Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie: Band 23, Heft 5 [Reprint 2021 ed.] 9783112565520, 9783112565513

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ZEITSCHRIFT FÜR ALLGEMEINE MIKROBIOLOGIE AN INTERNATIONAL JOURNAL ON MORPHOLOGY, PHYSIOLOGY, GENETICS, AND ECOLOGY OF MICROORGANISMS BAND 23 • 1983 • HEFT 5

W ISSN 0044-2208

AKADEMIE-VERLAG Z. Allg. Mikrobiol., Berlin 23 (1983) 5, 281-344

BERLIN EVP 2 0 , - M

Z E I T S C H R I F T FÜR A L L G E M E I N E M I K R O B I O L O G I E VOLUME 23

1983

NUMBER 5

CONTENTS Cellulolytic enzymes associated with the fruit rots of Citrus sinensis caused by Aspergillus aculeatus and Botryodiplodia theobromine Purification and production of the arom aggregate from Schizosaccharomyces pombe Fluoride-induced filaments of Erwiniu carotovora Growth of Candida albicans on artificial D-glucosc derivatives S h o r t Note Biological action of transition metal complexes. /?Lactamase-inhibiting activity of cis-dichlorodiammine-platinum(II) and (>-methyl-pyrid-2-ylammine-palladium-dichloridc (I'd 25681) in comparison to that of clavulanic acid and penicillanic acid sulfone CP 45899 by means of the nitrocefin test method using the TITERTEK/Microtitcr system Review The regulatory role of microbial secondary metabolites and related compounds as endogenous signals of cell differentiation

V . A . ADISA a n d A . 0 . FAJOLA

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R . BODE a n d G . K U N Z E

289

B . A . GASHE a n d M . M . GRULA

297

M . HRMOVÂ, E . STURDÎK, M . KOSÎK, P . GEMEINER a n d L . PETRUS

303

W . F . FLECK, B . H E Y N SCHRÖER

313

U . GRÄFE

and

H.-P.

319

ZEITSCHRIFT FÜR ALLGEMEINE MIKRO- BIOLOGIE A N INTERNATIONAL JOURNAL ON MORPHOLOGY, PHYSIOLOGY, GENETICS,

HERAUSGEGEBEN VON

G. F. Gause, Moskau 0 . Hoffmann-Ostenhof, Wien A. A. Imseneckii, Moskau R. W. Kaplan, Frankfurt/M. F. Mach, Greifswald 1. Malek, Prag C. Weibull, Lund

unter der Chefredaktion von W. Schwartz, Braunschweig und U. Taubeneck, Jena

AND ECOLOGY OF MICROORGANISMS UNTER MITARBEIT VON

J . H. Becking, Wageningen H. Böhme, Gatersleben M. Girbardt, Jena S. I. Kusnecov, Moskau 0 . Necas, Brno C. H. Oppenheimer, Port Aransas N. Pfennig, Göttingen I. L. Rabotnova, Moskau A. Schwartz, Wolfenbüttel

REDAKTION

BAND 2 3

• 1983 • HEFT 5

AKADEMIE-VERLAG BERLIN

U. May, Jena

Die Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie soll dazu beitragen, Forschung und internationale Zusammenarbeit auf dem Gebiet der Mikrobiologie zu fördern. Es werden Manuskripte aus allen Gebieten der allgemeinen Mikrobiologie veröffentlicht. Arbeiten über Themen aus der medizinischen, landwirtschaftlichen, technischen Mikrobiologie und aus der Taxonomie der Mikroorganismen werden ebenfalls aufgenommen, wenn sie Fragen von allgemeinem Interesse bebehandeln. Zur Veröffentlichung werden angenommen: Originalmanuskripte, die in anderen Zeitschriften noch nicht veröffentlicht worden sind und in gleicher Form auch nicht in anderen Zeitschriften erscheinen werden. Der Umfang soll höchstens l x / 2 Druckbogen (24 Druckseiten) betragen. Bei umfangreicheren Manuskripten müssen besondere Vereinbarungen mit der Schriftleitung und dem Verlag getroffen werden. Kurze Originalmitteilungen über wesentliche, neue Forschungsergebnisse. Umfang im allgemeinen höchstens 3 Druckseiten. Kurze Originalmitteilungen werden beschleunigt veröffentlicht. Kritische Sammelberichte und Buchbesprechungen nach Vereinbarung mit der Schriftleitung. Bezugsmöglichkeiten der Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie: Bestellungen sind zu richten — in der DLR an eine Buchhandlung oder an den Akademie-Verlag, DDR-1086 Berlin, Leipziger Straße 3 - 4 ; — im sozialistischen Ausland an eine Buchhandlung für fremdsprachige Literatur oder an den zuständigen Postzeitungsvertrieb; — in der BRD und Berlin(West) an eine Buchhandlung oder an die Auslieferungsstelle KUNST UND WISSEN, Erich Bieber, OHG, Wilhelmstraße 4 - 6 , D-7000 Stuttgart 1; — in den übrigen westeuroäpischen Ländern an eine Buchhandlung oder an die Auslieferungsstelle KUNST UND WISSEN, Erich Bieber GmbH, Dufourstraße 51, CH-8008 Zürich; — im übrigen Ausland an den Internationalen Buch- und Zeitschriftenhandel; den Buchexport, Volkseigener Außenhandelsbetrieb der Deutschen Demokratischen Republik, DDR-7010 Leipzig, Postfach 160, oder an den Akademie-Verlag, DDR-1086 Berlin, Leipziger Straße 3—4. Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie Herausgeber: Im Auftrag des Verlages von einem internationalen Wissenschaftlerkollektiv herausgegeben. Verlag: Akademie-Verlag, DDR-1086 Berlin, Leipziger Straße 3 - 4; Fernruf: 2 23 62 29 oder 2 23 62 21 Telex-Nr.: 114420; Bank: Staatsbank der DDR, Berlin, Kto-Nr.: 6836-26-20712. Chefredaktion: Prof. Dr. U D O T A U B E N E C K Prof. Dr. W I L H E L M S C H W A B T Z Anschrift der Redaktion: Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften, DDR-6900 Jena, Beutenbergstr. 11; Fernruf: Jena 852200; TelexNr.: 058621. Veröffentlicht unter der Lizenznummer 1306 des Presseamtes beim Vorsitzenden des Ministerrates der Deutschen Demokratischen Republik. Gesamtherstellung: VEB Druckerei „Thomas Müntzer", DDR-5820 Bad Langensalza. Erscheinungsweise: Die Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie erscheint jährlich in einem Band mit 10 Heften. Bezugspreise je Band 250,—M zuzüglich Versandspesen (Preis für die DDR 200,-M). Preis je Heft 2 5 , - M (Preis für die DDR 2 0 , - M ) . Urheberrecht: Alle Rechte vorbehalten, insbesondere die der Übersetzung. Kein Teil dieser Zeitschrift darf in irgendeiner Form — durch Photokopie, Mikrofilm oder irgendein anderes Verfahren — ohne schriftliche Genehmigung des Verlages reproduziert werden. — All rights reserved (including those of translations into foreign languages). No part of this issue may be reproduced in any form, by photoprint, microfilms or any other means, without written permission from the publishers. Erscheinungstermin: Juni 1983 Bestellnummer dieses Heftes 1070/23/5 © 1983 by Akademie-Verlag Berlin. Printed in the German Democratic Republic. AN (EDV) 75218

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(Department of Botany, University of Ibadan, Ibadan, Nigeria)

Cellulolytic enzymes associated with the fruit rots of Citrus sinensis caused by Aspergillus aculeatus and Botryodiplodia theobromae V . A . ADISA a n d A . 0 . FAJOLA

(Eingegcmgen

am 13. 5. 1982)

Botryodiplodia theobromae and Aspergillus aculeatus were inoculated in carboxymethylcellulose (CMC) medium and on filter papers. Hydrolysis of the CMC medium and degradation of the filter papers were observed, indicating the production of G1 and Cx cellulases by the two rot pathogens. The G1 and Cx enzymes were also detected in filtrates of rotted orange fruits obtained by infection with the two pathogens. The cellulases could not induce rot development on their own. However, when they were added to pectinases in an enzyme inoculum, the incubation period for inducing rot development was shorter, thus establishing a secondary role for the cellulases in the rot development. Optimum conditions for the action of the cellulases included a neutral pH and temperature ranging from 25 to 30 °C.

The role of pectinolytic enzymes in tissue maceration and cell separation during rot development has been much emphasized and well-documented (WOOD 1971, TRIBE 1955). However, the role of other enzymes such as cellulases in rot development has not been well-established. HUSAXK (1958) reported that relatively little is known about cellulases of plant pathogens in vivo. According to HUSAIN (1958) and HUSATN and DIMOND (1958), only a small proportion of plant pathogens are able to degrade insoluble cellulose, even after physical or chemical modification rendering it more susceptible to enzyme action. WOOD (1960) claimed that in the breakdown of the insoluble cellulose that is more important in the study of rot development and that investigations solely based on the degradation of soluble cellulose may have a limited impact. He also asserted that only cellulases of a few fungi have been studied in detail, and even with the same organism, there appears to be a general disagreement concerning the ability to degrade native cellulose. Furthermore, there are different views regarding the number of cellulases able to degrade cellulose.There may exist only one type (THOMAS and WHITAKER 1958), two t y p e s (KOOIMAN 1 9 5 7 ) , or a n u m b e r of e n z y m e s (HASH a n d KING 1 9 5 8 , R E E S E a n d LEVINSON 1 9 5 2 ) . H o w e v e r , t h e m o s t r e c e n t reviews (MANDELS a n d R E E S E 1 9 6 5 ,

MANDELS and STEINBERG 1976) emphasize that cellulose utilization by fungi depends on their capability to produce the C\ and C% enzymes. The production in vitro and in vivo of cellulases by Botryodiplodia theobromae and Aspergillus aculeatus as well as their role in the development of the post-harvest rots of Citrus sinensis are reported in this paper. Materials

and

methods

Production and quantitative estimation of cellulases: The production of cellulases by the two rot organisms in culture as well as in rotted and healthy orange tissues were investigated. The utilization of an insoluble (native) form of cellulose by the test fungi was tested by a modification of the method of GARRETT (1962). Wads of 10 filter papers (WHATMAN NO. 9.0 cm) were oven-dried, 20*

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(Department of Botany, University of Ibadan, Ibadan, Nigeria)

Cellulolytic enzymes associated with the fruit rots of Citrus sinensis caused by Aspergillus aculeatus and Botryodiplodia theobromae V . A . ADISA a n d A . 0 . FAJOLA

(Eingegcmgen

am 13. 5. 1982)

Botryodiplodia theobromae and Aspergillus aculeatus were inoculated in carboxymethylcellulose (CMC) medium and on filter papers. Hydrolysis of the CMC medium and degradation of the filter papers were observed, indicating the production of G1 and Cx cellulases by the two rot pathogens. The G1 and Cx enzymes were also detected in filtrates of rotted orange fruits obtained by infection with the two pathogens. The cellulases could not induce rot development on their own. However, when they were added to pectinases in an enzyme inoculum, the incubation period for inducing rot development was shorter, thus establishing a secondary role for the cellulases in the rot development. Optimum conditions for the action of the cellulases included a neutral pH and temperature ranging from 25 to 30 °C.

The role of pectinolytic enzymes in tissue maceration and cell separation during rot development has been much emphasized and well-documented (WOOD 1971, TRIBE 1955). However, the role of other enzymes such as cellulases in rot development has not been well-established. HUSAXK (1958) reported that relatively little is known about cellulases of plant pathogens in vivo. According to HUSAIN (1958) and HUSATN and DIMOND (1958), only a small proportion of plant pathogens are able to degrade insoluble cellulose, even after physical or chemical modification rendering it more susceptible to enzyme action. WOOD (1960) claimed that in the breakdown of the insoluble cellulose that is more important in the study of rot development and that investigations solely based on the degradation of soluble cellulose may have a limited impact. He also asserted that only cellulases of a few fungi have been studied in detail, and even with the same organism, there appears to be a general disagreement concerning the ability to degrade native cellulose. Furthermore, there are different views regarding the number of cellulases able to degrade cellulose.There may exist only one type (THOMAS and WHITAKER 1958), two t y p e s (KOOIMAN 1 9 5 7 ) , or a n u m b e r of e n z y m e s (HASH a n d KING 1 9 5 8 , R E E S E a n d LEVINSON 1 9 5 2 ) . H o w e v e r , t h e m o s t r e c e n t reviews (MANDELS a n d R E E S E 1 9 6 5 ,

MANDELS and STEINBERG 1976) emphasize that cellulose utilization by fungi depends on their capability to produce the C\ and C% enzymes. The production in vitro and in vivo of cellulases by Botryodiplodia theobromae and Aspergillus aculeatus as well as their role in the development of the post-harvest rots of Citrus sinensis are reported in this paper. Materials

and

methods

Production and quantitative estimation of cellulases: The production of cellulases by the two rot organisms in culture as well as in rotted and healthy orange tissues were investigated. The utilization of an insoluble (native) form of cellulose by the test fungi was tested by a modification of the method of GARRETT (1962). Wads of 10 filter papers (WHATMAN NO. 9.0 cm) were oven-dried, 20*

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weighed and placed in each of 8 sterile PETRI dishes. 50 ml of a basal medium containing the following substances (in mg/1) were added to each PETRI dish: K 2 H P 0 4 1000, MgS0 4 • 7 H 2 0 300, peptone 1000, yeast extract 100, and 1 ml of microelement solution (FERGUS 1964). The p H was adjusted to 7.0 with 0.2 N NaOH after sterilization. The cellulolytic activity of the rot organisms was tested in liquid cellulose cultures and rotted orange fruits using a modified method of REESE and MANDELS (1963). Two liquid media, carboxymethyl cellulose (CMCM) and basal medium (NCMC) were employed. Also orange fruits were inoculated with the test fungi. An average volume of 50 ml of fruit juice from each of the healthy and rotted fruits was taken for enzyme estimation. Reducing sugars (R.S.) were determined in CMCM, NCMC and fruit juices. One gram of 3,5,dinitrosalicyclic acid, 20 ml of 2 N NaOH, and 30 g of potassium sodium tatarate were dissolved in 100 ml of water and heated for 5 min in boiling water. 3 ml of this reagent and 10 ml of H 2 0 were added to 1 ml of each enzyme filtrate and the amount of the reducing sugars produced was estimated by determining the optical density (absorption spectrum) at 550 nm wavelength with a ZEISS spectrophotometer PM 2A. The values of the reducing sugars produced were read off from a calibration curve constructed from the optical densities given by serial concentrations (0, 0.125, 0.25, 0.5, 1.0, and 2.0 mg/ml) of standard solutions of D-glucose. The cellulases were assayed by inoculating 1 ml of enzyme filtrate (from cultures and fruit juices) into 9 ml of substrate containing 0.55% of CMC (BDH sodium salt) in 0.55 M citrate buffer, p H 4.5. Incubation was at 37 °C for 1 hr. One enzyme unit produces 4 mg of reducing sugar in 10 ml of the reaction mixture. The sugars are expressed as total reducing sugars (T.R.S.). The effect of temperature on the activity of cellulases from the different sources was investigated a t 10°, 15°, 20°, 25°, 30°, 40°, 50°, 60°, and 70 °C. After one hour, all reaction mixtures were cooled and stored at 0 °C before the total reducing sugars were determined. The p H was adjusted by following t h e m e t h o d of NOLAN (1976).

Effects of cellulolytic enzymes in rot development: Cellulases in culture (obtained as described above) and pectinases from 3 days old inoculated wheat offal cultures (WINSTEAD and WALKER 1954) were either separately or in combination used to treat the degreened sterilized surface of healthy orange fruits. Controls were inoculated with 2 drops of distilled water. Regular observations were made during incubation at 25 °C.

Results E s t i m a t i o n of c e l l u l a s e s i n c u l t u r e , h e a l t h y a n d r o t t e d o r a n g e f r u i t s B. theobromae and A. aculeatus significantly degraded the filter papers as s h o w n b y the losses of dry weight (Table 1). This net loss m a y be due t o the production of nonrecoverable products of cellulose degradation such as carbon dioxide. B o t h fungi grow on the filter papers and A. aculeatus also sporulated on it. I n liquid media the t w o test fungi caused significant hydrolysis of the m e t h y l cellulose-citrate medium (Table 1). Large quantities of extracellular cellulases were produced b y both fungi during the 5 d a y s incubation period. A. aculeatus produced more cellulases t h a n B. theobromae on CMCM, while B. theobromae produced more cellulases in the basal medium lacking cellulose (NCMC) than in CMCM. I n 5 successive trials, samples of the juice obtained from rotted orange fruits s h o w e d significant cellulolytic a c t i v i t y . The activities recorded in filtrates of fruits rotted b y A. aculeatus and B. theobromae were higher than those in culture filtrates (Tables 1 a n d 2). B o t h fungi produced significant a m o u n t s of C1 and Cx cellulases in vitxo a n d in vivo. I n contrast, o n l y slight traces (0.1 mg/ml) of cellulolytic e n z y m e a c t i v i t y w a s d e t e c t e d in filtrates from h e a l t h y orange fruits (Table 2). T h e stability and a c t i v i t y of the cellulases of the t w o fungi were affected b y p H and temperature (Figs. 1 and 2). The e n z y m e s were b o t h stable and active b e t w e e n p H 6 — 8 , w i t h the peak of a c t i v i t y being observed a t p H 7.0 (Fig. 2). The a c t i v i t y rose sharply from p H 3.0 to p H 7.0 and declined rapidly thereafter. There w a s a general increase in cellulase a c t i v i t y b e t w e e n 1 0 ° — 4 0 °C for B. theobromae and 1 5 ° — 5 0 °C

Cellulolytic enzymes of Aspergillus and Botryodiploclia

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U . GRÄFE

Veränderte Struktur der zellulären Rezeptoren bildet nach den bisher vorliegenden Informationen eine verbreitete Ursache der Resistenz von Bildnern gegen das eigene Antibioticum. Ribosomen aus Streptomyces azureus binden vergleichsweise nur wenig Thiostrepton wegen der Anwesenheit einer speziellen 23S rRNS-Komponente in ihrer methylierten Form ( D I X O N et al. 1 9 7 5 , C U N D L I E E E 1 9 7 8 , T H O M P S O N U. C U N D L I F F E 1 9 8 1 ) . Ähnlich erwies sich auch Strejptomyces tenjimariensis S S - 9 3 9 als hochresistent gegen das produzierte Aminoglykosid Istamycin (YAMAMOTO et al. 1 9 8 1 ) . Von Ribosomen aus Streptomyces erythreus ist bekannt, daß sie weder Erythromycin binden noch die für dieses Antibioticum typische Hemmung der Acetylphenylalanyl-Puromycinsynthetase beim in vitro-Test zeigten ( T E R A O K A U. T A N A K A 1 9 7 4 ) . Als Ursache wird ebenfalls Methylierung einer 23S-RNS des Ribosoms angenommen. Tetracycline inhibieren die ribosomale Proteinsynthese beim Produzenten wie bei anderen prokaryotischen Organismen durch Interferenz mit der 30S-Untereinheit des Ribosoms ( M I K U L I K et al. 1 9 7 1 ) . Produktivere Stämme des Streptomyces aureofaciens binden jedoch viel weniger Chlortetracyclin als unproduktive und beide wiederum vergleichsweise viel weniger als solche aus Escherichia coli. Bei anderen Streptomyceten wurde nachgewiesen, daß die Bindung des eigenen Antibioticums an Ribosomen vom Differenzierungszustand des Mycels abhängig ist ( J A N D A et al. 1 9 8 1 ) . Streptomyces antibioticus, Produzent der transkriptionswirksamen Actinomycine, ist in hohem Grad unempfindlich gegen das gebildete Oligopeptid, da, wie Untersuchungen an Rohpräparationen zeigten, die RNS-Polymerase durch Actinomycin-bindende Proteine geschützt wird ( J O N E S 1978a, 1978b, 1979, 1976). Hochgereinigte RNSPolymerase aus S. antibioticus wird dagegen ähnlich wie das Enzym aus E. coli beeinflußt ( J O N E S 1979). Extreme Unempfindlichkeit der RNS-Polymerase gegen Rifamycin ergibt sich nach Untersuchungen von W A T A N A B E U. T A N A K A ( 1 9 7 6 ) als Ursache für die Resistenz von Nocardia mediterranei gegen die produzierten Ansamycine (Rifamycin). Modulation der zellulären Wirkung des eigenen Antibioticums durch gerichteten Transport in das Medium oder partielle Inaktivierung an der Bindungsstelle wurde bei verschiedenen Produzenten nachgewiesen. Die Induktion vektorieller Transportsysteme ist als Teil des gesamten Differenzierungsprogramms zu verstehen und tritt parallel zur Idiophaseentwicklung in Erscheinung. Degeneration von Leistungsstämmen infolge Verlustes extrachromosomaler genetischer Elemente macht sich bei Streptomyceten zumeist nicht allein durch fehlende Luftmycel- und Antibioticumbildung sondern auch durch Aufhebung der Resistenz gegen den betreffenden Sekundärmetaboliten bemerkbar ( C H A T E K 1979, H O P W O O D U. M E R R I C K 1977, H O P W O O D 1981). So zeichnen sich beispielsweise Actinomycin-prouzierende Hyphen von S. antibioticus gegenüber vegetativem Substratmycel durch verminderte Aufnahmeraten des Antibioticums aus ( M A R S H A L L et al. 1968). Auch Chloramphenicol wird durch ältere Hyphenteile von Streptomyces spec. nicht mehr aufgenommen ( M A L I K 1979). Ähnliche Mechanismen bedingen die Resistenz von Pseudomonas fluorescens gegen Pseudominsäure ( H U G H E S U. M E L L O 1980), während zelluläre Entgiftung von Sekundärmetaboliten bei anderen Bildnern angetroffen wird. So wird Showdomycin durch den produzierenden Streptomyces spec. No. 383 selbst über einen Isomerisierungsschritt inaktiviert ( O Z A K I 1980). In Streptomyces spec. 3022 wirken Inaktivierung und Permeabilitätsänderungen beim Schutz vor dem produzierten Chloramphenicol zusammen ( M A L I K 1979, V c s r i N G 1979). Dieser Schutz ist notwendig, da in einem in uiiro-System mit Ribosomen dieses Organismus Chloramphenicol die Proteinsynthese ähnlich wie bei anderen Prokaryoten durch Bindung an die 50S-Ribosomeneinheit und Hemmung der Peptidyltransferase inhibierte ( M A L I K U. V I N I N G 1972). Ältere Hyphenteile erwiesen sich als undurchlässig für exogenes Chloramphenicol, und intrazellulär wird dieser Sekundär-

Sekundärmetabolite in der Cytodifferenzierung

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metabolit durch Hydrolyse und N-Deacetylierung inaktiviert (MALIK U. VINING 1 9 7 0 ) . Beide Resistenzmechanismen wurden auch bei Aminoglykosid- und Aminozyklitolproduzenten nachgewiesen. Streptomycin inhibiert bei Streptomyces griseus ähnlich wie bei anderen Prokaryoten die Proteinsynthese und verursacht Miscoding durch Interferenz mit dem Initiations- und Elongationsschritt ( C E L L A U. VINZNG 1 9 7 4 ) . Als besonders empfindlich erwiesen sich exponentiell wachsende Hyphen, während Idiophasemycelien weitgehend resistent waren ( C E L L A U. VINING 1 9 7 5 ) . Ursache der Resistenz ist vektorieller Transport des Streptomycins in das Medium sowie die zelluläre Inaktivierung durch Ribosomen-assoziierte Streptomycin-6-kinase (NIMI et al. 1 9 8 1 , SUGUYAMA et al. 1 9 8 1 A , 1 9 8 1 B , V A L U U. SZABO 1 9 7 9 ) . Über den Mechanismus des gerichteten Transports von Antibiotica aus der Zelle heraus in das Medium gibt es bisher noch keine allgemeingültigen Aussagen. Nach M A I E R et al. ( 1 9 7 5 ) bildet S. griseus z.B. intrazellulär das für den Produzenten weniger toxische Dihydrostreptomycin, das erst während der Ausschleusung in das Medium zu Streptomycin oxydiert werden soll. Inaktivierung des eigenen Antibioticums durch ribosomale Enzyme mit phosphorylierender oder acetylierender Wirkung wurde auch bei Streptomyces fradiae (Neomycinbildner) und Streptomyces kanamycetius (Kanamycinbildner) festgestellt (HOTTA U. YAMAMOTO 1 9 8 0 ) . Schließlich unterliegen auch die Oligopeptide Viomycin und Capreomycin der Inaktivierung durch die produzierenden Streptomyces spec. (SKINNER U. CUNDLIFFE 1 9 8 0 ) .

Exogene Faktoren, wie der Gehalt des Mediums an verschiedenen Metallionen, können das Resistenzverhalten der Bildner ebenfalls beeinflussen, indem sie, wie Magnesium, die Bindung von Aminoglykosiden an die Zellwand verändern (HOTTA U. OKAMI 1976a, 1976b, N I M I et al. 1976). Feedback-Regulation ist nach den bisher vorliegenden Informationen in verschiedenen Antibioticumbildnern nachweisbar (MARTIN U. DEMAIN 1980, G R Ä F E 1981) und spielt auch bei der Regulation der Alkaloidbiosynthese eine Rolle (SCHMAUDER U. GRÖGER 1976). Insgesamt zeigen die aufgeführten Beispiele, daß Produzenten von Sekundärmetaboliten verschiedene Mechanismen entwickelt haben, mit deren Hilfe die Wirkung auf die eigene Zelle modifiziert werden kann. Die Existenz von Selbstschutzmechanismen spricht daher ebenso wie die Autotoxizität von Sekundärmetaboliten dafür, daß sie eine spezifische Aufgabe als endogene Effektoren bei der Regulation bestimmter Stadien der Cytodifferenzierung erfüllen können. 3. A toxische endogene als Bestandteil hormonaler

Effektoren Regulationssysteme

3.1. E f f e k t o r e n des G e n t r a n s f e r s Eine Reihe atoxischer Signalstoffe erfüllt definierte Aufgaben innerhalb organismenspezifischer Differenzierungsprogramme durch Steuerung sexueller oder parasexueller Mechanismen des Gentransfers. Bei Mucorpilzen (Mucor mucedo, Phycomyces blakesleanus, Blakeslea trispora) wird der Kontakt unterschiedlicher Zelltypen (( + ) bzw. (—)) mit Hilfe terpenoider Verbindungen, der Trisporsäuren, getriggert (VAN DEN E N D E 1967, GOODAY 1974). Gelangen ( + ) - und ( —)-Hyphen in räumliche Nähe, so induzieren die zunächst nur in geringen Mengen ausgeschiedenen Vorstufen der Trisporsäure, Methyldihydrosporat (Prohormon ( + ) ) und Trisporol (Prohormon(—)) die Bildung von Trisporsäure beim jeweiligen Partner. Der erhöhte Trisporsäurespiegel triggert die Bildung der individuellen Vorstufen aus /S-Carotin, sowie ihre Ausscheidung in das Medium (WERKMAN U. V A N D E N E N D E 1973), von wo sie durch den komplementären Zelltyp aufgenommen und in Trisporsäure umgewandelt werden

U . GRÄFE

328

( G O O D A Y 1 9 6 8 , 1 9 7 4 , BULOCK et al. 1 9 7 4 ) . Der autokatalytische Anstieg des Trisporsäurespiegels induziert die anschließende Konjugation beider Hyphentypen zu Zygosporen. Produktion und Wirkungsweise der Trisporsäuren bei den Mucorales illustrieren die Triggerfunktion niedermolekularer Effektoren im Ablauf eines komplexen, genetisch vorprogrammierten Differenzierungsprozesses. Durch die positive feedback-Regulation der Trisporsäuresynthese tritt eine Signalamplifikation ein, die die Reversibilität bestimmter Schritte der Cytodifferenzierung begrenzt. Auch bei den im feuchten Milieu lebenden Pilzen der Gattung Allomyces dienen bizyklische Sesquiterpene als Sexualpheromone (MACHLIS 1 9 7 3 , MACHLIS et al. 1 9 6 6 ) . Weibliche Gameten produzieren das sogenannte L-Sirenin aus Farnesylpyrophosphat, das als A t t r a k t a n s f ü r männliche Gameten wirksam ist (PLATTNER U. RAPOPOET 1 9 7 1 ) .

Bei einigen eukaryotischen Mikroorganismen finden sich Sterole in der Funktion des Sexualhormons, z.B. in Achlya-Arten(McMOEEIS 1978). Weibliche Zellen synthetisieren hier aus Fucosterol als Vorstufe das Antheridiol, das in Konzentrationen > 1 0 pM die Bildung antheridialer Hyphen beim männlichen Partner sowie die Bildung des männlichen Hormons Oogeniol veranlaßt. Oogoniol, ebenfalls ein Sterol, induziert seinerseits die weiblichen H y p h e n zur Produktion von Oogonien. Antheridien und Oogonien bilden geschlechtsspezifische Gameten, die sich nachfolgend vereinigen. Die Beteiligung von Sterolen an der sexuellen Reproduktion parasitischer Pilze wie Phytophtora und Phytium gilt ebenfalls als wahrscheinlich (VAUEK et al. 1981). I n Neurospora crassa erfüllen bestimmte Kohlenwasserstoffe eine ähnliche Funktion, indem sie die Fertilität von Kreuzungen zwischen entgegengesetzten Zelltypen erhöhen (VIGFUSSON et al.

1971).

Bei Hefen wie Saccharomyces cerevisiae u. a. wird die Agglutination von Zellen unterschiedlichen Paarungstyps durch kurzkettige Peptide reguliert (STÖTZLEE U. DUNTZE 1 9 7 6 , STÖTZLER et al. 1 9 7 6 ) . «- bzw. a-Zellen bilden mehrere strukturell geringfügig modifizierte Peptide mit ähnlicher Wirkung, die jeweils in dem komplementären Zelltyp die Bereitschaft zur sexuellen Agglutination und Diploidisation fördern. Solche regulatorischen Peptide besitzen zumeist eine hohe Stammspezifität. So sind Zellen von S. cerevisiae und S. kluiveri trotz struktureller Ähnlichkeit ihrer Pheromone in bezug auf die Agglutination ihrer Zellen unverträglich (MC CULLOUGH U. HEESKOWITZ 1 9 7 9 ) .

Über ein ähnliche Signalsystem verfügt Rhodosporium toruloides, deren A- bzw. aZellen hydrophobe Peptide, die Rhodotorucine A und a bilden, die sich bevorzugt an membranöse Strukturen von komplementären Zellen anlagern und nachfolgend entsprechende biochemische und morphologische Veränderungen (Hemmung von K n o s p u n g u n d Z e l l t e i l u n g ) i n d u z i e r e n (KAMIKA et al.

1978).

Offenbar sind auch unter Prokaryoten Signalstoffe mit kompetenzfördernder Wirkung verbreitet (CUETIS 1969). Bei Streptococcus faecalis erfolgt ein rascher Austausch plasmidcodierter Merkmale (DUNNY et al. 1978), wobei die Agglutination unterschiedlicher Zelltypen durch ein hitzestabiles Peptid (clumping-inducing agent, 1—LOKD) des .weiblichen' Zelltyps induziert wird. Nach Übertragung des Plasmids werden weibliche Zellen in den männlichen Typ umgewandelt und verlieren die Fähigkeit zur Pheromonbildung. Über das Vorkommen von Kompetenzfaktoren bei Bacillus-Avten, Pneumococcus, Haemophilus und E. coli liegen ebenfalls Berichte vor (siehe VANEK et al.

1981).

Auf Grund ihrer Peptidstruktur unterliegen solche Effektoren einem raschen proteolytischen Abbau, der zur Regulation der Signalstärke und Wirkdauer beiträgt (TSUCHIYA et al.

1978).

Sekundärmetabolite in der Cytodifferenzierung

329

3.2. S p e z i e l l e E f f e k t o r e n d e r m o r p h o l o g i s c h e n u n d c h e m i s c h e n D i f f e renzierung Bisher gibt es nur fragmentarische Informationen über Struktur und Wirkmechanismus organismenspezifischer endogener Signalstoffe, die als ,hormonähnliche' Faktoren sowohl die Differenzierung von Einzelzellen als auch die Aggregation und das Verhalten von Zellpopulation regulieren. Offenbar sind solche Effektoren aber bei einzelligen wie auch im Zellverband wachsenden Mikroorganismen verbreitet. Besonders notwendig sind solche Stoffe als Signale der Kommunikation bei filamentösen Mikroorganismen, z.B. bei Actinomyceten und Pilzen, deren komplexer Lebenszyklus noch nicht in vollem Umfang verstanden wird ( K A L A K O U T S K I U . A G R E 1 9 7 6 , E N S I G N 1 9 7 8 ) . Bei Streptomyceten und anderen Vertretern der Gattung Actinomycetes ist über die Ausbildung spezieller morphologischer Formen (Luf tmycel, Sporen) hinaus auch der Austausch von genetischem Material oder die Übertragung extrachromosomaler genetischer Elemente (Plasmide, Transposons) möglich (CHATER U. MERRICK 1 9 7 6 , HOPWOOD U. W R I G H T 1 9 7 3 ) . Pilze verfügen ebenfalls über differenzierungswirksame Effektoren, die Kolonieform und -große sowie das Ausmaß der Sekundärmetabolitbildung bestimmen ( Z E N D E M et al. 1 9 8 2 , S H I B A T A et al. 1 9 8 0 ) . Hinsichtlich ihrer chemischen N a t u r handelt es sich entweder u m niedermolekulare lipophile Substanzen oder aber um relativ hydrophobe Peptide bzw. Proteine. Das läßt vermuten, daß die cytoplasmatische Membran oder andere membranöse lipidhaltige Strukturen einen ihrer bevorzugten Angriffspunkte in der Zelle bilden (Tab. 3). 3.2.1. Effektoren einzellig wachsender Mikroorganismen Neben zyklischem Adenosin-3',5'-monophosphat,Nucleosidpolyphosphaten und anderen metabolischen Kopplungsfaktoren sind spezielle Effektoren vorhanden, die auf Grund ihrer fehlenden Teilnahme am Grundstoffwechsel in die Gruppe der Sekundärmetabolite eingeordnet werden können. Untersuchungen an Bacillus-Arten bestätigen regulatorische Effekte relativ kleiner Moleküle auf die Sporulation ( H A N S O N 1975). Entsprechend SRINAVASAST et al. (1965) verfügen sporulierende Zellen von Bacillus subtilis, B. cereus und B. megaterium über lipophile endogene Faktoren (Sporogen), die in extrem geringer Konzentration die Sporulation vegetativer Zellen unter speziellen Bedingungen stimulieren (SRINAVASAN U. HALVORSON 1963). Die Produktion autoregulatorischer Faktoren durch B. cereus wird durch neuere Untersuchungen bestätigt (PROsrusr et al. 1981). Die Konzentrationserhöhung des Effektors im Medium f ü h r t e zu synchronen Veränderungen im Stoffwechsel vegetativer Zellen mit nachfolgender Transformation in somatische, sporenähnliche Formen. Pseudomonas carboxydoflava verfügt ebenfalls über einen spezifischen endogenen Faktor, der wachsende Zellen zum Übergang in die Ruhephase veranlaßt ( E L R E G I S T A N et al. 1980). Als Detergentien wirksame Stoffe sind teilweise in der Lage, bei Submerskultivierung verschiedener Mikroorganismen die morphologische Differenzierung zu fördern. So wird die Bildung von Myxosporen in Kulturen von Myxococcus xanthus durch Zusatz von Glycerol, Dimethylsulfoxid oder Äthylenglycol induziert ( W H I T E 1975). Bekannt ist ferner die Stimulation der Cystenbildung bei Acetobacter vinelandii durch w-Butanol. Der eigentliche zelluläre Effektor scheint dabei das gebildete /9-Hydroxyb u t y r a t zu sein, das die Aktivität von membrangebundenen Enzymen allosterisch beeinflußt ( S A D O F F et al. 1975). Die durch Bacillus megaterium produzierten Megacine (Bacteriocine) interferieren mit der Cytodifferenzierung des Produzenten und üben so eine synchronisierende Wirkung auf die Zellpopulation durch Hemmung des weiteren Wachstums vegetativer Zellen aus ( W A L K E R et al. 1975). Megacin A, eine stammspezifische Phospholipase, verändert die Permeabilität empfindlicher Zellen, Mega23

Z. Allg. Mikrobiol., Bd. 23, H. 5

330

U . GRÄFE

ein B blockiert die DNS-Synthese, Megacin Cx hemmt die Translation, und Megacin QM1551 wirkt als Entkoppler der Atmung. Bei Clostridium perfringens kontrollieren endo- und exogene Methylxanthine die Bildung von Endosporen während des Wachstums auf einem chemisch definierten Medium ( L U N D et al. 1 9 5 7 , SACKS U. THOMPSON 1 9 7 5 ) . Ob dieser Effekt über das System regulatorischer Nucleotide vermittelt wird, ist nicht bekannt. 3.2.2 Effektoren der Cytodifferenzierung und des Sekundärstoffwechsels von Streptomyceten Neben antibiotisch wirksamen Effektoren wie z.B. Pamamycin oder Methylenomyein kommen bei Streptomyceten als einer Gruppe industriell bedeutsamer, filamentös wachsender grampositiver Bakterien auch atoxische Signalstoffe vor, die sowohl die morphologische Differenzierung (Bildung von Luftmycelien und Sporen) als auch den Sekundärmetabolismus beeinflussen (Tab. 3). F ü r Oberflächenkulturen von Streptomyceten ist die Bildung von Luftmycelien charakteristisch, die in somatische Zellen und Sporen unterteilt sind. Endosporen, Arthrosporen, Chlamydosporen und Sklerotien können bei verschiedenen Vertretern der Gattung Actinomycetes gebildet werden. Die Produktion von Antibiotica und anderen Sekundärmetaboliten ist häufig mit der Bildung von Luftmycel und Sporen verbunden, d. h. Ausfall der Luftmycelbildung nach Mutation hat in vielen Fällen auch den Verlust der Antibioticumbildung zur Folge (HOPWOOD U. M E B E I C K 1 9 7 7 , CHATEE U. M E B E I C K 1 9 7 6 ) . Jedoch belegen Beispiele f ü r Antibioticumsynthesen durch Luftmycel-negative Mutanten (POGELL 1 9 7 9 ) , daß morphologische Differenzierung und Sekundärstoffsynthese als zwei häufig parallel verlaufende, aber separate Prozesse verstanden werden müssen, die gegebenenfalls durch gleichartige Signale gesteuert werden. Für die Ausbildung des sporentragenden Luftmycels spielen Umweltfaktoren wie Zusammensetzung des Mediums hinsichtlich Kohlenstoff- und Stickstoffquellen (COLEMAN U. E N S I G N 1 9 8 2 ) , Temperatur, Luftfeuchte, Spurenelementgehalt, besonders aber der K o n t a k t der Substrathyphe zur Gasphase (Luftsauerstoff) eine besondere Rolle (BBADSHAW U. W I L L I A M S 1 9 7 6 ) . Die bisher vorliegenden Informationen über die chemische Struktur der f ü r die Regulation der Luftmycelbildung von Streptomyceten erforderlichen speziellen endogenen Effektoren sind in Tabelle 3 zusammengefaßt. Abgesehen von Antibiotica wie Pamamycin und Methylenomycin (siehe Tab. 1) handelt es sich einmal um lipophile Derivate des Butyrolactons, die durch taxonomisch verschiedenartige Streptomyceten produziert werden ( E E I T T et al. in Vorbereitung, H A E A U. B E P P U 1 9 8 2 , G E Ä F E et al. 1 9 8 3 ) . Substanzen mit ähnlicher differenzierungsfördernder Wirkung auf Streptomyceten finden sich off enkundig auch unter den Sekundärprodukten anderer Vertreter der Gattung Actinomycetes ( H A E A U. B E P P U 1 9 8 2 , E E I T T in Vorbereitung als auch unter Pilzen. So bilden Clamydosporium cladosporoides und Drechslern erythrospila Stoffe unbekannter Konstitution (niedermolekular, lipophil), die asporogene Streptomyceten wie S. flavochromogenes und S. luteolutescens zur Bildung fertiler Luftmycelien anregen ( K Ü S T E E U. A T T A B Y 1 9 8 2 ) .

Eine zweite Gruppe endogener Effektoren von Streptomyceten wird durch proteinogene Substanzen repräsentiert, f ü r die das Vorkommen des sogenannten Faktors C bei Streptomyces griseus (SZABO et al. 1967 a) als Beispiel genannt werden kann. I n eine dritte Gruppe können formal differenzierungsaktive Pigmente und Cofaktoren eingeordnet werden. Regulatorische Butyrolactone: Untersuchungen über die Rolle des A-Faktors (autoregulatory factor) in der Biosynthese des Streptomycins und der Luftmycelbildung durch Streptomyces griseus lieferten einen wesentlichen Beitrag zum Verständnis der Funktion von Butyrolacton-Deri-

331

Sekundärmetabolite in der Cytodifferenzierung

Tabelle 3 Beispiele f ü r das Vorkommen endogener Effektoren der Cytodifferenzierung bei Streptomyceten und eukaryotischen Mikroorganismen Organismus B. subtilis B. cereus, B. megaterium B. cereus

Bezeichnung Effektor

Struktur

Wirkmechanismus

Literatur

SRINAVASAN

Pénicillium cyclopium

Faktor P

Dictyostelium discoideum

Discoidin

Lectine

Stimulator Sporulation Stimulator Sporulation Stimulation Myxosporenbild. Stimulation Cystenbilddung Synchronisation Zellpopulation Stimulation Endosporenbildung Stimulation Luftmycel- u. Antibioticumbildung Stimulation Luftmycel- u. Anthracyclinproduktion Stimulation Staphylomycinproduktion Induktion Conidienbildung Stimulation Sporulation Coenzym des letzten Schrittes der Tetracyclinbiosynthese Regulation Hyphenwachstum in Oberflächenkultur Stimulation Alkaloidsynthese u. Conidienbild. Cytodifferenz.

differentiationinducing factor Aggregationsinhibierender Faktor Discadenin

unbek.

Cytodiff.

unbek.

Cytodiff.

Purin

Inhibitor Sporenkeimung

Myxococcus xanthus Acetobacter vinelandii B. megaterium

.Sporogen' autoregulatorischer Effektor Glycerol n-Butanol Megacine

Clostridium perfringens

Methylxanthine

S. griseus

A-Faktor

S. griseus

L-Faktor

S.

IM-Factor

virginiae

S. griseus

C-Faktor

S. venezuelae

Sporulationspigment cosynthetic factor I

S.

aureofaciens

S.

rimosus

Rhizobium

solanii

Peptide

Butyrolacton

Butyrolacton

Butyrolacton Protein unbek. Flavin

Hyphenextensions- unbek. u. Hypheninhibitionsfaktoren

Inhibitor cAMP-Phosphodiesterase

23*

unbek. unbek.

Peptid

unbek.

Bacillus-Arten,

Hemmung cAMP-Abbau

et al. (1965) P R O N I N et

al.

(1981) WHITE

(1975) S A D O F F et

al.

(1975) W A L K E R et

al.

(1975) SACKS u . THOMPSON

(1975) KHOKHLOV U. TOVAROVA

(1972) E R I T T et

al.

(1982) YANAGIMOTO

et al. (1979) SZABO et

al.

(1967) S C R I B N E R et

al.

(1973) M I L L E R et

al.

(1960) S H I B A T A et

al.

(1980) Z E N D E M et

al.

(1982) M Ü L L E R U. GERISCH (1978)

KAY etal. (1979) BOZZARO U. GERISCH

(1979) et al. (1979)

ABE

D A R M O N et

(1978)

al.

332

U. GRÄFE

vaten in der Cytodifferenzierung von Actinomyceten (TOVAROVA et al. 1970, KHOKHLOV u. TOVAROVA 1972). Durch Mutagenbehandlung oder den Einfluß interkalierender Farbstoffe wurden aus Luftmycel- und Antibioticum-positiven Elternstämmen (Amy + , Str + , A-Faktor + ) mit hoher Frequenz Mutanten erhalten, die erst nach Zusatz des A-Faktors das normale Differenzierungsverhalten, d. h. die Produktion von Luftmycel, Sporen und Streptomycin, wiedererlangten (TOVAROVA et al. 1970, HARA U. BEPPU 1982). Weitere Mutantengruppen produzierten trotz Anwesenheit des A-Faktors kein Streptomycin, weil Defekte im Biosyntheseweg vorhanden waren oder verfügten über eine konstitutive, A-Faktor-unabhängige Synthese (HARA U. BEPPU 1982, EFREMENKOVA et al. 1 9 8 1 , KHOKHLOV 1 9 8 2 ) .

Nach KHOKHLOV et al. (1973, 1976) induzieren rechnerisch 1 [xg des A-Faktors die Produktion von ca. 50000 ¡ig Streptomycin durch die A-Faktor-negative, Luftmycelu n d S t r e p t o m y c i n - g e b l o c k t e M u t a n t e 1439 (KORNITSKAYA et al. 1975). I n Oberflächen-

kultur sind ca. 2 ng A-Faktor für die Induktion sichtbarer Zeichen von Luftmycelbildung erforderlich. Der A-Faktor wird durch die Amy + Str + -Elternstämme in Mengen bis zu 5 (jig • m l - 1 bei submerser Kultivierung gebildet, wobei das Konzentrationsmaximum je nach Bedingungen in der Zeit vom 1.—2. Tag der Kultivierung erreicht w i r d (KHOKHLOV U. TOVAROVA 1 9 7 2 , HARA U. B E P P U 1 9 8 2 ) .

Der A-Faktor besitzt die Struktur eines 2S-Isocapryloyl-3S-hydroxymethyl-y-butyrolactons (MG 242; C 13 H 22 0 4 ; PLINER et al. 1976), die inzwischen durch Totalsynthese bestätigt werden konnte (KLEINER et al. 1976, 1977, MORI 1981). Das entsprechende 3R-Isomere zeigt nur 1 /3 der Wirkung des natürlich vorkommenden Produktes (HARAU. BEPPU 1982), und die biologische Aktivität des A-Faktors ist an die Anwesenheit der 3-Hydroxymethylgruppe gebunden (ONOPRIENKO et al. 1979). Der größte Effekt des A-Faktors auf die Cytodifferenzierung wird bei Zusatz zu Beginn der Kultivierung erzielt. Nach den vorliegenden Informationen muß der biochemische Wirkmechanismus des A-Faktors auf morphologische Differenzierung und Sekundärstoffwechsel geblockter Mutanten dahingehend verstanden werden, daß er auf einer sehr frühen Stufe der Signalhierarchie als pleiotroper Effektor einen metabolischen Block aufheben kann und so die Einschaltung eines komplexen Genexpressionsprogrammes triggert. Auf Grund seiner Lipophilie darf vermutet werden, daß dabei eine Wechselwirkung mit Membran-assoziierten Zellfunktionen eine Rolle spielt. So steigt die Aktivität von Schlüsselenzymen der Streptomycinbiosynthese (Transamidinase) nach Zusatz von A-Faktor zur Mutante 1439 stark an (KHOKHLOV et al. 1973, 1976), ebenso wie die Produktion von Streptomycin-6-phosphotransferase NADP-Glykohydrolase (VORONINA et al. 1975,1978). Letzterem Enzym wurde daher eine mögliche Vermittlerrolle im Wirkmechanismus des A-Faktors durch Blockierung des Glucoseabbaus bei 8. griseus zugeschrieben. Untersuchungen über die Regulation der Enzymbildung bei anderen Streptomycinbildenden Streptomyceten sowie einem Leukaemomycinbildner sprechen jedoch gegen eine generelle Rolle der NADP-Glykohydrolase als nachgeordnetes Signal einer Signaltransformationskette des Differenzierungsstoffwechsels (GRÄFE et al. 1980, 1981a, 1981b), bestätigen aber eine Funktion für bestimmte Species von 8. griseus. A-Faktorzusatz induziert Luftmycelbildung und Antibioticumsynthese nicht allein bei Mutanten streptomycinbildender 8. griseus-Stämme sondern zeigt gleichermaßen Aktivität auch bei einigen geblockten Derivaten der Leukaemomycin-bildenden 8. griseus JA 5142 und S. griseus JA 3933 (FLECK, pers. Mitteilung), die mit Hilfe einer modifizierten Cosynthesetechnik (DELIC et al. 1969) d u r c h ERITT et al. (1982) aufge-

funden wurden. Umgekehrt zeigen die aus dem Anthracyclin-bildenden S. griseus isolierten Präparationen des L-Faktors (s. u.) Wirkung auf die streptomycingeblockte

S e k u n d ä r m e t a b o l i t e in d e r C y t o d i f f e r e n z i e r u n g

333

Mutante 1439, wenn auch erst in höherer Konzentration (FLECK, pers. Mitteilung). Daraus kann gefolgert werden, daß die von verschiedenen Streptomyceten produzierten Autoregulatoren hinsichtlich ihrer Wirkung, wenn auch in unterschiedlichen Konzentrationsbereichen, vergleichbar sind ( E F R E M E N K O V A et al. 1 9 8 0 ) . Leukaemomycin-bildende Stämme von S. griseus J A 5142 oder 3933 produzieren ebenfalls endogene Effektoren (L-Faktoren, Leukaemomycinproduktion-induzierende Faktoren) die die Luftmycel- und Antibioticumbildung in den entsprechenden geblockten Mutanten stimulieren ( E R I T T et al. 1982). Nach den Ergebnissen der Strukturuntersuchung handelt es sich um A-Faktor ähnliche Butyrolactone ( G R Ä F E et al. 1982a). Sie wirken auf geblockte Mutanten nur bei Zusatz zu Beginn der Kultivierung in optimaler Weise und werden nur zum Teil durch das Mycel aufgenommen. In Submerskultur werden diskrete Veränderungen der Mycelmorphologie, wie verminderte Fragmentierung und verstärkte Hyphenaggregation, beobachtet ( E R I T T et al. unveröff.). Eine gleichartige Wirkung wie der L-Faktor selbst zeigt der kürzlich aus Kulturen eines anderen Streptomyces-Stammes, S. viridochromogenes, isolierte Stimulator 2-(6'Methylheptanolyl)-3-hydroxymethyl-4-butanolid ( G R Ä F E et al. 1982b). Bei dem als IM-Faktor (inducing material) bezeichneten endogenen Effektor der Staphylomycinproduktion durch Streptomyces virginiae handelt es sich ebenfalls um ein Butyrolactonderivat (C 12 H 22 0 4 ) unbekannter Konstitution, das in einer Konzentration von > 2 0 ng • m l - 1 die Antibioticumbildung förderte und zugleich die negative feedback-Regulation der Staphylomycinproduktion durch exogenes Staphylomycin unterdrückte ( Y A N A G I M O T O et al. 1 9 7 9 ) . In erheblich höherer Konzentration zeigte Nonalacton eine gleichartige Wirkung. Daß Butyrolactone als Modifikatoren der Membranfunktion z.B. durch Beeinflussung der Biosynthese von Membrankomponenten oder der Membranfluidität wirksam sein können, lassen Untersuchungen über den Einfluß von Pantoyllacton auf Micrococcus lysodeicticus erkennen ( J O H N S O N et al. 1 9 7 8 , 1 9 8 0 ) . Nach Angaben K H O K H L O V ' S ( 1 9 8 2 ) handelt es sich auch beim Autoregulator der Lichtemission von Photobacterium fischerii um ein Butyrolactonderivat. Proteinogene Signalstoffe bei Streptomyceten: Untersuchungen über die Regulation der Conidienbildung in Submerskulturen von Streptomyces griseus führten Mitte der 60iger Jahre zur Entdeckung einer thermolabilen Substanz, Faktor C (C = cytodifferentiation), die in äußerst geringen Mengen (10 Moleküle pro Genom) die morphologische Differenzierung des Conidien-negativen Stammes 52-1 stimulierte und die Sporenauskeimung beeinflußte (SZABO et al. 1967 a, 1967 b). Faktor C wird durch den Conidien-bildenden Stamm 45H produziert und in das Medium abgegeben. Die cytologischen Effekte des Faktor C auf den Indikatorstamm sind Verstärkung des Anteils verzweigter, dickwandiger Hyphenteile und die Bildung morphologischer Vorstufen von Conidien ( V I T A L I S U. SZABO 1969) begleitet von verstärkter Polysaccharidbildung und Veränderungen im DNS/Proteinverhältnis ( S Z A B O et al. 1967a, 1967b). Faktor C ist ein aus 17 Aminosäuren und Glucosamin aufgebautes relativ hydrophobes Peptid (MG 34,5 kD, B I R O et al. 1980). Verschiedene Streptomyceten produzieren ähnliche Substanzen (SZABO, persönliche Mitteilung). Hochgereinigter Faktor C hemmt in vitro sowohl die DNS-abhängige RNS-Synthese als auch die zellfreie Proteinsynthese durch unspezifische Bindung an DNS und RNS und verursacht vermutlich dadurch die Cytodifferenzierung begünstigende Veränderungen im Transkriptions- und Translationssystem (SZABO et al. 1 9 6 7 a). Untersuchungen zur Aufklärung weiterer Schritte des durch Faktor C repräsentierten Anfangs einer Signalwandlungskette ergaben Hinweise auf die Beteiligung der Nucleotidpyrophosphotransferase ( B I R O et al. 1 9 7 9 ) , einem durch Plasmide codiertem Enzym ( H A M A G I S H I u . YOSHIMOTO 1 9 8 0 ) .

334

U . GBÄFE

Pigmente und Cofaktoren: In die Reihe lipophiler Effektoren der Differenzierung von Streptomyceten müssen auch verschiedene Pigmente eingeordnet werden, deren Produktion mit der Ausprägung bestimmter morphologischer Formen korreliert ist (CROSS U. A T T W E L L 1 9 7 5 ) . Pigmentbildung ist bei Streptomyceten u. U. mit der Anwesenheit von Plasmiden als Trägern extrachromosomaler genetischer Informationen verbunden (CHATER 1 9 7 9 , HOPWOOD U. MERRICK 1 9 7 7 , ' HOPWOOD 1 9 7 8 ) . In Streptomyces Venezuelas S 1 3 erfüllt das Sporulationspigment eine regulatorische Funktion als Induktor der Sporenbildung sowie bei der Ausprägung von Thermoresistenz der Sporen (SCRIBNER et al. 1 9 7 3 ) . Man diskutiert ferner, daß Pigmentbildung für den Schutz der Spore vor mutagener UVBestrahlung Bedeutung besitzt. Für die Biosynthesen von Tetracyclinen durch Streptomyces aureofaciens und 8. rimosus ist neben der Anwesenheit entsprechender Präkursoren in der Zelle auch ein niedermolekularer, cosynthetic factor I' in Konzentrationen > 2 X 10 - 1 0 M erforderlich ( M I L L E R et al. 1960). Nach vorläufigen Ergebnissen handelt es sich um eine Flavinähnliche Substanz (C19H22N409), die an der Wasserstoffübertragung im Verlauf spezieller Schritte der Biosynthese von Tetracyclinen teilnimmt. Mutanten ohne Cosynthesefaktor I können z. B. den terminalen Schnitt der Oxytetracyclinbiosynthese nicht mehr durchführen (RHODES et al. 1981). 3.2.3 Effektoren eukaryotischer Mikroorganismen Bei Pilzen sind endogene Effektoren bekannt, die die Ausdehnung von Oberflächenkolonien regulativ beeinflussen, wobei ein Wechselspiel zwischen hemmenden und stimulierenden Faktoren beobachtet wurde (SHIBATA et al. 1980). Z.B. produziert Rhizobium solanii mehrere lipophile Substanzen, die als Regulator der Hyphenausdehnung wirksam sind. Der aus diesen Kulturen isolierte Hyphenextensions-Inhibitor erwies sich auch gegenüber anderen Pilzen als aktiv. In Penicillien sind peptidartige Stoffe an der Regulation des Differenzierungsstoffwechsels beteiligt. So konnte aus Penicillium cyclopium WESTLING, dem Produzenten von Bezodiazepin-Alkaloiden eine Peptidfraktion isoliert werden, die die Sekundärmetabolitproduktion bei Zusatz zum Medium am Beginn der Kultivierung erheblich förderte (P-Faktor: Penicilliurn-Faktor) (ZENDEM et al. 1 9 8 2 ) . Der P-Faktor stimuliert die Proteinasyntheserate während der Wachstumsphase und fördert die Bildung von Conidien als Merkmal der Cytodifferenzierung dieses Organismus. Weitere Beispiele aus der Literatur belegen, daß endogene Effektoren der Cytodifferenzierung von verschiedenen eukaryotischen Mikroorganismen gebildet werden (YAKOVLEVA et al. 1 9 8 1 , F I S H E R U. WÖLK 1 9 7 6 ) . Wie die Untersuchungen am Schleimpilz Dictyostelium discoideum gezeigt haben, kann die Funktion autoregulatorischer Faktoren nicht losgelöst vom Gesamtprozess der Spezialisierung der Zellfunktion verstanden werden ( K A Y et al. 1 9 7 9 , WRIGHT 1 9 7 7 , ASHWORT 1 9 7 7 ) , der die Einordnung von Einzelsignalen bzw. Effektoren in eine Signalwandlungskette mit entsprechender Signalhierarchie erfordert. Nährstofflimitation im Medium und daraus resultierender Anstieg des exogenen Spiegels an zyklischem Adenosin-3',5'-monophosphat bilden nur den Anfang einer Signalkette, in der weitere spezifische Triggermoleküle ihren Platz haben ( K O N I J N et al. 1 9 6 7 ) . Beispiele dafür sind das Vorkommen Lectin-artiger Proteine (Discoidin, carbohydrate-binding protein), die an der Aggregation der Amöben beteiligt sind (MÖLLER U. GERISCH 1 9 7 8 ) , der thermostabile Factor D I F (differentiation-inducing factor), ferner ein spezielles Glycolipid, das bei hohen Zelldichten auftritt und den Beginn der sog. Prestem-Phase.anzeigt (KAY et.al. 1979), der Aggregations-inhibierende Faktor (AIF) aus exponentiell wachsenden Zellen (BOZZARO U.

Sekundärmetabolite in der Cytodifferenzierung

335

GERISCH 1979), das sog. Discadenin als endogener Inhibitor der Sporenauskeimung (ABE et al. 1976) sowie die Anwesenheit eines spezifischen Inhibitors der cAMP-Phos-

p h o d i e s t e r a s e (DARMON et al. 1 9 7 8 , siehe a u c h PARTHIER U. L E R B S 1 9 8 2 ) .

4. Potentielle Bedeutung endogener Effektoren für Biotechnologie und Wirkstofforschung Abgesehen von der bekannten praktischen Bedeutung einiger Peptid-Antibiotica von Bacillus-Arten fällt es beim augenblicklichen Stand unserer Erkenntnisse über Struktur und Funktion endogener Effektoren aus Mikroorganismen noch schwer, allgemeine Aussagen über ihre potentielle Bedeutung für die Beherrschung biotechnologischer Prozesse und die Wirkstofforschung zu treffen. Vordergründig müssen Arbeiten über den Wirkmechanismus organismenspezifischer Signalstoffe dem Bereich der Grundlagenforschung zugeordnet werden. Ihr Effekt auf den Produzentenorganismus kann als Modellfall für die Gewinnung vertiefter Einsichten in die Regulation der Cytodifferenzierung industriell relevanter Mikroorganismen dienen (POGELL 1979, BETINA 1980). Dabei kann daran gedacht werden, eine rationale Erklärung für eine Reihe bisher schwer verständlicher praxisnaher Phänomene zu erarbeiten. Beispielsweise könnte die bekannte Abhängigkeit des Fermentationsergebnisses von Differenzierungszustand sowie Zell- bzw. Sporenanzahl des emersen oder submersen Inokulums oder das Differenzierungsverhalten von Oberflächenkulturen mit der Anwesenheit endogener Effektoren erklärt und dadurch neue Wege zur Standardisierung gefunden werden (CALAM U. SMITH 1981). Schließlich könnte auch die Entwicklung neuer Gentransfertechniken von der Kenntnis spezifischer endogener Faktoren profitieren, die die Aggregation von intakten Zellen oder Protoplasten beeinflussen (BALTZ U. MATSUSHIMA 1981). Schließlich kann daran gedacht werden, durch Zusatz spezieller Effektoren Fermentationsergebnisse zu stabilisieren und gegebenenfalls zu verbessern. Dieses Ziel könnte dadurch erreicht werden, daß die bei industriellen Fermentationen häufig spontan auftretenden inaktiven Mutanten durch Zugabe des betreffenden endogenen Effektors zum normalen Differenzierungsverhalten angeregt werden können. In bezug auf die Suche nach neuen Wirkstoffen sollte nicht unerwähnt bleiben, daß endogene Effektoren aus Mikroorganismen biologisch wirksame Strukturmodelle und damit potentielle Pharmaca darstellen. Gerade in letzter Zeit wurden Überlegungen angestellt, das mikrobielle Sekundärmetabolitpotential noch besser für spezielle Anwendungen erschließen zu können und hierfür besondere Screening-Techniken zu entwickeln (WOODRUFF 1980). Hervorzuheben sind hier Streptomyceten und andere Vertreter der Gattung Actinomycetes, die über ihre Fähigkeit zur Bildung antimikrobiell wirksamer Antibiotica hinaus ein Reservoir für die Produktion von Wirkstoffen mit Effekt auf Warmblüter, Insekten und Pflanzen bilden (WOODRUFF 1980). Bemerkenswert ist ferner die mikrobielle Produktion von Enzyminhibitoren (UMEZAWA 1977), Immunomodulatoren (UMEZAWA 1980) und Substanzen mit Aktivität auf Differenzierungsprozesse tierischer Zellen (ASAHI U. ONO 1981), die neue Möglichkeiten der Therapie eröffnet haben bzw. zu eröffnen versprechen. Ob organismenspezifische Effektoren aus Mikroorganismen als Wirkstoffe über ihren Produzenten hinaus eingesetzt werden können wird allerdings davon abhängen, daß auch andere Zellen über entsprechend sensible Rezeptoren verfügen. Frau Dipl. Biol. X. ERITT möchte ich für ihre Unterstützung bei der Sammlung der Literaturangaben danken.

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