Acta Biologica et Medica Germanica: Band 4, Heft 6 [Reprint 2021 ed.] 9783112518564, 9783112518557

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umiiiiiiii.in ETMEDICA GERMANICA HERAUSGEBER: A. G R A F F I

• H. G U M M E L

. F. J U N G

. A. K R A U T W A L D

S. M. R A P O P O R T S C H R I F T L E I T U N G : W. S C H E L E R , H. B I E L K A

AKADEMIE-VERLAG

• BERLIN

• B AN D 4 • H E F T Ö - S E I T E

529-616 • 1960

AUFNAHMEBEDINGUNGEN 1. Es werden nur Arbeiten angenommen, die nicht an anderer Stelle mit demselben Inhalt veröffentlicht oder zur Veröffentlichung angeboten werden. Der Autor verpflichtet sich nach Annahme, die Arbeit an keiner anderen Stelle zu veröffentlichen. 2. Die Arbeit muß wissenschaftlich wertvoll sein. Bestätigungen bekannter Tatsachen, Versuche und Beobachtungen ohne positives Ergebnis werden, wenn überhaupt, nur in kürzester Form aufgenommen. Nicht aufgenommen werden Arbeiten referierenden Charakters, Polemiken und rein spekulative Arbeiten, falls sie nicht ganz wesentliche neue Gesichtspunkte enthalten. 3. Kurzmitteilungen über experimentelle Ergebnisse werden bei der Drucklegung zeitlich bevorzugt. Für ihren Inhalt ist ausschließlich der Autor verantwortlich. 4. Die Arbeiten müssen kurz und klar geschrieben und gegliedert sein. Problematik (Einleitung), Methodik, Befunde und Diskussion, evtl. Schlußfolgerungen sollen deutlich in Erscheinung treten. Der Arbeit soll ein Kurzreferat der wesentlichsten Ergebnisse vorausgestellt werden (Zusammenfassung von höchstens einer Druckseite). Neben einer anderssprachigen erscheint auf jeden Fall eine deutsche Zusammenfassung. Die Arbeiten werden in folgenden Sprachen angenommen: Deutsch, Russisch, Englisch und Französisch. 5. Besonders wertvolle längere Arbeiten können als Beihefte veröffentlicht werden. 6. Von jeder Versuchsart bzw. jedem Tatsachenbestand oder jeder Krankengeschichte ist nur je ein Beispiel in knappester Form (Telegrammstil) zulässig. Weiteres Material ist als Tabelle oder grafisch darzustellen. Beobachtungen an biologischem oder medizinischem Material sollen mit Zahlenangaben über die Signifikanz der Ergebnisse belegt werden. 7. Literaturangaben müssen unter Verwendung der Abkürzung des Chemischen Zentralblattes und in der dort üblichen Form erfolgen: Name und Vorname des Autors, Band-, Seiten- und Jahreszahl. Bücher werden mit Titel, Verlag, Erscheinungsjahr und Seitenzahl zitiert, z. B . B . X . Y . nach M. N. Biochem. Z., 222, 45 (1951). Am Ende der Arbeit wird die Literatur in der Reihenfolge aufgenommen, wie sie im Text zitiert ist mit entsprechender Numerierung. 8. Doppeltitel sind zu vermeiden, ebenso Zerlegung einer Arbeit in mehrere Mitteilungen. 9. Das Manuskript muß am Kopf den Herkunftsort der Arbeit tragen. Am Ende des Manuskriptes wird der Name und die Anschrift des Verfassers bzw. des in erster Linie für den Inhalt verantwortlichen Verfassers wiedergegeben. Einsendungen von Arbeiten aus Kliniken und Instituten ist eine Erklärung des Direktors oder Abteilungsleiters beizulegen, daß er mit der Veröffentlichung einverstanden ist und dem Verfasser auf die Aufnahmebedingungen hingewiesen hat. 10. Das Manuskript ist einseitig und möglichst mit Maschine weitzeilig zu schreiben. Die Abbildungsvorlagen sind auf besonderen Blättern einzureichen. 1 1 . Werden im Text wortgeschützte Bezeichnungen (z. B . Warenzeichen) benutzt, so ist nach Möglichkeit daneben eine international anerkannte und verständliche Bezeichnung (z. B . die chemische Zusammensetzung) anzugeben. 12. Von jeder Originalarbeit werden kostenlos 80 Sonderdrucke geliefert. Darüber hinaus können bis zu 100 Sonderdrucke gegen Berechnung bezogen werden. Die Herausgeber Manuskripte sind an die Herausgeber zu senden oder direkt an die Redaktion der Acta biologica et medica germanica, B e r l i n - B u c h , Lindenberger Weg 70

ACTA BIOLOGICA ET MEDICA GERMANICA Herausgeber: A. G r a f f i • H. G u m m e l • F. J u n g • A. K r a u t w a l d • S. M. R a p o p o r t Band 4

I960

Heft 6

Acta biol. med. germ., Band 4, Seite 529—534 (i960) Aus der Forschungsgemeinschaft der Deutschen Akademie der Wissenschaften zu Berlin, Institut für Medizin und Biologie, Berlin-Buch, Arbeitsbereich Klinische Medizin (Direktor: Prof. Dr. H. G U M M E L )

Zur Wirkung von Dehydroascorbinsäure auf die Überlebenszeit röntgenbestrahlter Mäuse R . HUBER, W . BRUCKER u n d

E.

SCHRÖDER

(Eingegangen am 3. 1. i960) Zusammenfassung Die therapeutische Wirkung der Dehydroascorbinsäure (DHAsc) auf die Absterberate ganzkörperbestrahlter Mäuse wird durch Diäthyldithiocarbamat, einem relativ spezifischen Hemmstoff der Ascorbinsäureoxydase nicht vermindert. Eine direkte Beziehung zwischen dem Wirkungsmechanismus der DHAsc und der von M A P S O N beschriebenen zusätzlichen Atmungskette in biologischen Systemen scheint nicht vorzuliegen.

Der Einfluß der DHAsc auf die Strahlenwirkung ist durch F L E M M I N G [ 1 ] , ihre Wirkung auf den Stoffwechsel und das Wachstum experimenteller Tiertumoren durch H E I S E , L Ü H R S und N E U N H Ö F F E R [ 2 ] bekannt geworden. Die Autoren [2] erklären den Effekt mit einer Beeinflussung des biologischen Oxydationssystems in Gestalt einer Steigerung des Sauerstoffverbrauches in der Tumorzelle. In der Strahlenbiologie spielt bekanntlich auch der Sauerstoff eine entscheidende Rolle. Eine zusammenfassende Übersicht über den sogenannten „Sauerstoffeffekt in der Radiologie" findet man u. a. bei B A C Q und A L E X A N D E R [ 3 ] bzw. H O L L A E N D E R [4]. 1958 berichtete H O L L A E N D E R [5] auf dem Lausanner Symposium, die bisherigen Vorstellungen über den ,,Sauerstoffeffekt" erweiternd, daß auch eine Erhöhung des Sauerstoffpartialdruckes p o s t i r r a d i a t i o n e m den biologischen Strahlenschaden verringern kann. Die Untersuchung, über die Wirkung der DHAsc auf die Strahlenwirkung wurde aus folgenden Gesichtspunkten durchgeführt: 37

A c t a biol. med. germ., Heft 6

530

R. HUBER,

W . BRUCKER,

E.

SCHRÖDER

1. Nach WARBURG ist die verminderte Sauerstoffverwertung ein faßbares biologisches Kriterium bösartiger Geschwülste. 2. Nach HEISE und Mitarbeitern steigert die DHAsc in Ca.-Geweben die Sauerstoffverwertung entscheidend. 3. Bösartige Geschwülste sind u. a. auch ein manifestes Zeichen des Strahlenspätschadens. 4. Die Forschungsrichtung auf dem Gebiete der Chemotherapie bösartiger Geschwülste und der Therapie des biologischen Strahlenschadens hat eine gemeinsame Basis in der Untersuchung des Wachstumsproblems. Die DHAsc führt bei Verabfolgung unmittelbar p o s t i r r a d i a t i o n e m zu einer statistisch gesicherten Steigerung der 30 Tage-Überlebensrate bei der Maus (HUBER, HEISE und LÜHRS, 1958 [6]). Die eventuelle Aufklärung des Wirkungsmechanismus des therapeutischen Effektes der DHAsc war Gegenstand der nachfolgenden Versuche. Versuchs anordnung

Tiermaterial: m 25,0 g schwere Inzuchtmäuse vom Stamm AB. jedem Käfig wurden 5 Tiere gehalten. Standard-Keks-Fütterung.

In

Bestrahlungsbedingungen: 250 kV, 1,5 mm Cu HWS, 125 r/min frei Luft. 40 cm FA, Ganzkörperbestrahlung zwischen 500 r und 800 r in Zellonkästchen,, Chemische Substanzen: Die Dehydroascorbinsäure (DHAsc), wurde uns freundlicherweise von der Fa. Merz & Co, Frankfurt a./M., überlassen. Das Chromatogramm zeigte außer einer geringfügigen Fraktion mit einem Rf-Wert von 0,03 keine weiteren Verunreinigungen. Fp: 212,5° C. Das Diäthyldithiocarbamat (DTC) war ein Handelspräparat der Fa. Merck, Darmstadt. Äthylen-diamin-tetra-essigsäure (EDTA) lag als Handelspräparat des VEB Berlin Chemie, Adlershof, vor. Die Substanzen wurden in je 0,5 ml phys. NaCl i.p. verabfolgt. DHAsc: 1,5 X 10~6 Mol/Tier, DTC bzw. EDTA 1,5 • 10~5 Mol/Tier. DTC und EDTA wurden 10 min ante irradiationem oder in Verbindung mit DHAsc unmittelbar post irradiationem appliziert. DHAsc wurde immer post irradiationem verabfolgt. Ergebnisse

Tabelle 1 zeigt den Einfluß auf die 20 Tg. Überlebensrate von Mäusen bei Verabfolgung der DHAsc unmittelbar post, bzw. des DTC 10 min ante irradiationem. ;

Einfluß von Dehydroascorbinsäure auf röntgenbestrahlte Mäuse Tabelle 1 Dosierung

Bestrahlung

Tierzahl

Zahl der • Überlebenden nach 20 Tagen

DHAsc

1,5 X 10 _6 Mol/Tier in 0,5 ml phys. NaCl unmittelbar post irrad. i. p.

SOOr 650 r 800 r

30 30 30

16 1 0

DTC

1,5 X 10" 5 Mol/Tier in 0,5 ml phys. NaCl 10 min ante irrad. i. p.

500 r 650 r 800 r

30 30 30

20 3 0

NaCl

in 0,9% Lsg. 0,5 ml, i. p. ante irrad. post irrad.

500 r 650 r

30 30

5 4

Substanz

Das Ergebnis ist nach den Tabellen von M A I N L A N D und M U R R A Y [7] statistisch gesichert. Dieses statistische Verfahren wurde auch bei der Auswertung der weiteren Versuche zu Grunde gelegt. Die therapeutische Wirkung der DHAsc sowie der bekannte radioprotektive Effekt von DTC [8]—[10] wurde erneut bestätigt. Beide Substanzen sind in der angewandten Konzentration nur bei 500 r wirksam. Die Aufgabenstellung, Klärung des therapeutischen Effektes der DHAsc beim Strahlenschaden erforderte diese niedrige Dosierung von DTC. Im nächsten Versuch wurde DTC 10 min ante und DHAsc unmittelbar post irradiationem verabfolgt. Die therapeutische Wirkung der DHAsc blieb erhalten bzw. erschien sogar gesteigert. Tabelle 2 Dosierung

Bestrahlung

Tierzahl

DTC

1,5 X 10" 5 Mol/Tier in 0,5 ml phys. NaCl 10 min ante irrad. i. p.

500 r

30

DTC

1,5 X 10" 5 Mol/Tier in 0,5 ml phys. NaCl 10 min ante irrad. i. p. +

Substanz

+

Zahl der Überlebenden nach 20 Tagen 16

DHAsc

1,5 X 10" 6 Mol/Tier in 0,5 ml phys. NaCl unmittelbar post irrad. i. p.

500 r

30

23

NaCl

in 0,9% Lsg. 0,5 ml ante irrad. i. p.

500 r

30

4

37*

532

R . HUBER,

W . BRUCKER,

E.

SCHRÖDER

Tabelle 2 zeigt den Einfluß von DHAsc post und DTC 10 min ante irrad. i. p. verabfolgt auf die 20 Tage Überlebensrate. Eine einfache Additionswirkung von DTC und DHAsc wurde im nächsten Versuch ausgeschlossen, der mit äquimolaren Endkonzentrationen der Summe der beiden Substanzen durchgeführt wurde (vergl. Tab. 1). Die bekannte radioprotektive Wirkung des DTC wurde vermieden, indem beide Substanzen nach Bestrahlung in der Reihenfolge DTC, DHAsc verabreicht wurden (vgl. Tabelle 3).

Tabelle 3 Substanz

DTC

+

Dosierung

Bestrahlung

Tierzahl

Zahl der Überlebenden nach 20 Tagen

0,75 X 10" 5 Mol/Tier in 0,25 ml phys. NaCl

500 r

30

16

500 r

30

12

500 r

30

10

unmittelbar post irrad. i. p.

500 r

30

6

0,5 ml in 0,9% Lsg. ante irrad. i. p.

500 r

30

5

DHAsc

0,75 X 10~6 Mol/Tier in 0,25 ml phys. NaCl post irrad. i. p.

DHAsc

0,75 X 10- 6 Mol/Tier in 0,5 ml phys. NaCl post irrad. i. p.

DTC

0,75 X 10 - 6 Mol/Tier in 0,5 ml phys. NaCl 10 min ante irrad.

NaCl

Auch aus diesem Versuch geht deutlich hervor, daß die therapeutische Wirkung der DHAsc durch Zugabe von DTC unmittelbar nach der Bestrahlung nicht beeinflußt wird, wenn auch das Ausmaß der Wirkung bei der verabfolgten Konzentration geringer ausfiel. Die Ergebnisse über die Beeinflussung der therapeutischen Wirkung der DHAsc mit EDTA ließen eine gleiche Wirkung wie mit DTC erkennen. Die angewandte Konzentration war jedoch zu toxisch, und die Versuchsreihen waren mit einer sehr hohen Mortalität belastet.

Einfluß von Dehydroascorbinsäure auf röntgenbestrahlte Mäuse

533

Diskussion der Ergebnisse

Die von H E I S E und Mitarbeitern -1958 [2] aufgestellte Hypothese über die Beeinflussung des Atmungssystems schien anfänglich auch für den Mechanismus der therapeutischen Wirkung der DHAsc gegen den Strahlenschaden zuzutreffen. MAPSON [11] hat festgestellt, daß in biologischen Systemen neben dem Cytochrom-Cytochromoxydase-System u. a. auch ein DHAsc-GlutathionAscorbinsäureoxydasesystem bestehen kann. DPNH 2 kann mit Glutathion reagieren, die Reoxydation des SH-Glutathions erfolgt durch DHAsc. Die entstehende Ascorbinsäure reagiert über die AscorbinsäureOxydase, einem Cu-Proteid, mit molekularem 0 2 . Dieser Schritt wird in der gewählten Versuchsanordnung durch DTC relativ spezifisch gehemmt. Das evtl. verantwortliche biologische System wird dadurch unterbrochen. Der therapeutische Effekt müßte dann aufgehoben sein. Wie die Ergebnisse zeigen, trifft diese Vorstellung in den Versuchen jedoch nicht zu. Weitere Untersuchungen zum Wirkungsmechanismus der DHAsc wurden an mikrobiologischen Objekten mit eingehender biochemischer Analyse durchgeführt, worüber getrennt berichtet wird (HARHASH, BRUCKER, HUBER). Der Effekt der DHAsc zeigte sich hier besonders in einer Abnahme der strahleninduzierten Verringerung der Desoxyribonucleinsäurebildung. Für den Wirkungsmechanismus der DHAsc wurde eine weitere Erklärungsmöglichkeit in Richtung einer eventuellen „Radikalfalle" gesucht. Die Wirkung der DHAsc nach dem Strahleninsult könnte daher über eine Beeinflussung langlebiger Radikale möglich sein. Die inzwischen vorliegenden Ergebnisse mit der Elektronenspinresonanz-Meßmethode in Modellversuchen zeigen, daß wahrscheinlich auch diese für die Wirkung der DHAsc angenommene Vorstellung nicht zutrifft. Die Untersuchungen über die Entstehung langlebiger Radikale bei der Bestrahlung im Zusammenhang mit dem Problem des biologischen Strahlenschutzes bzw. der Therapie des Strahlenschadens werden fortgesetzt. Literatur Naturwissenschaften 43, 2 0 6 ( 1 9 5 6 ) . U. O. N E U N H O E F F E R : Z. Krebsforsch. 62, 509 (1958). B A C Q , Z . M . U. P. A L E X A N D E R : Fundamentals of Radiobiology, London Butterworths Scientific Publications 1955. [4] H O L L A E N D E R , A.: Radiation Biology, Mc. Graw-Hill Book Comp. Inc., New York/Toronto/London 1954. [5] H O L L A E N D E R , A.: Vortrag auf dem Symposium über schädliche Wirkungen schwacher Strahlendosen, Physikalische Grundlagen und biologische Aspekte, Lausanne 2 7 . — 2 9 . März 1 9 5 8 . [6] H U B E R , R., E. H E I S E U. W. L Ü H R S : Vortrag auf der Arbeitstagung „Biophysik" in Oberhof vom 1 3 . — 1 5 . Oktober 1 9 5 8 . [ 7 ] M A I N L A N D , D . U . I . M . M U R R A Y : Science 1 1 6 , 5 9 1 ( 1 9 5 2 ) . [1]

FLEMMING, K . :

[2] [3]

HEISE,

E., W.

LÜHRS

534

R. HUBER,

W . BRUCKER,

E.

SCHRODER

D. W . : Acta physiol. pharmacol. neerl. 4 , 5 0 8 (1956). Z. M., A. H E R V E U. P. F I S C H E R : Bull. Acad. M6d. Belg. 1 8 , 2 2 6 (1953). [10] B E A U M A R I A G E , M. L . : Int. J . App. Rad. Isotopes 4 , 6 9 (1958). [ 1 1 ] M A P S O N , L. W . : Vitamins and hormones 1 1 , 1—28 (1953), Academic press. New York. [8] V A N B E K K U M ,

[9]

BACQ,

Summary The therapeutic action of Dehydro-ascorbinic-acid (DHAsc) on the mortality rate ofI mice totally irradiated is not diminished by Diethyldithiocarbamat, a comparatively specific inhibitor of Ascorbinic acid oxydase. Apparently, there is no direct correlation between the mode of action of DHAsc and that of additional respiration chains in biological system described by M A P S O N . Pe3iOMe JUiwTHjiiiHMTHOKapGaMaT, npeacTaBjiHioiyuM OTHOCHTCJILHO cneumJiHiecKHH HHrHSHTop OKCHjjaati acKop6nnoBoii K H C J I O T M , He noHHHtaeT TepaneBTHMecKoro neiicTBHH nernnpoacKop6nHOBOH K H C J I O T M (JUrAcK) Ha npoaeHT OTMHpaHHH Bceiiejio o6jiyqeHHbix Mbiiueit. KaK K A > K E T C H , He cymecTByeT iipaMoro O T H O UieHHH MeJKfly MexaHH3MOM aeiiCTBHH JUrACK H HoGaBOHHOH HblxaTejIbHOtt UeilH B 6H0Ji0rHqecKHx CHCTeMax, onwcaHHOft Manc0H0M.

Acta biol. med. germ.. Band 4, Seite 535—538 (i960) Aus der Forschungsgemeinschaft der Deutschen Akademie der Wissenschaften zu Berlin, Institut für Medizin und Biologie, Berlin-Buch, Arbeitsbereiche Biochemie (Direktor: Prof. Dr. K . L O H M A N N ) und klinische Medizin (Direktor: Prof. Dr. H.

GUMMEL)

Der Einfluß der Bartonellenanämie auf die Strahlenwirkung bei Ratten F . SCHMIDT u n d R .

HUBER

(Eingegangen am 3. 1. 196O) Zusammenfassung Die Verhütung der Bartonellenanämie bewirkt bei den ganzkörperbestrahlten Ratten eine deutliche Steigerung der Überlebensrate.

In früheren Versuchen mit radioprotektiven Substanzen fiel auf, daß die Ergebnisse mit Ratten gegenüber denen mit Mäusen trotz Berücksichtigung der strahlenbiologisch unterschiedlichen Empfindlichkeit sehr verschieden ausfallen. Mit und ohne Behandlung verendet ein große Zahl der Tiere außerhalb der dosisbedingten charakteristischen Spitzen für den Dünndarm- bzw. Knochenmarktod. Wir sind dieser Frage nachgegangen und fanden, daß die Tiere u. a. auch die Symptome einer akuten Bartonellenanämie zeigten. Mit dem Erreger dieser Krankheit (Bartonella muris), der vermutlich durch Ektoparasiten übertragen wird, sind praktisch alle Rattenzuchten in Europa und zum Teil auch in den USA durchseucht [1]—[5]. In der Regel bleibt die Infektion latent. Wird die Abwehrkraft der Tiere geschädigt, z. B. durch Milzextirpation, dann sterben fast alle Tiere innerhalb von wenigen Tagen an Bartonellenanämie. Auf dem Höhepunkt der Krankheit lassen sich die Erreger im Blutausstrich, außen an der Membran der Erythrozyten angelagert, in großer Zahl nachweisen. Die Krankheit ist einfach zu erkennen an blutigen Nasen, Augenwinkeln und Braunfärbung des Felles in der Genitalgegend. Diese Symptome werden durch hämolysiertes Blut, das auch in den Urin übertritt, hervorgerufen. Da viele strahlenbiologische Untersuchungen an Ratten bisher ohne Berücksichtigung dieser Infektionskrankheit durchgeführt werden, die möglicherweise in Abhängigkeit vom verwendeten Rattenstamm die Befunde verwischen kann, erschien es zweckmäßig, den Einfluß der Bartonellenanämie auch bei unserem Stamm auf die Röntgenletaldosis zu überprüfen.

536

F . SCHMIDT,

R.

HUBER

Methodik und Ergebnisse

Tiermaterial: $ und $ Ratten, Tierhaltung und Bestrahlungsbedingung wie bereits früher angegeben [6]. Versuchsbedingungen: a) unter Neoarsphenamin 50 $ Ratten von 100—120 g Gewicht wurden in 2 Gruppen geteilt. 15 Kontrolltiere wurden mit 550 r und weitere 10 mit 600 r bestrahlt. Jeweils die gleiche Zahl von Versuchstieren wurde mit derselben Strahlendosis behandelt, erhielt jedoch am folgenden Tag und nach weiteren 5 Tagen je 0,7 mg Neoarsphenamin. Das ist eine Dosis, die nachSplenektomie die Bartonellenanämie sicher verhütet. Das Ergebnis ist in Tabelle 1 zusammengestellt: Tabelle l Anzahl der überlebenden Ratten nach Ganzkörperbestrahlung mit 550 r bzw. 600 r und 2-maliger Neoarsphenamin-Injektion Ti erzähl

Behandlung

15 15

550 r + 1,4 mg Neoarsphenamin 550 r 600 r + 1,4 mg Neoarsphenamin 600 r

10 10

Zahl der Überlebenden nach: 30 Tg. 60 Tg. 120 Tg.

Aus der Tabelle ist zu ersehen, daß die angegebene Behandlung mit Neoarsphenamin keinen deutlichen Effekt auf die Letaldosis zeigte. Da jedoch auch die Mehrzahl der behandelten Ratten an Bartonellenanämie erkrankte, war entweder die angegebene Dosis an Neo-A zu niedrig (stärkere Abwehrschädigung durch eine Totalbestrahlung als durch Milzextirpation ?) oder die Tiere wurden durch Ektoparasiten, die wir nicht nachweisen konnten, nach Abklingen der ArsphenaminWirkung von neuem infiziert. Das verwendete Neo-Arsoluin ( F A H L B E R G - L I S T ) beeinträchtigte das Allgemeinbefinden der Versuchstiere deutlich. Wir verwendeten deshalb in einem Wiederholungsversuch als Therapeutikum gegen Bartonellenanämie Penicillin, das nach G R I E S E M E R [7] in einer Dosis von 1000 bis 10000 Einheiten je Ratte heilend wirkt. b) nach Neoarsphenamin, unter Penicillin 21 von 25 3 Ratten (130—150 g Gewicht), die eine Injektion von 7,4 mg Neo-Arsoluin überlebten und sich nach 14 Tagen wieder erholt hatten, wurden mit 600 r bestrahlt, nachdem sie vorher zur Befreiung von Ektoparasiten in Jacutinlösung1 gebadet worden waren. Nach der Bestrahlung erhielt jede Ratte im Abstand von 3 bis 4 Tagen 4 Injektionen von je 4000 E Penicillin. Mehrmaliges Baden in Jacutinlösung gehört zur Routine-Behandlung unserer für strahlenbiologische Versuche verwandten Inzuchten. 1

E i n f l u ß der Bartonellenanämie auf die S t r a h l e n w i r k u n g

537

24 Kontrollratten wurden lediglich mit gleicher Dosis bestrahlt. Die Ergebnisse zeigt Tabelle 2. Tabelle 2 Anzahl der überlebenden R a t t e n n a c h G a n z k ö r p e r b e s t r a h l u n g m i t 600 r u n d 650 r, Neo-Arsoluin- u n d m e h r m a l i g e r Penicillinbehandlung Tierzahl

10

14 11 10

Zahl der Überlebenden nach: 60 Tg.

Behandlung 7,4 m g Neo-Arsoluin + 600 r + 1 6 0 0 0 E Penicillin 600 r 7,4 m g Neo-Arsoluin + 650 r + 16 000 E Penicillin 650 r

7

(ca.

70%)

5 (ca. 3 6 % ) 8 (ca. 73%) 2

(ca.

20%)

In diesem Ansatz war ein deutlicher „Schutzeffekt" der Penicillinbehandlung festzustellen, der vorwiegend durch Verhütung der Bartonellenanämie bedingt sein dürfte. Es ist allerdings möglich, daß hierbei auch der Vorbeugung einer strahleninduzierten gesteigerten Infektionsanfälligkeit und der strahleninduzierten Bakteriämie durch die Penicillinbehandlung eine gewisse Bedeutung zukommt [8] — [10].

Zusammenfassend ergibt sich somit aus den Versuchen, daß die latente Durchseuchung mit Bartonellenanämie ein Faktor ist, der bei der Auswertung von Bestrahlungsversuchen zusätzlich berücksichtigt werden sollte. Literatur [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8]

H . L. : Atomic E n e r g y P r o j e c t , W e s t e r n Reserve Univ. Monthly Progr. R e p . April 19 52, NYO-1646. N A I M A N , D. N. : Amer. J . Roentgenol. 6 1 , 9 5 ( 1 9 4 9 ) . S C O T T , J . K . U. J . N . S T A N N A R D : J . Infect. Dis., Chicago 9 5 , 302 (1954). F U R T H , F . u. J . K. S C O T T : Atomic E n e r g y P r o j e c t , Univ. R o c h e s t e r Q u a t . Techn. Rep. Okt. 1950. M O L O M U T , N . , M . F R I E D M A N , I . J . R Y B Y U. A. H A B E R : Amer. J . Roentgenol. 6 6 , 245 (1951). S C H M I D T F . , R . H U B E R u n d R . C O U T E L L E : Acta biol. med. germ. 3 , 6 2 4 1 9 5 9 . G R I E S E M E R , R . A.: J . N a t . Cane. I n s t . 2 0 , 9 4 9 (1958). K A P L A N , H . S . , R . S . S P E C K u. E . J A W E T Z : J . L a b , a. Clin. Med. 4 0 , 6 8 2 ( 1 9 5 2 ) . FRIEDELL,

[9] MAISIN,

J., M . MANDART,

E.

Biol. 144, 1560 (1950). [10] S M I T H , W. W., F. S M I T H , H . J . Physiol. 172, 351 (1953)-

PLUYGERS, J. RUTH,

G . L A M B E R T U. G . P O D I O : C . R .

H . Y.

CANTER

Soc.

U. M. M. G R E N A N : Amer.

538

F . SCHMIDT,

R.

HUBER

Summary The survival rate of totally irradiated rats is clearly-increased by prevention of bartonella anemia. PC3I0MC IlpenoTBpameHHe CapTOHejuioBoii aHeMHH BH3MBaeT y Bceue.no oSjiyieHHHX Kpbic BtipaweHHoe noBtmieHne BbUKHBaeMOCTH.

Acta biol. med. germ., Band 4, Seite 539—549 (i960) Aus dem Institut für Medizin und Biologie der Deutschen Akademie der Wissenschaften zu Berlin-Buch (Präsident: Prof. Dr. Dr. H . c. W . F R I E D R I C H ) , Arbeitsbereich Biologische Krebsforschung (Direktor: Prof. Dr. A. G R A F F I )

Beeinflussung der Metastasenbildung nach intravenöser Injektion von Tumorasciteszellen bei der Maus durch zusätzliche Behandlung. II. W.

KRISCHKE

(Eingegangen am 21. 1. I960)

Zusammenfassung 1. Es wird auf die im Rahmen umfangreicher Untersuchungen über den Mechanismus der experimentell erzeugten Metastasierung bei der Maus und der R a t t e bisher erschienenen Veröffentlichungen zusammenfassend hingewiesen. 2. In Ergänzung früherer Untersuchungen über eine eventuelle Beeinflussungsmöglichkeit der Metastasierung bei der Maus nach intravenöser Injektion von Ascitestumorzellen wird hier abschließend von einigen weiteren zusätzlichen Behandlungsweisen berichtet. 3. In diesen Experimenten, bei denen es sich um Vor- oder Nachbehandlung mit zellulärem Material oder Extrakten aus frischen homologen bzw. heterologen Tumor- oder Normalgeweben, handelte, konnte unter den beschriebenen Bedingungen keine eindeutige Beeinflussung der Metastasierung nachgewiesen werden. 4. Trotz dieser hier zum großen Teil in therapeutischer Hinsicht negativ verlaufenen Versuche wird auf die eventuellen Vorteile der Methodik der serienweisen Metastasenerzeugung als zusätzliche Maßnahme zur bisherigen Testung von Substanzen hingewiesen und diese Methodik empfohlen.

Im Rahmen einer umfassenderen Untersuchung des Mechanismus der Metastasierung nach intravenöser Injektion von Ascitestumorzellen bei der Maus und der Ratte sind bereits mehrere Arbeiten erschienen [1], [2], [4]. Hierbei wurde auch die Abhängigkeit der Metastasierung von verschiedenen biologischen Bedingungen, wie Alter [3], Geschlecht [3], [2] Schwangerschaft [3], Hormonapplikation [4] sowie von der genetischen Herkunft des Tiermaterials [3] untersucht. Ferner wurden auch die zeitlichen Verhältnisse dieser künstlich erzeugten Geschwulstmetastasen unter Berücksichtigung der beiden Kreislaufsysteme Lunge und Körperkreislauf wie der einzelnen Organe selbst untersucht und beschrieben [5], [2]. Auch hinsichtlich der Frage der Abhängigkeit der Metastasenbildung von der applizierten Zellzahl, der Applikationsweise sowie der Tumorart

540

W .

KRISCHKE

und damit auch unterschiedlicher Zellgrößen bei verschiedenen Geschwulstarten wurden Untersuchungen durchgeführt [6], [2]. Schließlich wurden noch histologische Vergleichsuntersuchungen — zur eventuell genaueren Bestimmung der zur Metastasenbildung führenden erforderlichen Zellzahl — mit gefärbten Ascitestumorzellen nach deren intravenöser bzw. intracardialer Verabfolgung bei der Maus durchgeführt [7]. Alle diese Untersuchungen sollten die Grundlage bilden für eine eventuell gezielte therapeutische Beeinflussung von Metastasen, die im Serienversuch künstlich erzeugt werden können. Derartige Untersuchungen könnten auch für die Metastasenbekämpfung beim krebskranken Menschen von einiger Bedeutung sein. Kleinere, ungezielte, d. h. wahllos herausgegriffene zusätzliche Behandlungsweisen zwecks Beeinflussung des Metastasierungsprozesses nach intravenöser Injektion von EHRLicH-Ascitestumorzellen bei der Maus wurden bereits als orientierende Versuche beschrieben [8]. Anhangsweise und als Abschluß dieser Orientierungsuntersuchungen sollen hier noch einige weitere kleinere Versuche mit zusätzlichen Behandlungsweisen zur intravenösen Injektion von EHRLICH-Ascitestumorzellen Erwähnung finden. Es sei auch hier nochmals besonders hervorgehoben, daß es sich in allen Fällen um kleine und einzelne Versuchsserien handelt, deren Ergebnisse noch nicht gesichert sind. Vor allem aus den Erfahrungen der Gewebezüchtung ist bekannt, daß für das Wachstum der Zellen eine gewisse Stimulation durch bestimmte Faktoren erforderlich ist. Für die pflanzliche Zelle ergab sich durch die Entdeckung und Reindarstellung der Auxine und Heteroauxine eine weitgehende Aufklärung des Wuchsstoffproblems, während für die tierischen Zellen darüber noch große Unklarheiten bestehen. Nach CASPARI [9] sollen die aus zerfallenden Zellen frei werdenden Nekrohormone das Wachstum und die Vermehrung normaler und maligner Zellen anregen. A. FISCHER [ 1 0 ] machte die Nukleoproteidfraktion, andere Forscher hingegen machen auch Polypeptide, Proteasen oder verschiedene Cofermente und Vitamine für die wachstumsfördernde Wirkung verantwortlich. Man ersieht daraus, welch komplexer Natur das Problem der Wuchsstoffe bei der tierischen Zelle ist. Von dem Gedanken ausgehend, daß durch derartige humorale Faktoren eine Wachstumsförderung und damit vermehrte und beschleunigte Metastasenbildung nach i.v. Injektion von Ascitestumorzellen durch verschiedene Extrakte aus schnell wachsendem Normal- und Geschwulstgewebe eventuell zu erwarten war, führten wir die nachfolgenden Versuche durch. — Weiterhin wurde durch eine Vorbehandlung des Organismus mit gleichem oder ähnlichem Tumorgewebe der Versuch einer aktiven Immunisierung unternommen. So werden beispielsweise Kaninchen, die mit BROWN-PEARCE-Tumor geimpft waren, oftmals nach Regression oder Resorption dieser langsam wachsenden Geschwulst immun gegenüber einer nachfolgenden Impfung (DOMAGK [ 1 1 ] ,

Metastasenbildung nach i. v.-Injektion von Tumorasciteszellen

541

DoMAGKund H A C K M A N N [12], H A C K M A N N [13]). H O R N [14] ist es gelungen, durch Abbinden verschiedener Tumoren der Ratte (JENSEN-Sarkom, YosHiDA-Sarkom, WALKER-Carcinom, Transpl. Hepatom, eine transpl. Leukose der Ratte), diese Tiere resistent gegenüber einer Nachtransplantation der gleichen Geschwülste zu machen. Ergebnisse und Besprechung der Versuche

Vor- oder Nachbehandlung der Versuchstiere mit Extrakten aus frischen Geweben oder mit zelligem Material. 1. Zusätzliche

Behandlung

mit homologem

Tumormaterial

In zwei Serien wurde verschieden aufgearbeitetes EHRLicH-Carcinom der Maus für eine Vor- oder Nachbehandlung der mit dem gleichen Tumor in Ascitesform intravenös (iv.) zu injizierenden Tiere verwendet. In einer dritten Serie wurde der gleiche Tumor in abgeschwächter Form vor der i.v. Injektion des homologen Tumors appliziert. Allen drei Fällen lag dabei die gleiche Zielsetzung zugrunde, nämlich der Versuch der Herbeiführung einer Immunisierung der Tiere, a) In dem einen Fall wurde in der Weise vorgegangen, daß solide Tumoren des EHRLicH-Carcinoms, die man leicht und in relativ kurzer Zeit durch subcutane (s.c.) oder intramuskuläre (i.m.) Injektion des EHRLicH-Ascites-Carcinoms bei Mäusen erhalten kann, steril entnommen, zerkleinert und mit Seesand und etwas R I N G E R Lösung verrieben wurden. Dieser Gesamtbrei wurde etwa 1:10 mit RiNGER-Lösung verdünnt und 10 Minuten bei 4000 Touren zentrifugiert. Der Überstand wurde mit einer Spritze aufgenommen und abermals 10 Minuten bei 4 000 Touren zentrifugiert. Der Überstand hiervon diente zur Vorbehandlung der Versuchstiere. Alle diese beschriebenen Manipulationen wurden steril bei 0° C durchgeführt, um eine Zerstörung der Fermente und sonst wirksamen Bestandteile zu verhindern. Versuchsanordnung Zwei kleinere Versuchsansätze wurden in dieser Reihe durchgeführt. Der eine mit einer zweimaligen Applikation von je 0,5 ml EHRucH-Carcinom-Extrakt i.p., wobei die erste Injektion wenige Stunden vor der i.v. Injektion der Ascites-Zellsuspension erfolgte, und die zweite zwei Tage später. Kontroll- und Versuchstiere erhielten 3Mill. Zellen in 0,1 ml RiNGER-Lösung i.v. verabreicht. Insgesamt waren es 10 auswertbare Versuchs- und 11 Kontrolltiere. Im zweiten Ansatz erfolgte insgesamt eine fünfmalige Verabreichung i.p. von je 0,5 ml des in der beschriebenen Weise hergestellten EHRLICH-Carcinom-Extraktes jeden zweiten Tag. Die erste Applikation erfolgte am gleichen Tage wie die i.v. Injektion der Ascitestumorzellen, und zwar wenige Stunden danach. Versuchsund Kontrolltiere erhielten 1,5 Mill. Tumorzellen in 0,1ml RiNGER-Lösung. Die Kontrollen wurden parallel zu den Versuchstieren insgesamt fünfmal, d. h. jeden zweiten Tag einmal mit je 0,5 ml RiNGER-Lösung i.p. gespritzt. In diesem Ansatz konnten 12 Versuchs- und 19 Kontrölltiere ausgewertet werden.

E r g e b n i s s e : Sie sind in der Tabelle 1 zusammengefaßt. Aus den Durchschnittswerten beider Ansätze ist kein Unterschied zwischen Versuchsund Kontrolltieren zu ersehen. Die Metastasierung erfuhr infolge der zusätzlichen Behandlung mit dem Extrakt des homologen Tumors in unseren Versuchen keine ausschlaggebende Veränderung.

542

W.

KRISCHKE

Tabelle 1 Rub.

Ansatz

Zellzahl Mill.

10

3,0

3,2

2.3

0,9

Kontrollen

11

3,0

2,8

2.4

0,3

5 X 0,5 ml EHRL.-Ca-Extr.

12

1,5

1,5

0,9

0,6

19

1,5

0,7

0,26

0,5

2 x 0,5 ml

1 1

2 3

2

4

Metastasen/ Org. Tier Lunge gr. Krslf.

Tierzahl

Applikation

EHRL.-Ca-Extr.

5 X 0,5 ml

RlNGER-Lsg.

Kontrollen

b) In dem zweiten Fall wurde frisch entnommener Ascitestumor in der üblichen Weise gewaschen und ungefähr 1 Teil Zellsediment mit 4 Teilen RiNGER-Lösung verdünnt. Diese Zellsuspension wurde sodann 15 Minuten lang hochtourig homogenisiert (ca. 10000 Touren). Ein anderer Teil wurde viermal je 2 % Minuten lang mit dazwischen liegenden Pausen von je 2 % Minuten bei —2° C Außenkühlung und bei laufender Umrührung mit Ultrakurzwelle beschallt (3,95 K V und 800 KH). In ersterem Fall werden die Zellen zertrümmert, in letzterem findet eine sogenannte ,,Zellverkochung" statt. Diese Suspensionen wurden eingefroren und später bei Zimmertemperatur appliziert. Versuchsanordnung Insgesamt 55 Mäuse wurden fünfmal im ganzen, d . h . zweimal jede Woche mit diesen Suspensionen i.p. gespritzt, und zwar dreimal mit je 5,0 ml und infolge hoher Sterblichkeit durch diese Dosis dann zweimal mit je 0,2 ml. Eine Woche nach der letzten i.p. Applikation erhielten die Überlebenden und Kontrollen gleichen Tiermaterials je 1,5 Mill. Ascitestumorzellen in 0,1 ml RiNGER-Lösung i.v. injiziert. Die Kontrollen waren parallel zu den Versuchstieren mit gleichen Mengen R i N G E R Lösung i.p. gespritzt worden. E r g e b n i s s e : E s sei gleich vorweggenommen, daß die Sterblichkeit sowohl bei d e m H o m o g e n i s a t als auch bei d e m beschallten T u m o r m a t e r i a l sehr groß war und aus diesem Grunde die auswertbaren Tiere beider Serien z u s a m m e n g e f a ß t wurden. Die Ergebnisse dieses Versuches sind in der Tabelle 2 angeführt. Sie zeigen keinerlei Unterschiede zwischen den auswertbaren Versuchs- und Kontrolltieren in ihrer Metastasierung, Tabelle 2 Rub.

Gruppe

Metastas 3n /

Tierzahl

Zellzahl Mill.

Tier

Lunge

Org. gr. Krslf.

1

Versuchstiere

26

1,5

10,3

6,8

3,4

2

Kontrolltiere

25

1,5

11,0

7,5

3,4

Metastasenbildung nach i. v.-Injektion von Tumorasciteszellen

543

c) I n weiteren kleineren Ansätzen sollte die Abhängigkeit der Metastasierung nach Injektion von Ascitestumorzellen von dem gleichzeitigen Vorhandensein des homologen Tumors im Körper untersucht werden (I), beziehungsweise durch eine i.v. Vorinjektion von schwach virulentem Tumorascites in anderen Serien (II). Versuchsanordnung I n ersterem Fall (I) wurden Mäuse intramuskulär (i.m.) in einen Oberschenkel m i t EHRLicH-Carcinom geimpft. Acht Tage danach, nachdem bei den meisten Tieren der Angang des Tumors gerade gefühlt werden konnte, erhielten sie 1,5 Mill. Ascitestumorzellen i.v. injiziert. I m zweiten Fall (II) wurde in drei Ansätzen der Tumorascites je einer Maus nach jeweiligem Auswaschen für 24 Stunden im Eisschrank steril aufbewahrt, u m die Virulenz herabzusetzen und dann in der üblichen Weise in einer Menge von 1,5 Mill. Zellen pro Maus i.v. appliziert. Nachdem durch die bis dahin gestorbenen Tiere, beziehungsweise durch Tötung von mindestens einem Drittel jeden Ansatzes, der Beweis einer äußerst minimalen Metastasierung erbracht war, wurden Nachinjektionen von Tumorzellen durchgeführt und zwar erfolgte in der einen Serie 37Tage nach dieser ersten i.v. Injektion, in der zweiten 32 Tage und in der dritten 29Tage danach eine zweite i.v. Injektion von 1,5 Mill. Zellen pro Maus von einem Gemisch frisch punktierten Ascitestumormaterials mehrerer Mäuse. Parallel dazu und mit dem gleichen Tumorzellmaterial wurden unbehandelte Tiere gleicher Ansätze als Kontrollen gespritzt. Tabelle 3

a)

II

Zellzahl Mill.

Tier

Lunge

Org. gr. Krslf.

1

Ehrl.-Ca i.m. Versuchstiere

12 •M ™ rCJl 01 l-i U W >

1 w

£ S w DNP aus gewebe

+

+

RNP aus gewebe

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+

+ +

+ + +

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3

+

+ +

+ + +

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+ +

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3 ci S O pH W S Q

3 J

+

+ +

I

+

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558

G. PASTERNAK

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I +

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II

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Immunologische Versuche mit Tumor-Nukleoproteiden

:3 8 ! S?1 § ' £ ; ^ i ä3yeTCH HJIH (fioTOMexpMH: UBCTHafi „nocToniniaH ^aeroTa" B 10 CBeTOBbix pa3pnnoB B ceKyHHy I I O C T O H H H O H H P K O C T H H Sejian „BonpocHTenBHaH N A C T O T A " nepeMeHHOli L A C T O T H H CBETOBOII I U I O T H O C T H ycTaHaBjiHBaiOTCH Ha $H3HqecKH paBHyio nacTOTy jiHint Torna, Korna o6e KawyTCH paBHO cBeTJitiMH. IlpH noMomw aToro MeTo^a H MepuaTejibHoii OTOMeTpHH Ha 4-ex noaonMTHbix jranax HccnenoBajiacb cneKTpajibHaH $oTonyBCTBHTejibHocTb fovea centralis no OTHOUieHHK) K CBeTy paBHOii aHeprnn 4-ex CTeneHeii H P K O C T H . OKa3ajiocb, MTO n p w pa3JiHHHbix C T C I I C H H X H P K O C T H HeilTpajibHan BenHHHHa U B C T H H X (jiHJibTpoB, naiiaeiniaH M E P I J A T E J I B H H M $ O T O MeTpoM, ocTaeTca paBHoil, B TO BpeMH KaK oHa MeHHeTCH npn onpenejieHHH ee ycTaHOBjieHHGM H a paBHyio nacTory B cpejiHeM Huaiiaaoiie cneKTpa: MCM

H H J K E C T e n e n b H P K O C T H , TCM S o j i e e N P O H H U A E M B I M . T . e . 6 o n e e C B C T J I H M K A W E T C H

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npH

Acta biol. med. germ., Band 4, Seite 588—597 (1960) Aus dem Physiologisch-chemischen Institut der Humboldt-Universität (Direktor: Prof. Dr. Dr. S. M. R A P O P O R T )

Berlin

Über Veränderungen des Plasmafermentspiegels stark anaemischer Kaninchen (MDH, GOT, GPT) 1 E . L . GRAUEL, H . - J . RADERECHT u n d

S. M.

RAPOPORT

(Eingegangen am 10. 2. i960) Zusammenfasung Es wurden an 10 Kaninchen Untersuchungen über den Fermentgehalt des Plasmas im Verlauf einer Entblutungsanaemie angestellt. Außerdem wurden die Lipämie und der Plasmaproteinspiegel untersucht. Im Verlauf der Entblutung kommt es nur bei ganz extrem niedrigen HK-Werten zu starken Erhöhungen im Plasmaspiegel der Fermente MDH, GOT, GPT. Der Gesamteiweißgehalt des Plasmas bleibt auch bei starker Entblutung über lange Zeit relativ konstant. Im Verlauf der Entblutung t r i t t mit großen individuellen Unterschieden immer eine Lipämie auf. Die im Plasma auftretenden Fermente stammen mit großer Wahrscheinlichkeit aus der Leber. Über den Mechanismus des Fermentaustritts aus der Zelle sind sichere Aussagen an Hand der vorliegenden Untersuchungen nicht möglich.

Im Rahmen von Untersuchungen an anaemischen Kaninchen wurden einige Veränderungen in der Aktivität von Lipase und Amylase im Plasma beobachtet [1], Es erhob sich nun die Frage, inwieweit auch andere Fermentsysteme im Serum Veränderungen erleiden. Solche Veränderungen könnten Ausdruck von Schädigungen an Organen insbesondere der Leber sein. Dafür spricht die alte Beobachtung, daß es nach größerem oder oft wiederholtem Aderlaß zu einer starken Lipämie kommt [2], [3]. Wir untersuchten MDH, GOT, GPT und die Lipämie an stark entbluteten Kaninchen ausgehend davon, daß die drei genannten Fermente in besonders reichem Maße in der Leber vorhanden sind und unter dem Einfluß der ständigen Blutentnahme bei fallendem Haematokrit eine zunehmende Hypoxie der Gewebe eintreten müßte, die eine Abgabe von Fermenten ans Plasma zur Folge haben könnte. 1

Verwendete Abkürzungen: MDH — Milchsäuredehydrogenase, A E D H — Äpfelsäuredehydrogenase, GOT — Glutaminsäure-Oxalessigsäure-Transaminase, GPT — Glutaminsäure-Brenztraubensäure-Transaminase. DPN bzw. D P N H — oxyd. bzw. red. Diphosphorpyridinnukleotid. BE-Biicher-Einheit, die Fermentaktivität, die im opt. Test bei 25 °C und Schichtdicke 1 cm eine Veränderung der Extinktion bei 366 nm um 0,1/100" hervorruft, H K — Haematokrit.

Plasmafermentspiegel anaemischer Kaninchen

589

S c h o n W A R B U R G u n d C H R I S T I A N b e r i c h t e t e n 1 9 4 3 ü b e r das V o r k o m m e n glykolytischer F e r m e n t e im Serum tumortragender R a t t e n . 1954/55 b e a r b e i t e t e n d a n n W R O B L E W S K I , K A R M E N u n d L A D U E [ 5 ] , [ 6 ] , [ 7 ] in drei A r b e i t e n zum e r s t e n Mal die drei a u c h v o n uns b e s t i m m t e n F e r m e n t e v o r allen D i n g e n i m H i n b l i c k auf die D i a g n o s e v o n H e r z i n f a r k t e n u n d L e b e r e r k r a n k u n g e n . I n der Zwischenzeit sind von vielen A u t o r e n in einer g r o ß e n Z a h l v o n A r b e i t e n diese u n d andere F e r m e n t e b e i den u n t e r s c h i e d l i c h s t e n K r a n k h e i t s z u s t ä n d e n u n t e r s u c h t worden [8]. Material und Methoden 10 Kaninchen wurden innerhalb von 10 bis 18 Tagen 8 , 5 % bis 1 5 % ihres Körpergewichts an Blut entnommen. Die Kaninchen wurden mit einem Mischfutter (Grünfutter, Kartoffeln, Hafer) ernährt, die Wasseraufnahme war unbegrenzt. Das Gewicht der Tiere lag zwischen 2,0 und 5,0 kg. Es wurden H K , Gesamteiweiß, die Lipämie, MDH, GOT und GPT bestimmt. Die Bestimmung der Fermente erfolgte im optischen Test nach W A R B U R G nach folgenden Reaktionsschemata: MDH:

GOT:

CH» I " c=o I COOH

+

COOH I c= O I CH 2 I COOH COOH I o (CH,), I COOH COOH I c=o I CH,

DPNH +

H+

CH 3 CHOH

+

DPN

COOH COOH I CHNH 2

COOH I c=o (CH2)2 I COOH

GPT:

MDH

+

GOT

|

(CH2)2 j COOH

CH2 I AEDH

COOH I CHNH 2 I CH,

+

CH2 1 COOH

+

DPN

COOH |

CHOH

DPNH +

CH 2

H+

COOH GPT

COOH

COOH

CHNH 2 + |

(CH2)2 1 COOH MDH

DPNH

COOH 1 c=o

CHNH 2

COOH +

COOH

+

c=o CH 3

COOH CHOH

+

DPN

CH 3

Die Ansätze waren zusammengesetzt, wie die Tabellen 1—3 zeigen. Der Einsatz von Plasma wurde je nach der Aktivität der Fermente variiert, um in günstigen Meßbereichen zu bleiben. Dabei änderte sich zwar die Substratkonzentration in den Ansätzen, wo die Substrate mit dem Puffer gemischt waren; dies hat jedoch keine Bedeutung, da die Fermente in jedem Falle noch mit Substrat gesättigt waren. Die Messungen erfolgten bei Zimmertemperatur (etwa 25° C) im Photometer E P P E N D O R F bei 366 nm. Die Aktivität wurde aus dem proportionalen Bereich der Extinktions-

590

E , L . GRAUEL,

H.-J,

RADERECHT,

S. M .

RAPOPORT

Tabelle 1 Ansatz f ü r M D H DPNH Pyruvat Plasma T R A P p H 7,5

2 • I0"4m 2,5 • i c r 4 m 0,2 bis 0,6 mi 5 • IO - 2 m zu 2,0 ml

Tabelle 2 Ansatz für GOT DPNH 2 • 10 - 4 m Asparaginsäure 3 • 10" 2 m a-Ketoglutarat 1 • 10_2m AEDH 12 /ig/ml Plasma 0,4 bis 0,6 ml Phosphatpuffer p H 7,4 5 • 10~2 m zu 2,0 ml (Asparaginsäure war im Puffer gelöst)

Tabelle 3 Ansatz für G P T DPN 2 • 10 - 4 m Alanin S-tO^m a-Ketoglutarat 1 • 10~2 m MDH 40 E/ml Plasma 0,4 bis 0,6 ml Phosphatpuffer p H 7,4 5 • 10~2 m zu 2,0 ml (Alanin war im Puffer gelöst). abfallkurve ermittelt.. I m allgemeinen ist der Abfall über 5—10 Minuten proportional, bei sehr hohen Aktivitäten konnten nur die ersten beiden Minuten zur Berechnung Verwendung finden. Die Aktivitäten werden in Bücher-Einheiten pro ml Plasma angegeben. Als Hilfsenzyme wurden A E D H der Fa. Boehringer und MDH, die im Institut nach K O R N B E R G [9] präpariert wurde, benützt. Die MDH war nicht ganz frei von Transaminasen. Die Verunreinigung wurde jeweils bei Herstellung einer Verdünnung von der Ausgangslösung getestet und die Ergebnisse entsprechend korrigiert. D a ß die Bestimmung durch diese Verunreinigung trotzdem an Genauigkeit etwas verliert, scheint aus den absoluten Fehlern (Tab. 4) hervorzugehen: Es zeigt sich, daß bei etwa gleicher Größe der Durchschnittswert für GPT und GOT die absoluten Fehler für G P T doch größer sind. Grundsätzlich wurden zwei unterschiedliche Bestimmungsverfahren benutzt. Anfangs wurden die Doppelbestimmungen völlig gleich pipettiert, bei späteren Versuchen wurde eine proportionale Pipettierung angewandt. Diese zweite Methode h a t den Vorteil, daß evtl. nichtenzymatische oder apparative Fehler mit größerer Sicherheit auffallen; allerdings ist besonders bei hohen Aktivitäten die Proportionalität des Abfalls nicht immer ganz genau, wie es sich auch aus der Berechnung der Fehler ergibt (Tabelle 4).

Plasmafermentspiegel anaemischer Kaninchen

591

Tabelle 4 Absoluter Fehler der Bestimmungen a MDH (1.39) GOT (0,46) GPT (0,40)

b

m 83 27 n 188 57 S 0,173 ± 0,012 0,237 ± 0,03 m 16 28 n 32 58 S 0,0112 ± 0,0018 0,0134 ± 0,0017 m 16 22 n 32 47 S 0,0222 ± 0,004 0,0178 ± 0,0024 m — Anzahl der bestimmten Piasmate n = Anzahl der Einzelbestimmungen S = absoluter Fehler In Klammern angegeben die Normalwerte. Tabelle 5 Ausgangswerte der Fermente in BE/ml MDH

Anzahl der Tiere Streubereich Durchschnitt

10 0,66-2,44 1,39±0,51

GOT 4 0,27—0,66 0,46±0,16

GPT 4 0,1 —0,67 0,4 ± 0 , 2 3

Die Bestimmung der HK erfolgte mit Vollblut in einer zugeschmolzenen Kapillare durch Zentrifugation (30 min bei etwa 3000 Xg). Die Lipämie wurde als Extinktion des Leerwertes gegen Wasser bei 366 nm gemessen. Diese Werte sind nur innerhalb einer Versuchsreihe an einem Tier, nicht aber zwischen verschiedenen Tieren miteinander vergleichbar. Sie geben also nur relative Veränderungen im Verlaufe der Entblutung an. Die Bestimmung des Gesamteiweißes erfolgte nach der Methode von L O W R Y [I0];die Bestimmung mit der Biuretmethode bei lipämischem Plasma ist nicht möglich, weil es nach Zusatz des Kupferreagenz zu zunehmenden Trübungen in der Küvette kommt. Das Blut wurde durch Zusatz von 5 IE/m Heparin ungerinnbar gemacht. Ergebnisse Die für die einzelnen Tiere ermittelten Anfangswerte, die als Normalwerte aufzufassen sind, sind in Tabelle 5 zusammengefaßt. Die W e r t e stimmen, soweit es die T r a n s a m i n a s e n betrifft, mit den von W R O B L E W S K I a m Menschen ermittelten etwa überein. Die W e r t e für die M D H liegen jedoch erheblich niedriger. W R O B L E W S K I gibt für K a n i n c h e n im P l a s m a einen W e r t von 3 8 0 E / m l an, was etwa 10 Büchereinheiten entsprechen würde. W o r a u f diese Unterschiede beruhen, konnte nicht festgestellt werden. E i n e L i p ä m i e t r i t t bei allen entbluteten Tieren auf (Abb. 1, 3—5)- Sie ist bei den einzelnen Tieren aber sehr unterschiedlich s t a r k und t r i t t in sehr unterschiedlichem I n t e r v a l l n a c h der ersten E n t b l u t u n g auf. Sie

592

E . L . GRAUEL, H . - J . RADERECHT,

ml 50

zeigt im allgemeinen nur eine hohe Zacke, die dann auf mäßige Werte wieder abfällt um mehr oder weniger konstant zu bleiben. Meist stellt sie sich erst bei HK-Werten um 20 ein und erreicht ihr erstes Maximum gleichzeitig mit einem HK-Minimum (Abb. 3—5). Ein zweites Minimum im H K ergibt zwar auch wieder eine Zacke in der Lipämie-Kurve, diese erreicht jedoch nie die gleiche Höhe wie die erste, selbst dann, wenn das 2. HK-Minimum unter dem ersten liegt.

Blutentnahme

H l

0 Hk

40-.

Kaninchen 46 Gewicht 3950g

30-

V^

eo

*

10

Up. 0^-700

Lipämie

-x^-

7 4-600

I /

6--500

X

/

E/ml i 3 4-300

^

X

\

0

1

MDH

2

3

100g%EW 7

-

« — /

6 5 E/ml 3

2 -

1

-

00

-J I 1 2

I

3

L

S . M . RAPOPORT

4

5

6

Abb. 2

7

10 11

Tage

1. Die erste Gruppe besteht aus 3 Tieren. Bei unterschiedlicher Entblutung erreichen die Tiere nur in den ersten Tagen oder gar nicht HK-Werte unter 20%. Dabei zeigen sich in der MDH-Aktivität kaum Veränderungen, die Werte schwanken entweder um den Ausgangswert oder aber die Aktivität fällt sogar langsam

Plasmafermentspiegel anaemischer Kaninchen

ab. Als Beispiel für diese Gruppe kann Abb. 1 gelten. 2. In der zweiten Gruppe kann man die Tiere zusammenfassen, die über längere Zeit bei HKWerten unter 20 gehalten werden konnten. Sie umfaßt 4 Tiere. Bei 2 von diesen Tieren — Abb. 2 ist ein Beispiel dafür—stiegen die HK-Werte nach einem Abfall auf 15% und darunter schnell wieder an und blieben dann auf Werten um 20%. Es ergibt sich dann nach spätestens 11 Tagen ein Anstieg der MDH-Aktivität auf etwa das Doppelte des Ausgangswertes. Diese Anstiege sind bei der individuellen Schwankungsbreite der Normwerte, die eine normale zeitabhängige Schwankung bei einem Individiuum durchaus auch möglich erscheinen lassen, nicht unbedingt, aber doch mit einiger Wahrscheinlichkeit auf die Anaemie zu beziehen. 3- Die dritte Gruppe umfaßt 3 Tiere (Abb. 3—5), deren HK-Werte um den 10. Tag Werte um 12% und darunter erreichten, nachdem sie vorher schon einmal ähnlich niedrige Werte gezeigt hatten. Es kommt dabei zu einer deutlichen und mit Sicherheit auf die Anaemie beziehbaren Erhöhung der 41 Acta biol. med. germ., Heft 6

593

ml Blutentnahme 50

jn,o

. Hk Up. 40- -&00*

/ l I /

30 - -2200 20 - -2000

I

I

I

\ Kaninchen 43 \ Gewicht ¿000g > \ \

ty X—H

10 - -1800

I

0 - -1600 g%EW 7 - -1*00 6 - -1200

>

\

K" V

!

T

Lipämie

*

5 - -1000 E/ml 4 - -800 3 2 -

-600*

\ MDH

1 n

X

X.

1

Abb. 4

/

ll0,4

\

*

E . L. GRAUEL,

594 ml

50 -

Blutentnahme

H.-J.

RADERECHT,

10,35

S. M .

RAPOPORT

MDH-Aktivität, die das 5—10-fache des Ausgangswertes erreicht.

Die Betrachtung der Transaminasen ergibt folgendes Bild: Die Tiere von Abb. 2 und 5 zeigen eine gute Parallelität im Verhalten der Transaminasen zum Verhalten der MDH. Die Gipfel fallen immer zusammen mit Minima im H K . Besonders deutlich sind die Veränderungen in Abb. 5, wo sowohl GOT als auch GPT auf das 8-fache des Ausgangswertes ansteigen. Das Verhalten der Transaminasen in Abb. 4 hingegen 70 11 entspricht nicht dem VerTage halten der MDH, wenn auch Abb. 5 ein gewisser Anstieg der Transaminasen, besonders der GPT im Verhältnis zu dem sehr niedrigen Ausgangswert feststellbar ist. Bei dem 4. Tier, bei dem Transaminasen bestimmt wurden, zeigt sich nur in der GPT-Aktivität ein deutlicher Anstieg, wohingegen MDH und GOT keinen sehr deutlichen Anstieg erkennen lassen. Ob dieser Anstieg der GPT auf die Anaemie bezogen werden kann, bleibt daher zweifelhaft.

Diskussion

1. L i p ä m i e STARUP [ 1 1 ] konnte schon 1 9 3 4 nachweisen, daß die Lipämie auf einer verminderten Sauerstoff-Versorgung der Gewebe beruht, während ältere Autoren annahmen [2], [3], daß es sich bei der Lipämie nach Entblutung um eine Kompensation handele, um den herabgesetzten kolloidosmotischen Druck durch den Eiweißverlust zu erhalten, oder daß eine Hemmung der Plasmalipase für die Lipämie verantwortlich zu machen sei. Das Einsetzen der Lipaemie erfolgte auch bei STARUP bei ungefähr dem gleichen Grad der Entblutung. Er berichtet jedoch nicht über das Nichteintreten einer weiteren hohen Zacke nach vorhergehendem Abfall der Lipämie. Diese Erscheinung könnte in unseren Versuchen durch eine Veränderung der Zusammensetzung der Plasmaeiweiße oder durch

Plasmafermentspiegel anaemischer Kaninchen

595

Veränderungen der Lipase-Aktivität hervorgerufen sein. Allerdings ergaben orientierende elektrophoretische Untersuchungen, daß der Lipoidgehalt sich doch entsprechend der Trübungsmessung verhält. Die Lipämie entsteht nach H O R I U C H I [12] sowohl durch verringerte Aufnahme von Lipoiden aus dem Plasma als auch durch eine vermehrte Abgabe von Lipoiden ans Plasma. Mit unserem Befund, daß es bei einer weiteren Senkung des Haematokrits nach längerer Entblutung zu keiner weiteren proportionalen Erhöhung der Lipämie kommt, würde die Ansicht von S A R A I [ 1 3 ] übereinstimmen, daß ein großer Teil der Lipoide durch die Umwandlung des Fettmarks in rotes, blutbildendes Mark frei wird. Man könnte dann das Ausbleiben einer weiteren Erhöhung damit erklären, daß nach längerer Entblutung der größte Teil des Fettmarks bereits in rotes umgewandelt ist. 2. F e r m e n t v e r ä n d e r u n g e n Bei der Diskussion der Veränderungen im Plasmaspiegel der Fermente steht vor allen Dingen die Frage nach deren Herkunft im Vordergrund, da das Herkunftsorgan sicherlich gleichzeitig das Organ ist, das die Hauptschädigungen erlitten hat. Um die Herkunft der Fermente zu ermitteln, hat man in letzter Zeit besonders Vergleiche zwischen Verhältnissen, in denen die Fermente in einzelnen Organen zueinander stehen und denen im Plasma, angestellt. Es ist bekannt, daß die MDH in einer großen Anzahl von Organen in hoher Aktivität vorkommt, vor allem in Herz- und Skelettmuskel, Leber und Erythrocyten. GOT befindet sich vorwiegend in Leber, Herzund Skelettmuskel, GPT nur wenig in der Muskulatur, viel mehr in der Leber. In Erythrocyten ist die Transaminaseaktivität nur gering. Man hat daher aus dem Verhältnis der GOT zur GPT eine gewisse Organdiagnose zu stellen versucht. Eine Erhöhung der GPT-Aktivität im Plasma müßte danach vor allem bei Leberschädigungen, eine Erhöhung der GOT bei Muskelschädigungen auftreten. Dies trifft zwar für die Differentialdiagnose zwischen Herzinfarkt und akuter Hepatitis zu, jedoch zeigte L I N D E [14], daß zwar bei akuter Hepatitis die GPT im Plasma weit über das in der Leber vorliegende Verhältnis erhöht war, daß aber bei Intoxikationen die in der Leber vorliegenden Verhältnisse sich auch im Plasma bei gleichzeitiger Erhöhung beider Fermente einstellen. Wendet man diese Ergebnisse auf unsere Untersuchungen an, so wird man schließen müssen, daß die im Plasma vermehrt auftretenden Fermente aus der Leber stammen. In den drei abgebildeten Beispielen (Abb. 3—-5) verhalten sich GOT und GPT gleichsinnig, während in einem weiteren Versuch nur die GPT einen deutlichen Anstieg zeigte. Man kann auch die Frage nach dem Mechanismus der Freisetzung aufwerfen. Sicherlich ist die Freisetzung eine Folge der Hypoxie des Gewebes. Dafür spricht das Verhalten der 3 Gruppen bei der Betrachtung 41*

596

E . L . GRAUEL, H . - J . RADERECHT,

S . M . RAPOPORT

der MDH. Die Kaninchen, die nur einer mäßigen, nicht allzulangen Entblutung ausgesetzt wurden, zeigten so gut wie keine Veränderungen im MDH-Spiegel. Jene Gruppe mit stärker gesunkenem HK zeigt geringe, jedoch schon deutliche Anstiege der Aktivitäten, und erst die Gruppe mit extrem niedrigen HK-Werten zeigt auch große Erhöhungen der MDH-Aktivität. Man muß also annehmen, daß eine länger dauernde starke Anaemie sich derart an den Zellen auswirkt, daß entweder a) ein vermehrtes Absterben von Zellen einsetzt oder b) eine Änderung der Permeabilität eintritt oder aber c) auf den Reiz der Anoxie vermehrt Fermente gebildet und aus der Zelle ausgestoßen werden. Da wir annehmen, daß der Schaden vor allen Dingen in der Leber zu suchen ist, uns aber Zellnekrosen bei Anaemie dort nicht bekannt sind, halten wir Zellnekrosen als Ursache der erhöhten Fermentspiegel im Plasma für unwahrscheinlich. Gegen die Nekrosen sprechen auch Berechnungen, die H E S S [15] angestellt hat. Nimmt man nämlich einen kontinuierlichen Abbau der Plasmafermente an, der im Versuch nachgewiesen werden konnte und ziemlich rasch abläuft, so reicht der Fermentgehalt experimentell gesetzter Nekrosen niemals aus, um den Fermentspiegel über Tage erhöht zu erhalten. Es muß also zusätzlich zu den gesetzten Nekrosen eine ständige Freisetzung von Fermenten aus benachbarten, gereizten Geweben eintreten. Eine Veränderung in der Durchlässigkeit der Zellen für die einzelnen Fermente, also ein rein passiver Vorgang des Fermentaustritts erscheint uns ebenfalls nicht wahrscheinlich. Da es sich bei den drei Fermenten um Eiweiße mit Molekülgrößen etwa gleicher Größenordnung handelt, müßte man annehmen, daß bei Änderung der Durchlässigkeit alle drei Fermente jeweils etwa im gleichen Verhältnis erhöht sind. Das trifft aber nur für das Beispiel in Abb. 5 zu, während in Abb. 4 nur die MDH, bei einem anderen Tier nur die GPT erhöht waren. Wir neigen daher zu der Ansicht, daß es sich um eine aktive Neuproduktion der Fermente und deren Ausstoßung handelt. Literatur [1] RADERECHT, H . - J . : H a b i l i t a t i o n s s c h r i f t 1959. [2] BOGGS, T. O. U. R . S. M O R R I S : J . exp. Med. 11, 5 5 3 (1909), zit. n. S t a r u p (11). [3] MORAWITZ, P . U. J . P R A T T : Münchn. Med. Wschr. 5 5 , 1 8 1 7 ( 1 9 0 8 ) , zit. n. Star u p (11). [4] W A R B U R G , O . U. W . C H R I S T I A N : Biochem. Z . 3 1 4 , 3 0 9 ( 1 9 4 3 ) . . [5] L A D U E , J . S., W R O B L E W S K I , F. u. A. K A R M E N : Science 1 2 0 , 497 (1954). [ 6 ] W R O B L E W S K I , F . u. J . S. L A D U E : Proc. Soc. exp. Biol. Med. 9 0 , 2 1 0 ( 1 9 5 5 ) . [7] W R O B L E W S K I , F . u. J. S. L A D U E : Proc. Soc. exp. Biol. Med. 9 1 , 5 6 9 ( 1 9 5 6 ) . [8] B R U N S , F . H . : Clin. Chim. Acta 2 , 257 (1957).

Plasmafermentspiegel anaemischer Kaninchen [9]

597

in C O L O W I C K and C A P L A N . Methods of Enzymology, New York 1955, Vol. I, 441. [ 1 0 ] L O W R Y , O . H . U. Mitarb.: J . biol. Chemistry 193, 2 6 5 ( 1 9 5 1 ) . [ 1 1 ] S T A R U P , U . : Biochem. Z . 270, 7 4 ( 1 9 3 4 ) . [12] S A K A I , S.: Biochem. Z. 62, 387 (1914), zit. n. Starup (11). [ 1 3 ] H O R I U C H I , Y . : J . biol. Chemistry 44, 3 6 3 ( 1 9 2 0 ) . [14] L I N D E , S.: Scand. J . Clin. Invest. 10, 303 (1958). [15] H E S S , B. in „Struktur und Stoffwechsel des Herzmuskels", Stuttgart 1959KORNBERG, A.

Summary In 10 rabbits the enzyme levels of plasma was studied in the course of a withdrawal of blood causing anemia. Besides, lipemia and plasma protein levels were studied. In the bleeding period only with extremely low hematocrit readings the plasma levels of the enzymes MDH, GOT and GPT increase considerably. The total plasma protein level remains constant for a long period even when the animal is heavily bled. In the bleeding period lipemia with great individual variations is always registered. I t may be safely assumed that the plasma enzymes are formed by the liver. The investigations described do not allow certain conclusions on the mechanism of enzyme release from cells. Pe3H>Me H a B

1 0 - T H K p O J I H K a x np0H3B0J],HJIHCb HCCJieHOBaHHH O C O n e p w a H H H

rraa3Me

B

Tenemie

AHEMHH

BCJiejjCTBHH

OßECKPOBJIHBAHHH.

HccjienoBajiHCb nnneMMH H ypoBeHb npoTeHHOB B

$epMeHT0B

KpoMe Toro

njia3Me.

BTeqeHHH oßecKpoBjiHBaHHH CHJibHbie noBbimeHHH B ypoBHe $epMeHTOBMDH, GOT H GPT B njia3Me OTiuenaiOTCH J I H I U B ripn KpaftHe H H 3 K H X BejinmiHax reMOTOKpHTa.

Bceoßmee conep?KaHHe SejiKOB B nna3Me oeraeTCH 0TH0CHTejibH0 nocTOHHHHM na»Ke npH CHjibHOM oßecKpoBjieBaHHH. B TeneHHH oSecKpoBJieBäHHH Bcerj;a noHBUHCTCH jiHneMHH, noKa3biBaiomaH 6ojibmne HHflHBHnyajibHbie paajiHiHH. epMeHTbi, N O H B J I H I O M H E C H B njia3Me, c ßojibinoii BepoHTHOCTbK) HMCIOT neneHOHHOe npOHCXOWHeHHe. flOCTOBepHbie BbICKa3bIBaHHH 0 MexaHH3Me BblCTynJieHHH $epMeHTOB H3 KJieTKH Ha OCHOBaHHH HaHHblX HCCJieHOBaHHÄ HeB03MOJKHbl.

Acta biol. med. germ., Band 4, Seite 598—605 (i960) Aus dem Institut für Veterinär-Physiologie der Humboldt-Universität Berlin

Der Natrium-, Kalium- und Glukosegehalt in Serum und Erythrozyten von Vögeln und Fischen H.-A.

KETZ

und

G.

ASSMANN

unter techn. Mitarbeit von H.

WITT

(Eingegangen am 10. 2. i960) Zusammenfassung Werte für Glukose, Natrium und Kalium im Gesamtblut, Serum und in den Erythrozyten von Huhn, Gans, Ente und von verschiedenen Süßwasserfischen werden mitgeteilt. Die intracelluläre Kaliumakkumulation der kernhaltigen Erythrozyten ist stärker als bei den kernlosen Erythrozyten der meisten Säugetiere. Die intracelluläre Glukosekonzentration liegt im Vogelblut im Mittel höher, im Fischblut durchschnittlich auf gleicher Höhe wie im Blut der meisten Säugetiere. Die Glukosekonzentration im Gesamtblut und Serum liegt im Durchschnitt bei den Vögeln doppelt so hoch wie bei den untersuchten Fischen. Unter physiologischen Bedingungen weisen die untersuchten Vögel und Fische eine gleich hohe und konstante Natrium- und Kalium-Serumkonzentration auf wie die Säugetiere. Der Natriumgehalt in den kernhaltigen Erythrozyten liegt z. T. wesentlich niedriger als der der kernlosen Erythrozyten. Die Erhöhung der Wassertemperatur bei Fischen h a t einen fördernden Einfluß auf die Kaliumakkumulation der Erythrozyten. Einleitung

Vergleichende Untersuchungen über die intra- und extracelluläre Ionenverteilung des Blutes sind für die Analyse aktiver Ionentransportvorgänge von besonderem Wert. Unter Berücksichtigung tierartlicher Besonderheiten geben solche Untersuchungen Hinweise über das Problem der „Na-Pumpe", der Permeabilitätsfaktoren und den Mechanismus der K-Akkumulation. Letztere ist als ein aktiver Vorgang anzusehen, als dessen Hauptenergielieferant die Glukose angenommen wird [1], [2]. Bisherige Angaben über den Elektrolyt- und Glukosegehalt des Blutes, besonders der Erythrozyten, bei den Säugetieren enthalten sehr unterschiedliche Werte [3]. Untersuchungen über den Natrium-, Kalium- und Glukosegehalt in Serum und Erythrozyten von Pferd, Rind, Schaf, Ziege, Schwein, Hund, Huhn und Taube zeigten, daß die kernhaltigen Erythrozyten von Huhn und Taube Kalium am stärksten zu akkumulieren vermögen [3]. Hieraus ergab sich die Fragestellung, ob dieser im

Na-, K - und Glukosegehalt in Erythrozyten

599

Vergleich zu kernlosen Erythrozyten erhöhte Kaliumgehalt mit dem Kernstoffwechsel in Verbindung zu bringen ist. Dafür schienen uns weitere Untersuchungen an Erythrozyten von Hühnern, Gänsen, Enten und Fischen zweckmäßig. Die Einbeziehung von Fischblut in solche Versuche sollte gleichzeitig vergleichende Daten zur Frage der Temperaturabhängigkeit der Ionenaustauschvorgänge in Beziehung zum Glukosegehalt des Blutes in vivo liefern. Material und Methodik Die Untersuchungen wurden an nicht legenden New Hamshire- und Leghornhennen, an Gänsen und Enten nach 12stündigem Nahrungsentzug durchgeführt. Die Blutentnahme erfolgte aus der V. cutanea ulnaris in Abständen von mindestens 7 Tagen. Bei Fischen erfolgten die Bestimmungen an Tinea vulgaris (Schlei), Anguilla vulgaris (Aal), Esox lucius (Hecht), Perca fluvialis (Flußbarsch), Carassius vulgaris (Karausche), Leuciscus rutilus (Plötze), Blicca bjorkna (Güster) und Abramis brama (Blei). Sämtliche untersuchten Fische stammten aus den Gewässern der Berliner Umgebung, der Havel und dem Müggelsee. Vor dem Entbluten wurden die Fische für mindestens 72 Stunden in einem gut mit Sauerstoff versorgten Aquarium (100 X 5 0 X 4 0 cm) gehalten, um eine durch den Transport bedingte Asphyxie zu beseitigen. Die Blutentnahme erfolgte im allgemeinen nach leichter Betäubung durch Keulenschlag mittels Entblutung aus der A. und V. caudalis. Bei Anguilla vulgaris wurde das Blut nach Transversalschnitt am caudalen Ende der Brustflosse direkt aus dem Herzen entnommen. Die durch Entbluten aus der A. und V. caudalis gewonnene Blutmenge betrug im Mittel 0,80 ml pro 100 g Körpergewicht, die durch Entbluten aus dem Herzen gewonnene Menge 0,96 ml pro 100 g Körpergewicht. Bei kleineren Fischen wurden Sammelblutproben von mehreren Tieren für eine Bestimmung verwendet. Sämtliche Proben wurden innerhalb 3 Stunden bei Zimmertemperatur untersucht. Die Erythrozyten wurden durch Zentrifugieren (3000 U/min, 30 min) defibrinierten Blutes (Schüttelblut) gewonnen. Das hämolysierte Serum des Schüttelblutes und eine 2 mm starke noch vermehrt Serum enthaltende Schicht von Erythrozyten wurde mit einer Wasserstrahlpumpe abgesaugt [4]. Die Konzentrationsangaben für alle intracellulären Werte wurden mit dem Korrekturfaktor, 0,96 multipliziert [5], Diese ursprünglich für den Hämatokritwert geforderte Korrektur muß bei hohen Serumkonzentrationen nach einfachem Abzentrifugieren der Erythrozyten auch für die intracelluläre Konzentration, z. B. der Glukose oder des Natriums, berücksichtigt werden. Die Bestimmung des Hämatokritwertes erfolgte in Wintroberöhrchen nach Zusatz geringer Heparin-Natriummengen durch Zentrifugieren bei 3000 U/min für 30 min. Die Glukosebestimmungen in Gesamtblut, Serum und Erythrozyten wurden nach F R A N K und K I R B E R G E R [6] durchgeführt. Die Natrium- und Kaliumbestimmung erfolgte flammenphotometrisch, in Erythrozyten nach osmotischer Hämolyse mit Aqua bidest. Von den direkt in Gesamtblut, Serum und Erythrozyten bestimmten Werten wurden die intracellulären Elektrolyt- und Glukosewerte mit Hilfe der Berechnung aus Gesamtblutkonzentration und Hämatokritwert überprüft. Alle Versuchsreihen wurden statistisch ausgewertet [7]. In orientierenden Versuchen an kleinerem Tiermaterial prüften wir den Einfluß der Umgebungstemperatur auf den Elektrolyt- und Glukosegehalt von Gesamtblut, Serum und Erythrozyten bei Abramis brama (Blei). Für den Kälteversuch wurden die zu untersuchenden Bleie zunächst zur Beseitigung der Transportasphyxie für 72 Stunden in ein gut belüftetes Aquarium mit einer Temperatur von 13° C gebracht. Danach erfolgte die Umsetzung der Tiere in ein Aquarium, das in einem

H.-A. K e t z , G. Assmann

600

Kühlraum mit einer mittleren Temperatur von + 3 ° C aufgestellt war. Bei guter Belüftung wurde die Wassertemperatur durch laufend vermindertes Zugießen von Leitungswasser innerhalb 48 Stunden von 13° Cauf + 2 ° C gesenkt. Nach Aufrechterhaltung dieser niedrigen Temperatur für eine Dauer von 120 Stunden wurden die Fische in der oben beschriebenen Weise entblutet. Für den Wärmeversuch wurden die Bleie nach oben beschriebener Vorbehandlung in ein Aquarium mit einer Wassertemperatur von 18° C mit doppelter Belüftungsapparatur umgesetzt, um den bei erhöhter Temperatur gesteigerten Sauerstoffverbrauch decken zu können [8], [9]. Mit Hilfe einer Aquariumsheizung wurde die Wassertemperatur innerhalb 72 Stunden von 18° C auf 27° C gesteigert. Danach wurden die Tiere nach oben angegebenen Methoden entblutet. Ergebnisse '

I. Vögel Die Natrium-, Kalium- und Glukosewerte von Gans, Ente und Huhn sind in den Tabellen 1—3 zusammengefaßt. Tabelle 1 Natriumkonzentration in Gesamtblut, Serum und Erythrozyten bei Gans, Ente und Huhn (Mittelwert ± Standardfehler) Tierart

Gänse

Enten

Hühner

Anzahl der Tiere

Anzahl der Untersuchungen

6

41

6

22

6

18

Gesamtblut mÄquiv/1

Serum mÄquiv/1

Erythrozyten mÄquiv/1

76,2

140,5

10,8

2,0

6,0

0,6

77,8

138,3

8,4

2,2

2,3

0,5

84,3

143,6

10,7

3,9

2,4

1,7

±

±

±

±

±

±

±

±

±

Tabelle 2 Kaliumkonzentration in Gesamtblut, Serum und Erythrozyten bei Gans, E n t e und Huhn (Mittelwert ± Standardfehler) Tierart

Gänse

Anzahl der Tiere

Anzahl der Untersuchungen

6

44

Gesamtblut mÄquiv/1 48,8

±

0,88 Enten

Hühner

6

6

21

14

Serum mÄquiv/1

Erythrozyten mÄquiv/1

3,8

99,6

±

0,12

52,3

2,8

1,7

0,12

±

±

±

2,6

101,6

±

4,8

41,7

4,9

88,8

4,6

0,29

7,3

±

±

±

601

Na-, K - und Glukosegehalt in Erythrozyten

Tabelle 3 Glucosekonzentration in Gesamtblut, Serum und Erythrozyten bei Gans, Ente und Huhn (Mittelwert ± Standardfehler) Tierart

Gänse

Enten

Hühner

Anzahl Anzahl der Gesamtblut der Untermg-% Tiere suchungen

6

52

30

6

6

Serum mg-%

155,3

±

238,6

3,7

3,3

119,9

±

4,7

Erythrozyten mg-%

Hämatokrit

±

43,4

3,9

0,3

205,7

±

13,6

44,3

3,9

±

0,4

0,2

164,9

209,9

65,4

30,2

3,1

6,2

1,4

0,3

±

25

49,9

±

±

±

±

±

±

Die Versuchsergebnisse bestätigen frühere Befunde an Hühnern und Tauben, daß die kernhaltigen Erythrozyten im Vergleich zu kernlosen einen höheren Kaliumgehalt aufweisen [3]. Obwohl der Glukosegehalt des Serums z. T. mehr als doppelt so hoch ist wie bei den Haussäugetieren, liegt der Glukosegehalt in den Erythrozyten bei den untersuchten Vögeln nicht höher als bei den früher untersuchten Säugetiererythrozyten [3]. Auffallend ist der relativ niedrige Natriumgehalt der Vogelerythrozyten. II. F i s c h e Die Natrium-, Kalium- und Glukosewerte von Fischen sind in den Tabellen 4—6 zusammengefaßt. Tabelle 4 Natriumkonzentration in Gesamtblut, Serum und Erythrozyten von Fischen (Mittelwert ± Standardfehler) Tierart

Anzahl der Tiere

Tinea vulgaris

22

Anguilla vulgaris

21

Esox lucius

3

Carassius vulgaris

28

Abramis brama

88

Anzahl der Gesamtblut UntermÄquiv/1 suchungen

17

12

3

7

23

Serum mÄquiv/1

Erythrozyten mÄquiv/1

83,7

125,6

16,3

0,7

1,8

1,6

87,9

137,3

12,7

1,7

1,9

0,5

90,0

147,7

1,0

±

1,1

22,7 4-

82,1

127,0

1,8 15,9

5,7

1,1

4,7

85,5

138,1

13,9

1,7

2,9

1,8

± ±

± ±

±

± ±

±

±

± ±

± ±

602

H . - A . KETZ, G . ASSMANN

Tabelle 5 Kaliumkonzentration in Gesamtblut, Serum und Erythrozyten (Mittelwert ± Standardfehler) Anzahl der Tiere

Tierart

Anzahl der Gesamtblut UntermÄquiv/1 suchungen

Tinea vulgaris

22

18

Anguilla vulgaris

21

14

Esox lucius Abramis brama

Erythrozyten mÄquiv/1

30,5 ± 0,9

2,5 ± 0,2

85,9 ± 2,4

30,3

66,3 ±

1,0

4,1 ± 0,3 2,9 ± 0,2

43,0 ± 0,5

2,1 ± 3,0

73,8 ± 3,0

3

3

25,7 ± 0,2

88

20

35,3 ± 1,1

Anzahl Anzahl der Gesamtblut der Untermg-% Tiere suchungen

Tinea vulgaris

22

Anguilla vulgaris

21

Carassius vulgaris

28

Abramis brama

88

18

21

12

44

Fischen

Serum mÄquiv/1

2,9

Tabelle 6 Glukosekonzentration in Gesamtblut, Serum und Erythrozyten (Mittelwert ± Standardfehler) Tierart

bei

bei

Fischen

Serum mg-%

Erythrozyten mg-%

Hämatokrit mg-% '

114,0

163,5

35,0

37,0

4,0

1,0

2,9

1,0

93,0 ±

143,8

20,8

41,1

1,4

2,8

0,6

0,9

104,8

133,8

43,5

32,0

1,8

5,3

0,6

0,3

102,3

35,9

38,6

1,7

1,2

1,1

±

±

77,2

±

1,3

±

±

±

±

±

±

± ±

±

± ±

±

Die Glukosekonzentration im Gesamtblut liegt bei den untersuchten Vögeln im Durchschnitt fast doppelt so hoch wie bei den untersuchten Fischen. Dabei ist der weitaus größte Teil der bestimmten Glukose im Serum konzentriert. Die Erythrozyten enthalten bei den Vögeln etwa 20% und bei den Fischen etwa 25% der nach F R A N K und K I R B E R G E R bestimmten Glukose im Vergleich zu den entsprechenden Serum werten. Während der extracelluläre Kaliumgehalt bei den untersuchten Vögeln und Fischen annähernd auf gleicher Höhe liegt, weisen die Vogelerythrozyten im Durchschnitt eine um etwa 30% höhere Kaliumkonzentration

Na-, K- und Glukosegehalt in Erythrozyten

603

auf als die Erythrozyten der Fische. Dabei liegt der Kaliumgehalt im Serum beider untersuchter Tierstämme im Mittel bei 3—5% des in den kernhaltigen Erythrozyten nachweisbaren Kaliums. Umgekehrt ist der weitaus größte Teil des Natriums im Serum konzentriert, wobei in der Natrium-Serumkonzentration zwischen Vögeln und Fischen kein statistisch sicherer Unterschied besteht. Der absolute Natriumgehalt in den Erythrozyten liegt im Durchschnitt bei den Fischen doppelt so hoch wie bei den untersuchten Vögeln. Im Mittel macht der intracelluläre Natriumgehalt bei den untersuchten Vögeln 5% und bei den untersuchten Fischen 14% der extracellulären Natriumkonzentration aus. III. T e m p e r a t u r v e r s u c h e Der Befund, daß der intra- und extracelluläre Kalium- und Glucosegehalt im Blut der untersuchten Vögel höher liegt als im Blut der Fische, legt die Frage näher, ob die Körpertemperatur dabei eine Rolle spielt. An den hierzu nach bereits beschriebener Methode durchgeführten Temperaturversuchen an insgesamt 20 Fischen (Abramis brama) lassen sich folgende Ergebnisse zusammenfassen: Bei einer Erhöhung der Wassertemperatur auf 27° C wurde bei Erhöhung des Hämatokritwertes eine vermehrte intracelluläre Kaliumkonzentration gemessen, während der intracelluläre Glukosewert im Vergleich zu den gefundenen Normalwerten keinen sicheren Unterschied aufwies. Nach Erniedrigung der Wassertemperatur wurde bei gleichzeitiger Senkung des Hämatokritwertes eine Verminderung des intracellulären Glukosegehaltes ohne sichere Veränderung des Kaliumgehaltes in den Erythrozyten beobachtet. Die intra- wie extracellulären Natriumwerte weisen unter angegebenen Temperaturbedingungen im Vergleich zu den Normalwerten keine charakteristischen Unterschiede auf. Die angeführten Veränderungen im Elektrolyt- und Glukosegehalt des Blutes von Fischen sind als orientierende Befunde zu bewerten und bedürfen einer Nachprüfung an umfangreicherem Tiermaterial. Diskussion

Im Vergleich zu früheren Untersuchungen an kernlosen Erythrozyten verschiedener Säugetiere liegen die mitgeteilten Kalium- und Glukosewerte der kernhaltigen Erythrozyten von Vögeln höher [3]. Kein sicherer Unterschied besteht diesbezüglich zwischen den Erythrozyten der Säugetiere und Fische. Besonders auffallend ist der niedrige Natriumgehalt der kernhaltigen Erythrozyten im Vergleich zu den Erythrozyten der bisher untersuchten Säugetiere [3]. Der Einwand, daß besonders die Glukosewerte von Aquariumfischen nicht den normalen Werten von im freien Wasser gehaltenen Tieren entsprechen, kann auf Grund der Untersuchungen von K I E R M E I E R [10]

604

H.-A. KETZ,

G.

ASSMANN

und AMLACHER [ 1 1 ] vernachlässigt werden. Danach besteht kein Unterschied in den Blutzuckerwerten zwischen Aquariumstieren und frei gehaltenen Fischen. Voraussetzung ist allerdings eine einwandfreie Belüftung des Aquariums. Die von uns verwendeten Fische wurden während der 72stündigen Anpassung an das Aquariumsmilieu nicht gefüttert, da nach Untersuchungen von LASSLEBEN [ 1 2 ] und MENTEN [ 1 3 ] mit einer Verdauungshyperglykämie zu rechnen ist. Dagegen soll der Blutzuckerspiegel bei Fischen während des Hungers für lange Zeit unverändert bleiben [ 1 0 ] — [ 1 2 ] . Methodisch von Bedeutung ist der Hinweis, daß die Entblutung der Fische so schnell wie möglich erfolgen muß, da eine länger dauernde Asphyxie zu einer reflektorischen Hyperglykämie führt [11], [12], [14] — [ 1 9 ] .

Der von uns erhobene Befund, daß die Erhöhung der Wassertemperatur ohne eine sichere Veränderung des Blutzuckerspiegels bei Fischen einhergeht, stimmt mit Untersuchungen von KIERMEIER [ 1 0 ] überein. Voraussetzung ist allerdings eine besonders gute Durchlüftung des Aquariums, da mit erhöhter Wassertemperatur ein vermehrter Sauerstoffverbrauch verbunden ist. Ein Absinken des Blutzuckerspiegels nach Herabsetzung der Temperatur, wie es sich bei unseren Versuchen an Fischen ergab, stimmt mit analogen Untersuchungen an Vögeln überein [20] — [22]. Zur Frage der Ionenaustauschvorgänge zwischen Erythrozyten und Blutflüssigkeit in Abhängigkeit von der Umgebungstemperatur geben vorliegende Ergebnisse den Hinweis, daß die intracelluläre Kaliumakkumulation im Fischblut mit zunehmender Wassertemperatur eine Steigerung erfährt. Literatur Physiol. (Brit.) 1 1 2 , 5 9 , ( 1 9 5 1 ) . H . M.: Annual Rev. Physiol. Stanford, Univ. 1 5 , 1, (1953). V O G E L , G . U . H . - A . K E T Z : Zschr. vgl. Physiol. 3 8 , 5 5 8 ( 1 9 5 6 ) . L E E S O N , D . U . E . B. R E E V E : J . Physiol. (Brit.) 1 1 5 , 1 2 9 ( 1 9 5 1 ) . S I S S O N , G., C A I N , A. U. W . S . R O O T : Amer. J . Physiol. 1 8 0 , 485 (1955). F R A N K , H . U. E . K I R B E R G E R : Biochem. Z. 3 2 0 , 358 (1950). W E B E R , E . : Grundriß der biologischen Statistik J e n a 1956: V E B Gustav Fischer. F R E Y , E. E. J . U . J . S. H A R T : Biol. Bull. Mar. Biol. Labor. Woods Hole 9 4 ,

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GUTMANN,

Anschrift d. Verfasser: Dr. med. vet. habil. H.-A. K E T Z , Institut für Ernährung der Deutschen Akademie d. Wissenschaften, Potsdam-Rehbrücke, Arthur-ScheunertAllee 155; Dr. med. vet. G. A S S M A N N , Rathenow, Genthiner Straße 49. Summary

Values of glucose, sodium and potassium in total blood, serum and erythrocytes of hen, goose, duck and of various fresh fishes are given. There is more intracellular accumulation of potassium in erythrocytes containing nuclei than in erythrocytes free from nuclei of most mammalians. The intracellular concentration of glucose in bird's blood is higher in the mean, in the blood of fihes it equals in the average that in blood of most mammalians. The glucose concentration in total blood and serum of birds is in the average twice as high as in the fishes studied. In physiological conditions the birds and fishes studied have the same and constant serum concentrations of sodium and potassium like mammalians. The sodium concentration of erythrocytes containing nuclei is partly essentially lower than that of erythrocytes free from nuclei. An increase of water temperature enhances the accumulation of potassium in erythrocytes of fishes. PeäiOMe ABTOP

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K P O B H , CBIBOpOTKe H A P H T P O U H T A X K y p H I J b l , r y C H , y T K H H p a 3 J I H 4 H b I X

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B

A c t a biol. med. germ.. B a n d 5, Seite 606—616 (i960) Aus d e m I n s t i t u t f ü r Medizin u n d Biologie der Deutschen A k a d e m i e der Wissenschaften, Berlin-Buch, Arbeitsbereich Pharmakologie (Direktor: Prof. Dr. F. J U N G ) u n d d e m Pharmakologischen I n s t i t u t der Ernst-Moritz-Arndt-Universität, Greifswald (Direktor: Prof. Dr. W . S C H E L E R )

Über die Wasserbindung des Fe3+ in den Komplexen verschiedener Methämoglobine W .

SCHELER

(Eingegangen a m 1. 3. i960)

Zusammenfassung 1. E s w u r d e die L i c h t a b s o r p t i o n von t r o c k e n e n Hb(3)-Derivaten in K B r - P r e ß lingen gemessen u n d m i t den Spektren der wassergelösten Verbindungen verglichen. 2. Auf Grund des Absorptionsvergleiches werden Rückschlüsse auf die Wasserbesetzung des Fe 3 + in den Hb(3)-Derivaten gezogen. 3. Die Lichtabsorption der Hb(3)-Komplexe verschiedener Spezies w u r d e verglichen u n d Rückschlüsse auf die Wechselwirkung zwischen P r o t e i n u n d d e m Fe 3 + der prosthetischen G r u p p e gezogen. Die W a s s e r b i n d u n g a m Fe 3 + der prosthetischen Gruppen n i m m t in der Reihenfolge a b : Pferde-Mb(3) > Chironomus-Hb(3) > Pferde-Hb(3) > Tubifex-Hb(3). 4. Die B e d e u t u n g dieser B e f u n d e u n d Rückschlüsse wird d i s k u t i e r t .

In vorausgehenden Untersuchungen haben wir Aquo-Strukturen des Hämins und der Ferrihämoproteide für deren charakteristische Lichtabsorption („Methämoglobintyp" bzw. „Aquohämintyp") verantwortlich machen können [1], So sind beispielsweise im Methämoglobin (Hb (3)) etwa 4 Wassermoleküle am Fe3+ der prosthetischen Gruppen gebunden. Auch wiesen wir darauf hin, daß z. B. Hämin bei der Bindung von Stickstoffbasen sein Wasser abgibt und sich um das Fe eine oktaedrische Struktur des Ligandenfeldes ausbildet. — Nun existieren aber bei den Ferrihämoproteiden zahlreiche Komplexe mit Anionen und anderen Molekülen, bei denen die Bindung Fe3+-Ligand partiell ionischer und partiell kovalenter Natur ist. Es bestehen auf Grund unserer früheren spektralphotometrischen und magnetischen Messungen fließende Übergänge zwischen weitgehend kovalenten (CN~, Imidazol) und praktisch rein ionischen Komplexen (F~, H 2 0) [2]. Es erhob sich dabei die Frage, wie sich bei der Anlagerung eines Komplexliganden an das Fe3+ des Hb (3) dessen Wasserbindung ändert. Hierzu

Wasserbindung des Fe 3 + in Methämoglobinkomplexen

607

wurden spektrographische Untersuchungen an trockenen Hb(3)-Verbindungen durchgeführt. Darüber hinaus wurde der Proteineinfluß auf die komplex-bildenden Eigenschaften des Fe 3+ anhand vergleichender spektraler Analysen verschiedener Spezies-Hämoglobine studiert. Methodik Methämoglobine: Folgende Hb(3)-Arten wurden verwendet: Pferde-Metmyoglobin, Chironomus plumosus-Methämoglobin, Pferde-Methämoglobin und das Methämoglobin von Tubifex tubifex. Über die Präparationstechnik finden sich in- unseren früheren Publikationen Angaben. Anhydro-Methämoglobin: F ü r die Untersuchungen der Lichtabsorption trockener Hb(3)-Verbindungen verwendeten wir ausschließlich Pferde-Hb(3). Die Lyophilisation der Hb(3)-Verbindungen geschah folgendermaßen: Pferde-Hb(3)-Lösungen wurden mit den Salzen der komplexbildenden Anionen versetzt und zwar in Konzentrationen, bei denen auf Grund der Gleichgewichtskonstanten eine Umwandlung in den Komplex gewährleistet war. Die dabei auftretenden typischen Farbänderungen konnten mit dem bloßen Auge wahrgenommen werden. Bei geringer Farbänderung (OCN~, H C O O - u. a.) kontrollierten wir handspektroskopisch die Umwandlung. Die einzelnen Lösungen m i t den verschiedenen Hb(3)-Komplexen wurden in mit Schliffen versehenen röhrenartige Gefäße eingefüllt, an deren Wandung mittels flüssiger L u f t bzw. Methanol-CO a -Gemisch angefroren u n d in einer Hochvakuumanlage evakuiert. Sobald die Trocknung vollständig war, bröckelte das Pulver von der Wandung ab bzw. konnte durch vorsichtiges Klopfen gelöst werden. In diesem Stadium erfolgte die Nachtrocknung der trockenen P r ä p a r a t e mittels Warmluftföns ( ~ 4 0 ° C ) . Bei derartigem Vorgehen erreicht man ein E n d v a k u u m von 5 • lCr 6 Torr. Die Glasröhren mit dem ProteidPulver hielten wir unter Luftabschluß. Messung der Lichtabsorption: Wir verwendeten das Spektralphotometer der Fa. V E B Carl Zeiss, Jena. Die Anhydro-Hb(3)-Derivate untersuchten wir in F o r m von KBr-Preßlingen. Hierzu bereiteten wir das K B r entsprechend dem Vorgehen von v. D I E T R I C H [ 3 ] durch Schmelzen und plötzliches Abschrecken vor. Die pulverförmigen trockenen Hb(3)-Derivate wurden mit dem pulverisierten K B r innig vermischt und gepreßt. Die im Eigenbau hergestellte Preßvorrichtung (Feinmechanikermeister S C H L I C H T I N G ) konnte vor und während des Pressens evakuiert werden. Bei diesem Vorgehen erhielten wir völlig klare Preßlinge, die mit einer kleinen Haltevorrichtung in die Küvettenhalterung des Zeiss-Spektralphotometers eingesetzt werden konnten. Zum Vergleich diente eine analog hergestellte, nur aus der gleichen Menge K B r bestehende „Tablette". Die Preßlinge kamen frisch zur Verwendung, bei Aufbewahrung t r ü b e n sie nach.

Ergebnisse und Besprechung der Befunde I.

V e r g l e i c h der L i c h t a b s o r p t i o n g e t r o c k n e t e r u n d g e l ö s t e r Hb(3)-Verbindungen In einer früheren Mitteilung zeigten wir, daß in Glycerin gelöstes AnhydroMethämoglobin [ = A-Hb(3)] die Anionen der Salze KF, KOCN, NaN 3 , KCN usw. binden kann. Dabei treten die für wäßrige Lösungen bekannten spektralen Veränderungen auf [4]. Um aber jeglichen Lösungsmittel-

608

W. SCHELER

einfluß auf die spektralen Eigenschaften der trockenen A-Hb(3)-Derivate auszuschließen, wurden die Spektren der getrockneten, in KBr gepreßten Substanzen aufgenommen. Zu unserer Überraschung war die Lichtabsorption der meisten Stoffe weitgehend ähnlich, sie zeigten nämlich den für Parahämatine charakteristischen Absorptionsverlauf. In Abb. 1 sind eine Reihe von A-Hb(3)Derivaten in ihren Absorptionsspektren und zum Vergleich die entsprechenden Spektren in wäßriger Lösung angeführt. Die Anhydro-Derivate besitzen — mit Ausnahme der Imidazol- und der Cyanidverbindung — eine schwache Absorption im Roten und eine Doppelbande im Grünen, wobei das längerwellige Maximum nur als leichte Anhebung in der Absorptionskurve erscheint. Die Lage der einzelnen Maxima schwankt zwischen folgenden Werten: ~620—630 m[i (schwache Absorption) •—-562—565 m/i (leichte Schulter angedeutet) 530—534 m// (Maximum klar ausgeprägt) 409—413 ntyi (hohe deutliche Soretbande). Die Extinktion der Maxima nimmt zur Soretbande hin ständig zu. Das Cyanid- und Imidazolderivat besitzen im trockenen und im gelösten Zustand annähernd gleiche Spektren, sie zeigen auch keine Restabsorption im roten Spektralgebiet mehr. Die Uniformität der meisten Spektren der A-Hb (3)-Derivate und die erheblichen Veränderungen bei Lösung weisen nachdrücklich auf die Rolle des Wassers für die Bildung und die Lichtabsorption der Hb (3)Verbindungen hin. Offenbar ist die Lichtabsorption der Hb(3)-Komplexe wesentlich mit auf die Wasserbindung durch das Fe 3+ der prosthetischen Gruppen zurückzuführen. Um das Ausmaß dieser Wasserbindung in den Hb(3)-Komplexen grob quantitativ bestimmen zu können, gingen wir folgendermaßen vor: Saures Methämoglobin (bezeichnet als Hb(3)-H 2 0) besitzt die in Abb. 1 angegebene Lichtabsorption mit Maxima bei 631, (~576), (~540) und 500 mix. Die Soretbande findet sich bei 404,5 m^. Dieser Spektraltyp (,,Aquohämin"-Typ) stellt gewissermaßen das eine Extrem einer Übergangsreihe dar, deren anderes Extrem der „Parahämatin"-Typ bildet. Vertreter sind hierfür der Imidazol- und Cyanidkomplex; die Doppelbande im Grünen besitzt ihr höchstes Maximum zwischen 535 und 540 m/x. Während nun die letzten Verbindungen ihre spektralen Eigenschaften auch bei Wasserentzug behalten, ändert sich die Lichtabsorption der vorher angeführten Derivate weitgehend, ihr Spektrum wird im trockenen Zustand dem Imidazol-Hb(3)-Spektrum ähnlich. Wir haben infolgedessen für jede Verbindung den Quotienten E 500 m/xjE 540 m// ermittelt, der ein Maß für die Wasserbesetzung des Fe 3+ im Komplex darstellen sollte.

Wasserbindung des Fe 3 + in Methämoglobinkomplexen

609

Abb. 1. Lichtabsorption einiger Komplexe des Pferdemethämoglobins in wäßriger Lösung (rechts) bzw. in trockenem Zustand (links). Die Trockenspektren wurden in KBr-Preßlingen aufgenommen. Ordinate: Extinktion (in relativen Einheiten) Abszisse: Wellenlänge in mfi. 42

A c t a biol. med. germ., Heft 6

610

W . SCHELER

Entsprechende Quotienten wurden für die trockenen Verbindungen ermittelt und mit denen der gelösten Derivate verglichen (Tabelle 1). Tabelle 1

Derivat

H2O FHCOOOCNSCNSeCNNO 2 N3Im

CN-

PKHA

—1.74 3,13 3,69 3,92 3,92 3,30 4,73 7,00 9,20

AE -£•500 niß -^500 mfi m H b (3)E540 P •£•540 M/I A - H b ( 3 ) A-Hb(3) Hb(3) 1.52 1,44 1,44 1,15 1,04 0,87 0,83 0,62 0,62 0,62

0.88 0,98 1,00 0,89 0,91

0.64 0,46 0,44 0,26 0,13

0,87 0,67 0,72

—0,25 —0,05 —0,10

F e 20° 6

10' Hb(3)

X

13600 14180 12630 12440 10870 6400 7220 2380 3540 2680

Fe 20°

10" 6 A-Hb(3) X

Hb(3) — A-Hb(3)

4800 7800 5500 7200

8800 6380 7130 5240

3900 4500 2300 1900

3320 —2120 1240 780

Nach den Angaben der Tabelle 1 ist ersichtlich, daß, angefangen vom Hb(3)-H 2 0, bis zum Azid-, Cyanid- und Imidazolderivat ein stetiger Rückgang der Aquotisierung der Hb (3)-Komplexe erfolgt. Wir hatten in den vorausgehenden Untersuchungen [1] gezeigt, daß Methämoglobin (und sicherlich auch Metmyoglobin und verwandte Ferrihämoproteide) als Aquo-Komplexe des Fe3+ der prosthetischen Gruppe aufzufassen sind, und daß z. B. im Hb(3) ~ 4 Wassermoleküle gebunden sind, wobei Wasserstoffbindungen zwischen den Lösungsmittelmolekülen und den Pyrroleninstickstoffen des Porphyringerüstes wesentlich mit für die Bindung verantwortlich sind. Aus den Werten der Tabelle 1 muß geschlossen werden, daß bei der Ligandenbindung an das Fe3+ ein Teil oder alle Wassermoleküle abdissoziieren, daß also die Wasserbindung am Fe 3+ unterschiedlich stark reduziert werden kann. Das Ausmaß dieser Reduktion der H 2 0-Bindung wird bestimmt durch die Elektronegativität der Liganden und ihre Polarisierbarkeit (vgl. [5]). Je weitgehender die Elektronenakzeptoreigenscnaften des Fe 3+ der Ferrihämoproteide durch die Liganden in Anspruch genommen werden, um so weniger können H 2 0-Moleküle festgehalten werden. Es wurden deshalb in Tabelle 1 die pKHA-W7erte der betr. Säuren angegeben. Sie sind ein Maß für die Elektronegativität, das protochemische Potential (WIBERG [6]), der Anionen. Daß die H 2 0-Bindung in den Hb(3)-Komplexen, die mit für deren Lichtabsorption verantwortlich ist, unmittelbar an der prosthetischen Gruppe erfolgt (und nicht z. B. an ionisierten Proteingruppierungen), geht auch aus den magnetischen Daten hervor. So liegen die Werte für die magnetische Suszeptibilität der trockenen Hb (3)-Derivate erheblich niedriger als im gelösten Zustand [2], [7]. Die von uns früher mitgeteilten Suszeptibilitäten sind in Tabelle 1 mit angeführt. Zwischen den Werten der

Wasserbindung des Fe 3 + in Methämoglobinkomplexen

6l 1

Spalten 5 und 8 in Tabelle 1 besteht eine strenge Korrelation, ein Zeichen dafür, daß die spektralen und magnetischen Veränderungen bei der Wasserabdissoziation eng gekoppelt sind. Die Ursachen für die relativ niederen Werte der N3-Verbindung sind uns noch unklar. Die niederen magnetischen Suszeptibilitäten der trockenen AnhydroHb (3)-Derivate waren von uns mit einer starken magnetischen Anisotropie des Moleküls gedeutet worden, die beim frei gelösten Molekül zu einer Ausrichtung im Magnetfeld führt, während im pulverförmigen getrockneten Zustand eine solche Orientierung nicht möglich ist [7]. Auf Grund der vorliegenden spektralen Daten müssen wir jedoch annehmen, daß die Ursache der niederen magnetischen Suszeptibilitäten der A-Hb(3)Verbindungen in der Abdissoziation des komplex gebundenen Wassers und in der unmittelbaren Einbeziehung des Proteins in das Ligandenfeld des Fe 3+ zu suchen ist. Die magnetische Anisotropie des Moleküls dürfte nur zu einem gewissen Teil für das abweichende Verhalten der Suszeptibilität im getrockneten Zustand verantwortlich sein [12]. Mit der Abdissoziation von H 2 0 muß sich auch die Symmetrie des Ligandenfeldes um das Fe 3+ ändern, das schließlich bei den H 2 0-freien Hb(3)Komplexen wie Hb(3)-CN bzw. Hb (3)-Im oktaedrische Konfiguration annehmen sollte. Es ist, teilweise aus unseren früheren Untersuchungen, bekannt, daß auch die thermische Stabilität [8], die Löslichkeit (RUCKPAUL [9]), katalytische Fähigkeiten (unveröffentlicht) usw. des Hb (3) sich bei der Ligandenbindung ändern, daß also enge Wechselbeziehungen zwischen Fe « Porphyrin, Fe « Protein und Porphyrin ~ Protein bestehen. Wir geben deshalb nachstehend schematisch diese Veränderungen an: Liganden

Elektronegativität Bindungsneigung Hemmeffekte

(H 2 0)/ F 7 HCOO"/ OCN"'/ SCN"/ N;/ HS"/ CN"

Hb(3)Komplexe

42»

Kom plexstabilität Kovalenz der Bindung Fe Magnet. Suszeptibilität H 2 0-Bindung der prosth. Gr. Rotverschiebung Soretbande Porphyrin Extinktion im Grünen Thermische Stabilität Protein Löslichkeit Gesamtmol. Katalat. u. peroxyd. Aktiv. —J

612

W . SCHELER

In diesem Schema soll durch die Angaben Fe bzw. Porphyrin bzw. Protein darauf hingewiesen werden, daß es sich bei den angeführten Eigenschaften und Veränderungen um solche am Fe, am Porphyrin, am Protein handelt. Die erhöhte thermische Stabilität der Hb(3)-Komplexe gegenüber dem freien Hb (3) dürfte auf die unmittelbare Einbeziehung einer Proteingruppe in das Ligandenfeld des Fe3+ zurückzuführen sein. Ii-

V e r g l e i c h der s p e k t r a l e n E i g e n s c h a f t e n der K o m p l e x e v e r schiedener Methämoglobinarten Durch unsere Untersuchungen der spektralen Eigenschaften von Hämoglobinen verschiedener Spezies überblicken wir eine Serie von MethämoMb (3)-NO-,

t

/T

— 1

1

.

1

Abb. 2. Lichtabsorption der Nitrit-Verbindungen des Pferde-Mb(3), des ChironomusHb(3), des Pferde-Hb(3) und desTubifex-Hb(3). Phosphatpuffer pH = 6,7; l/75mol; [NaN0 2 ] = 2 • lCr1 mol. Diese Konzentration reicht auf Grund der Gleichgewichtskonstanten zur praktisch völligen Umwandlung des Hb(3) in die Nitritkomplexe aus. t = 20 °C. Ordinate: Extinktion (in willkürlichen Einheiten) Abszisse: Wellenlänge in mß.

globinverbindungen, die sich lediglich infolge ihres artverschiedenen Proteins voneinander unterscheiden. Die Proteinkomponente kann sich einmal durch die Struktur der Polypeptidketten und der Einlagerung der prosthetischen Gruppe — als sterische Faktoren — und durch ihre Aminosäuren'sequenz — und damit durch die Ladungsverteilung in Nähe der

Wasserbindung des Fe 3 + in Methämoglobinkomplexen

613

prosthetischen Gruppe — auf Gleichgewichte, Lichtabsorption, magnetische Eigenschaften des Fe usw. auswirken. In Abb. 2 wurde anhand der NC^-Verbindung verschiedener Hb-Arten gezeigt, wie erheblich die spektralen Eigenschaften gleicher Ligandenverbindungen sich zwischen Metmyoglobin einerseits und dem Tubifexmethämoglobin andererseits verändern können. Hierbei spiegelt sich der Einfluß der Proteinkomponente auf die Eigenschaften der prosthetischen Gruppe eindrucksvoll wider. Andere Komplexpartner bewirken bei den verschiedenen Hb-Arten ähnliche Unterschiede. Wir prüften nun die Frage, wie sich die Wasserbesetzung des Fe 3+ in den Komplexen dieser verschiedenen Hb-Arten verhält. Hierzu ermittelten wir gleichfalls die Quotienten £500/£540, um ein Maß dafür zu haben, wie stark die Verschiebung vom „Aquohämin"-Typ des Spektrums zum ,,Parahämatin"-Typ ist. Diese Quotienten sind für 4 verschiedene HbArten in Tabelle 2 und Abb. 3 niedergelegt:

Abb. 3. Veränderung der spektralen Eigenschaften (ausgedrückt durch den Quotienten Esoomil/EHolim) und der Wasserbindung in einigen Hb(3)Komplexenbei verschiedenen Spezies. Mb = Pferdemetmyoglobin, Ch = Chironomus-Methämoglobin, Hb=PferdeMethämoglobin, Tu = Tubifex-Methämoglobin

\

Mol. Gew.nsoo

31*00

67000 3000000

Es ergibt sich hieraus, daß beim sauren Metmyoglobin [Mb (3)] und seinen Derivaten die Wasserbesetzung des Fe 3+ deutlich stärker ist als bei den anderen Hb-Arten. Das bedeutet also, daß beim Mb(3) die Elektronenakzeptoreigenschaften des Fe 3+ durch die Proteinumgebung wesentlich schwächer betätigt werden als bei den übrigen Hämoglobinen. Die primär vorhandene energetische Wechselwirkung zwischen Protein und dem komplexbildenden Zentrum der prosthetischen Gruppe, dem Fe3+, nimmt in folgender Reihenfolge zu: Pferde-Mb(3) < Chironomus-Hb(3) < Pferde-Hb(3) < Tubifex-Hb(3).

614

W.

SCHELER

Tabelle 2 Derivat

Mb

CH

Hb

Tu

Mittel

H2O HCOOCH3.COOF-* OCNSCNNO2SeCNOHN3Im CN-

1,76 1,73 1,67 1,57 1,57 1,14 1,14 1,02 0,93 0,69 0,68 0,67

1,54 1,50 1,57 1,47 1,24 1,08 1,04 0,89 0,91 0,71 0,62 0,65

1,52 1,44 1,47 1,44 1,15 1,04 0,83 0,87 0,68 0,62 0,62 0,62

1,43 1,27 1,32 1,42 1,11 •0,99 0,76 0,81 0,66 0,76 0,68 0,67

1,56 1,48 1,51 1,38 1,27 1,06 0,94 0,90 0,79 0,70 0,65 0,65

Mittel

1,21

1,10

1,03

0,99

* Wegen der Blauverschiebung der Banden wurde hierbei EiS-JE-i0 gebildet.

Diese Reihenfolge ist für die Molekulargewichte dieser Hb-Arten die gleiche. Sicherlich besteht aber keine notwendige Korrelation zum Molekulargewicht, wie wir aus einem orientierenden Vergleich der Werte für Pferde-Hb(3) und Ratten-Hb(3) erkennen mußten. Beim sauren RattenHb(3) ist die Wasserbesetzung des Fe 3+ deutlich geringer als beim PferdeHb(3). Die Ursachen dürften vor allem in einer unterschiedlichen Aminosäurensequenz zu suchen sein und sich mit deren Aufklärung gleichfalls aufklären lassen. Abschließend sei auf Beobachtungen hingewiesen, die jedoch noch einer genaueren Analyse bedürfen. Es handelt sich um die Oxydationsneigung der Oxyhämoglobine verschiedener Spezies. Bekanntlich geht Myoglobin bei der Präparationsmethode, wie sie von THEORELL [ 1 0 ] angegeben wurde, spontan in Mb (3) über. Für Chironomus-Hb0 2 beobachteten wir selbst eine gleichfalls relativ schnelle Autoxydation. Wesentlich langsamer verläuft die Autoxydation hingegen schon beim Pferde-Hb0 2 und noch langsamer beim Tubifex-Hb0 2 . Bei letzterem kommt es sogar nach Zusatz äquimolarer Mengen K3Fe(CN)G zu einer spontanen Reduktion des gebildeten Hb (3). Erwähnt werden müssen in diesem Zusammenhang auch noch die sehr schnelle Autoxydation des freien Häms, bei dem ja überhaupt keine Proteinumgebung vorhanden ist, und die fehlende Spontanoxydation des Cytochrom c, bei dem durch die unmittelbare Komplexbildung mit 2 Imidazolen des Proteins das Fe2+ in engster Wechselwirkung mit der Proteinkomponente steht [11]. So besteht auch eine systematische Veränderung des Redoxpotentials dieser Ferrihämoproteide vom freien Häm einerseits bis zum Cytochrom c andererseits. Die entsprechenden Daten sind in der folgenden kleinen Tabelle enthalten:

Wasserbindung des Fe 3 + in Methämoglobinkomplexen

615

.Redoxpotential verschiedener Eisenporphyrinsysteme bei p H 7,0 Häm/ Hämin —0,115*

Myoglobin/ Metmyoglobin ' + 0,046

Hämoglobin/ Methämoglobin

Ferrocyt. c/ Ferricyt. c

+ 0,144

' +0,262

* extrapoliert auf p H 7,0

Wie zu erwarten, nimmt die Autoxydierbarkeit zu, je negativer das Redoxpotential des betreffenden Systems ist. Für die Hämoglobine der von uns untersuchten anderen Tierspezies fehlen bisher noch vergleichbare Werte. Im letzten Schema sind die Beziehungen der verschiedenen Eigenschaften der Hämoglobine zur Protein-Fe-Wechselwirkung veranschaulicht. Protein-Fe-Wechselwirkung Häm

Mb /Ch / H b / T u

Cyt.c

H 2 0-Bindung der prosth. Gr. Autoxydierbarkeit Redoxpotential Aus den Untersuchungen bzw. Vergleichen ergibt sich, daß die bei Ligandenbindung eintretenden Veränderungen der Lichtabsorption (als Porphyrineigenschaft) ebenso wie die Veränderung der paramagnetischen Suszeptibilität (als Kriterium der Elektronenstruktur des Fe3+) k e i n e für den betreffenden Liganden s p e z i f i s c h e n Veränderungen darstellen, sondern lediglich ein Maß für die Betätigung der Elektronenakzeptoreigenschaften des Fe 3+ und für die Veränderungen der Symmetrie des Ligandenfeldes, das unmittelbar vom Protein her wesentlich mitbestimmt ist. So kommt es, daß sich z. B. die Lichtabsorption des Chironomus-Hb (3)-Nitrits und die des Metmyoglobin-Selenocyanats sehr stark gleichen, obwohl sowohl Liganden wie Protein in den beiden Derivaten völlig unterschiedlich sind. Literatur [1] [2]

W . : Biochem. Z. im Druck und Acta biol. med. germ. im Druck. W., G . S C H O F F A U . F . J U N G : Naturwissenschaften 4 3 , 159 (1956); Biochem. Z. 329, 232 (1957). [ 3 ] v. D I E T R I C H , H . : Z. f. Naturforschung IIb, 1 7 5 ( 1 9 5 6 ) . [ 4 ] S C H E L E R , W . , G . S C H O F F A U . F . J U N G : Acta biol. med. germ. 1, 3 2 ( 1 9 5 8 ) . [ 5 ] S C H E L E R , W . : Z. physikal. Chemie 2 1 0 , 6 1 (1959). [ 6 ] W I B E R G , E . : Die chemische Affinität, Berlin, 1 9 5 1 . [7] S C H O F F A , G . , W . S C H E I . E R , O . R I S T A U U . F . J U N G : Acta biol. med. germ. 3 , 65 (1959). SCHELER,

SCHELER,

616

W.

[8]

SCHELER,

[9]

RUCKPAUL,

ScHELER

W., I . F I S C H B A C H u. F . J U N G : Biochem. Z. 3 2 6 , 358 K . : Acta biol. med. germ. 4 , 104 (i960). [ 1 0 ] T H E O R E L L , H . : Biochem. Z . 2 5 2 , 1 ( 1 9 3 2 ) . [ 1 1 ] T H E O R E L L , H . : Science 1 2 4 , 4 6 7 ( 1 9 5 6 ) Nobelvortrag. [12] G R I F F I T H , J . S . : Briefliche Mitteilung a n G . S C H O F F A . Frl. I N G E B O R G F I S C H B A C H und Frau lässige technische Mitarbeit.

K Ä T H E BUTTGEREIT

(1955)-

d a n k e ich f ü r ihre zuver-

Summary 1. T h e light absorbtion of anhydrous Hb(3)-derivatives in KBr-tablets was measured and compared with t h e spectra of compounds dissolved in water. 2. The w a t e r contents of F e 3 + in t h e Hb(3)-derivatives was concluded f r o m t h e comparison of absorbtion. 3. T h e light absorbtion of Hb(3)-complexes of various species were compared a n d t h e interaction between protein and F e 3 + of t h e prosthetic group was concluded f r o m this comparison. The water combining power of t h e prosthetic Fe 3 + decreases in t h e following order: Horse-Mb(3) >Chironomus-Hb(3) > H o r s e - H b ( 3 ) > T u b i f e x Hb(3). 4. The significance of these observations and conclusions is discussed.

Pe3MMe 1. H3MepHJiacb a6cop6i;HH CBeTa cyxHMH npoH3BonHbiMH MeTreMorjioGiraa B Ö P O M H C T O M KajIHH B IipeCCOBaHHOM BHHC H CpiaBHHBajiaCfa CO CneKTpaMH 3 T H X coeaHiieHHH, pa.3BenëHHbix B Bojie. 2. H a ocHOBaHHH cpaBHHBaHHH aßcopßiiHH «ejiajiHCb B M R O H W n o OTHomeHHio +++ K CHA6?KEHHK) F e B O H O Ü B npoH3BonHbix M E T R E M O R N O ß H H A . 3 . A6cop6ijHH CBeTa K O M I U I E K C O B MeireMorjioßHHa pa3JiHHHbix B H H O B cpaBHHBajiaCb H «ejiajIHCb BblBORbl OTHOCHTejIbHO B3aHM0«eftCTBHH MeJKny n p o TeHHOM H F e + + + rrpocTeTHiecKoü r p y n n b i . CBH3biBaHiie B O H M Ha F e + + + n p o TECTH^ecKHx r p y n n najjaeT B cjienyiomeM nopHHKe: MeireMorjioÔHH JIOmaneft-Mb(3) > MeTreMorjioÔHH XHp0H0Myca-Hb(3) > MeTreMorjioÔHH Jiomaneft-Hb(3) > MeTreMorjioÔHH Ty6H$eKca-Hb(3). 4 . OôcyjKHaeTCH 3HaneHHe 3THX naHHbix H BHBOHOB.

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, , . . . das vorliegende Werk zeigt eine Sorgfalt und Gründlichkeit in der klinischen Beobachtung und Beschreibung, wie sie im neueren psychiatrischen Schrifttum leider nur selten angetroffen wird."

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CONTENTS Pages and E . S C H R O D E R : The effect of dehydroascorbinic acid on the survival time of mice exposed to x-rays 529—534

R . HUBER, W . BRUCKER

and R . H U B E R : The influence of bartonella anemia on the irradiation effect in rats 535—538

F . SCHMIDT

: The influence of additional treatment on the formation of metastases in mice produced by intravenous injection of ascites tumor cells. II. . 539—549

W . KRISCHKE

: Immunologic investigations on the effect of nucleoproteides from subcellular fractions of E H R L I C H carcinoma of mice 550—564

G . PASTERNACK

and R . S C H R O E D E R : Investigations on the effect of various amidopyrin solutions upon cultures of fibroblasts 565—576

K . H . CHEMNITIUS

Critical examination of frequencies of rhythmic flash-lights used for heterochromous photometry 577—587

F . SCHWARZ:

E. L. G R A U E L , H . - J . R A D E R E C H T and S . M. R A P O P O R T : Changes of plasma enzyme levels in extremely anemic rabbits (LDH, GOT, GPT) 588—597 and G . A S S M A N N with the technical collaboration of H . W I T T : The concentration of sodium, potassium and glucose in sera and erythrocytes of birds and fishes 598—605

H.-A. KETZ

: On the watercombining power of the Fe3+ in complexes of various methemoglobine 606—616

W . SCHELER

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529—534 535—538 539—549 550—5Û4

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598—605

B.UIejiep: O cBH3bmanHH bosm Fe'+ B KoiunneKcax paajiiiMntix MeTreiuorjioOnnoB . .

606—616

T.-A.

INHALT Seite W . B R U C K E R U. E . S C H R Ö D E R : Zur Wirkung von Dehydroascorbinsäure auf die Überlebenszeit röntgenbestrahlter Mäuse 529—534

R . HUBER,

F.

S C H M I D T U. R . H U B E R :

Der Einfluß der Bartonellenanämie auf die Strahlen-

wirkung bei R a t t e n

535—538

W . KRISCHKE: Beeinflussung der Metastasenbildung nach intravenöser Injektion von Tumorasciteszellen bei der Maus durch zusätzliche Behandlung. I I . 539—549 G.

Immunologische Untersuchungen mit Nukleoproteiden aus subzellulären Fraktionen des EHRLicH-Carcinoms der Maus 550—564

PASTERNACK:

u. R . S C H R O E D E R : \Jntersuchungen mit verschiedenen Amidopyrin-Lösungen an Fibroblastenkulturen 565—576

K . H . CHEMNITIUS

F. E.

Die Beurteilung von Frequenzen rhythmischer Lichtblitze im Dienste der heterochromen Photometrie 577—587

SCHWARZ:

S. M. R A P O P O R T : Über Veränderungen des Plasmafermentspiegels stark anaemischer Kaninchen (LDH, GOT, GPT) . 588—597

L . G R A U E L , H . - J . R A D E R E C H X U.

u. G. A S S M A N N unter techn. Mitarbeit von H . W I T T : Der Natrium-, Kalium- u n d Glukosegehalt in Serum und E r y t h r o z y t e n von Vögeln und Fischen 598—605

H.-A. KETZ

W.

: Über die Wasserbindung des Fe 3 + in den Komplexen verschiedener Methämoglobine 606—616

SCHELER

Herausgeber und verantwortlich für den I n h a l t : Prof. Dr. H a n s Gummel, Prof. Dr. Arnold Graffi, Prof. Dr. Fritz Jung, Prof. Dr. Alfons Krautwald, Prof. Dr. SamuelMitja Rapoport. Schriftleitung: Prof. Dr. med. habil.Werner Scheler und Dr. H . Bielka, Berlin-Buch, Lindenberger Weg 70, F e r n r u f : 5698 51. App. 222. Verlag: Akademie-Verlag G m b H , Berlin W l , Leipziger Straße 3—4, (Fernruf: 220441.) Postscheckkonto Berlin 35021. Bestellnummer dieses H e f t e s 1053 IV/6. Die Zeitschrift erscheint monatlich. Bezugspreis: Einzelheft DM 9,50. Doppelheft: 19,—. Veröffentlicht u n t e r der Lizenz-Nr. ZLN 5022 des Ministeriums f ü r Kultur, H a u p t v e r w a l t u n g Verlagswesen. Gesamtherstellung: V E B Druckerei „ T h o m a s M ü n t z e r " Bad Langensalza. — Alle Rechte vorbehalten, insbesondere die der Übersetzung. Kein Teil dieser Zeitschrift darf in irgendeiner F o r m — durch Photokopie, Mikrofilm oder irgendein anderes Verfahren — ohne schriftliche Genehmigung des Verlages reproduziert werden. — P r i n t e d in Germany.