Acta Biologica et Medica Germanica: Band 17, Heft 3 [Reprint 2021 ed.] 9783112540503, 9783112540497

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HERAUSGEBER:

R. B A U M A N N , H. D U T Z , A. G R A F F I , H. G U M M E L , F . J U N G L.-H. K E T T L E R , S. M. R A P O P O R T U N T E R M I T A R B E I T VON:

W. B E I E R , H. D R I S C H E L , H. F K U N D E E , M. G E R S C H , E. G O E T Z E , H . H A N S O N , F. H A U S C H I L D , G . H O L L E , F. M A C H , H. M A T T H I E S , G. M O H N I K E f , O. P R O K O P , K. S C H U B E R T , F. S C H W A R Z , G. S T E R B A , A. W O L L E N B E R G E R SCHRIFTLEITUNG:

\V. S C H E L E R , H. B I E L K A

AKADEMIE-VERLAG

• BERLIN

. B A N D 17 • H E F T 3

• S E I T E 261-373

•

1966

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1. Es werden nur Arbeiten angenommen, die nicht an anderer Stelle mit demselben Inhalt veröffentlicht oder zur Veröffentlichung angeboten werden. Der Autor verpflichtet sich nach Annahme, die Arbeit an keiner anderen Stelle zu veröffentlichen. 2. Die Arbeit m u ß wissenschaftlich wertvoll sein.

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Die Herausgeber

ACTA BIOLOGICA ET MEDICA GERMANICA Herausgeber: R Baumann

H D u t z • A. G r a f f i • H. G u m m e l • F . J u n g • L - H S. M. R a p o p o r t

B a n d 17

1966

Kettler Heft 3

Acta biol med german., Band 17, Seite 261 —274 (1966) Aus dem Institut für Pharmakologie und Toxikologie der Humboldt-Universität zu Berlin (Direktor. Prof Dr F. J U N G )

Mechanismus der Bildung von inosinmonophosphat im menschlichen Erythrozyten II. Synthese des Inosinmonophosphat aus Inosin nach phosphorolytischer Spaltung des Inosins H

BANASCHAK

(Eingegangen am 8 3-1966) Zusammenfassung In menschlichen Hämolysaten wird die IMP-Synthese aus Inosin und ATP, die mit Phosphorolyse des Inosins eingeleitet wird, von der Adenylsäuredesammaseund der Inosmkmasereaktion abgegrenzt Die IMP-Synthese ist M g + + - K + - und phosphatabhängig Die Phosphatabhängigkeit kommt neben der Nukleosidphosphorylase- auch der IMP-Pyrophosphorylasereaktion zu, die auch die K + - a b h ä n gige Stufe ist Die einzelnen Reaktionsstufen werden näher charakterisiert. Es wird geschlossen, daß die R-5-P-Pyrophosphokmasereaktion der geschwmdigkeitsbegrenzende Schritt der IMP-Synthese über diesen Reaktionsweg ist. Einleitung

In der vorhergehenden Mitteilung haben wir über die Bildung von IMP in menschlichen Erythrozyten über eine Adenylsäuredesaminase berichtet und das Enzym näher charakterisiert [1]. Die Adenylsäuredesaminase zeigt in frischen Erythrozyten unter normalen Bedingungen eine sehr geringe Aktivität; eine sehr starke IMP-Bildung in den Zellen findet jedoch statt, wenn die Zellen mit einem Zusatz von Inosin oder Adenosin inkubiert werden. Die Bedeutung des Nukleosidzusatzes für die Verbesserung des Adeninnukleotidhaushalts und die Verlängerung der Konservierbarkeit der Erythrozyten ist seit den grundlegenden Untersuchungen von G A B R I O et al. [2] — [4] von emer.Reihe von Untere Suchern bestätigt worden Die von verschiedenen Autoren im Zusammenhang mit Abkürzungen: AMP Adenosmmonophosphat; A T P Adenosmtriphosphat, H x Hypoxanthin, IMP Inosinmonophosphat, J E S Jodessigsäure, 0-5-P Orotidyl-5-phosphat, P anorganisches Phosphat, P P anorganisches Pyrophosphat, P R P P Phosphoribosyl 7 pyrophosphat, R - l - P Ribose-1-Phosphat, R - 5 - P Ribose-5-Phosphat 18

Acta biol. med. german., Bd. 17, Heft 3

262

H . BANASCHAK

diesen Untersuchungen gefundene IMP-Bildung wurde jedoch zumeist nur als Neben fund erwähnt oder als Abbau der vermehrt gebildeten Adeninnukleotide gewertet. Um die Kenntnisse über den Nukleotidstoffwechsel der Erythrozyten zu erweitern, war es von Interesse, die IMP-Bildung in den Zellen unter Verwertung von Inosin bzw. Adenosin näher zu analysieren, nachdem der Mechanismus der Verbesserung des Adeninnukleotidhaushalts der Zellen durch diese Nukleoside grundsätzlich aufgeklärt werden konnte. Für die Aufklärung dieser Reaktion war der Nachweis der Phosphoribosylpyrophosphat-Synthese in der Leber verschiedener Tierarten [7], [8] und in Erythrozyten [9] sowie der Reaktion des P R P P mit Hypoxanthin zu IMP in der Taubenleber [6], [7], [10] von Bedeutung.

In der vorliegenden Arbeit soll die IMP-Bildung aus Inosin und ATP in Hämolysaten menschlicher Erythrozyten zunächst allgemein charakterisiert, sodann die IMP-Synthese über die R-5-P-Pyrophosphokinase- und die IMPPyrophosphorylasereaktion im einzelnen dargestellt und von der Inosinkinasereaktion abgegrenzt werden. Methodik Zur Bereitung von Hämolysaten wurden Erythrozyten mit isotoner NaCl-Lösung plasmafrei gewaschen und die gewaschenen Zellen mit Wasser und, wenn nicht anders angegeben, einem Zusatz von Saponin hämolysiert. Das Hämolysat wurde bei 4 °C über 30 min bei 30000 g stromafrei zentrifugiert. Dialysate wurden gewonnen, indem Hämolysate gegen Aqua dest. im Kühlraum über mehrere Tage unter Zusatz von Penicillin G dialysiert wurden; nach der Dialyse wurden die Stromata wie oben abzentrifugiert. Die Versuchsansätze wurden nach Zusatz der entsprechenden Substrate und Substanzen auf den gewünschten ^H-Wert mittels Glaselektrode eingestellt und im Thermostaten inkubiert. Die Bestimmung der Nukleotide erfolgte papierchromatographisch; den Versuchsansätzen wurden Proben von jeweils 2 ml entnommen und diese mit 0,5 ml 45%iger Trichloressigsäure, die im Mörser bei —20 °C eingefroren war, verrieben. Die ausgefällten Proteine wurden abzentrifugiert und der Extrakt papierchromatographisch mit den von G E R L A C H , F L E C K E N S T E I N und G R O S S [5] angegebenen Lösungsmittelgemischen aufgetrennt. Die unter der UV-Lampe abgezeichneten Flecken wurden in 1 N HCl eluiert und die Eluate spektrofotometrisch gemessen. Die PRPP-Bestimmung erfolgte durch Reaktion von Orotsäure mit P R P P zu 0-5-P mit Hilfe der 0-5-P-Pyrophosphorylase. Die Umwandlung von Orotsäure in 0-5-P ist durch einen Extinktionsabfall bei 295 nm gekennzeichnet; der molare Extinktionskoeffizient dieses Abfalls beträgt 3950 [8]. Jeweils 3 ml Probe wurden mit 1,5 ml 10%iger Trichloressigsäure (TCE) gefällt, im Mörser verrieben und abzentrifugiert. Zu 1 ml des Überstehenden wurden 0,33 ml gesättigte NaCl-Lösung gefügt. Ansätze: (a) Leerwert: 0,5 ml 1 0 ' 2 M Glutathion in 0,2 M Trispuffer, pH 8,0; 4,3 ml 0,2 M Trispuffer pH 8,0; 0,2 ml Ferment, (b) Nullwert; 0,5 ml 10~2 M Glutathion in 0,2 M Trispuffer, pH 8,0; 2,3 ml 0,2 M Trispuffer pH 8,0; 0,5 ml 10~ 3 M Orotsäure; 0,5 ml 5 • 10~2 M MgCl2; 1,0ml Meßprobe; 0,2 ml 2,5 • 10~ 3 M Phosphatpuffer pH 7,0. (c) Meßwert: 0,5 ml 10~2 M Glutathion in 0,2 M Trispuffer, pH 8,0; 2,3 ml 0,2 M Trispuffer, pH 8,0; 0,5 ml 1 0 " 3 M Orotsäure; 0,5 ml 5 • 10" 2 M MgCL,; 1,0 ml Meßprobe; 0,2 ml Ferment. Die Ansätze wurden 2 Std. bei Zimmertemperatur belassen; die Extinktion des Leerwertes und des Nullwertes wurde bei 295 um gegen HzO bestimmt und der Meßwert gegen den Leerwert gemessen.

Inosinmonophosphat-Synthese. II

263

0 - 5 - P - P y r o p h o s p h o r y l a s e w u r d e n a c h d e n A n g a b e n v o n KORNBERG, LIEBERMANN u n d SIMMS [8] a u s B i e r h e f e g e w o n n e n . P R P P w u r d e d u r c h I n k u b a t i o n menschlichen H ä m o l y s a t s m i t A T P u n d R - 5 - P wie folgt dargestellt: 50%iges S a p o n i n h ä m o l y s a t w u r d e m i t d e m gleichen V o l u m e n 0,2 M T r i ä t h a n o l a m i n p u f f e r , pH 8,0, v e r s e t z t u n d 5 - 1 0 ~ 3 M J o d a z e t a t , 1 0 - 2 M F l u o r i d , 10"3 M M g + + , 2 • 10"3 M A T P u n d 5 • 10"3 M R - 5 - P hinzugefügt. N a c h 2 Std. I n k u b a t i o n b e i 37 °C w u r d e d a s H ä m o l y s a t a b g e k ü h l t , d i e P r o t e i n e m i t 1/10 V o l u m e n 4 5 % iger T C E im E i s b a d gefällt u n d sofort a b z e n t r i f u g i e r t . D a s Ü b e r s t e h e n d e w u r d e d a n n m i t N a O H auf pH 8,0 e i n g e s t e l l t u n d d e r P R P P - G e h a l t w i e o b e n b e s c h r i e b e n b e s t i m m t . Dieser E x t r a k t w u r d e als P R P P - S u b s t r a t e n t w e d e r u n m i t t e l b a r eingesetzt oder d a s P R P P wurde aus dem E x t r a k t mittels Ionenaustauschchromatografie über Dowex 1 n a c h d e n A n g a b e n v o n KORNBERG, LIEBERMANN u n d SIMMS [8] a l s B a - S a l z g e w o n n e n .

Ergebnisse

Die Abbildung 1 zeigt die Bildung von IMP in einem stromafreien Hämolysat, das nach Zusatz von Inosin und A T P bei 37 °C und pH 8,3 inkubiert wurde. Um einen Abbau des A T P durch Phosphatasen bzw. seine Verwertung über den glykolytischen Stoffwechselweg weitgehend zu verhindern, wurde den Versuchsansätzen Fluorid und Jodessigsäure hinzugefügt. Die untere Kurve zeigt die IMP-Bildung im Kontrollansatz, dem lediglich A T P , jedoch kein Inosin hinzugefügt wurde. Diese IMP-Bildung über die Adenyl-

säuredesaminase ist in Kontrollansätzen bei allen unseren Versuchen bestimmt und durch Abzug von der IMP-Bildung in den Versuchsansätzen berücksichtigt worden. Der Zusatz von Saponin zu unseren Hämolysaten wurde gewählt, weil sich zeigte, daß das Enzymsystem für die Synthese von IMP aus Inosin und A T P sich nur z.T. frei im Zytoplasma befindet; mit Detergentien läßt sich vielmehr noch ein beträchtlicher Teil Enzymaktivität von den Stromata ablösen (Abb. 2). Saponin und Lysolezithin zeigten von den von uns untersuchten Detergentien den stärksten Effekt. 18*

264

H . BANASCHAK

4 -

a

b

c

d

e

Abb. 2. IMP-Bildung im Hämolysat nach Vorbehandlung der Erythrozyten mit oberflächenaktiven Substanzen. Die Zellen wurden bei Zimmertemperatur mit 4 Volumen HaO lysiert, dem Hämolysat die Detergentien vor dem Abzentrifugieren der Stromata hinzugefügt, (a) Kontrolle; (b) 0,4 ml Saponin einer 10%igen Lösung/20 ml Hämolysat; (c) 0,4 ml Na-cholat einer 10%igen Lösung/10 ml Hämolysat; (d) 20 mg Lysolezithin/20 ml Hämolysat; (e) 0,4 ml Tween 80 einer 10%igen Lösung/20 ml Hämolysat. Weiße Säulen: IMP-Bildung in den Kontrollen mit 2 • 10~3 M ATP; schwarze Säulen: IMP-Synthese aus 2 • 10" 3 M ATP und 10" 2 M Inosin nach Abzug des IMP-Wertes der Kontrollen; Inkubation bei 37 °C; pH 8,3

In der Tabelle 1 ist in drei Versuchsreihen der Einfluß von J E S und Fluorid auf die IMP-Synthese im Saponinhämolysat dargestellt, um den Einfluß dieser Substanzen, die wir aus obengenannten Gründen den Versuchsansätzen zufügten, auf diese Reaktion festzustellen. Es zeigte sich, daß sowohl J E S als auch Fluorid die Bildung von IMP unter den gegebenen Versuchsbedingungen begünstigt, und daß optimale Bedingungen bei dem von uns angewandten kombinierten Zusatz dieser beiden Stoffwechselinhibitoren bestehen. In einem besonderen Versuch wurde der Einfluß von Fluorid auf den IMPGehalt eines Hämolysats überprüft. Zu diesem Zweck wurde ein Hämolysat, dem Phosphat und IMP zugesetzt war, bei 37 °C mit und ohne Zusatz von Fluorid in einer Konzentration von 1 0 ^ M inkubiert. Wie aus Abbildung 3 zu ersehen ist, hat der IMP-Gehalt des Hämolysats nach einer Inkubationszeit von 5 Std. um die Hälfte abgenommen, während bei Zusatz von Fluorid der IMP-Gehalt im Versuchsansatz über die Inkubationszeit unverändert bleibt. Die Abbildung 4 zeigt die Abhängigkeit der IMP-Bildung im Saponinhämolysat. Die obere Kurve gibt die />H-Abhängigkeit der IMP-Bildung in den Kontrollansätzen mit einem ATP-Gehalt von 2 • 10~3 M wieder, während die untere Kurve die Abhängigkeit der wesentlich stärkeren IMP-Bildung unter Zusatz von Inosin darstellt.. Die Differenzkurve mit einem ^>H-Optimum bei 8,3 gibt somit die pHAbhängigkeit der ATP-abhängigen Synthese aus Inosin wieder; die IMP-

Inosinmonophosphat-Synthese. I I

265

Bildung in den Kontrollansätzen, in die verschiedene von ATP zur AMP führende Reaktionen und die Adenylsäuredesaminasereaktion eingehen, zeigt ein Optimum bei 7,5 Tabelle 1 Steigerung der IMP-Synthese im Hämolysat durch Fluorid und J E S . Inkubation bei 37 °C; Phosphatpuffer 3 ++ pH 8,3; 10~ M Mg IMP-Bild ung [• 10" 4 Mol/l/Std.] II III I

Substrate [Mol/1] ATP

2 • 10~3

0,32

_

0,45

0,32

0,95

0,55

3

ATP 2 • 10~ Fluorid 1CT2 ATP JES

3

2 • KT 5 • 1CT3

-

-

1,25

3

ATP 2-10" Fluorid 1CT2 JES 5 • 10" 3 ATP Inosin

2 • 10~3 10~2

0,65

2,1

-

.1,55

1,1

-

3,8

2,4

3,1

-

-

3,5

3

ATP 2 • 1CT Fluorid 10" 2 Inosin 10~2 ATP JES Inosin

2 • 10~3 5 • 10" 3 10~2

ATP 2 • 10" 3 Fluorid 10" 2 JES 5 • 10" 3 Inosin 1CT2

5,6

4,95

-

Die IMP-Synthese erwies sich als ein Mg++-abhängiger Prozeß. In Abbildung 5 ist ein Versuch dargestellt, in dem die IMP-Synthese im Saponinhämolysat in Gegenwart steigender Mg++-Konzentrationen im ^H-Optimum bestimmt wurde. Da die Erythrozyten auch nach dem Waschen mit isotoner NaCl-Lösung noch intrazellulär Mg++-Ionen enthalten, ist die IMP-Synthese auch bei den niedrigsten angewandten Mg++-Konzentrationen noch relativ groß. In Versuchen mit dialysierten Hämolysaten, denen K+-Ionen zugesetzt wurde, war eine IMP-Synthese ohne Mg++-Zusatz kaum noch nachweisbar (Tab. 2). Die Mg++-Ionen ließen sich dagegen hinsichtlich ihrer aktivierenden Wirkung auf die IMP-Synthese zum Teil durch Mn++Ionen ersetzen. Versuche mit dialysierten Hämolysaten zeigten ferner, daß der Verlust an IMP-synthetisierender Aktivität im Verlauf der Dialyse nicht nur auf die Abdiffusion von Mg++-Ionen zurückzuführen ist. Zugabe von Mg++-Ionen

266

H . BANASCHAK

0

1 2 3 4 5 [StdJ —-

Abb. 3. Hemmung des IMP-Abbaus Saponinhämolysat durch Fluorid. 37 Phosphatpuffer, ^H 8,3. O O = lCr 2 M Fluorid; • • = Kontrolle

°C;

Abb. 4. pVL-Abhängigkeit der IMP-Bildung im Saponinhämolysat. 10"2 M Fluorid; 5 - 1 0 " 3 M J E S ; 10" 3 M Mg+ + . Phosphatpuffersystem; im alkalischen Bereich Diäthylbarbiturat-Phosphatpuffersystem bei Erhaltung der Phosphatkonzentration; Inkubation bei 37 °C für 1 Std. • • = 2- 1CT3 M ATP; O o = 2- 10 -3 M ATP + 10-2 Mlnosin; x X = Differenzkurve

zum Dialysat vermag vielmehr nur -1/5—1/8 der ursprünglichen Aktivität des Hämolysats wieder herzustellen. Volle Reaktivierung des Dialysats ließ sich jedoch erreichen, wenn den Versuchsansätzen außer Mg++-Ionen auch K+-Ionen in einer Konzentration von 10" 1 M hinzugefügt wurden. In Abbildung 6 ist die Abhängigkeit der IMP-Synthese aus Inosin und ATP in einem

•4 lg

-3 -2 [Mg**]—+

Abb. 5. Abhängigkeit der IMP-Synthese aus Inosin und ATP im Saponinhämolysat von der Mg+ Konzentration. Inkubationsbedingungen wie in Abb. 4. (Die IMP-Bildung in den Kontrollen ohne Inosinzusatz ist in Abzug gekommen)

•3

-2 -7 0 Ig [K *] — ,

Abb. 6. Abhängigkeit der IMP-Synthese in einem 3 Tage dialysierten Hämolysat von der K+-Konzentration. Inkubationsbedingungen wie in Abb. 4. (Die IMP-Bildung in den Kontrollen ohne Inosin ist abgezogen)

Inosinmonophosphat-Synthese. I I

267

Tabelle 2 IMP-Bildung im dialysierten Hämolysat in Abhängigkeit von Mg + + und Mn + + . 10" 1 M KCl, mit Phosphat auf pH 8,3 gepuffert; Inkubationsbedingungen wie in Abbildung 4 angegeben Bivalente Ionen [Mol/1] Kontrolle Mg + + 10" 3 M n + + 10" 3

IMP-Bildung [• 1 0 - 4 Mol/l/Std.]

'

0,15 3,2 1,9

Tabelle 3 Aktivierung der IMP-Synthèse aus ATP und Inosin im dialysierten Hämolysat durch K + - , NH 4 - und Rb + -Ionen. Inkubationsbedingungen wie in Abbildung 4. (Die IMPBildung in den Kontrollansätzen mit IO - 1 M NaCl bzw. ohne Inosinzusatz ist abgezogen) Ionen [Mol/1] KCl 10" 1 NH4CI « R 1 RbCl 10" 1

IMP-Bildung [• 10" 4 Mol/l/Std.] 8,0 5,2 1,6

dialysierten Hämolysat von der K+-Ionen-Konzentration dargestellt. Das Optimum der Aktivität findet sich bei einer K+-Konzentration von 3 • 10~ 2 bis 1 0 _ 1 M; ein kleiner Teil der Aktivität war auch ohne Zusatz von K+Ionen noch nachzuweisen. Die K+-Ionen können zum Teil durch Ammoniumionen, schwächer durch Rb+-Ionen ersetzt werden (Tab. 3); Li+-Ionen zeigten keinen Effekt. (Durch mitgeführte Kontrollen ist bei diesen Versuchen sowohl die durch Adenylsäuredesaminase bedingte IMP-Bildung als auch der K+-unabhängige Anteil der IMP-Synthese abgezogen worden). Zur vollen Reaktivierung der IMP synthetisierenden Systeme im Dialysat sind ferner Phosphationen notwendig.

Abb. 7. Abhängigkeit der IMP-Synthese im dialysierten Hämolysat von der Phosphatkonzentration. « T 1 M KCl, sonst wie in Abb. 4. (Die IMP-Bildung in den Kontrollen ohne Inosinzusatz ist abgezogen)

-3 -2 -1 Ig [Phosphat] -

268

H.

BANASCHAK

Die Abbildung 7 zeigt die Abhängigkeit der IMP-Synthese im Dialysat in Gegenwart von K+- und Mg++-Ionen von der Phosphatkonzentration. Das Optimum der Aktivität findet sich bei einer Phosphatkonzentration von 5 • 10~2 bis 10"1 M; höhere Phosphatkonzentrationen verringern die Aktivität wieder. Ein kleiner Teil der Gesamtaktivität erweist sich als phosphatunabhängig. Arsenat kann Phosphat bei der Aktivierung der IMP-Synthese nicht ersetzen, während der phosphatunabhängige Anteil der Aktivität durch Arsenat nicht hemmbar ist (Tab. 4). Tabelle 4 I M P - S y n t h e s e im dialysierten H ä m o l y s a t in G e g e n w a r t v o n P h o s p h a t u n d A r s e n a t . 37 °C; pH 8,0; 1 0 _ 1 M K + ; 1 0 " 3 M M g + + ; 5 • 10~ 3 M J E S ; 1 0 ~ 2 M Fluorid. (Die I M P - B i l d u n g in d e n K o n t r o l l e n ohne Inosinzusatz ist abgezogen) IMP-Bildung [• 10" 4 Mol/l/Std.] Vers uch I II

[Mol/1]

A T P 2 • 10~ 3 Inosin 10~ 2 Phosphat i r r 1

8,4

9,0

A T P 2 • 10" 3 Inosin 10~2 Arsenat 10" 1

2,0

1,9

Die Messung der Temperaturabhängigkeit der IMP-Synthese im Hämolysat ergab nach Abzug der IMP-Bildung über die Adenylsäuredesaminase in den Kontrollen, denen kein Inosin hinzugefügt war, ein Temperaturoptimum bei ca. 43 °C (Abb. 8). Die Abbildung 9 zeigt, daß die IMP-Synthese im Hämolysat mit der gleichen Geschwindigkeit verläuft, wenn den Versuchsansätzen an Stelle des Inosins R-5-P und Hypoxanthin in derselben Konzentration hinzugesetzt wird. Da die IMP-Synthese aus Inosin und ATP im Hämolysat sich nicht durch zu-

Abb. 8. T e m p e r a t u r a b h ä n g i g k e i t der I M P - S y n t h e s e aus Inosin u n d A T P im H ä m o l y s a t . 1 0 " J M Phosphat; 1 0 _ 1 M K + ; 1 0 " 3 M M g + + ; 1 0 " ? M Fluor i d ; 5 • i c r 3 M J E S ; 2 • K T 3 M A T P ; 10" 2 M Inosin. (Die I M P - B i l d u n g in d e n K o n t r o l l e n ohne I n o s i n z u s a t z i s t abgezogen)

Inosinmonophosphat-Synthese. II

Abb. 9- IMP-Synthese im Hämolysat aus ATP, R-5-P und Hypoxanthin. • • = S • 1CT3 M ATP + 5 • « r 3 M Inosin; o O = 5 • 1CT3 M ATP + 5 • 1CT3 M R - 5 - P + 5 • 10~ 3 M H x ; sonstige Inkubationsbedingungen wie in Abbildung 8

269

0

1 [stdj

2 —

sätzlich hinzugefügtes Hypoxanthin steigern läßt (Tab. 5), ist aus diesen Versuchen zu entnehmen, daß weder die Nukleosidphosphorylasereaktion noch die Phosphoribomutasereaktion der geschwindigkeitsbegrenzende Schritt für die IMP-Synthese ist. Tabelle 5 IMP-Bildung im Hämolysat unter Zusatz von Hypoxanthin. Inkubationsbedingungen wie in Tabelle 4 angegeben [Mol/1] ATP

IMP-Bildung [• 10~ 4 Mol/1/2 Std.]

2 • 1CT3

2,8

ATP 2 • 10" 3 Inosin 10~2

13,4

ATP Hx

2 • 10~3 10- 2

2,4

ATP 2 • 1CT3 Inosin 10" 2 Hx 1(T 2

12,6

Die IMP-Synthese aus R-5-P, ATP und Hypoxanthin im dialysierten Hämolysat ist phosphatabhängig, obwohl anorganisches Phosphat in keinen der Reaktionsschritte eingeht; die oben dargestellte Phosphatabhängigkeit der IMP-Synthese aus Inosin und ATP ist also nicht allein auf die Nukleosidphosphorylasereaktion zurückzuführen. Die Tabelle 6 zeigt, daß der Einsatz von Triäthanolaminpuffer an Stelle des Phosphatpuffers die IMP-Synthese stark verringert. Nachdem der Reaktionsweg der IMP-Synthese aus Inosin und ATP, der mit phosphorolytischer Spaltung des Inosins eingeleitet wird, grundsätzlich aufgeklärt war, haben wir in den nachstehenden Versuchen die R-5-PPyrophosphokinase- und die IMP-Pyrophosphorylasereaktion im Erythrozyten gezielt untersucht, um die gewonnenen Befunde den jeweiligen Reaktionsschritten der IMP-Synthese zuordnen zu können. Die Abbildung 10 zeigt zunächst die Bildung von P R P P im Saponinhämolysat aus R-5-P und ATP im Verlauf der Inkubation bei 37 °C und pYl 8,0. Die oben beschriebene Phosphatabhängigkeit der IMP-Synthese aus R-5-P und Hypoxanthin und ATP konnte für die R-5-P-Pyrophosphokinasereak-

270

H.

BANASCHAK

Tabelle 6 Phosphatabhängigkeit der IMP-Synthese aus R-5-P, A T P und Hypoxanthin im dialysierten Hämolysat. 37 °C; pH 8,3; Versuchsbedingungen wie in Tabelle 4 angegeben IMP-Bildung [10 - 4 Mol/l/Std.] Puffer

A T P = 2 • 10" 3

A T P = 2 • 10" 3 Inosin = 10~2

[Mol/1]

[Mol/1]

A T P = 2 • 10~3 R-5-P = 5 . 10" 3 Hx = 5 • 10-3 [mol/1]

Phosphat Triäthanolamin

2,2

8,8

9,0 2,2

Phosphat Triäthanolamin

0,4

10,1

8,0 2,6

Phosphat Triäthanolamin + Phosphat

0,8

-

8,3

0,85

-

8,0

tion ausgeschlossen werden; die PRPP-Bildung im dialysierten Saponinhämolysat in Gegenwart von KCl, JES, Fluorid und Mg++-Ionen zeigte sowohl im Tris-, Triäthanolamin- und Phosphatpuffersystem nach 1 ¡2 stündiger Inkubation bei 37 °C die gleichen Werte. Es muß daher geschlossen werden, daß im Syntheseweg des IMP die IMP-Pyrophosphorylasereaktion die phosphatabhängige Reaktion ist. Es konnte weiterhin ausgeschlossen werden, daß die oben beschriebene K+Abhängigkeit der IMP-Synthese der R-5-P-Pyrophosphokinasereaktion zukommt; in unseren Versuchen konnten wir keinen Unterschied der PRPP-Bildung zwischen K+- und Na+-enthaltenen Ansätzen finden. Die R-5-P-Pyrophosphokinasereaktion zeigt ein ^>H-Optimum zwischen 8,0 und 8,5 (Abb. 11).

Abb. 10. P R P P - B i l d u n g im Saponinhämolysat. P h o s p h a t p u f f e r pH 8,0; • • = 2 • 10-3 M ATP; o O = 2 • 10" 3 M A T P + 5 • 1 0 ' 3 M R-5-P; sonstige I n k u bationsbedingungen wie in Abbildung 8

Abb. 11. pH.-Abhängigkeit der P R P P Bildung im Saponinhämolysat. I n k u b a t i o n bei 37 °C f ü r 1 Std.; 5 • 10~ 3 M J E S ; 1 0 " 2 M Fluorid; 1 0 " 3 M Mg + + ; 10 _ 1 M K + ; 5 • 1 0 - 3 M R - 5 - P ; 2 • 10-3M ATP

Inosinmonophosphat-Synthese. I I

271

In Abbildung 42a ist die Abhängigkeit der PRPP-Bildung im Hämolysat von der ATP-Konzentration bei einer R-5-P-Konzentration von 5 • 10"3 M und in Abbildung 12b von der R-5-P-Konzentration bei einer ATP-Konzen-

•

V)

s 3 s o $ 2 'o

Abb. 12. P R P P - B i l d u n g im Saponinhämolysat. (a) Abhängigkeit v o n der A T P K o n z e n t r a t i o n ; m i t 1 0 " 1 M Phosp h a t auf pH 8,3 g e p u f f e r t ; 5 • 10" 3 M J E S ; 10~ 2 M F l u o r i d ; l O " 3 M M g + + ; 5 • lCr3M R-5-P 37 °C. (b) Abhängigkeit von der R-5-PK o n z e n t r a t i o n ; 5 • 10- 3 M A T P Ig

-3

-2

[R-5-PJ-

10 20

30

LS]

trationvon 2 • 10~3 M dargestellt. Für beide Substrate zeigte sich für Konzentrationen über 5 • 10~3M eine Hemmung der Reaktion. Aus dem Anfangsteil der Kurve für die Substratabhängigkeit der PRPP-Bildung ergaben sich Tabelle 7 IMP-Bildung über die IMP-Pyrophosphorylasereaktion im dialysierten H ä m o l y s a t . I n k u b a t i o n bei 37 °C; m i t 1CT1 M Phosp h a t auf pH 7,8 g e p u f f e r t ; K r 1 M KCl; S u b s t r a t e : P R P P ; 5 • 10-3 M Hypoxanthin Angaben in [Mol/1] Kontrolle Mg

++

IMP-Bildung [ t o - 4 Mol/l/Std/ 0,3

1,25 • 10"

3

Mg++ 5 • « r 3 ++

3

++

3

++

3

Mg 5 • 10~ Fluorid 1 0 - 2

Mg S • 10" B o r a t 1,25 • 10" 2 Mg 5 • 10" P y r o p h o s p h a t 10~ 2

3,1 3,6 2,6 1,8

0,2

272

H.

BANASCHAK

für 37 °C und 8,0 folgende MiCHAELis-MENTEN-Konstanten der R-5-PPyrophosphokinase: K M (ATP) = 1,7 • 10" 4 M; K M (R-5-P) = 6,5 • 10" 4 M. Die IMP-Pyrophosphorylasereaktion wurde in dialysierten Hämolysaten, denen P R P P und Hypoxanthin als Substrate zugesetzt wurde, gemessen. Aus der Tabelle 7 ist zu ersehen, daß diese Reaktion magnesiumabhängig ist und durch Fluorid, Borat und Pyrophosphat gehemmt wird. In einem weiteren Versuch konnte gezeigt werden, daß die oben beschriebene K+-Abhängigkeit der IMP-Synthese aus Inosin und ATP im Hämolysat der IMP-Pyrophosphorylasereaktion zukommt. Ein dialysiertes stromafreies Saponinhämolysat wurde mit Na-Phosphat auf pH 8,0 gepuffert, mit P R P P , Hypoxanthin, Mg++- sowie Na+- bzw. K+-Ionen versetzt und bei 37 °C für \ Std. inkubiert. Aus Tabelle 8 ist zu ersehen, daß die IMP-Bildung durch K+-Ionen bedeutend verstärkt wird. Tabelle 8 K + -Abhängigkeit der IMP-Pyrophosphorylasereaktion pH 8,0; 10~3 M Mg ++ ; andere Zusätze wie in Tabelle 7 angegeben [Mol/1] NaCl 10" 1 KCl 10"1

IMP-Bildung [ l ( r 4 Mol/l/Std.] Versuch I II 0,5 2,1

0,6 2,4

Die Abbildung 13 gibt die />H-Abhängigkeit der IMP-Pyrophosphorylasereaktion wieder. Das />H-Optimum liegt bei 7,8 bis 8,0.

Abb. 13. pH-Abhängigkeit der IMP-Pyrophosphorylasereaktion im dialysierten Hämolysat. 37 °C; Inkubation für 1 Std.; lO" 1 M K + ; 1 0 " 3 M Mg ++ . Phosphatpuffersystem: im alkalischen Bereich in Kombination mit Diäthylbarbiturat; Substrate: P R P P ; 5 • 10" 3 M Hypoxanthin

Diskussion

Unsere Versuche mit dialysierten Hämolysaten menschlicher Erythrozyten zeigen, daß in den Zellen neben der IMP-Bildung über eine Adenylsäuredesaminase [1] eine IMP-Synthese unter Verwertung von Inosin stattfindet, wobei die Synthese mit einer phosphorolytischen Spaltung des Nukleosids

Inosinmonophosphat-Synthese. II

273

eingeleitet wird. Die Reaktion verläuft über mehrere Stufen nach folgendem Schema: Hx-R+P R-l-P R-5-P+ATP PRPP+Hx

— R-l-P+Hx R-5-P PRPP+AMP -> I M P + P P

Wird dem Versuchsansatz noch zusätzlich Adenin hinzugefügt, wie es von YOSHIKAWA und NAKAO [ 1 1 ] für die Verbesserung der Blutkonservierung vorgeschlagen wurde, konkurriert dieses Adenin mit dem Hypoxanthin nach der Phosphorolyse des Inosins um das P R P P unter Bildung von AMP. Die IMPSynthese über diesen Reaktionsweg ist sowohl Mg++- als auch K+-und phosphatabhängig. Für die R-5-P-Pyrophosphokinase ist auch von KORNBERG et al. [8] sowie K O R N et al. [6] eine Mg++-Abhängigkeit beschrieben worden. Wir konnten zeigen, daß die IMP-Pyrophosphorylase die K + - und phosphatabhängige Reaktion darstellt. In Gegenwart von J E S und Fluorid ist die IMP-Synthese über den beschriebenen Reaktionsweg stärker als bei Abwesenheit dieser Stoffwechselinhibitoren. Der scheinbar fördernde Einfluß des Fluorids auf die IMP-Bildung muß auf die Hemmung von Phosphatasen zurückgeführt werden, die IMP zum Teil wieder dephosphorylieren (Abb. 3). Der fördernde Einfluß der J E S jedoch kann als Folge der Hemmung der Phosphoglyzerinaldehyddehydrogenasereaktion gedeutet werden, wodurch es zu einem Rückstau an phosphorylierten Metaboliten kommt, die durch die Nukleosidphosphorylasereaktion über den Pentosephosphatzyklus in relativ großen Mengen nachgeliefert werden. Dieser Rückstau bis zum R-5-P erhöht die Substratkonzentration für die R-5-P-Pyrophosphokinasereaktion, wodurch die PRPP-Bildung und somit auch die IMP-Bildung begünstigt werden, wie folgendes Schema veranschaulicht (Abb. 14): Diese Deutung des fördernden Effektes der J E S auf die IMP-Synthese erfordert, daß die R-5-P-Pyrophosphokinasereaktion die geschwindigkeitsbegrenzende Reaktion der IMP-Synthese aus Inosin und ATP ist. Die Nukleosidphosphorylase u n d die P h o s p h o r i b o m u t a s e r e -

i

aktion haben wir als geschwindigkeitsbegrenzende Reaktio-

I

n e n ausschließen k ö n n e n (Tab.

5). Ein Hinweis auf die R-5-PPyrophosphokinasereaktion als geschwindigkeitsbegrenzende Stufe der IMP-Synthese läßt sich aus unseren Bestimmungen der ^>H-Optima der einzelnen Reaktionsstufen ableiten: Das ^>H-Optimum der IMP-Bildung aus Inosin und ATP bei ^>H 8,3

Inosin

| +P R-5-P*

Triosephosphat

_?ES_

Hypoxanthin

\ *ATP

±P.

PRPP*

AMP

^*Hypoxanthin

1,3 DPGS

'

IMP*PP

*ATP

Abb. 14

274

H.

BANASCHAK

stimmt überein mit dem ^H-Optimum der R-5-P-Pyrophosphokinasereaktion, während das />H-Optimum der Nukleosidphosphorylase sowie der IMPPyrophosphorylasereaktion bei niederen />H-Werten liegt. Ein Rest der IMP aus Inosin und ATP synthetisierenden Aktivität fand sich in unseren Versuchen als phosphat- und K+-unabhängig und als nicht hemmbar durch Arsenat. Wir haben nachweisen können, daß diese Restaktivität auf eine direkte ATP-abhängige Phosphorylierung des Inosins zu IMP über eine Inosinkinase zurückzuführen ist, über die an anderer Stelle berichtet werden soll. Literatur [1] B A N A S C H A K , H . : Acta biol. med. german. 16, 485 (1966). [ 2 ] G A B R I O , B . W . U . C . A . F I N C H : J . clin. Invest. 33, 2 4 2 ( 1 9 5 3 ) . [ 3 ] G A B R I O , B. W. U. C. A. F I N C H : Federat. Proc. 13, 51 (1954). [4] G A B R I O , B. W . U. F. M. H U E N N E K E N S : Federat. Proc. 13, 217 (1955)[ 5 ] G E R L A C H , E . , A. F L E C K E N S T E I N U. E . G R O S S : Pflügers Arch. ges. Physiol. Menschen Tiere 266, 5 2 8 ( 1 9 5 8 ) . [6] K O R N , E . D . , C . N . R E M Y , H . C . W A S I L E J K O U. J . M . B U C H A N A N : J . biol. Chemistry 217, 875 (1955). [7] K O R N B E R G , A., I. L I E B E R M A N N U. E . S . S I M M S : J . Amer. ehem. Soc. 76, 2007 (1954). [8] K O R N B E R G , A., I . L I E B E R M A N N U. E. S . S I M M S : J . biol. Chemistry 215, 389 (1955). [ 9 ] P R E I S S , J . U . P H . H A N D L E R : J . biol. Chemistry 225, 7 5 9 ( 1 9 5 7 ) . [ 1 0 ] R E M Y , C. N . , W . T . R E M Y U . J . M . B U C H A N A N : J . biol. Chemistry 217, 8 8 5 ( 1 9 5 5 ) . [ 1 1 ] Y O S H I K A W A , H . U . M . N A K A O : Folia haematol. [Leipzig] 78, 2 4 8 ( 1 9 6 2 ) . Summary Mechanism of formation of inosine monophosphate in h u m a n erythrocytes. I I . Synthesis of inosine monophosphate from inosine upon phosphorolytic decomposition of inosine I n h u m a n hemolysates the I M P synthesis from inosine and A T P which is initiated b y Phosphorylase of the inosine, is defined from adenylic acid desaminase and inosine kinase reactions. I M P synthesis is dependent on Mg + + K + and phosphate. Phosphatedependent are both the nucleoside Phosphorylase reaction and the I M P pyrophosphorylase reaction, the latter representing t h e K + dependent stage. The individual stages of reaction are characterized more closely. I t is concluded t h a t the R-5-P pyrophosphokinase reaction is the speed-limiting step of t h e I M P synthesis through this way of reaction. H . BANASCHAK:

PeaioMe r . E a H a m a K : MexaHH3M 06pa30BaHHH HH03HHM0H0(j»0C(j)aTa B nejiOBeiecKHX apHTpOUHTaX. II. CHHTe3 HH03HHM0H0$0C(|)aTa H3 HH03MHa nOCJie (J)OC, HaHHHaromHiiCH $0C$0pHJia30ft HH03HHa, pa3rpaHHHHBaeTCH OT peaKUHÄ ne3aMHHa3bI aaeHOJIOBOii KHCJIOTbl H HH03HHKHHa3bI. CHHTe3 HH03HHM0H0$0C$aTa 3aBHCHM OT M g + + , K + H XI i s - j g §0 » § >-o oO vO 00

T- N M n -t ro M KHJio pe3Koe noBbimeHHe aKTHBHocra MajiaT«erHji;poreHa3bi, Hocraraiomee 7 0 npouenTOB

y CTeHOSHpoBaHHbix, h 170 npoyeHTOB y njiaBaiomnx Kptic.

Acta biol. med. german., Band 17, Seite 349—356 (1966) Aus dem Institut f ü r gerichtliche Medizin der Humboldt-Universität zu Berlin (Direktor: Prof. Dr. med. O. P R O K O P )

„Xh" — ein genetisch determiniertes a a -Globulin (möglicherweise Xm(a) in Verbindung mit einem weiteren noch unbekanntem, vielleicht geschlechtsbegrenztem Antigen) G.

BUNDSCHUH

(mit E r w ä h n u n g von Daten von Dr. CH. RITTNER1, Bonn) (Eingegangen am 13. 4. 1966)

Zusammenfassung Durch Verwenden eines absorbierten Immunserums vom Pferd wurde im Diffusionstest ein Humanantigen nachgewiesen, das bei Frauen eine Präzipitationshäufigkeit von 77,6% und bei Männern eine Häufigkeit von 21,8% besitzt. I n der Immunoelektrophorese wandert das Antigen als a 2 -Globulin. Die Untersuchung von 66 Familien mit 124 Kindern wies eine genetische Steuerung des als X h bezeichneten Merkmals aus. Die bisher gefundenen drei ,,Ausnahmen" betrafen Mädchen. Die mögliche Beziehung zu dem von B E R G und B E A R N beschriebenen Merkmal Xm(a) sowie eine wahrscheinliche Erbhypothese werden diskutiert. Einleitung Die Anzahl der durch immunoelektrophoretische Analyse nachzuweisenden Serumeiweißkomponenten ist abhängig vom verwendeten Immunserum. Die in F o r m von Präzipitationsbögen dargestellten Eiweißkörper besitzen zum Teil eine genetisch gesteuerte Individualität. Beim Verwenden anderer Untersuchungstechniken (Stärke-' gelelektrophorese, Diffusionstest mit definiertem Antiserum) ist bei einigen Serumeiweißfraktionen eine Heterogenität zu erkennen. So enthält zum Beispiel die /3-Lipoproteidfraktion unter anderem 6 verschiedene, genetisch determinierte Antigene [Ag(a), Ag(b), Ag(x), Ld(a), Lp(a) und Lp(x)], die nur durch die homologen Antiseren nachzuweisen sind. (Zusammenfassende Übersicht im deutschen Schrifttum B U N D S C H U H [5].) Eine derartige Heterogenität ist bei weiteren Serumeiweißfraktionen zu vermuten; sie nachzuweisen, ist sehr wahrscheinlich eine Frage der Untersuchungstechnik. So fanden wir mit unserem Anti-Lp (ax) vom Pferd (Nr. 10) kurze Zeit, nachdem die Lp-Merkmale Lp(a) und Lp(x) bekannt waren ( B E R G [2], B U N D S C H U H [4]), ein Präzipitat gegenüber Humanseren, das zunächst als P r o d u k t unspezifischer Absorption angesehen wurde. D a es reproduzierbar darzustellen war, erfolgte eine systematische Bearbeitung. Dieses Merkmal zeigte sich in Seren bei Frauen wesentlich häufiger als bei Männern. Die in unserer Stichprobe ermittelten Häufigkeiten werden in Tabelle 4 zusammengestellt. Die Untersuchungsbefunde wurden erstmalig im Dezem1

I n s t i t u t f ü r Gerichtliche Medizin der Universität Bonn (Direktor: Prof. Dr. med. H.

ELBEL)

350

G. BUNDSCHUH

ber 1965 geladenen Gästen im Institut vorgetragen. Das erweiterte Material wird nachfolgend mitgeteilt. Das Merkmal wurde, da es eine Beziehung zum Geschlecht zeigte, vorerst X h o r s e genannt (Xh) (BUNDSCHUH [6]). Details zur Nomenklatur siehe unten. Material und Methodik Antiserum Verwendet wurde ein Anti-Humanserum vom Pferd (Nr. 10). Das Immunisierungsschema sowie die bei der Immunisierung von 9 weiteren Pferden gewonnenen E r f a h rungen wurden bereits früher mitgeteilt (BUNDSCHUH et al. [8]). Das Versuchspferd wurde über einen Zeitraum von mehr als 2 J a h r e n mit gepooltem Humanserum sowie mit Serum von Einzelspendern immunisiert. Das Antigen wurde i. v., s. c., i. m. und i. p. appliziert. Absorption Das Immunserum dieses Pferdes enthält unter anderem eine Reihe von a a -Globuline präzipitierenden Antikörpern. Die Absorption dieses Antiserums zu Anti-Gc und AntiLp(ax) wurde bereits an anderer Stelle beschrieben (BUNDSCHUH und K R A U S E [ 7 ] ) . Wird s t a t t eines Lp(a-x-) Humanserums ein Serum vom T y p Lp(a + x + ) zum Absorbieren verwendet, das die Eigenschaft X h nicht besitzt, so resultiert ein Antiserum, mit dem stark ausgeprägte Lp-positive T y p e n noch erfaßt werden können (Sudanfärbung), aber darüber hinaus das erwähnte, allem Anschein nach X-chromosomal gesteuerte Antigen bei den dieses Merkmal tragenden Seren deutlich präzipitiert wird (s. Abb.' 1). T e c h n i k : E i n Teil Humanserum wird mit einem Teil Antiserum vom Pferd gemischt und etwa 2 Std. bei + 3 7 °C aufbewahrt. Anschließend wird zentrifugiert und der Überstand als Antiserum verwendet. E i n „Ausreifen" dieses absorbierten Immunserums durch Lagerung über mehrere Wochen im Tiefkühlschrank scheint die Präzipitation günstig zu beeinflussen. Humanseyen Zur Ermittlung der Präzipitatiönshäufigkeit wurden mehrere Versuchsreihen von Seren gesunder Berliner Blutspender untersucht und zahlreiche Seren des Paternitätsmaterials getestet (siehe T a b . 3 ä —c). Die Studien des Erbganges wurden an Seren von Familien durchgeführt, die in einigen Dörfern des Bezirkes Frankfurt/Oder gesammelt wurden. Untersuchungstechnik a)

Diffusionstest

F ü r die genannten Verfahren wurde Difco-Noble Agar verwendet, wie er zum Nachweis der Ag- und Lp-Merkmale dient (Phosphatpuffer pH 7 , 3 nach ALLISON und B L U M B E R G [1]), für die Immunoelektrophorese wurde Veronal-Laktatpuffer nach H I R S C H F E L D [10] benutzt. Die Präzipitation des „neuen" Merkmals ist nach unseren Erfahrungen nicht an einen bestimmten Puffer gebunden, wie das für den Nachweis der Ag-Faktoren der F a l l ist. Das in Abbildung 1 gezeigte Präzipitat färbt sich nicht mit F e t t f a r b stoffen an, sondern lediglich mit Proteinfarbstoffen. E i n e Färbung mit Alizarinblau-S (Coeruloplasmindarstellung) gelang nicht. b) V e r s u c h e z u r

Reindarstellung

I n orientierenden Versuchen gelang eine Anreicherung des Materials mit Polyvinylpyrrolidon nach der von B U R S T E I N [9] angegebenen Methode. Das bezeichnete Antigen flotierte mit dem Lipoproteid. Lösen des flotierten Materials in geringer Menge i % -

" X h " , ein genetisch determiniertes a2-Globulin

351

i^er NaCl-Lösung. Anschließend Säulenfraktionierung mit Hilfe von Hydroxylapatit. feluieren mit 0,28 M Phosphatpuffer 7,3). In Abbildung 2 wird die immunoelektrophoretische Analyse des in dieser Weise eluierten Materials dargestellt. Auch Säulenchromatographie über Sephadex G 100 und G 200 ist möglich. Eine Arbeit über die Reindarstellung des bezeichneten Antigens befindet sich in Vorbereitung. Nomenklatur Bei der Niederschrift dieser Arbeit erhalten wir Kenntnis von einer Publikation aus der Rockefeiler University, New York ( B E R G und B E A R N [3]), in der ein Merkmal beschrieben wird, das mit dem von uns gefundenen möglicherweise identisch ist. Die Autoren haben das Antigen als a 2 -Makroglobulin identifiziert und verwenden die Bezeichnung Xm(a), B E R G und B E A R N benutzten Immunserum vom Kaninchen. Von drei immunisierten Kaninchen (sämtliche Tiere waren mit dem Serum der gleichen Spenderin immunisiert worden) kamen zwei Tiere interkurrent ad exitum. Das Serum des dritten Tieres enthielt schwach reagierende Antikörper gegen das erwähnte Antigen. Das von uns hergestellte absorbierte Pferdeimmunserum reagierte in der Anfangsphase ebenfalls nur schwach. Wir immunisierten das Pferd über längere Zeit nach, bis das Immunserum das „neue" Antigen deutlich präzipitierte. Die Erfahrungen, die wir beim Lp-Nachweis gewonnen haben, lehren, daß mit schwach präzipitierendem Immunserum nicht sämtliche Merkmalsträger erfaßt werden können. Das von B E R G und B E A R N gefundene Merkmal wurde als Xm(a) bezeichnet. Wir schließen uns dieser Nomenklatur an, sobald die Identität beider Merkmale durch Vergleich von Testseren erwiesen wird. Bis dahin verwenden wir wegen der abweichenden Befunde, insbesondere bei den Frauenseren in unserem Material, die Bezeichnung Xh. So resultiert für unseren Fall bei positivem Ausfall der Reaktion die Schreibweise Xh(-|-), beim Ausbleiben der Präzipitation die Schreibweise Xh( —). Das Antiserum ist entsprechend als Anti-Xh zu bezeichnen. Die Befunde

von

BERG

und

BEARN

Die genannten Autoren fanden folgende Häufigkeiten (Tab. 1): Tabelle 1 Häufigkeiten von Xm(a) in verschiedenen Stichproben (nach BERG u n d BEARN)

Population

männlich Xm(a+) in [%]

Norwegen Weiße U.S. Neger U.S. Island

100 57 81 66

23,0 26,3 30,8 24,2

weiblich Xm(a-f-) in [%] 101 69 151 80

Tabelle 2 Mögliche Geno- und Phänotypen im Xm-System Genotypen Frauen Männer

XmaIXma Xma!Xm XmjXm Xma/Y Xmj Y

Phänotypen Xm(a + ) Xm(a + ) Xm(a-) Xm(a+) Xm(a-)

56,4 50,7 59,6 47,5

352

G. BUNDSCHUH

Aus ihren Untersuchungsbefunden von 28 Familien mit 83 Kindern leiten sie folgende Erbhypothese ab: Das Merkmal wird X-chromosomal gesteuert. Das Gen Xm" dominiert über das vorerst noch hypothetische Allel Xm. Tabelle 2 zeigt die möglichen Geno- und Phänotypen. Aus der X-chromosomalen Steuerung resultiert, daß aus Paarungen: Mann Xm(a + )/ Frau Xm(a)— nur Xm(a — )-Söhne hervorgehen können. Die Töchter von Xm(a + )Vätern müssen X m ( a - f ) sein. X m ( a - ) - P a a r u n g e n können nur Xm(a —)-Kinder hervorbringen. Ausnahmen von dieser Hypothese fanden B E R G und BKARN* nicht.

Ergebnisse

Zur Berechnung der Präzipitationshäufigkeit bei Verwenden des von uns hergestellten Pferdeserums wurden insgesamt 464 Seren untersucht (klinisch gesunde Blutspender und Paternitätsmaterial beiderlei Geschlechts sowie die in Tab. 5 aufgeführten Familien). In den Tabellen 3 a—c werden die Befunde jeder Versuchsreihe in Beziehung zum Geschlecht dargestellt. T a b e l l e 3a Versuchsreihe 1 (Paternitätsmaterial ohne Kinder) n männlich weiblich

54 37

Xh(

r

) in

1

O'"

X h ( - ) in L%J

: /o i

29,7 81,9

7»,3 18,1

Abb. 1. Nachweis des Merkmals Xh im Diffusionstest. Die Serumproben 2 und 4 sind stark positiv, die Scrumprobc 3 reagiert mit Anti-Xh (Zentralloch) in Form schwacher Präzipitatbildung. Die Serumproben 1, 5 und 6 sind negativ

T a b e l l e 3b Versuchsreihe 2 (verwertbares Familienmaterial ohne Kinder) n männlich weiblich

64 70

Xh(-r)in|%]

:

Xh(-)in;%]

21,9

78,1

80,0

20,0

'Xh", ein genetisch determiniertes a 2 -Globulin

353

Abb. 2 a. Immunoelektrophoretische Analyse von Serum und isolierten Serumeiweißfraktionen (Agarose, Phosphatpuffer pH 7,3). oberer K a n a l : unabsorbiertes Anti-Humanserum vom Pferd; unterer K a n a l : absorbiertes Antiserum des gleichen Versuchstieres (Anti-Lp(ax), Anti-Xh); oberes Loch: isoliertes Lipoproteid (s. Text); mittleres Loch: Ausgangsserum für die Fraktionierung; unteres Loch: Lp- und Xh-haltige Serumfraktion; Xh-Antigen durch Pfeil gekennzeichnet, F ä r b u n g : Sudanschwarz, Azokarmin

Abb. 2b. Immunoelektrophoretische Analyse von Xh-positivem — (oberes Loch) und Xh-negativem H u m a n s e r u m (unteres Loch). Antiserum: absorbiertes Anti-Xh. F ä r b u n g : Azokarmin (Fettfärbung negativ) T a b e l l e 3c Versuchsreihe 3 (gesunde Blutspender) x h ( + ) in männlich weiblich

176 63

:%:

19,9 73,1

X h ( - ) in [%: 80,1 26,9

Tabelle 4 Gesamtmaterial

männlich weiblich

294 170

Xh( + ) in [_%]

X h ( - ) in [%]

21,8

78,2 22,4

77,6

Aus den Tabellen 3 und 4 ist abzuleiten, daß das Merkmal, mit unserem relativ stark reagierenden Antiserum getestet, bei Frauen weit häufiger als erwartet auftritt. Die Befunde bei den Männern stimmen mit den von B e r g und B e a r n gegebenen Werten weitgehend überein. Bevor wir die Abweichungen der Ergebnisse bei den Frauen diskutieren, seien die Befunde unserer Familienuntersuchungen demonstriert: (Tab. 5).

354

G.

BUNDSCHUH

Tabelle 5 Familienuntersuchungen mit Anti-Xh vom Pferd (66 Familien mit 124 Kindern, Doppelbestimmungen) Eltern Mann

Nachkommen

[%]

Frau

männlich Xh( + ) Xh(-)

weiblich Xh( + ) Xh(-

Xh( + ) • Xh( + )

13

20,0

9

11

Xh( + ) • Xh( —)

2

3,2

1

1

X h ( - ) • Xh( + )

41

61,4

24

15

X h ( - ) • Xh( —)

10

15,4

gesamt:

66

100,0

1

13

4

22

38

21 13

28

36

Interpretation siehe Text

Diskussion

Aus dem Ergebnis unserer bisherigen Familienuntersuchungen ist abzuleiten, daß das Merkmal genetisch gesteuert wird. Von RITTNER (Institut für Gerichtliche Medizin der Universität Bonn) wurden mit unserem Serum weiterhin 94 Familien getestet. Die gefundenen 13 kritischen Paarungen (beide Elternteile besitzen das Merkmal nicht) wiesen 29 Kinder auf, sämtliche Nachkommen waren ebenfalls negativ (unveröffentlicht). Die unterschiedliche Verteilung des Merkmals bei Frauen und Männern weist auf die Beteiligung eines geschlechtsgebundenen Gens hin. Ist das von BERG und B E A R N beschriebene Merkmal mit dem von uns gefundenen identisch, so reicht die von den Autoren postulierte Erbhypothese zumindest für unser Material und unsere Testergebnisse nicht aus, den Erbgang als ausschließlich X-chromosomal zu interpretieren: In dem von uns vorgelegten Familienmaterial wurden drei „Ausnahmen" von dieser Hypothese gefunden. Die drei Ausnahmen sind weiblichen Geschlechts. Die Ausnahmen im Material von RITTNER finden sich ebenfalls nur unter den weiblichen Nachkommen. Während unsere Familienseren einen Tag oder zwei Tage nach der E n t n a h m e untersucht wurden, war das Material von R I T T N E R bereits über 9 Monate im Tiefkühlschrank gelagert worden. B E R G und B E A R N geben an, noch an 2 Jahre altem Material Xm(a-|-)-Reaktionen beobachtet zu haben. Ob bei so alten Seren in jedem zu erwartenden Fall eine positive Reaktion vorhanden ist, müßte erst durch entsprechende Versuche erwiesen werden.

Da der Einwand des Serumalters bei unserem Material wegfällt, muß eine andere Ursache für die gefundenen „Ausnahmen" sowie den Überschuß weiblicher Merkmalsträger vorhanden sein. Für zwei Fälle wurde die Möglichkeit der Illegitimität durch die bei der Blutentnahme mithelfende Gemeindeschwester nachträglich eingeräumt (in Tabelle 5 durch Fußnote gekennzeichnet). Für die beiden Xh(—)-Mädchen von Xh(+)-Vätern

355

'Xh", ein genetisch determiniertes a 2 -Globulin

könnte geltend gemacht werden, daß das Merkmal bei Kindern erst zu einem späteren Zeitpunkt ausgeprägt wird oder passager fehlt (analog der Ahaptoglobinämie). Die Verteilung unter den weiblichen Nachkommen weist nämlich gegenüber den Erwachsenen insgesamt zu wenige Merkmalträger auf. Eine Versuchsreihe zur Klärung dieser Frage befindet sich in Vorbereitung. Unter 30 Nabelschnurseren wurde bisher keine positive Reaktion gesehen. Die von B E R G und B E A R N sowie von uns festgestellten Häufigkeiten betragen in der Gegenüberstellung (Tab. 6): Tabelle 6 Autoren BERG u n d

BEARN

(Norwegen) eigene Versuche

Merkmal

n

Männer positiv [%]

n

Frauen positiv [%]

Xm(a)

100

23,0

101

56,4

Xh

294

21,8

170

77,6

Während die Werte bei den Männern weitgehend übereinstimmen, werden — wie bereits erwähnt — mit dem Pferdeserum bei den Frauen wesentlich mehr Merkmalträgerinnen erfaßt, als von B E R G und B E A R N angegeben werden. Unter der Annahme, daß mit beiden Immunseren das gleiche Merkmal dargestellt wird, sind folgende Möglichkeiten denkbar: 1. Wird die von uns bei Frauen ermittelte Häufigkeit von 77,6% zu Grunde gelegt, so wäre bei Männern etwa die Hälfte an positiven Reaktionen zu erwarten, falls das von uns hier mitgeteilte Merkmal X-chromosomal gesteuert wird. Gefunden wurden aber nur 22%. Es könnte an ein epistatisch wirkendes Gen auf dem Y-Chromosom gedacht werden. Diese Konzeption ist wenig wahrscheinlich. 2. Wahrscheinlicher ist folgende Hypothese: Infolge der langfristigen Immunisierung des Versuchstieres mit den Seren verschiedener Spender hat das Tier nicht nur Antikörper gegen Xm(a) gebildet, sondern gegen ein weiteres bisher unbekanntes Antigen. Analoge Verhältnisse sind im Gm-, Ag- und Lp-System bekannt. Bis zur Klärung der Verhältnisse verwenden wir — wie oben beschrieben — die Bezeichnung Xh. Das vermutete zweite Antigen bereits jetzt zu bezeichnen, wäre verfrüht. Da in diesem Fall der Überschuß an Merkmalsträgern nur das weibliche Geschlecht betrifft, ist zu vermuten, daß das zusätzlich erfaßte Antigen geschlechtsbegrenzt (weiblich) ist. Gegenwärtig sind wir damit beschäftigt, durch weitere Absorptionsversuche und Feststellung der Titer bei männlichen und weiblichen Merkmalsträgern eine Abgrenzung der beiden Hypothesen herbeizuführen. Die Präzipitate der Seren weiblicher Merkmalsträger waren häufig stärker ausgebildet als die männlicher Merkmalsträger (Dosiseffekt oder Summationseffekt mit dem zweiten hypothetischen Antigen). Aus den bisherigen Ergebnissen zusätzlich andere Hypothesen abzuleiten, wäre Spekulation. Weitere Mitteilungen werden in Kürze folgen.

356

G . BUNDSCHUH

Literatur [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9]

[10]

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Summary G . B U N D S C H U H : " X h " —a genetically determined a 2 -globulin (possibly X m (a) in combination with a further, still unknown, perhaps sex-limited antigen)

Using an absorbed immune serum of horse, a h u m a n antigen is detected b y diffusion test having a precipitation rate of 77,6 per cent for women and 21,8 for men. In immune electrophoresis t h e antigen migrates as a 2 -globulin. An investigation of 66 families with 124 children revealed a genetic directedness of t h e characteristic feature denoted as " X h " . Three "exceptions" found so far, were girls. The possible relation with t h e feature Xm(a) described b y B E R G and B E A R N and a probable heredity hypothesis are discussed. Pe3JOMC r . E y H H i u y : , , X h " — reHeraiecKH N E T E P M H H H P O B A H H B I I I a 2 -mo6yjiHH ( B O 3 Xm(a) B C B H 3 H C HajIbHeftlUHM, HeHBeCTHLIM enje IIOJIOCnCHHcJjHHHblM aHTHreHOM)

MOJKHO

npHMeHflH norJiomeHHyio HMMyHHyio cbraopoTKy jiomanH, aBTop B H H B H J I iipn noMomH HH(J)(j)y3H0HH0r0 TecTa lejioBeiecKHH äHTiireH, oQjianaiomMH nacTOTOH oca>KHeHHH B 77,6 npoueHTOB y ÎKÊHIIIHH H 21,8 npoijeHTOB y MywHHH. B HMMyHH03JieKTpoope3e 3TOT aHTHreH MHrpnpyeT nam A 2 -rjio6yjiHH. MccjiejioBaHHe 66 ccMeiicTB c 124 neTBMH BbmBHjio reneTHiecKyio HanpaBJieHHOCTb npHSHana X h . HaHReHHbie no CHX n o p , ,HCKJiioHeiiHH" Kacaniicb acByine«. 06cy?KaacTCH B03MOIKHOE OTHOiueHHe K onwcaHHOMy B e p r o M H B a p H O M npH3HaKy Xm(a), a TaKwe BepoHTHaH rnnoTe3a yHacjie«OBaHHH.

Kurzmitteilungen

Acta biol. med. german., Band'17, Seite 357 — 359 (1966) Aus dem Institut für Pharmakologie der Friedrich-Schiller-Universität, Jena (Direktor: Prof. Dr. H . A N K E R M A N N )

Die Hexobarbitalnarkose bei infantilen Ratten W . KLINGER u n d H .

ANKERMANN

(Eingegangen am 22. 4. 1966)

Zusammenfassung Durch fortgesetzte Hexobarbitalbehandlung läßt sich die Narkosedauer infantiler R a t t e n unter Hexobarbital erheblich verkürzen und den Werten reifer Tiere annähern. Diese offenbar durch Induktion von arzneimittelabbauenden mikrosomalen Enzymen erreichte Beschleunigung der physiologischen Reifung ist nicht von Bestand. Nach Wegfall des Induktors verlängert sich die Narkosedauer wieder und geht auf altersgemäße Werte zurück, erreicht sie aber nicht ganz, sondern f ü g t sich in den physiologischen Reifungsprozeß ein. Aus diesen Versuchen wird die Annahme hergeleitet, die physiologische Reifung könne als geregelte physiologische De-Repression einer genetisch fixierten Anlage aufgefaßt werden.

In vorangegangenen Untersuchungen fanden wir, daß bei einer Wiederholung der Hexobarbitalnarkose im Abstand von 24 Std. die Narkosedauer infantiler Ratten erheblich verkürzt und den Werten reifer Ratten angenähert wird [1], Nach übereinstimmenden Befunden zahlreicher Autoren ist die Narkosedauer unter Hexobarbital dem Hexobarbitalabbau eng korreliert [2]. Die bei wiederholten Hexobarbitalgaben beobachtete Verkürzung der Narkosedauer kann daher als Folge eines durch Induktion mikrosomaler arzneimittelabbauender Enzyme der Leber beschleunigten Hexobarbitalabbaus angesehen werden. Es ist also möglich, die Entwicklung mikrosomaler arzneimittelabbauender Enzyme, deren Induktion und Rückbildung mittels der Hexobarbitalnarkose quantitativ zu verfolgen. Dabei interessiert besonders die Frage, ob die bei infantilen Tieren durch wiederholte Hexobarbitalapplikation den Werten erwachsener Tiere angenäherte Narkosedauer erhalten bleibt oder ob wieder eine Verlängerung auf das altersgerechte Niveau erfolgt, wenn die tägliche Induktorwirkung des Hexobarbitals wegfällt. Wir führten entsprechende Untersuchungen an infantilen Wistar-Ratten unter den gleichen Versuchsbedingungen wie früher [1] durch. Die Ergebnisse sind in Abbildung 1 dargestellt.

358

Kurzmitteilungen

Bei täglicher Hexobarbitalapplikation nähern sich die Narkosezeiten in bekannter Weise exponentiell den Werten erwachsener Tiere [1]. Bei Aussetzen der Behandlung nach der dritten Hexobarbitalgabe und Wiederholung nach 1, 2, 3 bzw. 5 injektionsfreien Tagen bewegen sich die Narkose-

Abb. 1. Narkosedauer von £ WistarR a t t e n unter 140 mg/kg Hexobarbital i.p. Versuchsgruppen (mehrmalige Hexobarbitalgaben): • • ; Kontrollgruppen (einmalige Hexobarbitalgaben): O O. Anzahl der Versuchstiere in Klammern hinter den Einzelwerten. Stark ausgezogene Linie: Rückgang der Induktion unter Berücksichtigung aller Gruppen mit unterschiedlich langem behandlungsfreien Intervall nach dem 15. Lebenstag Lebenstag

Zeiten wieder auf die Werte zu, wie sie bei erstmaliger Applikation von Hexobarbital bei Ratten gleichen Alters beobachtet werden. Dieses Ergebnis konnte in mehreren, wenig modifizierten Versuchen reproduziert werden. Die durch Induktion erreichte Beschleunigung der Entwicklung mikrosomaler Leberenzyme ist bei unserem Modell demnach nicht von Bestand. Dies Ergebnis legt den Gedanken nahe, daß die Entwicklung mikrosomaler Leberenzyme nach der Geburt kein einfacher „Reifungsvorgang" ist, der sich nach einer Beschleunigung ja nicht wieder spontan zurückbilden würde, sondern daß es sich um einen in seiner Geschwindigkeit geregelten Vorgang handeln könne. Nach vorangegangenen Untersuchungen [3], [4] scheint der Induktor am Regulator-Gen anzugreifen und im Sinne einer De-Repression zu wirken. Er greift nach den vorliegenden Ergebnissen beschleunigend in den normalen „Reifungsvorgang" ein. Folglich läßt sich auch der Prozeß der „Reifung" als eine ,,De-Repression" auffassen. Die durch die lange Narkosedauer demonstrierte geringe mikrosomale Aktivität infantiler Ratten spricht für eine ausgeprägte Hemmfunktion des Regulator-Gens. Mit zunehmendem Alter findet eine „physiologische De-Repression" s t a t t : Die Hemmfunktion des Regulator-Gens geht zurück, die mikrosomale Aktivität steigt an, die Narkosedauer unter Hexobarbital wird verkürzt.

Kurzmitteilungen

359

Offensichtlich wird diese De-Repression geregelt: Nach Wegfall des Induktors als „Störgröße", die zu einer Enthemmung des Regulator-Gens führte, geht die Enzymaktivität der Versuchsgruppe in Richtung auf das altersgerechte Niveau zurück, erreicht es aber nicht ganz, sondern mündet in die physiologische „Reifung" mit einer Geschwindigkeit ein, die sich als Resultante aus der inzwischen weitergelaufenen „physiologischen De-Repression" und der „Auslenkung" durch den Induktor unter Berücksichtigung der Enzymhalbwertszeit erklärt. Der Nachweis von Hemmstoffen in der Kernund Mitochondrienfraktion der Leber unreifer Tiere [5] weist auf die Möglichkeit einer Regelung durch spezifische Inhibitore hin. Nach unseren Versuchen erscheint die Bildung mikrosomaler arzneimittelabbauender Enzyme während der ersten Lebenswochen als „geregelte physiologische De-Repression" einer genetisch fixierten Anlage. Weitere biochemische Untersuchungen zur Stützung dieser Hypothese sind im Gange. Literatur [1] ANKERMANN,

H.,

W . K L I N G E R U. A . M Ö L L E R :

Acta biol. med. german. 14,

496

(1965).

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J. R . F O U T S : J. Pharmacol. exp. Therapeut. 142, 242 (1963). [ 3 ] K L I N G E R , W . : Acta biol. med. german. 13, 890 (1964). [4] K L I N G E R , W. U. M. K O C H : Acta biol. med. german. 14, 133 (1965). [ 5 ] F O U T S , J . R . U. R . H . A D A M S O N : Science [Washington] 129, 8 9 7 ( 1 9 5 9 ) R O G E R S , L . A . , G . A . A L C A N T A R A U.

Acta biol. med. german., Band 17, Seite 360 — 363 (1966) Aus dem Institut für gerichtliche Medizin und Kriminalistik der Ernst-Moritz-ArndtUniversität Greifswald (Direktor: Prof. Dr. med. habil. E. S C H E I B E )

Der Einfluß von Zink-Glyzinat auf die Antikörperbildung des Kaninchens S. WIERSBITZKY u n d E .

SCHEIBE

(Eingegangen am 24. 4. 1966) Zusammenfassung Kaninchen, die erfolglos mit OM- und ON-Erythrozyten (zur Herstellung blutgruppenspezifischer Anti-MN-Seren) immunisiert worden waren, bekamen ZnGlyzinat (2 mg Zn/kg) i.V.. 14 Tage nach der Injektion t r a t im Rahmen einer Gammaglobulinämie ein erhöhter Antikörpertiter der Agglutinine auf. Die Abhängigkeit der Antikörperzunahme vom Grad der Gammaglobulinänderung ist statistisch hochsignifikant.

Zink wird als ubiquitäres Element im pflanzlichen und tierischen Organismus weit verbreitet gefunden. Seine relativ hohe Konzentration in vielen Geweben rechtfertigt eigentlich kaum noch seine Bezeichnung als „Spurenelement". Viele Wirkungen des Zinks im Stoffwechsel sind noch unbekannt; doch dürfte der hauptsächliche Angriffsmechanismus in der In- und Reaktivierung von Fermenten liegen. V A L L E E [ 7 ] unterscheidet deshalb zwischen Zinkenzymen, Zinkenzymkomplexen, Zinkproteinen und Zinkproteinkomplexen, je nach der Art der Bindung zwischen Metall und Protein. So gibt es Enzymsysteme, die durch die Entfernung des Zinkanteils völlig inaktiviert werden, andere zeigen nur eine reversible Hemmung. In letzter Zeit fanden K R A N T Z [4] und K R A N T Z [3] Wirkungen des Zn auf den Eiweißstoffwechsel der Kaninchen: Nach Gaben von Zn-Aminosäuresalzen kam es regelmäßig zu einer Hypergammaglobulinämie zwischen der 2. und 3. Woche post injectionem.

Uns interessierte nun die Frage, ob bei einer so hervorgerufenen Steigerung der Gammaglobuline im Tierversuch auch gleichzeitig ein Anstieg der Immunglobuline zu beobachten ist. Methodik Kaninchen, die vor mehreren Wochen erfolglos zur Herstellung von blutgruppenspezifischen Anti-M- und Anti-N-Seren mit Erythrozyten der Blutformel OM bzw. ON immunisiert worden waren, wurden für die Untersuchung benutzt. Sie erhielten einmalig 2 mg Zn/kg Körpergewicht als Zn-Glyzinat i.v. Die Herstellung des ZnGlyzinats erfolgte nach der Methode von H E Y K E [2]. Als Kontrollen dienten Tiere, die 0,9%ige NaCl-Lösung i.v. bekamen. Die Blutentnahmen erfolgten vor der Gabe des Zn-Salzes, nach 3, 7 und 14 Tagen. Die Seren wurden gesammelt und bis zur endgültigen Aufarbeitung bei — 20 °C aufbewahrt.

361

Kurzmitteilungen

Aus den Elektropherogrammen wurde der mittlere Gamma-Globulin-Anstieg über 14 Tage statistisch ermittelt. Die inaktivierten Rohseren wurden gegen frische E r y throzyten der Muster AjM, AjN, A2, OM, ON und B titriert (ungar. Mikrotitrator Labor 3971) und die Änderung des Titers (in Stufen) mit der mittleren Gamma-Globulin-Zunahme über 14 Tage verglichen. Ergebnisse

Die Ergebnisse der Versuche gehen aus Tabelle 1 und Abbildung 1 hervor. Abbildung 1 zeigt, daß die Tiere mit dem höchsten Gamma-GlobulinAnstieg auch den stärksten Anstieg der Agglutinine zeigten. Der AntikörTabelle 1

Tier-Nr.

Mittlere Änderung der Gamma-Globuline [Rel.%]

Änderung des Titers [in Stufen]

5/11 5/13 5/14 5/19 5/22 1022

6,0 5,9 3,4 4,7 0,8 -0,6

5 4 2 4 1 0

Kontrolle 5/06 5/07

—

-1,5

(1) 0

pertiter ging dabei prallel zum Grad der Gammaglobulinämie; Tiere, die nicht mit Gammaglobulin Vermehrung reagierten, zeigten auch keine signifikant erhöhte Antikörperproduktion.

Abb. 1. Beziehung zwischen y-Globulinen und Agglutininen. x = Änderung des Titers in Stufen; y = mittlerer Anstieg der y-Globuline (rel. %); a, b, c = errechnete Werte

Mittels einer linearen Regressionsanalyse wurden die Regressionsgerade y = o,56 + 0,65 • x (y = Titeranstieg in Stufen, % = mittlere GammaGlobulin-Änderung in rel %) und der Korrelationskoeffizient r = 0,972 bestimmt. 25

Acta b'ol. med. german., Bd. 17, Heft 3

362

Kurzmitteilungen

Für 0,-1 % Irrtums Wahrscheinlichkeit und 5 Freiheitsgrade ist der Zufallshöchstwert für den Korrelationskoeffizienten r = 0,95

(nach

WEBER

[8]).

Da der errechnete Wert des Korrelationskoeffizienten über dem Zufallshöchstwert liegt, ist der Grad der linearen Abhängigkeit zwischen x und y hochsignifikant gesichert. Diskussion

Da Zink als Bestandteil der prosthetischen Gruppe von Enzymen bekannt ist, ist sein Einfluß auf die synthetischen Leistungen der Zelle verständlich. Da auch Fermente des Eiweißstoffwechsels (VALLEE [7], W O L F F [ 9 ] — [ 1 2 ] ) durch Zink in ihrer Aktivität beeinflußt werden, ist einzusehen, daß es nach Zinkzufuhr zu einer Anregung der Proteinsynthese kommen kann. Während K R A N T Z [3], [4] in den ersten Tagen nach Zinkzufuhr eine Zunahme der «-Globuline, am Ende der ersten Woche eine Steigerung der /^-Globuline und gegen den 14. Tag einen Anstieg der y-Globuline konstatierte, ist hier nachgewiesen, daß es im gleichen Rahmen auch zu einer Vermehrung an spezifischem Immunglobulin im Serum kommt. Andererseits ist nicht zu verkennen, daß der Ablauf der Pherogramme etwa einem unspezifischen Stress-Syndrom entspricht (SELYE [6], WUHRMANN und W U N D E R L Y [ 1 3 ] ) . Es ist somit durchaus möglich, daß die Steigerung der Immunglobuline im Blutserum gar keine echte Neubildung, sondern nur eine Freisetzung schon praeformierten Proteins aus dem RHS im Rahmen des ,,Alarmsyndroms", evtl. auch im Sinne einer anamnestischen Reaktion ist. Herrn Dozent Dr. L I P P M A N N vom Institut für Diabetes-Forschung und -Behandlung „Gerhardt Katsch" Karlsburg, Kr. Greifswald (Direktor: Prof. Dr. M O H N I K E J ) danken wir für die Anfertigung der Elektropherogramme. Herr H. P O S E R , Leiter der Biostatistischen Abteilung an der Universität Greifswald, führte freundlicherweise die Signifikanzberechnung durch. Für technische Assistenz danken wir Fräulein A N I T A Z E S S I N und Fräulein E L K E M Ö L L E R Literatur F L A S C H E N T R Ä G E R , B. u. E. L E H N A R T Z , Hrsg.: Physiologische Chemie. E i n L e h r und Handbuch Bd. 1 und 2/1 a u. b. Springer-Verlag, Berlin-Göttingen-Heidelberg 1951 u. 1954. [2] H E Y K E , H . - E . : Zinkkomplexe einiger Aminosäuren und verwandter Verbindungen. Math.-nat. Diss., Göttingen 1 9 5 4 zit. nach K R A N T Z , J . [ 3 ] . [ 3 ] K R A N T Z , J . : Über den Einfluß von Zinkverbindungen auf die Serumproteine und das rote Blutbild anämischer Kaninchen. Med. Inaugural-Diss., Greifswald 1965. [4] K R A N T Z , S. : Über den Einfluß von Zinkverbindungen auf die Serumproteine des Kaninchens. Med. Inaugural-Diss., Greifswald 1965. [5] L E T T E R E R , E . : Handbuch der Allgemeinen Pathologie. Band IV/II. Teil. Springer-Verlag, Berlin-Göttingen-Heidelberg 1957. [1]

Kurzmitteilungen

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25*

363

A c t a biol. m e d . g e r m a n . , B a n d 17, Seite 364 — 367 (1966) A u s d e m I n s t i t u t f ü r g e r i c h t l i c h e Medizin u n d K r i m i n a l i s t i k d e r E r n s t - M o r i t z - A r n d t Universität Greifswald (Direktor: Prof. Dr. med. habil. E . S C H E I B E )

Nachweis von Hämopexin in Nabelschnurseren R . GIEBELMANN u n d S. WIERSBITZKY

( E i n g e g a n g e n a m 25. 4. 1966)

Zusammenfassung I n 32 N a b e l s c h n u r s e r e n v o n S c h n i t t e n t b i n d u n g e n u n d 45 v o n N o r m a l e n t b i n d u n g e n k o n n t e in 8 1 % bzw. 9 8 % d e r F ä l l e n a c h A n r e i c h e r u n g m i t S e p h a d e x - G - 2 5 auf d a s 2,5fache Hämopexin stärkegel- und immunelektrophoretisch nachgewiesen werden. u n d M i t a r b e i t e r [14] e n t d e c k t e n p a p i e r e l e k t r o p h o r e t i s c h in d e r ¡8-Fraktion des m e n s c h l i c h e n B l u t s e r u m s ein H ä m - b i n d e n d e s Globulin. I m m u n e l e k t r o p h o r e t i s c h zeigte es sich als i d e n t i s c h m i t d e m ß t B-Globulin [13]. N a c h G R A B A R et al. [8] w i r d es h e u t e v o r w i e g e n d als H ä m o p e x i n (Hx) b e z e i c h n e t [22]. P r o Mol v e r m a g es 1 Mol H ä m i n zu b i n d e n . D e r H ä m o p e x i n g e h a l t des n o r m a l e n m e n s c h l i c h e n S e r u m s b e t r ä g t ca. 100 m g % [9]. N a b e l s c h n u r s e r e n g e b e n n a c h v e r s c h i e d e n e n A u t o r e n i m I m m u n e l e k t r o p h e r o g r a m m k e i n o d e r n u r ein k a u m e r k e n n b a r e s H x - P r ä z i p i t a t [4], [10], [11], [15], [18], [24], NEALE

Wir haben 45 Nabelschnurseren von normal- und 32 von schnittentbundenen Neugeborenen unvorbehandelt und nach Zusatz von menschlichem Hämoglobin stärkegel- und immunelektrophoretisch auf peroxidaseaktive Fraktionen untersucht. Parallel dazu erfolgten Konzentrierungen der Proben auf das 2,5fache mittels Sephadex-G-25- Die Konzentrate wurden ebenfalls elektrophoretisch aufgetrennt und auf Hämoglobin- und Hämin-bindende Fraktionen bzw. Präzipitate analysiert. D i e S t ä r k e g e l - E l e k t r o p h o r e s e w u r d e n a c h S M I T H I E S [23] in d e r M o d i f i k a t i o n v o n B U N D S C H U H [3] u n d M Ü L L E R [12] ( B o r a t p u f f e r pH 1 1 , ^ = 0,05 b z w . P h o s p h a t p u f f e r pH 7,5, yu = 0,08, S p a n n u n g s a b f a l l 8 V / c m , D a u e r 2 Std.) d u r c h g e f ü h r t . D i e selektive A n f ä r b u n g e r f o l g t e d u r c h B e n z i d i n / B a r i u m p e r o x i d in 5 0 % i g e r E s s i g s ä u r e . Z u r A g a r g e l - I m m u n e l e k t r o p h o r e s e w u r d e die M i k r o m e t h o d e n a c h S C H E I D E G G E R [21] a n g e w e n d e t (pH. 8,2, S p a n n u n g s a b f a l l 12 V / c m , D a u e r ca. 2,5 Std.). Als A n t i s e r e n d i e n t e n jeweils 1 p o l y v a l e n t e s A n t i h u m a n s e r u m v o m P f e r d u n d v o m K a n i n c h e n . D i e P r ä z i p i t a t e w u r d e n m i t A m i d o s c h w a r z 10 B sowie m i t B e n z i d i n / B a r i u m p e r o x i d in 50%iger Essigsäure sichtbar gemacht.

Im Stärkegel-Elektropherogramm erscheint das Hämopexin sowohl bei pYL 11 als auch bei ^>H 7,5 ca. in Höhe der 3 . - 4 . Hb-Hp-Bande des Haptoglobintyps 2-2 (Abb. -1). Bei Hp 1-1-Seren läßt es sich daher neben dem Haptoglobin nachweisen, im Gegensatz zu D E I C H E R und Mitarbeitern [5] sowie Nix und HARTMANN [16]. Immunelektrophoretisch findet man einen

Kurzmitteilungen

Abb. 1. Stärkegel-Elektropherogramm von Normalseren der drei Hp-Typen und zwei angereicherten Nabelschnurseren bei pH 11 nach Anfärbung mit Benzidin/Bariumperoxid in 50%iger Essigsäure

365

Hb

Hp 2-2

Hx

Hp 1-1

Hx

Hp2-1

Präzipitatbogen, der vom Transferrin- zum Haptoglobin H p 1-1- bzw. Hp 2-1-Bogen verläuft (Abb. 2 und 3). Bei den untersuchten 32 Nabelschnurseren von Schnittentbindungen konnte nach Anreicherung in 26 Fällen Hämopexin nachgewiesen werden. Bei den Normalentbindungen gelang das in 44 von 45 Fällen. Nur in 3 Serumproben war auch schon vor der Konzentrierung stärkegelelektrophoretisch die Hx-Bande zu sehen. Demnach enthält das Blutserum der Neugeborenen in der überwiegenden Mehrzahl der Fälle Hämopexin. Die Konzentration ist offenbar niedriger als im Serum Erwachsener (vgl. [1]). Die Schwierigkeiten beim Nachweis dürften aber vorrangig an der Qualität bzw. Spezifität der Antiseren und an der gegenüber der Peroxida-

Abb. 2. Immunelektropherogramm von zwei Nabelschnurseren bei pH 8,2 nach Anfärbung mit Amidoschwarz 10 B

Abb. 3. Immunelektropherogramm von H ä m - H x und H b H p nach Anfärbung mit Benzidin/Bariumperoxid in 50%iger Essigsäure

366

Kurzmitteilungen

sereaktion wesentlich unempfindlicheren Anfärbbarkeit mit Amidoschwarz 10 B liegen. Unter der Annahme, daß Stoffwechselbeziehungen zwischen Haptoglobin und Hämopexin bestehen (vgl. [17]) und daß die häufige Ahaptoglobinämie bei gesunden Neugeborenen [2], [6], [7], [19], [20] durch Verbrauch bedingt ist, könnte man aus unseren Befunden schließen, daß der Häm-Hx-Komplex wesentlich langsamer als der HbHp-Komplex aus der Blutbahn eliminiert wird. Fräulein E D E L T R A U D K A R G E und Fräulein E L K E M Ö L L E R sei für fleißige technische Mithilfe gedankt. H e r r n Doz. Dr. med. habil. R. H O H L B E I N , Chefarzt der Frauenklinik des Bezirkskrankenhauses Stralsund, danken wir für die freundliche Überlassung von Blutmustern Literatur W. : Immunanalyse von Glykoproteinen: I n : H. P E E T E R S : Protides of t h e biological fluids. Proceedings of t h e twelfth colloquium, Bruges 1964, Elsevier Publishing Co. Amsterdam, London, New York 1965, S. 363. [2] B E C K M A N , L . U. M . G R I V E A : Haptoglobin variations in newborn children. Acta genet. [Basel] 14, 159 (1964). [3] B U N D S C H U H , G. : Über ein vereinfachtes Verfahren zur qualitativen Haptoglobinbestimmung aus menschlichen und tierischen Seren. Dtsch. Gesundheitswes. 15, 2103 (1960). [ 4 ] C E R R U T I , P . , C . B O R R O N E U. G . C O R D O N E : Tecniche immunoelettroforetiche per la dimostrazione deH'aptoglobina. Aspetti nel siero di adulto e di cordone ombelicale. Minerva pediat. 14, 2 6 4 ( 1 9 6 2 ) . [1]

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Kurzmitteilungen

367

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Acta biol. med. german., Band 17, Seite 368 —370 (1966) Aus dem Institut für Gerichtliche Medizin der Humboldt-Universität zu Berlin {Direktor: Prof. Dr. med. O. P R O K O P )

Untersuchungen über den Agglutiningehalt der Eiweißdrüsen verschiedener Farbe bei Helix pomatia ST. SCHNITZLER u n d K . - O .

BARTZ

(Eingegangen am 10. 5- 1966) Zusammenfassung Für den Agglutiningehalt der Eiweißdrüsen von Helix pomatia-Exemplaren, die zur gleichen Jahreszeit am selben Tag gesammelt und untersucht wurden, ist die Farbe der Drüse nicht von Belang. In denselben Mengen Trockenpulfer findet sich annähernd der gleiche Agglutiningehalt.

Im Rahmen von Untersuchungen nach neuen Quellen für Blutgruppensubstanzen zu Immunisierungszwecken haben sich 1965 PROKOP, SCHLESINGER und RACKWITZ in verschiedenen Arbeiten [1] —[5] mit Wirbellosen befaßt und hierbei noch unbekannte Quellen für Pj-Substanz erschlossen. Auf diesen Arbeiten fußend, fand SCHEIBE mit seinen Mitarbeitern gleichfalls eine P r S u b s t a n z oder, wie PROKOP und Mitarbeiter sich vorsichtig ausdrückten, eine Pi-like substance bei Aurelia aurita (Ohrenqualle) [6]. Im Mai 1965 berichtete PROKOP auf dem Berliner Internationalen Gynäkologenkongreß, daß er mit seinen Mitarbeitern RACKWITZ und SCHLESINGER ein Blutgruppensystem B (Anti-A) bei Helix hortensis gefunden habe [7], [8]. Als auf der Suche nach weiteren und neuen Helixexemplaren in der Umgebung von Berlin mehrere Weinbergschnecken gefunden wurden, wurden auch diese untersucht. Sie hatten ebenfalls B-Substanz und nebenher einen hochthermostabilen außergewöhnlich starken Antikörper vom Typ Anti-A, der wegen einiger Besonderheiten Anti-A hel bezeichnet wurde [9]. Vergleichsuntersuchungen an tierischen Blutkörperchen zeigten, daß Anti-A hcI aus Helix hortensis durchaus anders als Anti-A (human) reagiert [10]. Eingehende Studien schließlich brachten das Ergebnis, daß Anti-A hel von Helix pomatia nicht aus inkorporierten Phytagglutininen stammen kann, sondern in der Eiweißdrüse der Schnecken gebildet wird und in hochkonzentrierter Form vorkommt [7], [9]. Anti-A heI präzipitiert im übrigen sowohl direkt als auch im OUCHTERLON Y-Test sezernierte A-Substanz und auch Bakterien [10 a] und scheint ein immunbiologisches Reagenz auf Verbindungen mit endständigem N-Azetyl-D-Galaktosamin zu sein [11], [12]. 1966 veröffentlichten BOYD et al. [13], ohne die Originalarbeiten des Berliner Instituts zu erwähnen, über weitere „Molluskagglutinin"-Träger und vor allem Otala lactea.

Kurzmitteilungen

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13. II. II. A.

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