Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie: Volume 24, Number 10 [Reprint 2021 ed.] 9783112566008, 9783112565995

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ZEITSCHRIFT FÜR ALLGEMEINE MIKROBIOLOGIE AN INTERNATIONAL JOURNAL ON MORPHOLOGY, PHYSIOLOGY, GENETICS, AND ECOLOGY OF MICROORGANISMS VOLUME 24 • 1984 • NUMBER 10

S^ ISSN 0044-2208

AKADEMIE-VERLAG • BERLIN Z. allg. Mikrobiol., Berlin 24 (1984) 10, 665-744

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M

Instructions to Authors 1. The journal publishes original papers, short communications, and review articles. Submission of a paper implies that it has not been published or has not been submitted for publication elsewhere. Manuscripts should be sent in duplicate with one set of the original illustrations to the Editor-in-Chief: Prof. Dr. U. Taubeneck, DDR-6900 Jena, Beutenbergstr. 11. 2. Manuscripts should preferably been written in English but may also be submitted in German. They should be typed double-spaced and be accompanied by a title page comprising: name and address(es) of the institution(s) where the work was done, title of the paper, and the complete name(s) of the author(s). Each paper must begin with a brief summary in English. Original papers should be divided into sections headed: Introduction, Materials and Methods, Results, Discussion, Acknowledgements, and References. A short title for use as running head should be provided. The exact mailing address of the author to whom correspondence, reprint requests etc. are to be addressed must be given at the end of the paper. 3. Tables, illustrations, and descriptive legends of the illustrations must be submitted on separate sheets. Each table should have a heading. The size of illustrations should not exceed the maximum printing area of 12 cm X 19 cm or 4.7 inches X 7.5 inches, respectively. 4. Literature citations in the text should be by author and year of publication. If there are more than two authors, only the first should be named, followed by "et al.". References should include only publications cited in the text. They should be given in alphabetical order: a) Books:

Family name(s) and initials of author(s), year of publication. Title of the book. Volume and Edition. Publisher and place of publication, e. g.: B e b t h e l i n , J . , B e l g y , G. a n d M a g n e , R . , 1977. S o m e a s p e c t s of t h e m e c h a n i s m

of solubilization and insolubilization of uranium from granites by heterotrophic microorganisms. I n : Bacterial Leaching Conference (W. Schwartz, Editor), pp. 261—270. Verlag Chemie Weinheim. b) Journals: Family name(s) and initials of author(s), year of publication. Title of the paper. Abbreviated name of the journal, volume (underlined), number of the first and last page, e.g.: K A p p e l i , 0 . , M u l l e r , M. a n d F i e c h t e r , A . , 1978. C h e m i c a l a n d s t r u c t u r a l a l t e r a -

tions at the cell surface of Candida tropicalis, induced by hydrocarbon substrate. J . Bacterid., 183, 952—958.

6. Galley proofs will be sent to the author in duplicate. One of them should be corrected and returned to the Editor-in-Chief or to Redaktion der Zeitschrift fur Allgemeine Mikrobiologie, DDR-6900 Jena, Beutenbergstr. 11, as soon as possible. 6. 100 reprints of each paper are provided free of charge. Additional reprints may be purchased at cost price.

ZEITSCHRIFT FÜR ALLGEMEINE MIKRO - BIOLOGIE AN

INTERNATIONAL

JOURNAL

von:

W. Frilschc, Jena G. F. G a n s e , M o s k a u 0 . Hoff n i a n n - O s t e n h o f ,

Wien

A. A. I n i s c n e c k i i , M o s k a u K. W . K a p l a n , F r a n k f u r t / M . F. Mach, Greifswald 1. Mälek, P r a g W . Schvvarlz, B r a u n s c h w e i g C. W c i b u l l , L u n d

ON

M O R P H O L O G Y . PHYSIOLOGY. GENETICS. AND ECOLOGY 01

hhraus

•^lOtD-^OO 10 M ^ io h

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O io 00 o ft ). The p l a s m a m e m b r a n e was identified by the presence of particles (> to 12 run in size.

Fig. 7. Freeze-etched replica of a growing spheroplast after 4 days of incubation. Multiple cisternae of the photosynthetic apparatus (arrows) are arranged in 8 parallel layers. Fixed with 1.5% glutaraldehyde, immersed in 30% glycerol. Magnification: 35.000 X

G r o w t h a n d regeneration of blue-green alga spheroplasts

685

Fig. 8. Electronmicrograph of t h e residual wall layer in spheroplast of a blue-green alga A. nidulans lysis by distilled w a t e r . Shadowed b y p l a t i n u m . Magnification: 35.000 x

after

Spheroplasts usually contained thylakoid cisternae concentrically situated (Fig. 6). Fresh spheroplasts had 2 to 4 thylakoids (Fig. 6). The growing spheroplasts possessed up to 8 thylakoids arranged parallel to the spheroplast surface under the plasma membrane; occasionally they were placed in the middle of the spheroplasts (Fig. 7). Close to them small vesicles were observed. The preparations of isolated surfaces of growing spheroplasts shadowed by platinum showed that these wall structures keep the isodiametrical shape of spherically growing spheroplasts even after their osmotic lysis. This demonstrates some degree of rigidity of newly formed wall structure. Furthermore, electron microscopy proved that newly synthesized amorphous wall material (Fig. 9) was added to the residual wall layer (Fig. 8) resembling amorphous wall surface of original cells (Fig. 10). This gives evidence of the synthesis and assembly of a new cell wall, even though incomplete, during the spheroplast growth in liquid media.

Discussion In blue-green algae lysozyme treatment degrades a peptidoglycan wall component (DREWS and MEYEB 1964) thus giving rise to spheroplasts that possess remnants of the cell wall on their surfaces, as shown by LINDSAY et al. (1971).

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M. GABRIEL

Fig. 9. E l e c t r o n m i c r o g r a p h of i s o l a t e d i n c o m p l e t e cell wall r e g e n e r a t e d in g r o w i n g s p h e r o p l a s t in n u t r i e n t m e d i u m . T h e p i c t u r e was t a k e n a f t e r 3 - d a y s of c u l t i v a t i o n . T o t h e residual wall l a y e r s o m e a m o r p h o u s wall m a t e r i a l w a s a d d e d . M a g n i f i c a t i o n : 2 2 . 0 0 0 X F i g . 10. E l e c t r o n m i c r o g r a p h of A.nidulanx

cells, f i x e d w i t h g l u t a r a l d e h y d e , d e h y d r a t e d b y a c e t o n e a n d

p h o t o g r a p h e d in s c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p e . M a g n i f i c a t i o n : 1 0 . 0 0 0 X

The residual wall layer, which was described by G O L E C K I ( 1 9 7 7 ) in A. nidulans cells withthe use of freeze-etehing and negative staining was designated " o u t e r m e m b r a n e " and it probably consisted of the remnants of so-called plastic layer of the cell wall composed of lipopolysaccharides and proteins that had been earlier isolated from the blue-green algae walls and studied by chemical methods (HÖCHT et al. 1965, DRKWS a n d ( J O L L W I T Z E R 1 9 6 5 , W E I S E et al.

1970). W e m a d e an a t t e m p t to r e m o v e this resi-

dual layer by treating spheroplasts with a mixture of snail enzymes, trypsin, pronase and lipase (GABRIEL, unpublished data). This procedure, however, was not successful and did not yield protoplasts. We cannot explain satisfactorily the fact that spheroplasts died soon after their transfer from the medium with lysozyme into the medium without lysozyme by means of centrifugation, as shown in Fig. 11. Spheroplasts showed no damage immediately after centrifugation of about 1000 g as it can be seen with higher centrifugation gravit y . Nevertheless, these spheroplasts died during 48 hours. The direct destruction of spheroplast structure during centrifugation can be the cause. The fact that egg-white prepared spheroplasts could survive longer than those prepared by pure lysozyme can be explained by a " p r o t e c t i v e " effect of egg proteins.

days F i g . 11. V i a b i l i t y o f .-I. nidutuns

s p h e r o p l a s t s in l i q u i d m e d i a : A - - l y s o z y m e

removed from

spiu-roplast.

s u s p e n s i o n b y r e p e a t e d e e n t r i f u g a t i o n a t 2 . 8 5 0 x g f o r 10 m i n b y t h r e e w a s h i n g s w i t h o s m o t i c s t a b i l i z e r . C u l t i v a t i o n in l i q u i d o s m o t i c a l l y s t a b i l i z e d m e d i u m ( B O U R R E L L Y ' S m e d i u m ) ; • — l y s o z y m e r e m o v e d b y repeated eentrifugation at 1000 X g for 10 min b y t h r e e washings with o s m o t i c stabil i z e r . C u l t i v a t i o n i n l i q u i d o s m o t i c a l l y s t a b i l i z e d BOURRELLY'S m e d i u m ; • — e g g - w h i t e l y s o z y m o r e m o v e d b y g r a d u a l d i l u t i o n a n d r e m o v a l o f o s m o t i c a l l y s t a b i l i z e d n u t r i e n t m e d i u m a t (> h o u r intervals and

b y a d d i n g n e w o s m o t i c a l l y s t a b i l i z e d BOURRELLY'S m e d i u m w i t h o u t l y s o z y m e

T h e results of this study contribute to the information previously obtained on the min to 2.5 hour's survival of blue-green alga spheroplasts ( V A N C H and W A R D 1 9 ( > 9 , BKJGIISS 1 9 ( 1 7 , (Jrsrcv d al. 1 9 7 0 , L I N D S A Y at at. 1 9 7 1 ) by demonstrating that 9 5 % of viable spheroplasts can be obtained most of them survive for 3 days, some of them for 8 days. These spheroplasts are capable of growing and synthesizing the incomplete cell wall in liquid media. Cultured spheroplasts showed up to a 40-fold increase in volume (luring 8 days, but this was not brought about by osmotic changes. The growing spheroplasts differed markedly from the rest of the population by their increased index of refraction and by the presence of a higher number of thylakoid cisternae in the cytoplasm. These results are in contrast to those of C R K K P I at al. ( 1 9 ( > 2 ) , G R O D Z I N S K I and C'OI.MAN (1973) and B A I ' L I N A at al. (1975) who reported a loss of viability accompanying the conversion of cells to spheroplasts in blue-green algae. .'50

The growing spheroplasts were able to synthesize new components of the cell wall and assemble incomplete wall of amorphous appearance resembling ultrastructurally normal cell wall of cells. This incomplete wall differed from membrane-like character of residual wall layer found in fresh spheroplasts. New incomplete wall was more rigid than the residual wall layer, as evidenced by the behaviour of spheroplasts in hypotonic media, in which they burst without a previous enlargement of their volume. Moreover, newly synthesized incomplete walls revealed a certain rigidity demonstrated by keeping the original isodiametrical shape of growing spheroplasts. Because in prokaryotic cells mainly peptidoglycan is responsible for the rigidity of the wall, it is probable that also this polymer is newly synthesized in blue-green alga spheroplasts. One of the reasons for the failure to attain the regeneration of structurally and functionally complete cell walls may be that blue-green alga spheroplasts may require

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31. G A B R I E L

special regeneration gel media like bacterial or b u d d i n g yeast p r o t o p l a s t s ( N H C A S 1 9 6 1 , L A N D M A N N et al. 1 9 0 8 ) p r e v e n t i n g the diffusion of soluble wall polymers f r o m t h e spheroplast's surface. Our hypothesis is s u p p o r t e d by similar findings as reported in this p a p e r obtained in liquid media of various composition ( G A B R I E L , unpublished d a t a ) a n d also with growing s p h e r o p l a s t s of other blue-green alga strain, Spirulina platensis ( G A B R I E L a n d G R O C I I , unpublished d a t a ) . Our preliminary results with modification of gel media for cultivation of blue-green alga spheroplasts suggest t h a t this a p p r o a c h could be successful. S t r u c t u r e s resembling t h e reversion of isodiametrical spheroplasts into rod-like r e v e r t a n t s were occasionally f o u n d d u r i n g the incubation of spheroplasts in a thin layer of 2" H agar medium. I t can be concluded t h a t viable s p h e r o p l a s t s of the blue-green alga A. nidulans are o b t a i n e d by egg-white lysozyme t r e a t m e n t in n u t r i e n t medium t h a t survive for 3 to 10 days, grow a n d regenerate new wall c o m p o n e n t s . However, only regeneration of incomplete wall occurs in liquid media u n a b l e to p r o m o t e reversion of s p h e r o p l a s t s to cells. References BAULINA,

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Z e i t s c h r i f t f ü r allgemeine Mikrobiologie 24 (1984) 10, 090

Buchbesprechungen J . D. Bü'LOCK a n d A. J . BU'LOCK (Editors), F e r m e n t a t i o n R e s e a r c h 1, T h e A c e t o n e - B n t a n o l F e r m e n t a t i o n a n d R e l a t e d Topics 1 9 8 0 - 1 9 8 3 . 139 S., 42 A b b . , 33 T a b . K e w / S u r r c y 1983. Science a n d Technology L e t t e r s / B i o t e c h n o l o g y Letters. I S B N : 0-94(i(i82-00-3 Der erste B a n d einer n e u e n Reihe, die es sich zur A u f g a b e g e m a c h t h a t . über neue und interess a n t e E n t w i c k l u n g s t e n d e n z e n der Biotechnologie zu berichten, e n t h ä l t 22 Einzelbeiträge über die mikrobielle A c e t o n - B u t a n o l - F e r m e n t a t i o n . E r s t e B e d e u t u n g e r l a n g t e n diese V e r f a h r e n in den dreißiger u n d vierziger J a h r e n in den USA u n d J a p a n zur G e w i n n u n g von A u s g a n g s s u b s t a n z e n f ü r die chemische G r o ß i n d u s t r i e . Die E n t w i c k lung der Petrolchemie, v e r b u n d e n mit den niedrigen R o h s t o f f p r e i s e n , ließen diese E n t w i c k l u n g e n schnell in Vergessenheit g e r a t e n . In letzter Zeit r ü c k e n diese alten Technologien u n d V e r f a h r e n e r n e u t in den M i t t e l p u n k t des Interesses, zumal neuere T e n d e n z e n auf dem Gebiet der S t a m m e n t wicklung u n d d a m i t R o h s t o f f v e r w e r t u n g h o f f n u n g s v o l l e Aussichten e r ö f f n e n , diese mikrobiellen V e r f a h r e n besonders u n t e r d e m Aspekt des G e s a m t e n e r g i e a u f w a n d e s ökonomisch zu gestalten. Die Einzelbeiträge, die als Originalarbeiten in den Biotechnology L e t t e r s im Z e i t r a u m 1980 — 1983 erschienen sind, geben einen z u s a m m e n f a s s e n d e n Ü b e r b l i c k über den bis zu diesem Z e i t r a u m err e i c h t e n S t a n d auf diesem speziellen Gebiet der Biotechnologie. Dieser R e v i e w resultiert aus d e m weltweiten I n t e r e s s e a n der A c e t o n - B u t a n o l - F e r m e n t a t i o n als potentieller Beitrag zur Energieu n d Resourcetechnologie u n d m u ß im Z u s a m m e n h a n g m i t n e u e n biowissenschaftlichen u n d biotechnologischen E n t w i c k l u n g s r i c h t u n g e n gesehen werden. U n t e r diesem A s p e k t stellt- der vorliegende B a n d eine ausgezeichnete Z u s a m m e n s t e l l u n g der r e l e v a n t e n Originalarbeiten einschließlich einer u m f a n g r e i c h e n Bibliographie dar. M . HILLTGER

A. Fi ECHTER (Editor), D o w n s t r e a m Processing. 202 S., 72 Abb., 18 T a b . Berlin 1983. Verlag. M 88,00.

(Jena)

Akademie-

D e r Akademie-Verlag m a c h t m i t d e m N a c h d r u c k der S c h r i f t e n r e i h e ..Advances in Biochemical E n g i n e e r i n g / B i o t e c h n o l o g y " einem breiten Leserkreis wichtige Ü b e r s i c h t s a r t i k e l zum neuesten S t a n d der A n w e n d u n g von Forschungsergebnissen aus den Gebieten Biochemie, Mikrobiologie. Molekularbiologie sowie Biotechnologie zugänglich. Der vorliegende 26. B a n d der Originalreihe, leider wenig glücklich mit „ D o w n s t r e a m P r o c e s s i n g " betitelt, d e m o n s t r i e r t mit den e n t h a l t e n e n vier Artikeln die Vielfalt dieser Zeitschrift. W ä h r e n d im ersten Artikel die Möglichkeiten der Bild u n g von P r o t e i n p r ä z i p i t a t e n u n d ihres Nachweises mittels Z e n t r i f u g a t i o n vorgestellt und diskut i e r t w e r d e n ( A u t o r e n BELL, HOARE, DUNNILL), wird im zweiten B e i t r a g die ¡Methode der Ultraf i l t r a t i o n u n d ihre A n w e n d u n g zur T r e n n u n g von B i o k a t a l y s a t o r e n a u s f ü h r l i c h beschrieben (Autor e n FLASCHHL. W A N D R E Y , K U B A ) . ESSER u n d LANG-HINRICHS d a g e g e n g e b e n e i n e a l l g e m e i n e Ü b e r -

sieht zum bisherigen S t a n d der molekularen K l o n i e r u n g von D N S in heterologen S y s t e m e n u n d deren p r a k t i s c h e n A n w e n d u n g . Schließlich gibt der letzte Beitrag dem Leser die Möglichkeit, sich einen Ü b e r b l i c k über die Biosynthese von ^ - T r y p t o p h a n , deren R e g u l a t i o n sowie über den S t a n d der mikrobiellen T r y p t o p h a n p r o d u k t i o n in der W e l t zu verschaffen. Es ist zu e r w a r t e n , d a ß diese Reihe einen b r e i t e n Leserkreis f i n d e n wird. ( ! . BARTH ( J e n a )

Z e i t s c h r i f t f ü r a l l g e m e i n e M i k r o b i o l o g i e 24 (1984) 10, 691 - 7 0 1

( B e r e i c h B i o c h e m i e der S e k t i o n B i o w i s s e n s c h a f t e n der K a r l - M a r x - U n i v c r s i t ä t L e i p z i g u nd P h y s i o l o g i s c h - c h e m i s c h e s I n s t i t u t der M a r t i n - L u t h e r - U n i v e r s i t ä t H a l l e - W i t t e n b e r g 2 )

A u f n a h m e u n d O x i d a t i o n v o n Monosacchariden bei Acinetobacter calcoaceticus1) H.-L\ KI.EÜER, (Hingegangen

I). HAFERBURG, O. ASPERGER, M . SCHMIDT

am 20. 3.

und

H.

Armen2

1984)

Acinetobacter calcoaceticun (S9-V is not a b l e t o g r o w on c a r b o h y d r a t e s or its d e r i v a t i v e s a n d t o use t h e m as sole c a r b o n sources. On t h e o t h e r h a n d , t h e p a r t i a l o x i d a t i o n o f s e v e r a l m o n o s a c c h a r i d e s (glucose, g a l a c t o s e , m a n n o s o , x y l o s e , a r a b i n o s e , r i b o s e ) b y i n t a c t cells has been d e m o n s t r a t e d b y acid production and measurements of o x y g e n consumption. Glucose a n d f r u c t o s e are t a k e n up b y i n t a c t cells. D i f f e r e n t t r a n s p o r t s y s t e m s exist f o r t h e uptake o f b o t h hexoses. T h e " a p p a r e n t " i f \ [ - v a l u e s f o r t h e m e m b r a n e t r a n s p o r t a m o u n t t o 1.5 • l O - 3 a n d 1.7 • 1 0 _ l moles/1 f o r glucose a n d f r u c t o s e , r e s p e c t i v e l y . G l u c o n o l a c t o n o n l y i n h i b i t s t h e transp o r t of glucose, w h e r e a s t h e t r a n s p o r t o f b o t h hexoses is i n h i b i t e d b y u r a n y l a c e t a t e . O t h e r m o n o s a c c h a r i d e s a n d m e t a b o l i c i n h i b i t o r s are w i t h o u t e f f e c t . A n e x c h a n g e o f i n t r a c e l l u l a r a g a i n s t e x t r a c e l l u l a r g l u c o s e has n o t been f o u n d . G l u c o n a t e a n d C 0 2 h a v e been i d e n t i f i e d as e x t r a c e l l u l a r p r o d u c t s o f g l u c o s e o x i d a t i o n a f t e r an i n c u b a t i o n p e r i o d o f m o r e t h a n 5 m i n . w h e r e a s g l u c o n a t e a n d (>-phosphogluconate h a v e b e e n d e t e c t e d as i n t r a c e l l u l a r p r o d u c t s . N o o x i d a t i o n p r o d u c t s h a v e b e e n f o u n d using f r u c t o s e as s u b s t r a t e . X o a c t i v i t y o f h c x o k i n a s e . p h o s p h o f r u c t o k i n a s e , p y r u v a t e kinase, a n d 6 - p h o s p h o g l u c o n a t e d e h y d r o g e n a s e h a v e been d e t e c t e d in cell-free e x t r a c t s o f s o n i c a t e d cells. A n a l d o s e d e h y d r o g e n a s e c o u p l e d w i t h an e l e c t r o n t r a n s p o r t s y s t e m occurs in t h e m e m b r a n e f r a c t i o n . T h e presence o f this e n z y m e was d e m o n s t r a t e d b y t h e r e d u c t i o n o f d i c h l o r o p h e n o l i n d o p h e n o l as w e l l as b y o x y g e n cons u m p t i o n w h i c h is i n h i b i t e d b y c y a n i d e . T h e aldose dehydrogenase exhibits a broad substrate specificity against different aldohexoses a n d a l d o p e n t o s e s d i f f e r i n g b y their / f j i - v a l u e s . C y t o c h r o m e b a n d t h e t e r m i n a l o x i d a s e c y t o c h r o m e o are c o m p o n e n t s o f t h e e l e c t r o n t r a n s p o r t s y s t e m . N e i t h e r h y d r o g e n p e r o x i d e is f o r m e d , n o r p y r i d i n e n u c l e o t i d e s p a r t i c i p a t e in aldose d e h y d r o g e n a t i o n .

Untersuchungen über die V e r w e r t u n g v o n Glucose als einziger C-Quelle durch die Gattung Acinetobacter lieferten in der Vergangenheit widersprüchliche Ergebnisse. I n früheren taxonomischen Studien wurde die U n f ä h i g k e i t zur Glucose Verwertung, d. h. zum W a c h s t u m mit Glucose als C-Quelle, für ein Charakteristikum Oxidase-negativer Moraxellen — zu denen Acinetobacter gezählt wurde — angesehen (BAUMANN et al. 19(i8). N a c h den jetzigen systematischen Festlegungen gehört das Genus Acinetobacter zur F a m i l i e der Neisseriaceae (BERGEY 1974, JUNI 1978), zu deren Haupteigenschaften auch die Ü x i d a s e - N e g a t i v i t ä t zählt. Auf der anderen Seite konnte gezeigt werden, daß es auch S t ä m m e von Acinetobacter gibt, die auf Glucose wachsen, zumindest aber aus Glucose Säure bilden können (HENDERSON 1967, JUNI 1972, KAPLAN II. ROSENHEIM) 1982). COOK und FEWSON (1973) wiesen f ü r den von ihnen benutzten Teststamm v o n A. calcoaceticus (früher Bacterium N . C. I. B. 8250) nach, daß die Zellen für Monosaccharide und Monosaccharidphosphate impermeabel sind. Die Unfähigkeit zum Transport der Zucker diskutierten sie als mögliche Ursache für die NichtVerwertung von K o h lenhydraten durch diesen Stamm. Auf der anderen Seite ist seit langem bekannt, daß bestimmte AcijietobacterSt&mme Glucose-metabolisierende E n z y m e , wie die Glucosedehvdrogenase, durchaus enthalten können (HAUGE 19(>0a und b), ohne daß sie mit Glucose zu wachsen v e r m ö g e n . ' ) H e r r n P r o f . D r . sc. m e d . HORST FRUNDKR, J e n a , z u m 05. G e b u r t s t a g g e w i d m e t .

Z e i t s c h r i f t f ü r a l l g e m e i n e M i k r o b i o l o g i e 24 (1984) 10, 691 - 7 0 1

( B e r e i c h B i o c h e m i e der S e k t i o n B i o w i s s e n s c h a f t e n der K a r l - M a r x - U n i v c r s i t ä t L e i p z i g u nd P h y s i o l o g i s c h - c h e m i s c h e s I n s t i t u t der M a r t i n - L u t h e r - U n i v e r s i t ä t H a l l e - W i t t e n b e r g 2 )

A u f n a h m e u n d O x i d a t i o n v o n Monosacchariden bei Acinetobacter calcoaceticus1) H.-L\ KI.EÜER, (Hingegangen

I). HAFERBURG, O. ASPERGER, M . SCHMIDT

am 20. 3.

und

H.

Armen2

1984)

Acinetobacter calcoaceticun (S9-V is not a b l e t o g r o w on c a r b o h y d r a t e s or its d e r i v a t i v e s a n d t o use t h e m as sole c a r b o n sources. On t h e o t h e r h a n d , t h e p a r t i a l o x i d a t i o n o f s e v e r a l m o n o s a c c h a r i d e s (glucose, g a l a c t o s e , m a n n o s o , x y l o s e , a r a b i n o s e , r i b o s e ) b y i n t a c t cells has been d e m o n s t r a t e d b y acid production and measurements of o x y g e n consumption. Glucose a n d f r u c t o s e are t a k e n up b y i n t a c t cells. D i f f e r e n t t r a n s p o r t s y s t e m s exist f o r t h e uptake o f b o t h hexoses. T h e " a p p a r e n t " i f \ [ - v a l u e s f o r t h e m e m b r a n e t r a n s p o r t a m o u n t t o 1.5 • l O - 3 a n d 1.7 • 1 0 _ l moles/1 f o r glucose a n d f r u c t o s e , r e s p e c t i v e l y . G l u c o n o l a c t o n o n l y i n h i b i t s t h e transp o r t of glucose, w h e r e a s t h e t r a n s p o r t o f b o t h hexoses is i n h i b i t e d b y u r a n y l a c e t a t e . O t h e r m o n o s a c c h a r i d e s a n d m e t a b o l i c i n h i b i t o r s are w i t h o u t e f f e c t . A n e x c h a n g e o f i n t r a c e l l u l a r a g a i n s t e x t r a c e l l u l a r g l u c o s e has n o t been f o u n d . G l u c o n a t e a n d C 0 2 h a v e been i d e n t i f i e d as e x t r a c e l l u l a r p r o d u c t s o f g l u c o s e o x i d a t i o n a f t e r an i n c u b a t i o n p e r i o d o f m o r e t h a n 5 m i n . w h e r e a s g l u c o n a t e a n d (>-phosphogluconate h a v e b e e n d e t e c t e d as i n t r a c e l l u l a r p r o d u c t s . N o o x i d a t i o n p r o d u c t s h a v e b e e n f o u n d using f r u c t o s e as s u b s t r a t e . X o a c t i v i t y o f h c x o k i n a s e . p h o s p h o f r u c t o k i n a s e , p y r u v a t e kinase, a n d 6 - p h o s p h o g l u c o n a t e d e h y d r o g e n a s e h a v e been d e t e c t e d in cell-free e x t r a c t s o f s o n i c a t e d cells. A n a l d o s e d e h y d r o g e n a s e c o u p l e d w i t h an e l e c t r o n t r a n s p o r t s y s t e m occurs in t h e m e m b r a n e f r a c t i o n . T h e presence o f this e n z y m e was d e m o n s t r a t e d b y t h e r e d u c t i o n o f d i c h l o r o p h e n o l i n d o p h e n o l as w e l l as b y o x y g e n cons u m p t i o n w h i c h is i n h i b i t e d b y c y a n i d e . T h e aldose dehydrogenase exhibits a broad substrate specificity against different aldohexoses a n d a l d o p e n t o s e s d i f f e r i n g b y their / f j i - v a l u e s . C y t o c h r o m e b a n d t h e t e r m i n a l o x i d a s e c y t o c h r o m e o are c o m p o n e n t s o f t h e e l e c t r o n t r a n s p o r t s y s t e m . N e i t h e r h y d r o g e n p e r o x i d e is f o r m e d , n o r p y r i d i n e n u c l e o t i d e s p a r t i c i p a t e in aldose d e h y d r o g e n a t i o n .

Untersuchungen über die V e r w e r t u n g v o n Glucose als einziger C-Quelle durch die Gattung Acinetobacter lieferten in der Vergangenheit widersprüchliche Ergebnisse. I n früheren taxonomischen Studien wurde die U n f ä h i g k e i t zur Glucose Verwertung, d. h. zum W a c h s t u m mit Glucose als C-Quelle, für ein Charakteristikum Oxidase-negativer Moraxellen — zu denen Acinetobacter gezählt wurde — angesehen (BAUMANN et al. 19(i8). N a c h den jetzigen systematischen Festlegungen gehört das Genus Acinetobacter zur F a m i l i e der Neisseriaceae (BERGEY 1974, JUNI 1978), zu deren Haupteigenschaften auch die Ü x i d a s e - N e g a t i v i t ä t zählt. Auf der anderen Seite konnte gezeigt werden, daß es auch S t ä m m e von Acinetobacter gibt, die auf Glucose wachsen, zumindest aber aus Glucose Säure bilden können (HENDERSON 1967, JUNI 1972, KAPLAN II. ROSENHEIM) 1982). COOK und FEWSON (1973) wiesen f ü r den von ihnen benutzten Teststamm v o n A. calcoaceticus (früher Bacterium N . C. I. B. 8250) nach, daß die Zellen für Monosaccharide und Monosaccharidphosphate impermeabel sind. Die Unfähigkeit zum Transport der Zucker diskutierten sie als mögliche Ursache für die NichtVerwertung von K o h lenhydraten durch diesen Stamm. Auf der anderen Seite ist seit langem bekannt, daß bestimmte AcijietobacterSt&mme Glucose-metabolisierende E n z y m e , wie die Glucosedehvdrogenase, durchaus enthalten können (HAUGE 19(>0a und b), ohne daß sie mit Glucose zu wachsen v e r m ö g e n . ' ) H e r r n P r o f . D r . sc. m e d . HORST FRUNDKR, J e n a , z u m 05. G e b u r t s t a g g e w i d m e t .

692

H . - P . K L E B E R et

al.

Wir h a t t e n in f r ü h e r e n U n t e r s u c h u n g e n zeigen können, d a ß der von uns verwendete S t a m m von A. calcoaceticus ((¡i)-V) einerseits Glucose als C-Quelle zum W a c h s t u m nicht verwerten k a n n ( K L E B H R et al. 1 9 7 3 ) , extrazellulär angebotene Glucose aber andererseits in der Lage ist, die Synthese der Isocitratlyase und der M a l a t d e h y d r o g e n a s e in diesem S t a m m in Art einer Katabolitrepression zu h e m m e n ( K L E B E R U . A U E T C I I 1 9 7 3 , 1974), d. h. wohl in die Zelle gelangen k ö n n t e . E s erschien uns deshalb interessant, die G l u c o s e a u f n a h m e und die Glucose-katabolisierenden E n z y m e noch einmal u n t e r diesen A s p e k t e n a u c h bei unserem T e s t s t a m m zu u n t e r s u c h e n . Die vorliegenden Ergebnisse zeigen n u n wirklich, d a ß die Glucose (auch die Fructose) d u r c h unseren Tests t a m m a u f g e n o m m e n wird. B e s t i m m t e E n z y m e der Glykolyse bzw. des o x i d a t i v e n P e n t o s e p h o s p h a t - W e g e s fehlen zwar, die Glucose (nicht dagegen die Fructose) k a n n aber unter Säurebildung begrenzt oxidiert werden, w o r a n p r i m ä r offensichtlich eine m e m b r a n g e b u n d e n e Aldosedehydrogenase m i t w i r k t .

Material und Methoden O r g a n i s m u s u n d W n c h s t u m s b e d i n g u n g e n : A. calcoaceticux G9-V, v o n u n s a u s B o d e n p r o b e n isoliert, w u r d e als S t a m m k u l t u r a u f 2 % i g e m B o u i l l o n - A g a r bei 4 °C i m D u n k e l n a u f b e w a h r t (KLEBER et al.

1973).

F ü r die U n t e r s u c h u n g e n d e r V e r w e r t u n g , des T r a n s p o r t s u n d d e r E n z y m a k t i v i t ä t e n z ü c h t e t e n wir die B a k t e r i e n bei 30 °C s u b m e r s a u f e i n e m R u n d s c h ü t t l e r ( V E B FANAL, B a d F r a n k e n h a u s e n ) in e i n e m f l ü s s i g e n M i n i m a l m e d i u m (KLEBER et al. 1973). welches die e n t s p r e c h e n d e n C-Quellen ( A c e t a t o d e r H e x a d e e a n ) — w e n n n i c h t a n d e r s a n g e g e b e n — in einer K o n z e n t r a t i o n v o n 20 g/1 e n t h i e l t . N-Quclle w a r s t e t s A m m o n i u m c h l o r i d (10 g/1). Die N ä h r b ö d e n w u r d e n m i t d e n a u s A n r e i c h e r u n g s k u l t u r e n g e w o n n e n e n B a k t e r i e n b e i m p f t u n d in d e r m i t t l e r e n l o g a r i t h m i s e h e n W a c h s t u m s p h a s e d u r c h Z e n t r i f u g a t i o n bei 0 °C f ü r 20 m i n u n d 6000 x g sowie z w e i m a l i g e s W a s c h e n m i t s t e r i l e m P h o s p h a t p u f f e r (0,067 mol/1; p H 7.5) a b g e e r n t e t . D a s W a c h s t u m d e r B a k t e r i e n w u r d e d u r c h M e s s u n g d e r E x t i n k t i o n bei 600 n m (SPEKOL, V E B CARL ZEISS J e n a ) b z w . a n h a n d d e s B a k terien-Trockengewichts verfolgt. Nachweis der Säurebildung: Die Säurebildung aus den K o h l e n h y d r a t e n bzw. Kohlenhydratderiv a t e n w u r d e m i t g e w a s c h e n e n Zellen in P e p t o n w a s s e r m i t B r o m t h y m o l b l a u als I n d i k a t o r u n t e r s u c h t . Die K o n z e n t r a t i o n d e r e i n g e s e t z t e n K o h l e n h y d r a t e b e t r u g d a b e i 5 g/1. Die S ä u r e b i l d u n g w u r d e n a o h 24 u n d 48 h k o n t r o l l i e r t . A t m u n g s m e s s u n g e n : Die A t m u n g s m e s s u n g e n ( 0 . , - V e r b r a u e h ) w u r d e n bei 30° m i t einer CLARK' s e h e n S a u e r s t o f f e l e k t r o d e , wie bei ASPBRUER u n d AURICII (1977) b e s c h r i e b e n , in K a l i u m p h o s p h a t p u f f e r (0,1 mol/1; p H 7,4) v o r g e n o m m e n . Bei M e s s u n g e n m i t i n t a k t e n Zellen w u r d e n H e x a d e e a n g e w a c h s e n e K u l t u r e n , die d u r c h S c h ü t t e l n in C - f r e i e m M e d i u m a n e n d o g e n e m S u b s t r a t v e r a r m t w o r d e n w a r e n , in K o n z e n t r a t i o n e n v o n 0,2 bis 0 , 5 m g P r o t e i n / m l e i n g e s e t z t . Die K o n z e n t r a t i o n a n d e n zu v e r a t m e n d e n K o h l e n h y d r a t e n b e t r u g 4 mmol/1. W u r d e n a n Stelle d e r i n t a k t e n Zellen n u r die M e m b r a n f r a k t i o n e n v e r w e n d e t , so w a r e n diese a u s H e x a d e c a n - g e w a e h s e n e n Zellen d u r c h Ult r a s c h a l l a u f s c h l u ß u n d Z e n t r i f u g a t i o n bei 1 0 0 0 0 0 x g ( n a c h v o r h e r i g e r E n t f e r n u n g i n t a k t e r Zellen) g e w o n n e n w o r d e n . M e s s u n g e n des M e m b r a n t r a n s p o r t s : D i e g e w a s c h e n e n B a k t e r i e n z e l l e n (in P h o s p h a t p u f f e r : 0,067 mol/1; p H 7 , 5 ; jeweils 2,4 m g B a k t e r i e n - T r o c k e n g e w i c h t / m l ) w u r d e n m i t " C - D - G l u c o s e ( R . 0 . AMERSHAM/UK; u n i f o r m m a r k i e r t ; 22.2 M B q / m m o l ) b z w . 1 ' C - i ) - F r u c t o s e (I. R . P . A. R a d i o i s o t o p e s , P r a g / C S S R ; u n i f o r m m a r k i e r t ; 14,8 M B q / m m o l ) in E r l e n m e y e r k ö l b e h e n u n t e r a e r o b e n B e d i n g u n g e n a u f einer S c h ü t t e l a p p a r a t u r bei 30 °C i n k u b i e r t . V e r b i n d u n g e n , d e r e n E i n f l u ß a u f d a s A u f n a h m e v e r h a l t e n u n t e r s u c h t w e r d e n sollte, w a r e n v o r d e m S t a r t m i t d e n r a d i o a k t i v m a r kierten Monosacchariden dem Ansatz zugesetzt worden. Nach den entsprechenden Versuchszeiten w u r d e die A u f n a h m e d u r c h r a s c h e A b t r e n n u n g d e r B a k t e r i e n v o m n i c h t - i n k o r p o r i e r t e n ' " C - m a r k i e r t e n M o n o s a c c h a r i d d u r c h F i l t r a t i o n ü b e r M e m b r a n f i l t e r (CHEMAPOL, P r a g / Ö S S R ; P o r e n g r ö ß e : 0 , 3 — 0 . 5 fim) b e e n d e t . N a c h d e m W a s c h e n d e r F i l t e r m i t e i s k a l t e m P h o s p h a t p u f f e r (0,067 mol/1; p H 7,5) w u r d e n diese a u f A l u m i n i u m m e ß s c h ä l c h e n a u f g e t r a g e n u n d a n d e r L u f t g e t r o c k n e t . D i e R a d i o a k t i v i t ä t w u r d e m i t d e m G a s d u r c h f l u ß z ä h l r o h r VA-Z-530 ( V E B M e ß e l e k t r o n i k D r e s d e n ) g e m e s s e n l i n d die i n k o r p o r i e r t e M e n g e a n G l u c o s e b z w . F r u c t o s e n a c h K o r r e k t u r d e r g e m e s s e n e n i m p u l s r a t e n f ü r A b s o r p t i o n u n d S e l b s t a b s o r p t i o n in n m o l / m i n • m g T r o c k e n g e w i c h t a n g e g e b e n . M e s s u n g v o n " C - K o h l e n d i o x i d : I n e i n e m K ö l b c h e n w u r d e n zu 2,5 m l e i n e r S u s p e n s i o n g e w a schener Bakterien nichtmarkiertes S u b s t r a t (u-Glucose u n d D-Fructose) u n d radioaktiver Tracer (beider M o n o s a c c h a r i d e ) i m V e r h ä l t n i s 1 0 : 1 g e g e b e n u n d l a n g s a m m i t einer K a p i l l a r e L u f t h i n d u r c h -

M o n o s a c c h a r i d a u f n a h m e bei A. cnlcoaceticus

093

geleitet, um die Baktcriensuspension in ständiger Bewegung zu halten. l)as Abgas wurde in 5 ml N a O H (0.05 mol/1) eingeleitet, von der nach 20 min ein aliquoter Anteil (100—500 ¡¿1) e n t n o m m e n , an der L u f t getrocknet u n d zur Messung gebracht wurde. Die Natronlauge zur C0 2 -Absorption wurde in A b s t ä n d e n von 20 min erneuert. Die Innenwände der verwendeten Glasgefäße und Glasp i p e t t e n waren vor den Versuchen hydrophobisiert worden. Autoradiographie: Intrazelluläre " C - m a r k i e r t c Glucosc bzw. deren Derivate wurden nach diinnschichtchromatographischer T r e n n u n g an Ccllulose TLC (SKKVA Heidelberg/BH 1); L a u f m i t t e l : Pyridin-Ethylacetat-Essigsäure-Wasser = 3 0 : 3 0 : 7 : 2 1 ) autoradiographisch nachgewiesen. Dazu wurden die D ü n n s c h i c h t p l a t t e n mit einem Autoradiographiefilm ( T F 13, V E B Filmfabrik Wolfen) bedeckt und je nach gemessener R a d i o a k t i v i t ä t zwischen 14 und 190 h im Dunkeln belassen. Autoradiographische Studien von Zellinhalts-Dünnschichtchromatogrammen wurden auch nach Inkubation von Zellen mit Xa., :,:; P0 4 (ISOCO.M.M KKZ G m b H , Dresden, 74.0 G Bq/mmol) unter den genannten experimentellen Bedingungen d u r c h g e f ü h r t . Bestimmung der E n z y m a k t i v i t ä t e n : Zur Bestimmung der E n z y m a k t i v i t ä t e n wurden Bakterien aus der logarithmisehen W a c h s t u m s p h a s e auf der Zentrifuge mit P h o s p h a t p u f f e r (0,007 mol/1; pH 7.5) gewaschen und anschließend in einem Puffer suspendiert, der dem zu untersuchenden Enzym entsprach. Die Zellen wurden mittels Ultrasehall (Ultra-Desintegrator TG 250 der F a . SOHOULIJKUCS: CO., F r a n k f u r t (Main)/BRD) aufgeschlossen. Dazu wurde die Bakteriensuspension bei 2 °C zweimal mit einer Frequenz von 20 kHz 30 s lang beschallt und ganze Zellen bei 5000 x g (10 min) zentrifugiert. Durch anschließende Zentrifugation des Überstandes bei 0 °C u n d 100000 X g (00 min) wurde die M e m b r a n f r a k t i o n erhalten. Die A k t i v i t ä t e n der u n t e r s u c h t e n E n z y m e wurden photometrisch im S p e k t r o p h o t o m e t e r VSU II (VEB CARL ZEISS J e n a ) bei R a u m t e m p e r a t u r b e s t i m m t . Die k o m p l e t t e n Systeme f ü r die E n z y m teste enthielten neben den entsprechenden Mengen an Bakterien-Überständen bzw. -Sedimenten des Aufschlusses folgende S u b s t a n z e n : — f ü r die Hexokinase: T r i e t h a n o l a m i n - P u f f e r (0.05 mol/1; p H 7.0), Glucosc (10 mmol/1), MgCI» (10 mmol/1), XADP+ (1 mmol/1), A T P (3 mmol/1) und eine entsprechende Menge an Glueose-0phosphat-dehydrogenase — f ü r die P h o s p h o f r u e t o k i n a s e : Imidazol/HCl-Puffer (0,1 mol/1; p H 0.8), Fructosc-0-phosphat (0.0 mmol/1), A T P (2mmol/l). MgCl, (5 mmol/1). KCl (0,1 mol/1) und N A D H (0,12 mmol/1) sowie entsprechende Mengen an Aldolase, Triosephosphat-isomerase und Glycerinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase, — für die P y r u v a t k i n a s e : Tris/HCl-Puffer (0.1 mol/1; p H 7.4). I ' E P (2 mmol/1). A D 1 ' ( 1 mmol/1). N A D H (0,15 mmol/1). M n S 0 4 (3 mmol/1) und eine entsprechende Menge an Lactatdehydrogenase, — f ü r die Glucose-O-phosphat-dehydrogenase: Tris/HCl-Puffer (0,1 mol/1; p H 7.0), Glueose-0p h o s p h a t (3 mmol/1). XADP+ (1 mmol/1) und MnCl, (2 mmol/1). — f ü r die m e m b r a n g e b u n d e n e Aldosedehydrogcnase: P h o s p h a t p u f f e r (0.1 mol/1; p H 5.8). Dichlorphenolindophenol als Elektronenacceptor (0,1 mmol/1). Glucose bzw. andere Aldosen (30 mmol/1). Die Hilfsenzyme und E n z y m s u b s t r a t e s t a m m t e n von BOKHIUNOKU ( M a n n h e i m / B R D ) . Die Prot e i n b e s t i m m u n g erfolgte nach LOWHY et al. (1951) mit l l i n d e r s e r u m a l b u m i n als S t a n d a r d s u b s t a n z . Die ,,reduziert-minus-oxidiert"-Differenzspektren der M e m b r a n f r a k t i o n e n (mit Glucosc als Substrat) wurden mit einem PEUKIN-ELMEU-Spektrophotometer (M 350) a u f g e n o m m e n .

Ergebnisse Wachstum,

Säurebilfluny

und

Veratmung

Die V e r w e r t u n g v e r s c h i e d e n e r K o h l e n h y d r a t e b z w . K o h l e n h y d r a t d e r i v a t e al.s e i n z i g e C - Q u e l l e n d u r c h A. culcoacetir.m, d i e F ä h i g k e i t zur S ä u r e p r o d u k t i o n a u s d i e s e n Verb i n d u n g e n s o w i e d e r e n V e r a t m u n g d u r c h i n t a k t e Z e l l e n ist in T a b e l l e 1 z u s a m m e n g e f a ß t . I m G e g e n s a t z zu o r g a n i s c h e n S ä u r e n ( b e s o n d e r s d e s C i t r a t - Z y k l u s ) , A m i n o s ä u r e n — a b e r a u c h F e t t s ä u r e n u n d m - A l k a n e n —, d i e u n s e r T e s t s t a n i m j e w e i l s als e i n z i g e C-Quelle g u t v e r w e r t e t (KLKUKK et al. 1973), w i r d m i t k e i n e m d e r u n t e r s u c h t e n K o h l e n h y d r a t e oder deren Derivaten ein W a c h s t u m erzielt. E i n e Säurebildung w a r a l l e r d i n g s bei e i n i g e n A l d o s e n ( P e n t o s e n u n d H e x o s e n ) — a m s t ä r k s t e n m i t G l u cose — nachweisbar, so daß m a n d a v o n ausgehen kann, daß eine A u f n a h m e dieser Monosaccharide (zumindest bis an die C y t o p l a s m a m e m b r a n ) und ein begrenzter Stoff-

694

H . - P . K L E B E R ei

ttl.

Tabelle 1 Wachstum, Säurebildung und relative Atmungsraten von intakten Hexadecan-gewachsenen Zellen von A. calconceticun aus der logarithmischen Waclistumsphase bei Anwesenheit verschiedener Kohlenhydrate bzw. deren Derivate Substrat

Wachstum (E 6 0 0 )

SäureProduktion

Relative Atmungsraten

(%)

Pentosen L-Arabinose i)-Ribose D-Xylose Hexoscn D-Fructose »-Galactose u-Clucose «-Mannose L-Ilhamnosc L-Sorbose Disaccharide Cellobiose Lactose Maltose Melibiose Saccharose Trehalose Trisaccharide Melizitose Raffinosc Kohlenhydra tderivate Glucose-G-phosphat Fructose-ö-phosphat Fructose-1.6-diphosphat u-Glucono-ü-lacton D-Glucosamin u-Glucuronat D,L-Mannitol u-Sorbitol

— — —

—

54 18 7(i

— — — — — —

—

— — — — — —

— — — — — —

n. b. 1 ) n. b. n. b. n. b. 0 n. b.

— —

— —

n. b. n. b.

— — — — — — — —

— — — — — — — —

n. b. n. b. n. b. 0 n. b. 0 0 0

| -j— —

0 47 100 20 0 0

') n. b. = nicht bestimmt

Wechsel möglich i.st. Die B e f u n d e der S ä u r e b i l d u n g korrelieren — von der Differenz bei der R i b o s e a b g e s e h e n — a u c h r e c h t g u t mit den E r g e b n i s s e n der A t m u n g s m e s s u n gen,\

E i n Z u s a t z v o n u n t e r s c h i e d l i c h e n K o n z e n t r a t i o n e n an G l u c o s e zu s u b o j ) t i m a l e n K o n z e n t r a t i o n e n v o n A c e t a t , welches von A. calcouceticus als einzige K o h l e n s t o f f und E n e r g i e q u e l l e gut v e r w e r t e t wird, e r h ö h t — a u c h n a c h l ä n g e r e n I n k u b a t i o n s z e i ten — das W a c h s t u m nicht. MembrantruHSport

von v-Glucose

und

D-Fructose

'Durch die r e g u l a t o r i s c h e B e e i n f l u s s u n g von i n t r a c e l l u l ä r e n E n z y m e n d u r c h G l u c o s e a n g e r e g t und d u r c h die S ä u r e b i l d u n g und A t m u n g s r a t e n b e s t ä r k t , u n t e r s u c h t e n wir die A u f n a h m e f ä h i g k e i t der Zellen f ü r u - G l u c o s e und parallel zum Vergleich a u c h für j ) - F r u c t o s e , für die wir k e i n e V e r a t m u n g und keine S ä u r e b i l d u n g f a n d e n . I n Abbildung 1 ist die A u f n a h m e b e i d e r M o n o s a c c h a r i d e d u r c h i n t a k t e Zellen v o n A. c.alc.oacuticus in A b h ä n g i g k e i t von der Zeit d a r g e s t e l l t . D i e K n r v e n k ö n n e n n i c h t d u r c h den K o o r d i n a t e n u r s p r u n g gelegt werden. O f f e n b a r bildet sich i n n e r h a l b der e r s t e n M i n u t e

M o n o s a c c h a r i d a u f n a h m e bei A.

20

695

calcoaceticus

40

60

t (min) A b b . 1. A u f n a h m e v o n n-Glucose ( • ) u n d j ) - F r u c t o s e (o) (in n r n o l / m g B a k t e r i c n - T r o c k e n g e w i e h t ) durcli Zellen von A. calcoaceticus- a u s d e r l o g a r i t h m i s c h e n W a c h s t u m s p h a s e (nach W a c h s t u m auf A c e t a t ) in A b h ä n g i g k e i t von d e r Z e i t . E x t r a z e l l u l ä r e M o n o s a c c h a r i d k o n z e n t r a t i o n : 1 mmol/1 Tabelle 2 E i n f l u ß von K o h l e n h y d r a t e n u n d einiger ihrer D e r i v a t e a u f die A u f n a h m e v o n D-Glucose u n d uF r u c t o s e d u r c h A. calcoace.ticux ( W a e h s t u m s b e d i n g u n g e n wie A b b . 1). Die e x t r a z e l l u l ä r e K o n z e n t r a t i o n von m a r k i e r t e r u-Olucosc u n d u - F r u e t o s e (als T r a n s p o r t s u b s t r a t e ) b e t r u g jeweils 1 m m o l / l Zusatz

Konzentration (mmol/1)

n-Olucose n-Fruetose l)-(Jalactose U-Hibose i>-(!lucono-(i-lacton i)-(!lucono-i>-lacton D-Glucono-d-lacton i)-(!lucuronat

10 10 10 10 10

1.0

0,1

10

H e m m u n g (in D-Glucose

Q) d e r A u f n a h m e v o n D-Fruetose

0 0 0 7(1

02 27

0

der I n k u b a t i o n eine a d h ä r i e r e n d e Schicht des T r a n s p o r t s u b s t r a t e s a n der ä u ß e r e n Zellb e g r e n z u n g a u s bzw. wird in dieser Zeit d e r Z e l l w a n d r a u m a u f g e f ü l l t . I n der zweiten Phase l ä u f t d a n n der eigentliche T r a n s p o r t der M o n o s a c c h a r i d e d u r c h die M e m b r a n ab. Aus d e n K u r v e n e r m i t t e l t e n wir initiale A u f n a h m e r a t e n f ü r i)-Glucose v o n e t w a (i limol/min • mg u n d f ü r j>-Fructose v o n e t w a 2 n m o l / m i n • mg B a k t e r i e n - T r o c k e n g e wicht. Die T r a n s p o r t g e s c h w i n d i g k e i t e n zeigen f ü r beide M o n o s a c c h a r i d e in A b h ä n g i g k e i t v o n der S u b s t r a t k o n z e n t r a t i o n t y p i s c h e S ä t t i g u n g s k u r v e n , so dal.5 wir v o n der Beteil i g u n g eines T r a n s p o r t p r o t e i n s in der M e m b r a n a u s g e h e n k ö n n e n . Die e r m i t t e l t e n „ s c h e i n b a r e n " K M - W e r t e ( M o n o s a c c h a r i d - K o n z e n t r a t i o n e n a u ß e r h a l b der Zellen bei h a l b m a x i m a l e r A u f n a h m e g e s c h w i n d i g k e i t ) b e t r a g e n f ü r die Glucose 1,5 mmol/1 und f ü r die F r u c t o s e 0,17 nmiol/1.

696

H . - P . KLEISEK et al.

B i s z u r (>. m i n d e r I n k u b a t i o n m i t uns verwendeten Methode kein

14

14C-J>-Glueose

ließ sieh im G a s r a u m mit d e r v o n

C 0 2 nachweisen. D a n a c h setzte eine meßbare

C02-

E n t w i e k l u n g ein, die sich bis zum E n d e der I n k u b a t i o n (90 min) als N a 2 1 4 C 0 3 registrieren ließ. W ä h r e n d der A u f n a h m e von samten Zeitraum kein

14

14C-J>-Fructose

als T r a c e r ließ sich über den ge-

C02 nachweisen.

U m die S p e z i f i t ä t d e r T r a n s p o r t s y s t e m e f ü r i>-Glucose lind D - F r u c t o s e zu p r ü f t e n wir den E i n f l u ß einiger K o h l e n h y d r a t e auf die der beiden Monosaccharide

testen,

Aufnahmegeschwindigkeiten

( T a b . 2). E i n e n d e u t l i c h e n

Hemmeffekt

zeigt dabei

nur

D - G l u c o n o - ö - l a c t o n . A c e t a t , d a s w i r i n d e r R e g e l a l s C - Q u e l l e in d e r K u l t i v i e r u n g a n g e w e n d e t h a b e n , h e m m t b e i K o n z e n t r a t i o n e n b i s 1 mmol/1 d i e n - G l u c o s e - A u f n a h m e e b e n falls nicht. Darüber

hinaus

Dinitrophenol,

untersuchten

.Jodaeetat,

wir d e n

Uranylacetat)

Einfluß

von

Stoffwechselinhibitoren

auf den Glucose-

und

(2,4-

Fructose-Membran-

t r a n s p o r t . N u r U r a n y l a c e t a t ( 1 m m o l / 1 ; in T r i s / H C l - P u f f e r , 0 , 5 mol/1; p H 7 , 5 ) als I n h i b i t o r und h e m m t die A u f n a h m e v o n J)-Glucose um 7 5 " 0 und die v o n tose

um

52%.

2,4-Dinitrophenol

und Jodaeetat

Transport der beiden Monosaccharide

Aktivitäten

ausgewählter

Enzyme

(beide

wirkt

l)-Frue-

1 mniol/1) b e e i n f l u s s e n

den

nicht.

de,s-

Ulucme-Katabolismus

N a c h dem gelungenen Nachweis der Fähigkeit zum M e m b r a n t r a n s p o r t d u r c h i n t a k t e Z e l l e n v o n A. c.aicoaccticus

der

Glucose

lag es n a h e a n z u n e h m e n , d a ß die U r s a c h e für

d i e U n f ä h i g k e i t d e s T e s t s t a m m e s , G l u c o s e a l s C - Q u e l l e z u v e r w e r t e n , im F e h l e n stimmter

Glueose-abbauender

der

wichtigen

zentralen

be-

,,1'athways"

liegt.

W i r p r ü f t e n d e s h a l b s o w o h l im z e l l f r e i e n U b e r s t a n d a l s a u c h i m p a r t i k u l ä r e n

Sedi-

ment, inwieweit bestimmte

Knzyme

K n z y m e des G l u c o s e - K a t a b o l i s m u s v o r h a n d e n sind.

d e r im z e l l f r e i e n U b e r s t a n d

n o c h im p a r t i k u l ä r e n

Niederschlag

waren

Phosphofructokinase, P y r u v a t k i n a s e und Glucose-6-phosphat-dehydrogenase verwendeten Metoden nachweisbar. Man muß somit annehmen, ticus

w e d e r d e r EMBDUN-MKYKRILOF-

daß

noch der HonucKUR-Weg

mit den

b e i A.

zum

We-

Hexokinase, calcoace-

unmittelbaren

A b b a u bzw. zur Assimilation der Glucose benutzt werden k ö n n e n . In den Membranfraktionen anhand

des

02-Verbrauchs

der aufgeschlossenen

ein

Zellen gelang es uns

Glueose-oxidierendes

Enzymsystem

allerdings,

nachzuweisen.

I m 1 0 0 0 0 0 X g - U b e r s t a n d k o n n t e n wir k e i n e n ( ) 2 - V e r b r a u c h messen. Die O x i d a t i o n s r a t e n d e r M e m b r a n f r a k t i o n e n l i e g e n f ü r G l u c o s e in d e r g l e i c h e n G r ö ß e n o r d n u n g die der N A D H - O x i d a t i o n den

02-Verbrauch

nicht.

( A S F U R G K R et al.

1981).

Wasserstoffperoxid

Pyridinnueleotide

konnten

wir

als

steigern

wie

dabei

Reaktionsprodukt

m i t k o m m e r z i e l l e r I ' e r o x i d a s e u n d o - I ) i a n i s i d i n n i c h t n a c h w e i s e n , so d a ß wir a u f die Existenz

einer

niembrangebundenen,

Glucosedehydrogenase

mit

einem

Elektronentransport

gekoppelten

schlössen.

Der Nachweis, daß auch Dichlorphenolindophenol

— nicht dagegen

Hexacyanofer-

rat und C y t o e h r o m c — durch das E n z y m reduziert wird, bestätigte diese (SCHMIDT 1 9 7 8 , ASPERCJEB et al.

Annahme

1981). D e r 0 2 - V e r b r a u c h mit i)-Glucose als S u b s t r a t

(nicht dagegen die D i c h l o r p h e n o l i n d o p h e n o l - R e d u k t i o n )

ist in d e r

Membranfraktion

d u r c h C y a n i d h e m m b a r , was für die E x i s t e n z eines C N " - s e n s i t i v e n Teils des E l e k t r o nentransportsystems

spricht.

Ohne künstlichen Elektronenacceptor

zeigen die

,,reduziert-minus-oxidiert"-I)iffe-

r e n z s p e k t r e n m i t D - G l u e o s e a l s S u b s t r a t e i n e R e d u k t i o n v o n C y t o e h r o m b in d e r M e m b r a n f r a k t i o n . C y t o e h r o m b sowie das t e r m i n a l e C y t o e h r o m o (das für die C y a n i d h e m m u n g in B e t r a c h t k o m m t ) h a t t e n wir b e r e i t s f r ü h e r bei u n s e r e m S t a m m n a c h g e w i e s e n ( A S P E K G E R et al.

1978,

1981).

regelmäßig

M o n o s a e e h a r i d a u f n a h m c bei A.

calcoaceticus

697

IM Ü b e r e i n s t i m m u n g mit d e n E r g e b n i s s e n der V e r a t m u n g von K o h l e n h y d r a t e n d u r c h i n t a k t e Zellen (vgl. T a b . 1) f a n d e n wir a u c h in d e n M e m b r a n f r a k t i o n e n , d a ß a u ß e r der Glueose a u c h einige a n d e r e M o n o s a c c h a r i d e gut oxidiert w e r d e n (Tab. :?). "Dabei liegen die r e l a t i v e n R e d u k t i o n s r a t e n f ü r D i c h l o r p h e n o l i n d o p h e n o l regelmäßig e t w a s u n t e r d e n e n des 0 2 - V e r b r a u c h s . N i c h t oxidiert werden n>-Fructose, L - l l h a m n o se, Saccharose, i>-Glucuronat, J)-Sorbitol u n d n),L-Mannitol. Da m a n a n n e h m e n m u ß , d a ß alle o x i d i e r b a r e n M o n o s a c c h a r i d e d u r c h ein u n d dasselbe E n z y m u m g e s e t z t werd e n , bezeichnen wir dieses E n z y m als m e m b r a n g e b u n d e n e „ A l d o s e d e h v d r o g e n a s e " , f ü r die d e r n a t ü r l i c h e p r i m ä r e E l e k t r o n e n a c c e p t o r ein U b i c h i n o n , der E l e k t r o n e n ü b e r t r ä g e r d a s C y t o c h r o m b u n d die t e r m i n a l e Oxidase C y t o c h r o m o sein k ö n n t e n (vgl. a u c h A S P H R U H K et (iL 1981). Die 0 2 - V e r b r a u c h s r a t e n , die f ü r die einzelnen Aldosen unterschiedlich sind, zeigen — a u s ihrer A b h ä n g i g k e i t von der S u b s t r a t k o n z e n t r a t i o n abgeleitet — eine identische m a x i m a l e R e a k t i o n s g e s c h w i n d i g k e i t (etwa (>() nmol 0 2 / m i n • mg P r o t e i n ) f ü r alle unTabelle 3 R e l a t i v e R a t e n des 0 2 - V e r b r a u c h s u n d d e r D i e h l o r p h e n o l i n d o p h c n o l - R e d u k t i o n d u r c h die M e m b r a n f r a k t i o n v o n A. calcoaceticus m i t einigen A l d o s e n als S u b s t r a t e Substrat

0,-Rate

(%)

(%)

DCPIP-Rate

D-(!lueose D-Xylose, j)-(ialaetose L-Arabinose D-Mannose u-Ribose

100 94 80 83 54 51

100 n . b. 1 ) 59 55 35 25

') n . b. = n i c h t b e s t i m m t

A b b . 2. A b h ä n g i g k e i t d e r O x i d a t i o n s r a t e n v (in ¡jtniol 0 2 / m i n • m g P r o t e i n ) d e r M e m b r a n f r a k t i o n v o n calcoaceticus

A.

( g e w o n n e n a u s H e x a d e c a n - g e w a c h s e n e n Zellen d e r l o g a r i t h m i s e h e n W a e h s t u m s p h a s e )

v o n d e r K o n z e n t r a t i o n [S] (in mmol/1) e i n i g e r A l d o s e n ( d o p p e l t - r e z i p r o k e A u f t r a g u n g n a e h LINKWEAVEK u n d BURK). D i e K M - \ V e r t e s i n d j e w e i l s a n d e n K u r v e n v e r m e r k t 15

Z. allg. Mikrobiol., 11(1. 24, 11. 10

H.-P. K l e b k k et al.

698

t e r s u c h t e n M o n o s a c c h a r i d e ( A b b . 2), s o d a ß der G e s e h w i n d i g k e i t s - l i m i t i e r e n d e R e a k t i o n s s c h r i t t bei e i n e m d e r C y t o c h r o m e liegen s o l l t e . Die K ^ - W e r t e d a g e g e n s i n d diff e r e n t ( A b b . 2). Nachweis

von

S l o f / t c e c h s i l p r o d u k t i o u des

(jlucosv-Kalabolismus

Wie im A b s c h n i t t über d e n M e m b r a n t r a n s p o r t b e r e i t s a n g e f ü h r t , g e l a n g u n s d e r Nachweis von C 0 2 als einem extrazellulär a u f t a u c h e n d e n Stoffwechselprodukt der G l u c o s e . U m w e i t e r e S t o f f w e c h s e l p r o d u k t e zu f i n d e n , f ü h r t e n wir zwei z u s ä t z l i c h e Versuche durch. I m e r s t e n V e r s u c h w u r d e n nach I n k u b a t i o n d e r B a k t e r i e n mit r a d i o a k t i v m a r k i e r ter G l u c o s e (1 mmol/1) f ü r u n t e r s c h i e d l i c h e Z e i t e n (5 m i n b z w . 1 h) d i e Zellen d u r c h Z e n t r i f u g a t i o n v o m e x t r a z e l l u l ä r e n T r a c e r a b g e t r e n n t u n d g e w a s c h e n . S o w o h l im I n k u b a t i o n s m e d i u m (mit d e m T r a c e r ) a l s a u c h im K x t r a k t d e r g e w a s c h e n e n Zellen (zellfreier U b e r s t a n d n a c h U l t r a s c h a l l a u f s c h l u ß ) f a n d e n sich n a c h d ü n n s c h i c h t c h r o m a t o g r a p h i s c h e r T r e n n u n g und a n s c h l i e ß e n d e r A u t o r a d i o g r a p h i c d e r C h r o m a t o g r a m m e a u ß e r G l u c o s e (die s o m i t a u c h wirklich i n t r a c e l l u l ä r i d e n t i f i z i e r t w u r d e ) a u c h n o c h einige r a d i o a k t i v m a r k i e r t e M e t a b o l i t e , u n t e r d e n e n wir e i n d e u t i g — a u c h d u r c h s e i n e Menge imponierend — durch Vergleichsstudien Gluconat identifizieren konnten ( A b b . :?). Inkubationszeit 5 min med Zellextr.

Vergleichs-Standards Glucose

Gluconat

Inkub.'

mit

C-Glucose 60 mm Zellextr

Inkub.-med.

O 0

0 0 r o

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A b b . :i. S c h e m a t i s e h e ' D a r s t e l l u n g von A u t o r a d i o g r a m m e n d ü n n s c h i c l i t c h r o i n a t o g r a p h i s c i i e r T r e n n u n g e n des I n k u b a t i o n s m e d i u m s (mit

ll

C - ( ! l n c o s c ; K o n z e n t r a t i o n bei V e r s u c h s b e g i n n : 1 mmol/1) lind d e s

Z e l l e x t r a k t s ( Ü b e r s t a n d t r a c e r f r e i g e w a s c h e n e r Zellen n a c h U l t r a s c h a l l a u f s c h h i ß ) von A. culcoace-

ticuts ( C - Q u c l l e : A e e t a t ) n a c h 5 b z w . 00 min I n k u b a t i o n

Kin Teil d e r g e w a s c h e n e n Zellen w u r d e parallel d a z u mit n i c h t - m a r k i e r t e r (Jluco.se e r n e u t f ü r 10 min i n k u b i e r t , um einen G l u c o s e - b z w . G l u c o s e m e t a b o l i t - A u s t a u s c h g e g e n e x t r a z e l l u l ä r e G l u c o s e n a c h z u w e i s e n . D a b e i f a n d e n s i c h im I n k u b a t i o n s m e d i u m n a c h d i e s e r Zeit weder r a d i o a k t i v m a r k i e r t e G l u c o s e n o c h einer ihrer M e t a b o l i t e . Im Z e l l e x t r a k t d a g e g e n ließen sich a u c h n a c h d e r I n k u b a t i o n mit n i c h t - m a r k i e r t e r G l u c o se die g l e i c h e n r a d i o a k t i v e n M e t a b o l i t e wie v o r h e r n a c h w e i s e n . Kin A u s t a u s c h v o n intrazellulärer Glucose oder von Glucosemetaboliten gegen extrazelluläre Glucose

M o n o s a o c h a r i d a u f n a h m e bei A.

calcoaceticus

699

f i n d e t s o m i t o f f e n b a r n i c h t s t a t t b z w . d e r v o r h a n d e n e E f f l u x dieser S u b s t a n z e n (vgl. A b b . 8) w u r d e n i c h t d u r c h e x t r a z e l l u l ä r e G l u c o s e m e ß b a r g e s t e i g e r t . I m z w e i t e n V e r s u c h w u r d e n die Zellen n a c h W a c h s t u m auf H e x a d e c a n f ü r 20 m i n mit n i c h t - m a r k i e r t e r G l u c o s e ( u n d z u m V e r g l e i c h a u c h o h n e Glucose) in A n w e s e n h e i t von Na332P()4 inkubiert, anschließend vom Tracer-Medium abgetrennt, gewaschen und mit Ultraschall aufgeschlossen. Die Zellextrakte w u r d e n einer D ü n n s c h i c h t c h r o m a t o g r a p h i e u n d a n s c h l i e ß e n d e i n e r A u t o r a d i o g r a p h i e u n t e r w o r f e n . D a b e i g e l a n g es uns, d u r c h V e r g l e i c h s s t u d i e n mit R e f e r e n z s u b s t a n z e n ( > - P h o s p h o g l u c o n a t a n h a n d sein e r 3 2 1 > -Markierung zu i d e n t i f i z i e r e n . E s k a n n a u s s c h l i e ß l i c h bei A n w e s e n h e i t v o n e x t r a z e l l u l ä r e r (Jlucose n a c h g e w i e s e n w e r d e n . Z u s ä t z l i c h w u r d e e i n e w e i t e r e 3 2 P - m a r k i e r t e V e r b i n d u n g g e f u n d e n , die a n h a n d i h r e s Jiv-Wertes, dem Ribose-5-phosphat (möglicherweise aber a u c h einem a n d e r e n v e r w a n d t e n Monosaccharidphosphat) zugeordnet werden könnte. Dies würde dafür sprechen, d a ß das entstandene Gluconat n a c h t r ä g l i c h in d e n Zellen p h o s p h o r y l i e r t u n d m ö g l i c h e r w e i s e s o g a r in R i b o s e - 5 - p h o s p h a t u m g e w a n d e l t w e r d e n k a n n . O f f e n s i c h t l i c h ist a b e r e i n E i n s c h l e u s e n dieser S u b s t a n z e n in z e n t r a l e B a h n e n d e s E n e r g i e s t o f f w e c h s e l s ( m i t d e r K o n s e q u e n z e i n e s W a c h s t u m s d e r Zellen) n i c h t m ö g l i c h .

Diskussion D i e U n f ä h i g k e i t einiger B a k t e r i e n - S p e c i e s , (Jlucose als einzige C-Quelle zu v e r w e r t e n , k ö n n t e auf d a s F e h l e n b e s t i m m t e r G l u c o s e - a b b a u e n d e r E n z y m e , auf die J m p e r m e a b i lität d e r b a k t e r i e l l e n M e m b r a n f ü r (Jlucose o d e r auf e i n e K o m b i n a t i o n b e i d e r F a k t o r e n z u r ü c k g e f ü h r t w e r d e n . W ä h r e n d Cook u n d F e w s o n (1973) f ü r i h r e n T e s t s t a m m v o n A. calcoaceticus eine I m p e r m e a b i l i t ä t d e r b a k t e r i e l l e n M e m b r a n f ü r G l u c o s e — a b e r a u c h f ü r F r u c t o s e — als U r s a c h e f ü r die U n f ä h i g k e i t d e r V e r w e r t u n g d i e s e r Mon o s a c c h a r i d e n a c h w i e s e n , w i r d v o n M a r u s u n d B u l l (19(3(I) bei Mima jtolymorpha d e r gleiche B e f u n d m i t d e m F e h l e n v o n H e x o s e - a k t i v i e r e n d e n K i n a s e n e r k l ä r t . Diese Zellen k ö n n e n — im G e g e n s a t z zu u n s e r e n E r g e b n i s s e n — a u c h auf p h o s p h o r y l i e r t e n M o n o s a c c h a r i d e n w a c h s e n , w o b e i G l u c o s e d e n T r a n s p o r t zu i n d u z i e r e n s c h e i n t ( B e l l u. M a r l s 19(>G). D i e v o n u n s d u r c h g e f ü h r t e n S t u d i e n s o l l t e n bei u n s e r e m T e s t s t a m m v o n A. calcoaceticus ((>9-V) zu e i n e r A u s s a g e ü b e r diese F r a g e s t e l l u n g f ü h r e n . G l u c o s e u n d F r u c t o s e w e r d e n v o n u n s e r e m S t a m m a u f g e n o m m e n (die „ s c h e i n b a r e n " K M - W e r t e b e i d e r u n t e r s c h e i d e n sich a l l e r d i n g s u m e i n e Z e h n e r p o t e n z ) . B e i d e T r a n s p o r t s y s t e m e sind u n a b h ä n g i g v o n einem P r o t o n e n g r a d i e n t e n u n d a u c h u n a b hängig voneinander: Fructose h e m m t nicht den Glucosetransport und umgekehrt. A n d e r e A l d o s e n b e e i n f l u s s e n die A u f n a h m e b e i d e r e b e n f a l l s n i c h t , n u r G l u c o n o l a c t o n h e m m t — u n d z w a r a u s s c h l i e ß l i c h — d e n G l u c o s e t r a n s p o r t , so d a ß diese S u b s t a n z o f f e n b a r d a s gleiche T r a n s p o r t s y s t e m wie die (Jlucose b e n u t z t , wie dies ä h n l i c h a u c h bei Pseudomonas putida b e s c h r i e b e n w u r d e ( V i c k n t e et al. 1975). D i e H e m m u n g d e r A u f n a h m e s o w o h l d e r G l u c o s e als a u c h d e r F r u c t o s e d u r c h U r a n y l a c e t a t — wie a u c h b e r e i t s v o n a n d e r e n Species b e k a n n t ( B o o s 1974) — s p r i c h t f ü r eine B e t e i l i g u n g v o n P h o s p h a t g r u p p e n an der Membranpassage beider. Diinnschichtchromatographische U n t e r s u c h u n g e n m i t a n s c h l i e ß e n d e r A u t o r a d i o g r a p h i e w e i s e n die a u f g e n o m m e n e G l u c o s e in d e r Zelle n a c h , i h r e n A u s t a u s c h g e g e n e x t r a z e l l u l ä r e G l u c o s e k o n n t e n wir nicht finden. D i e n a c h g e w i e s e n e P r ä s e n z f r e i e r G l u c o s e in d e r Zelle d e u t e t mit g r o ß e r W a h r s c h e i n l i c h k e i t auf die U n f ä h i g k e i t zu d e r e n A b b a u h i n . D a s F e h l e n v o n j e g l i c h e n A k t i v i t ä ten a n Hexokinase, Phosphofructokinase, P y r u v a t k i n a s e und Glucose-()-phosphatd e h y d r o g e n a s e u n t e r s t r e i c h t dies u n d b e d e u t e t , d a ß in Aciiietobacter w e d e r d e r EmbDEN-MicYERUOF-Weg n o c h d e r HoRECKER-Weg z u m Z w e c k e d e s A b b a u s b z w . d e r 45*

700

H . - P . KLEBER et

al.

E n e r g i e g e w i n n u n g möglich sind. Damit wäre eigentlich e n t s c h i e d e n , weshalb die G l u cose nicht C-Quelle f ü r A. calr aar e tieus (>9-V sein k a n n , wolil a b e r die S y n t h e s e a n d e r e r E n z y m e , z. B. der I s o c i t r a t l y a s e und der M a l a t d e h y d r o g e n a s e ( K I . E H J C U U. AUKLCIL 197.'?, 1974), zu r e p r i m i e r e n v e r m a g . E i n g e s c h r ä n k t wird diese Aussage n u r d a d u r c h , d a ß die Zellen einen b e g r e n z t e n Stoffwechsel der Glucose d o c h d u r c h z u f ü h r e n v e r m ö g e n . D a f ü r g a b es bereits a u s der L i t e r a t u r d e n Hinweis, d a ß b e s t i m m t e ^4ri«c/ofo«r/cr-Stänime eine G l u c o s e d e h y d r o g e nase e n t h a l t e n u n d zur S ä u r e b i l d u n g b z w . - a b g a b e a n d a s K u l t u r m e d i u m b e f ä h i g t sein k ö n n e n ( H A U G K 19(30a, H ) . H A U G K h a t t e d a n n in d e n (50er J a h r e n die Glucosedehydrogenase in seinem A. calcoaceticus-Stamm ( f r ü h e r Bart. anitratum) n ä h e r s t u d i e r t . Das E n z y m war m e m b r a n g e b u n d e n u n d zeigte a u c h gegen a n d e r e Aldohexosen und - p e n tosen eine A k t i v i t ä t (HAL'CJE l!)(i4a, 19(> r t c k a n d E n s i g n 1 9 8 3 , >1 a r d i s s o n , p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ) . I n t h e e x p e r i m e n t s r e p o r t e d h e r e we c o m p a r e d t h e p r o t e i n p a t t e r n s of t h e e o n i d i a of a Streptomyces griseus s t r a i n ( N o . 4 5 H) g r o w n on s o l i d m e d i a a n d in s u b m e r g e d c u l tures. A c c o r d i n g t o o u r e a r l i e r r e s u l t s , n o d i f f e r e n c e s c o u l d b e s h o w n b y light m i c r o s c o p y with F e u l g e n and periodic a c i d - S c n i F F reactions, methylgreen-pyronin staining or w i t h t h e m e t h o d d e v e l o p e d in o u r l a b o r a t o r y f o r s t u d y i n g r e p r o d u c t i v e f o r m s ( V i t a i . i s et al. 1 9 0 3 , V i t a l i s a n d S z a b o 19(>9). T h e eonidia from b o t h sources were similarly resistant to ultrasonic disintegration. T h e y w i t h s t o o d m o r e t h a n 10 m i n of u l t r a s o n i c a t i o n w i t h o u t a d e c r e a s e in t h e i r v i a b l e c o u n t , w h e r e a s v e g e t a t i v e n i y c e l i a w e r e d i s r u p t e d b y 3 0 —()0 s e c t r e a t m e n t ( 2 0 k H z , 1 . 5 A ) . T h e t w o k i n d s of e o n i d i a w e r e e q u a l l y r e s i s t a n t t o l y s o z v m e (1 n i g / m l ) t r e a t m e n t . H e a t r e s i s t a n c e w a s a l s o f o u n d t o a c t s i m i l a r o n t h e e o n i d i a f r o m solid a n d l i q u i d c u l t u r e s ( T a b l e 1), e x c e p t a t 7 0 °C, w h e r e a h i g h e r p e r c e n t a g e of s p o r e s f r o m s u b merged culture was inactivated.

Protein patterns of S. griseus spores

>0

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10

'2 o o 60 G

S ,0

c g o -5. ü S

co -5. S o ¡5

3

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strains during development. Z. allg. Mikrobiol., 24, 201 —209.

griseus

Mailing address: Dr. G. VALU, Institute of Biology, University Medical School. H-4012 Debrecen, Hungary

Z e i t s c h r i f t f ü r a l l g e m e i n e M i k r o b i o l o g i e 2 4 ( 1 9 8 4 ) 10, 7 0 9 - 7 1 I

Kurze

Originalmitteilung

( A k a d e m i e der W i s s e n s c h a f t e n der D D R , F o r s c h u n g s z e n t r u m für Molekularbiologie und Medizin, Z e n t r a l i n s t i t u t f ü r Mikrobiologie und e x p e r i m e n t e l l e T h e r a p i e , J e n a )

A new fluorimetric assay for streptothricins (>. HJOSSK, W . R O M K U a n d N . MIOSCJA

(Eimjetjttntjen inn 9. 4. l',)H-t) In s t r o n g l y acidic medium ( 7 0 % H C 1 0 4 ) Km = 3 8 1 n m ) with u n k n o w n s t r u c t u r e . A a n d cultures, r e s p e c t i v e l y , was worked o u t m e a s u r e m e n t s were in t h e r a n g e o f 10~ 8 — a s t a t i s t i c a l e v a l u a t i o n o f results a n d a f i n d i n g s are given.

s t r e p t o t h r i c i n s f o r m a f l u o r o p h o r e (Acx — 3 1 2 n n i ; f l u o r i m e t r i c d e t e r m i n a t i o n o f pure or crude p r o d u c t s b a s e d on t h i s r e a c t i o n . C o n c e n t r a t i o n s for f l u o r e s c e n c e 2 • 10~ 7 moles. I n t e r f e r e n c e s o f t h e a s s a y a r e discussed, c o m p a r i s o n b e t w e e n microbiological a n d f l u o r i m e t r i c

Streptothricins

antibiotics

arc

glycosidic

basic

consisting

of

a

heterocyclic

acid-like aglycone moiety, streptolidine, linked via N-glycosidic bond to

amino

gulosamine

w h i c h is s u b s t i t u t e d w i t h a c a r b a m o y l g r o u p a n d a n o t h e r a m i n o a c i d m o i e t y , in m o s t c a s e s /3-lysine. T h e w h o l e f i e l d h a s b e e n b r o a d l y r e v i e w e d b y KIIOKHLOV ( 1 9 7 8 ) . T h e literature does n o t c o n t a i n a n y m e t h o d for specific d e t e r m i n a t i o n of this g r o u p of a n t i b i o t i c s , e x c e p t for c h a r a c t e r i z a t i o n of a m i n o acids or a m i n o sugars b y

general

procedures (ninhydrin, Pauly, Fehling or biuret reaction). W e report here on a simple f l u o r i m e t r i c a s s a y u s i n g a " h a l o f l u o r i c " r e a c t i o n in s t r o n g l y a c i d i c m e d i u m . T h e d e t e r m i n a t i o n is d e s c r i b e d w i t h s p e c i a l r e f e r e n c e t o n o u r s e o t h r i c i n A a n d B , p r o d u c t s o f a variant of

Streptomyces noursci

( B H A D L K U U. T H R U M 1 9 ( i 3 ) .

'Preparation o f s a m p l e s : 0 . 0 ml a q u e o u s H C 1 0 4 ( 7 0 % ) a r e added t o 0 . 2 ml o f a n a q u e o u s solution o f a n t i b i o t i c (pure or crude p r o d u c t ; c l e a r e d c u l t u r e d b r o t h ) c o n t a i n i n g 10 ¡j.g t o 1 0 0 pig a c t i v e m a t t e r . T h e m i x t u r e is s h a k e n i m m e d i a t e l y , i n c u b a t e d for 2 0 min a t 70 °C in a w a t e r b a t h , t h e n stored for 1 h in w a t e r (20 °C) in t h e d a r k . M e a s u r e m e n t o f f l u o r e s c e n c e : T h e f l u o r o p h o r e e x h i b i t s a m a x i m u m o f a b s o r p t i o n at 3 1 2 n m , a m a x i m u m o f emission a t 3 8 1 n m ( b o t h u n c o r r e c t e d ) . D e t e c t i o n o f f l u o r e s c e n c e was p e r f o r m e d a t A ex 3 6 5 n m ( H g l a m p ; g r a t i n g ) a n d from A,.,,, 4 4 0 n m ( c u t o f f f i l t e r ) . E x c i t a t i o n a t a longer w a v e l e n g t h was chosen to a v o i d i n t e r f e r e n c e b y protein a b s o r p t i o n . T h e f l u o r e s c e n c e can be m e a s u r e d in a n y s u i t a b l e i n s t r u m e n t . W e used t h e SPKKOL 11 ( V E B CAUL ZEISS J e n a , D D R ) with f l u o r e s c e n c e e q u i p m e n t (single p h o t o m u l t i p l i e r mode). T h e concent r a t i o n o f n o u r s e o t h r i c i n was read o f f from a c a l i b r a t i o n g r a p h p r e p a r e d b y c a r r y i n g o u t t h e s a m e p r o c e d u r e with a t least four s t a n d a r d s in e a c h set. L i n e a r i t y o f f l u o r e s c e n c e response was o b t a i n e d f r o m 5 ¡ig up t o a t least 170 [xg, b u t t h e s t a n d a r d c a l i b r a t i o n c u r v e covers t h e r a n g e f r o m 5 ng/0.2 ml up t o 120 fxg/0.2 ml o f a n a q u e o u s s a m p l e . T h e " l i m i t c o n c e n t r a t i o n " (3 ptg/0.2 ml) is given b y t h e s c a t t e r i n g o f t h e b l a n k . T a b l e 1 r e p r e s e n t s t h e s t a t i s t i c a l e v a l u a t i o n o f results a n d a c o m p a r i s o n b e t w e e n f l u o r i m e t r i c a n d m i c r o b i o l o g i c a l a s s a y of culture broth. H y d r o l y s i s o f a n t i b i o t i c : 3 0 mg n o u r s e o t h r i c i n dissolved in 5 ml li N HC1, 2 hrs a n d 17 hrs a t 8 0 °C, 2 4 hrs a t 105 °C h y d r o l y z e d under nitrogen in a sealed t u b e ; HC1 was r e m o v e d b y r o t a r y vacuum evaporation. Circular p a p e r c h r o m a t o g r a p h y : S e r v a e e l c a t i o n e x c h a n g e p a p e r S A - 2 ; inner d i a m e t e r 2 . 3 c m , solvent f r o n t d i a m e t e r 9 . 5 c m ; 2 . 4 mg o f h y d r o l y z e d a n t i b i o t i c a p p l i e d along t h e i n n e r d i a m e t e r ; s o l v e n t : 0.1 mol/1 c i t r a t e buffer p H 5 . 6 ; d e v e l o p m e n t : 2 . 5 h r s ; d e t e c t i o n : p o l y c h r o m a t i c ninhydrin r e a g e n t ( c o n t a i n i n g copper n i t r a t e ) . G u l o s a m i n e : p i n k . R p = 0 . 3 9 ; 1 , 6 - a n h y d r o g u l o s a m i n c : p i n k . Rji' = 0 . 3 0 ; streptolidyl g u l o s a m i n i d e : yellow, Rj,' = 0 . 2 1 ; /3-lysine: blue, R j - = 0 . 1 8 ; s t r e p t o lidine: yellow. R p = 0 . 0 6 ; n o u r s e o t h r i c i n : blue, rests upon t h e origin. U n s t a i n e d s e g m e n t s were cut o u t , eluted (HC1), solutions dried a n d a l i q u o t s o f t h e residues were a n a l y z e d .

710

G. HESSE, W . RÖMER a n d N . MIOSUA

Table 1 Accuracy and reproducibility of standards and culture broth; comparison between fluorimetrie and microbiological assay of culture broth, n = 10; a = 3 -| 3 dose test with B. subtilis A T C C 0033 (in agreement with " A r z n e i b u c h " of G D R ) Standard 1 (0.3 (jtg/0.2 ml) aqu. sol.

Standard 2 (50.4 (xg/0.2 ml) aqu. sol.

Culture broth 4500 (ig/ml) Fluorimetrie assay

Microbiological assay"

Mean x

0.80

57.51

4235

4573

Standard deviation s

0.84

2.00

137

340

95%-confidence interval

(0.20; 7.40)

(50.78; 58.22)

(4137; 4333)

(4331; 4815)

T h e reaction takes place o n l y in s t r o n g l y acidic solution and fluorescence response is d e p e n d e n t o n the w a t e r content of the r e a c t i o n m i x t u r e ( F i g . 1). Salts such as sulfates, nitrates or p h o s p h a t e s w i t h non o x i d i z i b l e cations d o n o t cause errors in f l u o r e s c e n c e a m o u n t up t o 0.1 val/1 in t h e sample. Chlorides, F e ( I l ) - s a l t s a n d glucose d i m i n i s h t h e f l u o r e s c e n c e in a s t o c h i o m e t r i c w a y (0.06 val/1 = 4 5 % loss); o x i d i z i n g a g e n t s (e.g., K M n 0 4 , K 2 C r 2 0 7 ) d o so t o o , but in a less c o m p a r a b l e m a n n e r . O r g a n i c m a t t e r in the s a m p l e results in a y e l l o w color ( o x i d a t i o n ) and decreased fluorescence. O p p o s i t e l y , M e O H or M e O H / H a O m i x t u r e s d o not interfere, thus a l l o w i n g the analysis of m e t h a n o l soluble salts of s t r e p t o t h r i c i n s (e.g., p i c r a t e s ) . Cultures w i t h l o w a c t i v i t y ( l o w d i l u t e d test s p e c i m e n ) are d e t e c t a b l e o n l y using f o u r f o l d d i l u t i o n f o l l o w e d b y e x t r a p o l a t i o n t o i n f i n i t e d i l u t i o n . On t h e o t h e r hand, p o t e n t samples ( 2 ; 2 0 0 0 |j.g/ml) require o n l y one

100- ».

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Ratio H20 : HCI0¿

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(70%)

Fig. 1

Time of hydrolysis

20 (hi

Fig. 2

F i g . 1. L o w e r i n g of fluorescence by increasing water amounts in the test solution F i g . 2. Fluorimetric and microbiological recovery after mild alkaline and acidic hydrolysis •

= 0 . 1 s N a O H , 37 °C ( f l u o r i m . ) ; X =

1 N H C l , 105 °C (microbiol.)

1 N HCl, 105 °C ( f l u o r i m . ) ; • = 0.1 u N A O H , 37 ° C a n d

A new fluorimetrie assay for streptothricins

711

h i g h d i l u t i o n c o v e r e d w i t h a small e r r o r of d e t e r m i n a t i o n . T h e r e is 110 a g r e e m e n t bet w e e n loss of m i c r o b i o l o g i c a l a c t i v i t y a n d d e c r e a s e of f l u o r e s c e n c e a f t e r mild a l k a l i n e a n d a c i d i c h y d r o l y s i s (Fig. 2). I s o l a t i o n of c o n s t i t u e n t s of t h e a n t i b i o t i c a f t e r h y d r o lysis (KGOKOV at al. 1905) b y c i r c u l a r p a p e r c h r o m a t o g r a p h y (see e x p e r i m e n t a l ) a n d i n s e r t i o n i n t o t h e d e s c r i b e d t e s t s h o w e d a s l i g h t l y raised f l u o r e s c e n c e f o r l,(>-anhydrogulosamine. W e d i d n o t s u c c e e d in e l u c i d a t i n g t h e s t r u c t u r e of t h e f l u o r o p h o r e . I t s o c c u r r e n c e o n l y in s t r o n g l y a c i d i c s o l u t i o n e x c l u d e s all p r o c e d u r e s of isolation. T h e f i n d i n g s m e n t i o n e d in F i g . 2 a n d t h e f a i r l y e x a c t n o n - f l u o r e s c e n c e of m o l e c u l a r c o n s t i t u e n t s of n o u r s e o t h r i c i n a f t e r its h y d r o l y s i s s u g g e s t t h a t e i t h e r i n t e r m e d i a t e h y d r o l y t i c p r o d u c t s involving the c a r b o h y d r a t e moiety or preferential mesomeric forms, d e h y d r a t i o n o r labile s t a t e of o x i d a t i o n a r e r e s p o n s i b l e f o r t h e rise of f l u o r e s c e n c e (BARTOS a n d PESEZ 1972). T h e c i t e d i n f l u e n c e of r e d u c i n g a g e n t s a n d w a t e r a r g u e s f o r t h e l a t t e r hypothesis.

lJeferenccs B u r r o s . J . and 1'ESKZ, M., 1972. Organic analysis by luminiseence methods. Talanta, lit, 93 — 124. BKADLEU. d. und TIIRUM. H., 1963. Nourseothricin A und B, zwei neue antibakterielle Antibiotika einer Streptomyce« »oitrset-Variante. Z. allg. Mikrobiol., 3, 105 — 112. EOOBOV, C. A . , RESHETOV, P . D . a n d KHOKHLOV, A . S . , 1 9 6 5 . A m e t h o d f o r t h e q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s

of streptothriein hydrolysates. J . Chromatog., li), 214 — 215. KHOKHLOV, A. S., 1978. J . Chromatography Library, vol. 15, Antibiotics, separation and purification. Elsevier, Amsterdam-Oxford-New York, 017 — 713.

Mailing address: Dipl.-Chem. G. HESSE, Zentralinstitut für Mikrobiologie, und experimentelle Therapie der AdW, DDR-6900 Jena, Beutenbergstr. 11

Zeitschrift f ü r allgemeine Mikrobiologie 24 (1984) 10, 712

Buchbesprechung C. Ratlkiigu and J . S t a n f o r d (Editors). The Biology of Mycobaeteria — Volume 2: Immunological and Environmental Aspects. X 4 554 S., 08 Abb.. 40 Tab. London-New York-Paris-San DiegoSa n Franciseo-Sao Paulo-Sydney-Tokyo-Toronto 1983. Aeademic Press. $ 99.00. ISBN 0-12582302-9. Daß der 2. Band des Werkes schon ein J a h r nach der Veröffentlichung des 1. Bandes vorliegt, kann mit Genugtuung registriert werden. Das Buch ist in drei Teile mit insgesamt 10 Kapiteln gegliedert. Der erste Teil, der Zvveidrittel des Buches einnimmt, beschäftigt sich mit den immunologischen Aspekten. Allein schon am Umfang und der Zahl der Literaturzitate ist zu erkennen, welchen großen Aufschwung dieses Teilgebiet in den letzten 10 bis 15 Jahren genommen hat. Zwei Gründe dürften dafür entscheidend sein, die besondere Eignung der Gattung Mycobacterium, für das Studium der zellulären Immunmechanismen und die zahlreichen Untersuchungen des letzten Jahrzehnts über die Rolle von BOG und anderen Mykobakterienstämmen und -arten als Immunmodulatoren. Diese beiden Sachgebiete stehen daher im Vordergrund des Buches. Eingeleitet wird der erste Teil mit der Darstellung von Inhaltsstoffen, die als Adjuvanzien und Antigene wirksam sind. Es folgt eine ausführliche Abhandlung über die mykobakteriellen Granulome. Ausgehend von den Faktoren, welche die Granulome induzieren und deren Charasterika bestimmen. werden die histopathologischen Spektren mykobakterieller Erkrankungen in Abhängigkeit von diesen Faktoren diskutiert. Im Zusammenhang mit der Beschreibung von Tiermodellen und den Immunmechanismen wird auch auf die für tierexperimentelle Untersuchungen wichtigen bakteriologischen Voraussetzungen wie Bakterienkultivierung, Keimzählung usw. eingegangen. Großen Baum nimmt eine Abhandlung über die mononucleären Phagozyten und deren Rolle bei der Pathogenese, insbesondere von Tuberkulose und Lepra ein. Dabei geht es vor allem um die Beweisführung, daß mononucleäre Phagozyten, die sich mit pathogenen Mykobakterien bereits auseinandergesetzt haben, eine größere mykobaktericide Kapazität besitzen als diejenigen, welche einen solchen Kontakt noch nicht hatten. Im zweiten, mit ..Environmental Aspects" überschriebenen Teil, werden zunächst die einzelnen Vertreter der Gattung in Beziehung zu ihrer Umgebung in vier Gruppen (saprophytische, potentiell pathogene, fakultativ pathogene, obligat pathogene) eingeordnet und die Gruppen kurz charakterisiert. Es folgt eine Abhandlung der für die Vermehrung der Mykobakterien relevanten abiotischen und biotischen Faktoren. Besondere Aufmerksamkeit wird den bekannten BCG-Impfversuchen gewidmet und dabei die Ursachen für Erfolg bzw. Mißerfolg der einzelnen Aktionen diskutiert. Im Vordergrund dieser Diskussion steht die sehr interessante Frage nach der Bedeutung der ,,Umgebungs"-Mykobakterien im Prozeß der Immunisierung gegen Tuberkulose und Lepra. In einer Übersicht werden die tierpathogenen Arten kurz charakterisiert, ihre Verbreitung aufgezeigt und die bei den verschiedenen Tierspezies verursachten Mykobakteriosen beschrieben. Im dritten, nur wenige Seiten umfassenden Teil wird auf zwei Krankheiten mit möglicher mykobakterieller Ätiologie eingegangen, den Morbus Boeck und die Inflammatory Bowel Disease (1BD). Der zweite Band ist ebenso wie der erste, didaktisch gut aufgebaut. Jedes Kapitel beginnt mit einem übersichtlichen Inhaltsverzeichnis und schließt mit einem umfangreichen Literaturverzeichnis ab. Er kann allen an Mykobakterien interessierten, insbesondere Bakteriologen, Immunologen, Biochemikern, Forschungsstudenten und Fachlehrern empfohlen werden. A. Zur eck (Jena)

Zeitschrift für allgemeine Mikrobiologie ¡M (1984) 10, 7 1 3 - 7 1 7

Kurze

Originalmitteilung

(Sektion Biologie der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald und Akademie der Wissenschaften der DDR. Institut für Technische Chemie, Leipzig)

T h e effect of v a r y i n g concentrations of Mg 2 + and A T P upon the kinetic behaviour of d i h y d r o x y a c e t o n e kinase f r o m the methanol-assimilating y e a s t Candida methylica K.

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