Acta Biologica et Medica Germanica: Band 18, Heft 4 [Reprint 2021 ed.] 9783112518700, 9783112518694

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HERAUSGEBER: R. B A U M A N N , H. D U T Z , A. G R A F F I , H . G U M M E L , L.-H. K E T T L E R , S. M. R A P O P O R T

F. J U N G ,

UNTER MITARBEIT VON: W. B E I E R , H. D R I S C H E L , H. F R U N D E R , M. G E R S C H , E. G O E T Z E , II. H A N S O N , F. H A U S C H I L D , G. H O L L E , F. M A C H , H. M A T T H I E S , G. M O H N I K E f , O. P R O K O P , K. S C H U B E R T , F. S C H W A R Z , G. S T E R B A , A. W O L L E N B E R G E R SCHKU'TLEITUNG: W. S C H E L E R , H. B I E L K A

KADEMIE-VERLAG

• BERLIN

• B A N D 18 • H E F T 4

• S E I T E 451-553

• 1967

AUFNAHMEBEDINGUNGEN 1. Es werden nur Arbeiten angenommen, die nicht an anderer Stelle mit demselben Inhalt veröffentlicht oder zur Veröffentlichung angeboten werden. Der Autor verpflichtet sich nach Annahme, die Arbeit an keiner anderen Stelle zu veröffentlichen. 2. Die Arbeit muß wissenschaftlich wertvoll sein.

Bestätigungen bekannter Tat-

sachen, Versuche und Beobachtungen ohne positives Ergebnis werden, wenn überhaupt, nur in kürzester Form aufgenommen. Nicht aufgenommen werden Arbeiten referierenden Charakters, Polemiken und rein spekulative Arbeiten, falls sie nicht ganz wesentliche neue Gesichtspunkte enthalten. 3. Kurzmitteilungen für experimentelle Ergebnisse werden bei der Drucklegungzeitlich bevorzugt. F ü r ihren Inhalt ist ausschließlich der Autor verantwortlich. 4. Die Arbeiten müssen kurz und klar geschrieben und gegliedert sein. Problematik (Einleitung), Methodik, Befunde und Diskussion, evtl. Schlußfolgerungen sollen deutlich in Erscheinung treten. Der Arbeit soll ein Kurzreferat der wesentlichsten Ergebnisse vorausgestellt werden. Neben einer anderssprachigen erscheint auf jeden Fall eine deutsche Zusammenfassung. Die Arbeiten werden in folgenden Sprachen angenommen: Deutsch, Russisch, Englisch und Französisch. 5. Die Arbeiten werden im Sofortumbruch gesetzt; größere Korrekturen in Form von Streichungen bzw. Zusätzen sind daher in der Umbruchkorrektur nicht mehr möglich. 6. Genaue Hinweise zur Manuskriptgestaltung sind von der Redaktion der Zeitschrift anzufordern und sind unbedingt einzuhalten. 7. Manuskripte sind an die Herausgeber zu senden oder direkt an die Redaktion der Acta biologica et medica germanica, 1115 Berlin-Buch, Lindenberger Weg 70. 8. Von jeder Originalarbeit werden kostenlos 80 Sonderdrucke geliefert.

Darüber

hinaus können bis zu 100 Sonderdrucke gegen Berechnung bezogen werden. Die Herausgeber

ACTA BIOLOGICA ET MEDICA GERMANICA Herausgeber : R. B a u m a n n • H. D u t z • A. G r a f f i • H. G u m m e l • F. J u n g • L.-H. K e t t l e r S. M. R a p o p o r t B a n d 18

1 967

Heft 4

Acta biol. med. german., Band 18, Seite 451—456 (1967) Aus dem Institut für physiologische Chemie der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald (Direktor: Prof. Dr. N. H A R T M A N N ) und dem Institut für Tierernährungslehre der Humboldt-Universität zu Berlin (Direktor: Prof. Dr. H. B E R G N E R )

In vitro-Dejodierung von 1 3 1 J-Rose bengale durch Rattenleberhomogenat unter verschiedenen Stoffwechselbedingungen CHR. VOSS,

N . HARTMANN,

B. WIRTHGEN u n d H .

BERGNER

(Eingegangen am 17. 10. 1966)

Zusammenfassung E s wird nachgewiesen, daß Rattenleberhomogenat 131 J markiertes Rose bengale dejodieren kann. Der Dejodierungsindex (auf Leberprotein bezogen) sinkt nach F ü t t e r u n g einer Gelatinediät. Trijodthyroningaben oder Verabreichung eines Schilddrüsenpräparates verringerten ebenso wie Methylthiourazilzulagen den Dejodierungsindex des 1 3 1 J-Rose bengale.

In früheren Mitteilungen [1]—[4] haben wir über die in vivo-Dejodierung von 131 J-Rose bengale (Tetrajodtetrachlorfluoreszein) nach i.p. Injektion an Albinoratten unter verschiedenen Ernähungsbedingungen und Stoffwechseleinflüssen berichtet. In der vorliegenden Arbeit prüften wir, ob die in vivo zu beobachtende Dejodierung des Färbstoffmoleküls auch in vitro nachweisbar ist. Material und Methodik Als Versuchstiere dienten Albinoratten des institutseigenen Inzuchtstammes. Die Tiere wurden in Einzelkäfigen bei konstanter Raumtemperatur (23 °C) gehalten und erhielten F u t t e r und Wasser ad libitum. Die verwendeten Diäten sind in Tabelle 1 an 1 gegeben. Die Fütterungsdauer betrug 8 bzw. 14 Tage. Neben der Prüfung einer eiweiß : freien E r n ä h r u n g bzw. Gelatinediät in ihrem Einfluß auf die m J - R o s e bengale- in vitro-Dejodierung untersuchten wir auch die Wirkung einer Stoffwechselstimulierung 31

Acta biol. med. german., Bd. 18, H e f t 4

452

CHR. VOSS, N . HARTMANN, B . WIRTHGEN, H .

BERGNER

mittels Trijodthyronin (T3)1 und Thyreoidin ( T j 1 sowie einer Stoffwechselreduzierung mittels Methylthiourazil (MTU)2 hinsichtlich des Dejodierungseffektes. Folgende Gruppen wurden parallel gehalten: 1, 2, 8, 9, 11 sowie 3, 4, 7, 10 und 5, 6. Tabelle 1 Zusammensetzung der Futterdiäten Nr. und Bezeichnung der Diät Magermi Ichpulver Gelatine Sojaöl Mineralstoffmischung1 Zellulosemehl Vitaminmischung 1 Saccharose Maisstärke

1. Milch

[%]

2. eiweißfrei

[%]

45,4 —

5,0 3,0 4,0 2,0 10,0 30,6

—

5 6 4 2 10 73

3. Gelatine

[%]

10,7 5,0 6,0 4,0 2,0 10,0 62,3

1 Die Mineralstoff- und Vitaminergänzungen entsprachen den Empfehlungen des Arbeitskreises für Proteinbewertung der Gesellschaft für Ernährungsphysiologie der Haustiere [5].

Nach Beendigung einer jeden Vorfütterungsperiode wurden die Tiere durch Nackenschlag betäubt, entblutet und die gesamte Leber entfernt. Nach dem Abspülen mit M/15-Phosphatpuffer (nach S Ö R E N S E N ) vom £>H 8, Abtupfen und Wägen homogenisierten wir die Leber im Verhältnis 1:10 in Phosphatpuffer, der 10~3 M MTU enthielt, für 30 sec mit einem Ultra-Turrax (Fa. Jahnke und Kunkel KG). Die Eiweißbestimmung in dem so hergestellten Homogenat erfolgte nach K J E L D A H L . Zu 0,5 ml Homogenat (ca. 10 mg Eiweiß) gaben wir 30 bzw. 46 jxg radioaktives Rose bengale3 (etwa 6 —8(iCi). Alle Ansätze, die in der Auswertung miteinander verglichen werden sollten, erhielten stets die gleiche Rose bengale-Menge hinzugefügt. Nach Zusatz von 1 Tropfen Toluol und guter Durchmischung wurden die Gläser verschlossen und 18 Std. bei 37 °C inkubiert. Danach erfolgte Enteiweißung mit 1 Tropfen 2 n NaOH und für etwa 55 min absteigende Chromatographie auf SchleicherSchüll-Papier 2040a in destilliertem Wasser. Auf jeden Chromatogrammstreifen trugen wir 0,02 ml = 6 ng K J als Träger auf und daran anschließend 0,02 ml der inkubierten Probe auf den noch möglichst feuchten Fleck. Das Rose bengale bleibt nahezu an der Auftragstelle liegen, während der abgespaltene Jodidanteil vom absteigenden Wasser ausgewaschen wird. Der Ry-Wert für das Jodid lag bei einer durchschnittlichen Laufstrecke von 19 cm bei 0,62. Die Auswertung der Streifen erfolgte durch schrittweises Ausmessen der Aktivität mit dem G E I G E R - M Ü L L E R Zählrohr. Zu diesem Zweck wurde die gesamte Laufstrecke in 1 cm-Fraktionen unterteilt und diese durch Weiterschieben einer Bleiplatte mit 1 cm breitem Spalt und einer entsprechenden Aussparung für das Zählrohr ausgemessen. Um Verwischungen der Aktivität auf dem Streifen durch das Gewicht der Bleiplatte zu vermeiden, befand sich der Chromatogrammstreifen in einer zellophanartigen Hülle. Die Identität der jeweiligen Fraktionen wurde außerdem durch autoradiographische Befunde gesichert. 1 Hersteller des T 3 - und T 4 -Präparates: V E B Berlin-Chemie; Thyreoidin 0,1 enthält Thyreoidea sicca biologisch standardisiert 0,1 je Dragee. 2 Hersteller des MTU-Präparates V E B Philopharm. 3 Hersteller: Institut für Angewandte Isotopenforschung, Berlin-Buch.

In vitro-Dejodierung von

13l

J-Rose bengale

453

Der prozentuale Anteil des 1 3 1 J-Jodid, das pro mg Eiweiß während der Inkubationszeit gebildet wird (bezeichnet als D e j o d i e r u n g s i n d e x [DJ]), wird als Ergebnis der dejodierenden Aktivität des Gewebes angesehen und errechnet sich in folgender Weise

[6]:

P j _ % des

131

J-Jodid (im inkubierten Homogenat — im gewebefreien Medium) pro mg Eiweiß

Der Anteil des gebildeten 1 3 1 J-Jodid im inkubierten Leerwert (% J ' Leerwert) stieg mit dem Altern der 1 3 1 J-markierten Rose bengale-Lösung von 8 auf 13% an. Von jeder Probe wurden Doppelbestimmungen angesetzt. Da jeder Ansatz die gleiche Menge an Leberhomogenat und damit an Frischleber enthielt, geben wir zusätzlich auch die D e j o d i e r u n g s r a t e nach Abzug des Leerwertes an (% ] ' — % ] ' Leerwert). Alle Fehlerangaben sind die mittleren Fehler der Mittelwerte nach

i £ ( x _ x\2

mx ' = + ] / . Die Signifikanzprüfungen erfolgten mit dem t-Test. |/ n (n — 1) Ergebnisse und Diskussion

Grundsätzlich konnte nachgewiesen werden, daß Leberhomogenat von Ratten 131 J-markiertes Rose bengale dejodieren kann. Bei normaler Ernährung (Diät 1) werden unter den angegebenen Versuchsbedingungen etwa 6 0 % des 1 3 1 J (über den Leerwert hinaus) als freies Jodid abgespalten. Die Ergebnisse des Einflusses der eiweißfreien Ernährung bzw. der Gelatinediät auf die Dejodierung sind in Tabelle 2 verzeichnet. Betrachtet man die Dejodierungsrate (bei gleicher Homogenatmenge (siehe Methodik)), so ist bei allen parallel geprüften Gruppen — unabhängig von der Körpermasse und der Vorfütterungsdauer — bei schlechter Eiweißernährung stets eine signifikant geringere Dejodierung zu beobachten (Gruppe 1 : 2 = P < 0,001, Gruppe 3 :4 = P < 0,01, Gruppe 5:6 = P < 0,001). Die Ergebnisse stimmen mit den Untersuchungen in vivo [1], [2] sehr gut überein. Diese Übereinstimmung würde noch weiter erhärtet werden, wenn man in den Gruppen 2 und 6 die Dejodierungskapazität der Leber je 100 g Ratte berechnet, da in diesen Gruppen der Leberanteil je 100 g Körpermasse niedriger liegt als in den parallel geführten Kontrollgruppen. Bezieht man dagegen die Dejodierung nicht auf die Homogenatmenge, sondern auf den eingesetzten Eiweißanteil des Homogenats, wie im Dejodierungsindex geschehen, so sind bei den älteren Tieren (Gruppen 1—4) keine Unterschiede vorhanden. Dagegen ist bei den jüngeren Tieren (Gruppen 5 und 6) auch der Dejodierungsindex bei Gruppe 6 signifikant (P < 0 , 0 0 1 ) niedriger als bei Gruppe 5. In Tabelle 3 sind die Ergebnisse des Einflusses einer Stoffwechselstimulierung mittels Trijodthyronin und Thyreoidin auf die Dejodierung wiedergegeben. In Gruppe 7 ergab die Zulage von 5 mg Trijodthyronin zu 100 g Diät keine signifikante Veränderung der Dejodierungsrate. Da die Versuchstiere in Gruppe 7 ein sehr gutes Wachstum bei dieser T 3 -Zulage zeigten, wurde in Gruppe 8 die T 3 -Dosierung stark erhöht. Die Dosierung von 100 mg 3t*

Chr. Voss,

4 5 4

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A c t a biol. m e d . g e r m a n . B a n d 18, S e i t e 465 —480 (1967) Aus d e m I n s t i t u t f ü r Pharmakologie u n d Toxikologie der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald (Direktor: Prof. Dr. W . SCHELER)

In vitro-Untersuchungen zur metabolischen Rückbildung von Metverdoglobin zu Hämoglobin in Kaninchenerythrozyten R. BEYER und W .

SCHELER

( E i n g e g a n g e n a m 23. 1 1 . 1966)

Zusammenfassung B e i I n k u b a t i o n M e t V b - h a l t i g e r K a n i n c h e n e r y t h r o z y t e n in CO- b z w . ( ^ - A t m o s p h ä r e b e i 3 7 °C w e r d e n E l e k t r o n e n z u r R ü c k b i l d u n g d e s M e t V b zu H b s o w o h l a u s d e m S t o f f w e c h s e l d e r „ g r ü n e n " Zelle, a l s a u c h v o n e i n e m Teil d e s g r ü n e n B l u t farbstoffes selbst geliefert, der dabei weiter aufoxydiert u n d denaturiert. Die S p o n t a n r ü c k b i l d u n g i n d e n „ g r ü n e n " Zellen w i r d d u r c h Z u g a b e v o n S u b s t r a t (100 m M G l u k o s e , G l u k o s e u n d 0,1 m M M e t h y l e n b l a u , 10 m M L a k t a t ) b e schleunigt, wobei L a k t a t m i t 154% die R ü c k b i l d u n g a m effektivsten aktiviert. D i e L D H ist d u r c h h o h e P y r u v a t k o n z e n t r a t i o n (100 mM) h e m m b a r . D e r i n t r a z e l l u l ä r e Q L / P b e t r ä g t 0,38 u n d s t e i g t b e i e x o g e n e r Z u f u h r v o n L a k t a t u n t e r CO auf 1,35- D e r L a k t a t / C O - Q u o t i e n t liegt b e i e t w a 0,91. D i e sich d a r a u s f ü r die R ü c k b i l d u n g des M e t V b ergebenden Konsequenzen werden diskutiert. D e r G l u k o s e u m s a t z in d e n M e t V b - h a l t i g e n K a n i n c h e n e r y t h r o z y t e n e r r e i c h t n u r 1 / i dessen MetHb-haltiger. D i e A k t i v i t ä t e n v o n H e x o k i n a s e , G - 6 - P D H u n d L D H , e b e n s o die z e l l u l ä r e n K o n z e n t r a t i o n e n v o n G S H u n d A T P s i n d in M e t V b - h a l t i g e n E r y t h r o z y t e n e r n i e d r i g t u n d fallen während der I n k u b a t i o n noch weiter ab. D e r K + - G e h a l t d e r „ g r ü n e n " Zellen b e t r ä g t 75,5 m V a l K+/1 Zellen, i h r N a + - G e h a l t 50 m V a l Na+/1 Zellen. E i n stromafreies H ä m o l y s a t wurde unter Anwesenheit von Glukose und Methylenb l a u b e i pH 7,3 u n d 37 °C m i t s t o f f w e c h s e l a k t i v e n , n o r m a l e n K a n i n c h e n e r y t h r o z y t e n i n k u b i e r t . S c h o n n a c h 120 m i n I n k u b a t i o n w i r d s p e k t r o p h o t o m e t r i s c h n u r reines H b 0 2 nachgewiesen.

Grüne Umwandlungsprodukte des roten Blutfarbstoffes sind lange bekannt und wiederholt studiert worden. Zusammenfassende Berichte liegen von H E U B N E R [ 1 2 ] , J U N G [ 1 5 ] , K I E S E u n d SEIPELT [ 1 9 ] u n d v o n LEMBERG [ 2 2 ] v o r . Abkürzungen: A T P = Adenosin-triphosphat; BTS = Brenztraubensäure; G-6-PDH = Glukose-6-phosphat-Dehydrogenase; GSH = Glutathion, reduziert; H b = Hämoglobin; HbCO = Kohlenmonoxidhämoglobin; H b 0 2 = Oxyhämoglobin; M = m o l a r , Mol/1; m M = m i l l i m o l a r ; |iM = m i k r o m o l a r ; M e t H b = M e t h ä m o g l o b i n ; M e t V b = M e t v e r d o g l o b i n ; M S = M i l c h s ä u r e ; Mol = Mole. B e i H b , "Vb u n d i h r e n D e r i v a t e n s i n d d i e A n g a b e n auf F e b e z o g e n ( M o l e k u l a r g e w i c h t e i n e r e i n z e l n e n F e e n t h a l t e n d e n E i n h e i t : 17000); V b = V e r d o g l o b i n ; V b C O = K o h l e n m o n o x i d v e r d o globin

466

R. BEYER, W.

SCHELER

In ihrem pathophysiologischen Status gelten die Verdoglobine als so stark oxydativ geschädigte Blutf arbstoff derivate, daß sie nicht mehr zu Hämoglobin revertiert werden, sondern dem weiteren Abbau anheimfallen. Von dieser Sicht aus müssen toxische Verdoglobinämien in der Klinik weitaus ernster beurteilt werden als Methämoglobinämien, da bei letzteren die Rückbildung des Methämoglobins zu Hämoglobin durch den normalen Stoffwechsel der Erythrozyten und besonders bei Verabreichung von Methylenblau schnell und umfassend erfolgt. Wir bekamen einige Zweifel an der Irreversibilität der Verdoglobin-Bildung, nachdem wir beim MetverdoglobinNOz im physikochemischen und komplexchemischen Verhalten keine wesentlichen Differenzen zum Methämoglobin fanden [29] und ferner auch bekannt ist, daß man Verdoglobine mit Reduktionsmitteln — zumindest partiell — zu Hämoglobin reduzieren kann, das seinerseits wieder oxygenierungsfähig ist [22], Wir prüften deshalb unter verschiedenen Versuchsbedingungen und in diversen Anordnungen die Voraussetzungen und Modalitäten der metabolischen Reversion von Verdoglobin. Wir beschränkten uns dabei zunächst auf das durch gekoppelte Oxydation mittels Nitrit und H 2 0 2 hergestellte MetverdoglobinNOs, das durch die Wahl geeigneter Versuchsparameter leicht intraerythrozytär erzeugt werden kann [29]. Zwar erstrecken sich die oxydativen Veränderungen derartiger „grüner" Zellen nicht ausschließlich auf den Blutfarbstoff sondern auch auf Membranstrukturen und Fermentsysteme, doch hat man in ihnen ein geeignetes Modell der verdoglobinhaltigen Blutzellen zur Hand, wie sie bei bestimmten Vergiftungen ähnlich zu erwarten sind Material und Methodik Kaninchenblut wurde leicht narkotisierten Tieren durch Herzpunktion entnommen, mittels 3,8%iger Natriumzitratlösung ungerinnbar gemacht, abzentrifugiert und von Serum- und Leukozytenschicht befreit. Die Präparation MetVb-haltiger Erythrozyten erfolgte dann weiter wie in einer früheren Mitteilung [29] angegeben. Im allgemeinen wurde jeweils eine 30%ige Erythrozytensuspension in NaCl-Phosphat-Puffer-Lösung von pH = 7 , 3 mit und ohne Substrat in verschiedenen Gasatmosphären bei 37 °C im Warburg untersucht. In jedem Falle diente das Zellvolumen (Hämatokrit) als Bezugsgröße. Methämoglobinhaltige Erythrozyten für Vergleichsuntersuchungen wurden auf die übliche Weise hergestellt [27]. Bestimmungsmethoden: Brenztraubensäure bestimmten wir nach F R I E D E M A N N und Milchsäure im optischen Test nach G E R C K E N [ 8 ] . Für Glukose benutzten wir die handelsübliche Testkombination vom V E B Arzneimittelwerk Dresden. Zur ATP-Bestimmung wurde das Testbesteck der Fa. G. F. Boehringer & Söhne GmbH verwendet. Die G-6-PDH wurde modifiziert mit dem in ,,Methoden der enzymatischen Analyse" [23] beschriebenen Verfahren erfaßt. Die Messung der Hexokinaseaktivität erfolgte nach der von H I N T E R B E R G E R et al modifizierten Methode [13]. Die L D H wurde nach K O R N B E R G [20] bestimmt. Der Eisengehalt wurde nach H E I L M E Y E R und P L Ö T N E R [11] unter Einbeziehung einiger von K A T H E N [17] vorgeschlagener und eigener Veränderungen bestimmt. Die Aufnahme der Absorptionsspektren und die Konzentrationsbestimmungen des Hb, MetHb bzw. MetVb und derer Derivate und alle kolorimetrischen Messungen wurden am Spektralphotometer der Fa. V E B Carl Zeiß Jena, teilweise auch am registrierenden Spektralphotometer Modell Sp-700 der Fa Unicam, Cambridge, England, aufgenommen. H A U G E N [7],

In vitro-Rückbildung von Metverdoglobin

467

Ergebnisse

l. Manometrische prozesses

und spektralphotometrische

Bestimmung des

Rückbildungs-

Der reife Erythrozyt verfügt lediglich über einen schwachen glykolytischen Stoffwechsel, während die Atmung zu vernachlässigen ist. Deshalb konnten die manometrische Technik und CO bzw. 0 2 als Indikatoren für die Rückbildung des MetVb in Vb sowie Hb eingesetzt werden. Wir gingen dabei von der Beobachtung aus, daß Vb zwar CO aber nicht 0 2 , Hb beide Gase binden kann. Wir hofften, aus dem differentiellen Verhalten der 0 2 - und CO-Aufnahme bei der Rückbildung quantitative Rückschlüsse auf die jeweilige Vb/Hb-Relation im Ansatz ziehen zu können. Tatsächlich haben wir 0 2 als Gasphase im weiteren Verlauf der Rückbildungsversuche verlassen, da wir beobachten mußten, daß er weit stärker zur Reoxydation von rückgebildetem Vb zu MetVb und von Hb zu MetHb verbraucht wird als zur Oxygenierung des revertierten Hb. a) S p o n t a n r ü c k b i l d u n g Um individuelle Stoffwechselunterschiede auszuschalten und äquivalente Präparationsbedingungen zu schaffen, wurden MetHb-haltige als auch MetVb-haltige Erythrozyten aus dem Blut eines Tieres hergestellt. Dabei betrug der Gasverbrauch in [/.l • ml - 1 Zellen • Std. - 1 bei der „spontanen" Rückbildung MetHb-haltiger Kaninchenerythrozyten in 0 2 - bzw. COAtmosphäre 58 + 2,28, bei der MetHb-haltiger lagen die Werte wie folgt: 0 2 59 + 1,0, CO 57 + 2,64. Sie ist also für „braune" und „grüne" Zellen praktisch gleich. Da die metabolische Leistungsfähigkeit der MetHb-Zelle größer ist als die der MetVb-haltigen (vgl. unten), wird der Prozeß offensichtlich vom endogenen Substrat her limitiert. Allerdings erhält man bei Präparation nur einer toxisch veränderten Zellsuspension, die wesentlich rascher erfolgt, etwas höhere Werte für den Gasverbrauch substratfreier Zellen (vgl. unten). Werden nach 3-stündiger Spontanrückbildung die Zellsuspensionen osmotisch hämolysiert und durch scharfe Zentrifugation geklärt und die Lichtabsorption des Überstandes aufgenommen, lassen sich — je nach Gasatmosphäre — die HbCO- bzw. Hb0 2 -Banden neben einer starken Restabsorption im Roten (restliches MetVb, Vb, VbCO, MetHb) erkennen (Abb. 1). Eine vollständige Rückverwandlung in Hb läßt sich auch bei weiterer Verlängerung der Inkubation nicht erreichen. In Gegenwart von CO ist das Ausmaß der Hb-Bildung (HbCO) größer als in Gegenwart von 0 2 (Hb0 2 ). Daraus folgt, daß ein Teil des 0 2 zu Reoxydationszwecken dient. Bei Vergleichsversuchen mit MetHb wird unter CO eine nahezu vollständige Rückbildung in HbCO, unter 0 2 nur eine partielle in Hb0 2 erreicht. Auch hierbei dient ein Teil des verbrauchten 0 2 zu Oxydationsprozessen. 32

Acta biol. med. german., B d . 18, Heft 4

468

R. BEYER, W .

SCHELER

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Abb. 1. Absorptionsspektren von inkubierten MetHb- und MetVb-haltigen Kaninchenerythrozyten. 1 u. 1': MetHb-haltige Kaninchenerythrozyten 180 min ohne Substrat in O a -Atmosphäre inkubiert; 2: wie 1 u. 1', nur in CO-Atmosphäre inkubiert; 3: MetVb-haltige Kaninchenerythrozyten, sonst wie 1; 4: wie 3, nur in CO-Atmosphäre. Eingesetzte [MetHb] = 51 (xM; eingesetzte [MetVb] = 53 (¿M; pH = 5,8

Unter den Bedingungen der Spontanrückbildung denaturiert ein Teil des intraerythrozytären MetVb. Wenn nämlich zu verschiedenen Zeiten des Rückbildungsvorganges Proben entnommen, hämolysiert und scharf abzentrifugiert werden, sinkt der Eisen-Gehalt im Überstand ab (Tab. 1): Glykolyseinhibitoren wie N a F (10 mM) oder CH 2 J • COOH (50 mM) lassen die Spontanrückbilding des MetVb weitgehend unbeeinflußt. So sinkt die Tabelle 1 Veränderung des Fe-Gehaltes ((iMol/ml Zellen) in MetHb- und MetVb-haltigen Kaninchenerythrozyten-Hämolysaten zu verschiedenen Zeitpunkten der Spontanrückbildung unter CO Inkubationsdauer [Std.] 0 1 2

3

Fe-Gehalt im Hämolysat MetHb-Zellen

MetVb-Zellen

4,98 4,93 4,90 4,82

4,12 3,45 3,01 2,78

In vitro-Rückbildung von Metverdoglobin

469

CO-Aufnähme bei Anwesenheit von NaF auf 85%, von Monojodessigsäure auf 87% des Normalwertes. Offensichtlich ist bei fehlendem exogenen Substrat die Rückbildung nur in geringem Umfang ein metabolischer, weit stärker ein chemischer Prozeß, bei dem wahrscheinlich ein Teil des MetVb selbst Elektronendonor für andere MetVb-Moleküle ist und dabei weiter auf oxydiert (denaturiert). Tabelle 2 Vergleich der Rückbildungsgeschwindigkeiten MetVb-haltiger Kaninchenerythrozyten unter CO bei Anwesenheit verschiedener Substrate Substrate ohne Glukose

Konz. [mM]

0,1 1 10 100 1000 Glukose + Methylenblau 100 + 0,1 Laktat 10 Plasma Plasma -f- L a k t a t 10

Rückbildung Beschleunigung [nl CO • ml" 1 Zellen • Std." 1 ] [%] 70 70 70 85,6 104 94,5 118 178 179 181

22 48 35 68 154 171 172

b) E i n f l u ß von S u b s t r a t e n auf die MetVb-Rückb.ildung Substrate vermögen die MetVb-Rückbildung in unterschiedlichem Maße zu steigern (vgl. Tab. 2). Auffallend ist die nur relativ geringe Beschleunigung durch Glukose (maximal 48%), die auch durch Zusatz von Methylenblau nicht wesentlich gesteigert werden kann. Andere Zucker (Fruktose, Ribose) waren noch weniger aktiv als Glukose. Laktat ist für die MetVb-Rückbildung das effektivste Substrat. Werden die „grünen" Zellen statt in der gepufferten Salzlösung in Kaninchenplasma resuspendiert, ist die Rückbildung erheblich stärker, wahrscheinlich durch den Laktatgehalt im Plasma, denn zusätzliches

Abb. 2. Aktivität der verschiedenen Rückbildungssysteme in MetHb- (nach M A T T H I E S [ 2 5 ] ) und MetVb-haltigen Kaninchenerythrozyten. Glukose wird den ,,grünen" Zellen in lOfach höherer Konzentration angeboten. • ohne Substrat; JZZZJ Glukose (10 mM bzw. 100 mM); § L a k t a t (10 mM); • Glukose (10 mM bzw. 100 mM) + Methylenblau (0,1 mM) 32*

470

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SCHELER

Laktat steigert die Rückbildung nicht weiter. Erst wenn Laktat nach einer längeren Vorinkubationsperiode in Plasma der Zellsuspension zugesetzt wird, ist wieder eine deutliche Zunahme der Rückbildung zu erzielen. — Im übrigen vermag auch Adrenalin (7,7 mM) die spontane Rückbildung um etwa 50% zu beschleunigen. In Abbildung 2 wurden die Rückbildungsgeschwindigkeiten von MetHbhaltigen Kaninchenerythrozyten im Vergleich zu den „grünen" Zellen gegenübergestellt. Bei jenen ist die Glukose-Methylenblau-Kombination noch wirksamer als Laktat. Pyruvat (0,1 M) hemmt die Laktat-stimulierte MetVb-Rückbildung (Tab. 3). Tabelle 3 MetVb-Rückbildung in Kaninchenerythrozyten unter L a k t a t (10 mM) und P y r u v a t (100 mM) Inkubationsdauer [Std.]

CO-Aufmihme in [¡xl/rrtl] Zellen spontan

Laktat

Laktat + Pyruvat

67 96

154 248

60 101

1 2

2. Zum Stoffwechsel MetVb-haltiger

Kaninchenerythrozyten

Der intrazelluläre Laktat-Pyruvat-Quotient (Q LJP) ist für normale Kaninchenerythrozyten mit 4,5—21,8 [9], [18], [21] angeführt. Bei toxisch geschädigten Zellen ändern sich die zellulären Konzentrationen dieser Metaboliten. Der intrazelluläre Q L / P wird in jedem Falle < 1 . In MetVbhaltigen Kaninchenerythrozyten fanden wir 0,49 [¿Mol Pyruvat und 0,19 [J-Mol Laktat /ml Zellen. Wird Kaninchenerythrozyten exogenes Laktat als Substrat angeboten, geht die MetVb-Reduktion mit einem intensiven Laktatverbrauch und einem entsprechenden Pyruvatanstieg einher (Tab. 4). Der Q L/P, der in der „grünen" Zelle ohne exogenes Substrat 0,38 beträgt, steigt dabei auf etwa 1,35. Der Laktat/CO-Quotient (Q LjCO) beträgt ca. 0,91. Tabelle 4 Bilanz des Laktatverbrauches (L) und der Pyruvatbildung (P) in (xMol/ml Zellen von MetVb-haltigen Erythrozyten. Substrat: 10 mM L a k t a t ; Gasatmosphäre: CO Inkubationszeit [min]

L

P

L ~P

COVerbrauch

CO

60 120 180

6,37 7,6 9,0

4,69 5,79 6,67

1,36 1,31 1,35

6,24 8,81 10,50

1,02 0,86 0,86

L

In vitro-Rückbildung von Metverdoglobin

471

Der Glukosemetabolismus MetVb-haltiger Kaninchenerythrozyten ist auf 1 / 4 dessen MetHb-haltiger Zellen reduziert, wenn Glukose als Substrat zur Beschleunigung der Rückbildung eingesetzt wird. Bei den Nitritzellen erscheinen etwa 80% der metabolisierten Glukose in den untersuchten C3Verbindungen (MS und BTS). Die restlichen 20% der C 3 -Verbindungen sind sicherlich in den nicht bestimmten Metaboliten zu suchen. Bei den MetVb-Zellpräparationen findet sich die gesamte metabolisierte Glukose in den untersuchten C 3 -Verbindungen wieder (Tab. 5). Tabelle 5 Bilanz des Glukoseverbrauches und der C 3 -Nettobildung (MS, BTS) in (¿Atom C • ml" 1 Zellen von MetHb- und MetVb-haltigen Kaninchenerythrozyten; Substrat: Glukose 10 mM; Gasatmosphäre CO Zeilsuspensionen MetHb-ha.ltige Zellen MecVb-haltige Zellen

Inkubationszeit [min]

Glukoseverbrauch

60 120 180 60 120 180

15,0 27,0 36,0 3,6 5,4 9,6

Triosebildung

[>A C/ml] Zellen 13,3 21,0 25,8 3,7 6,5 9,1

wiedergefunden in

[%]

88,0 78,0 71,7 104 121 95

Beim Vergleich des GSH-Gehaltes1 in Hb0 2 -, MetHb- und MetVb-haltigen Kaninchenzellen erhielten wir für die normalen, unbehandelten Erythrozyten 1150 + 50 [ig GSH/ml Zellsuspension, für die Nitritzellen 503 ± 58,4, für die „grünen" Zellen 348 (ig + 31,7 GSH/ml. Im Verlauf der Rückbildung des grünen Blutfarbstoffes bleibt dieser GSH-Spiegel in den „grünen" Zellen erhalten. Werden Glukose und Methylenblau zugefügt, kommt es in den ersten 60 Inkubationsminuten vorübergehend zu einem GSH-Anstieg auf 600 [ig/ml Zellsuspension. Der für intakte Erythrozyten charakteristische GSH-Spiegel wird dabei nicht erreicht (Abb. }). Tabelle 6 Vergleich der Aktivitäten von Hexokinase (mM verbrauchter Glukose • l" 1 Zellen • Std.- 1 ), L D H (RACKER-Einheiten • ml" 1 Zellen) und G-6-PDH (WROBLEWSKI-Einheiten • m l - 1 Zellsuspension) in Hb0 2 -, MetHb- und MetVb-haltigen Kaninchenerythrozyten Enzym Hexokinase LDH G-6-PDH 1

Hb02

MetHb

MetVb

14,9 ± 2,2 13,3 ± 0,2 112,6 i : 3,2

9,2 ± 1,9 11,7 4 - 0 , 4 103,2 ± 6,3

3,8 ± 1 , 1 7,99 ± 1,3 19,9 ± 1,0

Herrn Doz. Dr. med. habil. A. G R I S K und Frau U. B E H R E N D möchten wir für die Durchführung der GSH-Bestimmungen herzlich danken.

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Abb. 3. GSH-Gehalt (A), G - 6 - P D H - A k t i v i t ä t (B) u n d A T P - G e h a l t (C) von MetVb-haltigen Kaninchene r y t h r o z y t e n w ä h r e n d der R ü c k b i l d u n g bei 37 °C. Abszisse: I n k u b a t i o n s d a u e r in Std.; Ordinate in A: GSH in (xg/ml Zellsuspension, in B :

G-6-PDHinWROBLEWsKi-Einheiten/ml Zellsuspension, i n C : A T P in ^Mol/ml Zellen. • = substratfreie Kontrolle; O = Glukose (100 mM); A = L a k t a t (10 mM)

Sfd.— Die Hexokinasereaktion untersuchten wir bei einem pH von 7,2. In „braunen" Zellen sinkt die Aktivität dieses Enzyms auf 62%, in „grünen" auf 26% der normalen Zellen (Tab. 6). Die Aktivität der LDH bleibt relativ unbeeinflußt (Tab. 6). Sie beträgt bei MetVb-haltigen Erythrozyten 60% der normaler und 68% der MetHb-haltiger. Damit korreliert auch die laktatbeschleunigte Rückbildung, die in MetVbhaltigen Zellen 62% der MetHb-haltiger beträgt. Die G-6-PDH-A ktivität in der MetVb-führenden Zellsuspension ist im Verhältnis zu den MetHbführenden auf etwa 1 / 5 reduziert. Sie beträgt 19,9 WROBLEWSKI-Einheiten/ml Zellsuspension (Tab. 6). Uns schien die Annahme berechtigt, daß die SH-Enzyme irreversibel inaktiviert sind. Deshalb überprüften wir am Beispiel der G-6-PDH das Verhalten der SH-Enzyme während der Rückbildung. Im Verlauf der Inkubation der MetVb-haltigen Zellen sinkt der G-6-PDH-Gehalt weiter ab (Abb. 3). Nach 180 min enthalten die Zellen noch etwa 45 % G-6-PDH des Ausgangsniveaus. Der ATP-Spiegel substratfreier MetVb-haltiger Erythrozyten verringert sich bei einem tl/2 = 222 min relativ langsam. Wesentlich rascher wird ATP abgebaut, wenn substratfreien „grünen" Zellen Laktat zugesetzt wird (i1/2 = 184 min). Bei Gabe von Glukose bleibt der ATP-Gehalt nahezu erhalten (Abb. 3). 3. Kationentransport metverdoglobinhaltiger Kaninchenerythrozyten Die Beziehungen des aktiven Kationentransportes zu den Stoffwechselprozessen sind von den verschiedensten Seiten untersucht worden. HARRIS

In v i t r o - R ü c k b i l d u n g von Metverdoglobin

473

[10], und MAIZELS [24] zeigten, daß die Glykolyse die Energie für die Aufrechterhaltung des Kationengradienten bei kernlosen Erythrozyten bereitstellt. Werden im Erythrozyten Schädigungen gesetzt, die zu ihrer Reparation den Stoffwechsel der Zelle ebenfalls in Anspruch nehmen, so kann das Ionengefälle zwischen innen u n d außen gestört sein, was sich in Veränderungen des Ionenbestandes der Zelle äußert. F ü r die MetHb-haltige Zelle wurden diese Zusammenhänge insbesondere von MATTHIES [26] untersucht. Wir prüften aus diesen Überlegungen heraus den Kationentransport MetVbhaltiger Erythrozyten. Die Darstellung des grünen Blutfarbstoffes in den Zellen erfolgt in einem osmotisch ungünstigen Milieu, bei einem p H von 6,0. Nach der Präparation besitzen die MetVb-haltigen Zellen einen />HWert von 6,7—6,9- Dabei erfolgte ein gewisser Angleich des intrazellulären Kationenbestandes. Ihr Kaliumgehalt beträgt 75,5 mVal K+/1 Zellen, der Natriumgehalt entsprechend 50 mVal Na+/1 Zellen. Bei Inkubation dieser Zellen in einem nur Na-Ionen enthaltenden Milieu setzt sofort eine schnelle Na+-Aufnahme u n d ein rapider K+-Verlust ein (Abb. 4). Auch durch Glukose als Substrat ist letztlich der Zusammenbruch des Kationenstatus nicht mehr aufzuhalten. Mit andauernder Inkubation tritt zunehmend Hämolyse der „grünen" Zellen auf.

A b b . 4. K a t i o n e n t r a n s p o r t in MetVb-haltigen Kaninchenerythrozyten. O r d i n a t e : Ä n d e r u n g des N a + - bzw. K+-Gehaltes der Zellen gegenüber dem Ausgangsw e r t in mVal/1 Zellen. Abszisse: Zeit in Std. • = ohne S u b s t r a t ; A = L a k t a t ; O = Glukose

4. Die Metverdoglobinrückbildung im extraerythrozytären System In Modellversuchen konnte gezeigt werden, daß intakte Erythrozyten Stoffe, die für die Erythrozytenmembran nicht permeabel sind, im Suspensionsmedium reduzieren. STOPP [31] untersuchte die Reduktion von Kaliumferrizyanid im Außenmilieu, BANASCHAK die des oxydierten Glutathions (zit. nach FAULHABER und SPINNER [6]).

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Wir benutzten dieses System um festzustellen, ob MetVb durch stoffwechselaktive normale Erythrozyten, obwohl es auf Grund seines Molekulargewichtes nicht in die Zellen einzudringen vermag, reduziert werden kann. Damit sollte eine weitere Aussage zur Reversibilität des MetVb möglich werden. Die Untersuchungen der extraerythrozytären MetVb-Reduktion wurden bei Zimmertemperatur bzw. bei 37 °C bei einem />H von 7,3 vorgenommen. Zu 1 ml stromafreiem MetVb-Hämolysat, dessen Konzentration auf 0,75—2,0 mM eingestellt war, wurden 2 ml gewaschene rote Kaninchenzellen, 0,4 ml Glukose (0,1 M), 0,4 ml Methylenblau (10 [AM) und 0,2 ml isotonischer Phosphat-Puffer zugesetzt. Sofort nach Vermischen sowie zu den gewünschten Zeitpunkten wurden jeweils die Erythrozyten durch 400

\[nm]-~500

600

Abb. 5. Absorptionsspektren vom MetVb-Hämolysat im extraerythrozytären System. 1: MetVb-Hämolysat (Max: 404, 606 nm); 2: wie 1, nach 5 min aerober Inkubation mit intakten Kaninchenerythrozyten (Max: 407, 541, 578 nm); 3: wie 2, nur nach 120 min aerober Inkubation bei 37 °C (Max: 415, 541, 575 nm). [MetVb] = 0,8 mM; pH = 7,3

In vitro-Rückbildung von Metverdoglobin

475

Zentrifugation sedimentiert und der Überstand spektralphotometrisch analysiert. Auf diese Weise wurde der Rückbildungsprozeß zeitabhängig verfolgt (0, 5, 60, 120 und 180 min). Die Inkubation erfolgte unter Luftatmosphäre, der Rückbildungsprozeß führt demnach vom MetVb zum Hb0 2 . Eine Hämolyse der roten Zellen wurde durch Hb-Bestimmung im Sediment vor und nach dem Versuch ausgeschlossen. Bereits 5 min nach dem Zusammenmischen von normalen Erythrozyten und MetVb-Medium sind Veränderungen der MetVb-Absorption in Richtung auf H b 0 2 zu erkennen. Nach 120 min Inkubation wird reines HbO a im Außenmedium gefunden (Abb. 5)- Die für die Reduktion von MetVb notwendigen Elektronen können demnach über die Zellmembran intakter Erythrozyten an das Milieu abgegeben werden. Nach B A N A S C H A K und S C H Ä F E R [ 3 ] üben Erythrozyten eine direkte Reduktionswirkung über ihre Zellmembran nach außen aus. Sie ist nicht an ein diffusibles Stoffwechselprodukt gebunden. Andererseits wirkt in Gegenwart von Methylenblau selbiges als Elektronenüberträger auf MetHb-führende Zellen und Hämolysat im Außenmilieu und damit als Aktivator der extraerythrozytären MetHb-Reduktion. Allerdings wird in unserer Versuchsanordnung auch ein kleiner Anteil des MetVb denaturiert. Wir bestimmten den Eisengehalt des MetVb-Mediums vor dem Vermischen mit den roten Zellen und nach 180 Inkubationsminuten. Er sinkt dabei in 1 ml Hämolysat von 1,7 [^Mol auf \ ,49 [¿Mol (12%). Diskussion

1. Wenngleich sich die „grünen" Zellen, wie sie in unserem Schädigungsmodell entstehen, sicherlich von den verdoglobin-haltigen Erythrozyten klinischer Verdoglobinämien durch eine stärkere Alteration ihrer Strukturelemente, besonders der Membranen und des Enzymbestandes, unterscheiden dürften, lassen sich mit ihnen eine Reihe von pathophysiologischen und biochemischen Fragen studieren. So war aus früheren Befunden von L E M B E R G [22] schon bekannt, daß Verdoglobine in vitro grundsätzlich zu den entsprechenden Hämoglobinen reduziert werden können. Wir bestätigten diese Beobachtungen und konnten darüberhinaus zeigen, daß auch die metabolischen Reduktionskapazitäten Verdoglobin-haltiger Zellen eine mehr oder weniger weitgehende Rückbildung zu funktionsfähigem Blutfarbstoff ermöglichen, der sowohl 0 2 wie CO zu binden vermag. Indessen haben wir den Sauerstoff als Gasphase bei den manometrischen Versuchen und als Indikator für das Ausmaß der MetVb -*• Hb-Umwandlung bald verlassen, da er nicht nur zur Oxygenierung des gebildeten H b sondern auch zu Oxydationszwecken verbraucht wird. Das Ausmaß der HbBildung unter identischen Bedingungen war unter 0 2 stets deutlich kleiner als unter CO. In Vergleichsuntersuchungen der MetHb-Rückbildung war gleichfalls eine solche Differenz zwischen 0 2 - und CO-Atmosphäre vorhanden. Wir mußten aus diesen Gründen darauf verzichten, aus dem differen-

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SCHELER

tiellen Verhalten der 0 2 - und der CO-Aufnahme Rückschlüsse auf die Vb/HbRelation beim MetVb-Rückbildungsprozeß ziehen zu können (denn Vb bindet nur CO, nicht 0 2 , Hb dagegen beide Liganden). Der Rückbildungsprozeß des MetVb läuft über die Stufen Vb, MetHb zu H b : MetVb — —

>• Vb ———>- MetHb — — i VbCO

>- Hb 1 HbCO

Die MetVb -> Hb-Reduktion ist ein 3 Elektronen bewegender Vorgang [4]. Offensichtlich läuft er in 1 -Elektron-Schritten ab, denn in den Rückbildungsansätzen lassen sich beide Intermediärprodukte Vb und MetHb nachweisen. Zwar ist es schwierig, die Lichtabsorption des Hämolysats eines solcher» Ansatzes zu differenzieren, denn immerhin enthält es 4 Komponenten: MetVb, VbCO, MetHb, HbCO. Vb und Hb können vernachlässigt werden, da sie bei der herrschenden CO-Spannung praktisch komplett in VbCO und HbCO übergehen. VbCO besitzt eine von Vb und MetVb verschiedene Lichtabsorption und kann gegenüber diesen abgegrenzt werden. Das MetHb läßt sich durch Differenzspektroskopie mit und ohne Liganden (F~, N7) in den Ansätzen nachweisen. Die obige Formulierung der Rückbildungsschritte enthält 2 Reduktionsund 1 Oxydationsschritt des Eisens: MetVb -> Vb; MetHb -> H b bzw. Vb -»• MetHb. Letzterer steuert 1 Elektron zur Reduktion des Verdoporphyrinsystems bei. Die quantitativen Verhältnisse bei der MetVb-Rückbildung mit Laktat als Substrat stimmen mit den aus Redoxmessungen gewonnenen Relationen recht gut überein. Bei der Dehydrierung der MS zu BTS werden 2 Wasserstoffe frei. Da die Reduktion des MetVb zu Vb 1 Elektron, die des MetVb zu H b 3 Elektronen benötigt, sollten bei Verbrauch von 1 Mol Laktat 2 Mole Vb oder 0,67 Mole Hb gebildet werden können:

ch3-choh-cooh

ch 3 -co-cooh

3ch 3 -choh-cooh^^h 3 -co-cooh

NAD

NADH2

3 NAD

3NADH2

2 Hb

2 MetHb

2 Hb

2 MetVb

Bildet sich ausschließlich Vb, so sollte der Quotient Verbrauchtes Laktat/ gebundenes CO (Q L/CO) 0,5, bei ausschließlicher Entstehung von H b 1,5 betragen. Tatsächlich lag Q L/CO in unseren Versuchen im Mittel bei 0,91. Daraus läßt sich ein Vb/Hb-Mischungsverhältnis von rund 3:2 errechnen, was mit der Analyse der Lichtabsorptionskurven annähernd übereinstimmt. 2. Die Reduktionskapazität gewaschener, substratfreier „grüner" Zellen ist niedrig. Dies ist weniger eine Frage des Mangels an endogenem Substrat, sondern berührt vorzugsweise den Fermentstatus der Zelle. Selbst bei Angebot von Glukose bzw. Fruktose oder Ribose nimmt die Rückbildung

In vitro-Rückbildung von Metverdoglobin

477

in Geschwindigkeit und Ausmaß nur wenig zu. Nur ein Teil der angebotenen Glukose wird energetisch nutzbar gemacht, da besonders die Hexokinase und andere SH-Enzyme der Glykolyse geschädigt sind. Die Hexokinaseaktivität beträgt in MetHb-haltigen Zellen nur noch 41,6% der MetHbhaltiger Erythrozyten. Dafür spricht auch der Abfall des GSH-Gehaltes in den grünen Zellen auf 30,2% des Gehaltes normaler Erythrozyten und die Unfähigkeit, ihn im Verlauf der Inkubation wieder zu regenerieren, wie es die MetHb-haltigen Zellen noch können [2]. Auch der Hexosemonophosphat-Zyklus spielt in den „grünen" Zellen bei der Blutfarbstoff-Rückbildung nur eine geringe Rolle. Verantwortlich dürfte wiederum die Alteration der SH-Enzyme sein. So beträgt die Glukose6-phosphat-Dehydrogenase-Aktivität der MetVb-haltigen Zellen nur etwa 1 / 6 der normaler und 1 / 6 der MetHb-haltiger Erythrozyten. Damit stimmt auch überein, daß die Rückbildungsbeschleunigung in MetVb-Zellen durch Glukose -f Methylenblau nur rund 19% der MetHb-haltiger Zellen beträgt. Als günstigstes Substrat für die MetVb-Rückbildung in den Zellen erwies sich Laktat (10 mM). Es steigerte die spontane MetVb-Rückbildung, die 70 [i.1 CO/ml Zellen betrug, um 154% auf 178 [il. Vergleichsweise dazu liegt die Laktat-beschleunigte Reduktion MetHb-haltiger Zellen bei 286 [il CO/Std. • ml Zellen [25]. Damit ist Laktat für die MetVb-Rückbildung sogar noch ein etwas effektiveres Substrat als für die des MetHb; denn es muß berücksichtigt werden, daß zur Bildung von Hb aus MetHb nur 1, für die aus MetVb aber 3 Elektronen benötigt werden, und daß das Hb/Vb-Verhältnis im Rückbildungsansatz etwa a / 3 beträgt. Die Aktivität der LDH bleibt trotz massiver oxydativer Schädigung der „grünen" Zellen weitgehend erhalten. Es wurde gefunden, daß sich dieses Enzym als sehr stabil gegenüber der Einwirkung von Oxydantien (Phenylhydrazin, 0 2 u. a.) erweist [30]. 3. Der relativ niedrige Energiebedarf des Erythrozyten dient der Aufrechterhaltung der Zellstruktur für etwa 120 Tage, der Erhaltung des Hämoglobins in funktionsfähigem 2-wertigem Zustand und der Aufrechterhaltung der Konzentrationsgradienten zwischen Zellinnerem und Blutplasma. Eine Oxydation des Blutfarbstoffes zu MetHb bzw. MetVb steigert die metabolischen Umsetzungen in der Blutzelle. Der Reparationsstoffwechsel ist aber an die Intaktheit des Enzymbestandes der Zelle gebunden. In diesem Falle, wie er etwa bei der MetHb-führenden Zelle vorliegt, ist neben einem gesteigerten Substratverbrauch auch ein erhöhter ATP-Umsatz zu beobachten [14], [21], [27]. MetVb-Zellen bauen ihr ATP dagegen relativ langsam ab. Die Ursache dürfte in der Schädigung solcher Fermente liegen, die ATP-abhängige Reaktionen katalysieren. Damit stimmt überein, daß der Kationenstatus der „grünen" Zellen, der durch die Präparationsschritte bereits erheblich alteriert wurde, nicht mehr normalisiert werden kann, sondern weiter zusammenbricht. Selbst bei Inkubation

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der „grünen" Zellen in einem K+-angereicherten Milieu kann das bei der Präparation verloren gegangene K+ nicht mehr aktiv zurückgeholt werden. 4. Da der MetVb-haltige Erythrozyt seine Enzym- und Strukturdefekte unzureichend reparieren oder kompensieren kann, vermögen die verbleibenden funktionierenden Stoffwechselwege nur eine partielle Rückbildung des MetVb zu gewährleisten. Eine Kompensation ist aber möglich, wenn normale Erythrozyten mit intaktem Fermentbestand den „grünen" Zellen zugemischt werden. So wird schon bei einem Verhältnis MetVb-Zellen: normale Zellen — 3:1 die Intensität der Spontanrückbildung um etwa 90% gesteigert. Dieser „Mischeffekt" führt zur wechselseitigen Beeinflussung der Zellen und ihrer Stoffwechselsysteme. Mehrere Untersucher beschäftigten sich mit dem Problem der Zwischenzellwirkung [1], [16], [28]. Werden Zellen mit verschiedenen Stoffwechseleigenschaften (z. B. MetHbhaltige und normale) gemischt, so ist der resultierende Gesamtstoffwechsel nicht einfach eine Summe beider Teile. Einerseits ist die Milchsäurebildung der zugemischten normalen Zellen für die beschleunigte MetHb-Reduktion verantwortlich zu machen, zum anderen erfahren aber auch die SH-abhängigen Enzyme eine schnellere Regeneration. Dieser Effekt ist auch zwischen Blutzellen verschiedener Tierarten möglich. Darüber hinaus bleibt er nicht nur den Blutkörperchen vorbehalten [5]. In entsprechender Weise vermögen normale Erythrozyten auch zellfreies MetVb in ihrem Milieu zu reduzieren. Rund 90% einer MetVb-Lösung sind innerhalb von 120 min zu Hb reduziert. Etwa 10% des eingesetzten MetVb denaturieren dabei. Nach allen diesen Befunden stellt der MetVb-haltige Erythrozyt eine nur bedingt reparationsfähige Zelle dar, die aber in Kooperation mit normalen Zellen den grünen Blutfarbstoff wieder zu funktionsfähigem Hämoglobin rückbilden kann. Literatur I n : IV. Internationales Symposion über S t r u k t u r u n d F u n k t i o n der roten Blutkörperchen. Berlin, 2 5 . - 2 7 . 8. 1964. Sonderdruck aus Folia h a e m a t o l . [Leipzig] 83, 181 (1965). [2] B A N A S C H A K , H . : Acta biol. med. german. 12, 85 (1964). [ 3 ] B A N A S C H A K , H . U. R . S C H Ä F E R : Arch. int. P h a r m a c o d y n a m . T h e r a p . 129, 3 3 0 [1] B A N A S C H A K , K .

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479

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Summary R . B E Y E R and W. S C H E L E R : Studies on the metabolic reduction of metverdoglobin to hemoglobin in rabbit erythrocytes in vitro

When incubating MetVb-containing rabbit erythrocytes in CO or 0 2 atmosphere at 37 °C, electrons for the reduction of MetVb to Hb are offered by the metabolism of the "green" cell, as well as from a portion of the green blood pigment itself, which undergoes further oxidation and denaturation. The spontaneous reduction in the "green" cells is accelerated by addition of substrate (100 mM glucose, glucose and 0.1 mM methylene blue, 10 mM lactate); lactate is most effective in activating reversion, with a value of 154 per cent. LDH can be inhibited by high pyruvate concentrations (100 mM). The intracellular L / P quotient equals 0.38 and rises to 1.35 as lactate is exogenously supplied. The lactate/CO quotient is about 0.91. Conclusions resulting for the reduction of MetVb are discussed. Glucose utilization in the MetVb-containing rabbit erythrocytes makes up only one fourth that of the MetHb-containing ones. The activities of hexokinase, G-6-PDH

R . BEYER, W . SCHELER

480

and L D H , and the cellular concentrations of G S H and A T P in the MetVb-containing erythrocytes are decreased and continue to decrease during incubation. T h e K + content of the " g r e e n " cells amounts to 75,5 m V a l K+/1 of cells, their N a + content is 50 m V a l Na+/1 of cells. A stroma-free hemolysate was incubated in presence of glucose and methylene blue at pH 7.3 and 37 °C with metabolically active normal rabbit erythrocytes. A l r e a d y 120 minutes after, only pure H b 0 2 is detected spectrophotometrically.

Pe3I0MC P . E e i i e p H B . I l l e j i e p : MccjienoBaHHH 0 MeTa6ojiimecKoin BOccTaHOBjieHHH MeTBep«orjio6HHa B APHTPOUHTAX KPOJIHKOB in vitro n p H HHKy6aUHH MeTBepH0rjl06HHC0Hep>KaiHHX 3pHTpOUHTOB KpOJIHKOB B aTMOc $ e p e CO H 0 2 npw 37°, 3jieKTpoHbi HJIH npeBpaujeHHH METBEPFLORJIO6HHA B reMoTJIO6HH BHCBoSownaiOTCH KaK npn MeTa6ojiH3Me ,,3ejieHoii" KJICTKH, TaK H OT iacTH OT caMoro 3ejieHoro KpoBHHoro narMeHTa, KOTopbili BHajibHeiiiiieM OKHCjineTCH H neHaTypHpyeTCH. CnoHTaHHoe BoccTaHOBjieHHe B ,,3ejieHbix" KJieTKax ycKopneTCH npn noSaBjieHHH cy6cTpaTa (100 MM rjii0K03bi, rjii0K03a H 0,1 MM MeTHjieHOBoil CHHH, 10 MM jiaKTaTa), npHneM jiaKTaT aKTHBHpoBaji npeBpameHHe HawSoJiee pe3K0 ( 1 5 4 % ) . L D H MOJKHO HHrH6HpoBaTb, npHMeHHH BbicoKHe KOHKEHTPAIIHH nnpyBaTa (100 MM). MHTPAI;ejiJiJ0JiHpH0e OTHomeHHe L/P paBHo 0,38 H noBbimaeTCH n p a 3K3oreHHofi nonage JiaKTaTa n o « CO no 1,35. OTHomeHHe jiaKTaT/CO cocTaBjineT npHMepHo 0,91. OScyHinaeTCH 3HaqeHHe STHX pe3yjibTaTOB HJiH BoccTaoBjieHHH MeTBepj;orjio6HHa. rjH0K03Hbiii o6MeH B MeTBepnorjio6HHConep>KamHx apHTpoqHTax KPOJIHKOB HOCTHraeT jiniub onHofi ^eTBepTH rjiroK03Horo oSiweHa MeTreMorjio6HHConep>KamHx. AKTHBHOCTH reKCOKHHa3bi, G - 6 - P D H H L D H , a TaKwe uejuiiojiHpHbie KOHyeHTpaUHH G S H H A T P noHHJKeHbi B METBEPNORJIO6HHCONEPHIAMHX SPHTPOMITAX H npoHOJiHiaiOT na«aTb BO BpeMH HHKySaiiHH. CoaepwaHHe K + B ,,3ejieHbix" KJieTKax cocTaBjiHeT 75,5 MBajib K+/JI KJieTOK, H HX conepHtaHHe Na+ — 50 MBajib Na+/ji KJieTOK. CBo6o«HbIH OT CTpOMbI TeM0JlH3aT HHKy0HpOBajlCH B IipHCyTCTBHH rjIH)K03W H MeTHJieHOBOH CHHH npH p H 7,3 H 37 °C C MeTa60JIHHeCKH aKTHBHHMH HOpMajIbHblMH apHTpOUHTaMH KpOJIHKOB. Y j K e nocjie 120 MHHyT HHKySaUHH CneKTpO(|)OTOMeTpHnecKH o6Hapy>KHBaeTCH TOJibKO HHCToe H b 0 2 .

Acta biol. med. german., Band 18, Seite 481—491 (1967) Aus dem I n s t i t u t für Pharmakologie und Toxikologie der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald (Direktor: Prof. Dr. W. S C H E L E R )

Untersuchungen über die Rückbildung von Metverdoglobin in vivo R. BEYER und W .

SCHELER

(Eingegangen am 23. 11. 1966)

Zusammenfassung 1. Im Bauchraum von Kaninchen erfolgt durch Kooperation der inkubierten MetVb-haltigen Erythrozyten mit den anderen Körperzellen eine beschleunigte Reduktion des grünen Blutfarbstoffes. 2. Wird V5 des Gesamtblutes von Kaninchen durch eine MetVb-haltige Erythro. zytensuspension ersetzt, normalisiert sich der Hämoglobingehalt des strömenden Blutes rasch. Der Eisengehalt bleibt über 2 Std. konstant. Der CO/Fe- bzw. 0 2 /FeQuotient beträgt bereits nach 5 bzw. 60 min etwa = 1. 3. Die Überlebenszeit in vitro mit DF 3 2 P-markierter normaler Kanincheneryth.rozyten beträgt 56 Tage, die der MetHb-haltigen 38 und der MetVb-haltigen 28 Tage.

Durch die Versuche der 1. Mitteilung war gesichert worden, daß MetVb in vitro sowohl extraerythrozytär sowie im Erythrozyten metabolisch zu funktionsfähigem Hb reduziert werden kann [4J. War damit schon wahrscheinlich gemacht, daß ein Verdoglobin-haltiger Erythrozyt auch im Organismus seinen oxydativ veränderten Blutfarbstoff wieder zu revertieren vermag, blieb doch der direkte Beweis dafür offen. Außerdem interessierte natürlich die Frage, ob die Blutzelle nach Rückbildung des MetVb zu H b eine normale Lebensdauer im Organismus besitzt oder einem schnellen Abbau anheimfällt. In der vorliegenden Mitteilung wird darüber berichtet. Methodik l.

Austauschtransfusioven

Die MetVb-haltige Kaninchenerythrozytensuspension, deren Hämatokrit mit Plasma auf etwa 45% eingestellt war, präparierten wir wie in [4] angegeben. Sie wurde sofort nach Beendigung der MetVb-Präparation (nach etwa 90 min) einem anderen Versuchstier in die Ohrvene infundiert. Gleichzeitig wurde durch einen PolyäthylenAbkürzungen: H b = Hämoglobin; H b 0 2 = Oxyhämoglobin; MetHb = Methämoglobin; MetVb = Metverdoglobin; Vb = Verdoglobin

482

R. BEYER, W.

SCHELER

katheter, der in die Vene des anderen Ohres 20 cm bis zur Vena jugularis vorgeschoben war [15], die gleiche Menge Blut entnommen. Insgesamt wurde 1 / 5 des Gesamtblutes ausgetauscht. Nach 5, 15, 30, 45, 60, 90, 120 und 240 min entnahmen wir jeweils eine Blutprobe von 3 ml zur Analyse des Spektrums, des Eisengehaltes, der 0 2 - und COBindungskapazität. Vergleichsweise wurden auch MetHb-haltige Zellen gegen 1 / 5 des Gesamtblutes ausgetauscht. 2. Intraperitoneale

Rückbildung

In einer anderen in vivo-Serie suspendierten wir jeweils 5 ml MetVb-haltiger Erythrozyten in 40 ml physiologischer Kochsalzlösung (Hämatokrit 10%) und injizierten sie Kaninchen i.p. Nach 20, 40, 60, 120 und 240 min wurden kleine Proben von 2—3 ml zurückpunktiert und spektralphotometrisch untersucht. Zum Vergleich wurde auch eine MetHb-haltige Erythrozytensuspension in den Versuch genommen. 3. Bestimmung

der 02- und

CO-Bindungskapazität

Die 0 2 - und CO-Bindungskapazität des Blutes wurde manometrisch gemessen. Die Seitenbirne der Kegelgefäße diente zur Aufnahme von 0,6 ml kaltgesättigter frisch hergestellter wässeriger K 3 [Fe(CN)6]-Lösung. In den Hauptraum wurde neben 0,8 ml Aqua dest. 2 ml NH4OH (0,1 %ig) pipettiert und 0,6 ml Blut unterschichtet [16]. Dann wurde Sauerstoff bzw. Kohlenmonoxid in die Gefäße eingeleitet, nach Temperaturkonstanz die K 3 [Fe(CN)6]-Lösung in den Hauptraum eingekippt und solange geschüttelt, bis die Druckdifferenz unverändert blieb. Durch Multiplikation der Druckdifferenz mit der Gefäßkonstante kann die Menge des verdrängten Gases ermittelt und auf die eingesetzte Hb-Menge bezogen werden. 4.

Eisenbestimmung

Der Eisengehalt wurde nach Veraschung der Blutprobe mit o-Phenanthrolin (Chemapol, CSSR) unter Zusatz von Weinsäure nach H E I L M E Y E R und P L Ö T N E R [8] unter Einbeziehung einiger von K A T H E N [ 1 2 ] vorgeschlagener und eigener Veränderungen bestimmt. 5.

Lichtabsorptionsmessungen

Die Aufnahme der Lichtabsorptionsspektren und die Konzentrationsbestimmungen des Hämoglobins, Methämoglobins bzw. Metverdoglobins und derer Derivate sowie alle kolorimetrischen Messungen erfolgten am Spektralphotometer der Fa. V E B Carl Zeiß, Jena. 6.

Isotopenversuche

In v i t r o - M a r k i e r u n g : Diisopropylfluoro-3=phosphat, DF 3 2 P, mit einer initialen spezifischen Aktivität von 200 (ic/ml stammte vom Radiochemical Center Amersham, England. Es war in 5 ml sterilem Propylenglykol in einer Konzentration von 0,5 mg/ml gelöst. Diese DF32P-Ausgangslösung wurde auf ein Volumen von etwa 10 ml mit physiologischer Kochsalzlösung aufgefüllt (Lösung I). Lösung I verdünnten wir nochmals 1:100 (Lösung II). Diese setzten wir in Vorversuchen zur Ermittlung der optimalen Markierungsbedingungen für die einzelnen Erythrozytenpräparationen ein. 1 ml der Lösung II (1 (ic) fügten wir zu 10 ml Hb0 2 -, MetHb- bzw. MetVb-haltiger Erythrozytensuspension (Hämatokrit 40%) und inkubierten dieselbe bei 37 °C. Nach 5, 10, 15, 30 und 60 min entnahmen wir Proben von je 2 ml. Danach erfolgte 3faches Waschen der markierten Blutzellen mit physiologischer NaCl-Lösung und

In vivo-Rückbildung von Metverdoglobin

483

wiederum Einstellen des Hämatokritwertes auf 40%. Von je 0,5 ml der so markierten Erythrozytensuspension wurden die Impulsraten gemessen. Aus den Ergebnissen dieser Vorversuche legten wir die Markierungsdauer auf 10 min bei 37 °C fest. Zur Markierung der auszutauschenden Hb0 2 -, MetHb- bzw. MetVb-haltigen Erythrozytensuspension benutzten wir Lösung I. Die jeweilige Zellensuspension war unmittelbar vor dem Versuch aus dem Blut anderer Kaninchen präpariert worden. Auf 50 ml Erythrozytensuspension kamen anfangs 0,5 ml der Lösung I, in späteren Versuchen nach Ablauf von zwei bis drei Halbwertszeiten 1,0 ml (50 bzw. 100 (xc/50 ml Zellsuspension). Der Markierung der Zellen folgten 3faches Waschen mit physiologischer NaCl-Lösung und das Einstellen des Hämatokritwertes auf etwa 50%. 50 bis 60 ml einer solchen Erythrozytensuspension infundierten wir Kaninchen in die Ohrvene, nachdem diesen Tieren durch Herzpunktion die etwa äquivalente Menge normalen Blutes entnommen worden war. Zur Messung der 3 2 P-Radioaktivität der Erythrozyten nahmen wir die erste Blutprobe gewöhnlich 1 5 min nach der Austauschtransfusion ab, weitere in mehrtägigen Abständen. Dabei punktierten wir etwa 5 ml Blut mit einer heparinisierten Spritze aus der Ohrvene, später auch aus dem Herzen. Davon wurde 1 ml Blut in Aluminiumschälchen, die mit passenden Filterpapierscheibchen ausgelegt waren, pipettiert. Das übrige Blut arbeiteten wir nach H E I M P E L et al. [9] zur Herstellung von Hämolysaten und zur Hämoglobinbestimmung auf. 1 ml des so präparierten Hämolysates gaben wir zum Messen der Impulsraten auch in Aluminiumschälchen. Die Proben wurden 2 Tage an der Luft getrocknet und danach mit dem Szintillationszähler am Strahlungsmeßplatz VA-M-160 von V E B Vakutronik, Dresden gemessen. Den physikalischen Abfall des 33 P (physikalische Halbwertzeit: 14,2 Tage) korrigierten wir bei allen Meßergebnissen.

Ergebnisse l . Intraperitoneale

Rückbildung

Zunächst injizierten wir in einer in vivo-Versuchsreihe Kaninchen 40 ml einer MetVb-haltigen Erythrozytensuspension (Hämatokrit = 10%) in den Bauchraum. Nach bestimmten Zeitabständen wurden kleine Mengen zurückpunktiert, die Erythrozyten hämolysiert, das Hämolysat durch Zentrifugation geklärt und die Lichtabsorption des Überstandes aufgenommen. Aus dem gemessenen Spektrum wurde der verbliebende MetVb-Gehalt berechnet. In Parallelversuchen wurde zum Vergleich auch eine MetHbZellsuspension i.p. injiziert. Das MetHb ist bereits nach 120 min vollständig reduziert (Abb. -1). Bei den „grünen" Zellen geht die Rückbildung bis zu einem Gemisch von Hb0 2 und verbleibenden Verdoverbindungen, da neben der Oxygenierung des gebildeten Hb auch eine Spontanreoxydation des Hb zu MetHb und des Vb zu MetVb erfolgt [4]. Bildet man den Quotienten der Extinktionen von 605 nm und 540 nm, erhält man für das MetVb vor der Injektion 1,12, 270 min danach 0,63. Für die Absorption des Hb0 2 beträgt er 0,065. Wird die Differenz dieses Quotienten zwischen MetVb und Hb0 2 (E605/E540) gleich 100% gesetzt, so errechnet sich für den Zeitpunkt 270 min nach der Injektion eine relative Rückbildung von etwa 47%. Die rückgebildete Quote ist in den ersten 20 min nach der Injektion mit 20% am größten, und sie nähert sich asymptotisch dem Grenzwert von ca. 50% (Abb. 2). 33

Acta biol. med. german., Bd. 18, Heft 4

484

R. BEYER, W .

SCHELER

nm——

1 (

nm—m~

Abb. 1 a. i. p.-Injektion einer MetHb-haltigen Erythrozytensuspension. [MetHb] = 82,5 (¿M; pH = 6,25. ): vor Injektion; 2 ( ): nach 120 min rückpunktiert. H ä m a t o k r i t der Suspension: 10% Abb. 1 b. i. p.-Injektion einer MetVb-haltigen Erythrozytensuspension. [MetVb] = 44,5 nM; pH = 5,89.

1 (

) vor Injektion; 2 (

): n a c h 20 m i n ; 3 (

): n a c h 40 m i n ; 4 (— • —):

nach 270 min rückpunktiert. Hämatokrit der Suspension: 10%. Ordinate: Extinktion; Abszisse: Wellenlänge in nm

mm — Abb. 2. Rückbildung einer i. p. verabreichten MetVb-haltigen Erythrozytensuspension. Ordinate: Relative Rückbildung in % ; Abszisse: Zeit nach der i. p.-Injektion in min

2. Rückbildung bei partieller Austauschtransfusion Die Kaninchen, denen 1 / 5 ihres Blutes gegen eine MetVb-haltige Erythrozytensuspension ausgetauscht wurde, blieben während und nach der Infusion in gutem Zustand. Von 5 Kaninchen überlebten 4. Ein Versuchstier verstarb an den Folgen unsachgemäßen Katheterisierens. 5 min nach der AT wurde die erste Blutprobe entnommen, weitere in viertelstündigen bis halbstündigen Abständen. Die Versuchsdauer erstreckte sich über 4 Std. Allerdings wurde die 4-Std.-Probe nur zur Analyse des Absorptionsspektrums

In vivo-Rückbildung von Metverdoglobin

485

verwertet. Um zu entscheiden, ob die MetVb-haltigen Erythrozyten aus dem zirkulierenden Blut abgefangen werden oder nicht, bestimmten wir im Versuchsverlauf mehrfach den Eisengehalt. Er blieb während der 2-stündigen Versuchsdauer konstant. Demnach werden die „grünen" Zellen nicht sofort durch die Milz eliminiert. Weiterhin wurde die CO- und 0 2 -Kapazität von Blutproben im Versuchsverlauf bestimmt. MetVb bindet weder CO noch 0 2 . Demzufolge sollte der CO/Fe- und der 0 2 /Fe-Quotient eine zuverlässige Aussage über die Rückbildung des MetVb zu Vb bzw. Hb erlauben. Da wir 1 / s des Gesamtblutes durch MetVb-haltige Zellsuspension ersetzten, liegen der Q CO/Fe und der Q 0 2 /Fe unmittelbar nach der AT bei ~0,8. Da wir die erste Blutprobe 5 min nach der Austauschtransfusion entnahmen, war der Q 0 2 /Fe zu diesem Zeitpunkt in der Regel schon wieder auf Werte um 0,85 angestiegen (vgl. Abb. 3)- Den zeitlichen Verlauf von Q 0 2 /Fe und Q CO/Fe rückextrapolierten wir auf 0,8. Die Rückbildung des MetVb zu Hb in den transfundierten Zellen ist nach 1 Std. bereits abgeschlossen. Zu diesem Zeiptunkt hat Q O ä /Fe wieder den Wert 1 erreicht.

T" 1

Vorperiode AT5

r

15

Abb. 3. Verhalten von Eisengehalt (%), CO/Fe- (A) und 0 2 /Fe-Quotient (o) nach partieller Austauschtransfusion (AT) von a) MetVb-haltigen (oben) und b) MetHbhaltigen (unten) Kaninchenerythrozyten. Ordinate: Relative Bezugsgröße für CO/Fe und 0 2 / F e bzw. für Eisengehalt; Abszisse: Zeit nach AT in min 33*

486

R . BEYER, W .

SCHELER

Überrascht waren wir dagegen bei der Bestimmung der Zeitfunktion von Q CO/Fe. Bereits 5 min nach der Transfusion war Q CO/Fe von 0,8 wieder auf 1,0 angestiegen (Abb. 3). Daraus ist zu schließen, daß das MetVb sehr leicht und schnell in das zur CO-Bildung befähigte Vb reduziert wird, das dann seinerseits wesentlich langsamer in Hb rückverwandelt wird. Die spektralen Bestimmungen an den entnommenen und sodann hämolysierten Blutproben geben einen zusätzlichen Beleg für den Rückbildungsvorgang. Bei Analyse der Absorptionsspektren zeigen die 5,15 und 30 min nach der AT entnommenen Blutproben durch Schultern im orangen Teil des Spektrums noch die Anwesenheit von Verdoverbindungen an. Das SoRET-Maximum ist ins Langwellige verschoben. In den nachfolgenden Proben unterscheiden sich dagegen die Absorptionsspektren nicht mehr von denen des Oxyhämoglobins. Das Verhalten von MetHb-haltigen Erythrozyten wurde in 3 Versuchen in grundsätzlich ähnlicher Weise untersucht. Der Fe-Gehalt bleibt ebenfalls über 2 Std. konstant. MetHb bindet weder CO noch 0 2 . 5 min nach der AT beträgt der Q CO/Fe bzw. 0 2 /Fe 0,87 bzw. 0,82, nach 15 min 0,91 bzw. 0,90. Nach 30 min schwankt er im Verlauf der weiteren Untersuchungen um 1 (Abb. 3)- Im Spektrum verliert sich schon in 15— 30 min die angedeutete Schulter um 630 nm gänzlich. Der Q 0 2 /Fe normalisiert sich somit bei den MetHb-Zellen mehr als doppelt so schnell wie bei den MetVb-haltigen; d. h. daß auch die Rückbildung zu funktionsfähigem Hb mit diesen Geschwindigkeitsrelationen erfolgt. Wie erwartet ist die Zeitfunktion von Q 0 2 /Fe und Q CO/Fe bei den „braunen" Zellen identisch, da ja hier im Gegensatz zur MetVb ->• Hb-Transformation kein Zwischenprodukt (Vb) auftritt, das nur zur Bindung eines Gases befähigt wäre. 3. Überlebenszeit DF32P-markierter

MetVb-haltiger

Kaninchenerythrozyten

Die Versuche über die in vivo-Rückbildung von MetVb-haltigen Kaninchenerythrozyten belegen die schnelle Wiederherstellung der normalen 0 2 -übertragenden Funktion dieser toxisch geschädigten Erythrozyten, ohne indessen etwas über deren Vitalität auszusagen. Ein Kriterium hierfür ist die mittlere Überlebenszeit der Blutkörperchen. Wir bestimmten vergleichend die Elution Hb0 2 -, MetHb- und MetVb-haltiger Kaninchenerythrozyten, die in vitro bzw. in vivo mit DF 3 2 P markiert worden waren und die gesunden Kaninchen transfundiert wurden. Zur Messung der in vitro-Einbaugeschwindigkeit von DF 3 2 P in Erythrozyten versetzten wir jeweils 10 ml Erythrozytensuspension mit 1 [xc DF 3 2 P und registrierten nach 5, 15, 30 und 60 min die Impulsraten der markierten Zellen. In einer DF 32 P-Lösung beladen sich rote Blutkörperchen relativ schnell mit dem Isotop. Bei Met Vb-haltigen Zellen ist der Grenzwert schon nach 5 min erreicht, bei MetHb- und Hb0 2 -haltigen nach etwa 15 min, wobei die Aufnahme bei Hb0 2 -haltigen Zellen offensichtlich am

I n vivo-Rückbildung von Metverdoglobin

487

langsamsten erfolgt. Mit zunehmendem Schädigungsgrad nimmt die Markierungsgeschwindigkeit zu (vgl. Abb. 4). Der Abfall in der Kurve 3 der Abbildung 4 ist auf die eintretende Hämolyse der MetVb-haltigen Zellen zu beziehen. Sie nimmt so stark zu, daß nach 30 min Inkubationsdauer ein genaues Pipettieren dieser Zellen durch starke Klumpung unmöglich ist. Dieser Effekt ist eindeutig dem DF 32 -P zuzuschreiben, da eine analoge Inkubation ohne diese Verbindung keine Hämolyse mit sich bringt. 16 15

14 13 12 x 103 0

5

10

15

min

—

30

4

60

Abb. 4. Einbaugeschwindigkeit von D F 3 2 P in Hb0 2 -, MetHb- bzw. MetVb-haltige Kaninchenerythrozyten in vitro bei 37 °C. Die eingesetzte Aktivität betrug 0,1 (¿c DF 3 2 P/ml Erythrozytensuspension. Ordinate: Imp./min; Abszisse: Inkubationsdauer in min 1x x Hb02-Erythrozyten; 2 O O MetHb-Erythrozyten; 3• A MetVb-Erythrozyten

Abbildung 5 zeigt den Verlauf der Erythrozytenaktivität bei Kaninchen, denen 1 / s des Gesamtblutes mit normalen bzw. toxisch geschädigten Erythrozytensuspensionen ausgetauscht wurde. In den ersten 24 Std. nach der Markierung liegt der Abfall der Erythrozytenaktivität immer um 50% (partielle Elution des Markierungsmittels [3], [5])- Bei Vernachlässigung der „Frühelution" in den ersten 24 Std. beträgt die Zeit, in der die Radioaktivität auf die Hälfte gesunken ist (DF 32 P —T/2), bei normalen Zellen 9, bei MetHb-haltigen 3, bei MetVb-haltigen 2,5 Tage. Die graphische Extrapolation des Kurvenverlaufes ergab demnach eine maximale Überlebenszeit für mehrmals in physiologischer Lösung gewaschene und reinkubierte rote Kaninchenerythrozyten maximal 56, für „braune" 38 und für „grüne" 28 Tage. Bei direkter i.m. oder i.v.-Injektion des DF 32 P liegt die Überlebenszeit normaler Kaninchenerythrozyten 10—15 Tage höher [6], [10]. In einer Reihe von Versuchen markierten wir die Erythrozyten in vivo, indem wir die Markierungssubstanz i.v. Kaninchen verabreichten. Das markierte Blut wurde nach Herzpunktion zu roten, „braunen" bzw. „grünen" Zellsuspensionen aufgearbeitet und Versuchstieren reinjiziert. Die

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R. BEYER, W .

SCHELER

100

50-

0 0

10

20

30

50

60

Tage—

Abb. 5. Relative Abnahme der Radioaktivität im Blut von Kaninchen nach Transfusion in vitro markierter Erythrozyten bei Vernachlässigung der „Frühelution" in den ersten 24 Std. Markierungssubstanz: DF 3 2 P. Ordinate: Radioaktivität der Erythrozytenfraktion des Blutes in % ; Abszisse: Zeit in Tagen

Überlebenszeit dieser Erythrozyten nimmt auch in der Reihenfolge zu: MetVb-haltige Zellen < MetHb-haltige Zellen < Hb0 2 -haltige Zellen. Diskussion

1. Die MetVb-Rückbildung im Tier bestätigt die bereits in vitro erhaltenen Ergebnisse. In Abhängigkeit von der gewählten Versuchsanordnung werden MetVb-führende Zellen partiell oder vollständig zu Erythrozyten regeneriert, die zum 0 2 -Transport befähigt sind. War bei den Inkubationsversuchen der „grünen" Zellen in der Bauchhöhle von Kaninchen noch keine komplette Rückbildung des MetVb zu Hb zu erreichen, führte die partielle Austauschtransfusion zu einer vollständigen Reduktion des Blutfarbstoffes. Die methodische Sicherung war durch die gleichzeitige Fe- und die CO- bzw. 0 2 -Kapazitätsbestimmung gegeben. Die Gesamthämoglobinkonzentration änderte sich während des Versuches nicht, so daß die CO/Fe- bzw. 0 2 /FeQuotienten zuverläßliche Parameter der Rückbildung zu Vb und zu Hb waren. Überraschend war die sehr schnelle Reduktion des MetVb zu Vb, die durch die Zeitfunktion des CO/Fe-Quotienten offenbar wurde. Sie ist schon nach 5 min komplett. Die vergleichsweise dazu verfolgte MetHb -»• HbReduktion verläuft wesentlich langsamer und ist erst nach rund 30 min beendet. Da es sich in beiden Fällen um eine Fe(III)->-Fe(II)-Reduktion handelt, ist diese Differenz unerwartet. Welche ursächlichen Faktoren bestimmend sind, läßt sich gegenwärtig nicht sagen. Vielleicht sind es Redoxpotentialunterschiede zwischen beiden Systemen oder aber Differenzen in der Permeabilität der Zellmembranen MetHb- und MetVb-haltiger Zellen.

In vivo-Rückbildung von Metverdoglobin

489

Die vollständige metabolische Reduktion des MetVb unter den Bedingungen der Austauschtransfusion ist überwiegend eine Leistung der umgebenden normalen Blutzellen sowie der Gewebe des Organismus allgemein. Sie gestatten die Reparation der Blutfarbstoffläsion, zu der die MetVb-Erythrozyten infolge ihres geschädigten Fermentbestandes allein nicht befähigt sind. Über diesen Kooperations- oder ,,Misch"-Effekt ist wiederholt gearbeitet worden [1], [2], [11]. Er kommt nicht nur den Blutzellen zu, sondern hat allgemeinen Charakter. So üben beispielsweise auch Leberzellen einen aktivierenden Einfluß auf die MetHb-Reduktion aus [7]. Andererseits liegen Befunde darüber vor, daß Kaninchen bei i.v.-Injektion von Hämoglobinhämolysaten in physiologischer Kochsalzlösung bereits nach 30 min im Harn merkliche Mengen Verdoglobin ausscheiden. Gleichzeitig tritt Vb im Plasma auf [14]. 2. Trotz der kompletten Rückbildung des MetVb sind die betreffenden Zellen in ihrer Vitalität nicht mit normalen Erythrozyten zu vergleichen. Sie verbleiben kürzere Zeit im Kreislauf als diese. Immerhin vergehen unter unseren Versuchsbedingungen etwa 2—4 Wochen, bis sie vollständig aus dem peripheren Kreislauf verschwunden sind. Diese Zeitspanne differiert zu den früheren Untersuchungen von KIESE und SEIPELT [13]. Sie verwendeten Verdoglobin CN- bzw. Verdoglobin S-haltige Erythrozyten, entnahmen Hunden (etwa 10 kg) ca. 100 ml ihres Blutes und infundierten 350 ml einer Erythrozytensuspension in Tyrodelösung. Diese enthielt 7,8 Millionen Erythrozyten pro ml und 4,5% Verdoglobin. Die Erythrozyten waren 17 Std. vor der Injektion einem anderen Hunde entnommen worden. Die Vb-Konzentration im Blut stieg nach der Infusion von 0,3 auf 2,8%. Gleichzeitig nahm die Erythrozytenkonzentration im Blut erheblich zu. Nach etwa l ö S t d . war neben der ursprünglichen Vb-Konzentration auch die normale Erythrozytenzahl wieder erreicht. Zwar wird als Hauptweg des Verschwindens von Vb aus dem Blute die Elimination der Vb-Erythrozyten durch die Milz diskutiert, doch läßt sich eine teilweise Reversion des Vb zu Hb und Verbleib der Blutzellen im Kreislauf nicht ausschließen. In den K i E S E - S E i P E L T s c h e n Versuchen enthielten indessen die Vb-haltigen Erythrozyten stets Heinz-Körperchen, die bei unseren Präparationen niemals auftraten. Möglicherweise ist darauf die relativ lange Verweildauer der geschädigten „grünen" Zellen in unseren Versuchen zurückzuführen, wenn nicht weiterhin ev. Speziesunterschiede zu berücksichtigen bleiben (Hund — Kaninchen). 3. Das von uns studierte .Verdoglobinmodell entsteht in vitro unter relativ drastischen Bedingungen (hohe NOa- und H 2 0 2 -Konzentration). Sicherlich sind deshalb auch die enzymatischen, die Stoffwechsel- und Membranveränderungen so auffällig. Vermutlich entstehen toxische Verdoglobinbildungen beim Menschen im Mechanismus zwar prinzipiell analog, doch sicherlich unter milderen Reaktionsbedingungen. Es ist wahrscheinlich, daß ein großer Anteil des grünen Blutfarbstoffes auch bei menschlichen Verdoglobin-

490

R . BEYER, W .

SCHELER

Vergiftungen teils durch eigene zelluläre teils durch kooperative Leistung des Gesamtorganismus zu funktionstüchtigem Hämoglobin revertiert werden kann. Dennoch entwickeln sich mäßige oder stärkere Anämien [17], die letztlich auf die reduzierte Lebensdauer der „grünen" Erythrozyten, auch wenn sie wieder ihren Blutfarbstoff rückgebildet haben, zu beziehen sind. Literatur [1] [2]

BANASCHAK,

H . : A c t a b i o l . med. german. 12, 85 (1964). U. R . S C H Ä F E R : Arch. int. Pharmacodynam. Therap. 129,

BANASCHAK, H .

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[13] [14]

[15] [16] [17]

BEYER,

Summary R.

BEYER

and W.

SCHELER

: Studies on t h e reduction of metverdoglobin in vivo

1. In t h e abdominal cavity of rabbits, incubated MetVb-containing erythrocytes cooperate with other body cells so as to effect an accelerated reduction of the green blood pigment. 2. If one fifth of t h e total blood of t h e rabbits is replaced by MetVb containing erythrocyte suspensions, the hemoglobin content of the circulating blood is rapidly normalized. The iron content remains constant for more t h a n 2 hours. The CO/Fe or 0 2 / F e quotient is of t h e order of 1 already 5 or 60 minutes after, respectively. 3. The in vitro DF 3 3 P-labelled normal rabbit erythrocytes survived for 56 days, t h e MetHb-containing and MetVb-containing — for 38 or 28 days, respectively.

In vivo-Rückbildung von Metverdoglobin

491

PeaioMe P . E e f t e p H B. I l l e j i e p : Hccjie«OBaHHH

1.

in

vivo

B

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MeTpeBHonnioßHHa

28 «Heft.

in

38 h

vitro MeT-

A c t a biol. med. german., B a n d 18, Seite 493 — 497 (1967) Aus d e m I n s t i t u t f ü r Pharmakologie der Friedrich-Schiller-Universität J e n a (Direktor: Prof. Dr. H . A N K E R M A N N )

Untersuchungen zum Mechanismus der Enzyminduktion XI. Die Wirkung von Barbital auf den L- Askorbinsäuregehalt der Leber bei graviden Ratten, ihren Foeten und bei infantilen Ratten W.

KLINGER u n d I. HEINRICH

(Eingegangen a m 11. 11. 1966)

Zusammenfassung D u r c h 3 x 150 m g B a r b i t a l / k g K G i. p. steigt die Askorbinsäure-Konzentration in der Leber trächtiger R a t t e n a m 15. u n d 21. Trächtigkeitstag nur geringfügig an. Die Askorbinsäure-Konzentration in der foetalen Leber a m 15- E n t w i c k l u n g s t a g ist m i t der in der m ü t t e r l i c h e n Leber p r a k t i s c h identisch, a m 21. E n t w i c k l u n g s t a g liegt sie noch ü b e r der Askorbinsäure-Konzentration in der m ü t t e r l i c h e n Leber. Bei infantilen Tieren v o m 6. u n d 10. L e b e n s t a g ist der Leber-Askorbinsäure-Gehalt geringer als bei erwachsenen Tieren; er wird durch I n d u k t i o n m i t B a r b i t a l u m die H ä l f t e erhöht. Die B e f u n d e werden im Z u s a m m e n h a n g mit vorangegangenen submikroskopischen Untersuchungen diskutiert.

In elektronenoptischen Untersuchungen konnte gezeigt werden, daß Barbital in der Leber gravider Ratten eine typische Proliferation des SER hervorruft, nicht jedoch in den Lebern der Foeten [1], obwohl Barbital die Plazenta passiert [2], Bei infantilen Tieren waren die Veränderungen nach Barbitalbehandlung am 6. Lebenstag noch unregelmäßig und schwach, deutlich jedoch am 10. Lebenstag [3]. Mit der vorliegenden Arbeit sollte geklärt werden, ob sich der Beginn der Induzierbarkeit der AS-Synthese bei der Ratte, gemessen an der AS-Konzentration in der Leber nach Barbitalbehandlung, festlegen und mit den vorangegangenen submikroskopischen Untersuchungen [1], [3] vergleichen läßt. Material und Methodik Die U n t e r s u c h u n g e n wurden a n W i s t a r - R a t t e n (Jena) der institutseigenen Koloniezucht d u r c h g e f ü h r t . Die Haltungsbedingungen wurden bereits beschrieben [1], J e 3 t r ä c h tige R a t t e n erhielten a n drei aufeinanderfolgenden Tagen 150 m g B a r b i t a l - N a / k g KG, l , 5 % i g in 0,9%iger NaCl-Lösung i. p., je 3 t r ä c h t i g e Kontrolltiere die gleiche Volum i n a 0,9%iger NaCl-Lösung. N a c h der B e h a n d l u n g a m 12. —14. bzw. 18. —20. Trächtigkeitstag (Bestimmung des Konzeptionstermins siehe [4]) wurden die Tiere a m 15. A b k ü r z u n g e n : S E R = smooth surfaced endoplasmatic reticulum (glattes endoplasmatisches R e t i k u l u m ) ; AS = L-Askorbinsäure; K G = Körpergewicht.

494

W . KLINGER, I. HEINRICH

bzw. 21. Trächtigkeitstag in Äthernarkose dekapitiert und entblutet. Zur AS-Bestimmung nach R O E und K U E T H E R (siehe [5]) wurden von der mütterlichen Leber 100 bis 200 mg entnommen, am 15. Entwicklungstag die Lebern aller Foeten eines Wurfes (n = 10—12) und am 21. Entwicklungstag die Lebern zweier Foeten zusammengefaßt. Infantile R a t t e n wurden vom 3 . - 5 - bzw. 7 . - 9 . Lebenstag mit Barbital behandelt und am 6. bzw. 10. Lebenstag zur Bestimmung der Leber-AS getötet. Während der Barbitalbehandlung blieben sie bei der Mutter (vgl. [3]). Eine Differenzierung der Foeten und infantilen Tiere nach Geschlecht erfolgte nicht, da nach vorausgegangenen Untersuchungen [6] geschlechtsspezifische Differenzen bei R a t t e n sich erst nach der 4. Lebenswoche nachweisen lassen. Es werden die arithmetischen Mittelwerte der AS-Konzentrationen mit Standardfehler angegeben, der statistische Vergleich erfolgte mit dem ¿-Test. Ergebnisse

Die Leber-AS-Konzentrationen von Ratten am 15. und 21. Trächtigkeitstag, ihrer Foeten und von infantilen Ratten am 6. und -10. Lebenstag nach Behandlung mit 3 x-150 mg Barbital-Na/kg KG i.p. sind im Vergleich zu den Kontrollen in Tabelle 1 dargestellt. Der Anstieg der Leber-AS-Konzentration durch die Barbitalbehandlung ist bei den Muttertieren am 1 5. und 21. Trächtigkeitstag gering und überschreitet nicht 10% der Kontrollwerte. Dieser Induktionseffekt ist am Tabelle 1 Leber-AS-Konzentrationen bei R a t t e n vom 15- und 21. Trächtigkeitstag, ihren Foeten sowie bei infantilen R a t t e n vom 6. und 10. Lebenstag nach 3 x 150 mg Barbital/kg KG an 3 aufeinanderfolgenden Tagen i.p. appliziert Alter der Versuchstiere Muttertiere 15. Trächtigkeitstag Muttertiere 15- Trächtigkeitstag Foeten 15. Entwicklungstag Foeten 15. Entwicklungstag Muttertiere 21. Trächtigkeitstag Muttertiere 21. Trächtigkeitstag Foeten 21. Entwicklungstag Foeten 21. Entwicklungstag 6. Lebenstag 6. Lebenstag 10. Lebenstag 10. Lebenstag

Anzahl der

Behandlung

Leber-AS [mg%]

Kontrolle

30,8 ± 1,9

3

3

Barbital

32,1 ± 1,1

3

3

Kontrolle

30,9 ± 1,5

3

35

Barbital

32,4 ± 1,1

3

33

Kontrolle

27,5 ± 1,5

3

3

Barbital

30,4 ± 1,5

3

3

Kontrolle

31,2 ± 0,6

12

24

Barbital Kontrolle Barbital Kontrolle Barbital

32,8 ± 0,9 24,5 ± 1,3 35,5 ± 1,8

11

22 6 7 6 7

27,0 ± 1,0

39,3 ± 1,5

LPJ

Meß- Einzelwerte tiere

6 7 6 7

0,50

< 0,10

J vJ 1 J

< 0,001 . < 0,001 < 0,001

< 0,001

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T e p H C T H K a T e T C H H H a p H T p O I J H T O B B R E N A P H H H 3 0 B A H H 0 Í Í HJIH C M e i n a H H O H C p a C T B O P O M I J H T p a T a H a T p H H H e j I O B e n e C K O H K p O B H C O H H O B p e M e H H b I M H 3 M e p e H H e M MHHMOH BH3KOCTH H c y q e T O M T e H ^ e H i i H H KJieTOK K a r p e r a t ( H H , o n p e n e j i H H C K o p o c T b

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pa3Mepa.

Acta biol. med. german., Band 18, Seite 507—511 (1967) Aus dem Institut für Pharmakologie und Toxikologie der Medizinischen Akademie Magdeburg (Direktor: Prof. Dr. med. habil. H. M A T T H I E S )

Der Einfluß des Tetrabenazins auf die Toxizität von Azetylcholin, Physostigmin und Prostigmin H . LIEBMANN u n d H .

MATTHIES

(Eingegangen am 17. 10. 1966)

Zusammenfassung Bei einer i.p. Applikation von 50 mg/kg Tetrabenazin unmittelbar vor der Verabreichung cholinerger Pharmaka (Azetylcholin, Physostigmin und Prostigmin), kommt es zu einer erheblichen Steigerung der Toxizität dieser Substanzen. Innerhalb der zweiten bis dritten Stunde nach Tetrabenazin-Vorbehandlung zeigt sich ein deutlicher Rückgang der verstärkten Toxizität für Physostigmin und Prostigmin. Bei Azetylcholin ist der Rückgang zur Norm nach 6 Std. Vorbehandlung mit Tetrabenazin vollständig. Mögliche Wirkungsmechanismen werden diskutiert.

Durch die Veröffentlichungen von M a l h o t r a und P r a s a d [1] konnte ein deutlicher Einfluß des Reserpins auf den Azetylcholin (ACh)-Gehalt sowohl in zentralen als auch in peripheren Bereichen festgestellt werden. In unseren Untersuchungen [2] haben wir eine teilweise erhebliche Toxizitätssteigerung für cholinerge Pharmaka nach Vorbehandlung mit Reserpin nachgewiesen. Es lag nahe, die durch Reserpin bedingten Aminveränderungen damit in einen gewissen Zusammenhang zu bringen. Andererseits kann natürlich ein direkter Einfluß des Reserpins auf das cholinerge System von vornherein nicht ausgeschlossen werden. Wenn man annimmt, daß die Toxizitätssteigerung für cholinerge Pharmaka unter Reserpin-Vorbehandlung eine Korrelation zu den bekannten Aminveränderungen aufweist, dann müßten auch andere Substanzen, die den Amingehalt in den Geweben beeinflussen, ebenfalls eine Toxizitätsveränderung hervorrufen. Vom Tetrabenazin, ein Derivat aus der Reihe der BenzochinolizinVerbindungen, ist bekannt, [3]—[5] daß es im ZNS und im Nebennierenmark zu einer ausgeprägten Amindepletion kommt. In dieser Hinsicht schien uns die Einbeziehung dieser Substanz in unsere Versuche als sehr zweckmäßig. Methodik Die Untersuchungen wurden an weißen Mäusen des Stammes „strain AB" durchgeführt. Die Versuchsdurchführung und -auswertung verlief nach den gleichen Prinzipien wie bei der vorausgegangenen Arbeit [2]. Sowohl Tetrabenazin als auch ACh.

508

H . LIEBMANN, H .

MATTHIES

u n d die Cholinesterasehemmstoffe Physostigmin und Prostigmin wurden i.a. in einem Volumen von 0,1 ml/10 g Maus i. p. verabreicht. Die statistischen Sicherungsgrenzen liegen hier bei p < 0 , 0 5 - Die Auswertung der Versuchsergebnisse erfolgte nach der Methode von L I T C H F I E L D u n d W I L C O X O N . Die Dosis f ü r Tetrabenazin wurde mit 50 mg/kg stets k o n s t a n t gehalten. Ergebnisse

Bei den von uns hier durchgeführten Versuchen ermittelten wir bei weißen Mäusen eine mittlere letale Dosis für ACh von 238 mg/kg. Unmittelbar nach der Injektion von 50 mg/kg Tetrabenazin beträgt die LD 50 für ACh nur noch •125 mg/kg. (Abb. 1). Diese starke Toxizitätssteigerung bleibt bis 3 Std. nach Tetrabenazin erhalten. Erst bei einem Intervall von 4 Std. zwischen

Abb. 1. D e r E i n f l u ß von 50 mg/kg Tetrabenazin auf die LD 5 0 von ACh. Abszisse: Vorbehandlungszeit m i t 50 mg/kg T e t r a b e n a z i n vor der B e s t i m m u n g der LD S 0 ; O r d i n a t e : m g / k g ACh, LD 50 . Alle ausgefüllten Zeichen sind gegen die Kontrollwerte mit einem p-Wert (p < 0,05) statistisch zu sichern

der Tetrabenazingabe und der Bestimmung der LD50 für ACh macht sich ein Rückgang der gesteigerten Toxizität bemerkbar. Dieser Wert läßt sich jedoch noch gegen die Kontrollwerte statistisch sichern. 6 Std. nach Tetrabenazin bewegen sich die Werte für die LD50 von ACh im Bereich der unvorbehandelten Kontrollen; eine statistische Sicherung gegenüber den Kontrollen läßt sich jetzt nicht mehr erreichen. Auch eine weitere Verlängerung des zeitlichen Abstandes zwischen der Tetrabenazingabe und der Bestimmung der LD50 für ACh ergibt keine Unterschiede mehr zu den Kontrollwerten, die nicht mit Tetrabenazin vorbehandelt wurden.

Tetrabenazin-Wirkung

509

Ebenso wie beim ACh stellt sich auch bei den Cholinesteraseinhibitoren Physostigmin und Prostigmin bei gleichzeitiger Verabreichung mit Tetrabenazin eine erhebliche Toxizitätssteigerung heraus, die für Prostigmin stärker ist als für Physostigmin (Abb. 2). Die für die mittlere letale Dosis benötigte Menge Physostigmin sinkt dabei von 940 ¡xg/kg im Mittel auf Werte um 400 ¡¿g/kg. 2 Std. nach der Tetrabenazingabe zeigt die LD 60 für Physostigmin schon wieder einen deutlichen Rückgang dieser eben beschriebenen Toxizitätssteigerung. Die LD 50 beträgt jetzt 600 ¡xg/kg. | pg/kg In diesem Bereich hält sich Phso. Eust. die mittlere letale Dosis für Physostigmin bis zu einem Intervall von 48 Std. nach der Tetrabenazingabe. Diese 300Werte sind gegen die Kontrollen noch statistisch zu sichern; erst der 72-Std.630Wert läßt keinen Einfluß des Tetrabenazins mehr erkennen. 500-

400

Abb. 2. Der Einfluß von 50 mg/ kg Tetrabenazin auf die LD 50 von Physostigmin (— • —) und Prostigmin ( ). Abszisse: Vorbehandlungszeit in Std. mit 50 mg/kg Tetrabenazin vor der Bestimmung der LD 50 ; Ordinate: (ig/kg Physostigmin und Prostigmin, LD 50

320

Ähnlich liegen die Verhältnisse auch beim Prostigmin. Durch die gleichzeitige Verabreichung von Tetrabenazin und Prostigmin wird die LD 50 von Prostigmin von 500 [xg/kg bei den Kontrollen auf 130 ¡xg/kg erniedrigt. Dieser Effekt hält noch weitere 2 Std. nach einer Tetrabenazingabe von 50 mg/kg an. 3 Std. nach der Tetrabenazininjektion. beträgt die LDS0 von Prostigmin bereits wieder 210 [xg/kg. Diese geringfügige, aber statistisch noch zu sichernde Steigerung der Toxizität nimmt im Laufe von 72 Std. nach der Tetrabenazingabe allmählich ab und erreicht danach erst wieder wie beim Physostigmin die Kontrollwerte.

H . LIEBMANN, H . MATTHIES

Diskussion

In unseren Versuchen zeigt sich eine beträchtliche Zunahme der Toxizität für ACh, Physostigmin und Prostigmin unmittelbar nach 50 mg/kg Tetrabenazin. Aus den Versuchen von P L E T S C H E R und Mitarbeitern [3] u. a. [4], [5] geht hervor, daß Tetrabenazin eine Senkung des 5-Hydroxytryptaminund Noradrenalingehaltes im ZNS hervorruft. Dabei imponiert vor allem die plötzliche Herabsetzung des 5-HT-Gehaltes. Der Gehalt des Hirngewebes an Noradrenalin scheint dagegen erst nach 4 Std. seinen Tiefstpunkt zu erreichen. Die Depletion der biogenen Amine ist dabei nicht so stark wie nach Reserpin; sie bleibt außerdem auf das ZNS und das Nebennierenmark beschränkt. Die mit der Tetrabenazinapplikation sofort einsetzende Toxizitätssteigerung könnte den Schluß zulassen, daß dieser Vorgang mit einer Aminverarmung in Zusammenhang stehen könnte. Besonders der Verlauf der Toxizitätskurve für ACh scheint diese Annahme zu bestätigen. Die unmittelbar nach Tetrabenazin auftretende Mortalitätserhöhung bei den Cholinesterasehemmern könnte ebenso in einem Zusammenhang mit der plötzlichen Aminfreisetzung stehen. Jedoch ist der deutliche Rückgang der erhöhten Toxizität spätestens 3 Std. nach der Tetrabenazingabe nicht ohne weiteres mit dem Verlauf der Amindepletion zu korrelieren. Ebensowenig verständlich ist in diesem Zusammenhang die noch über mindestens 48 Std. anhaltende mäßige Toxizitätssteigerung für die beiden Cholinesterasehemmer. Die Unterschiede zwischen den Toxizitätskurven der Cholinesterasehemmer und des ACh sind bei diesen Versuchen durchaus nicht so auffällig wie bei denen, die wir mit Reserpin durchgeführt hatten. Sie könnten auf zusätzliche Eigen Wirkungen der Hemmer zurückgeführt werden, über die j a noch zu wenig bekannt ist. In unseren Versuchen mit Reserpin [2] ließ sich jedenfalls keinerlei Übereinstimmung zwischen Cholinesterasehemmern und ACh finden, vielmehr zeigte sich bei den Hemmstoffen ein völlig anderer Kurventyp, der einen zumindest 2-phasischen Verlauf erkennen ließ. Aus den Ergebnissen dieser Untersuchung und den vorausgegangenen Versuchen mit Reserpin [2] wollen wir noch nicht den Schluß ziehen, daß die nachgewiesenen Toxizitätsveränderungen mit den bekannten Aminveränderungen in Zusammenhang stehen. Die weitere Klärung dieser Fragen m u ß durch nachfolgende Untersuchungen erreicht werden.

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PRASAD:

[ 2 ] L I E B M A N N , H . U. H . M A T T H I E S :

Tetrabenazin-Wirkung

511

Summary H. L i e b m a n n and H. M a t t h i e s : Effect of tetrabenazine on the toxicity of acetylcholine, physostigmine and prostigmine Intraperitoneal application of 50 mg/kg of tetrabenazine immediately before the administration of cholinergic drugs (acetylcholine, physostigmine and prostigmine) considerably enhanced the toxicity of these substances. Within 2 to 3 hours following tetrabenazine administration the enhanced toxicity regressed for physostigmine and prostigmine. Acetylcholine returned to normal within 6 hours from pretreatment with tetrabenazine. Possible mechanisms of action are discussed. Pe3K»Me T . JlHÔMaHH H T . M a T T H c : BjiHHHHe TeTpa6eHa3HHa Ha t o k c h h h o c t b aijeTHJIXOJlHHa, (J)H30CTHrMHHa H npOCTHrMHHâ BHyTpHÔpiomHHHoe BBejieHHe 50 MT/KT TeTpa6eHa3HHa HenocpejjcTBeHHo nepen BBeseHHeM xojiHH3primHi>ix npenapaTOB (aijeTHjixojiHH, $H30CTHrMHH h npocTHrmhh) npHBOflHT k 3HâHHTejibH0My noBbiuieHHK) t o k c h h h o c t h 3THx BemecTB. Hepes 2 — 3 naca nocjie oôpaôoTKH TeTpa6eHa3HHOM noBtmieHHaH t o k c h m h o c t b HanHHaeT najiaTb hjih $H30CTHrMHHa h npocTHraHHa, Torna KaK t o k c h h h o c t i > aiieTHjixoJiHHa B03BpamaeTCH k HopMe cnycTH 6 nacoB nocne oôpaôoTKH TeTpa6eHa3HH0M. 06CyWHaiOTCH B03M0JKHHe MeXaHH3MBI neiiCTBHH.

Acta biol. med. german., Band 18, Seite 513 — 516 (1967) Aus dem Institut für gerichtliche Medizin der Universität Bonn (Direktor: Prof. Dr. H . E L B E L )

Familienuntersuchungen zur Vererbung im Duffy-System CH.

RITTNER

(Eingegangen am 1.12. 1966) Zusammenfassung Eine Serie von 60 Familien mit insgesamt 226 Kindern wurde auf die Merkmale Fy(a) und Fy(b) untersucht. Die beobachteten Häufigkeiten der Paarungen und der Kinderaufspaltung werden mit den erwarteten verglichen. In der Paarung Fy(a + b + ) x F y ( a — b + ) wurde eine schwach signifikante Abweichung gefunden. Für das Vorkommen des stummen Allels Fy fand sich in dem Untersuchungsgut kein Anhalt.

Obwohl das Blutgruppensystem Duffy schon früh entdeckt wurde — (CUTBUSH und Mitarbeiter [1] beschrieben schon 1950 den ersten Antikörper, genannt nach dem Patienten Anti-Duffy(a); IKIN und Mitarbeiter [2] fanden 1951 den Antikörper gegen das Antigen Fy(b)) — spielt das System Duffy in der Vaterschaftsbegutachtung heute noch eine geringe Rolle. Zunächst blieben seine Anwendungsmöglichkeiten durch den Mangel an brauchbaren Antiseren beschränkt. Die jetzt erhältlichen Antiseren wiederum sind nicht billig und erfassen häufig die Reaktoren mit niedrigen Scorewerten nicht (s. RACE und SANGER [3] über die unterschiedlichen Stärkegrade des Antigens Fy(a) in einer englischen Population). So bleibt der gerichtliche Beweiswert von Fy(a) bis heute begrenzt. PETTENKOFER [4] führt in einem Gutachten des Bundesgesundheitsamtes aus, daß einem Ausschluß nach Fy(a) vorerst nur die Bewertung „Vaterschaft sehr unwahrscheinlich"zuzuerkennen sei. Nach RACE undSANGER [3] a.a.O. ist bisher nur von CLEGHORN [5] ein unausgelesenes Familienmaterial mit beiden Antiseren — Anti-Fy(a) und AntiFy(b) — untersucht worden. Aus diesem Grunde schien uns die Untersuchung einer größeren Familienserie in Deutschland sinnvoll. Sie wurde aber insbesondere durch den Umstand gerechtfertigt, daß RACE und SANGER a.a.O. schreiben, daß das bei Negern postulierte stumme dritte Allel Fy, welches mit keinem der beiden Antiseren zu erfassen ist, in der kaukasischen Bevölkerung ebenfalls vorzukommen scheint. Sie fanden inzwischen sechs Familien in Europa, bei denen der Erbgang im Duffy-System nur unter Annahme eines dritten Allels befriedigend erklärt werden kann. Es war des-

514

CH. RITTNER

halb im Hinblick auf die forensische Verwertbarkeit von größtem Interesse, ob auch in unserem Material Kinder aus Paarungen stammen würden, deren Phänotyp nur durch die Annahme des stummen Allels bei den Eltern erklärt werden könnte. Material und Methodik Blutproben von Familien wurden im Rahmen der Ausstellung sog. Unfallschutzkarten gesammelt. Es handelt sich um insgesamt 60 Familien mit 226 Kindern, die einzig unter dem Gesichtspunkt eine Auslese darstellen, als drei Kinder pro Familie für die Untersuchung Bedingung waren. Zum Ausschluß illegitimer Kinder wurden folgende Systeme untersucht: ABO, Rhesus, Gm(a) und Gm(x) (nur bei einigen Familien, H p und Gc). Über die Bestimmung der neueren Serumeigenschaften — Ag(x), Lp und Xh — und ihre Ergebnisse soll an anderen Stellen berichtet werden. Antiseren: Im Untersuchungszeitraum (für die Frequenzbestimmung von Fya seit Ende 1963) wurden mehrere komplette und inkomplette Anti-Fy(a)-Seren, sowie mehrere inkomplette Anti-Fy(b)-Seren der Firmen Molter/Heidelberg und D A D E Corp./ USA verwendet. Alle Familienblute wurden mit zwei Anti-Fy(a)- und Anti-Fy(b)Seren untersucht. In vier Blutproben konnte Fy(b) bei der Erstuntersuchung nicht zweifelsfrei bestimmt werden. Drei Familien wurden daher zu erneuter Blutentnahme einbestellt. Die frisch entnommenen Blutproben wurden nunmehr mit drei „verschiedenen" Anti-Fy(b)Seren untersucht. (In Anbetracht der Seltenheit von kräftigen Anti-Fy(b)-Seren erscheint es fraglich, ob die von verschiedenen Firmen bezogenen Antiseren tatsächlich aus verschiedenen Quellen stammten.) In der Kontrolle konnten alle Blute einwandfrei bestimmt werden. Ergebnisse und Diskussion

Im westdeutschen Raum hat das Merkmal Fya folgende Häufigkeit, bestimmt an 1007 nicht blutsverwandten erwachsenen Personen (Tab. 1): Tabelle 1 n davon F y ( a + ) Fy(a-)

1007 Personen = 100% 666 Personen = 341 Personen =

66,14% 33,86%

Diese Frequenzen stehen in guter Übereinstimmung mit den in der Literatur angegebenen Zahlen. B L U M E N T H A L (zitiert nach P R O K O P und U H L E N B R U C H [6]) bestimmte in Berlin eine Häufigkeit für Fya von 69,9%, H O L L Ä N D E R in B A S E L 65,95%. Routineuntersuchungen mit Anti-Fy(b)-Seren werden von uns erst seit vorigem Jahr durchgeführt, so daß hierüber noch keine ausreichend große Stichprobe vorliegt. Die Ergebnisse der Familienuntersuchung sind in der Tabelle 2 festgehalten. Die hier angegebenen Erwartungswerte wurden aus den von R A C E und S A N GER a.a.O. für England angenommenen Genfrequenzen berechnet. Die Autoren gehen dabei von einer Schätzung der Häufigkeit des stummen Gens von

Vererbung im Duffy-System

515

ca. 3% in der kaukasischen Bevölkerung aus. Die Übernahme schien insofern gerechtfertigt, als eine größere Abweichung der Frequenzen auf dem Kontinent nicht zu erwarten ist. Entsprechende Zahlen liegen nicht vor. Andererseits erklärt sich aber hieraus vielleicht doch ein Teil der Abweichung zwischen gefundenen und erwarteten Zahlen in der Tabelle 2. Tabelle 2 Ergebnisse der Untersuchung von 60 Familien mit 226 Kindern aufFy(a) u n d F y ( b ) . Berechnung der Erwartungswerte unter Zugrundelegung der englischen Frequenzen nach R A C E und S A N G E R Kinder — Phänotypen Paarung

Kinder

1

n

erw.

beob.

Fy(a+b—) x F y ( a - f b - ) F y ( a - f b - ) xFy(a + b + ) Fy(a+b + )xFy(a+b + ) Fy(a-b + )xFy(a + b - ) Fy(a —b + ) X Fy(a—b + ) Fy(a+b + ) x F y ( a - b + ) seltene Phänotypen

2,5 11,2 12,8 8,1 6,7 18,6 0,1

0 5 15 7 5 28 0

21 51 28 20 106

gesamt

60,0

60

226

Fy(a + b - )

Fy(a + b + )

erw.

beob.

erw.

10,5 12,75 1,3 0 2,6

9 11 0 0 l

9,85 25,5 25 0 50,4

20

beob.

Fy(a- b+) erw.

12 0,65 25 12,75 2S 1,7 0 19,95 68 53 133

beob.

0 15 0 20 38 73

Bis auf die Paarung F y ( a - f b + ) x F y ( a — b + ) ergibt sich eine ausreichend gute Übereinstimmung zwischen den erwarteten und beobachteten Häufigkeiten der Paarungen und den Aufspaltungen der Kinder-Phänotypen. Die Unterschiede werden einmal dort evident, wo R A C E und S A N G E R das Auftreten des stummen Gens vermuten und einen Erwartungswert dafür angeben: ein solcher Phänotyp wurde nicht gefunden. Es fand sich im vorliegenden Material keine Konstellation, die sich nur unter Einbeziehung des stummen Gens erklären ließe. Ihr Vorkommen kann jedoch in unserem Untersuchungsgut auch nicht ausgeschlossen werden. Die größte Abweichung zwischen erwarteten und beobachteten Werten ergibt sich in der Paarung F y ( a + b + ) X Fy(a—b+), die insgesamt zu häufig gefunden wurde. In der Kinderaufspaltung liegt ein Überschuß der Träger beider Merkmale vor. Es war hier die Signifikanz zu prüfen: Für die Paarungshäufigkeit errechnet sich ein %2-Wert von 4,75 {p = 0,03), tatsächlich eine, wenn auch schwache Signifikanz. Für die Häufigkeit von Fy(a-f b-)-) unter den Kindern ist %2 6,08 (ft = 0,01), für den Phänotyp (a—b+) ist y* 5,45 (p = 0,02 für 1 F.G.). Als Erklärung reicht die Zugrundelegung der englischen Frequenzen allein nicht aus. R A C E und S A N G E R [ 3 ] schreiben freilich auch (S. 85), daß eine Wahrscheinlichkeit von 1 in 25 auf dem Gebiet der Blutgruppen häufig noch nicht als „signifikant" gelten kann, so daß eine zufällige Abweichung in unserem Material nicht ausgeschlossen ist. 35

Acta biol. med. german., Bd. 18, Heft 4-

516

CH. R I T T N E R

Bei den oben erwähnten drei Familien, die einer Kontrolluntersuchung unterworfen wurden, hatte zuerst der Verdacht bestanden, daß ein stummes Allel vorliegen könnte. Dies konnte nicht bestätigt werden. Frl. E . S T A D L E R und Frau gedankt.

CH. K U H N

sei für sorgfältige technische Mitarbeit herzlich

Literatur [1]

C U T B U S H , M . , P . L. M O L L I S O N U. D. M . P A R K I N : A new human blood group. Nature [London] 165, 188 (1950). [2] IKIN, E. W., A. E. M O U R A N T , J. J. P E T T E N K O F E R U. G. B L U M E N T H A L : Discovery of t h e expected haemagglutinin, anti-Fy(b). Nature [London] 168, 1077 (1951). [3] R A C E , R . R . U. R . S A N G E R : Blood groups in man. Blackwell, Oxford, 4. Aufl. ( 1 9 6 2 ) [4] P E T T E N K O F E R , H. J.: Gutachten des Bundesgesundheitsamtes zum Beweiswert von Fy(a). [5] CLEGHORN, T . E . : z i t . b e i R A C E u n d

[6]

SANGER.

G. U H L E N B R U C K : Lehrbuch der menschlichen Blut- und Serumgruppen. V E B Georg Thieme, Leipzig 1963.

P R O K O P , O . U.

Summary CH. R I T T N E R :

Family studies on heredity in the Duffy system

A series of 60 families with a total of 226 children was examined for the Fy(a) and Fy(b) factors. The frequency of matings observed and their splitting in children were compared with the anticipated rates. The mating F y ( a + b + ) X Fy(a — b + ) showed a weakly significant deviation. The occurrence of the silent allele Fy could not be evidenced in any of t h e individuals investigated. Pe3K>iwe X . P H T T H e p : CeMeftHbie HccjienoBaHHH no yHacjienoBaHHio B CHCTeMe D u f f y 6 0 ceMeftCTB c o B c e r o 2 2 6 jjBTbMH HccjienoBajiHCb Ha (Jtanropbi HacjieacTBeHHOcTH F y ( a ) H F y ( b ) . H a ß j n o n a e M a H nacTOTa cnapuBaHHft H pacnpejjejieHHe aKTopoB

no HeTHM cpaBHHBajiHCb c ojKHijaeMbiMH. B cnapHBaHHH F y ( a - | - b + ) x F y ( a — b + ) Ha6jnonaJiocb oTKJioHeHHe c HeKOTopoft CTeneHbio nocTOBepHocTH. Hajinnwe HeMoro ajiJiejiH F y 0ÖHapy>KeH0 HH B OHHOM H3 HCCjienoBaHHbix J I H U .

Acta biol. med. german., Band 18, Seite 517 — 527 (1967) Aus dem Institut für Pharmakologie und Toxikologie der Humboldt-Universität Berlin und dem Pharmakologischen Institut der Deutschen Akademie der Wissenschaften zu Berlin (Direktor: Prof. Dr. F. J U N G )

Speicherung von Dextran in Leber und Milz der Ratte bei chronischer Applikation und ihr Einfluß auf Teilfunktionen dieser Organe E . SCHULZE u n d H .

LÖWE

(Eingegangen am 30.11.1966) Zusammenfassung Bei chronischer Vorbehandlung mit Dextran (mittleres Molekulargewicht 6 5 0 0 0 ) zeigten Ratten nach Absetzen der Medikation am 51. Tag einen verringerten Abbau von Hexobarbital, der sich in einer verlängerten Schlafzeit ausdrückt. Lichtmikroskopisch lassen sich in Leber und Milz Hypertrophien und Wucherungen der Zellen des retikulohistiozytären Systems beobachten. Elektronenmikroskopisch erkennt man in diesen Zellen multiple „Phagosomen" mit osmiophilem Material, das als phagozytiertes Dextran zu deuten ist. Darüberhinaus zeigen die Leberparenchymzellen vorbehandelter Tiere multiple osmiophobe Einlagerungen im Zytoplasma, die bei den Kontrollen nicht zu beobachten sind. Der Zusammenhang zwischen den morphologischen und funktionellen Befunden wird diskutiert. Sowohl die funktionellen, als auch die morphologischen Befunde sind nach Aussetzen der Dextrangabe für anschließende 59 Tage unverändert nachzuweisen.

wurden von GRÖNWALL und INGELMAN [ 1 1 ] — [ 1 5 ] Dextrane als „kolloidales Blutersatzmittel" in die klinische Therapie eingeführt. Die so verwendeten Dextrane werden durch biologische Synthese gewonnen (B. leuconostoc mesentericus). Das Schicksal der Dextrane im Organismus ist von unmittelbarem Interesse, da der Pharmakologe von so eingesetztem makromolekularen Stoffen — unter Umständen werden sie in erheblichem Ausmaß infundiert — eine völlige Indifferenz im akuten und chronischen Versuch verlangen muß. Die verwendeten Dextrane haben ein mittleres Molekulargewicht von 8 0 0 0 0 . Dabei verteilen sich die Molekulargewichte der unterschiedlichen Anteile folgendermaßen: 8 0 % etwa 1 0 0 0 0 0 , 1 0 % höchstens 2 0 0 0 0 0 und 1 G % nicht unter 2 5 0 0 0 . Es ist also ein erheblicher Anteil höhermolekularen Dextrans beteiligt. 1944

Nach G R Ö N W A L L und I N G E L M A N N [ 1 1 ] — [ 1 5 ] sollen etwa 3 0 — 4 0 % des infundierten Dextrans im Laufe der ersten 5 — 6 Std. durch die Nieren ausgeschieden werden. S C H W A R T Z K O P F F und W E I G M A N N [ 1 9 ] infundierten am Menschen 5 0 0 ml einer 6 % Dextranlösung, wobei nach 6 Tagen erst 55% im Harn erschienen waren. Neben einer renalen Ausscheidung des unzerstörten Dextranmolekiils werden Abbauprozesse im 35*

518

E . SCHULZE, H . L Ö W E

Organismus angenommen [2], [5], [7], [17], wobei das D e x t r a n m o l e k ü l z. T. gespalten, z. T. in t o t o f e r m a n t a t i v modifiziert werden soll. Die Verweildauer einzelner Kompon e n t e n der infundierten D e x t r a n e im Organismus soll z. T. bis 56 Tage betragen, wie verschiedene Untersuchungen besagen [6], [18]. Dabei wird das D e x t r a n nach bisherigen Kenntnissen im R H S gespeichert u n d zwar vor allem der höhermolekulare Anteil. F R I M M E R u n d H Ü B L [9] fanden bei entsprechender Applikation sogar eine vorübergehende Blockade des R H S , deren M a x i m u m a m 2. Tage nach der Infusion lag. Alle diese Ergebnisse wurden nach einmaliger Gabe von D e x t r a n erhalten; chronische Gaben u n d deren Folgen f ü r den Organismus sind noch wenig b e k a n n t geworden. Solche Untersuchungen geben aber erst die Möglichkeit, eventuelle Nebenwirkungen d u r c h längere D e x t r a n g a b e n zu erkennen.

Eigene Vorversuche mit chronischer Gabe eines Dextrans mit dem Molekulargewicht von 67000 wiesen darauf hin, daß es neben der Speicherung im R H S zu einer Beeinflussung der Funktion der Leberparenchymzelle kommt. Das deutet auf eine zusätzliche Dextranspeicherung in den Parenchymzellen, die zu den beobachteten Funktionsstörungen führt. Neben diesen funktionellen Gesichtspunkten interessierte uns auch die Morphologie des Speicherungsvorganges, zumal in der Literatur gegensätzliche Meinungen existieren. Eine große Zahl von Autoren, u. a. G A B L E R und J U N G [ 1 0 ] , sehen in den Mitochondrien die speichernden Organellen. Andere wieder, wie A L T M A N N [1], berichten über Ablagerungen der gespeicherten Stoffe in den Organellen der GoLGi-Region oder auch unmittelbar im Zytoplasma. Wir untersuchten Leber, Milz und Nieren chronisch dextranvorbehandelter Ratten sowohl licht- wie auch elektronenmikroskopisch, nachdem wir vorher an den R a t t e n die Hexobarbital-Schlafzeit im Vergleich zu entsprechenden Kontrollen festgestellt hatten. Die Dauer der Schlafzeit kann dabei als direkter Hinweis auf den Barbituratabbau in den Leberparenchymzellen gewertet werden. Methodik 20 männliche A l b i n o r a t t e n wurden 51 Tage mit einer täglichen Dosis von 4 ml einer Dextranlösung i.p. injiziert. D a s Molekulargewicht des D e x t r a n s b e t r u g 67000. 1 Als Lösungsmittel diente physiologische Kochsalzlösung. I n Parallele wurden 20 männliche Albinoratten in gleicher Weise mit 0,9%iger NaCl-Lösung injiziert. Diese Gruppe diente als Kontrolle. Vor Beginn der Versuche wurde an jeder Gruppe die Hexobarbital-Schlafzeit b e s t i m m t : Eine 1 %ige Lösung von H e x o b a r b i t a l - N a t r i u m wurde in einer Dosierung von 100 mg/ kg K G i.p. injiziert. Als K r i t e r i u m der Schlafzeit diente die Seitenlage der Versuchstiere. N a c h dem 51. Tage wurde die D e x t r a n a p p l i k a t i o n eingestellt. N a c h B e s t i m m u n g der Hexobarbital-Schlafzeit wurde ein Teil der Tiere getötet, Leber, Milz u n d Nieren e n t n o m m e n u n d histologisch sowohl licht- als auch elektronenmikroskopisch aufgearbeitet. An den verbliebenen Versuchstieren jeder Gruppe wurde in 14-tägigen Abs t ä n d e n die Hexobarbital-Schlafzeit bis zum 110. T a g nach Versuchsbeginn weiterhin b e s t i m m t . A m 110. T a g wurden die restlichen Tiere getötet u n d die genannten Organe ebenfalls histologisch aufgearbeitet. 1

W i r d a n k e n dem V E B Serumwerk Bernburg f ü r die Überlassung der Substanz

Dextranspeicherung Lichtmikroskopische

519

Methodik

Fixierung der Organe in einem Formalm/Alkohol-Gemisch. P a r a f f i n e i n b e t t u n g . Die Mikrotomschnitte wurden mit der S t a n d a r d - H E - M e t h o d e gefärbt und lichtmikroskopisch u n a b h ä n g i g durch zwei Personen bewertet. Elektronenmikroskopische

Bewertung

Kleine Gewebeblöckchen jeden Organs wurden in Veronal-gepufferten 0 s 0 4 (pH 7,5) 90 min bei 4 °C fixiert, in Vestopal-W eingebettet u n d a m PoRTER-BLUM-Mikrotom mit Glasmessern geschnitten. Die Schnitte wurden mit U r a n y l a z e t a t oder Bleih y d r o x y d n a c h k o n t r a s t i e r t und m i t dem SEM-3-Elektronenmikroskop der F i r m a V E B Fernsehelektronik mikroskopiert (60 kV Strahlspannung).

Ergebnisse

l. Verhalten der

Hexobarbital-Schlafzeit

Wie aus der Abbildung 1 ersichtlich, zeigte sich die Hexobarbitalschlafzeit am 51 • Versuchstag bei den dextranbehandelten Tieren im Vergleich zu den Kontrollen und zum Anfangswert als signifikant verlängert. Auch nach Absetzen der Dextranapplikation blieb diese Schlafzeitverlängerung über einen Zeitraum von 56 Tagen weiter erhalten. Die Kontrollwerte zeigten sich gegen die Ausgangswerte beider Versuchsgruppen in dem angegebenen Streuungsbereich konstant. 80 70 ^ 0 E 50

Jbo 0

1o 20 10 0 Abb. 1. Hexobarbital-Schlafzeit von R a t t e n nach chronischer Vorbehandlung mit D e x t r a n von MG 67000. Weiße Säule = Kontrolle; schraffierte Säule = D e x t r a n - v o r b e h a n d e l t . K = Schlafzeit der R a t t e n vor Applikation der Substanz (28 Tiere); I = Schlafzeit der R a t t e n sofort nach Absetzen der D e x t r a n a p p l i k a t i o n 51 Tage nach Versuchsbeginn, Signifikanz p < 1 % ; I I = Schlafzeit der R a t t e n 2 Wochen nach Absetzen der D e x t r a n applikation, Signifikanz p < 1 % ; I I I = Schlafzeit der R a t t e n 4 Wochen nach Absetzen der D e x t r a n a p p l i k a t i o n , Signifikanz p < 5 % ; IV = Schlafzeit der R a t t e n 6 Wochen nach Absetzen der D e x t r a n a p p l i k a t i o n , Signifikanz p < 5 % ; V = Schläfzeit der R a t t e n 8 Wochen nach Absetzen der Dextranapplikation, Signifikanz, p < 5%

520

E . SCHULZE, H .

LÖWE

2. Histologische Veränderungen in der Milz Lichtmikroskopisch zeigten sich im Gegensatz zu den Kontrollen Hypertrophien und Zell Wucherungen der weißen Milzpulpa. In der Abbildung 2 sind im lichtmikroskopischen Bild knötchenartige, hypertrophierte Retikulumzellen der weißen Pulpa dargestellt.

Abb. 2. Histiozytenwucherungen in der weißen Milzpulpa einer dextranvorbehandelten R a t t e (110. Tag)

Elektronenmikroskopisch zeigten sich analoge Bilder: Die Retikulumzellen der weißen Pulpa waren vergrößert und enthielten in ihrem Zytoplasma verschieden geformte Speichervakuolen. Die Phagozytoseeinschlüsse entsprechen dabei im wesentlichen den von GABLER und JUNG [10] beschriebenen Formen (Abb. 4). Die Veränderungen waren vom 51-—110. Tag in gleicher Form nachweisbar. j. Veränderungen in der Leber a) S t e r n z e l l e n Die dextranbehandelten Tiere zeigten lichtmikroskopisch sichtbar Sternzellenwucherungen und -hypertrophien, die sich im Gewebeschnitt als mutiple Granulome darstellten (Abb. 3). Unter dem Elektronenmikroskop fanden sich die Sternzellen analog den lichtmikroskopischen Befunden hypertrophiert und zeigten zahlreiche Speichereinschlüsse. Diese Einschlüsse gli chen dabei im wesentlichen den in der Milz beobachteten Formen. Neben diesen Phagozytoseeinschlüssen fanden sich normal gestaltete Mitochondrien. Ein Hinweis darauf, daß phagozytiertes Material in Mitochondrien gespeichert wird, konnte in keinem Fall gefunden werden (Abb. 5)-

Dextranspeicherung

521

Abb. 3. H y p e r t r o p h i e der Sternzellen in der Leber einer dextranvorbehandelten R a t t e (110. Tag)

b) L e b e r p a r e n c h y m z e l l e n (Abb. 6 und 7) Lichtmikroskopisch erschienen die Parenchymzellen der vorbehandelten Tiere z. T. mit schaumig aufgelockertem Zytoplasma. Elektronenmikroskopisch zeigten sich in ihrem Grundzytoplasma massive Einlagerungen osmiophoben Materials. Das eingelagerte Material engt dabei die Organellen des Zytoplasmas weitgehend ein. Die restlichen Mitochondrien und Elemente der Mikrosomenfraktion zeigten keine pathologischen Veränderungen. c) E x t r a z e l l u l ä r e V e r ä n d e r u n g e n Zwischen den Parenchymzellen zeigten sich die Gallekapillaren z. T. erweitert und mit einem feingranulärem osmiophilen Material angefüllt. Die Mikrovilli waren im Gegensatz zu den entsprechenden Kontrollen sehr zahlreich. Auch im DissEschen Raum fand sich häufig das feingranuläre osmiophile Material, welches auch in den Gallekapillaren zu beobachten war. 4. Veränderungen in der Niere Die Nieren der vorbehandelten Tiere zeigten weder lichtmikroskopisch noch elektronenmikroskopisch auffällige pathologische Befunde. Diskussion

Die chronische Gabe hochmolekularer Dextrane führt sowohl in der Milz als auch in der Leber zu einer Hypertrophie der speichernden Zellen des retikulohistiozytären Systems. In der Praxis muß man bei dieser Veränderung

522

K . SCHULZE, H . L Ö W E

A b b . 4. H i s t i o z y t der Milz einer d e x t r a n v o r b e h a n d e l t e n R a t t e (110. Tag). Neben H ä m o s i d e r i n a b l a g e r u n g e n finden sich m e m b r a n b e g r e n z t e P h a g o s o m e n ( y ) A b k ü r z u n g e n siehe A b b . 7

eine Teilblockade des RHS annehmen, wie das von F K I M M E K und H Ü B L ' 9 ] im akuten Versuch schon beschrieben wurde. Das RHS ist dadurch in seiner Abwehrfunktion für den Organismus beeinträchtigt. Neben der Speicherung im RHS läßt sich jedoch auch eine massive Einlagerung von Dextran in die Leberparenchymzellen der chronisch vorbehandelten Ratten erkennen. Die parallel durchgeführten Versuche zum Hexobarbitalabbau an solchen Versuchstieren zeigten eine funktionelle Minderung der enzymatischen Abbauvorgänge körperfremder Substanzen in der Leber. Da die abbauenden En-

Dextranspeicherung

523

Abb. 5. Hypertrophierte Sternzelle aus der Leber einer dextranvorbehandelten Ratte (110. Tag) mit großen Phasogomen ( -j, )

524

E . SCHULZE, H .

LÖWE

M

.

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-

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:

•KHTe,jibHocTH CHa. Ha6jiK>HeHHH Ha CBeTOBOM MHKpocKone o6Hapy>KHBaK)T b neqeHH h cejie3eHKe HajiHHHe rHnepTpo(J)HH h pa3pacTaHHH KJieTOK peTHKyjioracTHouHTapHOM c h c t c m h . H a a a e K T p o H H O M MHKpocKone w e b 3 t h x K J i e T K a x p a c n o 3 H a r o T C H M H O H i e c T B e H H b i e ,,$arOCOMbl" C OCMHO(J>H,JIbHbIIVl M a T e p H a j I O M , KOTOpblH CHHTaeTCH (JtarOLtHTHpOBaHHbiM neKCTpaHOM. KpoMe Toro, ne^eHoiHbie napeHXHMaT03Hbie KJieTKH npeHBapHTejIbHO 06pa60TaHHbIX 5KHBOTHHX nOKa3HBaiOT MHOHteCTBeHHbie OCMMOo6Hbie BKJIIOHeHHH B L(HT0njia3Me, K O T O p b i e OTCyTCTByiOT y KOHTpOJlbHblX 06pa3II0B. 06cyHtnaeTCH B3aHMooTHomeHne Mewny Mop$oJiorHHecKHMH H $yHKi(HOHa,JibHbiMH

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o6Hapy>KHTb 3a HajibHeftiiiHe 59 nHeii nocjie npeKpameHHH n a ™ neKCTpaHa.

Acta biol. med. german., Band IS, Seite 529—540 (1967) Aus der Abteilung für Elektronenmikroskopie der Charité (Leiter: Prof. Dr. H. D A V I D ) am Pathologischen Institut der Humboldt-Universität Berlin (Direktor: Prof. Dr. L. H. KEÏTLER)

Anordnung und Aufbau der Polysomen In der intakten Rattenleberzelle H . DAVID u n d E .

METZLER

(Eingegangen am 21. 11. 1966) Zusammenfassung Untersuchungen an 200 membrangebundenen Polysomen und 100 freien Polysomen in der normalen, intakten Leberzelle der R a t t e zeigen, daß zwischen beiden Formen Differenzen bestehen. Die membrangebundenen Polysomen setzen sich aus 7 — 23 Einzelribosomen zusammen und haben eine spiralförmige oder helixartige Gestalt, die freien Polysomen stellen unregelmäßige Aggregate von 4—13 Ribosomen dar. Die Durchschnittsgröße eines Ribosoms liegt in beiden Fällen bei 15 nm. 75% der membrangebundenen Polysomen besitzen eine Gesamtlänge von 500— 750 nm. In etwa 55% der Polysomen sind Dissoziationen eines oder mehrerer Ribosomen an den Enden zu beobachten. Diese Befunde entsprechen der ans isolierten Systemen gewonnenen Anschauung, daß die Ribosomen innerhalb der Pol}'somen an einem m-RNS-Faden entlangwandern und nach Fertigstellung der Peptide am Ende freigesetzt werden.

Während die Zahl der biochemischen Untersuchungen über Struktur und Funktion der Ribosomen und Polysomen schon sehr groß ist, liegen nur relativ wenige Arbeiten über die Form der Polysomen und der sie bildenden Ribosomen in der intakten Zelle vor. Es erhebt sich deshalb die Frage, wie weit die im Homogenat vorhandenen Polysomen dem Normalzustand in der Zelle entsprechen und ob sich aus dem morphologischen Bild Rückschlüsse auf die Länge der m-RNS und der durch sie bestimmten Zahl der angelagerten Ribosomen ergeben. Durch die intrazelluläre Analyse der Polysomen entsteht gleichzeitig die Möglichkeit, vorhandene Unterschiede zwischen den membrangebundenen und frei im Grundplasma liegenden Polysomen festzustellen, was nach der Homogenisation und fraktionierten Zentrifugation der Zelle auf Grund der möglichen Ablösung der Ribosomen von den Membranen bzw. der Zerstörung der Membranen und des Zerfalls der Polysomen schwer faßbar und in vielen Fällen zur Analyse der Eiweißsyntheseprozesse auch gar nicht erwünscht ist. Am häufigsten sind in intakten Zellen helixartige Anordnungen. Die bisherigen Untersuchungen über den intrazellulären Aufbau der Polysomen betreffen neben der Leber verschiedene Zelltypen. Helixformen wurden dabei innerhalb des Grundplasmas von mehreren Pflanzenzellarten beob-

530

H . DAVID, E . METZLER

achtet [ 1 0 ] , [17], [ 1 9 ] . B O N N E T und N E W C O M B [ 1 0 ] sahen in den Wurzelzellen des Rettichs helixförmige Polysomen auf den Membranen des endoplasmatischen Retikulums, die sich aus 15—17 einzelnen Ribosomen zusammensetzten. Ähnliche Polysomenformen sind bei Amöben vorwiegend im Kern, seltener im Zytoplasma zu finden [4], [10]. Polysomen von spiraligem oder helixartigem Arrangement sind auch in Retikulozyten [31], in sich differenzierenden Muskelzellen [36], in embryonalen Darmepithelzellen [5], Fibroblasten [36] und anderen Zellarten [20], [21], [29] vorhanden. Die Zahl der ein Polysom bildenden Ribosomen ist unterschiedlich und schwankt zwischen 4—5 und 15—20 [18]. Wahrscheinlich hängt die Länge eines Polysoms und die Zahl seiner Ribosomen von der Länge des m-RNS-Fadens ab, an dem die einzelnen Ribosomen angeheftet sind. Aus der Zahl der Ribosomen eines Polysoms ist indirekt abzulesen, ob Peptide mit hohem oder niedrigem Molekulargewicht synthetisiert werden. Polysomen mit 15—27 Ribosomen und einem Zentrum zu Zentrum-Abstand von 27,5 nm, was einem m-RNS-Faden von etwa 500 nm entspricht, sollen Proteine mit einem Molekulargewicht von 5 0 0 0 0 bilden können [ 1 0 ] . In der Muskulatur sollen aus bis zu 100 Ribosomen aufgebaute Polysomen zu finden sein, an denen große Moleküle wie Myosin synthetisiert werden [1], wobei jedoch eine polyzistronische m-RNS angenommen werden muß. Material und Methodik Die Untersuchungen erfolgten an normalen Leberzellen von weißen R a t t e n eines Inzuchtstammes. Das Lebergewebe wurde in 1 %iger isotonischer, bei p H 7,2 gepufferter OSO.,-Lösung fixiert, in Azeton entwässert und in Vestopal W eingebettet. Die Ultradiinnschnitte wurden mit einem Ultrotom (LKB-Producter, Stockholm) hergestellt und mit Bleizitrat nachkontrastiert. Die elektronenmikroskopischen Aufnahmen wurden mit einem SEM 3 -Elektronenmikroskop des V E B Fernsehelektronik Berlin bei einer Vergrößerung von 10000 durchgeführt. Die auf 77000fach vergrößerten Abbildungen wurden mit einem Episkop an eine Leinwand projiziert, woraus sich eine weitere Vergrößerung um den Faktor 8,2 ergab. Die Messungen erfolgten also bei einer Gesamtvergrößerung von 631 400. Ergebnisse

Die Ergebnisse beruhen auf der Messung von 200 membrangebundenen und 100 freien Polysomen aus normalen Rattenleberzellen. Die Gesamtzahl der ausgewerteten einzelnen Ribosomen aus diesen Polysomen beträgt 3157, wobei es sich um 2446 membranständige und 711 freie Ribosomen handelt. Freie und membranständige Einzelribosomen wurden nicht beurteilt. Als membranständig gelten die Polysomen, die den Membranen des endoplasmatischen Retikulums eng angelagert sind, so daß sich im Querschnitt das Bild des granulären endoplasmatischen Retikulums ergibt. Gemessen wurden nur diejenigen Polysomen des granulären endoplasmatischen Retikulums, die bei Tangentialschnitten angetroffen wurden, wobei eine schwache Osmiophilie des Untergrundes und der Übergang in das Membransystem in der Nachbarschaft als Kriterien gelten (Abb. 1, 2, 3).

Abb. 1. Ausschnitt aus einer Leberparenchymzelle der normalen Ratte. Im Bereich tangential angeschnittener Membranen des granulären endoplasmatischen Retikulums (schwach osmiophil) sind helixartige, schraubenförmige und häkchenartige Polysomen zu sehen (umrandet). 100000fach 36

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Abb. 2. Granuläres endoplasmatisches Retikulum aus einer Leberparenchymzelle der R a t t e . Unregelmäßige Anlagerung der Ribosomen an die Außenseite der Membranen im Querschnitt. I m T a n g e n t i a l s c h n i t t durch die Membranen wechselnde Konfiguration der Polysomen (umrandet). Zwischen den Membranen im Grundplasma freie P o l y somen (—>), die Aggregate von Ribosomen ohne besondere Konfiguration darstellen. 100000fach

Polysomen-Struktur in Leberzellen

Abb. 3- Ausschnitt aus zwei Parcnchymzellen der Rattenleber mit Anhäufung von freien Polysomen (->). Diese bestehen aus einer wechselnden Zahl von einzelnen Ribosomen und haben eine unregelmäßige Gestalt. lOOOOOfach

Die membranständigen Polysomen stellen kettenförmige, wechselnd konfigurierte Gebilde dar. Sie haben fast niemals einen gestreckten Verlauf, sondern sind schlmgenförmig, helixartig, schraubenförmig oder auch kreisrund (Abb. 4). Die bei unseren Messungen beurteilten Polysomen bestehen aus mindestens 7 und höchstens 23 Ribosomen (Abb. 5)- Die durchschnittliche Zahl liegt bei 12. Aus den unterschiedlichen Konfigurationen der Polysomen ergibt sich, im Gegensatz zu anderen Anschauungen, daß im Querschnitt durch die Membransysteme des granulären endoplasmatischen Retikulums keine regelmäßigen Abstände zwischen den Ribosomen zu erwarten sind, da sie im allgemeinen unter diesem Gesichtswinkel keinen funktionellen Zusammenhang besitzen (Abb. 4). Die Entfernung der Ribosomen von der Außenseite der Membranen liegt zwischen 0 und 1 nm, wobei Artefakte für diese Werte mit eingerechnet werden müssen. 36*

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Abb. 4. a (oben): Beispiel für die Konfiguration von membrangebundenen Polysomen (Aufsicht), b (unten): Querschnitt durch das gleiche Modell wie a) mit Darstellung der unregelmäßigen Ribosomenabstände, bedingt durch ihre Zugehörigkeit zu verschiedenen unterschiedlich konfigurierten Polysomen

Abb. 5- Schematische Darstellung der Zahl der Ribosomen je Polysom. Abszisse: Anzahl der Ribosomen; Ordinate: Prozentsatz der Polysomen mit einer bestimmten Zahl an Ribosomen. = membrangebundene Polysomen; = freie Polysomen

Polysomen-Struktur in Leberzellen

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Die freien Polysomen zeigen im Gegensatz zu den membrangebundenen keine erkennbare kettenartige Anordnung. Sie sind zu größeren Komplexen angeordnet. Wegen der dreidimensionalen Ausdehnung dieser Polysomen können keine so eindeutigen Aussagen gemacht werden wie bei den membranständigen. Deshalb muß unsere Zählung über die Anzahl der Ribosomen je freies Polysom als nicht vollkommen korrekt angesehen werden. Die kleinste Ribosomenzahl je freies Polysom beträgt 4, die größte 13, woraus sich ein Durchschnittswert von 7 ergibt. Unsere Messungen über die Größe der Ribosomen haben relativ einheitliche Werte erbracht (Abb. 6). Zwischen den membrangebundenen und freien Ribosomen ergeben sich keine Differenzen. Ihre Größe liegt zwischen 10 und 25 nm mit einem Maximum bei 12,5 —15 nm. Der Durchschnittswert liegt bei den membrangebundenen Ribosomen bei 15,4nm, beiden freien bei I5,0nm.

Abb. 6. Schematische Darstellung der Ribosomengröße der membrangebundenen ( ) und freien ( ) Polysomen. Abszisse: Größe in n m ; Ordinate: prozentualer Anteil

Die Gesamtlänge des einzelnen Polysoms konnte unter den vorliegenden Versuchsbedingungen nur für die membranständigen bestimmt werden. Die Länge eines Polysoms ergibt sich aus der Gesamtzahl der Durchmesser der dem Polysom zugehörigen Ribosomen und den dazwischenliegenden Abständen. 15% der gemessenen Polysomen sind unter 250 nm lang, 75% der Polysomen haben eine Länge zwischen 250 und 500 nm, 10% sind 500 bis 750 nm lang (Abb. 7). Die Befunde über die Verteilung der Abstände zwischen den Ribosomen in den membrangebundenen Polysomen stehen in Übereinstimmung mit den aus isolierten Systemen gewonnenen Vorstellungen über den Ablauf der Eiweißsynthese. In wenigen Bereichen beobachtet man außerdem zwischen den Ribosomen 2—3 nm breite, schwach osmiophile Fäden. Der allgemeine Abstand zwischen den Ribosomen liegt in 89% der Abstände bei Werten bis zu 20 nm. Von größerem Interesse sind die restlichen 11 %, die bei Werten von 22,5—55 nm liegen. 55,5% der Polysomen ( = 1 1 1 ) zeigen in ihrem Verlauf eine oder mehrere derartige Dissoziationsstellen. Bei 69 Polysomen ist nur eine Abtrennungsstelle vorhanden, bei 42 Polysomen sind sie mehrmals zu sehen (Abb. 8). Von den 174 gemessenen Abständen über 22,5 nm waren 41 ( = 24%) am Ende der Polysomen lokalisiert, d. h. stellen eine

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Abb. 7. Schematische Darstellung des Prozentsatzes (Ordinate) der verschie- ¿,q _ denen Längen der membranständigen Polysomen. % Abszisse: Länge in nm ,n

20

-

10-

0

1

1

-250

-375

1

-500

1

1

-625

-750 nm

Abtrennung des letzten Ribosoms dar. In weiteren 38 Fällen lag die Dissoziation so, daß 2 Ribosomen abgetrennt-wurden. In den anderen Fällen waren an den verschiedensten Stellen Dissoziationen zu beobachten, wobei besonders bei den sehr langen Polysomen (über 15 Ribosomen) oftmals eine Trennung in der Mitte zu erkennen war. Hierbei muß jedoch die Möglichkeit bedacht werden, daß derartige Trennungen auch durch Faltungen des m-RNS-Fadens aus der Bildebene vorgetäuscht werden können, was wir jedoch nicht für sehr wahrscheinlich halten. Da wir naturgemäß nicht feststellen konnten, wo Anfang und Ende eines Polysoms liegen, haben wir die Berechnungen der Dissoziationsstellen immer so durchgeführt, daß die dem Kettenpol nächste Stelle angegeben wurde. 70 60

•

50 40

EEE

30 20 10

0

-

MM

=E 1

-

69 42 A B

41 1

36 2

30 3

17 4

17 5

15 6

Tfr\

|

7über7

Abb. 8. Schematische Darstellung der Dissoziation von Ribosomen aus den membrangebundenen Polysomen. Gesamtzahl 200. A = Anzahl der Polysomen mit einer Dissoziationsstelle; B = Anzahl der Polysomen mit zwei oder mehreren Dissoziationsstellen. Auf der Abszisse weiterhin Angabe über die Verteilung der Abtrennungsstellen der Ribosomen (1 = 1 Ribosom abgetrennt, 2 = 2 Ribosomen abgetrennt usw.)

Polysomen-Struktur in Leberzellen

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Diskussion

Der Ablauf der Stoffwechselprozesse bei der RNS-abhängigen Proteinsynthese und die Verbindung der Vorgänge mit den einzelnen Zellbestandteilen sind aus isolierten Systemen im wesentlichen bekannt. Es ist notwendig, die erzielten Ergebnisse in der intakten Zelle zu überprüfen, da erst so Aufschlüsse über die Vorgänge in vivo erlangt werden können. In der normalen Leberzelle beträgt die Oberfläche der Membranen des endoplasmatischen Retikulums auf beiden Seiten 2 5 0 0 0 — 5 0 0 0 0 (I.3 [26]. Daraus ergibt sich fast als selbstverständlich, daß der größte Teil der vorhandenen Polysomen und Ribosomen in der reifen Zelle den Membranen angelagert ist, im Gegensatz zu den embryonalen Zellen mit nur wenigen Membranprofilen [16]. Die membrangebundenen Polysomen sollen besonders für die Proteine wichtig sein, die für den Export aus der Zelle bestimmt sind [3]. Die Hauptsyntheseaktivität soll in der reifen Leberzelle in den Ribosomen an den Membranen stattfinden [23]. Dabei besitzen die Membranen selbst ebenfalls durch eine Aktivierung der Aminosäureinkorporation für den Eiweißsyntheseprozeß eine Bedeutung [24]. Nach WEBB et al. [48] sind 50% der Polysomen membranständig. Strukturuntersuchungen an den Ribosomen haben ergeben, daß sie sich aus verschiedenen Untereinheiten zusammensetzen [3], [15], [22], [25], [32], [35], [41], [42], [43], [47]. Diese Untereinheiten sind bisher in der intakten Zelle nicht gesehen worden. COSSEL und POTEL [14] fanden Häufigkeitsgipfel bei ihren Ribosomenmessungen in einem Abstand von jeweils 2 nm mit einem Durchschnittswert von 1 4 , 5 — 3 1 nm. Die bisherigen Angaben über die Ribosomengröße in Zellen schwanken zwischen 10 und 20 nm. Unsere Befunde liegen mit 15,4 nm und 15 nm im Bereich dieser Ergebnisse. Besonders hervorzuheben ist, daß zwischen den membrangebundenen und freien Ribosomen keine Unterschiede bestehen. Bei den in vitro-Untersuchungen werden im allgemeinen höhere Werte angegeben, wobei jedoch Quellungen während der Präparation und die andersartige Methode der Darstellung eine Rolle spielen. Schrumpfungen der Ribosomen während der Fixierung und Einbettung in der intakten Zelle können ebenfalls bei den Messungen bedeutungsvoll sein. Unser besonderes Interesse galt der Konfiguration und Zahl der Polysomen. Wie in vielen anderen Organen sind auch die Polysomen der Leberzellen spiralförmig oder helixartig angeordnet [6], [7], pH], [33], [39]Von den anderen Autoren wird meist die Frage offen gelassen, ob es sich um membranständige oder freie Polysomen handelt, wobei von der Feststellung auszugehen ist, daß 3 0 — 5 0 % der Ribosomen als Polysomen vorliegen [8]. Die Polysomen sollen dabei an den Membranen liegen [48], während die Monomeren und Dimeren häufiger frei im Grundplasma lokalisiert sind. Nicht nur das Verhältnis der freien Ribosomen zu den Polysomen, sondern auch die Relation von freien und membrangebundenen Polysomen ist Ausdruck bestimmter Stoffwechselsituationen in der Leber,

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wie sie sich z. B. in der regenerierenden Leber nach partieller Hepatektomie äußern [12]. Unsere Untersuchungen zeigen, daß die kettenförmigen Polysomen verschiedener Konfiguration den Membranen angelagert sind. Die freien Polysomen bilden dagegen meist Aggregate und somit dreidimensionale Komplexe im Gegensatz zu den zweidimensionalen an den Membranen. In beiden Fällen läßt sich unter günstigen Bedingungen ein 2—3 nm breiter Faden nachweisen, der wahrscheinlich m-RNS darstellt [6], [7]. Bei den Ribosomenanhäufungen im Grundplasma kann jedoch nichts sicheres über ihre funktionelle Bedeutung gesagt werden, so daß z. B. unter pathologischen Bedingungen auch eine zufällige Aggregation angenommen werden kann oder muß [9], [41]. Aus der Voraussetzung einer Verbindung von Polysomen und nicht von einzelnen Ribosomen mit den Membranen des granulären endoplasmatischen Retikulums ergibt sich, warum auf Querschnitten durch die Membransysteme eine unregelmäßige Lagerung und ein ungleicher Abstand als regelrecht anzusehen ist, wie es auch schon von B R U N I und P O R T E R [11] und anderen beschrieben wird. Eine regelmäßige Lagerung kann unter Umständen schon als pathologisches Ereignis mit einem Hinweis auf einen m-RNS-Verlust gedeutet werden. Der Abstand von 20—30 nm soll etwa 60—90 Nukleotiden innerhalb des m-RNS-Fadens entsprechen [8]. Die durchschnittliche Entfernung der Polysomen von der Außenfläche der Membranen des granulären endoplasmatischen Retikulums ist schwer zu bestimmen. Sie liegt im allgemeinen zwischen 0 und 1 nm. Hierbei sind jedoch Schrumpfungsartefakte während des Fixierungs- und Einbettungsvorganges sicher von nicht unerheblicher Bedeutung. Wir können aus unseren Untersuchungen nicht entscheiden, ob ein Polysom nur mit einem Ribosom [7] oder mit mehreren bzw. allen der Membran angeheftet ist. Die im wesentlichen jedoch zweidimensionale Lagerung bei den Tangentialschnitten läßt zumindest eine gleichmäßigere Lagerung parallel zur Membranoberfläche vermuten. Unsere Befunde über die Zahl der Ribosomen je Polysom und ihre Länge an den Membranen liegen im Bereich der Angaben anderer Autoren [1], [6], [7], [28], [30], [34], [37], [38], [44], [49]. Die höchste Proteinsyntheserate findet dabei an den membrangebundenen Polysomen statt [2], [13]- Nach B A C H und JOHNSON [2] sind in HeLa-Zellen die membrangebundenen Polysomen aktiver als die freien Polysomen. Die Zeit der Bildung für eine Polypeptidkette hängt von der Dauer der Wanderung des Ribosoms an dem m-RNS-Faden und damit von der Länge des m-RNS-Fadens ab [34]. Bei der Proteinsynthese lösen sich dabei nach der Fertigstellung einer Peptidkette die Ribosomen von dem m-RNS-Faden ab. Unsere Ergebnisse hinsichtlich der Dissoziation der Ribosomen aus einem Polysom stehen mit dieser Anschauung in Übereinstimmung. Während jedoch im allgemeinen immer nur ein Ribosom zum Ende eines Polysoms freigesetzt werden soll, sahen wir auch Dissoziationen an anderen Stellen oder auch bei sehr langen Polysomen inmitten der Ketten. Ob es sich dabei um Artefakte oder um

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funktionell bedeutungsvolle Erscheinungen handelt, läßt sich bisher nicht klären. Auf Grund der Messungen der auswertbaren membrangebundenen Polysomen ist zu beweisen, daß zum Zeitpunkt der Untersuchung etwa 50% der vorhandenen Polysomen Polypeptidketten fertig synthetisiert hatten, wenn man von der Voraussetzung ausgeht, daß die Dissoziation der Ribosomen an den Endstellen als Zeichen eines derartigen Vorganges anzusehen ist. Die Befunde zeigen, daß die an isolierten Systemen gewonnenen Ergebnisse über die Beziehungen der Proteinsynthese zu den Ribosomen/Polysomen auch aus den Strukturen in der intakten Zelle selbst bestätigt werden können. Gleichzeitig geben sie Aufschlüsse über die im Homogenat nicht oder nur teilweise lösbaren Probleme, die der Anordnung der Polysomen an den Membranen oder im Grundplasma, ihrer Konfiguration und Größe. Erst die Kombination der Untersuchung an isolierten Zellbestandteilen und der Gesamtzelle ermöglicht es, die Zusammenhänge zwischen Struktur und Funktion in vivo voll zu erfassen. Literatur Brit. Med. Bull. 2 1 , 217 ( 1 9 6 5 ) . M. K. U. H . G. J O H N S O N : Nature [London] 2 0 9 , 893 (1966). B A R B I E R I , G. P . U. A . D I M A R C O : Exp. Cell Res. 3 0 , 193 (1963). B A R K E R , D. C.: I I I . europ. Conf. f. Electron Microscopy Prague 1964, B 4 1 . B E H N K E , O.: Exp. Cell Res. 3 0 , 597 (1963). B E N E D E T T I , E. L., W . S . B O N T U. H . B L O E M E N D A L : Lab. Invest. 1 5 , 1 9 6 (1966). B E N E D E T T I , E. L., W . S . B O N T U. H . B L O E M E N D A L : Nature [London] 2 1 0 , 1 1 5 6

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Summary H . DAVID a n d E . METZLER: A r r a n g e m e n t a n d s t r u c t u r e of p o l y s o m e s in i n t a c t r a t liver cells S t u d i e s o n 200 m e m b r a n e - b o u n d p o l y s o m e s a n d 100 f r e e p o l y s o m e s in t h e n o r m a l i n t a c t liver cell of t h e r a t r e v e a l e d d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e t w o t y p e s . M e m b r a n e b o u n d p o l y s o m e s a r e c o m p o s e d of 7 t o 23 i n d i v i d u a l r i b o s o m e s a n d a r e of s p i r a l s h a p e d a n d h e l i x - l i k e c o n f i g u r a t i o n ; f r e e p o l y s o m e s a p p e a r e d as i r r e g u l a r a g g r e g a t e s of 4 t o 13 r i b o s o m e s . T h e i r a v e r a g e size w a s 15 n m in b o t h cases. 75 p e r c e n t of t h e m e m b r a n e - b o u n d p o l y s o m e s a r e 500 t o 750 n m long. I n a b o u t 55 p e r c e n t of t h e p o l y s o m e s , o n e single or s e v e r a l r i b o s o m e s h a d d i s s o c i a t e d a t t h e i r e n d i n g s . T h e s e f i n d i n g s a r e in a c c o r d a n c e w i t h t h e c o n c e p t i o n d e r i v e d f r o m i s o l a t e d s y s t e m s t h a t t h e r i b o s o m e s w i t h i n t h e p o l y s o m e s a r e .traveling a l o n g a m - R N A s t r a n d a r e s e t f r e e a t its t e r m i n a t i o n as t h e peptides are completed. Pe3wiwe r. .IJaBHa; H 3 . M e T U J i e p : P a c n o J i o w e H H e H CTpyKTypa n o j m c o M B HHTaKTHoit neneHOHHO0 KJieTKe Kpbicw HccjienoBaHHH 2 0 0 CBH3aHHbix c MeMGpaHoft IIOJIHCOM H 1 0 0 C B O S O H H M X IIOJIHCOM: B HopMajibHoii, HHTaKTHOil neqeHOHHOH KJieTKe Kpbicw noKa3ajiH cymecTBOBaHHe OTJIHHHii MejKHy oCeHMH ie a r p e r a r a H3 4 — 1 3 P H 6 O C O M . CpeaHHii pa3Mep o«Hoii PHSOCOMH B O6OHX c j i y q a n x paBeH 1 5 HM. 75 npon;eHTOB cBH3aHHbix noJiHcoM HMEET o 6 m y i o RJiHHy B 5 0 0 — 7 5 0 HM. IIpHMepHO nojioBHHa noJincoM o S i i a p y j K H B a e T NHCCOUNAIIHH OAHOH HJIH H 6 C K O J I B K H X P H S O C O M H a H X O K O H I A H H H X .

flaHHbie pe3yjibTaTH cooTBeTCTByioT MHeHHio, cjioHiHBiiieMycH Ha 0CH0Be H3yneHHH H30JIHp0BaHHbIX CHCTEM, MTO pH^OCOMbl B H Y T P H nOJIHCOM HBHraiOTCH BROJIb H H T H M P H K H BBICBO6O>Ki;aK)TCH Ha ee KOHue n o c j i e TOTOBKH nenTHHOB.

Acta biol. med. german., Band 18, Seite 541 — 549 (1967) Aus der Universitätskinderklinik der Charité, Berlin (Direktor Prof. Dr. med. habil. J . D I E C K H O F . F ) und dem V E B Carl Zeiß, J e n a

Fremdfarbstoffe als Nebenkomponenten verschiedener Amidoschwarz lOB-Chargen und deren Einflüsse auf die Ergebnisse der Papierelektrophorese A. DITTMER

und

K . - F . TLACH,

unter Mitarbeit von

W.

KINZE1

(Eingegangen am 11. 11. 1966)

Zusammenfassung Dünnsc.hichtchromatographische Analysen haben gezeigt, daß die unterschiedlichen Industriechargen von Amidoschwarz 10B (As) bis zu 50% Fremdfarbstoffe als Verunreinigungen enthalten. Dadurch sinkt in einer „gesättigten" Färbelösung der reine AS-Gehalt entsprechend ab, und die Lösung erschöpft sich rascher. Darüberhinaus werden jedoch Fremdfarbstoffe auch durch Einflüsse auf das Elektropherogramm wirksam, da bei sinkenden Konzentrationen von AS die elektrophoretischen Einzelfraktionen unterschiedlich betroffen werden, so daß Verschiebungen im Pherogramm die Folge sind. Da der Einfluß stärker verunreinigter AS-Chargen in praxi nicht kontrollierbar ist, muß sich die Empfehlung darauf richten, unbedingt reine Farbstoffe zu verwenden. Einen Ausweg mit einigem Arbeitsaufwand stellt die Reinigung von Amidoschwarz nach KAWERAU [24] dar.

Von den anfänglich für die Papierelektrophorese (PE) empfohlenen Farbstoffen Amidoschwarz 10B [1] —[3], Bromphenolblau [4], [5], Azokarmin B [6] —[8] und Lichtgrün [9], [10] hat sich das Amidoschwarz 10B (AS) im klinischen Routinegebrauch weitgehend durchgesetzt. Dafür war in erster Linie die intensive Anfärbung der einzelnen Eiweißfraktionen ausschlaggebend. Die aufzutragende Serummenge ließ sich auf 0,06—0,08 ml herabsetzen, also auf die Hälfte der für Färbungen mit den übrigen Farbstoffen notwendigen Menge, so daß sowohl für die Auftrennung als auch für die fotometrische Auswertung optimale Vorbedingungen geschaffen waren. Frühere Untersuchungen an AS galten in erster Linie der gleichmäßigen Anfärbbarkeit der einzelnen Serumfraktionen [41] — [18]. Übereinstimmend wurde eine intensivere Anfärbung der Albumine im Vergleich zu den Globulinen ermittelt. Erst später wurde auf die Einflüsse der von der Streifentrocknung abhängigen und häufig unvollständigen Denaturierung hingewiesen [19]. Daß die fotometrische Auswertung am transparenten Strei1

s. Z. Institut für Pharmazie und Lebensmittelchemie, J e n a

542

A. DITTMER, K . - F . TLACH, W .

KINZE

fen gelegentlich gegenteilige Ergebnisse mit erniedrigten Albuminwerten ergab [20], [21], beruhte vorwiegend auf Messungen außerhalb des linearen Bereichs des LAMBERT-BEERschen Gesetzes. Soweit bekannt, wurden alle diese Versuche mit einem AS-Farbstoff gemacht, der sich als praktisch rein erwiesen hatte (Bayer oder Merck). Inzwischen hat sich jedoch das Marktangebot an AS-Chargen bedeutend erweitert. Bei diesem als „Wollschwarz" eingeführten Farbstoff sind jedoch die üblichen industriellen Qualitätsbegriffe nicht unbedingt von seiner chemischen Reinheit abhängig. Nebenkomponenten dürften dagegen in den definierten Färbelösungen für die P E zu einer quantitativen Bedeutung gelangen. Es war daher zu prüfen: I. ob und in welcher Menge Fremdfarbstoffe als Nebenkomponenten in verschiedenen AS-Präparaten enthalten sind, II. in wie weit diese Fremdfarbstoffe in den üblichen Färbelösungen als Störfaktoren durch Verdünnungseffekte und Verschiebungen des kolorimetrischen Absorptionsmaximums in Erscheinung treten und III. welche praktische Bedeutung diesen Verunreinigungen für die Ergebnisse der P E beizumessen ist. Folgende Chargen wurden zu vergleichenden Untersuchungen herangezogen (die Auswahl erfolgte zufällig, es handelte sich um uns zur Verfügung stehende Präparate): Amidoschwarz 10B, Carl Roth, Karlsruhe; 2. Amidoschwarz 10B, Hollborn, Leipzig; 3. Amidoschwarz 10B, Merck AG, Darmstadt; 4. Wollschwarz, VEB Farbenfabrik Wolfen 1 ; 5- Amidoschwarz 10B, Bayer, Leverkusen; 6. Amidoschwarz 10B, Fluka, Schweiz; 7. Amidoschwarz 10B, Lachema N.P., Brno, CSSR. Methodik zu I und II Diinnschichtchromatographische

Reinheitsprüfungen

U m zu einer exakten Definition der bereits von K N A P P [22] in papierchromatographischer Analysen gezeigten Heterogenität verschiedener AS-Chargen zu gelangen, verwendeten wir die Dünnschichtchromatographie (DC). A n s a t z : E i n Gemisch aus zwei Teilen, .Aluminiumoxid CD n e u t r a l zur Chromatograp h i e " 2 u n d einem Teil „Aluminiumoxid D zur D ü n n s c h i c h t c h r o m a t o g r a p h i e " 2 wurde mit Wasser zu einer dünnflüssigen Suspension angerieben u n d mit einem. Rofra-Sprüher gleichmäßig auf die Glasplatten gesprüht. Die P l a t t e n wurden im Trockenschrank bei 1 SO °C getrocknet u n d anschließend aktiviert. Die methanölischen Farbstofflösungen wurden m i t Mikropipetten aufgetragen. F l i e ß m i t t e l : n-Butanol/Eisessig/Wasser = 4/1/4. N a c h g u t e m Durchschütteln entstehen zwei P h a s e n ; die obere organische P h a s e wird als Fließmittel verwendet (PATRIDGE-Gemisch). 1 2

Nicht als Elektrophoresefarbstoff deklariert. V E B Chemiewerk Greiz-Döhlau.

Amidoschwarz-Färbung von Elektropherogrammen Laufzeit: 50 —60 min; Trennstrecke: K i n z e [23].

14 cm; Trennkammer: nach P o e t h k e

und

Ergebnisse zu I und II

Im Chromatogramm ließen sich alle untersuchten AS-Chargen in mehrere Komponenten zerlegen (Abb. 1). Die Typen 3 und 5 erwiesen sich als praktisch rein und zeigten neben der AS-Hauptkomponente lediglich noch zwei gleichfarbige Flecke wesentlich geringerer Konzentration, während die Typen 2 und 6 eine weitere, gelbbraune Komponente enthielten. Die Typen 1, 4 und 7 erwiesen sich als noch stärker verunreinigt und enthielten Nebenkomponenten mit z. T. höheren Konzentrationen von Fremdfarbstoffen, überwiegend rot-braune Töne.

NU

« Abb. 1. DC-Trennung von 7 Amidoschwarz 10B-Chargen

Bei der üblichen densitometrischen Streifenauswertung mit monochromatischem Licht werden zwar Fremdfarbstoffe anderer Wellenlänge teilweise abgefiltert, jedoch ist bei höheren Konzentrationen durchaus mit einem echtem Mischeffekt zu rechnen. Dementsprechend ist bei Messungen mit dem E R I I O (VEB Carl Zeiß, Jena) und dem üblichen Rotfilter OG 3 (600 nm) eine geringere Empfindlichkeit zu erwarten. Wie aus Abbildung 2 ersichtlich ist, liegen bei gleicher Farbkonzentration die Extinktionen der reinen AS-Typen 3 und 5 im Absorptionsmaximum für AS bedeutend höher als die der verunreinigten Chargen; darüberhinaus verschiebt sich bei zu37

Acta biol. med. german., Bd. 18, Heft 4

544

A . DITTMER, K . - F . TLACH, W .

KINZE

E

nm

—

Abb. 2. Extinktionen der geprüften AS-Chargen in Abhängigkeit von der Wellenlänge

nehmendem Gehalt an Fremdfarbstoffen durch den Mischeffekt die Wellenlänge des Absorptionsmaximums. E s bleibt dabei zwar die lineare Abhängigkeit der Extinktionen von der Konzentration erhalten und somit das LAMBERT-BEERsche Gesetz gültig (Abb. 3), doch werden für die heterogenen AS-Typen bei gleicher Konzentration wesentlich niedrigere Extinktionen gemessen. 5

3

6

i 7

Abb. 3. Beziehung zwischen der Konzentration verschiedener ASChargen und der Extinktion

c

Zur quantitativen Auswertung ist eine Eichkurve mit reinem AS nötig. Als Testfarbstoffe sind die identischen Typen 3 und 5 geeignet. Die Eichkurve ermöglicht dann, aus dem Flächeninhalt der einzelnen Komponenten die jeweilige Konzentration zu entnehmen. Für eine weitere exakte Bestimmung der Nebenkomponenten wurden von den AS-Typen 3, 6 und 7 Dünnschichtchromatogramme verschiedener Konzentrationen angefertigt und bei der Messung das Schott-Filter B G 3 (400 nm) vorgeschaltet, um von den schwächer markierten Fremdfarbstoffen höhere Extinktionen zu erhalten. Selbstverständlich muß die Eichmessung im selben Wellenbereich vorgenommen werden. Abbildung 4 zeigt das Diagramm einer Auftrennung des AS-Typs 7 mit mindestens 4 Nebenkomponenten, die insgesamt etwa 50% der Gesamtkonzentration ausmachen.

Amidoschwarz-Färbung von E l e k t r o p h e r o g r a m m e n

545

Abb. 4. D i a g r a m m einer DC-Trennung des T y p s 7. Extinktionskurve; Integralkurve

Methodik zu III B e t r a c h t e t m a n die eindeutigen Konzentrationsunterschiede von reinem AS in den verschiedenen Industriechargen u n d die Einflüsse auf die E x t i n k t i o n e n (vgl. Abb. 2 u n d 3), so ergibt sich die wichtige Frage nach den tatsächlichen Auswirkungen auf die A n f ä r b u n g der Proteine im E l e k t r o p h e r o g r a m m u n d auf die Meßergebnisse f ü r die Auswertung. Voraussetzung f ü r derartige q u a n t i t a t i v e Vergleiche war wiederum die Anfertigung von E i c h k u r v e n f ü r die jeweiligen Farbstoff C h a r g e n , n a c h d e m sichergestellt war, d a ß alle F a r b s t o f f e d e m I.AMBERT-BEERschen Gesetz genügen (Abb. 3). U n t e r s u c h u n g e n über Einflüsse einer höheren Eiweißkonzentration und dementsprechender größerer Eiweißdichte im Papier, die zu einem Absinken der Bindungskapaz i t ä t des Eiweißes f ü h r t (Albumin), u n d andererseits über die Grenzbereiche der Konzentrationen, innerhalb derer das L A M B E R T - B E E R s c h e Gesetz erfüllt ist, liegen bereits seit längerem vor u n d b r a u c h e n nicht erneut herangezogen zu werden [1], [2], [16]. Die in verschiedenen Modifikationen f ü r diese Untersuchungen gewonnenen E i c h k u r v e n lassen sich zur Definition von F ä r b e w e r t e n unterschiedlicher F a r b s t o f f c h a r g e n nicht ohne weiteres heranziehen. D a h e r h a b e n wir die E i c h k u r v e n unserer vorliegenden U n t e r s u c h u n g e n folgendermaßen e r m i t t e l t : Eiweißlösungen definierter K o n z e n t r a t i o n e n und identischer Volumen werden auf einer horizontalen Glasplatte mit den Abmessungen des üblichen Auswertebereichs auf den Papierstreifen gleichmäßig verteilt. Diese Eiweißlösung soll sich in einem gleichgroßen Streifen Elektrophoresepapier möglichst homogen verteilen. Dazu legt m a n das Papier a m besten u n t e r eine zweite Glasplatte gleicher Größe und läßt beide aus geringer H ö h e auf die P l a t t e mit der Eiweißlösung fallen. So erhält m a n Streifen einer definierten Eiweißkonzentration, ohne d a ß jedoch eine völlig gleichmäßige Verteilung als Vorbedingung unerläßlich wäre. E s ist zweckmäßig, die a n g e f ä r b t e n Streifen im T r a n s p a r e n z v e r f a h r e n auszuwerten. Man registriert die Einzelextinktionen über die gesamte Streifenlänge und zieht abschließend durch die E x t i n k t i o n s s c h w a n k u n g e n eine mittlere Gerade. E i n e Messung im Auflichtverfahren m u ß eine unterschiedliche Verteilung im Papier berücksichtigen u n d erfordert die Registrierung beider Streifenseiten. U m a u ß e r d e m die F a r b s t o f f a d s o r p t i o n an das Papier nicht in die E i c h k u r v e eingehen zu lassen, m u ß ein eiweißfreier Leerstreifen m i t g e f ä r b t u n d nach der E n t f ä r b u n g durchgemessen werden. Die Differenz des E x t i n k t i o n s m i t t e l s gegenüber weißem Papier b e s t i m m t die „ R e s t f ä r b u n g " , die d a n n v o m jeweiligen mittleren E x t i n k t i o n s w e r t der Teststreifen abgezogen werden m u ß . Ergebnisse zu III

Eichkurven der Farbstoffchargen 1 , 3 , 6 und 7, hergestellt mit Pferdeserum, zeigen überraschenderweise einen völlig identischen Verlauf, trotz der erheblichen Unterschiede im Reinheitsgrad der geprüften Chargen. Also üben 37*

546

A. DITTMER, K . - F . TLACH, W .

KINZE

Fremdfarbstoffe vorliegender Art und Konzentration keinen erkennbaren Einfluß auf die Anfärbung der undifferenzierten Serumproteine aus, solange die Färbelösung in der ursprünglichen, dem Ansatz entsprechenden Konzentration verwendet werden. Sogar der nicht für Elektrophoresefärbungen deklarierte Farbstoff „Wollschwarz" (Typ 4) macht darin keine Ausnahme. Da jedoch die Aussage lediglich für das undifferenzierte Gesamtprotein gilt, sind Rückschlüsse auf eine gleichmäßige Anfärbung elektrophoretisch aufgetrennter Einzelfraktionen daraus nicht ohne weiteres möglich. Insbesondere ist nicht geklärt, inwieweit sich bei einer durch Verunreinigungen bedingten Verminderung der AS-Ausgangskonzentration das Verhältnis AS: Fremdfarbstoffen durch den laufenden Gebrauch noch weiter zu Ungunsten des AS verschieben kann. Um die Anfärbung der Einzelfraktionen zu untersuchen, wurde der reine AS-Typ 3 in abfallenden Konzentrationen zur Färbung von Elektropherogrammen eines Testserums verwendet. Weiterhin wurden die Typen 1 , 3 , 4 und 7 in gesättigten Lösungen zur Färbung herangezogen und die Extinktionen der Albuminfraktion bei verschiedener Färbedauer verglichen. Abbildung 5 zeigt die Anfärbung der Einzelfraktionen. Während die a- und /S-Globuline bei sinkender Konzentration nicht wesentlich von den Ausgangswerten abweichen, fallen die Albumine bereits bei einer 50%igen Verdünnung ab und die y-Globuline steigen an. Aus Abbildung 6 geht die Auswirkung einer stärkeren Verunreinigung auf die Extinktionen der eluierten Albuminfraktion hervor. Die praktisch reinen Typen 3 und 5 haben nach der üblichen Färbedauer von 5 min den optimalen Färbewert erreicht; darüberhinaus bestehen auch schon nach 1 bzw. 3 min hohe Färbewerte, die nur wenig unter der optimalen endgültigen Anfärbung liegen. Bei den heterogenen AS-Chargen liegen die Färbewerte

\ \

\

Alb.

X

X

/ /

x—— —— X— •—

— —

/

t-Gtob.

/*

ß-Gtob. ._

. —

X

-Glob.

100

so Verdünnung der gesättigten

20 10 5 •/. Färbetösung

Abb. 5- Verschiebungen im Elektrophoresediagramm bei sinkender AS-Konzentration der Färbelösung

Amidoschwarz-Färbung von Elektropherogrammen

547

12

1,0

\ E0,8

( 0i; ;

0,6 -

OA

Ä

I 1 1

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1 10

—

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r30

Abb. 6. Abhängigkeit der Extinktionen des Albumin-Eluats von der Verunreinigung der AS-Typen x x = Typ 1; O O = Typ 3 ( = 5 ) ; O O = Typ 4; A A = Typ 7

nach 1 bzw. 3 min sehr viel niedriger und wesentlich unter dem erreichbaren Färbeoptimum, das auch nach 5 min noch nicht voll erreicht ist. Außerdem liegt bei stärkerer Verunreinigung das Färbeoptimum bedeutend niedriger (Typ 4), während ein weniger verunreinigter Farbstoff in gesättigter Lösung noch in der Lage ist, bei einer verlängerten Färbedauer das gleiche Färbeoptimum wie ein reiner Farbstoff zu erreichen. Diskussion

Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, daß Fremdfarbstoffe in Form Undefinierter Verunreinigungen in verschiedenen AS-Chargen eindeutig auf die Auswertungsergebnisse Einfluß nehmen. Auch wenn das undifferenzierte Serumeiweiß noch derart angefärbt wird, daß die Meßwerte von Fremdfarbstoffen unbeeinflußt bleiben, so erweist sich doch, daß nach der elektrophoretischen Auftrennung die einzelnen Fraktionen durchaus unterschiedlich von Störfaktoren betroffen werden. Das ist auch nicht besonders verwunderlich, da die unterschiedliche Anfärbung der Globulinfraktionen, besonders gegenüber dem Albumin, seit Jahren bekannt ist. Neu dagegen ist ihr unterschiedliches Verhalten bei sinkender Farbstoffkonzentration. Bedenkt man aber, daß eine 50%ige Verdünnung, die bei den Albuminen und den y-Globulinen bereits Veränderungen erkennen läßt, gleichzusetzen ist mit dem nur 50%igen AS-Gehalt beispielsweise einer noch voll gesättigten Lösung des AS-Typs 7, so wird man vom ersten Gebrauchstag an Einflüsse auf die elektrophoretischen Meßergebnisse erwarten müssen. Als Ursachen sind die gleichen Faktoren zu diskutieren, die auch zu einer ungleichmäßigen Anfärbung der Einzelfraktionen gegenüber reinem AS führen: Einerseits kommt die unterschiedliche Proteindichte innerhalb der

548

A . DITTMER, K . - F . TLACH, W .

KINZE

elektrophoretisch getrennten Fraktionen infrage, andererseits ist aber auch ein Einfluß seitens prosthetischer Endgruppen wahrscheinlich. Während für AS jedoch jede Eiweißfraktion ausreichend definiert ist, läßt sich über die Affinität der Fremdfarbstoffe zu den einzelnen Fraktionen nichts aussagen. Daraus wird man folgern müssen, daß verunreinigte AS-Chargen für elektrophoretische Zwecke nur bedingt verwendbar sind, da sie im klinischen Routinegebrauch nicht nur die methodische Fehlerbreite unnötig vergrößern, sondern darüberhinaus die elektrophoretischen Meßergebnisse unkontrollierbaren Einflüssen aussetzen und dadurch die Präzision ihrer Aussage erheblich vermindern. Literatur [1] GRASSMANN, W . U. K . HANNIG: Hoppe-Seyler's Z. physiol. Chem. 290, 1 (1952). [ 2 ] K N A P P , A . U. H . S I E L E R : Z . ges. inn. Med. Grenzgebiete 8 , 7 4 1 ( 1 9 5 3 ) . [3] DITTMER, A.: Papierelektrophorese, V E B Gustav Fischer Verlag J e n a , 1965. [4] DURRUM, E . L . : J . Amer. chem. Soc. 72, 2947 (1950). [ 5 ] C R E M E R , D . : U. A . T I S E L I U S Biochem. Z . 320, 2 7 3 ( 1 9 5 0 ) . [6] KÖRVER, G.: Klin. Wschr. 28. 693 (1950). [7] TURBA, F . U. H . ENENKEL: N a t u r w i s s e n s c h a f t e n 3 7 , 93 ( 1 9 5 0 ) .

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Summary A. D I T T M E R and K . - F . T L A C H with collaboration of W . K I N Z E : Foreign dyestuffs as by-components of different amidoblack 1 0 B batches and their influence on paperelectrophoretical studies Thin-layer chromatography revealed t h a t different industrial batches of amidoblack 1 0 B are containing up to 50 per cent foreign dyes as contaminants, which are lowering the pure amidoblack content in the " s a t u r a t e d " staining solution and due to which the solution is exhausted more rapidly. In addition, foreign dyes become effective b y influences on the electropherogram, since with decreasing amidoblack concentrations the electrophoretical individual fractions are affected in a different manner so

Amidoschwarz-Farbung von Elektropherogrammen

t h a t shifts in t h e p h e r o g r a m result.

549

Since t h e e f f e c t of m o r e s t r o n g l y

contaminated

a m i d o b l a c k b a t c h e s is n o t c o n t r o l l a b l e i n p r a c t i c e , t h e use o f p u r e d y e s t u f f s is s t r i c t l y recommended.

Purification

though somewhat

of

amidoblack

according

to

KAWERAU

[ 2 4 ] is

helpful

troublesome.

PC3I0MC A . J ^ H T T M e p H K.- M > > > > O ^ en O O O O CD CD / .'fi t>,f l > I f l >> N N>*'cD ^ (—i t>> CD N N N N O "o ri O OOO & ft-B- oft-S.tí ft a ft VO NCO ^

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Kurzmitteilungen

553

rotspektren mit dem des Progesterons. Die UV-spektrophotometrische Bestimmung ergab Werte im Bereich von 8—160 [xg/24 Std. Bei Fall 2 gelang es, mit einem Fünftel der Tagesausscheidung 28 ¡xg Progesteron in kristalliner Form zu erhalten. O ' / . A

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6 0

UUUI.III

Vergleich der Ultrarotspektren von isoliertem Progesteron (a) und reinem Progesteron (b). Die Spektren wurden als KBr-Mikropellets registriert

Erstmalig isolierten wir Progesteron aus dem Harn eines 20jährigen Mannes mit Nasen-Rachen-Fibrom und einer Astheno-Hypospermie [6]. Angeregt durch dieses Ergebnis 1 konnten I S M A I L und H A R K N E S S [7J Progesteron auch aus Schwangerenharn isolieren. Einschränkend ist zu bemerken, daß nur bei den Fällen 1, 3, 4 und 5 durch Laparotomie und Keilexzision histologisch das Vorliegen polyzystischer Ovarien im Sinne eines STEIN-LEVENTHAL-Syndroms gesichert wurde. In den anderen Fällen wurde die Diagnose durch Pelviographie gestellt, da die Patientinnen es ablehnten, sich einer Operation zu unterziehen. Der Nachweis von Progesteron neben Testosteron, epi-Testosteron und Androstendion bei polyzystischen Ovarien wird Anlaß sein, in weiteren Untersuchungen zu prüfen, inwieweit sich das Krankheitsbild durch die Bestimmung von Progesteron im Harn differenzieren läßt. Literatur [1]

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D O R F M A N U.

FREEMAN,

E.

G. L.

FORCHIELLI: SIEGEL,

S. I.

Steroids 7, 351 (1966). GRIBOFF,

R . I.

DORFMAN

U.

clin. Endocrinol. 25, 1 4 5 1 ( 1 9 6 5 ) V . u. G . G I U L I A N I : Steroids 4, 1 0 1 ( 1 9 6 4 ) . K., U. G. F R A N K E N B E R G : Hoppe-Seyler's Z. physiol. Chem. 336, 91

L. J. SOFFER: J. [4]

BROOKS, R .

[5]

SCHUBERT,

[6]

S C H U B E R T , K . , G . F R A N K E N B E R G , K . W E H R B E R G E R U. R . A L B R E C H T :

(1964).

[7]

schaften 53, 278 (1966). I S M A I L , A . U. R A .

HARKNESS:

Biochem.

J.

98, 1 5 P

Naturwissen-

(1966).

1 Mitteilung an Dr. H A R K N E S S (Edinburgh) beim V. Acta-Endocrinologica-Kongreß in Hamburg am 6. August 196S

Sym im

ptome

Blut

Schnelle, rationelle, exakte Untersuchung des Blutes — Blutkörperchenzählgerät: TEILCHENZÄHLER TuR ZG 1 Genaue," exakte Zählergebnisse (bis zu zehnfach genauer als das visuelle Verfahren), auch separateZählung von Erythrozyten, Leukozyten und Thrombozyten. Weitestgehend automatisiert (moderne elektronische Baueinheiten); schnelles • Zählen: 1 mm 3 Blut in ca. 5 s. Einfache, sichere Bedienung — leichtes Arbeiten? Für klinische Routineuntersuchungen in hämctologischen Laboratorien und für spezielle wissenschaftliche Aufgaben: TEILCHENZÄHLER TuR ZG 1 ein .Erzeugnis, der radiologischen Technik und medizinischen Elektronik der DDR VEB T R A N S F O R M A T O R E N RÖNTGENWERK DRESDEN BETRIEBSSTÄTTEN T E C H N I K 104 Berlin 8023 Dresden 701 Leipzig

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N

ERHARD

GEISSLER

Bakteriophagen Objekte der modernen Genetik (Wissenschaftliche Taschenbücher, Reihe Medizin)

1962 — 138 Seiten -

39 Abbildungen -

9 Tabellen -

8° — MDN 8,—

Der Verfasser dieses Taschenbuches beschäftigt sich mit den Bakteriophagen, einer Gruppe von Viren, die nicht Mensch, Tier oder Pflanze, sondern die Bakterien befallen und diese schädigen. Die Bakteriophagen haben in den vergangenen Jahren bei Naturwissenschaftlern und Medizinern immer größere Beachtung gefunden, nicht zuletzt deshalb, weil mit ihrer Hilfe grundlegende Aussagen über die Vererbungsvorgänge, über die Natur des Erbmaterials und über die genetische Steuerung von Stoffwechselprozessen gemacht werden konnten. Dabei sind die über die Feinstruktur der Erbfaktoren, über die bei der experimentellen Erzeugung von Erbänderungen (Mutationen) beteiligten Prozesse und die über die „Verschlüsselung" von Erbinformationen gewonnenen Erkenntnisse besonders interessant und aktuell.

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•

B E R L I N

Internationales Symposium der Gynäkologischen Endokrinologie v o m 15.-18. Mai 1963 Herausgegeben von Prof. Dr. HELMUT KRAATZ (Abhandlungen der DAW zu Berlin, Klasse für Medizin, Jahrgang 1965, Nr. 1) 1965. VI, 276 Seiten — 178 Abbildungen, davon 56 einfarb. auf 33 Tafeln und 6 mehrfarb. auf 1 Tafel — 39 Tabellen — 4° — MDN 50,-

Die Bedeutung der gynäkologischen Endokrinologie als einer sehr aktiven Untergruppe der allgemeinen Endokrinologie war zeitweise umstritten. Auch die Endokrinologie droht in verschiedene Spezialgebiete zu zerfallen. Offensichtlich ist es ein Entwicklungsprozeß, der sich einerseits aus der Schwierigkeit des Stoffes, der Hypothetik mancher Vorstellungen und der Notwendigkeit dauernder Revisionen überholter Anschauungen ergibt, andererseits aber auch aus einem vehementen, sich fast überstürzenden Fortschritt neuerTatsachen, die sich auf reale Experimente und praktische Forschungsergebnisse stützen. Die in den Symposionsbeiträgen dargestellten praktischen Üntersuchungsergebnisse tragen viel zur Klärung der Probleme bei und liefern der Arzneimittelindustrie wichtige Hinweise.

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B E R L I N

JOSEF TOBISKA

Die Phythämagglutinine M i t e i n e m K a t a l o g der s e i t 1888 auf P h y t h ä m a g g l u t i n i n g e h a l t untersuchten Pflanzen unter botanischer Mitarbeit von M. F e l k l o v a Wissenschaftliche Bearbeitung: W o l f g a n g R e i m a n n (Hämatologie u n d Bluttransfusionswesen, Band 3)

1964. XX, 302 Seiten • 18 Abbildungen • 65 Tabellen • gr. 8° • MDN 58,—

I m Vordergrund des Interesses der Serologen stehen heute die Phythämagglutinine, das sind pflanzliche Stoffe, meist E x t r a k t e aus Samen, welche die roten Blutkörperchen des Menschen allgemein oder je nach der Blutgruppe spezifisch agglutinieren. E s h a n d e l t sich hierbei u m ein f ü r das Gesundheitswesen wichtiges Problem, das praktische Bedeutung erlangt, wenn m a n die Phythämagglutinine für das Blutspendewesen verwendet. Der Autor, ein a n e r k a n n t e r Spezialist, h a t hier sein außerordentlich großes Wissen über dieses Gebiet zusammengefaßt. Die Monographie, ergänzt durch einen ausführlichen Pflanzenkatalog (ca. 3000 Pflanzen) und ein umfassendes Literaturverzeichnis, wendet sich daher sowohl an den Hämatologen u n d Serologen, wie an den Botaniker und Genetiker, an den Gerichtsmediziner u n d Hygieniker und ebenso an Blutspendezentralen, bakteriologische und serologische Anstalten und Institute.

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BERLIN

C O N T E N T S

Page

Biochemistry CH. VOSS, N . HARTMANN, B . W I R T H G E N 131

and

H . BERGNER : I n

vitro dejodation

of

J bengal rose b y r a t liver homogenate u n d e r different metabolic conditions 451—456

L. WINKLER: Changes of t h e lipid balance in m a t e r n a l liver, fetal liver, placenta and t h e whole fetus of r a t s following t o t a l b o d y irradiation with 800 R . . . 457 — 464 R . BEYER and W . SCHELER: Studies on t h e metabolic reduction of metverdoglobin t o hemoglobin in r a b b i t erythrocytes in vitro 465—480 R . BEYER a n d W . SCHELER: S t u d i e s o n t h e r e d u c t i o n of m e t v e r d o g l o b i n i n v i v o

481—491

Physiology W . KLINGER and I. HEINRICH: Studies on t h e mechanism of enzyme induction. X I . Action of b a r b i t a l on L-ascorbic acid content of t h e liver of p r e g n a n t rats, their foetuses and infantile r a t s 493 — 497 CH. VOGTMANN, H . GERBSXAEDT and P. RUETH: Flow p a t t e r n and s h a m viscosity of heparinized h u m a n blood and citrate blood in glass capillaries of m e a n w i d t h 499—505 Pharmacology H . LIEBMANN a n d H . MATTHIES : E f f e c t of tetrabenazine on t h e toxicity of acetylcholine, physostigmine and prostigmine 507 — 511 Serology CH. RITTNER : F a m i l y studies on h e r e d i t y in t h e D u f f y system Experimental

513-516

pathology

E . SCHULZE and H . LOEWE: Accumulation of d e x t r a n in t h e liver and spleen of r a t s a f t e r chronical application and its influence on t h e p a r t i a l functions of these organs 517-527 Ultrastructural

Research

H . DAVID and E . METZLER : A r r a n g e m e n t and s t r u c t u r e of polysomes in i n t a c t r a t liver cells 529-540 Methodology A . DITTMER a n d K . - F . TLACH w i t h c o l l a b o r a t i o n of W . KINZE: F o r e i g n d y e s t u f f s of

different amidoblack 10 B batches and their influence on paperelectrophoretical studies 541-549 Short

communications

K . SCHUBERT, K . WEHRBERGER, G . FRANKENBERG a n d

H . IGEL : P r o g e s t e r o n e

and

a , ^ - u n s a t u r a t e d steroid ketones of t h e C19 series in t h e urine of female p a t i e n t s with hirsutism 551-553

COflEPHÎAHIIE OrpaHHua

Buoxumuh X . © o c c , H . l ' a p T i i a n H , H . B i i p i r C H 11 l"1. B e p r H e p : JJeHOHupoBaHHe öeiirajibCKOri poaoBolí, MeneHHoii m J , KPMCIÌHMM neieno'iHH.M roiuorenaTOM npii pa3jin4Hbix meTaöojimiecKHX ycjiOBHHX in vitro

451 —456

JI. 13HHKJiep: rt.meueniiii jiiiniiAiioro xoafiwcTBa Ma'repmicKOii iieatmii, 3M0pii0Ha¿ibH0ii jieqCHH, ruiaueiiTbi H u e n o r o 3M0pnoHa KpbiCbi noc.ie oSmero oönyqeHUfi B a03e 800 p

457—464

P . B e i i e p li B . I l l e . ' i e p : HccjienoBamin o MeTaöojiii'iecHOM BoccraHOBjieH H H iueTBepnor.ioüHíia B apiiTpouirrax KpojiiiKOB in vitro

465—480

P. Beiiep

481—491

h B . I I I e . T e p : HccjlcjioeaHiifl o BOccTaiiOBJieimii MerBepnoraoöinia in vitro . .

0U3UOJÍO3UH B . K a i n i r e p H I i . P e i i n p i i x : IIcc.ienoBaHiin o i i e x a i i i w j i e anuiiMiioii î n m y K m i i i . XleîicTBiie ôapôiiTajia lia C0;U'p>i;a¡nie L-acKOp6iiHOBOii KIIC.IOTLI mvieini y ôepeïueHHbix Kpwc, n x DMÖpiiOHOB h y iin