Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie: Volume 24, Heft 1 [Reprint 2021 ed.] 9783112565827, 9783112565810

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ZEITSCHRIFT FÜR ALLGEMEINE MIKRQ-BIOLOGIE AN INTERNATIONAL JOURNAL ON MORPHOLOGY, PHYSIOLOGY, GENETICS, AND ECOLOGY OF MICROORGANISMS VOLUME 2 4 • 1984 • NUMBER 1

AKADEMIE-VERLAG • BERLIN ISSN 0044-2208

Z. allg. Mikrobiol., Berlin 24 (1984) 1, 1 - 6 4

EVP 2 0 , - M

Instructions

to Authors

1. The journal publishes original papers, short communications, and review articles. Submission of a paper implies that it has not been published or has not been submitted for publication elsewhere. Manuscripts should be sent in duplicate with one set of the original illustrations to the Editor-in-Chief: Prof. Dr. ü . Taubeneck, DDR-6900 Jena, Beutenbergstr. 11. 2. Manuscripts should preferably been written in Englisch but may also be submitted in German. They should be typed double-spaced and be accompanied by a title page comprising: name and address(es) of the institution(s) where the work was done, title of the paper, and the complete name(s) of the author(s). Each paper must begin with a brief summary in English. Original papers should be divided into sections headed: Introduction, Materials and Methods, Results, Discussion, Acknowlegements, and References. A short title for use as running head should be provided. The exact mailing address of the author to whom correspondence, reprint requests etc. are to be addressed must be given at the end of the paper. 3. Tables, illustrations, and descriptive legends of the illustrations must be submitted on separate sheets. Each table should have a heading. The size of illustrations should not exceed the maximum printing area of 12 X 19 cm or 4.7 X 7.5 inches, respectively. 4. Literature citations in the text should be by author and year of publication. If there are more than two authors, only the first should be named, followed by "e< a l " . References should include only publications cited in the text. They should be given in alphabetical order: a) Books: Family name(s) and initials of authors(s), year of publication. Title of the book. Volume and Edition, Publisher and place of publication, e. g.: BEETHELIN, J . , BELGY, G . a n d MAGNE, R . , 1 9 7 7 . S o m e a s p e c t s o f t h e m e c h a n i s m o f

solubilization and insolubilization of uranium from granites by heterotrophic microorganisms. I n : Bacterial Leaching Conference (W. SCHWARTZ, Editor), pp. 261 to 270. Verlag Chemie Weinheim.

b) Journals: Family name(s) and initials of authors(s), year of publication. Title of the paper. Abbreviated name of the journal, volume (underlined), number of the first and last page, e.g.: KXPPELI, O., MÜLLER, M . andFiECHTER, A . , 1 9 7 8 . Chemical and structural alterations at the cell surface of Candida tropicalis, induced by hydrocarbon substrate. J . Bacterid., 183, 952—958. 5. Galley proofs will be sent to the author in duplicate. One of them should be corrected and returned to the Editor-in-Chief or to Redaktion der Zeitschrift für allgemeine Mikrobiologie, DDR-6900 Jena, Beutenbergstr. 11, as soon as possible. 6. 100 reprints of each paper are provided free of charge. Additional reprints may be purchased at cost price.

ZEITSCHRIFT FÜR ALLGEMEINE MIKRO - BIOLOGIE

HERAUSGEGEBEN VON

G. F. Gause, Moskau 0 . Hoffmann-Ostenhof, Wien A. A. Imseneckii, Moskau R. W. Kaplan, Frankfurt/M. F. Mach, Greifswald 1. Mälek, Prag C. Weibull, Lund

unter der Chefredaktion von

A N INTERNATIONAL JOURNAL ON

W. Schwartz, Braunschweig

MORPHOLOGY, PHYSIOLOGY, GENETICS,

und

AND ECOLOGY OF MICROORGANISMS

U. Taubeneck, Jena

UNTER MITARBEIT VON

J . H. Becking, Wageningen H. Böhme, Gatersleben M. Girbardt, Jena S. I. Kusnecov, Moskau 0 . Neias, Brno C. H. Oppenheimer, Port Aransas N. Pfennig, Göttingen I. L. Rabotnova, Moskau A. Schwartz, Wolfenbüttel

REDAKTION

VOLUME 2 4 • 1 9 8 4 • NUMBER 1

AKADEMIE-VERLAG BERLIN

u

-

J e n a

Die Zeitschrift f ü r allgemeine Mikrobiologie soll dazu beitragen, Forschung und internationale Zusammenarbeit auf dem Gebiet der Mikrobiologie zu fördern. Es werden Manuskripte aus allen Gebieten der allgemeinen Mikrobiologie veröffentlicht. Arbeiten über Themen aus der medizinischen, landwirtschaftlichen, technischen Mikrobiologie und aus der Taxonomie der Mikroorganismen werden ebenfalls aufgenommen, wenn sie Fragen von allgemeinem Interesse behandeln. < Zur Veröffentlichung werden angenommen: Originalmanuskripte, die in anderen Zeitschriften noch nicht veröffentlicht worden sind u n d in gleicher F o r m auch nicht in anderen Zeitschriften erscheinen werden. Der Umfang soll höchstens 1 % Druckbogen (24 Druckseiten) betragen. Bei umfangreicheren Manuskripten müssen besondere Vereinbarungen mit der Schriftleitung und dem Verlag getroffen werden. Kurze Originalmitteilungen über wesentliche, neue Forschungsergebnisse. Umfang im allgemeinen höchstens 3 Druckseiten. Kurze Originalmitteilungen werden beschleunigt veröffentlicht. Kritische Sammelberichte und Buchbesprechungen nach Vereinbarung mit der Schriftleitung. Terms of Subscription Orders for the journal can be sent — in the GBR:

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Zeitschrift für allgemeine Mikrobiologie Herausgeber: I m Auftrag des Verlages von einem internationalen Wissenschaftlerkollektiv herausgegeben. Verlag: Akademie-Verlag, DDR-1086 Berlin, Leipziger Straße 3 - 4 ; F e r n r u f : 2 2 3 6 2 2 9 oder 2 2 3 6 2 2 1 ; Telex-Nr.: 114420; B a n k : Staatsbank der D D R , Berlin, Kto.-Nr. 6836-26-20712. Chefredaktion: Prof. Dr. U D O T A U B E N E C K , Prof. Dr. W I L H E L M S C H W A R T Z Anschrift der Redaktion: Zentralinstitut f ü r Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften, DDR-6900 J e n a , Beutenbergestr. 11; Fernruf: J e n a 852200; Telex-Nr. 058621. Veröffentlicht unter der Lizenznummer 1306 des Presseamtes beim Vorsitzenden des Ministerrates der Deutschen Demokratischen Republik. Gesamtherstellung: V E B Druckerei „Thomas Müntzer", 5820 Bad Langensalza. Erscheinungsweise: Die Zeitschrift für allgemeine Mikrobiologie erscheint jährlich in einem B a n d mit 10 Heften. Bezugspreis je Band 250, — M zuzüglich Versandspesen (Preis für die D D R 200,—M). Preis je H e f t 2 5 , - M (Preis für die D D R 2 0 , - M). Urheberrecht: Alle Rechte vorbehalten, insbesondere die der Übersetzung. Kein Teil dieser Zeitschrift darf in irgendeiner Form — durch Photokopie, Mikrofilm oder irgendein anderes Verfahren — ohne schriftliche Genehmigung des Verlages reproduziert werden. — All rights reserved (including those of translations into foreign languages). No part of this issue may be reproduced in any form, by photoprint, microfilms or any other means, without written permission from the publishers.

Erscheinungste:min: Februar 1984. Bestellnummer dieses Heftes 1070/24/1. © 1984 b y Akademie-Verlag Berlin. Printed in t h e German Democratic Republik. AN (EDV) 75218

Zeitschrift für allgemeine Mikrobiologie 2 4 (1984) 1, 3 — 12

(Akademie der W i s s e n s c h a f t e n der D D R , F o r s c h u n g s z e n t r u m für Molekularbiologie und Medizin, Zentralinstitut für Mikrobiologie u n d experimentelle Therapie, J e n a , Direktor: Prof. Dr. U . TAUBEXECK)

Inducers of both cytodifferentiation and anthracycline biosynthesis of Streptomyces griseus and their occurrence in actinomycetes and other microorganisms I. ERITT, U . GRÄFE a n d W . F . FLECK

(Eingegangen

am 19. 7.

1983)

M a n y t a x o n o m i c a l l y different strains of a c t i n o m y c e t e s as well as several other procaryotic a n d eucaryotic microorganisms were s h o w n t o produce inducers of cytodifferentiation a n d anthracycline b i o s y n t h e s i s being active towards blocked m u t a n t Z I M E T 4 3 6 8 2 of Streptomyces griseus. 37 o u t of 4 0 strains of the species of S. griseus (92.5%) yielding different kinds of antibiotics were able t o induce b o t h t h e f o r m a t i o n of aerial m y c e l i u m in t h e indicator strain Z I M E T 4 3 6 8 2 c o n c o m i t a n t w i t h t h e biosynthesis of anthracycline antibiotics. 80 (26.3%) o u t of 3 0 4 strains belonging t o 94 different Streptomyces species were also producers of inducing agents. A m o n g 77 strains of a c t i n o m y c e t e s belonging t o 28 different genera being apart from Streptomyces, 12 strains displayed inducing a c t i v i t y (15.6%). The results o b t a i n e d so far support the conclusion t h a t t h e f o r m a t i o n of inducing a g e n t s w a s neither associated w i t h a particular species of Streptomyces nor its c a p a c i t y t o produce a g i v e n antibiotic. The occurrence of inducers has been observed e v e n w i t h m e m b e r s of other genera. F e w strains were capable o f i n d u c i n g o n l y o n e o f t h e differentiation-associated functions. S o m e strains of Streptomyces species produced at least t w o different kinds of inducers discernible b y their Rf values on TLC.

Microorganisms can produce low-molecular weight substances, autoregulators, or bioregulators (KHOKHLOV 1982), which can take p a r t in the regulation of cytodifferentiation and antibiotic biosynthesis as so-called triggers. Occasionally, very low concentrations of the pertinent effector molecules are secreted into the medium where they play a role as a signal affecting, for instance in streptomycetes, not only the formation of antibiotics b u t also of aerial mycelium and spores. As it has been shown by K H O K H L O V (1982) and E R I T T et al. (1982), m u t a n t s of streptomj-cetes can be isolated which are blocked in the biosynthesis of autoregulators, and being unable both to sporulate and to express other differentiation-associated functions. B u t in the presence of autoregulatory effectors as e.g. 2S-(6'-methylheptanoyl)-3S-hydroxyniethyl-4-butanolide (A-factor) (KLEINER et al. 1976) these m u t a n t strains regained their capacity to differentiate, again ( K H O K H L O V 1982, G R A F E et al. 1982b, G R A F E a n d E R I T T 1983). Recently, we demonstrated t h a t anthracycline-producing strains of Streptomyces griseus ( Z I M E T 43668 and Z I M E T 43689) can secrete a substance related in its constitution to A-factor ( G R A F E a n d E R I T T 1983), and t h a t the blocked m u t a n t Z I M E T 43 682 responded to this effector with the onset of leukaemomycin biosynthesis and formation of aerial mycelia. I n the present communication we report on the results of our screening for similar compounds among actinomycetes and other microorganisms b y the use of the above indicator m u t a n t Z I M E T 43682. The aim of this work was to answer the question: is the production of autoregulatory substances specifically related to the parental strain Z I M E T 43689 or can they also be generated by other, even taxonomically different, strains, species and genera as well. l

Zeitschrift für allgemeine Mikrobiologie 2 4 (1984) 1, 3 — 12

(Akademie der W i s s e n s c h a f t e n der D D R , F o r s c h u n g s z e n t r u m für Molekularbiologie und Medizin, Zentralinstitut für Mikrobiologie u n d experimentelle Therapie, J e n a , Direktor: Prof. Dr. U . TAUBEXECK)

Inducers of both cytodifferentiation and anthracycline biosynthesis of Streptomyces griseus and their occurrence in actinomycetes and other microorganisms I. ERITT, U . GRÄFE a n d W . F . FLECK

(Eingegangen

am 19. 7.

1983)

M a n y t a x o n o m i c a l l y different strains of a c t i n o m y c e t e s as well as several other procaryotic a n d eucaryotic microorganisms were s h o w n t o produce inducers of cytodifferentiation a n d anthracycline b i o s y n t h e s i s being active towards blocked m u t a n t Z I M E T 4 3 6 8 2 of Streptomyces griseus. 37 o u t of 4 0 strains of the species of S. griseus (92.5%) yielding different kinds of antibiotics were able t o induce b o t h t h e f o r m a t i o n of aerial m y c e l i u m in t h e indicator strain Z I M E T 4 3 6 8 2 c o n c o m i t a n t w i t h t h e biosynthesis of anthracycline antibiotics. 80 (26.3%) o u t of 3 0 4 strains belonging t o 94 different Streptomyces species were also producers of inducing agents. A m o n g 77 strains of a c t i n o m y c e t e s belonging t o 28 different genera being apart from Streptomyces, 12 strains displayed inducing a c t i v i t y (15.6%). The results o b t a i n e d so far support the conclusion t h a t t h e f o r m a t i o n of inducing a g e n t s w a s neither associated w i t h a particular species of Streptomyces nor its c a p a c i t y t o produce a g i v e n antibiotic. The occurrence of inducers has been observed e v e n w i t h m e m b e r s of other genera. F e w strains were capable o f i n d u c i n g o n l y o n e o f t h e differentiation-associated functions. S o m e strains of Streptomyces species produced at least t w o different kinds of inducers discernible b y their Rf values on TLC.

Microorganisms can produce low-molecular weight substances, autoregulators, or bioregulators (KHOKHLOV 1982), which can take p a r t in the regulation of cytodifferentiation and antibiotic biosynthesis as so-called triggers. Occasionally, very low concentrations of the pertinent effector molecules are secreted into the medium where they play a role as a signal affecting, for instance in streptomycetes, not only the formation of antibiotics b u t also of aerial mycelium and spores. As it has been shown by K H O K H L O V (1982) and E R I T T et al. (1982), m u t a n t s of streptomj-cetes can be isolated which are blocked in the biosynthesis of autoregulators, and being unable both to sporulate and to express other differentiation-associated functions. B u t in the presence of autoregulatory effectors as e.g. 2S-(6'-methylheptanoyl)-3S-hydroxyniethyl-4-butanolide (A-factor) (KLEINER et al. 1976) these m u t a n t strains regained their capacity to differentiate, again ( K H O K H L O V 1982, G R A F E et al. 1982b, G R A F E a n d E R I T T 1983). Recently, we demonstrated t h a t anthracycline-producing strains of Streptomyces griseus ( Z I M E T 43668 and Z I M E T 43689) can secrete a substance related in its constitution to A-factor ( G R A F E a n d E R I T T 1983), and t h a t the blocked m u t a n t Z I M E T 43 682 responded to this effector with the onset of leukaemomycin biosynthesis and formation of aerial mycelia. I n the present communication we report on the results of our screening for similar compounds among actinomycetes and other microorganisms b y the use of the above indicator m u t a n t Z I M E T 43682. The aim of this work was to answer the question: is the production of autoregulatory substances specifically related to the parental strain Z I M E T 43689 or can they also be generated by other, even taxonomically different, strains, species and genera as well. l

4

I . ERITT, U . GRAFE a n d W . F . FLECK

Materials and m e t h o d s Microorganisms: The indicator strain used in this study was the prototrophic m u t a n t ZIMET 43682 of Streptomyces griseus (identical with IMET J A 5142/86 A m y - Lkm~) obtained by the combined use of UV-, X-rays and NTG (ERITT et al. 1982) from the parenta strain ZIMEP 43689 of Streptomyces griseus (Amy+ Lkm+) ( F L E C K and S T R A U S S 1975). All the other strains of actinomycetes and different microorganisms are deposited in the culture collection of the Central Institute of Microbiology and Experimental Therapy Jena (GDR). Cultivation, propagation and analytical procedure: S. griseus ZIMET 43682 was maintained on oatmeal agar. Due to the genetic instability, permanent selection of those clones was necessary possessing suitable properties as an indicator for 2,3-disubstituted butyrolactones (so-called L-factors: Leukaemomycin-inducing factors). Propagation and cultivation on surface layers of agar have been described (ERITT et al. 1982). Strains marked in the tables with an asterisk were cultivated in submerged fermentations by the use of a medium composed as follows (g • l - 1 ) : glucose 30, soya meal 10, NaCl 3, FeCl 3 • 6 H 2 0 5, CaC0 3 3 in t a p water (pH 7.3 at 29 °C for 96 hours). The culture broth was extracted with CHC13, samples of the residue of the evaporated extracts were applied to silica gel sheets (Silufol, Kavalier/CSSR) and run in CHCl 3 /methanol (95:5, v/v). TLC-plates were placed with the layer side on an agar inoculated with the indicator m u t a n t ZIMET 43682 as described by E R I T T et al. (1982). Rf-values were determined in bioautograms indicating halos of aerial mycelia and pigmented zones around the area of bioactive material.

Results Occurrence of inducers myces griseus

of anthracycline

biosynthesis

among

different

strains

of

Strepto-

Our first efforts were directed to the d e t e c t i o n of inducers of anthracycline b i o s y n t h e s i s a n d c y t o d i f f e r e n t i a t i o n of S. griseus Z I M E T 4 3 6 8 2 a m o n g other m e m b e r s of the species S. griseus. I n searching for inducing m e t a b o l i t e s , 42 strains were chosen w h i c h produced different k i n d s of antibiotics as e.g. grisein, s t r e p t o m y c i n , nonactin, strepto-

A

B

C

C) Strains of different genera (inl2 of 77 tested)

Bioregulators in microorganisms

5

cin, leukaemomycin a.o. (Tabl. 1). All strains tested so far were able to form aerial mycelium on outmeal agar. 39 of them showed antibiotic activity against Bacillus subtilis ATCC 6633, and 30 strains excreted a soluble pigment into the agar. 37 out of 40 strains of S. griseus (92.5%) showed inducing activity both on the formation of aerial mycelium and leukaemomycin biosynthesis of the indicator strain. The results of these studies are presented in Tables 1 and 5 (Fig. 1). Table 1 Induction of aerial mycelium formation and leukaemomycin biosynthesis in the blocked m u t a n t S. griseus ZIMET 4 3 6 8 2 ( A m y - , L k m - ) r ) by different strains of S. griseus Strain

Produced antibiotic

I M E T J A 1787 I M E T J A 3933 I M E T 40211 ATCC 10137 ATCC 10971 I M E T J A 4760 I M E T J A 5570 I M E T J A 5584 I M E T J A 5142 I M E T J A 10086 I M E T J A 4617 2 ) H - 4 5 3) H - 5 2 3)

Grisein Leukaemomycin Grisein Streptomycin Streptocin Streptomycin Leukaemomycin Nonactin Leukaemomycin Daunorubicin undefined (Factor C) Streptomycin

Induction of Lkm 1 ) Amy 1 )

_

+++ (+) +++ +++

^

_

+

+

+++ +++

—

—

++ +

+++

++

-f+ +

-f+ + -f+ +

—

—

+ + ++ +

+ + ++ +

+ +

!

) A m y = Aerial mycelium; Lkm = Leukaemomycin biosynthesis ) The following strains from type I M E T J A 4617 possessing detectable antibiotic activity of one ore more undefined antibiotics were also able to induce A m y and Lkm in the indicator mutant ZIMET 4 3 6 8 2 : I M E T : 40208, 4 0 2 1 0 , 4 0 2 1 4 , 40222, 40293, 40294, 40295, 40296, 40297, 40305, 40306, 4 0 3 0 8 , 40309. 4 0 3 1 0 , 40313, 40307, 40314. 4 0 3 1 5 J A ' 4 3 8 6 . J A 4697, J A 4758, J A 4759, J A 8975, J A 7991 ATCC 11429 3 ) Provided b y Prof. G. SZABO, Debrecen/Hungary 2

However, 3 strains of 8. griseus were found to be devoid of any inducing activity towards the indicator mutant ZIMET 43682. It is a remarkable fact that e.g. S. griseus H-45, well-known for the production of another differentiation-inducing factor (factor C, SZABO et al. 1967), did not produce detectable amounts of an inducer with activity towards the anthracycline-blocked mutant ZIMET 43682. As far as the streptomycin-producing strains of S. griseus are concerned, with the exception of strain IMET JA 4760 most of them yielded inducers too. The latter finding is in accord with EFREMENKOVA et al. (1981) which also failed to detect the A-factor in some streptomycin-producing strains obtained as secondary mutants from A-factor-deficient strains. Occurrence of inducers among different species of streptomycetes Apart from S. griseus, 304 strains of other Streptomyces species were proved to be producers of inducing agents. 168 of these strains (Table 5) belonged to 94 different species according to "The Approved Lists of Bacterial Names" 1980. Furthermore, 136 strains with unknown taxonomical classification were checked (not recorded in the "Approved Lists"). 80 strains out of the total sum of 304 tested (26.3%) were

6

I. Eritt, U. Grafe and W. F. Fleck

Table 2 a Induction of Amy and Lkm in the blocked mutant ZIMET 43682 by different strains and species of the genera Streptomyces Species

Strain-No.

Induction of: Amy Lkm

S. acrimycini 8. albus

IMET 40159 ATCC3005 IMET J A 3453 ISP 5313, ATCC 3551, \ ATCC 3004, ATCC 3006 J IMET JA 4927 ATCC 3307 ATCC 10382 IMET J A 9089 IMET JA 4438, ATCC 8663 IMET JA 4817 IMET JA 8031 IMET JA 4578 ISP 5058, IMET JA 2640 IMET JA 10096 IMET 40229 ATCC 3313 IMET JA 1449 IMET 41332 ATCC 10147, ATCC 3355 ATCC 3355 IMET: 41670, 41669, JA 2 368 ) JA 2417, JA 2535, JA 2701, ^ JA 3019 J IMET 40147 ATCC 19746 IMET JA 10081 IMET 40276 ATCC 11635 IMET JA 2629 ATCC 3319 IMET JA 4812 IMET 41338, IMET 40287 IMET 40288, IMET JA 4601, 1 IMET JA 4811 J IMET JA 8011 IMET 41404 IMET JA 4793 IMET JA 4808 IMET JA 4649 IMET JA 4847 IMET 40341 IMET 40342 IMET 40338 ATCC 13231 IMET 40348 IMET JA 8012 IMET JA 4655 IMET JA 3616 ATCC 12434 ATCC 3338 IMET JA 5068 IMET 40135 ATCC 19926 IMET JA 4842 IMET JA 4846 IMET JA 40381

+ + + + + +

8. ambofaciens 8. anulatus S. antibioticus S. badius S. bikiniensis 8. bobili 8. , S. cellulosae 8. chrysomallus 8. coelicolor

S. S. S. 8.

cremeus cyaneofuscatus diastatoehromogenes erythraeus

8. flaveolus 8. globisporus

S. gobitricini 8. S. S. S.

lateritius lipmanii litmocidini luteolutescens

S. S. S. S.

longisporoflavus microflavus novaecaesareae olivochromogenes

8. parvullus 8. 8. S. 8. 8. 8. S.

phaeochromogenes roseoflavus roseoviolaceus rubiginosohelvolus variabilis violaceorectus viridochromogenes

— + + + (+) -

+ + + + + + —

(+) (+) +++ + +++ (+) + — + + + + + + + + + + + + + + + + + — (+ ) + + + + + + + + +

+ + + +

++ |

+ +

++ +++ ++

7

Bioregulators in microorganisms

Table 2 b Strains of different streptomycetes species without any capacity to induce both Amy and Lkm of ZIMET 43682 S. S. S. 8. 8. S.

8. 8. 8. 8. S. 8. 8. S. 8. S. 8. S. 8. 8. S. S. 8. 8. S. 8. 8. 8. 8. S. 8. 8.

albidoflavus IMET 40457 albosporeus IMET 40453 albovinaceus IMET J A 4 8 2 3 atroolivaceus IMET J A 4 8 3 2 aurantiacus IMET 40251 aureofaciens IMET J A 4178 IMET J A 4179, IMET J A 4343, IMET J A 4571, IMET J A 4695,

IMET JA 4764, IMET JA 8030, IMET JA 9087, IMET JA 9088, IMET JA 20979, IMET 40255 cacaoi ATCC 3082 chromofuscus IMET 40171 coeruleofuscus IMET 40156 coerulescens ATCC 19742 daghestanicus IMET J A 4 8 0 3 diastaticus ATCC 3315 echinatus ATCC 19748 endus IMET J A 4029 felleus I M E N T 40452 flavidovirens IMET J A 4 8 1 4 flavotricini IMET J A 4 7 9 8 flavovirens ATCC 3320 fluorrescens IMET 41335 fumanus IMET J A 4 8 0 4 gelaticus ATCC 3 3 2 3 gibsonii ATCC 6852 glaucescens IMET J A 4 8 2 5 gougerotii ATCC 10975 griseoflavus IMET J A 3733,

IMET J A 10124 griseomycini IMET JA 4 8 3 0 griseorubens IMET JA 4 8 3 3 griseoruber IMET J A 4 8 4 8 griseorubiginosus IMET J A 4 8 4 9 griseostramineus IMET J A 4 8 3 6 halstedii ATCC 10897 hygroscopicus IMET 40324

IMET 43106

S. 8. 8. S. S.

intermedius ATCC 3329 ipomoea ATCC 11747 janthinus IMET 41333 kurssanovii IMET JA 4837 lavendulae IMET JA 2250, ATCC 14158, ATCC 14159, ATCC 8664

S. 8. 8. 8. 8. 8.

mutabilis IMET J A 4840 nigrescens IMET J A 4 8 3 4 noursei IMET J A 3890 odorifer ATCC 6246 olivaceoviridis IMET J A 4839 olivaceus ATCC 3335, ATCC 11626, IMET J A 4449, IMET J A 5203, IMET J A 9303, IMET J A 11296 S. purpurascens IMET J A 6686 S. rimosus ATCC 10970, IMET J A 4671, IMET J A 4673, IMET J A 4674, IMET J A 4675, IMET J A 4676, IMET J A 4763, IMET J A 11295 S. rochei ATCC 10739, IMET 43107, IMET J A 4265, IMET J A 4677 S. roseolilacinus IMET J A 4 7 9 4 8. roseolus IMET 40123 8. roseviridis IMET J A 4802 8. rubiginosus ATCC 19927 8. rutgersensis ATCC 3 3 5 0 S. sulphureus ATCC 30070 8. umbrinus IMET J A 4 8 0 5 S. venezuelae IMET 40220, IMET 41407, IMET 40127, IMET J A 3755, IMET J A 4206, IMET JA 4429, IMET J A 4430, IMET JA 4527, IMET J A 4528 8. violaceoniger IMET J A 10095 8. violaceoruber IMET JA 2861 8. violaceus IMET JA 6844 8. violascens IMET J A 4796 S. virginiae IMET J A 5288, IMET J A 9768

able to synthesize inducers of leukaemomycin biosynthesis, of aerial mycelium and spores being active towards the indicator m u t a n t S. griseus Z I M E T 43682 (Fig. 2). 45 strains out of 80 producers of inducers belonged to 34 species of the genera Streptomyces. I n some cases, several strains of the same species showed a different behaviour in our screening test (Table 2 a) suggesting t h a t the production of inducing metabolites m a y be rather a characteristic of a given strain t h a n the sign of a particular species (see c.f. H A R A and B E P P U 1982). Normally, both the production of leukaemomycin and aerial mycelium was provoked simultaneously, b u t some few strains (S. albus, I M E T J A 3453, S. variabilis I M E T J A 4842) were capable of inducing only one of these differentiation-associated functions (Fig. 2). This m a y be due to either the low q u a n t i t y of the produced inducers or the concomitant secretion of specific inhibitors which antagonized the effect of the former on both the secondary metabolism and morphological differentiation. However, extracts of surface cultures of

8

I . E E I T T , U . G R Ä F E a n d W . F . FLECK.

Table 3 Antibiotics produced by strains of different streptomycetes species with or without capacity to induce Amy and Lkm in the indicator IMET 43682 Antibiotics of positive strains 1 )

Antibiotics of negative strains 2 )

Actinomycin Albomycin Antimycin

Actinomycin Angustmycin Aureovocin

Oligomycin OTC Sideromycin

Flavofungin Flavomycin Grisein Griseorhodin Leukaemomycin Moenomycin Netropsin Nonactin Prasinomycin Sideromycin Spiramycin Streptocin Streptomycin Trypanomycin Vinacetin Viomycin

Antimycin Borrelidin Cephamycin Chloramphenicol Chloromycetin Chlortetracyclin Cinnamycin Distamycin Echinomycin Erythromycin Fervenulin Fungichromin Granaticin Grisein Netropsin Nourseothricin

Streptomycin Streptothricin Streptovirudin Tetracyclin Violamycin Viomycin Zaomycin

') Positive strains induced Amy and/or Lkm '-') Negative strains cannot induce Amy and Lkm Table 4 Strains and species of different genera of bacteria, actinomycetes and fungi with or without capacity to induce Amy and Lkm in the indicator ZIMET 43682 Strains with Amy/Lkm-inducing activity 1 ): Bacillus globifer OH ll 2 ), Coryneba-cterium citreum IMET 10288 2 ), Nocardia asteroides IMET 7 020 2 ), Nocardia rugosa IMET 7289'2), Pseudomonas spec. B7, Rhodococcus bronchialis IMET 7420, Rhodococcus coprophilus IMET 7483, Rhodococcus erythropolis IMET 7462, Rhodococcus rhodnii IMET 7464, Rhodococcus ruber IMET 7309, Rhodococcus rubropertinctus IMET 7469 Fusarium spec. CSP 244 B Strain without Amy/Lkm-inducing activity 3 ): Arthrobacter (9), Bacillus (3), Brevibacterium (5), Cellulomonas (3), Corynebacterium (9), Escherichia (1), Mycobacterium (9), Nocardia (6), Nocardioides (1), Rhodococcus (4), Absidia (1), Acremonium (2), Aspergillus (1), Beauveria (1), Cephalosporium (2), Emericellopsis (2), Fusarium (1), Oliocladium (1), Oidiodendron (1), Penicillium (1), Rhinocladiella (1), Verticillium (1) ') There are difficulties to reproduce screening phenomena continually 2 ) Names are not validly published or recorded in "The Approved Lists of Bacterial Names", 1980 ) Number of tested strains is represented in parenthesis

3

S. albus I M E T J A 3453 induced the f o r m a t i o n of aerial m y c e l i u m b u t n o t t h a t of l e u k a e m o m y c i n . Another e x a m p l e for special conditions under w h i c h the p r o d u c t i o n of inducers occurred has b e e n provided b y 8. luteolutescens I M E T 4 0 3 4 1 which showed inducing a c t i v i t y s o l e l y in surface cultures. A s s h o w n in Fig. 3 for 8. bikiniensis I M E T J A 8031, m a n y s t r e p t o m y c e t e s p r o d u c e d at least t w o different k i n d s of inducers separated b y their R t v a l u e s o n TLC-plates.

Bioregulators in microorganisms

9

Table 5 Totality of strains, species, and genera tested with or without Amy/Lkm-inducing activity towards the indicator m u t a n t ZIMET 43682 Strains Number/Species Genera

Strains tested

Active strains

Inactive strains

No.

%

No.

%

No.

%

40/Strains of 8. griseus

40

100

37

92.5

3

7.5

94/Species of Streptomyces1)

304

100

80

26.3

224

73.7

77

100

12

15.6

65

84.4

28/Genera of bacteria, actinomycetes, fungi 2 ) ') Without S. griseus -') Without Streptomyces

Fig. 2. Screening for metabolites of microbial origin with Amy/Lkm-inducing activity towards the indicator mutant ZIMET 43682 of S. griseus-. Oatmeal agar strips with cosynthetie pairs of screening strains (below) and the indicator (above) were placed on a lawn of Bacillus subtilis ATCC 6633 after incubation for 4 days. Inhibition zones around the indicator and white areas of aerial mycelium indicated the formation of leukaemomycin (Lkm) and aerial mycelium (Amy) caused by Amy/Lkm-inducing agents of screening strains in the indicator (Amy - Lkm"). A) Production of both leukaemomycin and aerial mycelium induced by the streptomycin-blocked a n d n o n - s p o r u l a t i n g L M l - m u t a n t o f S. griseus

( A m y " S t r " , ROTH et al.

1982).

B) Induction of leukaemomycin biosynthesis but without induction of aerial mycelium by S. variabilis IMET J A 4842 (Amy+, producer of an unidentified antibiotic). C) Induction of aerial mycelium by S. albus IMET J A 3453 (Amy+, producer of an unidentified antibiotic). No induction of leukaemomycin biosynthesis in the indicator strain ZIMET 43682 was observed. D) Induction of both the leukaemomycin biosynthesis and formation of spores by Bhodococcus coprophilus IMET 7483 F r o m o u r p r e c e e d i n g r e s u l t s it a p p e a r s l i k e l y t h a t e f f e c t o r s w i t h R f a p p r o x . 0.5 p o s s e s s e d a s i m i l a r s t r u c t u r e a s A - f a c t o r ( K H O K H L O V 1982) w i t h a L ' - c a r b o n y l g r o u p in t h e i r side c h a i n while t h o s e w i t h R t a p p r o x . 0 . 2 5 r e p r e s e n t e d 2 - ( c o ' - m e t h y l - a l k a n o l l ' - y l ) - 3 - h y d r o x y m e t h y l - 4 - b u t a n o l i d e ( G R A F E et al. 1 9 8 2 a , 1 9 8 2 b , 1 9 8 3 a , 1 9 8 3 b ,

I. ERITT, U. GHAFE and W. F . FLECK

10

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Fig. 3. Bioautographical development of a TLC-strip on agar test plates inoculated for 3 days with the indicator mutant ZIMET 43682 of 8. griseus (Amy - Lkm~). The culture broth of S. bikiniensis I M E T J A 8031 produced two different kinds of inducers distinguished by their R F values on TLC-bioautograms at 0.25 and 0.5. Samples of the residue of the evaporated CHCl 3 -extracts were applied to a silica gelstrip and run in CHCl 3 /methanol (95:5, v/v). TLC-strips were placed on indicator test plates as described by ERITT et al. (1982) GRAFE a n d ERITT 1 9 8 3 ) . S e v e r a l k i n d s of s t r e p t o m y c e t e s a s e.g. S.

viridochromogenes

ZIMET 43683 and S. cyaneofuscatus ZIMET 43 684 formed only effectors belonging to the latter type of structure while others, for instance S. griseus ZIMET 43689, generated the pertinent l'-keto derivatives. In order to elucidate the possible correlations between the capacity of the screening strains to synthesize particular antibiotics, on the one hand, and the secretion of stimulators of differentiation on the other, strains of several Streptomyces species were checked. The results demonstrated that inducers of cytodifferentiation of blocked mutant ZIMET 43682 can be produced not only by the parental strain ZIMET 43689 and other representatives of the species S. griseus but also by a wide variety of others, even taxonomically different, streptomycetes. Apparently, there existed no correlation between the capacity of these strains to produce the inducer molecules and the formation of secondary metabolites (Table 3). Thus, producers of antibiotics e.g. actinomycin, antimycin, grisein and streptomycin can be found among strains which do not generate the inducers as well as among those secreting these agents. Therefore, the results are compatible with the idea that, indeed, the production of inducers (L-factors) will not be connected with the formation of a given antibiotic. 77 strains belonging to 28 different other genera were also tested. 65 of them (84.4%) were inactive towards the indicator mutant ZIMET 43682, but 12 strains displayed inducing activity (Table 4). It should be noted that the stimulatory effect of these microorganisms was comparably lower than observed with streptomycetes. However, surface cultures of Rhodococcus rhodnii IMET 7464 and Rhodococcus erythropolis I M E T 7462 displayed significant activity. It is worth mentioning at this point that

11

Bioregulators in microorganisms

these strains and others tested so far cannot produce antibiotics and/or aerial mycelium during their life cycle.

Discussion The results presented in this s t u d y are consistant with following conclusions: The production of inducers of cytodifferentiation of the blocked m u t a n t Z I M E T 43682 of anthracycline-producing S. griseus will occur independent on b o t h a particular species of Streptomyces, the production of a given antibiotic, a n d can be observed even with members of other genera. Obviously, representatives of the same species of streptomycetes producing different kinds of antibiotics can secrete these effectors in the same m a n n e r as different species of streptomycetes do. At the present s t a t e of knowledge, it cannort be excluded t h a t the production of all these effectors might be of importance in the regulation of the cytodifferentiation of m a n y of these microorganisms. I t seems likely t h a t the regulatory impact of inducers as 2S-(6'-methylheptanoyl)-3S-hydroxymethyl-4-butanolide (A-factor, K H O K LOV 1982) does not concern the expression of a particular p a t h w a y of the secondary metabolism. Thus, this compound a n d related structures ( G K A F E et al. 1982b, 1983a) have been shown to afford b o t h the biosynthesis of streptomycin a n d anthracyclines b y the p e r t i n e n t blocked m u t a n t s of 8. griseus ( E B I T T et al. 1982). Otherwise, some m u t a n t s were isolated producing these antibiotics even in the absence of the above mentioned inducer a n d its derivatives ( E F B E M E N K O V A et al. 1981, H A R A a n d B E P P U 1982). The induction b y autoregulatory effectors of anthracycline biosynthesis a n d conc o m i t a n t morphological changes in the course of b o t h surface a n d submerged cultivations can be readily explained b y t h e trigger f u n c t i o n which these effectors of blocked m u t a n t Z I M E T 43692 possess in t h e expression of a particular w a y of differentiation. This explanation includes the possibility t h a t the autoregulators are r a t h e r needed as to switch on particular steps within the developmental cycle t h a n to enable the f o r m a t i o n of a special antibiotic. Acknowledgements W e t h a n k Prof. G. u s w i t h S. griseus SchuTZE a n d Mrs. culture collection. acknowledged.

SZABO ( I n s t i t u t e of Biology, Medical School, Debrecen, H u n g a r y ) for providing strains H - 5 2 and H - 4 5 . Our t h a n k s are also due t o Dr. H. PRAUSER, Miss B . E . WOITZEK for helpful discussions a n d the donation of strains from the I M E T Technical assistance of Mrs. E . WERTHER and Mrs. R . SCHUMANN is greatly

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12

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SZABO, G . , V A L Y I - N A G Y ,

Mailing address: I. ERITT Zentralinstitut f ü r Mikrobiologie u n d experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften, DDR-6900 J e n a , Beuthenbergstr. 11

Zeitschrift fur allgemeine Mikrobiologie 24 (1984) 1, 1 3 - 1 9

(Akademie der Wissenschaften der D D R , Forschungszentrum fiir Molekularbiologie und Medizin, Zentralinstitut fiir Mikrobiologie und experimentelle Therapie, Jena, Direktor: Prof. Dr. rer. nat. h a b i l . U . TAUBENECK)

Isolation and biological properties of arsenate-resistant strains noursei of Streptomyces W . FBIEDEICH, E . J . BORMANN a n d U . GRAFE

(Eingegangen

am 27. 5. 1983J

Arsenate-resistant (As 11 ) clones were obtained with high frequency from colony populations of streptothricin-producing strains of Streptomyces noursei by the paper strip method. Whereas in the As K -strains obtained from both wild type and mutant NG 13 the antibiotic production was reduced to approx. 60% of the parental level, the As" clones isolated from colony populations of mutant U V 12 displayed increased productivity (£=150%). However, their improved capacity to produce streptothricins was lost rapidly after repeated cell propagation in submerged cultures, suggesting that unstable genetic elements were involved in enabling S. noursei to grow in the presence of toxic concentrations of arsenate.

Many reports on antibiotic fermentations attest that excessive supply with inorganic phosphate suppresses the production of secondary metabolites of streptomycetes and Penicillium species (DEMAIN 1982). Therefore, most fermentations of antibiotics require the addition of inorganic phosphate in growth-limiting amounts, if high y i e l d s a r e t o b e o b t a i n e d (MARTIN 1978, INOUE et al. 1982, OMURA et al. 1981).

The molecular mechanism of the so-called 'phosphate effect' appears to be complex and may also depend on the particular microorganism (MARTIN 1977). Among the possible mechanisms are the inhibition and repression of the antibiotic-specific p a t h w a y as well as interference with the energy metabolism and the system of prec u r s o r g e n e r a t i o n (MARTIN a n d DEMAIN 1976).

In order to release antibiotic fermentations from the regulation b y inorganic phosphate, efforts have been mainly directed to the control of the phosphate pool in the medium. Recent results show that m u t a n t s deregulated in their response to inorganic phosphate can be obtained from the candicidine-producing Streptomyces griseus by either the conventional screening techniques or selection of arsenateresistant (As11) strains (MARTIN etal. 1979, NAHARRO et al. 1981). Because corresponding data for other antibiotic-producing streptomycetes are missing, the general value of the latter methods for the isolation of superior producers of antibiotics cannot be assessed. In the present work, we report on the isolation and some properties of arsenateresistant strains of Streptomyces noursei, a microorganism producing streptothricint y p e a n t i b i o t i c s (BRADLER a n d THRUM 1963).

Materials and methods Strains: Streptomyces noursei JA 3890b (BRADLER and THRUM 1963) was received from the culture collection of the Central Institute of Microbiology and Experimental Therapy, Jena. Mutant strains U V 12 and NG 13 were obtained by random selection for high antibiotic activity after using U V light and nitrosomethyl guanidine, respectively, as mutagens. The latter strains showed a 2—3 fold higher capacity to produce streptothricins (nourseothricin) than the parental strain.

Zeitschrift fur allgemeine Mikrobiologie 24 (1984) 1, 1 3 - 1 9

(Akademie der Wissenschaften der D D R , Forschungszentrum fiir Molekularbiologie und Medizin, Zentralinstitut fiir Mikrobiologie und experimentelle Therapie, Jena, Direktor: Prof. Dr. rer. nat. h a b i l . U . TAUBENECK)

Isolation and biological properties of arsenate-resistant strains noursei of Streptomyces W . FBIEDEICH, E . J . BORMANN a n d U . GRAFE

(Eingegangen

am 27. 5. 1983J

Arsenate-resistant (As 11 ) clones were obtained with high frequency from colony populations of streptothricin-producing strains of Streptomyces noursei by the paper strip method. Whereas in the As K -strains obtained from both wild type and mutant NG 13 the antibiotic production was reduced to approx. 60% of the parental level, the As" clones isolated from colony populations of mutant U V 12 displayed increased productivity (£=150%). However, their improved capacity to produce streptothricins was lost rapidly after repeated cell propagation in submerged cultures, suggesting that unstable genetic elements were involved in enabling S. noursei to grow in the presence of toxic concentrations of arsenate.

Many reports on antibiotic fermentations attest that excessive supply with inorganic phosphate suppresses the production of secondary metabolites of streptomycetes and Penicillium species (DEMAIN 1982). Therefore, most fermentations of antibiotics require the addition of inorganic phosphate in growth-limiting amounts, if high y i e l d s a r e t o b e o b t a i n e d (MARTIN 1978, INOUE et al. 1982, OMURA et al. 1981).

The molecular mechanism of the so-called 'phosphate effect' appears to be complex and may also depend on the particular microorganism (MARTIN 1977). Among the possible mechanisms are the inhibition and repression of the antibiotic-specific p a t h w a y as well as interference with the energy metabolism and the system of prec u r s o r g e n e r a t i o n (MARTIN a n d DEMAIN 1976).

In order to release antibiotic fermentations from the regulation b y inorganic phosphate, efforts have been mainly directed to the control of the phosphate pool in the medium. Recent results show that m u t a n t s deregulated in their response to inorganic phosphate can be obtained from the candicidine-producing Streptomyces griseus by either the conventional screening techniques or selection of arsenateresistant (As11) strains (MARTIN etal. 1979, NAHARRO et al. 1981). Because corresponding data for other antibiotic-producing streptomycetes are missing, the general value of the latter methods for the isolation of superior producers of antibiotics cannot be assessed. In the present work, we report on the isolation and some properties of arsenateresistant strains of Streptomyces noursei, a microorganism producing streptothricint y p e a n t i b i o t i c s (BRADLER a n d THRUM 1963).

Materials and methods Strains: Streptomyces noursei JA 3890b (BRADLER and THRUM 1963) was received from the culture collection of the Central Institute of Microbiology and Experimental Therapy, Jena. Mutant strains U V 12 and NG 13 were obtained by random selection for high antibiotic activity after using U V light and nitrosomethyl guanidine, respectively, as mutagens. The latter strains showed a 2—3 fold higher capacity to produce streptothricins (nourseothricin) than the parental strain.

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W . F R I E D R I C H , E . J . BORMANN a n d U . GRAFE

Media a n d growth conditions: The solid media used were AL 53 medium a n d D B agar containing (g • l" 1 ): A L 5 3 : dextrin (15.0), saccharose (3.0), yeast extract (1.0), peptone (5.0), urea (0.1), NaCl (0.5), K H 2 P 0 4 (0.5), F e S 0 4 (0.01), Bacto easaminoacids (6.0), agar (13.0) in aqua dest,; p H 6.5—7.0 (prior t o sterilization). I n special experiments, t h e phosphate was omitted. D B a g a r : p o t a t o starch (10.0), glucose (10.0), soja meal (3.5), (NH 4 ),S0 4 (3.5), MgS0 4 • 7 H 2 0 (0.7), JvaCl (0.35), CaC0 3 (2.0), ZnS0 4 (0.15), D I F C O agar (40.0) ; p H 6 . 0 - 6 . 2 (prior t o sterilization). For submerged cultivations a modified precultivation medium (A1 2g; G R A F E et al. 1974) was used which contained (g • l" 1 ): glucose (15.0), soja meal (15.0), K H 2 P 0 4 (0.3), XaCl (5.0), CaC0 3 (1.0); p H 6.5—0.9 (prior to sterilization). Strains t o be examined for their m a x i m u m capacity to produce streptothricins were grown in a s t a n d a r d medium containing glucose, soja meal, a n d inorganic salts (BOCKER et al., unpublished). Surface cultivations: Petri dishes (150 m m diameter) were filled with 40 ml of solidified AL 53 medium. All cultivations were s t a r t e d from spores harvested from surface cultures t h a t h a d been grown for 10 days on the same medium. 0.1 ml of a suspension of spores was spread on t h e agar surface a n d incubation was for 10 days at 29 °C. At zero time, wet paper strips (SCHLEICHER & S C H U L L 2043b, Kassel, F.R.G., 1 X 10 cm) soaked with 0.1 ml of a 1.5 M solution of N a 2 H A s 0 4 • 7 H 2 0 (MERCK/Darmstadt) were applied on the surface of appropriate agar plates. S u b s t r a t e effects were tested b y adding, a t zero time, solutions of casamino acids, K H 2 P 0 4 or glucose a t different concentrations t o wells (9 m m diameter) punched into the diffusion zone near the p a p e r strip. Arsenate-resistant clones able to grow within t h e zone of inhibition, were transferred to fresh Al 53 medium a n d incubated for 10 d a y s at 29 °C. The single As' ! colonies from surface cultures were used to inoculate Al 2 g medium. After 48 h of incubation at 29 °C. 1 ml of each culture was added t o 20 ml of the s t a n d a r d medium. All submerged cultivations were carried out at 29 °C in 100 ml flask containing 20 ml medium on a rotary shaker (240 r.p.m.). Antibiotic concentration was assayed by the agar plate diffusion test with Bacillus subtilis ATCC 6633 as indicator organism a n d a u t o m a t e d estimation of the inhibition zones ( M U H L I G et al. 1 9 8 2 ) . In order to minimize t h e experimental error, in each experiment 18 cultures were checked in parallel.

Results and discussion Fig. 1 shows that during surface cultivation using the paper strip method strains can be obtained from colony populations of both wild type Streptomyces noursei JA 3890 b and its mutant UV 12 which are resistant to growth inhibition by arsenate ions. We failed to select arsenate-resistant clones from strain XG 13 under these conditions (Fig. l c ) , because the whole population was already resistant. However, NG 13 grown in the absence of phosphate, was inhibited by arsenate and yielded As11 clones (Fig. Id). This suggests that high phosphate concentrations can circumvent the toxic effects of arsenate on S. noursei. Using the wild type strains and mutant UV 12, we were able to show that excess of inorganic phosphate antagonized the inhibitory effect of arsenate on the development of colonies as well. The As R clones derived from strains JA 3890b, UV 12, and NG 13 were heterogeneous with respect to their size, shape, and capacity to form aerial mycelium. In general, the largest colonies showed good sporulation behaviour. In order to test their capacity to produce streptothricin antibiotics, mycelium samples were used to start submerged cultivations. Table 1 shows that As E strains exhibiting improved biosynthesis of streptothricins were obtained only from strain UV 12. Superior producers showed antibiotic yields increased by up to 150%. In contrast, the As R isolates from the parental strain JA 3890b and NG 13 displayed a lower capacity to produce antibiotic than the average of the parental population. This suggests that selection of arsenate-resistant mutants being less sensitive to phosphate control of secondary metabolism may yield antibiotic overproducing strains only if there are no other limiting cellular factors.

15

Arsenate-resistant strains of S. noursei

Fig. 1. Selection of arsenate-resistant ( A s a ) clones of Streptomyces noursei J A 3890b and its mutant strains on A L 53 agar medium by means of the paper strip method. a) wild-type strain J A 3890b; b) strain U V 12; c) strain N G 13; d) strain N G 13 on A1 53 medium lacking phosphate

Table 1 Streptothricin production by the indicated strains in submerged cultures grown from single colonies in standard medium, (n: number of tested colonies; A s R : arsenate resistant strains) strain

n

mean value ( % )

deviation ( % )

JA JA UV UV NG NG

18 18 53 51 18 22

100 60.5 172.4 261.5 244.8 155.4

-t20.0 ±37.5 ±13.0 ±40.0 ±24.4 ±25.8

3890b 3890 b-As® 12 12-13-AsR 13 13-14-AsR

16

W . FRIEDRICH, E . J . BORMANN a n d U . G R À F E

I n a f u r t h e r experiment, we compared the inhibitory effect of inorganic phosphate on antibiotic biosynthesis during growth of the strains on standard medium. As demonstrated in Fig. 2, the production of streptothricins was particularly affected by PO^- ( > 1 5 m g - l - 1 ) in the wild t y p e strain J A 3890b, whereas UV 12 showed reduced sensitivity. The arsenate-resistant derivative UV 13-13-As R 7 exceeded UV 12 considerably in its capacity to produce antibiotic even in the presence of inorganic phosphate. In comparison, strain NG 13 was much less susceptible to phosphate inhibition t h a n all other strains, in full accord with b o t h its higher degree of resistance to arsenate (Fig. 1 c) and its elevated streptothricin production. During maintenance of strains on agar surfaces, resistance to arsenate has remained stable for several m o n t h s after repeated transfer to fresh A1 53 medium (Fig. 3).

Inhibitory effect of inorganic phosphate on streptothricin production by strains of S. noursei. O wild strain J A 3890b; A strain UV 12; A arsenate resistant strain UV 12 —13-As Il 7; • strain NG 13

Pig. 3. Resistance of strain UV 12 —13-As R 7 to arsenate. Colonies are shown t h a t developed on agar areas containing t h e highest arsenate concentration

Arsenate-resistant strains of S. noursei

17

On the other hand, during submerged cultivation, the A s " property of U V 12-13A s R was usually lost after three subcultivations for 4 8 hours each. When these mycelia were spread on an agar surface with arsenate-containing paper strips, the degree of growth inhibition was similar to t h a t shown b y the parental strain (Fig. 1 b). T h i s indicates t h a t the population regained sensitivity to arsenate, and t h a t the frequency of the resistant clones was reduced to about the same level as found with the ancestral strain U V 12. These results m a y be interpreted to mean t h a t unstable genetic elements are involved in the mechanism of resistance to arsenate ions (MOBLEY a n d ROSEN 1 9 8 2 ) .

I t seems likely t h a t during submerged cultivation on special media segregation occurs which greatly reduces the portion of the arsenate-resistant clones in the whole colony population. As shown in F i g . 4, the composition of media also has a m a j o r influence on the appearance of arsenate-resistant strains. Thus, zero time addition of casamino acids

Fig. 4. Decrease of sensitivity to growth inhibition by arsente in the presence of casamino acids. Wells contained 50 of a 2 0 % (A), 1 0 % (B), 5 % (C), and 2 . 5 % (D) solution of casamino acids 2

Z. allg. Mikrobiol., BD. 2 4 , H . 1

18

W . FRIEDRICH, E . J . BORMANN a n d U . GRÄFE

to the zone of growth inhibition near the arsenate-containing paper strip promoted the development of resistant colonies of all strains investigated in this study. This suggests that toxic effects of arsenate can be antagonized by nutrients other than inorganic phosphate. As far as the selection of high-producing m u t a n t s of Streptomyces noursei is concerned, the above results may support the idea that there exists, indeed, a correlation between the resistance to arsenate ions and the capacity to produce streptothricin antibiotics. The increase of antibiotic production by the m u t a n t strains UV 12 and NG 13, as compared with the wild type strain J A 3890 b, may be partly due to their decreased sensitivity to phosphate inhibition. On the other hand, if the strain possesssed a high degree of phosphate-insensitive antibiotic production, as for instance strain NG 13, the selection of arsenate-resistant clones yielded no further improvement of antibiotic production due to other endogenous factors which limited the biosynthesis of streptothricins. T h a t resistance of growth to arsenate and, concomitantly, of antibiotic production to phosphate inhibition m a y be only one of several prerequisites for an improved generation of secondary metabolites can be shown in experiments using the wild type strain J A 3890b. I n no case the As R -derivatives were superior producers of the antibiotic. Therefore, it can be concluded that selection of arsenate-resistant strains can be used as a tool to select clones with a lowered sensitivity to phosphate inhibition of antibiotic biosynthesis. However, success of this procedure may depend on the individual strain and the methods used. Thus, a major disadvantage of the described paper strip method appears to consist in the appearance of genetically unstable strains which show a high reversion rate to the As s phenotype during submerged cultivation. F u t u r e work in our laboratory is aimed at selecting stable As R derivatives and investigating their biochemical properties. Acknowledgement The technical assistance of Mrs. KERSTIN SCHMIDT is gratefully acknowledged.

References BRADLER, G. und THRUM, H., 1963. Nourseothricin A und B, zwei neue antibakterielle Antibiotika einer Streptomyces noursei Variante. Z. allg. Mikrobiol., 3, 105 — 112. DEMAIN, A. L., 1982. Catabolite regulation in industrial microbiology. I n : Overproduction of Microbial Products (Eds. KRUMPHANZL,V., SIKYTA, B. and VANEK, Z.). Academic Press—London, 3-20. GRÄFE, U . ,

BOCKER, H . ,

REINHARDT, G.

und

THRUM, H . ,

1974.

Regulative

Beeinflussung

der

Nourseothricinbiosynthese durch o-Aminobenzoesäure in Kulturen des Streptomyces noursei J A 3890b. Z. allg. Mikrobiol., 14, 6 5 9 - 6 7 3 . INOUE,S., NISHIZAWA, Y. and NAGAI,S., 1982. Effects of phosphate and asparagine on streptomycin formation by Streptomyces griseus in p H stat cultures. J. Ferment. Technol., 60, 105 — 110. MARTIN, J. F. and DEMAIN, A. L., 1976. Control b y phosphate of candicidin production. Biochem. Biophys. Res. Comm., 71, 1103 — 1109. MARTIN, J. F., 1977. Control of antibiotic synthesis b y phosphate. Adv. Biochem. Engin., 6, 105-127.

MARTIN, J. F., 1978. Manipulation of gene expression in the development of antibiotic production. I n : Antibiotics and Other Secondary Metabolites (Ed. HÜTTER, R., LEISINGER, T., NUESCH, I. and WEHRLI, W.). Academic Press —London, 19—38. M A R T I N , J . F . , NAHARRO, 0 . , L I R A S , P . a n d V I L L A N U E V A , J . R . , 1 9 7 9 . I s o l a t i o n o f m u t a n t s

dere-

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Arsenate-resistant strains of S.

noursei

19

A., VILLANUEVA, I . R . and MARTIN, J . F . , 1 9 8 1 . Study of the molecular mechanism of phosphate control of candicidin biosynthesis using phosphate-deregulated mutantts Adv. Bioteehnol. Vol. I I I (Eds. VEZINA, C. and MOO-YOUNG, M . ) , 1 3 5 — 1 4 0 Pergamon Press, Toronto, Canada. OMURA, S . , TANAKA, Y . , TANAKA, H . , TAKAHASTT, Y . , I W A I , Y . and KITAO, C., 1 9 8 1 . Stimulation of leucomycin production by magnesium phosphate and its relevance to nitrogen catabolite regulation. Adv. Bioteehnol. Vol. III (Eds. MOO-YOUNG, M . , VEZINA, C. and SINGH, K.), 1 8 1 to 186. Pergamon Press—Toronto, Canada.

NAHARRO, G . , GIL, I .

Mailing address: Dr. W . F R I E D R I C H , Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der AdW, DDR-6900 Jena, Beutenbergstrasse 11

2'

Zeitschrift für allgemeine Mikrobiologie 24 (1984) 1, 20

Buchbesprechungen R. H A L L B E R G (Editor), Environmental Biogeochemistry. 576 Seiten mit zahlreichen Abb. und Tab. Publishing House F R N Stockholm 1983. Mit 49 Themen, geordnet in 7 Gruppen, vermittelt der Herausgeber einen Überblick über die Vorträge des V. Internationalen Symposiums „Environmental Biogeochemistry", Stockholm 1981. Die Gruppenthemen lassen den weiten Bereich dieses Grenzgebietes erkennen, auf dem sich Geowissenschaften, Biochemie, Biologie, besonders Geomikrobiologie, begegnen. Die Gruppenthemen (Zahl der Vorträge in Klammern) lauten: Biogeochemie der Flüsse und Meere (6), Biogeochemie des Schwefels (5), des Stickstoffs (6), des Kohlenstoffs (7), von Metallen (11), wie Gold, Uran, Mangan, Eisen, Beziehungen zur Diagenese (4), darunter ein Bericht über anaerobe Diagenese rezenter Sedimente in der Ostsee, und schließlich noch eine Gruppe von Einzelthemen (10) mit Beiträgen unter anderem zum Si-Kreislauf, über das Verhalten synthetischer Chemikalien im Boden und über das Vorkommen von Blei und anderen Schwermetallen in schwedischen Seen. W. SCHWARTZ (Braunschweig)

G. D. H S I U N G , Diagnostic Virology (3rd Edition). X X I I + 276 S., 150 Abb., z. T. farbig, 30 Tab. New Häven-London 1982. Yale University Press. £ 19.50. Die vorliegende 3. Ausgabe der ,,Diagnostischen Virologie" beweist nahezu 2 Jahrzehnte nach der Erstauflage (1964) die gestiegene Bedeutung des Gebietes. Gerade die in den letzten Jahren erweiterten Möglichkeiten einer spezifischen antiviralen Chemotherapie setzen eine verbesserte Virusdiagnostik zwingend voraus. Modernen Erkenntnissen und Entwicklungen, z. B. auf den Gebieten der Hepatitis- und Rotaviren sowie der Kultivierung humaner Papovaviren, ist durch eine umfassende "Überarbeitung Rechnung getragen worden. Das Werk gliedert sich in 4 Teile. Teil 1 behandelt grundlegende Prinzipien der Virusdiagnostik und vermittelt Hinweise zur sicherheitsgerechten Gewinnung und Versendung von Untersuchungsproben. Teil 2 bietet umfassend die Methoden zur Virusisolierung und -erkennung wie Plaqueund Neutralisationsteste, Hämagglutinations- und Hämagglutinationshemmteste, Komplementfixationstest, ELISA, licht- und elektronenmikroskopische Techniken sowie physikochemische Methoden zur Charakterisierung von Virus-Hauptgruppen. Im Teil 3 werden die einzelnen humanrelevanten Virusgruppen vorgestellt. Teil 4 gibt wertvolle Hinweise zur Zellkulturtechnik. Das Buch ist mit instruktiven licht- und elektronenmikroskopischen Abbildungen reich illustriert, die, abgesehen von einigen farbigen Bildern, bei Hochglanzdruck qualitativ noch gewonnen hätten. Literaturhinweise am Ende der Kapitel nennen Standardwerke und wichtige Orginalarbeiten. Das Buch ist Ärzten und klinischen wie experimentellen Virologen sehr zu empfehlen. R. S. F R I T S C H (Jena)

Z e i t s c h r i f t f ü r allgemeine Mikrobiologie 24 (1984) 1, 2 1 - 3 1

(Ingenieurhochschule K o t h e n , Sektion Anlagenbau, Wissenschaftsbereich Biologie)

Abbau v o n Mischsubstraten durch Hefen II. Substrate der Sulfitablauge, Vergleich von Produktionsstämmen UTE KRAUEL, H . H . KRAUEL u n d

(Eingegangen

H.

WEIDE

am 8. 6. 1983)

I n c o n t i n u a t i o n of preceding investigations (KRAUEL et al. 1982) four Candida strains f r o m t h e same industrial b a t c h reactor for f e r m e n t a t i o n of waste sulfite liquor were e x a m i n e d . Simultaneous as well as successive s u b s t r a t e metabolism a n d catabolite effects were observed, a l t h o u g h using low s u b s t r a t e concentrations (0.15%).

Im Anschluß an die Untersuchungen zum Abbau einfacher Substrate der Sulfitablauge sowie eines Modell-Mischsubstrates durch zwei Candida-Stämme ( K R A U E L et al. 1982), werden nunmehr Ergebnisse für vier weitere Stämme mitgeteilt. Sie wurden aus der gleichen Produktionsanlage zur Verhefung von Sulfitablauge isoliert. Material und Methoden Analog zu den U n t e r s u c h u n g e n von KRAUEL et al. (1982) a n den Candida-Stämmen W1 u n d W 2 w u r d e n vier weitere H e f e s t ä m m e dieser G a t t u n g m i t den Laborbezeichnungen T 1 ; T 2 , und P2 g e t e s t e t . Die A n z u c h t der Hefen, die B e s t i m m u n g ihrer A t m u n g s a k t i v i t ä t e n sowie die d ü n n schichtchromatographische E r m i t t l u n g der Sequenzen des K o h l e n h y d r a t a b b a u s erfolgte wie bei K R A U E L et al. (1982) beschrieben. Die F o r m e l n zweier K o m p o n e n t e n des Mediums müssen a b e r korrigiert w e r d e n ; s t a t t FeCl 2 x 6 H 2 0 m u ß es heißen FeCl 3 X 6 H 2 0 u n d s t a t t H B 0 3 — H 3 B 0 3 . Der Gesamtzuckergehalt wurde q u a n t i t a t i v m i t Hilfe von Dinitrosalicylsäure n a c h M I L L E R (1959) b e s t i m m t ; die Glucosekonzentrationen w u r d e n mittels des G O D / P O D B l u t z u c k e r t e s t s „FERMOGNOST" ( V E B Feinchemie Sebnitz, D D R ) e r m i t t e l t .

Ergebnisse und Diskussion Die nunmehr untersuchten Hefestämme Tj/Tg, Pj/P 2 zeigten ebenfalls charakteristische, spezifische Atmungsaktivitäten beim oxidativen Abbau (Veratmung) der einfachen Substrate Glucose, Galactose, Mannose, Xylose, Arabinose und Acetat (Tab. 1). Tabelle 1 Spezifische A t m u n g s a k t i v i t ä t e n beim A b b a u einfacher S u b s t r a t e (¡xl 0 2 / m g T M • h) Anzucht

Glucose

Stamm

TI

T2

PI

D-Glu D-Man D-Xyl D-Gal D-Ara Na-Ace

69 73 83 (-)

85 73 42 70

83 77 76 (-)

84 78 80 (-)

89

77

117

133

—

Z e i t s c h r i f t f ü r allgemeine Mikrobiologie 24 (1984) 1, 2 1 - 3 1

(Ingenieurhochschule K o t h e n , Sektion Anlagenbau, Wissenschaftsbereich Biologie)

Abbau v o n Mischsubstraten durch Hefen II. Substrate der Sulfitablauge, Vergleich von Produktionsstämmen UTE KRAUEL, H . H . KRAUEL u n d

(Eingegangen

H.

WEIDE

am 8. 6. 1983)

I n c o n t i n u a t i o n of preceding investigations (KRAUEL et al. 1982) four Candida strains f r o m t h e same industrial b a t c h reactor for f e r m e n t a t i o n of waste sulfite liquor were e x a m i n e d . Simultaneous as well as successive s u b s t r a t e metabolism a n d catabolite effects were observed, a l t h o u g h using low s u b s t r a t e concentrations (0.15%).

Im Anschluß an die Untersuchungen zum Abbau einfacher Substrate der Sulfitablauge sowie eines Modell-Mischsubstrates durch zwei Candida-Stämme ( K R A U E L et al. 1982), werden nunmehr Ergebnisse für vier weitere Stämme mitgeteilt. Sie wurden aus der gleichen Produktionsanlage zur Verhefung von Sulfitablauge isoliert. Material und Methoden Analog zu den U n t e r s u c h u n g e n von KRAUEL et al. (1982) a n den Candida-Stämmen W1 u n d W 2 w u r d e n vier weitere H e f e s t ä m m e dieser G a t t u n g m i t den Laborbezeichnungen T 1 ; T 2 , und P2 g e t e s t e t . Die A n z u c h t der Hefen, die B e s t i m m u n g ihrer A t m u n g s a k t i v i t ä t e n sowie die d ü n n schichtchromatographische E r m i t t l u n g der Sequenzen des K o h l e n h y d r a t a b b a u s erfolgte wie bei K R A U E L et al. (1982) beschrieben. Die F o r m e l n zweier K o m p o n e n t e n des Mediums müssen a b e r korrigiert w e r d e n ; s t a t t FeCl 2 x 6 H 2 0 m u ß es heißen FeCl 3 X 6 H 2 0 u n d s t a t t H B 0 3 — H 3 B 0 3 . Der Gesamtzuckergehalt wurde q u a n t i t a t i v m i t Hilfe von Dinitrosalicylsäure n a c h M I L L E R (1959) b e s t i m m t ; die Glucosekonzentrationen w u r d e n mittels des G O D / P O D B l u t z u c k e r t e s t s „FERMOGNOST" ( V E B Feinchemie Sebnitz, D D R ) e r m i t t e l t .

Ergebnisse und Diskussion Die nunmehr untersuchten Hefestämme Tj/Tg, Pj/P 2 zeigten ebenfalls charakteristische, spezifische Atmungsaktivitäten beim oxidativen Abbau (Veratmung) der einfachen Substrate Glucose, Galactose, Mannose, Xylose, Arabinose und Acetat (Tab. 1). Tabelle 1 Spezifische A t m u n g s a k t i v i t ä t e n beim A b b a u einfacher S u b s t r a t e (¡xl 0 2 / m g T M • h) Anzucht

Glucose

Stamm

TI

T2

PI

D-Glu D-Man D-Xyl D-Gal D-Ara Na-Ace

69 73 83 (-)

85 73 42 70

83 77 76 (-)

84 78 80 (-)

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117

133

—

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UTE KRAUEL, H . II. KJRAUEL u n d H . W E I D E

Die S t ä m m e T j u n d T s b a u t e n a u ß e r Arabinose alle u n t e r s u c h t e n S u b s t r a t e a b . Wie beim f r ü h e r beschriebenen S t a m m W 2 k o n n t e a u c h beim A b b a u von Galactose d u r c h den S t a m m T j jeweils n u r ü b e r eine k u r z e Versuchsdauer eine geringe A t m u n g s a k t i v i t ä t gemessen werden (Abb. 1 ) . E i n e von P I N E A U L T etal. ( 1 9 7 7 ) f ü r den Galact o s e a b b a u bei Saccharomyces cerevisiae festgestellte T e m p e r a t u r a b h ä n g i g k e i t k o n n t e experimentell f ü r T 1 ( PX u n d P 2 n i c h t b e s t ä t i g t werden. T e m p e r a t u r e r h ö h u n g e n auf

Abb. 1. Stamm TJ. Glucoseanzucht. WARBURG-Versuche mit einfachen Substraten, o D-G1U, A D-Xy], • D-Man, • D-Gal, • D-Ara, Na-Ace

32 °C u n d 36 °C zeigten keine V e r ä n d e r u n g e n d e r A k t i v i t ä t gegenüber der Versuchsd u r c h f ü h r u n g bei 30 °C. D e n k b a r wäre a u c h hier eine H e m m u n g des G a l a c t o s e m e t a bolismus auf der S t u f e der P y r u v a t u m w a n d l u n g , d. h. verringerte F u n k t i o n s f ä h i g k e i t oder gänzliches F e h l e n spezifischer E n z y m e , wie P y r u v a t k i n a s e ( P A Y T O N U. R O B E R T S 1976), P y r u v a t c a r b o x y l a s e ( S K I N N E R U. A R M I T T 1972) oder des P y r u v a t d e h y d r o g e n a s e k o m p l e x e s ( P A Y T O N et dl. 1977, B o s etal. 1981, U I T Z E T T E R etal. 1982). Diese A u t o r e n u n t e r s u c h t e n M u t a n t e n von Aspergillus nidulans, die b e s t i m m t e Kohlenh y d r a t e nicht auf glykolytischem Wege verwerten, aber glukoneogenetische S u b s t r a t e in den Stoffwechsel einbeziehen k o n n t e n . W ä h r e n d der S t a m m T x Glucose u n d Mannose sofort mit f a s t der gleichen m a x i m a l e n R a t e v e r a t m e t e , zeigte er beim Xyloseu n d A c e t a t a b b a u erst n a c h einer 20 bis 30minütigen I n d u k t i o n s p h a s e seine h ö c h s t e n respiratorischen A k t i v i t ä t e n . I m Gegensatz zum S t a m m T x b a u t T 2 die Galactose mit f a s t gleicher I n t e n s i t ä t u n d Geschwindigkeit wie die S u b s t r a t e Glucose u n d Mannose ab. Die V e r w e r t u n g von A c e t a t erfolgt d u r c h beide S t ä m m e gleich g u t . Als Besonderheit m u ß der verzögerte Beginn der V e r a t m u n g aller S u b s t r a t e d u r c h T 2 h e r v o r g e h o b e n werden. Sogar bei der Glucoseverwertung w u r d e erst n a c h e t w a 50 min die volle A t m u n g s a k t i v i t ä t gemessen. Beim oxidativen A b b a u der Mannose, die d e r S t a m m T t sofort metabolisierte, k o n n t e ebenfalls eine Verzögerung (ca. 1 h) festgestellt w e r d e n . Maximale A b b a u r a t e n w u r d e n beim Angebot der X y l o s e u n d Galactose n a c h e t w a 50 min u n d beim A c e t a t n a c h 40 min erreicht (Abb. 2). W ä h r e n d

Abbau von Mischsubstraten durch Hefen. II.

23

M 10 2

mg TM-h

/

100

o

50

50

- *

100 min

Abb. 2. Stamm T,. Glucoseanzucht. WARBURG-Versuche mit einfachen Substraten, o D-Glu, A D-Xy], • D-Man, • D-Gal, • D-Ara, + Na-Ace

beim S t a m m T j n a c h Glucosevorkultur n u r die V e r a t m u n g bzw. der A b b a u von Xylose u n d Acetat einer I n d u k t i o n s p h a s e b e d u r f t e n , läßt sich die hier aufgetretene, zeitlich differenzierte Verzögerung f ü r die Verwertung von Glucose u n d Mannose nicht erklären. Die spezifischen A t m u n g s a k t i v i t ä t e n , mit oder ohne Verzögerung, waren f ü r Glucose u n d Acetat bei beiden T - S t ä m m e n im wesentlichen gleich hoch. Die Xylose wurde vom S t a m m T x doppelt so schnell v e r a t m e t wie vom S t a m m T 2 . H e r a u s r a g e n d e Abweichungen ergaben sich, wie anfangs angedeutet, zwischen beiden S t ä m m e n hinsichtlich der Galactoseverwertung. W ä h r e n d hier die spezifische A k t i v i t ä t des S t a m m e s T t n u r gering u n d n a c h 60 min nicht mehr e r f a ß b a r war, erreichte der S t a m m T 2 seine maximalen Werte erst nach 50 min (Abb. 1, 2). I n gleicher Weise wurden auch die spezifischen A t m u n g s a k t i v i t ä t e n des a n d e r e n Stamnipaares PX und P 2 ermittelt. Der Kurvenverlauf zeigt keine wesentlichen Abweichungen von den bisher dargestellten Verhältnissen; die Ergebnisse wurden deshalb in der Tabelle 1 zusammengefaßt. Ein Vergleich der f ü r die getesteten H e f e s t ä m m e ermittelten A t m u n g s a k t i v i t ä t e n mit im folgenden beschriebenen Abbausequenzen läßt keine Schlüsse bezüglich der S u b s t r a t p r ä f e r e n z e n zu. Ein im Gemisch bevorzugt assimiliertes S u b s t r a t m u ß nicht mit der höchsten spezifischen A t m u n g s a k t i v i t ä t verwertet werden. Zur Ü b e r p r ü f u n g von Ähnlichkeiten respektive Übereinstimmungen zwischen W a c h s t u m s p a r a m e t e r n und Respirationsmessungen und schließlich der B e d e u t u n g der W a c h s t u m s r a t e bzw. A t m u n g s r a t e f ü r den bevorzugten A b b a u bestimmter S u b s t r a t e wird in einer weiteren Mitteilung berichtet. P a r d e e (1961), H ä r d e r u n d D i j k h u i z e n (1975) bezeichneten als wichtigstes N a t u r p r i n z i p im Z u s a m m e n h a n g mit der Verwertbarkeit von Multikomponentensystemen, d a ß generell das S u b s t r a t , welches zuerst a b g e b a u t wird, die höhere Wachstumsgeschwindigkeit bewirkt. W ä h r e n d einerseits R ü s s e l u n d

24

UTE KRAUEL, H. H. KRAUEL und H. WEIDE

BALDWIN (1978) bei einigen Bakterien des Verdauungstrakts auch eine Abhängigkeit der Wachstumsgeschwindigkeit von katabolit-regulatorischen Mechanismen bestätigen, gaben ihre Untersuchungen mit weiteren Bakterienstämmen Anlaß zu gegensätzlichen Auffassungen. Stammspezifische Ergebnisse zeigten hier für Glucose (als bekanntlich bevorzugt assimilierbares Substrat und hier im Gemisch die Maltoseverwertung hemmend) eine geringere Wachstumsrate als mit Maltose. Nach der Verwertung der einzelnen getesteten Substrate und ihren Abbausequenzen im Gemisch könnte für alle sechs getesteten Stämme folgende Gruppeneinteilung vorgenommen werden: 1. Der Stamm W t baute alle vorgelegten Zucker ab. Die Sequenz ist: Glucose — Galactose — Mannose — Xylose. 2. Der Stamm T2 verwertete außer Arabinose alle Zucker in der Reihenfolge: Glucose — Galactose + Mannose — Xylose. 3. Der Stamm T x metabolisierte außer Galactose und Arabinose die restlichen Kohlenhydrate wie folgt: Glucose + Mannose — Xylose. 4. Die Stämme W2, P x und P 2 verwerteten Arabinose nicht, die Sequenz ist: Glucose — Mannose — Xylose; die Galactose hemmt den Xyloseabbau und wird selbst nur in geringem Umfang utilisiert. Damit sind zeitliche Abläufe und qualitative Bilanzen für die Reihenfolgen des Kohlenhydratmetabolismus gegeben. Die Ergebnisse sind darüber hinaus für ökonomische Fragestellungen von Bedeutung. Dazu geht man von den Funktionen der einzelnen Stämme in Mischpopulationen aus. Das Mischsubstrat wurde von TJ/T2 mit

Abb. 3. Abbausequenzen im Mischsubstrat nach Glucoseanzucht

„Summeneffekt" abgebaut, obwohl teilweise auch zeitliche Verzögerungen auftraten (Abb. 3). Die Galactose, vom Stamm Tj sehr schlecht verwertbar, konnte durch kooperativen Effekt in den Stoffwechsel einbezogen werden, aber auch hier wird der inhibitorische Einfluß auf den Xyloseabbau bemerkbar. Wenn z. B. Galactose im Substratgemisch fehlt (nur Glucose und Xylose vorhanden), wird nach dem Glucoseverbrauch die Xylose als Kohlenstoffquelle genutzt (KRAUEL et al. 1982). Wechselseitige Beeinflussung, d. h. Hemmung des Galactosestoffwechseis durch Xylose, muß durchaus in Betracht gezogen werden. Der Stamm P x begann Galactose als alleinige Kohlenstoffquelle schon nach 3 Stunden abzubauen, während im Gemisch mit Glucose, Xylose und

Abbau von Mischsubstraten durch Hefen. II.

25

Abb. 4. Abbau der Galactose nach Glucoseanzucht (oben), Abbausequenzen im Mischsubstrat nach Glucoseanzucht (unten)

Mannose erst n a c h 5,5 S t u n d e n ein leichter A b b a u zu verfolgen w a r (Abb. 4). K o m b i n a t i o n e n der S t ä m m e P x u n d P 2 e r ü b r i g t e n sich, d a auf G r u n d gleicher Sequenzen keine E r g ä n z u n g e n zu e r w a r t e n waren. D e r E i n f l u ß der Arabinose auf die A b b a u s e q u e n z e n im S u b s t r a t g e m i s c h wird n o c h untersucht. Parallel zur D ü n n s c h i c h t c h r o m a t o g r a p h i e w u r d e die Zuckerassimilation bei d e n S t ä m m e n TJ/T2, Pj/Pg q u a n t i t a t i v d u r c h E r m i t t l u n g des G e s a m t z u c k e r - u n d zusätzlich des Glucosegehaltes e r f a ß t (Abb. 5, 6, 7, 8). D e r K u r v e n v e r l a u f zeigt bei beiden S t a m m p a a r e n einen raschen Glucose- u n d M a n n o s e v e r b r a u c h i n n e r h a l b der ersten S t u n d e n , w ä h r e n d Galactose- u n d X y l o s e v e r w e r t u n g d u r c h eine kontinuierliche A b n a h m e m i t allerdings m a n c h m a l a u f t r e t e n d e n Verzögerungsphasen gekennzeichnet ist (Abb. 8); ob l e t z t e r e auf I n d u k t i o n e n schließen lassen ist n o c h n i c h t entschieden. Die S t ä m m e TJ/T2 zeigten bei K o m b i n a t i o n e n der einzelnen Z u c k e r s i m u l t a n e n oder s u k z e d a n e n S u b s t r a t a b b a u . Glucose u n d Mannose w u r d e n gleichzeitig v e r a t m e t (Abb. 9, 10), wobei die Glucose von beiden S t ä m m e n n a c h 2 S t u n d e n v e r b r a u c h t u n d die Mannose beim n a c h 2,5 S t u n d e n u n d beim T g erst n a c h 3,5 S t u n d e n n i c h t m e h r im K u l t u r m e d i u m n a c h w e i s b a r war. I n der K o m b i n a t i o n Glucose/Xylose erfolgte ü b e r e i n s t i m m e n d bei beiden S t ä m m e n eine b e v o r z u g t e A u f n a h m e von Glucose (nach 1,5—2 h), erst d a n a c h b e g a n n die X y l o s e v e r a t m u n g (Abb. 11, 12). M e h r f a c h reproduzierte Ergebnisse lassen auf eine G l u k o s e g r e n z k o n z e n t r a t i o n von e t w a 0,05—0,07 m g Glucose/ml schließen, d u r c h die d e r X y l o s e a b b a u n i c h t m e h r v e r h i n d e r t wird. Xylose als alleinige Kohlenstoffquelle w u r d e v o m T x z. B . schon n a c h einer k u r z e n I n d u k t i o n s z e i t (0,5 h) in den Stoffwechsel einbezogen u n d w a r n a c h 4 S t u n d e n v o l l k o m m e n metabolisiert (Abb. 13). I m Gemisch m i t Glucose k o n n t e n bei diesem S t a m m S p u r e n der Xylose noch n a c h 5 S t u n d e n

26

UTE KRAUEL, H . H . KRAUEL u n d H . WEIDE

1

2

3

4

5

S

7

h

Abb. 5. Abbausequenzen im Mischsubstrat nach Glucoseanzucht. o Glu, • Gesamtzuckergehalt

1

2

3

4

5

S

7 h

Abb. 6. Abbausequenzen im Mischsubstrat nach Glucoseanzucht. o Glu, • Gesamtzuckergehalt

A b b a u von Mischsubstraten durch Hefen. I I .

Abb. 7. Abbausequenzen im Mischsubstrat nach Glucoseanzucht. o G l u , • Gesamtzuckergehalt

D-Gal

D-Xyl

D-Man

D-Glu 1

2

3

4

5

e

7

h

Abb. 8. Abbausequenzen im Mischsubstrat nach Glucoseanzucht. o Glu, • Gesamtzuckergehalt

28

UTE KRAUEL, H. H . KRAUEL und H . WEIDE

9/1

9/1

3

Stamm

Stamm Tf

-i Ä

2

'

3

*

J

Abb. 9. Abbau des Substratgemisches Glu/Man nach Glucoseanzucht. o Glu, • Man Abb. 10. Abbau des Substratgemisches Glu/Man nach Glucoseanzucht. o Glu, • Man

9/1

Stamm

-+—+—H

\ J

1

+-

2

Stamm

Tf

\ ,

h

3

4

5

Abb. 11. Abbau des Substratgemisches Glu/Xyl nach Glucoseanzucht. o Glu, -j- Xyl Abb. 12. Abbau des Substratgemisches Glu/Xyl nach Glucoseanzucht. o Glu, + Xyl nachgewiesen werden. E i n ebenfalls sukzessiver S u b s t r a t a b b a u zeigte sich bei einem Glucose-Galactose-Gemisch durch die T e s t s t ä m m e TJ/T 2 . Wie bei der X y l o s e , wird Galactose erst nach Verbrauch der Glucose respektive bei einer geringen Grenzkonzentration (etwa 0,1 mg/ml) metabolisiert. Vom S t a m m T 2 wurde die Galactose nach 4 Stunden verwertet, während sie beim T j nach 5 Stunden immer noch im Medium nachzuweisen war (Abb. 14, 15). Solchen, hier experimentell herbeigeführten Situationen, d. h. einem Wechsel im quantitativen Substratangebot und damit dem Auftreten von Transient-Phasen, begegnen wir nicht nur ständig in der Natur, sondern auch unter technischen Bedingungen. E i n e k o n s t a n t e Substratkonzentration stellt sogar für Industriefermenter die nahezu „ u n n a t ü r l i c h e " Ausnahmesituation dar. Infolge des in fast allen Biotopen stetigen Wechsels der Bedingungen befinden sich

Abbau von Mischsubstraten durch Hefen. II.

29

9/1 3

„,

X

Stamm Ti

"t—t2

J

Ä

•

Abb. 13. Abbau des Substrates X v l nach Glucoseanzucht

9/1

9/1

3

3

Stamm Tj>

Stamm T-j II

\

A

o

A -

A

—

A

—

A

—

A

—

A

—

A

\

\ '

*

5

Abb. 14. Abbau des Substratgemisches Glu/Gal nach Glucoseanzucht. o Glu, A Gal Abb. 15. Abbau des Substratgemisches Glu/Gal nach Glucoseanzucht. o Glu, A Gal

vegetative Zellen von Mikroorganismen also wohl weit häufiger und anhaltender in Transients, als das allgemein angenommen wird. Der normale Verlauf einer BatchKultur ist diesbezüglich ja schon eine Folge von Transient-Stadien (WEIDE 1983). Über die Abbausequenzen und ihre ursächlichen Regulationsmechanismen, die Bedeutung von Substratkonzentrationen und Wachstumsraten für den simultanen oder sukzessiven Kohlenhydratmetabolismus gibt es unterschiedliche Meinungen. HÄRDER u n d DIJKHUIZEN ( 1 9 8 2 ) s o w i e KTJENEN ( 1 9 8 1 ) b e z e i c h n e n d e n M i s c h s u b s t r a t -

abbau durch Mikroorganismen als konzentrationsabhängig. Sie fanden bei hohen Substratkonzentrationen sequentiellen und beim Vorliegen von wachstumsbegrenzenden Konzentrationen simultanen Kohlenhydratmetabolismus. Sie verallgemeinerten jedoch diese Aussage nicht. Sie äußerten die Ansicht, daß unterschiedliche Mikroorganismen nicht die gleichen Reaktionen auf die Kombination zweier Substrate zeigen. Eine von einem Organismus diauxisch oder polyauxisch verwertete Substrat-

30

UTE KRAUEL, H . H . KRAUEL u n d H . WEIDE

kombination m u ß von einem anderen nicht in gleicher Weise metabolisiert werden. Eine von einem Mikroorganismus bevorzugte Kohlenstoffquelle k a n n f ü r einen anderen ein sekundäres Substrat sein. Der ausschließlich simultane Substratmetabolismus bei wachstumslimitierenden Konzentrationen u n d das Fehlen von Katabolitrepression bzw. -hemmung k o n n t e n in der vorliegenden Arbeit nicht erreicht werden, obwohl schon mit „geringen" Konzentrationen (0,15%) gearbeitet wurde. W ä h r e n d hier Glucose u n d Mannose im Gemisch gleichzeitig veratmet werden, zeigen Xylose und Galactose Sukzessionen, d. h. Glucose oder deren I n t e r m e d i a t e hemmen die Verwertung letztgenannter Zucker. D a m i t erhielten wir mit HSIAO et al. (1982) vergleichbare Ergebnisse, die kürzlich den P e n t o s e a b b a u durch Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Candida utilis u n d Rhodotorula toruloides untersuchten. Beim Einsatz der Zuckerkombination Glucose/Xylose wurde von Rhodotorula toruloides und Saccharomyces cerevisiae Xylose erst d a n n in den Stoffwechsel einbezogen, nachdem die Glucosevollkommen aus dem K u l t u r m e d i u m verschwunden war. Schizosaccharomyces pombe u n d Candida utilis begannen Xylose schon zu verwerten, obwohl noch geringe Glucose mengen nachzuweisen waren. Quantitative Aussagen über Glucosegrenz- bzw. H e m m konzentrationen, die den sequentiellen Xylosemetabolismus verursachten, wurden von den Autoren allerdings nicht gemacht. Als regulatorischen Hauptmechanismus f ü r die aufeinanderfolgende Einbeziehung der K o h l e n h y d r a t e in den mikrobiellen Stoffwechsel nennen sie ohne nähere Begründung K a t a b o l i t h e m m u n g und nicht -repression. Wir haben dazu bisher keine Untersuchungen d u r c h g e f ü h r t . Zur Erweiterung dieser grundlegenden Erkenntnisse sind nachfolgend wachstumskinetische und populationsdynamische Untersuchungen, sowohl in Batch- als auch in Chemostat-Kulturen, notwendig. Die Bedeutung der W a c h s t u m s p a r a m e t e r , besonders der Wachstumsrate, f ü r Substratpräferenzen und ihre praktischen Konsequenzen sind d u r c h weiterführende Untersuchungen zu klären. Literatur Bos, C. J . , SLAKHORST, S . M . , V I S S E R , J . and ROBERTS, C. F . , 1981. A third unlinked gene controlling the pyruvate dehydrogenase complex in Aspergillus nidulans. J. Bacteriol., 148, 594—599. HARDER, W. and DIJKHUIZEN, L., 1982. Strategies of mixed substrate utilization in microorganisms. Phil. Trans. R. Soc. London, B 297, 459—480. H A R D E R , W . and D I J K H U I Z E N , L., 1975. In: MOSER, A . , 1981. Bioprozeßtechnik, Springer-Verlag Wien—New York. HSIAO, H . Y., CHIANG, L. Ch., U E N G , P. P. and TSAO, G. T . , 1982. Sequential utilization of mixed monosaccharides by yeasts. Appl. Environm. Microbiol., 43, 840—845. K R A U E L , U T E , K R A U E L , H. H. und W E I D E , H., 1 9 8 2 . Abbau von Mischsubstraten durch Hefen. I . Substrate der Sulfitablauge. Z. allg. Mikrobiol., 22, 545—555. K U E N E N , J . G., 1981. Mixed substrates and mixed culture. Ant. v. Leeuwenhoek, 47, 187 — 189. MILLER, G. L., 1959. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugars. Anal. Chem., 31, 4 2 6 - 4 3 1 . PARDEE, W., 1961. In: MOSER, A., 1981. Bioprozeßtechnik, Springer-Verlag Wien—New York. PAYTON, M. H. and ROBERTS, C. F., 1976. Mutants of Aspergillus nidulans lacking pyruvate kinase. F E B S Letters, 6 6 , 7 3 — 7 6 . P A Y T O N , M . A . , MCCULLOUGH, W . , ROBERTS, C. F. and G U E S T , J . R . , 1 9 7 7 . Two unlinked genes for the pyruvate dehydrogenase complex in Aspergillus nidulans. J. Bacteriol., 129, 1222 to 1226. P I N E A U L T , B . , P R Ü D E N , B . and LOUTFI, H . , 1 9 7 7 . The effect of mixing, temperature and nutrient concentration on the fermentation of a mixed sugar solution simulating the hexose content of waste sulfite liquor. Canad. J. Chem. Eng., 55, 333—340. R Ü S S E L , J . B . and B A L D W I N , R . L . , 1 9 7 8 . Substrate preferences in rumen bacteria: Evidence of catabolite regulatory mechanisms. Appl. Environm. Microbiol., 36, 319—329. S K I N N E R , V. M. and ARMITT, S . , 1972. Mutants of Aspergillus nidulans lacking pyruvate carboxylase. F E B S Letters, 20, 1 6 - 1 8 .

Abbau von Mischsubstraten durch Hefen. II.

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UITZETTER, J . H. A. A., Bos, C. J . and VISSEK, J., 1982. Growth characteristics of Aspergillus nidulans mutants defective in carbohydrate metabolism. Ant. v. Leeuwenhoek, 48, 219—227. WEIDE, H., 1983. Mikrobielle Verwertung von Mischsubstraten. Sammelbericht. Z. allg. Mikrobiol., 23, 3 7 - 7 0 .

Anschrift: Prof. Dr. H. WEIDE, Ingenieurhochschule Kothen, Sektion Anlagenbau, WB Biologie, D D R 4370 K o t h e n , B e r n b u r g e r S t . 52—57

Zeitschrift f ü r allgemeine Mikrobiologie 24 (1984) 1, 32

Buchbesprechung T. M A N I A T I S , E. F . F B I T S C H and J . SAMBROOK, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, X + 545 S., 61 Abb., 28 Tab. Cold Spring Harbor, N. Y. 1982. Cold Spring Harbor Laboratory. So klar und einfach gentechnische Methoden auf dem Papier aussehen — der Teufel steckt auch hier im Detail. Und es gibt viele Details, und alle sind wichtig, und Schwierigkeiten im Detail setzen den Erfolg des Projekts aufs Spiel. Die Autoren dieses Buches, das aus einer Sammlung von Laboratoriumsprotokollen entstand, behandeln die meisten der Techniken und Prozeduren, die gegenwärtig zur Genklonierung angewendet werden. Das Buch enthält neben kurz gefaßten, leicht verständlichen theoretischen Grundlagen detaillierte Arbeitsvorschriften, die zu seiner direkten Benutzung auf dem Labortisch einladen. Dazu trägt auch die äußere Form des Werkes bei, das vom Verlag als Ringbuch in großer Schrift und mit übersichtlichem Text hergestellt worden ist. I m einzelnen beschreiben die 12 Hauptkapitel Wirts-Vektor-Systeme; Vermehrung und Erhaltung von Bakterienstämmen und Bakteriophagen; Isolierung von Phagen- und Plasmid-DNA; DN'AEnzymologie; Gelelektrophorese; Extraktion, Reinigung und Analyse von m R N A aus eukaryotischen Zellen; Synthese und Klonierung von cDNA; Einführung freier und in vitro verpackter DNA in Bakterienzellen; Konstruktion von Genombibliotheken; Identifizierung von Klonen mit rekombinanter DNA und deren Analyse; und schließlich Expressionsvektoren. Der Anhang enthält wichtige biochemische Techniken, Computerausdrucke der Sequenz, Restriktionsorte und -fragmente von pBR322 und eine Tabelle mit Informationen über häufig verwendete E. coliStämme. Das Buch ist in jeder Beziehung außerordentlich gründlich bearbeitet; es hat fast keine Druckfehler (einer, auf den aufmerksam gemacht werden sollte, befindet sich in Tabelle 4.1). Was enthält das Buch nicht ? Es konzentriert sich ausschließlich auf E. coli als Klonierungswirt. Man findet nichts über andere prokaryotische Klonierungssysteme und ebensowenig über eukaryotische Systeme. Aber dies erfordert wohl bereits einen getrennten Text. Mit dem vorliegenden Buch liegt ein ausgezeichnetes Hilfsmittel für alle vor, die gentechnische Methoden in der Forschung und im Unterricht anwenden. H. M A L K E (Jena)

Zeitschrift für allgemeine Mikrobiologie 24 (1984) 1, 33—40

(Sektion Biologie der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald, WB Molekularbiologie)

Molekularbiologische Charakterisierung der Genome v o n Candida spec. E H 15, Lodderomyces elongisporus CBS 2605, Pichia guilliermondii S 0 8 0 9 und Pichia guiltiermondii jp 1—61 G. KUNZE, M. HECKER u n d D.

BIRNBAUM

(Eingegangen am 13. 6. 1983) The D N A content of the nucleus of the yeast Candida rec. EH 15, Lodderomyces elongisporus CBS 2605, Pichia guillermondii S0809, Pichia guilliermondii fpl-61, and Saccharomyces cerevisiae D10 has been determined by renaturation kinetics. It was possible to make conclusions for the ploidy by measurements of the DNA content per cell and of the percentages of mitochondrial and plasmid DNA, respectively. From our data we conclude that Candida spec. EH 15 seems to be a diploid or a neuploid yeast containing a high value of mitochondrial DNA per total DNA. The kinetical complexity of the D N A is 8.1 X 109 D. We did not find any evidence for the existence of plasmid DNA. Lodderomyces elongisporus CBS 2605 in contrast to Candida spec. EH 15 seems to be a haploid strain with a small content of mitochondrial DNA. For the chromosomal DNA we found a relatively small kinetical complexity (7.4 x 109 D). Pichia guilliermondii S0809 is a haploid strain while the strain Pichia guilliermondii fpl—61 was found to be diploid. Only small differences exist between the kinetical complexity of the 9 respective DNAs (Pichia guilliermondii S0809 — 8.9 X 1 0 D ; Pichia guilliermondii fpl-61 — 9.4 x 109 D). Both contain likewise a small amount of mitochondrial. DNA. Saccharomyces cerevisiae D10 — our reference strain — shows the same qualities as those documentated in literature. In this strain we could determine plasmid DNA.

D a s Interesse an der Charakterisierung der Genome von H e f e n h a t in den letzten J a h r e n deutlich zugenommen. Das hängt damit zusammen, daß diese Organismen als E u k a r y o t e n zwar ein komplexeres Genom gegenüber dem Genom der P r o k a r y o t e n besitzen, das aber im Vergleich mit dem höherer Pflanzen und Tiere sehr klein ist und offenbar wesentlich weniger repetitive Sequenzen enthält ( B B I T T E N U . K O H N E 1968, G O L D B E R G et al. 1975). I n verschiedener Hinsicht d ü r f t e aber gerade die K e n n t n i s des Genoms von Pilzen einschließlich der Hefen von beträchtlichem Interesse sein, einerseits um Fortschritte bei der K e n n t n i s eukaryotischer Genome zu erhalten anderseits wegen der zunehmenden Bedeutung dieser Organismen in Hinblick auf ihre ökonomische N u t z u n g und der im Zusammenhang d a m i t notwendigen genetischen Manipulation. Wir wandten uns deshalb der Aufgabe zu, das Genom der industriell bedeutsamen Hefe Candida spec. E H 15 zu charakterisieren und vergleichsweise andere H e f e n wie Pichia guilliermondii, Lodderomyces elongisporus und die in genetischer Hinsicht gut erforschte Saccharomyces cerevisiae in die Untersuchungen einzubeziehen. Dabei versuchten wir, neben der chromosomalen D N A auch die DNA anderer genetischer Systeme (Mitochondrien-DNA, Plasmid-DNA) zu berücksichtigen. I m Ergebnis der Genomcharakterisierung, die vor allem mittels DNA-Reassoziationen u n t e r Einbeziehung solcher Methoden wie CsCl-Dichtegradientenzentrifugationen und CsCl/Ethidiumbromid-Dichtegradientenzentrifugationen durchgeführt wurde, sollten auch Aussagen über den Ploidiegrad der Hefen getroffen werden. Material und Methoden Stämme und Wachstumsbedingungen: Für die Untersuchungen wurden folgende Hefestämme verwendet: Candida spec. E H 15, Lodderomyces elongisporus CBS 2605, Saccharomyces cerevisiae 3

Z. allg. Mikrobiol., Bd. 24, H. 1

Zeitschrift für allgemeine Mikrobiologie 24 (1984) 1, 33—40

(Sektion Biologie der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald, WB Molekularbiologie)

Molekularbiologische Charakterisierung der Genome v o n Candida spec. E H 15, Lodderomyces elongisporus CBS 2605, Pichia guilliermondii S 0 8 0 9 und Pichia guiltiermondii jp 1—61 G. KUNZE, M. HECKER u n d D.

BIRNBAUM

(Eingegangen am 13. 6. 1983) The D N A content of the nucleus of the yeast Candida rec. EH 15, Lodderomyces elongisporus CBS 2605, Pichia guillermondii S0809, Pichia guilliermondii fpl-61, and Saccharomyces cerevisiae D10 has been determined by renaturation kinetics. It was possible to make conclusions for the ploidy by measurements of the DNA content per cell and of the percentages of mitochondrial and plasmid DNA, respectively. From our data we conclude that Candida spec. EH 15 seems to be a diploid or a neuploid yeast containing a high value of mitochondrial DNA per total DNA. The kinetical complexity of the D N A is 8.1 X 109 D. We did not find any evidence for the existence of plasmid DNA. Lodderomyces elongisporus CBS 2605 in contrast to Candida spec. EH 15 seems to be a haploid strain with a small content of mitochondrial DNA. For the chromosomal DNA we found a relatively small kinetical complexity (7.4 x 109 D). Pichia guilliermondii S0809 is a haploid strain while the strain Pichia guilliermondii fpl—61 was found to be diploid. Only small differences exist between the kinetical complexity of the 9 respective DNAs (Pichia guilliermondii S0809 — 8.9 X 1 0 D ; Pichia guilliermondii fpl-61 — 9.4 x 109 D). Both contain likewise a small amount of mitochondrial. DNA. Saccharomyces cerevisiae D10 — our reference strain — shows the same qualities as those documentated in literature. In this strain we could determine plasmid DNA.

D a s Interesse an der Charakterisierung der Genome von H e f e n h a t in den letzten J a h r e n deutlich zugenommen. Das hängt damit zusammen, daß diese Organismen als E u k a r y o t e n zwar ein komplexeres Genom gegenüber dem Genom der P r o k a r y o t e n besitzen, das aber im Vergleich mit dem höherer Pflanzen und Tiere sehr klein ist und offenbar wesentlich weniger repetitive Sequenzen enthält ( B B I T T E N U . K O H N E 1968, G O L D B E R G et al. 1975). I n verschiedener Hinsicht d ü r f t e aber gerade die K e n n t n i s des Genoms von Pilzen einschließlich der Hefen von beträchtlichem Interesse sein, einerseits um Fortschritte bei der K e n n t n i s eukaryotischer Genome zu erhalten anderseits wegen der zunehmenden Bedeutung dieser Organismen in Hinblick auf ihre ökonomische N u t z u n g und der im Zusammenhang d a m i t notwendigen genetischen Manipulation. Wir wandten uns deshalb der Aufgabe zu, das Genom der industriell bedeutsamen Hefe Candida spec. E H 15 zu charakterisieren und vergleichsweise andere H e f e n wie Pichia guilliermondii, Lodderomyces elongisporus und die in genetischer Hinsicht gut erforschte Saccharomyces cerevisiae in die Untersuchungen einzubeziehen. Dabei versuchten wir, neben der chromosomalen D N A auch die DNA anderer genetischer Systeme (Mitochondrien-DNA, Plasmid-DNA) zu berücksichtigen. I m Ergebnis der Genomcharakterisierung, die vor allem mittels DNA-Reassoziationen u n t e r Einbeziehung solcher Methoden wie CsCl-Dichtegradientenzentrifugationen und CsCl/Ethidiumbromid-Dichtegradientenzentrifugationen durchgeführt wurde, sollten auch Aussagen über den Ploidiegrad der Hefen getroffen werden. Material und Methoden Stämme und Wachstumsbedingungen: Für die Untersuchungen wurden folgende Hefestämme verwendet: Candida spec. E H 15, Lodderomyces elongisporus CBS 2605, Saccharomyces cerevisiae 3

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G . K U N Z E , M . HECKER u n d D . BIRNBAUM

D10, Pichia guilliermondii S0809 und Pichia guilliermondii fpl-61. Die Kultivierung dieser Hefen erfolgte in Vollmedium, das 1% Glucose, 4% Biomalz, 0,5% Hefeextrakt und 0,5% Pepton enthielt. Für die Markierung der Zellen mit H 3 32 P0 4 wurden diese im Minimalmedium nach K O W A L S K I u. F R E S C O (1971) angezogen. Isolation der chromosomalen DNA: Unmarkierte bzw. 32 P-markierte DNA wurde nach den Methoden von IVANOV et al. (1975) und P R I C E et al. (1978) isoliert. Nach mechanischem Aufbruch der Zellen mittels Trockeneis, Lysis mit SDS, Enteiweißung mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol und Behandlung mit Pankreas-RNase, Tl-RNase, a-Amylase sowie Pronase wurde die erhaltene DNA durch Hydroxyapatitchromatographie und CsCl-Dichtegradientenzentrifugation gereinigt und von der Mitochondrien-DNA getrennt. Durch Ultraschall (Labsonic; B R A U N , B R D ) konnte sie auf ein Molekulargewicht von ca. 0 , 4 x 1 0 6 D fragmentiert werden ( W O B U S 1 9 8 1 ) . DNA-Reassoziation: Die DNA-Reassoziationen wurden nach B R I T T E N et al. (1974), P R I C E et al. (1978) und W O B U S (1981) zwischen Cot-Werten von 0,1 und 500 bei 60 °C in 0,12 M Natriumphosphat-Puffer durchgeführt. Nach Trennung der einzelsträngigen von den doppelsträngigen Polynucleotidsequenzen mittels Hydroxyapatitchromatographie erfolgte die Messung der 32P-Markierung nach C L A U S E N ( 1 9 6 8 ) . Prozentuale Bestimmung des Mitochondrien-DNA-Gehaltes: Die quantitative Trennung der Mitochondrien-DNA von der chromosomalen DNA erfolgte mittels CsCl-Dichtegradientenzentrifugation nach H O L L E N B E R G et al. (1970). Nach Herstellung von Hefeprotoplasten durch Helikase (MARAZ U. S U I K 1981), Lysis dieser Protoplasten mit SDS und sofortiger CsCl-Dichtegradientenzentrifugation (BECKMAN-Spinco L2-65; Festwinkelrotor Typ 65; 43000 U/min; 48 h; 20 °C) wurden die erhaltenen Gradienten fraktioniert und der DNA-Gehalt der einzelnen Fraktionen mit Hilfe von Diphenylamin ( B U R T O N 1956) bestimmt. Plasmid-DNA-Isolation: Der qualitative Nachweis der Plasmid-DNA erfolgte nach LIVINGSTON u. K U F P E R ( 1 9 7 7 ) . Hierbei ist es möglich eventuell vorhandene Plasmid-DNA nach Anreicherung und anschließender CsCl/Ethidiumbromid-Dichtegradientenzentrifugation ( H O L L E R B E R G et al. 1976) bzw. Agarosegelelektrophorese von der chromosomalen und Mitochondrien-DNA zu trennen. Bestimmung des DNA-Gehaltes: Die DNA-Konzentration pro Zelle konnte nach den Methoden von B U R T O N ( 1 9 5 6 ) und G I L E S U. M Y E R S ( 1 9 6 5 ) bestimmt werden. Als DNA-Standard diente Heringssperma-DNA ( F E R A K ) . Ergebnisse Chromosomale

DNA

E i n e molekularbiologische Charakterisierung des Genoms bei H e f e n ist m i t t e l s D N A Reassoziationen möglieh (CHRISTIANSEN et al. 1971, 1972, LAUER et al. 1977, PRICE et al. 1978). Hierbei wird eine hohe K o n z e n t r a t i o n f r a g m e n t i e r t e r , u n m a r k i e r t e r sowie d e n a t u r i e r t e r chromosomaler D N A z u s a m m e n mit einer niedrigen K o n z e n t r a t i o n h o c h m a r k i e r t e r f r a g m e n t i e r t e r chromosomaler D N A m i t ähnlichen Eigens c h a f t e n (isoliert n a c h der gleichen Methode) bei b e s t i m m t e r T e m p e r a t u r u n d Zeit renaturiert. Mit Hilfe der Reassoziation lassen sich die kinetische K o m p l e x i t ä t der chromosomalen D N A (chromosomaler D N A - G e h a l t / h a p l o i d e m Genom), der Anteil der repetitiven u n d unikalen Sequenzen u n d die durchschnittliche R e p e t i t i o n s f r e q u e n z erm i t t e l n (WOBUS 1981) (Tab. 1). Als S t a n d a r d w u r d e die D N A von E. coli K 12 C 600 ( r - m " rec B, rec C, sbc B, thr, leu, thi) mit einer Genomgröße von 2,8 X 10 9 D (WOBUS 1981) eingesetzt, deren C o t i / 2 - W e r t mit 2,7 b e s t i m m t wurde. W ä h r e n d Candida spec. E H 15 u n d Lodderomyces elongisporus CBS 2605 im Vergleich mit a n d e r e n u n t e r s u c h t e n H e f e s t ä m m e n einen sehr hohen Anteil repetitiver Sequenzen besitzen (Candida spec. E H 15: 1 9 , 9 % ; Lodderomyces elongisporus CHS 2605: 15,5%), lassen sich in der durchschnittlichen Anzahl der repetitiven Sequenzen (Ni), deren C o t - W e r t e höher als 0,1 liegen, n u r geringe Unterschiede feststellen. Gleichzeitig besitzen die beiden g e n a n n t e n H e f e s t ä m m e mit 8,1 X 109 D (Candida spec. E H 15) u n d 7,4 X 10 9 D (Lodderomyces elongisporus CBS 2605) eine f ü r H e f e n relativ geringe kinetische K o m p l e x i t ä t der chromosomalen D N A .

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H5). Der als cyclischer Pentosephosphatweg ( P P W eye) ausgewiesene Anteil ist davon abgeleitet, daß das 2-C-Atom der Glucose erst nach Recyclisierung im P P W als 1-C decarboxyliert werden kann. Dabei fällt auf, daß bei 0 2 -limitiertem Wachstum von Stamm H im Gegensatz zur Abnahme des oxydativen P P W (1-C-Freisetzung) der cyclische P P W (2-C-Freisetzung) zunimmt. Bei H3 unterstreicht die unter (^-Limitation beobachtete Zunahme des cyclischen P P W den bereits im oxydativen P P W festgestellten Anstieg. Für H5 ist die Beteiligung des cyclischen P P W bei 0 2 -Limitation minimal und bei aerobem Wachstum überhaupt nicht mit Sicherheit nachweisbar. Addiert man die Glucose-Äquivalente, die über den oxydativen P P W decarboxyliert wurden mit den Glucose-Äquivalenten, die anschließend durch Recyclisierung erneut dem P P W zugeführt werden (schwarze Säulen in Abb. 2 u. 3), so können beim Vergleich der Stämme erhebliche Unterschiede festgestellt werden. Zusätzliche Unterschiede treten zwischen aerobem und 0 2 -limitiertem Wachstum auf (aerob: H > H3 > H 5 ; 0 2 -lim.: H3 > H > H5). Während bei Stamm H die Abnahme des oxydativen P P W durch Zunahme des cycl. P P W ausgeglichen wird, kommt es bei H3 unter 0 2 -limitierten Bedingungen sogar zu einer dreifachen Steigerung. Aus der

14

C-Inkorporation berechnete

Ertragskoeffizienten

Wird der Ertragskoeffizient für die produzierte Biomasse pro aufgenommene Hexose ermittelt (Tab. 3, FRA), SO treten bei Stamm H unter aeroben Bedingungen Abweichungen in Abhängigkeit von der C- und Energiequelle auf: Glc > Man > F r u ; bei H3 und H5 Man > Fru > Glc. Stamm H hat auf Glucose den höchsten, H3 und H5 hingegen den niedrigsten Ertragskoeffizienten. Bemerkenswert ist H5 mit 0,48 auf Mannose und 0,25 auf Glucose. Wird der Ertragskoeffizient für die produzierte Biomasse (FRA) ¡ n Beziehung gesetzt zu dem als Zellsubstanz fixierten Anteil des aufgenommenen radioaktiven Substratkohlenstoffs (Tab. 3, ^:KAmed 8 0 erhält man den Ertragskoeffizienten der Produktbildung nach 1 — F R A / ^ B A m e d ) ' i s t für alle 3 Stämme bei Wachstum auf Glucose am höchsten, wobei Stamm H5 im Vordergrund steht, der auch den niedrigsten TiiA-Wert resp. höchstens C0 2 /TM-Wert aufweist. Auf Mannose ist nur eine geringe Produktbildung bei Stamm H, nicht jedoch bei H3 und H5 zu beobachten. H5 zeigt auch auf Fructose keine Produktbildung, jedoch den höchsten C0 2 /TM-Wert. Bei Wachstum auf Fructose steht H3 mit höchstem y | A - W e r t und niedriger Produktund C0 2 -Bildung dem Stamm H gegenüber mit niedrigstem ZRA-Wert und relativ hoher Produktbildung. Der Ertragskoefizient für die Polysaccharidproduktion (Glycogen + Mannan) pro aufgenommene Hexose (Tab. 3, FRAG + M) zeigt, daß bei Wachstum auf Glucose Stamm H sowohl H3 als auch H5 überlegen ist. Bei Wachstum auf Mannose jedoch steht Stamm H an letzter Stelle. Der Anteil der G + M-Polysaccharid-Biosynthese an der Biosynthese der gesamten Biomasse ( FRAG + M/ Y?{A) ist bei Wachstum auf Mannose für Stamm H wesentlich niedriger als für H3 und H5, der auf Glucose resp. Fructose liegt wesentlich höher und übertrifft gemeinsam mit H5 den Stamm H3. Wird der Ertragskoeffizient für die Bildung der Fraktion P (Tab. 3, TRAP) ins Verhältnis gesetzt zum Ertragskoeffizienten der gesamten Biomasse ( YRAP/^RA), so erhält man auf Glucose für H3 und auf Fructose für H5 die größte Syntheseleistung.

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K a t a b o l e u n d anabole Sequenzen der K o h l e n h y d r a t v e r w e r t u n g in C. maliosa,

Tabelle 3 Aus d e m 1 4 C-Einbau berechnete Ertragskoeffizienten (Formel 6, 7 u n d 8) n a c h aerobem u n d 0 4 limitiertem W a c h s t u m auf Glucose, Mannose oder F r u c t o s e (Langzeit); = |j.mol Glc-Äquiv a l e n t e neu gebildete Zellsubstanz pro ptmol aus d e m Medium a u f g e n o m m e n e H e x o s e ; 7 j^""" 1 = = D P M als Zellsubstanz f i x i e r t e R a d i o a k t i v i t ä t pro D P M aus dem Medium a u f g e n o m m e n e r r a d i o a k t i v e r K o h l e n s t o f f ; T R A G + M = [¿mol Glc-Äquivalente neu gebildetes Glycogen + Mannan, F ^ ^ P = ¡¿mol Glc-Äquivalente neu gebildetes P r o t e i n etc. (Schema 1) pro [j.mol aufgen o m m e n e H e x o s e ; C 0 2 / T M = ¡xmol gebildetes C 0 2 pro mg Glc-Äquivalente neu gebildete Zellm a s s e ; k = lineare TM-Bildung bei 0 2 -limit. W a c h s t u m (¡¿mol Glc-Äquival. • h _ l • m l - ' ) Hexose

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Glucose

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H aerob 0 2 -lim. H3 aerob 0 2 -lim. H5 aerob 0 2 -lim. H aerob 0 2 -lim. H3 aerob 0 2 -lim. H5 aerob 0 2 -lim.

A

yRAm H5 der Glucose-Verwertung. Die Fructose-Verwertung gleicht mit C0 2 /TM:H < H5 und Produktbildung: H > H5 ebenfalls der GlucoseVerwertung. Der Anteil der Polysaccharid-Biosynthese an der Biomasse-Biosynthese ist unter 0 2 -Limitation auf Glucose und Fructose bei H3 niedriger als bei H und H5, wobei H von H5 übertroffen wird. Der Anteil der Fraktion P an der Biomasse-Biosynthese unter 0 2 -Limitation ist auf Glucose bei H höher als bei H3 und H5, auf Mannose sowie auf Fructose bei H5 am höchsten. 5*

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B. RÖBER u n d G. REUTEE

Diskussion Das Ende der logarithmischen Wachstumsphase von Candida maltosa H auf Hexosen als einziger C- und Energiequelle erfolgt durch Limitation des im Nährmedium gelösten Sauerstoffs, nachdem die entsprechende kritische Zellkonzentration erreicht ist. Es folgt lineares Wachstum. Die Ertragskoeffizienten, deren Mittelwerte aus der aeroben, logarithmischen Phase getrennt von der 0 2 -limitierten, linearen Phase in Tabelle 3 aufgeführt sind, zeigen in diesen Phasen weitgehende Konstanz, werden jedoch beim Phasenwechsel zum Teil beträchtlich beeinflußt. Der Phasenwechsel spiegelt sich auch wider, wenn gegen Ende der logarithmischen Phase (Glucose als C- und Energiequelle) Zellmaterial entnommen wird und in einem Versuch die 14 C0 2 Abgabe in Abhängigkeit von der Applikation unterschiedlich markierter Glucosen untersucht wird (Abb. 1, 2, 3). Durch geeignete Einstellung der Biomassekonzentration wurde in diesem Versuch der Phasenwechsel nach 30 min erreicht. Nach weiteren 30 min (0 2 -limitierte Phase) wurde das Zellmaterial nach Schema 1 aufgearbeitet und der Radioaktivitätseinbau in die Biopolymeren bestimmt (Tab. 1). Entsprechend t0 dieses Versuchs wurde Zellmaterial aus der logarithmischen Phase einer batch-Kultur mit Glucose, Mannose resp. Fructose als C- und Energiequelle verwendet, um die spezifische Aktivität einiger wesentlicher Enzyme des Kohlenhydrat-Metabolismus zu untersuchen. In allen Versuchen wurden Candida maltosa H und die daraus gewonnenen Mutanten H3 und H5 vergleichend untersucht. Die Biopolymeren-Markierung nach Applikation von Glucose, die in unterschiedlichen Positionen radioaktiv markiert ist, zeigt nach Tabelle 1, daß ein beachtlicher Teil der Hexosen erst nach Verlust von 1-14C und Regeneration im P P W in andere Sequenzen eingeschleust wird (Vergleich zwischen l- 14 C-Glc und U-14C-Glc in Tab. 1). Die Nutzung der im cyclischen P P W resynthetisierten Hexosen ist besonders ausgeprägt bei der Biosynthese von Polysacchariden, wie Mannan und Chitin, die in Fructose-6-Phosphat ein mit dem Grundstoffwechsel eng verbundenes Intermediat besitzen. Durch Recyclisierung im P P W werden außerdem sukzessiv die Atome C2 und C3 in die Position C1 resp. C2 gebracht. So erhöht sich nach Applikation von 2-14C-Glc oder 3,4-14C-Glc bei dem zunächst unvollständigen Abbau der Hexose die spezifische Radioaktivität des intrazellulären Hexosephosphats, so daß es gegenüber U-14C-Glc zu einem erhöhten Einbau in einige Polymeren-Fraktionen kommt. Dabei ist offensichtlich für die verschiedenen Polymere der Anteil der Biosyntheseleistung in Abhängigkeit von der Zelldifferenzierung unterschiedlich. Dies gilt ebenfalls für den Anteil kataboler Sequenzen am Glucose-Metabolismus, wobei eine gleichsinnige Veränderung nicht zu beobachten ist. Der gegenüber U-14C-Glc niedrigere Einbau von 3,4-14C-Glc in die Chitinfraktion ist auf ihren hohen Acetylanteil zurückzuführen, der demzufolge durch PyruvatDecarboxylierung bereitgestellt wird, so daß die markierten Atome der Glucose eliminiert werden. Durch Phosphoketolase freigesetzte C 2 -Fragmente, die 3- 14 C-Atome der Glucose enthalten (HÖFER et al. 1971), können somit für die Chitinbiosynthese nicht genutzt werden. Der Einbau von Glucose in die Polysaccharide nach Hexose-Resynthese im PPW setzt eine oszillierende PGI voraus. Fru-6P —» Glc-6P als bevorzugte Reaktionsrichtung könnte als Sonderfall bei völlig eingeschränkter Glycolyse auftreten. Die geringe spezifische Aktivität der Phosphofructokinase (Tab. 2) läßt den Schluß zu, daß der Glucoseabbau über Fructose-Bisphosphat weitgehend eingeschränkt ist und das via P P W entstandene Glycerinaldehyd-3P über die Endschritte der Glycolyse katabolisiert wird. Somit kommt dem P P W für die Bereitstellung von Energieäquivalenten eine besondere Bedeutung zu.

Katabole und anabole Sequenzen der Kohlenhydratverwertung in C. maltosa H

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Die Möglichkeit einer genotypisehen Beeinflussung des Kohlenhydrat-Metabolismus von Candida maltosa H k o m m t bereits bei den bemerkenswerten Abweichungen der M u t a n t e n in der Biopolymeren-Markierung (Tab.l) zum Ausdruck. Die drei S t ä m m e unterscheiden sich in dem während der Versuchszeit von 60 min erfolgten E i n b a u von U- 14 C-Glc in die Biopolymeren u n d in ihrem E i n b a u positionsmarkierter Glucose verglichen mit dem E i n b a u von U- 14 C-Glc. So zeichnet sich M u t a n t e H 3 in besonderer Weise durch ihre Fähigkeit aus, recyclisierte Hexose des P P W in Mannan sowie I n t e r m e d i a t e des P P W in die Verbindungen der P - F r a k t i o n einzubauen. I m Gegensatz zu H und H 3 k a n n H 5 bevorzugt l- 14 C-Glc in Mannan, Glucan, Chitin und F r a k t i o n P einbauen, d. h. recyclisierte Hexose wird offensichtlich nicht in allen Phasen der Zelldifferenzierung durch H 5 eingebaut. Dies steht im Einklang mit dem Ergebnis nach Applikation von 2- 14 C-Glc: I m Gegensatz zu H und H 3 erfolgt lediglich eine geringe Aktivitätserhöhung gegenüber U- 14 C-Glc im Glycogen. Eine A k t i v i t ä t s a b n a h m e bei 6- 1 4 C-Glc-Applikation gegenüber U- 14 C-Glc (H5 besonders in Glucan, jedoch auch in Chitin, Mannan und Glycogen: H in Mannan, Chitin und Glycogen; H 3 nur in Mannan) erfolgte, wenn durch Gluconeogenese aus Glycerinaldehyd-3P in der entstehenden Hexose die ehemaligen 6- 1 4 C-Atome symmetrisch auf 1-C und 6-C verteilt sind und so einer Decarboxylierung und Recyclisierung im P P W unterzogen werden. Den mit positionsmarkierter Glucose gefütterten und vorher auf Glucose gewachsenen S t ä m m e n standen E n z y m e des Kohlenhydrat-Metabolismus mit unterschiedlicher spezifischer A k t i v i t ä t zur Verfügung. N u r Phosphofructokinase zeigt unter allen untersuchten Bedingungen eine ausgesprochen niedrige spezifische A k t i v i t ä t und unterstreicht den bevorzugten Hexose-Katabolisnius über den P P W . S t a m m H hat die höchste Aktivität der Hexokinase, 6 P G - D H und P G I ; selbst die verglichen mit H 3 und H 5 niedrige G 6 P - D H ist noch höher als die 6 P G - D H . Dies steht im Einklang mit der bemerkenswert hohen Hexose-Recyclisierung über den P P W . Anders verhält sich H5. Die M u t a n t e zeigt niedrigste Aktivität der Hexokinase, 6 P G - D H und P G I . Dem entspricht eine geringe Beteiligung recyclisierter Hexosen am Einbau in die Polymeren. Die anabole F u n k t i o n der erhöhten P M I - A k t i v i t ä t von H 5 entspricht der eingeschränkten Lieferung von F r u - 6 P aus dem cyclischen P P W , (vgl. Tab. 1; U- 14 C-Glc: Niedrige Mannanbiosynthese in H5). Die Ergebnisse sind als Hinweis auf mögliche kausale Zusammenhänge zu werten, die durch weitere physiologische u n d enzymkinetische Untersuchungen gestützt werden müssen. Dies gilt auch f ü r die beobachteten Veränderungen der E n z y m a k t i v i t ä t e n bei Wechsel der C- und Energiequelle: N u r bei W a c h s t u m auf Mannose entspricht die Aktivität von 6 P G - D H der von G 6 P - D H ; auf Glucose und Fructose ist sie 3-6fach niedriger. Demnach k a n n 6 P G - D H die Rolle eines durch Glc oder F r u reprimierbaren Schrittmacherenzyms zukommen. J e nach radioaktiv markierter Position liefert Glucose in unterschiedlicher Weise 14 C0 2 (Abb. 1). Von den positionsmarkierten Glucosen liefert bei allen 3 S t ä m m e n 3,4- 14 C-Glc am meisten, 6- 14 C-Glc am wenigsten 1 4 C0 2 . Bildet m a n aus den Werten der Tabelle 1 die Summe der in die Biomasse eingebauten Glucoseäquivalente, so gilt bei allen 3 S t ä m m e n reziprok zur 1 4 CO a -Bildung f ü r 3,4- 14 C-Glc der niedrigste und f ü r 6- 14 C-Glc der höchste E i n b a u . Bei S t a m m H und H 3 liefert 2- 14 C-Glc wenig 14 C0 2 ,sie wird jedoch sehr gut eingebaut. Bei H 5 fällt der geringe E i n b a u von2- 1 4 C-Glc und die gleichzeitig geringe 1 4 C0 2 -Bildung auf. Die Werte der Abbildung I bilden die Basis f ü r die Berechnung der unterschiedlichen Beteiligung kataboler Sequenzen nach Formel (1) bis (5): Glycerinaldehyd-3P, das bei niedriger Phosphofructokinase-Aktivität vorwiegend aus dem P P W geliefert wird, k a n n über eine Teilsequenz der Glycose in P y r u v a t umgesetzt werden, das unter Decarboxylierung einerseits zu Acetyl-CoA, andererseits

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B . RÖBER u n d G . REUTEE

zu Äthanol abgebaut wird. Dieser in den Abbildungen 2 und 3 als „Glycolyse" bezeichnete Anteil der C0 2 -Abgabe wird bei 0 2 -Limitation und offensichtlich erhöhtem Glucose-Umsatz in allen drei Stämmen erhöht. Sowohl in dieser glycolytischen Sequenz als auch in der Summe aus oxydativem und cyclischem P P W steht unter aeroben Bedingungen S t a m m H an erster, S t a m m H 5 an letzter Stelle. Das Ausmaß des cyclischen P P W , abgeleitet von der Decarboxylierung nach Überf ü h r u n g von 2-C in 1-C der Hexose im Recyclisierungsprozeß, ist bei dem hohem Intermediatenbedarf f ü r Biosynthesen unter aeroben Bedingungen zunächst gering. Bei erhöhtem Glucose-Durchsatz unter 0 2 -limitierten Bedingungen erreicht der cyclische P P W in S t a m m H u n d H 3 die Größenordnung des oxydativen P P W . Ob dem sogar überhöhten Wert unter 0 2 -Limitation (Stamm H , Abb. 3) eine Bedeutung f ü r eine 2-C-Freisetzung außerhalb des P P W zukommt, bleibt zunächst offen. I m Gegensatz zu H und H 3 zeigt H 5 bereits aerob einen hohen Umsatz über den TCC. I n Übereinstimmung mit den Ergebnissen bei der Biopolymeren-Markierung sprechen die Versuche zur 1 4 C0 2 -Freisetzung bei H 5 im Vergleich mit H und H3 f ü r eine geringe Beteiligung des oxydativen P P W und f ü r eine fehlende Recyclisierung. Der hohe Umsatz über den TCC und über Glycolyse-Sequenzen bei eingeschränktem 1- 14 C-Verlust im oxydativen P P W und bei ausbleibendem cyclischen P P W sowie nahezu fehlender Phosphofructokinase läßt auf einen Nebenweg zur Bereitstellung von Glycerinaldehyd-3P schließen, das einerseits katabol umgesetzt wird, andererseits via Gluconeogenese zur symmetrischen Verteilung von 6-C auf 1-C und 6-C der Hexose f ü h r e n kann, entsprechend den besonders bei H 5 ausgeprägten Einbauverhältnissen nach Applikation von 6- 14 C-Glc. Die unter 0 2 -Limitation insbesondere bei H 3 und H 5 beobachtete Steigerung der Glucoseumsätze über den oxydativen P P W , über den TCC und über GlycolyseSequenzen k a n n auf eine partielle Repressionsdesensibilisierung der GlucoseE n d o x y d a t i o n zurückgeführt werden. Die aus der 1 4 C-Inkorporation berechneten Ertragskoeffizienten bestätigen die vorangestellten Versuchsergebnisse hinsichtlich der Unterschiede im Kohlenhydratmetabolismus in Abhängigkeit vom S t a m m , von C-und Energiequelle sowie von aerobem und 0 2 -limitiertem Wachstum. S t a m m H hat aerob auf Glucose den höchsten Ertragskoeffizienten, der zugleich den der beiden anderen S t ä m m e übertrifft. Auf Glucose wird auch die höchste Produktbildung erzielt; H 5 übertrifft dabei die anderen Stämme. Seine geringe E i n b a u möglichkeit f ü r 2- 14 C-Glc bei gleichzeitig geringer 1 4 C0 2 -Bildung d ü r f t e damit im Zusammenhang stehen. Die Prioritäten bei Ertragskoeffizienten und P r o d u k t b i l d u n g ä n d e r n sich mit der veränderten C- und Energiequelle sowie mit dem 0 2 -Angebot f ü r die Zellen. Dabei verhalten sich einzelne K o m p o n e n t e n der Biomasse nicht gleichsinnig: S t a m m H hat beispielsweise f ü r Mannan + Glycogen auf Glucose den höchsten Ertragskoeffizienten, auf Fructose den niedrigsten. Verglichen mit S t a m m H haben H 3 und H 5 bei aerobem Wachstum auf Mannose einen bedeutend höheren Ertragskoeffizienten f ü r die Gesamtbiomasse. Das gilt f ü r H 3 auch bei Wachstum auf Fructose. Offensichtlich lösen bei diesen Stämmen Mannose und Fructose keine Repression des aeroben Hexose-Stoffwechsels zugunsten eines fermentativen Hexoseabbaus aus. I n diesem Sinne k a n n auch die Erhöhung der Ertragskoeffizienten beim Übergang vom aeroben zum 0 2 -limitierten Wachstum auf Mannose oder Fructose bei S t a m m H sowie auf Fructose bei H 5 interpretiert werden. Die f ü r die lineare Trockenmassebildung k auf Glc in Tab. 3 veranschaulichte Reihenfolge H < H 3 < H 5 spiegelt sich im Ertragskoeffizienten der P r o d u k t b i l d u n g wider, deren Werte nach 1 — Y%Aj ebenfalls aus Tabelle 3 zu entnehmen sind: Hohe Produktbildung resp. hohe CO a -Bildung infolge ATP-entkoppelter E n d o x y d a tion der Hexose entspricht einer geringen Energieeffizienz des Stoffwechsels. D a r a u s

K a t a b o l e u n d anabole Sequenzen der K o h l e n h y d r a t v e r w e r t u n g in C. maltosa

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kann geschlossen werden, daß hohe Wachstumsgeschwindigkeiten repressionssensibler Hefen mit einem wenig energieeffizienten Metabolismus bei Wachstum auf reprimierenden Substraten verbunden sind. Darüber hinaus spiegeln sich die Unterschiede bei den linearen Wachstumsraten wider im unterschiedlichen Wachstum der Stämme auf verfestigten Nährmedien mit unterschiedlichen C- und Energiequellen (Mutantenselektionsmethode). Die vorliegenden Ergebnisse stehen in Einklang mit den bereits an anderen Mikroorganismen nachgewiesenen Zusammenhängen von ATP-Bereitstellung und Zells u b s t a n z s y n t h e s e ( P A Y N E 1 9 7 0 , DECKER el al. 1 9 7 0 , LAGUNAS 1 9 7 6 ) .

Abschließend ist festzustellen, daß durch ein umfangreiches Datenmaterial die Möglichkeit einer genotypischen und phänotypischen Variabilitätsbeeinflussung von Candida maltosa H im Hinblick auf seine Polymerenzusammensetzung bewiesen werden konnte. Die vorgestellten Ergebnisse und Methoden liefern eine Grundlage, unter Berücksichtigung von Polymeren-Zusammensetzung und Ertragskoeffizienten geeignete Mikroorganismen aufzufinden, die zu polyauxischer Substratverwertung geeignet sind.

Literatur u n d T H A U E R , R . K . , 1 9 7 0 . Wege der Energiegewinnung bei Anaerobiern. Angew. Chemie, 82, 153 — 173. E G L I , T H . , K Ä P P E L I , 0 . a n d F I E C H T E B , A., 1982a. R e g u l a t o r y flexibility of m e t h y l o t r o p h i c y e a s t s in c h e m o s t a t cultures: Simultaneous assimilation of glucose a n d m e t h a n o l a t a f i x e d dilution rate. Arch. Microbiol., 131, 1—7. E G L I , T H . , K Ä P P E L I , 0 . a n d F I E C H T E B , A., 1982b. Mixed s u b s t r a t e growth of m e t h y l o t r o p h i c y e a s t in c h e m o s t a t culture: Influence of t h e dilution r a t e on t h e utilization of a m i x t u r e of glucose a n d methanol. Arch. Microbiol., 131, 8 — 13.

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1869-1874.

A n s c h r i f t : Prof. Dr. G. REUTER, Sektion Biologie der Friedrich-Schiller-Universität — Mikrobielle Biochemie —, D D R 6900 J e n a , Wöllnitzer Str. 7

Zeitschrift f ü r allgemeine Mikrobiologie 24 (1984) I, 56

Buchbesprechung and C. M. B R O W N (Editors), Sediment Microbiology (Special Publications of the Society for General Microbiology; no. 7) V I I I + 234 S., 52 Abb. 36 Tab. London-New YorkSan Francisco-Sao Paulo-Sydney-Tokyo-Toronto 1982. Academic Press. $ 26.50. D . B. NEDWELL

Die Publikationen auf dem Gebiet der Gewässermikrobiologie in den letzten J a h r e n lassen deutlich erkennen, daß ein Verständnis der limnischen und marinen Ökosysteme nur dann möglich ist, wenn die mikrobiologischen Prozesse im Sediment in die Betrachtungen eingeschlossen werden. Zur Erkenntnis über die Bedeutung der Mikroorganismen in den Sedimenten haben sowohl Fortschritte bei der Kultur anaerober Mikroorganismen als auch neue Methoden zur Bestimmung der Stoffwechselaktivität unter ¿ra-siííi-Bedingungen wesentlich beigetragen. Angeregt durch das wachsende Interesse an diesem Gebiet veranstaltete die Ökologie-Gruppe der Gesellschaft für Allgemeine Mikrobiologie in England 1980 in Cambridge ein Symposium über Sedimentmikrobiologie. 8 Vorträge des Symposiums, die zum Teil beträchtlich erweitert und durch die Einbeziehung neuer Ergebnisse ergänzt worden sind, bilden den I n h a l t dieses Buches. Nach einem einleitenden Artikel über die ökologischen Bedingungen im Sediment folgt ein ausführlicher Beitrag über die Modellierung der Prozesse des Abbaus organischer Substanzen im Sediment. Dann werden Denitrifikation und Desulfurikation ausführlich behandelt. Auf den 3. und sicherlich wichtigsten terminalen Prozeß des anaeroben Abbaus organischer Substanzen in limnischen Gewässern, die mikrobielle Methanbildung, wird zwar in mehreren Artikeln eingegegangen, jedoch vermißt man ein eigenes Kapitel über die Methanogenese. Der interessante Versuch einer Bilanzierung der wichtigsten aeroben und aneroben Abbauprozesse der organischen Substanz im Sediment von Seen zeigt eindrucksvoll die Bedeutung der mikrobiellen Prozesse in den Sedimenten für die Stoffkreisläufe des gesamten Ökosystems. Die weiteren Artikel beschäftigen sich mit der mikrobiellen Aktivität in marinen Sedimenten, die mit Cellulose angereichert sind, mit den Wechselbeziehungen zwischen Bakterien und benthischen, wirbellosen Tieren im Sediment und mit der Umwandlung von Isoprenoid-Verbindungen im Oberflächensediment. Die Beiträge machen besonders deutlich, daß nur eine ökologische Betrachtungsweise unter Einbeziehung der zahlreichen komplizierten Wechselbeziehungen zu neuen Einsichten in dieses schwierige H a b i t a t führen kann, wobei eine interdisziplinäre Zusammenarbeit unerläßlich ist. Die meisten Artikel haben den Charakter von Übersichtsbeiträgen mit ausführlichen Literaturverzeichnissen und sind damit sowohl für den Gewässermikrobiologen als auch f ü r den Außenstehenden eine wertvolle Informationsquelle. Das Buch will keinen umfassenden Überblick über das Gesamtgebiet der Sedimentmikrobiologie vermitteln. Vielmehr war es das Anliegen der Herausgeber, wichtige Forschungsschwerpunkte darzustellen, Einsichten in die vielfältigen Probleme zu vermitteln und Anregungen f ü r weitere experimentelle Arbeiten zur Lösung der zahlreichen offenen Fragen zum besseren Verständnis der Mikrobiologie der Sedimente zu geben. J . HEYER ( J e n a )

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Kurze

Originalmitteilung

(Sektion Biologie, Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald) 3

H-Thymidininkorporation nach Isoleucinlimitation in „stringent" und „relaxed" kontrollierten Stämmen v o n Escherichia coli M . H E C K E K u n d A . SCHROETER

(Eingegangen am, 13. 6. 1983) Stringent and relaxed strains of E. coli subjected to isoleucine starvation were examined by followwing the incorporation of 3 H-thymidine into chromosomal DNA. After valine treatment to trigger an isoleucine deprivation (p)ppGpp is synthesized in the stringent strain only. Remarkable differences in the morphology of the amino acid starved cells of the stringent and relaxed strains can be observed. Upon isoleucine limitation 3 H-thymidine incorporation into DNA is reduced in both strains, but this inhibition is remarkably delayed in the relaxed strain. Our result show that the reduction of chromosomal DNA synthesis during amino acid limitation occurs also without ppGpp, but in the presence of ppGpp this process is accelerated. D i e durch d e n pleiotropen E f f e k t o r G u a n o s i n t e t r a p h o s p h a t (ppGpp) v e r m i t t e l t e ,,stringent control "ist für die A d a p t a t i o n v o n B a k t e r i e n an B e d i n g u n g e n der A m i n o s ä u r e l e m i t a t i o n v o n hervorragender B e d e u t u n g . D a b e i h a n d e l t es sich u m eine außerordentlich k o m p l e x e B e e i n f l u s s u n g verschiedenster Bereiche des M e t a b o l i s m u s , w o v o n der n e g a t i v e n K o n t r o l l e anaboler Prozesse w i e der S y n t h e s e v o n r R N A u n d ribosomaler P r o t e i n e sowie weiterer Translationsproteine, v o n Z e l l w a n d b e s t a n d t e i l e n oder M e m b r a n k o m p o n e n t e n eine Schlüsselrolle z u k o m m t (vgl. Ü b e r s i c h t e n bei GALLANT 1 9 7 9 , R I E D E L 1 9 8 3 , HECKER

1983).

Ü b e r die F u n k t i o n v o n p p G p p bei der R e g u l a t i o n der S y n t h e s e chromosomaler D N A v o n Escherichia coli liegen auf der anderen S e i t e k e i n e e i n d e u t i g e n B e f u n d e vor. Seit vielen J a h r e n ist b e k a n n t , d a ß unter d e n B e d i n g u n g e n einer Aminosäurelimit a t i o n auf Grund der v e r m i n d e r t e n P r o t e i n s y n t h e s e r a t e die I n i t i a t i o n der S y n t h e s e c h r o m o s o m a l e r D N A stark reduziert wird, w ä h r e n d die einmal b e g o n n e n e R e p l i k a tionsrunde abgeschlossen wird (LARK et al. 1963, MARSH U. HEPBURN 1980). E s erhebt sich die Frage, o b das unter d i e s e n B e d i n g u n g e n gebildete p p G p p in die n e g a t i v e K o n t r o l l e der D N A - S y n t h e s e e i n b e z o g e n ist. Zur Prüfung dieser Fragestellung wurden der „relaxed" Stamm von Escherichia coli CP79 (relA, ihr, his, arg, leu, thi) sowie sein „stringent" kontrollierter Partner CP78 (relA + , thr, his, arg, leu, thi) eingesetzt. Die Zellen wurden in Schüttelkultur bei 30 °C in einem synthetischen Medium nach MITCHELL und LUCAS-LENHARD (1980) bis zu einer optischen Dichte von 0,25 (SPEKOL mit Zusatzverstärker, V E B CARL ZEISS, Jena, 500 nm, Schichtdicke 1 cm) angezogen. Die unbehandelten Kontrollen wurden unter gleichen Bedingungen weiter kultiviert, während die Zellen zur Induktion eines Isoleucinhungers mit 1 oder 2 mg/ml L-Valin (vgl. H E C K E R et al. 1983 a) bzw. zur Hemmung der Proteinbiosynthese mit 50 oder 100 (ig/ml Chloramphenicol (CAP) versetzt worden sind. Zur Messung der DNA-Synthese wurden je 100 ¡xl Zellsuspension zu bestimmten Zeiten entnommen, 4 min mit 1 /iCi 3 H-Thymidin-(methyl) (spezifische Aktivität 5,4 Ci/mMol) inkubiert und der Einbau in Triehloressigsäure-fällbare Substanzen wie bei M A U S und NOVELLI (1961; vgl. H E C K E R et al. 1980) beschrieben, bestimmt. Der Nachweis von ppGpp erfolgte nach CASHELL et al. (1969; siehe H E C K E R et al. 1983 b). N a c h B e h a n d l u n g v o n E. coli C P 7 8 m i t Chloramphenicol w e r d e n die W a c h s t u m s u n d Vermehrungsprozesse eingestellt, wobei a u c h der 3 H - T h y m i d i n e i n b a u , der i m f o l g e n d e n als Maß für die D N A - S y n t h e s e g e w e r t e t w e r d e n soll, n a c h 120 bis 180 min

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H-Thymidininkorporation nach Isoleucinlimitation in „stringent" und „relaxed" kontrollierten Stämmen v o n Escherichia coli M . H E C K E K u n d A . SCHROETER

(Eingegangen am, 13. 6. 1983) Stringent and relaxed strains of E. coli subjected to isoleucine starvation were examined by followwing the incorporation of 3 H-thymidine into chromosomal DNA. After valine treatment to trigger an isoleucine deprivation (p)ppGpp is synthesized in the stringent strain only. Remarkable differences in the morphology of the amino acid starved cells of the stringent and relaxed strains can be observed. Upon isoleucine limitation 3 H-thymidine incorporation into DNA is reduced in both strains, but this inhibition is remarkably delayed in the relaxed strain. Our result show that the reduction of chromosomal DNA synthesis during amino acid limitation occurs also without ppGpp, but in the presence of ppGpp this process is accelerated. D i e durch d e n pleiotropen E f f e k t o r G u a n o s i n t e t r a p h o s p h a t (ppGpp) v e r m i t t e l t e ,,stringent control "ist für die A d a p t a t i o n v o n B a k t e r i e n an B e d i n g u n g e n der A m i n o s ä u r e l e m i t a t i o n v o n hervorragender B e d e u t u n g . D a b e i h a n d e l t es sich u m eine außerordentlich k o m p l e x e B e e i n f l u s s u n g verschiedenster Bereiche des M e t a b o l i s m u s , w o v o n der n e g a t i v e n K o n t r o l l e anaboler Prozesse w i e der S y n t h e s e v o n r R N A u n d ribosomaler P r o t e i n e sowie weiterer Translationsproteine, v o n Z e l l w a n d b e s t a n d t e i l e n oder M e m b r a n k o m p o n e n t e n eine Schlüsselrolle z u k o m m t (vgl. Ü b e r s i c h t e n bei GALLANT 1 9 7 9 , R I E D E L 1 9 8 3 , HECKER

1983).

Ü b e r die F u n k t i o n v o n p p G p p bei der R e g u l a t i o n der S y n t h e s e chromosomaler D N A v o n Escherichia coli liegen auf der anderen S e i t e k e i n e e i n d e u t i g e n B e f u n d e vor. Seit vielen J a h r e n ist b e k a n n t , d a ß unter d e n B e d i n g u n g e n einer Aminosäurelimit a t i o n auf Grund der v e r m i n d e r t e n P r o t e i n s y n t h e s e r a t e die I n i t i a t i o n der S y n t h e s e c h r o m o s o m a l e r D N A stark reduziert wird, w ä h r e n d die einmal b e g o n n e n e R e p l i k a tionsrunde abgeschlossen wird (LARK et al. 1963, MARSH U. HEPBURN 1980). E s erhebt sich die Frage, o b das unter d i e s e n B e d i n g u n g e n gebildete p p G p p in die n e g a t i v e K o n t r o l l e der D N A - S y n t h e s e e i n b e z o g e n ist. Zur Prüfung dieser Fragestellung wurden der „relaxed" Stamm von Escherichia coli CP79 (relA, ihr, his, arg, leu, thi) sowie sein „stringent" kontrollierter Partner CP78 (relA + , thr, his, arg, leu, thi) eingesetzt. Die Zellen wurden in Schüttelkultur bei 30 °C in einem synthetischen Medium nach MITCHELL und LUCAS-LENHARD (1980) bis zu einer optischen Dichte von 0,25 (SPEKOL mit Zusatzverstärker, V E B CARL ZEISS, Jena, 500 nm, Schichtdicke 1 cm) angezogen. Die unbehandelten Kontrollen wurden unter gleichen Bedingungen weiter kultiviert, während die Zellen zur Induktion eines Isoleucinhungers mit 1 oder 2 mg/ml L-Valin (vgl. H E C K E R et al. 1983 a) bzw. zur Hemmung der Proteinbiosynthese mit 50 oder 100 (ig/ml Chloramphenicol (CAP) versetzt worden sind. Zur Messung der DNA-Synthese wurden je 100 ¡xl Zellsuspension zu bestimmten Zeiten entnommen, 4 min mit 1 /iCi 3 H-Thymidin-(methyl) (spezifische Aktivität 5,4 Ci/mMol) inkubiert und der Einbau in Triehloressigsäure-fällbare Substanzen wie bei M A U S und NOVELLI (1961; vgl. H E C K E R et al. 1980) beschrieben, bestimmt. Der Nachweis von ppGpp erfolgte nach CASHELL et al. (1969; siehe H E C K E R et al. 1983 b). N a c h B e h a n d l u n g v o n E. coli C P 7 8 m i t Chloramphenicol w e r d e n die W a c h s t u m s u n d Vermehrungsprozesse eingestellt, wobei a u c h der 3 H - T h y m i d i n e i n b a u , der i m f o l g e n d e n als Maß für die D N A - S y n t h e s e g e w e r t e t w e r d e n soll, n a c h 120 bis 180 min

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M . HECKER u n d A . SCHROETER

vollständig gehemmt wird. ppGpp wird in Gegenwart von Chloramphenicol nicht gebildet (vgl. CASIIEL 1975; siehe T a b . 1, A b b . 1 und 2). Wird dagegen ein Isoleucinhunger durch F ü t t e r u n g mit L - V a l i n induziert, k o m m t es zur Induktion einer ppGppvermittelten „stringent response" (Abb. 1, siehe auch HECKER et al. 1 9 8 3 a ) . Das W a c h s t u m wird im Untersuchungszeitraum bis zu 2 4 0 min nach der Valingabe stark verzögert, aber nicht völlig ausgeschaltet, wobei sich die Zellen noch einmal teilen und ihr Volumen reduzieren (Tab. 1, vgl. GROSSMANN et al. 1982). Der 3 HThyniidineinbau sinkt zunächst noch schneller als nach CAP-Behandlung ab, bleibt dann aber auf einem bedeutend höheren Niveau stehen (Abb. 2).

ATP

||««•••«•

4

GTP

ppGpp pppGpp Origin 0

2

6

10 1260 0

2

6

10 126()

Abb. 1. Einfluß von L-Valin (1 mg/ml) sowie Chloramphenicol (100 (xg/ml) auf die Synthese von (p)ppGpp bei Escherichia coli CP78. 0, 2, 6, 10 und 1260 min nach Valinzusatz (linke Seite) bzw. Chloramphenicolzusatz (rechte Seite) wurde die Synthese von (p)ppGpp nach CASHEL et al. (1969) bestimmt. Unter Einfluß von Chloramphenicol bleibt die Bildung hoch phosphorylierter Guanosinnucleotide aus. D e r „ r e l a x e d " kontrollierte S t a m m C P 7 9 drosselt nach F ü t t e r u n g mit C A P in gleicher Weise wie sein „ s t r i n g e n t " kontrollierter P a r t n e r den 3 H - T h y m i d i n e i n b a u (Abb. 2). Auch bei der Induktion des Isoleucinhungers durch Valin läßt sich bei ausbleibender ppGpp-Bildung (vgl. HECKER et al. 1 9 8 3 a ) eine Hemmung des 3 HThymidineinbaus b e o b a c h t e n : I m Gegensatz zu C P 7 8 ist jedoch insgesamt eine verzögerte sowie geringere Reduktion d e s 3 H - T h i m i d i n e i n b a u s z u verzeichnen (Abb. 2). Die Zellen wachsen dabei im Untersuchungszeitraum von 2 4 0 min mit verminderter R a t e weiter, ohne sich noch einmal zu teilen (Tab. 1, siehe auch ISHIGURO U. RAMEY 1978, HECKER et al. 1983 b). Ähnliche Ergebnisse wurden erzielt, wenn die Zellen in die durch Aminosäurelimitation ausgelöste stationäre P h a s e des W a c h s t u m s eintreten. W ä h rend der S t a m m CP78 schon sehr frühzeitig nach Aminosäurehunger die D N A - S y n these abschaltet, ist sein P a r t n e r CP79 noch einige Stunden zum 3 H-Thymidineinbau in chromosomale D N A befähigt (Ergebnisse nicht dargestellt). Inwieweit diese Befunde

3

H-Thymidininkorporation nach Isoleucinlimitation in E. coli

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Abb. 2. Einfluß von Chloramphenicol (100 (ig/ml) (A) sowie L-Valin (1 mg/ml) (B) auf die 3 H-Thymidininkorporation in E. coli CP78 (®) und CP79 (o). Das unmittelbar vor der Valin- bzw. CAP-Zugabe gemessene Niveau der 3 H-Thymidininkorporation wurde gleich 100% gesetzt. Bezugsgröße: 3 H-Thymidineinbau in Trichloressigsäure-fällbare Substanzen (cpm) pro 100 [¿1 Zellsuspension (vgl. Wachstumsbedingungen im Untersuchungszeitraum in Tab. 1) Tabelle 1 Einfluß einer durch Valin induzierten „stringent control" auf Wachstum und Vermehrung von E. coli CP 78 und CP 79. Zum Zeitpunkt t0 wurde logarithmisch wachsenden Zellen 1 mg/ml bzw. 2 mg/ml L-Valin zugesetzt. Zeit

Bedingungen

0 . D.500 nm

Titer/ml

durchschn. Länge d. Zellen