Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie: Band 22, Heft 7 1982 [Reprint 2021 ed.] 9783112538968, 9783112538951

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ZEITSCHRIFT FÜR ALLGEMEINE MIKROBIOLOGIE AN INTERNATIONAL JOURNAL ON MORPHOLOGY, PHYSIOLOGY, GENETICS, AND ECOLOGY OF MICROORGANISMS HEFT 7 • 1982 • BAND 22

AKADEMIE-VERLAG EVP 20,— M

BERLIN

ISSN 0044-2208

34112

CONTENTS

OF

NUMBER 7

Transformation of 12-deoxycardenolids with tomyces purpurascens

Strep-

K . ALBRECHT, G . M A T E a n d T . L A N G

431

Cyanide-resistant respiration in a respiration-deficient mutant of Saccharomyces cerevisiae

J . D . ARRABACA AND M . C . LOUREIRO DIAS ' 437

Arthrobacter globiformis — a bacterium capable to lyse viable yeast cells Regulation of PEP-carboxylase from the facultative methylotrophic Acetobacter sp. MB 58

D . BLECHSCHMIDT, C . GOHR AND R . TROGER 443

A new major outer membrane protein in derivatives of Escherichia coli carrying the virulence Plasmid ColV-K94

J A N E C . MOOBES BURY

Polysaccharide structures of cell wall preparations from the food protein yeast Candida spec. H

J . N Ü S K E , H . D . GRIMMECKE AND G . REUTER 477

Characterization of a CaCl2-dependent transfection system from Escherichia coli and TS bacteriophage DNA

H . STOMPE, S . M I C H E L , AND G . R I C H T E R '

Regulation of protein biosynthesis in outgrowing spores of Bacillus subtilis

G . W A C H L I N AND M . H E C K E R

495

I . S P E N C E R - M A R T I N S AND N . VAN UDEN

503

Short N o t e The temperature profile of growth, death and yield of the starch-converting yeast Lipomyces kononenkoae

N . LOFFHAGEN AND W . B A B E L 453 AND

R . J . ROW465

W . MANN 487

507

Book Reviews

INHALTSVERZEICHNIS HEFT 7

Transformation Streptomyces

von 12-Desoxycardenoliden purpurascens

mit

Cyanid-resistente Atmung in einer atmungsdefekten Mutante von Saccharomyces cerevisiae Arthrobacter globiformis — ein neues befelytisches Bakterium Regulation der PEP-Carboxylase des fakultativ methylotrophen Acetobacter sp. MB 68 Ein neues Protein bei Escherichia cotf-Abkömmlingen mit dem Virulenzplasmid ColV-K94

K . ALBRECHT, G . M A T E T . LÄNG

und

431

J . D . ARRABAOA u n d M . C . L O U R E I RO D I A S ' 437 D . BLECHSCHMIDT, R . TRÖGER

C . GOHR

443

N . LOFFHAGEN u n d W . B A B E L JBURY A N E C . MOORES

und

453

R. J. Row-

Polysaccharid-Strukturen von Zellwand-Präparaten aus der Futtereiweiß-Hefe Candida spec. H

J . N Ü S K E , H . D . GRIMMECKE G. REUTER

Charakterisierung eines CaCl2-abhängigen Transfektionssystems von Escherichia coli und T3Phagen-DNS

H . STOMPE, S . M I C H E L , UND G . R I C H T E R

Aktivierung von Proteinbiosynthesen in auswachsenden Sporen von Bacillus subtilis

G . W A C H L I N UND M . H E C K E R

Kurze Originalmitteilung Temperaturprofil von Wachstum, Tod und Ertrag der Stärke-umwandelnden Hefe Lipomyces kononenkoae

I . SPENCER-MARTINS UDEN

Buchbesprechungen

und

465

und 477

W . MANN

UND

487

495

N . VAN 503

507

ZEITSCHRIFT FÜR ALLGEMEINE MIKROBIOLOGIE AN INTERNATIONAL

JOURNAL

ON

MORPHOLOGY, PHYSIOLOGY, GENETICS, A N D ECOLOGY OF MICROORGANISMS

H E R A U S G E G E B E N VON

F . Egami, Tokio G. F . Gause, Moskau 0 . Hoffmann-Ostenhof, Wien A. A. Imseneckii, Moskau R. W. Kaplan, Frankfurt/M." F- Mach, Greifswald 1. Mälek, Prag C. Weibull, Lund

unter der Chefredaktion von W. Schwartz, Braunschweig und U. Taubeneck, Jena

U N T E R M I T A R B E I T VON

J . H. Becking, Wageningen H. Böhme, Gatersleben M. Girbardt, Jena S. I. Kusnecov, Moskau 0 . Necas, Brno C. H. Oppenheimer, Port Aransas N. Pfennig, Göttingen I. L. Rabotnova, Moskau A. Schwartz, Wolfenbüttel

HEFT 7 1982 • BAND 22

REDAKTION

U. May, Jena

AKADEMIE-VERLAG • BERLIN

Die Zeitschrift f ü r Allgemeine Mikrobiologie soll dazu beitragen, Forschung u n d internationale Zusammenarbeit auf dem Gebiet der Mikrobiologie zu fördern. E s werden Mausnkripte aus allen Gebieten der allgemeinen Mikrobiologie veröffentlicht. Arbeiten über Themen aus der medizinischen, landwirtschaftlichen, technischen Mikrobiologie u n d aus der Taxonomie der Mikroorganismen werden ebenfalls aufgenommen, wenn sie Prägen von allgemeinem Interesse bebehandeln. Zur Veröffentlichung werden angenommen: Originalmanuskripte, die in anderen Zeitschriften noch nicht veröffentlicht worden sind u n d in gleicher F o r m auch nicht in anderen Zeitschriften erscheinen werden. Der Umfang soll höchstens l 1 / 2 Druckbogen (24 Druckseiten) betragen. Bei umfangreicheren Manuskripten müssen besondere Vereinbarungen mit der Schriftleitung u n d dem Verlag getroffen werden. Kurze Originalmitteilungen über wesentliche, neue Forschungsergebnisse. Umfang im allgemeinen höchstens 3 Druckseiten. K u r z e Originalmitteilungen werden beschleunigt veröffentlicht. Kritische Sammelberichte u n d Buchbesprechungen nach Vereinbarung mit der Schriftleitung. Bezugsmöglichkeiten der Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie: Bestellungen sind zu richten — in der DDK an den Postzeitungsvertrieb, an eine Buchhandlung oder an den Akademie-Verlag, DDR-1086 Berlin, Leipziger Straße 3 - 4 — im sozialistischen Ausland an eine Buchhandlung f ü r fremdsprachige Literaur oder an den zuständigen Postzeitungsvertrieb — in der BRD und Berlin (West) an eine Buchhandlung oder an die Auslieferungsstelle K U N S T U N D WISSEN, Erich Bieber, D-7000 S t u t t g a r t 1, Wilhelmstraße 4 - 6 — in den übrigen westeuroäpischen Ländern an eine Buchhandlung oder an die Auslieferungsstelle K U N S T U N D W I S S E N , Erich Bieber GmbH, CH-8008 Zürich, Dufourstraße 51 — im übrigen Ausland an den Internationalen Buch- u n d Zeitschriftenhandel; den Buchexport, Volkseigener Außenhandelsbetrieb der Deutschen Demokratischen Republik, DDR-7010 Leipzig, Postfach 160, oder an den Akademie-Verlag, DDR-1086 Berlin, Leipziger Straße 3—4. Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie Herausgeber: I m Auftrag des Verlages von einem internationalen Wissenschaftlerkollektiv herausgegeben. Verlag :Akademie-Verlag, DDR- 1086Berlin, Leipziger S t r a ß e 3 - 4 ; F e r n r u f : 2236229 oder 2236221 Telex-Nr.: 114420; B a n k : Staatsbank der D D R , Berlin, Kto-Nr.: 6836-26-20712. Chefredaktion: Prof. Dr. U D O T A U B E N E C K Prof. Dr. W I L H E L M S C H W A E T Z Anschrift der Redaktion: Zentralinstitut f ü r Mikrobiologie u n d experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften, DDR-6900 J e n a , Beutenbergstr. 11; F e r n r u f : J e n a 885614; TelexN r . : 058621. Veröffentlicht unter der Lizenznummer 1306 des Presseamtes beim Vorsitzenden des Ministerrates der Deutschen Demokratischen Republik. Gesamtherstellung: V E B Druckerei „Thomas Müntzer", DDR-5820 Bad Langensalza. Erscheinungsweise: Die Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie erscheint jährlich in einem B a n d mit 10 Heften. Bezugspreise je B a n d 220,—M zuzüglich Versandspesen (Preis f ü r die D D R 2 0 0 , - M ) . Preis je H e f t 2 2 , - M (Preis f ü r die D D R 2 0 , - M ) . Urheberrecht: Alle Rechte vorbehalten, insbesondere die der Übersetzung. Kein Teil dieser Zeitschrift darf in irgendeiner Form — durch Photokopie, Mikrofilm oder irgendein anderes Verfahren — ohne schriftliche Genehmigung des Verlages reproduziert werden. — All rights reserved (including those of translations into foreign languages). No p a r t of this issue may be reproduced in any form, b y photoprint, microfilms or any other means, without written permission from t h e publishers. Erscheinungstermin: Oktober 82 Bestellnummer dieses Heftes 1070/22/7 © 1982 by Akademie-Verlag Berlin. Printed in t h e German Democratic Republic A N (EDV) 75218

Zeitschrift f ü r Allgemeine Mikrobiologie

22

7

1982

( I n s t i t u t e for D r u g Research, B u d a p e s t , H u n g a r y , D i r e c t o r : D r . T .

Transformation of 12-deoxycardenolids with purpurascens1)

431-435

LANG)

Streptomyces

K . ALBRECHT, G. MATE a n d T . LANG

(Eingegangen

am

1.10.1981)

Streptomyces purpurascens t r a n s f o r m s p r i m a r y a n d secondary 12-deoxycardenolids into digoxin, 7/3-hydroxy-digitoxin a n d 7/¡-hydroxy-digoxin, respectively. A metabolic p a t h w a y is proposed for cardenolid t r a n s f o r m a t i o n s a n d t h e enzymes participating in it are investigated. T h e s u b s t r a t e concentration in t h e m e d i u m can be increased b y using a water-miscible solvent of electron donor character. The newly developed procedure yields 0.5 g / l - 1 of digoxin in a f i v e - d a y f e r m e n t a t i o n . S o m e c a r d e n o l i d s of p l a n t o r i g i n s u c h a s l a n a t o s i d - C a n d d i g o x i n c a n b e a p p l i e d d i r e c t l y f o r p h a r m a c e u t i c a l p u r p o s e s , w h e r e a s o t h e r m e m b e r s of t h i s g r o u p s u c h a s l a n a t o s i d - A , a c e t y l d i g i t o x i n , d i g i t o x i n , etc., r e q u i r e a c h e m i c a l o r m i c r o b i o l o g i c a l c o n v e r s i o n i n t o a p h a r m a c e u t i c a l l y m o r e a c c e p t a b l e f o r m . T h i s c o n v e r s i o n is t h e r e m o v a l of t h e g l u c o s e a n d a c e t y l g r o u p of t h e p r i m a r y g l y c o s i d e , b u t t h e m o s t i m p o r t a n t r e a c t i o n is t h e h y d r o x y l a t i o n of t h e C 1 2 p o s i t i o n of t h e s t e r o i d n u c l e u s . M i c r o o r g a n i s m s h a v e b e e n r e p o r t e d t o c a r r y o u t h y d r o x y l a t i o n a t t h e C 12 of s t e r o i d s (SCHUBERT et al. 1 9 5 7 ) a n d of c a r d i a c a g l y c o n (GUBLER a n d TAMM 1 9 5 8 ) , a s w e l l a s of s e c o n d a r y c a r d e n o l i d s (NOZAKI et al. 1 9 6 5 ) . T h e s e r e a c t i o n s a r e c a t a l y z e d b y f u n g i a n d s e v e r a l S t r e p t o m y c e t e s a n d are a c c o m p a n i e d b y s i d e r e a c t i o n s , e. g. 7 / 3 - h y d r o x y l a t i o n . P r o c e s s e s f o r t h e r e m o v a l of g l u c o s e a n d a c e t y l g r o u p s are a l s o k n o w n e. g., w i t h t h e a c t i o n of t h e p l a n t ' s o w n e n z y m e s y s t e m (BARISCH et al. 1 9 7 2 ) or b y f e r m e n t a t i o n w i t h Streptomyces griseolus (SZARKA et al. 1 9 7 8 ) . Our a i m h a s b e e n t o s e l e c t m i c r o o r g a n i s m s c a p a b l e of b o t h t r a n s f o r m a t i o n s m e n tioned above economically.

Materials

and

methods

Microorganisms: Strains a r e isolated soil S t r e p t o m y c e t e s selected for antibiotic screening b y Prof. Dr. I . S Z A B O . Streptomyces purpurascens KA-26, S. purpurascens KA-43, S. purpurascens K A - 8 2 a n d S. purpurascens KC-157 were classified b y H E R P A Y (1978) based on t h e i d e n t i t y of diagnostical characteristics of k e y i m p o r t a n c e . These identified strains are deposited a t t h e H u n g a r i a n N a t i o n a l Collection of Microorganisms u n d e r n u m b e r s MNG 179, 178, 177 a n d 176, respectively. T h e cardenolid substances were gifts f r o m G. R I C H T E R P h a r m a c e u t i c a l Works, Budapest. T h e isolates were tested a n d cultivated b y conventional shake f l a s k culture techniques using media containing 2 % soya meal a n d 3 % glucose, i n c u b a t e d a t 32 °C with t h e 12-deoxy-cardenolid s u b s t r a t e s lanatosid-A or digitoxin, respectively. T h e p r o d u c t s of t h e crude e x t r a c t s were sep a r a t e d b y TLC (Kieselgel H F 254, MEECK, applying a 3 5 : 5 5 : 1 0 m i x t u r e of cyclohexane, ethyla c e t a t e a n d ethanol as solvent) a n d were detected w i t h anisealdehyde reagent. Medium required for culturing of S. purpurascens contains 2 % ground n u t meal a n d 3 % glucose a n d has a p H = 7. T h e t e m p e r a t u r e is 32 °C, b o t h for growth a n d f e r m e n t a t i o n . T h e s u b s t r a t e (1 t o 5 g per litre of *) P r e s e n t e d a t t h e 2nd Symposium on Biochemical Aspects of Steroid Research, September 1 4 - 1 9 , 1981, W e i m a r / G D R 30'

432

K. Albrecht, G. Maté and T. Láng

medium) is introduced just prior to inoculation or after one day incubation. We employed a methanolic solution or in the case of digitoxin, preferably a solution of tetrahydrofurfuryl alcohol (Albbecht et al. 1978a). The transformation was monitored by TLC. After completion the products are extracted with chloroform and isolated by chromatography. The identification of the 7/J-hydroxy-derivatives are reported by Szeleczky et al. (1981). Yields are calculated as theoretical per cent.

Results

and

discussion

Of a total number of 1000 freshly isolated and unidentified soil Streptomycetes five strains were found to produce 12/?-hydroxylated cardenolids. Pour of them were classified into the species Streptomyces purpurascens and the 5th as Streptomyces alboniger ( H e r p a y 1978). One of these strains, the Streptomyces purpurascens KA-82, MNG 177 was investigated in detail. Incubation of lanatosid-A with S. purpurascens KA-82 deglucosylation, deacetylation and hydroxylation has been observed, indicating t h a t the strain has /3-glucosidase, deacetylase and hydroxylase activities. The metabolic products are summarized in Table 1. Purpurea-A, acetyldigitoxin and acetyldigoxin can be detected only as intermediates because of the rapid deacetylation and glycolysis of lanatosid-A. The intermediates proved to be precursors of digoxin and 7/?-hydroxy compounds, respectively. Fig. 1 shows the changes of the main glycosides during fermentation. Besides the rapid deacetylation and glycolysis as mentioned earlier, the slower hydroxylation results in a mixture of different hydroxy compounds. In the course of the fermentation, the formation of 12/3 and 7/3-monohydroxy compounds is followed by the formation of 7/3, 12/S-dihydroxy compounds. 7/?-hydroxy-digitoxin shows a maximum and is expected to be the precursor of the dihydroxy compound. On the other hand, .digoxin was never found hydroxylated to 7/3-hydroxy-digoxin (Table 2), indicating Table 1 Glycosides detected in transformation of lanatosid-A by Streptomyces purpurascens Purpurea-A Acetyl-digitoxin Acetyl-digoxin Digitoxin Digoxin 7/J-hydroxy-digitoxin 7/J-hydroxy-digoxin Table 2 Glycoside transformation not performed by Streptomyces purpurascens Lanatosid-A Purpurea-A Acetyl-digitoxin Acetyl-digoxin Digoxin

• Lanatosid-C •* Deacetyl-lanatosid-C • 7/?-hydroxy-acetyl-digitoxin • 7/3-hydroxy-acetyl-digoxin • 7/?-hydroxy-digoxin

t h a t the dihydroxy compound is formed via 7/3-hydroxydigitoxin. Fig. 2 summarizes the different transformation of cardenolids found with S. purpurascens and a proposed metabolic pattern. The rate of hydroxylation of digitoxin is slower compared with lanatosid-A (Fig. 3). This may be due to the inhibitory effect of the substrate digitoxin in contrast to lanatosid-A which does not show any substrate inhibition (Fig. 4).

Microbial transformation of cardenolids

433

Lanatosid-A (A), digitoxin (•), digoxin (O), 7/Miydroxy-digitoxin (A), 7/}-hydroxy-digoxin (•) Purpurea-A

7/3-hydroxy-digitoxin

Lanatosid-A

lanatosid-C

7/¡-hydroxy-Digoxin

Fig. 2. Metabolism of cardiac glycosides by Streptomyces purpurascens The availability of digitoxin substrate for hydroxylation can be increased by using a water-miscible solvent of electron donor character. Employing à methanolic solution only 300 |i.g/ml digitoxin concentration can be achieved, in the case of a solvent with electron donor character it would be 760 [i.g/ml. Table 3 compares the different solvents used for the administration of digitoxin on the basis of added substrate and produced hydroxy compounds.

434

K . ALBBECHT, G . M A T É , a n d T . LANG

Time (days)

Fig. 3. Digoxin production from lanatosid-A and from digitoxin by Streptomyces

purpurascens

Table 3 Effect of different solvents on digitoxin transformation. Initial digitoxin concentration in the case of methanol 0.4 mmoles/1, in other cases 1 mmol/1 (Methanol necessary for higher digitoxin concentration is toxic) Solvents Tetrahydrofuran Dioxane Tetrahydrofurfuryl alcohol Dimethyl formamide Dimethyl acetamide Dimethyl sulfoxide Pyridin Hexamethylphosphoric triamide Methanol

Digoxin produced mmoles/1 0.45 0.25 0.41 0.25 0.40 0.30 0.30 0.30 0.20

T e t r a h y d r o f u r a n , t e t r a h y d r o f u r f u r y l alcohol a n d d i m e t h y l a c e t a m i d e s e e m t o be m o s t suitable, b u t t h e o t h e r s also g a v e better yields t h a n m e t h a n o l . T h e process t o produce d i g o x i n f r o m lanatosid-A can be u s e d industrially. A c c o r d i n g t o our m e t h o d ( A L B B E C H T et al. 1978 b) a f i v e - d a y f e r m e n t a t i o n resulted in 0.5 m m o l e s d i g o x i n per litre w i t h 4 0 % conversion.

435

Microbial transformation of cardenolids

Initial substrate

conc. (mM/L

)

Fig. 4. Influence of initial substrate concentration on the transformation rate of lanatosid-A (1) and of digitoxin (2)

References K., SZELECZKY, Z., U D V A R D Y , N. E., H E R P A Y , M. and SZABÖ, I., 1978a. Eljäräs 12/y-hidroxikardenolid szarmazekok mikrobiologiai elöällitäsära. Hung. P a t e n t No. 176 250.

ALBRECHT,

ALBRECHT, K . , SZELECZKY, Z . , K I S S , J . ,

TRINN, M . , TÖMÖRKENY, E . , BALOGH, T . , ILA, L , N A G Y ,

L. and TÖLGYESI, L., 1978b. Eljaras kardenolid-szarmazekok mikrobiolögia ätalakitäsanäl a fermentle szubszträt-koncenträciöjänak növelesere. Hung. Patent No. 176 249.

BÄRISCH, H . , FISCHER, F . , SCHMIDT, H . J . u n d PÖTTER, H . , 1 9 7 2 . Ü b e r d e n E i n f l u ß v o n L u f t a u f

fermentative Vorgänge in Digitalis lanata ERH. Pharmazie, 27, 415. GUBLER, A. und TAMM, C., 1958. Umwandlung von Cardenoliden durch Mikroorganismen. I. 12/S-Hydroxylierung von Digitoxigenin. Helv. chim. Acta, 41, 297. HERPAY, M., 1978. Thesis of Master's Degree, E L T E University, Budapest. NOZAKI, Y . , MAYAMA, M . , A K A K I , K . a n d SATOH, D . , 1 9 6 5 . M i c r o b i o l o g i c a l 1 2 / ? - h y d r o x y l a t i o n

digitoxin, a steroidal glycoside. Agric. and Biol. Chem. (Japan), 29, 783.

SCHUBERT, A . , LANGBEIN, G . u n d SIEBERT, R . , 1 9 5 7 . M i k r o b i e l l e H y d r o x y l i e r u n g v o n

in 12- und 15-Stellung. Chem. Ber., 90, 2576.

of

Steroiden

SZARKA, E . , TÖMÖRKENY, E . , SZELECZKY, Z . , SZENTIRMAI, A . , BALOGH, T . , TÖLGYESI, L . , ILA, L . , W A C K , G . , ZÄMBÖ, I . , BERCZ, J . , SIMONOVITS, E . , MTJRÄNYI, Z . , ZSÖKA, J . a n d T R I N N , M . , 1 9 7 8 .

Mikrobiologiai eljäräs szekunder glükozidok elöällitäsära primer digitälisz glükozidokböl. Hung. Patent 175 601.

SZELECZKY, Z . , S 6 T I , F . , HORVATH, G Y . a n d ALBRECHT, K . ,

cosides. Steroids, 31, 11.

1981. 7 / 3 - H y d r o x y c a r d e n o l i d e

gly-

Mailing address: K . ALBRECHT Department of Microbiology Institute for Drug Research, H-1325 Budapest, P.O.B. 82, Hungary

22

Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie

1982

437-442

(Laboratory of Microbiology, Gulbenkian Institute of Science, 2781 Oeiras Codex, Portugal)

Cyanide-resistant respiration in a respiration-deficient mutant of Saccharomyces cerevisae J . D . ABRABAQA*) a n d M . C. LOUREIRO D I A S

(Eingegangen am

30.11.1981)

A respiration-deficient mutant of Saccharomyces cerevisiae, grown aerobically with glucose as the sole source of energy and carbon, showed residual respiration resistant to cyanide. The differential sensitivity of cell fractions to inhibition by hydroxamic acids and carbon monoxide suggested that more than one type of organelle, probably mitochondria and microsomes, was involved in the consumption of oxygen. Measurements of the rate of heat production by exponentially growing aerobic cultures of a respiration-deficient mutant strain of Saccharomyces cerevisiae, were higher than expected from the measured stoichiometry of alcoholic fermentation ( L O U R E I R O - D I A S and A R R A B A Q A 1 9 8 2 ) . These high values could be explained, at least partially, by the occurrence of residual oxygen consumption, insensitive to cyanide at concentrations up to 1 mm. Similar t y p e s of respiration have been described in several plant species and tissues (see I K U M A 1 9 7 2 , for a review) and microorganisms including Candida ( H E R R M A N N 1 9 6 7 , K E L L E R M A N et al. 1 9 6 9 ) , Neurospora ( L A M B O W I T Z and S L A Y M A N 1 9 7 1 , E D W A R D S et al. 1 9 7 3 ) and Moniliella ( D ' H O N D T 1 9 7 2 ) . In all these organisms, a branch of the mitochondrial respiratory chain, at the level of the b cytochromes and involving an alternative terminal oxidase, was postulated. In S. cerevisiae, grown anaerobically, a cyanide-insensitive, but carbon monoxidesensitive respiration has been described, involving P 4 5 0 t y p e cytochromes of the microsomal fraction ( K A W A G U C H I et al. 1 9 7 3 ) . In the present work, we tried to discriminate among the several known possibilities for an explanation for the respiration resistant to cyanide in this particular strain.

Materials

and

methods

The organism used was a respiration-deficient mutant of Saccharomyces cerevisiae, strain IGC 3507-III. The yeast was grown aerobically, in batch culture, in a mineral medium supplemented with vitamins, described earlier (VAN U D E N 1 9 6 7 ) , with 2 0 DIM glucose as sole source of energy and carbon, at 25 °C, for 45—48 hours. Mitochondria and microsomes were isolated from protoplasts, prepared as described by DIAMOND and ROSE ( 1 9 7 0 ) , or from whole cells, treated with glass beads, as described by LANG et al. (1977). The organelles were obtained from the 25,000 X g (mitochondria) and the 105,000 X g (microsomes) pellets, washed twice and suspended in buffer containing 0.25 M mannitol, 20 MM trisS0 4 , 1 MM EDTA, pH 7.2. Oxygen consumption was monitored using a CLABK-type electrode (RANK BROS, Bottisham, UK) connected to a LKB 6500 recorder; for the measurement of oxygen consumption by the cell ') Present address: Faculdade de Ciencias, R. Escola Politécnica, 58 1200 Lisboa

438

J . D . ARBABACJA a n d M . C . LOUBEIBO D I A S

fractions, the signal from the electrode was amplified by inserting in the circuit a KEITHLEY 150 B Microvolt Ammeter, and the signal was recorded between 10 and 9 mV. Spectrophotometry data were obtained in a BECKMAN Acta I I I splitbeam spectrophotometer. The rate of oxidation of NAD(P)H was recorded at 340 nm, using a 3 ml quartz cuvette. Protein concentration was estimated by the biuret method, as modified by HERBERT et al. (1971), using bovine serum albumin as standard. All chemicals were of. the highest analytical grade commertially available. Snail gut enzyme was from Industrie Biologique, Gennevilliers, France.

Results and

discussion

The rate of oxygen consumption by whole cells showed a linear relation with the amount of inoculum present in the assay, as seen in Fig. 1, corresponding to a specific transfer rate of oxygen of 0.24 mmoles • hr _1 • g - 1 (dry weight). This rate was not affected by the presence of cyanide (1 MM) or antimycin A (80 pmoles • mg"1). The difference in behaviour of the wild-type and the mutant grown under the same circumstances, both in rate and towards cyanide are shown in Fig. 2. While the respiration of the wild-type was completely inhibited by cyanide, at concentrations as low as 0.05 MM, the mutant was insensitive to concentrations up to and beyond 1 MM. A comparison between the difference spectra of the oxidized minus reduced mitochondrial extracts is shown in Fig. 3. As expected, the wild-type showed the presence of the complete set of cytochromes, which were absent in the extracts from the mutant; the peak near the cytochrome c in the mutant is probably due to cytochrome c peroxidase. Differences between the mitochondrial and microsomal extracts of the mutant towards inhibition by salicyl-hydroxamic acid (SHAM) (SCHOMBAUM et al. 1 9 7 1 ) and carbon monoxide (KAWAGUCHI et al. 1 9 7 3 ) are shown in Table 1 ; the addition of SHAM resulted in an inhibition of between 90 and 100% of the oxidation of NADH by

0.3

I

i

0.2

0.1

600

J

L

700

Dry weight ( j i g )

Fig. 1. Transfer rate of oxygen in the mutant. Each assay was done, inoculating in the chamber of the electrode, 3 ml of sterile growth medium, containing cells, growing exponentially at the desired population density

Cyanide-resistant respiration in a 8. cerevisiae mutant

439

the mitochondrial extract, and 80 to 9 0 % of the oxidation of NADPH. On the other hand, the addition of the inhibitor to microsomal extracts decreased only 1 0 % the rate of oxidation of NADH and less than 1 0 % that of NADPH. The behaviour towards CO was also different. The incubation of mitochondria with the inhibitor decreased the rate of oxidation of NAD(P)H by about 10%. The incubation of microsomes under the same circumstances resulted in almost total inhibition of the oxidation of either pyridine nucleotide. The addition of 1 mM cyanide to either extract did not result in any appreciable inhibition of the oxidation, as judged by

Time (min)

Fig. 2. The effect of cyanide on cell respiration. Growth medium was inoculated with cells (1 mg dry weight ml - 1 ). Concentrations up to 1 m M of KCN were added as indicated

0.1 c+c7 \wiLD

V

i %

\

VMJ

PD

0

II

WO

.

c

W I

600

—

600

Wavelength (nm)

Pig. 3. Difference absorption spectra of wild-type and mutant mitochondria. Mitochondrial protein (30 mg ml - 1 ) was added to 3 ml of buffer pH 7.4, containing 50 mM K-phosphate, 0.5 mg cholate and 1.0 mg deoxycholate/mg protein, in both cuvettes. NADH and Na dithionite were added to the sample before scanning

4:40

J . D . ABRABA^A a n d M . C . LOUBEIRO D I A S

Table 1 R a t e of N A D H oxidation (nmole • m i n - 1 • m g - 1 )

Fraction

R a t e of N A D P H oxidation (nmole m i n - 1 • mg - ) 1

control

SHAM

CO

0.48 0.42 0.37

0.03 0.38 0.38

0.46 0.00 0.37

Mitochondria Microsomes Supernatant

control 0.21 0.17 0.31

SHAM

CO

0.04 0.17 0.29

0.19 0.00 0.31

Rates of pyridine nucleotide oxidation obtained as indicated in Methods. The buffer contained 0.25 M mannitol, 0.01 M Tris-S0 4 , p H 7.2 to a final volume of 3 ml. Protein from the cellular fractions was added up to 5 mg • m l - 1 . SHAM was added to both cuvettes at 1 MM. The inhibition with CO was obtained by treating the extracts in a stream of CO for 30 s, before addition in the cuvette.

Hbve/ength (nm)

Fig. 4. Absorption spectra ( C 0 - 0 ; ) of the wild-type and mutant strains microsomal extracts. Microsomal protein (30 mg m l - 1 ) was added to two cuvettes containing medium as in Fig. 3. The sample cuvette was treated with a stream of CO for 2 min, before the addition of protein

the rate of oxygen consumption and by NAD(P) formation. Difference spectra of the microsomal extracts with and without CO, resulted in the appearance of peaks at 450 and 420 nm, indicating the presence of P 4 5 0 type cytochromes (Fig. 4). Assays of glycolate oxidase in either extracts failed to unveil any enzymatic activity (BERGMEYER

1962).

The differences in activity and in sensitivity towards inhibitors, between the mitochondrial and microsomal respiration, indicated that we are probably in the presence of at least two different pathways for the cyanide-resistant oxidation of pyridine nucleotides, involving oxygen as final oxidant. The mitochondrial fraction showed some similarities with cyanide-resistant respiration described in plants and microorganisms. The only evidence that could be obtained for the involvement of the mitochondrial NAD(P)H dehydrogenase of the normal respiratory chain was rather indirect ; the K m of the NADH dehydrogenase of the mutant was similar to the one of the wild type (Fig. 5). The maximum velocity was, however, two orders of magnitude lower, but this can be ascribed to differences in the terminal oxidase. The latter had also a much greater sensitivity towards the concentration of oxygen in the medium, when compared with the cytochrome c oxidase of the respiratory chain (results not shown).

Cyanide-resistant respiration in a S. cerevisiae

1/[NADH]

441

mutant

(M'7X

10~ 5 )

Fig. 5. Double reciprocal plot relating rates and NADH concentrations

We cannot discriminate between the existence of a novel terminal oxidase in the mitochondrial extracts and the involvement of a non-heme iron-sulfur center of the normal respiratory chain. The existence of a microsomal chain, involving cytochrome P 4 5 0 , as proposed by KAWAGUCHI et al. ( 1 9 7 3 ) can explain the results obtained with the microsomal fraction. The assessment of the N A D ( P ) H / 0 ratio is crucial in the understanding of these oxidative processes. In a 'mixed function' oxidase, we should expect the following scheme to operate: 4 NAD(P)H + 4 H + + 2 R + 0 2 ^ 4 NAD(P) + + 2 H 2 0 + 2 R H 2 while a 'dissipative' process should result in: 2 NAD(P)H + 2 H+ + 0 2 2 NAD(P) + + 2 H 2 0 . The N A D H / 0 2 and N A D P H / 0 2 ratios in both the microsomal and the mitochondrial fractions point to the latter case (Table 2). Table 2 Rates nmole • min - 1 • m g - 1

Fraction

Mitochondria Microsomes Supernatant

I

O2 consump.

NADH oxidation

0.25 0.23

0.48 0.42 0.37

NADH/O 2

O2 consump.

1.9 1.8

0.12 0.10

NADPH NADPH/O 2 oxidation 0.21 0.17 0.31

1.7 1.7

Rates obtained as indicated in Table 1. For the rates of 0 2 consumption a total volume of 5 ml was used in the 0 2 electrode chamber.

Although the main energy-yielding pathway in this mutant is alcoholic fermentation, 1 9 7 6 ) ; this could be explained, at least partially, by the operation of "the pentose-phosphate pathway. As some of the pyruvate is used in the formation of biomass, glycerol is produced for the C 0 2 is produced in significant excess (MARTÍNEZ-PEINADO

442

J . D . ARRABA$A a n d M . C . LOUREIRO D I A S

necessary reoxidation of NADH, but stoichiometrically the amount of glycerol produced by this strain is not high enough. This could explain the necessity for alternative oxidative pathways, leading to the oxidation of NAD(P)H in this strain, grown under the present conditions. References Methoden der Enzymatischen Analyse. Verlag Chemie. GMBH. Weinheim/Bergstr. D I A M O N D , R . J . and R O S E , A. H., 1970. Osmotic properties of spheroplasts from Saccharomyces cerevisiae grown a t different temperatures. J . Bacteriol., 102, 311—319. E D W A R D S , D . L . , K W I E C I N S K I , F . and H O R S T M A N N , J . , 1 9 7 3 . Selection of respiratory m u t a n t s of Neurospora crassa. J . Bacteriol., 114, 164 — 168. H E R B E R T , H . , P H I P P S , P . J . and S T R A N G E , R . E., 1971. Chemical analysis of microbial cells. I n : „Methods in Microbiology 5 B " (Editors: J . R . N O R R I S and D . W . R I B B O N S ) . Academic Press London-New York, p. 209. H E R R M A N N , H . , 1967. Wirkung von Kaliumcyanid auf Sauerstoffaufnahme und Kohlendioxidbildung verschiedener Arten der Gattungen Candida und Saccharomyces. Z. Allg. Mikrobiol., 7, 403-406. IKTJMA, H . , 1 9 7 2 . Electron transport in plant respiration. A . Key. PI. Physiol., 23, 4 1 9 — 4 3 6 . BERGMEYER, H . U . , 1962.

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ISHIDATE, K .

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TAGAWA, K . ,

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Non-mitochondrial

electron

transfer

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Mailing address: M. C . L O U R E I R O D I A S Laboratory of Microbiology Gulbenkian I n s t i t u t e of Science 2781 Oeiras Codex, Portugal

Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie

(Sektion Biologie der

22

7

Friedrich-Schiller-Universität

1982

443-451

Jena, Wissenschaftsbereich

Allgemeine

Mikrobiologie)

Arthrobacter globijormis — ein neues hefelytisches Bakterium D . BLECHSCHMIDT, C. GOHR u n d R . TRÖGER

(Eingegangen

am 6.

10.1981)

A bacterium capable to lyse viable yeast cells was isolated from compost enriched with baker's yeast cells and was identified as Arthrobacter globiformis. The yeast lytic enzyme complex produced by shaking culture was precipitated with ammonium sulfate, dialyzed and lyophilized. The crude residue contained jS-glucanase and a-mannanase, yet not chitinase. Optimale carbon sources in the culture medium for a high enzyme synthesis were 0.5% yS-glucan for the production of yS-glucanase, resp., 3% a-mannan for the production of «mannanase. Addition of 10% whole died baker's yeast cells to the culture medium effected similar results. The crude enzyme residue released among other things spheroplasts from cells of the yeast Pichia membranaefaciens, Metschnikoivia pulcherrima, Hansenula anomala and Candida guilliermondii „H". However, it did not or only weakly lyse viable cells of the yeasts Rhodotorula rubra, Rhodosporidium toruloides and Sporobolomyces roseus. The mutants of Candida guilliermondii ,,H" with modified glucan, resp., mannan concentrations in the cell walls did not indicate differences in their susceptibility to lysis.

Für die zahlreichen Aufgabenstellungen in der Hefeforschung, z. B. bei der Gewinnung von Protoplasten, bei der Aufklärung der Zellwandstruktur oder bei der schonenden Freisetzung von Zellinhaltsstoffen, ist ein enzymatischer Abbau der Hefezellwand erforderlich. Dabei erweisen sich mikrobielle Enzymgemische als besonders vorteilhaft, da sie in der Regel einfacher zusammengesetzt sind als das aus mehr als 30 Einzelenzymen bestehende Schneckenenzym. Außerdem besteht für mikrobielle Enzymgemische keine jahreszeitliche Abhängigkeit der Gewinnung. Auf Grund der komplexen Struktur der Hefezellwand sind zu ihrem Abbau lytisch hochwirksame Enzympräparate notwendig. Die Isolation lytischer Mikroorganismen sollte sich deshalb besonders auf die Fähigkeit der Bakterien zur raschen Lyse lebender Hefezellen konzentrieren. Einige Autoren isolierten lytisch aktive Bakterien direkt aus dem Erdboden (z. B . R O W L E Y U. B U L L 1 9 7 7 , I M A I et al. 1 9 7 7 , S C H U B E R T et al. 1 9 7 7 , M A N N et al. 1 9 7 8 , E M A N U I L O V A et al. 1 9 7 9 ) . Darüber hinaus wurde auch die Isolation hefezellwandlytischer Bakterien von Standorten beschrieben, an denen normalerweise Hefen zu finden sind ( J O N E S U. B A L L O U 1 9 6 9 , E M A N U I L O V A et al. 1 9 7 9 ) . Mit der vorliegenden Arbeit wurde das Ziel verfolgt, in einer mit Bäckerhefe versetzten Bodenprobe über einen längeren Zeitraum hinweg lytische Bakterien anzureichern und daraus einen hochaktiven Bakterienstamm zu isolieren. Weiterhin werden einige Eigenschaften des von diesem Stamm produzierten Enzymgemisches, insbesondere die Enzymbildung auf komplexen Substraten und die Eignung des lyophilisierten Rohpräparates zur Lyse unterschiedlicher Hefearten, vorgestellt. Material

und

Methoden

Der Untersuchungsstamm wurde aus Komposterde isoliert, die 3 Monate vorher zur Anreicherung hefezellwandlytischer Mikroorganismen massiv mit Bäckerhefe versetzt worden war. Die Isolation erfolgte auf Wasseragar mit eingegossenen toten Bäckerhefezellen. Die Stammhaltung

444

D . B L E C H S C H M I D T , C . GOHR u n d R . TRÖGER

erfolgte bei 28 °C auf Schrägagar folgender Zusammensetzung: 1 g P e p t o n , 2 g H e f e e x t r a k t , 10 g Bäckerhefe, 20 g Agar ad 1 1 a q u a dest. Die Vorkulturlösung f ü r Submerskulturen setzte sich zusammen aus 2 g P e p t o n , 2 g H e f e e x t r a k t u n d 5 g Bäckerhefe ad 1 1 a q u a dest. Die H a u p t k u l t u r lösung bestand aus 500 mg (NH 4 ) 2 S0 4 , 408 mg MgS0 4 X 7 H 2 0 , 10 mg F e S 0 4 X 7 H „ 0 , 20 mg CaCl 2 X 6 H 2 0 , 7,54 g K 2 H P 0 4 , 2,32 g K H 2 P 0 4 u n d 1 1 a q u a dest. Die c H + aller K u l t u r m e d i e n b e t r u g p H 7,2. J e nach der Aufgabenstellung enthielt diese H a u p t k u l t u r l ö s u n g als C-Quelle Bäckerhefe, M a n n a n , Glucan u n d Chitin, die in unterschiedlichen K o n z e n t r a t i o n e n u n d K o m binationen eingesetzt wurden. Die k o m p l e t t e Nährlösung wurde in 500-ml-Rundstandkolben zu je 100 ml 25 min bei 121 °C sterilisiert. Die B e i m p f u n g der Vorkultur erfolgte m i t Stanzstücken aus 7—10 Tage alten K u l t u r e n . Die I n k u b a t i o n der Vorkultur d a u e r t e 36—40 h bei 28 °C (Rundschüttler). Die H a u p t k u l t u r l ö s u n g wurde mit jeweils 5 ml Impfsuspensionen dieser Vorkultur b e i m p f t . Die H a u p t k u l t u r (Rundschüttler) dauerte 40—45 h bei 28 °C. Die Gewinnung bzw. Anreicherung des lytischen Enzymgemisches erfolgte durch die Ausfällung mittels (NH 4 ) 2 S0 4 (Sättigung von 7 0 % bei p H 6,5 u n d 5 °C) u n d Stehenlassen über N a c h t bei 3 °C aus einer 60 h alten Schüttelkultur mit 10% Bäckerhefe als C-Quelle. N a c h A b t r e n n u n g des Sättigungsproduktes durch K ü h l z e n t r i f u g a t i o n u n d anschließender Dialyse des in wenig P h o s p h a t puffer wieder aufgenommenen Niederschlages (24 h bei 3 °C gegen a q u a d e s t ; zweimaliger Wechsel des a q u a dest.) wurde das R o h p r ä p a r a t in der Gefriertrocknungsanlage LGA 05 lyophilisiert. Das Lyophilisat war bei —25 °C monatelang ohne Aktivitätsverlust h a l t b a r . Die Ausbeute b e t r u g 0,3—0,6 g/1 Kulturlösung. F ü r die B e s t i m m u n g der totalen lytischen A k t i v i t ä t des Enzymlyophilisats wurden 15 h alte Hefezellen aus Schüttelkulturen mehrmals mit PPM-Lösung (22,44 g N a 2 H P 0 4 u n d 79,20 g (NH 4 ) 2 S0 4 ad 1 1 a q u a dest., m i t Citronensäure auf p H 6,0 eingestellt u n d m i t 0,8 M Mannit versetzt) gewaschen, in P P M - L ö s u n g suspendiert u n d m i t entsprechend v e r d ü n n t e r Enzymlösung (meist 1 mg/ml) u n t e r Schütteln bei 28 °C inkubiert. E i n Teil der Zellen wurde vor dem Waschen mit TEM-Lösung (12,31 g T R I S - P u f f e r u n d 37,275 g E D T A a d 1 1 a q u a dest., mit konzentrierter K O H auf p H 8,0 eingestellt u n d mit 0,025 ml 2-Mercaptoäthanol versetzt) vorbehandelt (10', 28 °C, Reziprokschüttler). D e m Inkubationsgemisch wurden nach 90 min 2-ml-Proben e n t n o m m e n u n d mit 4 ml a q u a dest. v e r d ü n n t . N a c h 5 min Stehens w u r d e n die P r o b e n k r ä f t i g geschüttelt u n d anschließend die noch i n t a k t e n Hefezellen mittels THOMA-Kammer ausgezählt. Die B e s t i m m u n g der /S-Glucanaseaktiv i t ä t erfolgte bei p H 6,0 durch I n k u b a t i o n von 25 mg in 5 ml P h o s p h a t p u f f e r suspendierten Glucans aus Bäckerhefe m i t 6 ml K u l t u r f i l t r a t oder gelöstem lyophilisiertem R o h p r ä p a r a t bei 55 °C im Wasserbad (1 h). Anschließend wurde die Menge der dabei freigesetzten Zucker mittels 3,5-Dinitrosalicylsäurenach BOREL et al. (1952) b e s t i m m t (Eichkurve m i t Glucose als Äquivalent f ü r die aus dem Glucan freigesetzten reduzierenden Zucker). Die B e s t i m m u n g der a - M a n n a n a s e - A k t i v i t ä t erfolgte auf ähnliche Weise bei 50 °C u n d p H 7,0 (Eichkurve hier jedoch mit Mannose als Äquivalent f ü r die aus dem a - M a n n a n freigesetzten reduzierenden Zucker). Als eine Enzymeinheit wurde die Menge definiert, die u n t e r den Versuchsbedingungen in 1 h 1 piMol Glucose bzw. Mannose (als reduzierende Zucker) freisetzt. Die Bestimmung der chitinolytischen A k t i v i t ä t wurde modifiziert nach VESSEY u n d EGG (1973) d u r c h g e f ü h r t u n d b e r u h t e auf dem Nachweis des w ä h r e n d der I n k u b a t i o n aus dem Chitin freigesetzten N-Acetylglucosamins. /S-Glucan u n d « - M a n n a n w u r d e n aus Bäckerhefe gewonnen. Chitin lag als Chitin p r a c t . der F i r m a FLTJKA AG vor. Die K u l t u r der f ü r die Lyseuntersuchungen verwendeten M u t a n t e n von Candida guilliermondii „ H " erfolgte im YM-Medium (3 g H e f e e x t r a k t , 3 g Malzextrakt, 5 g P e p t o n , 20 g Glucose ad 1 1 a q u a dest.), w ä h r e n d das K u l t u r m e d i u m f ü r die H e f e s t ä m m e folgende Zusammensetzung aufwies: 3 g (NH 4 ) 2 S0 4 , l g K H 2 P 0 4 , 0,16 g K „ H P 0 4 , 0,7 g MgS0 4 X 7 H 2 0 , 0,5 g NaCl, 0,4 g Ca(N0 3 ) 2 , 5 g H e f e e x t r a k t u n d 20 g Glucose a d l l a q u a dest.

Ergebnisse Stammbeschreibung 3 Monate vor der Isolation wurde Komposterde an Ort und Stelle massiv mit Bäckerhefe versetzt. Aus dem sich darin anreichernden hefelytischen Mikroorganismengemisch wurde der Untersuchungsstamm isoliert. Die Kolonien dieses Stammes waren auf Wasseragar mit eingegossenen toten Bäckerhefezellen von deutlichen Lysehöfen umgeben (Abb. 1). Auf Stammhaltungs-

A. globiformis

— ein hefelytisches B a k t e r i u m

445

Abb. 1. Hefelytische A k t i v i t ä t von Arthrobacter globiformis nach 4 d auf Doppelschichtagar m i t Bäckerhefe in der Deckschicht

agar färbten sich die Kolonien mit zunehmendem Alter lebhaft gelb. Die Einzelzellen zeichneten sich durch einen ausgeprägten Formenwechsel zwischen filamentösen Formen in jungen Kulturen und kokkoiden Formen in älteren Kulturen aus. Endosporenbildung und Säurefestigkeit fehlten. Diese Eigenschaften sowie das grampositive Verhalten, die Säurebildung aus Glucose, die Fähigkeit zur Stärke- und Gelatinehydrolyse sowie zur Nitratreduktion, das streng aerobe Wachstum und der fehlende Celluloseabbau führten zur Einordnung des Stammes in die Gattung Arthrobacter. Darüber hinaus war der Stamm katalasepositiv und konnte ohne Biotin und Thiamin wachsen. Die Identifizierung des Untersuchungsstammes als Arthrobacter globiformis erfolgte auf Grund der Übereinstimmung seiner wesentlichen Merkmale mit denen der Artbeschreibung in B E R G E Y ' S Manual ( 1 9 7 4 ) . E n z y m b i l d u n g auf k o m p l e x e n C - Q u e l l e n Zur Untersuchung, der Fähigkeit zum hydrolytischen Abbau verschiedener komplexer C-Quellen und zur Optimierung der Abbauleistungen wurde Arthrobacter globiformis in Medien mit unterschiedlichen Konzentrationen von a-Mannan und /9-Glucan sowie Kombinationen dieser Polysaccharide mit Chitin kultiviert. Desgleichen ist als komplexe C-Quelle im Autoklaven sterilisierte Bäckerhefe eingesetzt worden. Nach 45 h Kulturdauer wurde im Kulturfiltrat die /J-Glucanase- bzw.

•o gp

ÍB CM TÍI 6 n a c h g e w i e s e n (Abb. 1). D i e neutralen K o h l e n h y d r a t e b e s t e h e n v o r w i e g e n d aus Mannose (Tab. 1).

Zellwand-Polysaccharid-Strukturen aus Candida spec.

481

Tabelle 1 Papierchromatographische und gaschromatographische Analyse der mit Citratpuffer aus Hefezellwand extrahierten Neutralzucker nach Gelchromatographie an Sephadex G 15 Fraktion (Polymerisationsgrad)

Zusammensetzung (Strukturen)

DPI

Mannose, Glucose, Arabinose (2,9:1:0,08) Ribose (Spuren); Verbindungen mit den Retentionszeiten T| I a n = 0,72; 1,80; 2,41 ManL?Man ; M a n ü M a n ManlHManOMan ManLlManL_?ManL_?Man Mail—ManL_?ManL_?Man ManLJManL_?Mani_?Man—Man

DP 2 DP 3 DP 4 DP 5

0,7

0,6

0,5

0A

0,3

0,2

0,1

10

20

30

W

50

60

70

80

90

100

110

120

Probe-Nr.

Abb. 1. Neutrale, niedermolekulare Kohlenhydrate, mit extrahiert. Elutionsmuster nach gelchromatographischer 189 cm) sowie Papierchromatographie von D P 1 bis D P Acetolyse des alkalistabilen makromolekularen

Citratpuffer aus isolierten Zellwänden Trennung an Sephadex G 15 (2,4 x 5. S = Standard-Kohlenhydrate nach Mannans aus Candida spec. H

Die von Dowex 50 mit 10 mM resp. 20 mM Puffer eluierten zwei Glycopeptidfraktionen lassen sich durch präparative Chromatographie an P N 11 (Laufmittel D ) in 9 ninhydrinpositive Fraktionen trennen; 6 davon enthalten Hexosen. Sie verhalten sich dünnschichtchromatographisch (Kieselgel G, Laufmittel E) und elektrophoretisch jeweils als einheitliche Fraktion. Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse der papierchromatographischen Analyse nach /5-Eliminierung resp. Hydrolyse: Fast ausschließlich sind Mannose resp. Manno-Oligosaccharide O-glycosidisch an Serin resp. Threonin gebunden. Auffallend ist, daß in den extrahierten Glycopeptiden regelmäßig Glycin, jedoch auch Glutamin(säure) und Asparagin(säure) nachweisbar sind (Laufmittel B und C).

482

J . N Ü S K E , H . D . GRIMMECKE u n d G . R E U T E R

Die von Dowex 2 eluierte saure Fraktion enthält Phosphat und Kohlenhydrate, die nach milder alkalischer Hydrolyse als tx (l,2)-gebundene Tri- und Tetramannose identifiziert werden konnten. Z W l - A b b a u ( v g l . S c h e m a 1) Zur näheren Charakterisierung der nach Mannanextraktion durch Citratpuffer verbliebenen Zellwand (ZW 1) wurden zunächst durch Hydrolyse mit 0,01 N HCl die glycosidischen Zucker-Phosphat-Bindungen gelöst. Die nach Fällung einer hochmolekularen Fraktion durch Methanol im Überstand verbliebene niedermolekulare Fraktion wurde gelchromatographisch an Sephadex G 15 getrennt in Zucker mit D P 1, 2, 3, 4, 5, wobei D P 1 und D P 3 mengenmäßig vorherrschen. Die gaschromatographische Analyse zeigt für D P 1 Glucose und Mannose im Verhältnis 1:11. Die Oligosaccharide von D P 2 bis D P 5 sind papierchromatographisch identisch mit den Oligosacchariden, welche durch Acetolyse des Zellwand-Mannans erhalten wurden. Höhermolekulare Oligosaccharide waren durch Chromatographie an Sephadex G 25 nicht nachzuweisen. Im verbliebenen Zellwandpräparat (ZW 2) wurden anschließend durch Behandlung mit 0,05 N NaOH die O-glycosidisch an Protein gebundenen Zucker freigesetzt. Die nach Fällung einer hochmolekularen Fraktion durch Methanol im Überstand verbliebenen niedermolekularen Bestandteile ließen sich an Sephadex G 15 in Zucker mit D P 1, 2, 3, 4, 5 trennen. Die Gaschromatographie von D P 1 zeigt Glucose und Mannose im Verhältnis 1:2. Durch Trennung an Sephadex G 25 waren keine zusätzlichen Oligosaccharide nachzuweisen. Die Ergebnisse sprechen dafür, daß 2 7 % der Zellwand so labil gebunden sind, daß sie bereits durch Citratpuffer extrahiert werden können. Weitere 19% sind offensichtlich glycosidisch über Phosphatbrücken bzw. O-glycosidisch, wahrscheinlich über Serin und Threonin an verbliebenen Zellwandproteinen gebunden. Werden diese Proteine durch Pronase hydrolysiert, gehen weitere 5 % in Lösung. Die verbliebene Zellwand (ZW 3-Pr) enthält somit nur noch 4 9 % der ursprünglichen Zell wand. Um die Bindungsverhältnisse zwischen Polysacchariden und Proteinen der Zellwand näher kennen zu lernen, wurden zusätzlich vergleichsweise nicht vorbehandelte Zellwände (ZW) mit Pronase behandelt. Dabei blieben 6 0 % der Zellwand ungelöst zurück (ZW-Pr). Die von einer hochmolekularen, löslichen Fraktion durch Dialyse abgetrennte und durch Ionenaustausch gereinigte niedermolekulare Neutralfraktion ließ sich durch präparative Papierchromatographie in 3 Hauptfraktionen trennen, die entsprechend der gaschromatographischen Analyse in erster Linie Glucose, eingeschränkter auch Mannose enthalten. Fraktion I ist ein dünnschichtchromatographisch einheitliches Glycopeptid, dessen Hydrolysat (6N HCl) entsprechend der zweidimensionalen Chromatographie an FND-Folie Glutaminsäure, Glycin, Serin und Alanin enthält. Die Fraktionen I I und I I I bestehen ebenfalls aus Neutralzuckern und ninhydrinpositiven Substanzen. Demnach sind neben Mannooligomeren auch Glucooligomere direkt an das Zellwandprotein gebunden. Diese aus nicht vorbehandelten Zellwänden durch Pronasebehandlung freigesetzten Verbindungen unterscheiden sich nicht grundsätzlich von den Verbindungen, die durch Pronasebehandlung von vorher chemisch abgebauten Zellwänden gewonnen wurden. Durch die von uns ausgeführten schonenden Abbau-Methoden wurde erreicht, daß die glycosidischen Bindungen zwischen den Zuckern erhalten blieben. Das isolierte Zellwandpräparat ZW3-Pr enthält neben Glucose ca. 15% Glucosamin, während nur noch 1% Mannose sowie 2,5% Protein und 0,015% Phosphor vorhanden sind. Nach Permethylierung geht der größte Teil von ZW3-Pr in Lösung. Durch gaschromato-

Zellwand-Polysaccharid-Strukturen aus Candida

spec.

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graphische Analyse der partiell methylierten Alditolacetate des Glucan-Chitins der isolierten Zellwände wurden neben--G— zusätzlich —G—Bindungen aufgefunden. Vorherrschend ist außer dem die —G—Bindung. Als Nachweis von Verzweigungsstellen der Glucanketten sind die erhaltenen Derivate der (1,2,3)- und der im Chromatogramm nicht voneinander getrennten (l,2,6)-resp. (l,3,6)-gebundenen Glucosen zu werten. Das nachgewiesene Derivat von (l,4)-glycosidisch gebundenem N-Acetylglucosamin entspricht dem Chitin der Zellwand. Diskussion Die Ergebnisse der Strukturaufklärung zeigen eine weitgehende qualitative und quantitative Identität des extrazellulären Mannans mit dem Mannan aus isolierten Zellwänden. Das nur in geringer Konzentration im Kulturmedium aufgefundene Mannan wurde wahrscheinlich aus der Zellwand ausgewaschen. Die Analysenergebnisse der beiden Mannane stimmen andererseits weitgehend überein mit den Ergebnissen unserer wesentlich ausführlicheren Arbeiten zur Strukturaufklärung des aus intakten Zellen dieser Species isolierten Proteophosphomannans (GRIMMECKE U. R E U T E R 1980, 1981). Neben diesem Hauptprodukt (PPM) werden jedoch durch Citratpuffer zusätzlich niedermolekulare Neutralzucker, Glycopeptide sowie Zuckerphosphate extrahiert. Alle drei Gruppen enthalten Mannose. In der Neutralfraktion wurden Mono- und Oligosaccharide gefunden, die den Acetolyseprodukten des alkalistabilen Proteomannans von PPM gleichen. Sie sind jedoch nicht identisch mit dem nach Spaltung der Phosphodiesterbindung bzw. nach /9-Eliminierung aus PPM gelchromatographisch ermittelten Elutionsmuster. Auch eine bei diesen Oligosacchariden aufgefundene strukturelle Heterogenität bezüglich« (1,2)-, « (1,3)- unda(l,6)-Bindungen gilt nicht für diese extrahierte Neutralzuckerfraktion. Die niedermolekularen Glycopeptide (Tab. 2), sind im wesentlichen aus Mono- bzw. Oligosacchariden aufgebaut, die O-glycosidisch an Serin (in einigen Fällen auch Threonin) gebunden sind. Nahe der Bindungsregion Ser(Thr)-Kohlenhydrat scheinen neben Glycin noch Asparagin (säure) essentiell zu sein. Die mit Citratpuffer extrahierten