Acta Biologica et Medica Germanica: Band 17, Heft 6 [Reprint 2021 ed.] 9783112540527, 9783112540510

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BIOLOGICA ETMEDICA HERAUSGEBER:

R. B A U M A N N , H . D U T Z , A. G R A F F I , H . G Ü M M E L , F. J U N G , L.-H. K E T T L E R , S. M. R A P O P O R T U N T E R M I T A R B E I T VON:

W. B E I E R , H. D R I S C H E L , H. F E Ü N D E R , M. G E E S C H , E. G O E T Z E , H. H A N S O N , F. H A U S C H I L D , G . H O L L E , F. MACH, H. M A T T H I E S , G. M O H N I K E f , O . P R O K O P , K . S C H U B E R T , F . S C H W A R Z , G. S T E R B A , A. W O L L E N B E R G E R SCHRIFTLEITUNG:

W. S C H E L E R , H. B I E L K A

AKADEMIE-VERLAG

BERLIN

B A N D 17

HEFT 6

S E I T E 671-834

1966

AUFNAHMEBEDINGUNGEN 1. Es werden nur Arbeiten angenommen, die nicht an anderer Stelle mit demselben Inhalt veröffentlicht oder zur Veröffentlichung angeboten werden. Der Autor verpflichtet sich nach Annahme, die Arbeit an keiner anderen Stelle zu veröffentlichen. 2. Die Arbeit muß wissenschaftlich wertvoll sein. Bestätigungen bekannter Tatsachen, Versuche und Beobachtungen ohne positives Ergebnis werden, wenn überhaupt, nur in kürzester Form aufgenommen. Nicht aufgenommen werden Arbeiten referierenden Charakters, Polemiken und rein spekulative Arbeiten, falls sie nicht ganz wesentliche neue Gesichtspunkte enthalten. 3. Kurzmitteilungen für experimentelle Ergebnisse werden bei der Drucklegung zeitlich bevorzugt. Für ihren Inhalt ist ausschließlich der Autor verantwortlich. 4. Die Arbeiten müssen kurz und klar geschrieben und gegliedert sein. Problematik (Einleitung), Methodik, Befunde und Diskussion, evtl. Schlußfolgerungen sollen deutlich in Erscheinung treten. Der Arbeit soll ein Kurzreferat der wesentlichsten Ergebnisse vorausgestellt werden. Neben einer anderssprachigen erscheint auf jeden Fall eine deutsche Zusammenfassung.

Die Arbeiten werden in folgenden

Sprachen angenommen: Deutsch, Russisch, Englisch und Französisch. 5. Die Arbeiten werden im Sofortumbruch gesetzt; größere Korrekturen in Form von Streichungen bzw. Zusätzen sind daher in der Umbruchkorrektur nicht mehr möglich. 6. Genaue Hinweise zur Manuskriptgestaltung sind von der Redaktion der Zeitschrift anzufordern und sind unbedingt einzuhalten. 7. Manuskripte sind an die Herausgeber zu senden oder direkt an die Redaktion der Acta biologica et medica germanica, 1115 Berlin-Buch, Lindenberger Weg 70. 8. Von jeder Originalarbeit werden kostenlos 80 Sonderdrucke geliefert. Darüber hinaus können bis zu 100 Sonderdrucke gegen Berechnung bezogen werden. Die Herausgeber

ACTA BIOLOGICA ET MEDICA GERMANICA Herausgeber: R. B a u m a n n • H . D u t z • A. G r a f f i • H . G u m m e l • F. J u n g S. M. R a p o p o r t B a n d 17

• L.-H. Kettler

1 966

Heft 6

A c t a biol. med. german., Band 17, Seite 671—682 (1966) Aus dem Physiologisch-chemischen Institut der K a r l - M a r x - U n i v e r s i t ä t ( K o m m . D i r e k t o r : Doz. Dr. med. habil. W . ROTZSCH)

Leipzig

Der Einfluß von Fruktose auf den Stoffwechsel freier Fettsäuren in der Leber und im Fettgewebe E. KUHFAHL und F.

MÜLLER

(Eingegangen am 21. 4. 1966) 1

Zusammenfassung A m Kaninchen wurden die Plasmakonzentration der unveresterten Fettsäuren ( U F S ) und die Fettsäurebilanz der Leber während kontinuierlicher Fruktoseinfusion bestimmt. Die UFS-Plasmakonzentration beträgt beim Kaninchen 559 (xval • 1~\ die hepatische Extraktionsrate 41,6%, die A u f n a h m e der U F S durch die Leber 7,44 (ival x X k g - 1 • min-1. Unter kontinuierlicher Infusion verschiedener Fruktosemengen zeigen hepatische Extraktionsrate und UFS-Plasmakonzentration unterschiedliches Verhalten. Während Zufuhrmengen bis 0,50 g • k g - 1 • S t d . - 1 Fruktose die hepatische E x t r a k tionsrate vermindern, ist sie unter der Infusion v o n 0,75 • k g - 1 • S t d . - 1 signifikant gesteigert. Die Plasmakonzentration der U F S steigt unter der Zufuhr von 0,25 g • k g - 1 x x S t d . - 1 Fruktose um 9 % und fällt bei größeren Infusionsgeschwindigkeiten ab (unter der Infusion v o n 0,75 g • k g " 1 • S t d . - 1 Fruktose auf 34,2% des Ausgangswertes) . Aus den Befunden wird gefolgert, daß die Zufuhr v o n Fruktose im F e t t g e w e b e und in der Leber den Stoffwechsel der freien Fettsäuren beeinflußt. I n der Leber wird eine W i r k u n g auf die Fettsäuresynthese und die Veresterung zu Triglyzeriden diskutiert. N a c h Revision am 18. 7. 1966 Abkürzungen und Definitionen: U F S = unveresterte Fettsäuren; Uj_ = Stoffbilanz der Leber (jxval • k g - 1 • m i n - 1 bzw. mg • k g - 1 • m i n - 1 ) ; cA, cLV = Plasmakonzentration im arteriellen Blut bzw. Lebervenenblut (¡ival • 1 _ 1 bzw. m g % ) ; m = Infusionsgeschwindigkeit (mg • k g - 1 • m i n - 1 ) ; E H P F = estimated hepatic plasma f l o w (ml x X k g - 1 • m i n - 1 ) , in Anlehnung an die im angloamerikanischen Schrifttum übliche Bezeichnung; m-GP = a-Glyzerophosphat; A z e t y l - C o A = A z e t y l - K o e n z y m A 1

44

Acta biol. med. german., Bd. 17, Heft 6

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E . KUHFAHL, F . MÜLLER

Fruktose senkt ähnlich wie die Glukose die Plasmakonzentration der unveresterten Fettsäuren [1], [2]. Die Wirkung von Glukose auf den Stoffwechsel der freien Fettsäuren ist in vitro und in vivo Gegenstand zahlreicher Studien gewesen (Zusammenfassung bei J E A N R E N A U D [3]). Das im Fettgewebe bestehende Gleichgewicht zwischen Hydrolyse und Resynthese der Triglyzeride wird bei erhöhtem Glukoseumsatz, z. B. unter Insulin- oder Glukosezufuhr, über eine vermehrte a-Glyzerophosphatbildung zugunsten der Resynthese verschoben und die Abgabe der U F S aus dem Fettgewebe gehemmt. Umgekehrt bewirkt ein verminderter Glukoseumsatz im Fettgewebe eine gesteigerte UFS-Abgabe. Auf diese Weise übt Glukose eine im Fettgewebe realisierte Kontrollfunktion auf den Fettsäurestoffwechsel aus [3]. BINDA et al. [2] nehmen für Fruktose einen ähnlichen Wirkungsmechanismus an. D a aber Fruktose — im Gegensatz zur Glukose — vorwiegend in der Leber umgesetzt wird und auch die freien Fettsäuren des Plasmas zu einem erheblichen Prozentsatz von der Leber aufgenommen werden [LOMBARDI [4]), lag es nahe zu untersuchen, ob und in welchem Maße Fruktosezufuhr die Fettsäurebilanz der Leber beeinflußt. Außerdem stellen die Intermediärprodukte des hepatischen Fruktoseabbaus verschiedene Verknüpfungspunkte zum Stoffwechsel der Fettsäuren dar. Für das Studium dieser Problematik schien uns die kontinuierliche Infusion der Fruktose am besten geeignet zu sein. Bei dieser Versuchsanordnung lassen sich im Fließgleichgewicht des Stoffdurchsatzes im Organismus bestimmte Stoffwechselgrößen und deren Veränderung über einen längeren Zeitraum reproduzierbar messen. Die Reaktion des Organismus auf die zugeführte Substanz kann unter Bedingungen studiert werden, denen auch endogen entstandene Metaboliten physiologischerweise unterliegen. Methodik

Versuchstiere waren 2,8 —3,0 kg schwere Kaninchen mit operativ eingelegten Polyäthylenkathetern in der Jugularvene (zur Infusion) und in der Lebervene (zur Blutentnahme). Bei einigen Tieren wurden außerdem Katheter in die Pfortader eingelegt. Die Katheter wurden nach der Operation mit Heparinlösung aufgefüllt, die unmittelbar vor dem Versuchsbeginn wieder abgezogen wurde (Heparin steigert über eine Aktivierung der Lipoproteinlipase die Plasmakonzentration der UFS). Die Tiere wurden 36 — 48 Std. nach der Operation nichtanaesthesiert im postabsorptiven Zustand eingesetzt. Sie waren während der Versuche in den Käfigen frei beweglich. Fruktose bestimmten wir [ 5 ] nach D I S C H E und B O R E N F R E U N D [ 6 ] und Glukose enzymatisch nach R I C H T E R I C H und C O L O M B O [7] in jeweils 5 0 jxl Plasma. Die U F S wurden nach T R O U T et al. [ 8 ] aus 1 0 0 oder 2 0 0 (xl Plasma extrahiert und kolorimetrisch nach der von K O N I T Z E R et al. [9] angegebenen Methode bestimmt. Zur Messung der Leberdurchblutung haben sich die Farbstoff-Clearance-Methoden bewährt. Neben dem Bromsulphalein, dessen Bestimmung im Plasma Schwierigkeiten bereitet ( S H O E M A K E R [ 1 0 ] ) , wurde in letzter Zeit vielfach Indocyaningrün Wofaverdin) 1 eingesetzt. Wofaverdin wird praktisch vollständig durch die Leber ausgeschieden, Wir danken dem V E B Farbenfabrik Wolfen für die freundliche Überlassung des Farbstoffes. 1

Fettsäurestoffwechsel unter Fruktoseinfusion

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und ein enterohepatischer Kreislauf konnte nicht nachgewiesen werden [11], [12]. Wir infundierten kontinuierlich 5 mg • k g - 1 • S t d . - 1 Wofaverdin. Die relativ hohe Farbstoffdosis wählten wir, um bei den geringen Plasmamengen, die bei kleineren Laboratoriumstieren gewonnen werden können, genügend große Extinktionsdifferenzen zwischen den Werten des Arterien- und des Lebervenenblutes zu erhalten. Wofaverdin wurde in 200 (¿1 Plasma nach Extraktion mit 1,0 ml Azeton spektrophotometrisch bestimmt (805 nm, d = 1 cm). Die Plasmakonzentration für Fruktose und Glukose wurde aus Doppelbestimmungen, die für UFS und Wofaverdin aus Dreifachbestimmungen ermittelt. Die Stoffwechselbilanz der Leber für UFS und Fruktose berechneten wir aus dem Plasmadurchfluß und der transhepatischen Konzentrationsdifferenz: Ut = (cA - cLV) • E H P F . Als hepatische Extraktionsrate bezeichnen wir den Quotienten E(%) = ° A ~ ° L V • 100 . CA Alle Angaben über Infusionsgeschwindigkeiten und den Stoffumsatz in der Leber sind auf 1 kg Körpergewicht bezogen. Wie Vorversuche ergaben, bestehen im postabsorptiven Kontrollzustand und auch während der Fruktoseinfusion zwischen der Konzentration der UFS in der Pfortader und im arteriellen Blut keine systematischen und signifikanten Differenzen. Für die Berechnung des hepatischen Stoffumsatzes wurde deshalb nur die arterielle Konzentration berücksichtigt. Nach S T R A C K et al. [ 1 3 ] kann man aus der mechanisch und thermisch hyperämisierten Ohrrandvene des Kaninchens praktisch arteriell zusammengesetztes Blut gewinnen. Die Versuchsanordnung, insbesondere die Zeit der Blutentnahmen, geht aus Abbildung 1 hervor. Nach einer 4- bis östündigen Kontrollperiode wurde 8 — 10 Std. lang Fruktose bzw. Glukose infundiert. 10stündige Infusion von RINGER-Lösung h a t t e auf die UFS-Plasmakonzentration und die Extraktionsrate keinen sichtbaren Einfluß. Alle in den Abbildungen oder Tabellen angegebenen Werte sind Mittelwerte des jeweiligen Versuchskollektivs. Die statistische Auswertung erfolgte im Paarvergleich (t-Test) mit zweiseitiger Fragestellung. Ergebnisse

Wir infundierten, in Anlehnung an frühere Untersuchungen über den Fruktoseumsatz [14], i.v. 0,25, 0,50 und 0,75 g • kg" 1 • Std." 1 Fruktose 10 Std. lang. Das Umsatzgleichgewicht stellt sich praktisch innerhalb von 2 Std. ein. Die wichtigsten aus dieser Versuchsreihe berechneten Kenndaten des Fruktoseumsatzes sind in Tabelle 2 zusammengefaßt. Sie weichen nur geringfügig von den bereits früher mitgeteilten Ergebnissen [14] ab. Im Rahmen dieser Untersuchungen interessieren besonders der Anteil der Leber am Gesamtumsatz der Fruktose. Von 0,25 und 0,50 g • k g - 1 • S t d . - 1 werden 86,2 bzw. 90,1% in der Leber umgesetzt. Bei der Zufuhr von 0,75 g • k g - 1 • Std. - 1 sinkt der hepatische Umsatz auf 73,5% ab. Unter Berücksichtigung der Ausscheidung werden demnach 8,1, 5,4 bzw. 16,6% der infundierten Fruktose extrahepatisch verwertet. Vermutlich ist die überhöhte Plasmakonzentration der Fruktose bei der Infusionsgeschwindigkeit 44«

674

E. KUHFAHL, F. MÜLLER

Tabelle 1 U FS-Plasmakonzentration im arteriellen Blut und in der Pfortader während der Kontrollperiode (RINGER-Infusion) sowie unter Zufuhr von 0,75 g • k g - 1 • S t d - 1 Fruktose. Angaben in (j.val • 1 _ 1 • N = 3 RiNGER-Infusion

Fruktoseinfusion

Zeit [Std.]

2

4

6

8

2

4

6

8

art. Blut Pfortader

572 591

610 557

551 562

570 593

289 251

233 210

189 206

206 181

0,75 g • k g - 1 • Std. - 1 Ursache des quantitativ bedeutsamen extrahepatischen Umsatzes. Dafür kommen außer der Niere und Darmschleimhaut nach FROESCH u n d GINSBERG [ 1 5 ] d a s F e t t g e w e b e in F r a g e .

I n der Muskulatur

wird praktisch keine Fruktose umgesetzt (Übersicht siehe bei LEUTHARDT u n d STUHLFAUTH [ 1 6 ] ) .

Die Plasmakonzentration der U F S beträgt in der Kontrollperiode 559 [Aval X X l " 1 (Durchschnittswerte aller Versuche, N = 17). Diese Werte liegen im Bereich der für Mensch, Schaf, Hund und Ratte in der Literatur angegebenen Plasmaspiegel. Allerdings geben LUTTON und TSALTAS [17] für das Kaninchen 2,6—3,8 mg % ( ^ 100—140 |i.val • l" 1 ) an. Ein beträchtlicher Teil der U F S wird in der Leber umgesetzt. Die hepatische Extraktionsrate beträgt im Durchschnitt 41,6% und der absolute Umsatz in der Leber 7,44 [xval • k g - 1 • min - 1 . Die Extraktionsrate von 41,6% weicht nur gering von dem beim Hund gefundenen Werten ab [18]. Ähnlich wie aus zahlreichen Angaben im Schrifttum ersichtlich ist, schwankte auch in unseren Versuchsserien die UFS-Plasmakonzentration und die Extraktionsrate der Leber von Tier zu Tier beträchtlich. In Abhängigkeit von der Infusionsgeschwindigkeit werden sowohl die Plasmakonzentration der U F S als auch die Extraktionsrate der Leber signifikant verändert. Die Versuchsergebnisse sind in den Tabellen 2 und } zusammengefaßt. Unter der kontinuierlichen Infusion von 0,75 g • k g - 1 • Std. - 1 Fruktose (Abb. 1) fällt der UFS-Plasmaspiegel um 65,8% gegenüber der KontrollTabelle 2 Intravenöse Infusion von Fruktose. Plasmakonzentration im arteriellen Blut (I) und in der Lebervene ( I I ) . Fruktoseumsatz in der Leber, renale Ausscheidung und Verwertung in den extrahepatischen Geweben (in % der Zufuhr)

Zufuhr

Plasmakonzentration [mg%]

[g.kg-i-Std-i]

I

0,25 0,50 0,75

15,3 28,6 79,3

|

II 4,6 3,5 51,9

EHPF ml • k g - 1 • m i n - 1 33,3 29,8 33,6

Umsatz Ausscheiin der dung Leber

Umsatz in extrahepatischen Geweben

[%]

[%]

[%]

86,2 90,1 73,5

5,7 4,5 9,9

8,1 5,4 16,6

Fettsäurestoffwechsel unter Fruktoseinfusion

675

Tabelle 3 _ UFS-Plasmakonzentration im arteriellen Blut (I) und in der Lebervene (II). d ^ sd = Differenz der arteriellen UFS-Plasmaspiegel zwischen Kontrollperiode und während Fruktoseinfusion (Mittelwerte und Standardabweichung) Fruktoseinfusion [g • k g - i • 0,25 0,50 0,75

Plasmakonzentration [jxval • l - 1 ] N

Std-1] 5 7 5

Kontrollperiode I II 605 549 530

372 291 333

Fruktoseinfusion I II 662 440 181

503 315 76

d

±sd

P

+ 57 ± 31

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1

Plasmakonzentration und hepatische Extraktionsrate der U F S zeigen unter kontinuierlicher Infusion verschiedener Fruktosemengen kein einheitliches Verhalten. Aufschlußreich ist besonders die Zufuhr von 0,50 g • k g - 1 • Std. - 1 Fruktose. Die Extraktionsrate der Leber für U F S ist gegenüber der Kontrollperiode vermindert. Unterstellt man zunächst, daß der UFS-Stoffwechsel in den anderen Geweben unverändert bleibt (Abgabe aus dem Fettgewebe, Verwertung in den extrahepatischen Geweben, z. B. Aufnahme durch die Muskulatur), müßte die Plasmakonzentration infolge der verminderten hepatischen Extraktionsrate ansteigen. Da Fruktose in der Muskulatur kaum verwertet wird, ist ein Einfluß auf die Fettsäureaufnahme in diesem Gewebe unwahrscheinlich. Der Abfall der UFS-Plasmakonzentration um 19,9% läßt sich danach nur durch eine gleichzeitig verminderte Abgabe von Fettsäuren aus dem Fettgewebe erklären. Das trifft auch für die Infusion von0,75 g • k g - 1 • Std. - 1 Fruktose zu. Der Anstieg der UFS-Plasmakonzentration während der Zufuhr von 0,25 g • k g - 1 • Std. - 1 Fruktose kann auf die verringerte hepatische Extraktionsrate zurückgeführt werden. Wahrscheinlich wird aber auch bei dieser Fruktosedosierung die Freisetzung von Fettsäuren aus dem Fettgewebe gehemmt und die verminderte Aufnahme durch die Leber teilweise kompensiert. Es ergeben sich demnach folgende Schlußfolgerungen : Unter der Zufuhr verschiedener Fruktosemengen beeinflussen Leber und Fettgewebe entweder gegenläufig oder synergistisch die UFS-Konzentration im Plasma. Quantitative Aussagen über die Anteiligkeit beider Organe sind nur durch den Einsatz markierter Fettsäuren möglich. Die geschilderten Zusammenhänge werden durch den Fruktosestoffwechsel in Leber und Fettgewebe verständlich.

Fettsäurestoffwechsel unter Fruktoseinfusion

679

Im Fettgewebe wird Fruktose durch Hexokinase phosphoryliert [15], [19]. Infolge des hohen / ^ - W e r t e s der Hexokinase gegenüber Fruktose und der geringen Affinität zum Transportsystem [19] ist ihre Umsatzgeschwindigkeit im Fettgewebe gering und wird erst bei relativ hohen Substratkonzentrationen, wie das bei der Infusion von 0,75 g • k g - 1 • Std. - 1 der Fall sein dürfte, quantitativ bedeutsam. Nach Spaltung in Triosen kann aus Fruktose a-GP entstehen, das zur Resynthese der durch ständige Hydrolyse freigesetzten Fettsäuren dient. Das anfallende freie Glyzerin kann vom Fettgewebe nicht wieder phosphoryliert werden [20], [21]. Wie aus den stöchiometrischen Verhältnissen hervorgeht und CAHILL et al. [22] auch experimentell nachweisen konnten, genügen bereits geringe a-GP-Mengen, um das Gleichgewicht zugunsten der Resynthese der Triglyzeride zu verschieben und die Abgabe freier Fettsäuren an das Plasma zu vermindern. Damit wird verständlich, daß auch eine quantitativ geringe Fruktoseaufnahme durch das Fettgewebe, z. B. unter der Infusion von 0,50 g • k g - 1 • Std." 1 , die UFS-Plasmakonzentration senkt. Eine indirekte Wirkung der Fruktosezufuhr auf das Fettgewebe, z. B. über einen erhöhten Blutglukosespiegel und entsprechend gesteigerte periphere Glukoseaufnahme, kann ausgeschlossen werden. Der Glukosespiegel zeigt, unabhängig von der Fruktosezufuhr, in den ersten Stunden immer eine Tendenz zum Abfall und erst nach einigen Stunden einen Anstieg von 5—10mg% über den Ausgangswert. Es besteht somit keine Korrelation zwischen Abfall der UFS-Plasmakonzentration und dem Glukosespiegel. In der Leber weist Fruktose durch die Bildung von Azetyl-CoA (Fettsäuresynthese) und a-GP (Veresterung der Fettsäuren zu Triglyzeriden und Phosphatiden) Verknüpfungspunkte zum Stoffwechsel der Fettsäuren auf. Der Einbau in Fettsäuren konnte mit 14C markierter Fruktose nachgewiesen werden [23]. a-GP wird hauptsächlich über Dihydroxyazetonphosphat aus Fruktose gebildet. Die reduktive Umwandlung des Glyzerinaldehyds in Glyzerin ist nach LAMPRECHT U. R A U S C H E N B A C H [ 2 4 ] praktisch ausgeschlossen. Nach M Ü N T Z und V A N K O [ 2 5 ] ist a-GP eines der Hauptprodukte des Fruktosestoffwechsels in der Leber. Einer Diskussion unserer Befunde anhand intermediärer Stoffwechselreaktionen stellt sich jedoch die Tatsache erschwerend entgegen, daß wir durch die Bestimmung der transhepatischen Konzentrationsdifferenzen zwar die Bilanz des Organs exakt erfassen, aber nicht entscheiden können, inwieweit in diesen komplexen Vorgang Stoffaufnahme und -abgabe sowie eine de-novo-Synthese eingehen. Die Aufnahme von UFS aus dem Plasma in die Zelle ist noch nicht in allen Teilschritten aufgeklärt. Nach R O S E et al. [26] beträgt die intrazelluläre Konzentration der freien Fettsäuren (die an Protein gebunden vorliegen sollen) in der Rattenleber 0,4—0,8 |J.val/g Gewebe, liegt also im Bereich des Plasmaspiegels. Die Aufnahme der UFS aus dem Plasma wird bestimmt

680

E . KUHFAHL, F.

MÜLLER

durch ihre Plasmakonzentration und die Geschwindigkeit, mit der die intrazellulär proteingebundenen Fettsäuren in den Stoffwechsel eingeschleust werden (EVANS [27]), d. h. durch Überführung in die Azyl-CoAThioester und nachfolgende Veresterung mit a-GP. Die Triglyzerid- bzw. Phosphatidsynthese ist die quantitativ wichtigste Reaktion der Azyl-CoAEster. Nur 25% der aufgenommenen Fettsäuren werden direkt oxydiert [18]. Durch eine gesteigerte de-novo-Synthese von Fettsäuren (bzw. deren CoAEstern) könnte danach andererseits die Aufnahme aus dem Plasma kompensatorisch gehemmt werden. So erklären wir die verminderten Extraktionsraten bei der Zufuhr von 0,25 und 0,50 g • k g - 1 • Std. - 1 Fruktose. Im Gegensatz dazu fanden wir unter der Zufuhr von 0,75 g • k g - 1 • S t d . - 1 eine erhöhte hepatische Extraktionsrate für UFS. Als Ursache dafür postulieren wir eine gesteigerte Triglyzerid-Synthese durch vermehrtes Angebot an a-GP. Dem intrazellulären Pool werden mehr Fettsäuren entnommen und der Nachstrom aus dem Plasma ist beschleunigt. Für die Veresterung zu Triglyzeriden stehen der Leber ein mitochondriales und ein mikrosomales Enzym zur Verfügung, die sich durch die optimale a-GP-Konzentration unterscheiden. Nach TZUR et al. [28] ist das mitochondriale System schon bei einer Konzentration von 1 [xMol a-GP/g Gewebe, also im Bereich der normalen a-GP-Konzentration in der Leber, maximal wirksam. Die erforderliche a-GP-Konzentration für die mikrosomale Triglyzeridsynthese beträgt 5—10 ¡xMol/g Gewebe. Eine zusätzliche mikrosomale Triglyzeridsynthese wird also nur durch ein erheblich gesteigertes Substratangebot (a-GP) möglich sein. Diese Erklärungsgrundlage wird gegenwärtig durch die Bestimmung der a-Glyzerophosphatkonzentration während kontinuierlicher Fruktoseinfusion geprüft. Im Gegensatz zur Fruktose erweist sich die Wirkung von Glukose auf den UFS-Umsatz als ausschließlich peripher, über das Fettgewebe ausgelöst. Die hepatische Extraktionsrate bleibt unverändert, obwohl unter der intraportalen Infusion von 0,75 g • k g - 1 • Std. - 1 Glukose ein beträchtlicher Teil der zugeführten Glukose von der Leber aufgenommen wird. Die unterschiedliche Wirkung eines quantitativ vergleichbaren Umsatzes von Fruktose und Glukose in der Leber auf die UFS-Bilanz weist auf die Bedeutung des voneinander abweichenden intermediären Stoffwechsels der beiden Monosaccharide hin. Die Fettsäurebilanz der Leber ist unter allen Fruktosedosierungen signifikant erniedrigt, entweder durch die verminderte hepatische Extraktionsrate (0,25 g • k g - 1 • Std. - 1 ) oder infolge des gesenkten arteriellen UFS-Plasmaspiegels (0,75 g • k g - 1 • Std. - 1 ). Durch die veränderte Extraktionsrate verschiebt sich der Anteil der Leber am Fettsäureumsatz des Gesamtorganismus. Unter der Infusion von 0,25 und 0,50 g • k g - 1 • S t d . - 1 nimmt er ab, während er bei 0,75 g • k g - 1 • Std." 1 Fruktose stark zunimmt. Die Ergebnisse weisen außerdem daraufhin, daß der Fettsäureumsatz in der Leber nicht unter allen Bedingungen lediglich eine Funktion der UFS-

681

Fettsäurestoffwechsel unter Fruktoseinfusion

P l a s m a k o n z e n t r a t i o n i s t [29]. Ä h n l i c h e B e f u n d e e r h o b e n SHOEMAKER e t al. [30] f ü r d i e W i r k u n g v o n I n s u l i n a u f d i e F e t t s ä u r e a u f n a h m e d e r L e b e r . Die Untersuchungen werden gegenwärtig am alloxandiabetischen Tier und hinsichtlich der antiketogenen W i r k u n g der F r u k t o s e fortgesetzt.

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682

E.

KUHFAHL, F.

MULLER

Summary E. K U H F A H L and F . M U E L L E R : E f f e c t of fructose on t h e metabolism of free f a t t y acids in t h e liver and adipose tissue T h e plasma concentration of unesterified f a t t y acids (UFA) and t h e f a t t y acid balance of t h e liver under continuous fructose infusion have been determined on rabbits. The U F A p l a s m a concentration in r a b b i t s a m o u n t s t o 559 (xval • l - 1 , t h e hepatic extraction r a t i o 4 1 . 6 percent, U F A absorption b y t h e liver 7.44 (ival • k g - 1 • m i n - 1 . Under continuous infusion of varying a m o u n t s of fructose t h e hepatic extraction r a t i o and U F A plasma concentration exhibited a varying behaviour. Amounts u p to 0.50 g • k g - 1 • h o u r - 1 of fructose diminished t h e hepatic extraction ratio, whereas significant rise is observed with infusion of 0.75 g • k g - 1 • h o u r - 1 . Administration of 0.25 g • k g - 1 • h o u r - 1 of fructose increases t h e U F A plasma concentration by 9 percent, while decrease occurs with higher infusion r a t e s (to 34.2 percent of t h e initial value, when infusing 0.75 g • k g - 1 • h o u r - 1 ) . I t is concluded t h a t t h e presence of fructose in t h e adipose tissue and t h e liver is affecting t h e free f a t t y acid metabolism. The action on f a t t y acid synthesis and esterification to triglycerides in t h e liver ist discussed. PcaiOMe E.

Ky$aJii>

H H-Stat-Methode nach der Anordnung von THOMITZEK [13] gemessen. DL- und L - P a l m i t o y l c a r n i t i n waren reinste P r ä p a r a t e [14] und wurden als neutralisierte Chloride verwendet. Die anderen S u b s t a n z e n waren handelsübliche P r ä p a r a t e . Die dargestellten Versuchsergebnisse sind jeweils r e p r ä s e n t a t i v e Einzelversuche aus einer Gruppe gleichsinnig verlaufender Versuche. Ergebnisse

In Abbildung 1 ist die Wirkung verschiedener Konzentrationen von CP dargestellt. Von 3,9 • 10" 6 m an führt CP zu einer initialen Schwellungsphase, die etwa 2—3 m i n anhält. Dann setzt bei den niederen CP-Konzentrationen spontan eine Kontraktion ein, die bis zu 25% der Schwellungsänderung beträgt. Etwa ab 6,5 • 1 0 - 6 M CP ist die Kontraktion nicht mehr deutlich zu beobachten, die Schwellung läuft jetzt gleichmäßig weiter. Da wir die Kontraktion der Mitochondrien vereinzelt auch in Medien ohne Mg + + oder Auszugsweise vorgetragen von R . DARGEL: 3. K o n g r e ß der F E B S , W a r s c h a u 1966, (Abstracts) Acad. Press., N . Y . S. 160

1

46*

706

R. D a r g e l , E. S t r a c k

Abb. 1. Mitochondriale Schwellung und Kontraktion unter dem Einfluß verschiedener CP-Konzentrationen. Streulichtmessungen. 3 mM MgCl2, 5 mM Sukzinat. CP (in (im) jeweils angegeben

Sukzinat beobachten konnten, untersuchten wir den Einfluß dieser Stoffe auf den Ablauf der Kontraktion. Abbildung 2 zeigt die Wirkung unterschiedlicher Mg + """-Konzentrationen. Die Kontrolle ohne Sukzinat und Mg + + sowie die Zugabe von Sukzinat allein ergaben keine Kontraktion. In Gegenwart von 3 mM Mg + + und 5 mM Sukzinat ist die Kontraktion nach 7 min ausgeprägt. Die Erhöhung der Mg + "'"-Konzentration auf 30 mM schwächt die Kontraktion gering ab, verringert aber wesentlich die initiale Schwellung, wahrscheinlich als Ausdruck eines osmotischen Effektes vom Magnesiumchlorid. Zusatz von 5 mM anorganischem Phosphat vermindert die Kontraktion deutlich, 10 mM hebt sie nahezu auf. Die Abhängigkeit der Kontraktion vom pW des Mediums geht aus Abbildung 3 hervor. Sie ist bei />H 7,5 maximal und beträgt etwa 50% der vorangegangenen Schwellungsänderungen. Sinkendes und steigendes pH verringert die Kontraktion, bei pH 8,5 tritt sie nicht mehr ein. In dem Maße, in dem die Kontraktion geringer wird, ist die Schwellung während der beobachteten 12 min erhöht. Da die langkettigen Acylcarnitine oberflächenaktive Verbindungen sind, war zu prüfen, ob sich andere oberflächenaktive Stoffe ähnlich verhalten. Abbildung 4 zeigt, daß Triton X-100 weder bei niederen noch bei hohen Konzentrationen eine Kontraktion hervorruft, sondern nur das Ausmaß der Schwellung in Abhängigkeit von der Konzentration steigert. Steigende Tritonmengen unterdrücken mehr und mehr die durch CP auslösbare Kontraktion. In Abbildung 5 ist der Einfluß von KCN auf die Kontraktion durch CP dargestellt. 2 mM KCN, zu Beginn der Inkubation dem Ansatz zugegeben, hemmen die initiale Schwellungsphase und die Kontraktion. Setzt man

K o n t r a k t i o n von Mitochondrien

707

Abb. 2. E i n f l u ß von M g + + u n d anorganischem P h o s p h a t auf die CP-induzierte K o n t r a k t i o n von Mitochondrien. Streulichtmessung. 5,2 [¿m C P ; 5 EM S u k z i n a t ; x x 30 mM M g + t ; • A 3 mM Mg + + ; • • 3 mM M g + + + 5 mM V v 3 mM Mg + + + 10 mM O o nur Sukzinat; • • Kontrolle

30

¿rg0'

20

Abb. 3. K o n t r a k t i o n von Mitochondrien d u r c h CP bei verschiedenem pH. Streulichtmessung. 3 mM MgCl 2 , 5 mM S u k z i n a t ; o O Maximale Schwellung, die w ä h r e n d der 12 min I n k u b a t i o n s z e i t b e o b a c h t e t w u r den (linke O r d i n a t e ) ; Kontraktion - X 100 m a x i m a l e Schwellung # % (rechte Ordinate)

-

10

5 pH

das Zyanid erst kurz vor Beginn der im Kontrollversuch auftretenden Kontraktion zu, so wird sie ebenfalls unterbunden und die Schwellung verstärkt. Der Abbildung 6 ist zu entnehmen, daß sich die Kontraktion durch ArsenatKonzentrationen über 1 mM unterdrücken läßt. Konzentrationen von 0,1 und 0,5 mM Arsenat verringern die initiale Schwellung, während größere Konzentrationen sie gering steigern. Das Ausmaß der Kontraktion bleibt bei 0,1 und 0,5 mM Arsenat gleich groß, es ist jedoch bei 1,0 mM deutlich herabgesetzt. Den Einfluß von D N P auf die Kontraktion durch CP macht Abbildung 7 deutlich. Ab 0,05 mM D N P kommt es zu einer deutlichen Vergrößerung der initialen Schwellung sowie zu einer stetig verringerten Kontraktion der Lebermitochondrien. 1 mM D N P unterdrückt die Kontraktionsphase.

708

R . DARGEL, E .

STRACK

Abb. 4. Schwellung von Mitochondrien unter dem Einfluß von Triton X - 1 0 0 . Streulichtmessung. 3 mM MgCl2, 5 niM Sukzinat. Kurve I : Kontrolle ohne Triton und CP. Kurve I I : 0 , 0 0 0 3 5 % Triton; Pfeil bedeutet Zugabe von 5,2 (xm CP. Kurve I I I : 0 , 0 0 0 7 % Triton; Pfeil 5,2 fxM CP. Kurve I V : 0 , 0 0 1 4 % Triton. Kurve V : 0 , 1 4 % Triton

Abb. 5- Hemmung der CP-induzierten Kontraktion durch KCN. Streulichtmessung. 5,2 (im CP, 3 mM MgCl2, 5 mM Sukzinat. Pfeil: Zugabe von KCN. • • Kontrolle ohne CP; o O 2 mM KCN; • • (unterer Ast) 2 MM KCN

Abb. 6. Einfluß von Arsenat auf die durch CP ausgelöste Kontraktion. Streulichtmessung. 5,2 um CP; Kontrolle ohne CP und Arsenat. Arsenatkonzentrationen (in MM) angegeben

Kontraktion von Mitochondrien

709

Tabelle 1 enthält die Ergebnisse mit verschiedenen Azidkonzentrationen. Mit 0,2 mM Azid nimmt die Kontraktion gering zu, ab 0,5 mM Azid wird sie bei verstärkter initialer Schwellung vermindert, 5 mM hemmt die Kontraktion vollständig. Bei sehr hohen Azidkonzentrationen (10 mM) wird auch die durch das Acylcarnitin ausgelöste Schwellung verringert. Tabelle 1 H e m m u n g d e r CP-induzierten K o n t r a k t i o n d u r c h Azid. MgCl 2 3 mM, S u k z i n a t 5 mM, l - C P 3 [¿m Azid [mM]

A Maximale initiale Schwellung

B Kontraktionsphase

0,2 0,5 1,0 5,0 10,0

13,9 13,0 14,0 19,9 27,2 20,1

8,6 9,1 5,2 2,8

[%]

[%]

C B A

—

X

100

61,8 70,0 36,4 14,1

—

—

-

-

D Hemmung d u r c h Azid

[%] —

41,2 77,2 100 100

R . DARGEL, E . STRACK

710

Die physikalischen Eigenschaften des CP lassen vermuten, daß es die Membranstruktur beeinflußt und dadurch die Kontraktion auslöst. Da die Mg + + -aktivierbare ATPase von Mitochondrien mit der Integrität der Membran in engem Zusammenhang steht, prüften wir das Verhalten der ATPase von Rattenherzsarkosomen. Wie aus Abbildung 8 hervorgeht, verringern CP-Konzentrationen um 10~5 M die Phosphatfreisetzung somit büßt die durch Mg + + stimulierbare ATPase an Aktivität ein. Erst steigende Konzentrationen von CP vergrößern die ATP-Hydrolyse. Tabelle 2 Mg++-aktivierte A T P a s e v o n D i g i t o n i n p a r t i k e l n u n t e r d e m E i n fluß von CP. M e d i u m : 1,35 M KCl, 3 MM MgCl 2 , 4 MM A T P , pH 7,5; 150 (IG P r o t e i n / A n s a t z . G e s a m t v o l u m e n 4,0 m l b e i 37 °C. p H - S t a t Bedingungen DL-CP [M]

10"5 10"4

10-3

Versuch 1 ;j.Äq H + / m i n 0,125 0,157 0,186 0,244

% 100 125 149 195

Versuch 2 LiÄq H + / m i n 0,117 0,152 0,176 0,211

% 100 130 150 180

Zerstört man die Mitochondrienmembran mit Digitonin, wird die ATPaseAktivität dieser Partikel durch Mg + + deutlich erhöht. Tabelle 2 gibt den Einfluß verschiedener CP-Konzentrationen auf die mit Mg + + aktivierte ATPase wieder. 10~5M CP führen schon zu einer Erhöhung der ATPaseAktivität. 10~4 M und 10" 3 M CP steigern sie wesentlich stärker. Diskussion

Oberflächenaktive Stoffe lassen bekanntlich Mitochondrien schwellen, höhere Konzentrationen von ihnen zerstören sie [15], [16], [17]. Auch Acylcarnitine mit längerer Acylkette führen zur Schwellung von Leber- und Herzmitochondrien [5], jedoch zeigen sie hierbei Besonderheiten, die von physiologischem Interesse sind. Kleinste Konzentrationen von CP lösen nach einer initialen Schwellung eine mehr oder minder ausgeprägte Kontraktion aus. Zusatz von Mg + + und Sukzinat verstärken diesen Prozeß, wobei sich das Sukzinat durch andere Substrate der primären Dehydrogenasen ersetzen läßt [9]. Anorganisches Phosphat, das nur unter aeroben Bedingungen zur Schwellung führt [18], [19], kann die durch CP induzierte Kontraktion aufheben. Wahrscheinlich führt das Phosphat zur vermehrten Bildung energiereicher, phosphorylierter Zwischenverbindungen, die nach Azzi und A Z Z O N E [20] Voraussetzung für „high amplitude"-Schwellungen sind. Hemmung des Elektronentransportes führt zum Verlust der Kontraktionsfähigkeit. So verhindert Zyanid die Kontraktion bei Zugabe sowohl vor dem

Kontraktion von Mitochondrien

711

Start als auch unmittelbar vor der Kontraktion. Im ersten Falle unterdrückt es zugleich die durch CP auslösbare initiale Schwellungsphase. Diese Beobachtungen weisen dem Elektronentransport auch für den Schwellungsvorgang Bedeutung zu. In ähnlicher Weise ließ sich durch CN~ die Phosphatinduzierte Schwellung von Mitochondrien vollständig hemmen [21], [22]. Bereits kleine Konzentrationen von DNP, die zur Entkopplung der oxydativen Phosphorylierung führen [23], verringern die Kontraktion der Mitochondrien; aber erst größere wie 1 m i hemmen sie völlig. Sicherlich ist die Entkopplung die Ursache für die Wirkung des DNP. Auch Arsenat, das die Mg + + -aktivierbare ATPase stimuliert [24], könnte durch den Zerfall des Zwischenproduktes I KeHHe cyjib^rnapHJibHoii npHpoubi HeopraHHHecKOii nHpo$oc(fiaTa3bi H3 nenapHbix apoiKHteii B OTJiHiiie

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Acta biol. med. german., Band 17, Seite 721 — 726 (1966J Aus dem Institut für Pharmakologie und Toxikologie der Medizinischen Akademie Magdeburg (Direktor: Prof. Dr. H. M A T T H I E S )

Elektrophoretische Markierung von Nervenzellen bei extrazellulärer Ableitung der Einzelzell-Aktivität mit Vielfach-Glasmikroelektroden W.

POHLE und H.

MATTHIES

(Eingegangen am 21. 6. 1966)

Zusammenfassung E s wird eine Methode beschrieben, die eine Markierung von Nervenzellen bei der extrazellulären Ableitung der Aktionspotentiale mit Vielfach-Glasmikroelektroden erlaubt, ohne daß damit eine Zerstörung des Gewebes im Bereich der Elektrodenspitze erfolgt. Auf diese Weise kann eine histologische Auswertung des Ableitungsbereiches durchgeführt werden, und nicht nur, wie bei den meisten bisher beschriebenen Methoden, eine grobe topographische Bestimmung der Lage der Elektrodenspitze. Darüber hinaus erlaubt die Methode die Markierung von mehreren Ableitungsstellen an einem Tier im Verlauf von einigen Stunden. Die Markierung erfolgt durch elektrophoretische Applikation von Trypanblau mit 10 bis 40 (iA. Durch Variation von Stromstärke und Applikationszeit können Farbmarken von 300 [im Durchmesser oder im günstigsten Falle Markierungen von Einzelzellen erreicht werden. Als Gegenfärbung erwies sich Kernechtrot als besonders günstig.

Bei der Ableitung der Aktionspotentiale einzelner Neuronen mit Glasmikroelektroden bereitet die Markierung der Lage der Elektrodenspitze zur späteren histologischen Bestimmung der untersuchten Hirnregion oder gar zur genaueren Feststellung der elektrodennahen Zellen eine besondere Schwierigkeit. Die uns aus der Literatur bekannten Markierungsmethoden erschienen uns entweder zu ungenau, zerstören das Gewebe oder sind nur mit sehr aufwendigen histologischen Methoden durchzuführen, was ihre Anwendung bei größeren Versuchsserien einschränkt. Das Setzen von Mikroläsionen oder das Fixieren des Gewebes unter Belassen der Elektrodenspitzen erschien uns zu grob [3] —[5], [7]. und S Z A B O [5] lehnten die Markierungsmethoden von B A U M G A R T E N [1] mit Goldchlorid in KCl [10], von N I C H O L et al. mit Kristallviolett und Perchlorsäure [8], von O I K A W A et al. mit Silbernitrat und anschließender Reduktion mit Natriumthiosulfat [ 1 1 ] , von M I T A R A L mit Lithiumkarmin in KCl [10] und die Anwendung von Eisensalzen nach R A Y P O R T [12] und T O M I T A [14] ab, da sie für den Routinebetrieb viel zu kompliziert seien. Neben den Mikroläsionsmethoden wird die BerlinerBlau-Reaktion in verschiedensten Modifikationen am häufigsten in der Literatur GALIFRET

47*

722

W.

POHLE, H .

MATTHIES

beschrieben [2], [6], [12], [14]. Da hierbei eine Perfusion des Gewebes notwendig wird, sind auch diese Verfahren zu umständlich. Wir suchten deshalb nach einer einfachen und sicheren Methode zur Markierung von Zellgruppen oder Einzelzellen im Nervensystem bei der extrazellulären Ableitung der Aktionspotentiale, die mit keiner Zerstörung der Zellen und des Gewebes verbunden ist und zugleich erlaubt, mehrere Ableitungsstellen nacheinander am gleichen Versuchstier ohne Beeinträchtigung der Potentialableitungen zu kennzeichnen.

Wir stellten uns daher die Aufgabe, eine Markierungssubstanz zu finden, die sich elektrophoretisch durch einen Ast einer Mehrfach-Glasmikroelektrode in den Ableitungsbereich applizieren läßt, nachdem die Wirkung von Substanzen auf die Aktionspotentiale der untersuchten Zelle gemessen worden war. Methodik

Für die Markierungsversuche wurden folgende Substanzen verwendet: Silbernitrat, Bleiazetat, Quecksilberchlorid, Eisenammonsulfat, Triphenyltetrazoliumchlorid, Alizarin S, Methylenblau, Methylgrün, Janusgrün, Trypanblau, Kristallviolett, Akridinorange, Neutralrot, Pikrinsäure, Eosin, Kernechtrot und Hämatoxylin. Nach der Markierung wurden die Gehirne in 10%igem Formalin fixiert, entwässert, in Paraffin eingebettet und 10 ¡j. dick in Serie geschnitten. Zunächst wurden die Schnitte ohne Gegenfärbung betrachtet, später wurden zweckmäßige Gegenfärbungen angewandt. Ergebnisse

Markierung

mit

Metallionen

Blei- und Quecksilber-Ionen lagern sich auf Grund ihrer bekannten hohen Affinität zu SH-Gruppen sehr gut an biologische Strukturen verschiedenster Art an, bleiben als schwerlösliche Chloride im Gewebe liegen und können mit Ammonsulfid gefällt werden. Auch der Nachweis von Blei mit Dithizon wurde erprobt sowie die Verstärkung des Bleiniederschlags durch Entwicklungsversilberung. Bei der Applikation von Silbernitrat entstanden bei der elektrophoretischen Applikation Störungen, da sich der entstehende Silberchlorid-Niederschlag an der Elektrodenspitze festsetzte und beim Herausziehen der Elektrodenspitze verschleppt wurde. Die Markierung mit niederschlagbildenden Schwermetallionen haben allgemein den Nachteil, daß sie zu schwach sind und leicht mit Artefakten verwechselt werden können. Eisenionen wurden als Eisenammoniumsulfat appliziert und mit der Turnbull-Blau-Methode sichtbar gemacht. Es zeigte sich aber, daß die Eisenionen in der Zeit zwischen den einzelnen Markierungen eines Versuchs von der Markierungsstelle aus verhältnismäßig leicht ins Gewebe diffundieren, so daß sich nur relativ große und sehr blasse Höfe bilden.

Vitalfärbung von Nervenzellen

Markierung

mit

723

Triphenyltetrazolium-Ionen

Die Applikation von Triphenyltetrazolium-Ionen ergab an den Applikationsstellen gut abgegrenzte kräftig gefärbte Markierungen durch Bildung des wasserunlöslichen Formazans. Diese Methode ist aber bei Paraffineinbettung nicht verwendbar, da der Farbstoff dabei quantitativ in Lösung geht. Wenn ein Kryostat für Serienschnitte zur Verfügung steht, könnte die Methode aber recht günstig sein. Markierung

mit

Farbstoffen

Markierungen mit Farbstoffen sind aus der Literatur bereits bekannt [8] bis [10]. Wir untersuchten die zur Verfügung stehenden Farbstoffe auf ihre Verwendbarkeit, wobei wir besonderen Wert auf Vitalfarbstoffe und spezifische Substanzen für Nervenfärbungen legten. Auch einige Kern- und Plasma-Farbstoffe wurden einbezogen. Die meisten der angewandten Substanzen gingen bei der Fixierung, Entwässerung und Paraffineinbettung weitgehend in Lösung oder wurden in ihrer Intensität so weit abgeschwächt, daß ein Wiederfinden der Markierungspunkte nur sehr mühevoll und unsicher wäre. Methylenblau, daß sich bei intrazellulärer Ableitung und anschließender Markierung, sowie bei Anwendung der Gefrierschnittechnik gut bewährt [13], gab selbst bei sehr intensiver Markierung, wie sie am frischen Material noch erkennbar war, im Paraffinschnitt nur eine sehr blasse Anfärbung der Nervenzellen. Die besten, im Paraffinschnitt gut sichtbaren Markierungen von Nervenzellen und Gliakernen wurden mit Akridinorange und Trypanblau erreicht. Mit Akridinorange gesetzte Markierungen können im nichtentparaffinierten Schnitt fluoreszenzmikroskopisch sichtbar gemacht werden. Eine Gegenfärbung nach Entparaffinierung des Schnitts ist möglich, aber unter Verlust der Fluoreszenz. Die markierten Zellen müßten vorher lokalisiert werden. Der Nachteil der Akridinorange-Markierung liegt aber vor allem darin begründet, daß der Farbstoff im lebenden Gewebe sehr schnell transportiert wird, so daß die Tötung des Tiers vor der Markierung notwendig ist. Das bedeutet aber, daß in jedem Versuch nur eine Markierung vorgenommen werden kann. Weitaus besser als Akridinorange eignete sich Trypanblau (Chemapol). Nachdem Vorversuche mit injiziertem Trypanblau und die mikroelektrophoretische Applikation mit einfachen Glasmikroelektroden erfolgreich waren, wurde folgende Methode entwickelt: Die Fünffach- oder Sechsfach-Glasmikroelektroden wurden mit Salzsäure, Wasser, Methanol und Äther vorgereinigt. Die gereinigten Elektroden wurden im Vakuum zunächst mit Methanol, dann mit filtriertem destilliertem Wasser gefüllt. Nach Präparation der zentralen Ableit-Elektrode und der seitlichen Applikations-Pipetten für den Versuch wurde in eine der seitlichen Mikropipetten gesättigte, filtrierte wäßrige Trypanblaulösung ein-

724

W . POHLE, H .

MATTHIES

gefüllt und durch Rühren mit einem feinen Draht die Durchmischung der Farbstofflösung mit dem in der Mikropipette verbliebenen Rest von destilliertem Wasser begünstigt. Vor Gebrauch wurde der Widerstand der Pipette gemessen und unter mikroskopischer Kontrolle geprüft, ob bei Anlegen einer Spannung auch Farbstoff an der Elektrodenspitze austritt. Diese Kontrolle ist notwendig, da gelegentlich feinste Teilchen die Pipettenspitze verstopfen können, so daß zwar ein Stromfluß gemessen werden kann, ohne daß Farbstoff in nennenswerter Menge aus der Spitze austritt. Als Stromquellen dienten Anodenbatterien (100 bzw. 200 V), der negative Pol wurde an die Farbstoffelektrode angelegt. Der Elektroden-Widerstand der von uns angewandten Glas-Mikroelektroden betrug bis 30 Mfi. Die Größe der Markierungen ist von der Stromstärke und der Applikationszeit abhängig. Es empfiehlt sich aber, eine Stromstärke von 40 ¡xA nicht zu überschreiten, da sonst das Gewebe im Bereich der Markierung zu stark blasig aufgelockert erscheint. Eine Applikationszeit von 15 min mit 50 [xA ergibt eine Farbmarke mit einem Durchmesser von etwa 3 00 ¡x, eine Applikationszeit von 2 min bei 10 bis 20 ¡x A ermöglicht bei günstiger Lage der Elektrodenspitze in unmittelbarer Nähe der Nervenzelle ihre isolierte Anfärbung. Bei einem Strom von weniger als 10 ¡j.A/min ist im allgemeinen eine sichere Markierung nicht zu gewährleisten.

Abb. 1. Mikromarkierungen aus dem H i r n s t a m m der R a t t e durch Mikroelektrophoretische Applikation von Trypanblau. Fixierung in Formalin, Paraffinschnitte, 10 n; Gegenfärbung mit Kernechtrot.

Maßstab = 100|X

Vitalfärbung von Nervenzellen

725

Zur Gegenfärbung erwies sich Kernechtrot als günstig, da sich dabei die elektrophoretisch intensiv blau markierten Zellen deutlich von den unmarkierten rot gefärbten Zellen abheben (Abb. 1). Unter diesen Bedingungen kann man auch einzelne, isoliert markierte Zellen in den Schnitten wiederfinden, selbst wenn ihre Markierung nicht sehr intensiv ist. Mit diesem Verfahren ist es möglich, an einem Versuchstier nacheinander in größeren Zeitabständen Ableitungen von Aktionspotentialen verschiedener Zellen durchzuführen und jeweils zu markieren. Wir konnten feststellen, daß Markierungen, die 8 Std. vor der Tötung des Tieres vorgenommen wurden, noch einwandfrei histologisch nachweisbar waren. Diskussion

Wenn man bei Messungen der Aktionspotentiale von einzelnen Neuronen im Zentralnervensystem nicht nur Wert auf eine anschließende grobe topographische Bestimmung der Lage der Elektrodenspitze legt, sondern auch eine histologische Auswertung des Elektrodenspitzen-Gebietes durchführen will, eignen sich die meisten der üblichen Methoden zur Markierung der Elektrodenlage nicht, da sie entweder gerade eine Zerstörung des Gewebes im Bereich der Elektrodenspitze zur Markierung benutzen, oder solche Farbmarkierungen anwandten, die entweder eine histologische Auswertung erschwerten oder die für größere Versuchsreihen zu aufwendig waren. Von den von uns geprüften Farbstoffen erwiesen sich viele deshalb als ungeeignet, da sie zum großen Teil beim Fixieren, Entwässern und Paraffinieren aus dem Gewebe herausgelöst wurden. Der Vitalfarbstoff Trypanblau hat den Vorteil, daß er zu 1 % in Wasser, aber nur zu 0,002% in Äthanol löslich ist, und daß er die Nervenzellen selektiv anfärbt, so daß sie sich gut vom umgebenden Gewebe abheben. Die Markierung mit Niederschlägen von Schwermetallen färbt hingegen das ganze Markierungsareal gleichmäßig, wodurch auch histologische Strukturfeinheiten verdeckt werden können. Außerdem besteht eine größere Verwechslungsmöglichkeit mit Artefakten. Da sich Trypanblau als Vitalf arbstoff in der lebenden Zelle, insbesondere auch in der Nervenzelle anreichert, ist es auch möglich, selbst mehrere Stunden zurückliegende Markierungen sicher wiederzufinden. Da es nicht notwendig ist, intraarteriell zu fixieren oder komplizierte histochemische Reaktionen durchzuführen, kann die Trypanblaumarkierung sehr vorteilhaft als Routinemethode in der Neurophysiologie angewandt werden. Literatur [1]

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HASHIMOTO,

Summary W . P O H L E a n d H . M A T T H I E S : E l e c t r o p h o r e t i c a l labelling of nerve cells during extracellular a c t i v i t y registration f r o m single cells using multiple glass microelectrodes A m e t h o d is described which p e r m i t s labelling of nerve cells during extracellular registration of action potentials using multiple glass microelectrodes w i t h o u t a n y d a m a g e to t h e tissue within t h e range of t h e electrode point. T h e procedure enables a histological e v a l u a t i o n of t h e recorded area, a n d n o t only a rough d e t e r m i n a t i o n of t h e location of t h e electrode point, as in m o s t m e t h o d s described so far. In addition, t h e m e t h o d enables labelling of several measuring points in one a n i m a l w i t h i n some hours. T h e label is induced b y electrophoretical application of t r y p a n e blue u p t o 40 (xa/min. Colour labels of 300 FIM in d i a m e t e r or, in f a v o u r a b l e cases, a labelling of single cells could be achieved b y v a r y i n g t h e c u r r e n t i n t e n s i t y or t i m e of application. PeaioMe B. NPH

ILOJIE

H

r.

METTHC:

BHEKJIETOIHOM

NOMOMH

3JIEKTPOIJ>OPETHQECKOE

OTBEHEHHH

MHOHIECTBEHHHX

AKTHBHOCTH

CTEKJIHHHBLX

C

MENEHHE

HEPBHBIX

EFLHHOJLHQHBLX

KJICTOK

KJIETOK

NPW

MHKP03JIEKTP0H0B

O N H C M B A E T C H METOA, N 0 3 B 0 J I H K > M H H M E I E H H E H E P B H B I X KJICTOK N P W BHCKJICTOHHOM OTBEAEHHH

NOTEHUHAJIOB

AEHCTBHH

NPH

NOMOIIJH

MHO?KECTBEHHBIX

CTEKJIHHHBLX

MHKpOaJieKTpOHOB, HE P A 3 P Y I H A H TKaHH B O6JIACTH BEPIHHHBL 3JieKTpO«A. TaKHM O 0 P A 3 O M MOHIHO npOBOHHTb RHCTOJIOTHHECKYK) O U E H K Y BCEFL O6JIACTH O T B E A E H H H , H HE TOJIBKO NATB R P Y S O E TONORPAHIECKOE

ONPEJIEJIEHHE NOJIOMEHHH

BEPMHHBI

AJIEKTPOAA, K a K 3 T 0 HMEET MECTO B 6 o j n > U I H H C T B E ONHCAHHBIX AO CHX N O P METOAOB. KPOME

TORO, AAHHBIII METOA N 0 3 B 0 J I H E T

MEQEHHE H E K O T O P B I X

MECT OTBEAEHHH

HA

npOH3BOHHTCH N Y T E M sjieKTpo^opeTH^ecKOtt annJiHKaiiHH TpHnaHOBoro CHHero CKopocTbio a o 40 MKa/ M H H . B A P B H P O B A H H E M CHJIM TOKa H B P E M E H H A N N J I H K A U H H MOJKHO AOCTHRATB KpaOAHOM JKHBOTHOM B T E ^ E H H E H E C K O J I B K H X MACOB.

MEHEHHE

COHHMX METOK JIHAMETPOM B MKM HVMK, H J I H B HAIIJIYMIIIEM CJIYHAE — M E ' I E I M E E A N HOJIHHHBLX

KJieTOK.

Acta biol. med. german., Band 17, Seite

727—732

(1966)

Aus der Medizinischen Klinik und Poliklinik der Medizinischen Akademie „Carl Gustav Carus" Dresden Lehrstuhl I I (Direktor: Prof. Dr. med. habil. F . R E N G E R )

Untersuchungen zur Ausscheidung von Ni-n-Butylbiguanid sowie Kreatin und Kreatinin i m Harn 1 H. HALLER u n d

S. E .

STRAUZENBLRG

(Eingegangen am 24. 6. 1966) Zusammenfassung Mittels eines papierchromatographischen Nachweises wurde die Ausscheidung von Butyl-BG im Harn nach einmaliger Verabreichung von 200 mg geprüft. Es zeigte sich, daß in den ersten 8 Std. etwa 75%, innerhalb von 24 Std. 85 — 90% des Medikamentes unverändert eliminiert werden. Triazine wurden nicht nachgewiesen. Aus den Ergebnissen läßt sich schließen, daß die Halbwertszeit ca. 2,5 Std. und die Plasmakonzentrationen um oder unter 1,0 [xg/ml betragen. Die daraus sich ergebenden Folgerungen für die Klinik werden besprochen. Die tägliche Kreatininausscheidung betrug zwischen 0,2 — 2,5 g- Die Kreatinurie (0,1 — 1,5 g pro Tag) korrelierte in etwa mit der Stoffwechselführung und wird als empfindlicher Gradmesser einer Verschlechterung des Kohlenhydratstoffwechsels gewertet.

Seit nunmehr fast 10 Jahren spielen die blutzuckersenkenden Substanzen vom Typ der Biguanide, insbesondere das Nj-n-Butylbiguanid (Butyl-BG) sowie das N 1 -/?-Phenylaethylbiguanid (Phenformin = DBI) in der Behandlung gewisser Formen des Mellitus-Syndromes eine bedeutende Rolle. Seit dieser Zeit steht auch die Aufklärung des Wirkungsmechanismus der Biguanide im Mittelpunkt des wissenschaftlichen Interesses. et al. [ 2 9 ] formulierten 1957 auf Grund von Tierversuchen vorsichtig folgende Hypothese über den Wirkungsmechanismus dieser Substanzen: Durch Hemmung verschiedener Atmungsfermente mit konsekutiver Gewebsanoxie resultiert sowohl eine erhöhte Glykolyse wie erniedrigte Glukoneogenese. Die Folgen sind Steigerung der Glukoseaufnahme der peripheren Gewebe und Senkung der Glukoseabgabe aus der glykogenarmen Leber. Beide Mechanismen sollen für die blutzuckersenkende Wirkung der Biguanide verantwortlich sein. Diese Hypothese wurde zunächst jahrelang als befriedigende Erklärung der durch diese Substanzen induzierten Blutzuckersenkung angesehen, zumal die Ergebnisse der Tierversuche sie unterstützten. Seit Kenntnis der in den letzten Jahren erhobenen Befunde, die mit im therapeutischen Bereiche liegenden Dosen ermittelt wurden, wissen wir, daß die Biguanide eine insulinähnliche oder aber den Insulineffekt potenzierende Wirkung ausüben.

WILLIAMS

1

Prof. Dr. G.

MOHNIKE,

gestorben 8. 3. 1966, zum ehrenden Gedenken.

728

H . H A L L E R , S . E . STRAUZENBERG

Besonders durch die von mehreren Autoren [20], [23], [26] meist durch 1 4 C-markierte Substanzen ermittelten Werte des Wirkspiegels wurde ersichtlich, daß die früheren Versuche, auf die sich die ursprünglichen Anschauungen über den Wirkungsmechanismus dieser Substanzen aufbauen, mit Konzentrationen durchgeführt wurden, die eine 50 —1000fache Steigerung gegenüber dem therapeutischen Serumspiegel bedeuten und somit zu unphysiologischen Effekten führen mußten. Die Bestimmung der Wirkspiegel sowie der Eliminationsverhältnisse der nativen Biguanide beim Menschen sind daher auch zur Aufklärung des Wirkungsmechanismus von hervorragendem Interesse.

In dem Bemühen eine genügend empfindliche und für das klinische Labor brauchbare Methode zum Nachweis nativer Biguanide in Körperflüssigkeiten zu finden, arbeiteten wir ein papierchromatographisches Verfahren aus, das zwar nur eine semiquantitative Aussage gestattet, jedoch einen guten Einblick in die Verhältnisse erlaubt. Unter Verwendung dieser Methode bestimmten wir bei 10 Diabetikern die Ausscheidung von Butyl-BG im Harn nach einmaliger Verabreichung von 200 mg. Methodik Rein diätetisch eingestellte Diabetiker nahmen die Prüfsubstanz nach Entleerung der Blase nüchtern ein und sammelten den Urin in 4-Std.-Portionen über 24 Std. Die Enteiweißung des Harnes erfolgte mittels Überdruckfiltration. 10 ml des Ultrafiltrates wurden im Vakuum bis zur Trockene eingeengt, mit Wasser, gesättigt mit Benzoesäure, aufgelöst und unter einem O a -Strom erneut bis auf 1 ml eingeengt. 0,02 ml des Untersuchungsgutes wurden aufgetragen und zweidimensional auf SCHLEICHER & ScHÜLL-Papier 2043 b g je 8 Std. in beiden Richtungen entwickelt. Fließmittel: \. n-Butanol-Essigsäure-Wasser (4:1:5), 2. n-Butanol-Pyridin-Wasser (3:2:3). Die Detektion erfolgte mit VOGES-PROSKAUER-Reagens in Anlehnung an eine Modif i k a t i o n v o n BARRIT [1] s o w i e EGGLETON e t al. [10].

Es stellen sich die Biguanide, sowie Kreatinin und Kreatin als kräftig violette Flecke dar. Harnstoff f ä r b t sich rot. Die Substanzen zeigen folgende R^-Werte (Tab. 1). Tabelle 1 R/-Werte (n = 20) Substanz

Harnstoff Kreatin Kreatinin Biguanid

1. Dimension

2. Dimension

X

±*

X

±s

0,14 0,28 0,40 0,72

0,026 0 027 0,035 0,021

0,29 0 37 0,53 0,70

0,028 0,031 0,026 0,028

Der quantitative Nachweis kann durch Elution der Farbflecke mit nachfolgender photometrischer Bestimmung erfolgen. Spektrophotometrisch zeigen D B I sowie Butyl-BG nach Reaktion mit «-Naphthol typische F a r b k u r v e n im grünen und gelben Spektralbereich mit einem Absorptionsmaximum bei 545 nm. Die Auswertung erfolgt ferner durch Planimetrierung der Flächen auf Grund der von FISHER et al. [11]

Ausscheidung von Nj-n-Butylbiguanid

729

gefundenen und von anderen Autoren ([5], [7], [12], [27]) bestätigten, innerhalb gewisser Grenzen linearen Beziehung zwischen Logarithmus der Konzentration und Fleckengröße. Auf Einzelheiten der Methodik sind wir an anderer Stelle näher eingegangen [15],

[16].

Ergebnisse und Diskussion

Nach Verabreichung einer Einzeldosis von 200 mg Butyl-BG werden in 8 Std. etwa 75 % der verabfolgten Substanz im Harn ausgeschieden. Die Elimination in den folgenden 16 Std. ist gering. Innerhalb eines Tages finden sich ca. 85 bis 90% des Medikamentes unverändert im Harn wieder (Tab. 2). Tabelle 2 Ausgeschiedene Menge in %

nach Std.

der Gesamtausscheidung im H a r n X

1- 4 5- 8 9-12 13-16 17-20 21-24

67,1 18,7 7,3 3,6 2,2 1,1

±« 8,7 4,9 3,1 1,8 1,1 0,7

der verabfolgten Dosis X

±s

58,7 16,9 6,4 3,1 1,9 1,2

7,6 4,4 2,7 1,3 1,1 0,7

Das Ergebnis deckt sich in auffallender Weise mit den Befunden von B E C K MANN und H Ü B N E R [4], die nach Gabe von 50 bzw. 100 mg in 24 Std. durchschnittlich 40,2 bzw. 78,2 mg unveränderte Substanz im Harn wiederfanden. Für DBI wird von W I C K et al. [28] nach oraler Gabe bei der Ratte eine renale Ausscheidung von 97,2% pro Tag angegeben. Analog den mit 14 C-Butyl-BG bei der Ratte von B E C K M A N N gefundenen Verhältnissen könnte der Rest mit den Faeces eliminiert werden. Nach Verabreichung eines als Antimalariamittel wirkenden Biguanides, des Paludrins (N r p-chlorophenyl-N 5 -isopropylbiguanid) wurde als Ausscheidungsprodukt sowohl im Tierversuch als beim Menschen das 4-6-Diamino(1-p-chlorophenyl) (-1 • 2-dihydro-2 • 2-dimethyl-s-triazin) nachgewiesen [9], Wir suchten daher auch im Harn unserer mit Biguaniden behandelten Diabetiker nach Triazinen des Butyl-BG, DBI und Dimethyl-BG, ohne die Substanzen auffinden zu können. Ebensowenig wie B E C K M A N N [ 2 ] , [ 3 ] gelang es auch uns nicht, den papierchromatographisch im Rattenharn nach Gabe von 14 C-Butyl-BG gefundenen radioaktiven, stärker polaren Metaboliten im Humanurin zu identifizieren. Bei Betrachtung der Ausscheidungsverhältnisse ergibt sich, da die Eliminationsgeschwindigkeit im Harn dem Wirkspiegel der Substanz proportional ist [4], eine Halbwertszeit von ca. 2,5 Std.

730

H . HALLER, S. E .

STRAUZENBERG

Da die Biguanide starke disaure Basen darstellen und man von ihnen eine Total-Clearance annehmen kann [18], läßt sich durch Umformung der Clearance-Gleichung der Plasmaspiegel errechnen [4]. Setzt man die Gesamtplasmadurchströmung der Nieren des Erwachsenen mit 700 ml/min fest, so errechnen wir nach der Formel T.,

,

,

,.

Plasmakonzentration =

Urinkonzentration r « e / m l l • Harnvolumen/min 700 m l / m i n

-

'

Plasmakonzentrationen zwischen 0,1 und 1,0 ¡i-g/ml für die Portionen der ersten beiden Sammelperioden. Bei Zutreffen der oben gemachten Prämissen ergeben sich selbst unter Berücksichtigung der Fehler der Methodik Wirkspiegel im Serum, die unter den von TRANQUADA [26] und anderen Autoren, jedoch etwa im gleichen Bereich der von BECKMANN und HÜBNER [4] ermittelten liegen. Aus den vorgelegten Untersuchungen ergeben sich einige praktische Folgerungen für die Klinik. Da das Niveau der therapeutisch erreichten Wirkspiegel im Serum sehr niedrig liegt und die Biguanide 8 Std. nach oraler Gabe zu 75 % bereits renal eliminiert sind (Halbwertszeit etwa 2,5 Std.), ist es ratsam, die Tagesdosis auf 3 Einzelgaben zu verteilen. Die klinischen Erfahrungen, daß die hypoglykämische Wirksamkeit nach 6 bis 8 Std. abklingt und bei Einnahme der Hauptmenge am Vormittag der niedrigste Blutzuckerwert zwischen 14 und 19 Uhr registriert wird, stimmen gut mit den dargelegten Ausscheidungsverhältnissen überein. Sowohl das rasche Abklingen der dosisabhängigen Nebenerscheinungen nach Absetzen des Medikamentes als auch der oft deutliche Anstieg des Blutzuckerprofiles während der Nacht mit relativ hohem Nüchternblutzucker bei oft geringer Harnzuckerausscheidung sprechen ebenso für das Fehlen einer Depotwirkung wie der rasche Wiederanstieg der Glykosurie nach Absetzen des Medikamentes. Obwohl nach 24 Std. kein meßbarer Serumspiegel mehr gefunden werden kann, bleibt dennoch die Frage offen, ob nicht doch ein geringfügiger Rest, der sich dem Nachweis entzieht, im Körper verbleibt und evtl. kumuliert. Diese Annahme könnte durch die Beobachtung STERNES [25], der bei wiederholten Dosen von Dimethylbiguanid eine gewisse Anhäufung fand, ebenso gestützt werden wie durch die Tatsache, daß bei protrahierter Behandlung eine Blutzuckersenkung häufig erst am zweiten und dritten Tag [19], [22], [24], eine Aglykosurie oft erst nach 4 bis 7 Tagen erreicht wird [14], [21]. Bei dem geschilderten papierchromatographischen Vorgehen läßt sich im gleichen Arbeitsgang auch Harnstoff, Kreatin und Kreatinin nachweisen. Letzteres fanden wir in den untersuchten Harnen der Diabetiker in einer Menge von 0,2 bis 2,5 g pro Tag. In über der Hälfte der Fälle bestand eine Kreatinurie zwischen 0,1 bis 1,5 g pro Tag. Dies ist insofern bemerkenswert, als bei diesen Fällen weder eine Azidose noch Ketonkörperausscheidung im Harn nachweisbar war.

Ausscheidung von N j - n - B u t y l b i g u a n i d

731

Die Patienten befanden sich im geschlechtsreifen Alter und es bestand keine Gravidität oder Menstruation während der Untersuchungsperiode. Auch eine Streßsituation oder hormonale Dysregulation ließen sich nicht finden. Die Kreatinurie korrelierte in etwa mit der Stoffwechselführung. Die Untersuchungen bestätigen somit die Auffassung, daß bei leichten Störungen die Kreatinurie der Ketonkörperausscheidung vorausgehen kann [6], [8], [13], [17] • Sie ist demnach als feinerer Indikator für die Stoffwechselverschlechterung anzusehen. Literatur [1 BARRIT, M. M.: J . P a t h o l . Bacteriol. 42, 441 (1936). [2 B E C K M A N N , R . : 5 . Kongr. d. I n t e r n a t . Diabetesvereinigung, T o r o n t o 1964. B E C K M A N N , R . : Arzneimittel-Forsch. 1 5 , 7 6 1 ( 1 9 6 5 ) . [3 B E C K M A N N , R . U . G. H Ü B N E R : Arzneimittel-Forsch. 1 5 , 7 6 S (1965). [4 B E R G A M I N I , C . U. W . V E R O N E S E : Analytica chim. A c t a [Amsterdam] 10, 3 2 8 ( 1 9 5 4 ) . [5 !6 B R E N T A N O , P . : Z. klin. Med. 1 2 4 , 2 3 7 (1933). BRIMLEY, R . C.: N a t u r e [Loudon] 163, 215 (1949). [7 [8 B Ü R G E R , M . U. H . M A H W I T Z : Arch. exp. P a t h o l . P h a r m a k o l . 7 4 ( 1 9 1 3 ) . [9

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FISHER,

[13

FRECKS,

Summary a n d S. E. S T R A U Z E N B E R G : Studies on excretion of N j - n - b u t v l biguanide, creatine and creatinine b y urine H . HALLER

E x c r e t i o n of b u t y l BG b y urine a f t e r single a d m i n i s t r a t i o n of 200 m g was studied b y a p a p e r c h r o m a t o g r a p h i c a l m e t h o d . T h e s u b s t a n c e is eliminated w i t h o u t change t o a b o u t 75 p e r c e n t within t h e first 8 hours, a n d t o 85 — 90 percent w i t h in 24 hours.

732

H . H A L L E R , S. E . STRAUZENBERG

Triazines could not be detected. I t is concluded that the half-life time must be about 2.5 hours and plasma concentrations about or below 1,0 ng/ml. T h e bearing of these findings on clinical practice is discussed. Daily creatine excretion varied f r o m 0.2 to 2.5 g- Creatinuria (0.1 to 1.5 g a day) correlated in general with the metabolic behaviour and is regarded as a sensitive indicator of a deterioration of the carbohydrate metabolism.

PeaioMe r . TaJiJiep H C. E . l I l T p a y u e H S e p r : MccjiejjOBaHiie BbijieJieHHH SyTHJiOHryaHHaa, «peaTHHa H KpeaTHHHHa B Moie H3yqeHO BtigejieHHe 6yTHji6HryaHH,ua B Mone nocjie 0HH0KpaTH0r0 BBeaeHHH 200 Mr, no MeTOHy xpoMaTorpaifiHH Ha OyMare. 3 a nepBbie 8 nacoB Hefi3MeHH0 BbinejiHeTCH npuMepHo 75 npoueHTOB, a B TeneHHe cyTOK — 85 ao 9 0 % BBeneHHoro BemecTBa. TpHa3HHbi He ogHapyjKHJiHCb. CorjiacHO nojiyneHHbiM pe3yjn>TaTaM nepHOH nojiypacnana paBeH npHMepHO 2,5 nacaM H ruia3MeHHbie KOHyeHTpaijHH OKOJIO HJIH HHwe 1,0 [jtr/MJi. OScyiKjiaeTCH 3HaneHHe STHX pe3yjibTaTOB HJIH KJIHHHKH. J],HeBHoe BbiHeJieHHe KpearaHa cocTaBjineT OT 0,2 no 2,5 r. K p e a THHypHH (0,1—1,5 r B aeHb) KoppejinpoBajia npHMepHO c xoaoM MeTa6ojiH3Ma h paccMaipHBaeTCH naK HyBCTBHTeJibHbift HHHHKaTop yxyauieHHH yrjieBoa,Horo MeTa6oji3Ma.

A c t a biol. med. german., B a n d 17, Seite 733 — 745 (1966) Aus der Kinderklinik der Karl-Marx-Universität Leipzig (Direktor: Professor Dr. med. habil. S. L I E B E )

Resorption und Stoffwechsel von D-(—) Fruktose, L-(—) Sorbose und Sorbit bei hereditärer Fruktoseintoleranz und bei gesunden Säuglingen 1 K . BEYREISS, H . WILLGERODT u n d

H.

THEILE

(Eingegangen a m 17. 5. 1966) Zusammenfassung Die Resorption u n d der U m s a t z von D-Fruktose, L-Sorbose u n d Sorbit w u r d e n bei einem Säugling m i t hereditärer Fruktoseintoleranz u n d bei gesunden Säuglingen verglichen. N a c h oraler Fruktose-Belastung erscheint F r u k t o s e bei h . F . I . f a s t vollständig als F r u k t o s e im peripheren Blut, bei den Kontrollen n u r zu 30 — 4 0 % . Dieser B e f u n d weist auf das Fehlen der A k t i v i t ä t von 1-Phosphofruktaldolase und fehlende U m w a n d l u n g von F r u k t o s e in der D a r m s c h l e i m h a u t hin. Sorbose wird dagegen nach oraler Z u f u h r sowohl bei h . F . I . wie bei den Kontrollen nur zu 30% im Vergleich zu i.v. Sorbosebelastungen im B l u t gefunden. Bei h . F . I . sind die Blutspiegelverläufe von F r u k t o s e und Glukose nach i.v. Infusion gleicher Mengen Sorbit oder F r u k t o s e ähnlich. Nach oraler Sorbitbelastung wird bei h . F . I . t r o t z der geringen Resorption der Glukosespiegel deutlich gesenkt. Der U m s a t z von F r u k t o s e ist bei h . F . I . nicht wesentlich verringert, er erfolgt jedoch bei erhöhten Fruktoseblutspiegeln. Dagegen ist der U m s a t z von L-Sorbose bei h . F . I . deutlich reduziert. Die Ergebnisse werden hinsichtlich des Resorptionsmechanismus f ü r F r u k t o s e diskutiert.

Der metabolische Defekt in der Leber bei hereditärer Fruktose-Intoleranz (h.F.I.) ist seit der Erstbeschreibung dieser Stoffwechselstörung von C H A M B E R S und P R A T T [7] in kurzer Zeit vor allem durch die Untersuchungen des Arbeitskreises um F R O E S C H (Übersicht bei [ 1 3 ] ) aufgeklärt worden. Die klinischen Erscheinungen nach parenteraler Fruktoseinfusion lassen sich daraus zwanglos ableiten. Dagegen fehlen eindeutige Erklärungen der erheblichen intestinalen Störungen nach oraler Fruktosegabe bei h.F.I., wie mehrfach beschrieben wurde [9], [13]. Diese Unsicherheit ergibt sich aus der Tatsache, daß wir im Gegensatz zum gut erforschten intermediären Stoffwechsel von Fruktose (Übersicht bei [18]) wenig über deren Schicksal in der Darm1

H e r r n Prof. Dr. S. Liebe zum 60. Geburtstag.

734

K . BEYREISS, H . WILLGERODT, H .

THEILE

Schleimhaut bei ihrer Resorption wissen. Seit den Untersuchungen C O R I S [8] ist bekannt, daß Fruktose zwar langsamer als aktiv resorbierte Glukose, jedoch schneller als passiv resorbierte Monosaccharide durch die Darmschleimhaut aus dem Darmlumen aufgenommen wird. Nach den heutigen Vorstellungen [10], [38] werden f ü r die Resorption von Monosacchariden mehrere F o r m e n des transzellulären T r a n s p o r t e s durch das E p i t h e l des D ü n n d a r m s unterschieden: 1. Eine Reihe von Zuckern, wie L-Sorbose [2], [6] t r i t t allein durch Diffusion d u r c h die D a r m w a n d , d. h. die Resorption ist p a s s i v . 2. D a r ü b e r hinaus werden andere Zucker u n t e r A u f w e n d u n g zelleigener Energie, u n t e r U m s t ä n d e n gegen einen Konzentrationsgradienten, d. h. a k t i v resorbiert. Zu diesen Zuckern zählen Galaktose und Glukose. Bei dieser T r a n s p o r t f o r m t r e t e n die Zucker mittels eines Transportsystems, eines Karriers, in die Epithelzelle ein. L ä ß t sich u n t e r b e s t i m m t e n Versuchsbedingungen allein der karrierabhängige Transp o r t nachweisen, wie er z. B. f ü r D-(-)-) Xylose an überlebender D a r m s c h l e i m h a u t beschrieben wurde [29], so spricht m a n von „ e r l e i c h t e r t e r D i f f u s i o n " . W ä h r e n d passiv resorbierte Zucker allein abhängig von der intraluminalen Konzentration u n t e r physiologischen Bedingungen unvollständig resorbiert werden, werden durch die u n t e r 2) g e n a n n t e n T r a n s p o r t f o r m e n die Monosaccharide beschleunigt u n d — u n t e r h a l b der maximalen R e s o r p t i o n s k a p a z i t ä t des D ü n n d a r m s — vollständig resorbiert. Die Untersuchungen C O R I S wurden vielfach im Tierversuch bestätigt, wobei gleichzeitig nachgewiesen wurde, d a ß F r u k t o s e in der D a r m s c h l e i m h a u t der verschiedenen Tierarten q u a n t i t a t i v unterschiedlich vorwiegend zu Milchsäure u n d Glukose umgewandelt wird [15], [27], [31]- Die gegenüber passiv resorbierten Zuckern beschleunigte Resorption von F r u k t o s e wurde durch diese U m w a n d l u n g erklärt. Beim Menschen fehlen eindeutige Angaben über das A u s m a ß des Stoffwechsels von F r u k t o s e im D a r m . Die überraschend niedrigen Blutspiegel nach oraler Fruktosebelastung [9], im Gegensatz zu i.v. Fruktoseinfusionen [26], weisen jedoch auf einen intensiven U m s a t z von F r u k t o s e in der Mukosazelle hin.

Bei h.F.I. ist die Aktivität der 1-Phosphofruktaldolase (E. C. 4.1.2.7) nicht nur in der Leber, sondern vermutlich auch in der Darmschleimhaut herabgesetzt [13]- Der mögliche Stoffwechselweg von Fruktose über Fruktose1-Phosphat, Spaltung in C-3-Bruchstücke und sekundärer Kondensation zu Glukose wäre durch diesen Enzymdefekt blockiert. Damit bietet die h.F.I. die Möglichkeit, die Resorption von Fruktose unabhängig von ihrer Umwandlung zu studieren und damit Aussagen über ihren Transportmechanismus durch die Darmschleimhaut zu machen. Wir führten deshalb bei einem Säugling mit h.F.I. und bei stoffwechselgesunden, etwa gleichaltrigen Säuglingen vergleichende Untersuchungen mit Fruktose, Sorbose und Sorbit durch, über die wir im folgenden berichten. Fallbericht E s h a n d e l t sich u m einen männlichen Säugling mit typischer Anamnese, der im Alter von 4 — 9 Monaten in unserer Klinik b e h a n d e l t wurde. N a c h d e m die Diagnose d u r c h spezielle U n t e r s u c h u n g gesichert war, wurde der Säugling fruktosefrei e r n ä h r t . Bei g u t e m Gedeihen wurde etwa 4 Wochen nach Beginn der Behandlung m i t den U n t e r suchungen begonnen. An anderer Stelle berichten wir ausführlich über den klinischen Verlauf im Z u s a m m e n h a n g m i t U n t e r s u c h u n g e n der V e r w a n d t e n [4].

Stoffwechsel von Ketohexosen

735

Methodik Die Resorption der Monosaccharide bestimmten wir nach dem Verfahren von Dosx und GLADKE [12] durch Vergleich der Flächen unter den Blutspiegelverläufen bei oraler und i.v. Belastung. Die vergleichenden Untersuchungen führten wir jeweils am selben Kind in 3 — 4tägigen Abständen durch. B e i i.v. Belastung infundierten wir den Testzucker kontinuierlich 60 min mit dem Infusionsgerät der F i r m a B r a u n (Melsungen). Das Infusionsvolumen betrug 20 —30 ml. Die Konzentration der Ketohexosen bestimmten wir im 2—3fachen Ansatz in 50—100 (xl Kapillarblut in 15 minütigen Abständen nach dem Verfahren von DISCHE und B O R E N F R E U N D [11], I m Nüchternblut fanden wir „DiscHE-positive" Substanzen bezogen auf Fruktose zwischen 0,8 — 2,2 m g % . Unsere Werte haben wir entsprechend korrigiert. Glukose wurde in 50 jxl Kapillarblut modifiziert nach R I C H T E R I C H und COLOMBO [28] enzymatisch mit GOD bestimmt. Die Ketohexosen störten dabei nicht. Für beide Methoden wurde das B l u t mit Zinksulfat-Natronlauge enteiweißt [34]. Während der Sorbitbelastungen haben wir nur Glukose und Fruktose im B l u t untersucht. Die Flächen wurden planimetrisch ausgewertet. Die Ausscheidung des infundierten Zuckers maßen wir im 24-Std.-Urin des Versuchstages mit der gleichen Methode. Papierchromatographisch fanden wir neben dem zugeführten Zucker keine anderen verwandten Substanzen in störenden Konzentrationen. Ergebnisse

In den Abbildungen 1 a bis c sind die Blutspiegelverläufe der Ketohexosen und von Glukose nach oraler und i. v. Belastung mit Fruktose, Sorbit und Sorbose bei unserem Patienten dargestellt. Die Kontrolle der Glukose[mg%] SO

0,5g/kg -

Fruktose

I

a)

[mg%] 80

60

¿0

20

•A v

)V

. 120

[mg %J 0.15 p/kg Sorbose ßgi 0.5g/kg Sorbose

0

SO

240

300 min

300 min

300 min

Abb. 1. Fruktose (Sorbose)-, und Glukoseblutspiegel bei hereditärer Fruktose-Intoleranz nach i.v. bzw. oraler Zufuhr von a) Fruktose (0,5 g/kg); b) Sorbit (0,5 g/kg); c) Sorbose (0,5 g/kg oral, 0,1 5 g / k g i - v . ) . Fruktose (Sorbose bei c): • »oral, x x i.v.; Glukose: 1 oral, x x i.v. «

i. v. oral

120

160

240

Acta biol. med. german., Bd. 17, Heft 6

736

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THEILE

spiegel wurde — um hypoglykämische Erscheinungen zu vermeiden — durch i. v. Glukoseinfusionen vorzeitig beendet. Die dargestellten Ergebnisse sind Mittelwerte aus je zwei Belastungen, die wir in etwa 4-wöchigen Abständen durchführten. Die Einzelwerte zeigten gute Übereinstimmung. Nach i. v. Fruktosebelastung (Abb. 1 a) mit 0,5 g/kg erreicht der Fruktoseblutspiegel mit Abbruch der Infusion den Höchstwert von 52,0 mg% und sinkt anschließend in 120 min auf den Ausgangswert ab. Der Glukosespiegel fällt von 62 mg% auf 32 mg% bei Infusionsende. Nach oraler Fruktosebelastung steigt die Konzentration von Fruktose im Blut träger und erreicht nach 150 min den Höchstwert von 15 mg%. Nach 300 min ist Fruktose immer noch im Blut nachweisbar. Der Glukosespiegel fällt langsamer als nach intravenöser Zufuhr von 64 mg% auf 34 mg%. Bei i. v. Sorbitbelastung (Abb. 1 b) erreicht der Fruktosespiegel 15 min nach Abbruch der Infusion mit 33 mg% den Höchstwert, sinkt im Vergleich zur i . v . Fruktoseinfusion langsamer und ist 150 min nach Beendigung der Belastung nicht mehr nachweisbar. Der Glukoseblutspiegel sinkt deutlich im gleichen Zeitraum von 70 mg% auf 20 mg%. Trotz niedrigem Fruktoseblutspiegel (6 mg%) bei enteralem Angebot von Sorbit ist der Einfluß auf den Glukosespiegel, der um 24 mg% abfällt, deutlich. Sorbose erreicht nach i. v. Infusion von 0,15 g/kg (Abb. 1 c) den Höchstwert von 33 mg% bei Beendigung der Infusion und ist nach 210 min aus dem Blut eliminiert. Auch bei oralem Angebot von Sorbose (0,5 g/kg) ist der Anstieg ihres Blutspiegels erheblich. Nach 105 min wird eine gleichbleibende Konzentration von 23 mg% erreicht. Glukose sinkt leicht von 63 mg% auf 49 mg% nach oraler Sorbosebelastung, dagegen kaum nach i. v. Sorboseinfusion ab. In der Tabelle 1 sind die Resorptionsraten und die Ausscheidung im Urin bei Fruktoseintoleranz zusammengefaßt. Die Flächen und die Ausscheidung von Fruktose sind nach oraler oder i. v. Fruktosebelastung linear abhängig von der Zufuhrmenge fast gleich. Nach i. v. Sorbitbelastung (0,5 g/kg) sind die Flächen unter den Fruktoseblutspiegeln so groß wie nach i. v. Fruktosebelastung (0,5 g/kg), dagegen erheblich kleiner (24%) bei oraler Sorbitbelastung. Oral angebotene Sorbose erscheint zu 33% i m Blut und wird wie bei i. v. Sorbosebelastung zu 80% durch die Niere ausgeschieden. In der Abbildung 2 a—c sind die Mittelwerte der Fruktose-, Sorbose- und Glukosespiegel bei gesunden Säuglingen im Alter von 6 bis 10 Monaten nach Fruktose- oder Sorbosebelastung dargestellt. Intravenöse Infusion von 0,5 g/kg Fruktose (Abb. 2 a) erhöht den Fruktoseblutspiegel bis zum Ende der Infusion auf 26 mg%. In 90 min fällt er auf 0,5 mg% ab. Die Glukosekonzentration sinkt von 67 mg% auf 59 mg% 15 min nach Beginn der i. v. Infusion und erreicht bei Ende der Infusion wieder den Ausgangswert. Bei enteralem Angebot von Fruktose werden nur 7 mg% Fruktose im Blut nach 90 min erreicht. Der Glukosespiegel steigt von 56mg% allmählich auf 75 mg%.

Stoffwechsel von Ketohexosen

737

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Acta biol. med. german., Band 17, Seite 755 — 758 (1966) Aus der Neurologischen Abteilung der Universitäts-Nervenklinik Rostock (Direktor: Prof. Dr. J. S A Y K )

Zur Differenzierung der lymphozytären Zellen im Liquor cerebrospinalis R.-M.

OLISCHER

(Eingegangen am 20. 7. 1966) Zusammenfassung I n Liquorzellbildern ließen sich durch Nukleolendarstellung zwei Reihen der kleinen lymphozytären Zellen nachweisen. Mengenmäßig entsprachen die Anteile der differenzierten makronukleären und multinukleären lymphozytären Zellen im normalen Liquor etwa den in der Literatur beschriebenen Werten des peripheren Blutes. Bei pathologischem Liquor waren es Abweichungen dieser Werte mit Anstieg der multinukleären Zellen nachweisbar. Sie lassen nach den bisherigen Beobachtungen keine Rückschlüsse auf die Genese der Erkrankungen zu und sind als unspezifisch anzusehen.

Bei einigen Erkrankungen des Zentralnervensystems wie Lues cerebrospinalis und Encephalomyelitis disseminata im chronischen bzw. subakuten Stadium sind im Liquor-Differentialzellbild häufig überwiegend kleine, uniforme lymphozytäre Zellen zu beobachten [7]. Im Gegensatz hierzu finden sich bei anderen neurologischen Erkrankungen mit meist unspezifisch veränderten Liquorzellbildern sehr oft erhebliche morphologische Differenzen der lymphozytären Zellen. Die Beobachtung dieser Unterschiede ließ die Frage aufkommen, ob sich im Liquor cerebrospinalis ähnlich wie in den lymphatischen Organen und im peripheren Blut eindeutig verschiedene Reihen lymphozytärer Zellen unterscheiden lassen. Material und Methodik F ü r die Anfertigung der Zellpräparate wurde die Sedimentkammermethode nach S A Y K [7] benutzt, welche die Anwendung beliebiger zytologischer Methoden gestattet. Verwendet wurden routinemäßig zur Untersuchung gekommene Liquores. Um Veränderungen der Zellen zu vermeiden, erfolgte die Herstellung der Zellpräparate sofort nach E n t n a h m e des Liquors. Zur Differenzierung der lymphozytären Zellen kam die Nukleolenfärbung nach S T O C K I N G E R und K E L L N E R [9] in der Modifikation nach B E G E M A N N et al. [2] (Methylenblaufärbung bei p H 4,96 kombiniert mit PASFärbung) zur Anwendung, die den Vorteil der simultanen Darstellung der Kernkörperchen und PAS-positiver Einlagerungen in den Zellen bietet. Kontrollpräparate wurden nach M A Y - G R Ü N W A L D / G I E M S A panoptisch angefärbt und die Zellen wie üblich differenziert. Als Normalwerte wurden in den Liquorzellbildern 75 ± 11% lymphozytäre und 25 r t 1°% monozytäre Zellen ermittelt.

756

R. M.

OLISCHER

Ergebnisse

112 Liquorzellbilder wurden mit der modifizierten Nukleolenfärbung [2] gefärbt. Bei 50 normalen Liquores konnten zwei Reihen der in der panoptischen Färbung überwiegend nicht differenzierbaren kleinen lymphozytären Zellen ermittelt werden. Diese, regelrechte Werte der Zellzahl, des Differentialzellbildes, des Eiweißgehaltes und des Ausfalles der Normomastixkurve bietenden Liquores stammten vorwiegend von Patienten, die zum Ausschluß einer neurologischen Erkrankung punktiert wurden. Es konnten 78 ± 12% mit ein bis zwei größeren, scharf begrenzten Nukleolen und 21 ± 9% multinukleäre Formen der lymphozytären Zellen in den normalen Zellpräparaten festgestellt werden; 1 ± 5 % der Zellen waren nicht einzuordnen. Es entsprachen die makronukleären lymphozytären Liquorzellen nach der GRUNDMANNschen Nomenklatur [5] im peripheren Blut den Follikellymphozyten und die multinukleären Zellen den Sinuslymphozyten. 62 Liquores, die als pathologisch anzusehen waren, unterteilten wir nach Liquorbefunden (Tab. 1). Alle Gruppen boten mit prozentualer Zunahme Tabelle l Differenzierung der lymphozytären Zellen in 50 normalen und 62 nach Liquorbefunden unterteilten Liquores durch Nukleolenfärbung in makronukleäre, multinukleäre und nicht einzuordnende Zellen. Angabe der Werte in Prozenten der in den Zellbildern ermittelten lymphozytären Zellen Vorkommen v. plasmozytären Zellen

geringere Pleozytose (20-100/3)

Eiweiß über 40 mg%

makronukleäre lymphoz. Zellen

78 ± 12 46 ± 29 40 ± 27

59 ± 27

51 ±

2 7

46 ± 24

multinukleäre lymphoz. Zellen

21 ±

9

SO ± 32

39 ± 29

46 ± 30

51 ± 22

l ±

5

Liquorbefunde

nicht einzuordnende Zellen

Pleozytose über 100/3 Zellen

normal

4 ±

9

57 ± 27 3 ±

8

n.

FÜHR

2 ± 10

Ausfall der Normomastixkurve unter 5

3

± 9

3 ±

7

der multinukleären lymphozytären Zellen in den Zellbildern gegenüber den in den normalen Liquores gefundenen Werten erhebliche Abweichungen, die nach der Berechnung mit der Formel von STUDENT eindeutig signifikant waren. Besonders Erkrankungen an tuberkulöser Meningitis, Encephalomyelitis disseminata und liquormetastasierenden Tumoren zeigten eine auffällige prozentuale Zunahme der multinukleären lymphozytären Zellen (teils bis 90%), die sich bei den ermittelten Durchschnittswerten in dem auffälligen Ansteigen der quadratischen Abweichung als Ausdruck der Streuung der Werte widerspiegelte. Signifikante Abweichungen der Werte des prozentualen Anteiles von makro- und multinukleären lymphozytären Zellen innerhalb dieser Gruppen ließen sich nicht nachweisen.

Differenzierung lymphozytärer Liquor-Zellen

757

Diskussion E s konnte mit der Nukleolenfärbung in Liquorzellbildern eine Differenzierung der lymphozytären Zellen in makronukleäre und multinukleäre Zellen durchgeführt werden. Zahlenmäßig entspricht der Gehalt in normalen Liquores mit 78 ± 1 2 % makronukleären und 21 ± 9 % multinukleären Zellen etwa den im peripheren B l u t ermittelten Werten. G R U N D M A N N [5] fand im peripheren B l u t 7 2 % makronukleäre Follikellymphozyten und 2 8 % multinukleäre Sinuslymphozyten. Diese W e r t e wurden von B E G E MANN et al. [2] mit 7 8 , 4 % Follikellymphozyten, 1 6 , 5 2 % Sinuslymphozyten und 5 , 0 8 % nicht einzuordnenden Zellen sowie von A M B S und S Ä L A T [1] bei Erwachsenen mit 6 7 , 4 % Follikel-, 2 7 , 0 % Sinuslymphozyten und 6 , 1 % nicht einzuordnenden Zellen bestätigt. Diese beiden Zelltypen der kleinen L y m p h o z y t e n ließen sich in ähnlichem Mengenverhältnis auch durch andere Differenzierungsarten, wie Nachweis unterschiedlicher Überlebenszeit [3], verschiedene Strahlenempfindlichkeit [10], ungleiche Reaktion auf Kortison [5] und unterschiedliche Ergebnisse fermentzytochemischer Untersuchungen [2] belegen. Nach B R A U N S T E I N E R et al. [3] k o m m t den L y m p h o z y t e n eine Schlüsselstellung im Rahmen der Entwicklung der Allergie v o m verzögerten T y p als Überträger zellulärer Antikörper durch Nukleinsäuren (u. a. auch E H R I C H [4]) zu. In diesem Zusammenhang erregt die zu beobachtende Autophagozytose kleiner lymphozytärer Zellen in den Liquorzellbildern bei entzündlichen Erkrankungen der Leptomeningen, bei intrazerebralen metastasierenden Tumoren und anderen Krankheiten des Zentralnervensystems besonderes Interesse und wird von uns weiter verfolgt. E s kann unserer Ansicht nach auf bestimmte funktionelle Tätigkeiten der lymphozytären Zellen im Rahmen immunologischer Vorgänge im Bereich des leptomeningealen Gewebes geschlossen werden. Die Gruppe mit normabweichendem Liquorsyndrom — wie Zell- und Eiweißvermehrung sowie Veränderungen im Differentialzellbild und pathologischem Ausfall der Kolloidkurven — zeigte signifikant von den Normwerten abweichende Ergebnisse der Differenzierung der lymphozytären Zellen mit prozentualem A b f a l l der A n z a h l der makronukleären Zellen bei erheblicher Streuungsbreite der Werte. Zwischen den einzelnen Gruppen der Liquorsyndrome ließen sich keine signifikanten Differenzen ermitteln. E s können diese Veränderungen daher zunächst nur als unspezifisch angesehen werden und erlauben somit vorerst keine diagnostischen R ü c k schlüsse. PAS-positive Einlagerungen waren in den lymphozytären Zellen des Liquors nur selten zu finden. B E G E M A N N et al. [2] sahen in den im peripheren B l u t vorwiegend in der sekundären Phase bakterieller Infekte in den Sinuslymphozyten nachgewiesenen PAS-positiven Plasmaeinlagerungen Hinweise auf besondere Funktionszustände der Zellen. Eine Ausnahme der durchweg im Liquor PAS-negativen lymphozytären Zellen zeigten einige Fälle mit dem Liquorsyndrom einer Virusmeningitis mit vorwiegend l y m -

R. M. O l i s c h e r

758

p h o - p l a s m o z y t ä r e r Z e l l d i f f e r e n z i e r u n g i m L i q u o r z e l l b i l d [6], [8], bei d e n e n n e b e n f e i n g r a n u l ä r e n E i n l a g e r u n g e n a u c h g r o b s c h o l l i g e P A S - p o s i t i v e Zelleinschlüsse, m o r p h o l o g i s c h d e n R u s s E L - K ö r p e r c h e n e n t s p r e c h e n d , n a c h w e i s b a r w a r e n . E i n e w e i t e r e sichere D i f f e r e n z i e r u n g d e r l y m p h o z y t ä r e n Z e l l t y p e n des L i q u o r c e r e b r o s p i n a l i s d u r c h z u s ä t z l i c h e U n t e r s u c h u n g e n , w i e unspezifische Esterase ist notwendig. Ü b e r das Ergebnis dieser f e r m e n t z y t o l o g i s c h e n U n t e r s u c h u n g e n soll i n einer w e i t e r e n M i t t e i l u n g b e r i c h t e t werden. Literatur [1]

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Anschrift des Verfassers: Dr. R.-M. O l i s c h e r , Neurologische Abteilung, Universitäts-Nervenklinik Rostock Summary R.-M. O l i s c h e r : Differentiation of lymphocytic cells in the cerebrospinal fluid Two rows of small lymphocytic cells were noted in pictures of the cerebrospinal fluid. The quantitative portions of differentiated macronuclear and multinuclear lymphocytic cells in normal fluids agree in general with the literature d a t a for peripheral blood. In pathological fluids these values deviated, and the multinuclear cells were found increased. So far they do not permit any conclusion concerning the genesis of the disease and are thus regarded as unspecific. PeaioMe P.-M. O j i H i u e p : K HH(i>KqHH, b cbh3h c sthm o6cy>KaaiOTCH ropMOHajitHbie bjihhhhh Ha Bbipa3HTeJibH0CTb aaHHoro KOMnjienca npH3HaKOB.

Acta biol. med. german., B a n d 17, Seite 766—771 (1966) I n s t i t u t e of Oncology, Bucharest, R u m a n i a

Modifications of cell adhesion in cystostatic treated cultures O. C o s t ä c h e l , L. F a d e i , E. B a d e a (Received: 21. 6. 1966) Summary The modifications of cell a t t a c h m e n t r a t e were studied during t h e e x p l a n t a t i o n of a golden h a m s t e r t u m o r in culture medium with various concentrations of T E M and sarcolysine. The a t t a c h m e n t index determined f r o m t h e three variable p a r a m e t e r s — a t t a c h m e n t period, m a x i m u m a t t a c h m e n t a n d m a x i m u m d e t a c h m e n t — varied inversely proportional to toxic concentrations. T h e results confirmed t h e possibility to use cell a t t a c h m e n t criterion in t h e testing of agent toxicity. T h e role of mechanisms controlling cell growth in t h e adhesion phenomenon is postulated. T h e correlations e x i s t i n g b e t w e e n t h e t o x i c i t y of s u b s t a n c e s i n t r o d u c e d in t h e c u l t u r e m e d i u m a n d t h e s u b s e q u e n t p h e n o m e n o n of cell d e t a c h m e n t h a v e been r e c e n t l y r e p o r t e d [2], [3]. These findings would support the hypothesis that cytostatics added to c u l t u r e e x p l a n t a t i o n w i l l decrease t h e r a t e of s p o n t a n e o u s cell a d h e s i o n on glass, p r o p o r t i o n a l w i t h s u b s t a n c e t o x i c i t y . I n t h e p r e s e n t p a p e r w e t r i e d to v e r i f y this h y p o t h e s i s w i t h the p u r p o s e to f i n d one r a p i d m e t h o d f o r c y t o s t a t i c s testing. Material and Methods The experiences were performed on a golden h a m s t e r t u m o r — sarcoma H 10 [9]. The 8 — 10 d a y t u m o r was trypsinized with 0,25% t r y p s i n (NBC 1:300) according to a previously described m e t h o d [4]. The cells harvested were resuspended (2 — 3 • 10 5 cells/ml) in 90% TC 199 m e d i u m supplemented with 1 0 % calf serum. T h e cytostatic agents tested (TEM, Sarcolysine) were added in cell suspensions at various dilutions. Cell suspension was dispensed in glass cups w i t h coverslips, S ml in each. The glass cups were incubated a t 37 °C. After selected intervals ranging f r o m 1 hour to 7 hours t h e glass cups contents were poured into test tubes and stirred u p for t h e homogenization of cell suspension. Great care was t a k e n t o eliminate procedural variations in t h e p r e p a r a t i o n of cell suspensions. Cell n u m b e r per ml medium was determined b y cell counting in t h e B u r k e r hemocyt o m e t e r . T h e n u m b e r f o u n d represented t h e cells detached or n o t a t t a c h e d t o glass.

Cell adhesion in vitro

767

Their percentage was determined by refering the values of cells remaining in suspension, in each cytotoxic dilution to the number of cells first explanted in culture. The curves of attachment rate were drown from the percentage of cells remaining in suspension. For morphological control, culture carrying coverslips were fixed with methanol acetic and stained with hematoxilin.

Results The study on the attachment of control tumor cells (Table 1), ascertained that the percentage of suspended cells represented a continuous descending curve, the attachment of cells on the glass being completed within 5 hours. Table 1 Rate of cellular attachment to glass of H 1 0 tumor cells in culture medium Time of cultivation in hrs.

Percentage s.e/ of cells remained in suspension 44,2 37-9 25.7 16.9 16.7 8.8 8.8 9-3

± ± ± ±

0.99 1-90 0.75 0.60

± 0.82

(5) (9) (9) (9) (9)

± 0.43 (11) ± 0.42 (3) ± 1-93 (3)

Number of determinations in brackets.

Addition to the culture medium of various concentrations of T E M or sarcolysine (Table 2 and 3) changed the rate of attachment as follows: A t first cell attachment was noticed with decrease of cell number in suspension, after a time period varying with the agent toxicity, cell detachment begins with the increase of cell number in suspension. The curves of adhesion varied in relation with the concentration of toxic agents. T h e raise of concentration increased the percentage of cells which did not become attached and the detachment intensity, but shortened the time lapse until the beginnings of detachment. Tables 1, 2 and 3 demonstrated that adhesion curves present the following three variable parameters: A t t a c h m e n t p e r i o d (AP): The time lag from the addition of cytotoxic until the appearance of cell lesions, manifested b y discontinuation of attachment and beginning of detachment. Maximum glass.

a t t a c h m e n t (MA): Maximum per cent of cells adhering to

50 Acta biol. med. german., Bd. 17, Heft 6

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Aminosäuren-Einbau in Mitochondrien

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zentration beider Wirkstoffe an und erstreckt sich beim Arginin unterhalb einer KCN-Konzentration von 4 mM nur auf den umfällbaren, also den als Eiweißsynthese anzusprechenden Anteil. Auch dieser Befund weist auf die biochemische Differenz der beiden Anteile der Arginin-Inkorporation hin. In Übereinstimmung mit unseren früheren Ergebnissen [4] konnte für a-Ketoglutarat auch in diesen Versuchen für Embryonalgewebe und T u moren keine deutliche Stimulierungswirkung auf die Aminosäure-Inkorporationen nachgewiesen werden.

2. Einige orientierende, vergleichende Inkorporationsversuche mit den Inkubationsmedien von KROON und von W I N T E R S B E R G E R unter Verwendung von markiertem Leuzin, Proteinhydrolysat und Arginin Wie in der Einleitung bereits ausgeführt wurde, war zu vermuten, daß infolge unterschiedlicher Einstellung der Permeabilitätsverhältnisse der Mitochondrienmembran eine starke Abhängigkeit der mitochondrialen Proteinsynthese von der speziellen Zusammensetzung des Inkubationsmediums vorhanden sein könnte, insbesondere hinsichtlich der Wirksamkeit von hemmenden oder fördernden Zusätzen während der Einwirkung der markierten Aminosäure. Die in der Tabelle 6 angeführten Versuche dienten dazu, durch direkten Vergleich zweier differenter Medien erste Hinweise über deren Eignung zur Untersuchung derartiger Fragestellungen zu gewinnen. Schon aus diesen wenigen Vergleichsuntersuchungen ergaben sich folgende Schlußfolgerungen : 1. Ohne weitere Zusätze waren beide Medien bei verschiedenen Gewebearten und verschiedenen markierten Aminosäuren ungefähr gleichwertig. Im Falle des Arginins betrifft dies sowohl die Gesamtinkorporation als auch den umfällbaren Anteil. 2. Während der Zusatz von Atmungssubstrat (a-Ketoglutarat) sowie der restlichen Aminosäuren in der Kombination mit dem Medium von WINTERSBERGER praktisch wirkungslos war, wie wir schon früher festgestellt hatten, wurde durch die gleichen Zusätze, vor allem kombiniert bei verschiedenen Gewebearten (Niere, Leber usw.), eine starke Stimulierung der Inkorporation speziell beim Leuzin bewirkt. D a m i t schien das KROONsche Medium wegen der darin zustande kommenden erhöhten Permeabilität der Mitochondrienmembran infolge des Fehlens von Rohrzucker und wegen seines Phosphatgehaltes vor allem für diejenigen Versuche geeignet, in welchen die Proteinsynthese in den Mitochondrien unter gleichzeitiger Einwirkung zusätzlicher Substrate und spezifischer Wirkstoffe betrachtet werden sollte. E s war also angezeigt, vor allem solche Versuche mit dem KROONschen Medium in Angriff zu nehmen, die der weiteren Analyse eines Unterschiedes zwischen verschiedenen Mitochondrienarten, also beispielsweise zwischen Tumor- und Normalgeweben dienen sollten, da mit diesem Medium weitaus bessere Bedingungen für die Wirksamkeit spezifischer Zusätze, mit denen z. B . eine Substitution etwa während 51*

A . GRAFFI, G . BUTSCHAK, W . K U H N , E . J . SCHNEIDER

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der Aufarbeitung oder bereits in vivo verloren gegangener Substrate und Wirkstoffe angestrebt wurde, erreichbar erschienen.

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