Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie: Volume 24, Number 6 [Reprint 2021 ed.] 9783112580509, 9783112580493

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ZEITSCHRIFT FÜR ALLGEMEINE MIKRQ-BIOLOGIE AN INTERNATIONAL JOURNAL ON MORPHOLOGY, PHYSIOLOGY, GENETICS, AND ECOLOGY OF MICROORGANISMS VOLUME 24 • 1984 • NUMBER 6

AKADEMIE-VERLAG • BERLIN ISSN 0044-2208

Z. allg. Mikrobiol., Berlin 24 (1884), 6, 361-424

EVP 2 0 , - M

Instructions to Authors 1. The journal publishes original papers, short communications, and review articles. Submission of a paper implies that it has not been published or has not been submitted for publication elsewhere. Manuscripts should be sent in duplicate with one set of the original illustrations to the Editor-in-Chief: Prof. Dr. U. Taubeneck, DDR-6900 Jena, Beutenbergstr. 11. 2. Manuscripts should preferably been written in English but may also be submitted in German. They should be typed double-spaced and be accompanied by a title page comprising: name and address(es) of the institution(s) where the work was done, title of the paper, and the complete name(s) of the author(s). Each paper must begin with a brief summary in English. Original papers should be divided into sections headed: Introduction, Materials and Methods, Results, Discussion, Acknowledgements, and References. A short title for use as running head should be provided. The exact mailing address of the author to whom correspondence, reprint requests etc. are to be addressed must be given at the end of the paper. 3. Tables, illustrations, and descriptive legends of the illustrations must be submitted on separate sheets. Each table should have a heading. The size of illustrations should not exceed the maximum printing area of 12 cm X 19 cm or 4.7 inches x 7.5 inches, respectively. 4. Literature citations in the text should be by author and year of publication. If there are more than two authors, only the first should be named, followed by "et al". References should include only publications cited in the text. They should be given in alphabetical order: a) Books: Family name(s) and initials of author(s), year of publication. Title of the book. Volume and Edition. Publisher and place of publication, e. g.: B E R T H E L I N , J., B E L G Y , G . and MAGNE, R . , 1 9 7 7 . Some aspects of the mechanism of solubilization and insolubilization of uranium from granites by heterotrophic microorganisms. In: Bacterial Leaching Conference (W. SCHWARTZ, Editor), pp. 2 6 1 — 2 7 0 . Verlag Chemie Weinheim. b) Journals: Family name(s) and initials of author(s), year of publication. Title of the paper. Abbreviated name of the journal, volume (underlined), number of the first and last page, e.g.: K Ä P P E L I , O., MÜLLER, M . and F I E C H T E R , A., 1978. Chemical and structural alterations at the cell surface of Candida tropicalis, induced by hydrocarbon substrate. J. Bacteriol., 133, 952-958. 5. Galley proofs will be sent to the author in duplicate. One of them should be corrected and returned to the Editor-in-Chief or to Redaktion der Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie, DDR-6900 Jena, Beutenbergstr. 11, as soon as possible. 6. 100 reprints of each paper are provided free of charge. Additional reprints may be purchased at cost price.

ZEITSCHRIFT FÜR ALLGEMEINE MIKRO - BIOLOGIE AN INTERNATIONAL JOURNAL ON

HERAUSGEGEBEN VON

G. F. Gause, Moskau 0 . Hoffmann-Ostenhof, Wien A. A. Imseneckii, Moskau R. W. Kaplan, Frankfurt/M. F. Mach, Greifswald 1. Mälek, Prag W. Schwartz, Braunschweig C. Weibull, Lund

UNTER DER CHEFREDAKTION VON

U. Taubeneck, Jena

MORPHOLOGY, PHYSIOLOGY, GENETICS, AND ECOLOGY OF MICROORGANISMS

UNTER MITARBEIT VON

j . H. Becking, Wageningen H. Böhme, Gatersleben M. Girbardt, Jena S. I. Kusnecov, Moskau 0 . Necas, Brno C. H. Oppenheimer, Port Aransas N. Pfennig, Göttingen I. L. Rabotnova, Moskau

REDAKTION

U. May, Jena R. May, Jena

V O L U M E 2 4 • 1984 • N U M B E R 6

AKADEMIE-VERLAG • BERLIN

Die Zeitschrift für allgemeine Mikrobiologie soll dazu beitragen, Forschung und internationale Zusammenarbeit auf dem Gebiet der Mikrobiologie zu fördern. Es werden Manuskripte aus allen Gebieten der allgemeinen Mikrobiologie veröffentlicht. Arbeiten über Themen aus der medizinischen, landwirtschaftlichen, technischen Mikrobiologie und aus der Taxonomie der Mikroorganismen werden ebenfalls aufgenommen, wenn sie Fragen von allgemeinem Interesse behandeln. Zur Veröffentlichung werden angenommen: Orginalmanuskripte, die in anderen Zeitschriften noch nicht veröffentlicht worden sind und in gleicher Form auch nicht in anderen Zeitschriften erscheinen werden. Der Umfang soll höchstens 1 '/2 Druckbogen (24 Druckseiten) betragen. Bei umfangreicheren Manuskripten müssen besondere Vereinbarungen mit der Schriftleitung und dem Verlag getroffen werden. Kurze Orginalmitteilungen über wesentliche, neue Forschungsergebnisse. Umfang im allgemeinen höchstens 3 Druckseiten. Kurze Orginalmitteilungen werden beschleunigt veröffentlicht. Kritische Sammelberichte und Buchbesprechungen nach Vereinbarung mit der Schriftleitung. Terms of Subscription Orders for the journal can be sent — in the GDR: to a book-shop, or to the Akademie-Verlag, DDR-10S6 Berlin, Leipziger Str. 3 — 4; — in the other socialist countries: to a book-shop for foreign language literature or to the competent news-distributing agency; — in the FRG and Berlin (West): to a book-shop or to the wholesale distribution agency K u n s t und Wissen, Erich Bieber, OHG, Wilhelmstr. 4 - 6 , D-7000 Stuttgart 1; — in the other Western European countries: to K u n s t und Wissen, Brich Bieber GmbH, Dufourstr. 51, CH-8008 Zürich; — in other countries: to the international book- and journal-selling trade, to Buchexport, Volkseigener Außenhandelsbetrieb der D D R , DDll-7010.Leipzig, Postfach 160, or to the Akademie-Verlag, D D R - 1 0 8 6 Berlin, Leipziger Str. 3 - 4 .

Zeitschrift für allgemeine Mikrobiologie Herausgeber: Im Auftrag des Verlages von einem internationalen Wissenschaftlerkollektiv herausgegeben. Verlag: Akademie-Verlag, DDR-1086 Berlin, Leipziger Straße 3 - 4 ; Fernruf: 2236229 oder 2236221; Telex-Nr.: 114420; Bank: Staatsbank der DDR, Berlin, Kto.-Nr. 6836-26-20712. Chefredaktion: Prof. Dr. U D O T A U B E N E C K , Anschrift der Redaktion: Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften, DDR-6900 Jena, Beutenbergstr. 11; Fernruf: Jena 852487; Telex-Nr. 058621. Veröffentlicht unter der Lizenznummer 1306 des Presseamtes beim Vorsitzenden des Ministerrates der Deutschen Demokratischen Republik. Gesamtherstellung: VEB Druckerei „Thomas Müntzer", DDR-5820 Bad Langensalza. Erscheinungsweise: Die Zeitschrift für allgemeine Mikrobiologie erscheint jährlich in einem Band mit 10 Heften. Bezugspreis je Band 250,— M zuzüglich Versandspesen (Preis für die DDR200, — M). Preis je Heft 2 5 , - M (Preis für die DDR 2 0 , - M). Urheberrecht: Alle Rechte vorbehalten, insbesondere die der Übersetzung. Kein Teil dieser Zeitschrift darf in irgendeiner Form — durch Photokopie, Mikrofilm oder irgendein anderes Verfahren — ohne schriftliche Genehmigung des Verlages reproduziert werden. — All rights reserved (including those of translations into foreign languages). No part of this issue may be reproduced in any form, by photoprint, microfilm or any other means, without written permission from the publishers. Erscheinungstermin: Juli 1984. Bestellnummer dieses Heftes: 1070/24/6. © 1984 by Akademie-Verlag Berlin. Printed in the German Democratic Republic. AN (EDV) 75218

Zeitschrift für allgemeine Mikrobiologie 24 (1984) 6, 3 6 3 - 3 6 8

(Department of Agricultural Biology, University of Ibadan, Ibadan, Nigeria)

Pectolytic enzymes produced by Xanthomonas campestris pathovar cassavae and their involvement in pathogenesis T . IKOTUN

(Eingegangen am 17. 10.1983) The plant cell wall-degrading activity of culture filtrates of Xanthomonas campestris pathovar cassavae grown in liquid medium supplemented with salts and galacturonic acid was higher than the activity found in filtrates of cultures grown in two other media. The pathogen produced pectin-methylesterase, pectate lyase and a small amount of polygalacturonase. These enzymes were thought to be involved in the pathogenetic process since they were present in the infected tissues. The presence of calcium pectate in plant tissue stimulated the activity of pectate lyase which apparently was the major cell wall-degrading enzyme. The presence of these enzymes at high dilutions in the infected host tissue was most likely responsible for the slow development of the disease caused by this pathogen. The in vitro production of cell wall-degrading enzymes has been demonstrated for m a n y bacterial plant pathogens, among them species of Pseudomonas, Erwinia and Xanthomonas (ABO-EL-DAHAB 1964, BURKHOLDER and STARE 1948, DYE 1960, NASTXNO a n d STARR 1 9 6 6 , SMITH 1 9 5 8 a, b , STARR a n d NASTJNO 1 9 6 7 , WOOD 1 9 5 5 , ZUCKER et al.

1972). I n contrast, there are only few reports on the production of these enzymes in vivo (KELMAN and COWLING 1964), and their role in pathogenetic processes has not been proved conclusively. DYE (1960) showed that Xanthomonas campestris p v cassavae, an important bacterial pathogen of cassava in Central and E a s t Africa produced pectic enzymes in vitro on a poly pectate medium. The involvement of these enzymes in pathogenetic processes was, however, not demonstrated. This paper reports on the production of pectic enzymes b y X. campestris p v cassavae and their possible role in pathogenesis. Materials and methods X. campestris pv cassavae strain C101 was obtained from the National Collection of Plant Pathogenic Bacteria (NCPPB), Harpenden, U.K. and was grown in a liquid medium of the following composition: K 2 H P 0 4 1.0 g, KH 2 P0 4 0.5 g, (NH 4 ) 2 S0 4 1.0 g, MgS0 4 • 7 H 2 0 0.5 g, dry cassava cell walls 10 g, distilled water 1 litre. In the two other media used cassava cell walls were replaced by 0.5 g of D-galacturonic acid or 5 g of sucrose as sole sources of carbon. The media were autoclaved at 121 °C for 10 min, cooled down and inoculated with 48 h old X. campestris pv cassavae cultures. The subsequent incubation was carried out on an rotary incubator (100 rpm) at 28 °C for 48 hours. Culture filtrates were obtained by sedimenting the cells from liquid cultures and passing the supernatant through an OXOID 45 membrane filter (porosity 0.45 (xm). Sterile filtrates were collected aseptically in sterile MCCABTNEY bottles and then assayed for enzyme activity. The cup plate assay described by MANN (1962) was used for the detection of pectin-methylesterase (PME) activity. Plates were kept at 25 °C and controlled after 12 hrs of incubation and later checked at 24 hrs intervals. Acid liberated from pectin (pectinic acids) were detected as a red zone surrounding the wells. The enzyme activity was expressed as the area of the red zone (MANN 1962). To test the polygalacturonase (PG) and pectate lyase (PL) activity, 2,5 g of sodium polypectate (NaPP) were dissolved in 125 ml of water and the pH was adjusted to 9.0 by the addition 24*

364

T . IKOTTJN

of 0.2 N NaOH and an equal volume of 0.2 M Tris-HCl buffer. Agar (final concentration 1%) was added and the mixture was autoclaved at 121 °C for 15 min. Similar media with pH values of 5 and 7 contained sodium citrate and sodium phosphate buffers, respectively. 25 ml aliquots of the liquidified agar were aseptically pipetted into petri dishes (9 cm in diameter) and after the medium had solidified wells with a diameter of 7 mm were cut into the agar. The bottom of the wells was finally sealed with a film of agar. About 0.04 ml of the culture filtrates and 0.04 ml of CaCl2 • 2 H 2 0 (0.002 M) were used as reaction mixture at pH 9 while 0.04 ml of water replaced the CaCl2 • 2 H 2 0 when reactions were carried out at pH 5 and 7. Plates were incubated at 25 °C and flooded every 24 hrs with 5 N HC1. White haloes developing around the wells after this treatment indicated PG and PL activities which again were expressed as the area of the white zones. The viscosity-reducing activity of the culture filtrates was detected by using CANNON-FENSKE viscosimeters (size 200) which were suspended in a water bath at 25 °C. Activities were measured at pH 5, 7 and 9. After 1 ml aliquots of the culture filtrates were added to 8 ml of NaPP and subsequently the pH 5 and 7 samples received 1 ml of water and 1 ml of CaCl2 • 2 H 2 0 was added to the pH 9 sample. The mixtures were well mixed by blowing them through the viscometers and the viscosity was measured at suitable intervals. Enzyme activity was calculated as 103/i (where t was the time (min) required for 50% reduction in the viscosity of NaPP) and expressed in relative viscometric units (RVU). All viscometers were first calibrated against water. The flow time for 10 ml of water represented 100% reduction in the viscosity of NaPP. The presence of cell wall-degrading enzymes and their involvement in pathogenesis was studied by excising necrotic lesions from infected cassava leaves (about 200 g) and transferring them into 50 ml of sterile distilled water. The obtained mixture was centrifuged for 15 min at 10,000 X g and 0 °C to remove plant debris. The supernatant was passed through a membrane filter and then concentrated in vacuo to a volume of 5 ml. The filtrate was assayed for enzyme activity by both the cup plate assay and viscometry. The effects of adding 0.1 M CaCl2 • 2 H 2 0 and BaCl2 on the enzyme activity of culture filtrates and infected plant extracts was again studied by the cup plate method. NaPP plates were prepared as described. The pH of the plates was adjusted to values between 4 and 9 by using the appropriate buffers. Each set of plates contained wells in triplicates to which 0.08 ml of culture filtrates and of infected plant extracts were added. The plant extracts used were supplemented with 1 ml of 0.1 M CaCl2 • 2 H 2 0 per every 9 ml of filtrate. Plates were kept at 25 °C. During the first 12 hrs of incubation the plates were flooded with 5 ir HC1 every 4 hrs. Later 24 hrs intervals (up to a total of 72 hrs) were chosen to test for enzyme activities. After 20 min of HC1 treatment the plates were examined for with haloes surrounding the wells which contained the filtrates. The areas of white haloes were calculated and the results for the different pH values were recorded after 24 hrs.

Results and discussion The results presented in Table 1 indicate that filtrates from cultures of X. campestris pv. cassavae grown in liquid media containing either cassava cell wall + salts or sucrose + casamino acids showed a weak PME activity which increased up to 72 hrs. The filtrate of the bacterial culture grown in galacturonic acid + salts medium Table 1 Pectinmethyle3terase activity of culture filtrates of Xanthomonas campestris pv cassavae Time (hrs)

4 8 12 24 48 72 1

Sucrose-casamino acid-salts and Cassava cell wall salts media —

0.1 0.7 3.1 3.6

) Area of red zone (PME activity) cm2

Infected plant extracts

Galacturonic acid-salts medium

0.6 0.8 1.4 5.0 8.3

1.51) 3.1 6.1 10.2 16.6 21.9

Pectolytic enzymes from X. campestris

365

showed a PME activity within 4 hrs and this was 5— 6 times higher than PME activity of the filtrates of culture cultivated in the other two media. The PME activity of extracts from infected plants was about twice as high as that of filtrates obtained from cultures grown in sucrose + casamino acid or cassava cell walls + salts media. The production of specific PME has been shown to be constitutive in several species of Xanthomonas including X. badrii, X. carotae, X. papervecicola, X. ricinicola, X. cassavae (DYE 1960) and X. malvacearum (ABO-EL-DAHAB 1964). However, the PME production was found to be inducible in X. campestris pv manihotis (IKOTUN, in press). After the pilot experiment described earlier, the pectolytic activity (PG/PL) of the culture filtrates was assayed over a p H range from 4—9. Citric acid-sodium citrate buffer (0.1 M) was used at p H 4 and 5, 0.1 M phosphate buffer was added a t p H 6 and 7, and 0.1 M Tris-HCl buffer was utilized a t p H 8 and 9. Preparation of N a P P plates and inoculation with culture filtrates were done as described above. Plates were incubated a t 25 °C and first at 6 hrs intervals (up to 24 hrs) and later a t intervals of 24 hrs (up to 72 hrs), 5 N HC1 was poured over 5 replicates of N a P P plates and left there for 20 min. The areas of white haloes which surrounded the wells containing the culture filtrates were measured and taken as the P G / P L activity. The results presented in Fig. l a show t h a t there was higher P G / P L activity in the galacturonic acid

6

7

phi values

6

9

4 5

6

7

8

pH values

Fig. 1. a) Pectate lyase activity in filtrates of cultures of X. campestris pv cassavae and of infected plant extract investigated by cup plate method. b) Viscosity-reducing activity of filtrates of a culture of X. campestris pv cassavae and of extracts from infected plants. O Filtrates from cultures grown in sucrose + casamino acid and cassava cell wall + salts liquid media; • extract from infected plants; x filtrate from a culture grown in galacturonic acid + salts medium culture filtrate than in the filtrates of cultures grown in cassava cells walls + salts or sucrose + casamino acid media. On all plates, there was a slight activity at p H 5, and little or none activity at p H 6 and 7. An increase in activity was observed from p H 8 to 9. This trend was similar for the three filtrates assayed.

366

T . IKOTTTK

When the filtrate from infected cassava tissue was concentrated in vacuo to 5 ml at 0 °C it had enzymatic activity which followed trends similar to those of culture filtrates of X. campestris pv cassavae (Fig. la). PL activity of the concentrated extracts was higher than those of filtrates of cultures grown in sucrose + casamino acid and cassava cell wall + salts media. Again, the activity of the extract reached a peak at pH 9 whereas it was low at the pH 4, 5, and 6. The extracts showed also PME activity. I t is now clear that X. campestris pv cassavae produced enzymes capable of degrading pectic substances in plant tissues. These enzymes were PME, PG, and PL. This result was consistent with the work of DYE (1961) who demonstrated the production of PME and protopectinases (PP) but did not report on the production of PG and PL. Protopectinases have been defined as a group of enzymes that hydrolyze the insoluble pectic substances in the middle lamella of plant cell walls. By this definition protopectinases may have included PG and PL. The production of hydrolytic PG has not been reported for species of Xanthomonas (STARE and NASUNO 1 9 6 7 ) . The only exception was X. campestris pv manihotis for which a weak production of PG was observed by FAWOLE and IKOTUN ( 1 9 7 8 ) . Results presented in Fig. l b show that also the reduction of viscosity of NaPP was highest at pH 9. There was low activity at the low pH values except at pH 5 where there was a slight rise. The activity of the extracts from infected plant was greater than that of filtrates from cultures grown in sucrose + casamino acid and cassava cell wall + salts media. The high activity of PME, PG/PL in the culture filtrate of X. campestris pv cassavae grown in galacturonic acid + salts medium was supported by a report of WOOD (1967) who showed that pectic substances such as pectin, polygalacturonic acid, galacturonic acid and polypectates stimulated the in vitro production from pectic enzymes by several microorganisms. In this work the activity of the filtrate of cultures grown in a galacturonic acid medium had an activity which was 4 times higher than that of culture filtrates obtained after cultivation in two other media. However, increased activity was recorded when the time of incubation of the plates was prolonged up to 7 2 hrs. The slightly increased activity at pH 5 indicated that X. campestris pv cassavae produced a low activity polygalacturonase. The stimulation of this activity by 0.1 M BaCl2 and its suppression by CaCl2 clearly indicated that PG was produced (Fig. 2). The activity was, however, low compared to that produced by soft rot organisms. The activity was probably comparable to that produced by X. campestris pv manihotis, another bacterial pathogen of cassava (FAWOLE and IKOTUN 1 9 7 8 ) . The higher activity of the filtrate at pH 9 indicated the production of a polygalacturonate írows-eliminase (PGTE) which was equivalent to PL and which was produced by X. badrii, X. carotoae, X. ricinicola, X. taraxaci, and X. campestris (NASUNO and STARE 1 9 6 6 ) and X. manihotis (IKOTUN, in press). The involvement of these enzymes produced by X. campestris pv cassavae in pathogenetic processes was supported by the fact that they were isolated from necrotic tissue of cassava infected by the bacterium. There was a very low activity of the initial extract but after concentrating it to 1/10 th of the original volume, the enzyme activity was high. This indicated that although these cell wall-degrading enzymes were produced by certain plant pathogens, they were probably produced so slowly and in such low amounts that their activities were difficult to detect by conventional methods. This led several authors to believe that species of Xanthomonas did not produce enzymes that degraded cell walls of plants as rapidly as soft rot-causing organisms (DYE 1 9 6 0 , NASUNO and STARE 1 9 6 6 , S T A E B and MOBAN 1 9 6 2 ) . This was further supported

Pectolytic enzymes from X.

5 pH

6 7 values

367

campestris

5 pH

6 7 values

Fig. 2. Effect of the addition of 1 ml of 0.1 M BaCl 2 (a) and 1 ml of 0.1 M CaCl2 (b) to filtrates of a culture of X. campestris pv cassavae and of an extract of infected plant tissue on their pectate lysae activity. O Filtrates from cultures grown in sucrose + casmino acid and cassava cell walls + salts liquid media; • extract from infected plants; x filtrate from a culture grown in gala,cturonic acid + salts medium

by the slow developing, primarily necrotic and dry nature of the diseases caused by many species of Xanthomonas. ZUCKER et al. ( 1 9 7 2 ) showed that soft rot organisms produced 100—1000 times as much enzymes within a short time as did plant pathogenic bacteria. Hence it was expected that the rate of action of these enzymes will be very low. This was supported by the results presented here. STEPHENS ( 1 9 7 4 ) showed that the cell wall-degrading activity of enzymes produced by Erwinia carotovora was in the order of 1000 (units) within a 10 min period; whereas with X. campestris pv cassavae, the highest activity was about 17.3 (units) after 24 hrs. This low enzymatic activity is likely to be responsible for the slow development of necrotic lesions caused by many species of Xanthomonas including X. campestris pv manihotis and X. campestris pv cassavas which are two important pathogens of cassava. It ist, therefore, concluded that the pectolytic enzymes involved in pathogenetic processes caused'by X. campestris pv cassavae were a small amount of PG, PME andPL. The presence of calcium as pectates in the middle lamella and elsewhere in the plant cell wall could enhance the activity of PL but it would suppress that of PG in vivo. This indicated that PME and PL probably played the dominant role in pathogenetic processes caused by X. campestris pv cassavae.

368

T.IKOTUN

Acknowledgements The author is grateful to Professor R. K. S. WOOD for his supervision and advice during the period of this study and to Drs. TAYO, FAFUNSO and Prof. OSHO of the University for their assistance in the preparation of this manuscript. This study was supported by the University of Ibadan — Ford Foundation Staff Development Program. References ABO-EL-DAHAB, M. J., 1964. Production of pectic and cellulolytic enzymes by Xanthomonas malvacearum. Phytopathology, 54, 597—601. BTJRKHOLDER, W. H. and STARE, M. P., 1948. The generic and specific characters of phytopathogenic species of Pseudomonas and Xanthomcmas. Phytopathology, 38, 494—502. DYE, D. W., 1960. Pectolytic activity in Xanthomonas. N. Z. J. Sci., 3, 61—69. FAWOLE, M. 0. and IKOTUN, T., 1978. The production of polygalacturonase by Xanthomonas manihotis. Acta phytopathol., 13, 375—381. KELMAN, A. and COWLING, E. B., 1964. Cellulase of Pseudomonas solanacearum in relation to pathogenesis. Phytopathology, 55, 148 — 155. MANN, B., 1962. Role of pectic enzymes in Fusarium wilt of tomato. Trans. Brit. Myc. Soc., 45, 169-178.

NASUNO, S. and STARR, M. P., 1966. Polygalacturonase of Erwinia carotovora J. Biol. Chem., 241, 5 2 9 8 - 5 3 0 6 .

SMITH, W. K., 1958 a. A survey of the production of pectic enzymes by plant pathogenic and other bacteria. J. Gen. Microbiol., 18, 33—41. SMITH, W. K., 1958b. Chromatographic examination of the products of digestion of pectic materials by culture solutions of plant pathogenic and other bacteria. J. Gen. Microbiol., 18, 42—48. STARR, M. P. and MORAS, F., 1962. Eliminative split of pectic substances by phytopathogenic soft rot bacteria. Science, 135, 920—921. STARR, M. P. and NASTJNO, S., 1967. Pectolytic activity of phytopathogenic Xanthomonads. J. Gen. Microbiol., 46, 425—434.

STEPHENS, G., 1974. The killing of plant cells by Erwinia carotovora. Ph. D. Thesis, University of London. 204 pp. WOOD, R. K. S., 1955. Studies in the physiology of parasitism. XVIII. Pectic enzymes secreted by Bacterium aroidaea. Ann. Bot. London, N.S., 19, 1 —27. WOOD, R. K. S., 1967. Physiological Plant Pathology. Blackwell Scientific Publications, Oxford and Edinburgh, 570 pp. ZTJCKER, M., HANKIN, L. and SANDS, D., 1972. Factors governing pectate lyase synthesis in soft rot and non-soft rot bacteria. Physiol. PI. Pathol., 2, 59—67. Mailing address: Dr. TUNDE IKOTUN, Department of Agricultural Biology, University of Ibadan, Ibadan, Nigeria

Zeitschrift f ü r allgemeine Mikrobiologie 24 (1984) 6, 369 - 376

(Department of Botany, Kutir Degree College, Chakkey-222146, J a u n p u r and Department of Botany, Banaras Hindu University, Varanasi-221005, India 1 )

Toxicity of the herbicide Stam f-34 (propanil) on Nostoc calcicola A. K . PANDEY, VIBHA SBJTVASTAVA1 a n d D . N . TIWARI1

(Eingegangen

am

9.11.1983)

The biological effect of the post-emergence rice field herbicide Stam f-34 on the nitrogen-fixing cyanobacterium (blue-green alga) Nostoc calcicola has been studied under cultural conditions. The herbicide caused an inhibition of the nitrogen-fixing growth of the alga which was concentrationdependent and lethal a t 30 ¡jLg/ml. Both glucose and acetate quite efficiently reversed the inhibitory action of Stam f-34 even when it was present at a lethal dose. Also, an addition of the amino acids arginine, aspartic acid, serine, threonine and glutamine readily reversed the toxic effects of Stam f-34 even a t lethal concentrations of the herbicide (except glutamine). Low p H values enhanced the toxicity while high p H levels lowered the found to herbicide to the alga. The herbicide was not be toxicity of the mutagenic since it did not induce in the alga mutations to streptomycin and methylamine resistance.

The cyanobacteria (commonly known as blue-green algae) occupy an important position among the soil and water microflora. The role of nitrogen-fixing cyanobacteria in the nitrogen economy of rice agriculture is now widely appreciated and in rice fields they belong to the dominant microflora (SINGH 1961, WATANABE et al. 1971, HENRIKSSON et al. 1975). Stam f - 3 4 (3,4-dichloropropionanilide) has been found to be very helpful to substancially increase the rice yield by selective elemination of weeds from rice fields (FRENCH and GAY 1963, KOBAYASHI et al. 1968, SUBRAHMANYAN et al. 1965, PAEK and PARK 1971). Since nitrogen-fixing cyanobacteria are an invariable component of rice fields and considered best from the environmental contaminations, therefore, they should be thoroughly screened for deleterious effects of herbicides. Although herbicides are normally used to control the growth of weeds on an agricultural field, a major portion of these chemicals is usally deposited on the surface of the soil and might adversely affect the cyanobacteria. The amide group of herbicides, generally employed in weed control of rice fields is known to efficiently inhibit the photosynthesis (DODGE 1975, HAWXBY et al. 1977). "Machete" and "lasso" (amide herbicides) have recently been found to be mutagenic (SINGH and VAISHAMPAYAN 1978, SINGH et al. 1979, PANDEY 1981). The herbicide 2 , 4 - D and MCPA have been reported to inhibit nitrogen fixation in cyanobacteria (LTJNDQVIST 1970, DAS and SINGH 1977, TIWARI et al. 1981). The present work was, therefore, undertaken to investigate toxic and mutagenic action of the herbicide Stam f-34 on the nitrogenfixing cyanobacterium Nostoc calcicola.

Materials and methods Clonal and axenic cultures of Nostoc calcicola were used as experimental material. The cultures were routinely grown in inorganic medium described by ALLEN and ARNON (1955) supplied with molecular nitrogen, incubated in a culture room maintained a t 25 i 1 °C and illuminated with fluorescent light (intensity approx. 2000 lux) for a photoperiod of 14 hrs and a nyctoperiod of 10 hrs, The mid log cultures were invariably used as inocula for each experiment.

Zeitschrift f ü r allgemeine Mikrobiologie 24 (1984) 6, 369 - 376

(Department of Botany, Kutir Degree College, Chakkey-222146, J a u n p u r and Department of Botany, Banaras Hindu University, Varanasi-221005, India 1 )

Toxicity of the herbicide Stam f-34 (propanil) on Nostoc calcicola A. K . PANDEY, VIBHA SBJTVASTAVA1 a n d D . N . TIWARI1

(Eingegangen

am

9.11.1983)

The biological effect of the post-emergence rice field herbicide Stam f-34 on the nitrogen-fixing cyanobacterium (blue-green alga) Nostoc calcicola has been studied under cultural conditions. The herbicide caused an inhibition of the nitrogen-fixing growth of the alga which was concentrationdependent and lethal a t 30 ¡jLg/ml. Both glucose and acetate quite efficiently reversed the inhibitory action of Stam f-34 even when it was present at a lethal dose. Also, an addition of the amino acids arginine, aspartic acid, serine, threonine and glutamine readily reversed the toxic effects of Stam f-34 even a t lethal concentrations of the herbicide (except glutamine). Low p H values enhanced the toxicity while high p H levels lowered the found to herbicide to the alga. The herbicide was not be toxicity of the mutagenic since it did not induce in the alga mutations to streptomycin and methylamine resistance.

The cyanobacteria (commonly known as blue-green algae) occupy an important position among the soil and water microflora. The role of nitrogen-fixing cyanobacteria in the nitrogen economy of rice agriculture is now widely appreciated and in rice fields they belong to the dominant microflora (SINGH 1961, WATANABE et al. 1971, HENRIKSSON et al. 1975). Stam f - 3 4 (3,4-dichloropropionanilide) has been found to be very helpful to substancially increase the rice yield by selective elemination of weeds from rice fields (FRENCH and GAY 1963, KOBAYASHI et al. 1968, SUBRAHMANYAN et al. 1965, PAEK and PARK 1971). Since nitrogen-fixing cyanobacteria are an invariable component of rice fields and considered best from the environmental contaminations, therefore, they should be thoroughly screened for deleterious effects of herbicides. Although herbicides are normally used to control the growth of weeds on an agricultural field, a major portion of these chemicals is usally deposited on the surface of the soil and might adversely affect the cyanobacteria. The amide group of herbicides, generally employed in weed control of rice fields is known to efficiently inhibit the photosynthesis (DODGE 1975, HAWXBY et al. 1977). "Machete" and "lasso" (amide herbicides) have recently been found to be mutagenic (SINGH and VAISHAMPAYAN 1978, SINGH et al. 1979, PANDEY 1981). The herbicide 2 , 4 - D and MCPA have been reported to inhibit nitrogen fixation in cyanobacteria (LTJNDQVIST 1970, DAS and SINGH 1977, TIWARI et al. 1981). The present work was, therefore, undertaken to investigate toxic and mutagenic action of the herbicide Stam f-34 on the nitrogenfixing cyanobacterium Nostoc calcicola.

Materials and methods Clonal and axenic cultures of Nostoc calcicola were used as experimental material. The cultures were routinely grown in inorganic medium described by ALLEN and ARNON (1955) supplied with molecular nitrogen, incubated in a culture room maintained a t 25 i 1 °C and illuminated with fluorescent light (intensity approx. 2000 lux) for a photoperiod of 14 hrs and a nyctoperiod of 10 hrs, The mid log cultures were invariably used as inocula for each experiment.

370

A . K . PANDEY, VIBHA SRIVASTAVA a n d D . N . TIWARI

Stock solutions of Stamf-34 (3,4-dichloropropionanilide, 35% E.C), a product of BTTAKAT Pulverising Mills Ltd., Bombay, were freshly prepared with hot sterile water and added to the actively grown cultures to get final concentrations ranging from 0.5 to 30 [jig/ml. Growth experiments were carried out in 100 ml conical sidearm flasks, and optical densities (O.D.) were measured at 650 nm by using a photoelectric colorimeter. The specific growth rate (k) was calculated by the e q u a t i o n o f KBATZ a n d MYERS ( 1 9 5 5 ) .

Cultures growing in N-free medium and containing Stam f-34 were supplemented individually with filter-sterilized solutions of KNO a (10 mM), NH4C1 (1 MM), glucose and sodium acetate (500 [xg/ml each) and the amino acids glutamine, aspartic acid, arginine, serine, and threonine in order to test their effect on Stam f-34. To study the effect of pH batches of the sterilized N-free media were adjusted to different pH values by carefully adding either HC1 or NaOH (0.1 N each). Addition of the herbicide did not affect the pH of the media. The mutagenic effect of Stam f-34 was measured by determining the frequency of mutation to streptomycin and methylamine (MA) resistance and by comparing them with the frequencies of spontaneous mutations as well as with those induced by the known mutagens NTG (N-methyl-N'nitro-N-nitrosoguanidine) and acriflavin. Application of Stamf-34, NTG (lOOjxg/ml each) and acriflavin (10 ¡xg/ml) for 10, 25 and 10 min, respectively, permitted about 55% survival. After the treatment, each sample was washed thoroughly by repeated centrifugation and washing, inoculated into basal medium and incubated for 3 days to allow for growth and segregation. The treated and control samples were screened for streptomycin and MA-resistant mutants by plating them onto agar plates containing streptomycin (6 |xg/ml) or MA (10 MM), doses which were lethal to the alga. Also 10 s fold dilutions of the above samples were spread on basal agar medium containing no selective agents to detect viable colonies. All the chemicals were dissoved and added individually to the medium which was filtersterilized before its use under aseptic conditions.

Besults The effect of inorganic nitrogen sources, organic acids (amino acids), organic carbon (glucose and acetate) and p H value on the toxicity of the commonly used rice field herbicide S t a m f-34 was studied. Growth of the cyanobacterium Nostoc

calcicola

was expressed in terms of the specific growth rate (k). The measurement of optical densities and calculation of the specific growth rate (k) showed a progressive decrease in the algal growth as the concentrations of the herbicide increased. A concentration of 30(xg/ml completely inhibited the growth of the alga (Fig. 1). The decreased specific growth rate (k) suggested a lag in growth of the alga under herbicide stress. The presence of combined nitrogen sources in the medium (NO^~ and NH£) slightly enhanced the algal growth in comparison to control (N-free medium) as it was evident from their higher specific growth rate (k). Nitrogen in the form of nitrate readily suppressed the toxicity of Stam f-34 and showed more protection than N-free and ammonia-containing media. Ammonia-containing medium showed an enhanced algicidal effect even at 20 (xg/ml (Fig. 1). The growth toxic effect to the herbicide was also examined in relation to carbon metabolism and the results are presented in Fig. 2. The control cultures grew well with glucose and sodium acetate (500 ¡xg/ml each) and did not show any lag against control. Addition of glucose or sodium acetate along with various doses of the herbicide protected the alga from the toxic effect of the herbicide as was evident from their higher specific growth rate (k). Both glucose and sodium acetate reversed the toxicity at algicidal dose but no recovery was obtained at an elevated concentration of Stam f-34 (50 ¡xg/ml). Evidently, glucose as well as sodium acetate seemed to cause a significant reduction in the inhibitory action of Stam f-34 on algal growth. The herbicide, therefore, seemed to inhibit photosynthetic C0 2 assimilation of the alga. I t also suggested that the herbicide affected the algal growth primarily by inducing a lag growth phase of the alga since no lag was observed after supplementation of glucose and

Stam f-34 toxicity

371

Fig. 1. Effect of different concentrations of Stam f-34 on growth (in terms of specific growth rate 1c) of N. calcicola in media supplemented with N 2 (•), (o) and NH4 (A)

Fig. 2. Effect of different concentrations of Stam f-34 (o) in the presence of glucose (•) and sodium acetate (A) on growth (in terms of specific growth rate k) of the cyanobacterium N. calcicola

acetate to the herbicide medium and the alga grew with an efficiency comparable to that of control sets (herbicide supplemented only). The role of various amino acids, glutamine, arginine, aspartic acid, serine and threonine was examined in relation to the herbicide toxicity to the alga at N2-fixing .growth conditions. The amino acid concentrations (25 (Jig/ml each used) yielded

372

A . K . P A N D E Y , VIBHA SRIVASTAVA a n d D . N . T I W A E I

Stam

f-3i

(pg

/ml)

Kg. 3. Effect of different concentration of Stam f-34 on specific growth rate (k) of N. calcicola in-N2 (•) and amino acids arginine (A), aspartic acid (o), serine (A), threonine (X), and glutamine (o) 030

r

Effl

contro1

EH

05fig/ml

50ug/ml ¡HI

• •

300pg/ml

200/jg/ml

pH

Fig. 4. Effect of pH on Stam f-34 toxicity in the cyanobacterium N. calcicola maximum growth of the alga. Cultures supplemented with the herbicide grew without any lag when the medium contained amino acids, although at relatively slower rates the untreated amino acid-containing control cultures as higher specific growth rate (k) than their respective controls (Fig. 3). All the amino acids used except glutamine help to overcome the herbicide toxicity even at algicidal doses. Arginine, which serves as a nitrogen reserve in blue-green algae, showed maximum protection against Stam f-34 toxicity. I t was followed by aspartic acid, serine, threonine and glutamine (Fig. 3).

Stam f-34 toxicity

373

A pH value of 9 supported maximum N2-fixing growth of the alga.The toxicity of the herbicide was reduced at the elevated pH value. At pH 7 different dosages of the herbicide did not allow algal growth to the extent obtained at pH 9 in N. calcicola. A Stam f-34 concentration of 20 (xg/ml caused complete disintegration of algal filament at pH 7 while with the same herbicidal dose some multiplication was still observed at pH 8. No growth occurred at a Stam f-34 concentration of 30 [jig/ml. A pH value of 9 reduced the herbicide toxicity and allowed an increase of approximately 75% in algal growth which eventually reached more than 80% at pH 10 and 11. This permitted nearly 3 % and 40% growth yield at a Stam f-34 concentration of 30 (Xg/ml, respectively (Fig. 4). Thus, it is concluded that alkaline pH values protected the alga from herbicide toxicity. N. calcicola mutated spontaneously to streptomycin and MA-resistance with a frequency of 2.3 X 10~6 and 2.6 X 10 - 6 , respectively. NTG and acriflavin-induced mutation frequencies were 5.5 X 10 - 5 and 6.3 X 10" 5 and 6.46 X 10" 8 and 3.3 X X 10 - 6 , respectively. Stam f-34 mutation frequencies in the presence of Stam f-34 were 2.3 X 10~® for streptomycin and 2.6 X 10 - 6 for MA resistance. These mutation frequencies were not higher than the spontaneous ones or those obtained after NTG or acriflavin treatment (Table 1). Table 1 Induction of herbicide-induced mutation to streptomycin and methylamin-resistance in Nostoc

calcicola

Mutagenic agent

Dose (Hg/ml)

Duration of treatment (min)

Spontaneous Acriflavin NTG Stam f-34

10 100 100

15 25 10

/o Survival

Mutation frequency Streptomycin (6 }*g/ml)

Methylamin (10 mil)

100 55 55 55

2.47 6.46 5.5 2.3

2.8 3.2 6.3 2.6

X X X X

lO- 6 10" 6 10" 6 10" 6

X x X X

10" 6 10" 6 10" 5 10" 6

Discussion

The biological significance of nitrogen-fixing cyanobacteria prompted the present study which was undertaken to investigate the biological effects of rice field herbicide Stam f-34 on N. calcicola. Stam f-34 commonly known as "propanil", is structurally identical with D C M U (3(3,4-dichlorophenyl)l,l dimethyl urea). I t selectively eradicates weed plants by its metabolic conversion into DLC (3,4-dichloroacetanilide) by oxidative phosphorylation and subsequent hydrolysis to DCA (3,4-dichloroaniline) and lactic acid ( Y I N et al. 1 9 6 8 ) . I t is known to inhibit several biochemical reactions such as R N A and protein syntheses (MORELAND et al. 1 9 6 9 ) , respiration (HOFSTRA and SWITZEB 1 9 6 8 ) , reduction of cytochrome by PS I I in photosynthetically acitve isolated chloroplasts (NISHIMURA and TAKAMIYA 1 9 6 6 ) . Its mode of action is like that of D C M U in blue green alga N. muscorum (VAISHAMPAYAN et al. 1 9 7 8 ) . Growth of the alga was inhibited at a very low concentration (0.5 (xg/ml) of the herbicide which underlined its growth inhibitory action. A combination of inorganic nitrogen sources (nitrate and ammonia) proved to be more supportive for algal growth than N2-medium. Nitrate as a nitrogen source mediated even more protection and readily reversed the herbicide-induced toxicity even at the algicidal dose of 30 ¡¿g Stam f-34/ml. This indicated a higher sensitivity of the nitrogen-fixing ability of the alga to herbicide stress than metabolic assimilation of combined nitrogen sources or

374

A. K. PANDEY, VIBHA SRIVASTAVA and D. N. TIWAEI

nitrate which might obstruct the passage of toxicants. The data obtained with ammonia as a nitrogen source were in agreement with NaCl-induced DDT toxicity to blue-green algae (BATTERTON et al. 1972). An alternative explanation may also be the formation of a complex between Stam f-34 and ammonia nitrogen which on hydrolysis release more toxic substances or alternatively, N H 4 C 1 caused an increased availability of more herbicide molecule(s) to the exact target site(s). Both the inorganic nitrogen assimilation and the inorganic carbon assimilation are reductive processes. Accordingly, the reversal of Stam f-34 inhibition of bluegreen algal growth in the presence of glucose or acetate should be attributed to their action as both a carbon source and a reductant source. Photosynthetic assimilation of C0 2 is a reductive process occurring on the basis of photochemically generated reductant during oxygenic photosynthesis. A substance which interferes with the above requirements will inhibit the photosynthetic algal growth either by reducing photolysis of water or interfering with the level of electron transport as reported by MORELAND (1980).

The employed amino acids glutamine, arginine, aspartic acid, serine and threonine protected the alga from herbicide toxicity even at an algicidal dose. Glutamine was the only exception, it failed to neutralize the toxicity of Stam f-34 at the lethal dose of 30 (Ug/ml. Arginine protected algae from herbicide toxicity with maximum efficiency since it serves as a nitrogen reserve in blue-green algae (SIMON 1971). Thus, the herbicide toxicity caused as a result no nitrogen starvation in the alga may be overcome by exogeneous supplementation of arginine. The results suggested that amino acids may play a dual role, either they reduced herbicide toxicity by forming biologically unavailable chelators/complexes or they altered the transport of resulting herbicideamino acid complexes/conjugates. The latter possibility has also been suggested for 2 , 4 - D uptake in higher plants and cyanobacteria (ANDREAE and GOOD 1957, FEUNG et al. 1973, 1974, PANDEY 1981). An alternative explanation may also be that Stam f-34 too was antagonistic to amino acids or acted as an organic carbon source which met the requirement of organic carbon, since amino acids are usually a poor source of nitrogen for the growth of blue-green algae (NEILSON and DOUDOROFF 1973). Maximum metabolic expression of N-fixing growth of algae was obtained at pH values above 6.5. The algae rarely multiplied and fixed nitrogen at pH values below 6 (DOOLEY and HOUGHTON 1973). The present observation demonstrated that increased pH values upto 9 invariably stimulated algal growth and the herbicide was less toxic at these conditions (Fig. 4). The increased herbicide toxicity/uptake at low pH values may be due to the increased concentration of H + ions, as compare to Stam f-34 molecules available at higher pH levels. Thus, corresponding to the exchangebility of the herbicide suggest the bioavailability of the herbicide is mostly governed by the pH or the redox potential and accordingly might be favouring the bioavailability of soluble as well as exchangable chemicals whereas higher pH may render this process. The present result agreed with an earlier report of increased 2,4-D uptake at low pH values in Chlorella pyrenoidosa (WEDDING and ERICKSON 1958). Stam f-34 did not increase the mutation frequency of N. calcicola to streptomycin and methylamine (MA) resistance over that observed for spontaneous mutations or NTG and acriflavin-induced mutations. It, therefore, was apparently not mutagenic to N. calcicola. Acknowledgements We are grateful to the Head of the Department of Botany of the Banaras Hindu University, for laboratory facilities. One of us (V.S.) wishes to thank the Indian Atomic Energy Commission, Bombay, for providing a fellowship.

375

Stam f-34 toxicity

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Mailing address: Dr. A. K. PANDEY, Department of Botany, Kutir Degree College, Chakkey222146, J a u n p u r U . P . , India •

Zeitschrift f ü r allgemeine Mikrobiologie 24 (1984) 6, 3 7 7 - 3 9 0

(Sektion Biologie — W B Allgemeine Mikrobiologie und W B Mikrobielle Biochemie — FriedrichSchiller-Universität- Jena)

Wachstum und Autolyse des Askomyceten Hypomyces ochraceus Metabolismus von U14C-, 1-14C- und 6 - u C-markierter Glucose K . H . RIEMAY, B . RÖBER u n d A . HILPERT

(Eingegangen am

26.10.1983)

Hypomyces ochraceus shows some similarities to other investigated hyphal fungi in the growth cycle, reduction of biomass (degree of autolysis, 63% during 21 d), and degradation of protein during the autolytic phase of growth. Contrary to other results, however, protein and polysaccharide degradation products (amino acids, glucose, oligosaccharides) are not released into, or accumulated in, the medium. 14C-D-glucose is mainly converted into product and utilized for the biosynthesis of polysaccharides in the growth phase. The fungus synthesizes protein predominantly from the peptone of the culture medium, and only to a small extent from 14C-glucose. The distribution of 14C in mycelium, culture medium and carbon dioxide indicates t h a t protein and polysaccharides are hydrolyzed; amino acids and hexoses are catabolized for the production of energy within the hyphae during the autolytic phase of growth in batch cultures of the fungus.

Autolyse — ein durch zelleigene Hydrolasen bewirkter lytischer Prozeß — wird in diskontinuierlichen Pilz-Kulturen als ein durch Erschöpfung der exogenen Energieund C-Quellen im Kulturmedium verursachter Abbauprozeß angesehen (STOLP U. STARR 1965, FENCL 1978), der Cytoplasma, Organellen und nach neueren Ergebnissen (REYES U. LAHOZ 1977, PEREZ-LEBLIC et al. 1982) auch die Zellwand einschließt. Dabei werden Glucose und andere Oligosaccharide, Proteine, Aminosäuren (ARIMA ++ etal. 1965, REYERS et al. 1981), Ammoniak (BAINBRIDGE et al. 1971), Phosphat, Mg , + K (BORROW et al. 1961) und andere Verbindungen ins Kulturmedium abgegeben. Wir teilen hier einige vom typischen Hyphenpilz-Autolysemuster abweichende Ergebnisse mit. Durch den Einsatz von U-14C-, 1-14C- bzw. 6-14C-Glucose wurde versucht, Glucoseverwertung, Produktbildung und Biomasseverlust in der Wachstumsund autolytischen Phase zu bilanzieren. Material und Methoden Kulturbedingungen: Hypomyces ochraceus (PEES.) TUL. Stamm m 359 (Pilzkulturensammlung Weimar der Sektion Biologie) in Petrischalen auf Malzagar (30 g Malzextrakt, 2 g Pepton, 30 g Agar, aqua dest. ad 1000 ml) bei 23 °C angezogen. Stanzstücke (8 mm Durchmesser) aus Wachstumszonen gleichen Mycelaiters (4 d) zur Beimpfung der Vorkulturen. Vorkulturen und Versuchsansätze zum Wachstumsverlauf mit Henneberg-I-Medium (JANKE 1946, verändert: 5 g Pepton peptisch, 2 g NH 4 H 2 P0 4 , 2 g K N 0 3 , 0,5 g MgS0 4 • 7 H 2 0 , 0,1 g CaCl2, 30 g Glucose, aqua dest. ad 1000 ml) in 500-ml-Langhalsstehkolben (100 ml Nährlösung) bei 23 °C im Dunkeln auf Rundschüttlern inkubiert. 2 ml Mycelsuspension (4 d Vorkultur) als Inokulam für einen Kolben. J e Probe 3 Parallelkolben. Langzeitmarkierung mit "C-Glucose: 200 ml Henneberg-I-Medium mit 3 ml Mycelsuspension der Vorkultur (s. o.) beimpft, die sterilfiltrierte 1-14C-, 6-14C- bzw. U- 14 C-Glucose zugegeben (2,5 ml/200 ml Kultur) und die Langhalsstehkolben mit steriler Belüftung (15 1 • h _ 1 , C0 2 -frei) bei 23 °C auf dem Rundschüttler inkubiert. (C0 2 -freie Belüftung in 200-ml-Kulturen veränderte den Wachstumsverlauf — verglichen mit 100-ml-Schüttelkulturen — nicht. Maximale Abweichung 25

Z. allg. Mikrobiol., Bd. 24, B . 6

Zeitschrift f ü r allgemeine Mikrobiologie 24 (1984) 6, 3 7 7 - 3 9 0

(Sektion Biologie — W B Allgemeine Mikrobiologie und W B Mikrobielle Biochemie — FriedrichSchiller-Universität- Jena)

Wachstum und Autolyse des Askomyceten Hypomyces ochraceus Metabolismus von U14C-, 1-14C- und 6 - u C-markierter Glucose K . H . RIEMAY, B . RÖBER u n d A . HILPERT

(Eingegangen am

26.10.1983)

Hypomyces ochraceus shows some similarities to other investigated hyphal fungi in the growth cycle, reduction of biomass (degree of autolysis, 63% during 21 d), and degradation of protein during the autolytic phase of growth. Contrary to other results, however, protein and polysaccharide degradation products (amino acids, glucose, oligosaccharides) are not released into, or accumulated in, the medium. 14C-D-glucose is mainly converted into product and utilized for the biosynthesis of polysaccharides in the growth phase. The fungus synthesizes protein predominantly from the peptone of the culture medium, and only to a small extent from 14C-glucose. The distribution of 14C in mycelium, culture medium and carbon dioxide indicates t h a t protein and polysaccharides are hydrolyzed; amino acids and hexoses are catabolized for the production of energy within the hyphae during the autolytic phase of growth in batch cultures of the fungus.

Autolyse — ein durch zelleigene Hydrolasen bewirkter lytischer Prozeß — wird in diskontinuierlichen Pilz-Kulturen als ein durch Erschöpfung der exogenen Energieund C-Quellen im Kulturmedium verursachter Abbauprozeß angesehen (STOLP U. STARR 1965, FENCL 1978), der Cytoplasma, Organellen und nach neueren Ergebnissen (REYES U. LAHOZ 1977, PEREZ-LEBLIC et al. 1982) auch die Zellwand einschließt. Dabei werden Glucose und andere Oligosaccharide, Proteine, Aminosäuren (ARIMA ++ etal. 1965, REYERS et al. 1981), Ammoniak (BAINBRIDGE et al. 1971), Phosphat, Mg , + K (BORROW et al. 1961) und andere Verbindungen ins Kulturmedium abgegeben. Wir teilen hier einige vom typischen Hyphenpilz-Autolysemuster abweichende Ergebnisse mit. Durch den Einsatz von U-14C-, 1-14C- bzw. 6-14C-Glucose wurde versucht, Glucoseverwertung, Produktbildung und Biomasseverlust in der Wachstumsund autolytischen Phase zu bilanzieren. Material und Methoden Kulturbedingungen: Hypomyces ochraceus (PEES.) TUL. Stamm m 359 (Pilzkulturensammlung Weimar der Sektion Biologie) in Petrischalen auf Malzagar (30 g Malzextrakt, 2 g Pepton, 30 g Agar, aqua dest. ad 1000 ml) bei 23 °C angezogen. Stanzstücke (8 mm Durchmesser) aus Wachstumszonen gleichen Mycelaiters (4 d) zur Beimpfung der Vorkulturen. Vorkulturen und Versuchsansätze zum Wachstumsverlauf mit Henneberg-I-Medium (JANKE 1946, verändert: 5 g Pepton peptisch, 2 g NH 4 H 2 P0 4 , 2 g K N 0 3 , 0,5 g MgS0 4 • 7 H 2 0 , 0,1 g CaCl2, 30 g Glucose, aqua dest. ad 1000 ml) in 500-ml-Langhalsstehkolben (100 ml Nährlösung) bei 23 °C im Dunkeln auf Rundschüttlern inkubiert. 2 ml Mycelsuspension (4 d Vorkultur) als Inokulam für einen Kolben. J e Probe 3 Parallelkolben. Langzeitmarkierung mit "C-Glucose: 200 ml Henneberg-I-Medium mit 3 ml Mycelsuspension der Vorkultur (s. o.) beimpft, die sterilfiltrierte 1-14C-, 6-14C- bzw. U- 14 C-Glucose zugegeben (2,5 ml/200 ml Kultur) und die Langhalsstehkolben mit steriler Belüftung (15 1 • h _ 1 , C0 2 -frei) bei 23 °C auf dem Rundschüttler inkubiert. (C0 2 -freie Belüftung in 200-ml-Kulturen veränderte den Wachstumsverlauf — verglichen mit 100-ml-Schüttelkulturen — nicht. Maximale Abweichung 25

Z. allg. Mikrobiol., Bd. 24, B . 6

378

K . H . RIEMAY, B . RÖBER u n d A . HILPEKT

der Autolysegrade 1,9%). Am Ende der Wachstumsphase (7. Tag) Parallelansätze vereinigt, steril zentrifugiert (23 °C, 1 h, 3000 g), Mycel zweimal mit Henneberg-I-Medium ohne Pepton und Glucose gewaschen und in 200 ml je Kolben Henneberg-I-Medium ohne Pepton und Glucose resuspendiert (sterile Autolyse). Bestimmungen: Lyophile Masse: Lyophilisierung und Wägung nach 24 h Aufbewahrung über P 2 0 5 . Trockenmasse auf aschefreien Filtern bei 105 °C bis zur Gewichtskonstanz. cH + mittels Glaselektrode sofort nach Abtrennen des Mycels im Kulturfiltrat. Glucose mit dem FERMOGNOSTTestbesteck (VEB Arzneimittelwerk Dresden). Protein nach LOWBY et al. (1951). Zellextrakt: Definierte Mengen Feuchtmycel über Trockeneis eingefroren, mit aqua bidest. bei 0 °C im Schüttelhomogenisator mit Ballotini (0,75 — 1 mm) 30 min homogenisiert. Lösliche und unlösliche Bestandteile nach Entfernen der Ballotini in der Kühlzentrifuge (0 °C, 13000 g) getrennt. Radioaktivitätsbestimmung: Kulturfiltrat — 250 (JLI mycelfreies Kulturfiltrat in 6 ml Dioxanszintillator ( R Ö B E R U. R E U T E R 1979). Mycel — Gewaschenes Mycel aus 2 ml Kultursuspension in 2 ml Methanol/Protosol (1:1, v/v) ultraschallhomogenisiert und hydrolysiert (12 h, 55 °C). Hydrolysat anschließend in 6 ml Dioxanszintillator ultraschallhomogenisiert. Mycelprotein — Mycel aus 3 ml Kultursuspension in 2 ml 0,3 N NaOH hydrolysiert (90 min, 60 °C), zentrifugiert (30 min, 6000 g) und das Protein mit 2 ml 25%iger TCE ausgefällt; mit Äther gewaschen und nach Protosolaufschluß in 6 ml Dioxanszintillator überführt. 14 C0 2 — Das aus den C0 2 -frei belüfteten Versuchsansätzen abgeführte C0 2 je Ansatz in 150 ml K O H (5,4 M) quantitativ absorbiert, die K O H nach jeder Probenahme (6 ml nach 10 bzw. 14 h) ausgetauscht. Zur Messung 2 ml K O H in 8 ml Methanol + 10 ml Dioxan-Toluol-Szintillator (7 ml Dioxanszintillator + 3 ml Toluolszintillator: 1000 ml Toluol, 6 g PPO, 0,8 dm POPOP). Bilanzierung der Radioaktivitätsverteilung (normiert auf 1 ml Kultursuspension): zlRAniy RAshex = AS ZLS: Aus dem Medium aufgenommene Glucose ([¿mol) A RAMy: I n das Mycel eingebaute Radioaktivität (DPM) RAshex: spezifische Radioaktivität der eingesetzten Glucose (DPM • ¡j.mol-1) y | A widerspiegelt den Anteil der aufgenommenen 14C-Glucose, der als Zellsubstanz im betrachteten Kultivierungszeitraum fixiert wurde. g

yBAmcd _ 1

HA

Z l B A M

y

— zlRAmed

zlRAmed: Aus dem Medium aufgenommene Radioaktivität (DPM) •^KAmed entspricht dem als Zellsubstanz fixierten Anteil des aufgenommenen radioaktiven Substratkohlenstoffes .

zip = zIS -

ZlRAmed RAshex

ZIP: Aus der radioaktiven Glucose gebildetes und in das Kulturmedium wieder abgegebenes Produkt. ZITMA =

TMo

R A m e d • 0 , 1 8 + RA»

üi1

1

»

¿ loi o

A P groß). — Nach Glucoseverbrauch beginnt eine Wachstumsphase, in der ausschließlich Mycelsubstanz metabolisiert und dabei vorwiegend zu C 0 2 oxydiert wird. — Abbauprodukte der Proteolyse sind im Medium nicht nachweisbar, so daß auch Aminosäuren zu C 0 2 oxydiert werden müssen, besonders in den Autolysephasen A 2 und A 3 (Publikation in Vorbereitung). Zusammenfassend soll hervorgehoben werden, daß der Autolyseprozeß bei Hypomyces ochraceus keinen Lyseprozeß unter Freisetzung von Aminosäuren aus der Proteolyse bzw. von Produkten des Polysaccharidabbaus darstellt. Die Polymerenbausteine werden dem Energiestoffwechsel und möglicherweise der Zellsubstanzsynthese zugeführt. Dabei wird deutlich, daß der parasitische Pilz sowohl die Stoffwechselprodukte des Wirtsorganismus als auch eigene Zellsubstanz mobilisieren kann. In diesem Sinne ist die Autolyse der Pilzkultur ein auf Verbrauch von Zellsubstanz beruhender Lebensprozeß, bei dem noch intakte katabole und anabole Sequenzen genutzt werden. In der autolysierenden Kultur können gleichzeitig noch wachsende Anteile (apikale Hyphenabschnitte), noch stoffwechselaktive, nicht wachsende Anteile (Hyphenkompartimente) und autolysierte Anteile (leere Hyphenkompartimente) nachgewiesen werden. Literatur ARIMA, K., UOZUMI, T. and TAKAHASHI, M., 1965. Studies on the autolysis of Aspergillus oryza'e, I. Conditions of autolysis. Agric. Biol. Chem., 29, 1033 — 1041.

390

K . H . RIEMAY, B . RÖBER u n d A. HILPERT

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239-249.

Anschrift: Dr. K. H. R I E M A Y , Friedrich-Schiller-Universität Jena, Sektion Biologie, WB Allgemeine Mikrobiologie, DDR-6900 Jena, Neugasse 24

Zeitschrift für allgemeine Mikrobiologie 24 (1984) 6, 3 9 1 - 3 9 6

(Max-Planck-Institut für Limnologie, D-2320 Plön/Holstein)

Die Eisenbakterien des Plußsees I I . Morphologie und Feinstruktur von Siderocapsa geminata

(SKUJA

1954/57)

W . - D . SCHMIDT

Gewidmet meinem hochverehrten Lehrer, Prof. Dr. zum 60. Geburtstag (Eingegangen

JÜRGEN OVERBECK

am 21. 9. 1983)

The morphology and finestructure of the "iron bacterium" Siderocapsa geminata is described and demonstrated by ultrathin sections. The iron- and manganese-hydroxide accumulating bacterium proved to be a gram negative, pleomorph microorganism with an apparent high extracellular enzymatic activity. The LPSmembrane and the slimelayer were composed of fibrous elements which accumulated preponderant Mn(IV). Intracellular Mn(IV) indicated an active enzymatic hydroxide formation.

Die Bezeichnung „Eisenbakterien" stammt von W I N O G R A D S K Y (1888). Nach MOLISCH (1910), N A U M A N N (1928, 1929a + b) und D O R F (1934) werden heute darunter Zellen verstanden, die befähigt sind Eisen und/oder Mangan als Hydroxid in oder auf ihren Zellstrukturen anzureichern. Die Definition berücksichtigt nicht, ob der Oxydationsprozeß stoffwechselphysiologisch genutzt („Eisenbakterien sensu strictu") oder ohne biologische Effektivität abläuft („Eisenbakterien sensu lato"). Die weitverbreitesten Formen sind die kapseltragenden, ein oder mehrzelligen unbeweglichen Eisenbakterien des Genus Siderocapsa (MOLISCH 1 9 1 0 ) . Außer Beschreibungen ihrer auffäligen Oxidfärbung und Morphologie liegen keine weiteren, z. B. stoffwechselphysiologischen Erkenntnisse über diese Bakterien vor. Die Isolierung von Reinkulturen erwies sich als schwierig und nicht reproduzierbar. Daher hat die Taxonomie und Physiologie dieser rein morphologisch definierten Bakteriengruppe immer wieder zu viel Vermutungen, Andeutungen und Diskussionen Anlaß gegeben. Die vorliegende Arbeit versucht auf Grund der Morphologie und Feinstruktur Anhaltspunkte über die Physiologie der selten beschriebenen Siderocapsa geminata aufzuzeigen (SKUJA 1954/57), die im Plußsee (Schleswig-Holstein) seit Jahrzehnten eine kontinuierliche Population ausbildet (SCHMIDT 1976, 1979).

Material und Methoden Der Plußsee ist ein eutropher, monomiktischer, humusreicher Laubwaldsee in SchleswigHolstein (bei Plön. Sein glacial entstandenes, kegelförmiges Seebecken hat eine Maximaltiefe von 28 m mittlere Tiefe 9,3 m). Zum Ende der Sommerschichtung bildet sich ein ausgeprägtes Sulphuretum aus (SCHMIDT 1976, OBERHÄUSER 1981). Andere „Eisenbakterien" sind hier Metallogenium

sp. (SCHMIDT 1976, 1979).

Die Bestimmung der Bakterien erfolgte nach morphologischen Kriterien (BERGEY 1974) durch Licht- und Transmissions-Elektronenmikroskopie. Die Feinstruktur der Zellen wurde durch die Ultradünn-Schnitt-Technik dargestellt: Von der Sedimentoberfläche, durch Filtration von Seewasser (200 ml) oder aus Sedimentationsfallen (Fa. HOFFMANN, mod. nach ZEITSCHEL, Kiel), wurde Zellmaterial während einer Massen-

Zeitschrift für allgemeine Mikrobiologie 24 (1984) 6, 3 9 1 - 3 9 6

(Max-Planck-Institut für Limnologie, D-2320 Plön/Holstein)

Die Eisenbakterien des Plußsees I I . Morphologie und Feinstruktur von Siderocapsa geminata

(SKUJA

1954/57)

W . - D . SCHMIDT

Gewidmet meinem hochverehrten Lehrer, Prof. Dr. zum 60. Geburtstag (Eingegangen

JÜRGEN OVERBECK

am 21. 9. 1983)

The morphology and finestructure of the "iron bacterium" Siderocapsa geminata is described and demonstrated by ultrathin sections. The iron- and manganese-hydroxide accumulating bacterium proved to be a gram negative, pleomorph microorganism with an apparent high extracellular enzymatic activity. The LPSmembrane and the slimelayer were composed of fibrous elements which accumulated preponderant Mn(IV). Intracellular Mn(IV) indicated an active enzymatic hydroxide formation.

Die Bezeichnung „Eisenbakterien" stammt von W I N O G R A D S K Y (1888). Nach MOLISCH (1910), N A U M A N N (1928, 1929a + b) und D O R F (1934) werden heute darunter Zellen verstanden, die befähigt sind Eisen und/oder Mangan als Hydroxid in oder auf ihren Zellstrukturen anzureichern. Die Definition berücksichtigt nicht, ob der Oxydationsprozeß stoffwechselphysiologisch genutzt („Eisenbakterien sensu strictu") oder ohne biologische Effektivität abläuft („Eisenbakterien sensu lato"). Die weitverbreitesten Formen sind die kapseltragenden, ein oder mehrzelligen unbeweglichen Eisenbakterien des Genus Siderocapsa (MOLISCH 1 9 1 0 ) . Außer Beschreibungen ihrer auffäligen Oxidfärbung und Morphologie liegen keine weiteren, z. B. stoffwechselphysiologischen Erkenntnisse über diese Bakterien vor. Die Isolierung von Reinkulturen erwies sich als schwierig und nicht reproduzierbar. Daher hat die Taxonomie und Physiologie dieser rein morphologisch definierten Bakteriengruppe immer wieder zu viel Vermutungen, Andeutungen und Diskussionen Anlaß gegeben. Die vorliegende Arbeit versucht auf Grund der Morphologie und Feinstruktur Anhaltspunkte über die Physiologie der selten beschriebenen Siderocapsa geminata aufzuzeigen (SKUJA 1954/57), die im Plußsee (Schleswig-Holstein) seit Jahrzehnten eine kontinuierliche Population ausbildet (SCHMIDT 1976, 1979).

Material und Methoden Der Plußsee ist ein eutropher, monomiktischer, humusreicher Laubwaldsee in SchleswigHolstein (bei Plön. Sein glacial entstandenes, kegelförmiges Seebecken hat eine Maximaltiefe von 28 m mittlere Tiefe 9,3 m). Zum Ende der Sommerschichtung bildet sich ein ausgeprägtes Sulphuretum aus (SCHMIDT 1976, OBERHÄUSER 1981). Andere „Eisenbakterien" sind hier Metallogenium

sp. (SCHMIDT 1976, 1979).

Die Bestimmung der Bakterien erfolgte nach morphologischen Kriterien (BERGEY 1974) durch Licht- und Transmissions-Elektronenmikroskopie. Die Feinstruktur der Zellen wurde durch die Ultradünn-Schnitt-Technik dargestellt: Von der Sedimentoberfläche, durch Filtration von Seewasser (200 ml) oder aus Sedimentationsfallen (Fa. HOFFMANN, mod. nach ZEITSCHEL, Kiel), wurde Zellmaterial während einer Massen-

392

W . D . SCHMIDT

entwicklung von Siderocapsa geminata im Winter 1977/78 gesammelt und mit 1% reinstem Formaldehyd sofort vor Ort fixiert—im Labor dreimal mit Puffer (KELLENBEKGEU 1958) gewaschen, mit 0,5% 0 s 0 4 in o. g. Puffer über 4 —12 h fixiert und in 2% Agar (OXOID) bei 40 °C eingebettet. Agarstückchen (1 cm 3 wurden in 0,2% Uranylacetat in Puffer pH 5 (s. o.) 1 h inkubiert, über die Alkoholreihe dehydriert (Äthanol = 50%/70%/90%/100%/l: 1 mit Propylenoxid/Propylenoxid reinst) und in SPUR bei 70 °C für 8 h eingebettet. Die Blöcke wurden mit einem Diamantenmesser geschnitten und kontrastriert mit Bleicitrat (REYNOLDS 1963) oder ohne Kontrastmittel in einem TEM 300, PHILLIPS, betrachtet. Photos wurden über Filmplatten aufgenommen. Bei normaler TEM wurde eine Schrägbeschattung mit einem Platin-Kohle-Gemisch durchgeführt.

Ergebnisse und Diskussion Morphologie Siderocapsa geminata wurde bisher nur von S K U J A ( 1 9 5 4 / 5 7 ) beschrieben und unterscheidet sich von allen anderen planktischen Siderocapsa spp. durch ihre geringe Zellgröße, ihre ovale bis längliche Zellform und durch ihr solitäres bis paariges Auftreten (Abb. 1).

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Abb. 1. Siderocapsa geminata aus dem Plußsee. A) Typisches, stark vereintes Stadium, B) mehrzelliges Stadium, B) mehrzelliges Stadium vor Kapsel-Teilung. Maßstab = 1 (¿m

Typisch ist die nahezu kreisrunde, mächtige Zellkapsel, die eine einheitliche Oxidauflagerung mit anscheinend schwammig, schaumiger Konsistenz aufweist. Die eigentlichen Zellen liegen meist in einer zentralen, nicht verockerten Kapselregion. Mehrzellige Stadien treten nur kurzfristig nach einer Zellteilung auf ( S C H M I D T 1 9 7 6 ) . Die Zellgröße beträgt 0 , 4 — 0 , 6 x 0 , 5 — 0 , 7 fxm. Der Kapseldurchmesser nimmt mit der Anzahl der zentralen Zellen zu und schwankt zwischen 6—9ji.m bei einer Zelle und 7—10(j.m bei zwei Zellen. Löst man die Oxide mit HCl, Oxalsäure oder EDTALösung ab, so verbleibt eine farblose, transparente Kapsel (schematischer Querschnitt eines zweizeiligen Aggregates s. S C H M I D T / O V E R B E C K 1 9 8 4 , Abb. 3 ) . Die Breite der scheibenförmigen Kapsel nimmt vom Rand bis zum unvererzten Zentrum deutlich zu — innerhalb des nicht verockerten Zentrums dagegen stark ab. I n dieser zentralen Vertiefung liegen die Zellen, die ihrerseits eine starke Kontrastierung und schwarz-braune Färbung besitzen. Diese Kontrastrierung verschwindet

Eisenbakterien des Plußsees. I I .

393

bei Behandlung mit HCl und ist auf eine ca. 0,1 um Oxidschicht zurückzuführen, die die Zellen meist vollkommen umgibt. Partielle Vererzung der Zelloberfläche täuscht Strukturen vor, die von W A L S Y ( 1 9 7 4 ) als periphere Gasvakuolen beschrieben wurden. Die Vererzung der Kapsel beginnt an deren Rand und schreitet gegen das Zentrum fort. Die Zellen sind hingegen immer vererzt. Mit Röntgenanalyse und chemischen Nachweisen konnten auf der Kapsel amorphe Mangan- und Eisenhydroxide in unterschiedlichen Mengenanteilen festgestellt werden. Verstärkt wurde jeweils jenes Schwermetall als Hydroxid ausgefällt, das auch im Wasser in höherer Konzentration vorlag. Vererzte „Filamente", die eine Verbindung zwischen den Zellen und den vererzten Teilen der Kapsel darstellen, sind andeutungsweise auf Abbildung 1 zu erkennen. Solche Filamente scheinen für Siderocapsa spp. und andere schleimproduzierenden Bakterien typisch zu sein (SCHMIDT U. OVERBECK 1 9 8 4 , K A L B E et al. 1 9 6 5 , M A Y E K 1 9 7 0 , HOENEN U. SCHWARTZ 1 9 7 5 , LAROCK U. EHRLICH 1 9 7 5 ) .

Kontinuierliche Beobachtungen der Siderocapsa geminata-Population im Plußsee ergaben, daß dieses Bakterium während der Entwicklungs- und Wachstumsphase pleomorphe, nicht vererzte Zellstadien ohne Scleimkapsel besitzt, die anscheinend Mn(IV) und Fe(II) reduzieren können (SCHMIDT 1 9 7 6 , 1 9 7 9 ) . Feinstruktur Die Feinstruktur von Siderocapsa geminata aus dem Plußsee ließ sich in Ultradünnschnitten durch TEM reproduzierbar darstellen. Die Abbildungen 2 und 3 zeigen erstmals für Siderocapsa spp. die Struktur von vererzter Kapsel und Zelle. Die 0,4—0,6 (xm großen Zellen besitzen eine stark ausgeprägte, äußere Membran (Lipoprotein-Lipopolysaccharid-Schicht), die Siderocapsa geminata eindeutig als gramnegatives Bakterium charakterisiert. In der Zelle selbst ist immer eine zentrale, elektronendichte Region nachzuweisen, die vermutlich aus amorphem Mn(IV) besteht und sich durch reduzierende Agentien beseitigen läßt. Periphere oder diagonale Membranpakete, die eine taxonomische Zuordnung zu den gram-negativen chemolithotrophen Bakterien rechtfertigen würden, sind nicht vorhanden. Auffälig ist die mächtige, stark gewellte LPS-Schicht, deren hohe Elektronendichte ebenfalls vermutlich durch Mn(IV)-Inkrustationen auf der Zelloberfläche hervorgerufen wird (s. o.). Die großen Abstände zwischen Zellwand und LPS-Layer sprechen für eine erhöhte extrazelluläre Exzymaktivität durch Siderocapsa geminata. Zwischen Zelle und der runden Kapsel liegt eine nahezu strukturlose Zone in der viele 0,01—0,02 (xm große „Vesikeln" zu erkennen sind (Abb. 3 — Pfeile). Hierbei handelt es sich um quer angeschnittene, feinste LPS-Ausstülpungen, die nur selten in ihrer ganzen Länge angeschnitten wurden (s. Abb. 2 und 3-Pfeile). Sie stellen eine Verbindung zwischen der Zelle und dem vererzten Kapselteil dar. Ihr Ursprung ist in der LPS-Schichtdeutlich zu erkennen. Das Kapselmaterial besteht in allen Fällen aus fibrillären Schleimstrukturen, die durch amorphes Mn(IV)-Hydroxid stark kontrastiert sind. Die fibrilläre Struktur der Schleimkapsel erklärt das schaumige Aussehen der Siderocapsa-Hydroxide (s. o.) und ist andeutungsweise auch bei anderen Siderocapsa spp. zu erkennen. Feine LPSAusläufer sind auch dort bei näherer Betrachtung der Bilder zu erkennen ( S A U E R 1 9 3 4 , K A L B E et al. 1 9 6 5 , HOENEN u. SCHWARZ 1 9 7 5 ) . Schleimstruktur und -kontrastierung sind nahezu identisch mit elektronenoptischen Befunden von Metallogenium spp. und scheinen für manganausfällende Bakterien spezifisch zu sein (KLAVENESS 1 9 7 7 , GREGORY et al. 26

1980).

Z. allg. Mikrobiol., B d . 2 4 , H. 6

394

W . - D . SCHMIDT

Abb. 2. Feinstruktur von Siderocapsa yeminata aus dem Plußsee. TEM-Ültradünnsclinitt von natürlichem Material, 1 Om, 10. 12. 1977. Maßstab = 0,5 y.m

Abb. 3. Feinstruktur von Siderocapsa geminata aus dem Plußsee. TEM Ultradünnschnitt von natürlichem Material, 1 Om, 10. 12. 1977. Maßstab = 0,5 (im

Eisenbakterien des Plußsees. II.

395

Neben einer rein morphologischen Beschreibung können die vorliegenden Ergebnisse in keinem Fall Angaben von D U B I N I N A U . Z H D A N O V ( 1 9 7 5 ) , Z H D A N O V U . D U B I N I N A ( 1 9 7 5 ) und G O K L E N K O et cd. ( 1 9 7 7 ) bestätigen, wonach alle Siderocapsacae dem Genus Arthrobacter angehören sollen. Ebenso liegen für die Einstufung dieses Bakteriums zu den chemolithotrophen Mikroorganismen keinerlei morphologische Hinweise vor. Siderocapsa geminata kann nach seiner Feinstruktur als gram-negatives, schleimproduzierendes, vermutlich pleomorphes, fakultativ anaerobes Bakterium mit hoher extrazellulärer Enzymaktivität angesehen werden (SCHMIDT 1976, 1979). Amorphes Hydroxid wird an den extrazellulären Schleimen, an der LPS-Membran sowie vermutlich auch in der Zelle abgelagert. Eine aktive, enzymatische Mangan(IV)-Ausfällung konnte nicht ausgeschlossen werden. Eine Eisenhydroxidakkumulation findet dagegen nur im Kapselbereich durch Co-Prezipitation statt. Den Herren Prof. J . O V E R B E C K , Prof. P. H I R S C H und Dr. V Ö L K E R (Inst. f. Allg. Mikrobiol., Universität Kiel) sowie Dr. W. G H I O R S E (Dept. of Microbiol., Univ. New York) danke ich für die hilfreiche Unterstützung dieser Untersuchungen.

Literatur Manual, 1974. B E R G E Y ' S Manual of Determinative Bacteriology (8. Aufl.). The Williams and Wilkins Comp., Baltimore, USA. D O R P E , P., 1 9 4 3 . Die Eisenorganismen. Pflanzenforschung Jena, 1 6 , 1 — 6 2 . D U B I N I N A , G . A . and ZHDANOV, A . V . , 1 9 7 5 . Recognition of the iron bacteria "Siderocapsa" as Arthrobacter and description of Arthrobacter siderocapsulatus so. nov. Intern. J . System. Bacteriol., 35, 3 4 0 - 3 5 0 . G O R L E N K O , V . M., D U B I N I N A , G . A . and K U S N E Z O V , S . J . , 1 9 7 7 . Ecology of water microorganisms (russ.). Isdatelstvo "Nauka". Moscow. G R E G O R Y , E. and P E R R Y , R . S . and S T A L E Y , J . T . , 1 9 8 0 . Characterisation, distribution and significance of Metallogenium in Lake Washington. Microbial Ecrobial Ecology, 6, 125 —140. H O E N E N , K. und SCHWARTZ, W., 1975. Nachweis con Siderocapsaceen am natürlichen Standort. Z. allg. Mikrobiol., 15, 639-643. K A L B E , L., K E I L , R. und T H I E L E , M., 1965. Licht- und elektronenoptische Studien an Arten von Leptothrix, Siderocapsa und Planktomyces. Arch. Protistenkd., 108, 29 —40. K E L L E N B E R G E R , E., 1958. DNA-containing plasma II. Bioph. Biochem. Cytol., 4, 671—678. K L A V E N E S S , D., 1977. Morphology, distribution and significance of the manganese-accumulating microorganism Metallogenium, in lakes. Hydrobiol., 56, 25—33. L A R O C K , P. A. and E H R L I C H , H. L . , 1975. Observations of bacterial microcolonies on the surface of ferromanganese nodules from Blake Plateau by scanning electron microscopy. Microbial. Ecol. 2, 84-96., M A Y E R , F., 1970. Elektronenmikroskopische Untersuchungen der Zellverbindung bei sternbildenden Bakterien. Z. allg. Mikrobiol., 10, 329—334. M O L I S C H , H., 1910. Die Eisenbakterien. Jena, Gustav-Fischer-Verlag. N A U M A N N , E., 1928. Siderogone Organismen und die Bildung von Seerz. Ber. dt. Bot. Ges., Bd. XLVI 2. N A U M A N N , E., 1929. Streitfragen der Eisenbakterienforschung. Zbl. Bakt. Abt. II, 92, 401—406. N A U M A N N , E., 1929. Die eisenspeichernden Bakterien. Zbl. Bakt. Abt. II, 78, 512—515. O B E R H Ä U S E R , R . , 1 9 8 1 . Untersuchungen über die hypolimnische Schwefelbakterienvegetation in zwei ostholsteinischen Seen. Diss., Univ. Kiel. R E Y H O L D S , R . S., 1963. The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electronmicroscopy. J. Cell. Biol., 17, 208—212. S A U E R , J., 1934. Untersuchungen über eisenspreichernde Bakterien. Diss., Univ. Kiel. S C H M I D T , W. D., 1976. Zur Biologie der Eisenbakterien — Siderocapsa geminata und Leptothrix echinata — des Plußsees. Dipl. Arb., Univ. Kiel. S C H M I D T , W. D., 1979. Morphologie und Physiologie manganoxidierender Mikroorganismen: Kultur- und in siiit-Untersuchungen zur ökologischen-mikrobiologischen Charakterisierung von Metallogenium sp. und Siderocapsa geminata. Diss., Univ. Kiel. S C H M I D T , W . - D . and O V E R B E C K , J . , 1 9 8 4 . Studies of "iron bacteria" from lakePluss. I . Morphology, fine structure and distribution of Metallogenium sp. and Siderocapsa geminata. Z. allg. Mikrobiol., 24, 3 2 9 - 3 3 9 . BERGEY'S

26*

396

• W . - D . SCHMIDT

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ZHDANOV, V. A, and DUBININA, G., 1975. Arthrobacter siderocapsulatus isolated from lake water. Microbiologiya, 49, 714—719.

Anschrift: Dr. W.-D SCHMIDT, Regierung von Unterfranken, Peterplatz 9, D-8700 Würzburg

Zeitschrift für allgemeine Mikrobiologie 24 (1984) 6, 397—401

(Sektion Biologie, WB Allgemeine Mikrobiologie, Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald)

Proteinbiosynthesen nach Hitzeschock in Bacillus

subtilis

G . WACHLLN u n d M . H E C K E E 1 )

(Eingegangen

am

6.12.1983)

Heat-activated spores of Bacillus subtilis synthesize during the early outgrowth special proteins which are absent from vegetative cells (HECKER 1983). Some of these outhgrowth-specific proteins may be synthesized in response to heat activation of spores. In vegetative cells of B. subtilis synthesis of several proteins is markedly induced when temperature is shifted up from 30 to 44 °C. None of these putative heat shock proteins is synthesized during early outgrowth of heat-activated spores at 30 °C.

I n der Evolution der Organismen spielt die Auseinandersetzung mit erhöhter Temperatur offensichtlich eine große Rolle. Nur so ist es zu erklären, daß ganz verschiedenartige Organismen wie Hefen, Zellen von höheren Pflanzen, von Drosophila oder von Säugetieren einen Hitzeschock mit der Bildung weniger Proteine, sogenannter Hitzeschockproteine, beantworten (vgl. Übersicht bei SCHLESINGER et al. 1 9 8 2 ) . Bemerkenswerterweise wird ein Teil dieser Proteine auch gebildet, wenn die Zellen einem osmotischen Schock, einer Verwundung oder sonstigen Stressfaktoren, die das Überleben gefährden, ausgesetzt werden. Vermutlich besteht eine ganz allgemeine Aufgabe dieser Proteine darin, die Integrität der Zelle in Zeiten höchster Belastung zu schützen (siehe ADAMS u. R I N N E 1 9 8 2 , HAMMOND et al. 1 9 8 2 , MINTON et al. 1 9 8 2 ) . Hitzeschockproteine konnten in jüngster Zeit auch in Zellen von Escherichia coli nachgewiesen werden (LEMAUX et al. 1 9 7 8 , YAMAMORI et al. 1 9 7 8 ) . Während der Temperaturbehandlung wird die Mehrzahl der vegetativen Proteine, wenn auch mit ganz unterschiedlicher Intensität, weitergebildet. Jüngsten Untersuchungen zufolge könnte die Struktur eines Regulatorproteins (Produkt des Gens htpR oder hin) nach Hitzeeinwirkung derartig verändert werden, daß es als Aktivator die Expression eines sonst wenig aktiven Hitzeschock-Regulons auslöst (vgl. NEIDHARDT u. VANBOGELEN 1 9 8 1 , YAMAMORI U. Y U R A 1 9 8 2 , NEIDHARDT et al.

1983).

Im Rahmen unserer Untersuchungen über das Genexpressionsprogramm auswachsender Sporen konnten wir feststellen, daß Sporen von Bacillus subtilis, die durch eine einstündige Behandlung bei 65 °C aktiviert worden waren, in den frühesten Keimungsstadien, unmittelbar nach der Hitzebehandlung eine Reihe von Proteinen synthetisieren, die weder in späteren Keimungsphasen noch in vegetativen Zellen nachzuweisen sind (WACHLIN u. HECKER 1 9 8 2 , HECKER 1 9 8 3 ) . Dabei könnte es sich unter anderen um solche handeln, die als Regulatorproteine in die Umwandlung von Sporen in vegetative Zellen eingreifen (vgl. HECKER 1 9 8 3 , ALBERTINI U. GALIZZI 1 9 8 2 , HECKER et al. in Vorbereitung). Um auszuschließen, daß ein Teil dieser frühen Synthesen durch die unmittelbar vorangegangene Hitzebehandlung der Sporen ausgelöst wurde, versuchten wir zunächst in vegetativen Zellen von Bazillus subtilis Hitzeschockproteine nachzuweisen. 1

) Herrn Professor Dr. HEINBICH BORRISS zum 75. Geburtstag gewidmet.

Zeitschrift für allgemeine Mikrobiologie 24 (1984) 6, 397—401

(Sektion Biologie, WB Allgemeine Mikrobiologie, Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald)

Proteinbiosynthesen nach Hitzeschock in Bacillus

subtilis

G . WACHLLN u n d M . H E C K E E 1 )

(Eingegangen

am

6.12.1983)

Heat-activated spores of Bacillus subtilis synthesize during the early outgrowth special proteins which are absent from vegetative cells (HECKER 1983). Some of these outhgrowth-specific proteins may be synthesized in response to heat activation of spores. In vegetative cells of B. subtilis synthesis of several proteins is markedly induced when temperature is shifted up from 30 to 44 °C. None of these putative heat shock proteins is synthesized during early outgrowth of heat-activated spores at 30 °C.

I n der Evolution der Organismen spielt die Auseinandersetzung mit erhöhter Temperatur offensichtlich eine große Rolle. Nur so ist es zu erklären, daß ganz verschiedenartige Organismen wie Hefen, Zellen von höheren Pflanzen, von Drosophila oder von Säugetieren einen Hitzeschock mit der Bildung weniger Proteine, sogenannter Hitzeschockproteine, beantworten (vgl. Übersicht bei SCHLESINGER et al. 1 9 8 2 ) . Bemerkenswerterweise wird ein Teil dieser Proteine auch gebildet, wenn die Zellen einem osmotischen Schock, einer Verwundung oder sonstigen Stressfaktoren, die das Überleben gefährden, ausgesetzt werden. Vermutlich besteht eine ganz allgemeine Aufgabe dieser Proteine darin, die Integrität der Zelle in Zeiten höchster Belastung zu schützen (siehe ADAMS u. R I N N E 1 9 8 2 , HAMMOND et al. 1 9 8 2 , MINTON et al. 1 9 8 2 ) . Hitzeschockproteine konnten in jüngster Zeit auch in Zellen von Escherichia coli nachgewiesen werden (LEMAUX et al. 1 9 7 8 , YAMAMORI et al. 1 9 7 8 ) . Während der Temperaturbehandlung wird die Mehrzahl der vegetativen Proteine, wenn auch mit ganz unterschiedlicher Intensität, weitergebildet. Jüngsten Untersuchungen zufolge könnte die Struktur eines Regulatorproteins (Produkt des Gens htpR oder hin) nach Hitzeeinwirkung derartig verändert werden, daß es als Aktivator die Expression eines sonst wenig aktiven Hitzeschock-Regulons auslöst (vgl. NEIDHARDT u. VANBOGELEN 1 9 8 1 , YAMAMORI U. Y U R A 1 9 8 2 , NEIDHARDT et al.

1983).

Im Rahmen unserer Untersuchungen über das Genexpressionsprogramm auswachsender Sporen konnten wir feststellen, daß Sporen von Bacillus subtilis, die durch eine einstündige Behandlung bei 65 °C aktiviert worden waren, in den frühesten Keimungsstadien, unmittelbar nach der Hitzebehandlung eine Reihe von Proteinen synthetisieren, die weder in späteren Keimungsphasen noch in vegetativen Zellen nachzuweisen sind (WACHLIN u. HECKER 1 9 8 2 , HECKER 1 9 8 3 ) . Dabei könnte es sich unter anderen um solche handeln, die als Regulatorproteine in die Umwandlung von Sporen in vegetative Zellen eingreifen (vgl. HECKER 1 9 8 3 , ALBERTINI U. GALIZZI 1 9 8 2 , HECKER et al. in Vorbereitung). Um auszuschließen, daß ein Teil dieser frühen Synthesen durch die unmittelbar vorangegangene Hitzebehandlung der Sporen ausgelöst wurde, versuchten wir zunächst in vegetativen Zellen von Bazillus subtilis Hitzeschockproteine nachzuweisen. 1

) Herrn Professor Dr. HEINBICH BORRISS zum 75. Geburtstag gewidmet.

398

G . WACHLIN a n d M . HECKER

Material und Methoden Zum Nachweis der Hitzeschockproteine wurden in Schüttelkultur bei 30 °C wachsende Zellen von Bacillus svhtilis SB19, Stamm ts 33-6 (Titer 1 X 108 Zellen/ml; Wachstumsmedien sowie weitere Bedingungen vgl. W A C H L I N U. H E C K E R 1982) einem Hitzeschock bei 44 °C ausgesetzt. Vergleichsweise wurden Zellen bei 30 °C belassen bzw. in einen Schüttelthermostaten bei 37 °C umgesetzt. Zum Zeitpunkt des Umsetzens wurden die Zellen mit 10 ¡xCi/ml 35 S-L-Methionin (spezifische Aktivität 800—1000 Ci/mmol, AMERSHAM) für 10 min gefüttert. Zum Nachweis der Proteinbiosynthesen während früher Keimungsstadien wurden 1 Stunde bei 65 °C in aqua dest. aktivierte Sporen in das Minimalmedium nach D E M A I N (1958) bei 30 °C überführt, das neben den proteinogenen L-Aminosäuren (je 50 [ig/ml, außer L-Met) mit 0,5% Glucose und 0,05% Adenosin supplementiert wurde. Nach 10 min waren 95% der Sporen im Phasenkontrastmikroskop verdunkelt und damit gekeimt ( = i 0 ). Unmittelbar nach dem Umsetzen von 65 °C in 30 °C (—10—0 min) bzw. nach erfolgter Keimung (0—10 min) wurden die Sporen mit 8 bzw. 4 |j.Ci/ml 35 S-L-Methionin gefüttert, die löslichen Proteine nach Aufschluß der sedimentierten Zellen durch Ultraschall und Zentrifugation gewonnen und wie bei O ' F A R R E L L (1975) beschrieben im zweidimensionalen System aufgetrennt. Die Gele wurden getrocknet und fluorographisch ausgewertet. Die Abbildungen 1 und 2 sind Fotografien der entwickelten Röntgenfilme (vgl. W A C H L I N U. H E C K E R 1982).

Ergebnisse und Diskussion Eine Umsetzung von bei 30 °C gewachsenen Bacillus subtilis-Zellen in einen 44 °CThermostaten führt zu markanten Veränderungen des Proteinsytheseprogramms der Zellen: Neben Proteinen, die bei 44 °C nicht mehr bzw. mit stark verminderter Intensität gebildet werden und solchen, deren Syntheserate annähernd gleich bleibt, treten Proteine auf, die bei 44 °C bedeutend stärker als bei 30 °C nachzuweisen sind (Abb. 1A— IC). Darunter sind Proteine, deren Synthese bei 30 °C überhaupt nicht zu messen ist, während die anderer bei 44 °C lediglich verstärkt wird (vgl. auch Angaben über die für das vegetative Wachstum notwendige Funktion einiger Hitzeschockproteine von E. coli bei T I L L Y et al. 1983). Es fällt auf, daß die überwiegende Anzahl der in Frage kommenden Proteine, die im übrigen teilweise auch bereits bei 37 °C gebildet werden (siehe Abb. 1B), sich im leicht sauren Bereich des Gels konzentriert. Unter diesen Proteinen sollten solche zu suchen sein, die die Zelle vor einer Hitzeschädigung zu schützen vermögen und folglich als Hitzeschockproteine einzuordnen wären. Sporen, die nach einer einstündigen Behandlung bei 65 °C aktiviert wurden, bilden unmittelbar nach dem Umsetzen in einen 30 °C-Thermostaten keines dieser vermutlichen Hitzeschockproteine mit größerer Intensität als die bei der gleichen Temperatur wachsenden vegetativen Zellen (Abb. 2 A und B). Damit dürfte sich die an anderer Stelle geäußerte Vermutung, wonach einige der in frühen Keimungsstadien auftretenden Proteine im Ergebnis der vorangegangenen Hitzebehandlung der Sporen synthetisiert werden, nicht bestätigen lassen (vgl. H E C K E R 1983). Unter den ausschließlich in frühen Keimungsstadien gebildeten Proteine sollten eher solche sein, die in

Abb. 1 A-C. • Proteinsynthesen logarithmisch wachsender Zellen von Bacillus subtilis bei 30 °C bzw. nach dem Umsetzen von 30 °C in einen 37 °C- bzw. 44 °C-Thermostaten. Die bei 30 °C wachsenden Zellen wurden sofort mit dem Umsetzen f ü r 10 min mit 10 ptCi/ml 35 S-L-Methionin gefüttert. Die Kontrolle wurde bei 30°C belassen. Trennung der 35 S-Methionin-markierten Proteine nach O ' F A R R E L L (1975). Basische Proteine auf der linken Seite der Gele, Vermutliche Hitzeschockproteine-mit Pfeil gekennzeichnet

400

G . WACHLIN a n d M . HECKER

IEF

1*

S D S

k

S D S

f \ fr ^

IEF

Abb. 2 A u. B. Proteinsynthesen in frühen Keimungsstadien hitzeaktivierter Sporen von Bacillus subtilis bei 30 °C Methodische Angaben vgl. Material und Methoden. Der Bereich auf dem 2D-Gel, in dem vermutliche Hitzeschockproteine gehäuft auftreten, wurde gekennzeichnet

irgendeiner Weise in die Regulation der Sporenkeimung einbezogen sind (vgl. TINI u . GALIZZI 1 9 8 2 , H E C K E R

ALBER-

1983).

Eine detaillierte Untersuchung über die Regulation der Synthese von Hitzeschockproteinen und ihrer Funktion in Bacillus subtilis erscheint aussichtsreich, da hier ein im Boden lebendes Bakterium vorliegt, das unter natürlichen Bedingungen nicht selten einer Überhitzung ausgesetzt ist. I n diesem Zusammenhang soll auch geprüft werden, ob die Synthese dieser Gruppe von Proteinen ausschließlich durch erhöhte Temperatur oder auch durch andere Stressfaktoren wir durch eine verminderte Sauerstoffversorgung, Nährstofflimitation oder durch einen osmotischen Stress ausgelöst wird.

401

Proteinbiosynthesen in B. subtilis

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Anschrift: Dr. M . H E C K E B , Greifswald, Jahn-Str. 15

Sektion Biologie

der Ernst-Moritz-Arndt-Universität,

DDR-2200

Zeitschrift für allgemeine Mikrobiologie 24 (1984) 6, 402

Buchbesprechung Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, Structure of DNA, Volume 47, 2-book set. 1234 S., zahlreiche Abb., 140 Tab. Cold Spring Harbor 1983. Cold Spring Harbor Laboratory. $ 168.00. ISBN: 0-87969-046-1. Die rechtsgewundene DNA-Doppelhelix in der B-Konformation, wie sie vor 30 Jahren konzipiert wurde, ist nur eine mögliche Form, in der DNA existieren kann. Die DNA-Strukturforschung der letzten Jahre führte zur Entdeckung der Linkshelix in der Z-Konformation, den verschiedenen enzymatisch kontrollierten Knäuelstrukturen und den durch bestimmte Sequenzen bestimmten cruciformen Strukturen. Es gibt Hinweise dafür, daß alle diese DNA-Formen für die Funktion des genetischen Materials eine Rolle spielen und daß folglich ihre Kenntnis Voraussetzung zum Verständnis vieler grundlegender Prozesse in der Molekularbiologie ist. Die vorliegenden Bände sind das Ergebnis des 47. Cold Spring Harbor-Symposiums, auf dem die führenden DNA-Strukturforscher der Welt ihre Ergebnisse über DNA-Strukturen auf allen Organisationsebenen präsentierten. Von den rund 250 Teilnehmern wurden 135 Beiträge in den 2 Bänden aufgenommen, die folgende Problemkreise berühren: Windungssinn der DNA, Konformationsanalyse, chemisch modifizierte DNA, chemische DNA-Synthese, DNA-Protein-Wechselwirkungen, Nucleosomenstruktur, DNA-Methylierung, DNA-Replikation, Gyrasen und Topoisomerasen, Rekombination und Mutation, DNA-Transkription, Genorganisation auf dem DNA-Molekül, repetitive DNA und Pseudogene, Zentromere und Telomere. Die Beiträge sind erwartungsgemäß von hohem wissenschaftlichen Niveau, anspruchsvoll geschrieben und enthalten die Ergebnisse, Theorien und Hypothesen, die mit diversen methodischen Zugängen gewonnen wurden. Sie reichen von rein physikochemischen Techniken der Kristallographie über chemische Prozeduren bis zu involvierten molekularbiologischen in wuo-Techniken. Die zentrale Hypothese, die als Grundmotiv des Gesamtgebiets angesehen werden kann und den Gegenstand intensiver experimenteller Arbeiten in der Zukunft sein wird, besagt, daß es spezifische Nucleotidsequenzen gibt, die von der BKonformation abweichende DNA-Konformationen stabilisieren und konformationelle Information — im Unterschied zu kodierender Information — für DNA-Protein-Interaktionen liefern. Die vorliegende Publikation wird für eine Reihe von Jahren das grundlegende Referenzwerk für Molekularbiologen sein, die Kenntnisse über DNA-Strukturen für ihre eigenen Forschungen benötigen. H.

MALKE

(Jena)

Zeitschrift für allgemeine Mikrobiologie 24 (1984) 6, 4 0 3 - 4 0 5

Kurze

Originalmitteilung

(Akademie der Wissenschaften der D D R , Forschungszentrum für Molekularbiologie und Medizin, Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie, DDR-6900 Jena)

Improved conditions for mating of the yeast Sac char omycopsis lipolytica G . BARTH a n d H . W E B E R

(Eingegangen

am

30.12.1983)

Conditions for mating of Saccharomycopsis lipolytica cells were investigated to enhance zygote formation. Conjugation frequencies could be increased about twenty five fold by using cells of the late logarithmic growth phase and a yeast-extract-malt medium to induce mating. A procedure based on these results is described and has been used to carry out complementation analysis in S. lipolytica much more rapidly.

Besides Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe the yeast Saccharomycopsis lipolytica has recently been subjected to intensive research. Most of the genetic techniques which have been developed to study Sacch. cerevisiae could be applied to the investigation of 8. lipolytica. B u t up to now neither strains nor methods have been described wich yielded conjugation frequencies higher t h a n 2 X 1CT4 diploid cells/number of mixed haploid cells (GAILLARDIN et al. 1973, ESSER and STAHL 1976, OGRYDZIAK etal. 1978). Therefore, complementation analysis in S. lipolytica remained quite laborious. More efficient mating procedures or strains exhibiting improved mating capacity were therefore necessary to facilitate genetic studies in this yeast. I n this paper a procedure is described which allowed to increase conjugation frequency of S. lipolytica. Strains: Auxotrophic mutants of S. lipolytica used in this study were induced by U V irradiation of strains H 194 AR.d H 195 (BABTH and WEBEB 1983). Derivates 27-K 108 and 32-K 283 of the strain H 222 were developed by an inbreeding program (KUBISCHKO 1984). Media: The compositions of complete medium (YEP-G), minimal medium (MMT), and yeast extract-malt medium (YM) were the same as described previously (BABTH and WEBEB 1983). RG medium has been described by HERMAN (1971), MC medium has been reported by MCCLABY etal. (1959) and PSM medium has been published by GAILLABDIN et al. (1973). Cultivation in liquid media was carried out in 50 ml flasks containing 10 ml medium. The flasks were placed on a reciprocal shaker. Mating mixtures were slowly shaken. All experiments were done at 28 °C.

As initial experiments several conjugation media (RG, MC and YM media) were tested for induction of mating. I n all cases YM medium was the most efficient one in inducing conjugation. Whereas frequencies of up to 4 X 1CT4 prototrophic cells/ number of mixed haploid cells were observed in R G or MC media, the frequency of diploid prototrophs could be increased up to 5 X 10 - 3 by using YM media for induction of mating. Moreover we were able to demonstrate, t h a t the precultivation time in or on complete media was quite important for the induction of high mating frequencies. Conjugation occurred only at a high level when cells of the late logarithmic growth phase (18—20 hours in YEP-G) were mixed in YM medium (Fig. 1). I t is, therefore, advisable to determine the growth kinetics of strains before they are used in a mating experiment. I n contrast to results of GAILLARDIN et al. (1973) we did not observe differences in mating frequencies after precultivation in or on PSM or Y E P - G media.

404

G. B a b t h a n d H . W e b e e

Time of second precultivation

< h)

Fig. 1 Correlation between conjugation frequency and precultivation time. 8. lipolytica H 194-10 crossed with H 195-81

On the basis of the above observation the following special mating procedure was developed for S. lipolytica-. Two auxotrophic strains of opposite mating type were separately precultivated in YEP-G for 22—24 hours. A second passage in YEP-G was made for up to 18 hours (the initial cell number was about 106 cells/ml). After cultivation the cells were washed once with distilled water and mixed in YM. The cell density necessary for optimal conjugation to occur depended on the particular strains. Derivatives of strain H 194 and H 195 yielded the highest conjugation frequency at a cell density of about 107 cells/ml. On the other hand a density of about 108 cells/ml was found to be essential for mutants of strain H 222. Mixtures were slowly shaken at 28 °C for 24 hours and then plated, onto MMT and YEP-G plates in. suitable dilutions. Four days after plating prototrophic colonies formed by diploid cells were counted and conjugation frequencies were estimated. In addition, the number of zygotes in relation to vegetative cells was determined microscopically in mixtures after 24 hours. • The results (Table 1) demonstrate that a frequency of about 5 X 10 - 3 prototrophs per cell was obtained in this way. But it was evident from all crosses that the number of zygotes observed microscopically was about ten to four hundred times higher than the number of viable diploid cells estimated by counting prototrophic colonies (Table 1). A similar low viability of zygotes was also observed by G a i l l a r d i n et al. (1973). Table 1 Frequencies of mating in crosses between different S. lipolytica mutants strains Frequency of matings Crosses

H H H H H H B

194 - 10 194 — 8 194 - 60 194 — 60 194 — 60 194 - 60 72 - 9

X H 195 -

81 X H 195 — 5 X H 195 - 81 X H 222 — 167 X B 72 — 12 X B 83 - 18 X B 97 - 89

Diploid cells per viable cells

Zygotes per number of mixed cells

4.0 X 10"3 1.4x10"® 1.8 X 10~3 3.2 X 10"4 1.6 X 10"5 1.9 X 10"5 4.9 x 10"3

5.7 3.2 4.5 4.0 1.0 7.9 5.8

X 10~

2

X 10~2 2 X 10" 3 X 10" 3 X 10~ x 10~3 2 X 10"

Improved conditions for mating of S. lipolytica

405

The basis of this phenomenon is not understood so far. I t can not be excluded at the moment that the low zygote viability is determined genetically. However, the enhancement of diploid formation by improvement of mating conditions, as demonstrated in this paper, suggested that limitations of nutrients or other unfavourable cultivation conditions may contribute to this low viability. As shown in Table 1, there were significant differences in the mating frequencies depending on the strains used. These differences can not solely be explained by variations of precultivation times, because optimal precultivation times were used for all strains listed in Table 1. We, therefore, assume that genetic differences between these strains accounted for their mating abilities. Strains with reduced mating frequencies (B 72-12 and B 83-18, Table 1) but no strains with significantly enhanced mating frequencies were obtained by inbreeding of H 194 and H 195. Our data demonstrate that contrary to sporulation and spore viability (WICKERHAM et al. 1 9 6 9 ) , the mating capacity of wild strains H 194 and H 195 was high. In contrast to a report by GAILLARDIN et al. ( 1 9 7 3 ) we found that in several strains cells of opposite mating types agglutinated after mixing in YM and a dense flocculation of the mating mixture was observed. When solid YM medium was used to induce mating the same conditions as described for liquid medium had to be observed. The following method was used for auxotrophic mutants of strain^ H 194 and H 195. Mutant strains of both mating types were incubated on YEP-G plates for 24 h. These strains were transferred to new YEP-G plates (4 lines per plate), separated for mating types and incubated for 18 h. Then, in each case two YEP-G plates with strains of the opposite mating type were crosswise replica plated onto one YM plate and incubated for 28 h. These YM plates were replica plated onto MMT with 1 % glucose. Diploid prototrophic strains were obtained after three days at 28 °C. Clear-cut results were obtained in complementation tests by this mating. Therefore, complementation analysis in S. lipolytica can be done routineously by this method. In conclusion, the procedure for induction of mating of S. lipolytica strains has been improved and complementation analysis in this yeast can now be done much more rapidly. Acknowledgement We thank Mrs. S. BRUCKNER for excellent technical assistance.

References

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163, 2 2 9 - 2 3 9 . WICKERHAM, L . J . , KURTZMAN, C. P . and HERMAN, A. J . , 1969. Sexuality in Candida

lipolytica.

In: Recent Trends in Yeast Research. Miner Institute, Chazy, New York, 81—92. Mailing address: Dr. G. BARTH, Zentralinstitut fur Mikrobiologie und experimentelle Therapie der AdW, DDR 6900 Jena, Beutenbergstr. 11

Zeitschrift für allgemeine Mikrobiologie 24 (1984) 6, 406

Buchbesprechung V. M. G O B L E N K O , G . A. D U B I N I N A und S. I. KTJZNETSOV, Die Binnengewässer, Band X X V I I I : The Ecology of Aquatic Micro-Organisms. I X + 252 S., 99 Abb., 44 Tab. Stuttgart 1983. E. Schweizerbart'sche Verlagsbuchhandlung (Nägele u. Obermiller). DM 98,00. ISBN 3-510-40039-9. Wesentliche Erkenntnisse und Einsichten über die ökologische Bedeutung der Mikroorganismen in limnischen Gewässern mit ihrer schwer überschaubaren Artenvielfalt und den stark differenzierten stoffwechselphysiologischen Leistungen verdanken wir den seit mehreren Jahrzehnten kontinuierlich betriebenen ökologischen Forschungen von S. I . KTJZNETSOV und seinen Schülern. Das vorliegende Buch, eine Übersetzung des 1977 erschienenen russischen Originaltitels, basiert auf diesen Ergebnissen und enthält eine Fülle von wertvollen Informationen. Das Schwergewicht liegt auf einer Darstellung der komplizierten mikrobiellen Strukturen aquatischer Ökosysteme, während die Bilanzierung der Leistungen der Mikrobengesellschaften entsprechend dem Erkenntnisstand der siebziger Jahre erst in den Ansätzen sichtbar wird. Nach 2 sehr kurzen einleitenden Kapiteln über Habitat (1 Seite) und allgemeine Merkmale der Mikroflora des Wassers (7 Seiten) werden in 4 Kapiteln die Mikroorganismen und ihre Ökologie, die an den Umsetzungen des Kohlenstoffkreislaufes (57 Seiten), des Stickstoffkreislaufes (31 Seiten), des Schwefelkreislaufes (70 Seiten) und an den Umsetzungen von Eisen und Mangan (56 Seiten) in der Natur beteiligt sind, behandelt. Den Schluß bildet ein ausführliches Literaturverzeichnis (20 Seiten). Bei der Charakterisierung der am Kohlenstoffkreislauf beteiligten Mikroorganismen wird unterschieden zwischen den Organismen der aeroben, mikroaerophilen und anaeroben Zonen und denen der Sedimentzone. Hier werden beschrieben: sprossende Bakterien, Bakterien mit Anhängen, fädige Bakterien, wasserstoffoxydierende, methanotrophe und methanogene Bakterien und bisher noch nicht kultivierte Mikroorganismen. In den anderen 3 Kapiteln wird der Behandlung der Ökologie eine taxonomische Charakteristik der entsprechenden Mikroorganismen, die durch Skizzen bzw. Mikrofotografien und durch Bestimmungsschlüssel ergänzt ist, vorangestellt. Das Buch zeigt zwar einerseits die Fortschritte, die bei der Untersuchung der Autökologie einzelner Gruppen von Mikroorganismen der Gewässer erzielt worden sind (phototrophe Bakterien, oligocarbophile Bakterien, Eisen- und Manganbakterien), macht aber zum anderen deutlich, wie weit wir derzeit von einer vollständigen Erfassung der Mikroorganismen und ihren Leistungen im Gewässer entfernt sind. Neuere methodische Ansätze fanden hier keine Berücksichtigung. Bei einzelnen Gruppen entspricht die Beschreibung nicht dem neuesten Erkenntnisstand (z.B. methanotrophe Bakterien). Der guten Ausstattung des Buches stehen zahlreiche Druckfehler gegenüber (z.B. phytoorganoheterotroph S . 5; Vibrio extorquene S. 44; Desulphotomaculum S. 62; Desulforomonas S. 97; Clorobiineae S. 114). Bei einer Neuauflage sollten außerdem die Übersichtlichkeit der vielen Kurven (Beschriftung) verbessert und das Sachverzeichnis erweitert werden. Diese Einschränkungen vermindern jedoch nicht den Wert dieses Buches als unentbehrliche Informationsquelle für alle Gewässermikrobiologen, Limnologen und Mikrobenökologen. J . H E Y E B (Jena)

Zeitschrift f ü r allgemeine Mikrobiologie 24 (1984) 6, 407—411

Kurze

Originalmitteilung

(Central Rice Research Institute, Cuttack-753006, Orissa, India)

Mineral requirements of the nitrogen-fixing blue-green alga Anabaenopsis raciborskii W O L O S Z R,. S . SHARMA a n d P . K . SINGH

(Eingegangen

am 13.

12.198S)

The essential requirements of macro- and microelements of a bloom-forming blue-green alga Anabaenopsis raciborskii WOLOSZ have been determined on the basis of A L L E N and A R N O N ' S medium. The requirement of calcium and phosphorus was low, whereas requirements of sodium and magnesium for algal growth were high. I t was possible to replace potassium by sodium, and sodium was found to be essential for growth on N 2 . A wide range of nitrate concentrations supported the growth whereas the requirement of ammonia and urea was low. The growth was dependent on molybdenum when the alga was cultivated with N 2 . Manganese and iron requirements were low and the alga showed a narrow range of cobalt tolerance. Modification of A L L E N and A R S O N ' S medium resulted in better growth and N 2 fixation of alga. T h e b l u e green algae (cyanobacfceria) s u c h as Anabaenopsis, Raphidiopsis a n d Microcystis f o r m e x t e n s i v e algal b l o o m s in p o n d s a n d d i t c h e s u s e d for v a r i o u s p u r p o s e s i n I n d i a . T h e s e b l o o m s s u p p o r t a l u x u r i a n t g r o w t h of t h e algae (SINGH 1955, 1961). T h e f a c t o r s responsible for s u c h b l o o m s are n o t f u l l y understood, a l t h o u g h a n increased a v a i l a b i l i t y of n u t r i e n t s h a s b e e n considered t o be largely responsible for their g r o w t h i n countries w i t h a t e m p e r a t e climate (STEWART et al. 1975, 1977). N 2 - f i x i n g algae are particularly i m p o r t a n t in such water. T h e y p l a y a n i m p o r t a n t role i n t h e f o o d chain b u t t h e y also p r o v e d t o be deleterious w h e n t h e y occur in excess. T h e nutritional r e q u i r e m e n t of such algae c o m m o n l y f o u n d in I n d i a h a s n o t y e t b e e n s t u d i e d and, therefore, this s t u d y w a s u n d e r t a k e n t o f i n d o u t t h e n u t r i e n t requirements of pure culture of Anabaenopsis raciborskii. Organism and growth: The planktonic blue-green alga Anabaenopsis raciborskii WOLOSZ was isolated from a water bloom of a permanent pond, the water of which had a p H of 7.5. An axenic culture of the alga was isolated by using standard microbiological techniques. The alga formed short trichomes containing about 12 cells per filament. Vegetative cells contained an abundant number of gas-vacuoles. The heterocysts were terminal a t both ends and akinetes were formed singly and adjacent to a heterocyst. Although the alga was initially isolated in modified Chu-10 medium ( G E R L O F F et al. 1950), the nutritional studies were conducted in A L L E N and A R N O N ' S medium without any combined nitrogen source. The medium is referred as AA-N. Cultures were maintained in 100 ml Pyrex conical flasks at 24 + 1 °C with an illumination of 750 ft. c. provided by cool fluorescent tubes for 14 hrs per day. One ml of an exponentially growing culture containing 0.7 X 10~4 filaments was inoculated into 99.0 ml of medium. Filaments were counted by using a haemocytometer and growth of the cultures was measured with a U N I C A M SP 1300 photoelectric colorimeter (red filter, 650 ¡JTM) on 8 th day of incubation and expressed as optical density (O.D.) units. The experiments were conducted in triplicate and each experiment was repeated 3 to 5 times. S o d i u m : T h e e f f e c t of s o d i u m o n t h e g r o w t h of t h e alga A. raciborskii w a s i n v e s t i g a t e d b y v a r y i n g t h e s o d i u m (as NaCl) c o n c e n t r a t i o n f r o m 0.25 X 1 0 - 3 M to 1 X 10~ 2 m in A A - N m e d i u m . I n t h e a b s e n c e of s o d i u m t h e alga failed t o g r o w a n d t h e inoculum

408

R . S . SHABMA a n d P . K . SINGH

turned yellowish. Maximum growth was obtained at a concentration of 6 X 10 - 3 M ; above this concentration the growth rates slightly decreased. The requirement of sodium in N2-fixing cultures was higher (6 X 10 - 3 M) than that of algae growing in AA-N medium (4 X 10 - 3 M). Potassium: Increasing the level of potassium from 0.25 x 10 - 3 M to 0.5 X 10 - 3 M in AA-N medium did not affect algal growth. A further increase in concentration from 1 X 10 - 3 M to 4 X 10 - 3 M resulted in a gradual decrease in growth rate. A sharp decrease in growth was noticed at higher concentrations and the algae did not grow at potassium concentrations above 8 X 10 - 3 M. In the complete absence of potassium algal growth remained unaffected after succesive transfer. Interaction of sodium and potassium: The alga responded appreciably to sodium even when the potassium supply was completely cut off. Even cultures with low concentrations of sodium showed better growth in absence of potassium than in its presence. When sodium was reduced to half (2 X 10 - 3 M) the concentration present in the basal medium, potassium had no effect. However, in the presence of potassium the requirement of sodium increased to obtain about equal growth. This indicated that potassium could not substitute for sodium whereas sodium could support algal growth in complete absence of potassium. In absence of sodium, potassium showed an inhibitory effect even at its lowest concentration of 0.25 X 10 - 3 M. The algal filaments were broken into fragments of 2—3 cells which turned pale yellow. The addition of potassium to the medium containing constant sodium did not increase the growth whereas increasing potassium concentrations adversely affected the growth even in presence of sodium. The number of filaments increased with an increase in the sodium level, whereas in absence of sodium the number of filaments decreased to the half the number of those cultures containing sodium. The filament number was always higher when potassium was omitted from the nutrient solution. Concentrations of potassium at 6 X 10 - 3 M and above were toxic to the filaments both in the presence or absence of sodium. From these results it was apparent that sodium antagonized the toxicity of potassium. Magnesium: The alga failed to grow in absence of magnesium. First the inoculum turned yellowish and subsequently culture bleached. The growth rate of the alga gradually increased when the magnesium concentration was raised from 0.25 X 10~3 M to 2 X 10 - 3 M. The optimum rate of growth was obtained at 2 X 10" 3 M. After raising the magnesium concentration further the growth gradually declined. Calcium: The growth rate of the alga increased rapidly when the concentration of calcium was raised from 0.5 x 10 - 4 M to 2.5 X 10 - 4 M. However, no additional increase in algal growth occurred by increasing the calcium concentration and further a decline in growth was noticed at concentrations of 1.5 X 10 - 3 M and above. Higher concentrations (above 1.5 X 10 _3 M) were not tested in this study because of the precipitation of calcium phosphate. Phosphorus: Increasing the concentration of phosphorus from 1 X 10~4 M to 2.5 X 10 - 4 M increased the algal growth whereas a decrease in growth was observed at a concentration of 5 X 10 - 4 M. The alga failed to grow in absence of phosphorus. Nitrate: Growth of the alga increased with an increase in the nitrate (NaN03) concentration; maximum growth was obtained at 4 X 10~3 M. Higher concentrations supported growth, however, it was comparatively slower. Nitrite: The growth response of the alga towards different concentrations of nitrite (NaNOa) (ranging from 0.1 X 10 _3 M to 1 X 10 _a M) indicated that nitrite did not support growth but exerted an inhibitory effect. The alga was even unable to grow at a nitrite concentration as low as 0.1 X 10 - 3 M. Ammonia: The maximum growth rate of alga was obtained in cultures supplemented with 1 X 10~3 M of ammonium chloride. Above this level there was a gradual decline

40Ô

Mineral requirements of Anabaenopsis

in growth. The degree of inhibition increased by raising the ammonia concentration further. Urea: Optimum growth was obtained at an urea concentration of 0.5 X 10 - 3 M while algal growth was inhibited at a concentration of 4 X 10 - 8 M. Molybdenum: The molybdenum requirement was investigated in presence of molecular nitrogen, ammonium and nitrate nitrogen. Molybdenum requirement varied depending on the presence of molecular nitrogen, nitrate (4 X lO- 3 M NaN0 3 ) or ammonia (1 X 10' 3 M NH4C1), and it was 2 X 10"7 M, 6 X 10 - 8 M, and 0.0, respectively, for maximum growth. In nitrate-containing media the growth did not increase further at molybdic acid concentrations above 6 X 10_8M whereas increase in algal growth was observed upto concentrations of 2 X 10~7 M in N-free medium. The growth rates in ammonia were same up to 6 X 10 - 8 M of molybdic acid and above this level growth decreased. Thus, • the molybdenum requirement for fixation of molecular nitrogen was approximately three times higher than that of nitrate reduction and when ammonium nitrogen was provided almost no molybdenum was required. Molybdenum deficiency was characterized by a yellowishgreen colour of the cultures. Cobalt: The requirement of cobalt was studied only in AA-N medium where maximum growth was obtained at 1 X 10 - 6 M of cobalt; growth decreased sharply at a concentration of 2 X 10~6 m and dropped to almost 50% in 4 X 10~® M cobalt. The alga failed to grow in absence of cobalt. Table 1 Optimum concentrations of different macro and micronutrients for maximum growth of Anabaenopsis raciborshii Elements

Concentration1) (Molarity)

Growth2) (optical density)

Specific growth rate constant (K)

Macroelements Sodium (NaCl) Potassium (KC1) Magnesium (MgS0 4 X 7 H 2 0) Calcium (CaCl2 X 2 H 2 0 ) Phosphorus (K 2 HP0 4 ) Nitrate (NaN0 3 ) Nitrite (NaN0 2 ) Ammonia (NH4C1) Urea (NH 2 CONH 2 )

6.0 • 0.5 • 2.0 • 2.5 • 2.5 • 4.0 • 0.5 • 1.00.5 •

10~4 10"3 10"3 10"4 10"4 10"3 10"3 10"3 10~3

0.20 0.14 0.18 0.18 0.19 0.35 0.45 0.39 0.43

0.37 0.33 0.36 0.36 0.37 0.44 0.20 0.46 0.47

Microelements Molybdenum (Mo03) Cobalt (CoCl2 X 6 HaO) Mangenese (MnS0 4 X 2 H 2 0) Iron (FeS0 4 )

2.0 • 1.01.5 • 1.5 •

10"' lO"6 10"6 10"6

0.46 0.35 0.42 0.60

0.24 0.22 0.23 0.26

*) Optimum concentration of element used in the medium while keeping other nutrients at the level of AA-N medium 2 ) Growth of the alga was recorded 8 days after inoculation

Manganese: Algal cultures in AA-N medium turned colourless in the absence of manganese. The optimum growth was obtained at a concentration of 1 X 10 -6 M. Further increase in concentration led to a decrease in growth. Iron: I n absence of iron the alga failed to grow in AA-N medium, the inoculum turned colourless and showed no sign of growth. The growth increased when the concentration of ferrous sulphate was raised from 5 X 10 - 7 M to 5.3 X 10 - s M. 27 Z. allg. Mikroljio]., Bd. 24, H. 6

410

R . S . SHARMA a n d P . K . SINGH

Table 2 Composition of original and modified ALLEN-ARNON medium and growth of Anabaenopsis raciborskii after 8 days of incubation Macro and microelements and growth NaCI MgS0 4 X 7 H , 0 CaCl2 x 2 H 2 0

K 2 H PO4

MnS0 4 X 2 H 2 0 MO03

CoCl2 x 6 H 2 0 CuS0 4 X 5 H 2 0 ZnS0 4 X 2 H 2 0 H 3 BO S FeS0 4 EDTA Optical density Specific growth rate K Doublings day Doubling time (hrs)

AA-N medium (M) 4.01.00.52.05.01.0-

IO" 3 IO'3 IO" 3

10"3 10- 7 10- 7

4 . 0 - IO"

7

0.2- 10"8 2.7 • IO" 7 8.8- io-« 1.0- IO" 5 1.0- IO" 5 0.14 0.46 1.6 15

Modified medium (M) 6.0 2.0 2.5 0.5 1.0 2.0 1.0 0.2 2.7 8.8 5.3 1.0 0.32 0.65 2.2 11

IO" 3 IO" 3 IO" 4 IO" 3

10-« 10- 8 IO" 6

10- 8 10- 6 10- 8 10"6 10"6

Improved medium: Based on the optimum concentrations of each element studied an improved and modified medium for growing the alga is suggested (Tables 1, 2). In this medium the alga grew at a faster rate (Table 2) up to 8 days and the growth was comparable with that reported for Anabaena cylindrica and Anacystis nidulans (HOOGENHOTJT a n d A M E S Z

1965).

The alga A. raciborskii grows abundantly during the summer months in India ponds, but the factor(s) responsible for its dominance in nature are not yet understood. Comparatively little is known about the exact nutrition and growth requirements of this common bloom producer. The present investigation on the mineral requirement of A. raciborskii revealed that in an inorganic nutrient solution its composition and the concentration of each essential element was an important factor affecting the growth of this alga, particularly with respect of phosphorus, nitrogen, sodium, potassium, molybdenum, and cobalt. Besides the determination of nutritional requirements and the proposal of a suitable medium for culturing A. raciborskii, it may be concluded from this study that the factor(s) responsible for an occurrence of blooms in tropical and temperate countries might differ. Pond water containing low N also supported blooms of N 2 -iixing algae intermingled with non N 2 -fixing forms and, therefore, eutrophication might not be essential for their dominance. Acknowledgements Authors are grateful to H. K. PANDE, Director, Central Rice Research Institute, Cuttack.

References GERLOFF, G . C., FITZGERALD, G . P . a n d SKOOG, F . , 1 9 5 0 . T h e i s o l a t i o n , p u r i f i c a t i o n a n d

culture

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Mineral requirements of Anabaenopsis

411

Limnological relations of Indian inland waters with special reference to water blooms. Proc. Internat. Assoc. Theor. Appl. Limnol., 12, 831 — 836. S I N G H , R. N., 1961. Role of blue-green algae in nitrogen economy of India agriculture. Indian Council of Agric. Res., New Delhi. S T E W A R T , W. D . P., S I F A D A , F., C H R I S T O F I , N. and D A F T , M. J., 1977. Primary production and microbial activity in fresh water habitats. Sympos. Soc. appl. Microbiol., 6, 31—35. S T E W A R D , W. D. P., T U C K W E L L , S . B. and M A Y , E., 1975. Eutrophication and algal growth in Scottish fresh water lochs. In: Ecology of Resource Degradation and Renewal ( M . J . C H A D WICK and G . T. G O D M A N , Editors). Blackwell Scientific Publ. Oxford, pp. 57—88. SINGH, R . N . , 1955.

Mailing address: Dr. P. India

27*

K . SINGH,

Central Rice Research Institute, Cuttack-753006, Orissa,

Zeitschrift für allgemeine Mikrobiologie 24 (1984) 6, 412

Buchbesprechung D. SCHLESSINGEB (Editor), Microbiology-1983. X I + 412 S., 57 Tab. 154 Abb. Washington 1983. American Society for Microbiology. ISBN 0-914826-53-0. „Microbiology-1983" — übrigens der Band, mit dem DAVID SCHLESSINGEB seine 10jährige Herausgeberarbeit an dieser nützlichen Serie beendet — wird wiederum breites Interesse in Mikrobiologenkreisen finden. Er enthält kurze und sehr informativ geschriebene Versionen von Vorträgen, die auf 7 wissenschaftlichen Symposien zu sehr unterschiedlichen aktuellen mikrobiologischen Forschungsgebieten gehalten wurden. Sechs von ihnen waren Bestandteil des wissenschaftlichen Programms des X I I I . Internationalen Kongresses für Mikrobiologie im Jahre 1982 in Boston. Der Band wird eingeleitet mit einer Serie von Artikeln zum relativ selten in der Literatur mit zusammenfassenden Darstellungen bedachten Thema Transkriptionstermination, Antitermination und mRNA-Processing. Der zweite Artikelkomplex behandelt die genetische Kontrolle der Initiation der DNA-Replikation von Phagen (Lambda, P4, T4) und ihren Wirten. Ihm folgen zwei Beiträge über die Auswirkungen moderner mikrobengenetischer Forschungsergebnisse und Methodologien auf die bakterielle Systematik. Der 4. Abschnitt des Bandes behandelt den Metabolismus von Cj-Verbindungen, in dem man u. a. auch einen zusammenfassenden Aufsatz über die Genetik methylotropher Bakterien finden kann. Der nächste Beitragskomplex behandelt die Entwicklungsbiologie von Bakterien, wobei die Schwerpunkte auf der Sporogenese von Bacillus, dem Zellzyklus von Rhodomicrobium, der Heterocystenbildung von Cyanobakterien, der Zellinteraktion bei Myxomyceten und den zeitlichen und räumlichen Differenzierurigsprozessen von Caulobacter liegen. Mykologische Probleme nehmen einen breiten Raum des Bandes im nächsten Themenkomkomplex ein, der zusammenfassende Darstellungen über Enzymregulation, die biochemische Transformation von xenobiotischen Verbindungen, die molekulare Grundlage des Dimorphismus, die Bildung infektiöser Konidien durch pathogene Pilze und schließlich über die Mechanismen der pilzlichen Pathogenese enthält. Ähnlich breiten Raum nimmt der 7. Problemkomplex ein, in dem es um das außerordentlich aktuelle Thema der Rolle des Eisens im Stoffwechsel nich'tpathogener und pathogener Bakterien sowie um den Eisenstoffwechsel in normalen und neoplastischen tierischen Zellen geht. Dieser Komplex enthält auch Artikel über neueste Forschungsergebnisse, die an obligat intrazellulären pathogenen Bakterien und Protozoen gewonnen wurden. Der ungewöhnlich informationsträchtige Band wird beschlossen mit fünf knappen Reviewartikeln zu folgenden Problemkreisen: Mikrobielle Paläontologie, chemiosmotische Theorie und Bakterienphysiologie, die Zähmung der Hepatitisviren, landwirtschaftliche Aspekte der Fusarium-Toxine und aktuelle Fragen der Parasitologie. H.

MALKE

(Jena)

Zeitschrift für allgemeine Mikrobiologie 24 (1984) 6, 413—424

'Sammelbericht (Akademie der Wissenschaften der D D R , Forschungszentrum für Molekularbiologie und Medizin, Zentralinstitut für Ernährung, Potsdam-Rehbrücke, Direktor: Prof. Dr. H. SCHMANDKE und Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie, Jena, Direktor: Prof. Dr. U. TAUBENECK)

Gewinnung von pektinolytischen Enzymen aus Aspergillus in Submerskultur

niger

H.HERMERSDÖRFER, E . J E L K E , A . LEUCHTENBERGER, CH. WARDSACK u n d H . RUTTLOFF (Eingegangen

am

28.11.1983)

Our present knowledge of the production of pectolytic enzymes and the regulation of their synthesis is reviewed. Emphasis is laid on the submerged production of polygalacturonase by Aspergillus niger, with special attention being paid to the correlation between mycelial morphology and enzyme synthesis. A. niger is singled out as the main industrial organism of large scale production of pectinases. Discrepancies in the literature regarding essential parameters for submerged cultivation of A. niger are regarded as being due to strain-specific properties of the different producer organisms.

Pektinenzyme haben ein weites Anwendungsspektrum in der Lebensmittelindustrie gefunden, insbesondere bei der Verarbeitung von Obst und Gemüse. Aktuelle Übersichten zu diesem Gebiet geben BOCK (1978), P I L N I K und ROMBOUTS (1979), ROMBOUTS und P I L N I K (1978, 1980) sowie RUTTLOFF etat (1978b). Im Weltmaßstab nehmen Pektinasen gegenwärtig den vierten Rang aller in der Lebensmittelindustrie eingesetzten Enzyme ein (ROMBOUTS U. P I L N I K 1980). Eine Vielzahl pektinolytischer Enzyme unterschiedlicher Wirkungsweise ist beschrieben worden (CHESSON 1980, REXOVA-BENKOVA U. MARCOVICZ 1 9 7 6 , ROMBOUTS U. P I L N I K 1 9 8 0 , RUTTLOFF et cd.

1978). Es handelt sich dabei hauptsächlich um Hydrolasen und Lyasen vom Endoals auch vom Exo-Typ. Unter den hydrolytisch spaltenden Enzymen dieser Gruppe befindet sich auch die Polygalakturonase (PGase), ein von A. niger und anderen Pilzen häufig ausgeschüttetes Enzym (BLAIN 1975). Für den Einsatz von pektinspaltenden Enzympräparaten in der obst- und gemüseverarbeitenden Industrie (z. B. zur Erhöhung der Saftausbeute beim Pressen von Obst, zur Klärung von Fruchtsäften und Wein sowie zur Herstellung von flüssigen Obst- und Gemüseerzeugnissen) ist das Enzymspektrum von wesentlicher Bedeutung (DÜRR u . SCHOBDSTGER 1 9 7 6 , ROMBOUTS U. P I L N I K 1 9 7 8 , ZETELAKI-HORVATH U. GATAI 1 9 7 7 , KRAKOWIAK 1 9 7 5 ) .

Die vorliegende Literaturübersicht stellt einen Beitrag zum derzeitigen Kenntnisstand über die fermentationstechnische Gewinnung pektinolytischer Enzyme dar. Dabei interessiert besonders die Submerskultivation von Pilzen (speziell A. niger) zur Gewinnung von PGase. Da sich die Hinweise auf die Bedeutung der Schimmelpilzmorphologie für die in submerser Kultur erfolgende Produktsynthese mehren, soll dieser Aspekt ebenfalls aus Sicht der Literatur erörtert werden. Stand der Pektinasegewinnung Auswahl der Mikroorganismen Einen Überblick zur Gewinnung von Pektinenzymen in den 60iger Jahren geben ROMBOUTS und P I L N I K ( 1 9 7 2 ) . Obwohl Hefen und Bakterien ebenfalls geeignet sind,

Zeitschrift für allgemeine Mikrobiologie 24 (1984) 6, 413—424

'Sammelbericht (Akademie der Wissenschaften der D D R , Forschungszentrum für Molekularbiologie und Medizin, Zentralinstitut für Ernährung, Potsdam-Rehbrücke, Direktor: Prof. Dr. H. SCHMANDKE und Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie, Jena, Direktor: Prof. Dr. U. TAUBENECK)

Gewinnung von pektinolytischen Enzymen aus Aspergillus in Submerskultur

niger

H.HERMERSDÖRFER, E . J E L K E , A . LEUCHTENBERGER, CH. WARDSACK u n d H . RUTTLOFF (Eingegangen

am

28.11.1983)

Our present knowledge of the production of pectolytic enzymes and the regulation of their synthesis is reviewed. Emphasis is laid on the submerged production of polygalacturonase by Aspergillus niger, with special attention being paid to the correlation between mycelial morphology and enzyme synthesis. A. niger is singled out as the main industrial organism of large scale production of pectinases. Discrepancies in the literature regarding essential parameters for submerged cultivation of A. niger are regarded as being due to strain-specific properties of the different producer organisms.

Pektinenzyme haben ein weites Anwendungsspektrum in der Lebensmittelindustrie gefunden, insbesondere bei der Verarbeitung von Obst und Gemüse. Aktuelle Übersichten zu diesem Gebiet geben BOCK (1978), P I L N I K und ROMBOUTS (1979), ROMBOUTS und P I L N I K (1978, 1980) sowie RUTTLOFF etat (1978b). Im Weltmaßstab nehmen Pektinasen gegenwärtig den vierten Rang aller in der Lebensmittelindustrie eingesetzten Enzyme ein (ROMBOUTS U. P I L N I K 1980). Eine Vielzahl pektinolytischer Enzyme unterschiedlicher Wirkungsweise ist beschrieben worden (CHESSON 1980, REXOVA-BENKOVA U. MARCOVICZ 1 9 7 6 , ROMBOUTS U. P I L N I K 1 9 8 0 , RUTTLOFF et cd.

1978). Es handelt sich dabei hauptsächlich um Hydrolasen und Lyasen vom Endoals auch vom Exo-Typ. Unter den hydrolytisch spaltenden Enzymen dieser Gruppe befindet sich auch die Polygalakturonase (PGase), ein von A. niger und anderen Pilzen häufig ausgeschüttetes Enzym (BLAIN 1975). Für den Einsatz von pektinspaltenden Enzympräparaten in der obst- und gemüseverarbeitenden Industrie (z. B. zur Erhöhung der Saftausbeute beim Pressen von Obst, zur Klärung von Fruchtsäften und Wein sowie zur Herstellung von flüssigen Obst- und Gemüseerzeugnissen) ist das Enzymspektrum von wesentlicher Bedeutung (DÜRR u . SCHOBDSTGER 1 9 7 6 , ROMBOUTS U. P I L N I K 1 9 7 8 , ZETELAKI-HORVATH U. GATAI 1 9 7 7 , KRAKOWIAK 1 9 7 5 ) .

Die vorliegende Literaturübersicht stellt einen Beitrag zum derzeitigen Kenntnisstand über die fermentationstechnische Gewinnung pektinolytischer Enzyme dar. Dabei interessiert besonders die Submerskultivation von Pilzen (speziell A. niger) zur Gewinnung von PGase. Da sich die Hinweise auf die Bedeutung der Schimmelpilzmorphologie für die in submerser Kultur erfolgende Produktsynthese mehren, soll dieser Aspekt ebenfalls aus Sicht der Literatur erörtert werden. Stand der Pektinasegewinnung Auswahl der Mikroorganismen Einen Überblick zur Gewinnung von Pektinenzymen in den 60iger Jahren geben ROMBOUTS und P I L N I K ( 1 9 7 2 ) . Obwohl Hefen und Bakterien ebenfalls geeignet sind,

414

H . H E R M E R S D Ö R F E R et

dl.

wurden hierfür bis in die Gegenwart bevorzugt Pilze eingesetzt. Die Gattungen Alternaria, Aspergillus, Botrytis, Fusarium, Pénicillium, Rhizoctonia (Corticium) und Sclerotinia werden in der Literatur am häufigsten genannt. Darunter sind A. niger, A. awamori, Rhizoctonia solani und Sclerotinia scleroticum die am meisten verwendeten Species. Nach Screening-Versuchen rangiert die Gattung Aspergillus an erster Stelle (ABDEL-FATTAH etal. 1 9 7 3 , CHAGA etal. 1 9 7 1 , RZEDOWSKI U. OSTASZEWICZ 1 9 7 0 , NISHIO U. NAGAI 1 9 7 9 ) . Nach ABDEL-FATTAH et al. ( 1 9 7 6 ) ist A. niger auch bei submerser Kulturform in der Lage, PGase in ausreichender Menge zu synthetisieren. Sowohl bei Emers-wie auch Submerskultivation wird am häufigsten A. niger zur kommerziellen Pektinaseproduktion eingesetzt (BARBESGAARD 1 9 7 7 , FOGARTY U. KELLY 1979).

Verfahren Für die Gewinnung von Enzymen aus Pilzen sind drei Verfahrensprinzipien bekannt, und zwar das seit langem praktizierte Emersverfahren sowie die neueren semisoliden und submersen Methoden. Derzeitig wird intensiv an der Erarbeitung von Submersverfahren gearbeitet, da diese gegenüber der Emersproduktion verschiedene Vorteile bieten. Es finden sich allerdings Hinweise, daß die submerse Gewinnung von PGase gegenwärtig noch mit Problemen behaftet ist (BLAIN 1 9 7 5 , BABBESGAARD 1 9 7 7 ) , und daß daher emerse Verfahren dominieren (FOGARTY U. K E L L Y 1 9 7 9 , ROMBOUTS u. P I L N I K 1 9 8 0 ) . Emersverfahren bieten den Vorteil einer besseren Sauerstoffversorgung der Kultur sowie eines breiten Enzymspektrums des Produktes. Im Vergleich zu Submersverfahren weisen emerse Produktionsverfahren allerdings auch erhebliche Nachteile auf. Der manuelle Arbeitsaufwand bei gleichzeitig ungünstigen hygienischen Arbeitsbedingungen ist sehr hoch, die Gesamtausbeute ist gering, und es besteht die Gefahr der Kontamination der Kultur durch Fremdorganismen. Mit der Einführung von Submersverfahren ist es möglich, qualitativ verbesserte Produkte bei gleichzeitig verringertem Produktionsaufwand herzustellen. Tabelle 1 Veröffentlichungen zur submersen Pektinasegewinnung aus Aspergillus niger Jahr

Autor

Gegenstand der Arbeit

1964 1967

KHERSONOVA FENIKSOVA u n d MOLDABAEVA RZEDOWSKI u n d OSTASZEWICZ CHAGA et al. GRIGOROW et al. SREEKANTIAH et al.

Beschreibung eines Kulturmediums Einfluß verschiedener Kohlenstoffquellen

1970 1972 1973 1973

1974a

1975 1976

MUKHEBJEE und MAJUMDAR MUKHERJEE und MAJUMDAB KRAKOWIAK u n d MALANOWSKA KRAKOWIAK u n d MALANOWSKA MARCZEWSKI TUTTOBELLO

1978

TUTTOBELLO

1974 b 1975 a 1975b

Stamm-Sreening und Beschreibung eines Kulturmediums Verfahrenstechnische Parameter für den Labormaßstab Vergleich von Emers- und Submersbedingungen Stamm-Screening, Vergleich von Emers- und Submersbedingungen, Kulturmedium Einfluß komplexer Medienbestandteile und Anwendung von metabolischen Inhibitoren Einfluß von Mineralstoffen Einfluß des pH-Wertes Nährmedienoptimierung

(statistische Versuchsplanung)

Submersfermentationsanlage (Rührtrommel) Vergleich von Emers- und Submersbedingungen, Einfluß der Temperatur und des Kulturmediums Einfluß der Temperatur im 10 1-Fermentor, Verfahrensbeschreibung

415

Pektinolytische Enzyme aus A. niger

Gemäß einem Patent von B A U M et al. ( 1 9 7 6 ) wird das Prinzip der Emers- und Submerskultur kombiniert. Nach emerser Kultivation eines Mycelrasens wird dieser in das Nährmedium getaucht. Das nunmehr kompakte Mycel ist in der Lage, Pektinenzym verstärkt auszuschütten. Die Veröffentlichungen über die submerse Gewinnung von Pektinenzymen aus A. niger sind in Tabelle 1 zusammengestellt. In der Mehrzahl handelt es sich dabei um Arbeiten, die Teilaspekte der Enzymgewinnung behandeln. Tabelle 2 veranschaulicht den Stand der vorliegenden Patentschriften zur submersen Pektinasegewinnung aus Pilzen. Einfluß verschiedener Kulturbedingungen auf die Pektinasesynthese Zum Komplex der industriellen Enzymgewinnung sowie zur Physiologie und Genetik industriell genutzter Pilze liegen zahlreiche Arbeiten vor (SMITH U. B E R R Y 1975, 1 9 7 6 , SMITH U. PATEMAN 1 9 7 7 , R E H M 1 9 8 0 , R O S E 1 9 8 0 , P E P P L E R U. PERLMAN W A N G et al.

1 9 7 9 , R U T T L O F F et al.

1979,

1 9 7 8 , D A N E H Y U. WOLNAK 1 9 8 0 , E N A T S U U. SIIIN-

MYO 1978). Von allgemeiner Bedeutung für die Enzymgewinnung aus Mikroorganismen sind nach DEMAEST (1972) die Auswahl der Species, die Medienzusammensetzung, die Art der Tenside, der pH-Wert, die Temperatur sowie die Sauerstoffversorgung. Als wichtigste physiologische Kriterien werden das Wachstumsstadium, die Wachstumsrate und die Mechanismen der Induktion, der Feed-Back-Repression und der katabolischen Repression genannt. Nach VASU ( 1 9 7 7 ) erfolgt die Bildung von PGase durch A. niger konstitutiv; die Synthese wird bei Substratüberangebot reprimiert. Pektinesterase hingegen wird als induktives Enzym produziert und durch Glucose sowie Saccharose reprimiert. Zu anderen Befunden gelangen SHINMYO et al. ( 1 9 7 8 ) sowie TAHARA et al. ( 1 9 7 5 ) . Nach diesen Autoren unterliegt die PGase-Bildung bei A. niger einer katabolischen Repression, wenn Glucose und Fructose im Nährmedium angeboten werden. Nach K A L U N J A N Z (1978, 1981) ist es für die PGase-Gewinnung mittels A. awamori und A. niger wichtig, organische und anorganische Stickstoff quellen gleichzeitig anzubieten. Dieser Autor weist ferner darauf hin, daß die Art der Stahllegierung der Fermentoren von Einfluß auf die PGase-Synthese ist (Hemmung der Enzymbildung durch Eisen- und Chromionen, Stimulierung durch Titan- und Aluminiumionen). Durch Vorgabe eines bestimmten pH-Wertes (Kulturmedium) sowie Vorbehandlung des verwendeten Pektins soll es des weiteren möglich sein, den Akzent der Enzymsynthese wahlweise auf die Exo- oder Endo-PGase-Bildung zu verlagern. Als weitere wichtige Einflußfaktoren sind nach diesem Autor zu nennen: das Alter des Inokulums, die Kultivationstemperatur sowie das Redoxpotential der Kulturflüssigkeit. Bei den folgenden Ausführungen über die für die Pektinasesynthese optimalen Kulturparameter wird ausschließlich die submerse Verfahrensweise berücksichtigt, wobei A. niger als Enzymproduzent im Vordergrund steht. In einzelnen, hiervon abweichenden Fällen wird die verwendete Species ausdrücklich genannt. Kohlenstoff quelle Von den meisten Autoren wird Pektin als notwendiger Bestandteil des Nährmediums angesehen (KHERSONOVA 1964, FENIKSOVA U. MOLDABAEVA 1967, RZEDOWSKI U. OSTASZEWICZ 1970, SREEKANTIAH et al. 1973, M U K H E R J E E U. MAJUMDAR 1974b, TUTTOBELLO 1976). Nach N Y I R I (1968) muß das als Induktor wirksame Pektin konstant auf einem niedrigen Konzentrationsniveau gehalten werden (A. ochraceus). Als industriell nutzbare, billige Nährstoffquelle setzten Z E T E L A K I et al. (1970a), KRAKOWIAK U. MALANOWSKA (1974a), CHAGA et al. (1973), KHERSONOVA (1964) sowie

4 1 6

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