Acta Biologica et Medica Germanica: Band 17, Heft 2 [Reprint 2021 ed.] 9783112540442, 9783112540435

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HERAUSGEBER:

R. B A U M A N N , H. D U T Z , A. G R A F F I , H. G U M M E L , F. JUNG L.-H. K E T T L E R , S. M. R A P O P O R T UNTER M I T A R B E I T VON: W. B E I E K , H. D E I S C H E L , H. F R U N D E R , M. G E R S C H , E. G O E T Z E , H . H A N S O N , F. H A U S C H I L D , G . H O L L E , F. M A C H , H. M A T T H I E S , C.MOHNIKEt, O.PROKOP, K.SCHUBERT, F.SCHWARZ, G. S T E R B A , A. W O L L E N B E R G E R SCHRIFTLEITUNG:

W. S C H E L E R , H. B I E L K A

AKADEMIE-VERLAG

• BERLIN

• B A N D 17 • H E F T 2

• S E I T E 117-260

• 1966

COflEPÍKAHHE Buoxumux

CTpaHnua

X . 3 a ü n , M . O . C. 3 j i - X a p a B H h A . B . X a p x a m : B.iHHHHe paaHbix HeopraHHHecKHx HCTOMHIIKOB a s o T a

Fusarium oxysporum

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HBYOKHCH y r n e p o a a

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KCTOKIICJIOTM

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117—126

X . 3 a f m H A . B . X a p x a m : üorjiomeHHe H accHMiuinmiH caxap03w H INITPHTA B OTHOIneHHH K pOCTy, nblXaHHK) H np0H3B0flCTBy KCTOKHCjIOTLI innopaMH

127 — 134

X . 3 a ñ j ( H A . B . X a p x a m : CpaBHHTejibHoe Hccjie^oBaHHe O B.'IIIHHIIII HHTpaxnoro a30Ta H a30Ta aMHHOKHCJIOT Ha AblxaHHe, npOH3BOHCTBO KeTOKHCJIOTtI H ailOnibUl OÖMeH y Fusarium oxysporum

135 — 144

B . - J I . TOM 11 MEK h E . I I l T p a K : O BÍIHHHHH najitMHTomiKapHHTHHa Ha KjieTKH acuHTHoro p a n a 3 P J I H X A in vitro H in vivo

145 — 159

&U3U0Jl0eUH T . y H r e p : IÍO3\IO;KIIOCT¡> NEPE.UI'ÍH aKcnepuivieHTajibHO Bbi3BaHHbix ii;iM('HeHiiií nepBHOfi aKTHBHOCTH npH 3aMeHe CnHHH0M03r0B0ß JKHHKOCTH

160 — 169

r . Í I M S O B C K H » H A . 3 B e p T : BjiHHHHe (jjyHKHHOHa.ibHoír neKopTHKauHH Ha peryjiHHHio TeMnepaTypti KPMCH

170—177

B . E i i 6 e . n i . , H . C t i K O p a H O . M e p i j i : HeöCTBHe CaÄDTA H CaDTRA n p a KanMHeM

178—185

OTpaBneHim

JI. B H H K J i e p : H3MeHeHHfl CBOßORHblX HÍHpHblX KIICJIOT B OKO.IOII.IO.PIOÜ HCHJJKOCTH, B 3M6pnOHajix>HOñ H MaTepHHCKHñ KpOBHHOñ Ti.iiKiMe Kpticti nocjie número peHTreHOBoro OSJIYNEHHA B noae 800 p

186—192

AMHH B . K a p H K . C p n a c T a B a : HcKyccTBeHHO BLi3BaHHtiii rimoTiipeo3 H nojiOBoe pa3BHrae npeAnyöepaJifcHbix o6e3bflH P e 3 y c

193—206

r . B o o c M a H H H K . T p e n T O B : racTOnorMHecKne 11 rncToxnMimecKiie iiccjienoBaHHH 06 yjKHBHHBOCTH TKaHeñ C rjiyÖHHHblMH 3JieKTpOHaMH II IIX II30JIIip0BaHHII B ueHrpa.ii.Hüil HepBHOñ cHCTeMe

207—216

17 amoAozuH r . B e K e M e i i e p H B . P y M J i e p : 0 5 oc"rpo;í TOKCIHIHOCTII II H H value of the medium. B E C K I N G [ 2 ] has shown that ammonia uptake was, however, accompanied by an increase in the hydrogen ion concentration of the medium. It is possible then that the hydrogen ions originate by exchange for ammonia ions absorbed from the medium. The steeper drop in the />H value of the medium containing ammonium sulphate than that which contained ammonium nitrate may be in all probability caused by the accumulation of the sulphate ion, the mechanism by which it influenced the of the medium is not clear. When the fungus was grown on media containing sucrose and nitrate-nitrogen, high keto acid production occured. That such high keto acid production was possibly associated with the presence of nitrite in the fungal tissue could be seen from the results of experiment II where absorption and utilization of 3 mg of nitrite-nitrogen resulted in the production of the highest amount of keto acids by the fungus. These results, therefore, seemed to substantiate, experimentally, the suggestion of W I R T H and N O R D ( 1 9 4 2 ) for the relation between nitrate utilization and keto acid production by the fungal mats. In the present work the fungal mats showed increasing rates of carbon dioxide output when the experimental inorganic nitrogen sources were added to the basal medium. It has been shown by STRAUSS [15] that aerobic oxidation with exogenous substrate is generally markedly increased if a source of nitrogen is provided. This, of course, converts the preparation at least potentially to a growing culture carrying on amino acid or even protein synthesis with evident demand upon energy and upon metabolic interme-

N-metabolism of Fusarium oxysporum

125

diätes of citric acid cycle. H A R H A S H [8] using the same experimental fungus showed that nitrate uptake is accompanied by the synthesis of protein, while B U D D andHARLEY [3] demonstrated that ammonia uptake by Neoc o s m o s p o r a v a s i n f e c t a is accompanied by the synthesis of a variety of organic nitrogen compounds. Experiment II revealed that feeding with 3 rng nitrate-nitrogen induced higher production of carbon dioxide than with 30 mg. This might be attributed to the accelaration of other processes in the presence of the small dose. On the other hand, although feeding with 3 mg of nitrite- or nitrate-nitrogen produced more or less equal increase in the fresh weight of the fungus, yet the rate of carbon-dioxide production in the presence of nitrate was much faster than in the presence of nitrite, particularly in the second 24 hours of the experiment. This might be due to the retardation of some processes in the fungus due to the presence of the nitrite nitrogen. Acknowledgement One of us (A.W.H.) expresses his sincere gratitude to Prof. Dr. S. RAPOPORT, director of the Institute for Physiological Chemistry, Humboldt University, Berlin, for valuable discussion during writing this work References [1] APPARAO, A . : E x p e r i e n t i a [ B a s e l ] 1 2 , 2 1 5 ( 1 9 5 6 ) .

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Der Einfluß

verschiedener

anorganischer Stickstoffquellen auf die Kohlendioxidabgabe und Ketosäureproduktion von Fusarium oxysporum Die höchste Aufnahme und Verwertung von Stickstoff durch die Pilzmyzelien liegt bei Gabe von Ammoniumstickstoff zum Medium vor. Natriumnitrit konnte in geringen Konzentrationen von den Pilzmyzelien aufgenommen und verwertet werden, erwies sich jedoch in relativ hohen Konzentrationen als toxisch.

H . SAID, M . F . S. E L - H A W A R Y , A . W .

126

HARHASH

Eine hohe Ketosäureproduktion durch die Pilzmyzelien war immer bei Verabreichung von N i t r i t oder N i t r a t als Stickstoffquelle zu verzeichnen, wobei N i t r a t vor seiner Assimilation wahrscheinlich zu Nitrit reduziert wird. Pe3MMe X . 3 a f t n , M. . C. 3 J I - X a B a p H

H

A. B. X a p x a r n :

BJIHHHNE

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opraHH^ECKHX HCTOHHHKOB a30Ta Ha OTHaiy aByoKHcii y r j i e p o n a H np0H3B0CTB0

KeTOKHCJiOTfci y F u s a r i u m oxysporum MaKCHMajibHoe norJiomeHHe H Hcn0Jib30Bamie a30Ta MHijejiHHMH HaSjnonajiocb n p n noßaBJieHHH k cpene HHTpaTa aMMOHHH. H H T P H T HaTpnn B H H 3 K H X KOHijeHTpaijHHX npHHHMaeTCH H Hcnojib3yeTCH ivinne JIHHMH , Torna KaK BbicoKHe KOHqeHTpaqHH OKa3ajiH TOKCHiecKoe neftcTBHe. ILPHßABJIEHHE HHTpHTa HJIH HHTpaTa B KanecTBe HCTOiHHKa a30Ta Bcerna npnBejio K BblCOKOMy npOH3BOHCTBy MHqejIHHMH KeTOKHCJIOTbl, IipHHeM HHTpaT BHHHMO BOCCTAHABJIHBAETCH B H H T P H T no ero accHMHJIHHHH.

Acta biol. med. german., Band 17, Seite 127 — 134 (1966) Cairo University, Faculty of Science, Botany Department

Sucrose and Nitrate Absorption and Assimilation in Relation to Growth, Respiration and Keto Acid Production by Spores of F u s a r i u m o x y s p o r u m H . SAID a n d A . W . HARHASH

(Received 23- 8. 1965)

Summary The results show that although the fungal spores did not make use of the sucrose in the media during the first day, yet they apparently hydrolysed a good deal of this sucrose in the external medium. High keto acid production by the fungal spores was associated with active absorption and utilization of sugar and nitrate though not proportionately. The results revealed complete absence of any nitrogen excretion from the mats, thus indicating that all the nitrate nitrogen absorbed was utilized by and maintained in the fungal mats. Introduction According to L O C K W O O D and co-workers [6] certain genera of fungi are unable to utilize nitrate as a source of nitrogen. On the other hand, W I R T H and N O R D [ 1 2 ] have shown that Fusarium lini usually utilizes nitrate- in preference to ammonium-N; and nitrite is produced as a result of nitrate reduction and may be accumulated in the culture media under certain conditions. Furthermore, these authors have attributed the accumulation of pyruvic acid in the nitrate media to the presence of nitrite which inactivates the carboxylase system. M A N D E L S [7], [8] working on Myrothecium verrucaria, suggests phosphorolytic breakdown of sucrose before its absorption and utilization even so high invertase activity is shown. So far as the authors are aware, sucrose phosphorylase has so far been found only in bacterial sources. Thus, D O U D O R O F F , K A P L A N , and H A S S I D [2] have prepared such an enzyme from the dried cells of Pseudomonas saccharophila. Sucrose has been used as the carbon source in the culture media of Fusarium oxysporum in the present investigation. The authors have, therefore, seized this opportunity and have studied its mode of absorption by this fungus.

The aim of the present experiments was to follow the mode of absorption of the sucrose by the fungal spores of Fusarium oxysporum. The experiments also aimed at following the successive stages of nitrate absorption and assimilation by these spores in relation to carbon dioxide output and keto acid production.

Acta biol. med. german., Band 17, Seite 127 — 134 (1966) Cairo University, Faculty of Science, Botany Department

Sucrose and Nitrate Absorption and Assimilation in Relation to Growth, Respiration and Keto Acid Production by Spores of F u s a r i u m o x y s p o r u m H . SAID a n d A . W . HARHASH

(Received 23- 8. 1965)

Summary The results show that although the fungal spores did not make use of the sucrose in the media during the first day, yet they apparently hydrolysed a good deal of this sucrose in the external medium. High keto acid production by the fungal spores was associated with active absorption and utilization of sugar and nitrate though not proportionately. The results revealed complete absence of any nitrogen excretion from the mats, thus indicating that all the nitrate nitrogen absorbed was utilized by and maintained in the fungal mats. Introduction According to L O C K W O O D and co-workers [6] certain genera of fungi are unable to utilize nitrate as a source of nitrogen. On the other hand, W I R T H and N O R D [ 1 2 ] have shown that Fusarium lini usually utilizes nitrate- in preference to ammonium-N; and nitrite is produced as a result of nitrate reduction and may be accumulated in the culture media under certain conditions. Furthermore, these authors have attributed the accumulation of pyruvic acid in the nitrate media to the presence of nitrite which inactivates the carboxylase system. M A N D E L S [7], [8] working on Myrothecium verrucaria, suggests phosphorolytic breakdown of sucrose before its absorption and utilization even so high invertase activity is shown. So far as the authors are aware, sucrose phosphorylase has so far been found only in bacterial sources. Thus, D O U D O R O F F , K A P L A N , and H A S S I D [2] have prepared such an enzyme from the dried cells of Pseudomonas saccharophila. Sucrose has been used as the carbon source in the culture media of Fusarium oxysporum in the present investigation. The authors have, therefore, seized this opportunity and have studied its mode of absorption by this fungus.

The aim of the present experiments was to follow the mode of absorption of the sucrose by the fungal spores of Fusarium oxysporum. The experiments also aimed at following the successive stages of nitrate absorption and assimilation by these spores in relation to carbon dioxide output and keto acid production.

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H . SAID, A . W .

HARHASH

Material and method The inoculum of the fungal spores was homogeneously destributed in the SO ml Doxs liquid medium (containing 6 % sucrose and 0.4% sodium nitrate). Two flasks were immediately removed and the media were filtered and then analysed for their initial pH value, sugar and nitrogen contents. The remaining flasks were incubated at 25 °C for nine days during which the carbon dioxide outputs by the growing fungus, its dry weight and nitrogen content were determinded every day starting from the third day. In the meantime all the culture media were analysed for their pii values, sugar, nitrogen as well as keto acid contents every day. Carbohydrate

analysis

For sucrose determination, an aliquot sample of the solution was hydrolysed in 0,5 N HC1 solution at 60 °C for half an hour, at the end of which the solution was neutralised to phenol red, made up to volume, and then its reducing power was determined, using the direct reducing method of S C H A F F E R and H A R T M A N N [1 O] after being modified by M A S K E L L and co-workers (unpublished work). In order to determine the total hexoses content, an aliquot sample was taken and its direct reducing value (D.R.V.) was determined by the previous method. Nitrogen

analysis

The technique for extraction of the dried mycelial mats and the method for the determination of the various nitrogen fractions have been standardized by S A I D and coworkers and have been commonly used in their laboratory since 1940. Keto acid

determination

For determination of keto acids in the culture media or the fungal mats and the identification of each individual keto acid the technique described by the author in a previous work ( H A R H A S H [ 5 ] ) was adopted. Carbon dioxide

estimation

For determination of carbon dioxide output by the fungal mats the method described by H A R H A S H [4] was used. Results

Analysis of the media f H value The -pH value of the initial culture media remained unchanged in the first two days after which it showed a gradual and steady rise up to the ninth day (Table 1). Such rise in the value of the media was most probably correlated with the rapid absorption of the nitrate ion by the growing fungus leaving the sodium ions in the external medium. Table 1 Changes in the pH values of the culture media p~R value after days 2

5-5

5-5

3

4

5

6

7

8

9

6.2

6.6

6.9

7-1

7-6

7-8

00

5-5

1

LO

Initial

Sucrose and nitrate metabolism of Fusarium oxysporum

129

Sugar analysis It appears clearly from fig. 1 that the media started with no D.R.V., but by the end of the first day reducing sugars appeared and continued to accumulate in the culture media up to the end of the fifth day. After that a steady decline in the D.R.V. took place till the end of the experiment. On the other hand, the drift in the total reducing value showed an insignificant decrease in the first day after which a steady decline ensued up to the sixth day and the decline slowed down in the last three days of the experiment. This decline in the T.R.V. indicated sugar absorption by the growing fungus. It is very interesting to note here that although the fungal spores did not make use of the sucrose in the media during the first day, yet they apparently 2 3 4 5 6 7 hydrolysed a good deal of this sucrose TIME IN DAYS in the external medium. After the first Fig. 1. Analysis of the sugar in the day more sucrose was apparently hy- different culture media (calculated as drolysed in the culture media and the grams glucose per 50 ml medium). fungal spores started to make use of the D.R.V. = direct reducing value; T.R.V. = total reducing value sugar in their media presumably from the hydrolysis products of sucrose. The results of the present experiment seemed to point that sucrose hydrolysis in the culture media of the fungal spores was faster than and preceded sugar absorption and by the end of the fifth day all the sucrose of the media was hydrolysed and the rate of sugar absorption from the hydrolysis products was the same as during the previous days where unhydrolysed sucrose still existed in the culture media. Sugar uptake I t appears from table 2 that no sugar uptake took place in the first day; the fungal spores being too small to make use of any measurable amount of Table 2 Sugar utilization (Calculated as grams glucose per mat) Time after 1st Total sugar utilized Sugar utilized per day

2nd

3rd

3th

5th

6th

7th

8th

9th day

0.32

0.62

0.87

1.12

1.35

1.50

1.57

1-77

0.32

0.30

0.25

0.25

0.23

0.15

0.17

0.10

130

H . SAID, A . W .

HARHASH

sugar. From the second day onwards the fungal spores apparently started germination and growth and hence their continued absorption of a more or less the same amount of sugar till the end of the sixth day after which the rate of sugar absorption showed decline till the ninth day of the experiment presumably because the fungal mat reached a state of maturity and protoplasmic constancy. K e t o acid analysis Preliminary analysis of fungal spores grown onDoxs liquid medium showed the presence of hardly detectable amounts of keto acids in the fungal mats. The present experiment was, therefore, designed in such a way that only keto acids recovered in the culture media were determined. The results recorded in table 3 showed that the fungal spores produced a small amount of keto acids during the first day of their growth on theDoxs liquid medium. This small keto acid production was produced during the germination of the spores at the expense of their initial carbohydrate content since they did not absorb any sugars during this period. From the second up to the fifth day of the experiment the germinated fungal spores absorbed and utilized a good deal of sugar and nitrate-nitrogen from their media and hence the observed relatively high production of keto acids, the rate of production decreasing until the fifth day when 9-22 mg pyruvic acid per 50 ml medium were recovered in the external medium. Table 3 Keto acids recovered in the media ' (Calculated as mg pyruvic acid per 50 ml medium) Time after

Total keto acids recovered in the media Keto acids formed per day

1st

2nd

3rd

4th

5th

6th

7th

8th

9th day

0.73

3-60

6.15

7-65

9.22

9.22

9.16

8.09

7-06

0.73

2.87

2.55

1.50

1-57

0.00 - 0 . 0 6 -0.07

-1.04

Nitrogen uptake The results recorded in table 4 showed that nitrate uptake was rather slow during the first two days presumably because the fungal spores were germinating and just beginning to form the mycelium. After the second day the mycelium was apparently actively growing and hence the observed rapid and steady rate of nitrogen uptake which was necessary for the building up of the protoplasm of the newly formed hyphae. This continued till the seventh day after which the fungal mat seemed to have reached maturity

Sucrose and nitrate metabolism of Fusarium oxysporum

and hence the observed drop in the amount of nitrate-nitrogen absorbed which was apparently used for maintenance of protoplasmic constancy. Analysis of these culture media for detection of any other form of nitrogen revealed complete absence of any nitrogen excretion from the mats, thus indicating that all the nitrate nitrogen absorbed was utilized by and maintained in the fungal mats. Table 4 Analysis of the media for nitrate-nitrogen (Calculated as mg nitrogen per SO ml medium i.e. per mat) Time after

Total uptake U p t a k e per day

Analysis

1st

2nd

3rd

4th

5th

6th

1.00 1.00

1.80 0.80

4.00 2.20

6.00 2.00

8.10 2.10

9-70 1.60

of the fungal

7th

8th

11.90 13-00 2.20 1.10

9th day 14.20 1.20

mats

Nitrogen analysis The inoculum containing the fungal spores used, in the present experiment was too small to be analysed for its initial nitrogen content. In fact even after growing these spores on the Dox's liquid medium for two days, it was still difficult to drain and extract the produced mycelium for analysis. The latter was, therefore, carried out starting from the end of the third up to end of the ninth day of the experiment. The growing fungal spores never produced any significantly appreciable amounts of nitrate-, ammonia- or amidenitrogen throughout the whole experimental period. Table 5 reveals that, "peptide"- and protein-nitrogen contents of the growing fungal mats showed continued increase up to the seventh day. The rate of protein formation being slower than that of peptide formation during the third and fourth days. From the fourth up to the ninth day of the experiTable 5 Tissue analysis of the growing fungal spores (Calculated as mg N per mat) Analysis after [time in hours]

Amino-N

leptide-N

Total soluble-N

Protein-N

Total-N

72 96 120 144 168 192 216

0.56 0.92 1.03 I.17 1.40 I.34 1.40

1.84 2.98 3-38 3-74 4.98 4.60 4.72

2.45 4.00 4.56 5.11 6.63 6.24 6.42

1.56 2.07 3-55 4.59 5-35 6.81 7-97

4.01 6.07 8.11 9.70 11.98 13.05 14.39

132

H . SAID, A . W .

HARHASH

ment the rate of protein formation became faster than that of "peptide" formation and hence the continued increase in the protein-nitrogen content concurrent with decrease in peptide-nitrogen content during the last two days of the experiment. D r y w e i g h t s of t h e f u n g a l m a t s The average dry weights of the duplicate mats are represented graphically in fig. 2. It appears that the fungal spores grew more or less exponentially; slow at first then increasing rapidly at a decreasing rate until the seventh day. After the seventh day the fungal mats apparently reached a state of maturity and protoplasmic constancy and hence the observed constant dry weight, till the end of the experiment.

Fig. 2. Dry weights of the growing fungal spores (in mg)

Carbon dioxide output A glimpse at fig. 3 would show that the rate of carbondioxide output by the growing fungal spores increased very steeply during the first 3 days and then slowed down until it reached its maximum during the fifth day which was then maintained constant till the ninth day of the experiment.

1

2

3 4 5 TIME IN

DAYS

6

7

8

9

Fig. 3. Carbon dioxide outputs by the fungal mats in the different media (Calculated as mg COa per mat) Discussion

The results of this investigation revealed that nitrate-nitrogen that was absorbed by spores or fungal mats of Fusarium oxysporum rapidly disappeared in the fungal tissues with a corresponding increase in amino-, peptide^

Sucrose and nitrate metabolism of Fusarium oxysporum

133

and protein-nitrogen. This indicated that the nitrates were apparently first reduced and, in the presence of carbon skeleton from the carbohydrate metabolism, were transformed into amino acids; the latter being subsequently synthesized into peptide and proteins. The growing fungal spores always produced during the metabolism some keto acids which were always excreted into the culture media of the fungus. The produced keto acids were indentified, by chromatographic analysis, to be pyruvic and a-ketoglutaric acids; the former forming the major component. Since these keto acids were possible components of aerobic carbondioxide production by the fungal mats, then it is probable to suggest that Fusarium oxysporum respired aerobically by means of a system similar to the well known tricarboxylic acid cycle. Under shortage or absence of sugar supply the keto acids produced in the medium might be absorbed and utilized by the fungal mats. The results revealed that Fusarium oxysporum always hydrolysed sucrose in the culture media apparently before its absorption. The rate of sucrose inversion was always greater than the rate of sugar absorption and hence the appearance and accumulation of reducing sugars in the sucrose culture media. It can also be definitely stated here that no enzyme was ever detected in the culture media that could invert sucrose when the fungal mats were removed. Sucrose inversion therefore, seemed to take place by means of invertase centres situated at the cytoplasmic surfaces of the fungal mats. Such surface-located enzyme systems have been invoked to explain sugar absorption by fungal tissues [1], [9], [11]. The respiration of the growing fungal spores usually increased very rapidly to a maximum which was reached in about 4 days and after that this maximum was maintained for the next five days (c.f. morphological studies on the fungus by the author; H A R H A S H [ 3 ] ) . It seems therefore, that during the first 4 days of the experiment the growing fungal spores were rapidly building up the mycelial hyphae and the necessary respiratory enzyme system. After the fourth day, though the mycelium was increasing its dry weight, yet the latter was not apparently accompanied by increase in the respiratory enzyme system and hence the observed constancy in the rate of carbon dioxide output per mat. Acknowledgement One of us ( A . W . H . ) acknowledges his gratitude to Professor Dr. S . R A P O P O R T , director of the Physiological Chemistry Institute, Humboldt University, Berlin, for helpful suggestions during writing this work References [1]

CIRILLO,

[2]

DOUDOROFF,

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Acta biol. med. german., Heft 2

148,

67

134 [5]

H . SAID, A . W .

HARHASH

A. W.,: Acta biol. med. german. 1 7 , 8 (1966). and O . E . M A Y : J . agric. Res. 5 3 , 8 4 9 ( 1 9 3 6 ) . [ 7 ] M A N D E L S , G. R.: Amer. J . Bot. 3 8 , 2 1 3 ( 1 9 5 1 ) . [ 8 ] M A N D E L S , G. R.: Plant Physiol. 2 9 , 1 8 (1954). [9] S A I D , H., and K. N A G U I B : Bull. Fac. Sei. Fouad I Univ., Cairo (1953). [ 1 0 ] S C H A F F E R , L . A . and A . F . H A R T M A N N : J . biol. Chemistry 4 5 , 3 4 9 ( 1 9 2 1 ) . [ 1 1 ] W A L S H , J . H . and J . L. H A R L E Y : New Phytologist 6 1 , 2 9 9 ( 1 9 6 2 ) . [12] W I R T H , J . C., and F. F. N O R D : Arch. Biochem. Biophysics 1, 143 (1942). HARHASH,

[6] LOCKWOOD, L . B . , G . E . W A R D

Zusammenfassung und A. W. H A R H A S H : Aufnahme und Assimilation von Saccharose und Nitrit in Beziehung zu Wachstum, Atmung und Ketosäureproduktion durch Sporen von Fusarium oxysporum H . SAID

Pilzsporen nehmen am ersten Tag keine Saccharose auf, hydrolysierten jedoch einen beträchtlichen Teil des Zuckers des Mediums. Eine aktive Aufnahme und Verarbeitung von Zucker und Nitrat führte, wenn auch nicht proportional, zu einer hohen Ketosäureproduktion durch die Pilzsporen. Aus den Myzelien werden keine Stickstoffverbindungen ausgeschieden; der gesamte absorbierte Nitratstickstoff wird von den Pilzmyzelien verbraucht. Pe3H»Me X . 3 a f l n H A. B. X a p x a m : IIorjiomeHHe H accHMHjramiH caxapo3bi H mrrpHTa B OTHOiueHHH K pocTy, HbixaHHK» H np0H3B0HCTBy KeTOKHCJiOTbi iimopaMH Fusarium oxysporum BaKTepnajibHbie rnnopbi He norjioiyajiH caxapo3bi B nepBLiö aeHb. OnHaKO, THHpojiH3yeTCH 3HaHHTejibHaH nacTb caxapa cpenbi. A K T H B H O B norJiomeHiie H noTpeöJieHHe caxapa H HHTpaTa npHBeno, X O T H He nponopunoHajibHo, K BbicoKOMy np0H3B0HCTBy mnopaMH KeTOKHCJiOTbi. A 3 0 T H b i e C O e n H H e H H H H3 M H I i e j I H e B He BLinejIHIOTCH; Becb n O r j I O m e H H b l t t H H T p a T HblÜ a 3 0 T n O T p e Ö J I H e T C H MHIiejIHHMH.

Acta biol. med. german., B a n d 17, Seite 135 — 144 (1966) Cairo University, F a c u l t y of Science, B o t a n y D e p a r t m e n t

Comparative Study of the Effect of Nitrate and Amino Acid-Nitrogen on the Respiration, Keto Acid Production and Nitrogen Metabolism of Fusarium oxysporum H . SAID a n d A. W .

HARHASH

(Received 23. 8. 1965) Summary T h e results showed t h a t alanine seemed t o be absorbed and utilized b e t t e r t h a n phenylalanine, leucine, aspartic acid or nitrate nitrogen. H i g h keto acid production b y t h e fungal m a t s was always associated with feeding with sodium n i t r a t e as a source of nitrogen. Sucrose was always hydrolysed in t h e culture media a t t h e cytoplasmic surfaces of t h e fungal m a t s before sugar absorption. Carbon dioxide production b y t h e fungal m a t s was stimulated in the presence of sugar alone or plus nitrogen sources. Sodium n i t r a t e and alanine induced highest stimulation. Introduction Of t h e v a s t n u m b e r of organic compounds which contain nitrogen, those of interest in fungal nutrition are usually such t h a t are essential for protein synthesis. T h u s A N D E R SON and E M M A R T [ 1 ] have reported t h a t L-leucine and L-aspartic acid do not stimulate t h e metabolism of Fusarium o x y s p o r u m ; L-aspartic acid is utilized in while leucine retards carbon dioxide production. F R E D E R I C K [5] working with tobacco wilt F u s a r i u m has proved t h a t good growth can be obtained on media containing aspartic or /3-alanine as t h e nitrogen source. I t has now been fairly established t h a t amino acids m a y play an i m p o r t a n t role in increasing fungal respiration and sporulation [6], [8], [9], [10]. T h e literature on t h e absorption and utilization of sucrose b y fungi has recently been reviewed b y C I R I L L O [ 3 ] . The release of monosaccharides f r o m sucrose has also been ascribed t o a cell surface activity [13], [14]. S A I D and N A G U I B [9] using Fusarium moniliforme have shown t h a t t h e invertase centres on t h e cytoplasmic surfaces of t h e plants are of furanofructosidase t y p e and not a-glucosidase since t h e y can hydrolyse sucrose b u t n o t maltose.

The present work was designed to compare the nitrogen absorption and utilization as well as keto acid production consequent to feeding with various amino acids. Material and Method The fungus used in t h e present work was a F u s a r i u m oxysporum isolated by the a u t h o r ( H A R H A S H ) f r o m t h e E g y p t i a n soil a t Giza and identified b y Dr. W . L. G O R D O N of t h e University of Manitoba, Canada. 10*

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Comparative Study of the Effect of Nitrate and Amino Acid-Nitrogen on the Respiration, Keto Acid Production and Nitrogen Metabolism of Fusarium oxysporum H . SAID a n d A. W .

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(Received 23. 8. 1965) Summary T h e results showed t h a t alanine seemed t o be absorbed and utilized b e t t e r t h a n phenylalanine, leucine, aspartic acid or nitrate nitrogen. H i g h keto acid production b y t h e fungal m a t s was always associated with feeding with sodium n i t r a t e as a source of nitrogen. Sucrose was always hydrolysed in t h e culture media a t t h e cytoplasmic surfaces of t h e fungal m a t s before sugar absorption. Carbon dioxide production b y t h e fungal m a t s was stimulated in the presence of sugar alone or plus nitrogen sources. Sodium n i t r a t e and alanine induced highest stimulation. Introduction Of t h e v a s t n u m b e r of organic compounds which contain nitrogen, those of interest in fungal nutrition are usually such t h a t are essential for protein synthesis. T h u s A N D E R SON and E M M A R T [ 1 ] have reported t h a t L-leucine and L-aspartic acid do not stimulate t h e metabolism of Fusarium o x y s p o r u m ; L-aspartic acid is utilized in while leucine retards carbon dioxide production. F R E D E R I C K [5] working with tobacco wilt F u s a r i u m has proved t h a t good growth can be obtained on media containing aspartic or /3-alanine as t h e nitrogen source. I t has now been fairly established t h a t amino acids m a y play an i m p o r t a n t role in increasing fungal respiration and sporulation [6], [8], [9], [10]. T h e literature on t h e absorption and utilization of sucrose b y fungi has recently been reviewed b y C I R I L L O [ 3 ] . The release of monosaccharides f r o m sucrose has also been ascribed t o a cell surface activity [13], [14]. S A I D and N A G U I B [9] using Fusarium moniliforme have shown t h a t t h e invertase centres on t h e cytoplasmic surfaces of t h e plants are of furanofructosidase t y p e and not a-glucosidase since t h e y can hydrolyse sucrose b u t n o t maltose.

The present work was designed to compare the nitrogen absorption and utilization as well as keto acid production consequent to feeding with various amino acids. Material and Method The fungus used in t h e present work was a F u s a r i u m oxysporum isolated by the a u t h o r ( H A R H A S H ) f r o m t h e E g y p t i a n soil a t Giza and identified b y Dr. W . L. G O R D O N of t h e University of Manitoba, Canada. 10*

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Comparative Study of the Effect of Nitrate and Amino Acid-Nitrogen on the Respiration, Keto Acid Production and Nitrogen Metabolism of Fusarium oxysporum H . SAID a n d A. W .

HARHASH

(Received 23. 8. 1965) Summary T h e results showed t h a t alanine seemed t o be absorbed and utilized b e t t e r t h a n phenylalanine, leucine, aspartic acid or nitrate nitrogen. H i g h keto acid production b y t h e fungal m a t s was always associated with feeding with sodium n i t r a t e as a source of nitrogen. Sucrose was always hydrolysed in t h e culture media a t t h e cytoplasmic surfaces of t h e fungal m a t s before sugar absorption. Carbon dioxide production b y t h e fungal m a t s was stimulated in the presence of sugar alone or plus nitrogen sources. Sodium n i t r a t e and alanine induced highest stimulation. Introduction Of t h e v a s t n u m b e r of organic compounds which contain nitrogen, those of interest in fungal nutrition are usually such t h a t are essential for protein synthesis. T h u s A N D E R SON and E M M A R T [ 1 ] have reported t h a t L-leucine and L-aspartic acid do not stimulate t h e metabolism of Fusarium o x y s p o r u m ; L-aspartic acid is utilized in while leucine retards carbon dioxide production. F R E D E R I C K [5] working with tobacco wilt F u s a r i u m has proved t h a t good growth can be obtained on media containing aspartic or /3-alanine as t h e nitrogen source. I t has now been fairly established t h a t amino acids m a y play an i m p o r t a n t role in increasing fungal respiration and sporulation [6], [8], [9], [10]. T h e literature on t h e absorption and utilization of sucrose b y fungi has recently been reviewed b y C I R I L L O [ 3 ] . The release of monosaccharides f r o m sucrose has also been ascribed t o a cell surface activity [13], [14]. S A I D and N A G U I B [9] using Fusarium moniliforme have shown t h a t t h e invertase centres on t h e cytoplasmic surfaces of t h e plants are of furanofructosidase t y p e and not a-glucosidase since t h e y can hydrolyse sucrose b u t n o t maltose.

The present work was designed to compare the nitrogen absorption and utilization as well as keto acid production consequent to feeding with various amino acids. Material and Method The fungus used in t h e present work was a F u s a r i u m oxysporum isolated by the a u t h o r ( H A R H A S H ) f r o m t h e E g y p t i a n soil a t Giza and identified b y Dr. W . L. G O R D O N of t h e University of Manitoba, Canada. 10*

136

H . SAID, A . W .

HARHASH

One-week old fungal mats, previously grown in conical flasks of 500 ccs capacity, each containing 50 ml. Doxs liquid medium were cleared off their old media, washed thoroughly and then two mats were dried at 60 °C and then extracted and analysed for the initial nitrogen fractions. The remaining mats were supplied with fresh Doxs medium supplied with the experimental different nitrogen sources. Immediately after introducing each fungal mat into its respective media two flasks from each treatment were removed, their media were analysed for their initial nitrogen and sugar contents. The remaining flasks were incubated at 25 °C for 48 hours during which the contents of duplicate flasks of each treatment were analysed at 24-hour intervals. Simultaneously duplicate flasks of each treatment were used for determination of the carbon dioxide outputs and keto acid production by the fungal mats. Carbohydrate

analysis

For sucrose determination, an aliquot sample of the solution was hydrolysed in 0.5 n HC1 solution at 60 °C for half an hour, at the end of which the solution was neutralised to phenol red, made up to volume, and then its reducing power was determined, using the direct reducing method of S C H A F F E R - H A R T M A N N [ 1 1 ] with the modification by M A S K E L L and co-workers (unpublished work). In order to determine the total hexose content, an aliquot sample was taken and its direct reducing value (D.R.V.) was determined by the previous method. Nitrogen

analysis

The technique for extraction of the dried mycelial mats and the method for the determination of the various nitrogen fractions have been commonly used in our laboratory since 1940. Keto acid

determination

For determination of keto acids in the culture media or the fungal mats, the technique previously described by the author in a previous work ( H A R H A S H [7]) was adopted. Carbon dioxide

estimation

For determination of carbon dioxide output by the fungal mats the method used by [7] was adopted.

HARHASH

Results Analysis

of the

media

fiQ ' v a l u e F e e d i n g w i t h a n y of t h e n e u t r a l a m i n o acids (alanine, p h e n y l a l a n i n e or leucine) i n d u c e d a s t e e p drop in t h e ^ H v a l u e in t h e first 2 4 h o u r s ( T a b l e 1). D u r i n g t h e s e c o n d 2 4 h o u r s of t h e e x p e r i m e n t n o f u r t h e r drop was o b s e r v e d in t h e fi~ii v a l u e in t h e m e d i a c o n t a i n i n g alanine, t h e drop b e i n g c o n t i n u e d m o s t slowly in t h e presence of leucine t h a n in t h e presence of p h e n y l a l a n i n e . I t should b e r e c a l l e d h e r e t h a t t h e presence of leucine, a n d p o s s i b l y a l a n i n e a n d p h e n y l a l a n i n e , in p l a n t c u l t u r e m e d i a c o n t a i n i n g sugar m i g h t i n d u c e f o r m a t i o n of acids such as gluconic a c i d w h i c h would b e responsible, a t l e a s t p a r t l y , for t h e drop of v a l u e of such m e d i a .

Sugar and N-metabolism of Fusarium oxysporum

I37

Table 1 Changes in the pH values of the various culture media Treatment

—N D o x — N Dox —N D o x —N D o x —N D o x

+ + -)+ +

sodium nitrate alanine phenylalanine leucine aspartic acid

pH value initial

after 24 hours

S-SO 5.50 5.50 S-50 3.30

after 48 hors

5-60 4.40 4.40 4.10 3-65

5-80 4.55 3-35 3-80 3-30

Addition of aspartic acid to the culture medium lowered the initial -pH value from 5-5 to 3-3- The pH. value of these media showed a slight rise in the first 24 hours after which'it dropped back to the initial value. Sucrose inversion and a b s o r p t i o n Analysis of the various culture media revealed the presence, in all the media, of a good deal of reducing sugars (hexoses). It could be seen from figure 1 that all the culture media showed a continued drop in their T.R.V. indicating sugar utilization by the fungal mats. During the first 24 hours of the experiment the greatest drop in the T.R.V. was in the sucrose media containing sodium nitrate or alanine and the smallest drop was in the media containing no nitrogen or leucine; the media containing phenylalanine or aspartic acid showing intermediate drop. On the other hand, during the second 24 hours the drop in the T.R.V. 0,60 of the various media was in the following order; + alanine > 0,70 + nitrate > — N > phenylala•-Ô V i - . nine > aspartic > leucine. 0,60

¿

0,50 0,40 Fig. 1. Analysis of the sugar in the different culture media (calculated as grams glucose per SO ml medium). D . R . V . = direct reducing value; T . R . V . = total reducing value. = N Dox; = nitrate; — • = alanine; — • • — = phenylalanine; = leucine; = aspartic acid

0,30 0,20 0,10

>

è

>;//// • *w \ # ¡ l ' y

'

1

1 24 TIME IN

\\

HOURS

4B

138

H . SAID, A . W .

HARHASH

In all the sucrose media the D.R.V. increased very steeply in the first 24 hours; the highest being shown in the media containing aspartic acid, the D .R.V. of the oth ermedia is in the following descending order: + phenylalanine, + alanine, + nitrate, + leucine and finally — nitrogen. During the second 24 hours the remaining sucrose in the various culture media was apparently completely inverted so that by the end of the experimental period all the sugar contents of the various media were in the form of reducing sugars. SAID [9] showed that the sum of the amount of sugar absorbed by the plant tissue and the D.R.V. estimated in the culture media at any time would give an estimate of the total sucrose inversion at the cytoplasmic surfaces of the plant tissue at that time.

Fig. 2. Average amounts of sucrose inverted in the culture media (in grams per 50 ml medium).

24 TIME IN

HOURS

= -N Dox; nitrate; — . — = alanine; — •• — = phenylalanine; = leucein; = aspartic acid

Figure 2 shows that in all the culture media the sucrose inversion was faster in the first than in the second 24 hours of the experiment. This result might be attributed at least partly to the drop in the concentration of the uninverted sucrose in those culture media. In this connection it may be mentioned that SAID and NAGUIB [8] showed that the fungus Fusarium moniliforme produced in its sucrose culture media some staling products which had a retarding effect on the activity of the enzyme concerned with the sucrose inversion and this might also be additional reason for the drop in the rate of sucrose inversion in the second 24 hours. It is interesting to note here that the drifts in the rates of sucrose inversion were not in line with the drifts in the sugar uptake from the various culture media thus indicating that the two processes were rather independent of each other and that each treatment might effect then differently. The fact that sucrose inversion always proceeded much faster than sugar absorption by the mats lead to the suggestion that sugar absorption was in all probability from the inverted products of sucrose andnot from the bigger unhydrolysed sucrose molecules.

Sugar and N-metabolism of Fusarium oxysporum

139

Nitrogen uptake Table 2 shows that the greatest nitrogen absorption during this period was from alanine and the smallest from aspartic acid where the nitrogen uptake was almost equal to that from the nitrate-nitrogen during the same period ; uptake from phenylalanine- and leucine-nitrogen being only slightly higher than from the latter. Table 2 Analysis of the media for nitrate- and amino-nitrogen (calculated as mg N per SO ml medium (i.e. per mat)) Nitrate- or amino-N utilized in

Nitrogen source Nitrate Alanine Phenylalanine Leucine Aspartic acid

1st 48 hours

2nd 24 hours

1.13 5.88

I.27 I.26

1.40 1.10

2.94 0.87

1.30

total 48 hours 2.40 7.14

—

—

.4.34 1-97

During the second 24 hours the highest absorption was still from alanine and the lowest from aspartic acid. On the other hand, the mats supplied with phenylalanine as a source of nitrogen seemed to have excreted in the second 24 hours of the experiment the small amount of amino-nitrogen which was absorbed during the first 24 hours, so that by the end of the experiment the amino-nitrogen content of those media became exactly the same as that of the initials at the beginning of the experiment. Excreted nitrogen from the fungal mats Nitrogen analysis of the various culture media revealed the occurrence of other forms of nitrogen, "peptide"-nitrogen, than those initially added to the basal media. Table 3 Peptide-nitrogen recovered in the media (calculated as mg N per 50 ml medium (i.e. per mat)) Treatment

Amounts of peptide-N recovered during 24 hours

—N Dox —N Dox —N Dox —N Dox — N Dox — N Dox

+ + + + +

sodium nitrate alanine phenylalanine leucine aspartic acid

48 hours

0.07 —

2.88 0.10 0.20 1.10

—

I.19

0.80 3.14 0.27

140

H . SAID, A . W .

HARHASH

The presence of alanine in the culture media induced excretion in the first 24 hours of some "peptide"-nitrogen part of which was apparently reabsorbed in the second 24 hours of the experiment (Table 3)- On the other hand, feeding with phenylalanine seemed to induce but slight excretion of "peptide"-nitrogen, the excretion being greater in the second 24 hours. Leucine feeding induced very small "peptide"-nitrogen excretion in the first 24 hours but this excretion increased very steeply during the second 24 hours. Feeding with aspartic acid induced "peptide"-nitrogen excretion which was reabsorbed during the second 24 hours. K e t o acid analysis I t can be seen from table 4 that the production and excretion of the keto acids were mainly during the first 24 hours of the experiment except in the case of the fungal mats grown on media containing nitrate where keto acid production continued throughout the 48 hours of the experiment. Comparison of the total amounts of keto acids excreted into the media revealed that feeding with nitrate nitrogen induced the highest keto acid production ; feeding with various amino acids apparently inducing but little production of such keto acids. Table 4 Keto acids recovered in the culture media (as mg pyruvic acid per 50 ml media) Nitrogen source

Keto acids recovered during 1 st 24 hours

2 nd 24 hours

0.51 3-60 0.92 0.60 1.41 1.35

0.00 2.85 0.16 0.01 0.12 0.00

— N Dox Sodium nitrate Alanine Phenylalanine Leucine Aspartic acid Analysis

of the fungal

total 48 hours 0.51 6.45 1.08 0.61 1-53 1.35

mats

Nitrogen analysis Table 5 shows the amounts of the various nitrogen fractions of the initial as well as the differently treated fungal mats after 24 and 48 hours of the experiment. The fungal mats never produced any significantly appreciable amount of nitrate-, ammonia-, or amide-nitrogen. Although the fungal mats grown on media containing sodium nitrate absorbed some nitrate-nitrogen, yet the latter did not appear in the mat, being presumably reduced and transformed into amino acids in the presence of the large sugar supply. The produced amino acids together with those initially present were apparently partly transformed into "peptide"- and protein-nitrogen.

Sugar and N-metabolism of Fusarium oxysporum

141

Table 5 Nitrogen analysis of the fungal m a t s (calculated as mg nitrogen per mat) Medium

Amino-N

Total soluble-N

Peptide-N

Protein-N

Total-N

Initials Initials

2.85

I

7-39

I

10.54

8.13

18,67

A f t e r 24 h o u r s —N Dox — N Dox + sodium nitrate - N Dox + alanine - N Dox -(-phenylalanine - N Dox +leucine - N Dox + aspartic acid

2.32

6.68

9.30

8.49

18.79

2.24

6.11

8.65

11.22

19-87

2.80

8.32

11.42

10.29

21.71

2.55

3-60

6.45

13.49

19-94

2.35

7.31

9-96

9-99

19-95

2.29

7-77

10.36

8.30

18.66

A f t e r 48 h o u r s - N Dox - N Dox + sodium nitrate - N Dox 4- alanine —N Dox +phenylalanine - N Dox -(- leucine - N Dox -(-aspartic acid

2.24

5-46

8.00

10.74

18.74

1.13

6.17

7-60

13-29

20.89

3.85

7-18

11-33

13-38

24-71

2.18

5-55

8.03

9-88

17.91

2.18

6.02

8.50

11-38

19.88

1.17

4.87

6.34

13-95

Ni;*' 20.29

I

'y

On the other hand, feeding with alanine induced the highest nitrogen uptake, in the first 24 hours, which was apparently almost completely transformed into "peptide"-nitrogen, the latter being partly excreted into the culture media and partly synthesized into protein-nitrogen. During the second 24 hours, however, the utilization of the absorbed alanine-nitrogen was apparently slowed down hence, the observed increase in the ammo-nitrogen content of the fungal mats, protein synthesis continuing at the expense of part of the absorbed amino-nitrogen and also of the "peptide"-nitrogen content of the tissue-medium system. Feeding with phenylalanine, leucine or aspartic acid induced absorption of smaller amounts of amino-nitrogen and apparently accelerated protein synthesis from the "peptide"- and amino-nitrogen fractions. Such protein synthesis continued throughout the 48 hours of the experiment in the presence of leucine and aspartic acid while in the case of phenylalanine feeding

142

H . SAID, A . W .

HARHASH

rapid proteolysis took place during the second 24 hours of the experiment so that by the end of the experiment the protein-nitrogen content of those samples was even less that of the samples fed with minus nitrogen Doxs media. It must be noted here that the pH value of these phenylalanine media dropped very steeply and became highly acidic at the end of the experiment and such high acidity must have been at least partly the cause of this rapid disintegration of the fungal mats. Comparison of the total protein-nitrogen contents of the differently treated fungal mats in relation to the amounts of nitrogen absorbed from the various media would indicate that aspartic acid and sodium nitrate were the most efficient nitrogen sources for protein synthesis in 48 hours. Carbon dioxide o u t p u t It appears from fig. 3 that the rate of respiration was in all the treatments higher in the second than in the first 24 hours of the experiment.

Fig. 3. Carbon dioxide outputs by the fungal mats in the different media, (calculated as mg C 0 2 per mat) = -N Dox; -N Dox + — • — = -N Dox + — • • — = -N Dox = -N Dox + -N Dox +

nitrate; alanine; + phenylalanine; leucine; aspartic acid

11 2i 36 TIME IN HOURS

On feeding with nitrate or alanine gave nearly the same highest rates of respiration throughout the experimental period. It is noteworthy to mention here that the mats fed with nitrate or alanine absorbed the largest amount of sugar from the culture media. Feeding with phenylalanine, leucine or aspartic acid induced rates of respiration which were nearly the same as that given by feeding with minus nitrogen Doxs medium during the first 24hours. During the second 24 hours, however, phenylalanine induced decrease, leucine a slight increase while aspartic acid gave nearly the same respiration rate as that shown by the samples fed with minus nitrogen Doxs medium. Discussion

The results showed that alanine seemed to be absorbed and utilized better than phenylalanine, leucine or aspartic acid. Although less nitrogen was

Sugar and N-metabolism of Fusarium oxysporum

absorbed from the last mentioned amino acid (presumably due to the high acidity), yet it seemed to favour protein synthesis in the fungal mats. Since no ammonia-nitrogen accumulated in the fungal mats or the media containing these different amino acids, it seemed that the latter were either utilized directly in building up peptides and proteins or they might have been transformed, by transaminase systems, into a more suitable form for protein formation. Fusarium oxysporum seemed to produce a relatively small amount of keto acids consequent to feeding with sucrose plus organic nitrogen sources while feeding with nitrate-nitrogen induced the highest keto acid production. This is interesting because it showed that keto acid production was mainly from the sugar metabolism and not from the carbon skeletons of the various amino acids used. In this connection it may be mentioned here that W I R T H and N O R D [ 1 5 ] showed that Fusarium lini oxidatively transformed alanine into pyruvic acid. However, the results of the present work showed that although Fusarium oxysporum absorbed and utilized a good deal of alanine, keto acid production was small and not much different from that obtained in the presence of other amino acids. The results revealed that Fusarium oxysporum always hydrolysed sucrose in the culture media apparently before its absorption. That these reducing sugars were not excreted from the fungal mats could be substantiated by the fact that no sugar of any kind was ever excreted into the control media containing no sugar. It can also be definitely stated here that no enzyme was ever detected in the culture media that could invert sucrose when the fungal mats were removed. Sucrose inversion, therefore, seemed to take place by means of invertase centres situated at the cytoplasmic surfaces of the fungal mats. Such sucrose inversion prior to its utilization was reported by several workers using both higher and lower plant tissues [2], [9]. On the other hand, D O R M E R and S T R E E T [ 4 ] and S T R E E T and L O W E [ 1 2 ] asserted that sucrose was broken down in the culture media of plant tissues before its absorption by means of a phosphorolytic and not hydrolytic mechanism. However, these authors failed to prove the occurrence of such phosphorylase system in their experimental plant tissues. The experiment showed that the presence of alanine highly accelerated sugar utilization by the fungal mats. On the other hand nitrate-nitrogen feeding stimulated sugar utilization only slightly, phenylalanine had practically no effect while leucine and aspartic acid induced slight diminution in sugar utilization. Comparison of the effects of sodium nitrate and the organic nitrogen sources showed that alanine stimulated carbon dioxide output by the fungal mats to almost the same level as sodium nitrate, the other amino acids apparently having very little effect upon the rate of carbon dioxide production; leucine seemed to induce slight carbon dioxide outputs, aspartic acid having no effect. The stimulation of the respiration rate in the presence of the inorgan-

H . SAID, A . W . HARHASH

144

ic nitrogen source was most probably due to the specific "salt respiration". On the other hand, the increased respiration rate in the presence of alanine might be attributed to activation of the respiratory enzymes. Acknowledgement One of us (A.W.H.) wishes to acknowledge the helpful suggestions of Prof. Dr. S. RAPOPORT, Director of the Institute for Physiological Chemistry, Humboldt University, Berlin, during writing this paper References [1] ANDERSON, A . K . a n d K . EMMART: P l a n t P h y s i o l . 9, 8 2 3 ( 1 9 3 4 ) . [2] BÜRSTROM, H . : P l a n t P h y s i o l . 10, 741 ( 1 9 5 7 ) .

[3] CIRILLO, V. P.: Arch. Biochem. Biophysics 48, 55 (1961). [4] DORMER, K . J . a n d H . E . STREET: A n n . B o t . [ R o m a ] 5 0 , 1 9 9 ( 1 9 4 9 ) .

[5] FREDERICK, W . T.: Phytopathology 45, 350 (1955). [6] GOKSSOYR, J . : P l a n t . P h y s i o l . 13, 5 5 9 ( I 9 6 0 ) .

[7] HARHASH, A. W . : Ph. D. Thesis, Cairo University (1958). [8] RAJENDRA, K . a n d R . K . GROVER: N e w P h y t o l o g i s t 63, 12 (1964).

[9] SAID, H. and K. NAGUIB: Bull. Fac. Sei Fouad I Univ., Cairo (1953)[10] SCHWABE, G . : P r o t o p l a s m a [Wien] 16, 396 (1932). [11] [12] [13] [14]

SCHAFFER, L . A . a n d A . STREET, H . E . a n d J . S. TOLBA, M . K . , a n d S. S . WALSH, J . H . a n d J . L .

F . HARTMANN: J . b i o l . C h e m i s t r y 4 5 , 3 4 9 ( 1 9 2 1 ) . LOWE: A n n . B o t . [ R o m a ] 55, 307 (1950). GHANEM: P l a n t P h y s i o l . 12, 3 7 ( 1 9 5 9 ) . HARLEY: N e w P h y t o l o g i s t 61, 299 (1962).

[15] WIRTH, J. C. and F. F. NORD: Arch. Biochem. Biophysics 1, 143 (1942). Zusammenfassung H . SAID und A. W. HARHASH: Vergleichende Untersuchung über den Einfluß von Nitrat- und Aminosäurestickstoff auf Atmung, Ketosäureproduktion und Stickstoffwechsel von Fusarium oxysporum Alanin wird von Myzelien von Fusarium oxysporum besser aufgenommen und metabolisiert, als Phenylalanin, Leuzin, Asparaginsäure oder Nitratstickstoff. Bei Verabreichung von Natriumnitrat als Stickstoff quelle wurde eine hohe Ketosäureproduktion durch die Myzelien erreicht. Saccharose wird vor ihrer Aufnahme aus den Kulturmedien in den zytoplasmatischen Membranen der Myzelien hydrolysiert. Die Kohlendioxydproduktion durch die Myzelien ist in Gegenwart von Zucker allein oder Zucker plus Stickstoffquellen stimuliert. Natriumnitrat und Alanin üben in dieser Hinsicht die stärksten Effekte aus. Pcaiowe X . 3 a ü n H A. B . X a p x a r n : CpaBHHTejibHoe nccjienoBaHHe o BJIHHHHH HHTpaTH O r O a 3 0 T a H a 3 0 T a a M H H O K H C J I O T H a JU>IXaHHe, n p 0 H 3 B 0 A C T B 0

KeTOKHCJIOTbl

H a30THfciM oÖMeH y Fusarium oxysporum MHijejiHH F u s a r i u m o x y s p o r u m jiyqrne norJiomaiOT H iiOTpeßjiHiOT aJiaHHH, n e M $eHHJiaJiaHHH, jieüiiHH, a c n a p a r H H O B y r o KHCJioTy HJIH HHTpaTHbrii a30T. J^oöaBJieHHe H H T p a T a H a T p u n B K a n e c T B e H C T O H H H K a a 3 0 T a npHBejio K B H C O K O M y NPOH3BOACTBY KETOKHCJIOTBI. C a x a p o 3 a RHHPOJIH3YETCH B UHT0NJIA3MATHHECKHX

MeMßpaHax MHiieJineB HO ee norJiomeHHH H3 KyjibTypanbHbix c p e j i .

np0H3B0nCTB0

MHIJEJIHHMH «BYOKHCH y r j i e p o n a CTHMYJMPOBAHO B NPNCYTCTBHH ONHORO

caxapa

HJIH c a x a p a njiioc HCTOHHHKH a30Ta. HnTpaT HaTpnH H ajiaHHH 0Ka3ajiHCb HanÖOJiee 3$(J»eKTHBHbIMH B 3T0M OTHOIHeHHH.

Acta biol. med. german., Band 17, Seite 145 — 159 (1966) Aus dem Physiologisch-chemischen Institut der Karl-Marx-Universität Leipzig (Komm. Direktor: Doz. Dr. W. ROTZSCH)

Der Einfluß von Palmitoylcarnitin auf EHRLiCH-Aszites-Tumorzellen in vitro und in vivo W . - D . THOMITZEK u n d E . STRACK

(Eingegangen am 29- 3- 1966)

Zusammenfassung D,L-Palmitoylcarnitin hemmt Atmung und Glykolyse von EHRLICH-Aszites-Tumorzellen. Der Hemmeffekt ist nicht nur von der zugesetzten Konzentration, sondern auch von der Zellmenge abhängig. Vergleichende Untersuchungen mit Albuminzusatz machen eine feste Bindung von Palmitoylcarnitin an Proteine wahrscheinlich. Abhängig von der Konzentration ist im Bereich von 10"6 bis 10"5 M die Wirkung auf die aerobe Glykolyse mehrphasisch. Die anaerobe Glykolyse, die Fruktolyse und die Glukolyse werden in Gegenwart von 2,4-Dinitrophenol durch Palmitoylcarnitin gehemmt. Der ATP- und NAD-Gehalt in den Zellen wird stark gesenkt. Palmitoylcarnitin besitzt zytolytische Eigenschaften, wie die Freisetzung von Enzymen und Proteinen aus den Zellen beweist. Die hohe Färbbarkeit mit Trypanblau zeigt die Zytotoxizität. Das Tumorwachstum kann durch höhere Dosen stark gehemmt werden, i.p. injizierte kleinste Dosen wirken unter Umständen fördernd. Der Wirkungsmechanismus von Palmitoylcarnitin kann z. T. auf seine oberflächenaktive Wirkungen zurückgeführt werden, da Vergleiche mit verschiedenen Detergentien Analogien erkennen lassen. Einleitung

Eine Reihe von Erkenntnissen der letzten Jahre über die Bedeutung des Carnitins im Stoffwechsel der tierischen Zellen hatte uns dazu geführt, den Einfluß von O-Acylderivaten des Carnitins auf Mäuseaszitestumorzellen zu studieren. Gerade diese Substanzen scheinen tief in die Lebensvorgänge der Zellen einzugreifen. Sie sind physiologische Zwischenstufen beim Umsatz der Fettsäuren in den Mitochondrien, deren Membran sie als Fettsäurekarrier anscheinend passieren können. Der kräftige Dipol in den O-Acylcarnitinen läßt sie fähig sein, andere aktive Stoffe mit Dipolcharakter zu beeinflussen. Weiterhin verändern sie, abhängig von der Kettenlänge der Acyle, die Permeabilität und Stabilität von Zelloberflächen. Besonders von den langkettigen Acylderivaten war zu erwarten, daß sie durch ihr invertseifenähnliches Verhalten sowohl Stoffwechselvorgänge als auch Oberflächen in den Zellen verändern können. Einzelheiten, wie sie uns der Mäuseaszitestumor bietet, scheinen besonders gut für Untersuchungen dieser Art geeig-

Acta biol. med. german., Band 17, Seite 145 — 159 (1966) Aus dem Physiologisch-chemischen Institut der Karl-Marx-Universität Leipzig (Komm. Direktor: Doz. Dr. W. ROTZSCH)

Der Einfluß von Palmitoylcarnitin auf EHRLiCH-Aszites-Tumorzellen in vitro und in vivo W . - D . THOMITZEK u n d E . STRACK

(Eingegangen am 29- 3- 1966)

Zusammenfassung D,L-Palmitoylcarnitin hemmt Atmung und Glykolyse von EHRLICH-Aszites-Tumorzellen. Der Hemmeffekt ist nicht nur von der zugesetzten Konzentration, sondern auch von der Zellmenge abhängig. Vergleichende Untersuchungen mit Albuminzusatz machen eine feste Bindung von Palmitoylcarnitin an Proteine wahrscheinlich. Abhängig von der Konzentration ist im Bereich von 10"6 bis 10"5 M die Wirkung auf die aerobe Glykolyse mehrphasisch. Die anaerobe Glykolyse, die Fruktolyse und die Glukolyse werden in Gegenwart von 2,4-Dinitrophenol durch Palmitoylcarnitin gehemmt. Der ATP- und NAD-Gehalt in den Zellen wird stark gesenkt. Palmitoylcarnitin besitzt zytolytische Eigenschaften, wie die Freisetzung von Enzymen und Proteinen aus den Zellen beweist. Die hohe Färbbarkeit mit Trypanblau zeigt die Zytotoxizität. Das Tumorwachstum kann durch höhere Dosen stark gehemmt werden, i.p. injizierte kleinste Dosen wirken unter Umständen fördernd. Der Wirkungsmechanismus von Palmitoylcarnitin kann z. T. auf seine oberflächenaktive Wirkungen zurückgeführt werden, da Vergleiche mit verschiedenen Detergentien Analogien erkennen lassen. Einleitung

Eine Reihe von Erkenntnissen der letzten Jahre über die Bedeutung des Carnitins im Stoffwechsel der tierischen Zellen hatte uns dazu geführt, den Einfluß von O-Acylderivaten des Carnitins auf Mäuseaszitestumorzellen zu studieren. Gerade diese Substanzen scheinen tief in die Lebensvorgänge der Zellen einzugreifen. Sie sind physiologische Zwischenstufen beim Umsatz der Fettsäuren in den Mitochondrien, deren Membran sie als Fettsäurekarrier anscheinend passieren können. Der kräftige Dipol in den O-Acylcarnitinen läßt sie fähig sein, andere aktive Stoffe mit Dipolcharakter zu beeinflussen. Weiterhin verändern sie, abhängig von der Kettenlänge der Acyle, die Permeabilität und Stabilität von Zelloberflächen. Besonders von den langkettigen Acylderivaten war zu erwarten, daß sie durch ihr invertseifenähnliches Verhalten sowohl Stoffwechselvorgänge als auch Oberflächen in den Zellen verändern können. Einzelheiten, wie sie uns der Mäuseaszitestumor bietet, scheinen besonders gut für Untersuchungen dieser Art geeig-

146

W . - D . THOMITZEK, E .

STRACK

net. Wir berichteten bereits in einer vorläufigen Mitteilung [1] über die +

Hemmwirkung von r>,L-0-Palmitoylcarnitin [(CH3)3NCH2CH0(C16H310)CH2COO-] = CP auf Atmung und Glykolyse der Tumorzellen. Es zeichnete sich sogar eine besondere Empfindlichkeit der Tumorzellen gegen diesen Stoff ab, und es schien uns deshalb von Wert zu sein, diese Ergebnisse zu vertiefen und noch offene Probleme weiter zu klären. Über diese Untersuchungen berichten wir hier. Methodik Die G e w i n n u n g des T u m o r m a t e r i a l s f ü r die U n t e r s u c h u n g d e r Glykolyse u n d der A t m u n g sowie die Z e l l v o l u m e n b e s t i m m u n g sind f r ü h e r bereits a u s f ü h r l i c h beschrieben w o r d e n [2]. Die Glykolyse w u r d e e l e k t r o t i t r i m e t r i s c h gemessen, i n d e m a m p H - S t a t (Titrigraph, R a d i o m e t e r , K o p e n h a g e n ) f o r t l a u f e n d die S ä u r e m e n g e m i t n/50 bzw. n/100 N a O H t i t r i e r t w u r d e , die sich n a c h Glukosezusatz bildete. Die N a O H w u r d e d u r c h eine N a C l / K C l - L ö s u n g (150/8 mM) isotonisch g e m a c h t . Die Versuche w u r d e n a n einer T i t r i e r b i r n e v o n e t w a 7 m l I n h a l t d u r c h g e f ü h r t , die a n einem U l t r a t h e r m o s t a t e n angeschlossen w a r u n d 4 — 5 m l einer u n g e p u f f e r t e n Salzlösung enthielt. W i r b e n u t z t e n folgende drei Salzlösungen: I : NaCl 145, KCl 5,7 mM; I I : wie I m i t MgCl 2 1,4 mM u n d I I I : wie I I m i t CaCl 2 4,3 mM. W e n n n i c h t a n d e r s v e r m e r k t , sind die Versuche bei 37 °C u n d a e r o b d u r c h Überleiten eines S a u e r s t o f f s t r o m e s d u r c h g e f ü h r t w o r d e n ; die G l u k o s e e n d k o n z e n t r a t i o n b e t r u g 10 — 20 mM, d e r ^ H 7,5. W e i t e r e Einzelh e i t e n der £ H - S t a t - M e t h o d i k sind schon beschrieben w o r d e n [2], [3]. D i e m a n o m e t r i s c h e n A t m u n g s m e s s u n g e n w u r d e n i m WARBURG-Apparat n a c h der üblic h e n T e c h n i k [4] m i t L u f t als G a s f ü l l u n g u n d K O H i m Z e n t r a l g e f ä ß d u r c h g e f ü h r t . Als g e p u f f e r t e Salzlösung (IV) b e n u t z t e n wir in A n l e h n u n g a n W u u n d R A C K E R [26] ein Gemisch v o n NaCl 80, KCl 16, K H 2 P 0 4 4 , MgCl 2 2 u n d Tris 20 mMol/1. D e r £ H - W e r t w u r d e m i t 1 N HCl auf 7,4 eingestellt. D e r Gehalt a n A T P u n d N A D w u r d e n a c h E n t e i w e i ß e n m i t eiskalter HC10 4 ( E n d k o n z . 0 , 3 N) e n z y m a t i s c h m i t der P h o s p h o g l y z e r a t m e t h o d e n a c h B Ü C H E R bzw. m i t Alkohold e h y d r o g e n a s e b e s t i m m t . D a b e i b e d i e n t e n wir u n s der i n d i r e k t e n F l u o r o m e t r i e , die auf der b e k a n n t e n U m w a n d l u n g v o n N A D m i t M e t h y l ä t h y l k e t o n in ein s t a r k fluoreszierendes P r o d u k t b e r u h t . Die z e l l a b t ö t e n d e W i r k u n g s t u d i e r t e n wir m i t der T r y p a n b l a u m e t h o d e [6]. Die frisch e n t n o m m e n e n Zellen w u r d e n in Eiswasser gekühlt, einmal m i t der 5 — 1 Ofachen Menge einer 0 , 9 % i g e n N a C l - L ö s u n g gewaschen u n d in Salzlösung I I suspendiert, der P h o s p h a t p u f f e r pH 7,4 bis zu einer E n d k o n z e n t r a t i o n v o n 10 mM zugesetzt w o r d e n war. N a c h Z u s a t z d e r T e s t s u b s t a n z e n b e t r u g d a s E n d v o l u m e n 1 ml. E s w u r d e 30 m i n bei 37 °C i n k u b i e r t u n d anschließend weitere 5 ml Salzlösung zugesetzt, d a n n bei geringer T o u r e n zahl 700 g) zentrifugiert, der Ü b e r s t a n d a b g e s a u g t u n d verworfen. Die Zellen w u r d e n in 1 m l Salzlösung a u f g e n o m m e n , m i t 5 m l T r y p a n b l a u - L ö s u n g (5 mg/100 m l 0 , 9 % NaCl) v e r s e t z t u n d bei m i t t l e r e r V e r g r ö ß e r u n g die g e f ä r b t e n u n d u n g e f ä r b t e n Zellen ausgezählt. D a s bei der I n k u b a t i o n freigesetzte Eiweiß b e s t i m m t e n wir i m Ü b e r s t a n d m i t der B i u r e t - M e t h o d e [7], n a c h d e m (10 m i n bei ca. 3000 g) die Zellen a b z e n t r i f u g i e r t worden w a r e n . Die T r ü b u n g w u r d e m i t K C N korrigiert [8]. Die A k t i v i t ä t der L a k t a t d e h y d r o genase w u r d e n a c h B E R G M E Y E R e t al. [ 9 ] b e s t i m m t . D a s T u m o r w a c h s t u m w u r d e a n H a n d der G e w i c h t s z u n a h m e der Tiere gemessen [10]. A u ß e r d e m b e s t i m m t e n wir e t w a a b 12. T a g den Anteil der ü b e r l e b e n d e n Tiere, u m einen t h e r a p e u t i s c h e n E f f e k t v o n C P zu erfassen. D,L-Palmitoylcarnitinhydrochlorid w u r d e n a c h d e m i m I n s t i t u t e r p r o b t e n V e r f a h r e n dargestellt, f ü r d a s wir Frl. D o z e n t D r . L . L O R E N Z d a n k e n . Vor E i n s a t z w u r d e d a s H y d r o c h l o r i d völlig gelöst u n d m i t N a O H neutralisiert. Die a n d e r e n V e r b i n d u n g e n

Palmitoylcarnitin-Wirkung auf Tumorzellen

147

waren handelsübliche Präparate. Die Konzentrationsangaben für ,,C 4 " beziehen sich auf % des Fertigpräparates, das nach Angaben des Herstellers 1 5 % Alkyldimethylbenzylammoniumchlorid enthält. Ergebnisse

Tabelle 1 zeigt drei Experimente über die Hemmwirkung von C P auf die aerobeGlykolyse. Bereits 2 - 1 0 ~ 5 m C P hemmten um 2 1 % , 7 • 10~4 m C P um über 9 0 % . Bei diesen Experimenten haben wir immer wieder beobachten können, daß sich die Zellen mit zunehmender CP-Konzentration (über l C r 4 m) mehr und mehr zusammenballen, bis schließlich einige größere Zellkonglomerate in einer nur wenig trüben Lösung zu finden sind. Um zu prüfen, ob C P möglicherweise durch seine seifenartige Eigenschaft an die ZellmemTabelle 1 Hemmwirkung von CP auf die aerobe Glykolyse. Salzlösung I I I , 153 |xl Zellen; weitere Bedingungen s. Methodik CP-Konz. [mM]

I (¿Mol H + / min

0 0,02 0,10 0,3 0,7

0,423 0,379 0,331 0,116 0,012

%

II [¿Mol H+/ min

100 90 78 27 3

0,528 0,415 0,327 0,168 0,080

/o

III txMol H+/ min

%

100 78 62 32 15

0,575 0,411 0,327 0,167 0,012

100 72 57 29 2

X

x (%)

0,509

100 79 64 29 6

0,402

0,328 0,150 0,035

bran gebunden wird, untersuchten wir die Abhängigkeit von der Stoffkonzentration und von der anwesenden Zellmenge. In Abbildung 1 zeigt sich, daß die Hemmwirkung von CP auf die aerobe Glykolyse sehr ausgeprägt von der Zellmenge abhängig ist. 23 [xl Zellen werden durch weniger als 4 • 10~5 m bereits zu 5 0 % gehemmt, während bei der 5fachen Zellmenge 1,2 • 10~4 M und bei der 1 Of achen Zellmenge mehr als 4 • 1 0 ~4 m benötigt wurden. Diese Ergebnisse warfen die Frage auf, ob die Wirksamkeit von CP von der anwesenden Abb. 1. Hemmung der Glykolyse durch Menge an Eiweiß beeinflußt wird. CP bei verschiedenen Zellmengen. Zusatz von Rinderserumalbumin verSalzlösung I I ; Glykolyse in % der minderte tatsächlich die CP-Wirkung CP-freien Kontrollen; Zellmengen an den kräftig: 0,3 mM CP hemmte die Kurven vermerkt

148

W . - D . THOMITZEK, E .

STRACK

Tabelle 2 W i r k u n g von Rinderserum-Albumin auf die CP-Hemmung der Glykolyse. Salzlösung II, 71 (il Zellen; Albuminzusatz vor C P , Endkonzentration 0,68% (ss 0,1 mM); Mittelwerte von je 2 Ansätzen ohne A l b u m i n

CP-Konz. [mM]

mit Albumin

(xMol H+/min

%

(iMol H + /min

%

0,510 0,442 0,150 0,082

100 87 29 16

0,546 0,478 0,416 0,424

100 88 76 78

0 0,1 0,3 0,5

aerobe Glykolyse ohne Albuminzusatz um 71%, mit Albuminzusatz um 24% (Tab. 2). In Abbildung 2 sind zwei am ^>H-Stat gewonnene Kurven über die glykolytische Säurebildung dargestellt, aus denen die Kinetik der Glykolyse zu ersehen ist. In der Kurve A verminderte der Zusatz von CP die Reaktionsgeschwindigkeit bei einer Konzentration von 0,3 mM in 5 min auf weniger als die Hälfte, während die auf 0,5 mM erhöhte Konzentration noch gering weiter verminderte. Dagegen war bei Zusatz von Albumin (Kurve B) die Hemmung nur geringfügig. Dieser Effekt von Albumin war von der Reihenfolge der Zugabe abhängig. Er war am stärksten ausgeprägt, wenn man CP mit Albumin mischte und dieses Gemisch den glykolysierenden Tumorzellen 0(

5 min ß .

/ Y

)

/

A 0,5mM CP

Y&

0,3mM CP

MCP

V

^ 0,5mMCP

Y

tiv0,1

*v t

0,3mM a

Z^Ä

ml 1CP

B/

A b b . 2. Darstellung des Verlaufs der glykolytischen Säurebildung ohne (A) und mit (B) Albumin nach CP-Zusatz. Salzlösung I I ; 71 [¿1 Zellen; 35 mg Albumin in 5 ml Endvolumen (0,1 MM); CP-Endkonzentrationen an den Pfeilen vermerkt. Geschwindigkeit der Glykolyse in (xÄq H + /min (Korrigiert für den Leerwert)

Palmitoylcarnitin-Wirkung auf Tumorzellen

149

zusetzte. Fügte man der Zellsuspension erst das Albumin und dann das CP zu, so war die Wirkung des Albumins abgeschwächt. Nach Eintritt der CPHemmung war der Albuminzusatz in den benutzten Mengenverhältnissen praktisch wirkungslos. In Tabelle 3 ist der Effekt von CP auf die aerobe und anaerobe Glykolyse verglichen. Trotz der wesentlich höheren Ausgangsrate unter anaeroben Bedingungen waren die Hemmeffekte bei kleinen Konzentrationen aerob und anaerob nahezu gleich, was sich auch in dem konstanten Verhältnis von 1,79 für anaerobe : aerobe Glykolyse ergibt. Dagegen war bei der-' höchsten geprüften Konzentration von 8 • 10 - 5 M die aerobe und anaerobe Glykolyse fast angeglichen (1,16), da die Hemmung unter den anaeroben Bedingungen sich fast verdoppelt hatte. Weiterhin haben wir geprüft (Tab. 4), wie CP auf die durch 2,4-Dinitrophenol aktivierte Glukolyse und auf die Fruktolyse wirkte. Die Fruktolyse kann im entkoppelten Zustand durch die Durchtrittsrate begrenzt sein [11]. SoTabelle 3 Aerobe und anaerobe Glykolyse unter CP. . . Salzlösung I I , 83,5 (¿1 Zellen. Anaerobe Versuche mit Argon und 1 mM K C N ; Mittelwert (x) und Standardabweichung von 5 Ansätzen aerob

CP [mM]

anaerob

%

(jiMol H+/min 0 0,02 0,04 0,08

0,328 0,319 0,279 0,193

+ ± ± ±

100 97 75 67

0,031 0,024 0,037 0,029

%

(¿Mol H+/min 0,588 0,572 0,482 0,225

+ ± + +

0,049 0,029 0,044 0,053

100 97 82 38

1,79 1,79 1,72 1,16

Tabelle 4 Wirkung von CP mit und ohne 2,4-Dinitrophenol (DNP) auf die Glukolyse und die Fruktolyse Salzlösung I I , 5 3 JJLI Zellen; D N P = 0,4 mM; V = Verhältnis von entkoppelter: nicht entkoppelter Glykolyse Glukolyse CP [mM]

0,00 0,02 0,04 0,08 0,16 11

Fruktolyse

mit D N P

ohne D N P (iMol H+/ min

%

lo.Mol H+/ min

%

0,200 0,180 0,156 0,064 0,024

10090 78 32 12

0,720 0,548 0,484 0,084 0,056

100 76 67 12 8

Acta biol. med. german., Heft 2

ohne D N P V

3,6 3,1 3,1 1,3 2,3

mit D N P V

fiMol H+/ min

%

^Mol H+/ min

%

0,212 0,192 0,180 0,060 0,016

100 91 85 28 8

0,716 0,492 0,284 0,044 0,028

100 69 40 8 4

3,4 2,6 1,6 0,7 1,7

150

W . - D . THOMITZEK, E .

STRACK

mit könnte CP durch veränderte Membranpermeabilität die Penetration des Zuckers beeinflussen. Die Glykolyse wurde bei beiden Zuckern im entkoppelten Zustand stärker gehemmt als im gekoppelten, was zu einer Abnahme des Verhältnisses aktiviert: nicht aktiviert führte. Hinzuweisen wäre auf die interessante Erscheinung, daß eine steile Wirkungszunahme des CP sowohl bei den Versuchen in Tabelle 3 wie in Tabelle 4 bei Konzentrationen zwischen 4 und 8 • 10"5 M eintrat. Wir haben weiterhin den Einfluß des pti-Wertes auf die Hemmung der Glykolyse durch CP untersucht. Dabei zeigten sich keine deutlichen Differenzen zwischen ^>H 6,5 und 8,0. Wurden die Zellen nach dem Zusatz von CP gewaschen, so trat eine Reaktivierung der Glykolyse nicht ein. Sie war sogar noch mehr vermindert als vor dem Waschprozeß (s. Diskussion). In Abbildung 3 sind Experimente dargestellt, in denen der Einfluß von CP auf die Atmung von EHRLICH-Aszites-Tumorzellen dargestellt ist. Auch sie nahm mit steigender Konzentration an CP ab. Bei 0,05 mM betrug sie 87%, bei 0,1 MM 57% und bei 0,5 MM 15% der Kontrolle. Verglich man die Hemmungsgrößen der Atmung mit denen der Glykolyse, so waren sie bei gleicher Zellmenge etwa gleich groß. Die durch CP gehemmte Atmung und Glykolyse ließ einen Abfall des ATPSpiegels erwarten. Das Experiment bestätigte diese Annahme (Abb. 4). Der ATP-Gehalt war nach 30 min langer Inkubation mit 0,3 mM CP in Gegenwart von Glukose auf rund % abgesunken, während er in den Kontrollen anstieg. Für die Beurteilung zytostatischer Wirksamkeit wird häufig der NAD-Gehalt herangezogen. Auch er war, wie Abbildung 4 zeigt, nach Inkubation mit CP deutlich gesenkt. Es stellte sich nun die Frage, wie weit der Abfall an NAD für die Hemmung von Atmung und Glykolyse bedeutsam ist. Wir haben in der Abbildung 5 den Einfluß von NAD und von Nikotinsäureamid, das ein kräftiger Hemmstoff der NADase ist,

min

Abb. 3. Der Einfluß von CP auf die Atmung von EAZ. Salzlösung IV; 94 [il Zellen; E n d volumen 3,0 ml; die Kurven A und B sind Mittelwerte aus 2, die Kurven C und D aus 3 Bestimmungen. A = Kontrolle; B = 0,05 mM CP; C = 0,1 mM CP; D = 0,5 mM CP. Kontrolle = Zeitpunkt der Zugabe

Palmitoylcarnitin-Wirkung auf Tumorzellen

151

auf die Glykolyse bei Gabe von CP dargestellt. Dabei zeigte sich, daß durch 1 • 10~2 M Niacin sowie durch 0,9 MM NAD die Wirkung von CP abgeschwächt wurde. 1 L ' 700

1,0

Abb. 4. Gehalt an ATP und N A D sowie Laktatbildung glykolysierender EAZ mit und ohne CP. 255 M-l Zellen in 3 ml Endvolumen (Salzlösung IV), Zusatz von 0,3 mM CP und 20 mM Glukose zur Zeit 0; • • = ohne CP; o o = mit CP; ATP; = NAD; Laktat (Ordinate L)

•600

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Es war nun naheliegend, die Wirksamkeit von CP aüf das Wachstum des EHRLICH-Aszites-Tumors zu prüfen. Dazu haben wir einmal in vitro den Aszites nach der Entnahme mit CP versetzt und ihn nach kurzer Zeit transplantiert. In anderen Ansätzen prüften wir, wie mehrmalige i.p. Injektionen von CP nach Transplantation wirkten. Eine typische Serie nach der ersten Anordnung ist in Abbildung 6 dargestellt. Gemessen an der Gewichtszunahme der Tiere verzögerte 1 MM CP das Tumorwachstum deutlich. Auch die Überlebenszeit wurde im Durchschnitt erheblich verlängert. Während bei den Kontrollen nach 23 Tagen weniger als 50% der Tiere lebten, waren unter CP noch nach 32 Tagen 50% am Leben. Interessanterweise wurde jedoch bei 0,1 MM CP das Tumor-Wachstum beschleunigt.

Abb. 5. Einfluß von N A D und Niacin ( = N) auf die Hemmung der Glykolyse durch CP. Automatisch registrierte glykolytische Säurebildungskurven am £H-Stat. 83,3 fil Zellen CP = 0,06 mM, NAD = 0,9 mM; Niacin = 1 0 mM

Die tägliche i. p. Injektion von CP am 1., 2. und 3- Tage nach der Transplantation hemmte bei 1 (¿Mol pro Tier das Wachstum fast völlig (Abb. 7). Dagegen waren 0,1 [¿Mol bereits wirkungslos. Bei einigen Tieren haben wir durch 3malige Injektion von 1 fi,Mol CP pro Tier am 1 . - 3 - Tag nach der Transplantation ein Angehen des Tumors ganz unterbinden können. Die Ii»

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152

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Abb. 6. Tumorwachstum (a) und Überlebensrate (b) bei Transplantation von CP-behandelten Aszites-Tumorzellen. Am Tage 0 i.p. Transplantation von 0,15 ml einer 4,2%iger Zellsuspension, die bei 1 = 0 mM (Kontrolle), bei I I = 0,1 m » und bei I I I = 1 mM CP enthielt, a = Gewichtszunahme (je Kurve n = 10); b = % überlebende Tiere 1

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Abb. 2. Cd-Verteilung auf Leber und Verdauungstrakt nach Applikation von 115m CdCl 2 (mit Träger) und CaDTPA oder CaÄDTA. Werte in % der verabreichten Dosis mit 95% Vertrauensintervall verzeichnet. 1 — 7 wie bei Abbildung 1

Abb. 3- Cd-Verteilung auf Nieren, Milz und Hoden nach Applikation von 115 m CdCl 2 (mit Träger) und CaDTPA oder CaÄDTA. Werte in % der verabreichten Dosis mit 95% Vertrauensintervall verzeichnet. 1 — 7 wie bei Abbildung 1

den Versuchen. Gegenläufig zum Plasmaspiegel nimmt die Cd-Konzentration in den Blutkörperchen im Verlauf von 48 Std. zu. Der Ca-Gehalt der Erythrozyten wird durch das Waschen mit einer physiologischen Lösung oder mit einer CaDTPA-Lösung nicht signifikant beeinflußt. In Tabelle 4 sind die Ergebnisse der Versuchsserie d) angeführt. Aus den Ergebnissen geht hervor, daß von den Plasmaproteinen das Albumin die größte Affinität zu Cd besitzt. Die übrigen geprüften Fraktionen reagieren nicht mit Cd. Wie aus den Konkurrenzversuchen mit CaDTPA ersichtlich ist, bindet Hämoglobin Cd etwas schwächer als Albumin. Diskussion

Unsere Versuche zeigen, daß bei Verlängerung des Zeitintervalls zwischen der Applikation des Cd und der Ca-Komplexe deren Wirkung sehr abgeschwächt wird. Diese Erscheinung könnte einerseits dadurch hervorgerufen werden, daß es im Organismus während dieser Zeit zu einer Veränderung des 13

Acta biol. med. germani., Heft 2

482

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Only the uterine lipids showed a slight but statistically significant increase after thyroidectomy (P < 0.05—0.02, table 8). The other constituents did not record any significant change. Thyroidectomy had no effect on the vaginal smear picture which remained typically prepuberal with scattered nucleated epithelial cells, an occasional cornified cell, leucocytes and bacteria. The circumgenital area showed a golden reddish tinge at the time of thyroidectomy, but became slightly more prominently coloured irrespective of sex and the status of the thyroid as the experiment progressed.

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196

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Hypothyroidism and sexual development

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Table 2 Effect of thyroidectomy on the accessory genital organs of male monkeys Prostate

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60.0 l 75.0

Data based on pooled samples of the prostate from 3 monkeys.

B. Effect of thyroidectomy on the pituitary The pituitary weight was significantly increased after thyroidectomy in both sexes (P < 0.02—0.01, table 3). Thyroidectomy had no effect on the gonadotrophin content of the pituitary and serum in male monkeys (table 3)- On the other hand, in the female the pituitary gonadotrophin content was increased (control vs. thyroidect., P < 0.0-1, table 3) but serum gonadotrophin did not register any significant change. It was noteworthy that the pituitary of control or hypothyroid male monkeys was devoid of gonadotrophin in contrast to that of the female which showed the presence of assayable quantities of the hormone (none vs. control or thyroidect., P < 0.05—0.01, table 3)- However, in both sexes gonadotrophin appeared to be absent from serum.

Fig. 1. Testis of a control monkey. Note typical prepuberal condition.

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Fig. 2. Testis of an euthyroid monkey injected with PMS gonadotrophin. Note increase in diameter of the tubules and peripheral arrangement of spermatogonia. The interstitium contains mostly fibroblast-like cells. X 350 Fig. 3. Testis of a hypothyroid monkey injected with PMS gonadotrophin. Note increase in diameter of the tubules, peripheral disposition of spermatogonia, presence of mitotic figures and Leydig cells (marked by narrow). X 350 Fig. 4. The vaginal smear of an ovariectomized monkey. Note mostly epithelial cells, leucocytes and bacteria. X 200 Fig. 5- The vaginal smear of an ovariectomized monkey injected with estrogen. Note the large number of cornified cells. X 200 Fig. 6. The vaginal smear of a thyro-ovariectomized monkey treated with estrogen. Note the very considerable number of cornified cells. X 200 14 Acta biol. med. german., Heft 2

Amiya B. Kar, K. Sri vast ava

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226

N . POPOV, W .

FÖRSTER

Unabhängig von dem untersuchten Substrat ist die Stärke der Hemmwirkung bei Ratten stets größer als bei Meerschweinchen. Ähnliche Speziesunterschiede sahen wir jedoch auch nach Harmin (s. unten). Digitoxin wurde nur mit DA als Substrat untersucht. Nach einmaliger Gabe von 5 mg/kg i.p. kommt es bei Ratten nach 4 Std., bei Meerschweinchen schon nach 2 Std. zu einer maximalen Hemmwirkung von 40 bzw. 30%. Die Wirkung hält bei Ratten mehr als 24 Std., bei Meerschweinchen nur etwa 4 Std. an (Abb. 2). Wird Digitoxin subakut verabreicht (täglich 3,0 bis 4,0 mg/kg i.p.), nimmt die Stärke der Hemmwirkung linear mit der Dauer der Digitoxinvorbehandlung zu. Nach 32 Versuchstagen wird bei DA als Substrat die MAO-Aktivität um mehr als 60% gehemmt (Abb. 3). Bei subakuter Verabreichung von nur 1,5—2,5 mg/kg/Tag Digitoxin i.p. für

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Abb. 2. Verlaufskurve der MAO-Hemmwirkung von Digitoxin (5 mg/kg i.p.) bei Dopamin als Substrat. Als Streuung ist der mittlere Fehler des Mittelwertes angegeben. O O = Ratte; • • = Meerschweinchen

Abb. 3- MAO-Hemmwirkung von Digitoxin bei Dopamin als Substrat in Abhängigkeit von der Dauer der subchronischen Vorbehandlung (3,0 — 4,0 mg/kg/Tag i.p.)

Monoaminoxydase und Digitaliskörper

227

60 Tage kommt es zu keiner MAO-Hemmung (P > 0,05); die letzte Versuchsserie wurde an 45 Ratten durchgeführt. Im Gegensatz zu Digitoxigenin und Digitoxin hemmt g-Strophanthin weder nach einmaliger Gabe noch nach subakuter Verabreichung die MAO-Aktivit ä t des Rattenhirns (P > 0,05). Die Untersuchungen mit den fünf Substraten wurden nach Inkubationszeiten von 15, 60 und 120 min durchgeführt. 4. Vergleichende Versuche mit Harmin Um die Wirkungsstärke der MAO-Hemmung durch Digitaliskörper besser beurteilen zu können, untersuchten wir unter gleichen Versuchsbedingungen den kurzwirksamen MAO-Hemmstoff Harmin (Fluka). Mit 5 mg/kg 100

Tyr

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Abb. 4. MAO-Hemmwirkung nach in vivo-Gabe von Harmin 30 min nach 15 mg/kg i.p. Beschriftung wie Abb. 1. Schwarze Säulen = R a t t e ; weiße Säulen = Meerschweinchen

Harmin i.p. traten z. Zt. des Wirkungsmaximums (30 min) nur bei NA und 5-HT als Substrat stärkere Hemmwirkungen auf, während bei Tyr, DA und TA als Substrat die MAO-Aktivität um weniger als 20% gehemmt war. Vollständig gehemmt wurde die MAO-Aktivität bei NA als Substrat mit 15 mg/kg i.p., bei 5-HT und TA mit 40 mg/kg i.p. Harmin, während bei dieser höchsten von uns untersuchten Dosis bei Tyr und DA als Substrat Hemmeffekte von nur etwa 60% erreicht wurden. In Abbildung 4 sind die Ergebnisse mit 15 mg/kg Harmin (Einwirkungszeit 30 min) graphisch dargestellt. Die Gegenüberstellung der Harminergebnisse an Ratten und Meerschweinchen zeigt, daß ähnlich wie bei den Digitaliskörpern die Hemmwirkung bei Meerschweinchen stets schwächer war als bei Ratten. Nur bei TA als Substrat war zwischen beiden Tierarten kein Unterschied nachweisbar.

228

N . POPOV, W . FÖRSTER

Diskussion

In den vorliegenden Untersuchungen wurde die Beeinflussung der MAOAktivität des Gehirns nur nach in vivo-Gabe der Steroide geprüft. In vitroVersuche führten wir nicht durch, da ein Alkoholzusatz zum Lösen der Steroide nicht zu vermeiden gewesen wäre; die Eigen Wirkung des Äthanols auf die MAO-Aktivität hätte sich nur schwer von dem Effekt der Digitaliskörper trennen lassen. Das wichtigste Ergebnis der vorliegenden Versuche ist der Nachweis, daß Digitaliskörper die MAO-Aktivität im Gehirn dosisabhängig zu hemmen vermögen. Diese Hemmung ließ sich bei verschiedenen Tierspezies (Ratte, Meerschweinchen und Katze) und unabhängig von dem zur Untersuchung verwendeten Substrat (DA, Tyr, 5-HT, NA und TA) nachweisen; sie kann daher als eine eigene Wirkkomponente bestimmter herzwirksamer Steroide angesehen werden. Im Rahmen der uns interessierenden Struktur-Wirkungsbeziehungen von Digitaliskörpern [13], [25] —[30] wählten wir für die Untersuchungen drei Steroide aus, die möglichst viele Rückschlüsse auf die Wirkungsbedingungen dieses Effektes ermöglichen sollten. Durch Verwendung eines apolaren und eines polaren Glykosides sowie eines der entsprechenden Genine sollte überprüft werden, ob die MAO-hemmende Wirkung stärker von der Polarität der Glykoside oder ihrer Wirkungsdauer abhängt. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, daß die Wirkungsdauer eines Steroids für den Einfluß auf die MAO-Aktivität ohne Einfluß ist, da das am kürzesten wirksame Digitoxigenin und das langwirkende Digitoxin den gleichen Effekt zeigten; g-Strophanthin beeinflußt auch in subletalen Dosen nach einmaliger oder wiederholter Gabe die MAO-Aktivität nicht. Nach eigenen früheren Untersuchungen [13] kann eine zentralnervöse Nebenwirkung polarer Glykoside trotzdem nicht generell abgelehnt werden. g-Strophanthin und Convallatoxol rufen schon in sehr niedrigen Dosen bei Hund und Katze zentrales Erbrechen hervor und wirken an Maus und Ratte mit etwa 10% der LD50 sedierend auf den Orientierungs- und Rattensprungtest. In den vorliegenden Ergebnissen sehen wir daher eine Bestätigung unserer früheren These [13], daß differente zentralnervöse Strukturen und im ZNS wirksame Enzyme durch die einzelnen Digitalissteroide unterschiedlich beeinflußt werden und daß Art und Stärke verschiedener zentraler Nebenwirkungen eigenen Struktur-Wirkungsbeziehungen gehorchen. Die subakuten Versuche mit Digitoxin ließen bei der Ratte deutlich einen mit der Versuchsdauer zunehmenden Einfluß auf die MAO-Aktivität des Gehirns erkennen. Er ist dosisabhängig und war nur nach den höchsten von uns verwendeten Dosen nachweisbar. Wurde die Dosis auf die Hälfte vermindert, ging der Einfluß auf die MAO-Aktivität trotz Verdoppelung der Versuchsdauer und damit etwa gleicher Gesamtdosis verloren. Ein Vergleich der durch unsere Digitalissteroide erzielten Beeinflussung der MAO-Aktivität mit der Harminwirkung ist nur bedingt möglich. Wie aus Abbildung 4 ersichtlich, hatte die gleiche Dosis Harmin bei den einzelnen

Monoaminoxydase und Digitaliskörper

229

Substraten eine sehr unterschiedlich starke Hemmwirkung. Aus äußeren Gründen konnte Digitoxin nach subakuter Gabe nicht mit allen Substraten und verschiedenen Inkubationszeiten untersucht werden. Die nach einmonatiger Digitoxingabe bei DA als Substrat beobachtete Hemmung der MAO-Aktivität um 60% entsprach einem akuten Harmineffekt von 40 mg pro kg i.p. Interessant ist die unterschiedlich starke Hemmwirkung der Digitaliskörper und des Harmins bei den drei untersuchten Tierspezies. In allen Versuchen wurde die MAO-Aktivität im Gehirn der Ratte stärker gehemmt als im Gehirn des Meerschweinchens oder der Katze. Da Wirkungsunterschiede in gleichem Maße bei Harmin und den Digitaliskörpern nachweisbar waren, sind sie nicht Ausdruck eines bei der digitalisresistenten Ratte verstärkten extrakardialen Effektes. Obwohl ein Rückschluß aus tierexperimentellen Ergebnissen auf klinische Wirkungen nur mit größter Vorsicht möglich ist, kann auf Grund unserer Befunde mit der Möglichkeit gerechnet werden, daß durch eine chronische Gabe langwirkender Glykoside, wie z. B . des Digitoxins, zentralnervöse Nebenwirkungen verursacht werden können, die sonst nur von MAOHemmern bekannt sind. Eine einfache Korrelation zwischen der Beeinflussung der MAO-Aktivität durch Digitaliskörper und ihren zentralnervösen Nebenwirkungen läßt sich dagegen nicht aufstellen, zumal auch verschiedene MAO-Hemmer sehr unterschiedliche zentralnervöse Erscheinungen auslösen. Trotzdem erhebt sich die Frage, ob eine gewisse Euphorie, die während der Digitalisbehandlung häufig zu beobachten ist, Folge einer zentralnervösen antidepressiven Eigenwirkung kumulierender Glykoside sein kann. Daß ein unterschiedlicher Amingehalt des ZNS, sei es eine Aminverarmung durch Reserpin, sei es eine intrazerebrale Injektion von NA oder 5-HT zentralnervöse Nebenwirkungen von Digitaliskörpern beeinflussen kann, zeigten wir in früheren Versuchen an dem durch intrazerebrale Injektion von Digitoxigenin ausgelösten Krämpfen bei Mäusen [34] und an der Beeinflussung des Digitaliserbrechens bei Hunden durch Vorbehandlung mit MAO-Hemmern [35]- Eine direkte Veränderung des NA-Gehaltes im Gehirn von Ratten und Meerschweinchen [36] nach einmaliger Gabe maximal verträglicher Dosen von g-Strophanthin, Digitoxin und Digitoxigenin konnte von uns bisher nicht nachgewiesen werden. Ein Anstieg im biogenen Amingehalt des ZNS war nach einer etwa 50%igen Hemmung der MAO-Aktivität durch Digitaliskörper kaum zu erwarten. Für sorgfältige Mitarbeit bei der technischen Versuchsdurchführung danken wir Frau N ü s s und Frl. K . B R Ü S H A F E R .

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N . POPOV

T h e effect of digitoxigenin, digitoxin and g-strophanthin on the monoamine oxidase activity of rat, guinea pig and cat brain has been investigated in vivo after single or repeated administration of high dosages. Substrates employed for manometric measurements were tyramine, dopamine, noradrenaline, tryptamine and 5-hydroxytryptamine. Digitoxigenin exhibited in each species and with each substrate a dose-dependent inhibition of monoamine oxidase activity, amounting to some 50 — 70 per cent; the effect was stronger in rats than in guinea pigs and cats. Digitoxin was of similar effect, its action increased with the time of treatment during subacute experiments. In contrast to the two digitalis steroids, g-strophanthin produced no inhibitory effect on

Monoaminoxydase und Digitaliskörper

231

monoamine oxidase activity in rats after single or repeated administration even when given in high dosage. W h e n comparing the inhibitory effects of harmine with dopamine as substrate, so approximately the same effects could be noticed after one month's administration of high digitoxin doses and after single administration of 40 mg/kg of harmine. L i k e the digitalis bodies, harmine inhibited the M A O a c t i v i t y of rat brain stronger than that of guinea pig and cat brain. T h e possible clinical importance of these findings is discussed in the light of earlier studies on central nervous side effects of various heart glycosides. Pe3ioMe H . I I o n o B H B . ( D ë p c T e p : O BJIHHHHH HanepcTHHKH Ha M0H0aMHH0KCHna3HyK> aKTHBHOCTb B M03re KpblC, MOpCKHX CBHHOK H KOIIieK HAYNAJIOCB BJIHHHHC HHRHTOKCNREHHHA, HIIRHTOKCNHA H cTpoMT 32472 > MT 32 472 * Serum ' MT 32 4 72 * Serum

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Abb. 2

Diskussion

Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, daß die passive Übertragung des Akzelerationseffektes nicht nur durch Serum, sondern auch durch Lymphknotenzellen tumortragender Spender möglich ist. Dagegen besitzt das gleiche Material normaler Kontrolltiere eine tumorwachstumshemmende

Kurzmitteilungen

257

Wirkung, die am ehesten als Ausdruck unspezifischer humoraler und zellulärer Schutzmechanismen aufzufassen ist. Einen entsprechenden Einfluß normaler Lymphknotenzellen im isologen Tumor-Wirt-System sahen u. a. K L E I N und S J Ö G R E N [2]. Im vorliegenden Versuchssystem fehlt nicht nur eine an Lymphknotenzellen gebundene immunologische Abwehrreaktion gegen das ausgebildete Mammatumortransplantat, sondern der normalerweise vorhandene Inhibitionseffekt ist unter dem Tumoreinfluß zugunsten einer wachstumsfördernden Wirkung verloren gegangen. Zu ähnlichen Ergebnissen in Bezug auf die Tumorstimulation kamen Y O S H I D A und S O U T H A M [8] bei Versuchen mit Milzzellen von Mäusen mit primären, chemisch induzierten Sarkomen. Während der wachstumsstimulierende Einfluß von Serum mit Mammatumorzellen vorbehandelter Spender bekannt ist [6], konnte mittels immunkompetenter Zellen solcher Tiere im Gegensatz zu unseren Ergebnissen wiederholt ein Hemmeffekt erzielt werden [1], [3], [7]. Letzteres weist möglicherweise darauf hin, daß Mammakarzinome der Maus spezifische Antigene besitzen, die im isologen System echte Immunreaktionen auszulösen vermögen. Die Klärung der Frage einer spezifischen Antigenität der CBA-Mammatumoren setzt, soweit Methoden zur Erzeugung einer Transplantationsimmunität Anwendung finden, genauere Kenntnisse über den Charakter der induzierten Tumorwachstumsakzeleration voraus, da mit einer Interferenz zwischen Akzeleration und möglicher schwacher immunologischer Abwehrreaktion zu rechnen ist. Entsprechend Untersuchungen befinden sich in Vorbereitung. Literatur [1] A T T I A , M. A . , K. B. D E O M E U. D. W . W E I S S : Immunology of spontaneous mammary carcinomas in mice. II. Resistance to a rapidly and slowly developing tumor. Cancer Res. 25, 4SI (1965). [2] K L E I N , E . U. H. O . S J Ö G R E N : Humoral and cellular factors in homograft and isograft immunity against sarcoma cells. Cancer Res. 2 0 , 4 5 2 ( I 9 6 0 ) . [ 3 ] MORTON, D. L., L . GOLDMAN U. D. A. W O O D : Immunological tolerance to spontaneous m a m m a r y adenocarcinomas (SMC). Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. 6, 47 (1965). [ 4 ] M Ü L L E R , M . U. E . - R . W E L C H E R : A k z e l e r a t i o n v o n

Mammakarzinomtransplantaten

bei CBA/Bln-Mäusen durch Vorbehandlung mit kleinen Dosen vitaler isologer Tumorzellen. A c t a biol. med. german. 15, 147 (1965).

[5] MÜLLER,

M . u. E . - R . W E L C H E R :

Wachstumsverzögerung

und

Akzeleration

von

Mammatumortransplantaten des Mäusestammes CBA/Bln durch Vorbehandlung der Empfänger mit vitalen Tumorzellen oder Milch zweier Mäusestämme. Acta biol. med. german. 16, 558 (1966). [6] W E I S S , D . W . u. M . A T T I A : Immunity to spontaneous mammary carcinomas in isologous mice. Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. 5, 67 (1964). [ 7 ] W E I S S , D . W . , L . J . F A U L K I N U. K . B . D E O M E : Acquisition of heightened resistance and susceptibility to spontaneous mouse mammary carcinomas in the original host. Cancer Res. 24, 732 (1964). [8] Y O S H I D A , T . O . U. C. M . SOUTHAM: Cell-associated immune reaction against autochthonous tumors in mice. Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. 4 , 74 ( 1 9 6 3 ) .

A n s c h r i f t der V e r f a s s e r : D r . E . - R . WELCHER, D r . M . MÜLLER, P a t h o l o g i s c h e s

Institut

der Medizinischen Akademie „Carl Gustav Carus", Dresden A 19, Schubertstr. 15.

Acta biol. med. german., Band 17, Seite 258—260 (1966) Aus der Biologischen Forschungsanstalt

Kloster/Hiddensee

SCHILDMACHER) d e r E r n s t - M o r i t z - A r n d t - U n i v e r s i t ä t

(Direktor:

Prof. Dr.

Greifswald,

dem Institut für stabile Isotope der Deutschen Akademie der Wissenschaften zu Berlin, Leipzig (Direktor: Prof. Dr. J . MÜHLENPFORDT) und dem Institut für Pharmakologie und Toxikologie der Karl-Marx-Universität Leipzig ( D i r e k t o r : P r o f . D r . F . HAUSCHILD)

Zur Wirkung von Theophyllin auf die Permeation von Wasserstoffperoxid H . SACHERT, G . H Ü B N E R u n d R . L U D E W I G

(Eingegangen am 6. 4. 1966)

Zusammenfassung Theophyllin setzt bei Internodialzellen von Tolypella nidifica die Permeabilität gegenüber H 2 0 2 herab. Die Lage des Gleichgewichts der Verteilung des H 2 0 2 zwischen Zellsaft und Außenmedium wird durch Theophyllin nicht oder nur unwesentlich beeinflußt.

Xanthinderivate, wie Koffein, Theophyllin etc., gelten als permeationsfordernd [ 1 ] . Besonders die Untersuchungen von F R Ö H L I C H und Z A K [2] — [5] werden als Beweis für die Steigerung der Zell-und Gewebepermeabilität häufig zitiert. Die Ergebnisse der Arbeiten dieser und anderer Autoren lassen jedoch mehrere Interpretationsmöglichkeiten zu, so daß uns die Ansicht, die Zellpermeabilität werde durch Theophyllin erhöht, bisher nicht eindeutig belegt scheint. Wir prüften mit Hilfe einer früher [6] mitgeteilten Technik, ob durch Theophyllin eine Beeinflussung der Permeation von Wasserstoffperoxid zu erzielen ist. Als Objekt dienten Internodialzellen der Brackwasser-Characee Tolypella nidifica [LEONH.], da aus diesen Zellen genügende Mengen von Zellsaft für eine direkte mikroanalytische Bestimmung permeierender Substanzen gewonnen werden können. H 2 0 2 wurde als permeierende Substanz gewählt, da dessen Permeation nicht durch aktiven Transport beeinflußt wird [6], [7] und mit mikrotitrimetrischen Methoden gut bestimmbar ist.

Nach 4- und 30-min Einwirkung des Theophyllins (0,l%ige Theophyllinlösung in Standortwasser) konnten keine Unterschiede in den Permeationsgeschwindigkeiten gegenüber den Kontrollen festgestellt werden. Dagegen wurde durch 12stündige Vorbehandlung mit Theophyllin sowohl bei normalen als auch bei Hydroxylamin-vorbehandelten Zellen (0,5% Hydroxylamin in Standortwasser, Einwirkungsdauer 4 min) die Permeation von H 2 0 2

Acta biol. med. german., Band 17, Seite 258—260 (1966) Aus der Biologischen Forschungsanstalt

Kloster/Hiddensee

SCHILDMACHER) d e r E r n s t - M o r i t z - A r n d t - U n i v e r s i t ä t

(Direktor:

Prof. Dr.

Greifswald,

dem Institut für stabile Isotope der Deutschen Akademie der Wissenschaften zu Berlin, Leipzig (Direktor: Prof. Dr. J . MÜHLENPFORDT) und dem Institut für Pharmakologie und Toxikologie der Karl-Marx-Universität Leipzig ( D i r e k t o r : P r o f . D r . F . HAUSCHILD)

Zur Wirkung von Theophyllin auf die Permeation von Wasserstoffperoxid H . SACHERT, G . H Ü B N E R u n d R . L U D E W I G

(Eingegangen am 6. 4. 1966)

Zusammenfassung Theophyllin setzt bei Internodialzellen von Tolypella nidifica die Permeabilität gegenüber H 2 0 2 herab. Die Lage des Gleichgewichts der Verteilung des H 2 0 2 zwischen Zellsaft und Außenmedium wird durch Theophyllin nicht oder nur unwesentlich beeinflußt.

Xanthinderivate, wie Koffein, Theophyllin etc., gelten als permeationsfordernd [ 1 ] . Besonders die Untersuchungen von F R Ö H L I C H und Z A K [2] — [5] werden als Beweis für die Steigerung der Zell-und Gewebepermeabilität häufig zitiert. Die Ergebnisse der Arbeiten dieser und anderer Autoren lassen jedoch mehrere Interpretationsmöglichkeiten zu, so daß uns die Ansicht, die Zellpermeabilität werde durch Theophyllin erhöht, bisher nicht eindeutig belegt scheint. Wir prüften mit Hilfe einer früher [6] mitgeteilten Technik, ob durch Theophyllin eine Beeinflussung der Permeation von Wasserstoffperoxid zu erzielen ist. Als Objekt dienten Internodialzellen der Brackwasser-Characee Tolypella nidifica [LEONH.], da aus diesen Zellen genügende Mengen von Zellsaft für eine direkte mikroanalytische Bestimmung permeierender Substanzen gewonnen werden können. H 2 0 2 wurde als permeierende Substanz gewählt, da dessen Permeation nicht durch aktiven Transport beeinflußt wird [6], [7] und mit mikrotitrimetrischen Methoden gut bestimmbar ist.

Nach 4- und 30-min Einwirkung des Theophyllins (0,l%ige Theophyllinlösung in Standortwasser) konnten keine Unterschiede in den Permeationsgeschwindigkeiten gegenüber den Kontrollen festgestellt werden. Dagegen wurde durch 12stündige Vorbehandlung mit Theophyllin sowohl bei normalen als auch bei Hydroxylamin-vorbehandelten Zellen (0,5% Hydroxylamin in Standortwasser, Einwirkungsdauer 4 min) die Permeation von H 2 0 2

Kurzmitteilungen

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in die Zellen herabgesetzt (Abb. 1). Da Hydroxylamin die Aktivität der Hydroperoxidasen senkt, ist bei Hydroxylamin-vorbehandelten Zellen der ständige H 2 0 2 -Verbrauch unterdrückt, so daß eine erhöhte Gleichgewichtskonzentration im Zellsaft gemessen wird [6]. Eine Schädigung der Zellen durch das Theophyllin trat nicht auf, wie durch Messung der Protoplasmaströmung festgestellt werden konnte.

A b b . 1. Permeation von Wasserstoffperoxid in die Vakuole von Internodialzellen der Characee Tolypella nidifica. Ordinate: H 2 0 2 -Konzentration im Zellsaft (c,), bezogen auf die H 2 0 2 -Konzentration im Außenmedium (ca); Abszisse: Permeationsdauer in sec. • • o——o • • o •

Normale Zellen; 4 min mit Hydroxylamin vorbehandelte Zellen; 12 Std. mit Theophyllin vorbehandelte Zellen; 12 Std. mit Theophyllin und anschließend 4 min mit Hydroxylamin vorbehandelte Zellen

Die Ergebnisse lassen im Zusammenhang mit unseren vorangehenden Untersuchungen [6], [7] erkennen, daß Theophyllin die Wirkung der Hydroperoxidasen nicht beeinflußt, sondern nur die Eintrittsgeschwindigkeit des H 2 0 2 in die Zellen herabsetzt. Nach 10-min Permeationsdauer liegen die Unterschiede zwischen den mit Theophyllin vorbehandelten und unbehandelten Zellen nahe der Fehlergrenze der Methode. Die Lage des Gleichgewichts der Verteilung des H 2 0 2 zwischen Zellsaft und Außenmedium wird demnach durchTheophyllin nicht oder nur unwesentlich beeinflußt. Wir d a n k e n Herrn Prof. Dr. S C H I L D M A C H E R für die großzügige Gewährung des Arbeitsplatzes und Frl. H O L F E L D für die technische Mithilfe. Literatur P. u. R . K O C H : Pharmazie L, 5 9 A. U. E . Z A K : Klin. Wschr. 4 , 2 3 0 3 A . U. E . Z A K : Klin. Wschr. 6 , 2 2 8 8

[1] MARQUARDT, [2] FRÖHLICH, [3]

FRÖHLICH,

(1946). (1925). (1927).

Kurzmitteilungen

260 [4]

FRÖHLICH,

A. U. E. Z A K : Naunyn-Schmiedebergs Arch. exp. Pathol. Pharmakol. 121, 108 (1927)-

[5]

FRÖHLICH,

A. U . E . Z A K : Naunyn-Schmiedebergs Arch. exp. Pathol. Pharmakol. 143.310 (1929)[6] H Ü B N E R , G. U. R. L U D E W I G : Z. Naturforsch. 1 9 B , 383 (1964). [ 7 ] - H Ü B N E R , G . , R . L U D E W I G U . V . G Ö R I S C H : Naturwissenschaften 4 8 , 7 2 ( 1 9 6 1 ) . Anschrift der Verfasser: Dr. H. S A C H E R T , jetzt: Institut für Biophysik. Berlin-Buch, Lindenberger Weg 70; Dr. G . H Ü B N E R , Institut f ü r stabile Isotope, 7 0 5 Leipzig, Permoserstr. 1 5 ; Doz. Dr. R . L U D E W I G , Institut für Pharmakologie und Toxikologie, 7 0 1 Leipzig, Härtelstr, 16 — 18.

Sicherheit am Arbeitsplatz Gasprüfröhrchen Z u r quantitativen Schnellbestimmung von Verunreinigungen der Luft durch C O , H 2 S, S 0 2 , N 0 2 , C S 2 und andere Gase Anwendungsgebiete: Chemiewerke (Mineralöle, Chemiefaser, Plaste), Laboratorien, Hüttenwerke, Bergbau, Gasversorgungs- und Kanalisationsbetriebe und weitere Industriezweige

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