Acta Biologica et Medica Germanica: Band 1, Heft 3 1958 [Reprint 2021 ed.] 9783112518960, 9783112518953

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ACTA BIQLOGICA ETMEDICA GERMANICA HERAUSGEBER: A. G R A F F I

• H. G U M M E L

• F. J U N G

. A. K R A U T W A L D

S. M. R A P O P O R T S C H R I F T L E I T U N G : W. S C H E L E R

AKADEMIE-VERLAG • BERLIN

• BAND I • H E F T 3

• S E I T E 23 7 - 3 64 • 1 95

8

AUFNAHMEBEDINGUNGEN 1. Es werden nur Arbeiten angenommen, die nicht an anderer Stelle mit demselben Inhalt veröffentlicht oder zur Veröffentlichung angeboten werden. Der Autor verpflichtet sich nach Annahme, die Arbeit an keiner anderen Stelle zu veröffentlichen. 2. Die Arbeit muß wissenschaftlich wertvoll sein. Bestätigungen bekannter Tatsachen, Versuche und Beobachtungen ohne positives Ergebnis werden, wenn überhaupt, nur in kürzester Form aufgenommen. Nicht aufgenommen werden Arbeiten referierenden Charakters, Polemiken und rein spekulative Arbeiten, falls sie nicht ganz wesentliche neue Gesichtspunkte enthalten. 3. Die Arbeiten müssen kurz und klar geschrieben und gegliedert sein. Problematik (Einleitung), Methodik, Befunde und Diskussion, evtl. Schlußfolgerungen sollen deutlich in Erscheinung treten. Der Arbeit soll ein Kurzreferat der wesentlichsten Ergebnisse vorausgestellt werden (Zusammenfassung von höchstens einer Druckseite). Neben einer anderssprachigen erscheint auf jeden Fall eine deutsche Zusammenfassung. Die Arbeiten werden in folgenden Sprachen angenommen: Deutsch, Russisch, Englisch und Französisch. 4. Besonders wertvolle längere Arbeiten können als Beihefte veröffentlicht werden. 5. Von j eder Versuchsart bzw. j edem Tatsachenbestand oder j eder Krankengeschichte ist nur je ein Beispiel in knappster Form (Telegrammstil) zulässig. Weiteres Material ist als Tabelle oder grafisch darzustellen. Beobachtungen an biologischem oder medizinischem Material sollen mit Zahlenangaben über die Signifikanz der Ergebnisse belegt werden. 6. Literaturangaben müssen unter Verwendung der Abkürzung des Chemischen Zentralblattes und in der dort üblichen Form erfolgen: Name und Vorname des Autors, Band-, Seiten- und Jahreszahl. Bücher werden mit Titel, Verlag, Erscheinungsjahr und Seitenzahl zitiert, z. B. B. X . Y . nach M. N. Biochem. Z., 222, 45 (1951). Am Ende der Arbeit wird die Literatur in der Reihenfolge aufgenommen, wie sie im Text zitiert ist mit entsprechender Numerierung. 7. Doppeltitel sind zu vermeiden, ebenso Zerlegung einer Arbeit in mehrere Mitteilungen. 8. Das Manuskript muß am Kopf den Herkunftsort der Arbeit tragen. Am Ende des Manuskripts wird der Name und die Anschrift des Verfassers bzw. des in erster Linie für den Inhalt verantwortlichen Verfassers wiedergegeben. Einsendungen von Arbeiten aus Kliniken und Instituten ist eine Erklärung des Direktors oder Abteilungsleiters beizulegen, daß er mit der Veröffentlichung einverstanden ist und den Verfasser auf die Aufnahmebedingungen hingewiesen hat. 9. Das Manuskript ist einseitig und möglichst mit Maschine weitzeilig zu schreiben. Die Abbildungsvorlagen sind auf besonderen Blättern einzureichen. 10. Werden im Text wortgeschützte Bezeichnungen (z. B. Warenzeichen) benutzt, so ist nach Möglichkeit daneben eine international anerkannte und verständliche Bezeichnung (z. B. die chemische Zusammensetzung) anzugeben. Die Herausgeber

ACTA BIOLOGICA ET MEDICA GERMANICA Herausgeber: A. G r a f f i • H. G u m m e l • F. J u n g Band I

• A . K r a u t w a l d • S. M. R a p o p o r t

1958

Heft 3

A c t a biol. med. germ., Band. 1, Seite 237—244 (1958). A u s der Neurologischen Klinik (Direktor: Prof. Dr. J . H R B E K ) und der Chemischen Anstalt (Direktor: Prof. Dr. F. S A N T A V Y ) der Medizinischen F a k u l t ä t der P a l a c k y Universität, Olomouc, Tschecholoslowakei

Glykoproteide des Liquors III. Die Glykoproteide im Liquor bei Epileptikern 1 B.

LANG,

L.

STEIDEL

und

J.

TRNECKA

(Eingegangen am 8. 1. 1958)

Zusammenfassung 1. I m R a h m e n der durchgeführten Untersuchungen des Liquors bei neurologischen Krankheiten auf den Gehalt proteingebundener Glycide ist auch eine Gruppe v o n 50 Epileptikern untersucht worden. 2. Festgestellt wurden zwei Gruppen, die einen unterschiedlichen Gehalt an Glyciden der im Liquor enthaltenen Proteine (ausgedrückt in Prozenten des Gesamtproteingewichts) aufweisen. Die Gruppe mit Normalwerten deckte sich fast völlig mit der Diagnose Epilepsia genuina, die Gruppe, bei der eine Erhöhung festgestellt wurde, stimmte mit der Diagnose Epilepsia posttraumatica und tarda überein. Die W e r t e der Gesamteiweißstoffe im Liquor bewegten sich bei beiden Gruppen in den Grenzen normaler physiologischer Variabilität.

Die geringe Menge der im Liquor cerebrospinalis (Lcs.) vorhandenen Proteine und die sich daraus ergebenden methodischen Schwierigkeiten hatten zur Folge, daß das Problem der Glykoproteide eine lange Zeit hindurch ungeklärt blieb. G R E V E N S T U K [ 1 ] führt in seiner im Jahre 1929 veröffentlichten Monographie nur vier Arbeiten über proteingebundene Glycide an, die jedoch zueinander in solchem Widerspruch stehen, daß die Existenz derartiger Glycide im Liquor angezweifelt wurde. Von L U S T I G und L A N G E R [2] ist zwei Jahre später der Nachweis erbracht worden, daß II. Mitteilung: V I t h Intern. Congr. of Neurol. (Brüssels) 1957; E x c e r p t a med., S e c t . V I I I , Congress Issue 1957, P- 63.

1

1 7 A c t a b i o l . med. germ. H e f t 3 •

238

B . LANG,

L. STEIDEL,

J.

TRNECKA

es möglich ist, die Orcinreaktion nach T I L L M A N S und P H I L I P P I ZU verwenden. Diesen Autoren ist es auch tatsächlich gelungen, proteingebundene Zucker im Liquor bei vier Patienten, die zufälligerweise einen sehr hohen Gehalt an Glykoproteiden aufwiesen, festzustellen. Einen neuen Impuls erhielt dieses Problem durch die Arbeit von S T A R Y und Mitarb. [3], die die zur Bestimmung von Galaktose und Mannose verwendete kolorimetrische Methode nach SOERENSEN und H A U G A R D T [4] modifizierten. Mit dieser Methode ist der Durchschnittswert der proteingebundenen Glycide im normalen Lcs. bestimmt worden (0,67 m g % + o , 2 5 mg%). Diese gebundenen Glycide betragen in Prozenten des Gesamtproteingewichts des Liquors ausgedrückt, 2,14% (Durchschnittswert des Gesamtproteingehalts: 32,6 m g % ± 8 , 2 mg%). Später ist eine Reihe mehr oder weniger methodischer Arbeiten ( F E R R A N T E und C A N T A R U T T I [5], ROBOS und Mitarb. [6], B A U E R [7]) veröffentlicht worden. Die Zahl der untersuchten in diesen Arbeiten angeführten Fälle ist jedoch für eine klinische Auswertung und Schlußfolgerung unzureichend. Als eine klinische Arbeit kann die Mitteilung von A P O S T O L und Mitarb. [8a] angesehen werden. Die Arbeit von S T A R Y und Mitarb. [8b] befaßt sich mit den Veränderungen im Gehalt der proteingebundenen Glycide im Lcs. der Kinder. Die zur Sprache gebrachten Erkrankungen sind jedoch von überwiegend internem Charakter (Nieren-, Blut-, Muskelkrankheiten u. ä.); von neurologischen Affektionen ist bloß die Meningitis vertreten. Um einen Uberblick über die Verhältnisse der proteingebundenen Glycide im Lcs. bei neurologischen Erkrankungen zu gewinnen, sind in den letzten zwei Jahren an unserer Klinik systematische Untersuchungen durchgeführt worden. Über die bei 230 Patienten gewonnenen Ergebnisse wurde bei Gelegenheit des im Jahre 1956 in Jesenik und im Jahre 1957 in Brüssel stattgefundenen Kongresses berichtet [9]. In der vorliegenden Arbeit wird beabsichtigt, eine Übersicht über die bei einer Gruppe von 50 Epileptikern gewonnenen Resultate zu bringen. Methodik D i e U n t e r s u c h u n g e n w u r d e n a n L i q u o r e n neurologischer P a t i e n t e n s o f o r t n a c h A b n a h m e (die ersten 10 m l n a c h A b l a s s e n der ersten 10 T r o p f e n ) v o r g e n o m m e n . E s w u r d e die B e s t i m m u n g der G e s a m t p r o t e i n e , der p r o t e i n g e b u n d e n e n G l y c i d e u n d a u c h die übliche biochemische G e s a m t u n t e r s u c h u n g d u r c h g e f ü h r t . D i e G e s a m t proteine w u r d e n m i t H i l f e der f ü r den L i q u o r m o d i f i z i e r t e n kolorimetrischen Met h o d e unter V e r w e n d u n g des NEssLER-Reagens b e s t i m m t . ' Untersuchung der proteingebundenen Hexosen: 5 m l L i q u o r w u r d e n n a c h H i n z u f ü g e n v o n 0,25 m l 5 o % i g e r Trichloressigsäure k r ä f t i g a b z e n t r i f u g i e r t u n d die F ä l l u n g z w e i m a l m i t je 2 m l 5 % i g e r Trichloressigsäure gewaschen. N a c h Z u g a b e v o n 0,2 m l destilliertem W a s s e r und V e r s e t z e n m i t 5 m l 70 gew. prozentiger S c h w e f e l s ä u r e u n d 0,65 m l Orcinreagens w u r d e dieses G e m i s c h g u t v e r m i s c h t u n d d a n n 20 Min. l a n g in einem W a s s e r b a d v o n 8o° C erhitzt. D i e sich ergebende o r a n g e - b r a u n e F ä r b u n g w u r d e m i t einer analog b e h a n d e l t e n S t a n d a r d h e x o s e l ö s u n g (50 m g M a n n o s e u n d 50 m g G a l a k t o s e in 100 m l destilliertem Wasser) p h o t o m e t r i s c h (Pulfrich P h o t o kolorimeter-Filter S 53) verglichen. D a s Orcinreagens ist aus 15 m l k o n z e n t r i e r t e r

Glykoproteide im Liquor bei Epileptikern

239

Schwefelsäure und 35 ml Wasser bereitet worden. N a c h A b k ü h l u n g wurden 50 ml einer auf kaltem W e g e bereiteten 3 % i g e n wäßrigen Orcinlösung hinzugefügt. Bestimmung der Gesamtproteine: Die in 0,2 ml Lcs. vorhandenen Eiweißstoffe wurden in einer gekrümmten Verbrennungseprouvette mit einem Tropfen 5 o % i g e r Trichloressigsäure ausgefällt. Nach Abzentrifugieren und Dekantieren des Überstandes wurde die Fällung zweimal mit 1 ml einer 5 % i g e n Trichloressigsäure gewaschen, mit zwei Tropfen Säure versetzt und die Eiweißfällung auf einem Sandbad mineralisiert. Nach völliger Verbrennung wurden 4 ml destilliertes Wasser hinzugefügt und das entstandene Gemisch unter stetigem Rühren mit 1 ml N e s s l e r Reagens versetzt. Die Gelbfärbung wurde im Photokolorimeter (Filter S 50) mit dem Kontrollversuch verglichen. Die Eiweißwerte wurden von der E i c h k u r v e abgelesen.

Ergebnisse Die Normalwerte wurden an 10 Liquoren von Patienten, bei denen außer subjektiven Beschwerden keine objektiven neuropathologischen Befunde vorlagen und bei denen auch die übliche biochemische Liquoruntersuchung Normalwerte ergab, festgestellt. Die von uns gefundenen Werte, d. h. 0,64 m g % + 0,27 mg% für proteingebundene Glycide und 31,5 m g % + 9,1 m g % für Liquorproteine stimmen mit den von S T A R Y und Mitarb. gemachten Befunden überein. Tabelle 1 Übersichtstabelle der Durchschnittswerte der Gesamteiweißkörper und der an sie gebundenen Glycide im Liquor und im Serum der Epileptiker

Anzahl der Fälle

Lic uor Ser um Gebun- GesamtGebun- Gesamtdene eiweiß- G • 100 Anzahl dene eiweiß- G • 100 Glycide körper Glycide körper der E E % in m g % in m g % in m g % in m g % Fälle %

(E)

(G)

Genuine Epilepsie Sekundäre Epilepsie 1 JackSON-

Epilepsie 1

Traumat. Ätiologie Andere Ätiologie

27

14

4

5

o,73 ± 0,19

35,8 ±

9,9

(G)

2,03 + 0,87

32,8

o,94

± 0,24

±

io,9

1,06 ± 0,30

±

37,5 8,5

0,68 ± 0,13

± 11,6

34,6

3,17

± 1,11

20

2,83 ±

1,19 1,97

± 0,49

7.790 ± 530

1,67 ± 0,20

± 35,5

7.440 ± 482

± o , 4 5

i59,o ± 23,2

7.690 ± 160

2,06 ± 0,17

138,2 ± 21,9

7-59o ± 5°°

1,82 + 0,29

130,8 ± 14,0 143,2

13

4

5

(E)

1,93

Mit Ausnahme der jACKsoN-Epilepsie

Es wurde ein Unterschied zwischen der genuinen und sekundären Epilepsie festgestellt. Bei sekundärer Epilepsie mit traumatischer Aetiologie und bei Epilepsia tarda ist der in Prozenten des Proteingewichts ausgedrückte Gehalt an gebundenen Glyciden beträchtlich höher (3,17% und 3,31%). Dieser' 17*

240

B. LANG,

L . STEIDEL,

J. T R N E C K A

Tabelle 2 Sekundäre Epilepsie — Durchschnittswerte der Gesamtliquoreiweißkörper und der an sie gebundenen Glycide

A r t der Epilesie

Anzahl der Fälle

Epilepsia posttraumatica 1 Epilepsia tarda Jackson-Epilepsie 2 Andere sekundäre Epilepsien 1 2

9 4 5 5

Gebundene Glycide in m g %

Gesamteiweißkörper in m g %

(G)

(E)

1,01 0,90 0,68 0,91

31.9 27,2 34.6 39,6

G • 100 E

%

3.16 3.31 1.97 2,29

Einschließlich der JACKSON-Epilepsie traumatischer Ätiologie Ohne traumatische Ätiologie

Unterschied konnte auch bei der Gruppe mit JACKSON-Epilepsie beobachtet werden; in Fällen mit traumatischer Aetiologie wurde ein Durchschnittswert von 2,83% der proteingebundenen Glycide ermittelt, während fünf Fälle anderer Aetiologie (Gefäß- und atrophische Prozesse) nur einen Durchschnittswert von 1,97 ergaben. Bei allen Epilepsiekategorien bewegt sich der Gesamtgehalt an Liquorproteinen in den Grenzen der biologischen Variationsbreite des normalen Befundes (31,5 m g % ± 9,1 mg%). Der höhere Gehalt an proteingebundenen Glyciden in Prozenten des Proteingewichts ausgedrückt, ist demnach die Folge einer absoluten Glycidmenge. Der Unterschied zwischen den genannten Gruppen würde noch stärker zutage treten, falls die Gruppe, benannt „anderweitige sekundäre Epilepsien", bei denen die Diagnose kaum als hundertprozentig gesichert angesehen werden kann, unberücksichtigt bliebe. Tabelle 3 Genuine Epilepsie — Durchschnittswerte der Gesamtliquoreiweißkörper und der an sie gebundenen Glycide bei den einzelnen Arten der Epilepsieanfälle

A r t des Anfalles

Grand mal P e t i t mal Temporale Epilepsie Mischtypen

Anzahl der Fälle

10 5 5 7

Gebundene Glycide in m g % (G)

Gesamteiweißkörper in m g %

0,76 0,71

38,7 33.0 38,8 33.1

o,73 0,63

(E)

G • 100 E

% 1,96 2,15 1,85 1.90

Bei der Gruppe genuiner Epilepsien kann eine Abhängigkeit weder vom Zeitpunkt des letzten Anfalles noch von der Krankheitsdauer oder vom Typus des E E G festgestellt werden.. Auffallend ist, daß bei der Einordnung genuiner Epilepsien nach der Art des Anfalles bei den von uns unter-

Glykoproteide im Liquor bei Epileptikern

241

suchten fünf Epilepsien mit petit mal sehr ausgeglichene Werte gefunden worden sind; die Durchschnittswerte lagen höher als bei den übrigen Gruppen (Tab. 3). 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 O 0 0 0 0

• 1.4

0 0 0 0 0 0

• EPILEPSIA POSTTRAUflATICA u TARDA

0 0 0 0 0 O 0 0 O OO 0 O

0

• • •O • 0 ••• • • • • •

22

3,0

3/3

4,6 :

Diagramm 1. Variationskurve der an Liquoreiweißkörper gebundenen Glycide bei Epileptiker. Ein Vergleich der Mittelwerte (2,3% u. 3,5%) zweier dargestellter Gesamtheiten, der durch Berechnung des /-Wertes ermittelt wurde (t = 4,33), gibt die statistische Sicherheit von 99,9% (P < 0,001). Abszisse: Gebundene Glycide in Prozenten des Gesamtgewichts der Liquoreiweißkörper ausgedrückt. Ordinate: Anzahl der Fälle.

Aus einem Vergleich unserer Ergebnisse mit den Resultaten der gesamten biochemischen Liquoruntersuchung konnte weder auf eine Parallele noch auf eine andere wechselseitige Beziehung geschlossen werden. Die gleichzeitig durchgeführten Serumuntersuchungen ergaben ähnliche, wenn auch nicht so ausgeprägte Resultate wie dies beim Liquor der Fall war. Beim Serum bewegen sich auch die Werte der gebundenen Glycide in den Grenzen der normalen Variationsbreite. Diskussion Mit Hilfe der üblich durchgeführten biochemischen Liquoruntersuchung sind bisher keine pathologischen Befunde, die für die genuine oder sekundäre Epilepsie charakteristisch wären, gemacht worden. Die Liquorbefunde sind vorwiegend normal, in etwa 20% der Fälle leicht pathologisch. T O W E R und M C E A C H E R N [10] haben zwar bei den meisten Epileptikern Spuren von' Acetylcholin im Liquor festgestellt, dieser Befund

242

B.

LANG,

L.

STEIDEL,

J.

TRNECKA

scheint jedoch eher ein direkter Ausdruck der Folgen des epileptischen Anfalles zu sein und verrät nichts über die Ursachen der Krankheit. E L L I O T T und P E N F I E L D [ 1 1 ] untersuchten die biochemischen Verhältnisse in frischen Gewebsexzisionen eines epileptogenen Herdes bei nichtan-

?5

20 • 15

EPILEPSIA POSTTRAUMATICA u TARDA

10

tf

22

3,0 %

Diagramm 2. Variationskurve der an Serumeiweißkörper gebundenen Glycide bei Epileptikern. Abszisse: Gebundene Glycide in Prozenten des Gesamtgewichts der Serumeiweißkörper ausgedrückt. Ordinate: Anzahl der Fälle.

aesthesierten Patienten. Die gefundenen Durchschnittswerte des Sauerstoffverbrauchs und der Kohlenhydratabgabe ebenso wie der aeroben und anaeroben Glykolyse wiesen keine signifikanten Unterschiede im Gegensatz zu den im Gewebe normaler menschlicher Gehirnrinde erwarteten Werten auf. Wichtig ist die von T O W E R und E L L I O T T [ 1 2 ] gewonnene Erkenntnis, daß sowohl die fokalen als auch nichtfokalen Gewebsschnitte (bei Inkubation in Glukose-Salzlösung mit normaler und erhöhter Kaliumkonzentration) freies Acetylcholin in ungefähr der gleichen Menge hervorbringen. Die Erhöhung des gebundenen Acetylcholins ist jedoch in den Fokalgewe-bsschnitten geringer als in den Schnitten des intakten Gewebes. Daraus geht hervor, daß das Fokalgewebe vermutlich nicht imstande ist, Acetylcholin in gebundener inaktiver Form in ausreichender Menge abzulagern. Aus den von uns gewonnenen Ergebnissen ist ersichtlich, daß die 50 Epileptikern entnommenen Liquoren eine große Gruppe in sich schließen, die einen normalen Gehalt an gebundenen Glyciden (in Prozenten des Proteingewichts ausgedrückt) aufweist. Diese Gruppe steht vorwiegend im

Glykoproteide im Liquor bei Epileptikern

243

Einklang mit der klinischen Diagnose Epilepsia genuina. Zu der zweiten Gruppe, bei der ein hoher Gehalt an gebundenen Glyciden festgestellt wurde, gehören fast ausschließlich Fälle von Epilepsia posttraumatica und Epilepsia tarda, d. h. in unserem Material, Fälle sekundärer Epilepsie mit Herdbefund. Unbeantwortet bleibt die Frage, ob dieser Befund tatsächlich der Ausdruck derselben Abweichung ist, wie sie direkt in dem Fokalgewebe vorgefunden wird. Dieses Problem bleibt Gegenstand unserer weiteren Arbeiten. Literatur [1] [2] [3] [4] [5]

A . : Ergebn. Physiol., biol. Chem. exp. Pharmakol. 28, 1 (1929). A . L A N G E R : Biochem. Z. 2 4 2 , 320 (1931). S T A R Y , Z . , H. B O D U R U . S . G . L I S I E : Klin. Wschr. 31, 339 (1953). S Ö R E N S E N , M. u. G. H A U G A A R D : Biochem. Z. 260, 247 (1933). F E R R A N T E , L . U . F . C A N T A R U T T I : Minerva pediat. (Torino) 6, 430 (1954). [ 6 ] Roboz, E., J . B. M U R P H Y , W . C. H E S S U . F . M . F O R S T E R : Proc. Soc. exp. Biol. Med. (N. Y . ) 89, 691 (1955). [7] B A U E R , H . : Dtsch. Z. Nervenheilkunde 1 7 5 , 488 (1957). [8a] A P O S T O L , R . R . , E . R O B O Z , W . C. H E S S U . F . M. F O R S T E R : Neurology (Mineapolis) 6, 859 (1956). [8b] S T A R Y , Z . , S . S . S O Y S A L , U . S . G . A N H E G G E R : Klin. Wschr. 3 4 , 900 (1956). [9] L A N G , B., F . M I K U L A , J. T R N E C K A U . V . B O H U N E K : V I t h Intern. Congr. of Neurol. (Brussels) 1957; Excerpta med. Sect. V I I I , Congress Issue 1957, p. 63. [10] T O W E R , D. B. U . D. M C E A C H E R N : Canad. J. Res. 2 7 , 120 (1949). [11] E L L I O T T , K . A . C . u. W . P E N F I E L D : J. Neurophysiol. 11, 485 (1948). [12] T O W E R , D. B. U . K . A . C. E L L I O T T : J. appl. Physiol. 4, 669 (1952). GREVENSTUK,

LUSTIG,

B.

U.

Anschrift der Verfasser: Dr. med. B. L A N G , Chemische Anstalt der Medizinischen F a k u l t ä t der P a l a c k y Universität, Olomouc, Lidickä 8. Tschechoslowakei.

Summary 1. In the course of studies concerning the contents of protein-bound glycides of cerebrospinal fluid in neurological diseases a group of 50 epileptic patients was examined. 2. T w o groups with different contents of glycides of the cerebrospinal fluid proteins (expressed as percentage of total proteion weight) were established. The group with normal values corresponded almost completely with the diagnosis of genuine epilepsy, while the group showing an increase corresponded with the diagnosis of posttraumatic and late epilepsy. The values of total cerebrospinal fluid proteins were within the limits of normal physiological variability in both groups.

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244

B. LANG,

L . STEIDEL,

J.

TRNECKA

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A c t a biol. med. germ., Band l, Seite 245—248 (1958) Aus dem Physiologisch-chemischen Institut der Humboldt-Universität Berlin (Direktor: Prof. Dr. S. R A P O P O R T )

Über die erhöhte Blutgerinnung nach Aderlaß H. J.

RADERECHT

unter Mitarbeit von

D.

GRÜNEBERG

(Eingegangen am 11. 12. 1957)

Zusammenfassung Es wurden an Kaninchen nach fortlaufender Entblutung einige Gerinnungsfaktoren sowie der Gehalt an Fibrinogen im Plasma bestimmt. Es zeigte sich, daß Faktor 7 und Prothrombin vom 2. Tag an aktiviert waren. Fibrinogen stieg nur nach der 1. Entblutung über den Normalwert an, um bald wieder zum Anfangswert zurückzukehren. Als Ursache der erhöhten Blutgerinnung nach mehrfachem Aderlaß ist also vor allem eine Ausschüttung des Prothrombins und des Gerinnungsfaktors 7 durch das aktivierte Knochenmark in den Blutkreislauf anzusehen.

Bei Untersuchungen über die Entblutungsanämie an Kaninchen fiel uns auf, daß bereits nach wenigen Blutentnahmen die Gerinnungszeit stark verkürzt wurde. Solche Zunahmen der Gerinnungsfähigkeit nach Blutverlusten wurden bereits von H A W S O N 1772 [6], von N A S S E 1836 [ 1 1 ] und H A R T M A N N 1909 [5] beschrieben. G R A Y U . L U N T [4] sowie C A N N O N und M E N D E N H A L L [1] fanden nach Blutverlust eine Zunahme des Fibrinogenspiegels im Blut und machten diese für die Zunahme der Gerinnungsgeschwindigkeit verantwortlich. Wir vermuteten nach mehrfachem Aderlaß eine Veränderung der Gerinnungsfaktoren und untersuchten aus diesem Grunde den Fibrinogenspiegel sowie das Verhalten einiger Gerinnungsfaktoren im Verlauf einer Entblutungsanämie. Methodik Die Untersuchungen wurden an grauen Feldkaninchen (Gewicht 3 kg) gemacht, die mit gemischtem Futter (Kartoffeln, Rüben, Korn) ernährt wurden. Zur Blutentnahme wurde das Kaninchenohr sauber rasiert und mit Paraffinöl eingerieben. Durch eine Kanüle wurden aus der Ohrvene täglich 50 ml Blut entnommen und am selben Tage Fibrinogen, das Prothrombinpotential nach Q U I C K [14]—[16], das isolierte Prothrombin, die Gerinnungsfaktoren 5 und 7, sowie das heparinartige Antithrombin bestimmt. Die Bestimmung des Fibrins wurde aus Citratplasma, nach Rekalzifizierung mit der Biuret-Methode, durchgeführt. Der Prothrombinspiegel wurde nach Q U I C K

246

H . J.

RADERECHT

[14]—[16], das Antithrombin nach einer Modifikation von J Ü R G E N S [7], [8] der Methode von D Y C K E R H O F F [3] bestimmt; Faktor 5 wurde nach O W R E N [12], [13], Faktor 7 nach K O L L E R [9] untersucht.

Ergebnisse Es wurden drei Versuche gemacht. In Diagramm 1 sind die Veränderun-

Zeit dargestellt. Als Ordinate wurde die Differenz der Gerinnungszeiten bei den einzelnen Bestimmungen zu drei Normaltieren aufgetragen, beim Fibrinogen direkt die Konzentration in mg/100 ml Plasma. Es zeigt sich,

Die erhöhte Blutgerinnung.nach Aderlaß

247

daß von den Gerinnungsfaktoren das Prothrombinpotential, gemessen an der Prothrombinzeit nach Q U I C K , bis zu dem 5.—8. Entblutungstag aktiviert ist. Ebenfalls aktiviert ist das isolierte Prothrombin und der Faktor 7. Der Fibrinogenspiegel steigt nach der 1. Entblutung um 30% an, um dann bereits langsam wieder zu fallen. Die Thrombintitration zur Erfassung des heparinartigen Antithrombins zeigte in sämtlichen Fällen keine deutlichen Abweichungen von den Kontrollen.

Diskussion Die von G R A Y und L U N T [4], sowie von C A N N G N und M E N D E N H A L L [ 1 ] gefundene Zunahme des Fibrinogenspiegels im Blut konnten wir ebenfalls beobachten. Jedoch liegt diese Zunahme nur bei etwa 30% des Ausgangswertes und ist damit nicht sehr erheblich. G R A Y U. L U N T sowie C A N N O N und M E N D E N H A L L stellten weiterhin fest, daß der Fibrinogenabgabe in den Kreislauf eine Zunahme der Adrenalinmenge im Blut parallel geht. In dem Maße wie der arterielle Druck zu fallen beginnt, wird nach ihren Untersuchungen Adrenalin in den Kreislauf abgegeben. Das Adrenalin wirkt hierbei mobilisierend auf die Fibrinogendepots der Leber. Die alleinige Ursache der Erhöhung der Gerinnungszeit nach Aderlaß konnte aber nicht in der Erhöhung des Fibrinogenspiegels zu suchen sein. Aus unseren Ergebnissen geht hervor, daß diese Erhöhung der Blutgerinnung auf eine Erhöhung der Konzentration der Gerinnungsfaktoren bzw. auf ihre Aktivierung im Blut zurückzuführen ist. Der Bildungsort dieser Faktoren ist z. T . bekannt. So fanden W I T T E und D I R N B E R G E R [2] das Prothrombin und Faktor 7 im Knochenmark meist deutlich erhöht. Weiter konnten M A R I N O und R I H - C H I N G [10] im Markextrakt von Knochen nach Enteiweißung Substanzen nachweisen, die die Blutgerinnung deutlich beschleunigen. Sie identifizierten diese durch chromatographische Analysen als Hypoxanthin, Inosin und Guanosin. Bei Verwendung von Reinsubstraten stellten sie noch bei Gaben von 200 y Hypoxanthin und Guanosin bei einem 2,5 kg schweren Kaninchen eine deutliche Beschleunigung der Blutgerinnung fest. Aus diesen Beobachtungen ergibt sich, daß u. a. das blutbildende Knochenmark als Bildungsort von Gerinnungsfaktoren angesehen werden muß. Durch die Entblutungsanämie ist nun bekanntlich das rote Knochenmark stark vermehrt. Es kann daher gefolgert werden, daß bei mehrfachen Blutungen das aktivierte Knochenmark neben der gesteigerten Bildung von Retikulozyten gleichzeitig im vermehrten Maße Prothrombin und Gerinnungsfaktor 7, sowie vielleicht noch andere die Blutgerinnung fördernde Substanzen (Hypoxanthin, Guanosin und Inosin) in den Kreislauf abgibt.

248

H.J.

RADERECHT

W i r danken Herrn Prof. Dr. J. JÜRGENS (I. Med. Klinik der Charité Berlin) für die Ausführung der ersten orientierenden Bestimmungen sowie für die Unterweisung in der Bestimmung der Gerinnungsfaktoren. Der Firma H o f f m a n n la Roche Berlin danken wir für die Überlassung von kristallinem Thrombin.

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Summary Some factors of blood clotting as well as fibrinogen content of plasma were determined in rabbits following repeated bleeding. It was shown that factor 7 and Prothrombin were activated starting with the second day. Fibrinogen showed only a transient increase after the first removal of blood, but soon returned to its nitial value.

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KOJIHieCTBy.

Acta biol. med. germ., Band l, Seite 249—258 (1958) Aus dem Institut für Medizin und Biologie der Deutschen Akademie der Wissenschaften, A B Pharmakologie, und dem Institut für Pharmakologie und Toxikologie der Humboldt-Universität zu Berlin (Dir.: Prof. Dr. F. J U N G )

Zur Pharmakologie der Tweens 1 I. Die Wirkung von Tween 80 auf periphere Gefäßgebiete B . W I E G ERSHAUSEN

und

D.

KUPKE

(Eingegangen am 23. 11. 1957)

Zusammenfassung Tween 80 führt bei Perfusion isolierter Gefäßgebiete, insbesondere der hinteren Extremitäten bei Katzen, zu einer meßbaren Herabsetzung der Oberflächenspannung des Blutes und zu einer Spasmolyse der Gefäße. Diese Befunde konnten statistisch gesichert werden. Es wird darauf hingewisen, daß im pharmakologischen Experiment die Anwendung von Tween 80 bei der Prüfung gefäßspamolytischer Substanzen nur bei Berücksichtigung der Eigenwirkung des Lösungsvermittlers sinnvoll ist.

Seit einigen Jahren haben nicht nur in der Nahrungsmittelindustrie, sondern vor allem auch in der pharmazeutischen Industrie synthetische Detergentien als Lösungsvermittler, Dispergiermittel und Emulgatoren Eingang gefunden. Dabei nehmen die nicht-ionogenen Stoffe eine ganz besondere Stellung ein, da ihre Toxizität bei peroraler Gabe weit geringer ist als die anionischer und kationischer Verbindungen [6]. Als besonders geeignet haben sich die Sorbitanabkömmlinge vom T y p des Tweens erwiesen, mit deren Hilfe verschiedene Rezepturschwierigkeiten überwunden werden konnten [3], [23], [27]. Auf Grund ihrer Schutzkolloidwirkung können sie auch noch in stärkerer Verdünnung die Ausfällung schwer löslicher Substanzen verhindern [20]. Diese mehr oder weniger viskosen Substanzen kann man sterilisieren, ohne daß sie ihre lösungsvermittelnden Eigenschaften verlieren [15], [26]. Bei der pharmakologisch-toxikologischen Bedeutung dieser Netzmittel hat in der Literatur ihre Toxikologie weitaus mehr Beachtung als die Pharmakologie gefunden. Nach H A U S C H I L D [8] ist „Tween 80 ein wertvolles für therapeutische und pharmaVorliegende Arbeiten wurden im Rahmen von Forschungsaufträgen des Staatssekretariats für Hochschulwesen und der Deutschen Akademie der Wissenschaften zu Berlin durchgeführt. Für die großzügige Bereitstellung der Mittel sei an dieser Stelle diesen Institutionen gedankt.

1

250

B . WIEGERSHAUSEN, D . K U P K E

zeutische Zwecke viel verwendetes Netzmittel". Dieser Meinung kann man, wenn es sich um die perorale [4], [5], [9], [10], [14], [25] und äußerliche [11], [20], [21], [26] Anwendung handelt, sicher zustimmen. B e i der parenteralen Anwendung jedoch sind die Ergebnisse in der Literatur [14], [16], [22], [24] nicht einheitlich, und es verwundert nicht, daß man dieser Applikationsart mit Skepsis gegenübersteht. Parenterale Verabfolgung von Tweens an verschiedene Tierspezies [7], [14], [16], [24] führt zu vorübergehender Depression des Blutdrucks. Caniden reagieren schon bei kleinen Mengen von Tween sehr heftig [7], [14], [17]. Dabei werden urticarielle Erscheinungen an H a u t und Schleimhaut und vermehrte Magensekretion beobachtet. Die Antagonisierung dieser E f f e k t e [7], [14], [18], ihre Beseitigung bzw. Abschwächung, kann durch Antihistaminica erreicht werden. Nach KRANTZ [14] beruhen die E f f e k t e der Tweens auf der Freisetzung von Histamin bzw. histaminähnlichen Körpern.

Es drängt sich nun die Frage auf, inwieweit Tween 80 (Polyoxyäthylensorbitanmonooleat) durch Eigeneffekte pharmakodynamische Wirkungen schwer löslicher Substanzen, die in Tween 80 gelöst worden sind, überdecken oder vortäuschen kann. Das gilt insbesondere für Durchströmungen isolierter Gefäßgebiete. K R A N T Z [14] hat mit hohen Tween 20-Konzentrationen am TRENDELENBURGschen Froschpräparat Vasokonstriktion beobachten können. Andererseits sprechen S C H M I D T , G O O D S E L L und R I C H A R D S von einer „potential vascular dilating activity" an isolierten Organen durch Tween 60 [24]. Aus jüngster Zeit liegen Arbeiten von v. B U B N O F F [2] vor, die über Ergebnisse von z. T. sehr schwer löslichen Substanzen wie p-Oxybenzoesäureester berichten. Diese Substanzen wurden für den Versuch zur Durchströmung isolierter Gefäßgebiete in nicht geringen Mengen Tween 80 gelöst. In der zitierten Arbeit wird davon gesprochen, daß „in Kontrollversuchen die verwendeten Dosen von Tween 80 ohne Wirkung" auf die Durchblutung sind. Bisher liegen in der Literatur keine Arbeiten vor, in denen systematisch spezifische Wirkungen von Tween 80 an peripheren Gefäßen von Säugetieren studiert worden sind. Diese Lücke zu schließen war das Ziel unserer Untersuchungen. Methodik A l s Versuchstiere dienten K a t z e n (ca. 3000 g, vorwiegend weibliche Tiere), da aus der Literatur bekannt ist, daß diese Spezies sehr widerstandsfähig ist und auf T w e e n weniger heftig reagiert als Hunde. Als Durchströmungsgebiet wählten wir nach einigen Versuchen an der Niere vornehmlich die hinteren Extremitäten. Diese wurden vollständig isoliert [19], [28]. V o n der Art. carotis führte ein Polyäthylenschlauch über einen Windkessel und ein druckanzeigendes Gummimembran-Manometer direkt in die Art. renalis bzw. femoralis. Das B l u t aus der peripheren Vene wurde über einen Tropfenzähler mit Ordinatenschreiber (nach JUNG [12]), in das Reservoir einer v o n uns modifizierten ScHUSTER-DALE-Pumpe geleitet. V o n dort wurde das B l u t in den zentralen Teil der V . femoralis reinfundiert. Die Registrierung des Blutdrucks geschah mit Hilfe eines Federmanometers aus der Art. femoralis der anderen Seite. — Tween 80 [1] in o,g%iger Kochsalzlösung k a m in 3,5 bis I 4 % i g e n Lösungen (wenige Versuche auch mit 28%) zur Anwendung. W i r applizierten diese Substanz in den Polyäthylenschlauch, der zur Art. renalis bzw. femo-

Wirkung von Tween 80 auf periphere Gefäße

251

ralis führte. Gleiches Volumen (0,5 ml) und gleiche Injektionsgeschwindigkeit (1 sec.) wurden in allen Versuchen beibehalten. Das Ausmaß der im zuführenden System auftretenden Druckerhöhung bei schneller Injektion ist weniger veränderlich als bei langsamer, wie wir uns durch die immer gleichen Ausschläge am Membranmanometer überzeugen konnten (Abb. 2). Die Erhöhung des Druckes im arteriellen Schenkel während der Injektion hat eine Steigerung der Tropfgeschwindigkeit auf der venösen Seite zur Folge. Weiterhin bestimmten wir die Größe des Ausflußvolumens mit Hilfe von Meßzylinder und Stoppuhr in ßmal 30-Sekunden-Perioden. Die Messung des Volumens begann 10 sec nach der Injektion in der 1. Periode von der 10. bis zur 40. sec, dann wurde 10 sec gewartet und das Volumen der 2. Periode von der 50. bis zur 80. sec bestimmt usw. Wenn man das Volumen durch die Anzahl der Tropfen gleicher Zeiteinheit dividiert, erhält man die Tropfengröße. Somit war es möglich, durch Messung der abtropfenden Blutmenge einmal ein Maß für die Durchblutung zu gewinnen und zum anderen durch Bestimmung der Tropfengröße eindeutige Aussagen über die oberflächenspannungsverändernde Wirkung des Tween 80 zu machen. Nach jeder Substanzaplikation injizierten wir zur Kontrolle 0,5 ml einer o,9%igen Kochsalzlösung. Der durch die Versuchsmethodik bedingte Blutverlust war gering und wurde durch Gaben von Polyvinylpyrrolidon (Normalidon, V E B Chem. Fabrik Grünau) ausgeglichen. Die Blutgerinnung wurde mit Heparin (Organo-Pharma, Praha/CSR bzw. Thrombophob, Nordmark-Hamburg) 5000—7500 I E pro Tier verhindert. Künstliche Beatmung der Tiere schien in allen Versuchen angebracht. Alle Ergebnisse wurden statistisch ausgewertet [13]. Zu Beginn unserer Versuche hatten wir in unsere Methodik das für Durchströmungsmessungen oft gebrauchte Bubble-flow-Meter eingeschaltet. Wir mußten aber im Verlauf unserer Untersuchungen beobachten, daß dieses Gerät sich für unsere Fragestellung als vollkommen ungeeignet erwies. Änderungen der Oberflächenspannung und der Viskosität der Durchströmungssflüssigkeit teilen sich dem Bubble-flow-Meter kaum mit bzw. liegen im Bereich der Fehierbreite dieser Apparatur.

Ergebnisse a) Einfluß von Tween 80 auf die Oberflächenspannung des Blutes Als Maß der Erniedrigung der Oberflächenspannung des Blutes, die durch Tween 80 zu erwarten war, galt die Veränderung des Bluttropfvolumens. Unter unseren Versuchsbedingungen betrug unter der Voraussetzung einer konstanten Abtropffläche das mittlere Volumen eines aus dem venösen Schenkel fallenden Bluttropfens 4,1—4,2 • io~2 ml. Zugabe von o,9%iger Kochsalzlösung (0,5 ml) verändert das mittlere Volumen der Bluttropfen nicht. Tween 80 führt zu einer signifikanten Verkleinerung der Bluttropfen von über 20% (Abb. 1). Schon in der 1. Periode nimmt das Tropfenvolumen ab. Es hat in der 2. Periode sein Minimum, und damit erreicht die Erniedrigung der Oberflächenspannung ihr Maximum. Die Zunahme des Tropfenvolumens in der 3. Periode schließlich zeigt Tendenz zur Normalisierung (Abb. 1 und Tab. 1). Der Effekt verschwindet erst nach 6 Minuten. Das zeigen Versuche, bei denen über längere Zeit Ausflußvolumen und Tropfenzahl registriert wurden (Abb. 3).

252

B . WIEGERSHAUSEN,

D,

KUPKE

Die schnellere Tropfenfolge unter Tween 8o-Gaben in der 1. Periode ist einerseits abhängig von dem durch die Injektion bedingten erhöhten Einflußdruck auf der arteriellen Seite, andererseits aber eine Folge der Oberflächenspannungserniedrigenden Wirkung von Tween 80 (Abb. 2).

Abb. 1. Änderung der Tropfengröße nach Gaben von Tween 80 in Abhängigkeit von der Konzentration und derZeit. 3,5%, 7,o%, 14,0%. Ordinate: Änderung des Bluttropfenvolumens in % (0,9% Kochsalzlsg. = 100%) Abzisse: I., II., I I I . Periode (siehe Text).

Atmung Durchblutung Einflußdruck (mmHg)

Blutdruck (mmHg)

Abb. 2: Perfusion der rechten Hinterpfote. Katze 3600 g. Urethan 1 g/kg i. p. Registrierung (von oben) der Atmung, der Durchblutung (Tropfenzähler, Ordinatenschreiber), .des Einflußdruckes und des Blutdruckes. Stärkerer Ausschlag, des Ordinatenschreibers nach oben bedeutet geringere Tropfenfolge. Zeitschreibung 1 min. (->siehe Text).

Wirkung von Tween 80 auf periphere Gefäße

253

Tropfenzähler und Ordinatenschreiber täuschen somit nur ein vermehrtes Ausflußvolumen vor, wie es besonders in der 2. und 3. Periode deutlich wird. Tabelle 1 Einfluß von Tween 80 auf die Oberflächenspannung des Blutes, gemessen an der Tropfengröße (in io~2 ml). Mittelwerte und mittlerer Fehler [ e = — j a u s 15 Versuchen. P = Sicherungsgrenze \ V»/ Periode

I

II

III

nach Injektion

10—40 sec

50—80 sec

90—120 sec

Physiologische Kochsalzlösung

4,2 + 0,061

4,2 + 0,076

4,2 + 0,051

Tween 80 3,5% P

3.9 ± 0,070 > 0,05

3.4 ± 0,033 < 0,01

3.5 ± 0,097 > 0,05

Physiologische Kochsalzlösung

4,1 ± 0,045

4,1 ± 0,045

4,2 + 0,037

Tween 80 7% P

3,8 + 0,059 > 0,05

3.3 ± 0,043 0,0027

0,0027

Physiologische Kochsalzlösung

4.1 ± 0,057

4.1 ± 0.057

4,1 + 0,052

Tween 80 14% P

4,0 ± 0,055 > 0,05

3.2 + 0,038 0,0027

0,0027

3.4 + 0.056

3.3 ± o.°4 2

Tabelle 2 Einfluß von Tween 80 auf die Durchblutung. Differenzen (zlV in l o - 1 ml) zwischen Ausflußvolumina nach Gaben von Tween 80 und physiolog. Kochsalzlösung.Mittelwerte und mittlerer Fehler aus je 14 Versuchen Periode Tween 80 3.5% Twen 80 7% Tween 80 14% b) Einfluß

II

I

III

Pfür l o l l

I o l l l

— 0,93 + 0,38 P 0,014

+ 0,61 + 0 , 1 3 + 0,71 ± 0,30 < 0,0027 < 0,006 P < 0,0027 P 0,017

— 0,38 ± 0 , 1 5 P 0,011

+ 1 , 8 1 ± 0,25 -j- 2,27 + 0,46 < 0,0027 < 0,0027 P < 0,0027 P < 0,0027

— 1,91 ± 0,17 P < 0,0027

+ 1,24 + 0,40 + 2,53 ± 0,39 < 0,0027 < 0,0027 P < 0,0027 P < 0,0027

von Tween 80 auf die

Durchblutung

Die Bestimmung des Ausflußvolumens unter der Voraussetzung eines konstanten Einflußdruckes als ein Maß für die Durchblutung der isolierten Extremität schien somit unumgänglich. Die 1 . Periode ist gekennzeichnet durch ein vermehrtes Ausflußvolumen. Dieses ist bedingt durch den erhöhten Einflußdruck während der Injektion und tritt nach KochlS

A c t a biol. med. germ. H e f t 3

254

B. WIEGERSHAUSEN,

D.

KUPKE

salzgabe stärker in Erscheinung als unter Tween 8o-Gaben (Abb. 3). Die Durchblutung ist nach Kochsalzgabe in der 3. Periode wieder normal. Nach Gaben von Tween 80 ist jedoch im Gegensatz zur 1. Periode die Durchblutung in der 2. und 3. Periode signifikant erhöht (Tab. 2 und Abb. 4). Dosiserhöhung führt auch hier weniger zu einer Steigerung der Wirkungsintensität, als vielmehr zu einer verlängerten Wirkungsdauer. ml 2.0

1.0

10'2ml 5,tire

w iü-'ml

3,5%

7%

TG

31ml ZS-r

A

«L

10'2 ml

1k %

«t

TG

3.0 • 0 ho SO 120 160 200 2W sec. lach Inj Abb. 3. Perfusion der rechten Hinterpfote. Katze Ç, 2600 g, Urethan 1 g/kg Veränderung des Ausflußvolumens (V in ml) und der Oberflächenspannung des Blutes gemessen an der Tropfengröße (TG in io~2 ml) physiolog. Kochsalzlsg. Tween 80. (Das Tropfenvolumen ist in diesem Versuch größer, da Schlauch mit weiterem Lumen gewählt wurde).

c) Beziehung blutung

zwischen

Oberflächensftannungserniedrigung

und

Durch-

Dieser Frage gingen wir in Versuchen nach, bei denen wir Ausfluß- und Tropfenvolumen über die üblichen drei Perioden hinaus verfolgten (Abb. 3). Das Maximum der Erniedrigung der Oberflächenspannung,

Wirkung von Tween 80 auf periphere Gefäße

255

gemessen an der Tropfengröße, zeigt sich nach ca. 2 min; dagegen wird das Maximum der Durchblutung erst nach 4 min deutlich. Die Veränderung der Oberflächenspannung des Blutes kann je nach Dosis bis zu 6 min anhalten, die Veränderung der Durchblutung 7—8 Minuten. B e s p r e c h u n g der E r g e b n i s s e Die vorliegenden Versuche machen deutlich, welches Ausmaß die durch Tween 80 verursachte Erniedrigung der Oberflächenspannung in vivo erreicht. Die Tropfengröße nimmt bei den von uns verabreichten Mengen um über 1 j 5 ab.

lösung = 100%. (Mittelwerte aus 14 Versuchen). Dabei muß darauf hingewiesen werden, daß zur Registrierung der Durchblutung nur dann die alleinige Verwendung eines Tropfenzählers sinnvoll ist, wenn man mit Substanzen arbeitet, bei denen erwiesen ist, daß sie die Oberflächenspannung des Blutes nicht vermindern. Unter Netzmitteleinfluß wird durch eine schnellere Tropfenfolge eine vermehrte Durchblutung nur vorgetäuscht.

Durch den momentan gesteigerten Einflußdruck auf der arteriellen Seite kommt es während der ersten Periode auf der venösen Seite zu einem erhöhten Ausflußvolumen. Dieses ist nach Tween 80-Gaben geringer als nach Kochsalzgaben und zeigt sich besonders bei Anwendung höherer Konzentrationen von Tween 80 (Abb.2->0rdinatenschreiber und Abb. 4). In der 2. und 3. Periode ist jedoch das Ausflußvolumen unter Tween 80Gaben gegenüber der Kontrolle signifikant vermehrt. Hierfür gibt es zwei Erklärungen: 1) Tween 80 führt primär zu einer vorübergehenden Verengerung der Gefäße, analog den Versuchen von K R A N T Z [14] am Froschpräparat und sekundär zu einer Spasmolyse der Gefäße. Letztere kann als gegenregulatorische Reaktion auf die 1. Periode oder als spezifische Wirkung von Tween 80 aufgefaßt werden. — 2) Die Ursache der lS»

256

B . WIEGERSHAUSEN,

D.

KUPKE

Verminderung des Ausflußvolumens bzw. der Durchblutung in der i . Periode beruht auf einer Herabsetzung der Strömungsgeschwindigkeit, bedingt durch die größere Viskosität des Tween 80 gegenüber physiol. Kochsalzlösung trotz des erhöhten Einflußdruckes. (Bei Versuchen im OsTWALDschen Viskosimeter ist die Strömungszeit I4%iger Tween 80Lösung gegenüber physiol. Kochsalzlösung um das Doppelte vermehrt). In der 2. und 3. Periode macht sich diese Erscheinung durch rasche Vermischung mit dem Blut nicht mehr bemerkbar, und es kommt auf Grund der Pharmakodynamik von Tween 80 infolge einer Gefäßerweiterung zu einer Steigerung der Durchblutung, die mehrere Minuten anhält. Wir neigen in unserer Auffassung dieser letzten Erklärung zu. Tween 80 führt danach zu einer Gefäßdilatation, die in der 1. Periode nur durch die Erhöhung der Viskosität der Perfusionsflüssigkeit verdeckt wird. Die Gefäßd i l a t a t i o n , w i e v o n KRANTZ v e r m u t e t u n d v o n SCHMIDT U. a. [24] f ü r T w e e n

60 angenommen, bedingt eine gesteigerte Durchblutung. Weiter ist durch unsere Versuche erwiesen, daß nicht nur Hunde, wie KRANTZ behauptet, sondern auch Katzen empfindlich und spezifisch auf Tween reagieren können. Ob bei Perfusion peripherer Gefäßgebiete mit Tween 80, insbesondere der hinteren Extremität, vermehrt Histamin oder histaminähnliche Körper auftreten, die eine Gefäßspasmolyse verursachen, muß in weiteren Experimenten geklärt werden. Abhängigkeit zwischen Ausflußvolumen und Oberflächenspannung des Blutes unter Tween 80 sind nicht ausgeschlossen, obwohl die Maxima beider Wirkungen nicht gleichzeitig feststellbar sind. Die pharmakodynamischen Effekte der Gefäßerweiterung halten länger an als die physikochemischen der Oberflächenaktivität. Nach den uns vorliegenden Ergebnissen scheint es notwendig zu betonen, daß der Pharmakodynamik der Tweens, insbesondere bei parenteraler Anwendung, Beachtung geschenkt werden muß. Eine Verwendung von Tweens und anderer selbst spasmolytisch wirksamer Lösungsvermittler im pharmakologischen Experiment, bei der Prüfung von Substanzen auf spasmolytische Wirkung (v. BUBNOFF [2] u. a.), ist abzulehnen, da sie die Klärung der Pharmakodynamik der zu untersuchenden Stoffe wesentlich erschwert. Dabei darf außerdem nicht übersehen werden, daß durch nicht-ionogene Netzmittel die Wirksamkeit von Pharmaka auf Grund einer veränderten Penetration und Resorption beeinflußt werden kann. A n dieser Stelle möchte ich nicht versäumen, für die verständnisvolle Assistenz bei der Durchführung der Versuche Frl. K . B I T T K A U ZU danken.

Anschrift des Verfassers: Dr. B. W I E G E R S H A U S E N . Institut für Pharmakologie und Toxikologie der Humboldt-Universität, Berlin W 8, Clara-Zetkin-Str. 94

Wirkung von Tween 80 auf periphere Gefäße

257

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258

B. WlEGERSHAUSEN,

D.

KUPKE

Summary Tween 80 when perfused into isolated vascular areas, particularly the hindleg of the cat, causes a measurable decrease of surface tension of the blood and a spasmolysis of the vessels. These findings were statistically valid. I t is pointed out t h a t the use of Tween 80 in pharmacological experiments testing vascular spasmolytic substances is only valid if the action of . the mediator of solution itself is taken into account.

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Acta biol. med. germ., Band 1, Seite 259—271 (1958) Aus der Deutschen Akademie der Wissenschaften zu Berlin, Institut für Medizin und Biologie, Arbeitsbereich Klinische Medizin (Direktor: Prof. Dr. H. G U M M E L )

Experimentelle Untersuchungen über die Phosphataseaktivität in der Rattenleber, insbesondere bei Hepatomen REINHOLD

ZAHNERT

(Eingegangen am 10. i. 1958) Zusammenfassung Es wurden histochemisch die Leber normaler Ratten und durch Buttergelbfütterung veränderte Rattenlebern untersucht. Dabei stellten wir fest, daß es in den cystischen Leberveränderungen sowie in den Leberzellen der Umgebung von Tumoren zum Auftreten bzw. zu einer Aktivitätszunahme der alkalischen Phosphatase kommt. Die soliden Tumoren blieben phosphatasefrei. Es wird darauf hingewiesen, daß durch den histochemischen Nachweis der Phosphataseaktivität nur ein Funktionszustand der Zelle dargestellt und ein der Glykose konform gehender Aktivitätsgrad der alkalischen Phosphatase angenommen werden kann.

Immer wird, insbesondere vor Radikaloperationen von malignen Geschwülsten des Bauch- und Thoraxraumes, die Frage gestellt, ob schon eine ausgeprägte Lebermetastasierung vorliegt oder aber mit einer Manifestation und zunehmendem Wachstum latenter Metastasierungen zu rechnen ist. Zur Klärung dieses Problems führten wir systematisch Phosphatasebestimmungen und Labilitätsteste im Serum, Bestimmungen der Serumeiweißfraktionen und der Gerinnungsfaktoren durch. Grundsätzlich haben wir bei entsprechenden pathologischen Befunden und bei jeder Lebervergrößerung den Patienten laparoskopisch untersucht. Uber die Ergebnisse wird an anderer Stelle noch berichtet. Bezüglich unserer Erfahrungen über den Wert der alkalischen Serumphosphatase haben L Ü H R S , G U M M E L und K I N D E R M A N N [ 1 ] 1 9 5 5 veröffentlicht. B E R N D T und L Ü H R S [ 2 ] nahmen später auf Grund weiteren vorliegenden Zahlenmaterials wie folgt Stellung: „Eine Vermehrung der alkalischen Serumphosphatase läßt wohl den Verdacht auf Leber- oder osteoblastische Knochenmetastasen aussprechen, ist aber allein keine Kontraindikation gegen die Operation." Die örtliche Verbreitung der Phosphatase wurde histochemisch insbesondere durch GOMORI [ 3 ] , T A K A M A T S . U [ 4 ] , B O U R N E [ 5 ] und andere

2Ö0

R.

ZAHNERT

demonstriert. K A B A T H und F U R T H [6] wiesen schon 1941 auf den unterschiedlichen Phosphatasegehalt im normalen und neoplastischen Gewebe hin. Erwähnt seien noch die speziellen Arbeiten über die Phosphataseaktivität der Leber durch W A C H S T E I N und Z A K [7]. J A K O B Y und M A R T I N [8] verglichen die Biochemie der Galle mit der histochemischen Verbreitung der alkalischen Phosphatase der Leber bei Kaninchen und Meerschweinchen und kamen entsprechend den Untersuchungen von B E C K M A N N [9], S C H Ö N D U B E [10] u. a. zu dem Schluß, daß die Serumphosphatase durch die Leberzellen in die Gallenwege und letztlich durch die Gallengänge in den Darm ausgeschieden wird. Entsprechend finden wir bei mechanischem Verschluß der Gallenwege beim Menschen und im Tierexperiment einen Anstieg der alkalischen Phosphatase in den Gallenkanälchen und in den Leberzellen ( C L E V E L A N D , R I C H F I E L D , G A L L und S C H I F F [11]). Die Frage nach den Beziehungen zwischen Enzymen, in diesem Falle Phosphatase, und malignen Tumoren wurde in letzter Zeit besonders -von K O B A Y A S H I , O G A T A und K I M U R A [12] aufgegriffen. Sie kamen zu dem Schluß, daß auf Grund der von ihnen durchgeführten Untersuchungen von frisch entnommenem Lebergewebe während der Laparotomie die Phospataseaktivität im Leberläppchen, und zwar zentral als auch peripher ganz allgemein bei Krebskranken höher ist, als bei Nichtkrebskranken. Im einzelnen wird dargelegt, daß diese erhöhte Phosphataseaktivität besonders in den Gallengängen, den Leberzellen, Kernkörperchen und den Venen der GLissoNschen Kapsel zu finden ist. Unterschiede im Zellkern wurden nicht festgestellt. Auch M U L A Y und F I R MINGER [13] erbrachten den Nachweis, daß die Phosphataseaktivität im Serum und in der Leber bei tumortragenden Ratten höher ist als bei normalen. Wir untersuchten zunächst einmal tierexperimentell durch Erzeugung von Hepatomen, welche Geschwulstzellen eine vermehrte Phosphataseaktivität zeigten und ob in der Umgebung dieser Zellen, bzw. überhaupt in den Leberzellen der Umgebung von entarteten Zellen eine Änderung der Phosphataseaktivität eingetreten ist. Ganz allgemein ist diese in normalen Leberzellen bei den Säugetieren sehr gering. Sie steigt aber bei in Regeneration befindlichen Leberzellen an (J. V E R N E [14]). Methodik und Technik A.

Allgemeines

Durch die im Organismus gehäuft vorkommenden phosphorsäurehaltigen Produkte ergibt sich die Vielzahl von Phosphatasen, wie sie verschiedentlich zusammengestellt wurden [15]. E s handelt sich im wesentlichen um hydrolytische Enzyme, die nach ihrem Wirkungsmechanismus in Mono-, Di- und Triphosphatasen eingeteilt werden. Auf die Einteilung der Phosphatase nach Substratspezifität ( A L B E R S ) sei hierbei hingewiesen [16]. Histochemisch wird die (KH) Phosphormonoesterase je nach ihrem optimalen p H -Spiegel in alkalische und saure Phosphatase eingeteilt. Es wäre müßig.

Phosphataseaktivität in Rattenleber und Hepatomen

261

auf die geschichtliche Darstellung einzugehen, da dies schon in einer Vielzahl v o n Arbeiten geschehen ist. Insbesondere sei auf die Darstellungen von G O M O R I [17] und P E A R S E [18] verwiesen. E s wird in diesem Zusammenhang noch auf folgende Punkte aufmerksam gemacht, die das Ergebnis beeinflussen können ( P E A R S E U . a.): Inaktivierung des E n z y m s während der Fixation und Einbettung, während der Aufbereitung und A u f b e w a h rung der Schnitte und durch Abweichung von p H -Optimum; Beeinflussung durch den A k t i v a t o r , (Magnesium-Ion), ungeeignetes Substrat (Glycero-Phosphat). F R I E D E N W A L D und C E O W E L L [19] stellten fest, daß frisches, unfixiertes Gewebesubstrat spez. Phosphatase enthielt, die in fixiertem Gewebe nicht nachgewiesen werden konnte. A u c h D A N I E L L I [20] zeigte, daß Gefrierschnitte eine höhere Phosphatasea k t i v i t ä t aufweisen als eingebettetes Gewebe. Allerdings besteht hierbei die Gefahr, daß das E n z y m durch Diffusion verlorengehen kann. B. Bestimmung

der alkalischen

Phosphatase

nach GOMORI mit kleinen

Abwandlungen

1. Organproben im Reagenzglas 15 Minuten tief gekühlt. 2. Fixierung in eiskaltem Aceton (ca. 18—24 Stunden). 3. Entwässern in zweimal gewechseltem Aceton (3—6 Stunden je nach Größe des Materials). 4. Anschließend in zweimal gewechseltes Benzol für 2 — 3 Stunden gelegt. 5. Einbetten in zweimal gewechseltes Paraffin bei 56° C. (1 y 2 — 2 Stunden). 6. Schneiden (4 ß), Aufziehen der Schnitte auf vorbereitete Objektträger. Trocknen der Schnitte bei 37 0 C (2 Stunden). Histochemische R e a k t i o n : 7. Entparaffinieren der Schnitte in X y l o l , absteigende Alkoholreihe in A q u a dest. 8. Einsetzen der Schnitte in die Bebrütungslösung nach G O M O R I ' (2 Stunden bei 37° C): Na-Glycerophosphat 0,3 g, Veronal-Na 0,5, Kalziumchlorid 2 % i g 25,0 ccm, Magnesiumsulfat i o % i g 10 Tropfen, A q u a dest. ad 50,0 ccm. Die p H -Messungen wurden in der Bebrütungslösung und im Veronal-Puffer ständig kontrolliert. E s fand sich konstant im Veronal-Puffer ein p H v o n 9,4 und in der Gesamtlösung ein p H von 9,35 (die Messung wurde mit dem Philippsgerät durchgeführt). 9. Abspülen in A q u a dest., innerhalb einer Minute dreimal wechseln. 10. Einstellen in 2 % i g e Cobaltsulfatlösung für 5 Minuten. 11. Abspülen in A q u a dest. (viermal innerhalb einer Minute wechseln). 12. Einstellen in verdünnte Ammoniumsulfidlösung für 5 Minuten (1:3 verdünnte i o % i g e Lösung). 13. Abspülen in A q u a dest., viermal wechseln, bis der letzte Wechsel nicht mehr nach Ammoniumsulfid riecht. 14. Gegenfärbung mit Kernechtrot für 10 Minuten zur besseren Kontrolldarstellung. 15. Aufsteigende Alkoholreihe, X y l o l , Balsam. Zur Kontrolle (K 1) wurden Parallelschnitte zur Bebrütung in die GoMORische Bebrütungslösung ohne Veronalpuffer gebracht, sonst erfolgte die gleiche Behandlung wie oben beschrieben. Wir hatten also in jedem Fall bei K 1, also ohne den entsprechenden pn-Bereich, niemals einen Phosphatasenachweis. Eine 2. Kontrolle wurde derart durchgeführt, daß die Parallelschnitte für 10 Minuten in 8 0 — i o o c C A q u a dest. gestellt wurden, um die Fermentwirkung zu hemmen (K 2), sonst B e handlung wie zuvor. Die Kontrollen waren stets negativ. W i r führten außerdem zur Kontrolle den histochemischen Nachweis wie er von S C H I E B L E R [21] modifiziert dargestellt wurde, genau in der von ihm angegebenen A r t durch und erhielten im wesentlichen die gleichen Ergebnisse.

2Ö2

R.

ZAHNERT

Bestimmung der sauren Phosphatase nach GOMORI 1. Einbettung wie bei der alkalischen Phosphatase. 2. Entparaffinieren der Schnitte nicht über die absteigende Alkoholreihe, sondern unter Ausschaltung der Fehlermöglichkeiten, wie sie N E U M A N N [22] dargestellt hat, über Xylol-Aceton und Aqua dest., um einen Verlust der Reaktionsfähigkeit des Gewebes durch Einwirkung von Äthylalkohol zu verhindern. 3. Herstellung einer Beizstammlösung: Molarer Acetat-Puffer p H 5,0 (kontrolliert) 3 Teile 5%iges Bleinitrat 1 Teil destilliertes Wasser 6 Teile 2% Natriumglycerophosphat 3 Teile Stammlösung 1 : 3 mit destilliertem Wasser verdünnt und auf 37 0 C erwärmt. 4. Schnitte werden 16 Stunden in dieser Lösung (bei 37° C im Brutschrank) belassen. 5. Anschließend innerhalb einer Minute dreimal Aqua dest. wechseln. 6. Zwei Minuten in 2%ige Essigsäure bringen, um Blei-Eiweißverbindung zu schaffen. 7. Waschen in 2—3mal gewechseltem Aqua dest. 8. Einstellen in verdünnte Ammoniumsulfidlösung (2 min). 9. Abspülen in Aqua dest. (s. oben). 10. Gegenfärbung mit frisch bereiteter Acridinrot- und Methylgrün-Lösung (2:1). 11. Anschließend kurzes und schnelles Durchgehen durch die aufsteigende Alkoholreihe Xylol-Balsam. Es wurden auch bei dieser Methode die Kontrolluntersuchungen an Parallelschnitten — wie oben angegeben — durchgeführt. Weiterhin wurden zur vergleichenden Beurteilung jeweils Nieren- und Dünndarmschnitte mitgeführt, die bei Normaltieren im wesentlichen stets gleichbleibend im Ausfall der Reaktion waren. C.

D.

Versuchsreihen

Wir setzten drei parallellaufende Versuchsreihen an: a) Ratten mit Standardkost. Diese war wie folgt beschaffen: 1400 g angerichtet als Tagesmenge für etwa 100 Ratten, pro R a t t e 14 g. Zusammensetzung: 400 g Zucker, 200 g Casein, 290g Mehl, 30g Weizenkleie, 30g Salzmischung ( 1 1 g K 2 H P 0 4 15,5 g NaCl, 2 g MgS() 4 , 1,5 g Citronensäure), 400 g Wasser. b) Ratten mit Standardkost u. 10 mg demethyliertes ,,Buttergelb"/die. (Herstellungsfirma des demethylierten Buttergelbs: Dr. Theodor Schuchard G. m. b. H.) I m allgemeinen wurde die Tagesmenge verbraucht, übriggebliebene Anteile wurden gewichtsmäßig nicht erfaßt, so daß keine eindeutige Aussage über die Gesamtbuttergelbmenge gemacht werden kann. Es wurde auf die genaue Mengenbestimmung verzichtet, da die Abhängigkeit der Tumorbildung von der verabreichten Buttergelbmenge in genügenden Fütterungsversuchen nachgewiesen ist. c) Sondenernährung mit 0,5 ccm Sonnenblumenöl + 10 mg demethyliertes Buttergelb/die.

Ergebnisse Nachfolgend werden die Angaben über den Gewichtsverlauf der Versuchstiere, die makroskopischen Befunde sowie die histologischen und histochemischen Veränderungen der Leber wiedergegeben. Versuchsreihe a) Normale Ratten mit Standardkost Tiere 1—5 mit Äthernarkose, Tiere 6—8 durch Schlag getötet; Demonstrationsfall. Tier 5.

Phosphataseaktivität in Rattenleber und Hepatomen

263

Makroskopisch und mikroskopisch kein Unterschied zwischen den einzelnen Tierleberpräparaten. (Abb. 1—3).

Abb. 1. Leber, alk. Phosphatase, Vergr. 180:1

Abb. 2. Leber, saure Phosphatase, Yergr. 140:1

Abb. 3. Niere, alk. Phosphatase (Kontrolle), Yergr. 9 : 1

Versuchsreihe b) Buttergelbfütterungsversuch Tier Nr. 8 (Histologie Nr. 13) Gewich tsverlauf: Bei Versuchsbeginn am 8. 1. 1957 115 g, am 23. 1. 135 g, am 22. 2. 100 g, am 26. 2. verstorben (49 Gesamtfütterungstage).

Cholangiomartige Hyperplasien und Hypertrophien der Epithelzellen. In den cholangiomatösen Partien starker Nachweis von alkalischer Phosphatase. Saure Phosphatase im allgemeinen vermindert. (Abb. 4—6).

264

R.

ZAHNERT

Tier Nr. 5 (Histologie Xr. 14) Gewichtsverlauf : Bei Versuchsbeginn am 8. 1. 1057 105 g, am 3 1 . 1 . 120 g, am 28. 2. verstorben (51 Gesamtfütterungstage). Leber für Phosphatase frisch verwendet.

A b b . 4. Leber, alk. Phosphatase, Yergr. 90:1

A b b . 5. Leber, alk. Phosphatase, Yergr. 180:1

A b b . 6. Leber, saure Phosphatase, Yergr. 90:1

Kombination sicherer cholangiomartiger ausgedehnter Wucherungen mit allerdings stark zurücktretenden auffälligen Hypertrophien von Leberepithelzellen. Kiesenkernzellen. Das Epithelparenchym ist jedoch mengenmäßig sehr stark zurückgetreten. Alk. Phosphatase mäßig positiv in den cholangiomartigen Bezirken. Außerdem sind Gallenkapillaren der hepatomartigen Abschnitte deutlich positiv.

Phosphataseaktivität in Rattenleber und Hepatomen

265

Tier Nr. 1 (Histologie Nr. 18) Gewichtsverlauf: Bei Versuchsbeginn am 8. 1 . 1 9 5 7 85 g, am 23. 1. 1 1 5 g, am 8. 4. 90 g, am 2 3 . 4 . verstorben (105 Gesamtfütterungstage). Leber für Phosphatase frisch verwendet.

Allgemeine Hypertrophien und Hyperplasien des Leberepithels. Keine cholangiomartige Bildung. Alk. Phosphatase o. B. Saure Phosphatase mittelstark. Tier Nr. 2 (Histologie Nr. 17) 10 Gewichtsverlauf: Bei Versuchsbeginn am 8. 1. 1957 1 0 5 g- a m 2 35 g> a m 8- 490 g, am 23. 4'. verstorben (105 Gesamtfütterungstage). Leber für Phosphatase frisch verwendet.

Regenerative Hyperplasien und cirrhoseähnliche Bilder, außerdem beginnende Cirrhose, z. T. Riesenkernzellen mit Nukleolen und vereinzelten Kernpyknosen. Alkalische Phosphatase in Spuren positiv. Saure Phosphatase mittelstark positiv. Tier Nr. 7 (Histologie Nr. 19) Gewichtsverlauf: Bei Versuchsbeginn am 8. 1. 1957 95 g, am 23. 1. 1 1 5 g, am 8. 4. 130 g, am 12. 6. 185 g, am 1 1 . 7. getötet (186 Gesamtfütterungstage)! Leber stark vergrößert, graugelber Knoten.

Ausgedehnte cholangiozelluläre Wucherungen und Cystenbildungen. Hyperplasien und starke Verfettung der Leberepithelien. Mehrfach atypische Zellen. Mitosen. Abschließend kann bezüglich der cholangiozellulären Komponente wohl schon von einem fertigen Karzinom gesprochen werden. Alkal. Phosphatase im Cholangiombereich herdförmig stark positiv. Der Zellcharakter ist der gleiche. Tier Nr. 3 (Histologie Nr. 20) Gewichtsverlauf: Bei Versuchsbeginn am 8. 1. 1957 85 g, am 23. 1. 105 g, am 8. 4. 1 1 5 g, am 12. 6. 150 g, am 9. 7. 125 g, am 18. 7. angefressen (191 Gesamtfütterungstage). Leber für Phosphatase frisch verwendet. Leber ausgesprochen vergrößert, mit vielen linsengroßen Flecken und erbsgroßen Cysten.

Cholangiozelluläres Karzinom. Dissoziation der hepatozellulären Partien mit auffälligen Hyperplasien und Hypertrophien. Kein eigentliches Hepatom. Alk. Phosphatase im Leberparenchym stellenweise im Bereich der Gallenkapillaren stark positiv. Cholangiom vielfach frei von Phosphatase, in anderen Partien allerdings herdförmig stark nachweisbar. Tier Nr. 4 (Histologie Nr. 21) Gewichtsverlauf: Bei Versuchsbeginn am 8. 1. 1957 100 g, am 23. 1. 1 1 0 g, am 8. 4. 125 g, am 12. 6. 1 1 0 g, am 29.7. 205 g, am 31. 7. getötet (206 Gesamtfütterungstage). Leber durchsetzt mit linsen- bis erbsgroßen hellbraunen Flecken und multiplen Cystenbildungen.

Im Bereich cirrhoseähnlich veränderter Partien cholangiomartige Partien. Gallengangscystenbildung. Hyperplasie der Leberzellen mit Kern-

266

R.

ZAHNERT

atypien. In diesem Falle kein sicheres Karzinom nachweisbar. Herdförmige Nekrosen. Im Bereiche eines umfangreichen Cholangioms mittelstarke alkalische Phosphatase-Reaktion.

Abb. 7. Alkal. Phosphatase, Vergr. 90:1

Abb. 8. Alkal. Phosphatase, Vergr. 140:1

Abb. 9. Alkal. Phosphatase, Vergr. 180:1 Tier Nr. 9 (Histologie Nr. 22) Gewichtsverlauf: Bei Versuchsbeginn am 8. 130 g, am 19. 3. 115 g, am 8. 4. 120 g, am x 55 g. a m 1 2 170 g, am 21. 6. 170 g, am getötet (206 Gesamtfütterungstage). Leber

1. 1957 110 g, am 23. 1. 120 g, am 22. 2.

23. 4. 125 g, am 9. 5. 135 g, am 21. 5. 9. 7. 190 g, am 29. 7. 200 g, am 31. 7.

vergröi3ert und drei feste Knoten.

Phosphataseaktivität in Rattenleber und Hepatomen

267

Streifenförmige cholangiomartige Wucherungen. Umschriebene Cystenbildungen. Grobtropfige Verfettung einzelner Leberzellenkomplexe. Vereinzelt schon angedeutet cholangiozelluläres Karzinom. Mehrfach sind die Gallengangswucherungen deutlich Phosphatase positiv. Gelegentlich scheinen auch die positiven Niederschlagsbildungen im Bereich streifiger Bindegewebslager zu liegen. (Abb. 7—9). Tier Nr. 6 angefressen und in Fäulnis übergegangen, nicht verwendet. Tier Nr. 10 bei Versuchsbeginn verstorben.

Abb. 10. Alkal. Phosphatase, Vergr. 1 4 0 : 1

Abb. 1 1 . Alkal. Phosphatase, Vergr. 280:1

Versuchsreihe c) Buttergelb-Sondenversuch Von 10 Tieren sind 8 verstorben. Bei 2 Tieren wurde die Leber ante finem frisch gewonnen. Tier Nr. 9 (Histologie Nr. 1 1 ) Gewichtsverlauf: Bei Versuchsbeginn am 31. 1. 1957 120g, am 14. 2. angefressen. Leber für Phosphatase nicht frisch verwendet. Buttergelbgesamtmenge 150 mg.

Hyperthrophien einzelner Leberzellen. Herdförmige Ansammlung von Elementen, wie sie ähnlich in den Blutbildungsherden zu finden sind. Alkal. Phosphatase negativ. Tier Nr. 7 (Histologie Xr. 10) d Gewichtsverlauf: Bei Versuchsbeginn am 8. 1. 105 g, am 22. 1. 120 g, am 31. 1. 130 g, am 3 1 . 1. verstorben. Kein eindeutig frisches Lebergewebe für Phosphatasebestimmung. Buttergelbmenge 230 mg

268

R.

ZAHNERT

Autolytisches Lebergewebe. Wieder blutungsartige Herde in größerer Menge. Keine Wucherungen von Leberepithelzellen. Alkal. Phosphatase negativ. Tier Nr. 4 (Histologie Nr. 12) a Gewichtsverlauf: Bei Versuchsbeginn am 31. 1. 1957 115 g, am 22. 2. 110 g, am 25. 2. getötet (ante finem). Buttergelbgesamtmenge 250 mg.

Abb. 12. Alkal. Phosphatase, Vergr. 140:1

Abb. 13. Alkal. Phosphatase, Vergr. 180:1

Abb. 14. Alkal. Phosphatase, Vergr. 560:1

Deutliche Hypertrophien und Hyperplasien der Leberepithelien. Mehrfach herdförmig auch Gallengangswucherungen, z. T. in großen Komplexen. Vielfach innige Durchmischung von Hepatom und Cholangiom.

Phosphataseaktivität in Rattenleber und Hepatomen

269

Alkalische Phosphatase an einer Stelle positiv. Reaktion in Umgebung von Gallengängen (s. Abb. 10 u. 11). Tier Nr. 5 (Histologie Nr. 16) e Gewichtsverlauf: Bei Versuchsbeginn am 31. 1. 1957 1:L5 g. a m 2 2 - 2 - 95 g (verstorben in der Nacht vom 5. zum 6. 3. 1957). Kein eindeutig frisches Lebergewebe f ü r Phosphatasebestimmung. Buttergelbgesamtmenge 340 mg.

Starke Hyperplasie des oft cholangiozellulären-hepatozellulären Teils. Atypische Hyperplasie der Leberzellen. Innige Durchdringung beider Bestandteile. Riesenzellen mit großen Nukleolen. Es könnte sich bereits um ein hepatozelluläres Karzinom handeln. Alkalische Phosphatase vor allem im hepatomartigen Teil positiv, allerdings auch in einigen cholangiomzelligen Teilen (s. Abb. 12—14). Diskussion Wir haben darauf verzichtet, eine ausführliche histologische Darstellung der erzeugten Leberveränderungen zu geben, da dies genügend in früheren Arbeiten beschrieben worden ist. Besonders F I S C H E R [23] weist darauf hin, daß zwar bei den von ihm untersuchten Fällen sicheres bösartiges Gewebe nachgewiesen wurde, sich aber an vielen Stellen Veränderungen fanden, bei denen nicht eindeutig festgestellt werden konnte, ob schon Krebs oder noch regeneratorische Hyperplasie vorlagen. Auch bei unseren Präparaten waren ähnliche Bilder zu sehen, vor allem war es schwierig zu entscheiden, ob adenomatöses oder adenokarzinomatöses Gewebe vorlag. Wie aus den beigefügten mikroskopischen Bildern ersichtlich ist, stieg die Phosphaseaktivität mit den Veränderungen des Lebergewebes entsprechend der verabreichten Menge von Buttergelb an. Dabei war auffällig, daß entsprechend der Entwicklung der drüsigen Anteile zur Malignität die Phosphaseaktivität zunahm; dagegen in den soliden Tumoren keinerlei Phosphatasenachweis geführt werden konnte. Zellen, die noch eindeutig als Leberzellen zu erkennen waren, ergaben in der Umgebung der tumorösen Veränderungen oft eine mittelstarke bzw. sogar starke Phosphatasereaktion. Wir führten zum Nachweis, daß es sich hierbei nicht um einen Zufallsbefund in einem Schnitt handelte, bei jedem Tier 25 Serienschnitte durch, die abwechselnd nach GOMORI bzw. modifiziert nach S C H I E B L E R gefärbt wurden. Die saure Phosphatase zeigte in dem Bereich der soliden Tumoren eine schwach positive, im Bereich der cystischen Tumoren eine stärker positive Reaktion, in den übrigen Lebergeweben eine geringfügig wechselnde Reaktion. Eine gesetzmäßige Verteilung der sauren Phosphatase im einzelnen war nicht zu erkennen. Abschließend glauben wir aussagen zu können, daß die Phosphataseaktivität von dem Charakter des Tumors abhängig ist, daß sie entsprechend der Entwicklung der tumorösen Veränderung in der Leber zunimmt und vor 19

A c t a biol. med. germ. H e f t 3

270

R.

ZAHNERI

allem, daß die Aktivität der Phosphatase auch in den angrenzenden, eindeutig noch als Leberzellen zu differenzierenden Gebieten ebenfalls zunimmt. Ein wesentlicher Unterschied, ob es sich dabei um ein frisch getötetes Tier oder ein verstorbenes Tier handelt, bei dem die Leber erst innerhalb von 12 Stunden verwendet wurde, konnte nicht gefunden werden. [24] weist darauf hin, daß der Phosphatasegehalt der erzeugten Hepatome von der cancerogenen Substanz abhängig ist. Bei chemischen Bestimmungen der Phosphatase z. B. enthielten transplantierte spontane Hepatome bei Mäusen und durch Kohlenstofftetrachlorid und Aminoazotoluol erzeugte Hepatome weniger Phosphatase als durch Chloroform hervorgerufene Lebertumoren. Die eigenartige Verbreitung der alkalischen Phosphatase hängt vermutlich mit dem Funktionszustand der Zelle zusammen. Von Krebszellen ist bekannt, daß eine gesteigerte Glykolyse vorliegt. V A C C A R I , S A B O T T O und M A N Z I N I [25] zeigten, daß durch einen mit Formalinzusatz hervorgerufenen Anstieg der Blutglykolyse auch die Zahl der Granulocyten zunimmt, die eine sehr starke Phosphatase-Reaktion im Zytoplasma erkennen ließen (siehe Diagramm 1 u. 2). GREENSTEIN

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Zschr. ges.

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271

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Anschrift des Verfassers : Berlin Buch, Lindenberger W e g 80 Ich bedanke mich besonders bei Herrn Professor KETTLER, Direktor des Pathologischen Instituts der Charité, und bei Herrn Dr. WILDNER, Geschwulstklinik B u c h , für die histologische Beurteilung der Präparate; ebenso danke ich Fräulein DELIUS für die technische Hilfe.

Summary Histochemical studies of the liver of normal rats and rats fed butter yellow were made. W e found in cystic changes of the liver and in liver cells surrounding tumors appearance of or increase in phosphatase activity. The solid tumors remained free of phosphatase. I t is pointed out that the histochemical proof of Phosphatase activ i t y can only picture the functional state of the cell and t h a t one might suppose a parallel between the degree of alkaline Phosphatase a c t i v i t y and glycolysis.

Pe3K)Me rie^eHB 3 H 0 p 0 B B I X K p b I C H K p b I C IlOCJie KOpMJieHHH HHMeTHJIbaMHH0a3o6eH30JieM (n) HccjiejiOBaJiacb rwcTOXHMHHecKHMH MeTOHaivra. B H J I O ycTaHOBJieHO, HTO B KHCToo6pa3Hbix TKaHHX neneHH H B KjieTKax neneHH B o ô j i a c r a o n y xojieft aKTHBiiocTb mëJioraoâ (J)oc(j)aTa3bi 3HaHHTejibH0 noBbimeHa. CaMH onyxojiH He conepmaT o

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C)

Abb. 4 Kationentransport von Rinderzellen, inkubiert bei 37° C in isoton. NaClKCl-Lösung mit einem K-Gehalt von 5 mÄq/lpH 7,4, Phosphat. Glucose 200 mg%. a) „Revertierte" Zellen nach Hämolyse von Rindererythrocyten in hypotoner Saccharoselösung bei x = 0,45. b) und c) nicht vorbehandelte Rinderzellen. Die unterbrochenen Kurven stellen Ansätze mit Zusatz von Jodacetat 1 0 - 3 Mol/1 dar

Diskussion Aus dem Dargelegten geht hervor, daß die Na-reichen Rinderzellen nach K-Anreicherung durch Inkubation in einem K-reichen Medium bei Wiedererwärmen auf 37° C auch unter Glukosezusatz nicht in der Lage sind, das vorher verlorene Na aktiv zurückzuholen. Offensichtlich stellt der für die Rindererythrocyten charakteristische Kationenbestand keine biologische Notwendigkeit dar, und es liegt der Schluß eines rein passiven Kationenaustausches in Richtung des Konzentrationsgradienten mit dem Na-reichen Serum nahe. Unsere Versuche zeigen jedoch (Abb. lb), daß Rindererythrocyten .unter bestimmten Bedingungen, wie Na-Anreicherung bei 4° oder durch reversible Hämolyse, durchaus in der Lage sind, aktiv Kationen zu transportieren, indem sie ihren Ausgangskationenbestand wieder herstellen. Die Rinderzellen unterscheiden sich in dieser Hinsicht nicht wesentlich von den K-reichen Kälbererythrocyten. Auch Kälbererythrocyten können nach K-Anreicherung in einem K-reichen Milieu mit einem Na-Gehalt von 5 mÄq/1 bei 37 0 C unter Glukosezusatz das überschüssige K nicht wieder heraustransportieren, sondern

Kationentransport bei Rindererythrocyten

301

es kommt auch hier zu einem weiteren K-Anstieg, während sie nach einem teilweisen Austausch ihres Zellkaliums gegen Na aus einem NaMilieu mit nur 5 mÄq K/1 das verloren gegangene K wieder in die Zelle zurückpumpen können. . Diese Befunde lassen sich nur unter der Annahme zweier Zellfraktionen, die je nach dem Alter des Kalbes bzw. Rindes im wechselnden Mischungsverhältnis die definitive Erythrocytenpopulation darstellen, deuten, und zwar einer zur Transportleistung fähigen K-Fraktion und einer Nareichen Fraktion, die nicht mehr aktiv Kationen transportieren kann. Wie oben gezeigt, lassen sich diese Fraktionen auch deutlich bei Kälbern nachweisen. Bei Rinderzellen ist dieser Nachweis nicht so leicht in derselben Weise zu führen, offenbar, weil die K-reiche Fraktion zu klein ist, um bei der nicht so sehr differenten osmotischen Resistenz beider Fraktionen deutlich in Erscheinung treten zu können. Indirekt kann man diese Fraktion jedoch nachweisen, wenn man Rindererythrocyten in hypotoner Saccharose weitgehend hämolysiert und die verbleibenden Zellen wieder mit NaCl isotonisiert. Da diese verbleibenden Zellen deutlich bestrebt sind, bei einer Temperatur von 370 unter Glukosezusatz sich wieder mit K zu beladen und Na zu entfernen, liegt die Schlußfolgerung nahe, daß sich unter diesen Zellen ein größerer Prozentsatz revertierter Na-angereicherter Zellen aus der K-haltigen Fraktion befindet. Unter diesem Aspekt werden auch die in Abb. 1a dargestellten Befunde verständlich: Ein aktiver Rücktransport nach Anreicherung mit K kann nicht stattfinden, da die Na-reiche Fraktion nicht mehr transportiert, während die K-Fraktion sich nicht über das Normale hinaus mit K anreichern kann. Die Na-Übersättigung der Rinderzellen in Abb. 3 geschieht ebenfalls auf Kosten der K-Fraktion. [1] hatte durch wiederholte Blutentnahmen bei Ratten eine Anreicherung von jungen Erythrocyten erreicht, die sich durch einen noch höheren K-Gehalt als die ausgereiften auszeichneten. Es handelt sich aber bei diesen jungen Zellen um Retikulozyten. Sie sind ebenfalls gegen osmotische Hämolyse resistenter als die normalen und wegen ihrer Größe durch Zentrifugieren von den reifen Zellen abtrennbar. Wir haben bei den sehr K-haltigen Kälberzellen nur vereinzelt Retikulozyten finden können. Eine Trennung der beiden Erythrocytenfraktionen durch Zentrifugieren war nicht möglich. Offenbar also verlieren die Rindererythrocyten erst eine gewisse Zeit nach Abschluß des Retikulozytenstadiums ihre Transportfähigkeit. Der Verlust der Transportfähigkeit ist nicht auf ein Versiegen der Glykolyse zurückzuführen. In letzter Zeit ist immer wahrscheinlicher gemacht worden, daß das A T P als Energieüberträger für den aktiven Transport eine entscheidende Rolle spielt ( G A R D O S [4], S T R A U B [16], [17] u. a.). Wir haben die schwach glykolysierenden und ATP-armen Rindererythrocyten durch reversible Hämolyse mit A T P angereichert, ohne daß diese Zellen die Fähigkeit gewonnen CHALFIN

21

Acta biol. med. germ. Heft 3

302

H.

BANASCHAK

h ä t t e n , sich s t a r k m i t K z u b e l a d e n . E s ist d a h e r e h e r w a h r s c h e i n l i c h , d a ß bei den R i n d e r e r y t h r o c y t e n v o n einem b e s t i m m t e n Z e i t p u n k t an der T r a n s p o r t m e c h a n i s m u s selbst im Sinne der Carriertheorie ausfällt. D i e M ö g l i c h k e i t s o l c h e r D e u t u n g ist d u r c h e x p e r i m e n t e l l e B e f u n d e , w i e d i e s e l e k t i v e H e m m u n g des T r a n s p o r t a p p a r a t e s b e i M e n s c h e n e r y t h r o c y t e n durch H e r z g l y k o s i d e ohne S c h ä d i g u n g der G l y k o l y s e , gegeben ( S C H A T Z M A N N [12], K U N Z u n d S U L S E R [8], S u L S E R u n d W I L B R A N D T [18]). D e r V e r l u s t des K a t i o n e n t r a n s p o r t m e c h a n i s m u s ' n e b s t e i n e m f a s t v o l l ständigen Versiegen der G l y k o l y s e bei R i n d e r e r y t h r o c y t e n scheint somit eine w e i t e r e P h a s e in d e r D i f f e r e n z i e r u n g einer Z e l l e z u sein, d e r e n F u n k tion i m m e r mehr ausschließlich der rein physikalisch-chemische T r a n s p o r t d e s l e b e n s n o t w e n d i g e n S a u e r s t o f f s ist. Für technische Mitarbeit möchte ich Fräulein meinen Dank aussprechen.

R . SCHÄFER

und Fräulein D.

LAU-

RENZ

Anschrift des Verfassers: Dr. H.

BANASCHAK,

Berlin W 8, Clara-Zetkin-Str. 94.

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DAVSON,

Summary 1. I t is shown that the initial high K-content of erythrocytes of calves decreases to values of adult cattle by the third month of life; the Na rises correspondingly. 2. B y hemolysis in hypotonic saccharose solution it is demonstrated that the erythrocyte population of calcves and adult cattle consists of two fractions of cells, . one being rich in Na, the other one in K . 3. The Na-rich fraction is unable to actively transport cations, while the K-rich cells show normal capacity for transport. With increasing differentiation the young K-rich cells loose their transport mechanism and equilibrate passively with the Na-rich ionic composition of the serum. 4. The possible sauses for the inability of active transport of cations are discussed.

Kationentransport bei Rindererythrocyten

303

Pe3K)Me 1. TejiHTa no Tpëx MecHijoB conepmaT B apHTpororrax öojitme KajiHH, qein B3pocjiBiß CKOT. C noHHjKeHHeM KOJiHMecTBa KajiHH noBbiinaeTCH HâTpniï. 2 . REM0JIH30M APHTPORIHPOB B

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A c t a biol. med. germ., Band 1, Seite 304—320 (1958) A u s dem Physiologisch-chemischen Institut der Humboldt-Universität Berlin (Direktor: Prof. Dr. S. R A P O P O R T )

Zur Anwendung der Austauschtransfusion als physiologisch-chemische Arbeitsmethode II. Über das Verhalten des Serumcholesterins H.-J. E.

RADERECHT

SCHÖLZEL,

D.

unter Mitarbeit von GRÜNEBERG

und

G.

I. S YLLM-RAPOPORT,

R.

COUTELLE,

VIERECK

(Eingegangen am 31. 12. 1957) Zusammenfassung .1. B e i Austauschtransfusionen mit Erythrozytensuspensionen in Dextran-Ringer-Lösung folgt der A b f a l l der Cholesterinkonzentration nach der theoretisch berechneten Exponentialfunktion in Abhängigkeit v o m Austauschvolumen C = 100 . e~Q . 2. Nach dem Abfall während der Austauschtransfusion steigt der Cholesterinspiegel im Plasma mit einer Halbwertszeit von 5 — 1 6 Stunden unerwartet hoch an. Gleichzeitig wird ein A b f a l l der Hämatokritwerte und der Erythrozytenzahlen festgestellt. 3. Der Hämatokritsturz deutet darauf hin, daß ein großer Teil oder alle infundierten E r y t h r o z y t e n kurze Zeit nach der Infusion zugrunde gehen. Diese t r i f f t besonders bei den Versuchen zu, bei denen dreimal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschene E r y t h r o z y t e n nach Suspension in Dextran-Ringerlösung infundiert wurden. 4. Die Ursache dieser intravasalen Hämolyse wird in einer passiven AntigenAntikörperreaktion der mit D e x t r a n sensibilisierten Mischerythrozyten durch das Plasma des Empfängerkaninchens gesehen. 5. Der A b f a l l v o m maximalen W e r t erfolgt mit einer Halbwertszeit von 96 bis 130 Stunden oder unregelmäßig. Dieser W e r t weicht von dem normalen W e r t der Cholesterinneubildung in der Leber (72 Std.) ab. Der A b f a l l der Plasmawerte geht bis unter die Anfangswerte und kompensiert sich dann langsam. Dies wird als eine biologische Regulation im Sinne einer dynamischen Gleichgewichtseinstellung gedeutet. 6. Nach Injektion von Heparin (20 mg/kg Körpergewicht) konnte bei Kaninchen in den meisten Fällen ein deutlicher A b f a l l der Cholesterinkonzentration im Plasma festgestellt werden.

In der 1. Mitteilung wurde das Prinzip der Anwendung der Austauschtransfusion als physiologisch-chemische Arbeitsmethode besprochen. In dieser Arbeit soll über Untersuchungen des Cholesterinspiegels im Blutplasma von Kaninchen während und nach einer Austauschtransfusion berichtet werden.

Austauschtransfusion. Verhalten des Serumcholesterins

305

Über den Umsatz und die Regeneration von Serumcholesterin liegen bereits eine Anzahl von Untersuchungen vor. So wurde von R I T T E R B E R G und S C H O E N H E I M E R [ 1 5 ] mit Deuterium an Mäusen eine Halbwertszeit für Cholesterin von 15—25 Tagen, von L O N D O N und R I T T E N B E R G [7] für Menschen eine Halbwertszeit von 8 Tagen bestimmt. P O P J A K und B E E K M A N S [12] stellten mit C 14 -Azetat an Kaninchen eine Halbwertszeit von 72 Stunden für Lebercholesterin fest. Uns schien die Austauschtransfusion eine geeignete Methode zu sein, die Regeneration von Plasmacholesterin zu untersuchen. Im folgenden wird über Versuche an Kaninchen berichtet, bei denen die Cholesterinkonzentration während und nach der Austauschtransfusion bestimmt wurde. Material und Methoden In der ersten Versuchsgruppe (4 Tiere) wurde der Abfall der Cholesterinkonzentration im Verlauf der Austauschtransfusion mit Erythrozytensuspensionen in Dextran-Ringer-Lösung untersucht. In der zweiten Versuchsgruppe (7 Tiere) wurden Austauschtransfusionen mit Erythrozyten in Dextran-Ringer-Lösung durchgeführt, bei denen die Erythrozyten dreimal mit physiologischer Kochsalzlösung unter Zusatz von 1/20 Volumen ACD-Lösung gewaschen und die fertige Erythrozytensuspension etwa 2—3 Stunden bei 4 0 C bis zur Transfusion aufbewahrt wurde. In einer dritten Versuchsgruppe wurden die Erythrozyten für die Infusionsuspension nur einmal mit physiologischer NaCl-Lösung gewaschen. In Kontrollversuchen (6 Tiere) wurde 1. der Einfluß der Operation selbst auf den Cholesterinspiegel im Plasma, 2. der Cholesterinspiegel beim Austausch mit Dextran-Ringer-Lösung ohne Erythrozyten, 3. der Cholesterinspiegel beim Austausch mit hämolysiertem Blut untersucht. Die Methode der Austauschtransfusion und die Zusammensetzung der Austauschflüssigkeit wurden in der 1. Mitteilung beschrieben. Die Bestimmung des Gesamtcholesterins im Serum wurde mit T S C H U G A E F F S Reagenz nach einer neuen Bestimmungsmethode durchgeführt [14]Die Cholesterinester werden mit alkoholischer Alkalilösung 60 Minuten in einem Wasserbad bei 37—40 0 C verseift. Nach dem Abkühlen wird das gesamte Cholesterin mit Petroläther extrahiert. Eine genau abgemessene Menge der Cholesterinlösung wird in einer kleinen Flasche in einem Wasserbad bei ca. 60° C unter Einleiten eines gefilterten Luftstromes eingetrocknet. Der trockene Rückstand des Cholesterins wird mit trockenem Chloroform angelöst und alsdann mit Azetylchlorid und Zinkchlorideisessig versetzt. Nach der Farbentwicklung bei 70° C werden die Flaschen in einem Eisbad abgekühlt und die Farbintensität gemessen.

306

H.-J.

RADERECHT

..Reagenzien 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

Ä t h a n o l frisch destilliert 9 6 % K p . 78° C. Petroläther frisch destilliert K p . 60—70° C. Azetylchlorid frisch destilliert K p . 51 0 C. Eisessig frisch destilliert K p . 118 0 C. Zinkchlorid wasserfrei p. a. K O H 33 g/100 ml. Zinkchloridreagenz.

80 g Zinkchlorid werden in einem Mörser rasch zerkleinert und gewogen. Darauf werden 300 ml Eisessig in eine Glasflasche mit Schiiffstopfen gegeben und das Zinkchlorid dazugebracht. In sorgfältig verschlossener Flasche wird geschüttelt, bis sich die Hauptmenge des Zinkchlorids gelöst hat. Dann gibt man weitere 100 ml Eisessig hinzu, erwärmt die Flasche einige Zeit im Brutschrank bei 800 C und schüttelt erneut bis zur vollständigen Lösung. Man läßt auf Zimmertemperatur abkühlen und ergänzt mit Eisessig auf 500 ml. Die resultierende Lösung ist meist mehr oder weniger stark opalisierend getrübt. Man klärt sie durch Zentrifugieren in verschlossenen Zentrifugengläsern (Schliffstopfen, 10 min bei 3000 g) oder durch Filtrieren durch eine Schott G 4-Fritte. Letzteres bewährt sich besonders bei größeren Ansätzen ausgezeichnet. E s dürfen hierbei keine Gummistopfen verwandt werden, sonst b e k o m m t die Lösung ein bräunliches Aussehen. Die absolut klare und wasserhelle Flüssigkeit wird in Ampullen eingeschmolzen und ist so mehrere Monate haltbar. Dunkel aufbewahren. 8. Standard-Cholesterin-Lösung 0,4 mg/ml. Durchführung 0,5ml Serum werdenmit 0,3 ml Kalilauge (33 g/100 ml) und 4,2 Im Äthanol vermischt. Nach dem Umschütteln läßt man die Mischung 60 min im Wasserbad bei 37—40°C. Darauf gibt man 0,5 ml Wasser und 10,0 ml Petroläther hinzu und schüttelt die Gläser 1 min. kräftig durch. Anschließend wird zentrifugiert (10 min 3000 g). 8,0 ml der überstehenden Petrolätherphase werden in eine kleine Weithalsflasche pipettiert und im Wasserbad bei 600 C unter Einleiten eines Luftstroms zur Trocknung eingedampft. Zum trockenen Rückstand gibt man 1,0 ml Chloroform, schwenkt kurz um und fügt anschließend 1,0 ml des Zinkchlorid-Eisessig-Reagenz und 1,0 ml Azetylchlorid hinzu. Nach dem Umschütteln werden die Flaschen für 10 min in ein Wasserbad von 70 0 C eingestellt. Hierbei werden die Flaschen mit einem Glasstopfen verschlossen. Anschließend stellt man sie in ein B a d mit Eiswasser zum Abkühlen. Die rot gefärbte Lösung wird in K ü v e t t e n eingefüllt, mit Chloroform auf 5,0 ml ergänzt und anschließend photometrisch gemessen (Filter Schott Y G 9 max. 510—545 m/j).

Ergebnisse Abb. 1 zeigt den Konzentrationsabfall des Cholesterinspiegels im Plasma von den Werten vor der Operation zu den Werten nach dem Einlegen der Kanüle vor Beginn der Transfusion und während der Transfusion bei 4 Versuchen. Zunächst zeigt sich ein Absinken der Cholesterinkonzentration von den Werten vor der Operation zu den Werten nach der Operation. Daran schließt sich während der Austauschtransfusion ein Abfall, bei dem die Cholesterinkonzentration exponentiell vom Verhältnis des Blutvolumens des Tieres zum Transfusionsvolumen abhängt.

Austauschtransfusion. Verhalten des Serumcholesterins

3°7

In Abb. 2 und 3 sind die Verlaufskurven der Cholesterinkonzentration der 2. Versuchsgruppe während und nach der Austauschtransfusion dargestellt und in Abb. 4 die dazugehörigen Hämatokritwerte. Bei der Darstellung der Cholesterinverlaufskurven benutzten wir ein halblogarithmisches Raster, weil es sich zeigte, daß die Konzentration während der Austauschtransfusion nach einer Exponentialfunktion abfällt, zum anderen in der Annahme, daß sich die Regenerationsvorgänge als System von Exponentialfunktionen darstellen lassen. Dies ist sicher nur eine sehr grobe Annäherung an den wirklichen Vorgang. In Wirklichkeit handelt es sich um einen Regulationsvorgang, bei dem ein reaktives Geschehen mit den einfachen Diffusions- und Regenerationsvorgängen parallel läuft. Das Absinken der Konzentration unter die Norm und das

Abb. 1. Konzentrationsabfall des Cholesterins im Plasma während der Austauschtransfusion (5 Versuche)

langsame Einpendeln zu Normalwerten in Form einer gedämpften Schwingung ist der Ausdruck einer dynamischen Regulation zur Erhaltung eines konstanten Cholesterinspiegels im Plasma. Aus dem Abfall des Blutspiegelkonzentrationsverlaufs wurde die Halbwertzeit des Umsatzes bestimmt und anschließend durch graphische Extrapolation zur Zeit T = o und unter Anwendung der Differenzenmethode die Halbwertzeit des Anstiegs. Letztere gibt annähernd die Geschwindigkeit der Erneuerung, bezogen auf das anschließend auftretende Maximum des Blutspiegels nach der Austauschtransfusion, an. Aus den so erhaltenen Halbwertzeiten berechneten wir die Erneuerungskonstante: In 2 Erneuerungskonstante K wobei T die ermittelte Halbwertzeit ist. In Tab. 2 wurden alle bestimmten Halbwertzeiten und die daraus berechneten Erneuerungskonstanten angegeben.

3 o8

H.-J.

RADERECHT

Abb. 2 Abb. 2 und 3. Verlaufskurven des Cholesterinspiegels während und nach der Austauschtransfusion (2. Versuchsgruppe). • Versuch 19, • Versuch 28, L3 Versuch 29, O Versuch 35, • Versuch 38, 9 Versuch 40, A Versuch 45.

Austauschtransfusion. Verhalten des Serumcholesterins

Abb. 3

3°9

3io

H.-J.

RADERECHT

Abb. 4. Hämatokritwerte der 2. Versuchsgruppe. • Versuch ig, n Versuch 28, H Versuch 29, O Versuch 35, • Versuch 38, O Versuch 40, A Versuch 45.

Die Verlaufskurven der Cholesterinkonzentration im Plasma zeigen bei den Versuchen der 2. Gruppe nach dem exponentiellen Abfall während der Austauschtransfusion zunächst einen sehr schnellen und hohen An-

Austauschtransfusion. Verhalten des Serumcholesterins

311

stieg über die normalen Konzentrationswerte hinaus (Halbwertzeit 5—17 Stunden). Es folgen 5 Tage lang gleichbleibende oder schwankende Werte, bis nach dem 5.—7. Tag die Konzentration exponentiell zum Normalwert bzw. bis auf Werte unterhalb des Normalwertes abfällt (Halbwertzeit 96—130 Stunden). Bei den Versuchen 19, 35, 38, 40 bleibt das Maximum bis zum 5. Tag, beim Versuch 28 bis zum 7. Tag erhalten. Einen unregelmäßigen Kurvenverlauf zeigen die Versuche 29 und 45.

Abb. 5. Verlaufskurven des Cholesterinspiegels während und nach der Austauschtransfusion (3. Versuchsgruppe). A Versuch 47, x Versuch 48.

Bei den Versuchen der Gruppe 3 (Abb. 5) zeigt sich ebenfalls im Anschluß an die Austauschtransfusion ein steiler Anstieg zu Werten über den Anfangswert. Versuch 47 zeigt dann aber bereits am 2. Tag nach der Transfusion einen quasiexponentiellen Abfall zu Werten unterhalb der Norm, um vom 7. Tag an langsam zu Normalwerten zurückzukehren. Im Versuch 48 bleibt der Cholesterinspiegel bis zum 7. Tag ca. 20% über der Norm. Bei den Kontrollversuchen (Abb. 6) zeigen die Operationskontrollen (Kx) nur einen geringen Einfluß auf den Cholesterinspiegel des Plasmas. Der anfängliche Abfall von dem Wert vor der Operation zu dem Wert nach

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H.-J.

RADERECHT

Abb. 6. Kontrollversuche, jg) K^ = Cholesterinspiegel im Plasma nach Kontrolloperationen. Mittelwerte aus 2 Versuchen. LI A K 2 , K 6 = Cholesterinspiegel im Plasma nach Austausch mit Dextran-RingerLösung, ohne Erythrozyten. * K 7 = Cholesterinspiegel im Plasma nach Infusion von hämalysiertem Blut. Mittelwerte aus 2 Versuchen.

Austauschtransfusion. Verhalten des Serumcholesterins

313

der Operation ist auf die Beeinflussung des Lipoidspiegels durch Heparin zurückzuführen. Die Austauschversuche mit reiner Dextran-Ringer-Lösung (K 2 , K 6 ) zeigen wie die Hauptversuche zunächst einen steilen Anstieg der Cholesterinkonzentration, der dann am 2. bzw. 3. Tag nach einer qüasiexponentiellen Funktion zu Normalwerten zurückkehrt. Tabelle 1 Nr.

Gewicht kg

19

28 29

35 38 40

45 47 48

Austauschvolumen in Tiefwert % des Blutvolumens mg%

44.5 55 57

3.75 3-25 3.5 2.7 2,4

3.0

Erythr. Cholesterin

mg%

mg

mg

25

270

18 16 20

60 100 180 90 40

455 53 95

39 42 47 73 51 42

7

167 87

3.0

2,8

ges. Menge Cholesterin

. 9,5 17

129 107 67 111

2,6

max. Anstieg

9.5 19

36

70

59

118 220 101

54 95 72

88

117

57

. Tabelle 2 Halbwertszeiten in Stunden

Nr.

Anstieg im Anschluß an die Transfusion T

K • 102

10 16 12 10

45

•5 5 7

6,93 4,33 5,77 6,93 13,90 13,90 9,90

47

10

48

17

K K

20

19

28 29

35 38

40

24

Abfall nach Erreichen des Maximums T

K • 102

28

2,50

130

o,53

130

o,54

6,93

130

o,53

3,47

48 48

i,44 i,44

4,08

2,89

unregelmäßig

0,67 104 96 0,72 unregelmäßig unregelmäßig

Auch der Kurvenverlauf der Cholesterinkonzentration bei Infusion von hämolysiertem Blut ist diesem ähnlich (K 7 ). In Tab. 1 und 2 wurden die aus den Konzentrationskurven ablesbaren und errechenbaren Werte dargestellt. Das Austauschvolumen wurde aus

314

H.-J.

RADERECHT

dem Transfusionsvolumen und dem Blutvolumen des Tieres (berechnet aus 4,5% des Körpergewichts nach Bestimmung mit P 32 -Erythrozyten [13]) in Volumen% des Blutvolumens angegeben. Der Hämatokritverlauf beider Versuchsgruppen (Abb. 4 und 7) zeigt ein eigentümliches Verhalten. Bei den Versuchen 19, 28, 29, 40, 45 (Aus-

Abb. 7. Hämatokritwerte der 3. Versuchsgruppe und der Kontrollversuche. A Versuch 47, x Versuch 48, 0 Versuch Klt • Versuch K 2 , A Versuch K, * Versuch K 7 .

tauschvolumen etwa 45—67 vol.%) zeigt sich ein Hämatokritabfall in den ersten beiden Tagen der Transfusion um 40—50%, bei Versuch 35 (Austauschvolumen 130%) ein Abfall von 60%. Nach dem 4.—5. Tag steigt der Hämatokrit bei den Versuchen 19, 28, 29, 35 und 40, bei Versuch 38 nach dem 6. Tag und bei Versuch 40 nach dem 8. Tag langsam wieder zu Normalwerten an.

Austauschtransfusion. Verhalten des Serumcholesterins

3*5

Im Gegensatz hierzu zeigt der Versuch 47 (Austauschvolumen 147%) nur einen Abfall um 30% und der Versuch 48 (Austauschvolumen 87%) ebenfalls nur 30% Abfall. Bei den Kontrollversuchen zeigen die Operationskontrollen praktisch keine Hämatokritveränderung (Versuch Kj). Bei den Kontrollen K 2 und K 6 wurde anstelle von Erythrozytensuspension nur reine MakrodexRinger-Lösung injiziert. Es zeigt sich sofort die erwartete Hämatokritabnahme. Die Ausgangswerte werden nach 8—10 Tagen wieder erreicht. Beim Versuch K , wurde das entzogene Blut nach Hämolyse in vitro wieder injiziert. Hier werden die Ausgangswerte bereits nach 5—6 Tagen erreicht. Diskussion In den Verlaufskurven wurden die Cholesterinwerte vor Beginn der Operation und vor Einleiten der Heparinisierung des Tieres, nach der Operation die Cholesterinkonzentrationen im Verlauf der Austauschtransfusion mit Tiefwert und nachfolgendem Konzentrationsanstieg aufgetragen. Man bemerkt in den meisten Fällen bereits nach Injektion des Heparins einen geringen Abfall der bestimmbaren Gesamtcholesterinkonzentration im Plasma. Durch Heparin wird somit der Cholesteringehalt im Plasma bei Kaninchen in v i v o deutlich erniedrigt, ähnlich wie es M E N G und Y O U M A N S 1953 [9] bei Hunden fanden. Der Abfall während der Austauschtransfusion folgt bei den Versuchen mit einmal gewaschenen Erythrozyten einer Exponentialfunktion. Dieses Verhalten wurde nach unseren theoretischen Überlegungen erwartet (vgl. 1. Mitt. Bei einer kontinuierlichen Austauschtransfusion errechneten wir für die Konzentration eines beobachteten Stoffes im abfließenden Blut die Beziehung M = c • B • e~Q , worin M die in einem bestimmten Augenblick noch vorhandene Menge des zu untersuchenden Stoffes, B die Blutmenge des Tieres, Q das Verhältnis des Transfusionsvolumens zur Blutmenge des Tieres und c die Konzentration des zu untersuchenden Stoffes bedeutet. Die in einem bestimmten Augenblick im Blutkreislauf noch vorhandene Menge soll also nach einer Exponentialfunktion vom Verhältnis des Blutvolumens zum Transfusionsvolumen abhängen. Die exponentielle Abhängigkeit der Konzentration vom Austauschvolumen wurde für Cholesterin beim Austausch mit Erythrozytensuspensionen in Dextran-Ringer-Lösung gefunden. Es zeigte sich, daß die Cholesterinkonzentration im abfließenden Blut unter Zugrundelegung des B l u t v o l u m e n s dem errechneten Exponentialgesetz folgt. Dies bedeutet, daß die Diffusion des Cholesterins in den intravasalen Kreislauf normalerweise sehr langsam vor sich geht und bestätigt somit ältere Untersuchun-

316

H.-J.

RADERECHT

gen von B R U G E R [I], sowie M A R B L E [8] und Mitarbeitern, die aus dem Vergleich von Serum und Transsudat auf eine kaum merkbare Permeation der Cholesterinmoleküle schlössen. Der Durchtritt durch die Membran soll hierbei nur in Verbindung mit Eiweiß stattfinden. Nach Erreichen des Tiefwertes stellten wir einen schnellen und hohen Anstieg der Cholesterinkonzentration im Plasma fest. Die Halbwertzeit dieses Anstiegs liegt zwischen 5 und 20 Stunden. Die Geschwindigkeit ist damit 3—12 mal größer als die Halbwertzeit des Lebercholesterins bei Kaninchen, die von P O P I A K und B E E C K M A N S [12] mit Deuterium und C 14 -markiertem Azetat zu 72 Stunden bestimmt wurde. Dies ist an sich unerwartet und nicht mit einfacher Rückdiffusion oder Regeneration zu erklären. Es drängt sich vielmehr die Ansicht auf, daß es sich hierbei um ein nicht mehr normales Geschehen handelt, das wahrscheinlich durch die sehr hohe Dextrankonzentration im Plasma bewirkt wird. Der starke Abfall des Hämatokriten im Verlauf und nach der Austauschtransfusion deutet darauf hin, daß die gesamte oder fast die gesamte Menge der infundierten Erythrozyten nach kurzer Zeit aus dem Kreislauf verschwindet. Als Ursache für den erstaunlich schnellen und hohen Anstieg der Cholesterinkonzentration im Blut kann man deshalb einen verstärkten Erythrozytenabbau ansehen. Hierbei wird einmal das Cholesterin der Erythrozytenmembran freigesetzt und andererseits durch die entstehende Anämie die Cholesterinausschüttung in das Blut stimuliert. Eine Erhöhung der Cholesterinkonzentration im Plasma durch Anämie (Anoxämie) wurde bereits von S T A R U P [16] beschrieben. Daneben muß man in Betracht ziehen, daß das infundierte Dextran im gesamten Histiozytenapparat des extravaskulären Bindegewebes, in der Niere und vor allem in der Leber gespeichert wird. Nach Untersuchungen von J A N C S O G A B O R [6] wird bereits Dextran mit einem mittleren Molekulargewicht Mw von 35.000 sofort gespeichert und verschwindet innerhalb von 5—7 Tagen aus den Zellen. Man kann deshalb vermuten, daß Dextran bei der Speicherung im RES ebenfalls gespeichertes Cholesterin verdrängt und daß andererseits nach Abbau und Abdiffusion des Dextrans aus den Speicherzellen das Cholesterin wiederum von ihnen aufgenommen wird: Nach dem sehr schnellen Anstieg zeigt die Cholesterinkonzentration 5Tage gleichbleibende bzw. schwankende Werte, um nach dem 5.—7. Tag exponentiell zum Normalwert abzufallen, zu einem Zeitpunkt also, wo das meiste Dextran die Speicherzellen des RES verlassen haben dürfte. Die Halbwertzeit des Abfalls nach Erreichen des Maximums liegt zwischen 96 und 130 Stunden, d.h. der Abfall geht langsamer vor sich, als es dem Leberumsatz entspricht. Dies könnte aber dennoch der normalen Abbaurate entsprechen, da man annehmen muß, daß zwischen dem Abbau in der Leber und dem Cholesterinspiegel im Plasma ein Gangunterschied besteht, da der begrenzende Faktor für den Umsatz des Plasmacholesterins die Kapazität der Leberzellen sein dürfte.

Austauschtransfusion. Verhalten des Serumcholesterins

317

Zwischen der 1. und 2. Versuchsgruppe bestehen Unterschiede. Bei beiden ist ein steiler Anstieg der Cholesterinkonzentration nach der Austauschtransfusion festzustellen, aber die Cholesterinwerte der 2. Versuchsgruppe bleiben im Verhältnis zum Austauschvolumen im Gegensatz zu den Werten der ersten Gruppe niedriger. Auch ist der Hämatokritabfall wesentlich geringer. Das deutet darauf hin, daß die Erythrozytenzerstörung bei der 2. Versuchsgruppe in einem geringeren Ausmaß oder überhaupt nicht eintritt. Die Kontrollen K e und K 2 zeigen nach dem steilen Abfall der Cholesterinkonzentration einen ebenfalls steilen Anstieg über die Norm, der aber bereits nach dem 2. bzw. 3. Tag in einer quasiexponentiellen Funktion zu Normalwerten zurückkehrt. Dieses Verhalten des Cholesterinspiegels nach einer einfachen Infusion im Anschluß an einen Aderlaß macht deutlich, daß für den primären Anstieg der Cholesterinkonzentration im Plasma neben der Anämie vor allem die Speicherung des Dextrans im RES der Leber und die dadurch bewirkte Entleerung der Cholesterindepots verantwortlich ist. Unerklärlich bleibt zunächst, warum die infundierten Erythrozyten so schnell abgebaut werden. Injiziert man einem Kaninchen nach einem Aderlaß Blut von einem anderen Tier, so bleibt der Hämatokritwert konstant, und die Cholesterinkonzentration ändert sich nur dann, wenn die Konzentration im Plasma des Spenderkaninchens eine andere ist als im Empfängertier. Man konnte beim Kaninchen bis heute keine normalen Blutgruppeneigenschaften vom Typ der A-, B-, O-Gruppen nachweisen und muß deshalb eine einfache Antigen-Antikörperreaktion als Ursache ausschließen. Dennoch können serologische Überlegungen zur Klärung des beobachteten Phänomens herangezogen werden. Aus der Serologie ist die sog. passive Erythrozytenagglutination bekannt. Man belädt hierbei gewaschene Erythrozyten mit Polysacchariden, z. B. Pneumokokkenpolysacchariden, und weist letztere durch nachfolgende Agglutination mit Immunserum, die gegen diese Polysaccharide gerichtet sind, nach. Bei der Herstellung der Transfusionssuspension bei den Versuchen 19—45 wurden die durch Herzpunktion bei verschiedenen Kaninchen gewonnenen Erythrozyten dreimal in physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Hierbei wird, so muß man annehmen, die albuminartige Eiweißhülle der Erythrozyten ( P O N D E R [3], R U H E N S T R O T H - B A U E R [10], [11]) entfernt. Bei der nachfolgenden Einwirkung von Dextran wird dieses in die Struktur der Erythrozytenmembran aufgenommen. Eine solche Aufnahme von Dextran in die Strukturelemente der Erythrozytenmembran machte bereits Z A D E - O P P E N [18] wahrscheinlich. Er behandelte gewaschene Erythrozyten mit Dextran, prüfte nach erneutem Waschen mit physiologischer Kochsalzlösung ihre osmotische Resistenz und stellte hierbei eine Erhöhung der osmotischen Resistenz fest. Gegen diese in ihren Antigen22

A c t a biol. med. germ. Heft 3

H . - J . RADERECHT

3i8

eigenschaften veränderten Erythrozyten kann das Kaninchenserum ein Antiserum darstellen und Agglutination und Lysis auslösen. Wird die albuminartige Eiweißhülle der Erythrozyten nicht oder unvollständig entfernt, so wird Dextran nicht oder nur teilweise eingebaut (Versuche Gruppe 3). Diese Erythrozyten bleiben dem Empfängerorganismus erhalten. Daneben besteht die Möglichkeit des Vorhandenseins inkompletter Antikörper an der Oberfläche der Erythrozyten. Das sind solche, bei denen der gebildete Antigen-Antikörperkomplex nicht zu einer Agglutination der beteiligten Korpuskeln führt. Inkomplette Antikörper werden in der Serologie durch die sog. Konglutinationsreaktion nachgewiesen ( B O R D E T ) . Das Konglutinin, ein Eiweißkörper, verbindet sich bei dieser Reaktion mit den sensibilisierten Erythrozyten und löst die Agglutination aus. Vor einigen Jahren konnten H U M M E L [4], [5] u. a. nachweisen, daß auch Polymere wie Dextran als Konglutinin wirken. Da nun weiter nach Untersuchungen von D A H R und F I S C H E R [2] bekannt ist, daß im Kaninchenplasma inkomplette Antikörper vorkommen, und andererseits zu den vorstehenden Versuchen Mischerythrozyten aus verschiedenen K a ninchen verwandt wurden, muß man zu dem Schluß kommen, daß im Verlauf des Experiments eine intravasale Konglutinationsreaktion abläuft : Die mit inkompletten Antikörpern beladenen Misch-Erythrozyten geben mit dem Antiserum in Gegenwart einer großen Menge von Dextran eine Konglutinationsreaktion, bei der alle oder fast alle infundierten Fremderythrozyten zerstört werden. Welche von beiden Möglichkeiten den Ausschlag gibt, muß offen gelassen werden. H e r r n P r o f . D r . S. M. RAPOPORT sind w i r f ü r seine H i l f e b e i der D u r c h a r b e i t u n g des V e r s u c h s m a t e r i a l s zu g r o ß e m D a n k v e r p f l i c h t e t .

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R I T T E N B E R G , D . U. R . STARUP,

SCHOENHEIMER:

U . : Biochem. Z.

THORSEN, G. ZADE-OPPEN,

3*9

270,

Summary 1. In exchange transfusions with suspensions of erythrocytes in Dextran-Ringer solution the fall of cholesterol concentration follows a theoretically calculated exponential function relative to the volume exchanged C = 100 . e" Q . Following the injection of Heparin (20 mg/kg body weight) into rabbits a distinct fall of cholesterol concentration of the plasma could be detected in most of the cases. 2. A f t e r the fall during the exchange transfusion the plasma level of cholesterol rises to an unexpected extent with a half time of 5 — 1 6 hours. A t the same time a fall of hematocrit and of the erythrocyte count is demonstrated. 3. T h e fall of hematocrit suggests that a great number or even all of the infused erythrocytes are destroyed shortly after the infusion. This holds particularly in such experiments where erythrocytes which were washed 3 times with physiological saline solution or Dextran-Ringer solution were infused. 4. The cause of intravascular hemolysis is seen in a passive antigen-antibody reaction of the mixed donor erythrocytes, sensitized with Dextran, with the plasma of the recipient rabbits. 5. The decrease from the maximal value occurs with a half time of 96—130 hours or irregularly. This value differs from the normal value of new formation of cholesterol in the liver (27 hours). Plasma values drop below the initial level to become slowly compensated. This is explained as a biological regulation in the sense of a dynamic equilibrium.

Pe3K)Me 1 . IloHHjKeHHe KOHi;eHTpamiH xoJiecTepHHa npji 06MeHH0ft TpaHC(J>y3HH cycneH3Hii A P I R R P O U H T O B B pacTBope H3 HeKCTpaHa H PHHrepa no«HHHHeTCH TeopeTH^eCKH BbWHCJleHHOH 3KCn0HeHL(HajIbH0H (fopMyJie B 3aBHCHM0CTH OT oßMeHHoro oßteMa C = 100 e-Q . n o c j i e BBeneHHH renapHa (20 mg/kg) B 6ojn>niHHCTBe c j i y i a e B SBIJIO y KpojinKOB HaftneHO Heraoe rronn>KeHne KOHneHTpaniiM xojiecTepima B ruia3Me. 2. IlOCJie nOHHHteHHH BO BpeMH OßMeHHOÖ TpaHCy3HH XOJieCTepHHOBHH ypoBeHb B njia3Me noBbimaeTCH H P E 3 B M H A Ü H O CHJibHO c nojiynepnoAOM B 5 — 1 6 nacoB. OnHOBpeMeHHO noHHwaeTCH reMaTOKpHT H KOJiH^ecTBO apHTpoUHTOB.

3. najieHHe reMaTonpnTa yKa3biBaeT Ha TO, HTO cpa3y Hie nocjie HHij)y3HH Sojibinafl MacTb hjih Bee HH«j)ynHpoBaHHbie apHTpoijHTbi nornßaioT. 9TO npOHCXOHHT B OCOßeHHOCTH B TeX CJiynaHX, KOTOpblX TpH pa3a B $H3H0JI0rHnecKOM pacTBope npoMHTbie apHTpouHTbi HHtjtynHpyioTCH nocjie cycneH3HH B aeKCTpaHHOM pacTBope PHHrepa. 4 . I L P H M H A 3Toro reM0JiH3a B c o c y n a x 3aKJii0HaeTCH B naccHBHoft peaKUHH aHTHreH-aHTHTejia co CTopoHbi njia3Mbi KpojiHKa no OTHomeHHio K jieKCTpaHOM CeHCH6HJIH3HpOBaHHbIM CMeUiaHHbIM 3pHTpOIIHTaM. 22*

320 5.

H.-J,

rioHHweHHe

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B

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3TO B

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ßHONORWIECKAH

A c t a biol. med. germ., Band l, Seite 321—331 (1958) Aus dem Institut für Medizin und Biologie der Deutschen Akademie der Wissenschaften, Arbeitsbereich Biologische Krebsforschung (Direktor: Prof. Dr. A. G R A F F I )

Über eine Methode zur experimentellen Erzeugung von Metastasen für Serienversuche W.

KRISCHKE

(Eingegangen am 20. 1. 1958) Zusammenfassung 1. Durch intravenöse Injektion von Ascites-Carcinom-Zellen wird bei Mäusen in hohem Prozentsatz eine multiple Geschwulstbildung in der Lunge und in den Organen des großen Kreislaufs hervorgerufen. Das dabei entstehende pathologische Bild kann in mehrfacher Beziehung der hämatogenen Metastasierung von einem Primärtumor aus als homolog angesehen werden. 2. Die geschilderte Impftechnik ist zur Untersuchung über den Mechanismus der Metastasierung geeignet und dürfte außerdem auch für tumortherapeutische Experimente gegenüber der subcutanen Geschwulstverimpfung Vorzüge aufweisen. 3. Die in großem Maßstabe an 1174 Tieren durchgeführten Untersuchungen ergaben eindeutige Unterschiede des Metastasenbefalles bei verschiedenen Organen, wobei die hohe Metastasenquote in der Lunge, den Nebennieren und dem Nackenorgan einem fast völligen Fehlen an Metastasen in Hoden, Gehirn, Milz, Darm und Leber gegenüberstehen. Der mögliche Mechanismus dieses unterschiedlichen Verhaltens der Organe (hämodynamische Wirkungen, organspezifische Abwehrbedingungen und chemisch bedingte Milieubedingungen für das Tumorwachstum) werden diskutiert.

Das Ziel der nachfolgend beschriebenen Untersuchungen bestand darin, ein der Tumormetastasierung beim Menschen adäquates Bild im Tierversuch zu erzeugen. Darauf aufbauend sollte dann 1. der Mechanismus der generalisierten Geschwulstaussaat näher analysiert werden und 2. dieser dem Terminalstadium der Geschwulstkrankheit vergleichbare Zustand (allgemeine Metastasierung) für therapeutische Versuche der verschiedensten Art benutzt werden. Versuche zur experimentellen Erzeugung einer multiplen Geschwulstbildung in obigem Sinne wurden bereits von verschiedenen Autoren in Angriff genommen ( W I B E A U [ 1 ] , S C H A I R E R [2], L O E W E N T H A L [3], W E I L [4], N A T H E R U. S C H N I T Z L E R [5], L E V I N u. S I T T E N F E L D [6] u. a. m.), ohne daß jedoch systematische Untersuchungen vorliegen, die als Grundlage für die Anwendung für Serienversuche ausreichten.

322

W.

KRISCHKE

Uns kam es vor allem darauf an, daß das benutzte Verfahren eine gute Reproduzierbarkeit zeigt und die multiple Geschwulstaussaat sich sowohl auf die Organe des großen als auch des kleinen Kreislaufes erstreckt. Diese Zielsetzung konnte durch intravenöse Injektion von Ascitestumorzellen in optimaler Weise erreicht werden. Methodik a) Tiermaterial: Für diese Versuche wurden überwiegend weiße, nicht ingezüchtete Mäuse beiderlei Geschlechts im Alter von 3 — 4 Monaten und mit einem durchschnittlichen Körpergewicht von 1 7 — 2 0 g verwendet. In geringerer Zahl wurden außerdem noch Tiere der Inzuchtstämme A B . , Halle-Welle, Nacktmäuse 1 , ,,db" und ,,sg" benutzt. Insgesamt waren ungefähr 1200 Tiere im Sinne der dargelegten Fragestellungen auswertbar. Die Fütterung der Tiere erfolgte mit Hafer, Milch und Grünzeug und ihre Haltung in Gruppen von 6 — 1 0 Mäusen in Glaskäfigen bei - f 2 o ° C . b) Tumormaterial: In diesen Untersuchungsreihen wurde ausschließlich das Ehrlich-Ascites-Carcinom als Impfmaterial benutzt. Die aus dem Bauchraum durch Punktion gewonnene Ascitesform hat den großen Vorteil einer homogenen auf Zellzahl beliebig einstellbaren Suspension runder Einzelzellen, die bei intravenöser Injektion gut vertragen werden und sich bei langsamer Applikation mit dem B l u t gleichmäßig mischen und sich im ganzen Körper verteilen. Der für die intravenöse Impfung verwendete Tumor-Ascites wurde Tieren zwischen dem 10. und 12. T a g nach der intraperitonealen Impfung entnommen, die Tumorzellen 2 — 3 m a l mit Ringerlösung auf der Zentrifuge ausgewaschen und anschließend die Suspension durch Auszählen in der THOMA-Kammer auf einen bestimmten Zellgehalt eingestellt. I m allgemeinen betrug die Zellzahl 1,5 Mill. pro 0,1 ml Ringerlösung, die als Standardmenge pro Maus benutzt wurde. c) Intravenöse Injektion: Sie erfolgte in eine seitliche Schwanzvene, die durch kurzes Eintauchen des Schwanzes in ca. 50 °C warmes Wasser künstlich erweitert wurde. Zweckmäßigerweise werden für die Injektion eine Tuberkulinspritze und sehr feine Kanülen benutzt (Injekta No. 17 kurz). Die Injektion soll möglichst langsam und gleichmäßig erfolgen. Die Einstichstelle wurde nach Beendigung der Injektion zur Verhinderung eines Rücklaufes mit einem Tupfer leicht angedrückt. d) Art der Auswertung: Sie erfolgte im allgemeinen auf Grund des makroskopischen Befundes bei der Sektion, wobei praktisch sämtliche Organe, zum Teil nach mehrfacher Aufteilung in einzelne Scheiben, sehr genau unter Zuhilfenahme eines Lupenmikroskops (Zeiß-Zitoplast) mit 6—8facher Vergrößerung auf Tumorknoten gesichtet wurden. Fragliche Befunde wurden durch eine histologische Untersuchung geklärt. Auf diese Weise dürfte eine Garantie für die Erfassung des größten Teils makroskopisch nachweisbarer „Metastasen" gegeben sein. Die Ausbildung der Metastasen wurde für jedes Organ und Tier gesondert sowohl nach Anzahl, als auch hinsichtlich der Größe registriert.

B e s c h r e i b u n g der B e f u n d e 1. Allgemeine

Betrachtungen

Insgesamt wurden in unseren Versuchen 1174 Tiere auf Metastasenbefall ausgewertet, bei denen im ganzen 13715 Metastasen gezählt wurden. Im Für die freundliche Überlassung von Tieren dieser Inzuchtstämme sind wir Frau Prof. Dr. P. H E R T W I G zu besonderem D a n k verpflichtet.

1

Experimentelle Erzeugung von Metastasen

323

Durchschnitt kamen also nach intrav. Injektion von 1,5 Mill. EhrlichCa-Asc.-Zellen 1 2 Metastasen pro Maus zur Entwicklung. Diese Ergebnisse resultierten aus 80 Einzelansätzen, die naturgemäß schon auf Grund eines gewissen Unterschiedes der Virulenz des Impfmaterials Schwankungen zeigten. Die Extremwerte an durchschnittlich pro Tier in den verschiedenen Ansätzen aufgetretenen Metastasenzahlen lagen dabei zwischen 0 und 23. Auf Grund unserer Beobachtungen traten Metastasen frühestens 10 Tage nach der intravenösen Injektion makroskopisch in

Abb. 1. Metastasen in Haut und Muskulatur einer iv. mit Ascitestumorzellen gespritzten Maus. Bauchseite.

Abb. 2. Dieselbe Maus wie in Abb. 1 nach Abtrennung der Haut. Rückenseite.

Erscheinung. Deshalb wurden ausschließlich jene Tiere, die nach dem 10. Tag verstarben, in alle hier von uns vorgenommenen rechnerischen Auswertungen einbezogen. Es sei weiterhin darauf hingewiesen, daß der überwiegende Anteil der Versuche nach 4 Wochen abgebrochen wurde, indem der bis zum 28. Versuchstag nicht spontan gestorbene Rest an Versuchstieren abgetötet und in gleicher Weise wie die verstorbenen ausgewertet wurde. Zu dieser Maßnahme sahen wir uns auf Grund der Tatsache berechtigt, daß der maximale Metastasenbefall und gleichzeitig die maximale Sterblichkeit der Tiere infolge der multiplen Geschwulstausbildung zwischen dem 18. und 21. Tage nach der Injektion lagen. Damit besteht kein Grund zur Annahme, daß durch die Abtötung der Tiere zu dem späten Zeitpunkt des Versuchs eine Verfälschung der Ergebnisse, speziell im Hinblick auf Häufigkeit und Verteilung der Metastasen zu-

324

\Y.

KRISCHKE

standekommt. l)ic Größe der Metastasen zeigte ähnliche Schwankungen wie deren Zahl und variierte zwischen Grießkorngröße und Kirschgröße. Im allgemeinen nahm die Tumorgröße mit der Yersuchsdauer zu, wobei benachbarte Metastasen sicherlich konfluieren konnten und damit im Spätstadium eine gewisse Gefahr besteht, daß die Anzahl der als Einzel-

A b b . 3. Metastasenbildung in zahlreichen Organen einer iv. m i t Ascitestumorzellen gespritzten Maus.

A b b . 4. Metastasen in der Lunge einer .Maus nach iv. Injektion \-( >n A weitest um orzel Im.

A b b . 5. Mikrometastase in der Lunge einer Maus nach iv. Injektion von Ascitestumorzellen (Obj. 10 X, Okul. 7 >;j.

Experimentelle Erzeugung von Metastasen

325

knoten erkennbaren Geschwulstbildungen evtl. eine Verminderung erfuhr. Den allgemeinen makroskopischen und histologischen Aspekt der Metastasierung geben die Abb. 1—5 wieder. 2. Gesonderte Betrachtung der Metastasenverteilung im Bereich des großen und kleinen Kreislaufs In diesem Abschnitt wollen wir uns mit der prozentuellen Häufigkeit an Metastasentieren nach intravenöser Injektion von 1,5 Mill. Tumorzellen beschäftigen, ohne Berücksichtigung deren Zahl und Lokalisation sowie mit dem prozentuellen Befall der einzelnen Kreislaufbereiche. Von den 1 1 7 4 gestorbenen und getöteten Tieren zeigten 847 Metastasenbildungen und damit 72% der behandelten Tiere unter Ausschluß der bis zum 10. Tag interkurrent verstorbenen Mäuse. Schon aus diesem Ergebnis resultiert die unterschiedliche individuelle Ansprechbarkeit der Tiere, indem fast bei einem Drittel der Mäuse trotz der Injektion von 1,5 Mill. Zellen eine Tumorausbildung unterblieb. Wenn wir eine Aufschlüsselung auf die beiden in der Gesamtzahl enthaltenen Gruppen, nämlich den zwischen dem 10. und 26. Versuchstag gestorbenen und den zwischen 25. und 29. Tag getöteten Tieren vornehmen, so ergeben sich für beide Gruppen ungefähr die gleichen Prozentwerte für den Metastasenbefall. In der Gruppe der gestorbenen Mäuse errechnen sich 74% Metastasen befallener Tiere (354 positive von 474 gestorbenen Tieren) während er für die getöteten Tiere 70% beträgt (493 unter 700 getöteten Tieren). Der etwas niedrigere Wert für die Gruppe der getöteten Tiere ist wahrscheinlich auf eine Auslese und Anreicherung von Mäusen mit gesteigerter individueller Resistenz den Tumorzellen gegenüber zurückzuführen. Allenfalls ergibt sich aus den ähnlichen Prozent werten für beide Gruppen, daß eine kombinierte Auswertung keine wesentliche Verschiebung der Resultate bedingt und deshalb auch für die weitere Auswertung gerechtfertigt erscheint. Eine weitere Frage betrifft die Häufigkeit der Metastasierung in den verschiedenen Organen. Zunächst wollen wir den Metastasenbefall in den beiden Kreislaufsystemen gesondert und gleichzeitig vergleichend betrachten (Tab. 1). Von den 1 1 7 4 untersuchten Tieren wiesen 64% Metastasen im Bereich des kleinen Kreislaufs, d. h. den Lungen auf, während nur 44% Metastasenbefall im Bereich des großen Kreislaufs, also in allen anderen Körperorganen erkennen ließen, obgleich letztere die Lungen um das ca. i2ofache an Gewicht übertreffen. Schon daraus resultiert die Bevorzugung der Lungenmetastasierung bei der von uns geübten intravenösen Injektion. Das gleiche Bild ergibt sich, wenn wir jeweils die Tiere betrachten, die ausschließlich in einem der beiden Kreislaufbereiche Metastasen aufweisen. F ü r die Organe des großen Kreislaufs errechnen sich dabei 10,9%, während für die Lungen 38,6% ermittelt wurden, also ein fast viermal höherer Wert. Bei den restlichen 50,5% der Tiere waren in den Organen beider Kreislaufsysteme gleichzeitig Metastasen vorhanden.

326

W.

KRISCHKE

In noch eindeutigerer Weise ergibt sich die bevorzugte Metastasenbildung in der L u n g e auf Grund der prozentuellen Verteilung der Metastasenanzahl auf die Organe der beiden Kreislaufsysteme. V o n den 1 3 7 1 5 insgesamt registrierten Metastasen befanden sich 10108 in den Lungen, während nur 3607 in den übrigen Körperorganen angetroffen wurden, d. h. also, daß 7 4 % aller Metastasen in der Lunge vorgefunden wurden, trotz ihres geringen Gewichtanteiles v o m Gesamtkörper. Tabelle 1 Metastasenbefall nach iv. Injektion von 1,5 Mill. Zellen des Ehrlich-AscitesCarcinoms pro Maus unter Berücksichtigung der Kreislaufbereiche Gesamttierzahl 1174 (gestorben und getötet) Metastasenpos. Tiere

Tiere

Prozent

847

100

Metastasen

Prozent

13715

100

2897

21

Metastasen nur in Lungen

327

38,6

Metastasen nur in Organen des großen Kreislaufes

92

10,9

362

3

Metastasen in beiden Kreislaufbereichen

428

50,5

10456

76

Metastasen in Lungen

754

64,0

10 108

74

Metastasen in Organen des großen Kreislaufes

520

44.o

3607

26

j. Metastasenbefall

der verschiedenen

Organe

Den Metastasenbefall der einzelnen Organe kann man in verschiedener Weise ausdrücken, 1. als Prozentsatz der Tiere, die in dem betreffenden Organ eine Metastasierung aufweisen, 2. durch die A n z a h l der Metastasen/ Organ, 3. durch den prozentuellen Anteil an Metastasen in jedem Organ von den Gesamtmetastasen und 4. durch B e z u g der Metastasenzahl auf ein konstantes Organgewicht. Alle vier Betrachtungsweisen haben eine gewisse Berechtigung, wobei allerdings der vierten der Vorzug deshalb einzuräumen ist, weil durch die Berücksichtigung der relativen Organgewichte gleichsam die spezifische Metastasierungsneigung in dem betreffenden Organ zum Ausdruck kommt. In der Tab. 2 sind alle 4 Beurteilungsweisen nebeneinander wiedergegeben. Für die Errechnung der Metastasenhäufigkeit pro Gewichtseinheit der Organe, der wir, wie erwähnt, eine besondere Bedeutung beimessen möchten (Rub. IV), wurden anhand von 4 Tieren mit einem Durchschnittsgewicht von 17,6 g die durchschnittlichen Organgewichte festgestellt. Die gewonnenen Werte sind in F o r m des Absolutgewichtes sowie in Prozent des Gesamtkörpergewichtes in der T a b . 3 dargestellt. Die Differenz (ca. 3,5 g) zwischen der Summe der ausgewogenen Organe und dem Gesamtkörpergewicht ergibt sich daraus, daß das B l u t sowie das Knochensystem nicht einbezogen wurden und außer-

327

Experimentelle Erzeugung von Metastasen

dem Magen- und Darminhalt gewichtsmäßig ausgeschaltet werden müssen. Im Knochensystem wurden auf Grund der makroskopischen Betrachtung niemals Metastasen nachgewiesen und eine histologische Aufarbeitung wurde nicht vorgenommen. Wenn wir die Ergebnisse der Tab. 2 vergleichend betrachten, so fällt zunächst eine gewisse Parallelität hinsichtlich der Metastasierungshäufigkeit und des Metastasenbefalls bei allen 4 verschiedenen Berechnungsweisen auf. Die Lunge steht in allen Fällen weitaus an der Spitze und übertrifft in jedem Fall jedes einzelne Organ des Tabelle 2 Der Größe n a c h geordnete Durchschnittswerte der Metastasierung der einzelnen O r g a n e nach iv. I n j e k t i o n von 1,5 Mill. Ehrlich-Asciteszellen pro Maus I R.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

15 16

% Metastasenpositive Tiere (v. 1 1 7 4 Tieren) Lunge Muskulatur Nackenorg. Nebennier. Nieren Lymphdr. Herz Thymus Haut Ovarien Magen Darm Leber Milz Hoden Gehirn

64,2 25,5 19,7 17,0 14,6 13,8 10.5 8,6 7.2 6,0 3.5 2,3 °>4 0,2 0,0 0,0

II

III

IV

Anzahl der Metastasen p r o Organ

% Metastasen von den Gesamtm e t a s t a s e n (13715)

Anzahl der Metastasen p r o g Organ

Lunge Muskulatur Nieren Nackenorg Haut Lymphdr. Nebennier. Herz Thymus Ovarien Leber Magen Darm Milz Hoden Gehirn

8,6 0,55 0-45 0,36 0,25 0,25 0,23 0,16 0,09 0,08 0,05 0,03 0,02 0,005 0,0 0,0

Lunge 73.5 M u s k u l a t u r 4.7 Nieren 3-8 N a c k e n o r g . 3,1 Haut 2,4 Nebennier. 2,0 Lymphdr. 1,8 Herz 1,4 Thymus o,7 Leber o,5 Ovarien o,3 Magen o,3 Darm 0,2 Milz 0,04 Hoden 0,0 Gehirn 0,0

Lunge 57,3 Nebennier. 27,7 Nackenorg. 12,6 Lymphdr. 3,0 Nieren 2,2 Thymus 2,0 Herz 1,6 Ovarien 1,6 0,18 Magen Haut 0,1 M u s k u l a t u r 0,06 Leber 0,05 Milz 0,05 0,018 Darm 0,0 Hoden Gehirn 0,0

großen Kreislaufs. Auch in den Organen des großen Kreislaufs sind jedoch beträchtliche Unterschiede in der Metastasenausbildung vorhanden, wobei vor allem auf das gänzliche oder fast gänzliche Fehlen von Metastasen in Gehirn, Hoden, Milz, Darm und Leber hinzuweisen ist. Ein beträchtlicher Anteil der Metastasen entfällt auf Muskulatur, die Nieren, das Nakkenorgan, die Nebennieren und die Haut, während die übrigen Organe eine Mittelstellung einnehmen. Bei einem Vergleich der 4 verschiedenen Betrachtungsweisen findet man den größten Unterschied zwischen der Gruppe 4 und den 3 übrigen Gruppen, die weitgehend untereinander übereinstimmen. Bei der Mitberücksichtigung des Organgewichtes rückt die Nebenniere mit weitem Abstand auf den 2. Platz und weist die Hälfte des Lungenwertes auf, während z. B. Muskulatur und Haut stark zurückfallen. Die aus den ersten 3 Spalten sich ergebende relative Häufigkeit an Metastasen in der Muskulatur ist also ausschließlich auf den sehr großen

328

W.

KRISCHKE

Gewichtsanteil dieses Gewebes vom Gesamtkörper zurückzuführen und keineswegs auf eine besonders große spezifische Metastasierungsneigung der Ascites-Tumorzellen im Muskelgewebe. Gerade umgekehrte Verhältnisse müssen für die Nebennieren und außerdem für das fettreiche Nackenorgan angenommen werden. Wenn man im Hinblick auf die spezifische Metastasierung Nebennieren und Muskulatur vergleicht, so ergibt sich eine Relation von 1:460, d. h. eine fast 5oofach größere spezifische Metastasierungsneigung in den Nebennieren. Eine bevorzugte Metastasierung in einem bestimmten Organ auf Grund besonderer chemischer oder struktureller Eigenschaften desselben ist also bei Bezug der Metastasenzahl auf Tabelle 3 Gewichtsdaten verschiedener Organe der weißen Maus

Rub.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Organe

Gesamtkörper Muskulatur, einschl. darin befindl. Fettund Bindegewebe Haut Darm Leber Gehirn Nieren Magen Lunge Milz Hoden Herz Lymphdrüsen Ovarien Thymus Nackenorgan Nebennieren

Summe der Organe

% vom AbsolutGesamtgewicht körper g gewicht 17,6 7.9

100 45-0

2,6 1.13 1.05 0,38 0,21 0,16 0,15 0,10 0,10 0,086 0,068 0,050 0,040 0,030 0,008

14.85 5.77 5,7 2,16 1,18 0,91 0,85 o.57 o.57 0,49 0,38 0,28 0,23 0,17 0,04

14,062

84,00

konstante Gewichtseinheiten nicht auszuschließen.—Verschiedene Einzeldaten über die in den oben beschriebenen Versuchsreihen erzielte Metastasierung sind in der Tab. 4 zusammengefaßt und in übersichtlicher Form wiedergegeben. Diskussion Aus den dargestellten Versuchen ergibt sich, daß durch die intravenöse Injektion von Ascites-Tumor-Zellen bei der Maus eine multiple Tumor-

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