Acta Biologica et Medica Germanica: Band 17, Heft 5 [Reprint 2021 ed.] 9783112540541, 9783112540534

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ACTA BIOLOGICA ETMEDICA GERMANICA JIERAUSGEBEK:

K.BAUMANN,

II. I H ' T Z ,

A. G R A F F I ,

L.-H. K E T T L E R ,

S. M.

UNTER MITARBEIT

H. G U M M E L ,

F.JUNG

RAPOPORT VON:

W. B E I E R , H. D R I S C H E L , H. F R U N D E R , M. G E R S C H , E. G O E T Z E , H . H A N S O N , F. H A U S C H I L D , G. H O L L E , F. M A C H , H. M A T T H I E S , G. M O H N I K E f , O . P R O K O P , K . S C H U B E R T , F. S C H W A R Z , G . S T E R E A , A. W O L L E N E E R G E R SCHRIFTLEITUNG:

W. S C H E L E R , H. B I E L K A

A K A D E M I E - V E R L A G

• B E R L I N

• B A N D 17 • H E F T 5

• S E I T E 561-670

•

1966

AUFNAHMEBEDINGUNGEN

1. Es werden nur Arbeiten angenommen, die nicht an anderer Stelle mit demselben Inhalt veröffentlicht oder zur Veröffentlichung angeboten werden. Der Autor verpflichtet sich nach Annahme, die Arbeit an keiner anderen Stelle zu veröffentlichen. 2. Die Arbeit m u ß wissenschaftlich wertvoll sein.

Bestätigungen bekannter T a t -

sachen, Versuche und Beobachtungen ohne positives Ergebnis werden, wenn überhaupt, nur in kürzester Form aufgenommen. Nicht aufgenommen werden Arbeiten referierenden Charakters, Polemiken und rein spekulative Arbeiten, falls sie nicht ganz wesentliche neue Gesichtspunkte enthalten. 3. Kurzmitteilungen für experimentelle Ergebnisse werden bei der Drucklegung zeitlich bevorzugt. Für ihren Inhalt ist ausschließlich der Autor verantwortlich. 4. Die Arbeiten müssen kurz und klar geschrieben und gegliedert sein. Problematik (Einleitung), Methodik, Befunde und Diskussion, evtl. Schlußfolgerungen sollen deutlich in Erscheinung treten. Der Arbeit soll ein Kurzreferat der wesentlichsten Ergebnisse vorausgestellt werden. Neben einer anderssprachigen erscheint auf jeden Fall eine deutsche Zusammenfassung. Die Arbeiten werden in folgenden Sprachen angenommen: Deutsch, Russisch, Englisch und Französisch. 5. Die Arbeiten werden im Sofortumbruch gesetzt; größere Korrekturen in Form von Streichungen bzw. Zusätzen sind daher in der Umbruchkorrektur nicht mehr möglich. 6. Genaue Hinweise zur Manuskriptgestaltung sind von der Redaktion der Zeitschrift anzufordern und sind unbedingt einzuhalten. 7. Manuskripte sind an die Herausgeber zu senden oder direkt an die Redaktion der Acta biologica et medica germanica. I I I S Berlin-Buch, Lindenberger Weg 70. 8. Von jeder Originalarbeit werden kostenlos 80 Sonderdrucke geliefert.

Darüber

hinaus können bis zu 100 Sonderdrucke gegen Berechnung bezogen werden.

Die Herausgeber

ACTA BIOLOGICA ET MEDICA GERMANICA Herausgeber : R. B a u m a n n • H . D u t z • A. G r a f f i • H . G u m m e l • F. J u n g • L.-H. K e t t l e r S. M. R a p o p o r t B a n d 17

1966

Heft 5

Acta biol. med. german., Band 17, Seite 561 —566 (1966) Aus dem Physiologisch-chemischen I n s t i t u t der Karl-Marx-Universität Leipzig (Komm. Direktor: Doz. Dr. W . R O T Z S C H )

Isoenzyme von Aminotransferasen i m menschlichen Serum W . ROTZSCH u n d

K.-W.

WENZEL

(Eingegangen am 10. 5- 1966)

Zusammenfassung Das Verteilungsmuster der Aminotransferasen (E. C. 2.6.1.1 und E. C 2.6.1.2) im menschlichen Serum in der Hochspannungselektrophorese auf Zelluloseazetat-Folie zeigt für die Aspartat-Aminotransferase zwei Isoenzyme. Das bei einem pH von 9 anodisch wandernde Isoenzym liegt im Bereich der «¡¡-Globuline, das kathodisch wandernde in der y-Globulin-Fraktion. Die Aktivität der Alanin-Aminotransferase liegt nahezu einheitlich im ß-Globulinbereich.

Untersuchungen über die Wirkung von Thyreohormonen führten uns zu den Fragen des Verhaltens der Aktivität von Aminotransferasen 1 in verschiedenen Organen und im Blutserum. Dabei ist im Serum vor allem auch auf das Vorkommen von Isoenzymen zu achten. Immunchemische, enzymkinetische und elektrophoretische Untersuchungen wiesen auf das Vorkommen von Isoenzymen verschiedentlich hin. I n Leber [ l ] - [ 8 ] , Herzmuskel [2], [5], [ 7 ] - [ 1 2 ] , Skelettmuskel [7], [8], [12], [13], Niere [2], [7] und Gehirn [7] sind die Ergebnisse sehr unterschiedlich. I n der Stärkegelelektrophorese [14], [15] konnten bis zu 6 Zonen der Aspartat-Aminotransferasen a u f g e f u n d e n werden. Besonders interessant ist die Klärung dieses Sachverhalts für diese Enzyme, da nach W O L F F [16] die nicht-kompetitive H e m m u n g der Glutamatdehydrogenase in vitro durch Thyroxin mit einer Disaggregation dieses E n z y m s begleitet sein soll. Ob dieses Prinzip verallgemeinert werden darf, ist noch völlig unbekannt. 1

L-Aspartat: 2-Oxoglutarat-Aminotransferase (E. C. 2.6.1.1) = GOT; L-Alanin: 2Oxoglutarat-Aminotransferase (E. C. 2.6.1.2) = G P T 37

Acta biol. med. german., Bd. 17, H e f t 5

562

W . ROTZSCH, K . - W .

WENZEL

Um die Grundbedingungen für die Aminotransferasen aufzuklären, prüften wir das Verhalten der Aspartat- und der Alanin-Aminotransferase-Aktivität im menschlichen Serum. Dabei bietet sich die Hochspannungselektrophorese als eine gut geeignete und relativ schnell durchzuführende, aber bisher für den Nachweis von Isoenzymen wenig geübte Methodik an. Methodik J e 0,2 ml frisches menschliches Serum aus dem Blutspendedienst der Medizinischen Universitätsklinik wurde auf Zelluloseazetat-Folie (40 • 35 cm) in 0,03 M VeronalNatrium/Natriumazetat-Puffer (£>H = 9,0; ¡i = 0,06) hochspannungselektrophoretisch bei einer Feldstärke von etwa 30 V/cm und einer Kühlung der Streifenunterlage von — 5 °C getrennt. Die Elektrophoresedauer betrug 3 Std. W i r verwendeten die Hochspannungselektrophorese-Apparatur nach WIELAND-PFLEIDERER (L. Hormuth, Wiesloch, Baden). Auf hämolysefreies Serum wurde geachtet. Anhand von mit Lichtgrün gefärbten Vergleichsstreifen wurden entsprechend der Lage der Serumproteinfraktionen die Pherogramme in Streifen zerschnitten und mit 0,1 M Phosphatpuffer (p~R = 7,4) unter Schütteln bei 4 °C etwa 2 Std. eluiert. Die quantitative Bestimmung der Aminotransferasen erfolgte in den Eluaten mit dem etwas modifizierten kolorimetrischen T e s t nach REITMAN und FRANKEL [17]- Die Aktivitäten wurden in jitMol Oxalazetat/ml/60 min bzw. Pyruvat/ml/30 min angegeben. Ergebnisse

Unter den angeführten Versuchsbedingungen wurde eine saubere elektrophoretische Trennung der Proteinfraktionen im Serum mit einer reproduzierbaren Darstellung der ßx- und /52-Globulin-Fraktionen sowie von } kathodisch wandernden, eng beieinanderliegenden y-Subfraktionen erreicht. In Tabelle 1 sind die prozentualen Eiweißwerte der einzelnen Proteinfraktionen zusammengestellt, wie sie nach Elution mit Phosphatpuffer und Tabelle 1 Mittelwerte (x) und Streuung (s) der prozentualen Eiweißwerte. Elution mit Phosphatpuffer (pH. = 7,4) und Proteinbestimmung nach LOWRY; hochspannungselektrophoretische Trennung auf Zelluloseazetat-Folie (n = 20) Eiweißfraktion

[%]

X

± 5

Albumin

«I

«2

ßi

Ä

7i

72

58,1 4,0

3,8 1,0

7,6 1,0

6,0 1,0

5,3 0,9

5,7 2,5

9,2 4,0

4,3 3,1

Proteinbestimmungen nach L O W R Y et al. [ 1 8 ] an Zelluloseazetat-Folie gewonnen wurden. Die Lage der Serumproteinfraktionen wurde durch Anfärben mit Lichtgrün ermittelt. Den Ergebnissen liegen die Pherogramme von 20 Normalseren zugrunde. Tabelle 2 gibt die prozentuale Verteilung der Aspartat-AminotransferasenAktivität von Serumproteinfraktionen wieder. Die angegebenen Werte sind Mittelwerte der prozentualen Aktivität in 10 Normalseren bezogen

Isoenzyme von Aminotransferasen

563

auf die Summe der Gesamtaktivität im Pherogramm. Die Hauptanteile der Aktivität fanden sich in der a 2 - und in der y-Globulinfraktion. Der größte Teil der kathodisch wandernden Fraktion befand sich in der y 2 -Subfraktion. Die Aktivität in den übrigen Eiweißfraktionen war sehr niedrig und dürfte durch Mitnahmeeffekte bei der Elektrophorese hervorgerufen sein. Tabelle 2 Mittelwerte und Streuung (x + s) der Aspartat-Aminotransferase-Aktivität in den Serumproteinfraktionen in /(Mol 0 x a l a z e t a t / m l / 6 0 min und in Prozent der Summe der Gesamtaktivität (n = 10) Eiweißfraktion Albumine ¡^-Globuline a 2 -Globuline ¿¡-Globuline ^-Globuline

,uMol/ml/60 min

[%]

0,13+0,08 0,05+0,05 0,67+0,09 0,07 + 0,05 0,42+0,09

9,6 + 6,0 3,8 + 3,8 50,0+6,7 5,2 + 3,8 31,4 + 6,7

In den Eluaten war durchschnittlich 7 4 % der Aktivität der Serumenzyme nachweisbar.

Das bei unseren Untersuchungen gewonnene elektrophoretische Verteilungsmuster der Serumaktivität zeigt die Existenz von 2 Isoenzymen im Unterschied zur Elektrophorese unter Verwendung von Stärke als Träger. In Abbildung 1 sind die Verhältnisse graphisch dargestellt. Die bei der Hochspannungselektrophorese erhaltenen Banden waren relativ scharf abgegrenzt. Die ß-Globulinfraktionen wurden gemeinsam auf ihre Aktivität geprüft; denn eine sichere Trennung nach den angefärbten Vergleichsstreifen war nicht immer einwandfrei durchführbar. In den y-GlobulinFraktionen war die Trennung etwas besser möglich. Der Hauptteil der Enzymaktivität lag jedoch in der mittleren Fraktion. Die Aktivität der Aspartat-Aminotransferase liegt im Bereich der a 2 -Fraktion (Isoenzym 1) und im Bereich der y 2 -Fraktion (Isoenzym 2). Nach dem Vergleich von W E B B [ 1 9 ] sollte man die experimentell gefundenen getrennten Aktivitäten vorerst numerieren und bei der weiteren Identifizierung die gleiche Nomenklatur benutzen wie sie bei der Trennung der Hämoglobine üblich ist, also mit Buchstaben. Für das weiterhin geprüfte Enzym, die Alanin-Aminotransferase, wurde in den Eluaten durchschnittlich 72% der Aktivität wiedergefunden. Der größte Teil der Aktivität lag in der /?2-Subfraktion. In Tabelle 3 sind die Mittelwerte der prozentualen Verteilung der Aktivität in den Serumeiweißfraktionen für 10 Normalseren angegeben. Etwa 70% der Gesamtaktivität wurde danach in der ß-Globulin-Fraktion nachgewiesen, der restliche Anteil lag vermutlich durch Mitnahmeeffekte bedingt auf die anderen Serumeiweißfraktionen gleichmäßig verteilt. 37*

564

W . ROTZSCH, K . - W .

WENZEL

A b b . 1. V e r h a l t e n der Alanin- ( ) und der Aspartat-Aminotransferase ( ) n a c h der H o c h s p a n n u n g s e l e k t r o p h o r e s e im m e n s c h l i c h e n Serum. I m oberen Teil ist ein P h e r o g r a m m m a ß s t a b g e r e c h t n a c h F ä r b u n g m i t L i c h t g r ü n dargestellt, im m i t t l e ren sind die p r o z e n t u a l e n E i w e i ß f r a k t i o n e n eingetragen u n d im u n t e r e n Teil die relativen Enzymaktivitäten Tabelle 3 Mittelwerte u n d S t r e u u n g (~x + s) der Alanin-Aminotransferase-Alctivität in den S e r u m p r o t e i n f r a k t i o n e n in ,«Mol P y r u v a t / m l / 3 0 min u n d in P r o z e n t d e r S u m m e der G e s a m t a k t i v i t ä t (n = 10). Eiweißfraktion Albumine o^-Globuline a 2 -Globuline ¿¡-Globuline y-Globuline

/¿Mol/ml/30 m i n 0,1 + 0 , 0 4 0,04+0,04 0,08 + 0,05 0,68+0,11 0,08+0,03

[%] 1 0 , 2 + 4,1 4,1 + 4,1 8 , 2 + 5,1 69,4+11,2 8 , 2 + 3,1

Aus Tabelle 3 und Abbildung 1 geht hervor, daß im menschlichen Serum Isoenzyme der Alanin-Aminotransferase physiologischerweise sehr wahrscheinlich nicht vorliegen.

Isoenzyme von Aminotransferasen

565

Diskussion

Für die Aspartat-Aminotransferase-Aktivität werden 2 Isoenzyme im menschlichen Serum in der Hochspannungselektrophorese nachgewiesen. Der Hauptanteil wandert anodisch in der a 2 ~F r a ktion (Isoenzym 1). Isoenzym 2 wurde in der y 2 -Fraktion einige Zentimeter kathodisch gewandert aufgefunden. Elektrophorese-Verteilungsmuster unter Verwendung von Stärke als Träger ergeben im menschlichen Serum mitunter weitere Isoenzyme. So fanden B L O C K und Mitarbeiter [14] 3 anionische und 2 kationische aktive Zonen. Auch D E C K E R und R A U [ 1 5 ] fanden in der Stärkegelelektrophorese 3—4 anodisch wandernde Banden für die Aspartat-Aminotransferase-Aktivität. Da diese Heterogenität des Enzyms nur im Stärkegel, nicht aber in der Agarelektrophorese [11] und auch in unseren Untersuchungen hochspannungselektrophoretisch nicht vorzufinden ist, liegt die Annahme nahe, daß es sich dabei um Polymerisationsphänomene des gleichen Enzyms und nicht um echte Isoenzyme handelt. Dieses wird bestätigt durch immunologische Untersuchungen [7], [11]. Die Aktivität der Alanin-Aminotransferase-Aktivität liegt vorwiegend im Bereich der /S-Globulin-Fraktionen. Auch bei Untersuchungen an verschiedenen Organen der Ratte [8], am Herzmuskel des Schweins [20] sowie am Skelettmuskel von Schwein und Rind [13] ist es nicht gelungen, Isoenzyme für die Alanin-Aminotransferase-Aktivität nachzuweisen. Durch Säulenchromatographie an Kalziumphosphatgel konnten K A T U N U M A et al. [20] im Herzmuskel des Schweins 2 Isoenzyme finden, die sie als sarkoplasmatisches und mitochondriales Enzym identifizieren konnten. Nach L A N G und MASSARRAT [11] findet sich jedoch in diesem Organ keine geringere Immunhemmung im Gesamtorganextrakt gegenüber dem isolierten Enzym, so daß sich kein Hinweis auf ein in der Antigenspezifität unterscheidbares Isoenzym für die Alanin-Aminotransferase-Aktivität ergibt. Mit den angeführten Ergebnissen rücken die Fragen über Isoenzyme von Transaminasen in den funktionellen Bereich. Es liegen also sehr wahrscheinlich für die Aspartat-Aminotransferase im Serum unterschiedliche Enzyme vor, deren molekulare Heterogenität durch verschiedene Primärstruktur vorstellbar wäre [8]. Von B O Y D [21] sind bereits Befunde bekannt, daß Isoenzyme im Serum bei Ratten bei Lebernekrose gefunden werden. Bei akuter Tetrachlorkohlenstoffvergiftung sank die Aktivität der Isoenzyme zytoplasmatischer Genese, während bei chronischer Thioazetamidvergiftung und bei der Hepatitis eine Abnahme mitochondrialer Enzyme feststellbar war ( R E I T H und Mitarbeiter [22]). Ob die Veränderungen der Aktivität von Aminotransferasen durch Thyreohormone [23] mit einer qualitativen Veränderung der Isoenzyme einhergeht, werden weitere Untersuchungen aufklären müssen. Literatur [1] BOYD, J. W.: Biochem. J. 81, 434 (1961). [2] BOYD, J. W . U. A. L . LATNER: Biochem. J. 82, 51 P (1962). [3] FLEISHER, G. A.: Federat. Proc. 19,6(1960).

566

W . ROTZSCH, K . - W .

[4] FLEISHER, G. A . : F e d e r a t . P r o c . [ 5 ] F L E I S H E R , G . A . , C . S . P O T T E R U. 229 (1960). [ 6 ] K A T U N U M A , N., T . M A T S U Z A W A U . [ 7 ] M O R I N O , Y . . H . K A G A M I Y A M A U. (1964).

WENZEL

19,10(1960). K. G. WAKIM:

P r o c . Soc. e x p . Biol. Med. 1 0 3 ,

A. H U Z I N O : J . V i t a m i n o l . [ K y o t o ] 8 , 7 4 ( 1 9 6 2 ) . H . W A D A : J . biol. C h e m i s t r y 2 3 9 , P C 943

Y A M A D A , A . , S . S A W A K I , A . F U K U M U R A U. M . H A Y A S H I : J . V i t a m i n o l . [ K y o t o ] 8, 286 (1962). [ 9 ] B O R S T , P . u. E . M . P E E T E R S : B i o c h i m . b i o p h y s i c a A c t a [ A m s t e r d a m ] 5 4 , 188 [8]

(1961).

U. W . W . C L E L A N D : B i o c h e m i s t r y [ W a s h i n g t o n ] 3 , 338 ( 1 9 6 4 ) . [ 1 1 ] L A N G , N . U. S. M A S S A R R A T : K l i n . W s c h r . 4 3 , 5 9 7 ( 1 9 6 5 ) . [ 1 2 ] S C H W A R T Z , M. K . , J . S . N I S S E L B A U M U. O. B O D A N S K Y : A m e r . J . clin. P a t h o l . 4 0 , 103 (1963). [13] K Ö R M E N D Y , L . , G . G A N T N E R U. R . H A M M : B i o c h e m . Z . 3 4 2 , 31 ( 1 9 6 5 ) . [14] B L O C K , W . D., R . C A R M I C H A E L U. C . E . J A C K S O N : P r o c . Soc. e x p . Biol. Med. 1 1 5 , 941 (1964). [ 1 5 ] D E C K E R , L . E . U. E . M. R A U : P r o c . Soc. e x p . Biol. M e d . 1 1 2 , 1 4 4 ( 1 9 6 3 ) . [16] W O L F F , J . : J . biol. C h e m i s t r y 2 3 7 , 230 (1962). [17] REITMAN, S. U. S. FRANKEL: A m e r . J . clin. P a t h o l . 2 8 , 56 (1957). [18] L O W R Y , O . H . , N . J . R O S E B R O U G H , A. L . F A R R U. R . J . R A N D E L L : J . biol. Chemistry 1 9 3 , 2 6 5 ( 1 9 5 1 ) . [ 1 9 ] WEBB, E . C.: N a t u r e [ L o n d o n ] 2 0 3 , 821 (1964). [20] K A T U N U M A , N., K . M I K U M O , M . M A T S U D A U. M . O K A D A : J . V i t a m i n o l . [ K y o t o l 8,68(1962). [ 2 1 ] B O Y D , J . W . : Clin. c h i m . A c t a [ A m s t e r d a m ] 7 , 4 2 4 ( 1 9 6 2 ) . [22] R E I T H , A., J . M O H R , E . S C H M I D T , F . W . S C H M I D T U. E . W I L D H I R T : K l i n . W s c h r . 4 2 , 909 (1964). [23] ROTZSCH, W . , Y.-ZÄ HAN U. H . AURICH: A c t a biol. m e d . g e r m a n . 8, 602 (1962). [10]

H E N S O N , C. P .

Summary W . ROTZSCH

and

K.-W. WENZEL:

I s o e n z y m e s of a m i n o t r a n s f e r a s e s in

human

serum T h e d i s t r i b u t i o n p a t t e r n of a m i n o t r a n s f e r a s e s (E. C 2.6.1.1 a n d E . C 2.6.1.2) in h u m a n s e r u m in h i g h - v o l t a g e e l e c t r o p h o r e s i s o n a foil of cellulose a c e t a t e r e v e a l e d t h e e x i s t e n ce of t w o i s o e n z y m e s f o r a s p a r t a t e a m i n o t r a n s f e r a s e . T h e i s o e n z y m e g o i n g t o w a r d t h e a n o d e a t p H 9 lies w i t h i n t h e r e g i o n of < x 2 - g I o b u l i n s a n d t h a t d i s p l a c e d t o w a r d t h e c a t h o d e is in t h e y - g l o b u l i n f r a c t i o n . T h e a l a n i n e a m i n o t r a n s f e r a s e a c t i v i t y lies a l m o s t uniformly within t h e ^-globulin range.

PcaiOMe B . P o T 11 in H K . - B . B e H u e j i h : H303H3HMH aMHHOTpaHC$epa3 B HejioBeqecKoii CHBOpOTKe 0 6 p a 3 e u p a c n p e n e j i e H H H aMHH0TpaHc TCS

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0,2). Die gestrichelt eingetragene Linie würde eine 1:1 Korrelation darstellen

Diskussion

Wir möchten hier aus der großen Zahl von Substanzen insbesondere diejenigen hervorheben , die sich durch besonders abweichendes Verhalten, durch besondere Eigenschaften oder gute Wirkung auszeichnen. Fünf der hier aufgeführten Substanzen bewirkten eine Steigerung der Körpertemperatur (Tab. 3), während die anderen die Temperatur nicht beeinflußten oder senkten. Eine unmittelbare Beziehung zur IsopropylSeitenkette in Anlehnung an die Amphetamin-Grundstruktur ließ sich aber nicht feststellen, denn eine ganze Anzahl anderer Substanzen in unserer Reihe mit gleichen Strukturmerkmalen zeigten trotz großer Ähnlichkeit keine temperatursteigernde

Monoaminoxydase-Hemmstoffe

1 2 5 10 20 50 100 200 MAO EDgg [mg/kg]

Abb. 2. Korrelation zwischen der Dosis, die die durch Reserpin gesenkte Pentetrazolkrampfschwelle um 3 0 % erhöht (Ordinate) und der MAO E D i s 0 (Abszisse). Korrelationskoeffizient r = 0,49, n = 37, p < 0,01

02

05

1

2 5 10 20 50 MAO EDjg0 [mg/kg]

100 200

Abb. 4. Korrelation zwischen der reserpinantagonistischen Dopawirkung (Weckwirkung) (Ordinate) und der MAO EDiso (Abszisse). Korrelationskoeffizient r = 0,614, n = 44, p < 0,001

0,1 0,2

0,5

1 2 5 10 20 50 MAO EDjgQ [mg/kg]

100 200

500

Abb. 3. Korrelation zwischen der Dosis, die die durch Reserpin gesenkte Körpertemperatur von R a t t e n um 1 °C erhöht (Ordinate) undderMAOEDi8o(Abszisse). Korrelationskoeffizient r = 0,5 3, n = 40, p < 0,001

2 MAO

5

10 20 50 EDIS0[mg/kg]

100 200

Abb. 5- Korrelation zwischen der Dosis, die die E D 2 0 des Tryptaminkrampfes zur E D 8 0 verschiebt (Ordinate) und der MAO EDios (Abszisse). Korrelationskoeffizient r = 0,640, n = 51, p < 0,001

500

620

H . Matthies, W . Lietz, Ch. Fähse, W . P o h l e , N . Popov, K .

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Dopa Pot. ED 80 [mg/kg] [mg/kg] [mg/kg]

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Abb. 8. Beeinflussung der Morphinwirkung durch 5,2 mg/kg Dihydroergotamin („Dihytamin") am Stabsprungtest der Ratte. Jede Säule entspricht dem Mittelwert von 20 Tieren (200 Sprünge) 60 min nach s.c. Injektion von 10 mg/kg Morphin

10 mg N-Allylmorphin/kg 15 min vor Morphin konnte den Morphineffekt völlig unterdrücken. Wurde Morphin 4 Tage unter Nalorphinschutz gegeben, hatte Morphin am 5- Tag ohne Nalorphin gegeben eine Reaktionsverlängerung um etwa 70% zur Folge, während bei der nur mit Morphin behandelten Kontrollgruppe am 5- Versuchstag keine Reaktionszeitverlängerung auftrat. Diskussion

Morphin führt zu einer Erniedrigung des Katecholamingehalts im Gehirn und im Nebennierenmark [6], [14], [15], sowie zur vermehrten Katecholaminausscheidung [2], [7], [8], [9], [14], [15], [19]. Nach Vorbehandlung mit MAO-Hemmern kommt es zu einer Erhöhung der Katecholamin-Werte im Gehirn nach Morphinapplikation, was gegen eine Beeinflussung der Aminsynthese sprechen würde [11], [14]. Serotonin- und AminobuttersäureGehalt im Gehirn werden durch Morphin nicht wesentlich beeinflußt [15], [19], da aber eine Hemmung der Serotonin Wirkung durch Morphin am Meerschweinchenileum beschrieben worden ist [5], und andererseits mannigfaltige Beziehungen zwischen Katecholaminen und Serotonin im ZNS anzunehmen sind, zogen wir auch Serotonin in unsere Untersuchungen mit ein. Aber nicht nur bei der akuten Morphinwirkung, sondern auch bei chronischer Applikation und der damit verbundenen Toleranz und bei Abstinenzerscheinungen lassen sich charakteristische Veränderungen im Katecholamingehalt erkennen, ohne daß ihre Bedeutung bisher eindeutig erklärt werden kann. Morphin führt zu einer Aminausschüttung und zu vorübergehendem Aminabfall im Gewebe und zur vermehrten Aminausscheidung.

Wechselwirkungen zwischen Morphin und biogenen Aminen

651

Bei wiederholter Gabe der gleichen Dosis nimmt die vermehrte Katecholaminausscheidung langsam ab und geht bis auf die Norm zurück, um erst wieder bei Erhöhung der Dosis erneut anzusteigen [6], [8]. Wird bei morphin-toleranten Ratten ein Abstinenzsyndrom durch Morphin-Entzug oder durch Nalorphingabe provoziert, so nimmt der Amingehalt in Hirn und Nebenniere ab, die Ausscheidung nimmt zu. Nalorphin scheint übrigens auch im akuten Versuch die durch Morphin induzierte Aminausschüttung zu verhindern, denn die als Folge der morphinbedingten Adrenalinausschüttung auftretende Hyperglykämie kann durch Nalorphin weitgehend abgeschwächt werden [12]. Allerdings wird auch die durch Adrenalin [12] oder Ephedrin [3] allein hervorgerufene Hyperglykämie durch Nalorphin teilweise gehemmt [12]. Die Senkung des Amingehalts nach Morphin wird ebenfalls durch Nalorphin wieder normalisiert [11], Auch die Hypophyse ist an der Katecholaminfreisetzung durch Morphin und an der Entwicklung der Toleranz- und Abstinenzerscheinungen beteiligt, hypophysektomierte Tiere zeigen abgeschwächte Abstinenzerscheinungen [22]. Die Bedeutung der biogenen Amine für die Entwicklung des Abstinenzsyndroms geht auch daraus hervor, daß durch Gabe von Noradrenalin und Serotonin, beziehungsweise ihrer Vorstufen DOPA, 5-Hydroxytryptophan, Tryptophan, Tyrosin oder Phenylalanin die Abstinenzerscheinungen stark abgeschwächt werden können, während durch Reserpin das Abstinenzsyndrom verstärkt wird [10]. Umgekehrt verhalten sich die Amine und Reserpin bei der Morphinanalgesie: Die Morphinanalgesie wird durch Adrenalin, Tyramin, Serotonin und 5-Hydroxytryptophan verstärkt, hingegen durch Reserpin abgeschwächt [20]. Allerdings scheinen die Versuchsbedingungen, insbesondere die Zeit der Reserpinvorbehandlung von Bedeutung zu sein, denn es liegen auch Beobachtungen über morphinsynergistische Wirkungen des Reserpins vor [1], Unsere Untersuchungen liefern weitere Befunde, die auf eine Beziehung zwischen Morphin Wirkung und Aminstoffwechsel im ZNS hinweisen. Es wäre denkbar, daß die Toleranz gegenüber Noradrenalin, die sich in unserem Test mit der Toleranzentwicklung gegenüber Morphin herausbildet, auf die durch Morphin hervorgerufene Noradrenalinfreisetzung zurückzuführen ist. Die Tatsache, daß sich mit der Morphintoleranz eine Toleranz gegenüber Serotonin weitaus langsamer und schwächer einstellt, stimmt sehr gut mit unseren früheren Befunden überein, wonach beim Vorliegen einer Noradrenalintoleranz nur eine geringe Abschwächung der Serotoninwirkung zu beobachten ist. Umgekehrt kommt aber bei der mit einer Toleranzentwicklung verbundenen wiederholten Gabe von Serotonin eine ausgeprägte Wirkungsabschwächung gegenüber Noradrenalin zustande [13]Auch diese Erscheinung wäre möglicherweise auf eine Noradrenalinfreisetzung durch Serotonin zurückzuführen. Bei der Morphin Wirkung soll auch nach MA YNERT und KLINGMAN [14] das Serotonin keine Rolle spielen. Daß umgekehrt durch chronische Noradrenalinapplikation, die zur Ausbildung einer Toleranz gegenüber Noradrenalin führt, keine völlige Toleranz

652

W . POHLE, H .

MATTHIES

gegenüber Morphin in Erscheinung tritt, würde dafür sprechen, daß die Morphinwirkung nicht ausschließlich über einen Mechanismus zustande kommt, an dem Noradrenalin entscheidend beteiligt ist. Bekanntlich hemmt Morphin ja auch die Cholinesterase, es aktiviert die Azetylcholinsynthese und setzt Histamin frei [4], [21], um nur einige Effekte zu nennen. Dihydroergotamin hemmt sowohl die Wirkung des Noradrenalins auf die bedingte Fluchtreaktion, als auch die Entwicklung der Toleranz gegenüber Noradrenalin. Offensichtlich scheint die Besetzung adrenerger Rezeptoren im ZNS mit Dihydroergotamin diese vor einer Reaktion mit Noradrenalin oder einem seiner Metaboliten zu schützen, der nur eine sehr langsame Rückreaktion zu folgen scheint. Unter Dihydroergotamin würde Noradrenalin oder einer seiner Metaboliten eliminiert werden, ehe sie mit dem Rezeptor reagieren könnten. Die etwas abgeschwächte Noradrenalinwirkung nach vier Tagen Noradrenalinapplikation unter Dihydroergotaminschutz ist sicher nicht nur Ausdruck einer trotz Rezeptorblockade entstandenen geringen Toleranz, sondern auch die unmittelbare Abschwächung der Noradrenalinwirkung durch die abklingende viertägige Dihydroergotaminapplikation. Die Serotoninwirkung auf die bedingte Reaktion konnte ebenso wie die Toleranzentwicklung trotz Erhöhung der Dihydroergotamindosis nicht wesentlich gehemmt werden. Umgekehrt zeigten kürzlich in unserem Institut durchgeführte, noch nicht publizierte Versuche, daß die Noradrenalinwirkung auf die bedingte Fluchtreaktion durch selbst unwirksame LSDDosen hemmbar ist. Die Beeinflussung der Toleranzentwicklung gegen Noradrenalin oder Serotonin und Morphin durch L S D konnte bisher noch nicht geprüft werden. Daß Noradrenalin jedenfalls in einer noch nicht klar erkennbaren Weise an der Hemmung der bedingten Reaktion durch Morphin beteiligt ist, geht aus der Hemmung dieser Morphinwirkung durch Dihydroergotamin hervor, sowie aus der Tatsache, daß die Hemmung der bedingten Reaktion als auch die Freisetzung der Amine durch Morphin ihr Wirkungsmaximum etwa nach 60 min zeigen. Das komplexe System nervaler Funktionseinheiten, das sicherlich am Zustandekommen der bedingten Fluchtreaktion beteiligt ist, scheint teils parallel, teils hintereinander geschaltete Elemente mit Noradrenalin- oder Serotoninempfindlichkeit zu enthalten, deren Mechanismus gegenwärtig noch nicht zu überschauen ist. Gegen das Vorliegen einer allgemeinen, unspezifischen Reaktion sprechen eine Reihe von Befunden, bei denen in einer bestimmten Versuchsanordnung jeweils eines der Amine ein abweichendes Verhalten zeigt. E s wird nach weiteren umfangreichen Untersuchungen vorbehalten bleiben müssen, zur weiteren Klärung dieses Problems beizutragen. Literatur [1] C O L E , J . u. D. P. D E A R N A L E Y : Experientia [Basel] 1 6 , 78 (1960). [ 2 ] C R A W F O R D , T . B. B. U. W . L A W : Brit. J . Pharmacol. Chemotherapy 1 3 , 3 5 ( 1 9 5 S ) . [3] D E S P A N D E R , V . R . u. R. S . G R E W A L : Indian J . med. Res. 4 7 , 147 (1959)[ 4 ] D O M E R , F. R . u. F. J O S S E L S O N : Arch. int. Pharmacodynam. Therap. 1 4 7 , 4 7 0 (1964).

Wechselwirkungen zwischen Morphin und biogenen Aminen [5]

653

GADDUM, J . H . U . Z. P . P I C A R E L L I : B r i t . J . P h a r m a c o l . C h e m o t h e r a p y 12, 3 2 3 ( 1 9 5 7 ) .

[6] GUNNE, L . M . : Nature [London] 184, 1960 (1959)[7] GUNNE, L . M . : Psychopharmacologia [Berlin] 2, 214 (1961). [8] GUNNE, L . M . : Ann. New Y o r k Acad. Sci. 96, 205 (1962). [9]

GUNNE, L . M . :

Nature

[London]

195, 815

(1962).

[10]

H U I D O B R O , F . , E . C O N T E R A S U. R . C R O X A T X O : A r c h . i n t . P h a r m a c o d y n a m .

[11]

KLINGMAN,

[13]

MATTHIES,

Therap.

146, 444 (1963).

G . I. u. E .

W.

MAYNERT:

J.

Pharmacol,

exp.

(1962). [12] MASAAKI, I . : Nippon Y a k u r i g a k u Zasshi 52, 646 (1956). H.,

H . J .

SCHMIDT

U. W . P O H L E :

Acta

biol.

Therapeut.

med.

135,

300

11,

849

german.

(1963). [14]

M A Y N E R T , E . W . U. G . I . K L I N G M A N : J . P h a r m a c o l , e x p . T h e r a p e u t . 1 3 5 , 2 8 5

[15]

MAYNERT,

E . W . U. G . I .

KLINGMAN:

J.

Pharmacol,

exp.

Therapeut.

(1962).

135,

(1962). [16] MED'ACOWIC, H . : Arch. int. P h a r m a c o d y n a m . T h e r a p . 1 1 4 , 201 (1958). [17] POHLE, W . U. H . MATTHIES: A c t a biol. med. german. 11, 513 (1963). [18] POHLE, W . u. H. MATTHIES: A c t a biol. med. german. 12, 583 (1964).

296

[ 1 9 ] QUINN, G . P . u . B . B . B R O D I E : M e d . E x p . [ B a s e l ] 4, 3 4 9 ( 1 9 6 1 ) . [20]

SIGG,

E. B.,

G . CAPRIO

U. J . A .

SCHNEIDER:

Proc.

Soc.

exp.

Biol.

Med.

97,

97

(1958). [21] TOSHIO, U . : Nippon Y a k u r i g a k u Zasshi 56, 1185 (I960). [22]

T S U N E Y O S H I , T . U. E . J . C A F R U N Y : J . P h a r m a c o l , e x p . T h e r a p e u t . 1 2 2 , 1 4 8

[23]

VOGT, M . :

J.

Physiology

123, 451

(1958).

(1954).

Summary W . POHLE and H. MATTHIES: I n t e r a c t i o n between morphine and biogenous amines in influencing t h e conditioned escape reaction of r a t s T h e t i m e of response in t h e jumping test — a conditioned escape reaction of t h e r a t — is prolonged b y noradrenaline, serotonin, and morphine. R e p e a t e d daily administration of t h e same doses of these substances results in a complete loss of action within three to five days. Development of tolerance t o morphine in consequence of its reperated application is paralleled b y complete tolerance to an equally effective dose of noradrenaline, while no tolerance to serotonin is observed a t this moment. F u r t h e r morphine application for t h e n e x t five days, however, produces tolerance to serotonin too. Tolerance to noradrenaline due to its repeated application does not lessen b u t shorten t h e action of morphine on t h e conditioned escape reaction. R e p e a t e d administration of serotonin produces tolerance to serotonin, b u t not t o morphine. Dihydroergotamine inhibited t h e action of noradrenaline and morphine on the conditioned response, while weakening t h e effect of serotonin to a minute degree only. Nalorphine reduced t h e inhibitory action of morphine. Dihydroergotamine inhibited t h e development of tolerance to noradrenaline, and nalorphine inhibited t h e tolerance to morphine. T h e findings are discussed with respect to t h e participation of biogenous amines in t h e mechanism of action of morphine. PeaioMe B . I I O J i e H X .

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587 — 597

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598 — 602

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603—613

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044—654

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667 — 670

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K 15 —19

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K 21—25

13. B y n a e p . i n x , M . UIIOTT ii A . I " p a c j » n : O T J U H I W I M e « a y Bbix li riopMajibiiMX Timiieti n o c o ^ e p / K a m i i o Z J H K

K 27 — 32

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Herausgeber und verantwortlich für den Inhalt: R. Baumann, H. Dutz, A. Graffi, H. Gummel, F. Jung, L.-H. Kettler, S . M. Rapoport. Schriftleitung: Prof. Dr. Werner Scheler und Dr. habil. Heinz Bielka, 1115 Berlin-Buch, Lindenberger Weg 70. Femruf: 569851. App. 222. Verlag: Akademie-Verlag GmbH, 108 Berlin, Leipziger Straße 3 — 4 (Fernruf: 22 0441) Telex-Nr. 011 773. Postscheckkonto Berlin 3 50 21. Bestellnummer dieses Heftes 1053/XVII/5. Die Zeitschrift erscheint monatlich. Bezugspreis: Einzelheft MDN 14,—, Doppelheft MDN 28, — . Veröffentlicht unter der Lizenznummer 1318 des Presseamtes beim Vorsitzenden des Ministerrates der Deutschen Demokratischen Republik. Gesamtherstellung: VEB Druckerei „Thomas Müntzer", 582 Bad Langensalza. — Alle Rechte vorbehalten, insbesondere die der Übersetzung. Kein Teil dieser Zeitschrift darf in irgendeiner Form — durch Photokopie, Mikrofilm oder irgendein anderes Verfahren — ohne schriftliche Genehmigung des Verlages reproduziert werden.

31002

INHALT Biochemie

Seite

W . R O T Z S C H U. K . - W . W E N Z E L

Serum

: Isoenzyme von Animotransferasen im menschlichen

561 — 566

Physiologie Der Einfluß von Hunger und proteinfreier Diät auf die fötalen Leberlipide sowie die Lipide von Plazenta und mütterlicher Leber 567 — 577

K . M A L B E R G U. L . W I N K L E R :

M.

BIEDERMANN:

frosches

Messung von Membranpotentialen an der Leber des Wasser-

578 — 586

Die Konzentrationen der unveresterten Fettsäuren im Serum neugeborener Ratten und ihre Beeinflussung durch Nebennierenhormone und Nahrungsaufnahme 587 — 597

W . H A U D E , G . M Ü H L A U U. E . G O E T Z E :

: Über den Einfluß von Barbital auf die Mortalität von Mäusen nach Ganzkörper-Röntgenbestrahlung 598 — 602

W . F I N C K , W . K L I N G E R U. H . L E I B E

L. ZETT: Membranpotential und Ionengehalt des isolierten Skelettmuskels bei Koffein-, Säure- und Kaliumkontraktur 603 — 613 Pharmakologie H.

M A T T H I E S , W . L I E T Z , C H . F Ä H S E , W . P O H L E , N . P O P O V U. K . G R A D E :

chende Untersuchungen über Monoaminoxydase-Hemmer

Verglei-

614—636

Der Einfluß von Dihydroxyphenylalanin auf den Serotoningehalt des Rattenhirns nach Vorbehandlung mit Monoaminoxydasehemmstoffen 637-643

N . P O P O V U. H . M A T T H I E S :

Über die Wechselwirkungen zwischen Morphin und biogenen Aminen bei der Beeinflussung einer bedingten Fluchtreaktion der Ratte 644—654

W . P O H L E U. H . M A T T H I E S :

Methodisches : Aufbau und Funktion implantierbarer Aufnehmer zur elektromagnetischen Durchflußmessung am uneröffneten Gefäß beim wachen Tier 655 — 659

C. MORGENSTERN

Kurzmitteilungen W.

P O H L E U. H. M A T T H I E S : Die Bedeutung der pressorischen Noradrenalinwirkung für die „Toleranzentwicklung" gegenüber Noradrenalin bei der bedingten Fluchtreaktion der Ratte 660—663

W.

P O H L E U. H. M A T T H I E S : Die Abnahme der pressorischen Noradrenalinwirkung bei artefizieller Blutdruckkonstanz 664—666

S.

ROSENTHAL,

S. P R E H N U. S. R A P O P O R T : Uridinfreisetzung aus ribosomaler RNS von Kaninchenretikulozyten durch alkalische RNase aus Retikulozytenribosomen und Pankreas 667—670

P.

L A N G E N U.

G.

SYDOW:

K. R E P K E : Hemmung der DNS- und Proteinsynthese von EhrlichAszitestumorzellen durch Pregnenguanylhydrazone Kl5—19

Beziehungen zwischen Hexokinaseaktivität, Glykolyse und Wachstumsrate in der normalen Lunge und in Lungentumoren von Mäusen K21 — 25 M. S C H Ü T T U. A. G R A F F I : Über Differenzen im DNS-Gehalt von Mitochondrien aus Tumor- und Normalgeweben K27 —32

V . WUNDERLICH,