Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie: Band 23, Heft 1 [Reprint 2021 ed.] 9783112565988, 9783112565971

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ZEITSCHRIFT FÜR ALLGEMEINE MIKROBIOLOGIE AN INTERNATIONAL JOURNAL ON MORPHOLOGY, PHYSIOLOGY, GENETICS, AND ECOLOGY OF MICROORGANISMS HEFT I • 1983 BAND 23

AKADEMIE-VERLAG • BERLIN ISSN 0044-2208

Z. Allg. Mikrobiol., Berlin 28 (1983) 1, EVP 2 0 , - M

34112

Z E I T S C H R I F T FÜR A L L G E M E I N E VOLUME 23

MIKROBIOLOGIE

1983

NUMBER 1

CONTENTS OF NUMBER 1 Effects of temperature and pU on growth and oospore production of three water-borne Pythimn Utilization of glucose and n-alkanes during citric acid synthesis by Saccharomycopsis lipolytica Lytic enzyme activity inautolysing mycelium of Asi>ergilhts niger

3

H . M . M . EL-SHAKO UN Y

D . FBANKE-RINKEU, E . NÓCKEL,

PORTNOWA

U . BEHHENS,

C U . FORNEK

and

A.

9

R . LAHOZ, F U E N S A N T A R E Y E S , P . G OMES a n d M . J . MARTÍNEZ

17

S . KRETSCHMEB a n d H . - E . JACOB

27

Short Notes

Autolysis of Therinoactinomyces vulgaris spores lacking carbon dioxide during germination Influence of oxygeneous (^-compounds on the growth of methane-assimilating bactcria

J . D . SCHNEIDER,

K . - D . WEND-

LANDT, E . BRÜHL a n d G . MIRSCHEL

33

H . WEIDE

37

Review

Microbial utilization of mixed substrates Book

Reviews

71

ZEITSCHRIFT FÜR ALLGEMEINE MIKRO - BIOLOGIE

H E R A U S G E G E B E N VON

F. Egami, Tokio G. F . G a u s e , M o s k a u 0 . Hoffmann-Ostenhof, Wien A. A . I m s e n e c k i i , M o s k a u R. W. Kaplan, Frankfurt/M. F . M a c h , Greifswald 1. Malek, P r a g C. W e i b u l l , L u n d

u n t e r der Chefredaktion von

AN

INTERNATIONAL

JOURNAL

ON

W. Schwartz, Braunschweig

MORPHOLOGY. PHYSIOLOGY. GENETICS.

und

A N D ECOLOGY OF MICROORGANISMS

U. Taubeneck, J e n a

U N T E R M I T A R B E I T VON

J . H. Becking, Wageningen H. Böhme, Gatersleben M. G i r b a r d t , J e n a S. I . K u s n e c o v , M o s k a u O. N e c a s , B r n o C. H . O p p e n h e i m e r , P o r t A r a n s a s N. Pfennig, Göttingen I . L. R a b o t n o v a , M o s k a u A. S c h w a r t z , W o l f e n b ü t t e l

REDAKTION

U. M a v , J e n a

BAND 2 3 • 1983- HEFT 1

AKADEMIE-VERLAG

BERLIN

Die Zeitschrift f ü r Allgemeine Mikrobiologie soll dazu beitragen, Forschung und internationale Zusammenarbeit auf dem Gebiet der Mikrobiologie zu fördern. Es werden Manuskripte aus allen Gebieten der allgemeinen Mikrobiologie veröffentlicht. Arbeiten über Themen aus der medizinischen, landwirtschaftlichen, technischen Mikrobiologie und aus der Taxonomie der Mikroorganismen werden ebenfalls aufgenommen, wenn sie Fragen von allgemeinem Interesse behandeln. Zur Veröffentlichung werden angenommen: Originalmanuskripte, die in anderen Zeitschriften noch nicht veröffentlicht worden sind und in gleicher Form auch nicht in anderen Zeitschriften erscheinen werden. Der Umfang soll höchstens l x / 2 Druckbogen (24 Druckseiten) betragen. Bei umfangreicheren Manuskripten müssen besondere Vereinbarungen mit der Schriftleitung und dem Verlag getroffen werden. Kurze Originalmitteilungen über wesentliche, neue Forschungsergebnisse. Umfang im allgemeinen höchstens 3 Druckseiten. Kurze Originalmitteilungen werden beschleunigt veröffentlicht. Kritische Sammelberichte und Buchbesprechungen nach Vereinbarung mit der Schriftleitung.

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Zeitschrift f ü r Allgemeine Mikrobiologie

1

23

1983

3-7

(Hygiene Institute, Innsbruck University, Innsbruck, Austria)

E f f e c t s of temperature and p H on growth and oospore production of three water-borne Pythium H . M. M. EL-SHAROUNY

(Eingegangen

am 7.

4.1982)

Temperature and p H significantly affect the growth and oospore production of the test fungi. The optimum temperature for mycelial production was nearly the same on both solid and liquid media. H-ion concentration has milder effect t h a n temperature. The optimum temperature and p H value for oospore production agree remarkably with their respectives for growth. T h e r e is n o d o u b t t h a t e n v i r o n m e n t a l c o n d i t i o n s e x e r t s a p r o f o u n d e f f e c t u p o n g r o w t h a n d r e p r o d u c t i o n of m i c r o o r g a n i s m s . T h e f u n g i a s a l a r g e g r o u p of t h e s e o r g a n i s m s p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n t h e f o r m a t i o n a n d d e s t r u c t i o n of n u m e r o u s n a t u r a l p r o d u c t s i n soil a n d w a t e r . M e a g r e i n f o r m a t i o n is a v a i l a b l e r e g a r d i n g t h e e f f e c t of c e r t a i n environmental factors such as temperature, p H , oxygen, moisture, a n d carbon source o n t h e g r o w t h a n d r e p r o d u c t i o n of s o i l - b o r n e Pythium (COCHRANE 1 9 5 8 , D E V E R A L L 1 9 6 5 , H A S K I N S 1 9 6 5 , CANT 1 9 7 1 , A D A M S 1 9 7 1 , F L O W E R S a n d L I T T R E L L 1 9 7 2 , L U M S D E N

et al. 1 9 7 5 , H A N C O C K 1 9 7 7 , a n d E L - S H A R O U N Y 1 9 8 0 , a n d b y m a n y o t h e r s ) . H o w e v e r , l i t t l e i n f o r m a t i o n is a v a i l a b l e c o n c e r n i n g t h e e f f e c t of e n v i r o n m e n t s o n g r o w t h a n d r e p r o d u c t i o n of w a t e r - b o r n e Pythium. B e c a u s e of t h i s f a c t , t h i s i n v e s t i g a t i o n w a s u n d e r t a k e n t o d e t e r m i n e t h e i n f l u e n c e of t e m p e r a t u r e a n d p H o n g r o w t h a n d o o s p o r e f o r m a t i o n of t h r e e w a t e r - b o r n e Pythium, n a m e l y Pythium torulosum COKER a n d P A T T E R S O N , P. catenulatum M A T H E W S , a n d P. butleri SUBRAMANIAN.

Materials

and

methods

Pythium torulosum C O K E R and P A T T E R S O N , P. catenulatum M A T H E W S , and P. butleri S U B R A have been isolated before ( E L - S H A R O U N Y and T I E F E N B R U N N E R , unpublished) from the river Inn (Innsbruck-Austria), and were maintained on corn meal agar (CMA). Identity of the cultures was confirmed periodically throughout the study. At first the investigation involved measuring growth as indicated by increases in colony diameter. Petri dishes containing 15 ml of potatoe-dextrose agar (PDA), and gallic acid medium (GAM) were inoculated with a 5 mm agar-mycelium disc from the margin of a 48-hr-old culture. Triplicate cultures of each fungus were incubated at 5 degree intervals between 5 and 45 °C. Colony diameters were measured a t 12-hr intervals. The second part of the investigation involved assessment of growth on the basis of dry weight of mycelium produced in glucose yeast extract (GYE) liquid medium (1.0% glucose and 0.2 % yeast extract) under varying temperature and p H conditions. The liquid medium was adjusted to p H 4.0. 5.5. 5.6, 7.5, and 9 with 0.1 N HC1 or 0.1 N XaOH, and was dispensed in 95 ml portions in 250-ml E R L E N J I E Y E R flasks and sterilized. The inoculum consisted of 10 agar-mycelium discs (5 mm) from the margin of growing cultures added to 25 ml of the G Y E medium and blended for 30 sec in a sterilized metal Waring Blender J a r . Five ml of this suspension were added to media at each p H and incubated at 20, 25 or 30 °C for 48 hr. Cultures at each pH-temperature treatment were blended as previously described, and 5 ml of the suspension from each treatment were used to inoculate additional media of the same p H and temperature treatment. After 24, 48 and 72 hr, mycelium from 2 flasks a t each p H level JIAXIAN

1»

4

H . M . M . EL-SHAKOUNY

and each temperature was harvested by filtration in a BUCHNER funnel on pre-weighed WHATMAN No. 2 filter paper. The mycelial pad was washed with distilled water, dried in a forced air oven at 80 °C for 48—72 hr, and the dry weight was determined. Mycelial fragments taken from each culture were microscopially examined for abundance of the oospores at different temperatures and pH levels.

Results

and

discussion

E f f e c t of t e m p e r a t u r e Colony diameters studies on P D A , CMA and on GAM (Fig. 1) revealed t h a t the three species of Pythium grew well in the 2 0 — 3 0 °C range with the m a x i m u m increase in colony diameter occurring between 2 5 — 3 0 °C when compared at a specific temperature, Pythium torulosum produced significantly the largest colonies among all the test fungi. The optimum temperature for radial growth of the three species varied slightly, depending on the type of medium. T h e optimal growth for P. torulosum and P. proliferum recorded at 25 °C, thus on both P D A and CMA, while on GAM the optimal radial growth was observed at 30 °C for both P. torulosum and P. undulatum and

Fig. 1. Average increase in colony diameter of Pythium species grown on PDA (®), CMA (O), and GAM ( x) over a wide temperature range

Oospore production of water-borne

Pythium

5

F i g . 2. Dry woig':ht of mycelium (mg) of three l'ythium species grown 4S his oil ( ! Y K broth at .'! temperatures and 3 pH levels (significant at 1 ° 0 level)

6

H. M. M. EL-SHAROUNY

at 20 °C for P. proliferum. The later Pythium grew optimally at 30 °C on both P D A and CMA. The three species of Pythium produced dense, superficial colonies on P D A a n d C M A , a n d d i f f u s e s u b m e r g e d c o l o n i e s o n G A M . MIDDLETON ( 1 9 4 3 ) , HALPIN et al.

(1952) and CANT (1971) have reported similar growth pattern for these fungi. As expected, mycelial dry weight determinations show that the greatest amount of dry mycelium was collected at 25 °C for P. torulosum and P. proliferum and recorded at 30 °C for P. proliferum. MANDELS (1965) found that a correlation does not always occur between colony diameter and actual amount of mycelium. E f f e c t of p H Effect of pH of the medium on mycelial production of the three Pythium species was tested on pH ranges from to 4 to 9. Within the ranges studied, our results indicate that pH has less effect on growth than temperature supporting the result found by CANT (1971). However, little variations in dry weight occurred among initial pH levels. For example, no growth was observed at pH 4, and pH 5.5 or pH 9 were the least favourable pH for mycelial production by all fungi at each temperature. The optimum growth for all the test fungi was in the 6.5—7.5 range and this was no surprising result, since these fungi were isolated from fresh water samples (pH range f r o m 6 . 8 - 7 . 6 ) ( F i g . 2 a n d T a b l e 1). Table 1 Mean 1 ) number of oospores per-high power (H.P.) field of Pythium species grown at various p H levels at 2 0 , 25 and 30 °C on G Y E medium 5.5 Species

Pythium Pythium Pythium

torulosum catenulatum butteri

20

6.5

7.5

9.0

25

30

20

25

30

20

25

30

20

25

30

1.2 ; 1.0 0 . 6 ! 1.0 3.2 1 2.6

0.8 0.4 1.6

5.2 2.3 8.1

4.8 2.2 7.8

4.7 2.0 7.9

5.4 2.4 8.5

4.7 2.3 7.6

4.5 2.2 7.1

5.7 2.5 8.2

4.9 2.3 7.4

4.4 1.9 7.8

Mean of five replicates

Mycelium samples picked from cultures grown at pH ranges from 5.5 to 9.0 scanned for reproduction organs indicated that hydrogen ion concentration did not significantly change the rate of oospore production at levels between pH 6.5 and 7.5, thus s u p p o r t i n g t h e f i n d i n g o f AL-HASSAN a n d F E R G U S ( 1 9 6 9 ) . T h e y c o n c l u d e d t h a t

the

H-ion concentrations that allowed good germination of oospores were the same that allowed good growth of mycelium. On the other hand the least numbers of oospores were observed at pH 5.5 and 9, considering the effect of temperatures, all the test fungi produced high numbers of oospores between 20 °C and 25 °C. These cardinal temperatures for oospore production agree remarkably well with cardinal temperatures of growth for these fungi.

A

cknowledgements

The author is grateful to Prof. Dr. MOSER, Head of Microbiology Institute and Dr. TIEFENBRUNNER, Hygiene Institute, Innsbruck, University, for their valuable help.

Oospore production of water-borne Pythium

1

References ADAJIS, P. B., 1971. Pythium avhanidermatum oospore germination as affected by time, temperature and pH. Phytopathology, 61, 1149 — 1150. AL HASSAN, K. K. and FERGUS, C. L., 1969. Oospore production of Pythium artorogus. Mycopath. et My col. Appl., 39, 273—286. CANT, H. F. and DOWLER, W. M., 1971. Effects of temperature and pH on growth and composition of Pythium irreguläre and Pythium, vexans. Mycologia, 03, 31 — 37. COCHRANE, V. W., 1958. Physiology of Fungi. J . Wiley & Sons, Inc., New York. 524 p. DEVERALL, B. J., 1965. The physical environment for fungal growth. I. Temperature, pp. 543—550. In: G. C. AINSWORTH and A. S. SUSSMAN (ed.), The Fungi. Vol. I : The Fungal Cell. Academic Press, New York. EL-SHAROTTNY, H. M. M., 1980. Root-infecting fungi with special reference to Pythium. Ph. D. Thesis, Faculty of Science, Assiut University, Egypt. FLOWERS, R. A. and LITTRELL, R. H., 1972. Oospore germination of Pythium aphanidexmatum as affected by casein, gallic acid, and pH levels in a selective medium. Phytopathol., 62, 757 (Abstr.). HALPIN, J . E . , HAUSON, E . W . a n d DICKSON, J . W . , 1952. S t u d i e s o n t h e p a t h o g e n i c i t y of s e v e n

species of Pythium on Red clover seedlings. Phytopathology, 42, 245—249. HASKINS, R. fi., 1965. Sterols and temperature tolerance in the fungus Pythium. Science, 150, 1615-1616. HANCOCK, J. G., 1977. Factors affecting soil populations of Pythium ultimum in the san Joaquin Valley of California, Hilgardia, 45, 107-122. HANDELS, G . R . , 1965. K i n e t i c s of f u n g a l g r o w t h , p p . 5 9 9 — 6 1 2 . I n : G . C. AINSWORTH a n d A . S .

SUSSMAN (ed.), The Fungi. Vol. I: The Fungal Cell. Academic Press, New York. MIDDLETON, J. T., 1943. The taxonomy, host range, and geographic distribution of the genus Pythium. Mem. Torrey Bot, Club, 20, 1 — 171. LUJISDEN, R. D., AYERS, W. A. and Dow, R. L., 1975. Differential isolation of Pythium species from soil by means of selective media, temperature, and pH. Canad. J. Microbiol., 21, 606—612. Mailing address: Dr. H. M. M. EL-SHAROUNY Botany Department, Faculty of Science, Assiut University Assiut, Egypt

Zeitschrift f ü r Allgemeine Mikrobiologie

23

1

1983

9-16

(Institut f ü r technische Chemie der Akademie der Wissenschaften der D D R , Leipzig, Direktor: Prof. Dr. sc. nat. M. RINGPFEIL)

Gemeinsame Verwertung v o n Glucose und n-Alkanen bei der Citronensäuresynthese durch Saccharomycopsis lipolytica D . F R A N K E - R I N K E R , U . B E H R E N S , E . NÜCKEL, CII. FORNER u n d A . PORTNOWA

(Eingegangen

am 27. 5. 1982)

Fermentations for the overproduction of citrate and isocitrate with S. lipolytica in media containing both glucose and M-alkanes as mixed C-source have been performed. Biomass and product yields strongly depend on the C-source of the inoculation culture. If the inoculation culture had been taken from media containing glucose as sole C-source b o t h glucose and Ji-alkanes were utilized for cell growth in the main culture whereas only glucose was utilized if the inoculation medium contained only m-alkanes. For idiophasic citrate and isocitrate production both glucose and Ji-alkanes were consumed independently of the C-source of the inoculum b u t t h a t C-source was preferentially utilized which hasbeen the C-source of the inoculation culture. These findings are reflected by the activities of the isocitrate lyase and the pyruvate carboxylase, respectively. In S. lipolytica both anaplerotic pathways are coexisting b u t the C-source of the inoculation culture determines the level of the specific activities even if the ratio of the cell-mass of the inoculum to the cell-mass of the main culture at the end of the growth phase is about 1:35.

Bei der Überproduktion von Citronen- und Isocitronensäure durch Saccharomycopsis (Candida) lipolytica in Medien mit einer gemischten C-Quelle aus Glucose und ?i-Alkan wird von B E H R E N S et al. ( 1 9 7 8 ) die gleichzeitige N u t z u n g beider Substrate nachgewiesen. E s erhebt sich die Frage, wie sich die spezifischen A k t i v i t ä t e n der E n z y m e der C4Nachlieferung — Isocitratlyase f ü r den Paraffinstoffwechsel, Pyruvatcarboxylase f ü r den Glucosemetabolismus ( F R A N K E - R I N K E R et al. 1 9 8 3 ) — bei gleichzeitiger Gabe beider Substrate verhalten. Die Repression der E n z y m e des Glyoxylatzyklus durch Glucose wird von K O R N B E R G ( 1 9 5 9 ) beschrieben und ist häufig bestätigt worden ( H O W E S U. M C F A D D E N

1962).

Über die Abhängigkeit der Höhe des Niveaus der P y r u v a t c a r b o x y l a s e von der angebotenen C-Quelle sind die Befunde in der L i t e r a t u r sehr widersprüchlich. R u i z A M I L et al. ( 1 9 6 5 ) zeigen f ü r verschiedene Hefen, daß die spezifische Aktivität der Pyruvatcarboxylase zwar bei Angebot von Glucose oder P y r u v a t als C-Quelle maximale Werte erreicht, aber auch bei Angebot von Malat, A s p a r t a t oder Acetat noch eine hohe spezifische Aktivität zu verzeichnen ist. Zu ähnlichen Ergebnissen kommen auch W E S S E L O W et al. ( 1 9 7 4 ) , die eine gleich hohe A k t i v i t ä t der Pyruvatcarboxylase in Zellextrakten von Candida-Heien bei der Züchtung auf w-Alkanen und Glucose finden. Dagegen weisen K O R N B E R G ( 1 9 6 6 ) und H I G A et al. ( 1 9 7 6 ) darauf hin, daß nur unter den Wachstumsbedingungen, f ü r die die anaplerotische F u n k t i o n der P y r u v a t c a r b o x j l a s e essentiell ist (z.B. Glucose oder P y r u v a t als C-Quelle), hohe P y r u v a t c a r boxylaseaktivitäten zu finden sind. Die Pyruvatcarboxylase soll durch Pj^ruvat oder einen mit P y r u v a t in Verbindung stehenden Metaboliten induziert werden und nicht der Repression durch Succinat oder eine andere C 4 -Verbindung unterliegen (SCRUTTON u. T A Y L O R 1 9 7 4 ) . Neben der Reprimierung der E n z y m e des Glyoxylatzyklus durch

10

D . F R A N K E - R I N K E R , U . BEHRENS, E . NÖCKEL, CH. FORNER u n d A . PORTNOWA

Glucose bzw. ihre Abbauprodukte wird auch die lleprimierung der Enzyme des Alkanabbaus in der Literatur beschrieben (DALHOFF U. KEIIM 1976). Beim Wachstum von Candida lipolytica wird nach Untersuchungen von JWANNY et al. (1974) festgestellt, daß aus einem Gemisch von Glucose und Hexadecan Glucose zuerst utilisiert wird. Erfolgt das Wachstum jedoch zunächst in einem Hexadecan-Mediuni und wird später Glucose zugesetzt, werden beide Substrate gleichzeiti gabgebaut. Ist Glucose zu Beginn des Wachstums die alleinige C-Quelle und wird Hexadecan später zugegeben, so wird Hexadecan nach einer Induktionsphase gemeinsam mit Glucose abgebaut. Beim Wachstum von Nocardia salmonicolor in einem Medium mit Glucose und Acetat werden beide Substrate gemeinsam abgebaut, die Induktion der Isocitratlyase wird durch Glucose nicht verhindert (SARIASLANI etal. 1975). Acinetobacter S^ecies assimilieren Acetat und Succinat zur gleichen Zeit, die spezifische Aktivität der Isocitratlyase ist nur um 25% geringer als beim Wachstum auf Acetat als alleinige C-Quelle (BELL U. HERMAN 1 9 6 7 ) . SUOMALAINEN U. ODRA (1978) u n t e r s u c h e n d i e I s o c i t r a t -

lyase-Aktivität von Saccharomyces cerevisiae in aeroben Kulturen mit Gemischen aus Glucose und Äthanol und kommen zu dem Schluß, daß Äthanol im wesentlichen f ü r den katabolen, energieliefernden Stoffwechsel verbraucht wird. Bei der Citronensäuresynthese mit Saccharomycopsis lipolytica in Medien mit Glucose als alleinige C-Quelle wird eine im Gegensatz zu Paraffin als C-Quelle stark reprimierte Aktivität der Isocitratlyase in der Wachstumsphase nachgewiesen, die beim Übergang zur Produktionsphase erlischt. Ähnlich wird bei Paraffin als alleinige CQuelle im Gegensatz zu Glucose als C-Quelle nur eine geringe Pyruvatcarboxylaseaktivität gemessen (FRANKE-RINKER 1982). Die Auswirkung der Verwertung zweier Substrate, die unterschiedliche anaplerotische Wege des Tricarbonsäurezyklus benötigen, auf die spezifischen Enzymaktivitäten der C 4 -Nachlieferung wird in vorliegender Arbeit am Beispiel des Wachstums und der Überproduktion von Citrat und Isocitrat bei Saccharomycopsis lipolytica untersucht.

Material

and, Methoden

Mikrobiologische Methoden: S t a m m : Saccharomycopsis (Candida) lipolytica E H 59 (Sammlung I n s t i t u t f ü r technische Chemie, Leipzig). K u l t i v i e r u n g : Mineralsalzmedium mit Thiamin-Zusatz wie von B E H R E N S et al. (1977) beschrieben. Als C-Quelle f ü r die I m p f k u l t u r wurden 50 g/1 Glucose bzw. 30 g/1 P a r a f f i n u n d f ü r die Fermentationen ein Gemisch aus 100 g/1 M-Paraffin u n d 100 g/1 Glucose verwendet. F e r m e n t a t i o n : 16-1-Laborfermentor mit 7 1 Füllvolumen, aseptischer Betrieb bei p H 5,0. 30 °C u n d 1,7 1 L u f t / 1 • min. Die Biomasse-Menge f ü r die Produktionsphase wurde durch die N-Quelle auf etwa 8 g/1 (50% Rohprotein) eingestellt. E n z y m b e s t i m m u n g e n : Zu den im T e x t angegebenen Zeiten wurden etwa 200 ml Probe entnommen u n d sofort bei 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wurde f ü r die Analyse der gelösten Substrate u n d Metabolite verwendet. Der Zellaufschluß u n d die Aktivitätsbestimmungen der CS, ACH, NAD- u n d N A D P - I C D H , ICL u n d PC erfolgten wie bereits von B E H R E N S et al. (1977), F R A N K E - R I N K E R U. B E H R E N S (1979) u n d F R A N K E - R I N K E R et al. (1983) beschrieben. Die spezifischen Aktivitäten stellen Mittelwerte aus mindestens 3 F e r m e n t a t i o n e n dar. Die Angabe des mittleren absoluten Fehlers erfolgt n u r dann, wenn mindestens 5 Parallelversuche vorlagen. Bestimmung der Substrate u n d Metabolite: Glucose, Ammonium-Ion, Citronen- plus Isocitronensäure (Gesamtsäure) wie bereits beschrieben von B E H R E N S et al. (1977), F R A N K E - R I N K E R U. B E H R E N S (1979) u n d F R A N K E - R I N K E R et al. (1983). Die Biomassekonzentration wurde aus der Menge des v e r b r a u c h t e n N H 4 - N berechnet (N • 6,25 - 2 ; da der Rohproteingehalt der Biomasse mit 5 0 % b e s t i m m t wurde). Die Ausbeutekoeffizienten (Y) wurden ausschließlich auf die verb r a u c h t e Menge des Glucose-Anteils bezogen, der P a r a f f i n v e r b r a u c h blieb unberücksichtigt. Abkürzungen: /t(h _ 1 ) spezifische W a c h s t u m s r a t e , 7i(h _I ) spezifische Produktbildungsrate, Y Ausbeutekoeffizient, X (g • l" 1 ) Biomasse, 8 (g • 1 _ I ) Glucose, P (g • l - 1 ) P r o d u k t (Citrat plus Isocitrat),

Citronensäuresynthese durch

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Saccharomycopsis

CS Citratsynthase (E.C. 4.1.3.7.), ACH Aconitathydratase (E.C. 4.2.1.3.), NAD-abhängige (E.C. 1.1.1.41.) und NADP-abhängige (E.C. 1.1.1.42.) ÏCDH Isoeitratdehydrogenase, ICL Isocitratlyase (E.C. 4.1.3.1.), PC Pyruvatcarboxylase (E.C. 6.4.1.1.). Ergebnisse

E i n f l u ß der I m p f k u l t u r — G l u c o s e als C-Quelle I n Tabelle 1 sind die Veränderungen der spezifischen E n z y m a k t i v i t ä t e n in der Tropho- und Idiophase von Citrat, Isocitrat überproduzierenden Kulturen mit Glucose plus P a r a f f i n als C-Quelle aufgeführt, die mit Vorkulturen angeimpft wurden, die als einzigste C-Quelle Glucose enthielten. Aus der W a c h s t u m s k u r v e wurde nach halblogarithmischer Darstellung die spezifische W a c h s t u m s r a t e ¡j, = 0,27 h _ 1 ermittelt. Die Ausbeute Y X is (g/g) wurde f ü r den Bereich der logarithmischen Phase ermittelt — die Probenahme f ü r die analytische Bestimmung erfolgte bei einem Gehalt NH 4 -N = 145 mg • 1 _1 . Sie wurde ausschließlich auf den Verbrauch von Glucose bezogen und beträgt Y = 0,73. Die Produktbildungsrate 7r(h _1 ) wurde ermittelt, indem die pro Zeiteinheit (h _ 1 ) gebildete Menge P r o d u k t (g/1) (Citronen- plus Isocitronensäure) auf die in derTropophase gebildete Biomasse (g/1) bezogen wurde und beträgt f ü r die 0. —13. h Idiophase 0,22 h _ 1 , 13.—33. h Idiophase 0,20 h" 1 u n d 3 3 . - 3 8 . h Idiophase 0,10 h" 1 . Die Ausbeute Y pjs (g/g) wurde ausschließlich auf den Verbrauch von Glucose bezogen und beträgt f ü r die 0. —13. h Idiophase 1,55; 13.—33. h Idiophase 1,5 und 3 3 . - 3 8 . h I d i o p h a s e 1,12. Tabelle 1 Einfluß der Vorkultur — Glucose als C-Quelle. Die Hauptkultur enthält Glucose 100 g/1 und Paraffin 100 g/1. Das Überimpfungsverhältnis beträgt 1:35. Spezifische Aktivität (¡j.mol • min (mg • l-i)

Animpfbiomasse 600* 360 250 210 145 130 107 40 25

(h) 9 33

ICL

PC

ACH

1

• mg

1

Protein)

NAD-ICDH

NADP-ICDH

Trophophase : 0,019 ±0,002 —

0,047 ±0,004 —

0,165 ±0,016 —

0,040 0,039 0,040 0,039 0,040 ±0,001 0,038 0,039 0,040 ±0

0,018 0,018 0,018 0,030 0,031 ±0,001 0,035 0,035 0,034 ±0,001

0,017 0,020

0,039 0,035

0,089 ±0,001 —

0,132 ±0,021 —

0,210 0,170 0,200 0,200 0,200 ±0 0,170 0,190 0,200 ±0 Idiophase

0,042 0,043 0,045 0,044 0,040 ±0 0,036 0,033 0,036 ±0,001

0,140 0,140 0.140 0,150 n. b. 0,180 0,180 0,177 ±0,005

0,170 0,150

0,013 0,023

0,060 0,060

Beginn der Feimentation

E i n f l u ß d e r I m p f k u l t u r — P a r a f f i n als C-Quelle I n den Tabellen 2 und 3 sind die Veränderungen der spezifischen E n z y m a k t i v i t ä t e n in der Tropho- und Idiophase von Citrat, Isocitrat überproduzierenden K u l t u r e n mit Glu-

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D. F b a n k e - R i n k e r , U. B e h e e n s , E. N ö c k e l , Ch. F o b n e b und A. P o e t n o w a Tabelle 2

E i n f l u ß der Vorkultur — P a r a f f i n als C-Quelle. Die H a u p t k u l t u r enthält Glucose 100 g/1 und P a r a f f i n 100 g/1. Das Überimpfungsverhältnis beträgt 1: 35. NH 4 -N-Gehalt des Mediums (mg • l-i)

Animpfbiomasse 580* 300 230 190 125 100 10

Spezifische Aktivität (umol • min ICL

ACH

PC

1

• mg

1

Protein)

NAD-ICDH

NADP-ICDH

0,035 ±0,009

0,136 ±0,023

Trophophase 0,202 ±0,018 —

0,012

0,324 ±0,023

—

0,059 ±0,001 0,058 0,057 ±0 0,059 0,059 0,059 ±0,001

—

0,018 ±0,001 0,019 0,021 ±0,001 0,020 0,022 0,023 ±0,001

—

0,0192 ±0,028 0,190 0,185 ±0,007 0,200 0,220 0,188 ±0,008

—

0,037 ±0,001 0,039 0,039 -1-0 0,040 0,040 0,044 ±0,001

0,145 -L0,001 0,150 0,153 ±o 0,140 0,140 0,143 ±0,003

* Beginn der Fermentation Tabelle 3 E i n f l u ß der V o r k u l t u r — P a r a f f i n als C-Quelle. Die H a u p t k u l t u r enthält Glucose 100 e/1 und P a r a f f i n 1C0 g/1. Das Überimpfungsverhältnis beträgt 1:10. NH 4 -N-Gehalt des Mediums (mg • I"')

Animpfbiomasse 600* 130 35 10

Spezifische Aktivität (,umol • min ICL

PC

1

• mg

1

Protein)

ACH

NAD-ICDH

NADP-ICDH

0,324 ±0,023

0,035 ±0,009

0,136 ±0,023

Trophoph a se 0,202 ±0,018 —

0,080 0,080 0,080

0,012 —

—

0,018 0,018 0,018

—

—

0,190 0,190 0,220

0,039 0,040 0,039

0,140 0,140 n. b.

0.220 0,120 0,120

0,018 0,018 0,023

0,100 n. b. 0,039

Idiophase (h) 9 33 57

0,054 0,020 0,020

0,024 0.012 0,012

* Beginn der Feimentation ose p l u s P a r a f f i n als C-Quelle a u f g e f ü h r t , die m i t V o r k u l t u r e n a n g e i m p f t w u r d e n , die als einzigste C-Quelle P a r a f f i n e n t h i e l t e n . A u s der W a c h s t u m s k u r v e w u r d e n a c h h a l b l o g a r i t h m i s c h e r D a r s t e l l u n g die spez i f i s c h e W a c h s t u m s r a t e [x = 0 , 2 6 h _ 1 e r m i t t e l t . D i e A u s b e u t e Y X / s (g/g) w u r d e f ü r d e n B e r e i c h der l o g a r i t h m i s c h e n P h a s e e r m i t t e l t — die P r o b e n a h m e f ü r die a n a l y t i s c h e B e s t i m m u n g e r f o l g t e b e i e i n e m G e h a l t N H 4 - N = 125 m g • 1 _ 1 . Sie w u r d e a u s schließlich auf d e n V e r b r a u c h v o n Glucose bezogen u n d b e t r ä g t Y = 0,4. A u s d e r W a c h s t u m s k u r v e w u r d e n a c h h a l b l o g a r i t h m i s c h e r D a r s t e l l u n g die spezif i s c h e W a c h s t u m s r a t e /x = 0 , 2 6 h _ 1 e r m i t t e l t . D i e A u s b e u t e Yx/s (g/g) w u r d e f ü r d e n B e r e i c h d e r l o g a r i t h m i s c h e n P h a s e e r m i t t e l t — die P r o b e n a h m e f ü r die a n a l y t i s c h e

Citronensäuresynthese durch Saccharomycopsis

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Bestimmung erfolgte bei einem Gehalt NH 4 -N = 130 mg • 1 _1 . Sie wurde ausschließlich auf den Verbrauch von Glucose bezogen und beträgt Y = 0,58. Die Produktbildungsrate ^ ( h - 1 ) wurde ermittelt, indem die pro Zeiteinheit (h _ 1 ) gebildete Menge P r o d u k t (g/1) (Citronen- plus Isocitronensäure) auf die in der Trophophase gebildete Biomasse (g/1) bezogen wurde und beträgt f ü r die 0.—20. h Idiophase 0,26 h _ 1 , 20.—33. h Idiophase 0,15 h _ 1 und 33. —60. h Idiophase 0,12 h _ 1 . Die Ausbeute Yp/sig/g) wurde ausschließlich auf den Verbrauch von Glucose bezogen und betrug f ü r die 0.—20. h Idiophase 2,62 und 20.—57. h Idiophase 4,35.

Diskussion M i s c h s u b s t r a t f e r m e n t a t i o n — B e i m p f u n g m i t auf G l u c o s e k u l t i v i e r t e n Zellen Die spezifische Wachstumsrate beträgt bei Vorlage von Mischsubstrat etwa 0,27 h" 1 und liegt hiermit in dem Bereich, wie er f ü r ein gutes Wachstum von Hefen ( M A R C I I A L et al. 1977 a u. b) sowohl auf P a r a f f i n als auch Glucose als alleinige C-Quelle ( F R A X K E B I N K E I I 1982) angegeben wird. Bei Mischsubstratfermentationen, die mit Glucose gezogenen Zellen beimpft wurden, beträgt die auf Glucose bezogene Ausbeute (Yx/s) f ü r das Wachstum der Biomasse, die aus dem N-Verbrauch ermittelt wurde, 0,73. B Y C I I T E R A et al (1977) geben f ü r Candida utilis bei reiner Glucoseverwertung Ausbeutekoeffizienten von 0,51 an. F ü r Saccharomycopsis lipolytica E H 59 werden Werte von etwa 0,35—0,4 ( B E H R E N S et al. 1978) gefunden. Der Ausbeutekoeffizient der Mischsubstratfermentation von 0,73 spricht daher f ü r eine gleichzeitige Verwertung von w-Alkanen f ü r das Biomassewachstum von Saccharomycopsis lipolytica bei Angebot eines Mischsubstrates von Glucose plus w-Alkanen. Die Mischsubstratverwertung hat beträchtliche Auswirkung auf die untersuchten E n z y m a k t i v i t ä t e n . Die spezifischen Aktivitäten unterscheiden sich von denen einer reinen Glucoseverwertung (Tab. 4). Die Aktivitäten der CS, ACH und ICL sind erhöht gegenüber den Aktivitäten bei reiner Glucoseverwertung, was f ü r den Ablauf des Glyoxylatzyklus in der Trophophase bei Angebot von P a r a f f i n plus Glucose spricht. Erniedrigt sind die Aktivitäten der NAD-abhängigen 1CDH und der PC. Die niedrige A k t i v i t ä t der N A D - 1 C D H k ö n n t e man mit einer verminderten Oxidation durch den Tricarbonsäurezyklus erklären, da durch die gleichzeitige Assimilation von Glucose plus Paraffin, durch die Schritte bis zum Acetyl-Coenzym A, bereits Energie bereitgestellt wird ( M A R C I I A L et al. 1977a). Die geringe spezifische Aktivität der PC läuft parallel mit einer nur geringen A u f n a h m e von Glucose (FORNER, 1981). Mit dem Ansteigen des Glucoseverbrauchs zum E n d e der logarithmischen Wachstumsphase steigt auch die Aktivität der PC an. E s k a n n nur vermutet werden, daß die Höhe der Aktivität der PC durch das Angebot an I V r u v a t reguliert wird ( S C R U T T O N U. T A Y L O R 1974). Durch den Paraffinanteil des Mischsubstrates k o m m t es zu einer signifikanten Erhöhung der spezifischen Aktivität der ICL, eventuell begünstigt durch einen niedrigeren Oxalacetatspiegel der Zelle (niedrige A k t i v i t ä t der PC), so daß bei W a c h s t u m von S. lipolytica bei Angebot von Glucose plus P a r a f f i n wahrscheinlich beide anaplerotischen Wege, Glyoxylatzyklus plus C 4 -Nachlieferung durch die PC, genutzt werden, wenn auch in vermindertem U m f a n g als bei einzelner Gabe der entsprechenden CQuellen, was sich in geringeren spezifischen Aktivitäten der ICL und PC ausdrückt. Eine gewisse „Austauschbarkeit" bzw. wechselseitige Ergänzung von heterotropher C0 2 -Fixierung u n d Glyoxylatzyklus wird auch von W E S S E L O W (1974) beschrieben. Nach dem logarithmischen W a c h s t u m fällt die spezifische Aktivität der ICL ab und ist etwa 70% geringer als bei P a r a f f i n als alleinige C-Quelle bei vergleichbaren spezifi-

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D . F R A N K E - R I N K E R , U . B E H R E N S , E . N Ü C K E L , C H . F O R N E R u n d A . PORT NOW A

Tabelle 4 Vergleich von spezifischen Enzymaktivitäten bei Kultivierung von Saccharomycopsis lipolytica auf unterschiedlichen C-Quellen nach Beimpfung mit auf Glucose bzw. auf »-Paraffin kultivierten Vorkulturen. Die Vorkulturen, jeweils nur eine C-Quelle, wurden am Ende der logarithmischen Phase im Verhältnis 1 : 1 0 in die Hauptkulturen überimpft

Enzym (spez. Akt. jimol • m i n - 1 • m g - 1 Protein) Trophophase CS ACH NADP-ICDH NAD-ICDH ICL PC

CS ACH NADP-ICDH NAD-ICDH ICL PC

Paraffin

C-Quelle Hauptkultur Mischsubstrat Mischsubstrat

Glucose

C-Quelle Vorkultur Paraffin

Paraffin

j

Glucose

Glucose

(Entnahme gegen Ende des log. Wachstums bei N H . - N ca. 1 9 0 - 1 3 0 mg/1) 1,000 0,455 0,380 n. b. ±0,260 ±0,049 ±0,071 0,324 0,190 0,190 0,165 ±0,021 ±0,023 ±0,016 0,136 0,140 0,178 0,132 ±0,023 ±0,032 ±0,021 0,035 0,025 0,039 0,089 ±0,015 ±0,001 ±0,009 0,080 0,036 0,019 0,202 ±0,018 ±0,003 ±0,002 0,012 0,018 0,031 0,047 ±0,004 ±0,001 0,547 ±0,025 0,164 ±0,030 0,077 ±0,012 0,015 ±0,009 0,094 ±0,015 0,002

Idiophase n. b. 0,220 0,100 0,018 0,054 0,024

0,345 ±0,007 0,155 ±0,031 0,063 ±0,004 0,032 ±0,006 0,021 ±0,004 0,036 ±0,003

0,200 0,089 ±0,015 0,057 ±0,005 0,038 ±0,005 0,006 0,046 ±0,005

sehen Produktbildungsgeschwindigkeiten. Auffällig ist das Ansteigen der PC-Aktivität beim Übergang von der Tropho- zur Idiophase um etwa 100°/o, so daß die Gesamtsumme an spezifischer Aktivität (ICL plus PC) beim Übergang zur Produktionsphase und zu Beginn der Produktbildungsphase, welche durch eine hohe spezifische P r o d u k t bildungsgeschwindigkeit gekennzeichnet ist, erhalten bleibt. Der auf Glucose bezogene Ausbeutekoeffizient von etwa 1,5 ist doppelt so hoch, wie er in Fermentationen mit Glucose als alleiniger C-Quelle gefunden wird und weist damit auf eine gemeinsame N u t z u n g von Glucose plus P a r a f f i n hin. Während bei Angebot von entweder Glucose oder P a r a f f i n die ICL bzw. PC in der Idiophase nicht mehr nachzuweisen sind, sind beide Enzyme bei Angebot des Mischsubstrates mit deutlicher Aktivität nachweisbar und bestätigen die gleichzeitige N u t z u n g von Glucose plus P a r a f f i n f ü r die CitratIsocitrat-Überproduktion. E s ist zu vermuten, daß die Keservepolysaccharid-Bildung bei Mischsubstratverwertung im Gegensatz zu reinen Paraffinfermentationen nicht über die Glukoneogenese verläuft, so daß die K a p a z i t ä t der ICL f ü r die Citronensäuren-Überproduktion voll wirksam werden kann.

Citronensäuresynthese durch

Mischsubstratfermentation,

Beimpfung Zellen

Saccharomycopsis

mit

auf P a r a f f i n

15 kultivierten

Bei Mischsubstratfermentationen mit auf Paraffin kultivierten Zellen als Impfmaterial werden in der Wachstumsphase auf Glucose bezogene Ausbeutekoeffizienten (Yxis) für die Biomassebildung zwischen 0,4 und 0,58 erzielt, was für eine alleinige Nutzung der Glucose für das Wachstum spricht. I S K E et al. (in Vorb.) stellen ebenfalls bei Einsatz von radioaktiv markiertem Paraffin bei Mischsubstratfermentationen (Paraffin plus Glucose) mit Saccharomycopsis lipolytica und Mischsubstrat gezogenen Zellen für die Beimpfung fest, daß weniger als 1 0 % der Biomasse aus Paraffin gebildet wird. Im Widerspruch dazu steht die Auswirkung des Paraffins auf die Höhe der spezifischen Aktivität der 1CL, die, abhängig vom Überimpfungsverhältnis (niedrigeres Überimpfungsverhältnis — geringere spezifische Aktivität) größer ist als bei Mischsubstratfermentationen mit auf Glucose kultivierten Zellen. Dagegen zeigen sich in der spezifischen Aktivität der PC während der logarithmischen Wachstumsphase keine Unterschiede. Dieser Befund kann nicht befriedigend erklärt werden. Offensichtlich erfüllt hier der Glyoxylatzyklus durch die geringe Aktivität der PC die anaplerotische Funktion für den Tricarbonsäurezyklus bei der Glucoseverwertung. Man kann vermuten, daß eventuell für die Mischsubstratfermentationen mit auf Glucose kultivierten Zellen während der Wachstumsphase das verbrauchte Paraffin bevorzugt für die Energiebereitstellung genutzt wird, wie S U O M A L A I N E N U. O U K A (1978) für Äthanol bei Kultivierung von Bäckerhefe in Glucose-Athanol-Gemischen vermuten. E i n f l u ß der C-Quelle d e r I m p f k u l t u r auf die M i s c h s u b s t r a t V e r w e r t u n g während der C i t r a t - I s o c i t r a t p r o d u k t i o n (Idiophase) I m Gegensatz zur Trophophase bestimmt die C-Quelle des Impfmaterials die bevorzugte Nutzung dieser C-Quelle in der Idiophase. Die auf Glucose bezogenen Ausbeuten sind bei Animpfung mit auf Paraffin kultivierten Zellen etwa 2,5fach höher als bei Animpfung mit auf Glucose kultivierten Zellen. Diese Tatsache spiegelt sich auch in den Enzymaktivitäten wider. Die ICL-Aktivität liegt bei den mit auf Paraffin kultivierten Zellen beimpften Mischsubstratkulturen deutlich höher, die PC-Aktivität steigt beim Übergang von der logarithmischen Wachstumsphase zur Idiophase dagegen nur um etwa 3 0 % an. Die Summe der spezifischen Aktivitäten der I C L und PC ist unabhängig von der C-Quelle der Impfkultur etwa gleich und charakteristisch für die Höhe der spezifischen Produktbildungsgeschwindigkeit am ersten Produktionstag. Mit dem Abfall der spezifischen Produktbildungsgeschwindigkeit sinken dann auch die spezifischen Aktivitäten der beiden Enzyme. Die Untersuchungen haben ergeben, daß bei S. lipolytica bei der Überproduktion von Citronensäuren mit dem Mischsubstrat Glucose plus Paraffin beide anaplerotische Wege des Tricarbonsäurezyklus existieren, wobei die spezifischen Aktivitäten der I C L und der PC geringer sind als bei Fermentationen mit Paraffin respektive Glucose als alleinige C-Quelle, jedoch als Summe diesen etwa entsprechen. Diese enzymatischen Untersuchungen bestätigen die analytischen Befunde von B E H I I E X S et al. (1978), daß für die Citrat-lsocitrat-Überproduktion mit Saccharomycopsis lipolytica und Glucose plus Paraffin beide Substrate gleichzeitig für die Produktsynthese genutzt werden. Von I S K E et al. (in Vorb.) wird durch Untersuchungen an Mischsubstratfermentationen mit S. lipolytica und Mischsubstrat (Glucose plus Paraffin) gezogenen Zellen für die Beimpfung durch Einsatz von radioaktiv markiertem Paraffin festgestellt, daß Glucose plus Paraffin gemeinsam in der Idiophase verwertet werden, Glucose aber hauptsächlich für die Keservestoffbildung und Paraffin dagegen für die Produktsynthese.

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D . F R A N K E - R I N K E R , U . B E H R E N S , E . NÜCKEL, CH. FORNER u n d A . POBTNOWA

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(Instituto "Jaime Ferran" de Microbiología, del Consejo Superior de Investigaciones Científicas, Madrid-6, Spain)

Lytic enzyme activity in autolysing mycelium of Aspergillus

niger

R . LAHOZ, FUENSANTA R E Y E S , P . GÓMEZ a n d M . J .

(Eingegangen am 10.

MARTINEZ

3.1982)

We have studied changes in the activity of some lytic enzymes contained in mycelium of Aspergillus niger in cultures relative to the autolytic phase of growth. Acid phosphatase, polygalacturonidase and «-amylase activity reached its highest level (40.7, and 8 U/sample, respectively) at the initiation of the autolytic phase of growth. 1,3-/?-Glueanase and /?-N-acetylglucosaminidase reached its highest level (3.5 and 2 U/sample, respectively) during the first days of autolysis. Alkaline phosphatase, cellulase, invertase, esterase, chitinase and proteolytic activity is also present in autolysing mycelium of A. niger, though comparatively low. Their maximum activity coincided with the beginning of the autolytic phase of growth. In all enzymes studied here, as autolysis proceeded, enzyme activity decreased by about 90%. Only esterase activity remained nearly constant throughout the whole period of autolysis described here.

Changes in lytic e n z y m e a c t i v i t y in f u n g a l mycelium relative to the a u t o l y t i c p h a s e of g r o w t h h a v e seldom been s t u d i e d over e x t e n d e d periods of incubation. T h u s , B R U N N E R et al. ( 1 9 7 1 ) working with Pénicillium chrysogenum observed t h a t excretion of proteinases into the culture fluid did n o t occur before m a r k e d autolysis h a d set in. Z O N N E V E L D ( 1 9 7 1 ) f o u n d t h a t 2 or 3 - d a y old p o s t - a u t o l y t i c cultures of Aspergillus nidulans showed m a x i m u m a c t i v i t y for /?-l,3-glucanase. T h e f u n g u s Humicola lanuginosa p r o d u c e d m a x i m u m amylase a c t i v i t y d u r i n g the a u t o l y t i c p h a s e "long a f t e r m a x i m u m mycelium was d e t e c t e d " ( B A R N E T T a n d F E R G U S 1 9 7 1 ) . Similarly, R E Y E S a n d B Y R D E ( 1 9 7 3 ) observed a s t e a d y increase in /3-N-acetylglucosaminidase a c t i v i t y in t h e culture fluid of Sclerotinia fructigena d u r i n g a u t o l y t i c periods of as long as 6 0 days. L A I I O Z et al. ( 1 9 7 6 ) described the time curves of the liberation of some lytic enzymes f r o m autolysing cultures of several fungi. A year later, R E Y E S et al. ( 1 9 7 7 ) described the release of ^-N-acetylglucosaminidase a n d chitinase d u r i n g autolysis of Neurospora crassa. R e c e n t l y , the a c t i v i t y a n d time curves of 1, 3-/S-glucanase in a u t o lysing c u l t u r e s of Schizophyllum commune were described b y R E Y E S et al. ( 1 9 8 0 ) . Finally, the p h e n o m e n o n of autolysis in f i l a m e n t o u s fungi was reviewed b y R I E M A Y a n d T R Ô G E R (1978a, b). N o t v e r y m a n y other r e p o r t s dealing w i t h lytic e n z y m e a c t i v i t y in autolysing m y celium of f i l a m e n t o u s f u n g i d u r i n g prolonged periods of time seem to h a v e been p u b lished. I n connection w i t h our own s y s t e m a t i c studies on the chemical, cytological a n d physiological changes in f i l a m e n t o u s f u n g i d u r i n g autolysis, we u n d e r t o o k a n investigation of a c t i v i t y changes in some lytic enzymes present in autolysing mycelium of Aspergillus niger cultures. Materials

and

methods

Organism and culture conditions: Aspergillus niger VAN TIEGHEM 120.49 was obtained from the Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn (Holland). It was grown in submerged cultures in litre capacity conical flasks, each containing 200 ml of a synthetic medium, consisting of the following mineral salts: X a X 0 3 2 g, KC1 0.5 g, FeS0 4 • 7 H 2 0 0.01 g, MgS0 4 • 7 H 2 0 0.5 g, K H 2 P 0 4 1 g, 2

Z. Allg. Mikrobiol., lid. 23, II. 1

18

R . LAHOZ, FUENSANTA R E Y E S , P . G6MEZ a n d M . J . MARTINEZ

CuS0 4 • 5 H 2 0 0.23 mg, ZnS0 4 • 7 H 2 0 1.10 mg, MnCI2 • 4 H 2 0 3.50 mg, distilled water to 1000 ml. Glucose (anhydrous) was used as the carbon source at a concentration of 20 g/1000 ml of medium, thereby obtaining a C/N ratio (atom/atom) of 28.0:1. Prior to sterilization, the medium thus prepared, was adjusted to pH 2.1 by the addition of concentrated HC1 using a BECKMAN pH meter (model zeromatic SS-3) with a BECKMAN no. 39501 combination electrode. This comparatively low initial pH of the culture medium was preferred to any other higher value in order to avoid A. niger growth in the form of pellets (GALBRAITH and SMITH 1960). The flasks were plugged with nonabsorbant cotton wool, and steam sterilized for three successive days, half an hour each day. The medium in each flask was inoculated with 1 ml of a spore suspension (25 X 10 6 spore/ml) in sterile distilled water from a 15-day-old culture of the fungus in malt-agar slopes. This spore concentration was determined using a SPENCER hemacytometer (model Bright-Line AO, Instrument Company Scientific Instrument Division, Buffalo, N.Y., U.S.A. 14215). The seeded flasks were incubated throughout these experiments in an orbital shaker (GALLENKAMP, model IH-400, London, England) at 200 rev/min and 30 °C, for a convenient length of time, generally a 15-day incubation period. Two samples of 100 ml each were taken at the same time, one to obtain the dry weight of mycelium, and the other to prepare the mycelium extract. Theses samples were taken 2, 3, 4, 7, 9, 11 and 14 days after inoculation. The mycelium was then separated from the culture fluid by filtration and the residual glucose in this culture fluid was estimated by the method of SOMOGYI (1945) in conjunction with that of KELSON (1944). Mycelium extraction: The mycelium was washed with distilled water and the enzymes extracted by the four methods described here: (a) grinding the mycelium with washed quartz sand (WOODHEAD and WALKER 1975); (b) mechanical hand grinding at —20 °C for 30 min; (c) breaking after (b) in an ultrasonic disintegrator (MSE, model MK2, 120 W), and (d) hand grinding after lyophilization (CARMINATTI and CABIB 1965). The resulting slurry was in all cases suspended in boratecitrate-phosphate buffer 0.1 M, pH 5.0 (TEORELL and STENHAGEN 1938) and the debris separated by eentrifuging at 0 °C (10,000 g) for 30 min. Supernatants were kept at —20 °C until needed. Enzymatic activities were stable for at least three months. Mycelium dry weight: The mycelium was separated from the culture fluid by filtration through a disk of WHATMAN no. 1 filter paper placed on the bottom of a previously tared Gooch crucible, washed with distilled water and dried to a constant weight at 70 °C in an oven. Enzyme assays: Enzyme activity in the mycelial extracts was estimated as in previous work (GOMEZ et al. 1977) as follows: esterase (E.C. 3.1.1.6.) was assayed using ^-nitrophenyl acetate as substrate (HUGGINS and LAPIDES 1947), one unit of enzyme activity being defined as the amount which liberated l.Ofxmole of p-nitrophenol per min at 37 °C in 50 MM borate-citrate-phosphate buffer pH 5.0. /5-N-Acetylglucosaminidase (E.C. 3.2.1.30) by the hydrolysis of p-nitrophenyl-/?2-acetamido-2-deoxy-D-gluc-opyranoside (WOLLEN et al. 1961). One unit of enzyme activity being defined as the amount which liberated 1.0 [¿mole of p-nitrophenol per min at 37 °C in 50 MM borate-citrate-phosphate buffer, pH 5.5. Acid phosphatase (E.C. 3.1.3.2) and alkaline phosphatase (EC 3.1.3.1) were assayed by the hydrolysis of disodium 4-nitrophenyl ortophosphate (BRIGHTWELL and TAPPEL 1968). One unit of enzyme activity was defined as the amount which liberated 1.0 ¡¿mole of ^3-nitrophenol per min at 37 °C in 50 MM borate-citrate- phosphate buffer pH 3.5 and 9.5, respectively. Chitinase (E.C. 3.2.1.14) was assayed by estimating the X-acetylglucosamine liberated (TRACEY 1955) when hydrolyzing a colloidal chitin suspension (0.2 mg per ml) obtained from prawn shell chitin, both prepared as described by JEUNIAUX (1966). One unit of chitinase activity was defined as the amount causing the liberation of 1.0ij.mole of N-acetylglucosamine from colloidal chitin per min at 37 °C in 0.1 M borate-citrate-phosphate buffer pH 5.5. 1—3, /?G l u c a n a s e ( E . C . 3 . 2 . 1 . 6 ) w a s e s t i m a t e d b y t h e h y d r o l y s i s o f l a m i n a r i n (MCLELLAN et al. 1 9 7 0 ) , o n e

unit of enzyme activity being defined as the amount which liberated 1.0 ¡¿mole of glucose per min at 37°Cin 50MM borate-citrate-phosphate buffer at pH 5.5. The presence of invertase (E.C. 3.2.1. 26) was measured by the hydrolysis of saccharose (1 mg/ml). The reaction was stopped by adding SOMOGYI reagent and the glucose liberated was determined by the method of SOMOGYI (1945) and NELSON (1944). One unit of enzyme was defined as the amount which liberated 1.0 [¿mole of glucose per min at 37 °C in 50 MM borate-citrate-phosphate buffer pH 5.5. Cellulase (E.C. 3.2.1.4) was estimated by the hydrolysis of earboxymethylcellulose sodium salt (1 mg/ml). The reducing groups liberated were estimated using the method of SOMOGYI (1955) and NELSON (1944), with glucose as the reference standard. One unit of enzyme was defined as the amount which liberated reducing end-groups equivalent to 1.0 ¡¿mole of glucose per min at 37 °C in 50 MM borate-citratephosphate buffer pH 5.5. «-Amylase (E.C. 3.3.1.1) was estimated by the hydrolysis of starch (1 mg/ ml). The glucose liberated was estimated and the unit of enzyme defined in the same way as previously described for invertase. Polygalacturonidase (E.C. 3.2.1.15) was assayed by the ARCHER and FIELDING method (1975). One unit of enzyme was defined as the amount which liberated reducing end-groups equivalent to 1.0 [/.mole of glucose per min at 37 °C in 50 MM borate-citratephosphate buffer pH 5.5. Proteolytic enzymes were assayed by the ANSON method (1938), using

19

Lytic enzyme activity of A. niger

casein as substrate (1 mg/ml). One unit of proteolytic activity was defined as the amount which liberated 1 [xmole of tyrosine per minute from casein at 37 °C in 50 mM borate-citrate-phosphate buffer pH 5.5 Determination of protein: Protein in mycelial extracts was estimated by the method of LOWRY et al. (1951).

Results Aspergillus niger grows in a dispersed filamentous mycelium. The criterium of autolysis we have adopted throughout this work has been the decrease in mycelial dry weight with incubation time, as it is usual in these studies ( B E H R 1930, R I T T E R 1955, L A H O Z et al. 1966, 1978, T E I N C I and R I G H E L A T O 1970, R E Y E S et al. 1980). The beginning of autolysis is taken as the time at which the mycelium weight in the culture is maximal. Therefore, the 3rd day of incubation was taken as the " 0 day of autolysis", the 4th day of incubation as the "1st day of autolysis", and so on. The dry weight of A. niger mycelium obtained at different autolysis times is represented in Table 1. Table 1 Changes in the dry weight of mycelium in cultures of Aspergillus niger during pre-autolytic and autolytic phase of growth. Each value represents the arithmetic mean of three replicates Time of incubation (days)

Time of autolysis (days)

Dry weight of mycelium/sample 1 ) (mg)

2 3 4 7 9 11 14

0 1 4 0 8 11

385 780 721 568 530 514 437

Standard deviation 62 77 81 —

86 88 39

Sample = amount of mycelium contained in 100 ml of culture — X o t calculated

Mycelium extracts The best mycelium extraction results were obtained using method b (see "Materials and Methods"). The total protein content in the mycelial extracts (Table 2) decreased at the beginning of autolysis and continued to decrease steadily until the end of the autolytic period described here. B e h a v i o u r of t h e e n z y m e s The presence of acid phosphatase, polygalacturonidase, «-amylase, 1, 3-/?-glucanase and /9-X-acetylglucosaminidase could be found in extracts of autolysing mycelium of A. niger (Figs. 1 to 5). Acid phosphatase, polygalacturonidase and »-amylase (Figs. 1, 2 and 3) showed the highest activity which coincided with the initiation of the autolytic phase of growth, their activity reaching values of 40, 7 and nearly 8 U/sample, respectively. On the other hand, l,3-/?-glucanase and /?-N-acetylglucosaminidase (Figs. 4 and 5) showed their maximum activity well within the period of autolysis, long after the maximum dry weight of mycelium was reached (Figs. 4 and 5), their highest activity being about 3,500 mU/sample and a little more than 2,000 mU/sample, respectively. 2«

20

R . LAHOZ, F U E N S A N T A R E Y E S , P . GÓMEZ a n d M . J.

MARTINEZ

Table 3 Changes in total protein in mycelial extracts of Aspergillus niger from the pre-autolytic and autolytic phase of growth Time of autolysis (days)

Time of incubation (days) 2 3 4 7 9 11 14

Protein (mg/sample) 1 )

47 56 59 34 24 20 19

0 1 4 6 8 11

] ) Sample = amount of mycelium contained in 100 ml of culture.

lime of autolysis (days)

Time of incubation ( days )

Fig. 1. Changes in the enzymatic activity of acid phosphatase (mU/sample) extracted from autolysing myceliumof Aspergillus niger cultures Time of autolysis (days) -2

-1

0

'

2

3

1

1

2

3

i

5

6

7

S 6 7 8 9 10 lime of incubation (days)

8

9

11 12

10

i1

13 V,

Fig. 2. Variations in the enzymatic activity of polygalacturonidase (mU/sample) extracted from mycelium of autolysing cultures of Aspergillus niger Comparatively, v e r y little a c t i v i t y was found f o r alkaline phosphatase,

cellulase,

i n v e r t a s e , esterase, e h i t i n a s e a n d p r o t e o l y t i c e n z y m e s . T h e i r v a l u e s a r e g r o u p e d

in

T a b l e 3. F o r all these e n z y m e s t h e h i g h e s t a c t i v i t y o b s e r v e d c o i n c i d e d w i t h t h e i n i t i a t i o n of t h e a u t o l y t i c p h a s e of g r o w t h , d e c r e a s i n g t h e r e a f t e r d u r i n g t h e w h o l e p e r i o d of a u t o l y s i s s t u d i e d .

21

Lytic enzyme activity of A. niger Time of autolysis -2

-1

0

1

2

3

i

(days) 5

Time of incubation

6

7

B

9

10

11

(days)

Fig. 3. Changes in the «-amylase activity (mU/sample) present in autolysing mycelium of Aspergillus niger cultures

Time of autolysis -2

-1

0

7

2

3

4

Time of incubation

(days ) 5

6

7

S

9

10

11

(days)

Fig. 4. Changes in the l,3-/S-glucanase activity (mU/sample) extracted from mycelium of Aspergillus niger cultures during the pre-autolytic and autolytic phase of growth

Time of autolysis

Time of incubation

(days)

(days)

Fig. 5. Variations in /j-N-acetylglucosaminidase activity (mU/sample) in the mycelial extracts of Aspergillus niger cultures during the pre-autolytic and autolytic phase of growth

22

R . LAHOZ, F U E N S A N T A R E Y E S , P . GÓMEZ a n d M . J . MAETINEZ

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Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie

Kurze

1983

23

33-35

Originalmitteilung

(Institut für technische Chemie der Akademie der Wissenschaften der D D R , Leipzig, D i r e k t o r : Prof. Dr. sc. n a t . M. RINGPFEIL)

Einfluß sauerstoffhaltiger (^-Verbindungen auf das W a c h s t u m methanassimilierender Bakterien J . D . SCHNEIDER, K . - D . WENDLANDT, E . BRÜHL u n d G . MIRSCHEL

(Eingegangen

am, SO.

4.1982)

Added ^ - c o m p o u n d s of the intermediates methanol, formaldehyde, formate and carbon dioxide show a catalytic effect on the growth rate and cell yield of CH,-assimilating bacteria G B 25 with serine pathway. Maximum stimulation is obtained b y added amounts of about 20 mg Cj-compound/g bacteria dry m a t t e r . T h e influence of C r c o m p o u n d s decreases as follows: methanol > carbon dioxide > formate > formaldehyde.

Zur Gewinnung von Energie und Bereitstellung von (^-Verbindungen für die zentralen Stoffwechselwege oxidieren methanotrophe Mikroorganismen in einer vorgelagerten Sequenz Methan über folgende Intermediate zu Kohlendioxid: CH 4

CHgOH -

HCHO -

HCOOH -

C02

Assimilation Die intermediär gebildeten sauerstoffhaltigen organischen Verbindungen Methanol, Formaldehyd und Ameisensäure können je nach Prozeßbedingungen in unterschiedlichen Mengen in das Medium ausgeschieden werden (HARRISON et dl. 1975, HARRISON 1973, HAEGGSTROEM U. DOSTALEK 1981). E s konnte verschiedentlich gezeigt werden, daß Cj-Intermediate das Wachstum methylotropher Mikroorganismen beeinflussen ( P I L A T U. PROKOP 1 9 7 5 , R I C H T E R etal. 1 9 7 4 , WENDLANDT 1981).

U. B R Ü H L

1980,

MEDRANO-ROLDAN

et

al.

1980,

PAPOUTSAKIS

et

al.

E s war deshalb das Ziel, die fördernden oder auch hemmenden Effekte der Intermediate einschließlich des Kohlendioxides auf die Wachstumsgeschwindigkeit und Ausbeute einer Bakterienkultur näher zu untersuchen, welche Methan via Serinweg assiliniiert. Die kontinuierlichen Fermentationen sind mit einer neu isolierten Bakterienkultur G B 2 5 Z I M E T 503 unter folgenden Bedingungen durchgeführt worden (siehe WENDLANDT et al. 1979): Temperatur = 38 °C, pH = 5,1, Verdünnungsrate = 0,167 h _ I , chemostatische 0 2 - L i m i t a t i o n und mittlere Bakterienkonzentration = 12 g Trockenmasse/1. Die sauerstoffhaltigen C x -Verbindungen wurden unter jeweils stationären Bedingungen schrittweise bis zu 3 g/1 der Methanfermentation zugeführt. I m Falle von Kohlendioxid erfolgte die Zuführung durch Bicarbonatverbindungen, welche bei pH = 5,1 zu 9 5 % im Fermentationsmedium in CO., überführt werden.

I m Ergebnis der Untersuchungen wurde gefunden, daß die (^-Intermediate je nach zugeführter Menge das Wachstum sowohl stimulieren (positive Katalyse) als auch inhibieren (negative Katalyse) können. Über 9 0 % der zugeführten (^-Verbindungen werden durch die Bakterienkultur G B 25 utilisiert; bei Methanol sind es nahezu 1 0 0 % . 3

Z. Allg. J J i k r o b i o l . , B ( l . 2 3 , H . 1

34

J . D . SCHNEIDER, K . - D . W E N D L A N D T , E . BRÜHL u n d G. MIRSCHEL

Melhanolzuführunqimg CH30H//-h)

Abb. 1. Abhängigkeit der Ausbeute von der Zuführungsrate des Methanols während des Wachstums der Bakterienkultur GB 25 auf Methan (Bedingungen: Verdünnungsrate = 0,167 h _ 1 , Temperatur = 38 °C, pH = 5,1 und 0 2 -Limitation) Tabelle 1 Optimale Mengen an zugeführten Cj-Intermediaten sowie dabei erreichte maximale Ausbeuten und kritische Verdünnungsraten

('¡-Intermediate

ohne Zusatz CH,OH HCHO HCOOH

co 2

zugeführte C] -Intermediate (Optimal wert) in g CJe BTS 1 )

_

0,023 0,022 0,018 0,0222)

kritische Verdünnungsrate in h"1

maximale Ausbeute in g BTS/g Methan

0,20 0,27 0,26 0,26 0,26

0,71 0,83 0,75 0,77 0,81

') BTS = Bakterientrockenmasse 2 ) einschließlich des metabolisch gebildeten CO,

A b b i l d u n g 1 zeigt a m Beispiel des Methanols einen typischen Verlauf des Einflusses der C j - I n t e r m e d i a t e auf die Zellausbeute. E s existieren in jedem Falle optimale K o n z e n t r a t i o n e n der z u g e f ü h r t e n ( ^ - V e r b i n d u n g e n , bei denen m a x i m a l e A u s b e u t e n u n d Geschwindigkeiten erreicht werden (Tab. 1). Die Ausbeutesteigerung bei Zusatz optimaler K o n z e n t r a t i o n e n der C j - I n t e r m e d i a t e ist f ü n f - bis z e h n m a l größer als es der z u g e f ü h r t e n Menge a n C j - I n t e r m e d i a t e n e n t sprechen würde. Die sauerstoffhaltigen (^-Verbindungen besitzen d e m n a c h eine k a t a l y t i s c h e W i r k u n g . E s ist a n z u n e h m e n , daß bei Methanol-, F o r m a l d e h y d - oder F o r m i a t z u s ä t z e n e n t weder zusätzliche R e d u k t i o n s ä q u i v a l e n t e f ü r das Methan-Monooxygenase-System g e l i e f e r t w e r d e n (TONGE et al. 1977, BABEL U. MOTHES 1978) o d e r e i n e W i r k u n g e r s t

v o m oxidierten E n d p r o d u k t C 0 2 ausgeht. Die sauerstoffhaltigen Cj-Verbindungen sind auf G r u n d ihrer stimulierenden Wirk u n g f ü r eine I n t e n s i v i e r u n g der Zellvermehrungsprozesse (SCP-Produktion) auf Basis M e t h a n geeignet. Wir danken den Herren Dr. mikrobiologischen Arbeiten.

K . KARBAUM

und Dr. sc. L.

WÜNSCHE

für ihre Unterstützung bei

W a c h s t u m methanassimilierender B a k t e r i e n

35

Literatur u n d M O T H E S , G . , 1978. Dissimilatorische Sequenzen in methylotrophen Bakterien. Z. Allg. Mikrobiol., 18, 17. H A E G G S T K O E M , M . H . a n d D O S T A L E K , M . , 1981. Growth of Methylomonas methanolica factors influencing growth yield. E u r o p . J . Appl. Microbiol. Biotechnol., 12, 107. H A R B I S O N , D . E . F., 1973. Studies on the affinity of methanol a n d methane utilizing bacteria for their carbon substrates. J . Appl. Bacteriol., HO, 301. H A R R I S O N , D . E . F., W I L K I N S O N , T . G . , W R E N , S. J . a n d H A R W O O D , J . H . , 1 9 7 5 . Mixed bacterial cultures as a basis for continuous production of SCP from Cj compounds. I n : Continuous Culture 6: Appl. a n d New Fields, J u l y 1975, Oxford; published 1976 London, p. 122 — 134. BABEL, W .

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D D R - P a t e n t Nr. 149872 vom 06. 07. 1979. Anschrift: Dr. sc. J . VEB

SCHNEIDEB JENAPHABM

DDR-6900 J e n a , Otto-Schott-Str. 13

3

Zeitschrift f ü r Allgemeine Mikrobiologie

28

1

1983

37-70

Sammelbericht (Ingenieurhochschule Kothen, Sektion Anlagenbau, Wissenschaftsbereich Biologie)

Mikrobielle Verwertung v o n Mischsubstraten H.

(Eingegangen

WEIDE

am 25. 6. 1982)

Decomposition of substrates by heterotrophic microorganisms is accomplished in natural biotopes such as in soil and in waters, on or in macroorganisms but also in laboratory and industrial biotopes. The interest of man in these processes is manifold. Starting with the division of substrates into three groups of simple substrates, complex and mixed substrates with or without solid particles their qualitative and quantitative occurrence in nature and their significance in biotechnology will be discussed. I n the decomposition of these substrates their utilization by pure cultures or mixed populations is to be exactly distinguished. Simple growth curves, di- or polyauxy, sequences of decomposition of simple substrates of a mixed substrate, population changes and successions are only some of the phenomena occurring in this process. The pathways of catabolism arc subjected to manifold regulations on the three levels of stoichiometric regulation, the regulation of enzyme activity and the regulation of enzyme synthesis. In natural biotopes there is hardly a constant substrate supply over a longer period. That's why certain mechanisms of regulation are permanently acting. Thus the " n o r m a l " physiological state for microorganisms is characterized by permanent transition situations — called "transients". These reactions are also applied to many biotechnological processes.

I n der nachfolgenden Übersicht wird eine Reihe theoretischer Grundlagen zum niikrobiellen A b b a u von Mischsubstraten erörtert. E s werden Ansatzpunkte f ü r Vorstellungen über die zur Verfügung stehenden Nutzungsmöglichkeiten dieses Vorganges in N a t u r und Technik dargelegt. F a k t e n aus den verschiedensten Gebieten, etwa der Physiologie, Biochemie, Ökologie, Genetik und Biotechnologie sind zu berücksichtigen. Nicht die umfassende Ausführlichkeit sondern die Darstellung von Schwerpunkten wird angestrebt. Diese sind: 1. 2. 3. 4.

Substrate, Substratgruppen Abbau der Substrate Begulationsmechanismen Transients 1. Substrate,

Substratgruppen

Die Verwertung organischer Verbindungen als Substrate f ü r die Kohlenstoffu n d Energiegewinnung wird als Chemoorganotrophie (oder Chemoorganoheterotrophie) bezeichnet. Man differenziert damit eindeutig von der Chemolithotrophie (Energiegewinnung durch Oxidation anorganischer Wasserstoffdonatoren) und deren speziellen Formen der Chemolithoautotrophie (C0 2 als Kohlenstoffquelle) und Chemolithoheterotrophie (Verwertung organischer Verbindungen zur Deckung des Kohlenstoffbedarfs). Die Substrate f ü r chemoorganotrophe Mikroorganismen sind in die drei Gruppen einfache Substrate (Tab. 1), Mischsubstrate und komplexe Substrate (Tab. 2) einzuteilen. Zum Verständnis der Definition f ü r Mischsubstrate müssen zuvor die beiden anderen Gruppen erörtert werden.

38

H . WEIDE

Tabelle 1 Ausgewählte Beispiele einfacher Substrate Aldosen

Hexosen

Glucose, Galactose, Mannose Fructose, Sorbose

Ketosen

Monosaccharide Pentosen

Aldosen

Ribose, Arabinose, Xylose

Disaccharide 1 )

Saccharose (G/F), Lactose (G/Ga), Maltose (G/G), Trehalose (G/G), Cellobiose (G/G)

Trisaccharide 1 )

Raffinose (G/F/Ga)

Alkohole

einwertig dreiwertig fünfwertig sechswertig

Organische Säuren

Mono-, Di-, Tricarbonsäuren Oxysäuren Aminosäuren

Kohlenwasserstoffe

n- und iso-Alkanc, Cycloparaffine Aromatische Kohlenwasserstoffe

Methanol, Äthanol Glycerol Arabitol, Adonitol, Sorbitol, Mannitol,

Xylitol Dulcit

Oligosaccharide, Symbole f ü r deren Monomere in Klammern Tabelle 2 Mischsubstrate und komplexe Substrate ohne Feststoffanteil

Mischsubstrate

Komplexe Substrate 1 )

theoretisch jede Kombination einfacher Substrate

mit Feststoffanteil, wie z. B. Holz- u. Stärkehydrolysate, ; Rohr- u. Rübenzuckermelassen, Molke, \ Sulfitablauge, Melasse/Alkohol, Sulfitablauge/Melasse 1 ) 2 )

Polymere (darunter Polysaccharide, Polypeptide), komplexe Naturstoffe (darunter Schrote, Mehle, Kartoffeln, Rüben, Holzabfälle, einjährige Pflanzen, Tierkörperabfälle) 3 )

') oft als „Technische Substrate" oder „Technische Kohlenstoff- und Energiequellen" bezeichnet -) nach technischem Aufschluß oder nach primärer Verarbeitung von Biomasse als Sekundärrohstoffe erhaltene Materialien (Substrate) 3 ) teils Substrate für sog. Feststoff-Fermentationen

1.1. E i n f a c h e S u b s t r a t e I n der Regel ist der Gehalt an einfachen, wasserlöslichen Substraten in Erdboden u n d Gewässern relativ niedrig. I h r Gesamtanteil an der Trockenmasse des organischen Materials beträgt selten mehr als 15% (NYKVIST 1963). Ein Beispiel f ü r das Vorkommen von Monosacchariden (Tab. 3) in Waldböden läßt folgendes erkennen: Die Glu-

39

Mikrobielle V e r w e r t u n g von Mischsubstraten Tabelle 3 E i n i g e freie Monosaccharide in einem Kiefernwaldboden, F - H o r i z o n t (aus GREENLAND U. OADES 1975, ALVSAKER U. MICHELSEN 1957 sowie GROV 1963, verändert) in % des organischen Materials Glucose Galactose Mannose Fructose Arabinose Xylose Rhamnose Ribose Gesamt:

0,22 0,02 Spur oder fehlend 0,035 0,04 0,03 Spur oder fehlend

in g/1 bei 15% organischen Materials 0,33 0,03 0,052

0,06

0,045

0,001

0,0015

0,346

0,513

cose, als a m häufigsten in den polymeren N a t u r s t o f f e n enthaltenes Monomeres, k a n n die Mengen anderer Monosaccharide u m ein bis zwei Zehnerpotenzen übertreffen. Die hier g e n a n n t e n Mengen f ü r Glucose liegen erheblieh höher als die K s - W e r t e f ü r Glucose bei einer Vielzahl von Mikroorganismen (um 10 — 100 ¡ig/1). Dennoch k a n n auch diesbezüglich kein direkter Vergleich angestellt werden, da die Verteilung des Substrates im Boden nicht homogen sondern vom Mikroareal abhängig ist. Vielfach ist der Anteil organischen Materials in Böden auch wesentlich geringer. F ü r gelöste Kohlenh y d r a t e (insgesamt) werden in p h y t o p l a n k t o n r e i c h e n Gewässern Mengen von einigen mg/1 g e n a n n t (UHLMANN 1981). W e r t e f ü r freie Glucose in Gewässern reichen von >

1 (Jtg/L ü b e r 5 0 ¡i.g/1 (BROCKMANN et al. 1 9 7 9 , MOSHIRI et al. 1 9 7 9 ) b i s 4 8 5 ¡i.g/1 (RAI 1 9 7 9 )

in den Tropen. Ganz allgemein k o m m e n in Gewässern der gemäßigten K l i m a z o n e n 10 — 5 0 ¡ig G l u c o s e / 1 h ä u f i g v o r (BABENZIEN 1 9 8 1 ) . HARRISON et al.

(1971) f a n d e n in

Sedimenten (Modellversuchen) einen schnellen U m s a t z von Glucose u n d bestätigten n i e d r i g e W e r t e v o n 5 ¡ig G l u c o s e / 1 i m I n t e r s t i t i a l w a s s e r (VALLENTYNE U. WIIITAKER 1956).

Die mehrwertigen Alkohole werden als mikrobielle S u b s t r a t e in ihrer B e d e u t u n g vielfach u n t e r s c h ä t z t . Den einwertigen Alkoholen (Methanol, Äthanol) wird u n t e r technischen A s p e k t e n der Biomassesynthese derzeit großes Interesse entgegengeb r a c h t . An organischen Säuren des Bodens sind natürlich die Stoffwechselprodukte des a n a e r o b e n A b b a u s von Cellulose und anderen Polymeren durch meso- und thermophile B a k t e r i e n zu nennen (MÜLLER 1965), d a r u n t e r B u t t e r - , Propion-, Milchsäure sowie Essig- und Ameisensäure (SCIIWARTZ 1954) und schließlich Bernstein-, Fmiiaru n d Apfelsäure (die nicht ausschließlich bei solchen Prozessen entstehen müssen). Auf d a s Vorkommen der g e n a n n t e n und zahlreicher anderer einfacher S u b s t r a t e dieser chemischen G r u p p e in ständig wechselnder Konzentration in der Rhizosphäre sei besonders hingewiesen. Aminosäuren können zugleich als Stickstoff- und Kohlenstoffquelle g e n u t z t werden. Sie k o m m e n in Böden vor (Tab. 4). Die Spektren und die jeweiligen Mengen der Aminosäuren d ü r f t e n in Wirklichkeit Reflektionen des zum betreffenden Z e i t r a u m im Mikroareal zersetzten, pflanzlichen und tierischen Materials sein. 9 0 % des Gesamtstickstoffs der meisten Böden sind in mikrobiellen Proteinen e n t h a l t e n und d a m i t g e b u n d e n ; n u r ein geringer Mengenanteil (Aminosäuren) ist jeweils kurze Zeit während der Autolvse der einzelnen Mikroorganismenzellen in freier F o r m bilanzierbar. I m Wasser einiger Seen (STEINBKRG 1977) wurden Asparagin- und Glutaminsäure, Serin, Glycin und

40

H. WEIDE

Tabelle 4 Einige freie Aminosäuren in einem Kiefernwaldboden, F-Horizont, ( a u s PARSONS U. T I N S L E Y 1 9 7 5 n a c h GROV 1 9 6 3 ) i n ¡jLg/g g e t r o c k n e t e r

Boden Asparaginsäure Glutaminsäure Serin Threonin Glycin Alanin Valin

74,1 77,6 28.0 23,8 53.1 62.2 51,1

Isoleucin Tyrosin Leucin Phenylalanin Lysin Histidin Methionin

45,5

16,1

Spur Spur 42,6

Alanin z u s a m m e n in Mengen von 0,01—0,92 fxmol/1 g e f u n d e n . (Beim d u r c h s c h n i t t lichen Molekulargewicht einer A m i n o s ä u r e von 100 liegt das im Bereich bis 92 ¡i.g/1.) I m Meerwasser ( B O I I L I N G 1 9 7 0 ) w u r d e n (umgerechnet) 1 9 , 5 — 7 0 pt.g/1 im Monatsm i t t e l resp. als M a x i m u m g e f u n d e n . Diese Mengen entsprechen in der G r ö ß e n o r d n u n g d e m Gehalt a n Glucose in Gewässern, womit ihre B e d e u t u n g u n t e r s t r i c h e n wird. Die aliphatischen Kohlenwasserstoffe h a b e n in den letzten 30 J a h r e n als S u b s t r a t e f ü r die B i o m a s s e p r o d u k t i o n u n d einige a n d e r e mikrobielle P r o d u k t e B e d e u t u n g erlangt. I n der N a t u r spielen sie in der Regel q u a n t i t a t i v n u r eine u n t e r g e o r d n e t e Rolle. H i e r erwachsen die P r o b l e m e vor allem aus plötzlichem, hohen Anfall solcher Subs t a n z e n — e t w a bei H a v a r i e n — u n d der wegen ihres l a n g s a m e n A b b a u s e i n t r e t e n d e n V e r g i f t u n g größerer Areale (Boden/Gewässer) sowie andererseits aus der teils schwachen oder fehlenden mikrobiellen A b b a u l e i s t u n g beim Vorliegen v o n s u b s t i t u i e r t e n Kohlenwasserstoffen in F o r m von Pesticiden oder I n d u s t r i e a b f ä l l e n oder unkontrolliert in die U m w e l t gelangenden A b p r o d u k t e n . Geringe, zunächst u n t e r h a l b der I n d u k t i o n s schwelle liegende K o n z e n t r a t i o n e n sind weitere offene P r o b l e m e in diesem Z u s a m m e n hang. E x o e n z y m e sind zur E i n b e z i e h u n g einfacher S u b s t r a t e in den Stoffwechsel n i c h t erforderlich. Die A u f n a h m e aller einfachen S u b s t r a t e in die Mikroorganismenzelle k a n n jeweils über die b e k a n n t e n speziellen Mechanismen erfolgen (Diffusion, erleicht e r t e Diffusion, a k t i v e r T r a n s p o r t , Permease-gekoppelter T r a n s p o r t , P h o s p h o t r a n s ferase-System usw.), f ü r b e s t i m m t e Mikroorganismen ist diesbezüglich d a n n noch weiter zu differenzieren ( D I L L S et al. 1 9 8 0 ) . U n a b h ä n g i g von den g e n a n n t e n Mengen f ü r die e i n f a c h e n S u b s t r a t e in n a t ü r l i c h e n B i o t o p e n m u ß v e r m e r k t werden, d a ß eigentlich z . B . K o h l e n h y d r a t e in der Regel gar nicht n a c h w e i s b a r sein d ü r f t e n . Sie werden ja d u r c h E x o e n z y m w i r k u n g aus P o l y m e r e n freigesetzt (2.2.). D a s erfolgt aber n u r in dem A u s m a ß , in d e m die S u b s t r a t e a u c h in die Zelle a u f g e n o m m e n werden. Selbst wenn Überschüsse e n t s t e h e n , m ü ß t e n diese d u r c h a n d e r e F o r m e n der Mischpopulation gleichzeitig oder z u m i n d e s t successiv verw e r t e t werden (Tab. 8). Sicher beschreiben diese Bilanzen in jedem Fall aktuelle Situationen von Transients. D a s gilt a u c h f ü r zeitweise z. B. beim A b b a u von großen Massen pflanzlichen Materials in b e s t i m m t e n Biotopen a u f t r e t e n d e F e t t s ä u r e n , die wohl n u r z u m geringen Teil aus dieser Biomasse s t a m m e n , sondern vielmehr mikrobielle I n t e r m e d i a t e sind ( U H L M A N N 1981). 1.2. K o m p l e x e S u b s t r a t e K o m p l e x e S u b s t r a t e sind P o l y m e r e oder k o m p l e x e N a t u r s t o f f e der P f l a n z e n , Tiere u n d Mikroorganismen. Sie sind f a s t s ä m t l i c h S t r u k t u r l e m e n t e oder R e s e r v e s t o f f e lebender, a b s t e r b e n d e r oder t o t e r Organismen oder Teile von diesen. K o m p l e x e Subs t r a t e sind die in der N a t u r vorrangig a n z u t r e f f e n d e n S u b s t r a t e f ü r mikrobielles W a c h s t u m ; lebende Zellen sind spezielle S y s t e m e k o m p l e x e r S u b s t r a t e .

Mikrobielle Verwertung von Mischsubstraten

41

P r i m ä r p r o d u k t e l a n d w i r t s c h a f t l i c h e r K u l t u r e n sowie V e r a r b e i t u n g s r ü c k s t ä n d e u n d A b f ä l l e aus der L a n d - , F o r s t - u n d N a h r u n g s g ü t e r w i r t s c h a f t erlangen im Zuge der a l l g e m e i n e n V e r k n a p p u n g v o n R o h s t o f f r e s e r v e n auf d e r E r d e als k o m p l e x e S u b s t r a t e f ü r biotechnologische Prozesse zunehmend an Bedeutung. I n der Regel gar nicht oder n u r g e r i n g f ü g i g t e c h n o l o g i s c h a u f g e a r b e i t e t e p f l a n z l i c h e M a t e r i a l i e n zu F e s t s t o f f F e r m e n t a t i o n e n (HF.SSELTINE 1977) s i n d h i e r zu n e n n e n . (Sie sollen — m i k r o b i e l l v e r ä n d e r t , meist mit P r o t e i n e n angereichert — zunächst wohl zur T i e r e r n ä h r u n g Verwendung finden.) K o m p l e x e S u b s t r a t e k ö n n e n — i m G e g e n s a t z z u e i n f a c h e n S u b s t r a t e n — n i c h t in die Zelle a u f g e n o m m e n w e r d e n . D e m m u ß die ( m e i s t ) h y d r o l y t i s c h e S p a l t u n g d e r P o l y m e r e n d u r c h E x o e n z y m e in die M o n o m e r e n v o r a n g e h e n . D i e in n a t ü r l i c h e n B i o t o p e n v o r k o m m e n d e n e i n f a c h e n S u b s t r a t e u n d d e r e n G e s a m t h e i t als G e m i s c h w e r d e n in b e s o n d e r e n S i t u a t i o n e n o f f e n b a r d o c h (2.) zu e i n e m erheblichen Anteil direkt aus komplexen S u b s t r a t e n freigesetzt. An wenigen Beispielen sei d e s h a l b auf die Z u s a m m e n s e t z u n g s o l c h e r M a t e r i a l i e n e i n g e g a n g e n . I n d e r N a t u r k o m m e n e t w a 2 0 0 P o l y s a c c h a r i d e v o r . E s ist m ö g l i c h , d a ß die M e h r h e i t d a v o n zu e i n e r b e s t i m m t e n Z e i t in r e l a t i v e n g b e g r e n z t e n A r e a l e n bis h i n e i n in die M i k r o a r e a l e k u r z f r i s t i g n a c h w e i s b a r ist. E i n T e i l d e r P o l y s a c c h a r i d e w i r d m i k r o b i e l l g e b i l d e t (SCHEFFER U. ULRICH 1960). D i e T a b e l l e n 5 bis 7 f a s s e n A n g a b e n ü b e r K o h l e n Tabelle 5 Hautgruppen von Polysacchariden des Bodens (nach GKEEXLAXD U. OADES 1975, verändert) Herkunft Pflanzen

Polysaccharide Cellulose ( 5 0 - 7 0 % ) Hemicellulosen (2—5%) Pektine ( 0 , 1 - 2 % ) Stärke. Gummen

Mikroorganismen

Zelhvandmaterialien, Kapseln, Schleim Speicher- und Reservestoffe (Stärke, Glycogen)

Tiere

Chitin Hyaluronsäure Glycogen

Hauptsächliche Komponenten (Monomere) Glucose Glucose, Galactose. Mannose. Glucuronsäure, Galacturonsäure, Arabinose, Xylose Galacturonsäure Glucose u. a. m. Glucose, Aminosäuren, Ribitol, Glycerol u. a. m. Glucose Glucosamin Glucuronsäure Glucose

h y d r a t e in B ö d e n z u s a m m e n . E t w a auf G l u c o s e b e z o g e n s i n d d a s n a t ü r l i c h u m m e h r als e i n e Z e h n e r p o t e n z h ö h e r e W e r t e , als sie f ü r e i n f a c h e S u b s t r a t e v o r l i e g e n . I n G e w ä s s e r n s i n d d i e s b e z ü g l i c h e r h e b l i c h e S c h w a n k u n g e n zu e r w a r t e n . A u s d e m H y d r o l y s a t v o n S e e w a s s e r - P o l y s a c c h a r i d e n ( J u l i / A u g u s t 1965) k o n n t e z . B . e i n G l u c o s e a n t e i l v o n 2 0 0 y.g/1 e r m i t t e l t w e r d e n (OHLE 1972). D i e s e M e n g e ü b e r t r i f f t die f r e i v o r k o m m e n d e G l u c o s e (1.1.) e b e n f a l l s . W e d e r im E r d b o d e n n o c h in G e w ä s s e r n b e s t e h t a l l e r d i n g s e i n b e s t i m m t e s V e r h ä l t n i s zwischen d e m jeweils g e b u n d e n e n u n d andererseits frei vork o m m e n d e n Anteil der einzelnen Zucker. I n n a t ü r l i c h e n Biotopen h a b e n Lignin, das 2 0 — 3 0 % des Holzes oder etwa 2 % k r a u t i g e r P f l a n z e n a u s m a c h t , o d e r a n d e r e r s e i t s e b e n H u m u s sowie d e s s e n A b b a u — u n d s e k u n d ä r e n t s t e h e n d e U m b a u p r o d u k t e (ALEXANDER 1961) e r h e b l i c h e B e d e u t u n g als S u b s t r a t e . I h r m i k r o b i e l l e r A u f s c h l u ß b e n ö t i g t in d e r K e g e l a u s v e r s c h i e d e n s t e n G r ü n -

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H. WEIDE

Tabelle 6 Anteile einiger Kohlenhydrate am organischen Material von Böden (aus GREENLAND U. OADES 1 9 7 5 , v e r ä n d e r t )

Ackerböden 6 —101) Wiesenböden 17 Waldböden 9, 6 - 1 6 , 4-)

Organisches Material einiger Böden in % Anteile in % des organischen Materials Kohlenhydrate Reduzierende Zucker Hexosen 5 ) Pentosen 5 ) Uronsäuren 5 ) Hexosamine 5 ) wasserlösliche Monosaccharide

25 - 5 0 3 ) 4—21 4 ) 5-20 2, 2 - 1 1 , 9 1-5, 6 bis 5 6 )