Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie: Band 23, Heft 8 [Reprint 2021 ed.] 9783112565568, 9783112565551

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ZEITSCHRIFT FÜR ALLGEMEINE MIKRQ-BIOLOGIE AN INTERNATIONAL JOURNAL ON MORPHOLOGY, PHYSIOLOGY, GENETICS, AND ECOLOGY OF MICROORGANISMS BAND 23 1983 HEFT 8

AKADEMIE-VERLAG • BERLIN ISSN 0044-2208

Z. allg. Mikrobiol., Berlin S8 (1983) 8, 4 7 3 - 536

EVP 2 0 , - M

Z E I T S C H R I F T FÜR ALLGEMEINE MIKROBIOLOGIE VOLUME 23

1983

NUMBEB 8

CONTENTS Growth measurements by monitoring light scattering of a filamentous blue-green alga which does not give uniform and stable suspension in culture vessels

S . P . ADHIKAKY

475

Production of phaseolotoxin and phosphosulfamylornithine by Pseudomonas syringae pv. phaseolicola in submerged culture

F . BTJBLITZ AND BEATE VÖLKSCH

485

Influence of phosphate concentration of the respiratory activity of Asotobacter vinelandii Action of 5-bromouracil and 6-bromo-2-deoxyuridine in combination with 8-azaadenine on UVsensitivity of bacteria

L . HAIDENWANG AND U . BEHBENS

491

H . - E . JACOB AND E . GOLOVINSKY

495

Production and isolation of the Phytotoxin tentoxin from Alternaria altemata

B . LIEBEBMANN AND B . OEBTEL

603

S h o r t Note Development of breeding stocks of the yeast Saccharomycopsis lipolytica by methods of moderate inbreeding

C. KUEISCHKO, S . G . INGE-VECHTOMOV AND H . WEBER

513

Review Molecularbiology of the germination of spores

M . HECKEB

617

Book Reviews

Bacillus

484, 602, 512, 516, 536

ZEITSCHRIFT FÜR ALLGEMEINE MIKRO- BIOLOGIE AN INTERNATIONAL JOURNAL ON MORPHOLOGY, PHYSIOLOGY, GENETICS,

HERAUSGEGEBEN VON

G. F. Gause, Moskau 0 . Hoffmann-Ostenhof, Wien A. A. Imseneckii, Moskau R . W. Kaplan, Frankfurt/M. F. Mach, Greifswald 1. Malek, Prag C. Weibull, Lund

unter der Chefredaktion von W. Schwartz, Braunschweig und U. Taubeneck, Jena

AND ECOLOGY OF MICROORGANISMS UNTER MITARBEIT VON

J . H. Becking, Wageningen H. Böhme, Gatersleben M. Girbardt, Jena S. I. Kusnecov, Moskau O. Necas, Brno C. H. Oppenheimer, Port Aransas N. Pfennig, Göttingen I. L. Rabotnovaj Moskau A. Schwartz, Wolfenbüttel

REDAKTION

BAND 23 • 1983 • HEFT 8

AKADEMIE-VERLAG BERLIN

U. May, Jena

Die Zeitschrift f ü r Allgemeine Mikrobiologie soll dazu beitragen, Forschung und internationale Zusammenarbeit auf dem Gebiet der Mikrobiologie zu fördern. Es werden Manuskripte aus allen Gebieten der allgemeinen Mikrobiologie veröffentlicht. Arbeiten über Themen aus der medizinischen, landwirtschaftlichen, technischen Mikrobiologie und aus der Taxonomie der Mikroorganismen werden ebenfalls aufgenommen, wenn sie Fragen von allgemeinem Interesse behandeln. Zur Veröffentlichung werden angenommen: Originalmanuskripte, die in anderen Zeitschriften noch nicht veröffentlicht worden sind und in gleicher Form auch nicht in anderen Zeitschriften erscheinen werden. Der U m f a n g soll höchstens 1^2 Druckbogen (24 Druckseiten) betragen. Bei umfangreicheren Manuskripten müssen besondere Vereinbarungen mit der Schriftleitung und dem Verlag getroffen werden. Kurze Originalmitteilungen über wesentliche, neue Forschungsergebnisse. Umfang im allgemeinen höchstens 3 Druckseiten. Kurze Originalmitteilungen werden beschleunigt veröffentlicht. Kritische Sammelberichte und Buchbesprechungen nach Vereinbarung mit der Schriftleitung.

Bezugsmöglichkeiten der Zeitschrift f ü r Allgemeine Mikrobiologie: Bestellungen sind zu richten — in der DDR an den Postzeitungsvertrieb, an eine Buchhandlung oder an den AkademieVerlag, DDR-1086 Berlin, Leipziger Straße 3—4; — im sozialistischen Ausland an eine Buchhandlung f ü r fremdsprachige Literatur oder an den zuständigen Postzeitungsvertrieb; — in der BRD und Berlin (West) an eine Buchhandlung oder an die Auslieferungsstelle K U N S T U N D W I S S E N , Erich Bieber OHG, Wilhelmstr. 4 - 6 , D-7000 S t u t t g a r t 1; — in den Übrigen westeuropäischen Ländern an eine Buchhandlung oder an die Auslieferungsstelle K U N S T U N D WISSEN, Erich Bieber GmbH, Dufourstr. 51, CH-8008 Zürich Schweiz; — im übrigen Ausland an den Internationalen Buch- und Zeitschriftenhandel; den Buchexport; Volkseigener Außenhandelsbetrieb der Deutschen Demokratischen Republik, DDR-7010 Leipzig, Postfach 160, oder an den Akademie-Verlag, DDR-1086 Berlin, Leipziger S t r . 3 — 4 .

Zeitschrift f ü r Allgemeine Mikrobiologie Herausgeber: I m Auftrag des Verlages von einem internationalen Wissenschaftlerkollektiv herausgegeben. Verlag: Akademie-Verlag, DDR-1086 Berlin, Leipziger Straße 3—4; F e r n r u f : 2236229 oder 2236121* Telex-Nr!: 114420; B a n k : Staatsbank der D D R , Berlin, Kto.-Nr.: 6836-26-20712. Chefredaktion: Prof. Dr. U D O T A T J B E N E C K Prof. Dr. W I L H E L M S C H W A B T Z . Anschrift der Redaktion: Zentralinstitut f ü r Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften, DDR-6900 Jena, Beutenbergstr. 11; F e r n r u f : J e n a 85 2 2 0 0 ; TelexN r . : 058621 Veröffentlicht unter der Lizenznummer 1306 des Presseamtes beim Vorsitzenden des Ministerrates der Deutschen Demokratischen Republik. Gesamtherstellung: V E B Druckerei „ T h o m a s Müntzer", DDR-5820 Bad Langensalza. Erscheinungsweise: Die Zeitschrift f ü r Allgemeine Mikrobiologie erscheint jährlich in einem B a n d m i t l O Heften. Bezugspreis je B a n d 250,— M zuzüglich Versandspesen (Preis f ü r die D D R 200,— M), Preis je H e f t 2 5 , - M (Preis f ü r die D D R 2 0 , - M). Urheberrecht: Alle Rechte vorbehalten, insbesondere die der Übersetzung. Kein Teil dieser Zeitschrift darf in irgendeiner Form — durch Photokopie, Mikrofilm oder irgendein anderes Verfahren — ohne schriftliche Genehmigung des Verlages reproduziert werden. — All rights reserved (including those of translations into foreign languages). No p a r t of this issue m a y be reproduced in any form, b y photoprint, microfilms or any other means, without written permission f r o m t h e publishers. Erscheinungstermin: Oktober 1983 Bestellnummer dieses H e f t e s : 1070/23/8 © 1983 b y Akademie-Verlag Berlin. Printed in t h e German Democratic Republic. AN (EDV) 75218

Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie

23

1983

8

475-483

(Nowrangpur College, Nowrangpur, Orissa, India)

Growth measurements by monitoring light scattering of a filamentous blue-green alga which does not give uniform and stable suspension in culture vessels S . P . ADHIKARY (Eingegangen

am 19.1.

1983)

I t has been tried to adapt the light scattering technique to measure the growth of a filamentous blue-green alga Westiellopsis profilica JANET which does not give stable and uniform suspension during its growth in culture vessels. Experiments were conducted to make stable suspensions of the organism and the results on the scattering and spectral studies were compared with that of Microcystis sp. which gives a uniform and stable suspension in culture vessels. Some conventional experiments were performed to show that the growth of the blue-green alga, Westiellopsis prolifica does not run with the rate of pigment metabolism. I t has also been observed that the alterations in size, shape, swelling and shrinkage and average cell characteristics of the alga resulted from alterations in physical and chemical characteristics of the culture media, significantly change the scattering values without much or any change in their growth rate in term of dry weight values.

Extensive reports are available on the growth measurements of microbes by monitoring the light scattering of microbiol suspension (AVIDOR et al. 1956, BERNHEIM 1 9 6 3 , DAS a n d SINGH 1 9 7 5 , KHAN a n d SEN 1 9 6 7 , THOMAS a n d DAVID 1 9 7 1 ) . I n c r e a s e

in light scattering by suspension has normally been considered as the manifestation of increase in population density of the microbes (MYERS 1962, VENKATARAMAN 1969). Many microbiologists have developed calibration curves that relate the light scattering of a particular wavelength to pre-determined dry weight values (CASTENHOLZ 1 9 7 2 , SAMEJIMA a n d M Y E R S 1 9 5 8 , VAN BAALEN a n d MARIER 1 9 6 3 ) o r cell n u m b e r

of populations (JEFEERY etal. 1973). Thus the scattering-technique for its technicalconvinience has been widely accepted for routine measurement of growth of most of

b a c t e r i a (BERNHEIM 1 9 6 3 , MAGER et al. 1 9 5 6 ) , u n i c e l l u l a r a l g a e (SAMEJIMA a n d M Y E R S 1 9 5 8 ) a n f f i l a m e n t o u s a l g a e (CASTENHOLZ 1 9 7 2 , DAS a n d SINGH 1 9 7 5 , THOMAS a n d

DAVID 1971) which give uniform and stable suspensions in culture vessels during their growth period. In addition to growth measurement, stable suspensions of pigmented microbes give further advantage of measuring absorption spectra of various pigments in vivo

(MYERS 1 9 6 2 ) .

An attempts has been made here to measure absorption spectra and growth by monitoring light scattering of a filamentous blue-green alga, Westiellopsis prolifica JANET which does not give uniform and stable suspension during its growth in culture vessels. Experiments were designed to make stable suspension of the organism and the results on the scattering and spectral studies were compared with that of Microcystis sp. which normally gives a uniform and stable suspension in culture vessels. Reports are also available on measurement of growth rate of blue-green algae and other photosynthetic microorganisms by monitoring optical density of microbiol s u s p e n s i o n a t t h e w a v e l e n g t h s o f 6 0 0 — 6 1 0 (CRIPPS a n d WORK 1 9 6 7 , J E F F E R Y et al. 1 9 7 3 , M Y E R S 1 9 6 2 , SAMEJIMA a n d M Y E R S 1 9 5 8 ) , 6 4 0 (KHAN a n d SEN 1 9 6 7 ) , 6 2 0 — 7 0 0

(DAS and SINGH 1975) where the interference by pigment absorption in scattering values

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(Nowrangpur College, Nowrangpur, Orissa, India)

Growth measurements by monitoring light scattering of a filamentous blue-green alga which does not give uniform and stable suspension in culture vessels S . P . ADHIKARY (Eingegangen

am 19.1.

1983)

I t has been tried to adapt the light scattering technique to measure the growth of a filamentous blue-green alga Westiellopsis profilica JANET which does not give stable and uniform suspension during its growth in culture vessels. Experiments were conducted to make stable suspensions of the organism and the results on the scattering and spectral studies were compared with that of Microcystis sp. which gives a uniform and stable suspension in culture vessels. Some conventional experiments were performed to show that the growth of the blue-green alga, Westiellopsis prolifica does not run with the rate of pigment metabolism. I t has also been observed that the alterations in size, shape, swelling and shrinkage and average cell characteristics of the alga resulted from alterations in physical and chemical characteristics of the culture media, significantly change the scattering values without much or any change in their growth rate in term of dry weight values.

Extensive reports are available on the growth measurements of microbes by monitoring the light scattering of microbiol suspension (AVIDOR et al. 1956, BERNHEIM 1 9 6 3 , DAS a n d SINGH 1 9 7 5 , KHAN a n d SEN 1 9 6 7 , THOMAS a n d DAVID 1 9 7 1 ) . I n c r e a s e

in light scattering by suspension has normally been considered as the manifestation of increase in population density of the microbes (MYERS 1962, VENKATARAMAN 1969). Many microbiologists have developed calibration curves that relate the light scattering of a particular wavelength to pre-determined dry weight values (CASTENHOLZ 1 9 7 2 , SAMEJIMA a n d M Y E R S 1 9 5 8 , VAN BAALEN a n d MARIER 1 9 6 3 ) o r cell n u m b e r

of populations (JEFEERY etal. 1973). Thus the scattering-technique for its technicalconvinience has been widely accepted for routine measurement of growth of most of

b a c t e r i a (BERNHEIM 1 9 6 3 , MAGER et al. 1 9 5 6 ) , u n i c e l l u l a r a l g a e (SAMEJIMA a n d M Y E R S 1 9 5 8 ) a n f f i l a m e n t o u s a l g a e (CASTENHOLZ 1 9 7 2 , DAS a n d SINGH 1 9 7 5 , THOMAS a n d

DAVID 1971) which give uniform and stable suspensions in culture vessels during their growth period. In addition to growth measurement, stable suspensions of pigmented microbes give further advantage of measuring absorption spectra of various pigments in vivo

(MYERS 1 9 6 2 ) .

An attempts has been made here to measure absorption spectra and growth by monitoring light scattering of a filamentous blue-green alga, Westiellopsis prolifica JANET which does not give uniform and stable suspension during its growth in culture vessels. Experiments were designed to make stable suspension of the organism and the results on the scattering and spectral studies were compared with that of Microcystis sp. which normally gives a uniform and stable suspension in culture vessels. Reports are also available on measurement of growth rate of blue-green algae and other photosynthetic microorganisms by monitoring optical density of microbiol s u s p e n s i o n a t t h e w a v e l e n g t h s o f 6 0 0 — 6 1 0 (CRIPPS a n d WORK 1 9 6 7 , J E F F E R Y et al. 1 9 7 3 , M Y E R S 1 9 6 2 , SAMEJIMA a n d M Y E R S 1 9 5 8 ) , 6 4 0 (KHAN a n d SEN 1 9 6 7 ) , 6 2 0 — 7 0 0

(DAS and SINGH 1975) where the interference by pigment absorption in scattering values

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S. P .

ADHIKABY

c a n n o t b e i g n o r e d . CASTENHOLZ ( 1 9 7 2 ) h a d o b s e r v e d a c l o s e a g r e e m e n t b e t w e e n t h e t u r b i d i t y u n i t s (at 6 1 0 n m ) a n d d r y w e i g h t of Oscillatoria cultures, b u t this relation did n o t hold g o o d at certain g r o w t h conditions w h e n changes in the p i g m e n t could b e r a p i d i n c o m p a r i s o n t o c h a n g e s i n d r y w e i g h t v a l u e s . U n l e s s t h e r a t e s of g r o w t h a n d p i g m e n t m e t a b o l i s m w e r e t h e s a m e , o p t i c a l d e n s i t y of t h e m i c r o b i o l s u s p e n s i o n a t p i g m e n t a b s o r b i n g w a v e l e n g t h s d i d n o t t r u e l y r e f l e c t t h e g r o w t h of t h e o r g a n i s m (MYERS 1 9 6 2 , VENKATARAMAN 1 9 6 9 ) . T o a v o i d i n t e r f e r e n c e b y p i g m e n t a b s o r p t i o n , s o m e lab o r a t o r i e s h a v e c h o o s e n t h e s p e c i f i c w a v e l e n g t h s of a s p e c t r u m l i k e 5 0 0 — 5 5 0 (MAGER et al. 1 9 5 6 , MYERS 1 9 7 2 , THOMAS a n d DAVID 1971), 7 5 0 (MCDONALD et al. 1 9 7 0 ) , 8 0 0 (GOEDHEER a n d KLEINENHAMMANS 1 9 7 7 ) etc., w h e r e t h e a b s o r p t i o n b y t h e p i g m e n t s is m i n i m u m a n d t h e a u t h o r s a s s u m e t h a t t h e o p t i c a l d e n s i t y is h e r e a f u n c t i o n of l i g h t s c a t t e r i n g b y t h e o r g a n i s m . S t u d i e s h a v e a l s o b e e n m a d e t o c u l t u r e m i c r o b e s i n a w i d e r a n g e of s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n s (BERNHEIM 1 9 6 3 , DANFORTH 1 9 6 2 , MAGER et al. 1 9 5 6 ) , U V i r r a d i a t i o n (AVIDOR et al. 1 9 5 6 , REDFORD a n d MYERS 1951), t o x i c c h e m i c a l s (AVXDOR et al. 1 9 5 6 ) , t e m p e r a t u r e (SOROKIN a n d MYERS 1 9 5 3 ) , l i g h t i n t e n s i t y (SOROKIN a n d KRAUSS 1 9 5 8 ) a n d i o n i c s t r e n g t h (AVIDOR et al. 1956, MAGER et al. 1 9 5 6 ) etc. t o i n v e s t i g a t e t h e e f f e c t of t h e s e f a c t o r s o n t h e m i c r o b i o l g r o w t h a s m o n i t o r e d b y l i g h t s c a t t e r i n g . B u t t h e s e f a c t o r s c a n a l s o c o n s i d e r a b l y a l t e r t h e s i z e a n d cell s u r f a c e of t h e m i c r o b e s a n d c o n s e q u e n t l y r e s u l t i n t h e c h a n g e of l i g h t s c a t t e r i n g v a l u e s w i t h o u t m u c h or a n y c h a n g e i n t h e i r g r o w t h r a t e i n t e r m s of d r y w e i g h t v a l u e s . F e w r e p o r t s are a v a i l a b l e (MESTRE 1 9 3 5 , VENKARATAMAN 1 9 6 9 ) o n t h e f a u l t y s i d e of t h e u s e of l i g h t s c a t t e r i n g t o m o n i t o r m i c r o b i o l g r o w t h . I t h a s b e e n t r i e d h e r e f o r a s y s t e m a t i c s t u d y o n t h e v a l i d i t y of t h e t e c h n i q u e i n m e a s u r i n g t h e g r o w t h r a t e of a f i l a m e n t o u s blue-green alga.

Materials

and

methods

Axenic cultures of t h e blue-green alga Westiellopsis prolifica were used as t h e experimental material. T h e algae were grown in A L L E N a n d A R N O N ' S medium ( 1 9 5 5 ) w i t h t r a c e elements (FOGG 1949) in medium free of combined nitrogen. T h e cultures were m a i n t a i n e d in a culture room a t 28 i 2 °C under continuous illumination f r o m d a y light fluorescent t u b e s a t a n intensity of 2200 lux. T h e cultures were h a n d shaken twice daily a n d were t r a n s f e r r e d a t 15 d a y intervals to fresh basal m e d i u m t o keep t h e alga in exponential growth phase for using in t h e experiments. Microcystis sp. was collected f r o m a local p o n d a n d t h e sample, as revealed b y microscopic studies, was f o u n d free f r o m a n y microbial contamination a n d hence it was directly used for experiments. T h e samples of Westiellopsis prolifica were homogenized in a micro-tissue homogenizer for a period of 2, 3 or 5 min separately. T h e samples were t h r o u g h l y shaked before t h e OD (scattering a t 760 nm) of t h e individual samples were recorded a t various time intervals. Scattering b y t h e suspension was measured a t 760 n m because of least interference b y t h e pigments absorption a t t h i s wavelength of t h e spectrum. To h a v e a calibration curve between growth versus OD a t 760 n m , t h e samples of Westiellopsis prolifica were homogenized for 3 min in AA medium. T h e homogenized samples were t h r o u g h l y s h a k e d a n d OD was measured in a B U S C H a n d L A M B spectronic-20 within 1 —2 min a f t e r p u t t i n g t h e cuvette in t h e sample holder of t h e i n s t r u m e n t . D r y weight of t h e sample was m e a s u r e d b y t h e procedure as decribed earlier (ADHIKARY 1981). F o r spectral measurements, t h e homogenized samples were suspended in 5 0 % glycerol (final concentration) and t h e absorption spectra of t h e t u r b i d samples were measured in a C A B L Z E I S S J e n a Y S U 2 - P spectrophotometer using t h e double diffusion technique as followed b y T H O M A S a n d NAGABAJA (1973). Organic substrates like glucose, fructose, sucrose, galactose, mannose a n d xylose were used, each a t t h e concentration of 0 . 2 % in t h e basal AA m e d i u m to induce heterotrophic growth of t h e alga. F o r few experiments, t h e alga was grown in AA m e d i u m deficient in magnesium (MgS0 4 ). T h e optical density values of t h e homogenized samples f r o m heterotrophic cultures or Mg 2 + deficient cultures were measured a t 760, 740, 720, 678, 665, 660, 652, 650, 620 a n d 600 n m .

Growth measurements of blue-green alga

477

The variation in OD at 760 nm for scattering measurements at different temperature, salts and pH were recorded. The homogenized samples were incubated at various temperatures and brought back to room temperature before OD of the samples was measured. Salts like MgS0 4 and CaCl2 were directly added to basal AA medium and the tried concentrations were computed as described in Fig. 4 (a—d). Desired pH of the culture medium was obtained by aseptic addition of few drops of N/10 NaOH or N/10 HC1 from time to time throughout the experimental period. In all the experimental samples, the OD at any wavelength was measured within first 1—2 min after homogenization.

Results and discussion Fig. 1. describes the changes in OD values at 760 nm of homogenized suspensions as a function of time. The initial OD of the sample homogenized for 5 min was 0.75 and the value does not change much for the first 2 min followed by an increase in OD with time and the peak value was 0.85 at 3.5 min after homogenization. The OD value declined thereafter and came down to 0.37 by the end of 5 min. Further changes in OD with time were insignificant and the value remained almost constant up to 20 min after homogenization. The OD of the samples (same quantity as in case of 5 min of homogenization) homogenized for 2 or 3 min was 0.5 in both cases does not change for the first 2 min followed by a rise in the next few minutes, with the peak value around 0.6. After 5 min of homogenization, OD values were 0.2 and 0.15 in case of samples homogenized for 3 or 2 min, respectively, and thereafter no significant change was noted up to 20 min.

Time (min)

Fig. 1. Changes in OD values at 760 nm of homogenized suspensions of Westiellopsis prolifica as a function of time. O 5 min homogenization, • 3 min homogenization, x 2 min homogenization

478

S. P . ADHIKABY

These results clearly indicate that the same quantity of algal sample showed various OD values as a function of time of homogenization. Thus it is important to note that during scattering measurements of a homogenized sample, the time of homogenization must remain constant for all test samples and the OD should be measured within 1 — 2 min after putting the cuvette in the sample holder of the instrument. Fig. 2 describes and compares the calibration curves of growth (in dry weight) versus scattering (OD at 760 nm) of Westiellopsis prolifica and Microcystis sp. In both cases, the curves were linear in shape. I t is also possible to have a calibration curve between OD at 760 nm versus growth, if OD of the homogenized sample measured after 5 min of homogenization when the change in OD is not very much significant for quite a considerable period of time.

Dry

weight

mg/ 1 ml

suspension

Fig. 2. Calibration curves of growth (in dry weight) versus scattering (OD at 760 nm) of Westiellopsis prolifica (o) and Microcystis sp. (•)

A comparison of absorption spectra of Microcystis suspension and homogenized suspension of Westiellopsis prolifica is shown in Fig. 3. The homogenized sample of Westiellopsis prolifica was suspended in 50% glycerol for better stability of the suspension. Both the suspensions exhibit normal spectral characteristics of blue green algae. The spectra in both the cases show peaks of chlorophyll at around 435 nm with carotenoid and phycocyanin bands at 490 nm and 620 nm, respectively. The red peaks are located at 678 nm of the spectrum in case of Westiellopsis prolifica and 672 nm in case of Microcystis sp. It is clear from both the spectra that at 760 nm there is minimum absorption by the algal suspensions where no interference of plant pigments are exhibited and it can be assumed that the optical density is here a function of light scattering by the organism. From these data it is also quite suggestive that growth measurements by light scattering and measurements of absorption spectra

479

Growth measurements of blue-green alga

k(nm) Fig. 3. Absorption spectra of whole cell suspensions of Microcystis sp. (®) and homogenized suspension of Westiellopsis prolifica ( O ) . Absorption values at different wavelengths were measured with C A R L Z E I S S Jena VSU 2-P spectrophotometer using 1 cm quartz cuvette

of a pigmented microbe which settles down during its growth, are possible, if proper precautions are taken during and after homogenization of the sample to make a stable suspension of the organism. Table 1 summarizes the changes in OD value of the samples of Westiellopsis prolifica induced by deficiency of Mg 2+ in culture medium. The OD values of constant quantity of homogenized samples obtained from the cultures incubated for over a period of 60 days with or without Mg 2+ remained the same at 720, 740 and 760 nm. However, nutritional deficiency caused significant decline in OD values of the same samples at 600, 620, 660, 665, and 678 nm (Table 1). Similarly the constancy of OD at 720, 740, and 760 nm and fluctuation of OD at 600 to 678 nm for all the samples of equal population (dry weight basis) from cultures grown in different pH may be noted (Table 2). Table 3 shows the alternations in OD values of the homogenized samples of Westiellopsis prolifica from cultures incubated for 20 days with various organic substrates in culture media. The OD values of the samples treated either with various organic substrates or grown without them remained the same on dry weight basis at 720, 740, 760 nm but on the other hand at 620, 660 and 678 nm the values of the same samples, if treated with either glucose, fructose or sucrose remained higher and they remained lower in case of galactose, mannose and xylose treatments in comparision with controls (without addition of any substrate). These results show that nutritional deficiency or addition of organic substrate like mannose, galactose or xylose during growth of the organism caused a significant decline in OD values for a constant population of samples at 620—678 nm, the wavelengths

480

S. P . ADHIKABY

Table 1 Optical density of a constant quantity (0.187 mg dry weight) of the homogenized suspension of Westiellopsis prolifica cultured and recultured over a period of 60 days in culture media with or without Mg2+

760

740

720

678

665

660

652

650

620

600

2

Mg +deficient culture media

0.1

0.1

0.1

0.11

0.11

0.11

0.11

0.11

0.11

0.11

Mg2+rich culture media

0.1

0.1

0.1

0.15

0.14

0.14

0.13

0.13

0.14

0.14

Table 2 Optical density of a constant quantity (0.187 mg dry weight) of the homogenized suspension of Westiellopsis prolifica cultured for 20 days in the culture media with different pH pH 5.5 6.0 7.0 8.5 10.0

760

740

720

678

665

660

652

650

620

600

0.1 0.1 0.1 0.1 0.1

0.1 0.1 0.1 0.1 0.1

0.1 0.1 0.1 0.1 0.1

0.13 0.14 0.15 0.16 0.14

0.13 0.13 0.14 0.15 0.14

0.12 0.13 0.14 0.14 0.13

0.11 0.12 0.13 0.13 0.12

0.11 0.12 0.13 0.13 0.12

0.12 0.13 0.14 0.15 0.14

0.12 0.12 0.14 0.14 0.13

Table 3 Optical density of a constant quantity (0.187 mg dry weight) of the homogenized suspension of Westiellopsis prolifica cultured for 20 days heterotrophically with different substrates Treatment (Substrate) Without any substrate Glucose Galactose Mannose Fructose Xylose Sucrose

760 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1

740

720

678

665

660

652

650

620

600

0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1

0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1

0.15 0.16 0.12 0.12 0.17 0.12 0.17

0.14 0.16 0.12 0.12 0.16 0.12 0.16

0.14 0.15 0.12 0.12 0.15 0.12 0.16

0.13 0.14 0.11 0.11 0.13 0.11 0.14

0.13 0.14 -0.11 0.11 0.14 0.11 0.15

0.14 0.15 0.12 0.12 0.15 0.12 0.16

0.14 0.15 0.11 0.11 0.14 0.12 0.15

where pigments like chlorophyll and phycocyanin etc. absorb light. On the contrary at same wavelengths, the OD value of the homogenized samples from cultures incubated in either glucose, fructose or sucrose remained higher than that of the controls (without substrate). The differential growth response to these substrates b y Westiellopsis prolifica has been marked in heterotrophic cultures (ADHIKABY and PATTNAIK 1979). Since OD values in above experiments were calculated on a dry weight basis, all these data would indicate that the rate of pigment metabolism (synthesis/degradation) is not the same as the growth rate and thus a calibration curve of dry weight versus OD at these wavelengths is meaningless for such experiments. The response of the alga to various p H of the medium has been observed previously (ADHIKABY 1980). The growth and chlorophyll content of the cultures were signifi-

481

Growth measurements of blue-greenalga

cantly declined in acidic and in extreme alkaline pH. Similar results were also observed in this case, where the interference of pigments in the OD values at 600 to 678 of homogenized suspensions from cultures of pH 7.0 and 8.5 is very well marked in comparison to samples of pH 5.5, 6.0 or 10.0 (Table 2). The OD values of the samples, grown with or without Mg 2 + , with or without various organic substrates or in different pH in culture media remained the same on dry weight basis at 760, 740 and 720 nm. Since pigments do not absorb light significantly at these wavelengths, the OD values here may be considered to be due to light scattering alone. But only if either nutritional deficiency or addition of exogeneous organic substrate did not bring any significant change in scattering properties of the organism during incubation period, a calibration curve of light scattering at 760 nm versus dry weight or cell number of the organism can be made to monitor algal growth rate. However, the experiments on the effects of pH, temperature and concentration of various salts on the changes of light scattering by the organism at 760 nm excludes the possibility of generalization of the technique. The changes in OD values at 760 nm of the homogenized suspension of Westiellopsis prolifica as induced by temperature, pH and concentration of various salts in the suspension medium are summarized in Pig. 4 (a—d). The OD of the samples (constant dry weight) showed higher values with increase in incubation temperature (4a).

30 0.13

f= g Ci «

W 50 Temperature (X)

c

0.12 __

v- 1 I

J/ X d

/

0.11

0.10

5.5 6 7 pH of suspension

1—II—

0.5 1.0 2.0 2.5 5J0 Concentration (mM)

k\

1

1

1 ,1—1

W 2.0 3.0 Concentration (M)

4.0

Fig. 4. Changes in the optical density at 760 nm of a constant quantity (0.187 mg dry weight) of the homogenized sample of Westiellopsis prolifica as effected by temperature (a), pH (b) and various salts (c, d). (c) • MgS0 4 , O CaCl 2 ; (d) NaCl

482

S. P . ADHIKABY

On the other hand p H treatment of the samples gave different kinds of results (4b). The optical density value (0.1) at p H 5.5 increased u p to a significant extent when the p H of suspensions were changed from 5.5 to 6.0, subsequently followed by a decline when the p H was changed to 7.0 and 8.0 and again a rise when the p H was adjusted a t 10.0. The increase in OD values with the increase in incubation temperature would suggest irreversible shrinkage of the surface of algal cell walls. The alteration in scattering properties due to changes in p H of the culture media may be due to redistribution of surface charges and subsequent conformational alterations in cell surface. The increase in OD by NaCl u p to 10% of its concentration (Fig. 4d) may be attributes to cell shrinkage due to removal of water from cell and subsequent decline in OD values during further increase in salt concentration may be due to entry of salts into the cells at its higher concentration t h a t results in nullifying the osmotic effect and cell size and shape. On the other hand, the alterations of scattering were different with CaCl2 and MgS0 4 treatments (4c). Mg 2+ treatment, in the concentration range of 0.5 to 5.0 mM, did not exhibit any change in the OD value whereas Ca 2+ brought about a negligible increase in the initial OD at the concentrations of 0.5 and 1.0 mM, followed by a significant increase in OD values on further increase in the concentration of the salt. I t is difficult to interpret these data in terms of osmotic phenomenon. However, the differential interaction of Mg 2+ and Ca 2+ with surface charge of the organism and consequent alteration in the properties of the cell surface cannot be ignored. Thus, all these data would suggest t h a t the alterations in the physical and chemical characteristics of the culture media may change the OD values significantly in addition to their effects on the growth and metabolism of the organism. Acknowledgements I wish to thank Dr. H. PATTNAIK, Professor and Head, Department of Botany, Berhampur University for providing necessary facilities and encouragement. Thanks are also due to Dr. U. C. B I S W A L ; Dr. Miss J A Y A N T I S A H U and Mr. S . N . P A D H Y for useful criticism on the work.

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484

Buchbesprechungen K. DRÖSSLER, Wörterbücher der Biologie — Immunologie. 150 S., 86 Abb., 11 Tab. Jena 1982. VEB Gustav Fischer Verlag. M 14,00. Der Verfasser hat mit diesem Taschenbuch den geglückten Versuch unternommen, die wichtigsten Begriffe aus dem Gesamtgebiet der Immunologie zusammenzufassen und zu erläutern. Die Darstellung wird durch zahlreiche Skizzen und Tabellen unterstützt. Verständlicherweise mußten die Auswahl der Termini im Rahmen des relativ kleinen Büchleins auf die wichtigsten begrenzt bleiben. Sehr zu begrüßen ist jedoch die Aufnahme der englischen Fachausdrücke als selbständige Stichwörter, da die immunologische Fachliteratur heute ohnehin fast ausschließlich in Englisch publiziert wird. Das Büchlein ist als Nachschlagewerk sowohl den Studenten der Biologie, Medizin und Veterinärmedizin als auch allen Praktikern, die die Immunologie „am Rande" benötigen, zu empfehlen. Einige Hinweise auf kleine Fehler sollen den Wert des Buches keineswegs schmälern: So sind Lektine nicht auf Pflanzen beschränkt, sondern auch bei Tieren und Mikroorganismen vorhanden, und der Begriff Protektin kann heute nur noch als Synonym für Lektin angesehen werden. Eine baktericide Wirkung ist für Protektine (Lektine) noch nicht nachgewiesen. Opsonine vermitteln die Bindung (nicht die Bildung) der Bakterien. Der Makrophage im ZNS wird heute besser als Hirnmakrophage bezeichnet, da die Mikroglia auch Zellen mit anderer Funktion aufweist. M. W A G N E R (Jena) J . H Ä U S L E R , Schizomycetes (Bakterien) (Band 20 der Süßwasserflora von Mitteleuropa, herausgegeben von H . ETTL, J. GERLOFF, H. H E Y N I G ) . X + 588 S., 340 Abb. Jena 1982. VEB Gustav Fischer-Verlag. M 148, 00. Dem Charakter der Publikationsreihe entsprechend werden im wesentlichen die typischen wasserbewohnenden Bakterien behandelt und für ihre Bestimmung, wo immer möglich, morphologische Merkmale herangezogen. Diese bewußten Beschränkungen haben zu einem Werk geführt, das in der Hand des Praktikers in den einschlägigen Arbeitsgebieten der Wasserwirtschaft im weitesten Sinne von gewissem Nutzen sein sollte. Ähnlich wie in B E R G E Y ' S Manual of Determinative Bacteriology (8. Aufl.) wird nicht versucht, ein phylogenetisch begründetes System darzustellen. Von den 10 Teilen, in die der Text gegliedert ist, entsprechen die Teile I—VII in ihrer Grobeinteilung dem B E R G E Y (Phototrophe Bakterien, Gleitende Bakterien, Bakterien mit Scheide, Knospende Bakterien und solche mit Anhängseln, Spirochäten, Spirillen und gekrümmte Bakterien, Gramnegative aerobe Stäbchen und Kokken). Die übrigen Teile (Chemolithotrophe Schwefelbakterien, Chemolithotrophe Eisen und Mangan ablagernde Bakterien, Addendum) sind den speziellen Gegebenheiten des Anliegens angepaßt. Außer bei den im Addendum zusammengestellten, nicht einordenbaren Organismen sind in allen Fällen Bestimmungsschlüssel bis zu den Arten angegeben. Sie werden durch sehr klare Zeichnungen (teilweise Umzeichnungen nach publizierten licht- und elektronenoptischen Aufnahmen) illustriert. Es ist allerdings fraglich, ob damit der oft hohe Informationsgehalt guter Photogramme voll erfaßt werden kann (z.B. wird der vor allem durch rasterlektronenmikroskopische Aufnahmen gut darstellbare Eindruck vom abgeflachten Bau der Trichome von Simonsiella in der Zeichnung keineswegs erreicht). Vielleicht wäre es nützlich, künftig in erheblich stärkerem Maße entsprechende Darstellungsmöglichkeiten vorzusehen. U. T A U B E N E C K (Jena)

Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie

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1983

8

485—490

(Sektion Biologie der Friedrich-Schiller-Universität Jena, Technische Mikrobiologie)

Bildung von Phaseolotoxin und Phosphosulfamylornithin durch Pseudomonas syringae pv. phaseolicola in Submerskultur F . BUBLITZ u n d B E A T E VÖLKSCH

(Eingegangen

am

31.1.1983)

Phaseolotoxin (N^-phosphosulfamyl-ornithyl-alanyl-homoarginine) from culture-supernatants of Pseudomonas syringae pv. phaseolicola and N Ä -phosphosulfamylornithine (PSOrn) obtained from phaseolotoxin by treatment with leucine aminopeptidase were compared in regard to their inhibition effects by means of the enzymatic toxin test as well as by bioassay. In the enzymatic toxin test PSOrn exhibits an inhibiting effect five times stronger than that of phaseolotoxin. The maximal inhibition due to PSOrn is also higher. On the other hand, only phaseolotoxin caused growth inhibition in the bioassays used (indicator organisms: Escherichia coli, Euglena gracilis). Tests are presented which allow to detect these compounds selectively. Their application showed t h a t the strain studied produced phaseolotoxin as well as PSOrn in submerged cultures.

Das phytopathogene Bakterium Pseudomonas syringae pv. phaseolicola ( B U R K und W I L K I E 1 9 7 8 ( Y O U N G et al. 1 9 7 8 ) [syn. Pseudomomas phaseolicola ( B U R K H O L D E R 1 9 2 6 ) D O W S O N 1 9 4 3 ] ist der Erreger der Fettfleckenkrankheit von Buschbohnen (Phaseolus vulgaris L.). Charakteristische Krankheitssymptome sind chlorotische Höfe um die Infektionsstellen sowie die Ausbildung einer systemischen Chlorose bei empfindlichen Sorten. An den Hülsen treten wasserdurchtränkte „Fettflecken" auf. Die im chlorotischen Blattgewebe beobachtete Ornithinanhäufung beruht auf der Hemmung der Ornithincarbamyltransferase (OCT, EC 2 . 1 . 3 . 3 ) ( P A T I L et al. 1 9 7 0 ) . Dieses Enzym katalysiert die Umsetzung von Ornithin und Carbamylphosphat zu Citrullin. Verursacht wird diese Hemmung durch ein extrazelluläres Toxin, das von P. phaseolicola gebildet wird. Diese als Phaseolotoxin bezeichnete Substanz wurde von M I T C H E L L ( 1 9 7 6 ) isoliert und gereinigt. Es handelt sich dabei um das Tripeptid N Ä -phosphosulfamyl-ornithyl-alanyl-homoarginin. M I T C H E L L und B I E L E S K I ( 1 9 7 7 ) konnten anderseits zeigen, daß in infizierten Bohnenblättern kein Phaseolotoxin, sondern dessen Spaltprodukt ^-phosphosulfamylornithin (PSOrn) nachweisbar ist. Die biologische Bedeutung dieser Spaltungsreaktion ist unklar. PSOrn bewirkt ebenfalls wie das Phaseolotoxin Chlorose ( M I T C H E L L U. HOLDER 1 9 2 6 ) YOUNG, D Y E

BIELESKI 1977).

Zur quantitativen und halb quantitativen Bestimmung des Phaseolotoxins finden verschiedene Methoden Anwendung: Chlorosetest an Blättern von Bohnen und Mangold ( R U D O L P H U. R A S C H E 1 9 7 9 ) , Hemmung der Bohnen-OCT in vitro ( P A T I L et al. 1 9 7 0 ) und ein mikrobiologischer Biotest ( S T A S K A W I C Z U. P A N O P O U L O S 1 9 7 9 ) . Die Nachweisgrenzen dieser Methoden unterscheiden sich beträchtlich. Bei der Anwendung des enzymatischen OCT-Testes und des E. coZi-Biotestes zur Kontrolle der Aufarbeitung des Phaseolotoxins erhielten wir scheinbar widersprüchliche Befunde. Sie deuten auf die Existenz mehrerer biologisch-aktiver Substanzen im Kulturüberstand hin. Zur Klärung dieser Frage wurde ein Aufbereitungs- und Testsystem entwickelt, das es gestattet, Phaseolotoxin und PSOrn selektiv im Kulturüberstand zu bestimmen. Diese Methoden werden beschrieben. Es wurde nachge-

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(Sektion Biologie der Friedrich-Schiller-Universität Jena, Technische Mikrobiologie)

Bildung von Phaseolotoxin und Phosphosulfamylornithin durch Pseudomonas syringae pv. phaseolicola in Submerskultur F . BUBLITZ u n d B E A T E VÖLKSCH

(Eingegangen

am

31.1.1983)

Phaseolotoxin (N^-phosphosulfamyl-ornithyl-alanyl-homoarginine) from culture-supernatants of Pseudomonas syringae pv. phaseolicola and N Ä -phosphosulfamylornithine (PSOrn) obtained from phaseolotoxin by treatment with leucine aminopeptidase were compared in regard to their inhibition effects by means of the enzymatic toxin test as well as by bioassay. In the enzymatic toxin test PSOrn exhibits an inhibiting effect five times stronger than that of phaseolotoxin. The maximal inhibition due to PSOrn is also higher. On the other hand, only phaseolotoxin caused growth inhibition in the bioassays used (indicator organisms: Escherichia coli, Euglena gracilis). Tests are presented which allow to detect these compounds selectively. Their application showed t h a t the strain studied produced phaseolotoxin as well as PSOrn in submerged cultures.

Das phytopathogene Bakterium Pseudomonas syringae pv. phaseolicola ( B U R K und W I L K I E 1 9 7 8 ( Y O U N G et al. 1 9 7 8 ) [syn. Pseudomomas phaseolicola ( B U R K H O L D E R 1 9 2 6 ) D O W S O N 1 9 4 3 ] ist der Erreger der Fettfleckenkrankheit von Buschbohnen (Phaseolus vulgaris L.). Charakteristische Krankheitssymptome sind chlorotische Höfe um die Infektionsstellen sowie die Ausbildung einer systemischen Chlorose bei empfindlichen Sorten. An den Hülsen treten wasserdurchtränkte „Fettflecken" auf. Die im chlorotischen Blattgewebe beobachtete Ornithinanhäufung beruht auf der Hemmung der Ornithincarbamyltransferase (OCT, EC 2 . 1 . 3 . 3 ) ( P A T I L et al. 1 9 7 0 ) . Dieses Enzym katalysiert die Umsetzung von Ornithin und Carbamylphosphat zu Citrullin. Verursacht wird diese Hemmung durch ein extrazelluläres Toxin, das von P. phaseolicola gebildet wird. Diese als Phaseolotoxin bezeichnete Substanz wurde von M I T C H E L L ( 1 9 7 6 ) isoliert und gereinigt. Es handelt sich dabei um das Tripeptid N Ä -phosphosulfamyl-ornithyl-alanyl-homoarginin. M I T C H E L L und B I E L E S K I ( 1 9 7 7 ) konnten anderseits zeigen, daß in infizierten Bohnenblättern kein Phaseolotoxin, sondern dessen Spaltprodukt ^-phosphosulfamylornithin (PSOrn) nachweisbar ist. Die biologische Bedeutung dieser Spaltungsreaktion ist unklar. PSOrn bewirkt ebenfalls wie das Phaseolotoxin Chlorose ( M I T C H E L L U. HOLDER 1 9 2 6 ) YOUNG, D Y E

BIELESKI 1977).

Zur quantitativen und halb quantitativen Bestimmung des Phaseolotoxins finden verschiedene Methoden Anwendung: Chlorosetest an Blättern von Bohnen und Mangold ( R U D O L P H U. R A S C H E 1 9 7 9 ) , Hemmung der Bohnen-OCT in vitro ( P A T I L et al. 1 9 7 0 ) und ein mikrobiologischer Biotest ( S T A S K A W I C Z U. P A N O P O U L O S 1 9 7 9 ) . Die Nachweisgrenzen dieser Methoden unterscheiden sich beträchtlich. Bei der Anwendung des enzymatischen OCT-Testes und des E. coZi-Biotestes zur Kontrolle der Aufarbeitung des Phaseolotoxins erhielten wir scheinbar widersprüchliche Befunde. Sie deuten auf die Existenz mehrerer biologisch-aktiver Substanzen im Kulturüberstand hin. Zur Klärung dieser Frage wurde ein Aufbereitungs- und Testsystem entwickelt, das es gestattet, Phaseolotoxin und PSOrn selektiv im Kulturüberstand zu bestimmen. Diese Methoden werden beschrieben. Es wurde nachge-

486

F. Bublitz und Beate Völksch

wiesen, daß vom untersuchten Stamm beide Wirkstoffe in Submerskultur produziert werden, und daß PSOrn kein artifizielles Produkt der Aufarbeitung ist. Material und Methoden Stamm und Kultivierung: Zur Toxinproduktion diente der von uns isolierte Stamm P. phaseolicola 6/0. Vor- und Hauptkulturen erfolgten in 500-ml-Rundstandkolben mit 100 ml Nährlösung nach W a t a n a b e (1963) mit verstärkter Pufferkapazität (0,55% (NH 4 ) 2 HP0 4 ; 0 , 2 6 % K H 2 P 0 4 ) auf Bundschüttlern. Die Hauptkultur wurde mit 10 ml einer 24 h alten Vorkultur bei 18 °C 48 h beimpft. Die Toxinbestimmung erfolgte im Kultuiüberstand nach Zentrifugieren bei 10000 U/min. Das Wachstum wurde durch Trübungsmessung (Extinktion bei 578 nm) bestimmt. Abtrennung von Phaseolotoxin zum separaten Nachweis von PSOrn: Das gebildete Phaseolotoxin wurde durch Adsorption an Aktivkohle abgetrennt. Dazu wurden 1 ml Kulturüberstand mit 40 mg Aktivkohle DARCO G 60 5 min geschüttelt und abzentrifugiert. Der Überstand enthielt das gesamte PSOrn. Spaltung von Phaseolotoxin durch Leucinaminopeptidase (LAP, EC 3.4.11.1): PSOrn erhielten wir aus Phaseolotoxin durch Spaltung mit LAP. Dazu wurde 1 ml Kulturüberstand mit Tris/HClPuffer auf pH 8,0 eingestellt (Endkonzentration 100 mM) und mit 3 mU LAP aus Rinderaugenlinsen (AWD Dresden) 12 h bei 25 °C inkubiert. Enzymatischer Test für Phaseolotoxin und PSOrn: Grundlage ist die von Patil et al. ( 1 9 7 0 ) beschriebene Hemmung der Ornithincarbamyltransferasereaktion. Der Nachweis des gebildeten Citrullins erfolgte mittels modifizierter Variante des von Ceriotti ( 1 9 7 3 ) angegebenen Verfahrens. Substratlösung: L-Ornithinmonohydrochlorid 20 mM, Carbamylphosphat als Di-Lithium-Salz 23 mM in Veronalpuffer pH 7,0 70 mM; Enzym 0,6 — 1,6 mü/25 jj.1. Färbereagens: Lösung A: 4 g Antipyrin, 50 mg Fe 2 (S0 4 ) 3 gelöst in 1 1 10%iger Schwefelsäure; Lösung B : 5 g Diacetylmonoxim mit 5%iger Essigsäure (V/V) auf 1 1 aufgefüllt. Die Essigsäure enthält 0 , 3 % B r i j 35. Vor Gebrauch werden gleiche Volumina der Lösungen A und B gemischt. Enzym und Toxin (beim Vergleichswert Puffer anstelle von Toxin) werden zu gleichen Teilen gemischt und 15 min bei 25 °C vorinkubiert. Die Enzymreaktion wird durch Zusatz von 50 ¡¿1 dieser Mischung zu 100 (il Substratlösung gestartet und nach 15 min bei 25 °C mit 1 ml Färbereagens abgestoppt. Die abgestoppten Proben werden anschließend 15 min auf 100 °C erhitzt und nach Abkühlen die Extinktion bei 460 nm gegen Wasser gemessen. Aus den Extinktionsdifferenzen zwischen den jeweiligen Haupt- und Blindwerten (vor Enzymzusatz abgestoppt) der Vergleichsbestimmung (100%) und der Toxinbestimmung wird die relative Hemmung errechnet. Als Enzym wurde teilgereinigte Bohnen-OCT verwendet. Die Reinigung erfolgte in Anlehnung an Kleczkowski und Cohen ( 1 9 6 4 ) . Als Ausgangsmaterial dienten Blätter von 3 Wochen alten Bohnenpflanzen (Sorte Berggold). Der Niederschlag zwischen 45-60%iger (NH 4 ) 2 S0 4 -Sättigung, gelöst in 0,1 m Trispuffer pH 8,5 wurde als teilgereinigte Bohnen-OCT (spez. Aktivität 5,7 mU/mg) eingesetzt. Bioteste: Die Bestimmung der Toxingehalte der Kulturüberstände erfolgte mittels Agardiffusionstest mit Euglena gracilis (Euglena-JSiotest) bzw. Escherichia coli N 100 (E. coK-Biotest) als Indikatororganismen. Die Testplatten ( 0 130 mm) für den Euglena-Biotest bestehen aus einer Grundschicht aus 40 ml eines 2%igen Bactoagar-^Zerca-Mediums (0,1 g NaCl, 0,4 g MgS0 4 • 7 H 2 0 , 0,4 g K H 2 P 0 4 , 0,05 g CaCl 2 ,1,0 g (NH 4 ) 2 S0 4 , 10 g Glucose, 2,0 g Glutaminsäure, 10 mg Fe-(III)-EDTA, 10" 2 mg Vitamin B 1 ; 5 • 1 0 - 4 mg Vitamin B J 2 ; 1 ml Spurenelementlösung auf 1 1 aqua dest.) und einer Deckschicht, die sich aus 4 ml 2%igem Bacto-Wasseragar und 4 ml Euglena-Snspension zusammensetzt. Zur Herstellung der üiigriewa-Suspension diente eine etwa 14 Tage alte .EttgrZema-Schrägagarkultur, die mit 10 ml aqua dest. abgeschwemmt wurde. In die Platten wurden Löcher ( 0 8 mm) gestanzt und in diese 50 [j.l der zu prüfenden Lösung einpipettiert. Die Platten wurden unter Kunstlicht (14 h hell, 10 h dunkel) bei ca. 28 °C inkubiert. Die halb quantitative Auswertung erfolgte nach 4 Tagen. Der E. coii-Biotest wurde in einer modifizierten Variante nach Staskawicz und Panopoulos (1979) durchgeführt. Die Herstellung der Testplatten erfolgte in gleicher Weise wie beim EuglenaBiotest. Die Deckschicht setzt sich aus 5 ml 2%igem Bacto-Wasseragar und 5 ml E. coZi-Suspension (E578 = 0,3) zusammen. Der Durchmesser des sich nach 24 h bei 27 °C ausbildenden Hemmhofes ist ein Maß für die Toxinkonzentration in relativen Einheiten (TE).

Ergebnisse und

Diskussion

Bei der Isolierung und Reinigung des Phaseolotoxins (unpublizierte Ergebnisse) wurde die Wirksamkeit der einzelnen Reinigungsschritte sowohl mit den Biotesten

Bildung von Phaseolotoxin durch Pseudomonas

487

als auch mit dem enzymatischen Toxintest überprüft. Wir wendeten zunächst die von P A T I L et al. ( 1 9 7 2 ) beschriebene Aufarbeitungsmethode aus dem Lyophilisat von aktivem Kulturüberstand an. Bei der analytischen Überprüfung erhielten wir scheinbar widersprüchliche Ergebnisse. Mit dem enzymatischen Toxintest konnten wir die Anreicherung eines Wirkstoffes nachweisen, während die hemmende Wirkung im E. coliTest bis unter die Nachweisgrenze abnahm. Diese Befunde sprechen eindeutig für die Existenz von zwei unterschiedlichen biologisch aktiven Substanzen im Kulturüberstand. Um die Ursache für den Verlust an E. coZi-hemmender Substanz während der Reinigung zu finden, wurde untersucht, ob aus dieser durch eine Zersetzungsreaktion die zweite hemmende Substanz entsteht, oder ob beide Substanzen gleichzeitig vom Organismus gebildet und anschließend während der Aufarbeitung getrennt werden. S e l e k t i v e r Nachweis von P h o s p h o s u l f a m y l o r n i t h i n und Phaseolotoxin Von M I T C H E L L und B I E L E S K I ( 1 9 7 7 ) sowie S T A S K A W I C Z und PANOPOULOS ( 1 9 8 0 ) wurde nachgewiesen, daß aus Phaseolotoxin durch LAP-Behandlung PSOrn entsteht. Wir untersuchten daher die Wirkung des Überstandes einer 48 h alten Kultur (Hauptkomponente Phaseolotoxin) sowohl unbehandelt als auch nach Einwirkung von LAP im enzymatischen Toxintest und in den Biotesten. Abbildung 1 zeigt, daß beide Substanzen — Phaseolotoxin und PSOrn — die OCTReaktion hemmen. Unterschiedlich ist das Ausmaß der Hemmung. Im Bereich erster Ordnung der Kurve (bei gleicher molarer Konzentration des Inhibitors) zeigt das Spaltprodukt PSOrn eine ca. fünffach stärkere Hemmung der OCT-Reaktion als das Phaseolotoxin (unterschiedliche Kurvenanstiege im Bereich erster Ordnung). Die maximale Hemmung bei Verwendung von PSOrn ist ca. 10% höher als beim Phaseolotoxin. Bei Verwendung von Reinsubstanzen und unter Reaktionsbedingungen, die nicht mit unseren übereinstimmen, konnten K W O K und P A T I L (1982) sogar eine 15 bis 20mal stärkere OCT-Hemmung erzielen. Die Wirkung der beiden Substanzen in den verwendeten Biotesten sind in den Abbildungen 2 und 3 dargestellt. Es läßt sich erkennen, daß nur Phaseolotoxin eine Wachstumshemmung bei E. coli und Euglena gracilis verursacht, während PSOrn

SS

100

E=

I

60 40

20

0,05 0,10

0,20 0,39 0,78

1,56

3,12 6,25

12,5

25

jil Toxin/Test

Abb. 1. Hemmung der Bohnen-OCT (enzymatischer Test) durch PSOrn (-A—A-) und Phaseolotoxin (-A—A-). Errechnete Ausgleichsgeraden im Bereich 1. Ordnung (- - - -).

488

F . BUBLITZ u n d BEATE VÖLKSCH

Abb. 2. Wirkung von Phaseolotoxin (1, 2) und PSOrn (3, 4) im E. coh'-Biotest.

Abb. 3. Wirkung von Phaseolotoxin (1, 2) und PSOrn (3, 4) im Euglena-Biotest

unwirksam ist. Da sowohl Phaseolotoxin als auch PSOrn in vitro die OCT-Reaktion hemmen, beruht die Unwirksamkeit des Spaltproduktes in beiden Biotesten möglicherweise auf Aufnahmephänomenen. So konnten STASKAWICZ und PANOPOTJLOS ( 1 9 8 0 ) zeigen, daß der Transport von Phaseolotoxin durch die Zellwand von E. coli und Salmonella typhimurium mittels Oligopeptidpermeasen (OPP) bewirkt wird und daß OPP~-Mutanten nicht durch Phaseolotoxin gehemmt werden. Weiterhin wiesen sie nach, daß OPP nicht zum Transport modifizierter Aminosäuren befähigt sind. Aus diesen Ergebnissen leiten sie die Vermutung ab, daß die Unwirksamkeit des PSOrn auf ein fehlendes Transportsystem zurückzuführen ist, sowie daß die Anzahl der Aminosäuren des Wirkstoffes eine wesentliche Funktion beim Transport durch die Membran hat. Die beschriebenen Transportphänomene für Phaseolotoxin und PSOrn können jedoch nicht in jedem Fall auf andere Organismen verallgemeinert werden. Phaseolotoxin bewirkt zum Beispiel keine Wachstumshemmung verschiedener Algen der Ordnung Chloroccocales (unpublizierte Ergebnisse). Wie im folgenden Abschnitt gezeigt werden wird, bildet der von uns verwendete Stamm 6/0 in Submerskultur sowohl Phaseolotoxin als auch PSOrn. Da es im Verlauf

Bildung von Phaseolotoxin durch

489

Pseudomonas

der Aufarbeitung und Reinigung zur Trennung der beiden Substanzen kommt, sind scheinbare Widersprüche beim Vergleich der einzelnen Teste erklärbar. Die Aufarbeitung des Kulturüberstandes durch Methanolextraktion führte nur zu einer Anreicherung des PSOrn, deshalb wurde eine andere Methode auf der Basis der Adsorption des Wirkstoffes an Aktivkohle geprüft (MITCHELL 1976). Das auf diese Weise isolierte und gereinigte Phaseolotoxin ist nach der Dünnschichtchromatographie und der Aminosäureanalyse identisch mit Literaturwerten. E s zeigte sich dabei, daß Phaseolotoxin durch Adsorption an Aktivkohle quantitativ aus Kulturüberständen entfernt werden kann, während PSOrn unverändert im Kulturüberstand verbleibt. Damit bestand die Möglichkeit, die beiden Wirkstoffe in zwei Einzeltesten selektiv zu erfassen: Phaseolotoxin im E . coii-Biotest und PSOrn nach Entfernung von Phaseolotoxin mit Aktivkohle im enzymatischen Toxintest. T o x i n b i l d u n g s v e r m ö g e n in S u b m e r s k u l t u r Mit Hilfe der beschriebenen selektiven Teste klärten wir die Frage, ob von Pseudomonas syringae pv. phaseolicola, nur Phaseolotoxin, oder ob beide Substanzen — Phaseolotoxin und PSOrn — vom Mikroorganismus gebildet werden. Dieses wurde in einer Submerskultur (Kultivierungsdauer 192 h) geprüft (Abb. 4). Beide Substanzen sind im Kulturüberstand über die gesamte Kulturdauer nachweisbar. Weiterhin ist auffällig, daß das PSOrn-Maximum 8 h vor dem Phaseolotoxin-Maximum auftritt. Wachstum und Toxinbildung verlaufen weitgehend parallel; der am Ende der Wachstumsphase erreichte Phaseolotoxingehalt bleibt über längere Zeit relativ konstant, während der PSOrn-Gehalt stärkeren Schwankungen unterworfen ist. Der erneute Anstieg des PSOrn-Gehaltes ab 4. Tag beruht wahrscheinlich auf der Wirkung der durch Zellyse freigesetzten Peptidasen, die aus Phaseolotoxin PSOrn bilden können. Über das Auftreten von PSOrn in Kulturüberständen liegt bisher keine Information vor. MITCHELL und BIELESKI (1977) wiesen es jedoch in infizierten B o h n e n b l ä t t e r n

nach. Sie konnten zeigen, daß Phaseolotoxin durch pflanzeneigene Peptidasen zu

_L fr

I 48

I 72

I 96

I 120

L 144

1_ 168

192 Stunden

Abb. 4. Toxinbildungsvermögen von Pseudomonas syringae pv. phaseolicola Stamm 6/0 in Submerskultur. Der relative Phaseolotoxingehalt (TE) wurde mittels des E. coK-Biotestes bestimmt 33

Z. Allg. Mikrobiol., B d . 23, H. 8

F . BUBLITZ u n d BEATE YÖLKSCH

490

P S O r n g e s p a l t e n wird u n d v e r m u t e n , daß diese R e a k t i o n a u c h in infizierten P f l a n z e n stattfindet. I n K u l t u r ü b e r s t ä n d e n w u r d e v o n M I T C H E L L u n d B I E L E S K I ( 1 9 7 7 ) bisher kein P S O r n n a c h g e w i e s e n . D a s liegt n a c h d e n vorliegenden E r g e b n i s s e n wahrscheinlich a n der Art der A u f b e r e i t u n g . W i r d als erster R e i n i g u n g s s c h r i t t eine A d s o r p t i o n a n A k t i v k o h l e d u r c h g e f ü h r t , so wird P S O r n n i c h t erfaßt. A u s g e h e n d v o n L i t e r a t u r d a t e n ( R U D O L P H U . R A S C H E 1681) u n d unseren Ergebnissen ergibt sich der H i n w e i s , daß für die Virulenz eines S t a m m e s das Verhältnis der b e i d e n v o n i h m produzierten W i r k s t o f f e — P h a s e o l o t o x i n u n d P S O r n — verantw o r t l i c h ist. R U D O L P H u n d R A S C H E (1981) verglichen einige Pseudomonas phaseolicola S t ä m m e hinsichtlich ihrer Virulenz u n d der chloroseinduzierenden W i r k u n g der jeweiligen K u l t u r ü b e r s t ä n d e bzw. der K o h l e e l u a t e . B e i S t ä m m e n hoher Virulenz f a n d e n sie i m K u l t u r ü b e r s t a n d u n d i m K o h l e e l u a t T o x i n . D a g e g e n e n t h i e l t bei S t ä m m e n geringer Virulenz nur der K u l t u r ü b e r s t a n d T o x i n . W i r v e r m u t e n , daß virulente S t ä m m e s o w o h l P h a s e o l o t o x i n als a u c h P S O r n ins K u l t u r m e d i u m abgeben, während n i c h t b z w . s c h w a c h virulente S t ä m m e wahrscheinlich nur P S O r n bilden. B e i zwei v i r u l e n t e n S t ä m m e n v o n Pseudomonas phaseolicola ( S t a m m 6/0; 1321) k o n n t e n wir n a c h w e i s e n , d a ß sie beide W i r k s t o f f e in Submerskultur ausscheiden. Ob es a u c h S t ä m m e gibt, die ausschließlich P h a s e o l o t o x i n bilden, m ü s s e n n o c h weitere U n t e r s u c h u n g e n zeigen. Literatur CERIOTTI, G., 1973. Optimal conditions for ornithine carbamyltransferase determination. A simple micromethod without deproteinization Clin. Chim. Acta, 47, 97 — 105. K L E C Z K O W S K T , K . and C O H E N , P. P., 1 9 6 4 . Purification of ornithine transcarbamylase from pea seedlings. Arch. Biochem. Biophys., 1 0 7 , 2 7 1 — 2 7 8 . K W O K , 0 . C. H . and P A T I L , S . S . , 1 9 8 2 . Activation of a chlorosis-inducing toxin of Pseudomonas syringae pv. phaseolicola by leucine aminopeptidase. FEMS Microbiol. Lett., 14, 2 4 7 — 2 4 9 . MITCHELL, R. E., 1976. Isolation and structure of a chlorosis-inducing toxin of Pseudomonas phaseolicola. Phytochem., 15, 1941-1947. M I T C H E L L , B . E . and B I E L E S K I , R . L., 1 9 7 7 . Involvement of phaseolotoxin in halo blight of beans. Transport and conversion to functional toxin. Plant Physiol., 6 0 , 7 2 3 — 7 2 9 . P A T I L , S . S . , K O L A T T U K U D Y , P. E . and D I M O N D , A . A . , 1 9 7 0 . Inhibition of ornithine carbamyl transferase from bean plants by the toxin of Pseudomonas phaseolicola. Plant Physiol., 46, 752-753. PATIL, S. S., TAM, L . Q.

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'

Anschrift: Dr. F. B U B L I T Z Sektion Biologie, Technische Mikrobiologie Friedrich-Schiller-Universität DDR-6900 Jena:, Beutenbergstraße 11

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Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie

1983

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491-494

(Akademie der Wissensehaften der DDR, Institut für technische Chemie, Leipzig, Direktor: Prof. Dr. sc. M. RINGPFEIL)

Influence of phosphate concentration on the respiratory activity of Azotobacter vinelandii L . HALDENWANG a n d U . BEHKENS

(Eingegangen am 22. 2.1983) Azotobacter vinelandii was grown in batch cultures supplied with ammonia as an N-source and phosphate at limiting concentrations. After phosphate depletion the respiratory rate was affected in a characteristic way. The oxygen consumption during growth and the phase following growth was substantially higher than in cultures amply supplied with phosphate. I t is suggested that phosphate limitation impairs the oxidative phosphorylation and stimulates the substrate phosphorylation which leads to a higher degree of respiratory NAD(P)H oxidation due to changes in the branched electron transport system. Azotobacter species a r e c a p a b l e of f i x i n g molecular n i t r o g e n f r o m aerobic e n v i r o n m e n t s . T o e n s u r e n i t r o g e n a s e a c t i v i t y in t h e p r e s e n c e of o x y g e n , Azotobacter cells p e r f o r m " r e s p i r a t o r y p r o t e c t i o n " ( D A L T O N a n d POSTGATE 1 9 6 9 ) which r e m o v e s excess o x y g e n v i a e n h a n c e d r e s p i r a t i o n b y p a r t i a l u n c o u p l i n g a n d p a t h w a y c h a n g e of t h e b r a n c h e d r e s p i r a t o r y chain ( H A D D O C K a n d J O N E S 1 9 7 7 ) . Moreover, Azotobacter species a c c u m u l a t e large a m o u n t s of e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e s w h i c h a r e likely t o r e d u c e t h e r a t e of o x y g e n d i f f u s i o n , t h e r e b y p r o t e c t i n g t h e n i t r o g e n a s e ( J A R M A N et al. 1 9 7 8 ) . H i g h p r o d u c t i v i t y in b a c t e r i a l a l g i n a t e s y n t h e s i s h a s b e e n a c h i e v e d in c o n t i n u o u s f e r m e n t a t i o n s a t c o n d i t i o n s of p h o s p h a t e l i m i t a t i o n a n d n i t r o g e n f i x a t i o n ( D E A V I N et al. 1 9 7 7 ) . Since r e s p i r a t o r y p r o t e c t i o n does n o t occur in m e d i a c o n t a i n i n g n i t r o g e n in a b o u n d f o r m a n increase in t h e yield of b a c t e r i a l a l g i n a t e s ist t o be e x p e c t e d . I t is t h e p u r p o s e of t h i s p a p e r t o i n v e s t i g a t e t h e i n f l u e n c e of limiting p h o s p h a t e c o n c e n t r a t i o n s o n t h e r e s p i r a t o r y a c t i v i t y of A. vinelandii in m e d i a s u p p l e m e n t e d with ammonia. Materials

and

methods

Organism: Azotobacter vinelandii, laboratory collection. Media (g/1 dist. water): Glucose 40.0 - NH4C1 • 2 H 2 0 2.0 - MgS0 4 • 7 H 2 0 0.2 - CaCl2 • 6 H 2 0 0.1 - FeS0 4 • 7 H 2 0 0.025 — NaMo0 4 • 2 H 2 0 0.005; the initial concentration of phosphate (P0) varied and will be specified in the experiments described. The proportion of Na 2 HP0 4 • 12 H 2 0 to KH 2 P0 4 was kept constant (1:0.23). Since K+-ions are known to influence the transport of phosphate additional K+-ions were supplied at low initial phosphate concentrations (P0 < Po-crit). The culture used for inoculation of the fermentor was prepared by transferring cells from agar plates to the medium (shaker culture) described above. After logarithmic growth part of the culture was transferred to the fermentor (1:35). Fermentation: Batch cultivation was carried out in a respirometric fermentor (1 1) equipped with devices for regulation of p H (7.5), temperature (30°) and dissolved oxygen (7.7 mg/1 = air saturation) (STOTTMEISTER 1979). In cultivations continuing for more than 3 hours after exhaustion of the N-source, nitrogen fixation was prevented by replacing N2 (air) by argon. Analytical methods: The respiration rate and oxygen consumption were determined as described by STOTTMEISTEB (1979). Phosphate was determined by a modified molybdate-vanadate method (KAKAC and VEJDELEK 1966). All results refer to a biomass concentration of 6.2 g (dry weight), calculated from the supplied amount of NH 4 -N (analysis according to BERGMEYER) multiplied by 6.25 times 2 (assuming a 50% crude protein content of the cells). 33»

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(Akademie der Wissensehaften der DDR, Institut für technische Chemie, Leipzig, Direktor: Prof. Dr. sc. M. RINGPFEIL)

Influence of phosphate concentration on the respiratory activity of Azotobacter vinelandii L . HALDENWANG a n d U . BEHKENS

(Eingegangen am 22. 2.1983) Azotobacter vinelandii was grown in batch cultures supplied with ammonia as an N-source and phosphate at limiting concentrations. After phosphate depletion the respiratory rate was affected in a characteristic way. The oxygen consumption during growth and the phase following growth was substantially higher than in cultures amply supplied with phosphate. I t is suggested that phosphate limitation impairs the oxidative phosphorylation and stimulates the substrate phosphorylation which leads to a higher degree of respiratory NAD(P)H oxidation due to changes in the branched electron transport system. Azotobacter species a r e c a p a b l e of f i x i n g molecular n i t r o g e n f r o m aerobic e n v i r o n m e n t s . T o e n s u r e n i t r o g e n a s e a c t i v i t y in t h e p r e s e n c e of o x y g e n , Azotobacter cells p e r f o r m " r e s p i r a t o r y p r o t e c t i o n " ( D A L T O N a n d POSTGATE 1 9 6 9 ) which r e m o v e s excess o x y g e n v i a e n h a n c e d r e s p i r a t i o n b y p a r t i a l u n c o u p l i n g a n d p a t h w a y c h a n g e of t h e b r a n c h e d r e s p i r a t o r y chain ( H A D D O C K a n d J O N E S 1 9 7 7 ) . Moreover, Azotobacter species a c c u m u l a t e large a m o u n t s of e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e s w h i c h a r e likely t o r e d u c e t h e r a t e of o x y g e n d i f f u s i o n , t h e r e b y p r o t e c t i n g t h e n i t r o g e n a s e ( J A R M A N et al. 1 9 7 8 ) . H i g h p r o d u c t i v i t y in b a c t e r i a l a l g i n a t e s y n t h e s i s h a s b e e n a c h i e v e d in c o n t i n u o u s f e r m e n t a t i o n s a t c o n d i t i o n s of p h o s p h a t e l i m i t a t i o n a n d n i t r o g e n f i x a t i o n ( D E A V I N et al. 1 9 7 7 ) . Since r e s p i r a t o r y p r o t e c t i o n does n o t occur in m e d i a c o n t a i n i n g n i t r o g e n in a b o u n d f o r m a n increase in t h e yield of b a c t e r i a l a l g i n a t e s ist t o be e x p e c t e d . I t is t h e p u r p o s e of t h i s p a p e r t o i n v e s t i g a t e t h e i n f l u e n c e of limiting p h o s p h a t e c o n c e n t r a t i o n s o n t h e r e s p i r a t o r y a c t i v i t y of A. vinelandii in m e d i a s u p p l e m e n t e d with ammonia. Materials

and

methods

Organism: Azotobacter vinelandii, laboratory collection. Media (g/1 dist. water): Glucose 40.0 - NH4C1 • 2 H 2 0 2.0 - MgS0 4 • 7 H 2 0 0.2 - CaCl2 • 6 H 2 0 0.1 - FeS0 4 • 7 H 2 0 0.025 — NaMo0 4 • 2 H 2 0 0.005; the initial concentration of phosphate (P0) varied and will be specified in the experiments described. The proportion of Na 2 HP0 4 • 12 H 2 0 to KH 2 P0 4 was kept constant (1:0.23). Since K+-ions are known to influence the transport of phosphate additional K+-ions were supplied at low initial phosphate concentrations (P0 < Po-crit). The culture used for inoculation of the fermentor was prepared by transferring cells from agar plates to the medium (shaker culture) described above. After logarithmic growth part of the culture was transferred to the fermentor (1:35). Fermentation: Batch cultivation was carried out in a respirometric fermentor (1 1) equipped with devices for regulation of p H (7.5), temperature (30°) and dissolved oxygen (7.7 mg/1 = air saturation) (STOTTMEISTER 1979). In cultivations continuing for more than 3 hours after exhaustion of the N-source, nitrogen fixation was prevented by replacing N2 (air) by argon. Analytical methods: The respiration rate and oxygen consumption were determined as described by STOTTMEISTEB (1979). Phosphate was determined by a modified molybdate-vanadate method (KAKAC and VEJDELEK 1966). All results refer to a biomass concentration of 6.2 g (dry weight), calculated from the supplied amount of NH 4 -N (analysis according to BERGMEYER) multiplied by 6.25 times 2 (assuming a 50% crude protein content of the cells). 33»

492

L. H a l d e n w a n g and U. B e h b e n s

Results and

discussion

A critical value of the initial phosphate concentration (P0) was found at Po-crit = 250 mg P0f~/1. I n cultivations starting with P 0 > Po-crit the specific growth rate ¡j, = ^ • — and the specific respiration rate q0 2 = - j - • — did not depend on the initial at

oc

at cc

phosphate concentration P 0 (Fig. l a ) .

Time ( h) Pig. 1. Influence of the initial phosphate concentration (P0) in batch grown Azotobacter vinelandii cells on growth and respiration rate. Medium supplied with N H ^ as N-source. O Respiration rate (g oxygen consumed/1 • h), • growth (g biomass-dry weight/1), A phosphate consumption (mg PO|~/l). In the graphical representation the lag phase has been excluded. Initial phosphate concentration (P 0 = mg POf-/l): Fig. l a — PO > Po-crit; K g . l b — Po = 225; Fig. l c — Po = 180; Fig. I d — Po = 135

I n experiments with P 0 < Po-crit the phosphate was consumed to a residual concentration of less t h a n 20 mg POf~ /I before the N-source was used up and growth ceased. During growth following the depletion of phosphate the respiration rate of the culture was found to depend on P 0 . At a P 0 ranging between Po-crit (250 mg/1) and 160 mg P O f ' / l the increase of the respiration rate slowly declined (Fig. lb/c), whereas in cultivations starting with P 0 160 mg P O | _ / l no increase was observed ("constant respiration rate", Fig. Id). This would reflect a limitation of the ATP regeneration rate as a result of a low phosphate content of the cells. I n cultivations starting at P 0 160 mg PO|~/l the cells may be assumed to mobilize phosphate reserves. The level of the constant respiration rate (P0 160 mg PO|~/l) was directly dependent on the amount of phosphate consumed, irrespective of the biomass concentration. After depletion of phosphate in the media (PO| _ < 20 mg/1) further cell growth resulted in a gradual decrease of the cellular phosphate content which caused a concomitant decrease of the specific growth rate and the specific respiration rate. Growth

Respiratory activity of A. vinelandii

493

Table 1 Influence of the initial phosphate concentration, P 0 , on the oxygen related yield, Y%/o2. All values refer to activities during growth P 0 (mg PO|-/l) P0 >

Po-crit

P0
when P 0 values were adjusted to low concentrations from 250 to 160 mg PO|~/l. At about 160 mg of phosphate/1 the F x / o r v a , l u e s were found to be more t h a n 40% lower t h a n in fermentations with non-limiting phosphate concentrations. This increase of oxygen consumption cannot be explained by the prolonged period of growth (see Table 1). Analogous to these results, numerical values obtained for the specific respiration rates after cessation of growth (Table 2) signifiTable 2 Influence of the initial phosphate concentration on the level of the respiratory rate after cell growth (Average q0 2 values determined for a period of 1.5 and 3.0 hours, respectively, after cessation of cell growth)

P„ (mg x PO|-/l)

P0 >

Po-crit

P0
Po-crit)- I n cultivations which started at a P 0 of about 160 mg PO^'/l the respiration rate of the culture reached a maximum while it was limited at a P 0 160 mg POI-/1 (see above). The distinct increase of the respiratory activity cannot be related to the synthesis of storage material ( P H B p. e.) or to A T P wasting reactions. Obviously, it reflects a decreased energy efficiency of the respiratory system due to phosphate limitation. I t seems likely t h a t catabolism is stimulated in A. vinelandii cells when energy limitation is caused by phosphate deficiency. The additionally produced

494

L . HALDENWANG a n d U . BEHRENS

NAD(P)H has then to be oxidized by increased respiratory activity. Therefore, the ATP regeneration rate at the level of substrate phosphorylation is increased while the ATP regeneration rate brought about the oxidative phosphorylation is limited due to phosphate shortage. This effect which to our knowledge has not yet been described seems to be part of the general regulatory principle for maintaining high ATP regeneration rates in situations where oxidative phosphorylation is impaired. This principle is also demonstrated by the P A S T E U R effect and by the increase of respiration following the uncoupling of oxidative phosphorylation. The results suggest that in A. vinelandii the mechanisms of uncoupling and pathway change of the branched respiratory chain which normally accompany nitrogen fixation, may be turned on by conditions of energy limitation as well. This paper is part of the Dissertation

(HALDENWANG

1981).

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pro-

duction of alginic acid by Azotobacter vinelandii in batch and continuous culture in extracellular microbiological polysaccharides. ACS Symp. Series No 4 5 , 1 4 — 2 6 , Washington, D . C. HADDOCK, B. A. and JONES, C. W., 1977. Bacterial rspiration. Bacteriol. Rev., 41, 47—99. HALDENWANG, L., 1981. Untersuchungen zum Einfluß der Phosphatkonzentration auf das respiratorische Verhalten von Azotobacter vinelandii. Dissertation A, Sektion Biowissenschaften, Karl-Marx-Universität Leipzig, D D R . J A B M A N , T. R . , D E A V I N , L., SLOCOMBE, S . and R I G H E L A T O , R . S . , 1978. Investigation on the effect of environmental conditions on the rate of expolysaccharide synthesis in Azotobacter vinelandii. J . gen. Microbiol., 107, 59—64. K A K A C , B. und V E J D E L E K , I . , 1 9 6 6 . Handbuch der Kolorimetrie, Bd. I I I , S . 1 0 2 7 . Fischer J e n a . S T O T T M E I S T E E , U . , 1979. Beschreibung eines Fermentationssystems mit geschlossenem Gaskreislauf und die Anwendung als Respirometer und Bilanzapparatur. Abh. AdW d. D D R , Abt. Mathem. Naturwiss. Techn. Nr. 3N 113-20. TSAI, I . C., ALADEGBAMI, S. L . a n d VELA, G. R . , 1979. P h o s p h a t e l i m i t e d c u l t u r e of

vinelandii.

J . Bacteriol., 139, 639—645.

Azotobacter

Mailing address: Dr. L. HALDENWANG Forschungszentrum Wassertechnik DDR-8060 Dresden, Otto-Wagner-Str. 3

Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie

23

1983

8

495-501

(Akademie der Wissenschaften der D D R , Forschungszentrum für Molekularbiologie und Medizin, Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie, Jena, Direktor: Prof. Dr. U. TAUBENECK u n d

Bulgarische Akademie der Wissenschaften, Zentrum für Biologie, Institut für Molekularbiologie, Sofia, Direktor: Prof. Dr. R. T S A N E V )

Wirkungen von 5-Bromuracil und 5-Bromdesoxyuridin in Kombination mit 8-Azaadenin auf die UV-Empfindlichkeit von Bakterien H . - E . J A C O B u n d E . GOLOVXNSKY

(Eingegangen am 26.

1.1983)

The presence of 5-bromouracil (BU) as well as 5-bromo-2-deoxyuridine (BUdR) in the cultivation media of bacteria results in the distinct increase of U V sensitivity. With the nucleic acid base analogue 8-azaadenine (8-AA) a similar effect was confirmed, however, not so pronounced. In the experiments reported here the combined action of B U or B U d R and 8-AA on Escherichia coli, Proteus mirabilis, Bacillus subtilis and Bacillus cereus was investigated. The sensitization effect of B U d R does not increase if 8-AA is present additionally during cultivation. On the contrary, a decrease of sensibilization occurs. This result may be caused by the protective effect of the adenine derivative against U V irradiation, if it is present in the cell, but not incorporated into the DNA.

Zellen von Escherichia coli, die in Gegenwart von 5-Bromuracil kultiviert wurden, besitzen gegenüber UV-Strahlung (bei 254 nm) eine wesentlich höhere Empfindlichkeit ( G K E E R 1960). P R U S O F F (1962) stellte dann an Hand physikochemischer Untersuchungen fest, daß die Substanz 6-Azathymin — verglichen mit dem Thymin — gegenüber UV-Bestrahlung bei 254 nm stabiler ist. Wird Streptococcus faecalis in Gegenwart dieser Substanz kultiviert, dann haben die Bakterien eine wesentlich verringerte UV-Empfindlichkeit ( G Ü N T H E R u. P R U S O F F 1962). — Der Vergleich der UVSensibilität von natürlichen Nucleinsäurebasen und deren Aza-Analoga an Hand physikochemischer Untersuchungen ergab für 8-Azapurine (8-Azaguanin, 8-Azaadenin) eine um etwa lOfach höhere Empfindlichkeit ( K I T T L E R U. B E R G 1967). Es war zu erwarten, daß beim Angebot dieser Nucleinsäureanaloga in der Nährlösung Mikroorganismen durch den Einbau der Verbindung in die Nucleinsäuren eine gesteigerte UVEmpfindlichkeit erhalten. Mit 8-Azaguanin fanden G R Ü N B E R G E K und S O R M (1963) sowie Z I M M E R M A N et al. (1967) diese Sensibilisierung. Für Untersuchungen mit 8-Azaadenin (8-AA) verwendeten wir den von G R Ü N B E R G E R und S O R M benutzten Bacillus cereusStamm und die Kulturbedingungen der Autoren. Die Gegenwart von 8-AA im Nährmedium erhöht die UV-Empfindlichkeit, wenngleich der Effekt auch gering ist ( J A C O B u. K I T T L E R 1970). Bei Proteus mirabilis hingegen wurde keinerlei Sensibilisierung gefunden. In den vorliegenden Experimenten wurde deshalb getestet, (1) ob auch hinsichtlich des Sensibilisierungseffektes von 5-Brom-2-uridin (BUdR) oder 5-Bromuracil (BU) Unterschiede zwischen den Bakterienarten vorliegen. Im Zusammenhang damit ist es (2) von prinzipiellem Interesse, aufzuklären, wie sich die Kombination von zwei Nucleinsäureanaloga auswirkt, die beide die UV-Empfindlichkeit steigern können. Deshalb wurde das 8-AA mit den bekannten UV-Sensibilisatoren 5-Brom-2-uridin (BUdR) oder 5-Bromuracil (BU) kombiniert und getestet, ob daraus eine additive oder sogar synergistische Steigerung der UV-Empfindlichkeit der getesteten Bakterienarten resultiert.

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(Akademie der Wissenschaften der D D R , Forschungszentrum für Molekularbiologie und Medizin, Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie, Jena, Direktor: Prof. Dr. U. TAUBENECK u n d

Bulgarische Akademie der Wissenschaften, Zentrum für Biologie, Institut für Molekularbiologie, Sofia, Direktor: Prof. Dr. R. T S A N E V )

Wirkungen von 5-Bromuracil und 5-Bromdesoxyuridin in Kombination mit 8-Azaadenin auf die UV-Empfindlichkeit von Bakterien H . - E . J A C O B u n d E . GOLOVXNSKY

(Eingegangen am 26.

1.1983)

The presence of 5-bromouracil (BU) as well as 5-bromo-2-deoxyuridine (BUdR) in the cultivation media of bacteria results in the distinct increase of U V sensitivity. With the nucleic acid base analogue 8-azaadenine (8-AA) a similar effect was confirmed, however, not so pronounced. In the experiments reported here the combined action of B U or B U d R and 8-AA on Escherichia coli, Proteus mirabilis, Bacillus subtilis and Bacillus cereus was investigated. The sensitization effect of B U d R does not increase if 8-AA is present additionally during cultivation. On the contrary, a decrease of sensibilization occurs. This result may be caused by the protective effect of the adenine derivative against U V irradiation, if it is present in the cell, but not incorporated into the DNA.

Zellen von Escherichia coli, die in Gegenwart von 5-Bromuracil kultiviert wurden, besitzen gegenüber UV-Strahlung (bei 254 nm) eine wesentlich höhere Empfindlichkeit ( G K E E R 1960). P R U S O F F (1962) stellte dann an Hand physikochemischer Untersuchungen fest, daß die Substanz 6-Azathymin — verglichen mit dem Thymin — gegenüber UV-Bestrahlung bei 254 nm stabiler ist. Wird Streptococcus faecalis in Gegenwart dieser Substanz kultiviert, dann haben die Bakterien eine wesentlich verringerte UV-Empfindlichkeit ( G Ü N T H E R u. P R U S O F F 1962). — Der Vergleich der UVSensibilität von natürlichen Nucleinsäurebasen und deren Aza-Analoga an Hand physikochemischer Untersuchungen ergab für 8-Azapurine (8-Azaguanin, 8-Azaadenin) eine um etwa lOfach höhere Empfindlichkeit ( K I T T L E R U. B E R G 1967). Es war zu erwarten, daß beim Angebot dieser Nucleinsäureanaloga in der Nährlösung Mikroorganismen durch den Einbau der Verbindung in die Nucleinsäuren eine gesteigerte UVEmpfindlichkeit erhalten. Mit 8-Azaguanin fanden G R Ü N B E R G E K und S O R M (1963) sowie Z I M M E R M A N et al. (1967) diese Sensibilisierung. Für Untersuchungen mit 8-Azaadenin (8-AA) verwendeten wir den von G R Ü N B E R G E R und S O R M benutzten Bacillus cereusStamm und die Kulturbedingungen der Autoren. Die Gegenwart von 8-AA im Nährmedium erhöht die UV-Empfindlichkeit, wenngleich der Effekt auch gering ist ( J A C O B u. K I T T L E R 1970). Bei Proteus mirabilis hingegen wurde keinerlei Sensibilisierung gefunden. In den vorliegenden Experimenten wurde deshalb getestet, (1) ob auch hinsichtlich des Sensibilisierungseffektes von 5-Brom-2-uridin (BUdR) oder 5-Bromuracil (BU) Unterschiede zwischen den Bakterienarten vorliegen. Im Zusammenhang damit ist es (2) von prinzipiellem Interesse, aufzuklären, wie sich die Kombination von zwei Nucleinsäureanaloga auswirkt, die beide die UV-Empfindlichkeit steigern können. Deshalb wurde das 8-AA mit den bekannten UV-Sensibilisatoren 5-Brom-2-uridin (BUdR) oder 5-Bromuracil (BU) kombiniert und getestet, ob daraus eine additive oder sogar synergistische Steigerung der UV-Empfindlichkeit der getesteten Bakterienarten resultiert.

496

H . - E . JACOB a n d E . GOLOVINSKY

Material

und

Methoden

B a k t e r i e n s t ä m m e : Proteus mirabilis V I P G 273 ( t h r - , a r g - ) ; Proteus mirabilis V I P G 758 E 998 (thr~, a r g - , thy~). Beide S t ä m m e erhielten wir von Prof. D r . H . B Ö H M E — Gatersleben, D D R . Escherichia coli 387; Bacillus subtilis L 2. Beide S t ä m m e gehören zur S t a m m s a m m l u n g des Ins t i t u t s f ü r Molekularbiologie der Bulgarischen Akademie der Wissenschaften, Sofia. Bacillus cereus SG 1314. Der S t a m m w u r d e u n s von D r . GRÜSTBERGER — P r a h a (CSSR) zur Verfügung gestellt. Medien: Das Medium von M E D I L L O ' K A N E w u r d e leicht modifiziert. Ein Milliliter enthielt: 100 [ig Threonin, T r y p t h o p h a n u n d Thymidin. Die genaue Zusammensetzung des f ü r Proteus verwendeten Mediums wurde bereits veröffentlicht (JACOB 1975). I m M 9-Medium w u r d e n E. coli 387, B. cereus u n d B. subtilis kultiviert. Das Medium n a c h S P I Z I Z E N ( 1 9 5 8 ) wurde zusätzlich f ü r B. subtilis L 2 eingesetzt. Feste Medien enthielten 1 , 5 % Agar. Kultivierung u n d Messung der V e r m e h r u n g : Die Kultivierung der Bakterien erfolgte in 50-mlSteilbrustflaschen, die m i t 3 ml Nährlösung gefüllt waren. Die Substanzen w u r d e n im allgemeinen vor der B e i m p f u n g zugefügt. An einer Seite der 50-ml-Kulturflasche befand sich eine K ü v e t t e (Schichtdicke 0,5 cm) f ü r die Messung der T r ü b u n g m i t Hilfe des PuLFKicH-Photometers (VEB C A R L Z E I S S Jena). Die K u l t u r e n w u r d e n in einem Wasserbad bei 37 ° C etwa 3 S t u n d e n geschüttelt. Der Titer b e t r u g d a n n etwa 107 Zellen/ml. F ü r die Bestrahlungsexperimente v e r d ü n n t e n wir diese K u l t u r l ö s u n g m i t NaCl-Lösung (0,9%) auf einen Titer von etwa 2000 Zellen/ml. I n gesonderten E x p e r i m e n t e n wurde festgestellt, d a ß durch diese V e r d ü n n u n g das verbleibende 8-AA bei UVBestrahlung keine Schutzwirkung h a t . I n den E x p e r i m e n t e n m i t Zellen aus der stationären Vermehrungsphase wurde die K u l t u r n a c h 16stündiger Vermehrung zentrifugiert, die Zellen 3mal in NaCl-Lösung (0,9%) gewaschen u n d d a n n in NaCl-Lösung (0,9%) m i t 0 , 5 % Glucose a u f g e n o m m e n . U n t e r diesen Versuchsbedingungen erfolgte keine weitere Zellteilung u n d auch keine A b n a h m e der Zellzahl. UV-Bestrahlung: Bei sämtlichen beschriebenen E x p e r i m e n t e n erfolgte die UV-Bestrahlung m i t einer Sterisol-Niederdrucklampe (Original H a n a u ) — Emission bei 254 n m —, deren Leistung b e t r u g bei einem A b s t a n d von 50 cm 16 • 10 4 J • m - 2 • m i n - 1 . E i n m a l w u r d e n die Bakteriensuspensionen in offenen Petrischalen (Füllhöhe 1—2 m m ) u n t e r leichtem Bewegen bestrahlt, d a r a u s Prob e n e n t n o m m e n u n d zur Bestimmung der Überlebenden auf N ä h r a g a r a u s p l a t t i e r t . Zum anderen w u r d e n die Bakterien auf N ä h r a g a r aufgespatelt (etwa 200 pro Platte) u n d d a n a c h m i t U V bes t r a h l t . I n beiden Fällen erfolgte das Auszählen der Kolonien nach 20 S t u n d e n Inkubationszeit bei 37 °C. Substanzen: T h y m i d i n , Threonin, Arginin u n d 5-Bromuracil sind P r o d u k t e von R E A N A L (Budapest). 5-Brom-2'-desoxyuridin, Desoxyadenosine u n d 8-Azaadenine s t a m m e n von SERVA (Heidelberg).

Ergebnisse Vermehrung von Bakterien In Gegenwart von BUdR bzw. B U Die in Tabelle 1 enthaltenen Ergebnisse bestätigen die bekannte Tatsache der Wachstumshemmung durch B U bzw. BUdR. Bei den getesteten Konzentrationen liegt der Hemmeffekt nach 3stündiger Kultivierung bei 15—25%. Stark davon weicht E. coli 387 ab ; bei BU-Gegenwart erfolgt eine sehr intensive Hemmung der Vermehrung. — Beim Großteil der Bestrahlungsversuche lag die Konzentration in dem Bereich, wo keine oder nur eine sehr geringe Beeinflussung der Vermehrung auftrat. In Gegenwart von 8-Azaadenin Anwesenheit von 8-AA im Kulturmedium führt zu keiner Vermehrungshemmung. U V - E m p f i n d l i c h k e i t der v e r w e n d e t e n B a k t e r i e n a r t e n Für die Untersuchungen wurden Zellen aus der logarithmischen Vermehrungsphase verwendet. Die Empfindlichkeit der beiden gramnegativen Arten Proteus mirabilis

497

UV-Sensibilisierung von Bakterien

Table 1 Percentage of growth inhibition — determined by means of turbidimetric measurements after 3 hours cultivation. The controls ( = 100%) are the cultures without BUdR or BU strain B. B. E. P.

subtilis L 2 cereus SG 1314 coli 387 mirabilis VI P H 273

a = b = c = d = e = f = g = n.d.

average value of 6 independent average value of 2 independent average value of 10 independent average value of 5 independent average value of 4 independent average value of 3 independent average value of 3 independent = not determined

control culture

culture with 200 ¡ig BUdR/ml

100 100 100 100

23.6a 24.1c 23.4d 22.8 f

culture with 200 ¡ig BU/ml 13.7b n.d. 80.2e 19.4s

experiments experiments experiments experiments experiments experiments experiments

und E. coli gegenüber UV-Licht von 254 nm ist nahezu gleich. Da nach der Literatur (z. B . STÖBL U. M U N D 1 9 7 2 ) Proteus mirabilis — verglichen mit E. coli K 1 2 — doppelt so UV-sensibel ist, muß der untersuchte E. coZi-Stamm relativ empfindlich sein. Bacillus subtilis (gram-positiv) hingegen ist wesentlich unempfindlicher. Bacillus cereus (gram-positiv) liegt zwischen beiden Gruppen. — Die zum Erzielen der LD 37 erforderlichen UV-Dosen sind in Tabelle 2 zusammengefaßt. Table 2 UV doses necessary for LD 37 of the bacterial strains used (cells from the logarithmic growth phase) 40 J / m 2 130 J / m 2 290 J / m 2

Escherichia coli 387 Bacillus subtilis SG 1314 Bacillus subtilis L 2

UV-Sensibilisierung Bei BU- oder BUdR-Angebot im Nährmedium erhöht sich bekanntlich die UVEmpfindlichkeit. Mit BUdR ist die Sensibilisierung größer als mit B U (siehe Tab. 3). Aus diesem Grunde wurde in der Regel BUdR eingesetzt. Table 3 Sensitivity of Proteus mirabilis "VT PG 273 against UV (254 nm), grown for 3 hours in the presence of 8 ¡¿g BU/ml or different amounts of BUdR. Time of irradiation (in s) resulting in LD 37 Control

B U (fxg/ml) 8

36.0 s

27.0 s

0.3 32.0 s

0.8 1 20.0 s

2.3

BUdR (fig/ml) 6.7 J 8.0

17.5 s 1 13.0 s 1 12.5 s

40.0

200.0

10.0 s

10.0 s

Proteus mirabilis VI PG 273

Die Abhängigkeit der UV-Sensibilisierung von der im Medium angebotenen BUdRKonzentration zeigt Tabelle 3: Während 0,3 FI.g/ml Kulturlösung noch kaum einen Effekt zeigt, verursachen 0,8 ¡J.g/ml schon eine beträchtliche Sensibilisierung. Die Wirkung nimmt zu bis 6 ¡xg/ml, höheres BUdR-Angebot steigert die UV-Empfindlichkeit nicht mehr, folglich wird das Sättigungsgebiet erreicht.

498

H . - E . JACOB a n d E . GOLOVINSKY

Escherichia

coli 387

Wird die gleiche BUdR-Konzentration wie bei P. mirabilis angewandt, dann ist der Sensibilisierungseffekt von E. coli deutlich kleiner. Die Gegenwart von 8-AA im Medium führt zu keiner Erhöhung der UV-Sensibilität, im Gegenteil beobachtet man eine geringere UV-Wirkung. Der Verlauf der Inaktivierungskurve bei Kombination von BUdR und 8-AA ähnelt dem der Kontrolle (Abb. 1).

Irradiation hm

(s)

Fig. 1. Sensitivity of Escherichia coli 387, against UV (254 nm) grown for 3 hours in the presence of 200[xg/ml BUdR ( • ) ; 71 ¡xg/ml 8-Azaadenine (o), or with both substances (A), • = control Bacillus

subtilis

L 2

Auch bei dieser Bakterienart verursacht BUdR-Gegenwart im Kulturmedium eine Zunahme der UV-Empfindlichkeit. Kultivierung mit 8-AA führt zu einer geringfügigen höheren UV-Empfindlichkeit; bei Kombination von BUdR und 8-AA geht der Sensibilisierungseffekt nicht über den von 8-AA hinaus. Bacillus

cereus SG 1314

Die Zunahme der UV-Empfindlichkeit bei verschiedenen BUdR-Konzentrationen ist in Tabelle 4 dargestellt. Konzentrationen > 8 [xg/ml verursachen keine wesentliche weitere Steigerung der Sensibilisierung mehr, die maximal bis zum Faktor 10 beträgt. In einer anderen Versuchsreihe wurde bei 180 min Kultivierungszeit BUdR (16 [J.g/ ml) verschieden lange Zeit angeboten. Es war überraschend, daß die Gegenwart der Substanz in den letzten 22,5 min Kultivierung ausreicht, um den gleichen Sensibilisierungseffekt zu erzielen wie bei 45, 90 und 180 min Kultivierung mit BUdR. Kultivierung mit 8-AA für 3 Stunden führt zu keiner veränderten UV-Sensibilität. I n der Kombination von BUdR und 8-AA ist die UV-Empfindlichkeit geringer als mit BUdR allein.

UV-Sensibilisierung von Bakterien

499

Table 4 Sensitivity of Bacillus cereus SG 1314 against UV (254 nm), grown for 3 hours in the presence of différent amounts of B U d R . Time of irradiation (in s) resulting in L D 37 Control 94.0 s 3

0.36 70.0 s

B U d R (fi-g/ml) 0.80 1 7.758.0 s

1

50.0 s

1

167.0 41.0 s

H - B U - und 3 H - B U d R - A u f n a h m e von Zellen

Bei diesen Experimenten mit vorläufigem Charakter wurde die Aufnahme der Substanzen durch wachsende und ruhende Bakterienzellen getestet. Bei wachsenden Zellen von E. coli z. B. wurde innerhalb von 30 min eine sehr schnelle Aufnahme von 3 H-BU gefunden (15faches vom Startwert). Es ist nicht ausgeschlossen, daß es sich dabei um Austauschprozesse handelt. Dafür spricht auch, daß ruhende Zellen von E. coli innerhalb von 2 Stunden sehr viel 3 H-BU aufnehmen. Ruhende Zellen von B. subtilis akkumulieren eine beträchtliche Menge 3 H-BU, H 3 -BUdR dagegen wird nicht aufgenommen (Abb. 2).

Fig. 2. Incorporation of 3 H - B U ( o ) and 3 H - B U d R (•) in resting cells of Bacillus subtilis L 2. For determination of uptake rate at different times of cultivation 0.05 ml of the culture solution were added to F N 7 filter paper discs ( V E B Spezialpapierfabrik Niederschlag/Erzgebirge, diameter 24 mm). The dried discs were treated three times with ice-cold trichloroacetic acid and than washed with alcohol and acetone. The radioactivity was determined in a dioxane systeme using a TRICAJRB liquid scintillation counter

Es muß betont werden, daß aus den Ergebnissen keine Aussagen über den Ort der „Inkorporation" möglich sind. Diskussion Auf die Vermehrung der untersuchten Bakterien wirken BU, BUdR und 8-AA in den angewandten Konzentrationen nicht oder nur geringfügig.

500

H . - E . JACOB and E . GOLOVINSKY

Die UV-Empfindlichkeit der einzelnen Bakterienarten ist stark unterschiedlich (s. Tab. 2). Innerhalb der Arten sind die physiologisch aktiven Zellen aus der logarithmischen Vermehrungsphase wesentlich empfindlicher als die ruhenden Zellen der stationären Phase. Durch Kultivierung der Bakterien mit B U oder BUdR wird die bekannte Erhöhung der UV-Sensibilität erreicht. Dabei ist das Angebot von BUdR wirkungsvoller als das von BU. Es ist möglich, daß nur BUdR auf dem üblichen metabolischen Weg in die DNS eingebaut wird. Im Gegensatz dazu war in den orientierenden Experimenten mit 3 H-BU und 3 H-BUdR die Aufnahme von 3 H-BU wesentlich schneller und intensiver als die von 3 H-BUdR. Die starke Adsorption oder Aufnahme des 3 H-BU könnte durch Austauschprozesse (Thymin —• BU) verusacht sein. Ein Austausch ist aber auch für BUdR nicht auszuschließen, denn es wurde bei der Bakterienart B. ce.re.us gefunden, daß bei einer 3stündigen Kultivierung BUdR (16 fxg/ml) nur die letzten 22,5 min in der Kulturlösung vorhanden sein muß, um die gleiche Sensibilisierung hervorzurufen wie sie die Anwesenheit während der gesamten Kulturdauer verursacht. Bei der UV-Sensibilisierung durch BUdR bestehen zwischen den untersuchten Arten keine großen Unterschiede. Diese Substanz muß folglich in die DNS eingebaut werden. Das Angebot verschiedener BUdR-Mengen im Nährmedium ergab, daß für P. mirabilis und B. cereus etwa 8 [xg/ml ausreichen, um bei 3stündiger Kultivierung einen maximalen Sensibilisierungseffekt zu verursachen. Wie bereits in der Einleitung erwähnt, war die bei B. cereus durch 8-AA verursachte UV-Sensibilisierung gering. Bei der adeninbedürftigen Mutante von P. mirabilis zeigten schon die Vermehrungsversuche, daß Adenin durch 8-AA nicht ersetzt werden kann; es wurde auch keinerlei UV-Sensibilisierung gefunden (JACOB U. K I T T L E E 1 9 7 0 ) . Es war daraus zu schlußfolgern, daß 8-AA bei B. cereus in wichtige Makromoleküle (DNS, RNS) eingebaut werden kann, bei P. mirabilis hingegen nicht. Die jetzt vorliegenden Ergebnisse zeigen, daß das Aufnahme- und Einbaugeschehen beim BUdR anders sein muß als beim 8-AA. Es ist nicht ausgeschlossen, daß sich 8-AA bei grampositiven Arten (z. B. B. cereus) anders verhält, als bei gramnegativen Arten (z. B. P. mirabilis, E. coli). Im Gegensatz zu den Ergebnissen von 1970 verändert bei den hier vorgestellten Experimenten bei B. cereus die Anwesenheit von 8-AA während der Kultivierung dessen UV-Empfindlichkeit nicht. Ursache dafür muß das gegenüber den früheren Versuchen veränderte Nährmedium sein. E. coli zeigte bei Kultivierung mit 8-AA sogar eine Abnahme der UV-Sensibilität. Bei der kombinierten Anwendung von BUdR und 8-AA lag der UV-Sensibilisierungseffekt unterhalb der Wirkung des BUdR allein. Durch die Kombination wurde also keinerlei Steigerung der UV-Empfindlichkeit, sondern eine Desensibilierung erzielt. Die Gesamtergebnisse lassen sich mit folgenden Annahmen deuten: Ein Sensibilisierungseffekt ist vorhanden, wenn 8-AA von der Zelle aufgenommen und in die DNS eingebaut wird. Wird hingegen die Substanz von der Zelle zwar aufgenommen, nicht aber in die Nucleinsäuren eingebaut, so kann das aufgenommene 8-AA wegen der beträchtlichen Absorption im UV die Zelle gegenüber dieser Strahlung schützen (Schutzoder Desensibilisierungseffekt). Dies wurde bei E. coli gefunden. Damit läßt sich auch die gegenüber den in vitro-Versuchen stark erniedrigte in vivo-Sensibilisierung durch 8-AA erklären; die nicht in die DNS eingebaute, aber in der Zelle vorhandene Substanz wirkt wegen ihres Schutzeffektes der Sensibilisierung entgegen1). 1 ) Generell ist zu dieser Problematik zu sagen, daß sich ohne radioaktiv markiertes 8-AA nicht feststellen läßt, ob und in welchem Umfang Aufnahme in die Zelle und Einbau in Nucleinsäuren erfolgt.

UV-Sensibilisierung von Bakterien

501

Auch die bei der kombinierten Anwendung von BUdR und 8-AA gefundenen Resultate lassen sich mit dieser Deutung erklären: BUdR wird in jedem Falle in die D N S der untersuchten Bakterienarten eingebaut (aus der Literatur ist bekannt, daß dieser Einbau nicht nur bei Mikroorganismen erfolgt). 8-AA hingegen scheint — besonders bei gramnegativen Bakterienarten — von der Zelle lediglich aufgenommen, jedoch nicht in die D N S inkorporiert zu werden. Ist BUdR in DNS vorhanden ( = Sensibilisierung) und 8-AA befindet sich im Zellinnern als Filter ( = Desensibilisierung), so werden, die erhaltenen Resultate verständlich. Neben dem Schutzeffekt der Substanz kann auch das Reparatur vermögen der verwendeten Wildstämme eine Rolle spielen: HRADECNA et dl. (1978) fanden, daß für die Nicht-m-two-Wirkung des 5-Azacytosins die Reparaturfunktionen des UVr- und des rec-Genes verantwortlich sind. Wir danken Frau M. HAMANN für die gewissenhafte technische Mitarbeit, den Herren Prof. Dr. H. BERG, Prof. Dr. P. LANGEN und Dr. L. KITTLEE f ü r wertvolle Hinweise.

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Dr. H.-E. JACOB

Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der AdW DDR-6900 Jena, Beutenbergstr. 11

Zeitschrift f ü r Allgemeine Mikrobiologie

28

8

1983

502

Buchbesprechungen E.

(Herausgeber), Allgemeine Biologie, bearbeitet von E. G Ü N T H E R , L . K Ä M P F E , E . J . M Ü L L E R , H . P E N Z L I N ( 4 . neubearb. Auflage). 4 8 5 S . , 1 9 9 Abb., 1 5 Tab. J e n a 1 9 8 2 . V E B Gustav Fischer-Verlag. M 18,00. LIBBERT LIBBERT, H .

Das bisherige Kompendium der Allgemeinen Biologie erscheint jetzt in der 4. Auflage unter dem Titel „Allgemeine Biologie" und ist Bestandteil der Studienreihe Bio Wissenschaften. Es ist in der D D R als Lehrbuch an Universitäten und Hochschulen offiziell anerkannt. Die überarbeitete neue Auflage (1. Auflage 1976) reflektiert die großen Fortschritte in den Biowissenschaften. So sind vor allem die zahlreichen neuen Erkenntnisse bei der Erforschung von Struktur und Funktion der Zelle sowie die spektakulären Befunde auf den Gebieten „Realisierung der genetischen I n f o r m a t i o n " und „Erbliche Veränderungen" weitgehend berücksichtigt. Vom S t a n d p u n k t des Mikrobiologen aus kann gesagt werden, daß vor allem die prokaryotischen Mikroorganismen als Forschungsobjekte und die Resultate, die mit ihnen erzielt wurden, in ihrer Bedeutung für den Gesamtfortschritt der Biologie a d ä q u a t repräsentiert sind. Das Buch h a t ein handliches Format, enthält klare, instruktive Abbildungen und ist drucktechnisch (Gliederung, Hervorhebungen etc.) gut gestaltet. Während ein recht ausführliches Sachregister die schnelle Information über bestimmte Sachverhalte ermöglicht, kann die sehr begrenzte Auswahl weiterführender Literatur nicht voll befriedigen. U . T A U B E N E C K (Jena)

H . W. SAUER, Developmental Biology oi. Physarum (Developmental and Cell Biology 11). 237 S., 61 Abb. Cambridge 1982. Cambridge University Press. £ 32.00. Neben Dictyostelium h a t Physarum manches zu bieten, das ihn zum multipotentiellen biologischen Modellsystem geradezu prädestiniert: Endogene Biorhythmen (regelmäßig oscillierende, Endoplasmaströmung und hochgradig synchrone Kernteilungszyklen im Plasmodium), experimentelle Manipulierbarkeit von Wachstum und Differenzierung, programmierbare Alternative zwischen reversibler Spherulation (im Dunkeln) und irreversibler Sporulation (im Licht). Der Entwiclungszyklus bietet drei Einwegübergänge von der haploiden Myxamöbe zum diploiden (oder haploiden) Makroplasmodium, vom Plasmodium zum Fruchtkörper und zurück zu Millionen meiotischer Mikroprotozoen. Dazu k o m m t der molekulargenetisch komplexe Hintergrund der Kreuzungstyp-Determination mit dem besonders interessanten mat A Genkomplex (Übergang einzellig/vielzellig ?), der Fusionskompatibilität u.a. m. Es ist das erklärte Ziel des Autors, etwas von der Faszination und der eigenen Neugier nach tieferem Verstehen dieses „Universalobjektes" im Leser zu wecken. I n 8 Kapiteln werden vor allem neue Daten und Deutungen behandelt und das Grundsätzliche in einfachen Schemata zusammengefaßt. Wo immer möglich wird versucht, an andere Phänomene — besonders bei höher entwickelten Vielzellern — anzuknüpfen, was den monographischen Charakter des Buches anregend erweitert. Man muß kein „Physarologe" sein, um dem klaren Text zu folgen und zu erkennen, wo — am Beispiel Physarum — die kardinalen Phänomene der Entwicklungsbiologie in konkrete genetische und biochemische Fragen einmünden. Man sollte häufiger ein solches Buch zur H a n d nehmen. G. K R A E P E L I N (Berlin)

23

Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie

1983

8

503-511

(Wissenschaftsbereich Mikrobielle Biochemie u. Wissenschaftsbereich Allgemeine Mikrobiologie der Sektion Biologie der Friedrich-Schiller-Universität, Jena)

Bildung und Isolierung des Phytotoxins Tentoxin aus Alternaria

alternata

B . LIEBERMANN u n d B . OERTEL (Eingegangen

am, 18.

3.1983)

A chlorosis-inducing phytoeffector from culture filtrate of Alternaria alternata ( F R I E S ) K E I S S L E R , whose mycelium was grown in synthetic media, was isolated with good yields (50 mg/1) and identified as tentoxin. In addition to this compound, purification on Sephadex G-15 yielded several byproducts with absorbance at 270 nm. This procedure of tentoxin isolation is more effective than traditional ones. The Phytotoxin, whose production depends on fermentation-temperature, can be determined quantitatively in a good agreement by bioassay or spectrophotometry.

Der phytopathogene Pilz Alternaria alternata (FKIES) KEISSLER synthetisiert das Phytotoxin Tentoxin, dessen Wirkungsspektrum weitgehend bekannt ist (DUBBIN u. UCHYTIL 1 9 7 7 ) . Dieses cyclische Tetrapeptid verursacht bei sensitiven Pflanzen, z.B. bei Gurkenkeimlingen, Chlorose (FULTON et al. 1 9 6 5 , TEMPLETON et al. 1 9 6 7 ) . Chemisch handelt es sich bei Tentoxin um Cyclo-(L-leucyl-N-methyl-trans-dehydrophenylalanyl-glycyl-N-methyl-L-alanyl) (KONCEWICZ et al. 1 9 7 3 , M E Y E R et al. 1 9 7 5 ) . Neuere Untersuchungen zum Wirkmechanismus haben ergeben, daß Tentoxin ähnlich dem Valinomycin durch elektrogenen Ionentransport als Membranpermeabilitätsvermittler für K + fungiert (KLOTZ et al. 1 9 8 2 ) . Zur Physiologie der Tentoxinbildung durch Alternaria alternata gibt es kaum Ergebnisse, lediglich der Einfluß der Kultivierungstemperatur auf die Toxinausbeute im Kulturfiltrat und Mycel wurde untersucht (SAAD et al. 1 9 7 0 ) . Die eingesetzten Nährböden waren stets komplexer Natur (FULTON et al. 1 9 6 5 , SAAD et al. 1 9 7 0 , WOODHEAD et al. 1 9 7 5 und SCHADLER et al. 1 9 7 6 ) . Die Isolierung und Reinigung des Tentoxins erfolgte durch Extraktion mit organischen Lösungsmitteln (Äther, Benzol, Chloroform), Einsatz von Ionenaustauschern sowie Adsorptionschromatografie an Kieselgel oder Aluminiumoxid. Teilweise wurde das Benzolsolvat aus Benzol auskristallisiert (GRABLE et al. 1 9 6 6 , SAAD et al. 1 9 7 0 , TEMPLETON 1 9 7 2 , WOODHEAD et al. 1 9 7 5 u n d SCHADLER et al.

1976).

In der vorliegenden Arbeit werden zum erstenmal Untersuchungen zur Abhängigkeit des Wachstums und der Produktbildung von der Fermentationsdauer vorgelegt. Die Nährbodenoptimierung führte zu einem synthetischen Medium, mit dem gute Tentoxin-Ausbeuten erreicht wurden. Die angewendete Isolierungsmethode ist bedeutend zeitsparender als die bisher publizierten Verfahren, ohne daß Abstriche an der Reinheit des Tentoxins zur verzeichnen sind. Außerdem ermöglicht diese Aufarbeitung die Erfassung verschiedener Nebenprodukte, die für Biosynthese-Untersuchungen interessant werden können. Das isolierte Tentoxin wurde für die Erarbeitung einer quantitativen Bestimmungsmethode (Biotest) verwendet. Material

und

Methoden

Stamm, Kulturführung und Nährmedien (NM): Der Stamm i 30 (Pilzkulturensammlung Weimar), nach VOESATZ (1969) von Chinakohl isoliert und als Alternaria alternata ( F R I E S ) K E I S S L E R identifiziert, wurde auf Schrägagar 6 Tage bei 28 °C unter kontinuierlicher Beleuchtung kultiviert, bei

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Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie

1983

8

503-511

(Wissenschaftsbereich Mikrobielle Biochemie u. Wissenschaftsbereich Allgemeine Mikrobiologie der Sektion Biologie der Friedrich-Schiller-Universität, Jena)

Bildung und Isolierung des Phytotoxins Tentoxin aus Alternaria

alternata

B . LIEBERMANN u n d B . OERTEL (Eingegangen

am, 18.

3.1983)

A chlorosis-inducing phytoeffector from culture filtrate of Alternaria alternata ( F R I E S ) K E I S S L E R , whose mycelium was grown in synthetic media, was isolated with good yields (50 mg/1) and identified as tentoxin. In addition to this compound, purification on Sephadex G-15 yielded several byproducts with absorbance at 270 nm. This procedure of tentoxin isolation is more effective than traditional ones. The Phytotoxin, whose production depends on fermentation-temperature, can be determined quantitatively in a good agreement by bioassay or spectrophotometry.

Der phytopathogene Pilz Alternaria alternata (FKIES) KEISSLER synthetisiert das Phytotoxin Tentoxin, dessen Wirkungsspektrum weitgehend bekannt ist (DUBBIN u. UCHYTIL 1 9 7 7 ) . Dieses cyclische Tetrapeptid verursacht bei sensitiven Pflanzen, z.B. bei Gurkenkeimlingen, Chlorose (FULTON et al. 1 9 6 5 , TEMPLETON et al. 1 9 6 7 ) . Chemisch handelt es sich bei Tentoxin um Cyclo-(L-leucyl-N-methyl-trans-dehydrophenylalanyl-glycyl-N-methyl-L-alanyl) (KONCEWICZ et al. 1 9 7 3 , M E Y E R et al. 1 9 7 5 ) . Neuere Untersuchungen zum Wirkmechanismus haben ergeben, daß Tentoxin ähnlich dem Valinomycin durch elektrogenen Ionentransport als Membranpermeabilitätsvermittler für K + fungiert (KLOTZ et al. 1 9 8 2 ) . Zur Physiologie der Tentoxinbildung durch Alternaria alternata gibt es kaum Ergebnisse, lediglich der Einfluß der Kultivierungstemperatur auf die Toxinausbeute im Kulturfiltrat und Mycel wurde untersucht (SAAD et al. 1 9 7 0 ) . Die eingesetzten Nährböden waren stets komplexer Natur (FULTON et al. 1 9 6 5 , SAAD et al. 1 9 7 0 , WOODHEAD et al. 1 9 7 5 und SCHADLER et al. 1 9 7 6 ) . Die Isolierung und Reinigung des Tentoxins erfolgte durch Extraktion mit organischen Lösungsmitteln (Äther, Benzol, Chloroform), Einsatz von Ionenaustauschern sowie Adsorptionschromatografie an Kieselgel oder Aluminiumoxid. Teilweise wurde das Benzolsolvat aus Benzol auskristallisiert (GRABLE et al. 1 9 6 6 , SAAD et al. 1 9 7 0 , TEMPLETON 1 9 7 2 , WOODHEAD et al. 1 9 7 5 u n d SCHADLER et al.

1976).

In der vorliegenden Arbeit werden zum erstenmal Untersuchungen zur Abhängigkeit des Wachstums und der Produktbildung von der Fermentationsdauer vorgelegt. Die Nährbodenoptimierung führte zu einem synthetischen Medium, mit dem gute Tentoxin-Ausbeuten erreicht wurden. Die angewendete Isolierungsmethode ist bedeutend zeitsparender als die bisher publizierten Verfahren, ohne daß Abstriche an der Reinheit des Tentoxins zur verzeichnen sind. Außerdem ermöglicht diese Aufarbeitung die Erfassung verschiedener Nebenprodukte, die für Biosynthese-Untersuchungen interessant werden können. Das isolierte Tentoxin wurde für die Erarbeitung einer quantitativen Bestimmungsmethode (Biotest) verwendet. Material

und

Methoden

Stamm, Kulturführung und Nährmedien (NM): Der Stamm i 30 (Pilzkulturensammlung Weimar), nach VOESATZ (1969) von Chinakohl isoliert und als Alternaria alternata ( F R I E S ) K E I S S L E R identifiziert, wurde auf Schrägagar 6 Tage bei 28 °C unter kontinuierlicher Beleuchtung kultiviert, bei

504

B. Liebebmann und B. Oertel

2—4 °C aufbewahrt und im Abstand von 8 Wochen überimpft. Von einer Vorkultur (14 Tage, 28 °C, kontinuierliche Beleuchtung, 20 ml NM/Petrischale) wurde eine Konidiensuspensipn in aqua dest. gewonnen. Die Hauptkultur, für die ca. 2 X 104 Konidien/ml NM inokuliert wurden, erfolgte als Oberflächenkultur in 2-1-Fernbach- bzw. 500-ml-Stehrundkolben mit 1 1 bzw. 100 ml Nährlösung. Für die Stammhaltung und die Vorkultur wurde folgende Zusammensetzung pro Liter aqua dest. verwendet: 10 g Hefeextrakt, 20 g Agar-Agar, 5,0 g Malzextrakt, 1,0 g KH 2 P0 4 , 0,5 g MgS0 4 • 7 H 2 0 und je 5 mg MnS0 4 • 4 H 2 0, ZnS0 4 • 7 H 2 0 und Fe(N0 3 ) 3 • 9 H 2 0, pH-Wert nach Sterilisation 6,8. Für die Hauptkultur wurden NM 8 bzw. modifizierte Richabd's Solution (NM 11) nach Booth (1971) eingesetzt. NM 8 pro Liter aqua dest.: 10 g Saccharose, 0,5 g Harnstoff, Salze s. o., nach Sterilisation pH-Wert 6,8. NM I I a bzw. b pro Liter aqua dest.: 50 g Saccharose, 10 g KN0 3 , 5,0 g KH 2 P0 4 , 0,25 g MgS0 4 • 7 H 2 0, 20 mg FeCL, • 6 H 2 0 und 10 g Amylose (a) oder Kartoffelstärke (b), nach Sterilisation pH-Wert 5,5. Biotest: 30 ml Kulturfiltrat (KF) wurden 5 X mit je 10 ml Äther ausgeschüttelt. Der Rückstand der Ätherphase wurde in 30 ml Testpflanzennährlösung (nach Eichhorn (1969) zusätzlich 1 ml Spurenelementlösung/1 nach Schropp u. Scharber (1933)) aufgenommen und in sterile Petrischalen gefüllt (d = 20 cm, 2 Lagen Filterpapier), in die 20 Samen von Cucumis sativus, Sorte „Eva", gegeben wurden. Kultiviert wurde bei 28 °C 1 Tag im Dunkeln und 5 Tage bei kontinuierlicher Beleuchtung. Der Chlorophyllgehalt der Kotyledonen wurde nach Sästak (1966) bestimmt und die Chlorose berechnet. Die Testpflanzennährlösung kam ungepuffert und ohne Agarzusatz zur Anwendung.

Schema 1: Isolierungsverfahren für Tentoxin (Details: siehe Material u. Methoden) K F : Kulturfiltrat NM: Nährmedium

Tentoxin aus Alternaria

alternata

505

Isolierung von Tentoxin (Schema 1): (a) Unbehandeltes K F wurde über eine Säule mit D O W E X 50 W X 4, H+-Form, 200—400 mesh, gegeben (90 ml H a r z / 4 1, 2,4 ml/min), mit 400 ml a q u a dest. w u r d e nachgewaschen. Durchlauf u n d Waschwasser wurden eingeengt u n d mit Dowex 1 x 4 , C 0 3 = - F o r m , 50 — 100 mesh, unter R ü h r e n versetzt bis p H - W e r t 5 erreicht war. Das F i l t r a t wurde vom H a r z a b g e t r e n n t u n d eingeengt. Anschließend wurde 5 x mit aliquoten Mengen Ä t h e r ausgeschüttelt, der R ü c k s t a n d der Ätherphase wurde in 40—50 °C heißem Wasser aufgenommen, die Lösung filtriert, f a s t zur Trockne eingeengt u n d in 50%igem Methanol aufgenommen, (b) Eingeengtes K F wurde einer kontinuierlichen Ä t h e r e x t r a k t i o n unterworfen ( W a s s e r b a d t e m p e r a t u r 60—70 °C), der R ü c k s t a n d der Ätherphase in 40 —50 °C heißem Wasser aufgenommen, die filtrierte Lösung über eine Säule mit Dowex 50 W X 4, s. o. gegeben (10 ml H a r z / 3 1 K F , 20 ml/h). Nachgewaschen wurde m i t 150 ml a q u a dest., Durchlauf u n d Waschwasser f a s t zur Trockne eingeengt u n d in 50%igem Methanol aufgenommen, (c) Vom K F abgetrennte u n d 3 X mit a q u a dest. gewaschene Mycelmatten wurden zerkleinert, u n t e r R ü h r e n bei 60 °C am R ü c k f l u ß m i t Ä t h e r 4 S t u n d e n u n d mit neuem Äther weitere 4 S t u n d e n extrahiert. Der R ü c k s t a n d der Ätherphase w u r d e in 90 °C heißem Wasser aufgenommen, die Lösung filtriert u n d wie u n t e r (b) beschrieben über Dowex-Harz gegeben (10 ml Harz/300 g Mycelfeuchtmasse). Die A b t r e n n u n g von N e b e n p r o d u k t e n erfolgte an Sephadex G-15-Säulen (1,0—2,5 cm X 160 cm, 7—20 ml/h) m i t Wasser als Elutionsmittel. Die F r a k t i o n e n wurden bei 286 n m a m S P E C O R D vermessen. C2 wurde rechromatografiert, zur Trockne gebracht, in L a u f m i t t e l aufgenommen u n d a n Kieselgel in Anlehnung an SAAD et al. (1970) weiter gereinigt (Kieselgel f. Säulenchromatografie 0,05—0,2 m m , Säule: 1,5 X 28 cm, L a u f m i t t e l : Essigsäureäthylester — Aceton — » - H e x a n = 2 — 1 — 1, 18 ml/h). Das L a u f m i t t e l wurde bei 90 °C aus den F r a k t i o n e n v e r d a m p f t , a q u a dest. zugegeben u n d bei 286 n m vermessen. Die Tentoxin enthaltenden F r a k t i o n e n wurden vereinigt, eingeengt u n d das Toxin gefriergetrocknet. Spektroskopische u n d chromatografische Methoden: Das I R - S p e k t r u m wurde a m U R 10 (VEB C A B L Z E I S S J e n a ) , das Massenspektrum an einem hochauflösenden Gerät ( J O E L Mass D a t a System Texas I n s t r u m e n t s ) aufgenommen. Mit dem S P E C O R D U V / V I S ( V E B C A B L Z E I S S J e n a ) w u r d e n die UV-Spektren aufgezeichnet u n d die q u a n t i t a t i v e Vermessung von Tentoxin bei 286 n m durchgeführt. Der DC-Nachweis von Tentoxin erfolgte durch Fluoreszenzlöschung auf Silufol UV 254. Laufmittel (LM) 1: Essigsäureäthylester — Benzol = 99 — 1, Rf = 0,19; LM 2: n - B u t a n o l — Eisessig — Wasser = 4 — 1 — 5 (obere Phase), R f = 0,80. Tentoxin wurde 24 Stunden bei 100 °C in 6 sr HCl hydrolysiert, HCl im V a k u u m entfernt. Der PC-Nachweis von Leucin, Glycin u n d N-Methylalanin w u r d e im 2-dimensionalen System an F N 4 d u r c h g e f ü h r t (LM 1: w-Propanol — Wasser = 3 — 1, LM 2: Phenol — Wasser = 4 — 1). Die Dansylierung u n d der Nachweis der dansylierten Hydrolyseprodukte erfolgte nach N E U H O F F (1973), die Derivatisierung der H y d r o l y s e p r o d u k t e u n d die gaschromatografische Analyse an 3 % OV 225 bei 120 °C in Anlehnung an METZ et al. (1971). Glycin wurde von eventuell v o r h a n d e n e m Isoleucin an 1 % Carbowax 6000 auf Chromosorb W - H M D S bei 105 °C abgetrennt.

Ergebnisse Biomasse

und und

Diskussion

Produktbildung

A l s s y n t h e t i s c h e r N ä h r b o d e n , der f ü r p h y s i o l o g i s c h e u n d b i o c h e m i s c h e U n t e r s u c h u n g e n b e n ö t i g t wird, erwies sich zunächst ein Harnstoff-Saccharose-Medium ( N M 8) g ü n s t i g , d a s a l l e r d i n g s b e d e u t e n d g e r i n g e r e T e n t o x i n m e n g e n (s. T a b . 1) e r g a b als d i e a u s d e r L i t e r a t u r b e k a n n t e n k o m p l e x e n M e d i e n . D o r t w u r d e n n a c h e n t s p r e c h e n d e n I s o l i e r u n g s v e r f a h r e n m a x i m a l 3 5 mg/1 K F erzielt (WOODHEAD et al. 1975). E i n w i c h t i g e r S c h r i t t zur N ä h r b o d e n o p t i m i e r u n g g e l a n g m i t d e m E i n s a t z e i n e r m o d i f i z i e r t e n R I C H A R D ' S S o l u t i o n . B e r e i t s F U L T O N et al. (1965), S A A D et al. ( 1 9 7 0 ) u n d W O O D H E A D et al. (1975) h a t t e n m i t g u t e n A u s b e u t e n d i e s e s M e d i u m b e n u t z t , bei d e m G l u c o s e d u r c h S a c c h a r o s e a u s g e t a u s c h t w o r d e n war, h a t t e n a b e r s t e t s G e m ü s e s a f t oder H e f e e x t r a k t zugesetzt. Wir verwendeten m i t Erfolg für die Oberflächenk u l t u r eine RICHARD'S S o l u t i o n m i t Saccharose o h n e die k o m p l e x e n Z u s ä t z e ( N M I I a b z w . b). A l s z w e i t e C-Quelle w u r d e e n t w e d e r A m y l o s e (a) o d e r K a r t o f f e l s t ä r k e (b) e i n g e s e t z t . T a b e l l e 1 z e i g t , d a ß a u c h m i t s y n t h e t i s c h e n N ä h r b ö d e n g u t e u n d sehr g u t e E n d a u s b e u t e n e r r e i c h t w e r d e n . A u s A b b i l d u n g 1 i s t e r s i c h t l i c h , d a ß bei e i n e m k o n t i n u i e r l i c h e n W a c h s t u m s v e r l a u f i n N M I I a erst a b 13. T a g T e n 34

Z. Allg. Mikrobiol-, Bd. 23, H. 8

506

B . LIEBBEMANN u n d B . OERTEL

Tabelle 1 Maximale Ausbeuten an Tentoxin (mg/1 Kulturfiltrat aus verschiedenen Nährmedien und nach verschiedenen Reinigungsstufen), NM = Nährmedium (1) Biotest nach Ätherextraktion des KF (2) nach Sephadex-G-15-Trennung über molaren Extinktionskoeffizient berechnet (3 a) gravimetrisch nach Auskristallisation aus Benzol (3 b) gravimetrisch nach Kieselgelreinigung u. Lyophilisierung NM 8 (1)

—

NM I I b

NM 11

19,6

68,0

—

—

20,4

66,4

(3 a)

—

-

—

35,0

(3 b)

—

15,5

50,2

—

(2) •

3,4

NM I I a

toxin im Kulturfiltrat nachweisbar ist. Um den 20. Tag erfolgt ein starker Anstieg der Produktivität (pjx) und damit eine intensive Produktbildung (p). Gegen Ende der Fermentation läßt die Produktivität nach, der leichte Abfall der Produktbildungskurve deutet darauf hin, daß abbauende Prozesse die aufbauenden überwiegen. Der Einfluß der Substratverwertung auf die Produktbildung ist Gegenstand weiterer Untersuchungen ( O E R T E L et al., unveröffentlicht). Sowohl bei NM 8 als auch bei NM I I a stellten wir in parallel durchgeführten Versuchen den Einfluß der Fermentationstemperatur auf die Tentoxinausbeute fest. Die Ergebnisse zeigt Tabelle 2. Die günstigste Temperatur liegt bei 23 °C bzw. bei 25 °C, das gilt sowohl für die absolute Tentoxinkonzentration als auch für die auf

Abb. 1. Biomasseproduktion, Produktbildung und pH-Wert bei Kultivierung von Alternaria alternata in Nährmedium I I a , Standkultur 28 °C (Mittelwert aus drei Parallelen). • Myceltrockenmasse (X); o Tentoxinkonzentration im Kulturfiltrat (p); • Produktivität (p/x); x pH-Wert

Tentoxin aus Alternaria

507

alternata

Tabelle 2 Einfluß der Fermentationstemperatur auf die Tentoxinbildung NM : Nährmediun, K P : Kulturfiltrat, KL: Kulturlösung, TM: Tockenmasse NM 8 nach 38 Tagen

NM I I a nach 30 Tagen

Temperatur CC)

Tentoxin (mg/1 KF)

(g/1 KL)

18

0,4

3,22

0,12

4,9

20,13

0,24

23

3,3

2,76

1,20

12,5

19,70

0,63

-

—

19,6

18.75

1,05

17,28

0,87

25

—

TM

Produktbildg. (mg/g TM)

Tentoxin (mg/1 KF)

28

1,1

2,37

0,46

15,0

35

0

0,65

0

0

TM (mg/1 KL)

7,44

Produktbildg. (mg/g TM)

0

Biomasse bezogenen Werte. Die Biomasse-Produktion nimmt mit steigender Fermentationstemperatur kontinuierlich ab. Aus Tabelle 2 ist weiterhin zu sehen, daß die höhere Tentoxinausbeute in NM I I a (im Vergleich zu NM 8) auf eine stärkere Biomassebildung und nicht auf eine bessere Produktivität des Mycels zurückzuführen sind. Auf NM 8 kultiviertes Mycel war tentoxinfrei. Eingesetzt wurden für diese Bestimmung 29 g Myceltrockenmasse. I m K F waren nach 30 Tagen 0,5 mg/1 nachweisbar. Dagegen ergab eine Fermentation in NM I I a , in deren K F nach 30 Tagen 3,4 mg/1 bestimmt wurden, 0,2 mg/g Myceltrockenmasse. Isolierung und Identifizierung Die Isolierung des Tentoxins (Schema 1) war abhängig vom verwendeten Nährmedium. Kulturfiltrate von Fermentationen in NM 8, das relativ wenig ionogene Bestandteile enthält, wurden direkt über Kationen- und Anionenaustauscher vorgereinigt, bevor mit Äther ausgeschüttelt und weiter aufgearbeitet wurde. Dieser Weg war mit K F , das von NM 11 stammt nicht möglich, weil Tentoxin und ein Teil der Nebenprodukte stark an Dowex 50 adsorbiert wurden. Deshalb wurde das konzentrierte K F zuerst einer kontinuierlichen Ätherextraktion unterworfen. Bereits nach 4 Stunden befanden sich 90% des Tentoxins in der Ätherphase, nach 6 Stunden 94% und nach 8 Stunden 99%. Eine 24stündige Extraktion (TEMPLETON 1972 mit Äther, W O O D H E A D et al. 1975 mit Benzol) ist deshalb nicht notwendig. Das K F darf jedoch nicht autoklaviert worden sein, da sonst die Phasentrennung empfindlich gestört wird. Anschließend wurde der Ätherrückstand in Wasser über eine kleine Säule mit Dowex 50 gegeben, um Farbstoff zurückzuhalten. Mit einer standardisierten Menge Wasser zum Nachwaschen konnten die Adsorptionsverluste gering gehalten werden. Die Neutralisation mit Dowex 1 entfällt, da alle Ionen bereits bei der Ätherextraktion abgetrennt worden sind. T E M P L E T O N (1972) erwähnt die Abtrennung von Tentoxin an Sephadex G-10 ( F E / F 0 = 3,5—4,5) aus konzentrierten Kultufiltraten. Dieses Ergebnis können wir nicht bestätigen, aus aufgearbeiteten Kulturfiltraten wurde Tentoxin kurz nach F 0 ( F E / F 0 = 1,65) eluiert und von Nebenprodukten nicht getrennt. Diese bisher nicht beschriebene Aufspaltung in verschiedene Verbindungen, die bei 270—290 nm absorbieren, gelang mit einer 160 cm langen Sephadex G-15-Säule (Abb. 2). Die Frak34*

508

B . LIEBEKMANN a n d B . OERTEL

3,0

A\

¿1

A2

B, ß2 C,

Ol

C3

C'j

^ 2,0 -

6t:

1,0

r i 0

1,8

i < I I 2,1

2,3

2ß

2,8

3,0

3,3

*

3,5

Vo Abb. 2. Trennung von Verbindungen aus dem Kulturfiltrat von Alternaria alternata, die bei 270 bis 290 nm absorbieren, an Sephadex G-15 (Zusammenfassung verschiedener Durchläufe) E = Extinktion; FE/VO = Elutionsvolumen/Ausschlußvolumen

tion C2, die biologisch aktiv ist und deren F B /F 0 -peak je nach Trennbedingungen zwischen 2,9 und 3,3 liegt, wurde an Sephadex G-15 rechromatografiert und ergab nach weiterer Reinigung an Kieselgel Tentoxin. Das gesamte Isolierungsverfahren dauert etwa 8 — 10 Tage und ist damit bedeutend zeiteffektiver als die bisher beschriebenen Methoden, bei denen allein die Kristallisation und Rekristallisation aus Benzol 4—8 Wochen benötigt (TEMPLETON 1972, WOODHEAD et al. 1975). Wurde die Kristallisation unterlassen, ergaben sich nur ungenügend reine Tentoxinpräparate, erkenntlich am wesentlich niedrigeren Extinktionskoeffizienten (SAAD et al. 1970) oder bis 20% Verunreinigung durch Dihydrotentoxin (SCHADLER et cd. 1976). Mit Hilfe des UV-Spektrums und des molaren Extinktionskoeffizienten, den M E Y E R et al. (1975) für wässerige Lösungen bei 285 nm mit 17500 angibt, konnten wir Tentoxin sowohl nach der Sephadex- als auch nach der Kieselgeltrennung identifizieren bzw. quantitativ bestimmen. Das UV-Spektrum ist neben dem Maximum bei 286 nm und dem Minimum bei 242 nm vor allem durch eine Schulter bei 222 nm charakterisiert. Unsere Tentoxinpräparate hatten eine Reinheit von 97—99%. Die weitere Identifizierung der von uns isolierten Substanz als Tentoxin stützt sich neben der biologischen Wirksamkeit (s. Biotest) und typische Banden des IR-Spektrums (MEYER et al. 1971, TEMPLETON 1972) vor allem auf das zur Sequenzanalyse herangezogene Massenspektrum (KONCEWICZ et al. 1973, M E Y E R et al. 1974). Außerdem fanden wir Übereinstimmung der R f -Werte (Laufmittel 1 bzw. 2) mit den Literaturangaben (DURBIN et al. 1973, KONCEWICZ et al. 1973). Nach saurer Hydrolyse konnten wir sowohl papier- als auch gaschromatografisch Glycin, Leucin und N-Methylalanin bestimmen, die auch dünnschichtchromatografisch nach Dansylierung des Hydrolysats neben Methylamin erfaßt werden, letzteres entsteht aus N-Methyldehydrophenylalanin.

Tentoxin aus Alternaria alternata

509

Biotest Isoliertes Tentoxin wurde als Eichsubstrat für die quantitative Bestimmung des Phytotoxins auf biologischem Wege verwendet. Abbildung 3 zeigt, daß der Bereich von ca. 0,25—0,5 fig/ml für die Auswertung dieses Biotestes brauchbar ist. SAAD et al. (1970) erreichten im semiquantitativen Biotest erst bei ca. 10 fxg/ml 9 0 % Chlorose, während TEMPLETON (1972) mit dieser Konzentration sogar nur ca. 3 0 % Chlorose erzielte. Ob diese unterschiedlichen Ergebnisse allein durch die Bedingungen des Biotests oder auch durch die verschiedenen Präparationen von Tentoxin hervor-

gerufen wurden, sei dahingestellt. Der von uns erarbeitete Biotest, mit dem relativ geringe Ten toxi nkonzentrationen erfaßt werden können, zeigt auch gute Ubereinstimmung mit den Werten, die nach der Sephadex-Trennung über den molaren Extinktionskoeffizienten errechnet wurden. Für physiologische Untersuchungen wurden deshalb je nach Aufgabenstellung beide Verfahren verwendet. Nebenprodukte Die durch die Sephadex-Trennung nachweisbaren Nebenprodukte (s. Abb. 2) sind chemisch instabiler als Tentoxin und werden deshalb durch die Aufarbeitung beeinflußt. So konnte besonders nach Rechromatografie zusätzlich zu A 2 noch A x und Ai gefunden werden. Wird das Kulturfiltrat vor der Aufarbeitung autoklaviert oder sehr weit eingeengt, steigen die peaks der A- und B-Gruppe stark an, was auf zusätzliche Entstehung aus anderen Bestandteilen des Kulturfiltrats hindeutet. Teilweise ergeben sich zusätzlich peaks, so z. B . B 2 in schlecht bzw. nicht Tentoxin produzierenden Kulturen. Cj und C3 zeigen eine schwach chlorotische Wirkung im Biotest. Der C3-peak ist nicht immer einheitlich, sondern wird durch C3, das einen etwas größeren F E / F 0 Wert hat, beeinflußt. C3 tritt besonders bei Kulturen auf NM I I b deutlich hervor. In diesem Medium verläuft die Bildung der Nebenprodukte C3 und C3 im Fermentations-

510

B . LIEBERMANN u n d B . OERTEL

ablauf anders als die des Tentoxins. Die Verbindungen treten zu einem relativ frühen Zeitpunkt auf und sind nach 26 Tagen nur noch in Spuren nachweisbar. Von den genannten Nebenprodukten, die alle bei etwa 270 nm ein Absorptionsmaximum haben, wurde bisher nur die C-Gruppe näher bearbeitet. Diese Substanzen, die im Gegensatz zu Tentoxin keine Peptidstruktur aufweisen, sind stickstofffreie, aromatische Verbindungen mit einer mehrfach ungesättigten Seitenkette, wobei eine Doppelbindung in Konjugation zum Phenylrest steht; außerdem sind alkoholische Gruppen vorhanden (LIEBERMANN et al., unveröffentlicht). Damit stehen diese Verbindungen in einem strukturellen und sicher auch biosynthetischen Zusammenhang (Polyketosäure-Weg) mit anderen Alternaria-Metaboliten (HARVAN U. PERO 1976), die sich vom Tentoxin unterscheiden. Fräulein E . H A N E R T und Frau A. H E N N I N G E R danken wir für zuverlässige technische Unterstützung bei der Versuchsdurchführung. Unser Dank gilt Herrn Dr. IHN (Zentralinstitut für Mikrobiologie u. experimentelle Therapie Jena) für die Aufzeichnung und Auswertung des Massenspektrums und Herrn Dr. B. B A U M A N N (Sächsische Akademie d. Wissenschaften, Forschungsgruppe Jena) für die mikrochromatografischen Analysen der dansylierten Hydrolyseprodukte.

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Tentoxin aus AlUrnaria alternala

511

TEMPLETON, G . E . , GBABLB, C. I . , FULTON, N . D . a n d BOLLENBACHEB, K . , 1 9 6 7 . F a c t o r s a f f e c t i n g

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Sektion Biologie der Friedrich-Schiller-Universität — Mikrobielle Biochemie — DDR-6900 Jena, Neugasse 23

Zeitschrift f ü r Allgemeine Mikrobiologie

23

1983

512

Buchbesprechung M . P . STARR, A . BALOWS, J . A . SCHMIDT ( E d i t o r s ) , A n n u a l

R e v i e w of M i c r o b i o l o g y , Vol. 36.

I X + 563 S., 41 Abb., 31 Tab. Palo Alto 1982. Annual Reviews Inc. $ 25.00 (USA $ 22.00).

Der neue B a n d enthält 20 Beiträge, deren Thematik, wie immer, in die verschiedensten Gebiete der Mikrobiologie hineinreicht. I m einzelnen werden folgende Probleme behandelt: Die Ökologie u n d Bedeutung der Protozoen in der aeroben Abwasserbehandlung (CURDS); Die Evolution von RNA-Viren (REANNY) ; Niedermolekulare mikrobielle Enzyminhibitoren (UMEZAWA); Primäre Amöben-Meningoencephalitis und die Biologie von Naegleria fowleri (JOHN) ; Colicine und andere Bacteriocine mit aufgeklärter Wirkungsweise (KONISKY); Immobilisierte Mikrobenzellen (FUKUI u n d TANAKA) ; Struktur u n d Dynamik der Phycobilisomen (GLAZER) Hämophilus-Infektionen, die nicht durch Haemophilus influenzae hervorgerufen werden (ALBRITTON); Magnetotaktische Bakterien (BLAKEMORE); Viroide und ihre Wechselwirkung mit den Wirtszellen (DIENER); Metabolische Veränderungen durch gezielte Selektion unter Laborbedingungen (MORTLOCK) ; Proteine der Zellumhüllung mit Beziehungen zum Eisen (NEILANDS); Sinnvolle Nutzung von Computern in der Mikrobiologie (KRICHEVSKY); Mikrobielle Lebensgemeinschaften im Darm von Termiten und anderen holzfressenden Insekten (BBEZNAK) ; Die Biologie der Rickettsien (WEISS) ; Mediatoren von Anaphylaxie und E n t z ü n d u n g (BACH) ; Möglichkeiten und Grenzen mikrobieller Modelle als Siebtests f ü r die Auffindung von krebswirksamen Substanzen (WHITE) ; Mechanismus der Inkorporation von Zellumhüllungs-Proteinen bei E. coli (MICHAELIS und BECKWITH); Die Labormethoden zum Nachweis der Bakteriämie (TILTON); Die pflanzenpathogenen Corynebakterien (VIDAVER).

Es gehört zweifellos zu den Vorzügen der Annual Reviews, daß sie innerhalb einiger aufeinanderfolgender J a h r e einen gründlichen und kritischen Überblick über solche Gebiete geben, die sich in rascher Entwicklung befinden oder aber erkennen lassen, daß ihre Bedeutung im Steigen begriffen ist. Zu letzteren zählen sicherlich die verschiedenen Gebiete der allgemeinen und angewandten Ökologie oder auch gewisse „ R a n d g r u p p e n " unter den Krankheitserregern, die in der letzten Zeit zunehmend berücksichtigt wurden. Der alljährliche autobiographische Beitrag s t a m m t diesmal von SIDNEY RAFFEL, der auf seine fünfzigjährige Beschäftigung mit der Immunologie zurückblickt. Mit dem vorliegenden Band scheidet MORTIMER P . STARR als Herausgeber aus. E r h a t sich im Verlaufe von 24 J a h r e n große Verdienste um die Entwicklung der Annual Review of MicrobiologyReihe zu einem der wichtigsten Organe der mikrobiologischen Sekundärliteratur erworben. U . TAUBENECK ( J e n a )

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23

1983

513-515

Kurze Originalmitteilung (Akademie der Wissenschaften der DDR, Forschungszentrum für Molekularbiologie und Medizin, Zentralinstitut f ü r Mikrobiologie und experimentelle Therapie, Jena, Direktor: Prof. Dr. rer. nat. hábil. U. TAUBENECK and J )Department of Genetics and Selection, Leningrad State University, 199164 Leningrad,UdSSR

Development of breeding stocks of the yeast Saccharomycopsis lipolytica by methods of moderate inbreeding CORNELIA KURISCHKO, S . G . LNGE-VECHTOMOV 1 ) a n d H . W E B E R

(Eingegangen am 8. 2. 1983) Sporulation parameters of genetically labelled strains, derived from a wild strain of the alkaneutilizing yeast Saccharomycopsis lipolytica were improved by a breeding program using brotherssister crosses. Sporulation frequency, the number of four-spored asci and viability of ascospores could be significantly enhanced. To date a number of genetically well-defined strains is available t h a t have good sporulation parameters and show a 1:1 segregation pattern of markers suitable for genetic analysis. D u r i n g t h e early period of y e a s t g e n e t i c s i n v e s t i g a t i o n s were m a i n l y carried out t o s o l v e the q u e s t i o n w h e t h e r strains of the g e n u s Saccharomyces were following t h e rules of Mendelian inheritance ( W I N G E a n d R O B E R T S 1958). T h e s e s t u d i e s led t o the devel o p m e n t of y e a s t strains suitable for g e n e t i c analysis. Strains of t h e baker's y e a s t Saccharomyces cerevisiae n o w w i d e l y u s e d in g e n e t i c s laboratories are characterized b y high f e r t i l i t y parameters. T h e present s i t u a t i o n in t h e g e n e t i c s of t h e alkane-utilizing y e a s t Saccharomycopsis lipolytica is comparable w i t h this early period of t h e g e n e t i c s of Sacch. cerevisiae. T h e d e v e l o p m e n t of g e n e t i c a l l y d e f i n e d strains of S. lipolytica has so far b e e n reported f r o m t w o laboratories (OGRYDZIAK et al 1978, GAILLARDUST a n d H E S L O T 1979). W e d e v e l o p e d a n i n d e p e n d e n t line of g e n e t i c a l l y well-defined strains b a s e d o n a haploid wild t y p e strain a n d a strain f r o m W I C K E R H A M ' S laboratory. I n this c o m m u n i c a t i o n w e p r e s e n t results of a n inbreeding program designed to construct strains w i t h a n i m p r o v e d sporulation f r e q u e n c y , t e t r a d f o r m a t i o n a n d v i a b i l i t y of ascospores. Strains of S. lipolytica used in our studies were obtained by crossing a mutant of strain YB-42312 (mating type B) kindly supplied by J . BASSEL (Berkely), with a m u t a n t of strain H 222 (mating type A) (Institut für techn. Chemie, Leipzig) and three subsequent backcrosses again with mut a n t s of strain H 222 (mutants were isolated in this laboratory by G. BARTH). The genome of the resulting strains, therefore, consisted mainly of H 222 sequences. The following designations have been used: K1 — the first inbreeding diploid, 1-K1, 2-K1haploid segregants from K l , and so on. Media: Complete medium (yeast extract-pepton-glucose) (YEPG) (SHERMAN et al. 1974); minimal medium (MM) (MISHINA et al. 1976, composition of trace elements as described by LINGENS and HELLMANN 1958); medium for mating (YM) (WICKERHAM 1951); sporulation medium (SpM) (WEBER 1 9 7 9 ) .

In order to introduce genetic markers into strains auxotrophic mutants were produced by UVmutagenesis. Doses resulting in a survival rate of about 10% were applied. Fresh cultures (24 h) on Y E P G plates were replica plated in a standard manner. Diploids were isolated from crosses between haploids with complementary nutritional markers. Mating was carried out on a solid agar medium (YM). To define the mating type of segregants, 32 different haploids were crossed on a single plate with tester strains for both mating types, i. e. we successfully adopted a method used in analysis of segregants of Sacch. cerevisiae (ZAKHAROV et al. 1976). Induction of sporulation we accomplished by transferring the diploid strains from Y E P G to SpM, (approximately 5 to 8 streakes per plate). After a incubation time of 5 —6 days at 28 °C asci containing 1 to 4 crescent or helm-shaped ascospores were formed on mycelial cells. In each inbreeding round diploids were analysed microscopically to improved sporulation.

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1983

513-515

Kurze Originalmitteilung (Akademie der Wissenschaften der DDR, Forschungszentrum für Molekularbiologie und Medizin, Zentralinstitut f ü r Mikrobiologie und experimentelle Therapie, Jena, Direktor: Prof. Dr. rer. nat. hábil. U. TAUBENECK and J )Department of Genetics and Selection, Leningrad State University, 199164 Leningrad,UdSSR

Development of breeding stocks of the yeast Saccharomycopsis lipolytica by methods of moderate inbreeding CORNELIA KURISCHKO, S . G . LNGE-VECHTOMOV 1 ) a n d H . W E B E R

(Eingegangen am 8. 2. 1983) Sporulation parameters of genetically labelled strains, derived from a wild strain of the alkaneutilizing yeast Saccharomycopsis lipolytica were improved by a breeding program using brotherssister crosses. Sporulation frequency, the number of four-spored asci and viability of ascospores could be significantly enhanced. To date a number of genetically well-defined strains is available t h a t have good sporulation parameters and show a 1:1 segregation pattern of markers suitable for genetic analysis. D u r i n g t h e early period of y e a s t g e n e t i c s i n v e s t i g a t i o n s were m a i n l y carried out t o s o l v e the q u e s t i o n w h e t h e r strains of the g e n u s Saccharomyces were following t h e rules of Mendelian inheritance ( W I N G E a n d R O B E R T S 1958). T h e s e s t u d i e s led t o the devel o p m e n t of y e a s t strains suitable for g e n e t i c analysis. Strains of t h e baker's y e a s t Saccharomyces cerevisiae n o w w i d e l y u s e d in g e n e t i c s laboratories are characterized b y high f e r t i l i t y parameters. T h e present s i t u a t i o n in t h e g e n e t i c s of t h e alkane-utilizing y e a s t Saccharomycopsis lipolytica is comparable w i t h this early period of t h e g e n e t i c s of Sacch. cerevisiae. T h e d e v e l o p m e n t of g e n e t i c a l l y d e f i n e d strains of S. lipolytica has so far b e e n reported f r o m t w o laboratories (OGRYDZIAK et al 1978, GAILLARDUST a n d H E S L O T 1979). W e d e v e l o p e d a n i n d e p e n d e n t line of g e n e t i c a l l y well-defined strains b a s e d o n a haploid wild t y p e strain a n d a strain f r o m W I C K E R H A M ' S laboratory. I n this c o m m u n i c a t i o n w e p r e s e n t results of a n inbreeding program designed to construct strains w i t h a n i m p r o v e d sporulation f r e q u e n c y , t e t r a d f o r m a t i o n a n d v i a b i l i t y of ascospores. Strains of S. lipolytica used in our studies were obtained by crossing a mutant of strain YB-42312 (mating type B) kindly supplied by J . BASSEL (Berkely), with a m u t a n t of strain H 222 (mating type A) (Institut für techn. Chemie, Leipzig) and three subsequent backcrosses again with mut a n t s of strain H 222 (mutants were isolated in this laboratory by G. BARTH). The genome of the resulting strains, therefore, consisted mainly of H 222 sequences. The following designations have been used: K1 — the first inbreeding diploid, 1-K1, 2-K1haploid segregants from K l , and so on. Media: Complete medium (yeast extract-pepton-glucose) (YEPG) (SHERMAN et al. 1974); minimal medium (MM) (MISHINA et al. 1976, composition of trace elements as described by LINGENS and HELLMANN 1958); medium for mating (YM) (WICKERHAM 1951); sporulation medium (SpM) (WEBER 1 9 7 9 ) .

In order to introduce genetic markers into strains auxotrophic mutants were produced by UVmutagenesis. Doses resulting in a survival rate of about 10% were applied. Fresh cultures (24 h) on Y E P G plates were replica plated in a standard manner. Diploids were isolated from crosses between haploids with complementary nutritional markers. Mating was carried out on a solid agar medium (YM). To define the mating type of segregants, 32 different haploids were crossed on a single plate with tester strains for both mating types, i. e. we successfully adopted a method used in analysis of segregants of Sacch. cerevisiae (ZAKHAROV et al. 1976). Induction of sporulation we accomplished by transferring the diploid strains from Y E P G to SpM, (approximately 5 to 8 streakes per plate). After a incubation time of 5 —6 days at 28 °C asci containing 1 to 4 crescent or helm-shaped ascospores were formed on mycelial cells. In each inbreeding round diploids were analysed microscopically to improved sporulation.

514

C . KTTRISCHKO, S . G . INGE-VECHTOMOW a n d H . W E B E R

The sporulation frequency was differentiated by points and the portion of 3- and 4-spored asci was expressed in percents. To test the viability of ascospores they were isolated by means of a micromanipulator ( V E B CARL ZEISS, Jena). Spore suspensions were prepared as described by OGRYDZIAK et al. ( 1 9 7 8 ) . Large numbers of ascospores were isolated by the paraffine oil method ( E M E I S and GÜTZ 1 9 5 8 , G A I L L A R D I N et al. 1 9 7 3 ) . Segregation of markers was studied in random ascospore samples by using every auxotrophic marker as a selective one. Prototrophs were not studied.

At the beginning of our studies the sporulation frequency and viability of spores of our strains were very low ( < 1 % ) and among asci one and two-spored asci predominated ( > 9 0 % ) . Similar results have been described by G A I L L A R D I N et al. ( 1 9 7 3 ) , O G R Y D ZIAK et al. ( 1 9 7 8 ) and WEBER ( 1 9 7 9 ) for other strains of this yeast. By means of the paraffin oil method a sufficient number of ascospores could be isolated for the first inbreeding crosses. This inbreeding program was based on brother-sister crosses between all segregants obtained from a given diploid. I n each round about 40—60 diploids were analysed microscopically. The viability of spores from diploid strains with the highest sporulation rate was estimated. Suitable stocks were selected for subsequent breeding steps. Data about sporulation improvement are listed in Table 1. After six rounds of inbreeding both the sporulation frequency and ascospore viability were increased drastically and the strains were found to be suitable for genetic investigations. Table 1 Improvement of sporulation in Saccharomycopsis Lineage parameter (in %)

3rd

lipolytica

Rounds of inbreeding 4th 5th

6th

K 5 3-spored asci 4-spored asci Viability of ascospores Viable tetrads (3 and 4 spores)

42 ± 4.9 12 ± 3.2 24 ± 3.0

37 ± 4.8 42 ± 4.9 39 ± 2.5

24 ± 6.0 46 ± 7.0 38 ± 3.0

22 ± 5.3 52 ± 6.5 76 ± 2.7

10 ± 4.1

25 ± 4.5

28 ± 5.3

56 ± 7.4

K 6 3-spored asci 4-spored asci Viability of ascospores Viable tetrads (3 and 4 spores)

32 ± 4.7 8 ± 2.7 —

38 ± 4.9 26 ± 4.4 66 ± 3.1

33 ± 6.1 53 ± 6.4 66 ± 3.0

23 ± 5.5 57 ± 6.4 74 ± 2.5

—

42 ± 6.5

41 ± 6.1

65 ± 5.5

Different strategies have been described to select breeding stocks for yeast genetics. One successful method to improve fertility of ascospores of Sacch. cerevisiae is based on germination of whole asci (INGE-VECHTOMOV 1 9 6 3 ) . To improve the sporulation of S. lipolytica O G R Y D Z I A K et al. ( 1 9 7 8 ) carried out inbreeding rounds with spores from asci containing four viable products of meiosis. The sporulation frequency increased along with spore viability. A method of moderate inbreeding has been applied successfully by G A I L L A R D I N et al. ( 1 9 7 3 ) to develop breeding stocks of S. lipolytica. We were able to show t h a t a very close inbreeding of spores from a single ascus resulted in a decreased sporulation frequency in 31 diploids analysed microscopically. Application of micromanipulation to our strains was only efficient for determination of ascospore viability. So far two markers were used in these inbreeding crosses: met A and leu A. The results of tetrad analysis did not show any linkage between the two markers used or between the genes and their centromers (14P: 15N:45T xl:i:*= 1-18; 0.80 > p > 0.50). Additional auxotrophic mutants were isolated after UV-mutagenesis of two segregants from a diploid of the second breeding round (1-K5 and 2-K5). Four of these

Breeding stocks of Saccharomycopsis

lipolytica

515

mutants were included in crosses with segregants from the sixth inbreeding round (5-K53 and 15-K53) in order to construct strains which carry multiple markers. The segregation patterns of all diploids were studied. In this manner stocks were developed with a segregation pattern of 1:1 for the genetic markers. A linkage was detected between the markers met A —lys A (25 + 0.9% crossing over) and arg A — leu A (30 + 1 . 2 % crossing over). These results agree with the assumption of O G E Y D Z I A K et al. (1978) that S. lipolytica has only a small number of chromosomes, since we were able to find two linkage groups among only seven markers (A/B, his A, leu A, arg A, lys A, ura A, met A). Our results confirmed that the method of moderate inbreeding is suitable for developing genetic stocks of S. lipolytica. This method was found to be efficient at least for two cultures of independent origin. Acknowledgement We t h a n k

I. KUNZE

for excellent technical assistance.

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CORNELIA K U R I S C H K O

Zentralinstitut f ü r Mikrobiologie u n d experimentelle Therapie der A d W DDR-6900 J e n a , Beutenbergstraße 11

Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie

23

1983

516

Buchbesprechung J . W . W E S T L E Y (Editor), Polyether Antibiotics — Naturaly Oocurring Acid Ionophores, Vol. I : Biology. 465 S., 51 Abb., 77 Tab. New Y o r k - B a s e l 1982. Marcel Dekter Inc. SFr. 185.00 I S B N : 0-8247-1655-8 Der ökonomische Erfolg des Einsatzes einiger Polyether-Antibiotica als Ergotropica oder Coccidiostatica in der Tierernährung hat das Interesse an dieser interessanten Gruppe sekundärer Naturstoffe aus Actinomyceten außerordentlich gefördert. Bisher wurden lediglich Teilaspekte ihrer Biogenese und Pharmakologie in Übersichten dargestellt. Es ist daher umso mehr zu begrüßen, daß nunmehr mit dem vorliegenden zweibändigen Werk zum ersten Mal eine komplette Zusammenfassung erstellt wurde, die über Strukturaufklärung und Biogenese, den biochemischen Wirkmechanismus, die Pharmakologie sowie über bereits praktisch realisierte und potentielle Anwendungen Auskunft erteilt. Die 10 Kapitel des hier rezensierten 1. Bandes betreffen vor allem die Biologie der Carboxylsäure-Ionophore, während Band 2 den Problemen der chemischen Strukturaufklärung vorbehalten ist. Kapitel 1 (J. W. WESTLEY) behandelt Nomenklatur und Struktur der bisher bekannten Polyether-Antibiotica, Kapitel 2 (B. L A T. PROSSER U. N. J . PALLERONI) die Taxonomie der produzierenden Actinomyceten. I m Kapitel 3 (CHAO-MIN LIT;) finden sich Angaben über mikrobiologische Aktivität, Produktion und Biosynthese der Polyether, und im Kapitel 4 (R. W. TAYLOR et al.) werden ihre Fähigkeit zur Bildung lipidlöslicher Kationenkomplexe und die angewandten physikochemischen Untersuchungstechniken erläutert. Das umfangreiche Kapitel 5 (P. W. REED) weist Carboxylsäure-Ionophore als einzigartige Wirkstoffe aus, die durch Interferenz mit dem Kationentransport einer Vielzahl von Zellen als potentielle Pharmaca geeignet erscheinen. Kapitel 6 ( M . D. R U F F ) und 7 ( M . W. OSBORNE et al.) referieren über die beiden wichtigsten Veterinären Applikationsmöglichkeiten für Polyether, ihre Eignung als Ergotropica für polygastrische Tiere und ihre Rolle als Coccidiostatica in der Geflügelzucht. In Kapitel 8 (H. G. HANGLEY) werden Ergebnisse pharmazeutischer Studien über Ionophoreneffekte auf Säugerzellen vorgestellt, die die Grundlage für den späteren Einsatz als Humantherapeutica bilden können. Diesbezügliche Hoffnungen knüpfen sich nach Kapitel 9 (P. W. R E E D u. G. M . BOKOCH) besonders an die festgestellten cardiovaskulären und renalen Wirkungen sowie die Interferenz einiger Polyether mit hormonalen Kontrollsystemen. Daß schließlich durch chemische Derivatbildung von natürlich vorkommenden Polyethern weitere neuartige Wirkstoffe gewonnen werden können, verdeutlichen Arbeiten über die Verwendung des Bromlasalocids als antihypertensives Agens (Kapitel 10, M. W. OSBORNE et

al.).

Alles in allem ein sehr wertvoller Band, mit dem einschlägig interessierten Chemikern, Biologen, Pharmakologen, aber auch Veterinären und Klinikern, ein Handbuch übergeben wurde, das nicht zuletzt auch durch die umfangreich zitierten Literaturangaben als eine Fundgrube von Informationen über die Biologie der Polyether-Ionophore gelten darf. U . GRÄFE ( J e n a )

Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie

23

1983

517-535

Sammelbericht (Sektion Biologie, W B Allgemeine Mikrobiologie, Ernst Moritz-Arndt-Universität Greifswald)

Molekularbiologie der Keimung von Bacillus-S\)oren M. HECKEK

(Eingegangen

am, 3. 2. 1983)

The review deals with recent results and problems of gene expression during germination of Bacillus spores. Three problems were selected: 1. The activation of metabolism as a prequisite for the synthesis of nucleic acids and proteins. 2. The activation of nucleic acid and protein synthesis during germination. 3. The gene expression programme of germinating spores. Using the highly sensitive two-dimensional Polyacrylamide gel analysis three major classes of proteins were distinguished, depending on the time of onset and duration of their syntheses: a) proteins made throughout germination (main class), b) proteins whose synthesis started only after a lag phase and then continued throughout germination, and c) proteins which are synthesized only during the early phases of germination. The programme of protein synthesis is an indicatoir for the control of gene expression during germination. The regulation of expression of these major gene groups during spore outgrowth is discussed. 1.

Einführung

Der Wachstums- und Entwicklungszyklus von Vertretern der Gattung Bacillus bietet ein geeignetes Feld für das Studium der molekularen Mechanismen der Zelldifferenzierung. Unter Bedingungen der Nährstofflimitation schalten die Zellen ein Genexpressionsprogramm ein, das die Umwandlung der vegetativen Zelle in die resistente, ungünstige Milieubedingungen überdauernde Spore steuert. Treffen andererseits Sporen auf geeignete Milieubedingungen, die Wachstum und Vermehrung zulassen, wandeln sie sich wieder in vegetative Zellen um, die solange ungehindert zu wachsen und sich zu vermehren befähigt sind, bis die Limitation eines essentiellen Nährstoffes erneut die Sporulation einleitet (Abb. 1). Was zeichnet gerade diesen Zyklus aus, daß er von zahlreichen Wissenschaftlern als Modellsystem für das Studium der Zelldifferenzierung bevorzugt wird ? Zunächst ist eine solche Differenzierung von Einzelzellen von einer relativ geringen Komplexität und damit einfach zu überschauen, wobei sich auch die Trennung zwischen Wachstum und Differenzierung als vorteilhaft erweist. Weiterhin ist der Zyklus experimentell gut zu beherrschen und zu synchronisieren. Und nicht zuletzt verfügt man heute über eine sehr solide Bacillus subtilis-Genetik dank einer gezielten Anwendung der Transformation, Transduktion und in jüngster Zeit auch der Protop l a s t e n f u s i o n (vgl. MACH 1 9 8 0 , MACH u. JATZWATJK 1 9 8 2 ) . N e b e n einer V i e l z a h l v e g e -

tativer Gene, deren Produkte in Abhängigkeit von den jeweiligen ernährungsphysiologischen Bedingungen benötigt werden, sind auch zahlreiche Gene bekannt, die während des Wachstums blockiert sind und erst mit Einschalten der Zelldifferenzierung abgerufen werden (vgl. HKNNER U. HOCH 1980, siehe auch Abb. 1). Das ist insbeson-

518

M. HECKER

Abb. 1. Die Regulation der Zelldifferenzierung bei Bacillus subtilis durch die Mechanismen differentieller Genexpression. Neben vegetativen Genen (kleinere Auswahl vegetativer Gene außen auf der Genkarte von B. subtilis aufgetragen), deren Produkte für Wachstum und Vermehrung erforderlich sind, sind Differenzierungsgene bekannt, die im vegetativen Wachstum „stumm' sind und nur nach Einschalten der Differenzierungsprozesse aktiviert werden. Bei den Differenzierungsgenen (Innenkreis, aus H E N N E R U. HOCH 1 9 8 0 ) unterscheiden wir die Sporulationsgene von denen, die die Kontrolle der Keimungsprozesse übernommen haben (gsp, ger)

dere von Bedeutung, wenn wir Zelldifferenzierung als selektive Realisierung bestimmter Teile der gleichen genetischen Information (vgl. NOVER 1 9 8 2 ) verstehen wollen. E s gibt wohl bei Pro- oder E u k a r y o t e n k a u m ein anderes Modellsystem der Differenzierung, bei dem gerade dieser Zusammenhang zwischen differentieller Genexpression u n d Zelldifferenzierung so überzeugend herzustellen ist wie bei der sporulierenden Zelle von Bacillus subtilis. Die entscheidende Frage, warum Sporulationsgene in der vegetativen Zelle „ s t u m m " sind u n d durch welche Mechanismen sie aktiviert werden, wenn ein extrazelluläres Signal die Sporulation einleitet, läßt sich gegenwärtig bereits weitgehend beantworten (vgl. Übersichten bei LOSICK 1 9 8 1 , D o i 1 9 8 2 ) , da sich einige führende molekularbiologische Laboratorien ganz auf diese Fragestellung konzentriert haben. W e n n m a n d a m i t über die molekularen Mechanismen der Sporulation enorme, wenn auch keinesfalls ausreichende Kenntnisse gewinnen konnte, m u t e t unser Wissen über den der Umwandlung von Sporen in vegetative Zellen zugrunde liegenden Differenzierungsprozeß vergleichsweise bescheiden an. F ü r ein umfassendes Verständnis der Zelldifferenzierung von Bacillus können daher Untersuchungen über die Sporenkeimung von besonderer B e d e u t u n g sein. Erfreulicherweise widmen sich gerade in jüngster Zeit einige Gruppen diesem Forschungsgebiet, so daß eine zusammenfassende Darstellung der von ihnen erhobenen B e f u n d e gerechtfertigt erscheint. Dabei wird auf Forschungsergebnisse, die vor zehn und mehr J a h r e n erzielt worden sind, nur in Ausnahmefällen eingegangen, da sie in vorliegenden Übersichtsartikeln ausführlich besprochen worden sind (vgl. Übersichten bei H A N S E N et al. 1 9 7 0 , K E Y N A N 1 9 7 3 , SussMAN u . DOUTHIT 1 9 7 3 ) .

Keimung von Bacillus-Sporen

519

Bei der Umwandlung von Sporen in vegetative Zellen handelt es sich offensichtlich um einen Differenzierungsprozeß, bei dem die Sporulation gleichsam aufgehoben bzw. „rückgängig" gemacht wird und der durch die Expression sogenannter „outgrowth"Gene gesteuert wird (vgl. Abb. 1). Bei einer „keimwilligen", d. h. aktivierten Spore wird die Keimung ausgelöst, wenn der Spore extrazelluläre Nährstoffe, meist Zucker oder Aminosäuren, günstige Umweltbedingungen anzeigen. Diese Signale, die von der Spore über noch unbekannte Signalrezeptoren empfangen werden (vgl. K E Y N A N 1 9 7 8 , R A C I N E et al. 1 9 8 1 ) , setzen über eine „Trigger-Reaktion" eine Kette von Ereignissen in Gang, die zunächst auf metabolischer Ebene, d. h. ohne Einschalten von RNA- oder Proteinbiosynthesen ablaufen, bis dann schließlich die Voraussetzungen für die Aktivierung der Genexpression geschaffen werden. Diese erste metabolische Phase, in der sporenspezifische Strukturen zerstört und Stoffwechselprozesse reaktiviert werden, wurde als Keimung bezeichnet (vgl. K E Y N A N 1 9 7 3 ) . Nach der Wiederaufnahme der Proteinbiosynthesen wandelt sich die Spore Schritt für Schritt in eine vegetative Zelle um, ein Prozeß, der ursprünglich als „outgrowth" von der Keimung abgegrenzt wurde. In Anlehnung an SETLOW ( 1 9 8 1 ) werden wir die Umwandlung von Sporen in vegetative Zellen als Keimung beschreiben und nicht streng zwischen Keimung und Auswachsen unterscheiden. Darüber hinaus werden in der vorliegenden Übersicht vorrangig Fragen der differentiellen Genexpression keimender Sporen betrachtet, während auf die Aktivierung der Sporen überhaupt nicht und auf die Keimung im herkömmlichen Sinne nur insofern eingegangen wird, als sie für das Verständnis der Reaktivierung der Makromolekülsynthesen von Bedeutung sein könnte.

2. Aktivierung

des Stoffwechsels der keimenden Spore als Voraussetzung Start der Nucleinsäuren- und Proteinbiosynthesen

für den

Bei der Analyse der Keimungsprozesse bakterieller Sporen fällt auf, daß Ereignisse, die unabhängig von Proteinneusynthesen ablaufen, für die Umwandlung der Spore in die vegetative Zelle von besonderer Bedeutung sind. Mit Keimungsbeginn werden einige, bereits in Sporen vorhandene hydrolytische Enzyme aktiviert, die nur wenige Minuten später sporenspezifische Strukturen sowie während der Sporulation gespeicherte Makromoleküle abbauen. Die Hydrolyseprodukte stehen in der Regel der keimenden Spore zur Verfügung (vgl. aber WARTH 1 9 7 8 ) . Die Mechanismen dieser Funktionalisierung hydrolytischer Enzyme sind weitgehend unbekannt (vgl. LOSHON et al. 1 9 8 2 ) , Proteinneusynthesen spielen offensichtlich keine Rolle. Im einzelnen handelt es sich um den Abbau des Peptidoglycans der Sporen, um den Abbau von Lipiden (vgl. E L L A R 1 9 7 8 ) sowie Membranproteinen (SETO-YOUNG U. E L L A R 1 9 7 9 ) , um die Hydrolyse gespeicherter Reserveproteine sowie RNA (SETLOW U. KORNBERG 1 9 7 0 , SETLOW 1 9 7 5 , 1 9 7 7 ) und nach Aufbau einer neuen Zellwand auch um die Zerstörung der Proteinhülle (vgl. Übersichten bei K E Y N A N 1 9 7 3 , 1 9 7 8 , SETLOW 1981). Die Spore, die zudem während der Sporulation gespeicherte niedermolekulare Substanzen wie Ca-Dipicolinat ausscheidet, verliert dabei Schritt für Schritt ihre charakteristischen Eigenschaften wie Lichtbrechung, Hitze- oder UV-Resistenz und ermöglicht durch Umbau ihrer Zellbegrenzungen die unmittelbare Kontaktaufnahme mit der Umwelt, insbesondere die Aufnahme von Nährstoffen aus dem extrazellulären Milieu. Damit werden schon in der sporulierenden Zelle Proteine mit ausgewiesener Funktion bei der Keimung gebildet (vgl. DION U. MANDELSTAM 1 9 8 0 ) . Schließlich werden mit Keimungsbeginn die in Sporen vorhandenen und katalytisch inaktiven Enzyme des Primärstoffwechsels reaktiviert, ohne daß hierfür poststranslationale Veränderungen erforderlich sein müssen. Der danach sofort einsetzende Intermediärstoffwechsel hat alle für die Wiederaufnahme der Wachstumsprozesse er-

520

M . HECKER

forderlichen metabolischen sowie energetischen Voraussetzungen zu schaffen. Ruhende Sporen enthalten nur Spuren von ATP oder NADH 2 , so daß zunächst energiereiche Verbindungen einschließlich der für den Anabolismus erforderlichen Reduktionsäquivalente zur Verfügung zu stellen sind, was u. a. durch den Katabolismus von gespeicherten niedermolekularen Substanzen wie 3-Phosphoglycerat oder L-Glutaminsäure erreicht wird (SETLOW 1981). Die während der Sporulation gebildeten Reserveproteine, auf die immerhin bis zu 25% der Sporenproteine entfallen, werden mit Keimungsbeginn durch Proteasen hoher Substratspezifität abgebaut, wobei etwa die Hälfte der bereit gestellten Aminosäuren von der keimenden Spore als Energiequellen und die andere Hälfte als Vorstufen für die bald einsetzende Proteinsynthese genutzt werden (SETLOW 1976, 1 9 8 1 JOHNSON U. T I P P E E 1981). Auch die hierfür zuständigen Proteasen werden schon in der sporulierenden Zelle synthetisiert, aber erst mit Keimungsbeginn funktionalisiert. Diese posttranslationale Modifikation ist offensichtlich mit einer geringfügigen Verringerung des Molekulargewichtes von 4 1 0 0 0 auf 4 0 0 0 0 (vgl. LOSHON et cd. 1 9 8 2 ) verbunden. Die keimende Spore ist zunächst als auxotrophe Zelle auf die Lieferung von verschiedenen Aminosäuren angewiesen, da sie erst im Verlauf der Sporenkeimung ihre Fähigkeit zur Synthese aller proteinogenen Aminosäuren wiedererlangt (SETLOW 1976, siehe Tab. 1). In ähnlicher Weise wird auch der Bedarf an Nucleotiden für die RNASynthese aus dem Abbau von RNA und erst später durch Neusynthesen gedeckt (SETLOW U. KORNBERG 1 9 7 0 , SETLOW 1 9 7 5 ) .

Damit schafft die Spore in der frühen Keimungsphase die stoffliche, energetische sowie strukturelle Basis für den Übertritt in die zweite, entscheidende Phase der Keimung, die durch die Reaktivierung der Makromolekülsynthesen gekennzeichnet ist und in der Umwandlung in eine vegetative Zelle gipfelt. Tabelle 1 Beispiele für Enzyme, die nicht unmittelbar mit Keimungsbginn, sondern erst in späteren Stadien der Keimungsphase von Bacillus-Sporen gebildet werden Literatur

Enzym 1. Enzyme des Nuoleotid- u. DNA-Stoffwechsels Thymidinkinase Deoxycytidinkinase Thymidylatkinase Ribonucleotidreduktase DNA-Polymerase I I I Aspartattranscarbamylase DNase (Einzelstrang-spezifisch) 2. Enzyme für Biosynthese von Aminosäuren Ornithintranscarbamylase Imidazolylacetolphosphattransaminase Aspartokinase Threonindesaminase Tryptophansynthetase

TANOOKA et al.

(1971)

SETLOW ( 1 9 7 3 ) CIARROCCHI et al. ( 1 9 7 7 ) SETLOW U. K O R N B E R G ( 1 9 7 0 ) COBIANCHI et al. ( 1 9 8 0 )

vgl. zusammenfassende Diskussion bei ( 1 9 7 7 , 1 9 8 1 ) , Y E H u . STEINBERG ( 1 9 7 8 )

3. Ausgewählte Enzyme des Intermediärstoffwechsels Trehalase Y E H U. S T E I N B E R G ( 1 9 7 8 ) alpha-Glucosidase S T E I N B E R G U. HALVORSON Histidase H A N S E N et al. ( 1 9 7 0 ) L-Alanindehydrogenase Alkalische Phosphatase 4. Enzyme für die Bildung von Teichonsäure sowie von Lipiden

(1968)

B O Y L E N U. E N S I G N ( 1 9 6 8 ) D A W E S U. HALVORSON ( 1 9 7 2 )

SETLOW

Keimung von

3. Beaktivierung

von Nucleinsäuren-

521

Bacillus-Sporen

und Proteinbiosynthesen Spore

in der

keimenden

Das Genom einer aktiven vegetativen Bakterienzelle setzt sich aus mehreren Domänen von DNA zusammen, die sich in einem negativen ,,supercoil"-Zustand befinden. Diese durch DNA-Topoisomerasen katalysierte Tertiärstruktur der DNA ist für die Bildung von Initiationskomplexen der Transkription erforderlich (vgl. Z U B A Y 1 9 8 0 , P E T T I J O H N 1 9 8 2 ) . Wenn man das „supercoiling" durch spezifische Inhibitoren der hieran entscheidend beteiligten DNA-Gyrase verhindert, läßt sich eine z. T. dramatische Hemmung der Genexpression verzeichnen, wobei sich neben streng DNAGyrase-sensitiven Genen auch solche mit geringerer DNA-Gyrase-Abhängigkeit unterscheiden lassen (vgl. S M I T H et al. 1 9 7 8 , OOSTRA et al. 1 9 8 0 , K A N O et al. 1 9 8 1 ) . In der ruhenden Spore dürfte sich die DNA in einem entspannten („relaxed") Zustand befinden und als solche nicht zur Transkription gelangen. Zunächst sind ATPabhängige strukturelle Umlagerungen erforderlich, die im wesentlichen durch die DNA-Gyrase katalysiert werden und die mit der Umwandlung bestimmter Domänen in den negativen ,,supercoil"-Zustand verbunden sind. Wenn man diesen Prozeß durch frühzeitige Gabe von Nalidixinsäure oder Novobiocin, Inhibitoren der beiden Untereinheiten der DNA-Gyrase, verhindert, kann das Genom aktivierter Sporen nicht zur Transkription gelangen (vgl. G O T T F R I E D et al. 1 9 7 9 , MATSUDA U. K A N E Y A M A 1 9 8 0 , HECKER 1982).

Damit ist in der DNA-Gyrase-abhängigen Veränderung der Tertiärstruktur der DNA der vermutlich erste Schritt zu sehen, der die Einschaltung der RNA-Synthese auswachsender Sporen vorbereitet. Nach diesen strukturellen Umlagerungen setzen die Transkriptionsprozesse zunächst mit zögernder und später mit zunehmender Intensität ein. Ältere Angaben von AMSTRONGund SUEOKA ( 1 9 3 8 ) von einer sequentiellen Aktivierung des Genoms, d . h. einer frühzeitigen Aktivierung der Synthese ribosomaler RNA und einer erst darauf folgenden Expression proteincodierender Gene, konnten nicht bestätigt werden. Unter den frühesten Transkriptionsprodukten sind neben tRNA, rRNA auch mRNA enthalten (SLOMA U. S M I T H 1 9 7 9 , A L B E R T I N I U. GALIZZI 1 9 8 2 ) , die z. T. als Poly(A)-RNA erfaßt wurde (vgl. H E C K E R et al. 1 9 3 1 , PRÖSCH et al. 1 9 8 1 ) und deren Poly(A)-Segmente aller Wahrscheinlichkeit nach im Anschluß an die Transkription angefügt wurden. Über die Bedeutung der Polyadenylierung prokaryotischer mRNA als Ereignis auf der Posttranskriptionsebene ist nur wenig bekannt ( H E C K E R et al. 1 9 8 1 , GOPALAKRISHNA U. SARKAR 1 9 8 1 ) .

Ein bedeutender und während der Keimung konstant bleibender Teil der RNASynthesekapazität auswachsender Sporen entfällt auf die Neubildung von ribosomaler RNA (SLOMA U. S M I T H 1 9 7 9 ) . Die Synthese von rRNA wird nach den Kenntnissen der Wachstumsphysiologie sicher auch in der keimenden Spore über das Nährstoffangebot reguliert (vgl. GAUSING 1 9 8 2 , R Y A L S et al. 1 9 8 2 ) . Auf Unterschiede im Muster neu synthetisierter tRNA im Verlauf der Keimung von B. subtilis-S-poren im Vergleich mit den in der Spore gespeicherten machen H E N N E R und S T E I N B E R G ( 1 9 7 9 ) aufmerksam, ohne daß diese Ergebnisse mit der Regulation der Proteinsynthese auswachsender Sporen in einen Zusammenhang gebracht werden können. Auffallend ist darüber hinaus, daß etwa ein Drittel der tRNA in Sporen ohne CCA-Ende gespeichert wird. Dieses wird erst mit Keimungsbeginn angefügt ( V O L D 1 9 7 4 ) . Die für Prokaryoten typische räumliche und zeitliche Kopplung der Transkriptions- mit den Translationsprozessen bedingt, daß auch in der auswachsenden Spore unmittelbar auf die mRNA-Synthese die Proteinsynthese folgt. Die Spore verfügt über einen potentiell funktionstüchtigen Translationsapparat, wenn man von An35

Z. Allg. Mikrobiol., Bd. 23, H. 8

522

M. HECKER

gaben über defekte Ribosomen, die nicht unwidersprochen geblieben sind (vgl. KoBAYASHI u. HALVORSON 1968, K I E E A S et al. 1978), absieht. Durch Einsatz spezifischer Inhibitoren der RNA-Synthese konnte gezeigt werden, daß der Start der Proteinsynthese vollständig von einer unmittelbar vorangegangenen mRNA-Neubildung abhängig ist (vgl. H A N S E N et cd. 1 9 7 0 ) . Selbst mit Hilfe hochleistungsfähiger Techniken zur Auf trennung von Proteinen ist es nicht gelungen, nach Applikation von Rifampicin irgendwelche Proteinsynthesen nachzuweisen ( W A C H L I N u. HECKER, unveröffentlicht). Daraus folgt, daß die Bacillus-Sj>ore wahrscheinlich keinerlei translationsaktive mRNA speichert. Bei älteren Angaben über die in Sporen vorhandene mRNA handelt es sich offensichtlich um Reste der mRNA-Population sporulierender Zellen, die nicht mehr zur Translation gelangen kann und vermutlich in frühen Keimungsstadien zerstört wird (vgl. J E K G U. D O I 1 9 7 4 , SETLOW 1 9 8 1 ) . mRNA-Moleküle mit einer erhöhten Lebensdauer sind in sporulierenden Zellen wiederholt nachgewiesen worden (siehe Übersicht bei P R I E S T 1977), wobei ihre Stabilisierung durch Bindung an cytoplasmatische Membranen sowie verstärkte Polyadenylierung erreicht werden könnte (vgl. H E C K E R et al. 1981a, H U S S A I N et al. 1982). Auf der anderen Seite zeichnet sich die in der keimenden Spore gebildete mRNA durch eine auch für mRNA vegetativer Zellen zutreffende Kurzlebigkeit aus ( S T E I N B E R G U. HALVORSON 1968), so daß das Proteinsyntheseprogramm einer auswachsenden Spore als repräsentatives Maß für das Genexpressionsprogramm angesehen werden darf ( W A C H L I N u. H E C K E R 1982). Die Abwesenheit translatierbarer mRNA unterscheidet die Bakterienspore von anderen Ruhe- oder Verbreitungseinheiten (z. B. Pilzsporen oder pflanzliche Samen), wobei bisher in keinem Fall eine keimungsessentielle Funktion der gespeicherten mRNA zweifelsfrei nachgewiesen werden konnte (vgl. H E C K E R et al. 1982). Inwieweit sich Angaben, wonach Sporen von Streptomyceten langlebige mRNA anhalten sollen ( H A R D I S S O N et al. 1980), bestätigen lassen, bleibt abzuwarten. Die Keimung von Bakteriensporen findet zunächst in Abwesenheit der DNA-Synthese statt, die erst in der zweiten Hälfte der Keimungsphase eingeschaltet wird (YOSHIKAWA 1 9 6 5 , SETLOW 1 9 7 3 ) .

Diese Sequenz in der Reaktivierung der Makromolekülsynthesen läßt sich nicht nur bei Sporen von Bakterien, sondern auch bei allen anderen, diesbezüglich untersuchten mikrobiellen sowie pflanzlichen Ruhe- und Verbreitungseinheiten beobachten (z. B. Sporen von Pilzen, pflanzliche Samen, siehe H E C K E R U. K Ö H L E R 1 9 7 9 , H E C K E R et al. 1 9 8 2 ) . In all diesen Fällen setzt die DNA-Synthese verspätet ein, weil die ruhenden „Verbreitungseinheiten" nicht alle für die Initiation der Replikation erforderlichen Proteine enthalten. Damit schafft erst die différentielle Genexpression die Voraussetzung für den Start der DNA-Synthese (vgl. auch Abschnitt 4). Ein noch vor der Initiation der DNA-Synthese stattfindender 3 H-Thymidin-Einbau ist wahrscheinlich auf DNA-Reparatur-Prozesse zurückzuführen (siehe Diskussion bei SETLOW 1 9 8 1 ) . Parallel mit der Initiation der Synthese chromosomaler DNA setzt eine verstärkte Lipidsynthese ein. In gleicher Weise werden die in der frühen Keimungsphase zerstörten sporenspezifischen Membranen und Zellwandkomponenten schon sehr bald durch neue, für vegetative Zellen charakteristische ersetzt. Das trifft für die in Sporen nicht vorhandene Teichonsäure in gleicher Weise zu wie für das Peptidoglycan oder für Membranproteine (vgl. Abb. 2, siehe K E Y N A N 1973, 1978, SETLOW 1981). Nach Abschluß der Synthese chromosomaler DNA sind die Voraussetzungen für die erste Zellteilung und damit für den Abschluß des Differenzierungsprozesses geschaffen. Bemerkenswerterweise wird die Entscheidung über das Anlegen einer Zellwand bereits in der frühen Keimungsphase, vermutlich noch vor oder unmittelbar nach Beginn der DNA-Synthese, gefällt, Wie durch Analyse einer temperatursensitiven filamentösen Mutante von Bacillus subtilis gezeigt werden konnte (PRÖSCH et al. 1982). Aller Wahr-

Keimung von i?aciKit,s-Sporen

523

Abb. 2. Autoradiographischtr Nachweis der Synthese von Membranproteini n während der Sporenkeimung von Bacillus subtilis. Hitzeaktivierte Sporen wurden nach 120minütiger Inkubation bei 30 °C in einem chemisch defi35 nierten Medium 10 min mit S-L-Methionin gefüttert, die Membranen isoliert und die Membranproteine nach O'FAKRELL (1975) aufgetrennt (links basische Proteine, DÜNGER U. HECKER, in Vorbereitung) scheinlichkeit nach handelt es sich dabei um ein Phänomen, das nicht allein für die keimende Spore charakteristisch ist, da ganz ähnliche Befunde auch für vegetative Zellen mitgeteilt worden sind (vgl. MIYAKAWA et al. 1982). Mit Abschluß der ersten Zellteilung k o m m t es schließlich auch zur Bildung von Geißeln (UMEDA U. AMAKO 1980). Erwartungsgemäß ist die Umwandlung von Sporen in vegetative Zellen von einer ungestörten Proteinsynthese völlig abhängig. I n Gegenwart von Chloramphenicol lassen sich zwar einige frühe Keimungsereignisse nachweisen, aber keinerlei W a c h s t u m . D a m i t sind die in Sporen enthaltenen Proteine allein nicht befähigt, die mit der K e i m u n g verbundenen Wachstumsprozesse zu steuern. Auch in den Sporen, die mit Inhibitoren der R N A - S y n t h e s e gefüttert worden sind, setzen weder Protein- noch D N A - S y n t h e s e n und folglich auch keine Wachstumsprozesse ein, so daß die Kontrollmechanismen der Umwandlung bakterieller Sporen in vegetative Zellen vorrangig im B e r e i c h der Transkription zu suchen sind (vgl. TOKBIANI U. LEVINTHAL 1967, HANSEN et al. 1970). Die Neusynthese ribosomaler R N A , die durch geeignete Konzentrationen von Nalidixinsäure spezifisch ausgeschaltet werden k a n n (HECKIR 1£82), ist für die K e i m u n g zwar wesentlich, aber nicht unumgänglich. Sporen, bei denen die Synthese stabiler R N A weitgehend gehemmt wurde, können unter bestimmten Bedingungen noch vollständig, wenn auch mit Verzögerungen zu S t ä b c h e n auswachsen (HECKEE 1982). Die frühe Aktivierung der Transkriptionsprozesse erfolgt erwartungsgemäß unabhängig von Proteinsynthesen. E i n e in späteren Keimungsphasen zu beobachtende verstärkte R N A - S y n t h e s e (vgl. SLOMA U. SMITII 1979) hängt dagegen von einer frühen Proteinsynthese ab, wie Ergebnisse unter E i n s a t z von Chloramphenicol zeigten (ALBEETLKI u. GALIZZI 1 9 7 5 ,

1982).

Schließlich kann die D N A - S y n t h e s e im E x p e r i m e n t vollkommen ausgeschaltet we-r den, ohne den Keimungsprozeß in irgendeiner Weise zu stören (GIXSBERG U. K EYXAN

524

M. HECKER

1 9 7 8 ) , während die erste Zellteilung zwangsläufig ausbleibt. In gleicher Weise ist auch die Keimung von Pilzsporen oder pflanzlichen Samen in Abwesenheit der Replikation chromosomaler DNA möglich (vgl. H E C K E R et al. 1 9 8 2 ) . Damit bietet die keimende Spore ein geeignetes Modellsystem, Prozesse der Zelldifferenzierung unabhängig von DNA-Synthesen zu studieren.

4. Das Genexpressionsprogramm

keimender

Bacillus-Sporen

Die Umwandlung der Spore in eine vegetative Zelle ist als Differenzierungsprozeß aufzufassen, bei dem das Genexpressionsprogramm der Spore in das einer vegetativen Zelle umgewandelt werden muß. Dieses Programm hat zu gewährleisten, daß die keimende Spore alle die für eine vegetative Zelle typischen Eigenschaften wiedererlangt, während andererseits Proteine mit ausgewiesener Keimungsfunktion zerstört werden müssen (vgl. z. B. spezifische Proteasen, LOSHON et al. 1 9 8 2 , Glucose-6-PDehydrogenase, O R L O W S K I U. GOLDMAN 1 9 7 5 ) . Die Annahme, daß dieser Prozeß durch die Expression von Differenzierungsgenen gesteuert wird, konnte im wesentlichen durch genetische Befunde erhärtet werden. Neben Mutanten, die in der ersten metabolischen Phase der Keimung geschädigt sind, kennt man auch solche, die bei erhöhten Temperaturen nicht mehr oder nur noch zum Teil in der Lage sind, die RNA-, Protein- oder auch DNA-Synthesen ihrer keimenden Sporen einzuschalten, während das vegetative Wachstum gar nicht oder nur unwesentlich beeinträchtigt ist (vgl. H E N N E R U. HOCH 1 9 8 0 , 1 9 8 2 , GALIZZI et al. U. GALIZZI 1 9 7 5 , 1 9 8 2 , T A R C H I - F A B R I et al.

1 9 7 6 , A L B E R T I N I et al.

1979,

ALBERTINI

1981).

Bekanntlich sind für die Aufrechterhaltung von Wachstum und Vermehrung zahlreiche unterschiedliche Genprodukte erforderlich, die die Anzahl von 1000 überschreiten dürften. Es erhebt sich die Frage, nach welchen Gesetzmäßigkeiten die zunächst inaktive Spore in der Frühphase der Keimung schließlich die Vielzahl der für die Wiederaufnahme der Wachstumsprozesse benötigten Gene einschaltet. Prinzipiell wäre eine gleichzeitige oder eine sequentielle, d. h. nach einer vorgegebenen Sequenz erfolgende Reaktivierung des Genoms denkbar. Darüber hinaus sind neben kontinuierlichen, den gesamten Zeitraum umfassenden Proteinsynthesen auch solche in Erwägung zu ziehen, die zu einem bestimmten Zeitpunkt an- und nach einiger Zeit wieder abgeschaltet werden, also auf bestimmte Differenzierungsstadien beschränkt sind (vgl. Abb. 3, siehe auch HALVORSON 1977). Von verschiedenen Arbeitsgruppen publizierte Ergebnisse führten zur Entwicklung von Modellvorstellungen, wonach die Aktivierung des Genoms auswachsender Sporen sowohl sequentiell als auch stadienspezifisch erfolgen soll (Übersicht bei H A N S E N et al. 1970), wobei nach neueren Vorstellungen die Produkte der ,,outgrowth"-Gene die Kontrolle des gesamten Prozesses übernehmen sollten (GALIZZI et al. 1976). Folgende Befunde sprechen für eine solche sequentielle Aktivierung des Genoms im Zuge des Auswachsens (siehe auch Tab. 1): 1. Mit Hilfe von Hybridisierungstechniken konnte gezeigt werden, daß sich die mRNA-Population mit fortschreitender Keimung signifikant, wenn auch nur gerinfügig ändert ( H A N S E N etal. 1970, S I L B E R S T E I N u. COHEN 1978, M A R G U L I E S et al. 1978, SETOGUCHI et al. 1978, A L B E R T I N I U. GALIZZI 1982). Dabei sind die beiden DNA-Stränge im unterschiedlichen Maße an der Transkription auswachsender Sporen sowie vegetativer Zellen beteiligt (SETOGUCHI et al. 1978). Schaltet man die Proteinsynthesen unter Einfluß von Chloramphenicol aus, treten keine neuen mRNA-Moleküle mehr auf ( A L B E R T I N I U. GALIZZI 1975, 1982), woraus geschlußfolgert werden kann, daß frühe Proteinsynthesen für das Anschalten neuer Gengruppen verantwortlich sein könnten.

Keimung von

Bacillus-Sporen

A

sofortige Aktivierung, kontinuierlich

B

sequentielle Aktivierung,

C

sequentielle Aktivierung, stadienspezifisch

S p o r e Spore

525

kontinuierlich

n k e i m u n g vegetative Zelle

Abb. 3. Möglichkeiten der Reaktivierung von Proteinbiosynthesen im Verlauf der Umwandlung von Sporen in vegetative Zellen. A) Die Proteinsynthesen setzen unmittelbar mit Keimungsbeginn ein und finden kontinuierlich während der gesamten Keimungsphase s t a t t . B ) Die Synthese einer zweiten Gruppe von Proteinen wird nicht unmittelbar mit Keimungsbeginn, sondern sequentiell und während unterschiedlicher Keimungsstadien eingeschaltet, erfolgt dann aber kontinuierlich. C) Die Synthese einer dritten Gruppe von Proteinen erfolgt sequentiell und ist auf nur wenige Keimungsstadien beschränkt

Außerdem wurden mRNA-Moluküle nachgewiesen, die lediglich in der auswachsenden Spore und nicht mehr in vegetativen Zellen auftreten und als Kandidaten für Transkriptionsprodukte von ,,outgrowth"-Genen anzusehen sind (MABGULIES et al. 1978).

2. Die Synthese einiger Enzyme des Intermediärstoffwechsels wird nicht unmittelbar mit Keimungsbeginn, sondern erst in fortgeschrittenen Keimungsstadien eingeschaltet, um wenig später wieder abgeschaltet zu werden (vgl. S T E I N B E R G u. HALVORSON 1 9 6 8 , HANSEN et al. 1 9 7 0 ) . Beispielsweise ist die auswachsende Spore zunächst nicht befähigt, alle Aminosäuren sowie Nucleotide schon selbst zu synthetisieren, weil einige der hierfür benötigten Enzyme in Sporen nicht gespeichert werden und erst im Zuge der Keimung synthetisiert werden (vgl. SETLOW U. K O R N B E R G 1 9 7 0 , SETLOW U. PRIMUS 1 9 7 5 , SETLOW 1 9 7 6 ) . Diese und ähnliche Untersuchungen über die periodische Synthese bestimmter Enzyme während des Auswachsens gipfelten in Vorstellungen, wonach das Genom vom Origin ausgehend mit Fortschreiten der Replikationsgabel aktiviert werden soll. Damit würde der Abstand des jeweiligen Gens vom Origin den Zeitpunkt seiner Expression festlegen (vgl. K E N N E T u. SUEOKA 1 9 7 1 ) . Durch neuere Untersuchungen von Y E H und S T E I N B E R G ( 1 9 7 8 ) mußten diese

526

M . HECKER

Vorstellungen verworfen werden, während die Annahme von der periodischen Synthese einiger Enzyme eine Bestätigung fand. Und schließlich fehlen in Sporen auch bestimmte, für die Aufnahme der DNASynthese erforderliche Enzyme, die ebenfalls erst im Zuge der Keimung bereitgestellt werden (vgl. TANOOKA et al. 1 9 7 1 , R A N A U. HALVORSON 1 9 7 2 , CIARROCCHI et cd. 1 9 7 7 , COBIANCHI et al. 1 9 8 0 , siehe weitere Beispiele aus Tab. 1 ) . 3. Zu unterschiedlichen Zeiten der Keimung wurde — allerdings unter Anwendung wenig auflösender proteinanalytischer Verfahren — eine Veränderung der Proteinsynthesemuster beobachtet, Befunde, die zu weitreichenden Hypothesen Anlaß gaben. So wurde eine alleinige Synthese weniger „früher Proteine" (vgl. TORRIANI u. LEVENTHAL 1 9 6 7 , GALIZZI et al. 1 9 7 6 ) dahingehend gedeutet, daß es sich hier um Produkte von ,,outgrowth"-Genen handelt, die erst die nachfolgende sequentielle Expression vegetativer Gene ermöglichen. Jedoch waren die zunächst eingesetzten eindimensionalen proteinanalytischen Verfahren noch zu unempfindlich, um schon zuverlässige Schlußfolgerungen zuzulassen. F ü r die Erhärtung der Annahme von einer sequentiellen Aktivierung des Genoms wurde es notwendig, mit Hilfe hochleistungsfähiger Methoden das Proteinsyntheseprogramm auswachsender Sporen, das auf Grund der Kurzlebigkeit der m R N A als repräsentativ für das Genexpressionsprogramm gewertet werden kann (vgl. Abschnitt 3), direkt zu messen. Mit der inzwischen zur Verfügung stehenden, von O ' F A R RELL ( 1 9 7 5 ) beschriebenen zweidimensionalen Technik, die auf einer gekoppelten Anwendung der Isoelektrofokussierung in einem pH-Gradienten sowie auf einer Elektrophorese in Polyacrylamidgradientengelen beruht, wurde es möglich, die Mehrzahl der in einer Bakterienzelle zu einem bestimmten Zeitpunkt stattfindenden Proteinsynthesen direkt zu erfassen, zweifellos ein wesentlicher methodischer Fortschritt, der eine weitreichende Anwendung in der Folgezeit garantierte. Mit Hilfe der O'FARRELL-Technik konnte gezeigt werden, daß das Proteinsyntheseprogramm in frühen Phasen der Keimung dem der vegetativen Zelle ähnelt (vgl. MITLLIN U. H A N S E N 1 9 8 1 , W A C H L I N U. H E C K E R 1 9 8 2 ) . Ein bedeutender Teil der für vegetative Zellen charakteristischen Proteine wird folglich nicht sequentiell und ebensowenig stadienspezifisch gebildet, da die Synthese dieser ersten Gruppe von Proteinen sofort einsetzt und über die gesamte Keimungsphase anhält. Demnach sollte unmittelbar mit Einsetzen der Keimungsprozesse eine Vielzahl vegetativer Gene (1. Gruppe) aktiviert werden, ohne daß hierfür eine vorangegangene Expression von Differenzierungsgenen erforderlich ist. Eine sequentielle, erst in späteren Keimungsstadien erfolgende Synthese ließ sich zunächst lediglich für eine kleinere Gruppe von Proteinen (2. Gruppe) zeigen, die einmal angeschaltet, in der Regel kontinuierlich über die Keimungsphase verläuft und auch noch in der vegetativen Zelle nachgewiesen werden kann (siehe auch Abb. 3). Dabei scheinen die konkreten Keimungsbedingungen das Proteinsyntheseprogramm zu beinflussen. I n LIEBIG-Fleischextrakt-Medium gekeimte Sporen zeigen in frühen Phasen des Auswachsens ein der vegetativen Zelle weit ähnlicheres Proteinsynthesemuster (vgl. W A C H L I N U. H E C K E R 1 9 8 2 ) als hitzeaktivierte, A b b . 4 A — F . P r o t e i n s y n t h e s e p r o g r a m m k e i m e n d e r Sporen v o n Bacillus subtilis. • D i e h i t z e a k t i v i e r t e n , in e i n e m chemisch d e f i n i e r t e n M e d i u m g e k e i m t e n Sporen (10 8 /ml) w u r d e n s o f o r t n a c h d e m U m s e t z e n in e i n e n 3 0 °C-Thermostaten ( — 10—0 min), n a c h A b n a h m e der Lichtbrechung (0 — 10 min) s o w i e zu w e i t e r e n Zeiten vor u n d n a c h der ersten Zellteilung m i t 35 S-L-Met h k n i n 10 m i n g e f ü t t e r t , die P r o t e i n e extrahiert u n d n a c h O'FABRELL (1975) a u f g e t r e n n t (links I arische Proteine, aus WACHLIN U. HECKER, in Vorbereitung). D i e erste Zellteilung ist n a c h e t w a 2 2 0 m i n abgeschlossen. D i e e i n g e s e t z t e Methodik erlaubt d e n N a c h w e i s der f r ü h e s t e n Proteins y n t h e s e (vlg. d a g e g e n WACHLIN U. HECKER 1982). A) —10 — 0 m i n , B ) 0 — 1 0 min, C) 10 — 2 0 m i n , D ) 120 - 130 min, E ) 2 1 0 - 2 2 0 m i n , F ) 2 6 0 - 2 7 0 m i n

Abb. 4 A - C

Abb. E - F

Keimung von Bacillus-SfOTen

529

in chemisch definierten Medien gekeimte Sporen (Abb. 4 , W A C H L E N U. H E C K E R , in Vorbereitung). Prinzipiell t r i f f t jedoch auch hier die weiter oben getroffenen Feststellung über den Verlauf der Reaktivierung der Proteinsynthesen auswachsender Sporen zu, wenn auch auffällt, daß neben der sofortigen Aktivierung vegetativer Gene bedeutend mehr sequentiell, d. h. zu fortgeschrittenen Keimungsstadien eingeschaltet werden (siehe Abb. 4, vgl. auch Tab. 1). Insgesamt korrigieren diese Ergebnisse ältere Vorstellungen von einer vollständigen sequentiellen Aktivierung des Genoms (vgl. T O R R I A N I U. L E V E N T H A L 1 9 6 7 , N U K U S H I N A U. I K E D A 1 9 6 9 , K E N N E T T U. S U E O K A 1 9 7 1 ) und erlauben zudem einen ersten Einblick in das Genexpressionsprogramm auswachsender Bacillus-Sporen. U n d schließlich zeigen die proteinanalytischen Befunde eine gute Übereinstimmung mit den von MARGTJLIES et al. ( 1 9 7 8 ) sowie S E T O G U C H I et al. ( 1 9 7 8 ) beobachteten Veränderungen der mRNA-Population während der Keimung und des logarithmischen Wachstums. Es erhebt sich die Frage, worin sich die sofort aktivierten Gengruppen von denen unterscheiden, die sequentiell eingeschaltet werden. Man könnte veimuten, daß die sehr f r ü h aktivierten vegetativen Gene nicht unter direkter Kontrolle durch die ,,outgrowth"-Gene stehen, sondern über die der auswachsenden Spore zur Verfügung stehenden Nährstoffe reguliert werden, während die Expression der erst später aktivierten Gene von den ,,outgrowth"-Genprodukten abhängig ist. I n dieser Beziehung wird die Expression der sofort transkribierten Gene in der auswachsenden Spore den gleichen Mechanismen gehorchen wie die Genexpression einer vegetativen Zelle (vgl. Übersicht bei Z U B A Y 1 9 8 0 ) , was nicht verwundern sollte, da die keimende Spore in gleicher Weise eine wachsende Zelle darstellt und die f ü r Wachst u m und Vermehrung erforderlichen Genprodukte benötigt. Wenn eine Vielzahl von vegetativen Genen und Gengruppen mit Eintreten einer Nährstofflimitation (und z. T. unabhängig von der Sporulation) abgeschaltet wird, beispielsweise durch die ppGpp-vermittelte „stringent control" ( G A L L A N T 1 9 7 9 , D U E S T E R et al. 1 9 8 2 , H E C K E R 1 9 8 3 , H E C K E R U. S C H R O E T E R 1 9 8 3 ) , so werden diese Gene in der auswachsenden Spore wieder reaktiviert, sofern die ernährungsphysiologischen Voraussetzungen d a f ü r geschaffen worden sind. Mit zunehmender Nährstoffversorgung („shift up") werden diese metabolisch regulierten Gene auch intensiver transkribiert werden, so daß eine zusätzliche Kontrolle durch Differenzierungsgene nicht vorliegen muß (vgl. B u u u. S O N E N S C H E I N 1 9 7 5 ) . Zu dieser Gruppe metabolisch regulierter Gene zählen mit Sicherheit die f ü r rRNA, t R N A sowie weitere Komponenten des Translationsapparates codierenden Gene (siehe M A A L G E 1 9 7 9 ) . Bereits 1 9 7 2 haben S H A W und A R M S T R O N G eine sofortige und kontinuierliche Synthese ribosomaler Proteine gemessen, was die Autoren allerdings nach den damaligen Vorstellungen von einer sequentiellen Aktivierung des Genoms keimender Sporen verwunderte. Auf der anderen Seite sollten die Gengruppen, die erst im Verlaufe der Keimung transkribiert werden, zumindest teilweise unter direkter Kontrolle der „outgrowth"Gene stehen. Vermutlich sind diese Gene im Verlauf der Sporulation spezifisch abgeschaltet worden, so daß eine Bereitstellung von Nährstoffen f ü r ihre Reaktivierung nicht ausreichend sein dürfte. Zusätzliche, möglicherweise durch ,,outgrowth"-Gene gesteuerte Bedingungen wie die Entfernung von Repressoren oder Bindung von Aktivatormolekiilen (vgl. Z U B A Y 1 9 8 0 ) sollten gefordert werden. I n jedem Fall wäre zu erwarten, daß die Expression von „outgrowth"-Genen der Expression dieser zweiten Gengruppe vorausgehen muß. Tatsächlich haben unsere proteinanalytischen Untersuchungen Hinweise auf eine Gruppe von Proteinen gebracht, die sofort mit Keimungsbeginn gebildet werden und bereits wenig später auf den zweidimensionalen Gelen nicht mehr nachzuweisen sind (vgl. Abb. 4, siehe auch M U L L I N U. H A N S E N 1 9 8 1 ) . Unter diesen Proteinen, deren Synthese auf wenige Kei-

530

M. HECKER

A

S o f o r t i g e A k t i v i e r u n g vegetativer Gene ( G r u p p e 1) — kontinuierlich, nicht unter Kontrolle d. ,putgtowth"-Gene

p

Sequentielle Aktivierung vegetativer Gene (Gruppe 2 ) vermutlich z.T. unter Kontrolle der jOutgrowth"-Gene

C

stadienspezifische

Aktivierung

S p o r e n k e i m Spore

u n

(u.a. l i outgrowth"-Gene'>)

g —

vegetative Zelle

Abb. 5. Schematische Darstellung der Reaktivierung des Genoms keimender Sporen von Bacillus subtilis (stark vereinfachte Auswertung der zweidimensionalen Gele, vgl. Abb. 4. Eine exakte Auswertung befindet sich in Vorbereitung). Bei der Einteilung in drei Gengruppen wurde davon ausgegangen, daß das Proteinsynthesemuster aufgrund der Kurzlebigkeit bakterieller mRNA als Maß für das Genexpressionsprogramm gewertet werden kann.

A) Die Gene der ersten Gruppe werden sofort mit Keimungsbeginn aktiviert und während der gesamten Keimungsphase transkribiert (vermutlich nicht unter Kontrolle der ,,outgrowth"-Gene). Hierbei handelt es sich um die größte Gruppe. B) Die Expression der zweiten Gengruppe erfolgt nicht sofort mit Keimungsbeginn, sondern erst im Verlauf der frühen, mittleren oder späteren Keimungsstadien (die Expression eines Teiles dieser Gengruppe könnte durch „outgrowth"-Gene kontrolliert werden). (C Die Expression der dritten, kleineren Gengruppe erfolgt stadienspezifisch, wobei die Mehrzahl auf frühe Keimungsstadien beschränkt bleibt. Hier könnten u. a. Produkte von „outgrowth Genen vermutet werden. In diese Auswertung sind natürlich nur die Proteinmoleküle (Gene) einbezogen worden, die in ausreichender Zahl pro Zelle vorliegen, so daß sie auf den zweidimensionalen Gelen sichtbar gemacht werden können.

mungsstadien beschränkt bleibt, sollten mögliche K a n d i d a t e n für P r o d u k t e der Differenzierungsgene gesucht werden. Auch S E T O G U C H I et al. ( 1 9 7 8 ) haben insbesondere in den ersten Keimungsstadien mRNA-Moleküle nachgewiesen, die in späteren P h a s e n oder in der vegetativen Zelle nicht mehr gebildet werden. Inwieweit einige der lediglich in der F r ü h p h a s e synthetisierten Proteine für die Keimung an sich unbedeutend sind, sondern erst durch die 60minütige Hitzebehand-

Keimung von Bacillus-Sporen

531

lung der Sporen induziert worden sind und als Hitzeschock-Proteine anzusehen sind (vgl. YAMAMORI u. Y U R A 1 9 8 2 ) , wird augenblicklich in unserem Laboratorium geprüft. Bei der Regulation der Transkriptionsprozesse auswachsender Sporen darf endlich die RNA-Polymerase nicht unerwähnt bleiben. Mit der Sporulationsauslösung werden die für die Promotorerkennung entscheidenden, für die vegetative Zelle charakteristischen Sigma-Faktoren gegen andere ersetzt, die eine besonders hohe Affinität zu Sporulationsgenen aufweisen (LOSICK 1981). Die Annahme, wonach die RNA-Polymerase erst im Verlauf der frühen Keimungsphase die für die vegetative Zelle typische Quartärstruktur wieder annimmt, wobei die Sigma-Faktoren der sporulierenden Zelle zerstört werden müßten, hat ihren Reiz keinesfalls verloren (siehe vorläufige Befunde bei COHEN et al. 1 9 7 5 , B u u u. SONENSHEIN 1 9 7 5 ) . Damit könnte sich die Affinität der RNA-Polymerase im Verlauf der Keimung zu den Promotoren vegetativer Gene (oder nur zu den sequentiell aktivierten?) deutlich erhöhen, eine weitere Möglichkeit, die zunehmende Transkription im Zuge der Umwandlung von Sporen in vegetative Zellen zu erklären. Zusammenfassend kann festgestellt werden, daß unter Einsatz hochauflösender proteinanalytischer Verfahren ein erster, wenn auch nur vorläufiger Einblick in das Genexpressionsprogramm einer keimenden Spore von Bacillus subtilis gewonnen werden konnte. Danach wird ein großer Teil vegetativer Gene — vermutlich ohne direkte Beteiligung der Differenzierungsgene — unmittelbar nach der Aktivierung des Metabolismus eingeschaltet, wenn ausreichend Nährstoffe zur Verfügung stehen. Unter den in den ganz frühen Stadien gebildeten Proteinen befinden sich auch solche, die bereits wenig später auf den zweidimensionalen Gelen nicht mehr nachzuweisen sind und unter denen Kandidaten für die Produkte „früher" Differenzierungsgene vermutet werden. Möglicherweise kontrollieren diese Regulatorproteine die Expression der vegetativen Gene, die erst in fortgeschrittenen Keimungsstadien aktiviert werden (vgl. Abb. 5). Schließlich könnte sich das Programm auch aus mehreren solcher Sequenzen zusammensetzen, bei dem die Aktivierung der einen Gengruppe die Voraussetzung für die Aktivierung der folgenden bildet. Möglicherweise sind damit auch „spätere outgrowth"-Gene an der nachfolgenden Aktivierung vegetativer Gene beteiligt. So wachsen Sporen der temperatursensitiven Mutanten unter restriktiven Bedingungen gerade bis zu dem Zeitpunkt aus, bei dem das Produkt des mutierten Gens für die weitere Steuerung des Differenzierungsprozesses benötigt wird. Dabei lassen sich auf einer frühen Stufe geschädigte Mutanten von solchen unterscheiden, die erst zu einem späteren Zeitpunkt einen Differenzierungsblock aufweisen (vgl. A L B E R T O « et al. 1 9 7 9 , A L B E R T I N I und GALIZZI 1 9 8 2 ) . Damit wird in Anlehnung an die Sporulation (vgl. P i GOT u. COOTE 1 9 7 6 , H E C K E R 1 9 8 0 , LOSICK 1 9 8 1 ) auch die Sporenkeimung als Ablaufen eines Genexpressionsprogramms verstanden, das in einer vom Programm vorgegebenen Sequenz Gene und Gengruppen abruft, deren Produkte die Umwandlung der Spore in die vegetative Zelle übernommen haben.

5.

Ausblick

Bei einer zusammenfassenden Betrachtung der Zelldifferenzierung von Vertretern der Gattung Bacillus fällt auf, daß dem gegenwärtig zu verzeichnenden großen Kenntniszuwachs über die Sporulation ein noch völlig unzureichendes Wissen über die Sporenkeimung gegenübersteht. In der vorliegenden Übersicht wurde versucht, neue Befunde über die Reaktivierung der Nucleinsäuren- und Proteinbiosynthesen in keimenden Sporen zusammenzustellen, wobei mehr Fragen aufgeworfen worden sind als

532

M . HECKER

Antworten gegeben werden konnten. Für ein umfassendes Verständnis der Molekularbiologie und Zelldifferenzierung der Gattung Bacillus sollte man daher auch in Zuk u n f t Problemen der Umwandlung von Sporen in vegetative Zellen verstärkte Aufmerksamkeit widmen und sich auf folgende Probleme konzentrieren: Die zielstrebige Analyse von temperatursensitiven Mutanten, die zu unterschiedlichen Zeiten der Keimung einen Entwicklungsblock aufweisen, verspricht weitere Erkenntnisse über das Genexpressionsprogramm keimender Sporen. Neben dem Studium des Proteinsyntheseprogramms dieser Mutanten mittels hochauflösender zweidimensionaler Verfahren wird man sich auf die Klonierung von ,,outgrowth"-Genen konzentrieren müssen. Mit Hilfe derartiger molekularer Sonden wären der genaue Zeitpunkt der Expression von ,,outgrowth"-Genen zu bestimmen sowie eine Identifizierung ihrer Produkte auf den zweidimensionalen Gelen möglich. Darüber hinaus könnten in zellfreien Transkriptionsssystemen die Gesetzmäßigkeiten der Expression dieser Differenzierungsgene studiert werden, wie es LOSICK und Mitarbeitern (vgl. LOSICK 1981) in eindrucksvoller Weise für Sporulationsgene gelungen ist. Hier sind die SigmaFaktoren der RNA-Polymerase in ganz entscheidendem Maße an der Transkriptionskontrolle der Sporulationsgene beteiligt, so daß man auch in der keimenden Spore der Struktur und Funktion der RNA-Polymerase besondere Aufmerksamkeit widmen sollte. Und schließlich wird es für ein umfassendes Verständnis des Genexpressionsprogramms der keimenden Spore Ziel zukünftiger Untersuchungen sein, durch Identifizierung zahlreicher Proteine der Genkarte von Bacillus subtilis (vgl. H E N N E B U . HOCH 1 9 8 2 ) eine entsprechende Proteinkarte zuzuordnen (vgl. BLOCH et al. 1 9 8 0 für E. coli). Literatur ALBERTINI, A. M. and lesion in ribonucleic ALBERTINI, A. M. and spore outgrowth. J.

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Anschrift:

D r . M. HECKER

Sektion Biologie der Ernst-Moritz-Arndt-Universität DDR-2200 Greifswald, Jahnstr. 15

Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie

23

1983

536

Buchbesprechung G. W I L D F Ü H E und W . W I L D F Ü H R (Herausgeber), Medizinische Mikrobiologie, Immunologie und Epidemiologie, Band IV, 1. und 2. Teil (2. neubearb. Auflage). XXVI + 1142 S., 175 Abb., 195 Tab., 13 färb. Taf. Leipzig 1982. VEB Georg Thieme. M 250,00. Mit den vorliegenden beiden Teilen des 4. Bandes findet dieses Lehr- und Handbuch seinen Abschluß. Hier werden die Laboratoriumsdiagnostik der Infektionskrankheiten und darüber hinaus ausgewählte mikrobiologisch-hygienische Untersuchungsmethoden den Bedürfnissen der Praxis entsprechend abgehandelt. Neben der Laboratoriumsdiagnostik der Infektionserreger finden auch deren wesentliche mikrobiologische Eigenschaften Berücksichtigung, so daß eine gewisse Abrundung erreicht wird. Von den Herausgebern wird die Möglichkeit ins Auge gefaßt, diesen Band auch als Einzelexemplar abzugeben. Das Stoffgebiet, von 37 Fachwissenschaftlern bearbeitet, ist in 12 Abschnitte aufgeteilt, die sehr weitgehend untergliedert sind und nach der Inhaltsübersicht eine rasche Orientierung ermöglichen. Der allgemeine Teil beschreibt Voraussetzungen für die mikrobiologische Diagnostik. Neben Entnahme und Einsendung von Untersuchungsmaterial werden die mikrobiologischen Untersuchungstechniken, die kulturelle Züchtung, biochemische Methoden und der Tierversuch ausführlich dargestellt. Im bakteriologischen Teil werden nach laboratoriumsdiagnostischen Gesichtspunkten die medizinisch bedeutsamen Bakterienarten, einschließlich Legionella pneumophila, abgehandelt. Die Nomenklatur der Bakterien richtet sich nach B E R G E Y ' S Manual of Determinative Bacteriology (1974). In übersichtlichen Schemata sind die Untersuchungsgänge zum Nachweis der jeweiligen Erreger zusammengefaßt. Der virologische Teil handelt die Methoden für die Labordiagnostik von Viruskrankheiten, wie Gewebekulturtechnik, Bruteitechnik, Tierversuch und Serologie, umfassend ab. Die spezielle Pilzdiagnostik unter besonderer Berücksichtigung menschenpathogener Pilze wird im mykologischen Teil beschrieben. Neben den typischen Eigenschaften der einzelnen Pilzgruppen sind die für die Laboratoriumsdiagnostik wichtigsten Differenzierungsmerkmale übersichtlich dargestellt. Der parasitologische Teil beinhaltet den Nachweis von Parasiten- und Helminthenstadien. In einem Anhang wird dieser Teil durch die Laboratoriumsdiagnostik der Toxoplasmose ergänzt. Im immunologisch-serologischen Teil sind alle wichtigen Methoden zum Nachweis und zur Identifizierung von Antigenen und von Antikörpern berücksichtigt. Speziell abgehandelt wird die serologische Diagnostik der Lues und die der rheumatischen Erkrankungen. Der zunehmenden Bedeutung der Immunologie entsprechend werden Nachweismethoden der zellvermittelten Immunität beschrieben. Ein Teil über besondere Arbeitsverfahren beinhaltet Methoden zur Prüfung auf Pyrogene, Resistenzbestimmung, Lysotypie und Bacteriocin-Nachweis. Entsprechend den Aufgabenstellungen der Hygiene-Institute haben in diesem Band auch die Laboratoriumsmethoden zur Prüfung der Desinfektionsmittel, der mikrobiologischen Lebensmittelüberwachung, der hygienisch-mikrobiologischen Wasseruntersuchung, der Bestimmung des Luftkeimgehalts, der Bestimmung von Keimen an Gegenständen und Flächen sowie die Prüfung auf Sterilität Berücksichtigung gefunden. Der Band faßt den derzeitigen Stand und die Möglichkeiten auf dem Gebiet der Laboratoriumsdiagnostik zusammen und gibt in vielen Fällen genaue und gesicherte Arbeitsvorschriften. Allen an der Laboratoriumsdiagnostik Interessierten wird er ein willkommener und zuverlässiger Ratgeber sein. Neben den schon bewährten Büchern auf diesem Gebiet wird auch dieses Werk seinen festen Platz einnehmen. H. P. S C H A U (Erfurt)

Products from Alkanes, Cellulose and other Feedstocks Herausgegeben von A. Fiechter

1981. VIII, 168 Seiten -

57 Abbildungen - gr. 8° - 7 6 , - M

Bestell-Nr. 7629412 (6620)

Der Band enthält fünf Beiträge, die einen Überblick über die mikrobiologische Produktion von Aminosäuren, organischen Säuren, Kohlehydraten etc. auf der Grundlage von Alkanen in Nährböden geben, die mikrobielle Reaktionen als Bestandteil der Totalsynthese von Prostaglandinen und seiner Derivate beschreiben, die praktische Umsetzung der Proteinproduktion mit Methanol als Substrat in Fermenten erläutern sowie die Mechanismen der Cellulase-Wirkung und die Kinetik der Hydrolyse von Cellulose durch Cellulase darlegen.

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Istvàn Andràssy

Klasse Nematoda (Ordnungen Monhysterida, Desmoscolecida, Araeolaimida, Chromadorida, Rhabditida) Herausgegeben von Herbert Franz (Bestimmungsbücher zur Bodenfauna Europas) 1983. Etwa 400 Seiten — 182 Abbildungen — gr. 8° — 35, — M; Ausland 60,— M Bestell-Nr. 7630325 (2114/9)

Es gibt nur wenige Zweige innerhalb der Zoologie, die in den letzten Jahrzehnten einen so großen Aufschwung aufweisen konnten, wie die Nematologie — die Erforschung der frei im Erdboden und Süßwasser und parasitisch an Pflanzen lebenden Fadenwürmer (Nematoden). I n der Literatur fehlte bisher ein zusammenfassendes Bestimmungsbuch, mit dessen Hilfe sämtliche freilebenden Nematodenarten leicht und sicher identifiziert werden können. Diese Lücke füllte nun der Band, der auf dem im Jahre 1976 veröffentlichten Nematodensystem des Verfassers aufgebaut ist. Er enthält 39 Familien, 180 Gattungen und rund 1100 gültige Arten. Die einzelnen Arten sind mit ihren wichtigsten Kennzeichnungsmerkmalen, Maßangaben, Verbreitungsdaten und der vollen Synonymik in die Schlüssel aufgenommen. Vorschläge bezüglich der Systematik der Nematoden sowie Beschreibung vieler neuer Taxa und zahlreiche nomenklatorische Kombinationen sind im Werk zu finden. Der besseren Anschaulichkeit wegen wurden alle Gattungsgruppen mit übersichtlichen Abbildungstafeln versehen. Bitte richten Sie Ihre Bestellungen

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