Archiv für Tierernährung: Band 13, Heft 5/6 [Reprint 2021 ed.] 9783112524589, 9783112524572

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ARCHIV FÜR TIERERNÄHRUNG BEGRÜNDET

VON

ERNST MANGOLD HERAUSGEGEBEN

VON

A N D R E A S HOCK und HANS B E R G N E R UNTER MITWIRKUNG VON K. Breirem, Vollebekk • J. Brüggemann, München J. K i e l a n o w s k i , Warschau • W. Lenkeit, Göttingen K. N e h r i n g , Rostock • H. T a n g l , Budapest Grete T h o r b e k , Kopenhagen • M. F. Tomme, Moskau W. Wöhlbier, Stuttgart-Hohenheim

13. BAND Ausgegeben am 20. 12.1963

HEFT

5/6

AKADEMIE-VERLAG

• BERLIN

ARCHIV FÜR T I E R E R N Ä H R U N G • IJ. B A N D NR.J/6 • S. 1 6 1 - 4 8 8 • B E R L I N • I . J U L I 196)

INHALT Untersuchungen zum N-Stoffwechsel beim laktierenden Rind unter Verwendung von oral verabreichtem Ammoniumbicarbonat- [ l6 Nl / . Mühlenpfordt und L. Hussel: 1. Mitteilung: Einführung E. Kolb: 2. Mitteilung: Literaturübersicht zum N-Stoffwechsel bei Wiederkäuern W. Rommel: 3. Mitteilung: Klinischer Bericht, Versuchsablauf und Probenentnahme M. Ulbricb, A. Wöllmen undH. und Mielke: 4. Mitteilung: Fütterung N-Bilanz

261 . . . .

264

. . . 275

287 M. Ulbrich und H. Scholz: 5. Mitteilung: Zum Einbau von Ammoniumbicarbonat-N in verschiedene Fraktionen des Panseninhaltes 296

H. Gürtler und I. Müller: 6. Mitteilung: Zum Einbau von Ammoniumbicarbonat-N in verschiedene Blutfraktionen 307 H. Mielke: 7. Mitteilung: Die Verwertung des Ammoniumbicarbonat-N zur Milchproteinsynthese und dessen Ausscheidung mit der Milch 329 A. Hennig, K. Gruhn und H. Faust: 8. Mitteilung : Einbau des markierten Stickstoffs in die Aminosäuren der Milch . 349 AI. Ulbrich und H. Scholz: 9. Mitteilung: Zur Ausscheidung von Ammoniumbicarbonat-N in Kot und Harn 366 J. Martin: 10. Mitteilung: Pathologisch-anatomische und -histologische Befunde 379 I. Müller undH. Gürtler: 11. Mitteilung: Zum Einbau von Ammoniumbicarbonat-N in verschiedene Organe 387 K. Gruhn und H. Faust: 12. Mitteilung : Aminosäuregehalt und Einbau des Ammoniumbicarbonat-N in die Aminosäuren der Leber, der Skelettmuskeln und des Diaphragma 401 H. Hübner und W. Rolle: 13. Mitteilung: Kinetische Betrachtungen über das Auftreten der 15 N-Markierung in der Milch 408 K. Wetzel, G. Hübner und O. Gebhardt: 14. Mitteilung: Mathematische Analyse der Verwertung von zugefüttertem Ammoniumbicarbonat für die Synthese von Milch- und Körpereiweiß 424 A. Wöllmen, H. Faust, J. Irlenbusch und F..-R. Franke: 15. Mitteilung: Vergleichende Betrachtungen über den Einsatz von Ammoniumbicarbonat-Stickstoff in der Fütterung oder Düngung 443 E.-R. Franke: 16.,Mitteilung: Zur Praxis der Ammoniumbicarbonat-Verfütterung 455 M. Ulbrich und H. Scholz: 17. Mitteilung: Zum Verbleib von Ammoniumbicarbonat-N beim Silierungsvorgang 460 W. Rolle undH. Hübner: 18. Mitteilung: Probenchemische Umarbeitung von Ammoniumchlorid durch Oxydation mit CuO zur massenspektrometrischen Isotopenanalyse am Stickstoff^. 467 H. Birkenfeld, G. Haase und G. Meier: 19. Mitteilung: Die Bestimmung der relativen Isotopenhäufigkeiten des Stickstoffs 471 H. Faust, H. Gürtler, G. Hübner, H. Hübner, H. Mielke, W. Rommel, M. Ulbrich und K. Wet^el: 20. Mitteilung : Zusammenfassender Bericht und Schlußbetrachtungen 475

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Untersuchungen zum N-Stoffwechsel beim laktierenden Rind unter Verwendung von oral verabreichtem Ammoniumbicarbonat-[15N] 1. Mitteilung Einführung In der Deutschen Demokratischen Republik wie auch in anderen Ländern, in denen die industrielle Produktion nach Umfang und Größe ständig zunimmt und einen zunehmenden Anteil aller Erwerbstätigen für sich in Anspruch nimmt, steht die Landwirtschaft ihrerseits vor der Aufgabe, einen steigenden Bedarf an Nahrungsmitteln aus ihrer pflanzlichen und tierischen Produktion zu decken. Diese Aufgabe kann die Landwirtschaft nur lösen, wenn sie ihre Arbeitsproduktivität steigert, wobei in der Perspektive ähnliche Maßstäbe anzulegen sind, wie sie in der industriellen Produktion bereits geläufig sind. Hierbei entfällt auf die chemische Industrie ein entscheidend wichtiger Beitrag, nämlich die Produktion großer und notwendigerweise noch wesentlich zu steigernder Mengen an Düngemitteln, Herbiziden, Insektiziden, Wuchsstoffen u. a. zur Erhöhung der pflanzlichen Produktion sowie zur Steigerung der Arbeitsproduktivität dieses großen Gebietes der Landwirtschaft. Mit derselben Konsequenz ist auch die Produktion solcher Stoffe in der chemischen Industrie anzustreben, welche als Tierfutter wertvoll sind, um die pflanzliche und tierische Produktion zu entlasten und die finanziellen Aufwendungen für den Import an Kraftfutter zu verringern. Die Produktion von Stoffen für die tierische Ernährung in der chemischen Industrie — und dies gilt in der Perspektive im Prinzip auch für die Stoffe für die menschliche Ernährung — kann bei der für eine industrielle Produktion charakteristischen kontinuierlichen Nutzung der Produktionsmittel mit allen Möglichkeiten der Mechanisierung bis zur Automatisation mit einer hohen Arbeitsproduktivität und intensiven Nutzung der investierten Anlagen ausgeführt werden. Der landwirtschaftlichen Produktion sind dagegen eigentümlich eine nicht kontinuierliche Nutzung der Produktionsmittel, sehr weitläufige Produktionsanlagen und entsprechend sehr hohe Aufwendungen für den innerbetrieblichen Transport, weitgehende Produktionsverluste durch ungünstige bioklimatische Bedingungen und, aus all diesen Ursachen resultierend, eine niedrige und nur schwer zu erhöhende Arbeitsproduktivität. Wenn bereits heute verschiedene von der chemischen Industrie durch chemische Synthese oder auf biochemischem Wege gewonnene Stoffe für die tierische Ernährung zur Anwendung kommen, so ist dieses nur der Anfang einer im obigen Zusammenhang als prinzipiell und äußerst bedeutungsvoll anzusehenden Entwicklung. In diesem allgemeinen Rahmen besteht zur Zeit ein besonderes Interesse an dem folgenden speziellen Problem: Von einigen einfachen anorganischen Stickstoff-Verbindungen, wie Ammoniumbicarbonat, Ammoniumsulfat und Harnstoff, ist seit längerer Zeit bekannt, daß sie als Zusatz zum Futter von Wiederkäuern bis zu einem merklichen Grade einen Ersatz für Eiweiß darstellen können. Es ist nachgewiesen, daß der Wiederkäuer den 18

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MÜHLENPFORDT und HUSSEL, 1. Mitteilung

Stickstoff aus diesen Verbindungen zum Aufbau von Aminosäuren und zur Bildung von Eiweiß verwenden kann. Dieselben Verbindungen sind aber auch als Düngemitte:! für die Steigerung der pflanzlichen Produktion von Bedeutung. Es ist daher erforderlich, die volkswirtschaftlich günstigste Verwendungsart objektiv zu ermitteln. Voraussetzung hierfür ist unter anderem die Kenntnis des Wirkungsgrades ihrer Verwertung bei Zusatz zum Futter der Wiederkäuer. Die Arbeitsgemeinschaft „Verfütterung von Ammoniumbicarbonat an das Rind" hatte sich zunächst die Aufgabe gestellt, den Verwertungsgrad des Stickstoffs von zugefüttertem Ammoniumbicarbonat bei laktierenden Kühen im Vergleich zum Verwertungsgrad des Stickstoffs des natürlichen Futters in bezug auf die Milchbildung zu bestimmen. Nach Ermittlung dieser noch nicht bekannten Kennzahlen wurden Schlüsse auf die volkswirtschaftlich günstigste Nutzung dieses Chemikals gezogen. Das Ammoniumbicarbonat wurde zum Gegenstand der Untersuchung gemacht, da es gegenüber dem ebenfalls anwendbaren Harnstoff den wesentlichen Vorteil besitzt, bei einer großtechnischen Herstellung billiger zu sein. Es erscheint zunächst auch unzweckmäßig, den nächsten Schritt in der Produktion zum Harnstoff auszuführen, der im tierischen Organismus auf dem Wege der Spaltung des Harnstoffs wieder rückgängig gemacht werden muß. Die größere Empfindlichkeit gegen Feuchtigkeit und der relativ hohe Zersetzungsdruck machen eine sorgsamere Behandlung des Ammoniumbicarbonats erforderlich. Sie erfordert eine besondere Technologie bei dem Transport und der Lagerung, wofür Säcke aus einem gasdichten Material allerdings ausreichen dürften. Für die im Rahmen der Arbeitsgemeinschaft durchgeführten Untersuchungen wurde ein mit dem stabilen Isotop 1S N markiertes Ammoniumbicarbonat verwendet. Die Verwendung des markierten Stickstoffs gestattete vertiefte Einblicke in biochemische Zusammenhänge, die insbesondere aus dem zeitlichen Verlauf der relativen Häufigkeit des 15 N in den zahlreichen weitgehend fraktionierten körpereigenen Substanzen und Exkreten der Tiere hervorgehen. Es bedarf besonderer Erwähnung und Begründung, daß entgegen der in der biologischen Forschung üblichen Verfahrensweise, die Beobachtungsergebnisse aus einer großen Zahl von Experimenten auszuwerten, im Rahmen dieser Arbeit an nur zwei Tieren je ein Experiment zur Durchführung kam. Eine Sicherung der Ergebnisse gegen individuelle Schwankungen wird darin gesehen, daß die Bestimmung der Wirkungsgrade der Verwertung des Stickstoffs aus dem Ammoniumbicarbonat und aus den natürlichen Futtermitteln gleichzeitig und an denselben Tieren ausgeführt wurde. Für die ökonomische Beurteilung ist nur das Verhältnis der Wirkungsgrade der Verwertung maßgeblich, welches bei einem solchen Vorgehen von individuellen Schwankungen wenig beeinflußt sein dürfte. Da die an beiden Tieren gewonnenen Ergebnisse gut übereinstimmen und die für den Stickstoff der natürlichen Futtermittel gefundenen Wirkungsgrade der Verwertung mit den klassischen Tabellenwerten in Einklang stehen, dürften allgemeingültige Schlußfolgerungen erlaubt sein. Die Untersuchungen haben nicht nur die Wirkungsgrade der Verwertung des Stickstoffs aus Ammoniumbicarbonat und aus natürlichen Futtermitteln ergeben, sondern auch einige biochemische Fragen beantwortet. Es entstanden aber auch neue, noch nicht geklärte Probleme, die zu beantworten weiteren Arbeiten vorbehalten

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bleibt. Hierbei werden die gewonnenen experimentellen Erfahrungen und methodischen Fortschritte von großem Nutzen sein. Es gebührt dem Ministerium für Landwirtschaft, Erfassung und Forstwirtschaft, insbesondere den Herren Dr. Jahn und Waschkeit, Dank dafür, daß der ArbeitSr gemeinschaft die finanziellen Möglichkeiten gegeben wurden, auf dem Gebiet der Verfütterung von Ammoniumbicarbonat bisher offen gebliebene Fragen einer Beantwortung zuzuführen. Es erfuhr dieses Kollektiv auch jede gewünschte Unterstützung durch die Bezirksleitung Leipzig der SED, insbesondere durch die Herren Krüger und Rizka. Besonderer Erwähnung bedarf die von den Autoren des zusammenfassenden Berichtes und der Schlußbetrachtungen geleistete Arbeit. A n dieser Stelle dankt die Arbeitsgemeinschaft ihrem Sekretär, Herrn Doz. Dr. R O M M E L , für die vorbildliche Erfüllung seiner Aufgabe. Prof. Dr. J.

MÜHLENPFORDT

Vorsitzender der Arbeitsgemeinschaft, Direktor des Instituts für Physikalische Stofftrennung, Leipzig, der Forschungsgemeinschaft der Deutschen Akade-. , mie der Wissenschaften zu Berlin

Prof. Dr.

L. HUSSEL

Dekan der Vet.-med. Fakultät der KarlMarx-Universität Leipzig, Direktor des Instituts für Staatsveterinärkunde und Veterinärhygiene, Leipzig Eingegangen: 17. Mai 196S

18*

264 .Aus dem Veterinär-Physiologisch-Chemischen Institut der Karl-Marx-Universität Leipzig (Direktor: Prof. Dr. Dr. E. KOLB) mit Abteilung für Ernährungsphysiologie (Leiter: Dr. H. GÜRTLER)

E . KOLB

Untersuchungen zum N-Stoffwechsel beim laktierenden Rind unter Verwendung von oral verabreichtem Ammoniumbicarbonat-[15N] 2.

Mitteilung

Literaturübersicht zum N-Stoffwechsel bei Wiederkäuern Einleitung Der Stoffwechsel von N-haltigen Verbindungen bei Wiederkäuern wurde in den letzten Jahren nicht zuletzt im Interesse der Erarbeitung rationeller Fütterungsnormen und der optimalen Ausnützung der Leistungsfähigkeit des Tierkörpers eingehenden Untersuchungen unterzogen, wobei insbesondere durch den Einsatz markierter Verbindungen zahlreiche neue Erkenntnisse gewonnen werden konnten. Es wurde gezeigt, daß der N - S t o f f w e c h s e l beim W i e d e r k ä u e r infolge der Ausbildung der als Gärkammern wirksamen Vormägen charakteristische B e s o n d e r h e i t e n aufweist, die in ernährungsphysiologischer Hinsicht als sehr zweckmäßig zu betrachten sind und das Tier von der Zufuhr hochwertiger Proteine unabhängig machen. Vergleichsweise zu Tieren mit einhöhligem Magen bestehen im N-Stoffwechsel bei Wiederkäuern insbesondere folgende spezielle Verhältnisse: 1. Ein erheblicher Teil der aufgenommenen P r o t e i n e wird innerhalb kurzer Zeit durch proteolytische Fermente von Mikroorganismen unter B i l d u n g von A m i n o s ä u r e n zerlegt. Die Aminosäuren werden teilweise unmittelbar zur Bildung mikrobieller Proteine verwendet, zum Teil dem Abbau durch Desaminasen unterworfen, wobei es zur Bildung von A m m o n i a k kommt. Das Ammoniak wird entweder zur Synthese von Aminosäuren in den Mikroorganismen herangezogen oder gelangt zur Resorption. 2. Verschiedene N - h a l t i g e V e r b i n d u n g e n n i c h t e i w e i ß a r t i g e r N a t u r , die in pflanzlichen Futtermitteln zum Teil einen erheblichen Umfang des Gesamt-N bilden, werden zum Teil in den Vormägen unmittelbar zur Synthese mikrobieller Proteine herangezogen bzw. tragen zur Ammoniakbildung bei, das zur Synthese von Aminosäuren verwendet wird. 3. Aus den Vormägen werden beträchtliche Mengen an Ammoniak resorbiert und der Leber zugeführt, in der eine umfangreiche Bildung von Harnstoff erfolgt. Ein beträchtlicher Anteil des Harnstoffs (rund 50%) wird über den Speichel und über die Kapillaren der Vormägen wiederum den Mikroorganismen der Vormägen für Proteinsynthesen zur Verfügung gestellt. Dieser sogenannte r u m i n o h e p a t i s c h e N - K r e i s l a u f stellt eine Sparmaßnahme des Organismus dar und dient der N-Versorgung der Mikroorganismen in den fütterungsfreien Intervallen, wenn die Freisetzung von NH 3 relativ gering ist.

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4. Durch die Mikroorganismen der Vormägen werden in erheblichem Umfange V i t a m i n e der B - G r u p p e gebildet, die für die Verwertung von Aminosäuren im Gewebe von Wichtigkeit sind, so das Pyridoxin, die Folsäure und das Vitamin B 12 . Infolgedessen sind die Wiederkäuer von der Zufuhr von B-Vitaminen im Futter unabhängig. Was die Bildung von Vitamin B 12 angeht, so ist eine ausreichende Zufuhr von Kobalt bedeutungsvoll. Die grundlegenden Umsetzungen der N-haltigen Verbindungen beim Wiederkäuer sind in Abbildung 1 zur Darstellung gebracht. In ernährungsphysiologischer Hinsicht bedeutet die umfangreiche Synthese von essentiellen Aminosäuren durch die Mikroorganismen eine E r h ö h u n g der b i o l o g i s c h e n W e r t i g k e i t der zugeführten pflanzlichen Proteine. Futter

Eiweiß

Pansen

E iweiß

Amino säuren

I.

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Harnstoff

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— Ha •nstoff

Speichel Leber

\ Peptide Amino säuren \l Mikrobielles Eiweiß

X ^ Anm i o n i a k ^

An nnosäuren.

I

Labmagen und Darm

E iweiß

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\ ' Amino

Kot

A n imoniak i

U nverdautes N ahrungseiweiß

An l m o n i a k ^ /

1 säuren

/ / Endogener Kot-N

li

\< linosäuen A n :\vebestoffwechse ) Gewebe ( G

Harnstoff L -^-Endogener

Harn

Harn-N Abb. 1. Der Stoffwechsel der N-haltigen Verbindungen beim Wiederkäuer

Zu Problemen des N-Stoffwechsels bei Wiederkäuern, unter besonderer Berücksichtigung des Einsatzes von N-haltigen Verbindungen nichtproteinartiger Natur, liegen zahlreiche Untersuchungen vor, die zum Teil in Monographien ( A N N I S O N und L E W I S , 1 9 5 9 ; S C H M A N E N K O W , 1 9 6 1 ) bzw. in Übersichtsreferaten ( R E I D , 1 9 5 3 ; SCHOENEMANN und K I L I A N , 1 9 6 0 ) ihren Niederschlag gefunden haben. D e r S t o f f w e c h s e l d e r N - h a l t i g e n V e r b i n d u n g e n i n den Vormägen Bereits vor über 70 Jahren wurde durch die Untersuchungen von H A G E M A N N bzw. von Z U N T Z ( 1 8 9 1 ) gezeigt, daß die Mikroflora der Vormägen in der Lage ist, N-haltige Verbindungen nichteiweißartiger Natur zur Synthese von Eiweiß(1891)

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K O L B , Literaturübersicht zum N-Stoffwechsel

Stoffen zu verwerten. Erst spätere Untersuchungen zeigten, daß auch die vom Wiederkäuer aufgenommenen Eiweißstoffe in den Vormägen in erheblichem Umfange abgebaut werden, wobei die Abbauprodukte zur Synthese mikrobieller Proteine herangezogen werden. Eine wichtige Rolle bei diesen Umbauvorgängen spielt das Ammoniak, das in den Vormägen in wechselnden Konzentrationen — in Abhängigkeit von der Fütterung — nachzuweisen ist ( M C D O N A L D , 1 9 4 8 ) . Das Ammoniak wird fortlaufend zur Synthese von Aminosäuren herangezogen bzw. unterliegt einer Resorption durch die Vormagenschleimhaut, so daß dessen Konzentrationen in den Vormägen, gemessen am Gesamtumsatz, relativ niedrig liegen. Der Abbau der Eiweißstoffe der Futtermittel erfolgt hauptsächlich durch die proteolytischen Fermente der Protozoen und Bakterien, zum Teil auch durch Fermente der Futtermittel. Die dabei entstehenden Aminosäuren werden durch bakterielle Desaminasen unter Ammoniakbildung in Ketosäuren übergeführt. Untersuchungen von EL-SHAZLY und SYNGE (1950) ergaben, daß nach Inkubation von hydrolysiertem Casein mit gewaschenen Pansenbakterien bis zu 35% des Aminosäure-N als Ammoniak erschienen. Zur Ammoniakbildung geben auch die Säureamide, das Asparagin und das Glutamin, Anlaß. Die V e r ä n d e r u n g e n des A m m o n i a k g e h a l t e s im Pansen nach Aufnahme unterschiedlicher Futtermittelmischungen wurden in zahlreichen Versuchen geprüft; es konnte gezeigt werden, daß insbesondere folgende Faktoren von E i n f l u ß sind: a) Die A r t und M e n g e der aufgenommenen P r o t e i n e ; s o ergaben Untersuchungen von ANNISON (1956), daß Casein, Erdnuß- und Sojabohnen-Eiweiß rasch abgebaut werden und nach Aufnahme alsbald zu einem erheblichen Ammoniakanstieg führen. Demgegenüber war der Ammoniakanstieg nach Verabreichung von Weizenkleie, von Mais-Eiweiß sowie von Rinderalbumin weniger umfangreich. Vergleichende Untersuchungen über die Abbaugeschwindigkeit von Casein und Fischmehl liegen von CHALMERS et al. (1954) vor. Nach Verabreichung gleichwertiger Proteinmengen bewegte sich der Ammoniakgehalt im Pansen beim Casein zwischen 48 und 68 mg%, beim Fischmehl zwischen 28 und 4 3 m g % . Daraus ist zu entnehmen, daß das Casein durch proteolytische Fermente der Mikroorganismen besonders schnell gespalten wird. Darauf deuten auch Untersuchungen von MCDONALD (1952) hin, der nach Verabreichung von 25 g Casein an Schafe einen Anstieg des Ammoniak-N auf 35 mg% feststellte. Demgegenüber ergab die Zuführung von 25 g Zein keine nennenswerten Veränderungen in der Ammoniakkonzentration. Ein ähnlich langsamer Abbau von Zein wurde bei Untersuchungen von ANNISON et al. (1954) festgestellt: Nach Verabreichung von 300 g Erdnußmehl an Schafe wurde ein Anstieg des Ammoniakgehalts auf Werte von 85 mg% ermittelt; demgegenüber betrugen die Werte nach Verabreichung von 100 g Casein 55 mg%, von 750 g Maisflocken aber nur 10 mg%. Bei Verabreichung von Heu und Mais bewegten sich die Werte im Bereich von 3—5 mg% Ammoniak, bei einer von Heu und Maisflocken zwischen 5 — 8 m g % . Auf Grund dieser Versuche kann angenommen werden, daß das Casein in den Vormägen zu 95%, das Zein hingegen nur zu etwa 40% abgebaut wird.

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Eine ergiebige Quelle für die Ammoniakbildung im Pansen stellt frisches Weidegras dar, insbesondere von Böden, die mit Stickstoffdüngemitteln behandelt werden. Bei Auftrieb von Wiederkäuern auf üppig gewachsene Weiden im Frühjahr ohne entsprechende Übergangsfütterung kann es bei Aufnahme großer Mengen proteinreichen Weidegrases zu einem stärkeren Anstieg des Ammoniakgehaltes in den Vormägen und im Blut und zur Ausbildung der Symptome der Weidetetanie kommen. b ) Das E i w e i ß - S t ä r k e e i n h e i t e n - V e r h ä l t n i s . Bei Gegenwart leicht verwertbarer Kohlenhydrate im Pansen ist die Ammoniakverwertung durch die Mikroorganismen begünstigt, so daß die Ammoniakkonzentration auf einem relativ niedrigen Niveau bleibt. So ergaben Untersuchungen von H E A D und ROOK (1957) in den Vormägen von Kühen auf der Weide Ammoniakkonzentrationen im Bereich von 31 und 35,8 mg%. Bei zusätzlicher Verabreichung von Stärke lag die Ammoniakkonzentration wesentlich niedriger, und zwar bei 17,5 mg%. Fütterungsversuche an Schafen durch L E W I S und M C D O N A L D ( 1 9 5 8 ) ergaben, daß die Ammoniakkonzentration in den Vormägen nach Caseinverabreichung bei gleichzeitiger Gabe von Stärke erheblich schneller gesenkt wurde als bei entsprechenden Kontrollen ohne Kohlenhydratzulagen. Untersuchungen über das Verhalten der Ammoniakbildung bei Rindern unter unterschiedlichen Fütterungsverhältnissen wurden von SCHULKEN ( 1 9 6 1 ) durchgeführt. Bei üblicher Winterfütterung — bestehend aus 1/2 kg Kraftfutter, 11/2 kg Trockenschnitzel, 71/2 kg Betarüben, 3 kg Heu und 21/2 kg Haferstroh — stieg der Ammoniakgehalt im Verlaufe einer Stunde nach der Futteraufnahme von 4 mg% auf 9 mg% an, um nach 6 Stunden wieder den Ausgangswert zu erreichen. Bei Verabreichung von 3 kg Kraftfutter im Abstand von 18 Stunden nach der letzten Fütterung erfolgte ein rascher Ammoniakanstieg im Pansen bis zu 25,7 mg%, der im Verlaufe von S1/* Stunden wieder auf das Ausgangsniveau zurückging. Bei gleichzeitiger Verabreichung von 3 kg Kraftfutter und 2 kg Stärkemehl betrug der Ammoniakanstieg maximal 21,7 mg%, wobei der Ausgangswert bereits nach 7 Stunden wieder erreicht war. Nach Verabreichung von Erdnußschrot, von Baumwollsaatmehl und von Sojaextraktionsschrot in einer Menge von 500 g Rohprotein {bei einem Rohprotein-Stärkeeinheiten-Verhältnis von 1:1,89) wurde ein unterschiedlicher Anstieg der Ammoniakkonzentration beobachtet. Das Maximum wurde nach Verfütterung von Erdnußschrot 4 Stunden nach der letzten Fütterung mit 27,2 mg% NH 3 festgestellt. Nach Aufnahme von Baumwollsaatmehl war das Maximum bereits nach einer Stunde mit einem Wert von 40,7 erreicht, wobei nach 4 Stunden wieder der Ausgangswert vor der Fütterung erreicht war. Bei Gaben von Sojaextraktionsschrot lag das Maximum nach 4 Stunden bei 15 mg%, der Ausgangswert war 6 Stunden nach der Futteraufnahme wieder erreicht. Aus den genannten Arbeiten ist ersichtlich, daß die mikrobielle Aminosäuresynthese unter Verwendung von Ammoniak in den Vormägen durch gut verwertbare Polysaccharide begünstigt wird, wobei letztere sowohl die Kohlenstoffgerüste für die Aminosäuresynthese als auch die Energie für die Proteinsynthese bereitstellen. Untersuchungen von W E L L E R , G R A Y und PILGRIM ( 1 9 5 8 )

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K O L B , Literaturübersicht zum N-Stoffwechsel

ergaben, daß 63—68% des Gesamtstickstoffs im Pansensaft von Schafen als mikrobieller Stickstoff vorlag, was nachhaltig die überragende Bedeutung der Mikroorganismen für die Eiweißsynthese aufzeigt. c) Die genügende V e r s o r g u n g der M i k r o o r g a n i s m e n der Vormägen mit es sent i e l l e n N a h r u n g s f a k t o r e n . Von Bedeutung für die Mikroorganismen ist insbesondere eine ausreichende Zufuhr von Sulfat, von Phosphat sowie von Spurenelementen (Kobalt, Kupfer, Mangan). Das Sulfat wird im Pansen zu Sulfid reduziert (LEWIS, 1954) und dieses für die Synthese von schwefelhaltigen Aminosäuren herangezogen. Der Einbau von Sulfat in mikrobielle Proteine ist verschiedentlich untersucht worden ( M Ü L L E R und KRAMPITZ, 1 9 5 5 , BLOCK et al.„ 1 9 5 1 ) . Bei Mangel an Kobalt ist die Synthese von B 12 -Vitaminen durch die Mikroflora der Vormägen eingeschränkt, was zu einer Herabsetzung der Vermehrung lebenswichtiger Vormagensymbionten Anlaß gibt. Die Kobaltmangelerkrankung der Wiederkäuer, die in vielen Gegenden der Erde auf Böden mit niedrigem Kobaltgehalt beobachtet wird, ist eine B 12 -Avitaminose, die durch Verabreichung von Vitamin B 12 therapeutisch beseitigt werden kann. d) Der N i t r a t g e h a l t des Futters. Das Nitrat der Futtermittel wird in den Vormägen über Nitrit in beträchtlichem Umfange in Ammoniak übergeführt, wobei es bei Aufnahme größerer Mengen an Nitraten zu Nitritvergiftungen kommen kann (HOLTENIUS, 1 9 5 7 ) . e) Die R e s o r p t i o n des A m m o n i a k s aus den Vormägen. Die Resorption des Ammoniaks aus den Vormägen wurde erstmals von M C D O N A L D ( 1 9 4 8 ) durch Punktion der Pansenvenen und durch Analyse des abfließenden Blutes nachgewiesen. Spätere Untersuchungen von L E W I S , H I L L und ANNISON ( 1 9 5 7 ) wiesen die Abhängigkeit der Ammoniakkonzentration im Pfortaderblut von der in den Vormägen nach. Das Ammoniak wird in der Leber zur Harnstoffbildung verwendet. Der Harnstoffgehalt im Blut beim Wiederkäuer geht dabei nach Untersuchungen der genannten Autoren der Ammoniakkonzentration im Pansen parallel. Nur ein äußerst geringer Anteil des Ammoniaks entgeht der Entgiftung in der Leber, weswegen die Ammoniakkonzentrationen im peripheren Blut außerordentlich niedrig liegen. Erst bei einem stärkeren Anstieg der Ammoniakkonzentration in den Vormägen wird die Entgiftungskapazität der Leber überschritten, woraus ein Anstieg des Ammoniaks im peripheren Blut resultiert. Nach Untersuchungen von L E W I S et al. ( 1 9 5 7 ) besteht zwischen Ammoniakkonzentration in den Vormägen und der im peripheren Blut die in Tabelle 1 dargestellte Beziehung. Unter den üblichen Fütterungsverhältnissen ist beim Schaf mit einer täglichen Ammoniakresorption von 5—15 g N zu rechnen. Vergiftungen infolge einer zu starken Ammoniakbildung in den Vormägen wurden gelegentlich nach Aufnahme größerer Mengen synthetischer N-Verbindungen (Harnstoff, Ammoniumbicarbonat) beobachtet! Der kritische Ammoniakgehalt, bei dem toxische Erscheinungen auftreten, liegt im peripheren Blut bei 1,4 mg%. Die Hauptveränderungen betreffen Funktionsstörungen des vegetativen Nervensystems, wobei Zittern, beschleunigte Atmung, Durchfälle sowie Krampf- und Erregungszustände beobachtet wurden ( T H A M M , IHLENBURG u n d LANGE, 1 9 6 1 ) .

.

Archiv für Tierernährung, Band 13, Heft 5/6, 1963

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Tabelle 1 Die Abhängigkeit der Ammoniakkonzentration im peripheren Blut von der in den Vormägen (Angaben in Millimol pro Liter) NHj-Gehalt in den Vormägen

NH 3 -Gehalt im Blut

20 40 60 80 100 120 140 160 180

0,06 0,06 0,12 0,28 0,42 0,58 0,68 0,85 1,04

Der r u m i n o h e p a t i s c h e N - K r e i s l a u f Eine bemerkenswerte Eigentümlichkeit des N-Stoffwechsels beim Wiederkäuer besteht darin, daß der in der Leber gebildete Harnstoff in beträchtlichem Umfange in die Vormägen zurückgelangt und somit der Mikroflora für synthetische Reaktionen zur Verfügung steht. Die Überführung von Harnstoff aus dem Blut in die Vormägen konnte erstmals von SIMMONET, LE BARS und MOLLE, ( 1 9 5 7 ) nachgewiesen werden. Eine nähere Analyse wurde von HOUPT ( 1 9 5 9 ) vorgenommen. Nach intravenöser Injektion von Harnstoff bei eiweißarm ernährten Schafen erschien nur etwa die Hälfte des verabreichten Stickstoffs im Harn. Dabei wurden Transportraten in die Vormägen von 5 , 1 2 — 1 3 mmol Harnstoff-N/Std. ermittelt, was einer solchen von 1 , 7 5 — 4 , 4 g N/Tag entspricht; bei Annahme eines Blutharnstoffspiegels von 30 mg% entspricht dieses einer Pansenclearance von 8—21 ml/min. Weitere Untersuchungen zur Frage der Passage von Harnstoff und Ammoniak durch die Paiisenwand liegen von GÄRTNER, DECKER und HILL ( 1 9 6 1 ) bzw. von DECKER, GÄRTÄER, HÖRNICKE und HILL ( 1 9 6 1 ) vor. Es konnte gezeigt werden, daß die Erhöhung der Harnstoffkonzentration im Blut mittels intravenöser Injektion bis auf das Doppelte des Ausgangswertes keinen Einfluß auf die Größe der Harnstofftransportrate durch die Pansenwand hat. An Ziegen wurde ein täglicher Transport von 6 , 7 — 1 3 , 5 g Harnstoff-N in die Vormägen ermittelt. Dabei wurde ein gegenläufiges Verhalten der Pansenclearance zur Nierenclearance und zum Harnfluß gefunden. Unter gleichartigen Fütterungsbedingungen entsprechen einem niederen Harnfluß jeweils immer hohe Pansenclearance-Werte und umgekehrt: Bei Wassermangel ist der Harnstofftransport in die Vormägen gesteigert, wobei die Harnstoffverluste über die Niere entsprechend abnehmen. Bei nachfolgender Aufnahme größerer Wassermengen wird der Harnstofftransport über die Pansenwand gedrosselt, während die Nierenclearance entsprechend ansteigt. Zum P r o b l e m der V e r f ü t t e r u n g von Harnstoff bzw. von Ammoniumbicarbonat Die Erkenntnis der Verwertung von stickstoffhaltigen Verbindungen nichteiweißartiger Natur (NPN = Nichtprotein-N) durch die Mikroorganismen der Vormägen

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KOLB, Literaturübersicht zum N-Stoffwechsel

für die Synthese mikrobieller Proteine in den Vormägen findet in der Tieremährung vielfach praktische Anwendung. Nach Angaben von DREPPER und ZUCKER ( 1 9 6 1 ) werden derzeit in den USA jährlich 100000 Tonnen Harnstoff für die Ernährung von Wiederkäuern eingesetzt. Hierbei ist der N-Bedarf des Wiederkäuers in Abhängigkeit von der Leistung besonders zu berücksichtigen, da eine über das den Proteinbedarf deckende N-Angebot hinausgehende N-Verabreichung in Form von synthetischen Verbindungen wertlos ist. Weiterhin ist auf eine ausreichende Energiezufuhr in Form von leicht verwertbaren polymeren Kohlenhydraten besonderer Wert zu legen. Unter Berücksichtigung dieser Gesichtspunkte ist es möglich, etwa 20—30% des N-Bedarfs von Wiederkäuern durch synthetische N-Verbindungen nichteiweißartiger Natur zu decken. Aus der großen Zahl von Untersuchungen zur Frage der Wirkung der Beifütterung von Harnstoff im Vergleich zu einer reinen Proteinernährung seien die Ergebnisse von DREPPER und ZUCKER erwähnt, die an Jungbullen die Wirkung eines harnstoffhaltigen Beifutters (Harnstoffmelasse) bzw. von Sojaschrot zu einem proteinarmen Grundfutter (Heu, Trockenschnitzel, Vitamin-Mineralstoffmischung) erprobten. Etwa 40% des insgesamt aufgenommenen verdaulichen Rohproteins entstammten den Zulagen an Sojaschrot bzw. an harnstoffhaltigem Beifutter. Die Zunahme in den einzelnen Versuchsgruppen und der Energieaufwand pro kg Zunahme sind aus Tabelle 2 ersichtlich. Tabelle 2 Zunahme und A u f w a n d an Stärkeeinheiten pro kg Zunahme bei Jungbullenmast bei unterschiedlicher N-Versorgung Gruppe N-Versorgung

Zunahme in g/Tier/Tag relativ (in % der Gruppe II) Stärkeeinheitenaufwand/kg Zunahme relativ (in % der Gruppe II)

I

II

proteinarm

Soja

868 79

1100 100

1156 105'

1129 103

3714 115

3238 100

3267 101

3380 103

III V 2 Soja V 2 Harnstoff

IV Harnstoff

Bei Milchkühen wird allgemein die Zufütterung von Harnstoff in Mengen von täglich 150—200 g empfohlen. Dabei ist der Bedarf der Tiere an Stickstoff in Abhängigkeit von der Milchleistung sowie der Proteingehalt der Futtermittel zu berücksichtigen. Bei Verabreichung von Harnstoff über den N-Bedarf hinaus tritt eine Stickstoffvergeudung ein, wobei noch zu berücksichtigen ist, daß für die Synthese von Harnstoff in der Leber Energie aufgewendet werden muß. Die Abhängigkeit des N-Bedarfs von Milchtieren von der Milchleistung ist aus Tabelle 3 ersichtlich. Bei unsachgemäßer Anwendung von N-haltigen Verbindungen nichtproteinartiger Natur kann es zu Vergiftungen kommen, insbesondere, wenn plötzlich große Mengen an Harnstoff bzw. an Ammoniumbicarbonat ohne vorherige Gewöhnung und ohne gleichzeitige Verabreichung leichtlöslicher Kohlenhydrate aufgenommen

271

Archiv für Tierernährung, Band 13, Heft 5/6, 1963

Tabelle 3 Bedarfsnormen an Eiweiß und an Stärkeeinheiten von Milchkühen bei unterschiedlicher Leistung Trockenmasse kg Erhaltungsbedarf + 5 kg Milch + 10 kg Milch + 15 kg Milch + 20 kg Milch + 25 kg Milch + 30 kg Milch

8-11 10-13 11-15 12-17 13-18 14-19 15-20

Verdaul. Eiweiß Stärkeeinheiten g bei 3,5% Fett 300 575 850 1125 1400 1675 1950

3000 4250 5500 6750

8000

9250 10500

werden. Allgemein sollte die Hamstoffmenge 1% der Trockensubstanz der Gesamtration bzw. 3% des Kraftfutters nicht überschreiten. Besonders zu berücksichtigen ist, daß Harnstoff nicht zusammen mit ungenügend erhitztem Sojaschrot, der das Ferment Urease enthält, verabreicht wird, da es sonst zu einer sehr raschen Ammoniakentwicklung kommt. Eine Sammlung von Arbeiten zu Problemen der Giftwirkung von Harnstoff bzw. von Ammoniak beim Wiederkäuer ist der Monographie von S C H M A N E N K O W (1961) bzw. der Arbeit von SCHOENEMANN und K I L I A N (1960) zu entnehmen. Es ist ersichtlich, daß bei allmählicher Gewöhnung und bei gleichzeitiger Verabreichung von leichtlöslichen Kohlenhydraten beim Rind Harnstoffmengen von 150 g pro 100 kg Körpergewicht (500—600 g pro Tier und Tag) schadlos verabreicht werden können. Solche Mengen liegen jedoch weit über dem Optimum der wirtschaftlich vertretbaren Fütterung von Harnstoff. Ähnlich wie Harnstoff führt auch Ammoniumbicarbonat bei plötzlicher Verabreichung in höheren Dosen zu Vergiftungserscheinungen. Bei Vergleichsuntersuchungen erwies sich die genannte Verbindung dem Harnstoff in N-äquivalenten Mengen im Ersatz von Proteinen beim Wiederkäuer als weitgehend ebenbürtig. Mit der Verwendung von Ammoniumbicarbonat in der Jungbullenmast beschäftigen sich u. a. Untersuchungen von HOLZSCHUH und W E T T E R A U (1961). Besonders zu berücksichtigen ist, daß die Ammoniumbicarbonat enthaltenden Futtergemische trocken und kühl gelagert werden, da sich sonst ein stärkerer Ammoniakverlust und ein unangenehmer Geruch der Futtermittel einstellt. Der Anteil des Ammoniumbicarbonats sollte nicht mehr als 8% der Mischfuttermenge betragen. Bei Jungbullen werden pro Tag 80—90 g Ammoniumbicarbonat zur Zufütterung empfohlen, bei Kühen mit einem Gewicht von etwa 500 kg bis zu 350 g Ammoniumbicarbonat. Für die praktische Anwendung ist die Bindung von Ammoniumbicarbonat an Melasse besonders empfehlenswert. Die Frage der Verwertung von NPN und der Einbau der in dieser Form aufgenommenen N-Verbindungen in die Milchproteine wurde durch L A N D und V I R TANEN (1959) orientierend geprüft; hierzu wurde mit dem stabilen Isotop 15 N markiertes Ammoniumnitrat bzw. Ammoniumsulfat verwendet. Es wurde gezeigt, daß 17—25% des N in Milchproteine eingebaut wurden. Die Markierung der Amino-

272

KOLB, Literaturübersicht zum N-Stoffwechsel

säuren verlief uneinheitlich. Der intensivste Einbau erfolgte nach 14 Stunden in die Amid-N-Fraktion der Milchproteine, gefolgt von der Glutaminsäure, der Asparaginsäure und dem Alanin. Nach 24 Stunden waren die Aminosäuren der Milchproteine weitgehend ähnlich markiert, mit Ausnahme des Histidins und des Cystins, die sehr niedrige relative Häufigkeiten aufwiesen. Es wird angenommen, daß insgesamt rund 40% der verabreichten Menge markierten Stickstoffs in Körperproteine eingebaut wurden. Für die Wirtschaftlichkeit des Einsatzes von Harnstoff bzw. von Ammoniumbicarbonat ist die Frage des Preises von kohlenhydratreichen Futtermitteln von entscheidender Bedeutung. In der Sowjetunion sowie in den USA hat die Anwendung von Harnstoff bzw. von Ammoniumbicarbonat insbesondere im Zusammenhang mit der Steigerung des Maisanbaues erheblich an Bedeutung gewonnen. Der Mais verfügt bei einem hohen Gehalt an Gesamtnährwert über einen relativ niedrigen Anteil an verwertbarem Stickstoff, weshalb sich hier Zugaben von Harnstoff bzw. von Ammoniumbicarbonat besonders empfehlen. Die b i o l o g i s c h e W e r t i g k e i t der N - h a l t i g e n V e r b i n d u n g e n n i c h t e i w e i ß a r t i g e r N a t u r bei W i e d e r k ä u e r n Der Umbau der N-haltigen pflanzlichen Futtermittel in den Vormägen in mikrobielle Proteine geht allgemein mit einer Erhöhung der biologischen Wertigkeit einher: Während diese bei den meisten pflanzlichen Futterstoffen mit 50—65 angegeben wird, beträgt sie bei mikrobiellen Proteinen rund 80. Es findet also eine erhebliche „Aufwertung" der N-haltigen Verbindungen in den Vormägen statt. Die biologische Wertigkeit von N-haltigen Verbindungen nichteiweißartiger Natur ist hauptsächlich von dem Ausmaß der NH 3 -Verwertung für mikrobielle Synthesen und von der N-Gesamtbilanz abhängig. Bei Mangel an leicht verwertbaren Polysacchariden führt die Aufnahme von NPN zu einem Ammoniakanstieg in den Vormägen, zu einer Steigerung der NH 3 -Resorption und zu einer Erhöhung der Harnstoffsynthese in der Leber. Ein vom Harnstoff-Blutspiegel abhängiger Teil des Harnstoffs geht jeweils über die Nieren verloren. Über die biologische Wertigkeit von Harnstoff bei Schafen liegen Untersuchungen von H A M I L T O N , R O B I N S O N und J O H N S O N ( 1 9 4 8 ) vor. Bei einem N-Anteil von 11,6% am Futter, wobei der Harnstoff 46% ausmachte, betrug die biologische Wertigkeit 47,6, demgegenüber bei einem N-Anteil von 17% und einem Harnstoffanteil von 63% aber 35,8. Ein Vergleich der Wertigkeit des Harnstoffs mit dem Stickstoff verschiedener anderer Futtermittel als Zulagen zur selben Grundration (mit einem N-Äquivalent von 10,5—13) ergab lediglich bei Kombination von Harnstoff und Leinsamenmehl eine signifikante Steigerung der biologischen Wertigkeit (auf 62,6) Harnstoff und Trockenmilchpulver zusammen ergaben eine Wertigkeit von 52,3,. Harnstoff und Casein von 48, Harnstoff, Casein und Cystin 54,5 sowie Harnstoff und Cystin 43,4. Untersuchungen von F I N G E R L I N G et al. ( 1 9 3 7 ) hatten für Harnstoff-N in Wachstumsversuchen an Bullen und Schafen gleichfalls eine biologische Wertigkeit von 50—60 ergeben, die nur geringfügig niedriger als die für den Stickstoff von WeizenGluten (mit 60—63) lag.

273

Archiv für Tierernährung, Band 13, Heft 5/6, 1963

Schlußbetrachtung Trotz erheblicher Fortschritte auf dem Gebiete der Erforschung des N-Stoffwechsels beim Wiederkäuer sind zahlreiche Fragen noch ungeklärt, insbesondere solche biochemischer Natur, die sich im Zusammenhang mit der Verfütterung synthetischer N-Verbindungen ergeben. So liegen wenig Hinweise über die Verwertung von NPN bei unterschiedlichen Futterkombinationen und N-Anteilen bei laktierenden Milchkühen vor, ferner keine präzisen Angaben über den Umfang der N-Verwertung zur Synthese von Milchproteinen. Von speziellem Interesse ist hierbei die Ermittlung der Verteilung des Stickstoffs auf die einzelnen Aminosäuren der Milchproteine, die Hinweise über Umfang und Geschwindigkeit der Bildung der einzelnen Aminosäuren und deren Herkunft ergibt. Orientierende Untersuchungen hierüber liegen von L A N D und V I R T A N E N ( 1 9 5 9 ) vor. Von Interesse ist in diesem Zusammenhang auch die Klärung der Frage der Geschwindigkeit der Überführung peroral aufgenommenen NPN in das Blut bzw. in die Milchdrüse sowie in die anderen Organe und die Ermittlung der Halbwertszeiten von Blut- und Organproteinen. In praktischer Hinsicht ist insbesondere die Klärung der Frage der Ausnutzbarkeit stickstoffhaltiger Verbindungen nichtproteinartiger Natur mit Hilfe von markierten N-Verbindungen als bedeutsam zu betrachten. Hierbei ist der Stickstoffbilanz und der Ausscheidung des markierten Stickstoffs über Harn und Faeces besondere Beachtung zu schenken. Literaturverzeichnis [1] ANNISON, E. F.: Biochem. J. 64, 705 (1956) [2] ANNISON, E . F . , M . J . CHALMERS, S . B . M . M A R S H A L u n d R . L . M . S Y N G E : J . A g r i c .

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[39] WIESNER, E.: Mhefte Vet. med. 15, 362 (1960) [40] ZUNTZ, N.: Pflügers Arch. ges. Physiol. 49, 483 (1891) Eingegangen 8. April 1963

275 Aus der Ambulatorischen und Geburtshilflichen Tierklinik der Karl-Marx-Universität Leipzig (Direktor Prof. Dr, NEUNDORF)

W.

ROMMEL

Untersuchungen zum N-Stoffwechsel beim laktierenden Rind unter Verwendung von oral verabreichtem Ammoniumbicarbonat-[15N] 3.

Mitteilung

Klinischer Bericht, Versuchsablauf und Probenentnahme Bei experimentellen Untersuchungen über den N-Stoffwechsel beim laktierenden Rind unter Verwendung von oral verabreichtem Ammoniumbicarbonat-[ 1 5 N] wurde uns die Aufgabe zuteil, die Versuchskühe klinisch zu überwachen, Blut- und Pansensaftproben zu gewinnen, 24-Stunden-Harn und -Kot zu sammeln sowie Leber-, Gebärmutter-, Muskulatur-, Lymphknoten- und Hautproben auf bioptischem Wege zu entnehmen. 1. V e r s u c h s t i e r e Für einen Leerversuch und zwei Versuche standen insgesamt 5 Kühe der Deutschen Schwarzbunten Rasse (Schwarzbuntes Niederungsvieh) zur Verfügung. Versuchskuh V 0: Versuchskuh V I:

4jährig, im 2. Monat tragend, tägliche Milchleistung 12 kg, 3jährig, gekalbt 15. 10. 1961, tägliche Milchleistung 10,8 kg, Gewicht 401 kg, Versuchskuh EV I: 3jährig, gekalbt 6. 7. 1961, tägliche Milchleistung 9,8 kg, Gewicht 411 kg, Versuchskuh V II: 3jährig, gekalbt 2. 2. 1962, tägliche Milchleistung 9,4 kg, Gewicht 415 kg, Versuchskuh EV II: 3jährig, gekalbt 1 3 . 2 . 1 9 6 2 , tägliche Milchleistung 9,6 kg, Gewicht 420 kg.

Diese Kühe wurden aus einem staatlich anerkannten tuberkulöse- und brucellosefreien Rinderbestand angekauft und für die einzelnen Versuchsabschnitte nacheinander im seuchenfreien Rinderstall des Instituts für Tierzucht und Tierernährung der Veterinärmedizinischen Fakultät Leipzig auf besonders vorbereiteten Standplätzen aufgestellt. 2. K l i n i s c h e K o n t r o l l e n Am Tage der Einstellung wurden die Versuchskühe einer gründlichen allgemeinen klinischen Untersuchung im herkömmlichen Rahmen unterzogen. Während der Vorversuchs- und Versuchsperioden wurden zu festgesetzten Tageszeiten Allgemeinbefinden, Futteraufnahme, Milchleistung, Temperatur, Atmung, Puls, Pansentätigkeit und Blutbild kontrolliert.

276

ROMMEL, Klinischer Bericht

3. V e r s u c h s a b l a u f Der Gesamtversuch unterteilt sich in einen Leerversuch und zwei Versuche, a) L e e r v e r s u c h Im Leerversuch, der an der Versuchskuh V 0 erfolgte, wurde die Technik der Blut- und Pansensaftentnahme sowie der 24-Stunden-Harn- und -Kotgewinnung geprüft. Die angefallenen Körperflüssigkeiten bzw. Ausscheidungsprodukte wurden den anderen Instituten für analoge Leerversuche zugeleitet. Im Hinblick auf die Blutgewinnung sollte geprüft werden, ob mehrere kurz aufeinanderfolgende Blutentnahmen vertragen werden oder ob das häufige Punktieren der Jugularvenen durch Anbringung eines Kapillarschlauches vermieden werden kann. Zu diesem Zwecke wurde ein 2,5 mm dicker PVC-Schlauch in die rechte V. jugularis eingeführt und an der äußeren Haut angenäht. Das Lumen des Schlauches wurde nach der Operation bzw. im Anschluß an die Blutentnahmen mit Heparinlösung gefüllt. Die Blutentnahmen selbst erfolgten durch Aspiration mit Spritzen verschiedenen Kalibers. Gleichzeitig wurde die linke V. jugularis im Abstand von 2 Stunden mehrmals am Halse aufsteigend punktiert. Während die Blutentnahmen durch Punktionen gut vertragen wurden und auch immer ausreichende Blutmengen gewonnen werden konnten, war die Blutentnahme durch den Kapillarschlauch unbefriedigend. Durch die Aspiration mit kleineren oder größeren Spritzen, die zuvor mit gerinnungshemmenden Mitteln ausgespült worden waren, konnte die pro Entnahme erforderliche Blutmenge von 300 ml nur langsam erhalten werden. Bei starker Aspiration trat Hämolyse ein, der Spritzenkolben setzte sich schnell fest. Im Hinblick auf die Pansensaftentnahme wurde in Anlehnung an die von W A Y N E et al. (1959) publizierte Technik beim Schaf eine verschließbare Pansenfistel angelegt und vergleichsweise Pansensaft per Nasenschlundsonde entnommen. Unter Leitungsanästhesie und prophylaktischem Antibiotikaschutz wurde aus der linken Bauchwand (Hungergrube) Gewebe kreisförmig herausgeschnitten, so daß ein Loch von 8 cm Durchmesser entstand. Die Pansenwand wurde extraperitonisiert und kreisförmig mit Peritoneum und äußerer Haut vernäht. Aus "der Pansenwand wurde daraufhin ein dem Durchmesser des Bauchwandloches entsprechend großes Stück Gewebe entfernt. In die Fistelöffnung wurde eine zylinderförmige stabile, durch Schraubverschluß schließbare Manschette aus PVC-Material eingesetzt. Die Heilung der Operationswunden verlief per primam, die Pansentätigkeit blieb ungestört. Bereits 5 Tage p. op. war mit der an sich gut sitzenden Kunststoffmanschette kein absoluter Fistelverschluß mehr möglich, da die Fistelränder bei den Pansenbewegungen ihre runde Form nicht beibehielten. Zunächst floß nur beim liegenden Tier Pansenflüssigkeit zwischen Fistelrand und Manschette ab. Später vergrößerte sich der Fisteldurchmesser und nahm ovale Form an, so daß bei maximalem Füllungszustand des Pansens auch am stehenden Tier geformte Panseninhaltsstoffe und Gase entweichen konnten. Die unter 4b und d beschriebene 24-Stunden-Harn- bzw. -Kotgewinnung bewährte sich im Leerversuch.

277

Archiv für Tierernährung, Band 13, Heft 5/6, 1963

b) 1. V e r s u c h Der 1. Versuch wurde mit den Versuchskühen V I und EV I am 21. 11. 1961 begonnen und am 18. 12. 1961 beendet. Die 28 Tage dieses Versuchs unterteilen sich in eine Vorversuchs- (14 Tage) und eine Versuchsperiode (14 Tage). In der Vorversuchsperiode wurden beide Kühe an bestimmte Melk- und Futterzeiten sowie an Ammoniumbicarbonat (2 x 125 g pro Tag) und ab 5. Vortag an das Urinal gewöhnt. Am 2. Vortag erfolgte eine Blutentnahme, am 1. Vortag eine Blut- und eine Pansensaftentnahme. Während der 14 Versuchstage erfolgten klinische Kontrollen, Füttern, Melken und Wiegen bei beiden Kühen, Probenentnahmen nur bei Versuchskuh V I entsprechend dem in Tab. 1 dargestellten Zeitplan. Versuchskuh EV I diente in der Versuchsperiode als Kontrollkuh für klinische Befunde, Futteraufnahme, Milchleistung und Körpergewichtsveränderung. Tabelle 1 Terminplan des 1. Versuchs Uhrzeit

Verrichtung

6.15 klinische Kontrolle Kot/Harn 6.30 Melken 6.50 Blut 6.55 Pansensaft 7.00 Füttern 8.00 Pansensaft 9.00 Blut 10.00 ' Pansensaft 10.45 Melken 11.00 Blut 12.15 Kot/Harn 13.00 Pansensaft 14.45 Melken 14.55 Blut 15.00 Füttern 17.00 Pansensaft 18.15 klinische Kontrolle Kot/Harn 18.45 Melken 18.55 Blut 19.00 Pansensaft 22.45 Melken 22.55 Blut 23.00 Pansensaft

Versuchstag e 6. 7. 8. 9.

1.

2.

3.

4.

5. 3

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+ + + + + +.

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+ + + + +

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+1

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10.

11. 12. 13.

14.

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+2 +

4-

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+ +

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+ +

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+

-1-

4-

+ + +

•

+ Blut

bis 4. Versuchstag, morgens, je Fütterung 125 g Ammoniumbicarbonat-[ 16 N] am 4. Versuchstag, abends, 112 g Ammoniumbicarbonat-[ 15 N], danach 125 g Ammoniumbicarbonat natürlicher isotoper Zusammensetzung pro Fütterung bis Versuchsende » 2.45 Uhr Melken, 2.55 Uhr Blut 4 Es erfolgte noch eine Blutentnahme nach 77, eine weitere nach 176 Tagen.

1

2

c) 2. V e r s u c h Der 2. Versuch wurde mit den Versuchskühen V II und EV II am 16. 4. 1962 begonnen und am 23. 5. 1962 beendet. Entsprechend der erweiterten Zielstellung und 19

Archiv für Tierernährung, Band 13, Heft 5/6,1963

278

ROMMEL, Klinischer Bericht

auf Grund der im 1. Versuch gewonnenen Erfahrungen änderten sich Gesamtversuchszeit und Zeitplan. Die Vorversuchsperiode dauerte 21 Tage, die Versuchsperiode 17 Tage. Versuchskuh EV II diente analog dem 1. Versuch als Kontrolle. Versuchskuh V II wurde am 17. Versuchstag geschlachtet und nach pathologischanatomischen sowie fleischbeschaulichen Gesichtspunkten untersucht und beurteilt. Der Zeitplan des 2. Versuchs geht aus den Tab. 2 und 3 hervor. Tabelle 2 Terminplan des 2. Versuchs — 1. Versuchstag Uhrzeit

Verrichtung

6.15 6.45 6.55 7.00 7.05 7.30 7.35 7.50 8.00 8.05 8.15 8.30 8.35 8.50 9.00 9.05 9.50 10.00 10.05 10.20 10.50 11.00 11.05 11.50 12.00 12.05 12.50 13.00 13.05 13.50 14.00 14.05 14.10 14.50 15.00 18.20 18.30 22.10

klinische Kontrolle, K o t / H a r n Melken Blut Füttern Harn Harn Blut Melken Harn Blut Pansensaft Harn Blut Melken Harn BlutMelken Harn Blut Pansensaft Melken Harn Blut Melken Harn Blut Melken Harn Blut Melken Harn Blut Pansensaft Melken Füttern Pansensaft klinische Kontrolle, Melken Pansensaft

Bemerkungen

125 g Ammoniumbicarbonat-[ 1 5 N] Dauerkatheter Dauerkatheter Dauerkatheter Dauerkatheter Dauer katheter

Dauerkatheter

Dauerkatheter Dauerkatheter Dauerkatheter

Dauerkatheter

125 g Ammoniumbicarbonat-[ 1 5 N]

Die Einhaltung der in den Zeitplänen vorgesehenen Termine für die einzelnen Verrichtungen und Eingriffe an den Versuchskühen V I und V II wurden in speziell

279

Archiv für Tierernährung, Band 13, Heft 5/6,1963

für diese Zwecke angefertigten Terminkalendern protokolliert. Zur Kennzeichnung wurden die einzelnen Proben mit den Anfangsbuchstaben des jeweiligen Materials versehen und fortlaufend mit arabischen Ziffern numeriert (H = Harn, K == Kot, B = Blut, P = Pansensaft, M = Milch 1; 2, 3 , 4 , . . .)• Tabelle 3 Terminplan des 2. Versuchs — 2. bis 17. Tag Uhrzeit 6.00 6.15 6.20 6.30 6.50 7.00 14.00 15.00 17.00 18.15 18.30 22.00 1 2

Verrichtung

2.

Wiegen klinische Kontrolle Kot/Harn Pansensaft Melken Blut Füttern Pansensaft Füttern Blut Pansensaft klinische Kontrolle Melken Pansensaft

3.

+ + + + + + + + + + + + + + +

4.

5.

6.

Versuchstage 7. 8. 2 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17.

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bis 6. Versuchstag, morgens, je Fütterung 125 g Ammoniumbicarbonat-[ 15 N], dann 125 g Ammoniumbicarbonat natürlicher isotoper Zusammensetzung 10.00 Uhr Biopsien

4. M e t h o d e n d e r P r o b e n e n t n a h m e a) B l u t e n t n a h m e u n d B l u t b i l d Die Blutentnahmen erfolgten nach Jodierung der Einstichstelle durch alternierend aufsteigende Punktion beider Jugularvenen mit sterilen Blutentnahmekanülen. Die jeweils entnommene Blutmenge belief sich auf 150 — 300 ml, ausnahmsweise auf 1000 ml. Das Blut wurde in dicht verschließbaren Erlenmeyerkolben, in denen sich Natriumoxalat zur Gerinnungshemmung befand, aufgenommen. Da die Punktionen manchmal in kurzen Zeitabständen erforderlich waren, wurden beide Drosselrinnen in den Versuchspausen prophylaktisch mit 10%iger Kamphersalbe versorgt. Bei Versuchskuh V I wurden insgesamt 31 Blutproben (ca. 6 1 Blut), bei Versuchskuh V II insgesamt 27 Blutproben (ca. 7 1 Blut) entnommen. Im Blutbild wurden Erythrozyten, Lymphozyten und Leukozyten differenziert nach Eosinophilen, Segmentkernigen, Stabkernigen, und Kernverschiebungsindex (KVI) sowie Monozyten berücksichtigt. Die Hämoglobinbestimmung erfolgte nach Sahli. b) 2 4 - S t u n d e n - H a r n g e w i n n u n g Die 24-Stunden-Harngewinnung erfolgte mit einem Urinal für weibliche Rinder (ROMMEL und ROMMEL 1 9 6 0 a, Abb. 1). Da das Urinal über längere Zeit am Tier verbleiben mußte, wurde die Polsterung der Befestigungsgurte durch Schaumgummi19*

280

R O M M E L , Klinischer Bericht

und Watteeinlagen verstärkt. Die Harnsammelflasche (201 Fassungsvermögen) befand sich in einem unter dem Stall gelegenen Kellerraum mit Durchschnittstemperaturen von etwa + 1 0 ° C. V o r jeder 24-Stunden-Sammelperiode wurden in die Flasche 10 ml konz. H 2 S 0 4 p. a. und 100 ml T o luol p. a. zur Konservierung des Harns eingefüllt. Die 24-Stunden-Harnmenge wurde auf den Milliliter genau bestimmt, die Konservierungsmittel wurden in Abzug gebracht. Aus dem 24-StundenHarngemisch wurden 300 ml entnommen und der Weiterverarbeitung zugeleitet. c) K a t h e t e r h a r n g e w i n n u n g Für in kurzen Zeitabständen erforderliche Harnuntersuchungen (Versuchskuh V II, 1. Versuchstag) wurde unter kleiner Extraduralanästhesie (Vermeidung von Harnverlusten durch Ausschaltung des Pressens nach Kathetereinführung) ein Gummikatheter in die Harnblase eingeführt und an den Schamlippen angenäht. Die Harnentnahmen erfolgten unter Aspiration mit einer Janetspritze bis zur völligen Entleerung der Blase. Nach den Entnahmen wurde der Katheter mit einem Glasstöpsel verschlossen, der aus der Vulva heraushängende Katheterteil wurde mit Heftpflaster auf der Kruppe befestigt. Abb. 1: Urinal für weibliche Rinder Zeichenerklärung: Aj = Rückengurte A 2 = Bauchgurte B = Grundplatte C = Trichteröffnung D = Gummitrichter

d) 2 4 - S t u n d e n - K o t s a m m l u n g Die Versuchskühe standen ohne Einstreu auf Gummimatten. Ihre seitliche Bewegungsfreiheit war durch befestigte Flankierbäume eingeengt. D a der K o t durchweg von fest-weicher Konsistenz war und der Harn über das Urinal abfloß, wurde auf eine Kotschürze verzichtet. D e r K o t wurde tagsüber nach dem Absetzen, .nachts gelegentlich anderer Probenentnahmen eingesammelt und in einem dicht verschließbaren Behälter aufbewahrt. Die 24-Stunden-Menge wurde auf 100 g abrundend ausgewogen. Nach dem Durchmischen wurden 300 g entnommen und der Weiterverarbeitung zugeleitet. e) P a n s e n s a f t e n t n a h m e Pansensaft wurde mit einer dicken Nasenschlundsonde entnommen. Auf die Aspiration mit einer 200 ml Ganzmetall-Janetspritze (Spritzenöffnung auf 12 mm erweitert) konnte meistens verzichtet werden; wenn die Sonde zunächst tief eingeführt und dann so weit zurückgezogen wurde, bis das „Sondenrauschen" aufhörte, wurden durch die Pansenkontraktionen binnen 5 bis 15 Minuten die erforderlichen 300 ml Pansensaft spontan abgesetzt. D e r Pansensaft wurde in Glaskolben, in denen sich bisweilen 2 ml konz. HCl p. a. befanden, aufgefangen und der Weiterbearbeitung zugeleitet. Nach der Benutzung wurde die Nasenschlundsonde gründlich mit Wasser durchgespült.

281

Archiv für Tierernährung, Band 13, Heft 5/6, 1963

f) B i o p t i s c h e G e w e b e e n t n a h m e n Haut- und Muskelgewebe sowie Hautlymphknoten wurden aus der linken Flanke durch einfachen chirurgischen Eingriff entnommen. Die Leberbiopsie erfolgte nach der von SCHULZ et al. 1 9 6 0 , die Uterusbiopsie nach der von ROMMEL 1 9 5 9 angegebenen Methode. Die Menge des Probenmaterials betrug in jedem Fall mindestens 1 g. 5. E r g e b n i s s e Nach den Ergebnissen der Einstellungsuntersuchungen konnten alle Versuchskühe als klinisch gesund beurteilt werden. Allgemeinbefinden, Verdauung, Milchleistung u. a. Körperfunktionen blieben in der gesamten Versuchsperiode ungestört. Die Puls-, Atmungs- und Temperaturwerte von den Versuchskühen V I und V II gehen aus Abb. 2 und 3 hervor. Die Pulsfrequenz stieg bei beiden Versuchskühen leicht an; Atmungsfrequenz und Körpertemperatur blieben annähernd konstant.

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Abb. 3: Puls-, Atmungs-, Temperaturwerte der Versuchskuh V II

Die Befunde am Blutbild gehen aus den Abb. 4—9 hervor. Bei Versuchskuh V I fiel die Erythozytenzahl von 6,5 auf 5,3 Mill. kontinuierlich ab. Parallel hierzu verringerte sich der Hb-Gehalt von 70 auf 50%. Bei den Leuko- und Lymphozyten war während der ersten 4 Versuchstage ein geringfügiger Anstieg und danach ein

282

R O M M E L , Klinischer Bericht

geringfügiger Abfall zu verzeichnen. Während die Eosinophilen- und Monozytenzahlen leicht schwankten, blieb die Zahl der Stabkernigen nahezu konstant, die Segmentkernigen vermehrten sich geringfügig. Der KVI fiel von 0,80 auf 0,40 ab. Das Blutbild der Versuchskuh V II zeigte keine wesentlichen Veränderungen. Die Unruhe der Kurven am 1. Versuchstag ist auf die an diesem Tag häufiger erfolgte Blutuntersuchung zurückzuführen. Der steile Abfall der Erythrozytenzahlen zwischen 5. und 9. Versuchstag kann auf den starken Blutentzug am 5. Versuchstag zurückgeführt werden.

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Abb. 6: Differentialblutbild der Versuchskuh V I (Abb. 6a — Segmentkernige, Stabkernige, Eosinophile)

283

Archiv für Tierernährung, Band 13, Heft 5/6, 1963

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Abb. 8: Gegenüberstellung der prozentualen Anteile des 15 -N-Gehaltes denen des N-Gehaltes in den beiden Milchprotein-Fraktionen (Milchprotein-N-Gehalt = 100%), dargestellt an den prozentualen Anteilen des N-(«—•) und des 15 N-Gehaltes (o—o) des Caseins.

Die Abb. 8 deutet auf eine während der Tage der Verfütterung von 15 N-markiertem Ammoniumbicarbonat vorhandene geringgradig stärkere Einbeziehung des markierten Stickstoffs in die Casein-Synthese als in die MSP-Synthese hin. Ab Probe 37 im Versuch I (4 Tage nach der letzten Gabe von Ammoniumbicarbonat-[ 15 N]) und ab Probe 24 im Versuch II (5 Tage nach der letzten Gabe von Ammoniumbicarbonat[ 15 N]) erfolgte dann aber ein relativ stärkerer Einbau von markiertem Stickstoff in die Milchserumproteine. 4. D i e

15N-Ausscheidung

m i t der M i l c h

Berechnungen über die quantitative Ausscheidung der verabreichten 15 N-Überschußmenge mit der Milch sind in den Tab. 1 und 2 angeführt. Im Versuch I konnten während der 14 Versuchstage 12,9% und im Versuch II während der 16 Versuchstage 11,9% (11,7%) der verabreichten 15 N-Überschuß-Menge in der Milch wiedergefunden werden. Die Tab. 2 enthält weiterhin Angaben über die quantative und prozentuale Ausscheidung des 15 N mit den drei N-Fraktionen. Für Casein-N beträgt sie 8,6%, für MSP-N 2,0% und für Rest-N 1,1% der verabreichten 15 N-Überschußmenge. Von einer analogen Berechnung wurde im Versuch I abgesehen, da eine Reihe von Zwischenwerten nicht ermittelt wurde. 5. D i e t a t s ä c h l i c h e V e r w e r t u n g d e s A m m o n i u m b i c a r b o n a t - N f ü r d i e Milchsynthese Mit den Berechnungen in der Tab. 4 wurde der Versuch unternommen, auf der Grundlage der den annähernd stationären Zustand charakterisierenden Werte für die relativen 15 N-Häufigkeiten die quantitative Ausscheidung des Ammoniumbicarbonat-N einer Tagesdosis von 250 g Ammoniumbicarbonat zu berechnen. Aus der Tab. 4 ist ersichtlich, daß die tatsächliche Verwertung des verabreichten 23*

344

M I E L K E , Die V e r w e r t u n g des Ammoniumbicarbonat-N

Ammoniumbicarbonat-N unter den gegebenen Versuchsbedingungen für die Milchsynthese 10,9% im Versuch I und 9,5% im Versuch II (Gesamtmilch) und für die Milchprotein-Synthese entsprechend 9 , 1 % und 8,5% beträgt.

Tabelle 4 Berechnungen über die N-Verwertung einer NH 4 HC0 3 -Tagesdosis von 250 g für die Milchsynthese auf der Grundlage der stationären 15 N-Werte

1. :2. 3. a b •c 4. 5. 6.

a b c d 7. a

b

8. 9.

24-Std.-Milchmenge N in der 24-Std.-Milchmenge Durchschnittliche prozentuale Anteile der drei N-Fraktionen am Gesamt-N und die daraus errechneten N-Mengen für: Casein-N MSP-N Rest-N N in den 250 g NH 4 HC0 3 mit 10,4 Atom-% 15N 15 N-Überschuß in den 250 g NH 4 HC0 3 Atom-% 15 N-Überschuß (stationäre Werte) im Gesamt-N im Casein-N im MSP-N im Rest-N Verwertung des NH 4 HC0 3 -N für die Milchsynthese 15 N-Überschuß in der 24-Std.-Milch und prozentualer Anteil dieser Menge an der verabreichten 15 N-Überschußmenge der Tagesdosis: im Gesamt-N im Gesamtprotein-N im Casein-N im MSP-N im Rest-N NH 4 HC0 3 -N in der 24-Std.-Milch und prozentualer Anteil dieser Menge an der verabreichten NH 4 HC0 3 -N-Menge der Tagesdosis : im Gesamt-N im Gesamtprotein-N im Casein-N im MSP-N im Rest-N Anteil des in die Milchproteine eingebauten NH 4 HC0 3 -N am Gesamtprotein-N der 24-Std.-Milch Milchmenge, deren Gesamtprotein-N-Gehalt der aus dem NH 4 HC0 3 -N der Tagesdosis synthetierten Gesamtprotein-N- Menge äquivalent ist

Versuch I

Versuch II

12,5 kg 52,1g

10,4 kg 45,9 g

76,6% = 39,9 g 1 7 , 6 % = 9,2 g 5 , 8 % = 3,0 g 44,55 g 4,75 g

75,6% = 34,7 g 1 7 , 9 % = 8,2 g 6 , 5 % = 3,0 g 44,55 g 4,75 g

0,930 0,830 0,800 1,550

0,920 0,880 0,830 1,570

0,519 0,434 0,355 0,079 0,050

g=10,91% g = 9,14% g = 7,48% g = 1,66% g = 1,05%

4,86 g=10,91% 4,07 g = 9,14% 3,33 g = 7,48% 0,74 g = 1,66% 0,47 g = 1,05% 8,3% 1,040 kg

0,452 0,404 0,331 0,073 0,066

g=9,52% g=8,50% g=6,96% g=l,54% g=l,39%

4,24 g = 9 , 5 2 % ,3,78 g = 8,49% 3,10 g = 6 , 9 6 % 0,68 g = 1 , 5 3 % 0,62 g = 1 , 3 9 % 8,8% 0,920 kg

Aichig für Tieretnährung, Band 13, Heft 5/6, 1963

345

Diskussion Die Einbeziehung des Stickstoffs von verfütterten Verbindungen nichteiweißattiger Natur in die Milchsynthese wurde mittels 15 N-Markierung bereits von K E M M E R [ 1 2 ] an einer Ziege und von L A N D und VIRTANEN [ 1 3 ] an 2 Milchkühen untersucht. L A N D und VIRTANEN verabreichten der einen Kuh 7 , 5 2 mg-atom 15 NÜbeischuß {0,113 g 1S N-Überschuß) als 15NH4NOa> der anderen Kuh 25,42 mg-atom M N-Überschuß (0,381 g 1S N-Überschuß) als (NH 4 ) 2 S0 4 in einmaliger Dosis. Im ersten Fall konnten nach 10 Tagen 17,21%, im zweiten Fall nach 17 Tagen 25,4% der verabreichten 15 N-Überschußmenge in der Milch wiedergefunden werden. Gegenüber den in den eigenen Versuchen verabreichten 15 N-Überschußmengen sind die von L A N D und VIRTANEN verwandten Mengen sehr gering. Trotzdem scheint in bezug auf die Ausscheidung der verabreichten 15 N-Überschußmenge mit der Milch eine weitgehende Übereinstimmung zu bestehen, wenn man berücksichtigt, daß in den eigenen Versuchen die Bestimmungen der 15 N-Häufigkeiten bereits abgebrochen wurden, als die untersuchte Milch noch einen 15 N-Überschuß aufwies, der doppelt bzw. viermal so hoch war wie die bei L A N D und VIRTANEN diesbezüglich überhaupt erreichten Höchstwerte. Es muß daher angenommen werden, daß bei Beobachtungen über längere Zeit die Ausscheidung des markierten Stickstoffs mit der Milch die für 14 Versuchstage bestimmten 12,9% im Versuch I und die für 16 Versuchstage bestimmten 11,9% im Versuch II noch überstiegen hätte und ebenfalls in den Bereich von 17—25% zu liegen gekommen wäre. Größere Bedeutung als diesen über die tägliche Ausscheidung ermittelten Werten, die eine zu hohe Verwertung des 15 N angeben, muß den bei den eigenen Untersuchungen erreichten annähernd stationären Werten für die relative Häufigkeit des 15 N beigemessen werden, die eine Berechnung der tatsächlichen Verwertung des Ammoniumbicarbonat-N erlauben. Der Nachweis eines annähernd stationären Zustandes gelang für Casein-N relativ gut im Versuch I. Die auf der Grundlage der stationären 15 N-Häufigkeiten ermittelte tatsächliche Verwertung des verfütterten Ammoniumbicarbonat-N zur Milchprotein-Synthese (Tab. 4) beträgt in beiden Versuchen ca. 9% (vgl. auch [22]). Die tatsächliche Verwertung des Ammoniumbicarbonat-N für die gesamte Milchsynthese (Milchproteine plus Rest-N-Verbindungen) beträgt im Versuch I 10,9% und im Versuch II 9,5% und liegt damit um ca. 2% niedriger als die über die jeweilige Tagesausscheidung von markiertem Stickstoff mit der Milch bestimmten Werte (Tab. 1 und 2) für die 14 bzw. 16 Versuchstage. Werden jedoch die bei verlängerter Versuchszeit zu erwartenden 17—25% (s. o.) für die Ammoniumbicarbonat-N-Ausscheidung mit der Milch den 10,9% und 9,5% gegenübergestellt, so ergeben sich bereits beachtliche Unterschiede. Diese für die tatsächliche Verwertung des AmmoniumbicarbonatN zu hohen Werte liegen in der Wiederverwendung des in Körpereiweiß eingebauten markierten Stickstoffs begründet. Der Einbau von Ammoniumbicarbonat-N in die Milch erfolgt relativ schnell. und VIRTANEN [ 1 3 ] konnten bereits 1 Stunde nach V I • breichung der 15 Nmarkierten Verbindungen eine erhöhte relative Häufigkeit aes 15 N in der Milch feststellen. Im Versuch I der vorliegenden Arbeit wurde zwar erst 4 Stunden nach der ersten Gabe von Ammoniumbicarbonat-[ 15 N] gemolken, die 15 N-Häufigkeit in LAND

346

MIELKE, Die Verwertung des Ammoniumbicarbonat-N

der Milch war jedoch zu diesem Zeitpunkt schon relativ hoch. Im Versuch II erfolgte der erste Milchentzug bereits 40 Minuten nach der ersten Gabe von Ammoniumbicarbonat-[ 15 N] und danach über weitere 7 Stunden stündlich. Dabei ergaben sich auch in dieser Milch (Probe 2) über der natürlichen 15 N-Häufigkeit liegende Werte, die in den darauffolgenden Stundengemelken im Gesamt-N und in den drei N-Fraktionen weiter anstiegen und nur in der Rest-N-Fraktion nach 4 Stunden wieder stärker absanken. Im Versuch I konnte der enge Zusammenhang der Ammoniumbicarbonat-Fütterungszeit mit dem unmittelbar danach erfolgenden schnellen Anstieg der relativen Häufigkeit des 15 N in allen N-Fraktionen der Milch, besonders aber im Rest-N, aufgedeckt werden. Die relative Häufigkeit des 15 N im Rest-N der Milch steht in direkter Beziehung zu den im Rest-N des Blutes ermittelten relativen 15 N-Häufigkeiten [6]. Die relativ hohe 15 N-Häufigkeit in der Rest-N-Fraktion der Milch 4 Stunden nach der letzten Gabe von Ammoniumbicarbonat-[ 15 N] und der Abfall der Markierung in der 5.—8. Stunde bzw. in der 5.—16. Stunde nach dieser Gabe lassen weiterhin Zusammenhänge zwischen einer schnellen Resorption des Ammoniumbicarbonat-N durch die Pansenwand, seinem Transport in der Rest-N-Fraktion des Blutes, dem Transformierungsprozesse in der Leber zwischengeschaltet sind, und der „Filtration" oder aktiven Sekretion Ammoniumbicarbonat-N-haltiger Verbindungen in die Rest-N-Fraktion der Milch vermuten, wobei jedoch zu berücksichtigen ist, daß es sich gegenüber den Milchproteinen um relativ geringe N-Mengen handelt. Da bei der Milchprotein-Synthese in erster Linie den freien Aminosäuren des Blutes eine Bedeutung als Bausteine der Milchproteine beigemessen wird, weniger den Plasmaeiweißen, die nur für das Serumalbumin und die Immunglobuline der Milch wichtig erscheinen [15], muß den Ammoniumbicarbonat-N-haltigen Verbindungen der Rest-N-Fraktion des Blutes unter dem Aspekt der Einbeziehung des Ammoniumbicarbonat-N in die Milchprotein-Synthese besondere Beachtung geschenkt werden (s. auch [7]). Neben der Tätigkeit der Pansenflora und -fauna bei der Verwertung des Stickstoffs aus nichteiweißartigen Verbindungen für die Eiweißsynthese bei den Wiederkäuern [1] müßte auf Grund der raschen Geschwindigkeit der den Ammoniumbicarbonat-N einbeziehenden Milchsyntheseprozesse auch an eine das „Ammoniumbicarbonat"-NH 3 bindende reduktive Aminierung der aKetoglutarsäure zu Glutaminsäure mit nachfolgenden Transaminierungsvorgängen zu anderen Aminosäuren im intermediären Stoffwechsel gedacht werden [14]. Diese Aminosäuren würden dann der Milchprotein-Synthese zur Verfügung stehen. Für die anfänglich gegenüber den Milchserumproteinen erhöhte 15 N-Häufigkeit bei den Caseinen sind offensichtlich Aminosäuren mit unterschiedlich hohen 15NHäufigkeiten verantwortlich zu machen, die in die entsprechenden Eiweißverbindungen eingebaut werden [13, 7]. Der in der Abb. 8 gegenüber Caseinen nachgewiesene relativ bevorzugte Einbau von 15 N-markierten Verbindungen in die Milchserumproteine ab 5. Tag nach der letzten Gabe von Ammoniumbicarbonat- N ] läßt auf die Einbeziehung von Plasmaeiweißen in die Synthese der Milchserumproteine, insbesondere der Serumalbumine und Immunglobuline, schließen. Die Plasmaeiweiße zeigen nämlich zu dieser Zeit höhere 15 N-Häufigkeiten als der ReststickstofF des Blutes [6].

347

Archiv für Tierernährung, Band 13, Heft 5/6, 1963

Zusammenfassung Im Rahmen einer umfangreichen Untersuchung wurden an zwei laktierende Rinder 18,76 g bzw. 26,14 g 15 N-Überschuß in Form von 10,4 Atom-% 15 N-markiertem Ammoniumbicarbonat über 4 bzw. 51/2 Tage verfüttert und die Änderung der relativen Häufigkeit des 15 N im Gesamt-N, im Casein-N, im Milchserumprotem-N und im Rest-N der Milch untersucht. Bereits 40 Minuten nach der ersten Gabe von Ammoniumbicarbonat-[ 15 N] war ein 15 N-Überschuß in der Milch festzustellen, der sich in den folgenden 3—4 Stunden progressiv erhöhte. Enge Beziehungen bestehen zwischen der Fütterungszeit des 15 N-markierten Ammoniumbicarbonats und dem Anstieg der relativen Häufigkeit des 15 N in der Milch. Die relativen 15 NHäufigkeiten erreichten im Versuch I am 3. und 4. Tag und im Versuch II am 5. und 6. Tag der Verfütterung von 15 N-markierten Ammoniumbicarbonat annähernd stationäre Werte. Auf der Grundlage dieser stationären Werte konnte die tatsächliche Verwertung des Ammoniumbicarbonat-N für die Milchprotein-Synthese unter den gegebenen Versuchsbedingungen mit ca. 9% ermittelt werden. Die Ausscheidung des Ammoniumbicarbonat-N in der Rest-N-Fraktion der Milch beträgt ca. 1% der aufgenommenen Menge. Die Bestimmung der Ammoniumbicarbonat-N-Verwertung über die tägliche Ausscheidung des verabreichten 15 N über längere Zeit nach der letzten 15 N-markierten Substanzgabe ergibt zu hohe, der tatsächlichen Verwertung nicht entsprechende Werte.

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349 Aus dem Institut für Physikalische Stofftrennung, Leipzig (Direktor: Prof. Dr. J. MÜHLENPFORDT) der Deutschen Akademie der Wissenschaften zu Berlin und dem Institut für Tierernährung der Friedrich-Schiller-Universität Jena (komm. Leiter: Dr. A. HENNIG) A . HENNIG, K . GRUHN, H .

FAUST

Untersuchungen zum N-Stoffwechsel beim laktierenden Rind unter Verwendung von oral verabreichtem Ammoniumbicarbonat-[15N] 8. Mitteilung Einbau des markierten Stickstoffs in die Aminosäuren der Milch Einleitung Z U N T Z [71] und H A G E M A N N [27] stellten vor etwa 70 Jahren die Hypothese auf, daß Wiederkäuer mit Hilfe ihrer Pansenflora in der Lage sind, stickstoffhaltige Verbindungen nichteiweißartiger Natur (NPN) zu verwerten. Jedoch hatten schon früher W E I S K E und Mitarb. [68] in N-Bilanzversuchen mit Schafen nachweisen können, daß das Asparagin die N-Bilanz und auch die Zunahme erhöht. Die zahlreichen weiteren Untersuchungen nach dem ersten Weltkrieg erbrachten den Nachweis (Übersicht bei J A H N [ 3 1 ] , K O L B [ 3 5 ] , S C H M A N E N K O W [ 5 6 ] ) , daß Harnstoff und andere NPN-Verbindungen einen Teil des Futtereiweißes bei Wiederkäuern mit einem funktionsfähigen Pansen ersetzen können. Der verabreichte Stickstoff aus NPN-Verbindungen wird, wie Versuche mit markiertem Stickstoff zeigen, in das Eiweiß des Körpers (WATSON und Mitarbeiter [67]) und auch der Milch [32, 36, 66] eingebaut. Die Verwertung der NPN-Verbindungen für Erhaltung und produktive Zwecke in größerer Menge setzt voraus, daß im Pansen durch die Bakterien alle essentiellen Aminosäuren synthetisiert werden können. Diesen Beweis konnten L O O S L I und Mitarbeiter [41] in Versuchen an Schafen und Ziegen führen, welche eine „purified diet" mit Harnstoff erhielten. Es ist jedoch auch durchaus möglich, daß ein Teil der NPNVerbindungen nach Hydrolyse im Pansen direkt — also unter Umgehung der Bakterien — in das Körper- oder Milcheiweiß eingebaut werden könnte. Aus dem Pansen wird bekanntlich besonders bei erhöhter NH 3 -Konzentration in der Pansenflüssigkeit Ammoniak absorbiert [1, 2], Die absorbierte Base wird im Blut teilweise in Glutamin überführt und schließlich in Harnstoff umgewandelt. Jedoch kann offenbar auch ein Einbau in nichtessentielle Aminosäuren erfolgen [17, 22, 34, 57, 62]. S C H U T T [58] und K O H L S T R U N K [34] nehmen auf Grund ihrer Versuche mit NH 4 C1 und Diammoniumadipinat an Ratten an, daß auch bei monogastrischen Tieren ein Teil des Eiweißes durch NPN ersetzt werden kann. Die Verwertung des NPN bei monogastrischen Tieren ist in erster Linie vom Anteil der nichtessentiellen Aminosäuren im Futter abhängig [20], Bei Verfütterung in der Praxis üblicher Rationen an wachsende Schweine und wachsendes Geflügel wurde dagegen keine Verwertung des NPN ermittelt [49], da ausreichend nichtessentielle Aminosäuren im Futter vorhanden sind. Beim Wiederkäuer werden auch unter normalen Fütterungsbedingungen größere Mengen an NPN verabreicht, da besonders Gärfutter und Grünfutter reich an Amiden sind [48]. Im Pansen selbst wird ein beträchtlicher Teil des nativen Eiweißes hydrolysiert und schließlich zu Ammoniak abgebaut [43, 51]. Das gebildete NH 3 wird von den Bakterien verwertet oder wird absorbiert [2, 39], wobei die Höhe der Absorption von der Ammoniakkonzentration im Pansensaft abhängig ist [30], Die Aminosäuregarnitur des Futters nimmt einen wesentlich geringeren Einfluß auf die N-Verwertung als es beim monogastrischen Tier bzw. Geflügel der Fall ist. Es besteht auch beim Wiederkäuer die Möglichkeit, daß adsorbiertes Ammoniak im Körper in nichtessentielle Aminosäuren eingebaut wird.

350

HENNIG u. a., Einbau des markierten Stickstoffs

Das Rohprotein der Milch setzt sich aus verschiedenen Fraktionen zusammen, welche sich in ihrer Aminosäuregarnitur deutlich unterscheiden [61]. Das trifft auch für die einzelnen Caseine der Milch zu. a-Casein enthält beispielsweise einige essentielle Aminosäuren in geringerer Menge als das ß - bzw. y-Casein. Das a-Lactalalbumin enthält 7% Tryptophan, während die übrigen Milchproteine höchstens 1,9% enthalten. Der verschiedenartige Aufbau der einzelnen Milchproteinfraktionen bzw. -unterfraktionen wirft die Frage nach dem Ort ihrer Synthese auf. In ersten experimentellen Untersuchungen mit einer unzureichenden Methode und einem nicht ausreichenden Analysenverfahren kam CARY [15] zu der Schlußfolgerung, daß die für die Proteinsynthese notwendigen Aminosäuren von der Milchdrüse aufgenommen werden. Die sogenannte arteriovenöse Methode, bei welcher die Gehaltsdifferenz des zu- und abfließenden Blutes als Kriterium benutzt wird, wurde später von einer Reihe Autoren verbessert [5, 14, 23, 50, 59]. Ergänzende Untersuchungen an der isolierten und künstlich durchbluteten Milchdrüse [13] und mit markierten Substanzen [9, 11] konnten die mit der AV-Methode gewonnenen Ergebnisse im wesentlichen bestätigen. Die freien Aminosäuren des Blutplasmas sind nach diesen Arbeiten als Vorstufen für die im Euter synthetisierten Milcheiweißkörper (a-, ß-Casein, /3-Lactoglobulin, a-Lactalalbumin) anzusehen. Die essentiellen Aminosäuren werden direkt in die Eiweißkörper der Milch eingebaut [7], während die nichtessentiellen Aminosäuren in einer begrenzten Menge in der Milchdrüse selbst gebildet werden [9, 10, 11, 60], Das Plasmaeiweiß selbst liefert nur einen unerheblichen Anteil der für die Milchproteine erforderlichen Aminosäuren [5, 6]. Die Immunoglobuline der Milch werden vom Blut in toto geliefert, aber ihre Zusammensetzung wird wahrscheinlich durch die Drüse modifiziert [61]. Nach LARSON und GILLESPIE [37, 38] soll entgegen früheren Ansichten auch das a-Lactalalbumin im Euter gebildet werden. Die von uns an zwei laktierenden Rindern durchgeführten Untersuchungen über den Verbleib des zugefütterten Ammoniumbicarbonat-[ 15 N] boten Gelegenheit, während der Versuchsdauer in den Aminosäuren der Milch die relative Häufigkeit des stabilen Stickstoffisotops 1 5 N zu ermitteln. Die Untersuchungen hatten das Ziel, orientierende Informationen über den zeitlichen Verlauf des Einbaues von markiertem Stickstoff in die essentiellen und nichtessentiellen Aminosäuren der Milch zu erhalten. 1. V e r s u c h s d u r c h f ü h r u n g u n d a n a l y t i s c h e M e t h o d e n 1.1. V e r s u c h s d u r c h f ü h r u n g 2 laktierende Kühe der Deutschen Schwarzbunten Rasse erhielten zu einer Futterration, bestehend aus Maissilage, Heu und Kraftfutter (Einzelheiten siehe ROMMEL [55] u n d ULBRICH u n d

SCHOLZ [ 6 4 ] ) , 2 5 0 g A m m o n i u m b i c a r b o n a t

natürlicher

iso-

toper Zusammensetzung je Tier und Tag in zwei Gaben. Nach einer Vorperiode von 1 4 (Versuch I) bzw. 28 "Tagen (Versuch II) wurde die gleiche Menge Ammoniumbicarbonat, jedoch mit einer relativen Häufigkeit des 1 5 N von 1 0 , 4 A t o m - % im Versuch I 4 Tage 1 und im Versuch II 51/2 Tage verabreicht. Die insgesamt in Form von Ammoniumbicarbonat verfütterte 15 N-Menge betrug im Versuch I 18,76 g und im Versuch II 26,14 g. Beide Kühe erhielten nach der Verfütterung der markierten Substanz bis zum Versuchsende die gleiche Ration wie in der Vorperiode. Die Fütterung der Kühe erfolgte jeweils um 7.00 und 15.00 Uhr. Die Melkzeiten wurden in Versuch I auf 6.30 Uhr, 10.45 Uhr, 18.45 Uhr und 22.45 Uhr festgelegt. 1

Am vierten Tag wurden nur 237 g markiertes Ammoniumbicarbonat verfüttert.

351

Archiv für Tierernährung, Band 13, Heft 5/6, 1963

Im Versuch II wurde am 1. Tag von 7.50 Uhr — 14.50 Uhr stündlich, in der darauf folgenden Versuchszeit jeweils 18.30 Uhr und 6.30 Uhr gemolken. Das Melken wurde mit der Hand vorgenommen. Die Milchleistung der Tiere, der N-Gehalt der Milch sowie der Anteil der einzelnen Milcheiweißfraktionen kann der Arbeit von MIELKE [46] entnommen werden. Die Zeitpunkte der Probenahme sind aus Tabelle 1 zu ersehen.

Tabelle 1 Probe-Nr.

Zeitpunkt der Probenahme

Versuchs tag

Versuch I 1 2 3 4 5 6 7 8 9

1. 1. 1. 1. 1. 2. 4. 6. 10.

6.30* 10.45 14.45 18.45 22.45 Sammelprobe von 14.45 und 18.45 >j »> >j >> )i »

Versuch II 1

1.

Sammelprobe vom Versuchstag 18.30 und Morgengemelk des nächsten Versuchstages ** >i » >> >) H J>

2 3 4 5

3. 5 *** 7. 11.

>>

>>

>>

>>

n

)>

* Vor Beginn der Hauptperiode ** Als Versuchstag wird der Zeitraum von 0—24.00 Uhr bezeichnet. * * * Im Versuch II wurde die Milch der Sammelprobe des 5. Tages in Casejn, Milchserumprotein und Reststickstoff fraktioniert.

1.2.

Analytische Verfahren

1.2.1. V o r b e h a n d l u n g d e r G e s a m t m i l c h Zur Bestimmung der Aminosäuren wurde die filtrierte Milchprobe im Trockenschrank bei 50—55 °C getrocknet, homogenisiert und mit Diäthyläther entfettet. 1.2.2. T r e n n u n g d e r E i w e i ß f r a k t i o n e n Die Fällung des Caseins erfolgte nachKiEFERLE und GLÖTZL [33], DasFiltrat des Rückstandes wurde mit 50 ml Allmenscher Gerbsäurelösung versetzt und nach den bei RÖDER [54] angegebenen Vorschriften weiter verarbeitet.

352

H E N N I G u. a., Einbau des markierten Stickstoffs

1.2.3. T r e n n u n g des H y d r o l y s a t s Die Trennung der Aminosäuren erfolgte nach der Vorschrift von

MOORE,

SPACKMAN u n d STEIN [ 4 7 ] u n d M A T T H I A S [ 4 2 ] .

Nähere Einzelheiten über die weitere Verarbeitung der Proben sind dem Beitrag von GRUHN und F A U S T [25] zu entnehmen. Die quantitative Bestimmung der Aminosäuren erfolgte papierchromatographisch. GRUHN [ 2 4 ] hat über die angewandte Methode ausführlich berichtet. 1.2.4. D i e B e s t i m m u n g d e r r e l a t i v e n H ä u f i g k e i t des I s o t o p s

15 N

Die relative Häufigkeit des Isotops 15 N wurde nach Oxydation des NH4C1 mit NaOBr zu N 2 emissionsspektrometrisch ermittelt [72], Die Ergebnisse der Isotopenanalysen werden als 15 N-Überschuß in Atom-% ( 15 N') angegeben; d. h. die natürliche Häufigkeit des Isotops 15 N von 0,370 Atom-% wurde von den ermittelten Werten jeweils abgezogen. Neben dem 15 N-Überschuß wurde in einigen Fällen der relative Einbaufaktor g

15 N'-Anteil

an der Summe des Aminosäure- 15 N' N-Anteil an der Summe des Aminosäure-N

zur Charakterisierung des Einbaues von markiertem Stickstoff in die einzelnen Aminosäuren verwendet. Eine nähere Diskussion zeigt, daß diese relativen Einbaufaktoren geeignet sind, auch dann den Einbau markierten Stickstoffs in die einzelnen Aminosäuren zueinander in Beziehung zu setzen, wenn die Aminosäuren in unterschiedlichen Mengenverhältnissen vorliegen, oder wenn markierter Stickstoff unterschiedlicher relativer Häufigkeit verwendet wird. Diese Methode bietet somit gegenüber der von A Q V I S T [3, 4 ] angegebenen eine Reihe von Vorteilen. 2. V e r s u c h s e r g e b n i s s e 2.1. G e h a l t d e r G e s a m t m i l c h 2 u n d des C a s e i n s an A m i n o s ä u r e n Der Gehalt der Gesamtmilch und des Caseins an Aminosäuren wurde nur im Versuch I ermittelt. Die Aminosäuregarnitur des Caseins und auch der Gesamtmilch unterscheidet sich kaum von den bereits bekannten Werten anderer Autoren [21, 28, 29]. Wir haben deshalb in Tab. 2 nur den Mittelwert von je neun Proben angegeben. Der Gehalt an einigen Aminosäuren (z. B. Glutamin- und Asparaginsäure) war jeweils in den nach der Fütterung ermolkenen Proben reduziert bzw. erhöht. Da für Betrachtungen über den Einbau des Stickstoffs aus markiertem Ammoniumbicarbonat in die verschiedenen Aminosäuren der auf die einzelnen Aminosäuren entfallende N-Anteil des Gesamt-Aminosäure-N (in diesem Falle der von uns ermittelten Aminosäuren) entscheidender ist als die Aminosäuregarnitur des Milcheiweißes, haben wir in Tab. 2 diesen Wert errechnet. 2 Als Gesamtmilch w i r d das sogenannte Rohprotein ( N x 6,37) bezeichnet. Als Bezugsbasis f ü r die A n g a b e des A m i n o s ä u r e gehaltes dient i m m e r das Hvdrolysatprotein.

353

A r c h i v f ü r T i e r e m ä h r u n g , B a n d 13, H e f t 5/6, 1963

Tabelle 2 Aminosäuregehalt der Gesamtmilch und des Caseins sowie Verteilung des N auf die einzelnen Aminosäuren (Mittelwerte) Gesamtmilch mg Aminosäure/lOOmg Hydrolysatprotein Glutaminsäure Asparaginsäure Glycin Alanin Serin Threonin Vahn Leucin * Isoleucin * Lysin Arginin Histidin Methionin Phenylalanin Tyrosin Tryptophan Prolin**

17,4 7,8 2,1 3,8 5,8 4,7 7,3 10,4 6,9 7,9 4,0 2,8 3,3 5,4 4,6 1,4 9,8

s

1,1 0,7 0,1 0,5 0,3 0.2 0,2 — —

0,2 0,1 0,1 0,1 0,1 0,7 0,06 -

Casein

mg Amino% N an der Summe des säure/100 mg ermittelten Hydrolysatprotein Ammosäure-N 12,4 6,1 2,9 4,5 5,8 4,1 6,5 8.3 5,5 11,3 9,6 5,7 2,3 3,4 2,7 -

8,9

19,1 8,0 2,0 3,6 7,0 4,7 7,7 9,0 6,1 7,7 4,3 3,3 3,6 5,7 5,4 1,3 10,9

s

0,4 0,4 0,1 0,2 0,1 0,3 0,4 — —

0,2 0,2 0,1 0,1 0,3 0,3 0,07 -

% N an der Summe des ermittelten Aminosäure-N 13,0 6,0 2,7 4,7 6,7 4,0 6,6 6,9 4,8 10,6 9,9 6,4 2,4 3,5 3,2 —

9,5

* N u r S u m m e beider A m i n o s ä u r e n b e s t i m m t * * L i t e r a t u r w e r t e [36]

2.2. E i n b a u de's m a r k i e r t e n N in die A m i n o s ä u r e n der G e s a m t m i l c h und des Caseins In den Abb. 1, 2 und 3 wird der von uns ermittelte 15 N-Überschuß in Atom-% für die einzelnen Aminosäuren zu den einzelnen Probenahmen mitgeteilt. Wir haben den Daten für die einzelnen Aminosäuren die Werte der Gesamtmilch bzw. des Caseins gegenübergestellt. Der Mittelwert für die von uns ermittelten Aminosäuren ist jeweils geringer als der für den Gesamt-N ermittelte Wert, da einmal von uns nicht alle Aminosäuren bestimmt wurden und möglicherweise während der Hydrolyse Ammoniak (wahrscheinlich aus Amidgruppen) frei geworden ist, dessen 15 N-Häufigkeit größer ist als die durchschnittliche 15 N-Häufigkeit in den von uns untersuchten Aminosäuren. 2.2.1. G e s a m t m i l c h Bereits zur ersten Probenahme — 225 Minuten nach der ersten Gabe des markierten N — wurde in der Mehrzahl der untersuchten Aminosäuren ein deutlicher Einbau des markierten N ermittelt. In der zweiten Probe haben fast alle Aminosäuren eine höhere 15 N-Häufigkeit als in der ersten Probe. Die zweite Gabe der markierten

354

HENNIG u. a., Einbau des markierten Stickstoffs

Substanz am Abend des ersten Versuchstages bewirkt einen weiteren Anstieg der in der Mehrheit der Aminosäuren. Gegenüber den ersten beiden Versuchsgemelken ist besonders der höhere 15 N-Überschuß des Arginins beachtenswert (Abb. 1).

15 N-Häufigkeit

U

Mag -

?

3

k

5

6

.

7

6

9.

10. Tag

Abb. 1. Atom-%- 1 5 N-Überschuß in den Aminosäuren der Gesamtmilch (Versuch I) ausgezogene K u r v e : durchschnittliche 15 N-Häufigkeit des Gesamt-N gestrichelte K u r v e : durchschnittliche 15 N-Häufigkeit des Aminosäure-N

In allen vier Proben ist ein bevorzugter Einbau des markierten Stickstoffs in die Glutaminsäure zu verzeichnen. In diese Aminosäure wird immer ein höherer Anteil des markierten N eingebaut, als auf Grund des prozentualen Anteils am Gesamt-N der untersuchten Aminosäuren erwartet werden müßte. Mit Ausnahme der ersten Probe ist am ersten Tag im Versuch I auch der prozentuale Anteil des 15 N' im Arginin höher als auf Grund der Verteilung des Aminosäure-N erwartet werden konnte. In der ersten Probe des Versuches II wird der bevorzugte Einbau des markierten N in das Arginin und die Glutaminsäure vermißt. Dagegen ist ein deutlich bevorzugter Einbau in die Asparaginsäure festzustellen. In den beiden Proben, welche noch während der Gabe des markierten N genommen wurden, ist im Versuch I wiederum ein bevorzugter Einbau des markierten Stickstoffs aus Ammoniumbicarbonat in die Glutaminsäure und das Arginin zu ermitteln. Für beide Aminosäuren wurde ein relativer Einbaufaktor 3 von 1,4 ermittelt. Im Versuch II wird zwar etwas mehr markierter Stickstoff in die Asparagina

siehe Seite 352.

355

Archiv für Tierernährung, Band 13, Heft 5/6, 1963

».

Tag

A b b . 2. Atom-%- 1 5 N-Uberschuß in den Aminosäuren des Milchcaseins (Versuch I ) ausgezogene Kurve: durchschnittliche 15 N-Häufigkeit des Gesamt-N-Caseins gestrichelte K u r v e : durchschnittliche 15 N-Häufigkeit des Aminosäure-N-Caseins 1—Tyr I ylleu YAeti

0.9

•Up-) 0.8

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Tag

Abb. 3. Atom-%- 1 5 N-Überschuß in den Aminosäuren der Gesamtmilch (Versuch I I ) ausgezogene K u r v e : durchschnittliche 15 N-Häufigkeit des Gesamt-N gestrichelte K u r v e : durchschnittliche 15 N-Häufigkeit des Aminosäure-N

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H E N N I G u. a., Einbau des markierten Stickstoffs

säure eingebaut als dem Anteil des Asparaginsäure-N am Gesamt-N entspricht, jedoch ist der Anstieg zu gering, um daraus Schlußfolgerungen abzuleiten. Der stärkere Einbau des 15 N in die Glutaminsäure und das Arginin im Versuch muß auf Kosten einiger anderer Aminosäuren gehen. In Übereinstimmung damit wurde für Isoleucin, Phenylalanin, Tyrosin und Prolin ein relativer Einbaufaktor < 1 ermittelt. Der Einbau des markierten N aus Ammoniumbicarbonat in die Aminosäuren der Milch wird bei mehrtägiger Verfütterung der markierten Verbindung etwa nach drei bis fünf Tagen im wesentlichen durch den Anteil des N der jeweiligen Aminosäure am Gesamt-N der untersuchten Aminosäuren bestimmt. Die im Versuch I ermittelten Abweichungen von dieser Regel bedürfen weiterer Aufklärung. Es ist jedoch durchaus möglich, daß der bevorzugte Einbau des markierten N in die beiden Aminosäuren im Versuch I auf die kürzere Vorperiode in diesem Versuch zurückzuführen ist. Allerdings sind andererseits auch bei den komplizierten Vorgängen im Pansen durchaus Abweichungen zu erwarten. Nach dem Absetzen der markierten Verbindung ist für sämtliche untersuchten Aminosäuren ein Rückgang des 15 N-Überschuß in Atom-% zu verzeichnen (Abb. 1 u. 2). Etwa 5 Tage nach der Hauptperiode ist für die Mehrheit der Aminosäuren ein geringerer 15 N-Überschuß zu ermitteln als 225 Minuten nach Beginn des Versuches. Im Versuch II ist allerdings der mittlere 15 N-Überschuß etwa fünf Tage nach dem Ende der Hauptperiode größer als im Versuch I. Die Verteilung des 1S N' auf die einzelnen Aminosäuren der Gesamtmilch erfährt nach der letzten Gabe markierten Stickstoffs eine Veränderung. Sie entspricht auch nicht mehr annähernd dem prozentualen Anteil des N der jeweiligen Aminosäure am Gesamt-N der untersuchten Aminosäuren. In beiden Versuchen wurde ein größerer Anteil des 15 N' vom gesamten Aminosäure- 15 N' in den basischen Aminosäuren gefunden. Er beträgt beispielsweise im Versuch II am 11. Versuchstag ~ 48%, während ihr N-Anteil nur ^ 26% beträgt. Ein prozentual geringerer 15 N'-Anteil wurde in beiden Versuchen in den zyklischen Monoaminosäuren und im Methionin ermittelt. Es wurde schon erwähnt, daß der Rückgang der 15 N'-Häufigkeit nach dem Absetzen der markierten Verbindung in beiden Versuchen unterschiedlich ist. Zur Aufklärung dieser Unterschiede empfahl es sich, den Quotienten des 15 N-Überschusses jeder untersuchten Aminosäure des Versuches I und II zu errechnen. Da im Versuch II die l,3fache Menge an markiertem Ammoniumbicarbonat im Vergleich zu Versuch I verfüttert wurde, gestattet der errechnete Quotient einen Vergleich auf der Basis der unterschiedlichen Dauer der Applikation des markierten N. Tabelle 3 Vergleich des 15 N' in einzelnen Aminosäuren im Versuch I und II zwei Tage nach dem Absetzen der markierten Verbindung s» 1,3 Arginin Histidin Lysin Glutaminsäure Serin

Quotient aus A t o m - % ~ 1,6 Alanin Methionin

15 N-Überschuß

des Versuches II und I 2,1 s* 4,5 Asparaginsäure Prolin Threonin Valin Isoleucin Leucin Phenylalanin (2,5)

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Wir wählten für diesen Vergleich den zweiten Tag nach der Hauptperiode, da in allen Aminosäuren beider Proben noch ein deutlicherer 15 N-Überschuß ermittelt wurde. Die für die einzelnen Aminosäuren errechneten Quotienten konnten in entsprechende „Gruppen" eingereiht werden. Einen Quotienten von 1,3 — er entsprach dem Verhältnis der Menge des verabreichten markierten N in beiden Versuchen — konnte für die basischen Aminosäuren sowie Glutaminsäure und Serin errechnet werden (Tab. 3). In diese Aminosäuren wurde demnach der markierte N auf Grund des Verhältnisses der Menge des applizierten markierten N eingebaut. Für die übrigen Aminosäuren wurde in der Gesamtmilch des Versuches II im Vergleich zu Versuch I ein größerer lä N-Überschuß ermittelt als aus der verabreichten Menge zu erwarten war. Besonders deutlich tritt dieser Unterschied für die Aminosäure Prolin hervor. Die Aminosäuren, welche in die Gruppe mit einem Quotienten von Ri 1,3 eingereiht werden konnten, verhalten sich bezüglich des Einbaues des markierten N nach dem Ende der Hauptperiode im Versuch I anders als die übrigen Aminosäuren. Bei ihnen wurde zu diesem Zeitpunkt ein höherer 15 N-Überschuß ermittelt, als auf Grund der prozentualen Verteilung der Summe des Aminosäure-N erwartet werden konnte. Ihr relativer Einbaufaktor war also immer > 1. 2.2.2. M i l c h e i w e i ß f r a k t i o n e n Der 15 N-Überschuß in Atom-% im Stickstoff der Aminosäuren des Caseins wurde im Versuch I und nur in einer Probe des Versuches II ermittelt (Tab. 1). In dieser Probe wurde auch der Einbau des markierten N in die Aminosäuren der Serumproteinund Reststickstofffraktion ermittelt. Im Einbau des markierten N in die Aminosäuren der Gesamtmilch (Abb. 1 u. 3) und des Caseins (Abb. 2) bestehen einige bemerkenswerte Unterschiede, welche auf die Aminosäuregarnitur der einzelnen Milcheiweißfraktionen und ihre Bildung im Körper zurückgeführt werden müssen. Die Aminosäuregarnitur des Caseins und der Gesamtmilch unterscheidet sich allerdings nicht wesentlich (Tab. 2), da der Caseinanteil an der Gesamtmilch die übrigen Eiweißfraktionen übertrifft [28]. In der vierten Probe des ^ersten Versuchstages wurde mit Ausnahme des Tyrosins, Phenylalanins, Lysins und Arginins in allen Aminosäuren der Gesamtmilch und des Caseins etwa der gleiche 15 N-Überschuß ermittelt (Abb. 1 u. 3). Während für Arginin der 15 N-Überschuß in der Gesamtmilch deutlich größer ist, wurden für die drei anderen Aminosäuren geringere Werte im Casein festgestellt. In den ersten drei Proben dieses Versuchstages sind ebenfalls Unterschiede im Einbau des markierten N in die Aminosäuren des Caseins und der Gesamtmilch zu verzeichnen. In der ersten Probe fällt auf, daß der 15 N-Überschuß in einigen Aminosäuren des Caseins deutlich höher ist als in der Gesamtmilch. Im Verlaufe des ersten Tages erfolgt eine Angleichung beider Meßwerte. Das ist besonders für Glutaminsäure, Alanin, Methionin, Leucin und Isoleucin ausgeprägt. Ein bevorzugter Einbau des markierten N erfolgt am ersten Tage in die Glutaminsäure und das Phenylalanin, da der prozentuale Anteil des 15 N' wesentlich größer ist als es dem Anteil des N dieser Aminosäuren an der Summe des Aminosäure-N entspricht. Ein relativ geringerer Einbau ist in allen Proben des ersten Tages im 24

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HENNIG u. a., Einbau des markierten Stickstoffs

Histidin und in den ersten drei Proben auch für Lysin nachzuweisen (RE-Faktor < i). Am zweiten und vierten Versuchstag entspricht der Anteil des 15 N' in den untersuchten Aminosäuren — mit Ausnahme der Glutaminsäure und des Glycins — etwa der Verteilung des N auf die einzelnen Aminosäuren (Tab. 4). Das ist in höherem Maße als bei der Gesamtmilch der Fall, da es sich um einen relativ einheitlichen Eiweißkörper handelt. Der bevorzugte Einbau des markierten N in die Glutaminsäure bestätigt den Befund für die Gesamtmilch. Der relativ geringere Einbau in das Glycin überrascht. Tabelle 4 Höchste Ausscheidung an 15 N' in den Aminosäuren sowie 15 N'-Anteil in einzelnen Aminosäuren in Prozent der Summe des Aminosäuren- 15 N' (Versuch I)

Glutaminsäure Asparaginsäure Glycin Alanin Serin Threonin Valin Leucin Isoleucin Lysin Arginin Histidin Methionin Phenylalanin Tyrosin Prolin

Höchste Ausscheidung/Tag

Anteil des 1 5 N'-% (Mittel 2. + 4. Tag)

Gesamtmilch

Gesamtmilch

2./4. 2. 2./4. 2. 2. 2. 4. 4. 4. 2./4. 4. 4. 4. 4. 2. 2.

Casein 4. 4. 2. 4. 2.4. 4. 4. 4. 2. 2-/4. 2./4. 2./A. 4.

2. 4.

17,6 6,0 2,1 3,4 5,5 4,0 7,8 9,4 2,8 10,1 13,7 7,5 1,9 1,6 •1,3 5,1

Casein 16,8 7,0 1.? 4/

6,0 4,0 7,0 5,8 4,0 9,8 7,5 6,2 • 2,3 3,8 3,0 10,7

In Tabelle 4 wird neben der Verteilung des 15 N' auf die einzelnen Aminosäuren auch der Tag mitgeteilt, an welchem die größte Menge 15 N' mit der einzelnen Aminosäure in der Milch und im Casein ausgeschieden wurde. Es ergeben sich für einige Aminosäuren Unterschiede, deren Signifikanz und physiologische Ursachen der Aufklärung in weiteren Versuchen vorbehalten bleiben müssen. Im 15 N-Überschuß der Aminosäuren des Caseins nach dem Absetzen der markierten Substanz ergibt sich eine weitgehende Übereinstimmung mit den Zahlen der Gesamtmilch (Abb. 3). Die Verteilung des 15 N' erfährt auch hier eine Veränderung. Diese erfolgt zugunsten der basischen Aminosäuren, der Glutaminsäure und des Serins. 69,7% des am sechsten Versuchstag in den untersuchten Aminosäuren ausgeschiedenen N entfallen auf diese fünf Eiweißbausteine, während ihr Anteil am Gesamtaminosäure-N nur 46,6% beträgt. Es liegt auf Grund der übereinstimmenden

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Befunde des Versuches I und II nahe, daß diese fünf Aminosäuren sich im Stoffwechsel des laktierenden Wiederkäuers anders verhalten als die übrigen. Eine Erklärung für diese Befunde zu finden ist sehr schwierig, da bisher keine Anhaltspunkte hierfür vorliegen und diese fünf Aminosäuren in bezug auf ihr Verhalten im Stoffwechsel des monogastrischen Tieres sich teilweise sehr unterscheiden. 2.2.2.1. C a s e i n , M i l c h s e r u m p r o t e i n u n d R e s t - N D a von M I E L K E (46) der Einbau des markierten N in das Casein, die Milchserumproteine und die Rest-N-Fraktion an dem gleichen Tier untersucht wurde, erschien es zweckmäßig, zumindest in einer Probe die relative Häufigkeit des l ä N in den Aminosäuren beider genannten Fraktionen gleichzeitig zu ermitteln. Wir wählten für die Untersuchung die Sammelprobe des 5. Tages der Versuchskuh V I I . Im Casein wurde ein relativ hoher 15 N-Überschuß in Threonin, Glycin, Valin und Phenylalanin, ein geringerer in Glutaminsäure, Prolin, Leucin und Lysin ermittelt (Abb. 4). Die Schwankungsbreite ist aber verhältnismäßig gering (0,45 bis 0,85

o» 03

0.7

(-]

o,6

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0.3

n

n

nn

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r-,

0,2

0.1 Glu Asp Sly Alo Ser Ihr Vbl Leu Jleu Lys Arg Met Phe Tyr Pro

Abb. 4. Atom-%- 1 5 N-Überschuß in den'Aminosäuren des Milchcaseins (5. Tag, Versuch II)

Atom-%). Der schon bei der Gesamtmilchprobe beobachtete geringere 15 N-Uberschuß in der Glutaminsäure findet sich im Casein wieder. Insofern werden die Befunde für Gesamtmilch bestätigt, sie stehen aber nicht im Einklang mit den Ergebnissen des Versuches I. Vergleicht man die Ergebnisse der Isotopenanalyse der Aminosäuren des Milchserumproteins (Abb. 5) mit dem Casein, so ist bemerkenswert, daß bei den Milchserumproteinen die Schwankungsbreite der 15 N'-Werte viel größer ist (0,12 bis 0,89 Atom-%) und daß der 15 N-Überschuß im Stickstoff der essentiellen Aminosäuren niedriger liegt. Dies erscheint ein weiterer Hinweis für den anderen Ursprung eines Teils der Milchserumproteine zu sein. Der Rest-N der Milch weist einen hohen 15 N-Überschuß in der Glutaminsäure und im Glycin auf. Im Threonin, Prolin, Isoleucin und Histidin wurde ein sehr geringer 15 N-Überschuß ermittelt, welcher auch geringer ist als in den beiden anderen Fraktionen. Zwischen dem 15 N-Überschuß in den Aminosäuren des Rest-N der Milch (Abb. 6) und des Blutes bestehen keine korrelativen Beziehungen. Das gleiche gilt auch für die Beziehungen zwischen dem 15 N-Überschuß in den Aminosäuren des Rest-N, des Blutes sowie des Milchserumproteins und Caseins. 24*

360

H E N N I G u. 2., Einbau des markierten Stickstoffs

BN' 1,0

0,9 0,8

0,7 0,6

Q5 0,4 03 0,2

II

0,1

Glu Asp Gly Alo Ser Ihr Vol Leu Jteu Lys Arg Mef Phe Tyr Pro

Abb. 5. Atom-%- 1 5 N-Überschuß

in den Aminosäuren des Milchserumproteins (5. T a g , Versuch II)

15N' 1,0

Q9 oe 0,7 0,6

0,5 0A

0J 0.? 0,1 Glu Asp Gly 41a Ser Tbr Leu J e u Lys Arg Urs Met Phe Pro

Abb. 6. Atom-%- 1 5 N-Überschuß in den Aminosäuren der Rest-N-Fraktion der Milch

Da die Milchdrüse die Aminosäuren des Blutes für die im Euter erfolgende Proteinsynthese selektiv auswählt [12, 13], sind auch keine Beziehungen zu erwarten. Weiterhin ist noch zu erwähnen, daß der 15 N-Überschuß in Atom-% nicht die Mengenverhältnisse der einzelnen Aminosäuren berücksichtigt. 3. D i s k u s s i o n der E r g e b n i s s e Mit vorliegender Arbeit sollte geprüft werden, in welchem Umfange der N des oral verabreichten Ammoniumbicarbonats für die Synthese einzelner Aminosäuren benutzt wird. Es war also nicht vorgesehen, den biochemischen Ablauf dieser komplizierten Prozesse zu untersuchen. Zweifellos überrascht, daß schon knapp vier Stunden nach der Verfütterung der markierten Verbindung in allen Aminosäuren markierter N nachgewiesen werden konnte. MIELKE [46] fand im Versuch II bereits eine Stunde nach der Gabe des markierten N im Casein und Milchserumalbumin eine deutliche Markierung. Auch GÜRTLER und MÜLLER [26] wiesen im Gesamtblut und im Plasmaeiweiß kurze Zeit nach Versuchsbeginn markierten N nach. Der 15 N-Überschuß erreichte bereits

A r c h i v f ü r T i e r e r n ä h r u n g , Band 13, Heft 5/6, 1963

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nach 30 Minuten im Gesamtblut ein Maximum. Es wird von den Verfassern angenommen, daß bald nach diesem Zeitpunkt ein Einbau des markierten N in die Plasmaproteine erfolgt. Da auch im Harn [65] kurze Zeit nach der Fütterung der markierten Verbindung ein relativ hoher 15 N-Überschuß ermittelt werden konnte, muß eine schnelle Absorption markierte Verbindungen stattgefunden haben. Ein großer Teil des kurz nach der Fütterung absorbierten markierten N dürfte direkt vom Pansenepithel als NH 3 aufgenommen und an das venöse Blut abgegeben worden sein. Dafür spricht die von M C D O N A L D [ 4 3 ] , BOUCKAERT und O Y A R T [ 1 2 ] und L E W I S und Mitarb. [ 3 9 ] ermittelte hohe NH 3 -Konzentration im Portalblut. Ein NH 3 -Überschuß im Blut wird bei monogastrischen Tieren teilweise von den Dicarbonsäuren aufgefangen [17, 4 4 , 5 7 , 6 3 ] , jedoch soll nach BRONK und FISHER [14] die akzeptorische Fähigkeit der a-Ketoglutarsäure bzw. der Glutaminsäure relativ gering sein. Diese an Ratten erhaltenen Ergebnisse können allerdings nicht ohne weiteres auf die Verhältnisse beim Wiederkäuer übertragen werden. Da sowohl Lysin und auch Threonin 225 Minuten nach der Aufnahme der markierten Substanz durch das Tier einen 15 N-Überschuß aufwiesen, kann angenommen werden, daß der markierte N in die beiden Aminosäuren mit Hilfe der Bakterien eingebaut wurde. Diese Annahme ist wahrscheinlich, weil Lysin [22, 57] und auch Threonin [19, 44, 45, 53] an den Transaminierungsvorgängen im Stoffwechsel der höheren Tiere nicht teilnehmen. Es entsteht allerdings die Frage, ob die von den Bakterien gebildeten Aminosäuren bereits innerhalb dieser kurzen Zeitspanne zur Synthese des Milchproteins zur Verfügung stehen. Bei einer Absorption der Aminosäuren durch das Pansenepithel würde diese Möglichkeit eher in Betracht gezogen werden können, als wenn diese erst im Dünndarm erfolgt. ANNISON [1] konnte zwar keinen Anstieg des a-Amino-N im Portalblut nach der Fütterung feststellen, jedoch vermochten D E M A U X und Mitarb. [16] bei Verabreichung synthetischer Aminosäuren an Hammel eine Absorption im Pansen zu ermitteln. Nach R . E. BROWN 4 werden mit Sicherheit Aminosäuren aus dem Pansen absorbiert. Auch L E W I S u. E M E R Y [40] konnten kürzlich experimentell belegen, daß einige Aminosäuren aus dem Pansen absorbiert werden. Im Dünndarm ist auf Grund der vorliegenden Versuche älteren Datums 225 Minuten nach der Gabe des markierten N kaum mit der Möglichkeit einer Absorption von Aminosäuren innerhalb dieser Zeitspanne zu rechnen. Neuere Ergebnisse [2, 8] über den Verlauf der Pansenentleerung lassen es aber nicht unmöglich erscheinen, daß innerhalb des in Frage stehenden Zeitraumes Aminosäuren mit 15 N aus Ammoniumbicarbonat absorbiert werden. BENZIE U. PHILLIPSON [8] wiesen bereits zwei Stunden nach der Fütterung B a S 0 4 im Dünndarm nach und RATHNOW [ 5 2 ] nimmt auf Grund seiner Analysen an, daß schon drei Stunden nach der Fütterung etwa 32% des verzehrten Futters den Pansen verlassen haben. Der markierte N in den nichtessentiellen Aminosäuren kann auch aus dem markierten absorbierten NH 3 entstammen. Allerdings wird der über die Glutaminsäure mit Hilfe von Transaminasen in anderen Aminosäuren eingebaute markierte N aus absorbierten NH 3 nach Versuchen an monogastrischen Tieren unter normalen Fütterungsbedingungen als gering eingeschätzt [44, 57]. '' persönliche M i t t e i l u n g v o m 26. A p r i l 1963

362

HENNIG u. a., Einbau des markierten Stickstoffs

Da im Körper Lysin nicht gebildet wird und an den- Transaminierungsvorgängen nicht teilnimmt, ist es möglich, Beziehungen zwischen der Menge des in der Milch ausgeschiedenen markierten Lysins und der Synthese des Lysins im Pansen aufzustellen. Für die Errechnung wurde der Tag der höchsten Lysin- 15 N'-Ausscheidung herangezogen. Die errechnete Lysinmenge spiegelt die minimale Größe an dieser Aminosäure wider, welche aus dem markierten Ammoniumbicarbonat im Pansen erzeugt wurde. Die tatsächlich gebildete Menge dürfte jedoch im Versuch größer gewesen sein, da Lysin auch im Körper abgelagert wird [25]. Bei Kuh V I wurde als Höchstmenge täglich 2,0 g Lysin, dessen N aus dem Ammoniumbicarbonat entstammt, und bei Kuh V I I 1,9 g in der Milch ausgeschieden. Bei einer mit wenig nativem Eiweiß gefütterten Ziege errechneten E D W A R D S und D A R R O C H [ 1 8 ] eine tägliche Lysinsynthese im Pansen von 2,3 g. Dieser Wert ist erheblich höher als der bei wachsenden Lämmern ermittelte [41]. In den Versuchen mit laktierenden Ziegen bzw. wachsenden Hammeln wurde fast nur NPN als N-Quelle im Futter verabreicht, so daß auch eine relativ umfangreiche Lysinsynthese im Pansen erwartet werden konnte. Da das Threonin ebenfalls kaum am N-StofFwechsel des Organismus teilnimmt, wurde die täglich mit der Milch abgegebene Menge an dieser Aminosäure, deren N aus dem Ammoniumbicarbonat entstammt, ebenfalls errechnet. Sie ist geringer als für Lysin und beträgt im Versuch I 1,4 g und im Versuch II 1,2 g. Wenn die im Futter verabreichten Anteile des verdauten Ammoniumbicarbonat-N am verdauten Gesamt-N mit dem Anteil des Lysins am Gesamtlysin, dessen N aus dem Ammoniumbicarbonat entstammt, in Beziehung gesetzt werden, so können Aussagen über die Verwertung des anorganischen N zur Lysinsynthese gemacht werden. Wir haben für diesen Vergleich jeweils den Versuchstag mit dem höchsten 15 N-Überschuß in der Milch herangezogen. Im Futter beträgt der verdaute Anteil des Ammoniumbicarbonat-N am Gesamt-N im Versuch I 21,5% und im Versuch II 25,2%. In der Milch entstammen dagegen nur 5,7% (Versuch I) bzw. 6,4% (Versuch II) des Lysin-N am Gesamtlysin-N aus dem Ammoniumbicarbonat. Für Threonin betragen die entsprechenden Werte 6,7% bzw. 8,1%. Der aus dem Ammoniumbicarbonat stammende N-Anteil am täglich sezernierten Milch-N beträgt am vierten Tag des Versuches I 8,9% bzw. 9,5% am fünften Tag des Versuches II. Es kann allerdings aus dem Vergleich der einzelnen Anteile des Ammoniumbicarbonat-N im Futter, in der Gesamtmilch und in einzelnen Aminosäuren nicht abgeleitet werden, daß der N dieser Verbindung in geringerem Maße in das Lysin oder Threonin als in die anderen N-Bestandteile der Milch eingebaut wird. Der hohe 15 N-Überschuß im Lysin nach dem Absetzen der markierten Substanz spricht eindeutig dagegen. In langfristigen Versuchen bei Kontrolle der Lysin- 15 N-Ausscheidung in der Milch könnten weitere Ergebnisse über die Verwertung des NPN für die Synthese der Aminosäuren im Pansen gewonnen werden. Der Einbau des markierten N in die übrigen Aminosäuren soll an dieser Stelle keiner vergleichenden Betrachtung unterzogen werden. Es wurde deshalb auch darauf verzichtet, entsprechende Beziehungen zwischen der von den anderen Autoren ermittelten Zusammensetzung der bakteriellen Proteine des Pansens [69] sowie des

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Grünfutters [70] zu suchen. Da das Milcheiweiß einige Aminosäuren in höherer Konzentration als die Grünfutter- oder Bakterienproteine enthält, bieten sich hier gute Ansatzpunkte für weitere Arbeiten. Zusammenfassung An zwei Kühen wurde der Einbau des markierten N aus dem Ammoniumbicarbonat in 16 Aminosäuren der Gesamtmilch untersucht. Bei einem Tier wurde auch die Häufigkeit des 15 N' in den Aminosäuren des Caseins und in einer Milchprobe auch in den Aminosäuren des Milchserumproteins und des Rest-N der Milch bestimmt. Ergebnisse: 1. Der Aminosäuregehalt der Milch und des Caseins bei Verfütterung des Ammoniumbicarbonats in Höhe von 250 g je Tier und Tag unterscheidet sich nicht von den bei üblicher Fütterung erhaltenen Werten. 2. Knapp vier Stunden nach der Verfütterung der markierten Verbindung wurde bereits in allen Aminosäuren ein Einbau des markierten N ermittelt. 3. Im zeitlichen Verlauf des Einbaues von markiertem N bestehen zwischen den einzelnen Aminosäuren Unterschiede. Sie betreffen in erster Linie die 15 N-Häufigkeit kurz nach der Verfütterung und nach dem Absetzen der markierten Substanz. 4. Die Verteilung des Ammoniumbicarbonat-[ 15 N] auf die einzelnen Aminosäuren der Milch und in stärkerem Maße des Caseins entspricht etwa vier Tage nach Verfütterung der markierten Substanz weitgehend dem N-Anteil der Aminosäuren an der Summe des N aller untersuchten Aminosäuren. 5. Im Einbau des markierten N in die Aminosäuren der Gesamtmilch und des Caseins bestehen besonders in den ersten Stunden nach Beginn der Verfütterung des Ammoniumbicarbonat-[ 15 N] Unterschiede. Nach dem Absetzen der markierten Substanz wird bezüglich der 15 N-Häufigkeit ein gleichsinniges Verhalten ermittelt. 6. Der markierte N wurde nach dem Absetzen der markierten Verbindung vorrangig in den basischen Aminosäuren gefunden. Herrn P. WIEFEL, Institut für Tierernährung, und Frl. U. WIESNER, Institut für Physikalische Stofftrennung, danken wir für die ausgezeichnete Mitarbeit bei der Durchführung der Untersuchungen.

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366 Aus dem Institut für Tierzucht und Tierernährung der Karl-Marx-Universität Leipzig (ehemal. Direktor: Prof. Dr. Dr. H. ARCULARIUS)

M . U L B R I C H u n d H . SCHOLZ

Untersuchungen zum N-Stoffwechsel beim laktierenden Rind unter Verwendung von oral verabreichtem Ammoniumbicarbonat-[ 15 N] 9. Mitteilung Zur Ausscheidung von Ammoniumbicarbonat-N in Kot und Harn Zur Klärung der Frage, wie Ammoniumbicarbonat in den Stickstoffhaushalt von Milchkühen eingeht, die diese N-Verbindung mit dem Futter erhalten, wurden umfangreiche Versuche mit 15 N-markiertem Ammoniumbicarbonat durchgeführt, zu denen auch die Untersuchungen von Kot und Harn gehörten. Um Aussagen über die Verwertbarkeit der mit dem Futter verabreichten stickstoffhaltigen Substanzen machen zu können, war die quantiative Bestimmung des Stickstoffs in Kot und Harn notwendig. Die stabilisotope Markierung des verabreichten Ammoniumbicarbonat-N sollte darüber hinaus Aufschluß geben, in welcher Zeit und in welchen Mengen der aufgenommene Ammoniumbicarbonat-Stickstoff von den Tieren ausgeschieden wurde. Methodik Es wurden nacheinander zwei Versuche durchgeführt. Im Versuch I erhielt dieVersuchskuh V I, nachdem sie in einer Vorversuchsperiode an die Aufnahme von täglich 250 g Ammoniumbicarbonat (17,8% N) mit dem Futter gewöhnt worden war, in der eigentlichen Versuchszeit 3 Tage lang je 250 g und am 4. Tag 237 g Ammoniumbicarbonat, mit einer relativen Häufigkeit des stabilen Isotops 15N von 10,4Atom-%. In diesen 4 Tagen erhielt die Versuchskuh V I insgesamt 176g Ammoniumbicarbonat-N bzw. 18,76 g 15 N-Überschuß. Nach Fütterung des markierten Ammoniumbicarbonates erhielt die Kuh wieder 250 g Ammoniumbicarbonat natürlicher isotoper Zusammensetzung je Tag. Der Versuchskuh V II wurden täglich ebenfalls 250 g Ammoniumbicarbonat der gleichen isotopen Zusammensetzung des Stickstoffs wie im Versuch I während einer Zeit von 51/2 Tagen mit dem Futter verabreicht, nachdem sie in der Vorversuchsperiode täglich 250 g Ammoniumbicarbonat natürlicher isotoper Zusammensetzung mit dem Futter aufgenommen hatte. Während dieser 51/2 Tage erhielt die Kuh insgesamt 245 g Ammoniumbicarbonat-N bzw. 26,14 g 15 N-Überschuß. Die Fütterung von Ammoniumbicarbonat natürlicher isotoper Zusammensetzung wurde anschließend weitere zehn Tage fortgesetzt und die Kuh danach geschlachtet. Die Sammlung von Kot und Harn erstreckte sich über 17 Tage. In beiden Versuchen standen die Kühe auf Gummimatten, von denen der abgesetzte Kot nahezu verlustlos gesammelt und in verschließbare Behälter gegeben wurde. Die Entnahme der Proben erfolgte im Versuch I vom 1. bis 7. Tag um 6.15, 12.15 und 18.15 Uhr. Vom 8. Tag wurden die Proben von 6.15 und 12.15 Uhr und

Archiv für Tierernährung, Band 13, Heft 5/6, 1963

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vom 9. bis 14. Tag jeweils nur eine 12.15 Uhr genommene24-Stunden-Sammelprobe zur Untersuchung verwendet. Die Zeit 12.15 Uhr zur Entnahme der Sammelproben war aus arbeitstechnischen Gründen gewählt worden, doch erwies sie sich als ungünstig für die Auswertung. Deshalb wurde für den Versuch II die Entnahme der 24-Stunden-Sammelproben für alle Versuchstage (1.—17. Tag) auf 6.15 Uhr festgelegt. Nachdem der gesamte Inhalt des Sammelbehälters gut durchgerührt worden war, ergaben kleine, an verschiedenen Stellen entnommene Kotproben die Gesamtkotprobe von etwa 200 g Kot. Aus dieser Probe gelangten nach nochmaligem guten Durchmischen 4 x 15 g Kot zur Verarbeitung. Zur quantitativen Stickstoffbestimmung nach der Makro-Kjeldahlmethode dienten 3 X 15 g Kot und zur Trockengewichtsbestimmung 15 g, wobei der Kot bei 60 °C bis zur Gewichtskonstanz getrocknet wurde. Als Katalysatoren bei der Veraschung gelangten im Versuch I Kupfersulfat und im Versuch II Selenreaktionsgemisch zur Anwendung. Nach der Titration der Vorlage mit Natronlauge unter Verwendung von Tashiro-Indikator wurde die Lösung wieder mit Salzsäure angesäuert und eingedampft, um das Ammoniumchlorid für die Isotopenanalyse zu gewinnen. Nach Schlachtung der Versuchskuh V II wurden Proben aus dem Inhalt von Pansen, Labmagen und verschiedenen Darmabschnitten entnommen und der Stickstoff nach der Makro-Kjeldahlmethode bestimmt. Eine Trockengewichtsbestimmung des Duodenuminhaltes war nicht möglich, weil das Duodenum zu wenig Untersuchungsmaterial enthielt. Zum Auffangen des Harnes diente ein Urinal, von dem aus der Harn in Flaschen geleitet und mit Toluol überschichtet wurde. Die Entnahme der Proben erfolgte während der Versuche I und II zu den gleichen Zeiten wie beim Kot. Am ersten Tag des Versuches II wurde außerdem nach der ersten Fütterung mit 15 N-markiertem Ammoniumbicarbonat (7.11 Uhr) bis 9.00 Uhr halbstündlich und von 9.00 bis 14.00 Uhr stündlich mittels Katheter Harn gewonnen, um den zeitlichen Verlauf der Ausscheidung markierten Stickstoffs im Harn unmittelbar nach der ersten Fütterung von 1 5 NH 4 HC0 3 verfolgen zu können. Von jeder Probeentnahme wurden 2 x 5 ml zur quantitativen Stickstoffbestimmung nach der Makro-Kjeldahlmethode verwendet und anschließend wie beim Kot das Ammoniumchlorid für die Isotopenanalyse gewonnen. Über die probenchemische Umarbeitung des Ammoniumchlorids und die massenspektrometrische Bestimmung der 1 5 N Häufigkeit berichten R O L L E und H Ü B N E R [ 7 ] sowie B I R K E N F E L D , H A A S E und M E I E R [ 1 ] .

Ergebnisse Die ermittelten Harn- und Kotmengen sowie die Ergebnisse der Stickstoff- und Isotopenanalysen sind in den Tabellen 1 —7 zusammengefaßt. Diese enthalten Angaben über den Zeitpunkt der Probenahme, den Stickstoffgehalt von Kot und Harn, die relativen Häufigkeiten des 15 N in den einzelnen Proben und die täglich ausgeschiedenen Mengen an Kot, Harn, Kotstickstoff, Harnstickstoff sowie 15 N-Überschuß. Während in den Tabellen die relative Häufigkeit des 15 N in

368

U L B R I C H u n d S C H O L Z , Ausscheidung von Ammoniumbicarbonat-N

Tabelle 1 Kotmengen und Stickstoffwerte nach Proben und Tagen von der Versuchskuh V I Versuchstag 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14.

Uhrzeit

6.15 12.15 18.15 6.15 12.15 18.15 6.15 12.15 18.15 6.15 12.15 18.15 6.15 12.15 18.15 6.15 12.15 18.15 6.15 12.15 18.15 6.15 12.15 12.15 12.15 12.15 12.15 12.15 12.15

N/kg Feuchtgewicht g

N/Probe g

15,33 14,14 13,93 16,20 15,47 17,00 16,13 15,33 16,27 15,80 14,73 14,93 12,47 22,27 15,60 16,00 16,47 16,07 15,27 15,40 15,47 15,07 15,27 14,53 15,20 6,13 15,27 15,33 15.20

3,84 3,05 3,04 3,98 3,51 3,38 3,61 4,12 3,40 3,58 3,54 3,35 3,38 3,46 3,58 3,32 3,36 3,30 3,10 3,57 3,29 3,36 3,11 3,21 3,24 3,63 3,48 3,41 3,36

46,08 24,40 13,98 40,79 20,36 20,28 36,82 40,79 20,40 49,40 21,24 28,81 51,71 17,99 29,71 38,18 16,80 28,38 31,31 26,42 21,38 29,57 21,15 (84,7)* 57,02 89,66 90,48 90,36 83,33

442,28 15,25

98,56 3,40

Probe

Kot

Trockensubstanz

Nr.

kg

0/ /o

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29

12,00 8,00 4,6 10,25 5,8 6,0 10,2 9,9 6,0 13,8 6,0 8,6 15,3 5,2 8,3 11,5 5,0 8,6 10,1 7,4 6,5 8,8 6,8 (24,52) * 17,6 24,7 26,0 26,5 24,8

Summe Mittel

24 Std.Kot

N/Tag

i. kg

kg

20,65

75,13

26,10

97,89

25,80

91,04

29,10

98,51

24,80

84,69

26,10

86,11

22,10

72,10

(24,52)* 17,60 24,70 26,00 26,50 24,80

(84,7)* 57,02 89,66 90,48 90,36 83,33

294,25 24,52

1016,32 84,69

* A n diesem Tag, an dem nicht die gesamte Tageskotmenge ermittelt werden konnte, wurde f ü r K o t und K o t - N der Mittelwertaller übrigen Tage eingesetzt

A t o m - % angegeben ist, ergibt sich die Menge des ausgescheidenen l ä N-Überschusses in g aus dem 1 5 N-Überschuß ( 1 5 N'). Z u r Errechnung der 1 5 N'-Werte wurde bei K o t eine natürliche relative Häufigkeit von0,375 A t o m - % und bei Harn von 0,370 A t o m - % von der experimenteller mittelten relativen Häufigkeit substrahiert. Z u r Berechnung der Mengen 1 5 N-Überschuß in g diente die Gleichung n

s

=

m

(J-s TTT' [As + 14

wobei n s = Molzahl des schweren Isotops

369

Archiv für Tierernährung, Band 13, Heft 5/6, 1963

Tabelle 2 Relative Häufigkeit des 1 5 N im Kotstickstoff und die sich daraus ergebende Menge Ammoniumbicarbonatstickstoff, die von der Versuchskuh V I mit dem K o t ausgeschieden wurde

Versuchstag

Uhrzeit

Probe

15N

(«.-%)

i5N'/ Probe g

Nr. 1.

6.15 12.15 18.15 6.15 12.15 18.15 6.15 12.15 18.15 6.15 12.15 18.15 6.15 12.15 18.15 6.15 12.15 18.15 6.15 12.15 18.15 6.15 12.15 12.15 12.15 12.15 12.15 12:15 12.15

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8. 9. 10. 11. 12. 13. 14.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29

(0,4) (0,5) (0,7) 0,719 —

(0,98) (1,1) 1,23 1,29 (1,29) (1,30) 1,30 (1,24) (1,12) 0,922 (0,85) 0,779 0,703 0,700 0,578 (0,53) (0,51) (0,45) 0,433 0,433 0,408 0,411 0,433

(0,01) (0,02) (0,14) 0,08 (0,10) (0,24) (0,32) 0,19 0,48 (0,21) (0,29) 0,51 (0,17) (0,24) 0,22 (0,09) 0,13 0,11 0,10 0,04 (0,05) 0,03 (0,05) 0,03 0,05 0,04 0,04 0,05

Summe Die in Klammern geset2ten Werte sind graphisch interpoliert.

m = N-Menge in g _ Atom-°/ 0 15 N-Überschuß ^

-

bedeuten.

lÖÖ

ausgeschiedene Menge in % Ammoniumdes gesamten 15 N'/Tag bicarbonat-N mit AmmoniumN/Tag bicarbonat aufg genommenem N g

0,17

1,6

0,9

0,42

3,9

2,2

0,99

9,3

5,3

1,01

9,5

5,4

0,63

5,9

3,4

0,33

3,1

1,8

0,19

1,8

1,0

(0,03) (0,05) 0,03 0,05 0,04 0,04 0,05

(0,3) (0,5) 0,3 0,5 0,4 0,4 0,5

0,1 0,3 0,1 0,3 0,2 0,2 0,3

4,03

38,0

21,5

370

ULBR1CH und S C H O L Z , Ausscheidung von Ammoniumbicarbonat-N

Tabelle 3 Harnmengen und Stickstoffwerte nach Proben und Tagen von der Versuchskuh V I Versuchstag 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14.

Uhrzeit

Probe

Harn 1

N/1 g

N/Probe g

6.15 12.15 18.15 6.15 12.15 18.15 6.15 12.15 18.15 6.15 12.15 18.15 6.15 12.15 18.15 6.15 12.15 18.15 6.15 12.15 18.15 6.15 12.15 12.15 12.15 12.15 12.15 12.15 12.15

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29

1,23 0,75 1,88 1,35 1,68 1,78 1,18 1,55 2,28 0,89 1,58 2,55 0,89 1,37 2,07 0,71 1,14 3,87 1,37 1,24 4,10 2,37 9,70 10,22 6,77 (6,17)* 5,70 5,09

8,64 10,73 16,13 12,18 3,78 15,02 16,69 12,38 11,38 15,18 5,18 18,28 16,15 11,36 15,17 14,11 7,75 13,51 10,50 13,51 13,57 8,74 8,85 6,44 6,79 13,14 13,19 13,34 12,28

43,20 13,20 12,10 22,90 5,25 25,23 29,37 14,61 17,64 34,61 4,61 28,88 41,18 10,11 26,78 29,21 5,50 15,40 40,63 18,51 16,83 35,83 18,60 62,47 68,75 81,07 (67,07) * 76,30 62,50

24 Std. Menge Harn in 1

343,97 11,86

Summe Mittel

3,98

N/Tag g

40,25

4,64

69,21

4,72

56,86

5,02

80,17

4,15

61,49

6,38

74,54

7,71

71,26

9,70 10,22 6,77 (6,17)* 5,70 5,09

62,47 68,75 81,07 (67,07) * 76,30 62,50

74,08 6,17

804,87 67,07

* An diesem Tag, an dem nicht die gesamte Tagesharnmenge ermittelt werden konnte, wurde f ü r H a r n und H a r n - N der Mittelwert aller Tage eingesetzt

Die Menge

15

n x 15 = Menge 1 5 N-Überschuß in g. N-Überschuß in G r a m m beträgt demnach Menge

15

N = m

¡As • 15 14

Löst man diese Gleichung nach m auf, so ergibt sich: + 14 Im verfütterten Ammoniumbicarbonat betrug die relative Häufigkeit des 1 5 N 10,4 A t o m - % . Nach Abzug der natürlichen relativen Häufigkeit des 1 5 N von

371

Archiv für Tierernährung, Band 13, Heft 5/6, 1963

Tabelle 4 Relative Häufigkeit des 15 N im Harnstickstoff und die sich daraus ergebende Menge Ammoniumbicarbonatstickstoff, die von der Versuchskuh V I mit dem Harn ausgeschieden wurde

Versuchstag

Uhrzeit

Probe

15N

Probe

(at.-%) 1.

2. 3. 4. 5.

6. 7. 8. 9.

10. 11. 12. 13. 14.

15N'/

6.15 12.15 18.15 6.15 12.15 18.15 6.15 12.15 18.15 6.15 12.15 18.15 6.15 12.15 18.15 6.15 12.15 18.15 6.15 12.15 18.15 6.15 12.15 12.15 12.15 12.15 12.15 12.15 12.15

1

2 3 4 5 6 7 8 9

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29

_ (0,10)* 1,22 1,50 1,28 1,87 1,86 2,08 1,93 1,86 1,50 2,11 1,92 1,39 1,22 0,979 0,868 0,769 0,696 0,630 0,612 0,562 0,544 0,535 0,696 0,463 —

0,448 0,441

Summe

g

ausgeschiedene Menge in % des gesamten mit Ammoniumbicarbonat aufgenommenen N

0,48

4,5

2,6

0,82

7,7

4,4

1,08

10,2

5,8

1,28.

12,0

6,8

0,52

4,9

2,8

0,22

2,7

1,5

0,19

1,8

1,0

Ammonium15 N'/Tag bicarbonatg

g

0,00 (0,09)* 0,11 0,28 0,05 0,41 0,36 0,23 0,29 0,56 0,05 0,54 0,69 0,11 0,25 0,16 0,02 0,06 0,14 0,08 0,04 0,07 0,03 0,12 0,10 0,08 (0,07)* 0,06 0,04

N/Tag

0,03 0,12 0,10 0,08 (0,07)* 0,06 0,04

0,3 ' 1,1 0,9 0,7 (0,6)* 0,6 0,4

5,09

48,4

0,1 0,6 0,5 0,4 (0,3)* 0,3 0,2 27,3

* Hierbei handelt es sich um geschätzte Werte

0,370 Atom-% erhält man einen 15 N-Überschuß für den Stickstoff des Ammoniumbicarbonates von 10,03 Atom-%. In beiden Versuchen unterlagen der Stickstoffgehalt pro kg Kot bzw. pro Liter Harn und das Trockengewicht des Kotes nur geringen Schwankungen. Obwohl bei der Versuchskuh V I das Trockengewicht des Kotes und dadurch auch der Stickstoffgehalt je kg Naßkot (Tab. 1) etwas höher als bei der Versuchskuh

372

ULBRICH und SCHOLZ, Ausscheidung von Ammoniumbicarbonat-N

1 5

a

CO Tf (N