Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie: Volume 24, Number 5 [Reprint 2021 ed.] 9783112580660, 9783112580653

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ZEITSCHRIFT FÜR ALLGEMEINE MIKROBIOLOGIE AN INTERNATIONAL JOURNAL ON MORPHOLOGY, PHYSIOLOGY, GENETICS, AND ECOLOGY OF MICROORGANISMS VOLUME 24 • 1984 • NUMBER 5

AKADEMIE-VERLAG ISSN 0044-2208

Z. allg. Mikrobiol., Berlin 24 k 2 und k 2 < ^ t k - 1 ist, so daß Km « k^1/k1 = Ks ist. Die unter diesen Voraussetzungen wachstumbestimmenden Geschwindigkeitskonstanten kx und können sich mit der Anzahl der Substratbindungsstellen ändern, die in die wachstumbestimmende Reaktion einbezogen sind. Sie gleichen den mikroskopischen Dissoziationskonstanten zweier Konformationen des Enzym-Substrat-Komplexes, wenn im wachstumbestimmenden Reaktionsschritt die Bindung des Substrats an das Enzym mit dem Übergang zwischen zwei Konformationen des Enzymsystems verknüpft ist. Mithin setzt die wachstumbestimmende Reaktion möglichenfalls die durch Anpassung erreichte richtige Orientierung der funktionellen Gruppen im aktiven Zentrum des katalysierenden Enzymproteins voraus (KOSHLAND 1963). Dabei ist sowohl denkbar, daß die Substratbindung die Konformationsänderung auslöst (sequenzielles Modell, KOSHLAND et al. 1966) als auch vorstellbar, daß sich das Substrat an eine von mindestens zwei miteinander im Gleichgewicht stehenden Konformationen (E und E ' ) bevorzugt bindet (concertiertes Modell, MONOD et al. 1965). Beide Modelle, die wohl zwei einander

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komplementäre Prinzipien beinhalten, können im wachstumbestimmenden Enzym zugleich verwirklicht sein und hier sowohl für die Bildung des Enzym-SubstratKomplexes (BOSSHARD 1976) als auch des Enzym-Produkt-Komplexes gelten. Im folgenden Schema stellen die Reaktionswege a,b und e,f das concertierte Modell und die Reaktionswege c,d und g,h das sequenzielle Modell dar. a e E + S-^E'+S E ' + P ^ E + P c % b IL f f g l ES ^ E'S ^ E'P ^ EP d h Die Geschwindigkeiten von Bildung und Dissoziation des katalytisch aktiven wachstumbestimmenden Enzym-Substrat-Komplexes sollten von Konformationsänderungen bestimmt werden, weil diese gegenüber den Vorgängen von Bindung und Dissoziation um Zehnerpotenzen langsamer sind (HESS 1968). Deshalb kann angenommen werden, daß die Dissoziationskonstante Ks des Enzym-Substrat-Komplexes und damit letztlich die Halbsättigungskonstante K des Populationswachstums der Gleichgewichtskonstante L des Konformationsübergangs gleichen: K = Km = KS = k^/k, = L Mithin wächst die ii-Zahlenfolge, weil die Anzahl der durch Substrat oder einen anderen Liganden besetzten Bindungsstellen abnimmt und sich demzufolge das Konformationsgleichgewicht zugunsten der katalytisch inaktiven Konformation verschiebt. Sie wächst geometrisch, wenn sich jede dieser Bindungsstellen auf einer anderen der miteinander wechselwirkenden und in äquivalenten Positionen assoziierten Untereinheiten eines oligomeren Enzymsystems befindet. Infolgedessen sind diese Bindungsstellen einander homolog, also identische Stellen in derselben Primärstruktur des Enzymproteins. Der Faktor q, um den die ^-Zahlenfolge wächst, gleicht dann dem Reziproken des Quotienten c = K R I K T aus den mikroskopischen Dissoziationskonstanten der Bindungsstellen in aktiver (K R ) und inaktiver ( K T ) Konformation des wachstumbestimmenden Enzymproteins. Wenn K ~ L ist und /i m eine steigende lineare Funktion der maximalen Geschwindigkeit der wachstumbestimmenden Hinreaktion darstellt, weist die negative Korrelation der wachstumskinetischen Größen —log K und log fj,m auf Konformationsänderungen hin, die eine bessere Substratbindung und eine schlechtere Katalyse bedingen (Abb. 5). Wahrscheinlich schaffen diese Konformationsänderungen ein hydrophoberes Milieu im Bereich des aktiven Zentrums des wachstumbestimmenden Enzyms und verursachen aber, daß das Substrat weniger richtig in diesem aktiven Zentrum gebunden wird. Die Besetzung einer Bindungsstelle am wachstumbestimmenden Enzym vermehrt also wahrscheinlich die unproduktiven Enzym-Substrat-Komplexe. Sie bedingt die Organisierung aktiver Zentren bei Mangel an freier Enthalpie, die erforderlich ist (LIPSCOMB 1982), um die energetisch ungünstigere katalytisch aktive Enzymkonformation zu erreichen. Sie führt somit zu einer Modus-Verschiebung vom sequenziellen zum concertierten Modell der Anpassung des aktiven Zentrums des wachstumbestimmenden Enzyms. Das ist gleichbedeutend mit einer Vergrößerung der Geschwindigkeitskonstante des Übergangs von der katalytisch aktiven zur (energetisch günstigeren) nativen Konformation dieses Enzyms bei Konstanz (KIRSCHNER et al. 1966) oder Abnahme der Geschwindigkeit kT des umgekehrten Konformationsübergangs. Auf Grund der HALDANE-Beziehung JTeq = k-jcjc^k - z kann erwartet werden, daß Änderungen zugunsten von Dissoziation oder Bildung des wachstumbestimmenden Enzym-Substrat-Komplexes mit gleichgerichteten Änderungen des Enzym-Produkt-Komplexes verknüpft sind und von gleichartigen Konformationsänderungen begleitet werden. 20

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Die Lücke anstelle des dritten Gliedes in der wachstumskinetischen if-Zahlenfolge weist darauf hin, daß neben der Ligandenbindung wahrscheinlich auch eine Assoziation von Dimeren des wachstumbestimmenden Enzyms die Konstante des Konformationsgleichgewichts bestimmt. Diese Lücke entsteht, wenn die Besetzung einer dritten Bindungsstelle am wachstumbestimmenden Oligomer dessen Assoziation vom Dimer zum Tetramer voraussetzt. Somit könnte das Dimer die kleinste enzymatisch voll aktive wachstumbestimmende Enzymeinheit sein, die zu einem Oligomer assoziiert, das aus einer geraden Anzahl von Untereinheiten besteht. Das Ergebnis, daß anscheinend alle Glieder einer lückenhaften experimentellen ÜT-Zahlenfolge demselben Bildungsgesetz gehorchen, zeigt, daß die Gleichgewichtskonstante des DimerTetramer-Übergangs etwa die Größenordnung der Gleichgewichtskonstante des durch Substrat induzierten Übergangs zwischen zwei Proteinkonformationen hat (HOFER 1973). Die Lücke kann nicht geschlossen werden, wenn nur solche Dimere assoziieren, die Substrat oder einen anderen Liganden binden und sich deshalb in einer von dieser Ligandenbindung bestimmten Konformation befinden. Sie ist infolgedessen der Hinweis, daß das wachstumbestimmende Enzymsystem in vivo wahrscheinlich nur als substratbindendes oder ligandenbindendes Molekül auftritt. Das stimmt mit den Erwartungen überein, daß wachsende Zellen genügend Substrat- und Ligandenmoleküle im Cytosol enthalten und daß letztlich nur der durch Substratbindung induzierte Konformationsübergang die Existenz des wachstumbestimmenden Enzymsystems sichert, indem er es vor Proteolyse schützt (VITTO et al. 1980). Die Lückenhaftigkeit der ^-Zahlenfolge schließt aus, daß die Assoziation von Dimeren oder anderen Untereinheiten des wachstumbestimmenden Enzymsystems vor der Substratoder Ligandenbindung stattgefunden hat oder daß dieses Protein schon im nativen Zustand ein Assoziat von einer konstanten Anzahl von Untereinheiten darstellt. Sie schließt damit aus, daß die wachstumskinetische iT-Zahleniolge nur durch Besetzung von Substrat- und Ligandenbindungsstellen entstehen kann. Somit ist das geometrische Wachstum der if-Zahlenfolge als Ergebnis einer engen Korrelation von Konformation, Aktivität und möglichenfalls Assoziation des wächstumbestimmenden Enzymproteins erklärbar. Diese Korrelation scheint vorauszusetzen (JAENICKE 1973), daß die Quartärstruktur dieses. Enzymproteins stabil ist. Die oben abgeleitete oligomere Struktur des wachstumbestimmenden Enzymproteins gewährleistet diese Stabilität, weil sie eine große Enzymoberfläche bedingt, die größtenteils nicht in den Bereich aktiver Zentren einbezogen ist, sondern dem EnZymprotein Wechselwirkungen mit nicht an den chemischen Katalyseschritten beteiligten Gruppen großer Substratmoleküle oder einer Matrix ermöglicht (BROCKERHOFF 1974). Diese Wechselwirkungen ergeben möglicherweise die MiCHAELis-Konstante K m des Substrats der wachstumbestimmenden Reaktion und somit die if-Zahlenfolge. Die gleichbleibende Größenordnung des Faktors q der ^-Zahlenfolge und seine anscheinende Unabhängigkeit von der Art des wachstumbegrenzenden Nährstoffs lassen die Kopplung des wachstumbestimmenden Enzymproteins an ein Substrat vermuten, das in eine sterisch gleichbleibende Matrix wie die Zellmembran eingebettet ist. Dieses Substrat kann das an die Zellmembran gebundene DNA-Molekül sein (RYTER 1 9 6 8 , SUEOKA u . QUINN 1 9 6 8 , LEIBOWITZ U. SCHAECHTER 1 9 7 5 , WTNSTON U. STJEOKA

1980). Daraus ergibt sich die Möglichkeit, daß der zur DNA-Replikation fähige Proteinkomplex oder ein anderes sich an die DNA bindendes und mit der Zellmembran assoziiertes Protein wachstumbestimmend sein können. Nicht auszuschließen ist, daß die Substratkonformation (CLELAND 1975) die wächstumbestimmende Reaktion begrenzt. In diesem Falle können die Glieder der wachstumskinetischen iT-Zahlenfolge die Gleichgewichte zwischen zwei Substratkonformationen abbilden. Möglicherweise induziert die Bindung des wachstumbestimmenden Enzymproteins an die DNA einen "Übergang der DNA-Konformation von einem

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zum anderen Grad der negativen Superhelizität. Die wachstumbestimmende Reaktion hinge in diesem Falle ähnlieh der Transkription (BOTCHAN 1976) vom Grad der negativen Superhelizität der D N A ab. Damit wäre zu erwarten, daß der Faktor q, um den die Zahlenfolge der Halbsättigungskonstanten K des Populationswachstums wächst, dem Quotienten K a I K 0 aus den Assoziationskonstanten des Enzym-DNAKomplexes im DNA-Zustand hoher (Ka) bzw. geringer (K0) negativer Superhelizität gleicht. Experimentellen Messungen zufolge (WANG et cd. 1974) kann dieser Quotient K„IK0 des Komplexes aus lac Repressor und Operator-DNA in E. coli bis zu annähernd 14 betragen. Diese Größenordnung entspricht der möglichen des Faktors q, um den die hier vorgestellten geometrischen ii-Zahlenfolgen wachsen. Eine solche Deutung setzt die Annahme voraus, daß die wachstumbestimmende Hinreaktion mit dem Übergang von einer geringen, katalytisch inaktiven zu einer hohen, katalytisch aktiven negativen Superhelizität der D N A verknüpft ist. Dabei können möglicherweise Proteine ähnlich dem Katabolit-Aktivator-Protein (SALEMME 1982) wie allosterische Effektoren der DNA-Konformation wirken und die Glieder der wachstumskinetischen if-Zahlenfolge verursachen. Die in einer derartigen wachstumbestimmenden Reaktion erreichte große negative Superhelizität der D N A gewährleistet eine hohe Wahrscheinlichkeit kurzzeitiger Trennungen (melting, breathing) der DNA-Basenpaare und infolgedessen die Erkennbarkeit kurzzeitig ungepaarter Basenpaare durch DNA-Entwindungsenzyme (ABDEL-MONEM U. HOFFMAN-BERLING 1980) und RNA-Polymerase (VOLLENWEIDER et al. 1979). Sie ermöglicht damit die DNA-Doppelhelix-Entwindung, die zur ersten Replikationsgabel führt und anscheinend Voraussetzung des Replikationsstarts und der DNA-Synthese ist (ALBEKTS et al. 1980). Sie gewährleistet den Start der Transkription, in der die RNA-Polymerase eine R N A - K e t t e synthetisiert, die das Startmolekül der DNA-Synthese darstellt ( O G A W A et al. 1977, KORNBERG 1978)!

Es ist hier nicht zu entscheiden, ob der in der wachstumbestimmenden Reaktion für möglich gehaltene Übergang zwischen zwei Beträgen' der Superhelizität Aa = (X — oc ° durch Änderung der topologisch veränderlichen Windungszahl « ° oder der unveränderlichen Windungszahl tx der D N A erreicht wird. Im erstgenannten Fall genügt die Bindung eines Proteins an die D N A , um einen begrenzten DNA-Abschnitt zu entwinden (WANG 1980); im zweiten ändern Topoisomerasen wie die DNA-Gyrase die DNA-Konformation in enzymatischer Reaktion (COZZARELLI 1980a, b). Die Annahme, daß die wachstumbestimmende Reaktion eine enzymatisch (möglichenfalls durch DNA-Gyrase) katalysierte Änderung der DNA-Konformation beinhaltet, könnte von der Beobachtung bestätigt werden, daß das mikrobielle Populationswachstum eine sigmoidale Funktion der Phosphatkonzentration ist und somit einem homotropen allosterischen Effekt entspricht. Diese Beobachtung stimmt mit der Tatsache überein, daß die DNA-Gyrase von organischen Phosphaten abhängig ist, indem sie A T P hydrolysiert (COZZARELLI 1980b). Die aus dem geometrischen Wachstum der if-Zahlenfolge abgeleitete oligomere Proteinstruktur kann einer wahrscheinlichen Regel (UMBARGER 1969) zufolge hinweisen, daß das angenommene wachstumbestimmende Enzymprotein am Beginn einer Reaktionskette steht und Reaktionswege miteinander verkettet (STEBBING 1980). Möglicherweise ergibt sich aus einer derartigen Stellung die Koordination von Zellwandsynthese, Zellteilung und DNA-Replikation. Die oben abgeleitete Annahme, daß die .geometrische iC-Zahlenfolge Konformationsgleichgewichte abbildet, führt zu dem Gedanken, daß Zellwandsynthese, Zellteilung und DNA-Replikation durch den gemeinsamen Konformationsübergang ihrer katalysierenden Enzymsysteme koordiniert werden. Das setzt voraus, daß diese miteinander koordinierten Enzymsysteme physikalisch assoziiert sind. Somit ist ein vielgliedriger Protein-DNA-Zellwand-Komplex zu erwarten, in dem die Enzyme der Zellwandsynthese und der D N A 20*

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Replikation mit der Zell wand und den Proteinen assoziiert sind, die den Start der Zellteilung auslösen (JACOB etal. 1963, MENDELSON 1982a). Die Möglichkeit, die Glieder der wachstumskinetischen ii-Zahlenfolge sowohl auf die Gleichgewichtskonstanten zweier Enzym-Konformationen als auch auf die zweier DNA-Konformationen zurückführen zu können, läßt erwarten, daß die Enzymkonformation und die DNA-Konformation aufeinanderfolgende Glieder derselben Kausalkette sind. Diese Schlußfolgerung trifft zu, wenn das wachstumbestimmende Enzymprotein an die DNA gebunden (S-Komplex) oder mit einem an die DNA gebundenen Protein kinetisch gekoppelt ist. Dann kann ein möglicher Konformationsübergang von der > « ^ a 13 T3 .tí + Ph.tí H.+ -S S O fi I l l S S ® 11-1 ' s "3

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