Acta Biologica et Medica Germanica: Band 18, Heft 5 [Reprint 2021 ed.] 9783112518724, 9783112518717

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HERAUSGEBER:

R. B A U M A N N , H. D U T Z , A. G R A F F I , H. G U M M E L , F. J U N G L.-H. K E T T L E R , S. M. R A P O P O R T U N T E R M I T A R B E I T VON:

W. B E I E R , H. D R I S C H E L , H. F R U N D E R , M. G E R S C H , E. GOETZE, H. HANSON, F. H A U S C H I L D , G . H O L L E , F. MACH, H. M A T T H I E S , G. M O H N I K E f , O . P R O K O P , K . S C H U B E R T , F . S C H W A R Z , G. S T E R B A , A. W O L L E N B E R G E R SCHRIFTLEITUNG:

W. S C H E L E R , H. B I E L K A

A K A D E M I E - V E R L A G • B E R L I N • B A N D 18 • H E F T 5

• S E I T E 555-665 • 1967

AUFNAHMEBEDINGUNGEN

1. E s werden nur Arbeiten angenommen, die nicht an anderer Stelle mit demselben Inhalt veröffentlicht oder zur Veröffentlichung angeboten werden. Der Autor verpflichtet sich nach Annahme, die Arbeit an keiner anderen Stelle zu veröffentlichen. 2. Die Arbeit m u ß wissenschaftlich wertvoll sein.

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hinaus können bis zu 100 Sonderdrucke gegen Berechnung bezogen werden.

Die Herausgeber

ACTA BIOLOGICA ET MEDICA G E R M A N I C A Herausgeber : R. B a u m a n n • H. D u t z • A. G r a f f i • H. G u m m e l • F. J u n g • L.-H. K e t t l e r S. M. R a p o p o r t B a n d 18

1967

Heft 5

Acta biol. med. german., Band 18, Seite 555 — 561 (1967) Aus dem Physiologisch-chemischen Institut der Karl-Marx-Universität (Komm. Direktor : Prof. Dr. W. R O T Z S C H )

Leipzig

Zum Problem der Kopplung zwischen aktivem Natriumund Monosaccharidtransport in der Dünndarmschleimhaut D . DETTMER, F . MÜLLER und

E.

KUHFAHL

(Eingegangen am 30. 11. 1966) Zusammenfassung 1. Bei einem erhöhten aktiven Monosaccharidtransport in der Dünndarmschleimhaut (z. B. unter Alloxan-diabetischen Bedingungen) ist die Na-K-Aktivität der Mg-Na-K-aktivierten Ouabain-hemmbaren ATPase erniedrigt. 2. Ouabain hemmt die Na-K-Aktivität, beeinflußt aber nicht die intrazelluläre Galaktoseakkumulation. 3. Glukose hemmt die Na-K-Aktivität und wird trotzdem aktiv transportiert. 4. Anhand dieser Befunde werden neue Gesichtspunkte der Kopplung zwischen aktivem Na- und Zuckertransport diskutiert, insbesondere eine mögliche Bedeutung des ATPase-Systems.

Natrium- und Monosaccharidtransport sind in der Dünndarmschleimhaut eng miteinander gekoppelt [1], [2]. Beide Transporte können sich wechselseitig beeinflussen. So erhöht Glukose das transmurale Potential [1], [2], ein Zeichen für die Stimulierung des Natriumtransports von Mukosa zu Serosa. Andererseits ist bei einem gesteigerten Natriumtransport, z. B. nach Mineralokortikoidapplikation, auch der Zuckertransport erhöht [3]. Fehlt Natrium im Medium, so werden Monosaccharide nicht aktiv transportiert [1], Natrium ist nötig für den Eintritt des Zuckers in die Zelle, zum anderen wird ihm bei der Energiebereitstellung für den aktiven Transportprozeß eine Funktion zugeschrieben [ 1 ] , C R A N E postuliert einen NatriumZucker-Carrier, der in die Zelle eintritt und dort infolge der niedrigen intrazellulären Natriumkonzentration dissoziiert. Diese wird gewährleistet durch einen aktiven Natrium-Efflux. Bei aktiven Ionentransporten nimmt die 38

Acta biol. med. german., Bd. 18, Heft 5

556

D . DETTMER, F . MÜLLER, E . KUHFAHL

Mg-Na-K-aktivierte, Ouabain-hemmbare ATPase eine zentrale Stellung ein [4], [5]. Im Zusammenhang mit der CRANEschen Theorie wäre bei einem erhöhten Zuckertransport eine höhere ATPase-Aktivität zu erwarten. Im Gegensatz hierzu konnten wir in einer früheren Kurzmitteilung [7] zeigen, daß unter Alloxan-diabetischen Bedingungen, also bei einem erhöhten Zuckertransport [6], die Na-K-Aktivität der Mg-Na-K-aktivierten, Ouabainhemmbaren ATPase erniedrigt ist. In der vorliegenden Arbeit haben wir diesen Befund unter verschärften Bedingungen überprüft und bestätigen können. Mögliche Schlußfolgerungen auf den Kopplungsmechanismus zwischen aktivem Zucker- und Natriumtransport werden diskutiert. Methodik Versuchstiere waren normale und Alloxan-diabetische B D - I I I - R a t t e n (150 —200 g) bzw. Goldhamster von etwa 70 g Gewicht. Der Alloxan-Diabetes wurde durch i.v. Injektion von 30 mg • k g - 1 Alloxan als 2,5%ige Lösung in Zitrat-Phosphat-Puffer, pH 4,0 [8] erzeugt. Die Versuche wurden am 4. Tag nach der Injektion durchgeführt. Den aktiven Zuckertransport erfaßten wir mit der Akkumulationsmethode nach C R A N E und M A N D E L S T A M [9], Die evertierten Dünndarmringe wurden in Anlehnung an BOSACKOVA und C R A N E [10] in einem K R E B S - H E N S E L E I T - B i k a r b o n a t - P u f f e r inkubiert, der anstelle von Natrium Tris-(hydroxymethyl)aminomethan (Tris)-Bikarbonat enthielt. Das Tris-Bikarbonat wurde durch Begasen einer Tris-Lösung mit C0 2 hergestellt. Die genaue Zusammensetzung des Inkubationsmediums war (Angaben) in mM): MgS0 4 1,2; K H 2 P 0 4 1,2; CaCl2 1,2; KCl4,8; Tris-HC0 3 25. Die Versuche wurden in einem RING-WARBURG-Gerät bei 37 °C durchgeführt; Gasphase 95% 0 2 / 5 % CO,.. Nach etwa 10 min Temperaturausgleich gaben wir Galaktose aus dem Seitenarm hinzu und inkubierten 10, 20 und 30 min (Doppelbestimmungen). Als Zucker verwendeten wir die aktiv transportierte, aber kaum metabolisierte Galaktose in einer Konzentration von 5 mM. Galaktose wurde mit o-Toluidin bestimmt [11]. Für die Untersuchung über die Ouabain-Wirkung auf die Galaktoseakkumulation kamen außer R a t t e n auch Goldhamster zum Einsatz. Die Inkubationszeit betrug 20 min (jeweils 3fach-Bestimmungen im Paarvergleich). Meßgröße für die intrazelluläre Akkumulation sind die Quotienten der Galaktosekonzentration in Gewebswasser und Medium (G/M). Das Gewebswasser ermittelten wir aus der Differenz Feuchtgewicht — Trockengewicht (durchschnittlich 80%). Gleichzeitig bestimmten wir die ATPaseAktivitäten der Dünndarmmukosa und verwendeten dazu eine „cell-debris-fraction" [12], [13]- Mg-, M g - N a - K - und Mg-Na-K-Aktivität unter 10" 4 M Ouabain wurden parallel bestimmt. Die einzelnen Ansätze enthielten 3 ¡xMol Tris-ATP, 3 ¡¿Mol Mg, 10 [/.Mol K, 100 (xMol Na, 30 fi.Mol Tris-HCl (pH 7,4) in einem Endvolumen von 1 ml. Das Mg-Medium wurde durch Saccharose-Zusatz auf die gleiche Tonizität gebracht. Tris-ATP präparierten wir mit Hilfe von Dowex 50. Das freigesetzte anorganische Orthophosphat bestimmten wir mit einem gering modifizierten Verfahren [14] nach M A R T I N und D O T Y [15], Protein nach L O W R Y et al. [16], etwa 20—50 ¡xg/Ansatz. Die einzelnen Ansätze wurden 5 min vorinkubiert; die Versuchszeit betrug ebenfalls 5 min. Leerwerte wurden gleichartig behandelt, das Eiweiß aber nach dem Phosphat-Reagenz hinzugegeben. Die ATPase-Aktivität wird angegeben in ¡/Mol P,/mg Protein/5 min. Ergebnisse

In Abbildung 1 sind die Gewebswasser/Medium-Quotienten für Galaktose in Abhängigkeit von der Zeit dargestellt. Sie liegen in unseren Untersuchungen bei Alloxan-diabetischen Ratten etwa doppelt so hoch und sind somit ein

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Natrium- und Zuckertransport Abb. 1. Gewebswasser/Medium-Quotienten normaler und alloxandiabetischer Ratten in Abhängigkeit von der Zeit

Beweis für den erhöhten Zuckertransport unter diabetischen Bedingungen. Gleichzeitig haben wir bei beiden Versuchsgruppen die ATPase-Aktivitäten bestimmt. In Tabelle 1 sind die Mg, Mg-Na-Kund die Mg-Na-K-Aktivitäten unter 10~ 4 M Ouabain gegenübergestellt. Die Na-K-Aktivität ist bei diabetischen Ratten signifikant erniedrigt (p < 0,01; min 2seitige Fragestellung). — Im Zusammenhang hiermit untersuchten wir die Wirkung von Ouabain auf die intrazelluläre Galaktose-Akkumulation. C S Ä K Y et al. [ 1 7 ] , [ 1 8 ] konnten mit der „everted sac "-Technik [19] eine Hemmung des aktiven Zuckertransports durch die Darmschleimhaut feststellen. Mit der Akkumulationsmethode war in unseren Untersuchungen bei Goldhamstern unter OuabainKonzentrationen von 10~ 5 , 1 0 - 4 und 1 0 - 3 M und bei Ratten unter 1 0 - 3 M keine statistisch signifikante Erniedrigung der intrazellulären GalaktoseAkkumulation nachweisbar (Tab. 2). Tabelle 1 einer ,,cell-debris-fraction" der Dünndarmmukosa normaler und alloxandiabetischer Ratten. Die Aktivitäten werden angegeben in /¿Mol P /mg Protein/S min

ATPasen-Aktivitäten

Normaltiere Alloxan-Diabetes

N

Mg

Mg-Na-K

Mg-Na-K + 1 0 ~ 4 M Ouabain

9 8

4,0 5,4

5,8 6,25

5,05 5,75

Na-K-Aktivität

x± s

1,78 ± 0,055 0,85 ± 0,058

Tabelle 2 Intrazelluläre Galaktaseakkumulation der Dünndarmmukosa von Goldhamstern und R a t t e n unter verschiedenen Ouabainkonzentrationen. Auswertung im Paarvergleich. G/M = Quotient der Galaktosekonzentrationen in Gewebswasser und Medium, d ^ sd = arithmetisches Mittel der Differenzen und Standardabweichung Tier Goldhamster Goldhamster Goldhamster Ratte 38*

N

G/M ohne Ouabain

G/M mit Ouabain

Ouabain in M

5 5 5 5

3,1 3,4 4,2 1,0

2,7 2,9 3,9 0,87

10-3 10~ 4 10" 5 «r3

d 0,40 0,52 0,40 0,14

i

sd

± ± ± ±

0,25 0,317 0,317 0,16

t

¿0,01

3,60 3,7 2,84 1,96

4,6 4,6 4,6 4,6

558

D . DETTMER, F. MÜLLER, E .

KUHFAHL

A u c h die durch Glukose hervorgerufene Steigerung des transmuralen Potentials zeigte unter Ouabain nicht die erwartete Hemmung [20]. LARIS et al. [21] und EWERS et al. [22] beschrieben eine H e m m u n g der A T P a s e von E r y t h r o z y t e n durch Phlorrhizin, Phloretin und Glukose. Die N a - K - A k t i v i tät unserer Mukosa-Präparation wird auch durch Glukose gehemmt (Abb. 2). Die 50%ige Hemmung liegt bei etwa 6 MM, unter 10 mM Glukose ist keine N a - K - A k t i v i t ä t mehr nachweisbar.

mMol

Glukose

Abb. 2. Glukosehemmung der N a - K - A k t i v i t ä t der Mg-Na-K-aktivierten Ouabain-hemmbaren ATPase. Schraffiert: Mg-Aktivität ohne Na+ und K+

Diskussion Nach CRANE [1], [23] besteht der aktive Zuckertransport aus einem Zweischrittmechanismus: 1. ein Na-abhängiger und energieunabhängiger Eintritt in die Zelle und 2. eine Na- und energieabhängige intrazelluläre A k k u mulation. CRANE [23] u n d SCHULTZ u n d Z A L U S K Y [24] n e h m e n an, d a ß N a p a s s i v m i t

der Glukose in die Zelle eintritt, die Triebkraft des Transports sei der bergab Na-Gradient, der durch einen aktiven N a - E f f l u x aufrechterhalten wird. Der aktive N a - E f f l u x kann mukosa- oder serosawärts gerichtet sein. Zur Zeit wird mehr die zweite Möglichkeit diskutiert [25]. Energiebedürftig im eigentlichen Sinne wäre dann nur der Na-Transport. Die Energie für den aktiven Ionentransport stellt eine spezifische A T P a s e , die durch M g - N a - K aktiviert und durch Ouabain gehemmt wird, aus A T P zur Verfügung. Offensichtlich handelt es sich hierbei nicht um ein einzelnes E n z y m , sondern um ein komplexes E n z y m s y s t e m in der Zellmembran. Die genaue Lokalisation ist noch unbekannt, wir vermuten aber, daß diese A T P a s e an der Mukosaund Serosaseite der Zellmembran vorhanden ist. CSAKY et al. [17], [18] beschrieben eine Hemmung des Zuckertransports durch die Darmschleimhaut unter Ouabain. BITTNER und HEINZ [26] konnten eine Ouabainhemmung der Aminosäureakkumulation in EHRLICH-Aszitestumor-

Natrium- und Zuckertransport

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zellen nachweisen. In einer neueren Untersuchung zeigten L Y O N und C R A N E [27], daß Ouabain die durch Glukose hervorgerufene Steigerung der transmuralen Potentialdifferenz weiter verstärkt, die nach W R I G H T [ 2 5 ] an der Serosaseite der Zelle zustande kommt. Angriffspunkt des Ouabain ist die ATPase, und diese rückt nun auch in bezug auf den Zuckertransport in den Mittelpunkt des Interesses. Es wäre zu erwarten, daß eine gesteigerte intrazelluläre Zuckerakkumulation eine erhöhte ATPase-Aktivität erfordert und daß Faktoren, die zu einer Steigerung der Aktivität führen, die Akkumulation verstärken und Faktoren, die hemmend wirken, die Zuckerakkumulation erniedrigen. Im Gegensatz dazu ist in unseren Untersuchungen bei einer erhöhten Akkumulation (unter diabetischen Bedingungen) die Na-K-Aktivität der Transport-ATPase erniedrigt. Wir können dieses Ergebnis weiter erhärten durch die Glukoseund Ouabainbefunde. Ouabain und Glukose hemmen die ATPase, Ouabain beeinflußt aber nicht die intrazelluläre Galaktoseakkumulation, und Glukose wird unter diesen Bedingungen aktiv transportiert. Nach unseren Untersuchungen besteht also keine einfache Korrelation zwischen ATPase-Aktivit ä t und aktivem Zuckertransport. Auch einige Angaben in der Literatur lassen sich in diesem Sinne deuten. So beschrieben BOSACKOVA und C R A N E [10] eine Hemmung des Zuckertransports durch Li, K, Rb, Cs, NH 4 und erklären diese durch kompetitives Verdrängen des Na vom Carrier. Diese Ionen wirken aber auch auf die ATPase im Sinne einer Aktivierung bzw. Dephosphorylierung. Die Transport-ATPase benötigt zur Aktivierung intrazelluläres Na [28], [29], extrazelluläres Na hemmt die Aktivität [30], [34], [32] aber ermöglicht erst einen aktiven Zuckertransport [1], Eine erniedrigte Aktivität bei erhöhtem Zuckertransport ist danach durchaus verständlich. Wir sehen uns daher veranlaßt, die Fragen der Kopplung zwischen Ionenund Zuckertransport, insbesondere das Problem der Energiebereitstellung für den aktiven Transportprozeß, unter neuen Gesichtspunkten zu diskutieren. Interessant sind in diesem Zusammenhang die Experimente von G A R R A H A N und G L Y N N [33] über die „Entkopplung" der Natrium-Pumpe am Erythrozyten. Eine niedrige intrazelluläre Natrium-Konzentration, ein kleiner ATP/P r Quotient oder ein Fehlen von extrazellulärem K führt zu einer Entkopplung der Natrium-Pumpe. In Kalium-freiem Medium zeigen Erythrozyten einen ATP-abhängigen Natrium-Transport bei äußerst geringer ATP-Hydrolyse. Die Autoren nehmen an, daß das ATP zur Bildung eines Natrium-Carriers verwendet wird, und daß dieser Carrier fast keinen Veränderungen unterliegt, da durch das fehlende Kalium die Dephosphorylierung verhindert wird. Auch die Glukosehemmung der ATPase könnte eine Hemmung der Dephosphorylierung bzw. eine zumindest partielle Entkopplung der Pumpe sein, denn mit unserer Methodik erfassen wir die ATPasen-Aktivität nur anhand der Freisetzung des anorganischen Orthophosphats, nicht aber die ATP-Spaltung. Möglicherweise ist eine Aufrecht-

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D . DETTMER, F . MÜLLER, E .

KUHFAHL

erhaltung der Phosphorylierung des ATPasen-Intermediates oder andererseits eine fehlende oder gehemmte Dephosphorylierung Voraussetzung für einen aktiven Zuckertransport. Faktoren, die das Intermediat stabilisieren, müßten dann einen Zuckertransport gewährleisten, andere, die zum Zerfall führen, eine Hemmfunktion haben. Eine mögliche Konsequenz wäre ein Zusammenhang zwischen Na-Zucker-Carrier und ATPasen-Intermediat. Ein schlüssiger Beweis steht aber noch aus. Weitere Experimente sind in Vorbereitung. Literatur R. IC.: Federat. Proc. 2 4 , 100 (1965). P. E . : Federat. Proc. 2 4 , 9 9 3 ( 1 9 6 5 ) .

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GLYNN,

[29]

WHITTAM,

Natrium- und Zuckertransport

561

Summary D. D e t t m e r , F. M u e l l e r and E. K u h f a h l : Problem of coupling between active sodium- and monosaccharide transport in the small-intestine mucosa 1. With increased active monosaccharide transport in the small-intestine mucosa — for instance in conditions of alloxan diabetes — the Na-K-activity of the M g - N a - K activated ouabain-inhibited ATPase is lowered. 2. Ouabain is inhibiting the Na-K-activity while not affecting intracellular accumulation of galactose. 3. Glucose is inhibiting the Na-K-activity, but is nevertheless actively transferred. 4. The results led to new ideas about the coupling between active sodium- and monosaccharide transport, in particular an eventual importance of the ATPase system. Pe3K»Me J}. JHeTTMep, : K Bonpocy o conpHweHHH Me>KAy a K T H B H b l M TpaHCnOpTOM HaTpMH H MOHOCQXapHHOB B C J l H 3 H C T O f t 060JI0MK6 TOHKOH

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Actabiol. med. german., Band 18, Seite 563 — 571 (1967) Aus dem Physiologisch-chemischen Institut der Karl-Marx-Universität Leipzig (Komm. Direktor: Prof. Dr. W . R O T Z S C H )

Untersuchungen über die Aufnahme freier Fettsäuren durch die diabetische Leber in vivo E . KUHFAHL, F . MÜLLER u n d D.

DETTMER

(Eingegangen am 3. 10. 19 66) Zusammenfassung An alloxandiabetischen Kaninchen wurden Plasmakonzentration, hepatische Extraktionsrate und Bilanz der unveresterten Fettsäuren (UFS) bestimmt. Die UFS-Extraktionsrate der diabetischen Leber ist signifikant vermindert, die UFS-Aufnahme infolge der erhöhten Plasmakonzentration gegenüber dem Normaltier gesteigert. Sowohl durch Insulin als auch durch Fruktose wird die hepatische Extraktionsrate für UFS signifikant erhöht. Die Ergebnisse werden diskutiert unter dem Gesichtspunkt der Regulation der hepatischen Fettsäureaufnahme. Einleitung

In vorangegangenen Untersuchungen [1] hatten wir Anhaltspunkte dafür gewonnen, daß die hepatische Aufnahme unveresterter Fettsäuren (UFS) außer von deren Plasmakonzentration [2], [3] auch vom Stoffwechselzustand der Leber beeinflußt wird. Je schneller die zunächst proteingebundenen Fettsäuren [4] nach Überführung in die Koenzym-A-Thioester in den Stoffwechsel eingeschleust werden, desto schneller erfolgt der Nachstrom aus dem Plasma. Die von der Leber aufgenommenen Fettsäuren unterliegen, abgesehen von einem geringen Teil, der oxydiert wird, der Veresterung zu Triglyzeriden und Phospholipiden [5] — [7]. Dabei kommt dem a-Glyzerophosphat (a-GP) eine regulierende Rolle zu [8]. Über die Regulation der Veresterung muß das a-Glyzerophosphat auch Einfluß auf die Fettsäureaufnahme nehmen. Die gesteigerte Extraktionsrate der Leber für UFS unter der Zufuhr von Fruktose [1 ] kann so durch die vermehrte Bildung von a-GP [9], [10] zwanglos erklärt werden. Offenbar wird die Verknüpfung zwischen Kohlenhydrat- und Fettsäurestoffwechsel in der Leber bereits bei der Regulation der Aufnahme unveresterter Fettsäuren wirksam. Unter diesem Gesichtspunkt ist bei diabetischen Tieren nicht nur infolge der erhöhten UFS-Plasmakonzentration, sondern auch durch den gestörten Kohlenhydratstoffwechsel der Leber eine Beeinflussung der hepatischen Fettsäureaufnahme zu erwarten.

564

E. K u h f a h l , F. M ü l l e r , D. D e t t m e r

In der vorliegenden Arbeit untersuchten wir an alloxandiabetischen Kaninchen den UFS-Umsatz der Leber sowie sein Verhalten unter Insulin und Fruktose. Methodik Versuchstiere waren Kaninchen mit operativ eingelegten K a t h e t e r n ' in Lebervene, P f o r t a d e r (zur B l u t e n t n a h m e ) und Jugularvene (zur Infusion). Die Versuche wurden a m frei beweglichen, nicht anästhesierten Tier u n t e r postabsorptiven Bedingungen im s t e a d y State des Stoffumsatzes d u r c h g e f ü h r t , der d u r c h kontinuierliche Infusion von F r u k t o s e bzw. Insulin eingestellt wurde. Einzelheiten der Versuchsanordnung wurden bereits beschrieben [1], Den experimentellen Diabetes erzeugten wir durch Alloxan (150 m g • k g - 1 in Phosp h a t - Z i t r a t p u f f e r , pH 4, gelöst [11]), das nach 24stündiger N a h r u n g s k a r e n z injiziert wurde. Die optimale Injektionszeit b e t r u g 8 min. Zur Vermeidung initialer hypoglykämischer Schocks wurde nach der Alloxaninjektion über einen Zeitraum von 12 Std. Glukose infundiert. Die Tiere wurden 6 —8 Tage d a n a c h operiert, wenn die Blutglukosekonzentration ständig > 250 m g % war. Die Stoffwechselbilanz der Leber f ü r U F S berechneten wir aus dem hepatischen Plasm a d u r c h f l u ß (mit W o f a v e r d i n bestimmt) und der transhepatischen Konzentrationsdifferenz. Einzelheiten der analytischen Methodik vgl. [1]. F ü r U F S berechneten wir a u ß e r d e m die hepatische E x t r a k t i o n s r a t e . Sie ist als v o m Plasmaspiegel unabhängige Größe (vgl. Ergebnisse) gut geeignet, den E i n f l u ß des Stoffwechselzustandes der Leber auf die hepatische U F S - A u f n a h m e zu charakterisieren. Wie beim normalen Tier [1] bestehen auch beim diabetischen Tier in der Kontrollperiode (RiNGER-Infusion) u n d u n t e r der kontinuierlichen Z u f u h r von F r u k t o s e u n d Insulin keine signifikanten und systematischen Differenzen zwischen der U F S - P l a s m a konzentration in der Arterie u n d in der P f o r t a d e r . F ü r die Berechnung des hepatischen Stoffumsatzes w u r d e nur die arterielle Konzentration berücksichtigt. Die Infusionsgeschwindigkeiten und die hepatischen U m s a t z r a t e n sind auf 1 kg K ö r pergewicht bezogen. Die statistische Auswertung erfolgte im Paarvergleich (/-Test) mit zweiseitiger Fragestellung. F ü r die Signifikanzprüfungen wurde eine Irrtumswahrscheinlichkeit p < 0,05 vorgegeben. Ergebnisse und Diskussion

In Tabelle 1 sind Plasmakonzentration, hepatische Bilanz und Extraktionsrate für UFS der diabetischen Tiere denen der normalen Tiere gegenübergestellt. Die Plasmakonzentration der UFS ist bei den diabetischen Tieren signifikant erhöht infolge einer gesteigerten Abgabe freier Fettsäuren aus dem Fettgewebe durch die im Insulinmangel erschwerte Verwertung der Glukose. Entsprechend dem gesteigerten Fettsäureangebot an die Leber ist auch die hepatische UFS-Bilanz der diabetischen Tiere erhöht, allerdings in geringerem Grade als der Plasmaspiegel. Das ist zurückzuführen auf die verminderte UFS-Extraktionsrate der diabetischen Leber. Um auszuschließen, daß diese verminderte Extraktionsrate lediglich eine Folge des erhöhten UFS-Plasmaspiegels ist, prüften wir ihre Abhängigkeit von der Plasmakonzentration (Abb. 1).

565

Fettsäureaufnahme durch diabetische Leber Es besteht sowohl bei den normalen wie auch bei den diabetischen Tieren keine Korrelation zwischen arterieller UFS-Plasmakonzentration und hepatischer Extraktionsrate (Korrelationskoeffizienten: r = 0,002 [normale Tiere]; r = 0,0003 [diabetische Tiere]). Die verminderte hepatische Extraktionsrate muß demnach als Folge einer diabetischen Störung des Leberstoffwechsels angesehen werden. Unter der kontinuierlichen Infusion von kg- 1

• Std.- 1

0.05.IE Insulin fällt die arterielle Plasmakonzentration auf 62,5% des Ausgangswertes ab, gleichzeitig steigt die Extraktionsrate der Leber von 32,5% auf 54,2%, d. h. sie wird über den Wert des normalen Tieres angehoben (Abb. 2, Tab. 2). Die Wirkung tritt bereits innerhalb von 2 Std. nach Beginn der Insulinapplikation ein. Die absolute UFS-Bilanz der Leber wird unter Insulin nicht verändert (Tab. 3, Abb. 2). Aus den einleitend dargelegten Gründen infundierten wir den alloxandiabetischen Tieren Fruktose (0,25 und 0,75 g- kg" 1 • Std. - 1 ). Fruktose wird von der Leber des diabetischen Kaninchens ebensogut verwertet wie beim normalen Tier (Übersicht bei L e u t h a r d t und S t u h l f a u t h [12]). Die Beeinflussung des UFS-Umsatzes durch Fruktose geht aus den Tabellen 2 und 3 hervor. Die Ergebnisse können wie folgt zusammengefaßt werden: 1. Die Plasmakonzentration der UFS sinkt ab. 2. Die hepatische Extraktionsrate steigt an. 3. Die UFS-Bildung der Leber wird erhöht. Die Zufuhr von 0,75 g • kg- 1 • Std.- 1 zeigt prinzipiell die gleichen Wirkungen wie am normalen Kaninchen [1 ]. Auffallend ist lediglich der geringe Abfall der arteriellen Plasmakonzentration an UFS. Wie Kontrollversuche am epididymalen Fettgewebe der Ratte ergaben, hemmt Fruktose die Abgabe der UFS am diabetischen Gewebe in wesentlich geringerem Ausmaß als am Fettgewebe normaler Tiere (in Vorbereitung). Wie unsere Ergebnisse zeigen, ist beim alloxandiabetischen Tier die hepatische Extraktions-

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Abb. 2. UFS-Plasraakonzentration (cA = Arterie, cLV — Lebervene), hepatische E x traktionsrate (ER) für U F S und UFS-Bilanz der Leber sowie Plasma-Glukosekonzentration alloxandiabetischer Kaninchen unter der Infusion von 0,05 I E • kg" 1 • S t d . - 1 Insulin. N = 4

Fettsäureaufnahme der Leber eine charakteristische Wirkung des Hormons. Die Abhängigkeit der transhepatischen Konzentrationsdifferenz von der Plasmakonzentration der UFS und dem hepatischen Stoffwechselzustand wird in Abbildung 3 dargestellt. Ein wesentliches Merkmal der diabetischen Leber ist die stark reduzierte Fettsäuresynthese auch unter Zufuhr von Fruktose [18]. Daraus ergab sich die Fragestellung, zu prüfen, inwieweit durch eine gleichzeitige Infusion von Fruktose und Insulin auch beim alloxandiabetischen Tier die Fettsäuresynthese zu normalisieren ist. Die Versuchsergebnisse sind in Abbildung 4 dargestellt. Nach einer 3stündigen Kontrollperiode infundierten wir 0,25 g • k g - 1 • S t d . - 1 Fruktose und danach zusätzlich Insulin (0,05 I E • k g - 1 • Std. -1 ). Die transhepatische Konzentrationsdifferenz und die Extraktionsrate, die unter der

Fettsäureaufnahme durch diabetische Leber

569

Abb. 3- Transhepatische Konzentrationsdifferenz {CA — Clv) für U F S in Abhängigkeit vom UFS-Plasmaspiegel der Arterie (c^). — I = normale Tiere, I I = alloxandiabetische Tiere, I I I = alloxandiabetische Tiere unter Fruktose (0,75 g • k g - 1 • Std - 1 ). • = Normaltier; • = Alloxan-Diabetes; o = Diabetes-Fruktose

Abb. 4. Transhepatische Konzentrationsdifferenz (cA — cLV) und Extraktionsrate der Leber (ER) für U F S alloxandiabetischer Kaninchen unter der kombinierten Infusion von Fruktose und Insulin. N = 3

570

E . KUHFAHL,

F . MÜLLER, D . DETTMER

Zufuhr von Fruktose zunächst ansteigen, verringern sich deutlich in den letzten Stunden der Insulininfusion. Wir deuten diesen Befund als eine Hemmung der Fettsäureaufnahme durch eine wiedereinsetzende Fettsäuresynthese der Leber. Literatur Acta biol. med. german. 17, 6 7 1 ( 1 9 6 6 ) . Amer. J . Physiol. 199, 4 0 3 ( I 9 6 0 ) . W. T. jr., W. L. S I E F E R T U. J. J. S P I T Z E R : Proc. Soc. exp. Biol. Med.

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Summary E. K U H F A H L , F. M U E L L E R and D . D E T T M E R : Studies on t h e uptake of f a t t y acids by t h e diabetic liver in vivo Rabbits with alloxan diabetes were tested for plasma concentration, hepatic extraction ratio and balance of unesterified f a t t y acids (UFA). The UFA extraction ratio of the diabetic liver is significantly reduced, and t h e U F A uptake is enhanced due to an elevated plasma concentration, compared with the normal animal. Both insulin and fructose significantly increase the hepatic extraction rate for UFA. The results are discussed with respect to t h e regulation of hepatic f a t t y acid uptake. Pe3IOMC E . K y $ a j i b , H-Optimum bei pH 7,7, wie aus Abbildung 4 zu ersehen ist. Versuche mit Zusatz von Kaliumionen in steigender Konzentration zu den Versuchsansätzen bestätigten unsere frühere Schlußfolgerung, daß die Inosinkinasereaktion eine K+-unabhängige Reaktion ist. Das Temperaturoptimum der Inosinkinasereaktion liegt zwischen 30 °C und 40 °C (Abb. 5); eine Erhöhung der Versuchstemperatur über 40 °C führt zu einem steilen Abfall der Aktivität.

Abb. 5 Abb. 4. pH-Abhängigkeit der Inosinkinasereaktion. Trispuffer-Extrakt aus Erythrozytentrockenpulver (Versuchsbedingungen wie in Abb. 3). 1 Std. Inkubation (die Werte sind ebenfalls auf Adenylsäuredesaminase korrigiert) Abb. 5- Temperaturabhängigkeit der Inosinkinasereaktion (Versuchsanordnung wie in Abb. 3)

Inosinmonophosphat-Bildung

585

In den Abbildungen 6 und 7 ist unter optimalen Versuchsbedingungen bei 37 °C die Abhängigkeit der Inosinkinasereaktion im Erythrozytentrockenpulverextrakt von der Inosinkonzentration bei einer ATP-Konzentration von 2 • 10 - 3 Mol/1 sowie von der ATP-Konzentration bei einer Inosinkonzentration von -10-2 Mol/1 dargestellt, wobei wiederum der jeweilige Wert der IMP-Bildung über die Adenylsäuredesaminasereaktion durch mitgeführte Kontrollansätze abgezogen wurde.

Abb. 6. Abhängigkeit der Inosinkinasereaktion von der Inosinkonzentration. A T P = 2 • 1(T3 Mol/1; pH 7,7 (Versuchsbedingungen wie in Abb. 1)

Abb. 7. Abhängigkeit der Inosinkinasereaktion von der ATP-Konzentration. Inosin = 1(T2 Mol/1; (Versuchsbedingungen wie in Abb. 1)

Während die IMP-Bildungsgeschwindigkeit bei Substratsättigung der Inosinkinase mit Inosin einen bestimmten Wert erreicht, der sich durch weitere Erhöhung der Inosinkonzentration nicht mehr verändert, wird die Inosinkinasereaktion bei Erhöhung der ATP-Konzentration über 2-10~ 3 Mol/l gehemmt. Aus der Darstellung nach L I N E W E A V E R - B U R K ergeben sich unter unseren Versuchsbedingungen im ^>H-Optimum bei -pW 7,7 und 37 °C für das Enzym folgende MiCHAELis-MENTEN-Konstanten: Km (ATP) = 8,6 • 10"4 Mol/1;

KM (Isonin) = 7,1 • 10"4 Mol/1.

586

H . B A N ASCH A K

Diskussion

In Erythrozytentrockenpulverextrakten haben wir neben der IMP-Synthese aus Inosin und ATP, die eine Phosphorolyse des Inosins voraussetzt, eine IMP-Synthese über eine Inosinkinase erstmalig nachweisen können. Damit wurde gezeigt, daß im Organismus eine Nukleotidsynthese aus Nukleosiden auch durch direkte ATP-abhängige Phosphorylierung der Nukleoside möglich ist. Im menschlichen Erythrozyten ist dieser Syntheseweg normalerweise von untergeordneter Bedeutung und nur unter besonderen Versuchsbedingungen, wie sie von uns gewählt wurden, exakt nachweisbar. Die in der Literatur vorliegenden älteren Angaben über eine Adenosinkinase in der Hefe und im Nierenhomogenat [3], [4], [12] haben später durch die Entdeckung der Adeninnukleotidsynthese über die R-5-P-Pyrophosphokinase- und die AMP-Pyrophosphorylasereaktion eine andere Deutung erfahren. Über denselben Reaktionsweg haben auch die Befunde von KORNBERG und PRICER [8], wonach 2,6-Diaminopurinribosid zu dem entsprechenden Triphosphoribosid phosphoriliert werden kann, und die Angaben von GREENBERG [6] über eine Biosynthese von 5 -Amino-4-Imidazolkarboxamidribotid aus dem Nukleosid eine Erklärung gefunden. Da ferner die Wirksamkeit von Nukleosidphosphorylase bei der Nukleotidsynthese aus R-5-P, ATP und Purin- bzw. Pyrimidinbasen wiederholt ausgeschlossen wurde, ist nach der Entdeckung des Nukleotidsynthesewegs über die R-5-P-Pyrophosphokinase- und die Nukleotidpyrophosphorylasereaktion nach einer Nukleosidkinase nicht mehr gesucht worden. Erst in neuerer Zeit ist die Möglichkeit einer direkten Phosphorylierung von Nukleosiden zu Nukleotiden im Erythrozyten vereinzelt diskutiert worden [10]. Für die IMP-Bildung im Erythrozyten ergeben sich nach unseren Untersuchungen somit mehrere Reaktionswege, die in Abbildung 8 veranschaulicht sind. Es ist anzunehmen, daß dieses --NH3 für die IMP-Bildung im Erythrozyten aufgestellte Schema auch allgemein den Syntheseweg von Nukleotiden im Erythrozyten wiedergibt.

Abb. 8. Schematische Darstellung der IMP-Bildung im Erythrozyten

Inosinmonophosphat-Bildung

587

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BANASCHAK,

Summary H. B A N A S C H A K : Mechanisms of inosine monophosphate formation in human erythrocytes. I I I . Inosine kinase reaction T h e author was able to demonstrate, in tris buffer extractions of acetone dry powder of human erythrocytes, an I M P synthesis from inosine and A T P via an inosine kinase reaction. Due to its phosphate- and K + -independence and its inability of being inhibited b y arsenate, this reaction is well distinguished from the I M P synthesis after phosphorolytic splitting of the inosine. The reaction showed an optimal activity at pH 7.7 and a temperature of 30 to 40 °C. Pesioiwe r . E a H a m a K : MexaHH3MH 06pa30BaHHH HH03HHM0H0$0C(|)aTa B MEJIOBE^ecKHx apMTpOIIHTaX. III. PeaKUHH H H 0 3 M H K H H 3 3 M yjlajIOCb

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noponiKa OCH-Wert dieses Puffers könnte allerdings die Ursache dafür sein, daß die Albuminfraktionen der beiden Arten in der Nähe der des TBG (Gerbillus) bzw. des TB PA (Mesocricetus) durch den Übertritt des Hormonjods stärker markiert sind. Im Papierelektropherogramm des Goldhamsterserums sind 48 Std. nach Inkorporation des Na 1 3 1 J insgesamt zwei radioaktive Fraktionenen vorhanden. Bei zu starker Markierung verschmelzen die beiden nahe beieinanderliegenden Fraktionen, während bei geringem Radiojodgehalt das Präalbumin allein die Hauptmenge bindet und nur eine schwach ausgebildete Schleppe in der Albuminfraktion erscheint, in der kein zweites Maximum zu erkennen ist. Die Markierung in vitro zeigt, daß die erste Fraktion eine ausgeprägte Affinität zum Thyroxin hat (TBPA), während die zweite vorzugsweise Trijodthyronin bindet. Durch einenZusatz von 0,5 [J.gTrijodthyronin läßt sich nachweisen, daß auch das TB PA eine geringe Menge dieser Jodverbindung enthält. Dieser Befund steht in einem gewissen Gegensatz zu den von INGBAR [8] sowie INGBAR und F R E I N K E L [ 9 ] und T A T A et al. [ 1 0 ] am Menschen erhobenen Befunden. Die Verschmelzung der beiden Fraktionen bei der Auftrennung in Veronalpuffer [ 3 ] kann nach den von T A T A et al. an der unterbliebenen Trennung des Präalbumins vom Albumin oder am Überwechseln des Thyroxin auf den T 3 -Globulin-Komplex liegen. Ob auch das Albumin des Goldhamsters wie beim Menschen an der Bindung des T 4 stärker beteiligt ist, muß 41

Acta biol. med. german., Bd. 18, H e f t 5

604

B.

RÖSLER

in Frage gestellt werden, da sich die Radioaktivität nicht auf die ganze Albuminfraktion ausdehnt. Bei Gerbillus pyramidum kann die Fraktion, die sich im Papierelektropherogramm zwischen dem Albumin und dem a r Globulin befindet, als thyroxinbindendes Globulin bezeichnet werden, zumal sie wie das T B G des Menschen auch ein beschränktes Bindungsvermögen für Trijodthyronin besitzt. Das T 3 -bindende Protein inmitten der Albuminfraktion scheint dagegen bei einem Zusatz von 0,1 (J.g T 4 kein Thyroxin zu binden, da das Radiojod in der Albuminfraktion ganz der Verteilung des Albumins angepaßt ist, ohne daß es nach der Markierung mit Thyroxin zu der Ausbildung einer schmalen Bande in dieser Fraktion kommt. Im Gegensatz zu den zwei jodhaltigen Komponenten nach Markierung in vitro mit Thyroxin und Trijodthyronin können nach Inkorporation von Na 1 3 1 J maximal drei nachgewiesen werden. Die Entscheidung, welche der beiden Fraktionen im Albumin mit dem trijodthyroninbindenden Globulin identisch ist, muß späteren Untersuchungen vorbehalten bleiben. Die Anwendung der zweidimensionalen Elektrophorese ist insofern aufschlußreich, weil mit ihrer Hilfe nachgewiesen werden konnte, daß es sich bei der im Albumin befindlichen T3-bindenden Fraktion von Mesocricetus auratus und Gerbillus pyramidum nach ihrer Lage im Stärkegel-Elektropherogramm um Globuline handeln muß. Für die Bindung geringer Jodmengen an das Albumin konnte allerdings auch bei Mesocricetus auratus und Gerbillus pyramidum der Nachweis erbracht werden, wie ebenfalls BRAVERMAN und INGBAR [11 ] beim Menschen eine geringe Bindung des Trijodthyronin bei pH 7,4 an das Albumin, hauptsächlich aber an das T B G feststellen konnten. Mit Hilfe der zweidimensionalen Elektrophorese läßt sich weiterhin zeigen, daß die Serumkomponenten, die das Trijodthyronin transportieren, in solch geringen Konzentrationen vorkommen, daß sie bei der angewandten Technik mit Amidoschwarz nicht dargestellt werden konnten. Auch die Identität der T 4 -bindenden Fraktionen von Goldhamster und Gerbillus mit den in diesem Bereich befindlichen färberisch darstellbaren Fraktionen ist nicht gesichert, da die Verteilung des Thyroxins nicht mit der Verteilung des Proteins übereinstimmt. So kann die im zweidimensionalen Stärkegel-Elektropherogramm fehlende Übereinstimmung der räumlichen Verteilung der Radioaktivität und des Proteins innerhalb der Präalbuminfraktion des Goldhamsters so gedeutet werden, daß entweder das Präalbumin des Goldhamsters in seiner Gesamtheit nicht mit dem T B P A identisch ist oder die elektrophoretische Motilität des T 4 -Präalbuminkomplexes gegenüber dem Präalbumin zunimmt. Eine fehlende Koinzidenz zwischen der Verteilung der Radioaktivität und der in ihrem Bereich mit Amidoschwarz färbbaren Fraktion ist ebenfalls für Gerbillus pyramidum festzustellen und berechtigt zu ähnlichen Schlußfolgerungen. Besondere Beachtung verdienen auch die deutlichen individuellen Unterschiede hinsichtlich der Anzahl der jodhaltigen Fraktionen im Papierelektropherogramm des in vivo markierten Gerbillusserums, da B L U M B E R G und R O B B I N S [ 1 2 ] bei Macacus rhesus drei Typen von Thyroxin-Präalbumin-

Thyroxin-Protein-Komplexe

605

Komplexen durch Stärkegel-Elektrophorese ermitteln konnten. Die Vermutung, daß Unterschiede in der Menge des inkorporierten 1 3 1 J die Ursache für das Zustandekommen dieser Typen sein könnten, berücksichtigt nicht, daß trotz des unterschiedlichen Jodangebotes die Proportionen der im Serum vorhandenenen jodierten Thyronine unverändert sein müßten. Nach den Ergebnissen der Markierung mit T3 und T4 muß bei der Klärung dieser Frage eine Veränderung des Mengenverhältnisses der jodierten Thyronine oder der mit ihnen reagierenden Proteine in Betracht gezogen werden. Hinsichtlich der für Goldhamster und Gerbillus pyramidum physiologischen jodierten Thyronine vermittelt dieMarkierung mit Trijodthyronin und Thyroxin gewisse Einblicke. Danach ist das natürliche Vorhandensein des Thyroxin und des Trijodthyronin wahrscheinlich. Die bei Gerbillus pyramidum festgestellten Unterschiede zwischen der Markierung in vivo und in vitro lassen darüber hinaus die Anwesenheit anderer jodierter Thyronine möglich erscheinen, was auch beim Goldhamster nicht auszuschließen ist.

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Acta biol. med. geiman., Band 18, Seite 607 — 611 (1967) Aus dem Institut für Pharmakologie und Toxikologie der Medizinischen Akademie Magdeburg (Direktor: Prof. Dr. med. habil. H. M A T T H I E S )

Die Beeinflussung der Hexobarbitalnarkose von Ratten durch intrazerebral injiziertes Noradrenalin und Serotonin J . SCHMIDT u n d S.

DREWS

(Eingegangen am 20. 12. 1966)

Zusammenfassung Vorder- und Hinterhirninjektion von Noradrenalin führen bei Ratten zu einer dosisabhängigen Narkoseverlängerung, die durch selbst unwirksame Dosen von Serotonin aufgehoben werden kann. Serotonin verursacht nur bei Vorderhirninjektion eine Narkoseverlängerung. Auch dieser narkoseverlängernde Effekt von Serotonin kann durch gleichzeitige Injektion selbst unwirksamer Dosen von Noradrenalin antagonisiert werden.

In vorangegangenen Untersuchungen über die Beeinflussung der Hexobarbitalnarkose von Mäusen durch intrazerebral injiziertes Noradrenalin (NA) und Serotonin (5-HT) konnten wir finden, daß beide Amine bei Injektion in das Vorderhirn (VH) zu einer Verlängerung der Narkosedauer führen [1], [3]. Diese Narkoseverlängerung war jedoch nicht nachweisbar, wenn beide Amine gleichzeitig injiziert wurden [2]. Es zeigte sich, daß NA den narkoseverlängernden Effekt von 5-HT und 5-HT die Wirkung von NA aufzuheben vermag. Da die gegenseitigen Wechselwirkungen von NA und 5-HT, d. h. die Wirkungsabhängigkeit des einen Amins von der Konzentration des anderen, für die Wirkungsweise der biogenen Amine und von Pharmaka die zur Beeinflussung des Gehaltes an diesen Stoffen im Organismus führen von Bedeutung sein könnten, untersuchten wir im folgenden Eigen- und Wechselwirkungen von NA und 5-HT an der Hexobarbitalnarkose von Ratten. Es sollte damit die Frage beantwortet werden, ob die bei Mäusen gefundenen Wechselwirkungen der Amine eine speziesabhängige Besonderheit darstellen oder auch bei Ratten, die wir für speziellere Untersuchungen dieser Wechselwirkungen vorgesehen hatten, nachweisbar sind. Methodik Die Untersuchungen erfolgten an weißen Ratten beiderlei Geschlechts im Gewicht von 120—180 g. Jede Versuchsgruppe bestand aus 5 oder 10 Tieren. In jedem Versuch wurde eine Kontrollgruppe mitgeführt, der wir das Lösungsmittel der Amine (0,155 M NaCl) intrazerebral injizierten. Die intrazerebrale Injektion von NA oder 5-HT er-

608

J . SCHMIDT, S. D R E W S

folgte frei Hand in das Vorderhirn oder Hinterhirn in Anlehnung an die für Mäuse angegebene Injektionstechnik. Das injizierte Volumen betrug normalerweise 10 |xl, maximal 25 |il. 15 min nach der Amininjektion wurden 100 mg/kg Hexobarbital i.p. appliziert. Der Zeitpunkt der Barbituratinjektion galt als Narkosebeginn. Die Narkose wurde als beendet angesehen, wenn sich die Tiere innerhalb 1 min 3mal aus passiver Seitenlage aufrichteten. Die Auswertung der Ergebnisse erfolgte im Vergleich zu dem zum gleichen Zeitpunkt mitgelaufenen Kontrollgruppen nach dem FISHER-Test. Ergebnisse

1. Noradrenalin NA führt bei intrazerebraler Injektion in das Vorder- oder Hinterhirn von Ratten zur Narkoseverlängerung. Dabei ist die Narkoseverlängerung bei HH-Injektion deutlicher als bei VH-Injektion (Abb. 1).

Abb. 1. Beeinflussung der Hexobarbitalnarkose von R a t t e n durch Vorder- und Hinterhirninjektion von Noradrenalin. Ordinate: Narkosedauer in Prozent der Kontrollgruppe

In einer zweiten Versuchsreihe prüften wir, ob die intrazerebrale Injektion von NA im Augenblick des Erwachens aus der Narkose wieder zu einem Verlust der Stellreflexe führt. Während bei Kontrolltieren die Injektion von 10 ¡xl einer 0,155 M NaCl-Lösung im Augenblick des Erwachens ohne Wirkung blieb, konnte bei VH-Injektion von 20 oder 50 [ig NA bei allen Tieren ein erneuter Verlust der Stellreflexe für durchschnittlich 36,8 bzw. 39,4 min beobachtet werden. Auch die HH-Injektion von 50 ¡ig NA führte allerdings nur bei 60% der Tiere zu einem erneuten Verlust der Stellreflexe für durchschnittlich 44,3 m i n Im folgenden untersuchten wir die Beeinflussung der durch NA hervorgerufenen Narkoseverlängerung durch gleichzeitige Injektion von 5-HT. Wie aus Abbildung 2 ersichtlich, vermag 5-HT dosisabhängig den narkoseverlängernden Effekt einer HH-Injektion von NA aufzuheben. Die Kombination von 100 [ig NA und 50 ¡ig 5-HT führt dabei nicht nur zur Aufhebung der Narkoseverlängerung, sondern im Verhältnis zu unvorbehandelten Kontrollen sogar zu einer reproduzierbaren Verkürzung der Narkose um 29%.

Narkosebeeinflussung durch biogene Amine

P

- C - N N - C - C • HCl C - C - N N • H2S04 Phenelzin

13.

^ ^ C - C - N N • HCl C Pheniprazin

106

98

Monoaminoxydase-Hemmstoffe und Gehirn-GABA

521

T a b e l l e l (Fortsetzung) Anzahl der Tiere

Substanz

C - C - N N • HCl 1 C

Dosis

LD„

[üMol/kg] [¡¿Mol/kg]

GABA

[%]

Asp [%]

Glu [%]

MAOHemmung

ED»

TAKrampf

[uMol/kg] [uMol/kg]

3

285

570

103

107

100

16

26

3

39

176

102

95

95

39

20

3

645

1290

103

95

95

926

83

3

553

1106

93

105

101

851

128

{ ^ y — C - C - C - N N • C204H2 O

6

375

750

22J* * 100

97

354

125

^

—C—C—C—NN—C—C •

6

496

1011

^

S — C - C - C - N N -C 2 0 4 H 2

9

276

602

6

173

346

5

151

3

^ - C - C - N N • C204H2 C ^

\ — / —

C

—C—C — NN • HCl l 1

l 1

l 1

OHC

C

^~\_C_C_NN.|H2SO4 —

1

1

1

OHC

C

• c2o4H2

\=/

| c

c

1

• c2o4H2 o

II

;i- - C - C - C - N N • C2O4H2

c 1

—

^>-C-C-C-C-C-NN -C 2 0 4 H 2

o II

C— (C)9 —NN—C—C • C 2 0 4 H 2 42«

132

622

H . MATTHIES, N . POPOV

Tabelle 2 Einfluß von Phenyläthylamin, Metamphet'amin und einigen MAO-Hemmstoffen vom Amin-, Hydrazid- und Harmintyp auf den GABA-, Asp- und Glu-Gehalt des Rattenhirns nach i.p.-Gabe und Einwirkungszeit von 2 Std. Sonstige Beschriftung wie Tabelle 1 Nr.

Anzahl der Tiere

Substanz

/ - X

28.

/

C

\

C—C-N-H2SO4

Dosis

LDM

[txMol/kg]

[uMol/kg]

GABA [%]

Asp [%]

Glu [%:

MAOHemmung ED 1 0 [uMol/kg]

TAKrampf [(¿Mol/kg]

9

43

126

100

101

97

17

2

6

144

313

109

100

97

87

5

6

413

91

104

92

4

20

101

105

98

6

918

1862

103

96

95

10

26

9

1095

1642

105

109

94

730

kurz wirksam 74

Tranylcypromin 2930.

^

~

\_-C-C-N

-HCl

Phenyläthylamin C-C-N-C

31.

C Methamphetamin 32.

/

V - C - N - C - C = C • HCl 1 C

Benzyl-N-methylpropinylamin C | 33. N ^ \ - C - 0 - N N - C • H,PO, \ = / | C Iproniazid 34.

Harmin

6

150

110

98

98

35.

Harmalin

6

150

109

89

110

Diskussion

Aus unseren ersten Mitteilungen [1], [4] über die Wirkung von MAOHemmern auf den GABA-Gehalt des Rattenhirns ging hervor, daß die Änderung des GABA-Gehalts nicht mit der Wirkung von Phenelzin auf die MAO-Aktivität des Gehirns korreliert: Der Bereich der dosisabhängigen Steigerung der GABA reicht weit über die Dosis hinaus, die eine vollständige Hemmung der MAO-Aktivität hervorruft, anderseits kommt es zwischen 8 und 16 Std. nach 86 [i.Mol/kg ( = 20 mg/kg) i.p. Phenelzin zu einer deut-

Monoaminoxydase-Hemmstoffe und Gehirn-GABA

623

liehen Abnahme des erhöhten GABA-Gehalts im Gehirn, während die MAOHemmung noch unverändert in dieser Zeit aufrechterhalten bleibt. Aus den in dieser Arbeit mitgeteilten Ergebnissen geht hervor, daß nicht, wie zunächst vermutet, der Hydrazinrest allein für die Erhöhung der GABA verantwortlich ist. Von den 27 untersuchten Hydrazinverbindungen hatten nur wenige einen Einfluß auf den GABA-Gehalt. Eine signifikante Erhöhung war außer durch Phenyläthylhydrazin nur noch durch Phenylpropylhydrazin zu erzielen; die erhöhende Wirkung von l-Phenyl-5-methyl5-hydrazinopropan ist nur mit p < 0,05 zu sichern. Sobald an den beiden wirksamen Arylalkylhydrazinen Substitutionen entweder an Alkyl-CAtomen oder an der Hydrazingruppe vorliegen, kommt es zu keiner Erhöhung des GABA-Gehalts. Beim l-Phenyl-3-methyl-3-hydrazinopropan ist sogar eine Erniedrigung der GABA zu beobachten. Erniedrigend wirkt auch Benzylhvdrazin. Phenylhydrazin ist in der angewandten Dosierung ohne Effekt. " Offensichtlich ist für eine Erhöhung des GABA-Gehalts eine freie Hydrazingruppe mit einem Mindestabstand von zwei C-Atomen von einem Phenylring notwendig, wobei eine Substitution an der Alkylseitenkette störend wirkt, ebenso wie die Substitutionen an den beiden Hydrazin-StickstoffAtomen. Über den Angriffspunkt, über den eine Erhöhung des GABA-Gehalts ausgelöst wird, lassen sich vorläufig nur Vermutungen anstellen. Einmal kommen Aktivierungen der Glutaminsäure-Dekarboxylase oder Hemmung der GABA-a-Ketoglutarsäure-Transaminase in Betracht. Beide enzymatischen Reaktionen benutzen Pyridoxalphosphat als Koferment, das bekanntlich auf Grund seiner Aldehydgruppe mit Hydraziden Hydrazone bilden kann, wodurch das Koferment abgefangen wird (Übersicht bei [5]). Anderseits ist bekannt, daß verschiedene Hydrazide nicht nur das Pyridoxalphosphat abfangen, sondern auch die Pyridoxalphosphokinase im Gehirn (und dadurch die Phosphorylierung des Pyridoxals) hemmen [6] —[8]. Für die Erhöhung des GABA-Gehalts im Gehirn scheint eine Hemmung der GABA-a-Ketoglutarsäure-Transaminase bei erhaltener Aktivität der Glutaminsäure-Dekarboxylase von Bedeutung zu sein. Dafür sprechen auch die Untersuchungen mit Aminooxyessigsäure, die zu einer GABA-Erhöhung führt [9] — [11]. Unklar bleibt aber, weswegen nicht auch die anderen von uns untersuchten Hydrazine auf diese Weise wirksam werden. Zum anderen ist aber auch ein Angriff des Phenelzins an transmembranalen Transportvorgängen in Betracht zu ziehen, wie von uns bei der Beeinflussung des Stoffwechsels der biogenen Amine angenommen wurde [12]. Es wäre in weiteren Untersuchungen zu prüfen, ob die Wirkung von Phenelzin auf den GABA-Gehalt des Gehirns durch andere, in unseren Versuchen unwirksame Verbindungen beeinflußt werden kann. Erste orientierende Experimente ließen eine Hemmung des GABA-Anstiegs nach Phenelzin durch chemisch verwandte Hydrazinderivate erkennen, worüber wir in Kürze ausführlich berichten werden.

624

H . MATTHIES, N . POPOV

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Acta biol. med. german., Band 18, Seite 625 — 632 (1967) Aus dem Pharmakologischen Institut der Pommerschen Medizinischen Akademie in Szczecin (Direktor: Doz. Dr. L . SAMOCHOWIEC)

Zytochemische Untersuchungen der Leber und Niere von Ratten nach chronischer Äthylalkoholintoxikation bei gleichzeitiger Medikation mit „essentiellen" Phospholipiden L . SAMOCHOWIEC, Z . S T E P L E W S K I 1 u n d J . W Ö J C I C K I

(Eingegangen am 26. 7. 1966)2

Zusammenfassung Untersucht wurde der Einfluß einer chronischen Alkoholintoxikation bei gleichzeitiger Lipostabil-Verabreichung auf die Lokalisierung der sauren Phosphatase und der ATPase in Leber und Niere weißer R a t t e n . Aus den Untersuchungen geht hervor, daß chronischer Alkoholismus die funktionelle Polarisierung der Hepatozyten stört und die Lipoproteidmembran der Lysosomen schwächt bzw. schädigt und zwar insbesondere in den Nierenkanälchen. Essentielle Phospholipidverbindungen schützen die Organe vor dem destruktiven Einfluß des Alkohols.

Bei chronischem Äthylalkoholmißbrauch kommt es zu verschiedenen organischen Schäden, wobei die Leber das am stärksten betroffene Organ ist. Die Leberschädigung durch chronischen Alkoholismus geht unter anderen auf einen Mangel an lipotropen Verbindungen, insbesondere Cholin [19] bis [21], [25], zurück. Die möglichen Entstehungsmechanismen dieser Störungen sind noch nicht restlos geklärt und werden noch diskutiert. Neuere Ergebnisse weisen auf die Möglichkeit hin, daß durch Alkohol einige Enzymsysteme der Leber geschädigt werden [8], [12], [17], [22]. Noch weniger ist über den negativen Einfluß des akuten wie chronischen Alkoholismus auf die Nierenfunktion [18], [26] bekannt. Die normale Leberzellfunktion hängt eng mit ihren Zytoplasmastrukturen, u. a. den Lysosomen [10], [23], [24] und den von den Parenchymzellen gebildeten Gallenkanälchen [10], [23], [24] zusammen. Ähnlich besteht eine Beziehung zwischen den Lysosomen der Nierenkanälchen und der Nierenfunktion [24]. Wir untersuchten daher das Verhalten der Lysosomen der Leber- und Nierenzellen nach chronischer Alkoholvergiftung bei Ratten, indem wir die Aktivität der sauren Phosphatase bestimmten, die von vielen Autoren als 1 2

Onkologisches Institut in Gliwice Nach Revision am 14. 12. 1966

626

L . SAMOCHOWIEC, Z . S T ^ P L E W S K I , J . W Ö J C I C K I

ein „Indikator" für diese Zytoplasmastruktur betrachtet wird [10], [23], [24], [31]. Zum Nachweis der Gallenkanälchen und der Funktionspolarität der Hepatozyten führten wir die ATPase-Reaktion durch [23], [24], [25]. Ziel der vorliegenden Arbeit waren somit zytochemische Untersuchungen der durch chronischen Alkoholeinfluß hervorgerufenen Veränderungen in Niere und Leber unbehandelter und mit Lipostabil 1 behandelter Ratten. Lipostabil enthält als Hauptwirkstoff „essentielle" Phospholipide. Diese spielen im Fettstoffwechsel eine wesentliche Rolle, schützen die Leber und sichern ihre normale Funktion [1], [5], [6], [16], [27], [29], [36]. Sie wurden auch mit Erfolg zur Therapie des nephrotischen Syndroms eingesetzt [5],

[10].

Material und Methodik Die Untersuchungen wurden an 61 weißen männlichen Wistar-Ratten gleichen Alters mit einem Körpergewicht von 160 — 210 g durchgeführt. Die Tiere wurden in 3 Gruppen eingeteilt: Gruppe I : Kontrollen; Gruppe I I : Tiere erhielten 150 Tage lang Äthylalkohol; Gruppe I I I : Tiere erhielten 150 Tage lang Äthylalkohol und gleichzeitig Lipostabil. Die Tiere wurden mit Standardfutter nach L E M B E C K gefüttert. Bei allen Tieren wurde täglich eine Magensonde angelegt. An 6 Tagen der Woche bekamen die Tiere der Gruppen I I und I I I Alkohol in Form einer 20%igen Lösung (1,5 ml/100 g Gewicht), die Tiere der Kontrollgruppe eine gleiche Menge physiologischer Kochsalzlösung. Lipostabil wurde i.p. in einer Verdünnung von 1: 7 in 5%iger Glukoselösung verabreicht, was einer Dosierung von 0,7 mg pro 100 g Körpergewicht entsprach. Die Tiere der Kontrollgruppe und der Gruppe I I bekamen i.p. eine 5%ige Glukoselösung in der Dosierung von 0,1 ml pro 100 g Körpergewicht. Die Tiere wurden in Äthernarkose durch Dekapitation getötet. Sofort danach wurden an jeweils gleichen Stellen von Leber und linker Niere kleine Stücke entnommen und anschließend über Nacht in kalter BAKER-Lösung [3] im Kühlschrank (0 — 4 °C) fixiert. Nach der Fixierung wurden mit dem Gefriermikrotom Gewebsschnitte von 8 — 10 |x Dicke angefertigt und in den so präparierten Schnitten die Aktivität der sauren Phosphatase nach G O M O R I [11] sowie der ATPase in der Leber nach W A C H S T E I N und M E I S E L [35] bestimmt. Ergebnisse Leber

In den Parenchymzellen der gesunden Leber ist die Aktivität der sauren Phosphatase in winzigen Granula des Zytoplasmas lokalisiert, die als Lysosomen bezeichnet werden [7], [23], [24] und die gleichmäßig verteilt entlang Abb.l.

Leber, Kontrolltier. Phosphatasenachweis nach G O M O R I . B K = B R O W I C Z cells; RC = renal corpuscle (of M A L P I G H I ) ; SS = sinusoidal surface; bc = bile canaliculi; pc = proximal convolution; L = Lysosomen Abb. 2. Leber, Kontrolltier. Reaktion auf ATPase nach W A C H S T E I N - M E I S E L Abb. 3. Leber nach 150-tägiger Alkoholintoxikation. Saure Phosphatase nach G O M O R I Abb. 4. Leber nach 150tägiger Alkoholintoxikation. Saure Phosphatase nach G O M O R I Abb. 5. Leber nach I50tägiger Alkoholintoxikation. ATPase nach W A C H S T E I N - M E I S E L Abb. 6. Leber nach Alkoholintoxikation und Lipostabil-Applikation. Saure Phosphatase nach G O M O R I KUPFFER

1

Fa. Nattermann, Köln

Âthvlalkoholintoxikation und essentielle Phospholipide

627

628

L . SAMOCHOWIEC, Z . S T ^ P L E W S K I , J . W Ö J C I C K I

der Gallenkanälchen an den sezernierenden Polen der Hepatozyten gelegen sind (Abb. 1). Einzelne BROWicz-KuPFFERsche Zellen zeigen eine stark positive Reaktion in den großen Granula des Zytoplasmas (Abb. 1). Die ATPase-Aktivität ist in den normalen Hepatozyten an den sezernierenden Polen lokalisiert und kennzeichnet die „Wände" der Gallenkanälchen (Abb. 2). Eine positive Reaktion auf dieses Enzym ist auch im Endothel einiger Kapillargefäße der Sinus zu sehen (Abb. 2). Nach 150 Tagen Alkoholverabreichung sind die Lysosomen mit der sauren Phosphatase in den Leberparenchymzellen verschieden groß und liegen unregelmäßig im Zytoplasma verteilt (Abb. 3)- Es fällt auch auf, daß bei diesen Tieren eine große Anzahl von BROWicz-KuPFFERschen Zellen eine hohe Aktivität der sauren Phosphatase aufweisen, und zwar sowohl in großen Granula des Zytoplasmas als auch in Form einer diffus verteilten Reaktion im gesamten Zytoplasma (Abb. 4). Die zytochemische Reaktion auf die ATPase in den Leberzellen dieser Gruppe ist im Bereich der Gallenkanälchen fast völlig verschwunden. Lediglich einige fragmentische und verdickte Kanälchen zeigen eine positive Reaktion (Abb. 5). Am Resorptionspol der Hepatozyten dagegen zeigt sich an der Seite der Sinusgefäße eine sehr starke Reaktion auf ATPase (Abb. 5). Bei den Tieren der Gruppe III, die 150 Tage lang Alkohol und gleichzeitig „essentielle" Phospholipide erhielten, läßt sich mit Hilfe der Reaktion auf saure Phosphatase feststellen, daß die Lysosomen in den Leberparenchymzellen ähnlich wie in der Kontrollgruppe gleichmäßig entlang der Gallenkanälchen liegen (Abb. 6). Die Zahl der BROWicz-KuPFFERschen Zellen mit positiver Reaktion ist geringer als bei Tieren der Gruppe II, aber höher als bei den Kontrolltieren. In dieser Gruppe zeigen die Gallenkanälchen in der Leber eine positive Reaktion auf die ATPase (Abb. 7) ähnlich wie in der Kontrollgruppe. Eine positive Reaktion auf dieses Enzym tritt auch an der Berührungsstelle von Leberzelle und Sinuskapillare auf. Niere

Mit Hilfe der zytochemischen Reaktion auf saure Phosphatase wurde gezeigt, daß in den Nieren der Kontrolltiere die Lysosomen im basalen und oberen Teil des Zytoplasmas derjenigen Zellen liegen, die die Mehrzahl der NierenAbb. 7. Leber nach Alkoholintoxikation und Lipostabil-Applikation. ATPase nach WACHSTEIN-MEISEL

Abb. Abb. Abb. Abb.

Abb. 8 . Niere des Kontrolltieres. Saure Phosphatase nach G O M O R I 9. Niere nach 1 50tägiger Alkoholintoxikation. Saure Phosphatase nach G O M O R I 10. Niere nach L sotägiger Alkoholintoxikation. Saure Phosphatase nach G O M O R I 1 1 . Niere nach Alkoholintoxikation und Lipostabil-Applikation. Saure Phosphatase nach G O M O R I 12. Niere nach Alkoholintoxikation und Lipostabil-Applikation. Saure Phosphatase nach G O M O R I

Àthylalkoholintoxikation und essentielle Phospholipide

629

630

L . SAMOCHOWIEC, Z . S T ^ P L E W S K X , J . W Ö J C I C K I

kanälchen bilden (Abb. 8). Diese Zytoplasmastrukturen in den Kanälchenzellen der Tiere dieser Gruppe sind immer gegen das sie umgebende Zytoplasma gut abgegrenzt (Abb. 8). Bei den Tieren der Gruppe II, die Alkohol erhielten, beobachteten wir eine Verengung des Lumens der Nierenkanälchen, und die Granula des Zytoplasmas mit Reaktion auf die saure Phosphatase sind gegenüber der Kontrollgruppe deutlich vergrößert (Abb. 9). Um diese Granula herum tritt sehr häufig eine stark diffuse Anfärbung des Zytoplasmas auf (Abb. 9 u. 10). In den Nieren der Tiere, die Alkohol plus Lipostabil bekamen, tritt die Reaktion auf die saure Phosphatase in Form von gleichmäßigen, recht großen Granula des Zytoplasmas auf (Abb. 11). Einige Kanälchen weisen eine große Zahl von kleinen Granula im Zytoplasma auf (Abb. 12), ähnlich wie bei den Kontrolltieren. Die diffuse Anfärbung des Zytoplasmas der Zellen der Nierenkanälchen tritt in dieser Gruppe entweder überhaupt nicht auf oder ist nur ganz schwach angedeutet (Abb. 11 u. 12). Diskussion

Sowohl die akute als auch die chronische Vergiftung mit Äthylalkohol ruft bei Ratten vor allem eine Leberverfettung und Dispersion des Glykogens der Hepatozyten hervor [13], [14]. IGLESIA und Mitarbeiter [13], [14] haben auch eine Reihe von Veränderungen in der Ultrastruktur der Leberzellen festgestellt, wie Verstreuung der Ribosomen, bläschenförmige Veränderungen im endoplasmatischen Retikulum (vesiculation of endoplasmic reticulum) sowie Vergrößerung und Anomalien in der Struktur der Mitochondrien. Nach unseren Untersuchungen führt die chronische Äthanolzufuhr bei Ratten zu Veränderungen, die sich auch mit zytochemischen Methoden nachweisen lassen. Die zytochemische Reaktion auf ATPase in den Gallenkanälchen und auf saure Phosphatase in den Gallenkanälchen und auf saure Phosphatase in den Lysosomen, die entlang der Kanälchen liegen, ist ein Hinweis auf den sezernierenden Pol der Leberzelle [23], [24], [34]. Es wurde festgestellt, daß die verschiedenen Faktoren, die den normalen Gallenabfluß bzw. die Gallenproduktion hemmen [10], [24], eine funktionelle Depolarisierung der Leberzellen bewirken. Das äußert sich in einer größeren Verteilung der Lysosomen im Zytoplasma und einer Abnahme der ATPaseAktivität in den Gallenkanälchen bei gleichzeitigem Anstieg dieser Aktivität an der dem Sinus zugewandten Oberfläche (Sinusoidal surface). Vergleicht man unsere Ergebnisse mit den oben erwähnten, so kann man annehmen, daß Äthylalkohol nach langdauernder Verabreichung beim Tier Störungen der Gallenproduktion und des Gallentransportes auslöst; das wiederum kann seinerseits sowohl die Fettresorption aus dem Darm als auch den Lipidhaushalt des gesamten Organismus stören. Lipostabil scheint einen Faktor darzustellen, der die Leberzelle vor Veränderungen dieser Art schützt. Selbstverständlich können wir auf Grund unserer Untersuchungen noch nichts über den Wirkungsmechanismus dieses Präparates sagen, sondern nur über

Äthylalkoholintoxikation und essentielle Phospholipide

die damit erzielten Wirkungen. Es ist nicht ausgeschlossen, daß es unmittelbar auf die Lipoproteidmembranen der intrazellulären Strukturen einwirkt. Es zeigt nämlich nicht nur eine Wirkung auf die Leberzelle, sondern wirkt auch prophylaktisch einer Freisetzung der sauren Hydrolasen aus den Lysosomen der dem Lumen zugewandten Zellschicht der Nierenkanälchen entgegen. Möglicherweise stabilisiert Lipostabil die Lipoproteidmembran der Lysosomen ähnlich wie es von Chloroquine-diphosphat [2] bekannt ist. Allgemein wird die Ansicht vertreten, daß die Reaktion auf saure Phosphatase als ein enzymatischer Nachweis für die aktiven RES-Zellen nutzbar ist [4], [9], [28], [30], [33]. Die zahlenmäßige Vermehrung der an saurer Photphatase reichen BROWicz-KuPFFERschen Zellen weist auf die Anregung dieses Systems in der Leber der alkoholgefütterten Tiere hin. Diese Stimulierung des RES ist wahrscheinlich Ausdruck einer Schädigung der Leberparenchymzellen. Phagozytierte Substanzen, die aus den geschädigten Zellen freigesetzt werden, können ein ausreichend starkes Stimulans für das R E S sein. Es ist jedoch nicht ausgeschlossen, daß auch das Äthanol selbst stimulierend auf das RES wirkt. Zum Schluß kann gesagt werden, daß diese Experimente eine Ergänzung finden durch jetzt fundierte elektronenmikroskopische Untersuchungen. Literatur Med. heute 10, 16 (1961). C. U. L. M A L L U C C I : Lancet 1964 II, 1371. B A K E R , J . R . : Q u a r t . J . microscop. Sei. 87, 4 4 1 ( 1 9 4 6 ) . B A R K A , T . , F . S C H A F F N E R U. H . P O P P E R : Lab. Invest. 10, 590 (1961). B I E R F E R T , E . : Med. u. E r n ä h r u n g 5, 205 (1964). B R O S S , W . , T . O R L O W S K I U. R . B A D U R A : Zbl. Chirurg. 87, 1 7 6 5 ( 1 9 6 2 ) . D E D U V E , C . I n : Subcellular Particles, Hrsg. T . Hayashi, Ronald Press, New York 1959, S. 128. F I G U E R O S , R. B. U. A. P. K O T Z : Gastroenterology 43, 10 (1962). G L O W I N S K I , M., Z. S T ^ P L E W S K I , W. W A R O N S K I U. H . W A C I A W C Z Y K : Zbl. Gynä-

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Summary L . SAMOCHOWIEC, Z . S T ^ P L E W S K I a n d J . W Ö J C I C K I : C y t o c h e m i c a l s t u d i e s o n

the

liver a n d k i d n e y of r a t s a f t e r c h r o n i c a l i n t o x i c a t i o n w i t h e t h y l alcohol a n d simultaneous medication with „essential" phospholipids T h e e f f e c t of c h r o n i c a l alcohol i n t o x i c a t i o n , w i t h s i m u l t a n e o u s a d m i n i s t r a t i o n of Lipos t a b i l , on t h e localization of acidic p h o s p h a t a s e a n d A T P a s e in t h e liver a n d k i d n e y of a l b i n o r a t s h a s b e e n i n v e s t i g a t e d . Chronical alcoholism is d i s t u r b i n g t h e f u n c t i o n a l p o l a r i z a t i o n of t h e h e p a t o c y t e s , a n d is w e a k e n i n g or d a m a g i n g t h e l i p o p r o t e i d m e m b r a n e of t h e lysosomes, especially in t h e r e n a l t u b u l e s . E s s e n t i a l p h o s p h o l i p i d c o m p o u n d s p r o t e c t t h e o r g a n s a g a i n s t t h e d e s t r u c t i v e e f f e c t of alcohol. PeaioMc J I . C a M O x o B t e n , 3 . C T e r u i e B C K H ü h M . B O I I I I H U K H H : HMToxHMimecKHe HccjiejjOBaHHH neneHH H n0HKHKpbicii0cjiexp0HHqecK0r0 0TpaBJieHHH3THji0BbiM ClmpTOM n p n OHHOBpeMeHHOH MeHHKaHHH ,,3CCeHUHajlbHbIMH" (J)OC(J)OJIHnHHaMH M 3 y l a j I 0 C I j BJIHHHHe XpOHHHeCKOM HHTOKCHKailHH CnlipTOM, npH OHHOBpeMeHHOH a a ^ e jiMnocTafinjia, Ha Jioiia,nH3aiiMio KHCJIOH (J)OC(|)aTa3M h AT-a3M B n e i e i r n H noHKe öejibix K p t i c . MccjiejiOBaHiiH noKa3ajiH, *ITO xpoHHiecKHü ajiKorojiH3M H a p y m a e T (JiynKiiHOHajibHyio n o j i H p H 3 a a m o renaTOUHTOB H o c j i a ß j i a e T HJIH JIHIIOnpoTeHHHyio MeMÖpany jih30C0M, B q a c r a o c T H B MoieBbix K a n a J i b n a x . 3ccenilHajibHbie $oc$oJTHnHHHbie coenHHeHHH 3 a m n m a i 0 T opraHbi OT p a 3 p y m a i o m e r o BJ1HHHHH aJIKOrOJIH.

A c t a b i o l . med. german., Band 18, Seite 633 — 647 (1967) Aus dem Physiologischen Institut der Universität Greifswald (Direktor: Prof. Dr. H. G E R B S T Ä D T )

Automatisches Herstellen maßhaltiger Glaskapillaren und Glasfäden H . GERBSTÄDT u n d M . W .

SCHMIDT

(Eingegangen am 11. 11. 1966) Zusammenfassung Prinzip und Konstruktion eines automatischen Gerätes zum Herstellen maßhaltiger Glaskapillaren, Mikropipetten, Glasfäden und Glasnadeln werden beschrieben. Die Ergebnisse vorangegangener Versuche über die Rolle der maßgebenden Faktoren beim Ziehvorgang werden mitgeteilt. Form und Anordnung von Heizkörper und Heizkörperhalterung sowie eine spezielle Zugstempelbremse sind wesentliche Konstruktionselemente des mit einer auf die im Zugzeitpunkt erreichte Glasviskosität wirkenden Regelung arbeitenden Gerätes. Das beschriebene Verfahren eignet sich besonders auch zur Produktion langer, dünnwandiger, englumiger und über ihre Länge gleichmäßiger Kapillaren bzw. Glasfäden. Durch entsprechende Auslegung des Gerätes ist es an verschiedene Forderungen hinsichtlich der Abmessungen der Produkte anpaßbar. Die erreichbare Reproduzierbarkeit wird an H a n d eines Beispiels angegeben und die Voraussetzungen hierfür erörtert. Einleitung

Ein im Rahmen einer großen Versuchsreihe entstandener laufender Bedarf an maßhaltigen Glaskapillaren nötigte uns zur Entwicklung eines routinemäßig einsetzbaren, auch ökonomische Gesichtspunkte berücksichtigenden Herstellungsverfahrens [1], [2]. Nach dem ein entsprechendes Gerät sich uns in jahrelangem Einsatz praktisch bewährt hat, sollen seine Konstruktion und Funktionsweise mitgeteilt werden. Bei herkömmlichen Verfahren werden die den geforderten Maßen entsprechenden Stücke aus einem großen Posten stark streuender Exemplare ausgesucht. Für unsere Aufgabenstellung kam dieser Weg wegen seines beträchtlichen Arbeitszeit- und Materialaufwandes nicht in Betracht. An seine Stelle hatte ein vollautomatisches Verfahren mit Einstellbarkeit aller die Abmessungen der Produkte bestimmenden Parameter zu treten, um eine Vorherbestimmbarkeit der Werte verschiedener, einzeln zu ziehender Exemplare ebenso zu ermöglichen wie die Serienproduktion von übereinstimmenden Stücken. Unser unter diesen Gesichtspunkten entstandenes Gerät eignet sich vornehmlich zum Herstellen dünnwandiger, englumiger, über ihre ganze Länge

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SCHMIDT

gleichmäßiger Kapillaren bei Anpaßbarkeit an wechselnde Forderungen hinsichtlich Länge und Durchmesser. Außerdem können mit ihm Mikropipetten, Glasfäden und Glasnadeln gezogen werden. Als Rohmaterial dienen einige Zentimeter lange Glasröhrchen bzw. Glasstäbe verschiedener Glassorten, deren Innen- und Außendurchmesser bekannt sein müssen, wenn definierte Ergebnisse erhalten werden sollen. Das Vermessen der Rohlinge ist selbstverständlich sehr viel einfacher und ungleich weniger zeitraubend, als es etwa umgekehrt das genaue Ausmessen der Ziehprodukte bei Verwendung unkontrollierter Rohlinge wäre. Erstere brauchen nur dann noch einzeln nachkontrolliert zu werden, wenn z. B. bei höheren Genauigkeitsforderungen das Rohrlumen als Bestimmungsgröße experimentell zu ermittelnder Meßwerte auftritt wie in unseren an anderer Stelle mitgeteilten Strömungsversuchen. Daß auch bei solchem Vorgehen unser automatisches Ziehverfahren ökonomisch einen größenordnungsmäßigen Vorteil bietet, folgt aus dem unten aufgeführten Zahlenbeispiel des Streuungsmaßes. Die in der Literatur mitgeteilten, teils manuell zu bedienenden [3], [4], teils halbautomatischen [5]—[9] oder bei einseitig festgelegten Anwendungsbereich (Glasmikroelektroden) automatisch [10] —[12] arbeitenden Vorrichtungen erlauben eine Modifikation ihrer Produkte über eine Veränderung der Heizleistung und der Ziehgeschwindigkeit. Ein Verfahren zum Ziehen langer, maßhaltiger Kapillarrohre ist hiermit allein nicht möglich und ein entsprechendes Gerät wurde bisher auch nicht beschrieben. Das Prinzip unseres Verfahrens liegt darin, den zeitlichen Ablauf des Ziehvorganges sich selbst entsprechend den Vorgängen im Werkstück steuern zu lassen. Zunächst wird der eingespannte, unter einem sehr geringen Zug stehende Rohling in bestimmter Ausdehnung derart beheizt, daß eine definierte Glasmasse bis zu einem bestimmten Grade erweicht. Die dann einsetzende geringe Verformung löst selbst mit vorwählbarer Verzögerung, während welcher das Glas weiter aufgeheizt wird, den von einem starken Elektromagneten bewirkten Zug aus. Die Ausgangslage des Ankers zur Spule des Magneten ist so gewählt, daß hohe Anfangsbescheunigungen erreicht werden können und der Elektromagnet im ganzen so ausgebildet, daß große Zuglängen (in einer von uns benutzten Ausführung 500 mm) trotz relativ kurzer Spulenlänge einstellbar sind. Mehrfach höhere Werte sind prinzipiell möglich. Höhe und Zeitdauer der Beschleunigung sind einstellbar. Die Zugrichtung ist senkrecht. Die verhältnismäßig hohen Werte von Masse und Endgeschwindigkeit des Zugstempels und Ankers erfordern eine besondere Bremsvorrichtung, welche trotz hoher Verzögerung so weich einsetzt, daß jede Reflexion des Stempels ausgeschlossen ist, wenn das in diesem Augenblick noch zähflüssige Werkstück keine unerwünschten Deformierungen erleiden soll. Zur Beheizung des Rohlings verwenden wir Platinheizkörper verschiedener Größe, die durch besondere Formgebung und Halterung eine thermisch bedingte Verlagerung ausschließen und eine gleichmäßige Beheizung des zu erweichenden Bezirkes erlauben. Gleichmäßige Beheizung eines senkrecht angeordneten Glasrohres ist nach unseren Versuchen am

Automatik zum Glasziehen

635

besten mit einem konzentrisch liegenden, leicht konischen Platinrohr zu erreichen, dessen kleinere Öffnung nach unten gerichtet ist. Die konvektiv bedingte Ungleichmäßigkeit der Beheizung, wie sie mit einem streng zylindrischen Rohr eintritt, wird hierdurch kompensiert. Versuche mit verschiedenartigen anderen Heizkörpern verliefen durchweg ungünstig, wie unten im einzelnen berichtet wird. Die Stabilisierung der Heizspannung sowie das Ausschalten störender Umgebungseinflüsse wie Zugluft sind Vorbedingungen reproduzierbarer Ergebnisse. Durch passende Wahl der erwähnten Größen lassen sich Form und Abmessungen der Produkte in engen Grenzen vorausbestimmen. Gleichmäßig weite Kapillaren können über die Länge der halben Zugstrecke und — je nach den geforderten Radien — auch darüber hinaus gewonnen werden. Als Rohmaterial benutzten wir hauptsächlich Duran-Glas-Röhrchen von 2 bis 3 mm Außendaurchmesser und 1 bis 2 mm Innendurchmesser. Für sehr dünne Kapillaren und für Mikropipetten ist Supremaxglas besonders geeignet, für letzteren Zweck ebenfalls Geräteglas. Auch Rasotherm- und Fischerglas erwiesen sich als brauchbar. Experimentelle Prüfung der Parameter des Ziehvorganges

Mit Hilfe eines hierfür passend ausgelegten Experimentier-Ziehgerätes untersuchten wir zunächst die Rolle folgender Faktoren: Heizkörperform, Heizkörpergröße, Heizkörpertemperatur, Heizzeit, Zugstrecke, Beschleunigung. Einige Versuche zur Prüfung der Rolle der Abmessungen des Rohlings hatten nur orientierenden Charakter, weil ein für systematische Untersuchungen ausreichendes Sortiment nicht zur Verfügung stand. 1. Versuche über die Rolle der Heizkörfierform Versuche mit Platindrahtschleifen Die hiermit gezogenen Kapillaren verjüngen sich stetig bis zur Mitte derart, daß die über die Länge aufgetragenen Durchmesserwerte einen etwa parabelförmigen Verlauf geben (siehe Abb. 1).

Abb. 1. Verlauf von Außen(A)- und Innen(I)-Durchmesser entlang einer Supremaxkapillare. Heizkörper: Schleife aus Platindraht (1 m m Durchmesser); Anfangsbeschleunigung 5 g; Zugstrecke 200 mm 43

Acta biol. med. german., Bd. 18, H e f t 5

636

H . GERBSTÄDT, M. W .

Schraubenförmig aufgewickelte

SCHMIDT

Platindrahtspulen

Mit diesen Spulen (Abb. 4a, b) waren erwartungsgemäß größere Zugstrecken zu erhalten, es ließ sich jedoch keine gleichmäßige Beheizung erzielen. Betrug der Abstand von Windung zu Windung etwa 1 mm, dann zeigten sich an den Kapillaren entsprechend den Zwischenräumen Buckel (Abb. 2a). Wurden die Windungen enger gelegt, geschah es oft, daß sie sich berührten. Eine Windung blieb dann kalt, die restlichen wurden entsprechend wärmer und die Kapillaren fielen wieder sehr ungleichmäßig aus (Abb. 2b). Diese Windungskurzschlüsse ließen sich nicht vermeiden, da der Platindraht beim Erwärmen und im glühenden Zustand oft unkontrollierbare Bewegungen ausführte. Ol/im 200

100

0

Abb. 2. Verlauf von Außen(A)- und Innen (I)-Durchmesser entlang von Duranglaskapillaren. Heizkörper: Platin-Drahtspule. a)Windungsabstand 1 mm; b) Durch Windungskurzschluß partiell kalter Heizkörper nach Verkleinerung des Windungsabstandes auf ca. 0,5 mm (gemessen am kalten Heizkörper)

Platinnetzzylinder Diese weisen einen anderen Nachteil auf, der sich z. T. schon bei den Spulen zeigte. Die Stromzuführungen am oberen und unteren Ende des Zylinders (Abb. 4c) dehnten sich beim Stromdurchfluß thermisch aus und der an ihnen aufgehängte Heizkörper wurde aus seiner Lage gebracht. Berühren des Werkstückes oder mindestens ungleichmäßige Beheizung waren die Folge. Wurden die Stromzuführungen stärker ausgelegt, dann entzogen sie dem Heizkörper soviel Wärme, daß dieser in sich beträchtliche Temperaturunterschiede aufwies. Versuche, die thermische Ausdehnung der Stromzuführungen mechanisch zu kompensieren, blieben erfolglos, z. B. der Versuch, den Heizkörper von vornherein soweit schief aufzuhängen, daß er sich durch das Erwärmen gerade richtet. Wurden die Stromzuführungen sehr kurz gehalten, dann wurde viel Wärme an die Halterungen abgeleitet. Auch hier entsteht also ein starkes Temperaturgefälle innerhalb des Heizkörpers. Platinblechzylinder Platinbelchzylinder (Abb. 4d) wurden aus Platinblechstreifen von 0,05 mm Dicke und verschiedener Breite hergestellt. J e zwei 25 mm lange Streifen wurden sich deckend übereinandergelegt und durch Punktschweißstellen verbunden. Ihre mittleren Abschnitte wurden derart auseinander gebogen,

Automatik zum Glasziehen

637

daß sie einen zylindrischen Raum von etwa 6 mm Durchmesser umfaßten. Die freien Enden der so entstandenen Körper wurden mit 0,5 mm starken Platinblechstreifen zur Erhöhung der mechanischen Stabilität verstärkt. Derartige Heizkörper erwärmen sich sehr gleichmäßig. Die thermische Ausdehnung der Zuleitungen bewirkt zwar eine zeitliche Abplattung des Platinblechzylinders, doch läßt sich diese durch eine beim Einspannen des Heizkörpers vorzunehmende passend bemessene Streckung kompensieren. Bei der vertikalen Anordnung dieser Heizkörper konzentrisch um das zu erwärmende Werkstück ergibt sich eine konvektiv bedingte Ungleichmäßigkeit der Erwärmung des Werkstückes. Deshalb gingen wir zu konisch geformten Platin-BJechrohren über. Kegelstumpf förmige Platin-Blech-Rohre Konische Platin-Rohre (Abb. 4e, f), deren kleinere Öffnung nach unten gerichtet ist, gewährleisten bei richtiger Bemessung volle Gleichmäßigkeit der Wärmezufuhr zum Werkstück wie aus Abbildung 3 hervorgeht. Hierfür muß der Winkel, den der Mantel des Kegels mit seiner Achse bildet, 2° betragen. D/um 400. 50.

0 0

10

20

30

1,0

¡./cm

Abb. 3. Verlauf von Außen(A)- und Innen(I)-Durchmesser entlang einer Supremaxglaskapillare. Heizkörper: Konisches Platinblechrohr 1 2 m m hoch; Xachheizzeit 50 sec; Anfangsbeschleunigung 4,5 g; Zugstrecke 480 mm

Abb. 4. Heizkörper, a) und b) Platin-Drahtspulen; c) Platin-Xetzzylinder; d) Zylindrisches Platin-Blechrohr; e) und f) Konisches PlatinBlechrohr ; Unbezeichnet: Dorn zum Formen konischer Rohre 43»

638

H . GERBSTÄDT, M . W .

SCHMIDT

2. Heizkörpergröße Die Heizkörpergröße ist von maßgebendem Einfluß auf die Abmessungen der Produkte des Ziehvorganges. Mit einem 4 m m langen Heizkörper der zuletzt beschriebenen Art lassen sich z. B. konisch endigende Kapillaren (z. B. Mikropipetten mit einer Schaftlänge von 20 mm) ziehen. Eine Verlängerung des Heizkörpers auf 22 m m ergibt unter sonst gleichen Bedingungen Exemplare mit etwa 100 m m langem Schaft oder bei genügend kurz gehaltener Zugstrecke nicht mehr zerreißende Kapillaren. Diese Kapillaren haben jedoch eine Form ähnlich der in Abbildung 1 gezeigten, wenn der Einfluß der Heizzeit (siehe unten) nicht berücksichtigt wird. 3.

Heizkörpertemperatur

Eine Erhöhung der Heizkörpertemperatur zeigt innerhalb der durch das Heizkörpermaterial gegebenen engen Grenzen einen gleichsinnigen Effekt wie eine Heizkörpervergrößerung: Der Kapillarschaft wird länger, weil mehr Glas erweicht wird. Im allgemeinen werden unsere Heizkörper auf Gelbglut gebracht. Da der ausnutzbare Temperaturspielraum verhältnismäßig klein ist, spielt in der Praxis die Variation der Heizkörpertemperatur keine wesentliche Rolle, es sei denn als Fehlerquelle bei ungenügender Heizstromstabilisierung. 4. Heizzeit Als maßgebender Faktor geht in das Ergebnis des Verformungsvorganges die Heizzeit ein. Diese Zeit ist insofern wichtig, als sie das beim jeweiligen Rohling erreichte Ausmaß seiner Viskositätsänderung bestimmt und zugleich Einfluß auf das Ausmaß der dem Ziehvorgang vorangehenden initialen Verformung hat. Sie muß bei ihrer Festlegung deshalb hierauf bezogen werden. Das geschah in unserer Versuchsanordnung infosern, als die Zeitspanne vom Erreichen eines bestimmten Erweichungsgrades des Glases bis zum Einsetzen des Zuges ( = „Nachheizzeit") in weiten Grenzen variiert wurde. Es sind auch andere Wege zum Erreichen des gleichen Effektes denkbar und bei Verfügbarkeit geeigneter elektronischer Bauelemente realisierbar z. B. Bezugnahme auf die initiale Verformungsgeschwindigkeit als Steuerfaktor. Bei Verwendung nicht zu kurzer Heizkörper nach 1,5 wird in einer ausreichend bemessenen Heizzeit ein genügend großer Abschnitt der Beheizungszone des Rohlings gleichmäßig erweicht, so daß auch Gleichmäßigkeit der Ziehprodukte über größere Längen, deren Betrag dann noch von der Ziehgeschwindigkeit abhängt, möglich wird. Während einer längeren Heizzeit tritt auch ein „Zusammenfallen" des Rohlings ein. Das bei Zugbeginn vorhandene Ausgangsmaterial ist nun englumiger als der Rohling und über eine größere Länge gleichmäßig viskos. Hieraus gezogene Kapillaren sind über eine große Länge gleichmäßig im Innen- und Außendurchmesser (Abb. 3).

Automatik zum Glasziehen

639

Die Abhängigkeit der Kapillarmaße (Außendurchmesser, Innendurchmesser und Wandstärke) von der Nachheizzeit ist in den Abbildungen 5 und 6 an zwei Beispielen dargestellt. D/,um

0 L, S

1

1

40

1

20

45

25

1

r sec

l

Abb. 5- Abhängigkeit der Durchmesserwerte (Außen = A; Innen = I) und der Wandstärke ( = W) von der Nachheizzeit für Duranglas. (Mittelwerte aus je 48 Einzelmessungen an 3 unter gleichen Bedingungen gezogenen Kapillaren). Rohlingsdurchmesser: 2,3/1,3 m m ; Heizkörper: konisches Platinrohr 12 m m hoch; Anfangsbeschleunigung 3 g; Zugstrecke 480 m m

Dlfjm

0h

•fO

, 15

1 20

1 —• 25 tjsec

Abb. 6. Abhängigkeit der Durchmesserwerte von der Nachheizzeit für Supremaxglas. Daten wie in Abb. 5 angegeben. (Heizkörpertemperatur entsprechend der höheren Erweichungstemperatur erhöht).

5. Zugstrecke

Vergrößerung der Zugstrecke unter sonst gleichen Bedingungen bewirkt beim Ziehen ohne Nachheizzeit eine zunehmende Einengung des Rohrquerschnitts bis beim Überschreiten eines Grenzwertes der Zugstrecke die Kapillare zerreißt. Dabei entstehen verhältnismäßig lange konische Rohr abschnitte, die gegebenenfalls einen kurzen zylindrischen zwischen sich fassen. Der erwähnte Grenzwert hängt von der Menge des erweichten Glases und damit von den bereits erörterten Faktoren ab. Wir gingen entsprechend unseren Bedürfnissen bis 480 mm. Durch entsprechende Bemessung der Heizkörper und der Glasrohlinge würde die Zugstrecke sich ohne weiteres mehrfach vergrößern lassen. Durch passende Wahl von Heizkörpergröße und Heizzeit können lange zylindrische Rohrabschnitte gewonnen werden.

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6.

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Beschleunigung

Nach unseren Erfahrungen muß die zeitliche Ausdehnung des. Ziehvorganges umso kürzer gehalten werden, je geringer der Querschnitt ist, attf welchen das plastische Glasrohr gedehnt wird entsprechend der zunehmenden Abkühlungsgeschwmdigkeit Für unsere Ansprüche muß also die Beschleunigung des unteren Teiles des Glasrohlmgs recht groß sein. Unser Gerät liefert die größte Beschleunigung zu Beginn des Ziehvorganges. Sie verringert sich bis zur Hälfte der Zugstrecke und fällt dann plötzlich auf etwa Null Auf der zweiten Hälfte der Zugstrecke ist die Geschwindigkeit annähernd konstant. Der ganze Zug Vorgang läuft m einem Zeitraum der Größenordnung 0,1 sec ab. Mit wachsender Beschleunigung bzw. Vierkürzung der Zeit des Ziehvorganges werden auch über ihre Länge hm zunehmend gleichmäßigere Produkte erhalten. Konstruktion Abbildung 7 gibt einen Überblick über das Gerät und die Bedienungselemente semer Frontplatte Eme eiserne Grundplatte ist durcli drei Sehraubfuße genau waagerecht emjustierbar Auf ihr steht ein starker Stativstab genau senkrecht, dessen oberer Teil die im Betrieb zu manipulierenden Baueinheiten fr§i zugängig trägt. Alle übrigen mechanischen und elektrischen Bauelemente sind ummantelt Zuoberst hält der Stab die obere Werkstuekhalterung (siehe Abb 8) Sie besteht aus zwei Messmgbacken mit senkrechter halbkreisförmiger Nut, die durch eine Schraube zusammengedrückt werden können Auf eine Polsterung durch Leder oder Gummi

Abb 7 Ziehgerät (Untert'e'ü) Auf dem sind n&bön-der Kontaktuhr alle Bedienungs- und Kontrollelemente mii Ausnnl.iin^ einiger nur yo» Zeit zu Zeit zu betätigender und des Hauptschalters angeordnet:. Letztere finden Sich auf der Frontplatte unterhalb des Pultes, rechts untere der BreöiskraftversteJl'®r Rechts oben im Bild ist der zylindrische Mantel des EMititawagneien sichtbar, aus dem das im Bilde nicht dargestellte Stativ {siehe Text) herausragt

Automatik zum Glasziehen

641

wurde verzichtet. Das Glasrohr bzw. der Glasstab bekäme dadurch eine unerwünschte Beweglichkeit, die gegebenenfalls eine Berührung mit dem Heizkörper zuließe. Für verschiedene Stärken des Rohlings ist allerdings ein Satz Backen mit um 0,5 mm abgestuften Nutendurchmessern notwendig. Die Backen sind leicht austauschbar an einer kurzen Stange befestigt, die sich durch einen Zahntrieb parallel zum Stativ bewegen und durch eine Klemmschraube fixieren läßt. Sie können also bei unterschiedlicher Länge des Ausgangsmaterials immer in die gewünschte Höhe gebracht werden, ohne die Werkstückhalterung als Ganzes am Stativ bewegen und dadurch dejustieren zu müssen. Durch einen horizontalen Feintrieb ist der Abstand der Halterbacken von der Stativstange einstellbar, so daß der Rohling genau in der Verlängerung des Stempels eingespannt werden kann. Eine allerdings nur selten notwendige seitliche Verschiebung ist durch Drehen der ganzen Halterung um die Stativstange möglich.

Abb. 8. Stativoberteil mit oberer Werkstückhalterung und Heizkörperhalterung mit Heizkörper. Die untere Werkstückhalterung mit Zugstempel wird von einem eingespannten Rohling getragen. Zugstempel und Unterstützungshebel mit Schalter S 1 in Ausgangsstellung Einige Zentimeter unter der oberen Glasrohrhalterung befindet sich a m Stativ die Heizung. Nach den oben erörterten Gesichtspunkten erhielt sie leicht auswechselbare Heizkörper, um verschiedene Heizkörperhöhen benutzen zu können. Die beiden Halterungen des Heizkörpers H 1 dienen gleichzeitig als Stromzuführungen (Abb. 8). Passend zur Form der Heizkörper stehen sie im Winkel von 180° zueinander. Entsprechend wechselnden Heizkörperbreiten kann ihr gegenseitiger Abstand durch Verschieben in einer Schwalbenschwanzführung verändert werden. Die Halterungen selbst bestehen aus 12 m m starken Rundmessingstäben, die auf ihrer Länge von 50 mm je vier große Kühlrippen zur Herabminderung der thermischen Längenänderungen besitzen. Der Heizkörper wird von senkrechten Schlitzen aufgenommen und durch Klemmschrauben gehalten. Die Schwalbenschwanzführung ist durch zwei im Winkel von 90° zueinander wirkende Feintriebe in einer waagerechten Ebene bewegbar. Mit ihrer Hilfe läßt sich der Heizkörper konzentrisch zur Achse des Zugstempels justieren. Um die bisher größten von uns verwendeten Heizkörper (Platinblechkegelstümpfe der Höhe 22 mm) zur Gelbglut zu bringen, waren etwa 150 Ampere notwendig. Dieser Strom wurde 1

Die Symbole entsprechen den in Abb. 9 (Schaltskizze) verwendeten Bezeichnungen

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einem für die doppelte Sekundärlast ausgelegten Transformator entnommen, der bei einer Primärspannung von 220 V sekundär 3,5 bzw. 7 V abgibt. Das Einstellen der Heizspannung passend zum jeweils benutzten Heizkörper erfolgt mit Hilfe eines vorgeschalteten stufenlosen Regeltransformators, der über einen magnetischen Spannungsstabilisator aus dem Netz gespeist wird. Wenige Zentimeter unterhalb des Heizkörpers ist ein Unterstützungshebel (Abb. 8) angeordnet, der durch eine passend eingestellte Druckkugelarretierung in waagerechter Lage festgehalten das Gewicht des Zugstempels zu tragen vermag. In dieser Position unterstützt der Hebel den Ring des Zugstempelkopfes mit einem Federstahlstreifen, der dann als Kontakt eines Schalters S 1 wirksam wird. Überschreitet die auf ihn wirkende K r a f t das Stempelgewicht, so gibt der Hebel unter Drehung um seine waagerechte Achse den Weg für den Zugstempel frei, wobei sich der Schalter S 1 wieder öffnet. In der Ausgangsposition des Zugstempels ist er ebenfalls geöffnet, d. h. der in waagerechter Lage befindliche Unterstützungshebel ist unbelastet. K n a p p um Zugspulenlänge tiefer t r ä g t das Stativ einen weiteren Schalter S 2, dessen Aufbau sich an die bekannten Tonarmschalter anlehnt. Sein Schalthebel ragt in seiner waagerechten Ausgangsposition, bei welcher der Schalter geschlossen ist, in den Weg des Zugstempelringes hinein. Beim Durchgang des letzteren wird dieser extrem leichtgängige Schalter ohne jegliche Rückwirkung auf die Stempelbewegung geöffnet. Der untere Teil des Stativstabes trägt das elektromagnetische Zugsystem. Die Zugspule besteht aus einem 300 mm langen Eisenrohr auf das 4800 Windungen 0,8 m m starken Kupferlackdrahtes aufgebracht sind. Um ein möglichst starkes Magnetfeld zu bekommen, gibt es zwei Wege: Großen Strom oder hohe Windungszahl. Hier wurde versucht einen Mittelweg zu gehen. Da die Spule einen Widerstand von 22 Q h a t , können bei einer angelegten Spannung von 220 V 10 Ampere fließen. Hierdurch wird das Netz nicht zu stark belastet, aber bei längerem Stromfluß wird die Zugspule stark erwärmt. Wegen der kurzen Dauer des Zugvorganges ist das in der Praxis belanglos. Außerdem wurden Sicherheitsvorkehrungen (Bimetallstreifenschalter und Kühlluftgebläse) getroffen. Der Zugstempel besteht aus Rundmaterial von 10 m m Durchmesser. E r bewegt sich in der Spule in Gleitpassungen. Das Kernstück bildet ein 300 mm langer Eisenstab. Die auf ihn ausgeübte K r a f t h a t ihren höchsten Wert bei einer Eintauchtiefe in die Spule von ca. 50 mm. Um mit dieser 300 mm langen Anordnung einen Zugweg von etwa 500 mm zu erreichen, wurde der Stempel mit zwei Verlängerungen hergestellt. Eine untere 150 m m betragende Verlängerung aus Rundmessing sichert eine einwandfreie Führung des Stempels in den Gleitpassungen auch in der Ausgangsposition, in welcher der Eisenkern nur wenig in die Spule eintaucht. Eine obere 300 m m lange aus Rundaluminium bestehende Verlängerung trägt an ihrem oberen Ende die untere Werkstückhalterung. Damit sind etwa 500 m m Zugstrecke möglich, sofern der Eisenkern des Zugstempels nicht nach völligem Eintauchen in die Spule durch deren Feld gebremst wird. Da Schalter S 2 zu diesem Zeitpunkt die Spule über das Relais R 2 stromlos macht, wird die Stempelbewegung von ihr nicht aufgehalten. Eine die hier zu berücksichtigenden besonderen Anforderungen erfüllende mechanische Bremse beendet den Zugvorgang. Die am oberen Stempelende angebrachte untere Werkstückhalterung ist nach Art einer Spannzange aufgebaut. Die Spannzangenklauen bestehen aus Hartgummi. Zwischen der unteren Werkstückhalterung und dem oberen Stempelende ist ein Ring mit einem Durchmesser von 20 m m angebracht, durch den bei der Stempelbewegung die beschriebenen Schalter betätigt werden. Der Elektromagnet wird mit Gleichstrom aus dem 220 V-Netz über einen Schaltschütz gespeist, dessen Kontakte mit 25 Ampere belastet werden können. Ein Kondensator unterdrückt den Öffnungsfunken. Dieser Schaltschütz h a t einige Schließer und Öffner als Nebenkontakte, deren Bedeutung aus der in Abbildung 9 wiedergegebenen Schaltskizze ersichtlich ist. Der Spule ist ein in acht Stufen regelbarer 1000 Watt-Widerstand zum Abstufen der Zugkraft vorgeschaltet. Die Zugkraft wurde als die Tragkraft gemessen, welche den Stempel in Ausgangsstellung gerade vor dem Herabfallen be-

Automatik zum Glasziehen

643

w a h r t . Sie wurde mit einer Federwaage auf 100 p genau bestimmt. Das Stempelgewicht ist hierin enthalten. Die initiale Zugkraft ist in neun Stufen von 350 p ( = Stempelgewicht) bis 2S00p wählbar. Am Ende des Zugweges muß die Stempelbewegung mit hoher aber allmählich einsetzender Verzögerung gebremst werden. Beim Abfangen durch einfachen Anschlag würde der Stempel eine rückläufige Bewegung ausführen, und die jetzt noch plastische Kapillare sich vollkommen verbiegen. Selbst wenn man den Stempel z. B. durch einen Raster an der Rückbewegung hindert, verbiegt sich die Kapillare am oberen Ende (Staucheffekt), denn nicht nur der Stempel wird gebremst, sondern auch das sich dehnende, abwärts schießende plastische Glas. Wir konstruierten deshalb eine stoßdämpfende Flüssigkeitsbremse. Doch mit der Vergrößerung der kinetischen Energie des Zugstempels bei längeren Zugstrecken und hohen Beschleunigungen reichte sie nicht mehr aus. Wir verwenden deshalb jetzt ausschließlich das folgend beschriebene Bremssystem: Das untere, aus Messing gefertigte, leicht konisch abgedrehte Stempelende gleitet am Ende des Zugweges in einen Zylinder mit Gleitpassung. Dieser Zylinder h a t zwei Querbohrungen im Winkel von 180° zueinander, durch die zwei Nocken von 4 m m Durchmesser etwa 1 mm tief zentral in die Stempelbahn hineinragen. Diese Stahlnocken werden durch den abwärts gleitenden Stempel nach außen gegen vorgespannte Stahlfedern gedrückt, die wiederum die Nocken gegen das untere Stempelende gepreßt halten. Der Stempel wird somit durch steil anwachsende Gleitreibung relativ weich gebremst. Die Stärke der Bremskraft läßt sich durch mehr oder weniger starkes Vorspannen der Stahlfedern einstellen. Das wird durch je einen gleicharmigen Hebel für jeden Bremsnocken erreicht. Die beiden Hebel, welche in Mittelstellung zueinander parallel liegen, werden durch Drehen einer zwischen ihnen angeordneten Welle mit elliptischem Querschnitt gemeinsam bewegt. Durch Drehen dieser Welle kann die Bremse gelöst oder in bestimmten Maße reproduzierbar angezogen werden. Zur Bemessung der Nachheizzeit dient eine Kontaktuhr, die in 75 sec einmal umläuft und auf 2,5 • 1 0 _ l s e c genau einstellbar ist. Größere Zeiten können mit der gleichen Uhr unter Verwendung einer den Uhrkontakt beim ersten Umlauf oder den ersten Umläufen unwirksam machenden Schaltung eingestellt werden, erwiesen sich jedoch innerhalb unseres Anwendungsbereiches des Verfahrens als nicht notwendig. Starten und Stoppen der Uhr erfolgt mit Hilfe einer elektromagnetisch betätigten Drucktaste. Das Uhrwerk schließt für die Dauer seines Laufes einen Schalter S 5, der wie Abbildung 9 zeigt den Stoppvorgang vorbereitet, indem er den von S 1 betätigten Start-Stop-Magneten nach erfolgtem Start wieder stromlos macht. Das Rücksteilen des Zeigers auf Null erfolgt von Hand. Handbedienung der Start-Stop-Taste ist gleichfalls möglich. Funktionsweise

Die Funktion des Gerätes sei an Hand der in Abbildung 9 gegebenen Schaltskizze erläutert: Nach Einspannen des Werkstückes wird derUnterstützungshebel waagerecht gestellt, wobei die Kontaktfeder von S 1 einen frei wählbaren Abstand vom Ring des Zugstempels behält, S 1 also offen bleibt. Dann wird S 2 und der Hauptschalter S 3 geschlossen. Damit erhält das Relais R 1 Strom und schließt den Heizstromkreis. Das Werkstück beginnt zu erweichen und verformt sich bis seine unter dem Zug des Stempelgewichtes erfolgende Streckung nach Erreichen des gewählten Ausmaßes den Ring des Stempelkopfes am Unterstützungshebel anschlagen läßt, wobei S 1 geschlossen wird. Bei Stellung et des Umschalters S 4 laufen nun folgende Vorgänge ab: Das Start-Stop-Relais der Uhr R 3 (24 V = ) erhält Strom. Die Uhr läuft

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Schalter; S 4 = Umschalter zum wahlweisen Ziehen mit (et) oder ohne (st) Nachheizzeit; S S = Schalter im Uhrwerk, bei laufendem Uhrwerk geschlossen; S 6 = Schließungstaste und S 7 = Öffnungstaste zum Schalten des Magnetstromes von H a n d ; R 1 = Heizstromrelais; R 2 = Magnetstromrelais mit den Kontakten K 1 als Öffner und K 2, K 3 und K 4 als Schließer; R 3 = Uhrenstart- und -stopmagnet; R 4 = Hilfsrelais mit Öffner zur Vorbereitung des Start- und Stopvorganges der U h r ; T 1 = stufenloser Regeltransformator; T 2 = Heiztransformator 220/3,5 bzw. 7 V, 2000 VA; H = Heizkörper; U = U h r ; M = Magnetspule; V = Kühlluftgebläse; W = Bimetallstreifenschalter innerhalb der Magnetspule

an und schließt dabei S 5, wodurch über das Hilfsrelais R 4 das Relais R 3 wieder stromlos gemacht wird. Nach Ablauf der gewählten Zeit gibt die Uhr Strom auf das Relais R 2, dessen Kontakte K 2, K 3 und K 4 schließen während K 1 öffnet. K 3 setzt den Zugmagneten unter Strom, dessen Kraft

Automatik zum Glasziehen

645

die Arretierung des Unterstützungshebels löst. K i setzt über R i die Heizung außer Betrieb, K 4 stoppt über R 3 die Uhr und K 2 hällt unabhängig von der Uhr den Steuerstrom für R 2 geschlossen. Der abwärtsgehende Stempelkopf öffnet am Ende der Beschleunigungsstrecke den Schalter S 2, womit über R 2 der Zugmagnet stromlos wird. Der Zugstempel setzt seine Bewegung bis zum Wirksamwerden der Bremse fort. Die beiden Drucktasten S 6 als Schließer und S 7 als Öffner dienen zum Einbzw. Abschalten des Zugstromes von Hand bei besonderen Anlässen. Ein Ventilator sorgt für Kühlung aller hoch belasteten Bauelemente, insbesondere des Zugmagneten. Dieser enthält zur Sicherheit einen Temperaturwächter W aus zwei Bimetallstreifen innerhalb seiner Wicklung, der den Strom bei Erwärmung auf über + 7 0 °C unterbricht. Ein Überbrückungsschalter (nicht gezeichnet) kann ihn außer Betrieb setzen. Einige Anzeige-Glimmröhren dienen der Überwachung der einzelnen Kreise. Das Gerät erlaubt auch ein Glasziehen ohne Nachheizzeit. Hierzu wird der Umschalter S 4 auf st gelegt. Der Zugzeitpunkt ist dann lediglich von der Wahl der Position des S 1 tragenden Unterstützungshebels abhängig und erfolgt nach entsprechender Vordehnung des Werkstückes oder erwünschtenfalls auch ohne diese. Das Gerät unterteilt also den Gesamtvorgang des Glasziehens in drei bzw. zwei Phasen, deren jede durch die gewählten Einstellungen an den entsprechenden Konstruktionselementen weitgehend beeinflußbar ist. Maßhaltigkeit und Reproduzierbarkeit der Ziehprodukte

Da es im Rahmen dieser Abhandlung nicht möglich ist, alle durch Variation der oben aufgeführten maßgebenden Faktoren erhältlichen Formen von Ziehprodukten, speziell von Kapillaren, sowie deren Reproduzierbarkeit zu erörtern, beschränken wir uns hier auf Zahlenangaben für zylindrische Kapillaren, zumal diese das schärfste Kriterium für die Leistungsgrenzen unseres Verfahrens bilden. Gleichmäßige zylindrische Form von Kapillaren über eine genügend große Länge war für unsere eigenen Bedürfnisse wesentlich. Wir prüften deshalb eine Anzahl unter dieser Forderung hergestellter Kapillaren auf die Schwankungen von Außen -und Innendurchmesser über ihre Länge und berechneten die mittleren Durchmesserwerte und deren Streuung. Das Ausmessen erfolgte an der unteren Stirnfläche der hängenden Kapillare mit einem umgekehrten Auflichtmikroskop (Zeiss, Jena) in Abständen von etwa 5 mm. Die Kapillare wurde zu diesem Zweck nach jeder Messung um diesen Betrag gekürzt. Vier zufällig herausgegriffene Beispiele von Supremaxglas-Kapillaren verschiedener mittlerer Innendurchmesser sind in der folgenden Tabelle unter Angabe ihrer Herstellungsdaten aufgeführt. Die Streuungswerte lassen eine weitgehende Gleichmäßigkeit der Durchmesser über größere Rohrlängen erkennen. Die für die Kapillaren Nr. 1 und 2 errechneten Streuungen der Innendurchmesser fallen mit dem Meßfehler zu-

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SCHMIDT

Tabelle 1 S u p r e m a x g l a s k a p i l l a r e n , m i t einem 10 m m h o h e n H e i z k ö r p e r und einer initialen Beschleunigung v o n 5,4 g gezogen L f d . Nr. Rohlingsdurchmesser [mm]

außen innen

Nachheizzeit [sec]

1

2

3

4

2,3 1,23

2,3 1,23

2,18 1,18

2,69 1,55

35

35

14

25

Z u g s t r e c k e [mm]

470

470

460

440

Vermessene R o h r l ä n g e [mm]

220

135

300

125

Kapillaraußendurchmesser [^m]

50,8

47,8

72,9

63,4

[fJ-m]

±4,1

±1,3

±3,1

±2,1

Kapillarinnendurchmesser [|xm]

6,2

6,1

19,4

30,9

±0,7

±0,6

Streuung

Streuung

(±0,2)

(±0,2)

sammen, bedürfen also einer weiteren Nachprüfung mit einem anderen nicht lichtoptischen Meßverfahren. Vielleicht liegen die tatsächlichen Werte noch etwas niedriger. Bei Beschränkung auf kürzere, passend begrenzte Rohrabschnitte, welche nur einen Bruchteil der Zugstrecke ausmachen, können besonders geringe Durchmessertoleranzen eingehalten werden. Unterschiedliche Abkühlungsbedingungen und verschieden lange Verformungszeiten verschieden liegender Rohrabschnitte mögen neben anderen Faktoren für die höheren Streuungswerte längerer Rohre verantwortlich sein. In einer anderen Meßreihe prüften wir die Reproduzierbarkeit der mittleren Durchmesserwerte zylindrischer Kapillaren bei konstanter Einstellung aller an unserem Gerät wählbaren Größen unter Kontrolle der Rohlingsmaße auf 10" 1 mm. Es wurden zehn Kapillaren aus Duranglasrohlingen der Durchmesser 2,3 /1,3 unter gleichen Bedingungen gezogen und ihre mittlerenDurchmesserwerte bestimmt. Aus diesen wurde eine „Mittelwertskapillare" und die Streuung der mittleren Durchmesserwerte der Einzelkapillaren berechnet. Die Versuchsdaten waren: Heizkörperhöhe = 6,5 mm; Nachheizzeit = 40 sec; Zugstrecke = 200 m m ; vermessene Rohrlänge = 100 m m ; initiale Beschleunigung = 8,0 g. Ergebnis: Außendurchmesser 55,1 ± 0,49 ¡¿m; Innendurchmesser 5,0 ± 0,25 [i.m. Bei entsprechender Einstellung der bestimmenden Faktoren können auch Kapillaren eines wählbaren Durchmessergradienten oder auch Glasfäden und Glasnadeln vorher festlegbarer Form reproduzierbar hergestellt werden.

A u t o m a t i k zum Glasziehen

647

Durch Kontrolle der Rohlingsmaße auf 10~ 2 mm und entsprechende Auswahl lassen diese Streuungen sich prinzipiell beträchtlich einengen, wie uns Messungen an stärkeren Kapillaren gezeigt haben. Literatur [1] [2] [3]

[4] [5] [6] [7] [8] [9] [10]

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H.

U. M . W . S C H M I D T :

G E R B S T Ä D T , H . U. M . W . S C H M I D T :

S u m m a ry a n d M. W . S C H M I D T : A u t o m a t i c m a n u f a c t u r i n g of glass capillaries a n d glass filaments t r u e to size H . GERBSTAEDT

T h e design a n d construction of an a u t o m a t i c a p p a r a t u s of m a n u f a c t u r i n g glass capillaries, micropipettes, glass filaments a n d glass needles t r u e to size are described. T h e results of preliminary experiments a b o u t t h e role of relevant factors in t h e process of drawing are reported. T h e shape and a r r a n g e m e n t of t h e heater a n d its holder a n d a special d r a w piston b r a k e are essential elements of design of a n a p p a r a t u s , t h e control of which is acting on t h e glass viscosity reached a t t h e m o m e n t of drawing. T h e m e t h o d described is particularly suited for t h e production of long, thin-walled, smallcaliber capillaries or glass filaments which are u n i f o r m t h r o u g h o u t their length. The design m a y be modified to suit different dimensional requirements of t h e products. T h e reproducibility of production is explained on an example and t h e prerequisites for reaching it are discussed. PC3WMC r. r e p 6 u i T e p ( T H M . B . I I I m h ä t : Toniioe aBT0MaTH*iecK0e H3r0T0BJieHHe cTenJIHHHblX KanHJIJIHpOB H CTeKJIHHHHX HHTefl ONHCHBAIOTCH

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Kurzmitteilungen Acta biol. med. german., Band 18, Seite 649 — 653 (1967) Aus dem Onkopathologischen Institut, Budapest (Direktor: Dr. B. KELLNER) und dem Staatlichen Onkologischen Institut, Budapest (Direktor: Dr. J . V I K O L )

Über einige Eigenschaften von Antikörpern verschiedener Tierspezies gegen NK/Ly-Mäuseaszitestumorzellen G . E L E K , L . V E K E R D I u n d J . TOPERCZER

(Eingegangen am 4. 7- 1966) 1

Bei Immunisierung heterologer Tierspezies mit Zellen werden Antikörper gegen eine Vielzahl verschiedener Antigene gebildet. Antikörper gegen Tumorzellen können in verschiedenen Spezies bedeutende Unterschiede aufweisen. In der vorliegenden Arbeit wird über Ergebnisse berichtet, die mit NK/Ly-Aszites-Tumorzellen bei Ratten, Kaninchen und Hühnern erhalten wurden. Die Antikörper wurden einerseits mit Hilfe der Agglutination, der Geldiffusion sowie der Immunolyse getestet. Andererseits wurde nach Inkubation der Tumorzellen mit den Immunsera die Transplantabilität der Tumorzellen untersucht (Neutralisationstest). Zur Immunisierung erhielten SO CB Wistar-Ratten, 5 ,,random"-gezüchtete Kaninchen und 6 Leghorn-Hühner jeweilig pro Injektion 80 • 10 6 Asziteszellen des NK/LyMäuselymphoms [6] für die Dauer eines Monats alle 3 Tage i.p. appliziert. Eine Woche nach der letzten Injektion wurde den Tieren Blut entnommen.

Die serologischen Untersuchungen wurden wie folgt durchgeführt und ergaben folgende Resultate: Agglutination Zu jeweils 0,5 ml der Serum-Verdünnungsserien (Faktor 2) wurden 40 • 10 6 in physiologischer Kochsalzlösung gereinigte Tumorzellen gegeben. Die Immunsera der Kaninchen und Hühner ergaben bei einer -1024 bzw. 512fachen Verdünnung eine Agglutination. Bei den Immunsera von Ratten konnte dagegen eine Agglutination nicht festgestellt werden (Tab. 1). Geldiffusion [1] Als Antigen verwendeten wir ein in destilliertem Wasser homogenisiertes Filtrat von NK/Ly-Tumorzellen. Bringt man in ein von zwei nebeneinander1

nach Revision am 16. 11. 1966

Kurzmitteilungen

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Tabelle 1 Serologische Aktivität verschiedener Immunsera

Reaktion

Antigen

Höchste Serumverdünnung mit positiver Reaktion Ratte

Kaninchen 1024

512

+

+

Agglutination

NK/Ly Asziteszellen [40 • 106 Zellen/ml]

keine Reaktion

Geldiffusion

Aszitesflüssigkeit Homogenatfiltrat (7% Eiweiß)

keine Prpzipitation

Neutralisation

N K / L y AszitesTumorzellen [80 • 106 Zellen/ml] 90 min bei 37 °C mit Immunserum-Komplement inkubiert

8

8

Huhn

keine zytotoxische Wirkung

liegenden Reservoirs ein Immunserum von Kaninchen, in das andere ein Immunserum von Hühnern gegen das selbe Antigen, so bilden sich teilweise sich vereinigende, teilweise aber auch verschiedene Präzipitationslinien aus. Dieser Befund weist auf die Gegenwart teils übereinstimmender, teils verschiedener Antikörper in den genannten Seren hin. Bei Anwendung der Aszitesflüssigkeit oder des Serums von Mäusen als Antigen wurde ein ähnliches Bild erhalten. Die Präzipitationslinien sind also nicht spezifisch für Tumorzellen. Gleichzeitig bildet sich auch zwischen den beiden Immunserum-Reservoirs eine Präzipitationslinie aus. Die beiden Seren reagieren also auch miteinander unter Bildung eines Antikörper-Komplexes. Auch bei Anwendung von Kaninchen-Normalserum anstelle der Immunsera werden die gleichen Präzipitationslinien ausgebildet. Normalserum des Huhnes hingegen — anstelle von Immunsera angewandt — ergaben keine Präzipitation. Diese Befunde beweisen, daß in Mäusetumorzellen und im Kaninchenimmunserum gleiche Antigen-Determinanten vorhanden sind. Zwischen Antigen und Rattenimmunserum konnte kein Präzipitat nachgewiesen werden. Immunolyse

Die Lyse von Tumorzellen kann mit Hilfe der radioaktiven Tracertechnik quantitativ bestimmt werden [2], Wir inkubierten mit 51Cr markierte Tumorzellen bei 3 7 °C für 90 min in verschiedenen Immunseren unterschiedlicher Konzentrationen. Das während der Lyse aus den Zellen freigesetzte 51 Cr kann im Zentrifugatüberstand nachgewiesen werden [3]. Da es nicht gleich gelang, mit Hilfe der Geldiffusion gewebsspezifische Antigene nachzuweisen, haben wir als Kontrolle für das Antitumor-Rattenimmunserum in diesem Versuch ein Immunserum angewendet, das, wie oben angegeben,

Kurzmitteilungen

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Abb. 1. Geldiffusion. 1. Hühnerimmunserum; 2. Kaninchenimmunserum; 3. Rattenimmunserum; 4. Filtrat homogenisierter NK/Ly-Zellen

durch Impfung von 1 ml Mäuseserum bei 20 Ratten hergestellt wurde. Die eine Lyse auslösende Wirkung dieses Serums hat jedoch diejenige des Tumor-Immunserums nicht erreicht. Das Tumor-Immunserum muß demnach auch gewebsspezifische Antigene enthalten. Die Testung der Lyse wurde bei Komplement-Überschuß vorgenommen. Das Immunserum der Ratten wurde mit frischem Rattenserum, das Hühner- sowie das KaninchenImmunserum wurde mit der gleichen Menge von frischem Serumgemisch aus Meerschweinchen auf das 2fache Volumen verdünnt (Tab. 2). HühnerImmunserum erzeugte keine Lyse. Für Immunseren von Kaninchen und Ratten konnte bei 16-bzw. 32facher Verdünnung eine gut meßbare Lyse festgestellt werden. Neutralisationstest Die Neutralisation wurde folgendermaßen durchgeführt. 80-10® Tumorzellen wurden in Immunseren verschiedener Verdünnung bei 3 7 °C für 90 min inkubiert. Mit 0,2 ml dieser Inkubate wurden Swiss Mäuse (Alter ca. 3 Monate) i.p. geimpft. Angang der Zellen und Tod der Tiere wurden registriert [4]. Ratten- und Kaninchensera übten in 8facher Verdünnung eine hemmende Wirkung auf den Angang der Tumorzellen aus, obwohl Präzipitine nur im Kaninchenserum nachweisbar waren. Das gut agglutinierende und präzipitierende Hühnerserum zeigte keine ähnliche Wirkung und zwar auch dann nicht, wenn vorher ein Gemisch frischer Hühner-, Ratten-, oder Meerschweinchensera als Komplement in großer Menge zur Zellensuspension hinzugefügt wurde. Die Anwesenheit rassenidentischen Komplements als Voraussetzung für die Entwicklung immunologischer Reaktionen ist bekannt [5]. Das Hühnerserum enthält geringere Mengen Komplement als die anderen:untersuchten Sera. Hämolyse der Mäuse-Erythrozyten durch frisches Hühnerimmunserum war in unseren Versuchen kaum festzustellen, während Immunsera 44

Acta biol. med. german., Bd. 18, H e f t 5

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