Acta Biologica et Medica Germanica: Band 1 1958 [Reprint 2021 ed.] 9783112530641, 9783112530634

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ACTA BIOLOGICA MEDICA HERAUSGEBER:

A. G R A F F I • H. G U M M E L • F. J U N G • A. K R A U T W A L D S. M. R A P O P O R T S C H R I F T L E I T U N G : W. S C H E L E R

Band 1 1958

AKADEMIE-VERLAG.

BERLIN

Herausgeber und verantwortlich für den Inhalt: Prof. Dr. Arnold Graffi, Prof. Dr. Hans Gummel, Prof. Dr. Fritz Jung, Prof. Dr. Alfons Krautwald, Prof. Dr. Samuel Mitja Rapoport. Schriftleitung: Doz. Dr. med. habil. Werner Scheler, Berlin-Buch, Lindenberger Weg 70, Fernruf: 5 6 9 8 5 1 . App. 461. Verlag: Akademie-Verlag GmbH, Berlin W 8, Mohrenstraße 39, Fernruf: 200386, Postscheckkonto Berlin 3 5 0 2 1 . Bestell- und Verlags-Nr. dieses Bandes 1053/I. Die Zeitschrift erscheint zweimonatlich. Bezugspreis: DM 9,50. Veröffentlicht unter der Lizenz-Nr. Z L N 5022 des Ministeriums für Kultur, Hauptverwaltung Verlagswesen. Gesamtherstellung: V E B Druckerei „Thomas Müntzer" Bad Langensalza. — Alle Rechte vorbehalten, insbesondere die der Übersetzung. Kein Teil dieser Zeitschrift darf in irgendeiner Form — durch Photokopie, Mikrofilm oder irgendein anderes Verfahren — ohne schriftliche Genehmigung des Verlages reproduziert werden. — Printed in Germany.

INHALT Heft 1 F. F E Y : Untersuchungen zur Pathogenese der durch zellfreie Tumorfiltrate erzeugten Leukämien der Maus 2 — 14 F. F E Y : Untersuchungen zur Charakterisierung der durch zellfreie Tumorfiltrate erzeugten Leukämien der Maus 1 5 — 31 W . S C H E L E R , G. S C H O F F A u. F . J U N G : Über Umsetzungen des AnhydroMethämoglobins 3 2 — 39 A . K R A U T W A L D , H . D U T Z U . K . V O I G T : Verlauf und histologische Nierenveränderungen bei experimenteller Nephritis unter Einwirkung von Mandelat und Hexamethylentetramin 4 0 — 48 W . E S C H B A C H u. R . H A N K E : Über den Stoffwechsel wachsenden Lebergewebes nach partieller Hepatektomie und den Versuch, diesen Stoffwechsel durch Follikelhormon zu beeinflussen 4 9 — 60 H. B I E L K A : Über Beziehungen zwischen Stoffwechsel und W a c h s t u m von Tumoren 6 1 — 78 J. I W I G u. F. J U N G : A T P - A b b a u in Methämoglobin-führenden Blutzellen 7 9 — 84 F. Z A W A C K I : Gegenseitige Ausscheidungsbeeinflussung von Sulfonamiden 85—100 H. E R N S T , H. W . R A T H E N O W U . H. J. E I C H H O R N : Untersuchungen mit der P 3 2 -Indikatormethode über die Hemmwirkung v o n N - O x y d - L o s t (Mitomen) auf Walker-Carcinom- und Normalgewebe der R a t t e . . 101—108 K . R I N T E L E N U . W . K N O B L O C H : Beeinflussung von Mäuse-Ascites-Tumoren durch Benzimidazolderivate 109—113 Kurzmitteilungen B . E . W A H L E R U . H . G . T H O M : Die paramagnetische Resonanz einiger freien Radikale aus der Gruppe der Diarylstickstoffoxyde 114—116

G . SCHOFFA,

Heft 2 Über die Verstärkung von Pharmacawirkungen durch cholinergische Medikamente S T . L I W C Z Y C , J . W . G U Z E K U . P. M I K U L O W S K I : Störungen im Funktionszustand der Niere durch einen v o m weichen Gaumen ausgehenden reflektorischen Prozeß H.-J. R A D E R E C H T U . M . S C H L E U S I N G : Zur K r i t i k der Pentdyopentreaktion als Nachweis von Urobilin-Urobilinogen I. S Y L L M - R A P O P O R T U . I. S T R A S S B U R G E R : Über den experimentellen Magnesium-Mangel beim Hund A . K R A U T W A L D , H . D U T Z U . K . V O I G T : Verlauf und histologische Nierenveränderungen der experimentellen Nephritis unter Einwirkung von Acetazolamid und Salyrgan H.-J. R A D E R E C H T : Die Austauschtransfusion als physiologisch-chemische Arbeitsmethode. I. Theoretische Grundlagen und Methodik . . . . L . P I C K E N H A I N U . H. M Ü H L K E : Der Einfluß der Mundatmung des Sprechens und des Lesens auf die Speichelsekretion des Menschen . W . S C H E L E R u. I . F I S C H B A C H : Über Eigenschaften des ChironomusMethämoglobins und seiner K o m p l e x e K . - H . CHEMNITIUS:

117—129

130—137 138—140 141—163

164—172 173—187 188—193 194—210

Inhaltsverzeichnis

IV

: Studien über den peripheren Volumpuls. I. Die physiologische Grundform des Fingervolumpulses und seine Veränderung durch die A t m u n g 211—220 H . M A T T H I E S : Zum Problem der Methämoglobinrückbildung in Erythrocyten 221—22S Kurzmitteilungen I . M A C A V E I : Zytologische Diagnose der Lymphogranulomatosis maligna H.

ANKERMANN

W.

SCHELER

aus Milchdrüsensekret

229—231

u. F. J U N G : Über die Sigmoidkoeffizienten der CyanidGleichgewichte des Methämoglobins und Metmyoglobins

232—235

Heft 3 L. STEIDEL U. J. TRENCKA: Glykoproteide des Liquors. I I I . Die Glykoproteide im Liquor bei Epileptikern 237—244 H . J . R A D E R E C H T u n t e r Mitarbeit von D . G R Ü N E B E R G : Über die erhöhte Blutgerinnung nach Aderlaß 245—248 B . W I E G E R S H A U S E N : Zur Pharmakologie der Tweens. I . Die Wirkung von Tween 8 0 auf periphere Gefäßgebiete 249—258 R . Z A H N E R T : Experimentelle Untersuchungen über die Phosphatase259—271 aktivität in der Rattenleber, insbesondere bei Hepatomen A . T E I T E L U . L . D A L L M A N N : Über eine paradoxe Bariumionenwirkung . 2 7 2 — 2 7 9 W . S C H E L E R : Über einige physikalisch-chemische Eigenschaften des Chlorocruorins von Spirographis Spallanzani 280—292 H . B A N A S C H A K : Über den Kationentransport bei Rindererythrocyten . . 2 9 3 — 3 0 3 H . - J . R A D E R E C H T u n t e r Mitarbeit von I . S Y L L M - R A P O P O R T , R . C O U T E L L E , E. S C H Ö L Z E L , D. G R Ü N E B E R G u. G . V I E R E C K : Zur Anwendung der Austauschtransfusion als physikalisch-chemische Arbeitsmethode. I I . Über das Verhalten des Serumcholesterins 304—320 W . K I R S C H K E : Über eine Methode zur experimentellen Erzeugung von Metastasen für Serienversuche 321—331 G . P I C K R O T H U . K . L I N D E : Die Behandlung der experimentellen Tuberkulose mit Isonikotinsäurehydrazid (INH)-Ultraschall-Aerosolen. . 3 3 2 — 3 4 7 J . JORDANOV, G . K O S T U R K O V U. S . M I N T S C H E V : Die Hühnereizelle (Dotterkugel) als Nährboden zur Züchtung der Tuberkelbakterien . 3 4 8 — 3 5 6 A. K R A U T W A L D , H . L I N K E U . W . W E I G E L : Über den Anteil ungesättigt e r F e t t s ä u r e n im menschlichen Serum bei Normalen und Adipösen 3 5 7 — 3 6 0 Kwzmitteilungen B.

LANG,

H.-J. M A T T H I E S U . S . M A T T H I E S : Die Wirkung von 5 - H y d r o x y t r y p t a m in auf acetylcholinempfindliche Nervenendigungen peripherer Gefäßgebiete "W. F Ö R S T E R : Über die Wirkung von Acetylcholin(ACH) auf die Herzvorhöfe von R a t t e n , Kaninchen, Katzen und Meerschweinchen nach Spartein- und Chinidinvorbehandlung

361—362

363—364

Heft 4 K A R L L O H M A N N 6 0 Jahre! 365—367 P . L A N G E N : Über Polyphosphate in Ostsee-Algen 368—372 E . L i s s : Über den Einfluß einiger alkylierter Nitrophenole auf den Stoffwechsel der Hefe 373—378 H . G R A E T Z , H . B I E L K A U. E . N E G E L E I N : Versuche über Wachstumsbedingungen für die Ehrlichsche Mäuseascites-carcinomzelle in vitro . . . 3 7 9 — 3 8 8 H . G R E I L I N G , W . W I N K E L M A N N U. E . S C H Ü T T E : Einfluß von Thiamin auf die P h o s p h a t a u f n a h m e und den Phosphatstoffwechsel des Erythrozyten 3 8 9—395

Inhaltsverzeichnis H.

u. S. R A P O P O R T : Über die Aktivitätsabnahme der Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase in der Rattenmamma bei Beendung der Laktation H . M A T T E N H E I M E R : Polyphosphate und Polyphosphatasen in Amöben . H . H A N S O N U . J . M E T H F E S S E L : Zur Spezifität der Peptidaseaktivität der Rinderlinse H . G . S C H W E I G E R U . S. R A P O P O R T : Der N-Stoffwechsel bei der Erythrozyten-Reifung. Atmung und Ammoniakbildung H . - J . R A D E R E C H T unter Mitarbeit von I . S . R A P O P O R T , R . COUTELLE, D. G R Ü N E B E R G , E. S C H Ö L Z E L U . G . V I E R E C K : Zur Anwendung der Austauschtransfusion als physiologisch-chemische Arbeitsmethode. III. Über das Verhalten des Fibrinogenspiegels F. H A U S C H I L D U . R . K I E S E W E T T E R : Pharmakologische Untersuchung von einigen neuen quartären Ammoniumderivaten K . A D E R H O L D : Tierexperimentelle Untersuchungen über die Wirksamkeit neu synthetisierter carcinolytischer Substanzen K . A . G R O O T - W A S S I N K : Zur Frage eines hypothalamischen Überträgerstoffes mit Einfluß auf die gonadotrope HypophysenvorderlappenAktivität A . T E I T E L U . L . D A L L M A N N : Über die Wirkung der Kaliumionen auf die Blutegelmuskulatur . E . E D L I N G E R : Über die Virusverteilung in Zellsuspensionen des Rousschen Hühnersarkoms

V

SCHARFSCHWERDT

396—404 405—413 414—421 422—431

432—443 444—449 450—458

459—470 471—485 486—495

Kurzmitteilungen P . O H L M E Y E R U. T . E G G E L I N G :

Invertase aus Trockenhefe

496—498

Heft 5 4(5)-Amino-5(4)-imidazolcarB R A U N S T E I N U. G . J . W I L E N K I N A : boxamid als normaler Harnbestandteil beim Menschen und den Säugetieren E. P E R L I C K : Regelvorgänge bei der Blutgerinnung H. G A R T M A N N : Zur Bedeutung und zum Vorkommen der sogenannten junktionalen Aktivität beim Naevuszellnaevus und Melanom . . . W . H O H L W E G , E . D A U M E U . E . B R O S E : Über die Follikelhormon-Inaktivierungsfähigkeit der Leber normaler, kastrierter und hormonbelasteter Ratten G. S T A R K E U . S . S E I D L : Über experimentelle homologe und heterologe Interferenzversuche bei der Tollwutinfektion E. S T R A C K U . I . L O R E N Z : Reizwirkung einiger Nitrile und Amine vom T y p des Carnitins auf den Froschmuskel G . H I L G E T A G , A . R I E C H E U . A . M A R T I N I : Über den Einfluß der „ H e f e " Konzentration auf die maximal mögliche Durchsatzgeschwindigkeit von Melasselösungen bei vollkontinuierlicher Arbeitsweise A . T E I T E L : Über die „Pseudospirochäten" der Erythrozyten und ihre Beziehungen zu den maulbeer- und stechapfelförmigen roten Blutkörperchen K . H E C H T U . G . M I S G E L D : Zur Kenntnis der bedingten-motorischen Nahrungsreaktionen I., II. und III. Ordnung bei Ratten (Ausbildung, Festigung, Wechselwirkung und Erlöschen) H . V O L K M E R : Elektronischer Lichtblitzgeber für biologische Messungen . A.

E.

499—505 506—519 520—539 540—547 548—555 556—564 565—576 577—585

586—622 623—626

Kurzmilteilungen U . SCHMIDT-GROSS :

Digestionsmetamorphose von Leukozyten

627—629

VI

Inhaltsverzeichnis

Heft 6 J. L . C H O D O R O V A : Die Kinetik der Polymerisation des Fibrin-Monomeren M . S P R Ö S S I G U. H. U R B A C H : Eine serologische Studie an Grippevirusstämmen vom T y p „ A s i a " M. H E R B S T , D. M I C H E L , O. H A R T L E B , W. G R O H M A N N U. A. G L Ä S E R : Beobachtungen bei Injektion von Adenosin-monophosphorsäure und Acetylcholin in verschiedenen Mischungen in die Coronarien am ausgeschalteten Herzen in Hypothermie T H . B E C K E R : Der Einfluß von Hypophysenextrakt auf den zytostatischen E f f e k t der Chemotherapie maligner Tumoren E . G E Y R H A L T E R , W . H A S S E L B A C H U. H . H . W E B E R : Die Wechselwirkung zwischen gelöstem Aktomyosin und anorganischen Polyphosphaten. C. H A R I N G , K . H E C H T U. G . M I S G E L D : Der Einfluß des Chlorpromazins auf das bedingt-reflektorische Verhalten von Ratten . K. H E C H T U. G. M I S G E L D : Die Bedeutung des Umweltzusammenhangs für die Bildung bedingter Reaktionen mit umgekehrter Reizfolge . . M . M Ü L L E R : Über Kreislauf- und Atmungseffekte der intravenösen Sauerstoffinsufflation an Meerschweinchen und Katzen K . Z A P F : Zur Frage der Reduktionsorte in Bakterien G. K O R B : Das Verhalten der normalen und geschädigten Froschleber bei . der Färbung mit dem Fluochrom Acridinorange F. S C H W A R Z , E. V O L K M E R U. K . I L L I G : Über die Licht-Schall-Empfindlichkeit einiger mit y-Hexachlorcylohexan vergifteter Kaltblüter. . M. B R A D L : Über physiologisch-optische Untersuchungen zum Reizmengengesetz an mit y-Hexachlorcyclohexan vergifteten Fröschen . Kurzmitteilungen

V . A . B E L I T Z E R U.

H.

631—640 641—651.

652—657 658—662 663—672 673—686 687—700 701—709 710—724 725—732 733—742 743—755

Versuche zur maximalen antirachitischen UV-Aktivierung isolierter menschlicher Haut 756—757

BEKEMEIER:

AUTORENVERZEICHNIS ADERHOLD, K ANKERMANN, H.

.

.

BANASCHAK, H.

.

. . .

BECKER, TH

BEKEMEiER, H . BELITZER,

V. A.

. . . .

.

HILGETAG, G.

.

.

•

•

565

HOHLWEG, W.

.

.

•

•

54°

293 658

ILLIG, K

•

•

733

IWIG, J

•

•

79

•

• 348

756

.

631

. . .

BIELKA, H

450 211

61, 3 7 9

BRADL, M

JORDANOV, J.

.

.

JUNG, F

. . .

32

232

• .

• .

444 109

•

•

725

•

• 348

743

BRAUNSTEIN, A. E.

.

.

499

KIESEWETTER,

R.

54°

KNOBLOCH, W .

.

.

.

.

.

.

.

.

BROSE, E

KORB, G CHEMNITIUS, K . - H .

.

.

C H O D O R O V A , J. L .

.

.

.

COUTELLE, R DALLMANN, L

117 631

DUTZ, H

KOSTURKOV, G. KRAUTWALD,

' •

•

• 3°4> 432

KRISCHKE, W.

.

.

. 272, 4 7 1

LANG, B

.

540 4 ° . 164

DAUME, E

.

.

A.

• 237 • 368

LINDE, K

•

•

332

LINKE, H

•

•

357

•

•

373

•

•

13°

•

•

556 229

496

L I W C Z Y C , ST. .

101

LORENZ, L

.

.

.

321

101

ERNST, H ESCHBACH, W

49

FEY, F

M A C A V E I , I.

.

.

.

.

.

MARTINI, A.

.

.

.

•

• 565

IS

MATTENHEIMER,

H.

FISCHBACH, I

194

MATTHIES, H.-J.

.

FÖRSTER, W

363

M A T T H I E S , S.

.

.

.

.

.

1,

.

METHFESSEL, GARTMANN, H GEYRHALTER, E.

357

•

.

EGGELING, T .

164,

•

LANGEN, P.

LISS, E

.

4°.

.

486 J.

. . .

.

EDLINGER, E EICHHORN, H.

79.

.

.

.

520

MICHEL, O.

• • 405 221, 361

J. .

•

•

361

•

•

4H

.

.

.

• 652

.

.

•

66^

MIKULOWSKI, P.

GLÄSER, A

652

M I N T S C H E V , S.

.

.

GRAETZ, H

379 380

MISGELD, G.

.

.

.

MÜHLKE, H

.

.

188

652

MÜLLER, M.

.

.

.

.

.

701

NEGELEIN, E.

.

.

•

•

379

GREILING, H GROHMANN, W .

.

GROOT-WASSINK,

K.

GRÜNEBERG, D.

.

. A.

459

. . .

245,

G U Z E K , J. W

304. 4 3 2 130

HANKE, R HANSON, H HASSELBACH, H.

.

.

.

HARING, C HARTLEB, O HAUSCHILD, F HECHT. K HERBST, M

130

• • 348 586, 6 7 3

.

.

. 586,

OHLMEYER, P.

.

.

.

.

496

49 414

PERLICK, E.

.

.

.

663

PICKENHAIN,

L.

. .

.

506 188

67.3 652

PICKROTH, G..

.

.

•

•

332

444

RADERECHT,

673 652

R A P O P O R T , S.

H.-J.

138,

173. 245.

304. 432

141>

3°4>

396

Autorenverzeichnis

VIII RAPOPORT,

432

TEITEL, A

RATHENOW, W

S. 1

101

THOM, H. G

114

RIECHE, A

565

TRNECKA, J

237

URBACH, H

641

RINTELEN,

K

272,

471,

577

10G

SCHARFSCHWERDT, H SCHELER, W .

.

.

396 32,

194,

232,

280

SCHLEUSING, M

138

SCHMIDT-GROSS, U

627

SCHOFFA, G

VIERECK, G

304,

VOIGT, K

' .

VOLKMER, E

432

40,

164

623,

733

32,

II4

304,

432

.

389

WAHLER, B. E

733

WEBER,

422

WEIGEL, W

357

548

WIEGERSHAUSEN, B

249

SPRÖSSIG, M

641

WILENKINA,

STARKE, G

548

WINKELMANN, W .

STEIDEL, L

237

STRACK, E

556

ZAHNERT, R

STRASSBURGER, 1

141

ZAWACKI, F.

SCHÖLZEL,

E

SCHÜTTE, E SCHWARZ, F SCHWEIGER,

H. G

SEIDL, S

.

H.

114

H

.

!

.

. 6 6 3

G. J

499 .

389

259 .

.

.

.

.

.

.

.

.

.

85

SACH WORT V E R Z E I C H N I S Acetazolamid, Nierenwirkung bei experimenteller Nephritis Acetylcholin-empfindliche Nervenendigungen peripherer Gefäße Acetylcholin, Herzwirkung bei Hypothermie Acridinorange, Färbung der normalen und geschädigten Froschleber Adenosin-monophosphorsäure, Herzwirkung bei Hypothermie Adipositas, ungesättigte Fettsäuren im Serum Aktomyosin, Wechselwirkung mit anorganischen Polyphosphaten Amine, Reizwirkung auf den Froschmuskel 4(5)-Amino-5(4)-imidazolcarboxamid, normaler Harnbestandteil Ammoniak, Bildung bei Erythrocytenreifung . Ammoniumderivate, quartäre, Pharmakologische Prüfung . A T P , Abbau in Methämoglobin-führenden Blutzellen Austauschtransfusion, Theoretische Grundlagen und Methodik Austauschtransfusion, Verhalten des Fibrinogens Austauschtransfusion, Verhalten des Serumcholesterins Bakterien, Reduktionsorte Bariumionen, Paradoxe Wirkung an glatter Muskulatur Benzimidazole, Beeinflussung von Mäuse-Ascites-Tumoren Blutgerinnung, Erhöhung nach Aderlaß Blutgerinnung, Regelvorgänge

164 361 . . 652 725 652 357 663 556 499 422 444 79 173 432 304 710 272 109 245 506

Carcinolytische Substanzen, Tumorwirkung neuer Verbindungen 450 Carcinom, Ehrlich'sches Mäuseascites, Wachstumsbedingungen in vitro . . . 379 Carcinom, Walker-, Hemmwirkung von N-oxyd-lost 101 Carnitin-verwandte Amine und Nitrile, Muskelwirkung 556 Chinidin, Vorbehandlung von Herzvorhöfen bei Acetylcholineinwirkung . . . 363 Chironomus-Methämoglobin, Physikalisch-chemische Eigenschaften . . . . 194 Chlorocruorin, Physikalisch-chemische Eigenschaften 280 Chlorpromazin, Einfluß auf das bedingt-reflektorische Verhalten von Ratten .. 673 Cholesterin, Verhalten bei der Austauschtransfusion 304 Cholinergische Stoffe, Verstärkung von Pharmakawirkungen 117 Diarylstickstoffoxyde, paramagnetische Resonanz einiger Radikale Digestionsmetamorphose von Leukocyten

114 627

Epilepsie, Glykoproteide des Liquors Erythrocyten, Kationentransport bei Rinder-E Erythrocyten, Probleme der Methämoglobinrückbildung Erythrocyten, Pseudospirochätenbildung Erythrocyten, Stickstoffwechsel bei E.-Reifung Erythrocyten, Thiaminwirkung auf die Phosphataufnahme Erythrocyten, Wirkung von Thiamin auf den Phosphatstoffwechsel

237 293 221 577 422 389 389

Fettsäuren, ungesättigte, im Serum von Adipösen Fibrin-Monomere, Polymerisationskinetik

357 631

X

Sachwortverzeichnis

Fibrinogenspiegel, Verhalten bei der Austauschtransfusion Follikelhormon, Beinflussung des Leberstoffwechsels Follikelhormon, Inaktivierungsfähigkeit der Rattenleber

432 49 540

Gefäßgebiete, periphere, Wirkung von Tween 80 Gefäßgebiete, periphere, Wirkung von 5-Hydroxytryptamin Glykoproteide, im Liquor bei Epileptikern Glykose-6-Phosphat-dehydrogenase, Aktivität in der R a t t e n m a m m a . . . . Grippevirusstämme T y p ,,Asia", Serologische Studien

249 361 237 396 641

Hefe, Einfluß alkylierter Nitrophenole auf den H.-Stoffwechsel 373 Hefe, Einfluß der H.-Konzentration bei der Melassevergärung 565 Hepatektomie, partielle, Stoffwechsel wachsenden Lebergewebes 49 Hepatome, Phosphataseaktivität 259 y-Hexachlorcyclohexan, Licht-Schall-Empfindlichkeit von Kaltblütern . . . 733 Hexamethylentetramin, Nierenwirkungen bei experimenteller Nephritis . . . 40 Hühnereizelle, Nährböden zur Tuberkelbakterien-Züchtung 348 5-Hydroxytryptamin, Wirkung auf azetylcholinempfindliche Rezeptoren . . 3 6 1 Hypophysenextrakt, Wirkung bei Tumorchemotherapie 658 Hypophysenvorderlappen, Beeinflussung der gonadotropen Aktivität des H. . 459 hypothalamischer Übertragerstoff, Einfluß auf Hypophysenvorderlappen . . 459 Hypothermie, Herzausschaltung in H. mit Anwendung von Acetylcholin und AMP 652 Interferenzversuche bei der Tollwutinfektion Invertase aus Trockenhefe Isonikotinsäurehydrazid-Aerosole, Behandlung der experimentellen kulose

548 496 Tuber-

332

Kaliumionen, Wirkung auf die Blutegelmuskulatur Kationen, Transport bei Rindererythrocyten

471 293

Laktation, Glukose-6-Phosphat-dehydrogenase bei Beendung der L Leber, Follikelhormon-Inaktivierungsfähigkeit Leber, Phosphataseaktivität der R a t t e n - L Leber, Stoffwechsel wachsenden L.-Gewebes Leukämie, Pathogenese der durch zellfreie Tumorfiltrate erzeugten L Leukämie, Charakterisierung der durch zellfreie Tumorfiltrate erzeugten L . . Leukozyten, Digestionsmetamorphose Lichtblitzgeber, elektronischer, f ü r biologische Messungen Liquor cerebrospinalis, Glykoproteide bei Epileptikern Lymphogranulomatosis maligna, Zytologische Diagnose aus Milchdrüsensekret

396 540 259 49 2 15 627 623 237

Magnesium, Mangeleffekte beim Hund Mandelat, Nierenwirkung bei experimenteller Nephritis Melasse, Durchsatzgeschwindigkeit von M.-Lösungen Melanom, funktionale Aktivität Metastasen, Methode zur experimentellen Erzeugung von M Methämoglobin, A T P - A b b a u in M.-führenden Blutzellen

141 40 565 520 321 79

229

Sachwortverzeichnis

XI

Methämoglobin-Cyanid, Sigmoidkoeffizienten des Gleichgewichtes . . . . . 239 Methämoglobin, Eigenschaften des Chironomus-M. und seiner Komplexe . . . 194 Methämoglobin, Rückbildung in Erythrocyten 221 Methämoglobin, Umsetzungen des Anhydro-M 32 Metmyoglobin-Cyanid, Sigmoidkoeffizienten des Gleichgewichtes 232 Mitomen, Hemmwirkung auf Walker-Carcinom der Ratte 101 Naevuszellnaevus, junktionale Aktivität Nahrungsreaktion, bedingt motorische I., II. und I I I . Ordnung Nephritis, experimentelle, Beeinflussung durch chemische Verbindungen . . . Niere, Einwirkung von Acetazolamid bei experimenteller Nephritis . . . . Niere, Einwirkung von Hexamethylentetramin bei experimenteller Nephritis Niere, Einwirkung von Mandelat bei experimenteller Nephritis Niere, Einwirkung von Salyrgan bei experimenteller Nephritis Niere, Funktionsstörungen durch einen reflektorischen Prozeß Nitrile, Reizwirkung auf den Froschmuskel Nitrophenole, alkylierte, Einfluß auf den Hefestoffwechsel N-Oxyd-Lost, Hemmwirkung auf Walker-Carcinom der Ratte Nucleotid, Stoffwechsel in Erythrocyten

520 586 164 164 40 40 164 130 556 373 101 79

Paramagnetische Resonanz freier Radikale von Diarylstickstoffoxyden . . . Pentdyopent, Kritik der P.-Reaktion als Urobilm-Urobilinogen-Nachweis. Peptidase, Aktivität in der Rinderlinse Phosphat, Einfluß von Thiamin auf die P.-Aufnahme in Erythrocyten . . . . Phosphat, Einfluß von Thiamin auf den P.-Stoffwechsel in Erythrocyten . . Phosphat, Stoffwechsel in Erythrocyten Phosphatase, Aktivität in der Rattenleber, besonders bei Hepatomen . . . . Phosphor 32 , Indikatormethode Polymerisation, Kinetik der P. von Fibrin-Monomeren Polyphosphatasen in Amöben Polyphosphate, anorganische, Wechselwirkung mit gelöstem Aktomyosin . Polyphosphate in Ostsee-Algen Pseudospirochäten der Erythrocyten

. 114 . 138 414 389 . 389 79 259 101 631 401 . 663 368 577

Radikale aus der Gruppe der Diarylstickstoffoxyde Resonanz, paramagnetische, freier Radikale von Diarylstickstoffoxyden . .

114 .114

Salyrgan, Nierenwirkung bei experimenteller Nephritis Sarkom, Virusverteilung in Zellsuspensionen des Rousschen S Sauerstoffinsufflation, Kreislauf- und Atmungseffekte Sekretion, Einfluß der Atmung, des Sprechens und Lesens auf die Speichel-S. . Sekret, Milchdrüse, Zytologische Diagnose der Lymphogranulomatose . . . . Spartein, Vorbehandlung von Herzvorhöfen bei Acetylcholineinwirkung . . . Spirographis Spallanzani, Physikalisch-chemische Eigenschaften des Chlorocruorins Stickstoff-Stoffwechsel bei der Erythrocytenreifung Sulfonamide, Gegenseitige Ausscheidungsbeeinflussung

164 486 701 188 229 363 280 422 85

Thiamin, Einfluß auf Phosphataufnahme und -stoffwechsel der Erythrocyten . 379 Tollwut, Homologe und heterologe Interferenzversuche 548 Tuberkelbakterien, Züchtung auf der Dotterkugel 348 Tuberkulose, INH-Aerosol-Therapie der experimentellen T 332

XII

Sachwortverzeichnis

Tumor, Beeinflussung von Mäuse-Ascites-T. durch Benzimidazole Tumor, Beziehungen zwischen Stoffwechsel und Wachstum Tumor, Einfluß von Hypophysenextrakt auf die T.-Therapie Tumor, Leukämien durch zellfreie T.-Filtrate Tween 80, Wirkung auf periphere Gefäßgebiete Ultraschall, INH-Aerosole zur Tuberkulosebehandlung Urobilin, Kritik des Pentdyopentnachweises Urobilinogen, Kritik des Pentdyopentnachweises UV-Aktivierung, antirachitische UV-A. menschlicher Haut Virus, Serologische Studie an Grippe-V. vom T y p „ A s i a " Virus, Verteilung in Zellsuspensionen des Rous-Sarkoms Volumpuls, Grundform und Einfluß der Atmung auf den Finger-V

109 61 658 2, 15 249 332 138 138 756 641 486 : 211

ACTA BIOLOGrlCA ETMEDICA GERMANICA HERAUSGEBER:

A. G R A F F I • H. GUMMEL . F. J U N G • A. K R A U T W A L D S. M. R A P O P O R T

AKADEMIE-VERLAG

• BERLIN

. B

ND I

• HEFTI

•

SEITE

1 - 1 1 6 • 1958

AUFNAHMEBEDINGUNGEN 1. Es werden nur Arbeiten angenommen, die nicht an anderer Stelle mit demselben Inhalt veröffentlicht oder zur Veröffentlichung angeboten werden. Der Autor verpflichtet sich nach Annahme, die Arbeit an keiner anderen Stelle zu veröffentlichen. 2. Die Arbeit muß wissenschaftlich wertvoll sein. Bestätigungen bekannter Tatsachen, Versuche und Beobachtungen ohne positives Ergebnis werden, wenn überhaupt, nur in kürzester Form aufgenommen. Nicht aufgenommen werden Arbeiten referierenden Charakters, Polemiken und rein spekulative Arbeiten, falls sie nicht ganz wesentliche neue Gesichtspunkte enthalten. 3. Die Arbeiten müssen kurz und klar geschrieben und gegliedert sein. Problematik (Einleitung), Methodik, Befunde und Diskussion, evtl. Schlußfolgerungen sollen deutlich in Erscheinung treten. Der Arbeit soll ein Kurzreferat der wesentlichsten Ergebnisse vorausgestellt werden (Zusammenfassung von höchstens einer Druckseite). Neben einer anderssprachigen erscheint auf jeden Fall eine deutsche Zusammenfassung. Die Arbeiten werden in folgenden Sprachen angenommen: Deutsch, Russisch, Englisch und Französisch. 4. Besonders wertvolle längere Arbeiten können als Beihefte veröffentlicht werden. 5. Von 3eder Versuchsart bzw. jedem Tatsachenbestand oder jeder Krankengeschichte ist nur je ein Beispiel in knappster Form (Telegrammstil) zulässig. Weiteres Material ist als Tabelle oder grafisch darzustellen. Beobachtungen an biologischem oder medizinischem Material sollen mit Zahlenangaben über die Signifikanz der Ergebnisse belegt werden, 6. Literaturangaben müssen unter Verwendung der Abkürzung des Chemischen Zentralblattes und in der dort üblichen Form erfolgen: Name und Vorname des Autors, Band-, Seiten- und Jahreszahl. Bücher werden mit Titel, Verlag, Erscheinungsjahr und Seitenzahl zitiert, z. B . B . X . Y . nach M. N. Biochem. Z., 222, 45 (1951). Am Ende der Arbeit wird die Literatur in der Reihenfolge aufgenommen, wie sie im Text zitiert ist mit entsprechender Numerierung. 7. Doppeltitel sind zu vermeiden, ebenso Zerlegung einer Arbeit in mehrere Mitteilungen. 8. Das Manuskript muß am Kopf den Herkunftsort der Arbeit tragen. Am Ende des Manuskripts wird der Name und die Anschrift des Verfassers bzw. des in erster Linie für den Inhalt verantwortlichen Verfassers wiedergegeben. Einsendungen von Arbeiten aus Kliniken und Instituten ist eine Erklärung des Direktors oder Abteilungsleiters beizulegen, daß er mit der Veröffentlichung einverstanden ist und den Verfasser auf die Aufnahmebedingungen hingewiesen hat. 9. Das Manuskript ist einseitig und möglichst mit Maschine weitzeilig zu schreiben. Die Abbildungsvorlagen sind auf besonderen Blättern einzureichen. 10. Werden im Text wortgeschützte Bezeichnungen (z. B . Warenzeichen) benutzt, so ist nach Möglichkeit daneben eine international anerkannte und verständliche Bezeichnung (z. B . die chemische Zusammensetzung) anzugeben. Die Herausgeber

ACTA BIOLOGICA ET MEDICA GERMANICA Herausgeber: A. G r a f f i • H. G u m m e l • F. J u n g • A . K r a u t w a l d * S. M. R a p o p o r t Band I

1958

Heft 1

Zum Geleit Die Acta biologica et medica germanica sollen interessierten Fachkreisen neue wissenschaftliche Ergebnisse aus dem Gesamtgebiet der experimentellen Medizin und Biologie vermitteln. Eine besondere Aufgabe soll darin bestehen, sowohl zur Verbindung der vielverzweigten Gebiete der medizinischbiologischen Grundlagenforschung beizutragen als auch das Band zur klinischen Forschung enger zu knüpfen und somit mitzuhelfen, das notwendige Gegengewicht zur unvermeidlichen Spezialisierung zu schaffen. Der Wiederaufbau einer leistungsfähigen Wissenschaft in der Deutschen Demokratischen Republik hat in steigendem Maße die Notwendigkeit eines engeren Kontaktes uud einer besseren gegenseitigen Orientierung und Koordinierung ergeben. Der Mangel einer biologisch-medizinischen Zeitschrift hat sich in dieser Beziehung hemmend ausgewirkt. Wir hoffen, daß unsere Zeitschrift, über eine Repräsentation der wissenschaftlichen Arbeit der Deutschen Demokratischen Republik hinausgehend, durch die Unterstützung und Mitarbeit der Fachkollegen aus ganz Deutschland und aus anderen Ländern einen Beitrag zur deutschen und internationalen Wissenschaft sowie zur Förderung freundschaftlicher, wissen^ schaftlicher Beziehungen leisten kann. Die Herausgeber

A c t a biol. med. germ. B a n d 1, Seite 2 — 1 4 (1958) A u s der Deutschen A k a d e m i e der Wissenschaften zu Berlin, Institut für Medizin und Biologie, Berlin-Buch, Arbeitsbereich Biologie (Direktor: Prof. Dr. A . GRAFFI)

Untersuchungen zur Pathogenese der durch zellfreie Tumorfiltrate erzeugten Leukämien der Maus F. F e y

(Eingegangen a m 30. 7. 57)

Zusammenfassung E s wurden hämatologische und histologische Untersuchungen zur K l ä r u n g der Pathogenese der nach I n j e k t i o n zellfreier Tumorfiltrate auftretenden L e u k ä m i e n der Maus, die als unreifzellige (Paramyeloblasten-) bzw. reifzellige myeloische L e u k ä m i e n und intrathorakal lokalisierte unreifzellige Leukosen klassifiziert wurden, durchgeführt. Vergleichswerte für die in verschiedenen Altersstufen vorzunehmenden Untersuchungen zur Leukämogenese wurden an normalen unbehandelten Mäusen des für alle Versuche verwendeten A G N E S - B L U H M - I n zuchtstammes ermittelt. D u r c h B l u t e n t n a h m e n in verschiedenen Zeitabständen nach der I n j e k t i o n zellfreier T u m o r f i l t r a t e konnte die L e u k ä m o g e n e s e anhand des Blutbildes verfolgt werden. Die Spezifität des Reaktionsablaufes wurde durch Kontrollversuche nach I n j e k t i o n v o n artfremdem Serum, homologem E m bryonalbrei und hitzeinaktiviertem Mäusetumorfiltrat untersucht. Die L e u k ä mogenese läuft in drei Phasen ab. Die Initialphase ist durch starkes Ansteigen unreifer granulozytärer Zellformen, die im Blutbild normaler Mäuse nicht in Erscheinung treten, gekennzeichnet. Innerhalb der Intermediärphase setzt eine A u s s c h w e m m u n g vorerst nur weniger Zellen mit infiltrativer W a c h s t u m s p o t e n z ein, die in zunehmendem M a ß e Organinfiltrationen hervorrufen und die l y m phatischen Keimzentren zerstören. D u r c h rapides Ansteigen der unreifen Granulozytenstadien im B l u t wird die Terminalphase eingeleitet, in deren Verlauf das typische Erscheinungsbild der L e u k ä m i e n auftritt. Eine f ü r die L e u k ä m o genese aufgestellte Arbeitshypothese wird diskutiert.

In den letzten Jahren wurde von uns in einer Reihe von Veröffentlichungen über die Entstehung von myeloischen Leukämien bei der Maus berichtet, die nach der Injektion zellfreier Filtrate aus malignen Impftumoren bei ca. 40—80% der als Neugeborene behandelten Tiere nach einer Latenzzeit von ca. 6—8 Monaten auftraten [4], [6], [7], [8]. Durch die experimentelle Leukämieerzeugung war uns die Möglichkeit gegeben, den gesamten Verlauf der Leukämogenese anhand des Blutbildes vom Zeitpunkt der Reizsetzung bis zum Terminalstadium zu verfolgen. Für diese Untersuchungen erwiesen sich gesicherte Vergleichswerte von un-

Pathogenese der durch zellfreie Tumorfiltrate erzeugten Leukämien

3

behandelten Mäusen als notwendig. Aus diesem Grunde mußten wir den Status der weißen Blutzellen bei normalen Mäusen des A G N E S - B L U H M Inzuchtstammes, sowie die Blutwerte verschiedener Altersstadien für die auf bestimmten Altersstufen vorzunehmenden Untersuchungen ermitteln. Methodik Das Blut wurde durch Kupieren der Schwanzspitze mittels Scherenschlag aus den Schwanzgefäßen entnommen. Mehrmalige Blutentnahmen wurden in einem Mindestintervall von 5 Tagen vorgenommen, da Blutentnahmen in kürzerer Folge nach S C H Ä F E R [12] oft eine Leukozytose hervorrufen. Die quantitative Leukozytenzählung erfolgte mit den in der Humanmedizin gebräuchlichen Leukozytenpipetten. Zur Differenzierung der weißen Blutzellen wurden die Ausstriche nach MAYG R Ü N W A L D - G I E M S A ( P A P P E N H E I M - U N N A ) gefärbt und an Parallelausstrichen die Peroxydasereaktion nach S A T O ausgeführt. Von den in verschiedenen Altersstadien abgetöteten Tieren wurden Paraffinschnitte von Milz, Lymphknoten, Thymus und Leber nach Formalin-, C A R N O Y und MAXiMow-Fixierung hergestellt. Gefärbt wurden diese mit H. E. und Methylgrün-Pyronin. An Gefrierschnitten von unfixierten Organstücken wurde die Peroxydasereaktion nach S A T O durchgeführt. Ergebnisse a) Stahls der weißen Blutzellen normaler

AGNES-BLUHM-Mäuse

Für die bekannte starke Streuung der Leukozytenwerte, die den Wert der Maus als hämatologisches Untersuchungsobjekt sehr fraglich erscheinen lassen, wurden als Gründe ungleiche Zuchtbedingungen, Einflüsse des Geschlechts und Alters der Tiere, Parasiten usw. und die unterschiedliche Technik der Blutentnahme angegeben. Durch die Verwendung von Inzuchtmäusen (Stamm A G N E S BLUHM) und konstanten Zuchtbedingungen konnten die Störfaktoren weitgehend ausgeschaltet werden. Zudem wurden die für die Ermittlung des Normalstatus der weißen Blutzellen verwendeten Mäuse unmittelbar nach der Blutentnahme seziert und die Tiere mit pathologischen Befunden nicht in die Auswertung einbezogen. Die auffälligsten zytologischen Unterschiede der weißen Blutzellen der Maus gegenüber den menschlichen bestehen im Auftreten von ringkernigen granulozytären Jugendstadien. Weiterhin fehlen basophile Leukozyten im peripheren Blut der Maus. Betreffs Einzelheiten sei auf unsere eingehende Bearbeitung hingewiesen [5]. Die quantitative Leukozytenzählung in 3 Altersstadien zeigt die Tab. 1. Es ist zu ersehen, daß die Streuung der absoluten Leukozytenanzahlen relativ gering ist. Vergleicht man die Werte innerhalb der 3 Alters1«

4

F.

FEY

Stadien, so ist festzustellen, daß keine signifikante Differenz besteht. Es ist also anzunehmen, daß das Alter keinen wesentlichen Einfluß auf den absoluten Leukozytenwert hat. In der Tab. 2 ist die prozentuale Verteilung der weißen Blutzellen in 4 Altersstadien dargestellt. Es ist zu ersehen, daß im weißen Blutbild die kleinen Lymphozyten und die neutrophilen Leukozyten dominieren. Für diese beiden Gruppen wurden Tabelle 1 Q u a n t i t a t i v e Leukozytenzählung bei 3 Altersstadien von AB-Mäusen Anzahl der Leukozyten bei

N r . der untersuchten Tiere 1 2

3 4 5

6

7

8

9

10

5 Tage alten Mäusen

5 Monate alten Mäusen

8000 8000 8000 5000 7000 7000 8000 8000 12000 7000

8800 8300 9500 11500 9000 8500 7000

1 Jahr alten Mäusen 8750 9000

13500

7000 7500 8250 11000

53oo

9300 9500

Mittelwert

Mittelwert

Mittelwert

8670 ± 4 9 2 9285 ± 7 9 0 7800 ± 5 2 5 G e s a m t m i t t e l w e r t : 8585 ± 1 2 5 0

Tabelle 2 Prozentuale Verteilung der weißen Blutzellen in 4 Altersstadien Prozentuale Verteilung bei 4 Altersstadien

Weiße Blutzellen

5 Tage Jug. Neutr. II N e u t r . Leukoz. J u g . Eosinoph. I I Eos. Leukoz. Monozyten Kl. Lymphoz. Gr. Lymphoz. Kl. Retikulumz.

1

2—3 Monate 1

30,8+1,5

3 64,3 ± 1 , 4 1

13,1 ± 1 , 4 o,5 1 4,5 79,4 ± 2 o,5

4—6 Monate

1 Jahr

1 16,8 ± 1 , 6

1,5 22,8 ± 1 , 5

0,5 6 74,5±i,7 1,5

0,5

3

71,1 ± 1 , 8 o,5 1

die mittleren Fehler der Mittelwerte errechnet, die eine objektive Beurteilung der vorhandenen Streuung ermöglichen. Diese ist im Vergleich zu anderen Inzuchtstämmen [3] sehr gering. Im Hinblick auf die relativen Leukozytenwerte innerhalb der einzelnen Altersstufen treten spez. bei den neutrophilen Leukozyten erhebliche Unterschiede auf, die nach 3 a statistisch gut gesichert sind, mit Ausnahme der Differenz zwischen

Pathogenese der durch zellfreie Tumorfiltrate erzeugten Leukämien

5

den Werten 2—3 Monate zu 4—6 Monaten, bei denen sich keine eindeutige Signifikanz ergab. Die Monozyten erscheinen weitgehend indifferent. Zusammenfassend läßt sich zu den Untersuchungen zur Ermittlung des normalen Blutstatus der weißen Blutzellen sagen, daß unter Anwendung geeigneter Methoden die bekannte große Streuung herabgesetzt werden kann. Das Alter der Tiere hat keinen wesentlichen Einfluß auf die absolute Anzahl, wohl aber auf den relativen Leukozyten wert. Ein Normalwert für letzteren läßt sich nur für ein bestimmtes Altersstadium angeben. b) Charakterisierung Leukämien

der nach Injektion

zellfreier Tumorfiltrate

induzierten

Durch hämatologische, histologische und zytologische Untersuchungen der nach Injektion zellfreier Sa I-Filtrate auftretenden Leukämien sowie durch Transplantationsversuche konnte nachgewiesen werden, daß es sich um echte Leukämien im Sinne von Neoplasmen handelt. Die nach dem makroskopischen Erscheinungsbild in Chloroleukämien, Leukämien mit gelblicher Verfärbung der Lymphknoten und Leukämien ohne Verfärbung der Lymphknoten eingeteilten Leukämien wurden als unreifzellige (Paramyeloblasten-) bzw. reifzellige myeloische Leukämien klassifiziert. Daneben fand sich noch eine besondere Leukämieform, die vorwiegend intrathorakal lokalisiert auftrat. Da innerhalb dieser auch aleukämische Verlaufsformen nachgewiesen werden konnten, hielten wir es für zweckmäßig, in diesem Falle den Terminus „Leukose" zu verwenden. Die Gruppe der intrathorakal lokalisierten Leukosen ist durch das Auftreten bestimmter atypischer Zellformen charakterisiert und wurde als unreifzellige myeloische Leukose klassifiziert. Besondere Beachtung wurde der Abgrenzung der Leukämien gegenüber leukämoiden Reaktionen und myeloischen Metaplasien nach den Kriterien von B A R N E S und S I S M A N [ 1 ] gewidmet. Weiterhin konnte erwiesen werden, daß keine Beziehungen zwischen der Anzahl der im Blut auftretenden Leukozyten, dem Reifungsgrad der Granulozyten und dem Vergrößerungsgrad der leukämisch veränderten Organe bei den angeführten Leukämiegruppen bestand. Ebenso konnten Korrelationen zwischen dem absoluten und relativen Leukozytenwert des peripheren Blutes und dem Grad der Organinfiltrationen nicht wahrscheinlich gemacht werden. c) Untersuchungen zur Leukämogen'ese Wir gingen bei der Untersuchung zur Klärung der Leukämogenese nach Injektion einer leukämogenen Noxe in Form von zellfreien Tumorfiltraten der Maus von der Voraussetzung aus, das Erscheinungsbild der Leukämieentstehung im Blut nachweisen zu können. In diesem Zusammenhang interessierten uns besonders der Nachweis einer Anfangs-

6

F. Fey

•reaktion und der Zeitpunkt des Manifestwerdens der Leukämie im Blutbild. Da mit einer Initialreaktion zu rechnen war, haben wir in der ersten Phase nach der Injektion Blutentnahmen im Abstand von 5 Tagen vorgenommen. Im weiteren Verlauf wurde die Blutentnahme monatlich durchgeführt. In den graphischen Darstellungen Abb. 1—6 sind auf der Abszisse die Zeiten der Blutentnahme, auf der Ordinate die Prozentsätze der ermittelten relativen Leukozytenwerte aufgezeichnet. Um die Übersichtlichkeit zu wahren, haben wir nur 3 Zellgruppen kurvenmäßig dargestellt. Die erste Gruppe umfaßt die unreifen Granulozyten (Myeloblasten, Promyelozyten, Myelozyten und Jugendliche I), die zweite die Jugendlichen II und die reifen Granulozyten, während sich die dritte Gruppe aus kleinen und großen Lymphozyten zusammensetzt. 1. Kontinuierliche Blutuntersuchungen an Mäusen nach Injektion zellfreier Sa I-Filtrate. Neugeborenen AGNES-BLUHM (AB)-Mäusen wurden Dosen von 0,2 ml zellfreien Sa I-Filtrats subkutan appliziert und in den angegebenen Zeitpunkten nach der Injektion Blutuntersuchungen durchgeführt. unreife Granulozyten

B/uibefund nach Injektion von zellfreiem Sei- Filtrat

reife Granulozyten Lymphozyten

Vi i/3

5101520 1 -Tage—•—

2

3

*

5

Monate nach Injektion —

Abb. 1

In der Abb. 1 sind die Ergebnisse der Blutuntersuchungen an 3 Mäusen dargestellt. Bei allen drei Fällen ist übereinstimmend eine starke Initialreaktion festzustellen. Die normalerweise im Blut nicht auftretenden unreifen Elemente erreichen am 5. Tage nach der Injektion Werte von 28—30%. Sie fallen im Laufe der Initialphase, die den Zeitraum bis

Pathogenese der durch zellfreie Tumorfiltrate erzeugten Leukämien

7

einen Monat nach der Injektion umfaßt, allmählich auf 4 — 1 0 % ab. Die reifen Granulozyten sind am 5. Tage etwas vermehrt und stellen sich bis zum 20. Tage ungefähr auf den Normalwert ein. Am auffälligsten verhalten sich die Lymphozyten, die nur zu ca. 25% auftreten, gegenüber einem Normalwert von 64% im entsprechenden Alter. Der Prozentsatz nimmt im Laufe der Initialphase zu, erreicht aber den Normalwert nicht ganz. Innerhalb des Zeitraumes von 1—2 bzw. 3 Monaten ist das Blutbild dem Normalwert angenähert. Das Erscheinen der unreifen Formen läßt auf irreversible Vorgänge schließen, die sich bei der Initialreaktion abgespielt haben müssen. Nach 3—5 Monaten steigt die Anzahl der unreifen Granulozyten im Blutbild kontinuierlich an. Parallel damit fallen die Lymphozyten ab. Die reifen Granulozyten sind weitgehend indifferent. Zu einem bestimmten Zeitpunkt steigen plötzlich die unreifen Granulozyten rapide an und leiten damit die Terminalphase ein. Das Blutbild der Terminalphase setzt sich im typischen Falle fast ausschließlich aus unreifen granulozytären Elementen zusammen. Die Lymphozyten sind kaum noch nachweisbar. In den meisten Fällen sind auch die unreifen Leukozyten im Blutbild reduziert, vereinzelt ist ihre Anzahl jedoch auch erhöht. Aus der graphischen Darstellung ist ersichtlich, daß die Leukämogenese in 3 Phasen, Initial-, Intermediär- und Terminalphase verläuft. Zur Klärung der Frage der Spezifität des Reaktionsablaufes nach der Injektion zellfreier Tumorfiltrate haben wir dieselben Untersuchungen an Mäusen nach Injektion artfremden Serums vorgenommen. 2. Kontinuierliche Blutuntersuchungen an Mäusen nach Injektion artfremden Serums. Neugeborenen AB-Mäusen wurden Dosen von 0,2 ml Kaninchenserum subkutan appliziert und in den angegebenen Zeitpunkten nach der Injektion Blutuntersuchungen durchgeführt. In der Abb. 2 sind die Untersuchungsergebnisse von 3 Mäusen nach Injektion artfremden Serums dargestellt. Alle drei Fälle zeigen einen relativ gleichartigen Reaktionsverlauf, der sich grundsätzlich von dem bei Mäusen nach Injektion von Tumorfiltraten unterscheidet. Nur bei der Maus Ko 7 läßt sich eine geringe Primärreaktion erkennen, während bei den übrigen Fällen bestenfalls eine kleine Schwankung registriert werden kann. Im weiteren Verlauf stimmen die angegebenen Kurven annähernd mit den Normalwerten überein. Die Injektion artfremden Serums scheint jedoch zu einer geringen Systemalteration geführt zu haben, was im Auftreten von unreifen Zellformen im peripheren Blut zum Ausdruck kommt. Aus der vergleichenden Gegenüberstellung der Abb. 1 und 2 läßt sich ersehen, daß der sich im Blutbild darstellende Reaktionsverlauf nach Injektion von Tumorfiltraten bzw. heterologem Serum nicht durch eine Reaktion des Organismus gegenüber artfremdem Eiweiß be-

8

F. FE Y

dingt ist. Da nach der Injektion von heterologen Seren und Tumoren keine Leukämien erzeugt werden können-[7], [8], läßt sich demgemäß im Blutbild auch keine Intermediär- bzw. Terminalphase nachweisen. Weitere Untersuchungen zur Klärung der Initialreaktion sollen im folgenden beschrieben werden. Biutbéfunde von artfremdem

%

nach Serum

Injektion (Kaninchen)

K06

ao

- unreife Granulozyten • reife Granulozyten • Lymphozyten

60

w 20 0 % so

Ko 7/2

HO w 20

r-r-r-T—r-

0 %

Ko 1

BO

V

60

-•

W 10 0

1T 1 --r-

51015 20 1 —Tage—•—

2 —Monate

3 4 nach Injektion —

6

Abb. 2

3. Untersuchungen zur Charakterisierung der Initialphase der Leukämogenese. Nachdem wir anhand der graphischen Darstellungen 1 und 2 festgestellt haben, daß im ersteren Falle eine ausgeprägte, nach Injektion artfremden Serums nur eine sehr geringe Reaktion nachzuweisen war, haben wir zur Sicherung der Befunde weitere Experimente durchgeführt. Initialphase nach Injektion von homologem Embryonalbrei SO r

Kotta ...O

60

-•••

• unreife Granulozyten • reife Granulozyten - Lymphozyten

Kofib

0

KoTIC ...» ..-•'''

»

iO 20 0

5

—9-—9-10 15 20

30

5

10

15

20

30

- Tage nach Injektion — Abb. 3

tf--9—-6—iV-

S

10

15

20

30

P a t h o g e n e s e d e r d u r c h zellfreie T u m o r f i l t r a t e e r z e u g t e n L e u k ä m i e n

9

In der Abb. 3 sind die Ergebnisse der Blutuntersuchungen bei 3 Tieren nach subkutaner Injektion von 0,2 ml homologem Embryonalbrei dargestellt. Aus dem Kurvenverlauf ist ersichtlich, daß auch bei diesem Versuch keine eindeutige Primärreaktion in Erscheinung tritt. Das zwar geringe, aber in allen 3 Fällen nachweisbare Auftreten von unreifen Blutzellen stimmt mit den Befunden überein, die an mit artfremdem Serum behandelten Tieren erhoben wurden. - unreife Granulozyten • reife Granulozyten • Lymphozyten KlZc

Initialphase nach Injektion von inaktiviertem SalFiltrat Ko 12 . _a

I

s

10 15 20

30

5

10

15

20

30

- Tage nach Injektion -—

5

10

15

20

Abb. 4

In einer weiteren Versuchsanordnung behandelten wir neugeborene AB-Mäuse mit Sa I-Filtrat, welches durch Erhitzen auf 65° C während einer halben Stunde inaktiviert worden war. Aus der Darstellung Abb. 4 ist zu ersehen, daß sich in diesen 3 Fällen eine schwache, aber deutliche Initialreaktion im Blutbild bemerkbar macht. Der Prozentsatz der unreifen Blutzellen ist gegenüber den Serum- und Embryonalbrei-Versuchen erhöht, kommt aber nicht annähernd an den Wert heran, der bei VerInitialphase nach Injektion von zellfreiem Sal-Filtrat 80 •

Wr

A3 n

• unreife Granulozyten • reife Granulozyten •• Lymphozyten 39 n

60 •

•

20 • 10 15 20

5 10 15 20 30 — Tage nach Injektion —

51015

20

30

Abb. 5

suchen mit aktivem Sa I-Filtrat erreicht wurde. Die reifen Leukozyten verhalten sich weitgehend indifferent, während bei den Lymphozyten anfangs ein geringes Abfallen unter den Normalwert unverkennbar ist. Zur Festigung der Befunde, die sich bei Injektion von zellfreien Tumorfiltraten in der Initialphase ergaben, führen wir noch 3 weitere Fälle derselben Versuchsanordnung an (Abb. 5). Der erste Fall zeigt das typische Bild der Initialreaktion, wie es bei den vorhergehenden analogen Versuchen in Erscheinung trat, während die beiden anderen Fälle zwei Abweichungsformen charakterisieren, wie sie zum Teil bei unseren Ver-

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suchen vorkamen. Bei der Maus 43 n ist der Prozentsatz der unreifen Leukozyten relativ gering, dagegen der Prozentsatz der reifen stark erhöht. Das Blutbild des Tieres 39 n zeigt demgegenüber ein sehr starkes Auftreten unreifer Granulozyten, die bei der nach 5 Tagen erfolgten ersten Untersuchung die Anzahl der reifen Leukozyten und die der Lymphozyten überstiegen. Der absolute Leukozytenwert vergrößert sich in der Initialphase nicht wesentlich. Die Schwankungen liegen innerhalb der biologischen Streuung. 4. Die Intermediärphase der Leukämogenese und das Manifestwerden der Leukämie im Blutbild. Aus den graphischen Darstellungen der Abb. 1 ist ersichtlich, daß die Primärreaktion ungefähr einen Monat nach der Injektion abklingt. Diesen Zeitpunkt betrachten wir als Beginn der Intermediärphase. Die Dauer der Intermediärphase ist individuell verschieden. Sie wird beendet durch das plötzliche starke Ansteigen der unreifen Zellen im peripheren Blut, verbunden mit einer meist rapiden Zunahme der absoluten Leukozytenwerte, die den Beginn der Terminalphase anzeigen. Das Blutbild innerhalb der Intermediärphase ist anfangs, außer den in einem gewissen Prozentsatz vorhandenen unreifen Granulozyten, annähernd normal. Auch die absoluten Leukozytenwerte sind im Höchstfalle nur wenig über die Norm erhöht. Fortschreitend läßt sich jedoch eine meist geringe, aber kontinuierliche Zunahme der unreifen Leukozyten und eine Abnahme der Lymphozyten beobachten. In diesem Stadium manifestiert sich die Leukämie im Blutbild. Wir haben Tiere 2 und 3 Monate nach Injektion zellfreier Tumorfiltrate abgetötet und die Organe histologisch untersucht. Es konnte festgestellt werden, daß das Knochenmark aller untersuchten Tiere eine merkliche Linksverschiebung im Reifegrad der Granulozyten zeigt. Die Milz war in allen Fällen vergrößert, die Follikel enthielten meist noch funktionierende Keimzentren. In der Pulpa waren alle Granulozytenstadien in der normalen Anzahl anzutreffen. Die Lebern zeigten in 5 Fällen eine beginnende perivaskuläre Infiltration. An den Lymphknoten fiel makroskopisch eine verstärkte Gefäßversorgung auf. Histologisch war eine fortschreitende Atrophie der lymphatischen Keimzentren und eine Einwanderung von vorwiegend unreifen Granulozyten mit einer primär perivaskulären Infiltration festzustellen. Die Lymphknoten waren zum Teil etwas vergrößert. 4—5 Monate nach der Injektion sind die Lymphknoten bei leukämischen Tieren fühlbar vergrößert und stellen damit ein relativ sicheres Kriterium für das Vorliegen einer Leukämie dar. 5. Die Terminalphase In der Abb. 7 sind 5 Fälle angeführt, die den Übergang von der Intermediärphase in die Terminalphase darstellen. Gut übereinstimmend ist das Verhalten der Lymphozyten, deren enorm starkes Absinken aus den

Pathogenese der durch zellfreie Tumorfiltrate erzeugten Leukämien

H

graphischen Darstellungen der Abb. 1 und 6 hervorgeht. Mit Ausnahme der Fälle 7 a/2 und 29 s/i werden die reifen Leukozyten auch weitgehend zurückgedrängt. Das Blutbild wird fast ausschließlich von unreifen Granulozyten bestimmt. Nur im Falle 29 s/i dominieren die reifen Terminalphase nach Injektion von zellrreiem Sal-Filtrat 7 a/2

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Abb. 6

Leukozyten. Entwicklungsstadien von Erythrozyten wurden selten im peripheren Blut des Finalstadiums gefunden. Die Tiere wurden vor Eintreten des exitus letalis abgetötet, so daß in vielen Fällen der finale Myeloblastenschub nicht erfaßt sein dürfte. Diskussion Anhand der beschriebenen Versuchsanordnungen konnten wir feststellen, daß die Reaktion des Organismus auf die Injektion des leukämogenen Agens ihren Ausdruck im Differentialblutbild findet. Das Phänomen der Leukämieentstehung läuft in drei Phasen ab: Initialphase, Intermediärphase und Terminalphase. Es muß nun entschieden werden, ob die

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Initialreaktion eine spezifische Antwort des Organismus auf die leukämogene Noxe darstellt oder lediglich ein unspezifischer, reaktiver Vorgang ist. Die sich aus den Versuchen mit Fremdserum, homologem Embryonalbrei und inaktivem Tumorfiltrat ergebenden Befunde sprechen durch das Auftreten von unreifen Granulozyten bei diesen Versuchen in gewisser Weise gegen eine Spezifität. Da die Reaktion hier aber bedeutend geringer ist, kann man vermuten, daß den beschriebenen Kontrollversuchen tatsächlich eine, wenn auch geringgradige unspezifische Reaktion zugrunde liegt, die aber bei den Versuchen mit aktiven Tumorfiltraten durch eine stärkere, spezifische Reaktion überlagert wird. Für den primären Angriffspunkt des leukämogenen Agens ergeben sich Hinweise aus der Form der Reizbeantwortung. Auf Grund der Ausschwemmung unreifer granulozytärer Zellen, die unter physiologischen Bedingungen niemals auftritt, liegt die Schlußfolgerung nahe, daß in erster Linie das myeloische System alteriert ist; zudem das Knochenmark auch als erstes Organ histologisch nachweisbar geschädigt ist. Von K R A U S E [10] konnte erwiesen werden, daß in Knochenmarkkulturen nach Zugabe zellfreier Tumorfiltrate spezifische Zell- und Kernschädigungen in Form von Vakuolenbildungen, Störungen in der Anfärbbarkeit usw. auftraten. Das Manifestwerden der Leukämie läßt sich im Blutbild mit Ausnahme der aleukämisch verlaufenden Leukosen nachweisen. Innerhalb der Intermediärphase steigt die Anzahl der unreifen Granulozyten im Blut erheblich an, während die Lymphozyten beträchtlich reduziert werden. Zu diesem Zeitpunkt sind an inneren Organen, speziell Lymphknoten und Leber, leukämische Infiltrationen festzustellen. „Die buchtenreichen Gefäßräume der retikulär gebauten Gewebe bilden einen präformierten günstigen Lebensraum für die sich dort ansiedelnden tumorösen Blutzellen" [9]. Parallel damit setzt die Vergrößerung der Lymphknoten ein und der absolute Leukozytenwert nimmt zu. Nach den von uns erhobenen Befunden bezüglich des Reaktionsmechanismus der Leukämogenese nach Injektion zellfreier Tumorfiltrate kommen wir zu folgender Vorstellung. Das injizierte leukämogene Agens löst im Organismus immunobiologische Prozesse aus [2], [11] und bildet (oder enthält ?) den Serumfaktor, der die leukämoide Ausschwemmung unreifer. Knochenmarkzellen veranlaßt. Diese Reaktion tritt im peripheren Blut als Initialphase in Erscheinung. Da auch nach Injektion von inaktivierten Filtraten und Fremdseren sich eine geringe Ausschwemmung zeigt, muß angenommen werden, daß diese Reaktion zum Teil unspezifisch verläuft. Parallel dazu muß im Knochenmark das leukämogene Agens die granulozytären Keimzentren in spezifischer Weise angreifen und deren allmähliche neoplastische Umwandlung bewirken. Der Vorgang läuft nach Abklingen der Initialphase und zu Beginn der Intermediärphase ab. Er äußert sich in der Abgabe weniger unreifer granulozytärer Zellen mit teilweise eindeutig infiltrativer Wachstumspotenz, die sich in verschiedenen Organen, wie Milz, Lymphknoten und Leber in

Pathogenese der durch zellfreie Tumorfiltrate erzeugten Leukämien

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Form von Metastasen ansiedeln. Es konnte gezeigt werden, daß bereits 2 Monate nach der Injektion in diesen Organen invasible Zentren nachweisbar sind. Das Knochenmark ist in dieser Zeitspanne alteriert, was durch eine merkliche Linksverschiebung im Myelogramm zum Ausdruck kommt. In der Milz und in den Lymphknoten setzt eine starke Proliferation der metastasierenden Zellen ein, was zu einer Verdrängung und Atrophie der lymphatischen Keimzentren führt. Vor dem Einsetzen der Terminalphase sind die lymphatischen Organe weitgehend myeloisch umgewandelt und in der Leber, Lunge, Niere usw. umfangreiche Infiltrationszentren nachzuweisen. Das Knochenmark enthält fast ausschließlich unreife, mit Merkmalen neoplastischer Umwandlung ausgestattete Zellen. Die Leukämie ist zu dieser Zeit auch im Blut manifest geworden. Je nach der Resistenz kommt es früher oder später zum Zusammenbruch der Abwehrfunktion des Organismus. Dieser Zeitpunkt leitet die Terminalphase ein, in deren Verlauf das Individuum an der Leukämie zugrunde geht.

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Summary Hematological and histological investigations were carried:outin;order to clarify the pathogenesis of leucemias of the mouse which arise after injection of cell-free tumor filtrates. These leucemias were classified as myelotic leucemias characterised by immature (paramyeloblasts) and mature cells and as leucoses with immature cells localised intrathoracally. Comparable values for the investigation of leucemogenesis at various age stages were obtained in normal untreated mice for the inbred AgnesBluhm stock which was used in all experiments. B y means of blood samples taken at various intervals after injection of cell-free tumor filtrates it was possible to follow the course of leucemogenesis. The specificity of the course of reaction was investigated by means of control experiments after injection of heterologous serum, homologous embryo homogenate and heat-inactivated mouse tumor filtrate. The leucemogenesis takes place in 3 phases. The initial phase is characterized by a strong increase of immature granulocytous cell forms which do not appear in the

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F . FEY

blood picture of n o r m a l mice. W i t h i n t h e intermediary phase only few cells with infiltrative growth capacity are a t first set free which increaringly cause infiltration of organs a n d destroy t h e l y m p h a t i c centers. T h e terminal phase is initiated b y i m m a t u r e granulocytes in t h e blood. I n its course t h e typical picture of leucemias in seen. A working hypothesis for leucemogenesis is discussed.

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Acta biol. med. germ!, Band 1, Seite 15—31 (1958) Aus dem Institut für Medizin und Biologie der Deutschen Akademie der Wissenschaften, Berlin-Buch, Arbeitsbereich Biologie (Direktor: Prof. Dr. A. G R A F F I )

U n t e r s u c h u n g e n zur C h a r a k t e r i s i e r u n g der d u r c h zellfreie T u m o r f i l t r a t e erzeugten L e u k ä m i e n der M a u s F. F e y

(Eingegangen am 30. 7. 57)

Zusammenfassung Durch hämatologische, histologische und zytologische Untersuchungen der nach Injektion zellfreier Sa I-Filtrate auftretenden Leukämien konnte nachgewiesen werden, daß es sich um echte Leukämien im Sinne von Neoplasmen handelt. Die nach dem makroskopischen Erscheinungsbild in Chloroleukämien, Leukämien mit gelblicher Verfärbung der Lymphknoten und Leukämien ohne Verfärbung der Lymphknoten eingeteilten Leukämien wurden als unreifzellige (Paramyeloblasten-) bzw. reifzellige myeloische Leukämien klassifiziert. Die Gruppe der intrathorakal lokalisierten Leukosen ist durch das Auftreten bestimmter atypischer Zellformen charakterisiert und wird als unreifzellige myeloische Leukose klassifiziert. Es bestehen keine Beziehungen zwischen der Anzahl der im Blut auftretenden Leukozyten, dem Reifungsgrad der Granulozyten und dem Vergrößerungsgrad der leukämisch veränderten Organe bei den angeführten Leukämiegruppen. Ebenso konnten Korrelationen zwischen dem absoluten und relativen Leukozyten wert des peripheren Blutes und dem Grad der Organinfiltration nicht wahrscheinlich gemacht werden. Einleitung In früheren Mitteilungen berichteten wir über gehäuftes A u f t r e t e n v o n L e u k ä m i e n bei der M a u s n a c h I n j e k t i o n zellfreier F i l t r a t e a u s v e r s c h i e d e n e n t r a n s p l a n t a b l e n M ä u s e t u m o r e n [11], [12], [13], [7]. I m R a h m e n dieser A r b e i t sollen d a s h ä m a t o l o g i s c h e u n d histologische E r s c h e i n u n g s b i l d der L e u k ä m i e n d a r g e s t e l l t u n d die sich d a r a u s e r g e b e n d e n H i n weise f ü r eine K l a s s i f i z i e r u n g a u s g e w e r t e t w e r d e n . D u r c h orientierende V o r u n t e r s u c h u n g e n h a t t e n wir festgestellt, d a ß es sich bei den i n d u z i e r t e n L e u k ä m i e n w a h r s c h e i n l i c h u m solche der m y e l o i s c h e n R e i h e h a n d e l t [11]. Z u r Z e i t liegen n u r w e n i g e M i t t e i l u n g e n ü b e r die r e l a t i v seltenen m y e loischen L e u k ä m i e n der M a u s v o r [6], i m G e g e n s a t z z u denen der l y m p h a t i s c h e n R e i h e , die w e s e n t l i c h besser erforscht sind [10], [15], [16], [18]. E s ist a l l g e m e i n b e k a n n t , d a ß eine K l a s s i f i z i e r u n g der L e u k ä m i e n bei M ä u s e n auf erhebliche' S c h w i e r i g k e i t e n s t ö ß t . Sehr k o m p l i z i e r t ist a u c h

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F. F E Y

die Abgrenzung myeloischer Leukämien gegenüber reaktiver extramedullärer Hämatopoese und leukämoiden Reaktionen [3]. Zur Klärung des Erscheinungsbildes der Leukämien wurden vergleichende Untersuchungen von Ausstrichen, Tupfpräparaten und Organschnitten vorgenommen, und der cytologischen Diagnostik in bezug auf Morphologie, Reifungsgrad und Merkmalen maligner Umwandlung besondere Bedeutung beigemessen. Wir sind uns bewußt, daß trotz Beachtung aller Kriterien die Klassifikation der Leukämien nicht absolut sein kann und weitgehend von der Interpretation des Untersuchers abhängt, wie es auch D U N N [6] erwähnt. Material und Technik 1. Tumormaterial: Zur Filtratherstellung benutzten wir den Tumor Sa I in Aszitesform [12], [13]. 2. Herstellung des Tumorfiltrates: Das zellfreie Tumorfiltrat wurde nach den in früheren Mitteilungen [11], [12], [13] eingehend beschriebenen Aufarbeitungsmethoden bereitet (doppelte Filtration der Homogenatüberstände in Ringer-Lösung im Verhältnis 1:10 durch G4-Filter). 3. Tiermaterial: Die Tumorfiltrate wurden neugeborenen Mäusen des Inzuchtstammes A G N E S BLUHM (AB), dessen spontane Leukämiequote unter 1 % liegt, subkutan unter die Nackenhaut in Dosen von 0,1 ml appliziert. Die injizierten Neugeborenen wurden von ihren Müttern aufgezogen und vor Eintritt der Geschlechtsreife nach Geschlechtern getrennt. Leukämien traten bei ca. 50—60% der behandelten Tiere nach einer Latenzzeit von 7—8 Monaten auf. Tiere mit makroskopisch eindeutigen Leukämiebefunden (vergrößerte Lymphknoten und Milz) und entsprechendem Blutbild wurden durch zerebrale Dislokation abgetötet. 4. Blutentnahmen: Das Blut wurde durch Kupieren der Schwanzspitze mittels Scherenschlag aus den Schwanzgefäßen entnommen. Mehrmalige Blutentnahmen wurden in einem Mindestintervall von 5 Tagen vorgenommen, da Blutentnahmen in kürzerer Folge nach S C H Ä F E R [23] oft eine Leukozytose hervorrufen. 5. Quantitative Leukozytenzählung: Sie erfolgte mit den in der Humanmedizin gebräuchlichen Leukozytenpipetten. 6. Differentialzählung der weißen Blutzellen: Die Ausstriche wurden mit Hilfe eines geschliffenen Objektträgers ausgeführt und nach Lufttrocknung nach M A Y - G R Ü N W A L D - G I E M S A ( P A P P E N H E I M - U N N A ) gefärbt. An Parallelausstrichen wurde die Peroxydasereaktion nach S A T O ausgeführt. Die Differenzierung erfolgte bei goofacher Vergrößerung (Ok. 10, Objekt. 90, Z E I S S ) . 7. Differentialzählung der weißen Knochenmarkzellen: Zur Untersuchung der Knochenmarkelemente erwies sich das Femurmark am geeignetsten. Das in Form eines Tröpfchens austretende Mark wurde auf Objekt-

Charakterisierung der durch zellfreie Tumorfiltrate erzeugten Leukämien

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2 6

Tod im Vers.

Sichere Differenzen in der Mortalität der einzelnen Serien ergaben sich nicht. Die Versuchsprotokolle sind im einzelnen in Inaugural-Dissertationen von T E I C H M A N N , Berlin 1956 und S C H U L Z K E , Berlin 1957, niedergelegt. 2. Histologische Befunde Die histologischen Befunde beider Serien werden in zahlenmäßiger Übersicht in Tab. 1 wiedergegeben, außerdem in Abb. 1 und 2 in graphischer Darstellung unter Berücksichtigung der prozentualen Aufgliederung nach Schweregraden. In der Mandelatgruppe, die histologisch das Bild einer schweren Nephritis-Nephrose bietet, sind zwischen behandelten und unbehandelten Nephritistieren keine signifikanten Unterschiede bei gleich hoher Mortalität festzustellen. Die Normaltiere, die Mandelat erhalt en hatten, bieten keine sicheren pathologischen Nierenveränderungen.

Nierenveränderungen durch Mandelat und Hexamethylentetramin

45

In der Hex.-Gruppe, in der eine mittelschwere Nephritis bei der Kontrollserie (B II) vorliegt, sind in der Behandlungsserie (B I) deutlich stärkere Ausprägungen sowohl der glomerulären als auch der tubulären Veränderungen nachweisbar. Auch die mit Hex. behandelten Normaltiere (B III) weisen in der Mehrzáhl mittelschwere glomeruläre Veränderungen mit stärkerer Hyperämie der Kapillarschlingen sowie tubuläre Veränderungen, vor allem Erweiterungen und vereinzelt auch Verfettungen auf. Diskussion Die Dosierung des Mandelats bei unseren Versuchen entspricht den in der Klinik üblichen Dosierungsvorschriften. Es wurde also, ähnlich wie in den anderen Serien, vermieden, den Versuchstieren höhere, über das therapeutische Maß hinausgehende Dosen zu verabfolgen. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, daß das Mandelat bei Normaltieren im Nierenparenchym keine sicheren Veränderungen hervorruft im Gegensatz zu unseren Ergebnissen in den Sulfonamid-Serien und der Terramycin-Serie [i i] u. [i 1 a]. Das Mandelat wirkt also bei Normaltieren unter unseren Versuchsbedingungen in geringer Dosierung nicht toxisch. Der Krankheitsverlauf, die Blutdruckwerte, die Harnbefunde und die histologischen Ergebnisse wurden bei den Nephritisserien durch Mandelatgaben nicht beeinflußt, so daß auch bei entzündlich vorgeschädigtem Nierengewebe eine toxische Einwirkung nicht zu konstatieren ist. In der uns zugänglichen Literatur konnten wir keine speziellen Hinweise auf die Wirkung von Mandelat auf Nieren bei experimenteller Nephritis finden. H E L M H O L Z und O S T E R B E R G [8] fanden bei exzessiv hohen Mandelatgaben im Rattenexperiment bei Normaltieren Nierenschädigungen und Todesfälle. In der klinischen Literatur wird übereinstimmend eine gute Verträglichkeit und geringe Toxizität von Mandelat bei Pyelitiden hervorgehoben (K A S S [1 o], S C H Ö L T E N [21], v. W E R Z [20], M E Y RAN [15]), während vor der Anwendung bei Nierenparenchymschäden z . T . gewarnt wird ( E I C H H O L T Z [6], A L K E N [ 1 ] , C O O K und B U C H T E L [4], K A P P E L [9], K U N S T M A N N [13]). Nach unseren experimentellen Untersuchungen wäre jedoch bei normaler therapeutischer Dosierung auch beim Vorliegen von Parenchymerkrankungen mit stärkeren toxischen Nebenwirkungen nicht zu rechnen, vorausgesetzt, daß die Diurese keine starke Einschränkung aufweist. Die Ergebnisse der Hex.-Gruppe zeigen im Gegensatz zu denen der Mandelatgruppe deutliche toxische Wirkungen des Medikaments, obwohl wir uns in unseren Experimenten an die in der Klinik üblichen Dosen hielten. Schon bei Normaltieren waren, ohne daß Veränderungen im allgemeinen Verhalten und in den Blutdruckwerten auftraten, im Harn eine leichte Eiweißausscheidung sowie im Sediment vereinzelt Leukozyten und Erythrozyten vorhanden. In den Nephritisserien lag zwar kein wesentlicher Unterschied im allgemeinen Verhalten der Tiere, in den Gewichtskurven und in der Freßlust vor, die statistische Auswertung der Blutdruckwerte

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A. KRAUTWALD,

H . DÜTZ,

K.

VOIGT

zeigte jedoch nach dem 10. Versuchstag ein signifikant langsameres Absinken der Blutdruckkurve bei der mit Hex. behandelten Serie (vgl. Abb. 3), so daß diese am 14. Versuchstag um 12 mmHg höher lag als die NephritisKontrollserie. Der Unterschied in den Harnbefunden im Sinne einer wesentlich stärkeren Albuminurie, Leukozyturie und Erythrozyturie bei der mit Hex. behandelten Serie war gleichfalls eindeutig. In bezug auf die Mortalität lagen keine sicheren Differenzen vor. Der Vergleich der histologischen Veränderungen zwischen beiden Nephritisserien bot eindeutig schwerere entzündliche glomeruläre Veränderungen bei der mit Hex. behandelten Serie, wobei besonders eine mäßig starke Hyperämie auffiel, ebenso fanden sich bei dieser Serie in wesentlich größerer Zahl tubuläre Erweiterungen. Bei statistischer Überprüfung ist dieser Unterschied signifikant (mit einer Wahrscheinlichkeit von 99%). Sichere Unterschiede in der Ausprägung sonstiger degenerativer tubulärer Veränderungen und Verfettungen waren nicht vorhanden. Die schwereren morphologischen Veränderungen an Glomerula und Tubuli bei der mit Hex. behandelten Nephritisserie erklären die im klinischen Verlauf beobachtete länger andauernde Hypertonie sowie die wesentlich stärker ausgeprägten pathologischen Harnbefunde bei dieser Serie gegenüber der unbehandelten Nephritis-Kontrollserie. Man kann also sowohl im klinischen als auch im morphologischen Bild eine eindeutige ungünstige Beeinflussung der experimentellen Nephritis durch die Gaben von Hex. bei einer im klinisch-therapeutischen Bereich liegenden Dosierung feststellen. Aber auch bei den Normaltieren fallen bereits leichte pathologische Harnbefunde auf, die ihr mophologisches Substrat bei der histologischen Auswertung in deutlichen glomerulären und tubulären Veränderungen finden. Auch hier bestand eine Hyperämie der Glomeruluskapillaren. Diese bei den Normaltieren zum Ausdruck kommenden Veränderungen zeigen ähnlichen Charakter wie die bei Anwendung von Sulfonamiden und Terramycin gefundenen toxischen Nierenparenchymschäden, sind also im Sinne einer Glomerulonephrose und einer toxischen Tubulusschädigung zu deuten. In der Literatur finden sich keine Angaben über die Wirkung von Hex. im Tierexperiment auf vorgeschädigtes Nierenparenchym. Seltsamerweise liegen auch nur ganz vereinzelte Mitteilungen über die morphologischen Auswirkungen von Hex. auf die Nieren von Normaltieren vor, obwohl dieses Mittel wegen seiner bakteriziden Wirksamkeit schon seit Jahrzehnten eine ausgedehnte klinische Anwendung findet. Die LD 50 wird von L A N G E C K E R [14], die sich in einer neueren Arbeit eingehend mit der Verteilung des Hex. im Organismus beschäftigt, für Ratten mit 9,2 g/kg i. v. angegeben. N I C O L A I E R [16] beschreibt beim Hund bei einer Dosierung von 12 g/die das Auftreten einer Hämaturie. Bei Kaninchen wird bei Gabe von log/die eine Albuminurie gefunden ( B A R D E T [2]). F L E I G [7] sah in Hundeversuchen nach. Hex.-Gabe einen Blutdruckanstieg und eine

Nierenveränderungen durch Mandelat und Hexemethylentetramin

47

Konstriktion der Nierengefäße. Die toxischen Wirkungen des Hex. sind auf eine Abspaltung von Formaldehyd zurückzuführen ( T R E N D E L E N B U R G [18]), die nach den Untersuchungen von S O L L M A N N [17] und L A N G E C K E R [14] in der Niere in Abhängigkeit vom p H des Harns erfolgt. S C H R E Y E R [18] konnte in Hundeversuchen bei i. v. Urotropingaben glomeruläre entzündliche Erscheinungen und tubuläre Epitheldesquamationen bei starker Hyperämie der Glomerula und Hämorrhagien in den Tubuli nachweisen, er beobachtete auch bei Pat., die wegen Meningitis mit höheren i. v. Dosen von Urotropin behandelt wurden, neben dem Auftreten einer hämorrhagischen Cystitis entzündliche Reizerscheinungen seitens der Nieren. In der klinischen Literatur finden sich auch sonst schon früh Hinweise auf das Auftreten von Hämaturie und Albuminurie bei länger dauernder Anwendung von Hex. (Biss [3], K U L I T Z K Y [12], N I C O L A I E R [16]). In der neueren Literatur warnt D É R O T [5] vor der Anwendung von Hex. bei Nephritiden. Nach unseren experimentellen Ergebnissen und auf Grund der klinischen Literatur ist die Anwendung von Hex. als Harnwegsdesinfiziens oder als Diurectium wegen seiner toxischen Wirkungen sowohl auf normales als auch vor allem auf entzündlich verändertes Nierenparenchym abzulehnen, um so mehr als jetzt wirksamere und unschädlichere Chemotherapeutika bei bakteriellen Infektionen zur Verfügung stehen. Literatur [1] A L K E N , C. E. und B. W E B E R : Dtsch. med. Wschr. 8 0 , 1833 (1955). [2] B A R D E T , G. : zit. nach N I C O L A I E R , A. : Zschr. klin. Med. 3 8 , 350 (1899). [3] Biss, M. A . : Edinb. Med. J. Oktober 1902. [ 4 ] C O O K , E . N . und H . A. B U C H T E L : J.Amer. Med. Assoc. 1 0 7 , 1673, 1799 (1936). [5] D É R O T , M . , M . M I O C Q U E und G . L A G R U E : Traitement des Néphrites aiguës. Paris 1955: G. Doin & Cie. [6] E I C H H O L T Z , F. : Lehrbuch d. Pharmakologie. Berlin 1951 : Springer, S. 420, 425. [7] F L E I G , C . : Compt. rend, de la Soc. de Biol. 63, 401 (1907). [8] H E L M H O L Z , H . F . und A . E . O S T E R B E R G : zit. nach E . N . C O O K und H . A . BUCHTEL.

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H . DUTZ,

HEFFTER:

K .

VOIGT

Handb. d. exp. Pharmakologie

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He

0Ka3biBaeT

HHKaroro

BJIHHHHH

Ha

KJIHHHHCCKHH

jieHiie K p o B H , Ha aHaJiH3 MOHH H Ha RNCTOJIORHIECKHII pHTa.

TAK>KE

H

y

3nopoBbix

Ha

naB-

BHH THHtejioro

XOH,

He-

W K H B O T H H X H e B H H H O n p n T O H H7 1,3 O.7 O,9 O,7

1,1

p. d. 2 mg F H

Prot. Nr.

QO 2

Q° 2

—14,6 —10,8 —12,3

0

93 98

100 101

6 mg FH 6 „ „ 6

„

„

6

„

„

—13.9

Mittelwert: —12,9 103 2 mg FH

QNA

0

4.0

8,0

0

10,0

0

QO 2

OP*

—10,5 —10,2 —14,0 — 9,9 —14,6 —11,8 — 7,2 — 6,7

O

0 0

1.4 3.5 1,0 2,8 2,9

0 0 : 0

2,3 1,6 3,2

— 7,o

0

2,4

O . O

0,9

C: 3. Tag p. op. Dosis

B : 2. Tag p. op. Prot. Dosis Nr. 2 mg F H 85 86 2 ,, 2 ,, 91 2 ,, 92 2 ,, ,, 97 Mittelwert: 119 4 mg FH 120 4 „ .. Mittelwert:

9.9

8,0

0

D: 6. Tag p. op. p. d. 2 mg FH Prot. QO Dosis QO2 Nr. 121 12 mg FH —12,5 O 8,5 122 12 ,, 9,2 O 6,7 123 12 ,, —11,1 10,3 O —12,1 124 12 ,, O Mittelwert: —11,9 8,7 2

7.2 7.0 7.4

.6,8 6.3

Mittelwert: E : 8. Tag p. op. Prot. Nr. 125 126 127

Dosis

7,o p. d. i mg FH Qoa

16mg F H —13.6 16 „ „ —13.3 16 „ „ —12,5 Mittelwert: —13.1

F : 11. Tag p. op.

0°* »M

QN.

O

7,9

0,6

1,0

4,o 4,4

°,5

5,4

G: 12. Tag p. op. p.d. 10 mg FH Prot. QO Dosis Qoj Nr. 120mg FH —12,0 O 153 5,0 O 154 120 ,, ,, — 9 , 7 3,0 !

Mittelwert: —10,9

O

4.0

Prot. Nr. 145 146 147 148

Dosis

151 152

Qo,

CA »M

22mg FH —10,7 22 ,, —10,4 22 ,, —10,0 22 ,, —10,3

0,8 1,8 o,3 2,2

Mittelwert: —10,3

1,3

H: 20. Tag p. op. Prot. Nr.

p. d. 2 mg FH

Dosis

3,5 7,0 6,9 7,5 6,2

p. d. 2 mg FH QO2

40 mg FH —10,8 40 „ „ — 9,5 Mittelwert: —10,2

Q02

QN°

1,5 1,4

9.0 9.7

i,5

9,4

Stoffwechsel wachsenden Lebergewebes

57

Auch die anaerobe Glykose wurde in Kästchengefäßen mit einem Flüssigkeitsvolumen von 3,0 ml gemessen. Versuchsflüssigkeit und Gasraum enthielten 5 Vol.-% C 0 2 und 95 Vol.-% Stickstoff. Zusammensetzung der bikarbonat- und glukosehaltigen Ringerlösung nach 0. WARBURG: 96 ml 0,154 mol. NaCl-, 2 ml 0,154 mol. KCl-, 2 ml 0,11 mol. CaCl2-, 20 ml 0,155 m ° l - NaHC0 3 - und 2,4 ml io%ige GlukoseLösung. Die Lösung wurde mit 5 Vol.-% C0 2 durch Einleiten der Versuchsgasmischung gesättigt. Die Druckänderungen wurden in der Regel alle 15 Minuten über die Zeit von einer Stunde abgelesen. Hingewiesen sei auf die allen erfahrenen Untersuchern seit langem bekannte Tatsache, daß die anaerobe Glykose häufig auch schon während der ersten vier Ablesungen einen Abfall aufweist. Die ersten Ablesungen entsprechen dann der wahren Druckänderung. Anschließend wurden die Gewebeschnitte in destilliertem Wasser kurz gespült und bei 105° C bis zur Gewichtskonstanz eine Stunde lang getrocknet. Die manometrisch gemessenen Druckänderungen wurden auf gleiche Gewichtsmengen umgerechnet und aus den so korrigierten Druckänderungen die Mengen an verbrauchtem Sauerstoff und entstandenem Kohlendioxyd in bekannter Weise errechnet. Ergebnisse Die Ergebnisse unserer Untersuchungen sind in den Tab. 1, 2 und 3 aufgeführt. An jeder Leber erfolgte die Bestimmung der anaeroben Glykolyse Qjjmehrfach. Das hierzu notwendige Untersuchungsmaterial wurde aus verschiedensten Gewebeschichten der Leber gewonnen. Trotz dieser Verschiedenheit des Untersuchungsmaterials sind die Werte für die anaerobe Glykolyse innerhalb jeder einzelnen Leber ähnlich. In früheren Untersuchungen wird die anaerobe Glykolyse der normalen Rattenleber mit Q^" = 0,6 bis Q£Jz = 3,3 angegeben. [41] Unsere Werte hierfür sind QJJ2 = 0,7 bis 5,9. Im Mittel beträgt Qjj2 = 3,3. Nach partieller Hepatektomie fanden wir im Mittel am 1. Tag p. op. Q]J« = 1,4, am 2. Tag 3,2, am 3. Tag 8,8, am 4. Tag 9,6, am 5. Tag 8,1, am 7. Tag 8,1, am 10. Tag 7,0, am 20. Tag 10,5, am 25. Tag 9,4, am 30. Tag 9,3 und am 40. Tag 8,3. Die Werte für die anaerobe Glykolyse sind damit am l . T a g p. op., also zur Zeit einer ersten Massenzunahme der wachsenden Leber unter Volumenvergrößerung des Cytoplasma, des Kernes und des Kernkörperchens, der massiven Fetteinlagerung und besonders bevor eine mitotische Aktivität in Gang kommt eindeutig herabgesetzt. Mit Einsetzen des eigentlichen, oben beschriebenen Wachstumsprozesses vom 2. Tag p. op. an, eingeleitet durch das Auftreten von Mitosen, steigt die anaerobe Glykolyse charakteristisch an, erreicht am 2. Tag wieder die

58

W , ESCHBACH, R . H A N K E

Werte der normalen Leber und ist vom 3 . — 4 0 . Tag p. op. um 1 0 0 — 2 0 0 % gesteigert. Für die normale Leber betragen die Atmung Q0z = —9,2 und die aerobe Glykölyse QJ = 1,1. Nach partieller Hepatektomie sind am l.Tag p. op. Q0z — 1 0 , 1 , 0, am

2. T a g

Q0i —9,9,

QO2 — 1 2 , 0 ,

1,0,

Q£2 o, a m 3 . T a g

am

20.

Q°* 3 . 1 . a m 3 0 . T a g Q 0 i — 1 2 , 6 ,

a m 4 0 - T a g QQ2 — 1 0 , 6 ,

Q0, — 1 2 , 6 ,

Tag Q0a — 1 0 , 0 ,

Q°* 1 , 3 ,

am

1,3,

3 . 3 , a m 3 5 . T a g Q0i

10. Tag

am

—11,1,

Tag Q0i

25.

— 1 0 , 9 , Q°« 0,9 und

1,9.

Die Werte der Atmung und der aeroben Glykölyse der wachsenden Leber bleiben damit vom 1 . — 4 0 . Tag p. op. im Bereich für die normale Leber. Die Ergebnisse unserer Untersuchungen mit dem Ziel, den aeroben oder anaeroben Stoffwechsel der Rattenleber durch Oestradiolbenzoat zu beeinflussen, sind in allen Einzelheiten in der Tab. 3 dargestellt. Eine signifikante Beeinflussung dieses Stoffwechsels durch Oestradiolbenzoat ist nicht möglich. B e i s p i e l eines V e r s u c h s p r o t o k o l l s Wachsende Leber ani 1 . Tag post operationem. Versuchsflüssigkeit: Bikarbonatund glukosehaltige Ringerlösung. Temperatur 3 7 0 C Gefäß Nr: Volumen der Versuchsflüssigkeit Volumen des Gasraumes Gefäßkonstanten

ml ml

V f

=

8,00

VG

=

8,74

Ko

=

0,789

KCO2 =

1,202

2

Gewicht des Gewebeschnittes

10,86

Im Gasraum Druckänderung in 45 Min.

5

VF

v

mg

Vol. % C0 2 in 0 2

H C O rrig.

14,83

ml ml

Vol. % C0 2 in 0 2 — 2 2

3 , 0 0 ml g = 14.49 m l ^g kco2 = 1,439 9,14 m g Vf

v

5

= — 56

10,50

=

10,86

- 54 • 1,202

Sauerstoffverbrauch: X o ,

+

—

=

54 " 0,789 +

54

Vol.% COa in N 2 + 5

mm, h = —

22

mm

22 • 1,469

1,202

1,469

0,789

Kohlendioxyd entwicklung: Xco 2

5

— 5 6

Im Gasraum Druckänderung in 45 Min. :

3,00

=

ko2 = 1,314 kco2 = 1 , 4 6 9 1 0 , 5 0 mg

Gefäß Nr. Volumen der Versuchsflüssigkeit Volumen des Gasraumes Gefäßkonstante Gewicht des Gewebeschnittes

Aerob

=

g

=

—

80,5

3

mm

1,314 22 •

1,314

0.789

1,314

1,202

1,469

57,3

mm

3

59

Stoffwechsel wachsenden Lebergewebes 3

—80,K03y. H o p M a j i b H a H neneHb Kpbicbi naeT B cpenHeivi HBbixamie B QO 2 = — 9 , 2 11 aHaapooHbiü rjiHKOJiH3 QIJ2 = 3 , 3 . 24 n a c a IIOJIH onepauHH T . e. B npeacTaniiH p o c T a TKaHH, naaaeT aHaapoÖHbiii TJIHK0JIH3 Ha Qm2 = 1,4'. HaHHHaeTCH H «CO,

Stoff- "und Energiewechsel bei 28° C (Tumorwachstum gehemmt) Atmung

QO2 3,9

Glycolyse 0a O »CO,

N o«ci co.

11,5

18,3

Q02 + CO,

4.85

3,38

5,33

8,23

1,95

1,50

¿tmol A T P

2,62

1,18

1,85

3,8o

1,05

0,52

0,82

1,57

~ P cal/Std.

2,92

1,28

2,00

4,20

1.16

0,56

0,90

1,72

X 10-' 2

2,38

3,45

X lO"2

der insgesamt in Form von ATP gebildeten Energiemenge aus, während die restlichen 2/3 aus der Atmung der Zelle stammen. Unter anaeroben Bedingungen wird sogar rund 50% des unter aeroben Bedingungen insgesamt von der Tumorzelle gewonnenen ATP's durch die Zuckerspaltung geliefert. Hinsichtlich des durch Atmung und Glycolyse gebildeten ~ P in Form von ATP wurde übereinstimmend von E L C I N A und S E J C [6] und von L I N D B E R G und Mitarb. [7] über die Einbauquote von P32 gefunden, daß im Ehrlich-Ascitestumor sogar 70% des gebildeten ATP's aus der Glycolyse stammen und nur 30% durch die oxydative Phosphorylierung gebildet werden. Ein noch höherer Energiegewinn der Tumorzelle aus der Glycolyse gegenüber der Atmung resultiert bei der Betrachtung der freien Energie (zlF), da die Relation zwischen dieser Energie und der in Form von ATP gebundenen bei der Glycolyse größer ist als bei der Atmung. Deshalb ist der auf die aerobe Glycolyse der Tumorzelle entfallende Anteil an freier Energie mit ca. 40% der gesamten freien Energie noch höher als der aus der Glycolyse gewonnene ATP-Anteil (ca. 30%). Energetisch gesehen unterscheiden sich also Atmung und anaerobe Glycolyse von Tumorzellen nicht wesentlich, und es scheint damit die Lebenserhaltung von Tumorzellen lediglich vom Energiegehalt und nicht von der Art der energieliefernden Stoffwechselprozesse abhängig zu sein, was die Ergebnisse der in vitro-Versuche (1. Abschnitt) ohne weiteres erklärt. Wie später noch gezeigt werden wird, dürfte auch die aus der aeroben Glycolyse stammende Energie für die Erhaltung von Tumorzellen ausreichen. Die große Bedeutung der Glycolyse für bestimmte Stoffwechselprozesse, die zum malignen Wachstum enge Beziehungen aufweisen, ergibt sich

76

H.

BIELKA

u. a. auch aus Versuchen über die Einbaurate von P 32 in Nucleinsäuren und Phosphoproteide [8]. Während bei Tumorgeweben die Einbaurate unter anaeroben Bedingungen infolge der beträchtlichen, durch Glycolyse gewonnenen Energie nur um ca. 15% gegenüber aeroben Bedingungen vermindert wird, trat bei normalen Geweben nach Sauerstoffausschluß eine Hemmung um 50—70% ein. Wenn somit die Energie aus Atmung oder Glycolyse, wie experimentell und auf Grund energetischer Berechnungen gezeigt wurde, zur Lebenserhaltung von Tumorzellen ausreicht, so scheint jedoch die Energie aus einem der beiden Stoffwechselprozesse für das Wachstum von Geschwulstzellen nicht zu genügen. Dies ergibt sich aus energetischen Berechnungen der im 2. Abschnitt enthaltenen Versuchsergebnisse über den Einfluß von Sauerstoffmangel auf das Wachstum von Tumorzellen in vivo. Im Rahmen dieser Versuche wurde festgestellt, daß Sauerstoffmangel das Wachstum von transplantierten Tumoren hemmt. Gleichzeitig ergab sich eine Hemmung des Stoffwechsels der tumortragenden Tiere, die sich u. a. auch in einem Abfall der Körpertemperatur von 38° C auf 28° C äußerte. Dieser Temperaturabfall wurde als Kriterium für das Ausmaß des Stoffwechsels der Tumorzellen unter Sauerstoffmangel in vivo gewertet. Aus entsprechend durchgeführten Untersuchungen über den oxydativen und glycolytischen Stoffwechsel von Tumorzellen bei 38° C •— entsprechend normalen Tumorwachstum unter normalen atmosphärischen Bedingungen — u n d bei 280 C—entsprechend den Bedingungen unter Sauerstoffmangel, unter denen Tumoren nicht mehr wachsen — geht hervor, daß die Stoffwechselprözesse von Tumorzellen bei einer Temperaturverminderung um io° um das 2—3fache absinken (Tab. 4). Aus den entsprechenden Stoffwechselwerten läßt sich eine adäquate Verminderung des Energiestoffwechsels der Tumorzellen errechnen (Tab. 4). Unter normalen Wachstumsbedingungen, d. h. bei 38° C, steht den Tumorzellen (pro mg Trockengewicht) eine aus Atmung -f- aerober Glycolyse stammende Gesamtenergie von ca. 8,2 X 10 2 cal/Std. zlF bzw. 4,2 X io - 2 cal ~ P zur Verfügung. Bei einer Gesamtenergie von ca. 3,5 X io - 2 cal/Std. AF bzw. 1,7 X io~2 cal ~ P, entsprechend den niedrigeren Q-Werten bei 28° C (Bedingungen unter Sauerstoffmangel) wachsen die Tumorzellen nicht mehr, bleiben jedoch am Leben. Aus diesen experimentellen Befunden und den daraus abgeleiteten energetischen Berechnungen gelangt man zu folgenden Ergebnissen (s. Tab. 4): Aus der Tatsache, daß bei einer Gesamtenergie von 3,45 x io _2 cal/Std. AF Tumoren zwar nicht mehr wachsen, die Tumorzellen jedoch am Leben bleiben, ergibt sich, daß die aus Atmung ( = 4,85 x io~2 cal/Std. ZlF) oder aerober ( = 3,4 X io~2 cal/Std. ZlF) bzw. anaerober ( = 5,3 x io~2 cal/Std. ZlF) Glycolyse unter normalen Bedingungen stammende Energie für die Lebenserhaltung von Tumorzellen ausreicht, da diese Energiebeträge in der gleichen Größenordnung oder sogar etwas höher liegen,

Beziehungen zwischen Stoffwechsel und Wachstum von Tumoren

77

wie die aus Atmung + aerober Glycolyse stammende Energie unter experimentellen Bedingungen, unter denen die Tumorzellen zwar nicht mehr wachsen, jedoch noch am Leben erhalten werden. Diese Schlußfolgerung wurde bereits auch aus den invitro-Experimenten gezogen (siehe oben). Weiter ergibt sich daraus, daß sich Tumorzellen mit Hilfe der Energie der aeroben Glycolyse nicht vermehren können, da die freie Energie dieses Stoffwechselprozesses unter normalen Bedingungen mit 3,4 X 10 2 cal/Std. ebenso groß ist, wie die aus Atmung-F Glycolyse stammende Energie unter Sauerstoffmangel, also unter Bedingungen, unter denen Tumorzellen nicht mehr wachsen. Da auch die aus der Atmung stammende freie Energie mit 4,85 x io~2 cal/Std. nur um ca. 40% gegenüber der aeroben Glycolyse größer ist, ist anzunehmen, daß auch diese Energie für das Tumorwachstum nicht ausreicht. Diese Annahme wird z. B. gestützt durch Versuche von H O L Z E R und Mitarb. [9], die zeigen konnten, daß bei einer starken Hemmung der Glycolyse ohne Beeinflussung der Atmung in vivo das Wachstum von Ascitestumoren gehemmt wird. Die aus der ungehemmten Atmung verbleibende Energie reicht also für das Wachstum der Tumorzellen nicht mehr aus, obwohl sie etwas mehr Energie als die Glycolyse liefert. Aus diesen Ergebnissen muß geschlossen werden, daß sich die Wachstumsenergie von Tumorzellen aus der aus Atmung + Glycolyse gewonnenen Energie zusammensetzt und größer ist als die Erhaltungsenergie, die aus Atmung oder Glycolyse geliefert werden kann. Es muß darauf hingewiesen werden, daß mit den vorstehenden Betrachtungen nur ein Problem der Fragen über Zusammenhang zwischen Stoffwechsel und Wachstum von Geschwulstzellen erfaßt wurde, nämlich der Bedeutung von Atmung und Glycolyse als energieliefernde Stoffwechselprozesse für das Wachstum. Eine sicher eben so wichtige Bedeutung für die gleiche Fragestellung haben Atmung und Glycolyse für die Bildung von Ausgangsprodukten für die verschiedenartigsten synthetischen Leistungen der Zelle, die für das Wachstum Voraussetzung sind. Da jedoch für derartige synthetische Prozesse Energie notwendig ist, ergibt sich die Bedeutung der hier diskutierten energetischen Fragen. Selbstverständlich haben die hier angeführten absoluten Zahlen nur die Bedeutung von Mittelwerten für Ascitestumorzellen unter den angegebenen Versuchsbedingungen. Herrn Prof. Dr. G R A F F I danke ich für die Überlassung des Themas und zahlreiche Ratschläge, Frl. I. S C H N E I D E R S für wertvolle technische Assistenz. Literatur [1] [2] [3] [4]

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WARBURG, OKAMOTO, WIND, THUM,

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: Verl. Stein-

u. J . F . S E J C : Dokl. Akad. Nauk. S S S R , N . S . 7 7 , 6 5 3 ( 1 9 5 1 ) . O., M. L . L J U N G G R E N , L . E R N S T E R and L . Révész: Exptl. Cell Res. 4. 243 (1953)M A N N , W . and J . G R U S C H O W : Proc. Soc. exptl. Biol. Med. 7 1 , 6 5 8 ( 1 9 4 9 ) • H O L Z E R , H . , G . S E D L M A Y R U . A . K E M N I T Z : Biochem. Z . 3 2 8 , 1 6 3 ( 1 9 5 6 ) . H O L Z E R , H . , J . H A A N U . D . P E T T E : Biochem. Z . 3 2 7 , 1 9 5 ( 1 9 5 5 ) .

[6] E L C I N A , N . V . [7]

[8] [9]

LINDBERG,

Summary Tumor cells survive in vitro with the energy of respiration or anaerobic glycolysis, while inhibition of both processes leads in a short time to the death of the cells. Oxygen lack leads in vivo to inhibition of growth of transplanted tumors. Biochemical and histological studies showed that this effect is not due to death of tumor cells by 0 2 lack. Energetic calculation of the above results leads to the conclusion that the energy of growth of tumor cells is the sum of respiration and glycolysis and is greater than the maintainance energy which is furnished by either respiration or glycolysis. P e 310 M e 1. B paMKax H3yqeHHH pojiH ntixaHHH H rjiHK0JiH3a Kan aneprmo naioiimx npoueccoB npw coxpaHeHHH H pocTe KJieTOK onyxojieii HccjiejjyeTCH in vitro II in vivo BJIHHHHe pa3HbIX BHeUIHHX yCJIOBHfi OÖMeHa BemeCTB Ha KJieTKII onyxojieii. 2 . OnbiTbi in vitro noKaaanH, HTO C noMombio aHeprnw H O S H T O H H S HbixaiiHH HJIII aHaapoÖHoro rjiHKOJiH3a K J I C T K H onyxojieii nepenuiBaioT, n p a OjioKHpoBamiii w e 0 6 0 H X npoueccoB 3a 5 nacoB H MeHee noraöaioT. 3. a) He^ocTaTOK KHCJiopona ( 7 % ) y J K H B O T H M X Be.ueT K nojiHOMy 3aaep>KHBaHHK) pocTa TpaHcnJiaHTHpoBaHHbix onyxojieii. (C 37 i. M., Kapqwuow 3pjiHxa i. p.). ripn HopMaJibHHx ycjioBHHx aTMOc$epbi pocT onyxojiH npoHOJiHiaeTCH B TOÌÌ we ereneHH Kan H B HopMajibHbix ycjioBHHx. 6) riyTeM rHCTOJiornqecKHx HccjienoBaHiifi 6HJIO noKa3aHo, HTO sanepHma pocxa onyxojieii npH HeflocraTKe 0 2 He oöocHOBaHO nornSamieii KJieTOK onyxojieii. B) yMenbiueHHe SHHoreHHoro cyöcTpaTa KJieTOK onyxojieii IIJIH noMexn (J)epMGHTaTHBHOH CHCTeMbI HblXailHH HJIH rjIHK0JIH3bI 0 2 TaK/KC He HaÖJIIOJiaJIOCb npii HenocTaTKe. r) y KJieTOK acHHTHOii onyxojiH BH«Ha npw HeaoeraTKe KHCJiopoaa neHopMajii>HOCTb MHT03H H Xp0M03OMOB. n) OßMeH BemecTB (KOjinnecTBo C 0 2 B SKcnnpHpoBaHHOM B03ayxe) H TeivrnepaTypa »HBOTHbix c onyxojiHMH CHJibHO yiweHbiuaeTCH npH HenocTaTKe 0 2 . e) 06cy>K,naiOTCH B03M0afHbie MexaHH3Mbi 3ajjep?KKH pocTa BcnpbiCKHBaeMbix onyxojieii npH HeaocTaTKe 0 2 . 4. 3HepreTHHecKHe pacneTbi pe3yjibTaT0B onwTOB n0Ka3biBai0T, MTO 3Heprnn pocTa KJieTOK onyxojieii BepoHTHo SepeTCH H3 nbixaHHH+rjiHK0JiH3, H OHa Sojibine neM A H E P R H H coxpaHeHHH KJieTOK, npoHcxojjHmaH H3 HbixaHHJi HJIH rJIHK0JIH3a OTflejIbHO.

Acta biol. med. germ., B a n d l , Seite 79—84 (1958) Aus dem Institut für Medizin und Biologie, A B Pharmakologie, der Deutschen Akademie der Wissenschaften zu Berlin, und dem Institut für Pharmakologie und Toxikologie der Humboldt-Universität Berlin

ATP-Abbau in Methämoglobin-führenden Blutzellen J . IWIG u n d

F.

JUNG

(Eingegangen am 30. 9. 57)

Zusammenfassung 1. Die Halbwertszeit des A T P bei roten Blutkörperchen des Kaninchens ohne Substratzugabe bei 3 7 0 und p H 7,4 beträgt 1 3 3 Min., wobei es im Verlaufe des A T P - A b b a u s zur A D P - und AMP-Zunahme und Bildung von Hypoxanthin kommt. 2. Die Halbwertszeit bei Hb(3)-Zellen ohne Substratzugabe liegt bei 76 Min. Die entstehenden A D P - und AMP-Mengen sind bedeutend geringer als bei Hb(2)-Zellen. Die Hypoxanthin-Bildung setzt früher ein. 3. Der A T P - A b b a u bei Hb(3)-Zellen unter Laktatzugabe zeigt die gleichen Verhältnisse wie unter 2. 4. Glukosezugabe verhindert bei Hb(3)-Zellen den A T P - A b b a u . 5. Mit Glukose und L a k t a t bebrütete Hb(3)-Zellen zeigen nach Schwund des Methämoglobins bei erneuter Bebrütung ohne Substrat die gleichen Verhältnisse wie normale rote Zellen.

Methämoglobin-führende Blutzellen (braune Zellen) verlieren bei Bebrütung in SubstratabWesenheit schnell ihre glykolytische Aktivität. Damit ergibt sich ein Versagen der Methämoglobinrückbildung und des Katiönentransports. M A T T H I E S [5] stellte bei Kaninchenzellen fest, daß das Rückbildungsversagen eine Halbwertszeit von ca. 70 Minuten besitzt und ihm ein ATP-Schwund in den Zellen entspricht. Dies paßt zu den durch zahlreiche Untersuchungen ( R A P O P O R T [ 1 0 ] , D E N S T E D T [ 1 1 ] , G A B R I O [ 1 ] u. a.) belegten Vorstellungen über die Vorgänge beim Schwund der glykolytischen Systeme in Blutkonserven. Da M A T T H I E S [5] aber auch feststellte, daß bei Methämoglobin-führenden Zellen der Kationentransport auch in Glukosegegenwart beeinträchtigt ist, liegt die Frage nahe, ob der schnelle Schwund in Methämoglobinführenden Zellen den Schwund in normalen Zellen übertrifft. Dies könnte einerseits durch die Besonderheiten des Stoffwechsels der braunen Zellen und andererseits durch eine Zellschädigung infolge der Methämoglobinbildung (Nitritbehandlung) verursacht sein.

So

J . IWIG,

F.

JUNG

Wir haben daher den ATP-Schwund in normalen und braunen Zellen sowie in ursprünglichen braunen, jedoch unter Glukose und Laktat regenerierten, Zellen verglichen und dabei auch einige Umwandlungsprodukte der ATP, nämlich Adenosindiphosphat (ADP), Adenylsäure (AMP) und Hypoxanthin (Hy) mit erfaßt. Methodik Kaninchenblut wurde mechanisch defibriniert und die Zellen abgetrennt. Anschließend wurden sie ßmal mit einer aus 4 Teilen einer 0,155 m NaClLösung und einem Teil m/15 Phosphatpuffer (pH 7,4) bestehenden Gemisch gewaschen und eine 50%ige Suspension hergestellt. Völlig parallel wurde ein zweiter Teil des Kaninchenblutes behandelt, der nach E n t fernung des Plasmas 5 Minuten bei Zimmertemperatur mit einem gleichen Volumen einer 2,4%igen NaN0 2 -Lösung behandelt worden war. Dabei tritt vollständige Umwandlung des Hämoglobins in Methämoglobin ein. Anschließend wurden die Suspensionen ohne Sjibstrat oder unter Zugabe von Glukose i o ~ 2 m oder Natriumlaktat i o _ 2 m bei 37 0 bebrütet und zu Beginn, nach 60 und 120 Minuten eine Probe zur Analyse entnommen. Bei Prüfung der Reversibilität der Nitritwirkung wurde im Gegensatz zu diesen Versuchen die Glukose bereits dem Nitrit wie den Waschflüssigkeiten zugesetzt. Für die Auswertung wurden die Proben 10 Min. bei 1 3 0 0 0 U/Min. zentrifugiert, und dann 0,75 ml Zellbrei mit 2,5 ml einer 5 %igen Trichloressigsäure bei — 3 0 ° zerrieben. Dann wurde die wieder aufgewärmte Zellfällung zentrifugiert und 0,1 bzw. 0,2 ml des Extraktes auf Schleicher & Schüll 2043 b Mg aufgebracht. Chromatographiert wurde in einem Gemisch von Isobuttersäure, Wasser und NH 4 OH (25%) im Verhältnis 66/33/1. Die Flecke wurden im UV-Licht ausgeschnitten, mit n/10 HCl eluiert und das Eluat bei 257 m/i kolorimetriert. Ergebnisse A. Abb. 1 stellt unsere wesentlichsten Ergebnisse zusammen. Werden normale oder Nitrit-behandelte Zellen in Glukosegegenwart bebrütet, so bleibt der ATP-Gehalt (Ausgangswert um 9 • 10 ~7 Mol/ml Zellen) bei den roten Zellen konstant, bei den braunen sinkt er nur geringfügig ab (1a). Werden unbehandelte rote Blutzellen ohne Substratzugabe bebrütet, so sinkt der ATP-Gehalt ab, und zwar mit einer Halbwertszeit um 1 3 0 Minuten. Ein ähnlicher Wert ergibt sich auch, wenn normale oder Nitritbehandelte Blutzellen zunächst solange mit i o ~ 2 m Glukose und Laktat bebrütet werden, bis das Methämoglobin der Nitrit-behandelten Zellen reduziert ist und anschließend eine Bebrütung in Substratabwesenheit erfolgt (lb). Hier bestehen bei beiden Zellarten identische Halbwertszeiten, die etwas länger sind als bei den unbehandelten roten Zellen. Abweichende Werte ergeben sich jedoch bei Zellen, die Methämoglobin ent-

8l

A T P - A b b a u in Methämoglobin-führenden Blutzellen

Hb(2) I 2 h mit Gluc. + L. Hb(3) I dann Versuch ohne Substrat

hb(2)+ Glucose / Hb(3)*G!ucose

.

0

60

120Min.

60

120 Min.

A b b . l . Ordinate: relativer Gehalt an A T P in bezug auf den Ausgangswert (Log. Maßstab). Abszisse: Zeit in Minuten. Hb(2) = normale rote Blutzellen, Hb(3) = Methämoglobinführende Zellen. L = L a k t a t . S = Substrat

Hb (3) red.

Hb (2)

Hb(3) ohneS

°o

Hb (3) + La etat .••"'

j 120

0

J 120

A b b . 2. Ordinate: Gehalt an Mononucleotid in i o - ' Mol/l. Abszisse: Zeit in Minuten. -o—o-Adenosindiphosphat -o o - Adenylsäure • x • • • x • Hypoxanthin Sonst vgl. T e x t und Legenden zu A b b . l

halten und dieses in Glukoseabwesenheit rückbilden. In Übereinstimmung mit den früheren Ergebnissen von MATTHIES [5] ergab sich eine Halbwertszeit von 70—80 Minuten, die auch durch Zugabe von Laktat (lb) nicht wesentlich modifiziert werden konnte. Die Halbwertszeit betrug dann 80 Minuten. 6 A c t a biol. med. germ. Heft 1

82

J. Iwig, F. JUNG

B. Diese Ergebnisse lassen sich durch, dem Papierchromatogramm ebenfalls entnehmbare, Werte über die Veränderung der ADP, AMP und HyKonzentrationen in den Zellen ergänzen. Die folgende Abbildung 2 gibt einige typische Versuche wieder. Bei der mäßigen Genauigkeit der Methode ließen sich immerhin folgende Feststellungen mit einiger Sicherheit gewinnen: Wurden normale oder methämoglobinhaltige Zellen mit Glukose und Laktat bebrütet, so traten während 120 Minuten keine eindeutigen und stärkeren Veränderungen des Gehalts an A D P und AMP auf. Die Werte entsprachen noch nach 120 Minuten den Ausgangswerten. Bildung von Hy wurde niemals beobachtet. Bei Bebrütung im Substratabwesenheit zeigten normale Zellen einen vom Ausgangswert ansteigenden Gehalt an AMP und ADP, ebenso verhielten sich ursprünglich methämoglobinhaltige Zellen, die ihr Methämoglobin in Gegenwart von Glukose und Laktat bereits reduziert hatten (2a und b). Hy wurde in 10 Versuchen an normalen Zellen imal nach 60 Minuten und 5mal nach 120 Minuten festgestellt. Bei dein ursprünglich methämoglobinhaltigen Zellen war in 6 Versuchen Hy dreimal nach 60 Minuten und immer nach 120 Minuten vorhanden (2b). Wurden methämoglobinführende Zellen ohne Substrat bebrütet, so war in 5 Versuchen stets Hy bereits nach 60 und dementsprechend mehr nach 120 Minuten vorhanden (2c). Genau dasselbe ergab sich, falls den methämoglobinführenden Zellen Laktat allein als Substrat angeboten wurde (2d). Der AMP- und ADP-Gehalt der methämoglobinführenden Zellen war nieder und zeigte während des Versuches im Gegensatz zum Hy-Gehalt keine wesentliche Tendenz zum Ansteigen. — Die Abbildung läßt das unterschiedliche Verhalten der verschieden behandelten Zellen eindeutig erkennen. Diskussion Auf Grund unserer Versuche ist der ATP-Schwund bei substratfreier Bebrütung in methämoglobinführenden Zellen etwa auf das Doppelte beschleunigt. Da diese Beschleunigung nach Ende der Rückbildung nicht mehr nachweisbar ist, kann sie nicht auf einer Zellschädigung durch die Nitritbehandlung beruhen. Vergleicht man den geringeren ADP- und AMP-Gehalt der bebrüteten braunen Zellen mit dem schnelleren ATPSchwund, so folgt daraus, daß auch die ADP- und AMP-Stufe des A T P Abbaus schneller durchlaufen wird. Dem entspricht die bei normalen Zellen kaum vorhandene, bei den braunen Zellen aber sehr in den Vordergrund tretende Bildung von Hy. Allerdings ist diese gesteigerte HyBildung auch noch bei den Zellen deutlich, die unter Substratschutz ihr Methämoglobin bereits rückgebildet hatten. Diese Ergebnisse lassen die Störung bei den braunen Zellen weniger bei den ATP-phosphorylierenden Prozessen suchen, als irgendwo bei den Umsetzungen unterhalb des AMP. (Auch das Myokinasesystem scheint

A T P - A b b a u in Methämoglobin-führenden Blutzellen

83

nicht betroffen). Beschleunigt scheint der Ubergang von Adenylsäure in Inosinsäure bzw. Hypoxanthin; bekanntlich sind auch im Blut sowohl Adenylsäure wie Adenosin-Desaminasen nachweisbar ( C O N W A Y U . C O C K [ 2 ] R U B I N S T E I N U . D E N S T E D T [ 1 1 ] ) , die somit bei den braunen Zellen aktiviert erscheinen. Gewisse Schwierigkeiten bereitet ein Vergleich dieser Ergebnisse mit den Versuchen von M A T T H I E S [ 5 ] über eine Interferenz zwischen Kaliumtransport und Methämoglobinrückbildung. Bei diesen Versuchen vermochte Glukose allein keine Restitution zu vermitteln, sondern es war die gleichzeitige Gabe von Laktat notwendig. Bei unseren neuen Versuchen genügte aber Glukose allein zur Erhaltung des zelleigenen ATP. Dies könnte allerdings darauf beruhen, daß bei den früheren Versuchen von M A T T H I E S Z U Beginn des eigentlichen Versuches schon eine gewisse Erschöpfung der Glykolyse vorlag. Abb. 4 seiner Arbeit belegt das insofern, als bereits zu Versuchsbeginn kaum eine merkliche Spontanreduktion des Methämoglobins nachweisbar ist und Glukosezugabe nach 1 stündiger Bebrütung keine Wirkung mehr auf die Methämoglobinrückbildung wie die Transportvorgänge zu haben scheint.

Literatur [1] GABRIO, B . W . , C . A . F I N C H U. F . M . H U E N N E K E N S : B l o o d 1 1 , 1 0 3 ( 1 9 5 6 ) . [2] C O N W A Y , E . J . U. R . C O O K E : B i o c h e m . J . 3 3 , 4 7 0 ( 1 9 3 9 ) .

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[5] MATTHIES, H . : Arch. exper. Path. u. Pharmakol. 226, 442 (1955). [6] P A Y S A N T , P . u . R . W O L F F : C . r. S o c . B i o l . ( P a r i s ) 1 4 6 , 1 2 5 0 ( 1 9 5 2 ) . [7] P A Y S A N T , P . u . R . W O L F F : C . r. S o c . B i o l . ( P a r i s ) 1 4 6 , 1 2 5 3 ( 1 9 5 2 ) .

[8] PAYSANT, P : L'acide adenosin-triphosphorique Impr. Georges Thomas (1952). [9] Prospekt der Papst-Brauerei U S A . [ 1 0 ] RAPOPORT, S . : J . C l i n . I n v e s t i g . 2 6 , 5 9 1

du globule rouge.

Nancy,

(1947).

[11] RUBINSTEIN, D. U. O. F. DENSTEDT: Canad. J. of Biochem. and Physiol. 34, 927 (1956).

Summary 1. T h e half time of A T P of rabbit-erythrocytes without addition of substrates is 133 minutes at 37 0 and pH 7,4- In the course of A T P breakdown A D P a n d A M P are increased and hypoxanthine is formed. 2. The half time in H b (3) cells without addition of substrates, is 76 minutes. T h e amount of A D P and A M P formed is much smaller than in H b (2) cells. T h e hypoxanthine formation begins earlier. 3. The breakdown of A T P in H b (3) cells is on addition of lactate similar to t h a t above. 4. Additions of glucose prevents the breakdown of A T P in H b (3) cells. 5. H b (3) cells which have been reformed b y glucose and lactate show on renewed incubation without substrate the same behaviour as normal erythrocytes. 6»

84

J.

IwiG, F.

J U N G

Pe3K)Me 1. BpeMH noJiypaciiaHa A T I I b upacHbix kpobhhbix iuapHKax y KpojiHKa 6ea aoôaBKHcyßcTpaTa n p n 3 7 ° h p n 7,4coeraBJineT 133mhh.,npH^eMb3tomnpouecce yBejiHHHBaeTCH kojihhcctbo aneH03HHHH0cKamHM kpobhhhm iuapHKaM MemaeT npeBpameHHio A T O . 5. ITyreM rjiK>K03H h JiaKTaTa b nepBOHa^aJibHoe cocTOHHHe npeBpameHHHe MeTFeMorjioÔHH conepwamne kjictkh naioT n p n noBTopeHHH HHKyÒauHH 6e3 cyßcTpaTa Te me pe3yjibTaTbi KaK h HopMajibHwe KpoBfiHtie rnapHKH.

A c t a biol. med. germ., Band l,

Seiten 85—100 (1958)

Aus dem Pharmakologischen (Direktor: Prof. Dr. F. J U N G )

Institut

der Humboldt-Universität

zu

Berlin

Gegenseitige Ausscheidungsbeeinflussung von Sulfonamiden F.

ZAWACKI

(Eingegangen am 30. 9. 57)

Zusammenfassung 1. Zur Trennung des Methylpyrimal-Euvernil-Gemisches wurde eine modifizierte Methode von W . H O F F M A N N angewandt. Die Änderung dieser Methode bestand darin, erstens, daß vor der Fällung des Methylpyrimals mit Kaliumquecksilberjodid das Gemisch diazotiert wurde und zweitens, daß die Proben, vor Zugabe des Kupplungsreagenzes zur kolorimetrischen Bestimmung des Sulfonamidgehaltes, mit Aceton entfärbt wurden. 2. Methylpyrimal und Euvernil werden exponential eliminiert. Als Modellsubstanzen eines Sulfaadditionspräparates (je 200 mg der beiden Sulfonamide pro kg Kaninchen i. v.) beeinflussen sie sich gegenseitig in ihrer Ausscheidung. Der Einfluß der beiden Verbindungen auf ihre gegenseitige Elimination ist stark signifikant. Die Elimination des Langsamausscheiders Methylpyrimal wird verzögert, die des Schnellausscheiders Euvernil dagegen beschleunigt. 3. Die gegenseitige Beeinflussung in der Ausscheidung des Methylpyrimals und Euvernils kann auf zweierlei Weise erklärt werden. a) Hemmung der tubulären Sekretion des Acetyl-Methylpyrimals durch Euvernil und Hemmung der tubulären Rückresorption des Acetyl-Euvernils durch Methylpyrimal, oder aber, falls beide Sulfonamide tubulär ausgeschieden werden, b) kompetitive Hemmung bei der Rivalität um die sekretorische Funktion des Tubulusapparates.

Der Begriff der Sulfaaddition wurde vor etwas mehr als einem Jahrzehnt von den schwedischen Forschern H A G E R M A N N [18], F R I S K und Mitarbeitern [16], [17] und annähernd gleichzeitig auch von dem Amerikaner L E H R [32] in die Chemotherapie der Infektionskrankheiten eingeführt. Darunter versteht man die Gabe eines Kombinationspräparates aus zwei oder auch drei verschiedenen Sulfonamiden, deren Blutspiegel und auch Wirkungen sich „addieren" sollen. Ein weiteres Moment war die Einschränkung der Gefahr einer Nierenschädigung — infolge der im Gemisch geringeren Kristallisationsneigung der Einzelkomponenten. Das erste derartige Präparat war das in Schweden hergestellte Sulfadital [26]. Es setzte sich aus 37% Sulfathiazol, 37% Sulfapyridin und 26% Sulfa-

86

F.

ZAWACKI

methylpyrimidin zusammen. Ihm folgten zahlreiche andere SulfonamidKombinationspräparate, wobei die bekanntesten Supronal, Supracid ( = Protocid), Pluriseptal, Dosulfin, Andal sind. Fast alle Sulfonamide (mit Ausnahme der aus dem Magendarmkanal nicht resorbierbaren Verbindungen) werden durch die Niere ausgeschieden. Sie unterscheiden sich jedoch untereinander durch verschieden lange Resorptions- und Ausscheidungsdauer. So werden einige (z. B . Globucid, Albucid, Euvernil) schnell, andere dagegen (wie z. B. die Sulfapyrimidine) nur langsam ausgeschieden. Die Aufnahme- und Eliminationsverhältnisse eines Sulfonamidpräparates bestimmen den Verlauf seiner Blutspiegelkurve. Die ungleichen Resorptions- und Ausscheidungsgeschwindigkeiten wurden deshalb auch bei der Herstellung von Sulfaadditionspräparaten berücksichtigt; so besteht z. B. das Supracid aus dem Schnellausschneider (und leicht resorbierbaren) Globucid und dem Langsamausscheider (und auch langsam resorbierbaren) Methylpyrimal. Bezüglich der Ausscheidung eines Kombinationspräparates wird bisher fast einstimmig die Ansicht vertreten, daß die Einzelkomponenten sich in ihrer Ausscheidung gegenseitig nicht beeinflussen. So kommt J. K L A M R O T H [27] bei experimentellen Arbeiten über Protocid zu dem Schluß, daß „bei der Ausscheidung jedes der Sulfonamide seinen eigenen Gesetzen folgt." F . Z B I N D E N und R . P U L V E R [56], die das erst kürzlich erschienene. Dosulfin (N^-Isopropoxybenzol-p-amino-benzolsulfonamid + Nj-4-Methylpyrimidyl-(2)-p-aminobenzolsulfonamid) an je 5 Kaninchen untersucht haben, berichten, „daß die Substanzen sich gegenseitig nicht beeinflussen, sondern unabhängig voneinander resorbiert, acetyliert und ausgeschieden werden." Auch F . H. D O S T [9] schreibt: „bei der Ausscheidung und Acetylierung folgt jede einzelne Verbindung, auch bei der Kombination verschiedener Präparate, jeweils ihren eigenen Gesetzen." Vor kurzen befaßten sich F . P O R T W I C H und H. B Ü T T N E R [42] mit dem Problem der Sulfonamidkonzentrationen im Serum nach Verabreichung kombinierter Sulfonamide (6-Sulfadimethyl-pyrimidin und Sulfamerazin). Auch sie behaupten, daß diese beiden Sulfonamide „sich bei der Ausscheidung gegenseitig nicht beeinflussen". D. L E H R [34] berichtet auf Grund seiner Untersuchungen über die Toxicität von Sulfonamidmischungen, daß die Aufnahme und Ausscheidung bei Kombinationen vollständiger waren, als bei Verabreichung der Einzelkomponenten. B. Z I E G L E R , H. E . B A G D O N und A. C . S H A B I C A [57] befaßten sich mit der Löslichkeit einiger Sulfonamide von allgemeiner klinischer Bedeutung. Sie kommen zu dem merkwürdigen Schluß, daß das Verhältnis vom „freien" Sulfonamid zum acetylierten Sulfonamid wechselt. D . L E H R [33], R . S C H L O T M A N N [48] und J . L E D B E T T E R [31] stellten ebenfalls fest, daß der Acetylierungsgrad nach Verabreichung eines Sulfonamid-Gemisches geringer ist, als nach getrennter Gabe der einzelnen Komponenten. J.

Gegenseitige Ausscheidungsbeeinflussung von Sulfonamiden

87

Bei all diesen Versuchen ist jedoch das Sulfonamidgemisch im Serum niemals quantitativ getrennt worden. Eine definitive Aussage über die gegenseitige Beeinflussung bzw. Nichtbeeinflussung der Ausscheidung der einzelnen Komponenten kann aber nur dann gemacht werden, wenn die Sulfonamide im Serum getrennt und dann einzeln bestimmt werden. J . K L A M R O T H [27] hatte zwar die Absicht, die Komponenten des Protocids zu erfassen; jedoch fehlten ihm damals die hierzu notwendigen Reagenzien. Im Folgenden soll nun untersucht werden, ob bei getrennter Erfassung der Einzelkomponenten nach Gabe eines Gemisches die Ausscheidungsverhältnisse die gleichen bleiben wie bei der Verabreichung der einzelnen Komponenten allein. Methodik a) Kinetische Betrachtungen zur Ausscheidung von Sulfonamiden Nach D O S T [7] gehören die Sulfonamide zu den chemischen Stoffen, die exponential eliminiert werden. Die exponentiale Elimination setzt aber erst dann ein, wenn nach intravenöser Injektion eines Stoffes ein Gleichgewichtszustand zwischen Blut und Gewebe erfolgt. Die Formel für die exponentiale Abnahme des Blutspiegels lautet. y = a • e~kt [1] wobei y den Blutspiegel zur Zeit t, a den fiktiven Blutspiegel zur Zeit t = o (d. h. der Blutspiegel, der zustande käme, wenn nach beendeter i.v. Injektion sofort ein Diffusionsgleichgewicht zwischen Blut und Gewebe bestehen würde), e die Basis des natürlichen Logarithmus, k die Eliminationskonstante und t die Zeit nach der i. v. Injektion (in Stunden) bedeuten. Der fiktive Blutspiegel zum Zeitpunkt der beendeten intravenösen Injektion kann auf eine einfache Weise ermittelt werden: Der Verlauf einer Exponentialfunktion ergibt im halblogarithmischen Raster eine Gerade. Wird diese Gerade von ihrem Beginn, also nach Eintreten des Diffusionsgleichgewichtes zwischen Blut und Gewebe nach links bis zum Zeitpunkt der Injektion weitergeführt, dann ergibt der Schnittpunkt dieser Geraden mit der Ordinate den fiktiven Blutspiegel a. Aus dieser Formel kann die Eliminationskonstante eines Sulfonamidpräparates abgeleitet werden: k* =

In >>! — In y 2 ~ h - t 1

1 bzw-

^ = 7

l n

a 7

[2]

Die Eliminationskonstante eines Stoffes gibt somit darüber Auskunft, mit welcher Geschwindigkeit ein Stoff aus dem Körper ausgeschieden wird. Da der exponentiale Verlauf einer K u r v e im halblogarithmischen Raster eine Gerade bildet, würden — theoretisch gesehen — zwei Blutspiegelbestimmungen, die nach erreichtem Diffusionsgleichgewicht gemacht werden, genügen, um eine Gerade zu bilden und die Eliminationskonstante zu errechnen. Von der Größe der Eliminationskonstante hängt die Steilheit der Blutspiegelkurve ab ( D O S T [10]). Da jedoch nach Sulfonamidgemischen eventuelle Änderungen der Elimination zu erwarten sind, muß der Blutspiegel der einzelnen Sulfonamide bei getrennter und kombinierter Darreichung solange verfolgt werden, bis kein Sulfonamid mehr nachgewiesen werden kann. Für die Möglichkeit einer gegenseitigen Beeinflussung der Ausscheidung spricht erstens die Tatsache, daß Sulfonamide in kleinen Dosen diuresefördernd, in höheren diuresehemmend wirken [37], [38]; damit im Zusammenhang steht die hemmende Eigenschaft der Sulfonamide auf die Carboanhydratase [36], [51]. Zweitens werden die Sulfonamide im verschiedenen Grade acetyliert. Obwohl bekannt ist, daß der Acetylierungsgrad einunddesselben Sulfonamids Schwan-

88

F.

ZAWACKI

kungen unterworfen ist, muß noch erinnert werden, daß die Acetylierungsrate bei Sulfonamidgemischen geringer ist als der Summe der Acetylierungsraten der Einzelkomponenten bei getrennter Verabfolgung entsprechen würde (s. S. 86). Diese Tatsache allein berechtigt zu der Annahme, daß die verschieden stark acetylierten Sulfonamide einen Einfluß auf die Ausscheidung des freien Sulfonamids haben. b)

Versuchsmaterial

Die Versuche wurden an Kaninchen beiderlei Geschlechts im Gewicht von 2 — 5 k g vorgenommen. Als Modellsubstanzen für ein Sulfaadditionspräparat dienten die Natriumsalze des Euvernils und Methylpyrimals. Euvernil ist das 2-Sulfanilamidocarbamid, Methylpyrimal das 2-Sulfanilamido-4-methylpyrimidin. N H.N—/

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Gegenseitige Ausscheidungsbeeinflussung von Sulfonamiden

93

A b b . l. Blutspiegelabfall des gesamten Methylpyrimals im halblogarithmischen Raster; x X nach Verabreichung von Methylpyrimal; o o nach Verabreichung von Methylpyrimal und Euvernil. Mittelwerte von 25 Kaninchen

A b b . 2. Blutspiegelabfall des gesamten Euvernils im halblogarithmischen Raster; x X nach Verabreichung von Euvernil; o o nach Verabreichung von Euvernil und Methylpyrimal. Mittelwerte von 25 K a ninchen

A b b . 3. Blutspiegelabfall des freien Methylpyrimals im halblogarithmischen Raster; x X nach Verabreichung von Methylpyrimal; o o nach Verabreichung von Methylpyrimal und Euvernil. Mittelwerte von 25 Kaninchen

Abb. 4. Blutspiegelabfall des freien Euvernils im halblogarithmischen Raster; x — X nach Verabreichung von Euvernil; o o nach Verabreichung von Euvernil und Methylpyrimal. Mittelwerte von 25 K a ninchen

Eliminationskonstante zunächst nur 0,094 und nimmt dann mit der Zeit allmählich wieder zu, bis sie den normalen Wert erreicht. Die Eliminationskonstante des gesamten Euvernils beträgt beim Kaninchen normalerweise 0,34 (in Stunden -1 ). Nach intravenöser Injektion des Sulfonamid-Gemisches beträgt die Eliminationskonstante zwischen der 2ten und 3ten Stunde nach der Injektion 0,522; sie nimmt dann wieder ab, bis sie nach etwa 5 Stunden wieder auf den ursprünglichen Wert kommt. Die Unterschiede zwischen den Eliminationskonstanten nach alleiniger und kombinierter i. v. Gabe sind statistisch signifikant (vgl. Tab. 2). Auffällig ist, daß nach intravenöser Injektion des Methylpyrimal-

94

F.

ZAWACKI

Euvernil-Gemisches, fast kein acetyliertes Euvernil mehr im Blut nachweisbar ist. Diskussion In fast allen bisherigen Veröffentlichungen [1], [9], [22], [26], [27], [28], [42], [49], [50], [54]) über die Ausscheidung eines Sulfaadditionspräparates wurde die Ansicht vertreten, daß sich die Einzelkomponenten in ihrer Ausscheidung gegenseitig nicht beeinflussen. Es ist jedoch bisher nicht bekannt, daß die Komponenten eines Kombinationspräparates im Blut einzeln erfaßt werden konnten, da die Trennung zweier Sulfonamide auf große Schwierigkeiten stößt. P. H E I N Ä N E N , S. N Y S S Ö N E N und L . T U D E R M A N N [19] sowie P. H E I N Ä N E N , L . T U D E R M A N N und L . R Ä M Ö [20] haben eine große Anzahl von Sulfonamidverbindungen mit Hilfe der Papierchromatographie qualitativ bestimmen können; es wurden auch sehr gut reproduzierbare R F -Werte gefunden (Methylpyrimal hat einen R F -Wert von 0,11 und Euvernil einen solchen von 0,28). Aber schon bei der Bestimmung der Fleckengröße traten so große Differenzen auf, daß von dieser Methode Abstand genommen wurde. Selbst die kolorimetrische Messung des eluierten Chromatrogamms eignet sich nicht zur Bestimmung eines Sulfonamids, da der Sulfonamidgehalt des Blutes — bei einem theoretischen Blutspiegelwert von 15 mg % — n u r 0,2 y/ml beträgt. Für die Untersuchung der Ausscheidung von Sulfonamiden bei Kaninchen ist diese Methode ungeeignet: es bedeutet schon eine große Belastung für das Tier und eine noch größere Fehlerquelle für die Blutspiegelbestimmungen, wenn man einem Tier stündlich mehr als 1 — 2 ml Blut abnimmt. Um jedoch auf dem erwähnten papierchromatographischen Wege den Blutspiegel eines Sulfonamids verfolgen zu können, müßte man einem Kaninchen bei niedrigerem Sulfonamidgehalt des Blutes größere Blutmengen auf einmal entnehmen; das ist bei mehreren Bestimmungen praktisch gar nicht mehr möglich. Auch das von P. L. de R E E D E R [45], [46] angegebene Verfahren zur Trennung von SulfonamidGemischen mit Hilfe der unterschiedlichen Löslichkeit der Sulfonamide in mehreren Lösungsmitteln und Präcipitation mit zahlreichen Reagenzien eignet sich nicht für Blutspiegeluntersuchungen (bei Kaninchen). Auch die neuesten Untersuchungen zur Charakterisierung der Sulfonamide und Sulfone mit dem Reagens nach R o u x von A. E . V I T O L O [64], boten keine Möglichkeit zur Trennung von Methylpyrimal und Euvernil in geringen Konzentrationen. Selbst auf die elegante Bromierungsmethode zur getrennten Erfassung des Methylpyrimals und Euvernils von H. W O J A H N und M. W I T T K E R [55] mußte wegen des geringen Blutspiegels verzichtet werden. Die oben beschriebenen Versuchsergebnisse zeigen jedoch, daß die mit Kaliumquecksilberjodid durchgeführte Fällung des Methylpyrimals nach vorherigen Diazotieren des Methylpyrimals und Euvernils, eine Bestimmung der beiden Sulfonamide bis zu einer Blutkonzentration von

Gegenseitige Ausscheidungsbeeinflussung von Sulfonamiden

95

i mg % gestattet. Die erzielten Ergebnisse bestätigen, daß Methylpyrimal und Euvernil, wenn sie allein intravenös injiziert werden, nach Einstellung des Diffusionsgleichgewichtes, exponential eliminiert werden. Das gilt sowohl für das freie, wie auch für das gesamte Sulfonamid. Der Eliminationscharakter des Methylpyrimals und Euvernils verändert sich jedoch sobald beide Sulfonamide gleichzeitig intravenös verabreicht werden. Sollte nun die Ansicht von J . K L A M R O T H [26], [27], F. Z B I N D E N und R. P U L V E R [56] sowie von F. D O S T [9] richtig sein, dann müßte nach Gabe des Sulfonamidgemisches der Blutspiegelabfall der isolierten Einzelkomponenten im halblogarithmischen Raster ebenfalls von der zweiten Stunde nach der Injektion geradlinig verlaufen. Da dies jedoch nicht der Fall ist, muß eine gegenseitige Beeinflussung in der Ausscheidung der Einzelkomponenten angenommen werden. Intravenös verabreichte Sulfonamide werden hauptsächlich durch die Niere eliminiert. Nach der Filtration durch die Glomeruli werden die meisten Sulfonamide — darunter auch Methylpyrimal und Euvernil —• in den Tubuli wieder rückresorbiert. Nach den Untersuchungen von J . R . E A R L E [6], [14], J . G. R E I N H O L D und Mitarbeitern [47]. D. L U N D Q U I S T [35], sowie F. P O R T W I C H und H. B Ü T T N E R [41], [43] werden verschiedene Sulfonamide bzw. deren Acetylderivate außerdem noch zusätzlich durch den Tubulusapparat sezerniert. Das ist von den ersten beiden Autoren für das Acetyl-Methylpyrimal nachgewiesen worden. Für eine tubuläre Sekretion des Euvernils bzw. seines Acetyl-Derivates konnte in der zugänglichen Literatur kein Anhaltspunkt gefunden werden. Bekanntlich gibt es Verbindungen, die, wie z. B. Caronamid oder Benemid, die Tubulusfunktion hemmen. Dadurch wird die Tubulussekretion von Stoffen, die durch den Tubulusapparat sezerniert werden, unterbrochen. Die Hemmung dieser Tubulusfunktion hat einen verzögerten Blutspiegelabfall solcher Stoffe zur Folge [2]. Am bekanntesten dürfte wohl die blutspiegelprolongierende Wirkung des Benemids auf das Penicillin sein. In Untersuchungen am Menschen konnte jedoch nachgewiesen werden, daß Benemid auch den Blutspiegel einiger Sulfonamide erhöhen kann. M. S C H O O G [51 J] sah eine signifikante Erhöhung des Elkosin-Blutspiegels, wenn er 2,0 g Elkosin zusammen mit 0,1 g Benemid verabreichte. Die gleiche Wirkung des Benemids beobachtete A. P. C R O S L E Y [4], [5] auch nach Verabreichung eines Sulfaadditionspräparates, das sich aus Pyrimal, Methylpyrimal und Dimethylpyrimal zusammensetzte. Heute sind schon viele Substanzen bekannt, die durch kompetitive Hemmung eine sekretionsmindernde Wirkung auf den Tubulusapparat ausüben. Dazu gehören auch die Schnellausscheider Perabrodil, p-Aminohippursäure und viele mehr; sie beanspruchen die Funktion der Tubulusepithelien so stark, daß eine zusätzliche Ausscheidung anderer Stoffe unmöglich, bzw. verzögert wird.

96

F.

ZAWACKI

Der Tubulusblocker Benemid ähnelt in seiner chemischen Struktur den Sulfonamiden: yCHg • CH2 • CHg H 2„ N % - S O 2 . N H H O O C / SCL-IST 2 2 2 2 \ = / \ = / \ Sulfanilamid Benemid CH2 • CH2 • CH3 —

HjN—S02-NH-C Euvernil NH2 Die erzielten Ergebnisse können nun folgendermaßen gedeutet werden: 1. Nach intravenöser Injektion von 200 mg Methylpyrimal pro kg Kaninchen setzt, neben einer sofortigen Abdiffusion des Methylpyrimals in das Gewebe, auch die renale Elimination ein; daneben wird noch ein Teil des Sulfonamids acetyliert, wobei der Grad der Acetylierung von der Verweildauer des Sulfonamids im Körper abhängig ist. Das freie Methylpyrimal wird durch die Glomeruli filtriert und in den Tubuli zum größten Teil wieder rückresorbiert. Das acetylierte Methylpyrimal dagegen wird nicht nur filtriert, sondern auch noch durch die Tubulusepithelien sezerniert. Nach Einstellung des Diffusionsgleichgewichtes zwischen Blut und Gewebe wird das freie und das gesamte Methylpyrimal im Sinne einer Exponentialfunktion eliminiert. Die Eliminationskonstanten betragen bei Kaninchen: gesamtes Methylpyrimal im Mittel 0,14 (Stunde -1 ) freies Methylpyrimal im Mittel 0,17 (Stunde 1 ). 2. Das in einer Dosis von 200 mg/kg Kaninchen intravenös verabreichte Euvernil diffundiert ebenfalls in das Gewebe, wird acetyliert und eliminiert. Auch das Euvernil unterliegt nach der Filtration der Rückresorption durch die Tubuli. Das Diffusionsgleichgewicht zwischen Blut und Gewebe stellt sich bei Kaninchen bereits 90 Minuten nach der Injektion ein. Von diesem Zeitpunkt an wird das gesamte und das unveränderte Euvernil exponential eliminiert. Das Euvernil wird jedoch viel schneller als das Methylpyrimal eliminiert. Seine Eliminationskonstanten liegen dementsprechend höher: gesamtes Euvernil im Mittel 0,34 (Stunde-1) freies Euvernil im Mittel 0,39 (Stunde 1 ). Beim Kaninchen wird das Euvernil also etwas zweieinhalbmal schneller eliminiert, als das Methylpyrimal. 3. Nach gleichzeitiger intravenöser Injektion von je 200 mg Methylpyrimal und Euvernil pro kg. Kaninchen unterliegen beide Sulfonamide der Abdiffusion in das Gewebe, der Acetylierung und der renalen Elimination. Die Ausscheidung des methylpyrimals ist jedoch verzögert, während die des Euvernils dagegen beschleunigt ist. Deshalb sinken auch die Eliminationskonstanten des Methylpyrimals (bis auf 0,094 und 0,105 beim gesamten bzw. freien Methylpyrimal) und die Eliminationskonstanten des Euvernils steigen an (bis auf Werte von 0,52 für das gesamte

Gegenseitige Ausscheidungsbeeinflussung von Sulfonamiden

97

und freie Euvernil). Die unter gleichzeitiger intravenöser Verabfolgung von Euvernil beobachtete Verzögerung in der Ausscheidung des Methylpyrimals kann nicht auf eine Herabsetzung der Filtration der letztgenannten Verbindung in den Glomeruli zurückgeführt werden. Unter solchen Umständen (z. B. bei Blutdruckveränderungen) müßten beide Sulfonamid Verbindungen die gleichen Änderungen in ihren Ausscheidungsmodus erfahren. Die Ursachen für die Verzögerung in der Ausscheidung des einen und für die Beschleunigung in der Ausscheidung des anderen Sulfonamidpräparates müssen deshalb im Tubulusapparat gesucht werden. Hier spielen zwei Vorgänge eine äußerst wichtige Rolle: einmal die Resorptions- und zum anderen die Sekretionsfähigkeit des Tubulusepithels. Wie oben schon gesagt wurde, wird Methylpyrimal und Euvernil zum großen Teil in den Tubuli der Niere rückresorbiert. Das ist jedoch wahrscheinlich nur bei den nichtacetylierten Verbindungen der Fall; denn die acetylierten Sulfonamid-Derivate sollen nach M. S E K U L A [52] unmittelbar ausgeschieden werden. Einer Sekretion durch die Tubulusepithelien unterliegt nach F . D O S T [ 1 1 ] lediglich das Radional, dagegen nicht das Euvernil, Sulfathiazol oder Sulfamethylthiodiazol. Es gibt jedoch Untersuchungen, wonach auch andere Sulfonamide, zumindest beim Menschen, tubulär ausgeschieden werden, so z. B. Sulfathiazol [35], Sulfaäthylthiodiazol, Sulfamethylthiodiazol, Acetyl-metylpyrimal [6], [14], [47] und 6-(Sulfanilamido)2,4-dimenthylpyrimidin [41]. Die Verzögerung in der Ausscheidung des Methylpyrimals kann also damit erklärt werden, daß Euvernil die tubuläre Sekretion des acetylierten Methylpyrimals blockiert. Dadurch müßte ein höherer Blutspiegel des Acetyl-Methylpyrimals resultieren. Das ist jedoch nicht der Fall. Die Differenz zwischen dem gesamten und freien Methylpyrimal ist nach intravenöser Injektion des Methylpyrimals sowie nach gleichzeitiger intravenöser Injektion des Methylpyrimals und Euvernils gleich groß. Die Erhöhung des Blutspiegels kann nur für freies (und damit auch für gesamtes) Methylpyrimal nachgewiesen werden. Das ist an und für sich nicht weiter verwunderlich, wenn man bedenkt, ,,daß im Organismus zwischen dem freien und dem N 4 -acetylierten Derivat ein chemischer Gleichgewichtszustand" besteht, wie das von einigen Sulfonamiden von F. D O S T [8] angenommen wird. Die erzielten Versuchsergebnisse zeigen, daß durch die Blockierung der tubulären Sekretion des acetylierten Methylpyrimals entweder keine weitere Acetylierung mehr stattfindet, oder aber, daß neben einer weiteren Acetylierung auch eine Wiederabspaltung der Acetylgruppe des durch weiter fortschreitende Acetylierung und gehemmte Ausscheidung des Acetyl-Derivates, sich stark anhäufenden Acetyl-Methylpyrimals, durch das Ferment Acylase einsetzt. Die Möglichkeit einer solchen Wiederabspaltung der Acetylgruppe ist in vivo und in vitro durch K R E B S , S Y K E S und B A R T L E Y (zitiert nach D O S T ) [29], [30] sowie L A N G E C K E R [30] beobachtet worden. 7 A c t a biol. med. germ. H e f t l

98

F . ZAWACKT

Der stark abfallende Blutspiegel des Euvernils spricht dafür, daß die Rückresorption des Euvernils im Tubulusapparat gehemmt wird. Für diese Hemmung kann nur Methylpyrimal verantwortlich gemacht werden. Auffallend ist nur die Tatsache, daß einige Stunden nach Verabreichung der beiden Sulfonamide fast gar kein Acetyl-Derivat des Euvernils im Blut gefunden wird. Da die Acetylierungsquote nach Gabe von Sulfonamid-Gemischen geringer ist, als es der Summe der Acetylierungsderivate bei getrennter Verabreichung der einzelnen Sulfonamide entsprechen würde;, ist man geneigt anzunehmen, daß Methylpyrimal eine größere Affinität zu der Acetylierungsfähigkeit der Leber (und anderer Organe) besitzt, als der Schnellausscheider Euvernil. Viel begründeter erscheint jedoch eine andere Erklärung für die verzögerte Elimination des Methylpyrimals und die beschleunigte Elimination des Euvernils. Nach F . D O S T wird Badional tubulär sezerniert, Badional hat jedoch eine so große Ähnlichkeit mit Euvernil, daß man geneigt ist, auch für Euvernil eine tubuläre Sekretion anzunehmen. — /S H,N — ^ ^.-SO.-NH-C 7 \ —/ N\ NHS Badional

_ H„N — f

o ^-SO,-NH-C^ Euvernil

\NH,

Dafür sprechen auch die fast gleich großen Eliminationskonstanten der beiden Verbindungen. Nach F. D O S T [12] hat Badional eine solche von 0,25 (beim Menschen). Sollte neben dem Acetyl-Methylpyrimal auch das Acetyl-Euvernil einer tubulären Sekretion unterliegen,' dann könnte man die Verzögerung in der Ausscheidung des Methylpyrimals bei gleichzeitiger Beschleunigung der EuverniLAusscheidung als kompetitive Hemmung bei der Konkurrenz um den Tubulusapparat auffassen. Literatur [ 1 ] AUFDERMAUER, A u n d W . PULVER: D i e M e d i z i n i s c h e S 8 8 6 ( 1 9 5 5 ) [2] B E Y E R , K H , F RUSSO, E K TILLSON, A K MILLER, W F V E R W E Y a n d S ' R ' GASS A m e r i c J of P h y s i o l o g y 1 6 6 , 6 2 5 ( 1 9 5 1 ) [3] SRATTON, A C a n d E K MARSHALL- J b i o l o g C h e m 1 2 8 , 5 3 7 ( 1 9 3 9 ) [4] CROSI.EY, A P , G M B A Y N E , S C CARFAGNO a n d W P BORGER. A m e r i c . J M e d 1 5 , 500 ( 1 9 5 3 ) [5], CROSLEY, A P , G M B A Y N E , S C CARFAGNO a n d W . P BORGER J . L a b o r a t . CLM M e d 40, 7 3 0 ( 1 9 5 2 ) [6] DAVID, P a n d J R E A R L E J of C l i n I n v e s t 2 3 , 9 1 4 ( 1 9 4 4 )

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F F F F F.

H H H H H

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[44] QUATTRIN, [45]

und

de de de

REEDER,

100

F.

ZAWACKI

Summary 1. The modified method of W . Hoffmann was employed for the separation of a mixture of methylpyrimal and euvernil. The modification consisted in a) that the mixture was diazotized before the precipitation of methylpyrimal with potassium mercury iodide and b) that the samples were discolored with acetone before addition of the coupling reagent for the colorimetric determination of the content of sulfonamide. 2. Methylpyrimal and euvernil are eliminated e x p o n e n t i a l l y . As model substances of an addition compound of sulfonamide (200 mg of both sulfonamides per kg rabbit i. v.) they influence themselves mutually in their elimination. The influence of both substances on their mutual elemination is very significant. The elimination of the slowly excreted methylpyrimal is retarded, that of the rapidly excreted euvernil is accelerated. 3. The mutual influence with respect to the excretion of methylpyrimal and euvernil can be explained in two ways: a) Inhibition of the tubular secretion of the acetylmethylpyrmal by euvernil and inhibition of the tubular reabsorption of the acetyleuvernil by methylpyrimal or, in case that both sulfonamides are excreted tubularly b) competitive inhibition in the competition for the secretory function, of the tubular apparatus.

Pe3i0Me 1. JUJIH pa3nejieHHH CMeceii npenapaTOB Methylpyrimal H Euvernil ynoTpeSjiaeTCH M0HH(j)HUHp0BaHHbra MeTOH no B . roijNjmaHHy. M3MeHeHHH 3Toro MeTORa 3ai«iio B TOM, HTO, BO-nepBbix, no ocaJKnemiH MeTHJitrmpHMajia HOHHCTLIM pTyTLKaJIHeM CMeCb HHaUOTHpOBajiaCb H, BO-BTOpblX, no HOSaBKH Kpacnmero peaKTHBa HJIH KOJiopHMeTpH^ecKoro onpeaejieHHa KOJiimecTBa cyjib$QHaMHHOB CMecb oSecuBeHHBajiacb aijeTOHOM. 2. IlpenapaTbi Methylpyrimal H Euvernil BbinejiHiOTCH no S K C N O T E H H H A J I B HOMy 3aK0Hy; KaK Monejib cyiwviauHOHHoro cyjibOHaMHna (200 mg Kawnoro cyjib$OHaMHna Ha kg Beca KpojiHKa i. v . ) OHH OKa3biBaiOT BJiHHHHe npyr Ha npyra npw HX Bbia;ejieHHH H3 opraHH3Ma. 3TO B3aHM0BjiHHHHe o6enx coeiiHHeHHft Ha HX BbijiejieHHe H3 opraHH3ivra oieHb OTHeraHBO. BbinejieHHe MejtJieHHOBbinejiHiomerocH Methylpyrimal eme 6ojibine 3aMe«jiHeTCH H BLinejieHHe 6biCTpoBbi«ejiHiomerocH Euvernil ycKopneTcn. 3. BjiHHHHe npenapaTOB Methylpyrimal H Euvernil MOJKHO oStHCHHTb H B O H K O : а) TopMOJKeHHe TySyjiapHoro Bhine.neHMH npenapaTa Acetyl-Methylpyrimal npenapaTOM

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Acetyl-Euvernil npenapaTOM Methylpyrimal, ecjin 06a cyjif>({ioH A M H N A BHUCJIHIOTCH Ty6yjiycaMH. б) KoMneTaTHBHoe TopMomeroie BCJieacTBHe copeBHOBaHHH no cenpenHH H3 T} r 6yjiycoB.

A c t a biol. med. germ.. Band 1, Seite 101—108 (1958) Deutsche Akademie der Wissenschaften zu Berlin, Institut für Medizin und Biologie, Arbeitsbereich Klinische Medizin (Direktor: Prof. Dr. H . G U M M E L )

Untersuchungen mit der P 32 - Indikatormethode über die Hemmwirkung v o n N - O x y d - L o s t (Mitomen) auf Walker-Carcinom- und Normalgewebe der Ratte H . ERNST, H . W . RATHENOW

und

H . J.

EICHHORN

(Eingegangen am 26. 9. 57)

Zusammenfassung E s werden Versuche beschrieben, bei denen mit Hilfe der P 32 -Markierung Untersuchungen über die Neubildungsrate der Trichloressigsäure-unlöslichenP-Fraktion des Walker-Carcinoms und anderer Gewebe der Ratte durchgeführt wurden. Der Vergleich mit N-Oxyd-Lost behandelter und unbehandelter Tumor-Ratten . gestattet Aussagen über die .Wirkungsgröße des Chemotherapeuticums. Die Ergebnisse zeigen deutlich den hemmenden Effekt auf die untersuchte Fraktion des Tumorgewebes. Hemmungen in der gleichen Größenordnung fanden wir am Knochenmark, kaum dagegen in Leber und Muskulatur. Es liegt daher nahe, anzunehmen, daß beim Mitomen eine ausgesprochene Tumorspezifität nicht vorliegt, sondern daß sich seine Wirkung auf Gewebe mit hohem DNS-Stoffwechsel ganz allgemein erstreckt. Möglichkeiten der Untersuchungen menschlicher Tumoren mit der Indikatormethode werden abschließend erwähnt.

Die Beurteilung der Wirkung von Tumorhemmstoffen in der experimentellen Krebsforschung stößt auf zahlreiche Schwierigkeiten. Die Uneinheitlichkeit der Ergebnisse bei der Anwendung der gleichen Verbindungen als Chemotherapeutica gegen Tiertumoren, dürfte z.T. auf der Unzuverlässigkeit der Methoden zur Beurteilung ihrer Wirkung beruhen. Ein relativ einfaches Kriterium ist die Überlebensrate von behandelten und unbehandelten Kollektionen. Dieser Vergleich liefert jedoch signifikante Ergebnisse erst dann, wenn große Serien untersucht worden sind. Ein Nachteil der Methode ist die erforderliche oft lange Beobachtungszeit, die Möglichkeit des Auftretens interkurrenter tödlicher Erkrankungen und die Abhängigkeit des Ergebnisses von der Zahl der implantierten Tumorzellen. Auf die bei großen Serienversuchen entstehenden Kosten sei ebenfalls hingewiesen. Der Größenvergleich von Tumoren behandelter und unbehandelter Tiere hat für die Beurteilung eines Chemotherapeuticums ähnliche Nachteile.

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H . ERNST,

H. W.

RATHENOW,

H . J.

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Außerdem ist die Größenmessung der meist sehr unregelmäßig begrenzten Geschwülste schwierig und ungenau. Eine gewisse Verbesserung dieser Methode ist durch die Nachformung des Tumors durch Plastilin ( D R U C K REY [2]) möglich. Die vergleichende Gewichtskontrolle von experimentellen Tumoren läßt ebenfalls keine ausreichend genaue Beurteilung des therapeutischen Effektes zu. Besonders durch nekrotische bzw. eingeschmolzene Gewebsbezirke entstehen hierbei oft größere Fehler. Ferner besteht auch hier wieder eine direkte Abhängigkeit von der Zahl der implantierten Tumorzellen. Die Messung der Fermentaktivität als Kriterium für die Tumorhemmung setzt genaue Kenntnisse des Angriffspunktes der zu untersuchenden Substanz voraus und fällt daher in den meisten Fällen von vornherein aus. Quantitative Rückschlüsse auf Grund des histologischen Bildes sind im allgemeinen nicht möglich. Die mikroskopische Betrachtung gestattet höchstens die Beurteilung gewisser sekundärer Veränderungen der Zellmorphologie (blasige Cytoplasmaveränderungen, Veränderungen an den Chromosomen, Kernzerfall und Cytolyse). Gegenüber den bisher aufgeführten Methoden ist die Zählung der Mitosen im Tumor ein zuverlässigeres Kriterium für die Wachstumspotenz des Gewebes ( Y O S H I D A [10], I S H I D A T E [6] u. a.). Allerdings sind zur Erlangung sicherer Ergebnisse zahlreiche Serienschnitte nötig, und die mikroskopische Auswertung setzt ein speziell geschultes Personal voraus. Für die Methode spricht die Unabhängigkeit von der Anzahl der implantierten Tumorzellen. Die aufgeführten gebräuchlichen Verfahren haben also entweder den Nachteil zu geringer Genauigkeit oder erfordern zu großen Aufwand. Ein gutes Testverfahren müßte folgende Forderung erfüllen: 1. exakte Meßbarkeit der Stoffwechselaktivität des Tumors, 2. Möglichkeit des quantitativen Vergleichs mit Stoffwechselgrößen anderer Gewebe. (Wir verstehen darunter beispielsweise den Vergleich der Stoffwechselaktivität des Tumors mit der des Knochenmarks, der Leber oder eines anderen Gewebes und damit den Grad der Tumorspezifität, z. B. eines Chemotherapeuticums, beurteilen zu können), 3. geringe Fehlerbreite und damit die Möglichkeit, in kleinen Serien zu arbeiten, 4. schnelle Durchführbarkeit der Methode (gegebenenfalls auch durch Hilfskräfte). Die Anwendung von Radiophosphor P 32 zur Messung der Neubildungsrate von phosphorhaltigen Tumorbausteinen vor und nach chemotherapeutischer Behandlung, bzw. bei behandelten und unbehandelten Tieren, schien uns als Grundlage für eine solche Testmethode geeignet. So konnte z. B. schon v. H E V E S Y [5] (1948) nachweisen, daß die Röntgenbestrahlung eines Tumors eine Hemmung der DNS-Neubildung bewirkt. Im Laufe der folgenden Jahre wurde in dieser oder ähnlicher Richtung

Hemmwirkung von N-Oxyd-Lost auf Carcinom- und Normalgewebe der R a t t e

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eine unübersehbare Anzahl von Untersuchungen durchgeführt, jedoch u. W. Routinemethoden zur Testung von Tumorhemmstoffen nicht entwickelt. Prinzip Das Wachstum eines Gewebes muß zwangsläufig mit einer Vermehrung seiner materiellen Substanz einhergehen. Die Neubildungsrate dieser materiellen Substanz sollte daher Ausdruck der Wachstumsgröße schlechthin sein. Durch Messung der Neubildungsrate von Tumorbausteinen sollte daher eine Aussage über die Wachstumsgröße des Tumors möglich sein. Einen wichtigen Bestandteil jeder Zelle und somit auch der Tumorzelle stellen organische Phosphorverbindungen, wie z. B. Nucleoproteide und Phosphatide dar, ohne deren Vermehrung ein echtes Wachstum nicht denkbar ist. Wir entschieden uns daher zu Messungen der Neubildungsraten der genannten Phosphorverbindungen, insbesondere auch deshalb, weil durch diese Methode die anfangs geforderten Bedingungen an einen derartigen Test weitgehend erfüllt werden. Nach M A U R E R und Mitarbeitern [8] kann man mit Hilfe der Indikatormethode die Neubildungsrate einer chemischen Verbindung berechnen, wenn man einerseits die mittlere spezifische Aktivität der Vorstufe, aus der diese Verbindung synthetisiert wird, während der Versuchsdauer kennt und andererseits die Radioaktivität der gebildeten Verbindung am Ende des Versuches gemessen hat. Diese Methode erfordert eine Reihe von Einzelbestimmungen und schien uns daher für Reihenversuche ungeeignet. Die besonders aus der angelsächsischen Literatur bekannte Bestimmung der relativen Umsatzrate birgt zwar einige Fehlermöglichkeiten und verzichtet auf absolute Werte, ist aber methodisch viel einfacher und schneller zu erreichen (vgl. auch M E I S S N E R [9].

Die Versuchstiere werden 2 oder 3 Stunden nach Injektion des markierten Indikatorpräparates getötet, die entsprechenden Organe entnommen, die zu untersuchenden Fraktionen chemisch abgetrennt und deren Radioaktivität gemessen. Außerdem wird die spezifische Aktivität der Vorstufe dieser Fraktionen bestimmt. Der Quotient aus Radioaktivität des Syntheseproduktes und spezifischer Aktivität der Vorstufe ist dann ein relatives Maß für die Neubildung der untersuchten Fraktion. Wir haben die so gewonnenen Ergebnisse mit denen nach der Methode von M A U R E R [8] verglichen und bezüglich der hier geschilderten Versuche eine gute Proportionalität feststellen können. Weiter haben entsprechende Vorversuche gezeigt, daß es im Rahmen unserer Fragestellung nicht unbedingt nötig ist, die Neubildungsrate der einzelnen phosphorhaltigen Fraktionen zu messen. Wir haben daher auf die chemische Fraktio-

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H . ERNST,

H. W.

RATHENOW,

H . J.

EICHHORN

nierung verzichtet und lediglich die Neubildung der Trichloressigsäure -unlöslichen Phosphorverbindungen insgesamt untersucht. (Trichloressigsäure weiterhin als TCS abgekürzt). Die P 32 -Aktivität dieser TCS-unlöslichen Phosphorverbindungen, dividiert durch die spezifische Aktivität der anorganischen Vorstufe, ist nun das relative Maß für die Neubildung der im wesentlichen aus Phosphatiden und Nucleinsäuren bestehenden Sammelfraktion. Es wurde an anderer Stelle auseinandergesetzt, inwiefern man berechtigt ist, die säurelösliche Fraktion des Serums hier als Vorstufe zu betrachten, wie es in der Literatur üblich ist ( E R N S T [3], M E I S S N E R [9]). Wir verstehen unter der relativen Neubildungsrate (A) der TCS-unlöslichen P-Fraktionen eines Gewebes also den Quotienten: P 3 2 - A k t i v i t ä t d . T C S - u n l ö s l i c h e n F r a k t i o n (z.B. d. T u m o r s ) P 3 2 - A k t i v i t ä t d. T C S - l ö s l i c h e n S e r u m f r a k t i o n mg Phosphor d. TCS-löslichen Serumfraktion Unter P 32 -Aktivität ist die gemessene Radioaktivität in Prozent der applizierten Gesamtaktivität zu verstehen. Alle Werte beziehen sich auf Messungen drei Stunden nach Verabfolgung des Indikatorpräparates. Methodik Auf insgesamt 50 männliche Albinoratten mit einem Gewicht von 200 g ± 10% wurde, nachdem sie auf konstante Kost und Umgebungsbedingungen gesetzt waren, Walker-Carcinom i. m. transplantiert. Vom 5. Tage an erhielten 25 Tiere täglich 0,5 mg Mitomen (N-Oxyd-Lost) i. v. Die restlichen 25 Tiere blieben unbehandelt und dienten als Kontrolle. Die Messung der Neubildungsrate der TCS-unlöslichen Phosphorverbindungen erfolgte nach4-, 5-, 6-und gtägiger Behandlung an je 5 Tieren und jeweils 5 unbehandelten Kontrolltieren. Zu diesem Zweck injizierten wir 10 /iC P 32 -Natriumphosphat (trägerarm) intraperitoneal. 3 Stunden später wurden die Tiere in Äthernarkose getötet. Blut, Tumor, Leber, z. T. auch Knochenmark- und Muskelgewebe wurden entnommen und sofort eingefroren. Später wurde das Vollblut zentrifugiert und die festen Gewebe nach Wägung homogenisiert. Serum bzw. Gewebshomogenisate konnten dann in TCS-lösliche und unlösliche Fraktionen getrennt werden. Alle Arbeiten erfolgten im Kälteraum. Die TCS-unlöslichen Gewebsfraktionen, sowie die TCS-lösliche Serumfraktion wurden dann mit Schwefel- und Salpetersäure verascht und die Veraschungsprodukte auf feste Volumina aufgefüllt. Die Messung der P 3 2 -Radioaktivität erfolgte im Flüssigkeitszählrohr. Der Gesamtphosphor des Blutserums wurde nach F I S K E und S U B B A K O W [ 4 ] bestimmt. Beim Knochenmark waren Einzeluntersuchungen wegen der geringen Menge des Materials nicht möglich. Die gewonnenen Proben von je 5 Tieren mußten daher zusammen verarbeitet und gemessen werden.

Ergebnisse Zunächst wurde die Neubildungsrate der TCS-unlöslichen Phosphorfraktion des Tumors von Ratten, die 9 Tage wie o. a. behandelt worden waren und von entsprechenden Kontrolltieren gemessen. Die Ergebnisse sind durch graphische Darstellung in Abb. 1 wiedergegeben.

Hemmwirkung von N-Oxyd-Lost auf Carcinom- und Normalgewebe der Ratte

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Die Höhe der Säulen entspricht der mittleren relativen Neubildungsrate der TCS-unlöslichen Tumorfraktion, einmal der mit Mitomen behandelten und zum anderen der unbehandelten Kontrolltiere. Es zeigt sich, daß nach der Behandlung die Neubildung der angegebenen Tumorfraktion um etwa 90% gehemmt ist. Dieser Hemmungseffekt zeigte sich auch in etwa der gleichen Größenordnung, jedoch mit erheblich stärkeren Einzelschwankungen (bis zu ± 100%), bei der Bestimmung ®

®

P3Z-Akt. Tumor spez.Akt.Serum

der Größe und des Gewichtes der Tumoren. Dem gegenüber beobachteten wir mit der Indikatormethode lediglich Schwankungen bis zu maximal ±

15%-

Zur Kontrolle der Leistungsfähigkeit der Methode haben wir in gleicher Weise zu einem Zeitpunkt, wo an Gewicht und Größe noch keine signifikanten Veränderungen zu beobachten waren, nach 4 tägiger MitomenBehandlung, die Messungen durchgeführt. Setzt man die relative Neubildungsrate der unbehandelten Kontrolltiere willkürlich gleich 100, so ergibt sich für die behandelten Ratten ein Wert von 68 ± max. 11,7. Die Tumorhemmung betrug in diesem Falle also 32%. Entsprechende Versuche nach 5- und 6 tägiger Behandlung ergaben Hemmungen der relativen Neubildungsrate der TCS-unlöslichen P-Tumorfraktion von 41 bzw. 43%.

LOÖ

H.ERNST,

H . W . R A T H E N O W ,

H.J.EICHHORN

In Abb. 2 sind die geschilderten Versuche noch einmal graphisch dargestellt. In der Abb. sind die jeweiligen relativen Neubildungsraten (NBR) der TCSunlöslichen Tumorfraktion als Säulen aufgezeichnet; die Abszisse gibt die Behandlungsdauer in Tagen an. Der Wert bei null Tagen entspricht dem Mittel aus 20 unbehandelten Tieren 14 Tage nach Tumorimplantation. Man erkennt in der Abb. deutlich die zunehmende Tumorhemmung in Abhängigkeit von der Behandlungsdauer und damit der Gesamtdosis des Mitomens. Wie bereits in der Einleitung erwähnt wurde, gestattet die Methode neben der Wachstumsrate des Tumors auch diejenige der anderen Gewebe zu bestimmen, um daraus Schlüsse auf den Grad der TumorspezifiP 3!-Akt.

Tumor

0

+ 5

Tage Mit omen - Behdndlung

ff

9

Abb. 2

tät eines Tumorhemmstoffes zu ziehen. Zu diesem Zweck untersuchten wir neben der relativen N B R der TCS-unlöslichen Fraktion des Tumors auch die der Leber, des Muskels und des Knochenmarkes von 7 Tage mit Mitomen vorbehandelten Ratten und entsprechenden Kontrolltieren. Die Ergebnisse sind in Tab. 1 wiedergegeben. Tabelle 1 Relative Neubildungsrate der TCS-unlöslichen P-Fraktionen von Tumor, Leber, Knochenmark und Muskel bei behandelten und unbehandelten Tieren

N-Oxyd-Lost unbeh. Kontr.

Tumor

Leber

57.6 100

91,8 100

Knochen- 1 Muskel mark 49,o 100

90,0 100

Aus den in Spalte 1 angegebenen Werten für die relative N B R mitomen" behandelter Tiere gegenüber den Kontrolltieren ergeben sich für Tumor

H e m m w i r k u n g v o n N - O x y d - L o s t auf Carcinom- und Normalgewebe der R a t t e

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und Knochenmark Hemmungen um 50%, für Leber und Muskel dagegen nur von ca. 10%. Diskussion In den geschilderten Untersuchungen wurde die radioaktive Indikatormethode zur Messung der Wachstumsrate vom Walker-Carcinom der Ratte verwendet. Wie die Ergebnisse zeigen, kann man mit dieser Methode Neubildungsraten bestimmter Fraktionen eines Gewebes mit relativ großer Genauigkeit messen. Damit ist die Möglichkeit gegeben, die Wirkung von Tumorhemmstoffen zu messen und den Grad ihrer Spezifität bzw. ihren Einfluß auf die Normalzellen exakt festzustellen. Wir verwendeten N-Oxyd-Lost (Mitomen-Asta) in einer täglich i. v. verabfolgten Dosis von 0,5 mg bis zu einer Gesamtmenge von 4,5 mg (vgl. dazu auch D R U C K R E Y [1]). Unter dieser Behandlung sank die relative N B R der TCS-unlöslichen P-Fraktion des Tumors mit zunehmender Gesamtdosis kontinuierlich ab. Es ist sehr wahrscheinlich, daß auch die Neubildung der übrigen Tumorbausteine in entsprechender Weise absinkt und damit das Wachstum des Gesamttumors gehemmt wird. Diese hypothethische Überlegung wird durch die Beobachtung gestützt, daß auch Gewicht und Größe der Tumoren sich gegenüber den unbehandelten Kontrolltieren in der gleichen Größenordnung verändern. Neben der Hemmung der relativen Neubildungsrate der TCS-unlöslichen P-Fraktion des Tumors konnte unter den gleichen Bedingungen auch eine Hemmung der TCS-unlöslichen P-Fraktion anderer Gewebe nachgewiesen werden. Besonders das Knochenmark wurde in der gleichen Größenordnung wie der Tumor gehemmt, Leber- und Muskelgewebe dagegen nur unwesentlich. Diese Tatsache wäre verständlich, wenn die Wirkung des Mitomens über den DNS-Stoffwechsel zustande käme (ISHIGAMI [7]). Danach würden alle Gewebe mit hohem DNS-Stoffwechsel in gleicher Weise der Wirkung des Mitomens unterliegen. Ausgehend von unseren Ergebnissen müssen wir annehmen, daß eine Tumorspezifität des Mitomens nicht vorliegt. Wir haben mit der o. a. Methode zunächst lediglich Untersuchungen über die Wirkung des Mitomens auf das Walker-Carcinom der Ratte angestellt. In einigen Versuchen verwendeten wir auch das Jensen-Sarkom und stellten eine völlige Übereinstimmung der Ergebnisse fest. Es ist vorgesehen, in gleicher Weise auch maligne Tumoren des Menschen zu untersuchen. So ergäbe sich vielleicht die Möglichkeit, die Frage des Effektes einer praeoperativen Röntgenbestrahlung des Bronchial- oder des Mamma-Carcinoms zu klären. Die dabei nötigen P 32 -Dosen müßten allerdings um etwa loo/i C liegen und sind damit nicht mehr ganz unbedenklich anwendbar. Auch die chemotherapeutische Wirkung auf Tu-

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H . ERNST,

H . W . RATHENOW,

H . J . EICHHORN

moren, die einer Probeexcision leicht zugänglich sind, k ö n n t e kontrolliert werden. E s scheinen sich also auch b e i m Menschen durch B e n u t z u n g der I n d i k a t o r m e t h o d e zur B e u r t e i l u n g der W a c h s t u m s r a t e v o n G e s c h w ü l s t e n einige Möglichkeiten z u ergeben.

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10] YOSHIDA, T.: VI. Internat. Cancer Congress Sao Paulo 1954.

Summary Experiments are described in which investigations of the rate of rejuvenation of the TCA-insoluble P-fraction of Walker carcinoma and other tissues of the rat were carried out by means of P32-labeling. Comparison with untreated tumor rats and those treated with N-oxyde-lost permits deducations about the magnitude of the effects of the chemotherapeutic. The results show clearly the inhibiting effect on the fraction of the tumor investigated. Pe3K>Me onbiTH,

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A c t a biol. med. germ., Band 1, Seite 109—113 (1958) Deutsche Akademie der Wissenschaften, Institut für Medizin und Biologie, Berlin-Buch — A B Pharmakologie (Dir.: Prof. Dr. F. J U N G )

Beeinflussung von Mäuse-Ascites-Tumoren durch Benzimidazolderivate 1. Mitteilung K.

RINTELEN und W .

KNOBLOCH

(Eingegangen am 27. 9. 57) Zusammenfassung 35 Benzimidazol-Derivate und 12 andere Stoffe wurden auf ihre Wirkung auf das EHRLicHsche Mäuseascites-Carcinom untersucht. /?,/?'-Dichlordiäthyl-aminomethyl-benzimidazol hemmte eindeutig, l-Benzyl-2-chlormethyl-benzimidazol in gewissem Ausmaß das Wachstum des Ascites-Tumors.

Die Behandlung der bösartigen Geschwülste des Menschen mit chemischen Stoffen hat bisher nur ziemlich geringe Erfolge aufzuweisen, insbesondere wenn man damit die fast unübersehbare Flut der am experimentellen Tiertumor geprüften Stoffe vergleicht. Trotzdem bleibt die Suche nach neuen cytostatischen Stoffen im Tierversuch gerechtfertigt und unerläßlich. Dabei ist es aber erforderlich, bei der Prüfung im Tierversuch stets ein schon bei Mensch und Tier erprobtes Cytostaticum vergleichsweise mit zu untersuchen ( O E T T E L [2]). Wir wandten uns aus bestimmten Gedankengängen heraus der Prüfung von Benzimidazolabkömmlingen zu. Eine große Reihe bisher meist in der Literatur nicht beschriebener Benzimidazole wurde synthetisiert ( K N O B L O C H und R I N T E L E N [ 1 ] ) . Von ihnen wurden 35 in ihrer Wirkung auf das EHRLicHsche Mäuseascites-Carcinom (EMAC) geprüft. Gegen die Verwendung gerade dieses Tumors bestehen zwar mehrere auch uns bekannte Einwände (vgl. z. B. [4]); wir entschlossen uns aber trotzdem aus manchen Gründen zu seiner Verwendung. Dabei war die Möglichkeit der Gewinnung von Tumorzellen ohne störendes Bindegewebe, nekrotische Teile usw. im Hinblick auf Untersuchungen des Stoffwechsels dieser Zellen unter dem Einfluß von Cytostatica mit der WARBURG-Methodik mitbestimmend. Neben den 35 Benzimidazolen wurden weitere 12 andere Substanzen geprüft, darunter als Vergleichssubstanz das 2,5-Bis-äthylenimino-hydrochinon 1 ( M A R X E R [7], L O U S T A L O T , S C H Ä R und M E I E R [8]). Für die freundliche Überlassung einer Versuchsmenge des Stoffes sei auch an dieser Stelle der C I B A AG. in Basel bestens gedankt

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K . RINTELEN,

W.

KNOBLOCH

Methodik Männliche Mäuse etwa gleichen Gewichts erhielten intraperitoneal 0,2 ml der Ascitesflüssigkeit einer Maus, die 10—13 Tage vorher ebenso beimpft worden war (gelegentlich wurde Mischascites von zwei Mäusen verwendet). Je nach Zellzahl des Ascites wurde dieser unverdünnt oder entsprechend mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt injiziert. Die Behandlung mit dem zu prüfenden Stoff erfolgte in einigen Fällen durch intraperitoneale Zufuhr. Da dies aber Störfaktoren unkontrollierbarer Art im Bauchraum bei der Ascitesentwicklung mit sich bringen konnte, wurde in der Mehrzahl der Fälle die subcutane Injektion vorgezogen. Dosierung und Zeitintervalle wurden vielfältig variiert. Beobachtet wurden: Allgemeinverhalten, Körpergewicht, Ascitesmenge, Zellzahl und Überlebensdauer. In der Mehrzahl der Fälle wurden die Tiere am 11., 12. oder 13. Tage getötet, sonst wurde der Spontantod abgewartet. Zum Vergleich wurde in jedem Versuch eine Kontrollreihe von Tieren angesetzt, die nur Ascites (gleichen Ursprungs wie die Versuchstiere) erhielten. Die Messung der Ascitesmenge geschah durch Absaugung mit Hilfe einer zu diesem Zwecke konstruierten kleinen Apparatur aus der vorsichtig eröffneten Bauchhöhle mittels Wasserstrahlpumpe in eine dazwischengeschaltete Mensur. Unter den geprüften Stoffen hatte — wie zu erwarten —• nur in den seltensten Fällen ein Stoff eine Hemmwirkung auf das EMAC, die zu einer näheren Prüfung aufforderte; es soll hier nur über diese Stoffe berichtet werden. Die in der Literatur gelegentlich angegebenen „HemmWirkungen" bis zu 20 und 25%lassen sich beim E M A C insbesondere bei i. p. Zufuhr der Hemmstoffe manchmal verhältnismäßig leicht erreichen, sind aber oft nicht reproduzierbar. Auf die Gründe hierfür soll hier nicht eingegangen werden. Ergebnisse In unseren Versuchen ließ sich durch 1 -Benzyl-2-chlormethyl-benzimidazolchlorhydrat (BI 3) eine hemmende Wirkung auf das EMAC-Wachstum erzielen. Sie lag, gemessen an der Hemmung der Gewichtszunahme, bei 3 5 — 4 0 % ( P < o , o i ) bei einer Dosierung von 70 mg/kg einmalig oder 30 bis 50 mg/kg wiederholt gegeben. Gewichtsverluste infolge toxischer Wirkungen von B I 3 traten bei dieser Dosierung nicht ein. Die Versuche wurden an insgesamt 81 Tieren durchgeführt (ausschließlich der Kontrolltiere). D a B I 3 nicht wasserlöslich ist, wurde es mit Hilfe von Diäthylenglykol in Lösung gebracht. Die dann injizierte Glykolmenge war nach den Angaben der Literatur und nach eigenen Vorversuchen ohne störenden Einfluß. Die LD 50 des B I 3 lag bei i. p. Gabe für die Maus bei 100 mg/kg. Im Blutbild war eine schwache Anämie und eine geringgradige Leukopenie nach B I 3 festzustellen.

Beeinflussung von Mäüse-Ascites-Tumoren durch Benzimidazolderivate

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In wenigen Versuchen ließ sich das Angehen des E M A C durch B I 3 vollständig verhindern; so lebten in 2 Versuchsreihen die 11 Tiere noch nach 70 Tagen, während die 9 Kontrolltiere wie üblich nach 1 3 — 1 9 Tagen gestorben waren und ausnahmslos Ascites aufwiesen. B e i den am 70.Tage getöteten Tieren war kein Ascites und keine Knötchenbildung im B a u c h raum nachweisbar. Eine orientierende P r ü f u n g des B I 3 an Mäusen mit Sarkom 37 ließ keine W i r k u n g des Stoffes auf dieses Sarkom erkennen.

Abb. 1. Gewichtsverlauf und Ascitesmenge bei Mäusen unter Einfluß von BI 39 Einer kurzen E r w ä h n u n g bedarf noch das 2-Chlormethyl-benzimidazolchlorhydrat (BI 2). Dieser Stoff förderte einerseits das W a c h s t u m des E M A C , daneben führte er in einer Reihe von Fällen zu diffuser Metastasierung des Tumors im ganzen Mäusekörper, wie sie sonst nie beobachtet werden konnte (abgesehen natürlich von der Tumoransiedlung bei i. v . Zufuhr in die Schwanzvene). E i n Grund für diese fördernde W i r k u n g des B I 2 ließ sich bisher nicht ermitteln. Eine Beschleunigung des E M A C W a c h s t u m s konnte K O C H durch Cysteamin erreichen [3]. Zwei weitere geprüfte Benzimidazole enthielten N-Lost. B e i der bekannten W i r k u n g des N-Lost auf viele experimentelle Tiertumoren und auch am Menschen war v o n vornherein eine hemmende W i r k u n g auf das E M A C zu erwarten (vgl. z. B . [9]). Diese H e m m Wirkung trat beim ß ,ß'-Dichlordiäthyl-aminomethyl-benzimidazol-JlCl (BI 39) sehr deutlich in Erscheinung. Die Versuche wurden an insgesamt 1 1 5 Mäusen durchgeführt (ausschließlich der Kontrolltiere). Die W i r k u n g w a r dosisabhängig und erfolgte nur, wenn das B I 39 mehrmals gegeben wurde; die erste Gabe mußte möglichst zeitig, spätestens am 3. T a g e nach der Überimpfung, erfolgen; später wurde die W i r k u n g unsicher. A l s Beispiel für den Verlauf vieler Versuche sei in der A b b i l d u n g eine K u r v e wiedergegeben, die Gewichtsverlauf und Ascitesmenge zeigt (Mittel aus je 8 Tieren). Der stark unterschiedliche Gewichtsverlauf der beiden Tiergruppen ist daraus deutlich zu ersehen (die geringe Gewichtsabnahme der Versuchstiere ist auf die bei

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K.

RINTELEN,

W .

KNOBLOCH

der gewählten Dosierung unerhebliche Toxicität desBl39 zurückzuführen.) Auch die Ascitesmenge war im Mittel stark verringert; während alle Kontrolltiere Ascites aufwiesen, war nur bei rund 50% der Versuchstiere Ascites vorhanden. Die LD 50 von B I 39 lag bei frisch hergestellter Lösung bei i. p. Gabe zwischen 80 und 100 mg/kg; war die Lösung 4 Tage alt oder älter, so war ihre Toxicität geringer, die Hemmwirkung auf das EMAC dagegen größer; nach dieser Feststellung wurden die weiteren Versuche nur noch mit mindestens 4 Tage alten Lösungen durchgeführt. Wie wir feststellen konnten, wandelte sich der feste Körper HCl

H

beim Stehen in wäßriger Lösung langsam um in: rw

n

_

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Danach erfolgt vermutlich eine Dimerisation (vgl. hierzu auch die Angaben von S C H M I D T [6].). Im Tierversuch war es möglich, den Mäusen das B I 39 meist ohne allzu große Reizwirkung s. c. zu injizieren; in der Klinik ist es notwendig, NLost-Präparate i. v. zu geben. Die wesentlich geringere Toxicität des B I 39 gegenüber dem N-Lost selbst (die über die Molgewichtsverhältnisse hinausgeht) und seine deutliche Hemmwirkung lassen es wünschenswert erscheinen, die Versuche mit diesem Stoff an anderen Tiertumoren fortzusetzen, um einen Hinweis dafür zu bekommen, ob sich vielleicht auf diesem Wege über das B I 39 ein auch später in der Klinik verwertbarer Anwendungsweg ergibt. Versuche, N-Lost-Verbindungen mit wesentlich verringerter Toxicität herzustellen, machten u. a. auch K E L L NER und Mitarbeiter [5]. Auf das 2 N-Lost-Gruppen enthaltende 2,6-Bis{ß,ß'-Dichlor diäthylaminomethyl)benzo-i ,2,4,5-bisimidazol-dihydrochlorid (BI 48) muß noch kurz eingegangen werden. Die LD 50 dieses Stoffes liegt bei 90 mg/kg (Maus, i. p. Gabe). Entgegen unseren Erwartungen war bei der Prüfung am EMAC nicht die geringste Beeinflussung des Wachstums feststellbar; die Gewichtskurven der Versuchstiere (31 Mäuse) und der Kontrolltiere (22 Mäuse) waren in ihren Mittelwerten oft beinahe gleichlaufend. Auch die Ascitesmengen waren kaum unterschiedlich.

Beeinflussung v o n Mäuse-Ascites-Tumoren durch Benzimidazolderivate

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OETTEL,

H.

SASSENRATH, ETHELDA M. GREENBERG;

N.,

DONALD

Cancer Res.

15,

C . MORRISON,

ANN- M . LARSON

and

DAVID

7 5 5 — 5 9 (1955).

Summary 35 derivatives of benzimidazole and 12 other compounds were investigated with respect to their effects on the Ehrlich mouse ascites carcinoma, /?, /J'-dichlordiethyl-amino-methyl-benzimidazole clearly caused inhibition of the growth of the ascites tumor, while i-benzyl-2-chloromethyl-benzimidazole inhibited only to a certain extent.

Pe3i0Me 35 coeflHHeHHft 6eH3HMHna30Jiaii 1 2 n p y r a x BemecTB HCCJieayioTCH B OTHOIUCHHH HX AeÜCTBHH Ha MblUIHHyiO OllyXOJIb 3pjIHXa. ß, /?,-JlHXJI0pHH3THJI-aMHH0MeTHJI6eH3HMnna30Ji 3anep>KHBaji HeconmeHHo, ji-6eH3HJib-r-xjiopMeTHJib-6eH3HMHaa30Ji nacTHiHO pocT acuHTOBOft onyxojiH.

S A c t a biol. med. germ. H e f t l

Kurzmitteilungen Acta biol. med. germ. Band 1, Seite 1 1 4 — 1 1 6 (1958) Deutsche Akademie der Wissenschaften, Berlin-Buch, Institut für Medizin u. Biologie, Arbeitsbereiche Pharmakologie (Dir.: Prof. Dr. F . J U N G ) und Biophysik (Dir.: Prof. Dr. W. F R I E D R I C H ) sowie Arbeitsstelle für Kreislaufforschung (Leiter: Prof. Dr. A. W O L L E N B E R G E R ) -

Die paramagnetische Resonanz einiger freien Radikale aus der Gruppe der Diarylstickstoffoxyde G . SCHOFFA,

B . E . WAHLER,

H . G . THOM

Eingegangen am 30. 9. 57)

Bei Untersuchungen über die Vorgänge bei der Methämoglobinbildung durch aromatische Stickstoffbindungen hatten sich Hinweise auf die Beteiligung freier Radikale ergeben, ihre Existenz konnte direkt jedoch nicht belegt werden. Da diese Radikale vermutlich Stickstoffoxydstruktur aufweisen, haben wir einige stabile Stickstoffoxyde nach ihrer paramagnetischen Resonanz untersucht. Von den freien Radikalen der Gruppe der Diarylstickstoffoxyde wurde bisher nur das 4,4'-dimethoxy-diphenylstickstoffoxyd (Di-p-Anisylstickstoffoxyd) von mehreren Seiten auf die paramagnetische Resonanz untersucht [1], [2], [3], [4]. Um den Einfluß der Substituenten auf die paramagnetische Resonanz und damit auf das freie Elektron zu prüfen, haben wir 4,4'-dimethoxy-diphenylstickstoffoxyd

(I)

4,4'-diaethoxy-diphenylstickstof f oxyd

(II)

4,4'-dinitro-diphenylstickstoffoxyd

(III)

synthesiert und die paramagnetische Resonanz bei ca. 9300 MHz und bei einer Feldstärke von ca. 3300 Gauß untersucht. Die Meßergebnisse wurden auf das bisher sehr genau gemessene i,i-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) (g = 2,0036, Halbwertsbreite der Linie Ii = 2,75 Oe) bezogen [1], [5]. Zum Vergleich und zur Übersicht haben wir auch eine Aufnahme des DPPH unter den gleichen Meßbedingungen hinzugefügt. Aus den beigefügten Abbildungen ist zu erkennen, daß sämtliche Diarylstickstoffoxyde wesentlich größere Halbwertsbreiten der para-

Kurzmitteilungen

115

magnetischen Resonanz zeigen als D P P H . D P P H (H = 2,75 Oe): fr. Radikal (I) (II) (III)

H 16,8 16,4 18,0

Sie beträgt, bezogen aiif

andere Autoren H Lit. 15.7

m.[5] —

Es zeigt sich, daß die Substitution der Methoxygruppen in (I) durch Aethoxygruppen in (II) die Halbwertsbreite der Linie im Bereich der Fehlergrenzen nicht ändert.

II

III

Da der sterische Effekt durch diese Substituenten in 4,4'-Stellung vernachlässigt werden kann, dürfte die 'breitere Linie in (III) unmittelbar auf den Einfluß der Nitrogruppe, auf das an der NO-Gruppe lokalisierte freie Elektron, zurückgeführt werden. Bei ungehinderter Spin-Spin-Wechselwirkung der freien Elektronen wäre bei D P P H theoretisch eine Linienbreite von ca. 100 Oe zu erwarten [1], [2]. Die außerordentlich schmale Resonanz des DPPH wird durch die Austauschkräfte zwischen den freien Elektronen der einzelnen Moleküle untereinander erklärt [6], Diese theoretische Überlegung wird durch die Tatsache gestützt, daß in stark verdünnten Lösungen eine wesentlich breitere Linie zu finden ist [3], [7]. Unsere Messungen zeigen also, daß

n6

Kurzmitteilungen

die Austauschkräfte zwischen.den freien Elektronen der Radikale (I), (II), (III) wesentlich geringer sind als bei DPPH. Der g-Faktor wurde bis zur zweiten Dezimale bestimmt und beträgt für alle Substanzen 2,00. Eine Hyperfeinstruktur konnte bei allen hier untersuchten Diarylstickstoffoxyden bis zur Temperatur der flüssigen Luft nicht beobachtet werden, ähnlich wie bei anderen Autoren [1]—[5] bei (I). Diese Tatsache spricht für die Migration des freien Elektrons in diesen Radikalen. Diese Befunde, die auf eine stärkere Bindung des freien Elektrons hinweisen, stützen wesentlich die Annahme, daß die sog. „antibonding" jr-Elektronenbahn von freien Elektronen besetzt und seine große Energie durch die Bildung einer normalen yr-Bindung zwischen N und 0 teilweise kompensiert, wird. Dadurch ist .das freie Elektron stärker an die NO-Gruppe gebunden, was die geringeren Austauschkräfte und größere chemische Stabilität dieser Radikale erklärt. Wir danken Herrn G. THÜR für die technische Hilfe bei der Durchführung der Messungen. Literatur [1] [2] [3] [4] [5] [6]

HOLDEN, A . , C . K I T T E L , F . MERRIT, W . YAGER: P h y s . R e v . 7 7 , 1 4 7 (1950). HOLDEN, A . W . YAGER, F . MERRIT: J . e h e m . P h y s . 19, 1 3 1 9 ( 1 9 5 1 ) . HUTCHISON, C. J r . , R . PASTOR, A . KOWALSKY: J . e h e m . - P h y s . 20, 5 3 4 ( 1 9 5 2 ) . B I J L , D., A . ROSE-INNES: P h i l . M a g . , S e r . 7, 44, 1 1 8 7 ( 1 9 5 3 ) . HOLDEN, A . , C. KITTEL, F . MERRIT, W . YAGER: P h y s . R e v . 7 5 , 1 6 1 4 (1949). GORTER, C., J . H . v a n VLECK: P h y s . R e v . 7 2 1 1 2 8 (1947).

[7] JARR'ET, S., HOWARD: Journ. of Chem. Phys. 2 1 , 761 (1953).

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