Acta Biologica et Medica Germanica: Band 18, Heft 6 [Reprint 2021 ed.] 9783112518748, 9783112518731

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HERAUSGEBER:

R. B A U M A N N ,

H. D U T Z ,

A. G R A F F I ,

L.-H. K E T T L E R ,

H. G U M M E L ,

F. J U N G ,

S.M. R A P O P O R T

UNTER MITARBEIT

VON:

W. B E I E R , H. D R I S C H E L , H. F R U N D E R , M. G E R S C H , E. G O E T Z E , H. H A N S O N , F. H A U S C H I L D , G. H O L L E , F. M A C H , H. M A T T H X E S , G. M O H N I K E f , O. P R O K O P , K. S C H U B E R T , F. S C H W A R Z , G. S T E R B A , A. W O L L E N B E R G E R SCHRIFTLEITUNG:

W. S C H E L E R , H. B I E L K A

AKADEMIE-VERLAG

• BERLIN

• B A N D 18 • H E F T 6

• S E I T E 667-749

• 1967

AUFNAHMEBEDINGUNGEN

1. E s werden nur Arbeiten angenommen, die nicht an anderer Stelle mit demselben Inhalt veröffentlicht oder zur Veröffentlichung angeboten werden. Der Autor verpflichtet sich nach Annahme, die Arbeit an keiner anderen Stelle zu veröffentlichen . 2. Die Arbeit muß wissenschaftlich wertvoll sein.

Bestätigungen bekannter Tat-

sachen, Versuche und Beobachtungen ohne positives Ergebnis werden, wenn überhaupt, nur in kürzester Form aufgenommen. Nicht aufgenommen werden Arbeiten referierenden Charakters, Polemiken und rein spekulative Arbeiten, falls sie nicht ganz wesentliche neue Gesichtspunkte enthalten. 3. Kurzmitteilungen für experimentelle Ergebnisse werden bei der Drucklegung zeitlich bevorzugt. F ü r ihren Inhalt ist ausschließlich der Autor verantwortlich. 4. Die Arbeiten müssen kurz und klar geschrieben und gegliedert sein. Problematik (Einleitung), Methodik, Befunde und Diskussion, evtl. Schlußfolgerungen sollen deutlich in Erscheinung treten. Der Arbeit soll ein Kurzreferat der wesentlichsten Ergebnisse vorausgestellt werden. Neben einer anderssprachigen erscheint auf jeden Fall eine deutsche Zusammenfassung. Die Arbeiten werden in folgenden Sprachen angenommen: Deutsch, Russisch, Englisch und Französisch. 5- Die Arbeiten werden im Sofortumbruch gesetzt; größere Korrekturen in Form von Streichungen bzw. Zusätzen sind daher in der Umbruchkorrektur nicht mehr möglich. 6. Genaue Hinweise zur Manuskriptgestaltung sind von der Redaktion der Zeitschrift anzufordern und sind unbedingt einzuhalten. 7. Manuskripte sind an die Herausgeber zu senden oder direkt an die Redaktion der Acta biologica et medica germanica, 1115 Berlin-Buch, Lindenberger Weg 70. 8. Von jeder Originalarbeit werden kostenlos 80 Sonderdrucke geliefert.

Darüber

hinaus können bis zu 100 Sonderdrucke gegen Berechnung bezogen werden. Die Herausgeber

ACTA BIOLOGICA ET MEDICA GERMANICA Herausgeber : R. B a u m a n n - H. D u t z • A. G r a f f i • H. Gummel • F. J u n g • L.-H. K e t t l e r S. M. R a p o p o r t B a n d 18 1967 Heft 6

A c t a biol. med. german., Band 18, Seite 667 — 675 (1967) Aus dem Institut für Physiologische Chemie der Friedrich-Schiller-Universität Jena (Direktor: Prof. Dr. H. FRUNDER)

Bildung von „ 32 P-Partikeln" in trägerfreien

32 P-Orthophosphat-

lösungen als Fehlerquelle bei biologischen Versuchen K . THIELMANN u n d M . SCHULZE

(Eingegangen am 30. 1. 1967)

Zusammenfassung Unter normalen Laboratoriumsbedingungen sind in neutralen, trägerfreien 32 POrthophosphatlösungen S —80% der Radioaktivität partikulär gebunden. Die Ursachen dafür sind Adsorption an vorgebildete Mikropartikel und Inkorporation durch Mikroorganismen, die mit Staubspuren in die Lösungen gelangen. Das partikelgebundene 32 P stellt eine erhebliche Fehlerquelle für biologische Versuche dar. Bei einem £H-Wert von 2 werden Adsorption und Inkorporation von 32 POrthophosphat verhindert.

Einleitung Biologische Versuche erfordern nicht selten den Einsatz trägerfreier 32 POrthophosphatlösungen. Dabei treten Schwierigkeiten auf, deren Unkenntnis zu groben Fehlresultaten führt. Sie beruhen in erster Linie auf der Anwesenheit von ,, 32 P-Partikeln" in der 32 P-Orthophosphatlösung. LAMERTON und HARRISS [1] haben bereits 1951 mitgeteilt, daß in käuflichen 32 P-Orthophosphatlösungen ein'erheblicher Anteil der Radioaktivität in Partikeln konzentriert ist, die sich durch niedertourige Zentrifugation abtrennen lassen. Sie bilden sich jedoch bei Stehen „reiner" Lösungen neu. Es gibt für die Partikelbildung in 32 P-Orthophosphatlösungen drei Erklärungsmöglichkeiten: A . Mikroorganismen inkorporieren das radioaktive Orthophosphat. 2. Orthophosphat wird von vorgebildeten Teilchen in der Lösung adsorbiert. 3. Nach Beobachtungen von PANETH [2] und HAISSINSKY [3] können Radioelemente zu sogenannten „Radiokolloiden" aggregieren. 45

A c t a biol. med. german., Bd. 18, Heft 6

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K . THIELMANN, M .

SCHULZE

In der vorliegenden Arbeit werden einige Befunde über Natur und Bildung 32 P-haltiger Partikel mitgeteilt, einige. Beispiele für Störmöglichkeiten in biologischen Versuchen diskutiert und gezeigt, wie die Partikelbildung verhindert werden kann. Methodik Trägerfreies 3 2 P-Orthophosphat (radiochemische Reinheit zwischen 96 und 99,5%) wird in Form von H 3 3 2 P0 4 oder Na 2 H 3 2 P0 4 von Isocommerz bezogen und nach folgendem Verfahren gereinigt: Auf eine Dowex-l-X-lO-Säule (Formiatform, 0,8 X 7 cm) werden 20 mC 32 P-Orthophosphat aufgebracht und diskontinuierlich mit je 20 ml folgender Lösungen eluiert: 1. 0,2 N Ameisensäure zur Entfernung einer radioaktiven Vorfraktion; 2. 3 N Ameisensäure zur Elution des 3 2 P-Orthophosphates; 3. 6.N Ameisensäure + 1 N Ammoniumformiat zur Entfernung einer radioaktiven Restfraktion. Das mit 3 N Ameisensäure eluierte 3 2 P-Orthophosphat wird im Vakuum getrocknet, mit 3 ml 0,5 N HCl versetzt, 1 Std. im kochenden Wasserbad gehalten und sauer aufbewahrt. Papierchromatographisch wandern nach Zusatz von Trägerphosphat in einem Laufmittelsystem von G R U N Z E und T H I L O [4] mehr als 99,5% der Radioaktivität mit dem Orthophosphat. Die 3 2 P-Orthophosphat-Stammlösung wurde für die Versuche mit 0,9% NaCl in bidest. Wasser verdünnt, so daß in 1 ml etwa 2 nC enthalten waren. In einigen Versuchen wurden die Lösungen 1 Std. bei 1 atü und 120 °C sterilisiert und anschließend mit Formaldehyd (0,5% Endkonzentration) versetzt. Keimzahlbestimmungen wurden auf Blutplatten durchgeführt. 1 Zur Erkennung einer partikulären Bindung von 3 2 P-Orthophosphat wurde die Sedimentierbarkeit bei verschiedenen Zentrifugalbeschleunigungen gemessen. „Niedertourige Zentrifugation" bedeutet im Folgenden 10 min Zentrifugation bei 20000 g, „hoch'tourige Zentrifugation" bedeutet 60 min bei 100000 oder 300000 g'. Mikroorganismen sedimentieren vollständig bei 20000 g. Bei den Zentrifugationsversuchen ist auf eine Adsorption von 3 2 P-Orthophosphat an die Wandung der Zentrifugenbecher zu achten. Sie kann bei Versuchen, die sich über einige Tage erstrecken, erhebliche Ausmaße erreichen und wurde mit Hilfe entsprechender Kontrollversuche korrigiert. Ergebnisse

In einer früheren Veröffentlichung [5] ist mitgeteilt worden, daß sich aus neutralen, trägerfreien 32P-Orthophosphatlösungen unter normalen Laboratoriumsbedingungen durch hochtourige Zentrifugation zwischen 5 und 80% der Radioaktivität sedimentieren lassen. Die folgenden Versuche wurden unternommen, um die Ursachen dieser Sedimentierbarkeit aufzuklären. 1. Aufnahme

von

32

P-Orthophosphat

durch

Mikroorganismen

Unsteril in 0,9%iger NaCl-Lösung hergestellte 32 P-Orthophosphatverdünnungen verlieren in kurzer Zeit erhebliche Anteile der löslichen Radio1

Für die mikrobiologischen Untersuchungen danken wir Herrn Dr. Institut für Medizinische Mikrobiologie der Universität Jena

KAPELL

vom

Partikuläre Bindung von

32

P-Orthophosphat

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aktivität durch Inkorporation in Mikroorganismen. Der inkorporierte Anteil läßt sich niedertourig abzentrifugieren. Die Verunreinigung von bidest. Laborwasser mit Mikroorganismen schwankt erheblich. Sie ist nicht allein abhängig vom Alter des Wassers, sondern auch vom Aufbewahrungsort, vom Verschluß der Wasserflaschen und ihrer Sauberkeit. Etwa parallel zur Keimzahl wird 32 P-Orthophosphat inkorporiert. Zwei extreme Beispiele sollen das demonstrieren: 0,3 [i.C gereinigtes 32 P-Orthophosphat wurde mit 100 ml 0,9%iger NaClLösung verdünnt, neutralisiert und Radioaktivität und Keimzahl gemessen. Eine der so hergestellten Lösungen enthielt 107 Keime/ml, eine zweite 200 vom Typ Proteus (0) und Alkaligenes. Aliquote Teile beider Lösungen wurden nach verschiedenen Zeiten bei 20000 g zentrifugiert und der sedimentierte Anteil der Radioaktivität in Prozent der Ausgangsaktivität bestimmt. In dem Ansatz mit 107 Keimen/ml waren 97% der Radioaktivität sedimentierbar. In der Lösung mit 200 Keimen/ml nimmt die Radioaktivität im Überstand 2 Std. lang kontinuierlich ab, bis etwa 20% inkorporiert sind (Abb. 1). Die geringe Zahl von Mikroorganismen wird jedoch durch die Aufnahme des radioaktiven Phosphates vollständig abgetötet. Eine erneute

Zerfälle min ml 4000

2000 [min]

Abb. 1. Änderung der Radioaktivität (Zerfälle • m i n - 1 • ml - 1 ) im Überstand einer trägerfreien, neutralen Lösung von 3 2 P-Orthophosphat und 0,9%iger NaCl-Lösung mit 200 Keimen/ml nach wiederholtem Abzentrifugieren der Mikroorganismen (10 min, 20000 g)

Blutplattenkultur zeigt Keimfreiheit. Danach wird die Radioaktivität im Überstand allmählich wieder größer, weil das 32 P aus den abgetöteten Mikroorganismen ausfließt. Dieser Versuchsablauf zeigt außerdem, daß es sich um eine echte Phosphataufnahme in Mikroorganismen handelt und nicht um eine Adsorption an ihre Oberfläche. Die inkorporierten 0,6 nC 32 P/ml entsprechen einer Masse von 2 • 10~6 ¡xg P. Die Aufnahme dieser kleinen Phosphormenge durch 200 Keime ist ohne weiteres denkbar. In weiteren Versuchen wurden Keimzahlen und Inkorporationsraten gemessen, die zwischen den beiden dargestellten Beispielen liegen, wobei jedoch nur eine lockere Korrelation zwischen Keimzahl und Inkorporation besteht, da die Phosphataufnahme verschiedener Stämme unterschiedlich ist. 45*

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K . THIELMANN, M .

SCHULZE

Der zweite der geschilderten Versuche zeigt, daß selbst bei geringen Keimzahlen, wie sie auch in relativ frischem bidest. Wasser die Regel sind, sehr beträchtliche Anteile von 32 P-Orthophosphat aus trägerfreier Lösung innerhalb kurzer Zeit durch Mikroorganismen inkorporiert werden können. 32 POrthophosphatlösungen müssen daher sofort nach dem Ansetzen sterilisiert und steril gehalten werden, wenn sie als neutrale Lösungen für biologische Versuche verwendet werden sollen. Die Inkorporation von 32 P-Orthophosphat in Mikroorganismen läßt sich im Experiment nur mit geeigneten Mangelstämmen prüfen. Bakterien aus einer Nährlösung oder von einer Kultur nehmen aus einer trägerfreien 32 P-Orthophosphatlösung in 0,9%igcr NaCl-Lösung kein 32 P auf. Geeignete Mangelstämme findet man hingegen im Laborstaub. Zusatz kleiner Mengen Staub zu trägerfreien 32 P-Orthophosphatlösungen verursacht eine Bindung von Radioaktivität. Die Werte in Tabelle 1 zeigen, daß diese partikuläre Bindung in jedem Fall größer ist, als nach Zusatz einer gleichen, jedoch autoklavierten Staubmenge. Nur die Differenz ist auf 32 P-Inkorporation in Mikroorganismen zurückzuführen. Daneben ist ein weiterer Faktor an der partikulären Bindung von 32 P-Orthophosphat beteiligt. Tabelle \ Sedimentierte Radioaktivität (in % der Ausgangsaktivität) aus trägerfreien neutralen 32 P-Orthophosphatlösungen (mit 2 nC/ml 0,9%iger NaCl-Lösung) unter verschiedenen experimentellen Bedingungen. I n den beiden Parallelwerten der Versuche A —C wurden aliquote Teile der gleichen Staubsuspension vor bzw. nach Sterilisieren zugesetzt. Die Zentrifugation erfolgte nach 4stündiger Inkubation der Ansätze bei Zimmertemperatur sedimentierte Radioaktivität in % der Ausgangsaktivität Versuch A B C a b D E

Zentrifugationsbedingungen [g] 20 20 20 300 300 300

000 000 000 000 000 000

nach Zusatz von unsterilem Staub

nach Zusatz von sterilisiertem Staub

aus staubarmen. sterilisierten Lösungen

30 15 17 43

25 4 0 27 18 0

0 4

Sehr deutlich wird das im Versuch C der Tabelle 1, bei dem eine Staubprobe in 400 ml 0,9%iger NaCl-Lösung aufgeschwemmt wurde. Die Hälfte dieses Volumens wurde sterilisiert, danach dem sterilisierten und dem nicht sterilisierten Volumen gleiche Mengen steriler 32 P-Orthophosphatlösung zugesetzt und beide Ansätze 4 Std. stehengelassen. Niedertourige Zentrifugation entfernte aus der unsterilen Lösung 17% der Radioaktivität, aus der sterilen Lösung jedoch keine Radioaktivität. Bei hochtouriger Zentrifugation sedimentieren in der sterilen Lösung 27%, in der unsterilen 43% der Radio-

Partikuläre Bindung von

32

P-Orthophosphat

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aktivität. Dieses Versuchsergebnis zeigt, daß neben Mikroorganismen, die niedertourig sedimentieren, im Staub auch noch schwer sedimentierbare Mikropartikel enthalten sind, die Radioaktivität binden (s. nächster Abschnitt). Mikroorganismen lassen sich durch sorgfältiges Sterilisieren aller Lösungen und Gefäße ausschalten. Eine bereits mit Mikroorganismen verunreinigte 32 P-Orthophosphatlösung zu sterilisieren, ist nicht sinnvoll, da inkorporiertes 32 P aus den abgetöteten Mikroorganismen nur langsam freigesetzt wird. In diesen Fällen empfiehlt sich eine Säurehydrolyse (Kochen in 1 N HCl). 2. Adsorption von 32P-Orthophosphat an vorgebildete

Mikropartikel

Die folgenden Versuche wurden durchgeführt, um die Bindung von 32POrthophosphat an partikuläres Material zu prüfen, das während der verschiedenen, im Laboratorium üblichen Handhabungen in die Lösungen gelangen kann. Das sind: Ionenaustauscherspuren bei der Reinigung des 32 P-Orthophosphats; Glasteilchen, die sich von rauhen Oberflächen der Glasgeräte (Injektionsspritzen, Glasstopfen u. a.) ablösen; nicht definierte Staubteilchen, die aus der Luft in Gläser und Lösungen hineinfallen. Ionenaustauscherreste und Glaspartikel Das käufliche 32 P-Orthophosphat wird in unserem Laboratorium an DowexSäulen gereinigt. Spuren des Austauscherharzes, die dabei in die Lösungen gelangen könnten, würden ausreichen, um erhebliche Anteile des 32 P-Orthophosphates partikulär zu binden. Es wurde daher in zwei identischen Versuchsansätzen die Sedimentierbarkeit von Radioaktivität aus einer Lösung nach Austauscherreinigung von Phosphat und Wasser und einer ohne diese Reinigungsschritte verglichen. In beiden Versuchsansätzen sedimentieren bei 100000 g 12 bzw. 11% der Radioaktivität. Austauscherreste können daher bei den von uns angewandten Reinigungsprozeduren nicht in die Lösungen gelangt sein und für die partikuläre Bindung verantwortlich gemacht werden. 32 P-Orthophosphat wird sehr fest an Glasoberflächen adsorbiert. Es lag daher nahe, an eine Adsorption an Glaspartikel zu denken. Das ließ sich jedoch mit folgendem Versuchsansatz ausschließen: Mit einem Glashomogenisator wurde eine Suspension feiner Glasteilchen in bidest. Wasser hergestellt und zu trägerfreien 32 P-Orthophosphatlösungen zugesetzt. Aus diesen Lösungen konnte durch hochtourige Zentrifugation in keinem Fall mehr Radioaktivität entfernt werden, als in den Kontrollversuchen ohne Glaszusatz. Mit diesen Versuchen ist nicht eine Adsorption von 32 P-Orthophosphat an kondensierte Silikate ausgeschlossen, die sich bei Kontakt mit stark alkalischen Lösungen aus dem Glas herauslösen können. Ein solcher Prozeß kann jedoch unter den gegebenen Bedingungen nicht an der Sedimentierbarkeit von 32 P-Orthophosphat beteiligt sein.

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K . THIELMANN, M . SCHULZE

Staub Nahezu partikelfreie Lösungen lassen sich herstellen, wenn zur Glasreinigung und zur Herstellung der Lösungen frisch bereitetes bidestilliertes Wasser verwendet wird. Setzt man jedoch diesen Lösungen geringe Mengen sterilisierten Laborstaubes zu, dann wird ein Teil der Radioaktivität partikulär gebunden (Tab. 1 D). Staub enthält also Mikropartikel, die 32 P-Orthophosphat adsorbieren. Nicht in jeder Staubprobe kommen jedoch adsorptiv wirksame Anteile vor (Tab. \ E). Auch die Größe der 32P-adsorbierenden Teilchen schwankt sehr stark. In einigen Versuchen lassen sich Partikel niedertourig abzentrifugieren, in anderen erst durch hochtourige Zentrifugation. Es ist außerordentlich schwierig, bei den im Laboratorium notwendigen Handhabungen eine Verunreinigung der Lösungen mit Staub zu vermeiden. Eine isotonische NaCl-Lösung in bidest. Wasser, die zwei Tage unter normalen Laboratoriumsbedingungen hantiert wird, kann beispielsweise 10 4 Teilchen/ml mit einem Mindestdurchmesser von 1 [xm enthalten und zusätzlich eine von uns nicht gemessene Zahl kleinerer Partikel. Von H A R R I S O N und R A Y M O N D [6] ist ein Verfahren zur Präparation „reiner" (partikelfreier) chemischer Lösungen angegeben worden. Dabei werden die verwendeten Glasgeräte sehr sorgfältig gereinigt und aus den Lösungen durch niedertourige Zentrifugation große Partikel entfernt. Als Maß für den Reinigungseffekt dienen Streulichtmessungen. Das Verfahren ist aufwendig und gewährleistet keinen Schutz gegen kleine Partikel. Sehr viel einfacher und sicherer läßt sich die Adsorption von 32 P-Orthophosphat an Trägermaterial durch Einstellen eines sauren pH verhindern. Bei pH 4 beginnt adsorbiertes 32 P-Orthophosphat sich von seinem Trägermaterial abzulösen, bei pH 2 ist mit Sicherheit keine Radioaktivität mehr adsorbiert. Das ist von uns früher [5] autoradiographisch belegt worden. Bei pH 2 ist außerdem die Aktivität von Mikroorganismen praktisch vollständig unterbunden. Dieses sehr einfache Verfahren trägt der Tatsache Rechnung, daß sich eine Verunreinigung der Lösungen durch Staubteilchen und damit von adsorbierendem Material und Mikroorganismen unter normalen Laboratoriumsbedingungen praktisch nicht vermeiden läßt. Sterilisieren der Lösungen schaltet lediglich die Inkorporation in Mikroorganismen aus und beseitigt nicht die Gefahr einer partikulären Bindung durch Adsorption. Kleine Volumina von Lösungen mit einem pH von 2 (50 ¡xl/Maus) werden bei i.v. Injektion im Blut sofort gepuffert. Die gleichzeitig injizierten Partikel stören nicht mehr. Durch die hohe Orthophosphatkonzentration im Plasma wird der adsorbierte Anteil des radioaktiven Orthophosphates vernachlässigbar klein und darüber hinaus eine Adsorption von 32 P-Orthophosphat in Gegenwart von Protein überhaupt unterbunden. Entsprechendes gilt für in-vitro-Versuchsansätze.

Partikuläre Bindung von

j. Bildung von

32

P-Orthophosphat

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,,32P-Radiokolloiden"

Radioaktive Isotope sollen durch Aggregation sogenannte „Radiokolloide" bilden [2], [3]. Die Entstehung von kolloidalem Phosphat aus 32 P-Orthophosphat ist unter den verwendeten Reaktionsbedingungen nicht denkbar. 1 Trotzdem sollte experimentell ausgeschlossen werden, daß unter dem Einfluß der /3-Strahlung des 3 2 P schwer überschaubare Reaktionen zu einer Aggregation von 32 P-Orthophosphat führen. Trägerfreie neutrale und sterile 32P-Orthophosphatlösungen wurden hochtourig zentrifugiert. Dabei sedimentierten in zwei Versuchen 11 bzw. 12% der Radioaktivität. Aliquote Teile der Lösungen wurden 9 Tage in dicht verschlossenen Zentrifugenbechern steril aufbewahrt und danach zentrifugiert. Es sedimentierten 10 bzw. 13% der Radioaktivität. Unter Bedingungen, die eine weitere Verunreinigung von 32 P-Orthophosphatlösungen mit partikulärem Material ausschließen, bilden sich demnach keine weiteren 32 P-Partikel. Bei einer Radiokolloidbildung hätte auch unter diesen Bedingungen zunehmend mehr Radioaktivität sedimentieren müssen. Experimentell ergibt sich somit kein Anhalt für die Bildung von Radiokolloiden. Ein zusätzliches Argument gegen die Radiokolloidbildung liefert folgende Überlegung: Berechnet man die Größe der Teilchen, die unter Zentrifugationsbedingungen wie in Versuch A der Tabelle 1 sedimentieren, dann ergibt sich, daß die eingesetzte Menge an 32 P-Orthophosphat nicht genügend Masse besitzt, um ein solches Teilchen zu bilden. Es muß daher Trägermaterial an der Bildung der 32 P-Partikel beteiligt sein. Diesen Berechnungen liegt die von P I C K E L S [7] angegebene Beziehung zugrunde. Sie sind, insbesondere hinsichtlich der Teilchendichte, mit einigen Unsicherheiten behaftet, die jedoch nicht groß genug sind, um das Ergebnis prinzipiell in Frage zu stellen. Diskussion

Es hat für biologische Versuche erhebliche Konsequenzen, wenn mehr oder weniger große Anteile einer 32 P-Tracermenge nicht frei gelöst, sondern in Partikeln konzentriert sind. Verschiedene Autoren [1], [8] haben autoradiographisch nachgewiesen, daß sich nach i.v. Injektion die Radioaktivität aus solchen Lösungen ungleichmäßig im Organismus verteilt und die 3 2 Phaltigen Partikel im retikuloendothelialen System (insbesondere in Leber und Milz) akkumulieren. Sie sind von uns auch histoautoradiographisch innerhalb KuPFFERScher Sternzellen nachgewiesen worden [5]. Bei s.c. und i.p. Injektion bleiben die Partikel am Injektionsort liegen; denn sie penetrieren nicht durch seröse Häute ([1] und eigene Versuche). Es gelangt eine kleinere 32 P-Orthophosphatmenge in den Kreislauf, als injiziert wurde. Für Beratung in dieser Frage danken wir den Herren Dr. Jena, sowie Herrn Prof. Dr. G R U N Z E , Berlin 1

FRÖHLICH

und Dr.

GITTER,

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K . THIELMANN, M . SCHULZE

Erhebliche Fehler entstehen bei i.v. Injektion partikelhaltiger trägerfreier Orthophosphatlösungen für Stoffwechseluntersuchungen an Organen, in denen die Partikel akkumuliert werden, wie beispielsweise der Leber. Bei Verwendung partikelhaltiger 32 P-Orthophosphatlösungen wird eine Phosphataufnahme von etwa 1 ¡xMol • g Leber - 1 • min - 1 vorgetäuscht, während der richtige Wert bei 0 , 0 5 ¡ J . M O 1 •. g Leber -1 • min - 1 liegt [ 9 ] . Die 32 P-Einbaukurve der Leber zeigt in Gegenwart von 32 P-Partikeln außerdem einen zweigipfligen Verlauf, der die Aufnahme von 32P in zwei Kompartmente (Partikel in die KuPFFERschen Sternzellen, gelöstes Orthophosphat in die Parenchymzellen) widerspiegelt. Berechnungen von Umsatzgrößen phosphorylierter Metabolite aus 32PMarkierungsversuchen haben sehr häufig zu Fehlresultaten geführt, weil die spezifische Aktivität des anorganischen Phosphates im biologischen Material verfälscht war (Diskussion hierzu siehe loc. cit. [10], [11]). Das partikuläre 32 P-Orthophosphat konserviert die unendlich hohe spezifische Aktivität der trägerfreien 32 P-Orthophosphatlösung. Es mischt sich im biologischen Material nicht mit dem frei gelösten Orthophosphat. Bei saurer Gewebsaufbereitung wird aus den Partikeln jedoch Orthophosphat freigesetzt. Das täuscht eine zu hohe spezifische Aktivität des Orthophosphat-pools vor und verfälscht beispielsweise die Berechnung von ATP-Umsatzraten in der Leber [11], Die Störmöglichkeiten durch 32 P-Partikel sind mit diesen Beispielen nicht erschöpft. Auch bei in-vitro-Versuchsansätzen ist mit einer Verfälschung der Ergebnisse durch 32 P-Partikel zu rechnen. Es ist sehr wahrscheinlich, daß auch andere Radioelemente in trägerfreier Lösung partikulär gebunden werden. Die Vermeidung einer partikulären Bindung ist eine Grundvoraussetzung für die Verwendung radioaktiver Isotope in trägerfreien Lösungen.

Literatur E . B. H A R R I S S : Brit. med. J . 1951, 9 3 2 . zit. nach E . B R O D A U. T . S C H Ö N F E L D . I n : H a n d b u c h der Mikrochemischen Methoden (Hrsg. F . H E C H T U. M. K . Z A C H E R L ) Springer, Wien 1 9 5 5 , Bd. II, S. 60. H A Ï S S I N S K Y , M.: Les Radiocolloïdes. I n : Actualités scientifiques et industrielles. S. 185- H e r m a n n & C ie , Paris 1934. G R U N Z E , H . U. E . T H I L O : Die Papierchromatographie der kondensierten Phosp h a t e . Akademie-Verl., Berlin 1954. H A L B H U B E R , K.-J., K . T H I E L M A N N U. G . G E Y E R : Acta histochem. [Jena] 2 6 , 301 (1967). H A R R I S O N , G. E . U. W. H . A. R A Y M O N D : Brit. med. J . 1951, 930. P I C K E L S , E . G. zit. in: H O P P E - S E Y L E R / T H I E R F E L D E R , H a n d b u c h der physiologisch- und pathologisch-chemischen Analyse, 10. Aufl. Springer, Berlin-GöttingenHeidelberg 1955, Bd. II, S. 559. L E D E R , O. : Pflügers Arch. ges. Physiol. Menschen Tiere 2 7 6 , 250 (1962). F R U N D E R , H . et al., in Vorbereitung

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MCELROY

[11]

32

U. B . G L A S S ,

Summary and M . S C H U L Z E : Formation of " 3 2 P-particles" in carrier-free orthophosphate solutions as a source of error in biological experiments

K . THIELMANN 32 P

Under normal laboratory conditions, in neutral carrier-free 3 2 P orthophosphate solutions, 5 to 80 percent of the radioactivity is particle-bound, being adsorbed to microparticles and incorporated by microorganisms that enter the solutions with traces of dust. The particle-bound 3 2 P is a considerable source of error in biological experiments. Adsorption and incorporation of 3 2 P orthophosphate are avoided at pH 2. Pe3ioMe K . TmibMaHH h M. I l l y j i b i i e : 0 6 p a 3 0 B a H M e „nacrai! 3 2 P " b cboôohhmx o t HOCHTejiH 32P-0pT0. O a IH n ï 9 t I< ^ ? 5 K ; 3 5 E ß O 1•g — bc " R z i be S « S S

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True gestational age of 1 st set at sacrifice

1st set

2nd set

intra-luminal injections 1 15 2 8 4 3 4 4 4 5 4 6 4 7 — 8 — 9 10 —

2 1 2 2 2 1 5 1 1 3

1 1 9 6 9 8 1 0 0 0

24 18 14 14 14 14 14 14 14 14

parametrial injection 11 14

2

5

24

The uteri of rats with two sets of implantations are shown in Figure 1 and 2. The difference in the swellings representing different days of actual gestation is apparent. A cut-open view of a uterine segment shows a normally developed fetus of 14 days of age in Figure 3 a, and Figure 3 b a microscopic section of an embryo, which implanted on the other side 4 days later.

Fig. 1. Superimplantation in the right horn after 15 days

Kurzmitteilungen

743

Fig. 2. Superimplantation in the left horn after a 4 days interval

Fig. 3 a. Cut open view of implantation site with rat fetus at day 14 of gestation

Fig. 3 b. Microscopic section of embryo from contra-lateral horn, implanted 4 days later than a

In the small series studied here the average number of implantations per rat was 7, which is within the normal range of our colony. In two instances the location of the secondary implantations were in the contra-lateral horn as well as adjacent to embryos which had implanted earlier. This implies that unattached blastocysts are able to survive even within the same horn where

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one or more embryos are developing for considerably longer periods of time than the 4 days noted by YOSHINAGA [3], These and previous observations of other authors suggest that in the rat the metabolic and morphologic processes in the endometrium which accompany and are part of the nidation and the later embryonal development are strictly circumscribed. The parts of the endometrium which do not harbor developing embryos remain at the stage of the fourth day at least through the fourteenth day of gestation and are still receptive to nidation. It is therefore unlikely that the rat placenta produces sufficient amounts of oestrogen, if any, which would elicit a typical response beyond the confines of the placental plate. References [ 1 ] CANIVENC, (1953). [ 2 ] CANIVENC,

[3]

R., C.

DROUVILLE

MAYER:

C.R. Séances Acad. Sci.

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and G.

16,

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237,

1036

Acta biol. med. german., Band 18, Seite 745 — 749 (1967) Aus dem Physiologisch-chemischen Institut der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald (Direktor: Prof. Dr. N. H A R T M A N N )

Über den Einfluß von Zinkverbindungen auf die Serumproteine normaler und anämischer Kaninchen S. KRANTZ, J . KRANXZ u n d N .

HARTMANN

(Eingegangen am 3. 2. 1967)

Zusammenfassung Nach Applikation von Zinksalzen (1 mg Zn/kg s.c.) kommt es bei normalen Kaninchen zu einem Abfall des Gesamtserumeiweißes, zu einer Abnahme der Albumine und einer deutlichen Zunahme der y-Globuline. Bei durch wiederholte Blutentnahmen anämisch gemachten Kaninchen zeigt sich nach Yerabfolgung der erwähnten Zinksalze ein Anstieg des Gesamteiweißes, der durch eine Zunahme der Globuline bedingt ist.

Die biologische Bedeutung des Zinks im Tier- und Pflanzenreich ist Gegenstand einiger Monographien [8], [10], [11], [15] und zahlreicher Einzelabhandlungen gewesen. Unseres Wissens liegen aber in der Literatur nur vereinzelte Beobachtungen vor [1], [7], [9], die sich mit den Auswirkungen von Zink auf den Eiweißstoffwechsel befassen. In der vorliegenden Arbeit sollen Veränderungen im Serumeiweißbild normaler und anämischer Kaninchen nach parenteraler Applikation von Zinksalzen mitgeteilt werden. Material und Methodik Es wurden Zinkazetat, Zinkasparagin, Zinkglutamat bei Normaltieren, sowie Zinkglyzinat, Zinkhistidinat und Zinksulfat bei durch wiederholte Blutentnahmen (Herzpunktion) anämisch gemachten Kaninchen eingesetzt. Zinkglyzinat, Zinkasparagin und Zinkhistidinat wurden nach einem von H E Y K E [3], Zinkglutamat nach einem von K U T S C H E R [6] angegebenen Verfahren hergestellt. Zinkazetat und Zinksulfat sind im Handel in ausreichenden Reinheitsgraden erhältlich. Die s.c. injizierte Zinkmenge betrug 1 mg Zn/kg Körpergewicht, bei Gabe von Zinkglutamat 0,2 mg Zn/kg wegen der schlechten Löslichkeit des Komplexes. Kontrolluntersuchungen wurden an Tieren durchgeführt, denen 2 ml 0,9%ige NaCl-Lösung appliziert worden waren. Vor und am 1., 3., 7. und 13. Tag nach der Injektion wurden den Tieren 2 ml Blut zu Untersuchungszwecken aus einer Ohrvene oder durch Herzpunktion entnommen. Bestimmung des Gesamteiweißes erfolgte mit der B i u R E T - M e t h o d e nach W E I C H S E L B A U M und B Ü C H N E R . Für die papierelektrophoretische Auftrennung des Serums (auf

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W F 12 Niederschlag/Erzgeb.) und die Auswertung der mit Azokarmin B angefärbten Pherogramme fand die von V E B Carl Zeiss Jena hergestellte Gesamtausrüstung für Papierelektrophorese Verwendung. Alle Ergebnisse wurden mit dem t-Test auf statistische Signifikanz geprüft. Ergebnisse

Die Normaltiere vertrugen die Zinkbelastung ohne Beeinträchtigungen des Allgemeinbefindens und des Ernährungszustandes. Dagegen zeigte sich bei der Hälfte der anämischen Kaninchen eine Reduktion des Körpergewichts im Versuchsverlauf. Die Tabellen 1 und 2 geben einen Überblick über die erhaltenen Ergebnisse. Die mit Zinkazetat und Zinkasparagin belasteten Normaltiere zeigten eine deutliche Abnahme des Gesamteiweißes, eine Verminderung der Albumine und eine Zunahme der Globuline — insbesondere der y-Globuline. Nach Zinkglutamat kam es nur zu einer Reduktion der Albumine und Vermehrung der /-Globuline. Ein Einfluß dieser Zinksalze auf das rote Blutbild nicht anämischer Kaninchen in der angegebenen Dosierung war nicht nachweisbar. Bei den anämischen Kaninchen fand sich nach Injektion von Zinkglyzinat und Zinkhistidinat eine Zunahme des Gesamteiweißes, welche durch einen Anstieg der Globulinfraktionen bedingt war. Ein geringfügiger Abfall der Albumine war nur nach Gabe von Zinkhistidinat zu beobachten. Die ausgeprägteste Vermehrung der y-Globuline stellte sich nach Applikation von Zinkglyzinat und Zinkhistidinat dar. Gleichzeitig konnte ein die Erythropoese stimulierender Effekt dieser Zinksalze beobachtet werden, da die Erythrozytenwerte der mit Zink belasteten Tiere schneller zur Norm anstiegen als die der Kontrolltiere. Zu den ausgeprägteren Veränderungen führte die Verabfolgung von Zinkazetat und Zinkglyzinat. Die geringsten Wirkungen zeigten Zinksulfat und Zinkglutamat, wobei bei letzterem die geringere Dosis in Rechnung zu stellen ist. Sicherlich spielen Besonderheiten im chemischen Bau sowie die Festigkeit der Bindung des Zinks an das Trägermolekül der getesteten Verbindungen eine entscheidende Rolle beim Zustandekommen der beobachteten Wirkungsunterschiede [12], [13]. Wir vermuteten, daß die gefundene y-Globulinvermehrung auf einem Anstieg der Immunoglobine beruhen könnte [2]. Diese Annahme wurde unlängst von W I E R S B I T Z K Y und S C H E I B E [ 1 4 ] bestätigt, deren Untersuchungen zunächst durch Ergebnisse zweier Dissertationen aus unserem Institut angeregt worden waren [4], [5].

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