Acta Biologica et Medica Germanica: Band 16, Heft 4 [Reprint 2021 ed.] 9783112587348, 9783112587331

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\(l\l!l!lllll.ll\ ETMEDICA GERMANICA HERAUSGEBER:

R. BAUMANN, H . D U T Z , A. G R A F F I , H . G U M M E L , F. JUNG L.-H. K E T T L E R , S. M. R A P O P O R T UNTER MITARBEIT

VON:

W. B E I E R , H. D R I S C H E L , H. F R U N D E R , M. G E R S C H , E. G O E T Z E , H. H A N S O N , F. H A U S C H I L D , G . H O L L E , F. MACH, H. M A T T H I E S, G. MOHNI KE f , O. P R O K O P , K. S C H U B E R T , F. S C H W A R Z , G. S T E R B A , A. W O L L E N B E R G E R SCHRIFTLEITUNG:

W. S C H E L E R , H. B I E L K A

AKADEMIE-VERLAG

• BERLIN

• B A N D 16 • H E F T 4

• S E I T E 329-463

• 1966

AUFNAHMEBEDINGUNGEN 1. Es werden nur Arbeiten angenommen, die nicht an anderer Stelle mit demselben Inhalt veröffentlicht oder zur Veröffentlichung angeboten werden. Der Autor verpflichtet sich nach Annahme, die Arbeit an keiner anderen Stelle zu veröffentlichen. 2. Die Arbeit muß wissenschaftlich wertvoll sein.

Bestätigungen bekannter Tat-

sachen, Versuche und Beobachtungen ohne positives Ergebnis werden, wenn überhaupt, nur in kürzester Form aufgenommen. Nicht aufgenommen werden Arbeiten referierenden Charakters, Polemiken und rein spekulative Arbeiten, falls sie nicht ganz wesentliche neue Gesichtspunkte enthalten. 3. Kurzmitteilungen für experimentelle Ergebnisse werden bei der Drucklegung zeitlich bevorzugt. Für ihren Inhalt ist ausschließlich der Autor verantwortlich. 4. Die Arbeiten müssen kurz und klar geschrieben und gegliedert sein. Problematik (Einleitung), Methodik, Befunde und Diskussion, evtl. Schlußfolgerungen sollen deutlich in Erscheinung treten. Der Arbeit soll ein Kurzreferat der wesentlichsten Ergebnisse vorausgestellt werden. Neben einer anderssprachigen erscheint auf jeden Fall eine deutsche Zusammenfassung.

Die Arbeiten werden in folgenden

Sprachen angenommen: Deutsch, Russisch, Englisch und Französisch. 5. Die Arbeiten werden im Sofortumbruch gesetzt; größere Korrekturen in Form von Streichungen bzw. Zusätzen sind daher in der Umbruchkorrektur nicht mehr möglich. 6. Genaue Hinweise zur Manuskriptgestaltung sind von der Redaktion der Zeitschrift anzufordern und sind unbedingt einzuhalten. 7. Manuskripte sind an die Herausgeber zu senden oder direkt an die Redaktion der Acta biologica et medica germanica, 1115 Berlin-Buch, Lindenberger Weg 70. 8. Von jeder Originalarbeit werden kostenlos 80 Sonderdrucke geliefert.

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hinaus können bis zu 100 Sonderdrucke gegen Berechnung bezogen werden.

Die Herausgeber

ACTA BIOLOGICA ET MEDICA GERMANICA Herausgeber : R. B a u m a n n

• H. D u t z

• A. G r a f f i • H . G u m m e l • F . J u n g

• L.-H. K e t t l e r

S. M. R a p o p o r t Band

16

1966

Heft 4

A c t a biol. m e d . g e r m a n . , B a n d 16, S e i t e 3 2 9 — 3 3 6 (1966) Aus d e m Physiologisch-chemischen I n s t i t u t der Karl-Marx-Universität Leipzig ( K o m m . D i r e k t o r : Doz. D r . W . R O T Z S C H )

Aminotransferasen und Thyreohormone1 W.

ROTZSCH

( E i n g e g a n g e n a m 11. 10. 1965)

Zusammenfassung 1. S c h i l d d r ü s e n h o r m o n e s t e i g e r n d i e A k t i v i t ä t d e r A l a n i n - u n d d e r A s p a r t a t A m i n o t r a n s f e r a s e in d e r L e b e r d e r R a t t e . 2. Die W i r k u n g ist d o s i s a b h ä n g i g ; d i e A s p a r t a t - A m i n o t r a n s f e r a s e r e a g i e r t s t ä r k e r . 3. T r i j o d t h y r o n i n ist w i r k s a m e r , T r i j o d t h y r o p r o p i o n s ä u r e u n d T e t r a j o d t h y r o essigsäure w i r k e n auf d i e A l a n i n - A m i n o t r a n s f e r a s e s t ä r k e r als T h y r o x i n . 4. I n d e n ü b r i g e n O r g a n e n v e r h a l t e n sich d i e E n z y m a k t i v i t ä t e n u n t e r S c h i l d d r ü s e n h o r m o n e n ä h n l i c h . H e r z u n d M u s k u l a t u r , H i r n g e w e b e u n d N i e r e zeigen e r h ö h t e Werte. 5. A u s v o r a n g e h e n d e n U n t e r s u c h u n g e n ü b e r d e n P y r i d o x i n g e h a l t in d e r S k e l e t t m u s k u l a t u r w i r d die I n d u k t i o n d e r T r a n s a m i n a s e n d u r c h d i e T h y r e o h o r m o n e auf e i n e e r h ö h t e E n z y m s y n t h e s e z u r ü c k z u f ü h r e n sein. 6. D i e U n t e r s u c h u n g e n s p r e c h e n d a f ü r , d a ß n i e d r i g e r e E n z y m a k t i v i t ä t e n m e h r auf eine a n a b o l e u n d e r h ö h t e E n z y m w e r t e m e h r auf eine k a t a b o l e S t o f f w e c h s e l l a g e hinweisen.

Die Veränderung von Enzymmustern unter dem Einfluß von Hormonen zu messen, hat verschiedentlich weitere Aufklärung über deren biochemische Wirkung ergeben. Das Verhalten von Aminotransferasen unter Schilddrüsenhormonen wurde bisher sehr unterschiedlich beurteilt (BERTOLINI und Mitarbeiter [4], C A N A L und Mitarbeiter [6], H O R V A T H [ 1 1 ] ) . Vor allem war die Ursache eine verschiedene Applikationsweise, veränderte Dosis und unterschiedliche Latenzzeit der verabreichten Schilddrüsenhormone. In vorliegender Arbeit wurde der Einfluß von Thyroxin und einiger verwandter Verbindungen auf die Aktivität der Alanin-Aminotransferase 1

Teilweise v o r g e t r a g e n auf d e r 2. A r b e i t s t a g u n g d e r G e s e l l s c h a f t f ü r e x p e r i m e n t e l l e Medizin d e r D D R , A r b e i t s g e m e i n s c h a f t B i o c h e m i e , M a g d e b u r g J u n i 1965 22

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ROTZSCH

(EC 2.6.1.2) und der Aspartat-Aminotransferase (EC 2.6.1.1) 1 in verschiedenen Organen, vor allem im Lebergewebe der R a t t e untersucht. Wir hatten früher den Einfluß von Aminotransferasen im Serum allein unter Thyroxin beschrieben [17]. Die vorliegenden Untersuchungen geben deshalb zudem Hinweise auf die Entstehung und Veränderung des Serumenzymspiegels durch die Organenzym-Aktivität. Über die induktive Wirkung von Hormonen hinaus interessierte die Frage, ob eine reduzierte Aminotransferase-Aktivität allgemein für eine anabole Stoffwechsellage und eine erhöhte Aktivität für einen katabolen Stoffwechsel sprechen kann. Methodik Die Aminotransferasen wurden nach einem gering modifizierten Verfahren nach R E I T M A N und F R A N K E L [15] kolorimetrisch als Dinitrophcnylhydrazone bestimmt, wie früher ausführlich beschrieben wurde ( R O T Z S C H et al. [17]). Die Ansätze wurden für beide Enzyme — wenn nicht besonders vermerkt — genau 30 min im Wasserbad bei 37 °C inkubiert und anschließend mit 1 ml 10~ 3 M 2,4-DinitrophenylhydrazinLösung ( V E B Berlin-Chemie) in l N HCl versetzt. Nach weiteren 20 min wurden 10 ml 0,4 N NaOH zugesetzt und nach 5 min am Mikrokolorimeter F E K - M mit Grünfilter in einer l O m m - K ü v e t t e gegen den jeweiligen Leerwert gemessen. Die angegebenen Einzelwerte sind Mittelwerte aus Doppelbestimmungen. Wir verwendeten R a t t e n des Inzuchtstammes B D I I I (Prof. D R U C K R K Y , Freiburg) von 150 —200 g Körpergewicht, die wir seit Jahren selbst nachzüchten. Auf gleiche Verteilung der Geschlechter wurde geachtet. Die Versuchstiere erhielten üblichcs Mischfutter und wurden bei Zimmertemperatur gehalten. Eingesetzt wurden für die Versuche folgende Substanzen: Thyroxin (L-Thyroxin, Reanal/Ungarn); Trijodthyronin (Hoechst-AG, Frankfurt/M.); Trijodthyropropionsäure (Fluka-AG, Schweiz); Tetrajodthyroessigsäure (Fluka-AG, Schweiz). Sie wurden den Tieren in den jeweils angegebenen Mengen i.p. in schwach alkalischer, wäßriger Lösung injiziert. Ergebnisse

In Tabelle 1 ist die Aktivität von Lebertransaminasen nach verschiedenen Thyroxindosen eingetragen. Die Tiere erhielten l m a l die angegebenen Thyroxinmengen i. p. und wurden nach 5 Std. getötet. Die Enzymaktivität wurde nach einer Inkubationszeit von 30 min für die Alanin-Aminotransferase und für eine Inkubationszeit von 60 min für die Aspartat-Aminotransferase nach der ursprünglichen Methodik bestimmt. Um vergleichbare Werte zu erhalten, ist die Enzymaktivität auch in Beziehung zu den Normalwerten in Prozent angegeben. Beide Enzymaktivitäten steigen mit zunehmender Thyroxingabe kontinuierlich an. Die höchsten Werte liegen für beide Enzyme bei 3 mg (134—155%). Die Irrtumswahrscheinlichkeit ,,P" ist in Tabelle 1 mit aufgenommen. Aspartat-Aminotransferase (GOT) = L - A s p a r t a t : 2-Oxoglutarat-Aminotransferase (EC 2.6.1.1.); Alanin-Aminotransferase (GPT) = L-Alanin: 2-Oxoglutarat-Aminotransferase (EC 2.6.1.2). 1

Aminotransferasen und Thyreohormone

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Tabelle 1 Die Aktivität von Aminotransferasen in der Leber nach verschiedenen Thyroxindosen nach 5 Std. m

S X,/Tier

Enzyme ,0

N p

G P T GOT 100 22

G P T GOT 94

3,0

1,0

0,1

-

GOT

GPT

132 6 < 0 , 5 H-Wert des Versuchsmediums war 7,4. Das Flüssigkeitsvolumen betrug 2,1 ml, in dem 2 mg Asziteszellen (Trockengewicht) suspendiert waren. Der Gasraum enthielt 5 Vol.% CO., in N z ; die Versuchstemperatur betrug 35 °C. Die anaerobe Glykolyse wurde nach 10-minütigem Temperaturausgleich der kompletten Versuchslösung im Thermostaten etwa 1 Std. lang gemessen. Auf eine 20-minütige aerobe Vorinkubation des kompletten Versuchsmtdiums in 9 5 % Luft— 5% C0 2 , wie sie von N E G E L F . I N et al. angegeben wird, wurde verzichtet, da hierdurch weder ohne noch mit Fettsäure eine Erhöhung der anaeroben Glykolyse beobachtet wurde. Zu einem ähnlichen Ergebnis gelangten G A J A et al. [5], die bei 1 5-minütiger aerober Vorinkubation von YosHiDA-Aszites-Hepatomzellen in 9 5 % O,— 5 ° 0 CO, ohne exogene Fettsäuren keinen Einfluß auf die anaerobe Glykolyse fanden. Nach eigenen Versuchen wird jedoch bei EHRLIEH-Aszites-Karzinomzellen eine etwa 10° o ige Erhöhung der anaeroben Glykolyse ohne exogene Fettsäuren bei 2-stiindjger Vorinkubation in 9 5 % L u f t — 5 % C 0 2 erreicht. Ergebnisse

In dem Bemühen, nach Möglichkeit in vivo-Verhältnisse auch auf in vitroUntersuchungen zu übertragen, wurden die genannten Fettsäuren in Form ihrer Serumalbumin-Komplexe eingesetzt. Außerdem wurde das die Serumalbumin-Fettsäure-Bindung störende Kalzium im Versuchsmedium

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H.

THEISE

durch Magnesium ersetzt. Wie jedoch den Versuchsergebnissen zu entnehmen ist, wurde in einigen Fällen auch bei gleichzeitiger Anwesenheit von Mg++ und Ca++ gearbeitet. Unter diesen Voraussetzungen, die im einzelnen in der Diskussion erörtert werden, führte die Untersuchung des Einflusses von gesättigten Fettsäuren, trans-Fettsäuren und Fettsäuren mit funktionellen Gruppen auf die anaerobe Glykolyse zu den folgenden Ergebnissen (s. Abb. 1):

60 55

r

60 SS

u fjg

»0 20 c ettsdure

30 40 50 60 70 oro mg Zellen (Trockengew /

Abb. 1. Einfluß verschiedener Fettsäuren auf die anaerobe Glykolyse von E H R L I C H Aszites-Karzinomzellen. Versuchsmedium mit Mg"f + . Kurve 1: Pentadekan- bis Nonadekansäure, y-Oxononadekansäure; 2: Laurinsäure; 3: Myristinsäure; 4: Vaccensäure; 5: Elaidinsäure; 6: 10-Hydroxyoktadekansäure; 7: Ölsäure

1. F ü r die gesättigten Fettsäuren der Kettenlänge C 1 5 —C 1 9 und für die y-Oxononadekansäure werden identische Kurven erhalten (Abb. 1, K u r v e 1). Mit zunehmender Konzentration dieser Fettsäuren im Versuchsmedium erfolgt ein Anstieg der anaeroben Glykolyse. B e i etwa 25 —30 dieser Fettsäuren pro mg Zellen (Trockengewicht) ist die maximale Glykolysestcigerung erreicht, die 2 0 — 2 5 % beträgt. Darüber hinaus bewirken noch höhere Fettsäurekonzentrationen weder einen Abfall noch einen weiteren Anstieg der Glykolyse. 2. Aus der Reihe der gesättigten Fettsäuren fallen die Laurinsäure und die Myristinsäure heraus (Abb. \, Kurve 2 und 3)- Die Laurinsäure ergibt eine glockenförmige Kurve mit einer maximalen Glykolysesteigerung von 2 5 — 3 0 % bei 25 —30 /ig Fettsäuren pro mg Zellen (Trockengewicht). F ü r

Fettsäurewirkung auf Energiestoffwechsel. I

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die Myristinsäure bewirken nur die niedrigsten Konzentrationen noch eine geringe Glykolysesteigerung von maximal 5—10%, während bei Erhöhung der Fettsäurekonzentration die Glykolyse auf den Ausgangswert (anaerobe Glykolyse ohne Fettsäure) abfällt. 3. Die trans-Fettsäuren Elaidinsäure und Vaccensäure zeigen eine der Myristinsäure ähnliche Beeinflussung der Glykolyse. Beide steigern die anaerobe Glykolyse bei niedrigen Fettsäurekonzentrationen maximal 15 bis 20%. Bei Erhöhung der Fettsäurekonzentration erfolgt für Vaccensäure (Abb. 1, Kurve 4) ein Abfall auf den Ausgangswert oder etwas darunter, während für Elaidinsäure (Abb. 1, Kurve 5) eine Abnahme unter den Ausgangswert auftritt, so daß beim Ubergang in den horizontalen Kurvenast eine um etwa 25% erniedrigte Glykolyse resultiert. Hier ist im mikroskopischen Bild eine Schädigung der Zellen erkennbar. 4. Die Hydroxylgruppen-tragenden Fettsäuren 10-Hydroxvoktadekansäure und 9,10-Dihydroxyoktadekansäure ergeben voneinander stark abweichende Dosis-Wirkungskurven. Während die 9,10-Dihydroxyoktadekansäure einen Kurvenverlauf aufweist, der dem der gesättigten C 15 —C 19 -Fettsäuren und der y-Oxononadekansäure nahezu identisch ist (lediglich die Erreichung der maximalen Glykolysesteigerung ist nach höheren Fettsäurekonzentrationen hin verschoben), erhält man für die 10-Hydroxyoktadekansäure eine Kurve (Abb. 1, Kurve 6), die in ihrem Verlauf Ähnlichkeit mit den Kurven 3 bis 5 hat, die aber für alle geprüften Fettsäurekonzentrationen gesteigerte Glvkolysewerte aufweist. Bei Verlängerung der Versuchsdauer über 1 Std. hinaus findet man jedoch einen Abfall der Glykolyse, so daß nach etwa 100 min Versuchsdauer die (^/-Werte des horizontalen Kurvenastes diejenigen der Elaidinsäure-Kurve erreicht haben. Die hohe Glykolysesteigerung für die niedrige 10-Hydroxyoktadekansäure-Konzentration bleibt während der ganzen Versuchsdauer unverändert. Die Maxima der Kurven 3—6 der Abbildung 1 liegen alle zwischen 10 und 15 /ig Fettsäure pro ml Versuchsflüssigkeit. 5. Setzt man dem Versuchsmedium außer Mg++ noch C a + + als zweites bivalentes Kation (Molverhältnis Mg^/Ca - * + = 1:2) zu, so erhält man für Laurinsäure, Myristinsäure, Elaidinsäure und Vaccensäure identische DosisWirkungskurven, wie sie in Abbildung 2, Kurve 2 wiedergegeben sind; es sind Kurven, die in ihrem Verlauf und der Höhe der Glykolysesteigerung denen der gesättigten C 15 —C 19 -Fettsäuren im Mg++-haltigen Versuchsmedium gleich sind. 6. Noch wesentlich stärker ausgeprägt als für die unter 5- genannten Fettsäuren ist der Einfluß der bivalenten Kationen Mg++ und Ca++ für die Wirkung der Ölsäure (cis-9-Octadecensäure), die hier zu Vergleichszwecken mitgetestet wurde. Im Mg++-haltigen Versuchsmedium bewirken steigende Ölsäurekonzentrationen einen sofortigen starken Abfall der

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Glykolyse (Abb. 1, Kurve 7), während im (Mg++ und Ca++)-haltigen Versuchsmedium eine 35—40%ige Glykolysesteigerung auftritt (Abb. 2, Kurve 1). 65

7 / •

60 55 & 50

/

/

/ / / /

45

0

10

/ /

/

/

/

/

20

fjg Fettsäure

/ 2

/

30

40

pro mg Zelten

50

60

70

(Trockengew.)

Abb. 2. Einfluß verschiedener Fettsäuren auf die anaerobe Glykolyse von E H R L I C H Aszites-Karzinomzellen. Versuchsmedium mit Mg + + und C a + + (Molverhältnis 1 : 2). Kurve 1: Ölsäure; 2 : Laurinsäure, Myristinsäure, Elaidinsäure, Vaccensäure Diskussion

Aus Arbeiten von Autoren, die sich unter verschiedenen Aspekten mit Fettsäuren beschäftigten, ist zu entnehmen, daß in Untersuchungen mit gesättigten Fettsäuren vorwiegend die Fettsäure-Albumin-Komplexe eingesetzt werden [6] —[8]. Die Bindung der Fettsäuren an Albumin ist seit langem bekannt. Der Bildung der Fettsäure-Albumin-Komplexe in vivo kommt große physiologische Bedeutung zu, da die höheren Fettsäuren so ihre die Oberflächenspannung herabsetzende Wirkung und die höchstwahrscheinlich dadurch bedingte zytotoxische Wirkung verlieren. Unveresterte Fettsäuren sind im Plasma von Mensch und R a t t e nur in einer Menge von 0,2 bis 2,0 Milliäquivalenten pro Liter vorhanden [9] — [12]. Für die in dieser Arbeit durchgeführten Versuche sollten die in vivo-Verhältnisse soweit wie möglich auch unter in vitro-Bedingungen realisiert sein. Dabei wurde die größte Bedeutung der Löslichkeit der gesättigten und der trans-Fettsäuren im Versuchsmedium von />H 7,4 beigemessen, da in ersten Versuchen ein Ausflocken dieser Fettsäuren ohne Anwesenheit von Serumalbumin beobachtet worden war, so daß die von NEGELEIN et al. [1] gefundene Unwirksamkeit zunächst auf deren unzureichende Löslichkeit zurückgeführt werden mußte. E s war daher zu überlegen, welches Mengenverhältnis Fettsäure zu Albumin gewählt werden sollte. Da nach [1] die Glykolysesteigerung durch nachträgliche Zugabe einer größeren Menge Serumalbumin wieder aufgehoben wird, war die Serumalbuminmenge so zu wählen, daß dieser Effekt von

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vornherein ausgeschaltet blieb. Es wurde ausgegangen von Untersuchungen GOODMANS [13], der fand, daß Fettsäuren mindestens in drei Stufen an Albumin gebunden werden. In der ersten Stufe erfolgt eine Bindung von 2 Mol Fettsäure pro Mol Albumin, in der zweiten eine schwächere Bindung von 5 Mol Fettsäure pro Mol Albumin und in der dritten Stufe eine noch schwächere Bindung von 20 Mol Fettsäure pro Mol Albumin, d.h. insgesamt werden 27 Mole Fettsäure pro Mol Albumin gebunden. Bei einem mittleren Molekulargewicht der zu untersuchenden Fettsäuren von 280 und des Serumalbumins von 68 000 müßte ein Mengenverhältnis Fettsäure zu Serumalbumin von 27 • 280/68000 = 1/9 sinnvoll sein. Nach GOODMAN [ 1 3 ] haben die gesättigten und einfach ungesättigten C 1 6 — C 1 8 Fettsäuren die höchsten Assoziationskonstanten, während z. B. Linolsäure eine lömal niedrigere Assoziationskonstante hat. Die Fettsäuren wurden daher alle in Gegenwart der 9fachen Menge Serumalbumin untersucht. In einigen Versuchen wurde auch die 30fache Menge Serumalbumin eingesetzt [14], um zu prüfen, inwieweit bei dieser hohen Serumalbuminmenge bereits eine Abschwächung der Fettsäurewirkung erfolgt. Es zeigte sich, daß bei Erhöhung der Serumalbuminmenge das Maximum der Glykolysesteigerung erst bei einer etwas höheren Fettsäurekonzentration erreicht wird, weil durch die 30fache Serumalbuminmenge ein größerer Anteil der Fettsäure so fest gebunden vorliegt, daß dieser nicht glykolysesteigernd wirksam werden kann. In diesem Zusammenhang war auch der Befund von K U N Z und K A I S E R [15] interessant, daß Ca++ die Serumalbumin-Fettsäure-Bindung hemmt, Mg++ dagegen nicht. Unter Berücksichtigung dieses Effektes für die in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Versuche konnte so eine Komplexbildung nur zwischen Fettsäure und Serumalbumin erwartet werden, wenn Ca++ durch Mg++ ersetzt wird. Die Versuche haben ergeben, daß in Abhängigkeit von den bivalenten Kationen Mg++ und Ca++ geradzahlige und ungeradzahlige gesättigte Fettsäuren, trans-Fettsäuren und einige andere Fettsäuren eine Steigerung der anaeroben Glykolyse hervorrufen, die zwar geringer (20—25%) als die der ungesättigten cis-Fettsäuren ist, die aber dennoch eindeutig vorhanden ist. Dieses Ergebnis steht in Ubereinstimmung mit Ergebnissen von B O R S T et al. [ 1 6 ] , die fanden, daß ungesättigte Fettsäuren die latente ATPase-Aktivität frischer Rattenlebermitochondrien stärker stimulieren als gesättigte Fettsäuren. K A T C H M A N et al. [17] fanden einen stärkeren Einfluß ungesättigter gegenüber gesättigten Fettsäuren auf die endogene Atmung von Leukämie-Zellen der Ratte. Die große Bedeutung der bivalenten Kationen für die Fettsäurewirkung kommt besonders deutlich zum Ausdruck bei Laurinsäure, Myristinsäure, Elaidinsäure und Vaccensäure, die in Mg+^-haltigem Versuchsmedium voneinander abweichende Dosis-Wirkungskurven ergeben haben (Abb. 1, Kurven 2 — 5), die aber im Versuchsmedium mit Mg++ und Ca4 + den glei-

H.

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THEISE

chen Kurvenverlauf aufweisen (Abb. 2, Kurve 2) wie die gesättigten F e t t säuren der Kettenlängen C15 bis C ]9 . Weiterhin haben die Versuche gezeigt, d a ß unter gleichen Versuchsbedingungen (Versuchsmedium mit Mg++ als bivalentem Kation) die q u a n t i t a t i v unterschiedlichen Wirkungen aller geprüften Fettsäuren zweifellos eine Folge ihrer chemischen S t r u k t u r sind. Die Sonderstellung der Myristinsäure in der Reihe der gesättigten F e t t s ä u r e n wird auch hier am Beispiel der anaeroben Glykolyse erneut bestätigt. Die Wirkung der Elaidinsäure ist ihrem cis-Isomeren, der Ölsäure (Abb. 1, K u r v e 7), unter den obigen Versuchsbedingungen durchaus schon vergleichbar in dem Sinne, daß f ü r höhere Fettsäurekonzentrationen eine deutlich erniedrigte Glykolyse resultiert. Myristin- u n d Elaidinsäure nehmen somit wegen ihrer besonderen Wirkungsweise eine Übergangsstellung zwischen den gesättigten und den cis-konfigurierten ungesättigten Fettsäuren ein. Der Befund, d a ß — im Gegensatz zur Elaidinsäure — die Vaccensäure, die sich nur durch die Lage der Doppelbindung von der Elaidinsäure unterscheidet, bei höheren Konzentrationen die EAC-Zellen nicht schädigt, ist ein weiterer Hinweis auf die spezifische Ansprechbarkeit der EAC-Zellen auf bestimmte, chemisch unterschiedlich strukturierte Fettsäuren. Zur Frage des Wirkungsmechanismus der Fettsäuren soll in einer folgenden Arbeit im Zusammenhang mit B e f u n d e n an cis-konfigurierten ungesättigten F e t t s ä u r e n Stellung genommen werden. Frl. G U D R U N S C H A R T E sei an dieser Stelle f ü r zuverlässige M i t a r b e i t bei der D u r c h f ü h r u n g d e r Versuche g e d a n k t . Literatur [1]

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F e t t s a u r e w i r k u n g auf E n e r g i e s t o f f w e c h s e l . I

371

Summary : T h e i n f l u e n c e of h i g h e r f a t t y acids on t h e e n e r g y m e t a b o l i s m of E H R ascites t u m o r cells. I. T h e e f f e c t of s a t u r a t e d a n d t r a n s - c o n f i g u r a t e d u n s a t u r a t e d f a t t y acids on t h e a n a e r o b i c glycolysis H . THKISIC

LICH

I t is s h o w n t h a t s a t u r a t e d a n d t r a n s - c o n f i g u r a t e d u n s a t u r a t e d f a t t y acids increase t h e a n a e r o b i c glycolysis of E H R L I C H ascites t u m o r cells as s e r u m a l b u m i n c o m p l e x e s . T h e m a x i m u m increase a v a r a g e d 20 t o 25 p e r c e n t a n d t h u s will b e lower t h a n t h a t of cisc o n f i g u r a t e d u n s a t u r a t e d f a t t y acids (35 t o 40 p e r c e n t ) . T h e choice of t h e b i v a l e n t c a t i o n s is e s s e n t i a l for t h e e f f e c t i v e n e s s of t h e f a t t y acids. I n m e d i a c o n t a i n i n g M g + + as t h e sole b i v a l e n t c a t i o n , t h e f a t t y acids e x e r t e d a q u a n t i t i v e l y d i f f e r e n t effect on t h e a n a e r o b i c glycolysis, d e p e n d i n g on its c h e m i c a l s t r u c t u r e . PeaioMC r.

Teii3e:

acqiiTHbix

BJIHHHHC KJieTOK

BHCUIHX

3pJinxa.

Hiiipnux 1.

KHCJIOT

JJeiicTBHe

H T p a H C - J K H p H b l X KHCJIOT H a a H a 3 p 0 6 l I b I H

na

aHepreTHHecKHii

HacbimeHiibix

/KHpHbix

ofiMen KHCJIOT

FJIHKO J1H3

iiOKa3biBaeT, I T O HacbimeHHbie H TpaHc-KomJmrypHpoBaHiibie BbicuiHe /KHpHbie KHCJIOTbl, B KaHeCTBe KOMnjieKCOB CblBOpOTOMHblX ajII)6yMHH0B, IIOBblmaiOT aHaapoOHbitt I - J I H K O J I H 3 acijHTHbix KJieTOK 3 p j i n x a . MaKCHMajibHoe noBbimeHHe B cpe^neM paBHO 2 0 — 2 5 % , T . e . HHHie MaKCHiwaJibHoro noBbimeHHH HeHaABTOP

CblmeHHblX

UHC-KOH(J)HrypHpOBaHHbIX

BblCIllHX

JKHpiIblX

KHCJIOT

(35

40%).

C y m e c T B e n n o e 3HaieHHe JIJIH 3 $ ( J ) 6 K T H B H O C T H w n p H b i x K H C J I O T HMeeT BbiGop OHBaJieHTHbix KaTHoiioB. B onbiTHoft c p e j j e , c o H e p w a m e i i M g + + KaK eaHHCTBeHHbiii GHBaJieHTHblii KaTHOH, HCCJiejOBaHHbie JKHpHbie KHCJIOTbl OKa3aJlH, B 3 3 B H C H M 0 C T H O T H X X H M H H E C K O H CTpyKTypbi, KaHecTBeHHO pa3JiHMHoe jieiicTBHe n a anaspoSHbiii TJ1HKO JIH3.

A c t a biol. m e d . german., B a n d 16, Seite 372 — 387 (1966) I n s t i t u t f ü r Zellphysiologie (Direktor: Dr. habil. H . B I E L K A ) des medizinisch-biologischen Forschungszentrums der Deutschen Akademie der Wissenschaften zu Berlin, Berlin-Buch

Anwendung der Manometrie zur Untersuchung des Zellwachstums b e i m EHRLiCH-Asziteskarzinom.

Einfluß der Sauerstoffkonzentration auf die Zell Vermehrung E. NEGELEIN,

I. LEISTNER u n d

L.

JÄHNCHEN

(Eingegangen am 14. 12. 1965)

Zusammenfassung Zur U n t e r s u c h u n g des W a c h s t u m s der Krebszelle wird die A n w e n d u n g der Manometrie vorgeschlagen, bei der die mit der V e r m e h r u n g der Zellen einhergehende Z u n a h m e des Gärungsstoffwechsels gemessen wird. Die zeitliche Z u n a h m e der Milchsäuregärung v e r l ä u f t nahezu logarithmisch. Sie b e t r ä g t e t w a 5 — 6 % pro S t u n d e ; das entspricht einer V e r d o p p l u n g der Zellzahl in 11,5—14 Std. Der Vorteil der manometrischen B e o b a c h t u n g des Zellwachstums liegt darin, d a ß eine Beeinflussung des W a c h s t u m s der Krebszelle u n t e r standardisierten Bedingungen in Versuchszeiten von etwa 24 Std. q u a n t i t a t i v e r k a n n t werden k a n n . Es wurde gefunden, d a ß die Krebszelle sich a m schnellsten bei sehr niedriger Sauerstoffkonzentration v e r m e h r t . Bei atmosphärischem S a u e r s t o f f d r u c k ist die Zellvermehrung schon beträchtlich g e h e m m t .

Im Folgenden wird die Anwendung der manometrischen Meßmethode zur Untersuchung des Wachstums von Krebszellen beschrieben. Manometrisch gemessen wird die Zunahme des Gärungsstoffwechsels, die mit der Zunahme von Zellsubstanz einhergeht. Durch Auszählen der Zellen bei Beginn und am Ende des Versuchs wird die Zunahme der Zellzahl ermittelt. Als Versuchsobjekt wurde bisher die EHRLICH-Asziteskarzinomzelle benutzt. In einem synthetischen Nährmedium, dem 4% Kälberserum zugesetzt sind, vermehren sich die Asziteszellen bei 35 °C in 24 Std. um etwa 180%. Die Milchsäuregärung bleibt anfangs etwa 3 bis 5 Std. konstant und steigt dann im weiteren Zeitverlauf zunehmend an. Der Anstieg entspricht dabei nahezu dem einer e-Funktion. Die relative Zunahme der Milchsäuregärung liegt zwischen 0,048 und 0,061 pro Stunde; sie entspricht einer Verdoppelung der Milchsäuregärung in 11,4—14,5 Std. Das Zeitintervall der konstanten relativen Zunahme beträgt unter den beschriebenen Versuchsbedingungen

I n v i t r o - K u l t i v i e r u n g von Aszites-Karzinomzellen

373

etwa 11 —19 Std. E s ist um so kürzer, je größer die anfangs eingesetzte Zellmenge war. Die gesamte Versuchszeit beträgt etwa 24 Std. Dann hat sich das Nährmedium so weit verändert, daß die Geschwindigkeit der Milchsäurebildung und die Vermehrung der Zellen schon deutlich gehemmt sind. Werden dann die Zellen mit frischer Versuchslösung wieder auf die Ausgangskonzentration verdünnt, so vermehren sie sich weiterhin in mindestens gleichem Maße wie vorher. Zellen, die sich in vitro vermehrt haben, machen zytologisch einen guten, intakten Eindruck. Sie haben eine nahezu einheitliche Größe, in der Regel einen Durchmesser von etwa 1 3 — 1 4 ^ . Im Gegensatz dazu ist die Größe der Asziteszellen, wenn sie dem Bauchraum der Maus entnommen werden, recht unterschiedlich. Bei Wiederverimpfung auf die Maus zeigten Zellen, die sich in vitro nach zweimal 24 Std. um 4 8 0 % vermehrt hatten, ein ungeschwächtes Wachstum. Die Zunahme der Milchsäuregärung ist ein Maß für das Wachstum der Zellen, aber nicht immer ein Maß für die Zellvermehrung. So fanden wir z. B . in Gegenwart einiger Pharmaka bei unverminderter Zunahme der Milchsäuregärung eine wesentlich geringere Zellvermehrung. In solchen Fällen waren die Zellen infolge gehemmter Zellteilung deutlich erkennbar in ihrer Größe gewachsen. Der Vorteil der manometrischen Beobachtung des Wachstums liegt darin, eine Beeinflussung unter definierten standardisierten Bedingungen schnell quantitativ erkennen zu können. Ein wesentliches Ergebnis dieser Arbeit ist die Erkenntnis, daß die Krebszelle sich am schnellsten bei sehr niedrigem Sauerstoffdruck vermehrt. Schon bei atmosphärischem Sauerstoffdruck ist die Zellvermehrung beträchtlich gehemmt. Material und Methodik Sämtliche Glasgeräte, ausgenommen die Bakterienfilter, werden in konzentrierter Chromschwefelsäure gereinigt und mit Wasser gründlich nachgewaschen. Obwohl uns die B e d e n k e n gegen Anwendung von Chromschwefelsäure b e k a n n t sind, verwenden wir sie weiterhin, weil bei uns bisher keine Nachteile durch sie aufgetreten sind. Die B a k terienfilter werden nach der von der Herstellerfirma empfohlenen Vorschrift mit heißer konzentrierter Schwefelsäure gereinigt. Die F i l t e r und die Versuchsgefäße werden zusätzlich mit 0 , 1 % i g e r Chelaplexlösung gespült und mit Wasser nachgewaschen. E s wird nur Wasser, das aus einer Glasapparatur doppelt destillert worden ist, benutzt. Die B a k t e r i e n f i l t e r werden eine Stunde im Dampftopf, alle übrigen Glasgeräte 2 Std. bei 155 °C im Heißluftsterilisator sterilisiert. Der zur Verbindung von Versuchsgefäß und M a n o m e t e r dienende Schliffkern am Manometer wird vor dem Ansetzen des Gefäßes a b g e f l a m m t und nur wenig a m oberen R a n d gefettet. Zwei Arten von Versuchsgefäßen wurden verwendet, deren F o r m e n aus den Abbildungen 1 und 2 ersichtlich sind. Die Gefäße haben ein Gesamtvolumen von etwa 60 ml. Die Abbildung 1 zeigt die allgemein benutzte einfache G e f ä ß f o r m ; das Gefäß der Abbildung 2 besteht aus zwei über eine B r ü c k e miteinander verbundenen R ä u m e n , die eine Mischung der Flüssigkeiten beider R ä u m e ermöglicht. D a s Volumen der Versuchsflüssigkeit b e t r ä g t 10 ml. W i r haben anfangs die zum E i n s a t z kommende Zellmenge zunächst in das halbe Volumen der Versuchsflüssigkeit gegeben, um nicht mit einer zu kleinen Zellkonzentration zu starten. Hierfür wurden die Zweiraumgefäße benutzt.

374

E . NEGELEIN, I. LEISTNER, L .

JÄHNCHEN

In beide R ä u m e kamen je 5 ml der Nährlösung, aber die Asziteszellen nur in einen der beiden Räume. Nach Ablauf der halben Versuchszeit, nachdem die Zellen sich schon v e r m e h r t h a t t e n , wurden sie durch Mischen der Flüssigkeiten beider R ä u m e auf das gesamte Flüssigkeitsvolumen verteilt. Spätere Versuche, bei denen vergleichsweise

Abb. 1 Einfache Gefäßform

Abb. 2 Zweiraumgefäß

E i n r a u m - und Zweiraumgefäße nebeneinander b e n u t z t wurden, zeigten aber, daß m a n gleiche Vermehrungsraten erhält, wenn die Zellen gleich bei Beginn des Versuchs über das gesamte Flüssigkeitsvolumen verteilt werden und d a ß die Anwendung des Zweiraumgefäßes keinen Vorteil bietet. Die Versuchsflüssigkeit ist im wesentlichen ein PARKER-Medium, das wir durch Zugabe einiger Substanzen ergänzt haben. Es wird ein vom I n s t i t u t für Seuchenschutz in Berlin-Weissensee hergestelltes Trockenpräparat nach P A R K E R benutzt, das nach S L O N I M und Mitarbeiter [ 1 ] modifiziert worden ist. Folgende Stammlösungen werden vorbereitet: 1,41 g PARKER-Trockensubstanz werden in 137 ml Wasser gelöst. Die Substanz e n t h ä l t Phenolrot als />H-Indikator. Zum Neutralisieren werden der Lösung etwa 1,4 ml 0,1 55 M N a H C 0 3 - L ö s u n g und zur Ergänzung noch 2,89 ml einer 5,6%igen Glukoselösung zugesetzt; 0,155 M Na-Glutamatlösung, neutral; 5,6%ige Fruktoselösung; 0,11 M P h o s p h a t lösung, bestehend aus 8 Teilen N a 2 H P 0 4 und 2 Teilen K H 2 P 0 4 ; 0,155 M N a H C 0 3 Lösung, der eine Spur Phenolrot zugesetzt wird; Kälberserum, das zur Inaktivierung 30 min auf 56 °C erhitzt worden ist und eingefroren bei — 20 °C a u f b e w a h r t wird und eine möglichst frisch hergestellte Glutathionlösung, die 31,9 mg Glutathion in 20 ml 0,1 55 M NaCl-Lösung enthält. Zum Sterilisieren werden die Phosphatlösung und die Bikarbonatlösung eine Stunde im Dampftopf erhitzt; alle übrigen Lösungen und das Serum werden durch Glasbakterienfilter G 5 (Jenaer Glaswerk Schott & Gen.) gesaugt. Das einmalige Sterilisieren der wäßrigen Lösungen bei 100 °C ist ebenso wie das trockene Sterilisieren der Glasgeräte bei 155 °C f ü r diese Zwecke ausreichend. Die sterilen Stammlösungen, ausgen o m m e n die Salzlösungen, werden eingefroren bei — 20 °C a u f b e w a h r t . Die NaHC0 3 -Lösung befindet sich in einem Glaskolben m i t Gaseinleitungs- und Gasableitungsrohr. Nach dem Sterilisieren, vor ihrer Benutzung, wird sie m i t Kohlendioxyd begast, bis ein vollständiger Farbumschlag des Indikators nach Gelb erreicht ist.

In vitro-Kultivierung von Aszites-Karzinomzellen

375

D i e Versuchsflüssigkeit s e t z t sich f o l g e n d e r m a ß e n z u s a m m e n : 1 0 4 , 0 m l d e s o b i g e n P A R K E R - M e d i u m s , e n t h a l t e n d 1,04 g P a r k e r s u b s t a n z ; 2 , 5 0 m l G l u t a t h i o n l ö s u n g ; 6 , 2 0 m l G l u t a m a t l ö s u n g ; 1,15 m l F r u k t o s e l ö s u n g ; 5,00 m l P h o s p h a t l ö s u n g ; 2 5 , 0 m l N a H C 0 3 - L ö s u n g u n d 6,25 m l K ä l b e r s e r u m . D a s G e s a m t v o l u m e n i s t 150,1 m l ; 10 m l d e s N ä h r m e d i u m s e n t h a l t e n 14,5 r n g G l u k o s e u n d 4,3 m g F r u k t o s e . N a c h d e m Mischen wird das N ä h r m e d i u m sofort in gleicher Weise m i t Kohlendioxid begast, wie beim Neutralisieren der NaHCOs-Lösung verfahren wurde. I n die fertige Versuchsflüssigkeit werden die Karzinomzellen in entsprechender Menge g e g e b e n . I m a l l g e m e i n e n w i r d d e r V e r s u c h m i t e t w a 2 - 10 6 Z e l l e n p r o A n s a t z (10 m l ) gestartet. Die wenig gefetteten Tubusstopfen werden eingesetzt u n d die Versuchsgefäße sofort an die M a n o m e t e r gebracht; G a s r a u m u n d Flüssigkeit werden m i t der 5 V o l . % C 0 2 - h a l t i g e n G a s m i s c h u n g b e s c h i c k t . D i e F a r b e d e s I n d i k a t o r s soll n a c h S ä t t i g u n g m i t d e r G a s m i s c h u n g o r a n g e s e i n , e n t s p r e c h e n d p H = 7,4. A u c h v o r d e m E i n l e i t e n d e r C 0 2 - h a l t i g e n G a s m i s c h u n g soll d i e V e r s u c h s f l ü s s i g k e i t n i e m a l s a l k a l i s c h , die F a r b e des Indikators nicht himbeerrot werden. Die Versuchsgefäße werden im W a s s e r t h e r m o s t a t b e i 35 °C m i t e t w a 25 S c h w i n g u n g e n p r o M i n u t e u n d e i n e r A m p l i t u d e von etwa 8 cm schaukelnd bewegt. Eine in horizontaler E b e n e erfolgende Beweg u n g d e r G e f ä ß e ist u n z w e c k m ä ß i g , weil eine solche erst bei h o h e r F r e q u e n z w i r k s a m w i r d . N a c h 30 m i n T e m p e r a t u r a u s g l e i c h w e r d e n d i e D r u c k ä n d e r u n g e n a m M a n o m e t e r abgelesen. Die Aszitestumorzellen werden durch intraperitoneale Verimpfung gewonnen. In der Regel b e n u t z t e n wir I n z u c h t m ä u s e des S t a m m e s X V I l / B l n , die uns v o m Bucher I n s t i t u t für Krebsforschung überlassen wurden. Zur I m p f u n g werden von einer frisch e n t n o m m e n e n sterilen Asziteszellsuspension, die m i t d e m gleichen V o l u m e n steriler 0 , 1 5 5 M N a C l - L ö s u n g v e r d ü n n t w o r d e n i s t , p r o M a u s 0,5 m l , d . s. e t w a 4 • 10 7 Z e l l e n , v e r w e n d e t . F ü r d e n W a c h s t u m s v e r s u c h w e r d e n d i e K a r z i n o m z e l l e n a m 6. b i s 7. T a g n a c h d e r V e r i m p f u n g e n t n o m m e n , w o b e i d i e Z e l l s u s p e n s i o n w i e d e r u m m i t d e m gleic h e n V o l u m e n s t e r i l e r i s o t o n e r N a C l - L ö s u n g v e r d ü n n t w i r d . E s sei e r w ä h n t , d a ß d i e Z e l l e n n i c h t g e w a s c h e n w e r d e n . D i e Z e l l v e r m e h r u n g w i r d e r m i t t e l t , i n d e m d i e Zelldichte in der Versuchsflüssigkeit bei Beginn u n d n a c h Beendigung des Versuchs bes t i m m t w i r d . W i r b e n u t z e n h i e r f ü r d i e Z ä h l k a m m e r n a c h FUCHS-ROSENTHAL m i t e i n e r Tiefe v o n 0,200 m m .

Ergebnisse

Als Versuchstemperatur wählten wir 35 °C, weil wir bei der physiologischen Temperatur von 37,5 °C keine größere Vermehrungsrate erhalten. Der Vorteil der niedrigeren Temperatur liegt darin, daß die Stoffwechselprozesse langsamer verlaufen und der dadurch bedingte Verbrauch des Nährmediums geringer ist. Vergleichsweise wurden zwei Versuche durchgeführt, einer bei 35 °C und der andere bei 37,5 °C. In 10 ml Versuchsflüssigkeit befanden sich anfänglich 2,20 • 10® Zellen; die Gasmischung enthielt -1,5 Vol.% Sauerstoff. Nach 24 Std. hatten sich die Asziteszellen im Versuch bei 35 °C um 128% und bei 37,5 °C um 123% vermehrt. An Milchsäure waren bei 35 °C 943 /A und bei 37,5 °C 1319 //l gebildet worden; das sind 40% mehr. Einfluß des Glutathions. Der in der PARKER-Substanz enthaltene Anteil an Glutathion ist für unsere Zwecke bei weitem nicht ausreichend. In 10 ml des Nährmediums sind 69 mg PARKER-Substanz, dessen Anteil an Glutathion

376

E . NEGELEIN, I. LEISTNER, L . JÄHNCHEN

nur 0,16 /ug beträgt. Nach Zusatz größerer Mengen fanden wir folgende zu vergleichende Vermehrungsraten: zugesetzte (ilutathionsmenge Vermehrungsrate

[%]

ohne

0,157 m g

0,314 m g

0,628 m g

44 38

115 120

193 174

146 160

Wie man hieraus ersieht, vermehrt sich die Krebszelle bei höherer Glutathionkonzentration wesentlich stärker. Unser Versuchsmedium enthält in 40 ml 0,266 mg Glutathion. Warum Glutathion benötigt wird, ist nicht geklärt. Vielleicht ist Glutathion für die Asziteskrebszelle von essentieller Bedeutung, oder vielleicht dient es, als Komplexbildner mit Schwermetallen, in unserer Testanordnung nur zur Entfernung störender Schwermetallspuren. Einfluß des Glutamats. Wie für Glutathion haben wir auch für Glutamat gefunden, daß die in der PARKER-Substanz enthaltene Menge nicht ausreichend ist. Die in 10 ml des Nährmediums enthaltenen 69 mg PARKER-Substanz haben einen Glutamatanteil von 0,560 mg DL-Natriumglutamat. Bei Zusatz weiterer Mengen von L-Glutamat fanden wir vergleichsweise folgende Vermehrungsraten: zugesetzte Menge von L-Natriumglutamat Vermehrungsrate

[%]

ohne

10,8 m g

21,6 m g

105 106

174 174

107 125

In 10 ml unseres Nährmediums sind 11,1 mg L-Natriumglutamat enthalten. Einfluß des Serums. Wir verwenden inaktiviertes Kälberserum; der Einfluß von Seren anderer Tierarten wurde nicht untersucht. Die Wirkung verschiedener Konzentrationen des Serums auf die Vermehrungsrate der Asziteskrebszelle ist aus der graphischen Darstellung in Abbildung 3 zu ersehen. Im Nährmedium ohne Serum betrug die Vermehrung nur etwa 20%. Schon mit 2,5 Vol.% voo Serum wurde nahezu die optimale Vermehrung erreicht. Größere Mengen an Serum, bis 17,4 Vol.%, hatten keinen weiteren Einfluß. In unserem Nährmedium beträgt der Serumanteil 4,2 Vol.%. J 10 15 -Serumanteil [lW.%] Für die Wärmeinaktivierung des Serums sind 30 min Erhitzen auf 52 °C ausreichend. Mit A b b . 3. E i n f l u ß d e r S e r u m Proben desselben Kälberserums, die 30 m i n k o n z e n t r a t i o n auf die Verauf verschiedene Temperaturen erhitzt worden mehrungsrate

I n v i t r o - K u l t i v i e r u n g von Aszites-Karzinomzellen

3 77

waren, wurden bei einer Konzentration von 4,2 Vol.% Serum vergleichsweise folgende Vermehrungsraten erhalten: Inaktivierungstemperatur V e r m e l i r u n g s r a t e [_%]

j nicht erhitzt 166

!

52 °C

60 °C

65 °C

208

208

205

Hieraus geht hervor, daß das Serum ohne nachteilige Folgen auch 30 min auf 65 °C erhitzt werden darf. Auch mit dem nicht inaktivierten Kälberserum wurde bei dieser Konzentration noch eine beträchtlich hohe Zellvermehrung erhalten. Es ist zweckmäßig, das Serum tiefgekühlt aufzubewahren. Zur Frage der Haltbarkeit wurde von inaktiviertem Kälberserum ein Teil im Kühlschrank bei Temperaturen zwischen 2° und 3 °C, ein anderer Teil eingefroren bei —20 °C aufbewahrt. Nach 21 Tagen fanden wir im Test mit dem bei —20 °C aufbewahrten Serum eine Zellvermehrung um 137 % und vergleichsweise mit dem im Kühlschrank aufbewahrten Serum nur 78%. Faktoren, die die Vermehrung in noch nicht übersehbarer Weise beeinflussen könnten, sind u. a. der Zustand der zum Einsatz kommenden Asziteskrebszellen und die Beschaffenheit des Kälberserums. Die Gewinnung der Krebszellen ist unter Material und Methoden beschrieben. Das Serum wurde aus geronnenem Blut gerade geschlachteter Kälber erhalten, wobei uns Alter und Lebensweise der Tiere unbekannt waren. Tabelle 1 informiert über durchschnittlich gefundene Vermehrungsraten aus 30 Versuchen. Die Versuchszeiten waren 23—25 Std. Sieht man von den beiden extremen Werten von 97 und 264% ab, so liegen die Vermehrungsraten zwischen 128 und 213%; im Mittel betrug sie 183%. In der letzten Spalte der Tabelle ist die in der Versuchszeit gebildete Milchsäuremenge eingetragen. Sie beträgt im Mittel etwa 21 % der in der Versuchsflüssigkeit enthaltenen Menge an Bikarbonat, die äquivalent 5600 [A Kohlendioxid ist. Die Versuchszeit beträgt in der Regel 24 Std. Nach dieser Zeit hat sich das Nährmedium so weit verändert, daß die Zellvermehrung und die Milchsäuregärung schon deutlich gehemmt sind. Die Hemmung tritt um so früher auf, je mehr Zellen anfangs eingesetzt werden. Dabei hat die Ansäuerung des Nährmediums infolge der Milchsäurebildung keinen wesentlichen Einfluß, wie aus Versuchen hervorgeht, die bei höherer Kohlensäurekonzentration wie auch bei niederer Bikarbonatkonzentration durchgeführt wurden. Unter sonst gleichen Bedingungen wurde einmal der anfängliche Kohlendioxyddruck verdoppelt, das andere Mal die Bikarbonatkonzentration auf die Hälfte herabgesetzt, wodurch in beiden Fällen eine />HVerschiebung von 7,4 auf 7,1 bewirkt wurde. Die Resultate dieser Versuche sind aus den Tabellen 2 und 3 zu ersehen. Wie daraus hervorgeht, hat die Verdoppelung des Kohlendioxiddrucks keinen, die Herabsetzung der Bikarbonatkonzentration auf die Hälfte einen nur geringen hemmenden Einfluß 25

Acta biol. med. german., Heft 4

E . NEGELEIN, I. LEISTNER, L.

378

JÄHNCHEN

Tabelle 1 V e r m e h r u n g d e r EHRLICH-Mäuseaszites-Karzinomzelle T e m p e r a t u r : 35 °C; G a s m i s c h u n g : 1,5 V o l . % 0 2 u n d 5 V o l . % C 0 2 in N a Versuchsdatum

Versuchszeit

A n z a h l c er Zellen

Zunahme am Ende d e r Zellzahl des V e r s u c h e s [Million] [%]

gebildete Milchsäure

[Std.]

bei Beginn des V e r s u c h e s [Million]

9- 4. 64

25

2,31

5,69

146

1037

13- 4. 64

24

3,10

8,43

172

1285

26. 5- 64

24,5 24,5

2,92 2,92

8,25 8,15

183 179

1696 1638

6. 7- 64

25

2,07

5,30

156

1222

25. 8. 64

24 24 24 24 24 24

1,97 1,97 1,97 1,97 1,97 1,97

6,06 5,88 5,73 5,35 6,16 6,01

208 198 191 172 213 205

1275 1195 1295 1260 1365 1220

3- 9- 64

24

2,15

5,88

174

1310

14. 9- 64

23 23

1,59 1,59

4,48 4,43

182 178

868 864

13- 11. 64

23 23

2,02

2,02

5,59 5,61

176 178

955 932

17- 11. 64

24 24

1,89 1,89

5,78 5,88

206 212

1219 1255

19- 11 • 64

23 23

1,92 1,92

5,35 5,71

179 198

862 973

30. 11. 64

24 24

1,74 1,74

5,24 5,10

201 193

1315 1250

3- 12. 64

23

1,41

5,13

264

941

11. 1. 65

24 24

2,13 2,13

5,74 5,58

170 162

1148 1173

19- 1- 65

24 24

1,62 1,62

4,42 4,34

173 172

830 832

26. 1. 65

24

4,08

8,03

97

1520

1. 2. 65

24

1,31

4,02

207

802

8. 2. 65

24

2,20

5,01

128

944

M

In vitro-Kultivierung von Aszites-Karzinomzellen

379

auf die Zellvermehrung. I m Mittel war mit 0,0125 M N a H C 0 3 die Vermehrungsrate nur u m 5% geringer, als mit der in unserem Nährmedium enthaltenen doppelten Konzentration. In der Regel war in unseren Versuchen die Ansäuerung durch die Gärung nicht so stark. E r s t bei Anwendung einer größeren Zellmenge, z. B. im Versuch mit 2,9 • 106 Zellen und einer Verm e h r u n g u m 183%, n a h m der Bikarbonatgehalt um 3 ° % a b u n d der Kohlendioxiddruck u m 75% zu, wobei die Ansäuerung einer />H-Verschiebung von 7,4 auf 7,0 entsprach. Der Verbrauch an Hexose durch die Milchsäuregärung betrug hierbei erst 38% der zugesetzten Menge. Wir können noch nicht sagen, wodurch am E n d e der 24-stündigen Versuchszeit das Zellwachstum gehemmt wird. Tabelle 2 Einfluß der Kohlendioxydkonzentration auf die V e r m e h r u n g s r a t e d e r EHRLicH-Mäuseaszites-Karzinomzelle V e r s u c h s z e i t : 25 S t d . , N a H C 0 3 : 0,025 M

N u m m e r des Versuchs

C02-Konzentration

A n z a h l d e r Zellen

Vermehrungsrate

[Vol.%]

bei Beginn des Versuchs [Million]

am Ende des Versuchs [Million]

5 10

2,18 2,18

5,19 5,16

138 137

5 10

2,64 2,64

6,50 7,30

146 176

3

5 10

2,31 2,31

5,69 5,61

146 143

4

5 10

3,00 3,00

7,18 7,17

139 139

1

[%]

In einigen Fällen wurden Versuche auch über 24 Std. hinaus durchgeführt, nachdem der erhöhte Kohlendioxiddruck durch Erneuern der Gasmischung wieder auf 5 Vol.% reduziert worden war. In zwei derartigen unter gleichen Bedingungen durchgeführten Versuchen, wobei sich die Zellen in den ersten 24 Std. u m 128% vermehrt h a t t e n , war nach insgesamt 46 Std. eine Zellvermehrung um 245% eingetreten. Die Zellen vermehrten sich im selben Nährmedium in den folgenden 22 Std. also n u r noch um 52%. Unverändert stark vermehren sich die Asziteszellen aber weiterhin, wenn sie in frisches Nährmedium gebracht werden. Nachdem sich die gleichen Zellen in den ersten 24 Std. von 2,2 • 106 auf 5,0 • 106, also um 128% vermehrt h a t t e n , wurden von dieser Zellsuspension zweimal 3 ml, das waren je 1,5 • 106 Zellen, zu 7 ml frischer Nährlösung gegeben. Nach weiteren 24 Std. wurden beim Auszählen 3,83 • 106 bzw. 3,38 • 106 Zellen pro Ansatz

E. Nkgklkix, I. Lkistnkk, I-. Jähxchkx

380

Tabelle 3 E i n f l u ß der B i k a r b o n a t k o n z e n t r a t i o n auf die Vermehrungsrate der EHRi.iCH-Mäuseaszites-Karzinomzelle Versuchszeit: 24 Std., Kohlendioxidkonzentration: 5 Vol. 0 ,,

N u m m e r des Versuchs

NaHCO,Konzentration

;mi

Anzahl der Zellen bei Beginn j am E n d e des Versuchs des Versuchs [Million] [Million]

\ ermehrungsrate

1,25 X 10" 2

1,87 1,87

4,67 4,72

150 153

1,25 x K r 2 10" 2

1,73 1,73

4,14 4,33

140 1 50

10" 2 10" 2

1,95 1,95

4,84 4,99

148

2,50 x u r 2 2,50

X

1,25 2,50

X

X

156

gefunden. Die in frische Nährlösung übergeführten Zellen h a t t e n sich also in den zweiten 24 Std. weiterhin u m 155% bzw. u m 126% v e r m e h r t ; die gesamte Vermehrung in zweimal 24 Std. b e t r u g bei E r n e u e r u n g des Milieus 480% bzw. 415%- In frische Nährlösung gebracht war die weitere Zellverm e h r u n g niemals geringer als zuvor. Man h a t keine Veranlassung anzunehmen, d a ß die Vermehrung der EHRLiCH-Asziteskarzinomzelle in unseren Versuchen an einen essentiellen W a c h s t u m s f a k t o r gebunden ist, den die Zelle von der Maus noch m i t b e k o m m t . Weniger als das Zellwachstum ist die Milchsäuregärung nach 24-stündiger Versuchszeit in dem v e r ä n d e r t e n N ä h r m e d i u m g e h e m m t . In dem o. g. Versuch war bei Beginn QM = 46; nach 24 Std. war in der v e r ä n d e r t e n Nährlösung QM = 40. In frische Nährlösung gebracht war die Milchsäureg ä r u n g derselben Zellen QM = 48; also um 2 0 % größer als in der alten, v e r ä n d e r t e n Nährlösung. Q M b e d e u t e t hier (A gebildete Milchsäure pro Std. u n d 3,8 • 106 Zellen. Wir wählten diese Zellzahl als Bezugsgröße, weil sie a n n ä h e r n d 1 mg Trockengewicht entspricht. Der zeitliche Verlauf der Milchsäurebildung ist aus den Abbildungen 4, 5 u n d 6 zu ersehen, in denen die zu verschiedenen Zeiten t gebildeten Milchsäuremengen a: aus drei Versuchen graphisch dargestellt sind. Die Vermehr u n g s r a t e n der Zellen, durch Auszählen ermittelt, betrugen 190% bzw. 196% u n d 170%. Wie m a n aus den Abbildungen ersieht, bleibt die Geschwindigkeit der Milchsäurebildung zunächst etwa 3 bis 5 Std. u n v e r ä n d e r t u n d steigt d a n n infolge des Zell Wachstums an. Die gestrichelte Linie stellt die geradlinige F o r t s e t z u n g der anfänglichen G ä r u n g d a r ; sie zeigt die Milchsäuremengen, die gebildet worden wären, wenn die Masse der Zellen nicht zugenommen h ä t t e . Die kleinen Kreise bezeichnen die zu verschiedenen Zeiten

In v i t r o - K u l t i v i e r u n g von Aszites-Karzinomzellen

381

manometrisch gemessenen Milchsäuremengen. Sie liegen weitgehend auf einer theoretisch berechneten logarithmischen Kurve, die durch die ausgezogene Linie dargestellt wird.

Abb. 4

Abb. 5

Abb. 6

Abb. 4. Zeitlicher Verlauf d e r Milchsäurebildung. V e r m e h r u n g s f a k t o r k = 0,048 pro S t d . ; Abszisse: Versuchszeit; O r d i n a t e : g e b i l d e t e Milchsäuremenge Abb. 5. Zeitlicher Verlauf der Milchsäurebildung. V e r m e h r u n g s f a k t o r k = 0,057 p r o S t d . ; Abszisse: Versuchszeit; O r d i n a t e : gebildete Milchsäuremenge Abb. 6. Zeitlicher Verlauf der Milchsäurebildung. V e r m e h r u n g s f a k t o r k — 0,061 pro S t d . ; Abszisse: Versuchszeit; O r d i n a t e : gebildete Milchsäuremenge

Ist m0 die Zellmenge, die beim Start des Versuchs, zur Zeit t0, eingesetzt wurde, q [¿ul/Std.] die Geschwindigkeit der Milchsäuregärung für die Einheit der Zellmenge und tx die Zeit der zunächst konstant bleibenden Gärung, dann ist die in dieser Zeit gebildete Milchsäuremenge x = q - m0-

ti

Ist m die zur Zeit t > tt vorhandene Zellmenge, die sich von rithmisch vermehrt, dann ist m = • e* ( — 1] k

(Gl .4).

Wir haben für die experimentell gefundenen Werte von x den Vermehrungsfaktor k ermittelt, dessen Wert der Beziehung zwischen x und t nach (Gl. 4) entspricht und fanden für den Versuch der Abbildung 4: k = 0,048 [1/Std.], für den Versuch der Abbildung 5: k = 0,057 [1/Std.], f ü r den Versuch der Abbildung 6: k = 0,061 [1/Std.]. Mit dem jeweiligen Wert von k sind die nach (Gl. 4) für die Zeiten t errechneten Milchsäuremengen % in den Abbildungen durch die ausgezogene Linie dargestellt. Wie m a n sieht, fallen die experimentell gefundenen Milchsäuremengen mit denen nach (Gl. 4) errechneten weitgehend zusammen. Die am Ende des Versuches auftretende Abweichung ist auf die schon erwähnte Veränderung des Nährmediums zurückzuführen. Die experimentell gefundene Kurve weicht verständlicherweise um so früher von der theoretisch errechneten ab, je größer die eingesetzte Zellmenge und je größer der Vermehrungsfaktor k ist. Einfluß der Sauerstoffkonzentration. F ü r das Wachstum der Krebszelle ist die Sauerstoffkonzentration von wesentlicher Bedeutung. Das von WARBURG [2] gefundene Resultat, daß die Krebszelle ohne Sauerstoff nicht wächst, können wir bestätigen. Wir beobachteten, d a ß schon eine Sauerstoffkonzentration von n u r 0,2 Vol.%, d. i. ein Sauerstoffdruck entsprechend einer 20 m m hohen Wassersäule, für die optimale Vermehrungsrate ausreichend ist. In Tabelle 4 sind Vermehrungsraten aus Versuchen eingetragen, die ohne Sauerstoff und bei Sauerstoffkonzentrationen von 0,20, 0,50 und 1,50 Vol.% durchgeführt wurden. Die Versuche 1, 2 u n d } der Tabelle zeigen, daß ohne Sauerstoff die Krebszelle sich nicht vermehrt. W ä h r e n d vergleichsweise bei 1,50 Vol.% Sauerstoff die Vermehrung im Mittel 154% betrug, vermehrten sich die gleichen Zellen ohne Sauerstoff im Mittel n u r u m 11%. Auch manometrisch wurde in den Versuchen ohne Sauerstoff zeitlich keine Zunahme des Gärungsstoffwechsels beobachtet. Am günstigsten für die Vermehrung der Asziteskrebszelle sind Sauerstoffkonzentrationen zwischen 0,20 und 1,50 Vol.%. Methodisch ist bei Anwendung kleiner Sauerstoffkonzentrationen von 0,5 Vol.% und darunter zu beachten, daß der durch die Zellen verbrauchte Sauerstoff ersetzt wird. Wird er nicht nachgeliefert, so nimmt seine Konzentration in der Flüssigkeit, begünstigt infolge der langsamen, unzureichenden Schüttelbewegung der Versuchsgefäße, relativ stark ab, wobei es zu Sauerstoffmangel und dadurch gehemmtes Zell Wachstum kommt. Deshalb wurde in den Versuchen 4 und 5 a der Tabelle 4 das Gasgemisch mit dem angegebenen Sauerstoffgehalt während der gesamten Versuchszeit langsam über die Nährflüssigkeit der

In vitro-Kultivierung von Aszites-Karzinomzellen

383

sich im Wasserthermostat bewegenden Versuchsgefäße geleitet. Wie aus den Resultaten dieser beiden Versuchsreihen hervorgeht, vermehrt sich die Asziteskrebszelle bei 0,20 Vol.% Sauerstoff gleich stark, wie bei 0,50 und Tabelle 4 Einfluß der Sauerstoffkonzentration auf die Vermehrung der EHRLicH-Mäuseaszites-Karzinomzelle (^-KonzenVers.tration Nummer

Vers.Zeit

Anzahl der Zellen Zunahme Bemerkung der über Nachliefebei Beginn I am Ende rung des verdes Versuchs des Versuchs Zellzahl brauchten O, [Million] [Million] [%]

[Vol.%]

[Std.]

1

null null 1,50 1,50

24 24 24 24

3,18 3,18 3,18 3,18

3,94 4,02 8,63 8,12

24 27 172 156

2

null null 1,50 1,50

24 24 24 24

2,47 2,47 2,47 2,47

2,32 2,56 6,22 5,78

- 6 4 152 134

3

null null 1,50 1,50

24 24 24 24

2,01 2,01 2,01 2,01

2,16 2,20 4,97 5,26

8 10 148 162

4

0,20 0,20 1,50

22 22 22

1,96 1,96 1,96

4,53 4,50 4,64

131 130 137

nachgel. nachgel. nachgel.

0,20 0,20 0.50 0,50 1,50 1,50

23 23 23 23 23 23

1,91 1,91 1 91 1,91 1,91 1,91

4,65 4,63 4,52 4,40 4,33 4,42

144 143 137 131 127 132

nachgel. nachgel. nachgel. nachgel. nachgel. nachgel.

0,20 0,20 0,50 0,50 1,50 1,50

23 23 23 23 23 23

1,91 1,91 1,91 1,91 1,91 1,91

3,70 3,59 3,99 4,07 4,39 4,33

94 88 109 113 130 127

nicht nicht nicht nicht nicht nicht

b

nachgel. nachgel. nachgel. nachgel. nachgel. nachgel.

4,50 Vol.%. — Im Gegensatz zur Versuchsreihe 5a wurde vergleichsweise in der Versuchsreihe 5 b der verbrauchte Sauerstoff nicht durch Überleiten der Gasmischung ersetzt. Die Vermehrungsraten sind hier bei anfänglich 0,50 Vol.% Sauerstoff deutlich kleiner und bei anfänglich 0,20 Vol.% wesentlich kleiner als in der Versuchsreihe 5a. Bei Anwendung von

384

E. NEGELEIN, I. LEISTNER, L.

JAHNCHEN

1,5 Vol.% Sauerstoff ist das ständige Überleiten der Gasmischung ohne Einfluß; die Vermehrungsraten in den Versuchsreihen 5 a und 5 b sind bei 1,5 Vol.% gleich groß. Wir fanden weiterhin, daß der Sauerstoff, obwohl er in sehr niedriger Konzentration für die Vermehrung der Krebszelle notwendig ist, in höherer Konzentration hemmend wirkt. Eine geringe Erhöhung der Konzentration von 1,5 auf 3,0 Vol.% läßt schon eine Hemmung der Zellvermehrung erkennen. Bei atmosphärischem Sauerstoffdruck ist die Zellvermehrung beträchtlich gehemmt und bei einem Sauerstoffdruck von 0,95 Atmosphären sehr stark. In Tabelle 5 sind die Vermehrungsraten aus Versuchen eingetragen, die bei Sauerstoffkonzentrationen von 1,5 bzw. 1,7, 3,0, 20,0 und 95,0 Vol.% durchgeführt wurden. Bei 3,0 Vol.% war in den Versuchen 1, 3 und 5 in fünf Fällen die Vermehrungsrate um 15 bis 20% kleiner, als bei 1,5 Vol.%; nur im Versuch 2 war einmal die Vermehrung bei 3,0 und 1,5 Vol.% Sauerstoff gleich groß. Bei 20,0 Vol.% Sauerstoff war im VerTabelle 5 E i n f l u ß d e r S a u e r s t o f f k o n z e n t r a t i o n auf die V e r m e h r u n g d e r EHRLicH-Mäuseaszites-Karzinomzelle A n z a h l d e r Zellen Vers.Nummer

bei B e g i n n des V e r s u c h s [Million]

am Ende des V e r s u c h s [Million]

Zunahme der Zellzahl

[%]

7,75 6,94

185 155

8,43 8.32

172

5,96 5,94 5.27 5.33 4,77

125 124 99

5,14 5,08 3,42 3,26

118

4.84 4,64 4,26 4,30 2.85

159 148

168

101

80

115 45

38

128

3,16

130 53 69

2,12

14

2.28

22

In v i t r o - K u l t i v i e r u n g von Aszites-Karzinomzellen

385

such 3 die Vermehrungsrate um 36%, in den Versuchen 4 und 5 im Mittel um 64% bzw. um 60% kleiner als bei 1,5 Vol.%. Bei 95 Vol.% Sauerstoff betrug die Zellvermehrung nach 24-stündiger Versuchszeit im Mittel nur 18%, während sie vergleichsweise bei 1,5 Vol.% im Mittel 154% betrug. In Abbildung 7 ist der Einfluß der Sauerstoffkonzentration graphisch dargestellt. Über den Angriffspunkt des Sauerstoffs im Mechanismus der Hemmung können wir noch nichts aussagen. — Für Wachstumsversuche ist methodisch die Anwendung eines Gasgemisches mit 1,5 Vol.% Sauerstoff zweckmäßig.

Abb. 7.

E i n f l u ß der Sauerstoffkonzentration auf die Zellvermehrung. Ordinate: R e l a t i v e Vermehrung, bezogen auf die Vermehrungsrate bei 1 , 5 V o l . % Sauerstoff Diskussion

Versuche zur Untersuchung des Wachstums der Aszites-Krebszelle bei niedrigem Sauerstoffdruck wurden von WARBURG, GEISSLER und LORENZ [2] beschrieben. Ihr Kulturmedium enthielt 20 Vol.% Pferdeserum, 20 Vol.% E x t r a k t von Hühnerembryonen und 60 Vol.% des Mediums nach GRAAF. Die Versuche wurden ebenfalls im Manometriegefäß durchgeführt, jedoch wurde die Milchsäuregärung während des Wachstums nicht gemessen. Das Wachstum wurde durch Volumenbestimmung des Zellsediments im Hämatokriten bestimmt. Die Vermehrung nach 24 Std. betrug 120%, wobei kein Unterschied zwischen Sauerstoffkonzentrationen von 0,37 Vol.% und 20 Vol.% gefunden wurde. Ohne Sauerstoff kam auch bei ihnen das Wachstum schnell zum Stillstand. Wir haben noch keine Erklärung dafür, warum wir, im Gegensatz zu WARBURG und Mitarbeitern, bei 2 0 Vol.% Sauerstoff eine beträchtliche Hemmung des Wachstums finden. Es gibt zwei Möglichkeiten: entweder liegt die verschiedenartige Wirkung der höheren Sauerstoffkonzentration an der verschiedenartigen Zusammensetzung des Kulturmediums, z. B. im Katalasegehalt, oder sie ist auf die verschiedenartige Bewegung der Kulturflüssigkeit, Nachlieferung des verbrauchten Sauerstoffs, zurückzuführen. Über die Züchtung eines in vitro in Suspension wachsenden Stammes von EHRLICH-Aszitestumorzellen wurde auch kürzlich von KARZEL [ 3 ] berichtet, in dessen Arbeit man eine ausführliche Zusammenstellung der Literatur früherer Versuche zur in vitrc-Züchtung dieser Zellen findet. Wie bei KARZEL

386

E. NEGELEIN,

I. L E I S T N E R , L .

JÄHNCHEN

bilden auch die Zellen unsrer Kultur weder Konglomerate noch haften sie an der Glasoberfläche fest. Eine zunächst notwendige Anpassung der Zellen an das Kulturmedium, wie sie von K A R Z E L beschrieben wird, haben wir niemals beobachtet. Offensichtlich starben bei ihm die Zellen bis auf „wenige lebende Zellen pro ml" zunächst deswegen ab, weil bei der geringen Bikarbonatkonzentration und der großen Einsaatmenge die Nährlösung in der Umgebung der am Gefäßboden liegenden Zellen sehr bald verbraucht war. Schätzungsweise sollten bei einer Dichte von nur 3 • 105 Zellen pro ml allein durch die Milchsäuregärung nach 24 Std. etwa 70% der zugesetzten Bikarbonatmenge und ebensoviel der zugesetzten Glukosemenge verbraucht sein. Viel kürzer ist dementsprechend die Zeit des Verbrauchs bei der großen Dichte der am Gefäßboden liegenden Zellen. Die Bewegung der Zellkultur erwies sich bei K A R Z E L deswegen nachteilig, weil dabei infolge nicht ausreichenden Kohlendioxiddrucks das Bikarbonat in Karbonat und Kohlendioxid zerfällt, wodurch die Kulturflüssigkeit zunächst alkalisch wird. Den technischen Assistentinnen Fräulein R E N A T E d a n k e n wir f ü r ihre gewissenhafte Mitarbeit.

GABEL

und F r a u

K A T H L E N SCHRÖDER

Literatur [1]

MORGAN, J .

F., I i .

Mikrobiol. Immunol. [2] [3]

WARBURG, O., KARZEL, K.:

u. R. C. P A R K E R : Proc. Soc. exp. Biol. Med. 7 3 , 1 ( 1 9 5 0 ) M. D R E V O , J . M I C H L U. I. M A R E S : Ceskoslov. Epidemiol.

J . MORTON

SLONIM, D . , O. CINNEROVÄ, 9,

111

(I960).

A . W . G E I S S L E R U.

S.LORENZ:

Z.

Med. Pharmacol, exp. 12, 137 (1965)

Naturforsch. 17b, 758(1962).

Summary E . N E G E L E I N , I . L E I S T N E R and L . J A E H N C H E N : Application of t h e manometric method for measuring t h e cell growth of E H R L I C H ' S ascites carcinoma. The influence of oxygen concentration on t h e cell multiplication I t is suggested to use m a n o m e t r y for d e t e r m i n a t i o n of canccr cell growth, measuring t h e increase of metabolism of f e r m e n t a t i o n which parallels cell multiplication. The temporal increase of lactic acid f e r m e n t a t i o n proceeds almost logarithmically, averaging 5 to 6 percent per hour, i. e. t h e cell n u m b e r will double within 11,5 t o 14 hours. T h e m a n o m e t r i c method of cell growth determination offers t h e a d v a n t a g e t h a t a n y influence on cancer cell growth under standardized conditions can be recognized q u a n titively within about 24 hours. I t has been found t h a t t h e cancer cell multiplies most rapidly with extremely low concentration of oxygen. Under atmospheric oxygen pressure t h e cell multiplication is already inhibited considerably.

PeaioMC E . H e r e j i e i i n , M. J l e i i c T e i i p h f l a i i x e i i : MaiioMeTpH'iecKHii iueTo;i HJiii H3MepeHHH pocTa KJieTOK aciiHTiioro paiiKeHne KJieTOK. n o B b m i e n i i e 6poHiac, t t o cooTBeTCTByeT yjiBoeHHio HHCJia iuieTOK b TeneHne 1 1 , 5 — 1 4 nacoB. UpeHMymecTBO TOM,

l

MaHOMeTpimecKoro

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KJieTOK

ITO B 0 3 M 0 H Í H 0 C B J I H H H H e H a p O C T p a K O B O i i K J i e T K H n p H

3ai;jiiOHaeTCH

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b

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BHnx M o l i l o KOJiHiecTBeHHO pacno3naBaTb b TeieHHe 24 nacoB. BbiJio y c T a i i O B J i e H O , 'ito p a n o B a a K J i e T K a p a 3 M H 0 > K a e T C H H a i i ñ o j i e e ñ b i c T p o i i p n BeCbMa HH3KHX KOIIUeHTpaiJHHX KHCJTOpOHa. V w e n p H a T M O C ( j ) e p H O M a a B J i e H H H KHCJiopoaa iiaÖJiioaaeTCH 3 i i a 4 H T e . J i b i i o noHHHiemioe p a 3 M H 0 H i e n H e kjictoh.

A c t a biol. med. german., B a n d 16, Seite 3 8 8 - 3 9 4 (1966) Aus dem Hygiene-Institut, P r a g (Direktor: Prof. MUDr, K.

SYMOX)

Der Einfluß einer chronischen Natriumnitrit-Intoxikation auf Ratten J. M u s i l

(Eingegangen am 25. 10. 1965)

Zusammenfassung 1. Ein Gehalt von 10 bzw. 20 mAq NaNO a im Trinkwasser bewirkt bei R a t t e n auch nach Expositionszeiten von 1 50 und 200 Tagen keine Veränderungen des Gesamthämoglobins; der prozentuale Methämoglobinspiegel ist erhöht. 2. Die Erniedrigung der E r y t h r o z y t e n z a h l ist statistisch nicht zu sichern, dagegen ist die Z u n a h m e des H ä m a t o k r i t s sowie des Hämoglobingehalts pro E r y t h r o z y t signifikiint. 3. Bei männlichen Versuchstieren steigt u n t e r diesen Bedingungen das relative Herzgewicht (bezogen auf das Körpergewicht) signifikant an. 4. Bei weiblichen R a t t e n ist das relative Milzgewicht signifikant erhöht.

Die physiologischen Eigenschaften des MetHb 1 , das nicht zur reversiblen Bindung von Sauerstoff befähigt ist, sind in der letzten Zeit häufig studiert worden [3], [11], [12], [14], [15], [24]. Auch der Toxikologie von MetHbbildenden Stoffen wurde Aufmerksamkeit geschenkt [6], [7], [13]. [16], [20], [22], [23]. Doch sind bisher die Mechanismen unbekannt, durch die der Säugetierorganismus die Hypoxie kompensiert, die bei langfristiger Verabreichung von MetHb-bildenden Stoffen infolge der Abnahme des funktionstüchtigen Hb entsteht. So folgt beispielsweise der Hypoxie des Höhentyps eine Erhöhung der Erythrozytenzahl im kardiovaskulären System. Bei einem alveolären p 0 2 von annähernd 60 mm Hg beläuft sich die Sauerstoffsättigung des Blutes auf etwa 90% [1]. Bei Methämoglobinhypoxien ändern sich dagegen der p 0 2 in der Atem- und der Alveolarluft nicht; die Sauerstoffzufuhr ist normal. Allerdings verfügt hier das kardiovaskuläre System über geringere Hb-Mengen für die Sauerstoffübertragung. Die Hypoxie besitzt bei der langfristigen Verabreichung von MetHb-bildenden Stoffen undulierenden Verlauf, da entsprechend der Aufnahme des Stoffes und seiner MetHb-Bildung sowie der fermentativen Rückbildung desselben Schwankungen der 0 2 -Kapazität des Blutes entstehen. In der vorliegenden Arbeit stellten wir uns die Frage, wie der Säugetierorganismus eine chemische MetHb-Bildung funktionell ausgleicht. 1

A b k ü r z u n g e n : H b = Hämoglobin; M e t H b

Methämoglobin

Chronische N a t r i u m n i t r i t - I n t o x i k a t i o n

389

Methodik Zu den Versuchen wurden W i s t a r - R a t t e n beiderlei Geschlechts verwendet. Sie wurden in Zuchtkäfigen aus Polystyrol mit Metalldeckel gehalten u n d m i t einer S t a n d a r d d i ä t (LARSEX) ernährt. Das Trinkwasser b e f a n d sich in Glasgefäßen mit Polystyrolsaugern. Die Tiere k a m e n an ihrem 33. Lebenstag (nach ihrer Abstillung) in den Versuch. Die Tiere aus den verschiedenen W ü r f e n wurden in einzelne Versuchsgruppen eingeteilt. Die Kontrollgruppe erhielt Wasser, in dem während der ganzen Versuchsperiode die N i t r a t k o n z e n t r a t i o n 30 mg/1 nicht überstieg, Nitrite waren nicht anwesend. Eine Versuchsgruppe b e k a m Wasser mit 10 und eine zweite mit 20 mAq NaNO a . I m Versuch wurden die grundlegenden biologischen P a r a m e t e r , wie Tiergewicht, Nahrungs- und Trinkwasserverbrauch, verfolgt [17]. M e t H b wurde nach der Methode von CRUZ [5] durch Differenzspektrophotometrie b e s t i m m t . Die Tiere wurden durch E n t b l u t u n g aus der A. carotis getötet und die Organe gewogen. Die relativen Organgewichte beziehen sich auf das Körpergewicht des Tieres vor der Tötung. Das Herz wurde nach F U L T O N et al. [9] p r ä p a r i e r t . Zur hämatologischen B e s t i m m u n g wurde das K a r o t i s b l u t mit dem A b d a m p f r ü c k s t a n d der Oxalatmischung gemischt. Die Anzahl roter und weißer Blutkörperchen wurde durch die Kölbchenmethode [25] und Hämoglobin nach der Z y a n m e t h ä m o g l o b i n m e t h o d e m i t der DRABKIN-Lösung [19] b e s t i m m t . Die H ä m a t o k r i t b e s t i m m u n g erfolgte in der A p p a r a t u r P r e m a [211. Weitere hämatologische Indizes, wie E r y t h r o z y t e n v o l u m e n (V Ery), H b - G e h a l t (I Hb) und H b - K o n z e n t r a t i o n im E r y t h r o z y t e n (K Hb) sind nach dem tschechoslowakischen hämatologischen Lineal Logarex abgelesen worden. Ergebnisse

1.

Methämoglobinbildung

Aus Tabelle 1 ist ersichtlich, daß die langfristige Verabreichung von nitrithaltigem Trinkwasser keine Veränderung der Gesamt-Hb-Konzentration des Blutes herbeiführt, aber andererseits einen erhöhten MetHb-Spiegel bedingt. Die MetHb-Werte sind in Prozent der Gesamtmenge des roten Blutfarbstoffes angegeben. Die Unterschiede zu den Kontrollen sind wegen der relativ großen Streuung der Einzelwerte nicht für alle Versuchsgruppen statistisch zu sichern. 2. Relatives Herzgewicht Die Herzgewichte in der Tabelle 2 sind als relatives Gewicht pro 400 g Gewicht des lebenden Tieres ausgedrückt. Aus den Ergebnissen kann man schließen, daß das langfristige Verabreichen des Natriumnitrits an Versuchsratten eine statistisch signifikante Erhöhung des Herzgewichtes bei Männchen zur Folge hat. Daran waren alle Herzabschnitte gleichmäßig beteiligt. 3. Milzgewicht Bei langfristiger Verabreichung von Natriumnitrit reagierten nur die Weibchen mit einer Erhöhung des Milzgewichtes. Bei Männchen senkten sie sich teilweise in geringem Maße. Im Hinblick auf die Streuung der Meßwerte ist diese Differenz jedoch insignifikant. Tabelle 3 gibt eine Übersicht über diese Veränderungen.

J . MUSIL

390

Tabelle 1 G e s a m t h ä m o g l o b i n k o n z e n t r a t i o n des B l u t e s u n d M e t h ä m o g l o b i n g e h a l t bei Kontroll- u n d V e r s u c h s g r u p p e n Männchen Exposition Tage

Gruppe

Anzahl

M

Weibchen Signifikanz

±s

tP

Anzahl |

M

Signifikanz

±s

tP

H b - K o n z e n t r a t i o n in g/100 m l

K 150

10 20

200

10 20

K

10 8 10

15,6 ± 0,65 14,8 ± 0,83 15,9 ± 0,21

NS NS

10 9 10

15,2 ± 0,36 15,1 ± 0,43 15,6 ± 0,75

NS NS

10 10 12

15,7 ± 0,21 15,6 ± 0,19 15,8 ± 0,30

NS NS

10 9 13

15,2 ± 0,20 15,0 ± 0,69 15,5 ± 0,36

NS NS

M e t l l b - G e h a l t in % des G e s a m t - H b

K 150

10 20

200

10 20

K

10 8 10

0,90 ± 0,090 2,82 ± 1,30 1,71 ± 0,305

NS NS

10 9 10

1,07 ± 0,305 2,13 + 0,271 5,34 ± 1,910

0,01 0,05

10 10 12

1,32 ± 0,397 2,09 ± 0,305 4,42 ± 1,55

NS NS

10 9 13

1,09 ± 0,387 1,65 ± 0,250 2,77 ± 0,432

0,05

NS

K = K o n t r o l l e ; 1 0 = 1 0 m Ä q bzw. 20 = 20 m Ä q NaNO„ im T r i n k w a s s e r ; angegeben sind die M i t t e l w e r t e (M) + S t a n d a r d a b w e i c h u n g (s); NS = N i c h t signifikant

Tabelle 2 R e l a t i v e Herzgewichte bei Kontroll- u n d Versuchsgruppen in g/100 Tiergewicht (Angaben wie in Tabelle 1)

Exposition Tage

M K

150

10 20

K 200

Weibchen

Männchen Gruppe

10 20

±s

0,250 ± 0,037 0,256 + 0,017 0,405 ± 0,023 0,239 ± 0,07 0,274 ± 0,015 0,291 ± 0,004

Signifikanz

tP NS 0,01

NS 0,01

M ± s

Signifikanz

tP

0,299 ± 0,08 0,301 4 0,025 0,318 + 0,025

NS NS

0,297 + 0,010 0,302 + 0,10 0,321 + 0,09

NS NS

Chronische Natriumnitrit-Intoxikation

391

Tabelle 3 Relative Milzgewichte bei Kontroll- und Versuchsgruppen in g/100 g Tiergewicht (Angaben wie in Tabelle 1) Weibchen

Männchen

Exposition Tage

Gruppe

150

K 10 20

0,353 ± 0,310 0,329 ± 0,035 0,334 ± 0,021

NS NS

0,352 + 0,011 0,487 ± 0,036 0,511 ± 0,040

NS 0,01

200

K 10 20

0,253 ± 0,020 0,264 ± 0,012 0,249 ± 0,053

NS NS

0,285 ± 0,014 0,331 ± 0,019 0,361 ± 0,023

NS 0,05

M

Signifikanz tP

±s

M ± s

Signifikanz tP

Tabelle 4 Hämatologische Größen bei Versuchs- und Kontrolltieren (Angaben wie in Tabelle 1) Exposition Tage

Weibchen

Männchen Gruppe M

±s

Signifikanz tP

M

±s

Signifikanz tP

Erythrozyten; lahl/mm 3 • 10 150

K 10 20

6643 ± 307,89 602b ± 284,7 5908 + 306,7

NS NS

5842 ± 341,0 5700 + 123,5 5731 ± 258,5

NS NS

200

K 10 20

5650 ± 284,9 5303 ± 229,3 4840 ± 247,7

NS NS

5259 ± 259,7 5177 ± 209,5 5174 ± 197,4

NS NS

150

K 10 20

42,6 ± 2,5 41,5 ± 1,74 45,1 ± 0,68

NS NS

39,8 ± 1,20 42.0 ± 1,48 42.1 ± 1,66

NS NS

200

K 10 20

41,4 ± 1,31 45,1 ± 0,68 48,8 ± 1,36

0,05 0,01

42,2 ± 0,64 42.6 ± 2,31 46.7 ± 1,13

NS 0,01

68,0 ± 4,47 72,81 ± 3,59 73,7 ± 2,24

NS NS

80,2 81,4 91,9

NS 0,05

Hämatokrj

150

K 10 20

200

K 10 20

ml/100 ml

Erythrozyte nvolumen /HOH o6pai>oTi;e CapfwTajioM : 6ojii>mne j(03bi TiipoKcmia noBbiiuaioT npoaojiHiHTejibiiocTb cua H TOPMO3HT conpamenHe ero npii iipejiBapHTejii.noH oCpaCoTKe 6ap6iiTaJioM, a Taitme HCKJiio'ieiiiie IIIHTOBHUIIOH >Kejie3bi. IH,HTOBHanaH wejie3a HBjineTCH KOOiiepaTopoM aJiH o 6 e n x Mo.iejieii HiiayKUim, HO ne HJIEIIOM B rjeiiH HiuJiopMaiiHH. IIIHX

Acta biol. med. german., Band 16, Seite 415 — 422 (1966) Aus dem Institut für Pharmakologie (Direktor: Prof. Dr. H. ANKERMANN) und dem Institut für Pathologische Physiologie (Direktor: Prof. Dr. E. GOETZE) der FriedrichSchiller-Universität J e n a

Untersuchungen zum Mechanismus der Enzyminduktion bei Ratten und Mäusen. VIII. Der Einfluß einer Röntgenbestrahlung auf die L- Askorbinsäure-Ausscheidung und auf ihre durch Barbital induzierte Steigerung bei Ratten sowie auf die Leber-L-Askorbinsäure-Konzentration und ihre Steigerung bei Mäusen W . KLINGER,

W . FINCK und H.

LEIBE

(Eingegangen am 22. 11. 1965)

Zusammenfassung Durch 600 R wird bei Ratten die Askorbinsäure-Ausscheidung für 3 Tage erhöht und anschließend gesenkt. Am 7. Tag nach der Bestrahlung ist sie wieder im Normbereich. Die Induktion einer gesteigerten Askorbinsäure-Ausscheidung durch 3 • 150 mg/kg Barbital wird nicht beeinflußt. Nach 1500 R ist die Askorbinsäure-Ausscheidung innerhalb der 4 Tage bis zum Tod der Tiere nicht signifikant verändert, die Induktion nur wenig herabgesetzt. In der Mäuseleber wird die normale Askorbinsäure-Konzentration durch 500 und 1500 R nicht verändert, bei BarbitalVor- oder-Nachbehandlung ist die Induktion nicht gestört. Der von uns angenommene Induktionsmechanismus ist durch eine erhebliche Strahlenresistenz ausgezeichnet.

Die Wirkung von Röntgenstrahlen auf den AS-Stoffwechsel wurde mehrfach untersucht. Bei M e e r s c h w e i n c h e n sinkt die AS-Konzentration nach Bestrahlung mit letalen und subletalen Dosen in allen Organen [1] — [31; die Verminderung ist um so stärker ausgeprägt und tritt um so früher ein, je höher die Dosis ist [1]. Die Fixationsfähigkeit der Gewebe für AS ist dabei deutlich herabgesetzt [4], [5], die Adsorptionskapazität im Blut erhöht [2], Über die AS-Ausscheidung nach Bestrahlung liegen widersprechende Berichte vor: Nach Y A S U D A [6] ist die AS-Ausscheidung nicht verändert, nach S T R A S H I N I N [ 5 ] ist sie nach subletalen Dosen vermindert, nach letalen Dosen vorübergehend vermindert und in den letzten Tagen vor dem Tode vermehrt. Eine Verminderung der AS- und eine Erhöhung der DAS-Konzentration wurde im Aortagewebe gefunden [7] und auf die in vitro nachgewiesene verminderte DAS-Reduktionsfähigkeit zurückgeführt [81. Abkürzungen: AS = L-Askorbinsäure; DAS = Diketogulonsäure; K G = Körpergewicht

Dehydroaskorbinsäure;

1)KS

=

416

W . KLINGER, W . FINCK, H .

LEIBE

B e i R a t t e n u n d M ä u s e n , f ü r die d i e A S kein V i t a m i n ist, w u r d e n a c h B e s t r a h l u n g e b e n s o wie bei M e e r s c h w e i n c h e n eine V e r m i n d e r u n g d e r A S - K o n z e n t r a t i o n in v e r s c h i e d e n e n O r g a n e n g e f u n d e n [9] —[12]. U n m i t t e l b a r n a c h 710 R w a r b e i R a t t e n d i e K o n z e n t r a t i o n in d e n N e b e n n i e r e n , im M u s k e l u n d im B l u t v e r m i n d e r t , im T h y m u s , in d e r Milz u n d in d e r L e b e r d a g e g e n u n v e r ä n d e r t . N a c h 1000 R w a r in d e r L e b e r u n d i m B l u t sogar eine T e n d e n z z u m A n s t i e g d e r K o n z e n t r a t i o n zu b e o b a c h t e n [13], d e r a u c h i m B l u t v o n H u n d e n n a c h 700 R b e s c h r i e b e n w u r d e [14]. D i e A u s s c h e i d u n g v o n D A S u n d D K S i m U r i n ist b e i R a t t e n n a c h 800 R v e r m e h r t [15]. B e i m M e n s c h e n t r i t t w ä h r e n d d e r S t r a h l e n t h e r a p i e ein A S - V e r l u s t u n d eine V e r m i n d e r u n g d e r P l a s m a k o n z e n t r a t i o n ein [16]. I m a l l g e m e i n e n w e r d e n die V e r ä n d e r u n g e n d e s A S - S t o f f w e c h s e l s n a c h B e s t r a h l u n g als F o l g e n e i n e r u n s p e z i f i s c h e n S t r e s s - R e a k t i o n a u f g e f a ß t [15], d i e a n d e r A S - K o n z e n t r a t i o n d e r N e b e n n i e r e n s c h o n n a c h 25— 50 R n a c h w e i s b a r w i r d [17]. N a c h isolierter K o p f b e s t r a h l u n g m i t 600 R k o m m t es b e i R a t t e n zu e i n e r l a n g d a u e r n d e n S e n k u n g d e r A S - K o n z e n t r a t i o n in Milz, N e b e n n i e r e n u n d L e b e r [18]. D i e P r o t e i n s y n t h e s e h a t sich b e i B e s t r a h l u n g m i t m i t t e l l e t a l e n bis l e t a l e n D o s e n als r e l a t i v r e s i s t e n t erwiesen [19]. A u c h d i e I n d u k t i o n a r z n e i m i t t e l a b b a u e n d e r E n z y m e in d e r R a t t e n l e b e r d u r c h v e r s c h i e d e n e P h a r m a k a w u r d e d u r c h R ö n t g e n - o d e r yB e s t r a h l u n g n i c h t b e e i n f l u ß t [20]. U n t e r d e n E n z y m e n , d i e physiologisch in A b h ä n g i g keit vom Alter induziert werden, wurde neben einem durch Bestrahlung nicht h e m m b a r e n I n d u k t i o n s m e c h a n i s m u s [21] a l l e r d i n g s a u c h ein S y s t e m b e s c h r i e b e n , dessen I n d u k t i o n m i t 200 — 400 R zu u n t e r d r ü c k e n ist [22] —[24]. KLEIN e t al. [25] f a n d e n , d a ß a u ß e r in T h y m u s , L y m p h k n o t e n u n d Milz k a u m eine Ä n d e r u n g d e r A S - K o n z e n t r a t i o n in d e n O r g a n e n d u r c h 600 R e i n t r i t t . D e r A b f a l l d e r K o n z e n t r a t i o n in d e n l y m p h a t i s c h e n G e w e b e n w i r d d u r c h B e h a n d l u n g m i t C h l o r e t o n als i n d u z i e r e n d e m P h a r m a k o n n i c h t w e s e n t l i c h v e r ä n d e r t . Diese E r g e b n i s s e lassen sich m i t d e n v o r a n g e s t e l l t e n B e f u n d e n n i c h t in Ü b e r e i n s t i m m u n g b r i n g e n . E i n e Ü b e r p r ü f u n g w a r d a h e r erforderlich.

Uns interessierte die Frage, ob die Induktionsfähigkeit durch höhere Strahlendosen beeinflußt wird. Wir untersuchten die Wirkung von 600 und 1500 R auf die AS-Ausscheidung und auf ihre Barbital-induzierte Steigerung bei Ratten sowie den Einfluß von 500 und 1500 R auf die Leber-AS-Konzentration bei Mäusen vor und nach Behandlung mit Barbital. Methodik 1. Versuchstiere: Geschlechtsreife W i s t a r - R a t t e n wie f r ü h e r a n g e g e b e n g e h a l t e n [26].

und Agnes-Bluhm-Mäuse

wurden

2. B a r b i t a l w u r d e s t e t s l , 5 % i g in 0 , 9 % i g e r N a C l - L ö s u n g i.p. a p p l i z i e r t . 3. N a c h w e i s d e r A S i m U r i n u n d in d e r L e b e r wie bei [26] a n g e g e b e n . 4. Bestrahlungsbedingungen'. R a t t e n w u r d e n e n t w e d e r m i t 600 R (200 kV, 20 m A , G e s a m t f i l t e r w e r t 1,5 m m Cu + 0,5 m m AI, D o s i s l e i s t u n g 37,5 R / m i n ) o d e r m i t 1500 R (200 k V , 20 m A , G e s a m t f i l t e r w e r t 1,5 m m Cu + 0,5 m m AI, D o s i s l e i s t u n g 46,1 R / m i n ) b e s t r a h l t . M ä u s e e r h i e l t e n 500 u n d 1 5 0 0 R (200 k V , 20 m A , G e s a m t f i l t e r w e r t 1,5 m m Cu + 0,5 m m AI, D o s i s l e i s t u n g 46,1 R / m i n ) . D e r F o k u s a b s t a n d b e t r u g s t e t s ca. 40 c m . D i e Dosis w u r d e m i t d e m HAMMER-Dosimeter g e m e s s e n . Die R a t t e n w u r d e n einzeln, d i e M ä u s e in G r u p p e n zu je 10 T i e r e n in V i n i d u r b e h ä l t e r n b e s t r a h l t , d i e m i t P e r l o n g a z e a b g e d e c k t w a r e n . Die M ä u s e w u r d e n auf e i n e m P l a t t e n -

Mechanismus der E n z y m i n d u k t i o n . V I I I

417

spielerteller mit 16 U / m i n im Strahlenkegel gedreht. U m tageszeitliche Empfindlichkeitsschwankungen der Tiere auszuschalten [281, wurden nicht m i t B a r b i t a l behandelte Kontroll- und Versuchstiere stets z u s a m m e n bestrahlt. 5- Die Ergebnisse wurden mit d e m ¿-Test statistisch m i t e i n a n d e r verglichen [27]. Bei den Ergebnissen werden die arithmetischen Mittelwerte mit S t a n d a r d f e h l e r angeführt. Ergebnisse

1. Die Wirkung von 600 R auf die AS-Ausscheidung und ihre Steigerung durch 3 • 150 mg/kg KG Barbital i.p. bei weiblichen Ratten ist in Abbildung 1 dargestellt. Es kommt nach der Bestrahlung für 2 Tage zu einer erhöhten AS-Ausscheidung, sie sinkt danach unter die Kontrollwerte und erreicht am 7- Tag wieder die Norm (II). Die Steigerung der AS-Ausscheidung durch Barbital (III) wird durch die Bestrahlung nicht beeinflußt, wie ein Vergleich mit unbestrahlten, barbitalbehandelten Kontrollen zeigt (IV).

Abb. 1. AS-Ausscheidung bei weiblichen W i s t a r - R a t t e n im Gewicht von 135 + 6 g. I = nach Scheinbestrahlung • • (n = 8); I I = nach 600 R O O ( n = 9;) I I I = nach 600 R und 3 • 1 50 mg/kg Barbital i.p. • n (m=10);1V = Kontrollgruppe, 3 • 150 mg/kg Barbital i.p. • • (n = 6). Diese Kontrollgruppe wurde einem vorangegangenen Versuch e n t n o m m e n [29]. Bestrahlung und Injektion bei f

T P
H 7,2 ist in allen ) Organen stärker als die bei ^H 7,5 und f Y i 9,4. Wieder sind es Niere und L e b e r der R a t t e n mit subtotalem Kaliummangel, die eine geringere E n z y m a k t i v i t ä t erkennen lassen. Die Befunde der AMPase 7,2 decken sich in bezug auf Niere und L e b e r (Abb. 2) mit denen der A T P a s e pH 7,2. Die A k t i v i t ä t der AMPase f\\ 7,2

a

b

Abb. 2. L o b e r : AMI'ase pH 7,2 nach Fixierung, Inkubationszeit 45 min. Vergrößerung: I14fach. Deutliche A b n a h m e der E n z y m a k t i v i t ä t bei K a l i u m m a n g e l (a), besonders um die Zentralvenen a) K a l i u m m a n g e l ; b) Kontrolle

in den Herzmuskelfasern (Abb. 3) der Kaliummangeltiere ist erhöht. Die Ergebnisse der /3-GPase fi\\ 7,2 sind in allen 3 Organen nicht unterschiedlich. Die APase weist eine Abnahme der A k t i v i t ä t der Herzmuskelfasern beim

a

b

Abb. 3. Merz: AMI'ase pH 7,2 nach Fixierung, Inkubationszeit 45 min. Vergrößerung:

114fach.

E n z y m a k t i v i t ä t s e r h ö h u n g in den Herzmuskel fasern bei Kaliummangel (a) a) K a l i u m m a n g e l ; b) Kontrolle

E n z y m l i i s t o c h e m i e des s u b t o t a l e n

Kaliummangels

445

subtotalen Kaliummangel auf. Bezüglich des Verhaltens der ANPase (Abb. 4) verweisen wir auf die Tabelle 1. Bei der SPase sind nur die Ergebnisse der Leber (Abb. 5) erwähnenswert, der Aktivitätsabfall in der Kalium-

a

b

A b b . 4. N i e r e : A N P a s e B B pH 9,2, I n k u b a t i o n s z e i t l S S t d . Yergröi3erung 1 U f a c h . Z u n a h m e d e r E n z y m a k t i v i t ä t in d e n E p i t l i e l i e n d e r p r o x i m a l e n T u b u l i bei K a l i u m mangel a) K a l i u m m a n g e l ; b) K o n t r o l l e

mangelieber ist deutlich, besonders wieder um die Zentralvenen. Ebenfalls eine Aktivitätsminderung findet sich bei der SNPase in der Niere der Tiere mit subtotalem Kaliummangel. Die N-Esterase, die im Herzen kaum reagiert, ist sowohl in den Nieren wie in der Leber der Kaliummangeltiere in ihrer Aktivität herabgesetzt. Die von uns bestimmten Dehydrogenasen sowie die MAO zeigten keine nennenswerten Aktivitätsunterschiede bei unseren Yersuchsbedingungen in den verwendeten Organen.

A b b . 5. L e b e r : S l ' a s e pH 5,6, I n k u b a t i o n s z e i t .i Std., u n f i x i e r t . V e r g r ö ß e rung 1 Hiach. 1 >eutliche d i f f u s e A b n a h m e d e r E n z y m a k t i v i t ä t in d e n L e b e r p a r e n c h v m z e l l e n bei K a l i u m m a n g e l ( u n t e n ) , a) K a l i u m m a n g e l ; b) K o n t r o l l e Diskussion

Unsere Ergebnisse weichen von denen ab, die bei hochgradigem Kaliummangel an Herz und Niere (EREXCH [6] u. a.) gefunden wurden. Wir fanden keine typischen fokalen Herznekrosen und Nierenpapillenveränderungen.

446

D.

KUNDE

Über histologisch gesicherte Leberbefunde bei Kaliumverminderung ist uns bisher nichts bekannt. Die fermenthistochemischen Ergebnisse in den 3 Organen lassen bei verschiedenen Enzymen die aktive Rolle des Kaliums im Zellstoffwechsel erkennen. Nach Angaben der Autoren ( N A G A N O et al. [ 2 1 J , [22]), die verschiedene Enzyme in Leber und Niere nach akuter experimenteller Hypokaliämie biochemisch bestimmten (G-6-Pase, FDP-Aldolase, GOT, GPT und G-6-PDH), fanden sich signifikante Änderungen einiger am Kohlenhydrat- und Proteinstoffwechsel beteiligter Enzyme. Diese Änderungen sind nach Meinung der Autoren Ausdruck einer gesteigerten Glukoneogenese und eines vermehrten Proteinabbaues. Die Bedeutung des Kaliumions für die regelrechte Fermentaktivität wird von vielen Autoren betont ( S C H Ü M A N N [ 3 2 ] , F R E N C H [6], N A G A N O et al. [ 2 1 ] , [ 2 2 ] , SCHATZMANN [29] u. a.). Von besonderer Bedeutung ist es für die Funktion der MembranATPase und damit für die Aufrechterhaltung der sogenannten NatriumKalium-Pumpe. Ein Kaliummangel, auch schon ein subtotaler Mangel über lange Zeit, führt, wie unsere Ergebnisse zeigen, zu faßbaren Fermentaktivitätsveränderungen. Die Angaben der Literatur über die verschiedenen Funktionen des Kaliums im Zellstoffwechsel sind so zahlreich, daß, wie B A J U S Z [ 1 ] es zusammenfassend ausdrückt, ein Mangel zur Alteration der zellulären Aktivität und der anatomischen Integrität führt. Auch K I N S O L V I N G et al. [13] wies an Meerschweinchennieren eine Natrium- und Kalium-abhängige Membranen-ATPase nach, die er von der mitochondrialen ATPase abgrenzen konnte. R E N D I und U H R [26] beschreiben eine ATPase, die für eine optimale Aktivität die Anwesenheit von Natrium- und Kaliumionen in einer bestimmten Konzentration benötigt, welche auch durch Inhibitoren der mitochondrialen ATPase nicht gehemmt werden kann. Nach W E L L E R und T A Y L O R [3 7] wird für den intrazellulären Einbau von 1 M M Glukose 1 M M Kalium benötigt. Kaliumionen sind bei der Umwandlung von Hexosediphosphat in Hexosemonophosphat notwendig ( M Ü N T Z und H U R W I T Z [ 1 9 ] ) , ferner für den Aufbau energiereicher Phosphatverbinden ( S Z E N T - G Y Ö R G Y I bei R O D E C K [27]) und für Dephosphorylierungsprozesse der Phosphobrenztraubensäure, beim Einbau der Phosphatgruppen in das ATP (PROSIEGEL et al. [25]), bei allen Transphosphorylierungsprozessen, in die ATP einbezogen ist [25]- Die Bedeutung des Kaliums im Zellstoffwechsel ist mit diesen Angaben längst nicht erschöpft, aber schwer werden die Aktivitätsänderungen der Phosphatasen dadurch deutbar. Die Ergebnisse zeigen eine faßbare Beeinflussung der Membranen-ATPase und des Adenylsäuresystems. Wie die Tabelle 1 ausweist, umfassen die Auswirkungen des Kaliummangels nur bestimmte />H-Bereiche; die Phosphatasen bei pH 9,4 haben z. B. kaum Aktivitätsunterschiede. Die Kernphosphatasen scheinen von einem subtotalen Kaliummangel nicht beeinflußt zu werden. Nach P O C H E [24], M o L N A R e t al. [16], D A V I D [ 3 ] (zusammenfassende Literatur) u. a. hat der Kaliummangel eine sogenannte Zytoplasmadedifferenzierung zur Folge. Diese tritt nach M A C P H E R S O N [ 1 5 ] in den Zellen der Blutgefäße, des Binde-

E n z y m h i s t o c h e m i e des s u b t o t a l e n K a l i u m m a n g e l s

447

gewebes, des Endokards, des retikulären Netzwerkes usw. nicht auf, was wieder die Rolle des Kaliums im Zellstoffwechsel von Parenchymzellen unterstreicht. Auch die unspezifischen Phosphatasen weisen eine deutliche Beeinflussung auf. Die von FRENCH [6] mittels eines hochgradigen Kaliummangels erzeugten Herzmuskelnekrosen zeichneten sich durch eine erhöhte Aktivität der SPase aus. Die Verstärkung der Reaktion (gering) der SPase in der Herzmuskulatur (und zwar hier weniger in den Herzmuskelfasern, sondern vielmehr in den Bindegewebszellen und Kapillarendothelien) ist auch bei unseren Befunden zu finden. Wahrscheinlich ist sie Ausdruck einer Aktivierung des Mesenchyms, ähnlich wie das HECHT [11] beim experimentellen Herzinfarkt gefunden hat. Eine Erhöhung der SPase in den Nierenpapillen beim experimentellen Kaliummangel, wie MORRISON und PANNER [17] sie fand, konnten wir nicht nachweisen. Die Befunde der APase von FRENCH [6] stimmen ebenfalls mit den unsrigen am Herzmuskel überein: Aktivitätsverlust der Herzmuskelfasern beim Kaliummangel bei gleichbleibender Reaktion der Kapillarendothelien. Literatur [1] BAJUSZ, E . : Age f a c t o r and myocardial necrosis: E x p e r i m e n t a l studies on t h e sensitizing effect of K - , Mg- and Cl-deficiencies. Gerontologia [Basel] 8, 66 (1963). [2] DARROW, D. C.' U. H . C. MILLER: T h e production of cardiac lesions b y repeated i n j e c t i o n s of desoxycorticosterone a c e t a t e . J . clin. I n v e s t . 21, 601 (1942). [3] DAVID, H . : E r g e b n i s s e und Prinzipien der submikroskopischen Pathomorphologie der Herzmuskulatur. Z. ges. inn. Med. Grenzgebiete 168, 481 (1963). [4]

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E n z y m h i s t o c h e m i e des s u b t o t a l e n K a l i u m m a n g e l s

449

Summary

1). K u n d e :

E n z y m e - h i s t o c h e m i c a l studies on l i v e r , h e a r t and k i d n e y s of rats under s u b t o t a l potassium d e f i c i e n c y B o t h specific a n d n o n s p e c i f i c phosphatases w e r e studied. A n influence on cell m e t a bolism became evident from : 1. a r e d u c t i o n of a c t i v i t y of m e m b r a n e A T P a s e under potassium d e f i c i e n c y in t h e k i d n e y and l i v e r ; 2. a d i f f e r e n t e f f e c t of t h e s u b t o t a l potassium d e f i c i e n c y on t h e response of t h e indiv i d u a l phosphatases, a n d thus, on the a d e n y l i c acid s y s t e m in heart, k i d n e y and l i v e r . PeaioMe JJ,. K y i i . i e : 3 H 3 H M r H c r o x n M i m e c K o e iiccjie;iOBaHne neneiiH, c e p ; m a h K p u c b i n p i i 3KcnepnMenTajiijH0M cyÔTOTajibHOM He^ocTaTHe KaJiHH

Abtopom

noiien

H3yieHbi cneuH(j)HHHbie h necneiiHijiimHbie a 3 w n p i i HejjocTaTKe KaJiHH b noHKe H neneHH, 2. n o pa3JiiiHHOMy 3$eKTy cyOTOTaJibnoro i i e a o c T a T K a KaJiHH Ha HiiTencHBHOCTb peaiiUHH OT.iejibHbix $oc(J)aTa3 h TeM caMbiM Ha cncTeMy aaeHHjioBoiï khcjiotm b cep^ue, nonne h neqeHii.

30

A c t a biol. med. german., H e f t 4

Acta biol. med. german., B a n d 16, Seite 450 —455 (1966) F r o m t h e Central Drug Research Institute, Lucknow, India (Director: Dr. M. L.

DHAR)

Effect of non-primate gonadotrophins on the testis of prepuberal rhesus monkeys AMIYA B . KAR, H . CHANDRA a n d V. P .

KAMBOJ

(Received: 2. 11. 1965) Summary The testis of prepuberal rhesus monkeys ( M a c a c a m u l a t t a ) responds to ovine F S H and L H when administered b y t h e intratesticular or intramuscular routes. How ever, t h e effects are mild as revealed b y t h e n a t u r e of histologic changes in t h e seminiferous tubules a n d t h e interstitium. The functional stimulation of t h e latter comp o n e n t seems to be somewhat more m a r k e d . No greater response is evoked in t h e testis b y a combined regime of t h e two hormones or b y t h e intratesticular procedure. The inguinal location of t h e organ is not altered, either. It is suggested t h a t t h e stage of development of t h e testis in these prepuberal animals is critical in influencing the degree response to exogenous gonadotrophins. Introduction In sexually i m m a t u r e rodents t h e stimulation of t h e seminiferous epithelium to t h e point of spermatozoa formation had not been achieved by exogenous F S H or L H jl], A combined administration of p i t u i t a r y F S H and h u m a n chorionic gonadotrophin (HCG) exerted a positive effect on t h e hormonal activities of t h e i m m a t u r e r a t testis b u t did not promote spermatogenesis [2], Intratesticular injection of F S H in i m m a t u r e hypophysectomized r a t s caused a h y p e r t r o p h y of t h e S E R T O L I - C C I I S b u t no changes in t h e gametogenic elements [3]. In a d u l t hypophysectomized r a t s and rhesus monkeys p r e g n a n t mare serum gonadotrophin (PMS) was effective in stimulating spermatogenesis only u p to t h e p r i m a r y spermatocyte stage 11], [4]. Similar results were obtained in a t t e m p t s to initiate spermatogenesis in prepuberal rat testis cultured in vitro, b y F S H a n d HCG [5], On t h e other hand, a recent report on successful restoration of full spermatogenesis in a hypophysectomized man b y h u m a n menopausal gonadotrophin (HMG) is noteworthy [6]. The possibility of a species specificity in testicular response to gonadotrophins was examined by K N O M L [7], H e injected HCG, equine L H and a h u m a n pituitary gonadotrophin preparation to hypophysectomized rhesus monkeys and noted a consistent stimulation of androgenic function of t h e testis. Equine L H and t h e h u m a n pit u i t a r y preparation which was found to contain substantial F S H activity, also caused an increase in diameter of t h e tubules and promoted mitotic activity in t h e seminiferous epithelium. I t was, therefore, concluded t h a t gonadotrophin preparations of non-primate origin were active on t h e testis of hypophysectomized rhesus monkeys; there was no absolute species specificity in this respect.

Gonadotrophin effect on testis

451

The present report is concerned with the effect of F S H and LH either alone or in combination, on the testis of prepuberal rhesus monkeys (Macaca mulatto) when administered by different routes. Material and Methods Sexually immature male rhesus monkeys of the Institute's primate colony weighing 1.5 to 2 kg and 4 to 5 months old, were used in this investigation. T h e animals were maintained in air-conditioned quarters (temperature 75 + 2 °F) under uniform husbandry conditions throughout the experimental period. T h e F S H and L H preparations were of ovine origin and procured from the National Institute of Health, Bethesda, U.S.A. (batch no. N I H - F S H - S - 3 ovine, and N I H - L H - S 8 ovine). T h e dose for intratesticular injection (I. t.) of the hormones was 100 fig (in 0.1 ml sterile distilled water) daily per testis for 5 days. For combined administration each testis received 100 fig of F S H + 100 fig of L H (in the same volume of the solvent) daily for the same period. T h e intratesticular injections were given under aseptic condition. F o r administration by the intramuscular (I. m.) route the dose of each gonadotrophin was 200 fig (in 0.1 ml sterile distilled water) daily per animal for 5 davs. For combined regime 200 fig F S H + 200 fig L H (in the same volume of the solvent) per animal was the daily dose. The control animals received the solvent alone b y the intratesticular and the intramuscular routes in a similar manner. The animals were sacrificed on the day following the last injection. T h e testes, seminal vesicles (SV) and the prostate were dissected out and weighed to the nearest 0.1 mg in a ROLLER-SMITH b a l a n c e .

For histological studies the tissues were fixed in BOUINS fluid and serial paraffin sections were stained with EHRLICHS hematoxylin and eosin. The prostatic acid phosphatase activity was measured by the procedure of HAWK et al. [8]. At the commencement of the experiment the testes of all the monkeys were found to be located in the inguinal canal and the circum-genital area showed a golden-reddish tinge. Results

It will be evident from the results presented in table 1 that I. t. injection of F S H and LH either alone or in combination caused a significant increase in testis weight (vs. controls P < 0.02—0.01). On the other hand, due to marked variations the I. m. regime did not evoke any statistically significant change in the weight of the testis, although in the F S H and the F S H + L H groups a trend towards increase was noticed. The location of the testes, continued to be inguinal in all of the animals. Histologically, the testis of the control monkeys presented typical prepuberal features [9]. The tubules were small and compact. The diameter was 50 to 60 ¡A, and they were populated mostly by SERTOLi-cells and occasional spermatogonia (fig. 1). No mitotic figures were seen. The tunica propria was not organized. The interstitium contained spindle shaped cells with dark stained nucleus. The vascularity of the organ was poor. The diameter of the tubules increased (70 to 90 ¡J) after I. t. injection of F S H but the tunica propria continued to be undifferentiated. In most of the tubules the SERTOLi-cells were 30

452

A . B . K A R , H . C H A N D R A , V . 1'. K A M B O J

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9HK1S I Fig. 1. Testis of a control m o n k e y . N o t e t y p i c a l p r e p u b e r a l features, x 380 Fig. 2. Testis of a m o n k e y injected w i t h ovine F S H b y t h e i n t r a t e s t i c u l a r r o u t e . N o t e increase in d i a m e t e r of t h e tubules, reorganization of t h e t u b u l a r e l e m e n t s a n d presence of m i t o t i c figures. T h e i n t e r s t i t i u m is u n c h a n g e d , x 380 Fig. 3. Testis of a m o n k e y i n j e c t e d w i t h ovine L H b y t h e i n t r a t e s t i c u l a r route. N o t e t h e presence of m i t o t i c figures b u t no p a r t i c u l a r increase in d i a m e t e r of t h e tubules. T h e i n t e r s t i t i u m c o n t a i n s an occasional epitheloid element, x 380 Fig. 4. T h e testis of a m o n k e y which received concurrent injection of ovine F S H + L H b y t h e i n t r a m u s c u l a r route. C o m p a r e w i t h fig. 2. N o t e presence of occasional LEYDIGcells in t h e i n t e r s t i t i u m (marked b y arrow), x 380

Gonadotrophin effect on testis

453

found to occupy a peripheral position (fig. 2). There were m a n y spermatogonia and mitotic figures were visible. The features of the interstitial cells were similar to those of the controls. No LEYDIG-cells were seen. There was an increase in vascularity of the organ. I. t. injection of L H did not cause any increase in tubular diameter (50 to 70 (i) but more spermatogonia and mitotic figures were observed (fig. 3)- The tunica propria was similar to that of the controls. The interstitium contained mostly undifferentiated spindle shaped cells and occasional epitheloid elements. No LEYDiG-cells were seen. The vascularity of the organ was somewhat increased. The combined administration of the two hormones b y the I. t. route evoked changes in the tubules which were more or less similar to those observed in the F S H (alone) group. There was no particular effect of this regime on the interstitium and no LEYDiG-cells were seen. The histological features of the testis of monkeys subjected to F S H or L H treatment b y the I. m. route were virtually similar to those of the corresponding I. t. groups. An additional change in animals injected with F S H -f- L H intramuscularly was the presence of occasional LEYDiG-cells in the interstitium (fig. 4). Table 1 Effect of gonadotrophins on genital organs of prepuberal monkeys

Status

Controls (4) 1 FSH, I. t. (4) LH, I. t. (4) F S H + LH, I. t.(4) FSH, I. m. (4) i LH, 1. m. (4) i FSH + LH, I. m. (4)

Testis weight [mg] Mean ± S. E.

Seminal vesicle weight [mg] Mean ± S. E.

Prostate weight [mg] Mean ± S. E.

330.00 340.00 431.25 717-50 332.00 420.00 416.25

182.00 183-75 255-00 310.00 185-00

i 208.25 351-25 402.75 407-25 305-50 210.25 317.25

22.61

39-26 37-41 34.64 51-84 15.78 55-27

± 46.09 ± 18.38 ± 43-89 ±131-90 ± 8.19 ± 30.28 ± 17-83

± ± ± ± ±

4.58 18.19 15-56 49-50 9-90 230.00 ± 34.89 205-00 ± 21.02

Prostatic acid phosphatase [mg P/gm/hour] Mean ± S. E.

0.52 ± 0.10 0-70 1.06 2.10 0.72 1.45 1.59

±0.16 ± 0.01 ± 0.00 ± 0.26 ± 0.26 ± 0.17

No. of monkeys in parenthesis

Irrespective of route, the F S H administration did not cause any change in S V weight (tab. 1). L H either per se or in conjunction with F S H stimulated S V weight, but due to wide variations the difference from the control animals was not statistically significant except in the case of the group subjected to F S H + L H treatment b y the 1 . 1 . group (P < 0 . 0 5 ; table 1). A more or less similar pattern was noticed in the ponderal response of the prostate to the gonadotrophins. Thus, F S H had no effect on the prostatic weight. L H stimulated the weigth of the gland, but except for the L H or F S H - f L H 1.1. groups (P < 0.01 and 0.05 respectively) the difference from the controls was not statistically significant (table 1).

454

A. B . KAR,

H . CHANDRA, V . P .

KAMBOJ

In contrast, the response of the prostatic acid phosphatase was more consistent. Thus, F S H caused (I. t. or I. m.) no change in enzyme activity. L H either alone or in combination with F S H caused a significant increased in acid phosphatase activity (P < 0 . 0 2 — 0 . 0 1 ; table 1). I t was interesting that combined F S H and L H administration b y the I. t. route was more effective in stimulating the enzyme activity than the I. m. procedure ( F S H + L H I. t. vs. F S H + L H I. m., P < 0 . 0 5 ; table 1). There was no effect of gonadotrophin treatment on the colouration of the circum-genital area. Discussion

T h e results of the present study show that the prepuberal rhesus monkey testis responds to ovine F S H and L H preparations. This is indicated b y ponderal stimulation of the testis, increase in diameter of the tubules, presence of mitotic figures, and some re-organization of the germinal elements as evidenced b y a preponderance of spermatogonia. Likewise, in the interstitium occasional epitheloid elements and even LEYDIG-cells are seen. The functional stimulation of the interstitial elements is suggested b y the increase in weight of the accessory genital organs and more consistently b y an enhancement of the prostatic acid phosphatase activity. T h e latter is considered as a highly sensitive secondary sexual character directly dependent upon the androgenic status of the testis [1]. I t is also pertinent that the androgenic stimulation of the prepuberal testis m a y not necessarily involve a morphologic transformation if the interstitial cells [40]. The testicular changes evoked b y the gonadotrophins are indeed modest. Similar findings have been recorded b y a number of investigators [1] — [4J. KNOBIL [7] who used much higher doses of the gonadotrophin preparations could not achieve any more gametogenic or interstitial stimulation than t h a t observed in the present study. Particularly disappointing are the effects of intratesticular infusion of the hormones. This procedure proved to be no more effective than the intramuscular injection even though it has been claimed that a dose of ovine L H or HCG as low as 0.025 fig can stimulate the LEYDiG-cells of hypophysectomized rats [11], However, intratesticular injection of ovine F S H to similarly operated rats failed to exert any effect on the seminiferous epithelium beyond causing a hypertrophy of the SERTOLI-cells [3]. Further, contrary to the reports of ENGLE [12] and KNOBIL [7] no descent of the testis has been observed in the present study. These facts therefore suggest that in the prepuberal monkeys (and perhaps in other mammalian species as well) the extent and amplitude of testicular response are dependent upon a critical stage of its development rather than on the source, dose or the route of gonadotrophin administration. In general, F S H exerted its effect specifically in the seminiferous tubules and L H on the interstitium. However, intratesticular L H inexplicably stimulated mitosis in the germinal elements without causing an increase in

Gonadotrophin effect on testis

455

tubular diameter. The combined administration of the two hormones exerted no particular stimulatory effect on the testis except for a little more marked influence on the interstitium. This investigation was supported b y a g r a n t from t h e Ford F o u n d a t i o n . The a u t h o r s are g r a t e f u l t o Dr. M. L. D H A R for his interest in t h i s study. T h e generosity of Dr. M. M . G R A F F of t h e National I n s t i t u t e of H e a l t h , Bethesda, U.S.A., and Dr. A. W I L H E L M I , E m o r y University, Allata U.S.A. in supplying t h e ovine F S H and L H preparations is acknowledged. T h a n k s are due to Mr. K. N A R A I N for technical assistance and Mr. S. K. N A T H for t h e photomicrographs Literature : 1] [2]

[3] [4] [5] [6] [7]

[8] [9] [10] [11] [12]

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Zusammenfassung A. B. K A R , H. C H A N D R A U. V. P. K A M B O J : Die W i r k u n g der Gonadotropine von N i c h t p r i m a t e n auf die Hoden präpuberaler Rhesusaffen Die Hoden präpuberaler Rhesusaffen ( M a c a c a m u l a t t a ) reagieren auf intratestikulär oder i n t r a m u s k u l ä r appliziertes F S H und L H . Diese Wirkungen sind jedoch, wie sich aus den histologischen Veränderungen in den Hodenkanälchen und dem Interstitium ergibt, gering. Die Stimulation durch L H scheint etwas ausgeprägter zu sein. Eine kombinierte Behandlung mit beiden H o r m o n e n bzw. eine intratestikuläre Injektion erzeugt im Hoden keine größere Reaktion. Die inguinale Lage des Organs wird nicht beeinflußt. E s wird angenommen, d a ß das Entwicklungsstadium der Hoden der präpuberalen Tiere im Hinblick auf die Reaktion gegen exogene Gonadotropine von B e d e u t u n g ist. Pe;iioMC A. B. K a p , X . X a n a p a H B . n . K a M G o t t : J],eiicTBne r o H a j o i p o n n H O B HenpHMaTOB Ha H H H K H npennyßepajibHbix oße3bHii H H H K H npeanyßepajiLHbix o6e3bHH (Macaca m u l a t t a ) pearwpyioT Ha HiirpaTecTHKyjinpHO MJiH BHyTpHMbiuieqHO BBeaeHHbie ropMOiibi ( F S H , L H ) . C V J H 110 xapaKTepy rHCTOJiornqecKHx H3MeHeHHH B ceMeHHbix KaHajn.qax H B npoMeniyTOHH O M npocTpaHCTBe, neöcTBHe OHnaKO neBejiHKO. C T H M V J I H U H H , Bbi3BannaH L H , n0BHOTM0My öojiee Bbipamena. KoMÖHHHpoBanHaH oßpaöoTKa O Ö O H M H R O P M O I I A M H H J I H HiiTpaTecTHKyjiHpHa« HHbeKUHH ne a a j i n HOBbimeHHe peaHUHii B H H M H Ü X . IlaxoBoe nojioHieHHe o p a r H a He H3MeHneTCH. ripeanojiaraeTCH, HTO CTa.iHH pa3B H T H H HH^ieK npejuiyöepaJibHbix >KHBOTHbix HpHTHMecnan B OTHOuienHH peaKHHH n a 3K3oreHHbie roHaaoTponHHbi.

Kurzmitteilungen Acta biol. med. german., B a n d 16, Seite 456 —458 (1966) Aus dem Pathologischen I n s t i t u t der H u m b o l d t - U n i v e r s i t ä t Berlin, dem Rudolf-Yirchow-Haus der Charité (Direktor: Prof. Dr. L. H. KETTLER)

Der Einfluß verschiedener Standardmedien auf den Feinbau von Amnionepithelzellkulturen R . M E Y E R u n d B . SCHUBERT

(Eingegangen am 15. 12. 1965)

Zusammenfassung Der Einfluß verschiedener Standardmedien (EAGLE, LEPINE und PARKER sowie eines Gemisches aus L a k t a l b u m i n h y d r o l y s a t mit einem Zusatz von 10% PARKERMedium) auf den Feinbau von Kurzzeitkulturen eines p e r m a n e n t e n Amnionepithelzellstammes wird untersucht. Die Zahl der Mitochondrien pro Zelle (repräsentiert durch ein relatives Äquivalent) und die Kernflächengröße ändern sich in Abhängigkeit von der Art des verwendeten Mediums. E s wurden Beziehungen zwischen dem morphologischen Aufbau der Amnionepithelzellen und der Aminosäurenzusammensetzung der Nährmedien diskutiert.

Vergleichende Untersuchungen am Endothel der Aorta und der Arteria pulmonalis des Kalbes und anderer Tierspezies ergaben einen differenten strukturellen Aufbau der Endothelzellen in beiden Blutgefäßen [1] — [3]. Diese Feststellung veranlaßte die Autoren, vom „ortsabhängigen T y p der Endothelzelle" zu sprechen. Morphologische Untersuchungen von Kurzzeitkulturen des Endothels dieser Blutgefäße ergaben, daß noch nach mehreren Tagen Unterschiede im Feinbau der Zellen bestehen, die aber q u a n t i t a t i v nicht mehr so deutlich in Erscheinung treten [4], [5]- Diese Tatsache wurde auf die einheitlichen Bedingungen während der Kultivierung zurückgeführt, die sowohl das Nährmedium, die Art der Züchtung als auch die Zusammensetzung und den Druck der Atmosphäre betreffen. Da dabei dem Nährmedium eine wesentliche Bedeutung zukommt, erschien es uns lohnend, dessen Auswirkungen auf den Feinbau der Zellen in der Gewebekultur zu beobachten. Ausgangspunkt unserer Versuche war ein permanenter Amnionepithelzellstamm, der in Demeterflaschen im Nährmedium E A G L E H e L a „einfach" mit einem Zusatz von 10% inaktiviertem Kalbsserum gezüchtet wurde. Zur Untersuchung gelangten die Fertigmedien aus dem Institut für Seuchenschutz Berlin-Weißensee, und zwar E A G L E HeLa „ n e u " (enthält die doppelte

Kurzmitteilungen

457

Menge von Aminosäuren tmd Vitaminen von E A G L E HeLa „einfach" bei gleicher Konzentration der Salzlösung), L E P I N E - und P A R K E R - M e d i u m , außerdem ein Mediumgemisch aus Laktalbuminhydrolysat und 10% PARKER-Medium. Die Züchtung erfolgte als mono-layer-cultures in Petrischalen, die mit Deckgläschen ausgelegt waren. Die eingebrachten Kulturen züchteten wir 3 und 0 Tage, pro Medium für jeden Zeitraum fünf Einzelexperimente. Es handelte sich also um insgesamt 50 Versuche. Während dieser Zeit wurden die Kulturen weder gefüttert noch umgesetzt. Nach Beendigung der Versuchsdauer führten wir mit der Hälfte der bewachsenen Deckgläschen die Darstellung der Mitochondrien durch. Wir hielten uns an ein von M E Y E R und H A C K E N S E L L N E R [ 3 ] publiziertes Verfahren. Die Auszählung nahmen wir am Projektionsbild der Schwarz-Weiß-Negative vor. Der endgültige mittlere Mitochondrienbesatz pro Zelle errechnete sich aus den absoluten Mitochondrienwerten von jeweils fünf Versuchen. Diesem Ergebnis entsprechen etwa 400— 500 Zellen. Aus diesen Zahlen ergibt sich durch Division der absoluten Mitochondrienzahl durch die Zellzahl der mittlere Mitochondrienbesatz pro Zelle. Diese Werte sind in der Tabelle 1 aufgetragen. Es muß die Einschränkung gemacht werden, daß es sich nicht um die absoluten Mitochondrienwerte, sondern, durch die Methodik der Darstellung bedingt, nur um ein relatives Äquivalent handeln kann. Sie entsprechen etwa einem optischen Flachschnitt durch die Amnionepithelzelle. Tabelle 1 Ergebnisse der Mitochondrienzählungen

Nährmedium

EAGLE EAGLE

HeLa „einfach" H e L a ,,neu"

LEPINE PARKER

! mittlerer Mitochondrieni b e s a t z p r o Zelle n a c h 3 Tagen

6 Tagen

19,5 28,0 32,9 40,2

34,3 32,8 41,0 40,1

18,9

27,3

Laktalbuminhydrolysat -f

10%

I'ARKER

Die restlichen Kulturen wurden in 10%igem Formalin fixiert und die Kerne mit WEiGERTschem Hämatoxylin dargestellt. Die Kernmessung führten wir mit einem Kompensationsplanimeter (Gebr. Wichmann, Berlin) durch. Die in der Tabelle 2 dargestellten Mittelwerte der Kernflächen stellen das Ergebnis von Messungen an jeweils 100 Kernen pro Versuchsanordnung dar. Die Mitochondrienzahlen und die Kernflächengrößen der Einzelversuche sind in Übereinstimmung mit dem Gesamtergebnis gleichsinnig ausgerichtet. Nach dem „Vorzeichentest" sind unsere Werte als statistisch signifikant zu bezeichnen.

Kurzmitteilungen

458

Tabelle 2 Ergebnisse der Kernflächennn ssungen

Nährmedium

Kernflächengrößü in /«2 nach 3 Tagen

I

6 Tagen

EAGLA H e L a

„einfach"

170,46

175,09

EAGLE H e L a

„neu"

167,91

178,12

LEPINIC

148.67

220,35

PARKER

168.68

204,81

144,82

210,45

Laktalbuminhydrolysat +

10%

PARKER

Zusammenfassend stellen wir fest, daß der morphologische Aufbau von kultivierten Zellen, in unserem Falle von einem permanenten Zellstamm, durch das verwendete Nährmedium beeinflußt wird. Das zeigt sowohl die von uns ermittelte Veränderungung der Mitochondrienzahl als auch die der Kernflächen. Obwohl eine direkte Übertragung der Verhältnisse eines permanencen Zellstammes auf die Gegebenheiten von Frischzellkulturen nicht möglich ist, läßt sich die eingangs erwähnte Bedeutung des Nährmediums im Rahmen des Milieus bestätigen. Bei der kausalen Genese dieser Beziehungen muß man auf die Zusammensetzung des Nährmediums, insbesondere auf seinen Gehalt an verschiedenen Aminosäuren, hinweisen. Eine endgültige Klärung der Relationen kann noch nicht gegeben werden. Literatur [1]

H A C K E N S E L L N E R , H . A . u . R . M E Y E R : A c t a b i o l . m e d . g e r m a n . 9, 4 2 8

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[2] HACKENSELLNER, H . A . : A c t a anatom. [Basel] (im Druck). [3]

M E Y E R , R . U. H . A . H A C K E N S E L L N E R : A r c h . e x p . V e t . M e d . ( i m

Druck).

[4]

M E Y E R , R . U. H . A . H A C K E N S E L L N E R : Z . Z e l l f o r s c h , m i k r o s k o p .

Anatom.

66,

197

(1965). [5]

H A C K E N S E L L N E R , H . A . U. R . M E Y E R : Z . m i k r . a n a t o m .

F o r s c h . 73, 3 0 6

A n s c h r i f t d e r V e r f a s s e r : D r . RUDOLF M E Y E R u n d BARBARA SCHUBERT,

(1965).

Pathologisches

Institut der Humboldt-Universität Berlin, 104 Berlin, Schumannstr. 20/21.

A c t a biol. m e d . g e r m a n . , B a n d 16, S e i t e 4 5 9 —460 (1966) A u s d e m I n s t i t u t f ü r G e r i c h t l i c h e Medizin d e r H u m b o l d t - U n i v e r s i t ä t zu B e r l i n ( D i r e k t o r : P r o f . D r . m e d . O. P R O K O P )

Die Frequenz von Inv(l) in der Berliner Bevölkerung O. PROKOP u n d

I. ISHIYAMA

( E i n g e g a n g e n a m 21. 12. 1965)

Ohne

auf

die v o n

et al.

RITTER

[3] d a r g e l e g t e

Formalgenetik

des

Inv-

S y s t e m s e r n e u t e i n z u g e h e n , g e b e n w i r n a c h f o l g e n d d i e F r e q u e n z v o n I n v (1), d a s v o n ROPARTZ e t a l . [6] e n t d e c k t w u r d e , in d e r B e r l i n e r bekannt.

Bevölkerung

D a wir zur Zeit Inv-Seren anderer Spezifität nicht zur V e r f ü g u n g

haben, v e r w e n d e n wir nur das Inv(l)-Antiserum u n d benutzen wie RITTER u n d W E N D T [5] die E r g e b n i s s e so, a l s w ü r d e n i c h t e i n vorliegen,

sondern

ein

Zweiallelen-System.

Das

Vierallelen-System

Familienmaterial

RITTER u n d W E N D T e r l a u b t diese R e d u z i e r u n g f ü r die P r a x i s .

von

Die eigenen

F a m i l i e n d a t e n werden an anderer Stelle veröffentlicht. Material und Methodik Z u r U n t e r s u c h u n g w u r d e n 660 S e r u m p r o b e n u n a u s g e l e s e n e r B l u t e v o n B e r l i n e r S p e n dern herangezogen. Bei d e r U n t e r s u c h u n g w u r d e gleichzeitig G m ( a ) , G m ( x ) u n d G m ( f ) m i t b e r ü c k s i c h t i g t . H i e r b e i w u r d e n j e zwei Seren A n t i - G m ( a ) , A n t i - G m ( x ) u n d ein S e r u m A n t i - G m ( f ) sämtliche vom SNagg-Typ verwendet. Das Anti-Inv(l)-Serum wurde von Herrn Dr. M O L T E R (Heidelberg) z u r V e r f ü g u n g gestellt. Die U n t e r s u c h u n g s t e c h n i k w i c h n i c h t v o n d e r in u n s e r m I n s t i t u t ü b l i c h e n a b (vgl. PROKOP u n d UHLENBRUCH [1]). D i e zu u n t e r s u c h e n d e n S e r e n w u r d e n in einer S t a n d a r d v e r d ü n n u n g v o n 1 : 1 0 v e r w e n d e t . E i n e S c h a c h b r e t t - T i t r a t i o n w a r — wie V o r v e r s u c h e zeigten — n i c h t e r f o r d e r l i c h . Ü b e r d a s E r g e b n i s u n t e r r i c h t e t die n a c h s t e h e n d e T a b e l l e : Tabelle V e r t e i l u n g v o n Inv(l) auf d i e e i n z e l n e n G m - M o s a i k s , d e r e n F r e q u e n z v e r m e r k t ist (n = 660)

n G m (a/a)

G m (a/f) G m (ax/f) G m (f/f) zusammen

8

(1,2%)

23

(3,4%)

d a v o n Inv(l---) 3

I n v ( l —) 5 20

174 (26,4%) 80 (12,2%) 375 (56,8%)

29 6 48

145 74 327

660 (100%)

89 (13,5%)

571 (86,5%)

Kurzmitteilungen

460

Die für die Berliner Populations-Stichprobe ermittelten Frequenzen stimmen g a n z g u t m i t d e n D a t e n v o n RITTER u n d W E N D T [5] ( 1 5 , 9 % ) , RITTER e t a l . [3] s o w i e RITTER u n d SCHMIDTMANN [4] u n d

RITTER u n d DRESCHER [2]

überein. Grobsichtlich hatten wir nach Erhebung der Daten den Eindruck, daß alle Gm(x)-tragenden Serummuster eine geringere Frequenz von Inv(l) besitzen. Dies ist aber statistisch nicht signifikant und liegt gerade noch in der Breite des dreifach mittleren Fehlers. Die untersuchten Seren zeigten sämtlich eine einwandfreie Zuordnung zu ihrem jeweiligen T y p , waren also entweder Hemmer oder nicht. Übergangsformen wurden nicht beobachtet. Literatur [1]

[2] [3]

[4]

[5] [6]

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PROKOP, O .

Acta biol. med. german., Band 16, Seite 461—463 (1966) Aus dem Pharmakologischen Institut der Medizinischen Akademie „Carl Gustav Carus" Dresden (Direktor: Prof. Dr. W . O E L S S X K R )

Paraplegie nach Strychninkrampf bei Kaninchen 1 ) H.

WALTHER

(Eingegangen am 23. 12. 1965)

Kaninchen in flacher Urethannarkose (500 mg/kg i.v.) reagierten auf eine nachfolgende Strychnindosis von 0,4 mg/kg i.v. mit abgeschwächten Krämpfen. Anschließend zeigten die Tiere sehr häufig schlaffe, vereinzelt auch spastische Lähmungen, besonders der Hinterextremitäten und teilweise der Blase. Diese waren vielfach reversibel, jedoch bei ca. 1 / 3 aller Tiere blieben sie bestehen und führten zu einer hochgradigen Atrophie der betroffenen Muskulatur. Einige Tiere verstarben. Das uneinheitliche und wechselnde klinische Bild ließ mehrere Deutungsmöglichkeiten offen. Der durch Strychnin bedingte Ausfall der rekurrenten RENSHAW-Hemmung konnte weder Dauerlähmungen noch die reversiblen Paresen ohne weiteres erklären. Ebenso war eine primäre Lähmung bzw. lissive Wirkung [3] an den Endplatten ausschließbar [12]. In der älteren Literatur fanden sich jedoch Angaben über eine lähmende Wirkung des Strychnins [1], [8], [10]. Sie wurde an Fröschen beobachtet, die nach einer Strychningabe infolge ihrer Hautatmung das erste Stadium des Tetanus überlebten und im zweiten eine Lähmung zeigten, welche nach Stunden oder Tagen unter erneuten tetanischen Anfällen reversibel war. Diese Lähmungen waren ebenfalls nicht endplattenbedingt und wahrscheinlich zentraler Genese. B e i m Säugetier tritt jedoch meist nach den ersten Tetanusserien der Tod ein. FALCK [4] erwähnt bei seinen ausführlichen Untersuchungen zur Strychnintoxizität an Kaninchen keine Lähmungen. E s war deshalb nicht vollständig auszuschließen, daß letale Strychnindosen, die durch die Vorbehandlung mit Urethan nicht zum Tode führen, in der zweiten Phase eine lähmende Wirkung aufweisen. B e i dem klinischen Bild war auch an eine Querschnittslähmung zu denken, zumal solche bekanntlich nach heftigen Krämpfen auftreten können und GOCHT [7] ähnliche Beobachtungen nach Starkstromeinwirkungen bei Kaninchen gemacht hatte. Unsere Tiere zeigten in der Regel jedoch nur 1

Teilweise zur 6. Tagung der Arbeitsgemeinschaft der Industrie- und Hochschulpharmakologen am 6. 5. 64 in Erfurt vorgetragen

462

Kurzmitteilungen

einen leichten, einmaligen Streckkrampf, und orientierende pathologischanatomische Untersuchungen von thorakalen und lumbalen Schnitten des Rückenmarkes ergaben keine eindeutigen morphologischen Äquivalente, so daß wir zunächst andere Ursachen vermuteten. Eine Gruppe von Tieren erhielt eine größere Strychnindosis (2 mg/kg) sehr langsam i.V., so daß Krampfanfälle vermieden wurden. Bei diesen Kaninchen traten keine Lähmungen auf. Damit war allein das Krampfgeschehen als Noxe zu betrachten, und wir prüften weiter, ob der beim Krampf auftretenden Apnoe und der damit verbundenen akuten Hypoxie im ZNS eine Bedeutung beizumessen ist. Unsere Gesamtapnoezeit betrug etwa 5 min, während irreversible Schädigungen von Ganglienzellen des Rückenmarkes bei Kaninchen infolge zeitlich abgestufter Ischämie durch totale Drosselung der Aorta erst nach 15—20 min festgestellt worden sind [2], [6]. Wir richteten deshalb erneut unser Augenmerk auf eine indirekte Schädigung des Rückenmarkes und fanden in etwa 80% der dauergelähmten Fälle eine röntgenologisch nachweisbare Kompressionsfraktur, meist des 12. Brust- oder 1. Lumbalwirbelkörpers. Da bei den restlichen Tieren kein Befund vorlag, muß angenommen werden, daß schon eine Contusio spinalis ohne röntgenologisch erfaßbare Schäden zu totalen Lähmungen führen kann. Sehr wahrscheinlich war in diesen Fällen ein spinaler Schock mit nachfolgendem Ausfall der Bahnung beteiligt [5]. Eine durch die Krämpfe traumatisch bedingte, länger anhaltende Mangeldurchblutung des nicht segmental versorgten Rückenmarkes könnte für diesen Funktionsausfall ebenfalls verantwortlich sein. Bei 285 Querschnittslähmungen nach Unfällen bestand eine größere Abhängigkeit der Paresefolgen von dem Umfang der Durchblutungsstörung als vom Grad des mechanischen Schadens [11], während die akute Hypoxie des ZNS infolge der Krampfapnoe nicht ursächlich beteiligt sein kann [2], [6], Histologische Schnitte kranial und kaudal der Läsion wiesen allerdings auch bei diesen späteren pathologisch-anatomischen Untersuchungen an wochenlang gelähmten Tieren keinen typischen, gefelderten Ausfall der Markscheidenfärbung im Sinne einer WALLER'schen Degeneration auf [9]. Die geringfügige Quellung der Markscheiden und die diffuse Verteilung über den Rückenmarksquerschnitt wurde nicht als ausreichend charakteristisch für eine komplette Querschnittslähmung betrachtet. Aus anfangs unerklärlichen Beobachtungen bei pharmakologischen Untersuchungen hat sich eine histologisch-morphologische Problematik ergeben, über die wir an anderer Stelle berichten werden. Die vorliegenden Befunde zeigen zugleich, wie leicht indirekte Pharmakawirkungen zunächst als spezifische Arzneiwirkungen erscheinen und daraus Fehldeutungen resultieren können. H e r r n OA. l)r. med. habil. F. S I E B E R , liadiologische Klinik der Medizinischen Akademie Dresden, d a n k e ich f ü r die B e g u t a c h t u n g der R ö n t g e n b e f u n d e u n d den med.techn. Assistentinnen F r a u 1?. B E S C H und Frl. K . K U N D E f ü r ihre Mitarbeit.

Kurzmitteilungen

463

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[7] GOCHT, W . : D i s s e r t a t i o n Medizinische A k a d e m i e Dresden 1964. [8] HEUBNER, W . u. S. LOEWE: N a u n y n - S c h m i e d e b e r g s A r c h . e x p . P a t h o l . m a k o l . 7 1 , 174 (1913) [9] JÄGER, J . : V o r t r . 4. T g . A r b . - G e m . Morphologie, 3. 10. 1964, Leipzig. [10] POULSSON, E . : N a u n y n - S c h m i e d e b e r g s A r c h . e x p . P a t h o l . P h a r m a k o l . (1890). [11] TÖNNIS, D . : M ü n c h e n e r . m e d . W s c h r . 103, 1338 (1961).

Phar-

26,22

[ 1 2 ] WALTHER, H . : A c t a b i o l . m e d . g e r m a n . 11, 93 ( 1 9 6 3 ) .

A n s c h r i f t des V e r f a s s e r s : Doz. D r . m e d . h a b i l . H . WALTHER, P h a r m a k o l o g i s c h e s s t i t u t der Medizinischen A k a d e m i e Dresden, 801 D r e s d e n , I . i n g n e r p l a t z 1.

In-

Errata 1. Zur A r b e i t J . MIKULÄSKOVÄ, M . H Ä V A u n d O . BRÄZDA: „ T h e E f f e c t of M e t h y l t e s t o s t e r o n e on F o r m a t i o n of S e c o n d a r y D e n t i n e in Molars of R a t s " A c t a biol. m e d . g e r m a n . 14, S e i t e 7 8 7 — 791 (1965). D i e A b b i l d u n g e n 6 und 7 auf S e i t e 789 sind g e g e n e i n a n d e r a u s z u t a u s c h e n . 2. Zur A r b e i t H . WEGNER, W . HELBIG u n d F . REICHEL: „ D i e A u s w i r k u n g der

genen B e e i n f l u s s u n g des W a s s e r h a u s h a l t e s n i e r e n r i n d e n - M e t a b o l i t e im H a r n "

auf

die Ausscheidung

der

exo-

Neben-

A c t a biol. m e d . g e r m a n . 15, S e i t e 222 — 2 2 8 (1965). S e i t e 224 und 2 2 5 m u ß es in den l e t z t e n S p a l t e n der T a b e l l e n 1, 2 und 3 a n s t e l l e Vorperiode richtig heißen Nachperiode.

K13 Aus dem Physiologisoh-ohemisohen Institut der Priedrioh-SohillerUniversität Jena (Direktor: Prof.Dr. H. FRUNDER) Das Verhalten des Umsatzes von Lipid-Phospbat in ltitoohondrien und Mikrosomen CCl^-gesohädigter Uäuselebern G. RICHTER (Eingegangen am 22.3.1966)

Früher wurde allgemein angenommen, daß die liitoohondrien die Strukturelemente der Leberzelle sind, die bei einer experimentellen CCl^-Sohädigung primär betroffen werden (Literatur bei [1]). Neuere Untersuchungen zeigten dagegen, daß primär die Ergastoplasmastrukturen gesohädigt werden [2], [3] . Trotz dieser gesicherten Befunde wird oft diskutiert, daß CCl^ als Fettlösungsmittel unspezifisoh alle lipidhaltigen Membranen in der Zelle sohädigt, und daß infolgedessen Mitoohondrien und Ergastoplasmamembranen gleiohmäßig betroffen werden [2]; denn es ist zu erwarten, daß bei einer unspezifisohen Wirkung des CCl^ der Umsatz der Phospholipide in den liitoohondrien und Uikrosomen im gleichen Maße beeinträchtigt wird . Um diesen Einwand gegen die Vorstellung einer primären Schädigung der Ergastoplasmastrukturen zu prüfen, wurde der Umsatz von Lipid-P in der liitoohondrien- und Itikrosomenfraktion der Mäuseleber 2-216 Std. naoh der CCl^-Sohädigung untersuoht. Die CCl^-Sohädigung, die Zellfraktionisierung und die Bestimmung des Lipid-P-Umsatzes erfolgte wie früher beschrieben [4] . Zur in vivo-IIarkierung erhielten die lläuse 10 p.C Na2H')2P0^ (trägerfrei) 2 Std. vor Tötung i.p. injiziert. Aus Tabelle 1 ist zu ersehen, daß in der normalen Leber die Umsatzgeschwindigkeit der Phospholipide der Mitoohondrien beträohtlioh kleiner ist als die der Phospholipide der Uikrosomen. Abkürzungen: DNS = Desoxyribonukleinsäure; RNS = Ribonukleinsäure; rspA = relative spezifische Aktivität

KU Sie maoht nur etwa 60 # aus. Berücksichtigt man nooh, daß die rspA der Phospholipide der Mitoohondrien duroh Verunreinigung der Mitochondrienfraktion mit Mikrosomen [5j mit einer höheren rspA verfälsoht wird, so ergibt sioh für die rspA der Phospholipide der Hitoohondrien naoh der entsprechenden Korrektur ein Wert, der etwa um 10 niedriger liegt (in Tab. 1 korr.).

Tabelle 1 rspA und Konzentration des Lipid-P (in /ig/mg Fraktions-H) der Mitoohondrien (H-O- und Mikrosomenfraktion (Ms) der Mäuseleber 2-216 Std. naoh CCl^-Sohädigung. spez. Aktivität des Lipid-P in der Fraktion rspA spez. Aktivität des säureltSsliohen P in der Gesamtleber

Normal 2 Std. 4 " 12 » 18 " 24 » 36 " 48 " 60 » 72 • 96 " 120 • 168 • 216 "

rspA

H1 unkorr. korr.

«

0,224 0,226 0,171 0,184 0,218 0,215 0,435 0,341 0,183 0,375 0,307 0,320 0,442 0,320

100 0,355 90 0,323 84 0,187 90 0,204 97 0,247 96 0,216 194 0,498 158 0,485 82 0,157 167 0,332 137 0,349 143 0,360 197 0,524 143 0,389

0,224 0,183 -

-

MB

unkorr.

* 100 91 53 56 70 61 140" 137 44 94 99 102 148 108

Konzentration H1 Ms 64 59 59 51 61

82 90 102 79 93

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

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-

-

-

-

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Aus der Tabelle 1 ist weiterhin ersiohtlioh, daß der Einbau von 32 P in die Phospholipide der Hikrosomen naoh der Schädigung rasoh absinkt und naoh 4 Std. nur nooh etwa die Hälfte des Binbaus in die normalen Hikrosomen ausmaoht. Die Umsatzgesohwindigkeit der Phospholipide der Mitochondrienfraktion nimmt dagegen nur gering ab, unter Bertloksiohtigung der Hikrosomenverunreinigung der Frak-

K15 tion naoh 2 Std. um 10 % und naoh 4 Std. um 15 t. Auoh nach 12 Std. ist die rspA des Lipid-Phosphats in den Mitoohondrien nioht weiter abgesunken. Saraus ergibt sloh, daß die Pbospholipide der llitoohondrien und Mikrosomen duroh die CCl^-Sohädigung untersohiedlioh betroffen werden. Während der Umsatz der mitochondrialen Phospholipide nur unwesentlich erniedrigt wird, ist der der mikrosomalen Phospholipide stark erniedrigt. Eine unspezifieohe Wirkung des CCl^ als Fettlttsungsmittel kann somit ausgeschlossen werden. Sie Phospholipidkonzentration in beiden Fraktionen verändert sloh dagegen nioht. Auffällig ist weiterhin das Verhalten der Umsatzgesohwindigkeiten der mitochondrialen und mikrosomalen Phospholipide in der sich anschließenden Phase der Leberregeneration (siehe hierzu auoh [