Acta Biologica et Medica Germanica: Band 28, Heft 1 [Reprint 2021 ed.] 9783112543085, 9783112543078

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ROTA BIOLOGICA ET MEDICA GERMANICA Band 28 Heft 1 Sette

1—199

gaia A B M G A J 28 (1) 1 - 1 9 9 (1972)

igj2

AUFNAHMEBEDINGUNGEN 1. Die ACTA BIOLOGICA E T MEDICA GERMANICA, Zeitschrift f ü r funktionelle Biowissenschaften, publiziert Arbeiten aus den Fachgebieten Biochemie, Physiologie (einschließlich Pathophysiologie), Pharmakologie und Immunbiologie. E s werden nur Arbeiten angenommen, die nicht an anderer Stelle mit demselben Inhalt veröffentlicht oder zur Veröffentlichung angeboten werden. Der Autor verpflichtet sich nach Annahme, die Arbeit an keiner anderen Stelle zu veröffentlichen. 2. Die Arbeit m u ß wissenschaftlich wertvoll sein. Bestätigungen bekannter Tatsachen, Versuche und Beobachtungen ohne positives Ergebnis werden, wenn überhaupt, nur in kürzester Form aufgenommen. Nicht aufgenommen werden Polemiken und rein spekulative Arbeiten, falls sie nicht ganz wesentliche neue Gesichtspunkte enthalten. 3. Kurzmitteilungen über experimentelle Ergebnisse werden bei der Drucklegung zeitlich bevorzugt. 4. Die Arbeiten müssen so kurz als möglich abgefaßt werden und in einem druckreifen Zustand geschrieben sein. Einleitung (Problematik), Methodik, Befunde u n d Diskussion sollen deutlich in Erscheinung treten. Der Arbeit soll eine Zusammenfassung der wesentlichsten Ergebnisse vorausgestellt werden. Arbeiten werden in Deutsch, Englisch und Russisch angenommen. Die Manuskripte sind in zweifacher Ausfertigung einzureichen. Von den Abbildungen sind 2 Kopien sowie 1 Satz reproduktionsreife Vorlagen beizufügen. Genaue Hinweise zur Manuskriptgestaltung sind von der Redaktion der Zeitschrift anzufordern und unbedingt einzuhalten. Manuskripte, die diesen Bedingungen nicht entsprechen, werden zurückgewiesen. 5. Die Arbeiten werden im Sofortumbruch gesetzt; größere Korrekturen in F o r m von Streichungen bzw. Zusätzen sind daher in der Umbruchkorrektur nicht zulässig. 6. Manuskripte sind an die Redaktion der ACTA BIOLOGICA E T MEDICA G E R MANICA, 1115 Berlin-Buch, Lindenberger Weg 70, zu senden. 7. Von jeder Originalarbeit werden kostenlos 80 Sonderdrucke geliefert.

Schriftleitung

Herausgeber

ACTA BIOLOGICA ET MEDICA GERMANICA

Herausgeber: R . Baumann, H. Dutz, A. Graffi, H. Gummel, F . Jung, L.-H. Kettler, O. Prokop, S. M. Rapoport Schriftleitung: H. Bielka, W. Scheler Band 28

1972

Heft 1

Zeitschrift für funktionelle Biowissenschaften

Acta biol. med. germ., Band 28, Seite 1 - 6 (1972) Aus dem Institut für Physiologische und Biologische Chemie der Humboldt-Universität Berlin (Direktor: Prof. Dr. Dr. Dr. h.c. S. M. R A P O P O R T )

Mitochondrien aus Kaninchenretikulozyten III. Zytochrom- und Phospholipid-Gehalt T . SCHEWE, R . WIESNER u n d W .

SCHULZ1

(Eingegangen am 2. 4. 1971)

Zusammenfassung Der Gehalt an Zytochromen und Phospholipiden ist in Mitochondrien von Kaninchenretikulozyten etwa doppelt so hoch wie in Rattenlebermitochondrien, während der Ubichinongehalt übereinstimmt. Einleitung E i n besonderes C h a r a k t e r i s t i k u m der R e t i k u l o z y t e n r e i f u n g ist das V e r schwinden der Mitochondrien. I n der v o r a n g e g a n g e n e n Veröffentlichung [2] w u r d e über die verschiedenen morphologischen E r s c h e i n u n g s f o r m e n d e r R e t i k u l o z y t e n m i t o c h o n d r i e n berichtet, die m i t d e r A k t i v i t ä t der S u k z i n a t Z y t o c h r o m c - O x y d o r e d u k t a s e korrelierbar zu sein scheinen. Die vorliegende 1 Frau Prof. S. R O S E N T H A L und Herrn Prof. S. M. R A P O P O R T danken wir für wertvolle Hinweise und anregende Diskussionen bei der Durchführung der Experimente und bei der Anfertigung des Manuskripts.

1 Acta biol. med. germ., Bd. 28, Heft 1

2

T . SCHEWE, R . WIESNER, W .

SCHULZ

Arbeit befaßt sich mit der Frage, ob sich die Mitochondrien der Retikulozyten in der Zusammensetzung von Mitochondrien anderer Herkunft unterscheiden. Wegen der Bedeutung für die biologische Oxydation ist dabei der Gehalt an Zytochromen, Gesamt-Ubichinon und Phospholipiden von besonderem Interesse> Material und Methodik Retikulozytenmitochondrien wurden aus retikulozytenreichem, leukozytenfreiem Kaninchenblut nach zwei Methoden gewonnen: Methode I : Messerhomogenisation von koaguliertem Blut [1, 2], Methode I I : Homogenisation gewaschener Zellsuspensionen mittels Glasperlen [3]2. Die zum Vergleich herangezogenen Präparationen von Rattenlebermitochondrien wurden nach D E D U V E et al. [ 4 ] gewonnen. Die Aktivität der Aspartataminotransferase (GOT) wurde, wie bei B E R G M A Y E R [6] angegeben, gemessen. Die Bestimmung der Zytochromoxydase erfolgte in 0,1 M Kaliumphosphatpuffer, p H 7,4, nach einer Modifikation der Methode von C O O P E R S T E I N und L A Z A R O W [7], die Zytochrome a, b, cx und c wurden aus Differenzspektren nach W I L L I A M S [ 9 ] und Protein nach L O W R Y et al. [ 1 0 ] bestimmt. Die Lipidextraktion erfolgte nach Hitzedenaturierung der Mitochondrien unter Stickstoff mit ChloroformMethanol 2:1. Die Reinigung des Lipidextraktes wurde nach F O L C H et al. [11] durchgeführt. Die Gesamtphospholipide wurden nach der Methode von B A R T L E T T [12] bestimmt. Die zweidimensionale Dünnschicht-Chromatographie der Phospholipide erfolgte nach dem Verfahren von D J A T L O V I T C K A J A et al. [13] auf Kieselgel H. Ubichinon wurde nach S Z A R K O W S K A und K L I N G E N B E R G [14] bestimmt. Ergebnisse und Diskussion

Bei der Präparation von Retikulozytenmitochondrien nach Methode I ließen elektronenoptische Aufnahmen eine Fibrinverunreinigung erkennen, die mit unserer Präparationstechnik nicht völlig abgetrennt werden konnte. Infolgedessen mußten in den nach Methode I gewonnenen Präparationen die auf Protein bezogenen Werte zu niedrig ausfallen. Aus diesem Grunde suchten wir nach einer anderen Bezugsgröße und wählten hierfür die GOTAktivität; denn nach den Untersuchungen von P E T T E et al. [ 1 5 ] weisen die Zytochrom/GOT-Quotienten von Mitochondrien verschiedener Rattenorgane einen ziemlich konstanten Wert auf. Die GOT-Aktivität hat sich außerdem als geeignetes Leitkriterium für den Reifegrad roter Blutzellen erwiesen, wie die Untersuchungen von R O S E N T H A L et al. [16] zeigten. Tab. 1 zeigt die Zytochrom/GOT-Quotienten von zwei nach Methode I und einer nach Methode II gewonnenen Präparationen. Es ist ersichtlich, daß die auf verschiedenen Wegen gewonnenen Mitochondrien-Präparationen in ihrem Zytochromgehalt übereinstimmen. Da bei der Mitochondrien-Präparation nach Methode II die Fibrinverunreinigung entfällt, können die auf Protein bezogenen Werte mit den Werten für Mitochondrien anderer Herkunft direkt verglichen werden. Andererseits war es möglich, in den Präparationen nach Methode I durch Messung der GOT-Aktivität die Menge an 2

Für die Bereitstellung dieser Präparation danken wir Herrn Dr. (Magdeburg).

W.

AUGUSTIN

Retikulozytenmitochondrien. III.

3

Tabelle 1 Zytochrom/GOT-Quotienten von Retikulozytenmitochondrien, die nach zwei verschiedenen Methoden präpariert wurden (s. Text) Präparation Zyt. b Zyt. cx Zyt. c

Methode I 1,20 0,98 1,36

1,20 0,56 1,38

Methode II 1,12 0,83 1,20

Fibrinverunreinigung zu erfassen, und damit vergleichbare Werte zu erhalten. Der Gehalt an Fibrin schwankte bei drei Präparationen zwischen 48 und 74% des Gesamtproteins. Bei der Aufnahme der Differenzspektren von Retikulozytenmitochondrien zwecks Bestimmung der Zytochrome konnte bei insgesamt neun Präparationen die Zytochrom a-Bande (Amax = 605 nm) nur dreimal nachgewiesen werden, obwohl alle Präparationen eine deutliche Zytochromoxydase-Aktivität aufwiesen. Dagegen waren die Zytochrome b, cx und c in den Spektren quantitativ auswertbar. Die Ursache für die Anomalie der Zytochrom «-Bande in den Differenzspektren liegt möglicherweise in einer Störabsorption durch Porphyrinderivate oder andere Verbindungen, die speziell in den Retikulozytenmitochrondrien auftreten können. Weiterhin ist eine erschwerte Zugänglichkeit der Zytochromoxydase in den Retikulozytenmitochrondrien für Natriumdithionit und Natriumborhydrid denkbar. Versuche, eine vollständige Reduktion der Zytochromoxydase durch Sukzinat unter anaeroben Bedingungen herbeizuführen, schlugen fehl, da der zur Aufnahme quantitativ auswertbarer Differenzspektren notwendige Zusatz von Natriumdesoxycholat offenbar zu einer Hemmung der Sukzinatdehydrogenase führt. Da der Zytochrom «-Gehalt aus den Differenzspektren nicht auswertbar war, wurde dieser — unter der Annahme gleicher molekularer Aktivität in Leber und Retikulozyt — aus der Zytochromoxydase-Aktivität ermittelt. Die Werte für die Zytochromoxydase-Aktivität wiesen in den verschiedenen Präparationen eine starke Streuung auf. Die mögliche Ursache dafür ist eine partielle Hemmung der Zytochromoxydase durch den Hemmstoff C, den ALTENBRUNN und RAPOPORT [17] in Kaninchenretikulozyten nachweisen konnten. Das Ausmaß der Hemmung hängt vermutlich stark von der für die Mitochondrien-Präparation verwendeten Retikulozytenmischpopulation ab. Die Hemmung durch Hemmstoff C wird durch Serumalbumin verstärkt [18]. Letzteres könnte die Ursache für die geringere Zytochromoxydase-Aktivität in den nach Methode I präparierten Mitochondrien sein, da hier — im Gegensatz zur Methode II — während der Homogenisation Serumalbumin zugesetzt wurde. Ein Vergleich der Zytochromoxydase-Aktivitäten von Mitochondrien aus Kaninchenretikulozyten und Rattenleber zeigt deutlich höhere Werte für die Retikulozytenmitochondrien (Tab. 2). Dasselbe gilt auch für die Zyto-

4

T . SCHEWE, R . WlESNER, W . SCHULZ

chrome b, cx und c, wie Tab. 3 zeigt. Auffällig sind ferner die signifikant unterschiedlichen Quotienten Zytochrom 6/Zytochrom c (Tab. 4). Ebenso wie der Gesamtzytochromgehalt ist auch der Phospholipidgehalt in den Retikulozytenmitochondrien relativ hoch. Er beträgt das 2,5 fache der Tabelle 2 von Retikulozytenchondrien

Zytochromoxydase-Aktivität

Methode Retikulozytenmitochondrien

¡¿Mol Zyt. c/min. mg. Protein 1

und

Lebermito-

nMol Zyt. a(mg Protein 1

I

0,224

0,34

II

0,540 0,310 0,680

0,83 0,48 1,04

0,149 ± 0,018 2

0,23

Lebermitochondrien 1

Die Proteinwerte wurden über die GOT-Aktivitäten korrigiert (siehe Text). 2 f ü r eine Irrtumswahrscheinlichkeit von 0,05. Tabelle 3 Gehalt an Zytochrom b, c1 u n d c in Retikulozyten- und Lebermitochondrien. Angaben in nMol Zytochrom/mg Mitochondrienprotein Zytochrom

Retikulozytenmitochondrien 1

Methode I I

0,600 0,280 0,690

0,557 0,417 0,595

Methode I Zyt. b Zyt. Zyt. c

0,585 0,470 0,657

Lebermitochondrien 2

Retikulozyt/ Leber-Quotient

0,317 0,176 0,343

1,8 2,2 1,8

1

siehe F u ß n o t e 1 zu Tab. 2. Die von uns ermittelten Werte stimmen annähernd mit denen von W I L L I A M S [ 9 ] überein. Tabelle 4 Tabelle 5 Zytochrom 6/Zytochrom c — Quotienten Phospholipidgehalt von Mitochonvon Retikulozyten- und Lebermitochondrien drien 2

Mitochondrienart

m g P-Lipid/mg Protein

Zyt. b/Zyt. c 1

Retikulozytenmitochondrien 0,83 ± 0,14 n = 5 Lebermitochondrien 1,34 ± 0,25 n = 32 1 Vertrauensintervalle entsprechend einer Irrtumswahrscheinlichkeit von 0,052 Anzahl der Präparationen

Leber Herz Retikulozyt 1

Werte berechnet n a c h Angaben

v o n FLEISCHER e t al. 2

0.14 1 ' 2 0.281 0,37 3 [19]

nach C A P L A N u n d G R E E N A W A L I [20] 3 Präparation nach Methode I I

Retikulozytenmitochondrien. III.

5

Leber- und das 1,3 fache der Herzmitochondrien (Tab. 5). Dagegen ergab die Bestimmung des Gesamtubichinons einen Wert von 1 ,45 nMol/mg Protein, was etwa dem Wert für Lebermitochondrien entspricht. Abb. 1 zeigt eine zweidimensionale dünnschichtchromatographische Auftrennung der Phospholipide aus einer Präparation von elektronenoptisch plasmamembranarmen Retikulozytenmitochondrien, präpariert nach Methode I 1 . Man erkennt die für Mitochondrien charakteristischen Hauptfraktionen Phosphatidylcholin, Phosphatidyläthanolamin und Kardiolipin sowie wenig Phosphatidylinosit. Daneben treten auch Sphingomyelin und Phosphatidylserin als Hinweis für Verunreinigungen durch Plasmamembranen auf, sowie unidentifizierte Fraktionen, bei denen es sich vermutlich um Hydrolyseprodukte der Hauptfraktionen handelt. So könnte die als Phosphatidylglyzerin vermutete Fraktion vom Kardiolipin herrühren. Weitere qualitative Unterschiede zu Mitochondrien anderer Herkunft sind nicht festzustellen. Die Präparationen nach Methode I und I I stimmen in

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Abb. 1. Dünnschicht-Chromatogramm der Phospholipide aus Mitochondrien von Kaninchenretikulozyten Sorbens: Kieselgel H (Merck); Schichtdicke: 0,5 mm. Aktivierung: 1 Std. bei 110 °C; Laufstrecke: je 15 cm. Laufrichtung I: CHC13—CH3OH—HaO 6 5 : 2 5 : 4 ; Laufrichtung II: CHCIj — CHjOH — 25% NH, 14:6:1 [13]. Anfärbung: a) Ninhydrin-Reagens; b) Joddampf; schraffierte Flächen: ninhydrinpositive Flecke Abkürzungen: Card. = Kardiolipin; P E = Phosphatidyläthanolamin; PC = Phosphatidylcholin; PG ? = Phosphatidylglyzerin (?); PI = Phosphatidylinosit; PS = Phosphatidylserin; Sph = Sphingomyelin; FS = unveresterte Fettsäuren; Ch = Cholesterin; ? = unidentifizierte Fraktionen Wir danken Herrn Prof. H. D A V I D und Fräulein I . U E R L I N G S (Berlin) für die Anfertigung der elektronenoptischen Aufnahmen nach ihrem Verfahren [5],

1

6

T . SCHEWE, R . WlESNER, W . SCHULZ

ihrem Phospholipidmuster überein. In Dünnschicht-Chromatogrammen der Neutrallipide findet sich ein relativ hoher Gehalt an unveresterten Fettsäuren, der möglicherweise als Hinweis auf einen intensiven Lipidabbau in den Mitochondrien-Mischpopulationen während der Retikulozytenreifung zu deuten ist. Der verhältnismäßig hohe Zytochrom- und Phospholipidgehalt steht im Einklang mit der elektronenoptisch nachweisbaren dichten Innenstruktur der Retikulozytenmitochondrien [5]. Eine Korrelation zwischen Zytochromgehalt und Anzahl der Cristae wird auch für Leber- und Herzmuskelmitochondrien angegeben [21]. Es ergibt sich die Schlußfolgerung, daß es sich bei Retikulozytenmitochondrien um eine potentiell hoch aktive Mitochondrienspezies handelt. Literatur [1] [2] [3]

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[12] [13] [14] [15]

[16] [17]

[18] [19] [20] [21]

BARTLETT, B .

Summary T. S C H E W E , R. W I E S N E R a n d W . S C H U L Z : Mitochondria f r o m rabbit reticulocytes. I I I . Cytochrome and phospholipid content The cytochrome and phospholipid content of mitochondria f r o m rabbit reticulocytes is about twice as high as t h a t of r a t liver mitochondria, whereas t h e ubiquinone content is unchanged.

Acta biol. med. germ., Band 28, Seite 7—12 (1972) Aus dem Anatomischen Institut der Friedrich-Schiller-Universität Jena (Direktor: Prof. Dr. G . G E Y E R )

Quantitative Untersuchungen über die Verteilung saurer Bindungsorte an menschlichen Erythrozytenschatten1 W . LINSS, G. GEYER, H . RICHTER und U.

HELMKE

(Eingegangen am 22. 4. 1971)

Zusammenfassung An Erythrozytenschatten wurden die elektronegativen Gruppen der Glykokalyx mit Hilfe der Eisenbindungsreaktion ultrahistochemisch dargestellt und quantitativ ausgewertet. Die erhebliche Streuung der Einzelwerte wird auf das unterschiedliche Alter der verwendeten Erythrozyten zurückgeführt. Die Bedeutung der Glykokalyx für die Elimination der Erythrozyten wird diskutiert. Einleitung

In einer früheren Arbeit wurde über die ungleichmäßige Anordnung saurer Bindungsorte an der Glykokalyx menschlicher Erythrozyten berichtet [4]. Dabei konnte beobachtet werden, daß die Dichte der Bindungsorte zwischen den einzelnen Erythrozyten erheblich schwanken kann. Nach den Untersuchungen von M A R I K O V S K Y und DANON [6] sind diese Differenzen abhängig vom Alter der Erythrozyten. Um konkrete Aussagen über die Dichte der Ladungsorte an der Erythrozytenoberfläche und über die Unterschiede zwischen den einzelnen Erythrozyten treffen zu können, haben wir eine quantitative Bestimmung der sauren Ladungsorte vorgenommen, über deren Ergebnis nachfolgend berichtet werden soll. Material und Methodik 1 Teil frisch entnommenes Cuboidalvenenblut wurde mit 4 Teilen ACD-Lösung (2,5 5 % Natriumzitrat, 0,8% Zitronensäure, 1,2% Dextrose) gemischt. Die Erythrozyten wurden abzentrii'ugiert und mit 0,17 M NaCl-Lösung mehrfach gewaschen. Zur Hämolyse verwendeten wir aufeinanderfolgende Stufen von 0,03, 0,01, 0,005 und 0,0037 M NaCl-Lösung und spülten mehrfach mit destilliertem Wasser. Die Erythrozytenschatten fixierten wir mit 1 %igem 0 s 0 4 oder mit 4%igem Formol und l%igem 0 s 0 4 . Die Darstellung der sauren Ladungsorte erfolgte mit der Eisenbindungsreaktion [3], 1 Mit Unterstützung durch einen Forschungsauftrag des Ministeriums für Wissenschaft und Technik der DDR.

8

W . LINSS, G. GEYER, H . RICHTER, U .

HELMKE

Ein Teil der so behandelten Erythrozytenschatten wurde auf befilmte Objektträgernetze aufgetragen, bei Zimmertemperatur getrocknet und elektronenoptisch untersucht. Das weitere Material wurde abzentrifugiert, über die Azetonreihe entwässert und in Epon eingebettet. Die Dünnschnitte untersuchten wir ohne weitere Kontrastierung im Elektronenmikroskop. Die elektronenoptischen Aufnahmen fertigten wir bei 30000, 40000 oder 80000facher Primärvergrößerung an und vergrößerten fotografisch auf 200000fach nach. In den Mikrogrammen von der Oberfläche der direkt auf Objektträgernetze aufgetragenen Erythrozytenschatten wurden die Ferrisolpartikel mittels Schablone auf 50 cm 2 je Zelle ausgezählt und aus dem so gewonnenen Wert die Zahl der Ferrisolpartikel pro um 2 errechnet. Die Auszählung wurde f ü r jeden Erythrozytenschatten von 3 Untersuchern vorgenommen und das Mittel errechnet. In den Dünnschnitten suchten wir Areale mit möglichst großen Flachschnitten der Erythrozytenmembran auf und bestimmten an ihnen in gleicher Weise die Zahl der Ferrisolpartikel pro (Am2. Ergebnisse

An den Erythrozytenschatten, die auf befilmte Objektträgernetze aufgetropft worden waren, ermittelten wir aus 119 ausgezählten Erythrozytenschatten einen Mittelwert von 6186 Ferrisolpartikeln pro ¡xm2 Oberfläche bei einer Standardabweichung von ±2015 Partikeln. Die Extremwerte lagen bei 3132 bzw. 12202 Ferrisolpartikel pro ¡i.m2 (Abb. 1). Eine Einteilung der Erythrozytenschatten in Gruppen entsprechend ihrer Eisenbindungskapazität ergab eine Häufung in den Gruppen unterhalb des Mittelwertes (Tab. 1). In die Gruppe mit der geringsten Ferrisolaffinität ließ sich eine geringere Zahl von Erythrozytenschatten einordnen (Abb. 2). Außerdem wurden an 40 Flachschnitten von Membranen eingebetteter Erythrozytenschatten die Ferrisolpartikel ausgezählt. Das Ergebnis entsprach in der Häufigkeitsverteilung und im Mittelwert grundsätzlich den an den Tropfpräparaten erhaltenen Befunden (siehe Tab. 1). Tabelle 1 Häufigkeitsverteilung der Erythrozytenschatten nach dem Eisenbindungsvermögen Zahl der Ferrisolpartikel pro (jm 2 Oberfläche 3001— 4000 4001— 5000 5001— 6000 6001— 7000 7001— 8000 8001— 9000 9001 — 10000 10001 — 11000 11001 — 12000 12001 — 13000

Zahl der Erythro- Zahl der Erythrozyten aus der zyten aus dem Tropfpräparation Schnittmaterial 9 32 27 18 12 7 6 4

2

2

2

12

13 6 1 3 1 1 1

Oberflächenladung von Erythrozyten

9

Abb. 1. Ausschnitte aus der Oberfläche von Erythrozytenschatten mit stärkerem (oben, 10870 Ferrisolpartikel pro jzm2 Oberfläche) und geringerem (unten, 4770 Ferrisolpartikel pro |im! Oberfläche) Eisenbindungsvermögen. Vergr. 200000fach

10

W . LINSS, G. GEYER, H . RICHTER, U .

"]

HELMKE

Abb. 2. Häufigkeitsverteilung der Erythrozytenschatten entsprechend ihrem Eisenbindungsvermögen. Die so erhaltenen Zahlenwerte ergeben die Kurve 1, für deren rechten Abschnitt eine Näherungskurve 2 eingezeichnet wurde. Die Abweichung im linken Abschnitt der Kurve 1 von Kurve 2 (fett gestrichelt) wird auf Funktion des EDS bezogen (s. Diskussion)

o 3000

5000

10000 Fe-Parhkel

Diskussion

Die quantitative Bestimmung der Zahl von Ferrisolteilchen, die an der Oberfläche der Erythrozytenschatten gebunden sind, bestätigt frühere Beobachtungen und zeigt die erheblichen Unterschiede zwischen den einzelnen Blutkörperchen. Die große Streuung der Werte kann darauf zurückgeführt werden, daß die hier verwendeten Erythrozyten sehr unterschiedlich alt sind. Aus früheren Untersuchungen ist bekannt, daß die Glykokalyx an jungen Erythrozyten eine größere Dichte besitzt als an gealterten Blutzellen [1, 4, 6, 8]. An der Oberfläche junger Erythrozyten können demzufolge auch mehr elektronegative Bindungsorte nachgewiesen werden. Bei der Zählung der Ferrisolpartikel an den Erythrozytenschatten ergab sich die Frage, ob dieser Wert einer Membranoberfläche zuzuordnen sei oder ob eventuell beide aufeinanderliegende Membranen des Erythrozytenschattens erfaßt werden. Die letztere Möglichkeit erschien bereits deshalb unwahrscheinlich, weil über Membranfalten, die bei dieser Präparationstechnik an jedem Erythrozytenschatten auftreten, nicht mehr Ferrisolpartikel als in benachbarten faltenfreien Arealen gefunden wurden. Darüber hinaus ergab die Auszählung der flachgeschnittenen Membranen in den Dünnschnitten ähnliche Werte. Wir nehmen deshalb an, daß bei der Auszählung nur die an eine der beiden Membranen gebundenen Ferrisolpartikel erfaßt worden sind. Mit biochemischen Methoden wurde die durchschnittliche Zahl der an der Oberfläche eines menschlichen Erythrozyten vorkommenden Sialinsäuremoleküle mit 24 • 10® bestimmt [2]. Daraus läßt sich unter Verwendung eines von P O N D E R [7] angegebenen Wertes für die Oberfläche eines menschlichen Erythrozyten (163 (im2) die Relation gebundener Ferrisolteilchen zur Zahl der Sialinsäuremoleküle berechnen. Für den gefundenen Mittelwert von 6186 Fe-Partikel ¡xm2 ergibt diese Berechnung durchschnittlich 1 Ferri-

Oberflächenladung von Erythrozyten

11

solteilchen pro 24 Sialinsäuremoleküle. Es kann nicht angenommen werden, daß alle Sialinsäurereste an der Bindung von Ferrisolteilchen beteiligt sind; die räumliche Struktur der Membran und überhaupt die sterischen Verhältnisse bei der Eisenbindungsreaktion stehen dem im Wege. Die Zahl der tatsächlich bindenden Sialinsäurereste kann jedoch mit den vorliegenden Angaben nicht ermittelt werden. Auch aus diesem Grunde sind die mit der Eisenbindungsreaktion erhaltenen Zahlen als Näherungswerte zu verstehen, und sie gelten unter der Voraussetzung, daß die Relation bei den altersabhängigen Veränderungen der Glykokalyx erhalten bleibt. Wenn man aber davon ausgeht, daß der Quotient eisenbindende Sialinsäurereste: freibleibende Sialinsäurereste bei jungen und alten Erythrozyten gleich ist, so ergibt sich eine Abnahme von maximal 47-10® Sialinsäuremolekülen auf minimal 1 2 • 10«.

Die Ursache für die unterschiedliche Beschaffenheit der Glykokalyx, die sich in der Sialinsäurezahl ausdrückt, wird nicht in einer von vornherein variablen Ausbildung gesehen. Sie beruht vielmehr auf der mit dem Alter des Erythrozyten fortschreitenden Abnutzung bei fehlender Regeneration [4]. Der Abnutzungsprozeß verläuft wahrscheinlich diskontinuierlich. Abgesehen von einer Schwankungsbreite im Maximalbereich läßt die relativ geringe Zahl von Erythrozyten mit hohem Eisenbindungsvermögen (also mit stark entwickelter Glykokalyx) den Schluß zu, daß die Abnutzung anfangs ziemlich schnell abläuft. Nach dem Erreichen eines gewissen Abnutzungsgrades nimmt die bereits lückenhafte Glykokalyx deutlich langsamer ab, wie die Häufung der Zählergebnisse unter und um den Mittelwert ausweist. Im Zusammenhang mit dem Abnutzungsprozeß der Glykokalyx erlaubt die Häufigkeitsverteilung Rückschlüsse auf die Elimination alter Erythrozyten aus der Blutbahn. Die Verteilungskurve in Abb. 2 ist rechtsschief, und sie konnte auch durch Übergang zu den Quadratwurzeln oder Logarithmen der Werte nicht „normalisiert" werden. Der rechte Kurvenabschnitt (Kurve 1) weist auf einen wahrscheinlich exponentiellen Verlauf hin. Eine mit den Werten verträgliche Kurve wurde eingetragen (ausgezogene Kurve 2). Ihre Fortsetzung (gestrichelter Abschnitt von Kurve 2) zu Klassen von Erythrozyten mit geringer Eisenbindung wäre zu erwarten, wenn die alten Erythrozyten nicht abgebaut werden würden, sondern im Blut verblieben. Es käme dann zu einer erheblichen Anreicherung von Erythrozyten höheren Alters 1 . In vivo wirkt jedoch die Tätigkeit des erythrozytendestruierenden Systems (EDS) dieser Entwicklung entgegen. Dafür spricht bereits der geringere Anstieg der ermittelten Kurve zwischen den Erythrozytengruppen mit 5—6000 bzw. 4—5000 Fe-Partikeln (im2. Der darauf folgende steile Abfall zeigt die nunmehr massiv einsetzende Erythrozytenphagozytose deutlich an. 1 Hierbei wird das Alter mit dem höheren Abnutzungsgrad der Glykokalyx identifiziert. Diese Vereinfachung ist aber nur im Regelfall und unter physiologischen Bedingungen zulässig. Bei entsprechenden pathologischen Prozessen muß vermutlich mit wesentlichen Abweichungen gerechnet werden.

12

W . LINSS, G . GEYER, H . RICHTER, U . H E L M K E

Zugleich kommt darin aber auch eine gewisse Toleranzbreite bei der Selektion von Erythrozyten durch das EDS zum Ausdruck. Die Befunde lassen sich mit den Vorstellungen über die Bedeutung der Glykokalyx für das Kontaktverhalten von Zellen gut in Einklang bringen. Sie zeigen, daß die Beschaffenheit der Glykokalyx und damit die Größe der elektronegativen Oberflächenladung eines roten Blutkörperchens der für seine Elimination entscheidende Parameter ist. Durch einen experimentell herbeigeführten Abbau der Glykokalyx kann die Elimination durch das EDS wesentlich beschleunigt werden [5]. Für technische Hilfe bei der Ausführung der Untersuchungen danken wir den med.techn. Assistenten Frau U. MÖLLER, F r a u M. SCHWENDT, Frau U. ROTHER, Fräulein A. P R I E S E , H e r r n K. L E R C H und H e r r n H . L E D E R B A C H . Der Abteilung f ü r experimentelle Zellforschung (Leiter: Prof. Dr. GIRBARTH) des Zentralinstituts f ü r Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Deutschen Akademie der Wissenschaften zu Berlin in J e n a und der elektronenmikroskopischen Abteilung des Bereiches Medizin der Friedrich-Schiller-Universität J e n a haben wir f ü r die Arbeitsmöglichkeiten zu danken.

Literatur Cationized ferritin used for labelling of negative charges in cell surfaces. V I I . Congrès I n t e r n , Microsc. Electr., Grenoble 1970, Band I I I , 33 [2] E Y L A R , E . H . , M . A. M A B O F F , O. V. B R O D Y U. J. L . O N C L E Y : J . biol. Chem. 2 3 7 , 1992 (1962) [3] G E Y E R , G . : Ultrahistochemie. Fischer, J e n a 1 9 6 9 [4] G E Y E R , G . , W . L I N S S U. P . S C H A A F : Acta histochem. (im Druck) [5] H A L B H U B E R , K . - J . , U. H E L M K E U. G . G E Y E R : Unveröffentlichte Ergebnisse [ 6 ] M A R I K O V S K Y , Y . U. D . D A N O N : J . Cell Biol. 4 3 , 1 ( 1 9 6 9 ) [7] PONDER, E . : Hemolysis and related phenomena. Grune and Stratton, New York 1948 [8] YAARI, A.: Blood 33, 159 (1969) [ 1 ] D A N O N , D . , L . G O L D S T E I N , Y . M A R I K O V S K Y U. F . S K U T E L S K Y :

Anschrift der Verfasser: Doz. Dr. med. W . LINSS, Anatomisches I n s t i t u t der FriedrichSchiller-Universität, D D R — 69 J e n a , Teichgraben 7

Summary a n d U. H E L M K E : Quantitative studies on distribution of acidic binding sites on h u m a n erythrocyte ghosts W . LINSS, G . GEYER, H . RICHTER

The electronegative groups of t h e glycocalyx of erythrocyte ghosts were demonstrated, ultrahistochemically by means of ion-binding reaction and were evaluated quantitatively. The considerable scatter of single values appeared t o be due t o t h e different age of t h e erythrocytes. T h e role of t h e glycocalyx for t h e elimination of erythrocytes is discussed.

Acta biol. med. germ., Band 28, Seite 13 — 20 (1972) Institut für Pharmakologie und Toxikologie der Medizinischen Akademie Magdeburg (Direktor: Prof. Dr. sc. med. H . M A T T H I E S )

Einbau von intraventrikulär applizierten 3 H-Uridinmonophosphat, H-Zytidinmonophosphat und 14 C-Orotsäure in die Hirn- und LeberRNS der Ratte 1 ' 2

3

N . POPOV, S. SCHMIDT, S. SCHULZECK u n d H .

MATTHIES

(Eingegangen am 1. 3. 1971/4. 5- 1971) Zusammenfassung Die zeitabhängige Verteilung der Radioaktivität im Homogenat, im säurelöslichen Überstand sowie die Inkorporation in die R N S des Rattenhirns und der Rattenleber wurde nach intraventrikulärer Applikation von 3 H-UMP, 3 H-CMP und 14 C-Orotsäure in einer Dosis von 0,558 [xMol/Ratte untersucht. Der Hirn-RNS-Gehalt war 16 Std. nach UMP-Applikation, 4 8 - 1 4 4 Std. nach CMP-Injektion und 4—48 Std. nach Orotsäuregabe erhöht. Die spezifische Aktivität der Hirn-RNS zeigte höchste Werte 24 Std. nach Applikation der drei RNS-Vorstufen, jedoch war die spezifische Aktivität nach CMP-Injektion wesentlich höher als nach UMP- und Orotsäure-Injektion. Es wurde eine eindeutige Inkorporation in die Leber-RNS nur nach Orotsäure-Applikation festgestellt. Einleitung

Im Rahmen unserer verhaltenspharmakologischen Untersuchungen an einer optischen Diskriminierungsreaktion führte eine einmalige intraventrikuläre Injektion von UMP, CMP und Orotsäure in einer Dosierung von 100 und 200 ng/20 (¿1 Liquorersatz zu einer verzögerten Extinktion der erlernten Verhaltensreaktion [1], Da nach Literaturangaben [2—6] die Pyrimidinvorstufen der RNS eine unterschiedliche Inkorporationsart, vor allem hinsichtlich der Zeitverläufe, aufweisen, war es zunächst Ziel der vorliegenden Arbeit, Untersuchungen an Kontrolltieren über die zeitabhängige Verteilung der Radioaktivität im Homogenat, im säurelöslichen Überstand sowie 1

Uber einen Teil der Versuchsergebnisse wurde auf der 2. Gemeinschaftstagung der Gesellschaften in der Deutschen Gesellschaft für experimentelle Medizin in Leipzig im September 1970 berichtet. 2 Die Untersuchungen wurden aus Mitteln des Ministeriums für Wissenschaft und Technik finanziert. Abkürzungen: UMP = Uridin-5'-monophosphat; CMP = Zytidin-5'-monophosphat; U T P = Uridin-S'-triphosphat; CTP = Zytidin-5'-triphosphat; P P O = 2,5-Diphenyloxazol; P O P O P = l,4-Di-(2-(-5-phenyloxazolyl))-benzol.

14

N . POPOV, S . SCHMIDT, S . SCHULZECK, H .

MATTHIF.S

die Inkorporation in die RNS des Rattenhirns und der Rattenleber nach intraventrikulärer Applikation von 3H-UMP, 3H-CMP und 14C-Orotsäure durchzuführen. Material und Methodik Die Versuche wurden an männlichen R a t t e n des Wistar-Stammes aus eigener Koloniezucht und mit einem Gewicht von 120 — 150 g durchgeführt. Die Tiere erhielten Standardfutter und Wasser ad libitum. Als Nukleinsäurevorstufen wurden folgende Substanzen verwendet: 3 H-Uridin-5'monophosphat (spezifische Aktivität 13,9Ci/mMol) und 3 H-Zytidin-5'-monophosphat (spezifische Aktivität 8,9 Ci/mMol) der Firma „The Radiochemical Centre" Amersham, England; 14 C-Orotsäure (spezifische Aktivität 40 mCi/mMol) wurde im Zentralinstitut für Kernforschung Rossendorf der Deutschen Akademie der Wissenschaften zu Berlin hergestellt. Für die intraventrikuläre Injektion wurden die Tiere 1 Woche vor Versuchsbeginn über dem Bregma skalpiert und die Abheilung der Operationswunde abgewartet. Unter leichter Äthernarkose erhielten die R a t t e n dann intraventrikulär in 20 |xl Liquorersatz 1 gelöstes »H-UMP oder 3 H-CMP, während die 14 C-Orotsäure in 0,03 N N a O H gelöst (pH-Wert etwa 8,0) und ebenfalls in einem Volumen von 20 (¿1 appliziert wurde. Die radioaktiven Substanzen wurden wie folgt dosiert: 0,558 [¿Mol = 225 (xg = 50 ptCi S H-UMP; 0,558 (iMol = 190 |ig = 50 fiCi 3 H-CMP; 0,556 ¡¿Mol = 99 [ig = 22,6 (xCi 14 C-Natriumorotat. Die RNS-Extraktion sowie die optische Bestimmung des RNS-Gehaltes wurden nach einer schon beschriebenen Modifikation [ 7 ] der Methode von O G U R und R O S E N durchgeführt. Der Gehalt an Orotsäure im Hirngewebe wurde radiochemisch und nach dünnschichtchromatographischer Auftrennung kolorimetrisch bestimmt [8]. Das Gewebehomogenat, der RNS-haltige Perchlorsäureextrakt sowie der säurelösliche Überstand wurden mit Hyamin-Hydroxid 10-X in 1 M Methanol (Firma „Packard Instruments", Wien) behandelt und in einem Dioxan-haltigen Szintillator (7 g PPO, 0,3 g POPOP, 100 g Naphthalin in 1 1 Dioxan) an einem Intertechnique S L 4 0 Szintillationsspektrometer gemessen. Die Aktivitätsbestimmungen in Leberhomogenat und -perchlorsäureextrakt wurden in gleicher Weise durchgeführt. Ergebnisse

In Tab. 1 sind die Ergebnisse über den Einfluß der angewandten RNS-Vorstufen auf den RNS-Gehalt im Rattenhirn dargestellt. Die Signifikanzberechnung mit dem ¿-Test ergab gegenüber den Liquorersatzkontrollen eine unterschiedliche zeitabhängige Beeinflussung des RNS-Gehaltes: Kurzzeitige RNS-Erhöhung 16 Std. nach UMP-Applikation, 48—144 Std. nach CMPInjektion und 4—48 Std. nach Orotsäure-Gabe. Der RNS-Gehalt in der Leber (Kontrollwert von 9,80 ± 0,80 mg/g frisches Gewebe; n = 6) blieb nach der Applikation aller drei RNS-Vorstufen unverändert. Die Abb. 1 —3 geben den zeitabhängigen Ablauf der Inkorporation der applizierten markierten Substanzen in Hirn- und Leberhomogenat sowie in die Hirn- und Leber-RNS wieder. Wie aus diesen Abbildungen zu entnehmen 1 Zusammensetzung des Liquorersatzes: 8,1 g NaCl; 0,25 g KCl, 0,276 g CaCl2 • 6 H 2 0 ; 0,238 g MgCl2 • H a O; 1,76 g NaHCO s ; 0,1g N a 2 H P 0 4 • 12 H 2 0 ; 0,13 g Harnstoff; destilliertes Wasser ad 1 1.

Nukleotideinbau in Hirn-RNS

15

Tabelle 1 Einfluß von intraventrikulär applizierten 3 H-UMP, 3H-CMP und 14C-Orotsäure (0,558 ¡xMol pro 20 (¿1 Liquorersatz/Ratte) auf den Hirn-RNS-Gehalt. Die Streuung ist als ±0^ angegeben. Die Signifikanzberechnung nach dem ¿-Test ist gegenüber den Liquorersatzkontrollen (24 Std. Einwirkungszeit) durchgeführt; n.s. = nicht signifikant Einwirkungszeit [Std.] 4 6 16 24 32 48 72 144

UMP [mg/g]

n

2,108±0,068 8 1,951 ±0,069 8 2,206 ±0,025 4 I,8O 9 ±O,144 4 2,004 ±0,075 1,886±0,112

4 4

CMP

Orotsäure

P

[mg/g]

n

P

[mg/g]

n

P

n.s. n.s. 555±°> 1 3° 2.558 ±0,166 2,i8o±o,o69

4 4 4 4 4 4 4 4

n.s. n.s. n.s. n.s. n.s. H-Werte ohne und mit Zusatz verschiedener Substrate und allosterischer Liganden untersucht (Abb. 1). Das Dialysat wurde 1:100 im Dialysepuffer (Zusammensetzung s. Abb. 1) verdünnt und danach sofort gemessen. Die Endkonzentration des Enzyms betrug bei allen Verdünnungen 50 [xg/ml. Der Aktivitätsverlust ohne Ligandenzusätze betrug bei pH 7,1 60%, bei pH 6,0 und 9,0 etwa 90%. Die Zusätze Fru-6-P, ATP, ITP, AMP und Fru-1,6-P 2 schützten das Enzym in unterschiedlichem Ausmaß vor Inaktivierung. Die beiden Substrate Fru-6-P und ATP stabilisieren in allen />H-Bereichen die Enzymaktivität am besten. ITP, AMP und Fru-1,6-P 2 zeigen in dieser Reihenfolge eine abnehmende Schutzwirkung. 2. Einfluß verschiedener Liganden auf das Molekulargewicht von HefePhosphofruktokinase bei unterschiedlichen pH-Werten Für Hefe-Phosphofruktokinase ergibt sich aus dem Aktivitätsgipfel nach Dichtegradientenzentrifugation bei pH 7,1 ein durchschnittlicher Sedimentationskoeffizient von 18,5 S (Abb. 2). Dieser Wert stimmt gut mit dem von

42

ST. L I E B E , W . DIEZEL, G. KOPPERSCHLÄGER, E .

HOFMANN

uns in der analytischen Ultrazentrifuge bestimmten überein [2]. Das daraus errechnete durchschnittliche Molekulargewicht beträgt 570000. Alle untersuchten Liganden (Fru-6-P, Fru-1,6-P 2 , ATP, ITP, AMP) führen in einer Konzentration von 2 mM zu keiner Änderung des Sedimentationsverhaltens. Wie wir früher zeigen konnten, liegt Hefe-Phosphofruktokinase bei pH 6,0 als dimeres Molekül (14,5 S) mit einem Molekulargewicht von 370000 vor [2]. Im Gegensatz dazu sedimentiert das Enzym sowohl in Gegenwart von 0,5 mM als auch 2 mM Fru-6-P (s. auch Abb. 6d) bei pH 6,0 mit 18,5 S [2]. Führt man das Enzym durch Dialyse in die Form von 370000 über (15 stündige Dialyse gegen pH 6,0) und dialysiert anschließend gegen pH 6,0 unter Zusatz von 2 mM Fru-6-P (1 Std.), so sedimentiert auch dann Hefe-Phosphofruktokinase als Molekül mit 18,5 5. 2 mM Glukose-6-P, Fruktose-1-P, pH 6.0

pH 7.1

^

Aktivität des nicht dialysierten Enzyms

^

0,5 m M Ä D T A , 3 m M 2-Merkaptoäthanol

pH 9.0

0,5 m M Ä D T A , 3 m M 2-Merkaptoäthanol

+ 2 m M F-6-P

[2]

0,5 m M Ä D T A , 3 m M 2-Merkaptoäthanol

+ 2 m M ATP

[H

0,5 m M Ä D T A , 3 m M 2-Merkaptoäthanol

+ 6 mM ATP

[i]

0,5 m M Ä D T A , 3 m M 2-Merkaptoäthanol

+ 2 m M JTP

H]

0,5 m M Ä D T A , 3 m M 2-Merkaptoäthanol

+ 2 m M 5' A M P

[•]

0,5 m M Ä D T A , 3 m M 2-Merkaptoäthanol

+ 2mM

FDP

Abb. 1. Einfluß des £H-Wertes und verschiedener Liganden auf die Stabilität der Hefe-Phosphofruktokinase bei Dialyse J e 50 (ig Hefe-Phosphofruktokinase (1 mg/ml) wurden 15 Std. gegen K-Phosphatpuffer (mit 0,5 mM ÄDTA und 3 mM 2-Merkaptoäthanol) unterschiedlicher £H-Werte ohne und mit Zusatz verschiedener Substrate und Effektoren dialysiert. Das Dialysat wurde 1 : 1 0 0 im Dialysepuffer verdünnt und danach sofort gemessen. pH-Wert der Meßlösung 7,5 (s. Material und Methoden)

Substrat- und Effektorwirkung auf PFK 14,5s

Gipfel der Referenzenzyme

o-

/

43

0,4 •

v

A

Aldolase Katalase Muskel- Phospho| | | frufctokinase 0.2 pH 6,0 • 1 mM ATP

5-

0 Tc 0,4-1 Ë 4

8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 Anzahl der Fraktionen

£,0.2 UD

Abb. 2. Sedimentation von Hefe-Phos- 3 phofruktokinase im Dichtegradienten bei pH 7,1 • 100 |J.g Hefe-Phosphofruktokinase (1 mg/ml) wurden 15 Sdt. I=L 0 gegen Gradientenpuffer dialysiert und auf einen Saccharosegradienten (5 — 1.5 20% Saccharose; 0,1 M K-Phosphatpuffer, pH 7,1 ; 0,5 mM ÄDTA; 3 mM 2-Merkaptoäthanol) aufgetragen. Zen1.0 trifugationsbedingungen s. Material und Methoden. Die Numerierung der Fraktionen erfolgt in Richtung stei0,5 gender Molekulargewichte Abb. 3 •

pH 6,0 • 6 mM ATP

4

8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 Anzahl der Fraktionen

Abb. 3. Sedimentation von Hefe-Phosphofruktokinase im Dichtegradienten bei pH. 6,0 unter Zusatz verschiedener ATP-Konzentrationen Gradient a —c: Jeweils 100 (xg Hefe-Phosphofruktokinase (1 mg/ml) 15 Std. gegen Gradientenpuffer dialysiert und auf einen Saccharosegradienten (5 — 20% Saccharose in 0,1 M K-Phosphatpuffer, pH 6,0: 0,5 mM ÄDTA; 3 mM 2-Merkaptoäthanol; Zusatz von a) 1 mM ATP, b) 2 mM ATP und c) 6 mM ATP) aufgetragen. Zentrifugationsbedingungen s. Material und Methoden. Die Numerierung der Fraktionen erfolgt in Richtung steigender Molekulargewichte Fruktose oder Fru-1,6-P 2 haben keinen Einfluß auf das Sedimentationsverhalten bei pH 6,0; auch bei Zugabe dieser Substanzen sedimentiert das Enzym mit 14,5 S. Abb. 3 zeigt die Wirkung verschiedener ATP-Konzentrationen auf das Sedimentationsverhalten von Hefe-Phosphofruktokinase im Dichtegradienten bei pH 6,0. In Gegenwart von 1 mM A T P sedimentiert das Enzym mit 14,5 5 . Das errechnete Molekulargewicht beträgt 370000. Bei 2 mM A T P findet sich neben einen! kleinen Anteil der 14,5 S-Kompo-

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nente ein großer Teil der E n z y m a k t i v i t ä t im Bereich zwischen 14,5 5 und 18,5 S. B e i 6 mM A T P hingegen erscheint ein Aktivitätsgipfel ausschließlich mit 18,5 5 . Mit I T P , A M P oder A D P (2 mM) t r i t t keine Änderung im Sedimentationsverhalten ein (14,5 5 ) . Aus dem Aktivitätsgipfel der Hefe-Phosphofruktokinase nach Dichtegradientenzentrifugation bei p H 9 , 0 ergibt sich unter diesen Bedingungen für das E n z y m ein durchschnittlicher Sedimentationskoeffizient von 1 7 , 4 5 (Abb. 4 a ) . 2 mM F r u - 1 , 6 - P 2 , I T P oder A M P führen zu keiner Verschiebung dieses Aktivitätsgipfels (Abb. 4 b). Bei Anwesenheit von 2 mM A T P k o m m t

Abb. 4. Sedimentation von Hefe-Phosphofruktokinase im Dichtegradienten bei pH 9,0. Gradient a) o o : 100 |xg Hefe-Phosphofruktokinase (1 mg/ml) 15 Std. gegen Gradientenpuffer dialysiert und auf einen Saccharosegradienten (S — 20% Saccharose; 0,1 M K-Phosphatpuffer, pH 9,0 ; 0,5 mM ÀDTA ; 3 mM 2-Merkaptoäthanol) aufgetragen. • • : 100 (ig Hefe-Phosphofruktokinase (1 mg/ml) 15 Std. gegen 0,1 M K-Phosphatpuffer, pH 9,0, dialysiert, 1 Std. gegen 0,1 M K-Phosphatpuffer, pH 7,1, redialysiert und auf einen Saccharosegradienten (5 — 20% Saccharose in 0,1 M K-Phosphatpuffer, pH 7,1 ; 0,5 mM ÄDTA; 3 mM 2-Merkaptoäthanol) aufgetragen. Gradient b) Jeweils 100 [xg Hefe-Phosphofruktokinase (1 mg/ml) 15 Std. gegen Gradientenpuffer dialysiert und auf einen Saccharosegradienten (5 — 20% Saccharose in 0,1 M K-Phosphatpuffer, pH 9,0; 0,5 mM ÄDTA; 3 mM 2-Merkaptoäthanol) aufgetragen. 2 mM AMP • •; 2 mM I T P o o, 2 mM Fru-1,6-P 2 X X. Zentrifugationsbedingungen s. Material und Methoden. Die Numerierung der Fraktionen erfolgt in Richtung steigender Molekulargewichte

Substrat- und Effektorwirkung auf P F K

45

es bei pH 9,0 zum Auftreten von zwei Aktivitätsgipfeln, für die sich Sedimentationskonstanten von durchschnittlich 1 7 , 4 5 und 10,6 S errechnen (Abb. 5 a). Eine gleichartige Verteilung findet sich bei pH 9,0 auch mit höheren ATP-Konzentrationen (6 mM) und auch bei pH 8,0 mit 2 mM ATP. Mit 2 mM Fru-6-P kommt es bei pH 9,0 zum Auftreten eines nahezu symmetrischen Aktivitätsgipfels mit einem durchschnittlichen Sedimentationskoeffizienten von 13,5 5 (entsprechend einem errechneten Molekulargewicht von 330000) (Abb. 6a). Ein Vergleich der Abb. 6a, b und c zeigt, daß mit sinkendem ^H-Wert (pH 9, pH 8, pH 7) die molekularen Formen von 13,5 S nach 18,5 S verschoben werden. Das Sedimentationsverhalten des Enzyms bei pH. 6 (ohne und mit Fru-6-P) stimmt mit früheren Experimenten [2] überein.

L 8 12 16 20 2t, 28 32 36 ¿0 U Anzahl der Fraktionen

Abb. 5. Sedimentation von Hefe-Phosphofruktokinase im Dichtegradienten bei verschiedenen pH-Werten unter Zusatz von 2 mM ATP. Gradient a und b : Jeweils 100 (ig Hefe-Phosphofruktokinase (1 mg/ml) 15 Std. gegen Gradientenpuffer dialysiert und auf einen Saccharosegradienten (5 — 20% Saccharose; 0,1 M K-Phosphatpuffer pH 9,0 (a) bzw. 7,1 (b); 0,5 mM ÄDTA; 3 mM 2-Merkaptoäthanol; 2 mM ATP) aufgetragen. Zentrifugationsbedingungen siehe Material und Methoden. Die Numerierung der Fraktionen erfolgt in Richtung steigender Molekulargewichte.

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,13.5 s 1.0

0.5 DH

9,0 »2 mM Fru -6 - P

E

•L £

3 £ o X

0

1.0-

a.

0,5-

pH8.0 • 2mM Fru-6-P b 4 8 12 16 20 2t 28 32 36 40 Anzahl der Fraktionen Abb. 6 a und 6 b

Diskussion

Hefe-Phosphofruktokinase mit einem Molekulargewicht von 570000 (Trimer) wird bei pH 6,0 in die Form mit 370000 (Dimer) umgewandelt. Durch Redialyse gegen pH 7,1 entsteht wieder das Ausgangsmolekül von 570000 [2]. Fru-6-P verhindert mit hoher Spezifität bei pH 6,0 nicht nur den Zerfall der Einheit von 570000 in die von 370000, sondern bewirkt auch eine Rückverwandlung des Moleküls vom Molekulargewicht 370000 in das von 570000. Wir können aus diesen Versuchen nicht entscheiden, nach welchem Reaktionsmechanismus die Dissoziation bzw. Reassoziation verläuft. Es sind 2 Reaktionswege möglich: oder

2 Trimer ^ 3 Dimer

1 Trimer ^ Dimer + 1 Monomer. Die Rückverwandlung eines isolierten dimeren Moleküls spricht für den ersten der beiden Prozesse.

Substrat- und Effektorwirkung auf PFK

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Abb. 6 c und 6d Abb. 6. Sedimentation von Hefe-Phosphofruktokinase im Dichtegradienten bei verschiedenen />H-Werten unter Zusatz von 2 mU Fru-6-P. Gradient a—d: Jeweils 100 ¡xg Hefe-Phosphofruktokinase (1 mg/ml) 15 Std. gegen Gradientenpuffer dialysiert und auf einen Saccharosegradienten (5 — 20% Saccharose; 0,1 M K-Phosphatpuffer, pH 9,0 (a), pH 8,0 (b), pH 7,1 (c) oder pH 6,0 (d); 0,5 mM ÄDTA; 3 mM 2-Merkaptoäthanol; 2 mM Fru-6-P) aufgetragen. Zentrifugationsbedingungen siehe Material und Methoden. Die Numerierung der Fraktionen erfolgt in Richtung steigender Molekulargewichte

Hinsichtlich der Stabilisierung bestimmter molekularer Formen durch Fru-1,6-P2 bei Veränderungen des pH-Wertes bestehen Unterschiede zwischen den Phosphofruktokinasen aus Hefe und aus Herzmuskel [13]. Für Hefe-Phosphofruktokinase werden katalytische und regulatorische ATP-Bindungsstellen postuliert, für ITP hingegen nur katalytische Bindungsstellen [6]. Da ITP das Enzymmolekül vom Molekulargewicht 570000 bei pH 6,0 nicht vor Dissoziation schützt und ATP eine Dissoziation nur in höheren Konzentrationen verhindert (6 mM ATP; Abb. 3), kann in Überein-

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ST. L I E B E , W . D I E Z E L , G . KOPPERSCHLÄGER, E .

HOFMANN

Stimmung mit den kinetischen Experimenten [6] geschlossen werden, daß möglicherweise die Besetzung der regulatorischen Stellen am Enzymmolekül durch ATP für diesen Effekt verantwortlich ist. Hefe-Phosphofruktokinase zeigt im sauren Milieu eine Verringerung der Hemmbarkeit durch ATP [5]. Die vorliegenden Versuche zeigen, daß sowohl in Gegenwart von Fru-6-P (0,5—2,0 mM) als auch von hohen ATPKonzentrationen (6 mM) das Molekül von 570000 erhalten bleibt. Wenn man voraussetzt, daß sich das Enzym bei sehr hohen Verdünnungen ähnlich verhält, werden offenbar unter den Bedingungen des optischen Tests bei pH 6,0 enzymkinetische Parameter des Moleküls vom Molekulargewicht 5 70000 gemessen. Die Aufhebung der ATP-Hemmbarkeit bei pH 6,0 müßte demnach auf Veränderungen am Molekül von 570000 ohne deutliche Molekulargewichtsverschiebung zurückzuführen sein. Bei pH 9,0 sedimentiert Hefe-Phosphofruktokinase gegenüber dem Versuch bei pH 7,1 etwas langsamer. Dieser Unterschied veränderte sich nicht durch Verlängerung der Dialysedauer auf 48 Std. und war durch einstündige Redialyse gegen pH 7,1 nicht reversibel (Abb. 4a). Die Frage, ob diese Veränderung in der Sedimentationsgeschwindigkeit durch eine Abnahme der Molekülgröße oder durch Änderung anderer Größen, wie partielles spezifisches Volumen, Hydratation oder Achsenverhältnis hervorgerufen wird, kann durch diese Versuche nicht beantwortet werden. Konformationsänderungen, die mit einer deutlichen Veränderung des Sedimentationsverhaltens einhergehen, sind für eine Reihe von Proteinen beschrieben worden [14—17]. Mit Fru-6-P-Zusatz zum Dialyse- und Gradientenpuffer errechnet sich für Hefe-Phosphofruktokinase bei pH 9,0 ein Molekulargewicht von 330000 Dalton. Wir nehmen aus diesen Versuchen an, daß bei pH 9,0 ohne Fru-6-P eine trimere Form und bei pH 9,0 mit Fru-6-P eine dimere Form der Hefe-Phosphofruktokinase vorliegt. Die nach Dialyse und Dichtegradientenzentrifugation wiedergefundene Gesamtaktivität war im Vergleich zum Parallelversuch ohne Fru-6-P etwa 6mal so hoch. Diskelektrophoretische Untersuchungen zeigten, daß Hefe-Phosphofruktokinase im alkalischen Milieu in kleinere, vermutlich enzymatisch inaktive Bruchstücke zerfällt [3]. Fru-6-P scheint den Zerfall der dimeren Form in enzymatisch inaktive Bruchstücke zu verhindern. Ob Fru-6-P bei pH 9,0 auch eine Umwandlung des trimeren in das dimere Molekül begünstigt, läßt sich nicht mit Sicherheit entscheiden. Auch ATP stabilisiert die Enzymaktivität bei pH 9,0, die dabei auftretenden Aktivitätsgipfel nach Dichtegradientenzentrifugation sind jedoch verschieden. Der Anteil des Enzyms, der im Aktivitätsgipfel mit 10,6 S sedimentiert, wird zur Zeit von uns näher untersucht. Die hier dargestellten Ergebnisse zeigen, daß eine Veränderung des unwertes sowie An- oder Abwesenheit der beiden Substrate Fru-6-P und ATPVeränderungen im Molekulargewicht der Hefe-Phosphofruktokinase herbeiführen können (Tab. 1). Fru-1,6-P 2 , ADP, ITP und AMP hingegen beein-

Substrat- und Effektorwirkung auf PFK

49

flußten unter den gewählten Bedingungen das Sedimentationsverhalten nicht. Während bei den pH-Werten 6,0, 7,1 und 9,0 ohne Zusatz eines Liganden immer nur eine Enzymform nachweisbar war, konnten bei pH 6,0 mit ATP-Zusatz und bei pH 8,0 bzw. 9,0 mit ATP- oder Fru-6-P-Zusatz mehrere Enzymformen mit jeweils unterschiedlichem Sedimentationsverhalten nebeneinander nachgewiesen werden. Das kinetische Verhalten der Hefe-Phosphofruktokinase ändert sich in Abhängigkeit vom />H-Wert und in Abhängigkeit von den Substratkonzentrationen [1,3.5,6]. Auf Grund der vorliegenden Untersuchungen ist es möglich, daß bei pH-Werten oberhalb und unterhalb von pH 7 bei der Aktivitätsmessung des Enzyms mehrere Molekülformen nebeneinander vorliegen können. Die Geschwindigkeitskurve des Enzyms bei Veränderungen der ATP- oder Fru-6-P-Konzentrationen braucht unter diesen Bedingungen demnach nicht die Kennlinie einer einzelnen Molekülform zu repräsentieren, sondern kann das Verhalten mehrerer Molekülarten unterschiedlicher oligomerer Struktur widerspiegeln. H U L M E und T I P T O N [19] diskutieren für die Herz-Muskel-Phosphofruktokinase als Ursache des kooperativen Verhaltens eine durch Fru-6-P hervorgerufene Assoziation bzw. eine durch ATP induzierte Dissoziation des Enzymmoleküls bei sehr niedrigen Enzymkonzentrationen. Da das Molekulargewicht der Hefe-Phosphofruktokinase auch bei kleinen Eiweißkonzentrationen bei pH 7,1 durch keinen der untersuchten Liganden verändert wird, andererseits aber das Hefe-Enzym bei diesem />H-Wert eine deutliche Kooperativität und ATP-Hemmbarkeit aufweist, scheint dies für HefePhosphofruktokinase nicht zuzutreffen. Hierüber müssen jedoch weitere Untersuchungen Auskunft geben. Literatur [1]

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Summary S T . L I E B E , W. D I E Z E L , G. K O P P E R S C H L A E G E R and E. H O F M A N N : Yeast phosphofructokinase: Substrate and effector actions upon association and dissociation behaviour

Using density gradient centrifugation the influence of pH, as well as of substrates, and effectors on the sedimentation behaviour and molecular weight of yeast phosphofructokinase has been investigated. At pH 7.1 yeast phosphofructokinase has a molecular weight of 570000 (trimer) and is composed of three entities with molecular weights of 180000 (monomer). The trimeric state is stabilized in the presence of either Fru-6-P, Fru-l ,6-P 2 , ATP, I T P or AMP. At pH 6.0 the dimeric state (370000, 14-5 5) is prevalent. This is stabilized by low concentrations of ATP, whereas in the presence of high concentrations of ATP and in the presence of Fru-6-P the trimeric state prevails at pH 7.1. B y contrast, Fru-l,6-P 2 , I T P and AMP do not influence the sedimentation behaviour of the 14.5 S molecule at pH 6.0. In alkaline media (pH 9.0) the sedimentation constant of yeast-phosphofructokinase was determined to be 17.4 S. In the presence of ATP two peaks are obtained after density gradient centrifugation, having 17.4 and 10.6 S. In the presence of Fru-6-P, however, one symmetrical peak with 13.5 S appears. Fru-l,6-P 2 , I T P and AMP do not change the behaviour of the 17.4 S molecule.

Acta biol. med. germ., Band 28, Seite 51 —62 (1972) Physiologisch-chemisches Institut der Friedrich-Schiller-Universität Jena (Direktor: Prof. Dr. med. habil. H . F R U N D E R )

Rapid and complete separation of red cells from containing medium

32

P-orthophosphate

U . TILL, W . KOEHLER a n d W . LOESCHE

(Received: March 19, 1971/June 9, 1971) Summary Sephadex G 75 columns are used to free erythrocytes completely from extracellular orthophosphate within about 15 sec. During the separation procedure the incubation conditions are kept constant and the cells are not altered as it is found in case of the conventional separation procedure b y centrifugation with large volumes of cold saline. Introduction

In investigations of membrane transfer and intracellular turnover of orthophosphate in erythrocytes, the time course of specific radioactivities of intracellular and extracellular Pi (counts per min per ^mol P4) has to be determined after addition of [ 3 2 P ] - P i to the medium. However, the specific radioactivity of intracellular P 4 cannot be calculated with reasonable reliability from the radiocounts of the red cell incubate and the medium by the use of the haematocrit value, because during the dynamic phase of radioactive exchange the label of extracellular P; is several orders of magnitude greater than that of the intracellular P». A similar calculation of the intracellular Pj-content also involves a considerable error. For this reason most investigators determine both parameters in red cells separated from extracellular Pj by centrifugation in icecold saline [1—6]. There are some objections to this method: The centrifugation time is very often much longer than the exposure period to the isotope. To arrest the metabolic activity in cells completely, cooling down to 0 °C is not sufficient. Therefore one has to consider an uncontrolled change of the intracellular metabolite concentrations and radioactive pattern. The present paper provides a method which allows a much more rapid and complete separation of red cells from highly labelled extracellular P4- by the use of Sephadex G 75 columns. First communications about the passage of blood cells through Sephadex columns were given by [7] and [8]. N A K A O et al. [9, 10] dealt with the suitability of various gels for the isolation of red 4*

52

U . TILL, W . KÖHLER, W .

LÖSCHE

cells from leucocytes and plasma. However, the removal of extracellular [ 3 2 P]-Pj requires special considerations which are the subject of the present paper. Methods Preparation and incubation of red cells About 80 ml of heparinized human blood are collected in an iced 300 ml Erlenmeyer flask and centrifuged at 1 °C (10 min, 800 X g). Plasma and the upper third of the cell sediment containing most of the leucocytes and reticulocytes are removed. Then, a tenfold volume of iced incubation medium (5.5 mM glucose, 146 mM NaCl, 5 mM KC1 and 1 mM Na 2 HP0 4 ) is added and the cells are resuspended and oxygenated by careful agitation. The suspension is centrifuged (5 min, 2300 X g) and the supernatant fluid is removed. After two more washings the red cell sediment is brought to a haematocrit of 40. As a rule the incubation medium is prepared just before use and percolated through a filter (G 5, V E B Glaswerk Schott & Gen., Jena) in order to remove bacteria and "particles" (see "Results"). All glassware used has to be cleaned carefully and rinsed with this medium. 25 ml of the erythrocyte suspension are incubated at 37 °C. The />H is kept constant at 7.4 ± 0.01 by a />H-Stat (Radiometer Copenhagen). After 30 min of incubation the glucose consumption and lactate production become constant (ratio about 1:2) and remain so for several hours. At this time 500 ¡xC of carrier-free [ 3 2 P]-P i (Isocommerz, Berlin) purified and stored according to [11] is added in either of two ways: a) addition to the incubate in a small volume (0.05 — 0.1 ml); b) incubated cells are centrifuged and resuspended in labelled medium. Separation of red cells by Sephadex All steps involved are run at 37 °C. Fig. 1 shows the arrangement and construction of the columns, filled with hydrated Sephadex G 75 (particle size 40—120 ¡¿). Sephadex G 75 contains up to 0.54 (¿atom phosphorus per g dry weight, measured after washing with Lowry solution (75 ml 70% HC104 (w/w), 278 ml conc. H 2 S0 4 (Merck, Darmstadt) and water to 2000 ml). Washing the Sephadex with tenfold volumes each of water, 0.5 N NaOH, 0.1 N HC1 and 0.5 M NaCl diminishes the P-content stepwise down to < 0 . 0 3 ¡¿atom per g dry weight. The purified gel is equilibrated with an elution medium containing all the components of the incubation medium except for Na 2 HP0 4 . This Pj-free medium has also passed through a filter. After the exposure period to [ 3 2 P]-P 4 1 ml of red cell incubate is put on a column immediately followed by elution at a pressure of 150 cm H 2 0 . The eluted red cells are dropped into the fourfold volume of 12% HC10 4 (w/w) and mixed at once. After centrifugation the supernatant is neutralised with 1 0 N KOH in an ice bath. The KC10 4 precipitate is centrifuged and extracted twice with water. In the combined supernatants, the P s and ATP content as well as the P j radioactivity are determined according to [12]. Separation of red cells by centrifugation according to [1—6]. For purpose of comparison, the erythrocytes are separated from the medium as follows: 5 — 10 ml incubate are mixed with the 40 fold volume of iced 0,9% (w/v) NaCl (passed through a bacteria filter) and centrifuged (15 min, 2500 X g). This step is repeated 3 times. Red cell determination The protein precipitates of the eluents and centrifugations are submitted to haematin and/or nitrogen measurements. Determination of haematin is performed as follows: The protein precipitated with HC1Q4 is resuspended in 2—5 ml 0-5 N NaOH. The

Separation of red cells from extracellular [ 3 2 P]-P {

53 elution so/uffan

ISOU mm

11

0 D supporting framework

T A

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Fig. 1. Sephadex columns for separation of red cells. On the left: Arrangement of 4 columns and of the reservoir with elution medium. On the right: Construction of columns in cross section. A = during application of 1 ml red cell suspension on the column by means of a syringe. B = during elution of red cells. (1) = three way tap, (2) = rubber stopper, (3) = glass tube (VEB Glaswerk Schott & Gen., Jena), (4) = spring under tension, (5) = adaptor, (6) = Sephadex G 75 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala), (7) = funnel, (8) = polyethylene tube, (9) = syringe. absorption spectrum corresponds closely to t h a t of HC1 produced haematin in alkaline solution. The plateau between 560 and 590 nm is suitable for quantitative determination. At 570 n m the Lambert-Beer law holds good for a range of 2— 50 [xl erythrocytes. The calculation of red cell content from haematin is performed using a known quant i t y of red cells as standard. The measurement should be carried out within 1 hour after the sediment is fully dissolved since the absorption later decreases. To check the reliability of the method a simultaneous micro-N-determination according to Kjeldahl is carried out. Both methods give approximately the same results. Without the help of Sephadex the Pj-content of the red cells ( = Ce = (xMol P j per ml red cells) is calculated according to the equation from the following d a t a : Cf = (xMol P j per ml total incubate, Cm = ¡xMol P 4 per ml incubation medium, H c t = Haematocrit. „ _ 100 • CH-values greater than 3-0. Comparison between Sephadex chromatography and centrifugation 45 min after application of the tracer, red cells were separated simultaneously by the centrifugation and by the Sephadex method. As shown in Table 2, the Pj content of centrifuged erythrocytes is considerably lower than in percolated red cells. It drops significantly already during the first centrifugation step. The behaviour of the specific radioactivity of the intracellular Pj and of the total cellular radioactivity depends on the way the isotope is added. When the carrier free [32P]-Pj is added immediately to the red cell incubate, the

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counts per min * 10

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LÖSCHE

from Pj. The specific radioactivity of this Pf should be extraordinarily high since chemical methods do not detect any decrease of cellular P; content after chromatography in spite of the eminent loss of total radioactivity (see Table 2, columns 1 and 2 a). This excludes the intracellular P f as the source of the Pi loss as well as extracellular P j; supposed to be adsorbed at the cells and stripped by the gel step. Therefore, it has to be assumed that following the addition of the isotope a part of the carrier-free [ 32 P]-P; is adsorbed by the red cells during the mixing period of 10—15 sec. To prove this assumption, in a special set of experiments [ 32 P]-Pj was added initially to the incubation medium and the erythrocytes were suspended subsequently. When performed in this way a Sephadex passage of centrifuged red cells diminished neither the specific radioactivity of the intracellular P { nor the total cellular radioactivity (see Table 2 columns b). This result demonstrates that the assumption stated above holds good and that the adsorbed carrier free [ 32 P]-Pj can not be removed by the conventional washing and centrifugation procedures. This adsorption can be avoided only by labelling the incubation medium first and then adding the red cells. If this artefact due to the tracer application is prevented one can decide whether or not there is a change in the intracellular labelling during the time consuming centrifugation method. The results listed in Table 2 (columns 2 b and 3b) reveal the following differences: After centrifugation, the specific radioactivity of the intracellular Pj and the total cellular radioactivity are significantly lower than after Sephadex chromatography. After a short exposure time of about 4.5 min (not listed in Table 2), the difference in the total cellular radioactivity is still greater: 5-6 ± 0.5% (4) after chromatography and 3.8I % (2) after centrifugation. The difference is covered by the decrease of the intracellular P4- content only to 10—25 %• This demonstrates, that still other labelled phosphorus compounds are removed by centrifugation. Furthermore, there also seems to exist an exchange between P* and other P-compounds during the centrifugation procedure, since the specific radioactivity of intracellular P» diminishes. Discussion

A separation of red cells from plasma by Sephadex was carried out also by other authors [7—10]. In accordance with them, we do not find an alteration of the cells during the passage. The present paper demonstrates the eminent fitness of this method for the separation of red cells from highly labelled extracellular Pj. The separation is complete, very fast and takes place under maintenance of incubation conditions. In principle the method is also suitable for separation of labelled compounds other than [32P]-Pj. The use of Sephadex G 75 is more advantageous than G 50 and G 25 respectively, because free haemoglobin and metabolites are also separated from red cells in case they are liberated from haemolyzed cells.

Separation of red cells from extracellular [ 3 2 P]-P t

61

The use of [32P]-P» for labelling involves some interferences which can be easily avoided. The trouble caused by [ 32 P]-Pj loaded particles and bacteria relates to both the Sephadex and the centrifugation method. Often an unobserved interference by such particles may be the reason for wrong measurements of the specific radioactivity of intracellular Ps. A test for the presence of [ 32 P]-Pj loaded particles and bacteria is easily possible by passing the labelled incubation medium through a Sephadex column before starting the experiments. The presence of particles is indicated by a double peak in the elution profile. In comparison to the separation of red cells by centrifugation in an excess of iced NaCl, the Sephadex method has decisive advantages. The time consumed for separation (15 sec) is much shorter than that for a 4 fold washing, which needs more than one hour. Moreover, the incubation conditions are maintained during the separation by equilibrating the Sephadex columns with P»-free incubation medium at 37 °C. The P{ content of the erythrocytes does not change at Sephadex percolation. Contrarily, the centrifugation leads to a drop of the Pj content. Therefore a stationary condition is not maintained during this procedure. If carrier-free [ 32 P]-P; is added immediately to the cell suspension, a certain number of erythrocytes adsorbes the acidified isotope before an even mixing has taken place. In all probability this is a />H-effect. But the pH of the tracer solution has to be kept at 3 in order to prevent the formation of labelled particles [11]. During the centrifugation the isotope remains adsorbed and greatly distorts the specific radioactivity of the intracellular Pi. Under these conditions we find values as reported from several authors [5, 6,13,14]. From this it has to be concluded that the specific radioactivities of the intracellular P» given by these investigators may be distorted by tracer adsorption or particles. Some authors believe to exclude a tracer adsorption by the fact, that the supernatant after the fourth centrifugation has a very low radioactivity, negligible in comparison with the incubation medium or with the sedimented cells [5,6]. We also found that the specific radioactivity of the intracellular Pf remains constant after the third centrifugation. Nevertheless, a subsequent Sephadex chromatography causes the mentioned decrease of the specific radioactivity. Obviously the linkage of [32P]-Pi at the cell surface is rather firm. The tracer adsorption can be prevented by a primary labelling of the filtered incubation medium. In this case the centrifugation is shown to diminish the specific radioactivity of the intracellular P* and to wash out labelled P, as well as labelled phosphorus compounds. The Sephadex method is not affected by these disadvantages and does not depend on the way of tracer application. A critical revision of the conclusions drawn from results obtained by the centrifugation method seems to be necessary. A forthcoming paper will deal with it.

62

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Acknowledgements The authors express their sincere thanks to Prof. Dr. H . F R U N D E R for support and helpful discussions during all phases of this work. Grateful acknowledgements are made to cand. med. A . K Ö H L E R and cand. med. I . R U S C H K E for their help during a great part of experiments. Thanks are also given to Mrs. C. R I T T E R for diligent and skilful technical assistance. Some results described in this paper have been presented a t the 6 t h International Symposium on "Structure and Function of Erythrocytes", Berlin, August 1970. References and D . B A C H in: Metabolism and Membrane Permeability of Erythrocytes and Thrombocytes. 1 s t International Symposium, Vienna, June 1 7 — 20, 1968. G E R L A C H , E . and K . M O S E R (editors). Thieme, Stuttgart, 1968, p. 430 G O M P E R T S , B. D.: Biochem. J . 100, 44P (1966) G O M P E R T S , B. D.: Biochem. J . 1 0 2 , 782 (1967) G O M P E R T S , B. D.: Biochim. biophys. Acta 1 7 7 , 144 (1969) P R A N K E R D , T. A . J . and K . I . A L T M A N N : Biochem. J . 5 8 , 622 (1954) P F L E G E R , K. and E . S E I F E N : Biochem. Z. 3 3 5 , 595 (1962) W E I N S T E I N , A . B.: J . Lab. clin. Med. 6 4 , 514 (1964) HORN, A.: personal communication N A K A O , M . , T . K A N K U R A and S . K U R A S H I N A : Enzymol. biol. clin. 1 0 , 3 1 6 ( 1 9 6 9 ) K A N K U R A , T., W. N A K A M U R A , H. E T O and M. N A K A O : Int. J . Radiat. Biol. 1 5 , 125 (1969) T H I E L M A N N , K. and M. S C H U L Z E : Acta biol. med. germ. 1 8 , 667 (1967)

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Zusammenfassung U. T I L L , W. K Ö H L E R und W. L Ö S C H E : Schnelle und vollständige Trennung der Erythrozyten von 3 2 P-Orthophosphat-haltigem Medium Erythrozyten werden mit Hilfe von Sephadex G 7 5 Säulen innerhalb von 15 sec vollständig von extrazellulärem Orthophosphat abgetrennt. Im Gegensatz zur konventionellen Abtrennung durch Zentrifugation im Überschuß an eiskalter Kochsalzlösung bleiben während der Sephadexpassage die Inkubationsbedingungen erhalten und die Zellen werden nicht alteriert.

Acta biol. med. germ., B a n d 28, Seite 63 — 71 (1972) Aus dem I n s t i t u t f ü r Physiologische und Biologische Chemie der Humboldt-Universität zu Berlin, Bereich Medizin (Direktor: Prof. Dr. Dr. S . M. R A P O P O R T )

Reinigung und Charakterisierung der dikumarolunempfindlichen NADH-spezifischen Dehydrogenase aus dem Zytosol der Rattenleber J. ZINSMEYER, W . SCHÖNFELD u n d C. WAGENKNECHT

(Eingegangen am 13. 4. 1971/14. 6. 1971) Zusammenfassung Eine dikumarolunempfindliche NADH-Dehydrogenase wurde aus dem Zytosol der Rattenleber über 200fach angereichert. I n den von uns b e s t i m m t e n kinetischen P a r a m e t e r n (Wasserstoffdonatoren, Elektronenakzeptoren, pH- u n d Temperaturabhängigkeit, Hemmstoffeinfluß) weist das E n z y m große Ähnlichkeit mit der NADH-Zytochrom J 5 -Oxidoreduktase aus den ergastoplasmatischen Membranen auf. Eine Ablösung von den Membranen während der Präparation erscheint jedoch unwahrscheinlich. Die mögliche H e r k u n f t und Funktion des E n z y m s wird diskutiert. Einleitung

Neben der Erforschung der verschiedenen Atmungs-Enzyme in den einzelnen Zellfraktionen ist die Frage nach ihrem Zusammenspiel von Interesse. Die Bedeutung dieser Frage wird deutlich, wenn man z. B. die NADH-Dehydrogenasekapazität der Zellfraktionen der Rattenleber betrachtet. Nach W A G E N K N E C H T und R A P O P O R T [ 1 ] sind nur 4 0 % in den Mitochondrien fixiert, 50% der Kapazität sind in den „Mikrosomen" und 10% im Zytosol lokalisiert. Zur Klärung der Frage der intrazellulären Atmungskooperation führten R A P O P O R T et al. [ 1 — 7 ] Modelluntersuchungen durch und diskutierten die biologische Funktion der „Diaphorasen" des Zytosol. Sie fanden, daß die NADPH-Dehydrogenasen des Zytosol direkt mit Zytochrom c reagieren können. Diese Reaktion war nicht durch mikrosomales Zytochrom b5 zu beschleunigen. Eine NADH-Zytochrom-c-Oxidoreduktase-Aktivität des Zytosol konnte dagegen nur gemessen werden, wenn Zytochrom b6 als Mediator zugesetzt wurde [6]. Weitere interessante Fragen wurden durch Bilanzuntersuchungen an den extramitochondrialen NADH-Dehydrogenasen aufgeworfen [4, 5,7]: Vergleicht man die Reduktase- und Diaphorase-Aktivität eines Gemisches aus der Mikrosomen-Fraktion und dem Zytosol mit den Aktivitäten der Einzelfraktionen, so kann man feststellen, daß zwar die Bilanz der Diaphorase-

64

J . ZINSMEYER, W . SCHÖNFELD, C. WAGENKNECHT

Aktivitäten stimmt, nicht jedoch die der Reduktase. Das bedeutet, daß eine Kooperation zwischen Zytosol und „Mikrosomen" bestehen muß, die Anschluß findet an das Zytochrom c. Durch Versuche mit dem Atmungshemmstoff aus Retikulozyten konnte gezeigt werden, daß auch eine Verbindung zwischen den NADH-Dehydrogenasen des Zytosols und den Eisen-Flavinenzymen der Mitochondrien möglich ist [2, 3], Diese Untersuchungen geben einen Hinweis für die biologische Funktion der Diaphorasen im Zytosol. Bei diesen Untersuchungen blieb die Frage offen, welche NADH-Dehydrogenase des Zytosol mit Zytochrom b5 reagiert und damit in der Lage ist, mit den „Mikrosomen" zu kooperieren. Von dieser Frage ausgehend versuchten wir, eine NADH-Dehydrogenase aus dem Zytosol der Rattenleber, die mit Zytochrom bs reagieren kann, anzureichern und einige Parameter dieses Enzyms zu bestimmen. Präparation Männliche Albinoratten wurden mit Äther narkotisiert und getötet, die Leber herauspräpariert und sofort sorgfältig mit 0,25 M Saccarose, die 10~3 M ÄDTA enthielt, blutfrei gespült. Die Leber wurde homogenisiert und die partikulären Fraktionen abzentrifugiert. Das so erhaltene Zytosol (Ü0) wurde mit Ammoniumsulfat versetzt.

Eiweiß

Aktivität

Abb. 1. Säulenchromatographische Trennung von NADH-Dehydrogenase an D E A E Zellulose. Aktivität ohne (A A) bzw. mit ( • •) Dikumarol; • • = Eiweiß. Säulenfüllung: DEAE-Zellulose in 0,01 M Phosphatpuffer, p~R 6,4; Volumen: 1300 ml, 0 4,5 cm, Höhe 8 2 c m . Gradient: Mischgefäß 1 1 0,01 M Phosphatpuffer, pH 6,4; Reservoir 1,7 1 0,3 M Phosphatpuffer, pH 6,4. Fraktionen: je 10 ml

Dikumarolunempfindliche NADH-Dehydrogenase

Eiweiß [mg/ml]

65

Aktivität [aE/min/mi']

0.2

2.0

0.1

1.0

0

0 10.

20.

30.

W.

50.

60.

70.

Fraktion— Abb. 2. Molekularsiebtrennung von NADH-Dehydrogenase an Sephadex. Säulenfüllung: Sephadex G 100 in 0,01 M Phosphatpuffer, pH 6,4; Volumen: 550 ml 0 4,3 cm, Höhe 38 cm. Fraktionen: je 6,4 ml Eine erste Fällung bei 45%iger Sättigung diente der sicheren Entfernung der ergastoplasmatischen Membranen, eine zweite bei 75%iger Sättigung der Konzentrierung des Materials. Zur weitgehenden Denaturierung der gleichfalls im Zytosol vorkommenden DT-Diaphorase, die E R N S T E R et al. [8—10] beschrieben haben, wurde das Material 45 min bei 40 °C inkubiert. Eine Anreicherung der dikumarolunempfindlichen NADH-Dehydrogenase erfolgte durch Adsorption an DEAE-Zellulose (Abb. 1) und präparative Gelfiltration mit Sephadex G 100 (Abb. 2). In der Spitzenfraktion dieser Molekularsiebtrennung konnte das Enzym 260fach gegenüber dem Zytosol angereichert werden. Eine zusammenfassende Darstellung des Präparationsganges ist in Tab. 1 gegeben. Zur Reindarstellung des Enzyms sind noch weitere Trennungen notwendig. Ergebnisse Einige Eigenschaften der dikumarolunempfindlichen NADH-Dehydrogenase wurden am vorgereinigten E n z y m untersucht. Folgende Resultate wurden erhalten. Donatoren Das E n z y m ist NADH-spezifisch, es reagiert nicht mit N A D P H . Die Michaeliskonstante für N A D H liegt nach den Auftragungen nach LINEWEAVER-BURK [ 1 1 ] , E A D I E [ 1 2 ] u n d HOFSTEE [ 1 3 ] bei 5,3 b z w . 5 , 4 • 1 0 ~ 6 M

(Abb. 3). Akzeptoren Als Elektronenakzeptoren wirken Ferrizyanid, 2,6-Dichlorphenolindophenol und Zytochrom bB. Mit Zytochrom c und Sauerstoff finden keine meßbaren Reaktionen statt. 5 Acta biol. med. germ., Bd. 28, Heft 1

66

J - ZINSMEYER, W . SCHÖNFELD, C. WAGENKNECHT

Tabelle 1 Reinigung der dikumarolunempfindlichen NADH-Dehydrogenase Ges.-Aktivität NADH|"[aMO1 NADH1 Dehydrog. L min J DT.-Diaphor.

Operation bzw. Fraktion

Ges.Protein [mg]

Zytosol (NH4)2S04-Fraktionierung 0,45—0,70 Niederschlag Hitzebehandlung (45 min b. 45 °C) DEAE-Zellulose „Batchen" mit NH4OH-vorbehandelter DEAEZellulose Sephadex G-100Filtration (Spitzenfraktion)

23200

1230

10100

spez. Aktivität mit Dikumarol

Anreicherungen

1:4

0,053

1,0

590

1:5,9

0,058

1,1

8100 3 360

393 360

1:1,5 1:0,03

0,048 0,109

0,9 2,0

660

198

1:0,00

0,300

5,7

14 11

1:0,00

1,3

10,8

200 260

Im NADH-2,6-Dichlorphenolindophenol-Meßsystem besitzt das Enzym eine geringe Aktivität und gehorcht einer komplizierten Kinetik. Deshalb wurden alle folgenden Parameter im NADH-Ferrizyanid-Meßsystem bestimmt. Die halbmaximale Geschwindigkeit wird bei einer Ferrizyanidkonzentration von 4,3 (LINEWEAVER-BuRK-Plot) bzw. 4,0 (Auftragung nach E A D I E ) mal 1CT6 M erreicht (Abb. 4). pH-A

bhängigkeit

Die NADH-Dehydrogenase ist über einen weiten ^>H-Bereich aktiv. Ein Optimum zeigt sich bei 5,8 (Abb. 5). Temperaturabhängigkeit

Bei logarithmischer Auftragung der Reaktionsgeschwindigkeit gegen den reziproken Wert der absoluten Temperatur resultiert in einem Bereich von 15°—ca. 40 °C eine Gerade, aus der sich ein Q10 von 1,5 und eine Aktivierungsenergie von 7 kcal/Mol errechnen lassen (Abb. 6). Hemmstoffe

Im Gegensatz zu den bisher bekannten, im Zytosol vorkommenden Chinonreduktasen ist das hier beschriebene Enzym unempfindlich gegenüber Dikumarol; 10 - 5 M Dikumarol hat keinen Einfluß auf die Aktivität.

Dikumarolunempfindliche NADH-Dehydrogenase

67

p-Chlormerkuribenzoat und NAD + hemmen das Enzym kompetitiv zu NADH; Kf (pMB) beträgt 9 • 10" 8 M (Abb. 7), Kf (NAD+) 2,8-10" 4 M (Abb. 8). Der Einfluß von Antimyzin A (10—25 ¡j-g/ml) und Dodezylsulfat (6 • 10"® bis 5 • 10~4M) auf die Aktivität ist gering. Im NADH-Ferrizyanid-Meßsystem wirkt auch 2—6-Dichlorphenolindophenol als Inhibitor.

Abb. 3. Abhängigkeit der NADH-Aktivität von der NADH-Konzentration. Auftragung nach E A D I E . Meßansatz: 0,05 M Phosphatpuffer, pH 7,4, 2,5 • 10"4 M K 3 [Fe(CN) e ]

Abb. 4. Abhängigkeit der NADH-Aktivität von der Ferrizyanidkonzentration Auftragung nach E A D I E . Meßansatz: 0,05 M Phosphatpuffer, pH 7,4, 7,5 • 10 _ 5 M NADH 5'

68

J . ZINSMEYER, W . SCHÖNFELD, C. WAGENKNECHT

Abb. 5. Abhängigkeit der N A D H - A k t i v i t ä t v o m £ H - W e r t . o Azetat-, • Phosphat-, A Tris-Puffer. Meßansatz: 1,94 ml 0,1 M Puffer, 0,01 m l 0,01 M N A D H , 0,02ml0,01 M K j [Fe(CN)„], 0,025 ml Enzymlösung

Abb. 6. Abhängigkeit der N A D H - A k t i v i t ä t von der Temperatur. Meßansatz wie in Abb. 5; Phosphatpuffer, pH 7,4

Abb. 7. H e m m u n g der NADH-Dehydrogenase durch £-CMB. Meßansatz wie in Abb. 3

Dikumarolunempfindliche NADH-Dehydrogenase 1 V

69

f 10'SM NADH

15

f 10

/

/2x10-sMNADH

y

^

Abb. 8. Einfluß von NAD+ auf die NADH-Dehydrogenase. Meßansatz wie in Abb. 3

Keinen Einfluß auf die Aktivität haben Rinderserumalbumin ÄDTA (10~3 M), FAD (lO"6 M) und Amytal (2 mg/ml).

(0,07%),

Diskussion

Das von uns gefundene Enzym besitzt NADH-Zytochrom &6-Oxidoreduktase-Aktivität. E s könnte in der Atmungskooperation seine Funktion besitzen. Im Gegensatz zu den im Zytosol vorkommenden Chinonreduktasen ist es NADH-spezifisch u n d dikumarolunempfindlich. V o n der von FRIMMER [14]

beschriebenen NADH-spezifischen Chinonreduktase aus Schweineleber läßt sich unser Enzym dadurch abgrenzen, daß es mit Ferrizyanid reagiert. Von den mitochondrialen Enzymen, die von verschiedenen Autoren [15 bis 28] beschrieben wurden, unterscheidet sich das hier beschriebene Enzym durch die höhere Affinität zu NADH, die größere Empfindlichkeit gegenüber p-Chlormerkuribenzoat und — im Gegensatz zu dem von HAHN et al. [26 bis 28] beschriebenen Enzym — die um über eine Größenordnung geringere Empfindlichkeit gegenüber Antimyzin A. In den bisher bestimmten Eigenschaften zeigt die dikumarolunempfindliche NADH-Dehydrogenase aus dem Zytosol der Rattenleber eine weitgehende Ubereinstimmung mit der NADH-Zytochrom &6-Oxidoreduktase aus den ergastoplasmatischen Membranen, die STRITTMATTER [29—31] beschrieb. Die Spezifität und Affinität zu NADH, die Affinität zu Ferrizyanid, die relativ geringe Abhängigkeit vom ^H-Wert, die geringe Affinität zu 2 - 6 Dichlorphenolindophenol und das Fehlen von Oxidase- und Zytochrom cReduktaseaktivität stimmen überein. Das von STRITTMATTER beschriebene Enzym ist gegenüber Antimyzin A bis zu einer Konzentration von 50 [¿g/ml

J . ZINSMEYER, W . SCHÖNFELD, C. WAGENKNECHT

70

unempfindlich, während die NADH-Dehydrogenase aus dem Zytosol in diesem Konzentrationsbereich deutlich gehemmt wird. Somit ist die Eigenständigkeit der hier beschriebenen NADH-Dehydrogenase sehr wahrscheinlich. Eine Ablösung von den Zellstrukturen kann wegen der schnellen und relativ schonenden Präparationsmethoden ausgeschlossen werden. Die zum Vergleich herangezogenen Präparate konnten erst durch Alkoholextraktion, Behandlung mit Schlangengift oder saure Inkubation über mehrere Tage von der Struktur abgelöst werden. Ein Vergleich mit diesen Enzymen ist jedoch interessant, wenn die Frage nach der Herkunft der NADH-Dehydrogenase diskutiert wird: Existiert die NADH-Dehydrogenase des Zytosols primär in der löslichen Phase oder entsteht sie durch in vivo-Ablösung von den Mitochondrien oder ergastoplasmatischen Membranen im Rahmen von Alterungs- oder Abbauprozessen? Diese Frage wurde für die relativ selbständige Diaphorase aus Kaninchenerythrozyten von RAPOPORT und WAGENKNECHT [32] diskutiert. Hier besteht die Möglichkeit, daß die relativ hohe NADH-DehydrogenaseAktivität in den Erythrozyten ein Relikt der im jugendlichen Zellalter vorhandenen Atmung darstellt. Eine NADH-spezifische Dehydrogenase aus Kaninchenerythrozyten kann ebenfalls mit Zytochrom bb reagieren [33]Über einen weiten Bereich ist die Aktivität relativ unabhängig vom püWert, jedoch zeigt sich ein deutliches Optimum bei 6,2. Die Affinität zu NADH ( K m = 2 • 10-® M) und Ferrizyanid (K M = 1,4 • 10"® M) des noch nicht reinen Enzyms ist ebenfalls recht groß [34]. Antimyzin A hemmt in einer Konzentration von 1 5 — 20 (xg/ml die Aktivität zu ca. 50% [35]. Jedoch ist das erythrozytäre Enzym bedeutend weniger empfindlich gegenüber />-Chlormerkuribenzoat als die NADH-Dehydrogenase aus dem Zytosol der Rattenleber (50%ige Hemmung bei 10" 5 M). Diese kinetischen Daten geben noch keine klare Auskunft über die evtl. Identität dieser Enzyme; sie schließen auf der anderen Seite einen gleichen Entstehungsmechanismus der löslichen Enzyme nicht aus. Klarheit wird dann bestehen, wenn die Enzyme rein dargestellt sind und dann exakt in ihren kinetischen und eiweißchemischen Eigenschaften verglichen werden können. Literatur [1] WAGENKNECHT, C. U. S . M . RAPOPORT: A c t a b i o l . m e d . g e r m . 1 2 , 5 4 2 ( 1 9 6 4 )

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71

Dikumarolunempfindliche N A D H - D e h y d r o g e n a s e

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C.,

J . ZINSMEYER U. B . N A C K : F o l i a h a e m a t . ,

Z I N S M E Y E R , J . U. B . N A C K :

Lpz.

89,

158

Unveröffentlichte Versuche

Summary J . Z I N S M E Y E R , W . S C H O E N F E L D and C . W A G E N K N E C H T : Purification and characterization of dicumarol-insensitive N A D H - s p e c i f i c dehydrogenase from cytosol of r a t liver A dicumarol-insensitive NADH-dehydrogenase w a s enriched more t h a n 200fold from c y t o s o l of rat liver. In its kinetic parameters (hydrogen donors, electron acceptors, p H and temperature dependence, inhibitory effect) the e n z y m e is largely similar t o the N A D H - c y t o c h r o m e & 6 -oxidoreductase from ergastoplasmatic membranes. However, detachment from the membranes during preparation seems t o be improbable. T h e possible origin and function of the enzyme is discussed.

Acta biol. med. germ., Band 28, Seite 73 — 80 (1972) Aus dem Institut für Pharmakologie und Toxikologie der Friedrich-Schiller-Universität Jena (Direktor: Prof. Dr. H. A N K E R M A N N )

Renale Wirkungen von Aldosteron und Spironolakton bei Ratten unterschiedlichen Alters H . BRÄUNLICH u n d L .

KERSTEN

(Eingegangen am 12. 1. 1971) Zusammenfassung An Ratten im Alter von 5 bis 33 Tagen wurde der Einfluß von Aldosteron und Spironolakton auf die renale Ausscheidung von Wasser und Ionen untersucht. Spironolakton ist bei Ratten aller Altersgruppen wirksam. Die Wirkung des AldosteronAntagonisten setzt jedoch bei 5 bis 20 Tage alten Ratten langsamer ein als bei älteren Tieren. Auch Aldosteron wirkt bei Ratten aller Altersgruppen. Die Veränderungen der renalen Ausscheidung von Natrium und Wasser stehen nach Applikation von Aldosteron und Spironolakton im Vordergrund. Im Vergleich zu Kontrollen wird der Natrium-Kalium-Quotient nach Gabe beider Stoffe größer. In Übereinstimmung mit Untersuchungen anderer Autoren verändern Aldosteron und Spironolakton die renale Ausscheidung von Kalium und H-Ionen nur relativ geringfügig. Auf mögliche Ursachen für die widersprüchlichen Angaben bezüglich der Wirksamkeit spezifischer Aldosteron-Antagonisten bei jungen Ratten wird hingewiesen. Einleitung

Untersuchungen über die Altersabhängigkeit der renalen Ausscheidung von Wasser und Ionen bei Belastung mit NaCl-Lösung und nach Gabe von Diuretika haben gezeigt, daß junge Ratten einen sehr intensiven Austausch von Natrium gegen H-Ionen und Kalium vollziehen [1, 2]. Bei Belastung mit NaCl-Lösung erreicht der Austausch bei 5 und 15 Tage alten Ratten ein solches Ausmaß, daß mehr Kalium als Natrium ausgeschieden wird. Sehr wahrscheinlich ist die hormonelle Regulation des Ionenaustauschs bei jungen Ratten noch unvollkommen entwickelt (siehe [2]). B E N T L E Y [ 3 ] sowie A L E X A N D E R und GRIMASON [ 4 ] kamen auf Grund der fehlenden Wirksamkeit spezifischer Aldosteron-Antagonisten zu dem Schluß, daß Aldosteron bei der Ratte erst nach dem 12. Lebenstag gebildet wird. B E N T L E Y [ 3 ] konnte nachweisen, daß zugeführtes Aldosteron bei jüngeren Tieren wirkt. Die genannten Untersuchungen sind jedoch aus methodischen Gründen nicht geeignet, die Frage nach der Funktionsfähigkeit des Aldosteron-Systems bei jungen Ratten eindeutig zu beantworten (siehe Diskussion). Daher wurden

74

H . BRÄUNLICH, L .

KERSTEN

Untersuchungen über den Einfluß von Aldosteron und Spironolakton auf die renale Ausscheidung von Wasser, Natrium, Kalium, H-Ionen und Ammonium bei Ratten verschiedenen Alters durchgeführt. Methodik Versuchstiere Die Untersuchungen erfolgten an 5. 7, 12, 20, 25 und 33 Tage alten Wistar-Ratten (Jena) eigener Kolonie-Zucht. Die 20 bis 33 Tage alten Tiere waren weiblichen Geschlechts, bei den jüngeren Hatten blieb das Geschlecht unberücksichtigt. Bis zum Beginn des Diurese-Versuchs blieben die R a t t e n bei der Mutter. Anzahl der Tiere pro Gruppe: 12; bei den jüngeren R a t t e n wurden bis zu 72 Tiere pro Gruppe eingesetzt, um genügend H a r n für die Ionenbestimmungen zur Verfügung zu haben. Pharmaka, 3 mg/kg Aldosteron (E. Merck AG, Darmstadt) bzw. 30 mg/kg Spironolakton (Aldactone, Boehringer GmbH, Mannheim) wurden einmalig i.p. appliziert. Bestimmungsmethoden Die ausgeschiedene Harnmenge wurde volumetrisch ermittelt; Natrium und Kalium wurden mit dem Flammenphotometer in üblicher Weise bestimmt. AmmoniumBestimmungen erfolgten nach der Mikrodiffusionsmethode von R I C H T E R I C H et al. [5]. Der £H-Wert des Harns wurde mit einer Mikroglaselektrode und dem Meßverstärker O P 205 („Radelkis*'/Ungarn) ermittelt. Nähere Angaben zu den Bestimmungsmethoden siehe [6]. Versuchsablauf Nach Belastung mit 10 ml/100 ml E Z R 0,9%iger NaCl-Lösung 48 und 24 Std. vor dem Diurese-Versuch erhielten die Tiere zu Beginn der 5stündigen Harnsammeiperiode 20 ml/100 ml E Z R 0,9%ige NaCl-Lösung i.p. Die renale Ausscheidung von Wasser und Ionen wurde im Vergleich zu Tieren gemessen, die zusammen mit der NaCl-Lösung Aldosteron bzw. Spironolakton i.p. erhielten. Der H a r n wurde in fünf lstündigen Versuchsperioden von nicht narkotisierten R a t t e n gewonnen. Zur Technik der Harngewinung siehe [6]. Darstellung der Ergebnisse, statistische

Bearbeitung

Die Meßwerte sind in ml bzw. in mval angegeben und auf 100 g Körpergewicht bezogen. In den Abbildungen sind arithmetische Mittelwerte mit Standardfehler angegeben. Signifikanzprüfungen erfolgten nach dem /-Test. Ergebnisse Aldosteron und Spironolakton sind auch bei jungen Ratten wirksam. Altersabhängige Wirkungsunterschiede bestehen insofern, als Spironolakton bei 5 bis 20 Tage alten Ratten später wirksam wird als bei älteren Tieren. In Abb. 1 ist der Verlauf der renalen Natrium-Ausscheidung nach Gabe von Spironolakton bei 1 5 und 33 Tage alten Ratten im Vergleich zu Kontrolltieren dargestellt. Spironolakton ist bei 1 5 Tage alten Ratten in der 3. bis 5. Stunde wirksamer als in den beiden ersten Stunden nach der Applikation. Um die Versuchsergebnisse bei den Tieren der verschiedenen Altersgruppen

Altersabhängige Aldosteron/Spironolaktonwirkung Abb. 1. Einfluß von Spironolakton (30 mg/kg i.p.) auf die renale Ausscheidung von Natrium während einer 5stündigen Versuchsperiode (Summationskurven). Vx bis V 5 = 1. bis 5- Std. nach Applikation. -15 Tage alte Ratten: A • Spironolakton; A A Kontrollen. 33 Tage alte Ratten: • • Spironolakton; o o Kontrollen

75

g 7

0,6 .

Qj

If ' vergleichen zu können, werden die Verände- | rungen der renalen Wasser- und Ionen-Aus- C Scheidung durch die beiden Pharmaka nur ^ 0,3 für die 4. Stunde nach der Applikation dargestellt. Erst in der 4. Stunde der 5stündigen 5 Versuchsperiode sind Aldosteron und Spiro0,2 nolakton auch bei jungen Ratten voll wirksam.

0,1

Natrium Aldosteron führt bei 7 bis 33 Tage alten 0 Ratten zu einer Verminderung der renalen Natrium-Ausscheidung. Spironolakton steigert die renale Natrium-Ausscheidung insbesondere bei den jüngeren Tieren und verringert damit die altersabhängigen Unterschiede hinsichtlich der renalen Natrium-Ausscheidung (Abb. 2). Kalium Aldosteron und Spironolakton beeinflussen die renale Kalium-Ausscheidung weniger als die Natrium-Ausscheidung (Abb. 3). Eine Tendenz zu quantitativen altersabhängigen Wirkungsunterschieden ist für beide Pharmaka nicht nachweisbar. Natrium-Kalium-Quotient Die gegensinnige Beeinflussung der renalen Ausscheidung von Natrium und Kalium durch Aldosteron und Spironolakton verändert den Natrium-Kalium-Quotienten erheblich. Die Ergebnisse sind in Abb. 4 dargestellt. Die Vergrößerung des Natrium-Kalium-Quotienten durch Spironolakton gegenüber Kontrollen ist bei 5 bis 20 Tage alten Tieren ausgeprägter als bei älteren Ratten. H-Ionen und Ammonium Die Veränderungen der renalen Ausscheidung von H-Ionen und Ammonium nach Aldosteron bzw. Spironolakton sind geringfügig und wie die der renalen

76

H . BRÄUNLICH, L . KERSTEN

Kalium-Ausscheidung nicht eindeutig. Lediglich die renale AmmoniumAusscheidung wird durch Spironolakton bei Ratten aller Altersgruppen vermindert. Nur bei den 33 Tage alten Tieren ist die Abnahme der Ammonium-Ausscheidung gegenüber Kontrollen von 0,0239 auf 0,01 \ 7 mval pro 100 g/Std. deutlich und statistisch gesichert. Auf eine Darstellung der Befunde wird verzichtet. Wasser- A usscheidung

Aldosteron führt nur bei den 25 und 33 Tage alten Ratten zu einer deutlichen Verminderung der renalen Wasser-Ausscheidung. Spironolakton steigert die renale Wasser-Ausscheidung bei Ratten aller Altersgruppen. Die Ergebnisse sind in Abb. 5 dargestellt.

Aldosteron Spironolakton

• •

•

•

•

•

•

•

•

•

• •

Abb. 2. Einfluß von Aldosteron (3 mg/kg i.p.) bzw. Spironolakton (30 mg/kg i.p.) auf die renale Ausscheidung von Natrium während der 4. Std. nach Applikation bei 5 bis 33 Tage alten Ratten. Unter den Kolumnen ist angegeben, ob Aldosteron bzw. Spironolakton die Natrium-Ausscheidung gegenüber Kontrollen signifikant verändert ( • für p < 0,05]^ • Kontrollen; • Aldosteron; l\\] Spironolakton

Altersabhängige Aldosteron/Spironolaktonwirkung

Aldosteron Spironolakton

77

33Alter[Tage] •

Abb. 3- Einfluß von Aldosteron bzw. Spironolakton auf die renale Ausscheidung von Kalium während der 4. Std. nach Applikation im Vergleich zu Kontrollen. Siehe Legende zu Abb. 2

Spironolakton

•

•

•

•

•

•

•

Abb. 4. Veränderung der Natrium-Kalium-Quotienten durch Aldosteron bzw. Spironolakton während der 4. Std. nach Applikation im Vergleich zu Kontrollen. Siehe Legende zu Abb. 2 Diskussion

Durch die gleichzeitige Bestimmung einer Vielzahl von Ionen erlauben die vorliegenden Untersuchungen neue Aussagen zum Wirkungsmechanismus des Aldosterons. Ferner läßt sich zeigen, daß spezifische Aldosteronantagonisten und auch zugeführtes Aldosteron bereits bei 5 Tage alten Ratten wirksam sind. Es ist überraschend, daß die renale Ausscheidung von Natrium durch Aldosteron und Spironolakton wesentlich mehr verändert wird als die H-Ionen-

78

H . BRÄUNLICH, L .

Aldosteron Spironolakton

•

•

KERSTEN

•

•

•

•

• •

Abb. 5. Einfluß von Aldosteron bzw. Spironolakton auf die renale Ausscheidung von Wasser während der 4. Std. nach Applikation; Vergleich mit Kontrollen. Siehe Legende zu Abb. 2

und Kalium-Ausscheidung. Geht man davon aus, daß die Verbindungen den Austausch von Natrium gegen H-Ionen und Kalium beeinflussen [7, 8], so müßte die renale Ausscheidung von H-Ionen und Kalium durch Aldosteron und Spironolakton im gleichen Umfang verändert werden wie die renale Natrium-Ausscheidung. Das trifft jedoch nicht zu. Auch andere Autoren haben bereits darauf hingewiesen [9—12]. Nach H E R K E N [13] kann kein direkter Zusammenhang zwischen der Beeinflussung der Ausscheidung von Natrium und von Kalium durch Aldosteron bestehen. H I E R H O L Z E R et al. [14] haben bei Mikropunktionsuntersuchungen nachweisen können, daß Aldosteron die Permeabilität für Natrium in allen Tubulusabschnitten und unabhängig von der Beeinflussung des Austauschmechanismus zu steigern vermag. Nach den vorliegenden eigenen Untersuchungen ist auf Grund der Veränderungen der renalen Ausscheidung von Natrium einerseits und von H-Ionen und Kalium andererseits eine Veränderung der Permeabilität der Tubuli für Natrium durch die beiden Verbindungen anzunehmen. Die Wirkungen von Aldosteron und Spironolakton können nur zum Teil auf eine Beeinflussung des Ionenaustauschs zurückgeführt werden. Zu diesem Ergebnis kamen auch S T U M P E und O C H W A D T [ 1 5 ] , die Aldosteroneffekte im Bereich des proximalen Tubulus bei Ratten feststellen konnten. Durch Aldosteron und Spironolakton wird auch die renale Wasser-Ausscheidung beeinflußt. Dabei haben die Veränderungen der renalen Wasser-Ausscheidung unter dem Einfluß dieser Stoffe ein geringeres Ausmaß als die

Altersabhängige Aldosteron/Spironolaktonwirkung

79

Veränderungen der Natrium-Ausscheidung. Es ist denkbar, daß die Veränderungen der Permeabilität für Wasser durch diese Stoffe unabhängig von deren Einfluß auf die renalen Austauschvorgänge für Ionen zustande kommen. Zugeführtes Aldosteron und Spironolakton sind auch bei jungen Ratten wirksam. Unter den gegebenen Versuchsbedingungen findet ein sehr intensiver aldosteronabhängiger Austausch von Natrium gegen H-Ionen und Kalium statt (siehe [1]). Deshalb kann die Wirkung des körpereigenen, freigesetzten Aldosterons durch Aldosteronzufuhr nicht wesentlich gesteigert werden. Das trifft auch für neugeborene Ratten zu. Der spezifische Aldosteronantagonist Spironolakton ist unter den gegebenen Bedingungen erwartungsgemäß weit wirksamer als zugeführtes Aldosteron. Die beträchtliche Zunahme der renalen Ausscheidung von Natrium und Wasser bei jungen Ratten nach Gabe von Spironolakton spricht dafür, daß auch bei 5 Tage alten Ratten bereits Aldosteron gebildet wird und wirksam ist, weil der spezifische Antagonist Spironolakton nur unter dieser Voraussetzung die Harnzusammensetzung verändern kann. Die renale Wirksamkeit zugeführten Aldosterons bei neugeborenen Ratten konnte bereits nachgewiesen werden [3]. A L E X A N D E R und GRIMASON [4] sowie B E N T L E Y [ 3 ] kamen auf Grund ihrer Untersuchungen zu der Feststellung, daß spezifische Aldosteronantagonisten bei der Ratte erst nach dem 12. Lebenstag wirksam sind. Die genannten Autoren haben die Tiere nicht mit Flüssigkeit belastet und konnten die äußerst geringen Harnvolumina bei jungen Tieren nicht messen. Es werden lediglich Veränderungen der Natrium-Kalium-Relation in den Harnproben angegeben, die geringer sind als in den vorliegenden eigenen Versuchen. Wir konnten den Nachweis einer gesteigerten renalen NatriumAusscheidung neugeborener Ratten nach Spironolakton erbringen. Durch die Belastung der Tiere mit NaCl-Lösung waren gute Voraussetzungen zum Nachweis einer Steigerung der renalen Natrium-Ausscheidung durch Spironolakton gegeben. B E N T L E Y [ 3 ] sowie A L E X A N D E R und GRIMASON [4] haben ferner die altersabhängigen Unterschiede hinsichtlich der Geschwindigkeit des Wirkungseintritts von Spironolakton nicht berücksichtigt. Spironolakton wird bei neugeborenen Ratten später wirksam als bei älteren Tieren. Da Spironolakton durch tubuläre Sekretion ausgeschieden wird und ein Zusammenhang zwischen tubulärer Sekretionsfähigkeit und Wirksamkeit wahrscheinlich ist [13], könnte der langsame Eintritt der SpironolaktonWirkung bei jungen Ratten auf einer ungenügenden Entwicklung der tubulären Sekretionsfähigkeit beruhen. Bei einer Anzahl von Diuretika besteht ein Zusammenhang zwischen altersabhängigen Wirkungsunterschieden und der Geschwindigkeit der renalen Ausscheidung [16]. Wenn auf Grund der Wirksamkeit von Spironolakton bei 5 Tage alten Ratten angenommen werden muß, daß in diesem Lebensalter bereits Aldosteron gebildet wird und wirksam ist, so muß die bestehende Unreife der hormo-

80

H . BRÄUNLICH, L . K E R S T E N

nellen Regulation des Ionenaustauschs bei neugeborenen und jungen Ratten andere Ursachen haben. Am wahrscheinlichsten ist eine noch mangelhafte funktionelle Reife des von K R Ü C K [ 1 7 ] nachgewiesenen natriuretischen Prinzips (siehe [2]). Für technische Mitarbeit danken wir Frl. R E N A T E P R E U S S . Literatur M., W . Z E N K , L. K E R S T E N U. H . BRÄUNLICH: Acta biol. med. germ. 23, 493 (1969) BRÄUNLICH H . U. L. K E R S T E N : Acta biol. med. germ. 27, 149 (1971) BENTLEY, P. J . : J . Endoer. 26, 361 (1963) ALEXANDER, F. u. P. GRIMASON: Br. J . exp. Path. 48, 540 ( 1 9 6 7 ) RICHTERICH, R . , J. P. COLOMBO U. H . W E B E R : Ärztl. Lab. 8, 259 (1962)

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Anschrift des Verfassers : Doz. Dr. H . BRÄUNLICH, Bereich Medizin der Universität Jena, Institut für Pharmakologie und Toxikologie, D D R 69 Jena, Zentraler Platz. Summary H . BRAEUNLICH and L. K E R S T E N : Renal effects of aldosterone and spironolactone in r a t s of different age The effects of aldosterone and spironolactone upon renal excretion of water and ions was investigated in rats aged 5 to 33 days. Spironolactone is effective in r a t s of all age groups, however the effects starts slower in 5 to 20-day-old animals t h a n in adults. Aldosterone too is effective in all age groups. Aldosterone and spironolactone predominantly cause changes of renal excretion of sodium and water and increase the sodium/potassium quotient as compared to controls. Consistently with the findings of other authors aldosterone and spironolactone have little effects on renal excretion of potassium and hydrogen ions. Possible causes of the contradicting results about the effectiveness of specif ic aldosterone antagonists in young rats are pointed out.

Acta biol. med. germ., Band 28, Seite 81 - 88 (1972) Aus dem Institut für Diabetes „Gerhardt K a t s c h " Karlsburg (Direktor: Prof. Dr. med. habil. H . B I B E R G E I L ) , Bereich Experimentelle Diabetesforschung (Leiter: Doz. Dr. med. habil. Dr. rer. nat. H . F I E D L E R ) , D D R — 2201 Karlsburg

Die Insulinwirkung auf die transmembrane Glukosebilanz des isolierten, perfundierten Rattenherzen V. Aufnahme von Glukose bei gleichzeitigem Galaktoseausstrom U . FISCHER

unter technischer Mitarbeit von E.

FISCHER, K . BRÜLLKE

und

H . SCHRÖDER

(Eingegangen am 1. 3. 1971) Zusammenfassung Isolierte Rattenherzen wurden 20 min mit einem galaktosehaltigen Medium perfundiert. In einer darauf folgenden lOminütigen Perfusionsperiode mit galaktosefreiem Medium wurde den Präparaten 0—25 mM Glukose angeboten. Der Glukoseeinstrom steigert den Galaktoseausstrom, ebenso wie die Glukoseaufnahme durch den Galaktoseausstrom erhöht wird. Die Raten werden durch Anwesenheit von Insulin zusätzlich gesteigert. Die Befunde werden als Ausdruck einer kompetitiven Stimulation zwischen den beiden Monosacchariden gedeutet und im Rahmen der Carrier-Hypothese des Membrantransports diskutiert. Einleitung

In einer vorangegangenen Mitteilung [1] konnten wir nachweisen, daß am isolierten perfundierten Rattenherzen der Nettoeinwärtstransport von Glukose durch Galaktose kompetitiv gehemmt wird, und daß umgekehrt auch die Galaktoseaufnahme in Anwesenheit von Glukose vermindert ist. Unter Insulineinfluß fand sich darüberhinaus in Gegenwart einer niedrigen Glukosekonzentration eine Steigerung der Galaktoseaufnahme. Ausgehend von der Carrier-Hypothese des Zuckermembrantransports und der bidirektionalen Wirksamkeit des Carriers [2, 3] sowie der Vermutung, daß beide Monosaccharide dasselbe Transportsystem benutzen, aber eine unterschiedliche Affinität zu ihm haben [4, 5], wurde der letztgenannte Befund als Ausdruck einer kompetitiven Beschleunigung [6] gedeutet, die erst infolge des durch Insulin bedingten Anstiegs der Membrantransportkapazität [7] meßbar wird. Für diese Schlußfolgerung werden mit den vorliegenden Experimenten weitere Beweise beigebracht. 6

Acta biol. med. germ., Bd. 28, Heft 1

82

U . FISCHER

Methodik Es wurden isolierte Herzen weiblicher Wistar-Ratten (170—200 g Körpergewicht, 12 Std. Nahrungskarenz) eigener Inzucht (Stamm Jena-Karlsburg) ohne Rezirkulation mit Krebs-Henseleit-HC0 3 -Puffer bei 37 °C perfundiert. Die Experimente fanden von Juni bis September 1970 statt. Haltungsbedingungen der Tiere, Präparation der Herzen, Perfusionsapparatur und -medium sowie Insulinzugabe (lOfach rekristallisiertes Rinderinsulin NOVO, Charge 016666, 4 • 10" 8 g/ml = 1 mE/ml) 1 sind in [8] im einzelnen beschrieben. Die Anordnung wurde insofern geändert, als die Präparate in einer ersten Perfusionsperiode mit Galaktose „überschwemmt" wurden. In der nachfolgenden Hauptperfusionsphase mit galaktosefreiem Medium verläßt dieser Zucker die Zellen wieder. Die Charakteristik des Vorganges weist auf einen Carrier-Transport hin, er ist durch Insulin stimulierbar [9], Zur Überprüfung der gegenseitigen Beeinflussung von Glukose- und Galaktosetransport wurden in dieser Phase dem Medium wahlweise verschiedene Glukosekonzentrationen zugefügt. Es befinden sich so auf der einen Membranseite (innen) Galaktose und auf der anderen (außen) Glukose, und die Transportvorgänge für beide Zucker (Ausstrom bzw. Abhub) sind gleichzeitig beurteilbar. An osmotisch wirksamen Substanzen (außer Ionen) enthielten das Perfusionsmedium I 30,0 mM Galaktose oder Saccharose und das Hauptperfusionsmedium 30,0 mM Saccharose oder 5,0, 15,0 bzw. 25,0 mM Glukose unter Ergänzung auf 30,0 mM mit Saccharose. Gemessen bzw. errechnet wurden Galaktoseausstrom und Glukoseaufnahme bezogen auf Trockengewicht (TG [8]) in der 1. 2., 3-, 4., 5- + 6., 7- + 8. und 9. + 10. min durch Multiplikation des Perfusionsvolumens (4—10 ml/min) mit der Konzentrationsdifferenz [9]Die verwendeten Analysenverfahren sind in [1] und [9] beschrieben. Zur Galaktosebestimmung wurde neben Galaktosedehydrogenase „Boehringer" (E.C. 1.1.1.48, optischer Test [10, 11]) in einigen Experimenten Galaktoseoxidase „Worthington" (E.C. I.I.3.9., kolorimetrisch mit Peroxidase und o-Toluidin [12, 13]) eingesetzt. Die Gewebekonzentration an Glukose und Galaktose wurden unter Verwendung des Gefrierstopfverfahrens [14] nach [1] bestimmt. Rechnerisch wurde der Glukoseverteilungsraum [% des Frischgewichts] und die mittlere Gewebegalaktosekonzentration in der 2. bis 4. min der Hauptperfusion [9] ermittelt. Für alle Größen sind í ¿ j j angegeben. Die statistische Auswertung erfolgte mit dem /-Test, dem Rang-Test nach W I L C O X O N sowie der Regressionsrechnung unter Zugrundelegung einer Irrtumswahrscheinlichkeit von p < 1 %. Ergebnisse Glukoseaufnahme-. A u s A b b . 1 g e h t der zeitliche Verlauf der G l u k o s e a u f n a h m e der Präparate hervor («-Zahlen s. Tab. 1). W i r w ä h l t e n 3 verschied e n e K o n z e n t r a t i o n e n ; eine sicher u n t e r h a l b d e s S ä t t i g u n g s b e r e i c h e s (5,0.mM), eine m i t t l e r e (15,0 mM) u n d eine sicher i m S ä t t i g u n g s b e r e i c h (25,0 mM) der N e t t o g l u k o s e a u f n a h m e [7]. D i e in der l . m i n g e m e s s e n e n W e r t e sind durch die „ A u f f ü l l u n g " des z u B e g i n n glukosefreien E x t r a z e l l u larraumes verfälscht. I n d e n darauf f o l g e n d e n Z e i t a b s c h n i t t e n wird ein lineares Verhalten erkennbar. F ü r alle Versuchsgruppen — m i t u n d o h n e gleichzeitig a b l a u f e n d e n G a l a k t o s e a u s s t r o m — steigert Insulin d e n Glukose1

Herrn Dr. O. JACOBI, Mainz, Firma NOVO-Industrie, danken wir für die großzügige Überlassung von Versuchsmengen dieser Insulin-Charge.

Insulinwirkung am Rattenherzen. V. GLUKOSE AUFNAHME

83

[lO" 6 Mol /100 mg TG~]

Abb. 1. Zeitlicher Ablauf der Glukoseaufnahme isolierter perfundierter Rattenherzen ohne Rezirkulation mit (schwarze Symbole) und ohne (weiße Symbole) Zugabe von 4 • 1CT8 g Insulin/ml. Auf summierung der in 1- bzw. 2-min-Abständen gemessenen Werte. Angebot unterschiedlicher extrazellulärer Glukosekonzentrationen bei Präparaten ohne (o, • ) und mit (A, • ) gleichzeitig ablaufenden Galaktoseausstrom. nZahlen und Streubreite s. Tab. 1, Erläuterungen im Text

einstrom in die Zellen, der Effekt deutet sich spätestens in der 3- min an. Während bei geringem extrazellulärem Glukoseangebot der Verbrauch durch die Bewegung von Galaktose in entgegengesetzter Richtung offenbar nicht beeinflußt wird, zeigt sich unter Sättigungsverhältnissen schon ohne Insulin eine gesteigerte Glukosetransportrate, die durch Insulin weiter erhöht wird. Die Streubreiten dieser Befunde sind sehr groß (vgl. Tab. 1). Das ergibt sich aus den infolge fehlender Rezirkulation des Mediums außerordentlich geringen Konzentrationsdifferenzen. Sie liegen bei einem Teil der Präparate einer jeden Gruppe im Streubereich der Analysenmethode und lassen so eine Glukoseaufnahme von 0 resultieren. Dadurch ist es nicht möglich, die gefundenen Differenzen mit der geforderten Wahrscheinlichkeit zu belegen (für die Insulineffekte und für die Auswirkung des gleichzeitigen Galaktosetransports bei 25,0 mM Glukose sind sie durch p < 5% ausgewiesen). Die von der 2. bis 10. min summierten Werte des Glukoseabhubs sind in der 5. Spalte von Tab. 1 im einzelnen angegeben. 6»

84

U . FISCHER

Tabelle 1 Glukoseaufnahme und Glukoseverteilungsraum in isolierten ohne Rezirkulation perfundierten Rattenherzen mit und ohne gleichzeitig ablaufendem Galaktoseausstrom bei unterschiedlichem extrazellulärem Glukoseangebot sowie mit und ohne Zugabe von 4 • 1CT8 g Insulin/ml Glukose im Medium [mM]

Galaktoseausstrom 0

5,0

+ 0

15,0

+ 0

25,0

_L 1

Glukoseaufnahme Glukoseverteilungs2. —10. min raum [10-® Mol/100 mg TG] [% FG]

Insulin

n

0

5 6 8 6

1,81 4,83 2,45 5,52

± ± ± ±

1,32 1,39 0,98 0,93

40,8 55,6 39,8 53,1

6 6 7 8

1,67 4,11 3,88 8,52

± ± ± ±

0,92 1,26 2,44 1,43

46,7 61,2 43,5 56,6

± ± ± ±

2,1 4.7 1 0,4 2.6 1

7 5 6 5

3,04 7,06 6,33 13,83

± ± ± ±

1,09 1,10 1,22 5,67

51,2 64,4 57,3 70,2

± ± ± ±

0,5 3 l.l1 2,0V 2,3 1 - 3

+

0

+ 0

+

0

+

0

+

0

+

± 0,1

± 6.21

± 3,3 ± 3.2 1

1

= p < 1% für Insulineffekt; = p < 1 % für Einfluß des Galaktoseausstroms; 3 = p < 1 % für Vergleich mit der korrespondierenden Gruppe unter 5,0 mM Glukose. Für Effekte von Insulin und/oder Galaktoseausstrom auf Glukoseaufnahme innerhalb der Gruppe p > 1%. 2

Die Angaben für den Glukoseverteilungsraum sind in der 6. Spalte der Tab. 1 enthalten. Das Verhalten in Abhängigkeit vom Glukoseangebot sowie die signifikante Steigerung unter Insulineinfluß bestätigen unsere bereits publizierten Befunde [1], Der gleichzeitig ablaufende Galaktoseauswärtstransport beeinflußt mit und ohne Insulin bei den beiden niedrigeren Konzentrationsstufen den Glukoseverteilungsraum noch nicht. Erst unter sehr hohem im Sättigungsbereich liegendem Glukoseangebot kommt es zu einer so großen Glukoseaufnahme und ihrer Ansammlung in freier intrazellulärer Form, daß es mit der von uns gewählten Methodik nachweisbar ist. Galaktoseauswärtstransport

unter Einwirkung

von Glukose:

Nach Abb. 2

verläßt die Galaktose den Intrazellularraum in exponentiell abfallenden Mengen. In der l . m i n wurden exzessive Werte gemessen (12,23 ± 1,19 • 10-® Mol/100 mg TG für alle Kontrollen, 14,32 ± 1,25 • 10"6 Mol/100 mg TG für alle Insulin-beeinflußten Präparate), was vorwiegend auf den Auswascheffekt des Extrazellularraumes zurückzuführen ist. Die gleichzeitige Bewegung von Glukose in der Gegenrichtung bewirkt schon in Abwesenheit von Insulin eine Steigerung der Galaktosetransportrate, die vom Glukoseangebot abhängig ist.

Insulinwirkung am Rattenherzen. V.

85

Abb. 2. Galaktoseausstrom aus isolierten perfundierten Rattenherzen ohne Rezirkulation nach 20minütiger Präperfusion mit 30,0 mM Galaktose mit (rechts) u n d ohne (links) Zugabe von 4 • 10~8 g Insulin/ml bei gleichzeitigem Angebot unterschiedlicher extrazellulärer Glukosekonzentrationen: o = 0 mM, • = 5,0 mM, A = 15,0 mM, • = 25,0 mM. M-Zahlen s. Tab. 2; die W e r t e f ü r s* sind bei fehlender Angabe in der P u n k t g r ö ß e enthalten; Befunde f ü r Gewebegalaktose und Ausstrom in der l . min s. T e x t Tabelle 2 Galaktoseausstrom aus isolierten, ohne Rezirkulation perfundierten Rattenherzen nach Präperfusion mit 30,0 mM Galaktose m i t und ohne gleichzeitig ablaufende Glukoseaufnahme in Anwesenheit u n d in Abwesenheit von 4 • 10" 8 g Insulin/ml Glukose im Medium [mM]

Insulin

0

+

5,0 15,0 25,0

Galaktoseausstrom [10" 6 Mol/100 mg TG1

n

2 . - 4 . min 0

11 8

0

8 6

0

9 9 6 6

+ + 0

+

2,65 4,99 4,67 6,80

± ± ± ±

0,21 0,38 l 0,35 2 0,39 1,2

4,29 ± 0,53 2 5,50 ± 0,40 8,64 ± 0,86 2 ' 3 12,30 ± 1.44 1 ' 2 ' 3

5. —10. min 1,70 1,50 2,21 1,73 2,08 1,98

± ± ± ± ± ±

0,37 0,26 0,34 0,25 0,37 0,50

4,89 ± 0,682>s 5,63 ± 1,072-3

1 = p < \ % f ü r Insulineffekt; 2 = p 1% (KontrolMoi/ioomgTG] l e n ) _ f ü r Unterschied des Anstieges beider Funktionen gilt p > 1 %

Unter der durch das Hormon bewirkten Vergrößerung der Carrier-Kapazität kommt dieses Phänomen noch deutlicher zum Ausdruck. Aussagekräftig sind diese Unterschiede nur in der 2.—4. min, wenn im Gewebe offenbar noch Galaktosekonzentrationen oberhalb des Sättigungsbereiches vorliegen [9], In Tab. 2 ist daher eine differenzierte Auswertung vorgenommen. Die Galaktosetransportrate wird in diesem Zeitabschnitt ohne Insulin durch den gleichzeitig in Gegenrichtung ablaufenden Glukosetransport stimuliert. Die Anwesenheit des Hormons bewirkt eine zusätzliche Steigerung. Die errechnete Gewebegalaktosekonzentration war in diesem Zeitraum für alle Versuchsgruppen gleich (13,94 ± 1,09 (Kontrollen) bzw. 13,49 ± 1,73 • 10 -6 Mol/g FG (Insulin)). Unter den gewählten Versuchsbedingungen ohne Rezirkulation mit Minutenvolumina von 4—10 ml bei Herzfrischgewichten zwischen 550 und 650 mg (errechnet nach [8]) glauben wir, einen Wiedereinstrom der Galaktose bzw. Wiederausstrom der Glukose quantitativ vernachlässigen zu können, da das in einer Richtung bestehende Konzentrationsgefälle für das jeweilige Monosaccharid kontinuierlich aufrechterhalten bzw. an jeder Zelle in sehr kleinen Zeiträumen wieder aufgebaut wird. Korrelation von Glukose- und Galaktose-Transportraten: Unter Einbeziehung der Präparate ohne Glukoseangebot, d. h. ohne gleichzeitigen Glukosetransport haben wir die gegenseitige Abhängigkeit von Galaktose- und GlukoseTransportraten überprüft (s. Abb. 3). Dabei sind nur solche Herzen in die Auswertung einbezogen, bei denen in jeder Einzelprobe (2., 3-, 4. min) eine Glukoseaufnahme tatsächlich meßbar war, woraus sich im Verhältnis zu den Werten in Tab. 1 abweichende «-Zahlen ergeben. Für die insulinstimulierten Herzen ist in dieser Auswertung eine signifikante Steigerung der Galaktosetransportrate mit ansteigenden Glukoseverbrauch nachweisbar. Bei den Kontrollpräparaten läßt sich diese Beziehung nicht mit der geforderten Wahrscheinlichkeit belegen. Auch ist der Unterschied beider Regressionen insignifikant.

I n s u l i n w i r k u n g a m R a t t e n h e r z e n . V.

87

Diskussion

Die bisher von verschiedenen Arbeitsgruppen vorgelegten Befunde stimmen mit einer Gültigkeit der Carrier-Hypothese des Membrantransports von Monosacchariden in der quergestreiften und Herzmuskulatur überein [15 bis 18]. Kompetitive Hemmung und kompetitive Stimulation zwischen Substraten, die dasselbe Transportsystem benutzen, sind wesentliche Charakteristika dieses Carrier-Transports [6]. Er unterliegt einer Sättigung [16]. Insulin steigert die maximale Kapazität des Systems [7]. Seit den Untersuchungen der Arbeitsgruppen um LEVINE [19], FISHER [4, 5] und WATERMAN [20] liegt die Vermutung nahe, daß Glukose und die nicht verstoffwechselbare Galaktose über denselben Carrier zwischen Extra- und Intrazellularraum befördert werden. Unsere früheren Befunde [1] bestätigen das durch den Nachweis einer kompetitiven Hemmung und unter Insulineinfluß auch einer kompetitiven Stimulation zwischen beiden Monosacchariden. Die vorgelegten Untersuchungen weisen dieses Phänomen für die Beeinflussung des Galaktosetransports durch die Glukoseaufnahme an nicht durch exogenes Insulin stimulierten Präparaten nach. Unter Einwirkung von Insulin wird es unter zusätzlicher Ausprägung der Transportsteigerung, die durch das Hormon hervorgerufen wird, erkennbar. Nach Gabe von Insulin ließ sich auch eine Stimulierung der Glukoseaufnahme durch die Galaktosebewegung zeigen. Diese Befundkonstellation läßt die Schlußfolgerung zu, daß der Insulineffekt nicht auf demselben Wege wirksam wird, wie die kompetitive Stimulation, nämlich einer beschleunigten Bewegung des Carrier-Moleküls durch Vergrößerung des transmembranen Gradienten (in der einen Richtung für den Carrier-Glukose-Komplex und in der anderen Richtung für den CarrierGalaktose-Komplex). Es scheint vielmehr, daß das Hormon Bindungsstellen am Carrier oder ganze Carrier-Mojeküle zusätzlich für das Substrat frei macht, sei es durch Dephosphorylierung im Sinne von RÄNDLE [21] oder durch Angriff an Sulfhydrylgruppen [22, 23]. Literatur [1] F I S C H E R , U . : A c t a biol. med. germ. 2 7 , 1 ( 1 9 7 1 ) [2] WILBRANDT, W . : F o l i a h a e m a t . Lpz. 83, 85 (1965) [3] S C H O F F E N I E L S , E . : Cellular aspects of m e m b r a n e p e r m e a b i l i t y . P e r g a m o n Press, Oxford 1967 [ 4 ] B R O N K , M . S. U. R . B . F I S H E R : J . Physiol., L o n d . 136, 4 3 5 ( 1 9 5 7 ) [ 5 ] F I S H E R , R . B . U. D . B . L I N D S A Y : J . Physiol., L o n d . 1 3 1 , 5 2 6 ( 1 9 5 6 ) [6] W I L B R A N D T , W . : Z u c k e r t r a n s p o r t e . I n : Biochemie des a k t i v e n T r a n s p o r t s . 12. Mosbacher Colloquium 1961. Springer, Berlin, Göttingen, Heidelberg 1961, S. 1 1 2 [7] FISCHER, U . : A c t a biol. med. germ. 26, 87 (1970) [8] FISCHER, U . : A c t a biol. m e d . germ. 25, 89 (1970) [9] F I S C H E R , U . : A c t a biol. med. germ. (im D r u c k ) [ 1 0 ] H J E L M , M. u. B. T E N G S T R Ö M : Biochem. Med. 2, 1 7 4 ( 1 9 6 8 )

88

U . FISCHER

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399 (I960)

12, 5 0 9 ( 1 9 6 5 ) ges. Physiol. 270,

[ 1 5 ] P A R K , C . R . , H . E . MORGAN, M . J . H E N D E R S O N , D . M . R E G E N , E . C A D E N A S U . R . L . P O S T : Recent Prog. Horm. Res. 1 7 , 493 ( 1 9 6 1 ) [ 1 6 ] M O R G A N , H . E., M . J . H E N D E R S O N , D. M . R E G E N U. C . R . P A R K ; J . biol. Chem. 236, 253 (1961) [ 1 7 ] M O R G A N , H . E . , D . M . R E G E N U. C. R . P A R K : J . biol. Chem. 239, 3 6 9 ( 1 9 6 4 ) [ 1 8 ] C H A U D R Y , I. H . u. M . K . G O U L D : Biochim. biophys. Acta 177, 5 2 7 ( 1 9 6 9 ) [ 1 9 ] L E V I N E , R . , M. G O L D S T E I N , S. K L E I N U. B . H U D D L E S T U N : J . biol. Chem. 179, 9 8 5

(1949)

[ 2 0 ] W A T E R M A N , F . K . U. G . H E T E N Y I JR. : Scand. J . Physiol. Pharmac. 44, 9 2 3 ( 1 9 6 6 ) [ 2 1 ] R A N D L E , P. J . : A. Rev. Physiol. 2 5 , 2 9 1 (1963) [22] E B O U E - B O N I S , D., A. M. C H A M B A U T , P. V O L F I N U. H. C L A U S E R : Bull. Soc. Chim.

biol. 49, 415 (1967)

[ 2 3 ] MORGAN, H . E . , J . R . N E E L Y , R . E . W O O D , C . LIEBECQ, H . L I E B E R M E I S T E R C. R. P A R K : Fedn Proc. Fedn Am. Socs exp. Biol. 24, 1040 (1965)

U.

Summary U. F I S C H E R with technical assistance of E. F I S C H E R , K. B R U E L L K E and H . S C H R O E DER : Action of insulin upon transmembraneous glucose balance of the isolated perfused rat heart. Y. Uptake of glucose with simultaneous efflux of galactose Isolated rat hearts were perfused for 20 min with a galactose-containing medium. During subsequent 10 min perfusion with galactose-free medium 0 to 25 mM glucose was added. Glucose influx was found to increase the efflux of galactose in the same way as galactose efflux is increased b y glucose uptake. The rates are additionally increased by the presence of insulin. The results are interpreted as expressing a competitive stimulation between the two monosaccharides and are discussed in terms of the carrier hypothesis of membrane transport.

Acta biol. med. germ., Band 28, Seite 89—98 (1972) Aus dem Institut für Pharmakologie und Toxikologie der Friedrich-Schiller-Universität J e n a (Direktor: Prof. Dr. H . A N K E R M A N N )

Die Entwicklung der renalen Ausscheidung von Natrium und Kalium in der postnatalen Periode bei der Ratte H . BRÄUNLICH u n d R . PUSCHMANN

(Eingegangen am 6. 5- 1971)

Zusammenfassung Die wiederholte Belastung mit NaCl-Lösung beschleunigt die Entwicklung der renalen Ausscheidungsfähigkeit f ü r Natrium in der postnatalen Periode beträchtlich. Die Steigerung der Natrium-Ausscheidung ist mit einer Erhöhung der Natriumkonzentration im H a r n verbunden. Zugleich scheiden diese Tiere weniger Kalium aus als Kontrolltiere. Es ist wahrscheinlich, daß die wiederholte Belastung mit NaCl-Lösung zu einer beschleunigten Entwicklung der hormonellen Regulation des Ionenaustauschs führt. Kalium ist für junge R a t t e n toxischer als f ü r erwachsene. Die altersabhängigen Unterschiede hinsichtlich der Toxizität von Kalium lassen sich durch die Altersabhängigkeit der renalen Kalium-Ausscheidung erklären: Junge R a t t e n scheiden bei Belastung mit KCl-Lösung im Versuchszeitraum weniger Kalium aus als erwachsene Tiere. Einleitung

Untersuchungen über die renale Ausscheidung von Wasser und Ionen bei Ratten verschiedenen Alters haben gezeigt, daß 5 und 15 Tage alte Ratten bezogen auf das Körpergewicht weniger Natrium ausscheiden als erwachsene Tiere. Das ist auch nach Zufuhr von NaCl-Lösung der Fall [1 —33- Es wurde die Entwicklung der renalen Natrium-Ausscheidung in der Periode bis zum 33. Lebenstag untersucht und geprüft, welchen Einfluß die wiederholte Belastung mit NaCl-Lösung auf die Entwicklung der renalen Ausscheidungsfähigkeit für Natrium hat. Bei Zufuhr von Kalium erfolgt dessen renale Ausscheidung durch einen aktiven Sekretionsmechanismus [4]. Altersunterschiede hinsichtlich Toxizität und renaler Ausscheidung von Kalium sind zu erwarten, sofern der Mechanismus der aktiven tubulären Sekretion von Kalium in der postnatalen Periode noch nicht voll entwickelt ist. Es wurde die Toxizität und die renale Ausscheidung von Kalium bei 5 bis 240 Tage alten Ratten untersucht.

90

H . BRÄUNLICH, R .

PUSCHMANN

Methodik Versuchstiere Es wurden Wistar-Ratten (Jena) eigener Koloniezucht verwendet. Während der Harnsammelperioden befanden sich die Ratten in den früher beschriebenen Diurese-Käfigen [1]. Während dieser Zeit waren die Jungtiere von den Muttertieren getrennt. Die Tiere wurden mit Standardfutter ernährt (Arbeitsgruppe für Yersuchstierzucht Berlin) und erhielten Wasser ad libitum. Bestimmungsmethoden Die ausgeschiedene Harnmenge wurde volumetrisch ermittelt. Die Bestimmung von Natrium und Kalium im H a r n erfolgte mit dem Flammenphotometer. Da die Kaliumbestimiuung durch den Natriumgehalt der Proben gestört wird, sind die angegebenen Kalium-Werte entsprechend korrigiert [1], Versuchsablauf U n t e r s u c h u n g e n bei N a t r i u m - B e l a s t u n g Die renale Ausscheidung von Wasser, Natrium und Kalium wurde bei 5 bis 7 Tage alten R a t t e n sowie bei 15 bis 33 Tage alten Ratten bestimmt. K o n t r o l l e n : Unbehandelte Ratten, bei denen täglich die renale Ausscheidung von Wasser, Natrium und Kalium während 3 aufeinanderfolgender 1 stündiger Sammelperioden bestimmt wurde. E i n m a l i g e B e l a s t u n g : Tiere erhielten einmalig und erstmalig am 5- bis 7. sowie in einer weiteren Versuchsgruppe am 15- 17-, 19- und weiter jeden 2. Tag bis zum 33. Lebenstag zu Beginn des 3stündigen Diurese-Versuchs 20 ml/100 ml E Z R 0,9%ige NaClLösung i.p. W i e d e r h o l t e B e l a s t u n g : Die R a t t e n erhielten vom 5. bis zum 7. Lebenstag bzw. in einer weiteren Gruppe vom 1 5. bis 33. Lebenstag jeden Tag zu Beginn des 3stündigen Diurese-Versuchs erneut 20 ml/100 ml E Z R 0,9%ige NaCl-Lösung i.p. appliziert. U n t e r s u c h u n g e n bei K a l i u m - B e l a s t u n g K a l i u m - T o x i z i t ä t : Für R a t t e n der verschiedenen Altersgruppen wurde die akute Toxizität von Kalium bestimmt. Um die erforderlichen Kalium-Mengen zuführen zu können, wurde KCl in einer schwach hypertonen Lösung (l,75%ig) i.p. gegeben. In einer weiteren Versuchsserie wurde ein subletale KCl-Dosis (500 mg/kg i.p.) im Abstand von 2 Std. wiederholt appliziert und die Mortalitätsrate bei verschieden alten R a t t e n in Abhängigkeit von der Zahl der zugeführten Dosen bestimmt. Ferner wurde für Ratten aller Altersgruppen jenes Zeitintervall bestimmt, in dem die Wiederholung der Applikation einer subletalen KCl-Dosis (500 mg/kg i.p.) bei 50% der Tiere zum Tod führt. K a l i u m - A u s s c h e i d u n g : Bei 5 bis 240 Tage alten R a t t e n wurde die renale KaliumAusscheidung nach i.p. Zufuhr von 500 mg/kg KCl während eines 5stündigen DiureseVersuchs gemessen. Darstellung der Ergebnisse, statistische

Bearbeitung

Die Konzentrationsangaben erfolgen in mval/1. Die ausgeschiedenen Mengen an Wasser, Natrium und Kalium sind in ml bzw. mval/100 g KG angegeben. E s wurden arithmetische Mittelwerte mit Standardfehler berechnet; Signifikanzprüfungen erfolgten nach dem ¿-Test. Unterschiede bei p Si 0,05 werden als signifikant bezeichnet. Die mittleren effektiven Dosen bei der Bestimmung der Kalium-Toxizität wurden nach der Methode von L I T C H F I E L D und W I L C O X O N [5] berechnet.

Entwicklung der Na + - und K + -Ausscheidung

91

Ergebnisse

Entwicklung

der

Natrium-Ausscheidung

Bei unbehandelten Kontrolltieren steigt die renal ausgeschiedene N a t r i u m Menge zwischen dem 15. und 33- Lebenstag auf das 3—4fache an (Abb. 1). Die Zufuhr von NaCl-Lösung steigert die renale Natrium-Ausscheidung altersabhängig unterschiedlich: 15 und 17 Tage alte Ratten scheiden im Versuchszeitraum nach einmaliger Belastung mit 20 ml/100 ml EZR 0,9%tiger NaCl-Lösung im Versuchszeitraum etwa die gleiche Natrium-Menge aus wie Kontrolltiere; erst nach dem 19. Lebenstag sind die im Versuchszeitraum ausgeschiedenen Mengen zwischen Kontrolltieren und erstmalig mit NaCl-Lösung belasteten Ratten signifikant unterschiedlich. Bis zum 33- Lebenstag nimmt die renale Natrium-Ausscheidung bei erstmalig belasteten Tieren weiter zu (Abb. 1). Gegenüber der einmaligen Natrium-Belastung führt die täglich wiederholte Belastung der Tiere mit NaCl-Lösung zu einer beschleunigten Entwicklung 02k

022 020 0.18 0,16

§ 0.1b

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\ 0,12

.1

§5

0,10

1 0,08 0,06 0,04 0,02 Alter

[Tage] sign.

o

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Abb. 1. Renale Natrium-Ausscheidung weiblicher Ratten am 15. bis 33. Lebenstag in Abhängigkeit von der Belastung mit NaCl-Lösung während eines 3stündigen DiureseVersuchs. • • = Kontrollen; • • = erstmalige Belastung mit 20 ml/100 ml EZR 0.9%ige NaCl-Lösung i.p. an den angegebenen Lebenstagen; • • = täglich wiederholte Gabe von 20 ml/100 ml EZR 0,9%ige NaCl-Lösung i.p. • = signifikante Unterschiede bei p gS 0,05

92

H . BRÄUNLICH, R . PUSCHMANN

der renalen Ausscheidungsfähigkeit in Abhängigkeit vom Lebensalter: Bereits nach 3 aufeinanderfolgenden Belastungen mit 0,9%iger NaClLösung scheiden die Tiere die 10—15 fache Natrium-Menge aus wie nach erstmaliger Applikation. Bei fortgesetzter Belastung bis zum 33- Lebenstag ist bereits nach der 3. Belastung am 17. Lebenstag keine weitere wesentliche Steigerung der renalen Natrium-Ausscheidung zu erzielen (Abb. 1). Bei Kontrolltieren ist zwischen dem 15. und 33. Lebenstag ein relativ gleichmäßiger Anstieg der N a t r i u m - K o n z e n t r a t i o n des Harns festzustellen. Die einmalige Belastung der verschieden alten Ratten mit NaCl-Lösung führt zu einer Steigerung der Natrium-Konzentration des Harns, die bei 15 bis 19 Tage alten Ratten noch wenig ausgeprägt ist. Bei täglicher Belastung mit NaCl-Lösung ist neben der Steigerung der renal ausgeschiedenen Natrium-Menge auch die Natrium-Konzentration des Harns gegenüber den erstmalig belasteten Tieren erhöht. Auch nach dem 20. Lebenstag ist die Natrium-Konzentration des Harns höher als bei den erstmalig belasteten Tieren, obwohl im Versuchszeitraum etwa die gleiche Natrium-Menge ausgeschieden wird. Bei wiederholter Belastung wird von den 23 bis 33 Tage alten Ratten eine relativ beträchtliche Natrium-Menge mit einer geringeren W a s s e r - Menge ausgeschieden als bei erstmalig belasteten Tieren (Tab. 1). Kontrolltiere scheiden im Versuchszeitraum mehr Kalium aus als Natrium; zwischen dem 15. und 33- Lebenstag nimmt die renale K a l i u m - A u s s c h e i d u n g kontinuierlich zu (Tab. 1). Bei einmaliger Belastung mit 0,9%iger NaCl-Lösung ist die renale Kalium-Ausscheidung der 15 bis 33 Tage alten Ratten gegenüber nicht belasteten Kontrolltieren erhöht, wobei die Unterschiede mit zunehmendem Alter der Tiere geringer werden. Die tägliche Belastung mit NaCl-Lösung führt nur in den ersten Versuchstagen zu einer gesteigerten renalen Kalium-Ausscheidung. 21 bis 33 Tage alte Ratten scheiden bei wiederholter Zufuhr von NaCl-Lösung nicht mehr Kalium aus als unbehandelte Kontrollen (Tab. 1). Untersuchungen an 5 bis 7 Tage alten Ratten haben gezeigt, daß die tägliche wiederholte Belastung mit NaCl-Lösung auch bei diesen Tieren zu einer Steigerung der renalen Natrium-Ausscheidung im Vergleich zu erstmalig belasteten Ratten führt (Tab. 2). Entwicklung

der

Kalium-Ausscheidung

L D M - W e r t e : In Tab. 3 sind die LD M -Werte für Kaliumchlorid angegeben. Kalium ist für junge Ratten toxischer als für erwachsene. Die Dosis-Wirkungs-Kurven verlaufen bei Ratten aller Altersgruppen außerordentlich steil. Die bestehenden, geringen Toxizitätsunterschiede zwischen den Altersgruppen konnten jederzeit reproduziert werden. Bei Gabe letaler Dosen sterben die Tiere spätestens 10 min nach Applikation der KCl-Lösung. W i e d e r h o l t e K a l i u m - B e l a s t u n g : 15 bis 240 Tage alte Ratten überleben die einmalige Applikation von 500 mg/kg KCl i.p. Bei den 5 Tage alten

Entwicklung der N a + - und K + -Ausscheidung

-m bo O S

13 -t-> T3 B 0 £ S> * 60 e3 Sgä £v §ù «^ 'S U 3 .g 0Cfl ^ Xfi 3 +j :rt.5 ® ;3 3 J — i •§ rt W 2 .2 | 2&"p > | j US

0,079 ± 0,006 0,100 ± 0,012 0,051 ± 0,003 0,076 ±" 0,009 0,064 ± 0,005 | 0,047 ± 0,010

T >

0,009 0,007 0,016 0,039 0,014 0,011

HWZ Harn [min] Ausscheidung in % der Zufuhr

N m N O 0O ^ 10 t^ 00 00 VO NO

0,061 ± 0,007 0,122 ± 0,005 0,197 ± 0,016 0,173 ± 0,014 0,170 ± 0,008 ! 0,121 ± 0,008

«7 S 0 >.ts0> Ol ® 'S »TS II § | 'S s>£ 2 Ö §K " ^Jj £ f .« q § gg g ¡3 'S § £ « fe g > ^ 'rt « g^ $ | ¡5 S . m ö 1-

0 0 0 0 O T- ui \o O n CH T- f) «

i ! 0,066 ± 0,004 ! 0,051 ± 0,005 0,081 ± 0,009 0,114 ± 0,011 0,078 ± 0,001 0,119 ± 0,020

Äquieffektives Applikationsi n t e r v a l l : In einer weiteren Versuchsserie wurde 5 bis 240 Tage alten Ratten 2mal 500 mg/kg KCl appliziert und jene Zeit zwischen den beiden Applikationen ermittelt, die eine 50%ige Mortalität bedingt. Von den 5 Tage alten Tieren starben 50%, wenn die 2. Applikation nach 365 min erfolgte. Bei den 105 Tage alten Ratten ist die gleiche Mortalitätsrate bei einem Applikationsintervall von 66 min nachzuweisen. Die Ergebnisse sind in Tab. 5 zusammengefaßt. Renale Kalium-Ausscheidung: Bei 5 bis 240 Tage alten Ratten wurde die renale Kalium-Ausscheidung nach Gabe von 500 mg/kg KCl während eines 5 stündigen DiureseVersuchs gemessen. Die Ergebnisse sind in Tab. 6 dargestellt. Junge Ratten scheiden pro 100 g Körpergewicht eine geringere Kalium-Menge aus als erwachsene. Insbesondere für den Zeitraum bis 120 min nach der Applikation bestehen deutliche altersabhängige Unterschiede der renal ausgeschiedenen Kalium-Mengen. Aus den Verlaufskurven der Kalium-Ausscheidung wurden Halbwertszeiten ermittelt, d. h. jene Zeit nach der Applikation von KCl, in der 50% der zugeführten KaliumMenge ausgeschieden wird (s. Tab. 6)-

g § 8 •'§ 1 « | § 2 0« »'S c k 53 ö *H § ffi

Alter [Tage]

Tieren sterben 3 von 10. Wird die genannte Kalium-Menge alle 2 Std. gegeben, so ist die Mortalitätsrate bei jungen Tieren höher als bei erwachsenen. In Tab. 4 sind die Ergebnisse der Toxizitätsbestimmungen bei wiederholter Kalium-Gabe zusammengefaßt.

95

vi m m ifl in O f ) ifl O ^

96

H . BRÄUNLICH, R .

PUSCHMANN

Diskussion

Bei Belastung mit NaCl-Lösung wird von jungen Tieren ein wesentlich kleinerer Teil der zugeführten Natrium-Menge im Versuchszeitraum ausgeschieden als von älteren Tieren. Eine langsame Resorption oder eine Einlagerung von Natrium und Wasser in die Gewebe als Ursache der relativ geringen renalen Natrium-Ausscheidung junger Ratten ließ sich ausschließen [6, 7]. Die außerordentlich rasche Entwicklung der renalen Ausscheidungsfähigkeit junger Ratten für Natrium bei täglich wiederholter Belastung mit NaCl-Lösung ist ein bemerkenswerter Befund. Dabei ist offensichtlich, daß die renale Natrium-Ausscheidung nur in einem bestimmten Umfang gesteigert werden kann. Es zeigt sich ferner, daß das Ausmaß der möglichen Steigerung vom Alter der Tiere abhängt, also offenbar vom Grad der funktionellen Reife der Niere limitiert wird: Der Effekt der wiederholten Belastung mit NaCl-Lösung ist bei 5 Tage alten Ratten weitaus geringer als bei 15 Tage alten Tieren. Es ist wenig wahrscheinlich, daß die täglich wiederholte Belastung junger Ratten mit NaCl-Lösung über eine Aufsättigung des Organismus zur gesteigerten renalen Natrium-Ausscheidung führt: Die Gewichtsentwicklung bei täglicher Belastung mitNaCl-Lösung im Vergleich zu Kontrolltieren spricht gegen eine Retention der zugeführten NaCl-Lösung. Bei fortgesetzter Belastung mit NaCl-Lösung treten Veränderungen der Harnzusammensetzung ein, die auf eine Beschleunigung der funktionellen Entwicklung der Niere schließen lassen: Erhöhung der Natrium-Konzentration im Harn und verminderter Austausch von Natrium gegen Kalium. Bei Tieren aller 3 Versuchsgruppen wurde auch der />H-Wert des Harns gemessen; die Befunde, die im Ergebnisteil nicht dargestellt wurden, sprechen gleichfalls für eine Reduzierung des Austauschs von Natrium gegen H-Ionen und Kalium bei täglich wiederholter Belastung mit NaCl-Lösung. Es gibt eine Reihe von Hinweisen darauf, daß die Regulation des Ionenaustauschs bei jungen Ratten noch nicht voll entwickelt ist: Junge Ratten bilden nur in geringem Maße Vasopressin. Das führt zur Ausscheidung eines wenig konzentrierten Harns [8, 9]- Altersabhängige Unterschiede bestehen auch hinsichtlich der Bildung und Freisetzung von Aldosteron (siehe [10]). Denkbar ist, daß die wiederholte Belastung junger Tiere mit NaClLösung die Entwicklung der genannten hormonellen Regulationsmechanismen beschleunigt. Die Steigerung der Harn-Ausscheidung bei Belastung mit NaCl-Lösung wird primär durch eine Verminderung der tubulären Reabsorption von Natrium ausgelöst. K R Ü C K [ 1 1 ] konnte nachweisen, daß dabei ein natriuretischer Faktor freigesetzt wird, der die Reabsorption von Natrium hemmt. Die geringe Fähigkeit junger Ratten zur renalen Ausscheidung zugeführten Natriums wäre mit der Annahme erklärbar, daß dieses Regulationsprinzip bei jungen Ratten noch nicht funktioniert. Die akute Toxizität von Kalium wird sicher nicht entscheidend von der Geschwindigkeit der renalen Ausscheidung beeinflußt. Die große Diskrepanz

Entwicklung der Na + - und K + -Ausscheidung

97

im Ausmaß der Toxizitätsunterschiede bei einmaliger und wiederholter Gabe ist durch die Altersunterschiede hinsichtlich der renalen Ausscheidungsfähigkeit für zugeführtes Kalium bedingt. Die Belastung mit KCl-Lösung führt zu einer gesteigerten renalen KaliumAusscheidung, die weder durch eine verminderte Reabsorption, noch durch einen verstärkten Austausch von Natrium gegen Kalium bedingt ist. Vielmehr kommt ein aktiver Sekretionsmechanismus in Gang, wobei keine Koppelung an den Natriumtransport oder an die Ausscheidung anderer Ionen besteht [4,12—15]. Die langsame Ausscheidung zugeführten Kaliums bei jungen Ratten muß durch die unvollkommene Entwicklung dieses aktiven Transportmechanismus bedingt sein. In vorangegangenen Untersuchungen wurden prinzipiell die gleichen altersabhängigen Unterschiede für die aktive renale Ausscheidung von ^-Aminohippursäure beobachtet [16]: Erst nach dem 33. Lebenstag wird die maximale Ausscheidungsfähigkeit erreicht; 105 und 240 Tage alte Ratten scheiden im Versuchszeitraum bereits wieder weniger aus als 33 und 55 Tage alte Tiere. Die Befunde über die ungenügend entwickelte Fähigkeit junger Ratten zur renalen Ausscheidung zugeführten Kaliums stehen nur scheinbar im Widerspruch zu der Tatsache, daß junge Tiere bei Belastung mit NaCl-Lösung sehr viel mehr Kalium ausscheiden als erwachsene [17]. Die Ursache ist in der unvollkommenen Entwicklung des aktiven Reabsorptionsmechanismus für Natrium und Kalium im proximalen Tubulus junger Ratten zu sehen. Das Natrium kann im Austausch gegen H-Ionen und Kalium weitgehend zurückgenommen werden, wobei jedoch die ausgeschiedene Kalium-Menge noch größer wird (siehe [17]). Für technische Mitarbeit danke ich Frl. RENATE PREUSS. Literatur [1] KERSTEN, L . U. H . BRÄUNLICH: Z. Versuchstierk. 10, 195 (1968)

[2] BRÄUNLICH, H. U. L. KERSTEN: Acta biol. med. germ. 21, 459 (1968) [3] STOPP, M . , W . ZENK, L . KERSTEN U. H . BRÄUNLICH: A c t a b i o l . m e d . g e r m . 2 3 , 7 2 3

(1969) [4] BERLINER, R. W. in: The Harvey Lectures, Series 55- Academic Press, New York 1961, S. 141 [5] LITCHFIELD, J. T. u. F. WILCOXON: J. Pharmac. exp. Ther. 96, 99 (1949) [6] BRÄUNLICH, H . , M . STOPP, W . ZENK U. L . K E R S T E N : A c t a b i o l . m e d . g e r m . 2 2 , 723 (1969) [7] BRÄUNLICH, H . , W . ZENK U. M . STOPP: A c t a b i o l . m e d . g e r m . 2 2 , 731 (1969) [8] HELLER, H . : J . E n d o c r . 8, 2 1 4 (1952) [9] CALCAGNO, P . L . , M . J . RUBIN U. D . H . WEINTRAUB: J . c l i n . I n v e s t . 3 3 , 91 (1954)

[10] BRÄUNLICH, H. U. L. KERSTEN: Acta biol. med. germ. 28, 73 (1972) [11] KRÜCK, F.: Klin. Wschr. 45, 30 (1967) [12] GIEBISCH, G., R. M. KLOSE U. G. MALNIC: Bull. Schweiz. Akad. med. Wiss. 23, 287 (1967) [13] HIERHOLZER, K. in: Normale und pathologische Funktion des Nierentubulus. K. J. ULLRICH u. K. HIERHOLZER Hrsg.). Hans Huber, Bern u. Stuttgart 1965 7 Acta biol. med. germ., Bd. 28, Heft 1

98

H . BRÄUNLICH, R .

[14] [15] [16] [17]

PUSCHMANN

J., J. F O U L K E S U. A. G I L M A N : Proc. Soc. exp. Biol. Med. 6 7 , 545 (1948) R. M . K L O S E U. G . G I E B I S C H : Am. J . Physiol. 2 1 1 , 529 ( 1 9 6 6 ) B R Ä U N L I C H , H . : Acta biol. med. germ. 2 4 , 3 2 7 (1970) S T O P P , M., W. Z E N K , L. K E R S T E N U. H . B R Ä U N L I C H : Acta biol. med. germ. 2 3 , 493 (1969) MUDGE, G.

MALNIC, G.,

Anschrift des Verfassers: Doz. Dr. H . B R Ä U N L I C H , Institut f ü r Pharmakologie und Toxikologie des Bereichs Medizin der Friedrich-Schiller-Universität Jena, D D R 69 Jena, Zentraler Platz. Summary H . B R Ä U N L I C H : Development of renal excretion of sodium and potassium in the postnatal period of rat Repeated administration of NaCl solution considerably promotes the development of renal excretion for sodium in the postnatal period which is associated with an increase in urinary sodium concentration. At the same time these animals excrete less potassium t h a n the control animals. I t is possible t h a t repeated administration of NaCl solution promotes hormonal regulation of ion exchange. Potassium is more toxic for young rats t h a n for adult ones. The age-dependent difference in the toxicity of potassium can be explained by the age-dependence of the renal potassium excretion: young rats injected with KCl solution excreted less potassium t h a n adults throughout the period of experiment.

Acta biol. med. germ., Band 28, Seite 99—107 (1972) Aus dem Institut für kortiko-viszerale Pathologie und Therapie der Deutschen Akademie der Wissenschaften zu Berlin, Berlin-Buch Wiltbergstraße 50 (Direktor: Prof. Dr. m e d . R . BAUMANN)

und dem V E B Berlin-Chemie, Direktionsbereich Forschung (Direktor : Dr. rer. nat. H . BÖSE)

Kardiovaskuläre Effekte von Angiotensin-II-Implantaten an der intakten unnarkotisierten Ratte Beitrag zur Erzeugung einer mittelfristigen experimentellen Hypertonie F . GRIEGER, H . BAUMANN u n d I. W O L F

(Eingegangen am 26. 5. 1971) Zusammenfassung Zur Erzeugung eines mittelfristigen experimentellen Hypertonie-Modells wurde der Effekt von Angiotensin-II-Implantaten an intakten, unnarkotisierten R a t t e n auf den systolischen Blutdruck analysiert. 1. Bei einer Dosierung von 3—4 mg/kg erreicht man einen Blutdruckanstieg über 40% der Ausgangslage mit Maximalwerten über 60% in einem Zeitbereich von 22—125 min nach der Implantation. 2. Bei einer Dosierung von 4—7 mg/kg sahen wir einen verzögerten Blutdruckanstieg. 40% Erhöhung von der Ausgangslage wurden nach 65 min erreicht, der Maximalwert bei 55% erst nach 130 min. Der Abfall auf das Ausgangsniveau erfolgte nach 5 Std. 3. Die geringsten Anstiege und die kürzeste Wirkungsdauer fanden wir im bereits toxischen Dosisbereich von 7—12 mg/kg. Dieser Effekt dürfte auf eine Eigenhemmung zurückzuführen sein. 4. Zusätzliche Überprüfungen der diastolischen Werte bei Einzeltieren weisen auf ein paralleles Verhalten des diastolischen Blutdruckes hin. 5. Die Darstellung der Herzfrequenz in F o r m eines Intervallhistogramms der R-RIntervalle zeigte bei einer Dosierung von 3—4 mg/kg während der Druckanstiegsphase eine Beschleunigung der mittleren Herzminutenfrequenz bei gleichzeitiger Verdopplung der Streuung der R-R-Intervalle. Einleitung

Ziel der vorliegenden Experimente war es, einen mehrstündigen hypertonen Zustand an Laboratoriumstieren zu erzeugen, um derartige Modelle für spezifische neuroelektrophysiologische Untersuchungen einsetzten zu können. Zur Erzeugung dieser experimentellen Hypertonie bei Ratten wurde Asp (NH2)1-Val5-Angiotensin II verwendet (Angiotensin „Berlin Chemie" Trokkenampullen, VEB Berlin-Chemie). Beim Angiotensin handelt es sich um ein Oktapeptid mit der Sequenz Asp(NH2)-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-Phe, das als die bisher stärkste pressorische Substanz gilt. Es ist etwa 5—10 mal 7*

F . GRIEGER, H . BAUMANN, I. W O L F

so wirksam wie Noradrenalin und führt schon in Dosen von 0,01 |¿g/kg zu einem signifikanten Blutdruckanstieg. Da die Wirkung nach 10—20 sec ihr Maximum erreicht und schon nach 2 min auf den Ausgangswert abfällt, mithin die biologische Halbwertszeit extrem niedrig ist, wird das Präparat, um therapeutisch über längere Zeiträume eine Blutdruckerhöhung zu bewirken, als Zusatz zu Tropfinfusionen gegeben (1—10 ¡ag/min; Blutdruckanstieg von 30—40 mmHg). Zur Erreichung einer Depotwirkung von Angiotensin II wurde die Effektivität von Angiotensin-Implantaten überprüft. Als Implantate bezeichnet man einen gepreßten oder gegossenen Formling, der unter die Haut oder in das Muskelgewebe gesetzt wird, sich dort langsam mit der umgebenden Gewebsflüssigkeit löst und so kontinuierlich kleine Mengen des Wirkstoffes freisetzt (Depot-Effekt). Da bei dieser Applikationsform nur Wirkstoffe mit einer hohen biologischen Aktivität verwendet werden können, liegt das Anwendungsgebiet der Implantate bis jetzt fast ausschließlich in der Hormontherapie (Testosteron, Progesteron, Oestradiol [1, 2]; Desoxykortikosteron [3,4]. Hier können die Hormone monatelang die Funktion künstlicher Drüsen übernehmen. Methodik Wir führten 27 Experimente an 12 männlichen R a t t e n des institutseigenen Inzuchtstammes (230—380 g KG) durch. Diesen Tieren haben wir durch eine kleine H a u t inzision, die mit einer Naht geschlossen wurde, s.c. an der Bauchseite Implantate (Preßlinge von ca. 2—3 m m Länge und 2 m m Durchmesser, unter Verwendung von Talkum oder NaCl als Gleitsubstanz) aus Angiotensin I I des V E B Berlin-Chemie in folgender Dosierung eingeführt: I. II. III. IV. V.

2,5 mg 5,5 mg 1,4 mg 2,0 mg 1,0 mg

Angiotensin; Angiotensin unter geringem Zusatz von Talkum; Angiotensin + NaCl; Angiotensin -f- NaCl; Angiotensin + NaCl.

Die Dosierung wurde nachträglich auf die Angabe mg/kg reduziert. Der systolische Blutdruck am unnarkotisierten Tier wurde nach der Methode von F R I E B E L und V R E D E N [5] indirekt am Rattenschwanz unter Berücksichtigung der von uns angegebenen Manschettenbreite [6] und unter Verwendung eines Arterienpulsabnehmers AP-2 des V E B Meßgerätewerk Zwönitz erfaßt. Die Messung erfolgte in einem auf 30 °C erwärmten Raum ohne zusätzliche, auf die Tiere gerichtete Erwärmung. Nach mehrwöchiger Eingewöhnung der R a t t e n an die Meßsituation wurde der basale systolische Blutdruckverlauf aus den täglichen Meßwerten von drei Wochen bestimmt. Während der Experimente wurde der Blutdruck über 3 — 6 Std. im 1 minAbstand gemessen. Zustand und Verhalten der Tiere während dieser Zeit wurden protokolliert. Die hier vorgelegte Auswertung der Versuche basiert auf Mittelwerten der Meßwerte im 5 min-Abstand (Abb. 1 u. 2). Der diastolische Blutdruck wurde nach B R E U N I N G E R [7] bei einzelnen Tieren während der Anstiegsphase des Blutdruckes geprüft. In einer weiteren Serie mit 8 Versuchen an 4 Ratten, denen zerebrale Elektroden implantiert waren, wurden 1 mg-Implantate (3—4 mg/kg) benutzt. Unter stochastischer kombinierter Blitz-Click-Stimulation zum Hervorrufen evozierter Potentiale, über die gesondert berichtet wird, wurde ein E K G

Angiotensin-Implantation bei der R a t t e

101

v o n der indifferenten zu einer Analelektrode abgeleitet und in F o r m eines Intervallhistogramms dargestellt. Weitere Einzelheiten siehe bei G R I E G E R und B A U M A N N [8]. Die Messungen des systolischen Blutdruckes während dieser Versuche erfolgten in e t w a 1 / stündigem A b s t a n d . 2

Ergebnisse

Aus Abb. 1 sind die Blutdruckverläufe für drei unterschiedliche Dosisbereiche ersichtlich. Es zeigen sich deutliche Unterschiede im Wirkungseffekt der Dosen. Dosen von 3 —4 mg/kg erzeugten den höchsten Blutdruckanstieg. Der Anstieg beträgt über 60% des Ausgangswertes. Im Mittel liegen die Blutdruckwerte von 22 min bis 125 min nach der Implantation um 40% höher als die Ausgangswerte. Im Dosisbereich von 4—7 mg/kg erfolgt der Anstieg des Blutdruckes langsamer. Ein mittlerer Anstieg von 40% der Ausgangswerte wird erst nach etwa 65 min erreicht. Der maximale Anstieg auf 55% des Ausgangsniveaus zeigt sich nach 130 min und liegt unter den Maximalwerten des 3 —4 mg/kgDosisbereiches. Der Abfall auf das Ausgangsniveau erfolgt erst nach 5 Std. Die geringsten Anstiege und die kürzeste Wirkungsdauer fanden wir im Dosisbereich von 7—12 mg/kg. In diesem Dosisbereich beobachteten wir auch biphasische Blutdruckverläufe, d. h. nach der hypertonen Phase schloß sich eine teilweise zeitlich stärker ausgeprägte hypotone Phase an (Abb. 2). In solchen Fällen waren erhebliche Schwankungen des Blutdruckes festzustellen, die sich in den Mittelwertsdarstellungen der Abb. 1 nicht mehr zeigen. In einigen Versuchen trat nach einer Dauer von etwa 120 min ein Verlust der Pulswelle der Schwanzarterie ein, der meist 10—15 min (bei einem Tier bis zu 45 min) dauerte und nicht als technisch bedingt angesehen werden konnte. Vorwiegend trat dieses Phänomen allerdings im Dosisbereich von 3 bis 4 mg/kg ein. In Abb. 3 haben wir die mittlere Wirkungsdauer der pro-kg-Dosierung gegenübergestellt. Unter Wirkungsdauer verstehen wir hier den Zeitbereich, der durch die Implantation und den Zeitpunkt begrenzt wird, an dem erstmals das Ausgangsniveau des systolischen Blutdruckes wieder erreicht bzw.

A b b . 1. Mittlere Blutdruckverläufe nach Angiotensin-II-Implantation in 3 Dosierungen bei intakten, unnarkotisierten R a t t e n . Abszisse: Zeit in m i n ; Ordinate: systolischer B l u t d r u c k in Prozenten der Ausgangslage (100%). • • 3 — 4 mg/kg, J V = 5; • • 7 — 1 2 m g / k g , N = 9; • • 4 — 7 mg/kg,

N= 5

102

F . GRIEGER, H . B A U M A N N , I. W O L F

Abb. 2. Darstellung von einigen individuellen Blutdruckverläufen. Abszisse: Zeit in min; Ordinate: systolischer Blutdruck in mmHg. Lücken in den Kurvenzügen bei Verlust der Pulswelle. Ausgeprägte hypotonische Phase mit erheblichen Schwankungen bei hoher Dosierung = 7 - 1 2 mg/kg; = 3 - 4 mg/kg; 7 - 1 2 mg/kg; 4 - 7 mg/kg

unterschritten wird. Bis zu einer Dosierung von 7 mg/kg ist ein fast linearer Anstieg dieser Wirkungsdauer erkennbar. Bei stärkerer Dosierung erfolgt eine Umkehr. Es tritt eine wesentliche Verkürzung der Wirkungsdauer ein, die etwa einer Dosierung von 2—3 mg/kg entspricht. Die Wirkungsdauer sowie auch der Gesamteffekt (Blutdruckerhöhung über die Zeit) des Angiotensin-II-Implantates ist abhängig von der Ausprägung der hypertensiven Blutdruckauslenkung in den ersten Minuten nach der Applikation. Leider war es technisch nicht realisierbar, statistisch auswertbare Daten innerhalb der ersten 5 Versuchsminuten zu erhalten. Die längere Wirkungsdauer für Dosen zwischen 4—7 mg/kg korreliert mit einem langsamen Anstieg des systolischen Blutdruckes im Verlauf der ersten 30 min, während die beiden Kurvendarstellungen für die übrigen Dosierungen (Abb. 1) einen transistorischen Abfall bei 10 min erkennen lassen. Unter der Annahme eines exponentiellen Abfalls der Wirkungskurve in Reaktion auf das erste Anfluten des Angiotensin — und dafür sprechen die vorliegenden Blutdruckeinzelwerte der Versuche aus den ersten 5 min nach der Implantation (Werte aus Versuchen im Dosisbereich 7—12 mg/kg: 2. min, N = 2: 48%; 3. min, N = 2: 3 8 % ; 4. min, N = 4: 3 2 % ; 5- min, N = 9: 27% über den Ausgangswerten) — läßt sich bei diesen auf eine wesentlich höhere Sofortwirkung schließen. Der diastolische Blutdruck war während des Anstieges des systolischen Blutdruckes erhöht. Wir beobachteten bei einem systolischen Blutdruck von 160—175 mmHg diastolische Werte zwischen 105—130 mmHg.

Angiotensin-Implantation bei der Ratte Abb. 3. Gegenüberstellung der Dosis (Abszisse) und der Wirkungsdauer (Ordinate). Wirkungsdauer = Zeit von der Implantation bis zur Rückkehr des systolischen Blutdruckes zum Ausgangsniveau bzw. erstmaliges Überschreiten derselben

103

300 i

[min]

2so-

In Abb. 4 sind die Ergebnisse der Herzfrequenzbeurteilung mittels des Intervallhistogramms des R R-Intervalles der EKG-Abteilung dargestellt. In der Blutdruckanstiegsphase fanden wir eine Beschleunigung der mittleren Herzminutenfrequenz um etwa 50 Schläge pro Minute bei gleichzeitiger Verdoppelung der Streuung der R-R-Intervalle für den vorwiegend aufgetretenen Verhaltenszustand Vlt der einem entspannten bis dösigen Zustand des Tieres entspricht. Eine wesentliche Verschiebung der Verhaltenszustände bei einer Dosierung von 3—4 mg/ kg gegenüber den Vorkontrollen lo 11 12 13 [mg/kg] war nicht festzustellen. Tachyphylaktische Erscheinungen bei Wiederholungen der Implantation, die wir im mehrwöchigen Abstand durchführten, konnten nicht beobachtet werden, ebenso kein altersabhängiger Wirkungsunterschied. Der Blutdruckeffekt der kurzfristigen Implantationsmanipulationen (Schmerzstress) wurde in Kontrolleingriffen ohne Wirkstoffapplikation bestimmt. Eine dabei auftretende Blutdrucksteigerung überschritt nie 15% des Ausgangsniveaus und dauerte nur wenige Minuten an. Diskussion

Die Angiotensinwirkung auf das intakte, nicht narkotisierte Tier wird, wie auch unten ausgeführt, als komplex beschrieben [9]. Die Komplexität des Wirkungsmechanismus wird in unseren Experimenten im Gegensatz zu Einzelinjektionen oder kontrollierten Infusionen noch durch die Bedingungen der Resorption und des Anflutens verstärkt. Weiterhin dürften auf Grund der längeren Wirkungsdauer veränderte regulative Eigenschaften der Individuen anzunehmen sein.

104

F . GRIEGER, H . B A U M A N N , I . W O L F

Imsec] so-

0

1

20

!

kO

1

60

1

SO

1

100

1

120

1

110

[min]

IfO

Abb. 4. Gegenüberstellung individueller Blutdruckverläufe der Vorkontrollen (VK, durchgezogen) und nach Angiotensin-II-Implantation (3—4 mg/kg) (AN, gestrichelt) und der mittleren Herzminutenfrequenz (oberer Teil, dick durchgezogene Stufendarstellung) als R-R-Intervall und der Streuung der R-R-Intervalle (dünn durchgezogene Stufendarstellung). Abszisse: Zeit in min; Ordinate: systolischer Blutdruck in mmHg, R-R-Intervalle bzw. R-R-Streuungen in msec

Die blutdrucksteigernde Wirkung des Angiotensin II erfolgt nach heutigem Erkenntnisstand über eine Yasokonstriktion der Arteriolen und der damit verbundenen Erhöhung des Gefäßwiderstandes, die durch eine Potenzierung des freigesetzten Noradrenalins und eine direkte Einwirkung auf die Gefäßmuskulatur hervorgerufen werden. Die Katecholamin-Freisetzung erfolgt aus den Nebennieren und den Speichergranula der peripheren postganglionären adrenergischen Nervenendigungen. Weitere, über das vegetative Nervensystem ablaufende Wirkungen bestehen aus einer Aktivierung der sympathischen Ganglien, einem sympathomimetischen Effekt durch einen zerebralen Angriffsmechanismus und einer zentral ausgelösten Hemmung der parasympathischen Einflüsse auf das Herz. Angiotensin bewirkt darüber hinaus eine Potenzierung der Aktivität der cholinergen Nerven [10,11]. Ein Teil dieser Mechanismen zeigt eine Dosisabhängigkeit, sogar mit partieller Wirkungsumkehr, wie sie z. B. für die Impuls-Transmission im Ganglion cervicale superior [12] und die Katecholamin-Sekretion des Nebennierenmarkes [13] beschrieben wurden. Angiotensin II wird durch verschiedene Enzyme im Blut und in den Geweben zerstört. K H A I R A L L A H et al. [14] schreiben diese Aktion einer im Plasma und in den roten Blutzellen vorhandenen Aminopeptidase zu und nennen sie Angiotensinase. Neuere Arbeiten differenzieren zwischen Angiotensinase Ax und A2, die TV-terminale Asparaginsäure bzw. Asparagin abspalten [15

Angiotensin-Implantation bei der Ratte

105

bis 18] und Ca2+ als Kofaktor erfordern. Entsprechend sind sie durch Komplexbildner hemmbar. Die Ergebnisse von REGOLI et al. [19] deuten außerdem auf die Existenz eines von Angiotensinase A unterschiedlichen Plasmaenzyms mit geringer hydrolytischer Aktivität hin. Dieses durch Diisopropylfluorphosphat (DFP) inhibierbare Enzym, die sog. Angiotensinase B, scheint eine Endopeptidase zu sein, die mit einer Nieren-Endopeptidase identisch ist. Die Spaltung erfolgt dabei zwischen Tyr 4 und Val® in der dem a-Chymotrypsin analogen Weise. Von Y A N G et al. [20] wird ferner ein in Schweinenieren, menschlichem Harn und an vermutlich noch anderen Orten vorhandenes, durch DFP hemmbares Enzym beschrieben. Dieses von ihnen Angiotensinase C genannte Enzym, das nicht mit Karboxypeptidase identisch sein soll, spaltet das C-terminale Phe 8 ab und bildet das biologisch inaktive Heptapeptid. Über den Anteil der Angiotensinase C an der gesamten AngiotensinaseAktivität besteht noch keine Klarheit. Trotz dieser dominierenden Rolle der Aminopeptidasen bei der Zerstörung des Angiotensin II-amids primär bei in vitro-Versuchen lehnen D O Y L E et al. [21] deren Bedeutung in vivo ab, da verschiedene Angiotensin-II-Analoge, die gegen die Einwirkung von Aminopeptidasen geschützt sind, die gleichen Dosis-Wirkungs-Kurven wie die Ausgangsverbindung haben. Die von ihnen vorgeschlagene Erklärung, daß die Zerstörung vorwiegend durch Endopeptidasen in den Geweben erfolgt, findet durch die Arbeiten von HODGE et al. [22] Unterstützung, die das Verschwinden von exogen zugeführtem Angiotensin II aus dem Blutkreislauf in erster Linie der Aufnahme durch die Gewebe zuschreiben. Denselben Autoren gelang mittels der von ihnen verwendeten „blood bathed organ technic", bei der ein vollständiges Organ an einen künstlichen Blutkreislauf angeschlossen wird, die Entdeckung des Entstehungsortes des Angiotensin II [23, 24]. Nach ihren mit Hundelungen erhaltenen Ergebnissen scheint der Lungenkreislauf das bisher einzige Gefäßsystem zu sein, in dem Angiotensin I in aktives Angiotensin II gespalten werden kann. Betrachten wir zunächst unsere Ergebnisse unter den genannten Aspekten. Im Dosisbereich 3 —4 mg/kg läßt sich die Reaktion durch eine Resorption und Anflutung, die noch im pharmakologischen Bereich liegen, erklären. Im mittleren Dosierungsbereich (4—7 mg/kg) wird die Resorption möglicherweise bereits durch lokale Sofortwirkungen verzögert, so daß eine protrahierte Anflutung im Gesamtorganismus resultiert. Eine noch stärkere Dosis führt zu einer übermaximalen Sofortreaktion, in deren Folge eine Katecholamin-Speicherentleerung in Betracht zu ziehen ist im Sinne des von DISTLER et al. [25] beschriebenen Effektes, und somit weiter anflutendes Angiotensin keine ausgeprägtere Wirkung auf das Blutdruckniveau erzielen dürfte. Am wachen Kaninchen konnten DICKINSON und Yu [26] bei Infusion über 3 Tage mit steigender Dosierung in die Jugularvene bei einer Dosierung von über 0,05 ng/min eine große Sofortreaktion mit einem länger anhaltenden anschließenden Rückgang des Blutdrucks innerhalb einiger Stunden auf

106

F . GRIEGER, H . BAUMANN, I. W O L F

5—10 mmHg über dem Kontrollniveau feststellen gegenüber stärkeren Effekten, d. h. einem höheren Druckniveau über längere Zeit, unterhalb dieses Dosisbereiches. Die von uns benutzte Höchstdosierung von 7—12 mg/kg dürfte unter Berücksichtigung dieser Daten somit zu einer dosisabhängigen Eigenhemmung [27] führen, d. h. derartige Dosierungen liegen bereits im toxischen Bereich. Auch die protokollierten Begleiterscheinungen, besonders die eines verstärkten parasympathischen Effektes (Bradykardie mit Rhythmusstörungen, forcierte Atmung) im Gegensatz zur Herzfrequenzbeschleunigung ohne Rhythmusstörungen bei einer Dosierung von 3 —4 mg/kg unterstützen unsere Auffassung. Wir entschlossen uns deshalb, in weiteren Serien nur noch die Dosierungen von 3 —4 mg/kg zu benutzen. Bei der langdauernden Einwirkung des Angiotensins können allerdings auch andere humorale Mechanismen — z. B. ein Effekt auf den Aldosteronmechanismus und den Elektrolytstatus — wirksam werden. Da die Erforschung der Angiotensin-Wirkung mehr auf eine Klärung partieller Mechanismen gerichtet ist, liegen nur vereinzelte Untersuchungen an der nichtnarkotisierten, intakten Ratte vor. Unsere Befunde stehen mit denen von G R O S S et al. [27] im Einklang, die mit Dauerinfusionen und kurzzeitig wiederholten Einzelinjektionen eine vorübergehende Eigenhemmung nach hoher Dosierung fanden. M A N D E L und S A P I R S T E I N [28] erhielten mit Infusionen von über 0 , 0 5 — 0 , 5 [ig/min aufsteigend einen gleichen quantitativen Effekt einer Blutdruckerhöhung von etwa 45 % des Ausgangsniveaus mit einem Maximum bei 3,5 min. Der regionale Gefäßwiderstand variierte dabei von fehlenden Veränderungen in den zerebralen Gefäßen bis zu einer 100—200%igen Widerstandserhöhung in den renalen Gefäßen. Eine Induktion einer artiellen Hypertonie durch die Applikation hoher Angiotensindosen in öliger Suspension, wie sie B I R O N et al. [29] beschrieben, konnten wir nicht befriedigend reproduzieren. Wir glauben, daß die Anwendung des Angiotensin II in der von uns benutzten Depotform geeignet ist, mittelfristige Blutdruckerhöhungen für experimentelle Zwecke hervorzurufen. Dieses angewandte Angiotensin-II-Hypertonie-Modell ist bei entsprechender Beachtung der Dosis-Wirkungsbreite geeignet, einige Mechanismen hypertoner Dysregulationen zu analysieren. Frau M. L O R E N Z und Frau H . K L O P S T E G wird für ihre gewissenhafte Mitarbeit bei der Durchführung der Experimente gedankt. Literatur Schweiz, med. Wschr. 7 4 , 6 7 1 ( 1 9 4 4 ) C.: Schweiz, med. Wschr. 7 6 , 635 (1946) L A Z A R U S , J. U. J. C O O P E R : J. Pharm. Pharmac. 1 1 , 257 (1959) B A L L A R D , B . E. u. E. N E L S O N : J. Pharmac. exp. Ther. 1 3 5 , 1 2 0

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Summary F . G R I E G E R , H . B A U M A N N and I. W O L F : Cardiovascular effects of angiotensin I I implantates upon the intact unanaesthetized rat. An attempt to create a mediumterm experimental hypertension

In order to create a medium-term experimental hypertension model the effect of angiotensin I I implantates upon systolic blood pressure has been investigated on intact, unanaesthetized rats. 1. Doses of 3 to 4 mg/kg cause blood pressure rises of more t h a n 40 per cent of normal with maximum values above 60 per cent within 22 to 125 min following implantation. 2. Doses of 4 to 7 mg/kg caused a delay in blood pressure rise. A 40 per cent increase over initial values was reached within 65 min, and a maximum of 55 per cent, not until 130 min. The blood pressure declined to initial level after 5 hr. 3. Lowest pressure increments and shortest duration of the effect was noticed with doses from 7 to 12 mg/kg. This effect is explained as self-inhibition. 4. Additional checks of the diastole in single animals suggest a similar behaviour of the diastolic pressure. 5. The heart frequency recorded as interval histograms of the R - R intervals under doses of 3 to 4 mg/kg showed an acceleration of the mean heart rate with doubled scatter of the R - R intervals.

Acta biol. med. germ., Band 28, Seite 109—120 (1972) Aus dem Forschungszentrum f ü r Molekularbiologie und Medizin der DAW zu Berlin, 1115 Berlin-Buch

Zur Pharmakologie von Hydrazinokarbonsäuren, Hydrazinopeptiden und anderen Hydrazinderivaten VIII. Struktur-Wirkungs-Untersuchungen sequenzen

an

heterologen

Eledoisinoktapeptid-

P . OEHME, J. BERGMANN, M. FALCK, J. G . REICH, W . - E . VOGT, H . NIEDRICH, J. PIRRWITZ, CH. BERSECK u n d F .

JUNG1

(Eingegangen am 2. 3. 1971)

Zusammenfassung

An Hand einer Reihe heterologer Eledoisinoktapeptidsequenzen, bei denen als Aminosäureanalogon die entsprechende Hydrazinokarbonsäure (NH 2 -NH-CHRCOOH) an verschiedenen Positionen des C-terminalen Eledoisinoktapeptides (Lys-Asn-Ala-Phe-Ile-Gly-Leu-MetNH 2 ) eingebaut wurde, werden Aussagen über die Bedeutung des Peptidrückgrates f ü r die biologische Wirksamkeit gemacht. Auf den Wirkungsmechanismus des stärker als das Eledoisinoktapeptid wirksamen 5-a-Azasn-Analogon wird spezieller eingegangen. Außerdem wird eine Methode zur Auswertung biologischer Experimente an isoo Herten Organen mittels E D V dargelegt. Einleitung

Über pharmakologische Effekte und Vorstellungen zum Wirkungsmechanismus von Hydrazinokarbonsäure wurde von OEHME et al. [ 1 — 1 3 ] bereits in einer Reihe früherer Veröffentlichungen berichtet. Bei den als Aminosäureanaloga aufzufassenden Hydrazinokarbonsäuren wird das pharmakologische und biochemische Wirkungsbild durch die äußerst reaktive Hydrazingruppe bestimmt [9, 10]. Durch Kombination derartiger Aminosäureanaloga („NH-Aminosäuren") mit Aminosäuren erhält man Hydrazinopeptide. Bei kurzkettigen Hydrazinopeptiden wird die biologische Aktivität dieser Sequenzen mit Heterobestandteilen von der eingebauten Hydrazinokarbonsäure geprägt. Dabei läßt sich die biologische Aktivität quantitativ aus der biologischen Wirksamkeit des Heterobestandteils und seiner Freisetzungsrate im biologischen System ermitteln [10—12]. Bei Einbau eines derartigen Aminosäureanalogons in biologisch hochwirksame Peptide spielt die 1

Unter technischer Assistenz von

B . BÜSSER, M . EICHSTÄDT

und

M. RUDEL.

P . OEHME e t a l .

•110

-CO-NH-CHR-C0-NH--

—CO-NH-NH

-CHR-CO-NH

Peptid

-

Hydrazinopeptid (verlängerte

Peptidkette)

N-Aminopeptid

—CO-N-CHR-CO-NH fi NH2

Verzweigtes

-CO-N-CHR-CO-NH---NH-CO-CHR'-NH

Hydrazinopeptid

-CO-NH-NR-CO-NH-

a.-Azapeptid (Azylsemikarbazid}

Abb. 1. Vergleich der Peptidgrundstruktur mit dem Aufbau der Heterosequenzen

biologische Eigenwirkung dieser Hydrazinokarbonsäure keine Rolle mehr, sondern es kommt durch sie lediglich zur Modifizierung der biologischen Wirksamkeit dieser hochaktiven Peptide. Wie in Abb. 1 dargestellt, kann sowohl am «- als auch am ^-Stickstoff der Hydrazinogruppe dieses Heterobestandteils der weitere Aufbau der Peptidkette erfolgen. Dabei kommt es im Falle des /9-Hydrazinopeptides zum Ersatz der Amidbindung im Peptidrückgrat durch eine Hydrazidbindung bei gleichzeitiger Kettenverlängerung („NH-Aminosäure" statt Aminosäure). Bei dem a-Azapeptid (substituiertes Semikarbazid) finden wir zwar auch eine Hydrazidbindung, aber keine Kettenverlängerung, da eine CH2-Gruppe der jeweiligen Aminosäure durch eine NH-Gruppe ersetzt wurde. !

.('M

Gly

| NH-CHZ-C0 i

.(LS".)... natürliche Sequenz

Amidbinduna

i

NHGly

J

( MNH\NH-CH2-CO

(Leu)

I

Hydrazinopeptid (Kettenverlängerung)

Hydrazidbindung

AzGly

Ms).

\NH-NH-CO

Hydrazidbindung

(Leu)

oc-Azapeptid (keine Kettenverlängerung)

Abb. 2. Struktureller Vergleich von Peptidbindung und eingeführten Heterobindungen

Pharmakologie von Hydrazinverbindungen. V I I I .

111

Durch den Einbau eines derartigen Heterobestandteiles wird also sowohl die Bindung zwischen den einzelnen Aminosäuren (biologischer Abbau) als auch das Peptidrückgrat, mit evtl. Auswirkungen auf die Konformation des Peptides — biologische Wirksamkeit — verändert. Damit können sich sowohl Änderungen der Spaltbarkeit als auch der biologischen Aktivität ergeben. Methodik Die Untersuchungen führten wir an der C-terminalen Oktapeptidsequenz 4—11 des hochwirksamen Eledoisinpeptids [14, 15] durch, über dessen pharmakologische Wirkungen zusammenfassend von S T O P P und N I E D R I C H berichtet wurde [ 1 6 ] . Zum Unterschied von der natürlichen Sequenz war in der von uns verwandten Eledoisinokta-

I

Pyr-Pro-Ser\Lys-Asp-Ala 1 2 3
H-Wert von 7,8 und einer Temperatur von 37 °C. Die Dosenfolge betrug 15 min und die Kontaktzeit 7 5 sec. Die Organe waren mit einem Gegengewicht von 2 g belastet und wurden lau-

112

P . OEHME e t al.

Pyr-Pro-Ser-Lys-Asp-Ala-Plpe-Ile-Gfy-Leu-Met NH2

Eledoisin

Lys-Asn

Eledoisin

Lys-NÜ-N-CO—

5-a.-Azasn-Eledoisin-Oktapeptid

- Oktapeptid

(4-tt)

I ¿H2-CO-NH2

Lys-NH-N-CHj-CO C=0 • CH,3 !i

5-N*(Ae)Gly

Lys

7-NHPhe

NH-NH-^H-CO

•NH-NH-CO-

Lys-

-Eledoisin

-Eledoisin

9-Azgly-Eledoisin

-

-

-

Oktapeptid

Oktapeptid

Oktapeptid

LysLys-

Abb. 4. Struktur der untersuchten Verbindungen fend mit reinem Sauerstoff begast. Die Registrierung isotonischer Kontraktionen erfolgte über einen Frontalschreibhebel auf einem Rußpapierkymographen. Plazentaarterie: Die Versuche an spiralig geschnittenen Arterien der menschlichen Plazenta wurden in einem 10 ml Organbad mit Tyrodelösung, pH 7,8, 37 °C und folgender Zusammensetzung durchgeführt: 6,9 g/1 NaCl, 0,35 g/1 KCl, 0,14 g/1 KH 2 P0 4 , 0,11 g/1 MgCl2, 2,1 g/1 NaHCO s , 0,28 g/1 CaCl2, 2,0 g/1 Glukose. Die Adaptationszeit betrug in diesem Falle 60 min bei 5 g Belastung, die Dosenfolge 15 min und die Kontaktzeit 60 sec. Begast wurde mit Karbogen. Zur isometrischen Kontraktionsmessung diente ein induktiver Weggeber (Einbau-Meßwertgeber 12, VEB GRW Teltow) mit Registrierung auf einem Kompensationsbandschreiber (Motorkompensator VEB MGW Magdeburg). Versuchsauswertung Während zur Auswertung der Versuchsergebnisse am isolierten Rattenkolon, Rattenduodenum, an der Meerschweinchensamenblase und Plazentaarterie nach Aufzeichnung vollständiger Dosis-Wirkungs-Kurven die auf Probit-Papier ermittelte halbmaximale Wirkung (EDj,,) herangezogen wurde, diente am Meerschweinchenileum und Rattenmagen die Dissoziationskonstante p2 des Pharmakon-Rezeptor-Komplexes als Vergleichsparameter. Beide Konstanten, obwohl auf verschiedene Weise bestimmt, geben eine Aussage über die Affinität der geprüften Substanzen zu den Rezeptoren. Als Ergebnisse der Experimente liegen Sätze von Dosiswerten und den dazugehörigen Meßwerten der Wirkung (mm Kontraktionshöhe) vor. Die Daten eines Meßsatzes wurden auf die Maximalkontraktion normiert, durch Berechnung der Mittelwerte und Streuungen verdichtet und die konstanten Parameter der Dosis-Wirkungs-Beziehungen durch Modellanpassung mittels eines ,,Least-Square"-Verfahrens geschätzt [21]. Die vorgegebenen Modelle waren einerseits ein lineares hyperbolisches Modell nach ARIENS

[22],

Pharmakologie von Hydrazinverbindungen. V I I I . andererseits ein quadratisch hyperbolisches Modell (erweitertes Modell),

wobei s die Wirkungsvariable (1 für das lineare und qu für das quadratische Modell), I die Dosisvariable, p\ die Konstante der intrinsischen Aktivität, p2 die Dissoziationskonstante der Bindung des 1. Pharmakonmoleküls, p3 die Dissoziationskonstante der Bindung des 2. Pharmakonmoleküls sind. Die Modellwahl erfolgte nach einem Variance-Ratio-Test [23]. Das quadratisch hyperbolische Modell wurde gewählt, wenn die Anpassung auf dem 5% Niveau signifikant besser als beim linear-hyperbolischen Modell war, anderenfalls wurde das lineare Modell als ausreichende Beschreibung der Dosis-Wirkungs-Beziehung angenommen. Alle Berechnungen wurden mit dem Robotron 300 ausgeführt. Ergebnisse

An den verschiedenen untersuchten glattmuskulären Organen rufen sämtliche untersuchten Analoga in gleicher Weise wie Eledoisin bzw. die C-terminale Eledoisinoktapeptidsequenz eine dosisabhängige Kontraktion hervor. Unterschiede finden sich in der Affinität, d. h. in den Dissoziationskonstanten des Pharmakon-Rezeptor-Komplexes bzw. in den ED60.

I 2 KT"

i

8 1,6 & 10"

6,4 1,28 2,56 5,12 1 2 - i0-> - 10-

4 -

» 1,6 '^Hol/ml Bad 10-

Abb. 5. Wirkung von Eledoisin-Oktapeptid 4—11 und der Heterosequenzen auf das Meerschweinchen-Ileum in vitro I : Eled.-Oktapep. n = 40; I I : 9-AzGly-Eled.-Oktap. n = 14; I I I : 9-N(Ac)Gly-Eled.Oktap. n = 8; IV: 9-NHGly-Eled.-Oktap. n = 6 8 Acta biol. med. germ., Bd. 28, Heft 1

114

P . OEHME et al.

1. Variation innerhalb der essentiellen Sequenz Variationen im essentiellen Pentapeptidbereich 7—11 sind nur sehr begrenzt möglich, z. B. bei Ersatz des Methioninamids durch einen Äthioninamidrest [24] oder des Glyzins durch Sarkosin bzw. Alanin [25]. Bei den erwähnten Beispielen kommt es zur Veränderung der AminosäureSeitenketten, während das Peptidrückgrat unverändert bleibt. Einbau eines Heterobestandteils an Stelle des Glyzins in Position 9 der Eledoisinsequenz (. . .Ile-GZy-Leu . . .) ergibt stattdessen eine Veränderung des PeptidrückS 9 10 grates innerhalb der essentiellen Pentapeptidsequenz. Bei Einbau des N H G l y (Hydrazinoessigsäure) in dieser Position kommt es zu einer erheblichen Wirkungsabnahme (auf ca. 1/40 am Meerschweinchenileum bzw. auf ca. 1/90 am Meerschweinchenblutdruck). Die zusätzliche Azetylierung am «-Stickstoff der Hydrazingruppe hat dann keinen Einfluß auf die biologische Wirksamkeit mehr. Bei Substitution des Glyzins durch Azaglyzin (die CH 2 -Gruppe des Glyzins durch N H ersetzt) ist die Wirkungsabnahme zwar ebenfalls noch deutlich, aber geringer. In Tab. 1 sind die relativen Wirksamkeiten (bezogen auf Eledoisinoktapeptid 4—11) zusammengefaßt.

2. Variation außerhalb des essentiellen Sequenzbereiches I m .ZV-terminalen Pentapeptidbereich des Eledoisins

Pyr-Pro-Ser-Lys-J sft-A\a,. . . 1

2

3

4

5

6

können die einzelnen Aminosäuren ohne wesentliche Aktivitätsveränderung ausgetauscht werden [16, 26]. Für unsere Untersuchungen wurde Asp (bzw. Asn) in Position 5 durch Azasn bzw. N H G l y (a-azetyliert) ersetzt und wiederum mit der Eledoisinoktapeptidsequenz verglichen. Tabelle 1 Relative Wirksamkeiten der Eledoisinoktapeptid-Heterologen mit Variationen innerhalb der essentiellen Pentapeptidsequenz 7—11. ED m bzw. p2 für Analogon EDS0 bzw. p2 für Eled.-Oktap. ED20 Analogon (2) Quotient ED20 Eled.-Oktapep.

(1) Quotient

Meerschweinchen- Meerschweinchenileum (1) blutdruck (2) 9-NHGly-Eledoisinoktapeptid 9-Azgly-Eledoisinoktapeptid 9-N" (Ac)Gly-Eledoisinoktapeptid

39,1 23,7 37,5

95,4 40,0 186,0

ED20 bedeutet in diesem Fall Senkung um 20% des Ausgangswertes. Ein Quotient > l entspricht einer geringeren Wirksamkeit gegenüber dem Standardpeptid.

Pharmakologie von Hydrazinverbindungen. VIII.

115

Tabelle 2 Relative Wirksamkeiten der Eledoisinoktapeptid-Heterologen mit Variationen außerhalb der essentiellen Pentapeptidsequenz 7—'II- (1) bzw. (2) vgl. Tab. 1 Meerschweinchen- Meerschweinchenblutdruck (2) ileum (l) S-a-Azasn-Eledoisinoktapeptid 5-NÄ (Ac)Gly-Eledoisinoktapeptid

0,23 1,1

0,29 0,4

Tabelle 3 Relative Wirksamkeit des 5-a-Azasn-Eledoisin-Oktapeptids an verschiedenen isolierten Organen in vitro. EDj, bzw. p2 5-Azasn-Eled.-Oktap. ED 50 bzw. p2 Eled.-Oktapep. E D J J

b z w .

p

2

5 - a -

Azasn Eled.-Oktap. [Mol/ml] Rattenmagen Rattenkolon Rattenduodenum Meerschweinchen-Samenblase (isotonisch) Meerschweinchen-Samenblase (isometrisch) Plazentaarterienstreifen (Mensch) Meerschweinchen-Ileum

Ed 60 bzw. p2 Eled.-Oktap. [Mol/ml]

1,85 1 0 - i o 10"11 5,5 5,6 10"11 1,38 1 0 - i o

1,08 1,45 1,5 3,9

2,0

10-io

6,5 •

2,8 4,9

10"6 10"12

Q

• 10"9 • io-10 •io-i» • 10"10

0,17 0,40 0,38 0,35

10-io

0,31

5,2 • 10"6 1,2 • IO"11

0,54 0,39

Beim 5 -N a (Ac) Gly-Eledoisin-Oktapeptid kommt es trotz der Verlängerung der Peptidkette und der Einführung einer zusätzlichen Seitenkette zu keiner Wirkungsabnahme, bei dem isoster substituierten 5 -a-Azasn-EledoisinOktapeptid sogar zu einer Wirkungszunahme. An einer Reihe anderer Versuchsobjekte wurde dieses Analoge ausführlich mit der entsprechenden Eledoisinoktapeptidsequenz 4—11 verglichen. Durchgehend zeigt sich bei allen untersuchten Objekten die stärkere Wirksamkeit dieses Heteropeptids. Weitere Untersuchungen zum Wirkungsmechanismus dieses Analogen brachten folgende Ergebnisse: a) Mischt man Eledoisinoktapeptid und 5 -oc-Azasn-Eledoisinoktapeptid im Verhältnis 1:1 und nimmt in üblicher Weise eine Dosis-Wirkungs-Kurve am Meerschweinchenileum auf, so ergibt sich ein eindeutig quantitativ additiver Effekt. b) Versuche zur Ca ++ -Abhängigkeit ergaben am Meerschweinchenileum keinen Unterschied im gesamten Dosis-Wirkungs-Bereich (bei 1/5, 1/10 und 1 /20 der normalen Ca ++ -Konzentration in der Badflüssigkeit) zwischen Eledoisinoktapeptid und 5 -oc-Azasn-Eledoisinoktapeptid. 8»

116

P . OEHME e t al.

Die Abnahme von Affinität und maximaler Kontraktionshöhe ist nahezu identisch. c) Wie am Blutdruck des Meerschweinchens wirkt 5 -a-Azasn-Eledoisinoktapeptid auch beim Huhn 3 —4mal stärker, obwohl hier ein anderer Wirkungsmechanismus vorliegt. Man findet auch wie beim Eledoisinoktapeptid die initiale Blutdrucksenkung und die durch Katecholaminfreisetzung bedingte folgende pressorische Phase (Abb. 7). Durch ReserpinVorbehandlung an drei aufeinanderfolgenden Tagen (jeweils 2 mg/kg i.m.) ist deshalb erwartungsgemäß auch bei diesem Analogon, wie für das Eledoisin beschrieben [15], die pressorische Wirkungsphase zu unterdrücken (Abb. 8). d) In der vorhergehenden Mitteilung [17] hatten wir bereits über die verlängerte Wirkung bei diesem Analogon berichtet. Dabei wurde davon ausgegangen, daß durch die Heterobindung am iV-terminalen Ende der aminopeptidatische Abbau gehemmt werden kann und dadurch eine verlängerte Wirkung eintreten könnte. Wir verglichen deshalb das Verhältnis Wirkungsdauer Wirkungsintensität

für das 5 -a-Azasn-Analogon mit dem Eledoisinoktapeptid 4—11. Als Kriterium der Wirkungsdauer wählten wir jeweils die Flächen innerhalb der Kurven (Senkung beim Meerschweinchen, Anstieg beim Huhn). Wie in Abb. 9 dargestellt, findet man für das 5 -a-Azasn-Analogon bei äquivalenter Wirkungsintensität jeweils eine längere Wirkungsdauer.

£ I$100 6

.§ 50

/

.E 20

5

9

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/

/ Ys Ca" V« Ca** / V

£ 10 *

0

Ca** normal

Ca** normal

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8 S 81S -y W A o

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\ ©o

VO O

d

CD

l

N 0D „„ba X 31d g/g ±

Versuchsbedingungen KCl mMol/1 120 min Inkubation ohne Esteraseblocker Arekolin (6-10"3mMol/l) 120 min Inkubation Eserin (10"1 mMol/1) Arekolin (6-10"3 mMol/1) 120 min Inkubation DFP (2,5 • 10"1 mMol/1) Arekolin (6 • 10"3 mMol/1)

4,7

25 4,7 25

4,7

Gewebe

n

Gewebe

Stammhirn n Überstand

(0,87) 3,05 ± 0,24 12

(2,21) 3,02 ± 0 , 1 2 12

(1.52) 1,91 ± 0,18

7

(1,91) 2,28 ± 0 , 1 3

(2,02) 4,14 ± 0,43

(2,04) 9 4,54 ± 0,41

(2,43) 3,71 ± 0 , 2 7

(3,04) (4,47) 6 5,41 ± 0,32 6 3,62 ± 0,17

(4,75)

(3,80) (2,84) 9 3,91 ± 0,20 9 3,03 ± 0,37

(4,08)

3,65 ± 0,20 6 3,69 ± 0,27 6 3,93 ± 0,16

n

8 9

(3,52) 6 3,73 ± 0 , 2 3 6

(4,34) (3,04) (3,68) (3,67) 3,90 ± 0,20 6 3,79 ± 0,16 6 4,11 ± 0,12 6 2,87 ± 0,17 (3,95)

25

Endhirn n Überstand

6

(3,96) 6 3,05 ± 0 , 1 3 6

In 4,7 mM Kaliumchloridlösung ist bei Versuchen ohne Esteraseblocker der Verlust an ACh während der Inkubation mit 65% im Endhirn viel größer als im Stammhirn (30%). Die Gegenwart eines Esteraseblockers macht auch das ins Inkubationsmedium abgegebene ACh bestimmbar und damit eine Aussage über das Ausmaß der Neusynthese an ACh möglich. Die Zuwachsrate beträgt mit Eserin im Stammhirnansatz 100%, im Endhirn nur 65%. Andererseits sind die Verlustraten in beiden Hirnteilen ganz ähnlich ( ~ 8 5 %). Die höhere Kaliumkonzentration führt zusammen mit Eserin im Endhirn zu einer beträchtlichen Steigerung der Syntheserate und gleichzeitig zu vermehrtem Verlust an ACh. Die Stammhirnschnitte reagieren dagegen nur mit einer Verschiebung des ACh-Gehalts zu Gunsten der Abgabe ins Medium. Der Verlust steigt um 25% < 1 %). Diese Veränderungen der Synthese- und Abgaberaten durch die höhere Kaliumkonzentration lassen eine Interpretation der ACh-Werte ohne Esteraseblocker zu. Hier ist der Verlust an ACh in beiden Hirnteilen mit etwa 35% fast gleich groß.

In vitro-Azetylcholinumsatz

137

Tabelle 3 Einfluß von Skopolamin auf Gehalt und Abgabe von Azetylcholin in End- und Stammhirnschnitten während Inkubationsversuchen. (Vergleichswerte aus Tab. 1 ohne Angabe statistischer Maßzahlen in Klammern) Azetylcholingehalt Og/g ± «*]

Versuchsbedingungen KCl mMol/1 120 min Inkubation ohne Esteraseblocker Skopolamin (2 • 10~3 mMol prol) 120 min Inkubation Eserin (10 - 1 mMol/1) Skopolamin (2 • 10"3 mMol prol) 120 min Inkubation DFP (2,5 • 1 0 " 1 nMol/1) Skopolamin (2 • lO-3 mMol pro 1

ind hirn Gewebe

n

St ami•nhirn

Überstand

n

(0,87) 4,7 25

0,15

9

(1,52) 1,03 ± 0,06

9

1,00 ±

(2,02) 4,7

25

4,7 25

3,18 ±

0,30

(2,43) 1,97 ± 0,11

(3,67) 3,66 ± 0,20

11

± 0 , 1 8

(4,47) 5,16 ± 0,27

n

(2,21) 2,07 ± 0,17

9

Überstand

n

-

(1.91 ) 2,03 ± 0,09 10

—

(2,04) 12 3,86 ± 0,27

(3,80) 9 3,93 ± 0 , 1 9

12

(3,04) 3,20 ± 0 , 1 4

(2,84) 7 2,95 ± 0,19

11

8

(3,52) 3,92 ± 0 , 1 5 11

(3,68) 9 5,55 ± 0,60

(4,34) 7 4,05 ± 0,23

(3,04) 9 3,10 ± 0,25

9

(4,75) 6,79 ± 0,40

(4,08) 7 3,37 ± 0,17

(3,96) 8 3,64 ± 0,26

7

(3,95) 3,02

-

Gewebe

8

Versuche mit D F P als Esteraseblocker führen zu qualitativ ähnlichen Ergebnissen. Allerdings verläuft die Synthese im allgemeinen rascher und ist auch bei der niedrigen Kaliumkonzentration im Endhirn schon höher als im Stammhirn. Begleitet wird dieser Effekt von einem vermehrten Verlust an ACh ins Medium. In Gegenwart von 4,7 mMol Kaliumchlorid ist die Syntheserate durch D F P bereits so erhöht, daß sich steigende Kaliumkonzentrationen nicht im gleichen Maße wie unter Eserin auswirken. Die Inkubation mit Arekolin (Tab. 2) ohne Esteraseblocker resultiert in Gewebsgehalten, die im Endhirn zum Teil über den Ausgangswerten liegen, und in jedem Falle die Vergleichswerte übersteigen. Der Effekt im Endhirn ist deutlich stärker. Arekolin bewirkt in Endhirnschnitten mit Eserin eine ganz erhebliche Synthesesteigerung, die in 4,7 mM Kaliumchloridlösung das Vierfache und bei der schon hohen Syntheserate der 25 mM KCl-Ansätze immer noch 1 50% {p < 0,1 %) beträgt. Das neu synthetisierte ACh wird

138

H . - D . F I S C H E R , W . OELSZNER

überwiegend ins Medium abgegeben. Dagegen führt Arekolin unter DFP zu keiner Änderung in Gehalt oder Abgabe von ACh. In Stammhirnschnitten ist ein Einfluß von Arekolin weder in Gegenwart von Eserin noch von DFP deutlich zu erkennen (p > 5%). Wie Arekolin ändert Skopolamin (Tab. 3) nur in Endhirnschnitten Gehalt und Abgabe von ACh. Dabei zeigen Ansätze mit Eserin bei niedriger Kaliumkonzentration vor allem eine beschleunigte Synthese, wenn auch mit gleichzeitiger Steigerung der ACh-Abgabe, während bei erhöhter Kaliumkonzentration der Skopolamineffekt vorwiegend in einer vermehrten Abgabe (P < 1 %) besteht. Die Wirkung ist in Gegenwart von DFP ganz ähnlich. Der ACh-Gehalt der Hirnschnitte nach Inkubation ohne Esteraseblocker ist nur im Endhirn bei 25 mM KCl-Lösung signifikant (p < 1 %) gegenüber dem Vergleichswert verändert. Diskussion

Cholinomimetika führen in vivo zu einer Steigerung des ACh-Gehalts, die nach Untersuchungen in vitro (Lit. bei [4, 15]) auf einer beschleunigten Synthese ohne direkte Stimulation der Cholinazetylase beruht [24—26]. Vielmehr weisen Ergebnisse in Gegenwart von Hemicholin auf die vermehrte Bereitstellung inaktiver ACh-Vorläufer hin [27]. Die Senkung des Hirn-ACh-Gehalts durch Cholinolytika basiert auf der vermehrten Freisetzung von ACh (Lit. bei [4]). Die Ausschaltung eines Rückkopplungsmechanismus zwischen ACh-Gehalt im umgebenden Medium und Freisetzungsrate könnte sowohl die erhöhte Freisetzung wie auch eine in vitro beobachtete Synthesesteigerung erklären [16, 28]. Der differenzierten Wirkung von Cholinomimetika und Cholinolytika im Endhirn und im Stammhirn [4,11] wurde bei in vitro-Untersuchungen bisher keine Aufmerksamkeit geschenkt (Lit. bei [4, 15—17]). Die bisherigen Befunde beziehen sich ausnahmslos auf Endhirnregionen, insbesondere Kortex oder auf Schnitte bzw. Homogenate von Ganzhirn. Unsere Ergebnisse mit End- und Stammhirnschnitten zeigen die gleiche Differenzierbarkeit des überlebenden Gewebes wie in vivo. Bereits bei Inkubation ohne Arekolin bzw. Skopolamin kommt es in Abhängigkeit von der Kaliumkonzentration zu deutlichen Unterschieden in der Reaktionsweise des ACh-Systems von End- und Stammhirn. Der Freisetzung und Synthese steigernde Effekt höherer Kaliumkonzentrationen [29—31] ist nur im Endhirn ausgeprägt. Im Stammhirn bleibt das GesamtACh unverändert, nur die Abgabe in das Medium nimmt zu (Tab. 1). Die erhöhte Abgabe von ACh durch Kalium wird mit einer Depolarisation der Zellmembran erklärt [16, 20, 32]. Damit ist eine allgemeine Stoffwechselsteigerung [33] und Erhöhung des Azetyl-CoA-Spiegels verknüpft, die vielleicht die beschleunigte ACh-Synthese begünstigt [34]. Diese Atmungs- und Glykolysesteigerung tritt regional unterschiedlich auf und ist vor allem im Endhirn ausgeprägt [35]. Der am Stammhirn hinsichtlich der ACh-Synthese

In vitro-Azetylcholinumsatz

139

fehlende Kaliumeffekt wäre danach mit der mangelnden Fähigkeit dieses Hirnteils zu erklären, auf eine Kaliumdepolarisation mit einer Stoffwechselsteigerung zu reagieren. Auf den Zusammenhang zwischen Stoffwechsel (Atmung, Glykolyse) und ACh-Gehalt sowie deren parallel verlaufende regionale Unterschiede während der Entwicklung wurde schon früher hingewiesen [36]. Auch die Arekolin bedingte Synthesesteigerung ist auf die Endhirnschnitte beschränkt. In Stammhirnschnitten ändert sich sowohl bei niedriger als auch bei hoher Kaliumkonzentration weder die synthetisierte ACh-Menge noch das Verhältnis von Gewebe zu Überstand. Die differenzierten Wirkungen des Arekolins auf End- und Stammhirn des Ganztieres [4] sind in vitro reproduzierbar. Auf die Übereinstimmung der in vitro und in vivo zum ACh-Anstieg nach Oxotremorin führenden Mechanismen weisen auch andere Befunde hin [-17]. Die Wirkung des Arekolins an Endhirnschnitten ist besonders in 4,7 mM Kaliumchloridlösung nachweisbar. Da das qualitativ gleich wirkende Oxotremorin ebenfalls zu einer Glykolysesteigerung führt [37], könnte die geringere Wirksamkeit des Arekolins bei hohen Kaliumkonzentrationen mit der dann bereits durch Kalium maximal stimulierten Glykolyse erklärt werden. Auch der im Gefolge eines durch Oxotremorin bedingten ACh-Anstiegs auftretende Abfall des Azetyl-CoA-Spiegels [38] könnte im Sinne eines Verbrauchs für einen dem Kalium ähnlichen Mechanismus der Cholinomimetika sprechen. Allerdings muß dabei berücksichtigt werden, daß kaum mehr als 5 % des Gesamtumsatzes von Azetyl-CoA an der ACh-Synthese beteiligt sind [38] und die unterschiedliche Kompartmentierung der einzelnen Systeme eine Interpretation der Befunde erschwert. Die bereits für Atropin an Hirnschnitten beschriebene Steigerung der Abgabe sowie auch der Synthese des ACh [16] können wir für Skopolamin bestätigen. Auch hier bleibt wie in vivo der Effekt auf das Endhirn beschränkt. In den Stammhirnschnitten sind in den unterschiedlichen Versuchsansätzen keine signifikanten Differenzen gegenüber den Kontrollen nachweisbar (Tab. 3). An den Endhirnschnitten ist der Skopolamineffekt bereits in 4,7 mM Kaliumchloridlösung deutlich. Die signifikant gesteigerte Abgabe von ACh in "das Medium ist von einer erheblichen Synthesesteigerung begleitet. Bei höheren Kaliumkonzentrationen führt Skopolamin ohne weitere Synthesesteigerung zu einer massiven ACh-Freisetzung, das Verhältnis Gewebs- zu ÜberstandsACh steigt über 1:2 an (Tab. 4). Diese Befunde stimmen mit Beobachtungen über die Förderung der ACh-Freisetzung durch Cholinolytika in vivo vom Kort ex und aus bestimmten Kerngebieten überein [39—41]. Die daraus resultierende Senkung des ACh-Gehalts in vivo ist auch in vitro an Hirnschnitten reproduzierbar. Unsere Befunde stützen die Annahme, daß Cholinolytika einen Rückkoppelungsmechanismus zwischen freigesetztem ACh und der weiteren Freisetzung blockieren [16]. Ob dieser Mechanismus auch unter physiologischen Bedingungen eine Rolle spielt, bleibt unklar. Eine Akkumulation von ACh als regulierende Größe ist infolge der hohen

140

H . - D . FISCHER, W .

OELSZNER

Tabelle 4 Einfluß unterschiedlicher Inkubationsbedingungen auf das Verhältnis Gewebs-ACh (in (xg/g): Überstands-ACh (in [xg/g) in Endhirnschnitten* Versuchsbedingungen 120 min Inkubation 120 min Inkubation Arekolin (6 • 10" 3 mMol/1) 120 min Inkubation Skopolamin (2 • 10~ 3 mMol/1)

KCl mMol/1

Eserin 10" 1 mMol/1

DFP 2,5 • 10" 1 mMol/1

4,7 25

1 :l 1:1,84

1:1 1:1,20

4,7

1:1,09

1:0,97

1:1,46

1:1,01

1:1,21

1:1,52

1:2,62

1:2,25

25 4,7 25

* In Stammhirnschnitten liegt der Quotient nach Inkubation mit 4,7 mM KCl konstant bei 1:0,70 bis 1:0,78 und nach Inkubation mit 25 mM KCl auch relativ einheitlich zwischen 1:0,97 und 1:1,29.

Azetylcholinesterase-Aktivität kaum vorstellbar, und bei allen Untersuchungen in vivo und in vitro kann auf den Zusatz eines Azetylcholinesteraseblokkers nicht verzichtet werden. Die von uns verwendeten Azetylcholinesteraseblocker Eserin und DFP zeigen — teils in Bestätigung früherer Befunde [16] — neben ihrer esterasehemmenden Wirkung direkte Effekte auf das ACh-System. Auch diese Wirkungen sind an Schnitten aus Endhirn besonders ausgeprägt, an Stammhirnschnitten teilweise angedeutet. Das Verhältnis der ACh-Menge in Gewebe und Überstand beträgt bei niederer Kaliumkonzentration für Eserin und DFP 1:1 und steigt in 25 mM Kaliumchloridlösung auf 1: 1 ,84 bzw. 1:1,2 (Tab. 4). Diese durch Eserin bewirkte Verschiebung spricht für einen Eigeneffekt im Sinne einer verstärkten ACh-Freisetzung, die bereits von anderer Seite beschrieben wurde [16]. In den entsprechenden Ansätzen mit Arekolin fallen die Werte auf 1:1,41 bzw. 1:1,01 ab und steigen mit Skopolamin auf 1:2,62 bzw. 1:2,25 an (Tab. 4). Offenbar wird der freisetzende Effekt des Eserins durch die nach Arekolin gesteigerte Synthese zum Teil ausgeglichen, während sich der gleichsinnige Effekt des Skopolamins zur Eserinwirkung addiert. Das könnte als Hinweise auf unterschiedliche Wirkungsmechanismen von Eserin und Skopolamin gelten, für die auch andere Befunde sprechen [16]. Unter D F P sind die insgesamt synthetisierten ACh-Mengen in niedriger und hoher Kaliumkonzentration signifikant größer als unter Eserin. Sie betragen mit D F P 4,89 bzw. 6,24 (xg/g gegenüber 1,6 bzw. 4,44 (xg/g unter Eserin (Tab. 1). Diese Unterschiede können nicht mit einer ungenügenden esterasehemmenden Wirkung des Eserins erklärt werden, da die ACh-

In vitro-Azetylcholinumsatz

141

Mengen in den Ansätzen mit Arekolin z. T. um das Mehrfache höher liegen und die in analogen Ansätzen mit DFP synthetisierten ACh-Mengen sogar übertreffen (Tab. 2). Die Ergebnisse lassen sich besser mit einer dem Arekolin ähnlichen Steigerung der ACh-Synthese durch D F P erklären. Damit würde auch verständlich, daß Arekolin in Gegenwart von D F P keine weitere Erhöhung der Syntheserate bewirkt und andererseits mit Skopolamin + D F P bei gleichzeitiger Verschiebung des Verhältnisses Gewebs-ACh: Überstands-ACh zugunsten des ersteren (Tab. 4) die höchsten Werte aller Versuchsansätze für neugebildetes ACh mit 6,75 bzw. 7,35 [¿g/g erzielt wurden. Dieser synthesesteigernde Eigeneffekt des D F P ist nur an Schnitten des Endhirns, nicht aber des Stammhirns nachweisbar. Nach Literaturangaben kommen die Bedingungen für isoliertes Hirngewebe den Verhältnissen in vivo näher, wenn die Kaliumkonzentrationen hoch sind [42, 43]- Wir können das aufgrund unserer Ergebnisse bestätigen. Unter diesen Versuchsbedingungen ist wie in vivo die Förderung der ACh-Freisetzung durch Cholinolytika besonders deutlich und die Synthesesteigerung durch Cholinomimetika weniger ausgeprägt. Der Nachweis einer Synthesesteigerung kann dann schwieriger werden. Dafür sind niedrige Kaliumkonzentrationen geeigneter, da die ACh-Synthese unter diesen Versuchsbedingungen gering ist. Die in vivo und in vitro übereinstimmenden Unterschiede in der Reaktionsweise von End- und Stammhirn kommen offensichtlich durch einen direkten Einfluß der untersuchten Substanzen auf die jeweiligen Hirnstrukturen zustande. Die Effekte sind in Übereinstimmung mit elektrophysiologischen Befunden [44] nicht an die Existenz bzw. Funktionstüchtigkeit entsprechender Nervenbahnen gebunden. Die Unterschiede sind vielmehr auf die größere metabolische Beeinflußbarkeit im Endhirn gelegener Regionen im Vergleich zu Stammhirngebieten [34] zurückzuführen. Für die gewissenhafte Durchführung der Versuche danken wir Frau I . KÜCHLER, Frl. E . R U D O L P H , Frl. K . S C H N E I D E R , Frl. A . H E R R M A N N und Frau K . OSTREICH. Literatur [ 1 ] GIARMAN, N. J . U. G . P E P E U : Br. J . Pharmac. Chemother. 2 3 , 1 2 3 ( 1 9 6 4 ) [2] T A K A H A S H I , R. U. M. H. A P R I S O N : J . Neurochem. 11, 887 (1964) [3] F I N K , Z . U. R . U R B A N : Activitas nerv. sup. 8, 373 (1966)

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H . - D . FISCHER, W . OELSZNER

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w i t h cooperation of K . W E S T E R M A N N , C . v. T h e effect of arecoline a n d scopolamine u p o n acetylcholine t u r n o v e r in slices of t h e telencephalon a n d c e n t r a l lobe Changes in synthesis a n d discharge of acetylcholine b y increased p o t a s s i u m concentrations, b y arecoline, scopolamine a n d proper effects of eserine a n d diisopropylfluorop h o s p h a t e t h a t go beyond esterase inhibition are d e m o n s t r a b l e only in cortex, h i p p o c a m p u s a n d s t r i a t u m ( = telencephalon). N o significant changes occurred in t h e c e n t r a l lobe. T h e s e observations are in line w i t h analogous differences in t h e reaction of telen-

In vitro-Azetylcholinumsatz

\

cephalic and central lobe regions of rats following administration of arecoline, scopolamine and eserine. The difference is explained b y t h e higher liability t o metabolic influence on t h e p a r t s of t h e telencephalon. I n t h e telencephalon arecoline predominantly promotes the synthesis, and scopolamine, t h e discharge of acetylcholine into t h e medium. T h e effect of arecoline is particularly pronounced a t low rates of synthesis in 4.7 mmolar potassium chloride solution, whereas t h e typical scopolamine effect is better demonstrable a t high potassium content. Also, low potassium content favours t h e synthesis of acetylcholine. I n telencephalic slices eserine and diisopropylfluorophosphate show proper effects independent of cholinesterase inhibition. Eserine favours t h e release of acetylcholine into t h e medium a n d diisopropylfluorophosphate, its synthesis. The effects interfere with t h e typical arecoline and scopolamine effects and can modify t h e latter quantitatively.

Acta biol. med. germ., B a n d 28, Seite 145 — 155 (1972) Aus der Universitäts-Nervenklinik Rostock, Abtlg. f ü r (Direktor: Prof. Dr. G . G Ö L L N I T Z )

Kinder-Neuro-Psychiatrie

Experimentelle Krampfanfälle durch Derivate der Glutaminsäure P. WIECHERT u n d H . H .

KNAAPE

(Eingegangen a m 14. 6. 1971)

Zusammenfassung An R a t t e n , H u n d e n und K a t z e n wurde die exzitatorische W i r k u n g von Glutaminsäure sowie deren Homologe und Derivate nach intrazisternaler bzw. intrazerebraler I n j e k t i o n geprüft. Sehr s t a r k exzitatorisch wirken neben der DL-Glutamin- und DL-Asparaginsäure, deren D- u n d L-Formen, einige N-substituierte Derivate sowie die Poly-Glutaminsäure, 3-Hydroxyglutaminsäure, a-Ketoglutarsäure, Bernsteinsäure, L-Zysteinsäure u n d e-Aminokapronsäure. Keine oder n u r sehr geringe exzitatorische W i r k u n g zeigen die E s t e r der Glutaminsäure, aliphatische Amine, co-Aminokarbonsäure m i t Ausnahme der e-Aminokapronsäure, Glutarsäure, 3,3-Dimethylglutarsäureanhydrid, Peptide der L-Glutaminsäure, DL-A-Aminoadipinsäure und 2,6-Diaminopimelinsäure. Einleitung

In früheren Mitteilungen berichteten wir, daß nach intrathekaler Applikation von L-Glutaminsäure bei Hunden [1, 2] und Ratten [3, 4] sowie nach intrazerebraler Injektion bei Katzen [5] dosisabhängige tonisch klonische Krampfanfälle auftreten. Von mehr als 30 bei Hunden getesteten Aminosäuren löste neben der Glutaminsäure nur noch die Asparaginsäure diese zerebrale Reaktion aus [6, 7]. In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Homologe und substituierte Derivate der L-Glutaminsäure auf ihre exzitatorische Wirkung bei Ratten, Hunden und Katzen untersucht. Material und Methodik Untersuchung an Ratten Zum Versuch wurden 690 männliche und weibliche R a t t e n eines Wistar-Stammes aus eigener Zucht m i t einem Körpergewicht von 150 bis 180 g verwendet. Die Substanzen wurden den R a t t e n nach der von H E N N E C K E und W I E C H E R T [8] beschriebenen Methode subokzipital injiziert. 5 Tiere erhielten jeweils 35 (¿1 u n d weitere 5 Tiere 50 [xl einer 0,25 M Lösung der zu t e s t e n d e n Verbindungen injiziert. Die Beobachtungszeit b e t r u g etwa 30 min. 10 Acta biol. med. germ., Bd. 28, Heft 1

146 Untersuchung

P . WLECHERT, H . H .

an

KNAAPE

Hunden

I n s g e s a m t w u r d e n 136 H u n d e im Alter v o n 10 bis 14 M o n a t e n u n d einem K ö r p e r g e w i c h t v o n 15 bis 20 kg u n t e r s u c h t . I m Mittel b e k a m e n je 2 Tiere 0,5 bis 1 mMol/2 m l der zu t e s t e n d e n S u b s t a n z intrazisternal injiziert. Die S u b o k z i p i t a l p u n k t i o n erfolgte n a c h F A N K H A T J S E R [ 9 ] in Seitenlage des m i t 0 , 5 bis 0,8 m g Sukzinylcholinchlorid kurzzeitig r e l a x i e r t e n Tieres. Die Beobachtungszeit b e t r u g 24 Std. Untersuchung

an

Katzen

207 ausgewachsene K a t z e n w u r d e n in Ä t h e r n a r k o s e stereotaktisch (Koordination n a c h J A S P E R u n d A J M O N E - M A R S A N [10]) bipolare E l e k t r o d e n im H i p p o k a m p u s v e n t r a l i s ( F : + 8 , 5 ; L : 9,0; H : —5,5) u n d eine I n j e k t i o n s k a n ü l e im H i p p o k a m p u s anteriorventralis d e x t e r ( F : + 1 0 , 0 ; L : 5,5; H : —6,5) e i n g e f ü h r t . V o m Schädelknochen w u r d e m i t Nadelelektroden ü b e r d e m G. sigmoides anterior, G. ectosylvius medialis u n d G. lateralis posterior beiderseits die bioelektrische A k t i v i t ä t m i t einem 8-Kanal-Schwarzer E E G bipolar registriert. Zur T e s t u n g d e r S u b s t a n z e n w u r d e die N a r k o s e abgebrochen u n d die m i t Sukzinylcholinchlorid relaxierten K a t z e n künstlich b e a t m e t . U n t e r E E G - K o n t r o l l e erhielten jeweils 3 K a t z e n die gleiche S u b s t a n z in Dosen v o n 50, 50 u n d 250 ¡il einer 0,5 M-Lösung in A b s t ä n d e n v o n 10 m i n m i t einer Mikrospritze injiziert. Untersuchte

Verbindungen

V E B Berlin-Chemie: Ä t h y l a m i n , ß-Alanin, DL-A-Aminoadipinsäure, e-Aminokapronsäure, DL-Asparaginsäure, L-Zysteinsäure, L-Glutamin, DL-Glutaminsäure, L-Glutaminsäure, Maleinsäure. V E B L a b o r c h e m i e A p o l d a : Bernsteinsäure, w-Butylamin, w-Propylamin. G. Schönert K G Leipzig: Malonsäure. V / O Sojuzchim E x p o r t , M o s k a u : Glutarsäure. R e a n a l , B u d a p e s t : y-Aminobuttersäure, L-Asparagin, L-Asparaginsäure. F e r r a k B e r l i n : DL-Äpfelsäure, 2,6-Diaminoheptandisäure, Iminodiessigsäure. Serva, H e i d e l b e r g : DL-4-Amino-/?-oxybuttersäure, 4-Aminopteroyl-L-Glutaminsäure, l-Dimethylaminonaphthalen-5-sulfonyl (Dansyl) L-Glutaminsäure • Piperidinsalz, LHistidyl-L-Glutaminsäure, Phenylthiohydantoin-DL-Glutaminsäure, Pteroylmonog l u t a m i n s ä u r e (Folsäure). T . S c h u c h a r d t , M ü n c h e n : N-(Benzyloxykarbonyl)-L-Glutaminsäure, 3-Hydroxy-DLG l u t a m i n s ä u r e , Poly-L-Glutaminsäure P O 065F l u k a AG, B u c h s Schweiz: N-Azetyl-L-Glutamin, 3-Äthyl-3-Methyl-glutarsäure, N-(4-Aminobenzoyl)-L-Glutaminsäure, 2-Aminopimelinsäure, D-Asparagin, D-Asparaginsäure, 2,2-Dimethylglutarsäure, 3,3-Dimethylglutarsäure, 3,3-Dimethylglutars ä u r e a n h y d r i d , D-Glutamin, D-Glutaminsäure, L-Glutaminsäure-5-äthylester, L-Glutaminsäure- 5-tert.-butylester-l-methylester, L-Glutaminsäure- 5-methylester, Glyzyl-LG l u t a m i n s ä u r e , 2 - K e t o g l u t a r s ä u r e , 3-Ketoglutarsäure, 2-Methylglutaminsäure, 2-Methylglutarsäure, 3-Methylglutarsäure, N-Phthaloyl-DL-Glutaminsäure, a - P y r r o l i d o n ( B u t y r o l a k t a m ) , L-Pyroglutaminsäure. M a n n - R e s e a r c h - L a b o r a t o r i e s N e w Y o r k : L-Arginyl-L-Glutaminsäure, N-Benzoyl-LG l u t a m i n s ä u r e , Y-L-Glutamyl-hydrazid, L-Lysyl-L-Glutaminsäure, A-L-Glutamyl-LGlutamyl-L-Glutaminsäure, A-L-Glutamyl-L-Tryptophan. Miles Laboratories, I n d i a n a : L-Alanyl-L-Glutaminsäure, Glutamyl-L-Valin, L-Tyrosyl-L-Glutaminsäure. I m eigenen L a b o r w u r d e n L-Glutaminsäure-dimethylester, G l u t a m i n s ä u r e - d i ä t h y l ester, L-Glutaminsäure-di-n-propylester, L-Glutaminsäure-di-iso-propylester nach

Krampfanfälle durch Glutaminsäurederivate

147

CHILES und NOYES [ I I ] , N-Azetyl-L-Glutaminsäure, N - A z e t y l - N - m e t h y l - L - G l u t a m i n -

säure nach

KNOOP und ÖSTERLIN [12] und N-Trimethyl-L-Glutaminsäure nach

ACKERMANN u n d KUTSCHER [13] synthetisiert.

Ergebnisse

Die Reaktion der Ratten, Hunde und Katzen auf die applizierte Testsubstanz ist gegliedert nach der Struktur von Homologen und Derivaten der L-Glutaminsäure und in Tab. 1 zusammengestellt. In der Regel ließen die verschiedenen Tiere bei der gleichen Substanz ein ähnliches Verhalten erkennen. Die Verlaufsform und Intensität des Krampfes konnte bei Ratten und Hunden aber unterschiedlich sein. Bei Katzen löste die Substanz entweder keine Nachentladungen oder innerhalb von 30 sec nach der Injektion eine vom ipsilateralen über den kontralateralen Hippokampus zum Kortex generalisierende 10—20/sec-Spitzenaktivität aus, die in 8—10/ sec-Wellen überging und innerhalb von sec abrupt aussetzte. Charakteristisch für die einzelnen Gruppen war: Gruppe 1: Aminodikarbonsäuren: DL-Glutaminsäure, DL-Asparaginsäure, DL-A-Aminopimelinsäure und L-Zysteinsäure zeigen die stärkste krampferregende Wirkung. DL-A-Aminoadipinsäure und 2,6-Diaminopimelinsäure erzeugen bei Ratten und Hunden keine Krampfaktivität und bei Katzen geringe Krampfentladungen. Auf die Imminodiessigsäure reagieren nur Ratten und Katzen. Gruppe 2: Sterischer Einfluß: Sowohl die D- als auch die L-Verbindungen der Asparaginsäure und Glutaminsäure wirken sehr stark exzitatorisch. Der sterische Einfluß ist gering. Die L-Formen beider Säuren wirken etwas heftiger. Gruppe 3: Amide und Hydrazide: Diese Verbindungen reagieren ebenfalls krampferregend. Besonders intensiv wirken D- und L-Asparagin sowie DGlutamin. Die anderen Amide und das Hydrazid zeigen nur Einzelreaktionen. Gruppe 4'. Zyklisierung: Während bei den Ratten nach zisternaler Applikation von 50 (i.1 ein präkonvulsives Laufstadium beobachtet wurde, reagierten Hunde nicht und Katzen erst nach Injektion von 250 (il. Gruppe 5: Peptide der Glutaminsäure: L-Alanyl-L-Glutaminsäure und LGlutamyl-L-Valin lösen bei allen Tieren keine Anfälle aus. Die übrigen Dipeptide reagieren unterschiedlich auf die verschiedenen Tierarten. Das Tripeptid der Glutaminsäure wirkt stark exzitatorisch. Gruppe 6: Polytnerisierung: Poly-L-Glutaminsäure löst bei Ratten und Hunden starke tonisch-klonische Krampfanfälle aus. Nach intrazerebraler Injektion bei Katzen konnten im EEG dagegen keine Nachentladungen registriert werden. 10»

P. WlECHERT, H. H. KNAAPE

148

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