oblongata) vereinigt. Tab. 1 zeigt einen Vergleich der Meßwerte aus dem gleichem Material, und zwar einmal die C0 2 -Bildung im manometrischen Versuch und anderseits nach hochTabelle 1 Gegenüberstellung der A k t i v i t ä t e n der G A D im Ü b e r s t a n d der 500 g - F r a k t i o n des R a t t e n h i r n s . Zuerst w u r d e die CO a -Bildung e r m i t t e l t u n d anschließend die G A B A Bildung gemessen. Die a n g e g e b e n e n W e r t e stellen d e n D u r c h s c h n i t t v o n 4 D o p p e l b e s t i m m u n g e n d a r . Die S t r e u u n g ist d u r c h ^ H-Optimum erfolgten, bei GAD bei p\{ 6,5, bei GABA-T bei fiYl 8,1. Möglicherweise wird dadurch die Herstellung exakter Korrelationen erschwert. Trotz dieser Schwierigkeit kann aber doch aus den Ergebnissen der Schluß gezogen werden, daß die Phenelzinwirkung durch mehrere Superpositionen belastet ist. Wie wir in einer anderen Arbeit feststellen konnten [21], ist der GABA-Anstieg nach Phenelzin durch strukturähnliche Monoaminoxydase-Hemmstoffe vom Amin- und Hydrazintyp aufzuheben, während die gleichen Substanzen hinsichtlich des GABA-Anstiegs nach AOAA unwirksam blieben. Literatur [1] [2]

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[20] VAN G E L D E R , N . M . : J . N e u r o c h e n i . 1 2 , 2 3 1 u. 2 3 9 (1965). [ 2 1 ] M A T T H I E S , H . U. N . POPOV: A c t a b i o l . m e d . g e r m . 2 0 , 3 7 1

(1968).

Summary N . POPOV, \Y. P O H L E a n d H . M A T T H I E S : T h e e f f e c t o f p h e n e l z i n e a n d a m i n o o x y a c e -

tic acid on y - a m i n o b u t y r i c acid, g l u t a m i c acid d e c a r b o x y l a s e a n d y - a m i n o b u t y r i c acid-;x-ketoglutaric acid t r a n s a m i n a s e in d i f f e r e n t regions of t h e r a t b r a i n P h e n e l z i n e c a u s e s increase of G A B A in all regions of t h e b r a i n b y i n h i b i t i n g G A B A t r a n s a m i n a s e w i t h o u t influencing t h e a c t i v i t y of g l u t a m i c acid d e c a r b o x y l a s e . A m i n o o x v a c e t i c acid also i n h i b i t s G A B A t r a n s a m i n a s e , b u t a t t h e s a m e t i m e reduces, to a v a r y i n g e x t e n t , t h e g l u t a m i c acid d e c a r b o x y l a s e a c t i v i t y w h i c h p r o d u c e s differ e n t i a l e f f e c t s on G A B A c o n t e n t depending on t h e r e l a t i v e degree of i n h i b i t i o n t o e i t h e r e n z y m e . T h u s m o s t d r a s t i c increase of G A B A is generallv b r o u g h t a b o u t in cases, where t h e i n h i b i t i o n of G A B A t r a n s a m i n a s e is p r o n o u n c e d . I'O.IIOMC H . I I 0 1 1 0 B , B . r i o j i e h X . M a n H c : BjiHHHiie (Jieiiejibniuia h aMimooKCHVKcyciioii KHCJioTbi n a y-aMHiioMaciiHiiyio K i i c j i o T y , a c K a p 6 o H c i i j i a 3 y rjiiOTaMMIIOBOH KMCJIOTU 11 T p a n e a M i i n a 3 y y-aMmioiviacjifiHoii KHcaoTLi 11 a-HeTorjiioTapOBOfi KHCJIOTbl B p a 3 i n . i x o 6 ; i a c T J i x M o s r a KpblCbl (I'eiiejibUHii npiiBojiHT K n o B b i m e n m o G A B A BO B c e x o6;iacT>ix Mo.sra nyTeM m i r H fiiipoiiaiiHH TpaiicaMHiiaabi, lie BJIHHJI 11a aKTHBHOCTi, aeiiapOoKCHJiasbi rjiioTaMiiHOBOii KIKYIOTU. AMHiiooKcnyi;cyciiaH KiicjioTa T a n n i c MiirH6iipyeT TpaiicaMHiia3y G A B A , n o B TO >KC BpeMn B MeiiHiomeii Mepe yMem.maeT aKTHBiiocTi, jieKap6oKctiJia3bi rjiioTaMHiioBoii i . n c . i o ' n j , r a n ' n o 11a c o ; i e p H ; a n n e G A B A aeftcTByeT ,iH(ji(J)t'peiiunpoBainii>iH (})ai>Top, B 3ABIICNM0CTII OT cTeneiiii TOPMOMENHH o a i i o r o II,:IH a p y r o r o r>ii3HMa. TabHM o o p a s o M , n a i i o o . i e e p e 3 i ; o e n o B b i m e m i e G A B A iiaO.THiaacTcn B ( ' . T y i a n x , Hor;ia Top:vioKeiio.

Kurzmitteilungen

Acta biol. med. germ., Band 20, Seite 517 — 520 (1968) Aus der Abteilung für Klinische Biochemie der I I . Medizinischen Klinik der Charité (Prof. Dr. DUTZ) und dem Krankenhaus Friedrichshain, Urologische Abteilung (Chefarzt Dr. M E B E L )

Leuzin-p-nitranilid spaltende Enzyme im Harn nach Nierentransplantation G. DIETRICH, E . EGGER und TH.

ERDMANN

(Eingegangen am 2 1 . 3. 1967) 1 Zusammenfassung E s wird über das postoperative Verhalten der Urin-LAP-Aktivität bei Hunden nach Homotransplantation einer Niere berichtet. Am 3 . - 6 . Tag nach der Transplantation steigt die Aktivität im Urin als Zeichen der beginnenden Rejektion. Eine Verzögerung des Anstieges ist bei Anwendung von immunodepressiven Mitteln zu verzeichnen. Die Bestimmung der LAP-Aktivität im Urin könnte somit als orientierende Methode zur Früherfassung der Rejektion angewendet werden.

Die bei der Spaltung des Substrates Leuzin-p-nitranilid erfaßten Enzyme werden in der Literatur bisher als Leuzinaminopeptidasen bezeichnet. Wir verwenden diesen Begriff der Einfachheit halber, obwohl sicher ist, daß dabei höchstwahrscheinlich verschiedene Enzyme in unterschiedlichem Ausmaß erfaßt werden. Leuzinaminopeptidasen (LAP) können in allen parenchymatösen Geweben nachgewiesen werden. Die Leuzinaminopeptidasen der einzelnen Organe sind wahrscheinlich nicht identisch, sie unterscheiden sich in ihren Eigenschaften (Substratspezifität, ^>H-Optimum u. a.) [1]. Soweit bekannt, kann die LAP des Serums das Nierenfilter nicht passieren [2]. So ist die LAP-Aktivität des Urins auch bei stark erhöhten Serumaktivitäten normal. In der Niere ist das Enzym vorwiegend im proximalen Tubulus lokalisiert. Im Normalurin ist die LAP-Aktivität sehr gering; sie stammt wohl aus den abgestoßenen Zellen des Gewebes [2]. Bei allen Nierenerkrankungen, die den proximalen Tubulus erfassen, ist die Enzymaktivität im Harn stark erhöht [3, 4]. Da in der Rejektionsphase nach Nierentransplantation vorwiegend der proximale Tubulus betroffen ist, war zu vermuten, daß die LAP-Aktivität 1

34

Xach Revision am 12. 12. 1967 Acta biol. med. germ., Bd. 20, Heft 4

518

Kurzmitteilungen

im Urin auch den Beginn und das Ausmaß der Rejektion anzeigen kann. In dieser Arbeit soll untersucht werden, ob im postoperativen Verlauf nach Nierentransplantation eine Veränderung der LAP-Aktivität im Urin auftritt, ob diese Veränderung die Rejektionsphase frühzeitig erfaßt und ein Kriterium für das Ausmaß der Abwehrreaktionen ist, um eine gezielte immunodepressive Therapie betreiben zu können. Methodik Bei 10 H u n d e n w u r d e die L A P - A k t i v i t ä t des Urins im postoperativen Verlauf nach der N i e r e n t r a n s p l a n t a t i o n täglich bestimmt. Bei den H u n d e n w a r vorher in gleicher Sitzung doppelseitige N e p h r e k t o m i e und H o m o t r a n s p l a n t a t i o n v o r g e n o m m e n worden. Die Totzeit der ü b e r p f l a n z t e n Niere b e t r u g auf G r u n d einer besonderen Technik nach E R D M A N N nicht m e h r als 6—10 min. 7 Tiere w u r d e n p.o. nicht behandelt, 2 H u n d e erhielten Trenimon, 1 H u n d wurde v o m 3. T a g a n p.o. hämodialysiert. Zur B e s t i m m u n g des individuellen Ausgangswertes der L A P - A k t i v i t ä t f ü r das bet r e f f e n d e Tier w u r d e der Urin i n t r a operationem aus der Blase a b p u n k t i e r t . Der Urin im p.o. Verlauf nach der T r a n s p l a n t a t i o n wurde täglich frisch aufgefangen u n d bis zur B e s t i m m u n g bei 4 °C a u f b e w a h r t . Die E n z y m b e s t i m m u n g erfolgte m i t dem L A P - F a r b t e s t von Boehringer ( S u b s t r a t : Leuzin-p-nitranilid, P h o s p h a t p u f f e r pH 7,2). Ergebnisse

Die Normalwerte der LAP betrugen im Mittel 0,48 IE/1 mit einer Variationsbreite von 0,4—0,7 IE/1 und einer Standardabweichung von ± 0 , 1 . Sie lagen somit in dem in der Literatur angegebenen Bereich [5].

Tage p.o.

Abb. 1. L A P - V e r h a l t e n im H a r n nach N i e r e n t r a n s p l a n t a t i o n . — • — • = L A P bei a k u t e m Nierenversagen; = L A P nach N i e r e n t r a n s p l a n t a t i o n ohne T h e r a p i e ; = L A P nach N i e r e n t r a n s p l a n t a t i o n mit immunodepressiver Therapie

Kurzmitteilungen

0

5

519

10 Tage

A b b . 2. L A P - V e r h a l t e n im H a r n nach Nierentransplantation und anschließender Dyalyse

I m p.o. Verlauf steigt die L A P - A k t i v i t ä t an. B i s z u m 2 . - 3 . T a g nach Transplantation sind die A k t i v i t ä t e n im Normbereich. Zwischen dem 3. und 6. T a g erhöht sich die A k t i v i t ä t auf das 4fache der Norm. D a die Tiere ohne Therapie gehalten wurden, k a m es am 3. bis 6. T a g zum T o d der Tiere. W i r d der T o d der Hunde an Urämie durch Hämodialyse hinausgezögert, kann ein weiterer Anstieg der L A P auf mehr als das 1 Ofache innerhalb von 10 Tagen gemessen werden (Abb. 2). B e i V e r w e n d u n g v o n immunodepressiven Mitteln und Z y t o s t a t i k a wird die L A P - A k t i v i t ä t erst a m 9. bis 12. T a g p.o. erhöht gefunden. Bei 2 Hunden, bei denen die Totzeit der Nieren bei der Transplantation wesentlich länger als in den übrigen Fällen war, trat bereits 36 Std. p.o. der Tod ein. Bei diesen Hunden war die A k t i v i t ä t schon a m 1. T a g auf das öfache erhöht. Diskussion

Die Erhöhung der L A P - A k t i v i t ä t im Harn scheint mit dem Beginn der Rejektionsphase einzusetzen. Bei den Veränderungen des proximalen Tubulus in der R e j e k t i o n wird entweder die L A P im vermehrten Maße von der Zelle gebildet und freigesetzt, oder die im T u b u l u s lokalisierte E n z y m menge tritt durch Permeabilitätsänderungen, die bei Störungen des Zellstoffwechsels frühzeitig einsetzen bzw. durch vermehrte Zellzerstörung, in den Harn über. Werden die A b wehr Vorgänge durch immunodepressive Substanzen hinausgezögert, so ist auch die Erhöhung der L A P - A k t i v i t ä t im Harn erst später feststellbar. A k u t e s Nierenversagen trat bei der angewandten Operationstechnik nicht auf, was durch Paralleluntersuchungen, besonders durch die Messung der Serumkontrollwerte, gesichert werden konnte. Nur bei den zwei Tieren, die schon r ä c h einem T a g starben, konnte ein akutes Nierenversagen nicht ausgeschlossen werden. D a in diesen beiden Fällen durch technische Schwierigkeiten während der Operation die Totzeit der Nieren sehr lang war, m u ß neben anderen schädigenden Faktoren auf den Gesamtorganismus ein ausgesprägter primärer Tubulusschaden angenommen werden. In solchen Fällen war die L A P schon a m folgenden T a g p.o. stark erhöht. 34»

Kurzmitteilungen

520

Die Messung der LAP könnte somit ein frühzeitiger Indikator für den Beginn der Rejektionsphase sein. Die Methode ist einfach, zeitsparend und nicht aufwendig. Sie kann im Routinelabor ohne Schwierigkeiten durchgeführt werden und so bei der Überwachung der nierentransplantierten Patienten eingesetzt werden. Literatur [1]

[2] [3] [4] [5]

KLAUS, D . :

Ärztl. Forsch.

15, 1 / 5 4 8

BERGEMANN, H., S. ESTRICH, (1963).

F.

(1961).

S C H E L E R U.

M.

SCHMIDT:

Ärztl. Lab. 9, 255 — 260

Klin. Wschr. 42, 275 (1964). G., P. B A R A N Y A , Z. S . C Z I R B E S Z U. P. C S A K I : Klin. Wschr. 43, G . : Acta paediat. hung. 3, 3 6 7 ( 1 9 6 2 ) .

B E R G M A N N , H . U. F . S C H E L E R : SZACZ, SZACZ,

Anschrift des Verfassers: Dr. G I S E L A D I E T R I C H , Biochemie, 104 Berlin, Schumannstr. 20/21.

II.

783

(1965).

Med. Klinik der Charité, Abt.

A c t a biol. m e d . g e r m . , B a n d 20, S. 521 - 5 2 2 (1968) A u s d e r I . M e d i z i n i s c h e n K l i n i k d e r K a r l s - U n i v e r s i t ä t in H r a d e c K r ä l o v e ( V o r s t a n d : P r o f . D r . m e d . FR. CF.RNIK)

Der Einfluß des extrazellulären pH auf die Kaliumtotalkapazität J . GKOH, P . 2DÄNSKY, P. BILEK, J . SISTEK u n d E . KVASNICOVA

( E i n g e g a n g e n a m 2. 10. 1967) 1

S C R I B X E R et al [1] bezeichnen als Kaliumtotalkapazität die Summe aller Anionen und reaktiver Gruppen, welche Kaliumionen binden können. Verschiebungen des extrazellulären pYi sollen das extrazelluläre Kalium unabhängig von der Kaliumtotalkapazität beeinflussen. Von GROH et al [2] wurde nachgewiesen, daß es im Laufe einer metabolischen Azidose bei anurischen Ratten gleichzeitig zu einem Anstieg des extrazellulären Kaliums und zu Änderungen der Konzentration des intrazellulären Kaliums kommt und zwar unterschiedlich in den einzelnen Organen. In den Erythrozyten nimmt die Kaliumkonzentration ab, im Skelettmuskel bleibt sie unverändert und im Herzmuskel steigt sie an. U. E. dürfte die Kaliumtotalkapazität mit dem Ionengleichgewicht eng verbunden sein. Um diese Hypothese zu überprüfen, wurden 3 Gruppen von anurischen Ratten mit unterbundenen Nierenstielen Kaliumlösungen folgender Zusammensetzung infundiert: 1. MKC1/MHC1; 2. MKC1; 3. M KHC0 3 / M NaHC0 3 . Die Kaliumkonzentration betrug in allen Lösungen 1 M. Um die Kaliumkonzentration um 4,81 + 0,11 mÄqu/1 im Plasma zu erhöhen, war es notwendig, 0,50 ml M KCl/M HCl oder 0,78 ml M KCl oder 0,90 ml M KHCO3/M NaHC0 3 auf 100 g Tiergewicht zu infundieren. Die Änderungen der Kaliumkonzentration in Erythrozyten, Skelettmuskeln sowie im Herzmuskel sind in Abb. 1 dargestellt. Tabelle 1 A b s o l u t e D i f f e r e n z e n v o n P l a s m a - K a l i u m [ m A q u ] in E r y t h r o z y t e n (KET), S k e l e t t m u s k e l (KMT) u n d H e r z m u s k e l (KHT)

1

Infusion

MKC1-MHC1

M KCl

MKHC03/MNaHC0.

KP KET KMT KHT

-f 4,93 4,00 + 32,00 -f 73,00

+ 4,76 + 19,00 + 42,00 + 84,00

+ 4,70 + 26,00 + 74,00 + 79,00

N a c h R e v i s i o n a m 4. 12. 1967

A c t a biol. m e d . g e r m . , B a n d 20, S. 521 - 5 2 2 (1968) A u s d e r I . M e d i z i n i s c h e n K l i n i k d e r K a r l s - U n i v e r s i t ä t in H r a d e c K r ä l o v e ( V o r s t a n d : P r o f . D r . m e d . FR. CF.RNIK)

Der Einfluß des extrazellulären pH auf die Kaliumtotalkapazität J . GKOH, P . 2DÄNSKY, P. BILEK, J . SISTEK u n d E . KVASNICOVA

( E i n g e g a n g e n a m 2. 10. 1967) 1

S C R I B X E R et al [1] bezeichnen als Kaliumtotalkapazität die Summe aller Anionen und reaktiver Gruppen, welche Kaliumionen binden können. Verschiebungen des extrazellulären pYi sollen das extrazelluläre Kalium unabhängig von der Kaliumtotalkapazität beeinflussen. Von GROH et al [2] wurde nachgewiesen, daß es im Laufe einer metabolischen Azidose bei anurischen Ratten gleichzeitig zu einem Anstieg des extrazellulären Kaliums und zu Änderungen der Konzentration des intrazellulären Kaliums kommt und zwar unterschiedlich in den einzelnen Organen. In den Erythrozyten nimmt die Kaliumkonzentration ab, im Skelettmuskel bleibt sie unverändert und im Herzmuskel steigt sie an. U. E. dürfte die Kaliumtotalkapazität mit dem Ionengleichgewicht eng verbunden sein. Um diese Hypothese zu überprüfen, wurden 3 Gruppen von anurischen Ratten mit unterbundenen Nierenstielen Kaliumlösungen folgender Zusammensetzung infundiert: 1. MKC1/MHC1; 2. MKC1; 3. M KHC0 3 / M NaHC0 3 . Die Kaliumkonzentration betrug in allen Lösungen 1 M. Um die Kaliumkonzentration um 4,81 + 0,11 mÄqu/1 im Plasma zu erhöhen, war es notwendig, 0,50 ml M KCl/M HCl oder 0,78 ml M KCl oder 0,90 ml M KHCO3/M NaHC0 3 auf 100 g Tiergewicht zu infundieren. Die Änderungen der Kaliumkonzentration in Erythrozyten, Skelettmuskeln sowie im Herzmuskel sind in Abb. 1 dargestellt. Tabelle 1 A b s o l u t e D i f f e r e n z e n v o n P l a s m a - K a l i u m [ m A q u ] in E r y t h r o z y t e n (KET), S k e l e t t m u s k e l (KMT) u n d H e r z m u s k e l (KHT)

1

Infusion

MKC1-MHC1

M KCl

MKHC03/MNaHC0.

KP KET KMT KHT

-f 4,93 4,00 + 32,00 -f 73,00

+ 4,76 + 19,00 + 42,00 + 84,00

+ 4,70 + 26,00 + 74,00 + 79,00

N a c h R e v i s i o n a m 4. 12. 1967

Kurzmitteilungen

522

Abb. 1. Kaliumgehalt bezogen auf Trockenrückstand in Erythrozyten (KTE), S k e l e t t m u s k e l (KTM) u n d

p < - 0,0/0,05 M HCl-M

•

KCl

L'Am

KCl

L^d 0,78 ml

0,50 ml à

0,010,010,05

0,010,010,01

H

M KHCOj-

H

0,90

¿pH-0,14

pH-0,51

Herzmuskel (KHT), ausgedrückt im Prozentsatz der Kontrollwerte. Apü = absolute Differenz vom Blut-^H. Statistische Bewertung ( S T U D E X T S t-Test) bezogen auf die Kontrollwerte M

NOHC03

ml

& pH + 0,21

A u s A b b . 1 ist zu e n t n e h m e n , d a ß bei d e r H y p e r k a l i ä m i e d a s e x t r a z e l l u l ä r e f t i e i n e n e n t s c h e i d e n d e n E i n f l u ß auf d a s K a l i u m in E r y t h r o z y t e n u n d i m S k e l e t t m u s k e l a u s ü b t . I m H e r z m u s k e l b l e i b t die E r h ö h u n g d e r K a l i u m k o n z e n t r a t i o n v o m e x t r a z e l l u l ä r e n p H u n a b h ä n g i g . A u s den E r g e b n i s s e n k a n n m a n s c h l i e ß e n , d a ß die K a l i u m t o t a l k a p a z i t ä t d u r c h die e x t r a z e l l u l ä r e A z i d o s e v e r m i n d e r t , d u r c h die e x t r a z e l l u l ä r e A l k a l o s e j e d o c h e r h ö h t w i r d . Z w e i t e n s e r g i b t sich a u s dieser A r b e i t , d a ß die E r y t h r o z y t e n k e i n e s w e g s a l s e i n Modell f ü r die M i n e r a l z u s a m m e n s e t z u n g a n d e r e r K ö r p e r z e l l e n d i e n e n können. Literatur [1]

SCRIBNER, B .

[2]

GROH, J . ,

H. u. J . M.

P. 2DAXSKY,

Sei. (im Druck).

BURNELL:

P. BÎLEK,

Metabolism J. SÎSTEK

VI.

5,

468 (1956).

E. KVASXICKOVÀ:

Am.

J.

med.

Summary J . G R O H , P. 2 D Â X S K Y , P . B Î L E K , J . S I S T E K and E . K V A S N I C K O Y Â : of extracellular pH on the potassium total capacity

The influence

Potassium increase in erythrocytes and skeletal muscle during experimental hyperpotassaemia depends on extracellular pK. On the contrary, an influence of extracellular pH on the heart muscle potassium has not been observed. I t may be persumed that total potassium capacity decreases with metabolic acidosis and increases with metabolic alcalosis. This finding is of practical therapeutic value.

Acta biol. med. germ., B a n d 20, Seite 523 — 526 (1968) Aus dem I n s t i t u t f ü r Veterinär-Physiologie (Direktor: Prof. Dr. L. LYHS) der H u m boldt-Universität zu Berlin

Zum Einfluß der „spreading depression" auf Blutzucker und Plasma-11-Hydroxykortikosteroide der Ratte bei unterschiedlicher Belastung C. GRAUL

(Eingegangen a m 13. 11. 1967)

Zusammenfassung Die Ausschaltung der Großhirnrinde mittels SD f ü h r t bei A l b i n o r a t t e n zur Verringerung der 11-HK-Anstiege in A n t w o r t auf Stress-Belastungen. Die H e m m u n g dieser R e a k t i o n n i m m t m i t der Belastung zu. Die BZ-regulierenden Mechanismen werden d u r c h SD nicht signifikant, doch aber merklich in u m g e k e h r t e r R i c h t u n g u n d w a h r scheinlich eher s e k u n d ä r beeinflußt. SD reduziert die S t a n d a r d a b w e i c h u n g e n von B Z und 11-HK. Besonders s t a r k ist diese R e d u k t i o n bei großer Belastung.

Vom Einfluß der Großhirnrinde auf die blutzuckerregulierenden Mechanismen zeugt eine Vielzahl von Befunden. Es sei hier nur auf LEIBSON [1] verwiesen, der die wichtigsten dieser Angaben zusammengestellt hat. Daß auch das Hypothalamus-Hypophysen-Nebennierenrinden-System der steuernden Rolle der Großhirnrinde unterliegt, ist heute nicht mehr zu bezweifeln [2—4]. Eigene frühere Ergebnisse aus Versuchen mit vergleichbarem Rattenmaterial hatten gezeigt, daß bei verschiedenen „Stress-Belastungen" (Anfassen, Umsetzen, Fixieren usw.) Blutzuckerspiegel (BZ) und Plasma-11-Hydroxykortikosteroide (11-HK) ansteigen, was mit den Angaben von SELYE [5] und vielen anderen Autoren übereinstimmt. Hier sollte untersucht werden, inwieweit die beiden, allgemeine Adaptationsmechanismen des Organismus kennzeichnenden Größen, BZ und 11-HK, durch die Großhirnrinde beeinflußt werden und ob diese Beeinflussung durch verschiedenartige Belastung des Organismus in unterschiedlicher Weise zum Ausdruck kommt. Der Einfluß der Großhirnrinde wurde durch deren Ausschaltung mittels spreading depression (SD) untersucht. Diese „funktionelle Dekortizierung" wurde auch deshalb gewählt, weil unseres Wissens nach die Methode bisher mit Ausnahme von Arbeiten aus der letzten Zeit [6, 7] zu Fragen der Temperaturregulation und des Energieumsatzes nicht zur Untersuchung vegetativer Funktionen verwendet worden ist.

Acta biol. med. germ., B a n d 20, Seite 523 — 526 (1968) Aus dem I n s t i t u t f ü r Veterinär-Physiologie (Direktor: Prof. Dr. L. LYHS) der H u m boldt-Universität zu Berlin

Zum Einfluß der „spreading depression" auf Blutzucker und Plasma-11-Hydroxykortikosteroide der Ratte bei unterschiedlicher Belastung C. GRAUL

(Eingegangen a m 13. 11. 1967)

Zusammenfassung Die Ausschaltung der Großhirnrinde mittels SD f ü h r t bei A l b i n o r a t t e n zur Verringerung der 11-HK-Anstiege in A n t w o r t auf Stress-Belastungen. Die H e m m u n g dieser R e a k t i o n n i m m t m i t der Belastung zu. Die BZ-regulierenden Mechanismen werden d u r c h SD nicht signifikant, doch aber merklich in u m g e k e h r t e r R i c h t u n g u n d w a h r scheinlich eher s e k u n d ä r beeinflußt. SD reduziert die S t a n d a r d a b w e i c h u n g e n von B Z und 11-HK. Besonders s t a r k ist diese R e d u k t i o n bei großer Belastung.

Vom Einfluß der Großhirnrinde auf die blutzuckerregulierenden Mechanismen zeugt eine Vielzahl von Befunden. Es sei hier nur auf LEIBSON [1] verwiesen, der die wichtigsten dieser Angaben zusammengestellt hat. Daß auch das Hypothalamus-Hypophysen-Nebennierenrinden-System der steuernden Rolle der Großhirnrinde unterliegt, ist heute nicht mehr zu bezweifeln [2—4]. Eigene frühere Ergebnisse aus Versuchen mit vergleichbarem Rattenmaterial hatten gezeigt, daß bei verschiedenen „Stress-Belastungen" (Anfassen, Umsetzen, Fixieren usw.) Blutzuckerspiegel (BZ) und Plasma-11-Hydroxykortikosteroide (11-HK) ansteigen, was mit den Angaben von SELYE [5] und vielen anderen Autoren übereinstimmt. Hier sollte untersucht werden, inwieweit die beiden, allgemeine Adaptationsmechanismen des Organismus kennzeichnenden Größen, BZ und 11-HK, durch die Großhirnrinde beeinflußt werden und ob diese Beeinflussung durch verschiedenartige Belastung des Organismus in unterschiedlicher Weise zum Ausdruck kommt. Der Einfluß der Großhirnrinde wurde durch deren Ausschaltung mittels spreading depression (SD) untersucht. Diese „funktionelle Dekortizierung" wurde auch deshalb gewählt, weil unseres Wissens nach die Methode bisher mit Ausnahme von Arbeiten aus der letzten Zeit [6, 7] zu Fragen der Temperaturregulation und des Energieumsatzes nicht zur Untersuchung vegetativer Funktionen verwendet worden ist.

Kurzmitteilungen

524 Methodik

J e 10 ca. 2 Monate alte männliche, 150 g schwere Albinoratten (Rattenzucht Rehbrücke) wurden nach Auslösung der SD (siehe unten) verschiedenartiger StressBelastung ausgesetzt. Als Vergleich zu einer Belastung relativ geringen Grades durch Einschränkung der Bewegungsfreiheit der Tiere in kleinen Käfigen ( W I L L E R [8]) — K 0 — wurden als stärkere Belastungsstufen das Aufbinden der Tiere auf einem B r e t t mit nachfolgender i.v. Injektion physiologischer Kochsalzlösung ( K s t r t s s ) bzw. der Injektion von 1 I E Insulin ( V s t r c s s - i n s ) gewählt. Der Grad der Auswirkung dieser Manipulationen auf die interessierenden Kennwerte war uns aus anderen Versuchen bereits bekannt. Operierte Kontrolltiere ohne SD (Schein-SD) sowie unoperierte Tiere (intakt) wurden in Gruppen gleichen Umfangs parallel untersucht. Die Versuche wurden zwecks varianzanalytischer Auswertung im Blockschema angelegt. Die SD wurde mit 25%iger KCl-Lösung nach B U R E S O V A [9] ausgelöst, nachdem die Tiere am Vortage in leichter Thiogenalnarkose operiert worden waren. 30 min nach Auslösung der SD wurden die ersten 3 Tiergruppen (K 0 ) dekapitiert, die übrigen 6 Gruppen fixiert und nach Ablauf weiterer 30 min getötet. Die 11-HK-Werte wurden fluorometrisch bestimmt. E s wurde eine, den uns zur Verfügung stehenden Plasmamengen angepaßte Variation der auf S I L B E R et al. [10] zurückgehenden Methode verwendet. Dabei stützten wir uns im wesentlichen auf die verfahrenstechnischen Angaben von S T A H L und D Ö R N E R (siehe [11]) ohne das Spezifitätsproblem für unsere Belange berücksichtigen zu müssen. Die BZ-Werte wurden nach F R A N K und K I R B E R G E R [12] bestimmt. Ergebnisse

Die Ergebnisse sind in der Abb. 1 in Form der arithmetischen Mittel und Standardabweichungen der BZ- und 11-HK-Werte dargestellt. E s seien hier nur die wesentlichsten Befunde mitgeteilt. Die genauere statistische Auswertung läßt Wechselwirkungen zwischen Belastung und SD, wie auch Beziehungen zwischen 11-HK und B Z vermuten, die auf jeder Belastungsstufe unterschiedlich zu sein scheinen. Diese Ergebnisse sollen in einer zusammenfassenden Arbeit veröffentlicht werden. Gemessen an den Werten der jeweiligen Kontrolltiergruppen hatte die S D zum Zeitpunkt der Tötung der Tiere zu einer starken, signifikanten Senkung der 11-HK-Werte geführt. Der Abfall war um so stärker ausgeprägt, je stärker der Grad der Belastung war. Dagegen reagierten die unoperierten Tiere (intakt) erwartungsgemäß bei steigender Belastung mit Erhöhung der 11-HK-Werte. Die höchsten 11-HK sind daher bei den V s . i n t a k t (signifikant gegenüber den K 0 . i n t a k t verschieden; 1 % < P < 5 % ) , die niedrigsten bei den V t s s - i n s - s D finden. Hinsichtlich der BZ-Werte wirkte sich die SD nicht so stark aus. Auf den ersten beiden Stufen kam es, trotz der besonders bei den K Stross . intakt sehr hohen BZ-Werte, durch SD eher zu einer weiteren BZ-Steigerung. Diese zusätzliche BZ-Steigerung ist statistisch nicht zu sichern. Sie ist wahrscheinlich sekundärer Natur. Die Insulininjektion senkte den B Z der gestreßten Tiere bis etwa zum „Ruhewert" ungestreßter (keinerlei Manipulationen ausgesetzter, sofort dekapitierter) Tiere. Sie ist im Falle der V stress . Ins _ SD , gemessen an dem den strcs

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Kurzmitteilungen

525

2001

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A b b . 1. D a r s t e l l u n g der B Z - u n d 1 1 - H K - G r u p p e n m i t t e l (x) u n d S t a n d a r d a b w e i c h u n g e n (s). (noruppe = = 1 0 ; in d e n G r u p p e n KO-SD u n d Kstress-SD e r f o l g t e die D a r s t e l l u n g o h n e „ A u s r e i ß e r " , n = 9. D i e „ A u s r e i ß e r " w u r d e n m i t d e m „ A u s r e i ß e r " - K r i t e r i u m n a c h HULTZSCH[13] e r m i t t e l t . ) W e i ß e S ä u l e n : B Z ; s c h w a r z e S ä u l e n : 11 - H K . a) „ i n t a k t " ; b) S c h e i n - S D ; c) SD. 1. K 0 ; 2. Kstrcss! 3- V S t rcss-Ins

höchsten BZ-Wert aller Gruppen darstellenden Wert der KStlvss_SD, etwas stärker zu bewerten, als bei den entsprechenden Kontrollen. Daraus kann die Vermutung einer gesteigerten Insulinempfindlichkeit der dekortizierten Tiere abgeleitet werden. Ferner wurde festgestellt, daß die Standardabweichungen sowohl bezüglich des BZ als auch der t 1 - H K durch SD auf den einzelnen Belastungsstufen vermindert wurden. Diese Verminderung ist bei Kstress_SD und VSm.ss_lns.SD signifikant gegenüber „intakt" (F-Test; teilweise p < 1%, zum Teil i % < p < 5%)- Die entsprechenden Beziehungen zwischen den Gruppen scheinen bezüglich des BZ andere zu sein, als hinsichtlich der 11-HK. Das Ausmaß der Senkung der Standardabweichung wird besonders deutlich bei Berücksichtigung des Umstandes, daß mit steigender Belastung die Standardabweichungen der intakten Tiere zunehmen und, zumindest bezüglich des BZ, siginifikant größer sind als die der K 0 . Aus diesen Ergebnissen geht die große Bedeutung der Großhirnrinde für die Formierung individueller Reaktionen vegetativer Mechanismen klar hervor. Die drei Schein-SD-Kontrollgruppen weisen — auf den einzelnen Belastungsstufen unterschiedliche — Besonderheiten gegenüber den intakten

526

Kurzmitteilungen

Tieren einerseits und den SD-Tieren andererseits auf. Das betrifft sowohl die Unterschiede der Mittelwerte zwischen den Gruppen als auch die der Standardabweichungen. Darauf kann jedoch hier nicht näher eingegangen werden. Eine nähere Erörterung aller hier mitgeteilten Befunde soll in einer später veröffentlichenden Arbeit in Zusammenhang mit der Darstellung der Ergebnisse der weiteren statistischen Auswertung erfolgen. Literatur [1]

L E I B S O X , L. G.: Sachar Krovi. Verlag der Akademie der Wissenschaften der U d S S R , Moskau-Leningrad, 1962. [2] BAJUSZ, E . : Aktuelle Fragen Psychiat. Neurol. 3, 106 (1966). [3] M A R K S , Y. u. R O S E , F . C.: Hypoglycemia. Blackwell Publ., Oxford 1965/66. [4] W O O D B U R Y , D. M.: Pharmac. Rev. 10, 275 (1958). [5] S E L Y E , H . : Dt. med. Wschr. 33/34, 1001 (1951)[6] D Y B O W S K I , G. U. A. E W E R T : Acta biol. med. germ. 17, 1 7 0 ( 1 9 6 6 ) . [7] D Y B O W S K I . G. U. W . R Ü D I G E R : Acta biol. med. germ. 18, 209 (1967). [8] W I L L E R , H . : Z. Versuchstierk. 8 , 324 (1966). [ 9 ] B U R E S O V A , O . : Physiologia bohemoslov. 5, 3 5 0 ( 1 9 5 6 ) . [10] S I L B E R , H. R . , D . B U S C H U. R . O S L A P A S : Clin. Chem. 4, 2 7 8 ( 1 9 5 8 ) . [ 1 1 ] S T A H L , F . u. G . D Ö R N E R : Acta endocr., Copenh. 5 1 , 1 7 5 ( 1 9 6 6 ) . [12] F R A N K , H . U . E . K I R B E R G E R : Biochem. Z . 320, 3 5 9 ( 1 9 5 0 ) . [ 1 3 ] H U L T Z S C H , E . : Wiss. Z . T H Dresden, 10, 3 7 5 ( 1 9 6 1 ) .

Die Versuche wurden unter technischer Mitarbeit von Frl. I. G. S C H R Ö D E R durchgeführt.

SAGROMSKI

und Frl.

Anschrift der Verfasserin: Dipl. Biol. C. G R A U L Inst. f. Veterinärphysiologie der Humboldt-LTniversität Berlin, 104 Berlin, Reinhardtstr. 4

Acta biol. med. germ., B a n d 20, Seite 527—531 (1968) Aus dem Physiologisch-chemischen I n s t i t u t der Friedrich-Schiller-Universität J e n a (Direktor: Prof. Dr. H . F R U N D E R )

Ein Beitrag zur F r a g e des V o r k o m m e n s einer R N S in den M e m b r a n e n des endoplasmatischen R e t i k u l u m s B. BRÜX1 u n d G.

RICHTER1

(Eingegangen a m 2. 12. 1967)

In der Literatur wurde wiederholt beschrieben, daß in den Membranen des endoplasmatischen Retikulums eine bisher nicht eindeutig charakterisierte R N S v o r k o m m t [1—6]. Sie ist auf Grund ihrer Basenzusammensetzung [2, 6], ihres Verhaltens bei der Dichtegradientenzentrifugation und bei der Chromatographie auf M A K - S ä u l e n [6] sowie hinsichtlich ihrer U m s a t z geschwindigkeit [3, 5] mit den bisher bekannten und genau charakterisierten R N S - A r t e n (ribosomale R N S , Messcngcr-RNS, T r a n s f e r - R N S , 5 SR N S ) offenbar nicht identisch. Die Behandlung der Mikrosomenfraktion mit Natriumpyrophosphat, wodurch die Ribosomen abgelöst und zerstört werden [1], ist eine oft benutzte Methode zur Isolierung der endoplasmatischen Membranen. E s ist jedoch noch nicht gesichert, ob mit Pyrophosphat die Ribosomen von den Membranen vollständig abgelöst werden. Ist das nicht der Fall, so könnte die R N S der so erhaltenen Membranfraktion aus Bruchstücken ribosomaler R N S stammen. Ziel der vorliegenden Arbeit war, Hinweise zu erhalten, ob in der durch Pyrophosphat-Behandlung erhaltenen Membranfraktion noch Ribosomen bzw. Ribosomenbruchstücke vorhanden sind. Material und Methodik Versuchstiere waren weiße R a t t e n einer Koloniezucht, denen 18 Std. vor Versuchsbeginn die N a h r u n g entzogen wurde. Die M i k r o s o m e n f r a k t i o n w u r d e n a c h A b t r e n nung der Kerne (5 min, bei 600 g) und der Mitochondrien (20 min, bei 20000 g) d u r c h Zentrifugation (90 min, bei 40000 g) gewonnen. Die Mikrosomenfraktion w u r d e m i t Verwendete A b k ü r z u n g e n : R N S = Ribonukleinsäure, MAK-Säule = Säule aus methyliertem Albumin auf Kieselgur, DOC = Xatriumdesoxycholat, R z = Rohrzucker, E D T A = D i n a t r i u m d i h y d r o g e n ä t h y l e n d i a m i n t e t r a a z e t a t , Tris = Tris(hydroxymethyl) a m i n o m e t h a n 1 Jetzige Anschrift: I n s t i t u t f ü r medizinische u n d allgemeine Mikrobiologie, Virologie und Epidemiologie der Medizinischen F a k u l t ä t der H u m b o l d t - U n i v e r s i t ä t zu Berlin, Abteilung Biochemie der Viren u n d Mikroorganismen

Acta biol. med. germ., B a n d 20, Seite 527—531 (1968) Aus dem Physiologisch-chemischen I n s t i t u t der Friedrich-Schiller-Universität J e n a (Direktor: Prof. Dr. H . F R U N D E R )

Ein Beitrag zur F r a g e des V o r k o m m e n s einer R N S in den M e m b r a n e n des endoplasmatischen R e t i k u l u m s B. BRÜX1 u n d G.

RICHTER1

(Eingegangen a m 2. 12. 1967)

In der Literatur wurde wiederholt beschrieben, daß in den Membranen des endoplasmatischen Retikulums eine bisher nicht eindeutig charakterisierte R N S v o r k o m m t [1—6]. Sie ist auf Grund ihrer Basenzusammensetzung [2, 6], ihres Verhaltens bei der Dichtegradientenzentrifugation und bei der Chromatographie auf M A K - S ä u l e n [6] sowie hinsichtlich ihrer U m s a t z geschwindigkeit [3, 5] mit den bisher bekannten und genau charakterisierten R N S - A r t e n (ribosomale R N S , Messcngcr-RNS, T r a n s f e r - R N S , 5 SR N S ) offenbar nicht identisch. Die Behandlung der Mikrosomenfraktion mit Natriumpyrophosphat, wodurch die Ribosomen abgelöst und zerstört werden [1], ist eine oft benutzte Methode zur Isolierung der endoplasmatischen Membranen. E s ist jedoch noch nicht gesichert, ob mit Pyrophosphat die Ribosomen von den Membranen vollständig abgelöst werden. Ist das nicht der Fall, so könnte die R N S der so erhaltenen Membranfraktion aus Bruchstücken ribosomaler R N S stammen. Ziel der vorliegenden Arbeit war, Hinweise zu erhalten, ob in der durch Pyrophosphat-Behandlung erhaltenen Membranfraktion noch Ribosomen bzw. Ribosomenbruchstücke vorhanden sind. Material und Methodik Versuchstiere waren weiße R a t t e n einer Koloniezucht, denen 18 Std. vor Versuchsbeginn die N a h r u n g entzogen wurde. Die M i k r o s o m e n f r a k t i o n w u r d e n a c h A b t r e n nung der Kerne (5 min, bei 600 g) und der Mitochondrien (20 min, bei 20000 g) d u r c h Zentrifugation (90 min, bei 40000 g) gewonnen. Die Mikrosomenfraktion w u r d e m i t Verwendete A b k ü r z u n g e n : R N S = Ribonukleinsäure, MAK-Säule = Säule aus methyliertem Albumin auf Kieselgur, DOC = Xatriumdesoxycholat, R z = Rohrzucker, E D T A = D i n a t r i u m d i h y d r o g e n ä t h y l e n d i a m i n t e t r a a z e t a t , Tris = Tris(hydroxymethyl) a m i n o m e t h a n 1 Jetzige Anschrift: I n s t i t u t f ü r medizinische u n d allgemeine Mikrobiologie, Virologie und Epidemiologie der Medizinischen F a k u l t ä t der H u m b o l d t - U n i v e r s i t ä t zu Berlin, Abteilung Biochemie der Viren u n d Mikroorganismen

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Kurzmitteilungen

8 — 10 ml 0,1 M X a t r i u m p y r o p h o s p h a t ( X a 4 P 2 0 7 . 10 H a O ) in 0,25 M Kz />H 7,5, p r o g L e b e r f r i s c h g e w i c h t homogenisiert, d a s H o m o g e n a t 30 min bei 0 ° C s t e h e n gelassen u n d 60 m i n bei 105 000 g" a b z e n t r i f u g i e r t . D a s S e d i m e n t w u r d e noch zweimal m i t der gleichen I ' y r o p h o s p h a t l ö s u n g gewaschen. N a c h A u f n a h m e in 1 mM j\IgCl 2 , 25 m M KCl, 35 m J l Tris pH 7,8 [7] w u r d e d a s Sedim e n t der P y r o p h o s p h a t - b e h a n d e l t e n JUikrosomen auf den D i c h t e g r a d i e n t e n a u f g e t r a g e n . Zur D O C - B e h a n d l u n g w u r d e eine 5 % i g e D O C - L ö s u n g in 0,1 IM Tris, pH 8,2, bis zu einer E n d k o n z e n t r a t i o n v o n 1,1 ° 0 zugegeben. Die D i c h t e g r a d i e n t e n z e n t r i f u g a t i o n erfolgte im linearen R z - G r a d i e n t e n (30— 10% Hz bzw. 2 0 — 5 % Kz in 0,1 m M ]\IgCl 2 , 25 mM KCl, 35 m M Tris, pH 7,8 [7] bei 0 —4°C in 5-ml-Bechern des freischwing e n d e n R o t o r s der YAC 40 bzw. YAG 60 der F i r m a J a n e t z k i , Engelsdorf. Von j e d e m B e c h e r w u r d e n e t w a 30 F r a k t i o n e n g e s a m m e l t u n d die F^xtinktion n a c h V e r d ü n n u n g m i t 0,01 M N a O H bei 260 n m gemessen. Die F e r r i t i n k o r r c k t u r w u r d e n a c h MUXRO e t a l . [8] v o r g e n o m m e n . S e d i m e n t a t i o n s k o n s t a n t e n w u r d e n n a c h M A R T I N u n d A M E S [9] b e r e c h n e t . Die R J S ' S w u r d e a u s d e n n a c h P y r o p h o s p h a t - B e h a n d l u n g e r h a l t e n e n S e d i m e n t e n m i t t e l s P h e n o l in G e g e n w a r t v o n 1 % B e n t o n i t u n d 2 % X a t r i u m d o d e c y l s u l f a t ext r a h i e r t . Die R N S w u r d e n a c h der A l k o h o l f ä l l u n g in 0,1 M XaCl, 0,001 M E D T A , 0,01 M Tris, pH 7,5, a u f g e n o m m e n . Die D i c h t e g r a d i e n t e n z e n t r i f u g a t i o n der R N S erfolgte im linearen R z - G r a d i e n t e n (20— 5 % R z in 0,1 M NaCl, 0,001 M E D T A , 0,01 M Tris pH 7,5). Z u r B e s t i m m u n g der B a s e n z u s a m m e n s e t z u n g w u r d e n die 2'(3')-Mononukleotide n a c h A l k a l i h y d r o l y s e (18 S t d . bei 37° in 0,3 M K O H ) d u r c h H o c h s p a n n u n g s e l e k t r o p h o r e s e in 0,05 M F o r m i a t p u f f e r , pH 3,5, g e t r e n n t .

Ergebnisse

Zunächst wurde die durch Pyrophosphat-Behandlung gewonnene Membranfraktion untersucht. Die Auftrennung des abzentrifugierten Membranmaterials im Dichtegradienten zeigt (Abb. 1), daß neben der schnell sedimentierenden Bande der Membranen schwer sedimentierbares Material kaum nachweisbar ist. Unter den Versuchsbedingungen würden sich Ribosomen und Polysomen mit einer Sedimentationskonstante von < 600 S in der Abb. 1 zwischen Fraktion 10 und 25 befinden. Daraus folgt, daß in der Pyrophosphat-behandelten Mikrosomenfraktion keine freien Ribosomen bzw. Polysomen mehr vorhanden sind. In dem schnell sedimentierenden Hauptgipfel können allerdings noch attachierte Ribosomen vorliegen. Diese müßten jedoch nach Auflösung der Membranen mit DOC freigesetzt werden. Es wurde deswegen die nach Pyrophosphat-Einwirkung erhaltene Membranfraktion mit DOC behandelt. Die Hauptmenge des Materials wandert, wie Abb. 2 zeigt, unter diesen Zentrifugationsbedingungen kaum und hat unter Annahme eines partiellen Volumens von Ribosomen eine Sedimentationskonstante von < 80 S. Polysomen bzw. Ribosomen sind also in der Membranfraktion kaum noch vorhanden. Reste von Dimeren bzw. leichten Polysomen sind allerdings auf Grund des geringen Extinktionsanstieges bei Fraktion 20—27 in Abb. 2 nicht eindeutig auszuschließen. Um zu prüfen, ob durch die kombinierte Pyrophosphat-DOC-Behandlung aus den Ribosomen Bruchstücke entstanden sind, wurde die Laufzeit der Dichtegradientenzentrifugation verlängert, so daß 50 S- und 30 S-Partikel

Kurzmitteilungen

Fraktionen

Abb. 1

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Fraktionen

Abb. 2

A b b . 1. S e d i m e n t a t i o n s v e r h a l t e n der P y r o p h o s p h a t - b e h a n d e l t e n M i k r o s o m e n f r a k t i o n im R z - G r a d i e n t e n (30—10% Rz). L a u f z e i t 40 m i n bei 35000 U / m i n i m S W - R o t o r (Janetzki). E K o rr = E 2 6 0 — 1,51 x E a A b b . 2. S e d i m e n t a t i o n s v e r h a l t e n der P y r o p h o s p h a t - b e h a n d e l t e n M i k r o s o m e n f r a k t i o n n a c h D O C - B e h a n d l u n g (1,1% E n d k o n z e n t r a t i o n ) i m R z - G r a d i e n t e n (30—10% R z ) . L a u f z e i t 40 m i n bei 35000 U / m i n im S W - R o t o r ( J a n e t z k i ) . E K O « = E 2 6 0 — 1,51 x E 3 2 0

aufgetrennt werden können. Aus Abb. 3 ergibt sich jedoch, daß abgesehen von einer schnell sedimentierenden Fraktion weder 80 S-, 50 Snoch 30 S-Partikel nachweisbar sind. Der Hauptteil des UV-absorbierenden Materials wandert trotz verlängerter Zentrifugationszeit nicht im Dichtegradienten. Der Anteil der relativ schnell sedimentierenden Fraktion an der Gesamtfraktion ist nicht konstant. Es ist vorerst nicht zu entscheiden, ob es sich um aggregierte Membranreste bzw. Ribosomenaggregate oder ähnliches handelt. Das schwer sedimentierbare Material läßt sich auch bei weiterer Verlängerung der Zentrifugationszeit nicht auftrennen. Das Entstehen von Ribosomenuntereinheiten durch Pyrophosphat-Behandlung ist also sehr unwahrscheinlich. Die durch Pyrophosphat-Behandlung erhaltene Fraktion besteht offenbar zum größten Teil aus Membrananteilen des endoplasmatischen Retikulums. Aus dieser Fraktion wurde eine RNS isoliert, die der in der Literatur beschriebenen Membran-RNS entspricht. Sie sedimentiert im Rz-Dichtegradienten einheitlich mit einem Gipfel bei 10 S (siehe Abb. 4). Die nahezu

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530

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Fraktionen

Abb. 3

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Abb. 4

Abb. 3 Sedimentationsverhalten der l'yrophosphat-behandelten Mikrosomenfraktion nach DOC-Behandlung ( 1 , 1 % Endkonzentration) im Rz-Gradienten ( 2 0 — 5 % Rz) Laufzeit 1 70 min bei 4 0 0 0 0 U/min im S W - R o t o r (Janetzki). EiI

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TOIIKOM 421—426

I*. F a a a e p : K u o n p o c y o K O M i i a p o i e i n a i u i n n a r p i m B « i c a o n e ' i e e K i i x j p u r p o m n a x F . D t h o ; i i » ^ ; , B . r i p o i i c e ; i b , P . X i n i ' i e 11 I I . J l a n r e n : JILI ii K a n e c T B C i m r n o H T o p o B (|)HrypaiuiH-;ieiiCTDiie K.

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K H T c a b i i o r o x o j i c c T e p i m a 11a c o ^ e p » i ; a i n i e M y K o n o a n c a x a p n n o B n e K O T o p t i x o p r a n o B

KopMaeuim 4 4 9 — 456

r'l. C . F a M 6 a p > i n : O o a n a T O M m i y c j i o B i i o r o ^ B u r a T e j i b i i o r o p e c ^ a e K c a

457 — 4 7 2

U . P i o j u i r e p , M . J l m i A C M a i i n , B . J l a a t 11 K . - J i . H o a a : B a i i M i u i e x a o p i i p o M a a u u a u a B H C n c p o - B i i c n e p a . : i b U b i e pe I ; e j i « m o r o n y a w p n KOUIIUI C VMCTOM i j H o a a e K r p i i ' i e e i;oi'i a K T H B i i o c T H M 0 3 r 0 B 0 i i K o p u ( i J K F ) Ii. F e p m u a m i :

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489 — 493

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495 — 501

5(">3— 508

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533 — 5 3 4 K 1 7 — 20

31002

INHALT Biochemie II. J . HÜTTER U. K . D I W O K : R . GLASER: Zur Frage der

G. K.

Seite Zur /3-Galaktosidase-Aktivität des Rattendünndarms Kompartmentierung des Natriums in menschlichen

421—426

Erythrozyten 427 — 436 ETZOLD, B. PREUSSEL, R. HINTSCHE U. P. L A N G E N : Thymin-2'-desoxypentopyranoside als Hemmstoffe der Uridin-Desoxyuridin-Phosphorylase. Konfigurations-Wirkungsbeziehungen 437 — 442 STAMMBERGER, G . RICHTER u. H . F R U N D E R : Veränderungen des Lebergewichtes sowie des Eiweiß-, Fett- und DNS-Gehaltes der CCl4-geschädigten Leber. . . . 443—447

Physiologie SZEDERKENYI U. G . LUSZTIG: Über die Wirkung protrahierter Cholesterinfütterung auf den Mukopolysaccharidgehalt einiger Organe L . S. GAMBARJAN: Zur Anatomie des bedingten motorischen Reflexes W . RÜDIGER, M . LINDEMANN, W. LAHL U. K.-D. NOLL: Der Einfluß von Chlorpromazin auf viszero-viszerale Reflexe der Gallenblase der Katze unter Berücksichtigung der bioelektrischen Aktivität der Hirnrinde (ECG) E . HERZMANN : Untersuchungen über die Wirkung von Dimethylsulfoxyd auf die experimentelle Hypercholesterinämie des Hähnchens M . B R A D L : Über den Einfluß der Ermüdung auf die optische Reaktionszeit des Menschen J. M. J E L I N E K : Die Wirkung einiger androgener Steroide auf die Anästhesie. . . . I. C. DATTA, J. N. KARKUN U . A . B . KAR : Untersuchungen zur Physiologie und Biochemie der Cervix. Veränderungen in der Cervix von Rhesus-Affen während des Menstruationszyklus. Wirkung von Ovariektomie und Östrogentherapie. . . . L . JÖZSA, G Y .

449—456 457—472 473 —481 483 — 487 489—493 495 — 501 503 — 508

Pharmakologie opov, W. POHLE U. H. MATTHIES : Einfluß von Phenelzin und Aminooxyessigsäure auf die y-Aminobuttersäure, Glutaminsäure-Dekarboxylase und y-Aminobuttersäure-a-Ketoglutarsäure-Transaminase in verschiedenen Regionen des Rattenhirns 509 — 516

N. P

Kurzmitteilungen G . DIETRICH, E. EGGER u. T H . E R D M A N N : Leuzin-p-nitranilid spaltende Enzyme im Harn nach Nierentransplantation J . G R O H , P . 2 D Ä N S K Y , P. BfLEK, J . SisiEKu. E. KVASNIÖOVA : Der Einfluß des extrazellulären pH auf die Kaliumtotalkapazität C. GRAUL: Zum Einfluß der "spreading depression" auf Blutzucker und Plasma-11-Hydroxykortikosteroide der Ratte bei unterschiedlicher Belastung . B . BRÜX U. G . RICHTER: Ein Beitrag zur Frage des Vorkommens einer RNS in den Membranen des endoplasmatischen Retikulums H . MATTHIES U. CHRISTA F Ä H S E : Die Wirkung von Methamphetamin auf das Erlöschen einer bedingten Fluchtreaktion der Ratte A. GRAFFI, O . PROKOP U. S T . SCHNITZLER: Weitere Untersuchung zur Frage der Tumorspezifität von N-Azetyl-D-Galaktosamin bei zwei Aszitestumoren. . .

517 — 520 521 — 522 523 — 526 527 — 531 533—534 Kl 7—20

Herausgeber und verantwortlich für den Inhalt: R. Baumann, H . Dutz, A. Graffi, H. Gummel, F. Jung, L.-H. Kettler, S. M. Rapoport. Schriftleitung: Prof. Dr. Werner Scheler und Dr. habil. Heinz Bielka, 1115 Berlin-Buch, Lindenberger Weg 70. Fernruf: 56985t. App. 222. Verlag: Akademie-Verlag GmbH, 108 Berlin, Leipziger Straße 3—4 (Femruf: 220441) Telex-Nr. 0112020, Postscheckkonto Berlin 35021. Bestellnummer dieses Heftes 1053/XX/4. Die Zeitschrift erscheint monatlich. Bezugspreis: J e Heft 18,— M, Sonderpreis für die D D R 14,— M. Veröffentlicht unter der Lizenznummer 1318 des Presseamtes beim Vorsitzenden des Ministerrates der Deutschen Demokratischen Republik. Gesamtherstellung: VEB Druckerei „Thomas Müntzer", 582 Bad Langensalza. — Alle Rechte vorbehalten, insbesondere die der Übersetzimg. Kein Teil dieser Zeitschrift darf in irgendeiner Form — durch Photokopie, Mikrofilm oder irgendein anderes Verfahren — ohne schriftliche Genehmigimg des Verlages reproduziert werden.