Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie: Band 22, Heft 9 1982 [Reprint 2021 ed.] 9783112539026, 9783112539019

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ZEITSCHRIFT FUR ALLGEME1NE MIKRQ-BIOLOGIE AN INTERNATIONAL JOURNAL ON MORPHOLOGY, PHYSIOLOGY, GENETICS, AND ECOLOGY OF MICROORGANISMS HEFT 9 • 1982 • BAND 22

AKADEMIE-VERLAG EVP 20,— M

BERLIN

ISSN 0044-2208

34112

CONTENTS

OF

NUMBER!)

Steroid modifications with immobilized biocatalysts — use of immobilized enzyme-requiring cofactor regeneration and of immobilized mycelium

F . KKGAK. P . ATBAT, P . DHULSTER. G . G E L L F , M . N . K I M . M . D . LKGOY a n d D . THOMAS 607

Growth characteristics and ultrastructure of protoplast type L-forms from Streptomycetes

J . GUMPERT

17

Alteration of interaction with virulent bacteriophage Tal during differentiation of Thermoactinomyees vulgaris

SIGRID KRETSCHMER

629

Genetic recombination in leukaemomycin-producing strains of Streptomyccs griseus

G . SCHUMANN a n d VV. F . F L E C K

(»39

Effects of freezing and thawing and storage by freezing on the biological and morphological properties of strain Ii-it of Klebsiella pneumoniae and its variants

M . TAKAHASHI, II I L) A

In vitro effect of dipyridamole on the pseudorabies virus — electron microscopical investigations

P . ZÖPEL

661

B . RÖBER a n d G . REUTER

671

Short Note In vitro incorporation of 14 C-hexose-6-phosphates in mannan, fi-glucan and glycogen with Candida spec. H and their mutants

S.

ITO

and K. Yos-

649

675

Book Reviews

INHALTSVERZEICHNIS

HEFT

9

Steroidumwandlung mit immobilisierten Biokatalysatoren

F . E R G A N , P . A m i AT, P . D H U L S T E R , G . G E L L F , M . N . K I M , M . D . LEGOY UND D . THOMAS 607

Wachstumscharakteristik und Ultrastruktur der Protoplastentyp-L-Formen von Streptomyceten

J . GUMPERT

617

Änderungen der Wechselwirkung zwischen Bacteriophagen Tal und Thermoactinomyces vulgaris in Abhängigkeit von der Differenzierung

SIGRID KBETSCHMER

629

Genetische Rekombination in Mutanten des Anthracyclin-Bildners Streptomyces griseus

G . SCHUMANN UND W . F . F L E C K

639

Einfluß von Frieren und Tauen und Gefrierlagerung auf die biologischen Eigenschaften des Stammes K-9 von Klebsiella pneumoniae und seinen Varianten

M . TAKAHASHI, S . ITO UND K . Y O S HIDA 649

Elektronenoptische Untersuchungen zur in vitroWirkung von Dipyridamol auf das Pseudorabiesvirus

P . ZÖPEL

661

B . RÖBER u n d G . REUTER

671

Kurze Originalmitteilung In (;it»-o-Einbau von 14 C-Hexose-6-phosphat in Mannan, ß-Glucan und Glycogen bei Candida spec. II und ihren Mutanten Buchbesprechungen

675

ZEITSCHRIFT FÜR ALLGEMEINE MIKROBIOLOGIE AN

INTERNATIONAL' JOURNAL

ON

MORPHOLOGY, PHYSIOLOGY, GENETICS. A N D ECOLOGY OF MICROORGANISMS

H E R A U S G E G E B E N VON

F. Egami, Tokio G. F . Gause, Moskau 0 . Hoffmann-Ostenhof, Wien A. A. Imseneckii, Moskau R. W. Kaplan, Frankfurt/M. F. Mach, Greifswald 1. Mälek, Prag C. Weibull, Lund

unter der Chefredaktion von W. Schwartz, Braunschweig und U. Taubeneck, Jena

U N T E R M I T A R B E I T VON

J . H. Becking, Wageningen H. Böhme, Gatersleben M. Girbardt, Jena S. I. Kusnecov, Moskau 0 . Necas, Brno H. Oppenheimer, Port Aransas N. Pfennig, Göttingen 1. L. Rabotnova, Moskau A. Schwartz, Wolfenbüttel

HEFT 9 • 1982 • BAND 22

AKADEMIE-VERLAG • BERLIN

REDAKTION

U. May, Jena

Die Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie soll dazu beitragen, Forschung und internationale Zusammenarbeit auf dem Gebiet der Mikrobiologie zu fördern. Es werden Manuskripte aus allen Gebieten der allgemeinen Mikrobiologie veröffentlicht. Arbeiten über Themen aus der medizinischen, landwirtschaftlichen, technischen Mikrobiologie und aus der Taxonomie der Mikroorganismen werden ebenfalls aufgenommen, wenn sie Fragen von allgemeinem Interesse bebehandeln. Zur Veröffentlichung werden angenommen: Originalmanuskripte, die in anderen Zeitschriften noch nicht veröffentlicht worden sind und in gleicher Form auch nicht in anderen Zeitschriften erscheinen werden. Der Umfang soll höchstens l 1 / 2 Druckbogen (24 Druckseiten) betragen. Bei umfangreicheren Manuskripten müssen besondere Vereinbarungen mit der Schriftleitung u n d dem Verlag getroffen werden. Kurze Originalmitteilungen über wesentliche, neue Forschungsergebnisse. Umfang im allgemeinen höchstens 3 Druckseiten. Kurze Originalmitteilungen werden beschleunigt veröffentlicht. Kritische Sammelberichte u n d Buchbesprechungen nach Vereinbarung mit der Schriftleitung. Bezugsmöglichkeiten der Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie: Bestellungen sind zu richten — in der DDR an eine Buchhandlung oder an den Akademie-Verlag, DDR-1086 Berlin, Leipziger Straße 3 - 4 — im sozialistischen Ausland an eine Buchhandlung f ü r fremdsprachige Literaur oder an den zuständigen Postzeitungsvertrieb — in der BRD und Berlin(West) an eine Buchhandlung oder an die Auslieferungsstelle K U N S T U N D W I S S E N , Erich Bieber, D-7000 Stuttgart 1, Wilhelmstraße 4 - 6 — in den übrigen westeuroäpischen Ländern an eine Buchhandlung oder an die Auslieferungsstelle K U N S T U N D WISSEN, Erich Bieber GmbH, CH-8008 Zürich, Dufourstraße 51 — im übrigen Ausland an den Internationalen Buch- u n d Zeitschriftenhandel; den Buchexport, Volkseigener Außenhandelsbetrieb der Deutschen Demokratischen Republik, DDR-7010 Leipzig, Postfach 160, oder an den Akademie-Verlag, DDR-1086 Berlin, Leipziger Straße 3—4. Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie Herausgeber: I m Auftrag des Verlages von einem internationalen Wissenschaftlerkollektiv herausgegeben. Verlag: Akademie-Verlag, DDR-1086 Berlin, Leipziger Straße 3 - 4; F e r n r u f : 2 23 62 29 oder 2 23 62 21 Telex-Nr.: 114420; B a n k : Staatsbank der D D R , Berlin, Kto-Nr.: 6836-26-20712. Chefredaktion: Prof. Dr. U D O T A U B E H E C K Prof. Dr. W I L H E L M S C H W A R T Z Anschrift der Redaktion: Zentialinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften, DDR-6900 J e n a , Beutenbergstr. 11; Fernruf: J e n a 885614; TelexN r . : 058621. Veröffentlicht unter der Lizenznummer 1306 des Presseamtes beim Vorsitzenden des Ministerrates der Deutschen Demokratischen Republik. Gesamtherstellung: V E B Druckerei „Thomas Müntzer", DDR-5820 Bad Langensalza. Erscheinungsweise: Die Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie erscheint jährlich in einem Band mit 10 Heften. Bezugspreise je Band 250,—M zuzüglich Versandspesen (Preis für die D D R 2 0 0 , - M ) . Preis je H e f t 2 5 , - M (Preis für die D D R 2 0 , - M ) . Urheberrecht: Alle Rechte vorbehalten, insbesondere die der Übersetzung. Kein Teil dieser Zeitschrift darf in irgendeiner Form — durch Photokopie, Mikrofilm oder irgendein anderes Verfahren — ohne schriftliche Genehmigung des Verlages reproduziert werden. — All rights reserved (including those of translations into foreign languages). No p a r t of this issue may be reproduced in any form, by photoprint, microfilms or any other means, without written permission from the publishers. Eracheinungstermin: November 1982 Bestellnummer dieses Heftes 1070/22/9 © 1982 by Akademie-Verlag Berlin. Printed in the German Democratic Republic AN (EDV) 75218

Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie

22

9

1982

607-615

(Laboratoire de Technologie Enzymatique, E R A No. 338 du C N R S . Pr. THOMAS D. B . P . 233 - 60206 Compiegne, France und Akademie der Wissenschaften der D D R , Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie, J e n a 1 , Direktor: Prof. Dr. rer. nat. U. TAUBENECK)

Steroid modifications with immobilized biocatalysts — use of immobilized enzyme-requiring cofactor regeneration and of immobilized mycelium F . ERGAN,

P . ATRAI1,

P. DHULSTER,

G. GELLF,

M. N. KIM,

M. D . LEGOY

and

D.

THOMAS

(Eingegangen

am 8. 3. 1982J

Two biological approaches have been investigated for specific modifications of steroids. The first one uses the purified enzyme for the specific dehydrogenation of androsterone to androstanedione. The enzyme used is 3a-hydroxysteroid dehydrogenase which requires a cofactor (NAD). A cofactor regeneration is needed so that the process could work continuously. The conjugation of two points (immobilization of the enzyme and optimization of the ratio methanol-water) allows a continuous work of the enzyme during 25 days. Moreover, we propose a chemical regeneration of the cofactor using methoxy derivative of phenazine methosulphate. Right now it is the limiting step of the process. The second approach of steroid modification uses a whole mycelium of Aspergillus phoenicis for the specific hydroxylation of progesterone to l l a - h y d r o x y progesterone. The transformation of 9 0 % of the progesterone is obtained with calcium alginate immobilization and the lowest number of products is obtained at p H lower than 2.5 with carrageenan and polyurethane immobilization. It seems promising to apply immobilized biocatalysts to the bioconversion of hydrophobic compounds in organic solvents system.

Until now little attention has been paid to steroid dehydrogenases. C R E M O N E S I et al. (1975) have described the preparation of 20/S-hydroxysteroids by using a dehydrogenase. The work of L A R S S O N and M O S B A C H (1976) has involved dehydrogenase in steroid-transforming microorganisms immobilized in polyacrylamide. Y A M A N E et al. (1979) have performed A '-dehydrogenation of steroids in water insoluble organic solvents by free microbial cells and by entrapped cells. Y A N G and S T U D E B A K E R (1978) have described the effect of an exogenous electron acceptor (phenazine methosulphate) during the continuous dehydrogenation of steroids by immobilized microbial cells. Steroid dehydrogenation at high substrate concentration using immobilized cells has been performed by C O N S T A N T I N I D E S (1980). On the other hand, studies on microbial steroid conversion have received increasing attention after the discovery by H E N C H in 1 9 4 9 of the cortisone effect on rheumatoids. So l l a - h y d r o x y l a t i o n of progesterone (precursor of cortisone) has been well studied: in fact, P E T E R S O N et al. ( 1 9 5 5 ) have shown that the product could easily be transformed at a low cost in cortisone. M A M O L I and V E R C E L L O N E ( 1 9 3 7 ) succeeded first in transforming 1 7 ketosteroids into 17/?-hydroxysteroids using a yeast. P E T E R S O N and M U R R A Y ( 1 9 5 2 ) have performed for the first time the LL«-hydroxylation of progesterone with Rhizopus nigricans. Several strains are used by I I Z U K A and N A I T O ( 1 9 6 7 ) for LLA-hydroxylation, including fungi spores used by V E Z I N A et al. ( 1 9 6 3 , 1 9 6 8 ) and by S I N G H et al. ( 1 9 6 8 ) . O H L S O N et al. ( 1 9 7 9 ) have immobilized fungi spores but Aspergillus phoenicis has not yet been used for this reaction. 41*

608

F . E R G A N et

al.

T h e p r e s e n t p a p e r d e a l s first w i t h t h e c o n t i n u o u s use of immobilized 3 a h y d r o x y s t e r o i d d e h y d r o g e n a s e ( 3 « H S D H ) in w a t e r - m e t h a n o l m e d i a , s e c o n d l y w i t h t h e use of i m m o b i l i z e d Aspergillus phoenicis. T h e c o m m o n a i m is t h e b y c o n v e r s i o n of steroids. T h r e e c o m m o n limiting f a c t o r s h a v e been s t u d i e d in e a c h c a s e : — I n s u c h b i o c o n v e r s i o n s of s t e r o i d s in o r g a n i c s o l v e n t s , i m m o b i l i z a t i o n m e t h o d s a n d t h e n a t u r e of s u p p o r t s o r gels used for i m m o b i l i z a t i o n of b i o c a t a l y s t s a r e important. — S o l v e n t s e m p l o y e d in t h e s e t r a n s f o r m i n g s y s t e m s should be ones w h i c h solubilize s u b s t r a t e s a n d p r o d u c t s a s m u c h a s possible a n d i n a c t i v e e n z y m e s a s little a s possible. — T h e t h i r d limiting f a c t o r is t h e r e g e n e r a t i o n of c o f a c t o r : in t h e c a s e of 3 « H S D H , t h e c o f a c t o r ( N A D ) is g r a f t e d a t t h e a c t i v e site level of t h e e n z y m e a n d r e g e n e r a t e d using a n e l e c t r o n c a r r i e r . I n t h e c a s e of s t e r o i d s h y d r o x y l a t i o n t h e i m m o b i l i z a t i o n of whole m i c r o o r g a n i s m s is i n t e r e s t i n g b e c a u s e it allows t h e c o f a c t o r r e g e n e r a t i o n .

Materials

and

methods

3ot-hydroxy steroid dehydrogenase (SIGMA, Pseudomonas testosteroni) was immobilized with an artificial protein membrane. Membrane production was done by a previously described crosslinking method (LEGOY et al. 1980). Enzyme activity, in the absence of cofactor regeneration was spectrophotometrically measured at 340 nm in a 0.05 M barbital buffer, pH 9.5, solution containing 2.3 • 10 '! M of NAD. For both native and immobilized enzymes to start the reaction the 3.5 • 1 0 - 4 M androsterone solution in methanol was added in the cuvette. In the presence of cofactor regeneration, 3