Systemische Fungizide und antifungale Verbindungen: Vorträge und Poster des internationalen Symposiums, 4–10 Mai, 1980, Schloß Reinhardtsbrunn [Reprint 2021 ed.] 9783112541760, 9783112541753

Citation preview

ABHANDLUNGEN DER AKADEMIE DER WISSENSCHAFTEN DER

DDR

Abteilung M a t h e m a t i k — Naturwissenschaften — Technik J a h r g a n g 1982 • N r . 1 N

V o r t r ä g e u n d Poster des V I . I n t e r n a t i o n a l e n S y m p o s i u m s

SYSTEMISCHE FUNGIZIDE UND ANTIFUNGALE VERBINDUNGEN veranstaltet durch die Gesellschaft f ü r Allgemeine u n d T e c h n i s c h e Mikrobiologie i n der Biologischen Gesellschaft der D D R u n d v o n der Gesellschaft f ü r Medizinische Mykologie der D D R v o m 4.—10. Mai 1980 im Schloß Reinhardsbrunn

Herausgegeben von

H . L y r u n d C. P o l t e r

AKADEMIE-VERLAG

• BERLIN

1983

Herausgegeben im Auftrage des Präsidenten der Akademie der Wissenschaften der DDR von Vizepräsident Prof. Dr. Heinrich Scheel

Erschienen im Akademie-Verlag, DDR-1086 Berlin, Leipziger Straße 3—4 © Akademie-Verlag Berlin 1983 Lizenznummer: 202 • 100/520/83 Gesamtherstellung: VEB Druckerei „Thomas Müntzer", 5820 Bad Langensalza Umschlag: Rolf Kunze Bestellnummer: 763 014 9 (2001/82/1 N) • LSV 4275 Printed in the German Democratic Republic DDR 7 2 , - M

Inhaltsverzeichnis

Vorträge A. K O C H : M y k o t o x i n b i l d e n d e Pilze — E i n e n e u e Zielgruppe f ü r F u n g i z i d e . . . W . E C K E R T : F u n g i c i d e t r e a t m e n t of h a r v e s t e d f r u i t s a n d v e g e t a b l e s : Opportunities and problems M . H R M O V A , L . D R O B N I C A , M . Z E M A N O V A : I n d u c t i o n of mycelial t y p e of d e v e l o p m e n t in Candida albicans b y fungicides a n d n u t r i t i o n a l a l t e r n a t i o n s G Y . J O S E P O V I T S : I n t e r m o l e k u l a r e s T r a n s m i s s i o n s v e r m ö g e n der E r r e g u n g s e n e r g i e bei Fungiziden und Konsequenzen D . J . A D A M S , G . W . G O O D A Y : Chitin synthesis as a t a r g e t — c u r r e n t progress . . . S T . N E U M A N N , F . J A C O B : N e u e Ergebnisse zur C a r b o x y l h y p o t h e s e des P h l o e m t r a n s p o r t s von X e n o b i o t i k a H.

7

J.

M . N . KOLOSOW,

W. W.

ONOPRIENKO,

H.

M. G. KARAPETJAN, F .

27 31 39

47

A.

Chimitscheskoje isutschenie a n t i b i o t i k a i m b r i z i n a . . Z u m W i r k u n g s m e c h a n i s m u s des s y s t e m i s c h e n F u n g i z i d s Chloroneb u n d d e n möglichen U r s a c h e n e r w o r b e n e r R e s i s t e n z bei Mucor mucedo (L.)

55

FRES

61

MAMEDOW, A. L . NIKONOW: P.

L . N . GLADKOWA,

11

WERNER,

H.

LYR:

P a t h o l o g i s c h e Z e l l w a n d s y n t h e s e bei Mucor mucedo ( L . ) F r e s . u n t e r E i n w i r k u n g einiger F u n g i z i d e u n d a n d e r e r V e r b i n d u n g e n 69 P . L E R O U X , R . F R I T Z , M . G R E D T : Cross-resistance b e t w e e n 3,5-dichlorophenyl cyclic imide fungicides (Dichlo/.olin, Iprodione, P r o c y m i d o n e , Vinchlo/.olin) a n d v a r i o u s aromatic compounds 79 M . K O V A C S , M . T Ü S K E : T h e possibility of d e v e l o p m e n t of resistance t o t r i a d i m e f o n in obligate p h y t o p a r a s i t i c f u n g i 89 C. J . D E L P , J . M . S E R R E S , B . A . H A D L E Y : Calculations of b u i l d u p of r e s i s t a n t f u n g i against b e n o m y l in c o m b i n a t i o n s with o t h e r fungicides 97 L . F E R E N C Z Y , A . F R A N K O , N . H A M A R G., R . H E G E D I T S E . , T . P F L I E G E L : I n t e r a c t i o n s b e t w e e n benzimidazole fungicides a n d o t h e r t y p e s of s y s t e m i c fungicides . . . . 1 0 7 M. G A S Z T O N Y I : T h e possible role of d i f f e r e n t e n z y m e s in t h e a c t i v a t i o n of t r i a d i m e f o n 113 F . J . S C H W I N N , T . S T A U B : Biological p r o p e r t i e s of m e t a l a x y l 123 L. C. D A V I D S E , H . G. K R U S E : R e s i s t a n c e to a c y l a l a n i n e f u n g i c i d e s in Phytophthora megasperma f. sp. medicaginis a n d P. megasperma f. sp. glycinea 135 S. G. G E O R G O P O U L O S , P . M Y T I L I N E O U , B . G. Z I O G A S : Genetic a c t i v i t y of m e t a l a x y l p r e p a r a t i o n in diploid Aspergillus nidulans 143 H . B U C H E N A U E R : Z u m W i r k u n g s m e c h a n i s m u s S t e r o l s v n t h e s e - b l o c k i e r e n d e r F u n g i z i d e 151 H . - J . P R E U S S E R : Z u m W i r k u n g s m e c h a n i s m u s von I m i d a z o l f u n g i z i d e n 161 H . D . S I S L E R , C . P . W O L O S H U K , P . M . W O L K O W : S t u d i e s o n t h e m o d e of action of tricyclazole a n d related c o m p o u n d s 171 W . F . P O L E T A J E V A , S. E . B E C K E R : Bilanz der D e h y d r o g e n a s e n u n d O x i d a s e n in Beziehung zur Anfälligkeit von zwei B a u m w o l l a r t e n g e g e n ü b e r verschiedenen Welkeerregern 177 A. T O M S I K O V Ä , J . S T E R B A , D . N O V Ä C K O V A : T h e r a p e u t i s c h e Möglichkeiten bei d e r Adiaspiromykose 185 l

LYR, G . CASPERSON:

Inhaltsverzeichnis

4

W . WOHLRAB, K . - D . WOZNIAK, K . SCHWABE, B . TSCHIERSCH, R . - P . ZAUMSEIL, K .

M.

Wirksamkeit und therapeutische E f f e k t i v i t ä t von 5-Bromsalizyl-4'-chloranilid und D e r i v a t e n P . L A N G C A K E , D . W . C A R T W R I G H T , J . P . R I D E : The dichloroeyclopropanes and other fungicides with indirect mode of action H . J U N G E , H . B O C H O W , M . J A C O B : Wirkungen von K o m b i n a t i o n e n systemisch aktiver Substanzen auf die Pathogenese von P f l a n z e n e r k r a n k u n g e n R . K Ä L B E R E R , F . M Ü L L E R , F . G R O S S M A N N : Anreicherung systemischer Fungizide an Infektionsstellen obligater u n d nichtobligater P a r a s i t e n G . I . B O R O D I N , S . M . C H O D S H I B A J E W A , W . I . R U N O W : Biochimija wsaimootnoschenij patogen-toksin-rastenije-fitoaleksin pri wertizillesnom wilte chloptschatnika . . . M . N . T A L I J E W A , W . W . M A S I N , L . W . R U N K O W A : Ob utschastii fitogormonow w sastschitnich reakzijach rastenija k fitogennim gribam TAUBE:

193 199 211 219 229 239

Poster, Gruppe A Antimicrobial activity of dithiocarbamates and other sulfur containing compounds H . B O C H O W , M . S. H . M O U S T A F A : Untersuchungen zur Fungizidtoleranz von Botrytis cinerea P E R S F . B Ö T T C H E R , I . A . S A M S O N O V A : Zur fungiziden u n d genetischen W i r k u n g von Benomvl G . C A S P E R S O N , H . L Y R : Elektronenmikroskopische Untersuchungen zum Wirkungsmechanismus von Pentachlornitrobenzol (PCNB) bei Mucor mucedo (L.) FRES. u n d Phytophthora cactorum ( L E B et C O H N ) S C H R O E T L . F E R E N C Z Y , A . F R A N K O , E . H E G E D Ü S , A . G A J A R Y , T . P F L I E G E L : Structure-activity studies on salicylanilides J . G O R S K A - P O C Z O P K O , S . W I T E K : Fungicial properties of some new q u a t e r n a r y ammonium salts J . GÖTZ: Resistenz von k a r t o f f e l p a t h o g e n e n F u s a r i u m s p p . gegenüber Benzimidazolen J . AUGUSTIN, L . DROBNICA, P . KRISTIÄN:

J . KOLODYNSKI,

S.

ULASZEWSKI,

R.

WITKOWSKA,

S.

WITEK,

T.

M.

243 247

255

259

264 271 277

LACHOWICZ:

Antifungal activity of some enolophosphate insecticides M . E. L A D Y G I N A : Antiviral activity of histones P . L E R O U X , M . G R E D T : Negatively correlated cross resistance between benzimidazole fungicides a n d N-phenyl c a r b a m a t e herbicides H . L Y R , L . B A N A S I A K , H . A U R I C H : W i r k u n g u n d Wirkungsweise flüchtiger Alkenale als Fungizide R. M A X I M O W A , N . P A L M O W A , T. S C H A R K O W A , B. C H U R A T O W A , M. L E J K I N A : Wirksamkeit von Trichothezin gegen Myzelien von F u n g i imperfecti u n d Gewebekulturen . . R . M Ü L L E R , U. B U R T H : Benzimidazol-Tcnsid-Formulierungen m i t Wirksamkeit bei Benomylresistenz J u . M. P L O T N I K O W A , G . W . S E R E S H K I N A : Osobennosti u l t r a s t r u k t u r i sowmestimoi i nesowmestmoi kombinazii griba Puccina graminis tritici i pschenizi H . - P . S C H N A U D E R , D. G R Ö G E R : Zur H e m m u n g der Chitin-Synthetase von Glaviceps purpurea durch ausgewählte E f f e k t o r e n W . S C H N A A K : Neuere Erkenntnisse zum A b b a u u n d Metabolismus von Benzimidazolcarbamidsäuremethylester in Pflanzen T H . S T R U M P F , D. Z A N K E , E. K L U G E : Fungizide ß - N a p h t h o x y - a l k y l h y d r o x a m s ä u r e n . .

331 337

Poster, Gruppe B L. N. A N D R E J E W : Rol witaminow w ustoitschiwosti rastenij k rshawtschinje . . . .

341

S. E . B E K K E R , I . O. SELJACH, E . S. LOBAKOWA, O . W . KAMSOLKINA, I . S. S. E . MANSUROWA:

287 291

297 303 309 315 321 327

KULAJEW,

Bioritmi w ontogenese wosbuditelja wilta i deistwije sistemnich

antibiotikow

345 W. N E U H A U S : B e s t i m m u n g der phytotoxischen Wirkung von Calixin auf K u l t u r p f l a n z e n 355 G . B I S C H O F F : Tridemorph-Resistenz bei Botrytis cinerea 361

H . BERGMANN, R . MÜLLER,

Inhaltsverzeichnis L.

FERENCZY,

E.

HEGEDÜS,

ZS. JASZAY,

M.

SZEGEDI,

F.

KEVEI,

T.

PFLIEGEL,

A.

F

I-(xanthene-9-carboxvl)-4-phenyl-semicarbazide ( M K F 1 9 9 ) , a new antiPhytophthora compound E . K A R T A S H O V A , S . G O R J A C H E V : E f f e c t of zinc upon viability and virulence of the fungus Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum E . K L U G E , H . L Y E : Vergleichende Untersuchungen über die W i r k s a m k e i t von Systemfungiziden gegen Erysiphe graminis DC M. L E N G I E S , G. S C H E L L E N B E R G , H . L Y R , D . Z A N K E : W i r k s a m k e i t des Wachstumsregulators P y d a n o n gegen Mehltauarten H . L Y R , M. S U N K E L : Zur Wirkungsweise von M e t a n a x i n Z. M A C I E J O W S K A - P O K A C K A : T h e influence of systemic fungicides on the development of Rhizoctonia on wheat H . M. M Ü L L E R , H . L Y R : Morphologische und zytologische Veränderungen bei Phytophthora infestans ( M O N T . ) D E B Y . und Phytophthora cactorum ( L E B . et C O H N ) S C H R O E T . unter dem Einfluß von M e t a l a x y l L . O R L I K O W S K I : Population dynamics of Phytophthora cryptogea in soil drenched with systemic fungicides and incidence of foot rot of gerbera G. O R O S , S. S Ü L E : Antibacterial activity of Calixin on phytopathogenic b a c t e r i a . . . C. P O L T E R , Aufnahme und Metabolismus von trans-2,6-Dimethyl-N-dodecylmorpholin bei unterschiedlich empfindlichen Pilzen R . T R Ö G E R , D . B L E C H S C H M I D T , G. M Ü L L E R : Verwendung von T M T D bei der Konservierung wertvoller Papiererzeugnisse M . A . D E W A A R D , A . F U C H S : Resistance to ergosterol biosynthesis inhibiting fungicides G. W Ü R B A C H , H . S C H U B E R T , E . P R A T E R : Allergische R e a k t i o n e n der H a u t auf senfölabspaltende Verbindungen E . V . Y U R I N A : F e a t u r e s of peroxidase isoenzyme content of rust uredospores . . . Autoren FRANKO:

'.i05 373 379 385 389 393 403 411 417 421 427 429 437 441

447

H . A . KOCH

Medizinische

Akademie

Erfurt,

DDE

Mykotoxinbildende Pilze — Eine neue Zielgruppe für Fungizide

Mykotoxine sind sekundäre Metabolite von Schimmelpilzen, vor allem Vertreter der G a t t u n g e n Aspergillus, Fusarium und Pénicillium. Bisher sind 104 Mykotoxine u n d ca. 200 toxinogene Schimmelpilze b e k a n n t . Mykotoxine wirken nach peroraler Aufn a h m e f ü r Mensch und Tier in höheren Dosen (ppm-Bereich) a k u t toxisch u n d k ö n n e n kurzfristig zum Tode f ü h r e n , in niedrigen Dosen (ppb-Bereich) wirken sie kanzerogen, m u t a g e n und/oder teratogen. Nahrungs- u n d F u t t e r m i t t e l werden o f t von Schimmelpilzen befallen, wenn dabei Mykotoxine gebildet werden, k o m m t es nach A u f n a h m e zu Mykotoxikosen. Beim Menschen sind als Folge des Verzehrs mykotoxinhaltiger N a h r u n g s m i t t e l schwere E r k r a n k u n g e n u n d Todesfälle beschrieben, wie z.B. die Alimentary Toxic Aleukia oder Aflatoxikosen (Tab. 1). I n E u r o p a sind derartige Fälle Tabelle 1 Wichtige Mykotoxine,

Produzenten

und

Wirkungen

Mykotoxin

Produzenten

wichtige Substrate

Biol. W i r k u n g e n

Aflatoxine (12 D e r i v a t e )

Asp. Asp.

Getreide*) Futtermittel, Obst

Zearalenon ( F 2-Toxin) (15 D e r i v a t e ) Triehothecene ('.57 D e r i v a t e )

Fus. graminearum Gib. zeae u. a. Fusarium&vten, Myrotheciumarten

Getreide*) Futtermittel, Stroh, Pellets Getreide*) Heu

Ochratoxin A

Asp. ochraceus, P. viridicactum, P. cyclopium

Getreide*) Futtermittel

Hepatotoxin, karzinogen, mutagen, teratogen Oestrogenisinus, Abort, Infertilität, teratogen Alimentary Toxic Aleukia, Knochenmarkzerstörungen, Dünndarm- und Hodendestruktion Nephrotoxin (Balkan-Nephropathie)

Ci trinili

P. viridicactum, P. citrinum u. a. P. expansum u. a.

Getreide*) Futtermittel, Obst Obst

Patulin

flavus parasiticus

*) einschließlich Mais u n d Reis

Nephrotoxin. Chromosomenschäden zytotoxisch ( k a r z i n o g e n '!) Lebernekrosen, L u n g e n - u. Z N S - Ö d e m e

8

H . A . KOCH

selten, in einigen tropischen Gebieten müssen wir mit erheblichen Dunkelziffern rechnen. Beim Tier — Nutz- und Haustiere — nehmen Mykotoxikosen besorgniserregend zu. Diese medizinisch und volkswirtschaftlich nicht vertretbare Zunahme ist Anlaß, den Mykotoxikosen zunehmende Aufmerksamkeit zu widmen. Schimmelpilze bilden Mykotoxine nicht nur art- und stammspezifisch, sondern auch in Abhängigkeit vom Substrat und den umgebenden biophysikalischen Bedingungen. Die Anwesenheit eines toxinogenen Schimmelpilzes sagt deshalb nichts über eine mögliche Mykotoxinkontamination aus. Mykotoxikosen können exakt nur durch chemischphysikalische oder biologische Mykotoxinnachweise diagnostiziert werden. Der Befall einer F r u c h t durch Schimmelpilze k a n n bereits auf dem Feld eintreten, dies ist witterungsabhängig oft beim Mais der Fall, wobei im Anschluß an einen Befall mit Fusarien die Toxinbildung z. T. erst später (z.B. ausgelöst durch einen Kälteschock) eintreten kann. F u t t e r m a i s erweist sich oft mit Zearalenon oder Trichothecenen kontaminiert ; auf dieser Basis ist es bereits zu schwerwiegenden Zwischenfällen in Tierbeständen gekommen. Auch beim Obst (z.B. Apfel) t r i t t der Befall mit Schimmelpilzen (u. a. Penicillium expansurn) oft schon vor der E r n t e ein. Bei unsachgemäßer Lagerung bis zur Verarbeitung k o m m t es zur Ausbreitung der Schimmelpilze im Stapel und die Praxis zeigt, daß z.B. zahlreiche Apfelsaftchargen das Mykotoxin Patulin enthalten. I n der Mehrzahl der Fälle t r i t t die Verschimmelung von Erntegut erst während der Lagerung oder Zwischenlagerung ein. Dabei begünstigen Feuchtigkeit und höhere Temperaturen die mikrobielle Kontamination. Bei einer relativen Feuchte unter 13% unterbleibt im Getreide das Wachstum von Schimmelpilzen, in ölhaltigen Früchten muß diese Grenze noch niedriger gehalten werden (z.B. Leinsamen 9 % , Soj abohnen 12%). Diese Bedingungen sind bei den oft notwendigen Zwischenlagerungen nicht einzuhalten. Da bei höherem Feuchtegehalt das Lagergut oft umgesetzt wird, um Temperaturanstiege zu unterbinden, kommt es regelmäßig zur Verbreitung von Schimmelpilzen im ganzen Stapel. Diese Erscheinung wird dadurch begünstigt, daß in der Regel feuchte Chargen und weniger feuchte H e r k ü n f t e nicht getrennt gelagert werden. Auch Stroh wird oft zu feucht gelagert und/oder vor der Verarbeitung werden die regelmäßig feuchten und pilzbefallenen Deckschichten der Mieten nicht entfernt. Die aus solchen Chargen hergestellten Futterpellets sind oft erheblich mit toxinogenen Pilzen kontaminiert. Lagerndes Getreide k a n n durch antimikrobielle Behandlung (z.B. Propionsäure oder Harnstoff) vor Verschimmelung relativ gut geschützt werden. Entsprechende Verfahren scheinen erfolgversprechend zu sein, sie sind jedoch noch nicht zur Praxisreife entwickelt. Die beim Tier nach Mykotoxinaufnahme entstehenden akuten Schäden variieren nach dem spezifischen Angriffsort der einzelnen Mykotoxine — im allgemeinen handelt es sich u m die Symptome einer akuten oder chronischen Toxikose. Diese Symptome können von einer F u t t e r Verweigerung, Verschlechterung der Futterverwertung bis zu drastischen Leistungsverminderungen und Massensterben reichen. Zu welchen Dauerfolgen bei Tieren subtoxische Mykotoxindosen führen, ist bisher k a u m untersucht. E s muß befürchtet werden, daß diese chronischen Schäden f ü r die Leistungszucht viel größere Bedeutung haben als wir gegenwärtig übersehen. I n welchem Ausmaß ein „carry over", d. h. eine Übertragung in tierische Nahrungsmittel erfolgt, ist nur teilweise bekannt, nach Aufnahme größerer Dosen muß damit gerechnet werden. Aflatoxine z. B. gehen in die Kuhmilch und in Hühnereier über. Bei Mastbullen M'aren

M y k o t o x i n b i l d e n d e Pilze — eine Zielgruppe f ü r F u n g i z i d e

9

Mykotoxinnachweise noch bis zu 12 Wochen n a c h dem Absetzen des k o n t a m i n i e r t e n F u t t e r s nachweisbar, u n d zwar sowohl im Muskelfleisch als auch in der Leber u n d Niere. Mykotoxikosen sind in der Mehrzahl der Fälle therapeutisch nicht beeinflußbar, auch solche Schäden, die durch geringe Dosen angerichtet werden, sind wahrscheinlich irreversibel. Über R e p a r a t u r m e c h a n i s m e n an mykotoxingeschädigter D N A u n d R N A ist bisher k a u m etwas b e k a n n t . Mykotoxindetoxifikationen sind im L a b o r m a ß s t a b möglich, in F u t t e r - u n d Nahrungsgütern u n t e r Praxisbedingungen aber nicht realisierbar. I n A n b e t r a c h t dieser U m s t a n d « müssen sich alle B e m ü h u n g e n auf die P r ä v e n t i o n konzentrieren. Weder in E u r o p a noch in f e u c h t w a r m e n Gebieten stehen entsprechende technische Voraussetzungen u n d Energievorräte zur Trocknung u n d trockenen Lagerung von E r n t e g ü t e r n , insbesondere K ö r n e r f r ü c h t e n , F u t t e r m i t t e l n u n d N a h r u n g s g ü t e r n zur Verfügung. Der E i n s a t z von geeigneten antifungiellen oder antimikrobiellen Substanzen zur U n t e r d r ü c k u n g des W a c h s t u m s von Schimmelpilzen k ö n n t e zur Lösung der Mykotoxinprobleme beitragen. Dabei wäre bei verschiedenen F r ü c h t e n , wie z.B. Mais, aber a u c h Citrusfrücht e n eine Behandlung auf d e m Felde d e n k b a r . F ü r Getreide wäre eine B e h a n d l u n g während der E r n t e oder u n m i t t e l b a r d a n a c h überlegenswert, u m das W a c h s t u m von Schimmelpilzen schon im Zwischenlager zu u n t e r b i n d e n . Auch der E i n s a t z von antifungiellen Prinzipien während der Lagerung, wie z.B. H a r n s t o f f , k ö n n t e a u ß e r o r d e n t lich nützlich sein. Die Entwicklung und/oder Vervollkommnung entsprechender Verfahren sollte von Phytopathologen, Veterinärmedizinern u n d H u m a n m e d i z i n e r n gemeinsam vorangetrieben werden, u m von A n f a n g a n alle medizinischen u n d volkswirtschaftlichen Gesichtspunkte zu berücksichtigen. D a die dargestellten P r o b l e m e f ü r alle Länder von großer B e d e u t u n g sind, ist es dringend notwendig, sich der Mykotoxikosen-Prävention mit großer K r a f t anzunehmen. Manche L ä n d e r exportieren F u t t e r m i t t e l zu günstigen Bedingungen, in vielen Fällen handelt es sich dabei u m Chargen, die mit Mykotoxinen mehr oder weniger stark k o n t a m i n i e r t sind. E s erscheint dringend geboten, E x p o r t e u r e u n d I m p o r t e u r e zu Qualitätskontrollen, die Mykotoxinnachweise einschließen, zu verpflichten u n d entsprechende Regelungen festzulegen, weil ohne diese Maßnahmen eine wirksame P r ä v e n t i o n k a u m möglich sein wird.

Diskussion

BUKTH: I m Vortrag wurden Getreide, Obst u n d deren V e r a r b e i t u n g s p r o d u k t e als besonders durch mykotoxinproduzierende Pilze gefährdet herausgestellt. Bei Speisekartoffeln ist in den letzten J a h r e n infolge der Z u n a h m e der „ U n t e r V a k u u m Lager u n g " und der B e l ü f t u n g gegen bakterielle N a ß f ä u l e n ein deutlich erhöhtes A u f t r e t e n von .Fwsanwra-Trockenfäulen zu beobachten. I s t dieses P r o b l e m schon im Hinblick auf Mykotoxinbildung untersucht worden ? KOCH: K o n k r e t e Angaben aus Mitteleuropa sind mir bisher nicht b e k a n n t . MÜLLER: Welche Möglichkeiten sehen Sie zur I n a k t i v i e r u n g von Mykotoxinen, z.B. durch Komplexbindung mit dem Zweck einer I n t o x i k a t i o n ? KOCII: F ü r die Praxis keine. MÜLLER: Gibt es beim Wirt (z.B. Apfel, aber auch anderen K u l t u r a r t e n ) ein sortenspezifisches Verhalten zur Mykotoxinbildung ?

10

H. A.

KOCH

KOCH: Mykotoxinbildung ist substratspezifisch und stammspezifisch. Unterschiede bei Apfelsorten hinsichtlich P . expawswn-Befall bestehen, sind aber wohl nicht von unterschiedlichen Inhaltsstoffen der Sorten, sondern von technologischen Bedingungen abhängig. MÜLLER: Sie behandelten das Problem des „carry over". Vom Standpunkt des Nutzers ist ein „carry over" für die Tierproduktion durch Verschneiden uninteressant zu machen, d. h. die toxische Schwelle so stark zu unterschreiten, daß der Mvkotoxingehalt unbedenklich ist. KOCH: Dies ist technisch möglich und mitunter die einzige Möglichkeit Schäden in Grenzen zu halten, bedeutet aber, daß subtoxische Dosen und damit Folgeschäden unübersehbar mit gestreut werden. MÜLLER: Sind Unterschiede in der Mykotoxinproduktion der Mikroorganismenart, auch das denkbare Fehlen der Mykotoxinbildung erkennbar ? KOCH: Dies kann beim gegenwärtigen Kenntnisstand über die Bildung stabiler Metabolite nicht entschieden werden. ECKERT: Although the presence of patulin in juice of apple infected with Penirilliurn expansxim may be a potential health hazzard, this problem does not appear to be a significant problem in apples that are consumed in their natural condition. Patulin does not diffuse from the disease lesion into the adjäcent sound flesh of the apple. Therefore removal of the diseased lesion also remove virtually all of the patulin. KOCH: Die Probleme treten bei der Produktion von Obstsäften und Konzentraten auf. Dazu werden die Apfel lange gelagert und unsortiert und nicht ausgeschnitten verarbeitet. BOCHOW: Welche Erfahrungen liegen bezüglich der Translokation von Mykotoxinen in den pilzbefallenen Substraten vor ? K ö n n t e man an Beeinflussungen der Translokation durch Antitranslokantien im Rahmen von Bekämpfungsmaßnahmen denken ''. KOCH: Die Diffusion in den Medien ist sehr unterschiedlich, z . B . Patulin ist nur in der befallenen Stelle vorhanden, Aflatoxine diffundieren weit in das Medium. F ü r die Praxis der Probenahme ist dies sehr wichtig, für die Bekämpfung nicht. BECKER: Wie ist ihre Meinung zur Bedeutung solcher Pilzprodukte, die wie Griseofulvin den Entwicklungsverlauf von Pathogenen hemmen und dabei die Bildung von Mykotoxinen und Antibiotika beeinflussen ? Mit einer Kollegin aus AlmaAta konnte ich zeigen, daß die Aflatoxinbildung vom Entwicklungsverlauf abhängig ist. Können Substanzen wie Griseofulvin als Schutzmittel gegen eine Mykotoxinproduktion dienen ? KOCH: Die Frage berührt ein hochinteressantes Problem, aber für eine Beantwortung ist unser gegenwärtiges Wissen zu gering. Weiterführende Literatur [1]

WYLLIE,

I. D. and L. G.

MOREHOUSE,

Mycotoxic Fungi, Mycotoxins, Mycotoxicoscs ALI K n c y c l o p e d i c H a n d b o o k V o l . 1 M y c o t o x i c F u n g i a n d C h e m i s t r y of M y c o t o x i n s Vol. 2 Mycotoxicoses of D o m e s t i c and L a b o r a t o r y Animals, P o u l t r y , and A q u a t i c Invertebrates and Vertebrates V o l . 3 M y c o t o x i c o s e s of M a n a n d P l a n t s , M v c o t o x i n C o n t r o l a n d R e g u l a t o r y P r a c t i c e s [ 2 ] MARCEL DEKKER, I n c . ; N e w Y o r k a n d B a s e l , 1 9 7 8

JOSEPH W . ECKERT

University

of California,

Riverside,

USA

Fungicide Treatment of Harvested Fruits and Vegetables: Opportunities and Problems

Introduction Harvested fruits and vegetables are susceptible to attack by specific fungi and bacteria generally are distinct from the pathogens of the growing crop. F o r example, Penicillium digitatum is the most serious cause of postharvest losses in citrus fruits, but this fungus does not attack any other fruit, vegetables or growing plant. Postharvest diseases result in a substantial reduction in agricultural productivity. Fruits and vegetables are often produced on farms distant from population centers and may ripen at a time of the year when demand is weak or the market is glutted with the product. These circumstances often result in a delay of several weeks or months for storage and shipment before the product reaches the consumer. Significant deterioration may occur during this period if the product is not treated with an effective antimicrobial agent and stored in an environment unfavorable to disease development. Diseases of fruits and vegetables observed in the market place can be traced chronologically t o : 1) infection or infestation of the product during the period of its development in the field or 2) infection through wounds created during the harvesting operation and through physiological injuries that result from an unfavorable storage environment [13, 14, 16]. The subsequent progress of an infection depends upon the growth requirements and the enzymatic capabilities of the pathogen and upon the physiological resistance of the plant tissue to invasion. Thus, infections of several species of fungi, especially those initiated early in the growing season, enter a latent or quiescent state soon after penetration because of the resistance of the host tissues to further invasion. After harvest, the fruit gradually loses this resistance as it ripens and the pathogen resumes growth, giving rise to an active decay lesion on the host. Diplodia Phomojysis, and Alternaria establish latent infections in the stem-end of citrus fruits because this organ is vulnerable to attack when the fruit are very small. Gloesporium rots (Pezicula spp.) of apples arise from quiescent infections that are initiated in the lenticels of the fruit months before the rots are observed in storage. Anthracnose (Colletotrichum) diseases of bananas, papayas and mangoes arise from latent infections initiated randomly over the entire surface of these fruits during their development in the plantation. Gray mold (Bortytis) on grapes and brown rot (Phytophthora) of citrus fruits originate as infections that are initiated in the field shortly before harvest. These infections may not be truly quiescent, but they develop at a slow rate in mature fruit, depending upon the disease resistance of the host tissue and the ambient tem-

12

J. W. Eckjskt

perature. The control of a postharvest disease that arises from a latent or quiescent infection depends upon the penetration of an effective dosage of the fungicide to the infection site before the host is extensively colonized by the pathogen. The second major class of postharvest diseases, from an etiological standpoint, originate by infection through injury sites that arise incidental to harvesting and preparing the product for market. These infection sites may be localized, e.g., the severed stem of a pineapple, avocado, or pear, or they may be randomly distributed over the entire surface as abrasions or cuts due to rough handling of the crop.

Methods of Postharvest Disease Control Postharvest diseases may be controlled by maintaining the resistance of the host and by inhibiting the development of the pathogen by application of an antimicrobial agent. Practical methods for delaying the senescence of harvested fruits and vegetables, which is correlated with disease susceptibility, are: i) store at the lowest temperature that can be tolerated by the product; ii) reduce the concentration of oxygen in the storage atmosphere to reduce respiration of the product ; iii) apply 2,4-D or gibberellic acid to retard senescence. Preservation of fresh fruits and vegetables by storage in an optimum environment is invariably combined with the use of antimicrobial agents in a program to minimize losses due to postharvest diseases. This approach minimizes the expense and complications associated with the use of excessive quantities of chemical preservatives on foods. Properties and applications of postharvest fungicides Fungicides and other chemical agents used for practical control of postharvest diseases of fresh fruits and vegetables are shown in Table 1 and Figure 1. These treatments perform one or more of the following functions: i) prevent the development of latent I

I

M

m

OH

0

M H

NOj

F i g . 1. F u n g i c i d e s in p r a c t i c a l use against p o s t h a r v e s t diseases. I — b i p h e n y l , I I — op h e n y l p h e n o l , I I I — t h i a b e n d a z o l e , I V — ben o n i y l , V — sec-butylamine, V I — dichloran

13

F u n g i c i d e t r e a t m e n t of fruits and vegetables Tabelle 1 Practical treatment

for control postharvest

disease

of fruits

and

vegetables

Crop

Treatment

Apple and pear

sodium o-phenylphenate thiabendazole benomyl thiabendazole benomyl thiophanate m e t h y l imazalil sodium o-phenylphenate thiabendazole benomyl sec-butylamine biphenyl 2,4-dichlorophenoxyacetic acid imazalil sulfur dioxide fumigation thiabendazole benomyl sodium d i m e t h y l d i t h i o c a r b a m a t e dichloran benomyl sodium o-phenylphenate benomyl thiabendazole benomyl sec-butylamine dichloran sodium o-phenylphenate dichloran

B a n a n a fruits

Citrus fruits

Grape Mango and p a p a y a Melons P e a c h , nectarine, cherry Pineapple Potato

Sweet p o t a t o Tomato

infections; ii) prevent the development of pathogenic fungi in harvest-related injuries; iii) protect the surface of the product against infection through injuries caused by handling the product after application of the fungicide; iv) inhibit the sporulation and spread of the pathogen from diseased fruit. The selection of a fungicide for a specific application depends upon: i) the sensitivity of the pathogenic fungus to the chemical agent; ii) the ability of the chemical agent to penetrate to the infection site in the host tissue; iii) the tolerance of the agricultural product to the chemical agent, both from the standpoint of phytotoxicity and the effect of the treatment upon the sensory properties of the product. Few postharvest treatments have been developed that are effective against Phycomycetes, Alternaria, Geotrichum or bacteria; thus, diseases incited by these microorganisms are difficult to control today. Many compounds that exhibit in vitro activity against these pathogens do not prevent their development in the host, apparently because these fungicides are unable to penetrate to the sites of infection. Postharvest fungicides of the first generation, e.g., sodium o-phenylphenate, dichloran and sec-butylamine are effective in preventing decay by wound-invading pathogens, e.g., Penicillium and Rhizopus, but have little effect upon the development of deep-seated infections. Fungicides developed since 1965 have shown excellent protective, eradicant and antisporulation action.

14

J. W.

ECKERT

Fungicides may be applied to harvested products either as gases or in water or wax formulations, depending upon the physical and chemical properties of the fungicide and the convenience of each method of application. Fumigation is advantageous for treatment of commodities such as strawberries and other highly perishable commodities that are not normally washed after harvest and may be adversely affected by contact with water. Today, most fungicide treatments are applied in water-base formulations that are sprayed or flooded onto the product as it is mechanically conveyed through the packing house. Formulations of fungicides in water-base waxes and in hydrocarbon-solvent-base waxes are in popular use also. Fungicides applied in water-base formulations to prevent infection at superficial injuries may be classified into two categories according to their distribution on the surface of the treated product : i) non-ionic water insoluble compounds (e.g., benomyl) which are applied in a manner that produces a uniform coverage of the agent over the entire surface of the product; ii) water soluble salts such as sodium o-phenylphenate, sec-butylammonium phosphate, and sodium carbonate which are applied in relatively concentrated solution (0.5— 3 % ) in water [13, 15]. The injuries on the fruit surface absorb the aqueous solution, whereas the intact cuticle is impermeable to the ionic compound. The treated product is rinsed lightly with fresh water following fungicide treatment and most of the chemical is removed from the surface of the fruit, except for a significant residue which remains active in the injury sites [13, 17, 21]. I n the sodium o-phenylphenate treatment, the water insoluble o-phenylphenol is precipitated in the acidic environment of the injured tissues which have a pH considerably below the p K a (10.01) of o-phenylphenol. An advantage of uniform, non-selective fungicide coverage of the fruit is that the entire surface of the product is protected to some degree from injuries incurred after the treatment is applied. Fungicides that may be phytotoxic must be applied selectivily to potential infection sites and the excess compound must be removed by rinsing the fruit with water to prevent injury to the surface cells of the fruit. Other fungicides, such as sec-butylamine and thiabendazole are not phytotoxic and substantial deposites may be left on the fruit without injury. Rinsing with water after treatment significantly reduces the fungicide residue on the product, and also reduces the antimicrobial effectiveness of the treatment as well. o-Phenylphenol (Fig. 1, I I ) is a broad-spectrum antimicrobial agent that is toxic to bacteria, fungi and plant cells. However, the o-pehnylphenate anion does not readily penetrate the hydrophobic surface barriers of many fruits and therefore, may be safely applied to them for control of postharvest diseases [21]. Solutions of sodium o-phenylphenate have been used extensively for control of postharvest diseases of citrus fruits, apples, pears, peaches, sweet potatoes and other perishable fruits and vegetables [13, 14, 15, 16]. The benefits of treating fruits and vegetables with sodium o-phenylphenate are two-fold: i) fungus spores and bacteria on the surface of the fruit or in the cleaning solution are killed; ii) a residue of o-phenylphenol is deposited in superficial injuries on the product, preventing infection at these sites during storage and marketing of the crop. K R O C H T A et al. [30] demonstrated that a foam prepared from a solution of 0 . 5 % sodium o-phenylphenate and 0 . 3 % sodium laurylsulfate was highly effective as a cushion for mechanically harvested tomatoes as they dropped into a bin and also prevented decay of fruit caused by Geotrichum and Jthizopus. These pathogens are not senitive to benzimidazole fungicides.

F u n g i c i d e t r e a t m e n t of f r u i t s a n d v e g e t a b l e s

15

Biphenyl has been added to the packaging material for citrus f r u i t s for t h e past 40 years to provide vapor-phase inhibition of sporulation of Pénicillium digitatum a n d P. italicum during long distance shipment a n d marketing of t h e crop (Fig. 4). Despite these m a n y years of successful use, biphenyl has t h r e e recognized problems t h a t limit its value as a postharvest t r e a t m e n t [13, 15]: i) t r e a t e d f r u i t m a y have a t e m p o r a r y "chemical" odor; ii) residues of biphenyl on t r e a t e d f r u i t m a y exceed t h e 70 mg/kg tolerance in E u r o p e a n d J a p a n , especially if the packages of f r u i t are not a d e q u a t e l y cooled during shipment ; iii) the biophenyl t r e a t m e n t is o f t e n ineffective when used on fruit t h a t were previously t r e a t e d with sodium o-phenylphenate. A low residue of o-phenylphenol on the f r u i t can suppress t h e g r o w t h o-phenylphenol/biphenylsensitive strains of Pénicillium spp., permitting t h e proliferation of o-phenylphenol/ biphenyl-resistant strains t h a t exist at a low level in the n a t u r a l population of Pénicillium [27]. sec-Butylamine (Fig. 1, V) m a y be applied to harvested crops either as a fumigation t r e a t m e n t or as a solution of a salt of stc-butylamine [17, 18]. The f u m i g a t i o n treatment controls Pénicillium on citrus fruits because: i) the injuries on t h e f r u i t surface become alkaline a f t e r absorption of the amine vapor a n d ii) fungistatic residues of neutral sec-butylamine salts persist in the injuries a f t e r the fumigation t r e a t m e n t is t e r m i n a t e d [18]. The sec-butylammonium cation is uniquely fungistatic t o several species of fungi [17, 22], The optical isomer ( — ) sec-butylamine is substantially more active t h a n the ( + ) isomer, although the racemic mixture is used in practice t o control postharvest diseases. Fumigation of seed a n d ware potatoes in t h e U K with secbutylamine controls Oospora a n d Phoma during storage [15, 26]. Gaseous sec-butylamine penetrates deeply into the potatoes so t h a t t h e fumigation can be delayed for 14 days a f t e r harvest without diminishing t h e effectiveness of the t r e a t m e n t . However, t h e t r e a t m e n t is not effective against Fusarium dry rot. I n California, oranges are drenched with a solution of 1 % sec-butylamine (phosphate salt, p H ca. 9) a f t e r harvest to protect t h e f r u i t injuries against infection b y Pénicillium spp. during the ethylene degreening period or during storage [16]. T h e degreening operation is highly conductive to the development of decay since it involves exposure of t h e f r u i t to a low concentration of ethylene gas (5 ppm) f o r several d a y s in a warm humid environment. »Scc-butylamine is also added to wax formulations applied to lemons before storage to control Pénicillium, b u t t h e t r e a t m e n t has no effect upon diseases caused b y Alternaría or Geotrichum, which are resistant to secb u t y l a m i n e as well as to the benzimidazole fungicides. The sec-butylamine t r e a t m e n t m a y be followed b y a post-storage t r e a t m e n t with a benzimidazole fungicide or biphenyl because these three fungicides do not select for cross-resistant strains of Pénicillium. Pénicillium expansum a n d Pezicula spp. were controlled on apples t r e a t e d with solutions of scc-butylamine salts [3]. The effectiveness against Pénicillium was diminished, however, when t r e a t e d f r u i t stored f o r several m o n t h s at low temperatures [29]. Dicliloran (Fig. 1, VI) is the most effective fungicide f o r control of Iihizopus stolonifer, a wound-invading pathogen of m a n y f r u i t s a n d vegetables. Cherries, peaches a n d other stone f r u i t s are usually t r e a t e d with this fungicide before shipment to distant markets [36, 49]. Dichloran is much less active against Monilinia fructicola, another m a j o r postharvest pathogen of stone fruits, and is only weakly active against other Iihizopus spp. and Mucor spp. [40]. Other fungicides must be combined with dichloran when

16

J. W.

ECKERT

these pathogens are a problem. Dichloran is the standard postharvest treatment for control of Rhizopus rot of sweet potatoes [45], but the treatment is ineffective against Ceratocystis black rot or Pénicillium rots. Recent trials have demonstrated the value of dichloran applied to tomatoes after harvest to control Botrytis [8] and Rhizopus rots [30]. The treatment had no infleunce upon Geotrichum rot, however. oH

BENOMYL

CARBENDAZIM

THIOPHANATE

METHYL

F i g . 2. T r a n s f o r m a t i o n of b e n o n i y l and t h i o p h a n a t e - m e t h y l t o c a r b e n d a z i m

Benzimidazole fungicides, thiabendazole, benoniyl, carbendazim, and thiophanate methyl (Fig. l - I I I , I V ; Fig. 2) have been used extensively to control postharvest diseases since these compounds were introduced in the late 1960's [15]. All of these compounds and their derivatives share a common antifungal spectrum, although they differ quantitatively in activity [20, 48]. In general, the benzimidazole fungicides have been used interchangeably for certain postharvest applications while, in other C&SGSj £t specific compound is preferred because of its biological or chemical properties [3, 4, 15, 34]. The benzimidazole fungicides have been used world-wide to control Penicillium decay and stem-end rots of citrus fruits [6, 16, 34], Penicillium blue mold and Gloeosporium (Pezicula) lenticel rots of apples [2, 3, 7, 24, 29, 42, 43], Crown rot (Fusarium, Ceratocystis) and anthracnose on bananas, Colletotrichum and Ceratocystis on several tropical fruits and Monilinia rot on stone fruits (peaches, cherries, plums) [4, 15, 41, 49]. Benoniyl is usually combined with dichloran for treatment of stone fruits in order to control both Monilinia and Rhizopus, the major postharvest diseases of these fruits. The success of the benzimidazole fungicides in the control of postharvest diseases is due to two factors: i) high intrinsic activity of these compounds against many of the fungi responsible for postharvest diseases and ii) ability of the benzimidazole fungicides to penetrate at least some degree through the hydrophobic surface barriers of the host, in order to reach the site of infection. Benomyl appears to penetrate the host surface more efficiently than thiabendazole, carbendazim, or thiophanate-methyl and may be more effective in disease situations in which the pathogen is situated below the surface of the host [1, 19, 23, 41]. Numerous trials conducted in the US and in Europe have demonstrated that the benzimidazole fungicides can control several diseases of potato tubers during storagedry rot (Fusarium), gangrene (Phoma), skin spot/Oospora) and silver scurf (Hdmiiithosjiorium) [5, 35, 38]. Thiabendazole appears to be somewhat more effective than benoniyl for the control of Fusarium and Phoma. Thiabendazole is applied at 42 g/metric ton by means of an ultra low-volume mist applicator as the potatoes are transported into storage [35]. High-volume applications may be more effective, but the residual water on the potatoes in storage may increase the risk of bacterial soft rot. A similar treatment of sugar beets has been effective in reducing decay by Penicillium and other fungi that cause a sugar loss in the beets during storage in outdoor piles.

F u n g i c i d e t r e a t m e n t of fruits and vegetables

17

Treatment of citrus fruits with a wax formulation containing 4—6 g thiabendazole/ liter results in a residue that inhibits sporulation of Pénicillium spp. on decaying fruits [19, 23]. Benomyl produces this same effect at about one-half the dosage required for thiabendazole. The significance of this observation is that the benzimidazole fungicides offer an effective alternative to the biphenyl treatment for the control of Pénicillium sporulation on citrus fruits during long-term storage and shipment (Fig. 4). Thiabendazole and carbendazim are stable under most conditions that might be encountered in the treatment of fruits after harvest. Thiabendazole can even be applied as a "smoke" in fruit and vegetable storage rooms [12]. Benomyl and thiophanatemethyl, on the other hand, are unstable in aqueous solution and in organic solvents [9, 19]. Benomyl suspensions in pure water appear to be stable because of the very low solubility of benomyl in water (ca. 4 mg/liter). However, benomyl is not stable in very dilute aqueous solutions or in formulations of wax coatings applied to fruits and vegetables after harvest. Under neutral conditions, benomyl decomposes significantly within a few hours to methyl 2-benzimidazolecarbamate (carbendazim); under alkaline conditions benomyl is converted to l,2,3,4-tetrahydro-3-butyl-2,4-dioxo-s-triazino(a)-benzimidazole (STB) within a few hours (Fig. 3) [19, 50]. Although carbendaÇ,H 9

H

H

Fig. 3 . R e a c t i o n s of b e n o m y l in a q u e o u s formulations

zim is almost as active as benomyl in preventing infection of citrus fruits by Pénicillium [34], S T B is essentially devoid of antifungal properties. However, carbendazim is more polar than benomyl and is significantly less effective in controlling sporulation of Pénicillium on citrus fruits because it does not penetrate into the peel of the fruit as efficiently as benomyl (Fig. 4) [19, 23]. Carbendazim and thiophanate-methyl, a progenitor of MBC [48], have been used as substitutes for benomyl. For some applications these compounds are equivalent in effectiveness to benomyl [3, 4, 31, 34], but for uses which require significant penetration into the host, MBC and thiophanatenlethyl appear to be inferior. All "benzimidazole" fungicides — thiabendazole, benomyl, carbendazim, and thiophanate-methyl have two serious biological limitations: i) all compounds in this group 2

Systemfungizide

18

J . W . ECKERT

j

o z

'

] MBC

ÈSSS-Sy)

benomyl

o < o Q < a: < to

0

1

2

DEPTH

3 BELOW

PEEL

(mm)

4

5

6

SURFACE

Fig. 4. Top. Penetration of 3 Hcarbendazini (MBC) and 3 Hbenomyl into the pericarp (peel) of an orange fruit. An equimolar amount of each compound was applied to 0.636 cm 2 areas of the fruit surface Bottom. Growth and sporulation of Pénicillium digital um on orange fruits treated with equimolar concentrations of earbendazim and benomyl. 0 — untreated control; MBC — 1.25 g earbendazim per liter; B E N - 1.90 g benomyl per liter. The interiors of all fruits were extensively colonized by P. digitatum are inactive against several microorganisms responsible for important postharvest diseases — Ehizopus and other mucors, Alternaria, Geotrichum, Phytophtliora, and all bacteria including Erwinia spp. which cause soft rots of potatoes and vegetable crops, ii) resistant strains of pathogens exist at low levels in populations of "benzimidazolesensitive" species of fungi. T h e resistant strains appear to be suppressed naturally b y the competitive action of the normal sensitive strains, but under continuous use of t h e benzimidazole fungicide, t h e resistant strains m a y become the m a j o r component of t h e pathogen population and render the benzimidazole fungicide t r e a t m e n t useless.

F u n g i c i d e treatment of fruits and vegetables

19

Diseases of secondary importance caused by Alternaría, Geotrichum and other pathogens of citrus fruits that are resistant to benzimidazoles have become a limiting factor in the storage and handling of this crop after treatment with a benzimidazole fungicide [6, 15]. The resistance of strains of Pénicillium to benzimidazole fungicides has seriously diminished the usefulness of these compounds as postharvest fungicides for citrus fruits and it now appears that this problem may also arise on other crops, following a period of continuous use of these fungicides. Resistance to benzimidazole fungicides The practices involved in preparing fresh lemons for market are diagramed in Figure 5, revealing the stages in this operation that favor the development of fungicideLEMONS Harvest

I.

Fungicide bath

J

Emulsion w a x + 2, 4-D + fungicide Store 1 — 4 m o .

I

F o a m wash-

SOPP Organic solvent w a x + fungicide

I

P a c k in cartons with biphenyl f Ship to m a r k e t

Fig. 5. Sequence of application of fungicides and other t r e a t m e n t s to lemon fruits after harvest

resistant strains of Pénicillium. Lemons may be washed in a bath of sodium o-phenylphenate and coated with a wax containing benomyl before storage. The selection pressure exerted by these treatments upon the Pénicillium population results in the proliferation of strains that are resistant to either or both of the fungicides applied before storage. Consequently, the application of thiabendazole and biphenyl to these fruit immediately before shipment fails to control Pénicillium decay during marketing because of the high frequency of fungicide-resistant strains. Benzimidazole-resistance in Pénicillium spp. was observed in California citrus packinghouses about 15 months after thiabendazole was incorporated in the wax formulation applied to lemons before storage. HARDING [ 2 8 ] reported that thiabendazoleresistant isolates of both P. digitatum and P. italicum occurred at a high frequency in the atmosphere of lemon packinghouses that used thiabendazole intensively as a pre-storage treatment for lemons. These isolates were not controlled by treating inoculated fruit with a high dosage (3 g/liter) of thiabendazole. Benzimidazole-resistant strains of P. digitatum and P. italicum have been isolated also, in Florida, Israel, Australia and Japan. A survey of citrus fruits arriving in the port of Rotterdam O*

20

J. W. Eckekt

revealed t h a t approximately one-half of the isolates of Pénicillium digitatum a n d P. italicum recovered f r o m f r u i t f r o m 20 countries was resistant to benzimidazole fungicides [37]. Benzimidazole-resistant strains of P. expansum have been reported on harvested apples and pears in Oregon [2], New Y o r k [42, 43] and Australia [29], Most observations of benzimidazole-resistant strains of Pénicillium spp. have followed intensive use of thiabendazole or benomyl over a period of some months, b u t Ktjramoto [31] reported a severe resistance problem on satsuma mandarins in J a p a n following application of a single a n n u a l spray of t h i o p h a n a t e - m e t h y l immediately before harvest. Several investigators have recorded the isolation of benzimidazole-resistant strains f r o m citrus groves and packinghouses where benzimidazole fungicides had never been used [28, 31].

R e c e n t D e v e l o p m e n t s in P o s t h a r v e s t Fungicides T h e structures of six new fungicides t h a t show promise against current disease problems are shown in Figure 6. Guazatine (Fig. 6, V I I ) is a broad spectrum fungicide t h a t is effective against benzimidazole-resistant strains of Pénicillium spp. a n d Geotrichum rot on citrus f r u i t s [32]. Guazatine is a practical postharvest fungicide applied t o citrus f r u i t s in Australia. Imazalil (Fig. 6, V I I I ) demonstrated, in large scale trials conducted t h r o u g h o u t t h e world, high effectiveness against Pénicillium decay and Diplodia stem end rot of zzr .NH, NH ? '^CNH(CH2)8NH2(CH2)8NHC( NH, NH.

r—N

u

K

jj

I

I

CH 2 CCHJCH 2 CH 2 CH 3

3+ fOAc )

a

VTTT

ch 2 choch 2 ch=ch 2

r

M O

X

I

o=cnch 2 ch 2 ch 3 çh 2 CH

C.

VC'

2° \ CI

/ d \

==

CH

S/P '/CHC-OCH N^ ( CCHJOCHJ

Now fungicides being e v a l u a t e d f o r c o n t r o l of p o s t h a r v e s t diseases. V I I — guaza_ imazalil) I X _ tino> v m

CH

0

sisthane, X — prochloraz, XI C G A - 6 4 251, X I I motalaxyl

CH

(

3

F u n g i c i d e t r e a t m e n t of fruits and vegetables

21

citrus fruits [33]. Imazalil strongly inhibits sporulation of Penicillium spp. on citrus fruits and is fully active against strains of Penicillium that are resistant to benzimidazoles, sec-butylamine, and o-phenylphenol. KOFFMANN et al. [29] reported that imazalil was very effective in controlling benzimidazole-resistant strains of Penicillium expansum on apples during long terra storage in a modified atmosphere. Our tests showed that imazalil was more effective than benomyl in controlling Monilinia fructicola (benzimidazole-sensitive strain) on sweet cherries, and others have reported good control of this pathogen on peaches [4]. Most remarkable, SPALDING [44] reported the control of Alternaria alternata on tomatoes by treatment of inoculated fruit with imazalil. Sisthane (Fig. 6, I X ) and prochloraz (Fig. 6, X ) have not been thoroughly tested against postharvest diseases, but these compounds appear to be highly effective against the same diseases as imazalil. A thorough evaluation may reveal unique applications for these compounds. A third compound in this class, CGA 64251 (Fig. 6, X I ) , controls benzimidazole-resistant strains of Penicillium expansum on apples [43] and we have shown that it is highly effective against Penicillium spp. on citrus as well as Geotrichum rot. Metalaxyl (Fig. 6, X I I ) [47] has provided good control of Phytophthora syringae on apples [25] and we have controlled P. citrophthora on lemons. I f applied early in the incubation period, metalaxyl can penetrate the waxy surface layer of the fruits to eradicate incipient infections of Phytophthora beneath. Local systemic action is essential for control of these diseases because Phytophthora infection is initiated in the orchard, but a postharvest fungicide treatment cannot be applied until several days later. Current practical control measures for Phytophthora fruit rots consist of protective fungicides (copper or captan) applied in the orchard before environmental conditions become conductive for infection.

Successes and Challenges in Postharvest Disease Control Substantial progress has been made over the past decade in the chemical control of postharvest diseases. The benzimidazole fungicides provided a conceptual breakthrough in that they demonstrated for the first time that latent or incipient infections located within host tissue could be inactivated by chemical treatments applied to the surface of the product after harvest. Stem-end rots of citrus fruit, lenticel rots of apples, latent infections of Colletotrichum on bananas and other tropical fruits, and lateseason infections of Monilinia on peaches have all been controlled by postharvest treatment of benomyl to an extent thought impossible in earlier times. Surface deposits of thiabendazole and benomyl on citrus fruits, within legal residue tolerance, can suppress the sporulation of Penicillium molds on the surface of citrus fruits more effectively than biphenyl, the standard fungicide for citrus shipment trade for four decades. Thiabendazole has equalled or surpassed the organomercurial fungicides in controlling certain important diseases of seed potatoes and this technology has been extended to the reduction of postharvest losses due to fungal pathogens in warehouse and fresh-pack potatoes as well. The outstanding successes of the benzimidazole fungicides in reducing storage losses in these crops has emphasized, by comparison, the inadequate control of diseases incited by microoganisms that are tolerant to this

22

J . W . ECKERT

class of fungicides, i.e., Alternaria, Geotrichum, Phytophthoru, Mucor, bacteria, a n d strains of f u n g a l p a t h o g e n s t h a t h a v e been selected for benzimidazole-resistance. More recent fungicide developments such as guazatine, sisthane, prochloraz a n d CGA 64251 h a v e showed t h a t diseases incited b y these p a t h o g e n s m a y also be controlled b y p o s t h a r v e s t fungicide t r e a t m e n t . I n addition, these new fungicides h a v e not yet selected virulent resistant strains f r o m t h e p a t h o g e n population a n d it has been speculated t h a t sensitive f u n g i do not possess t h e genetic capability to circumvent t h e biochemical lesion inflicted b y these fungicides. P r e l i m i n a r y tests with m e t a l a x y l h a v e indicated t h a t Fliytophthora f r u i t rots m a y be successfully controlled b y p o s t h a r v e s t fungicide application of this fungicide when field conditions before h a r v e s t forecast t h e probability of a n impending disease problem in storage. A l t h o u g h a few diseases of fresh f r u i t s a n d vegetables cannot be satisfactorily controlled b y p o s t h a r v e s t t r e a t m e n t s , existing fungicides h a v e d e m o n s t r a t e d t h e p o t e n t i a l for eliminating t h e m a j o r p a t h o logical sources of p o s t h a r v e s t losses. T h e challenge t o d a y is t o develop these fungicides i n t o t r u l y practical a n d economical t r e a t m e n t s . Diskussion G E O R G O P O U L O S : I would like t o address two questions t o Prof. E C K E R T : F i r s t , whycross resistance t o dichloran was not mentioned as one of t h e problems as it is in t h e case of cross-resistance between S O P P and biphenvl ? Second, is t h e effect of thiabendazole on t h e sugar c o n t e n t of sugarbeets a n indirect one, i.e. does it act b y p r e v e n t i o n of sugar c o n s u m p t i o n during f u n g a l g r o w t h ? E C K E R T : S O P P - b i p h e n y l cross resistance is a serious practical problem in citrus f r u i t s because S O P P m a y be applied t o these same f r u i t s a f t e r storage. T h e S O P P - b i p h e n y l resistant strains proliferate a n d these strains cannot be controlled w i t h biphenyl. T h e t r e a t m e n t of f r u i t s a n d vegetables with S O P P before storage a n d dichloran a f t e r storage is not a commercial practice; therefore cross resistance between these t w o fungicides is not a practical problem. Thiabendazole reduces t h e loss of sugar f r o m sugar beets during storage, p r e s u m a b l y b y reducing f u n g u s utilisation of t h e beet sugar a n d b y reducing host respiration t h a t is s t i m u l a t e d b y infection of t h e beets. I do not k n o w which mechanism is t h e m o s t i m p o r t a n t source of sugar loss in stored beets t h a t become infected b y fungi. BOCHOW: W e observed in t h e control of Botrytis cinerea on cabbage a t p o s t h a r v e s t t i m e a difference between t h e efficiency of fungicides in vivo a n d in vitro. Some t y p i c a l botryticides (thiram, glycophen, P C N B ) were ineffective in vivo on cabbage leaves on t h e side a n d other fungicides, especially benzimidazoles, were effective b o t h in vitro a n d in vivo. W e f o u n d t h e only cause were n o t differences in p e n e t r a t i o n ability in t h e fungicides, b u t t h e presence or absence of t h e cytokinin side effect, shown in b e n o m y l a n d related compounds. Cytokinins can stabilise t h e resistance of green p l a n t tissue against t h e a t t a c k of pectolytic enzymes. I n this connection we get in t h e case of benzimidazoles a combined effect on t h e resistance of p l a n t tissue a n d against t h e pathogen, which was t h e real cause for t h e b a d efficiency of b e n o m y l in t h e practical control of Botrytis on cabbage leaves a t p o s t h a r v e s t time. H a v e You a n y indications too, in this line ?

ECKERT: We h a v e never observed this cytokinin effect of b e n o m y l in citrus f r u i t s t r e a t e d a f t e r h a r v e s t , even in lemon f r u i t s which were t r e a t e d when t h e y are in a green i m m a t u r e condition. On t h e other hand, it is a common commercial practice t o s p r a y

Fungicide treatment of fruits and vegetables

23

oranges and lemons with gibberellic acid, when the fruit are developing on the tree for the purpose of delaying the harvest for several weeks. Fruit treated with gibberellic acid early in the season are more resistant to infection by Pénicillium spp. after harvest. Cabbage leaf cells may be in a more juvenile state than the cells of citrus fruit pericarp and thus better respond to the action of anti-senescence agents. I would like to point out, t h a t , several independent investigations have shown t h a t the pericarp of thiabendazole- and benomyl-treated grape fruit is more resistant to low-temperature ( < 1 0 °C) injury than untreated fruit. This effect of the benzimidazole fungicides must be mediated through an effect of these agents upon the plant cells. G R O S S M A N N : You pointed out that benomyl penetrates into the fruits much better than carbendazim does. This may be of advantage so far as disease control is concerned. But it may cause residue patterns because the peel of oranges normally is not eaten in contrast to the other parts of the fruits. Could you comment on this situation ? E C K E R T : Tolerances for pesticide residues on agricultural products are generally established on the basis of the weight of pesticide on or in the product at the time of potential consumption. No distinction is made between the pesticide which penetrates and that which remains on the surface. Thus, there is no penalty associated with the use of the pesticide t h a t penetrates efficiently into the host for more effective disease control. G R O S S M A N K : With regard to the restrictions of the use of benomyl e.g. in the Federal Republic of Germany, do You think t h a t thiabendazol can replace benomyl in citrus disease control 2 How deep does it penetrate into citrus fruits '' E C K E R T : I am not familiar with the exact limitations upon benomyl recently promulgated in the Federal Republic of Germany. None-the-less, thiabendazole is widely used today as a alternate fungicide to benomyl, despite the superior performance of benomyl in controlling many postharvest diseases of fruit crops. One of the reasons for the choice of thiabendazole for practical application are the limitations on benomyl residues on fruits imported into France, Belgium and J a p a n . Thiabendazole appears to be more effective for control of Fusarium dry rot of potatoes during storage and, therefore, has been used more extensively for this application t h a n benomyl. Both thiabendazole and carbendazim are inferior to benomyl in the their ability to penetrate into citrus fruits, presumably because the former fungicides are more polar than benomyl.

References [1] BEÏT-ARIE, R., Benzimidazole penetration, distribution and persistence in postharvest treated pears, Phytopathology 65 (1975), 1187—1189 [2] BERTRAND, P . F . and J . L. SAULIE-CARTER, The occurence of benomyl-tolerant strains of Pénicillium expansum and Botrytis cinerea in the mid-Columbia region of Oregon and Washington, P l a n t Disease Keptr. 62 (1978), 3 0 2 - 3 0 5 [3] BOMPEIX, G. and F . MORGAT, Cires, anti-échaudures, fongicides et conservation des pommes, Fruits 32 (1977), 189 — 196 [4] BOMPEIX, G., M. COEFFIC and P . GREFFIER, L u t t e contre les pourritures des pêches à Monilia sp., Botrytis sp. et Khizopus sp., Fruits 34 (1979), 423 — 430 [5] BOYD, A. E. W., Fungicides for p o t a t o tubers, Proc. 8th British Insectic. Fungic. Conf. 3 (1975),

1035-1044

24

J - W . ECKERT

[6] BROWN, G. E., Application of benzimidazole fungicides for citrus decay control, Proc. Int. Soc. Citriculture 1 (1977), 273 — 277 [7] BURCHILL, R . T. and K. L. EDNEY, An assessment of some new treatments for the control of rotting of stored apples, Ann. Appl. Biol. 72 (1972), 249 — 255 [8] CHASTAGNER, G. A. and J . M. OGAWA, A fungicide-wax treatment to suppress Botrytis cinerea and protect fresh-market tomatoes, Phytopathology 6i) (1979), 59 — 63 [9] CHIBA, M. and F . DOORNBOS, Instability of benomyl in various conditions, Bull. Envir. Contain. Toxicol. 11 (1974), 2 7 3 - 2 7 4 [10] CHO, J . J . , K. G. ROHRBACH and W . G. APT, Induction and chemical control of rot caused by Ccratocystis paradoxa on pineapples, P h y t o p a t h o l o g y 67 (1977), 700—703 [11] COITEY, H. M. and G. FARIAS, Control of postharvest decay of p a p a y a , HortSci. 14 (1979),

719-721

[12] DERBYSHIRE, D. M. and M. R . SHIPWAY, Control of post-harvest deterioration in vegetables in the U K , Outlook on Agric. 9 (1978), 2 4 0 - 2 5 2 [13] ECKERT, J . W . , Application and use of postharvest fungicides in D. C. TORGESON (ed.)/Fungicides — An Advanced Treatise, Academic Press, New York 1967, Vol. 1, 287-378,

13

[14] ECKERT, J . W . , Postharvest pathology — general principles in E. B . I'ANASTICO (ed.)/Postharvest Physiology, Handling and Utilization of Tropical and Subtropical F r u i t s and Vegetables, Avi Publ. Co., Westport, CT 1975, 393 — 414 [ 1 5 ] ECKERT, J . W . , C o n t r o l of P o s t h a r v e s t d i s e a s e s in SIEGEL, M . R . a n d H . D. SISLER ( e d s . ) / A n t i f u n g a l C o m p o u n d s , MARCEL DEKKER, I n c . , N e w Y o r k 1977, V o l . I, 269 —352

[16] ECKERT, J . W . , Post-harvest diseases of citrus fruits, Outlook on Agric. 9 (1978), 225-232 [17] ECKERT, J . W . and KOLBEZEN, M. J . , 2-Aminobutane salts for control of postharvest decay of citrus, apple, pear, peach, and b a n a n a fruits, P h y t o p a t h o l o g y 54 (1964), 978-986 [18] ECKERT, J . W . and KOLBEZEN, M. J . , F u m i g a t i o n of fruits with 2-aminobutane to control certain postharvest diseases, Phytopathology CO (1970), 545 — 550 [19] ECKERT, J . W . and M. J . KOLBEZEN, Influence of formulation and application method on the effectiveness of benzimidazole fungicides for controlling postharvest diseases of citrus fruits, Neth. J . PI. P a t h . 83, Suppl. 1, (1977), 3 4 3 - 3 5 2 [20] ECKERT, J . W . and M. L. RAHM, The antifungal a c t i v i t y of a l k y l benzimidazole-2v l c a r b a m a t e s and related compounds, Pestic. Sei. 10 (1979), 473 — 477 [ 2 1 ] ECKERT, J . W . , M . J . KOLBEZEN a n d B . A . KRAMER, A c c u m u l a t i o n of o - p h e n v l p h e n o l

by citrus fruits and pathogenic fungi in relation to decay control and residues, 1'roc. 1st Intern. Citrus Symp., Univ. Calif. (Riverside) 2 (1969), 1 0 9 7 - 1 1 0 3 [ 2 2 ] ECKERT, J . W . , M. L . RAHM a n d M . J . KOLBEZEN, F u n g i s t a t i c a c t i v i t y of c a t i o n s of

non-aromatic amines, ,T. Agric. Food Chem. 20 (1972), 104—109

[ 2 3 ] ECKERT, J . W . , M . J . KOLBEZEN, M . L. R A H M a n d K . J . ECKARD, I n f l u e n c e of b e n o -

m y l and methyl-2-benzimidazole c a r b a m a t e on the development of Pénicillium digitatum in the pericarp of orange fruit, Phytopathology 6!) (1979), 934 — 939 [24] EDNEY, K. L., Some experiments with thiabendazole and benomyl as postharvest treatments for the control of storage rots af apples, P l a n t Pathol. 15) (1970), 1 89 — 193 [25] EDNEY, K. L., Diseases caused by Phytoplitliora species. Postharvest fungicide trials Ann. R e p t . East Mailing E x p t . Sta. 1979 [ 2 6 ] GRAHAM, D . , G . A . HAMILTON, C . E . QUINN a n d A . D . RUTHVEN, U s e of

2-amino-

butane as a fumigant for control of gangrene, skin spot and silver scurf diseases of potato tubers, Potato Res. 16 (1973), 109—125 [27] HARDING, P . R . J r . , Differential sensitivity to sodium o-phenylphenate by biphenylsensitive and biphenyl-resistant strains of Pénicillium digitatum, P l a n t Disease R e p t r . 46 (1962),

100-104

[28] HARDING, P . J . J r . , Differential sensitivity to thiabendazole by strains of italicum and P. digitatum, P l a n t Disease R e p t r . 56 (1972), 256 — 260

Pénicillium

[ 2 9 ] KOFFMANN, W . , L . J . PENROSE, A . R . MENZIES, K . C . DAVIS a n d J . KALDOR, C o n t r o l

of benzimidazole tolerant Pénicillium (1978),

31-39

expansum

in pome fruit, Scienta Hortie. 9

Fungicide treatment of fruits and vegetables

25

K R O C H T A , J . M . , R . A . C A R L S O N , J . M . O G A W A and B . T . M A N J I , Harvesting into f o a m reduces tomato losses, Food Technol. 313 (1977), 42 — 46 K U R A M O T O , T . , Resistance to benomyl and t h i o p h a n a t e - m e t h y l in strains of Péniciland P. italicum in J a p a n , P l a n t Disease R e p t r . 60 ( 1 9 7 6 ) , 1 6 8 — 1 7 1 lium digitatum K U R A M O T O , T . and S. Y A M A D A , D F - 1 2 5 , a new experimental fungicide for control of s a t s u m a m a n d a r i n postharvest decays, I'lant Disease R e p t r . GO ( 1 9 7 6 ) , 8 0 9 — 8 1 2 LAVILLE, E . Y . , P . R . HARDING, Y . DAGAN, M . R A H A T , A . J . KRAGHT, a n d L . E . R I P -

PON, Studies on imazalil as a potential t r e a t m e n t for control of citrus f r u i t s decay, Proc. Int. Soc. Citriculture 1 ( 1 9 7 7 ) , 2 6 9 - 2 7 3 L Ö C H E R , F. and M . H A M P E L , Control of postharvest diseases of bananas, pineapples and citrus with earbendazim, Proc. 7th British Insecticide Fungicide Conf. 1 (1973), 301-308 LOGAN, C., R . B . C O P E L A N D and G. L I T T L E , Potato gangrene control b y ultra low volume s p r a y s of thiabendazole, Ann. Appl. Biol. 80 (1975), 199 — 204 L U E P S C H E N , N. S., K. G. R O H R B A C H , A. C. J O N E S and C. L . P E T E R S , Methods of controlling Phizopus decay and maintaining Colorado peach q u a l i t y , Colorado S t a t e Univ. E x p t . S t a . Bull. 5 4 7 S (1971) M C D O N A L D , R . E., L. A. R I S S E and B . M . H I L L E B R A N D , Resistance to thiabendazole and benomyl of Pénicillium digitatum and P. italicum isolated from citrus fruit from several countries, J . Amer. Soc. Hort. Sei. 104 (1979), 333 — 335 M E R E D I T H , D. S., Control of fungal diseases of seed potatoes with thiabendazole, Proc. 8th British Insectic. Fungic. Conf. 2 (1975), 5 8 1 - 5 8 7 M U I R H E A D , I . F . , Postharvest control of mango anthracnose with benomyl and hot water, Austral. J . E x p t l . Agr. Animal H u s b a n d r y 16 (1976), 600 — 603 O G A W A , J . M . , J . H. M A T H R E , D . J . W E B E R , and S. D . L Y D A , Effects of 2,6-dichloro4-nitroaniline on Phizopus species and comparison with other fungicides on control of Phizopus rot of peaches, P h y t o p a t h o l o g y 53 (1903), 950—955 P H I L L I P S , D. J . , Detection and translocation of benomyl in postharvest-treated peaches and nectarines, P h y t o p a t h o l o g y 65 (1975), 255 — 258 R O S E N B E R G E R , D. A. and F . W . M E Y E R , Benomyl-tolerant Pénicillium expansum in apple packing houses in Eastern New York, P l a n t Disease R e p t r . 63 (1979), 37 — 40 R O S E N B E R G E R , D. A., F . W . M E Y E R and C . V. C E C I L I A , Fungicide strategies for control of benomyl-tolerant Pénicillium expansum in apple storages, P l a n t Disease R e p t r . 63 (1979), 1 0 3 3 - 1 0 3 7 S P A L D I N G , D. H., Control of Alternaria rot of tomatoes b y postharvest application of imazalil, P l a n t Disease 64 (1980), 1 6 9 - 1 7 1 S T E I N B A U E R , C . E . and K U S H M A N , L . J . , Sweet potato culture and diseases, U . S . D e p t . Agr. Handbook 388 (1971), 3 5 - 6 8 S T O V E R , R . H., B a n a n a , P l a n t a i n and A b a c a Diseases, Commonwealth Myeological Institute, Kew, Surrey, England, 1972 U R E C H , P . A., F . S C H W I N N and T . S T A U B , CGA 48 988, a novel fungicide for the control of late blight, downey mildews, and related soil-borne diseases, Proc. 9th B r i t . Insectic. Fungic. Conf. 2 (Ï977), 6 2 3 - 6 3 1 V O N K , J . W . and K A A R S - S I J P E S T E I J N , A., M e t h y l benzirnidazol-2-yl-carbamate, the fungitoxic principle of thiophanate m e t h y l , Pestic. Sei. 2 (1971), 160—164 W A D E , N . L . and P . G . G I P P S , Postharvest control of brown rot and Phizopus rot in peaches with benomyl and dichloran, A u s t r a l i a n J . E x p t l . Agr. A n i m a l H u s b a n d r y 13 (1973), 6 0 0 - 6 0 3 W H I T E , E. R . , E. A. B O S E , J . M . O G A W A , B . T. M A N J I , and W . W . K I L G O R E , Thermal and base-catalvzed hydrolysis products of the systemic fungicide, benomyl, J . A g r . Food Chem. 21 (1973), 6 1 6 - 6 1 8

M . HRMOVÄ, L . DROBNICA a n d M . ZEMANOVÄ 1 Department 1Department

of Microbiology of Microbiology

and Biochemistry of of Ccmcnins University,

Slovak Poly technicalBratislava, ÖSSJi

University

and

Induction of Mycelial Type of Development in Candida albicans by Fungicides and Nutritional Alternations

Besides the usually observable yeastlike (Y), i.e. round cells the true mycelial (M) forms can be present in C. albicans, the initial stage of which is termed germ tubes (GT). The propensity of dimorphic development in C. albicans is of great diagnostic value and it serves as a useful model for studying the regulation of fungal morphogenesis. The literature is very abundant in cultivation conditions conductive to M morphology (for a review see ref. [2]). Generally, the development of GT can be considered as a consequence of shift-down phenomenon (worsened nutrition). Nevertheless, till now mechanisms regulating morphogenesis in C. albicans remain unclear. In this connection our previous experimental results with C. albicans [3] stressed the importance of the growth phase of cells undergoing M morphology. The purpose of this report was to point at the general importance of a certain physiological state of cells released for massive GT production in C. albicans as well as at three new GT induction techniques applicable at 28 °C. For all the methods published up to now the high cultivation temperature (37—43 °C) is the absolute prerequisite. Figure 1 depicts the high GT production in C. albicans, clinical isolate No. 13 used throughout when transferring the cells into the modified glucose-mineral salts-vitamins liquid medium Vita [1] with "limited" glucose (250 mmol/1 glucose concentration is in the original medium). The most pronounced conversion to M forms occurs within the use of cells from stationary growth phase (96 h cell culture). In this cultivation interval glucose was absolutely exhausted from the Vita liquid medium (residual P j cell number

Fig. 1. G r o w t h c u r v e of C. albicans in t h e a e r a t e d medium V i t a with 250 mmol/1 glucose concentration and G T production in the same medium with " l i m i t e d " glucose — 5 mmol/1. At appropriate time intervals/ a r r o w s / t h e cells w e r e w i t h drawn, washed and transferred to medium V i t a with low glucose reaching 1 8 . 2 • 10 6 c e l l c o n c e n t r a t i o n per ml. N u m b e r s indicate the p e r c e n t a g e of G T after 4 h c u l t i v a t i o n a t 2 8 °C

28

M . HRMOVÀ, L . DBOBNICA, M . ZEMAKOVA Fig. 2. E f f e c t of monorden on t h e g r o w t h a n d G T p r o d u c t i o n of C. albicans in t h e m e d i u m V i t a with 100 mmol/1 glucose concentration. M o n o r d e n w a s a d d e d a t zero h o u r d u r i n g i n d u c t i o n in t h e f o l l o w i n g concentrations: 500 [curve 1], 2 5 0 [2], 1 2 5 [3], 6 2 . 5 [4], 3 1 . 2 5 [ 5 ] , 1 5 . 6 [ 6 ] , 7 . 8 [ 7 ] , 3 . 9 [8] ¡ i m o l / l a n d without monorden being added [C]. Cells f r o m s t a t i o n a r y g r o w t h p h a s e w e r e u s e d as i n o c u l u m [ 9 6 h culture]. T h e percentage of G T a f t e r 8 h s h a k e c u l t i v a t i o n a t 2 8 °C in r e l a t i o n o t m o n o r d e n c o n c e n t r a t i o n s is i n s e r t e d

concentration was 13.8 ¡jig per ml). However, with subsequent glucose addition regrowth appared until the deprivation of P; front medium. I t seems reasonable to consider glucose as the growth limiting factor. According to the same principle M morphology was induced in other clinical isolates and collection C. albicans strains (ATCC, CCY) as well. Nevertheless, for the pronounced frequency of GT formation (higher than 5 0 % ) in each strain the suitable "limited" glucose concentrations has to be determined. I n close connection with the explanation of GT induction mechanisms might have been important our finding that antibiotic monorden (radicicol) initiates M growth in C. albicans. Figure 2 indicates the relationship between monorden concentrations and G T formation. However, the highest dose of monorden did not fully suppress the growth of Candida cells. The mechanism of monorden a t t a c k is not clear at present; its effect on cell wall or cytoplasmatic membrane components syntheses is supposed. Recent results of our laboratories indicate that monorden is a thiol-combining agent. The third new possibility for GT production resulted from experiments with N-acetylD-glucosamine as the sole carbon source in the synthetic medium Vita. Similarly as in previous techniques Candida cells from stationary growth phase were used as inoculum. With this aminosugar instead of glucose we observed at 28 °C in shake culture that on stationary phase cells, G T arose which later developed into true mycelia. F r o m the diagnostic standpoint of yeast and yeastlike microorganisms it is worth emphasizing the value of monorden especially for C. albicans. Table 1 summarizes that GT are produced only in C. albicans with the use of monorden and our method. The results concerning the biochemical and physiological characterisation of Y and M forms in C. albicans, i.e. aerobic fermentation, respiration, RQ values, sensitivity against some specific inhibitors (iodoacetamide, uranyl nitrate, cycloheximide, carbonyl cyanide phenylhydrazones), dynamics of incorporation of radioactive precursors (glycine, leucine, adenine), radioactivity distribution in different cellular fractions after 14 C-glycine incorporation, chitin content in isolated cell walls and finally the results of microscopic and electronmicroscopic (ultrathin sections and freeze-etching technique) studies concerning Y and M forms in C. albicans are a part of Ph. D. dissertation (HRMOVA, M. Morphogenesis of C. albicans and its regulation, Comenius University, Bratislava 1979) and are prepared for publication.

My e el formation in Candida

by fungicides and nutrition

29

Tabelle 1 Effect of monorden on GT production in different yeast and yeastlike microorganisms. For detail see Figure 2. Monorden was applied in 62,5 ¡imol/l concentration and GT production was followed for 48 h GT cerevisiae, strain No. 7 S. cerevisiae, strain No. X I I iS. cerevisiae, strain No. X l l a »S1. cerevisiae, strain S iS. cerevisiae, strain P Z 43 8. cerevisiae, strain V 3 Debaryomyces lianseni Hansenula anomala

— — — — — — — —

GT C. albicans, strain P n ] 0 C. albicans, isolate No. 1 C. albicans, isolate N o . 3 C. albicans, isolate N o . 5 C. albicans, isolate No. 8 C. albicans, isolate No. 13 C. utilis C. clausenii Brettanomyces anomalus Khodotorula glutinis

~r

+ +

-f - r

4—

— —

In this short communication we found it necessary to mention the most important results concerning the time course of DNA biosynthesis and caryokinesis during bud and GT formation. In the process of budding DNA replicates at the same time as in the process of GT formation and then nuclear division occurs in both cases. The budding process is finished by septum formation between mother and newly formed daughter cell. But in the process of M development GT grows apically and with its elongation the nucleus of cylindrical outgrowth migrates to the proximity of apex. With subsequent GT elongation another caryokinesis takes place and a cross-wall is formed (division of a new terminal cell) as well as GT further elongates. At its cross-walls, according to the cultivation conditions, immediate or retarded blastospores bud off from the mycelium. The more complicated regulation of morphogenesis in C. albicans occurs in the case of monorden while the further M growth of cells is connected with another monorden addition. According to us the regulation of morphogenesis in C. albicans depends upon the enzyme equipment of cells before transferring them into appropriate media governing Y and M development, i.e. before successive growth and DNA replication of released cells. This is emphasized mainly with biochemical and physiological differences of Candida cells obtained from exponential or stationary growth phases. The regulation of morphogenesis in C. albicans with various glucose concentrations found in our experiments we do not regard as a consequence of catabolite repression. This is in accordance with the results of S I N G H and D A T T A [4], that "glucose effect" or catabolite repression is absent in C. albicans. Diskussion

LYE: Dimorphismus ist bei Pilzen weit verbreitet. Es scheint ein allgemein verbreitetes Regulationssystem zu geben, wodurch entweder Hefe- oder Myzelwachstum induziert wird. Ich werde in meinem Vortrag eine Arbeitshypothese dazu in einem Schema vorstellen. Es sieht so aus, daß ihre Ergebnisse sich gut einfügen. Unklar ist nur der Wirkungsmechanismus von Monorden. Hemmt das Antibiotikum die GlukoseInkorporation oder den Glukose-Metabolismus ? Dann wäre der Effekt leicht erklärbar.

30

M . HRMOVA, L . DROBNICA, M .

ZEHAXOVA

HRMOVA: On the b a s e of literature it is supposed monorden can interfere with syn-

thesis of cell wall and membrane components. But we have found, that monorden reacts with low molecular thiols, i.e. monorden is a thiol binding agent. It can influence several metabolic processes, i.e. glycolysis and respiratory functions according its concentration. I t s primary site of action is now investigated. References [ 1 ] DROBNICA, L . , A d a p t a t i o n of y e a s t a n d b a c t e r i a to a n t i m i c r o b i a l s u b s t a n c e s d u r i n g c o n t i n u o u s f l o w c u l t i v a t i o n , F o l i a Microbiol. 5 (1960), 257 — 263 [ 2 ] HASENCLEVER, H . F . , T h e in v i t r o i n t e r a c t i o n s of Candida albicans w i t h n o n s p e c i f i c s e r u m p r o t e i n s , M y c o p a t h o l o g i a 6 5 (1978), 1 6 9 — 1 7 6 [ 3 ] HRMOVA, M . , L . DROBNICA a n d M . ZEMANOVA, I n d u k c i a m y c e l i a r n y c h f o r i e m

Candida

albicans a j e j b i o c h e m i c k e p o z a d i e , X I . K o n f e r e n e i a o k v a s i n k a c h , K v a s n y p r u m y s l 2 5 (1979), 161 [ 4 ] SINGH, B . R . a n d A . DATTA, G l u c o s e r e p r e s s i o n of t h e i n d u c i b l e c a t a b o l i c p a t h w a y f o r N - a c e t y l - D - g l u c o s a m i n e in y e a s t , B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m u n . 84 (1978), 58 — 64

G Y . JOSEPOVITS

Forschungsinstitut

für Pflanzenschutz,

Budapest,

Ungarn

Intermolekulares Transmissionsvermögen der Erregungsenergie bei Fungiziden und Konsequenzen

Einführung Chemische Prozesse verlaufen unter Änderung der freien Energie und benötigen Energie zur Aktivierung der Substrate. Diese energetische Abhängigkeit der Reaktionsfähigkeit besteht auch bei biologisch a k t i v e n Stoffen. E i n Sonderfall des EnergieAustausches zwischen zwei Molekülen ist die intermolekulare Transmission der E r r e gungsenergien, die ohne Transport von S u b s t r a t oder elektrischen L a d u n g e n a b l ä u f t . Wir untersuchten diese Erscheinung bei fungiziden Wirkstoffen. Der Energie-Austausch zwischen verschiedenen Molekülarten k a n n nach S T E I N B E R G [9] wie folgt untersucht werden: 1.) durch Messung der A b n a h m e der Fluoreszenz des Energie-Donators 2.) durch Messen der Z u n a h m e der Fluoreszenz des Akzeptors, sofern dieser fluoresziert 3.) durch Erfassen der Sensibilisierung des photochemischen Abbaues des Akzeptors. Von der Möglichkeit zur Gewinnung derartiger Aussagen die Photolabilität von Fungiziden zu messen, wurde bereits mehrfach Gebrauch g e m a c h t : Arbeiten von B U C I I E N ATTER [1] über photochemische Umwandlungen verschiedener System-Fungizide, die von C L A R K u n d W A T K I N S [ 2 ] über die Photolyse des Dichlofluanids, die von C L A R K u. a. [3] über die Photolabilität von Triadimephon, sowie die Mitteilung von RouCIIARI) u. a. [7] über den Abbau der Piperazin-Fungizide durch UV-Licht.

Fluoreszenzlösung durch Fungizide Wir haben uns zuerst die Frage gestellt, ob es System-Fungizide gibt, die die Fluoreszenz anderer Verbindungen vermindern können. Unsere Ergebnisse beweisen, d a ß Erregungsenergie fluoreszierender Stoffe auf manche Fungizide übertragen werden kann. Beispiele sind in Abbildung 1 zusammengestellt. Unter den Akzeptoren ist mit A D P auch ein N a t u r s t o f f . Sein Fluoreszenzlöschungsvermögen wurde mit N A D H im Vergleich zur Wirkung der Fungizide gemessen. Bemerkenswert ist, d a ß Benomyl u n d Carbendazim keine signifikante Verminderung der Fluoreszenz von Eosin, Chlorophyll oder Riboflavin verursachen, wohl aber Thiabendazol. Die Fluoreszenzlöschung durch Thiabendazol m u ß also dem Thiazol-Ring zugeschrieben werden.

32

G Y . JOSEPOVITS

Donor —-—» lOßiM/dm3

Akzeptor ImM/dm1

ADP Carboxin I Triforine — Seedwax - 3 Thiabendazole

NADH "-"—'Eosin =r-; Chlorophyll Riboflavin

:

Etridiazote

Ethirimo! — Eosin Chlorophyll

Alill. 1 . D u r c h F l u o r e s z e n z l ö s c h u n g f e s t g e s t e l l e F ä l l e intermolekularer Energie-Transmissionen

Etridiazol bildet unter den Energie-Donatoren eine Ausnahme. Dieser Wirkstoff kann die Fluoreszenz der untersuchten Verbindungen, wie Eosin etc. nicht verringern, weil sein Erregungsmaximum bei kürzeren Wellenlängen als die Maxima der Emissionsspektren dieser Verbindungen liegt. Entsprechend wurde durch spektrophotofluorimetrische Messungen nachgewiesen, daß seine Fluoreszenz durch Eosin oder Chlorophyll vermindert wird.

Zusammenhang zwischen der Fluoreszenzlöschung und Photosensibilisierung Ein sensibilisierender Effekt von Riboflavin auf den photochemischen Abbau von Ethirimol ist schon lange bekannt. Auch S I L B E R u. a. [8] und B U C H E N A U E R [ 1 ] haben ähnliche photokatalytische Wirkungen bei Pestiziden erwähnt. E s blieb aber zu prüfen, ob Fluoreszenzlöschung und Photosensibilisierung bei einem Stoff paar unter gleichen Umständen beobachtbar sind, ob also beide Effekte wirklich verschiedene Erscheinungsformen desselben Energie-Transportes sind. Am Beispiel des Stoffpaares lliboflavin und Ethirimol konnten wir zeigen, daß bei bestimmten Konzentrationsverhältnissen eine Verminderung der Fluoreszenz des Riboflavins um 2 7 % einer photochemischen Umwandlung des Ethirimols um 1 3 % (5 Minuten) parallel geht (Tab. 1). Der Abbau von Ethirimol in der Kontrolle bleibt Tabelle 1 Aunlöschunij der Fluoreszenz ( —z1J f ) von Bhiboflai-in sibilisierung des jihotochemischen Abbaus von ( — ACe) durch einander

und SenEthirimol

Riboflavin

Ethirimol

— ZlTf

— ACe

10"5 M/dm3 ]0-4'5 M/dm3 10-4 M/dm3 10-5 M/dm3

10~ 4 10-4 10-4 10-3

27%

13% 28% 35%

M/dm3 M/dm3 M/dm3 M/dm3

30%

in dieser Zeit mit unter 1 % unter der Nachweisgrenze. Durch Erhöhung der Riboflavin-Konzentration konnten diese Effekte noch gesteigert werden. Einen ähnlichen Zusammenhang fanden wir in früheren Versuchen bei der Wechselwirkung von Eosin mit Alkylen-bis-dithiokarbamaten.

T r a n s m i s s i o n v o n E r r e g u n g s e n e r g i e bei F u n g i z i d e n

33

Kinetische Analyse der photokatalytischen Wirkungen Eine Photosensibilisierung kommt nicht nur durch direkte Übertragung von Erregungsenergie des Donators auf den Akzeptor zustande, sondern auch durch Aktivierung des molekularen Sauerstoffs der Lösung oder durch Teilnahme des aktivierten Sensibilisators als chemischer Katalysator der Reaktion [8]. Hierzu wurden Versuche mit dem extrem photolabilen Carboxin und mit dem stabileren Ethirimol durchgeführt. Etridiazol diente in beiden Fällen als Sensibilisator, weil die UV-Absorption dieser Verbindung im kurzwelligen Bereich des Spektrums die photometrische Analyse beider anderen Substanzen nicht stört, und weil Etridiazol selbst, polarographisch gut bestimmbar ist. -4Ce (¡iM/dm3) 10050 _

I,

LEV-logC

Abb. 2. P h o t o e h e m i s c h e U m w a n d l u n g von E t h i r i m o l bei G e g e n w a r t von E t r i d i a z o l in verschiedenen K o n z e n trationen A b s z i s s e : — l o g K o n z e n t r a t i o n [ m o l a r ] des E t r i d i a z o l s Ordinate: Verminderung der K o n z e n t r a t i o n von E t h i r i m o l , O b e i e i n e r A u s g a n g s k o n z e n t r a t i o n des E t h i r i m o l von 1 0 0 j i M / d m 3 ; ^ bei einer Ausgangskonzentrations des E t h i r i m o l s e n t s p r e c h e n d d e r des E t r i d i a z o l s

Abbildung 2 zeigt die Abhängigkeit der photochemischen Umwandlung des Ethirimols von der Konzentration des Sensibilisators bei konstanter bzw. bei äquimolarer Ethirimol-Konzentration. Die nach einer Bestrahlungszeit von 5 Minuten in 30 cm Abstand von der Quecksilberdampf-Lichtquelle abgebaute Ethirimol-Menge wächst mit steigenden Konzentrationen beider Verbindungen. Bei konstanter EthirimolKonzentration nähert sich die Umwandlung einem Grenzwert. Bei äquimolarem Anstieg der Konzentrationen findet man einen steilen Anstieg des photochemischen Effektes etwa bei 10~ 4 M/dm 3 . Dieser Zusammenhang läßt sich besser auswerten, wenn die Konzentrationsskale durch eine Skale ersetzt wird, bei der die durchschnittlichen Molekülabstände abgetragen werden (Abb. 3). Eine starke Verminderung der photo-A€e

(ßM/dm3)

\ \

\

\

\ , 30

3 Sybtenifungizide

„ ä(rim)

Abb. 3. Photochemische Umwandlung von Ethirimol bei G e g e n w a r t v o n E t r i d i a z o l in v e r s c h i e d e n e n ä q u i m o l a r e n Konzentrationen Abszisse: Durchschnittlicher Molekül-Abstand errechnet aus den K o n z e n t r a t i o n e n O r d i n a t e : V e r m i n d e r u n g der K o n z e n t r a t i o n v o n E t h i r i m o l

34

G Y. JOSEPOVITS

chemischen U m w a n d l u n g ist bei einem A b s t a n d von 30 —40 n m zwischen den D o n a t o r u n d Akzeptor-Molekülen zu verzeichnen. Dies steht in guter Übereinstimmung mit der Theorie der Resonanz-Transmission der Erregungsenergie von F Ö R S T E R . D a n a c h ist eine wirksame Energie-Transmission nur innerhalb des Abstandes von R = x/2jrn gegeben [6]. Der photochemische Abbau von Carboxin in Gegenwart verschiedener Konzentrationen von Etridiazol als Sensibilisator zeigte einen ähnlichen Zusammenhang (Abb. 4). Zwischen den Konzentrationen 10" 4 und 10~ 3 M/dm 3 n i m m t die U m w a n d l u n g s t a r k zu. E s m u ß allerdings vermerkt werden, daß Carboxin auch ohne Sensibilisierung einen bedeutenden photochemischen Abbau erfährt. -ACk /iM/dm3 150-

1

SD

5%

50-

,0

0

A b b . 4. P h o t o c h e m i s c h e r A b b a u v o n C a r b o x i n b e i G e g e n w a r t v o n E t r i d i a z o l in v e r s c h i e d e n e n K o n z e n trationen Abszisse: —log K o n z e n t r a t i o n [ m o l a r ] d e s E t r i d i a zols O r d i n a t e : V e r m i n d e r u n g d e r K o n z e n t r a t i o n des Carb o x i n s , bei e i n e r A u s g a n g s k o n z e n t r a t i o n v o n 200 [J.M/ dm3

U m den Einfluß des Mediums auf die Sensibilisierung überprüfen zu können, haben wir die photochemischen Umwandlungen in äthanolischer und in wässriger Lösung miteinander verglichen. Die A b n a h m e der Konzentration des Ethirimols war in wässrigem Milieu etwas größer als im alkoholischen, der Abbau des Carboxin zeigte umgekehrte Beeinflussung; Dies gibt einen Hinweis darauf, daß der Sauerstoff bei dieser photochemischen U m w a n d l u n g nicht mitwirkt, denn Äthanol enthält mehr gelösten Sauerstoff als Wasser. Aus den kinetischen Versuchen geht hervor, daß der intermolekulare Energie-Austausch beim Prozeß der Photosensibilisierung der untersuchten Fungizide die entscheidende Rolle spielt. Der Sensibilisator n i m m t chemisch an der Reaktion keinen Anteil. Die P h o t o k a t a l y s e t r i t t nur bei Molekiil-Abständen entsprechend der Theorie v o n FÖRSTER a u f .

Der Einfluß v o n Begleitstoffen auf die Sensibilisierung E s ergibt sich n u n die Frage, ob eine Photosensibilisierung auch innerhalb des B l a t t gewebes möglich ist. I m allgemeinen läßt sich sagen, daß weder der aufgenommene Wirkstoff noch eventuell vorhandene Sensibilisatoren im I n n e r n des Blattgewebes eine solche Konzentration erreichen, daß die kritischen Molekülabstände zwischen D o n a t o r u n d Akzeptor erreicht werden. Trotzdem k a n n es zu Reaktionsmöglichkeiten kommen:

T r a n s m i s s i o n von E r r e g u n g s e n e r g i e bei F u n g i z i d e n

35

a) durch Komplex-Bildung zwischen Donator und Akzeptor b) durch physikalische oder chemische Bindung beider Moleküle an eine dritte Komponente c) durch Konzentration der Komponenten in Lipid-Phasen im Blattgewebe. Mit der ersten Möglichkeit braucht man nur in Sonderfällen zu rechnen. Das Vorhandensein der zweiten Möglichkeit wurde an Naturstoffen nachgewiesen. Die Fluoreszenz von 10" 5 M/dm3 NADH wurde durch 10~ 3 M/dm 3 ADP stark vermindert. Zehnfache Verdünnung eliminierte diesen Effekt vollständig. Wenn nun Laktat-Dehydrogenase zu dieser verdünnten Mischung gegeben wurde, zeigte sich wieder eine Fluoreszenzlöschung. Das Enzym allein verursachte aber keine Verminderung der Fluoreszenz von NADH. Ähnlich wurde die Fluoreszenzlöschung von Eosin durch Seedwax untersucht. Oleyl-methyltaurid (Arkopon) wurde als dritte Komponente gewählt. Seine Bindung an Seedwax war früher schon nachgewiesen worden [5]. Ein Einfluß des Arkopons auf den Energie-Transport vom Eosin zum Seedwax war schon in einer Konzentration von 10" 5 M/dm 3 ausgeprägt vorhanden (Tab. 2). Tabelle 2 Verminderung der Fluoreszenz Arkopon daran Eosin

Seedwax

IO'5 M/dm3 IO" 5 M / d m 3 10"5 M/dm3

10"3 M/dm3 IO" 4 M / d m 3 10"4 M/dm3

(— Alf)

von

Eosin

Arkopon — —

10"5 M/dm3

durch

Seedwax

und

der Einfluß

von

-Alf 40% 10% 42%

Wir wollten auch prüfen, ob ähnliche Einflüsse auf die Photosensibilisierung existieren. 3 X 10~ 5 M/dm 3 Etridiazol sensibilisieren den photochemischen Abbau gleicher Ethirimol-Konzentrationen geringfügig. Wir haben dann Arkopon oder Emulsogen E L (einen nichtionogenen Emulgator vom Polyoxyäthylen-Typ) bzw. einen wässrigen Extrakt aus Weizen-Blättern zur wässrigen Ethirimol-Lösung gegeben. Die Detergentien wurden in Konzentrationen angewendet, die Micellenbildung und dadurch „Solubilisierung" der Fungizide ermöglichten. Entgegen unseren Erwartungen verminderten alle Begleitstoffe den Sensibilisierungseffekt (Tab. 3). I n Versuchen von T A N A K A u. a. [10] steigerte dagegen Micellenbildung den photochemischen Abbau von Tabelle 3 Der Einfluß verschiedener Beimengungen auf den durch Ethridiazol sensibilisierten photochemischen Abbau von Ethirimol (—ACe). Die Konzentration beider Fungizide = 3 X 10 ¡i M/dm? Beimengungen

-C

_

21,5 [¿M/dm 3 12 [¿M/dm 3 13 ¡¿M/dm 3 3 ¡¿M/dm 3 0 [¿M/dm 3

1 g/dm3 Arkopon 0,5 g / d m 3 E m u l s o g e n E L 5 g/dm3 Emulsogen E L 3 g/dm3 W e i z e n - E x t r a k t SD5O/O 3*

e

2 ¡¿M/dm 3

36

GY.

JOSEPOVITS

Monuron. Unser negatives Ergebnis ist wahrscheinlich so zu erklären, daß die Detergenz-Micellen nur eines der beiden Fungizide" solubilisiert" haben. Dadurch wurden die Komponenten weiter getrennt statt angenähert. Dasselbe gilt wahrscheinlich für Weizenextrakte, die, wie wir früher bereits zeigten, Komponenten enthalten, die mit Etridiazol Addukte bilden [4]. Schlußfolgerungen Unter den Systemfungiziden gibt es Wirkstoffe, die zu einem intermolekularen Energie* Austausch mit anderen Fungiziden oder mit anderen Verbindungen fähig sind. Das gibt die Möglichkeit eine photochemische Inaktivierung auch solcher Wirkstoffe zu sensibilisieren, die relativ stabil sind. Die praktische Bedeutung der hier näher untersuchten Beispiele besteht in der Verallgemeinerungsfähigkeit dieser Erkenntnisse und nicht so sehr in den konkreten Ergebnissen dieser Beispiele, die sich nicht auf Blatt-Fungizide beziehen. Bei Anwendung von Wirkstoff-Kombinationen sollte man auch die Möglichkeit einer Sensibilisierung des photochemischen Abbaues des einen Wirkstoffes durch den anderen in Betracht ziehen. Auch Naturstoffe im Blattgewebe oder in Exudaten können einen photokatalytischen Effekt ausüben. Die Verhältnisse im Innern des Blattgewebes sind für die Sensibilisierung photochemischer Inaktivierungen weniger günstig als die an der Blattoberfläche. Anwesende Naturstoffe können die Sensibilisierung aber steigern oder verringern. Dies hängt vom chemischen Charakter des Wirkstoffes ab. Die Sensibilisierung des photochemischen Abbaues bestimmter Naturstoffe (wie z.B. des Chlorophylls) durch ins Blatt aufgenommene Wirkstoffe kann eine der Ursachen der Phytotoxizität sein. Unsere Ergebnisse beziehen sich auf die intermolekulare Übertragung von Erregungsenergien aus Lichtadsorptionen. Sie lassen die Frage offen, ob solche Wirkstoffe auch in Transmissionsprozesse von aus chemischen Quellen stammenden Erregungsenergien eingreifen können. Danksagung I c h danke F r a u D r . M. GASZTONYI für wertvolle Mitarbeit bei einem Teil der Versuche sowie D r . K . SZÖKE für die Möglichkeit, spektrophotofluorimetrische Messungen im I n s t i t u t für Gesundheitswesen durchführen zu können.

Literatur [ 1 ] BUCHENAUER, H . , Untersuchungen über die S t a b i l i t ä t verschiedener systemischer Fungizide gegenüber Einwirkung von U V - und Sonnenlicht auf Glas und B l ä t t e r n von Bohnenpflanzen I n t e r n . S y m p . Systemfungizide. A k a d . Verlag, Berlin, 1975, 327 [ 2 ] C L A R K , T „ D . A . M . W A T K I N S , P h o t o l y s i s o f d i c h l o f l u a n i d , P e s t i c . S e i . I) ( 1 9 7 8 ) ,

[3]

to 228

225

C L A R K , T . , U. a., Photolysis, metabolism and other factors influencing the Performance of triadimephon as a powdery mildew fungicide, P e s t i c . Sei. !) (1978), 497 — 506 [4] GASZTONYI, M., F a k t o r e n , die die S e l e k t i v i t ä t der fungitoxischen W i r k u n g von E t h a z o l beeinflussen, Abhandl. d. A k a d . Wiss. D D R 1979, N2, I n t e r n . S y m p . Systemfungizide, A k a d . Verlag, Berlin, 1979, 207 — 213

T r a n s m i s s i o n v o n E r r e g u n g s e n e r g i e bei F u n g i z i d e n

37

V e r s u c h e m i t einigen h e t e r o z y k l i s c h e n S t i c k s t o f f v e r b i n d u n g e n h i n sichtlich ihres T r a n s p o r t e s d u r c h Z e l l - M e m b r a n e n I n t e r n . S y m p . S y s t e m f u n g i z i d e . A k a d . V e r l a g , B e r l i n , 1975, 279 [6] K N O X , R . S., E x c i t a t i o n e n e r g y t r a n s f e r a n d m i g r a t i o n : T h e o r e t i c a l c o n s i d e r a t i o n s , i n : G O V I X D J E E ( E d . ) , B i o e n e r g e t i c s of p h o t o s y n t h e s i s . A c a d . P r e s s , N e w Y o r k , 1 9 7 5 , [ 5 ] JOSEPOVITZ, GY.,

183-221

[7] ROUCHARD, J . , u . a., P h o t o d e c o m p o s i t i o n of p i p e r a z i n e in w a t e r b y " s u n l i g h t " u l t r a violet r a d i a t i o n , P e s t i c . Sei. !) (1978), 3 0 5 - 3 0 9 [ 8 ] SILBER, J . , C . PREVITALI, N . SILBERA, P h o t o r e a c t i o n s of r i b o f l a v i n i n t h e p r e s e n c e of

2 , 4 - d i c h l o r o - p h e n o x y a c e t i c acid (2,4-D), J . Agric. F o o d C h e m . 24 (1976), 679 — 680 [9] STEINBERG, I . Z., L o n g - r a n g e n o n r a d i a t i v e t r a n s f e r of electronic e x c i t a t i o n e n e r g y in p r o t e i n s a n d p o l y p e p t i d e s , A n n . R e v . B i o c h e m . 40 (1971), 8 3 — 1 1 4 [ 1 0 ] TANAKA, F . S . , R . G . W I E N , E . R . MANSAGER, E f f e c t of n o n i o n i c s u r f a c t a n t s o n t h e

p h o t o c h e m i s t r y of 3 - / 4 - c h l o r o p h e n v l - / l ,1 - d i m e t h y l u r e a in a q u e o u s s o l u t i o n , J . A g r i c . F o o d C h e m . 27 (1979), 7 7 4 - 779

D . J . ADAMS a n d G . W .

Department

of Microbiology,

GOODAY

University

of Aberdeen.

U.

K.

Chitin Synthesis as a Target — Current Progress

There is a requirement for wide-spectrum, non-toxic antifungal compounds active against h u m a n a n d animal pathogens, as contemporary anti-fungal drugs are variably toxic in therapeutic dosage. Chemotherapy is a problem of comparative biochemistry in t h a t t h e effectivness of a chemotherapeutic agent is dependent u p o n there being a n exploitable difference between the pathogen a n d the host. The chemical n a t u r e of present d a y anti-fungal antibiotics, for example the polyenes, a n d so their effects, lack t o t a l specificity in t h a t in addition to destroying fungal cells t h e y also have det r i m e n t a l effects on the cells of the host. Chitin synthase is t h e enzyme responsible for t h e catalysis of the last step in chitin biosynthesis. I t is found in fungi b u t not in m a m m a l s and so a specific inhibitor might be expected to prevent growth of fungi, b u t should lack host toxicity. T h e analogy is with the inhibition of bacterial cell wall synthesis b y penicillin. There is one group of compounds with this mode of action, t h e polyoxins. T h e y are powerful specific antifungal antibiotics t h a t have been used widely in J a p a n as agricultural fungicides. T h e y were discovered in 1 9 6 3 ( S U Z U K I et al. [ 1 1 ] ) a n d the producing strain classified as Streptomyces cacoi var. asoensis. More recently nikkomycin, a closely related antibiotic, was described f r o m a strain of Streptomyces tendae ( D A H N et al. [6]). There is strong evidence to suggest t h a t the p r i m a r y mode of action of the polyoxins involves chitin biosynthesis. E N D O et al. [ 7 ] showed t h a t polyoxin J) competitively inhibited t h e synthesis of chitin b y h y p h a e of Neurospora crassa. All subsequent work has borne out their suggestion t h a t t h e anti-fungal properties of the polyoxins are d e p e n d e n t upon the structural resemblence of these compounds to t h e substrate molecule for chitin biosynthesis, UDP-N-Acetylglucosamine (UDP-GlcNAc) (GOODAY [8]). A group of compounds with structures resembling part or all of the UDP-GlcNAc molecule was selected for study. Their inhibitory properties were tested against a solubilized chitin synthase preparation f r o m Coprinus cinereus a n d compared with those of polyoxins. The synthesis of a polyoxin-type compound was also investigated a n d the inhibitory properties of the compound derived, 5'-0-octanoyluridine, were tested against a solubilized enzyme preparation. The anti-fungal activity of nikkomycin, which has already been described as a p o t e n t inhibitor of chitin synthase f r o m C. cinereus ( B R I L L I N G E R [ 4 ] ) was tested against a pathogenic fungus. I n addition, the toxicity of nikkomycin to m a m m a l i a n cells was compared with the toxicities of a range of anti-fungal drugs.

40

D . J. ADAMS, G. W .

GOODAY

0 h /CN

HN

CH

l

II CH

A CH3COO-CH2

OH OH

0

II

HN

A

CH CH

00 AN / CH3-(CH2)-COO-CHJ

OH OH

HN

CH

I

fi OA

HO,

COOH

CH,

S

I

CH

N//

N

i

I3 ^CH CH

II

CH

/

CH

SNH

I

OH

OH OH

NH,

0 II

HN

. A H

I

OH

H

I

i

H

OH

H— C-—C — CNH.CO

NH,

OH

¿=0 -c—c- -NH- -CH-0

A CH

I

II

CH

N

I '

H OH OH

F i g . 1 . Structures of uridine derivatives. A, 5'-0-acetyluridine; B, 5'-0-octanoyluridine; C, nikkomycin; D, piomycin B/polyoxin L

Materials and Methods Preparation of chitin synthase and enzyme assays were as described by A D A M S & G O O D A Y [2]. Tunicamycin was dissolved in 1 M-NaOH before addition to the assay mixture and assays with 5'-0-0ctanoyluridine contained 1 0 % dimethylformamide. 5'-0-octanoyluridine was synthesized as described by A D A M S [1]. To test the effect of nikkomycin on Candida albicans, a suspension of yeast cells (Roche Products, Basle, Switzerland; strain 109) containing approximately 10 6 cells m l . 1 was used to inoculate a 9 cm Petri dish of Bacto-SABOURAUD dextrose agar (Difco, Detroit, Michigan, USA). Plates were surface dried in a laminar flow cabinet and antibiotic assay discs placed in the centre of the agar. 10 or 100 [ig of nikkomycin, dissolved in 20 ¡il of distilled water, were added to each disc. Plates were incubated at 30 °C. For cytotoxicity testing in vitro, V79 Chinese hamster fibroblast cells (Royal Marsden Hospital, Surrey, U.K.) were used under sterile conditions. A monolayer of cells was grown until just sub-confluent in a 200 ml tissue culture flask using medium I (Dulbecco's minimal essential medium (Gibco/Biocult) containing 1 5 % (w/v) foetal calf serum (Gibco/

Chitin synthesis as a target

41

B i o c u l t ) and g e n t a m y c i n ( S i g m a ; 200 [ i g m l 1 )), i n c u b a t e d a t 37 °C and 9 0 % h u m i d i t y . T h e medium was removed and the monolayer rinsed with saline ( 1 . 0 % , w/v). Trypsin (Difco, 0 . 2 5 % w/v) in buffer (0.05 M-tri-sodium c i t r a t e ; 0.5 M - N a C l ; p H 7.6) was added to the flasks so t h a t it j u s t covered the cells. F l a s k s were incubated a t 37 °C for 10 min. A cell suspension was prepared b y adding a p p r o x i m a t e l y 40 ml of medium I . T h e suspension was transferred to two plastic universal bottles and centrifuged (50 g, 5 min). T h e pellet was resuspended in medium I . A single-cell suspension was ensured b y vigorous pumping with a P A S T E U R pipette. Cells were counted using a C O U L T E R counter (Coulter E l e c t r o n i c s L t d . , D u n s t a b l e , Bedfordshire, U . K . ) and diluted with medium I to give a suspension containing 5 X 10 4 cells m i n " 1 . Drugs were dissolved in dimethylsulphoxide ( D M S O ) and added to 2 ml portions of cell suspension in the well of a C O S T A R culture plate 3 5 2 4 ( L . H . Engineering L t d . , S t o k e Poges, B u c k i n g h a m s h i r e , U K ) so t h a t a 0 . 5 % (v/v) solution of D M S O was prepared. Control incubations contained only D M S O . T h e plates were i n c u b a t e d a t 37 °C and 9 0 % h u m i d i t y for 4 — 5 days or until there was adequate growth in the control wells. T h e medium was discarded and the wells were washed four times with saline ( 1 . 0 % , w/v). 1 ml of a solution containing 0.19 M-Na 2 CO a , 0.1 M - N a O H , 0 . 4 m M - C u S O , • 5 H 2 0 , 0.9 mM-potassium sodium t a r t r a t e and 0.3 mM-sodium dodecyl sulphate in distilled water was dispensed i n t o each well. P l a t e s were incubated a t 37 °C for 30 min or until all the cell layers were digested. F O L I N and C I O C A L T E U ' S phenol reagent (0.1 ml) was added to each well with thorough mixing and plates incubated a t 37 °C for 60 min. Eggo nm was read in a P y e U n i c a m S P 1800 s p e c t r o p h o t o m e t e r . T o compensate for a n y residual protein originating from the growth medium, the instrument was adjusted to zero against digests from cell-free c o n t r o l s . A graph was drawn of E66Q nm against drug c o n c e n t r a t i o n (see F i g . 3). T h e a m o u n t of drug required to reduce cell protein concentration by half was called the I 5 0 of t h a t drug.

Results and Discussion Structural analogues of UDP-GlcNAc significantly inhibited the chitin synthase activity from. C. cinereus (Table 1). The natural products uridine, UDP, polyoxin L Table 1 Effect of natural and synthetic derivaties of uridine

on chitin synthase

activity

Compound

Concentration (mM)

% Inhibition

5'-0-Acetyluridine 5'-Amino-5'-deoxy-5-fluouridine 5'-Amino-2',5'-dideoxy-5-fluorouridine l-(5'-Deoxy-a-£-lyxofuranosyl)-5-fluorouracil l-(5'-Deoxy-/?-D-arabinofuranosyl)-5-fluorouracil l-(5'-Deoxy-j3-D-lyxofuranosyl)-5-fluorouracil 2'-Deoxy-5-fluoro-3-methyl-900

Drug conc. (p.g ml

1

)

photeriein B ;

A griseofulvin

Although the synthetic analogues tested here have not proved as inhibitory to the enzyme as the antibiotics polyoxin and nikkomycin, nevertheless the results show that this line of research is worth pursuing. The results of the inhibition of enzyme activity and fungal growth, and the non-toxicity to mammalian cells of the compounds discussed here shows us that the goal — of the devising of specific non-toxic antifungal agents — should be attainable in the forseeable future.

44

D . J . ADAMS, G . W . GOODAY

Diskussion P F L I E G E L : W h y have dimilin a n d its analogues no fungicidal activity ? T h e y are said to be inhibitors of chitin synthase. A D A M S : I do not know the mode of action of dimilin although I have been told t h a t it inhibits chitin synthase activity in insects. LYE: Dimilin u n d ähnliche Verbindungen haben keine Wirkung auf die Chitinsynthetase. Der Wirkungsmechanismus ist offensichtlich ganz verschieden von Polyoxin. A D A M S : On consideration of the structure of dimilin it appears unlikely, t h a t it inhibits chitin synthase b y acting as a substrate analogue. Indeed the mode of inhibition of dimilin is probably non-specific .As we have discussed it can inhibit chitinase activity a n d perhaps its in vivo inhibitory properties manifest themselves as a result of this alteration in the balance between chitin synthesis and lysis during growth. S I S L E R : A recent paper in Pesticide Biochemistry and Physiology shows t h a t polyoxin prevents chitin synthesis in insects. The effect is similar to t h a t produced b y diflubenzuron. Do these compounds act in the same manner ? A D A M S : SO far I a m aware, the mode of inhibition of chitin synthesis b y diflubenzuron is unknown. However it seems unlikely t h a t it imposes competitive inhibition in t h e manner of the polyoxin range of compounds. HRMOVA: H a v e You investigated some physico-chemical properties of your compounds. If the substance is lipophylic, it can p e n e t r a t e very quickly t h r o u g h the cell membrane, i.e. it is more effective t h a n t h e hydrophylic one. ADAMS: We have not examined the physico-chemical properties of our compounds in detail. I t would certainly be very interesting to establish the affinity of, for example 5'-octanoyluridine, for cell membranes. GEORGOPOULOS: I n view of the work done in J a p a n which showed t h a t polyoxins compete with dipeptides for the same permease, I would like to comment on the possibility of chitin synthase inhibition b y a structure, the u p t a k e of which would not be inhibited b y dipeptides ? L Y R : Wie Dr. GEORGOPOULOS erwähnte, fanden japanische Forscher, d a ß Polyoxin eine spezifische Permease braucht, u m in die Zelle aufgenommen zu werden. Das ist aber ein großer Nachteil f ü r eine Verbindung, d a Resistenzmutationen leicht eintreten können. E s würde aber gut die Selektivität erklären. Die Permease m ü ß t e artspezifisch unterschiedlich a u f t r e t e n . A D A M S : A S Professor L Y R said, it does seem a disadvantage for an inhibitor t o require t r a n s p o r t into t h e cell. P e r h a p s a group of chitin synthase inhibitors which readily diffuse into t h e fungal cell should be saught. However, it is difficult to envisage how such compounds could impose the specific inhibitors achieved b y polyoxins. E C K E R T : I s polyoxin-resistance in fungi dependent upon an alteration in the polyoxin-transport system ? W h a t is the evidence t h a t the active site of chitin synthetase is located within t h e cell permeability barrier. P r e s u m a b l y t h e enzyme must be closely associated with t h e elongating chitin microfibril. A D A M S : At t h e last Reinhardsbrunn symposium Dr. G O O D A Y suggested t h a t polyoxin resistance was dependent upon alteration in t h e polyoxin t r a n s p o r t system for two reasons: Polyoxin-resistant strains of fungi t h a t have arisen amongst polyoxin-

Chitin synthesis as a target

45

treated populations in the field have chitin synthases just as susceptible to inhibition by polyoxin; secondly, simple peptides strongly antagonise the action of polyoxin in vivo, but have no effect on the activity of chitin synthase in vitro. That is, if the entry of the polyoxin into the cells is the site of antagonism by the peptides, polyoxin resistant strains may achieve as a result of an alteration in their peptide transport system. On extraction, chitin synthase is generally associated with plasmamembrane fractions. Experiments including the effects of toxic compounds on chitin synthesis in protoplasts suggest that the active site of the enzyme is located on the inner surface of the plasmamembrane. The evidence suggests therefore that chitin synthase is an integral protein of the cell membrane, interacting with UDP-GlcNAc in the cytosol and forming the chitin microfibril on the outer face of the membrane. LYE: Gibt es Unterschiede im Abbau von Polyoxin und Nikkomycin innerhalb einer Pilzzelle ? Ist Nikkomycin stabiler ? A D A M S : We have no information on the comparative degradation of polyoxin and nikkomycin. Perhaps nikkomycin is an effective inhibitor of Candida albicans in vitro because it is a comparatively stable compound. Literature [1]

ID. J., Chitin synthase of Coprinus cinereus, P h . D. Thesis, University of Aberdeen, U . K . 1980 [ 2 ] A D A M S , D . J . & G . W . G O O D A Y , A rapid chitin synthase preparation for t h e assay of potential fungicides and insecticides, Biotechnology L e t t e r s 2 (1980), 75—78 [ 3 ] A D A M S , D . J . & G . W . G O O D A Y , P a r t i a l purification a n d characterisation of chitin synthase f r o m Coprinus cinereus, Abs. S7 —9, Special F E B S Meeting on E n z y m e s , Dubrovnik, Yugoslavia, April 1979 [4] B R I L L I N G E R , G. U., Metabolic products of microorganisms 181. Chitin s y n t h a s e f r o m f u n g i : a test model for substances with insecticidal properties, Archives of Microbiology 121 (1979), 7 1 - 7 4 [5] C H A T T A W A Y , F . W., M. R . H O L M E S , & J . E . B A R T O W , Cell wall composition of t h e mycelial and blastopore f o r m s of Candida albicans, J o u r n a l of General Microbiology 51 (1968), 3 6 7 - 3 7 6 ADAMS,

[6] BAHN,

U.,

H.

HAGENMAIER,

H.

HOHNE,

W.

A.

KONIG,

G.

WOLF,

& H.

ZÄHNER,

Stoffwechselprodukte von Mikroorganismen 154 Mitteilung. Nikkomycin, ein neuer Hemmstoff der Chitinsynthese bei Pilzen, Archives of Microbiology 107 (1976), 143-160 [ 7 ] E N D O , A . , K . K A K I K I , & T . M I S A T O , Mechanism of action of the a n t i f u n g a l a g e n t polyoxin D , J o u r n a l of Bacteriology 104 (1970), 1 8 9 - 1 9 6 [8] G O O D A Y , G . W., The action of polyoxin on fungi, A b h a n d l u n g e n Der Akademie Der D D R Nr. 2N " S y s t e m f u n g i z i d e " (1979), 1 5 9 - 1 6 8 [ 9 ] H O R I , M . , K . K A K I K I , & T . M I S A T O , I n t e r a c t i o n between polyoxin a n d the active centre of chitin synthase, Agricultural Biological Chemistry 38 ( 1 9 7 4 ) , 6 9 9 — 7 0 5 [ 1 0 ] S E L I T R E N N I K O F F , C. P., Competitive inhibition of Neurospora crassa chitin s y n t h a s e activity by tunicamycin, Archives of Biochemistry a n d Biophysics 195 ( 1 9 7 9 ) , 234-244 [11]

SUZUKI, S., K . ISONO, J . NAGUTSA, T . M I Z U T A N I , Y . K A W A S H I M A ,

& T . MIZUNO, A

new

antibiotic, polyoxin A, J o u r n a l of Antibiotics 18 (1975), 131 — 132

Acknowledgements W e t h a n k Mrs. J A N E H A W K E S , Mr. R. M I D D L E T O N and Mr. E . B A R B E R for their advice and able technical assistance, and Roche P r o d u c t s for financial support.

ST. NEUMANN u n d F .

Sektion

JACOB

Biowisnenschaften

der Martin-Luther-Universität

Halle-Wittenberg,

DDR

Neue Ergebnisse zur Carboxylhypothese des Phloemtransports von Xenobiotika

Der gezielte Einsatz von Pflanzenschutzmitteln erfordert in Abhängigkeit von der erwünschten Wirkung bestimmte Mobilitätseigenschaften der eingesetzten Verbindungen. Der Erfolg einer Wirkstoffbehandlung hängt in entscheidenem Maße davon ab, daß die Angriffsorte von den Substanzen zum geeigneten Zeitpunkt in ausreichender Konzentration erreicht werden. Besondere Bedeutung besitzen in diesem Zusammenhang Verbindungen, die gemeinsam mit den Assimilaten über das Phloem in der Pflanze verteilt werden und alle wachsenden und speichernden Teile oberhalb und unterhalb der Fütterungsstelle erreichen können. Sie gelangen auch in die nach der Applikation hinzuwachsenden Blätter, die ebenso wie andere wenig transpirierende Organe von xylemmobilen Substanzen nach Wurzelapplikation nicht erreicht werden. Die Zahl der phloemmobilen Xenobiotika ist jedoch außerordentlich gering. Die bisher bekannten Fungizide, Insektizide und Nematizide sind, wie Übersichten zeigen, fast ausschließlich xylemmobil, nur bei den Herbiziden finden wir einige Gruppen mit phloemmobilen bzw. ambimobilen Eigenschaften [7, 8, 1, 3]. Alle diese Verbindungen besitzen als gemeinsames strukturelles Merkmal eine Carboxylgruppe im Molekül. Offensichtlich erleichtert diese Struktur den entsprechenden Verbindungen den Eintritt in das Phloem. Dieser von unserer Arbeitsgruppe auf Grund einer Literaturrecherche gefundene Zusammenhang f ü h r t e zur Formulierung der Carboxylhypothese des Phloemtransportes von Xenobiotika, einer Arbeitshyptohese, die sich in den letzten J a h r e n als außerordentlich fruchtbar erwiesen hat. Alle von uns getesteten Substanzen zeigten nur dann einen Transport im Phloem, wenn sie eine -COOHGruppe im Molekül besaßen bzw. Metabolite mit dieser Gruppierung bilden konnten. Unabhängig von uns stellte C R I S P [1] ähnliche Zusammenhänge zwischen chemischer Struktur und Phloemmobilität bei Insektiziden fest. I n Analogie zu der von M I T C H E L L u. a. [5] vorgenommenen Umwandlung des xylemmobilen Chlorprophams in ein phloemmobiles Milchsäurekonjugat gelang es ihm, durch Konjugation des xylemmobilen Insektizids Matazil mit Milchsäure eine phloemmobile Verbindung zu erhalten. Eine wesentliche Stütze der Hypothese stellen Experimente dar, bei denen die Mobilit ä t bekannter Werkstoffe mit der ihrer carboxylgruppen-freien bzw. carboxylgruppenhaltigen Derivate verglichen wurde.

Material und Methoden Sinapis

a l b a w u r d e n a c h K e i m u n g auf F i l t e r p a p i e r in 1/10 k o n z e n t r i e r t e r N ä h r l ö s u n g n a c h [2] u n t e r k o n s t a n t e n B e d i n g u n g e n (15°, rel. L u f t f e u c h t i g k e i t 55 — 6 0 % , 16 S t u n -

ESCHRICH

48

ST. NEUMANN, F .

JACOB

den Licht) in einer Klimakammer angezogen. Zum Versuchszeitpunkt waren die Keimblätter fast ausgewachsen, die Primärblätter hatten ungefähr ein Drittel ihrer Endgröße erreicht. Die Applikation der zu untersuchenden Substanzen erfolgte durch Einstellen der Keimpflanzen in die radioaktive Lösung (Wurzelapplikation) bzw. durch Auflegen eines Keimblattes mit der Oberseite auf die Testlösung (Blattapplikation). Nach 3 Stunden wurden die Pflanzen in einzelne Abschnitte zerlegt, diese in Methanol extrahiert und die Radioaktivität im Plüssigkeitsszintillationszähler gemessen. Zur Charakterisierung des Mobilitätsverhaltens wurden folgende Größen berechnet: ^ , , dmp außerhalb des Fütterungsorgans , .„ Translokationsrate (%) = § h • 100 : dmp in der Gesamtpflanze Translokationsquotient proz. Anteil an der Gesamtradioaktivität in Wurzel und Hypokotyl nach Blattapplikation

(ICTR =

_

;

;

;

;

proz. Anteil an der Gesamtradioaktivität in Keimblättern und Spitze nach Wurzelapplikation Für die Yucca-Versuche wurden 20 —30 cm lange Abschnitte der Blütenstandsachsen von im Freiland kultivierten Yucca filamentosa-Pflanzen über die untere Schnittfläche mit den Testsubstanzen gefüttert. Das aus der oberen Schnittfläche austretende Exsudat wurde über 12 Stunden gesammelt, anschließend zur Trockne eingedampft, mit geeigneten Lösungsmitteln aufgenommen und dünnschichtchromatografisch auf Silufol getrennt. Die Auswertung der Chromatogramme erfolgte mit dem Dünnschichtscanner bzw. durch Messung der Radioaktivität der einzelnen Folienabschnitte im TRICARB. Die Achsen wurden in 1 cm lange Abschnitte zerlegt, mit geeigneten Lösungsmitteln extrahiert und die Radioaktivität der Extrakte gernessen. Isolierte Leitgewebe erhielten wir durch Präparation des zentralen Leitgewebsstranges aus den Blattstielen von Cyclamen spec. Nach 1 Stunde Wässerung in 0,25 mmol/1 CaS0 4 wurden kleine Abschnitte 1 h in inaktiver Substratlösung vorinkubiert, anschließend 1 h radioaktiv gefüttert (Substratansatz 10 mmol/1 Saccharose in 0,25 mmol/1 CaS0 4 bzw. 100 [xmol/1 MCPA in 0,25 mmol/1 CaS0 4 , MES-Puffer pH = 5, Temperatur 25 °C). Nach Auswaschen des AFS in 0,25 mmol/1 CaS0 4 für 10 min. wurde in Methanol extrahiert und die Radioaktivität gemessen. Eingesetze Verbindungen, spez. Aktivitäten und verwendete Laufmittel: U- 13 C-Saccharose, 540 mCi/mmol, Papier, n-Butanol: Aceton: H 2 0 = 2 : 7 : 1 ; U- 14 C-Glukose, 100 rnCi/ mmol, Papier, n-Butanol:Aceton:H 2 0 = 2 : 7 : 1 ; 2- u C-2,4-D, 28 mCi/mmol, Silufol, Benzol :Dioxan: Essigsäure = 9 0 : 2 5 : 4 ; 1- 14 C-MCPA, 60 mCi/mmol, Silufol, n-Butanol :Äthanol:3N NH 3 = 120:30:50; U- 3 H-Dichloranisol, 18,4 mCi/mmol, Silufol, Chloroform -.Aceton = 7 :3; Ring-"C-Defenuron, 2,06 mCi/mmol, Silufol, Chloroform: Aceton = 7 : 3 ; U- 3 H-Phenylureidoessigsäure, 294 mCi/mmol, Silufol, Ä t h a n o l : H 2 0 = 7:3, U- 3 H-Atrazin, 2,5 mCi/mmol, Silufol, Chloroform:Aceton = 7:3, U- 3 H-Alanyl-s-triazin, 2,9 mCi/mmol, Silufol, Äthanol:H a O = 7:3

Ergebnisse und Diskussion Zur Kennzeichnung des Mobilitätsverhaltens benutzten wir den von unserer Arbeitsgruppe entwickelten iSiwa^ns-Mobilitätstest. Mit ihm ist es möglich, mit relativ einfacher Versuchsanordnung und bei einer Versuchsdauer von nur 3 Stunden, das Mobilitätsverhalten einer Verbindung zu erkennen und quantitativ durch eine Größe, den Translokationsquotienten Q tr , zu beschreiben. Der Q tr drückt das Verhältnis zwischen der Phloem- und der Xylemmobilität einer gegebenen Verbindung nach Blatt- und Wurzelapplikation aus. Die für die einzelnen Mobilitätsgruppen charakteristischen Werte unterscheiden sich deutlich voneinander, so daß aus dem im Test

49

Zur C a r b o x a l h y p o t h e s e des P h l o e m t r a n s p o r t s

für die untersuchte Verbindung erhaltenen Ergebnis eine klare Zuordnung eines bestimmten Mobilitätsverhaltens erfolgen kann. Q tr -Werte > 1 besitzen phloemmobile Substanzen, Q tr -Werte < 0 , 2 kennzeichnen xylemmobile Verbindungen, Q ir -Werte zwischen 0,3 und 0,9 weisen Ambimobilität der Verbindungen aus. Man kann also erwarten, daß eine durch Variation in der Molekülstruktur bedingte qualitative Veränderung des Mobilitäsverhaltens sich auch in einer Veränderung des Q tr widerspiegelt. 2,4-D gilt als Standardbeispiel für phloemmobile Verbindungen, sie besitzt im Senftest einen Q tr von 6,4. Ausgehend von unserer Vorstellung, daß die Mobilität im Phloem durch das Vorhandensein der Carboxylgruppe bedingt ist, müßte mit dem Verlust dieser Gruppe auch die Fähigkeit im Phloem geleitet zu werden, verloren gehen. Durch Eliminierung der -COOH-Gruppe erhält man 2,4-Dichloranisol (Abb. 1). Diese

C!

Cl

2,b-Dichtorphenoxyessigsaure

U-Dichtomnisol Abb.

1

Verbindung zeigt nach Blattapplikation einen äußerst geringen Transport aus dem Fütterungsblatt. Nur 1,5% der aufgenommenen Radioaktivität sind in Wurzel und Hypokotyl nachzuweisen. Für 2,4-D liegt dieser Wert fast zehnmal so hoch. In zwei weiteren Beispielen versuchten wir durch Einführung von Carboxylgruppen in typisch xylemmobile Verbindungen Phloemmobilität zu erreichen. Das Harnstoffherbizid Defenuron verbleibt nach Blattapplikation zum größten Teil im gefütterten Keimblatt. In den durch den Phloemstrom erreichten Abschnitten Wurzel und Hypokotyl finden wir nur 0,9 % der durch die Pflanze aufgenommenen Radioaktivität, eine Menge, die vernachlässigt werden kann. Nach Wurzelapplikation beträgt die Translokationsrate 71%, in den Keimblättern und der Spitze finden wir 52,6%. Der Q tr liegt bei 0,03. Die durch Einführung einer -COOH-Gruppe erhaltene Verbindung zeigt ein völlig anderes Mobilitätsverhalten. I m Gegensatz zum Defenuron beträgt die Translokationsrate nach Blattapplikation 35,0%, der prozentuale Anteil an der Gesamtradioaktivität in der Wurzel und im Hypokotyl 18,2%. Der Q tr von 0,62 kennzeichnet die Verbindung als ambimobil (Abb. 2). Die Triazine sind ebenfalls ausgesprochen xylemmobile Substanzen. Atrazin z.B. zeigt im Sinapistest ein ähnliches Verteilungs-

0 Defenuron Blattapplikation: X

KB

98,1%

* KB

65,0%

0,9%

Qtr = 0,03 4

Systemfungizide

Q,r -0,62

Abb. 2

50

ST. NEUMANN, F .

Atrazin ? M^N ,„ I II s 3 CjHs-NH-C^ ^ ,C-NH-CH XCH3 Tabelle 1 Sinapis alba Verteilungsmuster von kation. Versuchsdauer:

' Alanyl-s-Triazin j.I i I

H-Atrazin und 3H-Alanyl-s-Triazin 3 It; 15°, rel. F. 60°/o

nach

3

3 H-Atrazin J?lattapplikation

A u f n a h m e (nmole) Außenlösung 5 X 10" 5 mol/1 Translokationsrate ( % ) % der Gesamtradioa k t i v i t ä t in Wurzel \ Hypokotyl J gefüttertem K e i m b l a t t ungefüttertem K e i m b l a t t Prirnärblättem Qtr

II

HOOC-(CH2)2-NH-C% ,C-NH-(CH2)2-COOH

22,9

3,1

53,9 46.1 20.2

1,7 96,6 0,6 0,8

33,7 0,05

Abb. 3 . Sinapis alba Verteilungsilluster von 1 4 C-Defenuron und 3 H Phenylureidoessigsäure nach Blattapplikation

Blatt-

und

Wurzelappli-

3 H-AlanyI-s-Triazin HlattappliWurzelapplikation kation

Wurzelapplikation

6,9

JACOB

0,75

2,3

13,4 1 J

7,6 86,6 2,6 3,2

25,1 74,9 12,5

1 \ 12,6 0,60

J

muster wie Defenuron (Q t r = 0,05). B e i dieser Stoffgruppe verknüpften wir den Grundkörper mit Aminopropansäure und gelangten zu einer Verbindung mit ambimobilen Eigenschaften (Qtl. = 0,60) (Abb. 3 ; T a b . 1). U n i die im Phloem transportierten Substanzen näher zu charakterisieren und auszuschließen, daß Stoffwechselprodukte der applizierten Verbindungen bei der Radioaktivitätsmessung im Senftest erfaßt wurden, führten wir eine R e i h e von E x p e r i m e n t e n mit Blütenstandsachsen von Yucca filamentosa durch. Wie T A M M E S u. a. [8] zeigten, handelt es sich bei dem aus der Schnittfläche austretenden E x s u d a t um reinen Phloemsaft. Wir applizierten an abgeschnittene 2 0 — 3 0 cm lange Blütenstandsachsen über die untere Schnittfläche die zu prüfenden Substanzen und sammelten über einen Zeitraum bis zu 12 Stunden das aus der oberen Schnittfläche austretende E x s u d a t . Anschließend wurde die Achse in 1 cm lange Abschnitte zerlegt und zur Radioaktivitätsmessung aufgearbeitet. Am E x s u d a t bestimmten wir ebenfalls R a d i o a k t i v i t ä t und trennten es dünnschichtchromatografisch auf. Tabelle 2 zeigt eine Zusammenstellung der Ergebnisse. I m E x s u d a t tritt nur bei Applikation von Verbindungen mit -COOH-Gruppen Radioa k t i v i t ä t auf. Mit Ausnahme von Glukose ist die applizierte Verbindung in allen Fällen unverändert im E x s u d a t nachzuweisen. Die carboxylgruppen-freien Verbindungen werden an der Schnittfläche zwar in die Achse aufgenommen und im X y l e m transportiert — eine Aufarbeitung der Achse zeigt eine durchgehende radioaktive Markierung — können aber offensichtlich nicht in das P h l o e m eintreten. E s ergibt sich die F r a g e nach dem Mechanismus, mit dem die Aufnahme der phloemmobilen, carboxylgruppen-haltigen X e n o b i o t i k a in das Phloem erfolgt. Nach unseren

Z u r C a r b o x y l h y p o t h e s e des P h l o e m t r a n s p o r t s Tabelle 2 Yucca filamentosa Applikation von ausgewählten

organischen

Verbindungen

51

an isolierte

Blütenstandsachsen

Applizierte Verbindung

Carboxylgruppenhaltig

Radioaktivitat im Exsudat

im E x s u d a t nachgewiesene radioaktive Verbindung

C-Defenuron H-Phenylureidoessigsäure 3H-Atrazin 3H-Alanyl-s-Triazin 14C-Glukose

— + — +

— • — + +

— 3H-I'henylureidoessigsäure — 3H-Alanyl-s-Triazin 14C-Saccharose

14 3

heutigen Kenntnissen muß angenommen werden, daß die Aufnahme in den Symplasten nicht den limitierenden Schritt darstellt. Experimentelle Beobachtungen zeigten, daß auch viele Substanzen, die nicht phloemmobil sind, wie z . B . Harnstoffe, gut in den Symplasten aufgenommen werden. Diese Aufnahme ist Voraussetzung für die entsprechende Wirkung dieser Verbindungen. Auch beim Transport durch die Wurzel muß für xylemmobile Substanzen spätestens an der Endodermis eine symplastische Passage angenommen werden. Als entscheidender Schritt muß die Aufnahme in den Siebröhren-Geleitzellen-Komplex angesehen werden. Untersuchungen der Aufnahmekinetik von MCPA in isoliertem Leitgewebe der Blattstiele von Cyclamen ergaben keinen Anhaltspunkt für eine Carrier-vermittelte Aufnahme. Die erhaltenen Kurven sprechen für eine Aufnahme durch Diffusion und unterscheiden sich deutlich von denjenigen, die für Saccharose erhalten wurden. Diese weisen eine MICHAELis-MENTEN-Kinetik auf mit einem K j r - W e r t von 11,1 mmol/1 und V m a x von 12,6 mol/gxh (Abb. 4). Wir müssen für Xenobiotika einen anderen Aufnahmemechanismus

annehmen als für Zucker. I m Apoplasten des Sli-GZ-Komplexes beträgt der pH-Wert 5, im Inneren der Siebröhre 8 [4], Alle von uns untersuchten phloemmobilen Xenobiotika zeigen in den beiden pH-Bereichen deutliche Unterschiede in ihren Verteilungskoeffizienten, bedingt durch den Übergang von der undissoziierten in die dissozierte Form. I m sauren Bereich sind sie wesentlich lipophiler als im basischen. E s ist denkbar, daß die im Apoplasten vorliegende undissoziierte, lipophile F o r m leicht in das 4»

52

ST. NEUMAUK, F . JACOB

Phloem eintreten k a n n , dort zur hydrophileren F o r m dissoziert, deren Austritt in den Apoplasten aber n u r sehr langsam erfolgt. Die Akkumulation der phloemmobilen Xenobiotika würde nach dem Prinzip einer Ionenfalle erfolgen. U n t e r diesem Gesichtsp u n k t wäre die Rolle der Carboxylgruppe beim P h l o e m t r a n s p o r t von Xenobiotika als die Fähigkeit der betreffenden Verbindung aufzufassen, bei unterschiedlichen p H Werten, die den physiologischen Bedingungen von Apoplast- u n d Siebröhre entsprechen, in 2 F o r m e n aufzutreten, die sich in ihrer Lipophilie u n d damit in ihrem Permeationsvermögen deutlich voneinander unterscheiden. E s bleibt zu prüfen, inwieweit das auch von anderen chemischen S t r u k t u r e n erreichbar ist. Diskussion ZANKE: Wir kennen n u r sehr wenige Fungizide mit freier Carboxylgruppe, z . B . einige Salizylsäure derivate. I n d e r Regel ist mit der E i n f ü h r u n g einer -COOH-Gruppe in ein aktives Molekül ein Verlust der fungiziden Wirksamkeit u m mehrere Größenordnungen verbunden. H a b e n Sie bei bestimmten Verbindungsklassen eine Korrelation zwischen der Größe des Q z v -Wertes und der Fungitoxizität gefunden ? NEUMANN: Wir haben bei allen unseren Untersuchungen keine P r ü f u n g der biologischen Aktivität vorgenommen. E s ist aber zu erwarten, daß die von uns vorgestellten -COOH-gruppenhaltigen Derivate der Wirkstoffe nicht mehr biologisch a k t i v sind. E s wäre von großer Bedeutung, wenn es gelänge, Substanzen zu synthetisieren, die von der Pflanze aufgrund bestimmter Molekülstrukturen gut aufgenommen u n d transportiert werden u n d a m Wirkort durch metabolische Prozesse in die biologisch aktiven Verbindungen umgewandelt würden. Ähnliche Überlegungen wurden von CEISP für Insektizide angestellt. LYR: Eine F r a g e a n Prof. SCHWINN: Wird Metalaxyl, ein ambimobiler Carboxylsäuremethylester, in der Pflanze gespalten, sodaß die freie Säure f ü r den in der Literat u r beschriebenen Phloem-Transport verantwortlich sein könnte ? SCHWINN: Metalaxyl wird zwar in X y l e m u n d Phloem transloziert, doch ist der X y l e m t r a n s p o r t sehr viel stärker ausgeprägt. Soweit wir wissen, wird das OriginalMolekül transloziert; die Säure t r i t t zwar als Metabolit auf, doch ist ihre fungizide Wirkung wesentlich kleiner als die des Original-Moleküls. Vielleicht k a n n die Tatsache, d a ß die Carboxylgruppe von Metalaxyl verestert ist, die relativ geringe Phloemmobilit ä t erklären. JOSEPOVITS: H a b e n Sie versucht eine Korrelation zwischen den gemessenen Q TR Werten u n d den p K a -Werten der Carboxylsäure zu finden ? NEUMANN: Alle bisher von uns untersuchten Verbindungen besitzen p K a -Werte, die die Dissoziation zwischen p H 5 u n d p H 8 möglich machen. Eine Korrelation zwischen der Lage des p K a -Wertes und der in das Phloem aufgenommenen Menge an Xenobiot i k u m ist zu erwarten. Wir werden diese Frage prüfen, z.B. durch eine vergleichende B e t r a c h t u n g der A u f n a h m e von Essigsäure u n d Trichloressigsäure. F ü r den E i n t r i t t in das Phloem genügt offensichtlich nicht, d a ß die Substanzen schwache Säuren schlechthin sind. Phenol z.B. ist auch eine schwache Säure, es ist aber nicht phloemmobil. Voraussetzung ist, daß die Säure bei p H 5 u n d p H 8 in zwei unterschiedlichen Formen, undissoziiert u n d dissoziiert a u f t r e t e n kann. F ü r Phenol liegt der p K a - Wert aber über 8. JOSEPOVITS: E s ist b e k a n n t , daß einige anionische dissoziierbare Verbindungen zur Komplexbildung mit kationogenen Stoffen fähig sind. E s könnte interessant sein zu

53

Zur Carboxalhypothese des Phloemtransports

untersuchen, ob eine solche Komplexbildung die Phloemmobilität beeinflussen könnte. N E U M A N N : Darüber haben wir keine Untersuchungen. C R I S P stellte auf dem IUPACKongreß in Zürich einige Derivate von 2,4-D vor und fand, daß nur die Verbindungen zur Translokation fähig waren, die in der Pflanze in die freie Säure umgewandelt wurden. MÜLLER: Die von Ihnen vorgestellten Ergebnisse beziehen sich auf den

Sinapis

alba-Test. Ist es denkbar, daß holzige Pflanzen anders reagieren und der von Ihnen für das Testregime ausgeschlossene „carrier Effekt" in holzigen Pflanzen wirken kann ? Haben Sie vergleichende Untersuchungen machen können ? N E U M A N N : Mit holzigen Pflanzen haben wir nicht gearbeitet. Vergleichende Mobilitätsuntersuchungen an anderen Testobjekten, Keimpflanzen von Cucumis sativus, Helianthus annuus und Linum usitatissimum haben aber, ebenso wie Experimente am isolierten Maisblatt, gezeigt, daß das im Sinapis-Test für eine bestimmte Substanz ermittelte Mobilitätsverhalten auch für alle anderen Objekte gilt. Eine Substanz, die im Sinapis-Test z.B. phloemmobil ist, ist auch in anderen Pflanzen phloemmobil. Unterschiede ergeben sich lediglich in quantitativer Hinsicht, z.B. in der Größe der beobachteten Translokationsraten. Hier spielen Stoffwechselvorgänge im Fütterungsorgan eine Rolle. Literatur [1] CRISP, C. E . , Molecular design of systemic insecticides and functional groups in translocation. Pesticid. Chem. P r o c . I n t . Congr. Pestic. Chem. 2nd 1 (1972), 211 — 2 6 4 [2] ESCHRICH, W . , Translocation 1 3 C-markierter Assimilate im L i c h t und im Dunkeln bei Vicia faba P l a n t a 7 0 ( 1 9 6 6 ) , 9 9 - 1 2 4 [ 3 ] J A C O B , F . , S T . NEUMANN a n d U . S T R O B E L , S t u d i e s o n m o b i l i t y o f e x o g e n a p p l i e d s u b -

stances in plants, Transactions of the 3rd symposium on accumulation of nutrients and regulators in plant organism, Warszawa, in Proceedings of the R e s e a r c h I n s t , of Pomology, Skierniewice, Poland, Ser. E . 5 (1973), 3 1 5 - 3 3 0 [4] MALEK, F . and D . A. BAKER, Proton Co-transport of sugar in phloem loading, P l a n t a 135 (1977), 2 9 7 - 2 9 9 [ 5 ] MITCHEL, J . W . , P . C . MARTH a n d W . H . PRESTON, S t r u c t u r a l m o d i f i c a t i o n t h a t

in-

263-265 [ 6 ] MITCHEL, J . W . , B . C. SMALE a n d R . C. METCALF, A b s o r p t i o n a n d t r a n s l o c a t i o n

of

creases translocability of some plant regulating c a r b a m a t e s ,

Science 120

(1954),

regulators and compounds used to control plant diseases and insects., in METCALF, R . C. (Hsg.), Adv. P e s t , control. R e s . , Interscience publishers, New Y o r k , 1960, Vol. 3, 3 5 9 - 4 3 6

[ 7 ] W A I N , R . L . a n d G . A . CARTER, i n TORGESON, D . C . ( H s g . ) , F u n g i c i d e s , A c a d e m i c p r e s s , N e w Y o r k , 1 9 6 7 V o l . 1, 5 6 1 - 6 1 1

[8] TAMMES, P . M. L . , C. R . VONK and J . VAN DIE, Studies on phloem exudation from Yucca flaccida HAW. X I . X y l e m feeding of 1 4 C-sugars and some other compounds, their conversion and recovery from the phloem exsudate, A c t a B o t . Neerl. 23 (1973), 233-327

M . H . KOJIOCOB, B . B . O H O N P N E H K O , JL. H . TJIANKOBA, M . T . K a p a n e T H H , O . A . MAMENOB, A . JL HHKOHOB XUMUU UMenii IlHcmumym GUOOPAHUHECKOIL AnadeMuu HayK CCCP, MocKea, CCCP

XMMHieciioe

Hayieiiiie

CPEFLH A H T H ( | ) y H r a j i b H b i x

M .

M .

AiiTii5iiOTHKa

IUeMftKuna

M\ropHu,Hiia

SHTHSHOTHKOB o c o S y i o

H Majio H3yieHHyio

n e c K O M OTHOiueHHH r p y n n y c o c T a B J i a i o T r y a H H H H H C O j x e p j K a m n e MaKpOJlHHbi: [ 4 , 7, 8 ] ,

a3ajIOMHUHHbI

Fx — F5

[1,

2],

KOnnaMimilH

B XHMH-

HenojmeHOBbie

[3],

HMSPWUHH [ 9 ] , N P H M I M H H [ 6 ] H H e K 0 T 0 p b i e n p y r n e .

HH^HMHIJHHbl OHH o6jianaroT

u i H p o K H M c n e K T p o M n e i i c T B H H , y r H e T a n p o c T n a T o r e H H b i x H K H T e j i b H b i x 6aKTepHtt F

h MHKo6aKTepnii.

HJIH B a r H H a n b H o r o

OnwcaHO

KJinHHnecKoe

npHMeHHe

a3anoMHUHHa

j i e n e H H H KAHHHFL030B H T p H X O M O H a n o 3 a ,

a HHKHBAET

2 0 . n O C K O J I b K y B BOJJHO-MeTaHOJIbHOM

paCTBOpe

0CH0BH0CTbro ( p K a 3 , 5 — 4 ) , HO T H T p y e T C H

MOHOKHCJIOTa, aHTH6HOTHK yKa3biBaeT

Ha

ero

HBJiaeTCH

BepoHrayio

MeONa

HBHTTep-HOHOM. 3 n e -

SMnnpHHecKyio

opMyjiy

56

M. H. K o j i o c o b h «p.

ryaHHHHHOBOü r p y n n n p o B K H b HMgpHHHHe 6 h j i o HOKa3aHO JiyJ^aBHca, p e a n u n n C a n a r y q H , K a n h cjienoBajio o>KHaaTb h j i h Tpex3aMemeHHoro ryaHHHHHa, 6biJia 0TpHijaTejibH0H. riocKOJibKy n p n ?KecTKOM mejiOHHOM rHnpojiH3e HMSpmjiiHa 06pa30BbiBancH TOJibKO o j j h h jieTyHHii aMHH — MeTHJiaMHH, a aMMHana h nHMeTHJiaMHHa o6Hapy>KHTb He y g a j i o c b , H3 Tpex B03M0?KHbix nacTHHHbix opMyji ( 1 — 3 , R = C 5 3 H 9 4 0 1 8 ) aHTHÓHOTHKy 6bijia n p H n i i c a H a opMyjia (3). OHa 6biJia p a c m n p e H a no (J»opMyjibi (4), TaK K a n enHHCTBeHHbiM JierKOKHnamHM nponyKTOM KHCJiOTHoro HajmnHe

opecqeHTHoñ peamineñ KoHa h

MeTaH0JiH3a

HMSpmiHHa

o n a 3 a j i C H HHMeTHJiMajioHaT,

HAeHTH(|)HmipoBaHHbiií

xp0MaT0-Macc-cneKTp0MeTpHeñ, h JiorHHHO Smjio npennojio>KHTb, hto MaJioHOBan KHCJiOTa CBH3aHa b M o n e K y n e aHTHÓHOTHKa b (JiopMe KHCJioro 3 e

"o C SJ O;

S C .2

w

c 10 ® —> tc ^

o3 S

o ^cß s S CO tfl ® ° ei ^ S «

o o S S tS

^ S s S e o

^ W

Wirkungsspektrum zeigt, im Vergleich zum Chloroneb alle biologischen Wirkungen nahezu Chloroneb-identisch sind, scheint es sich hierbei u m einen nachgeordneten E f f e k t zu handeln. Nach W E I N B A C H u n d G A R B U S [7] ist f ü r chlorierte Phenole neben der E n t k o p p l e r wirkung die Bindung an Mitochondrienproteine von essentieller Bedeutung. Chloroneb und DCMP unterscheiden sich hierin offenbar n u r geringfügig, so d a ß ihr primärer 5

Systemfungizide

66

P . WERNER, H . LYR

Abb. 3. Sauerstoffaufnahme durch Keimmyzelien von Mucor mucedo im W a r b u r g - A t mungstest nach I n k u b a t i o n verschiedener K o n z e n t r a t i o n e n von 2,5-Dichlor-4-methoxyphenol (nach LYR, unveröffentlicht)

Wirkungsmechanismus identisch ist. DCHQ hat dagegen einen stärkeren Entkopplereffekt, aber keine Chloroneb-analoge Wirkung. Chloroneb ist als Fungizid besonders dadurch interessant, daß es eine ausgeprägt selektive Wirkung gegenüber einigen Pilzarten, darunter den wirtschaftlich bedeutsamen Oomycetengattungen Pythium und Phytophthora besitzt. Unsere Ergebnisse deuten die Möglichkeit an, daß die artspezifisch unterschiedliche Affinität von Mitochondrienmembranen eine Ursache für diese Selektivität ist. Vergleichende Untersuchungen der Aminosäure-Zusammensetzung von Mitochondrienmembranen-Protein aus einem sensiblen und einem resistenten Mucor mucedo Stamm ergaben eine mutative Veränderung der Aminosäurezusammensetzung. So wurde beim resistenten Stamm, der aus dem sensiblen über mehrere Passagen isoliert worden war (BISCHOFF und LYR [2]), nur noch ein Tyrosin-Anteil von 0 , 2 % festgestellt, während der Tyrosin-Gehalt des sensiblen Stammes 2 , 9 % betrug. Alle anderen Aminosäuren waren bei R- und S-Stämmen in absolut gleichen Proportionen vorhanden (Tab. 4). Modellvorstellungen von AESCHBACH et al. [1] zufolge ragen die hydrophoben Tyrosinreste aus den Peptidketten heraus und tragen durch Wasserstoffbrückenbildung wesentlich zur Stabilisierung der Proteinstruktur bei. Denkbar wäre, daß Chloroneb auf bisher unbekannte Weise mit diesen hydrophoben Resten in Wechselwirkung tritt und entweder Protein-Bindungen oder die spezifischen und anfälligen Protein-Phospholipid-Bindungen stört. Diese Wechselwirkungen könnten zu Konfigurationsänderungen, allosterischen Aktivierungen oder Inaktivierungen der an die Mitochondrienmembran gebundenen Enzyme führen, was eine unspezifische Re-

Wirkungsniechanismus von Chloroncb und Resistenz bei Mucor Tabelle 4 Aminosäure-Zusammensetzung der Mitochondrienproteine Ii- und S-Stämmen von Mucor mucedo (Auswald) Aminosäure

R 3/1

S3

Lysin Histidin Threonin Serin Alanin Valin Methionin Leucin Tyrosin Phenylalanin

7,1 2,8 6,3 7,1 10,5 7,5 1,3 9,2 0,2 4,8

6,9 2,7 5,7 6,8 10,1 7,5 1,9 8,8 2,9 4,7

67

von

d u k t i o n des 0 2 - V e r b r a u c h e s erklären würde. D e n b k a r e Folge solcher Wechselwirk u n g e n k ö n n t e a u c h die F r e i s e t z u n g bzw. A k t i v i e r u n g m e m b r a n g e b u n d e n e r P r o t e a s e n sein, die M e m b r a n z e r s t ö r u n g e n bewirken u n d d a d u r c h einen K a t a s t r o p h e n z y k l u s einleiten, ähnlich wie er f ü r Terrazol [6] beschrieben wurde. Als U r s a c h e n der Selekt i v i t ä t sind wahrscheinlich a u c h neben unterschiedlichen P r o t e i n s t r u k t u r e n U n t e r schiede in der L i p i d - Z u s a m m e n s e t z u n g z. B . die P h o s p h o l i p i d - S t e r o l - R e l a t i o n b e d e u t sam, die die räumliche S t r u k t u r der M e m b r a n u n d ihre S t a b i l i t ä t b e e i n f l u ß t . D e m P r o b l e m der selektiven W i r k u n g von Chloroneb soll in weiteren U n t e r s u c h u n g e n n a c h gegangen werden. Bei einzelnen P i l z a r t e n k ö n n e n unterschiedliche U r s a c h e n vorliegen, wie der Nachweis von 2 bis 5 d i f f e r e n t e n R - G e n e n bei a r o m a t i s c h e r H y d r o k a r b o n Fungizid-Resistenz zeigt [3]. N e b e n der M i t o c h o n d r i e n m e m b r a n b i n d e n o f f e n b a r a u c h a n d e r e M e m b r a n e n d a s E P R Chloroneb, was E f f e k t e im K e r n b e r e i c h u n d Anomalien der Chromosomen-Verteilung zur Folge h a b e n k ö n n t e (GEORGOPOULOS [3]). Diskussion SCHWABE: W u r d e n a u c h die S t r u k t u r p r o t e i n e der M i t o c h o n d r i e n isoliert u n d die B i n d u n g a n diese bei sensiblen u n d resistenten S t ä m m e n u n t e r s u c h t ? WEENER: ES

w u r d e n keine gereinigten P r o t e i n e u n t e r s u c h t .

GROSSMANN: Sie e r w ä h n t e n die gute W i r k u n g v o n Chloroneb gegen O o m y c e t e n ( Pythium, Phytophthora). H a b e n Sie g e p r ü f t , ob a u c h die M i t o c h o n d r i e n - M e m b r a n e n solcher Pilze eine hohe A f f i n i t ä t zu Chloroneb aufweisen ? WERNER: A f f i n i t ä t s u n t e r s u c h u n g e n nicht d u r c h g e f ü h r t .

an

Oomyceten-Membranen

wurden

bisher

JOSEPOVITS: Sie h a b e n gezeigt, daß Chloroneb u n d sein M e t a b o l i t D i c h l o r o - m e t h oxy-phenol eine ähnliche fungitoxische W i r k u n g h a b e n . H a b e n Sie g e p r ü f t , ob dieser Metabolit gleiche Unterschiede in der B i n d u n g a n M i t o c h o n d r i e n - M e m b r a n e n des empfindlichen u n d resistenten S t a m m e s zeigt wie Chloroneb u n d ob Kreuzresistenz zwischen beiden V e r b i n d u n g e n b e s t e h t ?

WERNER: An m a r k i e r t e n Metaboliten h a b e n wir keine B i n d u n g s u n t e r s u c h u n g e n d u r c h g e f ü h r t . Zwischen Chloroneb u n d D C M P b e s t e h t in h o h e m M a ß e Kreuzresistenz.

68

P. WEENER, H .

LYR

D A V I D S E : Did you look at the kinetics of the binding of chloroneb to the mitochondrial protein ? It should be interesting to know whether you can saturate the binding site, indicating a specific binding. W E R N E R : Wir haben keine kinetischen Untersuchungen zur Bindung von Chloroneb an Mitochondrienprotein durchgeführt. Wir haben bisher kein gereinigtes Protein hergestellt, um solche hochspezifischen Bindungsuntersuchungen durchführen zu können. S C H E W E : Aufgrund der hier vorgestellten ultrastrukturellen und biochemischen Veränderungen der Membranen muß man mit einer möglichen Wirkung des Chloroneb über den Radikalstoffwechsel rechnen. Xenobiotika, die in situ Radikale bilden können, führen in tierischen Zellen zu ähnlichen Veränderungen. Daher wäre es interessant, die zelleigenen Schutzsysteme gegen Radikalschädigungen, wie z.B. SuperoxidDismutase und Glutathion-Peroxidase, sowie den SH-Gehalt der Mitochondrien von resistenten und empfindlichen Pilzen vor und nach Chloroneb-Behandlung zu untersuchen. Auch die auffälligen Unterschiede im Tyrosingehalt ließen sich in dieser Hinsicht erklären, da Tyronsinreste bei Radikalschädigungen besonders leicht angegriffen werden.

Literatur [ 1 ] AESCHBACH, R . , R . AMADO, H .

[2]

[3] [4] [5]

[6] [7] [8]

[9]

NEUKOM, F o r m a t i o n

of D i t y r o s i n e C r o s s - L i n k s

in

P r o t e i n e b y O x y d a t i o n of T y r o s i n e R e s i d u e s , B i o c h e m . et. B i o p h y s . A c t a 435) (1976), 292 B I S C H O F F , G . u n d H . L Y R , D a s R e s i s t e n z v e r h a l t e n v o n Mucor mucedo L . F R E S . gegenü b e r C h l o r o n e b u n d a n d e r e n F u n g i z i d e n , A r c h . f. P h y t o p a t h o l . u . P f l a n z e n s c h u t z 1980, im D r u c k GEORGOPOULOS, S. G., D e v e l o p m e n t of f u n g a l r e s i s t a n c e to f u n g i c i d e s , I n : A n t i f u n g a l C o m p o u n d s , Vol. I i , M. R . S I E G E L a n d H . D . S I S L E R , D E K K E R , N e w Y o r k , 1977 H O C K , W . K . a n d H . D . S I S L E R , S p e c i f i t v a n d M e c h a n i s m of A n t i f u n g a l A c t i o n of C h l o r o n e b , P h y t o p a t h o l o g y 59 (1969 a), 627 H O C K , W . K . a n d H . D . S I S L E R , M e t a b o l i s m of C h l o r o n e b b y Rhizoctonia solani a n d o t h e r F u n g i , J . A g r . F o o d C h e m . 17 ( 1 9 6 9 b ) , 123 RADZUHN, B., Z u m W i r k u n g s m e c h a n i s m u s des s y s t e m i s c h e n F u n g i z i d e T e r r a z o l D i s s e i ' t a t i o n s s c h r i f t , H u m b o l d t - U n i v e r s i t ä t zu B e r l i n 1978 WEINBACH, E . a n d J . GARBUS, T h e I n t e r a c t i o n of u n c o u p l i n g P h e n o l s w i t h Mitoc h o n d r i a a n d w i t h M i t o c h o n d r i a P r o t e i n , J . Biol. C h e m . 240 (1965), 1811 WERNER, P . , H . LYR u n d G. CASPERSON, Die W i r k u n g v o n C h l o r o n e b , einigen A b b a u p r o d u k t e n u n d c h l o r i e r t e n P h e n o l e n auf d a s W a c h s t u m u n d die U l t r a s t r u k t u r einiger P i l z a r t e n , V o r t r a g I n t e r n . S y m p o s i u m „ S y s t e m f u n g i z i d e " R e i n h a r d s b r u n n 1977, A k a d e m i e - V e r l a g 1979, 299 WIESE, M. V. a n d J . M. VARGAS, I n t e r c o n v e r s i o n of C h l o r o n e b a n d 2,5-Dichlor-4m e t h o x y p h e n o l b y soil M i c r o o r g a n i s m s , P e s t i c i d e B i o c h e m . a n d P h y s i o l o g y 3 (1973), 214

H. L Y R und G.

CASPERSON

Institut für Pflanzenschutz]orschuncj Kleinmachnow, DDK

der Akademie

der

Landwirtschaftsiuissennchaften,

Pathologische Zellwandsynthese bei Mucor mucedo ( L . ) F R E S . unter Einwirkung einiger Fungizide und anderer Verbindungen

E i n e anomale Zellwandverdickung unter der Einwirkung wachstumshemmender Konzentrationen einiger Fungizide, z . B . Terrazol, Chloroneb und Pentachlornitrobenzol ( P C N B ) konnte bei Mucor mucedo elektronenoptisch nachgewiesen werden ( L Y R U. a . [ 1 1 ] , C A S P E R S O N u n d L Y R [ 5 , 6 ] , W E R N E R u . a . [ 2 4 , 2 5 ] , R A D Z U H N u n d C A S -

Hierbei wird das normale Spitzenwachstum mehr oder weniger stark blockiert, es entsteht ein dickwandiges Myzel mit oft bizarren Verzweigungen (Abb. 1). B e i anderen Mucorules-Arten wird ein hefeartiges W a c h s t u m ( Y - F o r m ) mit gleichzeitiger Zellwandverdickung ausgelöst, wobei die Neigung zum M (mycelial) — Y (yeast) — Dimorphismus bei den einzelnen Arten unterschiedlich stark ausgeprägt ist.

PERSON [ 1 9 ] ) .

Während man ursprünglich in einer Umschaltung des Stoffwechsels auf Glykolyse (Anaerobiose) oder Schädigung der Atmungsfunktion eine hinreichende E r k l ä r u n g für den Übergang von der M- zur Y - F o r m sah ( B A R T N I C K I - G A R C I A [ 1 ] , T E R E N Z I und S T O C K [22], F R I E D E N T H A L U. a. [8], S C H U L Z U. a. [21], zeigen neuere Befunde, daß der Prozeß komplizierter ist. Zwar führt Anaerobiose zur Y - F o r m , aber nur, wenn verwertbare Hexosen (Glucose > F r u c t o s e > Mannose > Galaktose) in ausreichender Konzentration vorhanden sind (BARTNICKI-GARCIA [1]). Wahrscheinlich ist der endogene cAMP-Spiegel in noch ungeklärter Weise an der morphogenetischen Regulation beteiligt ( P A Z N A K O W and S Y P H E R D [ 1 7 ] ) , während G M P keine derartigen Beziehungen erkennen läßt ( O R L O W S K I and S Y P H E R D [ 1 6 ] ) . Anaerob ist ein 4-fach höherer Spiegel an c A M P in der Zelle vorhanden als anerob ( L A R S E N and S Y P H E R D [ 9 ] ) . B e i Zugabe von 1 mM c A M P bildet sich auch aerob die Y - F o r m aus, jedoch nur in Gegenwart von Hexosen, nicht jedoch mit Glycerin, Succinat oder Maltose ( O R L O W S K I and S Y P H E R D [15]). Interessanterweise kann die Y - F o r m auch durch einige Fungizide bei den Mucorales induziert werden (FISHER [7]). E s soll in diesem B e i t r a g versucht werden, die eigenen Ergebnisse in Zusammenhang mit denen aus der L i t e r a t u r zu diskutieren, zumal sie auch von allgemeinem Interesse für die Zellregulation sind.

Ergebnisse I n den in Tabelle 1 zusammengestellten Ergebnissen fällt auf, daß keine volle Übereinstimmung zwischen Schädigung des Atmungssystems und der Ausbildung der Y - F o r m besteht. Ü b e r die Schädigung der Mitochondrienstruktur liegen nicht von

70

H . L Y R , G.

CASPERSON

Abb. 1. Mucor mucedo, 12 h K u l t u r mit a) 0 ppm, b) 2 ppm, c) 10 ppm Terrazol. Vergr. 200:1

allen Verbindungen Daten vor. Offensichtlich reicht eine Blockierung der Atmungskette und die damit verbundene Umschaltung auf aerobe Glykolyse nicht aus, um die Morphogenese umzuschalten, was besonders für Amytal, Rotenon, Theonyltrifluorazeton, sowie den Entkoppler 2,4-Dinitropehnol zutrifft (SCHULZ U. a. [ 2 1 ] ) . Die eigenen Versuchsergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Die Inkubationszeit betrug, wenn nicht anders vermerkt, 2 Stunden nach einer etwa 4-stündigen Keimzeit der Sporen in 100 ml Flüssigkeitskultur auf Schütteltischen. Nähere Angaben siehe

Pathologische Zellwandsynthese bei Mucor Tabelle 1 Zusammenstellung rales auslösen

einiger

Verbindungen,

durch Fungizide

die

W i r k u n g auf Atmungssystem

hefeartiges

Wachstum

Konzentration

/S-l'henyläthylalkohol

1.4 • IO" 2 M +

+

+

Chloramphenicol Glukose

0,22% l • IO3 M 1 •10 3 + M 0,22 M

-f-f

+

Cycloheximid

1

Kotenone

1 •IO" 3 M

Theonyltrifluoraceton Antimycin A

1 •IO- 4 M

+

-f

—

1 •IO" 5 M

+

-f

—

3 •] 0 - 4 M

+

-

+

1 •IO" 4 M

+

-f

+

2.4 D M P

-)-

-f

-r

+

+

+ + +

IO" 4 M

—

Tabelle 2 Einige Versuchsergebnisse an Mucor Dickenzunahme der Zellwand nach Konzentration im Medium 3 %

bei

—

mucedo. 2 Stunden

Inkubation

in °0

der

Konzentration [Xg/llll

Zellwanddicke in ° ( )

Kontrolle Chloroneb 3,5-Dichlor-4mothoxyphenol Dichloran Diphenyl

0 20 20

100 225 245

0 + -f

20 5 15 20 20 20 10 10

218 182 95 154 280 175 344 200

H—r

Muco-

Referenz

21

Mycotypha microspora Mucor rouxii Mycotypha microspora Mycotypha microspora. Mycotypha microspora Mycotypha microspora Mycotypha •microspora Mycotypha microspora Mycotypha microspora Mycotypha microspora

Agens

Drazoxolon PCNB J.'CNB + K , Terrazol Terrazol - f 10° o Glukose

(Y-Form)

Schädigung Y Organismus der MitoForm chondrienstruktur

Verbindung

-f +

71

22 21 30 21 21 21 21 21 30 21

Kontrolle.

Glukose-

Schädigungen an Zellkern Mitoeh.

H—r

+

+ 4-

+

H—r 4- 44-4-4'

+

+

0 4- 44- — + -r -i—

4-

++ n—r

+ +

J

L

u n d L Y R [5]. D i e e l e k t r o n e n m i k r o s k o p i s c h e n A u f n a h m e n w u r d e n a u f X e l l w a n d d i c k e hin v e r m e s s e n u n d die V e r ä n d e r u n g e n a n M i t o c h o n d r i e n u n d Z e l l k e r n i n s g e s a m t e r f a ß t ( A b b . 2 u. 3). CASPERSON

F u n g i z i d e , die zu der G r u p p e der s o g e n a n n t e n „ A r o m a t i s c h e n H y d r o k a r b o n - F u n g i z i d e " z u s a m m e n g e f a ß t werden, wie P C N B , C h l o r o n e b , D i c h l o r a n u n d D i p h e n y l ver-

72

H. LYR,

G.

CASPERSON

Ü . CI I L K

¡k Mi

.Ä •¡g \

w

i'

Abb. 2. Mucor mucedo Cisternaler Ring (Ci)

ohne Behandlung. Dünne

Zellwand

(W),

Mitochondrien(Mi),

halten sich bezüglich der Zellwandverdickung und den morphologischen Veränderungen der Zellstruktur sehr ähnlich ( W E R N E R U. a. [24, 25], CASPERSON und L Y R [6]), so daß man einen gleichen oder sehr ähnlichen Wirkungsmechanismus annehmen kann, was durch den Nachweis von Kreuzresistenz bestärkt wird (BISCHOFF und LYR [4]). Nach W E R N E R und L Y R [26] wird Chloroneb an die Mitochondrienmembran gebunden, wobei hydrophobe Aminosäure-Reste, wie der aromatische Ring des Tyrosins, mögliche Bindungsstellen sind. Das gleiche könnte auch für andere Fungizide zutreffen. Obwohl Terrazol (Ethridiazol )einen anderen Wirkungsmechanismus hat als Chloronebbesteht eine Kreuzresistenz zu Chloroneb, deren Deutung allerdings noch aussteht ( B I S C H O F F und L Y R [4]). Die Zellwandverdickung zeigt eine deutliche Abhängigkeit zur Zeitdauer des Wirkstoffeinflusses (Abb. 4), wie zur eingesetzten Konzentration der Wirkstoffe (Abb. 5). Während die Kurve der Zellwanddicke bei Terrazol, PCNB und Chloroneb nach einem Anstieg abflacht, durchläuft die Kurve bei Diphenyl ein Maximum bei relativ niedrigen Konzentrationen und fällt dann unter den Kontrollwert ab. Typische Entkoppler, wie 2,4-Dinitrophenol, Pentachlorphenol und 2,4,5und 2,4,6-Trichlorphenol ergaben bezüglich einer Zellwandverdickung in Übereinstimmung mit den Resultaten von SCHULZ U. a. [21] keine Effekte, schädigten teilweise aber die Mitochondrienstruktur, wobei Pentachlorphenol eine starke Lysis verursachte. Antimycin A ergab in unseren Versuchen bis zu einer Konzentration von 2 ppm, die die Atmung von Mucor völlig blockiert, keine Zellwandverdickung.

A b b . 3. Mucor mucedo n a c h 2 h B e h a n d l u n g m i t 20 p p m P e n t a c h l o r n i t r o b e n z o l ( P C N B ) . S t a r k v e r d i c k t e Z e l l w a n d (W), M i t o c h o n d r i e n (Mi) g e s c h w o l l e n , C r i s t a e teilweise in L y s i s , Z e l l k e r n ( Z K ) m i t E r w e i t e r u n g d e s p e r i n u k l e ä r e n R a u m e s , P l a s m a l e m m » (PI) h e b t sich stellenweise v o n d e r Z e l l w a n d a b , Zelle i s t s t a r k v a k u o l i s i e r (V)

A b b . 4. Z e l l w a n d v e r d i c k u n g b e i Mucor mucedo in A b h ä n g i g k e i t v o n d e r E i n w i r k z e i t v o n 20 p p m C h l o r o n e b

H . L Y E , G . CASPERSON

74

Alill. 5 . Z e l l w a n d V e r d i c k u n g bei Mncor miicedo W i r k s t offen und Wirksloffkoir/.ent rat ionen

n a c h 2 Ii B e h a n d l u n g mit

verschiedenen

U n t e r anaeroben Kulturbedingungen (Durchströmen der Kultur mit reinem X 2 ) erhielten wir Zellwandverdiekungen nach 2, 4, 8 und 20 Stunden von 90, 100, 116 und 1 3 4 ° 0 bezogen auf aerobe Kontrolle = 1 0 0 % . Somit läßt sich ein leichter E f f e k t bei ausschließlicher Glykolyse nachweisen, wie er für die Bildung der Y - F o r m beschrieben wurde. Gleichzeitiger Zusatz zur anaeroben Kultur von 20 ppm P C N B ergab jedoch Zellwandverdiekungen von 133, 138, 240 und 3 0 0 % . Der 2 Stunden W e r t für P C N B ohne X 2 lag in diesem Verseuh bei 1 7 5 % , woraus eine leichte Reduktion der Zellwandverdickung unter anaeroben Bedingungen zu erkennen ist, jedoch keine prinzipielle Blockierung der Fungizidwirkung.

Diskussion ])ie Ergebnisse zeigen, daß unter Einwirkung bestimmter Fungizide eine e x t r e m rasche Zellwandsynthese initiiert wird, so daß bereits nach 2 Stunden je nach Wirkstoffart und -konzentration eine Zunahme der Zellwanddicke auf 200 bis 3 0 0 % erreicht wird. E s ist bisher nicht analysiert, wie sich hierbei das Verhältnis der einzelnen Zellwandkomponenten

verschiebt.

MACEIS u n d GEORGOPOULOS

[12] erhielten

nach

P C X B - B e h a n d l u n g bei Neurospora crassa eine Erhöhung der Glukansynthese und

P a t h o l o g i s c h e Zellwandsynthese bei Mucor

durch Fungizide

75

Abb. 6

eine Hemmung der Chitinsynthese. Auch bei der Unischaltung auf Hefewachstum bei Mucor rouxii wird die Glucan- und Mannansynthese gegenüber der Chitinsynthese erhöht (BARTNICKI-GARCIA und NICKERSON [3]). Dieses massive Appositionswachstum, das die gesamte Zellwand betrifft, ist mit demjVerlust der'Apikaldominanz der Hyphenspitze bezüglich der Wandsynthese verknüpft, wobei je nach Pilzart hefeartiges Wachstum oder abnormes Myzelwachstuni mit stark verdickten Zellwänden auftritt. Für die massive Zellwandsynthese, wie sie sowohl unter Fungizid-Einwirkung als auch in abgeschwächtem Maße unter anaeroben Bedingungen abläuft, ist ein Uberschuß an Vorstufen (UDP-Glukose, UDP-Azetylglukosamin, GDP-Mannose) sowie an ATP zur Regeneration von U T P bzw. GTP erforderlich. Hierzu ist ein Überschuß an Glukose, Fruktose oder Mannose im Medium erforderlich, die über Fruktose-6-Phosphat als gemeinsames Intermediat konzentrierbar sind. Im Stadium areober Glykolyse ist bei Süccliaromyces cerevisiae der ATP-Spiegel der Zelle im Maximum bei gleichzeitiger hoher Glukose-Aufnahmerate (v. MEYENBURG [ 1 3 ] ) . Die Glukan-Synthese bei Candida wird zu etwa 6 0 % direkt aus der Glykolyse und zu 4 0 % durch Resynthese von Pentose aus dem Pentose-Phosphat-Stoffwechselweg realisiert ( R Ö B E R und R E U T KR [20]). Fungizide, wie Chloroneb, Terrazol, PCNB führen zu einer Strukturzerstörung der Mitochondrien und dadurch zu einem begrenzten Absinkten der oxidativen ATPBereitstellung und einer Erhöhung des ADP-Spiegels, was zur aeroben Glykolyse führt (PASTELR-Effekt). Allein damit ist jedoch noch nicht die starke Wirksamkeit erklärbar, denn PCNB stimuliert auch unter anaeroben Bedingungen die Zellwandsynthese (Tab. 2), was nicht durch Schädigung der Mitochondrienfunktion erklärt werden kann, die bei den zellwand-aktiven Wirkstoffen typisch ist. Offensichtlich

76

H . L Y E , G . CASPERSON

tritt zugleich eine allgemeine Depression der zellwandgebundenen Chitin- bzw. Glukansynthethasen ein, die nach ULANE und CABIB [23] durch Anwesenheit eines Inhibitorproteins in inaktiver F o r m an den Zellwänden vorhanden sind. Aufgrund unserer Untersuchungen zum Wirkungsmechanismus von Terrazol und Chloroneb kamen wir zur Auffassung, daß diese Verbindungen kryptische, membrangebundene Phospholipasen und Proteasen aktivieren, was zur Destruktion der Mitochondrienmembran aber auch zu einem Angriff auf andere Membransysteme führt (RADZUHN [18], WEENER U. a. [26]). Da begrenzte Proteolyse ein offenbar weit verbreiteter rasch und irreversibel wirkender Regulationsmechanismus in der Morphogenese ist (NEURATH und WALSH [14]), liegt der Gedanke nahe, daß bestimmte Fungizide durch induzierte Protetolyse das Inhibitorprotein der Chitin- bzw. GlukanSynthetase eliminieren und dadurcheine anomale Zellwandsynthese auslösen, die im Zustand einer aeroben Glykolyse sehr intensiv verläuft, da dann sowohl der A T P Spiegel als auch der Glukose-6-Phosphat-Spiegel besonders hoch sind. Entkoppler der oxidativen Phosphorylierung und Atmungskettenblocker sind deshalb nicht oder nur sehr gering wirksam, da sie den ATP-Spiegel drastisch senken und wahrscheinlich keine direkte Protease-Aktivierung auslösen. Inwieweit Fungizide, wie P C N B , die in vitro die Chitin-Synthetase stark stimulieren, auch in vivo einen zusätzlichen Effekt auslösen, ist unklar. Eine direkte Interaktion der Fungizide mit der UDP-N-Acetylglukosamin: Chitin-N-AcetylglukosaminylTransferase als Ursache der Zellwandverdickung ist wahrscheinlich, da bei Chloroneb und Terrazol ein solcher Effekt in vitro nicht gefunden wurde (LYR und SEYD [10]). E s ist denkbar, daß bei Glukose-Zusatz oder beim Übergang zur Anaerobiose ebenfalls spezifische Proteasen aktiviert werden, die zu einer Derepression der Chitin-Synthetase führen. cAMP durfte nach PAZNOKAS und SYPHERD [17] durch die Phosphorylierung von spezifischen Proteasen ein wichtiger Regulationsfaktor sein. N 6 , Ü 2 '-Dibutyryl-Adenosin-3,5-cyclo-monophosphat verursacht ähnlich wie ein hoher Spiegel an cAMP Stillstand des Apikaiwachstunis und Hyphenveränderungen an Mucor, mucedo und Mucor hiemalis [27]. Andererseits erfolgt bei niedrigem Glukose-Spiegel eine Derepression von Glukanasen die in latenter F o r m Zellwand gebunden vorliegen [29], die einer anomalen Zellwandsynthese vorbeugt [28], Die komplexen Beziehungen lassen sich in einem Übersichtsschema darstellen (Abb. 6). Diskussion DELP (Comment): Chloroneb unlike the other fungicides discussed here, is a systemic fungicide and has relatively poor activity in vitro against Pythium and Rhizoctonia compared to rates which control disease in treated seedling. Seed must be protected from seed rot pathogen with other fungicides like thiram or captan. B u t once the seedling has emerged, the chloroneb accumulates in the hypocotyl and protects against damping off. Additional mode of action studies may find an effect on the host (perhaps cell wall) to make the host more resistant to the pathogen. GEORGOPOULOS : I would like to address two questions to Prof. L Y R First, since biphenyl is highly volatile, how did you control concentration in your experiment which seems to indicate a difference in the effect on wall thickness depending on biphenyl concentration ?

Pathologische Zellwandsynthese bei Mucor

durch Fungizide

77

Second, would you like to comment on the ability of apparently all members of the aromatic hydrocarbon group to disturb the hereditary process in fungi ? LYR: These experiments were performed within 2 hours in nutrition solution where the loss of biphenyl can be neglected. Second question : This property depends on the mechanism of action of this group of fungicides, which at present is not yet exactly known. It may be, that the observed interference with the nuclear membrane is an indication for this effect, because membrane activity is a general feature of these fungicides, but secondary effects can not be excluded at present. Literatur [1] BARTNICKI-GARCIA, S., Control of dimorphism in Mucor by hexoses: inhibition of hyphal morphogenesis, J . B a c t . 96 (1968), 1 5 8 6 - 1 5 9 4 [2] BARTNICKI-GARCIA, S. and E. LIPPMAN, Fungal morphogenesis: Cell wall construction in Mucor rouxii, Science 165 (1969), 302 — 304 [3] BARTNICKI-GARCIA, S. and W . J . NICKERSON, Isolation, composition and structure of cell walls of filamentous and yeast-like forms of Mucor rouxii, Biochim. Biophys. Acta 58 (1962), 1 0 2 - 1 1 9 [4] BISCHOFF, G. und H. LYR, Das Resistenzverhalten von Mucor mucedo gegenüber Chloroneb und anderen Fungiziden, Arch. f. Phytopathol. u. Pflanzenschutz 16 (1980), 1 1 1 - 1 1 8 [5] CASPERSON, G. und H. LYR, Wirkung von Terrazol auf die Ultrastruktur von Mucor mucedo, Z. allg. Mikrobiol. 15 (1975), 4 8 1 - 4 9 3 [6] CASPERSON, G. und H. LYR, Die Wirkung von Pentachlornitrobenzol (PCNB) auf die Ultrastruktur von Mucor mucedo und Phytophthora cactorum, Z. allg. Mikrobiol. im Druck [7] FISHER, D. J . , Induction of yeast-like growth in Mucorales by systemic fungicides and other compounds, Trans. Br. mycol. Soc. 68 (1977), 397 — 402 [8] FRIEDENTHAL, A., A. EPSTEIN, S. PASSERON, Effect of potassium cyanide, glucose and anaerobiosis on morphogenesis of Mucor rouxii, J . gen. Microbiol. 82 (1974), 15-24 [9] LARSEN, A. D. and P. S. SYPHERD, Cyclic adenosine 3',5'-monophosphate and morphogenesis in Mucor racemosus, J . Bact. 117 (1974), 432 — 438 [10] LYR, H. und W . SEYD, Hemmung der Chitin-Synthetase von Mucor rouxii in vitro durch Fungizide und andere Werkstoffe, Z. allg. Mikrobiol. 18 (1978), 7 2 1 - 7 2 9 [ 1 1 ] LYR, H . , B . LAUSSMANN u n d G. CASPERSON, W i r k u n g s i n e c h a n i s m u s v o n T e r r a z o l , Z. a l l g . M i k r o b i o l . 15 (1975), 3 4 5 - 3 5 5

[12] MAORIS, B. and S. G. GEORGOPOULOS, Apparent effect of pentachlornitrobenzene on the hyphal wall polysaccharides of two strains of Neurospora crassa, Z. allg. Mikrobiol. 13 (1973), 4 1 5 - 4 2 3 [13] MEYENBURG, K., von Katobolit-Repression und der Spi'ossungszyklus von Saccharomyces cerevisiae, Vierteljahresschr. Naturf. Ges. Zürich, 114 (1969), 113 — 222 [14] NEURATH, H. and K. A. WALSH, Hole of proteolytic enzymes in biological regulation. A review, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 73 (1976), 3 8 2 5 - 3 8 3 2 [15] ORLOWSKI, M. and P. S. SYPHERD, Cyclic guanosine 3',5'-monophosphate in the dimorphic fungus Mucor racemosus, J . B a c t . 125 (1976), 1226—1228 [16] ORLOWSKI, M. and P. S. SYPHERD, Cyclic guanosine 3',5'-monophosphate in the dimorphic fungus Mucor racemosus, J . Bact. 125 (1976), 1226 —1228 [17] I'AZNOKAS, L. J . and P. S. SYPHERD, Respiratory capacity, 3',5'-cyclic adenosine monophosphate and morphogenesis of Mucor racemosus, J . B a c t . 124 (1975), 134 to 139

[18] RADZUHN, B., Zum Wirkungsmechanismus des systemischen Fungizids Terrazol, Dissertation, Universität Berlin, 1978

78

H . LYR, G.

[ 1 9 ] RADZUHN, B .

und

G.CASPERSON,

Zum

Wirkungsmechanismus

von

CASPERSON

Terrazol,

In:

H . u n d C. P O L T E R (Hsg) S y s t e m f u n g i z i d e A b h . , A k a d . W i s s . D D R N r . 2 (1979), 195-206 RÖBER, B . u n d G. REUTER, B i o s y n t h e s e d e r Z e l l w a n d - P o l y s a c c h a r i d e M a n n a n u n d G l u c a n als Spiegelbild u n t e r s c h i e d l i c h e r A b b a u w e g e d e r Glucose d u r c h Candida spec., Z. allg. M i k r o b i o l . 1!) (1979), 1 8 7 - 1 9 4 SCHULZ, B . E . , G . A . K R A E P E L I N and W . H I N K E L M A N N , Factors affecting dimorphism in M y c o t y p h a ( M u c o r a l e s ) : a c o r r e l a t i o n w i t h t h e f e r m e n t a t i o n / r e s p i r a t i o n equilib r i u m , J . g e n . Microbiol. 8 2 ( 1 9 7 4 ) , 1 — 1 3 T E R E N Z I , H . F . a n d R . S T O C K , S t i m u l a t i o n of f e r m e n t a t i o n a n d y e a s t - l i k e m o r p h o genesis in Mucor rouxii b y p h e n e t h y l a l k o h o l , J . B a c t . !)7 ( 1 9 6 9 ) , 1 2 4 8 — 1 2 6 1 U L A N E , R . F . a n d E . C A B I B , T h e a c t i v a t i n g s y s t e m of c h i t i n s y n t h e t a s e f r o m Saccharomyces cerevisiae, J . Biol. C h e m . 24i) ( 1 9 7 4 ) , 3 4 1 8 - 3 4 2 2 WERNER, P . , H . LYR u n d G. CASPERSON, D i e W i r k u n g v o n C h l o r o n e b , s e i n e n A b b a u p r o d u k t e n , sowie v o n c h l o r i e r t e n P h e n o l e n auf d a s W a c h s t u m u n d die U l t r a s t r u k t u r v e r s c h i e d e n e r P i l z a r t e n , A r c h . I ' h y t o p a t h . u . P f l a n z e n s c h u t z 14 (1978), 301 — 312 WERNER, 1'., H . LYR u n d G. CASPERSON, D i e W i r k u n g v o n C h l o r o n e b , einigen A b b a u p r o d u k t e n u n d c h l o r i e r t e n P h e n o l e n auf d a s W a c h s t u m u n d die U l t r a s t r u k t u r einiger P i l z a r t e n , I n : LYR, H . u n d C. 1'OLTER (Hsg) S y s t e m f u n g i z i d e , A b h . A k a d . W i s s . D D R N r . 2 (1979), 2 9 9 - 3 1 0 WERNER, 1'. u n d H . LYR, D e r W i r k u n g s m e c h a n i s m u s v o n C h l o r o n e b u n d die m ö g lichen U r s a c h e n d e r R e s i s t e n z g e g e n ü b e r dieser V e r b i n d u n g , S y m p o s i u m R e i n h a r d s b r u n n 1980 6 2 J O N E S , B . E . a n d J . D . B U ' L O C K , Die W i r k u n g v o n N , 0 ' - D i b u t y r y l - A d e n o s i n - 3 , 5 c y c l o m o n o p h o s p h a t auf die M o r p h o g e n e s e der M u c o r a l e s , J . g e n . Microbiol. 103 (1977), 2 9 - 3 6 S A N T O S , T., J . R . V I L L A N U E V A a n d G . N O M B E L A , R e g u l a t i o n of ß-\ , 3 - g l u c a n a s e s y n t h e s i s in I'enicUliuin italicum, J . B a c t . 133 ( 1 9 7 8 ) , 5 4 2 — 5 4 8 LYK,

[20]

[21]

[22] [23]

[24]

[25]

[26]

[27]

[28]

[29] KRITZMAN, G., I. CHET a n d

Y.

HENIS,

Localization

o f ß-(\,3)-glucanate

in

the

my-

c e l i u m of Sclerotium rolfsii, J . B a c t . 134 (1978), 470 — 475 [30] HALL, M. G. u n d N . KOLANKAYA, T h e p h y s i o l o g y of m o u l d - y e a s t d i m o r p h i s m in t h e g e n u s Mycotypha (Mycorales), J . g e n . Microbiol. 82 (1974), 25 — 34

P . L E R O U X , 11. F R I T Z a n d M .

Institut National 78000 Versailles

de la Recherche — France

GREDT

Agronomique,

Laboratoire

de Phytopharmacie,

CN HA,

Cross-Resistance between 3,5-Dichlorophenyl Cyclic Imide Fungicides (Dichlozolin, Iprodione, Procymidone, Vinchlozolin) and Various Aromatic Compounds

Introduction T h e 3,5-dichlorophenyl cyclic iniides (dichlozolin, iprodione, procymidone, vinchlozolin, ...) are new fungicides. T h e y are active against various phytopathogenic fungi and they are used especially for control of grew mould when resistance to benziniidazole fungicides occurs. Resistance to iprodione, procymidone or vinchlozolin is readily obtained in Botrytis cinerea, Pénicillium expansum and Ustilago maydis under l a b o r a t o r y conditions. Cross-resistance always occurs between t h e 3,5-dichlorophenyl cyclic imides. T h i s phenomenon is also observed with chloroneb, dichloran, biphenyl and quintozene (LEROUX et al. [6, 7]).

I n this work we investigated the effects of various other compounds (especially aromatics) on wild and m u t a n t strains of Aspergillus nidulans, Botrytis cinerea, Pénicillium, expansum and Ustilago maydis.

M a t e r i a l and Methods Fungal strains Aspergillus nidulans strain 003 was generously supplied by J . M. VAN TU YL (Laboratory of Phytopathology, Wageningen, the Netherlands). Mutant strains AC, AD and A I descended from strain 003 were selected on nutrient medium containing chloroneb, dichlobenil or iprodione (100 ¡j.g pesticide/ml medium). Strain CHL-4, tolerant to chloroneb was p r o v i d e d p a r J . M . VAN T U Y L .

The sensitive strains of Botrytis cinerea, (S) Pénicillium expansum (P) and Ustilago maydis (M) were the same as those described previously (LEROUX et al. [7]). Botrytis cinerea strains SUG 2 and SOV 2 were selected respectively on iprodione and vinchlozolin (30 ¡xg/ml). Pénicillium expansum strain POG 2 was selected on iprodione (100 ¡xg/ml) and Ustilago maydis strain MUC 1 on chloroneb (100 fig/ml). Chemicals Technical or pure fungicides (dichlozolin, iprodivne, procymidone, vinchlozolin, chloroneb, dichloran, hexachlorobenzene, quintozene and tecnazene) were kindly provided by B A S F (Ludwigshafen-am-Rhein, Germany), Du Pont de Nemours (Welmington, USA), Hoechst (Frankfurt, Germany), Rhône Poulenc (Vitry, France) or Sumitomo (Hyogo, J a p a n ) . Technical chlorthiamid and dichlobenil were generously supplied by Shell (Sittingbourne, England) and Philips-Duphar (The Netherlands). The other chemicals were obtained

80

P . LEKOUX, R . FRITZ, M .

f r o m E g a - C h e m i e ( G e r m a n y ) , E a s t m a n (USA), F l u k a - B u c h s ( S w i t z e r l a n d ) , ( F r a n c e ) , P f a l z a n d B a y e r (USA) a n d P r o l a b o ( F r a n c e ) .

GREDT

Interchim

Growth tests I n h i b i t o r y e f f e c t s of t o x i c a n t s o n m y c e l i a l g r o w t h w e r e m e a s u r e d as d e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( L E R O T J X e t al. [6]). All t e s t s were c a r r i e d o u t o n solid m e d i u m a n d c h e m i c a l s w e r e a d d e d in m e t h a n o l to m o l t e n a g a r ; t h e f i n a l s o l v a n t c o n c e n t r a t i o n w a s 1 % . I n o c u l a t i o n w a s realized b y p l a c i n g i n v e r t e d a g a r disc w i t h y o u n g m y c e l i u m o n t h e a g a r s u r f a c e . W i t h Ustilago maydis similar e x p e r i m e n t s w e r e c o n d u c t e d , u s i n g disc c o n t a i n i n g s p o r i d i e s innidulans a n d 25 °C f o r s t e a d of m y c e l i u m . I n c u b a t i o n t o o k place a t 35 °C f o r Aspergillus t h e o t h e r f u n g i . R a d i a l g r o w t h w a s m e a s u r e d e v e r y d a y d u r i n g o n e w e e k . F o r each cond i t i o n , t h e c o n c e n t r a t i o n ( E D 50) which g a v e a g r o w t h r a t e i n h i b i t i o n of 5 0 % w a s calculated. T h e r e s i s t a n c e f a c t o r (R) w a s d e f i n e d as t h e r a t i o b e t w e e n t h e E D - 5 0 v a l u e of r e s i s t a n t s t r a i n a n d t h e E D 5 0 - v a l u e of sensitive s t r a i n .

Results Dichlozolin, iprodione, procymidone a n d vinchlozolin were very effective against wild strains of fungi. E D 50-values between 1 a n d 10 [J-g/ml were obtained with Aspergillus nidulans, Penicillium expansum or TJstilago maydis a n d t h e y were below 1 [xgj ml with Botrytis cinerea. Strains selected either on chloroneb, dichlobenil, iprodione or vinchlozolin were tolerant to all 3,5-dichlorophenyl cyclic imide fungicides. Resistance factors were always greater t h a n 100 (Fig. 1, Table 1). High levels of resistance were also observed with several polynuclear aromatics especially acenaphthene, fluorene and phenanthrene (Fig. 1, Table 1). Resistance factors were generally below 10 with n a p h t h a l e n e a n d related compounds (Table 1). W i t h biphenyl derivatives, resistance often occured but isomers generally h a d different comportments. Two- substitution was usually found to i m p a r t more toxicity towards sensitive strains and higher level of resistance, t h a n four-substitution. This phenomenon was specially clear with hydroxybiphenyls (Fig. 2). I n our experiments the most effective compound among the chlorinated benzenes was pentachlorobenzene. The increasing n u m b e r of chlorine atoms f r o m two to five enhanced the fungitoxicity (Table 2 and 3). The resistance level was always greather t h a n 25 with pentachlorobenzene. A m u t a n t of Botrytis cinerea selected on this toxicant was also resistant to the 3,5-dichlorophenyl cyclic imides. Chlorinated anilines were generally more active t h a n chlorinated benzenes. Resistance factors greater t h a n 100 were obtained with 2,3,4,6-tetrachloroaniline a n d pentachloroaniline (Table 2). High levels of resistance were also obtained with some chlorinated nitrobenzenes, especially with the fungicides tecnazene a n d quintozene (Table 2). Among the aromatic fungicides mentioned in Table 4, resistance occured to dicloran a n d chloroneb b u t not to chlorothalonil a n d pentachlorophenol. This phenomenon was also observed with the herbicides chlorthiamid a n d dichlobenil. M u t a n t strains of Botryis cinerea had a normal growth on medium containing 1 % of methanol whereas the wild strain was partially inhibited. E x p e r i m e n t s conducted with higher concentrations of methanol indicated t h a t E I ) 50-values for resistant a n d sensitive strain were 1. 1 % a n d 5 % . This phenomenon was also observed with t h e other fungi (Fig. 3).

Cross-resistance: Cyclic imide fungicides/Aromatic compounds 1

•O—AD

003

growth rate as % of control

X—JC

• S T i - j k a - o ."U

7

10

81 •-CHL-Ï

iprodione

t00

1000

concentration (tig/m I ) dichlobenil

acenaphthene

Fig. 1. Effects of iprodione, acenaphthene and dichlobenil on mycelial growth of Aspergillus nidulans

Discussion Strains of Aspergillus nidulans, Botrytis cinera, Pénicillium expansum and Ustilago maydis tolerant to 3,5-dichlorophenyl cyclic imide fungicides are also resistant towards toxicants belonging to the "aromatic hydrocarbon group" defined by G E O R G O P O U L O S and Z A R A C O V I T I S [ 3 ] . Our results indicated that the herbicides chlorthiamid and dichlobenil can be included in this group. 6

Systemfungizkle

82

P . LEKOUX, R . F R I T Z , M . G R E D T

Table 1 Effects of 3,5-dichlorophenyl of fungi Toxicants

cyclic

A. nidulans E D 50M R [003] (e)

imides

and polynuclear

B. cinerea E D 50 R) [S] (d)

3 , 5 - D I C H L O R O P H E N Y L CYCLIC IMIDES 4 4 4 4 4 4 3 4 4 3

dichlozolin iprodine procymidone vinchlozolin

POLYNUCLEAR AROMATICS 2 >3 acenaphthene 2 fluorene >3 3 4 phenanthrene naphthalene a-naphthol /S-naphthol 2 0 a-naphthylamine 2 1 biphenyl 2 2-bromobiphenyl 1/2 4-bromobiphenyl 0 — 2-chlorobiphenyl 2 1 3-chlorobiphenyl 2 0/1 0 4-chlorobiphenyl — 2 1 a r o c h l o r 1232 1/2 1 a r o c h l o r 1242 2 1 2-aminobiphenyl 2 1 2-nitrobiphenyl 1/2 2-hydroxy biphenyl 3 3-hydroxy biphenyl 3 0/1 4-hydroxy biphenyl 3 0/1

3 3 3 2 1 2 1 2 3 2 2 3 1 3 1 3 3 4 3 3

on mycelial

growth

I', expansum I f . mai/dis E D 50( a ) R(>>) ED50W RM [P] [ P O G 2] [M] [MUC 1 ]

4 4 4 4

3 3 3 3

4 4 4 1 0 0/1 0

3 3 3 1 2 2 1 2 3 1 2 3 1/2 2 1 3 2 3 2 2

2 1/2 1/2 3/4 >1 3 >1 2/3 2/3 3 1/2 1

aromatics

4 4 4 4

4 4 4 1 0 0 0 >2 1 >1 3 >1 >2 >1 2 2 2 0 0

3 4 3

>3 >3 >3

3 3 3 1 2 2 0 2 3 1 3 3 1 2 2 3 2 3 3 3

>3 > 3 4 >1 1 1 1 2 2 > 1 3 4 >1 >2 >2 1 2 2 1 1

(a) E D 50-values f o r sensitive s t r a i n s ; 4 = E D 50 < 1 (Jtg/inl, 3 = 1 fig/ml < E D 50 < 10 (xg/ml; 2 = 10 (xg/ml < E D 50 < 100 (xg/ml; 1 = 100 [xg/ml < E D 50 < 1000 ¡xg/ m l ; 0 = E D 50 < 1000 (ig/inl. (b) r e s i s t a n c e f a c t o r s (see t e x t ) ; 0 = 0 < R < 2.5, 1 = 2.5 < R 10, 2 = 10 < R < 25 3 = 25 < R < 100, 4 = R < 100. (c) r e s i s t a n c e f a c t o r s were c a l c u l a t e d w i t h s t r a i n s AC, A D a n d A I . (d) r e s i s t a n c e f a c t o r s were c a l c u l a t e d w i t h s t r a i n s S U G 2 a n d SOV 2.

We did not realize genetic analysis, however, the same chromosomal genes probably control resistance to these various compounds. The biochemical mode of action of either 3,5-dichlorophenyl cyclic imide or aromatic hydrocarbon fungicides ist no eluciated. Some of t h e m inhibit the nucleic acid biosynthesis; this effect can be responsible for the increasing sectoring in diploid strains of Aspergillus nidulans ( F R I T Z et al. [ 2 ] , G E O E G O P O U L O S et al. [ 4 , 5]). Some of the tested polynuclear aromatics are procarcinogens which bind, a f t e r metabolic activation, to different macromolecules, especially nucleic acids. This activation requires cytochroni P-450 mediated monoxygenase or mixed function

C r o s s - r e s i s t a n c e : Cyclic imiile f u n g i c i d e s / A r o m a t i c c o m p o u n d s ^

—o—

5

83

SUG 2 •

100 2 - hydroxybiphenyl

growth rate as % of control

\ 50

O

_1_ 0.1

\ \

1

10

1000

100

concentration (jig/mi )

TOO

X.

3- hydroxybiphenyl

100

\

W \

50

0.1

10

V+

\

\ \

\

50

4- hydroxybiphenyl

\ +1

K

\

1000

0.1

Fig. 2. E f f e c t s of h y d r o x y b i p h e n y l s on m y c e l i a l g r o w t h of Botrytis

10

100

1000

cinerea

oxidase system. I n animals this types of cytochrome are induced by various products including aromatic compounds A H O K A S [ 1 ] , A special form of cytochrome P-450 (cytochrome P r 4 5 0 or P 448) is induced by polynuclear aromatics in "responsive" mouse strains but the induction is absent in "non responsive" strains. This "responsiveness" to aromatic hydrocarbons is genetically controlled by locus Ah. N E B E R T [8]. 6»

84 Table 2 Effects of chlorinated growth of fungi (a) Toxicants

P.

benzenes,

chlorinated

A. nidulans

ED 50

R

CHLORINATED BENZENES 1,2-dichlorobenzene — 1,3-diehlorobenzene 0 — 1,4-dichlorobenzene 0 1,2,3-triehloroben1 0/1 zene 1,2,4-triohloroben1 0 zene 1 1,3,5-trichloroben>1 zene 1 1,2,3,4-tetrachlor>.1 obenzene 1 1,2,3,5-tetrachlor>1 obenzene 1,2,4,5-tetrachlorI >1 zene 3/4 pentachlorobenzene 3 — hexachlorobenzene 0 CHLORINATED ANILINES 3-chloroaniiine 2 4-chloroaniline 1 3.4-dichloroaniline 2 2,6-dichIoroaniline 1 3.5-dichloroaniline 3 2,4,6-trichloroaniline 2 3,4,5-trichloroaniline 3 2,3,5,6-tetrachloro- 3 aniline pentachloroaniline 2/3

anilines

JB. cinerea

EU 50

R

LEROTJX, R .

or chlorinated

nitrobenzenes

P. expunsum

ED 50

I',

R

1

1

1

0

1

1

>1

1

2

2

2

1

2> 2

>2

2

5:2

1/2

>1

1

>1

3 0

4

3 2

>3 >2

0/1 0 0 1 1 1 0 3

3 0

4

1 0 0/1 1 0/1 1 1 1

1 1 2 2 3 3 3 4

0/1 0 0/1 1 2 2 1 4

2 1/2 2 2 2 3 3 3

4

3

4

1

0/1 2 1/2 2

0

—

1 2

1/2

CHLORINATED NITROBENZENES 1 1 nitrobenzene 0/1 2-chloronitrobenzene 3 2 4-chloronitrobenzene 3,5-dichloronitro2 0/1 3 benzene 1 2,3,4 - trichloro ni tro - 3 3 benzene 1 2,4,5-trichloronitro- 3 3 benzene 3 2 teonazene 3 quintozene 3 2/3 3

2

2 >3 —

maydis

1

H

1 1 1 1

2

mycelila

> 1 >1 >1 0

0 0 1

>1

on

R

>2 >1 >1 0/1

1

GREDT

ED 5o"

1 1 1 1

2

(a) notations the same as in Table 1.

FRITZ, M.

—

>

1

2 2 2 2 2/3 3 3 4 4

1 1 1 1 1 1 4 4 4

0 1

1 2 2 3

1 2 1 1

2

0

3

0

2

3

1

3

1

4 4

3 3

4 4

4 4

4 4

Cross-resistance: Cyclic imide fungicides/Aromatic c o m p o u n d s Table 3 Effects of chloronitated benzenes cinerea strains $ and SUG 2

on mycelial

Chlorinated benzenes

growth

of

950 850 950

>1000 >1000 >1000

] ,2,3-trichlorobenzene 1,2,4-trichlorobenzene 1,3,5-trichlorobenzene

200 300 250

500 1000 >1000

25 25 30

350 >1000 >1000

1,2,3,4-tetrachlorobenzene 1,2,3,5-tetrachlorobenzene 1,2,4,5-tetrachlorobenzene pentachlorobenzene hexachlorobenzene

Table 4 Effects of nitroaniline fungi (a)

NITROANILINE 2-nitroaniline 3-nitroaniline 4-nitroaniline 2-chloro-4-nitroaniline 2,4-dichloro-6-nitroaniline dichloran

derivatives

3

>1000

>1000

>1000

and

aromatic

A. nidulans E D 50 R

DERIVATIVES 2 0 1 0 1 0 2 1 3 3

1/2 >3

various

0

—

compounds

on mycelial

growth

B. cinerea E D 50 R

P. expansum E D 50 R

2 1 1/2 2

1/2 0/1 0/1 1

1/2 1 2 2

0 0 0 0

3

3

3

1

4

4

3

>3

3

>3

4 2 4

3 2 3

>3 1 4

3 2 3

>3 2 >3

—

0

0

_

V A R I O U S AROMATIC COMPOUNDS 3 3 3 chloroneb chlorthiamid 2 1 3 3 4 3 dichlobenil 1,3,5-trimethylbenzene 1,2,4,5-tetramethylbenzene pentamethylbenzene chlorothalonil pentachloro phenol

Botrytis

E D 50-values (ixg/ml) strain S strain S U G 2

1,2-dichlorobenzene 1,3-dichlorobenzene 1,4-dichlorobenzene

Toxicants

85

0

U. maydis E D 5o' R

2 1 1 2

1 0 1 0 3

3

0

0

1

^ 1

1

1

1

> 1

1 4

0/1 0

2 3 3

2 0 0

2 1 3

2 0 0

1 1 3

> 1 0 0

(a) notations the same as in T a b l e 1.

of

86

P.

Aspergillus nidulans

1

LEBOUX,

—•—AI

003

R.

FRITZ, M .

CREDT

—o —ctu-i

Methanol

concentration (%) Botrytis cinerea

— +

5

—

•—

sue 2

Fig. 3. Effects of ethanol and methanol on mycelial growth of Aspergillus Botrytis cinerea

nidulans

or

I t is possible t h a t a similar phenomenon occurs with fungi. I n other words, resistance can be due to a deficiency in certain forms of cytochrome P - 4 5 0 . T h e antagonistic effects of methylene dioxyphenyl compounds (piperonylbutoxide, sulfoxide, ...) towards 3,5-dichlorophenyl cyclic imides in sensitive strains is an indirect proof of the interference of these fungicides with cytochrome P - 4 5 0 .

C r o s s - r e s i s t a n c e : Cyclic iinide f u n g i c i d e s / A r o m a t i c c o m p o u n d s

87

I t ist necessary to do new experiments to discover the biochemical mode of action of these various antifungal compounds and to elucidate the mechanism of resistance. Diskussion L A N C A K E : I S it possible that cross resistance to all these unrelated compounds is due to a common mechanism, for reduced permeability of fungal cells to the fungicides ? L E R O U X : We observed, that absorption and "exsorption" of either iprodione or vinchlozoline is similar with resistant and sensitive strains.

LYE: The common structure in all new Botrytis active compounds you investigated, seems to be the dichlorobenzene-group. The results on mechanism of chloroneb (see W E R N E R and L Y R ) are in agreement with this. If you take pentachlorophenol you have another dominating mechanism of action (uncoupler of oxidative phosphorylation) and you get no cross resistance. Of course some other properties can modify the activity (penetration, inactivation). L E R O U X : A S mentioned by other research workers cross resistance between pentachlorophenol or chlorothalonil (this compound reacts with thiol groups) and dichlorophenyl cyclic imides and other aromatics tested does not exist. This observation indicates that these last fungicides are not uncouplers of oxidative phosphorylation and do not react with thiol groups. S I S L E R : Does sensitivity to methanol reflect a membrane sensitivity to alternation by hydrocarbon ? L E R O U X : It is proved that methanol can be oxidized into formaldehyde by an enzyme requiring cytochrome P 4 5 0 . It is possible that if resistance to aromatic fungicides is due to a deficiency in cytochrome P 4 5 0 , the activation of methanol does not occur.

References [ 1 ] AHOKAS, J . T . , C y t o c h r o m e P - 4 5 0 in fish liver m i c r o s o m e s a n d c a r c i n o g e n a c t i v a t i o n i n KHAN M . A . Q . ,

J.

J.

LECH,

and

J.

J.

MENN

(eds)/Pesticide

b o l i s m in a q u a t i c s y s t e m , A C S s y m p o s i u m series [2]

FRITZ, li., I'. LEROUX et M. GREDT, M e c h a n i s m e

and

xenobiotic

de l'action fongitoxique

de la

dione ( 2 6 0 19 R P ou g l y c o p h è n e ) , de la v i n c h l o z o l i n e et, du d i c l o r a n s u r Botrytis l ' h y t o p a t h . Z. !)0 ( 1 9 7 7 ) , 1 5 2 - 1 6 3 [3]

GEORGOPOULOS,

S.

G.

and

C.

ZARACOVITIS,

Ann. R e v . Phytopathol. 5 (1967), [4]

GEORGOPOULOS,

S.

G.,

A.

KAPPAS

Tolerance

of

fungi

to

organic

GEORGOPOULOS,

S. G., M.

promi-

cinerea

fungicides,

109-130 and

A.

C.

HASTIE,

Induced

sectoring

Aspergillus nidulans as a c r i t e r i o n o n f u n g i t o x i c i t y b y i n t e r f e r e n c e w i t h p r o c e s s e s , P h y t o p a t h o l o g y (Mi ( 1 9 7 6 ) , 2 1 7 — 2 2 0 [5]

meta-

Washington 1979, 279 — 296

SARRIS a n d

B.

N.

ZIOGAS, M i t o t i c

instability

in

diploid

hereditary

in

Aspergillus

iiidulans caused b y t h e fungicides i p r o d i o n e , p r o c y m i d o n e a n d v i n c h l o z o l i n , P e s t i o . Sci. 10 ( 1 9 7 9 ) , 3 8 9 - 3 9 2 [6]

LEROUX,

P.,

R.

FRITZ

et

M.

GREDT,

Etudes

en

laboratoire

de

souches

de

Botrytis

cinerea r é s i s t a n t e s à la dichlozoline, a u d i c h l o r a n , a u q u i n t o z è n e , a la v i n c h l o z o l i n e e t a u 2 6 0 19 R P (ou g l y c o p h è n e ) , P h y t o p a t h . Z. 8!) ( 1 9 7 7 ) , 3 4 7 - 3 5 8

88 [7]

P . LEROUX, R . FBITZ, M .

GKEDT

P., M. G E E D T et R . F R I T Z , Etudes en laboratoire de soiiches de quelques champignons phytopathogenes résistantes à la diohlozoline, à la dicyclidine, a l'iprodione, à la vinchlozoline et à divers fongicides aromatiques, Med. Fac. Landbouww. Rijskuniv. Gent 43 (1978), 8 8 1 - 8 8 9 [8] N E B E R T , D. J . , Genetic differences in microsomal electron transport: the Ah locus. In F L E I S H E R S . and L. P A C K E R (eds.)/Methods in enzymology, volume L I I : biomenbranes, Academic Press, New York (1978), 2 2 6 - 2 4 0 LEROUX,

MAGDA KOVACS a n d M .

Research

Institut

¡or Plant

TUSKE

Protection,

Budapest,

Hungary

The Possibility of Development of Resistance to Triadimefon in Obligate Phytoparasitic Fungi

Triadimefon (Bayleton K ) is one of the most important systemic fungicides of the last five years, which effectively control among others the obligate parasitic fungi of cereals. Earlier benomyl was used against powdery mildews, but lately this excellent fungicide has lost its earlier importance in this field, because of the appearence of benomyl resistant strains. I n our study we wanted to find out, whether we have to reckon with similar problems following the use of triadimefon. This problem has been theoretically treated by D E L P [2]. Literature data on the problems of fungicide resistance of phytopathogenic fungi are abounding, but informations on the resistance of the obligate parasite powdery mildews are scarcely available even in the reviews of G E O R G O P O U L O S [6] or F K H R M A N [3].

When we restrict our investigations to fungicides which inhibit sterol-biosynthesis, the field is relatively easy to survey. I n their experiments S H E R A L D et al. [8] and L E R O U X and G R E D T [7] used a Ustilago maydis strain, which was resistant against triarimol and triforine. The problem of resistance against sterol-biosynthesis inhibitors was extensively studied by F U C H S and D R A N D A R E V S K I [ 4 ] and F U C H S et al. [ 5 ] , but they worked with facultative parasites, as did D E W A R D and V A N N I S T E L R O O Y [ 9 ] . As to the above authors the fungi which are resistant against sterol-biosynthesis inhibitors, do not represent real danger in the agricultural practice because of their decreased fitness. C O R B E T T [ 1 ] does not share this opinion, but he does not elaborate. W A L M S L E Y - W O O D W A R D et al. [ 1 0 ] experimented with barley powdery mildew in glasshouse and in the field, but they used ethirimol and tridemorph, and these fungicides are not sterol-biosynthesis inhibitors. As we could not find in the literature appropriate method which would have best suited our aims, we worked out the following experimental arrangement (Fig. 1). T h e c i r c l e s i n d i c a t e t h e p o t s , w h i c h were t r e a t e d w i t h i n c r e a s i n g d o s e s of f u n g i c i d e s . I n t h e a r r a n g e m e n t " b a s i c s e n s i t i v i t y " w e c h e c k e d t h e c o n s t a n c y of t h e f u n g i c i d e s e n s i t i v i t y o f t h e f u n g i u s e d in o u r e x p e r i m e n t s ; t h e i n o c u l u m s w e r e t a k e n a l w a y s f r o m u n t r e a t e d plants. I n the arrangement " f o r c e d " the inoculums were t a k e n from plants, where the r a t e of infection was 50 + 1 0 % . I n the a r r a n g e m e n t " o n e w a y " the passage was m a d e bet w e e n t h e p l a n t s t r e a t e d w i t h t h e s a m e doses, w h e n t h e r a t e of i n f e c t i o n w a s h i g h e r t h a n 5 0 % . P l a n t s treated with higher doses were infected with inoculums from p l a n t s with an 5 0 % i n f e c t i o n r a t e . I n t h e a r r a n g e m e n t " s t e p s f o r w a r d " t h e p a s s a g e w a s m a d e a l w a y s to a plant treated t h e n e x t higher dose.

The experimental conditions are shown on Figure 2.

M . K o v  c s , M. T u s k k

90 „FORCED"

„BASIC SENSITIVITY" I. II-

o

o

o

O

O

O

O o

I

I.

O ò

ó

50 V.

o

o

i "

i o

o

o

4 o

i o

_ o

O

U-i-A o o

O

O

A O

Q

A

Ì

v. i ì i i o o Ò Ò

v. 1 ì i è 6 6 ô Ò

„STEPS FORWARD"

„ONE WAY"

i. » o o o o o O O II.

o "i i i

o o i ' i i i i i

1 VI. o

I o

o

l

i o

o i i

i i

^

I.

O

o

O

O

O

t

o

o

o

o

11 I . I i

i Ox OA AO O

1 O

o

o

o

o

^ *\

\

VI. ^O O ^ o

V» v

\\

r ' o

X

*

O

\

VO

O

O

TO;

TO

Vig. 1. Scheme of the experimental arrangements

F U N G I

plants per pot

PLANTS

/

T 1 ME - T \ B L E (d a y s ) e v« l u i t i 0 2nd 1st / / 3rd

4th

Erysiphe graminis f.sp. tritici

winter wheat cv. MV-A

50

0.

5.

7.

13.

15.

17.

19.

Erysiphe graminis f.sp. hordei

winter barley cv. MV-37

50

0.

5.

7.

13.

15.

17.

19.

Uromyces appendiculatus

bean cv. Pinto

A

0.

8.

10.

22.

—

—

—

Uromyces vicia-fabae

broad bean cv. Bonus 10

A

0.

11.

13.

25.

—

—

—

Rearing:

in

plastic

pots

Fungicides:

TRIADIMEFON

Treatment:

10 ml

via

( 200

ml),

( Bayleton

roots ;

5

Vermiculite, 25 WP ),

parallel

nutrient

runs

per

dose

powdery mildews Mode of inoculation : Mode of

evaluation :

wind-chamber number of infected plants number of pustules on the 1st leaf

FiiÇ. '2. Experimental conditions

solution

BENOMYL (Chinoin-Fundazol 50 WP)

rusts pinsel number of per

cm2

P

pustules er

leaf

Resistance to triadimefon in obligate parasitic fungi

91

TRIADIMEFON

BENOMYL

EC50 (/Jmol/ml ) 100 60 AO

20

-

"

1) calc. found — —

V ( 2 : 1)

0,22 0,14 0,10 — —

2,12 1,40 1,04

V (2: 1) — —

V (2: 1)

0,10 0,13 0,17 — —

V(2:

33,6 23,1 17,6 — —

V (2::1)

0,09 0,06 0,04

300 0,07 0,11 0,06 0,05 300 0,7 0,05 0,06 1 0,07 0,6 0,05 0,06 0,22 300 12 24 12 9 3 0,03 0,05 0,06 0,05

D.S. — —

1,9 2,3 2,0 — —

42,4 29,3 1 —

•2.0 2,1 0,8 — —

1,4 1,9 2,0 — —

1,8 1,0 0,9

Of greatest practical significance perhaps is the fact t h a t benomyl-tolerant Botrytis cinerea strains isolated from the field whose MIC were above 200 ,u.g/ml (the M I C of benomyl-sensitive Botrytis cinerea is 0.07 fig/ml) could be re-sensibilized to benomyl b y t h e addition of fenapronil whose MIC towards these strains was 15 and 3.7 ¡jig/ml, resp. Synergism was 6 to 54-fold, the greater value was always found with mixtures in which the q u a n t i t y of benomyl prevailed over that of fenapronil. W e have no explanation for the experimental fact t h a t smallest degree of synergism or even antagonism was found with the ratio 1 : 1 of the two fungicides. T h e only exception was strain " C " in which initial tolerance had probably proceeded onto genetical resistance. I t is interesting to note t h a t in this case a distinct antagonsim manifested itself, since addition of benomyl increased the M I C of fenapronil (Table 3). T h e in vivo experiments using mixtures of benomyl with triadimefon or fenapronil on

110

L . FERENCZY et al.

Table 3 Combined, action of benomyl (III) and fenapronil four benomyl-rcsistent Botrytis cinerea strains

Fungal strain

Fungicide

A

HI V m + V (2 : 1 ) (1:1) (1:2) J JI V I I I + V (2:: 1) (1:1) (1:2)

B

C

D

MIC (¡xg/ml) cale.

i IL

y i n + V (2: 1) (1:1) (1:2) HI V H I + V (2: 1) (1:1) (1:2)

—

39,5 27,9 21,6 — —

10,8 7,3 5,4 —

10,8 7,3 5,5 — —

39,5 27,9 21,6

(V)

against

D.S.

found 200 15 3,7 15 3,7 200 3,7 0,2 15 0,4 200 3,7 60 200 30 200 15 7,5 30 3,7

—

10,7 1,9 5,8 — —

54,0 0,5 13,7 —

0,2 0,0 0,2 — —

5,3 0,9 5,8

wheat infected with conidia of Erisyphe gra.minis in both cases showed additivity or a small degree of synergism. I n conclusion it m a y be stated t h a t fungicidal mixtures of mitosis inhibiting benzimidazoles with ergosterol biosynthesis inhibiting systemic fungicides, — especially with fenapronil, — can be of great practical value for three reasons: 1) in most cases t h e y can retard or even prevent t h e occurence of tolerant or resistant fungal strains; 2) because of synergism between them, the applied doses m a y often be reduced; 3) in cases where one of t h e m fills up a gap in the a c t i v i t y spectrum of t h e other, even activity spectra m a y be broadened. T h e combination of benzimidazoles with promidione or vinchlozolin is contraindicated because of antogonism between theses two groups of systemic fungicides. Diskussion

GEORGoroTJLOS: I would like to make one comment on the difference observed between the benzimidazole resistant strains of Botrytis obtained from the field and the one selected in the laboratory. Botrytis m a y be heterocaryotic and t h a t the presence of the fungicide m a y change the ratio of nuclei in a heterocaryon is well known. I t is, perhaps, possible for t h e companion fungicide to change the nuclear ratio to the opposite direction. I n the laboratory-selected strain the nuclear ratio might be very much in favor of the benzimidazole resistant gene, so t h a t the effect of the companion, if any, m a y t a k e a long time to recognise. PFLIEGEL: T h a n k you for this comment, professor GEORGOPOULOS, which most probably is the one reason of the differences found among different Botrytis strains.

Interactions between benzimidazoles and other fungicides

111

B u t still the explanation why in all cases the ratio 1 : 1 of benomyl to fenapronil is so much worse t h a n either the 2 : 1 or the 1 : 2 ratio is missing. LEROUX: Synergistic effects are observed between prodione and benzimidazole fungicides in cereal seed t r e a t m e n t s . P F L I E G E L : R e s u l t s between in vitro experiments with differing kinds of fungi m a y differ from those obtained in seed dressing. Anyhow, I must confess t h a t after having observed a strong antagonism between benzimidazoles and vinchlozolin or iprodione (D.S. = 0.2) a t the ratio 1 : 1 we discontinued work on this kind of dual compositions. T h a n k s to your comment, we shall immediately check the situation with other ratios as well. LEROUX: Fenapronil is an imidazole fungicide related to imazalil. I t inhibits ergosterol biosynthesis in t h e same manner as triadimefon. W e observed also in Ustilago maydis cross-resistance between fenapronil, triadimefon, imazalil and related compounds (LEROUX, unpublished results). P F L I E G E L : I suppose t h a t cross-resistance should be expected generally between fungicides with the same mechanism of action. According to our laboratory experiments, however, tolerance to fenapronil can be provoked onyl with difficulty, and it is of transient character. DELP: T h e patent claiming synergestic action of M B C + Chlormequat for Cercosporella control (yield improvement) of cereals is not valid because data from all sources including the patent show only expected additive effects. I a m impressed with Dr. P F L I E G E L in results which show synergistic effects with 1/2 and 2/1 ratios of benomyl/fenapronil b u t little effect a t 1/1 ratio against Botrytis strain. W e have done some work on combination and have negative results which 1/1 ratios b u t with the mixtures we did not t r y other ratios and m a y have missed possible synergism. Most demonstrations of synergism in specific situation in culture have not proved to be of practical value under use condition in the field. New information which will lead to practical use of synergism is needed and welcome. PFLIEGEL: Allow to t h a n k you most cordially, professor DELP, for your words of acknowlegement, and for your comments. I t goes without saying t h a t our laboratory results can be of real practical value only if t h e y can be proven in t h e field. KERKENAAR: Some inhibitors of ergosterol biosynthesis also led to accumulation of f a t t y acids like triadimefon. How do you explain in this case the synergestic effect because you mentioned the antagonistic effect of compounds causing accumulation of f a t t y acids ? PFLIEGEL: T h e leading idea of our experiments was to find systemic fungicides complementary to the benzimidazoles having distinctly different mechanisms of action which, if possible, are synergistic with them. On basis of your experimental results we are convinced t h a t we have found such a group in the ergosterol biosynthesis inhibiting compounds, but we do not want to deduce theoretical hypothesis from these experiments. Anyhow, your comment m a y be an explanation of the f a c t t h a t interaction between triadimefon and the benzimidazoles is only additive while the same between fenapronil and the benzimidazoles is synergistic. B E C K E R : E S ist sehr interessant, was Sie über die E i n h a l t u n g der Mischungsverhältnisse bei Fungizidmischungen dargelegt haben. E t w a s Ähnliches haben wir bei der Abhängigkeit der Pilzanfälligkeit der Baumwolle von Mineralstoffen, insbesondere von

112

L. FERENCZY et

al.

Z i n k u n d K o b a l t g e f u n d e n . A u c h hier ist ein b e s t i m m t e s V e r h ä l t n i s dieser I o n e n f ü r h o h e R e s i s t e n z e r f o r d e r l i c h . M e i n e n Sie n i c h t , d a ß d i e s d a f ü r s p r i c h t , d a ß es b e i P i l z e n einen spezifischen „Parasitär-Stoffwechsel" gibt, der d u r c h Fungizide neben d e m Normalstoffwechsel mit erfaßt werden m u ß ? P F L I E G E L : Ich bin vollkommen mit Ihrer Beantwortung einverstanden, bitte aber u n s e r e bisherigen E r g e b n i s s e als viel v e r s p r e c h e n d e , a b e r g r o ß e V o r v e r s u c h e zu bet r a c h t e n . D i e V e r e i n f a c h u n g u n d O p t i m i e r u n g d e r F u n g i z i d m e n g e n - V e r h ä l t n i s s e in v i t r o u n d in v i v o s t e h e n n o c h v o r u n s .

References [ ] ] BERGER, P . D., Disease p r o g r e s s of Gercospora apii r e s i s t a n t t o b e n o i n y l , P l a n t Dis. R e p . 57 (1973), 8 3 7 - 8 6 0 [ 2 ] B O L L E N , G . J . , R e s i s t a n c e of b e n o m y l a n d s o m e c h e m i c a l l y r e l a t e d c o m p o u n d s in s t r a i n s of Pénicillium species, N e t h . J . P l a n t P a t h o l . 77 (1971), 187—193 [ 3 ] B O L L E N , G . J . , and G . SCHÖLTEN, Acquired resistance to benomyl and some other s y s t e m i c f u n g i c i d e s in a s t r a i n of Botrytis cinerea in c y c l a m e n , N e t h . J . P l a n t P a t h o l . 77 ( 1 9 7 0 ) ,

8 3 - 9 0

[4] BUCHENAUER, H . , I n h i b i t i o n of ergosterol b i o s y n t h e s i s in L'stilago avenae b y t r i a d i m e f o n a n d f l u o t r i m a z o l e , M i t t . Biol. B u n d e s a n s t . L a n d - u . F o r s t w i r t s c h a f t , B e r l i n D a h l e m , H e f t 165, 154-5 (CA. 1975, 85, 138417) [5] COLBY, S. R . , C a l c u l a t i n g s y n e r g i s t i c a n d a n t a g o n i s t i c r e s p o n s e s of h e r b i c i d e c o m b i n a t i o n s , W e e d s , 1« ( 1 9 6 8 ) , " 2 0 - 3 1 [6] DAY, P . R . , R e c e n t d e v e l o p m e n t s in t h e g e n e t i c s of t h e h o s t p a r a s i t e s y s t e m , A n n . R e v . P h y t o p a t h o l o g y , 4 (1966), 2 4 5 - 2 6 8 [7] D E K K E R , J . , L . C. D A V I D S E , A c q u i r e d r e s i s t a n c e t o b e n z i m i d a z o l e d e r i v a t i v e s . I n : " P e s t i c i d e s " / ! U P A C 3rd I n t . Congr., H e l s i n k i , 1974/, 410-3. T h i e m e V e r l a g , S t u t t g a r t (1975) [8] DELP, C. J . , a n d H . L . KLOPPINC, P e r f o r m a n c e a t t r i b u t e s of a n e w f u n g i c i d e a n d m i t e ovicide c a n d i d a t e , P l a n t Dis. R e p . 52 (1968), 95 — 99 [9] FRITZ, R . , P . LEROUX, a n d GREDT, M e c h a n i s m of a n t i f u n g a l a c t i v i t y of p r o m i d i o n e , vinchlozolin a n d d i c h l o r a n o n Botrytis cinerea 1'ERS, P h y t o p h a t o l !)0/2 (1977) 152— 163 [10] GEORGOPOULOS, S. G., a n d C. DOVAS, A s e r i o u s o u t b r e a k of s t r a i n s oiCercospora beticola r e s i s t a n t t o b e n z i m i d a z o l e f u n g i c i d e s in n o r t h e r n Greece, P l a n t Dis. R e p . 5 7 ( 1 9 7 3 ) , 3 2 1 - 4

[11] GRIFFE, P . J . , R e s i s t a n c e t o b e n o m y l a n d r e l a t e d f u n g i c i d e s in Colletotrichum musae. T r a n s . B r i t . Mycol. Soc. (»3 (1974), 1 3 7 - 1 4 1 [ 1 2 ] L A C Y , M . L . , a n d J . M . V A R G A S , J r , R e s i s t a n c e of f u n g i t o f u n g i c i d e s . I n : C h e m i e d e r P f l a n z e n s c h u t z - u n d S c h ä d l i n g s b e k ä m p f u n g s m i t t e l (ed. R . WEGLER), Vol. 4, 239 — 256, S p r i n g e r V e r l a g , Berlin, 1977 [ 1 3 ] R A G S D A L E , N . N . , Specific e f f e c t s of t r i a r i m o l o n s t e r o l b i o s y n t h e s i s in Ustilago ntnydis, Biochini. B i o p h y s . A c t a 3 8 0 ( 1 ) ( 1 9 7 5 ) , 8 1 — 9 6 [ 1 4 ] R I C H M O N D , D . V . , a n d A . P H I L I P S , E f f e c t of b e n o m y l a n d c a r b e n d a z i m o n m i t o s i s in h y p h a e of Botrytis cinerea a n d r o o t s of Allium cep», P e s t i c i d e B i o c h e i n . I ' h v s i o l . 5 (1975),

3 6 7 - 9

[15] KUPPEL, E . G., B i o l o g y of b e n o m y l - t o l e r a n t s t r a i n s of Gercospora beticola f r o m s u g a r b e e t , P h y t o p a t h o l o g y , 65 (1975), 785 — 9 [ 1 6 ] S C H R O E D E R , W . T . . a n d R . P R O V V I D E N T I , R e s i s t a n c e to b e n o m y l in p o w d e r y m i l d e w of c u c u r b i t s , P l a n t Dis. R e p . 53 (1969), 271 - 5 [17] TAJIJIES, P . M. L., Isoboles, a g r a p h i c r e p r e s e n t a t i o n of s y n e r g i s m in pesticides, N e t h . J . P l a n t P a t h o l , p . 73 (1964) [ 1 8] VARGAS, J . M., J r , A b e n z i m i d a z o l e r e s i s t a n t s t r a i n of Erysiphe graminis, P h v t o p a t h o logv, (>3 (1973) 1 3 6 6 - 8 [19] WICKS, T., T o l e r a n c e of t h e a p p l e s c a b f u n g u s t o b e n z i m i d a z o l e f u n g i c i d e s , P l a n t Dis. R e p . 58 (1974), 8 8 6 - 9

M A Y A GASZTONYI

liesearch

Institute

for Plant

Protection,

Budapest

The Possible Role of Different Enzymes in the Activation of Triadimefon

Introduction I t has been found t h a t in beans, barley a n d soil triadimefon, l-(4-chlorophenoxy)-3,3 dimethyl-l-(l,2,4-triazol-l-yl)-butanone, systemic fungicide is transformed into triadimenol (a reduced derivative of the above compound), also having a fungicide effect [1, 8]. We have proved similar transformation in other plants a n d phytopathogenic fungi [3, 4], At the same time we found t h a t t h e degree of transformation varies in species a n d it is in correlation with the sensitivity of fungal species to triadimefon. Triadimenol is more active against most fungi a n d is never less active t h a n triadimefon [5], (Fig. 1). T h u s the transformation m a y be considered as activation in t e r m s of fungicidal activity. Through the increase in the n u m b e r of asymetrical centers, the two stereoisomers of triadimefon are transformed into four isomers of triadimenol, in the f o r m of two enantiomer pairs. Figure 2 shows one mirror image model f r o m each enantiomer pair a n d the diastereomer relationship between these two. VOGELER [ 8 ] a n d S P E C H T [ 7 ] determined t h a t the two enantiomer pairs are not produced in the same proportion in soil a n d plants. Others have found, however, the proportions in marrow and Aspergillus niger to be equal [2]. I t was later shown t h a t their fungitoxicities differ, a n d B a y e r researches worked out a method for production of an enriched f o r m of the more active product [6]. I n view of these facts, we set out to answer these questions: 1. Is the biological reduction of triadimefon reversible ? 2. Is only one enzyme or enzyme-complex responsible for the transformation, or are there separate enzymes involved ? 3. Is the proportion of enantiomer pairs produced dependent upon the species of fungus, and does this have a role in selectivity ?

The Investigation of the Irreversibility of Reduction I n our previous experiments, we found the Cladosporium cucumerinum mvcelia to reduce triadimefon the most intensively, therefore we once again included this species in our experiments. F o r our other test object we chose Sacxharomyces cerevisiae, which is advantageous due to the ease in method of biochemical assay in cell suspensions. After incubation for varying lengths of time in media containing triadimefon or triaS

SystenifiliiiiizHle

114

M . G ASZTONYI

V

g=0,83S

Xi 1 •-^vi^^ôJivi-Q^vjij&t^

vj tj tj

K" U

^

"

if

~ V* •

Sí •

J5

; ••;:* iW^PEBfcWFxi^ílíi

fc"

s .

i., G . M O R P U R G O , a n d G . S E R J I O N T I , I n d u c e d s o m a t i c s e g r e g a t i o n

in

GEORGOPOULOS,

SIEGEL,

Aspergillus

nidvlans,

H.

S.

D.

G.,

M. R .

and

York,

1 9 7 7 , V o l . 2,

GEORGOPOULOS,

Aspergillus

S.

G e n e t i c s 4 5 ( 1 9 6 0 ) , 785 — 800 Development

SISLER

nidulans

of

fungal

(eds.) A n t i f u n g a l

resistance

Compounds,

to

fungicides,

MARCEL D E K K E R ,

in

Inc.,

New

4 3 9 - 4 9 5 G.,

A.

KAPPAS,

and

A.

C.

HASTIE,

Induced

sectoring

in

diploid

as a criterion of f u n g i t o x i c i t y by i n t e r f e r e n c e with h e r e d i t a r y

processes, P h y t o p a t h o l o g y

G ( 1 9 7 G ) , 2 1 7 — 2 2 0

Genetic activity of metalaxyl in

aspergillus

149

[ 4 ] GEORGOPOTJLOS, S. G., M. SAKRIS, a n d B . N. ZIOGAS, Mitotic i n s t a b i l i t y in

Aspergillus

nidulans caused by the fungicides iprodione, procymidone, and vinclozolin, Pestic. Sei. 10 (1979), 3 8 9 - 3 9 2 [5] KAPPAS, A., On the mechanisms of induced somatic recombination by certain fungicides in Aspergillus nidulans, Mutat. Res. 51 (1978), 189—197 1.6] KAPPAS, A. and S. G. GEORGOPOTJLOS, Interference of griseofulvin with the segregation of chromosomes at mitosis in diploid Aspergillus nidulans, J . Bacteriol. 119 (1974), 334-335 [ 7 ] KAPPAS, A . , S . G., GEORGOPOTJLOS, a n d A . C . HASTIE, On t h e g e n e t i c a c t i v i t y of

benzimidazole and thiophanate fungicides on diploid Aspergillus

nidulans,

Mutat. Res.

26 (1974), 1 7 - 2 7 [ 8 ] LUKENS, R . J . , D . CHAN, a n d G. ETTER, O r t h o 2 0 6 1 5 , a n e w s y s t e m i c f o r t h e c o n t r o l

of plant diseases caused by Oomycetes. Proc. Am. Phytopath. Soc. 5 (1978), 142.

[ 9 ] PONTECORVO, G., J . A . ROPER, L . M . HEMMONS, K . 1). MACDONALD, a n d A . W .

J.

BTJFTON, The genetics of Aspergillus nidulans, Advan. Genet. 5 (1953), 141 — 238 [10] ROPER, J . A., Production of heterozygous diploids in filamentous fungi, Experientia 8 (1952), 1 4 - 1 5 [11] SHANFIELD, B. and E. KÄFER, Chemical induction of mitotic recombination in Aspergillus nidulans, Genetics 67 (1971), 209 — 219 [ 1 2 ] URECH, P . A . , F . SCHWINN, a n d T . STATJB, C G A 4 8 9 8 8 , a n o v e l f u n g i c i d e f o r t h e c o n -

trol of late blight, downy mildews and related soil-borne diseases, 1'roc. Br. Crop.

Conf. (1977), 0 2 3 - 6 3 1

H . B U C H E N A U nit

Institut

für l'flanzenkrankheiten

der Universität

Bonn,

5300 Bonn,

BBÜ

Zum Wirkungsmechanismus Sterolsyntheseblockierender Fungizide

Einleitung I n den letzten J a h r e n wurden eine Reihe neuer fungitoxischer Verbindungen mit systemischen Eigenschaften entwickelt, die sich hinsichtlich ihrer Wirkungsweise in Pilzen u n d ihrer Nebenwirkungen in höheren Pflanzen von den übrigen bisher bek a n n t e n systemischen Fungiziden unterscheiden. Als gemeinsames S t r u k t u r m e r k m a l besitzen diese neuen Substanzen einen N-substituierten heterozyklischen Ring, welcher entweder ein Pyrimidin (Triarimol, Fenarimol, Nuarimol), Triazol (Triadimefon, Triadimenol, Biloxazol, Fluotrimazol, Diclobutrazol, CGA 64251, CGA 64250) oder Imidazol (Imazalil, Prochloraz, Phenapronil, Clotrimazol, Miconazol) darstellt. Eine Ausnahme in dieser Hinsicht bildet die S t r u k t u r von Triforine (Piperazin-Derivat). Fungitoxisches Wirkungsspektrum Vergleichende Untersuchungen zum fungitoxischen W i r k u n g s s p e k t r u m von Triadimefon, Triadimenol, Fenarimol, Nuarimol u n d Imazalil ergaben, d a ß sich die Verbindungen auf der Grundlage der ED 5 0 -Werte als toxisch bis hoch toxisch gegenüber verschiedenen Pilzarten, die zu den Klassen der Ascomyceten (z.B. Erysiphe graminis f. sp. hordei, Sphaerotheca fuliginea, Gaeumannomyces graminis, Sordaria fimicola), Deuteromyceten (z.B. Septoria nodorum, Colletotrichum trifolii, Botrytis cinerea, Cladosporium cucumerinum, Pleiochaeta setosa, Fusarium culmorum, Verticillium albo-atrum, V. dahliae) u n d der Basidiomyceten (Rhizoctonia solani, Ustilago avenae) gehören. Gegenüber den Oomyceten und Zygomyceten besaßen die Verbindungen eine schwache bis begrenzte Toxizität (BUCHENAUER [10], [13]). Das antimykotische Wirk u n g s s p e k t r u m der geprüften Substanzen entsprach weitgehend d e m von Triforine ( F U C H S u n d D R A N D A R E V S K I [ 2 4 ] ) u n d d e m von Triarimol ( B R O W N a n d H A L L [ 4 ] ) . E s ergab sich keine enge Korrelation zwischen der Toxizität der verschiedenen Verbindungen und der taxonomischen Stellung der in die Untersuchungen einbezogen Pilze. Sogar bei Pilzen, die der gleichen G a t t u n g angehörten, k o n n t e n Unterschiede in der Empfindlichkeit gegenüber diesen Wirkstoffen festgestellt werden. Wirkungsmechanismus in Sporidien von Ustilago

avenae

Die Substanzen induzierten in Sporidien von Ustilago avenae starke morphologische Veränderungen. Die Sporidien, die sich normalerweise durch Sprossung vermehren,

152

H . BUCHEKAUEK

wurden unter Fungizideinfluß vielzellig und verzweigt. Auch die Sporenkeimung wurde durch die Substanzen im allgemeinen nur geringfügig beeinflußt, andererseits verursachten die Wirkstoffe deutliche Veränderungen im Keimschlauchwachstum, wie z . B . starke Verkürzung und Verzweigung der Keimschläuche. Während in Anwesenheit der Substanzen die allgemeinen Stoff Wechselprozesse (Atmung, Nuklein- und Proteinsynthese) erst nach relativ langen Einwirkungszeiten (4—6 Stunden) beeinträchtigt wurden, wurde die Ergosterolbiosynthese bereits unmittelbar nach Zugabe dieser Wirkstoffe gehemmt. Demgegenüber wurde der Stoffwechsel der anderen Lipidkomponenten in der Anfangsphase durch die Fungizide nicht nennenswert beeinflußt. Die Hemmung der Ergosterolbiosynthese war begleitet von einer Anreicherung der C-4,4-Dimethyl-, C-4-Methyl- und C-14-Methylsterolfraktion. Da in Gegenwart der Fungizide während der Sterolbiosynthese keine Verbindung jenseits des C-14-Demethylierungsprozesses angetroffen wurden, kann die oxidative C-14-Demethylierung als der primäre Wirkort dieser Substanzgruppe angesehen werden. Darüberhinaus hemmen einige Substanzen (z.B. Triarimol, Fenarimol und Nuarimol) die Einführung der C-22(23)-Doppelbindung und die Reduktion der C-24(28)-Doppelbindung

( R A G S D A L E u n d S I S L E R [ 3 6 ] ; S H E R A L D U. a . [ 3 9 ] ;

SHERALD

u n d S I S L E R [ 4 0 ] ; R A G S D A L E [ 3 4 ] ; K A T O U. a . [ 3 1 ] ; B U C H E N A U E R [ 5 ] ; [ 6 ] ; [ 7 ] ; [ 8 ] ;

[9];

[ 1 0 ] ; [ 1 1 ] ; L E R O U X u n d G R E D T [ 3 2 ] ; S I E G E L u n d R A G S D A L E [ 4 1 ] ; VAN D E N B O S S C H E [ 2 ] ) .

Die in der Seitenkette vorkommenden Reaktionen finden wahrscheinlich erst nach der C-14-Demethylierung statt (RAGSDALE [35]). Die Hemmung der C-14-Demethylierung deutet darauf hin, daß von den „mixed function" Oxidasen ein oder mehrere Enzyme, die die C-14-Demethylierung katalysieren, durch die Wirkstoffe besonders gehemmt werden. E s liegt nahe anzunehmen, daß die Fungizide, welche N-substituierte Imidazol-, Pyrimidin- und Triazolderivate darstellen, in ähnlicherweise wie die Arylimidazole mit dem Cytochrom P - 4 5 0 Bindungen eingehen (BAGGALEY U. a. [1]; WILKINSON u. a. [45]). I m Sterolstoffwechsel der meisten Pilze wird gewöhnlich die C-14-Methylgruppe vor den C-4-Methylgruppen entfernt. Dadurch, daß in den behandelten Zellen die C-14Demethylierung blockiert ist, während die C-4-Methylgruppen noch abgespalten werden können, kommt es zur Anreicherung von Sterolzwischenprodukten in den behandelten Zellen, die im ungestörten Sterolstoffwechsel nicht auftreten. Mit zunehmender Inkubationszeit reicherten sich in den behandelten Sporidien einerseits die freien Fettsäuren stark an, andererseits verminderten sich deutlich die Gehalte an verschiedenen Phospholipiden. Die Anreicherung der freien Fettsäuren in den Sporidien als Folge der Fungizideinwirkung ist möglicherweise z. T. auf einen Abbau bzw. verminderte de novo Synthese der polaren Lipide zurückzuführen. Diese Akkumulation an freien Fettsäuren in den behandelten Sporidien, die als eine Sekundärwirkung der Fungizide aufzufassen ist, verstärkt die fungitoxische Primärwirkung dieser Fungizidgruppe. Von Fettsäuren ist bekannt, daß sie auf Pilzzellen toxisch wirken (RIETH [37]; SUMRELL U. a. [43]). E s kann daher angenommen werden, daß den hohen Gehalten an freien Fettsäuren in den Fungizid-behandelten Zellen möglicherweise eine entscheidende Bedeutung für die Mortalität der Sporidien zukommt, während die primäre Wirkung der Mittel mehr fungistatischer Natur ist. I n diesem Zusammenhang sollte auch auf die Hypothese der Anlagerung der Fungizide an Sterol-Trägerproteine ('sterolcarrier protein') hingewiesen werden. Während der enzymatischen Umwandlung werden die wasserlöslichen Sterolvorstufen an Sterol-

Wirkungsmechanismus Sterolsynthese-blockierender Fungizide

153

Trägerproteine gebunden und nach Transport an ihren Wirkort wird das SterolTrägerprotein wieder freigesetzt ( R I T T E E and D E M P S E Y [ 3 8 ] ) . Möglieherweise lagern sich die Ergosterolbiosynthesehenimer an bevorzugte Stellen des bzw. der SterolTrägerproteine an, wodurch entweder die Bindung an die Sterolzwischenprodukte verhindert oder spezifische enzymatische Reaktionen die zur oxidativen Eliminierung der C-14-Methylgruppe führen, gehemmt werden. Die Bildung des Sterol-Trägerprotein-Komplexes wird durch die Anwesenheit von Phospholipiden beschleunigt ( R I T T E R and D E M P S E Y [ 3 8 ] ) . E s ist deshalb nicht ausgeschlossen, daß aufgrund des verminderten Phospholipidgehaltes in den behandelten Sporidien die Bildung des Sterol-Trägerprotein-Komplexes gehemmt ist. E i n e Inkubation der Fungizide mit Eilecithin führte nach einer 4-stündigen Inkubationszeit zu einer deutlich höheren Absorption bzw. zu einer Verschiebung der Absorptionsmaxima. Dieser E f f e k t beruht vermutlich auf einer Interaktion zwischen den Fungiziden und dem Phospholipid ( B U C H E N A U E R [ 1 2 ] ; [ 1 5 ] ) . Ergosterol ist die Hauptsterolverbindung in vielen Pilzarten und erfüllt offenbar eine wichtige Aufgabe in der Funktion und Struktur der Pilzmembranen (HENDRIX [28]; W E E T E [ 4 4 ] ) . F ü r die Wirksamkeit der Sterole in den Membranen müssen drei Kriterien erfüllt sein: a) eine freie Hydroxylgruppe an der C-3-Position; b) ein Steroidringsystem mit einer planaren a-Außenseite, die keine Methylgruppen an der C-4- und C-14-Position enthält sowie einer gewölbten ß- Außenseite, die durch die beiden Methylgruppen an der C-10- und C-13-Position gebildet werden, und c) eine intakte aliphatische Seitenkette, die sich am C-17 des Steroidkernes befindet (BROCKENHOFF [3]; N E S [ 3 3 ] ; G R U N W A L D [ 2 5 ] ; H U A N G [ 2 9 ] ) . Die Interaktionen zwischen Sterolen und Phosphlipiden, die physikalisch zu einer Verdichtung („condensing e f f e c t " ) der Membranen führen, beeinflussen somit entscheidend die Mobilitätscharakteristika (d. h. die inneren Molekularbewegungen) der Membranlipide. Die Sterole regulieren auf diese Weise die Membranpermeabilität und spielen somit eine wesentliche R o l l e in den Membranfunktionen ( D E M E L und D E K R U Y F F [ 2 0 ] ; V A N D E E N E N [ 1 9 ] ; B R O C K E N H O F F [3]). Die biologische Bedeutung der Sterole in den Pilzen erstreckt sich nicht ausschlielich auf die Funktion der Membranen, sondern sie sind auch zur sexuellen und asexuellen Reproduktion der Arten notwendig, die zur Familie der P y t h i a c e a e gehören ( E L L I O T T U. a . [ 2 1 ] ; H A S K I N S U. a . [ 2 6 ] ; H E N D R I X

[27]).

Der durch die Fungizide induzierte Defekt im Membranenaufbau kann die selektive Permeabilität so stark verändern, daß ein E f f l u x von intrazellulären Bestandteilen eintritt. Diese Erscheinung wurde beispielsweise bei Candida albicans nach Behandlung mit Clotrimazol ( I W A T A u. a. [ 3 0 ] ) und Miconazol ( S R E E D H A R A S W A M Y U. a. [ 4 2 ] ) beobachtet.

Wirkungsweise im Infektionsverlauf von Erysiphe

graminis

Die verschiedenen Stadien des primären Infektionsablaufes von Gersten- und Weizenmehltau wurden durch die Substanzen unterschiedlich stark beeinflußt. Außer einer verminderten Keimrate, die stark konzentrationsabhängig war, wurden gelegentlich durch Veränderungen an den Appressorien beobachtet. Die auffallendsten strukturellen Veränderungen wurden während der Haustorienentwicklung beobachtet. I n den Epidermiszellen behandelter Pflanzen war die Haustorienentwicklung unvollständig,

154

H . BÜCHENAÜEB

wobei die Schädigung besonders an den fingerartigen Fortsätzen in Erscheinung t r a t ; die Form dieser Fortsätze war beträchtlich verändert und zahlenmäßig reduziert. Die Scheidenmembran, die bei ungestörter Entwicklung eng die Haustorien umgibt, war angeschwollen. Aufgrund dieser starken Schädigung der Haustorien wurde die weitere Mehltauentwicklung, wie sekundäre Myzel- und Haustorienbildung, blockiert. Wenn unterstellt wird, daß diese Wirkstoffgruppe auch bei Mehltaupilzen in den Sterolstoffwechsel eingreift, würde dies zu unvollständigen Membranstrukturen und folglich zu starken Störungen in den Membranfunktionen führen. Die starken Deformationen während der Haustorienentwicklung in den behandelten Pflanzen sind wahrscheinlich auf defekte Membranstrukturen zurückzuführen, wodurch schließlich die innige kompatible Beziehung zwischen Wirt und Pathogen gestört sein würde.

Untersuchungen zur Kreuzresistenz Die Mehrzahl der geprüften Mutanten von Cladosporium cucumerinum und Botrytis cinerea wies einen hohen Grad an Kreuzresistenz zwischen Triadimefon, Triadimenol, Fenarimol, Nuarimol, Phenapronil und Imazalil auf. Diese positive Kreuzresistenz zwischen den verschiedenen Verbindungen kann als weiterer Hinweis für einen ähnlichen bzw. identischen Wirkungsmechanismus innerhalb dieser Fungizidgruppe im Pilzstoffwechsel gedeutet werden ( B U C H E N A U E R [12]).

Gasphasenwirkung Die verschiedenen Substanzen zeigten deutliche Unterschiede hinsichtlich ihrer Wirkung über die Gasphase gegenüber Gerstenniehltau. Die ausgeprägtesten Effekte entfalteten Triadimefon und Triadimenol. Während die beiden Substanzen bereits bei niedrigen Konzentrationen (z.B. 5 X 1 0 " 4 M ) den Mehltaubefall an Gerstenprimärblättern nahezu vollständig unterdrückten, zeigten die übrigen Substanzen erst bei höheren Konzentrationen (z.B. 1 0 " 3 M) eine eindeutigere Wirkung über die Gasphase. Bezüglich der Wirksamkeit über die volatile Phase ergab sich bei den Substanzen folgende R e i h e : Triadimefon > Triadimenol > Nuarimol > Fenarimol > Fluotrimazol > Imazalil (BUCHENAUER [10]; [12]). Obwohl die Mehltau-wirksamen Substanzen im allgemeinen eine geringe Flüchtigkeit besitzen, ist eine Rückverteilung der Wirkstoffrückstände auf der Pflanzenoberfläche über die Dampfphase für die Bekämpfung der Echten Mehltaupilze von Bedeutung.

Transformation von Triadimefon in die Diastereomeren von Triadimenol durch Pilze und Pflanzen Nach Zugabe von Triadimefon zu einer 8 Tage alten Kultur von Fusarium culmorum in Nährlösung, wurde diese rasch in die beiden Diastereomeren von Triadimenol (Triadimenol-I und Triadimenol-II) umgewandelt. Nach einer 2-tätigen Einwirkungszeit lagen von der nachweisbaren Fungizidmenge im Filtrat und Myzel nur noch 3 9 , 6 % als Triadimefon vor. Diese anfangs starke Umwandlungsintensität verlangsamte sich

Wirkungsmechanismus Sterolsyiithose-blockierendor Fungizide

155

mit fortschreitender Inkubationsdauer. Der Triadimefon-Anteil betrug z.B. nach 3, 6, 10 und 15 Tagen 30, 18, 9 und 3,5%, demgegenüber reicherten sich gleichzeitig die Triadimenol-Diasteromeren an. Nach 15 Tagen erreichte Triadimenol-II 71% und Triadimenol-I 25% des nachweisbaren Fungizidgehaltes. Bei den Diastereomeren von Triadimenol-I handelt es sich um die Threo- und bei den Isomeren von Triadimenol-II um die Erythroform. Die beiden Isomeren von Triadimenol besitzen eine unterschiedliche fungitoxische wie systemische Wirksamkeit. Um eine entsprechende Hemmung des Myzelwachstums von Cladosporium cucumerinum zu erzielen, war im Vergleich zu Triadimenol-I (Threoform) von Triadimenol-II (Erythroform) eine 3—4 mal höhere Konzentration notwendig. Eine deutliche Überlegenheit von Triadimenol-I gegenüber Triadimenol-II kommt in der Bekämpfung des Gerstenmehltaus nach Gießbehandlung zum Ausdruck. Nach Wurzelbehandlung zeigte Triadimenol-I eine 4—5 mal stärkere systemischfungitoxische Wirksamkeit als Triadimenol-II. Auch im Vergleich zu Triadimefon und Triadimenol besitzt Triadimenol-I eine deutlichere systemische Wirkung gegenüber Gerstenmehltau. Ähnliche Wirkungsunterschiede wurden nach Spritzbehandlung erzielt. Sowohl nach Wurzel- als auch nach Sproßbehandlung ergab sich in der Wirksamkeit der verschiedenen Verbindungen gegenüber Gerstenmehltau die Reihenfolge: Triadimenol-I > Triadimenol > Triadimefon > Triadimenol-II. Das Sproßwachstum der Tomatenpflanzen wurde z.B. durch Triadimenol-II stärker gehemmt als durch Triadimenol-I. I n orientierenden Untersuchungen über Aufnahme und Translokation wurden Gerstenkeimlinge (8 Tage alt) im Gießverfahren über die Wurzel mit den verschiedenen Fungiziden behandelt, die Sprosse zu verschiedenen Terminen nach der Fungizidapplikation extrahiert und die fungitoxischen Substanzen in den Extrakten mit Hilfe der Bioautographie-Technik nachgewiesen. Die Bioautogramme der E x t r a k t e von Pflanzen, die mit Nuarimol, Fenarimol und Imazalil behandelt worden waren, zeigten jeweils eine Hemmzone, wobei deren R f -Werte mit denen der entsprechenden technischen Wirkstoffe übereinstimmten. Andererseits wiesen die Bioautogramme der Sproßextrakte von Triadimefon — behandelten Pflanzen zwei fungitoxische Zonen auf ( B u c h e n a t j e r [6]). Unter Verwendung verschiedener Lösungsmittelgemische entsprachen die R r W e r t e der einen Hemmzone denen von Triadimefon, während die der zweiten Hemmzone mit denen von Triadimenol übereinstimmten. Untersuchungen über die Umwandlung von Triadimefon in Gerstenpflanzen ergaben 3 Tage nach der Behandlung einen Triadimefongehalt von 60,5%, dieser verminderte sich mit zunehmender Inkubationszeit auf 14,6% nach 24 Tagen. Gleichzeitig reicherten sich in den Gerstenpflanzen mit fortschreitender Einwirkungszeit die Transformationsprodukte von Triadimefon, insbesondere die Stereoisomeren von Triadimenol, an. Die Halbwertszeit von Triadimefon in Gerstenpflanzen betrug etwa 4—5 Tage. Während in den ersten Untersuchungsterminen (bis 12 Tage nach Behandlung) ein höherer Anteil an Triadimenol-I als an Triadiemenol-II in den Extrakten der Gerstensprossen nachgewiesen wurde, hatte sich zu Versuchsende (24 Tage) ein Gleichgewicht zwischen beiden Diastereomeren eingestellt ( B u c h k n a u e r [12]; [14]).

156

H . BUCHENAVKH

Wirkung auf das Wachstum höherer Pflanzen sowie auf den Gibberellinund Lipidstoffwechsel Wurzel- bzw. Saatgutbehandlungen mit Triadimefon, Triadimenol, Fenarimol, Nuarimol und Imazalil hemmten das Wachstum der Koleoptilen, Primärblätter und Wurzeln von 7 Tage alten Gersten- und Weizenkeimlingen. Bei vergleichbaren Konzentrationen hemmten die verschiedenen Verbindungen das Wachstum unterschiedlich stark, wobei sich hinsichtlich der Hemmwirkung folgende Reihe ergab: Nuarimol > Fenarimol > Triadimefon > Triadimenol > Imazalil. I m allgemeinen wurde bei den Keimlingen das Wurzelwachstum stärker durch die Fungizide gehemmt als das der Koleoptilen und Primärblätter ( B U C H E N A U E R [ 1 2 ] ; B U C H E N A U E R und G R O S S M A N N [ 1 6 1 ! BUCHENAUER u n d RÖHNER

[17]).

Saatgutbehandlungen mit Triadimefon und Triadimenol verzögerten die Seneszenz der Primärblätter von Gersten- und Weizenkeimlingen. Mit zunehmendem Alter der Keimlinge enthielten die Primärblätter der behandelten Pflanzen im Vergleich zur Kontrolle erhöhte Gehalte an Chlorophyllen, Karotinoiden, Xanthophyllen und Nukleinsäuren. Triadimefon und Triadimenol zeigten im Betacyanin-Test mit Amaratithus caudatus-Keimlingen Cytokinin-ähnliche Aktivität ( F Ü R S T E R [ 2 2 ] ; [ 2 3 ] ) . Behandlungen mit verschiedenen Gibberellinsäuren wirkten der durch die Fungizide induzierten Hemmung des Längenwachstums der Koleoptilen und Primärblätter entgegen. I m Vergleich zu den unbehandelten Sprossen enthielten die E x t r a k t e der behandelten Sprosse verminderte Gehalte an Gibberellin-ähnlichen Substanzen, wobei eine deutliche Beziehung zwischen der Hemmung des Sproßwachstums und den Gibberellingehalten bestand. Die Fungizide induzierten in Sprossen von Gerstenpflanzen z. T. starke Veränderungen in der C-4-Desmethylsterolfraktion, wobei eine Beziehung zwischen der wachstumsregulatorischen Aktivität der Substanzen und dem Gehalt der Phytosterole wie Campesterol, Stigmaterol und /3-Sitosterol festgestellt wurde; mit zunehmender Hemmung des Sproßwachstums verminderten sich die Gehalte an Phytosterolen. Studien zum Wirkungsmechanismus von Ancymidol, einem Wachstumsregulator bei Pflanzen, der strukturelle Ähnlichkeit mit den Fungiziden Triarimol, Fenarimol und Nuarimol besitzt, deuten darauf hin, daß Ancymidol primär in die Gibberellinsäuresynthese eingreift, indem die Umwandlung von Kauren zum Kaurenol bzw. die Transformation von Kaurenol zum Kaurenal gehemmt werden. Ancymidol hemmt somit die oxidative Demethylierung an der C-19 Position während der Gibberellinbiosynthese in Pflanzen ( C O O L B A U G H U. a. [ 1 8 ] ) . Möglicherweise greifen die Fungizide an den gleichen Stellen wie Ancymidol in die Gibberellinbiosynthese ein. In diesem Zusammenhang scheint es erwähnenswert, daß die Fungizide sowohl in Pilzen als auch in Pflanzen einen analogen Wirkungsmechanismus besitzen; sie greifen jeweils in oxidative Demethylierungsreaktionen von verschiedenen Stoffwechselwegen ein. Bei vergleichbaren Wirkstoffkonzentrationen wurde in Pflanzen der Gibberellinsäurestoffwechsel empfindlicher durch die Fungizide gehemmt als die Sterolbiosynthese. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Wirkstoffe analoge Reaktionen im pilzlichen und pflanzlichen Stoffwechsel beeinflussen können, wobei sich die Effekte vermutlich in beiden Fällen auf die Membranfunktion auswirken. Allerdings besteht keine Beziehung zwischen fungitoxischer Wirkung und einer Wachstumshemmung bei höheren Pflanzen.

Wirkungsinechanismus Sterolsynthese-bloekierender Fungizide

157

Diskussion BANASIAK: Die untersuchten Wirkstoffe weisen als gemeinsames Strukturmerkmal den N-substituierten Triazol-Ring auf. Trägt diese Gruppierung zur Wirkungsweise der Verbindungen bei oder erfüllt sie nur eine Trägerfunktion für andere essentielle Strukturelemente ? B U C H E N A U E R : B e i den N-substituierten heterozyklischen Verbindungen, wie Pyrimidin-, Triazol- und Imidazolderivaten, befindet sich jeweils ein N-Atom in 3'Position, welches wahrscheinlich für die Bindung am Angriffsort verantwortlich ist. B Ö T T C H E R : Ergosterol und andere Sterole stabilisieren bekanntlich Phospholipidmembranen und somit auch das Plasmalemma. Eine Blockierung der ErgosterolBildung muß demnach Membranen schädigen. Wie erfolgen jedoch die beobachteten Zellwandveränderungen, die z . B . bei der Induktion der multipolaren Sproßknospenbildung bei Ustilago beobachtet wurden ? B U C H E N A U E R : Rasterelektronenmikroskopische Untersuchungen von D E N O L L I N und B O R G E R S zeigten, daß nach Miconazol-Behandlung die normalen Teilungsvorgänge gestört waren; es bildeten sich Aggregationen von miteinander verbundenen Zellen wie sie auch bei Ustilago «Tewae-Sporidien beobachtet werden. Die behandelten C. albicans-Zellen hatten ebenfalls ihre bevorzugte polare Position der Knospen und Knospennarben verloren und die Wirkstoffeinwirkung führte sogar zu einer Erhöhung der Knospen und Knospennarben. Die behandelten Zellen tendierten zu einer erhöhten Teilungsrate gegenüber den Kontrollzellen. Diese anomalen Differenzierungs- und Teilungsvorgänge der behandelten Sporidien lassen sich auf eine gestörte Membranzusammensetzung zurückführen. F ü r die Einleitung der Teilungsprozesse spielt Ergosterol eine Rolle, wie beispielsweise bei C. albicans nachgewiesen werden konnte. PFLIEGEL: Denken Sie nicht, daß die Wirkung dieser Stoffe vom Redoxpotential des zentralen tertiären (oder quaternären) Kohlenstoffatonis abhängt und die (Hetero)arylsubstituenten (außer ihrer sterischen Wirkung) nur indirekt durch Beeinflussung dieses Redoxpotentials dazu beitragen ? BUCHENAUER: Während vieles dafür spricht, daß für die gemeinsame Wirkung dieser Substanzgruppe das N-Atom in 3-Position der N-substituierten Ringe von ausschlaggebender Bedeutung ist, stellt Ihre Hypothese über die Wirkung der Verbindungen einen interessanten Aspekt dar. SCHMIDT: Gibt es Hinweise zur Wirkungsbeeinflussung von Triadimefon beim gemeinsamen Einsatz mit Halmstabilisatoren, wie z . B . Chlormequat oder Ethephon in Getreide, bzw. werden Halmstabilisatoren in ihrer Wirkung durch Triadimefon beeinflußt ? BUCHENAUER: Die Halmstabilisatoren bzw. Halmverkürzungsnuttel wie Chlormequat oder Ethephon werden routinemäßig zu bestimmten Entwicklungsstadien des Getreides (insbesondere des Weizens und der Gerste )eingesetzt. Bei der Anwendung von Triadimefon liegen allerdings bestimmte Schadschwellen für die einzelnen Krankheitserreger zu Grunde. I n den meisten Fällen wird es daher nicht zur gleichzeitigen Anwendung beider Wirkstoffkomponenten kommen. Unter bestimmten Umständen müssen beispielsweise Triadimefon und Chlormequat bzw. Ethephon gleichzeitig appliziert werden. Hier sind bestimmte Interaktionen sowohl auf die Wirtspflanzen als auch auf die Krankheitserreger denkbar. Bisher liegen mir keine Informationen über solche Wechselwirkungen vor.

158

H . BUCHENAVEB

LYR: Can you explain me, or perhaps Prof. SISLER can do that, why sterol synthesis blocking in mildews should have such a high effect, when the parasite can take up sterols from plant cells ? Incorporation of foreign sterols into membranes of several organisms is frequently demonstrated, not only in fungi ? BUCHENAUER: Die Bedeutung von Ergosterol im Vergleich zu Cholesterol für die Zellfunktion wurde beispielsweise an Saccharomyces cerevisiae unter anaeroben Bedingungen untersucht. Während sich die Hefezellen in einem ergosterol-haltigen Medium normal vermehrten, trennten sich nach Cholesterolzugabe nach der ersten Vermehrungsrate die Tochterzellen nicht mehr von den Mutterzellen. Die Folge waren Zellaggregationen, ähnliche Effekte wie sie bei Ustilago arcriae-Sporidien in Anwesenheit der Ergosterol-Biosynthe-Hemmer beobachtet wurden. Auf die „ E c h t e n Mehltaupilze" übertragen würde dies bedeuten, daß für die Funktionsfähigkeit der Haustorienniembran vom Pilz synthetisiertes Ergosterol erforderlich ist und, daß die Phytosterole die Funktion von Ergosterol nicht übernehmen können. SISLER: The action of the group of compounds may not be limited to sterol C-14 demethylation. Oxidative demethylation in other pathways may be concurrently inhibited. Therefore ergosterol does not reverse toxicity. There are also various other explanations. F o r example, the large quantity of ergosterol precursors present in the treated cells may interfere with the utilization of ergosterol in the membrane. That is, they may occupy a position in the membrane which keeps added ergosterol from entering the membrane. NAUMANN : Welche Erklärung gibt es für die unterschiedliche Empfindlichkeit nahe verwandter Pilze gegen Triadimefon und die anderen erwähnten Fungizide, wenn man denselben Wirkungsmechanisnius bei allen diesen Verbindungen in Betracht zieht ? BUCHENAUER: F ü r die unterschiedliche Empfindlichkeit taxonomisch nah verwandter Pilze gegenüber dieser Wirkstoffgruppe sind drei verschiedene Mechanismen denkbar: 1. Unterschiede in der Aufnahmerate 2. Strukturunterschiede in den Rezeptormolekiilen 3. unterschiedlich starke Inaktivierung der Wirkstoffe Welcher der in Frage kommenden Mechanismen für die Sensitivitätsunterschiede verantwortlich ist, ist noch weitgehend unbekannt. GASZTONYI: AS you have shown in experiments with Fusarium culmorum incubated with triadimefon, this fungus is able not only to reduce the tridimefon to triadimenol, but in this reduction the more active diastereomer of triadimenol (I) is produced in great quantity. And inspite of this fact, the Fusarium species (in your experiment F. culmorum) are very resistant to tridimefon. Have you any idea for the explanation of this phenomenon ? I think, it may be explained by the differences in the affinity of the acceptor in this fungus or by very low local accumulation of a.i. at the site of action. Have you any experiments in this direction ? The uptake of triadimefon by Fusarium spp. is lower than by sensitive C. cucumerinum, but it is not so low that it can be an explanation for the resistance. BUCHENAUER: Ich stimme Ihrer Erklärung über die unterschiedliche Affinität am Angriffsort zu.

159

Wirkungsmechanismus Sterolsynthese-blockierender Fungizide

Literatur BAGGALEY,

K. H.,

S. D .

ATKIN,

P.

D.

ENGLISH,

R.

M.

HINDLEY,

B.

MORGAN

ami

J . GREEN, I n h i b i t i o n of cholesterol b i o s y n t h e s i s b y 1 - a l k y l i m i d a z o l e , B i o e h e m . P h a r maool. 24, (1975), 1 9 0 2 - 1 9 0 3 BOSSCHE,

H.

VAN D E N

,G. WILLEMSENS,

W.

COOLS, W .

F.

J.

LAUWERS

and

L.

LB

JEUNE, B i o c h e m i c a l e f f e c t s of m i c o n a z o l e o n f u n g i . I I . I n h i b i t i o n of e r g o s t e r o l bios y n t h e s i s in Candida albicans, C h e m . - B i o l . I n t e r a c t i o n s 21 (1978), 5 9 — 7 8 BORCKENHOFF, H . , Model of i n t e r a c t i o n of p o l a r lipids, cholesterol a n d p r o t e i n s in biological m e m b r a n e s , L i p i d s i) (1974), 645 — 650 BROWN, I . F . j r . a n d H . R . HALL, S t u d i e s o n t h e a c t i v i t y of t r i a r i m o l ( E L - 2 7 3 ) a g a i n s t c e r t a i n p o w d e r y m i l d e w f u n g i , P h y t o p a t h o l o g y (il (1971), 886 BUCHENAUER, H . , S y s t e m i s c h - f u n g i z i d e W i r k u n g u n d W i r k u n g s i n e c h a n i s m u s v o n T r i a d i m e f o n ( M E ß 6447), M i t t . Biol. B u n d e s a n s t . L a n d . - F o r s t w . B e r l i n - D a h l e m , H . 165 (1975), 1 5 4 - 1 5 5 BUCHENAUER, H . , U n t e r s u c h u n g e n z u r s y s t e i n i s c h e n W i r k u n g u n d z u m E i n f l u ß v o n © B a y l e t o n ( T r i a d i m e f o n ) auf v e r s c h i e d e n e pilzliche G e t r e i d e k r a n k h e i t e n , P f l . S c h u t z - N a c h r i c h t e n ( B a y e r ) 29 (1976), 2 6 7 - 2 8 9 BUCHENAUER, H . , M o d e of a c t i o n of t r i a d i m e f o n in Ustilago avenae, l ' e s t i c . B i o c h e m . P h y s i o l . 7 (1977a), 3 0 9 - 3 2 0 B U C H E N A U E R , H . , Biochemical effects on the systemic fungicides fenarimol (EL-222) a n d n u a r i m o l (EL-228) in Ustilago avenae, Z. P f l . K r a n k h . P f l . S c h u t z 84 ( 1 9 7 7 b ) , 286-299 B U C H E N A U E R , H . , S t u d i e s o n t h e m o d e of a c t i o n of i m a z a l i l in Ustilago avenae, Z. P f l . K r a n k h . P f l . S c h u t z 84 (1977c), 4 4 0 - 4 5 0 B U C H E N A U E R , H . , M o d e of a c t i o n a n d s e l e c t i v i t y of f u n g i c i d e s w h i c h i n t e r f e r e w i t h e r g o s t e r o l b i o s y n t h e s i s , P r o c . B r . C r o p . P r o t . Conf. — P e s t s a n d D i s . 3 ( 1 9 7 7 d ) , 699-711 BUCHENAUER, H . , I n h i b i t i o n of ergosterol b i o s y n t h e s i s b y t r i a d i m e n o l in Ustilago avenae, P e s t i c . Sei. i) (1978) BUCHENAUER, H . , U n t e r s u c h u n g e n z u r W i r k u n g s w e i s e u n d z u m V e r h a l t e n verschied e n e r F u n g i z i d e in P i l z e n u n d K u l t u r p f l a n z e n , H a b i l i t a t i o n s s c h r i f t ( 1 9 7 9 a ) , B o n n BUCHENAUER, H . , C o m p a r a t i v e s t u d i e s on t h e a n t i f u n g a l a c t i v i t y of t r i a d i m e f o n . t r i a d i m e n o l , f e n a r i m o l , n u a r i m o l , imazalil a n d f l u o t r i m a z o l e in v i t r o , Z. P f l . K r a n k h . P f l . S c h u t z 80 (1979b), 3 4 1 - 3 5 4 B U C H E N A U E R , H . , C o n v e r s i o n of t r i a d i m e f o n i n t o t w o d i a s t e r e o m e r s , t r i d i a i n e n o l - I a n d t r i a d i m e n o l - I I , b y f u n g i a n d p l a n t s , I X . I n t e r n . C o n g r e s s of P l a n t P r o t e c t i o n . W a s h i n g t o n D . C., A u g u s t 5 - 1 1 (1979c), A b s t r . N o . 939 BUCHENAUER, H . , I n t e r a c t i o n of d i f f e r e n t lipid c o m p o n e n t s w i t h v a r i o u s f u n g i c i d e s , Z. P f l . K r a n k h . P f l . S c h u t z 87 (1980), (im D r u c k ) B U C H E N A U E R , H . u n d F . G R O S S M A N N , T r i a d i m e f o n : M o d e of a c t i o n o n p l a n t s a n d f u n g i , N e t h . J . PI. P a t h o l . 83 (1977), 9 3 - 1 0 3 B U C H E N A U E R , H . und E . R Ö H N E R , Einfluß von Nuarimol, Fenarimol, Triadimefon u n d I m a z a l i l auf d e n Gibberellin- u n d L i p i d s t o f f w e c h s e l in j u n g e n G e r s t e n - u n d W e i z e n p f l a n z e n , M i t t . Biol. B u n d e s a n s t . L a n d - F o r s t w . B e r l i n - D a h l e m , H . 178 (1977), 158 C O O L B A U G H , R . C . , S. S. H I R A N O a n d C . A . W E S T , S p e c i f i c i t y of a c t i o n of a n c y m i d o l , a p l a n t g r o w t h i n h i b i t o r , P l a n t P h y s i o l . 57 (1976), 77 D E E N E N , V A N , L. L . M., l ' h o s p h o l i p i d e : B e z i e h u n g e n z w i s c h e n i h r e r c h e m i s c h e n S t r u k t u r u n d B i o m e m b r a n e n , N a t u r w i s s e n s c h a f t e n 50 (1972), 485 — 491 D E M E L , R . A . a n d B . D E K R U Y F F , T h e f u n c t i o n of s t e r o l s in m e m b r a n e s , B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 457 (1976), 1 0 9 - 1 3 2 E L L I O T T , C . G., M. R . H E N D R I X , B . A . K N I G H T S a n d W . P A R K E R , A s t e r o i d g r o w t h f a c t o r r e q u i r e m e n t in a f u n g u s N a t u r e 2 0 3 (1964), 427 — 428 F Ö R S T E R , H . , E i n f l u ß v o n T r i a d i m e f o n auf d e n P i g m e n t - , N u k l e i n s ä u r e - u n d P r o t e i n g e h a l t j u n g e r G e r s t e n p f l a n z e n , M i t t . Biol. B u n d e s a n s t ! . L a n d - F o r s t w . B e r l i n - D a h lem, I I . 178 (1977), 159

160

H.

BUCIIENATJER

H., Mechanism of action and side effects of triadimefon and triadimenol in barley plants, 3rd Intern. Congr. PI. Pathol. München 16 — 23 August (1978) p. 365 F U C H S , A. and C H . A. D R A N D A R E V S K I , Wirkungsbreite und W i r k u n g s g r a d von Triforine in vitro und in vivo, Z. P f l . K r a n k h . P f l . S c h u t z 80 (1973), 403 — 417 G E U N W A L B , O., P l a n t sterols, Ann. R e v . P l a n t Physiol. 2« (1975), 209 — 236 H A S K I N S , K . H . . A. P . T U L L O C H and R . G . M I C E T I C H , Steroids and the S t i m u l a t i o n of sexual reproduction of species of Pythium, Can. J . Microbio. 10 (1964), 187 — 195 H E N D R I X , J . W . , Sterol induction of reproduction and stimulation of growth of Pythium and Phytophthora, Science 144 (1964), 1 2 2 8 - 1 2 2 9 H E N D R I X , ,7. W . , Sterols in growth and reproduction in fungi, Ann. Kev. P h v t o p a t h . 8 (1970), 1 11 - 1 3 0 H U A N G , C . H . , A structural model for the cholesterol-phosphatidylcholine complexes in bilayor membranes, Lipids 12 (1977), 348 — 356 I W A T A , K . , H . Y A M A G U C H I and T . H I R A T A M , Mode of action of clotrimazole, Sabour a u d i a 11 (1973), 1 5 8 - 1 6 6 K A T O , T . , S. T A N A K A , M . U E D A and Y . K A W A S E , Inhibition of stei-ol biosynthesis in Monilinia jructigena b y the fungicide S-1358, Agr. Biol. Chem. 39 (1975), 169—174 L E R O T J X , P . and M . G R E D T , Effects de quelques fongicides systemiques sur la biosynthese de l'ergosterol chez Botrytis cinerea P E R S . , Penicillium expansum L I N K et Ustilago maydis (D. C.) CDN, Ann. Phytopathol. 10 (1978), 45 — 60 NES, W . R . , Role of sterols in membranes, Lipids !) (1974), 596 — 612 R A G S D A L E , N. N., Specific effects of triarimol on sterol biosynthesis in Ustilago maydis, Biochim. Biophys. A c t a 380 (1975), 81—96 R A G S D A L E , N. N., Inhibition of lipid synthesis. I n : Antifungal Compounds (Eds. H. S I S L E R and M . R . S I E G E L ) M A R C E L D E K K E R Inc., New York, Vol. I I (1977), 333 to 363 R A G S D A L E , N . N . and H. J ) . S I S L E R , Mode of action of triarimol in Ustilago maydis, 1'estie. Biochem. Physiol. 3 (1973), 2 0 - 2 9 R I E T H , H., Die unterschiedliche Bedeutung der Fettsäuren in ihrer fungistatischen W i r k u n g , Fette-Seifen-Anstrichmittel 7!) (1977), 1 2 0 - 1 2 1 R I T T E R , M . C. and M . E . D E M S E Y , Squalene and sterol carrier protein: S t r u c t u r a l properties, lipid-binding, and function on cholesterol biosynthesis, I'roc. Natn. A c a d . Sei. (USA) 70 (1973), 2 6 5 - 2 6 9 S H E R A L D , J . L . , N . N . R A G S D A L E and H . 1 ) . S I S L E R , Similarities between the systemic fungicides triforine and triarimol, I'estic. Sei. 4 (1973), 719—727 S H E R A L D , J . L. and H. 1). S I S L E R , Antifungal mode of action of triforine, I'estic. Biochem. Physiol. 5 (1975), 4 7 7 - 4 8 8 S I E G E L , M . R . and N . N . R A G S D A L E , Antifungal mode of action of imazalil, I'estic. Biochem., Physiol, i» (1978), 4 8 - 5 6 S R E E D H A R A S W A M Y , K . H . , M . S I R S I and G . R A M A N A N D A R A O , Studies on the mechanism of action of miconazole. Effect of miconazole on respiration and cell permeability of Candida albicans, Antimicrobi Agents Chemother. 5 (1975), 420 — 425 S U M W E L L , G . , R . R . M O D and F . C. M A Q C E , Antimicrobial a c t i v i t y of some f a t t y acid derivatives, J . Americ. Oil Chem. Soc. 55 (1978), 395 — 397 W E E T E , J . D., Sterols of the f u n g i : Distribution and biosynthesis, 1'hytochemistry 12 (1973), 1 8 4 3 - 1 8 4 6 W I L K I N S O N . C . F . , K . H E T N A R S K I and L . J . H I C K S , Substituted imidazoles as inhibitors of microsomal oxidation and insecticide synergists, Pestie. Biochem. Physiol. 4 (1974). 2 9 9 - 3 1 2 FÖRSTER,

H.-J.

PREUSSER

Institut für Mikrobiologie D-6100 Darmstadt/FRO

der Technischen Hochschule

Darmstadt,

Zum Wirkungsmechanismus von Imidazolfungiziden

N e b e n den von B a k t e r i e n , S t r e p t o m y z e t e n u n d Pilzen als S e k u n d ä r m e t a b o l i t e gebildeten A n t i m y k o t i k a A m p h o t e r i c i n B , N y s t a t i n , P i m a r i c i n u n d Griseofulvin n e h m e n die s y n t h e t i s c h e n a n t i f u n g a l e n V e r b i n d u n g e n in der m o d e r n e n T h e r a p i e der Mykosen einen immer b r e i t e r w e r d e n d e n R a u m ein. E i n prinzipielles P r o b l e m bei der E n t w i c k lung neuer C h e m o t h e r a p e u t i k a gegen h u m a n p a t h o g e n e Pilze ist die s t r u k t u r e l l e u n d funktionelle Ähnlichkeit von P a r a s i t u n d W i r t im zellulären Bereich. B e i d e sind E u k a r y o n t e n , in deren Zellen ähnliche stoffwechselphysiologische Prozesse a b l a u f e n , so d a ß eine Schädigung des Pilzes zugleich eine inhibierende W i r k u n g auf d e n Stoffwechsel der Wirtszelle a u s z u ü b e n v e r m a g . E s sollte d a s Ziel der p h a r m a z e u t i s c h e n F o r s c h u n g sein, solche A n t i m y k o t i k a zu entwickeln, die bei hoher E f f e k t i v i t ä t gegen d e n P a r a s i t den W i r t s o r g a n i s m u s so wenig wie möglich schädigen. N e b e n t i e r e x p e r i m e n tellen u n d klinischen T e s t s k o m m t den U n t e r s u c h u n g e n ü b e r den W i r k u n g s m e c h a n i s m u s n e u e n t w i c k e l t e r a n t i f u n g a l e r S u b s t a n z e n eine besondere B e d e u t u n g zu. U n s e r e A r b e i t s g r u p p e h a t es sich v o r g e n o m m e n , aus a u s g e w ä h l t e n , medizinisch r e l e v a n t e n T e s t o r g a n i s m e n den W i r k u n g s m e c h a n i s m u s von I m i d a z o l f u n g i z i d e n in v i t r o zu erforschen u n d — soweit p r a k t i s c h d u r c h f ü h r b a r — mit in vivo E x p e r i m e n t e n zu vergleichen. Hierzu bedienen wir uns in erster Linie solcher V e r f a h r e n , die Aussagen ü b e r f e i n s t r u k t u r e l l e V e r ä n d e r u n g e n in den Zellen ermöglichen. D a r ü b e r h i n a u s w e r d e n die submorphologischen Ergebnisse d u r c h biochemische U n t e r s u c h u n g e n e r g ä n z t , die in einer physiologisch-genetisch a r b e i t e n d e n G r u p p e unseres I n s t i t u t s z u m Teil m i t den gleichen S u b s t a n z e n u n d Organismen d u r c h g e f ü h r t werden. Ü b e r die zeitliche Folge von p a t h o m o r p h o l o g i s c h e n V e r ä n d e r u n g e n in der P a r a s i t e n zelle u n t e r d e m E i n f l u ß unterschiedlicher K o n z e n t r a t i o n e n v o n E c o n a z o l - n i t r a t , eines M i t t e der 60er J a h r e entwickelten A n t i m y k o t i k u m s a u s der R e i h e der I m i d a z o l d e r i v a t e , w u r d e bereits f r ü h e r b e r i c h t e t [5, 6]. I m folgenden sollen die d u r c h E c o n a z o l bei h u m a n p a t h o g e n e n Pilzen ausgelösten P r i m ä r e f f e k t e beschrieben u n d Ü b e r l e g u n g e n z u m W i r k u n g s m e c h a n i s m u s der S u b s t a n z d i s k u t i e r t werden.

Material und Methoden Der für die in vitro Versuche verwendete Stamm 101/58 von Trichophyton rubrum wurde 1976 von einer Patientin isoliert und wird seitdem auf Malzextrakt-Pepton-Dextrose-Agar kultiviert. Diesen sowie den durch regelmäßige Tierpassagen hochvirulenten S t a m m 200/175 von Candida albicans stellte uns freundlicherweise Dr. W. DITTMAR, Labor für Mykologie der Firma H O E C H S T AG in Frankfurt/M., zur Verfügung. Der Wachstums11 Systemfungizide

H.-J. Pretjsser

162

inhibitor Econazol-nitrat, 1 -[2'-(2,4-dichlorphenyl)-2'-(4-chlorbenzyloxy)-äthyl]-imidazolnitrat, (Hersteller: CILAG-CHEMIE AG, Schaffhausen/Schweiz) wird in Äthanol gelöst. Von der Stammlösung werden entsprechende Verdünnungen mit 0,8% NaCl-Lösung hergestellt. Kultivierungs- und Präparationsmethoden werden an anderer Stelle ausführlich beschrieben [5, 6], Für die in vivo Versuche wurden einer, an akuter Candida-Mykose erkrankten Patientin vor und während einer 3-Tage-Therapie mit 3 X 150 mg EconazolSuppositorien Vaginalabstriche entnommen und diese wie üblich für elektronenmikroskopische Untersuchungen präpariert [10]. Die Gefrierbruchpräparationen erfolgten nach einem an anderer Stelle beschriebenen Verfahren in einer Hochvakuum-Gefrierätzanlage BAF 301 der Firma BALZERS AG, Balzers/Fürstentum Liechtenstein [9]. Die elektronenmikroskopischen Untersuchungen geschahen in einem Elmiskop 102 der Firma Siemens AG, Berlin, bei 80 kV.

Ergebnisse und Diskussion Die unbehandelte Trichophyton rubrum-Ze\\e wird von einer, im Querschnitt strukturlos erscheinenden Zellwand umgeben. Der von einer wellenförmig verlaufenden Cytoplasmamembran begrenzte Protoplast ist mit Polysomen dicht gefüllt. Die zahlreich vorhandenen, rundlichen Mitochondrien besitzen lamelläre Cristae (Abb. 1). Fügt man einer wachsenden Flüssigkeitskultur 0,25 (jtg Econazol pro ml hinzu, so treten nach etwa zweistündiger Inkubationszeit die ersten elektronenoptisch sichtbaren Veränderungen im Zellinneren auf. Die zuvor deutlich nachweisbaren Außenmembranen der Mitochondrien, Kernmembranen und andere intrazelluläre Membransysteme lassen sich nicht mehr darstellen. Lediglich die den Protoplasten umgebende Cytoplasmamembran bleibt sichtbar (Abb. 2). Im Zellwandprofil erscheinen homogen verteilte fein-

Abb. 1. Ultradünnschicht von Trichophyton

rubrum;

unbehandelte Zelle Vergr. 36000x

Wirkungsirieehanismus von Imidazolfungiziden

163

Abb. 2. Ultradünnschnitt von Trichophyton rubrum nach zweistündiger Einwirkung von 0.25 ¡xg Econazol pro ml Nährsubstrat; intrazelluläre Membransysteme sind nicht mehr darstellbar, Kontraststeigerung der Zellwand Vergr. 48000 x granuläre Ablagerungen. Ähnliche Strukturveränderungen der Zellwand beobachtet man auch in vivo an Candida albicans aus vaginalem Abstrichmaterial während einer 3-Tage-Therapie mit Econazol-Suppositorien: Vor der Behandlung sind die Zellen des Candida-Myzels von einer strukturlos erscheinenden Zellwand umgeben (Abb. 3) 4 Std. nach Applikation eines 150 mg Econazol-Suppositoriums nimmt die Zellwand der Sproßzellen eine granuläre Strukturierung an, während die Organellen im Zellinneren noch weitgehend unverändert erscheinen (Abb. 4). 24 Std. nach Behandlungsbeginn sind im Abstrichmaterial nur noch vereinzelt vermehrungsfähige CandidaZellen nachweisbar. Abbildung 5 zeigt ein invasives Myzel innerhalb einer Vaginalepithelzelle. Die die Zellen umgebenden Wände sind stark kontrastiert. F ü r die durch Econazol hervorgerufenen primären Strukturveränderungen in den Zellen humanpathogener Pilze bieten sich folgende beiden Deutungsmöglichkeiten 1. Das Antimykotikum bewirkt während der Penetration durch die Zellwand eine Freisetzung gebundener Zellwandlipide und -lipoproteine. Bei der nachfolgenden Fixierung bzw. Kontrastierung des Materials für die Elektronenmikroskopie kommt es zu einer Anlagerung von Schwermetallionen an diese Lipide, was zu der beobachteten Kontrasterhöhung führt. Da nach R A T T R A Y u. a. [ 1 2 ] der Lipidgehalt der Zellwand von Candida albicans mit 0 , 0 3 — 0 , 6 % ihres Trockengewichts nur sehr gering ist, erscheint eine Kontraststeigerung auf diesem Wege recht unwahrscheinlich.

164

H.-J.

Abb. 3. Myzel von Candida albicans im Vaginalabstrieh einer an akuter erkrankten, unbehandelten Patientin

Candida-Mykose Vergr. 2 4 0 0 0 X

PREUSSER

Abb. 4. Candida albicans - Zellque rsehn i 11 in Vaginalepithelzelle nach vierstündiger Einwirkung eines 150 mg Econazol-Suppositoriums; erhebliche Kontrasterhöhung des Zellwandprofils Vergr. 7 2 0 0 0 X

W i r k u n g s m e c h a n i s m u s von Imidazolfungiziden

Abb. 5 . I n v a s i v e s Myzel von Candida albicans n a c h 2 4 s t ü n d i g e r E i n w i r k u n g eines 150 m g E c o n a z o l - S u p p o s i t o r i u m s ; s t a r k e K o n t r a s t e r h ö h u n g der Zellwand, P r o t o p l a s t w e i t g e h e n d lysiert V e r g r . 14 5 0 0 x

A b b . 6 . S c h e m a t i s c h e D a r s t e l l u n g der I n n e n s t r u k t u r i e r u n g der C y t o p l a s m a m e m b r a n von Candida albicans

166

H . - J .

PREUSSEK

2. Das Antimykotikum penetriert durch Zellwand und Cytoplasmamembran und bewirkt eine Extraktion von Lipiden, Phospholipiden und anderen lipidhaltigen Substanzen aus intrazellulären Membransystenien von Zellorganellen. Wie an anderer Stelle berichtet, können in econazolbehandelten Zellen größere Lipidmengen elektronenoptisch und cytochemisch nachgewiesen werden [8], Darüber hinaus verändert Econazol die Permeabilität der Cytoplasmamembran, so daß die extrahierten Lipide nach Passage der Membran in der Zellwand mittels entsprechender Kontrastierungssubstanzen nachgewiesen werden können. F ü r diese Deutung sprechen Befunde von K E H N U. Z I M M E R M A N N [ 2 ] , die in physiologischen Versuchen mit Candida albicans durch Econazol eine Permeabilitätserhöhung der Cytoplasmamembran hervorrufen konnten. E s stellt sich nun die Frage, ob und in welcher Weise Imidazolderivate die Struktur der Cytoplasmamembran verändern. Nach biochemischen in vitro Versuchen an Candida albicans mit Miconazol und Clotrimazol scheint die Vermutung zuzutreffen, daß Imidazole die Biosynthese des Membranbausteins Ergosterin inhibieren, wodurch die Stabilität der Membran herabgesetzt wird [1, 16]. Diese Erklärung mag für den Wirkungsmechanismus der Imidazole zwar zutreffen, erseheint jedoch nach Befunden von Hemmtests mit Bakterien unvollständig. Von mehreren Forschergruppen konnte nämlich nachgewiesen werden, daß Imidazolderivate bakterizid auf grampositive Bakterien wirken, also auf Prokaryonten, deren Membranen keine Steroide enthalten [11, 13, 14, 15]. Zur weiteren Aufklärung dieses Problems erschien es daher sinnvoll, das

Altb. 7. G e f r i e r b r u e h a b d r u c k der inneren S p a l t h ä l f t e der C y t o p l a s m a m e m b r a n einer u n b e h a n d e l t e n , sprossenden Candida albicans-Ze\\e; d i c h t e r , h o m o g e n e r B e s a t z mit globulären P r o t e i n e n , in das Zellinnere hineinreichende M e m b r a n i n v a g i n a t i o n e n ; der P f e i l m a r k i e r t die B e s c h a t t u n g s r i c h t u n g ! Vergr. 3 6 0 0 0 X

Wirkungsmechanismus von Imidazolfungiziden

167

Ahl). 8 . G e f Y i e r b r u c h a b d r u c k d e r i n n e r e n M e m b r a n s p a l t h ä l f t e n a c h 2 4 s t ü n d i g e r E i n w i r k u n g v o n 10 ;j.g E c o n a z o l p r o m l ; R e d u z i e r u n g d e r A n z a h l g l o b u l ä r e r P r o t e i n e u n d g r u p p e n w e i s e A n o r d n u n g in h e x a g o n a l e n M u s t e r n , A b r e i ß e n v o n T e i l e n d e r ä u ß e r e n M e m b r a n s p a l t h ä l f t e : der Pfeil m a r k i e r t die B e s c h a t t u n g s r i c h t u n g ! Vergr. 100000 X

innere Gefüge der Cvtoplasmaniembran von Candida albicans mit Hilfe der Gefrierbruchtechnik zu untersuchen. Mit dieser Methode erhält man Ansichten der beiden Spalthälften einer Membran ( E F - und P F - F l ä c h e ) , da die Brüche zumeist im hydrophoben inneren Bereich der Membran verlaufen und so die beiden Lipidlamellen voneinander getrennt werden (Abb. 6). Die P F - F l ä c h e („plasmatic fracture f a c e " ) ist dicht und homogen mit etwa 10 nm großen globulären Partikeln besetzt. Sie bestehen nach K O P P [3] aus den hydrophoben Anteilen von Proteinen, die in die protoplasmaseitige Lipidlamelle integriert sind und in das apolare Membraninnere hineinragen. Invaginationen der Cytoplasmamembran senken sich in Form von rinnenförmigen Vertiefungen in das Innere der Zelle (Abb. 7). X a c h ! i \ x i.mans vi. a. [4] sollen in diesen Einfaltungen Enzyme der Mannanbiosynthese gebildet werden. Nach sechsstündiger Einwirkung von Econazol verschwinden zunächst die Membraninvaginationen. Unter anhaltendem Eeonazoleinfluß löst sich dann der dichte Partikelbesatz der P F - F l ä c h e in einzelne Partikelgruppen auf, die oftmals ein hexagonales Muster bilden (Abb. 8). Dazwischen treten immer zahlreicher partikelfreie Bereiche auf. Der Gefrierbruch verläuft bei derartig stark veränderten Membranen nicht mehr exakt zwischen den beiden Lipidlamellen, so daß Teile der äußeren Lamelle abgerissen werden und der P F - F l ä c h e als Bruchstücke anhaften.

168

H.-J.

PKEUSSER

Wir nehmen an, daß durch eine verminderte Hydrophobie im Membraninneren die stabilisierenden Wechselwirkungen zwischen beiden Lipidlamellen verringert werden. Dadurch ändert sich der Bruchverlauf während der Präparation und Teile der äußeren Lipidlamelle reißen ab. Sie haften der P F - F l ä c h e als Bruchstücke an. Eine, durch das Antimykotikum verursachte Verringerung des Ergosteringehalts der Membran könnte diese Stabilitätsminderung auslösen. Außerdem ändern sich Anzahl und Anordnung der globulären integralen Membranproteine, denen in erster Linie Transportfunktionen zuzuordnen sind. Durch diese Strukturveränderung im Membrangefüge wird vermutlich auch der kontrollierte Membrantransport erheblich beeinflußt. Die beobachteten und hier beschriebenen Strukturveränderungen verursachen nicht nur einen Funktionsverlust der Membranen, sondern sie führen direkt oder indirekt auch zum Tod der Zellen. Ausplattierungen derartig stark geschädigter Zellen zeigten nämlich eine Überlebensrate von weniger als 0 , 5 % .

Zusammenfassung Die zur Therapie von Humanmykosen verwendeten Antimykotika aus der Reihe der Imidazolderivate beeinflussen die Permeabilität der Zellhülle der Pilze. Dieser Effekt beruht vermutlich auf einer Biosynthesehemmung des essentiellen Membranbausteins Ergosterin. Darüber hinaus findet gleichzeitig mit der Permeabilitätserhöhung eine mengenmäßige Abnahme und eine Umorientierung integraler Proteine in der Cytoplasmamembran statt. Dieser Vorgang beeinflußt möglicherweise die Transportfunktion der Zellhülle. E s scheint, daß unter dem Einfluß der antifungalen Verbindungen lipidhaltige Substanzen aus intrazellulären Membransystemen extrahiert werden und dann durch die defekte Cytoplasmamembran und die Zell wand in das Nährmedium gelangen. Aufgrund der Bindungsfähigkeit von Schwermetallen an Lipide während Fixierung und Kontrastierung können diese Substanzen in der Zellwand elektronenmikroskopisch nachgewiesen werden. Mittels biochemischer Analysenverfahren sollte es gelingen, die extrahierten Lipide im Nährmedium qualitativ und quantitativ zu bestimmen.

Summary Imidazole derivatives used as antimycotics in the therapy of human mycoses affect the permeability of the fungal cell envelope. I t is suggested that this effect depends on an inhibition of the biosynthesis of the essential membrane component ergosterol. Moreover, the increase of the membrane permeability is accompanied by a decrease in number of integral proteins and by a change of their orientation in the cytoplasmic membrane. This process may affect the transport function of the cell envelope. I t seems that under influence of the antifungal agents lipid containing substances will be extracted from intracellular membrane systems and, then, pass the defect cytoplasmic membrane and the cell wall. Due to the binding power of heavy metals to lipids during fixation and staining these substances can be detected electron microscopically in the cell wall.

Wirkungsmechanismus von Imidazolfungiziden

169

Q u a l i t a t i v e a n d q u a n t i t a t i v e d e t e r m i n a t i o n s of t h e e x t r a c t e d lipids should b e feasible in t h e c u l t u r e m e d i u m b y m e a n s of a n a l y t i c a l biochemical m e t h o d s . Diskussion LYE: Welches sind die U r s a c h e n der h u m a n t o x i s c h e n W i r k u n g , die Sie e r w ä h n t e n ? Gibt es Anzeichen, d a ß die S y n t h e s e der S t e r o i d h o r m o n e blockiert wird ? PREUSSER: Die e r w ä h n t e n W i r k u n g e n k ö n n e n n i c h t als toxisch e i n g e o r d n e t werden. S C H E W E : A u f g r u n d der vorgestellten Ergebnisse von I h n e n u n d D r . B U C H E N A U E R b e s t e h t die Möglichkeit, d a ß die hier b e s p r o c h e n e n F u n g i z i d e eine P e r o x i d a t i o n der M e m b r a n p h o s p h o l i p i d e v e r u r s a c h e n . D a f ü r sprechen folgende F a k t e n : — D r . B U C H E N A U E R wies eine chemische Modifizierung der P h o s p h o l i p i d e n a c h m i t d e m A u f t r e t e n eines U V - A b s o r p t i o n s m a x i m u m s bei 240 n m ; dies spricht f ü r die B i l d u n g k o n j u g i e r t e r Diene, wie sie a u c h bei der L i p i d p e r o x i d a t i o n e i n t r i t t . — Die B i l d u n g von L i p i d p e r o x i d e n w ü r d e a u c h die e l e k t r o n e n o p t i s c h e n V e r ä n d e r u n g e n bei A n w e n d u n g der G e f r i e r b r u c h t e c h n i k e r k l ä r e n ; die E i n f ü h r u n g der h y d r o p h i l e n -O-O-H G r u p p e n setzt die H y d r o p h o b i z i t ä t der u n p o l a r e n F e t t s ä u r e reste h e r a b u n d d a m i t die Wechselwirkung m i t den integralen M e m b r a n p r o t e i n e n , w o d u r c h deren Solubilisierung b e w i r k t werden k a n n . — D a s geschädigte E n z y m s y s t e m der E r g o s t e r o l - B i o s y n t h e s e ist d a s m i k r o s o m a l e C y t o c h r o m P - 4 5 0 - S y s t e m . Aus U n t e r s u c h u n g e n des e n t s p r e c h e n d e n S y s t e m s d e r L e b e r ist b e k a n n t , d a ß das mikrosomale E l e k t r o n e n t r a n s p o r t s y s t e m d u r c h Lipidp e r o x i d a t i o n i n a k t i v i e r t wird (z.B. K A G A N et al.). Somit k ö n n t e die H e m m u n g der E r g o s t e r o l y s n t h e s e einen S e k u n d ä r e f f e k t darstellen. KOCH: Econazol, Miconazol u n d Clotrimazol h a b e n bei systemischer A n w e n d u n g zu einer I n d u k t i o n v o n L e b e r m i k r o s o m e n - E n z y m e n g e f ü h r t , w o d u r c h m i t z u n e h m e n d e r T h e r a p i e d a u e r eine I n a k t i v i e r u n g e i n t r i t t . Welche Beeinflussungen v o n P r o t e a s e n d u r c h I m i d a z o l e h a l t e n Sie f ü r möglich ? PREUSSER: Die b e o b a c h t e t e q u a n t i t a t i v e A b n a h m e integraler M e m b r a n p r o t e i n e u n t e r I m i d a z o l e i n f l u ß k a n n möglicherweise darauf b e r u h e n , d a ß d u r c h d a s A n t i m y k o t i k u m im P l a s m a l e m m a lokalisierte m e m b r a n g e b u n d e n e P r o t e a s e n freigesetzt u n d / oder a k t i v i e r t werden.

Literatur [1]

H A L L E R , I., Imidazole-antimycotics: experience with clotrimazole, experimental aspects, aims for the future, in: H . - J . P R E U S S E R (Hsg.), Medical Mycology, Gustav Fischer Verlag, S t u t t g a r t 1980, 241 — 253 [ 2 ] K E R N , R . und F . K . Z I M M E R M A N N , Über den Wirkungsmechanismus des Antimyzetikum Econazol, Mykosen 20 (1977), 1 1 3 - 1 4 6 [3] K O P P , F . , Electron microscopy of yeasts, in: D . M. P R E S C O T T (Hsg.) Methods in Cell Biology, Academic Press, New York 1975, Vol. X I , 23 — 44 [4] L I N N E M A N S , W . A . M . , P . B O E R and P . F . E L B E R S , Localization of acid phosphatase in Saccharomyces cerevisiae: a clue to cell wall formation, J . Bact. 131 (1977), 638 — 644 [ 5 ] P R E U S S E R , H . - J . , Die Wirkung von Econazol auf die Feinstruktur der Zellen von Trichophyton rubrum, Mykosen 18 ( 1 9 7 5 ) , 4 5 3 — 4 6 5 [6] P R E U S S E R , H . - J . , Effects of in vitro t r e a t m e n t with econazole on the ultrastructure of Candida albicans, Mykosen 19 (1976), 3 0 4 - 3 1 6

170

H.-J.

PREUSSER

[ 7 ] PREUSSER. H . - J . u n d LT. BARTLETT, D i e W i r k u n g v o n E c o n a / . o l - n i t r a t a u f Candida albicans. I. D e r K i n f l u ß a u f d i e V e r m e h r u n g s r a t e u n d d i e U l t r a s t r u k t u r d e r in v i t r o Z e l l e n , N o t a b e n e m e d i c i 7 ( 1 9 7 7 ) , (i —9 IS] PREUSSER, H . - J . a n d H . KOSTEK, E c o n a z o l e e f f e c t s o n Trichophyton rubrum and Candida albican« — e l e c t r o n m i c r o s c o p i c a n d c y t o c h e m i c a l s t u d i e s , M y k o s e n , S u p p l . 1 ( 1 9 7 8 ) , 3 1 4 — 321 19] PREUSSER. H . - J . a n d H . KOSTEK. F r e e / . e - f r a c t u r e s t u d i e s of t h e p l a s m a l e i m n a of Candida albicans a f t e r t r e a t m e n t w i t h e c o n a / o l e - n i t r a t e , S a b o u r a u d i a 17 ( 1 9 7 9 ) . 389-398 [10]

PREUSSER,

H.-J.,

H.

KOSTEK,

M.

KLEIN,

H.

BECKER

und

W .

P.

NASS,

Elektronen-

m i k r o s k o p i s c h e U n t e r s u c h u n g e n a n Candida albicans a u s v a g i n a l e m A b s t r i c h m a t e r i a l w ä h r e n d e i n e r 3 - T a g e - T h e r a p i e m i t E c o n a z o l . A r / . n e i m . - F o r s c h . ( D r u g . K e s . ) 2!) (1979) 1432-1437 [ 1 1 ] RAAB, W . . M y k o s e b e h a n d l u n g m i t J m i d a z o l d e r i v a t e n . S p r i n g e r - V e r l a g . B e r l i n 1 9 7 8 [ 1 2 ] RATTRAY, J . B . M . , A . SCHIBECI a n d 1). K . K I D B Y , L i p i d s of y e a s t s , B a c t . R e v . 8 » (1975), 1 9 7 - 2 3 1 [ 1 3 ] SCHÄR, G . , F . H . K A Y S E R a n d M . C . D F P O S T , A n t i m i c r o b i a l a c t i v i t y o f e c o n a z o l e

and

m i c o n a z o l e in v i t r o a n d in e x p e r i m e n t a l c a n d i d i a s i s a n d a s p e r g i l l o s i s . C h e m o t h e r a p v •>•> (197(>), 2 1 1 - 2 2 0 [14]

THIENPONT,

D.,

J.

VAN

CUTSEM,

J.

M.

VAX N U E T E N .

C. J .

E.

NIEMEGGERS

and

IT.

MARSBOOM. B i o l o g i c a l a n d t o x i c o l o g i c a l p i ' o p e r t i e s of e c o n a z o l e , a b r o a d s p e c t r u m a n t i m y c o t i c . A r z n e i m . - F o r s c h . ( D r u g K e s . ) 2 5 (1975), 2 2 4 — 2 3 0 [ 1 5 ] VAN CUTSEM, J . M . a n d J ) . THIENPONT, M i c o n a z o l e , a b r o a d - s p e c t r u m a n t i m y c o t i c a g e n t w i t h a n t i b a c t e r i a l a c t i v i t y , C h e m o t h e r a p y 17 ( 1 9 7 2 ) , 3 9 2 — 4 0 4 [Hi]

VAN

DEN

BOSSCHE,

H.,

G.

WILLEMSENS,

W .

COOLS. W .

F.

J.

LAUWERS

and

JEUNE. B i o c h e m i c a l e f f e c t s of m i c o n a z o l e o n f u n g i — I I . I n h i b i t i o n of b i o s y n t h e s i s in Candida albicans. O h e m . - B i o l . ' I n t e r a c t . 2 1 ( 1 9 7 8 ) , 59— 78

L.

LE-

ergosterol

H . D . SISLER, C. P . WOLOSHUK a n d P . M .

Department

of Botany,

University

of Maryland,

WOLKOW

College Park,

Maryland,

U.S.A.

Studies on the Mode of Action of Tricyclazole and Related Compounds

There is considerable interest in compounds which control fungal diseases of plants by modifying the host-parasite relationship through mechanisms other t h a n direct toxicity to fungal growth. It is a reasonable assumption t h a t a diverse variety of modifications of this relationship may lead to the failure of disease development or to a marked diminishment of disease severity. A recent s t u d y by M A I T I et al. [ 5 ] , showed t h a t specific inhibition of cutinase b y cutinase antibodies or b y diisopropylfluorophosphate protected pea epicotyls from infection b y Fusarium solani pisi. I n neither case did the protecting agent prevent growth of the pathogen on the plant tissue surface. Several recent studies have been made with compounds which control rice blast disease caused b y Pyricularia oryzae b y mechanisms other t h a n conventional fungitoxicity. C A R T W R I G H T et al. [2] showed t h a t 2,2-dichloro-3,3-dimethylcyclopropane carboxylic acid accentuated production of momilactone phytolexins in rice plants challenged b y P. oryzae and suggested t h a t this m a y b e the basis for rice blast control b y the compound. Probenazole, a compound related to saccharin, is reported b y W A T A N A B E [ 1 1 ] to be more effective in preventing penetration of rice plants by P. oryzae t h a n as an inhibitor of growth of the pathogen in vitro. Another compound, tricyclazole, is highly effective in controlling rice blast disease at concentrations below those which inhibit growth of the pathogen in vitro [6]. E v e n though t h e compound is essentially devoid of toxicity to P. oryzae in the concentration range of 1 to 20 [xg/ml [3, 9], it is a potent inhibitor of melanin biosynthesis in this f u n g u s at concentration of 0.1 fxg/ml or less [10, 14], Although tricyclazole is not reported to control diseases caused b y Verticillum dahliae, it inhibits melanin biosynthesis in this fungus. Since the polyketide-melanin biosynthetic p a t h w a y has been partially elucidated in V. dahliae [1, 8, 12], the organism was used to s t u d y the mode of action of tricyclazole on melanin biosynthesis [10]. These studies showed t h a t tricyclazole primarily blocks the p a t h w a y in V. dahliae between 1,3,8-trihydroxynaphthalene and melanin. More recently a similar mode of action of tricyclazole has been demonstrated in Thieluviojmis basicola [13]. The present paper reports on the effect of tricyclazole and of two compounds with a similar mode of action on growth and melanin biosynthesis in P. oryzae and considers some possible relationships between the action of the compounds on this pathogen and disease control.

172

H.

D.

S l S L E R , C. P . W O L O S H U K ,

P. M.

W O L K O W

Results Fungitoxicity and inhibition of melanin biosynthesis Tricyclazole ( E L 291), 5-methyl-l,2,4-triazolo (3,4-6)-benzothiazole [3]; C G A 49104, l,2,5,6,-tetrahydro-4H-pyrollo-[3,2,l-i,J]-qumolin-4-one [6] and pp-389, 4,5-dihydro4-methyltetrazolo (1,5a) quinazolin-5-one [7], (Fig. 1) specifically control rice blast disease caused b y P. oryzae. A l l of the compounds are v e r y weak fungitoxicants but are potent inhibitors of melanin biosyntheses in P. oryzae [Tab. 1]. Tricyclazole and C G A 49104, in particular, display outstanding potency as selective inhibitors of melanin biosynthesis. Partial inhibition can be detected at concentrations less than 1 0 " 8 M and 10" 7 M f o r the t w o compounds respectively [14].

N =

il

N

N N-CH,

TRICYCLAZOLE (EL-2911

CGA

vi

49104

0

pp 3 8 9

Fig. 1. Structures of tricyclazole, CGA 49104 and pp-389

Table 1 Effect of various concentrations of EL 291 (tricyclazole), CGA 49104 and pp-389 on radial growth (O) and melanization (M) of Pyricularia oryzae on sucrose-nitrate agar medium \_10~\ after 7 days ¡xg/ml Compound

EL-291 CGA pp-389 a b

0.01

0.1

1.0

50

10

G*

Mb

G

M

G

M

G

M

G

M

0 0 0

2 1 0

0 0 0

3 2 1

0 0 0

3 3 2

0 0 0

3 3 3

18 18 0

3 3 3

Percent inhibition of growth. Inhibition of melanization: 0, none; ] , slight; 2, moderate; 3, complete.

Although the three compounds appear dissimilar in several structural features, all share in common the structural configuration shown in F i g . 2. I t is believed that the 3 compounds act in a similar or identical manner for the following reasons, (a) A l l are specific f o r the control of rice blast disease, (b) A l l selectively inhibit melanin biosynthesis in P. oryzae at non-fungitoxic concentrations, (c) A l l produce a similar pattern of polyketide pigment excretion in this fungus [14].

fy [

|l

_ I r4

3

Fig. 2. Configuration common to tricyclazole, CGA 49104 and pp-389 R i = H , CH 3 or (CH 2 in ring system) : R 2 = N , C H or CH 2 in ring system; R 3 = 0 or ( N in ring system) ; R 4 = S, CH 2 or N in ring system (compare with Fig. 1)

Mode of action of tricyclazole and related compounds

173

Site of action in melanin biosynthetic pathway of P. oryzae

Tricyclazole blocks the pentaketide pathway (Fig. 3) between 1,3,8-trihydroxynaphthalene and melanin in V. dahliae and as a consequence various metabolites such as 2-hydroxyjuglone accumulate. We have investigated the effect of tricyclazole on the pentaketide pathway to melanin in P. oryzae. While melanin biosyntheses in this organism is more sensitive to tricyclazole than in V. dahliae, the action of the compound is similar in the two organisms. Low concentration (0.01—1.0 [ig/rril) block the pathway prior to vermelone in P. oryzae (Fig. 3) and this leads primilary to the accumulation of 2-hydroxyjuglone together with some flaviolin and 3,4-dihydro-3,4,8-trihydroxy-1 (2H)napthalenone (DTN). Only the latter compound is detectable in untreated cultures (Tab. 2). Higher concentrations (10 [xg/ml or greater) inhibit conver-

Acetate

pentaketide

H O ' ^ - ^ - ' O H

HO'

Scytalone

1,J,8-THN

STAGE 1 MAINLY SOLUBLE REDDISHBROWN PIGMENTS PRODUCED (PREDOMINANT AT 20 ofi MORE )FI/ML TTTLCYCLAZOLE) STAGE 3 NORMAL GRAY-BLACK INSOLUBLE PIGMENT (MELANIN) PRODUCED

Other

Products

Pig. 3. Scheme showing polyketide pathway to melanin with associated side p a t h w a y s and indicating pigment production at various stages. A b b r e v i a t i o n s : 1 , 3 , 8 - T H N , 1,3,8,-trihydroxynaphthalene ; 1 , 3 , 6 , 8 - T H N , 1,3,6,8-tetrahydroxynaphthalene ; 2 H J , 2-hydroxyjuglone; D T N , 3,4 dihydro-3,4,8-trihydroxy-l (2H) naphthalenone ; D D N , 3,4 dihydro-4, 8-dihydroxy-l (2H) naphthalenone; 1,8-DHN, 1,8-dihydroxynaphthalene

sion of 2-hydroxyjuglone to DTN and apparently partially block the pathway prior to scytalone with the result that accumulation of flaviolin and products derived from this metabolite is accentuated (Fig. 3, Stage I). Products derived from flaviolin include 3,3'-biflaviolin a compound first identified in T. basicola [13] and 4-hydroxyscytalone. These metabolites tend to accumulate in older cultures treated with tricyclazole. The metabolite 3,4-dihydro-4,8-dihydroxy-l (2H)-naphthalenone (DDN), derived from DTN (Fig. 3), is found in untreated cultures of both P. oryzae and V. dahliae. This metabolite accumulates in older cultures of P. oryzae treated with 1 (Ag/ml or less

H . D . SlSLER, C. P . WOLOSHUK, P . M. WOIKOW

174

Table 2 Effect of several concentrations of tricyclazole of polyketide metabolites in sucrose-nitrate I'. oryzaea& Tricyclazole [ig/ml 0 0.1 1.0 10.0 a

on agar

accumulation cultures of

¡jig/1 25 ml a g a r med ium 2HJ

Flaviolin

DTN

0 76 89 84

0 11 22 66

5 21 9 trace

Medium c o n t a i n i n g inhibitor (0—10 ¡xg/ml) i n n o c u l a t c d with conidial suspension a n d i n c u b a t e d for 5 d a y s e x t r a c tion a n d p u r i f i c a t i o n of m e t a b o l i t e s by p r o c e d u r e s of TOKOUSBALIDES a n d SISLER (10)

of tricyclazole, b u t its p r o d u c t i o n is strongly suppressed b y c o n c e n t r a t i o n s of 10 ¡Ag/ m l or greater. I n t h e p a t h w a y of polyketide-nielanin biosynthesis as presently conceived [1, 8, 10, 13], tricyclazole p r i m a r i l y blocks t h e r e d u c t i o n of 1 , 3 , 8 - t r i h y d r o x y n a p h t h a l e n e t o vernielone in t h e f u n g i V. dahliae [10] P. oryzae [14] a n d T. basicola [13]. T h e precise n a t u r e of this inhibition, however, has n o t been d e t e r m i n e d . Since t h e p a t t e r n of p e n t a k e t i d e p i g m e n t excretion associated w i t h inhibition of melanin biosynthesis in P. oryzae is similar in cultures t r e a t e d with either tricyclazole C G A 4 9 1 0 4 or pp389, t h e t h r e e c o m p o u n d s a p p a r e n t l y act a t t h e same site in t h e melanin b i o s y n t h e t i c p a t h w a y of t h i s organism. Relationship of inhibition of melanin biosynthesis to disease control A l t h o u g h it is believed t h a t a relationship exists between inhibition of melanin biosynthesis a n d rice blast control, this relationship has n o t been established. H o w e v e r , in view of t h e u n u s u a l selectivity a n d high p o t e n c y of tricyclazole, CGA 49104 a n d pp-389 as inhibitors of melanin biosynthesis, it seems likely t h e t y p e of e n y z m e inhibited in t h i s p a t h w a y is involved in action leading t o disease control. T h e e n z y m e m a y n o t b e restricted t o melanin biosynthesis in t h e p a t h o g e n a n d it m a y also occur in t h e host plant. Cultures of tricyclazole t r e a t e d wild t y p e P. oryzae closely resemble buff m u t a n t s genetically defective in melanin biosynthesis. L a t t e r e l l [4] r e p o r t e d t h a t such m u t a n t s are not p a t h o g e n i c . More t h a n 30 buff m u t a n t s of P. oryzae (p — 2), derived spont a n e o u s l y or b y U V irridiation, h a v e been selected in our l a b o r a t o r y . T h u s f a r , p a t h o genicity a n d t h e biochemical lesion in melanin biosyntheses h a v e been s t u d i e d in only one of these m u t a n t s , p — 2 nij. This m u t a n t is n o t p a t h o g e n i c to rice varieties Nova-66 a n d N a t o which are readily infected b y t h e p a r e n t w i l d - t y p e strain. Accumulation p a t t e r n s of t h e p e n t a k e t i d e metabolites 2 - h y d r o x y j u g l o n e , flaviolin a n d D D N in this m u t a n t are n e a r l y identical w i t h those f o u n d in t h e wild t y p e strain t r e a t e d with 0.1 ¡i.g/ml of tricyclazole. These results s t r o n g l y indicate t h a t t h e observed effects of tricyclazole CGA 4 9 1 0 4 a n d pp-389 are a n t i p a t h o g e n i c in n a t u r e . I t r e m a i n s to be established, however, w h e t h e r

M o d e of a c t i o n of t r i c y c l a z o l e a n d r e l a t e d c o m p o u n d s

175

the genetic suppresion of pathogenicity in p-2n]j, or chemical suppression in the wild type are based on the pentaketide-melanin biosvnthetic pathway. Although we have no evidence at present to indicate how these compounds modify the host-parasite relationships one or more of the following are suggested as possible mechanisms. 1. Elicitor release is accentuated and results in a more rapid response of the host defense system such as phytoalexin accumulation or lignification. The elicitor may be a polyketide metabolite, a cell wall component or some other substance. This is regarded as the most attractive hypothesis. 2. The fungicides or accumulating fungal metabolites may inhibit activity or repress production of certain enzymes required for infection. 3. The fungicides may inhibit production of phytotoxins derived from the polyketide pathway (Stage I I I , Fig. I ) or from other pathways. 4. Compounds may act directly on host plant increase rate of mobilization and magnitude of resistance response. I n view of the similarity of the buff mutant and chemically treated wild-type strain of P. oryzae, it seems more likely that primary action of the compounds is on the pathogen rather than on the host. Investigations are in progress to clarify this and other questions relating to the mode of action of these compounds. Acknowledgements T h e study was supported b y R e s e a r c h G r a n t A 1 0 0 2 2 5 f r o m the N a t i o n a l I n s t i t u t e of Allergy and Infectious Diseases, U . S . Public Health Service. Scientific P u b l i c a t i o n No. A 2 7 5 8 , Contribution No. 5 8 0 8 of the U n i v e r s i t y of M a r y l a n d Agricultural E x p e r i m e n t Station.

Diskussion LANGCAKE: Are there other plant pathogens in which pathogenicity is linked to melanin biosynthesis ? SISLER: I a m n o t a w a r e of a n y .

LANGCAKE : What is the pathogenicity of the albino mutants of Verticillium atrum ?

albo-

SISLER: I believe the albino strains are pathogenic. Melanin synthesis is localized in the microslerotia in Verticillium dahliae. Survival time is reported to be reduced in albino microsclerotia. SCHWINN: What is your evidence for the loss of pathogenicity ? Have you made corresponding in vivo-tests ? SISLER : We have tested 3 of the buff mutants on 2 varieties of rice which are highly susceptible to the black wild-type strain. None of the buff mutants were pathogenic in these tests. GEORGOPOULOS : Although I think you are probably right, I must indicate the frequent loss of virulence following mutagenic treatment. I t would be good to show that the block to melanin biosynthesis and the loss of pathogenicity are the result of the same mutation.

176

H . D . SLSLER, C . P . WOLOSHTJK, P . M .

WOLKOW

References [1]

B E L L , A . A., J . E . P U H A L L A , W . J . T O L M S O F F a n d R . D . S T I P A N O V I C , U s e of m u t a n t s t o e s t a b l i s h ( - f ) - s c y t a l o n e a s a n i n t e r m e d i a t e in m e l a n i n b i o s y n t h e s i s b y Verticillium dahliae, C a n a d . J . Microbiol. 22 (1976), 7 8 7 - 7 9 9

[ 2 ] CARTWRIGHT,

D.,

P.

LANGCAKE,

R.

J.

PRYCE,

D.

P.

LEWORTHY

and

J.

P.

RIDE,

C h e m i c a l A c t i v a t i o n of h o s t d e f e n c e m e c h a n i s m s a s a basis f o r c r o p p r o t e c t i o n , N a t u r e 267 (1977),

511-513

[3] FROYD, J . D., C. J . PAGET, L . R .

[4]

[5] [6]

GUSE, B . A . DREIKORN, a n d

J . L . PAFFORD,

Tri-

c y c l a z o l e : A n e w s y s t e m i c f u n g i c i d e f o r c o n t r o l of Piricularia oryzae o n rice, P h y t o p a t h o l o g y 66 (1976), 1 1 3 5 - 1 1 3 9 L A T T E R E L L , F . M . , P h e n o t y p i c s t a b i l i t y of p a t h o g e n i c r a c e s of Pyricularia oryzae a n d i t s i m p l i c a t i o n s f o r b r e e d i n g of b l a s t r e s i s t a n t rice v a r i e t i e s in p r o c e e d i n g s s e m i n a r o n h o r i z o n t a l r e s i s t a n c e t o t h e b l a s t d i s e a s e of rice. C e n t r o I n t e r n a c i o n a l d e Agric u l t u r a T r o p i c a l , Cali, C o l u m b i a ( 1 9 7 5 ) , 1 9 9 - 2 3 4 M A I T I , I . B . a n d P . E . K O L A T T U K U D Y , P r e v e n t i o n of f u n g a l i n f e c t i o n of p l a n t s b y specific i n h i b i t i o n of c u t i n a s e , Science 205 ( 1 9 7 9 ) , 5 0 7 — 5 0 8 S C H W I N N , F . , M . N A K A M U R A a n d G . H A N D S C H I N , CGA 4 9 1 0 4 , a n e w s y s t e m i c f u n g i cide a g a i n s t rice b l a s t , I X I n t . C o n g r . P l a n t P r o t e c t i o n ( A b s t r a c t s ) W a s h i n g t o n D . C. (1979),

479

[7] SHEPHERD, M. C. a n d S. R . RAMASWAMY, C o n t r o l of rice b l a s t w i t h t h e s y s t e m i c f u n g i c i d e p p 3 8 9 , T h i r d I n t . C o n g r . P l a n t P a t h o l . ( A b s t r a c t s ) M u n i c h (1978), 358 [8] STIPANOVIC, R . 1). a n d A . A . BELL, I ' e n t a k e t i d e m e t a b o l i t e s of Verticillium dahliae. I I . A c c u m u l a t i o n of n a p h t h o l d e r i v a i t v e s b y t h e a b e r r a n t - m e l a n i n m u t a n t b r m - 2 , M y c o l o g i a 69 (1977), 1 6 4 - 1 7 2 [9] T O K O U S B A L I D E S , M . C. a n d H . D . S I S L E R , E f f e c t of t r i c y c l a z o l e o n g r o w t h a n d seco n d a r y m e t a b o l i s m in Pyricularia oryzae, P e s t i c . B i o c h e m . P h y s i o l . 8 (1978), 76 — 32 [ 1 0 ] T O K O U S B A L I D E S , M . C. a n d H . D . S I S L E R , Site of i n h i b i t i o n b y t r i c y c l a z o l e in t h e m e l a n i n b i o s y n t h e t i c p a t h w a y of Verticillium dahliae, P e s t i c . B i o c h e m . P h y s i o l . 11 (1979),

6 4 - 7 3

E f f e c t s of p r o b e n a z o l e ( O r y z e m a t e ) o n e a c h s t a g e of rice b l a s t f u n g u s oryzae CAVARA) in its life cycle, J . P e s t i c . Sci. 2 (1977), 395 — 404 [ 1 2 ] W H E E L E R , M . H . , W . J . TOLMSOFF, A . A . B E L L and H . H . MOLLENHAUER, Ultra s t r u c t u r a l a n d c h e m i c a l d i s t i n c t i o n of m e l a n i n s f o r m e d b y Verticillium dahliae f r o m ( + )-scytalone, 1,8-dihydroxynaphthalene catechol a n d L-3,4-dihydroxyphenyla l a n i n e , C a n a d . J . Microbiol. 24 ( 1 9 7 8 ) , 2 8 9 — 2 9 7 [13] WHEELER, M. H . a n d R . D . STIPANOVIC, M e l a n i n b i o s y n t h e s i s in Thielaviopsis basicola, E x p t l . M y c o l . 3 (1979), 3 4 0 - 3 5 0 [ 1 4 ] W O L O S H U K , C . P . , P . M . W O L K O W a n d H . D . S I S L E R , E f f e c t of 3 f u n g i c i d e s specific f o r c o n t r o l of rice b l a s t disease o n g r o w t h a n d m e l a n i n b i o s y n t h e s i s b y Pyricularia oryzae, P e s t i c . Sci., I n p r e s s [11]

WATANABE, T.,

(Pyricularia

W . F . POLETAJEVA u n d S . E . B E C K E R Botanisches Institut der Akademie der Wissenschaften Lehrstuhl für Mikrobiologie der Biologischen Fakultät Lomonossow-Universität, Moskau, UdSSR

der TSSK, der Moskauer

Aschchabad, Staatlichen

Bilanz der Dehydrogenasen und Oxidasen in Beziehung zur Anfälligkeit von zwei Baumwollarten gegenüber verschiedenen Welkeerregern Es ist bekannt, daß in den mittelasiatischen Republiken zwei Arten von Baumwollwelkekrankheiten vorkommen. Die eine Art wird hervorgerufen durch den Erreger Fusarium oxysporum SCHLECHT f. sp. vasinfectum ( R O B I N ) B E R K H . , der an die feinfaserigen südlichen Sorten von Gossypium barbadense L. angepaßt ist. Die andere Art der Baumwollwelke wird hervorgerufen durch Verticillium dahliae KLEB., charakteristisch für die mittelfaserigen Sorten der Art Gossypium hirsutum L., die in nördlicheren Gebieten kultiviert werden. Hybriden beider Gossypium-Arten werden von beiden Erregern nur mäßig befallen. Da sich die beiden Baumwollarten sowohl im Habitus der Pflanzen als auch in ihrer Reifezeit voneinander unterscheiden, wurde vermutet, daß diese Unterschiede in Beziehung stehen zum Grad der Anpassungsfähigkeit der Pathogene an die Unterschiede im Stoffwechsel, besonders der REDOX-Regime beider Baumwollarten, die sich in der Morphologie und Vegetationsdauer widerspiegeln. Wie in einer kurzen Mitteilung bereits erwähnt [3], wurden von uns zur Bestätigung der Hypothese über den Zusammenhang zwischen dem Unterschied in der Erregerart und den Unterschieden im Stoffwechsel ihrer Wirtspflanzen Untersuchungen des Zellsaftes von Stengeln junger Baumwollpflanzen durchgeführt. Mit Hilfe einer einfachen Methode wurde die Enzymaktivität auf chromatischem Papier bestimmt, das mit oTolydin getränkt war. Zur Ermittlung der Glukoseaerodehydrogenase-Aktivität wurde das Papier mit Glukoselösung getränkt und zur Polyphenoloxidase-Aktivitätsbestimmung mit destilliertem Wasser. Die Enzymaktivität wurde aus dem Durchmesser der Blauzone ermittelt, die sich rings um einen mit Zellsaft gefüllten Zylinder bildet. Durch Interpolation auf die Penicillin-Aktivitätskurve, dargestellt auf halblogarithmischem Papier, kann man die Enzymkonzentration in festgelegten Einheiten bestimmen. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen zeigt Abbildung 1, in der die Baumwollsorten und -arten in der Reihenfolge einer zunehmenden Resistenz gegenüber Fusarienwelke und Anfälligkeit gegenüber Verticillose dargestellt sind (Abszisse von links nach rechts). Zur Unterscheidung des Komplexes thermolabiler Komponenten der REDOX-Systeme von den thermostabilen wurde außer dem Nativsaft auch Stengelsaft untersucht, der 30 Minuten bei 60 °C erwärmt wurde. Das Ergebnis zeigt, daß der Unterschied in der Reihe der Baumwollsorten nach zweiwöchigem Wachstum (punktierte Kurve) noch sehr gering ist. Nach sechs Wachstumswochen (ausgezogene Kurve) ist der Unterschied am größten. Dieser Zeitpunkt fällt zusammen mit der Ausbildung der Resistenzmechanismen in der Pflanze (siehe Hinweise 1, 2, 4, 5, 10), besonders mit einem Ansteigen des Polyphenoloxidase (PPO)12

Systemfungizide

178

W.

F . P O L E T A J EVA, S . E .

BECKER

Altl). 1. Konzentration der Dehydrogenase (DH) und der Polyphenoloxydase (PPO) im Zellsaft des B a u m wollstengels, ermittelt avis dem Diffusions/.oneii-Durchmesser und in festgelegten Einheiten a u s g e d r ü c k t . Die Sorten sind in der Reihenfolge einer zunehmenden Resistenz gegenüber Fusariose und einer Resistenzverminderung gegenüber 1 * e r t i c i l l i u m welke angeordnet. Punktierte K u r v e nach 2 W a c h s tuniswochen Ausgezogene K u r v e nach 6 Wachstumswochen

Abb. 2. V e r h ä l t n i s zwischen den Konzentrationen der Dehydrogenasen (DH) und der Polyphenoloxydasen (PPO) im Stengelsaft von B a u i n w o l l p f l a n z e n im N a t i v z u s t a n d und nach E r w ä r m e n für 30 Minuten bei 60 °C. Anordnung der Baumwollsorten wie bei Abb. 1 P u n k t i e r t e K u r v e nach 2 W a c h s tumswochen Ausgezogene K u r v e nach 6 Wachstumswochen Spiegels. Die P P O erhöht folgerichtig die Resistenz gegenüber Fusarienwelke und vermindert die Resistenz gegenüber Vertillose. Bei rechnerischer Auswertung ergibt das Verhältnis der Dehydrogenasen (DH-) A k t i v i t ä t zur Polyphenoloxidasen (PPO)-Aktivität f ü r jede der untersuchten Sorten (Abb. 2) nach sechs Wachstumswochen eine umso stärker sinkende K u r v e je höher die

R e d o x a s e n - B i l a n z u n d A n f ä l l i g k e i t von B a u m w o l l e g e g e n W e l k e e r r e g e r

179

Resistenz der Sorten gegenüber Fusarienwelke ansteigt. Das zeigt die besondere Anpassungsfähigkeit von Fusarium oxysporum an die Art und Sorten mit vorherrschender Dehydrogenasen-Aktivität und von Verticillium dahliae an die Art und Sorten mit einem Stoffwechsel, bei dem die Oxidasen überwiegen. Die morphologischen und Stoffwechselbesonderheiten der Welkeerregerarten stimmen offensichtlich mit dieser Konzeption überein, insofern als das hellgefärbte Fusarium, oxysporum in seinen Konidien reichlich Karotinoide bildet, die mit Hilfe der N A D P Dehydrogenasen [9] synthetisiert werden. Dieselbe Kategorie von Enzymen (NAD und N A D P ) synthetisiert auch das Toxin, die Fusarinsäure. Dagegen sind aggressive Stämme von Verticillium dahliae aktive Produzenten von Melaninen, die mittels Polyphenoloxidasen gebildet werden [6, 7, 12]. Diese Stämme besitzen schwarze Sklerotien. I n die Reihe letzterer gehört auch ein anderer Krankheitserreger an Baumwollpflanzen, Thielaviopsis basic.ola ( B E E K , ex B R . ) F E R R A R I S . Alle diese drei Erreger von Baumwollkrankheiten, wie auch der die llhizosphäre besiedelnde Antagonist Aspergillus terreus THOM, wurden von uns hinsichtlich ihrer Ausscheidung von Glukoseaerodehydrogenasen und Potyphenoloxidasen in die Umgebung geprüft. Die Untersuchungen wurden in der gleichen Weise durchgeführt wie die Prüfung des Zellsaftes der Baumwollpflanzen, nur mit dem Unterschied, daß die Diffusionszonen auf chromatographischem Papier durch Diffusion aus Agarblöcken entstanden, die aus der Mitte von Pilzkolonien herausgeschnitten und auf das chromatographische Papier aufgelegt wurden. Die in der Tabelle 1 zusammengestellten Ergebnisse basieren auf Untersuchungen an 10 und mehr Stämmen jeder Art, mit Ausnahme von Verticillium dahliae, dessen Stämme nur selten die genannten Enzyme aus dem Myzel in das umgebende Medium abgaben (von mehr als 10 Stämmen nur 2). Aus der Tabelle geht hervor, daß wie erwartet, bei Fusarium oxysporum das Verhältnis zwischen der Dehydrogenase und der Oxidase zugunsten ersterer verschoben ist. Die DH-Aktivität liegt im Durchschnitt um das 5-fache höher als die PPO-Aktivität. Dagegen ist bei melaninsynthetisierenden Erregern das Verhältnis zugunsten der P P O verschoben, deren Konzentration bei Thielaviopsis basicola um das 2,5-fache höher ist als die DH-Konzentration. So kann man wahrscheinlich annehmen, daß die Anpassung der Erreger an bestimmte Baumwollarten tatsächlich auf einer Ähnlichkeit der R E D O X - V e r h ä l t n i s s e ihres Stoffwechsels mit denjenigen der Baumwollpflanzen beruht. Aus einem Vergleich der Abbildung 2 und der Tabelle 1 ist zu ersehen, daß die Sorten Nr. 8763 und 9078 am stärksten mit Fusari umwelke befallen werden. Hier liegt das Verhältnis der D H : P P O etwa in der Mitte des Bereiches, innerhalb dessen ein Erreger in der Lage ist, eine Baumwollpflanze zu infizieren. Eine Erklärung dafür ist in der Bildung des Toxins durch den Erreger, die Fusarinsäure, zu suchen, für deren Synthetisierung Dehydrogenasen erforderlich sind. Dagegen weist der nichtpathogene Aspergillus terreus, der die Rhizosphäre beider Baumwollarten besiedelt und dessen Antibiotikum Geodin durch beide Kategorien von Fermenten gebildet wird, nur verhältnismäßig geringe Schwankungen im Verhältnis von D H : P P O auf, das bei 1,0 liegt (Tab. 1). I m Gegensatz dazu variieren sowohl die im Boden lebenden als auch die in den Baumwollpflanzen parasitierenden Stämme von Fusarium oxysporum hinsichtlich ihres Verhältnisses D H : P P O und der Menge der gebildeten Enzyme wesentlich stärker. Der Schwankungsbereich erstreckt sich von völligem Fehlen einer Enzymausscheidung bei einigen bodenbiirtigen Formen 12»

180

w . F . POLETAJEVA, S. E . BECKER

Tabelle 1 Vergleich des Niveaus und der Aktivitätsverhältnisse von Glukoseaerodeliydrogenase und Polyphenoloxidase (PPO) bei Baumwollpathogenen und ihrem Antagonisten, gillus terreus, der die lihizosphäre besiedelt Forschungsobjekt: Arten, Stämme

Pathogene

Antagonist

(DH) Asper-

Anzahl der Mittlere Konzentrationen und Verhältnis Unterihre Grenzwerte für Oxidations- D H : P P O suchungen enzyme in festgelegten Einheiten Glukoseaerodehydrogenase (DH)

Polvphenoloxidase

15

2,83 (0-9,5)

0,79 (0-2,15)

3,98 (0-18,8)

Thielaviopsis basicola (aus Pflz.)

10

2,54 (0-8,20)

6,91 (0,6-16,0)

0,38 (0-2,05)

Verticillium dahliae (aus Pflz.)

2

0,86 (0,72-1,0)

1,06 (0,73-1,06)

0,90 (1,45-1,88)

0,64 (0,23-2,90)

0,67 (0,24-2,55)

1,03 (0,50-1,79)

Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum, infektionsfähig (Aktivität der Fusarinsäure 48 mkg/ml und mehr)

Aspergillus terreus (aus Khizosphaere)

19

(PPO)

bis zu einer hohen A k t i v i t ä t , besonders der D H , bei aggressiven p a t h o g e n e n S t ä m m e n m i t hoher F u s a r i n s ä u r e - P r o d u k t i o n . Die Ü b e r e i n s t i m m u n g der P a r a m e t e r ihrer toxischen A k t i v i t ä t mit der D e h y d r o g e n a s e n - A k t i v i t ä t zeigt Abbildung 3.

Abb. 3. Abhängigkeit der Bioysnthese-Aktivit ä t der Fusarinsäure bei Fusarium oxysporum f . sp. Glukoseaerodehydrogenase im Myzel. Punktierte K u r v e mittleres Niveau

Redoxasen-Bilanz u n d Anfälligkeit von Baumwolle gegen Welkeerreger

181

Bei einer statistischen Auswertung dieser Ergebnisse wurde der Korrelationskoeffizient zwischen der Fusarinsäure-Aktivität und der Glukoseaerohydrogenase-Aktivität errechnet. Mit S = 0,729 + 0,124 war die Beziehung des enzyniatischen P a r a m e t e r s zur antibiotischen Aktivität genügend hoch gesichert. Eine wesentlich geringere Übereinstimmung ergab bei dieser Berechnung die Toxizität von Fusarium oxysporum mit dem Verhältnis D H : P P O (S = 0,504 + 0,287), sie fehlte völlig f ü r die A k t i v i t ä t der P P O . Desgleichen gelang es nicht, eine gesicherte Korrelation zwischen den enzyniatischen P a r a m e t e r n u n d der antibiotischen Aktivität bei Aspergillus terreus zu erhalten. Hier variieren die enzyniatischen Werte bedeutend weniger als die antibiotische Aktiv i t ä t gegenüber Fusarium oxysporum u n d Neurospora sitophila. D a s Verhältnis D H : P P O , das im Durchschnitt um 1 lag, schwankte nicht stärker als u m das 4-fache (s. Tab. 1). Diese F a k t e n sind vollkommen logisch, insofern als diese Art nicht pathogen ist und als B o d e n s a p r o p h y t nicht zu einer Anpassung a n den spezifischen Stoffwechsel von Wirtspflanzen gezwungen ist, die f ü r den Prozeß der Pathogenese erforderlich ist. Leider konnte eine Gegenüberstellung der P a r a m e t e r der Toxizität f ü r die P f l a n z e n u n d der enzymatischen Werte bei den melaninbildenden P a t h o g e n e n Verticillium dahliae und Thielaviopsis basicola bisher nicht vorgenommen werden. Die Ursache liegt einmal darin, d a ß diese E n z y m e von V. dahliae n u r in geringen Mengen in die Umgebung abgegeben werden, zum anderen fehlen eindeutige Angaben über deren N a t u r u n d über q u a n t i t a t i v e Bestimmungsmethoden der H a u p t a g e n t e n ihrer Pathogenese, die bisher offensichtlich n u r zum Teil untersucht wurden (siehe z . B . 6, 8, 7, 11, 12, 13). Der Versuch einer Zusammenstellung der Anfälligkeitsstufen von Baumwollsorten gegenüber Thielaviopsis basicola mit den f ü r diese Sorten charakteristischen D H - u n d P P O - A k t i v i t ä t s g r a d e n u n d ihren Verhältnissen zueinander (Tab. 2) f ü h r t e nicht zu dem erwarteten Ergebnis, da die an Dehydrogenasen reichen Sorten der Art Gossypium barbadense stärker befallen werden. D a r a u s ergibt sich die Vermutung, d a ß — vorausgesetzt, daß das durch den Erreger produzierte P h y t o t o x i n H a u p t a g e n t der P a t h o genese ist, — das Toxin in diesem Falle nicht auf dem Wege der Melaninbildung entsteht oder es ist als eine Vorstufe zu betrachten, die noch ohne Beteiligung der Phenoloxidasen synthetisiert wird. Obgleich der eindeutige Beweis von Beziehungen zwischen der Anpassung der R E D O X Bilanz der E n z y m e pathogener Pilze an die ihrer Wirtspflanzen u n d ihrer Aggressivität gegenüber bestimmten Pflanzensorten u n d -arten bisher noch nicht immer möglich ist, gibt es doch dieses Beispiel f ü r eine spezifische Abhängigkeit zweier Erreger, Fusarium oxysporum und Verticillium dahliae, von Arten und Sorten der Baumwolle. Eine Beziehung zwischen der Befallsintensität u n d den jeweils mehr oder weniger stark an Sauerstoff gebundenen Stoffwechseltypen der Baumwollpflanzen — von G. bardense bis G. hirsutum — spricht f ü r die B e d e u t u n g dieses P a r a m e t e r s . Weiterhin sprechen spezifische Alternativen im Metabolismus pathogener Pilze d a f ü r . Die Kenntnis dieser Prozesse eröffnet Möglichkeiten, mittels synthetischer Inhibitoren oder I m munitätsagenten in diese Prozesse einzugreifen und gezielt die Ausbildung von pathogenen Eigenschaften zu hemmen. Die praktische Anwendung fiir den Pflanzenschutz, mit Hilfe systemisch wirkender Verbindungen die Ausbildung eines Stoffwechseltyps bei den Pilzen zu erreichen, der dem der Wirtspflanzen nicht entspricht, oder durch züchterische M a ß n a h m e n den Stoffwechsel der Wirtspflanzen zu beeinflussen mit dem Ziel, eine Adaption des P a t h o -

182

W . F . POLETAJEVA, S . E . B E C K E H

Tabelle 2 des Befallsgrades der Baumwollsoften durch Zusammenstellung der Menge der Zettsaftkomponenten mit Dehydrogenaseund Arten:

(lossypium

Sorten:

876:5

A u s vergleichenden UnB e f a l l s h ö h e t e r s u c h u n g e n 43,15 v o n 3 viruder B a u m wollpflanzen lenten Stämmen durch ThielaviopGrenzwerte sis basicola d e r Befalls- 8 2 , 5 - 1 0 0 stärke unter Feldbedingungen Aktivität Glukoseaeroder Oxidativ-dehydrokomponenten genäse (DH) im erwärmten BaumPolyphenolwollzellsaft oxidase nach 6 (PPO) Wachstumsw o c h e n in Verhältnis festgelegten D H : P P O Einheiten

barbndense 9078

20.6 — 96.2

Thielaviopsis basicola Polyphenoloxidaseahtivität Hybride

und

G. h i r s u t u n i

9647

133

28,2

3,6

8.2

7.6-68.6

24.4-84,0

40,3-100

138-F

0,80

0,41

0.39

0,95

0,95*

0.21

0.43

0,52

2,70

2,90*

3.81

0,95

0,75

0,35

0.33*

* v e r w a n d t m i t d e r S o r t e 138 — F d e r F e r g a n a s o r t e 108 — F .

gens auszuschließen, ist natürlich eine Sache der Z u k u n f t . Aber Schritte in dieser Richtung haben zweifellos eine Perspektive, gerade f ü r das systematische Vorgehen auf dem Gebiet der Phytopathologie. Diskussion KOCH:

Gibt es Anhalte f ü r die Wirkung von Trichothecenen auf die Kaumwolle ?

: Wir haben keine derartigen Ergebnisse. Nach unseren Versuchsergebnissen ist das Hauptwelketoxin die Fusarinsäure. BECKES

LYR: Fusarinsäre ist ein hochwirksames und seit längerer Zeit bekanntes Toxin, welches die Zellpernieabilität bei Pflanzen schädigt. Vor kurzem wurde die Verbindung in J a p a n als starker Hemmstoff der Monoaminooxidase des Nervensystems als P h a r m a k o n patentiert. Das zeigt, daß viele Verbindungen oft unerwartet vielseitige Wirkungen haben. B E C K E R : Vom Wirkungsmechanismus der Fusarinsäure war bisher n u r b e k a n n t , daß sie sehr starke E r h ö h u n g der Permeabilität der Wirtszellen hervorruft. Ihre Wirksamkeit gegenüber MAO ist sehr interessant und verdient weitere Aufmerksamkeit.

R e d o x a s e n - B i l a n z u n d A n f ä l l i g k e i t von B a u m w o l l e gegen W e l k e e r r e g e r

183

N A U M A N N : Worauf b e r u h t n a c h I h r e n E r f a h r u n g e n die pathologische W i r k u n g v o n Verticillium dahliae ? BECKER: B e i Verticillium, dahliae i s t d a s T o x i n - P r o b l e m v i e l k o m p l e x e r a l s b e i Fusarium oxysporum. H i e r h a n d e l t es s i c h w a h r s c h e i n l i c h n i c h t u m F u s a r i n s ä u r e , s o n d e r n u m a n d e r e T o x i n e wie V e r t i c i l l i n . U b e r e i n i g e T o x i n e v o n V. dahliae w i r d P r o f . B O R O D I N n o c h einiges b e r i c h t e n .

BUCHENAUER: W e l c h e B e d e u t u n g b e s i t z t d a s L y c o m a r a s m i n w ä h r e n d d e r P a t h o g e n e s e v o n Fusarium oxysporum in B a u m w o l l p f l a n z e n ? BECKER: M ö g l i c h e r w e i s e ist L y c o m a r a s m i n ü b e r h a u p t n i c h t a m P a t h o g e n e s e p r o z e ß b e t e i l i g t , d a s e i n e S y n t h e s e zu s p ä t e r f o l g t , b e i L a b o r k u l t u r e r s t n a c h M o n a t e n . F u s a r i n s ä u r e wird jedenfalls schneller gebildet u n d ihre S y n t h e s e ist e n g e r m i t d e m W e l k e v e r l a u f v e r b u n d e n , wie d i e Ü b e r e i n s t i m m u n g z w i s c h e n W e l k e i n t e n s i t ä t u n d T o x i n k o n z e n t r a t i o n in d e r P f l a n z e z e i g t .

Literatur [1] BECKER. S. E . , T h e o r e t i s c h e G r u n d l a g e n d e r P a t h o g e n e s e , ökologischer H i n t e r g r u n d u n d k o m p l e x e M e t h o d e n im K a m p f gegen die F u s a r i e n w e l k e . In S a m m l u n g 2 : „ Ö k o l o g i s c h - p h y s i o l o g i s c h e M e t h o d e n im K a m p f gegen die F u s a r i e n w e l k e d e r B a u m w o l l p f l a n z e n " I L I M - V e r l a g , A s c h c h a b a d , 1973, 2 3 3 - 2 5 4 (russ.) 12] BECKER. S. F . , T h r e e c a t e g o r i e s of f u n g i c i d a l d e f e n s e s u b s t a n c e s of p l a n t s w i t h s y s t e m i c a c t i o n (on t h e m o d e l of c o t t o n diseases). J n " S y s t e m i c F u n g i c i d e s " , V . I n t e r n a t i o n a l S y m p o s i u m , A k a d e m i e - V e r l a g , B e r l i n , 1979, 15 — 30 (engl.) 13] B E C K E R , S. F . , W . F . POLETAJEVA, I . D . PUSCHKARJEVA, O . E . MILOVA, T h e

dehydro-

g e n a s e s a n d p o l y p h e n o l o x y d a s e s b a l a n c e in c o n n e c t i o n with t h e succession of species a n d s o r t r e s i s t a n c e of c o t t o n to wilt. A b s t r a c t s of r e p o r t s of 3-rd I n t e r n a t i o n a l Congress of P l a n t P a t h o l o g y , M ü n c h e n , 1978, p . 236 (engl.) [4]

BECKER, S. Ii. u n d

I. D . PUSCHKARJEVA,

Histochemische

Untersuchungen

des

Wir-

k u n g s m e c h a n i s m u s des W e l k e t o x i n s auf B a u m w o l l p f l a n z e n . I n d e r S a m m l u n g 1 : „ Ö k o l o g i s c h - p h y s i o l o g i s c h e M e t h o d e n im K a m p f gegen die F u s a r i e n w e l k e d e r B a u r n w o l l p f l a n z e n " , I L I M - V e r l a g , A s c h c h a b a d , 1971, 223 — 231 (russ.) L5] B E C K E R . E . S . u n d

I. D . PUSCHKARJEVA, D i e W i r k u n g

von Mikroelementen

und

ge-

wisser o r g a n i s c h e r V e r b i n d u n g e n auf die D e h y d r o g e n a s e - A k t i v i t ä t d e r B a u m w o l l pflan/.en in B e z i e h u n g z u r E r h ö h u n g i h r e r W e l k e r e s i s t e n z . I n d e r S a m m l u n g 3 : „Ökologisch-physiologische Methoden im K a m p f gegen Fusarienwelke der B a u m w o l l p f l a n z e n " , I L I M - V e r l a g , A s c h c h a b a d , 1977, 126—140 (russ.) | 6]

BELL, A . A., J . E . PUHALLA,

W . J . TOLMSOFF,

R . D . STIPANOVIC,

U s e of m u t a n t s

e s t a b l i s h ( + ) - s c y t a l o n e as a n i n t e r m e d i a t e in m e l a n i n b i o s y n t h e s i s b y dahliae. C a n a d . J o u r n . Microbiology, 22 (1976a), 7 8 7 - 799 [7]

BELL, A. A., R .

D . STIPANOVIC, J . E . P U H A L L A , P e n t a c e t i d e m e t a b o l i t e s of

to

Verticillium Verticil-

lium dahliae. I d e n t i f i c a t i o n of ( - f ) - s c y t a l o n e as n a t u r a l p r e c u r s e r t o m e l a n i n , T e t r a h e d r o n , 82 (1976b), 1 3 5 3 - 1 3 5 6 [8] BORODIN, G. I . u n d W . I . RUNOV, U n t e r s u c h u n g ü b e r die N a t u r gewisser t o x i s c h e r P r o d u k t e v o n Verticillium dahliae. I n : „ A r b e i t e n d e r I . K o n f e r e n z d e r B i o c h e m i k e r der Mittelasiatischen R e p u b l i k e n u n d K a s a c h s t a n s " . Verlag F A N der Usbekischen S S R , T a s c h k e n t , 1967, 4 3 1 - 4 3 6 (russ.) [9] KRITSKY, M. S„ Die P r o b l e m e „ S i g n a l — A n t w o r t " in U n t e r s u c h u n g e n ü b e r E r s c h e i n u n g s f o r m e n in d e r i n d i v i d u e l l e n E n t w i c k l u n g v o n P i l z e n . I n d e r S a m m l u n g : „ M i k r o o r g a n i s m e n - O n t o g e n e s e " , V e r l a g W i s s e n s c h a f t , M o s k a u , 1979, 1 75— 1 85 (russ.) [ 1 0 ] P U S C H K A R J E V A , I . D . u n d S. E . B E C K E R , K e r n a k t i v i t ä t u n d L o k a l i s a t i o n d e r S c h u t z s y s t e m e gegen W e l k e in d e r B a u m w o l l p f l a n z e . I n d e r S a m m l u n g 2 : „ Ö k o l o g i s c h physiologische M e t h o d e n im K a m p f g e g e n die F u s a r i e n w e l k e d e r ß a u m w o l l p f l a n z e n " , I L I M - V e r l a g , A s c h c h a b a d , 1973, 2 0 6 - 2 1 8 (russ.)

184

W . F . POLETAJEVA, S. E .

BECKER

R U N O V , W . I . , G . I . BOKODIST, W . A . G T T S E I N O V , L . T. T S C H E P E N K E , Ü b e r die N a t u r d e r V i r u l e n z des V erticillium daliliae. I n : „ A r b e i t e n des 12. I n t e r n a t i o n a l e n B o t a n i s e h e n K o n g r e s s e s " , V e r l a g W i s s e n s c h a f t , L e n i n g r a d , 1975, 501 (russ.) [12] STIPAUOVIC, R . 1). a n d A . A . BELL, P e n t a c e t i d e m e t a b o l i t e s of Verticillium daliliae. I I . A c c u m u l a t i o n of n a p h t h o l d e r i v a t i v e s b y t h e a b b e r a n t m e l a n i n m u t a n t B R M - 2 , Mycologia, (ii) (1977), 4 8 7 - 4 8 8 [11]

[13]

TSCHEPENKO,

L . I., G . I . BOBODIN, W .

I. RUNOV, B .

S. SALICHOVA, R e i n i g u n g

und

C h a r a k t e r i s i e r u n g d e r Verticilline — t o x i s c h e S u b s t a n z e n des Verticillium daliliae. I n d e r S a m m l u n g : „ I m m u n i t ä t u n d R u h e d e r P f l a n z e n " , V e r l a g W i s s e n s c h a f t , Mosk a u , 1972, 1 5 1 - 1 6 0 (russ.)

A L E N A TOMSIKOVÄ, J I R I STÉRBA

and

D A N A NOVÄCKOVÄ

(technische Mitarbeit)

Institut für Mikrobiologie und Epidemiologie der Medizinischen Fakultät der Karls Universität, Pilsen, l'arasitologisches Institut der Tschechoslowakischen Akademie der Wissenschaften, l'rag, ÖSSB

Therapeutische Möglichkeiten bei der Adiaspiromykose

Emmonsia crescens EMMONS et J E L L I S O N 1 9 6 0 , dem Erreger der Adiaspiromykose, wurde in den letzten Jahren besondere Aufmerksamkeit gewidmet, anfangs als Ursache einer chronischen Lungenerkrankung der wild lebenden kleinen Nagetiere (CHEVREL e t a l . [ 1 ] , D O B Y e t a l . [ 3 ] , EMMONS e t a l . [ 6 ] ,

O T C E N Ä S E K e t a l . [ 1 2 ] , PROKOPIC e t a l .

später als Erreger einer schweren chronischen disseminierten Erkrankung des Menschen ( C U E V A et al. [ 2 ] , D O B Y et al. [ 4 ] , KODOTJSEK et al. [ 9 ] , L E S H C H E N K O et al. [14]),

[10], SLAJS et al.

[15]).

Wenn auch die Adiapiromykose in der Tschechoslowakei mit Fungizon und Pimafucin ( D V O R A K et al. [ 5 ] , OTÖENASEK etal. [ 1 3 ] ) erfolgreich geheit wurde, bleibt die Therapie dieser Erkrankung stets offen. Aus diesem Grunde studierten wir bei dieser Erkrankung nicht nur die Wirkung von verschiedenen Chemotherapeutika, sondern auch die Möglichkeit der passiven Immunisierung.

Material und Methoden Zum Studium benutzten wir 4 Emmonsiastämme, die sich voneinander durch Virulenz und antigene Aktivität (TOMSIKOVÄ et al. [ 1 9 ] ) unterscheiden, weiter Emmonsia parva und Chrysosporium pannorum. 1. Versuche in vitro Zur Feststellung der Empfindlichkeit der saprophytischen Phase aller studierten Stämme gegenüber 22 Antimykotika wurde der Blättchen-Agar-Diffusionstest (TOMSIKOVÄ et al. [18]) benutzt. Weiter verfolgten wir die Wirkung von Pimafucin, Fonderma und Amphotericin B auf die parasitische Phase von E. crescens (TOMSIKOVA [ 2 0 ] ) . 2. Versuche in vivo Die Wirkung von Amphotericin B, Pimafucin \ind Fonderma wurde bei experimenteller Adiaspiromykose an 32 6 Wochen alten weißen Mäusen verglichen (TOMSIKOVÄ et al. [20]). Die Tiere wurden einmalig intraperitoneal mit 0,5 ml Aleuriensuspension (Dichte 3 x —10 5-6 ) infiziert. Der Einsatz von Chemotherapeutika erfolgte gleichzeitig oder 5, 10, 14, 16, 24, 28 und 30 Tage nach der Infektion. Die durch die experimentelle Erkrankung verursachte mögliche Spätallergie wurde an Hand des Pfotenschwellungstestes ( G R A Y et al. [ 7 ] , M U K P H Y et al. [ 1 1 ] ) , festgestellt. Die Wirkung des spezifischen Antiserums auf den Verlauf der experimentellen Adiaspiromykose wurde an 7 weißen Mäusen getestet, denen gleichzeitig mit dem, in dem

A. Tojisikovä, J . STERBA, D. NOVACKOYA:

186

v o r a n g e h e n d e n V o r s u c h e r w ä h n t e n , T n o k u l u m o d e r 7. 15, 22, 28, 34 T a g e n a c h d e r I n f e k t i o n 0,5 m l d e s Kaninchen-JJmnjOii.s'j'a-Antiseruins i n t r a p e r i t o n e a l appliziert wurde. Die T i e r e e r h i e l t e n d i e S t a n d a r d - L a b o r n a h r u n g u n d W a s s e r a d l i b i t u m u n d w u r d e n bei 2 0 - 2 5 °C g e h a l t e n . N a c h der vorher f e s t g e s e t z t e n Zeit w u r d e n die Tiere beider G r u p p e n e n t b l u t e t u n d s t e r i l s e z i e r t . Alle O r g a n e w u r d e n d e r m a k r o s k o p i s c h e n u n d m i k r o s k o p i s c h e n U n t e r s u c h u n g u n d d e r K u l t i v i e r u n g auf d e n m y k o l o g i s c h e n N ä h r b o d e n u n t e r z o g e n .

Ergebnisse 1. Versuche in vitro Die breitesten Inhibitionszonen im Diffusionstest bildete bei allen u n t e r s u c h t e n S t ä m m e n F o n d e r m a . An 2. Stelle war in dieser Hinsicht Mycosynalar, an 3. Stelle A m y k o n (Abb. 1, 2, 3). Die Empfindlichkeit der Myzelphase gegenüber den A n t i m y k o t i k a wies eine b e s t i m m t e Parallelität mit der Morphologie der Kolonien auf. I m Gegensatz zu P i m a f u c i n und EMMONSIA 1 nhibitionsz o n e n in m i n Fonderma Amykon Fungicidin Amphotericin B OandioHerinal Gentiane Salifungin J )equafungan ¡Sporilin Celestoderm Etacortin Fungiplex Visorit Nitrofungin Ac. l a c t i c u m Mycosynalar Canesten Pevaryl Pimafucin Bromochrom Tonoftal Monistat

—

• • • • • • • •• •• • •• ••

-10

•

• • • • • • ••

• • • • •

• • • • • • •

•

-20

• • •

WIRKUNG DER

-30

-40

• • • • • • • • •

• • • • • • • •

• • • •

• • • • • • • • • • • • •

• • •

• • • •

ANTIMYKOTIKA

-50

• • • •

-60

-70

•

• • • • • • • •

• • • •

Abb. 1. D i e D i s k e n b e z e i c h n e n die e r r e i c h t e n I n h i b i t i o n s z o n e n

• •

-80

-90

•••

•

187

Therapie der Adiaspiromykose KMQNSIA CKESCüNS 100 I. II. III. IV.

FONDiRMA 3P0RIUN CEIi,3T0DEWH aTACQKTlN

Abi). 2. Heinmzonen beim B l ä t t c h e n - T e s t

CHBYSCüPQhlüM I. II. III. IV.

FONDc-KMA SPORILIN CKLESTÜDEM1 cTACOKTH»

Abb. 3 . H e m m z o n e n b e i m Agar-Diffusionstest

Amphotericin B , wirkte Fonderma auch auf die parasitische P h a s e fungizid. B e i 26 °C kam es zu einer Keimung der Adiasporen auf dem SABOL'KAUDagar, falls F o n d e r m a gleich nach der E n t n a h m e der Adiasporen aus dem Tier appliziert wurde. Ebenfalls wurde die beginnende Keimung unterbrochen. 2. Versuche in vivo a) Wirkung von Chemotherapeutika: B e i Tieren, denen das Antigen nur einmal appliziert wurde, entwickelte sich nach 36 Tagen eine disseminierte Adiaspiromykose mit typischem makro- und mikroskopischen Bild der 36 tägigen experimentellen E r k r a n k u n g (BOISSEAU-LEBEREUIL, SLAJS e t al. [ 1 6 ] und STERBA et al. [17]). B e i den V e r s u c h s t i e r e n w a r der B e f u n d v o n d e r a n -

gewandten Therapie, der Zeit der Therapie, dem Therapieeinsatz und den Applikationsgaben abhängig (Abb. 4). B e i allen Applikationsformen des Pimafucins entwickelte sich eine disseminierte Adiaspiromykose mittleren Grades ( + + ). Nach Verabreichung von Amphotericin B entstand mittelstarke Adiaspiromykose ( + + ) nur bei den Tieren bei denen dieTherapie gleichzeitig oder 5 Tage nach der Applikation des Antigens einsetzte. I n den anderen Fällen verstärkte sich die Dissemination. B e i der Verabreichung von F o n d e r m a konnten einige Adiasporen um die Infektionsstelle und im Leberhilus nur dann festgestellt werden, wenn die Therapie erst 30 Tage nach der Infektion eingesetzt hatte. Sonst war der histologische Befund negativ, oder es wurden nur einzelne tote Adiasporen angetroffen.

A. TOMSIKOVX, J . STERBA, D. Xoväckova

188 TIEREXPERIMENTE C a q, 3 £

t"O ® JS £ NH

A l k ' "P 6

1

8 9

Antigen ^ Antimvkotika • *

"

,

11 12 15 16 17 19 23 24 25 26 29 30 31 32 33 36

• ••• • • •• • • •

• • • e

S ®

o M

E A B A

«

c, 'o

1 J30 ft £
0 pH

s

• • • • •

•

•

• • •

s

• • •

•

• • • • • a • • • •

s

A

c

'S 503

Histoloeische " r Befunde

8°

A S A A A A A A A

•

A 0 A A A A A A A

•

- • ; £ • ©

•

a

i

^

4 4 4

• • • • • • a • • • • a • •

• •

• • • • • a • • • •

a

•

a

•

•

4 4 4

• • • • • • a • • • • B • •

• •

• • • • • s • • • •

a

•

;

• • • #

1

• • •• •• •• •• • •• • •

• •

• • • 4 • 4 • 4 •

• • • • • •

4 _ 4 — —

4

—

\

• • •• • 4

• • • • • • 1 H • • •• •• 4

HI

+

• • • • • 4 • 4 • 4 •

••••-^•••••-Htt

t Entblutung |

Abb. 4. Die großen Disken bezeichnen die I n t e n s i t ä t des pathologischen Prozesses, die kleinen Disken den Applikationstag, die eingerahmten Disken den Applikationsanfang

B e i entwickelter Adiaspironiykose trat auch eine allergische Spätreaktion in F o r m einer verschieden starken Anschwellung der mit dem Antigen injizierten Pfoten auf. b) Wirkung von spezifischem Antiserum Der therapeutische E f f e k t des Antiserums hing wie bei den Antimykotika von der Zeit der Verabreichung ab. Wurde das Antiserum in den ersten 15 Tagen nach der Infektion appliziert, entwickelte sich keine Erkrankung. B e i späterer Applikation wurden

Therapie

der

Adiaspiromykose

189

© -x -ö c

+ +

+

W

O

bD C ^

X Z

o ^ £ n ® © bD"S ©

c © © fi

c ©

o c

o c X & o

Sil

M

S 0,10

—

Autoradiographic (Str. basale) 5500 Zellkerne gesamt 296 Zellkerne markiert 5,38 ü [%] 1,00 DNS-Si X2 3 ( 1 9 5 8 ) , 1 2 7 - 3 0 [58] D E W A A R D , INI. A., Mechanisms of action of t h e o r g a n o p h o s p h o r o u s fungicide, p y r a zophos, Meded. Lanrlb. H o g c s c h . W a g e n i n g e n , N e d e r l a n d , 74 (1974), 14 [ 5 9 ] D E W A A R D . M. A.. Mode of action of the o r g a n o p h o s p h o r o u s fungicide p y r a z o p h o s . in H . L Y R a n d C . P O L T E R (eds) ' S v s t e m f u n g i z i d e ' , I n t e r n . S y m p . R e i n h a r d s b r u n n . A k a d e m i e - V e r l a g Berlin 1975, p 197 T.,

H.

IGARASHI,

K.

MATSUMOTO,

S.

SEKI,

S. M A S E

and

Y.

SEKIZAWA,

The c h a r a c t e r i s t i c s of probena/.ole (Oryzemate) for the control of rice blast, J . P e s t . S c i . , •> ( 1 9 7 7 ) .

2 9 1 - 6

[61]

E f f e c t s of probenazole (Oryzemate) on each stage of t h e rice blast f u n g u s (Piricular'ui oryzae O A V ) in its life cycle, J . P e s t . Sei., 2 ( 1 9 7 7 ) , 3 9 5 — 4 0 4

[62]

WATANABE, T., Y . SEKIZAWA, M . SHIMURA, Y . SUZUKI, K . MATSDJIOTO, M .

WATANABE,

T.,

IWATA

and

S. MASE, E f f e c t s of probena/.ole (Oryzemate) on rice p l a n t s with reference to controlling rice blast, J . P e s t . Sei., 4 (1979), 5 3 - 9 [63] W A T K I N S , J . E., L. J . L I T T L E F I E L D a n d G . D . S T A T L E R , E f f e c t of t h e systemic fungicide 4 - n - b u t y l - l , 2 , 4 - t r i a z o l e on t h e d e v e l o p m e n t of Puccinia recondita f. sp. tritiri on w h e a t . P h y t o p a t h o l . , 7 (1977), 985 — 9 [ 6 4 ] W H I T E , G . A . a n d G . D . T H O R N , S t r u c t u r c - a c t i v i t v relationships of c a r b o x a m i d e fungicides a n d the succinic acid d e h y d r o g e n a s e complex of Cryptococcua laurentii a n d Uxtilago maydis, P e s t . B i o c h e m . Physiol., 5 (1975), 380 — 95 Dr. P.

LANGCAKE

Shell Biosciences L a b o r a t o r y , S i t t i n g b o u r n e R e s e a r c h Centre, S i t t i n g b o u r n e , K e n t M E 9 8AG, England. Dr. J. P.

RIDE

D e p t . of Microbiology, The University, B i r m i n g h a m B15 2TT, United Kingdom

Dr. D. W .

CARTWRIGHT

D e p t . Applied Biology, Chelsea College, Hortensia Road, London, United Kingdom

HELMUT J U N G E , H E L M U T BOCHOW u n d MARTHE J A C O B Sektion

Gartenbau

der Humboldt-Universität

zu Berlin,

DDli

Wirkungen von Kombinationen systemisch aktiver Substanzen auf die Pathogenese von Pflanzenerkrankungen

Neben dem Interesse, das den Wirkungsmöglichkeiten und -mechanismen einzelner systemisch aktiver Pflanzenschutzmittel zukommen muß, verlangt auch zunehmend die Trage an Aufmerksamkeit, inwieweit sich durch eine kombinierte Anwendung systemisch aktiver Substanzen neue Situationen zur Einflußnahme auf eine Phytopathogenese ergeben. Erstens erfordert die Praxis des Pflanzenschutzes aufgrund parallelen Auftretens von Schaderregern, in Anbetracht von Komplexkrankheiten und durch verschiedene Einflußnahmen und biologische Prozesse, wie der Wachstumsregulierung und pathologischer Vorgänge, die Notwendigkeit des parallelen oder gemeinsamen Einsatzes von Wirkstoffen. Zweitens läßt sich gerade bei Substanzen, die über das System der Pflanzen zur Wirkung kommen, theoretisch an eine Reihe von Wechselwirkungen bei kombinierter Anwendung denken, die es im positiven Falle für Erweiterungen der Wirkungsphäre und in negativen Fällen zur Fixierung neuer Grenzen, zu studieren gilt. Ausgehend von Erkenntnissen aus den Wirkungsmechanismus gegenwärtig bereits näher bekannter systemisch aktiver Verbindungen ergeben sich dabei folgende Möglichkeiten für wissenswerte Interaktionen bei kombiniertem Einsatz hinsichtlich Auswirkungen auf die Pathogenese von Pflanzenkrankheitserregern (JUNGE [3]). — Eine gegenseitige Beeinflussung bei Aufnahme und Transport der Wirkstoffe in der Pflanze, insbesondere von Veränderungen der Transportgeschwindigkeit. — Veränderungen des Resistenz Verhaltens der Pflanzen durch variierte Wirkungen auf Stoffwechselprozesse der Pflanze bzw. Wirkungen nicht toxischer Komponenten auf die Pathogene und — Veränderungen in der Aktivität der Wirkstoffe durch deren chemostrukturellen Umbau in der Pflanze oder die Beeinflussung der Affinität in den Rezeptorregionen der Organismen. Wir wandten uns dem Studium dieser Fragen zu (JUNGE [3]) unter Verwendung zunächst bekannter systemischer Pflanzenschutzmittel, vornehmlich Fungizide, und Wachstumsregulatoren, in kombiniertem Einsatz. Als Untersuchungsobjekt wurde die Pathogenese systemisch eine Pflanze befallender Erreger, als hauptsächlichste Zielobjekte innertherapeutischer Maßnahmen, herangezogen. Aus dem Kreis der Untersuchungen sollen im folgenden einige Erfahrungen über das Auftreten von Wechselwirkungen beim kombiniertem Einsatz von systemischen Fungiziden und Wachstumsregulatoren an Antirrhinum-Vüsaizen bei einem Befall durch 14*

212

H . JUNGE, H . BOCHOW, M .

JACOB

Vcrticillium albo-atrum. R K E . et B E R T H . dargestellt werden, wobei gleichzeitig den Mechanismen solcher Wechselwirkungen nachgegangen wurde. I m E r g e b n i s mehrerer Versuche ergab sich zunächst n a c h W u n d i n f e k t i o n ca. 62 T a g e a l t e r Antirrhinm»i - Pf 1 a n z en ein e t w a 9 5 % i g e r V erticillium-HeisW, der in Abhängigkeit von der J a h r e s z e i t zu Welkeerscheinungen f ü h r t e , die n a c h etwa 30 Tagen d u r c h einen Welkeindex zwischen 50 im F r ü h j a h r u n d 80 im S p ä t s o m m e r gekennzeichnet waren. Die A n w e n d u n g von B e n o m y l (500 p p m ) 5 Tage prä- oder 7 Tage postinfektionell im G i e ß v e r f a h r e n e r b r a c h t e eine f a s t vollständige U n t e r d r ü c k u n g von Welke u n d Befall der P f l a n z e n . Dagegen erwies sich T h i o p h y n a t - M e t h y l m i t 715 p p m n u r bei präinfektioneller A p p l i k a t i o n als wirksam, nicht aber bei postinfektioneller B e h a n d l u n g , wo Welke u n d Befall n u r gering u n t e r der k ü n s t l i c h infizierten K o n t r o l l e blieben. Auch Triforin, das mit 285 p p m postinfektionell d u r c h Spritzen der P f l a n z e n appliziert wurde, k o n n t e n u r einen geringen B e k ä m p f u n g s e r f o l g erreichen. G i e ß b e h a n d l u n g e n mit Fenaminosulf (210 p p m ) oder P r o t h i o c a r b (1000 p p m ) verm i n d e r t e n den Befall der P f l a n z e n nicht, die W e l k e s y m p t o m e w u r d e n jedoch teilweise erheblich v e r s t ä r k t . Die postinfektionelle A n w e n d u n g (1. Tag) der W a c h s t u m s r e g u l a t o r e n im Spritzverf a h r e n h a t t e n e b e n der B e e i n f l u ß u n g des P f l a n z e n w a c h s t u m s a u c h eine V e r ä n d e r u n g des K r a n k h e i t s b e f a l l e s zur Folge. So w u r d e d u r c h D a m i n o z i d in sehr hoher Dosierung (42500 p p m ) vorwiegend bei Versuchen im S p ä t s o m m e r u n d H e r b s t die Welke der P f l a n z e n deutlich r e d u z i e r t , w ä h r e n d beim E r r e g e r n a c h w e i s in den P f l a n z e n gegenüber W e l k e i n d e x (0-100)

%

n

Daminozid

§

GibbereLlin

§3

D a m + Gibb.

Versach: Okt/Nov. ( n - 9 )

Aldi. 1. W i r k l i n g alleiniger u n d k o m b i n i e r t e r A n w e n d u n g v o n S y s t e m f u n g i z i i l e n u n d W a c l i s t u m s r e g u l a t o r e n auf die A u s p r ä g u n g d e r W e l k e s y m p t o m e an Antirrhivum-Pflan/.en

nach künstlicher Infektion durch Verticillium

albo-atrum

Kombinationen systemisoher Substanzen und Phytopathogenese

213

der Kontrolle nur geringe Verminderungen zu finden waren. Die E i n s c h r ä n k u n g der Welkesymptome war dabei im F r ü h j a h r weniger ausgeprägt. Gibberellin (3,5 ppm) v e r s t ä r k t e dagegen in den F r ü h j a h r s - u n d Winterversuchen das Krankheitsbild auffällig und h a t t e in Spätsommerversuchen n u r gering welkemindernde Tendenzen. Auch hierbei blieb der alternative Befallsnachweis unbeeinflußt. Die K o m b i n a t i o n der Wachstumsregulatoren Daminozid und Gibberellin h a t t e im allgemeinen additive Wirkungen. Die kombinierte Anwendung der Wachstumsregulatoren vor bzw. n a c h den Systemfungiziden wurde hinsichtlich a u f t r e t e n d e r Wirkungen durch Anwendung eines hier nicht näher zu beschreibenden mathematischen Modells mit additivem Charakter zu Erwartungswerten in Beziehung gesetzt, u m echte Wechselwirkungen zu kennzeichn e n (JUNGE [3]).

Wurde Benomyl nach den Wachstunisregulatoren appliziert, so blieben die a u f t r e t e n den Wechselwirkungen meist gering u n d ausschließlich in den Spätsommerversuchen waren sichtbare Minderungen der fungiziden Wirkung zu beobachten. I n den Kombinationsbehandlungen mit Thiophanat-Methyl u n d Triforin k o n n t e dagegen eine teils beträchtliche Einschränkung der Fungizidwirkung festgestellt werden, die vornehmlich bei Anwendung des Systemfungizides in K o m b i n a t i o n mit Gibberellin auft r a t . Hier waren stets die Krankheitsausprägung u n d o f t noch stärker der Befallsnachweis verändert (Abb. 1, Abb. 2). Befallsnachweis

%

Versach Okt./Nov (n = 9)

H I Daminozid § Gibberellin US Damir,•Gibt

Abb. 2. W i r k u n g a l l e i n i g e r u n d k o m b i n i e r t e r A n w e n d u n g W a e h s t u m s r e g u l a t o r e n auf d e n B e f a l l v o n Antirrhinum-Pflanzen t i o n d u r c h Verticillium albo-atrum

von

Systemfungiziden und nach künstlicher Infek-

214

H . J U N G E , H . BOCHOW, M . JACOB

K a m e n die alleine u n w i r k s a m e n S y s t e m f u n g i z i d e Fenaminosulf oder P r o t h i o c a r b in der Folge n a c h den W a c h s t u m s r e g u l a t o r e n zum E i n s a t z , so waren häufig b e t r ä c h t l i c h e welke- u n d b e f a l l s m i n d e r n d e W i r k u n g e n zu b e m e r k e n , die in s t a r k e n Wechselwirk u n g e n Niederschlag f a n d e n . U m die U r s a c h e n der b e o b a c h t e t e n Wechselwirkungen einzugrenzen, wurden L a b o r versuche m i t a b g e s c h n i t t e n e n Sprossen von Antirrhinum-Vüa.nzen a n g e s e t z t . Der Nachweis des a k r o p e t a l e n T r a n s p o r t e s des Fungizides in der P f l a n z e erfolgte dabei d u r c h einen Agar-Bio-Test mit d e m Erreger Verticillium albo-atrum. E s k o n n t e gezeigt werden, d a ß d u r c h Einstellen der Sprosse in eine Benomyl-Suspension (500 p p m ) u m die auf Agar ausgelegten Stengelstücke von verschiedenen S p r o ß h ö h e n eine deutlich von u n t e r e n zum oberen Sproßteil a b g e s t u f t e H e n i m h o f b i l d u n g induziert w u r d e , w ä h r e n d die W i r k u n g von C h l o r m e q u a t (1500 p p m ) nicht von der Wasserkontrolle abwich. E i n Einstellen f ü r 24 h in C h l o r m e q u a t - L ö s u n g vor d e m Einstellen der Sprosse f ü r 24 h in Benomyl-Suspension e r h ö h t e dagegen den F u n g i z i d n a c h w e i s in den 3 unters u c h t e n S p r o ß h ö h e n deutlich (Abb. 3). A u c h ein Einstellen in ein Gemisch beider S u b s t a n z e n k o n n t e eine geringe E r h ö h u n g in der H e m m h o f b i l d u n g h e r v o r r u f e n , die aber n u r k n a p p über d e n E r wart ungs werten a u s d e m a d d i t i v e n m a t h e m a t i s c h e n Modell lag. Dagegen rief die Anwendungsfolge von Hemmflächen je Stengelstück 1 000 [mm1]

Summe der Hemmflächen 2 000

1500

i 500 -

1.Versuchsflüssigkeit (0-24-h) 2. V e r s a c h s flüssigkeit (24.-48 h)

l:-:rm—-

Í'Tj'itmj_

Wasser

Wasser

Wasser

CCC Benom. 1500ppm 500 ppm

Wasser

iL

CCC

Benom.

1000

- 500

Wasser

Benom.

Benom. + CCC

CCC

Stengelregionen: HU oberen 0 mittleren E] unteren

I

Erwartungswert

Abb. 3. Darstellung der Hemmflächen durch Auslegen 1 cm langer Teile aus unteren, mittleren und oberen Stengelregionen auf mit Verticillium albo-atrum homogen beimpften Biomal/.-Agar-Platten, nach Einstellen (1er Antirrhinum-Sprossc in Versuehsflüssigkeit im Vergleich zum Erwartungswert

Kombinationen systetischer Substanzen und Phytopathogenese

215

M ö g l i c h e T r a n s l o k a t i o n s b e e i n f l u s s u n g bei K o m b i n a t i o n e n vun s y s t e m i s c h aktiven S u b s t a n z e n , b e z o g e n a u f d e n T r a n s p o r t eines P S M

Abb. 4. Mögliche Translokationsbeeinflußung bei K o m binationen von systemisch aktiven Substanzen, bezogen auf den Transport eines Pflanzenschutzmittels

Chlormequat nach Benomyl eine fast vollständige Identität des Fungizidnachweises in allen Stengelhöhen hervor, der in der Summe erheblich unter dem nach alleiniger Anwendung von Benomyl blieb. Da beide Substanzen im schwach sauren Xylemsaft der Pflanzen als Kationen angesprochen werden können, führen wir die Transportbeeinflußung bei der kombinierten Anwendung beider Mittel auf eine Transport-Konkurrenz der Wirkstoffionen zurück. Der im Verhältnis zum Transpirationsstrom langsamere Transport der Substanzen könnte dabei mit einer ständig wechselnden Sorption und Desorption der Wirkstoffionen an Carboxylgruppen der Zellwände verdeutlicht werden. Käme hier dem Chlormequat eine höhere Bindungsaffinität zu, so würde die von E R W I N U. a. [ 1 ] postulierte Bindung der aktiven Substanz von Benzimidazolen an Pflanzenbestandteile in den Stengeln durch vorhergehende oder gleichzeitige Applikation von Chlormequat vermindert bzw. durch nachfolgend verwendetes Chlormequat wieder aufgehoben worden sein. Parallel zur Verdrängung aus dem Gefäßsystem wäre dann ein schnellerer akropetaler Transport des fungiziden Wirkstoffes bedingt. Eine langfristige Nachlieferung durch sukkzessive Desorption von diesen Bindungen in Stengeln und ähnlich auch im Wurzelbereich und damit Disponibilität des Wirkstoffes in basisnahen Stengelbereichen zur effektiven Bekämpfung beginnender Tracheomykosen würde damit vermindert werden.

216

H.

JUNGE,

H.

BOCHOW, M .

JACOB

Ähnliche Effekte, die für diese Deutungsweise der Wechselwirkungen sprechen, konnten im Labortest auch für beobachtete Interaktionen beim gemeinsamen Einsatz von systemischen Nematiziden, die gegen einen Pflanzenbefall durch Meloidogync hapla CHITWOOD eingesetzt wurden, für Benomyl und Wachstumsregulatoren, die den Befall von Pflanzen durch Wurzelnematoden beeinflußten, gefunden werden. Die postulierten Möglichkeiten der Transportbeeinflußung infolge des gemeinsamen Einsatzes systemisch aktiver Substanzen wurden schematisiert (Abb. 4), woraus in Abhängigkeit der Potenz und des Umfanges von transpirationsseitig bzw. bindungsseitig realisiertem Transport, sowohl eine Hemmung als auch eine Förderung der Bewegung der einzelnen Wirkstoffe in der Pflanze abgeleitet werden kann.

Abb. 5 . W e c h s e l b e z i e h u n g e n z w i s c h e n d e n E l e m e n t e n der , W i r t - P a r a s i t - U n i w e l t - W i r k s t o f f ' - S y s t e m e , die f ü r die E r k l ä r u n g v o n W e c h s e l w i r k u n g e n , wie sie beim kombinierten Einsatz systemiseh wirksamer Substanzen entstehen können, herangezogen werden müssen

F ü r die Diskussion der bei kombiniertem Einsatz systemiseh aktiver Verbindungen auftretenden Wechselwirkungen vornehmlich auf die Pathogenese von Tracheomykosen werden damit von uns hauptsächlich Beeinflußungen im Transportgeschehen der Wirksubstanz in der Pflanze gesehen. E s können jedoch in Anbetracht des gesamten Beziehungsgefiiges (Abb. 5), Wirt—Parasit—Umwelt—Wirkstoff' auch noch weitere Ursachen an der Entstehung der beobachteten Wechselwirkungen beteiligt sein, wie dies durch Untersuchungen von ELAMAYEN [2], T E U T S C H [ 4 ] u. a. Autoren angedeutet wird. Vornehmlich werden dabei nach unseren Erfahrungen die Wirt—ParasitBeziehungen — z . B . lokalisierter oder systemischer Pflanzenbefall — d. h. von der Pathogenese abhängige Verschiedenheiten eine Schlüsselrolle bei der Auswirkung von Wirkstoffinteraktionen spielen. Die weitere Erfassung erscheint uns zur gezielten Effektivitätssteigerung des Einsatzes systemisch aktiver Verbindungen im Pflanzenschutz bedeutungsvoll. Diskussion GROSSMANN : K a n n der hemmende Einfluß der Wachstumsregulatoren auf den therapeutischen Effekt von Thiophanat-Methyl darauf beruhen, daß die Umwandlung dieser Verbindung in MBC verlangsamt wird ? BOCHOW: Bei kurzen Versuchszeiten ist für diese Möglichkeit der Ergebnisinterpretation keine Grundlage gegeben. GROSSMANN: Worauf ist es zurückzuführen, daß in den Versuchen mit abgeschnittenen Sprossen von Löwenmäulchen das Benomyl so langsam in die oberen Sproßteile transloziert wurde ? War die Luftfeuchtigkeit sehr hoch ?

Kombinationen systemischer Substanzen und Phytopathogenese

217

B O C H O W : E S ist richtig. Die U n t e r s u c h u n g e n liefen bei A n w e n d u n g r e l a t i v hoher L u f t f e u c h t e (entsprechend geringer T r a n s p i r a t i o n ) . Wir w a r e n a n einem schnellen T r a n s p o r t in unseren Versuchen nicht interessiert. BECKER: I h r e U n t e r s u c h u n g e n mit Gemischen von F u n g i z i d e n u n d W u c h s s t o f f e n sind sehr interessant u n d zwar negative Ergebnisse nicht weniger als positive. H a t t e n Sie a u c h solche ? I n t e r e s s a n t ist vor allem inwieweit Wechselwirkungen zwischen P a t h o g e n u n d W i r t s p f l a n z e b e t r o f f e n werden u n d die S u b s t a n z e n den C h a r a k t e r von S c h u t z s u b s t a n z e n a n n e h m e n . Wir h a t t e n bei einigen Mischungen (z.B. Griseofulvin mit D i o x y p h e n y l a l a n i n ) u n e r w a r t e t negative Ergebnisse, da diese beiden S u b s t a n z e n , die beide d a s P i l z w a c h s t u m h e m m e n , einen e n t g e g e n g e s e t z t e n W i r k u n g s m e c h a n i s m u s h a b e n . Bei B e h a n d l u n g mit der Mischung entwickelt sich d a s P a t h o g e n f a s t so g u t wie in der u n b e h a n d e l t e n Kontrolle.

E s ist zu v e r m u t e n , d a ß Mischungen aus Griseofulvin u n d B e n o m y l oder Colchizin, wobei eine K o m p o n e n t e auf die R N S - S y n t h e s e u n d das W a c h s t u m u n d die a n d e r e auf den K e r n m e t a b o l i s m u s u n d die K e r n t e i l u n g einwirkt, a u c h n e g a t i v e E r g e b n i s s e geben werden. E s scheint, d a ß m a n d e r a r t i g n e g a t i v e E r g e b n i s s e m a n c h e r Gemische voraussagen k a n n u n d dies ist a u c h eine H a u p t a u f g a b e der W i s s e n s c h a f t . B O C H O W : Die A u s f ü h r u n g e n von F r a u P r o f . B E C H E R b e t r e f f e n einen wichtigen Aspekt der bei der Wechselwirkung von systemisch a k t i v e n V e r b i n d u n g e n in der P f l a n z e zu e r w a r t e n ist. Wir v e r w e n d e t e n hier S u b s t a n z e n , bei d e n e n v o m W i r k u n g s m e c h a n i s m u s allein schon her, eine negative Blockierung nicht zu e r w a r t e n w a r u n d k o n z e n t r i e r t e n u n s auf wechselseitige T r a n s l o k a t i o n s b e e i n f l u s s u n g e n . B U C H E N A U E R : Welche f u n k t i o n e l l e n Wechselwirkungen zwischen W a c h s t u m s r e g u latoren und Halmstabilisatoren wurden analysiert 1 BOCHOW: I m Falle der K o m b i n a t i o n s w i r k u n g von S y s t e m f u n g i z i d e n u n d W 7 achst u m s r e g u l a t o r e n bei Getreide u n d der B e k ä m p f u n g der H a l m b r u c h k r a n k h e i t sowie bei a n d e r e n Möglichkeiten der Wechselwirkung zwischen e n t s p r e c h e n d e n V e r b i n d u n gen interessieren u n s n i c h t n u r E r k l ä r u n g e n b e s t i m m t e r E f f e k t e , sondern vor allem die N u t z u n g der E i n w i r k u n g von W a c h s t u m s r e g u l a t o r e n auf d a s T r a n s p o r t s y s t e m der P f l a n z e u n d d a m i t gezielte Beeinflussungen der T r a n s l o k a t i o n von systemischen Pflanzenschutzmitteln.

Literatur [ 1 ] E R W I N , D . C . , W A N G , M . C . , SIMS, J . J . , T r a n s l o c a t i o n o f

2-(4-thiazolyl)benzimidazole

in cotton, L'hytopathology 60, 1970, 1291 (Abstr.) [2] ELAMAYES, M. M., ABU, Untersuchungen über Anwendungsmöglichkeiten systeinischer Wirkstoffe zur Bekämpfung von Wurzelgallenälohen und anderen Sehaderregern, Dissertation, Humboldt-Universität Berlin, 1973 [3] JUNGE, H., Wirkungen der gemeinsamen Anwendung verschiedenartiger, systemisch aktiver Substanzen auf das Wachstum der Pflanzen und deren Befall durch bodenbürtige Krankheitserreger, Dissertation, Humboldt-Universität Berlin, 1980 [4] TEUTSCH, H., Wechselwirkungen zwischen Waohstumsregulatoren und systemischen Fungiziden im Hinblick auf Entwicklung und Krankheitsbefall von Tomatenpflanzen, Dissertation, Universität Hohenheim, Stuttgart-Hohenheim, 1977

I i . K Ä L B E R E R , F . M F LT.KK u n d F .

Institut für Phytomedizin der Bundesrepublik Deutsehland

GROSSMANN

Universität

Hohenheim,

7000

Stuttgart

70,

Anreicherung systemischer Fungizide an Infektionsstellen obligater und nichtobligater Parasiten

Über die Akkumulation systemischer Fungizide an Infektionsstellen ist schon mehrfach berichtet worden ( B A T E S und T W E K B Y [ 1 ] , U P H A M und D E L P [ 5 ] , H O U S E W O R T I I [2] u. a.). Diese Angaben beschränkten sich aber auf Infektionen durch obligate Parasiten, überwiegend Rostpilze. I n unsere eigenen Untersuchungen bezogen wir dagegen auch nichtobligate Erreger ein. Ferner versuchten wir, einen Beitrag zur Klärung der Ursachen der Akkumulation zu leisten. Die folgenden Ausführungen stützen sich im wesentlichen auf die Dissertation von K Ä L B E R E R [3]. Zur Methodik F ü r die U n t e r s u c h u n g e n s t a n d e n die s y s t e r n i s c h e n F u n g i z i d e C a r b e n d a z i m u n d P y r a c a r b o l i d z u r V e r f ü g u n g , die b e i d e m i t 1 4 C m a r k i e r t w a r e n . S i e w u r d e n d e n P f l a n z e n in d e n m e i s t e n F ä l l e n i n e i n e r N ä h r l ö s u n g ü b e r die W u r z e l n v e r a b r e i c h t . T e i l w e i s e e r f o l g t e die A p p l i k a t i o n a u c h a u f die B l ä t t e r . B o h n e n (Phaseolus vulgaris), Sorte „ S a x a " , wurden an den P r i m ä r b l ä t t e r n m i t Uromyces appendiculatus b z w . Colletotrichum lindemuthianum i n o k u l i e r t ; G e r s t e (Hordeum distichon), S o r t e „ F i r l b e c k s U n i o n " , m i t Erysiphe graminis f. sp. hordei oder mit Jihynchosporium secalis. D i e V e r s u c h e w u r d e n in e i n e r K l i m a k a m m e r d u r c h g e f ü h r t . Die Auswertung wurde entweder autoradiographisch vorgenommen oder, nach Verbrenn u n g der zu u n t e r s u c h e n d e n P r o b e n , m i t H i l f e e i n e s F l ü s s i g s z i n t i l l a t i o n s s p e k t r o m e t e r s der F a . P a c k a r d ( T r i c a r b 3 3 8 0 ) . H i n s i c h t l i c h v o n E i n z e l h e i t e n m u ß a u f KÄLBERER [ 3 ] verwiesen werden.

Infektion von Bohnen durch Rost (Uromyces

appendiculatus)

Nach Verabreichung der Fungizide über die Wurzeln war die zu erwartende Anreicherung im Bereich der Pusteln deutlich zu erkennen (Abb. 1). Wie ebenfalls aus der Abbildung hervorgeht, befindet sich um die Pusteln herum eine Zone geringerer Radioaktivität. Die Akkumulation der Fungizide in den Pusteln selbst ist offenbar mit einem Entzug aus dem unmittelbar angrenzenden Gewebe verbunden. Zur genaueren Erfassung der quantitativen Verhältnisse wurden einzelne Pusteln und die sie umgebenden Ringe mit Injektionsnadeln bzw. dünnen Röhrchen aus den B l ä t tern ausgestanzt, wie dies die folgende Skizze veranschaulicht: Ring um

Pustete

ausgestanzte Pustel eigentliche Pustel—

0,5 mm

0,8Smm 1,74 mm

220

R.

KÄLBERER, F . MÜLLER, F .

GROSSMANN

Al)b. 1. 1 4 C - A k k u m u l a t i o n in R o s t p u s t e l n auf B o h n e n - P r i m ä r b l ä t t e r n n a c h A p p l i k a t i o n von 1 4 C - C a r b e n d a z i m (links) bzw. 1 4 C-PyracarbolirpapMenTOB H a r a 3 0 0 G \ i e H j i n c T b e i i

H (J)0T0(})0C(J)0pHJiHp0BanHe ( B ) ( f l - n b i x a u H e , O

—

xjiomiaTiiHKa

(A)

(J)OTOCHHTC3)

K O H T p o j i b n a CBETY H B T e M H O T e ; a e t i C T B i i e n p e r i a p a T O B n a BBUEJIEIME C O a ( a u x a H a e )

< i e p e 3 1 2 MHH n o c j i e BMKJIIO-

'ieHHH c B e T a ; ;ieiicTBne n p e n a p a T O B n a MiiTeiicHBnocTi. noTpe6jieiiHH C 0 2

mecTB,

caMoperyjiHpyeMaa

HCKyccTBeHHO

noBbiuiaeT

MOHuepH^HBaH H o p M a j i t H o e —

cnoco6cTByeT

BHHX n y T e ñ Hbix

cpemi

S i i o j i o n w e c K a H C H C T e M a KJICTKH, C OJJHOM c r o p o u b i , ypoBeHb

6bicTpoñ

HHriidHTopa.

H yBejiHneHHio II

HaCTIIHHO

BCTpeHaioTCfi

nponyTKOB

6nojiorHHecKHx

yTHJiH3aiiHH

6llOCHHTe3a

KOTOPHX

neo6xonHMbix

nporeKaHHe

OKHCJieHHH B e n e T

ripOHyKTOB

fiHua,

(({)0T0CHHTe3)

MeTa6ojiH3Ma,

peaKuiiñ,

B KJieTOHHOM c o n e

OKHCJieHHWX

BemecTBa

a

c

apyroñ,

Mo6njiH3auHH

BemeCTB

TOKCHHHbie

pe3ep-

np0MeíKyT0MKJieTKH

HJIÍI

X03-

(|»HT0naT0-

reHOB. Il03T0My

06pa30BaHHe

HJIH n o j ] ; A e ñ C T B H e M e r o II M O J K C T

BbI3bIBaTbCH

aiiTH(|)yHrajibHbix MeTa60JiHT0B UejIblM

píIflOM

He

BemeCTB HBJIHCTCH

SlIOJIOrHHeCKH

npn

saparKeHim

cneuHOpHJlHpOBaHHH, 0T0.1H3a BO«I.I H a p . ) ^

/

06pa30BanHe HHjiyiiTopa

I l p e a o j i e H H e MexaHH3Ma yCTOttMHBOCTH H IlpOHHK HOBeHHe B TKaHH

MHayUHpoBaHHe peanuHH CBepxMyBCTBHTejlbHOCTH H BKJIIOieHHe pe3epBHbix nvTeil o k h c j i c h h h

IIpOHyUHpOBaHHe TOKCHHa'

0 6 p a 3 0 B a H H e (j)HTOajieKCHHOB h a p . anTH(J)ynraJii.Hbix BeuiecTB

P h c . 6 . C x e ^ i a B3aiiM00TH0iiieiiiifi naT0reii-T0Kciiii-pacTeiiiie-(j)HT0ajieKciiii-iiaT0reii BepTHUHJiJiesnoM BHJiTe x j i o i i ' i a T i i i i K a

HaHÖonee

Batti h h m

momchtom

naToreHC3a

5iB:meTCH

npoHUKOBcmic

a H T e n a B H y T p b p a c T e m i H . H a 3 t o m 3 T a n e , n a n ii H a n o c n e n y i o m n x , pojib

BbinojiHHioT

noBepxHOCTii

TOKCHHecKHe

BemecTBa

KJieTOHHOH o ö o j i o H K H

B036ynnTeJin,

naToreHa.

B03ÖyBanrnyio

Haxoflnmueca

MaßiipaTejibiio

npn

Hapyman

Ha KJie-

236

r . H. BopojiHH, C. M. Xoa>KH6aeBa, B. M. P y H o B

TOMHbie MeMÖpaH H TCM caMbiM aKTHBHpya penapaTHBHbie CHCTeMbi pacieHHH, OHH oßnernaiOT npouecc N P 0 H H K H 0 B E N H H B036yflHTejiH. I l p H STOM, BHUHMO, ecjin HHflyuHpoBaHHe peaKUHH CBepxHyBCTBHTejibHOCTH npoTenaeT MejyieHHO H nOH B03fleHCTBHeM 3HaMHTeJIbHbIX KOJIHHeCTB TOKCHHeCKHX MeTaÖOJIHTOB, naToreH nojiynaeT B03M0?KH0CTb KaKOÖTO nepHoa ßeenpenaTeTBeHHO pa3BHBaTCbH h CB0eBpeMeHH0 nepeMemaeTCH H3 30Hbi, n o a B e p r a y T O ß aHTHKHO B03NEFLCTB0BATB Ha ÖHOXHMHHecKHe npoueccbi, ynacTByiomHe B C(|)epe B3awMOOTHOineHHH naToreH-pacTeHHH H HCKyccTBeHHO noBbicHTb HMMyHHTeT. OHHaKO cjieayeT yMHTbiBaTb, MTO npou;ecc HABEJJEHHOII ycTOHHiiBOCTH He HACHTH^eH n p o u e c c y , pa3BHBaiomeMyca npH KOHTAKTE pacTeHHH c naT0reH0M; OH OHHOMOMeHTeH, 3aTpaniBaeT TOJibKO HacTb KOMnjieKca peaKUHft B3aHM00THOUieHHfl II (|)yHKUHOHHpyeT KOpOTKOe BpeMH. McXORH H3 3TI1X COOÖpa>KeHHH, HCKyccTBeHHoe noBbimeHHe ycTOHHHBOCTH pacTeHHii JiorHHHee Hcn0Jib30BaTb B HapoHHOM XO3HHCTBE B KANECTBE npo(|)HJiaKTHHecKoro CPENCTBA (nonoceBHaa oßpaßoTKa ceMHH) HJIH B coHeTaHim c aHTnßHOTHKOTepanHeii B nepnoHbi yrpo3bi MaccoBoro nopameHHH pacTeHHii B036yu;HTejiHMH. B 3ai-iJiioHenHH aBTopbi BbipamaioT HCKpenHioio ßjiaranopHoerb 3aB. 0Tfleji0M 6HO({)H3HKH HHCTHTyTa ÖHOXHMHH A H YsCCP MjieH.-Kopp. A H Y3CCP TaiiiMyxaMeHOBy B. A . 3a noMomt B H3yHeHHH aeiicTBHH upenapaTOB Ha BM h 3aB. jiaßopaTopiieü HMMyHHTeTa pacTeHHH H H 3 B P A H Y 3 C C P A ß A 3 X O H J K A E B Y M. 3a noMoim» B HsyHGFiHH aeftcTBHH TOKCHieCKHX BeiljeCTB V. dahliae IIa CKOpOCTb C>6pa30BaHHH (J)HTOajieKCHHOB rOCCHIIOjioßoro pna;a. Diskussion SCHMALFUHS: Welche fungiziden Wirkstoffe werden zur Bekämpfung von Verticillium an Baumwolle in der UdSSR eingesetzt ? B O R O D I N : E S werden zahlreiche in der UdSSR produzierte Fungizide eingesetzt, die sowohl für den Einsatz in Baumwolle als auch zur Bekämpfung von Verticillium geeignet sind. SCHMALFUHS: Haben die angewandten Fungizide auf die Zusammensetzung und Struktur der besprochenen Eiweißkomplexe einen Einfluß ? BORODIN: Dies hängt von der Konzentration der Eiweißkomplexe ab. JIirrepuTypa [1]

B o p o H H H F . M . h B . H . P y n o B , M s y n e m i e iipHpoabi HenoTopbix TOKcimecKHX npoayHTOB Verticillium dahliae K L E B . , T p y a b i ,,1 KOH({)epeHUHH 6HOXHMHKOB p e c n y ß j i H K C p e a n e n A3HH H K a 3 a x c T a n a . „ c D A H " V 3 C C P , T a m n e H T , 1 9 6 7 , 4 3 4 — 4 3 6

[2] IJopoHHH r . H., B. C. CajiHXOBa, C. M. Xoa/KHßaeBa, Jl. M. MeiieHKO, O . . K a p n a n e ß a , B . M . P y H o B , O . C. O T p o M e H K o H A . C. C A A W K O B . O x a -

panTepe B3anM00TH0meHHH iiaToreii-TOKCHH-pacTeuHe npii BepTHHHJiJie3HOM BHJITC xjioiiiaTHHKa. JJOKJiaaw ,,IT KOH(J>epeHUHH 6HOXHMMKOB pecnyfwiHK CpeHHeft A3HH H Ka3axcTaHa", „ B I J 1 B I M " , pyii3e, 1 9 7 6 , c e p . ,,6HOXHMHH p a c T e H H i l " , 37—39

237

BepTHUHJIJIC3HbIH BHJIT XJlOnHaTHHIia

13] B o p o j H H r . H . , H i . Ca(J)HH30B, C . M . X o f l j K H Ö a e B a , O . O . O n j i a r o B a H B . H . P y n o B . JHeilcTBHe TOKCHHecKHX BemecTB Verticillium dahliae K L E B . Ha KJ16TKH JIHCTBEB x j i o n n a T H H K a . Y 3 6 . 6HOJT. HTYPHAJI JVS 4 ( 1 9 7 8 ) ,

15—18

[4] B o p o H H H r . M . , JI. H . H e n e H K O , C. M . X o a m n f i a e B a , B . H . P y H O B , O . C. O i p o m e H K O , A . C. CaHbiKOB H C. 3 . M y x a M e a w a H O B . ToKXH^ecKHe BemecTBa y

PASJIH^HBIX

6H0THn0B,

p a c , BHHOB

Verticillium

dahliae

KLEB.

B

C6.

,,KHT p o j i b nepBOH JIHHHH oöopoHbi pacTeHHH, n p e naTCTByiomeft npopacTaHHio c n o p naToreHa H e r o npoHHKHOBeHHio B c y ß a n i i HepMajibHbie TKaHH. M s y n e m i e ßapbepHOH paKUHH,

n p O H B J I H I O m e r O I J H T O K H H H H O B y i O a K T H B H O C T b II O Ö H a p y j K e H H O T O B H H T a K T H b l X , HHKyÖHpOBaHHblX AKTHBHOCTB

BO

ÖHOTECTA

c Rf 0,63—0,75.

BJiaiKHOH (220%)

YKa3aHHoe

KaMepe

H

3apa?KeHHbIX

oÖHapyiKeHa

TAK>KE

B

JIHCTbHX.

30He

BbICOKail

xpoMaTorpaMMbi

B e m e c T B O H e n p o H B H j i o 3KTHBHOCTH HH B H H T a K T -

H b l X ,HH B H H K y Ö H p O B a H H b l X BO B J i a ? K H O H K A M E P E J I H C T b H X , a T O J l b K O B O T B e T na

3apanieHHe

Botrytis

allii.

OcTanbHbie

3apa?KeHHbix JiHCTbeB J i y K a n p o H B H J i n

AEÖCTBHE B n p e n e j i a x OT 1 3 0 % AO 1 5 0 % . pacTaioujHX

KOHHHHH

HHTOKHHHHOBOH

rpnßa

B 30He

BemecTBa,

xpoMaTorpaMMbi

3KCTpaKT0B ÖHOTCCT

T a K H M 0 6 p a 3 0 M , n o f l , BJIHHHHCM

Ha6jiionaeTCH

aKTHBHOCTH

nofiBjieHHe Hoßoro

30HH

AOCTOBepHoe C T H M y j i n p y i o m e e KaK

KOJiHnecTBeHHoe

xpoMaropaMMbi

oöjianaiomero

C Rf

npo-

yßennHeHHe

0,0—0,13,

TaK

TAKOH AKTHBHOCTBIO ( R f 0 , 6 3

H no

O , 7 5 ) . r i o j i y I i e H H b i e AAHHBIE BCHNETEJIBCTBYIOT o TOM, HTO H 3 M E H E H H E HHTOKHHHHOBOH

aKTHBHOCTH

JIBJIHeTCH

OflHOH

H3

MOÖHJIbHblX

peaKHHH

paCTeHHH

Ha

3APANIEHHE H NONTBEP>KNAIOT (J)H3HONORHHECKYIO C O N P M K E H H O C T B I I B Y X CHCTCM (|)H3H0JI0rHHeCKH

aKTHBHblX

—

COeflHHeHHH

MEHHE a K T H B H O C T H

OAJI

KOHTpOJlHpyiOIHHX

NPOIJECC JIHrHH(|)HKaiJHH

napajuiejibHO

c

ayKCHHOB

H nepOKCHna3bI,

H UHTOKHHHHOB.

(|)epMeHTOB

Ha

CTpyKyTyHblX

3JieMeHTOB

aKTHBHOCTH O A J I

H nepOKCHHa3bI,

(TaÖJi. 2).

aKKyMyjIHUHH

TaG/iuifa 2 CodepMcanue nojiucßenojioe u itKinumlocmh &AJI KOHuduaMU Botrytis allii. RI0JIH({)EH0JIM (B M K r / 1 r )

Eojiee

(|)eHOJIbHbIX B e m e C T B

AKTHBHOCTI, AJI (B y c j i . e a . / l

Me30$HJ1JI

3nnaepMHC

Me30Cj)HJlJl

263 389

65 92

464 660

87 80

34,4 130

10.2 29

46.4 200

410 665 284

11 40 25

923 892 455

90 37 82

ariHflepMHC

A. v ctorialis 20 30

Me30(jmjui

r)

O

K, 6

siraaepMHC

B HH-

e Jiucmbfix nod eJiumiueM unohij.i.Hi;uu

O

^16

3iinaepMHC

Me30(j)HJ!Jl

10 20

70 85

30 25

A. altissimum 13.4 40 27 30

22 20

76 65

14 20

A. pskemense 130 132 168

97 10 34

360 180 1104

78 18 46

U n p H M e i i a n H e . K 1 6 — JIHCTB« Mepe3 1 6 ' i a c . HHKyßauHH B TCMIIOTC, O BaHHbie jiMCTLH n e p e 3 1 6 l i a c . Systemfungizido

TKaHH,

TecHyio conpnBHCOKHH ypoBeHb

ONPEAENEHHEM c y M M b i N 0 J I H ( J ) E H 0 J I 0 B NOKA3AJIO

/KEHHOCTB H3MEHEHHFL 3 T H X NOKA3ATEJIEH

16

M3Y-

yCJIOBHHX

pa3HbIX

—

HOHKyjiHpo-

M . H . T a j i i i e B a , B . B . M a 3 M n, Jl. B . P y n K U B a

242

Hbix coe;iiineiiiiii llOKpOBIIOtt TKailll nyHOB 1104 BJIHHHHCM HHOKyjIHUHH HOIIHJHflMH Botrytis flliii M ü K K MiiKOJioriin 11 (])yTonaToaorHH 10 (1976), 108 —110 |2] ZUCKER, M., J. AHRENS, Quantitative assay of ehlorogenie acid, Plant Phvsiol. 83 (1958), 2 4 6 - 2 4 9 [3] P y i i K O B a JI. B . , liccjieaoBaiiHe ayKcmioB MCTO.IOM {iiiOTecTOB B I;H. POCT paTeiinii M npnpo;uibie pery.iHTopbi MocKisa H a y n a 1977, 52 — 59 [4] M a 3 H i i B . B . , JI. C. I I I a i i i K O B a , J I H . A H a p e e B , E . H . K o M H a e p KO, M . M . / K . i o O a , B . H . K e ( J ) e a n , CiieuM(J)IMHOCTI> BJIHHIIHH KiiiieTima na oßpasoBaoiie aMapaiiTiiua y iUiipmibi (AmariuitlniH caudatus L . ) h Ha pocT i,;i.i.iyc;i ceMH^o.lH coil (Oli/cine .soja L . ) ß o i u i a a w A H CGGP 23 (1976), 506—509 [5] ZUCKER, Ai., Sequential induction of Phenylalanin ammonia — lyase and a lyaseinactivating system in p o t a t o tuber disks, P l a n t Physiol. 43 (1968), 365 — 374 [6] P y i i K O B a JI. B . , M . H . T a j i i i e B a , O paenpeaejieiimi (|)enojii>iibix coeiiHiieiiHii B jiHCTiiflx i i e n o T o p u x BiinoB pojja Allium flon.najihi A H C C C P 225 (1975), 232—234 [7] P y i i K O B a .'I. B . , M . H . T a j i w e B a , O paciipeaejieime iiHaojibHbix coeamieHHH B J1HCTI.HX «IVKOU II HX HSMeiieilHH HÖH BJIHHHIieM rpHÖHOH HH(j»ei;HHH. B c6. ,,(JlHTOropMOHW — p e r y j i i i T o p u pocTa p a c T e i m f i " MocKBa H a y n a 190, 6 4 — 7 3

J . AUGUSTIN, L . DROBNICA a n d P .

Department Bratislava,

of Microbiology Czechoslovakia

KRISTIÄN

and Biochemistry,

Slovak

Polytechnical

Iniversity,

Antimicrobial Activity of Dithiocarbamates and Other Sulfur Containing Compounds

Some synthetic organic compounds decompose to isothiocyanates spontaneously in aqueous solutions at laboratory temperature. Thus they resemble aglucones which are formed by enzymatic hydrolysis of glucosinolates. On the basis of this analogy with natural substances, M A R T I N [3] introduced the German name „Synthetische Senfolbildner" for synthetic compounds, which spontaneously decompse to isothiocyanates. The name appeared in English literature as "Mustard oil formers". Presently, all these compounds belong to the group of antimicrobially active sulfur compounds. A more detailed review dealing with physico-chemical properties of mustard oil formers can be found in our previous papers ( A U G U S T I N [ 1 ] , D R O B N I C A et al. [ 2 ] ) . In this paper phy^co-chemical constants of decomposition of the compounds are given. The rate of decomposition of monothiocarbamates, dithiocarbamates and their esters and 3-substituted rhodanines in acidic, neutral and alkaline solutions was calculated from spectrophotometric measurements in absorption maxima in ultraviolet region. The results, expressed as observed rate constants ¿-obs, dependent on pH value of the reaction mixture and half life of decomposition are given in Tables 1 —6. The only primary product of decomposition of monothiocarbamates in acicid, neutral and mild alkaline conditions at laboratory temperature is an amine and carbonyl sulfide. Isothiocyanate, once reacted with O H " ions cannot be regenerated b y reverse reaction. Table 1 Rate constants fcob8 of decomposition thiocarbamates in neutral and acid phosphate bu/fer (equation 1) R - N H - C S - O R = n-butylbenzyl4-bromobenzyl4-inethoxyphenylphenyl4-broinophenyl4-aeetylphenyl-

n-monosubstituted monoconditions at 25 °G 0,1 M

k obs . l 0 6 § [H+] (1 • m o l - 1 • m i n - 1 )

^1/2 a t p H 7.4 (min)

2.09 1.96 1.23 52.5 29.7 14.4 6.25

11.5 12.3 19.7 0.38 0.67 1.38 3.84

0,1 M p h o s p h a t e buffer p H 6 , 0 - 7 , 6 0,1 M b o r a t e bu/fer p H 7,2 — 9,1 16*

244 Table 2 Bate constants dithiovarbamates

J . AUGUSTIN, L . DROBNICA, P .

of decomposition of n-aryl- and in acidic solutions at 25° C (equation

R — N H —CS —S R =

kobs . [H+] (1 • m o l " 1 • m i n " 1 )

benzyl4-methoxy phenyl4-ctoxyphenylphenyl* 4-bromophenyl4-acetylphenyl-

0.00645 1.81 1.89 2.91 3.00 3.40

KRISTIÂN

n-aralkyl 2)

ti/2 P^ 5 O™'1)

at

1070 3.82 3.67 2.38 2.31 2.00

Table 3 Bate constants &Hbs of decomposition of n-aryl- and n-aralkyldithiocarbamates at pH 7.4 and 37 °C, 0.1 M phosphate buffer (equation 3) R — N H —CS — S " X + R = X = Na+ Na+ NH+ Na* NHJ

4-acetylphenyl4-bromophenylphenyl" 4-methoxvphenvlbenzyl- " "

kobs-10-2 (min-1)

tl;2 (min)

1.30 1.29 1.96 3.00 920

53.3 53.8 35.4 22.8 0.075

Table 4 Jiate constants &obs of decomposition of monothiourethans in mild alkaline solutions. 0.1 M phosphate buffer, pH 8.0 25 °C (equation 4) R-NH-CS-0-C R = n-butylbenzyl4-bromobenzyl4-methoxy phenyl4-methylphenyr4-bromophenyl4-acetylphenyl-

6

H

5

k o b s • IO" 2 (min-1)

t1;2 (min)

1.05 0.86 0.72 29 21 71 87

66.0 80.7 96.3 2.40 3.30 0.97 0.80

Alkali metal and a m m o n i u m salts of N-arylsubstituted dithiocarbamic acids decompose to antimicrobially inactive amines even in mild acidic solutions. At p H 5,0, what is typical for the cultivation of yeasts, half life of decomposition is within t h e range of 2—4 minutes. N-alkylsubstituted dithiocarbamates are much more stable under the same conditions, with half life about 24 hours. Under neutral a n d mild alkaline conditions such as p H 7,4, what is typical for bacterial cultivations, aryl derivatives decompose to corresponding isothiocyanates with half ranging from 20 to 60 minutes.

A n t i m i c r o b i a l a c t i v i t y of d i t h i o c a r b a m a t e s Table 5 Bate constants k0^s of decomposition of dithiocarbamic acid esters in mild alkaline phosphate buffer pH = 7.4 at 25 °C (equation R t — N H — CS — S -R - 2 Rx = R2 benzylbenzylbenzyl4-methoxyphenylphenyl4-bromophenylphenyl-

=

propylbenzylphenylpropylpropylpropylbenzyl-

245 n-monosubstituted solutions. 0.1 M 5)

kobs ' 1 0 - 2 (min

^1/2 (min)

stable stable 25 0.88 0.79 0.90 3.4

a a 2.77 78.8 88.4 77.0 20.4

a, H a l f life a t 37 °C a t given p H ~ 42 hours Table 6 Half life of decomposition of n-substituted rhodanines in mild alkaline solution. 0.1 M Mc Ilvaine buffer pH 7.4 25 °C (equation 6 a, 6 b) R -

tl/2 (min)

phenyl4-methoxyphenyl4-etoxyphenyl4-acetylphenyl4-bromophenyl4-dimethylaminophenyl4-nitrophenyl4-methylphenyl4-carbethoxyphenyl3-nitrophenyl3-acetaminophenylmethyln-butylbenzyl4-bromobenzyl-

160 180 239 74.3 98.3 257 59 204 74.3 66.2 192 670 670 264 210

O-Phenyl esters of N-arylmonosubstituted monothiocarbamic acids decompose to isothiocyanates quantitatively in neutral and mild alkaline solutions and in organic solvents such as dimethyl sulfoxide. N-alkyl- and N-aralkyl- derivatives are at least b y two orders more stable under the same conditions. O-Alkyl esters of N-monoaryl- and N-monoalkyl-monothiocarbamic acids are stable in acidic, neutral and strong alkaline solutions at laboratory temperature and do not form isothiocyanates. Alkyl esters of N-alkyl and N-aralkyl substituted dithiocarbamic acids are stable in acidic neutral and mild alkaline solutions at laboratory temperature. Alkyl esters of N-arylsubstituted dithiocarbamic acids decompose to isothiocyanates in neutral and mild alkaline solutions.

246

J . AUGUSTIN, L . DROBNICA, P .

KRISTIÂN

N-arylsubstitued rhodanines decompose to isothiocaynates in n e u t r a l and mild alkaline solutions, however, N-alkylsubstituted rhodanines decyclise without formation of isothiocyanates. All the above mentioned reactions are p H dependent. I t means t h a t ionization equilibrium itself plays a decisive role in their stability in solutions and in their antimicrobial activity. R-NH-CSO-

+ H+

R - N H 2 + COS

R - N H - C S - S " X + - > R - N H 2 + CS2 R-NH-CS-S"X

+

^ R-NCS + SH~

(1) (2) (3)

R-NH-CS-0-C 6 H 5 - > R-NCS + HO-C 5 H 6

(4)

R-NH-CS-S-R 2 ^

(5)

Rj-NCS + HS-R 2 -I-11.0

Ar-N-SC-S-CH 2 -CO

Ar-NCS + HOOC-CH 2 -SH

(6a)

+ U..O

Alk-N-CS-S-CH 2 -CO :

i

Alk-NH-CS-S-CH 2 -COOH

(6b)

References [1] AUGUSTIN, J . , M u s t a r d oil f o r m e r s . P h y s i c o - c h e m i c a l , b i o c h e m i c a l a n d biological asp e c t s , Assoc. P r o f . Thesis, 237 p p . S l o v a k P o l y t e c h n i c a l U n i v e r s i t y , B r a t i s l a v a , 1970 [ 2 ] D R O B N I C A , L . , P . K R I S T I Ä N , a n d J . A I T G U S T I N , T h e c h e m i s t r y of t h e -NCS g r o u p . I N : I ' A T A I S. ( E d . ) . T h e c h e m i s t r y of c y a n a t e s a n d t h e i r t h i o d e r i v a t i v e s , I n t e r s c i e n c e , N e w Y o r k 1 9 7 7 , Vol. 2 , 1 0 0 3 - 1 2 2 1 [ 3 ] M A R T I N , D . , Synthetische Senfölbildner mit bakterizider, fungizider, nutritiver u n d d a s W a c h s t u m v o n V i r e n h e m m e n d e r W i r k u n g , A k a d e m i e - V e r l a g , Berlin, 1962

H . BOCHOW u n d M . S . H .

Sektion

Gartenbau

MOUSTAFA

der Humboldt-Universität

zu Berlin,

DDR

Untersuchungen zur Fungizidtoieranz von Botrytis cinerea

PERS.

Zur Auffindung weiterer Hinweise über die praktische Bedeutung der E n t w i c k l u n g einer Fungizidresistenz von Pilzen nach Anwenden von Benzimidazol-Fungiziden, im besonderen bei der Nacherntebehandlung von K o p f k o h l ( B r a s s i c a oleracea conv. capitata ( L . ) A L E T var. capitata) zur B e k ä m p f u n g des Fäuleerregers Botrytis cinerea PERS. während der Kopfkohllagerung, wurde das Verhalten einiger B.cinerea-Isolate von Benomyl-behandeltem und unbehandeltem K o p f k o h l untersucht. Zusammenstellungen über bisherige Erfahrungen einer Resistenz bei Botrytis cinerea gegenüber Benzimidazolen liegen bei F E H R M A N N [2] vor. Die Nacherntebehandlung von K o p f kohl mit Benzimidazolen ist bei B O C H O W und H E N T S C H E L [ 1 ] beschrieben. Tabelle 1 Fungizidempfindlichkeit Fungizide

Benomyl ThiophanatMethyl Carbendazim Glycophen Thiram

p p m

0,1 1,0 10,0 0,5 5,0 50,0 0,1 1,0 10,0 0,1 1,0 10,0 5,0 50,0 500,0

von 3 Botrytis cinerea-Isolaten, R2U m 32 0 0 0 0 0 53 0 0 45 0 0 80 0 0

Isolate R2B m v

V

99

90 13 5 15 0

34

35 0 0 48 24 18 90 35 25

1 3

0 96 171 61 0

38 4 19 68 0 23 13

R2U,

R 2 B und

R2TJ'

R2U' in

90 0 0 0 0 0 35 23 0 47 20 0 90 43 23

V

0

47 8 0 13 0 10 22

m = Mittlerer Durchmesser der Pilzkolonie auf Agar nach 10 Tagen Wachstum v = Variationskoeffizient (s % ) Gemessen am Myzelwachstum auf Agar zeigt Tabelle 1 für drei B. cinerea-Isolate (Populationsisolierungen) die R e a k t i o n gegenüber verschiedenen K o n z e n t r a t i o n e n der Fungizide B e n o m y l , Thiophanat-Methyl, Carbendazim, Glycophen und T h i r a m an. E s handelt sich dabei um folgende Populationsisolierungen:

248

H.

BOCHOW, M . S. H .

MOUSTAFA

II 2 U: Isoliert von 4 Monate lagerndem Weißkohl, unbehandelt; geprüft kurze Zeit nach Inkulturnahme des Pilzes. R 2 B : Isoliert ebenfalls von 4 Monate lagerndem Weißkohl der gleichen Partie wie bei II 2 U, jedoch nach voraufgegangener einmaliger Benomyl-Behandlung des Pflanzenmaterials vor der Einlagerung. R 2 U ' : Eine Subkultur von R 2 U, die nach Inkulturnahme des Isolates Wachstum auf 0,1 ppm Benomyl-Agar zeigte. Die Verhaltensweise der getesteten Isolate belegt, daß sowohl die einmalige BenomylBehandlung des Lagerkohls bei der nachfolgenden Besiedlung durch B. cinerea als auch die einmalige Subkultur der Isolate auf Benomyl-Agar (R 2 U') bereits zur Herausbildung fungizidresistenter Formen des Pilzes führte (R 2 B zu R 2 U, R 2 U' zu R 2 U). Die Resistenz des Isolates R 2 B erwies sich als mäßig gegenüber Benomyl (bis zu 10 ppm), Thiophanat-Methyl (0,5 ppm) und in einer unerwarteten Kreuzresistenz gegenüber Glycophen (10 ppm) und Thirani (500 ppm). Beim Isolat R 2 U' ergab sich bei mäßiger Resistenz gegenüber Benomyl gleichfalls Kreuzresistenz zu Glycophen und Thiram. Bisher war bei B. cinerea lediglich Kreuzresistenz zwischen Benzimidazolen und Glycophen beobachtet worden ( H O L Z [3], L E R O U X U. a. [5]). Eine Überprüfung der genannten Isolate auf ihre Pathogenität durch Inokulation auf Scheiben von Kohlrabiknollen (Brassica oleracea var. gongyloides L.) ergab, gemessen an der Induktion von Fäulnis, keinerlei Unterschiede in Bezug zur Fungizidempfindlichkeit der -Boiri/iis-Isolierungen. Den schwach fungizidresistenten Isolaten R 2 B und R 2 U' war die gleiche Pathogenität zu eigen, wie dem fungizidsensiblen Isolat R 2 U (Tab. 2). Tabelle 2 Pathogenität der Botrytis cinerea-Isolate K2U, R2B und Ii 2 U' auf Kohlrabiknollenscheiben. Fäulniszone in mm um das Inokulum (Mittel aus 5 Wiederholungen), 7 Tage Inkubation Isolate

Fäulniszone m m nach 5 Tagen nach 7 Tagen

R2U R2B R2U'

19 21 23

GD0;05 =

30 28 29

4,9

Zur Induktion einer höheren Fungizidresistenz wurden Transferationen der BotrytisIsolate auf verschieden konzentriertem Benomyl- und Thiophanat-Methyl-Agar vorgenommen. 7-malige Übertragungen erfolgten dabei unter Laborbedingungen sowohl jeweils geradlinig auf Benomyl- bzw. Thiophanat-Methyl-Agar als auch jeweils kreuzweise von Benomyl- auf Thiophanat-Methyl-Agar und umgekehrt. 3 von 8 subkultivierten Isolaten (R 2 U, R 2 B', ein R 2 B-Isolat, das einmal auf 10 ppm Benomyl wuchs, und K 2, ein Isolat von unbehandeltem Weißkohl vom Freiland aus Kaha, Ägypten) zeigten nach den 7-maligen Fungizid-Agar-Passagen eine hohe Resistenz gegenüber Benomyl bzw. Thiophanat-Methyl (Tab. 3): R 2 U r b r t ; K 2 Bj b r t ; K 2 rt . Die Resistenz blieb auch nach 3-maliger Kultur auf fungizidfreiem Agar konstant und schien damit genetisch fixiert. Sie belief sich nach Testung bei allen 3 For-

F u n g i z i d t o l e r a n z von Botrytis

cinerea

249

Tabelle 3 Fungizidempfindlichkeit von 3 Botrytis cinerea-1solaten Benomyl- und Thiophanat-Methyl-Agar

nach

7-maliger

Übertragung

Ausgangsisolat

Induzierte Form

Übertragen von Fungizid-Agar p p m

W a c h s t u m ( + ) bzw. ( — ) n a c h 7 T r a n s f e r a t i o n e n auf B e n o m y l - u. T h i o p h a n a t M.-Agar (ppm)

R2U

R 2 Urb

Benomyl

R2Urt

Thioph.

0,25

R2B;b

Benomyl

0,1

R2B;t

Thioph.

0,5

Benomyl

0,1

Thioph.

0,5

Benomyl Thioph" Benomyl Thioph. Benomyl Thioph. Benomyl Thioph. Benomyl Thioph. Benomyl Thioph.

R2B'

K2 K2rt

10,0 50,0 10,0 50,0 10,0 50,0 10,0 50,0 10,0 50,0 10,0 50,0

au/

(+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (+) (—) (+) (+)

m e n auf Verträglichkeiten v o n 100 p p m B e n o m y l , 5.000 p p m T h i o p h a n a t - M e t h y l u n d 1.000 p p m Glycophen, u n d e r g a b d a m i t w i e d e r u m K r e u z r e s i s t e n z zwischen B e n o m y l u n d Glycophen. Die R e s i s t e n z e n t w i c k l u n g gegenüber T h i o p h a n a t - M e t h y l erschien dabei in diesem T r a i n i n g s t e s t schneller als an B e n o m y l vorsieh zu gehen (z.B. K 2 r t , ausschließlich t o l e r a n t gegenüber T h i o p h a n a t - M e t h y l ) . I m T r a i n i n g s t e s t v e r ä n d e r t e n die Isolate im Verlaufe der S u b k u l t u r auf d e m F u n g i z i d Agar von der 4. bis 5. T r a n s f e r a t i o n a b , ihr morphologisches Aussehen. I m Vergleich zur A u s g a n g s k u l t u r ( S t a m m k u l t u r ) verlor sich die S p o r u l a t i o n des Pilzes, die Myzelien waren d e f o r m i e r t , d a s W a c h s t u m überwiegend r e s u p i n a t u n d die S k l e r o t i e n b i l d u n g unterschiedlich. E i n Vergleich des M y z e l w a c h s t u m s der n a c h den P a s s a g e n f u n g i z i d r e s i s t e n t e n I s o l a t e R 2 B r ' t ; R 2 U r t u n d K 2 r t mit den e n t s p r e c h e n d e n Ausgangs- oder S t a m m k u l t u r e n auf fungizidfreiem Agar, ergab eine deutlich v e r r i n g e r t e F i t n e s s der r e s i s t e n t e n Botrytis-Formen (Abb. 1). I n P a t h o g e n i t ä t s v e r s u c h e n auf Knollenscheiben von K o h l r a b i erwiesen sich die fungizidresistenten F o r m e n im Gegensatz zu den A u s g a n g s k u l t u r e n als a p a t h o g e n . E s w u r d e der F r a g e n a c h g e g a n g e n , ob die vorliegende V e r k n ü p f u n g von hoher Benzimidazol-Fungizidresistenz u n d geringer F i t n e s s bzw. A p a t h o g e n i t ä t bei den r e s i s t e n t e n Botrytis-lso\a,ten bei R e k u l t i v i e r u n g der Pilze auf K o h l b l a t t m a t e r i a l stabil bleibt. Zugleich w u r d e g e p r ü f t , wie sich eine Mischung von f u n g i z i d - r e s i s t e n t e m u n d -sensiblem P i l z m a t e r i a l bei I n o k u l a t i o n e n auf K o h l b l ä t t e r n v e r h ä l t . Hierzu w u r d e eine Myzelmischpopulation des fungizidresistenten I s o l a t e s R 2 B i b m i t der e n t s p r e c h e n d e n fungizidsensiblen A u s g a n g s k u l t u r des gleichen Isolates (R 2 B') d u r c h Z u s a m m e n wuchs auf Agar hergestellt. Diese Mischpopulation u n d die jeweiligen P a r t n e r allein — fungizidresistent, a p a p t h o g e n R 2 Bj.b u n d fungizidsensibel, p a t h o g e n R 2 B ' — w u r d e n 3mal n a c h e i n a n d e r auf W e i ß k o h l b l ä t t e r inokuliert, eine Serie m i t u n b e h a n d e l ten B l ä t t e r n , eine zweite auf B l ä t t e r , die zuvor m i t einer 0,1 %igen B e n l a t e - S u s p e n s i o n b e s p r ü h t w u r d e n . J e d e I n o k u l a t i o n der K o h l b l ä t t e r w u r d e u n t e r b r o c h e n d u r c h eine

250

H.

BOCHOW, M.

S. H .

MOUSTAFA

- KZ R ZU RZB' KZ (Thiophanate-M)rf RZU ( Thiophanate - M)rt R2B'( Thiophanate-M)rf Abb. 1. M y z e l w a c h s t u m MBC-resis'tenter (K 2 r t ; R 2 U r t ; R 2 Bjt) und sensib l e r Botrytis cinerea-Isolate ( A u s g a n g s f o r m e n d e r resistenten Isolate : K 2; R 2 U ; R 2 B') auf fungizidfreiein Agar

11 Tage

Tabelle 4 l'athogenitätstest mit dem apathogenen. Benomylund Thiophanat-M.-resistenten B. cinerea Isoint B2B'Th auf Weißkohlblättern, unbehandelt und mit 0,l°/oiger Benlate-Suspensioii besprüht, vergleichsweise zur pathogenen, fungizidsensiblen Ausgangsform K2B' sowie einer Mischpopidation beider Formen (1:1). Inkubationszeit 14 Tage. 3-malige Volgetestung als Passage üsolate

Fungizidbehandlung

Fäulniszone (nun) — relativ

der Blätter

Test 1 (39) (10) (10)

R2B'

unbehandelt Benomyl unbehandelt Benomyl unbehandelt

R2B;b

Benomyl

R2B' R2Br'b

Test 2

Test 3

(11) (34)

100 2(5 100 110 100

(41) (15) (13) (12) (36)

100 37 100 92 100

(41) (20) (21) (20) (40)

100 49 100 95 100

(14)

41

(16)

44

(23)

57

15-tätige Rekultivierung der Pilzisolate auf fungizidfreiem Agar, um zur Fortsetzung der Blattinfektionen ein ausreichendes Inokulumpotential zu gewinnen. Tabelle 4 zeigt die Fäulnisinduktion der gewählten Isolate bei den 3 sukzessiven Tests auf Kohlblättern sowie den Grad der Einschränkung des Befalles durch die Benomyl-Vorbehandlung der Blätter. I m 3. Test waren nicht nur die Ausgangskultur und Mischpopulation sondern auch die vormals apathogene, fungizidresistente F o r m pathogen. Be-

Fungizidtoleranz von Botrytis

cinerea

251

Tabelle 5 Fungizidempfindlichkeit der Botrytis cinerea-Isolate 1Ì2B', H2BJ'J, und der Mischpopulation Ii 2 B' + JÌ2B¡.h nach den Wirtspassagen ( = Tab. 4) Isolate

R2B' K2B;„ K2B'

W a c h s t u m auf B e n o m y l - A g a r (ppni) in m m nach 10 Tagen 0 8,7 5,5 7,7

0,1 7,5 5,3 7,3

1,0 5,1 5,4 6,5

2,5

5,0

—

—

10,0 —

5,3 5,3

5,0 5,2

4,0 4,2

K2B;b merkenswert ist dabei die Beeinflussung der 3 verschiedenen Botrytis-lPoTmen durch die B l a t t b e h a n d l u n g mit B e n o m y l . W ä h r e n d die fungizidsensible F o r m in vivo erwartungsgemäß durch die B e n o m y l - B e h a n d l u n g der B l ä t t e r reduziert wurde, war dies bei der Mischpopulation entsprechend der P a r t n e r k o m b i n a t i o n nur begrenzt der F a l l und bei der fungizidresistenten F o r m waren Fäulnisinduktion auf behandelten B l ä t tern nahezu gleich. E i n e Überprüfung der Fungizidempfindlichkeit der F o r m e n nach den K o h l b l a t t inokulationen in vitro auf Benomyl-Agar (Tab. 5) bewies, daß die Differenzierungen der B e n o m y l - R e s i s t e n z bei den 3 F o r m e n im Verlaufe der T e s t s k o n s t a n t geblieben waren. Die Untersuchungen belegen für die vorliegenden Botrytis cmerea-Isolate, d a ß die festgestellte Benzimidazolresistenz und die F i t n e s s und P a t h o g e n i t ä t dieser F o r men nicht unmittelbar in Verbindung stehen. I n vivo vermochte sich die P a t h o g e n i t ä t und F i t n e s s zu restaurieren bzw. (Mischpopulationsform) zu erhalten bei Verbleiben der Fungizidresistenz, so daß für beide Merkmale eine getrennte genetische F i x i e r u n g anzunehmen ist, wie sie auch von Sozzi und G E S S L E B [6] vermutet wird. Unsere B e o b a c h t u n g e n über das Verhalten fungizidresistenter Botrytis cinerea-Formen legten die Vermutung nahe, daß die resistenten F o r m e n gegenüber den sensibleren nicht nur reaktionsunempfindlicher gegen die geprüften Benzimidazole waren, sondern eventuell auch über eine Detoxifikation der Fungizide sich selbst ständig günstigere Wuchsbedingungen auf behandelten S u b s t r a t e n schafften, sofern sie im W a c h s t u m zunächst , F u ß gefaßt' h a t t e n . Wir überprüften deshalb Möglichkeiten einer D e t o x i fikationswirkung von wachsendem Myzel der Pilzisolate auf B e n o m y l , wie sie z . B . von K A T A E I A und G K O V E R [ 4 ] als eine mögliche Mechanismus-Form für die Fungizidresistenz angesehen wird. D a s Isolat R 2 B j b und seine Ausgangskultur (fungizidsensibel) R 2 B ' wurden parallel auf fungizidfreier Biomalznährlösung kultiviert. N a c h 3-wöchiger Wachstumszeit wurde von Wiederholungen mit gleichem Myzelgewicht bei den K u l t u r e n jeder F o r m die Kulturflüssigkeit entnommen und steril filtriert. Diese sterile Kulturflüssigkeit wurde anschließend mit 1,0 ppm B e n o m y l versetzt und runde Filterpapierscheiben damit getränkt. Die Scheiben wurden auf fungizidfreiem Agar ausgelegt, der mit der fungizidsensiblen Ausgangskultur R 2 U inokuliert wurde. Abbildung 2 zeigt n a c h 10 Tagen W a c h s t u m dieses Pilzes bei 1 unter dem E i n f l u ß der von der fungizidresistenten F o r m herrührenden Benomyl-versetzten K u l t u r f i l t r a t e das Wuchsbild und bei 2 dasjenige unter Einwirkung der von der sensiblen F o r m stammenden F i l t r a t e . W ä h -

252

H.

BOCHOW, M .

S. H .

MOCSTAFA

Alib. 2. W a c h s t u m eines fungi/.idsensiblen Botrytis c?>ierea-Isolates (R 2U) unter (lern E i n fluß von K u l t u r f i l t r a t e n MBC'-resistenter und -sensibler Botrytis-Yormvn, mit B e n o m y l Zusat/.. 1 2 3 4

= = = =

K u l t u r f i l t r a t von Tsolat R 2 Bj' b MBC-resistent -+- B e n o n i y l K u l t u r f i l t r a t von Isolat R 2 B ' MBC-sensibel + B e n o n i y l K u l t u r f i l t r a t von Isolat R 2 BJ. b nach W a c h s t u m bei Benomyl-Zusat/, K u l t u r f i l t r a t einer schwach MBC-resistenten F o r m des Isolates R 2 B ' nach W a c h s tum bei Benomyl-Zusat/. 5 = K u l t u r f i l t r a t von Isolat R 2 B ' nach W a c h s t u m bei Benomyl-Zusat/. 6 = Benomyl-Suspension p H 5,8 7 = Benomyl-Suspension p H 4,5

rencl im e r s t e n F a l l e d a s h i n z u g e s e t z t e B e n o n i y l k e i n e r l e i W i r k u n g a u s ü b t e — a u f g r u n d einer v e r m u t e t e n D e t o x i f i k a t i o n d u r c h das K u l t u r f i l t r a t — ließ sich im zweiten F a l l e e i n e H e m m w i r k u n g des F u n g i z i d e s allerdings a u c h e t w a s e i n g e g r e n z t , b e o b a c h t e n . I n e i n e m w e i t e r e n V e r s u c h wurden w i e d e r u m die b e i d e n 7i(j?n/faVFornien a u f B i o m a l z f l ü s s i g k e i t s m e d i u m k u l t i v i e r t , j e d o c h u n t e r Z u s a t z v o n 1,0 ppm 'Benoniyl b e r e i t s zu B e g i n n d e r K u l t u r . Die f u n g i z i d r e s i s t e n t e F o r m wuchs, w ä h r e n d die s e n s i b l e i m W a c h s t u m s t a g n i e r t e . D i e V e r w e n d u n g der steril f i l t r i e r t e n K u l t u r l ö s u n g e n im P a p i e r s c h e i b e n t e s t gegen die f u n g i z i d s e n s i b l e F o r m a u f A g a r zeigt in der A b b i l d u n g 2 b e i N r . 3 d a s W a c h s t u m bei g e t r ä n k t e n F i l t e r p a p i e r s c h e i b e n mit B e n o n i y l - K u l t u r f i l t r a t v o n der f u n g i z i d s e n s i b l e n F o r m . B e i einer der W i e d e r h o l u n g e n t r a t bei der V o r k u l t u r d e r f u n g i z i d s e n s i b l e n F o r m in der 1 , 0 p p m B e n o n i y l e n t h a l t e n e n N ä h r l ö s u n g W a c h s t u m a u f . D i e V e r w e n d u n g des K u l t u r f i l t r a t e s v o n dieser V a r i a n t e im F i l t e r s c h e i b e n t e s t gegen den f u n g i z i d s e n s i b l e n T y p des Botrytis-Vilzes e r g a b d a s in A b b i l d u n g 2 un-

F u n g i z i d t o l e r a n z von Botrytis

cinerea

253

ter Nr. 4 dargestellte Wuchsbild der Testform. Nr. 5 zeigt dagegen die Verhältnisse unter Verwendung von Kulturfiltrat der resistenten Form, die mehr als bei Nr. 4 auf eine weitgehende Detoxifikation des Benomyls verweisen. E i n direkte Tränkung von Filterpapierscheiben mit einer 1,0 ppm Benomyl-Suspension, die jedoch auf verschiedene pH-Werte eingestellt wurde, führte zur Wachstumsbeeinflußung des fungizidsensiblen Testpilzes wie unter Nr. 6 und Nr. 7 in der Abbildung 2 wiedergegeben. Die Suspension bei Nr. 6 und Nr. 7 hatte einen pH-Wert von 5, 8 und Nr. 7 von 4,5. Innerhalb dieses Bereiches bewegten sich auch die pH-Werte der verwendeten Kultufriltrate in den dargestellten Versuchsvarianten: Nr. 1 = 4 , 5 9 ; Nr. 2 = 4,35; Nr. 3 = 4,52; Nr. 4 = 4 , 8 2 ; Nr. 5 = 5,58. Die eingetretenen Beeinflussungen der Benomyl-Wirkung durch Kulturfiltrate von Botrytis cinerea können deshalb ihre Ursache nicht in pH-Veränderungen der Medien haben. Auch hier nicht dargestellte Kontrollen von Kulturfiltraten der Isolate ohne Benomyl-Zusätze übten keinen unterschiedlichen Einfluß aus. Sie verhielten sich wie Aqua dest. E s wird angenommen, daß die untersuchten Formen durch oder aus dem wachsenden Myzel Detoxifikationswirkungen auf Benomyl hervorrufen, wobei die fungizidresistenten Formen zu diesem weit mehr befähigt sind als die entsprechend sensibleren Formen. Wachstum des Pilzes und Detoxifikation des Benomyls stehen dabei in positiver Wechselwirkung.

Zusammenfassung E s konnte bestätigt werden, daß Botrytis cinerea einen hohen Grad an Anpassungsfähigkeit besitzt und leicht zur Herausbildung von resistenten Formen gegenüber Spezialfungiziden, wie Benzimidazolen, neigt. B e i lang anhaltender Einflußdauer der Fungizde, wie bei der Behandlung lagernden Pflanzenmaterials, gilt dies besonders. Auffällig ist die leichte Entwicklung von Kreuzresistenz, die zwischen MBC-Fungiziden Glycophen und Thiram beobachtet wurde. E s zeigte sich ferner, daß die Eigenschaften Fungizidresistenz und Fitness bzw. Pathogenität bei Botrytis cinerea unabhängig voneinander gesteuert werden können. Eine Kopplung hoher Fungizidresistenz mit geringer Fitness ist in einer Population von B. cinerea veränderlich, indem auf natürlichen Substraten bei Beibehaltung der Resistenz die Fitness sich wieder entwickeln kann. Bezüglich des Resistenzmechanismus von B. cinerea gegenüber Benzimidazolen (Benomyl) scheinen unter anderem auch von wachsenden Myzel ausgehende, über die Kulturflüssigkeit zum Tragen kommende Detoxifikationserscheinungen bedeutsam zu sein. Sie wurden durch entsprechende Experimente ermittelt.

Literatur [ 1 ] BOCHOW, H . und K . D . HENTSCHEL, P h y t o s a n i t ä r e M a ß n a h m e n zur B e k ä m p f u n g pilzlicher F ä u l e e r r e g e r bei der Geinüselagerung, N a c h r b l . P f l a n z e n s c h u t z D D R HB ( 1 9 7 9 ) , 97-101 [ 2 ] FEHRMANN, H . , S y s t e m i s e h e F u n g i z i d e — ein Ü b e r b l i c k . 11. F u n g i z i d r e s i s t e n z p h v t o p a t h o g e n e r P i l z e , " P h y t o p a t h . Z. 8 8 ( 1 9 7 6 ) , 1 4 4 - 1 8 5

254

H . BOCHOW, M . S . H . MOUSTAFA

[3] HOLZ, B., A b o u t one case of resistance of Botrytis cinerea 011 grapes against the new contact fungicides Ronilan, R o v r a l and Sumisclex for control of Botrytis cinerea, Biol. Bundesanst. f. Land- u. Forstw., Berlin (West) u. Braunschweig, Jahresbericht 1978, H . 44

[4] KATARIA, H . R . and R . K . GROVER, A d a p t a t i o n of Rhizoctonia solani to systemic and non-systemic fungitoxicants, Z. P f l a n z e n k r a n k h . 81 (1974), 472 — 478 [5] LEROUX, I'. FRITZ, R . u n d M. GREDT, L a b o r a t o r y studies on strains of Botrytis cinerea PERS. resistant to dichlozoline, dichloran, quintozene, vinchlozoline and 2 6 0 1 9 R (glycophene), P h y t o p a t h . Z. 80 (1977), 3 4 7 - 3 5 8 [6] Sozzi, D. and C. GESSLER, Fungicide (MBC) resistant m u t a n t s of Fusarium oxysporuni f. sp. lycopersici and Botrytis cinerea, pathogenicity and fitness. Phytopath. Z. 07 (1980), 1 9 — 24

F . BÖTTCHER u n d I. A.

Ernst-Moritz-Arndt-Universität,

SAMSONOVA

Sektion

Biologie,

Greifswald,

DD R

Zur fungiziden und genetischen Wirkung von Benomyl

Als Ursache der fungiziden Wirkung von Benzimidazolderivaten wird eine Blockierung der Mikrotubuli-Assemblierung angenommen [3]. KAPPAS und Mitarbeiter konnten zeigen, daß bei Aspergillus niduluns auch mitotisches Nondisjunction von Chromosomen durch Benomyl induziert werden kann [4, 5]. Inzwischen wurde Benomyl ebenfalls bei Hybriden zwischen A. niduluns und A. rugulosus [6], Penicilliurn citri num und P. cyuneo-fulvum [1], Saccharomyces c.erevisiue [7] und Sacchuromycopsis lipolytica [9] erfolgreich zur Erzeugung mitotischer Segreganten eingesetzt. Diese Befunde waren nicht unerwartet, da Mikrotubuli offensichtlich eine essentielle Komponente des mitotischen Apparats darstellen. Bei Untersuchungen an der ascomycetalen Hefe Pichia guilliermondii und dem Heterobasidiomyceten Rhodosjwridium toruloides fanden wir jedoch, daß fungizide Wirkung und mitotische Rekombination nicht miteinander korreliert sind. V o n »ins w u r d e n p r o t o t r o p h e H e f e s t ä m m e u n t e r s u c h t , die f ü r c h r o m o s o m a l e G e n e h e t e r o z y g o t s i n d . D i e a n P. guilliermondii G 2 7 X G 6 5 u n d Ii. toruloides Sp23-1 erhaltenen E r g e b n i s s e sind r e p r ä s e n t a t i v f ü r b e i d e A r t e n . D i e H e f e n w u r d e n a u f V o l l n i e d i u n i a g a r ( M A ) k u l t i v i e r t , der in 1 1 A q u a d e s t . 4 0 g B i o m a l z , 5 g G l u c o s e , 10 g P e p t o n , 5 g H e f e e x t r a k t u n d 2 0 g A g a r e n t h i e l t . B e n o m y l w u r d e i n D i m e t h y l f o r m a i n i d g e l ö s t u n d d e m V M A zug e s e t z t . D i e K o n z e n t r a t i o n des L ö s u n g s m i t t e l s i m V M A b e t r u g m a x i m a l 1 % , d a b e i K o n z e n t r a t i o n e n ü b e r 2 % t o x i s c h e E f f e k t e m ö g l i c h s i n d . D i e Zellen v o n P. guilliermondii k u l t i v i e r t e n wir m i n d e s t e n s 7 T a g e , die l a n g s a m e r w a c h s e n d e n Zellen v o n R. toruloides m i n d e s t e n s 1 0 T a g e bei 3 0 ° o d e r 22 °C. D i e sich a u f d e m V M A e n t w i c k e l n d e n K o l o n i e n wurden zum Erfassen auxotropher Segreganten auf Minimalinediumagar [2] überstempelt und danach einer Auxanographie unterworfen.

Fungizider Effekt Die Beziehungen zwischen der Benomyl-Konzentration im VMA (D) und der Überlebendenfrequenz (N/N 0 ) manifestieren sich bei beiden Arten als ,,Vieltreffer"-Kurven, die sich durch die Gleichung N/N 0 = 1 — (1 — e ~ k D ) n beschreiben lassen, in der k eine die Sensibilität der Zellen charakterisierende Konstante und n für die die Inaktivierung (den fungiziden Effekt) notwendige Trefferzahl darstellt (Abb. 1). B e i allen untersuchten Stämmen ist n größer als 10 5 . Dieser Befund bestätigt die Annahme, daß die Tubulin-Untereinheiten der Mikrotubuli die Targets sind, deren Schädigung die Ursache der fungiziden Wirkung von Benomyl ist. Wahrscheinlich kann sich eine Zelle nicht mehr reproduzieren, wenn 10 5 oder mehr Tubulin-Untereinheiten nicht mehr assemblierungsfähig sind (Abb. 2).

256

F.

10'1

r ° -

10-'

-

1

t0-} 10-*

10~3

10'3 •

10~*

10'*-

10'5

10~6

-

10 ~6

10'7

-

10'5

SAMSONOVA

N/No

N/N0 1

BÖTTCHER, I. A.

3Ö°C 22°C 100

200

300 m mg Benomyl/ / VMA

10'7

100

200 300 WO mg Benomy!/I VMA

Altb. 1. Abhängigkeit rlcr Überlebensraten (N/N 0 ) von der B e n o m v l - K o n z e n t r a t i o n im Anzuehtinedium (VMA) bei P. guilliermondii (a) und B. toridoides (b). B e i B e n o m y l K o n z e n t r a t i o n e n über 4 0 0 tng/1 war N / N 0 niedriger als 10~ 8 . I n k u b a t i o n s l e m p e r a t u r 22 °C (•) oder 30 °C ( o )

Abb. 2. Modellvorstellungen zur fungiziden B e n o m y l - W i r k u n g . 1 = Mikrotubuli-Assemblierung ohne B e n o m y l , 2 = B l o c k i e r u n g der M i k r o t u b u l i - E n d e n durch B e n o m y l (Modell A), 3 = T u b u l i n - U n t e r e i n h e i t e n sind durch B i n d u n g von B e n o m y l nicht mehr assemblierungsfähig (Modell B ) . Die experimentellen B e f u n d e sprechen für Modell B

Mitotische Segregation B e n o m y l induziert bei den von uns untersuchten Pilzen keine Mutationen. Mitotische Segregationen können jedoch bei P. guilliermondii mit großer Frequenz entstehen, obwohl andere Agenzien, die bei einigen Pilzen mit hoher Effizienz mitotischen Chromosomenverlust bewirken, nicht oder nur wenig rekombinogen sind (Tab. 1). B e i R. toruloides führt B e n o m y l nicht zur E n t s t e h u n g mitotischer Segregationen, obwohl die fungizide Wirkung stärker ist als bei P. guilliermondii (vergl. Abb. 1 a und 1 b) und auch das Chromosomenverlust in der Mitose verursachende Acriflavin [8] weitaus rekombinogener ist als bei dieser ascomycetalen Hefe (Tab. 2). I n den Tabellen sind nur mitotische Segreganten berücksichtigt worden, die sich als auxotrophe Kolonien auf dem VMA entwickelten. Die K o n z e n t r a t i o n des B e n o m y l s im VMA betrug 1 0 0 — 2 0 0 mg/1. I n diesem B e r e i c h ist die Segregantenfrequenz nicht von der B e n o m y l k o n z e n t r a t i o n abhängig und die inaktivierende Wirkung gering (vergl. Abb. 1). B e i der Entwicklung der Kolonien von P. guilliermondii auf dem B e n o m y l VMA erfolgen weitere mitotische Segregationen, so daß auch die entstehenden prototrophen Kolonien viele auxotrophe Zellen enthalten. Die zum Vergleich angeführten Segregantenfrequenzen bei Einwirkung von Griseofulvin ( 4 0 0 — 8 0 0 mg/1), p-Fluor-

Fungizide u n d genetische W i r k u n g von B e n o m y l Tabelle

1

Mitotische

Segregation

bei P. guilliermondii

x G67:

025

+

+

Benomyl

Griseo-

p-Fluor-

Acri-

trolle

22°

30 °C

fulvin

Phe

flavin

2870

2413

1400

400

2198

273

0

0

11

9,5

0

0,1

2 0 0 0 1 0 0 0 0 0

80 46 78 5 25 1 11 2 20 5

100

¿i

o—B.

pg/ml)

strains B. 15or.

B. Co],

>100

>100

-

8

15

-

>100

>100 0.2

>100

>100 0.4

-

100

200

-

>1000

>1000

30 100

25 150

0.2 2 2.5 140

0.2 2 3 120

— 20 10 20 80

20 25 40 120

S. Ver. 1

in

>100

0.5

300 >1000 30 200

(ED-0-valites

cinerea

B. Knie.

benomyl carbendazini thiabendazole thiophanate-methyl

Strains

cinerea

299

Eme.

B. Bor.

¿fco

CARBENDAZ/M

0.01

10

0.1

concentration

100

(fig!m!)

BARBAN

0W/-

P i g . 2. E f f e c t s of c a r b e n d a z i m and b a r b a n on m y c e l i a l g r o w t h of Botrytis cinerea

300

P . LEKOUX, M .

GREDT

or pendimethalin) and propham. W i t h the other N-phenylcarbamate herbicides (barban, chlorbufam, chlorpropham) the E D 5 0 values for strains B . B o r and B. Col. were a p p r o x i m a t i v e l y 5 to 10 times lower than f o r B . Erne, and S. Ver. 1 (Table 1 and F i g . 2). W i t h Pénicillium,

strains P . U B 4, P . U B 5 and P . N B , resistance occured

expansum

simultaneously with carbendazim and thiabendazole. T h e dinitroaniline herbicides and griseofulvin were not e f f e c t i v e against this fungus. A s observed with

Botrytis

cinerea, some strains tolerant to benzimidazole fungicides (P. U B 5 and P . B N ) were hyper-sensitive to the N-phenylcarbamate herbicides (including propham) (Table 2). T h e results reported in T a b l e 3 showed that all the strains of Aspergillus

nidulans

had similar comportments towards griseofulvin, dinitroaniline and N-phenylcarbamate herbicides (Table 3). Table 2 Effects of toxicants on mycelial growth of Pénicillium Toxicants

expansum (EDb0-values

Pénicillium P.

in ¡ig/ml)

expansum strains

1'. U B 4

P. U B 5

>100 40

>100 20

>100 40

>100

>100

>100

>100

benfluralin butralin pendimethalin trifluralin

>1000 >1000 >1000 >1000

>1000 >1000 >1000 >1000

>1000 >1000 >1000 >1000

>1000 >1000 >1000 >1000

barban chlorbufam chlorpropham propham

50 35 40 150

60 40 40 200

15 10

4 10 5 50

0.1 0.4

carbendazim thiabendazole griseofulvin

Table 3 Effects of toxicants on mycelial growth of Aspergillus (EDh0-values in y.g/ml) Toxicants

Aspergillus 003

nidulans strains Ben 1 '3

Ben 14

carbendazim thiabendazole

0.3 2

griseofulvin

5

7

7

pendimethalin trifluralin

>1000 >1000

>1000 >1000

>1000 >1000

barban chlorbufam chlorpropham propham

8 10 30 90

10 15 30 120

12 15 20 80

>90 >100

0.15 20

30

nidulans

P. N B

Cross resistance between benzimidazole fungicides and herbicides

301

Discussion T h e benzimidazole fungicides posses a biochemical mode of action d i f f e r e n t f r o m t h e o t h e r a n t i m i t o t i c c o m p o u n d s t e s t e d because we never observed cross resistance b e t w e e n them. T h e f a c t t h a t t h e benzimidazole resistant s t r a i n s h a v e t w o t y p e s of c o m p o r t m e n t w i t h N - p h e n y l c a r b a m a t e herbicides indicates t h a t , p r o b a b l y several m e c h a n i s m s of resis t a n c e exist. I t is also possible t h a t t h e v a r i a t i o n s in sensitivity t o N - p h e n y l c a r b a m a t e herbicides a r e not correlated with t h e modification of p r o p e r t i e s of t u b u l i n . F u r t h e r biochemical investigation is needed to clarify t h i s p h e n o m e n o n . However, t h e existance of such negatively correlated cross resistance b e t w e e n benzimidazole fungicides a n d some N - p h e n y l c a r b a m a t e herbicides can b e i n t e r e s t i n g in practice. T h e a d j u n c t i o n of a N - p h e n y l c a r b a m a t e d e r i v a t i v e (not p h y t o t o x i c ! ) t o benzimidazole f o r m u l a t i o n s can p r e v e n t t h e d e v e l o p m e n t of resistance of t h e s e fungicides in t h e field.

References The antimitotic properties of the benzimidazole fungicide carbendazim and a mechanism of resistance to this compound in Aspergillus nidulans, Thesis of Agricultural University, Wageningen, The Netherlands (1976), 1 — 84 D R A B E R , W. and C . F E D T K E , Herbicide interaction with plant biochemical systems, in G E I S S B Ü H L E R , H . (ed.)/Advances in Pesticide Science Pergamon press, Oxford and New York 1979, 4 7 5 - 4 8 6 L E R O U X , P . et M . G R E D T , Effects du barbane, du chlorbufame, du chlorprophame et du prophame sur diverses souches de Botrytis cinerea et de Pénicillium expansum sensibles ou résistantes au carbendazime et au thiabendazole, C. R . Acad. Sc. Paris, série D, 28!» (1979), 6 9 1 - 6 9 3 L E R O U X , P. et M . G R E D T , Phénomènes de résistance croisée négative chez Botrytis cinerea entre les fongicides benzimidazoles et des herbicides carbamates, P h y t i a t r . P h y t o p h a r m . 28 (1979), 7 9 - 8 6 L E R O U X , P et M. G R E D T , Effets de divers herbicides sur la croissance mycélienne de souches de Botrytis cinerea et de Pénicillium expansum sensibles ou résistantes à certains fongicides, Weed Res. (sous presse) L E R O U X , P., R . F R I T Z et M . G R E D T , E t u d e s en laboratoire de souches de Botrytis cinerea résistantes à la dichlozoline, au dichloran, au quintozene, à la vinchlozoline et au 260 19 R P (ou glycophène), P h y t o p a t h . Z. 8î> (1977), 3 4 7 - 3 5 8 VAN TUYL, J . M., Genetics of fungicide resistance, Meded. L a n d b . Hogesch. Wageningen, 77 2 (1977), 1 - 2 3 6

[1] DAVIDSE, L . C . ,

[2]

[3]

[4]

[5] [6] [7]

H . L Y R , L . BANASIAK und H .

ALRICII

Institut für l'flamenschutzforscliung der Akademie der Lundvcirtscliaftswissenschaften, Kleinmachnow, DDR und Sektion Biowissenschaften, Wissenschaftsbereich Biochemie der Martin-Lutlier-L'niversität, Hülle- Wittenberg, DDR

Wirkung und Wirkungsweise flüchtiger Alkenale als Fungizide

Alk-2-en-l-ale sind flüchtige, biozid wirksame Verbindungen, die bei Pflanzen weit verbreitet vorkommen und von einigen Arten auch in größeren Mengen über die Blätter gasförmig ausgeschieden werden. Nach ersten Hinweisen bei Ailanthus glandulosa, Ginkgo biloba und Jlobinia pseudoacucia [8, 9, 13, 15] zeigt sich, daß derartige Verbindungen, wie Hex-2-en-l-al, neben anderen Aldehyden und niedermolekularen Alkoholen Bestandteile des Aromas von Pflanzen und deren Früchten (Tomate, Gurke, Bohnen, Äpfel, Bananen u. a.) sind [1, 19]. Nach neueren Erkenntnissen [3, 5 — 7, 10] entstehen Alkenale durch Einwirkung des Enzyms Lipoxygenase auf ungesättigte Fettsäuren (Linolsäure, Linolensäure) in Gegenwart von Sauerstoff über eine intermediäre Hydroperoxid-Zwischenstufe nach folgendem Reaktionsschema für Hexenal: Linolsäure | Lipoxygenase + 0 2 13- Hydroperoxy-Linolsäure -1-

ADH

(Z)-Hex-3-en-l-al ^

AD1I

(E)-Hex-2-en-l-al ^

(Z)-Hex-3-en-l-al (E)-Hex-2-en-l-al

Lipoxygenase kommt membrangebunden in Chloroplasten-Lamellen und auch in Mitochondrien vor, wobei die Fettsäureoxidation verstärkt in alternden Zellen auftritt [7] und möglicherweise sogar ein Trigger-Prozeß zur Auslösung von Zellalterungsprozessen ist. Über die Bedeutung dieser Verbindungen als potentielle Abwehrstoffe bei Pflanzen (Phytonzide nach TOKIN) ist bisher nur wenig bekannt. E s wird angenommen, daß diese flüchtigen Blattbestandteile im interzellulären Kaum auftreten [4]. Eingehende Untersuchungen zur fungiziden Wirkung, auch im Verhältnis zur Phytotoxizität, fehlen bisher. Das Arbeiten mit flüchtigen Fungiziden bringt auch besondere methodische Probleme. Um den Grund der Wirksamkeit abschätzen zu können, synthetisierten wir einige Alkenale (C3-C7) und deren Acetale und unterzogen sie einer vergleichenden Testung gegen einige Pilzarten und zwei Wirt-Parasit-Kombinationen. D i e P i l z e b z w . i n f i z i e r t e G e t r e i d e p f l a n z e n w u r d e n e i n e r G a s p h a s e d i e s e r V e r b i n d u n g e n in g e s c h l o s s e n e n G l a s z y l i n d e r n b e i e i n r e E i n w i r k u n g s d a u e r v o n 2 4 bis 72 S t u n d e n u n d e i n e r T e m p e r a t u r v o n 2 5 °C a u s g e s e t z t .

Testobjekte waren Pythium spec., lihizoctonia

solani und Trametes versicolor, die auf Agar-

p l a t t e n ( 3 % M a l z a g a r ) k u l t i v i e r t u n d d a n n i n g e s c h l o s s e n e n G l a s g e f ä ß e n der G a s p h a s e

304

H .

LYR,

L. BANASIAK,

H .

AURICH

der Verbindungen ausgesetzt wurden. Jede Konzentration wurde in siebenfacher Wiederholung geprüft. Als Maß der Wirkung diente die Reduktion des Radialwachstums. Die Werte für die E D M und ED 9 5 wurden durch grafische Interpolation erhalten. J u n g e Gersten- und Weizenpflanzen wurden in Quarzsand angezogen, mit Sporen von Erysiphe graminis bzw. Puccinia triticina infiziert und 24 Stunden in einer Klimakammer der Gasphase der Verbindungen ausgesetzt. Nach 6 bis 8 Tagen (Mehltau) bzw. 10 bis 12 Tagen (Rost) erfolgte die Auszählung der gebildeten Pusteln. Uie Mittelwerte wurden in Beziehung zu den unbehandelten Kontrollen gesetzt und daraus die Hemmwirkung in Prozent errechnet. Bei Applikation über die Wurzel wurden 0,5 bis '3,0 ml der Testsubstanzen 24 Stunden vor bzw. nach der Infektion dem Quarzsand als Kultursubstrat zugesetzt. Zu Ermittlung der phytotoxischen Wirkung der Verbindungen wurden die Blätter von jeweils 10 Testpflanzen mit 1 ml der Lösungen fein besprüht. Die Phytoxizität wurde entweder an der Zahl abgestorbener Pflanzen oder nach dem Schädigungsgrad (Boniturskala 9 bis 1) bestimmt. Tabelle 1 Fungizide Wirkung von Alk-2-en-l-alen und deren Acetale bei Applikation über die Oasphase gegenüber drei Testpilzen im Vergleich zu bekannten fungiziden Wirkstoffen (Agar-PlattenTest). ED50- Werte (ED9i-Werte) in y.l/1 Fungizide

I'ythium

Rhizoctonia

Formaldehyd

0,8 ( > 2 0 )

4,5 (100)

Propenal Butenal l'entenal Hexenal Heptenal

0,8 4,8 1,4 3,5 2,1

0,7 1,3 2,7 6,6 1,4

Mittelwerte

2,5

Propenaldiethylacetal Butenaldiethylacetal Pentenaldimethylacetal Hexenaldiethylacetal Heptenaldiethylacetal

1,3 3,3 12,3 32,7 5,7

Mittelwert

11,0

Benoinyl Carboxin Triarimol Tridemorph

>100 100 >10 60

(>20) (25) 3) (>30) (>25)

(1,9) (5,6) (7,0) (>30) (11)

2,5 (4) (50) (54) (>65) (60)

0,5 6,3 2,9 19,0 6,8 7,1 5 7 >10 40

(1,3) (48) (16) (>60) (>60)

Trametes 3,6 ( > 1 0 0 ) 1,4 2,2 3,0 14,7 6,1

(18) (70) (28) (320) (34)

0 ED 5 0 3,0 1,0 2,8 2,7 8,3 3.2

5,5

3,5

0,8 2,5 60,0 37,8 27,9

(4) 0,9 (48) 4,0 ( > 1 6 0 ) 25,0 (>170) 29,8 ( > 1 5 0 ) 13,4

25,8

14,6

>100 8 0,3 6

I n Tabelle 1 sind für drei Pilzarten die ED 5 0 - und ED 9 5 -Werte von einigen Alkenalen und deren Acetale dargestellt. Eine Entfernung der Wirkstoffe aus der Gasphase führt nicht zur Wiederaufnahme des Wachstums, d.h. die Wirkung ist fungizid. Auffallend in Tabelle 1 sind die sehr niedrigen Werte im Vergleich zu konventionellen Fungiziden, die dem Agar-Nährmedium in üblicher Weise zugesetzt wurden. Trametes versicolor, ein baumbewohnender Holzzerstörer ist deutlich unempfindlicher als die beiden bodenbewohnenden Pilzarten. I m Mittel aller Werte nimmt die Wirksamkeit mit steigender Zahl der C-Atome ab, wobei sich hier zwei Faktoren überlagern: sinkender Dampfdruck mit zunehmender Kettenlänge — steigende Lipophilie. Bei Hexenal wird oft ein Minimum der Wirkung erreicht. Verbindungen mit ungerad-

F l ü c h t i g e A l k e n a l e als F u n g i z i d e

305

zahliger Anzahl von C-Atomen haben im allgemeinen eine relativ stärkere Wirkung als solche mit geradzahligen C-Atomen. Dieser B e f u n d k ö n n t e mit dem Abbau über einen /?-Oxidationsmechanismus zusammenhängen. Die Acetale sind bei Gasphasenapplikation im Durchschnitt etwas schwächer wirksam, wofür der geringere D a m p f d r u c k und der f ü r die Wirkung erforderliche Zerfall in die freien Alkenale verantwortlich sind. F o r m a l d e h y d hat zum Vergleich eine teilweise sehr geringe Wirksamkeit. Bei Zugabe der Verbindungen zum N ä h r m e d i u m sinkt deren E f f e k t i v i t ä t u m das 32- bis 610-fache (Propenal) bzw. 6- bis 70-fache (Butenal). Reaktionen mit Nährbodenbestandteilen u n d damit verbundener I n a k t i v i e r u n g der Verbindungen sind mögliche Ursachen f ü r das Absinken der Aktivität. Sehr interessant ist die starke Wirksamkeit gegenüber obligaten P a r a s i t e n (Tab. 2). Die Substanzen sind 24 Stunden nach der Infektion zur Einwirkung gekommen, haben also einen deutlich kurativen E f f e k t . Weizenrost reagiert dabei empfindlicher als der Tabelle 2 Fungizide Wirkung von Alk-2-en-l-alen und deren Acetale auf die Wirt-Parasit-Kombinationen Puccinia triticina (Weizen und Erysiphe graminis) Gerste bei Applikation über die Gasphase (24 Stunden Einwirkzeit). Q = Quotient aus LD50 Wirtspflanze/EDi0 Parasit EDb0- Werte in (j,1/1 Alkenale

Puccina

Erysiphe

Formaldehyd

0,21

4,8

0,25

2,2

Propenal Butenal Pentenal Hexenal Heptenal

0,01 0,09 0,02 0,09 0,06

11,2 4,5 110,0 52,6 19,6

0,02 0,08 0,77 0,22 0,04

15,2 4,8 3,4 6,3 35,7

Mittelwerte

0,04

40,3

0,22

13,2

Propenaldiethylacetal Butenaldiethylacetal Pentenaldiethylacetal Hexenaldiethylacetal Heptenaldiethylacetal

0,04 0,50 0,64 0,16 0,80

5,5 9,1 14,3 33,3 4,3

0,04 0,26 1,41 0,94 0,18

5,5 16,6 11,1 5,9 14,3

Mittelwerte

0,43

13,3

0,56

10,7

Q

Q

Gerstenmehltau. D a die Verbindungen in höheren K o n z e n t r a t i o n e n phytotoxisch sind, war es interessant, einen phytotherapeutischen I n d e x in F o r m eines Wertes Q (Quotient aus L D 5 0 W i r t s p f l a n z e / E D 5 0 Parasit) zu ermitteln. Dabei zeigt sich, d a ß besonders P e n t e n a l u n d Hexenal bzw. deren Acetale günstige Indices ergeben, was auf eine Bed e u t u n g als negative Fungizide hinweist. I m Gegensatz zu Getreide erweisen sich andere P f l a n z e n a r t e n (Bohne, Tomate, Gurke, Begonia) leider empfindlicher gegenüber Alkenalen, so d a ß ein direkter Einsatz als P f l a n z e n s c h u t z m i t t e l über Blattapplikation k a u m in B e t r a c h t k o m m t . Die p h y t o t h e r a p e u t i s c h e Spanne zur B e k ä m p f u n g von B l a t t k r a n k h e i t e n ist zu gering. Bemerkenswert und wegen der phytotoxischen Nebenwirkung etwas u n e r w a r t e t , ist ein eindeutiger systemischer E f f e k t einiger Verbindungen gegen Puccinia triticina (Tab. 3). Der ED 5 0 -Wert f ü r Propenal und B u t e n a l liegt im Bereich von 6 bis 14 ¡¿1/1. 20

Systemfungizide

306 Tabelle 3 Fungizide Wirkung Wirt-Paramt-Kombhuition

H.

von

Alk-2-en-l-alen und deren Puccina triticina/Weizen

protektiv

LYR,

Acetule bei Hemmwerte

L.

BANASIAK,

H.

Wurzelapplikation in Prozent

AURICH

auf

die

kurativ

Alkenale

I0"3

10"4

10~ 3

1 0 " 4 (Mol/1)

Propenal Butenal Propenalglvcerinacetal Butenalglycerinacetal

100 88,4 100 100

100 61,8 100 100

100 100 100 100

38,3 100 100 (HS.7

Mehltau reagiert unempfindlicher und erfordert höhere Dosen. Bei 60 [xl/1 treten unter diesen Bedingungen noch keine phytotoxisehen Schäden auf. Die in Tabelle 3 aufgeführten, nicht flüchtigen Acetale zeigen erst über 1000 [Aß eine Schädigung, wobei an der Verlagerung der Schadzonen in akropetaler Richtung der X y l e m t r a n s p o r t erkennbar ist. I n anderen Versuchen ergeben sich auch deutliche insektizide und akarizide Wirkungen, die bei Milben und einigen Dipteren stärker als bei Colepteren sind. B e i der relativ breiten bioziden Wirksamkeit dieser Verbindungsklasse ist ein relativ unspezifischer Wirkungsmechanismus wahrscheinlich. Die Wirkung beruht vor allem auf der hohen R e a k t i v i t ä t der Alkenale. Als „ v i n o l o g e " Verbindungen liegen im Unterschied zu den weniger wirksamen analogen gesättigten Aldehyden [12] zwei elektrophile Reaktionszentren vor, die mit nucleophilen Reaktionspartnern, wie Aminen, Aminosäuren, Alkohlen, Phenolen, Mercaptanen u. a., in Wechselwirkung treten. Zur Erklärung der inhibierenden Wirkung der Alkenale ist besonders die R e a k t i o n mit Sulfhydryl-Gruppen enthaltenden Verbindungen, wie Glutathion, Cystein interessant, weil das eine Ursache der Inaktivierung von wichtigen E n z y m e n sein kann [2]. Die Wirkung verschiedener Aminosäuren auf Alkenale wurde experimentell untersucht, indem die Veränderung der Absorptionsmaxima gemessen wurde (Abb. 1). Aus dieser Reaktion läßt sich folgern, daß hierdurch ein wesentliches Unterscheidungsmerkmal zu gesättigten Aldehyden gegeben ist, die bei einer Konzentration von 80 [xmol/I (8 bis 12 [Aß) nach NYMAN [14] keine fungizide Wirkung aufweisen, sondern das Wachstum von Dipodascus aggregatus mehr oder weniger stimulieren. Gleiches zeigen auch Versuche von SCHILDKNECHT und RAUCH [15] an Ciliaten, wo H e x a n a l im Gegensatz zu Hexenal biologisch inaktiv ist. Hexadienal wirkt hier schwächer, während andere Aldehyde nur wenig wirksam sind. D a die u n t e r s c h i e d l i c h e E m p f i n d l i c h k e i t der einzelnen P i l z a r t e n (vgl. T a b . 1) a u c h in e i n e m d i f f e r e n z i e r t e n o x i d a t i v e n A b b a u der A l k e n a l e b e g r ü n d e t sein k a n n , ist die A n g r e i f b a r k e i t v o n P e n t e n a l u n d H e x e n a l d u r c h die A l d e h y d d e h y d r o g e n a s e v o n Acinobaeter caleoacetieus u n t e r s u c h t w o r d e n . D a s E n z y m ist m e m b r a n g e b u n d e n , N A D P - a b h ä n g i g u n d o x i d i e r t l a n g k e t t i g e A l d e h y d e . E s w i r d n a c h A n z u c h t der B a k t e r i e n a u f 11-Alkanen geb i l d e t [17], D a s E n z y m , d a s g e s ä t t i g t e A l d e h y d e ( N o n a n a l ) g u t o x i d i e r t , g r e i f t l ' e n t e n a l u n d H e x e n a l j e d o c h n i c h t a n . D i e s e A l k e n a l e h a b e n b i s zu einer K o n z e n t r a t i o n v o n 0,45 mmol/1 k e i n e n k o m p e t i t i v e n H e m m e f f e k t g e g e n ü b e r N o n a n a l . E i n e p a r t i k u l ä r e , a k z e p t o r a b h ä n g i g e A l k o h o l d e h y d r o g e n a s e a u s Pseudomonas putida ( A n z u c h t a u f n - A l k a n e n ) oxid i e r t a l i p h a t i s c h e A l k o h o l e , wie H e x a n o l , O c t a n o l , m i t D i e h l o r p h e n o l i n d o p h e n o l a l s A k z e p t o r zu d e n e n t s p r e c h e n d e n A l d e h y d e n [18]. M e s s u n g e n m i t H e x a - 2 , 4 - d i e n - l - o l ( S o r b i n a l k o h o l ) a l s S u b s t r a t e r g a b e n bei Z u s a t z v o n 1,25 mmol/1 H e x e n a l eine H e m m u n g v o n 5 7 % , w ä h r e n d l ' e n t e n a l bei 1,0 mmol/1 k e i n e W i r k u n g zeigt. E i n e N A D H - a b h ä n g i g e A l k o h o l d e h y d r o g e n a s e a u s Saecharomyces cerevisiae blieb d u r c h A l k e n a l e u n b e e i n f l u ß t .

F l ü c h t i g e A l k e n a l e als F u n g i z i d e

307

bzw. a-Alanin (III) [B] in 5 0 % i g e m n - P r o p a n o l

Diese ersten Ergebnisse zeigen, daß Alkenale resistent gegen Aldehyddehydrogenasen sind, die a m Abbau von n-Alkanen mitwirken, ü b spezifische, induzierbare AlkenalDehydrogenasen durch Mikroorganismen gebildet werden, ist gegenwärtig noch nicht geklärt. Der Metabolismus in der Pflanze verläuft r e d u k t i v von Hexenal über Hexenol zu Hexanol [16], der d a n n durch akzeptorabhängige A D H oxidiert werden k a n n . Orientierende Versuche an E T P aus Rinderherzmitochondrien ergeben keinen Hinweis auf eine H e m m u n g der A t m u n g s k e t t e durch Alkenale [11]. SCHILDKNECHT u n d RAUCH [ 1 5 ] f a n d e n i n d e r U m g e b u n g s l u f t v o n Robinia •pseado-

acaciu eine Konzentration an Hexenal von 3 ¡¿g/m 3 . Das entspricht einer Konzentration von 3 • 10"6 ¡¿1/1. Eine Rostinfektion k a n n bei 24-stiindiger E i n w i r k u n g von 0,3 ¡i.1/1 Hexenal bzw. 0,08 [xl/1 Pentenal eliminiert werden. Da m a n a n n e h m e n k a n n , daß die Hexenal-Konzentration im Interzellularsystem von Robinia höher als in der Umgebungsluft ist, könnte eine solche K o n z e n t r a t i o n ausreichen, um einen Pilzbefall zu verhindern. F ü r andere Pflanzenarten liegen ähnliche Messungen nicht vor. Möglicherweise ist die Bildung von Alkenalen geringer und die Eigenempfindlichkeit höher. I m m e r h i n ist nicht auszuschließen, daß Alkenalen eine innertherapeutische F u n k t i o n zur Keimfreihaltung des Pflanzeninneren z u k o m m t . Alkenale werden besonders intensiv nach Gewebeverletzungen gebildet, was wahrscheinlich mit der Freisetzung von F e t t s ä u r e n durch Phospholipasen u n d der Aktivierung von Lipoxygenasen zusammenhängt, die besonders in Chloroplasten und Mitochondrien lokalisiert sind. D a d u r c h ist ein zusätzlicher Abwehrmechanismus gegen pilzliche oder tierische Schädlinge denkbar, was n a c h F u n k t i o n und Bildungsweise den Phytoallexinen entspricht. Literatur [1] DRAWERT, F . U. a., U b e r d i e B i o g e n e s e v o n A r o i n a s t o f f e n b e i P f l a n z e n u n d F r ü c h t e n , A n n . C h e m . 6 9 4 (1966), 2 0 0 - 2 0 8 20*

308

H . L Y E , L . BANASIAK, H . A U R I C H

[ 2 ] E S T E R B A U E R , H . , H . ZOLLNER a n d N . SCHOLZ, R e a c t i o n of g l u t a t h i o n e w i t h

[3] [4] [5] [6]

conju-

g a t e d carbonyls, Z. N a t u r f o r s c h . 30 c (1975), 466 — 473 GARDNER, H . W . , D e c o m p o s i t i o n of linolenic acid h y d r o p e r o x i d e s . E n z y m a t i c reactions c o m p a r e d with n o n e n z y m a t i c , J . Agrie. F o o d . Chem. 23 (1975), 129 — 136 GRAMBOV,H. J . , T h e influence of volatile leaf c o n s t i t u e n t s on t h e in vitro d i f f e r e n t i a t i o n and g r o w t h of Puccinia graminis f. sp. tritici, Z. P f l a n z e n p h y s i o l . 85 (1977), 361 — 372 GBOSCH, W . a n d G. LASKAWY, Differences in t h e a m o u n t a n d r a n g e of volatile carbonyl c o m p o u n d s f o r m e d b y lipoxygenase isoenzymes f r o m soybeans, J . Agric. F o o d . Chem. 23 (1975), 7 9 1 - 7 9 4 HATANAKA, A. U. a., F o r m a t i o n of 12-oxo-trans-10-dodecenic acid in chloroplasts f r o m Thea sinensis leaves, P h y t o c h e m i s t r y 16 (1977), 1828—1829

[ 7 ] MACLEOD, J . A . a n d H . E . P I K K , F o r m a t i o n of ( E ) - h e x - 2 - e n a l a n d

b y fresh leaves of Brassica

(Z)-hex-3-en-l-ol

oleracea, J . Agric. F o o d Chem. 27 (1979), 469 — 475

[ 8 ] MAJOR, R . T . , P . MARCHINI a n d T . SPROSTON, I s o l a t i o n f r o m Gingko

biloba

L. of

an

inhibitor of f u n g u s g r o w t h , J . Biol. Chem. 235 (I960), 3 2 9 8 - 3 2 9 9 [ 9 ] MAJOR, R . T . , P . MARCHINI, a n d A . J . BOULTON, O b s e r v a t i o n o n t h e p r o d u c t i o n of a -

hexenal by leaves of certain p l a n t s , J . Biol. Chem. 238 (1963), 1813 — 1816 [10] MATTHEW, J . A. a n d T. GALLIARD, E n z y m a t i c f o r m a t i o n of c a r b o n y l s f r o m linolenic acid in leaves of Pliaseolus vulgaris, P h y t o c h e m i s t r y 17 (1978), 1043 — 1044 [11] MÜLLER, W . , Persönliche Mitteilung, 1979 [12] NANDI, B., E f f e c t of volatile aldehydes, ketones, esters a n d terpenoids on g r o w t h a n d d e v e l o p m e n t of f u n g i associated with w h e a t grains in t h e field a n d in storage, Z. Pfl. K r a n k h . 84 (1977),

11-128

[13] NYE, W . a n d H . A. SPOEHR, T h e isolation of hexenal f r o m leaves, Arch. Biochem. B i o p h y s . 2 (1943),

23-35

[14] NYMAN, B., T h e effect of various aliphatic a l d e h y d e s a n d related c o m p o u n d s on t h e g r o w t h of Dipodascus aggregatus, Physiol. P l a n t 22 (1969), 1322—1328 [15] SCHILDKNECHT, H . u n d G. RAUCH, Die chemische N a t u r der „ L u f t p h y t o n c i d e " v o n B l a t t p f l a n z e n , insbesondere von Eobinia pseudoacacia, Z. N a t u r f o r s c h . l(i b (1961), 423 — 429 [ 1 6 ] STONES, E . J . , R . M . H A L L a n d , S . J . K A Z E N I A C , F o r m a t i o n of a l d e h y d e s a n d

alco-

holes in T o m a t o f r u i t s f r o m U- 1 4 C labeled linolenic a n d linoleic acid, J . F o o d . Sei. 10 (1975), 1 1 3 8 - 1 1 4 1 [17] TAUCHERT, H . U. a., P y r i d i n n u c l e o t i d - u n a b h ä n g i g e O x y d a t i o n von längerkettigen aliphatischen Alkoholen d u r c h ein E n z y m aus Acinobacter calcoaceticus, Z. Allg. Mikrobiol. 15 (1975), 4 5 7 - 4 6 0 [ 1 8 ] TAUCHERT, H . , M . GRUNOW u n d H . A U R I C H , R e g u l a t i o n u n d

einige

Eigenschaften

einer p a r t i k u l ä r e n , a k z e p t o r a b h ä n g i g e n Alkoholdehydrogenase aus Pseudomonas putida beim W a c h s t u m auf n-Alkanen, Z. Allg. Mikrobiol. 18 (1978), 675 — 680 [19] TRESSL, R . a n d DRAWERT, F . , Biogenesis of b a n a n a volatiles, J . Agric. F o o d . Chem. 21 (1973),

560-565

R . MAXMIOWA, N . PALMOWA, T . SCHARKOWA, B . CHUKATOWA, M .

Staatliche

Lomonossow-Universität

Moskau,

LEJKINA

UdSSR

Wirksamkeit von Trichothezin gegen Myzelien von Fungi imperfecti und Gewebekulturen

Trichothezin- ein fungizides Antibiotikum — wird aus Trichothecium roseum gewonnen. Seine Suramen-Formel ist C 1 9 H 2 4 0 5 . Chemisch ist es ein Esther des Trichothecolons und der Isokrotonsäure vom Molekulargewicht 332, hat den Schmelzpunkt 118° und ist in organischen Lösungsmitteln gut löslich und optisch aktiv ([«]D 1 8 = + 4 4 ) . Eine fungizide Aktivität seiner Nährlösung wurde von B R I A N und H E M M I N G bereits 1947 beschrieben. Isolierung und Identifizierung gehen auf F R E E M A N und M O R R I S O N [4] zurück. Trichothezin wirkt gegen Pyrenomyceten, Actinomyceten und Basidiomyceten, sowohl gegen einige phytopathogene als auch tierpathogene Arten ( B E C K E R et al. [3], F R E E M A N und M O R R I S O N [ 4 ] , S I L A E W [ 6 ] V Ö R Ö S [ 7 ] ) . Trichothezin hemmt pflanzenund tierpathogene Viren, wirkt aber nicht gegen Bakterien. Trichothezin gehört, wie auch ökologisch wichtige Mykotoxine und andere Antibiotika, zu den Sesquiterpenen. Diese Substanzen mit sehr ähnlicher Biogenese (über Mevalonsäure) haben auch einen ähnlichen Wirkungsmechanismus, der bei eukaryotischen Zellen in einem Angriff auf die ribosomale Proteinsynthese besteht ( B A M B E R G [ 2 ] ) . Für den Wirkungsmechanismus der Sesquiterpene ist die Struktur der C-15-Position sehr wichtig. Substanzen, die in dieser Position eine sauerstoffhaltige Gruppe besitzen, wie z.B. Verrucarin verursachen einen schnellen Abbau der Polysomen. Stoffe, die in dieser Position eine Methylgruppe haben, wie z.B. Trichodermin, hemmen zwar die Verlängerung der Peptidkette, zerstören aber die Polysomen nicht. Vermutlich hat auch Trichothezin, das in dieser Position ebenfalls eine Methylgruppe besitzt, einen solchen Wirkungsmechanismus (Abb. 1). Die Gruppe der Sesquiterpene besitzt gegen Pilze, Protozoen und verschiedene Säugetierzellen hohe biologische Aktivität. Trichothezin wird in der Sowjetunion produziert und im Pflanzenschutz angewendet, insbesondere gegen Gurken-Mehltau in Treibhäusern [1].

= H R2 = CH3CH-CH0C0 R3 - H

Fig. 1. Strukturformel von Trichothezin

310

R . MAXIMOWA e t al.

I m Laboratorium der Staatsuniversität Moskau untersuchen wir die Biologie, Variabilität und Physiologie von Trichothecium roseum und die Biosynthese von Trichothezin sowie auch anderer, von diesem Organismus gebildeter, biologisch aktiver Verbind u n g e n (MAXIMOWA e t a l . [ 5 ] ) .

F ü r den Produzentenstamm stellt Trichothezin auch keinen neutralen Stoff dar. Die Empfindlichkeit von T. roseurn gegen Trichothezin liegt bei 200—400 mkg/ml. I n 0,1 —1,0 mkg/ml-Konzentrationen hemmt es die Keimung von Konidien von T. roseurn, im Nährmedium das Myzelwachstum schon in den ersten Phasen der Entwicklung. Nach einer Adaptationsperiode nimmt die Wachstumsintensität wieder zu. 500 mkg/ml bewirken einen stärkeren Hemmeffekt (Abb. 2). Zugabe des Antibiotikums zu einem vorher 48 Stunden gewachsenen Myzel verursacht stärkere Verminderung der Biomasse. Eine Lyse des Myzels kann festgestellt werden.

Fig. 2. E i n f l u ß von Trichothezin auf das W a c h s t u m v o n T. roseum 1 Kontrolle, 2 200 mkg/ml Trichothezin, 3 - 500 mkg/ml, 4 - 200 mkg/ml Trichothezin nach 48 Stunden

Stunden

Trichothezin hemmt die biosynthetische Aktivität von T. roseum stark. Davon ist auch die Biosynthese des Antibiotikums betroffen. Diese kann in den ersten 72 Stunden der Kultur beobachtet werden. Danach steigt die Biosyntheseaktivität etwas an; wird das Antibiotikum 48 Stunden alten Pilzkulturen zugesetzt, ist der Einfluß auf die Biosynthese des Antibiotikums weniger ausgeprägt. I n jedem Fall wird nicht nur die Trichothezin-Biosynthese gehemmt, sondern auch ein Abbau des Antibiotikums in der Kultur bewirkt. Tricholysin",, ein Enzymkomplex ,der Enzyme mit proteolytischer und Esteraseaktivität enthält, bewirkt diesen Abbau (Abb. 3).

24

43

72

96 Stunden

F i g . 3 . E i n f l u ß v o n T r i c h o t h e z i n a u f die b i o s y n t h e t i s c h e A k t i v i t ä t v o n T. roseum 1 - Kontrolle, 2 — 200 mkg/ml Trichothezin v o r d e r S a a t , 3 — 5 0 0 m k g / m l v o r der S a a t , 4 — 200 mkg/ml nach 48 Stunden W'achstum, 5 — 500 inkg/ml nach 48 Stunden W a c h s t u m

W i r k s a m k e i t von T r i c h o t h e z i n gegen F u n g i iinperfeeti

311

E s hat den Anschein, daß die Verminderung der biosynthetischen Fähigkeiten der Pilzzelle das Resultat einer Störung wichtiger Stoffwechselprozesse ist. Betroffen sind Energiehaushalt und Eiweißsynthese, was sich am Wachstum wiederspiegelt. In Gegenwart von Trichothezin war die Dehydrogenasenaktivität des Myzels vermindert, besonders auffällig in den ersten Phasen der Kultur. Die Dehydrogenasenaktivität wird nach Adaptation des Myzels an das Antibiotikum wiederhergestellt (Abb. 4).

11

mkg/m/ ISO 700

SO

[Mi 24

72

48

120

Stunden

Fig. 4. E i n f l u ß von T r i c h o t h e zin a u f die D e h v d r o g e n a s e aktivität 1 — Glukose, 2 — P y r u v a t , 3 — Zitrat, 4 — Sukzinat. Helle S ä u l e n — Kontrolle, dunkle Z u g a b e von 2 0 0 m k g / ml T r i c h o t h e z i n

Trichothezin vermindert auch bei anderen empfindlichen Pilzen, z . B . VerticMlium dahliae und Fusarium moniliforme die Dehydrogenasenaktivität. Resistenz gegen Trichothezin ist bei diesen Pilzen von einer Abnahme der Wirkung des Antibiotikums auf das Dehydrogenasensystem begleitet. Trichothezin hat auch auf die Morphologie des Submersmyzels von T. roseum Einfluß. E s beschleunigt die Myzelentwicklung, begünstigt die „Tiefenkonidienbildung", die Bildung von Initialzellen, von knospendem Myzel und von Chlamydosporen. Letzteres führt zur Herausbildung neuer, antibiotikumresistenter und zu intensiverer Trichothezin-Bildung befähigter Myzelgenerationen. Der Einfluß des Trichothezins auf den die Verbindung produzierenden Pilz wurde nach kurzfristigem K o n t a k t des Antibiotikums mit dem Pilz in einer 2 0 0 — 5 0 0 mkg/mlKonzentration bei 48 Stunden altem Myzel, bei pH 4,0 und 7,0 untersucht. E s findet eine Adsorption an der Myzeloberfläche statt (Abb. 5). Die Zellmembranpermeabilität mkg/m/ 400 300

20'

B

W

F i g . 5 . T r i c h o t h e z i n a d s o r p t i o n auf der Myzeliumoberfläehe A — Triehothezinkonzentration 200 mkg/ml B — 500 mkg/ml 1 — K o n t r o l l e , p H = 7,0, 2 — im K o n t a k t mit M y z e l i u m , p H = 7,0, 3 - K o n t r o l l e , p H = 4 , 0 , 4 — dasselbe im K o n t a k t m i t M y z e l i u m

wird erhöht. Als Folge kommt es zum Austritt wichtiger Zellkomponenten in das Außenmedium. Betroffen sind z . B . Phosphorverbindungen und bei 260 nm adsorbierende Substanzen (Nucleotide) (Abb. 6). Adsorption des Wirkstoffes und Permeabilitätsstörungen in den Zellen sind bei pH = 7,0 und einer Konzentration von 500 mkg/ ml intensiver als bei pH 4,0, bzw. niederen Konzentrationen. I n Anwesenheit von XII., und Cholesterin ist die toxische Wirkung von Trichothezin herabgesetzt. Das Wachstum setzt neu ein, der Verlust an Phosphorverbindungen ist verlangsamt und vermindert.

312

R . MAXIMOWA e t

Phosphor

400 300 200 100

A

1 2 3 W

al.

Nuk/eofide

JTütf

1 2 3 70'

12

3

12

3

180'

60'

Fig. 6. Verlust der Zellen an Phosphor und an bei 260 nin UV-absorbierenden Stoffen 1 - Kontrolle, 2 - 200 mkg/ml Triehothezin, 3 — 500 mkg/ml, helle Säulen — pH = 4,0, dunkle — pH = 7,0

W

A

•

#

% >#

¡Hp 4 m

•JE. tlm m

ü

Jjf «i

>

1 * f i i :f*

m '

#

§

Hl *

r k

Fig. 7. Einfluß von Triehothezin auf Gewebekulturen 1 — Monoschieht von , , S P E W " (Kontrolle), 2 — Monoschicht von S P E W in Gegenwart von 0,2 mkg/ml Triehothezin 3-2SPEW Kulturen nach 48 Stunden [Kontrolle], 4 — dasselbe in Gegenwart von Imkg/ml Triehothezin

Wirksamkeit von Trichothezin gegen F u n g i imperfecti

313

Von Monoschichten von Schweinsembryonierenepithel (SPEW) wurde Trichothezin in hoher, zytostatisch wirksamer Konzentration, gebunden. Trichothezin h e m m t das W a c h s t u m der Zellen der S P E W bei Zellpassage in K o n z e n t r a t i o n e n von 0,2—0,3 mkg/ ml und im K o n t a k t mit einer in 48 Stunden gewachsenen K u l t u r in einer solchen von 0,6 —1,0 mkg/ml (Abb. 7). Nach 24 bzw. 48 Stunden W a c h s t u m wird eine H e m m u n g der Zellteilung b e o b a c h t e t ; die mitotische A k t i v i t ä t ist vermindert. E s k o m m t zu keiner Schichtbildung in der Gewebekultur. Veränderungen der Zellform u n d Zellhäufungen wurden beobachtet. Zugabe von Trichothezin zur reifen Gewebekultur f ü h r t zur Zerstörung der Zellschicht. Die Zellen werden rundlich, die K e r n e schrumpfen. D a n n entsteht eine Zellpyknose und als E n d r e s u l t a t folgt Lyse, charakterisiert durch Membranzerstörung und Ausfließen des Zellinhaltes. Die toxische W i r k u n g von Trichothezin steigt mit seiner Konzentration u n d Einwirkzeit. E s wurde die hemmende Wirkung von Trichothezin f ü r Pilze und seine hohe A k t i v i t ä t bei Zellmonoschichten von Gewebekulturen gezeigt. Trichothezin besitzt ein breites Wirkungsspektrum. E s k a n n das W a c h s t u m hemmen, morphogenetische Wirkungen hervorrufen, energetische u n d biosynthetische Prozesse h e m m e n u n d auch die mitotische Aktivität. Diese Stoffwechelstörungen sind Folgen der spezifischen E i n w i r k u n g des Antibiotikums auf die Zellpermeabilität, die zu einem Mangel an Stoffen in den Zellen f ü h r t . Der Wirkungsmechanismus von Trichothezin, mit seinem m e m b r a n o tropen E f f e k t , ist dem Wirkungsmechanismus der Polyen-Antibiotika ähnlich.

Literatur [1] A n n o t i e r u n g v o n P e s t i z i d e n . W e r k e d e r S t a a t s k o m i s s i o n f ü r c h e m i s c h e K a m p f m i t t e l g e g e n P f l a n z e n s c h ä d l i n g e u n d U n k r a u t (russisch), M o s k a u , 1973 [ 2 ] B A M B E R G , J A M E S , I I . , Chemische und biochemische F o r s c h u n g e n der Trichothezenm y k o t o x i n e n , M y k o t o x i n e u n d a n d e r e m i t F u n g i v e r b u n d e n e N a h r u n g s p r o b l e m e (englisch). [ 3 ] B E C K E R , S. E . , L I S I N A , E . S., M A X I M O W A , R . A., D i e E i g e n s c h a f t e n des a n t i b i o t i s c h e n S p e c t r u m s u n d d e r W i r k u n g s m e c h a n i s m u s einiger A n t i b i o t i k a a u s P i l z e n . I n t e r n . S y m p o s i u m E b e r s w a l d e , A c a d e m i e v e r l a g B e r l i n , 1967, 115—119 ( d e u t s c h ) [4] FREEMAN, G. G., MORRISON, K . J . , T r i c h o t h e z i n — ein f u n g i z i d e s M e t a b o l i t e n p r o d u k t a u s Trichothecium roseum, N a t u r e , 162 (1948), 4106 — 4110 (englisch) [5] MAXIMOWA, R . A . , SILAEW, A . B . , PALMOWA, N . 1 \ , SCHARKOWA, T . S.,

B . G . , P O C H , L . 1 . , GRUSCHIKA, W . A . , M I N A E W A , T . A . , B i o l o g i s c h e

CHURATOWA,

Eigenschaften

eines i m p e r f e k t e n F u n g u s , Trichothecium roseum des T r i c h o t e z i n a n t i b i o t i k u m s p r o d u z e n t e n . S a m m l u n g : „ D i e A n t i b i o t i k a u n d i h r e P r o d u z e n t e n " , V e r l a g „ N a u k a " , Mosk a u , 1975, 2 3 2 - 2 4 0 (russisch) [6]

SILAEW, A . B . , MAXIMOWA, R .

A . , SCHEKLANOW, E .

D., LESCHENKO, W .

M.,

RUKA-

M., N A G I B I N , W . W . , T r i c h o t h e z i n u n d seine k l i n i s c h e A n w e n d u n g in d e r B e h a n d l u n g v o n einigen D e r m a t o m y k o s e f o r n i e n . S a m m l u n g : C h e m o t h e r a p i e v o n I n f e k t i o n e n u n d die H e i l m i t t e l r e s i s t e n z p a t h o g e n e r M i k r o o r g a n i s m e n , M o s k a u , 1973, 1 2 3 - 1 2 4 (russisch) [7] VÖRÖS, I . A., T r i c h o t h e c i n a n t i b i o t i c u m a l k a l m a z a s a h o v e n y i k a r e k o z o k eilen N ö v e n y t e r i n e l e s , 4 (1955), 2 3 3 - 2 4 0 ( H u n g . ) WISCHNIKOWA, W .

R. MÜLLEK u n d U.

BURTII

Institut für 1'flanzensehutzforsc.hung Kleinmachnow, DD11

der Akademie

der

Landirirtschaftsicissenschaften,

Benzimidazol-Tensid-Formulierungen mit Wirksamkeit bei Benomylresistenz

1. Einleitung Pilzkrankheiten der Kulturpflanzen verursachen jährlich hohe Ernteverluste. Neben züchterischen Maßnahmen kommt dem Einsatz von Fungiziden eine entscheidende Bedeutung bei der Ausschöpfung des Ertragspotentials unserer Kulturpflanzen zu. Mit dem weltweiten Einsatz systemischer Fungizide seit etwa 12 Jahren trat das Problem der Resistenzentwicklung bei pflanzenpathogenen Pilzen gegenüber einigen Wirkstoffgruppen in den Vordergrund. Speziell für die Gruppe der BenzimidazolFungizide (Benomyl, Carbendazim, Thiabendazol, Fuberidazol und Thiophanatmethyl), wurden bei verschiedenen pilzlichen Schaderregern Resistenzerscheinungen mit Gruppen-Resistenz für diese Wirkstoffe beobachtet. Ziel der vorliegenden Untersuchungen war es, die fungizide Wirksamkeit von Benzimidazol-Tensid-Formulierungen (gegen Populationen von Erysiphe graminis DC. und Sjihaerotheca fuliginea ( S C H L E C H T . ) S A L M O N ) zu prüfen, bei denen eine ausgeprägte Benomylresistenz nachgewiesen worden war.

2. Material und Methoden In Tabelle 1 werden die Handelspräparate, Prüfmuster, Tenside und Lösungsmittel aufgeführt, die für die Versuche verwendet wurden. Die Bestimmung der fungiziden Wirkung der Präparate gegen Erysiphe graminis DC. erfolgte an Pflanzen der Sommergerstensorte „Tilgina" im Einblattstadium. Die Applikation der Fungizide wurde mittels Tropfnaß-Behandlung in den Konzentrationen 250, 50 und 10 ppm Wirkstoff durchgeführt. Nach Infektion und Inkubation der Versuchspflanzen wurde die Auswertung durch Blattbonitur in den Boniturstufen 9 bis 1 nach S T E P H A N [ 6 ] vorgenommen. Die Untersuchungen zur Penetration in Anlehnung an einen Penetrationstest nach D K A K D A E E W S K I und M A Y E R [2] (an Epidermisstücken von Allium porrum) durchgeführt. Als Testorganismus diente Aspergillus niger. Als I'enetrations/.eit wurde 24 Std. gewählt. Die Auswertung erfolgte durch Messen der Hemmhöfe. Die Wirksamkeit der Präparate bei Benomylresistenz wurde an einem benomylresistenten Stamm von Sphaerotheca fuliginea ( S C H L E C H T . ) S A L M O N an Gewächshausgurken ( S O R T E Quix) und Erysiphe graminis DC. an Sommergerste (Sorte „Eligna") untersucht. Zur Selektion der benomylresistenten Stämme wurden Gewächshausgurken in wöchentlichem R h y t h m u s mit 50; 100; 250 und 500 ppm Benlate und Sommergerstenpflanzen mit 50; 100; 500; und 1000 ppm Benlate tropfnaß behandelt. Im Anschluß an die Selektion benomvlresistenter Stämme wurde ein Kreuzresistenztest durchgeführt. Die Auswertung erfolgte durch eine Blattbonitur.

316

R . MÜLLEK, U . B U R T H

Tabelle 1 Wirkung von Benomylbzw. Carbendazim-Tensid-Formulierungen Fungizide gleichspräparaten gegen einen benomylsensiblen und einen benomylresistenten Fungizide

Wirkstoffgehalt

Wirkstoff

Benomyl-Wirkstoff Carbendaziin-Wirkstoff Benlate Derosal Calixin Sickosul Prüfmittel 1 Prüfmittel 2 Prüfmittel 3 Prüfmittel 4 Prüfmittel 5 Prüfmittel 6

—

—

50% 60% 75% 88% 5% 5% 7.5% 10% 15% 25%

Benomyl Carbendazim Tridemorph Schwefel Benomyl Carbendazim Carbendazim Carbendazim Carbendazim Carbendazim

Tenside

chemische Zusammensetzung

Tensid I Tensid I I Tensid I I I DMSO DMF

A l k y l p h e n y l ä t h o x i l a t 7 ... 8 A e O / m o l 1 A l k y l p h e n y l ä t h o x i l a t 4 ... 5 A e O / m o l A l k y l p h e n y l ä t h o x i l a t 50 ... 52 A e O / m o l Dimethylsulfoxid Dimethylformamid

1

und Stamm

Ver-

—

AeO = Äthylenoxidzahl

3. Ergebnisse u n d Diskussion Die fungizide Wirkung von Tankmischungen der H a n d e l s p r ä p a r a t e Benlate u n d Derosal mit Tensiden sowie Lösungsmitteln ist aus Tabelle 2 ersichtlich. Ein Vergleich der fungiziden Wirkung der verschiedenen Varianten zeigt, daß bei einer Anwendungskonzentration von 50 p p m Wirkstoff mit den H a n d e l s p r ä p a r a t e n Benlate ein Wirkungsgrad von 6 6 % und Derosal von 3 % erreichbar ist. Durch den Zusatz von Lösungsmitteln u n d Tensiden in die Spritzbrühen k o n n t e in jedem Fall eine Steigerung der fungiziden Wirkung erreicht werden. E s t r a t e n jedoch deutliche Unterschiede in Abhängigkeit vom Wirkstoff und von den Zusätzen auf. I n den Tankmischungen mit Lösungsmitteln k a m es n u r in der Kombination von DMSO mit Benlate zu nennenswerten E f f e k t e n , die zu erwarten waren, da DMSO ein gutes Durchdringungsvermögen f ü r biologische Membranen besitzt und die A u f n a h m e anderer Substanzen in die Zelle fördert ( M A R T I N u n d H A U T H A L [4]). Einen weitaus stärkeren Einfluß üben Tenside auf die fungizide Wirkung beider H a n d e l s p r ä p a r a t e aus. Bei Verwendung von Benlate in Kombination mit Tensid I und I I wurde der Wirkungsgrad von 6 6 % auf 9 9 % erhöht. Deutliche Unterschiede in der E f f e k t i v i t ä t des einzelnen Tensids waren n u r in Tankmischungen mit Derosal feststellbar. Tensid I u n d I I mit Äthylenoxidzahlen von 7 ... 8 bzw. 4 ... 5/mol h a t t e n einen erheblichen höheren E f f e k t als Tensid I I I mit 50 ... 52 AeO/mol. Ein vergleichbarer E f f e k t durch Mischung von Thiophanatmethyl mit einem Tensid wurde von C O L E u n d Cox [1] bei der B e k ä m p f u n g von Sphaerotheca fuliginea und Botrytis cinerea u n d von M E R C E R U. a. [5] bei der B e k ä m p f u n g

Benzimidazol-Tensid-Formulierungen bei Benomvlresistenz

317

Tabelle 2 Fungizide Wirkung von Tankmischungen der Handelspräparate Benlate und Derosal Tensiden gegen Erysiphe graminis DC. an Sommergerste nach kurativer Anwendung Variante

Wirkstoff 50 p p m

Benlate Benlate Benlate Benlate Benlate Benlate Derosal Derosal Derosal Derosal Derosal Derosal

Benomyl Benomyl Benomyl Benomyl Benomyl Benomyl Carbendazim Carbendazim Carbendazim Carbendazim Carbendazim Carbendazim

—

—

—

-

Lösungsmittel 5 0 0 ppm

+ +

DMF UMSO

-

—

—

Wirkungsgrad %

—

66 99 99 98 71 95 3 96 93 82 10 14 74 56 31 0 0

+ Tensid I + Tensid I I + Tensid I I I — — —

+ +

DMF DMSO

— —

Tensid 250 p p m

DMF DMSO

+ + +

Tensid I Tensid I I Tensid I I I

— —

Tensid I Tensid I I Tensid I I E — —

mit

v o n Podosphaera leucotricha e r r e i c h t . K L O P P I N G u . a . [ 4 ] weisen a u f eine b e t r ä c h t l i c h e W i r k u n g s s t e i g e r u n g d u r c h T a n k m i s c h u n g e n v o n C a r b e n d a z i n i m i t den T e n s i d , , T r e m 0 1 4 " g e g e n Sphaerotheca fuliginea hin. D i e U r s a c h e n f ü r die W i r k u n g s v e r b e s s e r u n g b e i F u n g i z i d - T e n s i d - K o m b i n a t i o n e n l a s s e n sich m i t H i l f e eines P e n e t r a t i o n s t e s t e s k l ä r e n . F ü r diesen T e s t w u r d e n flüssigf o r m u l i e r t e P r ü f m u s t e r der W i r k s t o f f e B e n o m y l u n d C a r b e n d a z i n i m i t e i n e m W i r k s t o f f - T e n s i d - V e r h ä l t n i s v o n 1 : 1 , 2 bis 1 : 7 v e r w e n d e t ( T a b . 3 ) . E s zeigen s i c h d e u t l i c h e U n t e r s c h i e d e in d e r f u n g i z i d e n W i r k u n g u n d i m P e n e t r a t i o n s v e r m ö g e n z w i s c h e n d e n Tabelle 3 Kurative Wirkung von Handelspräparaten und Prüfmustern gegen Erysiphe an Oersteund Ergebnisse zum Penetrationsvermögen an Allium porrum L . Variante

Wirkstoff

Benomyl Carbendazim Benlate Derosal Prüfmuster 1 Prüfmuster 2 Prüfmuster 3 Prüfmuster 4 Prüfmuster 5 Prüfmuster 6

Benomyl Carbendazim Benomyl Carbendazim Benomyl Carbendazim Carbendazim Carbendazim Carbendazim Carbendazim

WirkstoffTensidVerhältnis

— — —

1:7 1:7 1:2 1:6 1:4 1:1,2

graminis

Uc.

Wirkungsgrad ( % ) 50 ppm Wirkstoff

Penetrationsvermögen (Hemmhofdurchmesser m m )

21 0 56 2 98 96 82 95 92 75

24 8 25 8 54 51 36 41 38 30

R . MÜLLER, U .

318

BIRTH

einzelnen Varianten. F ü r den Wirkstoff Carbendazini wurde erwartungsgemäß ein geringeres Penetrationsvermögen b e o b a c h t e t als für B e n o m y l ( P R A N D A R E W S K I und M A Y E R [ 2 ] , Ahnliehe Ergebnisse wurden für die Handelspräparate (Benlate und P e r o sal) ermittelt. E r s t durch Flüssigformulierung mit einem hohen Tensidanteil wird eine erhebliche Wirkungs- und Penetrationsverbesserung erreicht. F ü r einen optimalen E f f e k t scheint das Wirkstoff-Tensid-Verhältnis der Formulierung von Bedeutung zu sein. Die carbendazimhaltigen Prüfmuster haben bei einer Einteilung sowohl nach dem Penetrationsvermögen als auch nach dem Wirkstoff-Tensid-Verhältnis die gleiche Rangordnung: Prüfmuster 2 (Verhältnis 1 : 7 ) > Prüfmuster 4 (Verhältnis 1 : 6 ) > Prüfmuster 5 (Verhältnis 1 : 4 ) > Prüfmuster 3 (Verhältnis 1 : 2 ) > Prüfmuster 6 (Verhältnis 1 : 1 , 2 ) . N a c h den Ergebnissen des Penetrationstestes wird die ausgezeichnete fungizide Wirkung der Flüssigformulierungen mit einem hohen Tensidgehalt durch eine erhöhte Wirkstoffaufnahme bewirkt. Benomylresistenz konnte in Gewächshausversuchen an Sjihuerothecu fuliginca nach 18 und an Erysiphe graminis nach 25 Behandlungen nachgewiesen werden. Mit beiden benomylresistenten Erregern wurde ein Kreuzresistenztest durchgeführt, für die die Muster 1 und 2 mit dem höchsten Penetrationsvermögen ausgewählt wurden. Die Ergebnisse des Kreuzresistenztests sind in Abbildung 1 dargestellt. P e r Abbildung 1 ist zu entnehmen, daß Gruppenresistenz bei beiden benomylresistenten Testpilzen nur für die Handelspräparate B e n l a t e und P e r o s a l a u f t r a t . P i e Vergleichsmittel Sicksul und Calixin hatten erwartungsgemäß eine unveränderte fungizide Wirkung. P i e Prüfmuster 1 und 2 (Wirkstoff-Tensid-Verhältnis 1 : 7 ) auf der Wirkstoffbasis von B e n o m y l und Carbendazini wirkten überraschenderweise an beiden benomyl-

Wirkungsgrod %

Sphaerotheca

700

fähginea

Erysiphe

graminis

F^L

SO

B ± L I. SO C ^ CS"

t^H

f> § ff R ?

benomy¡sensibler

s?

c. _

•SI ST

Stamm

to CM

QJ CS-

CO

I

I

«SS-

, QoN?0sv1 >: ,

£ §^

benomy/resistenter Stamm

Abb. 1. Fungizid«; Wirkung von Benomyl- bzw. Carbendaziin-Tensid-Foimulierungen und Vorgleichspräpartaeii gegen einen benoinylsensiblen und einen benoinyli'esistenten Stamm

Benzimidazol-Tensid-Formulierungen bei Benomylresistenz

319

resistenten Testpilzen resistenzbrechend. Sowohl das benoyml- als auch das carbendazimhaltige Prüfmuster erreichten gegen den benomylresistenten S t a m m von Spliaerotheca fuliginea einen Wirkungsgrad von 9 9 % sowie gegen den benomylresistenen S t a m m v o n E r y s i p h e graminis einen Wirkungsgrad von 9 6 % . Dieser E f f e k t k o n n t e auch mit dem Prüfmuster 5 (Wirkstoff-Tensid-Verhältnis 1 : 4 ) an einem benomylresistenten S t a m m von Venturia inaequalis nachgewiesen werden.

4. Zusammenfassung I n Tankmischungen ergeben Tenside (Alkylphenyläthoxylate) mit einer Äthylenoxidzahl von 4 ... 8/mol in K o m b i n a t i o n mit B e n l a t e und Derosal eine erhebliche Verbesserung der fungiziden Wirkung. I n Flüssigformulierungen ist das WirkstoffTensid-Verhältnis für die fungizide Wirkung gegen Erysiphe graminis D e . von Bedeutung. Die bessere fungizide Wirkung der B e n o m y l - bzw. Carbendazim-Tensid-Formulierungen wird durch eine Erhöhung des Penetrationsvermögens verursacht. Die Benoniyl- bzw. Carbendazim-Tensid-Formulierungen (Verhältnis 1 : 4 und 1 : 7 ) zeigen gegenüber benomylresistenten S t ä m m e n von Sphaerothecu f uliginea ( S C H L E C H T . ) S A L M O X und Erysiphe graminis DC. eine uneingeschränkte Wirkung.

IO.

M .

r.'iaeHuii

n .

T

i 0 T H H K 0 B a ,

y

I i O M Ó i i i i a n m i

JJjIH

t

CCCP,

jjByx

yCTOÌÌHIlBOCTH.

MapKI13

BbicoKoycToiiHiiB.

tritici,

u

tritici

pacTeHiuix,

copTa

Sr6

C o B i i e e x i i M o i i

IipOnCXOHHLUHX

graminis

jihhiiìì

CCCP

graminis

H3MeHeHHÌÌ,

il BOcnpiiiiMHiiBbix

nuiemiubi, h

Mocnea,

Puccinia

r p n ó a

S i i O T H n a p a c b i 2 1 Puccinia

nocne

C e p e i K K i i n a

i b T p a e p y i ; T y p w

HCCJieHOBaHHH

ycToiiiiHBbix

B .

cad AJI

óomaiiHCCKuù

O c o ó e i m o c T i x

T.

h

Ha

buia

H e e o i i M e c T i i M o f t Iliiiciiiiijbi

iicn0Jib30BaHa

K

3TOMy

pjKaBiiiHbi reHOM

ohhiim

SHOTHIiy.

MapKI13

Sr

M c c j i e A O B a H i i e n p o B O H H j i o c b Ha 6 - 0 i i , 10-bift 11 2 2 - o i i

n

geHb

3apa>KeiiHH.

npoHHKafi

B

JiHCTbH

nmeHHHbi,

ni(|)bi

P.

graminis

b Mea?KjieTOHHOM n p 0 C T p a H C T B e , n o c b i j i a n

tritici

raycTopmi

pacnpocTpaHHjincb

BHyrpb

Pile.

1.

KneTOK

Pa3BHTne

graminis

tritici

ninenimbi

Me30-

nocjie

P.

rpnOa

b

TKaHH

(coBMecTHMan

KOMfiimauMH) u à 10-biii

3apaiKeiiHfl

nenb

C 3 M

1500 B

—

rsaKyojib

TI —

F

—

raycTopim

l'In

—

njia.'iMaacMMa

JI —

.iiinii.iu

l i r

—

ny3bipi>KH

M

MUTOXOHapHH

Xji

—

xjiopoiuiacT

M M

—

MC>Ki;;ieTO'ini,iii

M K

—

MeMOpamibrii

MT

B

KOMÓimamia

B036yniiTeJiH CTeSjieBOÌi

MapKH3, pa3JiHHaiomiixca

BOCIipHHMHIIB

3rpOBHe

CyÒKJieTOHHOM

MMKpOTCJIO

O

—

21

Systemfungizide

oCoJioMKa

Miine.niiii

komiuickc

iiceB;ioiiapeHXHMa

liIF 3F H

— —

—

meiìKa

rojiba«iH

raycropiiH

3iiHonjia3MaTHliecKHÌi Hjjpo

peTHKyjiyM

x

322

IO. M. njlOTHiiKOBa, r . B. CepeHiKiiua

(|)HJlJia (pMC. 1). ripil COBMeCTIIMOil KOMÓllHaUHII rpn6 06pa30BHBajI pa3BCTBjieHHbiii MC/KKJicTOMHbiii Mimennii ii MHoroHHCJieHiibie raycTpoiiii (pnc. 2), npH HCCOBMCCTIIMOÌi — eMa np0T0inia3Mbi II TaKcnce Bcex opranenji: xjiopon.iaeroB, finpa, MIITOXOIIHPIIH, MiiKpoieji, angonjiasMaTiiMecKoro poTiiKyayMa, pnSocoM. IIpn iiecoBMecTiiMoii HOMSmiamiii Y>KC Ha paHHiix cponax impernimi naSaionanncb ciuibiibie iisMeiieinifi BCCX KJICTO'IHbix oprane:i,i (piicc. 5). npoiicxon,ii;io pasyineiine Biiemiieìi OSO.IOMKII XJIOponjiacTOB II yMoiibuicime ajieKTponnon naoniocTii iuiacTor;io6ya. OT\ICnajiHCb iiapymeiiini crpyKTypbi MiuoxonHpiiii, Bbipa?Kaiomnecfi B pacnaac KpiiCT II pa3pymeiinii Biieinneii MCMÓpaiibi. B o6enx KOMSmiamiax 6M,I iipno BbipaHieii Tancnc fmpa ÌIKCTKH xo3Hiina B cropony raycTopiiii napa:iiiTa ( p n c . 6, 7). ILSMOIICIIIIH Kaca:incb ne TOJibKO TpacTpyKTypa KOMÓiniaruin Piiccinia

11 niiieHHUbi

325

PIIC. 7. TaKCHC H H3MeHeHHe yjibTpacTpyKTypn Hjipa B KJieTKe niueHHijbi MapKH3 Sr6 Ha 22-oil Hem. nocjie 3apaHKH 3 H n o n j i a 3 M a T H H e c K o r o

H naToreHOM

ßhicTpoM

(pnc.

MEMÔPAH-

peraKyjiyMa,

r o j i b H H Π( p H C . 1 2 ) . TOJIMWHA

yBejiHHHBajiacb y ycTOüHHBbix pacTeHHñ (Taßji. Tarn™

ocoöoro

aHnonjiasMaTHHecKoro

KjieTKax

H nysbipbKii

TparaycTopnajibHoro MewHy

OÔHAPYJKEHO

6HJIO

npoH3Boji;Horo

He-

acco-

ypoBHe

ycTOÜHHBbix

30HM Mettifly X03HHH0M H n a -

326

IO. M . n j l O T H H K O B a , r . B .

Puf. 8.

H30JiHp0i!ainiHii

3aMopaHiHDaiiHe

—

h;i

xjiopormacT

TpaBJieiine T 3 M

x

iiopaiKeimoii

CepejKKHiia

kjiotkii niueiiiim.i M a p r o i s Sr 6 .

50000

P n e . 9 . I l s o j i i i p o B a n H B i x x j i o p o r u i a c T H3 3nopoBoii HjieTKii i m i e m i n b i MapKH3 S r 6 . 3 a Mopa>Kni!aiiHe — TpaBJieHiie T 3 M x 40000 P i i e . 10. MeMÒpaiiHbiii KOMnjieKC b KOHTaKTC e r a y c T o p n e i i r p i i ó a P. graninis tritici b kìictkc iimeiiHHH MapKH3 S r u (10-biii n e m . n o c j i e sapauxeiiiin) T 3 M x 80000 P n e . 1 1 . KoHTaKT THiKeii 3HjioiiJia3MaTHMecKoro p e T H K y j i y M a c 3 K C T p a r a y c T o p H a j i b H o n MeMópaiioii iiieiiKH r a y c r o p m i r p n i ì a P. graninis tritici b KJieTKe iiiueiiHUbi MapKH3 Sr 6 (10-i>iii n e n b n o c n e 3apan;eHHH) T 3 M x 90000 P h c . 12. KoHTaKT armapaTa ronb^HiH c 3KCTparayeTopnaJibHoii

tritici

M e M f > p a H o i i F.

b KJieTKe n i n e n n n b i MapKH3 Sr 6 (10-biii ;i;eHi> n o c j i e 3apaweiiHH) T 3 M

x

graninis

40000

H . - P . SCHMAUDEK u n d D .

Institut für Biochemie DDR-4020 Halle/Saale,

GRÖGER

der Pflanzen der Akademie Weinberg 2

der Wissenschaften

der

DDlt,

Zur Hemmung der Chitin-Synthetase von Claciceps purpurea durch ausgewählte Effektoren

Chitin ist ein wichtiger Bestandteil der CZai-ire^M'-Zellwand, der in ihr bis zu 4 8 % (bestimmt als Glucosamin) enthalten sein kann [10, 11]. E s lag daher nahe, das Chitinsynthetisierende System von Claviceps näher zu untersuchen und zu charakterisieren. Die Einflüsse verschiedener fungizider Stoffe auf das Wachstuni und Alkaloidbildung von Claviceps haben S C I I M A U P E R und G R Ö G E R [12] beschrieben. Von den untersuchten Substanzen zeigten im submersen in-vivo-Test vor allem Hinosan, Nystatin, Parathionmethyi, Pentachlorphenol und Terrazol einen deutlichen Einfluß auf Wachstum und Alkaloidbildung. Polyoxin B , Polyoxin I ) wie auch Streptovirudin zeigten in diesem Testsystem nur geringe Wirkungen, die auf Permeationsprobleme zurückgeführt werden könnten [12], I m in-vitro-System (zellfreier Überstand der 2 0 0 0 0 g Fraktion in 0,05 M Imidazol/ HCl-Puffer, pH 7,0—7,1, mit 3 0 % Glycerin) zeigten die Effektoren Polyoxin B , Polyoxin 1), Hinosan, Pentachlorphenol, Streptovirudin, U D P , U M P sowie einige ungesättigte Fettsäuren deutliche Hemmeffekte gegenüber der Chitin-Synthetase [13]. E s war überraschend, daß die Chitin-Synthetase von Claviceps durch Präparate, die Diflubenzoran enthielten, nicht signifikant gehemmt wird, wie es für andere Pilze u. a. B R I L L I N U E R [ 3 ] , von E C K [ 4 ] sowie L Y R und S E Y D [ 8 ] beschrieben haben. F ü r Polyoxin T) ist aufgrund der strukturellen Ähnlichkeit mit dem Substrat des Enzyms (Abb. 1) von verschiedenen Autoren eine kompetitive Hemmung beobachtet worden ( z . B . [1, 2, 4]). Eine Reduzierung der Enzym-Aktivität durch Hinosan fanden LYR und S E Y D [8] bei Mucor rouxii. Von den bereits erwähnten negativen Effektoren für das Claviceps-Enzym wurden die Polyoxine B und 1), Hinosan, das in seiner Struktur noch unbekannte Streptovirudin [5, 14] und Pentachlorphenol näher auf einen möglichen Hemmtyp hin untersucht. Während es unmöglich war, die mit Pentachlorphenol erzielten Ergebnisse zu interpretieren, da die Substanz nur allgemein toxische Einflüsse zeigte, könnten für die Polyoxine B und D sowie das Streptovirudin-Gemisch eine kompetitive Hemmung wahrscheinlich gemacht werden. Hinosan zeigte dagegen einen Hemmtyp, in dem eine kompetitive Hemmung dominiert, aber von anderen Einflüssen des Hemmstoffs auf das Enzym überlagert wird [13]. Abbildung 2 zeigt für alle vier untersuchten Verbindungen die Hemmkurven und Dixon-Plots. Man kann ihr entnehmen, daß im Gegensatz zu einigen anderen Organismen (Coprinus [3], Aspergillus [1], Mucor rouxii [2]) der K . - W e r t für Polyoxin D relativ hoch ist. E r liegt, wie im Falle des bisher noch nicht als Chitin-Synthetase-

328

H . - P . SCHMAUDER, D .

GROCER

UDP- N - acety Iglucosamin

COOH 0= C-NH-CH

R

0 ^ ^ NH N-^o

HjN-C-H H-C-OH HO—C — H I H - C - O - C O -NHj I H

CH3-CH2-0-P-S

s

t)

Polyoxin B: R=CHjOH 0- Efhyl -S,S -diphenylphosphorodithiolat Polyoxin D: R = C00H "Hinoson"

Altll. 1 . F o r m e l n des S u b s t r a t e s der C h i t i n - S y n t h e t s e (UDP-Nacetylglucosamin) und einiger H e m m s t o f f e dieses E n z y m s . (Vergl. hierzu [6])

Hemmstoffes beschriebenen Polyoxin B , im Bereich des K m - W e r t e s für das Substrat 0,13 bzw. s» 0,1 mM). Die anderen getesteten Hemmstoffe zeigen analoge Konzentrationsabhängigkeiten für die Größe von K j : Streptovirudin K j 0,18 mM; Hinosan K j sa 0 , 1 3 mM, so daß auffällig ist, daß für die C h i t i n - S y n t h e t a s e von

Clavicejjs

purpurea bislang kein hochwirksamer kompetitiver Hemmstoff, der im ¡j. Molbereich wirkt, gefunden werden konnte. Die erhaltenen Dixon-Plots zeigen bei hohen Hemmstoffkonzentrationen eine Abweichung von der Linearität, die der für U D P beschriebenen entspricht [7, 9]. Dieses Phänomen deutet auf das Vorliegen einer komplexen Kinetik hin, d. h., in hohen Konzentrationen beeinflußt der Hemmstoff nicht nur die Bindungsstelle für das Substrat im Enzym, sondern übt weitere, noch nicht näher charakterisierte, Wechselwirkungen auf das Enzym bzw. Substrat aus. Danksagung W i r d a n k e n H e r r n P r o f . L)r. sc. H . L Y R , I n s t i t u t für P f l a n z e n s c h u t z f o r s c h u n g K l e i n m a c h now, für die Ü b e r l a s s u n g einiger F u n g i z i d e sowie H e r r n D r . sc. K . ECKABDT, Zentrali n s t i t u t für Mikrobiologie und e x p e r i m e n t e l l e T h e r a p i e der A d W , J e n a , für die P r o b e n von Streptovirudin.

Liter atur [ ] ] ARCHER, D . B . , Chitin b i o s y n t h e s i s in p r o t o p l a s t s and subcellular f r a c t i o n s of gillus fumir/atus, Bioohein. J . 1 6 4 ( 1 9 7 7 ) , 653 —G58

Asper-

H e m m u n g d e r C h i t i n s s y n t h e t a s e von Claviceps

v ops

purpurea

329

40 W
2 5 , 0 • 10"5

O-CH-CO-NH-OH

6,8 • 10"5

1 0 , 2 • 10" 5

17,0 • 10- 5

10,2 • 10"5

3,4 • 10"5

0,7 • 10"5

6,2 • 10- 5

1,9 • 1 0 " 5

0,6 • 10' 5

5,0 • 1 0 " 5

1,2 • 10" 5

2,0 • 10" 5

.OH 0-CHJ—CO-N

O-CH2-CO-NH-O

10"

Erysiphe graminis

Q-lo O-CH2-CO-NH-O

I

O-CH2-C=O

Bei pilzlichen Spezies wurde eine gute Wirkung gegenüber einigen Oomyeeten und Erysiphe graminis MAKCIIAL (Tab. 1) gefunden. Die fungizide Wirkung n i m m t mit steigender Lipophilie a b (Abb. 3); es ist somit f ü r die A k t i v i t ä t relativ bedeutungslos, ob sich der /?-Naphthoxy-llest in der oc- oder co-Stellung von Alkylhydroxamsäuren befindet. E s wurde eine lineare Beziehung zwischen den EI) 5 0 -Werten und der hydrophoben S u b s t i t u e n t e n k o n s t a n t e n rr gefunden (oc = 0,05). ED 5 0 = 3,12 • 10" 5 7t + 15,45 • 10" 5

(n = 1, 2, 3, ... , 10)

Danach ist die /5-Naphthoxy-acethydroxanisäure (n = 1) die wirksamste Verbindung in der Reihe der /3-Naphthoxy-alkylhydroxamsäuren mit freier funktioneller Gruppe, und eine Wirkungssteigerung durch Verlängerung der Alkylkette ist nicht erreichbar. I n weiteren chemischen Synthesen wurde der Wasserstoff am N- und O-Atom der H y d r o x a m s ä u r e f u n k t i o n substituiert und die fungizide Aktivität dieser Verbindungen lintersucht. Eine Veränderung im pilzlichen Wirkungsspektrum t r a t nicht ein; es

340

T h . Strumpf, D. Zanke, E . K l u g e

*n-10 25

Ì 20 a 75

x n--3

xn-2 n-7

0-(CH2)„ -C0-NH-0H

Abb. 8. Zusammenhang zwischen der Wirkung von co(^-Naphthoxy)-alkylhydroxamoi säuren gegenüber Phylophthora cactorum ra-005 s2 (Leii. et Coen) S c h r o e t . (Myzelwaohstunistest — ED 5 0 ) und der SubstituentenkonEDsi-3,12-10-sX+7S^5-10-s i 0,951 0,975ja 3,15 W'" s t a n t e n n 10

wurde aber eine deutliche Steigerung der Aktivität beobachtet (Tab. 1). Zwischen der Lipophilie und der Wirkung konnte keine signifikante Korrelation gefunden werden, so daß bei den an der funktionellen Gruppe substitutierten Verbindungen neben dem hydrophoben Terni elektronische oder sterische Einflüsse beteiligt sein müssen.

Schlußfolgerungen Die Wirksamkeit von /S-Naphthoxy-alkylhydroxamsäuren wird wesentlich durch den hydrophoben T e r m beeinflußt, was auf eine relativ unspezifische Wirkung schließen läßt. Die Verbindungen vereinigten in sich eine günstige K o m b i n a t i o n von fungiziden und bakteriziden Eigenschaften, ohne jedoch die Aktivität von Spitzenwirkstoffen zu erreichen. I h r e P h y t o t o x i z i t ä t ist gering.

Literatur [1] Artemenko, A. J . , Synthese von O-Acvlhvdroxanisäuren (russ.), Zh. org. Khim. 7 (1971), 7 1 4 - 7 2 1 [2] H a u s e r , C. K . and W . B . R e n f r o w jr., Benzohydroxamic aeid, in B l a t t , A. H. (Hsg) Organic Synthesis, J o h n Wiley & Sons, New York 1943, Vol. I I , 67 [3] M a e h r , H., Antibiotics and other naturally occuring Hydroxamic acids and Hydroxamates, Pure Appi. Chem. 28 (1971), 6 0 3 - 6 3 6 [4] P r i y a d a r s h i n i , U. and S. G. Tandon, Preparation and properties of some N-Aryl Hydroxamis acids , J . Chem. Eng. 12 (1967), 143 — 144

JI. H .

AHHPEEB

rjiaeHbiü

ßomaHtmecKiiü

cad AnadeMuu

uayn CCCP,

Mocnea,

CCCP

PoJIb BHTaMHHOB B yCTOHIHBOCTH PaCTeHHH

K

3HaieHHe

yCTOHHHBOCTH

K

Kny n H T a T e j i b H H M H n o T p e Ö H o e T H M H n a p a 3 H T a H a n e K B a T H o ß K O H i i e H T p a u H e i i cooTBeTCTByiomnx coenHHeHHH, HeoöxoHHMbix n a T o r e H y , B paCTeHHH. H a peHeJieHHyiO

pOJIb BHTaMHHOB, B HaCTHOCTH, M e 3 0 H H 0 3 H T a ,

ÖHOTHHa,

on-

naHTO-

TeHOBOH KHCJIOTbl, T H a M H H a H U P . , B p a 3 B H T H H B036YHHTEJIEH HH(|)eKL(HOHHbIX 6ojie3Heü,

0C06EHH0

Bbi3biBaeMbix

canpoHTHbiMH

opraHH3MaMH,

YKA3MBA-

ETCH B P H ^ E p a ö o T [ 5 — 7 ] . Y H H T H B A N ß o j i b i u y i o NPNCNOCOÖJIEHHOCTB o ß j i n r a T HHX

napa3HTOB

JKHTB, HTO n p H

K

OßMEHY

BEMECTB

OÖJIHraTHOM

pacTeHHH-xo3HHHa,

napa3HTH3Me

pOJIb

MO?KHO

npenno.no-

BHTaMHHOB B yCTOHHHBOCTH

p a C T e H H H K HH(|)eKIiHOHHbIM 3 a 6 o j i e B a H H H M 3HaMHTejIbHO B 0 3 p a C T a e T . B c 3THM H3YNEHHE p o n n BEMECTB A o n o j i H H T e j i b H o r o NHTAHHH n p n napa3HTH3Me

CBH3H

OÖJINRATHOM

HMEET ö o j i b i u o e 3HANEHHE AJIH BbiHBJieHHH aKTopoB

YCTOHHH-

BOCTH PACTEHHH K HHTJIEKHHH, TEM ö o j i e e , HTO 3KCNEPHMEHTANBHBIE

HCCJieno-

B3HHH B 3TOM OTHOUieHHH OHeHb HeMHOrOHHCJieHHbl [ 8 — 1 6 ] . H a u i H

HCCJiejIO-

BAHHH ßBIJIH NOCBHMEHBI H 3 y n e H H i o p o n n BHTAMHHOB r p y n n b i B

—

6HOTHH3,

naHTOTeHOBOH

NMEHHHBI

H-tejiTOii HHHE.

(Puccinia

Kan

6oJIbHbIX

KHCJIOTbl

H THaMHHa

striiformis)

NOKA3AJIO

paCTeHHHX,

H CTeßJieBOH

H3YNEHHE non

B yCTOHHHBOCTH (P.

conepmaHHH

BJIHHHHeM

pacTeHHii

graminis

f . sp. tritici)

BHTAMHHOB

HH(|)eKLlHH

B

B JIHCTbHX

K

p>KaB-

3HOPOBBIX nnieHHUbl

H co-

HEPMAHHE BHTAMHHOB B 0 3 p a c T a e T ( T a Ö J i . 1 ) . OCOÖEHHO B03PACTAET B ß o j i b H b i x PACTEHHHX

CONEPIKAHHE

6HOTHH3 . Y ? K E

NEPE3 CYTKH y p o ß e H b

BJIHHHHEM HH(J»EKHHH B 0 3 p a c T a e T HA 3 0 — 4 0 % , NEPNIAHHE YBEJIHHHBAETCH

B 2—2,5

pa3a

no

ÖHOTHHA

a HA 1 2 — 15 CYTKH — e r o cpaBHeHHio

co

3ßOPOBBIMH,

NON coHe-

342

Jl. H . A H g p e e B

Ta6.iu.ua 1 CodepMcaHue ôuomuna u naumomeHoeoii Kucsiombi e jiucmbnx pa3Jiwaibix no ycmounueocmu copmoe, uitonijjiupoeaimbix P. graminis f. sp. tritici paca 21 (e MKzlep cyxoeo eeca)

CopT

Karum FpeKyM 114 . Iiittji Kjiaö

CTeiieiii)

CocTOHHHe

BpeMfi nocjie MHOKyjiHUHH,

yCTOii'IOBOCTH

paCTeHHÍÍ

B cyTKax

yCTOii'IHBblil

cpejuieyCTOiiMHBblii BOCnpHHMlIHBLlii

Knjiii

yCTOii'IHBblli

TpeKyM 114

cpeaiieyCTOIPIHBblÜ

JThttji Kjiaö

BOCIipHHM'IHBblii

Bhothii 3aopoBoe fìoJiiiHoe 3/J0p0B0e GoJibiioe 3aopoBoe ßojibnoe nanTOTenoBaH 3nopoBoe 6ojii>Hoe 3nopoBoe ßojibnoe 3aopoBoe ñojibnoe

0

6

0,48

0,39 0,73 0,43 0,42 0,67 1,17

—

0,46 —

0,75 —

KMCJiOTa 41,0 49,0 — 68,0 13,5 13,5 — 15,0 40,0 40,0 47,0 —

12

0,40 1,02 0,40 1,02 0,70 1,34 50,0 68,0 12,5 9,0 35,0 66,0

18

0,40 1,04 0,34 0,83 0,55 1,31 48,0 54,0 15,0 22,5 40,0 68,0

HHOKyjIHpOBaHHhIMH paCTeHHHMH. COAÊp/KaHHe naHTOTeHOBOH KHCJIOTbl H THaMHHa non bjihhhhcm h h ^ c k h h h TaKHíe B03pacTaeT, x o t í i h b MeHbiueft CTeneHH. HanSojibinee yBejinneHHe coAepHíaHHH bht3mhhob HaÔJiionaeTca b nepnon nepexoHa rpnöa b penpojiyKTHBHyio (|)a3y pa3BHTHH. 3HaHHTeiibHoe noBbimeHHe coflepniaHHH BHTaMHHOB oÔHapyjKHBaeTca b j i h c t b h x nmeHHHbi y BOCnpHHMHHBblX K p?KaBHHHHe COpTOB no CpaBHeHHIO C yCTOHHHBHMH. 0 6 pamaeT Ha ce6a BHHMaHHe BbicoKoe conep?KaHHe BHTaMHHOB b y p e a o c n o p a x CTeßjieBOH, ÍKejITOH H ßypoii p/KaBHHHbl. n o CpaBHeHHIO C TKaHHMH paCTeHHH conepmaHHe ÖHOTHHa b h h x b 7 —10 pa3 Bbime. T a n o e BbicoKoe coflep>KaHHe BHTaMHHOB b y p e n o c n o p a x , bhhhmo, HBjiaeTca BamHbiM una nepBbix 3TanoB pa3BHTHH naToreHa b $a3e HHKaBHHHbi, He cnocoÖHbi k c h h Te3y pana BHTaMHHOB, b tom ' m e n e ÖHOTHHa, mii HcnbiTann pan neaKTHBHbix CTpyKTypHbix aHajioroB ÖHOTHHa h ero aHTHMeTaôojiiiTB n u n 6opb6bi c pjKaBHHHHblMH 6ojie3HHMH. BßeneHHe B Cpejiy 3K30reHHbIX HeaKTHBHblX CTpyKTypHbix aHanoroB ÖHOTHHa, no HaiueMy npennonojKeHHio, hojiîkho öhjio C03naTb He$HHHT BHTaMHHOB b cpene h npiiBecTH k HenonHOueHHOMy miTaHHio naToreHa. B cbh3h c s t h m mm nciibiTann nencTBHe pana iieaKTiiBHbix aHanoroB

BHTaMHHbl H yCTOHHHBOCTI) paCTeiIHH K pHiaBHHHe

343

ÖHOTHHa

(neCTHOÔHOTHH, H30FL,eCTH06n0THH, HOpHeCTHOÖHOTHH, TOMOHeCTHu p . ) . McnbiTaHHe npenapaTOB n p o B o n n j i H nyTeM y n e T a H H T H S H p y i o i q e r o nencTBHH npenapaTOB n p n n p o p a m n B a H i i i i y p e n o c n o p CTe6jieBoft P M A B H H H B I B p a c T B o p a x HcnbiTbiBaeMbix coeAHHeHnii pa3HOH KOHueHTpauHH. EbiJio Y C T Â H O B J I E H O , MTO n p e n a p a T H S O H C C T H O S H O T H H MHriiönpyeT n p o p a c T a H H e y p e n o c n o p B KOHHeHTpaijHH 1 0 0 Mr/ji. C X O A H M M A E I I C T B H E M oönanaji H30Mep HOpneCTHOÖHOTHHa H TOMOHeCTHOÔHOTHH . IIoJiyHeHHbie naHHbie HeMOHCTpiipyiOT nepcneKTHBHOCTb naJibHeftiuHx HCCJienoBaHiiii c uejibio HCii0Jib30BaHHH HeanTHBHblX CTpyKTypHblX aHaJIOTOB Ô H O T H H Â HJIH 6opb6bI C pîKaBHHHOH. OÔHOTHH

H

Pe3ioMe YcTaHOBJieHa onpenejieHHan p o j i b BHTaMHHOB — 6HOTHH&, naHTOTeHOBOH KHCJIOTbl H THaMHHa B yCTOHHHBOCTH paCTCHHH niHeHHHbl K pîKaBHHHe. YCTOHMHBbie pacTeHHH, Kan n p a B H j i o , xapaKTepH3yrc>Tcn noHH/KeHHbiM conep>KaHHeM BHTaMHHOB nO CpaBHeHHIO C BOCnpHHMHHBbIMH paCTeHHHMH. l i o n BJIHHHH6M HH(|)eKUHH COßepHiaHHe BHTaMHHOB B TKaHHX paCTCHHH B03paCTaeT, npH^eM 3TO yBejiHHeHHe i i o c r a r a e T ö o j i b i u n x pa3MepoB y BocnpnnMMHBbix pacTeHHft. McnbiTaHHe pa3JiHHHbix npenapaTOB HeaKTHBHbix C T p y m y p H b i x a H a j i o r o B ÔHOTHHa B HeJIHX HHrHÖHpOBaHHH pa3BHTHH HHeKIJHH nOKa3a.HO, HTO 3TH n p e n a p a T b i Î I B J I H I O T C H nepcneKTHBHbiMH X H M H H C C K H M H coenHHeHHHMH, co3naiouiHMn HenoTtHOiiennyio nHTaTejibHyio c p e n y HJIH n a T o r e H a .

JlHTepaTypa [1] C y x o p y n o B , K . T . , 3. X . T e p S e p , F. I I . 13apa6aiiOBa, H . A . I 3 o p o g y j i H H a K SHOXHMHM pacTHTejiLuoro HMMynHTeTa yneiiHe sariHCKH CapaTOBci;oro ynnBcpciiTCTa, X (1933) J\° 1 [2] B e p H e p , A . P . , E . T. K J I H H T , K HMMymiTeTy IMOHOB. N P H H H I M ycTOftiHBOCTH ruionoB apGyaa K „nepHoii r u m m " . T p y a t i KOMHCCHH no iippiirauiiH A H CCCP, 3 (1934) [3] C y x o p y n o B , K . T . , OH3H0Ji0rHH HMMynHTeTa pacTeHHÎi M33:. A H CCCP, MocKBa 1952 [4] GARBEB, E. D., A nutrition — inhibition hypothesis of pathogenicity. Amer. Naturalist 90 (1956), 183—194 [5] HANDELS, G. R., Biotin and interrupted growth of Myrothecium verrucnrin, Amer. J. Bot. No. -52 (1955), JY? 10 [6] LUKERIC, F. L., J . E . D E V A Y , Effect of myoinositol in host tissues on parasitism of Bromus domestica var. President bv Bhodosticta querciana, Phytopathology 54 (1964), 697 [7] C y x o p y n o B , K . T . , B. B. CPHJIHIIIIOB, H . A . I I I a g M a H O B a , H3iio,noriMecKH aHTHBiibie BemecTBa upw BepTHumiJieae xnormaraiiKa A o n j i a a u A H CCP 188 (1966), 470—472 [8] DEFAGO, G., E f f e c t de l'aneurine et de ses composants et de l'heteroauxine sur la croissance de trois parasites du ble, Phytopathol. Zeitschr. 13 (1940), 292 — 299 19] PRYOR, 1). E., The influence of vitamin B ' on the development of cantaloupe powdery mildew, Phytopathology 32 (1942), J\? 10 [10] GOTTLIEB, D., H . HART, Growth substances and the rust fungi, Phytopathology 33 (1943), N o . 8

J l . H. A H n p e e B

344

[11] HASSEBRAUK, K., Untersuchungen über die Einwirkung von Sulfonamiden und Sulfonen auf Getreideroste. 3. Untersuchungen über den Wirkungsmechanismus von Sulfonamiden und Sulfonen, Phytopath. Z. Ii» (1952), 56—72 [12] HOTSON, H. H., The inhibition of wheat stem rust by sulfadiazine and the reversal of this effect by paraaminobenzoic acid and folic acid, Phytopathology, 42 (1952), No. 1 [13] YARWOOD, C. E., A. P. HALL, M. M. NELSON, Nutritive value of rust-infected leaves, Science 117 (1952),

326-327

[14] HOBBS, C. D., M. C. FUTRELL, Influence of vitamins and other compounds on the degree of infection of wheat by Puccinia graminis tritici, Phytopathology 53 (1963), 230-231

[15] HUSAIN, M., C. D. HOBBS, M .C. FUTRELL, Effect of infection by Puccinia graminis tritici on the vitamin B 6 , niacin and pantothenic acid contents of wheat plants, Phytopathology 54 (1964), 5 0 2 - 5 0 5 [16] SHAW, M., N. COLOTELO, The physiology of host-parasite relations. X I I . The effect of stem rust on the nitrogen and amino acids in wheat leaves, Can. J. Bot. 39 (1961), 1351-72

E e K K e p , 3 . 3 . , M . 0 . C e n a x , E . C. J l o ö a n o B a , 0 . B . K a M 3 0 J i K i i H a , H . C. K y j i a e B H C. 3 . M a H c y p o B a Katfiedpu MuKpo6uojiozuu, Hu3iuux pacmeHuü u EUOXUMUU EUOJIOZUHCCKOZO (fianyjibmema MOCKOSCKOZO Focydapcmeeunozo Ynueepcumema, Mocnea, CCCP

B i i o p i i T M b i B O i i T o r e H e 3 e Bo3Öy,n,iiTe.jiii B m i T a H JJCHCTBHC CHCTCMLIX AHTHÖHOTHKOB

npeAnpHHHTbie paHee panoM aBTopoB STOH paßoTbi HCCJienoBanna ßnopHTMa npn pa3BHTHn HCBHTH BHHOB rpnßoB B norpyjKeHHoii H arapoBOH K y j i b T y p a x [5, 6] noKa3anH, HTO OH HMeeTca y B c e x H3yneHHbix npejjcTBaBHTejieii pa3Hbix TaKCOHOMHHecKHX r p y n n (Peronosporales, Saccharomycetales, Pyrenomytales, Plectascales, Polyporales, Agaricalzs H Hyphomycetales) name, CC.IIH OH He BbiHBJiaeTCH no 30HajibH0CTH pocTa Ha a r a p e . 3TH PHTMM pa3JiHHaioTcn TOJibKO no miHTeJIBHOCTH HX nepHOHOB (OT 5-TH-6-TH cycTOHHoro y npeflCTBaBHTejiH nepoHocnopOBbix Phytophthora infestans HO 4-X-5-TH nacOBOro y apo>K?KeH), npnneM OTnejibHbiM TaKCOHOMHiecKHM rpynnaM CBOHCTBeHHa onpeneJieHHaa nponojimnTejibHOCTb nepnona. HanpHMep, rn k h o c t h 3 a T o p M a >KHBaHHH HJIH HCKJIIOMeHHH upa; K H — KOJiH n i i i i a n n o j i i i M H K C i i i i a

[KH]

352

3. 3. E e K K e p ii ap-

Pin*. 7. OcuHJUinium npoueiiTa aKTHBiipoBamibix « a e p [ A H ] h GoraTbix piioocoMaMH rH({) [ T P ] npn pa.sjiHiiHi.ix ao3HponKax rpH3eo(J)yjii)BHiia H iiojiHMHKcnna B iiorpyriienHoii Kyjii/rype Fusarium oxysporum B T o p o r o miKJia npii no3e

aHTiißnoTHKa

B 40 MKr/ivo, n p n KOTopoii OÖHHHO

Ha6nioAaeTCH HanaJio CHH/KEHHH p o c i a y 3Toro o p r a m i 3 M a . [ 4 ] OCUHJUIHUHH yBejiH4eHHH KOJiniecTBa iinep n p n 3TOM He H3MeHHeTCH. IIpoHJieHne n e p n o n a

6jiOKiipc>BKN « n e p ECTECTBEHHO BEUEL K n p o u e c c y yMeHb-

IIieHHH H 3aMeHJieHH?I HX

aKTHBaUHH

(puc. 7),

HTO npHBOflHT B KOHeHHOM

CHCTE K 3aMenaeHHio H yraeTeHHio pa3BHTHH HOBOM r e H e p a u i i n RII(|), o ß n a i j a -

BnaT-6nOpHTMbI H neHCTBHe ailTHÖHOTHKOB

353

i o m w x a n a n T a u H e f i K n a p a 3 H T H 3 M y , XOTH n p o u e H T ß o r a r a x pHÖocoiviaMii B HX HHCJie

ocuHJiJinpyeT

na

ypoBHfix

npaKTHHecKH

HC O T J i H i i a i o m H x c a

OT

KOH-

TpOJlil. M 3 3 T 0 r 0 MOJKHO npCJinOJIO/KHTb, HTO OCHOBHOH MEX3HH3M CMCTCMHOrO 3(|)99— 711 [2] H U D E C O V Ä , D., J . K O V A C , S . G A H E R , B i o l o g i c k a u c i n n o s t t r i m o r f a i n i d u p r o t i Erysiphe cichoracearum n a u h o r k a e h , A g r o c h e m i a , B r a t i s l a v a 18 (1978), 361 — 363 [3] MÜLLER, H . J . , E i n e M e t h o d e z u r P r ü f u n g v o n S y s t e m f u n g i z i d e n , Z e n t r a l b l . f. B a k teriologie, P a r a s i t e n k u n d e , I n f e k t i o n s k r a n k h e i t e n u n d H y g i e n e , I I . A b t . , 120 (1966), 720-725 [4] SCHLÜTER, K . , H . C. WELTZIEN, E i n B e i t r a g z u r W i r k u n g s w e i s e s y s t e i n i s e h e r F u n g i z i d e auf Erysiphe graminis, M e d e d . E a c . L a n d b o u w e t e n s c h . R i j k s u n i v G e n t 36 (1971), 1159-1164 [1]

BUCHENAUER,

M . LENGIES, G. SCHELLENBERG, H . L Y R u n d D .

Institut für Pflanzenschutzforschung Kleinmachnow, DDK

der Akademie

ZANKE

der

Landwirtschaftsivissenschaften,

Wirksamkeit des Wachstumsregulators Pydanon gegen Mehltauarten

Pydanon (3,6-Dioxo-4-hydroxy-hexahydro-pyridazinyl-4-essigsäure) ist als Wachstumsregulator aus der Literatur bekannt, K N O E V E N A G E L U. a. [ 2 ] , K O L L I [ 3 ] . Diese Verbindung und ihre Derivate wurden als Wachstumshenmier in verschiedenen Anwendungsgebieten beschrieben. Durch S I N H A und W O O D [4] wurde der Einfluß von Wachstunisregulatoren auf die Verticilliumwelke von Tomatenpflanzen untersucht. Tabelle 1 Wuchshemmung konzentration:

10

von Winterweizen mg/ml)

Substanz

und

Wintergerste

durch

Pydanon-Derivate

(Wirkstoff-

W u c h s h e n n n u n g in % n a c h 10 T a g e n

OH

°=r\H2 h-N„n>0 I

Wintergerste

Winterweizen

Blatt-

Blatt-

Wurzelapplikation

Wurzelapplikation.

88

6(3

65

80

83

74

33

58

60

58

28

60

63

60

23

80

H

O = P S

H2

0 C Z H5

I H H0^,CH2-OC H2

/ C Ü H5 N

\

C2H5

I

H 0-C-(CH2)3-CHJ

ch2-C^ H2 H-N.

25

0

Systemfungizide

OH

M. LENGIES, G . SCHELLENBERG, H .

386

LYR, D.

ZANKE

B U C I I E N A U E E und E R W I N [ 1 ] demonstrierten, daß durch Blatt- oder Bodenbehandlung von Tomaten- und Baumwollpflanzen mit Pydanon vor der Inoculation mit einem mikrosklerotischen Stamm von Verticillium dahliae die Schwere der Blatt- und Gefäßverfärbungen gemindert werden kann. Hieraus resultierte unser Interesse, die Wirksamkeit dieser Verbindungen gegen Echte Mehltauarten im Zusammenhang mit ihrer wachstumsregulierenden Wirkung näher zu untersuchen.

Zur E r m i t t l u n g der w u c h s h e m m e n d e n E i g e n s c h a f t e n von P y d a n o n und seinen D e r i v a t e n wurde W i n t e r g e r s t e der S o r t e , , Vogelsanger G o l d " zur B l a t t b e h a n d l u n g in T ö p f e n auf E r d e und zur W u r z e l b e h a n d l u n g in K u l t u r r ö h r c h e n auf Q u a r z s u b s t r a t angezogen. N a c h d e m die P f l a n z e n eine d u r c h s c h n i t t l i c h e H ö h e von 8 bis 10 c m erreicht h a t t e n , wurden die S u b s t a n z e n in F o r m einer l % i g e n wässrigen L ö s u n g ü b e r die B l ä t t e r als T r o p f n a ß s p r i t z u n g \ind über die W u r z e l n durch Gießen appliziert. 10 T a g e nach der B e h a n d l u n g wurde der L ä n g e n z u w a c h s der P f l a n z e n b e s t i m m t und daraus die p r o z e n t u a l e W u c h s h e m m u n g im Vergleich zu den b e h a n d e l t e n K o n t r o l l e n e r m i t t e l t . A n a l o g wurde m i t W i n t e r w e i z e n der Sorte ,,Alcedo" verfahren.

E s zeigte sich, daß Pydanon und seine Derivate gute wachstumsretardierende Effekte bei den untersuchten Pflanzenarten bewirkten, die sowohl bei Blatt- als auch bei Wurzelapplikation zu beobachten sind. Dabei fiel außerdem eine gewisse Sortenabhängigkeit in der Wirkung auf (Tab. 1). Tabelle 2 Befallsunterdrückung Pydanon-Derivate Substanz

von Erysiphe graminis MARCHAL ( Wirkstoffkonzentration: 100 \uj/ml)

Mehltaubefallsunterdrückung in % n a c h 7 d protektiv kurativ

44

50

50

57

26

78

37

61

H

H

H

0-C-(CH,),-CHJ

H

durch

W i r k s a m k e i t v o n P y d a n o n gegen Mehltau

387

Tabelle 3 Befallsunterdrückung von Podosphaera leucotricha vate (Wirkstoffkonzentration: 500 \xg/ml) Substanz

( E L L . et Ev.)

Behandlungsart

H0^CH2-Cf H2

protektiv

SALM durch Pydanon Mehltaubefallsunterdrückung in % nach 8 d

15 d

100

83

°

kurativ systemisch-protektiv systemisch-kurativ

93 86 86

83 69 79

.CH,-C^°

protektiv kurativ systemisch-protektiv systemisch-kurativ

100 78 86 78

79 69 65 51

N i

O^^SHÜ

OC2HS

LQ

Deri-

H

HO^/CHJ CCn^C2H5

protektiv

71

62

f ] Hz N-N^jg/^O ^

kurativ systemisch-protektiv systemisch-kurativ

100 49 93

69 20 41

protektiv kurativ systemisch-protektiv systemisch-kurativ

100 100 71 71

97 79 79 62

^ H j

0 =

O-C-(CH2)3-CH3 Q 0

£ |_|

>
v von ^^ Botrytis cinerea EDS0 =3"t0 ~ 7mot Lsg. trons - 2,6-Dimethyl-N-dodecylmorholin I I I I I 7 / 3 7 1 s 7 x70' x70'

3 7 1 3 ' xlO'emol.Substanzlsg. x70's

Abb. 8. Vergleich der als Trocken massezuwachsHemmung gemessenen fungiziden W i r k s a m k e i t chromatographisch gereinigter Substanzen von trans-2,6-Dimethyl-Ndodecylmorpholin und seinem N-oxid bei 65 Stunden Schüttelkultur von Botrytis cinerea in Nährlösung nach S I S L E R DieWachstumshemmung ist bei beiden S u b s t a n z e n in e t w a s unterschiedlichem U m f a n g m i t Verminderung der t y p i s c h e n P i g m e n t b i l d u n g und Auftreten einer Myzelaggregation verbunden

von großer Bedeutung (Abb. 8). Gegenüber Botrytis cinerea-Kulturen ist die fungizide Wirksamkeit der oxidierten Verbindung erheblich geringer als diejenige des Wirkstoffes. N-Oxid-Bildung ist also ein wirksamer Entgiftungsmechanisnius f ü r den fungiziden Wirkstoff.

Literatur [1] [2]

H A W K I N S , I ) . 1 ) . , W . H . D O W N , L . F . C H A S S E A I T D and J . 1 ) . L E W I S , The metabolism of tridemorph in rats, Pestic. Science 5 (1974), 535 — 542 J E R C H E L , O . und G. J U N G , N-Oxide und N,N'-Dioxi(le tertiärer Amine, Her. Chem. Ges. 85 (1952),

1130-1138

and N . D R E S C H E R , The behaviour of tridemorph in soil, L'roc. 7 T H B r i t . Insect. Fung. Conf. 1973, 57 [4] W A R I N G , R . H. and M . S. W O L F E , Distribution of tridemorph and its metabolites in barley plants grown to m a t u r i t y , I'estic. Science (1 (1975), 169—172

[3]

OTTO, S .

TRÖGER, 11., BLECHSCIIMIBT, I ) . u n d G . MÜLLER Friedrich

-Schiller-1'niversität

Jena,

DDR,

Sektion

Biologie

Verwendung von TMTD bei der Konservierung wertvoller Papiererzeugnisse

Zwischen 1964 und 1970 haben die Autoren eine Vielzahl von Untersuchungen zur Konservierung pilzgeschädigter Papiererzeugnisse d u r c h g e f ü h r t . Neben dem J e n a e r Papierspaltverfahren unter Anwendung desinfizierender und alkalisierender Heißwasserbäder sowie dem Einsatz von alkalischen Kleistern aus Cellin (Carboxymethylzellulose) durch den R e s t a u r a t o r (MÜLLER) wurden zusätzlich die Möglichkeiten des Einsatzes von mikrobenvernichtenden Stoffen im Cellinkleister untersucht. An die Fungizide werden dabei hohe Anforderungen gestellt. Sie dürfen nicht humantoxisch, müssen ungefärbt, nicht flüchtig, nicht leim- bzw. kleisterverändernd u n d auch nicht schädlich gegen Druckfarben, Tinten u n d die Papierfasersubstanzen sein. Alle meist gegen Mikroben gut wirksamen Schwermetalle wie Hg, Ag, Cu, Cd, Zn u n d P b beeinträchtigen die Leimung und die Kleisterkonsistenz oder wurden durch die Kleistersubstanzen unwirksam. Von den geprüften organischen Fungiziden h a t t e n sich in den Kurzzeitversuchen (ca. 1 —4 J a h r e ) a m besten Tetramethylthiuramidsulfid (TMTD, 1—6 mg/ml Cellinkleister) und Captan (5 mg/ml Kleister) bewährt. 1966 u n d 1969 h a t t e n die Autoren u. a. über die Anwendung u n d Beeinträchtigung des T M T D (Bestimmung mit modif. CuJ-Methode) auf u n d in Papier nach Normallager und auch bei künstlicher Alterung berichtet (Wiss. Z. d. Fr.-Schiller-Univ. 15, 465, 1966 u n d Zbl. Bibl. Wes. 83, 342, 1969). 1979 wurden wieder Analysen über die Beständigkeit des T M T D vorgenommen u n d die fungizidversetzten Papiere nach 10 bzw. 14 J a h r e n bezüglich Haltbarkeit und Vergilbung sowie Mikrobenfestigkeit bei B e i m p f u n g und Feuchtlagerung getestet. Dabei zeigte sich, d a ß T M T D in Cellin mit Metallzusätzen auf Hadern- und Filterpapier nach 14 bzw. 10 J a h r e n noch mit meist mehr als 7 5 % der Anfangsmenge vorhanden ist und die Papiere bei B e i m p f u n g und Feuchtlager (6 Monate) nicht von Mikroben bewachsen und zerstört werden k o n n t e n (Kontrolle völlig verrottet). Folgender Ansatz hat sich am besten b e w ä h r t : T M T D bzw. Captan (5 mg/ ml) gebrauchsfertiger Cellinkleister) wird in warmem Aceton gelöst und durch Wasserzugabe auch mit Zusätzen frisch feinst verteilt ausgefällt. I n die milchigweiße Suspension wird die entsprechende Menge Cellin eingerührt. Der Kleisteransatz benötigt etwa 24 Std. Quellung f ü r gut streichfähige Konsistenz. Wichtig f ü r die Wirksamkeit des T M T D ist die feinste Verteilung an der Carboxymethylzellulose. Nicht gelöste Fungizid-Partikel verfärben sich braun und waren auf Filterpapierbögen festzustellen. Dicke Leimschichten auf dem Papier erscheinen nach 14 J a h r e n Lagerung leicht weißgelb verfärbt. Während der Papierfabrikation in den „ S t o f f " eingerührtes HandelsTMTD war im handgeschöpften Papier völlig a b g e b a u t , u n d die Bögen waren vergilbt und schimmelten bei Beimpfung. Da T M T D sich über D i t h i o k a r b a m a t e zer-

428

R.

TRÖGER, D .

BLECHSCHMIDT,

G.

MÜLLER

setzt, kamen bei einigen Cellin-TMTD-Chargen geringe Zn- und Mn-Salz-Zusätze zur Anwendung, um in der Zersetzungsreaktion die wirksamen Fungizide Zineb (Ziram) bzw. Maneb in der Leimschicht entstehen zu lassen. Über ihre fungizide Wirkung kann noch nichts ausgesagt werden, da bei Anwesenheit von T M T D im Leim die fungizide Wirkung bereits gegeben war. F ü r die Erhaltung des T M T D scheinen diese Metallsalzzusätze aber sehr wesentlich zu sein. (Die ausführliche A b h a n d l u n g erscheint im Zhl. B i b l i o t h e k s w e s e n )

M . A . DE WAARD a n d A . FUCHS Laboratory

of Phytopathology,

Agricultural

I'niversity,

Wageningen,

The

Netherlands

Resistance to Ergosterol Biosynthesis Inhibiting Fungicides

Introduction Since 1967 fungicides have been developed which specifically interfere with ergosterol biosynthesis. F o r various reasons these fungicides occupy a rather special place among the systemic fungicides. Chemically, they comprise a heterogeneous group, however, with two common characteristics. They all have at least one nitrogen-containing heterocyclic ring; in addition, with two exceptions (buthiobate and prochloraz) they contain at least one asymmetric carbon atom. On the basis of the chemical nature of the nitrogen-containing heterocyclic ring present the following sub-groups can be distinguished: — — — — —

piperazines: triforine morpholines: dodemorph, fenpropimorph, tridemorph pyridines: buthiobate pyrimidines: fenarimol, nuarimol, triarimol imidazoles: clotrimazole*, econazole*, imazalil, miconazole*, phenapronil, prochloraz — triazoles: biloxazol, CGA64.250, CGA 64.251, diclobutrazol, fluotrimazole, triadimefon, triadimenol

Due to the presence of (an) avsmmetric carbon atom(s) these chemicals occur in different steroisomeric forms which may often differ significantly in fungitoxicity. F o r instance, the (—) enantiomer of triforine is much more active than its ( + ) analogue ( O S T [ 1 5 ] ) . Fenpropimorph ( P O M M E B and H I M M E L E [ 1 6 ] ) and triadimenol ( B U C H E N AUEK [ 5 ] ) present two other examples of which the activity has been found to depend on the stereoisomer involved. Apart from the stereoisomerism due to the presence of the asymmetric carbon atoms in the side chains, in the triforine molecule another form of stereoisomerism originates from the nature of the piperazine ring. The chair form of the piperazine ring permits the l-formamido-2,2,2-trichloroethyl side chains to occur in two different orientations at each of the ring nitrogen atoms, viz. equatorial or axial. According to J O S E P O V I T S and G A S Z T O N Y I [ 1 4 ] , with one side chain equatorial and the other axial, hydrogen bonding can be assumed to occur between the formamide group in one chain and the carbonyl group in the other. Alleged higher water solubility of this stereoisomer than * U s e d in m e d i c i n e a g a i n s t h u m a n f u n g a l p a t h o g e n s .

M . A . DE W A A R D , A . F U C H S

430

t h a t of the one with both side chains oriented equatorially is believed to be responsible for its greater biological activity. I n general, t h e ergosterol biosynthesis inhibitors are broad spectrum fungicides, acting against representatives of Ascomycetes, Basidiomycetes, and Fungi imperfecti ( F U C H S and D R A N D A R E V S K I [ 7 ] ; B U C H E N A U B R [ 4 ] ) ; Oomycetes, on the other hand, are m u c h less s e n s i t i v e (SREGELEI al., [ 2 0 ] ; BUCHENAUER a n d ROHNER [ 6 ] ; DE WAARD a n d

I n interpreting the literature data, it should be realized, however, t h a t the reported sensitivities of fungi towards these fungicides — which even among taxonomically closely related fungal species often differ considerably — might depend on the predominant stereoisomer present in t h e formulations used (c/. O S T [ 1 5 ] ) . Ergosterol biosynthesis inhibitors affect spore germination generally less than germ t u b e elongation. I n i t i a l spore germination m a y be normal while germ tubes m a y become heavily distorted resulting in abnormal growth. H y p h a e are frequently swollen and/or excessively branched. Nevertheless, dry weight increase, respiration a c t i v i t y mitosis and nucleic acid and protein synthesis are not or only slightly inhibited. However, in cultures treated with these fungicides often accumulation of free f a t t y acids occurs together with a decrease in C-4 desmethyl sterols (primarily ergosterol) and an increase in methyl and dimethyl sterols. Therefore, inhibition of C-14 demethylation in the ergosterol biosynthetic p a t h w a y is believed to be t h e primary site of a c t i o n , although additional sites of a t t a c k are possible (c/. R A G S D A L E [ 1 7 ] ) . RAGSDALE [ 2 5 ] ) .

R e s i s t a n c e ; Fitness and Virulence of Resistant M u t a n t s P r a c t i c a l application of fungicides which inhibit ergosterol biosynthesis has not so far led to a n y confirmed case of resistance*. I n contrast, in vitro, resistant m u t a n t s can often be readily obtained b y selection of untreated or mutagen-treated conidia on agar media with lethal concentrations of anyone of these fungicides. Resistance in fungi to ergosterol biosynthesis inhibiting fungicides is often accompanied with a decrease in fitness or pathogenicity. This has been demonstrated first

in % of uninhibibited growfh

Fig. 1. Relation between virulence of some Cladosporium cucumerinum mutants in a cucumber seedling test and degree of resistance, a : green wildtype strain; b : off-white 'parent' strain (from: Fuchs et al., 1977)

* However, recently increased levels of tolerance of Erysiphe graminis f. sp. hordei to tridemorph in both glasshouse and field experiments have been reported ( W A L M S L E Y WOODWAED e t a l . , [ 2 7 ] ) .

Resistance to ergosterol biosynthesis inhibiting fungicides

431

with triarimol- and triforine-resistant mutants of Cladosporium cucumerinum; the degree of resistance was found to be inversely proportional to pathogenicity (FUCHS and V I E T S - V E R W E I J [10]; F U C H S etal., [9]) (Fig. 1). Later, this finding has been confirmed in experiments with the same and other fungal species ( B U C H E N A U E R [3]; VAN TUYL [21]). Imazalil resistance in Penicillium expansum, on the other hand, was not always coupled with decreased fitness (VAN TUYL [21]). Mutants of Aspergillus nidulunS with identified genes for resistance displayed varying degrees of reduced fitness with respect to spore germination, germ tube elongation, mycelial growth or sporulation (DE W A A E D and S I S L E R [26]; DE W A A R D and G I E S K E S [22]). Germ tube elongation rate appeared to be negatively correlated with degree of resistance. All mutant strains resembled each other in impaired ability to produce spores. Mutant strains of C. cucumerinum also produced less spores, which at the same time were often inviable (SHERALD and S I S L E R [19]; F U C H S and DRANDAREVSKI [8]). The above observations suggest that resistance in pathogenic fungi to ergosterol biosynthesis inhibiting fungicides might have significant epidemiological implications since the chance of such strains to survive in the absence of selection pressure by the fungicide is severely reduced. F U C H S and DRANDAREVSKI [8]), therefore, concluded that development of resistance to this type of fungicide under practical conditions is rather unlikely. The danger of development of resistant populations may once more be reduced inasmuch as resistant strains can be controlled with normal fungicide a p p l i c a t i o n r a t e s (BROWN a n d H A L L [ 2 ] ) .

Cross-Resistance A summary of data on cross-resistant patterns to ergosterol biosynthesis inhibiting fungicides has been compiled by F U C H S et al. [9]. Usually, cross-resistance of fungi to these fungicides is reciprocal; however, exceptions to this rule have been noticed. For instance, imazalil resistance in C. cucumerinum (FUCHS et al. [9]), in Phialophora cinerescens (VAN T U Y L [21]) and in A. nidulans strain J130 (DE W A A R D and G I E S K E S [22]) was not always attended with resistance to other ergosterol biosynthesis inhibitors tested. Similarly, imazalil or tridemorph resistance in Ustilago maydis did not cause resistance to triadimefon (BARUG and K E R K E N A A R [1]). These data suggest that some of these fungicides — in particular imazalil — may have additional sites of attack besides C-14 demethylation. Moreover, different mutations, even within the same gene, might lead to different mechanisms of resistance or to slight differences in the same mechanism, for instance, to a differential uptake of these fungicides (DE W A A R D and VAN NISTELROOY [24]). These hypotheses might also explain the varying degrees of resistance to a particular fungicide (e.g. F U C H S and V I E T S - V E R W E I J [10]; VAN T U Y L [ 2 1 ] ; DE W A A R D a n d G I E S K E S [ 2 2 ] ; B A R U G a n d K E R K E N A A R [ 1 ] ) .

The genetics of fungicide resistance has been thoroughly investigated by VAN TUYL [21] who described eight genes for multigenic resistance to imazalil and fenarimol in A. nidulans, the imaA or imaB genes conferring the highest degree of resistance to imazalil. Allelic imaA or imaB mutations, however, could also result in significantly lower levels of imazalil resistance. Upon combination of different ima genes for resistance in recombinant strains a higher degree of resistance was obtained, indicating additive effects (VAN TUYL [21]).

M . A . DE WAARD, A .

432

FUCHS

Resistance to sterol biosynthesis inhibiting fungicides in A. niduluns may also give rise to pleiotropic effects (cross-resistance, hypersensitivity) of fungitoxicants with a dissimilar mechanism of action such as acriflavin, chloramphenicol, cycloheximid