Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie: Band 23, Heft 7 [Reprint 2021 ed.] 9783112565582, 9783112565575

Citation preview

ZEITSCHRIFT ALLGEMEINE MIKRO -BIOLOGIE AN INTERNATIONAL JOURNAL ON MORPHOLOGY, PHYSIOLOGY, GENETICS, AND ECOLOGY OF MICROORGANISMS BAND 23 • 1983

HEFT 7

AKADEMIE-VERLAG ISSN 0044-2208

Z. Allg. Mikrobiol., Berlin 23 (1983) 7, 4 0 9 - 4 7 2

BERLIN EVP 2 0 , - M

Z E I T S C H R I F T FÜR A L L G E M E I N E M I K R O B I O L O G I E VOLUME 23

1983

NUMBEK 7

CONTENTS Streptomyc.es roflainycoin

tnaghwi,

a new species producing

M . AFZAL, N . D . NIMEE a n d M . N A ZI AB

411

General control of amino acid biosynthesis in mutants of Candida spec. EH 15/D

R . BODE AND P . CASPEE

419

Cyanide-resistant respiration in Streptomyces citreofluoresceus Inhibition of photosystein II of nitrogen-fixing bluegreen alga Nostoc linckia by the rice-field herbicide benthiocarb Effect of temperature on chlorophyll stability of some subaerial blue-green algae

F . HÄNEL, U . GEÄFE, S. M . TRUTKO AND V . K . AKIMENKO 429

S. N . TRIPATIII

443

A comparison of manganese oxidation by growing and resting cells of a freshwater bacterial isolate, strain FMn 1

M . A . ZAFKIN AND H . L . EHELICH

447

A novel Mn a+ -oxidizing enzyme system in a freshwater bacterium

J . ZINDULIS AND H . L . EHELICH

457

A.MADEIRA-LOPES UDEN

467

R . K . SINGH, B . D . SINCIH AND H . N . SINGII 435

Short N o t e Effects of cycloheximide on the temperature profile of Saccharomyces cerevisiae Book R e v i e w s

AND IS". VAX

428, 434, 442, 456, 466, 4 7 0 - 4 7 2

ZEITSCHRIFT FÜR ALLGEMEINE MIKROBIOLOGIE AN I N T E R N A T I O N A L JOURNAL ON MORPHOLOGY, PHYSIOLOGY, GENETICS, AND ECOLOGY OF MICROORGANISMS

H E R A U S G E G E B E N VON

G. F. Gause, Moskau 0 . Hoffmann-Ostenhof, Wien A. A. Imseneckii, Moskau R. W. Kaplan, Frankfurt/M. F. Mach, Greifswald 1. Mälek, Prag C. Weibull, Lund

unter der Chefredaktion von W. Schwartz, Braunschweig und U. Taubeneck, Jena

U N T E R M I T A R B E I T VON

J . H. Becking, Wageningen H. Böhme, Gatersleben M. Girbardt, Jena S. I. Kusnecov, Moskau O. Necas, Brno C. H. Oppenheimer, Port Aransas N. Pfennig, Göttingen I. L. Rabotnova, Moskau A. Schwartz, Wolfenbüttel

BAND 23 .1983 • HEFT 7

REDAKTION

U. May, Jena

AKADEMIE-VERLAG BERLIN

Die Zeitschrift f ü r Allgemeine Mikrobiologie soll dazu beitragen, Forschung und internationale Zusammenarbeit auf dem Gebiet der Mikrobiologie zu fördern. E s werden Manuskripte aus allen Gebieten der allgemeinen Mikrobiologie veröffentlicht. Arbeiten über Themen aus der medizinischen, landwirtschaftlichen, technischen Mikrobiologie und aus der Taxonomie der Mikroorganismen werden ebenfalls aufgenommen, wenn sie Fragen von allgemeinem Interesse behandeln. Zur Veröffentlichung werden angenommen: Originalmanuskripte, die in anderen Zeitschriften noch nicht veröffentlicht worden sind und in gleicher Form auch nicht in anderen Zeitschriften erscheinen werden. Der Umfang soll höchstens l 1 / 2 Druckbogen (24 Druckseiten) betragen. Bei umfangreicheren Manuskripten müssen besondere Vereinbarungen mit der Schriftleitung und dem Verlag getroffen werden. Kurze Originalmitteilungen über wesentliche, neue Forschungsergebnisse. Umfang im allgemeinen höchstens 3 Druckseiten. Kurze Originalmitteilungen werden beschleunigt veröffentlicht. Kritische Sammelberichte und Buchbesprechungen nach Vereinbarung mit der Schriftleitung.

Bezugsmöglichkeiten der Zeitschrift f ü r Allgemeine Mikrobiologie: Bestellungen sind zu richten — in der DDR an den Postzeitungsvertrieb, an eine Buchhandlung oder an den AkademieVerlag, DDR-1086 Berlin, Leipziger Straße 3 - 4 ; — im sozialistischen Ausland an eine Buchhandlung f ü r fremdsprachige Literatur oder an den zuständigen Postzeitungsvertrieb; — in der BRD und Berlin (West) an eine Buchhandlung oder an die Auslieferungsstelle K U N S T U N D W I S S E N , Erich Bieber OHG, Wilhelmstraße 4 - 6 D-7000 S t u t t g a r t 1; — in den übrigen westeuropäischen Ländern an eine Buchhandlung oder an die Auslieferungsstelle K U N S T U N D W I S S E N , Erich Bieber GmbH, Dufourstraße 51, CH-8008 Zürich Schweiz; — im übrigen Ausland an den Internationalen Buch- und Zeitschriftenhandel; den Buchexport, Volkseigener Außenhandelsbetrieb der Deutschen Demokratischen Republik, DDR-7010 Leipzig, Postfach 160, oder an den Akademie-Verlag, DDR-1086 Berlin, Leipziger Straße 3—4.

Zeitschrift f ü r Allgemeine Mikrobiologie Herausgeber: I m Auftrag des Verlages von einem internationalen Wissenschaftlerkollektiv herausgegeben. Verlag: Akademie-Verlag, DDR-1086 Berlin, Leipziger Straße 3—4; F e r n r u f : 2236229 oder 2236121; Telex-Nr.: 114420; B a n k : Staatsbank der D D R , Berlin, Kto.-Nr.: 6836-26-20712. Chefredaktion: Prof. Dr. U D O T A T J B E N E C K Prof. Dr. W I L H E L M S C H W A B T Z . Anschrift der Redaktion: Zentralinstitut f ü r Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften, DDR-6900 J e n a , Beutenbergstr. 11; F e r n r u f : J e n a 852200; TelexN r . : 058 621 Veröffentlicht unter der Lizenznummer 1306 des Presseamtes beim Vorsitzenden des Ministerrates der Deutschen Demokratischen Republik. Gesamtherstellung: V E B Druckerei „Thomas Müntzer", DDR-5820 Bad Langensalza. Erscheinungsweise: Die Zeitschrift f ü r Allgemeine Mikrobiologie erscheint jährlich in einem B a n d mit 10 Heften. Bezugspreis je B a n d 250,— M zuzüglich Versandspesen (Preis f ü r die D D R 200,— M), Preis je H e f t 2 5 , - M (Preis f ü r die D D R 2 0 , - M). Urheberrecht: Alle Rechte vorbehalten, insbesondere die der Übersetzung. Kein Teil dieser Zeitschrift darf in irgendeiner Form — durch Photokopie, Mikrofilm oder irgendein anderes Verfahren — ohne schriftliche Genehmigung des Verlages reproduziert werden. — All rights reserved (including those of translations into foreign languages). No p a r t of this issue may be reproduced in any form, b y photoprint, microfilms or any other means, without written permission f r o m t h e publishers. Erscheinungstermin: September 1983 Bestellnummer dieses Heftes: 1070/23/7 © 1983 b y Akademie-Verlag Berlin. Printed in the German Democratic Republic. AN (EDV) 75218

Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie

28

1983

7

411

-418

(Department of Biochemistry, Faculty of Science, Kuwait University, Kuwait)

Streptomyces

maghwi, a new species producing roflamycoin

M. AFZAL, N . D . NIMER a n d M . NAZAR

(Eingegangen am 28.

9.1982)

A new Streptomyces species is described for which the name S. maghwi is proposed. The organism is characterized by a pink mass of aerial mycelium, spiral spore chains, spores with smooth surfaces and a nonchromogenic vegetative mycelium. S. maghwi produces roflamycoin (SCHLEGEL et al. 1981) formerly known as flavomycoin (SCHLEGEL et al. 1971). The type strain oi S. maghwi is deposited with CBS, Netherland.

During the course of our screening program for new antibiotics from sandy desert Streptomyces, a new species of streptomycete, strain K U B - 4 4 . 7 8 was isolated from Maghwa oil fields which was found to produce roflamycoin (flavomycoin). The name Streptomyces maghwi is proposed for the organism. This paper deals with the taxonomic studies of the organism. Description of production, isolation and identification of the antibiotic are presented. Materials and methods The holotype strain of Streptomyces maghwi is maintained as lyophilized preparation under the accession number KUB-44.78 at the Department of Biochemistry, University of Kuwait. The strain belongs to the genus Streptomyces W A K S M A N and H E N B I C I because the cell wall preparation contains LL-diaminopimelic acid and glycine with no meso diaminopimelic acid ( B E C K E R et al. 1 9 6 5 ) . The other criteria characteristic for Streptomyces are also in good agreement with the strain. The taxonomic studies were carried out in accordance with the methods described b y SHIELING a n d GOTTLIEB ( 1 9 6 6 ) a n d W A K S M A N ( 1 9 6 1 ) .

Results and discussion Microscopical c h a r a c t e r i s t i c s The aerial and substrate mycelia develop well. The mature spores occur in chains of more than 10. Spore chains belong to the open spirals of section Spira of PRIDHAM and HASSELTINE (1958) (Fig. 1). The spores are oval, 0 . 8 6 ~ 1.20 X 0 . 3 4 ~ 0 . 3 9 pun in diameter with smooth surface (Fig. 2). Cultural characteristics Streptomyces maghwi was cultivated on various media at 28 °C and cultural characteristics were observed at 7, 14 and 21 days. The results are shown in Table 1. The growth was excellent on inorganic salts-starch agar, glycerol-asparagine agar, tyrosine agar and CZAPEK'S solution agar with abundant sporulation, aerial mass colour was in the Red series of PRIDHAM and TRESNER (1974). No melanoid pigments were formed on peptone-yeast extract iron agar, tyrosine agar and tryptone-glucoseliver extract-yeast broth (LYONS and PRIDHAM 1976). 28*

Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie

28

1983

7

411

-418

(Department of Biochemistry, Faculty of Science, Kuwait University, Kuwait)

Streptomyces

maghwi, a new species producing roflamycoin

M. AFZAL, N . D . NIMER a n d M . NAZAR

(Eingegangen am 28.

9.1982)

A new Streptomyces species is described for which the name S. maghwi is proposed. The organism is characterized by a pink mass of aerial mycelium, spiral spore chains, spores with smooth surfaces and a nonchromogenic vegetative mycelium. S. maghwi produces roflamycoin (SCHLEGEL et al. 1981) formerly known as flavomycoin (SCHLEGEL et al. 1971). The type strain oi S. maghwi is deposited with CBS, Netherland.

During the course of our screening program for new antibiotics from sandy desert Streptomyces, a new species of streptomycete, strain K U B - 4 4 . 7 8 was isolated from Maghwa oil fields which was found to produce roflamycoin (flavomycoin). The name Streptomyces maghwi is proposed for the organism. This paper deals with the taxonomic studies of the organism. Description of production, isolation and identification of the antibiotic are presented. Materials and methods The holotype strain of Streptomyces maghwi is maintained as lyophilized preparation under the accession number KUB-44.78 at the Department of Biochemistry, University of Kuwait. The strain belongs to the genus Streptomyces W A K S M A N and H E N B I C I because the cell wall preparation contains LL-diaminopimelic acid and glycine with no meso diaminopimelic acid ( B E C K E R et al. 1 9 6 5 ) . The other criteria characteristic for Streptomyces are also in good agreement with the strain. The taxonomic studies were carried out in accordance with the methods described b y SHIELING a n d GOTTLIEB ( 1 9 6 6 ) a n d W A K S M A N ( 1 9 6 1 ) .

Results and discussion Microscopical c h a r a c t e r i s t i c s The aerial and substrate mycelia develop well. The mature spores occur in chains of more than 10. Spore chains belong to the open spirals of section Spira of PRIDHAM and HASSELTINE (1958) (Fig. 1). The spores are oval, 0 . 8 6 ~ 1.20 X 0 . 3 4 ~ 0 . 3 9 pun in diameter with smooth surface (Fig. 2). Cultural characteristics Streptomyces maghwi was cultivated on various media at 28 °C and cultural characteristics were observed at 7, 14 and 21 days. The results are shown in Table 1. The growth was excellent on inorganic salts-starch agar, glycerol-asparagine agar, tyrosine agar and CZAPEK'S solution agar with abundant sporulation, aerial mass colour was in the Red series of PRIDHAM and TRESNER (1974). No melanoid pigments were formed on peptone-yeast extract iron agar, tyrosine agar and tryptone-glucoseliver extract-yeast broth (LYONS and PRIDHAM 1976). 28*

412

M . AZFAL, N . D . NIMER a n d M . NAZAB

Fig. 1. Photomicrograph of S. maghwi on glycerol-asparagine agar (10 days at 28 °C) (X 400)

Fig. 2. Electron micrograph of S. maghwi on glycerol-asparagine agar (10 days at 28 °C) ( X 4800)

Physiological

properties

Physiological properties of Streptomyces maghwi were examined according to the methods of SHIRLING a n d GOTTLIEB (1966), WAKSMAN (1961) a n d BERD (1973). S o d i u m c h l o r i d e t o l e r a n c e

was d e t e r m i n e d b y t h e m e t h o d of TRESNER (1968).

A roflamycoin-produoing S. maghwi

413

Table 1 Cultural characteristics of strain No. KUB-44.78 and S. roseoflavus CBS-740.72 Media

Strain No. KUB-44.78

• 8. roseoflavus CBS-740.72

G1) excellent G: good AM: scanty, white AM: scanty, white 2 R: 72.d.OY ) R : 57.1.Br S: none S: none Oat meal agar (ISP3) G: good G: poor AM: scanty, 31.p.y. pink AM: scanty, white R : white R : 89.p.y. S: none S: none Inorganic salts-starch G: excellent G: good agar (ISP4) AM: abundant, 4.1. pink AM: abundant, 19.gy.red R: 29.m.y. pink R : 19.gy.red S: none S: none Glycerol-asparagine G: excellent G: moderate agar (ISP5) AM excellent, 4.1.pink AM: scanty, white R : 5.m. pink R : 76.1.yBr S: none S: none Peptone yeast iron G: good G: good agar (ISP 6 ) AM: none AM: none R: 74.s.yBr R : 74.s.yBr S: none S: none Tyrosine agar (ISP 7 ) G: excellent G: good AM: excellent, 3.1.,p.y. pink AM: scanty, white R: 28.1.Y pink R : 39.gy.rO S: none S: none CZAPEK'S s o l u t i o n G: excellent G: very poor agar AM: abundant, 31. p.y. AM: none pink R : 70.1.OY R : none S: none S: none Tryptic soya agar G: good G: good AM: none AM: none R : 72.d.OY R: 1.81.gy.red S: none S: none G: growth, R : colour of reverse, AM: colour of aerial mycelium, S: colour or presence of diffusible pigment 2 ) Colour designations are according to ISCC-NBS; Colour-name charts illustrated with centroid colours (Supplement to NBS circular 553) Yeast extract-malt extract agar (ISP2)

The results are compared with Streptomyces roseoflavus A R A I C B S 7 4 0 . 7 2 , and Streptomyces roseoflavus J A 5068 and are shown in Table 2. It grows from 22—42 °C, the preferred range being 25 — 35 °C. The culture shows positive reactions in peptonization of milk and its coagulation. The growth on the medium containing cellulose A R A I ( 1 9 7 5 ) is excellent with abundant white aerial mycelium. Liquefaction of gelatin, melanin production and tyrosinase reaction were negative. The microorganism belongs, therefore, to a Streptomyces species which is thermodurant, halotolerant and non-chromogenic. Carbon

utilization

Utilization of carbon sources was determined according to the procedures of and GOTTLIEB ( 1 9 6 6 ) . The results are compared with Streptomyces roseoflavus A R A I C B S 7 4 0 . 7 2 and Streptomyces rosefloavus J A 5 9 6 8 and presented in Table 3 . SHIRLING

414

M. AFZAL, N. D. NIMEE and M. NAZAB

Table 2 Comparison of physiological properties of KUB-44.78, 8. roseoflavus AEAI CBS 740.72 and S. roseoflavus J A 5068 Strain No. KUB-44.78

S. roseoflavus ARAI CBS 740.72

8. roseoflavus J A 5068 2 )

_

Tyrosinase reaction Gelatin liquefaction Milk coagulation Milk peptonization Melanin formation 1 ) Sodium chloride tolerance Cellulose decomposition Temperature range

—

+ + +

—

+ +

— — —

ND ND Slow ND

—

13%

5%

2 0 - 4 2 °C

ND

) Tryptone-yeast extract broth (ISP 1) and peptone-yeast extract iron agar (ISP 6) + = Positive reaction: — = Negative reaction: ND = Not done 2 ) Data taken from SCHLEGEL et al. (1971) 1

Table 3 Carbon utilization of strain No. KUB-44.78, S. roseoflavus CBS 740.72, and S. roseoflavus J A 5068 Carbon source D( + ) glucose D-Xylose L-Arabinose L-Rhamnose Raffinose D-Fructose D-Galactose D-Mannitol ¿-Inositol Salicin Sucrose

Strain KUB-44.78

+ + + +1)

+++ + + + ++ +++ +

S. roseoflavus CBS 740.72

++ +

± —

_ —

— — J — — J — — ) — — J —1—

+ +++

—

_ _ — —

S. roseoflavus J A 5068 2 )

++ ++ ++ —

+ + + + +

+ + + +

—

) Excellent growth + + + + , fair + + + , moderate + + , poor + , no growth —. 2 ) Data taken from SCHLEGEL et al. (1971) 1

The above taxonomic studies demonstrate that Streptomyces maghwi can be classi-

fied into table 17.44 f (S; C-; S) in the Red series of PKIDHAM and TRESNER (1974),

because its spore chain morphology belongs to the section Spirales (S), melanoid pigments are not formed and spore surface is smooth. The consideration of taxonomic characteristics and antifungal spectrum pointed out that the strain KUB-44.78 could be compared with Streptomyces rosefloavus var. jenensis J A 5068 (flavomycoin) SCHLEGEL a n d THRUM ( 1 9 6 8 ) a n d SCHLEGEL et al. ( 1 9 7 1 ) , Streptomyces

flavofungini

ARAI et al.

roseoflavus

var.

(flavofungin) BOGNAR et al. (1972), Streptomyces roseoluteus (lagosin)

( 1 9 7 8 ) , a n d Streptomyces

ruber

( m y c o t i c i n ) WASSERMAN et al.

(1967).

Streptomyces roseoflavus ARAI and Streptomyces roseoluteus BESSELL have been desribed in ISP reports (SHIRLING and GOTTLIEB 1974, 1968). Comparison with Streptomyces roseoluteus was ruled out as it is known to produce lagosin (fungichromin) which shows a characteristic pentaene UV spectrum (OROSHNIK and MEBANE 1963). Antifungal spectrum of the metabolite of KUB-44.78 considered together with UV spectrum suggested that S. roseoflavus, ARAI CBS 740.72 would be the most suitable representative strain from the known species of the table 17.44f for comparison. Comparison of the cultural characteristics, physiological properties, and carbon utilization of the two cultures are shown in Table 1, 2 and 3, respectively, together with

A roflamycoin-producing 8. maghwi

415

t h e p u b l i s h e d d a t a on Streptomyces roseoflavus J A 5068 (SCHLEGEL et al. 1971). I t is a p p a r e n t t h a t s t r a i n K U B - 4 4 . 7 8 is n o t i d e n t i c a l with Streptomyces roseoflavus ARAI CBS 740.72 a n d S. roseoflavus J A 5068. F u r t h e r m o r e t h e m e t h a n o l i c e x t r a c t of t h e m y c e l i u m of S. roseoflavus ARAI CBS 740.72 shows a d i f f e r e n t p a t t e r n of m e t a b o l i t e s

(by tic) when compared with the methanolic extract of the mycelium of KUB-44.78 grown under identical conditions on date syrup medium. All this evidence shows that strain KUB-44.78 is a new species for which we propose the name Streptomyces maghwi "maghwi denotes the site of collection of sample as Maghwa oil fields". Fermentation Stock cultures of Streptomyces maghwi were maintained on ISP4. A loopful of spores from a mature slant was inoculated into 250 ml conical flask containing 60 ml of the medium composed of: liver-extract 100 ml, glucose 5.0 g, yeast extract 5.0 g, tryptone 10.0 g, K 2 HP0 4 (anhydrous) 1.0 g, distilled water 900 ml. Liver extract was prepared by the method of LYONS and PRIDHAM (1965). The final pH of this medium after autoclaving was 6.9—7.0. This medium was used to grow the inoculum on a gyrotory shaker at 28 °C for 48 hours. The fermentation medium was composed of: date syrup (Iraqi National Manufacturing Company, Basra, Iraq) 20.0 g, glucose 10.0 g, peptone (DIFCO) 5.0 g, water 1000 ml, calcium carbonate 100 mg was weighed separately into each of the 500 ml conical flasks having 100 ml of the above date syrup solution. After sterilization the pH was 6.7—6.9. The inoculum was used at 5% level and the fermentation flasks were incubated at 28 °C on a gyrotory shaker for 96 hours with agitation at 220 rpm.

A typical time course curve of fermentation in flasks is shown in Fig. 3. Antibiotic production was monitored by the measurement of optical density of the methanolic extract of mycelium at 364 nm as well as paper disc assay method using Candida albicans N R R L Y-477 as the test organism. Mycelial growth was expressed as weight of dried mycelium per ml of the medium. Isolation and identification Mycelium was filtered by suction and washed well with water to remove soluble constitutents. The hard pressed, partially wet mycelium cake from 8 litres of broth, was extracted with methanol ( 3 x 1 1 ) at room temperature, under artificial red light. The combined methanolic extract was concentrated under vacuum to 500 ml paleyellow suspension containing water. The suspension was washed with petroleum ether b.p. 40—60 °C (3 x 500 ml) and then extracted with warm ethyl acetate (4 x 500 ml). The combined ethyl acetate extracts were dried over anhydrous sodium sulphate and evaporated to dryness to give a yellow fluorescent solid (1.146 g). The solid was crystallized from methanol to give fine yellow needles m.p. 164—168 °C (dec.). Anal, calcd. for C40H66O12: C 65.04; H 9.01%. Found: C 65.10; H 8.95%. Specific rotation: W25 = —58° (c 3, dimethylformamide). The compound was photosensitive and thus decomposed under ordinary conditions to a mixture of at least three compounds (tic; water saturated ethyl methyl ketone). This warranted its isolation under artificial red light which partially delayed the decomposition. After crystallization it was stored in dark evacuated tube. The infrared and UV absorption spectra of the crystalline material showed a marked change as a function of time. All these characteristics were in total agreement with the polyene antibiotic roflamycoin previously isolated f r o m Streptomyces roseoflavus var. jenensis J A 5068 SCHLEGEL et al. (1971).

Also the I R and UV spectra of freshly crystallized material were identical with those for roflamycoin and these are shown in Figs. 4 and 5, respectively. Treatment with potassium permanganate, bromine solution, and catalytic hydrogenation were in

416

M. Azfal, N; D. Nimer and M. Nazab

Incubation

time ( hours )

Fig. 3. A tpycical time course of roflamycoin production by S. maghwi strain KUB-44.78. The medium and culture conditions are described in the test. A Growth, # antibiotic, • pH

Wavelength (nm)

Fig.. 4. UV spectrum of roflamycoin produced by 8. maghwi

A roflamycoin-producing S. maghwi

Wave number

417

(cm'1)

Pig. 5. Infrared absorption spectrum of roflamycoin (KBr) produced by S. maghwi agreement with roflamycoin, a n d support other d a t a concluding t h a t the antibiotic p r o d u c e d b y t h e n e w species Streptomyces maghwi is r o f l a m y c o i n . A d i r e c t c o m p a r i s o n b e t w e e n t h e a n t i b i o t i c p r o d u c e d b y 8. maghwi a n d t h e a u t h e n t i c s a m p l e of r o f l a m y c o i n ( p r o v i d e d b y D r . SCHLEGEL, Z I M E T , D D R - 6 9 0 0 J e n a , G D R ) w e r e f o u n d t o b e i d e n t i c a l . T h e a n t i f u n g a l s p e c t r u m of c r y s t a l l i n e r o f l a m y c o i n is s h o w n in T a b l e 4. Table 4 Antifungal activity of roflamycoin Test organism

MIC (lig/ml)1)

23 Candida albicans N R R L Y-477 12 Saccharomyces pastorianus N R R L Y-139 10 Aspergillus niger 8 Pénicillium, citrinum CMI 61272 6 Mucor ramannianus N R R L 1839 1 ) Minimum inhibitory concentrations determined by agar dilution method in brain heart infusion agar at 37 °C Acknowledgement A financial grant No. SBO 06 from the Research Management Unit, Kuwait University to carry out these investigations is thankfully acknowledged.

References T., 1975. Culture media for actinomycetes. Soc. Actinomycetes Japan, p. 10. T., K U R O D A , S. and MIKAMI, Y., 1978. Classification of Actinomycetes with reference to antiobiotic production: In. Actinomycetes, The Boundary Microorganisms (T. A B A I , Editor), p. 623. Toppan Company Ltd. Tokyo. B E C K E R , B., LECHEVALIER, M. P . and LECHEVALIER, H . , 1965. Chemical composition of cell wall preparation from strains of various form-genera of aerobic actinomycetes. App. Microbiol 18, 2 3 6 - 2 4 3 . B E R D , D . , 1 9 7 3 . Laboratory identification of clinically important aerobic actinomycetes. A P P I Microbiol., 25, 6 6 5 - 6 8 1 .

ABAI, ABAI,

BOGNAE, R . , MAKLEIT, S . , ZSUPAK, K . , B R O W N , B . O . , LOCKLEY, W . J . S . , T O U B E , T . P . a n d W E E -

DON, B. C. L., 1972. Flavofungin : A mixture of 13,15,17,19,21,23,25,27-octahydroxy 31-isopropyl-14-methyl-andl3,15,17,19,21,23,25,27-octahydroxy-14-methyl-31-S-butyl-hentriaconta2,4,6,8,10,28-hexaen-31-olide. J . C. S. Perkin, 1, 1848-1856. L Y O N S , A. J . and PRIDHAM, T . G., 1965. Colorimetric determination of aerial mycelium of Streptomycetes. J . Bacteriol., 89, 159 — 169. OROSHNIK, W . and M E B A N E , A . D . , 1 9 6 3 . The polyene antibiotics. Progr. Chem. Nat. Prods.. 21,

17-79.

418

M . AFZAL, N . D . N I M E R a n d M . NAZAR

G., H A S S E L T I N E , C. W. and B E N E D I C T , R . G., 1958. A guide for the classification of Streptomycetes according to selected groups. Appl. Microbiol., 6, 52—79. P R I D H A M , T . G. and T R E S N E R , H. D., 1974. I n : B E R G E Y ' S Manual of Determinative Bacteriology, 8th Edition. The Williams and Wilkins Co. Baltimore, pp. 749—829. SCHLEGEL, R . und THRUM, H., 1968. Flavomycoin, ein neues antifungales Polyenantibiotikum. Experientia, 24, 11 — 12. SCHLEGEL, R. and THRUM, H., 1971. A new polyene antibiotic, flavomycoin. Structural investigations. I. and I I . J . Antibiotics, 24, 360—374. S C H L E G E L , R., F Ü G N E R , R., B R A D L E R , G . und T H R U M , H., 1971. Flavomycoin, ein neues Polyenantibioticum aus Streptornyces roseoflavus. Produktion, Isolierung und Eigenschaften. Z. Allg. Mikrobiol., 11, 6 6 1 - 6 7 0 . PRIDHAM, T .

SCHLEGEL, R . , T H R U M , H . , ZIELINSKI, J . a n d BOROWSKI, E . , 1 9 8 1 . T h e s t r u c t u r e o f r o f l a m y c o i n ,

a new polyene macrolide antifungal antibiotic. J . Antibiotics, 34, 122 — 124. B . and G O T T L I E B , D . , 1966. Methods of characterization of Streptornyces species. I n t . Syst. Bacteriol., 15, 313—340. SHIELING, E. B. and GOTTLIEB, D., 1968. Cooperative description of type strains of Streptornyces. I I I . Additional species description from first and second studies. I n t . J . Syst. Bacteriol., 18, 279-392. SHIRLING, E. B. and GOTTLIEB, D., 1974. Cooperative description of type strains of Streptornyces. V. Additional descriptions. I n t . J . Syst. Bacteriol., 22, 265—394. T R E S N E R , H . D., H A Y E S , J . A. and B A C K U S , E. J . , 1968. Differential tolerance of Streptornyces to sodium chloride as taxonomic aid. Appl. Microbiol., 16, 1134 — 1136. WAKSMAN, S. A., 1961. The Actinomycetes, Vol. I I . The Williams and Wilkins Co. Baltimore. SHIRLING, E .

WASSERMAN, H . H . , V A N YERTZ, J . E . , M C A U S T L A N D , J . E . , BOROWITZ, D . J . a n d K A M B E R ,

B.,

1967. Mycoticins, polyene macrolides from Streptornyces ruber. J . Amer. chem. Soc., 89, 1535 to 1 5 3 6 . Mailing address: Dr. M. NAZAR Biochemistry Department, Kuwait University, Faculty of Science P. 0 . Box 5969 Kuwait, Kuwait

Zeitschrift f ü r Allgemeine Mikrobiologie

23

1983

419-427

(Sektion Biologie der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald, W B Molekularbiologie)

Allgemeine Kontrolle der Aminosäurebiosynthese in Mutanten von Candida spec. E H 15/D R . B O D E u n d P . CASPEB

(Eingegangen

am

5.11.1982)

T h e general control of amino acid biosynthesis was investigated in Candida spec. E H 15/D, using single a n d double m u t a n t a u x o t r o p h i c strains a n d p r o t o t r o p h i c r e v e r t a n t s s t a r v e d for their required amino acids. These experiments show,that s t a r v a t i o n for lysine, histidine, arginine, leucine, threonine, proline, serine, methionine, homoserine, asparagine, glutamic acid or aspartic acid can result in derepression of enzymes. A correlation was f o u n d between t h e degree of derepression, g r o w t h of strains, a n d concentration of required amino acids. The amino acids pcol p a t t e r n of m u t a n t s a n d r e v e r t a n t s is different f r o m t h a t in t h e wild t y p e strain.

Für die Regulation der Biosynthese vieler Aminosäuren von Neurospora crassa beschrieben CARSIOTIS U. L A C Y (1965) ein komplexes Kontrollsystem. Diese „cross-pathway regulation" bzw. „allgemeine Kontrolle der Aminosäurebiosynthese" ließ sich auch in Saccharomyces cerevisiae (SCHÜRCH et al. 1974, W O L F N E R et dl. 1975, D E L F O R G E et al. 1975), Aspergillus nidulans ( P I O T R O W S K A 1980), Claviceps fusiformis ( S C H M A U D E R et dl. 1981) und Hansenula henricii ( B O D E U. B I R N B A U M 1981a) nachweisen. Sie äußert sich in einer Dereprimierung von verschiedenen Aminosäure-Biosyntheseenzymen unter Aminosäure-Mangelbedingungen. Die Induzierung der allgemeinen Kontrolle kann sowohl mit Hilfe von Aminosäuremutanten als auch durch die Verwendung von Analoga festgestellt werden. Die Existenz dieser allgemeinen Kontrolle konnte von uns auch in der Hefe Candida spec. EH 15/D nachgewiesen werden (BODE et al. 1983). Mit Hilfe von Analoga stellten wir dabei fest, daß dieses Regulationsphänomen durch Transkription kontrolliert wird und zu einer nicht-koordinierten Dereprimierung von Enzymen der Biosynthese der Aminosäuren Asparagin, Tryptophan, Phenylalanin, Tyrosin, Histidin, Lysin, Arginin, Threonin, Isoleucin, Leucin, Valin, Cystein und Methionin führen kann. Um weitere Informationen über die Natur dieser Regulation zu erhalten, wurden in dieser Arbeit verschiedene Aminosäuremutanten verwendet und die Effekte, die dabei auftraten, näher charakterisiert. Material und Methoden S t ä m m e : F ü r die U n t e r s u c h u n g e n wurde der H e f e s t a m m Candida spec. E H 15/D verwendet. D e n W i l d s t a m m stellte u n s das I n s t i t u t f ü r Technische Chemie der A d W der D D R , die Aminos ä u r e m u t a n t e n u n d das F u s i o n s p r o d u k t f p 3 6 - 1 ^ —— i — A die Forschungsl + + met-6 arg-101 abteilung Hefegenetik der E M A - U n i v e r s i t ä t Greifswald freundlicherweise zur Verfügung. F ü r weitere U n t e r s u c h u n g e n w u r d e n p r o t o t r o p h e B e v e r t a n t e n verwendet, die s p o n t a n aus den verw e n d e t e n MNNG-induzierten M u t a n t e n auf M i n i m a l m e d i u m - P l a t t e n nach 2—5 Tagen B e b r ü t u n g entstanden. K u l t u r b e d i n g u n g e n : Die A n z u c h t der H e f e n erfolgte als S c h ü t t e l k u l t u r bei 30 °C f ü r 16 h. Als Nährlösung wurde das Minimalmedium nach T A N A K A et al. (1967) m i t 1 % Glucose u n d 1 mg/1 Biotin verwendet. D a s N ä h r m e d i u m f ü r die M u t a n t e n u n d p r o t o t r o p h e n R e v e r t a n t e n w u r d e in den angegebenen K o n z e n t r a t i o n e n m i t L-Aminosäuren supplementiert.

Zeitschrift f ü r Allgemeine Mikrobiologie

23

1983

419-427

(Sektion Biologie der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald, W B Molekularbiologie)

Allgemeine Kontrolle der Aminosäurebiosynthese in Mutanten von Candida spec. E H 15/D R . B O D E u n d P . CASPEB

(Eingegangen

am

5.11.1982)

T h e general control of amino acid biosynthesis was investigated in Candida spec. E H 15/D, using single a n d double m u t a n t a u x o t r o p h i c strains a n d p r o t o t r o p h i c r e v e r t a n t s s t a r v e d for their required amino acids. These experiments show,that s t a r v a t i o n for lysine, histidine, arginine, leucine, threonine, proline, serine, methionine, homoserine, asparagine, glutamic acid or aspartic acid can result in derepression of enzymes. A correlation was f o u n d between t h e degree of derepression, g r o w t h of strains, a n d concentration of required amino acids. The amino acids pcol p a t t e r n of m u t a n t s a n d r e v e r t a n t s is different f r o m t h a t in t h e wild t y p e strain.

Für die Regulation der Biosynthese vieler Aminosäuren von Neurospora crassa beschrieben CARSIOTIS U. L A C Y (1965) ein komplexes Kontrollsystem. Diese „cross-pathway regulation" bzw. „allgemeine Kontrolle der Aminosäurebiosynthese" ließ sich auch in Saccharomyces cerevisiae (SCHÜRCH et al. 1974, W O L F N E R et dl. 1975, D E L F O R G E et al. 1975), Aspergillus nidulans ( P I O T R O W S K A 1980), Claviceps fusiformis ( S C H M A U D E R et dl. 1981) und Hansenula henricii ( B O D E U. B I R N B A U M 1981a) nachweisen. Sie äußert sich in einer Dereprimierung von verschiedenen Aminosäure-Biosyntheseenzymen unter Aminosäure-Mangelbedingungen. Die Induzierung der allgemeinen Kontrolle kann sowohl mit Hilfe von Aminosäuremutanten als auch durch die Verwendung von Analoga festgestellt werden. Die Existenz dieser allgemeinen Kontrolle konnte von uns auch in der Hefe Candida spec. EH 15/D nachgewiesen werden (BODE et al. 1983). Mit Hilfe von Analoga stellten wir dabei fest, daß dieses Regulationsphänomen durch Transkription kontrolliert wird und zu einer nicht-koordinierten Dereprimierung von Enzymen der Biosynthese der Aminosäuren Asparagin, Tryptophan, Phenylalanin, Tyrosin, Histidin, Lysin, Arginin, Threonin, Isoleucin, Leucin, Valin, Cystein und Methionin führen kann. Um weitere Informationen über die Natur dieser Regulation zu erhalten, wurden in dieser Arbeit verschiedene Aminosäuremutanten verwendet und die Effekte, die dabei auftraten, näher charakterisiert. Material und Methoden S t ä m m e : F ü r die U n t e r s u c h u n g e n wurde der H e f e s t a m m Candida spec. E H 15/D verwendet. D e n W i l d s t a m m stellte u n s das I n s t i t u t f ü r Technische Chemie der A d W der D D R , die Aminos ä u r e m u t a n t e n u n d das F u s i o n s p r o d u k t f p 3 6 - 1 ^ —— i — A die Forschungsl + + met-6 arg-101 abteilung Hefegenetik der E M A - U n i v e r s i t ä t Greifswald freundlicherweise zur Verfügung. F ü r weitere U n t e r s u c h u n g e n w u r d e n p r o t o t r o p h e B e v e r t a n t e n verwendet, die s p o n t a n aus den verw e n d e t e n MNNG-induzierten M u t a n t e n auf M i n i m a l m e d i u m - P l a t t e n nach 2—5 Tagen B e b r ü t u n g entstanden. K u l t u r b e d i n g u n g e n : Die A n z u c h t der H e f e n erfolgte als S c h ü t t e l k u l t u r bei 30 °C f ü r 16 h. Als Nährlösung wurde das Minimalmedium nach T A N A K A et al. (1967) m i t 1 % Glucose u n d 1 mg/1 Biotin verwendet. D a s N ä h r m e d i u m f ü r die M u t a n t e n u n d p r o t o t r o p h e n R e v e r t a n t e n w u r d e in den angegebenen K o n z e n t r a t i o n e n m i t L-Aminosäuren supplementiert.

420

R . B O D E u n d P . CASPER

Gewinnung des Enzymextraktes: Der Aufschluß der Hefezellen erfolgte mit Hilfe einer X-Presse in 0,1 M Tris-HCl (pH 7,5). Das Homogenat wurde bei 2 0 0 0 0 g 20 min zentrifugiert und der Überstand zur Bestimmung der Enzymaktivitäten verwendet. Zur Determinierung der MICHAELis-Konstanten der Saccharopin-DHG wurde der Überstand mittels Sephadex G-25 noch von den niedermolekularen Bestandteilen befreit. Enzymbestimmungen: Die Aktivitätsbestimmung der Anthranilat-Synthase (EC 4.1.3.27) erfolgte nach BODE U. BIRNBAUM (1978a), der Saccharopin-DHG (EC 1.5.1.7) nach SINHA et al. (1971), der Ornithin-Carbamyltransferase (EC 2.1.3.3) nach SCHIMKE (1970), der y-Cystathionase (EC 4.2.99.9) nach FLAVIN U. SLAUGHTER (1971), der Shikimat-DHG (EC 1.1.1.25) nach BODE u. BIRNBAUM (1981b), der Threonin-Deaminase (EC 4.2.1.16) nach HATFIELD U. UMBARGER (1971), der Phenylalanin- und Tryptophan-Aminotransferase (EC 2.6.1.27) nach BODE U. BIRNBAUM (1978b). Proteinbestimmung: Die Proteinkonzentration der Enzymextrakte wurde nach LOWRY et al. (1951) bestimmt. Rinderserumalbumin diente als Referenzprotein. Bestimmung des Aminosäurepools: Die Konzentration an freien Aminosäuren in der Zelle wurde nach DELFORGE et al. (1975) mit dem MIKROTECHNA Automatischen Aminosäureanalysator ermittelt (Dr. H. LÜBS, Inst. f. Med. Genetik der Univ. Greifswald, danken wir für die Anfertigung der Analysen). Die Bestimmung von Tryptophan erfolgte nach BODE et al. (1980).

Ergebnisse Zum Nachweis der Existenz der allgemeinen Kontrolle in den Aminosäuremutanten und -revertanten wurden Aminosäure-Biosyntheseenzyme herangezogen, von denen bekannt war, daß sie beim Wildstamm durch Antimetaboliten dereprimiert werden können, sowie die Shikimat-DHG als nicht reguliertes Protein ( B O D E et al. 1983). Die Mutanten wurden unter Aminosäurelimitation angezogen; dabei konnte ohne Ausnahme eine Erhöhung der Enzymaktivitäten nachgewiesen werden, die der allgemeinen Regulation unterliegen. Tabelle 1 verdeutlich, daß die Limitierung von Lysin, Histidin, Arginin, Leucin, Threonin, Prolin, Serin, Methionin, Homoserin, Asparagin, Glutamin- oder Asparaginsäure in den Zellen zur Auslösung einer derartigen Regulation führte. Die Mutanten wurden dabei durch die supplementierte Aminosäurekonzentration in unterschiedlicher Weise in ihrem Wachstum begrenzt. Die veränderten Dereprimierungsfaktoren können als Folge des Wachstumsverhalten der einzelnen Stämme betrachtet werden. Die Stämme l-ys-14 und lys-16 stellen Mutanten dar, deren Saccharopin-DHG defekt ist. Für dieses Enzym konnte bei den anderen Mutanten ein maximaler Dereprimierungsfaktor von 2,8, für die Anthranilat-Synthase von 6,8 und für die OrnithinCarbamyltransferase von 12,0 festgestellt werden. Die Erhöhung der spezifischen Aktivität der Enzyme war aber bei den einzelnen Mutantentypen nicht identisch, sondern differierte zum Teil erheblich voneinander. Dieses Verhalten ließ sich nicht unbedingt auf das unterschiedliche Wachstum der Mutanten zurückführen. So konnte für arg-13 und arg-15 eine relativ hohe Ornithin-Carbamyltransferase-Aktivität nachgewiesen werden, während sich die restlichen Argininmutanten in den Durchschnitt der anderen Mutantentypen einordnen ließen. Eine ähnliche Situation konnte für die Anthranilat-Synthase in den Stämmen lys-11, ser-1 und glu-1 nachgewiesen werden. Im weiteren sollte geprüft werden, inwieweit die Dereprimierung einzelner Enzyme der Aminosäurebiosynthese in den Mutanten von der Erhöhung der supplementierten Aminosäurekonzentration abhängig ist. Wie Abbildung 1 zeigt, wurde die Dereprimierung der Enzyme durch diese Anzuchtbedingungen in Abhängigkeit von der Konzentration der Aminosäure reduziert bzw. praktisch aufgehoben. Dieser Prozeß ging mit einem wesentlich besseren Wachstum der Mutantenzellen einher. Die untersuchten Enzyme zeigten dabei eine ähnliche Dereprimierungskinetik. Damit können sekundäre Effekte, die sich vielleicht nach der Mutagenese bei den Mutanten manifestiert haben als Induktoren der allgemeinen Kontrolle ausgeschlossen werden.

Kontrolle der Aminosäurebiosynthese

421

Tabelle 1 Trockengewicht (TG) und relative Enzymaktivitäten von Mutanten der Hefe Candida E H 15/D nach Anzucht unter Aminosäurelimitation (10 mg/1 Aminosäure supplementiert) Stamm

TG (g/1)

4,9 EH 15/D lys-11 0,58 lys-14 0,66 0,54 lys-15 lys-16 0,66 0,62 lys-17 lys-18 0,80 lys-19 0,57 his-4 2,0 his-17 2,3 arg-2 0,83 arg-11 1,5 1,0 arg-12 1,2 arg-13 arg-14 0,61 arg-15 1,1 leu-4 0,83 leu-6 1,3 1,4 leu-7 thr-5 2,0 ihr-6 1,6 1,5 pro-2 pro-3 1,2 pro-4 1,4 1.2 pro-5 ser-1 1,6 met-6 0,78 met-11 1,0 hser-4 0,95 glu-1 0,49 asn-5 1,2 0,82 asp-1 nd — nicht bestimmt

spec.

Saccharopin-DHG

AnthranilatSynthase

OrnithinCarbamyltransferase

ShikimatDHG

1,0 2,6 0,0 2,5 0,0 2,8 2,1 2,5 1,4 1,5 2,3 1,7 2,2 1,8 2,0 1,7 1,6 1,3 1,4 1,9 1,3 1,5 2,0 1,6 1,5 2,1 2,2 1,5 1,3 2,3 1,3 1,3

1,0 5,3 3,3 nd 3,0 2,5 2,1 1,4 2,3 3,1 1,4 1.3 1,8 1,9 2,6 2,4 2,1 1,8 nd nd 1,4 3,0 2,8 1,4 2,0 6,4 1,7 1,8 4,0 6,8 2,8 1,7

1,0 3,6 2,7 2,0 1,9 2,8 2,1 1,6 1,1 1,3 3,4 2,3 2,8 9,0 5,1 12,0 1,4 1,2 1,4 1,3 1,3 2,0 1,6 1,6 1,5 1,6 1,7 5,5 nd 1,4 1,3 1,4

1,0 1,4 1,0 nd 1,0 1,0 nd nd nd 1,0 1,0 0,9 0,9 nd 1,0 nd nd 1,0 nd 1,0 nd nd 1,0 nd 1,0 nd nd 1,0 1,1 1,0 nd 1,0

Die Dereprimierung der verschiedenen Enzyme bzw. die Limitierung einer Aminosäure schlug sich in den Zellen als Veränderung des Aminosäurepools nieder. Für diese Untersuchungen wurden die beiden Lysinmutanten lys-14 und lys-16 verwendet, die mit zwei verschiedenen Lysinkonzentrationen gewachsen waren. Wie Tabelle 2 zeigt, ließ sich ein unterschiedliches Verhalten der einzelnen Aminosäurekonzentrationen in Abhängigkeit von der angebotenen Lysinmenge im Vergleich zum Wildstamm feststellen. Der Pool an Threonin, Serin, Glutamin, Glutaminsäure, Glycin, Alanin, Valin, Isoleucin, Ornithin und Arginin liegt in dereprimierten Zellen (10 mg/1 Lysin) der beiden Mutanten in erhöhter Konzentration vor. Er nimmt aber mit der Erhöhung der Lysinkonzentration, die zu einem undereprimierten Zustand der Zellen führt, wieder ab und nähert sich dem Poolniveau des Wildstammes. Für Asparaginsäure konnte dagegen eine Erniedrigung des Pools nachgewiesen werden, der mit steigender Lysinkonzentration wieder zunimmt. Ein unterschiedliches Verhalten zeigten die Aminosäurepools von Prolin, Cystein, Leucin, Tyrosin, Phenylalanin und Tryptophan bei beiden untersuchten Lysinmutanten. Die Konzentration an Histidin wurde bei Zufütterung von Lysin in den Zellen gesteigert. Wurden Doppelmutanten zur Überprüfung der Expression der allgemeinen Kontrolle verwendet, so ließ sich feststellen, daß durch eine weitere Aminosäurebedürftig-

422

R . B O D E u n d P . CASPER

Lys

Arg

Met Pro Leu Konzentration (mg/l) Abb. 1. Relation des Trockengewichtes (TG) und relativer Enzymaktivitäten von Mutanten der Hefe Candida spec. E H 15/D zur Aminosäuresupplementierung (x, Trockengewicht; Anthranilat-Synthase; O, Saccharopin-DHG; • , Ornithin-Carbamyltransferase) Tabelle 2 Aminosäurepool (nm) von Stämmen der Hefe Candida

spec. E H 15/D

Stamm Aminosäure Asparaginsäure Threonin Serin Glutamin Glutaminsäure Prolin Glycin Alanin Valin Cystein Isoleucin Leucin Tyrosin Phenylalanin Tryptophan Ornithin Lysin Histidin Arginin

E H 15/D 1 53,2 4,7 5,4 12,5 66,9 2,2 4,6 33,7 7,4 1,3 2,3 4,2 1,9 2,5 1,0 6,1 9,5 1,5 4,3

lys-142

lys-143

lys-162

lys-163

lys-14 16R 1

8,6 5,6 7,5 14,1 107,7 3,0 7,6 39,4 110,4 1,6 5,7 4,1 1,5 2,4 1,0 8,6 3,1 1,5 •7,6

23,8 4,2 5,0 11,2 103,7 3,1 4,1 25,6 18,6 1,7 3,9 4,7 2,2 2,9 1,1 3,8 112,4 8,0 3,4

2,9 16,5 27,6 17,2 159,0 7,5 10,7 53,4 159,0 2,1 9,5 14,7 3,2 5,2 2,1 7,3 3,7 4,2 14,3

46,4 4,4 5,0 11,0 39,7 2,4 3,4 12,8 8,4 1,3 4,4 4,9 2,6 3,3 1,1 0,5 49,7 5,0 3,6

11,5 4,7 5,1 6,6 67,0 4,4 4,3 40,0 10,4 1,3 4,5 5,6 1,7 7,2 1,0 7,2 4,6 1,6 3,5

lys-16 28R1 1,8 8,3 14,8 13,9 38,2 1,9 12,7 43,9 14,30 1,2 4,1 6,0 2,6 3,2 1,1 13,8 3,9 1,0 4,0

Anzucht erfolgte in XMM, 2 10 mg Lysin/1 MM, 3 250 mg' Lysin/1 MM k e i t der D e r e p r i m i e r u n g s f a k t o r n i c h t z u s ä t z l i c h g e s t e i g e r t werden k o n n t e . S o w o h l die A r g i n i n / L y s i n - a u x o t r o p h e ( T a b . 3) als a u c h die M e t h i o n i n / A r g i n i n - a u x o t r o p h e Mut a n t e ( T a b . 4) v e r h i e l t e n sich d a b e i a n a l o g .

Kontrolle der Aminosäurebiosynthese

423

Tabelle 3 Trockengewicht und relative Enzymaktivitäten der Doppelmutante arg-2 lys-1 von spec. E H 15/D nach unterschiedlichen Anzuchtbedingungen

Candida

Anzuchtbedingung

Saccharopin-DHG Anthranilat-Synthase Ornithin-Carbamyltransferase Threonin-Deaminase Phenylalanin-Aminotransferase Tryptophan-Aminotransferase Shikimat-DHG Trockengewicht (g/1)

20 20

20 250

250 20

2,7 4,8 3,2 4,3 3,6 2,8 1,1 0,8

2,5 4,5 2,6 3,8 3,0 2,8 1,0 1,3

1,2 2,5 2,4 3,0 2,1 2,0 1,1 2,1

250 mg/1 Lysin 250 mg/1 Arginin 1,0 1,1 2,0 1,1 1,3 1,4 1,0 4.3

Tabelle 4 Trockengewicht und relative Enzymaktivitäten der Doppelmutante met-6 arg-10 von spec. E H 1 5 / D nach unterschiedlichen Anzuchtbedingungen

Candida

Anzuchtbedingung

Saccharopin- DHG Anthranilat-Synthase Ornithin-Carbamyltransferase Threonin-Deaminase Phenylalanin-Aminotransferase Tryptophan-Aminotransferase Shikimat-DHG Trockengewicht (g/1)

20 20

20 250

250 20

2,2 3,4 5,2 3,3 3,1 2,6 1,0 1,3

1,8 2,6 4,7 3,0 2,8 2,5 1,0 1,8

1,7 2,2 4,2 2,4 2,4 2,2 1,0 2,3

250 mg/1 Arginin 250 mg/1 Methionin 1,3 1,5 2,0 1,9 2,0 1,9 0,9 4,0

In dem prototrophen Fusionsprodukt beider Stämme fp 36-1 ließ sich keine Dereprimierung der verwendeten Enzymaktivitäten mehr feststellen. Das von diesem Stamm produzierte Trockengewicht von 4,5 g/1 läßt sich auch mit dem des Wildstammes vergleichen. Die in diesem diploiden Fusionsprodukt gebildeten Enzymmengen reichten aus, um die Zellen normal mit den entsprechenden Aminosäuren zu versorgen und keine Limitation zuzulassen. Ein anderes Bild zeigte sich nach der Untersuchung von prototrophen Revertanten einiger von uns benutzter auxotropher Mutanten. Bei diesen nicht durch weitere Mutagenbehandlung erhaltenen Revertanten ließ sich ebenfalls eine Dereprimierung von Enzymen feststellen (Tab. 5). Die einzelnen Dereprimierungsfaktoren variierten bei den untersuchten Revertanten sehr stark. Eine Korrelation mit dem Wachstum der Hefen ist nicht immer deutlich festzustellen. Bei den Revertanten von lys-14 wurde durch die Erhöhung der spezifischen Aktivität der ehemals defekten SaccharopinDHG das Wildtypniveau erreicht, während die Revertanten von lys-16 nur einen geringen Teil dieses Enzyms zu produzieren vermögen. Bei letzteren Stämmen ließ sich eine Verdopplung der Dereprimierung der Anthranilat-Synthase gegenüber den Revertanten von lys-14 feststellen, während die •y-Cystathionase dieses Verhalten nicht zeigte. Dieses Enzym besitzt jedoch von vornherein schon eine höhere Dereprimierbarkeit als andere Enzyme, die durch die allgemeine Kontrolle reguliert werden (BODE et al. 1983). Auch bei weiteren untersuchten Lysin-, Arginin-, Prolin- und LeucinRevertanten konnten dereprimierte Enzyme festgestellt werden.

424

R . BODE u n d P . CASPER

Tabelle 5 Trockengewicht (TG) und relative Enzymaktivitäten protropher Revertanten einiger Mutanten von Candida

Stamm EH 15/D

TG (g/1)

4,9 4,4 4,0 3,0 4,0 2,8 4,0 3,9 3,6 4,3 3,9 3,8 3,0 3,9 3,7 4,2 4,0 4,0 3,4 3,9 3,5 3,9 3,8 3,5 3,8 3,4 4,0 nd — nicht bestimmt

lys-14 lys-14 lys-14 lys-14 lys-14 lys-14 lys-14 lys-14 lys-14 lys-14 lys-16 lys-16 lys-16 lys-16 lys-16 lys-16 lys-16 lys-16 lys-16 lys-17 lys-17 arg-12 arg-12 arg-14 pro-5 leu-6

1R 2R 3R 4R 5R 8R 15R 16R 17R 18R 2R 4R 5R 6R 16R 17R 20R 28R 30R 3R 4R 1R 2R 1R 1R 1R

spec. E H 1 5 / D

y-Cystathionase

Saccharopin-DHG

AnthranilatSynthase

1,0 2,2 5,5 9,0 7,0 12,0 5,0 9,0 12,0 9,0 5,0 7,2 8,4 5,6 6,8 5,2 9,2 3,0 9,4 3,6 13,0 9,0 9,2 9,0 8,6 8,8 11,0

1,0 1,1 1,0 1,0 1,0 1,1 0,9 1,1 1,1 0,9 1,0 0,14 0,11 0,17 0,13 0,11 0,12 0,13 0,11 0,13 8,0 10,0 1,3 1,5 2,3 1,4 1,8

1,0 1,9 2,0 1,8 1,2 1,4 1,6 2,1 1,6 1,4 1,5 3,8 4,1 4,2 3,5 4,0 4,0 3,3 4,1 3,1 1,4 2,8 1,2 1,3 3,6 2,1 .1,5

ShikimatDHG 1,0 1,0 nd nd nd nd nd 1,0 1,0 0,9 1,0 nd nd nd nd 1,1 1,0 1,0 1,0 nd 1,0 nd 1,0 1,0 1,1 0,9 1,1

Die Derepression war auch bei den Revertanten durch die Zugabe der entsprechenden Aminosäure zum Wachstumsmedium reduzierbar. Wie in Abbildung 2 dargestellt ist, förderte die Zugabe der Aminosäuren das Wachstum der Stämme und unterdrückte im stärkeren Maße die allgemeine Kontrolle. Sehr deutlich konnte dieses Verhalten mit der y-Cystathionase nachgewiesen werden. Die Ergebnisse deuten darauf hin, daß die erfolgten Reversionen der Enzymaktivität nicht zur vollständigen Versorgung der Zellen mit den entsprechenden Aminosäuren ausreichten. Für einige Revertanten von lys-14 und lys-16 wurde das ehemals defekte Enzym untersucht. Tabelle 6 verdeutlicht, daß neben der Verringerung der Aktivität der Saccharopin-DHG (Tab. 5) auch deren MiCHAELis-Konstanten verändert worden sind. Für NADH und Lysin betrugen sie bis zum 4fachen der Werte des Wildstammes. Ähnliche Eigenschaftsveränderungen der betroffenen Enzyme können auch bei den anderen Revertanten die Ursache ihres dereprimierten Zustandes sein. Von den Revertanten lys-14 16R und lys-16 28R wurde außerdem der Aminosäurepool untersucht (Tab. 2). Dabei war festzustellen, daß der Lysingehalt nicht das Niveau des Wildstammes erreicht. Aber auch andere Aminosäuren lagen in einer vom Wildstamm abweichenden Konzentration in den Zellen vor. Etwa für die Hälfte der Aminosäuren konnte in beiden Revertanten ein erhöhtes Niveau festgestellt werden. Grundlegende Unterschiede zwischen den Revertanten bestehen in dieser Hinsicht nicht. Die Veränderungen im Aminosäurepool dieser Zellen entsprechen zum Teil den Veränderungen der Mutantenzellen, die mit einer geringen Lysinkonzentration supplementiert worden waren.

425

Kontrolle der Aminosäurebiosynthese

Lys

Lys

Leu Konzentration

Arg (mg/t)

Pro

Abb. 2. Relation des Trockengewichtes (TG) und relativer Enzymaktivitäten von prototrophen Revertanten der Hefe Candida spec. E H 15/D zur Aminosäuresupplementierung (x, Trockengewicht; • , Anthranilat-Synthase; o , Saccharopin-DHG; A, y-Cystathionase) Tabelle 6 MiCHAELis-Konstanten der Saccharopin-DHG des Wildstammes und prototropher Revertanten von Candida spec. E H 15/D Stamm E H 15/D lys-14 1R lys-14 3R lys-14 5R lys-14 16R lys-16 4 R lys-16 6R lys-16 28R lys-16 30R

Km ( m i ) L-Lysin

2-Oxoglutarat

0,90 1,50 1,85 2,70 2,50 3,25 3,00 3,33 2,60

0,83 0,80 0,83 0,85 0,83 0,81 0,80 0,83 0,83

NADH 0,23 0,42 0,47 0,55 0,50 0,60 0,55 0,63 0,55

Diskussion Die Synthese verschiedener Enzyme der Aminosäurebiosynthese wird in Candida spec. E H 15/D durch die allgemeine Kontrolle reguliert. Diese Regulationsmöglichkeit der Zellen konnte sowohl durch den Einsatz von Aminosäureantagonisten (BODE et al. 1983) als auch durch unsere Untersuchungen mit Aminosäure-Mangelmutanten und deren prototrophen Revertanten nachgewiesen werden. Dabei wurde durch Limitierung einer Aminosäure eine Mangelsituation in den Zellen geschaffen, die zur Dereprimierung von Enzymen führte. Die gewonnenen prototrophen Revertanten stellen Stämme dar, deren ehemals blockierte Synthese nicht den notwendigen Substratdurchfluß garantieren können, 29 Z. Allg. Mikrobiol., Bd. 23, H. 7

426

R . BODE und P . CASPEB

da die betroffenen Enzyme sowohl in ihrer Aktivität als auch in ihren kinetischen Parametern verändert sein können. Sie sind vergleichbar mit den bradytrophen Mutanten anderer in dieser Hinsicht untersuchter Mikroorganismen (DELFORGE et al. 1975, NIEDERBERGER et al. 1981, BODE U. BIRNBAUM 1981a). Die erzielten Ergebnisse verdeutlichen, daß bei allen eingesetzten Mutanten und Revertanten Enzymdereprimierungen hervorgerufen werden können. Ein Mangel an Lysin, Histidin, Arginin, Leucin, Threonin, Prolin, Serin, Methionin, Homoserin, Asparagin, Glutamin- oder Asparaginsäure führt in Candida spec. E H 15/D zur Auslösung der allgemeinen Kontrolle. Hinzu kommen noch Tryptophan und Phenylalanin, deren Wirkung durch Verwendung von Analoga nachgewiesen werden konnte (BODE et al. 1983). Unsere Untersuchungen an Doppelmutanten zeigen weiterhin, daß nur eine Aminosäurelimitation notwendig ist, um den maximal möglichen Dereprimierungsfaktor der Enzyme zu erzielen. In Saccharomyces cerevisiae ist praktisch auch jede Aminosäurelimitation in der Lage zu einer Dereprimierung zu führen (NIEDERBERGER et al. 1981), während dies in Neurospora crassa ( K E M P U. F L I N T 1982, BARTHELMESS 1982), Aspergillus nidulans (PIOTROWSKA 1980) und Hansenula henricii (BODE U. BIRNBAUM 1981a) nicht der Fall ist. Mit der Aufhebung der Limitierung in den Mutanten und Revertanten von Candida spec. E H 15/D verschwindet auch die Dereprimierung von Enzymen fast vollständig. Das primäre Signal zur Induzierung der allgemeinen Kontrolle ist offenbar das Fehlen nur einer Aminosäure. Obwohl zu berücksichtigen ist, daß durch die Limitierung die Konzentration vieler Aminosäuren in der Zelle anstieg. Eine Veränderung des intrazellulären Aminosäurepools konnte unter diesen Bedingungen auch bei S. cerevisiae (DELEORGE et al. 1975) und N. crassa (BARTHELMESS et al. 1974) nachgewiesen werden. Die einzelnen Limitationen führten dabei zu teilweise identischen Konzentrationsveränderungen der Aminosäuren in der Zelle. Die in dieser Hinsicht untersuchten beiden Zi/s-Mutanten und Revertanten von Candida spec. E H 15/D zeigten eine ähnliche Tendenz in ihren Aminosäurepools an. Der Überschuß an synthetisierten Aminosäuren kann einmal die direkte Folge der durch eine Aminosäure reduzierten Translation sein bzw. das Ergebnis einer erhöhten Syntheseleistung, hervorgerufen durch die dereprimierten Aminosäure-Biosyntheseenzyme. Diese Unbalanciertheit des Aminosäurehaushaltes der Zellen konnte durch Zufütterung von Aminosäuren auch im Wildstamm induziert werden, die ebenfalls zu Enzymdereprimierungen führte (BODE et al. 1 9 8 3 ) . NIEDERBERGER et al. (1981) konnten bei 8. cerevisiae einen ähnlichen Effekt nachweisen, den sie auf eine Reduzierung anderer Aminosäuren in der Zelle zurückführten. Die Regulation der allgemeinen Kontrolle erfolgt sowohl in Candida spec. E H 15/D (BODE et al. 1983) als auch in S. cerevisiae transkriptional (ZALKIN U. YANOFSKY 1982). Für das HIS 4- und das T R P 5-Gen von 8. cerevisiae konnte nachgewiesen werden, daß diesen Genen eine identische Region vorgelagert ist, die offenbar die Regulationssequenz der allgemeinen Kontrolle darstellt (HAUGE U. GREER 1982).

Literatur BARTHELMESS, I. B., 1982. Mutants affecting amino acid cross-pathway control in Neurospora crassa. Genet. Res. Camb., 39, 169—185. BARTHELMESS, I . B., CURTIS, C. F. and KACSER, H . , 1974. Control of the flux to arginine in Neurospora crassa: derepression of the last three enzymes of the arginine pathway. J. Mol. Biol., 87, 3 0 3 - 3 1 6 . BODE, R. und BIRNBAUM, D., 1978 a. Die Enzyme der Biosynthese aromatischer Aminosäuren bei Hansenula henricii: Charakterisierung der Anthranilat-Synthase. Biochem. Physiol. Pflanzen, 172, 2 4 5 - 2 5 3 .

Kontrolle der Aminosäurebiosynthese

427

BODE, R . u n d BIRNBAUM, D., 1978b. Die E n z y m e der Biosynthese aromatischer Aminosäuren bei Ilansenula henricii: Die Aminotransferasen. Biochem. Physiol. Pflanzen, 173, 44 —50. B O D E , R . u n d B I R N B A U M , D . , 1 9 8 1 A . Allgemeine Regulation der Aminosäurebiosynthese in Hansenwla henricii. Z . Allg. Mikrobiol., 2 1 , 7 1 9 — 7 2 7 . BODE, R. u n d BIRNBAUM, D. 1981 b. Aggregation u n d Trennbarkeit der E n z y m e des Shikimat-Pathway bei Hefen. Z. Allg. Mikrobiol., 21, 417—422. BODE, R . , BÖTTCHER, F . a n d BIRNBAUM, D . , 1980. I s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n of a n t h r a n i l a t e -

excreting m u t a n t s of Hansenula henricii. Cell. Mol. Biol., 26, 615—620. P . u n d K U N Z E , G . , 1983. Die Auslösung der allgemeinen Kontrolle der Aminosäurebiosynthese bei Candida spec. E H 15/D durch Amitrol. Biochem. Physiol. Pflanzen, 178, 457-468. CARSIOTIS, M . a n d L A C Y , A . M . , 1965. Increased activity of t r y p t o p h a n biosynthetic enzymes in histidine m u t a n t s of Neurospora crassa. J . Bacteriol., 89, 1472 — 1477. D E L F O R G E , J . , M E S S E N G U Y , P . and W I A M E , J . - M . , 1975. The regulation of arginine biosynthesis in Saccharomyces cerevisiae. The specificty of argR~ m u t a n t s a n d the general control of amino acid biosynthesis. E u r . J . Biochem., 57, 231—239. FLAVIN, M. a n d SLAUGHTER, C., 1971. y-Cystathionase {Neurospora). I n : Meth. Enzymol., 17B, 433—439 (TABOR, H. a n d TABOR, C. W., Editors). Academic Press New York. H A T F I E L D , G . W . a n d U M B A R G E R , H . E . 1971. L-threonine deaminase, biosynthetic (Bacillus subtilis). I n : Meth. Enzymol., 17B, 561—566 (TABOR, H . and TABOR, C. W., Editors). Academic Press New York. H A U G E , B. and G R E E R , H . , 1982. Constitutive regulatory mutations and a 5' H I S 4 transcript implicated in general control of amino acid biosynthesis in yeast. Proc. 11th I n t e r n . Conf. Yeast Genet. & Molec. Biol. Montpellier, E20. KEMP, B. F. a n d FLINT, H . J . , 1982. Cross-pathway control of ornithine carbamoyltransferase synthesis in Neurospora crassa. J . gen. Microbiol., 128, 1503 — 1507. L O W R Y , 0 . H . , R O S E B R O U G H , N . J . , F A R R , A. L . and R A N D A L L , R . J . , 1 9 5 1 . Protein measurement with t h e Folin phenol reagent. J . biol. Chemistry, 198, 2 6 5 — 2 7 5 . N I E D E R B E R G E R , P . , MIOZZARI, G. and H Ü T T E R , R . , 1 9 8 1 . Biological role of the general control of amino acid biosynthesis in Saccharomyces cerevisiae. Molec. Cell. Biol., 1 , 5 8 4 — 5 9 3 . PIOTROWSKA, M., 1980. Cross-pathway regulation of ornithine carbamoyltransferase synthesis in Aspergillus nidulans. J . gen. Microbiol., 1 1 6 , 3 3 5 — 3 3 9 . SCHMINKE, R . T., 1970. Ornithine carbamyltransferase (Mycoplasma). I n : Meth. Enzymol., 17A, 295—297 (TABOR, H . a n d TABOR, C. W., Editors). Academic Press New York. SCHNAUDER, H . P., MAIER, W. u n d GRÖGER, D., 1981. Einfluß von Amitrol auf Claviceps fusiformis, S t a m m SD 58. Z. Allg. Mikrobiol., 21, 6 8 9 - 6 9 2 . S C H Ü R C H , A . , MIOZZARI, G . a n d H Ü T T E R , R., 1974. Regulation of t r y p t o p h a n biosynthesis in Saccharomyces cerevisiae: mode of action of 5-methyl-tryptophan and 5-methyl-tryptophansensitive m u t a n t s . J . Bacteriol., 117, 1131—1140. BODE, R . , CASPER,

SINHA, A . K . , KURTZ, M . a n d BHATTACHARJEE, J . K . , 1971. E f f e c t of h y d r o x y l y s i n e o n t h e b i o -

synthesis of lysine in Saccharomyces. J . Bacteriol., 108, 715—719. A., O H I S H I , N . and F U K U I , S., 1 9 6 7 . Studies on the formation of vitamins and their functions in hydrocarbon fermentation. Production of vitamin B 6 by Candida albicans in hydrocarbon medium. J . Ferment. Technol., 4 5 , 6 1 7 — 6 2 3 . W O L F N E R , M . , Y E P , D . , M E S S E N G U Y , F . and F I N K , G . R . , 1 9 7 5 . Integration of amino acid biosynthesis into t h e cell cycle of Saccharomyces cerevisiae. J . Mol. Biol., 96, 2 7 3 — 2 9 0 . Z A L K I N , H . a n d Y A N O F S K Y , C., 1 9 8 2 . Yeast gene T R P 5 : structure, function, regulation. J . biol. Chemistry, 257, 1 4 1 9 - 1 5 0 0

TANAKA,

A n s c h r i f t : D r . sc. R . BODE

Ernst-Mori tz-Arndt-Universität Greifswald Sektion Biologie W B Molekularbiologie DDR-2200 Greifswald, J a h n s t r a ß e 15 a

29

Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie

23

1983

428

Buchbesprechungen G. BBEITIG und W . VON TÜMPLING (Herausgeber), Ausgewählte Methoden der Wasseruntersuohung, Band I I : Biologische, mikrobiologische und toxikologische Methoden (2. Überarb. und erweit. Auflage). 579 S., 100 Abb., 88 Tab. Jena 1982. VEB Gustav Fischer Verlag, M 82,00. Die 2. Auflage des 2. Bandes der „Ausgewählten Methoden der Wasseruntersuchung" präsentiert sich in einem neuen Gewand, aus der Loseblattsammlung der 1. Auflage ist ein geschlossener Band entstanden und in einer stark erweiterten und überarbeiteten Fassung. Von den vorliegenden rund 80 biologischen, mikrobiologischen und toxikologischen Analysenanleitungen wurden über 1/5 neu aufgenommen (u. a. Algenkultur, Heterotrophes Potential, Primärproduktion des Periphytons, Sedimentationsrate, Stickstoffbindung mit der Acetylenmethode, verschiedene Toxi•zitätstests wie IRGA-Test oder Forellentest). Andere bereits bewährte Methoden wurden ergänzt lind gegebenenfalls berichtigt bzw. auf den neuesten internationalen Wissensstand gebracht. Die Gliederung der 1. Auflage wurde im wesentlichen belassen. Lediglich verschiedene mikrobiologische Arbeitstechniken zur Erfassung der potentiellen Aktivität wurden dem Abschnitt „Bioaktivität und Biomasse" zugeordnet. Das Buch gliedert sich in 4 Sachgebiete. Die Methoden zur biologischen Wasseruntersuchung werden auf über 350 S. behandelt (Grundlagen zur Analyse der ökologischen Situation, Analyse aquatischer Lebensformgruppen, Bestimmung der Bioaktivität und Biomasse). Ungefähr 70 Seiten sind den wassertoxikologischen Untersuchungstechniken gewidmet. Die hygienisch-mikrobiologischen Methoden nehmen etwa 60 Seiten ein (Allgemeines, Methodische Grundlagen der bakteriologischen Wasseruntersuchung, Virologische Wasseruntersuchung). Mit einer Methode (Wurmeier) sind die parasitologischen Wasseruntersuchungen vertreten. Angaben zur Standardausrüstung der Laboratorien, zur zusammenfassenden Methodenu n d Bestimmungsliteratur, Bildtafeln, Nachträge und ein Sachregister ergänzen das gut gedruckte und hervorragend bearbeitete Buch. Den 69 Autoren, den beiden Redakteuren G. BBEITIG und W. v. TÜMPLING, den Herausgebern und dem Verlag gebühren Dank und Anerkennung für diese gelungene Neugestaltung der Methodensammlung, die keiner besonderen Empfehlung mehr bedarf, da sich ja bereits die 1. Auflage in der Praxis ausgezeichnet bewährt hat. R.

KOSCHEL

(Neuglobsow)

L. E. B R Y A N , Bacterial Resistance and Susceptibility to Chemotherapeutic Agents. 234 S., 16 Abb., 20 Tab. Cambridge 1982. Cambridge University Press. £ 7.95. Das vorliegende Buch behandelt in komprimierter Form die bakterielle Resistenz gegenüber Wirkstoffen und ihre Ursachen. Neben den Labortestmethoden werden vor allem die biochemischen Mechanismen der Antibiotica-Wirkung und der bakteriellen Resistenz, die genetischen Grundlagen der Resistenz, Zusammenhänge zwischen Penetration und Wirkort-Resistenz und die Resistenzeigenschaften klinischer Problemkeime behandelt. Weiterhin wird auf Möglichkeiten eingegangen, die Resistenzausbreitung durch die Entwicklung neuer Wirkstoffe und Inhibitoren der Resistenzmechanismen einzuschränken. Die Strukturformeln wichtiger antibakterieller Wirkstoffe werden im Anhang wiedergegeben. Außerdem enthält das Buch wertvolle Tabellen, die zu den genannten Themen gute Übersichten geben. Die Darstellung kann als ein gelungener Wurf bezeichnet werden, die biochemischen, genetischen und klinischen Aspekte der Resistenzentwicklung in ihrer Dynamik darzustellen. Es ist das Hauptanliegen des Autors, Zusammenhänge insbesonders zwischen Wirkungsmechanismen, Resistenzeigenschaften und Permeation, sichtbar zu machen. Dabei kommen der Darstellung die Erfahrungen des Autors sowohl als Arzt als auch als ausgewiesener Mikrobiologe auf dem Wirkstoffgebiet zugute. In der relativ ausführlichen Darstellung der Resistenzentwicklung gegenüber Aminoglykosiden spiegelt sich das spezielle Arbeitsgebiet des Autors wider. Leider finden sich weder im Text noch in den Übersichtstabellen Literaturhinweise. Jedem Kapitel ist lediglich ein Literaturverzeichnis angefügt, welches aber keinen unmittelbaren Bezug zu bestimmten Textstellen hat. Dies wird als ein echter Mangel des sonst so aufschlußreichen Buches empfunden. Aus diesem Grunde ist das Buch auch weniger als Nachschlagewerk geeignet und als solches wohl auch nicht gedacht. Es dürfte aber allen in der antibakteriellen Wirkstofforschung arbeitenden Biologen, Medizinern und Chemikern wertvolle Anregungen für die eigene Arbeit und f ü r das Erkennen von Zusammenhängen auf diesem Gebiet geben. J . H A U P T (Jena)

Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie

23

1983

429-433

(Akademie der Wissenschaften der D D R , Forschungszentrum für Molekularbiologie und Medizin, Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie, Jena 1 ) und Institut für Biochemie und Physiologie der Mikroorganismen der Akademie der Wissenschaften der UdSSR, Puschtschino (Oka) 2 ))

Cyanide-resistant respiration in Streptomyces

citreoßuorescens

F . HÄNEL 1 ), U . GRÄFE 1 ), S . M. TRUTKO2) a n d V . K . AKIMENKO 2 )

(Eingegangen

am 7.12.

1982)

The capacity of Streptomycetes to carry out cyanide-resistant respiration was investigated. W i t h the model strain, Streptomyces citreofluorescens, it was shown that deprivation of glucose followed by transition from exponential to stationary growth was coupled with declining sensitivity of cellular respiration to cyanide ions. Cyanide-resistant oxidase is located within the cytoplasmic membrane. The occurrence of the cyanide-resistant oxidase did not correspond to qualitative changes of cytochrome spectrum. Cytochrome d is involved neither in cyanide-sensitive nor in cyanide-resistant rspiratory chain.

Several microorganisms display a considerable resistance of their respiration totoxic cyanide ions (HENRY and N Y N S 1 9 7 5 ) . In fungi and bacteria, cyanide-insensitive respiration has been frequently observed under cultivation conditions giving rise to a low activity of the main respiratory chain, as e.g., growth in the presence of specific inhibitors of electron transport or during limitations of oxygen, copper ions, and/or carbon sources (AKIMENKO 1 9 8 1 ) . Concerning the structure and function of the cyanide-resistant oxidase system, at present, two different explanations have been given in the literature. Several authors believe that diminished sensitivity of the bacterial respiration to cyanide can be due to the occurrence of a cytochrome d terminal oxidase (HADDOCK and JONES 1 9 7 7 , HARRISON 1 9 7 6 , JONES 1 9 7 7 , JURTSHUK et al. 1 9 7 5 , KNOWLES 1 9 7 6 , WHITE and SINCLAIR 1 9 7 1 ) . Others proposed that cyanide-resistant oxidase represents an iron-sulfur protein which can accept the reducing equivalents directly from the main path of the respiratory chain at a site located between the coenzyme Q (or the menaquinones) and cytochrome b (AKIMENKO 1 9 8 1 ) . Surprisingly, up to now, no data are available about cyanide-insensitive respiration of Streptomycetes, although members of this group of Gram-positive bacteria have been widely used as producers of antibiotics and other secondary metabolites. Therefore, the present work deals with the capacity of a model strain, Streptomyces citreofluorescens, to carry out cyanide-resistant respiration. I t was the aim of this work to enlarge our understanding of basic respiratory processes in Streptomyces, since oxidative metabolism appears to be coupled with industrial-scale product synthesis in these organisms (MARTIN and DEMAIN 1 9 8 0 ) .

Materials and methods Strain, media and growth conditions: Streptomyces citreofluorescens BKM A-96 from the CultureCollection of Bacteria of USSR was grown in a modified C Z A P E K medium ( W A K S M A N 1950) (g • l - 1 ) : N a N O s 3, KCl 0.5, MgS0 4 0.5, F e S 0 4 0.01, glucose 20, K 2 H P 0 4 1, p H 7.0. A 2-day inoculum was

Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie

23

1983

429-433

(Akademie der Wissenschaften der D D R , Forschungszentrum für Molekularbiologie und Medizin, Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie, Jena 1 ) und Institut für Biochemie und Physiologie der Mikroorganismen der Akademie der Wissenschaften der UdSSR, Puschtschino (Oka) 2 ))

Cyanide-resistant respiration in Streptomyces

citreoßuorescens

F . HÄNEL 1 ), U . GRÄFE 1 ), S . M. TRUTKO2) a n d V . K . AKIMENKO 2 )

(Eingegangen

am 7.12.

1982)

The capacity of Streptomycetes to carry out cyanide-resistant respiration was investigated. W i t h the model strain, Streptomyces citreofluorescens, it was shown that deprivation of glucose followed by transition from exponential to stationary growth was coupled with declining sensitivity of cellular respiration to cyanide ions. Cyanide-resistant oxidase is located within the cytoplasmic membrane. The occurrence of the cyanide-resistant oxidase did not correspond to qualitative changes of cytochrome spectrum. Cytochrome d is involved neither in cyanide-sensitive nor in cyanide-resistant rspiratory chain.

Several microorganisms display a considerable resistance of their respiration totoxic cyanide ions (HENRY and N Y N S 1 9 7 5 ) . In fungi and bacteria, cyanide-insensitive respiration has been frequently observed under cultivation conditions giving rise to a low activity of the main respiratory chain, as e.g., growth in the presence of specific inhibitors of electron transport or during limitations of oxygen, copper ions, and/or carbon sources (AKIMENKO 1 9 8 1 ) . Concerning the structure and function of the cyanide-resistant oxidase system, at present, two different explanations have been given in the literature. Several authors believe that diminished sensitivity of the bacterial respiration to cyanide can be due to the occurrence of a cytochrome d terminal oxidase (HADDOCK and JONES 1 9 7 7 , HARRISON 1 9 7 6 , JONES 1 9 7 7 , JURTSHUK et al. 1 9 7 5 , KNOWLES 1 9 7 6 , WHITE and SINCLAIR 1 9 7 1 ) . Others proposed that cyanide-resistant oxidase represents an iron-sulfur protein which can accept the reducing equivalents directly from the main path of the respiratory chain at a site located between the coenzyme Q (or the menaquinones) and cytochrome b (AKIMENKO 1 9 8 1 ) . Surprisingly, up to now, no data are available about cyanide-insensitive respiration of Streptomycetes, although members of this group of Gram-positive bacteria have been widely used as producers of antibiotics and other secondary metabolites. Therefore, the present work deals with the capacity of a model strain, Streptomyces citreofluorescens, to carry out cyanide-resistant respiration. I t was the aim of this work to enlarge our understanding of basic respiratory processes in Streptomyces, since oxidative metabolism appears to be coupled with industrial-scale product synthesis in these organisms (MARTIN and DEMAIN 1 9 8 0 ) .

Materials and methods Strain, media and growth conditions: Streptomyces citreofluorescens BKM A-96 from the CultureCollection of Bacteria of USSR was grown in a modified C Z A P E K medium ( W A K S M A N 1950) (g • l - 1 ) : N a N O s 3, KCl 0.5, MgS0 4 0.5, F e S 0 4 0.01, glucose 20, K 2 H P 0 4 1, p H 7.0. A 2-day inoculum was

430

F . H A K E L , U . GKAFE, S . M . TRUTKO a n d V . K . AKIMENKO

grown in a modified OGATA medium (MINASYAN et al. 1978) (g • L"1): glucose 50, Bacto peptone 10, soya meal 5, K N 0 3 2, MgS0 4 • 7 H 2 0 0.5, CaCl2 • 2 H 2 0 0.1, p H 7.0. The cultivation was carried out in shake flasks (750 ml) containing 50 ml medium at 30 °C on a rotary shaker (200 r.p.m.). The mycelial dry weight was measured gravimetrically. Respiration measurements: The intensity of respiration of mycelia and preparations of membranes was measured polarographically with a CLARKE type platinum electrode, coated with a t e f l o n membrane (22—25 °C). The respiration medium contained ( n m ) : KC1 60, NaCl 60, N a H 2 P 0 4 6.5, MgCl 2 4, E D T A 0.1, Tris-HCl 10, p H 7.2. In the inhibition experiments 1 QM cyanide was added at zero time. Membrane preparations: The mycelium was harvested b y centrifugation (15 min, 5000 g), washed with 0.1 M NaCl, resuspended in 10 mM Tris-HCl (pH 7.4) and 10 m i l MgCl 2 and disrupted by 5-times sonic treatment for each 1 min using a MSE-150 sonic oscillator whereby the temperature was maintained below 4 °C. Mycelial debris was spun at 10000 g (15 min). Subsequently, the supernatant was centrifuged at 1 0 5 0 0 0 g (120 min) and the sediment was resuspended in the same buffer. Protein content of membranes was assayed according to GORNALL et al. (1949). Measurement of cytochrome levels: Cytochrome spectra of whole mycelia and membrane preparations, respectively, were recorded b y measuring the oxidized ( H 2 0 2 ) versus the reduced (dithionite) forms at room temperature and 77 K using a HITACHI model C-356 spectrophotometer. To record CO spectra, both cuvettes were supplied with dithionite and, subsequently, one of t h e m was gassed with carbon monoxide for at least 3 min. Quantitative calculations were based on molar-absorbances ( m M - 1 • c m - 1 ) of 14.0 for cytochrome a (SMITH 1978); 22.1 for cytochrome 6 (MATSUSHITA et al.

1 9 7 9 ) ; 2 8 . 3 f o r c y t o c h r o m e o (SMITH 1 9 7 8 ) .

Glucose estimation: Glucose in the medium was estimated b y use of common glucose oxydase m e t h o d (JEMMALLI a n d R O D R I G E S - K A B A N A

1970).

Results and

discussion

Fig. 1 displays t h a t cellular respiration of Streptomyces citreofluorescens was inhibited by 1 MM cyanide and t h a t the degree of inhibition depended on the age of culture. Obviously, deprivation of glucose followed by transition from exponential to stationary growth appears to be coupled with declining sensitivity of cellular respiration to cyanide ions. Thus, the degree of inhibition decreased from 70% in the 24 h to 40% in the 144 h. Concomitantly, the endogenous respiration diminished to a value of approx. 15% of the activity found during exponential development. According to A K I M E N K O (1981), transition from logarithmic growth to stationary phase forms an essential prerequisite for the occurrence of cyanide-insensitive respiration in cultures of several bacteria. Under these conditions it seems likely t h a t the main pathway of respiration will be inhibited due to the accumulation of high-energy molecules (ATP, NADH) not being used any more for biosynthetic processes. Consequently, futile cycles as, e.g., cyanide-resistant respiration can be induced which are characterized by a very low efficiency of energy conversion. As it has been proposed ( A K I M E N K O 1981), cyanide-resistant respiration of microorganisms can be caused either by changes in the terminal steps of the main respiratory pathway or by the occurrence of a cytosolic flavine oxidase being effective independently from the normal respiratory chain. In order to explain the causes of cyanide-resistant respiration of Streptomyces citreofluorescens, we investigated the inhibition by cyanide of oxygen uptake using both complete mycelia and preparations of cytoplasmic membranes. According to Fig. 1 intact mycelia and membranes showed the same degree of inhibition of the respiration, suggesting t h a t the cyanide-resistant oxidase is located within the cytoplasmic membrane as an integral part of the respiratory system. From the above experiments it seemed not clear whether cyanide-resistant respiration corresponds to qualitative or quantitative alterations of cytochrome spectra. Therefore, we recorded the redox-difference spectra of cytochromes from membranes showing either cyanide-sensitive or cyanide-insensitive respiratory activity at deep temperature (77 K) (Fig. 2). The membrane preparations did not differ in their cyto-

Cyanide-resistant respiration in

431

Streptomyces

100

BO.

F' 20

.5 ^

70

SO

S fe 1 1

10

I S "

S 555 was proved by a weak shoulder at 555 nm which became more evident in the appropriate membrane preparations from the logarithmic phase. In addition, the levels of all cytochromes were elevated in the membranes from stationary phase cultures (Table 1). Table 1 Cytochrome contents of membrane preparations of Streptomyces on the growth phase Growth phase

logarithmic stationary

citreofluroescens in dependence

Cytochrome content (nmol per mg protein) b

c

a

0

0.322 0.555

0.182 0.229

0.139 0.177

not estimated 0.241

432

F. HÄNEL, U . GRÄFE, S. M. TKUTKO a n d V. K . AKIMBNKO

In whole cells as well as in the pertinent membrane preparations from both the logarithmic and the stationary phase, the presence of a second cytochrome o-type terminal oxidase could be established (Fig. 3). It should be mentioned at this point, however, that the occurrence of the cyanide-resistant oxidase in membranes from stationary phase cultures did not correspond to qualitative changes of cytochrome spectrum. In contrast to literature data (HADDOCK and JONES 1977, HARBISON 1976,

i

m

-i—i—i 550

i

i

i

i

500

i

i

i

630

Wavelength (nm )

Fig. 2. Cytochrome spectra of membrane preparations, recorded at 77 K. 1 — exponential growth (48 h), 2 — stationary growth (96 h). Protein concentration in the cuvettes 1.3 and 1.8 mg • ml - 1 , respectively

JONES 1 9 7 7 , JURTSHUK et al.

1 9 7 5 , KNOWLES 1 9 7 6 , W H I T E a n d SINCLAIR 1 9 7 1 ) s u g -

gesting that cyanide-resistant respiration may be coupled to the presence of cytochrome d, the results presented above disclose that, at least in the investigated Streptomyces citreofluorescens, unsensitivity to cyanide does not require the occurrence of this terminal oxidase. Seen in this light, it appears more likely that cyanide-insensitive respiration can be carried out via an iron sulfur protein similar as it has been shown for Pseudomonas aeruginosa (AKIMENKO 1981). But clearly, further experiments are necessary to further support this hypothesis.

433

Cyanide-resistant respiration in Streptomyces 420

\ l

550

400

600

650

Wavelength Inm) Pig. 3. CO spectrum of the whole mycelium from the stationary growth phase (96 h). Protein concentration in the cuvettes 6 mg -ml" 1 References A K I M E N K O , V . K . , 1 9 8 1 . Cyanide-resistant respiration 16, 3 - 3 0 . GORNALL, A. G., B A B D A W I L L , C. J . and DAVID, M. M.,

in microorganisms. Uspekhi Mikrobiologii,

1949. Determination of serum proteins by means of biuret reaction. J . biol. Chem., 177, 751—766. HADDOCK, B. A. and J O N E S , C. W., 1977. Bacterial respiration. Bacteriol. Rev., 41, 47—99. HARRISON, D. F. F., 1976. Regulation of respiration in growing bacteria. Adv. Microbiol. Physiol., 14, 243-313. H E N R Y , M . F . and N Y N S , E . J . , 1 9 7 5 . Cyanide-insensitive respiration. An alternative mitochondrial pathway. Sub-Cell Biochem., 4, 1—65. J E M M A L L I , M . and R O D R I G E S - K A B A N A , R . , 1 9 7 0 . A polarographic method for the rapid determination of glucose with glucose-oxidase. Anal. Biochem., 3 7 , 2 5 3 — 2 5 6 . J O N E S , C. W., 1977. Aerobic respiratory system in bacteria. In: Microbial Energetics (Editors: HADDOCK, B . A. and HAMILTON, W . A.). Cambridge University Press Cambride—London— New York—Melbourne, p. 33—59. J U R T S H U K , P. J R . , M U E L L E R , T. J . and ACORD, W. C., 1975. Bacterial terminal oxidases. Critical Rev. Microbiol., 3, 399—468. KNOWLES, C. J., 1976. Microorganisms and cyanide. Bacteriol. Rev., 40, 652 —680. MARTIN, J . F . and D E M A I N , A . L . , 1 9 8 0 . Control of antibiotic biosynthesis. Microbiol. Rev., 4 4 , 230-251. MATSUSHITA, K . , SHINAGAWA, E . , ADACHI, 0 .

and AMLYAMA, M., 1979. Membrane-bound gluconate dehydrogenase from Pseudomonas aeruginosa. J . Biochem., 85, 1173 —1181. M I N A S Y A N , A . E . , C H E R M E N S K Y , D . N. and E L L A N S K A Y A , I . A . , 1 9 7 8 . Synthesis of enniatin in a culture of Fusarium sambucinum F U C K 5 2 3 7 7 . Mikrobiologiya, 4 7 , 6 7 — 7 1 . S M I T H , L., 1978. Bacterial cytochromes and their spectral characterization. Meth. Enzymol., 53, part D, 202-212. W A K S M A N , S. A., 1950. The actinomycetes: Their nature, occurrence, activities and importance. Annals of Cryptogamic Phytopathology, 22, 1 —230. W H I T E , D. C. and SINCLAIR, P. R., 1971. Branched electron transport systems in bacteria. Adv. Microbial. Physiol., 5, 173—211. Mailing address : Dr. F. H Ä N E L Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der AdW DDR-6900 Jena, Beutenbergstraße 11

Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie

23

1983

434

Buchbesprechung H . D a l t o x (Editor), Miorobial Growth on Compounds (Proceedings of t h e Third I n t e r n a t i o n a l Symposium held in Sheffield, U K 1 2 - 1 6 August 1980). X I I I + 377 S., 120 Abb., 86 T a b . London—Philadelphia—Rheine 1981. H e y d e n . £ 28.00. U n t e r dem einheitlichen Titel des mikrobiellen W a c h s t u m s auf (^-Verbindungen werden in dem vorliegenden S y m p o s i u m s b a n d im wesentlichen drei recht unterschiedliche physiologische Prozesse behandelt, nämlich die Methylotrophie als oxidativer A b b a u v o n Methan, Methanol u n d anderen C r V e r b i n d u n g e n , die Methanbildung u n d die a u t o t r o p h e C0 2 -Fixierung. Zur Sprache k o m m e n F o r t s c h r i t t e in der Biochemie dieser Prozesse, w ä h r e n d F r a g e n des W a c h s t u m s als hier mehr formale K l a m m e r des Symposiums n u r a n wenigen Stellen wiederaufgegriffen werden. Den aktuellen M i t t e l p u n k t des Buches bildet zweifellos die Methylotrophie m i t den fünf Sitzungen Stoffwechsel, Energetik, neue Entwicklungen, Taxonomie u n d a n g e w a n d t e Aspekte. Die Beiträge geben ganz überwiegend sowohl k n a p p e f a c h k u n d i g e E i n f ü h r u n g e n wie auch Einblicke in den aktuellen S t a n d der verschiedenen Probleme, u n d daneben f i n d e n sich natürlich entsprechend dem Zweck des Symposiums viele handfeste Originalergebnisse. B e h a n d e l t werden im einzelnen die Eigenschaften von Methanmonooxigenasen einschließlich ihrer Spezifität f ü r höhere Kohlenwasserstoffe, Methanoldehydrogenasen u n d deren neue prosthetische G r u p p e PQQ (engl, pyrroloquinolinequinone), C-fixierende Stoffwechselwege bei Methylotrophen, Beziehungen zwischen Methylotrophie u n d Autotrophie, W a c h s t u m auf Methylaminen, Energetik u n d C-Assimilation bei met h y l o t r o p h e n Hefen, m e t h a n o t r o p h e Hefen, Elektronentransportwege u n d A T P - B i l d u n g bei Methylotrophen, T a x o n o m i e m e t h y l o t r o p h e r Bakterien u n d Hefen, erste genetische Versuche bei diesen Organismen, Bewertung von W a c h s t u m s e r t r ä g e n , Herstellung von Einzellerprotein m i t Methanol u n d einige spezielle Beiträge. Die anderen behandelten Stoffwechseltypen t r e t e n in diesem B u c h in U m f a n g u n d B e d e u t u n g deutlich hinter der Methylotrophie zurück. Die Sitzung zur Autotrophie beschäftigt sich mit der Regulation der C0 2 -Fixierung im CALVIN-Zyklus p h o t o t r o p h e r u n d chemolithotropher Bakterien, der Chemolithotrophie bei Desulfovibrio, der Mixotrophie, d e m W a c h s t u m auf K o h l e n m o n o x i d im Vergleich m i t H 2 u n d F o r m i a t sowie Auto- u n d Heterotrophie bei Cyanobakterien. Die Methanbildung wird mit einer Sitzung recht k n a p p b e h a n d e l t ; hier stehen die Gärungsstöchiometrie von Methanosarcina, C-Einbau, W a c h s t u m auf Methylaminen, neuartige Coenzyme der Methanbildung, Eigenschaften der Methylreductase, die Energiekopplung u n d ATP-Bildung dieser Organismen u n d weitere Bemerkungen zu ihrer Evolution im B l i c k p u n k t des Interesses. Trotz des direkten D r u c k s von den M a n u s k r i p t e n ist das Buch g u t lesbar; die Abbildungen werden den Erfordernissen voll gerecht. Besonders anerkennenswert ist der g u t ausgearbeitete Sachindex, der dem Leser gezieltes Suchen nach seinen F r a g e n erlaubt. D a s Buch wendet sich a n alle F a c h l e u t e des mikrobiellen Cj-Stoffwechsels, insbesondere wenn sie das betreffende Symposium n i c h t besuchen k o n n t e n , u n d darüber hinaus a n alle, die einen aktuellen Einstieg in dieses Gebiet suchen u n d sich von hier aus die ältere L i t e r a t u r erschließen wollen. A. C. S c h w a b t z (Bonn)

Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie

23

1983

435-441

(Department of Genetics and Plant Breeding, Institute of Agricultural Sciences, Banaras Hindu University, Varanasi-221005 1 and School of Life Sciences, University of Hyderabad, Hyderabad-500 1342, India)

Inhibition of photosystem II of nitrogen-fixing blue-green alga Nostoc linckia b y the rice-field herbicide benthiocarb R . K . SINGH 1 , B . D . SINGH 1 a n d H . N . SINGH 2 (Eingegangen

am

23.11.1982)

Effects of rice-field herbicide benthiocarb (S-(4-chlorobenzyl)-N,N-diethyl thiolcarbamate) was studied on the nitrogen-fixing blue-green alga Nostoc linckia. The herbicide caused inhibition of growth and heterocyst formation, an increase in intensity of photoacoustic signals, and a fourfold reduction in oxygen evolution, but did not affect dark 0 2 -uptake. The inhibition of growth and heterocyst formation was relieved by 500 (xg/ml glucose. A Het~Nif~ mutant of Nostoc muscorum failed to show an increase in reversion frequency after treatment with 10 (J.g/ml benthiocarb for 1 hr.

Contribution of blue-green algae to the nitrogen economy of paddy fields is wellr e c o g n i s e d ( D E 1 9 3 9 , SINGH 1 9 6 1 , W A T A N A B E 1 9 6 2 , 1 9 7 8 , VENKATARAMAN a n d GOYAL

1968) and transfer of fixed nitrogen to rice (RENAUT et al. 1975, VENKATARAMAN 1 9 7 7 ) a n d o t h e r h i g h e r p l a n t s (MAYLAND a n d MCINTOSH 1 9 6 6 , STEWART 1 9 6 7 ) h a s

been demonstrated. Natural soil nitrogen fertility is a crucial factor for attaining yield increase in rice (KOYAMA et al. 1973). Extensive application of herbicides and other toxic chemicals might adversely affect blue-green algae, and thereby the nitrogen economy of paddy fields. Therefore, it is important to evaluate the effects of such chemicals on natural nitrogen fixers. Commonly used herbicides appear to primarily inhibit photosynthesis by blocking photolysis of water (BISHOP 1958, 1962, ASHTON a n d CRAFTS 1 9 7 3 , MORELAND 1 9 8 0 ) , a n d p o s s i b l y i n t e r f e r e w i t h

primary

energy transfer (ZWEIG et al. 1963). Further, some of the herbicides are potent mutag e n s i n b l u e - g r e e n a l g a e (SINGH a n d VAISHAMPAYAN 1 9 7 8 , SINGH et al. 1978).

Benthiocarb, commonly known as saturn, is a widely used broad spectrum herbicide in rice-fields both as pre- and postemergence applications. It is reported to inhibit the HILL reaction in spinach chloroplasts, rice and barnyard grass, and also root respiration and «-amylase biosynthesis in seeds of rice and barnyard grass ("Saturn" Bull. Kumiai Chemical Industries CO. Ltd. Tokyo, Japan). However, there is no information on bioaction of this herbicide on blue-green algae. The present paper desribes the effect of benthiocarb on growth, nitrogen fixation, mutagenecity, and its mode of action in the blue-green algae Nostoc linckia and Nostoc muscorum.

Materials and methods Organism and growth media: The heterocystous nitrogen-fixing (Het + Nif + ) blue-green alga Nostoc linckia was isolated from local rice-fields and was used in the present study after raising clonal and axenic populations by standard microbiological techniques. A nonheterocystous nonnitrogen-fixing (Het~Nif~) mutant strain of heterocystous nitrogen-fixing (Het + Nif + ) blue-green alga Nostoc muscorum• (SINGH and SINGH 1981a) was used for testing mutagenecity of the herbi-

Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie

23

1983

435-441

(Department of Genetics and Plant Breeding, Institute of Agricultural Sciences, Banaras Hindu University, Varanasi-221005 1 and School of Life Sciences, University of Hyderabad, Hyderabad-500 1342, India)

Inhibition of photosystem II of nitrogen-fixing blue-green alga Nostoc linckia b y the rice-field herbicide benthiocarb R . K . SINGH 1 , B . D . SINGH 1 a n d H . N . SINGH 2 (Eingegangen

am

23.11.1982)

Effects of rice-field herbicide benthiocarb (S-(4-chlorobenzyl)-N,N-diethyl thiolcarbamate) was studied on the nitrogen-fixing blue-green alga Nostoc linckia. The herbicide caused inhibition of growth and heterocyst formation, an increase in intensity of photoacoustic signals, and a fourfold reduction in oxygen evolution, but did not affect dark 0 2 -uptake. The inhibition of growth and heterocyst formation was relieved by 500 (xg/ml glucose. A Het~Nif~ mutant of Nostoc muscorum failed to show an increase in reversion frequency after treatment with 10 (J.g/ml benthiocarb for 1 hr.

Contribution of blue-green algae to the nitrogen economy of paddy fields is wellr e c o g n i s e d ( D E 1 9 3 9 , SINGH 1 9 6 1 , W A T A N A B E 1 9 6 2 , 1 9 7 8 , VENKATARAMAN a n d GOYAL

1968) and transfer of fixed nitrogen to rice (RENAUT et al. 1975, VENKATARAMAN 1 9 7 7 ) a n d o t h e r h i g h e r p l a n t s (MAYLAND a n d MCINTOSH 1 9 6 6 , STEWART 1 9 6 7 ) h a s

been demonstrated. Natural soil nitrogen fertility is a crucial factor for attaining yield increase in rice (KOYAMA et al. 1973). Extensive application of herbicides and other toxic chemicals might adversely affect blue-green algae, and thereby the nitrogen economy of paddy fields. Therefore, it is important to evaluate the effects of such chemicals on natural nitrogen fixers. Commonly used herbicides appear to primarily inhibit photosynthesis by blocking photolysis of water (BISHOP 1958, 1962, ASHTON a n d CRAFTS 1 9 7 3 , MORELAND 1 9 8 0 ) , a n d p o s s i b l y i n t e r f e r e w i t h

primary

energy transfer (ZWEIG et al. 1963). Further, some of the herbicides are potent mutag e n s i n b l u e - g r e e n a l g a e (SINGH a n d VAISHAMPAYAN 1 9 7 8 , SINGH et al. 1978).

Benthiocarb, commonly known as saturn, is a widely used broad spectrum herbicide in rice-fields both as pre- and postemergence applications. It is reported to inhibit the HILL reaction in spinach chloroplasts, rice and barnyard grass, and also root respiration and «-amylase biosynthesis in seeds of rice and barnyard grass ("Saturn" Bull. Kumiai Chemical Industries CO. Ltd. Tokyo, Japan). However, there is no information on bioaction of this herbicide on blue-green algae. The present paper desribes the effect of benthiocarb on growth, nitrogen fixation, mutagenecity, and its mode of action in the blue-green algae Nostoc linckia and Nostoc muscorum.

Materials and methods Organism and growth media: The heterocystous nitrogen-fixing (Het + Nif + ) blue-green alga Nostoc linckia was isolated from local rice-fields and was used in the present study after raising clonal and axenic populations by standard microbiological techniques. A nonheterocystous nonnitrogen-fixing (Het~Nif~) mutant strain of heterocystous nitrogen-fixing (Het + Nif + ) blue-green alga Nostoc muscorum• (SINGH and SINGH 1981a) was used for testing mutagenecity of the herbi-

436

R . K . SINGH, B . D . SINGH a n d H . N . SINGH

cide. Cultures were routinely grown in Chu No. 10 medium as modified by G E R L O F F et al. (1950) and were maintained in exponential phase by transferring to fresh medium every seven days and shaken daily for 1 hr in an orbital incubator ( S I N G H and S I N G H 1981b). The basal medium without fixed N source or supplemented with 5 mM KN0 3 was designated as N2 or NO"j medium.Throughout the study, NO^-grown exponential phase cultures were used as inocula, after harvesting and washing thrice with distilled water, unless otherwise stated. Growth and heterocyst frequency were recorded as described previoulsy ( S I N G H and S I N G H 1981b). Photoacoustic spectroscopy: A photoacoustic spectrometer (PAS) model 6001 was used to study the effect of benthiocarb on photosynthetic energy transformation in N. linckia. 50 ml samples from N2- and NOj-grown exponential phase cultures, having comparable optical densities, were centrifuged, washed and resuspended in 1 ml of the respective media. From this concentrated suspension, 0.5 ml was adsorbed onto cotton wool, kept in sample holder and the spectrum was recorded ( C A H E N et al. 1 9 7 8 ) . The same sample was then saturated with 0 . 5 ml of 4 (¿g/ml benthiocarb, and the spectrum was recorded again. The spectra were corrected with corbon black and cotton wool soaked with 0.5 ml herbicide (4 ¡jLg/ml). Oxygen-evolution: Oxygen-evolution and uptake was studied using a CLARK-type electrode ( R A N K brothers) following S I N G H (1980). Algal filaments in exponential phase, grown in N2 or NOJ medium, were harvested, washed 3—4 times with distilled water, and resuspended in 3 ml reaction buffer containing equal parts of COj buffer (7 parts 0.1 M NaHC0 3 : 3 parts 0.1 M Na2C03) and A V R O N ' S medium (Tris/HCl 15 M M , pH 7.8, NaCl2 2 M M , MgCl2 4 M M and potassium phosphate buffer, 4 MM). Reaction was started in dark and then illuminated with a projector lamp (1000 W) providing 3000 lux light at the surface of reaction vessel. Temperature of the reaction vessel was maintained at 30 °C by circulating water. The herbicide was added, when required, to a final concentration of 4 [ig/ml through stopper hole by a microsyringe. Chlorophyll a was estimated by the mehod of M A C K I N N B Y (1941). Mutagenesis and reversion analysis: Mutagenesity of the herbicide was scored as reversion frequency of a Het~Nif" mutant of the blue-green alga N\ muscorum to prototrophy (Het + Nif + ) on solid N2 medium ( S T E W A R T and S I N G H 1975). A 10 [ig/ml dose of the herbicide for 1 hr, which permitted about 50% survival, was used in this study. Benthiocarb, a carbamate group herbicide, having chemical name and structure as below was obtained from K O M I A I Chemical Industries CO. Ltd., Tokyo, Japan (50% active ingradients). (S-(4-chlorobenzyl)-N,N-diethyl thiolcarbamate) O /=\ II /C2HJ ci—4 >—CH2SCN< \C2H5 For each experiment fresh herbicide solution was prepared in double distilled water. All other chemicals were of reagent grade, from BDH Ltd.) Bombay, India.

Results N. linckia grew well in the N 2 medium as well as in the N O j medium. In the N 2 medium, 5—6% cells differentiated into heterocyst; the differentiation was completely suppressed by 5 mM N O j in the medium. The alga utilized exogenous glucose as carbon and/or energy source (Fig. 1A, B). Growth of the alga was inhibited by the herbicide both in N 2 and N O j media, and the inhibition was concentration-dependent. At 4 fig/ml, growth was completely inhibited in both the media (Fig. 1 A, B). The growth inhibition by the herbicide was almost fully reversed by exogenous glucose at 500 [J.g/ml (Fig. 1 A, B). The alga formed 5 — 6 per cent heterocyst within 24 hr of transfer of nonheterocystous filaments from NO3 medium to the N 2 medium. The herbicide suppressed heterocyst differentiation in the N 2 medium; the inhibition increased with herbicide concentration, and there was no heterocyst differentiation in cultures containing 4 [xg/nil herbicide (Fig. 2c—f). Exogenous glucose (500 fig/ml) did not appear to affect heterocyst differentiation in the N 2 medium (Fig. 2b), but the herbicide inhibition of heterocyst differentiation was completely relieved by 500 ¡i.g/ml glucose (Fig. 2g).

Inhibition of PS I I of Nostoc by benthiocarb

Incubation

437

(days)

Pig. 1. Growth (OD at 665 nm) of N. linckia in control ( o ) , 500 [J-g/ml glucose ( • ) ; 1 ug/ml ( A ) , 2 ¡J.g/ml (A), 3 (J-g/ml ( • ) , 4 ¡xg/ml ( • ) benthiocarb and 4 |J.g/ml benthiocarb + 500 ug/ml glucose ( x ) in N 2 ( A ) and N O j (B) media, respectively

Fig. 2. Heterocyst frequency ( % ) of N. linckia in N 2 medium with or without benthiocarb and/or glucose: Control (a), 500 (J-g/ml glucose (b), 1 (¿g/ml (c), 2 (Jg/ml (d), 3 (J-g/ml (e), 4 (J-g/ml ( f ) benthiocarb, and 500 ¡J-g/ml glucose plus 4 (xg/ml benthiocarb (g)

Algal filaments gave three distinct P A signals at 440, 620 and 675 nm in the visible spectrum ; of these 440 and 675 nm signals correspond to chlorophyll, while 620 nm signal represents phycocyanin (Fig. 3). The 620 nm signal in NOj-grown filaments was more pronounced than in the N2-grown filaments. The herbicide-treated N2- and NO^ grown filaments showed a relatively higher P A signal at 675 nm than the untreated filaments. N2-grown filaments of N. linckia, evolved oxygen with a rate of 657.58 ¡j.M/mg Chi a X hr and consumed 149.56 [j.M/mg Chi a X hr oxygen in the dark (Fig. 4a) ; this was significantly higher than 02-evolution (525.60 |iM/mg Chi a x hr) and dark 02-uptake

438

R . K . SINGH, B . D . SINGH a n d H . N . SINGH

Fig. 3. Photoacoustic spectrum of N a - and NOj-grown filaments of N. linchia without ( ) or with 4 (xg/ml benthiocarb treatment ( - - - - ; ), respectively

Fig. 4. Oxygen evolution and dark 02-uptake of N 2 - and NOj"-grown filaments of N. linckia without (a and b) or with (c and d) benthiocarb treatment, respectively. The arrow indicates the time when filaments were illuminated

Inhibition of PS I I of Nostoc by benthiocarb

439

(121.38 [AM/mg Chi œ x h r ) by NO-j-grown filaments (Fig. 4b). Addition of 4 fxg/ml of herbicides in the reaction vessel reduced 0 2 -evolution to nearly one-fourth in the N 2 grown (168.24 [i.M/mg Chi a x hr) and NO^-grown (145.74 [xM/mg Chi ax hr) filaments, whereas the dark 0 2 -uptake remained unaffected (Fig. 4c, d). The H e t " N i f ~ mutant strain reverted spontaneously to prototrophy with a frequency of 2.6 X 10~7. Treatment with the herbicide did not increase the reversion frequency (2.4 x 10~7) over the spontaneous level; a total of 1010 cells were screened.

Discussion D C M U (3-(3,4-dichlorophenyl),-l-dimethyl urea) is a specific inhibitor of the HILL reaction (photosystem I I ) which blocks the photochemically generated reducing power ( N A D P H 2 ) formation without any adverse effect on formation of A T P through cyclic photophosphorylation (BISHOP 1958, 1962). Photoautotrophs fail to recover D C M U inhibition of growth in the presence of a exogenous carbon source like glucose, fructose or sucrose, whereas photoheterotrophs show rapid recovery of growth under identical conditions. STANIER (1973) has used D C M U in classifying blue-green algae into obligate photoautotrophs and photoheterotrophs. This simple technique can be used in studying the mode of action of herbicides if they are suspected to be inhibitors of photosynthesis in photoheterotrophs. Growth of N. linckia at the expense of exogenous carbon source clearly indicates it to be a photoheterotroph. The protection of growth and heterocyst formation from herbicide inhibition by an exogenous carbon source (glucose) clearly shows that benthiocarb has an inhibitory effect on photo synthetic C0 2 assimilation and that the formation of heterocyst requires carbon supply. These findings further support the conclusion that N. linckia is a photoheterotroph. As the P A S directly measures the thermal energy generated upon absorption of radiation by the sample, the P A signal of the sample with inhibited photosynthesis should give a higher P A signal than the normal one. A higher P A signal was generated by algal filaments treated with the herbicide than that from the untreated ones. The increase in the intensity (height) of the P A signal of the treated samples seems to be due to inhibition of photosynthetic conversion of light energy into chemical energy (no photochemical loss) as a result of which that amount of light energy is converted into heat resulting in a higher P A signal. These results suggest that the herbicide benthiocarb inhibits the transformation of light energy into chemical energy. The drastic inhibition of photosynthetic 0 2 -evolution, but not of dark 0 2 -uptake, in the herbicide-treated samples gives a more direct evidence for the inhibition of the HILL reaction (photosystem I I ) by the herbicide. 0 2 -evolution experiments also suggest that N 2 -grown filaments develop more chlorophyll and are more efficient photosynthetically than NO^-grown filaments, whereas the later develop more phycocyanin. These findings clearly demonstrate that the inhibition of growth and of heterocyst formation by the herbicide benthiocarb is primarily through inhibition of photosystem I I similar to that by DCMU. Benthiocarb failed to increase the reversion frequency of the Het~Nif~ mutant of N. muscorum to prototrophy ( H e t + N i f + ) over the observed spontaneous level. This indicates that the herbicide is not mutagenic in this system. However, its mutagenecity in other systems should be investigated before the herbicide may be accepted as nonmutagenic.

440

R . K . SINGH, B . D . SINGH a n d H . N . SINGH

A

cknowledgement

The financial support by Council of Scientific and Industrial Research, New Delhi to R K S is gratefully acknowledged.

References ASHTON,

504.

F. M. and

CRAFTS,

A. S., 1973. Mode of Action of Herbicides. John Wiley Press New York,

N. I., 1958. The influence of the herbicide DCMU, on the oxygen-evolving system of photosynthesis. Biochim. biophysica Acta, 27, 205—206. B I S H O P , N. I., 1962. Inhibition of the oxygen-evolving system of photosynthesis by amino-triazines. Biochim. biophysica Acta, 57, 186 —189. C A H E N , D., M A L K I N , S . and L E R N E R , E . I., 1 9 7 8 . Photoacoustic spectroscopy of chloroplast membranes: Listening to photosynthesis. F E B S Lett., 92, 3 3 9 — 3 4 2 . DE, P. K., 1939. The role of blue-green algae in nitrogen fixation in rice-fields. Proc. R. Soc. London Ser. B, 127, 121—139. F O G G , G . E . , 1 9 7 1 . Blue-green algae in rice cultivation. Proc. 3rd. Int. Conf. on the Global Impacts of Applied Microbiology. Univ. Bombay, India. 46 —52. G E R L O F F , G . C . , F I T Z G E R A L D , G . P . and SKOOG, F . , 1 9 5 0 . The isolation, purification and culture of blue-green algae. Amer. J . Bot., 37, 2 1 6 — 2 1 8 . K O Y A M A , T., C H A M M E K , C . and N I A M A R I C H A N D , N., 1 9 7 3 . Nitrogen application technology for tropical rice as demonstrated by field experiments using 15N tracer technique. Tech. Bull. Trop. Agric. Cent. Japan, 3, 1 —79. M A C X I N N E Y , G . , 1 9 4 1 . Absorption of light by chlorophyll solutions. J . Biol. Chem., 140, 3 1 5 — 3 2 2 . 15 M A Y L A N D , H. F. and M C I N T O S H , T. H., 1966. Availability of biologically fixed atmospheric N to higher plants. Nature, 209, 421—422. M O R E L A N D , D. E., 1980. Mechanisms of action of herbicides. Ann. Rev. Plant Physiol., 31, 597 to 638. R E N A U T , J., SASSON, A., P E A R S O N , H. W. and S T E W A R T , W. D. P . , 1975. Nitrogen-fixing algae in Morocco. I n : Nitrogen Fixation by Free-Living Microorganisms (W. D. P. S T E W A B T , ed.). Cambridge Univ. Press Cambridge, London, pp. 229—248. S I N G H , H. N. and V A I S H A M P A Y A N , A., 1978. Biological effects of rice-field herbicide machete on various strains of the nitrogen-fixing blue-green alga Nostoc muscorum. Env. Exp. Bot., 18, 8 7 - 9 4 . S I N G H , H . N . , S I N G H , H . R . and V A I S H A M P A Y A N , A . , 1 9 7 8 . Toxic and mutagenic action of the herbicide alachlor (Lasso) on various strains of the nitrogen-fixing blue-green alga Nostoc muscorum and characterization of the herbicide induced mutants resistant to methylamine and L-methionine-DL-sulfoximine. Env. Exp. Bot., 19, 5 — 12. S I N G H , R. K., 1980. Genetic regulation of heterocyst and nitrogen fixation in the blue-green alga Nostoc muscorum. Ph. D. Thesis, Banaras Hindu University, Yaranasi, India. S I N G H , R. K. and S I N G H , H. N., 1981a. Isolation and preliminary characterization of mutants of the cyanobacterium Nostoc muscorum resistant to growth inhibition by methylamine. Mol. Gen. Genet., 184, 3 3 4 - 3 3 6 . S I N G H , R . K . and S I N G H , H. N . , 1 9 8 1 B . Genetic analysis of het and nif genes in the blue-green alga Nostoc muscorum. Mol. Gen. Genet., 184, 5 3 1 — 5 3 5 . S I N G H , R. N., 1961. The role of blue-green algae in nitrogen economy of Indian agriculture. ICAR, New Delhi, India. 175. S T A N I E R , R. Y., 1 9 7 3 . Autotrophy and heterotrophy in unicellular blue-green algae. I n : The Biology of Blue-Green Algae ( N . G. CARR and B. A. W H I T T O N , Eds.), pp. 5 0 1 — 5 1 8 . Univ. Califormia Press, Berkely. S T E W A R T , W. D. P., 1967. Transfer of biologically fixed nitrogen in a sand dune slack region. Nature, 214, 603—604. S T E W A R T , W . D. P. and S I N G H , H. N . , 1 9 7 5 . Transfer of nitrogen-fixing (nif) genes in the blue-green alga Nostoc muscorum. Biochem. Biophys. Res. Commun., 62, 6 2 — 6 9 . V E N K A T A R A M A N , G. S., 1977. Blue-green algae as a biological nitrogen input in rice cultivation. I n : Proc. Nat. Symp. on Nitrogen Assimilation and Crop Productivity, pp. 132—141. Hissar, India. V E N K A T A R A M A N , G . S. and G O Y A L , S. K . , 1 9 6 8 . Influence of blue-green algal inoculation on crop yield of rice fields. Soil Sci. Plant Nutr., Tokyo, 14, 2 4 9 - 2 5 1 .

BISHOP,

Inhibition of PS I I of Nostoc by benthiocarb

441

WATANABE, A., 1962. Effect of nitrogen-fixing blue-green alga, Tolypothrix tenuis, on the nitrogenous fertility of paddy soils and on the crop yield of rice plants. J . Gen. Appl. Microbiol., 8, 85-91.

WATANABE, I., 1978. Biological nitrogen fixation in rice soils. I n : I R R I Soils and Rice, pp. 465 to 478. Los Banos, Philippines. ZWEIG, G., TAMAS, I. and GREENBERG, E., 1963. The effect of photosynthesis on oxygen-evolution and fluorescence of illuminated Chlorella. Biochim. biophysica Acta, 66, 196—205. Mailing address: Dr. R. K . SINGH Department of Genetics & Plant Breeding Banaras Hindu University Varanasi-221 005, U. P., India,

30 Z. Allg. Mikrobiol., Bd. 23, H. 7

Zeitschrift f ü r Allgemeine Mikrobiologie

23

7

1983

442

Buchbe sprechungen P . L. G I G A S E and E. A. E. V A N M A R C K , (Editors), Contributions to Microbiology and Immunology, Vol. 7: From Parasitic Infection to Parasitic Disease (Colloquium on the Pathogenesis of Disease induced through Parasites, as compared to other Noxious Agents, Antwerp, December 11 — 13, 1981). 269 S., 104 Abb., 30 Tab. Basel—München—Paris-London—New York—Sydney 1983. S. Karger. § 108.00. Parasitäre Erkrankungen gewinnen in der Human- und Veterinärmedizin, besonders der Entwicklungsländer, immer mehr an Bedeutung. I m Gegensatz dazu stehen die Kenntnisse über die Pathogenese dieser Erkrankungen, selbst bei der schon frühzeitig bearbeiteten Schlafkrankheit und der Malaria. Zunehmend wird die Bedeutung immunologischer Vorgänge erkannt. Der vorliegende B a n d u m f a ß t die 31 Beiträge eines Colloquiums im Dezember 1981 in Antwerpen über die Pathogenese von Erkrankungen durch Parasiten im Vergleich zu anderen Noxen. I m Vordergrund stehen Trypanosomen, Plasmodien und Helminthen. Die Beiträge stehen unter den H a u p t themen : Mechanismen und Paktoren in der Pathogenese parasitärer Erkrankungen; Mechanismen immunologisch bedingter Schädigungen; Pathogenese der Trypanosomiasis; Hirnbeteiligung bei Malaria und Trypanosomiasis; Fibrose als Folge parasitärer und anderer Erkrankungen. Das letztgenannte Kapitel weist Wege auf, parasitär bedingte Fibrosen als Modell zu nutzen, um die durch andere Noxen verursachten Collagenschädigungen zu beurteilen und therapeutisch zu beeinflussen. — Ein Vortrag verdient aus Sicht des Rez. besondere Beachtung: R O N C O et al. wesen darin nach, daß Interferongaben bei neugeborenen Versuchstieren über eine Glomerulonephritis zu schweren Schäden und zum Tod führen. Die Ergebnisse wird man bei der Beurteilung der therapeutischen Wirksamkeit von Interferon sorgsam beachten müssen. W . KÖHLER ( J e n a )

A. H O L L A E N D E R , R. D . D E M O S S , S . K A P L A N , J . K O X I S K Y , D . SAVAGE and R. S . W O L F E (Editors), Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals. X I I I + 485 S., 150 Abb., 69 Tab. New York-London 1982. Plenum Press. S 55.00. Dieser Symposiumsband bietet eine ausgezeichnete Übersicht über den weitestgehend neuesten Stand der Gen-Technologie bei einer Vielzahl von Mikroorganismen und deren Einsatz bei der Verbesserung der Leistungen dieser Mikroorganismen für eine industrielle Nutzung. Dabei wird hauptsächlich auf prinzipielle Möglichkeiten der Nutzung billiger und in ausreichenden Mengen verfügbarer Substrate sowie der genotypischen Optimierung von Produktsynthesen eingegangen. Hervorzuheben ist, daß neben gut untersuchten Objekten wie Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis, Streptococcen und Streptomyceten auch solche industriell nutzbaren Mikroorganismen behandelt werden, bei denen die Anwendung der Gen-Technologie noch in den Anfängen steht. Besonders deutlich wird die Bedeutung der engen Verbindung von Erkenntnissen und Methoden der Biochemie, Physiologie, klassischen Genetik und Gen-Technologie für Grundlagenforschung und industrielle Nutzung. Der schnelle methodische Fortschritt in der rekombin a n t e n DNS-Forschung und dessen industrielle Anwendung erfordert neue biochemische und genetische Untersuchungen zur Expression von Genen sowie zur Kontrolle komplexer Regulationssysteme. Unter den sich damit beschäftigenden Vorträgen ist insbesondere auf die vergleichenden Untersuchungen der Regulationssequenzen für Gene glykolytischer Enzyme sowie der Alkoholdehydrogenasen in Hefe zu verweisen. G. B A R T H (Jena)

28

Zeitschrift f ü r Allgemeine Mikrobiologie

1983

7

443-446

(Centre of Advanced Study in Botany, Banaras Hindu University, Varanasi-221 005, India)

Effect of temperature on chlorophyll stability of some subaerial blue-green algae S.

(Eingegangen

TRIPATHI

am 23.

11.1982)

Chlorophyll stability index of eight subaerial blue-green algal species, collected from their n a t u r a l habitats, i.e., bark of trees, soil and roof-tops and from cultures, has been determined. The algae from natural habitats showed greater chlorophyll stability compared to those algae from cultures. Among the natural algae, high chlorophyll stability was observed in the algae inhabiting adverse habitats. A slight modification in the method of M U R T Y and MAJUMDBR (1962) for determination of chlorophyll stability index has been made. Here the total percentage loss in the a m o u n t of Chi a of heated sample in relation to its unheated sample has been considered a s chlorophyll stability index. S e v e r a l w o r k e r s h a v e s t u d i e d t h e e f f e c t of t e m p e r a t u r e o n c h l o r o p h y l l s t a b i l i t y a n d o b s e r v e d a s p e c i f i c i t y i n loss of c h l o r o p h y l l of p l a n t s ( K A L O Y E B E A S 1 9 5 8 , S A H A DEVAN

1961,

MURTY

and

MAJUMDER

1962,

PUBTJSHOTHAMAN

et

al.

1974

and

RAO

d e r i v e d t h e t e r m c h l o r o p h y l l s t a b i l i t y i n d e x (CSI) b y d e t e r m i n i n g t h e d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e c o l o u r i m e t r i c r e a d i n g s of t h e c h l o r o p h y l l e x t r a c t f r o m h e a t e d a n d u n h e a t e d leaf s a m p l e s of p i n e a n d c o r r e l a t e d w i t h d r o u g h t r e s i s t a n c e of t h e p l a n t , i.e., less t h e v a l u e of C S I o b t a i n e d , m o r e w a s t h e c a p a c i t y of p l a n t t o r e s i s t d r o u g h t . M U E T Y a n d M A J U M D E R ( 1 9 6 2 ) m o d i f i e d t h e t e c h n i q u e of K A L O Y E B E A S f o r C S I d e t e r m i n a t i o n i n r e l a t i o n t o s t u d i e s of d r o u g h t - r e s i s t a n c e i n rice, w h i c h w a s f o l l o w e d b y P U B USHOTIJ A M A N et al. ( 1 9 7 4 ) a n d R A O ( 1 9 7 6 ) i n m e a s u r i n g C S I of s o m e a l g a e . T h e s e e x p e r i m e n t s w e r e p e r f o r m e d o n c u l t u r e d a l g a e . I n t h e p r e sent s t u d y , subaerial algae f r o m n a t u r a l h a b i t a t s as well as f r o m cultures, h a v e been c o n s i d e r e d f o r C S I d e t e r m i n a t i o n . S u c h a l g a e f a c e h i g h v a r i a b i l i t y of h u m i d i t y , t e m p e r a t u r e a n d l i g h t i n t e n s i t y u n d e r t h e i r n a t u r a l s u b s t r a t e s — soil, b a r k of t r e e s , r o o f t o p of b u i l d i n g s etc. ( T R I P A T H I 1 9 8 0 ) . T h e C S I of t h e s e a l g a e is d i s c u s s e d i n r e l a t i o n t o climatic conditions prevailing at the n a t u r a l habitats. 1976).

KALOYEBEAS

(1968)

Materials

and

methods

All the algal samples were collected from nature in the summer season, the resting period. After removing the adhering soil particles without damaging filaments of the mats, the samples were k e p t over silica gel a t 25 ^ 1 °C in dark till they were used. The samples constituted crust of Myxosarcina burmensis, from a cemented wall, and mats of Lyngbya arboricola and Tolypothrix byssoidea from bark of Mangifera indica, Porphyrosiphon notarisii and Scytonema guyanense from soil, Scytonema javanicum from bark of Madhuca indica, and Tolypothrix sp. and Scytonema geitleri f r o m roof top of a building a t the campus of Banaras Hindu University. To obtain t h e algae a t growing conditions for the experiment, the stored samples were incubated a t 25 ^ 1 °C temperature and 1600 lux light intensity for 72 hrs on sterile filter papers soaked with double distilled water. These algae were also brought into culture using the standard culture methods for bluegreen algae a t the above temperature and light intensity in CHU No. 10 (CHU 1942) growth medium. I n the case of L. arboricola and P. notarisii, soil extract (5%) was added into the medium. To determine the CSI of the algae, method of M U R T Y and MAJUMDER ( 1 9 6 2 ) was used with t h e modification t h a t the total percentage loss in the amount of Chi a (}xg/g) of heated sample in 30*

28

Zeitschrift f ü r Allgemeine Mikrobiologie

1983

7

443-446

(Centre of Advanced Study in Botany, Banaras Hindu University, Varanasi-221 005, India)

Effect of temperature on chlorophyll stability of some subaerial blue-green algae S.

(Eingegangen

TRIPATHI

am 23.

11.1982)

Chlorophyll stability index of eight subaerial blue-green algal species, collected from their n a t u r a l habitats, i.e., bark of trees, soil and roof-tops and from cultures, has been determined. The algae from natural habitats showed greater chlorophyll stability compared to those algae from cultures. Among the natural algae, high chlorophyll stability was observed in the algae inhabiting adverse habitats. A slight modification in the method of M U R T Y and MAJUMDBR (1962) for determination of chlorophyll stability index has been made. Here the total percentage loss in the a m o u n t of Chi a of heated sample in relation to its unheated sample has been considered a s chlorophyll stability index. S e v e r a l w o r k e r s h a v e s t u d i e d t h e e f f e c t of t e m p e r a t u r e o n c h l o r o p h y l l s t a b i l i t y a n d o b s e r v e d a s p e c i f i c i t y i n loss of c h l o r o p h y l l of p l a n t s ( K A L O Y E B E A S 1 9 5 8 , S A H A DEVAN

1961,

MURTY

and

MAJUMDER

1962,

PUBTJSHOTHAMAN

et

al.

1974

and

RAO

d e r i v e d t h e t e r m c h l o r o p h y l l s t a b i l i t y i n d e x (CSI) b y d e t e r m i n i n g t h e d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e c o l o u r i m e t r i c r e a d i n g s of t h e c h l o r o p h y l l e x t r a c t f r o m h e a t e d a n d u n h e a t e d leaf s a m p l e s of p i n e a n d c o r r e l a t e d w i t h d r o u g h t r e s i s t a n c e of t h e p l a n t , i.e., less t h e v a l u e of C S I o b t a i n e d , m o r e w a s t h e c a p a c i t y of p l a n t t o r e s i s t d r o u g h t . M U E T Y a n d M A J U M D E R ( 1 9 6 2 ) m o d i f i e d t h e t e c h n i q u e of K A L O Y E B E A S f o r C S I d e t e r m i n a t i o n i n r e l a t i o n t o s t u d i e s of d r o u g h t - r e s i s t a n c e i n rice, w h i c h w a s f o l l o w e d b y P U B USHOTIJ A M A N et al. ( 1 9 7 4 ) a n d R A O ( 1 9 7 6 ) i n m e a s u r i n g C S I of s o m e a l g a e . T h e s e e x p e r i m e n t s w e r e p e r f o r m e d o n c u l t u r e d a l g a e . I n t h e p r e sent s t u d y , subaerial algae f r o m n a t u r a l h a b i t a t s as well as f r o m cultures, h a v e been c o n s i d e r e d f o r C S I d e t e r m i n a t i o n . S u c h a l g a e f a c e h i g h v a r i a b i l i t y of h u m i d i t y , t e m p e r a t u r e a n d l i g h t i n t e n s i t y u n d e r t h e i r n a t u r a l s u b s t r a t e s — soil, b a r k of t r e e s , r o o f t o p of b u i l d i n g s etc. ( T R I P A T H I 1 9 8 0 ) . T h e C S I of t h e s e a l g a e is d i s c u s s e d i n r e l a t i o n t o climatic conditions prevailing at the n a t u r a l habitats. 1976).

KALOYEBEAS

(1968)

Materials

and

methods

All the algal samples were collected from nature in the summer season, the resting period. After removing the adhering soil particles without damaging filaments of the mats, the samples were k e p t over silica gel a t 25 ^ 1 °C in dark till they were used. The samples constituted crust of Myxosarcina burmensis, from a cemented wall, and mats of Lyngbya arboricola and Tolypothrix byssoidea from bark of Mangifera indica, Porphyrosiphon notarisii and Scytonema guyanense from soil, Scytonema javanicum from bark of Madhuca indica, and Tolypothrix sp. and Scytonema geitleri f r o m roof top of a building a t the campus of Banaras Hindu University. To obtain t h e algae a t growing conditions for the experiment, the stored samples were incubated a t 25 ^ 1 °C temperature and 1600 lux light intensity for 72 hrs on sterile filter papers soaked with double distilled water. These algae were also brought into culture using the standard culture methods for bluegreen algae a t the above temperature and light intensity in CHU No. 10 (CHU 1942) growth medium. I n the case of L. arboricola and P. notarisii, soil extract (5%) was added into the medium. To determine the CSI of the algae, method of M U R T Y and MAJUMDER ( 1 9 6 2 ) was used with t h e modification t h a t the total percentage loss in the amount of Chi a (}xg/g) of heated sample in 30*

444

S. N . TBIPATHI

relation to its unheated sample considered as OSI rather than the colourimetric differences. For experiments, the required amount of natural materials, obtained after incubation, and cultured materials were exposed to 65 ^ 1 °C in water, sufficient to dip the sample, in a water bath for 1 hr. The pigments were extracted in acetone (80%) from heated and unheated (control) samples. For the natural samples oiScytonema and Tolypothriz, acetone extract was further fractionated in column by centrifugation with petroleum ether and water, because the total acetone extract did not show the absorption peak for Chi a. The top fraction of petroleum ether in the column contained Chi a, which was dried after isolation and taken up in acetone. For estimation of the amount of Chi a, the formula of TALLING and DRIVES (1963) was used. The total dry weight of the samples was taken after recording absorbance of the acetone extract of Chi a. The percentage loss in the amount of the chlorophyll on heating was calculated as: Chi ((xg/g) of the _ Chi (pg/g) of a °/ loss 'n Chi a — '8a the heated alga ^^ Chi (¡ig/g) of the unheated alga

Results and

discussion

After K A L O Y E K E A S (1958), the technique for determination of chlorophyll stability index has been modified by several workers. I n the most acceptable method of M U S T Y and M A J U M D E K (1962) 1 g of leaf sample was heated to 65 i 1 °C in 25 ml water for 1 hr and chlorophyll extraction was done in 40 ml of acetone (4:1) to determine the CSI of rice plant. I n this technique, variation in water content and vexatiousness in correct weighing of the required amount of fresh samples, with particular reference to algae, prior to their heating magnify the errors. Further, the use of large amount of acetone for extraction of chlorophyll of a single sample is a wastage of the solvent. The consideration of quantitative (¡¿g/g) difference in chlorophyll of heated and unheated samples overcomes the disadvantages of the earlier method. Because, after recording the absorbance at 663 nm of Chi a in acetone, all the fractions (acetone extract and the residue) of the sample m a y be dried and accurately weighed. F u r t h e r the difference in the amount of chlorophyll in term of [J.g/g of 0.25, 0.5 and 0.75 g (weighed dried samples prior to incubation) of natural samples was negligeable in comparison to 1 g of heated and unheated samples (not mentioned in Table 1). Thus, this procedure also overrules the requirement of same amount of all the samples. The ecological studies on subaerial blue-green algae ( T B I P A T H I 1980) have shown t h a t among subaerial habitats, open roof-top and terrace of buidlings pose maximum adversity of environmental conditions. Besides full exposure to sun and quick runoff during growing season, the habitats face high temperature (69 °C) for few hours at midday in summer. The intensity of harshness is found considerably low under shade habitats bark of trees, soil etc. These habitats maintain their water status for a longer duration, where temperature does not exceed more t h a n 52 °C in summer. Diversity of algal species is also affected by high variability of environment at their habitats. Species of Tolypothrix and Scytonema are amongst the most abundantly occurring algal species on roof-tops, where members of Oscillatoriaceae, Nostocaceae and Stigonematales are observed completely missing. Species of Tolypothrix and Scytonema colonize at drier surfaces rather exposed to sun and algae like Lyngbya and Porphyrosiphon dominate at the surfaces receiving diffused sunlight and retaining humdity for longer duration under bark and soil habitats. Myxosarcina burmensis is one of the primary colonizers at the highly wet habitats under shade. The stability of chlorophyll of the algae, collected from nature and culture, at high temperature is presented in Table 1. The extend of variation in the chlorophyll stability of algae is much in relation to their adaptability to climatic conditions

Temperature and chlorophyll stability

m e M^ S—

e _ ^^ Ci A^

445

1—1t> TH t 00 >o (N CO eo 00 O 00