Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie: Band 23, Heft 4 [Reprint 2021 ed.] 9783112565469, 9783112565452

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ZEITSCHRIFT FÜR ALLGEMEINE MIKROBIOLOGIE AN INTERNATIONAL JOURNAL ON MORPHOLOGY, PHYSIOLOGY, GENETICS, AND ECOLOGY OF MICROORGANISMS BAND 23 • 1983 • HEFT 4

™ ISSN 0044-2208

AKADEMIE-VERLAG • BERLIN Z. Allg. Mikrobiol., Berlin 83 (1983) 4, 2 0 9 - 2 8 0

EVP 2 0 , - M

Z E I T S C H R I F T FÜR ALLGEMEINE MIKROBIOLOGIE VOLUME 23

1983

NUMBER 4

CONTENTS Selection of yeasts for single cell protein production on media based on Jerusalem artichoke extracts

V^BONIQUE APAIBE, AND P . GALZY

Gene-enzyme relationships of the arom multienzyme complex of Schizosaccharomyces pombe

R . BODE

219

Preparation and partial characterization of monas oryzae phytotoxin

R . S. DUBEY

225

Xantho-

J . P . GUIRAUD 211

Degradation of aniline and monochloroanilines by Rhodococcus sp. An 117 and a pseudomonad: A comparative study

U . KAMINSKI, D . JANKE, H . PRAUSEB AND W . F E I T S C H E 235

Formation of protoplasts from the ascomycete Hypomyces ochraceus ( P E E S . ) T U L . and their regeneration

K . H . R I E M A Y , SILVIA E L L B I C H AND R . TEÖGEB 247

Growth parameters and productivity of the methanotrophic bacterial strain GB 26 as influenced by oxygen-containing Cj-compounds

J . D . SCHNEIDER, K . - D . W E N D T LAND, E . B R Ü H L AND G . M I B S C H E L

259

P . J . M Ü L L E R , A . CHRISTNEB J . H . OZEGOWSKI

269

Short Note Sequential processes of phosphate limitation and of phosphate release in streptomycin fermentations Book Reviews

AND

275

ZEITSCHRIFT FÜR ALLGEMEINE MIKRO- BIOLOGIE

H E R A U S G E G E B E N VON

G. F. Gause, Moskau 0 . Hoffmann-Ostenhof, Wien A. A. Imseneckii, Moskau G. Ivanovics, Szeged R. W. Kaplan, Frankfurt/M. G. W. Kidder, Amherst F. Mach, Greifswald 1. Malek, Prag C. Weibull, Lund

AN INTERNATIONAL JOURNAL ON MORPHOLOGY, PHYSIOLOGY, GENETICS, AND ECOLOGY OF MICROORGANISMS

unter der Chefredaktion von W. Schwartz, Braunschweig und U. Taubeneck, Jena

U N T E R M I T A R B E I T VON

J . H. Becking, Wageningen H. Böhme, Gatersleben M. Girbardt, Jena S. I. Kusnecov, Moskau 0 . Necas, Brno C. H. Oppenheimer, Port Aransas N. Pfennig, Göttingen I. L. Rabotnova, Moskau A. Schwartz, Wolfenbüttel

BAND 23 -1983 • HEFT 4 REDAKTION

U. May, Jena

AKADEMIE-VERLAG • BERLIN

Die Zeitschrift f ü r Allgemeine Mikrobiologie soll dazu beitragen, Forschung und internationale Zusammenarbeit auf dem Gebiet der Mikrobiologie zu fördern. E s werden Manuskripte aus allen Gebieten der allgemeinen Mikrobiologie veröffentlicht. Arbeiten über Themen aus der medizinischen, landwirtschaftlichen, technischen Mikrobiologie und aus der Taxonomie der Mikroorganismen werden ebenfalls aufgenommen, wenn sie Fragen von allgemeinem Interesse behandeln. Zur Veröffentlichung werden angenommen: Originalmanuskripte, die in anderen Zeitschriften noch nicht veröffentlicht worden sind und in gleicher Form auch nicht in anderen Zeitschriften erscheinen werden. Der Umfang soll höchstens 1^2 Druckbogen (24 Druckseiten) betragen. Bei umfangreicheren Manuskripten müssen besondere Vereinbarungen mit der Schriftleitung und dem Verlag getroffen werden. Kurze Originalmitteilungen über wesentliche, neue Forschungsergebnisse. Umfang im allgemeinen höchstens 3 Druckseiten. Kurze Originalmitteilungen werden beschleunigt veröffentlicht. Kritische Sammelberichte und Buchbesprechungen nach Vereinbarung mit der Schriftleitung.

Bezugsmöglichkeiten der Zeitschrift f ü r Allgemeine Mikrobiologie: Bestellungen sind zu richten — in der DDR an den Postzeitungsvertrieb, an eine Buchhandlung oder an den AkademieVerlag, DDR-1086 Berlin, Leipziger Str. 3—4 — im sozialistischen Ausland an eine Buchhandlung f ü r fremdsprachige Literatur oder an den zuständigen Postzeitungsvertrieb — in der BRD und Berlin (West) an eine Buchhandlung oder an die Auslieferungsstelle K U N S T U N D WISSEN, Erich Bieber OHG, D-7000 S t u t t g a r t 1, Wilhelmstraße 4 - 6 — in den übrigen westeuropäischen Ländern an eine Buchhandlung oder an die Auslieferungsstelle K U N S T U N D WISSEN, Erich Bieber GmbH, CH-8008 Zürich Schweiz, Dufourstraße 51 — im übrigen Ausland an den Internationalen Buch- und Zeitschriftenhandel; den Buchexport, Volkseigener Außenhandelsbetrieb der Deutschen Demokratischen Republik, DDR-7010 Leipzig, Postfach 160, oder an den Akademie-Verlag, DDR-1086 Berlin, Leipziger Straße 3—4.

Zeitschrift f ü r Allgemeine Mikrobiologie Herausgeber: I m Auftrag des Verlages von einem internationalen Wissenschaftlerkollektiv herausgegeben. Verlag: Akademie-Verlag, DDR-1086 Berlin, Leipziger Straße 3—4; F e r n r u f : 2236229 oder 2236121; Telex-Nr.: 114420; B a n k : Staatsbank der D D R , Berlin, Kto.-Nr.: 6836-26-20712. Chefredaktion: Prof. Dr. U D O T A U B E N E C K Prof. Dr. W I L H E L M S C H W A B T Z . Anschrift der Redaktion: Zentralinstitut f ü r Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften, DDR-6900 J e n a , Beutenbergstr. 11; F e r n r u f : J e n a 885614; TelexN r . : 058621 Veröffentlicht unter der Lizenznummer 1306 des Presseamtes beim Vorsitzenden des Ministerrates der Deutschen Demokratischen Republik. Gesamtherstellung: V E B Druckerei „ T h o m a s Müntzer", DDR-5820 Bad Langensalza. Erscheinungsweise: Die Zeitschrift f ü r Allgemeine Mikrobiologie erscheint jährlich in einem B a n d m i t l O Heften. Bezugspreis je Band 250,— Mzuzüglich Versandspesen (Preis f ü r die D D R 200,— M), Preis je H e f t 2 5 , - M (Preis f ü r die D D R 2 0 , - M). Urheberrecht: Alle Rechte vorbehalten, insbesondere die der Übersetzung. Kein Teil dieser Zeitschrift darf in irgendeiner Form — durch Photokopie, Mikrofilm oder irgendein anderes Verfahren — ohne schriftliche Genehmigung des Verlages reproduziert werden. — All rights reserved (including those of translations into foreign languages). No p a r t of this issue m a y be reproduced in any form, b y photoprint, microfilms or any other means, without written permission f r o m t h e publishers. Erscheinungstermin: J u n i 1983 Bestellnummer dieses H e f t e s : 1070/23/4 © 1983 b y Akademie-Verlag Berlin. Printed in t h e German Democratic Republic. AN (EDV) 75218

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(Sciences et Technologies des Industries Alimentaires, Université des Sciences et Techniques du Languedoc, 34060 Montpellier Cedex France, and Laboratoire de Génétique et Microbiologie, INRA-ENSAM, 34060 Montpellier Cedex1, France)

Selection of yeasts for single cell protein production on media based on Jerusalem artichoke extracts VÉRONIQUE APAIRE, J . P . GUIRAUD a n d P . GALZY1

(Eingegangen am 20.7.1982) Several yeast strains can grow with good yield (0.16 to 0.19 mg protein/mg carbohydrate) on nitrogen supplemented Jerusalem artichoke extract. The most promising strain is Lipomyces starkeyi. Including by-products (pulps, proteins of extract), protein production can reach 2 metric tons/ha. T h e p r o d u c t i o n of single cell p r o t e i n f r o m i n d u s t r i a l wastes, a g r i c u l t u r a l p r o d u c t s or b y - p r o d u c t s is n o t o n l y i n t e r e s t i n g f o r d e v e l o p i n g c o u n t r i e s b u t also f o r i n d u s t r i a l ized c o u n t r i e s w h i c h h a v e t o s u p p l e m e n t a n i m a l f e e d w i t h some sources of p r o t e i n . T h e p r o d u c t is c o m p e t i t i v e only w h e n t h e s u b s t r a t e u s e d is c h e a p a n d r e a d i l y a v a i lable. T h a t is w h y we i n v e s t i g a t e d t h e possibility of p r o t e i n p r o d u c t i o n f r o m J e r u salem a r t i c h o k e (Helianthus tuberosus) e x t r a c t s , c o n t a i n i n g p o l y f r u c t o s a n s of t h e inulin t y p e . J e r u s a l e m a r t i c h o k e is a rustic, r o b u s t p l a n t which grows well o n a v e r a g e q u a l i t y soil, w i t h good yields (30 t o 60 m e t r i c t o n s / h e c t a r e ) . A t t h e p r e s e n t t i m e , J e r u salem a r t i c h o k e is o n l y u s e d as a n i m a l f o d d e r . H o w e v e r , several i n d u s t r i a l a p p l i c a t i o n s b a s e d o n this p l a n t h a v e b e e n c o n s i d e r e d : e t h a n o l p r o d u c t i o n ( U N D E R K O F L E R et al. 1 9 3 7 , BOINOT 1 9 4 2 , G U I R A U D et al. 1 9 8 1 ) , f r u c t o s e s y r u p ( K I E R S T A N 1 9 7 8 , FLEMMING a n d GROOTWASSINK 1 9 7 9 , G U I R A U D a n d G A L Z Y 1 9 8 1 A , b ) .

S e v e r a l y e a s t s t r a i n s a d a p t e d to t h e p r o d u c t i o n of p r o t e i n on s y n t h e t i c m e d i a w i t h a d d e d i n u l i n were selected p r e v i o u s l y ( G U I R A U D et al. 1 9 7 9 ) . Our a i m is to show t h a t t h e s e y e a s t s a r e able t o grow on J e r u s a l e m a r t i c h o k e e x t r a c t w i t h good p r o t e i n yield.

Materials

and,

methods

Biological material: We used Jerusalem artichoke of the "Violet de Rennes" variety. The yeast strains were either from the Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Delft, Holland (CBS) or from the collection of our own laboratory (LG): Kluyveromyces fragilis CBS 1555, Kluyveromyces marxianus LG, Debaryomyces cantarellii CBS 4349, Candida salmanticensis CBS 5121, Pichia polymorpha CBS 186, Lipomyces starkeyi LG, Schwanniomyces castellii CBS 2863. Cultivation technique: Unless stated otherwise, the cultures were incubated at 28 °C in ERLENMEYER flasks, filled to 1/10 of their volumes and shaked (1.3 Hz; 75 mm amplitude). Jerusalem artichoke extract preparation: The tubers were washed, diced into 1 cm cubes and crushed with a blade grinder. Water was added to obtain an extract with 650 g of wet matter per liter and the mixture was crushed again with an Ultraturrax, pressed and filtered through cloth. The tyndallization was performed by 3 successive heatings at 24 h interval to 80 °C during 15 min. The extract was sometimes supplemented with the following solution, containing per liter: Ammonium sulfate 60 g, potassium phosphate 50 g, magnesium sulfate 5 g, sodium chloride 1 g, calcium chloride 1 g, boric acid 50 mg, manganese sulfate 40 mg, zinc sulfate 40 mg, sodium molybdate 20 mg, copper sulfate 4 mg. 15*

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(Sciences et Technologies des Industries Alimentaires, Université des Sciences et Techniques du Languedoc, 34060 Montpellier Cedex France, and Laboratoire de Génétique et Microbiologie, INRA-ENSAM, 34060 Montpellier Cedex1, France)

Selection of yeasts for single cell protein production on media based on Jerusalem artichoke extracts VÉRONIQUE APAIRE, J . P . GUIRAUD a n d P . GALZY1

(Eingegangen am 20.7.1982) Several yeast strains can grow with good yield (0.16 to 0.19 mg protein/mg carbohydrate) on nitrogen supplemented Jerusalem artichoke extract. The most promising strain is Lipomyces starkeyi. Including by-products (pulps, proteins of extract), protein production can reach 2 metric tons/ha. T h e p r o d u c t i o n of single cell p r o t e i n f r o m i n d u s t r i a l wastes, a g r i c u l t u r a l p r o d u c t s or b y - p r o d u c t s is n o t o n l y i n t e r e s t i n g f o r d e v e l o p i n g c o u n t r i e s b u t also f o r i n d u s t r i a l ized c o u n t r i e s w h i c h h a v e t o s u p p l e m e n t a n i m a l f e e d w i t h some sources of p r o t e i n . T h e p r o d u c t is c o m p e t i t i v e only w h e n t h e s u b s t r a t e u s e d is c h e a p a n d r e a d i l y a v a i lable. T h a t is w h y we i n v e s t i g a t e d t h e possibility of p r o t e i n p r o d u c t i o n f r o m J e r u salem a r t i c h o k e (Helianthus tuberosus) e x t r a c t s , c o n t a i n i n g p o l y f r u c t o s a n s of t h e inulin t y p e . J e r u s a l e m a r t i c h o k e is a rustic, r o b u s t p l a n t which grows well o n a v e r a g e q u a l i t y soil, w i t h good yields (30 t o 60 m e t r i c t o n s / h e c t a r e ) . A t t h e p r e s e n t t i m e , J e r u salem a r t i c h o k e is o n l y u s e d as a n i m a l f o d d e r . H o w e v e r , several i n d u s t r i a l a p p l i c a t i o n s b a s e d o n this p l a n t h a v e b e e n c o n s i d e r e d : e t h a n o l p r o d u c t i o n ( U N D E R K O F L E R et al. 1 9 3 7 , BOINOT 1 9 4 2 , G U I R A U D et al. 1 9 8 1 ) , f r u c t o s e s y r u p ( K I E R S T A N 1 9 7 8 , FLEMMING a n d GROOTWASSINK 1 9 7 9 , G U I R A U D a n d G A L Z Y 1 9 8 1 A , b ) .

S e v e r a l y e a s t s t r a i n s a d a p t e d to t h e p r o d u c t i o n of p r o t e i n on s y n t h e t i c m e d i a w i t h a d d e d i n u l i n were selected p r e v i o u s l y ( G U I R A U D et al. 1 9 7 9 ) . Our a i m is to show t h a t t h e s e y e a s t s a r e able t o grow on J e r u s a l e m a r t i c h o k e e x t r a c t w i t h good p r o t e i n yield.

Materials

and,

methods

Biological material: We used Jerusalem artichoke of the "Violet de Rennes" variety. The yeast strains were either from the Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Delft, Holland (CBS) or from the collection of our own laboratory (LG): Kluyveromyces fragilis CBS 1555, Kluyveromyces marxianus LG, Debaryomyces cantarellii CBS 4349, Candida salmanticensis CBS 5121, Pichia polymorpha CBS 186, Lipomyces starkeyi LG, Schwanniomyces castellii CBS 2863. Cultivation technique: Unless stated otherwise, the cultures were incubated at 28 °C in ERLENMEYER flasks, filled to 1/10 of their volumes and shaked (1.3 Hz; 75 mm amplitude). Jerusalem artichoke extract preparation: The tubers were washed, diced into 1 cm cubes and crushed with a blade grinder. Water was added to obtain an extract with 650 g of wet matter per liter and the mixture was crushed again with an Ultraturrax, pressed and filtered through cloth. The tyndallization was performed by 3 successive heatings at 24 h interval to 80 °C during 15 min. The extract was sometimes supplemented with the following solution, containing per liter: Ammonium sulfate 60 g, potassium phosphate 50 g, magnesium sulfate 5 g, sodium chloride 1 g, calcium chloride 1 g, boric acid 50 mg, manganese sulfate 40 mg, zinc sulfate 40 mg, sodium molybdate 20 mg, copper sulfate 4 mg. 15*

212

VEKONIQUE A P A I R E , J . P . G U I R A U D a n d P . G A L Z Y

Analytical techniques: Total sugars were determined by the anthrone method (TREVELYAN and Nitrogen content was assayed by K J E L D A H L method ( B R A D S T R E E T 1 9 6 5 ) and cellular protein by biuret method according to STICKLAND ( 1 9 5 1 ) . Amino acids content was determined with an autoanalyzer after hydrolysis according to the method of G U N D L A C H et al. ( 1 9 5 9 ) ; tryptophan was determined according to SIMPSON et al. ( 1 9 7 6 ) . Chemical indices were determined according to BLOCK and MITCHELL ( 1 9 4 6 ) . The cell free lipid extract was prepared by the azeotropic method ( K A H A N E and REGORD 1 9 6 4 ) and purified according to FOLCH et al. ( 1 9 5 7 ) . Cellular growth determination was performed by nephelometric measurements at 400 nm. Cellular dry matter was determined by dessication at 104 °C during 24 h. HARBISON 1 9 8 2 ) .

Results C h a r a c t e r i s t i c s of t h e e x t r a c t

utilized

We have previously published (GUIEAUD et al. 1981) the average composition of Jerusalem artichoke tubers, extract and resulting pulp after crushing and pressing. The raw extract used in this experiment contained 150 g of dry matter per liter, 86% of which was carbohydrate and 1.8% was nitrogen, mostly from protein (1.15% protein nitrogen). Since this carbohydrate concentration was much too high for the raw extract to be used directly as culture medium, we diluted the extract to obtain a juice containing 5 g of sugar per liter. The non-protein nitrogen content of this juice was too low (40 mg/1) for a good protein yield. To obtain 16 to 20 g cellular protein per 100 g of sugars, 120 to 160 mg of nitrogen per liter is needed. I t was thus necessary to supplement the juice with at least 160 mg inorganic nitrogen per liter. This supplementation was made with a mineral salt solution so that 1 g of nitrogen per liter medium was obtained. This concentration was clearly higher than minimum requirement. Cultures grown in juice without supplementation served as controls. G r o w t h s t u d i e s on t y n d a l i z e d j u i c e Our first experiments were carried out with tyndalized juice in order to limit accidents due to eventual contaminations. This medium was used to study the growth of 7 strains previously selected on synthetic media (Table 1). Growth rates were higher on supplemented juice than on raw juice. The best results were obtained for Kluyveromyces fragilis and Pichia polymorpha (p = 0.30). Growth rates were generally higher on Jerusalem artichoke juice than on synthetic medium. This could be due to the lesser degree of carbohydrate polymerization in Jerusalem artichoke juice compared to pure inulin, so that the hydrolysis phase preceding carbohydrate utilization was shorter. With raw juice, the growth yields, and particularly protein yields, were low. This is expected since the medium was deficient in nitrogen. However, it is interesting to note that some protein yields reached 0.1 mg/mg carbohydrate when non-protein nitrogen content of the juice was expected to allow only yields of up to 0.05 mg protein/mg carbohydrate. This may be explained either by the utilization of part of juice protein by the yeast, or by the recovery of this protein along with the yeast cells during centrifugation. With nitrogen supplementation, growth rates were considerably higher. The increase was particularly remarkable in protein yields which doubled in certain cases. The best dry matter yield was obtained for Schwanniomyces castellii, followed by Lipomyces starkeyi and Candida salmanticensis. The best yield in protein was obtained for Lipomyces starkeyi, followed by Schwanniomyces castellii. Compared to those obtained from culture on synthetic medium with inulin (GUIRAUD et al. 1979), these results were generally lower except for Schwanniomyces castellii and Lipomyces starkeyi where they were better.

Protein production b y Lipomyces starheyi

213

Table 1 Growth yields of the indicated yeast species after cultivation in tyndalized raw and supplemented Jerusalem artichoke juices (5 g carbohydrate/liter), at normal p H (6.6). R = raw juice, S = supplemented juice, % of total native juice protein D r y matter Growth Strain

Candida salmanticensis Debaryomyces cantarella Kluyveromyces fragilis Kluyveromyces marxianus Lipomyces starheyi Pichia polymorpha Schwanniomyces castellii

Media

R S R S R S R S R S R S R S

Carbohydrate

yield

yield

rate

used

mg D M / m g

0.17 0.23 0.23 0.29 0.24 0.30 0.26 0.27 0.26 0.27 0.23 0.30 0.25 0.27

Protein

Protein content

mg protein/

residual

carbohyd-

mg carbohy-

juice

rate

drate

%

0.39 0.44 0,35 0.38 0.29 0.36 0.28 0.40 0.35 0.48 0.35 0.33 0.38 0.48

0.10 0.16 0.10 0.15 0.08 0.14 0.08 0.14 0.09 0.19 0.07

28 32 25 29 36 41 29 45 34 50 50 49 20 23

96 99 95 97 95 98 97 98 92 98 94 98 96 96

0.11

0.10 0.18

In each experiment we determined the protein content of the juice after cell recovery. These substances were native proteins already present in the juice but not utilized or recovered with the yeast cell. The levels obtained were low and represented at most 50% of native proteins. We expected a marked difference between supplemented and raw juices since the presence of inorganic nitrogen would limit the utilization of juice proteins. The observed differences for most strains were small. There was probably protein recovery by precipitation during yeast cells recovery. Table 2 Growth yields on raw and supplemented Jerusalem artichoke juices (5 g carbohydrate/liter, p H ajusted to 3.5 and non-sterilized) R : raw juice, S: supplemented juice, % of total native juice protein

Dry matter Growth Strain

Media

Carbo-

yield

rate

hydrate

mg DM/mg

used

carbohydrate

Candida salmanticensis Debaryomyces cantarllii Kluyveromyces fragilis Kluyveromyces marxianus Lipomyces starheyi Pichia polymorpha Schwanniomyces castellii

R S R S R S R S R S R S R S

0.15 0.20 0.21 0.27 0.24 0.30 0.27 0.27 0.25 0.30 0.23 0.24 0.20 0.23

93 99 96 97 97 98 97 97 88 97 95 96 91 96

0.34 0.37 0.35 0.39 0.29 0.35 0.28 0.38 0.29 0.45 0.31 0.32 0.31 0.45

Protein yield mg protein/mg carbohydrate

0.09 0.16 0.08 0.14 0.09 0.13 0.10 0.14 0.10 0.17 0.07 0.10 0.08 0.16

Protein content residual juice

% 32 78 46 38 35 60 45 62 40 51 28 26 38 39

Protein (and N ) content of cells mg/mg D M

25.5 42.5 22.5 35.5 32 38.5 34.5 36.5 34.5 39 21.5 31.5 26.5 35.5

(4.3) (7.9) (3.8) (6.1) (5.5) (6.7) (5.6) (6.1) (5.7) (6.5) (3.8) (5.7) (4.4) (6)

214

VBRONIQTJE APAIEB, J. P . GUIRAUD a n d P. GALZY

G r o w t h s t u d i e s on n o n - s t e r i l e j u i c e A sterilization process of the juice represents an important production cost factor. Therefore we tried to use a non-sterile juice, acidified to p H 3.5; this p H prevents the development of numerous bacterial contaminants without affecting yeasts. The growth yields were slightly lower than those observed for tyndallized juice (Table 2). The highest dry-matter yields were obtained for Schwanniomyces castellii and Lipomyces starkeyi, and the highest protein yields were obtained for Lipomyces starkeyi. I t should be noted that, except for Pichia polymorpha, the protein contents of residual juice were higher at p H 3.5 than at normal pH. The total protein recovery was more efficient at p H 3.5. Cell c o m p o s i t i o n

studies

The protein and KJELDAHL nitrogen contents of the different strains grown on acidified juice (pH 3.5) are summarized in Table 2. The highest protein content was obtained for Candida salmanticensis (42.5%), followed by Lipomyces starkeyi (39%). The aminograms for proteins of the different strains were determined after culture on synthetic medium YNB with inuline (Table 3). This medium was chosen so as to limit interference due to recovery of juice proteins. An aminogram was also obtained for Lipomyces starkeyi, the most promising strain, grown on Jerusalem artichoke juice. Chemical indices were calculated for the essential amino acids. All the strains have a good composition of essential amino acids (C.I. = 100), except for the sulphur-containing amino acids methionine and cysteine. Schwanniomyces castellii and fortunaly, Lipomyces starkeyi were characterized by satisfactory contents of all essential amino acids including methionine and cysteine. This is fairly rare among yeasts which generally are poor in sulphur-containing amino acids. Lipomyces starkeyi grown on Jerusalem artichoke juice showed a different aminogram, especially with regard to sulphur-containing amino acids which were clearly deficient. This confirmed that juice proteins were recovered along with yeast cells during the centrifugation step. Since Lipomyces starkeyi strain is reputed to have a high lipid content (STAKKEY 1946), it seemed interesting to verify this property after cultivation on supplemented Jerusalem artichoke juice at 5 g carbohydrate/liter. The lipid content of dry matter was found to amount to 12.5%. This value was considerably higher than the lipid contents (5 — 10%) of various yeast strains reported in the literature (KORENAGA 1977, MOULIN et al.

1975).

A t t e m p t s to o p t i m i z e p r o t e i n p r o d u c t i o n The protein yields obtained for the 7 strains used in these experiments were over" estimated since some juice protein was recovered along with the yeast cells. Under these conditions, it might be interesting to recover juice protein before yeast inoculation. When a Jerusalem artichoke juice was adjusted to p H 3.5 and treated to 90 °C, about 40% of the proteins precipitated and could be recovered by centrifugation. The protein content of a juice submitted to such a treatment was reduced from 10.4 to 6.5 g protein/1. We have grown Lipomyces starkeyi cultures on such a juice. The protein yield thus obtained was 0.145, which was lower than with raw juice (0.175); at the same time about 10% decrease of protein that obtained content in residual juice was observed. The total amounts of protein recovered by the two methods were about the same. The deproteinization technique before culture inoculation required a lot of energy and seemed not to have any advantage. Ultrafiltration technique would also be dif-

Protein production by Lipomyces

g ®^ a ^w o o MS rJMo.S fi ® i t s.Ss -P -r-a ^ 00 ®K l-S c3

starkeyi

CD IO HINH

00

CO C5 Ci l>

^ H^

H

00

215

t> ^

O C0 2 > HCOOH > HCHO. This result together with spectrophotometric NAD H determinations suggests that the NADH pool determines the balance between the assimilatory and oxidative utilization of formaldehyde.

Methanotrophe Bakterien oxidieren Methan enzymatisch stufenweise über CxIntermediate zu Kohlendioxid (BROWN et al. 1 9 6 4 , JOHNSON U. QUAYLE 1 9 6 4 , B A B E L u. MOTHES 1 9 7 8 ) (Schema 1 ) :

CH3 OH

H++NAOH

HAß*

r\

X

HCHO

XH,

HCOOH

MAO*

Assimilation

Bei Bakterien mit Serin-Zyklus erfolgt die Assimilation des Formaldehyds via Transformylierung an Glycin. Der von uns eingesetzte Bakterienstamm GB 25

assimiliert Formaldehyd bzw. aktivierten Formaldehyd via Serinweg (BABEL U.

MIETHE, pers. Mitteilung). Es konnte sowohl bei methan- als auch bei methanolutilisierenden Mikroorganismen gezeigt werden, daß C^-Intermediate das Wachstum beeinflussen können (PILAT U. PROKOP 1975, RICHTER et al. 1974, WENDLANDT u. BRÜHL 1980, PAPDUTSAKIS et al. 1981). Auch bei dem methanassimilierenden Bakterienstamm GB 25 bewirken die sauerstoffhaltigen C r Verbindungen Methanol, Formaldehyd, Ameisensäure und Kohlendioxid einen katalytischen Effekt, welcher zur Erhöhung der Zellausbeute und der maximalen Wachstumsrate führt (SCHNEIDER et al. 1983). 18*

Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie

1983

28

4

|

259-268

(Institut für technische Chemie der Akademie der Wissenschaften der DDR, Leipzig, Direktor: Prof. Dr. sc. nat. M. R I N G P F E I L )

Effektorwirkung von sauerstoffhaltigen Cj-Verbindungen bei der Kultivierung des methanotrophen Bakterienstammes GB 25 J . D . SCHNEIDEE, K . - D . WENDLANDT, E . BRÜHL u n d G . MIRSCHEL

, am 30. 7.1982) Addition of oxygen-containing C1-compounds to chemostat cultures of GB 25 increases both the yield of biomass and the specific growth rate. At optimum concentrations the catalytic activity of these compounds increases with increasing growth rates. Their influence on maintenance coefficients and maximum yield coefficients decreases in the order OH3OH > C0 2 > HCOOH > HCHO. This result together with spectrophotometric NAD H determinations suggests that the NADH pool determines the balance between the assimilatory and oxidative utilization of formaldehyde.

Methanotrophe Bakterien oxidieren Methan enzymatisch stufenweise über CxIntermediate zu Kohlendioxid (BROWN et al. 1 9 6 4 , JOHNSON U. QUAYLE 1 9 6 4 , B A B E L u. MOTHES 1 9 7 8 ) (Schema 1 ) :

CH3 OH

H++NAOH

HAß*

r\

X

HCHO

XH,

HCOOH

MAO*

Assimilation

Bei Bakterien mit Serin-Zyklus erfolgt die Assimilation des Formaldehyds via Transformylierung an Glycin. Der von uns eingesetzte Bakterienstamm GB 25

assimiliert Formaldehyd bzw. aktivierten Formaldehyd via Serinweg (BABEL U.

MIETHE, pers. Mitteilung). Es konnte sowohl bei methan- als auch bei methanolutilisierenden Mikroorganismen gezeigt werden, daß C^-Intermediate das Wachstum beeinflussen können (PILAT U. PROKOP 1975, RICHTER et al. 1974, WENDLANDT u. BRÜHL 1980, PAPDUTSAKIS et al. 1981). Auch bei dem methanassimilierenden Bakterienstamm GB 25 bewirken die sauerstoffhaltigen C r Verbindungen Methanol, Formaldehyd, Ameisensäure und Kohlendioxid einen katalytischen Effekt, welcher zur Erhöhung der Zellausbeute und der maximalen Wachstumsrate führt (SCHNEIDER et al. 1983). 18*

260

J . D . SCHNEIDER, K . - D . WENDLANDT, E . BRÜHL u n d G . MIRSCHEL

Eine optimale stimulierende Wirkung der C]-Verbindungen wird bei einer Zugabe von ca. 2 X 10~ 2 g Cj-Verbindung/g gebildete Biomasse (als BTS) erreicht. Die katalytische Wirkung ist von der chemischen Natur der zugesetzten (^-Verbindung abhängig, für den Stamm GB 25 in der Reihenfolge: CH 3 OH > C 0 2 > HCOOH > HCHO (SCHNEIDER et al. 1983). E s war das Ziel dieser Arbeiten, die Abhängigkeiten der Effektorwirkung der zugesetzten Cj-Verbindungen von der Wachstumsrate des Bakterienstammes GB 25 zu untersuchen und modellmäßig zu erfassen.

Material

und

Methoden

Alle Untersuchungen sind mit einem neu isolierten Bakterienstamm der Arbeitsbezeiehnung GB 25 ZIMET B 502 durchgeführt worden (WENDLANDT et al., in Vorbereitung). Die experimentellen Versuche wurden in einem 15-1-Rührfermentor kontinuierlich unter Chemostatbedingungen durch Variation des Methan/Sauerstoff-Verhältnisses bei sonst konstanter Gesamtgasmenge und Rührereintragsleistung durchgeführt. Als konstante Prozeßbedingungen wurden eingestellt: pH-Wert 5,1, Fermentationstemperatur 38 °C. Die Nährsalze wurden so dosiert, daß weder Limitationen noch Inhibierungen auftreten konnten (WENDLANDT et al., in Vorbereitung). Die C r Verbindungen wurden mit dem Nährmedium in den Permentor dosiert, entsprechend einer Menge pro 1 g gebildete Biomasse von: 0,023 g CH3OH, 0,022 g HCHO, 0,018 g HCOOH und 0,022 g C0 2 (als Bicarbonatäquivalente). Die Durchflußraten wurden im Bereich von D = 0,067 bis 0,167 h - 1 variiert. Modellansätze: Die Abhängigkeit des Ausbeutekoeffizienten Y von der Wachstumsrate der Mikroorganismen kann nach der bekannten linearen Beziehung von PIRT (1965) bzw. SCHULZE undLIPE (1964) beschrieben w e r d e n :

Y

yco + ' ™y

(1)

Durch Auflösung der Gleichung 1 nach Y erhalt man eine hyperbolische Funktion der Form:

bzw. nach dem Stationäritätsprinzip mit ¡x = D gilt: Die beiden Koeffizienten m und 7 0 0 in Gleichung 3 können als systemspezifische Konstanten angesehen werden, so daß auch das Produkt m X zu der Systemkonstante Kp zusammenge zogen werden kann. Der Betrag von KD stellt diejenige Wachstumsrate dar, bei welcher der WerY°°/2 erreicht wird. So folgt aus (3) Gleichung 4: Y = r°° — — — D+Kd

K(4)

'

Gleichung 4 besitzt eine Analogie zur Adsorptionsisotherme für heterogenkatalytische Reaktionen und auch zum Wachstumsmodell nach MONOD. Für reale Systeme ist Y°° eine fiktive Größe, da die wahre maximale Ausbeute Fmax noch vor Erreichen der maximalen Wachstumsrate bzw. auch der kritischen Durchflußrate erhalten wird. Definitionsgemäß wird die zum 7 m a x -Wert gehörende Durchflußrate als optimale Durchflußrate •Dopt bezeichnet, so daß aus Gleichung 4 folgt: Jmax = yoc

Da * •Dopt + -K-D

(5)

Im Falle der kontinuierlichen Kultivierung des Bakterienstammes GB 25 beträgt JD0pt — 0 , 9 5 DCRIT-

261

Waohstumssteigerung bei methanotrophen Bakterien

Des weiteren wurde ein stöchiometrisoher Quotient gebildet, welcher das Verhältnis zwischen Sauerstoff- und Methanverbrauch pro gebildete Biomasseeinheit widerspiegelt. Dieser Quotient wurde aus «CH. =

kalkuliert.

Y

*IY°'

Ergebnisse CH4-Limitation Zusätze von sauerstoffhaltigen Cx-Verbindungen, die zugleich auch (\-Intermediate im (^-Metabolismus sind, erhöhen sowohl die maximale Wachstumsrate (kritische Durchflußrate) als auch die Ausbeutekoeffizienten bezüglich Methan und Sauerstoff. Die erhaltenen experimentellen Daten lassen sich sehr gut durch die Modelle der Gleichung 1 bzw. 3 beschreiben (vgl. Abb. 1 und 2). Die nach Gleichung 1 ermittelten Koeffizienten Y°° und m sowie die experimentell bestimmten kritischen Durchflußraten D c r i t , sowie die für D0pt berechneten Y m a x - Werte sind zusammenfassend für die einzelnen Cj-Verbindungen in den Tabellen 1 (CH4bezogene Koeffizienten) und 2 (0 2 -bezogene Koeffizienten) aufgeführt. Tabelle 1 Kalkulierte methanbezogene Koeffizienten der Gleichung 1 sowie ermittelte kritische Durchflußraten ohne und mit zugeführten sauerstoffhaltigen Cj-Verbindungen beim C-limitierten Wachstum des Bakterienstammes GB 25 yoo Zusätze

CH 3 OH HCHO HCOOH

co2 —

Tos

(g BTS/ gCH4)

Dent (h"1)

(g C H J g B T S • h)

1,15 0,96 1,03 1,08 0,86

0,048 0,039 0,042 0,045 0,034

0,25 0,21 0,22 0,24 0,20

ymax

(g BTS/ gCH4) 0,94 0,81 0,85 0,89 0,76

Tabelle 2 Sauerstoffbezogene Wachstumskoeffizienten nach Gleichung 1 ohne und mit zugeführten sauerstoffhaltigen Cj-Verbindungen beim C-limitierten Wachstum des Bakterienstammes GB 25 (Dcrit-Werte vgl. Tab. 1) Zusätze

To, (g BTS/g 0 2 )

CH3OH

0,42 0,34 0,34 0,38 0,27

HCHO HCOOH

co2 —

mo, (g 0 , / g BTS • h) 0,166 0.147 0,147 0,157 0,123

7OT (g BTS/g 0 2 ) 0,32 0,27 0,27 0,30 0,23

Man erkennt aus der grafischen Darstellung der Abbildung 1, daß oberhalb eines Schnittpunktes der Kurvenschar die effektorische Wirkung der zugeführten Cj-Verbindungen progressiv anwächst und praktisch mit Erreichen der optimalen Durchflußrate endet. Dieser Schnittpunkt kann als sogenannter isoeffektorischer Punkt bezeichnet werden, welcher im Falle der F s -Werte durch D i s o = 0,04 h _ 1 und r' s s0 = 0,50 g BTS/g CH 4 und für die y^-Werte durch Dis0 = 0,033 h" 1 und = 0,14 g BTS/g Oa bestimmt wird.

262

J . D . S C H N E I D E R , K . - D . W E N D L A N D T , E . B R Ü H L u n d G . MIRSCHEL

Abb. 1. Einfluß zugesetzter C r Verbindungen auf die Ausbeute (Ys) in Abhängigkeit von der Durehflußrate bei C-Limitation. (O) CH 3 OH, ( • ) C0 2 , ( • ) HCOOH, ( X ) HCHO, (A) ohne Zusatz; Dopt; (—) Modellkurve nach Gleichung 3 und Daten der Tabelle 1

Unterhalb der isoeffektorischen Durchflußrate (D < Diso) besitzen die zugeführten Cj-Verbindungen eine schwach ausgeprägte inhibierende Wirkung, die sich in der Verringerung der Y-Werte im Vergleich zur Fermentation ohne Zusätze ausdrückt. Prinzipiell steigt die Effektorwirkung bei hoher Durchflußrate in der Reihenfolge: CH3OH > C0 2 > HCOOH > HCHO In dieser Reihenfolge nehmen auch unter vergleichbaren Fermentationsbedingungen die Werte für die Systemkoeffizienten r m a x , m, D o p t und K B ab. Sauerstofflimitation Unter den Bedingungen einer chemostatischen 0 2 -Limitation werden analoge Beziehungen wie für die C-limitierten Fermentationen erhalten (Tab. 3 und 4). So fällt auch hier die Effektorwirkung in der Reihe: CH 3 0H > C0 2 > HCOOH > HCHO Gegenüber dem C-limitierten Prozeß sind die F s , Y™ax- und m s -Werte niedriger, dagegen die entsprechenden Yo*x- und m 0j -Werte sowie die kritische Durchflußrate höher. Auch beim 0 2 -limitierten Prozeß treten isoeffektorische Punkte bei Z) js0 = 0,036 h" 1 und Ys = 0,5 g BTS/g CH4 bzw. Y0l = 0,13 g BTS/g 0 2 auf (vgl. hierzu Tabelle 3 Methanbezogene Wachstumskoeffizienten nach Gleichung 1 mit und ohne Zuführung sauerstoffhaltiger Cj-Verbindungen unter Sauerstofflimitation yoo Cj-Verbindung

CH 3 OH HCHO HCOOH

co 2 —

(g BTS/ gCH 4 ) 1,02 0,87 0,91 0,96 0,80

TOS (g CH4/ g BTS • h) 0,036 0,031 0,032 0,033 0,026

I>crit (h"1) 0,26 0,27 0,26 0,26 0,20

yraax

(g BTS/ gCH 4 ) 0,89 0,79 0,81 0,85 0,72

Wachstumssteigerung bei methanotrophen Bakterien

263

Abb. 2). Die höchsten Ausbeutesteigerungen werden unter den gewählten Prozeßbedingungen bei Methanolzusätzen von 0,022 g CH3OH/g BTS erreicht. Sie betragen 23% für die 7? ax -Werte und 40% für die 7g s ax -Werte gegenüber den Fermentationen ohne Zuführung von Methanol. Tabelle 4 Sauerstoffbezogene Wachstumskoeffizienten nach Gleichung 1 mit und ohne Zuführung sauerstoffhaltiger C r Verbindung unter 0 2 -Limitation C r Verbindung CH 3 OH HCHO HCOOH C0 2 —

yg> (g BTS/g 0 2 ) 0,47 0,34 0,38 0,39 0,29

«10, (g 02/g BTS • h) 0,202 0,173 0,191 0,210 0,147

7max

(g BTS/g 0 2 ) 0,34 0,28 0,29 0,30 0,24

Dih'1) Abb. 2. Einfluß zugesetzter C r Verbindungen auf die Ausbeute ( 7 S ) in Abhängigkeit von der Durchflußrate bei 0 2 -Limitation. (o) CH 3 OH, ( • ) C0 2 , ( • ) HCOOH, ( X ) HCHO, ( A ) ohne Zusatz; (—|) D0pt-; ( — ) Modellkurve nach Gleichung 3 und Daten der Tabelle 3

S t ö c h i o m e t r i e der

Biomassesynthese

Die Zusätze der sauerstoffhaltigen (^-Verbindungen beeinflussen die Bilanz der mikrobiologischen Methanutilisation. Die Zusammensetzung der Biomasse ändert sich unter dem Einfluß der Cj-Zusätze nicht nachweisbar. Sie beträgt C0 04. H 0 07 O0 0a N 0 01. Aus der Massenbilanz ist zu erkennen, daß sich durch diese Zusätze die spezifischen Mengen an Endprodukten (C0 2 , H 2 0 ) verringern und dadurch der spezifische Verbrauch für Sauerstoff und Methan herabgesetzt wird (Tab. 5). Das Verhältnis der utilisierten spezifischen Mengen an Methan und Sauerstoff ist nicht konstant, es ist u. a. abhängig von der Art der Zusätze der Cj-Intermediate, der Wachstumsgeschwindigkeit der Mikroorganismen und den ausgewählten Limitationsbedingungen (vgl. Abb. 3 und 4):

264

J . D . SCHNEIDER, K . - D . W E N D L A N D T , E . B R Ü H L u n d G . MIRSCHEL

Tabelle 5 Massenbilanz der Zell Vermehrung der Bakterien GB 25 unter den Bedingungen D — 0,167 h _ 1 , Oj-Limitation und Zusätzen an C r Verbindungen (CH 3 OH = 0,023 g/g B T S ; H C H O = 0,022 g/g B I S ; H C O O H = 0,018 g/g B T S und C0 2 (als Bicarbonat) = 0,022 g/g B T S ) sowie 0,12 g NH 3 /g BTS) Zusatz an Cj-Verbindungen ohne HCHO HCOOH co2 CH 3 OH

1,40 g 1,34 g 1,29 g 1,24 g 1,20 g

CH 4 CH 4 CH 4 CH 4 CH 4

+ + + + +

4,32 g 3,95 g 3,74 g 3,68 3,28 g

0 2 - * 1 g BTS 0 2 ^ 1 g BTS 02 1 g BTS 1 g BTS 0 2 -> 1 g BTS

+ + + + +

2,03 g 1,88 g 1,74 g 1,61 g 1,50 g

C0 2 C0 2 C0 2 C0 2 C0 2

+ + + + +

2,48 g H 2 0 2,35 g H 2 0 2,25 g H 2 0 2,12 g H 2 0 20,7 g H 2 0

CV» - Limitation

i 0,05

i 0,10

i .0,15

i 0,10

i 0,25

Dlh'1) Abb. 3. Abhängigkeit des stöchiometrischen Quotienten a ® ^ von der Durchflußrate und der A r t der zugesetzten C r Verbindungen unter CH 4 -Limitation (Symbole für (^-Verbindungen wie in Abb. 1 und 2) «CH4 = / (ß> C j - Z u s ä t z e , L i m i t a t i o n s a r t )

Der stöchiometrische Quotient occkt kann als ein Maß für die Effizienz der Biomassesynthese angesehen werden. Je kleiner dieser Quotient ist, desto größer ist die Zellausbeute und umso geringer ist die C0 2 - und Wasserbildung. Aus Gleichung 6 resultiert für den Fall einer unendlich hohen Wachstumsrate: («Sj°°=

(7)

Der Zusammenhang zwischen Gleichung 6 und 7 kann im untersuchten Bereich der Durchflußrate von D = 0,167 ... 0,067 h _ 1 in erster Näherung durch eine Geradengleichung beschrieben werden (Abb. 5): occk, =

(«g&J- +

^o/c • D - 1

(8)

Die Kurvenschar in Abbildung 5 für die CH 4 -Limitation verläuft nahezu parallel, wie auch aus den K 0 /c-Werten in Tabelle 6 zu erkennen ist. Hingegen werden bei

265

Wachstumssteigerung bei methanotrophen Bakterien 4,0 Y

Oi - Limitation

3,8

3,6

^ &

3,4

'S 3,0

2,8

2,6

2,4 0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

Df/i'1)

Abb. 4. Abhängigkeit des stöchiometrischen Quotienten a®^ von der Durchflußrate und der Art der zugesetzten C r Verbindungen (Symbole siehe Abb. 1 bzw. 2 unter 0 2 -Limitation)

CHif- Limitation 3/5 t ^

3,4

^ 3 , 2

3,0

2,8

10

15 HD

(h)

Abb. 5. Lineare Korrelation zwischen dem ocgJ^-Wert und der reziproken Durchflußrate im Bereich zwischen 5 und 15 h unter CH 4 -Limitation (Symbole für C r Verbindungen wie in Abb. 1 und 2) 19

Z. Allg. Mikrobiol., Bd. 23, H. i

266

J . D . SCHNEIDER, K . - D . WENDLANDT, E . BRÜHL u n d G . MIRSCHEL

Sauerstofflimitation sowohl der Koeffizient i^o/c als auch die («clrj 0 0 -Werte durch die Cj-Zusätze beeinflußt. Der Koeffizient K 0 / c für den 0 2 -limitierten Prozeß ist etwa 2—3mal höher als für den C-limitierten Prozeß. Dagegen werden im 0 2 -limitierten Prozeß geringere stöchiometrische Quotienten (acH,)°° erhalten. Das praktisch erreichbare Minimum der stöchiometrischen Quotienten «CH, wird bei den jeweiligen optimalen Durchflußraten erreicht; sie betragen 2,6 ... 3,0 g 0 2 /g CH 4 (0 2 -Limitation) und 2 , 9 - 3 , 3 g 0 2 /g CH 4 (CH 4 -Limitation). Tabelle 6 Stöchiometrische Quotienten