Acta Biologica et Medica Germanica: Band 18, Heft 2 [Reprint 2022 ed.] 9783112619902, 9783112619896

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ACTA BIOLOGICA ETMEDICA GERMANICA HERAUSGEBER:

R. B A U M A N N , H. DUTZ, A. G R A F F I , H . G U M M E L , F. J U N G , L.-H. K E T T L E R , S.M. R A P O P O R T UNTER MITARBEIT VON:

W. B E I E R , H. D R I S C H E L , H . F R U N D E R , M. G E R S C H , E. G O E T Z E , H . H A N S O N , F. H A U S C H I L D , G . H O L L E , F. MACH, H. M A T T H I E S , G.MOHNIKE f, O.PROKOP, K.SCHUBERT, F.SCHWARZ, G. S T E R B A , A. W O L L E N B E R G E R SCHRIFTLEITUNG:

W. S C H E L E R ,

AKADEMIE-VERLAG. • BERLIN

H. B I E L K A

• B A N D 18 • H E F T 2

• S E I T E 125-304

• 1967

AUFNAHMEBEDINGUNGEN

1. Es werden nur Arbeiten angenommen, die nicht an anderer Stelle mit demselben Inhalt veröffentlicht oder zur Veröffentlichung angeboten werden. Der Autor verpflichtet sich nach Annahme, die Arbeit an keiner anderen Stelle zu veröffentlichen . 2. Die Arbeit muß wissenschaftlich wertvoll sein.

Bestätigungen bekannter T a t -

sachen, Versuche und Beobachtungen ohne positives Ergebnis werden, wenn überhaupt, nur in kürzester Form aufgenommen. Nicht aufgenommen werden Arbeiten referierenden Charakters, Polemiken und rein spekulative Arbeiten, falls sie nicht ganz wesentliche neue Gesichtspunkte enthalten. 3. Kurzmitteilungen für experimentelle Ergebnisse werden bei der Drucklegung zeitlich bevorzugt. Für ihren Inhalt ist ausschließlich der Autor verantwortlich. 4. Die Arbeiten müssen kurz und klar geschrieben und gegliedert sein. Problematik (Einleitung), Methodik, Befunde und Diskussion, evtl. Schlußfolgerungen sollen deutlich in Erscheinung treten. Der Arbeit soll ein Kurzreferat der wesentlichsten Ergebnisse vorausgestellt werden. Neben einer anderssprachigen erscheint auf jeden Fall eine deutsche Zusammenfassung. Die Arbeiten werden in folgenden Sprachen angenommen: Deutsch, Russisch, Englisch und Französisch. 5. Die Arbeiten werden im Sofortumbruch gesetzt; größere Korrekturen in Form von Streichungen bzw. Zusätzen sind daher in der Umbruchkorrektiur nicht mehr möglich. 6. Genaue Hinweise zur Manuskriptgestaltung sind von der Redaktion der Zeitschrift anzufordern und sind unbedingt einzuhalten. 7. Manuskripte sind an die Herausgeber zu senden oder direkt an die Redaktion der Acta biologica et medica germanica, I I I S Berlin-Buch, Lindenberger Weg 70. 8. Von jeder Originalarbeit werden kostenlos 80 Sonderdrucke geliefert.

Darüber

hinaus können bis zu 100 Sonderdrucke gegen Berechnung bezogen werden. Die Herausgeber

ACTA BIOLOGICA ET MEDICA GERMANICA Herausgeber : R . B a u m a n n • H . D u t z • A. G r a f f i • H . G u m m e l • F . J u n g • L.-H. K e t t l e i S. M. R a p o p o r t B a n d 18

1967

Heft 2

A c t a biol. med. german., B a n d 18, Seite 125 — 130 (1967) A u s d e m I n s t i t u t f ü r Physiologische Chemie der Universität Rostock (Direktor: Prof. Dr. med. habil. D. M Ü C K E )

Wirkung von 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure auf die NukleinsäureBiosynthese der einzelligen Alge Poteriochromonas stipitata I. SCHRÖDER, W . DUMMLER, K . J U N G u n d D .

MÜCKE

(Eingegangen a m 25. 7. 1966) 1 Zusammenfassung E s w u r d e die R N S - u n d DNS-Biosynthese in Poteriochromonas stipitata in Abh ä n g i g k e i t von der 2,4-D-Konzentration u n d w ä h r e n d des Entwicklungsverlaufs bei k o n s t a n t e r 2,4-D-Konzentration untersucht. W ä h r e n d sich bei variierter 2,4-DK o n z e n t r a t i o n nach 10 Tagen die D N S - K o n z e n t r a t i o n nur unwesentlich veränderte, e r h ö h t e sich die RNS-Menge bei 10~ 3 M 2,4-D gegenüber der Kontrolle auf 200% u n d n a h m bei geringerer 2,4-D-Konzentration stetig ab. Bei U n t e r s u c h u n g des zeitlichen Verlaufs e r h ö h t e n sich die R N S - u n d D N S - K o n z e n t r a t i o n e n bereits 12 — 24 Std. n a c h 2;4-D-Zugabe u m 200 bzw. 300%. Weitere I n k u b a t i o n bis zu 10 T a g e n f ü h r t e zu einer kontinuierlichen A b n a h m e der NS-Werte.

Wie in der Literatur [1], [2], [3] mitgeteilt wird, übt 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D) einen signifikanten Einfluß auf die Nukleinsäure (NS)Produktion aus. Diese Befunde erstrecken sich fast ausschließlich auf die RNS, während nur vereinzelt [1] auf Grund biochemischer Zusammenhänge auch eine Einflußnahme auf die DNS postuliert wird. Unsere Untersuchungen berücksichtigen beide NS-Typen. Die NS-Biosynthese wurde in Abhängigkeit 1. von der 2,4-D-Konzentration und 2. vom zeitlichen Verlauf bei konstanter 2,4-D-Konzentration ermittelt. Methodik 1. Nukleinsäure-Bestimmung F ü r die D u r c h f ü h r u n g der vorliegenden Untersuchungen w a n d t e n wir das von OGUR u n d ROSEN [4] angegebene, von SOLDO [5] modifizierte Verfahren an, das entsprechend der Aufgabenstellung abgewandelt wurde (vgl. auch [6]). Wie auch aus [7] ersichtlich ist, w a r eine einwandfreie T r e n n u n g von R N S - u n d D N S - F r a k t i o n nicht zu erreichen. 1

N a c h Revision a m 14. 9. 1966

9

Acta biol. med. german., Bd. 18, Heft 2

126

I . SCHRÖDER, W . DUMMLER, K . J U N G , D . M Ü C K E

Die n a c h verschiedenen Zeiten e n t n o m m e n e n Zell-Suspensionen wurden bei 4 °C f ü r 12 min bei 1700 U/min zentrifugiert, d a s abzentrifugierte K u l t u r m e d i u m wurde verworfen. N a c h 2maligem Waschen m i t 0,3%iger NaCl-Lösung wurde ein Teil des ZellR ü c k s t a n d e s wieder m i t 20 ml a q u a dest. suspendiert. 2 P r o b e n dieser Suspension zu je 5 ml dienten der NS-Bestimmung, 2 P r o b e n zu je 2 ml der Trockengewichtsbes t i m m u n g . Die Berechnung erfolgte jeweils bezogen auf 100 m g Trockenmasse. Z u m E n t f e r n e n störender Verbindungen wurde vor der E x t r a k t i o n der N S die ZellSuspension fraktioniert extrahiert. a) 5 m l Zell-Suspension wurden bei 4 °C mit 5 ml 70%igem Äthanol versetzt u n d a b zentrifugiert; der R ü c k s t a n d wurde erneut mit 5 ml 70%igem Äthanol, der 0,1% Perchlorsäure enthielt, versetzt u n d wiederum zentrifugiert. b) Der R ü c k s t a n d wurde mit 5 ml eines Gemisches Ä t h a n o l — Ä t h e r (3:1) f ü r 3 min bei 40 °C extrahiert. Diese E x t r a k t i o n wurde so oft wiederholt, bis der Ü b e r s t a n d farblos war. c) Der R ü c k s t a n d w u r d e mit 5 ml 0,2 n Perchlorsäure bei 4 °C versetzt, u m g e s c h ü t t e l t u n d sofort zentrifugiert. Dieser Vorgang w u r d e 2mal wiederholt. Zur E x t r a k t i o n der N S w u r d e der von störenden Verbindungen gereinigte R ü c k s t a n d f ü r 10 m i n bei 70 °C m i t 5 m l 2 n Perchlorsäure e x t r a h i e r t u n d zentrifugiert. D u r c h Nachwaschen des R ü c k s t a n d e s mit heißer (70 °C) 2 n Perchlorsäure w u r d e die E x t r a k t i o n vervollständigt. D a s E n d v o l u m e n der vereinigten E x t r a k t e b e t r u g 10 ml. D N S w u r d e nach der Diphenylamin-Methode von G I L E S u n d M Y E R S [8] b e s t i m m t , R N S n a c h der Orzin-Methode von M E J B A U M [9] u n d S T U M P F [ 1 0 ] . D a d u r c h die Orzin-Methode alle Pentosen e r f a ß t werden, w u r d e nach E r m i t t l u n g der DNS-Menge [8] die durch sie verursachte „ O r z i n - E x t i n k t i o n " in Abzug g e b r a c h t . Die hierzu erforderlichen K o r r e k t u r w e r t e wurden einer D N S - E i c h k u r v e e n t n o m m e n . Als S t a n d a r d diente D N S aus Heringssperma (Fa. Light, Colnbrook-GB). Die Möglichkeit, auf diesem Weg R N S u n d D N S b e s t i m m e n zu können, w u r d e d u r c h Modelluntersuchungen gesichert. Zu diesem Zweck wurden 66,6 [ig R N S (Fa. Waldhof I a, Mannheim) u n d 16,6 (ig D N S jeweils in Lösung gemischt. Die E x t i n k t i o n wurde n a c h Reaktion mit Orzin zu 320 • 10~ 3 ermittelt; die d u r c h die D N S v e r u r s a c h t e „OrzinE x t i n k t i o n " b e t r u g 15 • 1 0 - 3 . Die RNS-Menge ergab sich hieraus zu 66,0 [ig. 2. Züchtung von Poteriochromonas

stipitata

Die Algenzellen w u r d e n f ü r die vorliegenden Untersuchungen stets in 5 1-Kulturen bei + 28 °C im D u n k e l n u n t e r kräftiger B e l ü f t u n g (15 —20 1/Std.) in einem vollsynthetischen N ä h r m e d i u m folgender Zusammensetzung gezüchtet (Angaben f ü r 5 1 Medium): NH 4 C1 21,4 g, Zitronensäure 3,47 g, K H a P 0 4 1,0 g, MgS0 4 • 7 H a O 1,0 g, CaC0 3 0,76 g, Na 2 Mo0 4 • 2 H 2 0 0,15 g, T h i a m i n 10 mg, Biotin 0,05 mg, V i t a m i n B 12 0,05 mg, Spurenelementlösung [11] 50 ml, Glukose 75 g. B e i m p f t wurde stets m i t einer 5 Tage alten K u l t u r entsprechend 1 • 105 Zellen/ml Endvolumen. Dieses Medium liefert hohe Ausbeuten a n Zellmaterial; nach lOtägiger I n k u b a t i o n werden u n t e r optimalen Bedingungen ca. 1,5 — 3 g Zelltrockenmasse/1 K u l t u r geerntet. 3. Züchtung mit Zusatz von 2,^-D a) V a r i a t i o n d e r

2,4-D-Konzentration

Die Z ü c h t u n g der Protozoen erfolgte bis zum 6. T a g wie angegeben. Zur Herstellung der 2,4-D-Lösungen wurde die freie Säure in alkalischem Milieu gelöst; die Lösungen w u r d e n durch Zugeben von Salzsäure vorsichtig auf pH 6—7 gebracht. Die 2,4-DE n d k o n z e n t r a t i o n im 5 1-Kolben variierte von 1 0 - 3 bis 10~ 7 M. Die Zugabe erfolgte n a c h d e m 6. T a g unter sterilen Bedingungen. Die Inkubationszeit b e t r u g 10 Tage.

Dichlorphenoxyessigsäure-Wirkung auf Nukleinsäure-Synthese b) V a r i a t i o n d e r I n k u b a t i o n s z e i t b e i k o n s t a n t e r

127

2,4-D-Konzentration

Die Züchtung erfolgte bis zum 6. Tag wie angegeben. Die Endkonzentration im 5 1Kolben betrug 10~5 M. Die Zugabe erfolgte wiederum nach dem 6. Tag. Die ProbenEntnahme wurde nach unterschiedlichen Zeitabständen vorgenommen. Ergebnisse und Diskussion

l. Abhängigkeit der NS-Produktion

von der 2,4-D-Konzentration

Die Ergebnisse sind in Abbildung 1 graphisch dargestellt. Der DNS-Gehalt der Kontrolle beträgt 280 ¡xg/100 mg Trockengewicht, der RNS-Gehalt 1270 (Ag/lOO m g Trockengewicht. Die angegebenen Werte sind Mittelwerte, die aus 3 zeitlich nacheinander durchgeführten Ansätzen resultieren.

M

2,4-D

Abb. 1. Abhängigkeit x

der Nukleinsäure-Produktion von der 2,4-D-Konzentration nach 10 Tagen. x = RNS; O O = DNS; A A = Ausbeute

2. Abhängigkeit der NS-Produktion von der Zeit bei konstanter 2,4-D-Konzentration Die graphische Darstellung der Ergebnisse ist in Abbildung 2 wiedergegeben. Die Ergebnisse sind ebenfalls Mittelwerte, die aus 3 zeitlich nacheinander durchgeführten Ansätzen resultieren. Wie aus Abbildung 4 ersichtlich ist, verändert sich bei variierter 2,4-D-Konzentration innerhalb von 10 Tagen die DNS-Menge nur unwesentlich. Dagegen erhöht sich die RNS-Menge bei 10~3 M gegenüber der Kontrolle auf 200% und nimmt bei geringerer 2,4-D-Konzentration laufend ab. Zur Deutung dieser Ergebnisse wurde in Abbildung 1 die Zell-Ausbeute bei entspre9

128

I. SCHRÖDER, W . DUMMLER, K . JUNG, D . M Ü C K E

chenden 2,4-D-Konzentrationen aufgenommen. Diese Kurve verläuft annähernd umgekehrt proportional zum Verlauf der RNS-Kurve. Die geringe Ausbeute bei höheren 2,4-D-Konzentrationen mit relativ hohem RNS-Gehalt läßt auf eine Mitose-Hemmung bzw. Verzögerung bei intakter RNS-Produktion schließen. Die Möglichkeit einer starken Mitose-Stimulierung, verbunden mit erhöhter RNS-Produktion, die in kürzerer Zeit zum Zelltod führt, konnte jedoch aus den vorliegenden Befunden nicht ausgeschlossen werden.

Tage

—»-

Abb. 2. Abhängigkeit der Nukleinsäure-Produktion von der Zeit bei einer 2,4-D-Konzentration von 10~5 M. x x = RNS; O O = DNS

Aus diesem Grunde wurden Zellzahlbestimmungen durchgeführt und morphologische Alterationen der Zellen untersucht. Die Ergebnisse dieser Versuchsreihen, die in erweitertem Umfang fortgeführt und später veröffentlicht werden sollen, lassen folgendes erkennen: Bei einer 2,4-D-Konzentration von 10~3M werden die Geißelbewegungen und die Mitose sofort gehemmt. Die Zellzahl bleibt im Variationsbereich konstant. Ein weiteres Wachstum der Zellen erfolgt nicht. Die Aufrechterhaltung der Nukleinsäureproduktion konnte bisher nicht direkt bewiesen werden, jedoch lassen die stark erhöhten RNS-Werte hierauf schließen (Abb. 1). Eine Verringerung der 2,4-D-Konzentration ( < 10~4M) ermöglicht zunächst noch die freie Beweglichkeit der Zellen und stimuliert die Mitose bei konstanter Zellgröße stark. Bei einem 2,4-D-Gehalt im Bereich von 10"5 Mol/1 wird nach kurzer Inkubationszeit ein weiteres Zellwachstum ermöglicht. Hierdurch entstehen Riesenzellen, deren Durchmesser noch mehr als das Vierfache des Wertes der Normalzellen (~10 ¡u) betragen kann.

Dichlorphenoxyessigsäure-Wirkung auf Nukleinsäure-Synthese

129

Die Untersuchung des zeitlichen Verlaufs (Abb. 2) zeigt demgegenüber sowohl erhöhte RNS- als auch DNS-Mengen bereits 12—24 Std. nach 2,4-DZugabe (10~ 5 Mol). Diese Werte erhöhen sich auf 200% bzw. um nahezu 300%. Diese stark gesteigerte NS-Produktion ist deshalb so bedeutsam, weil auch die DNS-Bildung davon betroffen ist. Daraus läßt sich auch aus diesen Befunden auf eine Mitose-Beeinflussung durch 2,4-D schließen. Die stetige Abnahme der NS-Konzentration bei weiterer Inkubationsdauer wird auf eine 2,4-D-Inaktivierung durch zellulären Abbau wie auch durch Oberflächen-Adsorption zurückgeführt. Weitere Untersuchungen werden z. Z. durchgeführt, um den Verbleib des 2,4-D ZU klären. Literatur Weeds 10, 123 (1962). [2] KEY, J . L . : Weeds 11 ,177 (1963). [ 3 ] K E Y , J . L . u. J . B . H A N S O N : Plant Physiol. 36, 1 4 5 ( 1 9 6 1 ) . [4] OGUR, M. U. G. ROSEN: Arch. Biochem. Biophysics 25, 262 (1950). [5] SOLDO, A. T . : Arch. Biochem. Biophysics 55, 71 (1955). [ 1 ] C H R I S P E E L S , M . J . U. J . B . H A N S O N :

[6] K E R N , H . : P l a n t a 5 3 , 5 9 5

(1959)-

[7] GULICH, L . : P l a n t a 5 4 , 3 7 4

(I960).

Nature [London] 206, 93 ( 1 9 6 5 ) . [ 9 ] M E J B A U M , W . : Hoppe-Seyler's Z . physiol. Chem. 258, 1 1 7 ( 1 9 3 9 ) . [10] STUMPF, P . : J . biol. Chemistry 169, 367 (1947). zit. in: Laboratoriumstechnik für Biochemiker. Hrsg.: B . KEIL und Z. SORMOVÄ, Geest u. Portig, Leipzig 1965, [8]

G I L E S , K . W . U. A . M Y E R S :

S. 608.

[11]

M Ü C K E , D . U. W . D U M M L E R :

Pharmazie 15,

305

K . JUNG

D. MUECKE:

(I960).

Summary I . SCHROEDER,

W . DUMMLER,

and

Action

of

2,4-dichlor-

phenoxyacetic acid on the nucleic acid biosynthesis in the single-cell alga Poteriochromonas stipitata The RNA and DNA biosynthesis in Poteriochromonas stipitata in dependence on 2,4-D concentration and during development at constant 2,4-D concentration has been studied. While DNA concentration varied but slightly on changed 2,4-D concentration within 10 days, RNA level increased at 10~ 3 Mol 2,4-D to 200 percent and decreased continuously at lower 2,4-D concentrations. DNA and RNA concentrations increased already 12 —24 hours after addition of 2,4-D by 200 or 300 percent respectively. Further incubation for about 10 days caused a continuous fall of NA values. T h e results are discussed. PeaioMe H . I H p e j j e p , B . .IJyMMJiep, K . IOHT H JH. MiOKe: JHetfcTBue 2,4-«HXJiop$eHOKCHyKCyCHOii KHCJIOTbl Ha 6HOCHHTe3 HyKJieHHOBMX KHCJIOT y OHHOKJieTOqHoft BonopocJiH Poteriochromonas stipitata MccjienoBancfl

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H JHHK

MOCTH OT K O H U e H T p a i i H H 2 , 4 - J H H BO

430

I. Schröder, W. Dummler, K. Jung, D. Mücke

paijHH 2,4-JH. Torna KaK KOHiieHTpaipiH JIHK H3MGHHJiact> jrauib He3HaHHTejibHo B Te^eHHe 10 nHeií npn BapbHpoBaHHoft KOHueHTpaqmi 2 , 4 - J J , kojimhcctbo P H K

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A c t a biol. med. german., B a n d 18, Seite 131 — 139 (1967) Aus d e m I n s t i t u t f ü r Physiologische u n d Biologische Chemie der H u m b o l d t - U n i v e r s i t ä t zu Berlin (Direktor: Prof. Dr. Dr. S. M.

RAPOPORT)

Eine Antimyzin A- und Alkan-empfindliche lösliche NADH 2 -Dehydrogenase aus Rattenleber I. Versuche zur Reinigung und Charakterisierung V . H A H N u n d C. W A G E N K N E C H T

(Eingegangen a m 1. 9. 1966) Zusammenfassung 1. E s wird ü b e r die Reinigung einer aus R a t t e n l e b e r m i t o c h o n d r i e n abgelösten NADH 2 -Dehydrogenase [NADH 2 : (Akzeptor)-oxydoreduktase] (1.6.99.3) mittels fraktionierter Ammonsulfatfällung u n d chromatographischer T r e n n u n g an D E A E Zellulose u n d Sephadex G-100 berichtet. 2. N A D H 2 ist d a s einzige Substrat. N A D P H 2 u n d Sukzinat reagieren nicht. Als Akzeptoren fungieren Dichlorphenolindophenol, Kaliumferrizyanid u n d ein System Z y t o c h r o m b 5 —Zytochrom c, a b e r nicht Lipoat. 3. Verschiedene H e m m s t o f f e wurden in ihrer W i r k u n g auf dieses E n z y m u n t e r sucht. E i n e 50%ige H e m m u n g w u r d e bei einer E n d k o n z e n t r a t i o n a n Antimyzin A v o n 7 • 10" 6 M, an H e p t a n von 2,8 • 10~2 M u n d a n p-Chlormerkuribenzoat von 8 • 10" 6 M gefunden.

Bei Untersuchungen an der mitochondrialen NADH g -Zytochrom c-Oxydoreduktase (1.6.2.-1) fanden RAPOPORT und W A G E N K N E C H T [ 1 ] — [ 3 ] einen starken Aktivitätsabfall während der Inkubation von Rattenlebermitochondrien bei pH. 6,0 und 0—4 °C für 2—5 Tage. Dabei wurde gleichzeitig festgestellt, daß die Diaphorase-Aktivität nur einen geringen Aktivitätsverlust erlitt und ein Teil dieser Aktivität in der Suspensionsflüssigkeit nachweisbar wurde. Eine Ablösung der Diaphorase von der Mitochondrienmatrix und damit die Umwandlung in ein lösliches Enzym mußte als sehr wahrscheinlich angenommen werden. Gegenstand dieser Arbeit sind Untersuchungen an der abgelösten Diaphorase, ihre Anreicherung und ihre Eigenschaften. Material und Methodik Die als Untersuchungsmaterial verwendeten Mitochondrien wurden n a c h der Methode von H O G E B O O M u n d S C H N E I D E R [ 4 ] gewonnen. Alle Arbeiten wurden bei 0 — 4 °C bzw. u n t e r E i s k ü h l u n g ausgeführt. Frische R a t t e n l e b e r w u r d e mit 0,9%iger NaCl-Lösung gewaschen, zerkleinert u n d m i t der 3fachen Menge 0,25 M Rohrzuckerlösung (bezogen Verwendete A b k ü r z u n g e n : N A D H 2 = Nikotinsäureamidadenindinukleotid reduziert; N A D P H 2 = Nikotinsäureamidadenindinukleotidphosphat reduziert; D C I P = Dichlorphenolindophenol; p-CMB = para-Chlormerkuribenzoat.

432

V . H A H N , C. WAGENKNECHT

auf das Frischgewicht) homogenisiert. Anschließend wurde mit der gleichen Rohrzuckerlösung auf das lOfache Volumen aufgefüllt. Zur Abtrennung der Kernfraktion wurde für 15 min bei 1000 X g zentrifugiert und der Niederschlag verworfen. Zur Sedimentation der Mitochondrien wurde anschließend für 30 min bei 12 000 X g zentrifugiert. Die sedimentierten Mitochondrien wurden 2mal mit 0,9%iger NaCl-Lösung gewaschen und jeweils 20 min bei 10000 X g zentrifugiert. Danach wurden die Mitochondrien im Verhältnis Material von 1 g Leber in 2 ml 0,1 M Phosphat-Puffer, pH 6,0, suspendiert und für 5 — 6 Tage bei 0 °C aufbewahrt. Zur Kontrolle der Reinigungsschritte wurden sowohl Eiweißgehalt als auch Aktivität bestimmt. Als Meßmethoden kamen zur Anwendung: a) Eiweißbestimmung: Die Eiweißbestimmung wurde nach der Methode von et al. [5] durchgeführt.

LOWRY

b) Bestimmung der Enzymaktivität: Die Aktivität des Enzyms wurde mit einem Spektrophotometer, das mit einem automatischen Schreiber ausgerüstet ist, bestimmt. Gemessen wurde die Extinktionsabnahme des blauen Farbstoffes Dichlorphenolindophenol (DCIP) bei 600 nm. Meßansatz (Endvolumen 2 ml): 0,02 ml N A D H 2 (10/uMol/ml); 0,03 ml DCIP (1 mg/ml); 0.03 ml KCN (0,15 M) und Enzymlösung; mit 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,4, auf 2 ml aufgefüllt. Temperatur 25 °C. Ergebnisse

1. Gang der Reinigung Zunächst wurde die bei 0 °C aufbewahrte Mitochondriensuspension mittels Zentrifugation in lösliche Phase, die die abgelöste NADH2-Dehydrogenase enthält, und strukturierte Anteile getrennt. Die so erhaltene, klare Enzymlösung wurde einer fraktionierten Ammonsulfatfällung unterzogen. Die Fraktionierung wurde bei 0—4 °C und 6,0 durchgeführt, wobei die Lösung durch Zugabe von festem Ammoniumsulfat auf die gewünschte Sättigung gebracht wurde. Es wurden folgende Sättigungsschritte verwandt: 0,33", 0,5-, 0,65- und 0,75-Sättigung. Die Niederschläge wurden in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,4, aufgenommen. Die höchsten Anreicherungen wurden bei 0,65- bzw. 0,75-Sättigung gefunden. Sie betrug im Durchschnitt das 5fache. Eine größere Menge der bei 0,65- bzw. 0,75-Sättigung erhaltenen Fraktionen wurde zur Entfernung der Ionen ohne merklichen Aktivitätsverlust dialysiert und im Anschluß daran zur weiteren Reinigung auf eine Chromatographiesäule ( 0 3 cm, Länge 100 cm) gegeben. Das Füllmaterial war DEAE-Zellulose, die mit 0,01 M Phosphatpuffer auf />H 6,1 eingestellt war. Nachdem das Material auf die Säule aufgegeben war, wurde eine Gradientenelution mittels Phosphatpuffer, pH 6,1, von 0,01 auf 0,3 M durchgeführt und die Elutionsflüssigkeit mittels eines automatischen Fraktionsteilers in getrennten Portionen aufgefangen (Abb. 1). Die aktivsten Fraktionen wurden vereinigt und gemeinsam lyophilisiert. Mittels der beschriebenen Methoden konnte das Enzym ca. lOOOfach gereinigt werden. Die Tabelle 1 zeigt ein typisches Beispiel der Anreicherung in einer Übersicht. Danach wurde das Enzym auf

Lösliche NADH 2 -Dehydrogenase

133

Abb. 1. Verlauf der Chromatographie an einer DEAE-Zellulose-Säule ( 0 3 cm, Länge 100 cm). Gradientenelution von 0,01 M auf 0,3 M mit Phosphatpuffer, pH 6,1. Linke Ordinate: Aktivität (ausgezogene Kurve); rechte Ordinate: Eiweiß (gestrichelte Kurve) 40

60

SO

Fraktion-Nr.

eine Sephadex G-100-Säule (0 2 cm, Länge 150 cm) gegeben und mit 0,01 M Tris-Puffer pH 7,4, der 0,5 N an NaCl war, eluiert: Elutionsgeschwindigkeit 4 ml/Std. Durch diese Behandlung wurde von der Enzymlösung eine höhermolekulare inaktive Eiweißfraktion, die gelb gefärbt war, abgetrennt. Durch diesen Reinigungsschritt konnte eine Anreicherung um das 3—4fache erzielt werden. An dem erhaltenen Produkt wurden die Versuche zur Charakterisierung vorgenommen. Tabelle 1 Anreicherung der abgelösten NADH 2 -Dehydrogenase Material Mitochondriensuspension Überstand 0,75-Sättigung (NH 4 ) 2 S0 4 DEAE-Zellulose 2.

ml 90 180 2,5 5,0

Gesamtaktivität Oval] 16,90 15,75 5,94 1,06

Eiweiß

Spez. Aktivität

[mg]

[(¿vai • 10"2/mg]

10800 302 24 0,6

0,15 5,20 25,00 176,00

Eigenschaften

Die gereinigte Fraktion zeigt das in Abbildung 2 dargestellte Spektrum. Die Gipfel liegen bei 460 nm. Zur Molekulargewichtsbestimmung wurde die Enzymlösung über Sephadex G-200 gegeben. Dazu wurde eine Säule von 45 cm Länge und 1,5 cm Durchmesser mit 10 mg beschickt. Die Elution erfolgte mit einer Geschwindigkeit von 6 ml/Std. Als Eichsubstanzen wurden Aldolase, Laktatdehydrogenase, Rinderserumalbumin, Trypsin und Zyto-

Abb. 2. Spektrum der Antimyzin-A-empf indlichen N ADH 2 - (Akzeptor) -Oxydoreduktase in destilliertem Wasser. Enzymeiweißkonzentration ca. 10 mg/ml; Lichtweg 1 cm

134

V . H A H N , C. WAGENKNECHT

chronic verwandt (Abb. 2a). Mit dieser Methode wurde ein Molekulargewicht von ca. 50000 ermittelt. Abbildung 3 zeigt die Enzymaktivität des ca. lOOOfach angereicherten Präparates in Abhängigkeit vom />H. Das Aktivitätsoptimum liegt bei fYL 6,4. Die Aktivitätsbestimmungen erfolgten in 0,1 M Phosphat-Puffer, als Elektronenakzeptor wurde Dichlorphenolindophenol verwandt. Der Temperaturquotient Q10 beträgt 2,0. Die Aktivi-

IgMG—Abb. 2 a

pH Abb. 3

Abb. 2 a. Eichkurve der Molekulargewichtsbestimmung mit Sephax G-200. Elutionsflüssigkeit: 1 M Phosphatpuffer, pH 6, der 1 M an NaCl ist. Ordinate: EV = Elutionsvolumen in ml; Abszisse: lgMG = Logarithmus des Molekulargewichtes. Verwendete Eichsubstanzen (Molekulargewicht gegen das Elutionsvolumen aufgetragen) : x = Zytochrom c; o = Trypsin; • = Rinderserumalbumin; A = Laktatdehdrogenase; • = Aldolase Abb. 3. Abhängigkeit der Enzymaktivität vom £H-Wert in 0,1 M Phosphatpuffer mit D C I P als Akzeptor

tät in Abhängigkeit von der Temperatur ist in Abbildung 4 dargestellt. Die Aktivierungsenergie wurde zu 12600 cal/Mol errechnet (Abb. 4a). Die MiCHAELis-Konstante für das Substrat NADH 2 wurde mit 1,4-10 _ 4 M ermittelt. In Abbildung 5 ist im LiNEWEAVER-BuRK-Diagramm die Substratabhängigkeit dargestellt. Es wurden auch verschiedene andere Substrate in ihrer Reaktion zur NADH2-Dehydrogenase überprüft. Das Enzym rea-

Abb. 4. a) Abhängigkeit der Enzymaktivität von der Temperatur; b) Ermittlung der Aktivierungsenergie

Lösliche NADH 2 -Dehydrogenase

135

giert nicht als Lipoatdehydrogenase, da weder mit reduziertem noch mit oxydiertem Lipoat eine Reaktion erfolgte. Sukzinat und NADPH 2 erwiesen sich ebenfalls als inaktive Substrate. Bei der Überprüfung verschiedener Elektronen- und Wasserstoffakzeptoren wurde als hervorstechendes Merkmal die Reaktion mit Zytochrom b5 bestätigt. Mit Zytochrom c reagiert das Enzym nur minimal im Verhältnis zu anderen Elektronenakzeptoren. Es zeigt auch gegenüber Chinonen keine JL V

Abb. 5. LiNEWEAVER-BuRK-Diagramm zur E r m i t t l u n g der MiCHAELis-Konstante f ü r N A D H 2 im Meßsystem mit Kaliumferrizyanid. NADH a -Dehydrogenase K m = 1,4 X 10" 4 M

Aktivität. Das Verhältnis der Maximalaktivitäten des Enzyms zu den Elektronenakzeptoren Dichlorphenolindophenol, Zytochrom b 5 und Kaliumferrizyanid in Abhängigkeit vom fiK ist in Tabelle 2 angegeben. Aus dieser Tabelle ist auch die geringe ^H-Abhängigkeit der Enzymaktivität in Ferrizyanid- und im Zytochrom b 5 -System erkennbar. Tabelle 2 Maximalaktivität in verschiedenen Systemen Akzeptor Dichlorphenolindophenol Kaliumferrizyanid Zytochrom b 5 -Zytochrom c

«H-Wert 6,4 7,4 3,0 35,6 1,3

0,5 33,6 1,3

Verschiedene Hemmstoffe wurden in ihrer Wirkung auf das gereinigte Enzym überprüft. Dabei wurde eine Hemmung des löslichen Enzyms durch Antimyzin A ermittelt. Die Beeinflussung der Enzymaktivität durch unterschiedliche Hemmstoffkonzentrationen ist in Abbildung 6 dargestellt. Die Titrationskurve zeigt eine 50%ige Hemmung bei 7 • 10~6 M Endkonzentration. Ein weiterer Hemmstoff ist p-Chlormerkuribenzoat, dessen 50%ige Hemmwirkung bei einer Endkonzentration von 8 • 10~ 6 M liegt (Abb. 7). Heptan als Inhibitor der partikelgebundenen NADH 2 -Zytochrom-c-Oxydoreduktase zeigt auch eine Wirkung auf das lösliche Enzympräparat. Von

136

V . HAHN, C. WAGENKNECHT

-6 lg [J]

M/h

-5 Ig [ J ]

Abb. 6. Titrationskurve des Enzyms mit Antimyzin A

M/t-*

Abb. 7. Titrationskurve des Enzyms mit p-CMB

besonderem Interesse ist die kompetitive Hemmung gegenüber NADH 2 . Abbildung 8 zeigt diese Beziehungen in einer Darstellung nach H U N T E R und DOWNS. Die Hemmkonstante für Heptan liegt bei Ki 2,8 • 10~ 2 M für eine Rohfraktion des Enzyms. Andere Hemmstoffe wie Dikumarol, Jodazetat und Amytal zeigten auch in höheren Konzentrationen keine Wirkung. Eine unspezifische Hemmung durch höhere Harnstoffkonzentrationen (Endkonzentration 2—8 M) wurden beobachtet.

Abb. 8. Kompetitive Hemmung des n-Heptans gegenüber NADH 2 im FerrizyanidMeßsystem. Darstellung nach

HUNTER

und

DOWNS.

[ J ] = Heptankonzentration Mol/1; A =

VJV

Diskussion man das angereicherte Enzym mit anderen NADH 2 -DehydroVergleicht genasen, die auch aus Mitochondrien gewonnen wurden, so erkennt man Unterschiede im Präparationsgang. Die abgelöste Diaphorase entsteht im Gegensatz zu den anderen mitochondrialen Enzymen durch eine Inkubation der Lebermitochondrien bei pH 6 und 0—4 °C aus der NADH 2 -Zytochromc-Oxydoreduktase. Während der Inkubation tritt ein starker Aktivitätsverlust an NADH 2 -Zytochrom-c-Oxydoreduktase auf. Die NADH 2 -Dehydrogenase-Aktivität bleibt jedoch überwiegend erhalten. Wie früher beschrieben wurde, ist der Aktivitätsabfall der Reduktase mit der Zerstörung eines Imidazol-Metallkomplexes und mit der Ablösung einer Dehydrogenase [1] —[3] verbunden. Die anderen isolierten mitochondrialen NADH 2 -Dehydrogenasen nach K I N G [6] und SINGER [ 1 4 ] besitzen gleichfalls nicht mehr

Lösliche NADH 2 -Dehydrogenase

137

die Eigenschaft mit Zytochrom c zu reagieren. Die Ursache dafür ist unbekannt. Alle mitochondrialen NADH 2 -Dehydrogenasen besitzen gemeinsam die Eigenschaft, nur mit künstlichen Elektronenakzeptoren zu reagieren. Das gereinigte Enzym kann mit Zytochrom b 5 reagieren. Diese besondere Eigenschaft besitzen auch die zytoplasmatische lösliche Diaphorase aus Leber [17] und die lösliche Diaphorase aus Erythrozyten [18]. In dieser Eigenschaft unterscheidet sich die abgelöste NADH 2 -Dehydrogenase aber von den mitochondrialen Dehydrogenasen nach KING [6] und KEARNEY und SINGER [8] sowie der STRAUBschen Diaphorase [9] (1.6.4-3) und gegenüber der DT-Diaphorase (1.6.5.1) nach ERNSTER [10]. Ein weiterer Unterschied besteht darin, daß Chinone ebenfalls keine Affinität zur NADH 2 -Dehydrogenase aus Rattenleber zeigen. Somit ist es auch nicht unter die Menadion( 1 . 6 . 5 . 2 ) u n d C h i n o n r e d u k t a s e n ( 1 . 6 . 5 . 1 ) (GUIDITTA u n d STRECKER [ 1 1 ] u n d

MARTIUS [12]) einzuordnen.

Vergleicht man die ^>H-Optima miteinander, so stellt man fest, daß die lösliche NADH 2 -Dehydrogenase aus Lebermitochodrien ein ^H-Optimum bei 6,4 gegenüber DCIP besitzt. Im Gegensatz dazu liegen die ^>H-Optima der aus Mitochondrien gewonnenen Enzyme nach SINGER [14] sowie nach MAHLER [13] (1.6.5.2.), das ein Kunstprodukt darstellt [15], [16], oberhalb pH 7,4. Einheitlich für alle Enzyme ist die Affinität zum Substrat NADH 2 . Die MiCHAELis-Konstante ist ähnlich denen der Dehydrogenasen und liegt bei 1 , 4 - 1 C T 4 M . Die Molekulargewichte aller aufgeführten Dehydrogenasen sind wenig verschieden voneinander und liegen in der Größenordnung von 50000. Unterschiede ergeben sich beim Vergleich der Spektren. So hat die Dehydrogenase nach SINGER einen kontinuierlichen Anstieg im Bereich von 550 bis 410 nm und einen Gipfel bei 410 nm. Die Antimyzin-A-empfindliche Dehydrogenase zeigt nach Behandlung mit Sephax G-100 ein Spektrum, in dem der vorher ebenfalls vorhandene Gipfel bei 410 nm abgetrennt wurde. Untersuchungen mit verschiedenen Hemmstoffen der Atmungskette ermöglichen einen Vergleich mit den anderen Enzymen. In der Tabelle 3 sind die aus der Literatur bekannten Wirkungen von p-Chlormerkuribenzoat, Antimyzin A, Dikumarol und Amytal auf verschiedene Vergleichsenzyme zusammengestellt. p-CMB, als SH-Reagenz bekannt, reagiert mit allen aufgeführten Enzymen. Daraus kann man schlußfolgern, daß auch beim untersuchten Enzym SH-Gruppen an der Reaktion beteiligt sein müßten. Tabelle 3 Wirkung der Hemmstoffe

Mitochondriale Zytochrom cReduktase MAHLER-Enzym KING-SINGER-Enzyme

Abgelöste Dehydrogenase DT-Diaphorase nach ERNSTER

p-CMB

Antimyzin

+ + + + +

+ — —

+

—

'

Dikumarol

Amytal

+

+

—

—

—

—

—

—

+

—

138

V . HAHN, C. WAGENKNECHT

Von besonderer Bedeutung ist die Hemmwirkung des Antimyzin A auf die abgelöste Diaphorase. Dies scheint die erste beobachtete Hemmung eines Enzyms der Hauptatmungskette in einem löslichen System zu sein. Die Hemmung läßt die Verwandtschaft der abgelösten Dehydrogenase mit dem Atmungskettensystem annehmen. Die Hemmung durch Alkane wurde bisher nur an partikelgebundenen Enzymen beobachtet [7]. Der kompetitive Hemmtyp des Heptan gegenüber dem NADH 2 weist möglicherweise auf eine Beteiligung einer apolaren Bindungsstelle am Aktivitätszentrum hin. Man muß annehmen, daß der Unterschied zwischen der in dieser Arbeit beschriebenen Dehydrogenase und anderen Dehydrogenasen darin besteht, daß die Antimyzin-empfindliche Dehydrogenase unter schonenderen Bedingungen präpariert wurde, ohne Verwendung von Proteinasen oder Phospholipasen. Literatur S. M. U. C. W A G E N K N E C H T : Naturwissenschaften 4 4 , 515 (1957). C. U. S. M. R A P O P O R T : Acta biol. med. german. 3 , 3 2 1 (1959). W A G E N K N E C H T , C . : Habilitationsschrift, Berlin ( 1 9 6 3 ) .

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Summary and C . W A G E N K N E C H T : A soluble N A D H 2 dehydrogenase from rat liver susceptible to antimycin A and alkane. I. Purification and characterization experiments. V. HAHN

1. The purification of a N A D H 2 dehydrogenase [ N A D H 2 : (acceptor)-oxidoreductase] (1.6.99.3.) isolated from rat liver mitochondria, by means of a fractionated ammonium sulfate precipitation and chromatographical separation on D E A E cellulose and sephapex G-100 is reported.

Lösliche NADH 2 -Dehydrogenase

139

2. N A D H a is the o n l y substrate. N A D P H 2 and succinate do not react. Dichlorphenolindophenol, potassium ferricyanide and a cytochrome b 5 -cytochrome c system act as acceptors, b u t lipoate does not. 3. Different inhibitors have been investigated for their action on this enzyme. A 50 percent inhibition was observed with antimycin A at a concentration of 7 x 10~ 6 M, with heptane a t 2.8 X 1 0 ~ 2 M and with p-chlormercuribenzoate a t 8 X 10~ 6 M. Pe3MMe B. TaH h B a r e H K H e x T : P a c T B o p H M a H N A D H 2 - A e r H j i p o r e H a 3 a H3 KpbicHHOii n e i C H H , HyBCTBMTejiLHafl k aiiTHMHUHiiy A h a j i n a H y . I. OnbiTH k o h h c t k c h oxapaKTepH30BaHHK) 1. CooCmaeTCH 06 o h h c t k c NADH 2 -HerHHporeHa3bi [ N A D H 2 : (ai;ijeiiT0p)-0KCMpeHyKTa3ti] (1. 6. 99.3), H30JiHp0BaHH0ii H3 m h t o x o h h p h h neneHH k p m c h , npn noMomn $paKmioHHpoBaHHoro ocaHt^enHH cyjinfiaTa aiviMOHMH h xpoMaTorpa(j)HqecKoro pa3nejieHHH Ha JH3A3-nejuii0Ji03e h ce^aaeKC G - 1 0 0 . 2. N A D H 2 HBjineTCH CHHHCTBenHBiM cy6cTpaT0M. N A D P H 2 h cyKiiHHaT He p e a r n pyioT. B ita^ecTBe aKuemropoB AeiicTByiOT nHXjTop^eHOjiHHaocfieHOJi, eppjmnaHHH KaJIHH H CHCTeMa H3 L(HTOXpOMa b5-L[HTOXpOMa C, HO He JlHIIOaT. 3. H 3 y i a J i o c b jjeiicTBHe pa3Htix HHrngHTopoB Ha s t o t 3H3HM. 50%-Hoe HHrn6HpoBaHHe ycTaHOBJieHo n p n k o h c i h o h KOHijeHTpauHH aHTHMHiiHHa A I • 1 0 - 6 M , renTaHa — 2,8 • 10~2 M H p-xji0pMepKypH6eH30aTa — 8 • 10~6 M .

Acta biol. med. german., Band 18, Seite 141—154 (1967) Aus dem Institut für Pharmakologie und Toxikologie der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald (Direktor: Prof. Dr. W.

SCHELER)

Untersuchungen zum Hämintransfer zwischen Methämoglobinen verschiedener Spezies und Humanserumalbumin sowie dessen Beeinflussung durch Liganden K . MÜLLER und W .

SCHELER

(Eingegangen am 6. 9. 1966) Zusammenfassung Nach in vivo-Markierung der Hämoglobine von Maus, Ratte und Meerschweinchen mit 5 9 Fe werden diese allein und in Gegenwart von Humanserumalbumin der Stärkegelelektrophorese unterworfen. Der bei />H 6 vom Methämoglobin abgespaltene Anteil des Hämins läßt sich radiometrisch zu 1,08 bzw. 8,35% ermitteln; Die Bildung von Methämalbumin wird durch SCN - nur sehr gering, durch F~ stärker und besonders durch CN~ und Nj" beträchtlich verringert. Auch bei pH. 9 kann der Hämintransfer durch Zyanidionen vermindert werden. Die Abschätzung der Konstanten für die zugrundeliegenden Gleichgewichte läßt Rückschlüsse auf die Bindungsverhältnisse zwischen Hämin und Protein zu. Die Verknüpfung zwischen F- und E-Helix der Polypeptidkette, His-Fe+-H 2 0-His, wird bei Ersatz des H a O durch Liganden verstärkt und auf diese Weise die MetHb-Konformation gegenüber denaturierenden Einflüssen stabilisiert.

Die Bindung zwischen Hämin und Apoproteinen ist bei diversen Hämoproteiden reversibel. Durch geeignete Verfahren gelingt es, beide Komponenten voneinander zu trennen, und bei ihrer Rekombination bildet sich das funktionstüchtige Ausgangsprodukt zurück. Auf diese Weise konnte die Wechselwirkung zwischen Häminkomponente und Protein z. B. bei Myoglobin [2], Hämoglobin [1], [2], [44], Peroxydase [6] studiert werden. Obwohl in Myoglobin oder Hämoglobin zwischen Eiweiß und Eisenprotoporphyrin I X keine kovalenten Bindungen bestehen, ist die Gleichgewichtskonstante der beiden Chromoproteide sehr niedrig, d. h. die Bindungsfestigkeit ist hoch. B A N E R J E E [ 1 ] gibt für das Metmyoglobin des Pferdes einen pK'-Wert von 15,2 (^H 7,25) und für das Schaf-Methämoglobin einen pK'a von 42,46 und einen pKi von 4 5,47 (^H 8,75) an. Derartig hohe pK-Werte sind nur einer indirekten Bestimmung über kompetitive Gleichgewichte zugänglich, bei denen der Häminkomponente ein mit dem genuinen Protein konkurrierender Partner (z. B. eine niedermolekulare Base oder ein anderes Apoprotein) angeboten wird. Von B L J U M E N F E L D [4] wurden zu diesem Zwecke Gelatine, Albumin und weitere Produkte eingesetzt. Dabei erfolgt eine affi10

Acta biol. med. german., Bd. 18, Heft 2

142

K . MÜLLER, W .

SCHELER

nitätsbestimmte Verteilung des Hämins auf die konkurrierenden Partner. Dieses Phänomen hat B L J U M E N F E L D als „Transhämierung" bezeichnet. Wir benutzten den Hämintransfer vom Methämoglobin auf Humanserumalbumin, um hieraus Rückschlüsse auf die Stärke der Hämin-Protein-Bindung in den Methämoglobinen verschiedener Spezies unter dem Einfluß von Liganden des Methämoglobins zu ziehen. Material und Methodik F ü r die Abtrennung des gebildeten MetHa 1 sind elektrophoretische Methoden vorzuziehen. Sowohl Stärkeblock- als auch Stärkegelelektrophorese erweisen sich als geeignet [9]. Während bei der Blockelektrophorese leicht eine Elution der Banden erfolgen kann und die Bestimmung der Konzentration auf verschiedenen Wegen möglich ist, k a n n die Stärkegelelektrophorese nur unter bestimmten Voraussetzungen quantitativ ausgewertet werden. Die früher beschriebene densitometrische Auswertung nach Benzidinfärbung wird durch die Beeinflussung der Peroxydaseaktivität durch Liganden eingeschränkt [3]. In der vorliegenden Arbeit wurden die Pherogramme nach in vivo-Markierung des Hämoglobins radiometrisch ausgewertet. Präparation von ™Fe-markiertem MetHb. Die radioaktive Markierung von Mäuse-Hb erfolgte in vivo nach einer Vorschrift von S A S S und S P E A R [15] durch i.p. Applikation wäßriger Lösungen von 5 9 Fe-II-zitrat bei jeweils 10 Tieren (Tab. 1). Nach 9 bis 11 Tagen wurde das Blut durch Exsanguinieren gewonnen, die Erythrozyten 3mal in physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und das H b intrazellulär mit 2,4%iger Natriumnitrit-Lösung oxydiert. Nach dreimaligem Waschen der braunen Zellen wurde durch Hämolyse eine konzentrierte MetHb-Lösung erhalten [17]. Tabelle 1 Zusammenstellung der Aktivierungsversuche mit sterilen 6 9 Fe-II-zitratlösungen, die je ml 33,3 mg Askorbinsäure, 3 mg Zitronensäure und 0,09 ml Benzylalkohol enthielten, ^ H - W e r t 6 h a t t e n und weniger als 0,02% 60Co enthielten. Die Applikation erfolgte i . p . Bei Versuch 1 bis 4 wurden jeweils 10 Mäuse mit einem Durchschnittsgewicht von 20 g, bei Versuch 5 2 Meerschweinchen mit je 120 g Gewicht eingesetzt V TJI ÖUCIL

Laufzeit [Tage]

1 2 3 4 5

11 11 11 9 9

Ausgangslösung [Ci/g] Fe Menge [mCi] 26,7 26,7 20,0 15,0 15,0

600 680 500 600 500

[fj.Ci/ml] 6,15 10,95 5,81 10,35 4,91

Hämolysat [mCi/g] Fe 38,8 44,9 43,0 55,0 24,0

QiCi] 37 66 35 62 26

Die Konzentrationsbestimmungen erfolgten spektralphotometrisch nach der Zyanidmethode bei 540 nm mit einem millimolaren Extinktionskoeffizienten von 12,8. Ratten- und Meerschweinchen-Methämoglobine wurden ganz analog gewonnen, nachdem 120 g schwere Meerschweinchen bzw. 100 g schwere R a t t e n je 250 juCi in 2,5 ml 59 Fe-II-zitratlösung i.p. erhalten hatten. 1

In der vorliegenden Arbeit wurden folgende Abkürzungen verwendet: MetHb bzw. H G für Methämoglobin, MetHa bzw. H A für Methämalbumin, Alb bzw. A für Humanserumalbumin, H für Hämin, G für Globin, S für Stärkegel, L für Liganden wie CN~, N j , SCN", F - .

Ligandeneinfluß auf Hämintransfer Pufferlösungen. Als Puffer für die Inkubation der MetHb-Alb-Gemische und für die Stärkegelelektrophoresen wurde ein Universalpuffer nach den Vorschriften von B R I T T O N und R O B I N S O N verwendet [5], Durch Zusatz von jeweils 0,05 M KF, KCN, KSCN oder NaN 3 wurde außer beim Fluorid (72% bei p H 6) eine vollständige Umwandlung des MetHb in den entsprechenden Komplex erreicht und während der Elektrophorese beibehalten. Um auch bei den Untersuchungen von ligandenfreiem M e t H b bzw. MetHb-OH gleiche Ionenstärke zu gewährleisten, wurde eine äquivalente Menge NaCl zugesetzt. Inkubation und Elektrophorese. Nach kurzer Inkubation mit dem ligandenhaltigen Puffer wurde dem MetHb das Alb in Form einer 20%igen Lösung des Serum- und Impfstoffinstituts P r a g (Charge Nr. 24/2-0663-3) zugesetzt. I n Parallelansätzen wurde s t a t t Alb eine entsprechende Menge Wasser zugegeben. Nach 1- und 25-stündiger Inkubation bei 4 °C wurden die zu vergleichenden Gemische in abwechselnder Reihenfolge je 11 mal verimpft. Dazu wurden in einer horizontalen Trennkammer [7] 12,5%ige Stärkegele mit 22 Startschlitzen vorbereitet. Jeder Schlitz besaß ein Fassungsvermögen von ca. 0,04 ml Gemisch. Nach einer Trennzeit von 5 Std. bei 7 V/cm und 12 mA/cm 2 wurde der Gelblock mehrfach horizontal aufgeschnitten [8]. Färbemethoden. Zur Charakterisierung der Banden wurden die Gellamellen in folgende Färbebäder eingelegt: Amidoschwarz (Eiweißanteile), Pyridin/Dithionit (Pyridinhämochromogene aus MetHb, MetHa und Hämin) und Benzidin/H 2 0 2 (Peroxydaseaktivität von MetHb, MetHa und Hämin). Bei p H 6 war MetHb kathodenwärts gewandert, MetHa und Alb mit gleicher Geschwindigkeit anodenwärts. Bei pH 9 wanderten alle Komponenten zur Anode. Radiometrische Auswertung. Aus einer 3 mm dicken Gellamelle wurden kleine Bereiche so ausgeschnitten, daß sie die zu untersuchenden Banden getrennt voneinander vollständig enthielten und Meßschälchen von 25 mm Durchmesser und 3 m m Tiefe ausfüllten. In den übrigen Teilen des Pherogramms konnten weder radiometrisch noch mit den erwähnten Färbemethoden weitere Banden nachgewiesen werden. Die Bestimmung der Zählraten erfolgte mit einem Glockenzählrohr VA-Z-310 in einer Universalabschirmkammer VA-H-100 (Abstand der Probe vom Zählrohrfenster 2 mm) a m Strahlungsmeßplatz VA-M-160 (all Geräte für die radiometrische Messung vom V E B Vakutronik Dresden). Es erfolgte Impuls- und Zeitvorwahl mit 6 min und 1000 Imp. mit anschließender Berechnung der Zahl der Impulse pro 6 min. Ergebnisse

l. HäminabSpaltung aus Methämoglobin bei der Stärkegelelektro-phorese Wird Methämoglobin (HG) einer Stärkegelelektrophorese unterworfen, so wandert es nach Lage des isoelektrischen Punktes bei p H 6 kathodisch. Dabei beobachtet man bei geeigneten Nachweismethoden neben der HGBande eine sehr schwache Nebenbande. Sie macht insgesamt nur wenig mehr als 1% aus und konnte anhand spektralphotometrischer Kriterien als Hämin (H) identifiziert werden. Die Häminkomponente wandert bei pH 6 anodisch, so daß sich beide Banden durch den Startschlitz getrennt finden. Die Häminbande enthält kein freies Eisen, was durch Rhodanidinkubation des Stärkegels ausgeschlossen werden konnte (artefizieller Zusatz von niedrigen FeCl3-Mengen ergab positive Reaktion). Da nach Angaben von B A N E R J E E [ 1 ] die Stabilität der Hämin-GlobinBindung (HG-Bindung) im MetHb sehr hoch ist — pKa beträgt 12,46 und pKb = 1 5,17 —, sollte bei der Elektrophorese keine Abspaltung des Hämins vom Globin erfolgen. Das Auftreten proteinfreien Hämins unter den Ver10»

K . MÜLLER, W .

144

SCHELER

suchsbedingungen hat 2 Ursachen: 1. Das für die Trägerelektrophorese verwendete Stärkegel wirkt als Konkurrenzpartner des Globins bei der Wechselwirkung mit Hämin (Bindung des Hämins über die anionischen Propionylgruppen an die polaren HO-Gruppen der Stärke). 2. Durch das Gleichspannungsfeld wird die Trennung des bei f K 6 anionischen Hämins und kationischen Globins (G) begünstigt. In Tabelle 2 sind die mit Mäuse-MetHb erhaltenen Impulsraten der HGund der HS-Bande aufgeführt: Tabelle 2 Radiometrische Bestimmung der Häminabspaltung vom Mäuse-MetHb bei der Stärkegelelektrophorese. pH 6,0. [MetHb] = 1,53 mM, [NaCl] = 50 mM; Meßwerte 1 - 1 1 (Elektrophorese Nr. 18) korrigiert mit Nulleffekt 108 Imp. pro 6 min; Meßwerte 12 — 22 (Elektrophorese Nr. 19) korrigiert mit Nulleffekt 114 Imp./6 min, im übrigen vgl. Methodik Meßwert 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

HS • 100 HS + HG

Impulsraten [Imp./6 min] HS + H G HG HS 3006 3941 5361 3229 4245 4604 4536 6972 5386 4157 4918 5140 4656 4047 4532 4730 3767 3654 5235 4126 3355 4698

2967 3887 5327 3118 4181 4550 4483 6918 5278 4103 4888 5094 4629 4047 4428 4721 3742 3608 5215 4082 3342 ' 4663

1,30 1,37 0,64 3,44 1,51 1,17 1,17 0,77 2,01 1,30 0,61 0,90 0,58 0,00 2,30 0,19 0,66 1,26 0,38 1,07 0,39 0,75

39 54 34 111 64 54 53 54 108 54 30 46 27 0 104 9 25 46 20 44 13 35

M ± s = 1,08 ± 0,77

Im Mittel werden unter den Versuchsbedingungen 1,08% des Hämins vom Globin abgespalten. Formulieren wir das zugrundeliegende Konkurrenzgleichgewicht, wobei S = Stärkegel und [S] die pro Volumeneinheit vorhandene molare Menge häminbindender Gruppen im Gel ist, ergibt sich: HG + S ^ H S + G

bzw.

K

1

=

iHS] • iG]. f H G l . rsi

u\ w

Ligandeneinfluß auf Hämintransfer

145

In erster Näherung können wir [S] = [HS] + [S] = const. setzen und da [HS] = [G] folgt: Kr

=

[HS]2 [HG]

(2)

K* ergibt sich für den vorliegenden Fall mit 1,80 • 10"7, pK* ist 6,74. 2. Häminabspaltung aus Methämoglobinkomplexen bei der Elektrophorese Für die nachfolgenden Untersuchungen war es von Interesse festzustellen, ob bei Anwesenheit von Methämoglobinliganden in den Ansätzen und im Gel die Abspaltung der prosthetischen Gruppe beeinflußt wird. Die Ergebnisse finden sich in Tabelle 3Tabelle 3 Häminabspaltung aus Methämoglobin-Liganden-Komplexen (LHG). Versuchsbedingungen wie bei Tabelle 2. Mittelwerte und Standardabweichung aus je 11 Meßwerten auf 2 Elektrophoresen Ligand ohne (NaCl) KSCN KF NaN 3 KCN

Konzentration [mM]

% LHG

50 50 50 50 50

0 100 72 100 100

[HS] + [LHS] • 100 [HG] + [LHG] + [HS] + [LHS] 1,08 1,17 1,25 0,53 0,71

± ± ± ± ±

0,77 0,22 1,24 0,52 0,70

F", SCN~ verändern gegenüber der NaCl-Kontrolle die Häminabspaltung nicht signifikant, N3~ und CN~ hemmen sie (P = 0,1%). Nehmen wir in erster Näherung an, daß die Bindung zwischen Hämin und Gel durch die Anwesenheit von Liganden nicht modifiziert wird, wäre die verminderte Häminabspaltung in Gegenwart von N3~ und CN~ auf eine Verfestigung der Hämin-Globin-Bindung zu beziehen. Versucht man unter diesen Vorbehalten die Zunahme der Bindungsfestigkeit größenordnungsmäßig abzuschätzen, ergeben sich pK*-Werte von etwa 7,36 (Azid) bzw. 7,11 (Zyanid). Indessen haben bei der immerhin beträchtlichen Streuung der Meßwerte und der Komplexität der Bedingungen diese Zahlen nur orientierenden Charakter. 3. Hämintransfer zwischen Methämoglobin und Humanserumalbumin Menschliches Serumalbumin (A) vermag Hämin zu binden. Es bildet sich das Methämalbumin zunächst als l:l-Komplex, dessen />K-Wert mit 8,3 angegeben wird [12]. Demnach ist die HA-Verbindung rund 10000 mal weniger fest als die HG-Verbindung. Trotzdem ist das Albumin ein weitaus stärkerer Konkurrenzpartner des Globins um das Hämin als das einfache Stärkegel. Die H-Bindung soll über dessen Propionylgruppen an das A

K . MÜLLER, W .

SCHELER

erfolgen [10]. Inkubiert man eine HG-Lösung in der angegebenen Weise einige Zeit mit A und trennt hinterher beide Proteine voneinander ab, ist ein Teil des H aus dem HG auf A übergegangen und hat HA gebildet: HG + A ^ HA + G

bzw.

K„ =

[HA] • [G] [HG] • [A]

(3)

„Freies", d. h. an das Gel gebundene Hämin (HS) konnte neben HA und HG nicht nachgewiesen werden. In Tabelle 4 sind Meßwerte des radiometrisch bestimmten Hämintransfers für eine bestimmte Versuchsserie zusammengestellt : Tabelle 4 R a d i o m e t r i s c h e B e s t i m m u n g der H ä m i n ü b e r t r a g u n g v o n M ä u s e - M e t H b auf A l b bei d e r Stärkegelelektrophorese. pH 6,0 • [MetHb] = 1,53 mM, [A] = 1,20 mM, [NaCl] = SOmM; M e ß w e r t e 1 — 11: E l e k t r o p h o r e s e Nr. 18, I n k u b a t i o n 1 Std., korrigiert m i t N u l l e f f e k t 108 I m p . / 6 m i n ; M e ß w e r t e 12 — 22: E l e k t r o p h o r e s e N r . 19, I n k u b a t i o n 25 Std., korrigiert m i t N u l l e f f e k t 114 I m p . / 6 min, i m ü b r i g e n vgl. M e t h o d i k Meßwert 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

I m p u l s r a t e n [Imp./6 min] HA + HG HG HA 3693 3629 3753 3868 4018 4499 4707 4548 2313 6787 5291 5021 4040 3985 3798 4287 4240 3234 4547 3569 4315 3611

3380 3328 3415 3521 3716 4126 4297 4178 2050 6221 4847 4566 3785 3715 3516 3929 3854 2943 4129 3332 3976 3311

313 301 338 347 302 373 410 370 263 566 444 455 255

270

282 358 386 291 418 237 339 300

H A • 100 HA + HG 8,44 8,30 9,00 8,79 7,51 8,38 8,72 8,14 11,33 8,34 8,40 9,05 6,32 6,78 7,43 8,35 9,11 9,00 9,20 6,66 7,86 8,31

M ± s = 8,35 ± 1,05

Unter den Bedingungen der Tabelle 4 gehen also 8,35% des Hämins vom Methämoglobin auf das Albumin über. Berechnen wir aus diesem Wert nach (3) K2, ergibt sich '1,06 • 10"2, ¿>K2 = 1,98.

Ligandeneinfluß auf Hämintransfer

147

Wenn wir entsprechend wie für das HG in Gleichung (1) auch für HA unter gleichen Bedingungen ein Gleichgewicht formulieren: HA + S ^ HS + A ^

und

K3 =

[HS]

' [A] [HA] • [S]

(4)w

und ferner ebenfalls vereinfachen, so daß wir KJ = 3

(5)

[HA]

erhalten, dann ergibt sich unter Einsetzen von Kf und K* die Beziehung: K 2 = K f / K * bzw. -pK2 = i>Kt . (6) Daraus läßt sich pK* = pK* — pK2 = 4,73 für die betreffenden Versuchsbedingungen errechnen. Weiter läßt sich für [A] + [HA] = [H] + [HA] = 1,2 mM eine Häminabspaltung von 11,7% aus dem Methämalbumin errechnen. Experimentell wurden in dieser Richtung keine Bestimmungen vorgenommen. Im übrigen wurden auch bei anderen A- und HG-Konzentrationen Transhämierungsversuche durchgeführt (weitere Angaben in Tabelle 5). Tabelle 5 Häminübertragung zwischen M e t H b und Alb unter verschiedenen Versuchsbedingungen. Stärkegel- (bzw. Stärkeblock-)Elektrophorese, pH. 6,0, BRiTTON-Puffer mit 50 mM NaCl; sonstige Versuchsbedingungen vgl. unter Methodik Alb Konz. |"mM]

H A • 100 HA + HG

PK*

1,53

1,2

8,35 ± 1,05

1.98

Maus Maus Maus

2,20 2,20 2,20

1,2 0,8 0,4

6,24 ± "1.70 5,40 ± 1,52 4,90 ± 1,91

2,09 2,05 1,84

Maus Meerschw.

1,68 1,84

1,2

1,2

4,40 ± 0,95 3,64 ± 1,42

2,53 2,66

Mensch

1,20

1,5

6,2

2,47

Ansatz Nr.

Meßwerte

18, 19

22

Maus

34-36

24 21 21

41, 42

22 20

Block

5

Me tHb Konz.[mM] Spezies

± 1,0

Da sich die unter identischen Bedingungen erhaltenen Transhämierungswerte für Maus — 4,40% — und Meerschweinchen — 3,64% — mit P = 0,1 % signifikant voneinander unterscheiden und der Mittelwert für alle in Tabelle 5 aufgeführten pK2-Werte des Mäuse-MetHb 2,10 beträgt, erscheint die Hämin-Globin-Bindung im Meerschweinchen-MetHb und im humanen MetHb als fester. Bei letzterem natürlich mit der Einschränkung, daß die Werte mittels Stärkeblockelektrophorese gewonnen wurden.

148

K . MÜLLER, W .

SCHELER

4. Hämintransfer zwischen Methämoglobinkomplexen und Humanserumalbumin Methodisch wurde in gleicher Weise wie in Abschnitt 2 vorgegangen, lediglich wurden keine reinen Lösungen der Methämoglobinkomplexe verimpft, sondern Mischungen mit Albumin, die 1 bzw. 12 bzw. 25 Std. inkubiert worden waren. Die Inkubationszeit von 1 Std. reicht aus, um bei ftü 6,0 Gleichgewichtsbedingungen zu erhalten. Der mathematische Ansatz kann in vereinfachter Form von einem Konkurrenzgleichgewicht ausgehen: LHG + A - L H A + G

und

(7)

L-LriLrJ • [AJ

Tabelle 6 enthält für Mäuse- und Human-MetHb die Transhämierungsraten sowie die ^>K4-Werte. Tabelle 6 Hämintransfer zwischen MetHb-Komplexen und Alb unter definierten Versuchsbedingungen (vgl. auch unter Methodik). Bei einer Ligandenkonzentration von 50 mM liegt beim F " - K o m p l e x 72% Umwandlung vor, bei 100 mM 8 3 % , bei den übrigen Liganden ist die Umwandlung vollständig MetHb-Spezies MetHb-Konz. Liganden-Konz. Albumin-Konz. Inkubation pH Elektrophorese Bestimmung Liganden ohne (NaCl) KSCN KF NaN a KCN

Maus 1,53 50 1,2 1 und 25 6,0 Stärkegel radiometrisch

[mM] [mM] [mM] [Std.]

%

Mensch 1,2 100 1,5 12 6,0 Stärkeblock spektralphotometrisch

%

n

Transfer

£K4

n

Transfer

22 22 22 22 22

8,35±1,05 7,07±0,79 3,95±0,99 2,58±0,94 2,22±1,23

(1,98) 2,12 2,67 3,05 3,18

5

6,2±1,0

3 2 3

4,5±0,55 1,2±0,1 1,8±0,55

(2,46) 2,75 3,92 ' 3,57

Unter der Annahme, daß die Bindung zwischen Hämin und Albumin bei der Bindung von Liganden an das Methämalbumin nur unwesentlich verändert wird, ergibt sich aus dem Vergleich des />K4- mit dem zugehörigen ^K 2 -Wert (1,98) die Schlußfolgerung, daß durch die Bindung von Liganden an Methämoglobin die Abspaltung der prosthetischen Gruppe erschwert, d. h. die Bindung zum Protein verfestigt wird. Die erwähnte Annahme wird vor allem dadurch in ihrer Wahrscheinlichkeit erhöht, daß die Bindung zwischen Hämin und Albumin über die Propionylgruppen erfolgt und daß deshalb die Bindung eines Liganden am zentralen Eisenatom sich weit weniger auf die Hämin-Protein-Bindung auswirken sollte als im Falle des Methämoglo-

Ligandeneinfluß auf Hämintransfer

149

bins, wo Gruppen des Proteins unmittelbar zum Ligandenverband des Hämineisens gehören (Histidinimidazol) und so durch eine Ligandenbindung am Eisen unmittelbar in ihrer Elektronendichteverteilung modifiziert werden [22]. 5. Hämintransfer im alkalischen Milieu Bei ^>H-Werten > 7 geht das saure Methämoglobin zunehmend in die alkalische Form über (^>Hsoo/o « 8,3). es bildet sich der Hydroxydkomplex. In ihm ist die prosthetische Gruppe lockerer gebunden [4], [13]. Mit unseren Transferuntersuchungen bei pH 9,0 konnten wir dies bestätigen. Dabei sind die Transhämierungsraten erheblich von der Inkubationszeit abhängig, und eine 1 -stündige Inkubation reicht nicht für die Einstellung von Gleichgewichtsbedingungen aus (vgl. Tab. 7). Tabelle 7 Hämintransfer zwischen alkalischem Methämoglobin und Humanserumalbumin unter verschiedenen Bedingungen. Stärkegelelektrophorese, pH 9,0, BRITXON-Puffer mit 50 mM NaCl, Inkubation bei 4 °C, jeweils 11 Meßwerte gemittelt Spezies Maus Maus Maus Maus Maus Maus Ratte Ratte Maus Maus Ratte Ratte

MetHbKonz. [mM]

Albumin Konz. [mM]

Inkubationsdauer [Std.]

Ligand Konz. [mM]

1,68 1,68 1,68 1,68 1,68 1,68 1,55 1,55 1,68 1,68 1,55 1,55

ohne ohne 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2

1 25 1 25 25 72 25 72 120 120 120 120

ohne ohne ohne ohne ohne ohne ohne ohne KCN 50 KCN 50 KCN 50 KCN 50

Inkubationsdauer mit Ligand [Std.]

— — — — —

1

24 1 24

0/ %

Transfer 1,96 3,02 11,1 19,7 18,4 23,5 18,3 22,6 18,8 15,9 16,5 13,6

Bereits ohne Albumin ist die Abspaltung des Hämins aus dem alkalischen MetHb stärker als im sauren Milieu (3,02 statt 1,08%). In entsprechender Weise steigt auch der Hämintransfer auf das Albumin (19,7 statt 8,35%). Das Zyanid vermindert die Transhämierungsrate. Wie erforderlich ist das Zyanid auch wirksam, wenn es erst nachträglich dem Gemisch zugesetzt wird und einige Zeit weiter inkubiert wird. Wie in Tabelle 7 sichtbar, bestehen im alkalischen Milieu zwischen Mäuseund Ratten-MetHb keine Speziesunterschiede in der Transferrate, dagegen wird durch KCN die Hämin-Globin-Bindung bei der Ratte etwas stärker verfestigt als bei der Maus.

150

K . MÜLLER, W .

SCHELER

Diskussion

Durch i.p.-Applikation von 59 Fe-Zitrat ließen sich die Blutfarbstoffe von Maus, Ratte, Meerschweinchen radioaktiv markieren. Da die Aktivität in der prosthetischen Gruppe lokalisiert ist, kann mittels radiometrischer Methoden deren Abspaltung vom Globin gut verfolgt werden. Ebenso haben wir spektralphotometrische Methoden für das gleiche Problem erfolgreich eingesetzt. Sie sind indessen weniger empfindlich und technisch umständlicher. Der Nachteil des radiometrischen Vorgehens liegt darin, daß es sich vorzugsweise nur für kleinere Spezies eignet. Die Radioaktivität fand sich nach zweckentsprechendem Vorgehen stets in der prosthetischen Gruppe des Hämoglobins. Eine Fe-Abspaltung konnte ausgeschlossen werden, da Radioaktivität in den Gelen nur mit einer äquivalenten Peroxydaseaktivität und Pyridinhämochromabsorption parallel ging, nicht aber eine positive Rhodanidprobe ergab. Die prosthetische Gruppe ist im Hb bzw. MetHb und den Derivaten reversibel gebunden. Eine kovalente Bindung zwischen Hämin und Protein besteht nicht, obgleich die Dissoziationskonstante sehr niedrig ist. Der />K'-Wert beträgt für Pferde-Metmyoglobin 15,2, für Schaf-Methämoglobin ist pKa = 12,46 und pKb = 15,17 [1]. Das Gleichgewicht ist also praktisch völlig auf das intakte Proteid hin verschoben. Eine Häminabspaltung vom nativen Globin bzw. Apomyoglobin kann bei mittleren pH-Werten nur erfolgen, wenn das Medium Partner enthält, die mit dem Globin um die prosthetische Gruppe konkurrieren können. Das tritt u. a. bei Anwesenheit von menschlichem Serumalbumin ein. BLJUMENFELD [ 4 ] , der als erster sich ausführlich mit dieser Problematik befaßt hat, hat neben Albumin weitere Häminakzeptoren sowie auch verschiedene Hb-Derivate als Donoren studiert. Bei unseren Untersuchungen war bemerkenswert, daß unter den Versuchsbedingungen bereits die Stärkegelmatrix (desgleichen die Stärke bei der Blockelektrophorese) als Konkurrenzpartner um das Hämin auftritt. Entsprechende Beobachtungen machten wir mit Dextrangelen bei chromatographischen Reinigungen verschiedener Blutfarbstoffe. Nach wiederholten Gelfiltrationen von MetHb über Sephadex G 75 färbt sich das Gel allmählich dunkler. Die Ursache ist eine Bindung von Hämin, das aus MetHb abgespalten wird. Sie ist partiell irreversibel, offensichtlich aggregiert bzw. polymerisiert das Häminmonomere in den Hohlräumen des Gels und kann diese dann nicht mehr verlassen. Vermutlich trägt bei der Trägerelektrophorese das angelegte Feld zusätzlich zur Häminabspaltung aus dem MetHb bei, da bei pH 6 Hämin und Globin entgegengesetzt wandern. Immerhin werden bei den Standardversuchsbedingungen etwas mehr als 1 % der prosthetischen Gruppen abgespalten. Daraus errechnet sich ein scheinbarer ^>K-Wert von 6,74. Wird MetHb mit Albumin inkubiert, so ist nach der elektrophoretischen Trennung der beiden Proteine ein Teil der Radioaktivität ( = des Hämins) auf das Albumin übergegangen. Der Prozentsatz kann beträchtlich sein, bei pH 6,0 waren es > 8 % . Die Verteilung des Hämins

Ligandeneinfluß auf Hämintransfer zwischen Globin und Albumin erfolgt unter den Versuchsbedingungen etwa mit den relativen Affinitäten 100:1. Bei der Komplexbildung des Methämoglobins wird das zwischen Hämineisen und distalem Imidazol befindliche Wassermolekül verdrängt. Die Liganden nehmen im Komplex eine Brückenposition zwischen Eisen und distalem Imidazol ein. Ihre Affinität zum positiv geladenen Hämineisen wird im wesentlichen durch ihre Nukleophilie bestimmt [17], Als grundsätzliche Momente wirken Bindungskräfte zum distalen Imidazol, wobei dieses durch seine Mesomerie sowohl H-Akzeptor als auch H-Donor für die Ausbildung von Wasserstoffbindungen sein kann, je nachdem ob der Ligand H-Donor-(HL~) oder H-Akzeptoreigenschaften (L~) besitzt: bzw.

H \ = /

i . . . f U .. -L • • • H N / V N |

\ = /

II OH~ gehört zur ersten, F~, Ns~ und andere zur zweiten Gruppe. Für den Azidkomplex geben STRYER et al. [22] eine Ii-entsprechende Röntgenstruktur an. Prinzipiell ist eine Verfestigung der Hämin-Protein-Bindung bei der Ligandenbindung durch die Wasserstoffbrücke zum distalen Imidazol möglich, wenn sie einen höheren Bindungsbeitrag liefert als das dadurch verdrängte Wassermolekül, also z.B. bei F~ oder OH". Letzteres soll aber zunächst außer Betracht bleiben. Doch reicht die dadurch gewonnene Zunahme der Bindungsenergie keinesfalls aus, um die beträchtliche Verfestigung der Hämin-Protein-Bindung bei der Bindung von N3~ oder CN - zu erklären. Die Deutung kann auf der Basis anderer von uns durchgeführter Versuche vorgenommen werden [20]. Hämine bilden mit Imidazolen Komplexe. Im allgemeinen binden sich pro Hämin 2 Imidazole [18]. Unter geeigneten Bedingungen kann aus dem Di-imidazol-Komplex von Häminen durch anionische Liganden (CN~, N3~) ein Imidazol verdrängt werden. Das im Mischkomplex enthaltene Imidazol verfügt — verglichen mit der freien Form — über stärker acide Eigenschaften. Die Iminogruppe des Imidazols ist nur sehr schwach sauer (¡¿>Ka = 14,4), während sie beim Imidazol des Mischkomplexes pK a -Werte noch < 1 0 erreichen kann [20]. Dies weist auf eine verstärkte Einbeziehung des Imidazols in den Ligandenverband des F e 3 + hin, wenn aus dem Di-imidazol-Komplex von Hämin ein Imidazol durch Anionen vom Typ des N 3 " oder CN~ verdrängt wird. In entsprechender Weise interpretieren wir die Intensivierung der Hämin-Protein-Bindung im Methämoglobin bei der Bindung von Liganden. PARSHALL [11] hat für Platin-Komplexe eine prinzipiell analoge trans-Aktivierung bei Liganden mit stärkeren TI-Akzeptor-Eigenschaften beobachten können. Diese Verfestigung der Hämin-Globin-Bindung bei der Komplexbildung des Methämoglobins bleibt nicht auf die Hämin-Umgebung lokalisiert. Sie kann zu Konformationsänderungen führen, die sich z. B . auf den Assoziationsgrad

152

K . MÜLLER, W .

SCHELER

des MetHb auswirken. Dialysiertes menschliches Methämoglobin ist weitgehend in dimere Einheiten gespalten. Zugabe von eben zur Komplexbildung ausreichenden N3~-Konzentrationen bedingt Tetramerisierung, während Cl - in gleicher und noch höherer Konzentration hierzu unfähig ist [19]. Die verstärkte Einbeziehung des proximalen Imidazols in den Komplexverbarid der prosthetischen Gruppe und die Folgeerscheinungen dürften auch für die stabilisierende Wirkung der Liganden gegenüber einer Wärme- oder Säuredenaturierung des MetHb [16], [21] ursächliche Bedeutung haben. Das alkalische MetHb, also die OH "-Verbindung, nimmt bei den Transhämierungsversuchen eine Sonderstellung ein. Das ist nicht verwunderlich, änderte sich doch bei der Alkalisierung des MetHb nicht nur die Besetzung des Hämineisens (H 2 0 —> OH - ), sondern Ladung, Löslichkeit, Hydratation, kurzum die ganze Konformation des Proteins. Zum anderen sind die Versuche bei -pH 6 und 9 wegen der grundsätzlichen Veränderungen der Versuchsparameter einem direkten Vergleich nicht zugänglich (Modifikation des Albumins, des Gels etc.). Weitere Einzelheiten der Befunde sind teils schon im experimentellen Teil diskutiert, teils sprechen sie für sich. Das gilt insbesondere für die sich abzeichnenden Speziesunterschiede, die indessen noch für weitere Tierarten zu studieren wären. Literatur [1] BANERJEE, R . : S t u d y of hematin-globin linkage. D e t e r m i n a t i o n of equilibrium constants. Biochem. biophysic. Res. Commun. 8, 114 (1962). [2] B A N E R J E E , R . U. S. F I L I T T I - W U R M S E R : F u n c t i o n of t h e h a e m s in t h e s t r u c t u r a l integrity of hemoglobin. Acta biol. med. german. Suppl. 3, 30 (1964). [3] B I S S E R T , J . : Über die Beeinflussung der P e r o x y d a s e a k t i v i t ä t des Methämoglobins u n d des Haptoglobin-Methämoglobin-Komplexes d u r c h Liganden des P o r p h y r i n eisens. Med. Diss. Greifswald, 1966. [4] BLJUMENFELD, L. A.: Hämoglobin u n d reversible Sauerstoffbindung. Verl. Sowjetwissenschaft, Moskau 1957. [5] BRITTON, H . T . S . U. R . A . ROBINSON:

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Ligandeneinfluß auf Hämintransfer [13] [14]

[15] [16]

[17] [18] [19] [20] [21] [22]

153

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Anschrift der Verfasser: Prof. Dr. med. habil. W . S C H E L E R und Dipl.-Chem. K . M Ü L L E R , Institut für Pharmakologie und Toxikologie der Ernst-Moritz-Arndt-Universität, 22 Greifswald, Friedrich Loefflerstr. 23 d Summary K. M U E L L E R and W . S C H E L E R : Studies on hemin transfer between methemoglobins of different species and human serum albumin and the effect of ligands on it Hemoglobins of mice, rats and guinea pigs were labelled in vivo with 6 9 Fe, and subjected to starch gel electrophoresis alone and in presence of human serum albumin. At pH 6, an amount of 1.08 and 8.35 percent respectivly of hemin dissociated from the methemoglobin. The formation of methemalbumin is weakly inhibited by SCN~, more reduced by F~ and considerably reduced by C N - and N j . The hemin transfer may also be inhibited by cyanide ions at pH 9. Estimation of the constants of the underlying equilibriums permits conclusions as to the binding between hemin and protein. The linkage beween t h e F and E helix of the polypeptide chain, His-Fe+ —H 2 0-His, is reinforced when H 2 0 is replaced by ligands, and thus the MetHb conformation is stabilized against denaturing influences. Pe3H»Me K . M i o j i j i e p H B. I H e j i e p : HccjieHOBaHHH o T p a H c n o p T e reMHHa MEWMY MeTreMorjioÖHHaMH pa3Hbix BHHOB JKHBOTHBIX H NEJIOBENECKHM C M B O P O T O H H M M ajiböyMHHOM H BJiHHHHe jiHraHHOB Ha Hero IIOHBeprajIHCb M e T C H H K ) 59 Fe in vivo, H 3aTeM, H 3JieKTpoix (19 h 22 h c h l ) , mojiohhlix (5, 10, 20 h 30 neHb nocjie poHtaeHHH), a Taione 3nopoBbix, aHewmqecKHX h HcnyccTBeHHO nojiHHHTeMHqecKHx B3pocjibix Kpbic. HeopraHHTCCKHii ({ioc(J)op onpeHenHJicH b k p o b h h h x KJieTKax h b njia3Me pa3nejibH0. 2 . B KpbicHHbix peTHKyjioiiHTax HeopraHHqecKHtt KHMbi b co3peBmnx apHTpouHTax. ConepwaHHe 2,3-PGS yBejiHHHBaeTCH b 10 p a 3 . y H e o p r a m m e c K o r o opa KOHijeHTpauHH yMeHbinaeTCH 6bicTpee b k p o b h h h x KJieTKax, leM b njia3Me. 5. y S e p e M e H H H X KpbIC KOHUeHTpaiJHH H y K J i e O T H H O B B OHHOM MHJIJIHJIHTpe K p o b h h h x KJieTOK He OTJiHiaeTCH o t KOHijeHTpaijHH y n e p e M e H H b i x Kpbic. 6. T l o c j i e

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Acta biol. med. german., Band 18, Seite 177 — 186 (1967) Aus der Deutschen Akademie der Wissenschaften zu Berlin, Institut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie, Jena (Direktor: Prof. Dr. med. H. KNÖLL), Abteilung für Steroidforschung

Die Ausscheidung von C 19 -Steroiden i m Kaninchenharn nach Verabfolgung von 3 H-Dehydroepiandrosteron K . SCHUBERT u n d G . SCHUMANN

(Eingegangen am 10. 9. 1966) Zusammenfassung Zwei weibliche Kaninchen wurden mit 3 H-Dehydroepiandrosteron bzw. mit 3 HDehydroepiandrosteron und inaktivem Dehydroepiandrosteron-Phosphat belastet und die Stoffwechselprodukte im Harn untersucht. Es wurden folgende Steroide isoliert: Dehydroepiandrosteron, Androsteron, Ätiocholanolon, Ätiocholandion, epi-Testosteron, zl 5 -Androsten-3/?,17«-diol, 5a-Androstan-30,l 7^-diol. Hauptprodukte des Stoffwechsels waren die Diole, wobei ¿d5-Androsten-3/?,l 7«-diol stark dominierte. Es ist auffallend, daß beim Kaninchen die Reduktion der 17-Oxogruppe des Dehydroepiandrosterons bevorzugt zur 17H 5) pH 1 + 4 n

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Acta biol. med. german., Band 18, Seite 219 — 232 (1967) Aus dem Physiologischen Institut der Humboldt-Universität Berlin (Komm. Direktor: Doz. Dr. med. habil. W . R Ü D I G E R )

Über den Einfluß beidseitiger Hypothalamusläsionen auf die chemische Wärmeregulation der juvenilen Ratte H . CHOINOWSKI, P . BARTSCH u n d W .

RÜDIGER

(Eingegangen am 8. 8. 1966) Zusammenfassung Von insgesamt 45 untersuchten juvenilen Wistarratten wurden 21 jenseits des 4. Lebenstages nach stereotaktischen Daten im rostralen Hypothalamus elektrolytisch koaguliert (2 mA/10 V/16 sec) und mit 24 wurf- und altersgleichen Tieren, die nach ähnlicher Traumatisierung außerhalb des Hypothalamus koaguliert wurden, verglichen. Als Kriterium für die Beurteilung der Temperaturregulation diente die kontinuierliche Registrierung von Rektaltemperatur und 0 2 -Aufnahme bei konstantem Po 2 (ISO i 2,5 Torr) unter gleicher thermischer Belastung im transit-state (kontinuierliche Abkühlung von 36° auf 20 °C Umgebungstemperatur bei 0,12 °C/min nach anfänglicher Yorphase von 45 min Dauer). Die Versuchstiere wurden bis zum 15. Lebenstag im Verlauf von 109 Doppelversuchen untersucht. Bei einer Gruppe von 8 Tieren wurde eine schwere Störung sowohl der 1. als auch der 2. chemischen Temperaturregulation bei Vorliegen einer kompensatorischen Einschränkung der Wärmeabgabe gefunden. Diese Tiere zeigten bei hyperthermen Rektaltemperaturen signifikant höhere, bei hypothermen Rektaltemperaturen signifikant niedrigere 0 2 -Aufnahmewerte gegenüber den Vergleichstieren. Im Bereich normaler Nesttemperaturen fanden sich keine Unterschiede. Dieser Effekt wurde als spezifisch für die bilaterale Ausschaltung der Area praeoptica medialis beobachtet. Bei weiteren 13 Tieren fanden sich zum Vergleichstierkollektiv keine statistisch sicheren Unterschiede. In keinem Fall wurde bei diesen Tieren das Einbezogensein der Area praeoptica medialis gefunden. Die Area praeoptica medialis kann somit als wesentliches Stellglied der chemischen Thermogenese juveniler Wistarratten angesehen werden.

Der juvenile Warmblüter ist bereits zu einer kälteinduzierten Stoffwechselerhöhung befähigt. Dieser Befund wurde an Mensch [6], Hund [38], Schwein [37], Kaninchen [7], [8], [14], Ratte [44], [22] und Maus [10],[20], [21], [27], [42] bewiesen. Aus diesen Untersuchungen geht hervor, daß der neugeborene Warmblüter trotz teilweise größter Instabilität seiner Körpertemperatur seinen Oxydationsstoffwechsel in engen Grenzen gegensinnig zur Temperatur verstellt. Da sich dieser Sachverhalt mit der noch unausgereiften Myelinisierung im ZNS [9] und dem völligen Fehlen elektrisch nachweisbarer Kältezitterimpulse [27], [7], [8] in den ersten Lebenstagen mit einer „shivering thermogenesis" nicht vereinbaren ließ [4],

220

H . CHOINOWSKI, P . BARTSCH, W . R Ü D I G E R

war es zunächst naheliegend, den Mechanismus dieser ,,non-shivering-thermogenesis" im Verhalten peripherer Gewebe zu suchen. Tatsächlich fand man in vivo [48] und bei kürzeren Inkubationszeiten auch in vitro [2] temperaturabhängige Stoffwechselverläufe, die in erster Näherung ähnlich dem Verhalten des Gesamtorganismus unter Hypothermie sind, jedoch im Bereich physiologischer Körpertemperatur keine ausreichende Erklärung geben. W i e andererseits aus zahlreichen Ausschaltungs- und Reizversuchen an verschiedenen adulten Spezies hervorgeht, nehmen zentralnervöse, insbesondere hypothalamische Areale Einfluß auf die Regulation von Körpertemperatur und Stoffwechsel. Die prinzipielle prozentuale Vergleichbarkeit kälteinduzierter Stoffwechselverläufe adulter und juveniler Warmblüter legt mithin die Vermutung nahe, daß auch der thermoregulatorische Stoffwechel juveniler Homoiothermer übergeordneten zentralnervösen Strukturen unterliegen könnte.

In den vorliegenden Untersuchungen wurde deshalb unter gleichartiger thermischer Belastung in transit-state geprüft, inwieweit Mikroausschaltungen im Hypothalamus der 4—6 Tage alten Ratte die postnatale chemische Wärmeregulation \—\o Tage post koagulationem beeinträchtigen bzw. welche speziellen hypothalamischen Strukturen Einfluß auf die Intensität der postnatalen chemischen Wärmeregulation nehmen. Methodik An 45 juvenilen Albino-Ratten des institutseigenen Wistar-Inzuchtstammes wurde in 109 Versuchen 0 2 -Aufnahme (VoJ und Rektaltemperatur (RT) unter den Bedingungen gleichartiger thermischer Belastung und konstantem Po2 (Poa = 1 5 0 ^ 2 , 5 Torr) bis zum 15. Lebenstag auf einem Kompensationsbandschreiber verfolgt. Die Anwendung des von BARTSCH et al. [3] entwickelten automatischen WARBURG-Apparates V S 64 ermöglichte die fortlaufend integrierende Registrierung des Vo 2 /min und die Stabilität der Sauerstoffspannung in der Inspirationsluft. Die Aufzeichnung der Rektaltemperatur erfolgte über kleine Cu/Konstantan-Elemente (Innenwiderstand 16 ü ) nach Verstärkung der Thermospannung in einem Fotozellenkompensator. Als thermische Belastung wurde nach einer Vorphase von 45 min bei 36 °C Umgebungstemperatur (UT) die kontinuierliche anschließende Abkühlung bis auf 20 °C U T (5- —15- Lebenstag) gewählt. Die mittlere Abkühlungsgeschwindigkeit betrug 0,12 °C/min. Nach Erreichen der Endtemperatur schloß sich eine temperaturkonstante Nachphase von etwa 30 min Dauer an. Außerhalb der Versuche befanden sich die Versuchstiere bei ihren Muttertieren in einem thermostatierten R a u m (22° ^ 1 °C) unter herkömmlichen Aufzuchtbedingungen. Die beidseitige elektrolytische Koagulation rostraler Hypothalamusareale erfolgte an 23 Tieren jenseits des 4. Lebenstages. Die Tiere befanden sich zu diesem Zweck in einem speziell für diese Spezies konstruierten stereotaktischen Gerät von CHOINOWSKI und KRUPP [11]. Die rechte und linke Trepanation der Kopfhaut und des Schädeldaches wurde durch eine auf die betreffenden Koordinaten ausgerichtete Mikroelektrokauterisationsnadel bei 10 mA, 30 V vorgenommen. Durch die so entstandenen, sehr kleinen Schädelöffnungen, die eine ausgezeichnete Heilung erlaubten, wurde die Koagulationselektrode (Spitzendurchmesser 36 p), eine isolierte Mikroelektrode aus V2A-Stahl, mittels eines Mikrobetriebes eingeführt und die Koagulation bei der stromzeitkonstanten Beziehung von 2 mA/10 V/16 sec ausgeführt. Die verbliebenen 23 Tiere dienten als Kontrolltiere in Paralleluntersuchungen. E s wurde streng auf Wurfgleichheit geachtet. Sie unterschieden sich von der anderen Tiergruppe nur darin, daß bei ihnen die eigentliche Koagulation trotz sonst gleicher stereotaktischer Manipulation im

Wärmeregulation bei Hypothalamusläsionen

221

H y p o t h a l a m u s ausblieb, aber an anderer Hirnstelle in beliebiger Höhe des Stichkanals erfolgte. Von der Anwendung jeglicher Narkotika (Äther) während der stereotaktischen Operation wurde nach anfänglichen Mißerfolgen abgesehen. Die Überlebensrate konnte' dadurch von ca. 20% auf 100% erhöht werden. Die koagulierten Versuchstiere wurdennach dem 30. Lebenstag getötet und ihre Gehirne zur histologischen Aufarbeitung in 10%igem Formalin fixiert. Die histologische Auswertung der Koagulationsherde erfolgte an HE-gefärbten Schnitten nach dem Atlas von F i f k o v a und M a r s a l a [19]. Ergebnisse

Die spezifische bilaterale elektrolytische Koagulation im mediorostralen Hypothalamus führte im Gegensatz zu unspezifischen Koagulationen anderer intrakranieller zentralnervöser Strukturen zu charakteristischen Veränderungen sowohl im Verhalten der 0 2 -Aufnahme als auch im Verlauf der Rektaltemperatur. I? fem302 °2 [jo9-mlnj

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Abb. 1. Zeitlicher Verlauf der mittleren Sauerstoffa u f n a h m e (Vo2), der Rektaltemperatur (RT), der Differenz zwischen Rektal- und Umgebungstemperatur (A RT) spezifisch und unspezifisch koagulierter j uveniler R a t t e n sowie des koagulationsspezifischeri Stoffwechsel( v o 2 — v * a ) und Temperaturdefizits (RT° —RT*.)

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15 Acta biol. med. german., Bd. 18, Heft 2

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Acta biol. med. german., Band 18, Seite 233 — 244 (1967) Aus dem Institut für Pharmakologie und Toxikologie der Medizinischen Akademie Magdeburg (Direktor: Prof. Dr. med. habil. H. M A T T H I E S )

Die Wirkung von Monoaminoxydase-Hemmstoffen auf den Tryptamin-Gehalt des Rattenhirns und den „Tryptamin-Krampf" N . POPOV, W . L I E T Z u n d H . MATTHIES

(Eingegangen am 1. 9. 1966) Zusammenfassung Nach i. v. Injektion von Tryptamin kommt es bei Ratten zu charakteristischen krampfartigen Erscheinungen, deren Potenzierung durch MonoaminoxydaseHemmstoffe als Test für deren Wirkungsstärke in vivo benutzt wird. Gleichzeitige Untersuchungen der Monoaminoxydase-Aktivität und des Tryptamin-Gehalts im Gehirn und die Zuordnung dieser Werte zu den beobachteten Krampferscheinungen führen zu folgenden Ergebnissen: 1. Zwischen dem Tryptamin-Krampf und dem Tryptamin-Gehalt des Gehirns läßt sich eine Korrelation erkennen; bei einem Tryptamin-Gehalt über 600 ng/g Gehirn ltrampfen alle Ratten. 2. Nach Vorbehandlung mit den Monoaminoxydase-Hemmstoffen Phenelzin oder Tranylcypromin ist der Tryptamin-Gehalt des Gehirns nach i. v. Tryptamin-Injektion beträchtlich erhöht, den verstärkten Krampferscheinungen entsprechend. 3. Diese Erhöhung des Tryptamin-Gehalts im Gehirn ist dem Verlauf der Monoaminoxydase-Hemmung nicht korreliert: die Wirkung beider Inhibitoren auf den Tryptamin-Gehalt ist von wesentlich kürzerer Dauer als die hemmende Wirkung auf die Monoaminoxydase, der Anstieg des Tryptamins im Gehirn nach Phenelzin oder Tranylcypromin ist unter den Bedingungen vollständiger MonoaminoxydaseHemmung unterschiedlich stark.

Die Akkumulation der biogenen Amine im Gehirn nach Phenelzin oder Tranylcypromin verläuft sehr unterschiedlich [1], [2], auch wenn die Monoaminoxydase (MAO) durch beide Inhibitoren vollständig gehemmt ist. Für den Anstieg der Amine im Gehirn müssen demnach noch andere Faktoren als die Hemmung ihrer oxydativen Desaminierung von Bedeutung sein. In einer anderen Arbeit hatten wir feststellen können, daß der sogenannte „Tryptaminkrampf"-Test eine der geeignetsten Methoden zur Bestimmung der Aktivität der MAO-Hemmstoffe in vivo darstellt [3]. In der vorliegenden Arbeit soll berichtet werden, inwieweit auch bei diesem Test andere Angriffspunkte als die MAO-Aktivität von Bedeutung für die Wirkungsstärke der untersuchten Inhibitoren sein könnten. Wir wählten als Modellsubstanzen wiederum Phenelzin als MAO-Hemmstoff vom Hydrazin-Typ und Tranylcypromin als Hemmstoff vom Amin-Typ und untersuchten ihren

234

N . POPOV, W . LIETZ, H .

MATTHIES

Einfluß auf den Tryptamin-Gehalt nach i. v. Injektion verschiedener Tryptamin-Dosen und zu verschiedenen Zeiten nach der Applikation der MAOHemmstoffe. Gleichzeitig bestimmten wir jeweils die Aktivität der MAO des Gehirns gegenüber Tryptamin als Substrat und setzten diese Werte in Beziehung zu den beobachteten Krampferscheinungen. Methodik Die Versuche wurden an Wistar-Ratten beiderlei Geschlechts aus eigener Kolonie-Zucht und einem Gewicht zwischen 100 und 150 g durchgeführt. Tranylcypromin (VEB Fahlberg-List) 5 mg/kg und Phenelzin (VEB Arzneimittelwerk Dresden) 20 mg/kg wurden i. p. appliziert. Die i. v.Tryptaniin^Injektion erfolgte 1, 2,16 und 24 Std. nach Vorbehandlung mit den MAO-Hemmstoffen. Die Bestimmung desTryptamins im Gehirn erfolgte nach der fluorometrischen Methode von H E S S und U D E N F R I E N D [ 4 ] mit einem Spektrofluorophotometer. Die Enteiweißung wurde mit 0,4 n Perchlorsäure an Stelle von 0,1 n Salzsäure durchgeführt. Durch diese Modifikation der Originalmethode war eine größere Empfindlichkeit und die Gewinnung von klarem Überstand bei größeren Mengen des Gehirnmaterials möglich (Abb. 1). Die Anregung der Fluoreszenz wurde bei 365 nm, die Messung bei 450 nm (unkorrigierte Werte) vorgenommen. Durch die Extraktion wurde die störende Anwesenheit von 5-Hydroxytryptamin und Tryptop h a n verhindert. Die Wiedergewinnung des Tryptamins aus den Homogenaten erfolgte zu 96%.

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' ^ ^ Tryptamin /ug/3ml

Abb. 1. Tryptamin-Eichreihen (InternStandard) Skt. = Skalenteile des Geräts

Ergebnisse

Die Hemmung der MAO-Aktivität des Rattenhirns 1, 2,16 und 24 Std. nach Applikation der MAO-Hemmstoffe Phenelzin und Tranylcypromin ist in Tabelle 1 wiedergegeben. Beide Inhibitoren lassen bis zu 16 Std. nach Applikation eine vollständige oder fast vollständige Hemmung der MAO-Aktivität erkennen; zwischen der 16. und 24. Std. nimmt die Hemmung langsam ab, nach Tranylcypromin stärker als nach Phenelzin. Die Bestimmung des Tryptamins im Gehirn unbehandelter Kontrolltiere ergab, daß normalerweise nur geringe Mengen von Tryptamin vorhanden sind. Die Auswertung von 65 Kontrollen mit Injektion von 0,9%iger NaClLösung ergab einen Durchschnittswert von 5 0 ± 1 5 n g / g frisches Gehirn. 1

Tryptamin-HCl reinst, Ferrak-Berlin.

Wirkung von Monoaminoxydase-Hemmstoffen

235

Tabelle 1 Manometrische Bestimmung der MAO-Aktivität im Rattenhirn mit Tryptamin als Substrat (Hemmung in % der Kontrollen; n = Zahl der Versuche) Phenelzin [20 mg/kg] i.p.

[Std.] nach Applikation 1 2 16 24

Tranylcypromin [5 mg/kg] i.p.

[%]

n

[%]

n

94 100 91 89

7 3 6 6

100 100 100 62

4 4 4 4

Nach Injektion von Tryptamin kommt es in Abhängigkeit von der applizierten Dosis zu einer beträchtlichen Erhöhung des Tryptamin-Gehalts. Bei einer Dosis von 5 mg/kg i. v. kommt es nicht bei allen Tieren zu den typischen Krampferscheinungen. Aus diesem Grunde wurden die Durchschnittswerte für den Tryptamin-Gehalt des Gehirns für die krampfenden und nichtkrampfenden Tiere getrennt berechnet, wobei sich zeigt, daß der TryptaminGehalt bei den krampfenden Tieren erheblich höher liegt (Tab. 2). Bei einer Dosierung von 10 mg/kg Tryptamin i. v. und höher krampfen alle Tiere, deshalb ist auch nur ein Durchschnittswert für den Tryptamin-Gehalt angegeben. Die Analyse der Einzelwerte nach 5 mg/kg Tryptamin zeigt, daß die individuelle Krampfschwelle sehr unterschiedlich ist: es gibt Tiere, die bereits bei einem Gehalt unter 100 ng/g Krampferscheinungen zeigen, während andererseits auch Tiere mit über 500 ng/g noch nicht krampfen. Bei einem Tryptamin-Gehalt von über 600 ng/g ist aber bei allen Ratten der typische Tryptamin-Krampf zu erkennen. Die Vorbehandlung der Tiere mit Phenelzin oder Tranylcypromin 1 Std. vor der i. v. Injektion von Tryptamin erhöht auch bei der niedrigen Dosierung von 5 mg/kg Tryptamin die Krampf rate auf 100%. Wie aus der Tabelle 2 Beziehungen zwischen Tryptamin-Gehalt des Gehirns und Tryptamin-Krampf nach 5 mg/kg Tryptamin i.v. Anzahl der Tiere mit Krampf 1 2 3 3 1 S 1S = 26% 490 ± 80

ohne Krampf 21 7 5 S 2 3 43 = 74% 190 ± 30

Tryptamin-Gehalt [ng/g] frisches Gesamthirn 0-100 101 —200 201-300 301-400 401-500 über 500 Tryptamin-Gehalt [ng/g] ^ mittlerer Fehler des Mittelwerts

236

N . POPOV, W . LIETZ, H .

MATTHIES

Tabelle 3 hervorgeht, ist der Tryptamin-Gehalt nach Tranylcypromin-Vorbehandlung deutlich erhöht (p < 0,05), während nach der Vorbehandlung mit Phenelzin der durchschnittliche Tryptamin-Gehalt des Gehirns nur in der Größenordnung des Mittelwertes der Tiere liegt, die nach 5 mg/kg Tryptamin allein Krampferscheinungen zeigten. Tabelle 5 Tryptamin-Gehalt des Rattenhirns nach i.v. Injektion von Tryptamin Tryptamin [mg/kg] i-v.

S

10

15

Ohne Vorbehandlung ohne K r ä m p f e mit Krämpfen

190 ± 30 (43) 490 ± 80 (15)

640 ± 60 (6)

810 ± 39 (92)

1160 ±

410 ± 50 (15)

740 ± 50 (6)

870 ± 50 (27)

1410 ± 120 (6)

*

**

**

**

660 ± 60 (12)

1080 ± 70 (6)

20 mg/kg Phenelzin 1 Std. vor Tryptamin 5 mg k g Tranylcypromin 1 Std. vor Tryptamin

nach min 20

80(6)

1370 ± 140 (26) 2030 ± 230 (6)

Angaben in ng/g ^ mittlerer Fehler des Mittelwertes. In Klammern Anzahl der Tiere. Signifikanzangaben gegenüber Tryptamin ohne Vorbehandlung: * = p < 0,05; ** = p < o , 0 1 .

Auch bei den übrigen Tryptamin-Dosierungen sind nach Tranylcypromin die Tryptamin-Werte im Gehirn signifikant höher, während nach Phenelzin lediglich eine geringe, aber nicht signifikante Erhöhung zu verzeichnen ist. Auch der Vergleich der Krampfstärke und des Krampfverlaufs ließ Unterschiede zwischen unvorbehandelten und vorbehandelten Tieren erkennen, aber auch die Ergebnisse nach Phenelzin- oder Tranylcypromin-Vorbehandlung unterschieden sich deutlich voneinander. Nach 10 oder 15 mg/kg Tryptamin ohne Vorbehandlung war der Krampf nach 5 min völlig abgeklungen. Nach Phenelzin-Vorbehandlung war der Krampf intensiver und dauerte 10 bis 20 min. Nach Tranylcypromin kam es zu einer erheblichen Verstärkung der Symptomatik im Verlauf des Krampfgeschehens, die Krampfdauer betrug mehrere Stunden. In Tabelle 4 sind die Beobachtungen über Krampf int ensität und -dauer zusammengefaßt. Auf Grund dieser langanhaltenden Krampferscheinungen nach Vorbehandlung mit MAO-Hemmstoffen und wegen der unterschiedlichen Wirkung der beiden verwendeten Modellsubstanzen untersuchten wir den zeitlichen Verlauf des Tryptamin-Gehalts im Gehirn nach i. v. Injektion von 15 mg/kg Tryptamin 1, 2, 6, 16 und 24 Std. nach Gabe von Phenelzin oder Tranylcypromin. Die Ergebnisse dieser Versuchsreihe sind in Abbildung 2 darge-

Wirkung von Monoaminoxydase-Hemmstoffen

237

Tabelle 4 Übersicht über Dauer und Intensität des Tryptamin-Krampfes nach 15 mg/kg Tryptamin i.v. Zeit nach TryptaminInjektion 5 sec

Ohne Vorbehandlung

1 Std. nach 20 mg/kg Phenelzin

Pfotenballen

Pfotenballen

1 Std. nach 5mg/kg Tranylcypromin Pfotenballen

10 sec

Trommeln mit gespreizten Vorderpfoten; Hinterpfoten und Hinterextremitäten gespreizt, Rückwärtsdrängen zur Käfigwand

20 sec

Kopf wird eingezogen, Thorax wird an den Boden gepreßt Hin- und Herbewegung des Kopfes

Aufrichten mit angehobenen Vorderpfoten

30 sec

Hin- und Herbewegung des Kopfes

Starke Kopfbewegungen, flatternde Vorderpfoten, ausgeprägter Rückwärtsgang

60 sec

Hin- und Herbewegung des Kopfes

Hinterpfoten geballt, Salivation, Seitenlage mit Konvulsionen, verkrampfte Atembewegungen

2 . - 5 . min

Abklingen derPfotenund Kopfbewegungen und des Krampfes

Kopf stark eingezogen, starkes Auf- und Abbewegen der Vorderpfoten, starkes Kopfschütteln, Salivation

6. —10. min

Vorderpfoten geballt, Pfotentrommeln, Kopf auf die Pfoten Kopfschütteln aufgelegt

11. —20. min

Pfoten tippen, Zittern, Abnahme des Krampfes

60. min

|

4 . - 6 . Std.

Weitere Zunahme der Krampferscheinungen, Vorderkörper macht Kopfbewegung mit Pfoten- und Kopfbewegungen halten an, Körperbewegung Allmähliches Abklingen der Krämpfe

stellt. W i e daraus hervorgeht, steigt der Tryptamin-Gehalt bei unvorbehandelten Tieren kurzzeitig auf etwa 8 0 0 ng/g, u m dann innerhalb von 10 bis 15 min wieder auf die Kontrollwerte abzufallen. 1 Std. nach Phenelzin führt die i. v. Injektion von 15 mg/kg T r y p t a m i n zwar nicht zu höheren T r y p t a min-Werten im Gehirn, der Abfall erfolgt aber wesentlich langsamer, so daß erst zwischen der 2. und 3. Std. nach der Tryptamin-Injektion die Kontrollwerte wieder erreicht werden. Nach Tranylcypromin hingegen k o m m t es zu einem außerordentlich starken Anstieg der T r y p t a m i n - W e r t e im Gehirn, 16

Acta biol. med. german., Bd. 18, Heft 2

238

N . POPOV, W . L I E T Z , H .

MATTHIES

der Abfall ist stark verzögert, und nach 4 Std. ist der Tryptamin-Gehalt noch so hoch, wie im Maximum der Tiere ohne Vorbehandlung. Auch 2 Std. nach Gabe der MAO-Hemmstoffe bewirken diese eine wenn auch nicht mehr so starke Erhöhung und verlangsamte Abnahme der TryptaminWerte, wobei wiederum Tranylcypromin wesentlich wirksamer als Phenelzin ist. 16Std

2 Std

1 Std.

ZtStd.

.c

I

;

2

3

Stunden

4 0 nach

1

2

3

i

o

Ä

10

1

Tryptamininjektion

Abb. 2. Zeitlicher Verlauf des Tryptamin-Gehalts im Rattenhirn nach i.v. Injektion von 15 mg/kg Tryptamin 1, 2, 16 und 24 Std. nach Vorbehandlung mit 20 mg/kg Phenelzin i.p. (O O) oder 5 mg/kg Tranylcypromin i.p. ( • •); • A = Tryptamin-Injektion ohne Vorbehandlung. Die Streuung ist angegeben als mittlerer Fehler des Mittelwertes

16 und 24 Std. nach Applikation haben die beiden Inhibitoren nur noch eine geringe Wirkung; auch unterscheiden sie sich nicht mehr voneinander: der anfängliche Tryptamin-Anstieg nach der Injektion ist zwar noch leicht erhöht gegenüber den Werten, die bei den Tieren ohne Vorbehandlung gefunden werden, der Abfall erfolgt aber genau so schnell. Diskussion

Die physiologische und pharmakologische Bedeutung des Tryptamins ist noch nicht vollständig geklärt. Es wird im allgemeinen angenommen, daß Tryptamin ein normaler Metabolit des Tryptophan-Stoffwechsels ist [5]. Im Gegensatz zum 5-Hydroxytryptamin passiert das Tryptamin wegen der fehlenden polaren OH-Gruppe die Blut-Hirn-Schranke [6] — [8]; auch vermag es Zellmembranen zu durchdringen und wird schnell eliminiert [9]. Über die eventuelle Bedeutung des Tryptamins als Vorstufe des 5-Hydroxytryptamins im Gehirn besteht noch keine Klarheit. Der Abbau soll hauptsächlich durch die Monoaminoxydase erfolgen, bei Menschen wird das Amin unter der Wirkung von MAO-Hemmstoffen unverändert mit dem Urin aus-

Wirkung von Monoaminoxydase-Hemmstoffen

239

geschieden [ 9 ] . Auf Grund dieser Feststellungen sind S J O E R D S M A et al. [ 9 ] der Meinung, daß durch die Tryptamin-Bestimmung im Urin nach Tryptamin-Belastung ein gutes Bild von der MAO-Hemmung erhalten werden kann. Die i. v. Injektion von hohen Tryptamin-Dosen ruft charakteristische Krampferscheinungen hervor; bei der Ratte genügen etwa 10 mg/kg, bei der Maus sind 40 mg/kg notwendig [10]. Die erste Phase des Krampfes tritt sofort nach der Injektion auf und ist durch krampfartige Bewegungen der Vorderpfoten und Rückwärtsgang gekennzeichnet. Sie dauert je nach Dosis wenige Sekunden bis Minuten und wird von DEN YS et al. [10] als Phase der „lokalisierten Konvulsionen" bezeichnet. Ihr schließt sich eine zweite Phase an, die durch Tremor, Einziehen des Kopfes, Buckelbildung und stereotypes Hin- und Herbewegen des Kopfes charakterisiert ist und mehrere Minuten dauern kann. Diese typischen Symptome sind wohl nicht artspezifisch, denn sie werden in ähnlicher Weise auch bei Mäusen beobachtet, n u r daß die notwendigen Dosen etwa 4 mal so hoch sind wie bei Ratten [11], Da der Abbau des Tryptamins, wie schon erwähnt, hauptsächlich über die MAO erfolgt, müßte eine Hemmung dieses Enzyms zu einer Verstärkung oder Verlängerung der durch Tryptamin hervorgerufenen Krampferscheinungen führen und somit eine Testung der Wirksamkeit von MAO-Hemmstoffen ermöglichen. T E D E S C H I et al. [12], [13] entwickelten hauptsächlich auf der Auswertung der ersten Phase des Krampf geschehens den sogenannten ,,Tryptaminkrampf-Test". Dabei werden durch subkonvulsive Dosen von Tryptamin nach Vorbehandlung mit MAO-Hemmstoffen die Krampferscheinungen ausgelöst. Nach T E D E S C H I ist die Potenzierung der TryptaminWirkung auf die Auslösung zentraler Mechanismen zurückzuführen, weshalb dieser Test ein zuverlässiger Indikator für die Hemmung der MAO-Aktivität im ZNS sein soll. An einer größeren Zahl von Hydrazinkörpern überprüften M A T T H I E S et al. [ 3 ] die Korrelation zwischen der Hemmung der Hirn-MAO und der Potenzierung des Tryptaminkrampfes und kamen zu dem Ergebnis, daß unter einer Reihe von verschiedenen Tests die Tryptaminkrampf-Potenzierung bei einfacher Durchführung die beste Korrelation zeigt. Eine Korrelation zwischen der Erhöhung des Tryptamin-Gehalts im Tryptaminkrampf-Test und der Stärke der MAO-Hemmung wurde von G R E E N und S A W Y E R [14] festgestellt. Es wurden allerdings nur niedrige Dosen der Hemmstoffe angewandt, so daß nur partielle Hemmung des Enzyms vorlag. Während im allgemeinen die Akkumulation der endogenen Amine erst bei fast vollständiger Hemmung der MAO zu beobachten ist, mag bei der Anflutung hoher Konzentrationen des Tryptamins nach i. v. Injektion auch die partielle Hemmung schon den Abbau meßbar beeinflussen. Die Normalwerte, die von diesen Autoren für die Kontrollen mit 32 ng/g Gehirn und nach 5 mg/kg Tryptamin i. v. mit 170 ng/g angegeben werden, stimmen befriedigend mit unseren eigenen Werten von 50 ng/g, bzw. 190 ng/g überein. Bei der Bestimmung der Krampfschwelle in Versuchen mit Tryptophan und MAO-Hemmstoffen fanden H E S S und D O E P F N E R [15] keine direkte Korre16*

240

N . POPOV, W . L I E T Z , H .

MATTHIES

lation zwischen Tryptamin-Gehalt und dem Verhalten der Tiere. In unseren Versuchen ergaben sich zwar gewisse Schwierigkeiten bei der Bestimmung der Krampfschwelle, dennoch lag bei einer Dosierung von 5 mg/kg Tryptamin der Tryptamin-Gehalt krampfender Tiere bei 490 ± 80 ng/g Gehirn, bei den nicht krampfenden Tieren betrug er nur 190 ± 30 ng/g. Die genauere Analyse der Einzelwerte (Tab. 2) läßt erkennen, daß aber auch einzelne Tiere mit sehr niedrigem Tryptamin-Gehalt krampfen und einige Ratten mit hohem Tryptamin-Gehalt keine deutlichen Krampferscheinungen zeigen. Dieser Befund ist zum Teil auf eine unterschiedliche Empfindlichkeit der einzelnen Tiere zurückzuführen. Sicherlich ist die exakte Erfassung des Maximums des Tryptamin-Gehalts deshalb sehr schwierig, da dieser nach Tryptamin-Injektion innerhalb weniger Minuten starke Veränderungen zeigt. Dennoch lassen unsere Ergebnisse erkennen, daß etwa bei 400 ng/g Tryptamin-Gehalt im Gehirn 50% der Versuchstiere krampfen, und daß ab 600 ng/g alle Ratten Krampferscheinungen zeigen. Unsere Beobachtungen machen darüber hinaus deutlich, daß nicht nur die erste Phase des Krampfes als Kriterium für die hervorgerufenen Veränderungen ausreicht (Tab. 4). Diese Phase kann als Initialvorgang angesehen werden, der bei Erreichen der Krampfschwelle das Krampfgeschehen einleitet. Aber auch bei so hohen Tryptamin-Dosen, wie sie bei 15 rng/kg vorliegen, wird darüber hinaus keine wesentliche Intensitätssteigerung beobachtet. Wenn allerdings eine Vorbehandlung mit MAO-Hemmstoffen erfolgte, dann treten die starken und langanhaltenden Krampferscheinungen auf, wie sie in Tabelle 4 aufgeführt werden. Aus alledem ergibt sich wohl mit hinreichender Beweiskraft, daß eine unmittelbare Beziehung zwischen dem Tryptamin-Gehalt des Gehirns und der Intensität und Dauer des Krampfes besteht. E s bleibt allerdings noch zu berücksichtigen, daß bestimmte Änderungen im Gehalt des ZNS an biogenen Aminen gleichfalls durch die Behandlung mit MAO-Hemmstoffen ausgelöst werden, und es muß noch offen bleiben, ob nicht dadurch auch eine Beeinflussung des Krampfablaufs bewirkt wird. Keine Korrelation ist hingegen zwischen der Wirkung der MAO-Hemmstoffe auf die MAO-Aktivität selbst und auf die durch sie hervorgerufene Akkumulation des injizierten Tryptamins im Gehirn festzustellen. In Abbildung 3 sind die MAO-Hemmung und die Tryptamin-Werte im Gehirn 30 min nach Tryptamin-Injektion zu verschiedenen Zeiten nach Applikation der MAOHemmer gegenüber gestellt. Es zeigt sich zunächst sowohl bei Phenelzinals auch bei Tranylcypromin-Vorbehandlung, daß die Wirkung der MAOHemmstoffe auf die Tryptamin-Akkumulation bereits zu einem Zeitpunkt aufhört, da noch eine vollständige Hemmung der MAO zu beobachten ist. Zu ähnlichen Ergebnissen, sowohl an Ratten als an Mäusen, kamen auch D E N Y S et al. [10]. Auch die sehr unterschiedlichen Wirkungen der beiden MAO-Hemmstoffe Phenelzin und Tranylcypromin, obwohl jeweils in Dosierungen verwandt, die zu einer vollständigen Hemmung der MAO führen, deuten darauf hin, daß die Akkumulation des Tryptamins nicht allein von

Wirkung von Monoaminoxydase-Hemmstoffen

241

der Enzymhemmung abhängig ist. Offensichtlich ist die Hemmung der MAO und damit die Verhinderung der Tryptamin-Desaminierung Voraussetzung dafür, daß die Beeinflussung eines anderen Prozesses — etwa eines Transportvorgangs — durch die MAO-Hemmer wirksam werden kann. Diese Annahme könnte auch durch die Beobachtungen von DEN YS et al. [10] unterstützt werden, daß die Dissoziation zwischen der Hemm Wirkung auf die MAO-Aktivität und der Potenzierung des Tryptaminkrampfes bei i. p. Applikation des Tryptamins noch ausgeprägter ist. 3,0f Tranylc

Phenelzin

2,5-

20

mg/kg

5

ypromi

r>

mg/kg

2,0 • m

1,5-75-

1,0-50 • •

OL

ö> o

o 5

h -

1 6

-ih 16

24

1

Sfd.

nach

Applikation

2

6

16

24

Abb. 3. Gegenüberstellung der Monoaminoxydase-Hemmung (weiße Säulen) und der T r y p t a m i n w e r t e im Rattenhirn 30 min nach Tryptamin-Injektion (15 mg/kg i.v.) zu verschiedenen Zeiten nach i.p. Applikation der MAO-Hemmstoffe (schwarze Säulen). TA = T r y p t a m i n ; MAO-H = Hemmung der Monoaminoxydase-Aktivität; K = NaClKontrollen

Der zeitliche Ablauf dieser zweiten Wirkung der MAO-Hemmstoffe könnte darauf hinweisen, daß es sich nicht um einen irreversiblen Prozeß handelt, wie bei der MAO-Hemmung. Es ist in diesem Zusammenhang bedeutsam, daß auch die Akkumulation der endogenen biogenen Amine nicht allein durch MAO-Hemmung bestimmt wird, wie wir in früheren Untersuchungen zeigen konnten [1], [2]. Auch der Gehalt von Noradrenalin, Dopamin und 5-Hydroxytryptamin steigt nur in den ersten 4—6 Std. nach Gabe der meisten MAO-Hemmstoffe im Gehirn an, oft ist bereits ein deutlicher Rückgang der Amin-Werte zu beobachten, obwohl noch vollständige Hemmung der MAO-Aktivität vorliegt. In diesem Zusammenhang sei auch darauf verwiesen, daß eine Dosiserhöhung der MAO-Hemmstoffe über die minimale Dosis für 100 %ige MAO-Hemmung zu einer weiteren Erhöhung vonNorad-

242

N . POPOV, W . L I E X Z , H . M A T T H I E S

renalin, 5-Hydroxytryptamin und Dopamin im Gehirn führen [16]. Daraus kann man ebenfalls schließen, daß durch die MAO-Hemmstoffe ein zweiter Mechanismus neben der Desaminierung beeinflußt wird, der sich auf den Gehalt der Amine im ZNS auswirkt. Es ist durchaus wahrscheinlich, diese Befunde an den endogenen Aminen und die hier beschriebenen Beobachtungen über die Tryptamin-Akkumulation nach Belastung auf gleichartige Wirkungen der MAO-Hemmstoffe auf einen Transportmechanismus für Amine zurückzuführen. Damit wird aber fraglich, ob aus dem klinischen Tryptamin-Belastungstest, wie er von SJOERDSMA et al. [9] vorgeschlagen wird, wirklich auf den Grad der MAO-Hemmung ohne weiteres geschlossen werden kann. Erstaunlich scheint zunächst, daß trotz des Vorliegens eines weiteren, durch MAO-Hemmer beeinflußbaren und von der MAO-Hemmung unabhängigen Mechanismus im Gesamtvorgang der Tryptamin-Akkumulation dennoch der Tryptaminkrampf-Test so gut für die in vivo-Bestimmung der MAO-Hemmer geeignet ist. Bei Berücksichtigung unserer hier vorgelegten Ergebnisse wird jedoch erkennbar, daß die dem Tryptaminkrampf-Test zu Grunde liegenden Versuchsbedingungen — Anwendung einer niedrigen, nur bei 10 oder 20% der Tiere zu Krampf führenden Tryptamin-Dosis, und Ermittlung der unteren Grenzdosis der MAO-Hemmstoffe, die eben den Prozentsatz der krampfenden Tiere auf 80 % erhöht — vor allem die MAO-Hemmung zur bestimmenden Komponente zu machen scheint. Aus unseren Untersuchungsergebnissen wird aber wiederum ersichtlich, daß die Vorstellungen über die antidepressive Wirkung der „MAO-Hemmstoffe" noch unvollständig sind. Ist dieser klinisch-therapeutisch angestrebte Effekt auf die Akkumulation der biogenen Amine zurückzuführen, so ist es ganz sicher nicht ausreichend, die Aufmerksamkeit so ausschließlich auf die Hemmung der MAO-Aktivität zu richten, wie das zumeist erfolgt ist. Möglicherweise ist die Sackgasse, in die die Entwicklung therapeutisch wirksamer Antidepressiva aus der Reihe der MAO-Hemmstoffe geraten ist, auf diese einseitige Orientierung zurückzuführen, und vielleicht kann die Berücksichtigung der anderen akkumulationsstörenden Faktoren bei der tierexperimentellen Prüfung zu therapeutisch wertvolleren Substanzen führen, vielleicht sogar aus der Vielzahl derjenigen Verbindungen, die allein auf Grund einer nicht allzu starken Hemmwirkung auf die MAO für eine weitere eingehende, auch klinische Prüfung, nicht mehr in Betracht gezogen wurden. Literatur [1] [2] [3]

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Summary N . P O P O V , W . L I E X Z and H . M A T T H I E S : Action of monoamine oxidase inhibitors on the tryptamine content of the rat brain and the ,,tryptamine convulsions"

Intravenously injected tryptamine produced characteristic spasmodic symptoms, the potentiation of which by monoamine oxidase inhibitors has been utilized as a test for their activity in vivo. Simultaneous observations of the monoamine oxidase activity and the tryptamine level in brain, and comparison of these values with the observed convulsions led to the following results : 1. A correlation exists between t h e , .tryptamine convulsions" and the brain tryptamine level; a tryptamine level exceeding 600 ng/g of brain causes convulsions in all rats. 2. After pretreatment with the monoamine oxidase inhibitors, phenelzine and tranylcypromine, the brain tryptamine level following intravenous tryptamine injection is considerably enhanced, consistent with the more pronounced convulsions. 3. This enhancement of the brain tryptamine level is not correlated with the course of monoamine oxidase inhibition: the effect of either inhibitor on the tryptamine level is of much shorter duration than the inhibitory action on the monoamine oxidase. Under complete monoamine oxidase inhibition, the increase of brain tryptamine after phenelzine and tranylcypromine is more or less strong. I'cawMe H. IlonoB,

B. JIHTI; H r .

MaTTHc:

BJIHHHHC HHI-H6HTOPOB

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244

N . POPOV, W . L I E T Z , H . MATTHIES

2. Ilocjie

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Acta biol. med. german., Band 18, Seite 245 — 249 (1967) Aus dem Pharmakologischen Institut der Universität Halle-Wittenberg (Damal. Direktor: Prof. Dr. K. P O H L E )

Das Aethoxoseoedem der Rattenpfote und seine Beeinflussung durch Azetylsalizylsäure, Damaszenin, Phenylbutazon und Salizylamid H . BEKEMEIER u n d W .

SCHMOLLACK

(Eingegangen am 20. 9. 1966) Zusammenfassung Ein sich nach subplantarer Injektion von 0,1 ml einer l%igen wäßrigen Lösung von Natriumkarboxymethylzellulose (Aethoxose) entwickelndes Rattenpfotenoedem wird hinsichtlich des Ausmaßes und des Tempos seiner Bildung sowie Rückbildung beschrieben und bezüglich seiner Beeinflußbarkeit durch bekannte Antiphlogistika untersucht. Bei i.p. Applikation von Damaszenin und Phenylbutazon werden Ergebnisse wie am Dextranoedem erhalten, bei p.o. Gabe von Azetylsalizylsäure, Damaszenin und Phenylbutazon ergeben sich in orientierenden Versuchen dagegen gewisse Abweichungen, die für besondere Eigenschaften des Aethoxoseoedems sprechen könnten.

Für die Prüfung alter und die Entwicklung neuer antiphlogistisch wirksamer Pharmaka sind auf der Suche nach besseren Testobjekten zahlreiche Modellentzündungen und Oedeme vorgeschlagen worden, ohne daß bisher ein ideales Testobjekt gefunden wurde. Im Verlaufe unserer Untersuchungen über antiphlogistisch wirksame Verbindungen [3], [4] verwendeten wir ein Rattenpfotenoedem, das durch Injektion einer Aethoxoselösung erzeugt wird. Über seine Eigenschaften wird berichtet. Methodik Verwendet wurden nüchterne männliche Albinoratten eines in Koloniezucht gehaltenen Wistarstammes im Gewicht von 150 — 200 g, deren rechte Hinterpfote schon vor Versuchsbeginn etwa 0,5 cm oberhalb des Sprunggelenkes mit einem alkoholresistenten Farbstift ringförmig markiert und deren Volumen bis zur Markierung durch Eintauchen in das unten beschriebene Meßgefäß ermittelt worden war. In diese Pfote wurden 0,1 ml einer 1%igen wäßrigen Aethoxoselösung subplanter injiziert. Die Aethoxoselösung ist von einer derartigen Konsistenz, daß hier — im Gegensatz zu Formalin- und Dextranlösungen — auch ohne besondere Vorkehrungen kein Austreten von Lösung aus dem Stichkanal auftritt. Gleichzeitig mit der Aethoxoseinjektion erfolgte i.p. oder perorale Gabe der Testsubstanzen Azetylsalizylsäure, Damaszeninhydrochlorid, Phenylbutazon-Natrium oder Salizylamid in 0,8 ml aqua dest., wobei die Azetylsalizylsäure und das Salizylamid zur Verbesserung der Löslichkeit mit Na 2 C0 3 auf pH 9 alkalisiert wurden. 1, 3 und 5 Std. nach Applikation wurde erneut das Pfoten-

246

H . BEKEMEIER, W .

SCHMOLLACK

volumen bestimmt. Bei der Verfolgung des Oedemverlaufs wurde über 33 Std. gemessen. Die Bestimmung des Pfotenvolumens erfolgt durch Eintauchen in ein mit Äthanol gefülltes Überlaufgefäß. Die Gefäßgröße ist so gehalten, daß eine oedematöse R a t t e n pfote eben gerade bequem hineingetaucht werden kann. Die überlaufende Flüssigkeit fließt in eine 2 ml-Bürette, in der das Volumen abgelesen wird. Infolge seiner geringen Oberflächenspannung fließt das Äthanol ziemlich glatt und schnell durch den Überlauf a b und bildet an der Bürettenwand keine Tropfen. Dadurch wird ausreichende Genauigkeit und Schnelligkeit beim Messen erzielt. Äthanol scheint bei der Kürze der Einwirkungszeit keinen Einfluß auf das Oedem zu haben. Nach dem Messen werden die Pfoten zudem vorsichtig mit Zellstoff abgetupft. Der Meßvorgang verläuft wie folgt: Füllen des Überlaufgefäßes mit Äthanol, nach 1,5 min Wartezeit Ablesen des Bürettenstandes, kurzes Eintauchen der Rattenpfote bis zur Farbstiftmarkierung, 1,5 min danach erneutes Ablesen des Bürettenstandes; nach Ablassen des Büretteninhaltes ist das System für die nächste Messung bereit. Man benötigt somit für eine Messung 3 — 4 min. Dieser Nachteil kann durch gleichzeitige Benutzung mehrerer Meßsysteme ausgeglichen werden. Ergebnisse

Nachdem in Vorversuchen durch subplantare Injektion von Lösungen unterschiedlicher Aethoxosekonzentration die l%ige Lösung als gut brauchbar zur Oedemerzeugung gefunden worden war, wurde in ersten Versuchen der Verlauf von Bildung und Rückbildung des Oedems verfolgt. Wie Abbildung 1 zeigt, nimmt das Pfoten volumen nach Injektion ziemlich rasch zu und erreicht schon nach etwa 3— 5 Std. sein Maximum; dann sinkt es kontinuierlich und ist nach 24—33 Std. praktisch normalisiert. Aus diesem Verlauf ergibt sich, daß die optimalen Testzeiten in den ersten 5 Std. liegen. 30 30

so

30

* l !S

2S

20

20

I

3

5

7

9

II

12 Std. noch Injektion

-H 24

10

iL

•

Abb. 1. Verlauf von Bildung und Rückbildung des Aethoxoseoedems der Rattenpfote nach subplantarer Injektion von 0,1 ml einer l%igen Aethoxoselösung in % s-) des Ausgangsvolumens. Zahlen oberhalb der Säulen: Zahl der Tiere

Von diesem Ergebnis ausgehend prüften wir nunmehr, inwieweit die Entstehung des Aethoxoseoedems durch bekannte antioedematös wirkende Pharmaka zu beeinflussen ist und wählten dabei als Testzeiten 1, 3 und 5 Std. nach Aethoxoseinjektion. In einer ersten Versuchsreihe wurden die Pharmaka i.p., und zwar gleichzeitig mit der Aethoxose injiziert. Nach den

Aethoxose-induziertes Oedem

247

in Tabelle 1 zusammengestellten Ergebnissen erwiesen sich alle geprüften Pharmaka, nämlich Phenylbutazon, Salizylamid und Damaszenin, als wirksam. In einer zweiten Versuchsreihe wurde geprüft, inwieweit das Aethoxoseoedem bei peroraler Gabe bekannter antioedematös wirksamer Pharmaka beeinflußt wird. Hierbei ergab sich nach Tabelle 2 für Azetylsalizylsäure und Phenylbutazon ein positives Ergebnis, während Damaszenin unwirksam blieb. Tabelle 1 Volumenzunahme der R a t t e n p f o t e nach subplantarer Injektion von 0,1 ml einer 1 %igen Aethoxoselösung und gleichzeitiger i.p. Injektion von 0,8 ml/Tier aqua bidest. (A.), Phenylbutazon (Ph.), Damaszenin (D.) oder Salizylamid (S.)% Die Substanzen wurden im gleichen Flüssigkeitsvolumen appliziert Substanz

Tierzahl

[mg/kg] 0,8 ml A. 60 mg P h . 200 mg Ph. 400 mg D. 100 mg S. 1 2

Pfotenvolumenzunahme in % nach Applikation 1 Std

20 10 10 10 5

23,6 27,7 21,0 10,3 8,6

± ± ± ± ±

9,3 9,5 15,5 4,9 2 5.6 1

3 Std 51,4 29,5 20,4 15,0 7,3

± 23,4 ± 6,3* ± 11,5 2 ± 8,0 2 ± 5,3 2

5 Std 51,5 30,4 20,6 10,3 1,9

± 21,5 ± 15,3 1 ± 11,2 2 ± 4,8 2 ± 2,6 2

mit p < 0,01, mit p < 0,001 signifikant von Kontrollgruppe (A.) verschieden Tabelle 2

Volumenzunahme der Rattenpfote nach subplantarer Injektion 1 %igen Aethoxoselösung und gleichzeitiger peroraler Gabe von bidest. (A.), Azetylsalizylsäure (As.), Phenylbutazon (Ph.) oder Die Substanzen wurden im gleichen Flüssigkeitsvolumen Substanz

Tierzahl

[mg/kg] 0,8 ml A. 500 mg As. 4 0 0 mg P h . 800 mg D. 1 2

Pfotenvolumenzunahme in % nach Applikation 1 Std

10 5 5 5

von 0,1 ml einer 0,8 ml/Tier Aqua Damaszenin (D.). appliziert

21,2 21,2 25,7 26,3

± ± ± ±

10,5 6,3 5,0 9,2

3 Std 55,8 43,2 30,4 51,3

± 22,8 ± 18,6 1 ± 9,3 2 ± 7,3

5 Std 44,2 50,1 29,9 49,9

± 16,6 ± 20,8 ± 5,1 ± 16,9

mit p < 0,01, mit p < 0,001 statistisch signifikant verschieden von Kontrollgruppe (A.)

Diskussion

Nach den Ergebnissen der Abbildung 1 ist das Aethoxoseoedem durch ziemlich schnellen Verlauf charakterisiert, wobei das Maximum nach

248

H . BEKEMEIER, W .

SCHMOLLACK

3— 6 Std. erreicht wird und Rückbildung praktisch zur Norm innerhalb 24 Std. eintritt. Eine echte Entzündung scheint kaum vorzuliegen; denn die Pfote zeigt nur relativ schwache Rötung, und insbesondere wurde bisher keine Gewebsschädigung beobachtet. Das Aethoxoseoedem ähnelt insofern offenbar dem Carragheenin- [14] und noch mehr dem Dextranoedem. Alle 3 Oedemprovokatoren sind ja auch chemisch verwandt. Sie stellen Polysaccharide dar, wobei Carragheenin Galaktose als Baustein [6], [11] enthält, Dextran aus Glukose in vorzugsweise 1,6-Bindung aufgebaut ist [10] und Aethoxose Natriumkarboxymethylzellulose darstellt [7]. Für die Polysaccharide wurde diskutiert, ob nicht Freisetzung von Histamin oder Serotonin für die Oedementstehung teilweise mitverantwortlich ist, jedoch dürfte dies nicht der Fall sein [8], [15]. Aethoxose ist als Arzneibuch wäre vorgesehen; ein entsprechender Vorschlag zur Aufnahme in das Deutsche Arzneibuch, 7. Ausgabe, liegt vor [7]. Insofern wird gewährleistet sein, daß Aethoxose mit konstanten Eigenschaften stets zur Verfügung steht. Die Beeinflußbarkeit des Oedems durch bekannte Antiphlogistika scheint bei i.p. Applikation kaum von der für das Dextranoedem abzuweichen. Wie schon am Dextranoedem gefunden wurde [3], erweist sich auch am Aethoxoseoedem nach Tabelle 1 bei i.p. Applikation Damaszenin als wirksamer als Phenylbutazon; denn das besser oedemhemmende Damaszenin wurde zu etwa 112 der LD 50 gegeben, während bei Bezugnahme auf die von BÜCH [5] und MEYER [9] zu 23O—250 mg/kg angegebene LD 50 die Dosierungen für das schwächer hemmende Phenylbutazon bis 4 / 5 der LD 50 betragen. Auffällig ist die starke Wirksamkeit des Salizylamids am Aethoxoseoedem, das an anderen Modellen und bei allerdings auch anderer Applikationsart vergleichsweise nicht so wirksam gefunden wurde [1], [12], [14], doch dürfte in unseren Versuchen eine durch die Alkalisierung eingetretene erhebliche allgemeine Wirkungsverstärkung des Salizylamids bei gleichzeitiger Eigenwirkung des Na 2 C0 3 von wesentlichem Einfluß sein. Bei peroraler Applikation bekannter Antiphlogistika dagegen scheint sich das Aethoxoseoedem ein wenig anders als das Dextranoedem zu verhalten. Während Azetylsalizylsäure am Dextranoedem sich schon bei 1 / 7 der LD 50 als gut hemmend erwies [3], zeigt es nach Tabelle 2 am Aethoxoseoedem bei 1 / 3 der LD 50 nur schwache Effekte. Damaszenin war am Dextranoedem bei vielleicht : / 4 der LD 50 wirksam, am Aethoxoseoedem dagegen bei ungefähr J / 3 der LD 50 nicht. Für Phenylbutazon könnten sich die Effekte entsprechen ; denn am Dextranoedem war eine gewisse Oedemhemmung durch 1 / 7 der LD 50 statistisch nicht zu sichern, wohl aber der Einfluß von etwa 1 / 2 der LD 50 am Aethoxoseoedem. Es will uns Wert erscheinen, die hier nur an einem kleinen Material beobachteten Unterschiede zwischen beiden Oedemarten unter Hinzunahme noch anderer Modelle weiter zu verfolgen, um die Besonderheiten des Aethoxoseoedems und seine Eignung als aussagekräftiges Modell genauer zu untersuchen.

Aethoxose-induziertes Oedem

249

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REES, D. A.: J.

[ 1 2 ] W A G N E R - J A U R E G G , T . U . J A H N U. O . B Ü C H :

Summary H . B E K E M E I E R a n d W . S C H M O L L A C K : E t h o x o s e e d e m a of t h e r a t paw a n d t h e influence of acetyl salicylic acid, damascenine, phenyl b u t a z o n e a n d salicylamide on it

S u b p l a n t a r injection of 0.1 ml of 1 percent aqueous solution of sodium c a r b o x y m e t h y l cellulose (ethoxose) into r a t s produced a p a w edema, t h e extent and t h e r a t e of formation a n d regression of which is described a n d t h e possible influence b y t h e known antiphlogistics on it is discussed. I n t r a p e r i t o n e a l injection of damascenine a n d p h e n y l b u t a zone yielded t h e same results as with d e x t r a n edema. In contrast, peroral administration of acetyl salicylic acid, damascenine and p h e n y l b u t a z o n e in orientation tests revealed certain deviations which might be indicative of peculiar properties of t h e ethoxose edema. PC3H>MC P. E.eKeMeftep

II

B . IIlMOJiJiaK:

9 T O K C O 3 H L I H OTCK

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H H E AUETHJICAJIHIIHJIOBOH KHCJIOTBI, HAMACLTEMMA, I3BajI0Cb KOToptrii o n H C b r e a e T C H B OTHomeHHH pa3Mepa

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OTena.

3TOK-

A c t a biol. med. german., B a n d 18 Seite 251—257 (1967) Aus der Abteilung f ü r Pathologische Physiologie der Höheren Nerventätigkeit der Charité (Leiter: Prof. Dr. med. habil. G . M I S G E L D ) , Berlin

Komplementbestimmungen und papierelektrophoretische U n t e r s u c h u n g e n an R a t t e n b l u t s e r u m bei MASUGI-Nephritis G.

PROTSCH

(Eingegangen am 24. 6. 1966) 1 Zusammenfassung E i n e MASUGi-Nephritis bei R a t t e n wurde experimentell durch Injektion von nephrotoxischem Kaninchenserum erzeugt. Das Versuchsziel war, serologische Veränderungen durch Komplementbestimmung u n d Papierelektrophorese zu erfassen. Einige Stunden nach Injektion des nephrotoxischen Kaninchenserums t r a t eine deutliche Komplementverminderung auf. Das durch Papierelektrophorese erhaltene Serumbild zeigte nach Injektion von nephrotoxischem Kaninchenserum Verminderung der Albumine sowie signifikante E r h ö h u n g der a 2 und «j-Globuline. Die /¡-Globuline waren mäßig erhöht, dagegen waren die y-Globuline nicht wesentlich von den Normalwerten abweichend.

Als Beitrag zur Klärung der Frage der allergischen Vorgänge bei der MASUGi-Nephritis der R a t t e sollen die primären allergischen Reaktionen mit Hilfe der Komplementbestimmung und der Papierelektrophorese nach Injektion von nephrotoxischem Kaninchenserum untersucht werden 2 . Im Prinzip wird dabei in einem heterologen Tier (Kaninchen) ein aktiver Antikörper gegen Rattenglomeruli produziert (MASUGI [ 1 ] ) . Bringt man den Antikörper des Kaninchens (nephrotoxisches Kaninchenserum) in die Blutbahn der Ratte, so erfolgt in den Glomeruli sofort eine Fixierung dieses Antigens, und es resultiert eine Antigen-Antikörper-Reaktion ( K R A K O W E R und G R E E N SPON [ 2 ] ) .

Die oben angegebenen Bestimmungsmethoden wurden im Serum von normalen R a t t e n und mit NKS 3 behandelten durchgeführt. Weil die unmittelbar nach NKS-Injektion auftretende Immunreaktion nachweisbare Änderungen im Serum erwarten läßt, wurden Komplementtiterbestimmungen und elektrophoretische Untersuchungen in stündlichen Abständen (1 —9Std.) vorgenommen. 1

N a c h Revision a m 5. 9. 1966 Die Untersuchungen beziehen sich auf Teilprobleme des Fragenkomplexes „allergische Vorgänge a m Modell der MASUGi-Nephritis unter Berücksichtigung des Einflusses auf die N e r v e n t ä t i g k e i t " . 3 N K S = nephrotoxisches Kaninchenserum. 2

252

G . PROTSCH

Material und Methodik Von 20 weiblichen R a t t e n mit 200 —250 g Körpergewicht wurden Normalwerte bestimmt. Für die einzelnen Versuchsserien wurden je 15 R a t t e n benutzt. Zur Erzeugung der MASUGI-Nephritis erhielten die Tiere 2mal im Abstand von 24 Std. N K S i.v. (1 ml/100 g Körpergewicht) 1 . Zur Verminderung der unspezifischen Toxizität wurde das Serum während 30 min auf 56 °C erwärmt. Nach Injektion des N K S kamen spontan 2 — 3% der Tiere durch anaphylaktischen Schock ad exitum. 24 Ratten, die normales Kaninchenserum erhielten, dienten als Kontrolle. Das Blut wurde nach Injektion einer letalen Dosis Thiopental aus der Vena cava caudalis gewonnen und das Serum später abzentrifugiert. Komplementbestimmung Die Komplementbestimmung erfolgte spektrophotometrisch unter Verwendung der 50% Hämolyse-Einheit von Hammelbluterythrozyten nach O S L E R et al. [3]. Die Rattenseren wurden in einer geometrischen Verdünnungsreihe mit 0,5%iger NaClLösung verwandt. Nach Zugabe von sensibilisierten Hammelbluterythrozyten wurden die Proben für 30 min bei 37 °C inkubiert und anschließend die nicht hämolysierten Erythrozyten abzentrifugiert. Die Hämolysegrade im Überstand der einzelnen Proben sind der Extinktion bei 570 nm direkt proportional. Die graphische Darstellung der Hämolysegrade (bzw. der Extinktionen) in Abhängigkeit von der Komplementmenge (bzw. Serummenge) ergibt im Bereich der 50%-Hämolyse eine Gerade. Die aufgetragenen Kurvenpunkte wurden extrapoliert und die für eine 50%-Hämolyse benötigte Serummenge daraus ermittelt. Als Normalwert wurde die Menge normales Rattenserum festgesetzt, die für eine 50%Hämolyse von sensibilisierten Hammelbluterythrozyten notwendig ist. Papierelektrophorese Die papierelektrophoretische Trennung von Serum erfolgte nach der von D I T T M E R [4] modifizierten Methode mit dem Gerät von K N A P P auf FN,-Papier. Die Auftrennung geschah in etwa 12 Std. bei 120 V/1,3 mA in Veronal-Natrium/Natriumazetatpuffer, pH 8,6 — 9,0, ft = 0,08. Nach Färbung mit Amidoschwarz 10 B wurden die einzelnen Serumfraktionen mit 0,1 n N a O H eluiert. Die Farbintensität in den Eluaten wurde bei 610 nm gemessen, die prozentualen Werte tabellarisch zusammengefaßt und auf ihre Signifikanz geprüft ( W E B E R [5]). Eiweißbestimmungen Die Bestimmung des Gesamteiweißes erfolgte mit der Biuretmethode. Ergebnisse

Komplementbestimmung Die Veränderungen des Komplementtiters nach Injektion von NKS wurde über 9 Std. verfolgt. Aus der graphischen Darstellung (Abb. \) ist zu ersehen, daß sofort nach Applikation zunehmende Serummengen zur Erreichung der 50%-Hämolyse notwendig waren, d . h . der Komplementgehalt im Serum fiel ab. Die niedrigsten Werte wurden 3 —4 Std. p. i. erreicht. In den folgenden Stunden nahm das Komplement wieder zu und stieg teilweise über den Normwert. 1

Frau Dipl. Biol.

BRUNK

danke ich für die Herstellung des NKS.

Serumbild bei MASUGI-Nephritis

253

Komplementbestimmungen, die über mehrere Tage vorgenommen wurden, zeigten nur unwesentliche Abweichungen von den Normal werten. In der Kontrollserie, die die gleiche Menge normales Kaninchenserum erhielt, lagen die Komplementwerte innerhalb des Normbereiches. Abb. 1. Verhalten des Serumkomple- 8j " ments der R a t t e nach Verabreichung 'S* des nephrotoxischen und normalen J ' Kaninchenserums (1 ml/100 g Körper- j«. o,2 gewicht). § J e d e r P u n k t der Kurve ist aus den g 0.3 Durchschnittswerten von 10—12 Tie- g ren gebildet jjj O • x

O =

normales Kaninchenserum; • = nephrotoxisches Kaninchenserum; x = normales Rattenserum

o gg * ^

2

3

4

5

Stunden post

6

7

injektionem

Tabelle 1 Durchschnittliche Serumwerte 1—9 Std. nach Injektion von N K S Ges. Eiweiß

Albumine

[g/100 ml]

[%]

«1

«2

ß

Y

1 2 3 4 5 6 7 8 9

3,2 4,6 3,1 3,8 4,3 4,0 4,8 3,0 3,6

32,4 35,3 30,4 31,0 34,6 33,5 36,5 29,2 32,2

15,1 13,9 15,0 15,5 15,4 15,4 14,3 15,4 14,0

17,8 16,8 18,5 18,3 17,7 18,1 16,7 19,4 20,2

20,2 20,3 20,1 20,1 19,8 19,6 21,6 21,0 21,2

12,0 14,0 14,1 15,4 14,7 14,3 12,2 15,1 11,0

Normalwert

6,4

41,5

13,2

12,7

19,1

14,1

Std. p.i.

Globuline T%1

Tabelle 2 Durchschnittliche Serumwerte 1 — 8 Std. nach Injektion von normalem Kaninchenserum Std. p.i.

-17

Ges. Eiweiß

Albumine

Globuline r%]

[g/100 ml]

[%]

KH03JieKTpoopeTimecKHe

HCCJieHOBaHHH H a CBIBOpOTKe K p H C H H O f i KpOBH n p H H e $ p H T e

Ma3yrH

B B e n e H H e M KpbICaM He(|)pOTOKCHqeCKOft KpOJIHKOBOft CblBOpOTKH SblJI B H 3 B a H 3KCn e p H M e H T a j i b H b i i i Hei|)pHT M a 3 y r H .

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reHi ¿jm Abb. 4. Ausschnitt aus einer Leberparenchymzelle, 24 Std. nach Gabe von Aktinomyzin C. Deutliche Hyperplasie des vesikulären endoplasmatischen Retikulums (H). Regelrechte Struktur der Mitochondrien (M). Vereinzelt Anteile des granulären endoplasmatischen Retikulums (Egr) mit herdförmig abgelösten Ribosomen. x 37000

Abb. 5- a (oben): Ausschnitt aus einer Leberzelle 23 Std. nach Gabe von Aktinomyzin C. Schvvellungszustand und sphärische Transformation der Mitochondrien (M). Herdförmige Auflösung der Matrixsubstanzen. Herauslösung der Grundsubstanz (G). Vesikuläre Umwandlung des endoplasmatischen Retikulums. Ansammlung von Fetttropfen (F). X 16000 b (unten): Ausschnitt aus einer Leberzelle nach gleicher Behandlung wie 5 a mit vollständiger Herauslösung der Grundsubstanz (G) und herdförmiger Auflösung des Karyoplasmas (K). Um das Mitochondrien (M) noch einzelne Anteile des granulären endoplasmatischen Retikulums. Die Ribosomen liegen teilweise noch in Polysomenform (P) vor, sind aber vielfach von den Membranen abgelöst, x 28 500

Abb. 6. Ausschnitt aus einer Leberparenchymzelle 23 Std. nach Gabe von AktinomyzinC. Ausgedehnte Herauslösung der Grundsubstanz (G). Vesikuläre Umwandlung (V) des granulären endoplasmatischen Retikulums mit Ablösung der Ribosomen (r). Schwellungszustand der Mitochondrien (M). Herdförmige Auflösung der Matrixsubstanzen. Ein ringförmiges Mitochondrion umgibt Teile des endoplasmatischen Retikulums und einen Fetttropfen (F). x 30000

Acta biol. med. german., Band 18, Seite 275 — 290 (1967) Aus der Abteilung für Elektronenmikroskopie der Charité (Leiter: Prof. Dr. H. am Pathologischen Institut der Humboldt-Universität Berlin (Direktor: Prof. Dr. L. H. K E T T L E R )

DAVID)

Leberparenchymzellveränderungen nach partieller Hepatektomie bei gleichzeitiger Aktinomyzingabe H . DAVID u n d I. UERLINGS

(Eingegangen am 8. 9. 1966)

Z usammenf assung An partiell hepatektomierten Ratten wurden die Veränderungen der Leberzellen der Restleber nach Gabe von Aktinomyzin C und D untersucht. Neben Herauslösungen und Verklumpungen des Karyoplasmas treten Verklumpungen oder Dissoziationen der Nukleolusbestandteile auf. Das endoplasmatische Retikulum wird vesikulär umgewandelt, die Polysomen lösen sich teilweise von den Membranen ab. Die Mitochondrien sind herdförmig geschwollen und zeigen Matrixherauslösungen und Fragmentierungen der Cristae. Die GoLGi-Felder sind hyperplastisch und enthalten vermehrt osmiophile Fettpartikel in den Vesikeln. In den Zellen sind pinozytotisch aufgenommene Fetttröpfchen und größere Fetttropfen zu sehen. Besonders auffällig ist die große Zahl von Zytolysomen in der Nachbarschaft des GoLGl-Feldes, nahe den Gallenkapillaren und vereinzelt auch in den übrigen Zellbereichen. Die Veränderungen der Leberzellen nach partieller Hepatektomie und Gabe von Aktinomyzin sind wesentlich ausgeprägter als nach Gabe von Aktinomyzin allein. Infolge des erhöhten m-RNS- und Proteinbedarfes in der regenerierenden Leber sind die Aktinomyzin-bedingten Störungen innerhalb des Metabolismus dieser Substanzen mit weitreichenden Folgen verbunden. Jedoch scheint eine einmalige Gabe des Aktinomyzins noch keine irreversiblen Schäden der Leberzellen zu bewirken.

Die partielle Hepatektomie ist als Modell für den Ablauf von Regenerationsprozessen ein häufiges morphologisches und biochemisches Untersuchungsobjekt. Die wesentlichen Befunde sind von B U C H E R [9] zusammenfassend dargestellt worden. Im Rahmen der erhöhten Wachstumsrate kommt es zur Zunahme der DNS-, RNS- und Proteinsynthese. Unsere vorliegenden Untersuchungen gingen von der Frage aus, in wie weit das submikroskopische Bild der regenerierenden Leber verändert wird, wenn man gleichzeitig zum Regenerationsreiz Substanzen gibt, die die RNS-Synthese und damit die Proteinbildung hemmen. Die in normalen Leberzellen unter diesen Bedingungen auftretenden Veränderungen haben wir in einer vorangehenden Arbeit dargestellt ( D A V I D und M A R X [ 1 6 ] ) .

2 76

H . DAVID, I. UERLINGS

Material und Methodik Bei insgesamt 22 weißen Ratten wurde eine partielle Hepatektomie durchgeführt. Ein Teil der Tiere erhielt 0,1 —1,0 [xg/g Körpergewicht Aktinomyzin C (Sanamyzin; Bayer, Leverkusen) oder Aktinomyzin D (Cosmegen; Merck, Sharp, Dohme, West Point Pa) zum Zeitpunkt der Operation oder kurz danach. Die Injektionen erfolgten i.p. oder intralienal. In einem Zeitraum zwischen 4 und 31 Std. wurden die Tiere getötet und das Gewicht des Leberrestgewebes mit dem entnommenen Lebergewebe verglichen. Kleine Gewebsstückchen wurden sofort zur elektronenmikroskopischen Untersuchung in 1 %iger isotonischer 0s0 4 -Lösung fixiert und in Vestopal W eingebettet. Die Schnitte wurden mit einem Ultrotom (LKB-Produkter, Stockholm) hergestellt. Ein Teil der Schnitte wurden mit Bleizitrat nachkonstrastiert. Die Aufnahmen wurden mit einem Elektronenmikroskop SEM 3 des V E B Fernsehelektronik Berlin hergestellt bei einer Vergrößerung von 2000 — 30000. Photographische Nachvergrößerungen .

Ergebnisse

Eine genaue Festlegung des prozentualen Anteils des resezierten Lebergewebes in bezug auf die Gesamtmenge ist nicht möglich. Es handelt sich immer um eine Schätzung. Wir entfernten jeweils 5 5 —65 % der Gesamtmenge. Innerhalb von 24 Std. war das Gewicht der Restleber wieder fast normal, ohne daß es signifikante Unterschiede zwischen den unbehandelten Tieren und denen mit gleichzeitiger Gabe von Aktinomyzin gab. l. Befunde an Kontrolltieren {partielle Hepatektomie ohne weitere

Behandlung)

Die Zellkerne sind in den ersten Stunden nach der partiellen Hepatektomie vergrößert. Das Karyoplasma ist herdförmig herausgelöst, wird aber nach mehr als 24 Std. wieder regelrecht. Vereinzelt sieht man verklumpte Nuleoli, später sind sie hypertrophiert und teilweise der Kernmembran angelagert. Das endoplasmatische Retikulum ist in den ersten Stunden dilatiert und teilweise vakuolisiert. Nach mehr als 24 Std. normalisiert sich der Befund wieder, und jetzt beobachtet man vielfach Membranpakete des granulären endoplasmatischen Retikulums. Die Ribosomen sind besonders in den Anfangsstadien den Membranen als komma- oder kreisförmige Polysomen angelagert. Im Gesamtverlauf kommt es nur vereinzelt zur Ablösung der Polysomen. 10 Std. nach der partiellen Hepatektomie zeigen die Mitochondrien eine regelrechte Struktur und Größe. Nach 24 Std. sind sie mehrfach geschwollen, abgerundet und vergrößert. Die Matrix mitochondrialis ist herdförmig herausgelöst. Im Bereich der Außenmembran der Mitochondrien bilden sich selten kleine Myelinfiguren aus. Das Grundplasma wird fokal herausgelöst. In den ersten Stunden finden sich 1000—2000 A große osmiophile Partikel in den Vesikeln unter der sinusoidalen Zelloberfläche. Später fließen sie teilweise zu größeren Fetttropfen zusammen, die manchmal mehrere Zellabschnitte ausfüllen können. Die GoLGi-Felder sind mäßig hyperplastisch. Die GoLGi-Vesikel sind dila-

Leberveränderung nach Hepatektomie und Aktinomyzingabe

2 77

tiert und enthalten osmiophile Partikel. In der Umgebung des GoLGi-Feldes, nahe den Gallenkapillaren, sind Lysosomen, ganz selten Zytolysomen und einzelne Pigmentgranula zu beobachten. Die Gallenkapillaren sind erweitert. Nach einer mehr als 24 Std. anhaltenden Regeneration sind deutlich vermehrt Mikrobodies vorhanden. Manchmal findet man Zytolysomen mit Myelinfiguren. Außerdem treten Glykogenareale sowie vereinzelt Herde von glatten Vesikeln auf. 2. Befunde bei Tieren mit partieller Hepatektomie und Gabe von Aktinomyzin Nach 4 Std. zeigen die Zellen unterschiedlich starke Veränderungen. Einige Zellen sind normal, andere haben ein ödematöses Grundplasma und vesikuläres oder vakuoläres endoplasmatisches Retikulum. Das Karyoplasma ist in fast allen Kernen über große Bereiche verklumpt, das Chromatin weist eine marginale Kondensation auf. Die Nukleoli zeigen eine Dissoziation der Nukleolonemata und der Pars amorpha und eine Verklumpung der Nukleolonemata (Abb. 1). Die Gesamtmenge des granulären endoplasmatischen Retikulums ist vermindert, jedoch sind die Polysomen nicht eindeutig reduziert. Die Mitochondrien sind bizarr geformt oder geschwollen u n d enthalten weniger Cristae und eine herausgelöste Matrix. Außerdem sieht man vermehrt Mikrobodies. Unterhalb der sinusoidalen Zelloberfläche finden sich vereinzelt glattwandige Vesikel mit osmiophilen Fetttröpfchen, die man auch im DissEschen R a u m sehen kann. Die GoLGi-Felder sind hypertrophiert und enthalten in den Vesikeln reichlich osmiophile Granula sowie auch größere osmiophile Ablagerungen. 4 1 / 2 Std. nach der Operation und Zuführung des Aktinomyzins entsprechen die Zellveränderungen im wesentlichen den schon beschriebenen. Die Mitochondrien enthalten vorwiegend nach intralienaler Zuführung des Aktinomyzins längsgerichtete Innenmembranen und werden teilweise von Myelinfiguren umgeben (Abb. 2). Die Zahl der Mikrobodies ist hoch. Die GOLGIFelder sind erheblich hypertrophiert (Abb. 3). In den Vesikeln liegen reichlich osmiophile Partikel (Abb. 4). Die Nachbarschaft der GoLGi-Felder ist von zahlreichen Zytolysomen in unterschiedlichen Entwicklungsstadien angefüllt (Abb. 5, 6, 7, 8 b). Sie sind von einfachen oder mehrschichtigen myelinartigen Membranen umgeben und enthalten Mitochondrien, endoplasmatisches Retikulum, Ribosomen, Fetttropfen und Grundplasma. Nach 8—10 Std. zeigt das Karyoplasma eine erhebliche Herauslösung oder Verklumpung der Granula und eine marginale Kondensation. Die Nukleoli sind verklumpt oder weisen eine Dissoziation ihrer Bestandteile auf. Das endoplasmatische Retikulum der granulären Form ist meist erheblich vakuolisiert, die Ribosomen und Polysomen sind herdförmig von den Membranen abgelöst. Es finden sich Herde aus glatten Vesikeln und Membranresten. Die Mitochondrien sind geschwollen, die Cristae sind fragmentiert oder aufgelöst, die Matrixgranula fehlen. Das Grundplasma ist ödematös. Überall

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sieht man kleine Fetttröpfchen und größere Fettansammlungen. Im Bereich der GoLGi-Felder enthalten die Vesikel kleinere und größere osmiophile Partikel. Die Zahl der Mikrobodies ist weiter angestiegen. In der Zeit von 2 3 — S t d . normalisiert sich ein Teil der Befunde langsam wieder. Neben dissoziierten und verklumpten Nukleoli sind auch hypertrophierte zu sehen. Manche Nukleoli sind homogen oder werden von einer membranartigen oder filamentösen Granulalage umhüllt (Abb. 1). Vereinzelt sind sie auch zu osmiophilen Körpern zerfallen. Das Karyoplasma zeigt zwar noch immer umschriebene Verklumpungen, ist aber in einigen Kernen auch regelrecht angeordnet. Das Grundplasma ist in einzelnen Zellen in größeren Arealen herausgelöst. Neben kleineren Fettpartikeln sind oft reichlich große F e t t tropfen zu beobachten. Das granuläre endoplasmatische Retikulum ist weiterhin vesikulär umgewandelt. Die Ribosomen und Polysomen in typischer Formierung sind teilweise von den Membranen abgelöst. Am Ende des Untersuchungszeitraumes sind auch regelrechte Lagerungen des granulären endoplasmatischen Retikulums, manchmal auch in größeren Paketen, vorhanden. Die Mitochondrien sind in vielen Zellen noch geschwollen und zeigen Fragmentierungen der Cristae sowie Matrixherauslösungen. Die Mikrobodies sind meist vermehrt. Häufig treten Glykogenansammlungen auf. Einzelne Zellen werden nekrotisch. Die auffälligsten Veränderungen sind auch jetzt im Gebiet der GoLGi-Felder zu sehen. Sie sind erheblich vergrößert und enthalten in den Vesikeln Lipidablagerungen. Neben Lysosomen sieht man nicht nur in der Umgebung der GoLGi-Felder sondern auch in den übrigen Zellbereichen zahlreiche differente Zytolysomenbiidungen aus den verschiedensten Zellbestandteilen (Abb. 8 a). Sie verschwinden auch bis zum Ende des Versuches nicht. Die Gallenkapillaren sind oft dilatiert. j. Vergleichende Übersicht über die Bef ände Zwischen den Kontrollfällen mit partieller Hepatektomie ohne weitere Medikation und denen nach zusätzlicher Aktinomyzingabe bestehen hinsichtlich der LeberparenchymzellVeränderungen keine prinzipiell unterschiedlichen Befunde. Different sind nur der Grad der Veränderungen sowie der Zeitpunkt und die Dauer. Nach Aktinomyzingabe treten die Befunde im allgemeinen früher und stärker auf und halten über längere Zeit an. Besonders ausgeprägt sind die Verklumpung und Dissoziation der Nukleolusbestandteile und des Karyoplasmas. Während normalerweise nur vereinzelt Zytolysomen im Rahmen der partiellen Hepatektomie auftreten, sind sie zusammen mit der GoLGi-Feldhypertrophie ein hervorstechendes Ereignis nach der Aktinomyzingabe, wobei sie nicht nur in der Nähe des GoLGi-Feldes liegen sondern auch in anderen Zellbereichen zu finden sind.

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Diskussion

Neben den zahlreichen lichtmikroskopischen Veröffentlichungen über die Leberveränderungen nach partieller Hepatektomie sind in den letzten J a h ren auch schon mehrere Arbeiten über die elektronenmikroskopischen Befunde erschienen ([1], [2], [3], [4], [6], [8], [11], [19], [25], [26], [27], [39], [40], [41]). Sie entsprechen in ihren Ergebnissen im wesentlichen unseren Kontrollfällen. Über die aktinomyzinbedingten Veränderungen der normalen Leber haben wir vorher berichtet (David und M a r x [16]). Sie sind im besonderen durch den Eingriff der Substanz in die DNS-, m-RNS-abhängige Proteinsynthese bedingt und äußern sich vorwiegend in Veränderungen des Karyoplasmas u n d des Nukleolus sowie des granulären endoplasmatischen Retikulums. Daneben kann es auch sekundär zu weiteren Schädigungen kommen. Hierbei ist zu berücksichtigen, daß oft ausgedehnte Hyperplasien und Schwellungen der Sternzellen zu Durchblutungsstörungen führen (David [15]). Die Aktinomyzine sind aus Streptomyzeskulturen isolierte, zytostatisch und karzinostatisch wirkende Antibiotika, die sich im Bereich der GuaninMoleküle der DNS anlagern und infolge Hemmung der RNS-Polymerase die m-RNS-Synthese inhibieren. Die DNS-Synthese wird dagegen erst später u n d durch wesentlich höhere Dosen gehemmt ([5], [12], [33])- Möglicherweise wird die DNS-Bildung durch bestimmte RNS-Moleküle beeinflußt, deren Synthese durch das Aktinomyzin unterdrückt wird. Nach B e l y a e v a [7] ist die Mitosezahl nach Gabe von Aktinomyzin bei der partiellen Hepatektomie reduziert und die Menge an zweikernigen Zellen vermindert. Die bisherigen elektronenmikroskopischen Untersuchungen über die Leberzellveränderungen nach partieller Hepatektomie und gleichzeitiger Aktinomyzinmedikation [30] haben keine sicheren Unterschiede gegenüber den Befunden nach Gabe von Aktinomyzin allein ergeben [22], [36], [37]. Am auffälligsten ist die Reduktion der Polysomenzahl und der 80-S-Ribosomen, wobei intrazellulär noch Ribosomenaggregate in erheblicher Menge bestehen bleiben können [35], [34]. Bedeutungsvoll soll die Ablösung der Polysomen von den Membranen des granulären endoplasmatischen Retikulums sein. Dieses Ereignis beobachtet m a n auch in regenerierenden Lebern nach partieller Hepatektomie und in Hepatomen [10], [43]Biochemische Befunde über die Veränderungen der Leber bei partieller Hepatektomie und gleichzeitiger Gabe von Aktinomyzin liegen in größerer Menge vor. Die RNS-Synthese wird nach partieller Hepatektomie schon durch viel kleinere Dosen beeinflußt [20], [21], [28], [42]. Die DNS-Synthese beginnt zu einem späteren Zeitpunkt. Die normalerweise nach partieller Hepatektomie erhöhten Enzyme Desoxyzytidylat-Desaminase, Thymi dinKinase, DNS- und RNS-Polymerase werden durch Aktinomyzin gehemmt [17], [18], [29]. Die Thymidylat-Synthetase soll dagegen nicht beeinflußt werden. Aktinomyzin hemmt auch aus anderen Ursachen aktivierte Syntheseprozesse in der Leber. So wird die durch Eisengabe induzierte Apoferritinbildung

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inhibiert, was Y O S H I N O et al. [ 4 5 ] auf die Unterdrückung der m-RNSSynthese zurückführen. Phénobarbital bewirkt eine erhöhte Bildung mikrosomaler entgiftender Enzyme mit einer parallel verlaufenden Vermehrung des glatten endoplasmatischen Retikulums [31], [32]. Dieser Effekt kann ebenfalls durch Aktinomyzin unterdrückt werden. Unsere Untersuchungen zeigen, daß durch die partielle Hepatektomie und Aktinomyzin teilweise gleichartige Veränderungen hervorgerufen werden, daß aber andererseits besonders in einigen Punkten eine Summierung des Effekts auftritt. So wurden von uns äußerst selten, von einigen anderen Autoren in größerer Menge, auch bei alleiniger partieller Hepatektomie Zytolysomenbildungen beobachtet [6], [25]. Die von uns bei der kombinierten Behandlung gefundenen massiven Zytolysomenherde besonders in der Umgebung der GoLGi-Felder und im perikanalikulären Bereich, aber auch in den übrigen Zellbezirken weisen auf eine ausgeprägte Schädigung in der intrazellulären Eiweißsynthese hin, wie sie beispielsweise bei Gabe von Aminosäure-Analoga und -Inhibitoren beobachtet wird [24], [44]. In Einzelfällen kann es auch zum endgültigen Untergang von Zellen kommen. Zusammenfassend kommen wir auf Grund der bekannten morphologischen und biochemischen Befunde zu dem Schluß, daß die Schädigung der Leber unter den Bedingungen einer experimentell bedingten erhöhten Stoffwechsel- und Mitoserate durch die Aktinomyzine wesentlich stärker ist als unter Normalbedingungen. Infolge der Inhibition der im Kern lokalisierten mRNS-Synthese wird die zytoplasmatische Proteinbildung eingeschränkt, woraus sich Veränderungen der Mitochondrien in funktioneller und morphologischer Hinsicht ergeben. Da die Mitochondrien jedoch ebenfalls DNS besitzen und eine eigenständige RNS-Synthese haben sollen [23], ist auch ein direkter Effekt des Aktinomyzins auf diese Organellen möglich. Als Folge der Schädigung des Proteinstoffwechsels bilden sich fokale Nekrosen oder Zytolysomen aus, die aus dem regelrechten Stoffwechsel ausgeschlossene Zellbezirke darstellen [13]. Als Feedback-Prozeß kommt es zur Hemmung der normalerweise im Zeitraum von 25—30 Std. besonders hohen DNS-Syntheserate [38] und der danach einsetzenden Mitosetätigkeit. Soweit zu beurteilen, sind die Erscheinungen jedoch nicht irreversibel sondern bedeuten im wesentlichen eine Retardierung der normalen Regenerationsprozesse. Literatur [1] BADE, E . G . : Z. Zellforsch, mikroskop. Anatom. 61, 754 (1964). [2] BADE, E . G. : Zbl. allg. Pathol. p a t h o l . A n a t o m . 105, 426 (1963/64). [3] BADE, E . G. : Virchow's Arch. pathol. Anatom. Physiol. klin. Med. 338, 237 (1965). [4] BARTÖK, I . u . S. VIRÄGH: Z . Z e l l f o r s c h , m i k r o s k o p . A n a t o m . 6 8 , 741 ( 1 9 6 5 ) . [5] BASERGA, R . , R . D . ESTENSEN U. R . O . P E T E R S E N : A m e r . J . P a t h o l . 46, 5a ( 1 9 6 5 ) . [6] B E C K E R , F . F . u . B . P . L A N E : A m e r . J . P a t h o l . 47, 783 ( 1 9 6 5 ) .

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tides in the vesicles. Pinocytotically absorbed fat-globules and larger fat-globules were noticed in the cells. The great number of cytolysosomes close to the G O L G I field and to the biliary capillaries and sporadically in the remaining cell areas is striking. Changes following both partial hepatectomy and administration of actinomycin are much more pronounced than after actinomycin alone. Because of the elevated need for m E N A and protein in the regenerating liver, the actinomycin-induced disorders within the metabolism of these substances are connected with far-reaching consequences. However, a single administration of actinomycin does not appear to cause an irreversible damage to the liver cells. PeaioMe T . JUaBHH H H . Ï O p j i H H r c : IfeMeHeHHH KJICTOK napeHXHMbi neneHH nocjie HaCTHHHOii renaT3KT0MHH C OHHOBpeMeHHbIM BBeUeHHeM aKTMHOMHUHHa

Ha N A C T H I H O renaT3KT0MHp0BaHHi>ix Kpbicax H3yqajiHCb H3MEHEHHH KJICTOK neneHOHHOii napeHXHMbi nocjie BBeneHHH aKTHHOMHUHHa C H D. HaQjuoaaeTCH OTCJiaHBaHHe H 0 6 P A 3 0 B A H H E KOMKOB Kapnonjia3Mbi, a TAKJKE 0 6 P A 3 0 B A H H E KOMKOB H HHCCOQHAUHH KOMNOHEHTOB HnptiiiiKa. 3HHONJIA3MATHHECKHIT P E T H K Y N Y M npeBpamaeTCH Be3HKyjiHpH0, nojincoMbi omaTCH oTCJiaHBawrcH OT MeMÔpaH. MHTOXOHHPHH HaôyxaiOT, MaTpmja BbicoBbiBaeTca H rpeÔHH npepbiBaioTCH. 3oHbi rojitflWH rHnepnjiacTHHHbi H conepwaT noBbimeHHoe KOjnmecTBO OCMHO$HJIbHbIX JKHpOBblX laCTHII B Be3HKyJiaX. B KJieTKaX HaCjIIOHaiOTCH riHHOUHTOTHnecKH norjiomeHHbie >KHpoBbie Kaiura H ôojiee KpynHbie jKHpoBbie KanjiH. BHHMaHHe npHBJieKaeT Sojibuuoe HHCJIO UHTOJIHSOM B coceRCTBe 30Hbi TOJUJAJKH, BÔJIH3H HteOTHblX KanHJIJIHpOB H MeCTaMH H B HpyrHX yiaCTKaX KJleTKH. H3MeHeHHH neieHoiHbix KJICTOK nocjie MacTHHHoft renaTUKTOMHi-i H BBejjeHHH aKTHHOMHi(HHa 6oJiee BbipaweHbi, "ieM nocjie OHHoro BBeneHHH aKTHHOMHiyiHa. BcjiejjcTBHe noBbimeHHoil noTpe6HocTH pereHepHpyiomeii ne^eHH B M P H K H B npoTeHHe HapymeHHH, Bbi3BaHHbie aKTHHOMHiiHHOM, B npenejiax MeTa6ojiH3Ma 3THX BemeCTB CBH3aHbI CO CJIOJKHblMH nOCJieHCTBHHMH. OHHaKO, OHHOKpaTHOe BBe«eHHe aKTHHOMHiiHHa BHAHMO He BbisabiBaeT eme neoSpaTHMLix noBpe/K«eHHH neieHOHHbix KJIÊTOK.

Ahh. 1. a : In zahlri'iehc Fragnu-nU' zorfallonor Xukloolus (X). Hcrauslosunf» deiKaryopla.sniagrantila unti umsehrU'biMU» marginalo Kondonsation di\s t'hromatiiir.. 2? Siti, nach partit'ller Hopalcktoniio unti Gabo vtm Aklinomyzin. 15111111; b : I Hssoziation unti Homogenisierung tlor Anlcile tlos Xukloolus (X). 25 Sul. natii partiollor Hopatoktoniio unti Gabo vt>n Aktinomyzin. li)il(ii): c : \^illstandig abgorundotor, granularor, homogon orschoinondor Xukloolus (X) ohm! i Mfforonziorung tlor Bostandtoilo. 4 i>Std. nach partiollor Hopatoktoniio unti Gainvtm Aktinotnyzin. 2501111; d : Granular gobautor Xuklct)lus (X) mit umgobondctn holloni Ht)f unti Ansbiltlung t'intT 1110111 branartigon Lago von (Granula tmd iMlatnonton. 31 Std. nach parlioilor Hopatoktoniio unti Gabo von Aktinomyzin. 225"»

Ahl). 2. a : Ausbildung von Myelmmembranen um ein Mitoehrondrion (M) mit beginnender Auflösung der Cristae. In der Umgebung vereinzelt Mikrobodies (111) sowie nieist freie Ribosomen. Die übrigen Mitochondrien sind unauffällig. 4 l -' i Std. nach partieller Hepatektomie und Gabe von Aktinomyzin. 45 "im; Ii: Kndstadium eines Mitoeliondrienabbaues. Die Myelinmembranen unigeben eine diffuse Ansammlung von Yesikein [ \ ). In der l'mgebung verschiedene weitere Stadien des Abbaues von Zytoplasniaorganellen (Y,Q). 25 Sttl. nach partieller Hepatektomie und Gabe von Aktinomyzin. 30111111

Leberveränderung nach Hcpatektomie und Aktinomyzingabe

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Abb. 3. Multiple, verschiedenartig gebaute Zytolysomen (Z) und Mikrobodies (m) in der Umgebung des Zellkerns (K). Regelrechte Struktur der Mitochondrien. Herdförmig abgelöste Kibosomen. 4 ' 4 Std. nach partieller Hepatektomie und Gabe von Aktinomvzin. x 20000 1>) Acta biol. med. gcnimii., B ' " -

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Abb. 6. Multiple Zytolysomenbildungen (Z), die nahe der Zellmembran liegen und sich aus Mitochondrien und Anteilen des granulären endoplasmatischen .Retikulums aufbauen. Regelrechte Struktur der übrigen Mitochondrien (M). Herdförmige Ablösung der Ribosomen von den Membranen des endoplasmatischen Retikulums. A = Zellmembran. 4V2 Std. nach partieller Hepatektomie und Gabe von Aktinomyzin. X 45000

Leberveränderung nach Hepatektomie und Aktinomyzingabe

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Abb. 7. Ausschnitt aus einem Zytoplasmadesintegrationsherd mit unterschiedlich aufgebauten Zytolysomen. Sie werden von einer einfachen oder von myelinartigen Membranen umgeben und enthalten neben Mitochondrien Anteile des granulären endoplasmatischen Retikulums. 4V2 Std. nach partieller Hepatektomie und Gabe von Aktinomyzin. X 50000

Abb. S. a : Beginnende Zytolysomenbildung (Z) aus verschiedenen Organellen, insbesondere Mitochondrien und Anteilen des endoplasmatischen R e t i k u l u m s a u f g e b a u t . 25 Std. nach partieller H e p a t e k t o m i e und Gabe von Aktinomyzin. x 30000; b : E n d s t a d i u m des Abbaues von Organellen i n n e r h a l b von Zytolysomen (Z). E s finden sich jetzt nur noch osmiophile Körper (O) sowie A n s a m m l u n g e n osmiophiler Substanz, die von M y e l i n m e m b r a n e n u m g e b e n w e r d e n . In der U m g e b u n g GoLGi-Vesikel (G) mit kleinen Lipidablagerungen. 4 ] /a Std. nach partieller H e p a t e k t o m i e und Gabe von Aktinomyzin. x 30000

Kurzmitteilungen A c t a b i o l . med. german., B a n d 18, Seite 2 9 1 — 2 9 3 (1967) A u s der Deutschen A k a d e m i e der Wissenschaften zu Berlin., Institut f ü r Mikrobiologie und experimentelle Therapie, J e n a (Direktor: Prof. Dr. med. H . K N Ö L L ) Abteilung f ü r Steroidforschung

Über ein neues mikrobielles Abbauprodukt des Progesterons und seine synthetische Darstellung K . SCHUBERT, K . - H . B Ö H M E u n d C. HÖRHOLD

( E i n g e g a n g e n a m 1 5 . 9. 1966)

Bei der Einwirkung von Mycobacterium smegmatis auf Progesteron I in einer Nährsalzlösung nach T U R F I T T [ 1 ] wurde neben den Abbauprodukten IV—VI [2] eine kleine Menge einer UV-positiven Komponente gebildet. Die Isolierung und Charakterisierung dieser Substanz bereitete auf Grund des geringen Vorkommens und der Instabilität gegenüber Säuren und verschiedenen Adsorptionsmitteln einige Schwierigkeiten. Es zeigte sich, daß diese Verbindung am besten durch Einwirkung von M. smegmatis auf das Ketol VI zu erhalten ist. Für die Extraktion aus dem Kulturfiltrat mußte Äther an Stelle von Chloroform verwendet werden, da bereits die im Chloroform enthaltenen Säurespuren zu einer Zerstörung der Substanz führten. Die Trennung vom nicht umgesetzten Ketol VI wurde durch präparative Papierchromatographie im System Bush B 7 (Benzol/Methanol/Wasser, 2:1:1) erreicht. Die R/-Werte waren für X I I I 0,65 und für VI 0,85 • Die weitere Reinigung erfolgte dünnschichtchromatographisch an Kieselgel G, dem zur Sichtbarmachung UVpositiver Substanzen ein Leuchtstoff N 40 grün/R (vom VEB Leuchtstoffwerk Bad Liebenstein) zugesetzt war, im System Methylenchlorid/Azeton (4:1). Das Eluat zeigte keine Kristallisationsneigung. Das UV-Absorptionsspektrum ergab ein Maximum bei 249 nm, das für ein «./^-ungesättigtes Keton mit einem Substituenten in a-Stellung charakteristisch ist. Die Annahme, daß es sich bei der isolierten Verbindung um 7 a-Methyl-5,6,7,7a-tetrahydroindan-l,5-dion-(ß-propylalkohol-(4)) handeln könnte, wurde bestätigt durch das massenspektrometrisch ermittelte Molekulargewicht von 222 und durch das IR-Spektrum: 3470 c m - 1 OH-Valenzschwingung, 1750 cm" 1 C=0-Valenzschwingung (17-Keton), 1650 cm" 1 CO-Valenzschwingung ( > C = C—C = 0), 1405 cm" 1

Kurzmitteilungen

292

0-

+

CH300C» VE

m

0 H00C

m

Razematspaltung (d-Form) I N-NH-CO-NHi

NH2-C0-NH-N*^ CH300C^J

I I NH2

HOCH2 \ J

XR

0' H0CH2 Abb. 1. Schema der mikrobiellen Bildung und der Synthese von 7«-Methyl-5,6,7,7«tetrahydroindan-1,5-dion-(^-propylalkohol-(4))

Kurzmitteilungen

293

CH-Deformationsschwingung (16-Methylen des 17-Ketons), 1060 c m - 1 OHDeformationsschwingung, 790—780 c m - 1 CH-Deformationsschwingung Der Strukturbeweis durch Synthese wurde nach dem in der Abbildung dargestellten Weg (VII->XIII) durchgeführt. In den Schritten V I I — X folgten wir den ersten Stufen der Totalsynthese von Steroiden nach V E L L U Z [3]. Die Herstellung des ungesättigten Ketols X I I I aus der Ketosäure X erfolgte über das Disemikarbazon des Ketosäuremethylesters X I durch Reduktion mit Lithiumborhydrid in Propanol. Die chemischen Eigenschaften und die physikalischen Konstanten des synthetisch und auf mikrobiellem Wege erhaltenen Produktes waren identisch. Die synthetische Herstellung von X I I I schafft günstige Voraussetzungen für weitere mikrobielle Untersuchungen in der Hydroindan-Reihe. Herrn Dr. R . T Ü M M L E R danken wir für die A u f n a h m e des Molekülmassenspektrums und Herrn Ing.-Chem. K . W E H R B E R G E R für die infrarotspektrophotometrische Untersuchung. Literatur G. E . : Biochem. J . 3 8 , 4 9 2 ( 1 9 4 4 ) . K . - H . B Ö H M E U. C . H Ö R H O L D : Hoppe-Seyler's ( 1 9 6 1 ) ; Steroids 4 , 5 8 1 ( 1 9 6 4 ) . L . : C . R . hebd. S6ances Acad. Sei. 2 5 7 , 3086 ( 1 9 6 3 ) .

[1]

TURFITT,

[2]

SCHUBERT, K . , 325, 260

[3]

20

VELLUZ,

Acta biol. med. german., Bd. 18, Heft 2

Z.

physiol. Chem.

Acta biol. med. german., Band 18, Seite 295 — 297 (1967) Aus der Deutschen Akademie der Wissenschaften zu Berlin, Institut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie, Jena (Direktor: Prof. Dr. med. H . K N Ö L L ) Abteilung für Steroidforschung

Bildung von a-Ketoglutarsäure und Bernsteinsäure beim mikrobiellen Abbau des Steranskeletts K . SCHUBERT, K . - H . BÖHME u n d C. HÖRHOLD

(Eingegangen am 15-9. 1966)

Der biologische Abbau des Steranskeletts wird neuerdings mit verstärktem Interesse verfolgt, da im Säugetierorganismus bei Anwendung von 14C-markierten Steroiden die Bildung von markiertem C02 nachgewiesen werden konnte [1]. Im Rahmen unserer Untersuchungen über biologisch mögliche Abbauwege von Steroiden wurde durch Einwirkung von Mycobacterium smegmatis auf Progesteron I eine größere Zahl von Umwandlungs- und Abbau-Produkten isoliert und identifiziert [2]. Unter den mikrobiell erhaltenen Produkten tritt 7«-Methyl-l -acetyl-perhydroindanon-(5)-(/S-propionsäure-(4)) (¿-Ketosäure IV) als Abbaustufe besonders hervor. Bei ausgewählten Bedingungen läßt sich IV aus I mit Kulturen von Nocardia opaca in einer Ausbeute von 7 0 % gewinnen [3]. Zur Untersuchung des weiteren Abbaues der KH03JieKTp0$0peTHliecKHe iiccnejiOBaniiii uà ctiBopoTKe KpLiciiiioii KpoBU npn iieiJipHTe M A 3 y r H r.

flaBiiji H H . M a p K c : HaineneHBH KJieTOK neieiiomioìi napeHXHMM noc.ie BBeneinin aKTiiiioMimima IL H A

r . , I a lì 11 a H TI. l O p j i H u r c : 11 jMeiiemiH KJieTOK napeuxHMw iie*ieiin nocne aaCTii'iiion renaTSKTOMiiii c onHOBpeMeiiHbiM BBnemieivi aKTHHOMHiiHHa

Kpamnue

251—257 259—273 275 —290

coo6meuua

K . U l y G e p T , K . - r . B e i n e H K . r è p r o j i b H : HOBLIÌÌ Miinpooiitiii npojiyiiT pacmenaeniiii nporecTepona 11 ero cniiTe3

291—293

K . I I I y O e p T , K . - r . Bèute H K . r é p r o j i b f l : 06pa30Baime a-KeT0rvii0Tap0B0ii 11 miTapiioii KHCJiOT npii MHHPO6HOM pacmenjieiiHH CKejieTa CTepaHa

295 —297

r . B y p K a p f l T , r . - X . r a 6 m , M . F c p G e p 11 M . B i o x n e p : CpaBirarenbuoe iio.inporpacjiiinecKoe H ociiHJijionojiHporpaiJiHHeeKoe onpeneneirae npoii3Bojintix reMor.ioSiina . . . .

299 — 301

P . r n 6 e j i b M a H H H E . 111 e IÌ Ci e : I l e p un ice iiraaiioaKiimiiaH utMKOiìan (JipaKiiHH B oSjiacTii jÌ-r.IOUy."I IIIIOB IIVIIO IIlOlì CbIBOpOTKH

303 — 304

CONTENTS Biochemistry I.

Y.

K.

R. B.

K. T.

R.

Page

and D . M U E C K E : Action of 2,4-dichlorphenoxyacetic acid on t h e nucleic acid biosynthesis in t h e single-cell alga Poteriochromonas stipitata H A H N and C . W A G E N K N E C H T : A soluble N A D H 2 dehydrogenase f r o m r a t liver susceptible to antimycin YA and alkane . I. Purification and characterization experiments M U E L L E R and W . S C H E L E R : Studies in hemin transfer between methemoglobins of different species and h u m a n serum albumin and t h e effect of ligands on i t . . D A R G E L , E . S T R A C K and W . - D . T H O M I T Z E K : Action of palmitoyl carnitine on mitochondrial ATPases O S W A L D and G . D A S S L E R : Concentration of nucleotides and other acid-soluble phosphoric compounds in t h e r a t blood in maturing and aging erythrocytes. . . S C H U B E R T and G . S C H U M A N N : Excretion of C 1 9 steroids in rabbit urine following administration of 3 H-dehydroepiandrosterone G O E T Z E and E . G O E T Z E : Isozyme p a t t e r n and activity of lactic dehydrogenase and malate dehydrogenase in the labyrinth and the junctional zone of r a t placentas D A R G E L and E . S T R A C K : Specific action of L-palmitoyl carnitine on t h e contraction of mitochondria SCHROEDER, W . DUMMLER, K . J U N G

125 — 130

131 — 139 141 — 154 155 — 162 163 — 175 177—186

187 —194 195 — 204

Physiology D. G. H.

and A. K E M P E R : Bound ascorbic acid in t h e brain of guinea pigs and its behaviour in scurvy 205 — 20S D Y B O W S Y K I and W . R U E D I G E R : Increase of h e a t production in rats b y epidural administration of KC1 solutions 209—217 C H O I N O W S K I , P . B O A R T S C H and W . R U E D I G E R : Effect of bilateral hypothalamic lesions on t h e chemical thermoregulation of juvenile rats 219—232 SCHWARTZ, R . GLOWATZKI

Pharmacology and H . M A T T H I E S : Action of monoamine oxidase inhibitors on t h e t r y p t a m i n e content of t h e r a t brain and the " t r y p t a m i n e c r a m p " 233 — 244 B E K E M E I E R and W . S C H M O L L A C K : Ethoxose edema of the r a t paw and the influence of ecetyl salicylic acid, damascenine, phenyl butazone and salicylamide on it 245 — 249

N . POPOV, W . LIETZ H.

Experimental

Pathology

: Complement determinations and paper electrophoretical studies on r a t blood serum with Masugi nephritis 251—257 H. D A V I D and I. M A R X : Changes of liver parenchymal cells following administration of actinomycin C and D 259 — 273 H . D A V I D and I . U E R L I N G S : Changes of liver aarenchymal cells following partial hepatectomy with simultaneous administration of actinomycin 275 — 290 G. PROTSCH

Short

communications

and C . H O E R H O L D : A new microbial degradation product of progesterone and its synthetic preparation K . S C H U B E R T , K . - H . B O E H M E and C. H O E R H O L D : Formation of a-ketoglutaric acid and succinic acid during microbial degradation of t h e sterane f r a m e w o r k . . . . G . B U R K H A R D T , H . - C H . G A B S C H , M . G E R B E R and M . B U E C H N E R : Comparative polarographic and oscillopolarographic determination of hemoglobin derivatives. . . R. G I E B E L M A N N and E . S C H E I B E : A perioxidase-active protein fraction in t h e /?-globulin region of umbilical cord sera K . SCHUBERT, K . - H . BOEHME

291 —293 295 — 297 299 — 301 303 — 304

INHALT Seite

Biochemie I.

W. D U M M L E R , K . J U N G U. D. M Ü C K E : Wirkung von 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure auf die Nukleinsäure-Biosynthese der einzelligen Alge Poteriochromonas stipitata 125 — 130

SCHRÖDER,

Eine Antimyzin A- und Alkan-empfindliche lösliche NADHj-Dehydrogenase aus Rattenleber 131 — 139

V . H A H N U. C . W A G E N K N E C H T :

K.

M Ü L L E R U. W. S C H E L E R

Untersuchungen zum Hämintransfer zwischen Methämoglobinen verschiedener Spezies und Humanserumalbumin sowie dessen Beeinflussung durch Liganden . . . 141 —154 E. S T R A C K U. W . - D . ATPase von Mitochondrien

R . DARGEL,

THOMITZEK:

Einfluß von Palmitoylcarnitin auf die . 1 5 5 — 162

Die Konzentration von Nukleotiden und anderen säurelöslichen P-Verbindungen im Blut der Ratte während der Erythrozytenreifung und -alterung 163 — 175

B . O S W A L D U. G . D A S S L E R :

K.

S C H U B E R T U.

G. S C H U M A N N : Die Ausscheidung von C 19 -Steroiden im Kaninchenharn nach V erabfolgung von 3 H-Dehydroepiandrosteron 177 — 186

T.

GOETZE

R.

D A R G E L U. E .

u. E. G O E T Z E : Isozymmuster und Aktivität der Laktatdehydrogenase und Malatdehydrogenase in Labyrinth und der Verbindungszone von Ratten- • plazenten 187 — 194 S T R A C K : Spezifische Wirkung von L-Palmitoylcarnitin auf die Kontraktion von Mitochondrien. 195 — 204

Physiologie

A. K E M P E R : Gebundene Askorbinsäure im Gehirn von Meerschweinchen und ihr Verhalten bei Skorbut • 205 — 208

D . S C H W A R T Z , R . G L O W A T Z K I U.

G.

D Y B O W S K I U.

W. R Ü D I G E R : Zur Steigerung der Wärmeproduktion der Ratte bei epiduraler Applikation von KCl-Lösung 209—217

H.

CHOINOWSKI, P . BARTSCH

u. W. R Ü N D I G E R : Über den Einfluß beidseitiger Hypothalamusläsionen auf die chemische Wärmeregulation der juvenilen R a t t e . . . 219—232

Pharmakologie

N.

POPOV,

W. L I E T Z U. H. M A T T H I E S : Die Wirkung von Monoamidase-Hemmstoffen auf denTryptamin-Gehaltdes Rattenhirn und den „ T r y p t a m i n - K r a m p f " 233 — 244

H.

B E K E M E I E R U.

W. S C H M O L L A C K : Das Aethoxoseoedem der Rattenpfote und seine Beeinflussung durch Azethylsalizylsäure, Damaszenin Phenylbutazon und Salizylamid 245—249

Experimentelle

Pathologie

G.

P R O T S C H : Komplementbestimmungen und papierelektrophoretische Untersuchungen an Rattenblutserum bei Pasugi-Nephritis . . . 251—257

H.

D A V I D U. I . M A R X :

Leberparenchymzellveränderungen nach Gabe von Aktino-

myzin C und D H.

259—273

Leberparenchymzellveränderungen nach partieller Hepatektomie bei gleichzeitiger Aktinomyzingabe 275 — 290

D A V I D Ù. I . U E R L I N G S :

Fortsetzung umseitig!

31002

Kurzmitteilungen

Seite

Über ein neues mikrobielles Abbauprodukt des Progesterons und seine synthetische Darstellung 291—293

K . S C H U B E R T , K . H . B Ö H M E U. C . H Ö R H O L D :

: Bildung von A-Ketoglutarsäure und Bemsteinsäure beim mikrobiellen Abbau des Steranskeletts. 295 — 297

K . S C H U B E R T , K . H . B Ö H M E U. C . H Ö R H O L D

Vergleichende polarographische und oszillopolarographische Bestimmung von Hämoglobin-Derivaten 299 — 301

G . B U R K H A R D T , H . - C H . G A B S C H , M . G E R B E R U. M . B Ü C H N E R :

E. S C H E I B E : Über eine peroxidative Eiweißfraktion im /J-Globulinbereich von Nabelschnurseren 303 — 304

R . G I E B E L M A N N U.

Herausgeber u n d verantwortlich für den I n h a l t : R . B a u m a n n , H . Dutz, A. Grafii, H . Gumrael, F. J u n g , L.-H. Kettler, S. M. Rapoport. Schriftleitung: Prof. Dr. W e r n e r Scheler u n d Dr. habil. H e i n z Bielka, 1115 Berlin-Buch, Lindenberger Weg 70. F e r n r u f : 5 6 9 8 5 1 . App. 222. Verlag: Akademie-Verlag G m b H , 108 Berlin, Leipziger Straße 3—4 (Fernruf: 2 2 0 4 4 1 ) Telex-Nr. 01 1 773, Postscheckkonto Berlin 3 5021. Bestellnummer dieses H e f t e s 1053/XVIII/2. Die Zeitschrift erscheint monatlich. Bezugspreis: Einzelheft MDN 14,—, Doppelheft MDN 28, — . Veröffentlicht u n t e r d e r L i z e n z n u m m e r 1 3 l 8 d e s Presseamtes b e i m Vorsitzenden des Ministerrates der Deutschen Demokratischen Republik. Gesamtherstellung: V E B Druckerei „ T h o m a s M ü n t z e r " , 582 Bad Langensalza. — Alle R e c h t e vorbehalten, insbesondere die der Übersetzung. K e i n Teil dieser Zeitschrift darf in irgendeiner F o r m — durch Photokopic, Mikrofilm oder irgendein anderes V e r f a h r e n — ohne schriftliche Genehmigung des Verlages reproduziert werden.