Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie: Band 22, Heft 1 1982 [Reprint 2021 ed.] 9783112580769, 9783112580752

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ZEITSCHRIFT FÜR ALLGEMEINE MIKROBIOLOGIE AN INTERNATIONAL JOURNAL ON MORPHOLOGY, PHYSIOLOGY, GENETICS, AND ECOLOGY OF MICROORGANISMS HEFT 1 • 1982 BAND 22

W EVP 20,—M

AKADEMIE-VERLAG

BERLIN

ISSN 0014-8206

84112

CONTENTS OF NUMBER 1 Rubredoxin-reductase in crude extracts ol Acinetobacter calcoaceticus in dependence on carbon source and growth phase Isolation of membrane-associated folded chromosomes from Anacystis nidulans

R . C L A U S AND H . - P . K L E B E R

A . ELLINGER, WEISSHÄUPL

P . DWOBSKY

3

AND

V. 17

Mannan-localization by concanavalin A in connection with electron microscopical and chemical investigations of differently prepared cell walls of the food-protein yeast Candida spec. H.

W . F I S C H E B AND G . R E U T B K

29

Leaching of uranium-containing phosphorites with heterotrophic microorganisms

K . - H . K U L L M A N N AND W . S C H W A B T Z

41

Changes in cytoplasmic ultrastructure during submerged cultivation of a peptide alkaloids-producing strain of Claviceps purpurea (FR.) TUL.

W . LÖSECKE, D . NEUMANN, S C H M A U D E E AND D . G R O G E R

49

Short

H.-P.

Notes

Connection between protein and polysaccharide content in cell wall-modified Candida spec. H mutants Electron microscopic demonstration of negative surface charges on cytoplasmic membranes of Bacillus subtilis with protamine-ferritin Excretion and action of epimerase from ter vinelandii

Asotobac-

R U T H K Ö L B L I N AND R . T R Ö G E K

63

F . MACH, P . BERGMANN, U . PEÜLLEI; AND L . W Ü L F E L

69

C H E . W E T Z L E E AND U . B E H R E N S

73

Book Reviews

77

INHALTSVERZEICHNIS H E F T 1 Rubredoxin-Reductase in Rohextrakten von Acinetobacter calcoaceticus in Abhängigkeit von CQuelle und Wachstumsphase Isolierung von membrangebundenen, gefalteten Chromosomen aus Anacystis nidulans

R . C L A U S UND H . - P . K L E B E R

A . ELLINGER, P . DWOBSKY WEISSHÄUPL

3

UND

V. 17

Mannan-Lokalisation durch Concanavalin A im Zusammenhang mit elektronenmikroskopischen und chemisch-analytischen Untersuchungen an unterschiedlich präparierten Zellwänden der Futtereiweißhefe Candida spec. H.

W . F I S C H E R UND G . R E U T E R

29

Laugung von uranhaltigen Phosphoriten mit heterotrophen Mikroorganismen Veränderungen in der Ultrastruktur des Cytoplasmas während der submersen Kultivierung eines PeptidAlkaloide-produzierenden Stammes von Claviceps purpurea (FR.) TUL.

K . - H . K U L L M A N N UND W . SCHWABTZ

41

Kurze Originalmitteilungen Zusammensetzung zwischen Protein- lind Polysaccharidgehalt in zellwandmodifizierten Mutanten von Candida spec. H

W . LÖSECKE, D . NEUMANN, S C H M A U D E B UND D . G B Ö G E B

H.-P. 49

R U T H K Ö L B L I N UND R . T R Ö G E R

63

Elektronenmikroskopischer Nachweis negativer Oberflächenladungen an cytoplasmatischen Membranen von Bacillus subtilis mit Protamin-Ferritin

F . MACH, P . BERGMANN, U . PFÜLLEE UND L . W Ö L F E L

69

Zur Bildung und Wirkung der Epimerase von Azotobacter vinelandii Buchbesprechungen

CHB. WETZLEB u n d U. BEHRENS

73

77

ZEITSCHRIFT FÜR ALLGEMEINE MIKRO- BIOLOGIE MORPHOLOGIE, PHYSIOLOGIE, GENETIK UND OKOLOGIE DER MIKROORGANISMEN

ISSN 0044-2208 H E R A U S G E G E B E N VON

F . Egami, Tokio G. F. Gause, Moskau 0 . Hoffmann-Ostenhof, Wien A. A. Imseneckii, Moskau R. W. Kaplan, Frankfurt/M. F. Mach, Greifswald 1. Mälek, Prag C. Weibull, Lund

unter der Chefredaktion von W. Schwartz, Braunschweig und U. Taubeneck, Jena

U N T E R M I T A R B E I T VON

J . H. Becking, Wageningen H. Böhme, Gatersleben M. Girbardt, Jena S. I. Kusnecov, Moskau O. Necas, Brno C.H. Oppenheimer, Port Aransas N. Pfennig, Göttingen I. L. Rabotnova, Moskau A. Schwartz, Wolfenbüttel

HEFT 1- 1982 BAND 22

REDAKTION

U. May, Jena

AKADEMIE-VERLAG • BERLIN

Die Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie soll dazu beitragen, Forschung und internationale Zusammenarbeit auf dem Gebiet der Mikrobiologie zu fördern. Es werden Manuskripte aus allen Gebieten der allgemeinen Mikrobiologie veröffentlicht. Arbeiten über Themen aus der medizinischen, landwirtschaftlichen, technischen Mikrobiologie und aus der Taxonomie der Mikroorganismen werden ebenfalls aufgenommen, wenn sie Fragen von allgemeinem Interesse behandeln. Zur Veröffentlichung werden angenommen: Originalmanuskripte, die in anderen Zeitschriften noch nicht veröffentlicht worden sind und in gleicher Form auch nicht in anderen Zeitschriften erscheinen werden. Der Umfang soll höchstens i y 2 Druckbogen (24 Druckseiten) betragen. Bei umfangreicheren Manuskripten müssen besondere Vereinbarungen mit der Schriftleitung und dem Verlag getroffen werden. Kurze Originalmitteilungen über wesentliche, neue Forschungsergebnisse. Umfang im allgemeinen höchstens 3 Druckseiten. Kurze Originalmitteilungen werden beschleunigt veröffentlicht. Kritische Sammelberichte und Buchbesprechungen nach Vereinbarung mit der Schriftleitung. Bezugsmöglichkeiten der Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie: Bestellungen sind zu richten — in der DDR an den Postzeitungsvertrieb, an eine Buchhandlung oder an den AkademieVerlag, DDR-1086 Berlin, Leipziger Str. 3—4. — im sozialistischen Ausland an eine Buchhandlung für fremdsprachige Literatur oder an den zuständigen Postzeitungsvertrieb — in der BRD und Berlin (West) an eine Buchhandlung oder an die Auslieferungsstelle KUNST UND WISSEN, Erich Bieber OHG, D-7000 Stuttgart 1, Wilhelmstraße 4 - 6 — in den übrigen westeuropäischen Ländern an eine Buchhandlung oder an die Auslieferungsstelle KUNST UND WISSEN, Erich Bieber GmbH, CH-8008 Zürich Schweiz, Dufourstraße 51 — im übrigen Ausland an den Internationalen Buch- und Zeitschriftenhandel; den Buchexport, Volkseigener Außenhandelsbetrieb der Deutschen Demokratischen Republik, DDR-7010 Leipzig, Postfach 160, oder an den Akademie-Verlag, DDR-1086 Berlin, Leipziger Straße 3—4. Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie Herausgeber: Im Auftrag des Verlages von einem internationalen Wissenschaftlerkollektiv herausgegeben. Verlag: Akademie-Verlag, DDR-1086 Berlin, Leipziger Straße 3 - 4 ; Fernruf 2236229 oder 2236221 • Telex-Nr.' 114420; Bank: Staatsbank der DDR, Berlin, Kto.-Nr.: 6836-26-20712. Chefredaktion: Prof. Dr. U D O TATJBENECK, Prof. Dr. W I L H E L M SCHWARTZ. Anschrift der Redaktion: Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften, DDR-6900 Jena, Beutenbergstr. 11; Fernruf: Jena 885614; TelexNr. 058621 Veröffentlicht unter der Lizenznummer 1306 des Presseamtes beim Vorsitzenden des Ministerrates der Deutschen Demokratischen Republik. Gesamtherstellung: VEB Druckerei „Thomas Müntzer", DDR-5820 Bad Langensalza. Erscheinungsweise: Die Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie erscheint jährlich in einem Band mit 10 Heften. Bezugspreis je Band 250, — M zuzüglich Versandspesen (Preis für die DDR 200,—M) Preis je Heft 2 5 , - M (Preis für die DDR 2 0 , - M). Urheberrecht: Alle Rechte vorbehalten, insbesondere die der Übersetzung. Kein Teil dieser Zeitschrift darf in irgendeiner Form — durch Photokopie, Mikrofilm oder irgendein anderes Verfahren — ohne schriftliche Genehmigung des Verlages reproduziert werden. — All rights reserved (including those of translations into foreign languages). No part of this issue may be reproduced in any form, by photoprint, microfilms or any other means, without written permission from the publishers. Erscheinungstermin: Januar 1982 Bestellnummer dieses Heftes 1070/22/1 © 1982 by Akademie-Verlag Berlin, Printed in the German Democratic Republic. AN (EDV) 75218

Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie

22

1

19S2

3-15

(Bereich Biochemie der Sektion Biowissenschaften der Karl-Marx-Universität Leipzig, DDR)

Rubredoxin-Reductase in Rohextrakten von Acinetobacter calcoaceticus in Abhängigkeit von C-Quelle und Wachstumsphase R . CLAUS u n d H . - P . K L E B E E

(Eingegangen am 6. 4.1981) By immunization of rabbits with discelectrophoretically purified rubredoxin-reductase from Ac. calcoaceticus an antiserum against this enzyme was prepared. The antiserum was monospecifical to a diaphoretic activity, which had a Ry-value identical with the rubredoxin-reductase-Ry value. It has been shown by discelectrophoresis, Immunoelectrophoresis, OTJCHTEKLONY technique and kinetic investigations that crude extracts of bacteria grown on C16, malate, succinate or acetate contain rubredoxin-reductase. By the LATJEELL technique we demonstrated that the amount of the enzyme is nearly independent of the carbon source. There are only differences during the different growth phases. Acinetobacter calcoaceticus ist in der Lage, auf n-Alkanen (mit Kettenlängen über 12 C-Atomen) als einziger Kohlenstoffquelle zu wachsen (KLEBER et al. 1973). Aus Versuchen mit intakten Zellen wurde ein Abbau weg über Alkohol und Aldehyd zur Säure angenommen (AUEICH U. EITNER 1973), der durch den Nachweis einer Alkaninduzierbaren Pyridinnucleotid-unabhängigen Alkoholdehydrogenase (TAUCHEET et al. 1975) und NADP+ -abhängigen Aldehyddehydrogenase (SOEGEE U. AUEICH 1978) seine Bestätigung fand. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, daß zellfreie E x t r a k t e von Ac. calcoaceticus Alkane zur korrespondierenden Fettsäure oxydieren (AUEICH et al. 1977, ASPERGER et al. 1978). Hingegen ist der initiale Oxydationsschritt, der die Umwandlung des Alkans zum Alkohol katalysiert, noch unbekannt. Die Isolierung und Charakterisierung einer bakteriellen Alkanemonooxygenase gelang bisher nur bei Pseudomonas oleovorans (COON et al. 1973). Bei diesem Stamm besteht das Hydroxylierungssvstem aus Rubredoxin, einer NAD FI: Rubredoxin-Reductase und der eigentlichen Hydroxylase PETERSON et al. 1966, PETEESON U. COON 1968, UEDA U. COON 1972). In Analogie zu diesen Ergebnissen gelang in Ac. calcoaceticus der Nachweis eines Eisen-Schwefel-Proteins, welches nach Isolierung und Reinigung als Rubredoxin charakterisiert werden konnte (AURICH et al. 1976). Weitere Untersuchungen ergaben, daß dieses Protein erst durch Wachstum auf Kohlenwasserstoffen induziert wird und somit in Beziehung zur Kohlenwasserstoffverwertung stehen könnte (CLAUS et al. 1970). In der gleichen Bakterienspecies konnte, ähnlich wie in Ps. oleovorans (PETERSON U. COON 1968, UEDA et al. 1972), nach Wachstum auf w-Alkanen das Vorkommen einer NADH :Rubredoxin-Reductase nachgewiesen werden, die partiell gereinigt und in einigen Eigenschaften charakterisiert wurde (CLAUS et al. 1978, 1979). Ein direkter Beweis für die Beteiligung dieses Enzyms — aber auch des Rubredoxins — an der w-Alkanhydroxylierung durch Ac. calcoaceticus war bisher auf Grund der Schwierigkeiten, die bei der Reinigung der Hydroxylase auftraten, nicht möglich. E s war deshalb von Interesse, einige regulatorische Aspekte der Rubredoxin-Reductasebildung zu untersuchen. Voraussetzung dafür war die Entwicklung von Methoden, die einen Nachweis des Enzyms in Bakterienrohextrakten gestatten. l«

Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie

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19S2

3-15

(Bereich Biochemie der Sektion Biowissenschaften der Karl-Marx-Universität Leipzig, DDR)

Rubredoxin-Reductase in Rohextrakten von Acinetobacter calcoaceticus in Abhängigkeit von C-Quelle und Wachstumsphase R . CLAUS u n d H . - P . K L E B E E

(Eingegangen am 6. 4.1981) By immunization of rabbits with discelectrophoretically purified rubredoxin-reductase from Ac. calcoaceticus an antiserum against this enzyme was prepared. The antiserum was monospecifical to a diaphoretic activity, which had a Ry-value identical with the rubredoxin-reductase-Ry value. It has been shown by discelectrophoresis, Immunoelectrophoresis, OTJCHTEKLONY technique and kinetic investigations that crude extracts of bacteria grown on C16, malate, succinate or acetate contain rubredoxin-reductase. By the LATJEELL technique we demonstrated that the amount of the enzyme is nearly independent of the carbon source. There are only differences during the different growth phases. Acinetobacter calcoaceticus ist in der Lage, auf n-Alkanen (mit Kettenlängen über 12 C-Atomen) als einziger Kohlenstoffquelle zu wachsen (KLEBER et al. 1973). Aus Versuchen mit intakten Zellen wurde ein Abbau weg über Alkohol und Aldehyd zur Säure angenommen (AUEICH U. EITNER 1973), der durch den Nachweis einer Alkaninduzierbaren Pyridinnucleotid-unabhängigen Alkoholdehydrogenase (TAUCHEET et al. 1975) und NADP+ -abhängigen Aldehyddehydrogenase (SOEGEE U. AUEICH 1978) seine Bestätigung fand. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, daß zellfreie E x t r a k t e von Ac. calcoaceticus Alkane zur korrespondierenden Fettsäure oxydieren (AUEICH et al. 1977, ASPERGER et al. 1978). Hingegen ist der initiale Oxydationsschritt, der die Umwandlung des Alkans zum Alkohol katalysiert, noch unbekannt. Die Isolierung und Charakterisierung einer bakteriellen Alkanemonooxygenase gelang bisher nur bei Pseudomonas oleovorans (COON et al. 1973). Bei diesem Stamm besteht das Hydroxylierungssvstem aus Rubredoxin, einer NAD FI: Rubredoxin-Reductase und der eigentlichen Hydroxylase PETERSON et al. 1966, PETEESON U. COON 1968, UEDA U. COON 1972). In Analogie zu diesen Ergebnissen gelang in Ac. calcoaceticus der Nachweis eines Eisen-Schwefel-Proteins, welches nach Isolierung und Reinigung als Rubredoxin charakterisiert werden konnte (AURICH et al. 1976). Weitere Untersuchungen ergaben, daß dieses Protein erst durch Wachstum auf Kohlenwasserstoffen induziert wird und somit in Beziehung zur Kohlenwasserstoffverwertung stehen könnte (CLAUS et al. 1970). In der gleichen Bakterienspecies konnte, ähnlich wie in Ps. oleovorans (PETERSON U. COON 1968, UEDA et al. 1972), nach Wachstum auf w-Alkanen das Vorkommen einer NADH :Rubredoxin-Reductase nachgewiesen werden, die partiell gereinigt und in einigen Eigenschaften charakterisiert wurde (CLAUS et al. 1978, 1979). Ein direkter Beweis für die Beteiligung dieses Enzyms — aber auch des Rubredoxins — an der w-Alkanhydroxylierung durch Ac. calcoaceticus war bisher auf Grund der Schwierigkeiten, die bei der Reinigung der Hydroxylase auftraten, nicht möglich. E s war deshalb von Interesse, einige regulatorische Aspekte der Rubredoxin-Reductasebildung zu untersuchen. Voraussetzung dafür war die Entwicklung von Methoden, die einen Nachweis des Enzyms in Bakterienrohextrakten gestatten. l«

4

R . CLAUS u n d H . - P . KLEBER

In der vorliegenden Arbeit soll über den Einfluß von «-Alkanen und anderen CQuellen sowie der Wachstumsphase auf den Gehalt der Rubredoxin-Reductase in Rohextrakten von Ac. calcoaceticus berichtet werden. Material

und

Methoden

Stammhaltung und Kultivierung von Ac. calcoaceticus sind an anderer Stelle beschrieben (KLEBER u. AURICH 1973). C-Quellen waren Hexadecan (6 g/1), Acetat (20 g/1). Succinat (20 g/1) bzw. Malat (20 g/1). Die Bakterien wurden durch Zentrifugation geerntet (10 min bei 6000 x g), zweimal mit Phosphatpuffer (0,1 mol/1; pH 7,4) gewaschen und in 10 ml des gleichen Phosphatpuffers resuspendiert. Zur Gewinnung von Rohextrakten wurden die Bakteriensuspensionen mittels Ultraschall (KLEBER u. AURICH 1973) — in einigen Fällen mit Alcoa — aufgeschlossen und anschließend bei 0 °C und 20000 X g für 20 min abzentrifugiert. Durch eine weitere Zentrifugation bei 100000 X g für 60 min wurde der — in den Untersuchungen verwendete — partikelfreie Überstand erhalten. Die teilweise Anreicherung der Rubredoxin-Reductase aus Ac. calcoaceticus erfolgte nach CLAUS et al. (1979), wobei die Reinigung bis zur Stufe der 1. Chromatographie an DEAE-Cellulose erfolgte. Die Reductase wurde dadurch ca. 8fach angereichert. Zur Gewinnung eines weitgehend homogenen Enzympräparates für die Immunisierung wurde die angereicherte Rubredoxin-Reductase diskelektrophoretisch aufgetrennt und die Proteinbande mit einem Rp-Wert von 0,42 (CLAUS et al. 1979) aus dem Gel geschnitten und ohne vorherige Fixierung mit Trichloressigsäure in Phosphatpuffer (0,067 mol/1; pH 7,4; 9 g/1 NaCl enthaltend) (PBS) homogenisiert. Das so aus mehreren Gelröhrchen gewonnene Enzym diente — zusammen mit dem zerkleinerten Polyacrylamid — als Antigen für die Immunisierung. Die Präparation von diskelektrophoretisch homogenem Rubredoxin aus Ac. calcoaceticus erfolgte v a r i i e r t (CLAUS 1979) n a c h AURICH et al. ( 1 9 7 6 ) .

Mit dem gewonnenen Reductasepräparat wurden 2 Kaninchen (weiße Neuseeländer) immunisiert. Vor der Immunisierung wurde das Antigenmaterial im Verhältnis 1:1 mit komplettem FREUND sehen Adjuvans (kFA) gemischt. Die Primärimmunisierung erfolgte durch Injektion von jeweils 1 ml Antigensuspension s. c. in die vier Fußballen sowie i. m. in den Nacken. Nach 8 Wochen wurden innerhalb von drei aufeinanderfolgenden Tagen weitere Injektionen (0,5 — 1,0 ml; 1 x i.m.; 2 x i.v.) gegeben. Eine Woche später wurde diese Immunisierung nach gleichem Schema (ohne kFA) wiederholt. Die Blutentnahme und Antiserumgawinnung erfolgte 10 Tage nach der letzten Injektion durch Herzpunktion. Alle diskelektrophoretischen Untersuchungen sowie die Feinreinigung der Rubredoxin-Reductase erfolgten in Polyacrylamidgel (70 g/1) mit Tris-Glycin-Puffer (pH 8,3) als Elektrodenpuffer. Die Trenndauer betrug bei einer Stromstärke von 7 mA/Gelröhrchen ca. 2 h. Zum Entfernen von Ammoniumpersulfat aus dem gebrauchsfertigen Gel wurde vor der Proteintrennung ein zweistündiger „Vorlauf" bei gleicher Stromstärke durchgeführt. Nach der Auftrennung wurden die Proteinbanden mit Trichloressigsäure (125 g/1) fixiert und mit Coomassie-Brilliantblau (0,4 g/1; SERVA, Heidelberg) angefärbt. Zur Aktivfärbung — spezifisch für Diaphorasen — enthielt die Färbelösung Iodnitrotetrazoliumchlorid (0,1 mmol/1) und NADH (4 mmol/1) in aqua dest. Nach Erscheinen der aktiven Banden (bei Raumtemperatur nach etwa 15 min) wurde mit Essigsäure (50 g/1) fixiert. Immunelektrophoretische Untersuchungen erfolgten in BEHRisrG-Agar (15 g/1; ¡J. = 0,05; p H 8,6) nach der Mikromethode von SCHEIDEGGER (1955). Der Doppeldiffusionstest nach OUCHTERLONY wurde im gleichen Agar-System durchgeführt, wobei auch die Färbetechnik der der Immunelektrophorese entsprach. Der Färbeansatz für die Aktivfärbung entsprach dem der Diskelektrophorese. Die quantitative Bestimmung der Rubredoxin-Reductase durch Anti-Rubredoxin-ReductaseSerum erfolgte nach der Methode von LAURELL (1972). Der Cytochrom c-Reduktionstestansatz enthielt Phosphatpuffer (0,01 mol/1; pH 7,4), Cytochrom c (0,03 mmol/1), NADH (0,3mmol/l), ca. 18 [ig Rubredoxin sowie verschiedene Mengen RubredoxinReductase bzw. Rohextrakt in 1 ml Endvolumen. Gestartet wurde mit Rubredoxin, nachdem der Leerwert für Rubredoxin-Reductase und NADH ermittelt worden war. Der Einfluß des AntiRubredoxin-Reductase-Serums auf die Activität der Rubredoxin-Reductase wurde durch Zugabe des Antiserums zum kompletten Testansatz ermittelt. Die Messungen erfolgten bei 550 nm (PERKIN-ELMER M-356, Hitachi, Tokio; d = 10 mm). Die Diaphoraseaktivität der Rubredoxin-Reductase (bzw. von Rohextrakten) wurde nach UEDA et al. (1972) m i t K a l i u m f e r r i c y a n i d als E l e k t r o n e n a k z e p t o r bei 420 n m (VSU I I , CARL ZEISS J e n a )

gemessen. Das komplette System enthielt Phosphatpuffer (0,01 mol/1; pH 7,4), K3(Fe(CN)6) (0,3 mol/1), NADH (0,3 mmol/1) und verschiedene Enzymmengen (Endvolumen 2 ml; d = 10 mm). Bei Untersuchungen zur Hemmung der Enzymaktivität durch das Antiserum wurde dieses in ver-

Rubredoxin-Reductase aus Ac.

calcoaceticus

5

schiedenen Mengen mit Enzym (bzw. Rohextrakt) 60 min inkubiert und nach Zentrifugation (10000 X g, 10 min) der Überstand zum kompletten Testansatz (ohne Reductase) zugegeben. Die Proteinbestimmung erfolgte nach LOWRY et al. (1951) mit Rinderserumalbumin als Standard.

Ergebnisse Die zur Klärung der Spezifität des gewonnenen Anti-Rubredoxin-Reductase-Serums durchgeführten immunelektrophoretischen Untersuchungen ergeben bei Verwendung eines 8fach angereicherten Reductasepräparates als Antigen mindestens 3 Präzipitationsbanden in der Passivfärbung (Abb. la). Nach Aktivfärbung ist jedoch nur eine Präzipitationsbande zu beobachten (Abb. lb). Auch bei Verwendung des Doppeldiffusionstestes nach O U C H T E R L O N Y treten — unabhängig von der Konzentration des Antiserums — nach Passivfärbung 3 Präzipitationsbanden auf (Abb. 2a). Wird nach dem Doppeldiffusionstest aktiv (auf diaphoretische Aktivität) angefärbt, so tritt — wie in der Immunelektrophorese — nur eine Präzipitationsbande auf (Abb. 2b). Dabei entspricht die Lage dieser Bande der inneren der bei der Passivfärbung auftretenden Banden, was durch nachträgliche Passivfärbung der aktiv gefärbten Präparate gezeigt werden konnte. Mit dem OTTCHTEELONY-Test konnte nachgewiesen werden, daß die angereicherte RubredoxinReductase in der Lage ist, die präzipitierenden Antikörper des Antiserums vollständig zu absorbieren. Dabei wurde das Antiserum vor der Verwendung im Test mit Rubredoxin-Reductase inkubiert, was zum Ausbleiben von Präzipitationsbanden führte.

t

1

AS

Fig. l a

AS

Fig. l b

Abb. 1. Immunelektrophorese von Rubredoxin-Reductase (1) (15 (xg Protein) und Bakterienrohextrakt (2)(200;xg Protein) nach Wachstum von Ac. calcoaceticus auf Hexadecan; Anti-RubredoxinReductase-Serum (AS) (50 ¡xl). a) Passivfärbung, b) Aktivfärbung

6

R . CLAUS u n d H . - P . K L E B E R

Abb. 2a

Abb. 2b

Abb. 2. Doppeldiffusionstest nach OUCHTERLONY. Versuchsbedingungen: Agarosegel (15 g/1); Diffusionsdauer 24 h. Anti-Rubredoxin-Reductase-Serum (AS) (20 ¡xl); 14,6 fil (1), 13,1 |xl (2), 11,7 ¡¿1 (3), 10,2 (¿1 (4), 8,8 [xl (5), 7,33 [il (6) angereicherte Rubredoxin-Reductase. a) Passivfärbung mit Coomassie-Brillantblau (schematisch) b) Aktivfärbung mit NADH und Iodnitrotetrazoliumchlorid

Zur qualitativen Charakterisierung von Reductasegehalten in Bakterienrohextrakten in Abhängigkeit von der C-Quelle wurden Immunelektrophoresen und Untersuchungen nach OUCHTERLONY durchgeführt. Aus den Abbildungen l a und 3a ist ersichtlich, daß unabhängig von der verwendeten C-Quelle mit beiden Methoden nach Passivfärbung 3 Präzipitationsbanden auftreten. Nach Aktivfärbung (Abb. l b und 3b) ist jeweils nur eine Präzipitationsbande zu beobachten, welche der angereicherten Rubredoxin-Reductase entsprechen sollte.

Abb. 3a

Abb. 3b

Abb. 3. Doppeldiffusionstest nach OUCHTERLONY. Versuchsbedingungen: vgl. Abb. 2 Rohextrakte von Ac. calcoaceticus nach Wachstum auf Hexadecan (H; 244,6 ¡ig), Succinat (S 243,5 fxg), Acetat (A; 244,6 \ig) und Malat (M; 233,2 ¡xg Protein). a) Passivfärbung mit Coomassie-Brillantblau (schematisch) b) Aktivfärbung mit NADH und Iodnitrotetrazoliumchlorid

Die Lage der Passivbanden im OUCHTERLON Y-Test ist dabei jedoch in Abhängigkeit von der C-Quelle unterschiedlich (vgl. Abb. 3a). Unter den einzelnen Banden tritt aber keine Spornbildung auf, was auf Proteine mit gleichen antigenen Determinanten schließen läßt. Da jeder der gewonnenen Rohextrakte in der Lage ist, die präzipitierenden Antikörper des Antiserums vollständig zu absorbieren, ist die Anwesenheit eines identischen Antigens in allen Rohextrakten — unabhängig von der eingesetzten C-Quelle — wahrscheinlich. Der qualitative Nachweis von Rubredoxin-Reductase nach Wachstum auf verschiedenen C-Quellen gelang auch mittels diskelektrophoretischer Untersuchungen. Dazu wurden Bakterienrohextrakte u n d angereicherte Rubredoxin-Reductase mit verschiedenen Antiserummengen 1 h bei Raumtemperatur vorinkubiert u n d anschließend die Immunkomplexe abzentrifugiert. Abbildung 4 zeigt, daß bei Auftrennung eines angereicherten Enzympräparates mehrere Aktivbanden auftreten. Dabei nimmt die Intensität der Bande mit einem R F - W e r t von 0,42, welche nach

Rubredoxin-Reductase aus Ac. calcoaceticua

7

CLAUS et al. ( 1 9 7 9 ) der Rubredoxin-Reductase zuzuordnen ist, mit zunehmender Antiserumkonzentration ab bzw. verschwindet vollständig. I m übrigen Bandenmuster treten dabei keine weiteren Veränderungen auf. Werden anstelle von RubredoxinReductase Bakterienrohextrakte verwendet, tritt der gleiche Effekt auf. Das Vorhandensein von Rubredoxin-Reductase in Rohextrakten von Ac. calcoaceticus nach Wachstum auf verschiedenen C-Quellen konnte mit Hilfe kinetischer Messungen bestätigt werden. Hierbei wurde der hemmende Einfluß von Antiserum auf die diaphoretische Aktivität bzw. die Cytochrom c-Reduktionsrate der RubredoxinReductase untersucht. Aus Abbildung 5 a ist ersichtlich, daß die Aktivität des Enzyms in Abhängigkeit von der eingesetzten Antiserummenge abnimmt, wobei unter den Versuchsbedingungen eine maximale Hemmung von 90% erreicht wurde. Werden verschiedene Reductasemengen bei gleichzeitiger Variation der Antiserummenge eingesetzt, so ist die f ü r eine 50%ige Hemmung benötigte Antiserummenge linear proportional der im Testansatz enthaltenen Reductasekonzentration (Abb. 5 b). Dieses Verhalten könnte für eine quantitative Reductasebestimmung ausgenutzt werden. Aus der Auftragung der Restaktivität gegen den Quotienten aus eingesetzter Antiserum- und verwendeter Reductasemenge ergibt sich für eine 50%ige Hemmung ein Wert von 0,44, der als Titer des gewonnenen Antiserums bezeichnet und zur Charakterisierung dieses verwendet werden kann (Abb. 6). Werden im Cytochrom c-Reduktionstest Rohextrakte (anstelle von Rubredoxin und Rubredoxin-Reductase) von Bakterien nach Wachstum auf verschiedenen CQuellen eingesetzt, so ist ebenfalls in Abhängigkeit von der Antiserummenge eine

Abb. 4. Diskelektrophoretische Auftrennung eines angereicherten Rubredoxin-Reductasepräparates (nach Wachstum der Bakterien auf 6 g/1 Hexadecan) nach Vorinkubation mit Anti-RubredoxinReductase-Serum und anschließender Aktivfärbung. Inkubationsansatz: Jeweils 75 [ig Reductase-haltiges Protein wurden mit 0 (1), 100 (2), 200 (3) bzw. 300 [il (4) Antiserum in 400 (¿1 PBS (Endvolumen) 60 min inkubiert und 100 ¡j.1 des nach Zentrifugation erhaltenen Überstandes aufgetragen.

8

R . CLAUS u n d H . - P . R L E B E B

Hemmung der Cytochrom c-Reduktion zu beobachten (Abb. 7). Dabei werden in Abhängigkeit von der verwendeten C-Quelle folgende maximale Aktivitätshemmungen erreicht: Acetat 45%; Succinat 40%; Malat 35%; Hexadecan 65%. Eine 30%ige Hemmung wird — in Abhängigkeit von der C-Quelle — bei folgenden Verhältnissen von eingesetzter Antiserummenge (fi.1) zur Menge an eingesetztem Rohextrakt (p.g) erreicht: Hexadecan 0,16; Acetat 0,19; Succinat 0,60 undMalat0,68. Dies unterstreicht die Anwesenheit der Rubredoxin-Reductase in allen Rohextrakten, wobei der Gehalt in Malat- und Succinat-gewachsenen Bakterien erhöht zu sein scheint.

Abb. 5. Hemmung der Rubredoxin-Reductase (angereichertes Enzym) durch Antiserum im Cytochrom c-Reduktionstest. a) Zum kompletten Testansatz (vgl. Material und Methoden) mit 14,6 ¡¿g (o), 29,2 ¡xg (•) und 43,8 [ig (•) Rubredoxin-Reductase wurden verschiedenene Mengen Antiserum zugegeben. b) Für eine 50%ige Hemmung der Cytochrom c-Reduktion benötigte Antiserummenge in Abhängigkeit von der im kompletten Testansatz enthaltenen Reductasemenge

Die diaphoretische Aktivität eines angereicherten Reductasepräparates nimmt mit steigender Antiserumkonzentration ab, wobei eine maximale Hemmung von 8 2 % erreicht wird (Abb. 8). Werden verschiedene Rohextrakte im Test eingesetzt, so ist ebenfalls eine Aktivitätsabnahme in Abhängigkeit von der eingesetzten Antiserummenge festzustellen. Dabei wird eine maximale Hemmung nach Wachstum auf Acetat von 40%, Succinat von 45%, Malat von 50% und auf Hexadecan als C-Quelle von 60% erreicht. Fiir eine Aktivitätshemmung von 30% beträgt die benötigte Antiserummenge 0,011 (j.1 (Acetat-Bakterien), 0,071 (j.1 (Succinat-Bakterien), 0,036 (j.1 (MalatBakterien) bzw 0,008 fi.1 (Hexadecan-Bakterien), wenn 1 [ig der jeweiligen Rohextrakte im Testansatz eingesetzt werden. Für die gleiche Hemmung der angereicherten Reductase sind 0,274 [il/p-g erforderlich. Diese Befunde stimmen mit den Ergebnissen

Rubredoxin-Reductase aus Ac.

9

caleoaceticus

der Hemmung des Cytochrom c-Reduktionstestes gut überein und weisen ebenfalls auf einen erhöhten Reductasegehalt in Succinat-gewachsenen Zellen hin. Quantitative Aussagen zum Rubredoxin-Reductasegehalt in Bakterienrohextrakten nach W a c h s t u m auf verschiedenen C-Quellen wurden mit Hilfe der LAUKELL-Technik

Antiservmmenge (ji!)/ Rubredoxinmenge (JJLI) Abb. 6. Hemmung der Cytochrom c-Reduktionsrate in Abhängigkeit von der eingesetzten Antiserummenge bei jeweils konstanter Rubredoxin-Reductasekonzentration. Zum kompletten Testansatz (vgl. Material und Methoden) mit verschiedenen (7,3 ¡ig, 14,6 |ig, 29,2 ug, 43,8 [ig), jeweils konstanten Mengen Rubredoxin-Reductase wurden unterschiedliche Mengen Antiserum gegeben und die Hemmung der Aktivität zum Quotienten aus Antiserummenge und Reductasemenge aufgetragen. Tabelle 1 Reductasegehalt von Rohextrakten nach Wachstum von Ac. calcoaceticus C-Quellen

C-Quelle

Succinat Acetat Malat Hexadecan

auf verschiedenen

eingesetzte Rohextraktmenge ([ig Protein)

ermittelter Reductasegehalt (Hg)

Reductasegehalt

Mittelwert Reductasegehalt

einges. Rohextraktmenge (!*g/t*g)

einges. Rohextraktmenge (Hg/Pg)

51,0 25,5 36,0 18,0 36,0 27,0 18,0 18,0 12,0

3,10 1,20 5,00 2,10 5,00 3,10 1,70 1,90 1,20

0,061 0,047 0,140 0,117 0,140 0,115 0,095 0,105 0,100

0,054 0,129 0,117 0,102

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E . CLAUS u n d H . - P . K L E B E R

Antiserummenge (JJL!)

Abb. 7. Hemmung der Rubredoxin-Reductase (Rohextrakte) durch Antiserum im Cytochrom c-Reduktionstest. Zum kompletten Testansatz (vgl. Material und Methoden; ohne Rubredoxin) mit 122,3 [ig Protein eines Rohextraktes Hexadecan- ( o ) ; 91,3 ug Succinat- ( • ) ; 268,8 (ig Acetat- ( • ) u n d 102,4 ¡ig Malat-gewachsener Bakterien ( • ) wurden verschiedene Mengen Antiserum zugesetzt. Tabelle 2 Reductasegehalt von Rohextrakten nach Wachstum von Ac. calcoaceticus auf Acetat in verschiedenen Wachstumsphasen Wachstumsdauer (h) 4

6

9

20

eingesetzte Rohextraktmenge ([ig Protein)

ermittelter Reductasegehalt (Hg)

Reductasegehalt

Mittelwert Reductasegehalt

einges. Rohextraktmenge (Pg/fAg)

einges. Rohextraktmenge (Pg/l*g)

60,0 46,4 30,0 20,0 69,6 46,4 34,8 23,2 57,2 38,1 28,6 19,1 215,2 134,5

13,00 9,50 7,80 5,30

0,217 0,238 0,260 0,265

0,245

—

14,20 12,30 8,50 17,70 12,70 9,50 6,70 7,20 5,00

—

0,300 0,350 0,365 0,310 0,333 0,332 0,350 0,033 0,038

0,338

0,331 0,036

Rubredoxin-Reductase aus Ac. calcoaceticus

11

Abb. 8. H e m m u n g der diaphoretischen A k t i v i t ä t verschiedener R o h e x t r a k t e durch Anti-Rubredoxin-Reductase-Serum. Die R o h e x t r a k t e von auf verschiedenen C-Quellen gewachsenen Bakterien (Hexadecan (o),

4 8 9 , 2 fxg; A c e t a t ( • ) , 1075,2 (IG; M a l a t ( • ) , 4 0 9 , 7 ixg; S u c c i n a t ( • ) , 3 6 5 , 2 ;xg) b z w . a n g e r e i c h e r t e

Rubredoxin-Reductase ((A), 29,2 ¡ig) wurden jeweils mit 0, 5, 10, 20, 40 u n d 80 ¡xl Antiserum versetzt u n d mit P B S auf 120 ¡¿1 Endvolumen aufgefüllt. Nach Vorinkubation (30 min) und Zentrifugation (10000 X g, 10 min) wurden 50 IJ.1 des Überstandes zum kompletten Testansatz (vgl. Material u n d Methoden) gegeben.

Reductasemenge (pg)

Abb. 9. Abhängigkeit der Präzipitationshöhe (mm) von der Reductasemenge (¡xg) in der I m m u n elektrophorese nach LAUBELL. Versuchsbedingungen: Agarosegel (15 g/1) mit 0,8 ml Antiserum in 12,5 ml Gellösung; Plattengröße 130 X 75 m m ; Stromstärke = 50 m A ; Elektrophoresedauer = 5h

12

E . CLAUS und H . - P . KLEBER

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

Abb. 10. Immunelektrophorese nach LAUBELL mit verschiedenen Mengen R o h e x t r a k t nach Wachstum auf Acetat zu verschiedenen Wachstumszeiten. Versuchsbedingungen: vgl. Abb. 9 1 — 5 Rubredoxin-Reductase als Eichprotein: 7,3 (1); 6,57 (2); 5,84 (3); 4 , 3 8 (4); 2,92 (5) [ig. 6 — 9 R o h e x t r a k t nach 4 h Wachstumsdauer: 60 (6); 4 0 (7); 30 (8); 20 (9) ¡xg. 1 0 - 1 3 R o h e x t r a k t nach 6 h Wachstumsdauer: 69,6 (10); 4 6 , 4 (11); 34,8 (12); 23,2 (13) ¡xg. 1 4 - 1 7 R o h e x t r a k t nach 9 h Wachstumsdauer: 57,2 (14); 38,1 (15); 28,6 (16); 19,1 (17) ¡ig.

Reductasegehalt

Tabelle 3 von Rohextrakten nach Wachstum von Ac. calcoaceticus verschiedenen Wachstumsphasen

ermittelter Reductasegehalt (Hg)

Reductasegehalt

Mittelwert Reductasegehalt

einges. Rohextraktmenge (Hg/Hg)

einges. Rohextraktmenge (Hg/Hg)

Wachtumsdauer (h)

eingesetzte Rohextraktmenge (Hg)

5

18,0 12,0 9,0 6,0

2,25 1,60

35,0 23,3 17,5 11,7

5,20 3,60 2,50 1,70

0,148 0,155 0,143 0,145

236,0 157,3 118,0 78,7

8,00 6,60 5,20 4,00

0,034 0,042 0,044 0,051

7

23

_ —

auf Hexadecan in

0,125 0,133 —

0,129

—

0,148

0,043

gemacht. Als Eichprotein diente hierbei das angereicherte Reductasepräparat. Aus Abbildung 9 ist zu ersehen, daß die Höhe der auftretenden Präzipitationsgipfel proportional der eingesetzten Reductasemenge ist. In den Untersuchungen wurden Rohextrakte von Bakterien eingesetzt, die auf Acetat, Malat, Succinat und Hexadecan 10 h kultiviert worden waren. Der aus der Eichkurve (vgl. Abb. 9) ermittelte Reductasegehalt sowie der Quotient aus Reductasegehalt/eingesetzter Rohextrakt menge ist für die jeweilige C-Quelle in Tabelle 1 zusammengefaßt. Der Gehalt von Bakterienrohextrakten an Rubredoxin-Reductase in verschiedenen Wachstumsphasen mit Acetat (Abb. 10, Tab. 2) und Hexadecan (Tab. 3) als C-Quelle macht deutlich, daß das Enzym in Ac. calcoaceticus konstitutiv ist, wobei es in der stationären Phase zu einem deutlichen Abfall der Enzymaktivität kommt.

Rubredoxin-Reductase aus Ac.

caleoaceticus

13

Diskussion Ein Nachweis der Rubreduxin-Reductase in Zellrohextrakten aus Ac. calcoaceticus ist mit spektrophotometrischen Methoden nicht möglich, da diese auch nach weitgehender Entfernung der Membranen bereits ohne exogenes Rubredoxin hohe spezifische Cytochrom c-Reduktionsraten zeigen, die durch Zugabe von Rubredoxin nicht weiter gesteigert werden können (HOFFMANN 1 9 7 9 ) . Immunologische Verfahren sollten helfen, das Enzym in Rohextrakten zu bestimmen, um damit auch Aussagen zur epigenetischen Regulation der Rubredoxin-Reductase machen zu können. Um das gewonnene Antiserum für quantitative Bestimmungen der RubredoxinReductase in Rohextrakten aus Ac. calcoaceticus verwenden zu können, wurde dieses zunächst auf seine Spezifität gegenüber dem Enzym untersucht. Obwohl die verwendete Methode zur Gewinnung des Antigenmaterials ein monospezifisches Antiserum erwarten ließ, waren sowohl in der Immunelektrophorese als auch im OUCHTERLONYTest drei Präzipitationsbanden nach Proteinfärbung nachweisbar. Das Auftreten von nur einer Präzipitationsbande nach Aktivfärbung auf diaphoretische Aktivität läßt dabei vermuten, daß es sich bei den anderen Banden der Passivfärbung um inaktive Enzymbruchstücke handelt. Der Befund, daß nach Inkubation des angereicherten Reductasepräparates bzw. der verschiedenen Rohextrakte mit dem gewonnenen Antiserum, anschließender Diskelektrophorese und Aktivfärbung sich die Intensität von nur einer Proteinbande verändert bzw. diese verschwindet, unterstreicht die Monospezifität des Antiserums gegen ein Protein mit dem R F -Wert von 0 , 4 2 . Da nach CLAUS et al. ( 1 9 7 9 ) die Rubredoxin-Reductase aus Ac. calcoaceticus in der Diskelektrophorese mit einem R F -Wert von 0,42 aufgetrennt wird, erscheint das gewonnene Antiserum für eine spezifische, quantitative Bestimmung der Rubredoxin-Reductase verwendbar zu sein. Zunächst konnte qualitativ das Vorhandensein dieses Enzyms in allen Rohextrakten — unabhängig von der verwendeten C-Quelle — mit Hilfe der Immunelektrophorese, der Diskelektrophorese und dem OTJCHTERLONy-Test nachgewiesen werden. Die vollständige Absorption der präzipitierenden Antikörper durch alle untersuchten Rohextrakte ist dafür ein weiterer Beweis. Erste quantitative Angaben über den relativen Reductasegehalt in den einzelnen Rohextrakten konnten über die Hemmung der diaphoretischen Aktivität gegenüber Ferricyanid bzw. der Cytochrom c-Reduktionsrate durch das Antiserum gemacht werden. Die nicht vollständige Hemmung der diaphoretischen Aktivität kann dabei auf das Vorhandensein anderer, mit dem spezifischen Antiserum nicht präzipitierender Diaphorasen (gegenüber Ferricyanid) zurückgeführt werden. Die quantitativen Unterschiede im Reductasegehalt der verschiedenen Rohextrakte sind sicher in erster Linie durch die unterschiedlichen Wachstumsphasen der Bakterien begründet. Dies wird durch die Ergebnisse unterstrichen, welche mit Hilfe der LAURELL-Technik gewonnen wurden. Hier ist eine eindeutige Zunahme des Reductasegehaltes mit der Wachstumsdauer zu verzeichnen, wobei jedoch im späteren Wachstumsverlauf der Gehalt wieder abnimmt. Die C-Quelle ist hierbei ohne Bedeutung. Nach den vorliegenden Ergebnissen ist die Rubredoxin-Reductase aus Ac. calcoaceticus konstitutiv und wird durch Kohlenwasserstoffe induziert. Dies steht in einem gewissen Gegensatz zu den Ergebnissen zur Induktion des Rubredoxins durch nAlkane (CLAUS et al. 1 9 8 0 ) . Einerseits muß jedoch betont werden, daß der Cytochrom c-Reduktionstest eine relativ unspezifische Methode zur Bestimmung spezifischer katalytischer Eigenschaften von Eisen-Schwefel-Proteinen und deren Oxydoreductasen darstellt. Andererseits ist bekannt, daß Eisen-Schwefel-Protein-Oxydoreductasen relativ unspezifisch mit verschiedenen Eisen-Schwefel-Proteinen und anderen Elek-

14

R . CLAUS u n d H . - P . K L E B E R

t r o n e n a k z e p t o r e n u n d Ü b e r t r ä g e r n r e a g i e r e n k ö n n e n (OMURA et al. 1 9 6 6 , ZANETTI u . FOKTI 1 9 6 6 , SHIN 1971, UEDA U. COON 1 9 7 2 ) . S o i s t e s d e n k b a r — a u c h u n t e r d e m

Aspekt einer ökonomischen Nutzung des Enzymbestandes der Zelle — daß eine konstitutiv in der Zelle gebildete Oxydoreductase unter anderem auch die Funktion der Rubredoxin-Oxydoreductase bei einer notwendigen Alkanoxydation übernehmen kann. Unter den Bedingungen der w-Alkanassimilation würde in Ac. calcoaceticus dann nur das Rubredoxin — und gegebenenfalls die Hydroxylase — induziert. W i r d a n k e n H e r r n Prof. D r . H . A M B R O S I U S u n d F r l . L E H M A N N (Bereich Tierphysiologie u n d Immunologie der Sektion Biowissenschaften Leipzig) f ü r die U n t e r s t ü t z u n g bei der Gewinnung des Anti-Rubredoxin-Reductase-Serums sowie F r a u U. L O R I f ü r die sorgfältige technische Assistenz bei der D u r c h f ü h r u n g der immunologischen Untersuchungen.

Literatur ASPERGER, O . ,

FUTTIG, A . ,

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Oxydation

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Isolation

f r o m adrenal cortex of a n o n h e m e iron protein a n d a flavoprotein f u n c t i o n a l as a reduced triphosphopyridine nucleotide cytochrome P - 4 5 0 reductase. Arch. Biochem. Biophysics, 1 1 7 , 6 6 0 . P E T E R S O N , J . A., B A S U , D . a n d COON, M . J . , 1 9 6 6 . E n z y m a t i c co-oxidation. I . Electron carriers in f a t t y acid a n d h y d r o c a r b o n hydroxylation. J . biol. Chemistry, 241, 5162. P E T E R S O N , J . A. a n d COON, M . J . , 1 9 6 8 . E n z y m a t i c co-oxidation. I I I . Purification a n d properties of rubredoxin, a component of t h e co-hydroxylation system of Pseudomonas oleovorans. J . biol. Chemistry, 243, 329. SCHNEIDEGGER, J . J . , 1955. U n e micro-méthode de l'immunoeléctrophorèse. I n t . Arch. Allergy, 7, 103. SHIN, M., 1971. F e r r e d o x i n - N A D P reductase f r o m spinach, p. 440. I n : Methods in Enzymology, Vol. 23 (COLOWICK, S. P . a n d KAPLAN, N . O., Editors). Academic Press, N e w Y o r k .

Rubredoxin-Reductase aus Ac. calcoaceticus

15

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ZANETTI,

Anschrift: Dr. R. CLATJS Bereich Biochemie der Sektion Biowissenschaften der Karl-Marx-Universität Leipzig DDR-7010 Leipzig, Talstr. 33

Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie

22

1

1982

17-27

(Institut für Mikromorphologie und Elektronenmikroskopie der Universität Wien, and Institut für Allgemeine Biochemie der Universität Wien, and Ludwig Boltzmann-Forschungsstelle für Biochemie, Wien)

Isolation of membrane-associated folded chromosomes from Anacystis nidulans A . ELLINGER, P . D W O R S K Y a n d V . W E I S S H Ä U P L

(Eingegangen am 24. 3. 1981) Particles containing folded D N A were isolated from the blue-green alga Anacystis nidulans. The structure of these particles is vesicle-like and similar to that of membrane-associated nuclear bodies which had been isolated form Escherichia coli under comparable conditions. The sedimentation constant is between 8000 and 9000 Svedbergs. The D N A is inside the particles and is attached to the thylakoid membranes.

The DNA of bacteria is packaged into a very small volume of about I ¡am3 in the cell and can be isolated by enzymic digestion of the cell wall and subsequent lysis of the spheroplast by detergents. The lysis conditions can be varied in such a way t h a t the DNA does not unfold and can be isolated in a condensed state. This so-called nuclear body or nucleoid contains in addition to DNA also UNA, proteins, and cell envelope material associated with the chromosome. Nucleoids have been isolated from Escherichia coli (STONINGTON and PETTIJOHN 1 9 7 1 ) , Salmonella typhimurium ( M A N I S et al. 1 9 7 6 ) , Pseudomonas testosteroni ( R E I M E R and D R A H O V S K Y 1 9 7 6 ) , Mycoplasma hyorhinis (TEPLITZ 1 9 7 7 ) , Bacillus subtilis ( D W O R S K Y 1 9 7 7 , G U I L L E N et al. 1 9 7 8 ) , Caulobacter crescentus (EVINGER and A G A B I A N 1 9 7 9 ) , and Azotobacter vinelandii ( S A D O F F et al. 1979).

Folded chromosomes from E. coli can be isolated as membrane-free ( W O R C E L and and as membrane-associated particles (WORCEL and B U R G I 1 9 7 4 ) . Investigation of the cell envelope portion attached to the DNA showed involvement of the outer membrane ( D W O R S K Y 1 9 7 6 ) , the cell wall (KORCH et al. 1 9 7 6 , W E I S S H Ä U P L and D W O R S K Y 1 9 7 8 ) , and the cytoplasmic membrane (PORTALIER and WORCEL 1 9 7 6 ) . Attachment between DNA and the cell envelope of bacteria had already been established much earlier by isolation of DNA-membrane complexes (for review: LEIBOWITZ and SCHAECHTER 1 9 7 5 ) and electron microscopy ( R Y T E R 1 9 6 8 ) . Thus JACOB et al. ( 1 9 6 3 ) postulated that binding of the bacterial chromosome to the cell envelope is necessary for segregation of the nucleoids during cell division. In addition to this it was found by electron microscopy t h a t interior bacterial membrane systems like mesosomes also attach to the nucleoid ( A L T E N B U R G et al. 1 9 7 0 , R O G E R S 1 9 7 0 ) . However, endo-membranes were not yet found in nuclear bodies. Therefore we decided to investigate nucleoids obtained from an organism containing photosynthetic membrane systems which should be easily detected in nuclear body preparations. For this purpose we selected for our work the blue-green alga Anacystis nidulans (cyanobacterium Synechococcus B E R K E L E Y strain No. 6 3 0 1 ) . BURGI 1972)

Materials and methods Strain and growth: A. nidulans (The Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin No. 625) was grown at 37 °C under continuous illumination by fluorescent lamps (5000 lux, 2

Z. Allg. Mikrobiol., B d . 22, H . 1

Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie

22

1

1982

17-27

(Institut für Mikromorphologie und Elektronenmikroskopie der Universität Wien, and Institut für Allgemeine Biochemie der Universität Wien, and Ludwig Boltzmann-Forschungsstelle für Biochemie, Wien)

Isolation of membrane-associated folded chromosomes from Anacystis nidulans A . ELLINGER, P . D W O R S K Y a n d V . W E I S S H Ä U P L

(Eingegangen am 24. 3. 1981) Particles containing folded D N A were isolated from the blue-green alga Anacystis nidulans. The structure of these particles is vesicle-like and similar to that of membrane-associated nuclear bodies which had been isolated form Escherichia coli under comparable conditions. The sedimentation constant is between 8000 and 9000 Svedbergs. The D N A is inside the particles and is attached to the thylakoid membranes.

The DNA of bacteria is packaged into a very small volume of about I ¡am3 in the cell and can be isolated by enzymic digestion of the cell wall and subsequent lysis of the spheroplast by detergents. The lysis conditions can be varied in such a way t h a t the DNA does not unfold and can be isolated in a condensed state. This so-called nuclear body or nucleoid contains in addition to DNA also UNA, proteins, and cell envelope material associated with the chromosome. Nucleoids have been isolated from Escherichia coli (STONINGTON and PETTIJOHN 1 9 7 1 ) , Salmonella typhimurium ( M A N I S et al. 1 9 7 6 ) , Pseudomonas testosteroni ( R E I M E R and D R A H O V S K Y 1 9 7 6 ) , Mycoplasma hyorhinis (TEPLITZ 1 9 7 7 ) , Bacillus subtilis ( D W O R S K Y 1 9 7 7 , G U I L L E N et al. 1 9 7 8 ) , Caulobacter crescentus (EVINGER and A G A B I A N 1 9 7 9 ) , and Azotobacter vinelandii ( S A D O F F et al. 1979).

Folded chromosomes from E. coli can be isolated as membrane-free ( W O R C E L and and as membrane-associated particles (WORCEL and B U R G I 1 9 7 4 ) . Investigation of the cell envelope portion attached to the DNA showed involvement of the outer membrane ( D W O R S K Y 1 9 7 6 ) , the cell wall (KORCH et al. 1 9 7 6 , W E I S S H Ä U P L and D W O R S K Y 1 9 7 8 ) , and the cytoplasmic membrane (PORTALIER and WORCEL 1 9 7 6 ) . Attachment between DNA and the cell envelope of bacteria had already been established much earlier by isolation of DNA-membrane complexes (for review: LEIBOWITZ and SCHAECHTER 1 9 7 5 ) and electron microscopy ( R Y T E R 1 9 6 8 ) . Thus JACOB et al. ( 1 9 6 3 ) postulated that binding of the bacterial chromosome to the cell envelope is necessary for segregation of the nucleoids during cell division. In addition to this it was found by electron microscopy t h a t interior bacterial membrane systems like mesosomes also attach to the nucleoid ( A L T E N B U R G et al. 1 9 7 0 , R O G E R S 1 9 7 0 ) . However, endo-membranes were not yet found in nuclear bodies. Therefore we decided to investigate nucleoids obtained from an organism containing photosynthetic membrane systems which should be easily detected in nuclear body preparations. For this purpose we selected for our work the blue-green alga Anacystis nidulans (cyanobacterium Synechococcus B E R K E L E Y strain No. 6 3 0 1 ) . BURGI 1972)

Materials and methods Strain and growth: A. nidulans (The Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin No. 625) was grown at 37 °C under continuous illumination by fluorescent lamps (5000 lux, 2

Z. Allg. Mikrobiol., B d . 22, H . 1

18

A . ELLINGER, P . DWORSKY a n d V . WEISSHAUPL

if not stated otherwise) and aeration (approximately 0.5% CO, in air) in the medium of KRATZ and MYERS (1955) supplemented with 0.1% NaHC0 3 . The DNA was labelled by addition of 0.3 mCi (11 MBq) [methyl- 3 H]thymidine per 100 ml culture medium for two generations. Isolation of nuclear bodies: The cells were harvested at an optical density of 1.5 a t 600 nm (measured in a BECKMAN photometer); this is equivalent to 7 X 10S cells/ml. The cells of 100 ml medium were centrifuged for 1 min at 10000 rpm, washed with 20 ml of 0.01 M Tris buffer pH 8.0 containing 0.1 M NaCl, 0.01 M NaN 3 and 20% sucrose and then suspended in 1 ml of the same mixture. After addition of 0.2 ml 0.4% lysozyme (SIGMA Chem. Comp., St. Louis) in 0.05 M EDTA p H 8.0 the suspension was incubated for three hours at room temperature. Lysis was carried out, by addition of 0.5 ml of a detergent solution containing 0.2% cetyltrimethylammonium bromide 0.2% Brij 58 and 0.08% deoxycholate (DWORSKY 1976). The lysate was centrifuged at 4000 X g for 4 min to remove unlysed cells. The supernatant was layered on a 10 to 30% sucrose gradient (DWORSKY 1976) a n d s e d i m e n t e d in a SPINCO S W 50.1 rotor.

Isopycnic centrifugation: For measurement of the density of membrane fragments discontinuous gradients from 40 to 65% sucrose (LOFFBLHARBT and KINDL 1976) were used. They were run in

a SPINCO S W 27.1 r o t o r a t 25000 r p m for 40 hours.

Molecular weight of the DNA: Nuclear bodies were treated with pronase and sodium dodecyl sulfate according to LEVIN and HUTCHINSON (1973). The DNA was centrifuged in 5 to 20% sucrose gradients containing 1.0 M NaCl in a SPINCO SW 50.1 rotor. Assay of DNA: The DNA was assayed fluorimetrically with DABA (3,5-diaminobenzoic acid). After precipitation with 5% TCA (trichloroacetic acid) the DNA was filtered on glass fiber filters. The precipitate was dissolved in ammonia, the solvent was evaporated to dryness, and the residue was treated with 30% DABA in 4N hydrochloric acid (KISSANE and ROBINS 1958). The samples were measured in a PERKIN-ELMER fluorescence spectrophotometer 203. For excitation a wavelength of 408 nm was used, the emission was measured at 508 nm. Electron microscopy: The DNA-containing fractions of the gradients were stained with 1% 0 s 0 4 and sedimented by centrifugation. The resulting pellets were embedded in 2% agar. Onemillimeter blocks of the embedded cells were treated with 0.5% uranyl acetate (KELLENBERGER et al. 1958) for 1.5 h. After dehydration with a graded ethanol series and propylene oxide the samples were embedded in Epon 812. Ultrathin sections (70 nm) were examined in a PHILIPS EM 400 electron microscope. Measurement of radioactivity: The fractions of the gradients were treated with 0.1 M NaOH and then precipitated with 5% TCA and filtered on WHATMAN GF/A glass fiber filters. The filters were dried and counted in a scintillation counter. Results Isolation procedure The m e t h o d which was used for isolation of D N A - c o n t a i n i n g particles from. A. nidulans was similar to t h a t one used for E. coli ( D W O R S K Y 1976) and B. subtilis ( D W O R S K Y 1977). The cells were treated with l y s o z y m e and then lysed b y detergents. A f t e r removal of cell debris and unlysed cells b y a short centrifugation at low speed, t h e lysate was layered on a sucrose gradient and sedimented for 7 min at 9000 rpm. A f t e r centrifugation t w o green bands were seen, one on the top and the other in the m i d d l e of the gradient at about 9000 S (Svedberg units) (Fig. 1). The coloured fractions had absorption m a x i m a at 440 n m and 678 nm. The spectrum of the green band (Fig. 2) in the middle of the gradient was similar to t h a t obtained from pyridine extracts of whole algae by SIGALAT and K O U C H K O V S K Y (1975). The particles contain chlorophyll (peaks at 440 and 678 n m in Fig. 2) and carotenes (shoulder at 490 nm) in a proportion similar to that of whole cells, but very little if any phycocyanine. Calculated from the ratio of chlorophyll to D N A , about 5 to 10% of the photosynthetic membranes from the cells were left within the particles while the phycobilisomes were lost during the lysis procedure. TCA precipitable radioactivity appears only in the middle of the gradient showing t h a t the D N A sediments w i t h the particles. A n assay with D A B A , a reagent which should be highly specific for D N A , shows t w o fluorescence m a x i m a (Fig. 1). A f t e r treatment of the fractions with deoxyribonuclease prior to TCA precipitation t h e peak

Membrane-associated folded chromosomes f r o m A.

nidulans

19

Fraction number

Fig. 1. Isolation of nuclear bodies f r o m A. nidulans. T h e cleared lysate was layered on a 10 to 3 0 % sucrose gradient a n d centrifuged a t 9000 r p m for 7 min. The fractions were diluted 1 : 6 w i t h 0.01 M Tris buffer p H 8.0 a n d t h e absorbancy (E4.10) was measured a t 440 n m ( • ) . Then t h e D N A was precipitated with 5 % TCA. The washed precipitates were dissolved in 0.1 M N H 3 a n d divided i n t o t w o equal p a r t s . I n one of t h e m t h e radioactivity ( • ) was measured, in t h e other one t h e D N A was assayed with D A B A (A, c d n a . given in ^g DNA per fraction). The a m o u n t s of D N A a n d radioa c t i v i t y shown in t h e figure were calculated for t h e original fractions. The arrow shows t h e position of nuclear bodies from E. coli.

Tig. 2. Visible spectrum of t h e D N A - c o n t a i n i r g fractions f r o m t h e middle of t h e gradients. E : absorbancy

in the middle of the gradient disappears. The maximum on the top of the gradient is probably caused by the high amount of lipophilic substances and detergents in the l y s a t e (THOMAS a n d FARQUHAR 1978).

The incorporation of thymidine into DNA in our strain of A. nidulans was very low, namely under 0.1%. This is obviously strain-dependent because some authors also f o u n d v e r y l i t t l e i n c o r p o r a t i o n (GLASER et al. 1 9 7 3 , PIGOTT a n d CARR 1971, R KSTAINO

and FRAME TON 1975) while others observed a much higher one (SSYMANK et al. 1977). Electron microscopy Electron micrographs of particles from the middle of the 10 to 30% sucrose gradients show vesicle-like structures (Fig. 3). Remnants of inner membrane are left within these vesicles. In the interior fibrils can be seen (Fig. 4) which connect the membranes, 2*

20

A. Ellinger, P. Dworsky and V. Weisshaupl.

Kg. 3. Electron micrograph of DNA-containing particles from A. nidulans. The bar represents 1 [im They are similar in appearance to the DNA in the nucleoplasm seen in ultrathin sections of whole bacterial cells which have been stained in the same way by K e l l e n b e r g e r ' s (1958) method. After treatment of the particles with deoxyribonuclease these fibrils disappear (Fig. 5). We conclude therefore that they are the DNA. When the particles are cut in such a way that the sectional plane is perpendicular to most membranes only a few of these fibrils can be seen (Fig. 4 A). B u t when membranes and fibrils are lying parallel or nearly parallel the DNA fibers are organized into whole bundles (Fig. 4 B and 4C). This may be due to the fact that the peripheral DNA-fibrils of the nucleoplasmic region should be parallel to the surface of the nucleoid as well as to nearby membranes: electron microscopic examinations of whole cells of A. nidulans show the nucleoplasm surrounded by thylakoids (Fogg et al. 1973). Beyond that, bunching up of fibrils in the direction of membranes (arrow in Fig. 4C) is sometimes observed. This suggests there an attachment of DNA to these membranes. P r o p e r t i e s of the D N A The viscosities of the lysate and the DNA-containing fractions of the gradients were not different from those of solutions of the same composition but containing no algae.

22

A. Ellinger, P. Dworsky and V. Weisshattpl

Fig. 4c Fig. 4. Single DNA-containing particles from A. nidulans at higher magnification. The bar represents 0.25 |;m, (A) Sectional planes are perpendicular to most membranes. (B) Most endo-membranes are cut at an acute angle. (C) Same as B, but fibrils bunch up near membranes (arrow) B u t after raising the temperature or treatment with Triton X - 1 0 0 the fractions became very viscous. This suggested a condensed state of the DNA which could be unfolded under rigorous lysis conditions. The molecular weight of the DNA was estimated to be about 2 to 3 X 10 9 Daltons (Fig. 6). This is in good agreement with the value of 2.12 X 109 Daltons found by Heedman et al. (1079) for the DNA of A. nidulans and indicates that the particles contain whole chromosomes. Since the chromosomes of E. coli ( W o r c r l and Bukgi 1972, D w o r s k y 1976) and B. subtilis (Dworsky 1977) are superhelical the question arose whether the genome of A. nidulans exists also in a superhelical state. However, when the DNA-containing par tides from Anacystis were centrifuged in sucrose gradients containing various amounts of ethidium bromide the sedimentation rate did not depend on the concentration of the intercalating compound (Fig. 7). This may be attributed to two causes: (i) The chromosome is not superhelical at all. In this case a straight line as seen in Fig. 7 would be only feasible if there were single strand breaks in the DNA. Otherwise the curve should have a minimum at zero concentration of ethidium bromide, (ii) The DNA is entrapped within the membranes as it is seen on the electron micrographs. Relaxation of the superhelices takes place inside the particles and does not alter their dimension and therefore does also not influence the sedimentation behaviour. This is the more likely explanation because the particles also do not show sedimentation anomalies; the sedimentation velocity of the particles does not depend on the rotor speed (data not

Membrane-associated folded chromosomes f r o m A. nidulans

23

Fig. 5. DNA-containing particle from a fraction which was incubated with 50 (-ig/ml pancreatic DNase for one hour. The bar represents 0.25 |xm

Fraction

number

Fig. 6. Molecular weight of t h e DNA. DNA was isolated f r o m nuclear bodies of A. nidulans b y t r e a t m e n t with sodium dodecyl sulfate and pronase. I t was layered on 5 to 2 0 % sucrose gradients and centrifuged for 20 hours a t 8300.rpm. • 3 H-labelled D N A f r o m Anacystis F o r comparison, 14 C-labelled D N A from E. coli (A) was added t o t h e gradient. The arrow shows t h e position of Ti-phage D N A

24

A. ELLINGER, P . DWORSKY and V. WEISSHÄUPL 7000

1 t? JS

)andlipid droplets (L ~i) are surrounded by E R membranes. 26400 x

Ultrastructural changes in Claviceps

55

Fig. 10 — 13. Light and electron micrographs of submerged cultures of Claviceps purpurea producing saprophytically alkaloids (strain Pepty 695, medium NL 720); fixation: glutaraldehyde/0s0 4 ; nucleus (N), mitochondria (M), endoplasmic reticulum (ER), lipid droplets (L), glycogen (G), septum (S), cell wall (W); marker = 1 ]J.m Fig. 10. Part of a short thickened hypha of a 5 days old culture. 9200 X

The amount of filamentous hyphae in the medium is small and decreases steadily during cultivation. The ultrastructure of these cells is very similar to the hyphae of alkaloid-free strains of Claviceps purpurea ( L O S E C K E et al. 1980 b). Fig. 14 shows the changes of the volume ratios of the most important cell organelles in the short thick hyphae during cultivation of strain Pepty 695/S on "production" medium. The proportion in volume of nuclei, mitochondria, E R and vacuoles decreases during the initial time of cultivation which is caused mainly by an increase of the cell volume. Simultaneously the lipid content of the cells increases to the 4th day to 50— 6 0 % of the cell volume. The filamentous hyphae, occurring in the first three days of cultivation are not considered. After the 4th day these particular filamentous hyphae also start to develope and a mixture of different organized cells is present. Therefore a morphometric analysis seems not to be significant. After the 12th day of cultivation the material looks again uniform. S t r a i n P e p t y 695/S g r o w n in r i c h m e d i u m (NL 8 5 6 ) The mycelium of strain Pepty 695/S, grown in a rich medium (NL 856) is not able to form ergotoxine alkaloids.

56

W. Losecke, D. Neumann, H.-P. Schmauder and D. Gboger

Fig. 11. Large single cell of a culture, 9 days old. Numerous nuclei (N) are situated near the thick cell wall (W). 4000 x

Fig. 12. Large single cells of a culture, 9 days old. a. Light micrograph. The indicated area b corresponds with the electron micrograph in Fig. 12b. 384 X b. P a r t of a large single cell with nuclei (N) and lipid droplets (L). 16200 X

57

U l t r a s t r u c t u r a l changes in Clavieeps

r

0m ' ..h:

w ^

13a

*

Fig. 13. Lipid droplets (L) and polysaccharide deposits (G) in a 9 days old culture, a. During embedding in glycolmethacrylate t h e lipid is partially extracted. 15200. X b. Lipid droplets (L) are surrounded b y negatively contrasted B R membranes 24000 x 3d

Id 20 15 rfi

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Fig. 14. Morphometric analysis of t h e development of Claviceps purpurea producing saprophyti?ally alkaloids (strain P e p t y 695, medium N L 720). Average proportion in volume of nuclei (a), mitochondria (b), endoplasmic reticulum (c), vacuoles (d), lipid (e), glycogen (f) on t h e cell volume of t h e hyphae (with standard error)

58

W . LÔSECKE, D . N E U M A N N , H . - P . SCHMAUDER a n d D . GRÔGER

Light microscopy In rich medium (NL 856) only little branched filamentous hyphae are formed during the first three days of cultivation (Fig. 15). The mycelium looks like that of the strain Pur 218, which also cannot form alkaloids ( L O S E C K E et al. 1980b). Between the 3rd and 5th day of the culture the size of some cells is enlarged and later the mycelium breaks down in parts of different length (Fig. 15). Similar to the cultivation in "production" medium short, thick hyphae are formed in NL 856. Contrary to the fermentation in NL 720 these hyphae do not show any contrast in the light microscope after 0 s 0 4 fixation. Later some conidiospores occur and the proportion of long thin filamentous hyphae is always high, throughout the whole cultivation period. After 9 days in rich medium the culture consists of hyphae without any contrast, fragments of 2 —3 cells and single cells (Fig. 16).

Fig. 15 — 17. Light and electron micrographs of submerged mycelium of strain Pepty 695, not producing alkaloids in medium NL 856; fixation: glutaraldehyde/0s0 4 ; vacuole (V), myelin-like droplets (m), mitochondria (M); marker = 1 [¿m Fig. 15. Mycelium of a culture (3d) with extended hyphae and fragments of thickened hyphae. 154 X Fig. 16. Mycelium of a culture 9 days old with extended hyphae, fragments of 2 to 3 cells and large single cells. 384 x

Electron microscopy On the second day of cultivation in "rich" medium the cells have the following appearance: Numerous mitochondria, ER membranes, small amounts of lipid droplets and vacuoles and a dense well contrasted cytoplasm are characteristic for the enlarging filamentous hyphae (Fig. 17). Lipid is often phagocytized by vacuoles. In contrast to the producing conditions no vesicles in the cytoplasm and near the plasmalemma can be observed. After 9 days of cultivation the cells possess a large central vacuole and cytoplasm and organelles are restricted to a small border near the cell wall (Fig. 18). Furthermore there are only a few lipid droplets present. The heterogeneity of the culture and shrinkage artifacts caused by the preparation allow no morphometric analysis of the cells. Discussion The cyclol alkaloids producing C. purpurea strain Pepty 695/S displays during the idiophase cytodifferentions which were not described before. The alkaloid synthesis starts between the first and second day of cultivation in "production" medium (NL

Ultrastructural changes in

Claviceps

59

Fig. 17. Part of an enlarging hypha of a 3 days old culture with only few lipid droplets (L), vacuoles (V) and numerous mitochondria (M). 20000 X Pig. 18. Hypha of a 9 days old culture. Note the large vacuole (V) and the shrinkage of the cell, caused by the preparation for electron microscopy. 12000 X

720) and reached a first maximum between the 3rd and 5th day. That means the morphological and biochemical differentiations have to be accomplished in the first days of cultivation. According to our light, electron microscopic and morphometric data during the first 3—5 days of cultivation the sphacelial mycelium is converted to a sclerotial tissue with plectenchymatic pellets. The most advanced form in this direction are the enlarged single cells. The hyphae, which are metabolic active during the first 5 days of cultivation differ clearly from the extremely lipid rich slightly active cells of the later stages. In these hyphae only little structural changes can be observed. They show a close relation to cells of mature sclerotia (LOSECKE et al. 1980). Morphometric data support the observation that the development of a "sclerotial" mycelium takes place between the 3rd and 5th day of cultivation. However, the development of the fungus is not completely synchronized due to this type of fermentation. A certain part of the cells retains the filamentous form and the corresponding ultrastructure. Their morphological differentiation towards a sclerotial mycelium starts not before the 5th day of cultivation. Therefore a second maximum in the alkaloid production rate between the 8th and 11th day of cultivation is reached. The data led to the conclusion that the alkaloids in strain Pepty 695/S are synthesized mainly in the thickened hyphae between the second and 5th day of cultivation. The older sclerotial cells are obviously able to form alkaloids to a much lesser extend. Besides a particular biochemical also specific morphological and ultrastructural differentiations are prerequisites for the alkaloid synthesis. The same strain cultivated in a rich medium is not able to produce alkaloids. Not only in the light but also in the electron microscope these cells show another kind of cyto-differentiation compared with producing hyphae.

60

W . L Ö S E C K E , D . NEUMANN, H . - P . SCHMAUDER a n d D .

GRCGER

Alkaloids are stored in the sclerotia of ergot fungi. The secondary metabolites are accumulated inside the cells (NEUMANN et al. 1979). A special kind of selection of high producing strains (e. g., by determination of the alkaloid content in the medium) led to the isolation of strains, which are able to transport and to excrete the alkaloids under submerged conditions. But the general principle of the accumulation of ergolines, remaining inside the cell, seems not to be changed. This means that the alkaloids which are stored in the mycelium (5% of the total amount), of strain Pepty 695/S are localized in the lipid droplets in the same way as in sclerotia of the parasitically grown Claviceps purpurea (NEUMANN et al. 1979). Our knowledge about the site of alkaloid synthesis within the cells of ergot fungi is still obscure. Apparently no methods are available up till now to localize this process at the cellular level. VOBISEK and REHAAEK (1978) assume from studies of the localization of acetyl-CoA-carboxylase that alkaloids are formed in the endoplasmic reticulum. This seems to be not conclusive as definite evidence. The tested enzyme is too unspecific for ergoline formation and the histochemical reaction has some sources of errors. However, the speculation of these authors find some support by our experiments with strain Pepty 695/S. We observed an extended E R forming a lot of small vesicles. This might be in relation to alkaloid synthesis and transport; because 95% of the alkaloids are excreted into the medium. For this process a compartimentated transport in small membrane surrounded vesicles seems to be possible. Some other indications for the site of synthesis are the strong structural connections between the place of alkaloid storage (lipid droplets) and E R membranes. However, these structures can also be found in plants never forming alkaloids or other storage compounds (BERGFELD et al. 1978). This might be rather the result of a connection between lipid synthesis and E R membranes. So at the moment we have no definite experimental evidence for the asumption that the E R is indeed the site of alkaloid synthesis in Claviceps. The lipid storage is apparently a prerequisite for the accumulation of alkaloids in Claviceps even for those strains excreting most of the alkaloids. Whether there is also a strong correlation between lipid and alkaloid synthesis is not yet clear. Acknowledgements We are very grateful to our colleagues of the Institut für Festkörperphysik und Elektronenmikroskopie der Akademie der Wissenschaften der DDR, Halle, for the preparation of the scanning micrographs. References R., H O N G , Y . - N . , K Ü H N E , T . and S C H Ö P F E R , P., 1978. Formation of oleosomes (storage lipid bodies) during embryogenesis and their breakdown during seedling development in cotyledons of Sinapis alba L. Planta, 148, 297 — 307. L E D U C , E. H . and B E R N H A R D , W., 1967. Recent modifications of the glycolmethacrylate embedding procedure. J . Ultrastruct. Res., 19, 169—199. L Ö S E C K E , W., N E U M A N N , D., G R Ö G E R , D. and S C H M A U D E R , H.-P., 1980a. Ultrastructure of cytoplasmic changes during development of sclerotia in Claviceps purpurea (FR.) TUL. Arch. Microbiol., 125, 2 5 1 - 2 5 7 . L Ö S E C K E , W., N E U M A N N , D., S C H M A U D E R , H.-P. and G R Ö G E R , D., 1980b. Ultrastructure of submerged non-alkaloid producing strains of Claviceps purpurea (FR.) TUL. Biochem. Physiol. Pflanzen, 175, 5 5 2 - 5 6 1 . M A N T L E , P. G . and TONOLO, A . , 1968. Relationship between the morphology of Claviceps purpurea and the production of alkaloids. Trans. Brit, mycol. Soc., 5 1 , 4 9 9 — 5 0 6 . N E U M A N N , D . , L Ö S E C K E , W . , M A I E R , W . and G R Ö G E R , D . , 1 9 7 9 . Localization of alkaloids in sclerotia and suspension cultures of Claviceps purpurea (FR.) TUL. Biochem. Physiol. Pflanzen, 174, BERGFELD,

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22

Zeitschrift f ü r Allgemeine Mikrobiologie

Kurze

1

1982

63-68

Originalmitteilung

(Friedrich-Schiller-Universität J e n a , Sektion Biologie, W B Allgemeine Mikrobiologie)

Zusammenhang zwischen Protein- und. Polysaccharidgehalt in zellwandmodifizierten Mutanten v o n Candida spec. H R U T H KÖLBLIN u n d R .

(Eingegangen

am 27.

TRÖGER

3.1981)

The contents of protein (as t o t a l N) a n d of polysaccharides f r o m 38 m u t a n t s of Candida spec. H were analyzed. The results were obtained b y calculation of t h e correlation-coefficient. I t expresses a significant interrelation between b o t h characters: An increase of one of t h e contents implied a decrease of t h e other one. Some m u t a n t s show higher concentrations of protein in comparison w i t h t h e normal ratio between cell wall-polysaccharides a n d protein. Mikroorganismen g e w i n n e n z u n e h m e n d an B e d e u t u n g bei der Erschließung neuer Proteinquellen. D a b e i w e r d e n ihre F ä h i g k e i t e n z u m schnellen W a c h s t u m u n d zur B i l d u n g v o n P r o t e i n e n h o h e r Q u a l i t ä t u n t e r V e r w e r t u n g billiger R o h s t o f f e i n d u s t r i e l l genutzt. B e i einer unter o p t i m a l e n K u l t u r b e d i n g u n g e n w a c h s e n d e n Hefezelle b e t r ä g t der A n t e i l a n P r o t e i n ca. 4 0 % d e r G e s a m t z e l l s u b s t a n z . E i n e r w e s e n t l i c h e n E r h ö h u n g dieses P r o z e n t s a t z e s sind physiologische Grenzen gesetzt, da die Zelle zur A u f r e c h t erhaltung ihres S t o f f w e c h s e l s n e b e n d e m P r o t e i n n o c h Nucleinsäuren, Z e l l w a n d p o l y mere, Membraniipide, niedermolekulare Bausteine und Metabolite des Intermediärs t o f f w e c h s e l s b e n ö t i g t (FRITSCHE 1 9 7 8 ) . U n b e k a n n t i s t b i s h e r , o b d i e Z e l l w a n d k o m p o n e n t e n (ca. 2 0 % d e r G e s a m t z e l l s u b s t a n z ) s o w o h l i n q u a n t i t a t i v e r als a u c h i n q u a l i t a t i v e r H i n s i c h t i n e i n e r e n g e n B e z i e h u n g z u m W a c h s t u m der H e f e n stehen. E s ist denkbar, daß eine Verringerung d e s Z e l l w a n d a n t e i l s d a s W a c h s t u m einer Z e l l e n i c h t n e g a t i v b e e i n f l u ß t . D i e B e a n t w o r t u n g der Frage, ob diese Zelle auf K o s t e n der Bereitstellung v o n Z e l l w a n d k o m p o n e n t e n m e h r P r o t e i n b i l d e t , i s t G e g e n s t a n d der v o r l i e g e n d e n A r b e i t . Organismus: Candida spec. H , aus dem I n s t i t u t f ü r technische Chemie der A d W , Leipzig. Mutagene Agenzien: U V - S t r a h l e n : 254,5 n m , 120 — 150 sec bei 10,6 ffm"1, 70 Std. alte K u l t u r e n . UV-Strahlen in K o m b i n a t i o n m i t Nitrosomethylharnstoff (NMU): 5 sec U V ; 0,1 M N M U 35—40 min, 7 Std. alte K u l t u r e n . N-Methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidin (MNNG): 200—400 ¡xg je ml 60 min bei 32 °C, 24 Std. alte K u l t u r e n . K u l t i v i e r u n g : S t a m m h a l t u n g auf YM-Medium (3 g H e f e e x t r a k t , 3 g Malzextrakt, 5 g P e p t o n , 10 g Glucose, 20 g Agar), Ü b e r i m p f u n g alle 3 Monate. Die Vor- u n d H a u p t k u l t u r w u r d e u n t e r Verwendung von 100 ml modifizierter BEADER-Nährlösung (3 g (NH 4 ) 2 S0 4 , 1 g K H 2 P 0 4 , 0,16 g K 2 H P 0 4 , 0,7 g MgS0 4 • 7 H.,0, 0,5 g NaCl, 0,4 g CaCl 2 , 5 g H e f e e x t r a k t , 20 g Glucose) u n d 500 m l Standkolben bei 28 °C auf einem Großraumschüttler m i t 200 U / m i n d u r c h g e f ü h r t . I n o c u l u m der V o r k u l t u r : Abschwemmung einer 24 Std. alten YM-Agar-Kultur m i t 0,9%iger NaCl-Lösung; die Menge des Inoculums entsprach einer Hefetrockenmasse von 0,3 m g p r o ml N ä h r m e d i u m . Inoculum der H a u p t k u l t u r : 24 Std. alte V o r k u l t u r ; die Menge des I n o c u l u m s e n t s p r a c h einer Hefetrockenmasse von 0,15 mg pro ml N ä h r m e d i u m . Aufstellen der W a c h s t u m s k u r v e n durch E r m i t t l u n g folgender P a r a m e t e r : E x t i n k t i o n der O r g a n i s m e n k u l t u r bei 578 n m (Spekol, V E B CARL ZEISS J e n a ) , Glucosegehalt (Dextronal-Teststreifen, V E B Feinchemie Sebnitz) u n d p H - W e r t (mV 88, V E B Präcitronic Dresden). Auswahl der M u t a n t e n : F ü r die vorliegenden U n t e r s u c h u n g e n w u r d e n solche M u t a n t e n ausgewählt, die sich in ihrem Gehalt a n einem der drei Zellwandpolysaccharide (hochmolekulares

22

Zeitschrift f ü r Allgemeine Mikrobiologie

Kurze

1

1982

63-68

Originalmitteilung

(Friedrich-Schiller-Universität J e n a , Sektion Biologie, W B Allgemeine Mikrobiologie)

Zusammenhang zwischen Protein- und. Polysaccharidgehalt in zellwandmodifizierten Mutanten v o n Candida spec. H R U T H KÖLBLIN u n d R .

(Eingegangen

am 27.

TRÖGER

3.1981)

The contents of protein (as t o t a l N) a n d of polysaccharides f r o m 38 m u t a n t s of Candida spec. H were analyzed. The results were obtained b y calculation of t h e correlation-coefficient. I t expresses a significant interrelation between b o t h characters: An increase of one of t h e contents implied a decrease of t h e other one. Some m u t a n t s show higher concentrations of protein in comparison w i t h t h e normal ratio between cell wall-polysaccharides a n d protein. Mikroorganismen g e w i n n e n z u n e h m e n d an B e d e u t u n g bei der Erschließung neuer Proteinquellen. D a b e i w e r d e n ihre F ä h i g k e i t e n z u m schnellen W a c h s t u m u n d zur B i l d u n g v o n P r o t e i n e n h o h e r Q u a l i t ä t u n t e r V e r w e r t u n g billiger R o h s t o f f e i n d u s t r i e l l genutzt. B e i einer unter o p t i m a l e n K u l t u r b e d i n g u n g e n w a c h s e n d e n Hefezelle b e t r ä g t der A n t e i l a n P r o t e i n ca. 4 0 % d e r G e s a m t z e l l s u b s t a n z . E i n e r w e s e n t l i c h e n E r h ö h u n g dieses P r o z e n t s a t z e s sind physiologische Grenzen gesetzt, da die Zelle zur A u f r e c h t erhaltung ihres S t o f f w e c h s e l s n e b e n d e m P r o t e i n n o c h Nucleinsäuren, Z e l l w a n d p o l y mere, Membraniipide, niedermolekulare Bausteine und Metabolite des Intermediärs t o f f w e c h s e l s b e n ö t i g t (FRITSCHE 1 9 7 8 ) . U n b e k a n n t i s t b i s h e r , o b d i e Z e l l w a n d k o m p o n e n t e n (ca. 2 0 % d e r G e s a m t z e l l s u b s t a n z ) s o w o h l i n q u a n t i t a t i v e r als a u c h i n q u a l i t a t i v e r H i n s i c h t i n e i n e r e n g e n B e z i e h u n g z u m W a c h s t u m der H e f e n stehen. E s ist denkbar, daß eine Verringerung d e s Z e l l w a n d a n t e i l s d a s W a c h s t u m einer Z e l l e n i c h t n e g a t i v b e e i n f l u ß t . D i e B e a n t w o r t u n g der Frage, ob diese Zelle auf K o s t e n der Bereitstellung v o n Z e l l w a n d k o m p o n e n t e n m e h r P r o t e i n b i l d e t , i s t G e g e n s t a n d der v o r l i e g e n d e n A r b e i t . Organismus: Candida spec. H , aus dem I n s t i t u t f ü r technische Chemie der A d W , Leipzig. Mutagene Agenzien: U V - S t r a h l e n : 254,5 n m , 120 — 150 sec bei 10,6 ffm"1, 70 Std. alte K u l t u r e n . UV-Strahlen in K o m b i n a t i o n m i t Nitrosomethylharnstoff (NMU): 5 sec U V ; 0,1 M N M U 35—40 min, 7 Std. alte K u l t u r e n . N-Methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidin (MNNG): 200—400 ¡xg je ml 60 min bei 32 °C, 24 Std. alte K u l t u r e n . K u l t i v i e r u n g : S t a m m h a l t u n g auf YM-Medium (3 g H e f e e x t r a k t , 3 g Malzextrakt, 5 g P e p t o n , 10 g Glucose, 20 g Agar), Ü b e r i m p f u n g alle 3 Monate. Die Vor- u n d H a u p t k u l t u r w u r d e u n t e r Verwendung von 100 ml modifizierter BEADER-Nährlösung (3 g (NH 4 ) 2 S0 4 , 1 g K H 2 P 0 4 , 0,16 g K 2 H P 0 4 , 0,7 g MgS0 4 • 7 H.,0, 0,5 g NaCl, 0,4 g CaCl 2 , 5 g H e f e e x t r a k t , 20 g Glucose) u n d 500 m l Standkolben bei 28 °C auf einem Großraumschüttler m i t 200 U / m i n d u r c h g e f ü h r t . I n o c u l u m der V o r k u l t u r : Abschwemmung einer 24 Std. alten YM-Agar-Kultur m i t 0,9%iger NaCl-Lösung; die Menge des Inoculums entsprach einer Hefetrockenmasse von 0,3 m g p r o ml N ä h r m e d i u m . Inoculum der H a u p t k u l t u r : 24 Std. alte V o r k u l t u r ; die Menge des I n o c u l u m s e n t s p r a c h einer Hefetrockenmasse von 0,15 mg pro ml N ä h r m e d i u m . Aufstellen der W a c h s t u m s k u r v e n durch E r m i t t l u n g folgender P a r a m e t e r : E x t i n k t i o n der O r g a n i s m e n k u l t u r bei 578 n m (Spekol, V E B CARL ZEISS J e n a ) , Glucosegehalt (Dextronal-Teststreifen, V E B Feinchemie Sebnitz) u n d p H - W e r t (mV 88, V E B Präcitronic Dresden). Auswahl der M u t a n t e n : F ü r die vorliegenden U n t e r s u c h u n g e n w u r d e n solche M u t a n t e n ausgewählt, die sich in ihrem Gehalt a n einem der drei Zellwandpolysaccharide (hochmolekulares

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