Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie: Band 23, Heft 6 [Reprint 2021 ed.] 9783112565483, 9783112565476

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ZEITSCHRIFT FÜR ALLGEMEINE MIKRQ-BIOLOGIE AN INTERNATIONAL JOURNAL ON MORPHOLOGY, PHYSIOLOGY, GENETICS, AND ECOLOGY OF MICROORGANISMS BAND 23 • 1983 • HEFT 6

AKADEMIE-VERLAG ISSN 0044-2208

Z. Allg. Mikrobiol., Berlin 23 (1»83) 6, 3 4 5 - 4 0 8

BERLIN EVP 2 0 , - M

Z E I T S C H R I F T FÜR A L L G E M E I N E V O L U M E

23

MIKROBIOLOGIE

1983

N U M B E R

6

CONTENTS Effects of different factors on the sporulation of Pithophora oedogonia (MONT.) WITTROCK

S . C. AGRAWAL a n d Y . S . R . K . SARMA

Relation of anabolic-catabolie glucose utilization in growth-limited cultures of Streptomyces griseus

A . CHRISTNER, R . REICHE

Effect of the autoregulator from Streptomyces griseus JA 5142 on surface cultures of blocked mutant ZIMET 43682 Replication and expression of the plasmid pBR 322 during discontinuous cultivation of a stringent and a relaxed Escherichia coli

U . GRÄFE, G . R E I N H A R D T , D . KREBS, I . ERITT a n d A.STEUDEL

359

M . HECKER, W . WIEHLE, A . SCHROETER a n d F . MACH

367

E . J . BORMANN

347 and 351

Improvement of ¥•values with Hansenula polymorphs, growing on methanol by simultaneous utilization of glucose

R . MÜLLER, W . BABEL

Recombinogenic activity of nalidixic acid for artificial hybrids but not for natural strains of Candida albicans : Evidence for the monoploidy of natural strains Characterization of conjugative plasmids belonging to a new incompatibility group (IncZ)

A.SARACHEK

385

H . TSCHÄPE a n d E . TIETZE

393

P . K . AGRAWAL, C. S . B H A T T a n d L . VISHWANATHAN

403

Short Note Inhibition of fungal NADI*+-isocitrate dehydrogenase by citric acid Book Reviews

K . D . MARKUSKE

and 375

366, 392, 402, 407, 408

ZEITSCHRIFT FÜR ALLGEMEINE MIKROBIOLOGIE AN

INTERNATIONAL

JOURNAL

ON

MORPHOLOGY, PHYSIOLOGY, GENETICS, A N D ECOLOGY OF MICROORGANISMS

H E R A U S G E G E B E N VON

G. F . Gause, Moskau 0 . Hoffmann-Ostenhof, Wien A. A. Imseneckii, Moskau R. W. Kaplan, Frankfurt/M. F. Mach, Greifswald 1. Mälek, Prag C. Weibull, Lund

unter der Chefredaktion von W. Schwartz, Braunschweig und U. Taubeneck, Jena

U N T E R M I T A R B E I T VON

J . H. Becking, Wageningen H. Böhme, Gater.-leben M. Girbardt, Jena S. I. Kusnecov, Moskau 0 . Necas, Brno H. Oppenheimer, Port Aransas N. Pfennig, Göttingen 1. L. Rabotnova, Moskau A. Schwartz, Wolfenbüttel

Band 23 1983 He£t 6

AKADEMIE-VERLAG ' BERLIN

REDAKTION

U. May, Jena

Die Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie soll dazu beitragen, Forschung und internationale Zusammenarbeit auf dem Gebiet der Mikrobiologie zu fördern. Es werden Manuskripte aus allen Gebieten der allgemeinen Mikrobiologie veröffentlicht. Arbeiten über Themen aus der medizinischen, landwirtschaftlichen, technischen Mikrobiologie und aus der Taxonomie der Mikroorganismen werden ebenfalls aufgenommen, wenn sie Fragen von allgemeinem Interesse behandeln. Zur Veröffentlichung werden angenommen: Originalmanuskripte, die in anderen Zeitschriften noch nicht veröffentlicht worden sind und in gleicher Form auch nicht in anderen Zeitschriften erscheinen werden. Der Umfang soll höchstens l 1 ^ Druckbogen (24 Druckseiten) betragen. Bei umfangreicheren Manuskripten müssen besondere Vereinbarungen mit der Schriftleitung und dem Verlag getroffen werden. Kurze Originalmitteilungen über wesentliche, neue Forschungsergebnisse. Umfang im allgemeinen höchstens 3 Druckseiten. Kurze Originalmitteilungen werden beschleunigt veröffentlicht. Kritische Sammelberichte und Buchbesprechungen nach Vereinbarung mit der Schriftleitung. Bezugsmöglichkeiten der Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie: Bestellungen sind zu richten — in der DBB an den Postzeitungsvertrieb, an eine Buchhandlung oder an den AkademieVerlag, DDR-1086 Berlin, Leipziger Str. 3 - 4 ; — im sozialistischen Ausland an eine Buchhandlung für fremdsprachige Literatur oder an den zuständigen Postzeitungsvertrieb; — in der BRD und Berlin (West) an eine Buchhandlung oder an die Auslieferungstelle KUNST UND WISSEN, Erich Bieber OHG, Wilhelmstraße 4 - 6 , D-7000 Stuttgart 1; — in den übrigen westeuropäischen Ländern an eine Buchhandlung oder an die Auslieferungsstelle KUNST UND WISSEN, Erich Bieber GmbH, Dufourstraße 51, CH-8008 Zürich; — im übrigen Ausland an den Internationalen Buch- und Zeitschriftenhandel; den Buchexport, Volkseigener Außenhandelsbetrieb der Deutschen Demokratischen Bepublik, DDR-7010 Leipzig, Postfach 160, oder an den Akademie-Verlag, DDR-1086 Berlin, Leipziger Straße 3 — 4. Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie Herausgeber: Im Auftrag des Verlages von einem internationalen Wissenschaftlerkollektiv herausgegeben. Verlag: Akademie-Verlag, DDR-1086 Berlin, Leipziger Straße 3 - 4 ; Fernruf: 223 62 29 oder 2236221; Telex-Nr.: 114420; Bank: Staatsbank der DDR, Berlin, Kto.-Nr.: 6836-26-202 712. Chefredaktion: Prof. Dr. U D O T A T J B E N E C K , Prof. Dr. W I L H E L M S C H W A K T Z Anschrift der Redaktion: Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften, DDR-6900 Jena, Beutenbergstr. 11; Fernruf: Jena 852200; TelexNr.: 058621. Veröffentlicht unter der Lizenznummer 1306 des Presseamtes beim Vorsitzenden des Ministerrates der Deutschen Demokratischen Republik. Gesamtherstellung: VEB Druckerei „Thomas Müntzer", 5820 Bad Langensalza. Erscheinungsweise: Die Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie erscheint jährlich in einem Band mit 10 Heften. Bezugspreis je Band 250, — M zuzüglich Versandspesen (Preis für die DDR 200, — M). Preis je Heft 2 5 , - M (Preis für die DDR 2 0 , - M ) . Urheberrecht: Alle Rechte vorbehalten, insbesondere die der Übersetzung. Kein Teil dieser Zeitschrift darf in irgendeiner Form — durch Photokopie, Mikrofilm oder irgendein anderes Verfahren — ohne schriftliche Genehmigung des Verlages reproduziert werden. — All rights reserved (including those of translations into foreign languages). No part of this issue may be reproduced in any form, by photoprint, microfilms or any other means, without written permission from the publishers. Erscheinungstermin: August 1983 Bestellnummer dieses Heftes: 1070/23/6 © 1983 by Akademie-Verlag Berlin. Printed in the German Democratic Republic. AN (EDV) 75218

Zeitschrift f ü r Allgemeine Mikrobiologie

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( D e p a r t m e n t of B o t a n y , B a n a r a s H i n d u University, Varanasi, I n d i a )

Effects of different factors on the sporulation of Pithophora oedogonia ( M O N T . ) W I T T R O C K S. C. AGRAWAL a n d Y . S . R . K .

(Eingegangen

SARMA

am 17. 9. 1982)

T h e present s t u d y emphasizes t h e effects of different qualities of visible light, intensities of white light, t e m p e r a t u r e a n d p H on t h e sporulation in t h e green alga Pithophora oedogonia ( M O N T . ) WITTROCK. Of t h e different qualities of light used, green light was f o u n d t o delay t h e initiation of sporulation. Percentage of sporulation was greatly decreased in yellow light followed by red light. Delay in t i m e t a k e n for initiation of sporulation a n d decrease in percentage sporulation were observed a t 0.25 a n d 0.5 K lux intensity of white light. Sporulation u p t o t h e e x t e n t of its n a t u r a l population was achieved with white light between 2 to 3.5 K lux, t e m p e r a t u r e between 20 to 30 °C a n d p H between 4—9.

Factors controlling sporulation in green algae are little understood. Young filaments of Cladospora sp. were shown to exhibit akinete formation when grown in red light and not in blue light (PANTASTICO and Z E N A I D A 1 9 7 3 ) . Akinete formation in Ulothrix acrorhiza was observed to occur above 2 5 °C (OHGAI and T O R A Y A 1 9 8 0 ) . Effects of different qualities of light, intensities of white light, temperature and p H have been studied on the sporulation of Stigeoclonium pascheri by A G R A W A L ( 1 9 8 0 ) . In the present study we report the effect of various factors on the induction of akinete formation in Pithophora oedogonia ( M O N T . ) W I T T R O C K . Materials

and

methods

T h e alga Pithophora oedogonia ( M O N T . ) WITTROCK was collected f r o m a fresh w a t e r p o n d a t B . H . U . Campus. Clonal cultures were raised f r o m single germinating akinete a n d m a i n t a i n e d in B O L D ' S Basal Medium (BBM) (Cox a n d B O L D 1966) a t 22 ± 1 °C a n d illuminated a t 2 K lux light intensity f r o m d a y light fluorescent t u b e s for 16 hrs per day. T h e initiation of akinete f o r m a t i o n which commences to a p p e a r after f i v e days f r o m t h e d a y of inoculation of vegetative f i l a m e n t s was evident b y contraction of t h e greater p a r t of t h e protoplasm of a cell t o w a r d s one end. This p a r t gets s e p a r a t e d b y a s e p t u m a n d subsequently develops a thick wall u p o n m a t u r a t i o n a f t e r 15 d a y s of inoculation of filaments. F r a g m e n t s containing 8 —15 cells of 5 d a y old actively growing veget a t i v e f i l a m e n t s obtained f r o m B B M containing 5 fold N a N 0 3 (presence of high N a N 0 3 delays akinete formation) were used as source of inoculum. Quality of light: Different qualities of visible light were achieved b y w r a p p i n g t h e culture plates (inoculated with desired material) all a r o u n d with cellophane p a p e r of different colours a n d exposing t h e m t o cool white fluorescent light of culture chamber a t different distances so as to achieve uniform light intensity of 2 K lux in all cases. T h e spectral characteristics (wave lengths) of t h e light o b t a i n e d w i t h t h e filters against fluorescent l a m p as a light source was determined b y means of calibrated h a n d spectroscope. I n t e n s i t y of white light: I n o c u l a t e d culture plates (not covered with cellophane paper) were illuminated w i t h different light intensities, obtained b y a d j u s t i n g t h e distance of plates f r o m t h e light source (white fluorescent light) a t a c o n s t a n t t e m p e r a t u r e of 22 ^ 1 °C- Different light intensities were measured with t h e help of a s t a n d a r d lux meter. To obtain zero lux light intensity, some inoculated culture plates were k e p t in complete darkness a t 22 ^ 1 °C. T e m p e r a t u r e : I n o c u l a t e d culture plates were k e p t in B.O.D. i n c u b a t o r (SIS) a d j u s t e d t o differ e n t t e m p e r a t u r e s b u t a t a c o n s t a n t light intensity of ca. 2 K lux for 16 h a day. p H : T h e culture m e d i u m was a d j u s t e d t o different p H levels as determined t h r o u g h measurem e n t w i t h SYSTRONIC digital p H meter before autoclaving, either b y adding 1 N HC1 or 2 % N a O H 24*

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( D e p a r t m e n t of B o t a n y , B a n a r a s H i n d u University, Varanasi, I n d i a )

Effects of different factors on the sporulation of Pithophora oedogonia ( M O N T . ) W I T T R O C K S. C. AGRAWAL a n d Y . S . R . K .

(Eingegangen

SARMA

am 17. 9. 1982)

T h e present s t u d y emphasizes t h e effects of different qualities of visible light, intensities of white light, t e m p e r a t u r e a n d p H on t h e sporulation in t h e green alga Pithophora oedogonia ( M O N T . ) WITTROCK. Of t h e different qualities of light used, green light was f o u n d t o delay t h e initiation of sporulation. Percentage of sporulation was greatly decreased in yellow light followed by red light. Delay in t i m e t a k e n for initiation of sporulation a n d decrease in percentage sporulation were observed a t 0.25 a n d 0.5 K lux intensity of white light. Sporulation u p t o t h e e x t e n t of its n a t u r a l population was achieved with white light between 2 to 3.5 K lux, t e m p e r a t u r e between 20 to 30 °C a n d p H between 4—9.

Factors controlling sporulation in green algae are little understood. Young filaments of Cladospora sp. were shown to exhibit akinete formation when grown in red light and not in blue light (PANTASTICO and Z E N A I D A 1 9 7 3 ) . Akinete formation in Ulothrix acrorhiza was observed to occur above 2 5 °C (OHGAI and T O R A Y A 1 9 8 0 ) . Effects of different qualities of light, intensities of white light, temperature and p H have been studied on the sporulation of Stigeoclonium pascheri by A G R A W A L ( 1 9 8 0 ) . In the present study we report the effect of various factors on the induction of akinete formation in Pithophora oedogonia ( M O N T . ) W I T T R O C K . Materials

and

methods

T h e alga Pithophora oedogonia ( M O N T . ) WITTROCK was collected f r o m a fresh w a t e r p o n d a t B . H . U . Campus. Clonal cultures were raised f r o m single germinating akinete a n d m a i n t a i n e d in B O L D ' S Basal Medium (BBM) (Cox a n d B O L D 1966) a t 22 ± 1 °C a n d illuminated a t 2 K lux light intensity f r o m d a y light fluorescent t u b e s for 16 hrs per day. T h e initiation of akinete f o r m a t i o n which commences to a p p e a r after f i v e days f r o m t h e d a y of inoculation of vegetative f i l a m e n t s was evident b y contraction of t h e greater p a r t of t h e protoplasm of a cell t o w a r d s one end. This p a r t gets s e p a r a t e d b y a s e p t u m a n d subsequently develops a thick wall u p o n m a t u r a t i o n a f t e r 15 d a y s of inoculation of filaments. F r a g m e n t s containing 8 —15 cells of 5 d a y old actively growing veget a t i v e f i l a m e n t s obtained f r o m B B M containing 5 fold N a N 0 3 (presence of high N a N 0 3 delays akinete formation) were used as source of inoculum. Quality of light: Different qualities of visible light were achieved b y w r a p p i n g t h e culture plates (inoculated with desired material) all a r o u n d with cellophane p a p e r of different colours a n d exposing t h e m t o cool white fluorescent light of culture chamber a t different distances so as to achieve uniform light intensity of 2 K lux in all cases. T h e spectral characteristics (wave lengths) of t h e light o b t a i n e d w i t h t h e filters against fluorescent l a m p as a light source was determined b y means of calibrated h a n d spectroscope. I n t e n s i t y of white light: I n o c u l a t e d culture plates (not covered with cellophane paper) were illuminated w i t h different light intensities, obtained b y a d j u s t i n g t h e distance of plates f r o m t h e light source (white fluorescent light) a t a c o n s t a n t t e m p e r a t u r e of 22 ^ 1 °C- Different light intensities were measured with t h e help of a s t a n d a r d lux meter. To obtain zero lux light intensity, some inoculated culture plates were k e p t in complete darkness a t 22 ^ 1 °C. T e m p e r a t u r e : I n o c u l a t e d culture plates were k e p t in B.O.D. i n c u b a t o r (SIS) a d j u s t e d t o differ e n t t e m p e r a t u r e s b u t a t a c o n s t a n t light intensity of ca. 2 K lux for 16 h a day. p H : T h e culture m e d i u m was a d j u s t e d t o different p H levels as determined t h r o u g h measurem e n t w i t h SYSTRONIC digital p H meter before autoclaving, either b y adding 1 N HC1 or 2 % N a O H 24*

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S . C . AGRAWAL a n d Y . S . R . K .

SABMA

solutions. There was no change in the pH of medium, adjusted to any particular pH on 5th day after inoculation of experimental materials, however, it increased from pH 4.0 to 4.2, 5.0 to 5.2, 6.0 to 6.3, 7.0 to 7.3 and 8.0 to 8.2 in 20 day old culture. No change was observed in the pH of medium adjusted to either 9.0 or 10.0 even after 20 days of inoculation of the experimental material.

Results and

discussion

Q u a l i t y of l i g h t The quality of light was found to influence sporulation. In white light, initiation and maturation of akinete formation takes place on 5 and 15 days of inoculation, respectively. As compared to white light, the yellow, blue and red light were ineffective in regard to initiation and maturation of spores (Table 1). Green light was found to delay the initiation of sporulation by 15 more days. Percentage of sporulation was greatly decreased in yellow light followed by red light. Percentage sporulation in Table 1 Effects of different factors on sporulation of P. oedogonia Factors Quality of light White Red Yellow Green Blue Intensity of white light (K lux) 0.25 0.50 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 Temperature (°C) 0 5 10 15 20 25 30 35 40 pH

4 5 6 7 8 9 10

Initiation (days)

Maturation (days)

% akinete formation

5 5 5 20 5

15 15 15 30 15

97.0 72.0 53.5 97.5 97.0

7 7 6 5 5 5 5 4

23 19 15 15 15 15 13 11

36.0 49.5 70.0 91.3 96.0 97.4 98.5 99.0

—

3 5 5 5 5 12 13 —

8 5 5 5 5 5 5

—

10 15 15 15 15 22 26 —

18 15 15 15 15 15 15

0.0 40.5 69.0 90.3 98.0 98.2 99.0 75.6 0.0 98.5 97.0 98.0 96.3 98.4 98.0 8.4

S p o r u l a t i o n of Pithophora

oedogonia

349

blue and green light was similar to that of white light. In the green alga Stigeoclonium pascheri, of different qualities of light used, red light was most favourable to sporulation while green the least (AGRAWAL 1 9 8 0 ) . However, in Cladophora sp. P A N TASTICO and Z E N AIDA ( 1 9 7 3 ) observed no akinete formation in blue light although this was not the case in the present study. I n t e n s i t y of w h i t e l i g h t Akinetes were not formed in P . oedogonia in total darkness and all the vegetative cells died after 10 days of inoculation. Initiation of sporulation was seen to be delayed by one day in 1 K lux illumination, while it was delayed by two days in both 0.5 and 0.25 K lux illumination. Akinetes were found to mature four days in advance in 3.5 K lux illumination. A sharp decrease in percentage sporulation was observed at 0.25 and 0.5 K lux illumination (Table 1). In the blue -green alga Nodularia spumigena no spore formation was reported in total darkness, and the sporulation was delayed when the intensity was reduced below 2 K lux ( P A N D E Y and T A L P A S A Y I 1980). A reduction of sporulation was observed in Anabaena cylindrica at light intensities above 0.8 K lux and above 2.5 K lux few spores were formed (WOLK 1965). Also in Nostoc PCC 7524, sporulation was delayed by increasing the light intensity ( S U T H E R L A N D et al. 1979). However, in present study such was not the case. In green alga Stigeoclonium pascheri percentage sporulation reached maximum levels at the light intensity of 3.5 K lux (AGRAWAL 1980). But in the present study, light intensities between 2 to 3.5 K lux were equally favourable to maximum sporulation. Temperature Spores of P . oedogonia initiate and mature after 5 and 15 days, respectively, at 20 °C (control). No change was observed at 10, 15 and 25 °C in the time taken for initiation and maturation of spores as compared to control. However, the time taken for initiation of sporulation was considerably enhanced at 30 and 35 °C (Table 1). Maturation of spores was observed to be slightly delayed at 35 °C. All the vegetative cells died at 0 and 40 °C and as such the question of sporulation did not arise. The temperature at or below 10 °C decreased the percentage sporulation. A decrease in percentage sporulation was also observed at 35 °C. In the green alga Stigeoclonium pascheri percentage sporulation had a maximum at 25 °C temperature (AGRAWAL 1980). Similarly in a species of Chlamydomonas the temperature of 26 °C was most effective for its zygospore production (TRAINOR 1958). In the present study of P. oedogonia temperatures in the range of 20—30 °C were most favourable for sporulation. pH The initiation and maturation of P . oedogonia spores began after 5 and 15 days, respectively, between the pH of 5 and 10. At the pH of 4.0 initiation of sporulation was delayed by 3 more days. However, percentage of sporulation did not change within the range of pH 4 to 9 although there was a sharp decrease in percentage of sporulation at the pH of 10. TANOUE and ARUGA (1975) reported that remarkable cyst formation in Platymonas sp. within very short period of time by raising the pH of the culture to 9.0 or by lowering it to 6.0 as compared to their sluggish formation at the pH of 7.0 or 8.0. However, in Stigeoclonium pascheri it was pH of 8.0 which produced maximum results for sporulation (AGRAWAL 1980). In the present study a range of pH between 4—9 produces maximum sporulation.

350

S . C. AGRAWAL a n d Y . S. R . K . SARMA

T h e p o p u l a t i o n of P. oeodogonia w h i c h w a s collected f o r t h e p r e s e n t i n v e s t i g a t i o n s p o r u l a t e s u p t o 99 p e r c e n t in n a t u r e . F r o m t h e p r e s e n t s t u d y it is e v i d e n t t h a t perc e n t a g e s p o r u l a t i o n in c u l t u r e s of P. oedogonia r e a c h e d n e a r l y u p t o t h e e x t e n t of i t s n a t u r a l p o p u l a t i o n n o t o n l y a t a p a r t i c u l a r t e m p e r a t u r e , light i n t e n s i t y or p H b u t also w i t h i n a wide r a n g e of t h e s e p a r a m e t e r s .

Acknowledgements Thanks are due to Head, Department of Botany, B.H.U. for proving laboratory facilities and U.G.C. for financial assistance.

References AGRAWAL, S. C., 1980. Palynological studies on the green alga Stigeoclonium pascheri (VISCHER) Cox & BOLD. Ph. D. Thesis, Banaras Hindu University. Cox, E. R. and BOLD, H. C., 1966. Taxonomic investigation of Stigeoclonium. I n : Phycological studies VII (Ed. Univ. Texas), p. 10. OHGAI, M. and TORAYA, F., 1980. Formation and germination of the akinetes in Ulothrix acrorhiza. Shimonoseki Univ. Fish., 28, 83—88. PANDEY, R. K. and TALPASAYI, E. R. S., 1980. Control of sporulation in a blue-green alga Nodularia spumigena MERTENS. Ind. J. Bot., 3, 128 - 133. PANTASTICO, J . B. and ZENAIDA, S., 1973. Akinete differentiation in Cladophora sp. III. Effect of ageing and related factors. Philipp. Agric., 57, 305—312. SUTHERLAND, J . M . , HERDMAJT, M . a n d STEWART, W . D . P . , 1979. A k i n e t e s of t h e c y a n o b a c t e r i u m

Nostoc PCC 7524: Macromolecular composition, structure and control. J. Gen. Microbiol., 115, 273—287.

TANOUE, E. and ARUGA, Y., 1975. Encystment of Platymonas in culture. Mer. (Tokyo)., 15, 37-42. TRAINOR, F. R., 1958. Control of sexuality in Chlamydomonas chlamydogama. Amer. J. Bot., 45, 621-626.

WOLK, C. P., 1965. Control of sporulation in a blue green alga. Dev. Biol., 12, 15—35. Mailing address: Prof. Dr. Y. S. R. K. SARMA Department of Botany Banaras Hindu University Varanasi—221 005, India

Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie

23

1983

6

351-358

( V E B Jenapharm, Jena, DDR)

Relation of anabolic-catabolic glucose utilization in growth-limited cultures of Streptomyces griseus A. CHRTSTNER, E . J . BORMAJSTV a n d R . R E I C H E

(Eingegangen

am 7. 5.1982,

revidiert eingegangen am

6.10.1982)

Phenotypically different submerged mycelium conserves had been produced from a spore conserve of the HP-strain Streptomyces griseus and proofed in a product formation culture as a test system. The phenotypical characters induced on the base of the genotype proved in a cultivation cycle during 30—34 reduplications of the biomass constant. Employing the H P phenotype we investigated the possibility of economizing the substrate turnover by utilizing the anabolic potential for the synthesis of secondary substances and/or reducing the conservation catabolism during the stationary growth stage. As criteria for that served the stoichiometric turnover equation of the streptomycin biosynthesis and the quotient q 0 2 l q a l u c taking at full substrate oxidation the numerical value 6. During the stationary growth stage the relation of maintenance anabolism to maintenance catabolism in addition to the formation as secondary substances is not fixed in the tested H P phenotypes, but in a striking manner variable. The relation of by-product synthesis to secondary metabolism synthesis, too, is variable in the stationary growth stage with constant maintenance catabolism. Due to those response reactions on phenotypical manipulations an economization of the substrate turnover during the product formation stage with stationary growth is not possible in the streptomycin producer Streptomyces griseus.

The efficiency of microbial fermentation processes is determined by the productivity and the effectivity of substrate conversion likewise. By microorganisms producing secondary metabolites the substrate economy is important especially since the yields T p/S in relation to products show low values (BORMANN and CHRISTJSTER 1980). Thus only about 10% of the substrate were found as weight equivalents in antibiotics whereas the remaining 90% are utilized for catabolic reactions or by-product synthesis. Continuing own works about the anabolic-catabolic glucose turnover in Streptomyces griseus during stationary growth phase attention was given to the question how this relation of substrate consumption may be influenced by modification of biological material for seed cultures. That means investigations of submerged cultures in a laboratory fermenter inoculated with seed material coming from lyophilized conserves of aerial mycelium and spores or submerged mycelium, respectively. The last form is widely introduced in fermentation practice due to their uniformity of kind. The aerial mycelium conserves served as master conserves for mycelium conserves because the sporulation does not correlate strongly with biosynthesis (ROTH et al. 1982) and moreover, the surface cultures are difficult to be standardized for preparat i o n a n d b e a r i n g (KUNKEL 1 9 7 4 , SUTER et al. 1 9 7 6 , KALAKOUTSKI a n d AGRE 1 9 7 6 ) .

Our purpose was to obtain lyophilized mycelium from submerged cultures in different physiological stages. We want to check wether those differences can be fixed by lyophilization so that in a following fermentation under identical conditions differences in the effectivity of substrate consumption will appear. This concept based on the idea that the course of secondary metabolism is decided by the initial conditions of a fermentation process (CALAM 1978, NOVER et al. 1978). Due to a characteristic succession

of utilization of amino acids and glucose as substrates by Streptomyces griseus (BOR-

Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie

23

1983

6

351-358

( V E B Jenapharm, Jena, DDR)

Relation of anabolic-catabolic glucose utilization in growth-limited cultures of Streptomyces griseus A. CHRTSTNER, E . J . BORMAJSTV a n d R . R E I C H E

(Eingegangen

am 7. 5.1982,

revidiert eingegangen am

6.10.1982)

Phenotypically different submerged mycelium conserves had been produced from a spore conserve of the HP-strain Streptomyces griseus and proofed in a product formation culture as a test system. The phenotypical characters induced on the base of the genotype proved in a cultivation cycle during 30—34 reduplications of the biomass constant. Employing the H P phenotype we investigated the possibility of economizing the substrate turnover by utilizing the anabolic potential for the synthesis of secondary substances and/or reducing the conservation catabolism during the stationary growth stage. As criteria for that served the stoichiometric turnover equation of the streptomycin biosynthesis and the quotient q 0 2 l q a l u c taking at full substrate oxidation the numerical value 6. During the stationary growth stage the relation of maintenance anabolism to maintenance catabolism in addition to the formation as secondary substances is not fixed in the tested H P phenotypes, but in a striking manner variable. The relation of by-product synthesis to secondary metabolism synthesis, too, is variable in the stationary growth stage with constant maintenance catabolism. Due to those response reactions on phenotypical manipulations an economization of the substrate turnover during the product formation stage with stationary growth is not possible in the streptomycin producer Streptomyces griseus.

The efficiency of microbial fermentation processes is determined by the productivity and the effectivity of substrate conversion likewise. By microorganisms producing secondary metabolites the substrate economy is important especially since the yields T p/S in relation to products show low values (BORMANN and CHRISTJSTER 1980). Thus only about 10% of the substrate were found as weight equivalents in antibiotics whereas the remaining 90% are utilized for catabolic reactions or by-product synthesis. Continuing own works about the anabolic-catabolic glucose turnover in Streptomyces griseus during stationary growth phase attention was given to the question how this relation of substrate consumption may be influenced by modification of biological material for seed cultures. That means investigations of submerged cultures in a laboratory fermenter inoculated with seed material coming from lyophilized conserves of aerial mycelium and spores or submerged mycelium, respectively. The last form is widely introduced in fermentation practice due to their uniformity of kind. The aerial mycelium conserves served as master conserves for mycelium conserves because the sporulation does not correlate strongly with biosynthesis (ROTH et al. 1982) and moreover, the surface cultures are difficult to be standardized for preparat i o n a n d b e a r i n g (KUNKEL 1 9 7 4 , SUTER et al. 1 9 7 6 , KALAKOUTSKI a n d AGRE 1 9 7 6 ) .

Our purpose was to obtain lyophilized mycelium from submerged cultures in different physiological stages. We want to check wether those differences can be fixed by lyophilization so that in a following fermentation under identical conditions differences in the effectivity of substrate consumption will appear. This concept based on the idea that the course of secondary metabolism is decided by the initial conditions of a fermentation process (CALAM 1978, NOVER et al. 1978). Due to a characteristic succession

of utilization of amino acids and glucose as substrates by Streptomyces griseus (BOR-

A. C h b i s t n e e , E . J . B o r m a n n a n d R . R e i c h e

352

m a n n et al. 1978) t h e d i f f e r e n c e s of s t a r t p o i n t s h o u l d b e p r o v i d e d b y use of l y o p h i l i z e d m y c e l i u m h a r v e s t e d in t h e p h a s e of glucose u t i l i z a t i o n or w i t h o u t glucose u t i l i z a t i o n . T h e e f f e c t i v i t y of s u b s t r a t e c o n s u m p t i o n w a s d e t e r m i n d b y e s t i m a t i o n of r a t e s of glucose u p t a k e (/ G l u c , o x y g e n u p t a k e rf' 2 a n d p r o d u c t f o r m a t i o n k p . W e e s t i m a t e d t h e r e l a t i o n of t h e r a t e s w h e r e b y t h e s t o i c h i o m e t r i c e q u a t i o n of t h e s t r e p t o m y c i n bios y n t h e s i s (1) w a s a p p l i e d f o r t h e c a l c u l a t i o n of t h e p a r t of g l u c o s e f o r t h e p r o d u c t . (1)

3.25 C 6 H 1 2 0 6 + 7 N H 3 + 1.5 C 0 2 + 13.5 A T P + 3 H 2 0 — C 2 1 H 3 9 N 7 0 1 2 + 11.5 A D P + 11.5 P i + 2 A M P + 2 P P .

T h e r e l a t i o n of t h e r a t e s s h o w s t h e s c h e m e : 0 Gluc

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0.15 h - 1 . Energy balances of the utilization of the single substrates are used for interpretation of these results. F r o m this it is evident that methanol does not play the role of an energyrich substrate in the metabolism of yeast. Rather glucose is the energy-providing substrate in this combination.

Die Ertragskoeffizienten ( Y ) sind wichtige ökonomische Kenngrößen technischmikrobiologischer Prozesse. Sie zu verbessern, ist eines der Hauptziele biotechnologischer Forschung. Das aus der energetischen Bewertung der Substrate abgeleitete Auxiliarsubstrat-Konzept ( B A B E L 1 9 7 9 , 1 9 8 0 a, b) bietet einen Ansatz dafür. Danach sollte es möglich sein, durch Mischen von Substraten mit unterschiedlichem Energie/ Kohlenstoff-Verhältnis bei simultaner Verwertung die Verbrauchskoeffizienten (1 ¡Y) zu senken und/oder die Wachstumsgeschwindigkeit zu erhöhen. Glänzende Bestätigung hat dieses Konzept bereits erfahren durch die Arbeiten von V A N V E B S E V E L D et al. ( 1 9 7 9 — Mannit/Methanol — Paracoccus denitrificans), DIJKHUIZEN u. H A R D E R ( 1 9 7 9 — Acetat/Formiat — Pseudomonas oxalaticus), L I N T O N et al. ( 1 9 8 1 — Glucose/Formiat — Beneckea natriegens) und H E I N B I T Z et al. ( 1 9 8 2 — Parex/ Saccharose — Lodderomyces elongisporus). Es ist selbstverständlich, daß nicht jede — im obigen Sinne — geeignete Kombination und nicht jedes Mischungsverhältnis zum Erfolg führt und daß die physikalischenergetisch begründete Aufteilung der Substrate für die chemo-organo-heterotrophe Ernährung biochemisch verifiziert werden muß. Die Entscheidung darüber, ob ein Substrat Energieüberschuß hat und welche Substrate simultan verwertet werden können, wird auf biochemischem Niveau, also letztlich vom verwendeten Mikroorganismus gefällt. So ist Methan zweifellos energiereicher als Methanol, jedoch infolge des Methanoxygenierungsmechanismus wird dieser Unterschied aufgehoben, wahrscheinlich das Verhältnis sogar umgekehrt. Und Formiat ist, wenn es als einzige Kohlenstoff- und Energiequelle dient, eindeutig ein Energiedefizit-Substrat. Für Mikroorganismen dagegen, die Formiat lediglich oxydieren, aber den Formiat-Kohlenstoff nicht assimilieren können, wird Formiat zum Energieüberschuß-Substrat mit einem Energie/Kohlenstoff-Verhältnis von oo ( B A B E L 1 9 8 1 ) .

376

R . MÜLLEE, K . D . MARKUSKE u n d W .

BABEL

Methanol zählt zu den Kohlenstoff-limitierten Substraten (BABEL 1 9 7 9 , R O E L S 1980), im Falle, daß die experimentellen Ertragskoeffizienten größer als 0,54 g Trockensubstanz pro g Methanol sind (z.B. Pseudomonas C — G O L D B E R G et al. 1 9 7 6 , RocKEMeiaL 1 9 7 8 ) , erweist es sich auch biochemisch als solches (LINTON U. S T E P H E N S O N 1 9 7 8 , B A B E L 1 9 7 9 ) . Derartige Ertragskoeffizienten wurden jedoch mit „Serinweg-Bakterien" und Hefen nicht erreicht. Für diese Organismen liegen die Ertragskoeffizienten bei 0 , 4 g Trockensubstanz pro g Methanol (s. G O L D B E R G et al. 1 9 7 6 , E G L I 1 9 8 0 ) . Werte von 0 , 5 7 g/g (Torulopsis glabrata — A S T H A N A et al. 1 9 7 1 ) und 0 , 6 6 g/g (Candida boidinii K Y - 1 — M A L A S H E N K O et al. 1 9 7 6 ) sind für Hefen aus theoretischen Gründen eher unwahrscheinlich, 0,51 g/g dürften das Maximum darstellen (BABEL, unveröffentlichte Ergebnisse). Die metabolischen Bilanzen des Serin-Weges (bei Bakterien) wie des Triosephosphat-Weges der Hefen weisen darauf hin, daß für die Synthese von 3-Phosphoglycerat aus Methanol Energie (in Form von ATP und Reduktionsäquivalenten) aufgewendet werden muß, so daß — wenn diese Organismen nicht über effizientere Energiekonservierungssysteme verfügen als „Hexulosephosphatweg-Bakterien", wodurch die Energieaufwendungen für die Assimilationsschleifen kompensiert werden — das Wachstum dieser Organismen auf Methanol und damit die Fexp--Werte Energie-limitiert sind (vgl. A N T H O N Y 1 9 7 8 ) . Die unterschiedlichen Aufwendungen für die Synthese von 3-Phosphoglycerat aus Methanol via Ribulosebisphosphat-Weg und Serin-Weg, aber ähnliche Ertragskoeffizienten für Pseudomonas 1, Pseudomonas 135, Pseudomonas AMI, Pseudomonas M27, P. rosea (alle Serin-Weg — G O L D B E R G et cd. 1976) bzw. Paracoccus denitrificans (Ribulosebisphosphat-Weg — V A N V E R S E V E L D U. STOUTHAMER 1978) lassen den Schluß zu, daß der höhere Bedarf an Energie für die Nettosynthese von 3-Phosphoglycerat via Ribulosebisphosphat-Weg durch eine effizientere Energiekonservierung ausgeglichen werden kann. Die vorliegende Arbeit konzentriert sich auf die Kombination Methanol/Glucose — Hansenula polymorpha, wobei — unter Beachtung der besonderen Dj Y-Charakteristik für die Assimilation von Methanol — geprüft werden sollte, ob mit Hilfe von Methanol der Ertragskoeffizient für die Energie-limitierte Glucose gesteigert werden kann bzw. ob der überschüssige Kohlenstoff der Glucose zur Verbesserung des Fjicthanoi führt.

Material und

Methoden

Organismus und Kultivierung: Die Versuche wurden mit Hansenula polymorpha MH 20 (Stammsammlung ItC Leipzig) durchgeführt. Die Hefe wurde chemostatisch (Kohlenstoff-limitiert) in einem Laborfermentor LF-2 (CSAV Praha) bei 37 °C und einem pH-Wert von 4,5 kultiviert. Der pH-Wert wurde mittels 0,3 N NaOH konstant gehalten. Das Arbeitsvolumen betrug 1,4—2,0 1. Der Lufteintrag wurde bei einer konstanten Rührgeschwindigkeit von 500 U/min so eingestellt, daß im stationären Zustand der Fermentation eine Sauerstoffsättigung von 40 ^ 10% vorlag. Zur Kultivierung wurde das von EGLI (1980) beschriebene Mineralsalzmedium unter Zusatz von Thiamin und Biotin eingesetzt. Schaumbildung wurde durch Zugabe von 0,002% (v/v) SilikonAntischaumemulsion (SEKVA Biochemica, Heidelberg) unterdrückt. Die limitierenden Kohlenstoffquellen waren Methanol (p.A., V E B Laborchemie Apolda), Glucose (DAB 7, G E R M E D Berlin) bzw. ein Methanol/Glucose-Gemisch. Die Ausgangskonzentration der Kohlenstoffquelle betrug 3,05 g/1. Analytische Methoden: Die Biomassekonzentration wurde photometrisch bei 700 nm mittels SPEKOL (VEB CABL Z E I S S Jena) bestimmt und das Trockengewicht einer Eichkurve entnommen. Diese Eichkurve wurde gravimetrisch mit gewaschenen Zellen ermittelt, die bei 105 °C bis zur Gewichtskonstanz getrocknet wurden. Glucose wurde enzymatisch mit dem Hexokinase-Testbesteck (BoEHRiNGER-Mannheim) bestimmt. Die Methanol-Konzentration wurde mit einem Gaschromatographen GCHF 18.3 (CHROMATRON Berlin) ermittelt. Die Säule war 1 m lang und mit Porolyt gefüllt. Die Säulentemperatur betrug 110 °C, die Temperatur am Detektor und am Verdampfer 140 °C.

Methanol-Assimilation d u r c h H.

polymorpha

377

R e s p i r a t i o n : Die Respiration w u r d e mittels 0 2 - E l e k t r o d e (SMZ 300, METRA, Radebeül) bes t i m m t . Die Hefezellen w u r d e n n a c h 2maligem Waschen in einer K o n z e n t r a t i o n v o n ca. 1 m g Trockensubstanz zu 5 ml des Kultivierungsmediums in eine Meßvorrichtung gegeben. Die Messung wurde bei 30 °C u n d einem p H - W e r t v o n 4,5 d u r c h g e f ü h r t .

Ergebnisse Die W a c h s t u m s - u n d Ausbeutecharakteristik f ü r Hansenula polymorpha MH20 bei chemostatischer Kultivierung auf Methanol ist in Abbildung 1 dargestellt. Aus der doppelt reziproken A u f t r a g u n g der spezifischen W a c h s t u m s r a t e gegen die MethanolK o n z e n t r a t i o n wird eine maximale spezifische W a c h s t u m s r a t e auf Methanol von 0,24 h " 1 erhalten (nicht gezeigt). Der maximale Ertragskoeffizient Y (0,36 bis 0,38 g TS/g Methanol) wird n u r bei kleinen Wachstumsgeschwindigkeiten erreicht. Bei W e r t e n von fi > 0,12 h " 1 n i m m t Y ab. Bei /iTmx b e t r ä g t die Ausbeute n u r noch 0,23 g/g. Das Ausmaß der Abnahme von Y korreliert mit dem A u f t r e t e n von RestMethanol im F e r m e n t o r . Ob ein ursächlicher Zusammenhang zwischen beiden Ereignissen besteht, wird gegenwärtig g e p r ü f t . Der experimentell erreichte Ertragskoeffizient f ü r Glucose b e t r ä g t 0,50 g/g bei D — 0,127 h - 1 . Bei höheren Wachstumsgeschwindigkeiten (0,29 h _ 1 ) sinkt die Ausbeute auf 0,46 g/g ab, vermutlich bedingt durch Äthanolbildung (vgl. EGLI 1980). Zur Untersuchung der simultanen Verwertung beider Substrate wurde Hansenula polymorpha MH20 auf Methanol bzw. Glucose allein sowie auf unterschiedlichen Gemischen beider Substrate kultiviert. Zur Bewertung der E r t r ä g e wurden die Ertragskoeffizienten herangezogen, die unter den jeweiligen Bedingungen f ü r die Einzels u b s t r a t e erzielt worden sind. Wegen der besonderen Dj Y-Charakteristik f ü r Methanol wurden diese Untersuchungen bei verschiedenen Verdünnungsraten durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Abbildung 2 zusammengefaßt. Die erreichten Biomassekonzentrationen sind in allen Fällen höher als die unter der Annahme einer additiven Verwertung der Substratanteile zu erwartenden. Dieses Verhalten wird auf die simultane Verwertung beider Substrate zurückgeführt u n d im folgenden als Mischsubstratbzw. Auxiliarsubstrateffekt bezeichnet. Dieser E f f e k t ist jeweils maximal n u r bei einem bestimmten Verhältnis der Substrate abhängig von der gewählten Verdünnungsrate D (Abb. 3). Bei Geschwindigkeiten ¡i > 0,13 h _ 1 verändert sich das Verhältnis zugunsten der Glucose zunehmend.

Verdiinnungsrate (h'1) A b b . 1. W a c h s t u m s - u n d Ausbeutecharakteristik von Hansenula polymorpha M H 20 auf Methanol. Die H e f e wurde chemostatisch u n t e r den in Material u n d Methoden beschriebenen Bedingungen auf 3,05 g/1 Methanol kultiviert. 9 Biomasse, o Methanol, Ertragskoeffizient (g Trockensubstanz/g verbrauchtes S u b s t r a t )

26 Z. Allg. Mikrobiol., Bd. 23, H. 6

378

R . M Ü L L E S K . D . MABKTJSKB u n d W . B A B E L

Bei Verdünnungsraten von 0,090 h~ 1 wurden vergleichbare Resultate inbezug auf die Ausbeute erhalten wie bei Kultivierung bei D = 0,127 h _ 1 (nicht gezeigt). Der Mischsubstrateffekt ist maximal bei Wachstumsraten um 0,1 h _ 1 (Abb. 3). Gegenwart von Glucose bewirkt zusätzlich, daß Hansenula polymorpha MH20 Methanol mit größeren Wachstumsgeschwindigkeiten utilisieren kann als dies für dieses Substrat allein möglich ist (Abb. 2c; vgl. E G L I 1980, E G G E L I N G U . S A H M 1981, E G L I B : D=OJ1k

C-0

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1,5

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= 0,290

I

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Verdünnungsrate ( h~1)

Abb. 3. Ausbeutesteigerung bei simultaner Verwertung von Methanol und Glucose. Der Mischsubstrateffekt wurde berechnet aus der Steigerung der Biomassekonzentration in Relation zu der bei additiver Verwertung der Substrate berechneten (vgl. Abb. 2) beim jeweils optimalen Mischungsverhältnis (•) bzw. bei einem konstanten Gewichtsverhältnis von 75% Methanol und 25% Glucose (o)

Methanol-Assimilation durch H. polymorpha

379

et al. 1982). Jedoch liegen die erreichten Biomassekonzentrationen, trotz Mischsubstrateffektes, wegen der starken Abnahme des Y-Wertes für Methanol beträchtlich unter den maximal möglichen Werten (Abb. 2). Daß Glucose die Verwertung von Methanol oberhalb von D ^J 1 ™ 01 ermöglicht, hat eine Erniedrigung der RestmethanolKonzentration bei Geschwindigkeiten von DC Mix / J£ < D ^ h a n o 1 zur Voraussetzung (zu ersehen in Abb. 2 aus der Abnahme der Differenz der bei additiver Verwertung der Substrate erzielten Biomassen zu den bei vollständigem Umsatz des Methanols möglichen). Es erhebt sich die Frage, ob diese niedrigeren Methanol-Konzentrationen etwa veränderte (erhöhte) Y-Werte für Methanol zur Folge haben und damit den Auxiliarsubstrateffekt nur vortäuschen. Gegen diese Möglichkeit sprechen die Ergebnisse bei Kultivierung bei D = 0,127 h - 1 . Bei dieser Wachstumsgeschwindigkeit sind die experimentell erhaltenen Ertragskoeffizienten für die Einzelsubstrate maximal, Restmethanol liegt in noch nicht meßbarer Konzentration vor (vgl. Abb. 1), und dennoch ist hier die Ausbeutesteigerung am größten (Abb. 3). Der Effekt wird auf eine simultane Verwertung beider Substrate zurückgeführt. Diese Tatsache berechtigt, auch bei den größeren D-Werten die Y-Werte für Methanol zur Berechnung des Mischsubstrateffektes zugrundezulegen, die bei Wachstum auf diesem Substrat allein erhalten wurden. Zur Gesamtcharakterisierung des Stoffwechsels wurde die Fähigkeit zur Respiration auf Methanol bzw. Glucose nach chemostatischer Kultivierung von Hansenula polymorpha MH20 auf Methanol, Glucose bzw. dem Substratgemisch, bei welchem der Mischsubstrateffekt maximal war, herangezogen (Tab. 1). Die Ergebnisse zeigen, daß bei simultaner Substratverwertung der Stoffwechsel so eingestellt ist, daß die charakteristischen Substratumsätze dem Verhalten bei Wachstum auf den jeweiligen Einzelsubstraten entsprechen. Detaillierte enzymatische Untersuchungen werden durchgeführt (Publikation in Vorbereitung). Wie die Ergebnisse in Abbildung 2 zeigen, ändern sich in Abhängigkeit von der gewählten Verdünnungsrate die Substratanteile, die zur Erzielung des maximalen Mischsubstrateffektes erforderlich sind. Es erhebt sich die Frage, ob dieses Verhalten in Beziehung zu der mit Vergrößerung von D einhergehenden Verringerung des YWertes für Methanol steht. Aus Abbildung 4 geht hervor, daß das jeweilig ermittelte optimale Mischungsverhältnis tatsächlich mit der Effizienz der Methanol-Verwertung Tabelle 1 Respiratorische Aktivität von Hansenula polymorpha MH 20 bei Wachstum auf unterschiedlichen Substraten bzw. Substratgemischen D (h-»)

Wachstum auf

Respiration auf Glucose Methanol (nM 0 2 /min • mg TS)

0,127

Methanol Glucose Methanol -f- Glucose

190 51 115

0 32 20

0,214

Methanol Glucose Methanol + Glucose

164 15 148

0 23 35

0,290

Methanol Glucose Methanol + Glucose

7 66

-

15 12

1

)

Bei Wachstum auf Substratgemischen wurde das bei den entsprechenden Verdünnungsraten ermittelte optimale Mischungsverhältnis (s. Abb. 2) eingesetzt, kein Wachstum bei dieser Verdünnungsrate 26*

380

R . MÜLLEK, K . D. MAKKTJSKE und W . BABEL

korreliert, d. h. daß der Glucose-Anteil im Mischsubstratoptimum in dem Maße ansteigt, wie der F-Wert für Methanol bei der entsprechenden Geschwindigkeit abnimmt. Für die Berechnung wurde ein theoretisch maximaler Ertragskoeffizient für Methanol von 0,51 g/g zugrundegelegt (BABEL unveröff.). Dieser Wert und die Tatsache, daß die experimentellen Y-Werte nur um 0,38 g/g liegen (Abb. 1, vgl. EGLI 1980) erklären, daß eine Ausbeutesteigerung durch simultane Verwertung von Glucose auch bei den experimentell maximalen F-Wertfen für Methanol zu erwarten ist. Aus dem Schnittpunkt mit der Abszisse in Abbildung 4 folgt, daß der F-Wert für Methanol bei ^ a x bei 0,09 liegt. Die Extrapolation der D j Y-Kurve in Abbildung 1 bis zum Schnittpunkt mit diesem Wert ergibt einen // m a x -Wert von ca. 0,35 h - 1 bei simultaner Verwertung von Methanol und Glucose. Dieser Wert stimmt mit vorläufigen wachstumskinetischen Daten bei Mischsubstratverwertung annähernd überein (Publikation in Vorbereitung).

Ay

Abb. 4. Variation des optimalen Mischungsverhältnisses in Abhängigkeit von der Effizienz der Methanol-Verwertung. Die Änderung des optimalen Mischungsverhältnisses Q (Methanol: Glucose, in Mol/1) bei variablem D (vgl. Abb. 2) wurde mit der Abnahme des Y-Wertes für Methanol bei Erhöhung von D (vgl. Abb. 1) korreliert. Die Verringerung der Effizienz der Methanol-Verwertung AY wurde errechnet aus der Differenz des auf biochemischer Basis errechneten maximalen Y-Wertes für Methanol von 0,51 g/g und den bei den entsprechenden Verdünnungsraten ermittelten Ertragskoeffizienten

Die bei der simultanen Substratassimilation erhaltenen Biomasseausbeuten lassen verschiedene Interpretationen zu, da keine Untersuchungen mit radioaktiv markierten Substraten durchgeführt wurden. Für den Fall, daß Methanol ein Energieüberschußsubstrat ist, sollte der C-Einbau der Glucose verbessert werden können. Wird angenommen, daß Glucose zu 100% eingebaut wird ( F = 0,85 g/g), erhält man bei kleinen Wachstumsgeschwindigkeiten noch Y-Werte für Methanol, die mit 0,43 g/g größer als die experimentell ermittelten sind, d. h. hier führt die simultane Verwertung beider Substrate zu einer Steigerung der Y-Werte für beide Substrate. Bei höheren Wachstumsraten stimmt diese Relation auf Grund der Ergebnisse in Abbildung 1 nicht mehr und kehrt sich bei Werten für // > (Uj1'®!,1'™01 sogar um, d. h. hier ist der C-Anteil der Glucose in der Mischung schon größer als für einen 100%igen Einbau benötigt würde (Abb. 5). Wahrscheinlicher ist — unter Berücksichtigung der Ergebnisse in Abbildung 4 — daß Glucose sogar Energie für die Assimilation von Methanol liefert. Wird die bei Mischsubstratverwertung erhaltene Biomasse allein auf den Kohlenstoffeinbau aus Methanol zurückgeführt, so ergibt sich ein F-Wert von 0,54 g/g, der mit dem theoretisch berechneten maximalen F-Wert für Methanol von 0,51 g/g praktisch identisch ist und dem mit 67% C-Einbau aus Energieüberschußsubstraten (vgl.

Methanol-Assimilation durch H. polymorpha

381

0,8

§

0,6

Ofi 0,2

-0,2 0

0,1

0,2

0,3

Vtrdünnungsrate (h'1)

Abb. 5. Theoretische Ertragskoeffizienten bei simultaner Verwertung von Methanol und Glucose. Den Berechnungen liegen die Ergebnisse aus Abb. 2 zugrunde. • Ertragskoeffizient für Methanol unter der Annahme einer 100%igen Inkorporation des Kohlenstoffs aus Glucose (Zoiucose = = 0,85 g/g); A Ertragskoeffizient für Methanol unter der Annahme, daß Glucose nur der Energiebereitstellung dient und kein Kohlenstoff aus diesem Substrat inkorporiert wird (,,Methanol" Biomasse); o Kohlenstoffeinbau aus Methanol unter den bei A getroffenen Annahmen; • Ertragskoeffizient für Glucose unter der Annahme, daß Methanol nur der Energiebereitstellung dient und kein Kohlenstoff aus diesem Substrat inkorporiert wird (,,Glucose"-Biomasse); e Kohlenstoffeinbau aus Glucose unter den bei A getroffenen Annahmen.

1979) erreichten Grenzwert entspricht (Abb. 5). Diese Betrachtungen gelten nur für Werte von /jl < /uJ;^txhano1. Bei größeren spezifischen Wachstumsraten ändert sich das optimale Mischungsverhältnis so weit zugunsten der Glucose, daß vergleichbare Y-Werte nur dann erhalten werden, wenn man annimmt, daß der GlucoseKohlenstoff jetzt zur Biomassesynthese genutzt wird und Methanol primär der Energiebereitstellung dient. Dann beträgt der Y-Wert für Glucose 0,66 g/g und kommt dem theoretisch maximalen Wert von 0,59 g/g nahe. Der Kohlenstoff-Einbau aus Glucose entspräche 78%. Bei Erreichen des /. § 'S —< 03

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396

H . TSCHAPE a n d E . TIETZE

Results 14 plasmids (Table 2) are representatives from a group of more than 30 plasmids isolated from various wild type strains including Shigella sonnei, Shigella flexneri, Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae. The strains originated in different countries and were sent for plasmid analysis to our institute. Each of these plasmids could be transferred by conjugation to E. coli K12 substrains and from them to other enteric bacteria, including Salmonella, Citrobacter, and Proteus. I n all bacterial hosts tested the plasmids under question have been stably maintained; in E. coli Hfr(H) the}' did not repress the F-pilus production and are therefore designated Cultures of E. coli K12 J 5 3 harbouring these plasmids were not lysed by donor specific phages M13, fr, I f m , P R R 1 , PRD1, PR4, and Ike in surface spot tests and did not support propagation of these phages. The molecular sizes of the plasmids under investigation range between 60 and 70 Md as determined by agarose gel electrophoresis (Table 2). I n testing the incompatibility grouping all plasmids listed in Table 2 did not show immunity to superinfection by the reference plasmids used in these experiments (Table 1) and transconjugant clones stably maintained both resident and superinfecting plasmids with one exception plasmids from the IncB group (here pIE617, R16 as representative examples, Table 3). However, instability observed with IncB plasmids refers only to the resident plasmid whereas the superinfecting plasmid is maintained fairly stable under even nonp/E5bU 60.01 Md

plE 5U5 . plE 570 plE 619 p/E 620 p/E 626 65.U1 Md 63.56 Md 62.78 Md 65.76 Md 65.36 Md

Md 10.0-

5.0-

2.0-

1.0-

0.5Tig. 1. D N A f r a g m e n t p a t t e r n s generated b y E c o R I digestion of 6 InoZ reference plasmids. The E c o R I digestion of partially purified plasmid D N A w a s performed as described in TIETZE et al. (1982). Additionally, E c o R I - d i g e s t e d R 1 0 0 - D N A (TANAKA et al. 1976) was e m p l o y e d as reference for t h e molecular w e i g h t e s t i m a t i o n of restriction fragments. T h e electrophoresis w a s carried o u t in 0 . 7 % a n d 1.0% agarose gels a t 5 m A for 16 hours. Fig. 1 summarizes t h e results f r o m gels w i t h different agarose concentrations b y arranging t h e f r a g m e n t s according t o their sizes. The s u m of f r a g m e n t sizes is g i v e n w i t h the p l E of t h e respective plasmid (conféré also Table 2). The e n z y m e E c o R I w a s a gift b y Dr. W . HARTMANN, Z I M E T , J e n a , G . D . R .

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R387

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