Acta Biologica et Medica Germanica: Band 28, Heft 2 [Reprint 2021 ed.] 9783112578322, 9783112578315

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funktioneile Biowissemcbaßen

R. Baumann • II. Dutz A. Graffi • I I. Gummcl

F. Jung • L.-W. Kcttlcr O. Prokop • S. M. Rapoport Unter Mitarbeit von : H. Ambrosius • H. Ankermann G. Dörncr • H. Drischcl H . A . Freye • H. Frunder E . Goctzc • H. Hanson E . Hofmann • W. Köhler F. Markwardt • 1-1. Matthics W. Oclßner • G. Pasternak A. Schellenbcrgcr • E . Schubert F. Schwarz • G . Sterba A. Wollenberger

Band 28 Heft 2 • igj2 Seite 201—396

ABMGAJ 28 (2) 201-396 (1972)

AKADEMIE-VERLAG BERLIN

AUFNAHMEBEDINGUNGEN 1. Die ACTA BIOLOGICA E T MEDICA GERMANICA, Zeitschrift f ü r funktionelle Biowissenschaften, publiziert Arbeiten aus den Fachgebieten Biochemie, Physiologie (einschließlich Pathophysiologie), Pharmakologie und Immunbiologie. E s werden nur Arbeiten angenommen, die nicht an anderer Stelle mit demselben Inhalt veröffentlicht oder zur Veröffentlichung angeboten werden. Der Autor verpflichtet sich nach Annahme, die Arbeit an keiner anderen Stelle zu veröffentlichen. 2. Die Arbeit muß wissenschaftlich wertvoll sein. Bestätigungen bekannter Tatsachen, Versuche und Beobachtungen ohne positives Ergebnis werden, wenn überhaupt, nur in kürzester Form aufgenommen. Nicht aufgenommen werden Polemiken u n d rein spekulative Arbeiten, falls sie nicht ganz wesentliche neue Gesichtspunkte enthalten. 3. Kurzmitteilungen über experimentelle Ergebnisse werden bei der Drucklegung zeitlich bevorzugt. 4. Die Arbeiten müssen so kurz als möglich abgefaßt werden und in einem druckreifen Zustand geschrieben sein. Einleitung (Problematik), Methodik, Befunde und Diskussion sollen deutlich in Erscheinung treten. Der Arbeit soll eine Zusammenfassung der wesentlichsten Ergebnisse vorausgestellt werden. Arbeiten werden in Deutsch, Englisch und Russisch angenommen. Die Manuskripte sind in zweifacher Ausfertigung einzureichen. Von den Abbildungen sind 2 Kopien sowie 1 Satz reproduktionsreife Vorlagen beizufügen. Genaue Hinweise zur Manuskriptgestaltung sind von der Redaktion der Zeitschrift anzufordern und sind unbedingt einzuhalten. Manuskripte, die diesen Bedingungen nicht entsprechen, werden zurückgewiesen. 5. Die Arbeiten werden im Sofortumbruch gesetzt; größere Korrekturen in F o r m von Streichungen bzw. Zusätzen sind daher in der Umbruchkorrektur nicht zulässig. 6. Manuskripte sind an die Redaktion der ACTA BIOLOGICA E T MEDICA G E R MANICA, I I I S Berlin-Buch, Lindenberger W e g 70, zu senden. 7. Von jeder Originalarbeit werden kostenlos 80 Sonderdrucke geliefert. Schriftleitung

Herausgeber

ACTA BIOLOGICA ET MEDICA GERMANICA Zeitschrift

für funktionelle

Herausgeber: R. A. F. O.

Baumann, H. Dutz, Graffi, H. Gummel, Jung, L.-H. Kettler, Prokop, S. M. Rapoport

Schriftleitung: H. Bielka, W. Scheler Band 28

1972

Heft 2

Biowissenschaften

Acta biol. med. germ., Band 28, Seite 201 —207 (1972) Aus der Orthopädischen Klinik der Charité der Humboldt-Universität zu Berlin (Direktor: Prof. Dr. med. habil. G. K A I S E R )

Ein Beitrag zur Bestimmung der Pyrophosphataseaktivität i m Knochen K . L I N D E N H A Y N , G . WELLMITZ u n d D . H I R T H E

(Eingegangen am 19. 1. 1971/11. 6. 1971) Zusammenfassung Die in der Literatur beschriebene hohe Pyrophosphataseaktivität des Knochen konnte nicht bestätigt werden. Es wird gezeigt, daß beim Inkubieren eines Knochenhomogenates mit Pyrophosphat aus dem Knochenmaterial durch eine Verdrängungsreaktion Phosphat in Freiheit gesetzt wird und so eine hohe Enzymaktivität vortäuschen kann. Einleitung

Nach den Untersuchungen von FLEISCH et al. [ 1 ] sind kondensierte Phosphate, wie Pyrophosphat und langkettige Polyphosphate, befähigt, die kollageninduzierte Kalziumphosphatfällung in vitro in Konzentrationen bis zu 10~6 M zu blockieren. Das Vorkommen von Pyrophosphat in Urin [2], Plasma [3] und Knochen [4] spricht dafür, daß das Pyrophosphat eine bedeutende Rolle in der biologischen Regulierung der Kalzifikation spielen 14

Acta biol. med. germ., Bd. 28, Heft 2

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K . LINDENHAYN, G. WELLMITZ, D.

HIRTHE

kann. FLEISCH et al. [5] konnten schließlich zeigen, daß Pyrophosphat und langkettige Polyphosphate auch die Verkalkung in vivo hemmen. Nach einer Hypothese von FLEISCH soll eine Verkalkung erst nach Zerstörung des Pyrophosphates durch Pyrophosphatase möglich sein, ein Enzym, das in großen Mengen in verkalkenden Geweben vorhanden ist [6—9]. PERKINS [6] hat Pyrophosphatasebestimmungen in Kaninchenknochen durchgeführt, macht aber keine quantitativen Angaben über die Fermentaktivität. Er weist darauf hin, daß bei der Bestimmung beträchtliche Mengen Phosphat aus dem Gewebe selbst befreit werden. Nach den Untersuchungen von CARTIER und PICARD [7] ist die Aktivität der Pyrophosphatase in den Wachstumszonen des Knochens relativ hoch. DULCE [8] extrahiert Knochen mit Wasser und inkubiert den Extrakt mit Magnesiumpyrophosphat. Diese Methode liefert sehr schwankende Werte, auch nach einer von uns durchgeführten Modifikation [11]. CERLETTI et al. [9] zerkleinerten den Knochen mit Hilfe von Quarzsand und inkubierten den Knochenbrei 8 min mit einem großen Überschuß an Pyrophosphat. Die Reaktion wird gestoppt durch Erhitzen oder durch Zugabe von Trichloressigsäure. Die in dieser kurzen Zeit in Freiheit gesetzten Phosphatmengen sind relativ groß. Nach CERLETTI et al. [9] besitzt sowohl kompakter als auch spongiöser Knochen eine hohe Pyrophosphataseaktivität. In Extrakten von nichtorganisierten, von hypertrophen und proliferierenden Knorpelzellen sowie von primärer Spongiosa fand KUHLMANN [10] Pyrophosphatase nur in proliferierenden Knorpelzellen, saure und alkalische Phosphatase jedoch in allen Extrakten. Eigene Untersuchungen konnten die Angaben von CERLETTI und DULCE nicht bestätigen [12]. Methodik Herstellung des 32P-markierten

Pyrophosphates

32

10 (xC trägerfreies P-markiertes P h o s p h a t wurden mit 2 ml Na 2 HP0 4 -Lösung (228 mg N a 2 H P 0 4 • 2 H 2 O / l 0 ml) versetzt, zur Trockene eingeengt, 10 Std. auf 240 bis 250 °C erhitzt und d a n n mit 1 ml Wasser aufgenommen. Die Pyrophosphatkonzentration entspricht d a n n 172 mg Na 4 P 2 0,/10 ml. Herstellung der

Knochenhomogenate

Frisch entnommene Knochen von ca. 80 g schweren W i s t a r r a t t e n wurden von anhaftendem Weichteilgewebe und Knochenmark befreit und dann in einem Glashomogenisator unter Eiskühlung mit physiologischer Kochsalzlösung (5 ml auf 100 mg Knochen) homogenisiert. Bestimmung

der

Pyrophosphatase

Die Bestimmung der Pyrophosphatase ist aus Tab. 1 ersichtlich. Nach dem Inkubieren werden 0,5 ml aus j edem Röhrchen auf eine Anionenaustauschersäule [13] aufgetragen und das Phosphat vom Pyrophosphat getrennt (Dowex 1X2, 200—400mesh, Gegenion Cl", Säulenfüllung 0,95X5,5 cm in Gegenwart von 0,5 M HCl). Dazu wird zunächst mit insgesamt 10 ml Wasser nachgewaschen und mit 50 ml 0,05 M HCl das Phosphat, anschließend mit 0,5 N HCl das Pyrophosphat eluiert. Nach entsprechender Verdünnung werden die Impulsraten in einem Flüssigkeitszählrohr

Pyrophosphataseaktivität in Knochen

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Tabelle 1 Methodik zur Bestimmung der Pyrophosphatase in Knochenhomogenaten mit radioaktivem Pyrophosphat Zentrifugenglas 1 0,2 ml Tris-Puffer, 0,2 M, pH 7,6 0,1 ml MgS0 4 -Lösung (158 mg MgS0 4 • 7 H a 0/10 ml) 0,1 ml Pyrophosphatlösung (172 mg Na 4 P 2 O 7 /l0 ml)

Zentrifugenglas 2 0,2 ml 0,1 ml 0,1 ml 0,2 ml

Tris-Puffer MgS0 4 -Lösung Pyrophosphatlösung Homogenat

beide Proben 60—120 min unter ständigem Schütteln bei 37 °C inkubiert 0,2 ml Homogenat 0,15 ml 0,5 N HCl 0,75 ml H 2 0

—

0,15 ml 0,5 N HCl 0,75 ml H a O

0,5 ml aus Zentrifugenglas 1 u. 2 auf Anionenaustauschersäule zur Phosphat-Pyrophosphattrennung gemessen. Der Fehler der Bestimmung beträgt ¿ 2 % , wenn die Proben während der Inkubation in einem Wasserbad geschüttelt werden. Verwendet man zur PhosphatPyrophosphat-Trennung die Martin-Doty-Separierung, beträgt der Fehler ¿ 7 , 1 % . Ergebnisse

Die Versuchsergebnisse in Tab. 2 und 3 zeigen, daß beim Inkubieren von Knochenhomogenat mit Pyrophosphat aus dem Knochenmaterial auch ohne eine Enzymreaktion Phosphat in Freiheit gesetzt werden kann. Bei dem in Tab. 2 dargestellten Versuch wird der größte Teil des in den Knochen oberflächlich eingebauten radioaktiven Phosphates durch Zusatz von Pyrophosphat wieder verdrängt. Die nach der oben angegebenen Methodik an Knochenhomogenisaten durchgeführten Enzymbestimmungen zeigten, daß die gespaltenen Substratmengen der Reaktionszeit direkt proportional sind (Abb. 1). Bei Verminderung der Magnesiumionenkonzentration im Substrat kommt es zwar zu einem Abfall der Enzymaktivität, die Reaktion läuft jedoch auch ohne Zusatz von Magnesiumionen ab. Wird das Magnesium durch Zink bzw. Kobalt ersetzt, ist ebenfalls ein Aktivitätsabfall zu beobachten. Bei Verminderung der Substratkonzentration (Magnesiumpyrophosphat) nimmt die Spaltung des Substrates sehr schnell ab (Tab. 4). Wahrscheinlich wird das radioaktive Pyrophosphat der verdünnten Substratlösung gleich vom Knochen adsorbiert oder gegen Phosphat des Hydroxylapatites ausgetauscht und steht zur enzymatischen Spaltung nicht mehr zur Verfügung. Die Abhängigkeit der Enzymaktivität von der Erhöhung der Substratkonzentration geht aus Tab. 5 hervor. Es ist bekannt, daß Pyrophosphatase durch SH-Verbindungen aktiviert [14] oder auch gehemmt werden kann 14»

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Tabelle 2 Verdrängung von am Knochen oberflächlich adsorbiertem radioaktivem Phosphat durch Pyrophosphat. 538 mg Rattenknochen wurden mit 10 ml physiologischer Kochsalzlösung, 10 ml Trispuffer, pH 7,6, und 9,5 ml 32 P-markierter Phosphatlösung (10 ¡¿C) homogenisiert, vom Homogenat 2 ml entnommen, zentrifugiert und im Überstand die Impulsrate gemessen. Ebenso wurde nach portionsweiser Zugabe von Natriumpyrophosphat (344 mg Na 4 P a 0 7 je 4 ml) verfahren Zusatz von Pyrophosphat zum Knochenhomogenat [ml]

103 Imp./min

0 0,5 1,0 3,0

44 140 163 169

Tabelle 3 Verdrängung von Phosphat aus dem Knochen durch Pyrophosphat 10 |iC 32 P-Phosphat in 2 ml physiologischer Kochsalzlösung wurden einer ca. 180 g schweren Ratte injiziert, nach 4 Std. das Tier getötet und 1,9 g Knochen mit 40 ml physiologischer NaClLösung und 20 ml Trispuffer homogenisiert und die Impulszahl der Lösung ohne und nach Zusatz von Pyrophosphat gemessen (580 mg Na 4 P 2 O 7 /10 ml) Zusatz von Pyrophosphat zum Knochenhomogenat [ml] 0 0 0,75 1,75 2,75 4,75 6,75 11,75

(Aktivität (Aktivität (Aktivität (Aktivität (Aktivität (Aktivität (Aktivität (Aktivität

des des des des des des des des

Gesamthomogenates) „klaren" Zentrifugates) „klaren" Zentrifugates) „klaren" Zentrifugates) „klaren" Zentrifugates) „klaren" Zentrifugates) „klaren" Zentrifugates) „klaren" Zentrifugates)

Imp./min 356 18 67 149 198 226 218 233

[15]. I n Gegenwart von Thioglykolsäure durchgeführte Bestimmungen ergaben eine verminderte E n z y m a k t i v i t ä t . Zur B e s t i m m u n g der Pyrophosphataseaktivität m i t radioaktivem P y r o phosphat in einzelnen Knochenabschnitten wurde ein R a t t e n f e m u r in 4 Teile zersägt (s. Abb. 2), die einzelnen Teile insgesamt homogenisiert und

205

Pyrophosphataseaktivität in Knochen

Abb. 1. Abhängigkeit der gespaltenen Substratmenge von der Zeit Abb. 2. Aufteilung des Rattenfemurs in 4 Abschnitte zur Enzymbestimmung

Tabelle 4 Abhängigkeit der Enzymaktivität von der Substratkonzentration Substratkonzentration (Magnesiumpyrophosphat) [Mol/1]

Enzymaktivität [Imp./min]

2,7 • l c r 3 2,98 • l ( r 4 7,54 • 1CT5

6110 7 0

Tabelle 5 Abhängigkeit der Enzymaktivität von der Substratkonzentration Konzentration der zum Inkubieren verwendeten MgS0 4 -Lösung

| Na 4 P 2 0,-Lösung

Enzymaktivität [Imp./min]

[mg/10 ml] 39,5 79 158 316

43 86 172 344

502 1415 1644 1617

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Tabelle 6 Enzymaktivität der in Abb. 2 angegebenen Abschnitte eines Rattenfemurs Abschnitt

Enzymaktivität in ^Mol gespaltenes Pyrophosphat/60 min/ 100 mg Knochen

I II III IV

3,68 2,60 0,48 4,83

die Fermentaktivität nach der oben angegebenen Methode bestimmt. Hierbei zeigte sich, daß die Pyrophosphataseaktivität im Epiphysenbereich 4 am größten, in der Diaphyse dagegen am niedrigsten ist (Tab. 6). Das ist nicht verwunderlich, denn Knochenkompakta ist relativ arm an Zellen, weshalb auch keine beträchtlichen Enzymaktivitäten zu erwarten sind. Diskussion

Mit der von C E R L E T T I et al. [9] angegebenen Methode fanden wir im Knochen ebenfalls hohe Enzymaktivitäten, mußten jedoch feststellen, daß die in Freiheit gesetzten Phosphatmengen unabhängig von der Inkubationszeit waren. Das spricht dafür, daß das Phosphat nicht durch eine Enzymreaktion gebildet wird. Bekanntlich tauscht Hydroxylapatit F~, S O " und andere Ionen sehr leicht gegen Phosphat aus. Aus dem in Tab. 3 dargestellten Versuch geht hervor, daß bei der Inkubation des Knochenhomogenates mit Natriumpyrophosphat Phosphat aus dem Hydroxylapatit verdrängt wird. In einer einfachen Gleichung verdeutlicht könnte man schreiben: P 2 0*- + 2 CaHP0 4 !

Ca 2 P 2 0 7 j

+ 2 HPOr"

Phosphat wird also auf Grund einer Verdrängungsreaktion frei und nicht durch eine enzymatische Reaktion. Daher ist es nicht verwunderlich, daß C E R L E T T I et al. [9] für Kompakta eine doppelt so hohe „Pyrophosphataseaktivität" finden als für Spongiosa, denn Kompakta besteht zu 60% aus anorganischem Material, Spongiosa aber nur zu 30%, so daß auch etwa die doppelte Menge an Phosphat ausgetauscht werden kann [16]. Unsere Untersuchungen zeigen, daß die Beendigung der Enzymreaktion zur Bestimmung der Pyrophosphatase im Knochen nicht einfach durch Erhitzen erfolgen darf, da die Verdrängungsreaktion dann sofort unter Freisetzung von Phosphat vor sich geht und so eine hohe Enzymaktivität vortäuscht. In jedem Fall muß daher nach der Bestimmung angesäuert werden, damit alles Kalziumphosphat in Lösung geht. Der während der Bestimmung eingetretene Ionenaustausch spielt dann keine Rolle mehr. Bei der Pyrophosphatasebestimmung an Gesamthomogenisaten von Knochen ohne Ver-

Pyrophosphataseaktivität in Knochen

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wendung von radioaktivem Pyrophosphat besteht das Problem, kleine, durch Enzymwirkung freiwerdende Phosphatmengen neben großen Phosphatmengen nachzuweisen, die beim Ansäuern nach dem Inkubieren aus dem Knochenmaterial in Lösung gehen. Im kompakten Knochen ist es daher nicht möglich, auf einfachem Wege eine Pyrophosphataseaktivität nachzuweisen. I m Epiphysenbereich dagegen besteht keine Schwierigkeit, da hier die Enzymaktivität höher, der Kalziumphosphatgehalt dagegen geringer als in der Diaphyse ist. In Extrakten von homogenisiertem kompaktem Knochen konnten wir keine Pyrophosphataseaktivität nachweisen. Aus unseren Untersuchungen geht hervor, daß in diaphysärem Knochen nur eine geringe, in den Epiphysenbereichen dagegen eine höhere Enzyma k t i v i t ä t vorhanden ist. Die Angaben von CERLETTI et al. [9] nach denen kom-

pakter Knochen und Spongiosa eine hohe Pyrophosphataseaktivität aufweisen, konnten von uns nicht bestätigt werden. Die Messungen wurden im Lsotopenlabor des Pathologischen Institutes der Charité (Direktor: Prof. Dr. med. habil. L . K E T T L E R ) durchgeführt. Den Herren Dozent Dr. K U N Z und Dipl.-Chem. B R A S E L M A N N sei an dieser Stelle gedankt. Literatur "1"

F L E I S C H , H . , F . S T R A U M A X N , R . S C H E N K , S . B I S A Z , E . F R E I , J . M A K K K I U. M .

ALL-

Helv. phvsiol. pharmac. Acta 22, C 71 (1964) [ 2 ] F L E I S C H , H . U. S. B I S A Z : Am. J . Physiol. 203, 6 7 1 ( 1 9 6 2 ) [3] F L E I S C H , H . U. S. B I S A Z : Helv. phvsiol. pharmac. Acta 20, C 52 (1962) "4] P E R K I N S , H . R. U. P . G. W A L K E R : J . Bone J t Surg. B 40, 333 (1958) 5 F L E I S C H , H., D. S C H I B I Î L E R , J . M A E R K I U. J . F R O S S A R D : Helv. phvsiol. pharmac. Acta 22, C 1 1 9 (1964) "6] P E R K I N S , H. K . : Biochem. J . 57, X V (1954) 7] C A R T I E R , P. U. J . P I C A R D : Bull. Soc. Chim. biol. 37, 1169 (1955) [8] D U L C E , H . - J . : Hoppe-Seyler's Z . physiol. Chem. 319, 272 (i960) [9' C E R L E T T I , P . , P . L . I P O T A U. G . T A N C R E D I : Experientia 14, 440 (1958) : 1(>: K U H L M A N N , K . E . : J . Bone J t Surg. A 47, 545 (1965) 11 \ W E L L M I T Z , G. u. K. L I N D E N H A Y N : Wiss. Z. Humboldt-l'niv. Berlin, math.-naturwiss. R . 18, 415 (1969) 12] L I N D E N H A Y N , K . , G . W E L L M I T Z U. G . S C H R A M M : Wiss. Z . Humboldt-Univ. Berl., math.-naturwiss. Reihe 18, 417 (1969) [ 1 3 ] F L E I S C H , H. u. S . B I S A Z : Helv. physiol. pharmac. Acta 21, 8 8 ( 1 9 6 3 ) [14] S C H E U C H , I). u. S . R A P O P O R T : Acta biol. med. germ. 6 , 23 (1961) [15] Cox, Ii. P., P. G I L B E R T U. M. J . G R I F F I N : Biochem. J . 105, 155 (1967) [16] H E U C K , F . : Radiologia austriaca 14, 40 (1963) C.ÖWER:

Anschrift der Verfasser : Orthopädische Klinik der Charité, 104 Berlin, Scharnhorststr.3 Summary K . L I N D E N H A Y N , G. W E L L M I T Z and D . H I R T H E : A contribution to the determination of pvrophosphatase activity in bones The high pyrophosphatase activity of bones described in the literature could not be confirmed. I t is shown that in incubating a bone homogenate with pyrophosphate, phosphate can be set free from the bone material as a result of a displacement reaction and thus can impart the impression of high enzyme activity.

A c t a biol. m e d . germ., B a n d 28, Seite 2 0 9 - 2 2 0 (1972) Aus der Sektion B i o w i s s e n s c h a f t c n der K a r l - M a r x - U n i v e r s i t ä t Leipzig, Bereich Bioc h e m i e (Leiter: P r o f . D r . H . A U R I C H )

Reinigung und Eigenschaften der L-Aminosäureoxydase aus Neurospora H . AURICH, D. LUPPA

und

G.

SCHÜCKER

( E i n g e g a n g e n a m 1 3 . 4. 1971/21. 6. 1971)

Zusammenfassung Neurospora crassa bildet eine lösliche L - A m i n o s ä u r e o x y d a s e , die sowohl im Myzel als a u c h im zellfreien K u l t u r f i l t r a t g e f u n d e n w e r d e n k a n n . Die L - A m i n o s ä u r e o x y d a s e a u s d e m 160000 x ¿--Überstand des Myzels w u r d e d u r c h A m m o n i u m s u l f a t f r a k t i o n i e r u n g , Gelfiltration an S e p h a d e x G-200 u n d C h r o m a t o g r a p h i e an D E A E - Z e l l u l o s e m e h r als 100fach a n g e r e i c h e r t . Die L - A m i n o s ä u r e o x y d a s e aus d e m K u l t u r f i l t r a t w u r d e m i t A m m o n i u m s u l f a t gefällt u n d f r a k t i o n i e r t sowie d u r c h G e l f i l t r a t i o n a n S e p h a d e x G-200 gereinigt u n d d a d u r c h i n s g e s a m t e t w a 30fach angereichert. N a c h der R e i n i g u n g zeigen beide E n z y m e in der D i s k - E l e k t r o phorese n u r noch eine einheitliche B a n d e . Sie sind in gereinigter F o r m bei 4 °C wochenlang ohne Aktivitätsverlust haltbar. Die E n z y m e a u s beiden P r ä p a r a t i o n s g ä n g e n besitzen ein M o l e k u l a r g e w i c h t v o n 300000 ( ± 5 % ) , zeigen f ü r L - P h e n y l a l a n i n als S u b s t r a t ein £>H-Optimum v o n 9,5 und ein T e m p e r a t u r o p t i m u m v o n 49 °C (Aktivierungsenergie f ü r die O x y d a t i o n v o n L - P h e n y l a l a n i n : 9 9 0 0 cal/Mol). Sie e n t h a l t e n F A D als p r o s t h e t i s c h e G r u p p e u n d geben e n t s p r e c h e n d e A b s o r p t i o n s s p e k t r e n m i t M a x i m a bei 295 u n d 405 n m sowie einer Schulter bei 475 n m . N a c h R e d u k t i o n d u r c h L - P h e n y l a l a n i n bzw. N a t r i u m d i t h i o n i t v e r r i n g e r t sich die E x t i n k t i o n bei 405 n m , die S c h u l t e r bei 475 n m v e r s c h w i n d e t vollständig. Aus d e r E x t i n k t i o n s d i f f e r e n z bei 405 n m zwischen o x y d i e r t e m u n d r e d u z i e r t e m E n z y m k a n n auf e i n e n G e h a l t v o n 4 F A D / E n z v m m o l e k ü l geschlossen w e r d e n . Einleitung

Neurospora crassa bildet u n t e r b e s t i m m t e n Bedingungen eine lösliche L-Aminosäureoxydase (L-Aminosäure:0 2 -oxydoreduktase, EC 1.4.3-2.), die sowohl in Myzelextrakten als auch während der Autolyse des Myzels im zellfreien K u l t u r f i l t r a t nachgewiesen werden k a n n ¡"11. Die gemessenen A k t i v i t ä t e n sind von der Z u s a m m e n s e t z u n g des N ä h r m e d i u m s u n d von der W a c h s t u m s p h a s e abhängig [2]. Hochgereinigte E n z y m p r ä p a r a t e w u r d e n aus Neurospora bisher nicht dargestellt. T H A Y E R u n d H O R O W I T Z [ 3 ] h a t t e n das E n z y m n u r mit A m m o n i u m s u l f a t sowohl aus dem K u l t u r f i l t r a t als auch aus einem Myzelextrakt gefällt. B U R T O N [ 4 ] versuchte, das E n z y m aus dem N ä h r m e d i u m durch Azeton- bzw. A m m o n i u m s u l f a t f ä l l u n g mit anschließen-

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H . AURICH,

I). L U P P A , G .

SCH('CKJ:K

der Adsorption an Kupferhydroxid anzureichern. Alle bisher bekannten Daten über die L-Aminosäureoxydase bezüglich Molekülgröße und Art, Anzahl und Bindung der prosthetischen Gruppen im aktiven Zentrum und der Reaktionskinetik stammen praktisch aus Untersuchungen an Enzymen aus Schlangengift bzw. tierischen Geweben. Für Ncurospora ist die Existenz einer L-Aminosäureoxvdase im Myzel und einer im Medium von besonderem Interesse. Um Aussagen über die Identität oder Verschiedenheit beider Enzyme machen zu können, war es notwendig, beide getrennt zu isolieren und zu charakterisieren. Die vorliegende Mitteilung beschreibt Präparationsgänge zur Anreicherung der L-Aminosäureoxydase aus dem Myzel und aus dem Medium von Nenrosfiora crassa. Außerdem wurden einige wichtige Eigenschaften der präparierten Enzyme untersucht und verglichen. Material und Methoden V e r s u c h s o b j e k t war .V. crassa 3a6A ( F G S C 955)- Als I n o k u l u m dienten M a k r o k o n i d i e n aus einer K u l t u r , die bei 4 - 4 °C auf „ X e u r o s p o r a Culture A g a r " (1 )ifco) g e h a l t e n wurde. Zur Gewinnung der Myzelien bzw. des K u l t u r f i l t r a t s wurden O b e r f l ä c h e n k u l t u r e n auf einem vollsynthetischen Minimalmedium [5] gezüchtet, das 0,3 ¡^g Biotin/1, als C-Ouelle 2 ° 0 Glukose und als X - Q u e l l e 0,1 % A m m o n i u m t a r t r a t , 0,1 ° ( ) A m m o n i u m n i t r a t und 0 , 0 5 % L-Arginin enthielt. N a c h dem B e i m p f e n wurde die K u l t u r f l ü s s i g k e i t zu j e 4 0 ml in 300 m l - E r l e n m e y e r k o l b e n v e r t e i l t und im D u n k e l n bei 30 °C i n k u b i e r t . Als M a ß für die W a c h s t u m s i n t e n s i t ä t wurde das M v z e l t r o c k e n g e w i c h t b e n u t z t . Zur Verfolgung der A k t i v i t ä t der L-Aminosäureoxydase während der R e i n i g u n g ben u t z t e n wir — etwas v a r i i e r t — die M e t h o d e von L i x et al. [6"|. Dazu wurden a d ä q u a t e Mengen des E n z y m s m i t 10 [xMol L - P h e n y l a l a n i n in 0,1 M T r i s / H C l - P u f f e r (¿>H 7,5; 2 ml E n d v o l u m e n ) in offenen R e a g e n z g l ä s e r n bei 38 °C im W a s s e r b a d g e s c h ü t t e l t (220 Schwingungen/min). K a t a l a s e f r e i e n E n z v m p r ä p a r a t i o n c n wurden zur V e r m e i d u n g der D e k a r b o x y l i e r u n g des e n t s t e h e n d e n P h e n y l p y r u v a t s (durch das parallel dazu sich bildende H 2 O a ) etwa 60 I E K a t a l a s e zugesetzt. Die R e a k t i o n wurde durch Zugabe von 0,4 ml 2 5 % i g e r Trichloressigsäure gestoppt und der E i w e i ß n i e d e r s c h l a g abzentrifugiert. V o m k l a r e n Ü b e r s t a n d wurde 1 ml m i t 3 m l 0,1 M T r i s / H C l - P u f f e r , pYl 7,5, g e m i s c h t und die E x t i n k t i o n bei 300 n m (1 c m S c h i c h t d i c k e ) im U n i v e r s a l - S p e k t r o p h o t o m e t e r V S U 1 ( V E B Carl Zeiss J e n a ) gegen eine g l e i c h b e h a n d e l t e P r o b e ohne S u b s t r a t z u s a t z gemessen. D i e Auswertung erfolgte a n h a n d einer E i c h k u r v e , die m i t P h e n v l p y r u v a t a u f g e n o m m e n wurde. Zur Messung der initialen R e a k t i o n s g e s c h w i n d i g k e i t e n b e i der E r m i t t l u n g der T e m peratur- und />H-Optima der L-Aminosäureoxydase b e n u t z t e n wir ein von uns e n t wickeltes polarographisches Verfahren [71 m i t Hilfe einer vibrierenden P l a t i n e l e k t r o d e n a c h CHANCE und WILLIAMS [8] in einer offenen Meßzelle. Die K o n z e n t r a t i o n s a b n a h m e des an der R e a k t i o n beteiligten Sauerstoffs wurde kontinuierlich registriert. Zugabe von K a t a l a s e ist dabei n i c h t notwendig, da das e n t s t e h e n d e W a s s e r s t o f f p e r o x i d an der P l a t i n e l e k t r o d e sofort zersetzt wird und den polarographischen T e s t n i c h t stört. D i e spezifische A k t i v i t ä t des E n z y m s ist in I n t e r n a t i o n a l e n E i n h e i t e n pro mg P r o t e i n angegeben. Als M a ß für die E n z y m m e n g e b e n u t z t e n wir die I n t e r n a t i o n a l e E i n h e i t (1 I E = 1 jiMol S u b s t r a t u m s a t z / m i n ; S u b s t r a t : L - P h e n y l a l a n i n ) . D e r E i w e i ß g e h a l t wurde bis zu den S ä u l e n t r e n n u n g e n n a c h der Methode von LOWRV et al. [9] b e s t i m m t . In den F r a k t i o n e n der S ä u l e n e l u a t e wurde das P r o t e i n a n h a n d der E x t i n k t i o n bei 280 nm im D u r c h f l u ß p h o t o m e t e r U v i c o r d I I ( L K B P r o d u k t e r A B ,

L-Aminosäureoxydase aus X e u r o s p o r a

211

Schweden) gemessen. Als S t a n d a r d s wurden H u m a n - und R i n d e r s e r u m a l b u m i n verwendet. Die Anreicherung der Hnzvme wurde mit Hilfe der Disk-Elektrophorese in Polyakrylamidgel in einer von M A U R K R [10] beschriebenen A p p a r a t u r verfolgt. Die Anfangss t r o m s t ä r k e b e t r u g 1 mA pro R ö h r c h c n ; d a n a c h w u r d e mit 5 niA p r o Gel g e a r b e i t e t (Laufzeit 120 min). E s wurde ein Mittelporgel (7,5% Akrylamid, pW 8,9) verwendet. Die Proteine wurden mit Coomassie Brillant Blau G 250 a n g e f ä r b t . Zur D a r s t e l l u n g der A k t i v i t ä t der L-Aminosäureoxvdase wurden die Gele bei 37 °C im D u n k e l n in einem Gemisch von 0,25 mg Jodnitrotetrazoliumchlorid, 0,025 mg P h e n a z i n m e t h o s u l f a t und 66 mg L-Phenylalanin in 100 ml 0,1 M Tris/HCl-Puffer, pYl 7,5, i n k u b i e r t . Die e n z v m aktiven B a n d e n f ä r b e n sich rot. Molekulargewichtsbestimmungen wurden mit Hilfe der Disk-Elektrophoresc im kontinuierlichen P o l v a k r v l a m i d g e l g r a d i e n t e n d u r c h g e f ü h r t [11]*. Die E n z y m s p e k t r e n wurden mit Hilfe des D o p p e l s t r a h l p h o t o m e t e r s DK-2A (Beckman I n s t r u m e n t s G m b H ) bei K a u m t e m p e r a t u r a u f g e n o m m e n . Die Kiivetten waren luftdicht verschließbar (Schichtdicke 1 c m ; Volumen 4 ml). Die R e d u k t i o n des FAD erfolgte mit L-Phenylalanin bzw. X a t r i u m d i t h i o n i t . Ergebnisse und Diskussion

1. Reinigung

der

Enzyme

R e i n i g u n g der L - A m i n o s ä u r e o x y d a s e aus dem Myzel G e w i n n u n g des M y z e l e x t r a k t s D i e M y z e l i e n w u r d e n a m 14. W a c h s t u m s t a g g e e r n t e t . Z u diesem Z e i t p u n k t erreicht die spezifische A k t i v i t ä t im M y z e l e x t r a k t ihr M a x i m u m [12]. J e 30 M y z e l i e n w u r d e n d u r c h F i l t r a t i o n v o m K u l t u r m e d i u m g e t r e n n t , m i t etwa 400 ml eiskaltem Wasser und anschließend mit 0,02 M Phosphatpuffer, fYi 7,5, g e w a s c h e n . D a n a c h w u r d e n sie bei 4 °C m i t S e e s a n d i m Mörser zerrieben. D a s H o m o g e n a t w u r d e m i t 7 0 m l P h o s p h a t p u f f e r v e r d ü n n t u n d filtriert. I n diesem F i l t r a t w u r d e die A k t i v i t ä t der L - A m i n o s ä u r e o x y d a s e g e m e s s e n (I, T a b . 1). D u r c h Z e n t r i f u g a t i o n bei 1 6 0 0 0 0 X g (30 min) erh ö h t e sich die spezifische A k t i v i t ä t des E n z y m s i m Ü b e r s t a n d e t w a auf d a s D o p p e l t e (II, T a b . 1). Fraktionierung mit

Ammoniumsulfat

D e r E x t r a k t a u s 3 • 30 M y z e l i e n w u r d e m i t f e s t e m A m m o n i u m s u l f a t auf einen S ä t t i g u n g s g r a d v o n 8 0 % g e b r a c h t (III). N a c h 9 0 m i n w u r d e der N i e d e r s c h l a g a b z e n t r i f u g i e r t ( 1 0 0 0 0 0 X g, 15 min) u n d a n s c h l i e ß e n d in 75 m l 6 0 % g e s ä t t i g t e r A m m o n i u m s u l f a t l ö s u n g s u s p e n d i e r t . N a c h Z e n t r i f u g a t i o n bei 1 0 0 0 0 0 X g (15 min) w i r d ein g e l b l i c h g e f ä r b t e r Ü b e r s t a n d erhalten, der e t w a 7 5 % des E n z y m s e n t h ä l t (IV). D i e spezifische A k t i v i t ä t des E n z y m s e r h ö h t sich d a b e i e t w a u m d a s 9 f a c h e ( T a b . 1). * Für die D u r c h f ü h r u n g der Molekulargewichtsbestimmungen sind wir H e r r n Dr. DIKZI:L, Physiologisch-chemisches I n s t i t u t der Karl-Marx-Universität, zu D a n k verpflichtet.

212

H . A U R I C H , D . L U P P A , G . SCHÜCKER

Tabelle 1 Anreicherung der L-Aminosäureoxydase aus dem Myzel von N. crassa (ausgehend von 90 Myzelien, 14. Wachstumstag)

Reinigungsschritt

I Myzelextrakt II Überstand III Ammoniumsulfatfällung (80%) IV Ammoniumsulfatfraktion ( 6 0 - 8 0 % ) V Gelfiltration an G-200 VI Chromatographie an DEAE-Zellulose

Aktivität GesamtProtein Gesamt- Spez. Akt. Akt. [IE/mg [mg] [IE) Prot.]

Ausbeute [%]

Anreich.grad

100

10,4

0,013 0,030

96

2,3

9,7

0,035

90

2,7

8,3 6,0

0,333 1,06

77

25

5,6

55

82

2,2

3,2

1,45

30

112

840

10,8

34 S 280 24,8

1

G e l f i l t r a t i o n a n S e p h a d e x G-200 Der mit Hilfe von Kollodiumhülsen eingeengte Überstand wurde mit Hilfe aufsteigender Gelfiltration in Sephadex G-200 in einer K 25/45-Säule (Pharmacia, Uppsala) mit Phosphatpuffer weiter getrennt (Abb. 1). Das Eluat wurde in 5 ml-Fraktionen gesammelt. Das Enzym erscheint mit dem zweiten Proteingipfel. Die aktivsten Fraktionen wurden vereinigt (V). Die spezifische Aktivität des Enzyms erhöht sich bei der Gelfiltration um mehr als das 3fache (Tab. 1). C h r o m a t o g r a p h i e an D E A E - Z e l l u l o s e Die nach der Gelfiltration erhaltene Enzymlösung wurde in Kollodiumhülsen eingeengt und auf eine mit Phosphatpuffer äquilibrierte DEAE-ZelluloseSäule (2,5 X 13 c m ) aufgetragen. Die Elution erfolgte mit Phosphatpuffer bei Zusatz steigender Kochsalzkonzentrationen (Abb. 1). Die Hauptmenge des Enzyms erscheint nach Elution mit 0,19 M NaCl. Die aktivsten Fraktionen wurden vereinigt (VI); sie sind schwach gelb gefärbt und enthalten ein insgesamt etwa llOfach angereichertes Enzym (Tab. 1). Nach der Chromatographie an DEAE-Zellulose zeigt die Disk-Elektrophorese nur noch eine einzige Proteinbande, die der L-Aminosäureoxydase entspricht. Nach längerem Stehen findet sich bei der Elektrophorese eine zweite Proteinbande, die enzymatisch inaktiv ist und das doppelte Molekulargewicht vom aktiven Enzym besitzt (vgl. Abschnitt 2.1). Das inaktive Protein läßt sich durch Chromatographie an DEAE-Zellulose wieder entfernen.

L-Aminosäureoxydase aus Neurospora

213

FRAKTIONEN Abb. 1. Gelfiltration (oben) der mit Ammoniumsulfat vorfraktionierten L-Aminosäureoxydase aus dem Myzel von N. crassa an Sephadex G-200 (aufsteigend) mit K H 2 P 0 4 / Na 2 HP0 4 -Puffer (0,02 M, pH 7,5). Chromatographie (unten) der aus der Gelfiltration gewonnenen Myzel-L-Aminosäureoxydase an DEAE-Zellulose mit K H 2 P 0 4 / N a 2 H P 0 4 - P u f f e r (0,02 M, p H7,5) bei Zusatz von 0,1 M (1. Pfeil) bzw. 0,19 M NaCl (2. Pfeil). In beiden Diagrammen sind eingetragen der Proteingehalt der 5 ml-Fraktionen ( als Extinktion bei 280 nm) und die Enzymverteilung ( • • ; in IE/ml). Die weiter verarbeiteten Fraktionen sind jeweils schraffiert

R e i n i g u n g der L - A m i n o s ä u r e o x y d a s e aus dem K u l t u r f i l t r a t Gewinnung des R o h e n z y m s Am 23 • Wachstumstag wurde das Medium durch Filtration von den Myzelien getrennt und auf 4 °C abgekühlt. Das Filtrat ist eine klare, gelb gefärbte Flüssigkeit. Zur Einengung wurde zuerst eine Fällung mit Ammoniumsulfat (80% Sättigung) vorgenommen und über Nacht stehengelassen. Das aus 5 1 Kulturfiltrat gefällte Protein wurde 15 min bei 100000 X g zentrifugiert und in 100 ml 0,02 M Phosphatpuffer, -pH 7,5, aufgenommen. Nach Abzentrifugieren einer leichten Trübung ist der Überstand klar und enthält die gesamte Aktivität an L-Aminosäureoxydase (I, Tab 2). F r a k t i o n i e r u n g mit A m m o n i u m s u l f a t Das Protein wurde durch Zugabe von Ammoniumsulfat bis zur 80%igen Sättigung wieder gefällt. Der nach Zentrifugieren (100000 X g, 15 min) erhaltene Niederschlag wurde in 200 ml 60% gesättigter Ammoniumsulfat-

214

H . A U R I C H , D . L U P P A , G . SCHÜCKER

Tabelle 2 Anreicherung der L-Aminosäureoxydase aus dem Kulturfiltrat von N. crassa (ausgehend von 5000 ml Medium nach 23 Wachstumstagen)

Reinigungsschritt

I Ammoniumsulfatfällung (80%) II Ammoniumsulfatfraktion (60—80%) III Gelfiltration an G-200

GesamtProtein [mg]

Aktivität GesamfcAkt. [IE]

Spez. Akt. [IE/mg Prot.]

Ausbeute [%]

Anreich.grad

570

24

0,04

100

1

32

10

0,33 1,2

44

8

23

30

4,5

5,4

lösung suspendiert. Nach erneuter Zentrifugation wird ein klarer Überstand erhalten, dessen spezifische Aktivität einer etwa 8fachen Anreicherung entspricht (II, Tab 2). Danach wurde die Lösung noch einmal mit Ammoniumsulfat auf 80% Sättigung gebracht und zentrifugiert. Der Niederschlag, der die gesamte Enzymmenge enthält, wurde in einer adäquaten Menge an Phosphatpuffer gelöst. G e l f i l t r a t i o n an S e p h a d e x G-200 Die aus der Salzfraktionierung erhaltene Proteinlösung wurde durch aufsteigende Gelfiltration mit Sephadex G-200 in einer K 25 /45-Säule mit Phosphatpuffer weiter aufgetrennt (Abb. 2). Das Enzym erscheint mit dem zweiten Proteingipfel. Die enzymatisch aktivsten Fraktionen wurden vereinigt und in Kollodiumhülsen eingeengt (III, Tab. 2). Die Lösung ist schwach gelb gefärbt und enthält ein etwa 30fach angereichertes Enzym.

FRAKTIONEN Abb. 2. Gelfiltration (aufsteigend) der mit Ammoniumsulfat vorfraktionierten L-Aminosäureoxydase aus dem Kulturfiltrat von N. crassa an Sephadex G-200 mit K H 2 P 0 4 / Na 2 HP0 4 -Puffer (0,02 M, pH 7,5)E s sind eingetragen der Proteingehalt der 5 ml-Fraktionen ( ; als Extinktion bei 280 nm) und die Enzymverteilung ( • • ; in IE/ml). Die weiter verarbeiteten Fraktionen sind schraffiert

L-Aminosäureoxydase aus Neurospora

215

Die Disk-Elektrophorese der Präparation aus dem Kulturfiltrat zeigt nach der Gelfiltration nur noch eine einzige Proteinbande, die der L-Aminosäureoxydase entspricht. Das Enzym aus dem Kulturfiltrat verhält sich dabei dem aus dem Myzel völlig gleichartig. H a l t b a r k e i t der L-Aminosäureoxydase Bei der Isolierung der L-Aminosäureoxydase aus dem Myzel wurden nur dann gute Ausbeuten erzielt, wenn die ersten Präparationsschritte rasch durchgeführt wurden. Das Enzym verlor im Myzelextrakt auch bei 4 °C nach kurzer Zeit seine Aktivität. ÄDTA- und FAD-Zusatz hatten keinen Einfluß. Nur bei Aufbewahrung in 80% gesättigter Ammoniumsulfatlösung bei 4 °C war der Aktivitätsverlust gering (Halbwertszeit: 30 Tage). Mit der Abnahme des Fremdeiweißes bei der Reinigung erhöht sich die Stabilität des Enzyms mehr und mehr. Das gereinigte Enzym ist bei 4 °C wochenlang praktisch ohne Aktivitätsverlust haltbar. Das Kulturfiltrat-Enzym mit seiner höheren spezifischen Aktivität im Rohextrakt zeigt demgegenüber von vornherein eine wesentlich bessere Haltbarkeit. Das gereinigte Enzym aus dem Kulturfiltrat verhält sich praktisch genau wie das aus dem Myzel. 2. Eigenschaften

der

L-Aminosäureoxydase

Molekulargewicht Das Molekulargewicht wurde mit Hilfe der Disk-Elektrophorese im linearen Akrylamidkonzentrationsgradienten mit Hilfe von Eichproteinen ermittelt [11]. Für beide Enzympräparate, aus dem Myzelextrakt und aus dem Kulturfiltrat, wurde ein Wert von 300000 ± 5 % berechnet. Neben der aktiven Enzymbande wurde bei beiden Präparationen nach einigen Tagen eine schwache inaktive Proteinbande erhalten, deren Molekulargewicht bei 600000 ± 5% liegt (vgl. auch Abschnitt 1). Ein ähnliches Molekulargewicht (310 000) besitzt die L-Aminosäureoxydase aus Rattennieren [13]. Die aus Schlangengift isolierten Enzyme sind kleiner. Ihre nach unterschiedlichen Methoden ermittelten Molekulargewichte liegen zwischen 130000 und 150000 [14]. Über aggregierte Enzymformen ist beim Schlangengiftenzym nichts bekannt. Spektrale Eigenschaften und prosthetische Gruppe Alle bekannten unspezifischen Aminosäureoxydasen sind Flavoproteide. In Übereinstimmung mit BURTON [4] konnte die prosthetische Gruppe der L-Aminosäureoxydase sowohl aus dem Myzel als auch aus dem Medium papierchromatographisch als FAD identifiziert werden [12]. Auf Grund des FAD-Gehaltes finden sich im Absorptionsspektrum der L-Aminosäureoxydase aus N. crassa ähnlich wie beim Schlangengiftenzym [15] Maxima bei 295 nm und bei 405 nm und eine weniger deutliche Schulter

216

H . AURICH, ]). LUPPA, G.

b e i 475 n m ten F A D . [16].

(Abb. 3).

SCHÜCKER

A l l e drei B a n d e n gehören z u m S p e k t r u m des oxydier-

D a s f r e i e o x y d i e r t e F A D z e i g t M a x i m a b e i 2 8 0 , 375 u n d 4 5 0 n m

D u r c h die B i n d u n g an das P r o t e i n sind die A b s o r p t i o n s b a n d e n

oder minder nach längeren W e l l e n l ä n g e n hin

mehr

verschoben.

WELLENLÄNGE A b b . 3. A b s o r p t i o n s s p e k t r u m der g e r e i n i g t e n L - A m i n o s ä u r e o x y d a s e aus -V. crassa (0,3 m g P r o t e i n / m l ) in P h o s p h a t p u f f e r (0,02 M ; pYL 7,5) z w i s c h e n 275 und 600 n m unter a e r o b e n B e d i n g u n g e n ( o b e n ) . D a z u ist i m unteren B i l d ( A u s s c h n i t t z w i s c h e n 350 und 550 n m ) bei A b w e s e n h e i t v o n Sauerstoff d e r E i n f l u ß v o n l - P h e n y l a l a n i n (0,67 • 10~a M ; ) s o w i e v o n X a t r i u m d i t h i o n i t (3,3 • 10~ 5 M ; ) auf das A b s o r p t i o n s s p e k t r u m der g e r e i n i g t e n L - A m i n o s ä u r e o x v d a s e aus A'. crassa (1,2 m g P r o t e i n / m l ) in P h o s p h a t p u f f e r (0,02 M ; p W 7,5) d a r g e s t e l l t

L-Aminosäureoxydasc aus Neurospora

217

Bei Zusatz von Substrat verringern sich die Extinktionen bei 405 und bei 475 nm (Abb. 3). Bei Sauerstoffzutritt wird der alte Zustand wieder hergestellt. Vollkommene Reduktion der prosthetischen Gruppe wird in Gegenwart von Dithionit erreicht. Dabei verschwindet die Schulter bei 475 nm vollständig. Die gleichen Veränderungen sind an freiem FAD beim Übergang der oxydierten in die reduzierte Form zu beobachten. Aus der Extinktionsdifferenz bei 405 nm zwischen oxydiertem und Dithionitreduziertem Enzym wurde mit Hilfe des Extinktionskoeffizienten des freien FAD bei 375 nm [16] der FAD-Gehalt des Enzyms ermittelt. Da bei den FAD-Enzymen nur unwesentliche Extinktionsdifferenzen gegenüber freiem FAD beobachtet wurden, setzten wir bei unseren Berechnungen des FADGehaltes voraus, daß die betrachtete FAD-Bande durch den Einfluß des Proteinrestes nur in ihrer Lage, nicht aber in ihrer Extinktion verändert wird. A^on unterschiedlichen Enzympräparaten aus Myzelextrakten wurden Werte zwischen 2,8 und 3,4 Mol FAD/Mol L-Aminosäureoxydase, von Präparaten aus dem Medium Werte zwischen 2,2 und 3,6 Mol FAD/Mol L-Aminosäureoxydase errechnet. Wir schließen daraus auf einen FAD-Gehalt von 4 FAD pro Enzymmolekül. Für die Schlangengiftenzyme wurde ein FAD-Gehalt von 2 FAD/L-Aminosäureoxydase-Molekül gefunden [14, 17], wobei aber hier die Molekulargewichte nur bei 130000—150000 liegen [14]. Die L-Aminosäureoxydase aus Rattenniere besitzt FMN als prosthetische Gruppe (6 FMN/Molekül) und ein Molekulargewicht von 310000 [13, 18]. T e m p e r a t u r - und ^>H-Optimum Das Temperaturoptimum der L-Aminosäureoxydase aus N. crassa liegt bei 49 °C (Abb. 4). Myzel- und Kulturfiltrat-Enzym zeigen dabei identische Kurven. Bei Temperaturen über 50 °C beginnt nach einigen Minuten allerdings eine Inaktivierung des Enzyms durch irreversible Denaturierung. Da dieser Prozeß aber sehr viel langsamer abläuft als der katalytische, war eine Registrierung der initialen Reaktionsgeschwindigkeiten auf polarographischem Wege mühelos durchführbar. Aus den Veränderungen der Reaktionsgeschwindigkeiten bis 40 °C wurde mit Hilfe der ARRHENiusschen Gleichung eine Aktivierungsenergie von 9900 cal/Mol für die Oxydation von L-Phenylalanin ermittelt. Das in der Literatur angegebene Temperaturoptimum des NeurosforaEnzyms liegt etwa 4 °C niedriger [2, 4] als das von uns gefundene. Die Ursache für diese Differenz ist in den benutzten Methoden zu suchen. Da mit Hilfe der Warburg-Technik nicht initiale, sondern nur Durchschnittsgeschwindigkeiten in einem bestimmten Zeitintervall gemessen werden können, werden bei höheren Temperaturen Werte erhalten, die auf Grund der vor der Ablesung erfolgten Denaturierung zu niedrig sind. Die aus der polarographischen Kurve innerhalb der ersten Sekunden bzw. Minuten nach Start der Reaktion ersichtliche Reaktionsgeschwindigkeit repräsentiert dagegen die wirkliche Enzymaktivität bei der entsprechenden Temperatur. 1 5 Acta biol. med. genn., Bd. 28, Hi'ft 2

H . A u r i c h , 1). I . u p p a , G. S c h C c k k r

218

TEMPERATUR Abb. 4. A b h ä n g i g k e i t der spezifischen A k t i v i t ä t (in LH/mg P r o t e i n ) der i.-Aminosäureo x v d a s e a u s d e m Myzel von A'. crassa von der T e m p e r a t u r . P u f f e r : 0,05 AI X a t r i u m p y r o p h o s p h a t , pH 9,5; S u b s t r a t k o n z e n t r a t i o n : 0,67 • 10~ 3 r.-Phenvlalanin; eingesetzte E n z v m m c n g c : 0,1 m g (Start der R e a k t i o n m i t K n z y m ) ; K n d v o l u m e n : 1,5 ml. Die T e m p e r a t u r e n w u r d e n w ä h r e n d der R e a k t i o n in der Meßzelle registriert

:< >

1.0

»—
H-Wert n i m m t die R e a k t i o n s g e s c h w i n d i g k e i t u n t e r B i l d u n g d e r D i h y d r o p y r a z i n / P y r a z i n d e r i v a t e e r h e b l i c h zu. P h e M K b i l d e t ein ^>H-unabhängiges D o p p e l m a x i m u m (283/301 n m , K u r v e 3), w ä h r e n d b e i m P h e C K a b p Y i 6 schnell ein M a x i m u m bei 3 0 9 n m ( K u r v e 4) a u f t r i t t .

0

250

300

350 nm

Abb. 1. Spektrale V e r ä n d e r u n g von P h e C K und P h e M K in 2 • 10~3 M Lösung. K u r v e 1 : P h e C K und P h e M K , frisch gelöst in 10" 2 X HCl, Wasser oder P u f f e r . 2: P h e C K in Wasser, pH 5, nach 25 min bei 40°, identisch mit P h e M K in Wasser, pH 5, nach 3 Std. bei 40°. 3: P h e M K bei pH 6,9 nach 2 Std. bei 40°. 4: PheCK bei pH 6,75 nach 10 min bei 20°

265

Leuzinaminopeptidase-Inhibitor Abb. 2.

6 0.8

sm

o

S.5

6.0

6.5

7.0 pH

Abhängigkeit der Zersetzung von PheCK. von 4 • lO"4 M PheCK in 5 • 10~2 M Phosphatpuffer nach 10 min bei 20°

?,S

Das Maximum der Instabilität des PheCK, gemessen an der Absorption bei 309 nm, liegt bei pH 7 (Abb. 2), die des PheMK entsprechend der Absorption bei 283 nm bei pH 7,4. Am jeweiligen ^>H-Optimum ist die Zersetzungsgeschwindigkeit des PheCK etwa 40mal größer als die des PheMK. In Gegenwart von Dioxan (17%) wird beim PheMK die Extinktionszunahme bei 283 nm um 40% gegenüber der in reinem Puffer unterdrückt. Beim PheCK (e309nm) findet man keinen Lösungsmitteleinfluß. Für PheCK beträgt der experimentell ermittelte molare Extinktionskoeffizient £309 = 7,2 • 103, für PheMK e283 = 4,5 • "103. Nimmt man an, daß eine maximale Absorption bei 3 09 nm einer vollständigen Zersetzung des PheCK gleichkommt, so muß unter Inkubationsbedingungen mit dem Enzym (4 • 10~3 M PheCK, pH 7, 20°) bereits nach 10 min mit einer 25%igen Inaktivierung des Inhibitors gerechnet werden. Von wesentlichem Einfluß auf die Hemmbarkeit der Leuzinaminopeptidase durch PheCK ist der />H-Wert der Präinkubation mit Mn2+ und der Inkubation mit dem Inhibitor (Tab. 1). In Abwesenheit von Mangan ist PheCK gegenüber dem Enzym praktisch wirkungslos, da Mn 2+ -Ionen — wohl über die Ausbildung der konformativen Besonderheiten des aktiven Zentrums — auch für den enzymatischen Prozeß erforderlich sind [1]. Mangan hat gegenüber der LAP ein Aktivierungsoptimum von pYi 9. Da unter diesen Bedingungen der Inhibitor zu instabil ist, wurde das Enzym zunächst 40 min mit Mn2+ bei pH 8,8 präinkubiert, dann der ^>H-Wert auf 6,8 erniedrigt und bei diesem />H 40 min mit L-PheCK inkubiert. Dabei zeigte sich, daß die Hemmwirkung mit 48% Restaktivität (Serie 1 in Tab. 2) noch weiter gesteigert Tabelle 1 Einfluß des ^H-Wertes auf die Hemmung der LAP durch L-PheCK (exp. Bedingungen siehe Modifikation \) Präinkubation mit Mn 2+ pH

Inkubation mit PheCK

6,90 7,47 8,03 8,28 8,65

6,75 7,17 7,40 7,25

18 Acta biol. med. germ., Bd. 28, Heft 2

p H

7,20

% Restaktivität (Ansätze) 39 ± 8 (7) 29 ± 4 (7) 33 ± 6 (7) 68 (3) 91 (2)

266

S. Fittkau Tabelle 2 Variation der Versuchsbedingungen im System Mn 2 + /LAP/L-PheCK (exp. Bedingungen siehe Modifikation 2)

Serie 1 2 3 4 5

Präinkubationsbedingungen Mn 2+ + LAP und auf pH 8,8 Mn 2+ auf pH 7,4, dann + LAP und auf pH 8,8 Mn 2+ auf pH 8,8, dann + LAP und auf pH 8,8 wie 2 wie 1

Lösung

Enzymkonz, im Inkub.-Ansatz

% Restaktivität (Ansätze)

wäßrig

6 • lO-'M

48 ± 7 (15)

wäßrig

6 • 10-" M

45 ± 15 (13)

wäßrig

6 • 10" 8 M

28 ± 8 (16)

25% Dioxan wäßrig

6 • 10" 8 M 1,2 • 1CT7 M

73 ± 5 (7) 71 ± 15 (14)

werden kann, wenn die Manganlösung v o r Zugabe der LAP auf pH 7,4 (Serie 2, Restaktivität 45%) bzw. auf das Präinkubations-^>H von 8,8 (Serie 3, Restaktivität 28%) eingestellt wird, ein Effekt, der zunächst nicht zu deuten ist. In Gegenwart von Dioxan, das in einer Konzentration von 25% im Kontrollversuch ohne signifikanten Einfluß auf die enzymatische Aktivität der LAP gegenüber Leuzinhydrazid ist, ist PheCK wenig wirksam. Hier können sowohl dem Inhibitor gegenüber wirksame Konformationsänderungen als auch eine Beeinflussung der kovalenten Bindung von PheCK an das Protein eine Rolle spielen. Das zunächst hoch erscheinende Molverhältnis PheCK zu LAP (10® zu 1) entspricht wegen der kontinuierlich fortschreitenden Zersetzung des Inhibitors nicht der im Inkubationsansatz bei pH 6,8 wirksam werdenden Inhibitorkonzentration. Wie empfindlich das System LAP/PheCK auf Änderungen der molaren Verhältnisse reagiert, zeigt der deutlich herabgesetzte Hemmeffekt, wenn bei gleichbleibender PheCK-Konzentration die des Enzyms verdoppelt wird (Serie 5). Ein Inkubations-/>H-Wert von 6,8 ist für die Ausbildung einer kovalenten Bindung des Inhibitors an die Leuzinaminopeptidase sicher nicht optimal. Inwieweit unter diesen Bedingungen PheCK bereits irreversibel gebunden ist oder ob die Verbindung nur kompetitiv wirkt, ist kinetischen und chemisch-analytischen Untersuchungen mit 14 C-markiertem PheCK vorbehalten. Für eine feste Bindung spricht die vergleichsweise geringe Hemmung der LAP durch den kompetitiven Inhibitor L-PheMK unter den Bedingungen der Versuchsserie 2 (Restaktivität 87 ± 6%). Bei weiteren Untersuchungen sollte auch ein möglicher reduktiver Einfluß der a-Aminoketone auf die Konformation und Aktivität der Leuzinaminopeptidase nicht außer Betracht gelassen werden.

Lcuzinaminopepti dase-I nhibi tor

267

F ü r e r s t e U n t e r s u c h u n g e n ü b e r d e n E i n f l u ß v o n M a n g a n - I o n e n auf d i e H c m m b a r k e i t d e r L A P d u r c h P h e C K d a n k e ich F r l . D r . M A R L I E S F R O H N E . H e r r n D r . A . K O L B E , S e k t i o n C h e m i e d e r U n i v e r s i t ä t H a l l e , m ö c h t e ich f ü r d i e A u f n a h m e der IR-Spektren und Frau DOROTHEA. P A U L I für sorgfältige technische Mitarbeit danken. Literatur [1]

H A N S O N , H . , D . G L Ä S S E R U. H . K I R S C H K E :

Hoppe-Seyler's

Z.

p h y s i o l . C h e m . 340,

107 (1965) [2]

F R O H N E , M . U.

[3]

FROHNE, M., R . MICHAEL,

H.

Hoppe-Seyler's S. F I T T K A U U . H .

HANSON:

Z.

p h y s i o l . C h e m . 350, 2 1 3 ( 1 9 6 9 ) Hoppe-Seyler's Z . physiol.

HANSON:

[17]

C h e m . 350, 223 (1969) I. M A R Q U A R D T U . H . H A N S O N : I n V o r b e r e i t u n g F R O H N E , M. U . H . H A N S O N : I n V o r b e r e i t u n g S H A W , E . : Meth. Enzymol. u , 6 7 7 ( 1 9 6 7 ) O N G , E . B., E . S H A W U. G. S C H O E L L M A N N : J . biol. C h e m . 240, 694 (1965) T O B I T A , T . 11. J . E . F O L K : B i o c h i m . b i o p h y s . A c t a 147, 1 5 ( 1 9 6 7 ) S M I L L I E , L . B . U . D . R . W H I T A K E R : J . A m . c h e m . Soc. 89, 3 3 5 0 ( 1 9 6 7 ) K A F A T O S , F . C., J . H . L A W U . A . M . T A R T A K O F F : J . biol. C h e m . 242, 1 4 8 8 P L U M M E R , T . H . J R . U . W . B. L A W S O N : J . biol. C h e m . 2 4 1 , 1 6 4 8 ( 1 9 6 6 ) V I S S E R , L . , I). S . S I G M A N u. E . R . B L O U T : B i o c h e m i s t r y 10, 7 3 5 (1971) M O R I H A R A , K . U. T . O K A : A r c h s B i o c h e m . B i o p h y s . 138, 526 (1970) S H A W , E . U . G . G L O V E R : A r c h s B i o c h e m . B i o p h y s . 139, 2 9 8 ( 1 9 7 0 ) L U D E W I G , M . : Unveröffentlichte Befunde G R A S S M A N N , \ V . U. E . W Ü N S C H : C h e m . B e r . 9 1 , 4 6 2 ( 1 9 5 8 ) C L E L A N D , G. H . U . C . N I E M A N N : j . A m . c h e m . Soc. 7 1 , 841 (1949)

[18]

LEHMANN,

[4] [5] I"6]

[7] [8] [9] [10] [11]

[12] [13] [14] [15] [16]

LUDEWIG, M.,

F. E.,

A. BRETSCHER,

H . KÜHNE,

E . SORKIN,

H e l v . c h i m . A c t a 33, 1 2 1 7 (1950) G . R . U . A . E . M A R T E L L : B i o c h e m i s t r y 3,

M. ERNE

U. H .

(1967)

ERLEN-

MEYER: [19]

LENZ,

A n s c h r i f t des A u t o r s : D r . rer. n a t . h a b i l . Hollystr. 1

745

(1964)

SIEGFRIED FITTKAU,

DDR

402

H a l l e (Saale),

Summary S. F I T T K A U : S y n t h e s i s a n d p r o p e r t i e s of L - c h l o r o - 3 - a m i n o - 4 - p h e n y l - b u t a n o n e - 2 , a n i n h i b i t o r of l e u c i n e a m i n o p e p t i d a s e f r o m b o v i n e e y e l e n s e s T h e s y n t h e s i s a n d p r o p e r t i e s of t h e c h l o r o m e t h y l k e t o n e a n d m e t h y l k e t o n e of L-phen y l a l a n i n e a n d of DL-leucine a r e d e s c r i b e d . As s u b s t r a t e - a n a l o g o u s i n h i b i t o r s t h e c o m p o u n d s w e r e t e s t e d f o r t h e i r a b i l i t y t o s e l e c t i v e l y m o d i f y r e s i d u e s in t h e a c t i v e c e n t r e of l e u c i n e a m i n o p e p t i d a s e . U n d e r c e r t a i n e x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s w h i c h t a k e a c c o u n t of t h e g r e a t i n s t a b i l i t y of a - a m i n o k e t o n e s in n e u t r a l a n d a l k a l i n e s o l u t i o n l e u c i n e a m i n o p e p t i d a s e , on p r e i n c u b a t i o n w i t h M n 2 + , is i n h i b i t e d b y L - P h e C K t o 80 p e r c e n t as c o m p a r e d t o l e u c i n e h y d r a z i d e as s u b s t r a t e . L - P h e M K s h o w s a n i n h i b i t o r y e f f e c t of only 1 3 per cent.

18»

A c t a biol. m e d . g e r m . , B a n d 28, S e i t e 2 6 9 — 281 (1972) Aus d e m P h y s i o l o g i s c h - c h e m i s c h e n I n s t i t u t der M a r t i n - L u t h e r - I ' n i v e r s i t ä t W i t t e n b e r g , H a l l e (Saale) ( D i r e k t o r : P r o f . D r . H . HAXSOX)

Halle-

Eigenschaften eines hochmolekularen Arylamidase-Phosphatase-Komplexes aus Rattennierenmikrosomen R . KLKINK und J.

SCHUBERT1

( H i n g e g a n g e n a m 21. 7. 1971)

Zusammenfassung E i n h o c h m o l e k u l a r e r A r y l a m i d a s e - a l k a l i s c h e P h o s p h a t a s e - K o m p l e x wurde d u r c h T r i t o n X - 1 0 0 - B e h a n d l u n g aus R a t t e n n i e r e n m i k r o s o m e n e x t r a h i e r t und d u r c h e i n m a l i g e S e p h a r o s e - 4 B - G e l f i l t r a t i o n von d e n ü b r i g e n m i k r o s o m a l e n P r o t e i n e n a b g e t r e n n t ( l r 0 = V 0 ). H i e r b e i wurde die A r y l a m i d a s e (AA) 50- bis öüfach, die P h o s p h a t a s e 30- bis 3 5 f a c h a n g e r e i c h e r t . E i g e n s c h a f t e n des K o m p l e x e s : 1. K o h l e n h y d r a t g e h a l t : 1 2 , 5 % p r o t e i n g e b u n d e n e H e x o s e n , 7 % U r o n s ä u r e n ; keine Xeuraminsäure; 2. I s o e l e k t r i s c h e r P u n k t : pH 4 , 1 5 und 4 , 6 5 ; 3. O p t i m a l e s A A - S u b s t r a t : L - A l a n i n - | 8 - n a p h t h v l a m i d ; 4. ^ H - O p t i m u m : 7,5 (für AA) b z w . 9,5 (für P h o s p h a t a s e ) ; 5. E f f e k t o r e n w i r k e n m i t A u s n a h m e des X - A t h v l m a l e i n i m i d s ( k o m p e t i t i v e r A k t i v a t o r der P h o s p h a t a s e ) und b e s t i m m t e r K a t i o n e n ( X i 2 + und Z n 2 + h e m m e n n u r AA) g l e i c h s i n n i g auf b e i d e E n z y m Wirkungen; 6. W ä h r e n d das A A - S u b s t r a t L - L e u z i n - / ? - n a p h t h y l a m i d die P h o s p h a t a s e k o m p e t i t i v h e m m t , zeigt das P h o s p h a t a s e - S u b s t r a t p - X i t r o p h e n v l p h o s p h a t k e i n e n E i n f l u ß a u f die A A . Einleitung A m E n z y m r e i c h t u m der Niere hinsichtlich der H y d r o l a s e n h a b e n die M i k r o s o m e n u n d P l a s m a m e m b r a n e n e r h e b l i c h e n A n t e i l , d a sie u n t e r d e n v e r s c h i e denen Zellbestandteilsfraktionen sowohl die h ö c h s t e n A k t i v i t ä t e n

an

Este-

r a s e [1 — 3 ] , a l s a u c h a n a l k a l i s c h e r P h o s p h a t a s e [4, 5 ] u n d A r y l a m i d a s e [ 5 , 6 ] besitzen.

W ä h r e n d d i e K a r b o x y l e s t e r a s e n r e l a t i v l e i c h t (z. B . d u r c h 0 , 1 % -

tiges Triton X - 1 0 0 )

von den mikrosomalen bzw. endoplasmatischen

b r a n e n a b l ö s b a r s i n d [2], w e r d e n zur S o l u b i l i s a t i o n d e r 1

Mem-

Nieren-Phosphatase

Teil der D i p l o m a r b e i t J . SCHUBERT, H a l l e / S . 1971

H e r r n P r o f . D r . H . HAXSOX zum 60. G e b u r t s t a g in D a n k b a r k e i t g e w i d m e t .

270

R. KLEINE, J.

SCHUBERT

und -Arylamidase weit drastischere Bedingungen verlangt (Butanol [7] oder kombinierte Desoxycholat-Lipase-Behandlung [8] für Phosphatase; Autolyse [9—12] oder Heterolvse und Toluol-Behandlung [13—17] für Arylamidase). Ein Nachteil dieser Isolierungsverfahren ist ihre unkontrollierbare Wirkung oder Unspezifität, da außer den beiden interessierenden Enzymen auch andere, nicht erwünschte Proteine vom Membranmaterial losgelöst werden und darüber hinaus eine begrenzte Proteolyse der Enzymproteine nicht verhindert werden kann. Erfolgversprechender hinsichtlich ihres Reinheitsgrades und ihrer größeren Ähnlichkeit zur physiologisch wirksamen Form sind daher Versuche, die mit den von Fremdaktivitäten bereits weitgehend befreiten, aber noch komplex gebundenen beiden Enzyme unternommen werden. Diese schonende, nichtenzymatische Solubilisierung der komplex gebundenen Arylamidase und Phosphatase ist durch Triton X-100-Behandlung möglich (vgl. dazu [2]). Hierüber sowie über einige Eigenschaften dieses Enzym-Komplexes soll im folgenden berichtet werden. Uber Teile vorliegender Arbeit wurde bereits kurz berichtet [18], M a t e r i a l und M e t h o d i k Substrate F ü r die S p e z i f i t ä t s u n t e r s u c h u n g e n w u r d e n i n s g e s a m t 23 s y n t h e t i s c h e S u b s t r a t e s o w i e kristallisiertes R i n d e r h ä m o g l o b i n (Serva, Heidelberg) eingesetzt. Näheres über die E i g e n s c h a f t e n d e r v e r w e n d e t e n A m i n o s ä u r e - / 3 - n a p h t h y l a m i d e (L-I1C, L - V a l , L - S e r , L - P r o , L - A s p (x), L - P h e , L - T v r , L - T r v s o w i e L - Z y s t i n - d i - ß - n a p h t l i v l a m i d ) f i n d e n s i c h b e i NKSVADBA [ 1 9 " . L - P v r r o l i d o n v l - / S - n a p h t h v l a m i d w a r e i n P r ä p a r a t v o n D r . A . SZEVVZCTK, W r o c l a w . L-Alanin-, L-Leuzin-/?-naphthylamid und L-Leuzin-p-nitroanilid waren H a n d e l s p r ä p a r a t e (Sigma, St. Louis, F l u k a , B u c h s und V E B Berlin-Chemie). An Peptidase-Substraten wurden eingesetzt: L-I.euzvlglvzvlglvzin (Fluka, Buchs), L-Leuzinamid, Glvzvlleuzin, i.-Leuzvlglvzin und i>L-Alanylleuzvlglvzin (letztere alles 1 nstitutspräparate). Zur B e s t i m m u n g der alkalischen P h o s p h a t a s e diente p - N i t r o p h e n v l p h o s p h a t (HalliesK G , Sebnitz) bzw. a - X a p h t h v l p h o s p h a t ( S c h u c h a r d t , M ü n c h e n ) . Als t y p i s c h e s K a r b o x y l e s t e r a s e s u b s t r a t diente P h e n v l b u t v r a t [ 2 0 \ Bestimmung

der

Substrathydrolysen

D i e B e s t i m m u n g des f r e i g e s e t z t e n / 3 - X a p h t h y l a m i n s e r f o l g t e n a c h e i n e r l e i c h t m o d i f i zierten B r a t t o n - M a r s h a l l - R e a k t i o n r21]. Die H y d r o l y s e der P e p t i d a s e s u b s t r a t e wurde papierchromatographisch verfolgt; L a u f m i t t e l : sek. Butanol/Ameisensäure/Wasser ( 7 5 : 1 5 : 1 n ) ; S p r ü h r e a g e n z : 0 , 5 % i g e X i n h v d r i n l ö s u n g [22]. D i e H y d r o l y s e v o n L - L e u z i n - p - n i t r o a n i l i d und p - X i t r o p h e n v l p h o s p h a t wurde im E p p e n d o r f - P h o t o m e t e r b e i 25 ° C d u r c h d i r e k t e P h o t o m e t r i e d e s g e b i l d e t e n p - N i t r a n i lins b z w . p - N i t r o p h e n o l s b e i 4 0 5 11111 v e r f o l g t . A n s a t z z u s a m m e n s e t z u n g : 0,2 ml gepufferte Substratlösung - 0,05 ml E n z y m v e r d i i n n u n g . Z u r U m r e c h n u n g in ¡¿Mol S p a l t p r o d u k t d i e n t e n die m o l a r e n E x t i n k t i o n s k o e f f i z i e n t e n 18 5 3 0 (für f r e i g e s e t z t e s p - X i t r o p h e n o l [23]) u n d 98OO (für f r e i g e s e t z t e s p - X i t r a n i l i n , J . LASCH, p e r s ö n l . M i t t . ) . D i e B e s t i m m u n g d e r P h e n y l b u t y r a t 1

S y n t h e t i s i e r t v o n H e r r n D r . H . NKSVADBA, W i e n

Mikrosomaler Arylamidase-Phosphatase-Komplex

271

Hydrolyse erfolgte durch kontinuierliche Titration der freigesetzten Buttersäure nach d e m / > H - S t a t - V e r f a h r e n ( N ä h e r e s b e i [2]). Effektoren S ä m t l i c h e M e t a l l i o n e n w u r d e n in F o r m i h r e r C h l o r i d e e i n g e s e t z t . D e s w e i t e r e n k a m e n f o l g e n d e E f f e k t o r e n z u r A n w e n d u n g : X - Ä t h y l m a l e i n i m i d (Arco-Chemie, B e r l i n ) , J o d a z e t a m i d ( V E B L a b o r c h e m i e , A p o l d a ) , 2 - M e r k a p t o ä t h a n o l (Serva, H e i d e l b e r g ) , D i t h i o t h r e i t o l (Serva, H e i d e l b e r g ) , p - C h l o r m e r k u r i b e n z o a t , N a - S a l z ( V E B B e r l i n C h e m i e ) , P u r o m y z i n - H C l ( X u t r i t i o n a l B i o c h e m . Corp., C l e v e l a n d , Ohio), a , a ' - D i p y r i d y l ( I n s t i t u t f ü r o r g a n . P r ä p . , Leipzig), o - P h e n a n t h r o l i n - H C l ( U S B , Belgien), A t h y l e n diamintetraazetat, Dinatriumsalz (Schuchardt, München), Diisopropylfluorphosphat (Uhlein C h e m i e , B e r l i n ) ; L - Z v s t e i n • H C l , L - P h e n y l a l a n i n u n d / ? - N a p h t h y l a m i n w a r e n gängige Handelspräparate. Die E f f e k t o r e n w u r d e n im F a l l e d e r A r y l a m i d a s e b e s t i m m u n g in V e r o n a l / H C l - P u f f e r (,u = 0,016, pH 7,5), z u r P h o s p h a t a s e b e s t i m m u n g in G l y z i n / X a O H - P u f f e r (/t = 0,05, />H 10,2 b z w . 9,5) gelöst. X a c h e i n e r P r ä i n k u b a t i o n v o n 1 5 m i n bei K a u m t e m p e r a t u r w u r d e d u r c h S u b s t r a t z u s a t z die R e a k t i o n g e s t a r t e t . Eiweißbestimmung

und

Eiweißkonzentrierung

D i e E i w e i ß b e s t i m m u n g e r f o l g t e n a c h L o w r y e t al. [24]. Die s c h o n e n d e K o n z e n t r i e r u n g d e r a n f a l l e n d e n P r o t e i n l ö s u n g e n e r f o l g t e in e i n e r A m i c o n - A p p a r a t u r (DenHaag) mit einer UM-10-Membran. Kohlenhydratanalysen Z u r q u a n t i t a t i v e n K o h l e n h v d r a t b e s t i m m u n g d e r F n z y m p r ä p a r a t i o n e n w u r d e n folgende Verfahren angewendet: 1. S i a l i n s ä u r e m i t R e s o r z i n - H C l n a c h S v e n n h r h o l m (Serva, H e i d e l b e r g ) als S t a n d a r d ) ;

[25]

(X-Azetyl-neuraminsäure

2. U r o n s ä u r e n m i t Orzin-HCL n a c h B r o w n [26] ( G l u k u r o n s ä u r e als S t a n d a r d ) ; 3. P r o t e i n g e b u n d e n e H e x o s e n m i t 0 r z i n - H 2 S 0 4 n a c h W i n z l e r [27] ( G a l a k t o s e als Standard). Z u r D a r s t e l l u n g d e r k o h l e n h v d r a t h a l t i g e n P r o t e i n e im G e l e l e k t r o p h e r o g r a m m w u r d e eine Perameisensäure-Schiff-Reaktion (PAS-Reaktion) nach den A n g a b e n von B i k l et al. [28] d u r c h g e f ü h r t . Gewinnung

des

Mikrosomenextrakts

F r i s c h e , b l u t l e e r e N i e r e n w u r d e n im V e r h ä l t n i s 1 : 8 (G/V) m i t 0,25 M R o h r z u c k e r l ö s u n g 5 min hochtourig homogenisiert (,.Ultra T u r r a x " der F a . K u n k e l KG, Stauffen, Brsg.). D i e s e s G e s a m t h o m o g e n a t w u r d e 15 m i n bei 8500 X £fin e i n e r K ü h l z e n t r i f u g e (K-24, F a . J a n e t z k i , Leipzig) z u r E n t f e r n u n g d e r Z e l l t r ü m m e r , K e r n e u n d M i t o c h o n d r i e n z e n t r i f u g i e r t . Z u r I s o l i e r u n g d e r M i k r o s o m e n f r a k t i o n w u r d e d e r Ü b e r s t a n d (Mikrosom e n u n d H y a l o p l a s m a ) f ü r 60 m i n bei 105 000 X g (Vac-60, F a . J a n e t z k i , Leipzig) z e n t r i f u g i e r t . Z u r H e r s t e l l u n g d e s E n z y m e x t r a k t e s w u r d e n d i e M i k r o s o m e n in 0 , 3 % T r i t o n X - 1 0 0 (Serva, H e i d e l b e r g ) e n t h a l t e n d e n V e r o n a l / H C l - P u f f e r , ¡öH 7,5, r e s u s p e n d i e r t u n d 5 m i n h o m o g e n i s i e r t u n d a n s c h l i e ß e n d d u r c h Z e n t r i f u g a t i o n (30 m i n bei 9 0 0 0 0 X g) v o n u n l ö s l i c h e n B e s t a n d t e i l e n ( „ P e l l e t s " ) b e f r e i t u n d z u r G e l f i l t r a t i o n v e r wendet. Gelfiltration Hierzu diente eine Sepharose 4B (Pharmacia, Uppsala)-Säule ( 2 , 5 x 6 5 c m ; F t = = 320 m l ; V0 = 92 ml), E l u t i o n s p u f f e r : V e r o n a l / H C l , ß = 0,016, />H = 7,5. D i e k o n t i n u i e r l i c h e r e l a t i v e E i w e i ß b e s t i m m u n g e r f o l g t e im U v i c o r d ( L K B P r o d u k t e r , S c h w e d e n ) bei 280 n m .

272

R.

Analylische

KLEIXE,

J.

SCHUBERT

Polyakrylamidgelelektrophoresc

Sie w u r d e im w e s e n t l i c h e n n a c h den A n g a b e n v o n M A U R E R [ 2 9 ] in o, 5 X 9 c m g r o ß e n R ö h r c h e n (Höhe u n d K o n z e n t r a t i o n des Gels: 7 c m bzw. 5%ig) u n t e r V e r w e n d u n g v o n C y a n o g u m 41 (Serva, Heidelberg) als P o l y m e r i s a t i o n s g e m i s c h u n d P e r o x i d i s u l f a t (P. P. H . Polski) als K a t a l y s a t o r im d i s k o n t i n u i e r l i c h e n Tris-Glyzin (5 mM, pH 8,3 bzw. 3 7 0 m M , pH 9 , 5 ) - P u f f e r s y s t e m d u r c h g e f ü h r t (60 m i n ; 1,5 — 2,0 m A p r o R ö h r c h e n ) . R e f e r e n z p r o t e i n : H u m a n s e r u m a l b u m i n ( F o r s c h u n g s i n s t i t u t f ü r I m p f s t o f f e , Dessau). Zur E i w e i ß a n f ä r b u n g w u r d e 0,05%iges Coomassie G-250 (Serva, Heidelberg) in 12,5%iger Trichloressigsäure b e n u t z t ( E n t f ä r b u n g ist h i e r b e i n i c h t nötig). Z u m q u a l i t a t i ven N a c h w e i s der A r y l a m i d a s e im G e l e l e k t r o p h e r o g r a m m w u r d e n n i c h t f i x i e r t e Gele m a x i m a l 15 m i n in einer V e r o n a l / H C l (pH 7,5)-gepufferten L-Leuzin-/J-naphthylamidL ö s u n g (5 • 10~4 M) i n k u b i e r t u n d a n s c h l i e ß e n d zur F a r b s t o f f k u p p l u n g m i t einer 0,1 folgen w ä ß r i g e n L ö s u n g von E c h t b l a u s a l z B (Bayer, L e v e r k u s e n ) ca. 5 m i n b e h a n d e l t . A n a l o g erfolgte die D e t e k t i o n d e r alkalischen P h o s p h a t a s e u n t e r V e r w e n d u n g einer V e r o n a l / H C l (pH 9,3)-gepufferten L ö s u n g v o n « - N a p h t h y l p h o s p h a t . Bestimmung

der isoelektrischen

Punkte

(IEP)

Die I E P - B e s t i m m u n g erfolgte d u r c h isoelektrische F o k u s s i e r u n g m i t A m p h o l i n e n (/>H-Bereich 3 bis 10) der F i r m a L K B P r o d u k t e r (Schweden) in einer 110 ml-Säule 1 . Ergebnisse

Isolierung

und Anreicherung

des

Arylamidase-Phosphatase-Komflexes

W i r d ein m i t t e l s T r i t o n X-100 hergestellter M i k r o s o m e n e x t r a k t a u s R a t t e n nieren (vgl. Methodik) einer Gelfiltration auf Sepharose 4 B u n t e r w o r f e n (Fraktionisierungsbereich f ü r P r o t e i n e : 0,3 bis 3 Millionen [46]), so erscheint im S ä u l e n a u s s c h l u ß v o l u m e n ein scharf von den restlichen P r o t e i n e n abget r e n n t e r P r o t e i n p e a k , der bereits m i t bloßem Auge an seiner opaleszenten T r ü b u n g e r k a n n t werden k a n n (vgl. A b b . 1). Der h o c h m o l e k u l a r e C h a r a k t e r des Materials dieses P e a k s zeigt sich a u c h a n seiner N i c h t p e n e t r i e r b a r k e i t in Agarose- oder großporige P o l y a k r y l a m i d g e l e w ä h r e n d der E l e k t r o p h o r e s e . In T a b . 1 ist die Verteilung beider E n z y m a k t i v i t ä t e n , der A r y l a m i d a s e (AA) u n d der alkalischen P h o s p h a t a s e , v o m R o h h o m o g e n a t bis zur Sepharose-Gelfiltration zusammengestellt. W ä h r e n d die AA im S e p h a r o s e - P e a k u m das 50 bis öOfache angereichert vorliegt, w u r d e die P h o s p h a t a s e a k t i v i t ä t n u r u m d a s 30fache erhöht. Bei einem P r o t e i n g e h a l t des ersten SepharoseP e a k s v o n 1 bis 1,2% des eingesetzten R o h h o m o g e n a t s lag die A k t i v i t ä t s a u s b e u t e bei 60 bis 6 2 % f ü r AA u n d 3 4 % f ü r P h o s p h a t a s e . Dieses E r g e b n i s spricht f ü r eine Verschiedenartigkeit beider E n z y m w i r k u n g e n . Eigenschaften

des

Enzymatische

Arylamidase-Phosfhatase-Komplexes Aktivität

Die nähere U n t e r s u c h u n g der S e p h a r o s e - E l u a t e auf E n z y m a k t i v i t ä t e r g a b d a s ausschließliche V o r k o m m e n von AA u n d alkalischer P h o s p h a t a s e im h o c h m o l e k u l a r e n P r o t e i n p e a k (Abb. 1). Die restlichen mikrosomalen 1

F ü r die B e n u t z u n g der A p p a r a t u r m ö c h t e n wir H e r r n Dr.

K.

KRETSCHMER

danken.

Mikrosomaler Arylamidase-Phosphatase-Komplex

273

Hydrolasen, wie Karboxylesterasen, Exo- und Endopeptidasen (getestet bei pH 4 und 8) waren nur in der zweiten, niedriger molekularen Proteinfraktion nachweisbar.

55 SO Fraktion Abb. 1. Gelfiltration des mikrosomalen Triton X-100-Extraktes aus Rattennieren auf einer Sepharose 4B-Säule (2,5 X 65 cm, V0 = Ausschlußvolumen der Säule) und Kohlenhydratanalyse des ersten Peaks. Ph-But. = Phenylbutyrat (Karboxylesterasesubstrat); pNPh = p-Nitrophenol (Spaltprodukt der Phosphatasewirkung auf p-Nitrophenylphosphat); ß-NA = /¡-Naphthylamin (Spaltprodukt der Arylamidasewirkung auf L-Leuzin-/?-naphthylamid); I E P = isoelektrischer Punkt Tabelle 1 Anreicherungsschema der Arylamidase- und alkalischen Phosphatase-Aktivitäten des mikrosoipalen Enzymkomplexes Fraktion

Gesamthomogenat Zytoplasma + Mikrosomen Zytoplasma Mikrosomaler E x t r a k t Sepharose 4B-Eluate

Ges-EW [mg]

L-Ala -jg-NA

p-I i P P

spez. Akt.

Q

spez. Akt.

0

3667 1826

0,27 0,56

(i) 2,30

0,12 0,21

(i) 1,75

1355 496 40

0,065 0,90 15,10

0,24 3,32 56,00

0,054 0,56 3,75

0,45 4,70 31,20

spezifische Aktivität = ¡¿Mol • mg P r o t e i n - 1 • 5 m i n - 1 ; Q = Anreicherungsfaktor ; Ges-EW = Gesamtprotein; L-Ala-/?-NA = L-Alanin-/3-naphthylamid; p-NPP = p-Nitrophenylphosphat.

274

R . KLEINE, J.

SCHUBERT

100-

Ata Leu Tyr Phe Try Arg His Asp Thr Die VU Ser Pyr Pro Cys

Abb. 2. Hydrolyse verschiedener Aminosäure-/S-naphthylamide durch die Arylamidase des Enzymkomplexes. Angabe der relativen Aktivität (L-Alanin-jS-naphthylamid = 100). Pyr = Pyrrolidonyl

In Abb. 2 ist die Substratspezifität der AA-Wirkung des Enzymkomplexes gegenüber 16 verschiedenen Aminosäure-/3-naphthylamiden graphisch dargestellt. Erwartungsgemäß erwies sich L-Alanyl-ß-naphthylamid (charakteristisches Substrat der AA-N [30]) als das beste Substrat. Dagegen wurden L-Arginyl- bzw. Aspartyl(a)-/?-naphthylamid (charakteristische AAB - bzw. AA-A-Substrate [30]) nur geringfügig hydrolysiert. Ein Vergleich mit der durch einen Autolyseschritt aus Schweinenierenmikrosomen solubilisierten Arylamidase [11] ergab mit Ausnahme der aromatischen /?-Naphthylamide, die besser als L-Leuzin-/?-naphthylamid hydrolysiert werden, ein analoges Verhalten. Eine weitere Übereinstimmung zwischen vorliegender hochmolekularer und der durch Auto- oder Heterolyse [10—13, 15] solubilisierten AA ergab sich aus ihrer Fähigkeit der Hydrolyse von Alanyl-, Leuzyldi- und Leuzyltripeptiden. Außer dem charakteristischen Phosphatase-Substrat p-Nitrophenylphosphat konnte auch a-Naphthylphosphat zum Phosphatasenachweis des Komplexes benutzt werden. Kohlenhydratgehalt Auf Grund des Vorkommens von Glykoproteiden in Membranproteinen [31] und des Sialoproteincharakters der bisher beschriebenen alkalischen Phos-

Mikrosomaler Arylamidase-Phosphatase-Komplex

275

phatasen [32] wurden Kohlenhydratanalysen des Enzymkomplexes durchgeführt. Wie aus der Tabelle in Abb. 1 zu entnehmen ist, enthält der Komplex 12,5% proteingebundene Hexosen, 5% Uronsäuren, aber keine Neuraminsäure. Der Glykoproteidcharakter des Komplexes konnte auch bei der Elektrophorese auf Polyakrylamid oder Agarose durch seine intensive Perjodsäure-Schiff(PAS)-Reaktion am Startpunkt (dringt nicht in den Träger ein!) demonstriert werden. Kinetische Parameter In Tab. 2 sind die wichtigsten kinetischen Parameter beider Enzymwirkungen zusammengefaßt. Obwohl die AA Leuzin-p-nitranilid (das optimalere Alaninderivat war leider zu diesem Zeitpunkt noch nicht verfügbar) 2,5 mal besser als die Phosphatase das vergleichbare p-Nitrophenylphosphat hydroTabelle 2 Kinetische Parameter der beiden Enzymaktivitäten des Komplexes bei 25 °C

£H-Opt. -Km ^max ^maxA^m

L-Ala-/J-NA

L-Leu-p-NA

7,5 0,14 • 10~4 Mol 1,0 [xMol • min - 1 0,072 • min - 1

7,5 7,2 • 10" 4 Mol 7,1 ¡¿Mol • min - 1 0,0098 • m i n - 1

p-NPP 9,5 2,8 • 1 0 - 4 Mol 2,7 [¿Mol • m i n - 1 0,0096 • m i n - 1

Erklärung der Substratabkürzungen s. Tab. 1.

Abb. 3. Aktivitätskurven der Arylamidase (Substrat: L-Alanin-/?-naphthylamid) und Phosphatase (Substrat: p-Nitrophenylphosphat) des Enzymkomplexes. Die pNitrophenylphosphat-Hydrolyse erfolgte im pufferfreien Milieu (pH-Stat-Bedingungen [2]); anschließende Ausmessung des gebildeten p-Nitrophenols im Eppendorf-Photometer bei 405 nm. • • L-Ala-/?-naphthylamid; o O p-Nitrophenylphosphat

276

R . KLEINE, J .

SCHUBERT

05

Abb. 4. Isoelektrische Fokussierung des Arylamidase-Phosphatase-Komplexes. Auftragung von 5 mg Protein. Die E280-Messung erfolgte im Hilger & Watts-UvispecSpektrophotometer rei

^

Mg 2'

3.5 10-'

Cd 2*

\ 3,5 10-3

Cu* f

3.5-10-1 |

Co 2'

15-10-'

Z/72*

3.510-i

Ni

2

1

3.5-10-' iS-iö-i

o-Phen.

3.S-1Ö-*

Puromyzin

i.s-a-i

| 1

1

2.510-1 • 2.5-10-'' ~\2,5-10-1

Zn * Co

2.5-10-»

Ni

Z f

1 i

2,5-10-1

2

t

|

DTT

Cd 2f

§

1

3.5 10-1

2-ME

Cu 2*

I

|

3.5-IÖ-i

Na3 POt,

Mg zt

1

3.5-10-1

i f

ÄDTA

Aktivität

1

12.5-10-1 \ 2.5-10-1

o-Phen. ÄDTA

l.Sid-i

2-ME

2.5-10-1

OTT

2.5-10-1

Puromyzin

2.5-10-3 |

I

1 l

1

Abb. 5- Effektoreneinfluß auf die Phosphatase- und Arylamidaseaktivität des Enzymkomplexes. Angabe der relativen Aktivität (ohne Effektor = 100) Erklärungen der Abkürzungen im Text. Die Zahlen an den Säulen geben die Effektorkonzentration im Präinkubationsansatz in M an

Mikrosomaler Arylamidase-Phosphatase-Komplex

277

lysiert, ist der Quotient F m a x /Äji, der das beste Maß für den katalvtischen Effekt eines Enzyms darstellt [33], für beide Enzyme nahezu gleich. Die in Abb. 3 wiedergegebenen ^>H-Aktivitätskurven beider Enzyme unterscheiden sich nicht von denjenigen, die durch einen Auto- oder Heterolyseschritt isoliert wurden [-1-1, 42], Bei der Bestimmung des isoelektrischen Punktes des Komplexes in der Elektrofokussierungssäule wurden nach anfänglich einheitlicher Bande am Versuchsende zwei deutlich unterscheidbarc Proteinbanden nachgewiesen, die nach ihrer Elution einen I E P von 4,15 bzw. 4,65 besaßen (s. Abb. 4). Effektoreneinfluß Zur weiteren Abgrenzung und Charakterisierung beider Enzymwirkungen wurde der Einfluß zahlreicher Phosphatase- und Arylamidase-Effektoren auf die p-Nitrophenylphosphat- und L-Alanin-ß-naphthylamid-Hydrolysewirkung des Enzymkomplexes untersucht. Die wichtigsten Ergebnisse sind in Abb. 5 graphisch dargestellt. Von den typischen Phosphatase-Inhibitoren, wie Athylendiamintetraazetat (ÄDTA), o-Phenanthrolin (o-Phen.), a, oc'-Dipyridyl, Orthophosphat, Cu 2 ' [34, 35] und L-Phenylalanin (organspezifisch [36]) erwies sich ÄDTA als stärkster Hemmstoff, gefolgt von Cu 2+ , Orthophosphat, o-Phen. und Dipyridyl. Dagegen erwiesen sich L-Phenylalanin, bestimmte Sulfhydrylblocker (p-Chlormerkuribenzoat, Jodazetamid) und der Serinhydrolasehemmstoff Diisopropylfluorphosphat im getesteten Konzentrationsbereich (3,5 • 10~6 bis 3,5 • 10" 3 M) als unwirksam. Unerwartete Effekte zeigten Cd2 + (hemmt in 3,5 • 10~4 M Konz, noch zu 87% !), Puromyzin sowie die beiden SH-Blokker Dithiothreitol und N-Athylmaleinimid (NÄM), von denen letztere einen gegenteiligen Effekt zeigten. Während Dithiothreitol hemmte, aktivierte NÄM die Phosphatase um maximal das 3fache. Wie aus Abb. 6 hervorgeht, wirkt NAM als kompetitiver Aktivator, dessen Aktivierungskonstante im Dixon-Webb-Plot [37] mit 10" 6 M/1 ermittelt wurde. Ein Vergleich der Wirkung der eingesetzten Effektoren auf die Aktivität der Phosphatase und Arylamidase (AA) (s. Abb. 5) zeigt bezüglich des Effekts der Metallionen, mit Ausnahme des Zn 2 ^ und Ni 2+ (hemmen nur die AA) sowie des Chelatbildners o-Phen., ein gleichsinniges Verhalten. In Übereinstimmung mit F E M F E R T und P F L E I D E R E R [ 3 8 ] sowie F E L G E N H A U E R und G L E N N E R [10] konnte die Insensitivität gegenüber ÄDTA auch für vorliegende komplexgebundene AA bestätigt werden (s. Abb. 5)Auf Grund der in der Literatur existierenden widersprüchlichen Angaben über die Co 2+ -Wirkung auf partikelgebundene AA (nach [39, 10, 11] stark aktivierend, nach [12, 40, 41] nur gering aktivierend) wurde der Effekt des Co2^ auf die komplexgebundene AA näher untersucht. Wie aus Abb. 5 und 7 hervorgeht, wirkt Co2* nur in niedriger Konzentration leicht aktivierend, mit zunehmender Konzentration verschwindet die Aktivatorwirkung zugunsten eines geringfügigen reproduzierbaren Hemmeffektes.

278

K. K l e i n e , J. Schubert

• -I

-1.0

-

-0.5

, , , , , , r-,

, , , , ,

07 Oh 0.6 OS 1.0 U 1.4 Iß W ¿0 ?2 Zh 2.6 2S

•^j-'fO'3

Abb. 6. I.ineweaver-Burk-Plots der p-Nitrophenylphosphat (p-XPP)-Hydrolyse durch den Enzymkomplex in Gegenwart von 1 • 10~ 5 IM L-Leuzin-/5-naphthylamid (LXA) bzw. X-Äthylmaleinimid (XÄM) (1,2 • 10" 4 M) bei pW 10,2

Abb. 7. Abhängigkeit der Arylamidase (AA)-und Phosphatase (AP)-aktivität des Enzymkomplexes von der Co 2 + -Konzentration

Weiterhin wurde geprüft, ob eine gegenseitige Beeinflussung beider Aktivitäten durch das jeweilige Substrat der anderen Enzymwirkung besteht. E s zeigte sich, da!3 die im Komplex bereits 2,5 mal aktivere Arylamidase (s. T a b . 2) weder in ihrer Aktivität noch in ihrem K M -\Yert durch zugesetztes a-Naphthylphosphat verändert wird. Dagegen erfährt die p-Nitrophenylphosphat-(P-NPP)-Hydrolyse durch Leuzin-/?-naphthylamid (Leu-/?-Na)Zusatz eine signifikante Verzögerung in ihrer Initialphase. E r s t mit Erreichen der Endphase der Hydrolyse ist die lag-Periode überwunden; wahrscheinlich durch stattgefundene Leu-ß-NA-Hydrolyse, da die L-Leuzin-/3-

Mikrosomaler Arvlamidase-Phospha tase-Komplex

279

naphthylamid-Spaltprodukte (L-Leuzin und /3-Naphthylamin) keinen Einfluß auf die p-NPP-Hydrolyse hatten. Die Ermittlung des Hemmtyps der Leu-/?-NA-Wirkung nach den graphischen Verfahren von L I N E W E A V E R - und B U R K [47] und H U X T E R und D o w x s [ 4 8 ] ergab, daß Leu-/3-NA als kompetitiver Inhibitor wirkt (vgl. dazu Abb. 6). Diskussion

Aus den bisherigen Untersuchungen anderer Autoren über das Vorkommen hydrolytischer Enzyme in Membranen ging ihr hoher Gehalt an Arylamidasen und alkalischer Phosphatase hervor [5, 43], die nur durch enzymatische Behandlung von den Membranen abgelöst werden konnten ¡8, 16, 44]. In vorliegenden Untersuchungen wird erstmals das Vorkommen eines hochmolekularen Enzymkomplexes in Rattennierenmikrosomen bewiesen, der durch nichtenzymatische Behandlung mittels Triton X-100 von unlöslichem Membranmaterial abgelöst und gereinigt werden konnte. Hinweise für das Vorliegen hochmolekularer Arylamidase in intestinalen Plasmamembranen ergaben sich nach kurzzeitiger Papainbehandlung [16, 44]. Da den Glykoproteinen eine wesentliche Rolle bei der Enzymfixierung auf der Membranoberfläche zukommt [31, 44], wird der relativ hohe Kohlenhydratgehalt des vorliegenden Enzymkomplexes verständlich (s. Abb. -1). Das Fehlen anderer mikrosomaler Enzyme in dem Arylamidase-Phosphatase-Komplex kann jedoch vorerst nicht erklärt werden, obwohl über eine analoge Assoziation beider Enzyme aus Kückenserum berichtet wurde 145]. Die Versuche über Substratspezifität (s. Abb. 2), Effektorenbeeinflußbarkeit (s. Abb. 5) und Kinetik (s. Abb. 3, 4, 6 u. 7; Tab. 2) beider Enzymwirkungen lassen keine signifikanten Unterschiede zu den durch Auto- oder Heterolyse isolierten Enzymen erkennen. Die unerwarteten Effekte, wie das Vorhandensein zweier I E P (s. Abb. 4), die NÄM-Aktivierbarkeit sowie die L-Leu-/?NA- und Puromyzin-Hemmbarkeit der Phosphatase bedürfen der Wiederholung mit dem aus dem Komplex herausgelösten Enzym. Untersuchungen in dieser Richtung sind im Gange [18]. Angaben über das Molekulargewicht des Enzymkomplexes waren nicht erhältlich, da weder durch Gelchromatographie auf Sepharose 4B (Enzymkomplex erscheint im Säulenausschlußvolumen) noch durch Polyakrylamidgelelektrophorese (Komplex dringt nicht ins Gel ein) eine Molekulargewichtsbestimmung möglich war. Die noch ausstehende Prüfung des Sedimentations- und Diffusionsverhaltens des Komplexes in der Ultrazentrifuge soll in dieser Richtung zu einer Klärung der Frage nach der Teilchengröße beitragen. Über die Ergebnisse der schonenden Trennung beider Enzymaktivitäten mittels analytischer und präparativer Diskelektrophorese nach vorhergehender enzymatischer oder nichtenzymatischer (im sauren ^H-Bereich) Behandlung wird in Kürze berichtet (R. K L E I N E und J . S C H U B E R T ) .

280

R . KLEINE, J.

SCHUBERT

Literatur

[1] HANSON, H . U. R . KLEINE: H o p p e - S e y l e r ' s Z. p h y s i o l . C h e m . 315, 208 (1959) [2] KLEINE, R . : H a b i l i t a t i o n s s c h r i f t , M a r t i n - L u t h e r - U n i v e r s i t ä t H a l l e , M a t h . N a t u r w i s s . F a k . 1968 [3]

DE D U V E , C.,

R . W A T T I A U X u . E . A . B A R N A R D : A d v . E n z y n i o l . 24, 2 9 1

(1962)

[4] GRIFFIN, M . J. U. R . P . COX: N a t u r e , L o n d . 204, 476 (1964) [51 COLEMAN, R. U. J. B . FINEAN : B i o c h i m . b i o p h y s . A c t a 125, 197 (1966) [6]

N A G E L , W . U. F . W I L L I G : Z . V i t a m . - H o r m . - F e r m e n t f o r s c h .

14, 8 9

(1965/67)

[7] MORTON, R . K . : B i o c h e m . J. 57, 595 (1954) [8] M E L A N I , F . , M . F E R X A R A R O U . V . P . C H I A R U G I : B i o c h e m .

J . 1 2 1 , 33

(1971)

[9] MATHESON, A . , S . B J E R R E U. C . S . H A N E S : C a n a d . J . B i o c h e m . 41, 1 7 4 1 ( 1 9 6 3 ) [10] FELGENHAUER, K . U. G . G . G L E N N E R : J . H i s t o c h e m . C y t o c h e m . 14, 401 (1966) [11]

HANSON,

H.,

H.-J. HÜTTER,

H.-G. MANNSFELDT,

K . KRETSCHMER

U.

C.SOHK:

H o p p e - S e y l e r ' s Z. p h y s i o l . C h e m . 348, 680 (1967) [12] BEHAL, F . J. U. M. X . STORY: A r c h s B i o c h e m . B i o p h y s . 131, 74 (1969) [13] B I N K L E Y , F . : J. A m . c h e m . Soc. 82, 987 (i960) [14]

P F L E I D E R E R , G . U. P . G . C E L L I E R S : B i o c h e m .

Z . 339, 1 8 6

(1963)

[15] BINKLEY, F . , F . LEIBACH U. X . KING: A r c h s B i o c h e m . B i o p h y s . 128, 397 (1968) [16] EICHHOLZ, A . : B i o c h i m . b i o p h y s . A c t a 163, 101 (1968) [17]

KENNY,

A . j . , S . G . G E O R G E U. S . G . R . A P A R I C I O : B i o c h e m .

J. 1 1 5 , 18 p

(1969)

[18] KLEINE, R . U. J. SCHUBERT: V o r t r a g auf d e m S y m p o s i u m , , R e a c t i o n M e c h a n i s m a n d C o n t r o l P r o p e r t i e s of P h o s p h o t r a n s f e r a s e s " , R e i n h a r d s b r u n n , 3 . - 8 . 5- 1971 [19] XESVADBA, H . : M h . C h e m . 93, 386 (1962) [20] KLEINE, R . : A c t a biol. m e d . g e r m . 24, 745 (1970) [ 2 1 ] K L E I N E , R . U. J . P O N Y I : Z . v g l . P h y s i o l . 5 5 , 39 ( 1 9 6 7 ) [22] B L E C H , W . , P . HERMANN U. R . K L E I N E : A c t a b i o l . m e d . g e r m . 9, 1 2 6 ( 1 9 6 2 )

[23] RICHTERICH, R . : K l i n i s c h e C h e m i e . K a r g e r , B a s e l 1968 [24]

L O W R Y , O . H . , X . J . R O S E B R O U G H , A . L . F A R R U. R . J . R A N D A L L : J . b i o l .

Chem.

193, 265 ( 1 9 5 1 ) ; G L Ä S S E R , 1). u. R . K L E I N E : P h a r m a z i e 1 7 . 3 2 ( 1 9 6 2 )

[25] SVENNERHOLM, L . : B i o c h i m . b i o p h y s . A c t a 24, 604 (1957) [261 BROWN, A . H . : A r c h s B i o c h e m . B i o p h y s . 11, 269 (1946) [27] W I N Z L E R , R . J . : M e t h . b i o c h e m . A n a l y s i s 2, 2 7 9 ( 1 9 5 5 ) [28]

B I E L , H . , X". H E I M B U R G E R , D . K R A F T , T . K R A N Z U. R . S C H M I D T B E R G E R :

Behring-

w e r k - M i t t . 43, 1 (1964) [29] MAURER, H . R . : D i s k - E l e k t r o p h o r e s e . D e G r u y t e r , B e r l i n 1968 [30] MARKS, X . u. A . LAJTHA i n : P r o t e i n M e t a b o l i s m of t h e X e r v o u s S y s t e m . THA (Hrsg.). P l e n u m Press, X'ew Y o r k u. L o n d o n 1 970, S. 39 [31] COOK, G . M. W . : B i o l . R e v . 43, 363 (1968) [32]

SAINI, P. K .

[33]

HOFSTEE, B. H . J.: Science, X . Y .

U. J . D O N E : F E B S - L e t t .

[34]

STADTMAX, X. C. in: T h e E n z y m e s .

7, 86

116, 329

A. LAJ-

(1970) (1952)

2. A u f l . P . D . B O Y E R , H . L A R D Y

U. K .

MVR-

BÄCK (Hrsg.) 5, 55. A c a d e m i c Press, X'ew Y o r k u. L o n d o n 196I [35]

F I S H M A N , W . H . U. X . K . G N O S H : B i o c h e m .

J . 105, 1 1 6 3

(1967)

[36] FISHMAN, W . H . , S . G R E E N U. X . I . I N G L I S : N a t u r e , L o n d . 198, 685 ( 1 9 6 3 )

[37] DIXON, M. U. E . C . W E B B : E n z y m e s . 1. A u f l . L o n g m a n s , G r e e n a n d Co., L t d . , L o n d o n 1959, S. 457 [38]

F E M F E R T , U . U. G . P F L E I D E R E R :

FEBS-Lett.

14, 8 9

(1971)

[39] MAHADEVAN, S. U. A . L . TAPPEL: J. biol. C h e m . 242, 2369 (1967) [40]

P F L E I D E R E R , G . , M . S T A N U L O V I C , E . D . W A C H S M U T H , H . D E T E R M A N N U. G .

BRAU-

NITZER: B i o c h e m . Z. 340, 552 (1964) [41]

VANHA-PERTTULA, T., V.

K . H O P S U u. G . G . G L E N N E R : J . H i s t o c h e m .

14, 3 1 4 (1966) 42] NEUMANN, H . : B i o c h i m . b i o p h y s . A c t a 3, 1 1 7 (1949)

Cytochem.

Mikrosomaler Arylamidase-Phosphatasc-Komplex

281

[43] EMMELOT, P . , A. VISSER U. E . L . BENEDETTI : B i o c h i m . b i o p h y s . A c t a 150, 3 6 4 (1968). [ 4 4 ] FORSTNER, G. G . : B i o c h e m . J . 121, 781 (1971) [45] LAW, G. R . J . : S c i e n c e , X . V . 156, 1107 (1967) [46] RAMACHANDRAX, S., Y . K . Y I P u. S. R . WAGLE: E u r . J . B i o c h e m . 12, 201 (1970) [47] LINEWEAVER, H . U. I). B U R K : J . A m . c h e m . S o c . 56, 6 5 8 (1934) [48] HUNTER, A. u. E . C. DOWNS: J . biol. C h e m . 157, 4 2 7 (1945) Summary R . K L E I X E U. J . SCHUBERT: P r o p e r t i e s of a high m o l e c u l a r w e i g h t a r y l a m i d a s e — phosphatase —complex from rat kidnev microsomes A high m o l e c u l a r w e i g h t a r v l a m i d a s e — a l k a l i n e p h o s p h a t a s e - c o m p l e x was e x t r a c t e d f r o m r a t k i d n e y m i c r o s o m e s b y m e a n s of T r i t o n X - 1 0 0 t r e a t m e n t a n d s e p a r a t e d f r o m t h e o t h e r m i c r o s o m a l p r o t e i n s b y m e a n s of s u b s e q u e n t g e l f i l t r a t i o n on S e p h a r o s e 4 B . T h e p u r i f i c a t i o n f a c t o r was 50 t o 6 0 a n d 30 to 35 fold for a r y l a m i d a s e a n d p h o s p h a t a s e respectively. F o l l o w i n g p r o p e r t i e s of t h e c o m p l e x were e l u c i d a t e d : 1. C a r b o h y d r a t e c o n t e n t : 12,5 per c e n t p r o t e i n - b o u n d h e x o s e s , 7 per c e n t uronic a c i d s ; b u t n o sialic a c i d ; 2. I s o e l e c t r i c p o i n t : />H 4 , 1 5 a n d 4 , 6 5 ; 3. O p t i m a l s u b s t r a t e for a r v l a m i d a s e : L - a l a n i n e - ^ - n a p h t h y l a m i d e ; 4. O p t i m a l p~H: 7,5 a n d 9,5 f o r a r y l a m i d a s e a n d p h o s p h a t a s e r e s p e c t i v e l y ; 5. E f f e c t o r s used d i s p l a y n e a r l y t h e s a m e e f f e c t s on b o t h e n z y m e a c t i v i t i e s w i t h e x c e p t i o n of X - e t h y l m a l e i m i d e (a c o m p e t i t i v e a c t i v a t o r of p h o s p h a t a s e ) a n d c e r t a i n c a t i o n s (Ni2+- and Z n 2 + - i o n s inhibit arvlamidase only); 6. I n c o n t r a s t t o p - n i t r o p h e n y l p h o s p h a t e w h i c h p r o v e d t o be i n e f f e c t i v e on a r y l a m i d a s e L-leucine-/?-naphthy]amide a c t s as c o m p e t i t i v e i n h i b i t o r on p h o s p h a t a s e .

19

Acta biol. med. genu., Bd. 28, Heft 2

Acta biol. med. germ., B a n d 28, Seite 283 — 297 (1972) Aus d e m Physiologisch-chemischen I n s t i t u t der M a r t i n - L u t h e r - V n i v e r s i t ä t W i t t e n b e r g , Halle (Saale) (Direktor: Prof. Dr. H . H A N S O X )

Halle-

Charakterisierung der Nierenesterasen verschiedener Säugetier-Spezies K.

KLKIXE

(Eingegangen am 21. 7. 1971)

Zusammenfassung Das E s t e r a s e a k t i v i t ä t s s p e k t r u m der Nieren a c h t verschiedener Säugetierarten sowie je eines Vertreters der Vögel, Reptilien, A m p h i b i e n und Fische wurde u n t e r sucht. E s k o n n t e n artspezifische Unterschiede festgestellt w e r d e n ; die Säugetiernieren weisen die höchsten A k t i v i t ä t e n auf. D u r c h den E i n s a t z verschiedener F e t t s ä u r e e s t e r s u b s t r a t e sowie charakteristischer E f f e k t o r e n und aus V e r s u c h e n über die Verteilung der E s t e r a s e a k t i v i t ä t in den Zellfraktionen wurde g e f u n d e n , d a ß es sich in den Säugetiernieren um eserinresistente, m e t a l l i o n e n u n a b h ä n g i g e und p a r t i k e l g e b u n d e n e B - T y p - E s t e r a s e n (/>H-Optimum bei 8) h a n d e l t . Aus Versuchen über die H y d r o l y s i e r b a r k e i t drei verschiedener E s t e r t y p e n des Tyrosins (X-Azetyl-, O-Azetyl- u n d nicht s u b s t i t u i e r t e r Tyrosinester) geht hervor, d a ß sich von den h o c h a k t i v e n F e t t s ä u r e e s t e r a s e a k t i v i t ä t e n noch eine alkalische O-Azyltyrosin-Hvdrolase und eine saure X"-Azylaminosäureesterase, die beide vorwiegend im H y a l o p l a s m a v o r k o m m e n , a b t r e n n e n lassen. Die d r i t t e Aminosäureesterasewirkung k o n n t e von der unspezifischen K a r b o x y l e s t e r a s e , mit A u s n a h m e des R a t t e n n i e r e n e n z y m s (aktivierbar d u r c h SH-Blocker), nicht u n t e r s c h i e d e n werden. Einleitung

Trotz ihres Enzymreichtums besonders an Aminopeptidasen [1 —4] und Esterasen [5, 6] liegen über die Niere bezüglich ihres Esterasespektrums im (Gegensatz zu den eingehend bearbeiteten Leberesterasen [7 —13] wenig Untersuchungen vor. Aus den zu Beginn unserer Untersuchungen vorliegenden Arbeiten war zu entnehmen, daß in der Niere des Menschen [14] und der Ratte [15] elektrophoretisch mindestens fünf Esterasewirkungen nachweisbar sind und daß der größte Teil der Nieren-Karbonsäureesterasen in der Mikrosomenfraktion lokalisiert ist [8, 9]. Durch Verwendung der SerinHydrolase-Hemmstoffe Diisopropylfluorphosphat (DFP) und E 600 sowie des Cholinesterase-Hemmstoffes Eserin konnte gezeigt werden, daß der überwiegende Teil der Nierenesterasen organophosphatempfindlich [14, 16] H e r r n Prof. Dr. 19*

H . HAXSON

zum 60. G e b u r t s t a g in Verehrung gewidmet

284

R.

KLEINE

und eserin-unempfindlich [17] ist, d . h . zur Gruppe der B-Typ-Esterasen [18, 19] zählt. Da die Niere sowie andere Organe außer Karbonsäureestern auch freie und NH 2 -geschützte Aminosäureester (vom Typ der Chymotrypsin- und Trypsinsubstrate) hydrolysieren können [2, 20], war zu klären, welche Beziehungen zwischen den typischen Karbonsäureesterasen und den Aminosäureesterasen der Gewebe bestehen. Aus diesem Grunde befaßten wir uns mit dem Problem der Differenzierung esterolytischer und esteroproteolytischer Gewebsenzyme sowie ihrer Beziehung zu den Gewebs- und Sekretionsenzymen. Als Organ benutzten wir die in dieser Beziehung kaum untersuchte esterasereiche Niere. In den folgenden Ausführungen wird zunächst über das Esterase-Vorkommen in den Nieren und Nierenzellfraktionen verschiedener Säugetierarten berichtet, um für die sich anschließenden Isolierungs- und Charakterisierungsversuche der einzelnen Esterasewirkungen von der geeigneten Tierspezies und Zellfraktion ausgehen zu können. Material und Methodik Substrate F o l g e n d e S u b s t r a t e w u r d e n e i n g e s e t z t ( A b k ü r z u n g in K l a m m e r ) : a) H a n d e l s p r ä p a r a t e : T r i b u t y r i n (TB), E . M e r c k , D a r m s t a d t ; A t h v l b u t y r a t (AB), V E B B e r l i n - C h e m i e ; T w e e n 20, S e r v a , H e i d e l b e r g ; o - X i t r o p h e n y l - / i - i > - g a ] a k t o p y r a n o sid (zur B e s t i m m u n g d e r /J-Galaktosidase), E Q A C h e m i e K G , S t e i n h e i m ( B R D ) . b) e i g e n e P r ä p a r a t e 1 : X - A z e t y l - L - t y r o s i n - Ä E 2 ( A T Ä E ) , O - A z e t y l - L - t y r o s i n (O-AT), O - A z e t y l - p - h y d r o x y p h e n y l p r o p i o n s ä u r e ( O - A H P P ) , L - T v r o s i n - Ä E - H C l ( T Ä E ) , XB e n z o y l - L - a r g i n i n - A E ( B A Ä E ) , P h e n v l a z e t a t , P h e n y l b u t y r a t (PB), X i t r o b r e n z k a t e c h i n s u l f a t (zur B e s t i m m u n g d e r A r v l s u l f a t a s e ) , X - B e n z o y l - D L - a r g i n i n - / 9 - n a p h t h y l a m i d (zur B e s t i m m u n g des K a t h e p s i n B ' ) ( B A X A ) . Effektoren D i i s o p r o p v l f l u o r p h o s p h a t (I)EP) ( l ' h l e i n C h e m i e , B e r l i n ) , E s e r i n s a l i z y l a t o d e r - s u l i a t ( A r z n e i m i t t e l w e r k D r e s d e n ) , A t o x y l , X'AE u n d C h i n i n ( H a n d e l s p r ä p a r a t e ) , p - C h l o r m e r k u r i b e n z o e s ä u r e (p-CMB) ( K o c h & L i g h t , E n g l a n d ) M o n o j o d a z e t a m i d ( S c h u c h a r d t , München). Die P r ä i n k u b a t i o n s z e i t e n ( E n z y m - - E f f e k t o r ) b e t r u g e n 7—10 m i n bei Z i m m e r t e m p e ratur. Bestimmitngsverfahren D i e E s t e r h y d r o l y s e w u r d e e n t w e d e r d u r c h a u t o m a t i s c h e T i t r a t i o n im / > H - S t a t ( R a d i o m e t e r , K o p e n h a g e n ) ( H y d r o l y s e d e r E e t t s ä u r e e s t e r sowie d i e j e n i g e d e s T Ä E , A T Ä E , B A Ä E und O - A H P P ) oder durch quantitative Papierchromatographie (TÄE, O - A T ) v e r f o l g t ( N ä h e r e s bei 16 . D i e ß-Ga 1 a k t o s i d a s e w u r d e n a c h G A Y G I L L e t al. [21], die A r v l s u l f a t a s e n a c h B A U M e t al. [22] u n d d i e B A N A - H y d r o l y s e n a c h d e r v o n u n s l e i c h t m o d i f i z i e r t e n M e t h o d e v o n G O L D B A I « ; u n d R U T E N B U R G [23] b e s t i m m t ( N ä h e r e s bei [16]). D i e B e s t i m m u n g d e s P r o t e i n - X e r f o l g t e in e i n e r H a i b m i k r o k j e l d a h l - A p p a r a t u r (0,02 X* Lösungen). 1 2

S y n t h e s e u n d p h y s i k a l i s c h e E i g e n s c h a f t e n sind a n a n d e r e r Stelle b e s c h r i e b e n [16]. Ä E = Äthylester.

X i e r e n e s t e r a s e n verschiedener Säugetiere

285

2\ierenpräparationen Die Nieren s t a m m t e n entweder von institutseigenen L a b o r a t o r i u m s t i e r e n (Wistarr a t t e n , Agnes-Blum-Mäusen, Meerschweinchen, Kaninchen) oder von Schlachthoftieren (Rind, Schwein) sowie von einem Schäferhund und drei menschlichen Leichen ( O r g a n e n t n a h m e 12 bis 24 Std. post mortem). Mit A u s n a h m e der Menschenniere wurden die Nieren in situ bzw. u n m i t t e l b a r nach ihrer Exzision (beim Kind und Schwein) n a c h e i n a n d e r m i t eiskalter 0,9° 0 iger NaCl- und 0,25 Rohrzuckerlösung blutfrei durchströmt. Zur H o m o g e n a t h e r s t e l l u n g mittels eines eisgekühlten Glashomogenisators w u r d e die gesamte Niere mit A u s n a h m e des herausgeschnittenen Nierenbeckens (bei R a t t e , Maus, Meerschweinchen) bzw. das Nierenrindengewebe ( b e i d e n übrigen Spezies) eingesetzt. Die Gewinnung der Kern-, Mitochondrien-, Mikrosomen- und Zytosol ( = Zytop l a s m a ) - F r a k t i o n erfolgte nach einem leicht modifizierten S c h x e i d e r - H o g e h o o u Zentrifugierungsschema [24] u n t e r Verwendung einer MSK-Kiihlzentrifuge. Ergebnisse

Esteraseaktivitäten

im

Nierenrohhomogenat

Die Ergebnisse der Aktivitätsbestimmungen in den schlachtfrischen und blutfrei durchströmten Nieren sieben verschiedener Säugetierarten sowie dreier Menschennieren sind in Tab. 1 zusammengefaßt. Darüber hinaus wurden die Esteraseaktivitäten in den Nieren der Schildkröte, des Huhnes, Frosches, Fisches sowie der Muschel (Mytilus galloprovincialis) bestimmt. Abgesehen von der hohen Aktivität in der Muschelniere liegen die Aktivitäten der übrigen Nicht-Säugetiernieren unter derjenigen der Säugetiere (vgl. dazu [16]). F ü r die weiteren Untersuchungen dienten daher nur Säugernieren. Erwartungsgemäß wurden große artspezifische, aber auch substratspezifische Unterschiede gefunden. Vergleich der

Fettsäureesterhydrolysen

Aus der Gruppe der Fettsäureester wurden die Buttersäureester ausgewählt, da sie neben den Valeriansäurederivaten die besten Substrate für die Nierenesterasen 1 darstellen. Von den vier verschiedenen mit Buttersäure veresterten Alkoholen wurde stets die aromatische Alkoholkomponente (Phenol oder Naphthol), in unserem Beispiel das Phenol, weitaus am besten freigesetzt. Da auch der K M -Wert für die Phenylester am niedrigsten ist (s. Tab. 1), ist der Quotient V m a x /K M bei ihnen am höchsten. Dies wird am Beispiel der Schweineniere, die über ein breites Esterasespektrum verfügt (s. Tab. 1), in Abb. 1 am Beispiel der Lineweaver-Burk-Diagramme demonstriert. Obwohl P B unter V m a x -Bedingungen nur 2,1 mal besser als T B hydrolysiert wird, beträgt der Unterschied im V m a x /K M -Ouotient beider Ester das 25fache. Von den aliphatischen Estern wurde mit Ausnahme der R a t 1 Das gleiche Ergebnis wurde mit Leber und B l u t verschiedener Spezies als E n z y m quelle erhalten [16].

286

R.

KLEINE

Tabelle 1 Esteraseaktivitäten der Nieren verschiedener Tierarten v — (j.Mol hydrolysierter Ester • m i n - 1 • mg Eiweiß-N des Rohhomogenats - 1 bei 37,5 °C; arithmet. Mittel von n Versuchen; s = mittlerer Fehler des Mittelwertes. Substratkonzentration: 43 (Tween 20), 40 (TB, ÄB), 20 (ATÄE, BAÄE), 15 (PB), 10 (TÄE, O-AT) mM; Zyt = Hyaloplasma, M = Mitochondrien-, MS = MikrosomenFralction. v beim jeweiligen ^H-Optimum bestimmt Spezies

Substrat

V

s

n

Mensch

ATÄE BAÄE TÄE O-AT TB ÄB PB Tween 20

Rind

ATÄE BAÄE TÄE TB ÄB PB Tween 20

0,05 0,01733 0,08 1,46 6,52 0,242 0,52 0,101 14,30 ±0,2 0,33 0,1514

4 1 1 4 5 2 3

Schwein

ATÄE BAÄE TÄE O-AT TB ÄB PB Tween 20

0,39 0,0592 0,36 3,70 ±0,3 0,33 9,40 ±0,8 5,90 ±1,87 25,20 3,64 10,10 2,28

4 1 2 1 2 4 3 3

Hund

ATÄE TB ÄB PB Tween 20

0,17 ±0,05 2,35 0,3365 5,39 ±0,75 4,45 1,12 ±0,05

2 4 5 1 2

Ratte

ATÄE BAÄE TÄE O-AT TB ÄB PB Tween 20

0,28 0,23 0,43 0,07 2,92 0,58 3,02 0,38

1,91 1,45 4,90 0,58 1,82 5,38 11,20 2,28

±0,16 ±0,14 ±0,07 ±0,50 0,25 0,59 ±0,13

0,354 0,70 0,32 0,08 0,374 1,40 2,52 0,479

2 2 2 1 2 3 3 2

14 6 8 7 8 9 3 8

mM/1

-

ü

7;

max

—

max -KM

-

£H-Opt.

Vork.

6,2 6,0 9,1 8,0 7,9 8,0 9,0

8,4 7,6 6,8

2,54 7,70 0,85

0,30 1,01 0,125

2,9

0,45

0,155

24,0 6,5

0,95 0,48

0,041 0,074

7,0 6,5 8,5 7,0-9,0 M+MS 8,0-9,0 M+MS 7,5-8,0 M+MS 9,5 6,5 6,0 9,0

7,1 2,3 0,54 1,0

12,7 10,0 27,0 12,4

1,79 4,35 50,0 12,4

8,0-8,5 8,0-9,0 7,5-8,0 9,0

M+MS M+MS M+MS M+MS

2,4 1,3 0,3

2.7 6,4 4.8

1,13 4,93 16,0

6,0—7,0 8,5 8,0-8,5 7,5-8,0 8,5

Zyt, MS MS MS MS MS

6,0 6,2 8,5-9,0 7,0-8,0 7,5 7,0-7,5 8,0 9,5

Zyt Zyt MS Zyt MS MS MS MS

17,0 3,04 1,6 1.43 11,5 8,0* 3,30* 5,5 1,97 11,2 7,15 4,0

2.44

0,18 0,89 0,41 0,36 0,64 0,61

Nierenesterasen verschiedener Säugetiere

287

Tab. 1 (Fortsetzung) Spezies

-^M mM/1

^max

Substrat

V

s

ATÄE BAÄE TB ÄB Tween 20

0,30 0,28 11,20 2,70 0,90

0,03 0,13 2,87

3 3 3 1 1

9,4 5,8 12,5 0,8 1,1

0,44 0,40 18,0 2,9 4,1

0,05 0,07 1,44 3,60 3,65

6,5 6,2 8,0 7,5 10,0

Zyt Zyt MS MS MS

ATÄE BAÄE TÄE MeerO-AT schwein- T B chen ÄB PB Tween 20

2,65 0,31 3,13 0,23 15,12 2,26 21,50 0,70

0,45 0,10 0,61

4 3 3 1 8 • 8 1 5

19,2 3,0 3,0

4,4 0,4

0,23 0,13

6,5 6,2 8,5

MS MS MS

13,0 6,5

21,0 2,8

1,61 0,43

10,9

0,8

0,07

7,5 7,5 7,5 9,5

MS MS MS MS

21,8 2,1 10,0

0,80 0,30

0,04 0,14

6.5 6.6 8,5

M M M+MS

2,86 0,40 31,10 0,27

8,0 8,0 8,0 9,2

M+MS M + MS M+MS M+MS

Maus

2,98 0,39 0,06

n

y

max

£H-Opt.

Vork.

.

Kaninchen

ATÄE BAÄE TÄE O-AT TB ÄB PB Tween 20

0,33 0,26 6,62 0,38 11,30 1,85 25,80 0,90

0,086 0,052 1,47 2,06 0,438 2,20 0,114

8 3 4 1 16 15 3 4

5,3 10,6 1,1 4,5

15.1 4,3 34.2 1,2

* mit partiell gereinigtem E n z y m !

tenniere (höhere ÄB-Spaltung) und Schweineniere (höhere Tween-Spaltung) TB am besten angegriffen. Alle späteren Charakterisierungsversuche wurden daher mit PB oder TB durchgeführt. Gemeinsames Charakteristikum aller Nieren-Karbonsäureesterasen ist ihr breites alkalisches Optimum, das mit Werten zwischen pH 6,5 und 8,5 für die ABase in Neutralpunktnähe sowie bei 9 und 10 für die Tweenase am weitesten im alkalischen Bereich liegt. Eine der Hauptursachen hierfür ist in der unterschiedlichen Eigenhydrolyse der Ester zu suchen. Als Beispiel sind in Abb. 2 die fiYl-Kurven der TB-Hydrolyse durch Nierenhomogenat sechs verschiedener Säugetierarten wiedergegeben. Vergleich der A m i n o s ä u r e e s t e r h y d r o l y s e n Durch Einsatz drei verschiedener Estertypen des Tyrosins war es möglich, drei voneinander abgrenzbare Esterasewirkungen bereits im Rohhomogenat der Niere nachzuweisen.

288

R.

i—1

T 5

[JJ V

1

10

PB TB ÄB Tw

KM mMol/l 0,5k 7,10 2,20 1,00

Vmax 27,0 12,7 10.0 10,0

r

15 [Tween20]

Schweineniere VfU Mol-min~ 1-mg

1

KLEINE

EWN '

1

v

max ~ KW 50,0 1,8

4.5

10,0

Abb. 1. Lineweaver-Burk-Diagramme der durch Schweinenieren-Homogenat katalysierten Äthylbutyrat (ÄB)-, Tributvrin (TB)-, Phenvlbutyrat (PB)- und Tween 20(TW)-Hydrolyse

a) N-Azylaminosäureesterase (ATÄE-ase)

Ihre charakteristischen Substrate sind N-azetylierte oder N-benzoylierte, also ninhydrinnegative Aminosäureester vor allem des Tyrosins, Phenylalanins und Arginins (ATÄE, BTÄE, APÄE, BAÄE). Wie aus Tab. 1 hervorgeht, finden sich deutliche Aktivitäten nur in Ratten- und Meerschweinchenniere. Eine weitere 20 [TB] m Mol// Besonderheit ist ihr />H-Optimum, das bei den verschiedenen Tierarten zwischen p H 5,9 und 6,5 liegt (s.Abb. 2). Hierdurch unterscheidet sich die Nieren-ATÄEase von der ATAEase anderer Organe, wie Serum, Leber, Milz, Lunge, Muskel (vgl. dazu [2, 25]), sowie von den übrigen Karbonsäureesterasen vom B-Typ, die alle ein im alkalischen Bereich liegendes />H-Optimum besitzen. Weitere Eigenschaften der Nieren-ATÄEase finden sich in einer folgenden Arbeit [26]. b) O-Azetyl-Aryl-Esterase Dieses Enzym ist dadurch charakterisiert, daß es selektiv an der mit Essigsäure veresterten phenolischen OH-Gruppe des Tyrosins sowie anderer aromatischer Ester der Essigsäure angreift. Charakteristisches Substrat ist O-Azetyltyrosin, optimales Substrat Phenylazetat. Dagegen werden die Ester TÄE und ATÄE nicht angegriffen. Über weitere Eigenschaften dieses gereinigten Rattennierenenzyms wurde von uns bereits kurz berichtet [27]. c) Aminosäureesterase Diese dritte, besonders in Niere und Leber [2] lokalisierte Esterasewirkung benötigt freie, d. h. nicht azylierte Aminosäureester als Substrate. Optimale Substrate sind die Äthyl- sowie Propyl- und Butyl-Ester des Tyrosins, Phenylalanins, Tryptophans und Leuzins [16]. In ihrem Vorkommen ähnelt sie der ÄBase, mit der sie den annähernd gleichen K M -Wert (10—15 mMol/1), ihre intrazelluläre Verteilung (s. Tab. 2), ihr im Alkalischen liegendes fYiOptimum (Abb. 2) und ihr Verhalten gegenüber Esteraseinhibitoren (s. Tab. 3) teilt.

Nierenesterasen verschiedener Säugetiere

289

A b b . 2. / > H - A k t i v i t ä t s k u r v e n d e r N i e r e n e s t e r a s e n v e r s c h i e d e n e r S ä u g e t i e r e g e g e n ü b e r ATÄE, TÄE und TB. A k t i v i t ä t d e s ¡ 6 H - O p t i n i u m s = 100; d i e E s t e r a s e - A k t i v i t ä t e n (v = ¡iMol • m i n - 1 • m g E i w e i ß - N - 1 ) der verschiedenen Nieren beim />H-Optimum sind zum Vergleich m i t a n g e g e b e n e n ( S ä u l e n ) ; V d e r R a t t e n n i e r e (R) = 1,0; M S = M e e r s c h e i n c h e n ; K = K a n i n c h e n ; Ri = Rind; S = Schwein ( . . . ) ; H = H u n d ; M = Mensch

A ktivitätsverteilung in den Zellbestandteilen Als weiteres Kriterium zur Differenzierung der Esterasewirkungen diente ihr Vorkommen in den nach dem leicht modifizierten S C H N E I D E R - H O G E B O O M Zentrifugierungsschema [24] erhaltenen Zellbestandteilsfraktionen der Nieren sechs verschiedener Säugetierarten. Eiweißbilanz In Bilanzversuchen, bei denen die Waschwässer der einzelnen Zellfraktionierungsschritte sorgfältig gesammelt und mit weiterverarbeitet werden, wurden durchschnittlich 85 bis 100% des Eiweiß-N des eingesetzten Rohhomogenats in den Fraktionen wiedergefunden. Das Ergebnis der prozentualen Eiweiß-N-Verteilung auf die Zellfraktionen der sechs verschiedenen Säugetiernieren ist in Abb. 3 wiedergegeben. Bei einem relativ konstanten zytoplasmatischen Anteil (zwischen 35 und 43%) wurden zum Teil erhebliche artspezifische Unterschiede des in den Zellpartikeln vorkommenden Eiweiß-N festgestellt. Auf Grund des im Vergleich zur Mikrosomenfraktion größeren EiweißReichtums der Mitochondrienfraktion wird verständlich, daß letztere die größere Esterasegesamtaktivität, erstere jedoch die höhere spezifische Aktivität für die partikelgebundenen Esterasen besitzt (s. Abb. 4). Esteraseverteilung Zur Feststellung des mengenmäßigen Esterase-Aktivitätsanteils, bezogen auf Gesamtprotein-N, der einzelnen Zellfraktionen wurden analog der

R.

290

KLEINE

Tabelle 2 Intrazelluläre Verteilung der Nierenesterasen (Bilanzversuche) Spezif. A k t . = ¡¿Mol hydrolysierter Ester • m i n - 1 (bei O - A T • 60 m i n - 1 ) • mg E i w e i ß - 1 bei 37,5 ° C (=v); v = arithmet. Mittel von n Fraktionierungsversuchen; Gesamt-Akt. = v bezogen auf mg Eiweiß pro Fraktion; A H = Ausgangshomogenat; K = Kern-, Z y t = Hyaloplasma-, M = Mitochondrien-, MS = Mikrosomenfraktion Rattenniere a) lösliche Esterasen spezif. A k t . Zellfraktion

»abs.

s

spezif. A k t .

Gesamt-Akt. ü

frei.

u

abs.

A T Ä E ; 0 , 0 2 M ; pH

s

rel.

fabs.

s

AH

K

Zyt

M

MS

0,374 0,048

0,273 0,150

0,790 0,309

0,279 0,014

0,056 0,030

1,00

0,73

2,12

0,75

0,15

O - A T ; 0,01 M;

n = ¿ K-»MS

7,4 10,9 8,9 2,6 77,0 103,6 144,0 59,4 21,9 46,5 37,7 20,0 0,8 3,0 9,4 1,3

100,0

5,3

69,6

22,9

2,2

K

3,95

—

1,00

frei.

B A Ä E ; 0 , 0 2 M ; pH.

6,0;

38,2

0,254

1,46 0,227

4,34

0,478

4,19 0,167

0,015

0,042

0,245

0,024

1 , 7 2 0,050 0 , 0 1 5

pH 7 , 0 ;

1,00

0,89

1,89

0,66

0,19

s

6,2;

4

71,5 108,5 125,0 64,3

tn 89,5 — ¿ K—>MS

5,5 7,8 3,7 1,3 38,9 70,0 93.8 50.9 15,5 26,3 21,9 10,1 1,38 2,33 7,50 1,00

O - A H P P ; 0 , 0 1 M ; pH

n— 1 AH

fabs.

fiel.

n = 4 104,4 177,2 200,0 83,3

Gesamt-Akt.

100,0

29,3

5,3

3,4

70,9

7,8

20,8

4,9

3,0

2,0

7,0;

n = 1 285,8

100,0

—

0,53

—

1,00

272,9

100,0

—

0,73

-

0,19

1,9

0,6

-

0,31

-

0,58

6,7

2,5

-

10,25

-

2,60

223,0

78,0

-

0,57

-

1,08

141,6

52,0

-

M

2,05

-

0,52

36,1

12,6

-

0,30

-

0,57

42,7

15,7

-

MS

1,75

—

0,44

24,8

8,7

—

0,72

-

1,36

81,8

29,9

-

Zyt

291

Nierenesterasen verschiedener Säugetiere Tabelle 2 (Fortsetzung) b) partikelgebundene Esterasen (vorwiegend mikrosomale) spezif. Akt. Zellfraktion

s

abs.

v

frei.

Gesamt-Akt. ^abs.

±

spezif. Akt.

"rel.

s

^abs.

Äthylbutyrat; 0,04 M; pH 7,5

^rel.

»rel.

Tributyrin ; 0,04 M; pH 7,5

n = 1

n = 3—6

Gesamt-Akt.

n =

n —1

4-5

376= 100,0

0,335

0,0374

1,00

80,0

69,5 = 100,0

-

7,8

0,167

0,0913

0,49

6,8

9,8

71,4

-

19,3

0,179

0,0614

0,59

13,2

18,9

0,95

117,2

-

31,2

0,312

0,0288

0,93

19,3

27,8

2,90

158,0

-

42,2

0,978

0,216

2,92

30,2

43,5

AH

0,93

0,179

1,00

421,0

K

0,27

0,142

0,29

29,3

Zyt

0,35

0,078

0,38

M

0,88

0,223

MS

2,70

0,718

Phenylbutyrat; 0,015 M; pH 8,0

| ± |

Phenylacetat; 0,015 M; pH 8,0 n

n == 2

AH

1,57

0,02

1,00

K

581,0 168,0

100,0

2,01

—

6,0

1,00

= 1 103,0

100,0

0,66

0,19

0,42

12,4

2,1

1,01

-

.0,50

2,2

2,1

Zyt

0,63

0,11

0,40

120,1

64,7 . 20,3

1,28

-

0,64

31,2

30,3

M

0,90

0,02

0,61

102,7

25,0

17,7

1,16

—

0,58

16,0

15,6

MS

3,86

0,10

2,46

346,7

73,4

59,6

4,77

-

2,37

53,4

52,0

Tween 20; 0,045 M; pH 9,0

T Ä E ; 0,015 M; pH 9,0

n — 1

n = 4

n — 1 96,2= 100,0

107,4

-

8,6

-

15,8

AH

0,41

0,0634

1,00

111,2

K

0,24

0,0861

0,61

8,3

Zyt

0,26

0,051

0,64

15,2

M

0,34

0,0509

0,83

30,0

-

MS

1,16

0,2

2,86

42,7

-

. .

1,00

7100

4645= 100,0

30,9

—

0,29

236

5,1

23,6

—

0,22

734

15,6

31,2

58,9

-

0,55

1575

34,0

44,5

335,0

—

3,14

2100

45,3

Eiweißverteilung Bilanzversuche durchgeführt. Außerdem wurde die spezifische, d. h. die auf ein mg Protein-N bezogene Aktivität ermittelt, um die Aktivitätshöhe der einzelnen Zellfraktionen miteinander vergleichen zu können. Als Beispiel für die mit mehreren Estersubstraten bei den Nieren von sechs Säugetierarten ermittelten Esteraseaktivitätsverteilungen sind in Tab. 2 das Esterasespektrum der Rattennierenzellfraktionen und in Abb. 4 die spezifische und gesamte Tributyrinase (TBase)-Aktivität in den Nieren-

k. Klkini-:

292

zellfraktionen von fünf Säugetierarten tabellarisch bzw. graphisch wiedergegeben. W ä h r e n d die Mikrosomen in den Nieren aller Spezies die höchste spezifische T B a s e - A k t i v i t ä t aufweisen, bestehen in der Verteilung der Ges a m t a k t i v i t ä t der TBase deutliche artspezifische Unterschiede. Zur n ä h e r e n Charakterisierung u n d Reinigung der partikelgebundenen Esterasen diente daher die vereinigte Mitochondrien-Mikrosomenfraktion. I m Gegensatz zu diesen Karbonsäureesterasen, wozu auch die Aminosäureesterase gezählt werden k a n n , sind sowohl die O-Azetylarylesterase als auch die A T A E a s e der R a t t e n n i e r e vorwiegend im Hyaloplasma lokalisiert (s. T a b . 2). Z u m gleichen Ergebnis f ü h r t e n auch Fraktionierungsversuche in 0,45 M Rohrzuckerlösung nach der Methode von S H I H K O und T A P P E L ¡28], wonach die Lysosomen i n t a k t bleiben sollen. W u r d e ein derartiges Homogen a t einer einmaligen Zentrifugierung (60 min bei 160000 Xg, J a n e t z k i Kühlzentrifuge) unterworfen, so f a n d e n sich 4 5 % der ATÄEase, aber n u r 13,4% [Arylsulfatase bzw. K a t h e p s i n B' (Substrat BANA)] bzw. 31,5%

20

40

60

80 %

Kaninchen Rind Schwein Hund Kerne Zytoplasma

Mitoch.

A b b . 3. I n t r a z e l l u l ä r e V e r t e i l u n g des E i w e i ß - X d e r N i e r e n sechs v e r s c h i e d e n e r S ä u g e tierarten. A n g a b e d e r p r o z e n t u a l e n d u r c h s c h n i t t l i c h e n V e r t e i l u n g (n = A n z a h l d e r F r a k t i o n i e rungsversuche) des Eiweiß-X

T a b e l l e 3. Effektoreneinfluß auf Xierenesterasen Die Zahlen geben die verbliebene A k t i v i t ä t ( K o n t r o l l w e r t = 100) a n ; M o l a r i t ä t bezieht sich auf die im Ansatz vorliegende I n h i b i t o r k o n z e n t r a t i o n . Die E n z y m e wurden mit dem jeweiligen E f f e k t o r 5 bis 10 min bei Z i m m e r t e m p e r a t u r p r ä i n k u b i e r t ; anschließende I n k u b a t i o n erfolgte nach S u b s t r a t z u g a b e beim />H-Optimum Esterase-Inhibitoren Spezies

X a l [M] Kr2

10~ 3

Kr4

71

87 84

97

A t o x y l [M]

Eseri n TMÌ

Kr3 ! Kr1

K)-3

10"1

10"5

D F P TM ; 10"°

99 62

93 96

49 23

66

99 58 67 64 42

99 76

4

51

75

2 8 2 1 0 7 10

1. auf A T A E a s e Ratte Maus

62

83

2. auf Ä B a s e Ratte Maus Meerschw. Kaninchen Schwein Kind Hund

9 18 15 25 22 20

41 68 75 25 95 94 95

9 60 36 5 68 81 70

j

0,5

7

40 5

78 56

mit 1 0 " 5 M = 73

78 75

11 2 0

3. auf T B a s e bzw. P B a s e (b. Schwein) Ratte Maus Meerschw. Kaninchen Schwein Hund

40 18 27 30 60 10

58 80 77 70 87 30

81

36

92 96 100 70

74

101

'90 83 75

1

61 72 90 36 59 32

72 100 97 76 80 85

14 4 0

90 67 75

91

5 0 1

;

i i

SH-Blocker

B) Spezies

Ratte Meerschw. Kaninchen

p - C M B [MI Kr1

I 2 • 10"5

73 97 58

100 105

J o d a z e t a m i d [M] 10" 5

10~ 3

. auf AT Ä E a s e i 101 99 102 100 I 101

Kr4 99 100

2. auf Ä B a s e und T Ä E a s e p-CMB [M] Kr4

5 • 1 ,fi -fi fi C C o g — - aj fi fi fi ü D U bo « +J +-> +J fi .2 -fi Jfi .fi 3 +J .y S Ai S $ $ o rt O 0) CD ^ fa be o bo bo be tu ^ fi ro C 3 ^ 3V- 3 ^ fi ' cS to3^ B o 13 « O D O "o "o "o •tí C O .fi d S £ I I > Il CL, =3 Q a>fia;fi afi aí .5 < u a > ü á -M o-M o o o o 1—[ . •tí ft Oh OH ai (U o ü c fe & -fi a< •3 -5 -5 " f e o fi fi C/D g fi" e" e" -fi o o 2o c > rt ^ V h U SÌ fe fa fe fe .S S •3 £ s O es o o s ^ •fe vO CN •fi bo J J J h ; "tí i>i o X

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