La ciencia del Diagnostico de Laboratorio

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La ciencia del diagnóstico

de laboratorio Segunda edición

La ciencia

del diagnóstico de laboratorio Segunda edición

John Crocker Department of Cellular Pathology, Birmingham Heartlands Hospital, Bordesley Green East, Birmingham, UK

David Burnett Micropathology, LTD University of Warwick Science Park Sir William Lyon´s Road Coventry CV4 7EZ, UK

Traducción: QFB Carina Amador Vázquez

Revisión técnica: Dr. Cs. Ismael Vásquez Moctezuma

MÉXICO • BOGOTÁ• BUENOS AIRES • CARACAS • GUATEMALA • LISBOA MADRID • NUEVA YORK • SAN JUAN • SANTIAGO • SAO PAULO AUCKLAND • LONDRES • MILÁN • MONTREAL • NUEVA DELHI SAN FRANCISCO • SINGAPUR • ST. LOUIS • SYDNEY • TORONTO

Director Editorial: Marco Antonio Tovar Sosa Editor Sponsor: Fausto Acosta García Editor de desarrollo: Camilo Heras Martínez Supervisor de producción: Olga Sánchez Navarrete Diseño de portada: Utopía visual

NOTA La medicina es una ciencia en constante desarrollo. Conforme surjan nuevos conocimientos, se requerirán cambios de la terapéutica. El(los) autor(es) y los editores se han esforzado para que los cuadros de dosificación medicamentosa sean precisos y acordes con lo establecido en la fecha de publicación. Sin embargo, ante los posibles errores humanos y cambios en la medicina, ni los editores ni cualquier otra persona que haya participado en la preparación de la obra garantizan que la información contenida en ella sea precisa o completa, tampoco son responsables de errores u omisiones, ni de los resultados que con dicha información se obtengan. Convendría recurrir a otras fuentes de datos, por ejemplo, y de manera particular, habrá que consultar la hoja informativa que se adjunta con cada medicamento, para tener certeza de que la información de esta obra es precisa y no se han introducido cambios en la dosis recomendada o en las contraindicaciones para su administración. Esto es de particular importancia con respecto a fármacos nuevos o de uso no frecuente. También deberá consultarse a los laboratorios para recabar información sobre los valores normales.

LA CIENCIA DEL DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO Prohibida la reproducción total o parcial de esta obra, por cualquier medio, sin la autorización escrita del editor.

DERECHOS RESERVADOS © 2007 respecto a la primera edición en español por McGRAW-HILL INTERAMERICANA EDITORES. S.A.DE C.V. A Subsidiary of The McGraw-Hill Companies. Inc. Corporativo Punta Santa Fe Prolongación Paseo de la Reforma 1015 Torre A Piso 17, Colonia Desarrollo Santa Fe, Delegación Álvaro Obregón C.P. 01376, México, D.F. Miembro de la Cámara Nacional de la Industria Editorial Mexicana, Reg. Núm. 736 ISBN-13: 978-970-10-6200-5 ISBN-10: 970-10-6200-0 Translated from the Second English edition of The science of laboratory diagnosis By: John Crocker and David Burnett Copyright © 2005 by: John Wiley & Sons, Ltd. The Atrium, Southern Gate, Chichester, West Sussex PO 19 8SQ England All rights reserved ISBN (original): 0-470-85912-1 1234567890 Impreso en México

09865432107 Printed in Mexico

A nuestras familias con amor

“Faith” is a fine invention When Gentlemen can see– But microscopes are prudent In an Emergency Emily Dickinson

Contenido Prefacio a la primera edición

xv

Prefacio a la segunda edición

xvii

Lista de colaboradores

SECCIÓN 1

HISTOPATOLOGÍA

Editor de sección

1

xix

1

John Crocker

Manipulación y preparación de la muestra para el diagnóstico histopatológico de rutina

Métodos indirectos Métodos de múltiples etapas Aplicaciones de la inmunohistoquímica Control de calidad Automatización Proyección de imagen Lecturas adicionales

5

2

Tinciones generales

Introducción Principios de la técnica y de la organización de la ME Aplicaciones de la microscopia electrónica de transmisión Técnicas y procedimientos especializados Resumen Reconocimientos Bibliografía Lecturas adicionales

3 3 4 4 5 7 11 13 15 15

6

Introducción Diseño básico del microscopio Tipos de microscopia Micrografía Lecturas adicionales

17

3

Histoquímica de la enzima

17 17 20 25 25 25

7

4

Inmunohistoquímica

27 27 28 29

35

Jane Starczynski y John Crocker Introducción Métodos directos

35 35

Métodos cuantitativos en la patología tisular Introducción Métodos Aplicaciones de la medición en la patología diagnóstica Automatización en histología Conclusión Lecturas adicionales

27

31 34 34

48 54 59 59 60 60

61 61 61 63 66 67

69

Peter W Hamilton y Derek C Allen

Trevor Gray y Neil Hand Introducción Estructura y clasificación Conservación y preparación Técnicas histoquímicas Aplicaciones diagnósticas de la histoquímica enzimática Conclusión Referencias

Microscopia de luz

44

Brian Boullier

Barrie Sims ¿Por qué la tinción? Mecanismos básicos de tinción Métodos comunes de tinción Conclusiones Lecturas adicionales Agradecimientos

43

Brian Eyden

P.J. Smith y J.L. Warfield Introducción Sistemas para manipular la muestra Recepción y manipulación de la muestra Fijación y descalcificación Preparación e inclusión del tejido Microtomía Técnicas especiales Lectura adicional Reconocimientos

Microscopia electrónica en patología

35 35 41 41 41 41 42

8

Marcadores de la proliferación en histopatología

69 69 75 79 81 81

83

Cheryl E Gillett y Diana M Barnes Introducción Marcadores de proliferación Uso práctico de marcadores Método de evaluación Conclusión Lecturas adicionales

83 83 88 89 92 92

viii

CONTENIDO

SECCIÓN 2

CITOLOGÍA

93

12

9

Citopatología

95

Adrian T Warfield Introducción Tipos de muestra citológica Técnicas para la preparación de frotis Fijación de la muestra Técnicas de concentración celular Métodos de tinción Citodiagnóstico Citomorfología Exactitud y limitaciones de la citología Citopatología ginecológica y exploración cervical Aseguramiento de la calidad en la citología diagnóstica Lecturas adicionales

SECCIÓN 3 MICROBIOLOGÍA - BACTERIOLOGÍA Editor de sección

10

95 95 99 99 99 103 104 105 112 113

13

119 119

121

14

123 123 123 124

Pruebas automatizadas en bacteriología

145 145 145 146 148 149 150 150

Técnicas de bacteriología molecular: preparación y aplicación de la muestra 151 Necesidad de métodos moleculares Preparación de la muestra Amplificación Control de calidad Práctica actual Epidemiología y tipificación Problemas con los métodos moleculares Aplicación futura Lecturas adicionales

151 151 152 153 153 156 156 157 157

Otras pruebas en bacteriología

159

124 125 125 128

15

Darrel Ho-Yen Introducción Pruebas para el anticuerpo Pruebas para el antígeno Prueba del complejo inmunitario específico del antígeno Otras pruebas Desarrollos futuros Lecturas adicionales

129

Eric Y Bridson Medios de cultivo en microbiología Formulación de los medios de cultivo Enriquecimiento y selección en medios fluidos Medios de cultivo químicamente definidos medios complejos indefinidos Factores ambientales de crecimiento Actividad del agua (aw) Almacenaje de los medios de cultivo Pruebas de calidad El futuro de los medios de cultivo Microbiología cuántica Lecturas adicionales

135 135 136 140 144

Richard E Holliman y Julie D Johnson

Microscopia en bacteriología: aplicación y preparación de la muestra 123

Medios de cultivo en bacteriología

Introducción Identificación directa Identificación después del cultivo Identificación de bacterias de importancia médica Lecturas adicionales

Introducción Sistemas de cultivo sanguíneo Comprobación de la sensibilidad antimicrobiana y sistemas de identificación Sistemas de examen de la orina Sistemas de identificación y sensibilidad antimicrobiana para micobacterias Comentario Lecturas adicionales

Dugald R Baird

11

135

Paul C Boreland

Darrel Ho-Yen

Introducción Microscopia de luz Microscopia de fluorescencia Muestras para microscopia Examen de muestras sin teñir por transmisión de luz Examen de muestras sin teñir mediante iluminación de fondo oscuro Tinción de las muestras Lecturas adicionales

Identificación de bacterias Andrew J Hay

Editor de sección Adrian T Warfield

129 130 131 131 132 132 132 133 134 134 134

16

Control de la quimioterapia antimicrobiana

159 159 162 162 163 164 164

165

Ian M Gould Introducción Principios generales del control del laboratorio de la quimioterapia Comprobación de la sensibilidad

165 167 168

ix

CONTENIDO

Automatización Control del hospital y enlace clínico Conclusión Lecturas adicionales

169 170 171 171

21

Introducción Automatización en el laboratorio de diagnóstico ¿Debe automatizarse el Laboratorio? Otros desarrollos en la automatización Conclusiones Lecturas adicionales

SECCIÓN 4 MICROBIOLOGÍA, VIROLOGÍA, MICOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA 173 Editor de sección

17

Darle Ho-yen

Microscopia en virología: aplicación y preparación de la muestra

175

22

18

175 176 177 178 180 180 180

Microscopia electrónica en virología

181

19

Cultivo tisular

181 181 182 187 187 188 188 189

23

20

Pruebas serológicas en virología

197

Goura Kudesia Introducción Principios Técnicas Interpretación y uso de las pruebas serológicas Futuro de la serología Lecturas adicionales

197 197 198 203 204 205

Virología: otras pruebas Detección de la enfermedad por prion Diagnóstico Pruebas de susceptibilidad antivírica Inmunidad mediada por células Lecturas adicionales

24

209 210 212 212 212

213 213 213 220 222 222

225

Micología

225 227 228 231 232

233

David W Warnock Introducción Examen microscópico Cultivo Identificación Pruebas serológicas Nuevas direcciones en el diagnóstico Lecturas adicionales

191 191 191 192 193 193 196 196

207

Alex WL Joss

William L Irving y Alan Pawley Introducción Selección de los cultivos celulares Preparación de cultivos celulares Especímenes clínicos para el aislamiento de virus Identificación del crecimiento vírico Conclusiones Lecturas adicionales

Técnicas moleculares en virología Introducción Técnicas de amplificación del ácido nucleico Análisis de la secuencia Resumen Lecturas adicionales

175

Hazel Appleton Introducción Métodos Usos de la microscopia electrónica Laboratorio de virología Reacción rápida de urgencia Virus de nueva aparación Conclusiones Lecturas adicionales

207

Paul E Klapper

Marie M Ogilvie Introducción Histopatología: cuerpos de inclusión y células multinucleadas gigantes Virología Inmunofluorescencia Examen microscópico de los cultivos celulares Desarrollos Reconocimientos Lecturas adicionales

Pruebas automatizadas en virología Roger P Eglin

25

Parasitología

233 234 235 236 237 238 238

239

Robert WA Girdwood Introducción Microscopia Montajes húmedos Extendidos y frotis Histopatología Fluorescencia Microscopia electrónica Cultivo Infección animal Xenodiagnóstico Serología Métodos moleculares Lecturas adicionales

239 239 240 240 241 241 241 242 242 242 243 243 244

x

CONTENIDO

SECCIÓN 5

HEMATOLOGÍA

Editor de sección

26

Adherencia plaquetaria Investigaciones de la agregación plaquetaria Analizador PFA-100 para la función plaquetaria Investigaciones sobre la liberación plaquetaria Citometría de flujo Tromboelastograma Lecturas adicionales

245

Peter E Rose

Morfología de las células sanguíneas y de la médula ósea

247

Supratik Basu Morfología de la sangre periférica Examen y morfología de la médula ósea Células no hematopoyéticas y parásitos en sangre y médula ósea Lecturas adicionales

27

Principios de los contadores automatizados de células sanguíneas

247 249

31

263 263

Identificación del grupo sanguíneo Métodos para identificar el grupo sanguíneo Tamizaje de anticuerpos Compatibilidad cruzada Práctica de la transfusión Lecturas adicionales

265

28

Métodos para la identificación de hemoglobinopatías

265 265 265 267 268 269 271

295

Steven Walton y Peter E Rose

Graham Martin Introducción Medición de la Hb Mediciones de los eritrocitos Medición de los reticulocitos y RBC nucleados Eritrocitos nucleados Mediciones de los leucocitos Lecturas adicionales

Servicio transfunsional del hospital

291 291 292 292 292 293 293

32

295 296 297 300 301 301

Citometría de flujo y biología molecular en la hematología 303 Ian Chant Introducción Citometría de flujo e inmunofenotipificación Valoración de la función plaquetaria por citometría de flujo Biología molecular en la hematología Resumen Lecturas adicionales

273

303 304 307 307 310 311

Nick Jackson y Anne Sermon Introducción Técnicas de tamizaje Diagnóstico de laboratorio de hemoglobinopatías y de talasemias Detección, identificación y cuantificación de hemoglobinopatías Agradecimientos Lecturas adicionales

29

Investigaciones especiales del factor von Willebrand

273 273

33

Cobalamina (vitamina B12) y folato Hierro Resumen Lecturas adicionales

34

281

Introducción Características clínicas Desórdenes hemolíticos Segmento final Lecturas adicionales

281 282 285 287

35 30

Análisis de plaquetas

289

Steven Walton y Peter E Rose Introducción Estructura y función Conteo plaquetario Anticuerpos plaquetarios Tiempo de sangrado

Investigación del laboratorio de la hemólisis

313 317 322 322

323

Paul Revell

Mohammad S. Enayat Introducción Pruebas fenotípicas Pruebas genotípicas para identificar la mutación Lecturas adicionales

313

Frank Wells

274 274 279 279

Investigaciones hemáticas

Investigaciones de laboratorio de la hemostasis

323 323 326 332 332

333

Peter E Rose y Catherine Caveen 289 289 290 291 291

Introducción Tiempo de protrombina Tiempo parcial de tromboplastina activada (APTT) Tiempo de trombina Tiempo de reptilasa

333 333 335 337 338

xi

CONTENIDO

Fibrinógeno Ensayos del D-dímero y de los FDP Ensayos del factor Marcadores de la coagulación activada Evaluación automatizada de la coagulación Lectura adicional

SECCIÓN 6

CITOGENÉTICA

Editor de sección

36

343

Brian Boullier

Bandeo y análisis cromosómico

345

Mervyn Humphreys Introducción Bandeo cromosómico Análisis cromosómico Lecturas adicionales

37

Marcadores Ensayos homogéneos Métodos de separación Automatización Miniaturización Cálculo de los resultados Exactitud y precisión Control de calidad Especificidad, reactividad cruzada e interferencia “Efecto de gancho” por dosis alta Lecturas adicionales

338 339 339 340 341 341

Hibridización in situ fluorescente

40

SECCIÓN 7

QUÍMICA CLÍNICA

345 345 352 355

Introducción Teoría Especificidad: cómo los electrodos se hacen selectivos Reacciones electroquímicas Electrodos de glucosa Detectores electroquímicos Electrodos complejos Otros electrodos complejos mediados por las enzimas Comprobación en los puntos de cuidado (POCT) Respaldo Reconocimientos Lecturas adicionales

357 357 357 358 358 358 360 361 362

41

Adquisición, aplicaciones e interpretación de los datos bioquímicos clínicos

363

39

Inmunoensayo en bioquímica clínica

Introducción Técnicas de absorción de la luz Turbidimetría y nefelometría Luminescencia Lecturas adicionales

42

391 392 393 394 394

395 395 395 397 399 403

Espectrometría atómica analítica

405

Andrew Taylor

365 366 367 371 371 371

Introducción Principios Instrumentación Aplicaciones Aseguramiento de la calidad Conclusiones Referencias

405 405 407 413 414 414 415

373 43

Joan Butler y Susan M Chambers Introducción Diseño del ensayo Condiciones del ensayo y calibradores

384 386 389 390 390

365

William J Marshall Introducción Recolección y análisis de la muestra Interpretación de los datos de laboratorio Bioquímica clínica basada en evidencia Conclusión Lecturas adicionales

Absorción de la luz, dispersión y técnicas de luminiscencia en bioquímica clínica rutinaria

381 381

Bernard F Rocks

Editor de sección William J Marshall

38

381

Alan D Hirst

Ivor Hickey Elección de la sonda Marcación de las sondas Hibridación Detección de la sonda hibridada Aplicaciones en la investigación básica Aplicaciones en la genética médica Aplicaciones en el diagnóstico e investigación del cáncer Lecturas adicionales

Electrodos ion-selectivos

375 376 376 377 377 377 378 378 379 380 380

373 373 374

Técnicas químicas del reactivo seco

417

JA Schroeder, JC Osypiw y GS Challand Introducción Principios de la metodología

417 418

xii

CONTENIDO

Ejemplos específicos Control de calidad de la química del reactivo seco Resumen Lecturas adicionales

44

Técnicas de separación

419 423 427 427

49

Introduction Estructura y función de HLA Genética del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) La mecánica de tipificación HLA Tipificación molecular Resumen

429

SECCIÓN 8

INMUNOLOGÍA

Editor de Sección

45

429 429 429 431 433 434 436

SECCIÓN 9 50

437

46

Ensayos del complemento

51

47

Inmunología celular

447 447 449 453

455

Aarnoud Huissoon Introducción Pruebas cuantitativas y cualitativas Estudios funcionales El futuro de la inmunología celular Lecturas adicionales

455 455 459 463 463

487

Microdisección por láser y captura de tejido

489

489 492 493 493

Análisis del gen por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real 495 Cara M Martin, Orla Sheils y John O ’Leary

J North y K Whaley Introducción Ensayos de los niveles séricos del complemento Lecturas adicionales

482 482 483 486

John O’Leary

LCM-PixCell® y AutoPix® de Arcturus Microdisección con microrrayo láser Leica AS LMD Lecturas adicionales

439 439 439 440 443 446 446 446

481 481

Orla Sheils, Paul Smyth, Esther O’Regan, Stephen Finn, Richard Flavin y John O’Leary

David Burnett Introducción Una breve perspectiva histórica Técnicas cualitativas Métodos cuantitativos Conclusión Reconocimientos Lecturas adicionales

PATOLOGÍA MOLECULAR

Editor de sección

David Burnett

Ensayos proteicos

481

Mark Hathaway

Roy Sherwood ¿Por qué separar? Cromatografía Cromatografía de capa fina (TLC) Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) Cromatografía de gases (GC) Electroforesis Lecturas adicionales

Tipificación de HLA

52

Introducción Química de la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real Química de la TaqMan de PCR (ensayo de la 5’nucleasa) Sondas TaqMan de unión al surco menor del DNA Iniciador TaqMan y diseño de la sonda Detección del amplicón Detección por TaqMan en tiempo real Cuantificación absoluta Cuantificación relativa Genes housekeeping Aplicaciones de TaqMan PCR en patología Referencias

495

496 498 498 499 500 500 500 500 501 504

Reacción en cadena de la polimerasa en la célula

505

495

John O’Leary, Cara M Martin y Orla Sheils

48

Enfermedades del complejo inmunitario y crioglobulinas

465

Siraj A Misbah Introducción Ensayos para los complejos inmunitarios circulantes Enfermedad sérica Lupus eritematoso sistémico Crioglobulinemia Lecturas complementarias

465 466 467 468 477 480

Introducción Visión general de la metodología Tecnologías de PCR celular: definiciones Amplificación del DNA en la célula Detección de los amplicones Reacción de amplificación, controles y detección en el tejido para uso en ensayos de PCR DNA en la célula Amplificación del RNA en la célula Problemas de la amplificación por PCR en la célula

505 505 506 508 510

510 511 511

xiii

CONTENIDO

Trabajo futuro con los ensayos basados en la PCR en la célula Referencias

53

Análisis de SNP de alta densidad y de arreglos de cDNA

515

Orla Sheils, Cara M Martin, Paul Smyth, Jon Sherlock, Stephen Finn, Esther O’Regan, Steve Picton y John O’Leary Introducción Tecnología Affymetrix GeneChip Perfil de SNP y matrices de DNA Sistema de expresión con microarreglo de Applied Biosystems Ilumina, “microarreglo de ordenamientos®” Manejo de datos y análisis secundario Referencias

54

Análisis por microarreglo de la hibridación genómica comparativa de los tejidos humanos

55 515 515 517 517 519 521 521

523

Esther O’Regan, Paul Smyth, Stephen Finn, Cara M Martin, Orla Sheils y John O’Leary Antecedentes de hibridación genómica comparativa (CGH) y de su microarreglo

Apreciación global de hibridación genómica comparativa Aplicaciones clínicas Microarreglos Conclusión Referencias

513 513

Secuenciación de ácidos desoxirribonucleicos

524 525 525 528 528

531

Cara M Martin, Steven J Picton, Orla Sheils y John O’Leary Introducción Historia de la secuenciación del ácido desoxirribonucleico Secuenciación química del ácido desoxirribonucleico El método dideoxi de secuenciación del DNA Secuenciación automatizada Proyecto del Genoma Humano Áreas que avanzan en la secuenciación de los ácidos nucleicos Referencias Lecturas adicionales

Índice alfabético

531 531 532 532 534 536 537 538 538

539

523

ERRNPHGLFREORJVSRWFRP

Prefacio a la primera edición Tanto nosotros como nuestros colegas hemos encontrado en nuestra experiencia de muchos años que las personas de todos los niveles que trabajan en nuestros laboratorios no tienen experiencia en algunos aspectos. Nos hemos dado cuenta que existe la necesidad de un libro que una todas las disciplinas de la patología, el cual pueda explicar los porqué y para qué de la medicina de laboratorio. Debemos enfatizar que este material no intenta ser un libro de recetas; nuestro objetivo es mucho mayor que explicar los principios básicos de las técnicas de laboratorio y la interpretación de los resultados que se obtienen de ellos. Hemos tratado de asegurar que este libro lo puedan utilizar varios tipos de lectores. Estos podrían incluir estudiantes, patólogos, cirujanos y médicos, así como técnicos de laboratorio. Los contenidos son multidisciplinarios y existe coincidencia entre algunos capítulos y secciones. Esto es intencionado y refleja el estado verdadero de la patología moderna. Sentimos que es importante que los patólogos de cada subespecialidad muestren más interés por la actividad de sus colegas de laboratorio. Este libro tiene la intención de presentar los métodos más comunes y sus avances más recientes. Otra vez se enfatiza que la unión entre la patología y la medicina de laboratorio es forzada aunque con frecuencia conveniente. Sin embargo, esperamos que los profesionales de una especialidad lean otras secciones. Por ejemplo, para trabajar el campo de los linfomas, los histopatólogos necesitan entender bien la hematología y la microbiología. Lo anterior, por supuesto, interviene en el tratamiento del linfoma en los pacientes, como la microbiología cuando se presentan infecciones oportunistas después de la quimioterapia. Además, los químicos necesitan relacionar sus descubrimientos a los procesos hematológicos.

Otra característica de este libro es que en algunas partes, existen coincidencias entre capítulos y secciones; esto es completamente intencional y refleja una vez más el estado actual del laboratorio clínico. Así, la aplicación, contextos e interpretación de varios métodos inevitablemente serán diferentes dependiendo de la disciplina. El lector será avisado de esta particularidad en las secciones cubriendo temas como la microscopia de electrones y técnicas moleculares, que son metodologías que forman parte de manera extensa de diferentes disciplinas. Es más, los problemas de comunicación producen un efecto de deterioro evitable en los avances de metodologías de uso común y de investigación. En nuestro conocimiento este libro es único y esperamos que dé los elementos a mucha gente capacitada o en capacitación en medicina de laboratorio no sólo en su propio campo sino también en otros. La mayoría de los capítulos incluye una lista de las principales referencias aunque en algunos casos lo hemos creído innnecesario; además, algunos capítulos tienen una lista de referencias grande que puede reflejar su complejidad o su contenido de gran alcance. Por supuesto, deseamos expresar nuestra garatitud a todos nuestros editores de sección y los autores de los capítulos. Naturalmente, también estamos en deuda con nuestro editor John Harrison y su equipo. Extendemos nuestro agradecimiento a Ruth Fry, Vivien Garland y Valerie Griffiths por su ayuda en la asistencia y respuesta a las interminables llamadas telefónicas.

John Crocker David Burnett

John Crocker (1952-2004) John Crocker demostró en su relativa corta vida un conocimiento agudo y un profundo interés en la ciencia de muchas formas. Fue premiado en el King´s College, Cambridge, a la edad de 16 años. Después, estudió medicina. Su primer libro, de cerca de 250 páginas, lo realizó en su tercer año en Cambridge, los resultados de su tesis de patología. Ahí fue en donde John conoció a su pareja de toda la vida y esposa, Kate. Después de su examen, John decidió estudiar patología. Su primer puesto fue en el East Birmingham Hospital (ahora el Birmingham Heartlands Hospital), del cual regresó como colaborador después de siete años en el Departamento de Patología en la University of Birmingham, durante los cuales obtuvo su M.D. Fue ahí donde desarrolló su interés por la investigación de linfomas. John disfrutaba su trabajo en el Departamento de Histopatología en el Heartlands Hospital, especialmente gracias a su buena relación con sus colaboradores. A pesar de haber contribuido al diagnóstico usual, servicios de enseñanza y administrativos del departamento, John trató de mantener una carrera activa de investigador, colaborando con otros patólogos y científicos, especialmente de las universidades de Warwick, Birmingham y Wolverhampton; sus dos últimas cátedras. Con Jane Starczynski y sus colaboradores, desarrolló técnicas únicas en la disciplina. Sus aportaciones a la patología fueron reconocidas en un evento de admisión poco usual, en 1995, como miembro honorario del Royal College of Physicians. Con gran interés que incluía astronomía, música, literatura contemporánea, biología marina, computación, arte, fotografía, química y geología, es claro que John fue polifacético. Su naturaleza ecléctica fue parte de su trabajo y sus creencias que los patólogos de todas las disciplinas tienen mucho que aprender del otro, y efectivamente, de otras disciplinas científicas, fue el filósofo detrás del libro que tiene en sus manos. Por desgracia, John murió antes de que su segunda edición se publicara. Todos sus familiares, amigos y colegas lo recordaremos no sólo como un científico extremadamente inteligente y entusiasta, sino también como un hombre jovial y bondadoso con un profundo sentido de compasión. Deseo dedicar este segunda edición a su memoria. David Burnett, marzo 2005

Prefacio a la segunda edición Han pasado seis años desde la primera edición de este libro y actualmente tenemos un nuevo editor, John Wiley & Sons, que convino que era oportuno poner al día este volumen. Los autores siempre están entusiasmados de tener la oportunidad de mejorar lo que escribieron y esto se refleja aquí. También es la oportunidad de actualizar ciertas áreas debido al rápido desarrollo en esos campos, aunque, inevitablemente, hay algunos capítulos a los que se les ha cambiado el título. Algunos capítulos ahora tienen nuevo autor o incluyen otros. Las razones son varias. En algunos casos,

los autores han recibido apoyo de nuevos colaboradores y otros se han retirado desde la publicación de la primera edición. De forma trágica, un autor, Graeme Bird, murió. No obstante, la esencia del libro continúa, aunque el estilo ha cambiado inevitablemente a consideración de los editores actuales, quienes quieren agradecer todo su apoyo, especialmente al Dr. Joan Marsh. También queremos agradecer a Ruth Fry por su asistencia. John Crocker David Burnett

Lista de colaboradores Derek C Allen Histopathology Laboratory, Belfast City Hospital, Belfast BT9 7AD, UK Hazel Appleton Health Protection Agency, Specialist and Reference Microbiology Division, 61 Colindale Avenue, London NW9 5TH, UK Dugald R Baird Formerly Department of Microbiology, Lanarkshire Acute Hospitals NHS Trust, Hairmyres Hospital, Eaglesham Road, East Kilbride G75 8RG, UK Diana M Barnes Hedley Atkins/Cancer Research UK Breast Pathology Laboratory Guy’s Hospital, St. Thomas Street, London SE1 9RT, UK Supratik Basu Pathology Laboratory, Warwick Hospital, Lakin Road, Warwick CV34 5BJ, UK Paul C Boreland Microbiology Department, Ulster Hospital, Dundonald, Beifast BT16 1RH Brian Boullier Illuminate Communications, The Beacons, Leeds Road, Lightcliffe, Halifax HX3 8NU, UK Eric Y Bridson Formerly Oxoid Ltd, 3 Bellever Hill, Camberley, Surrey BU15 2HB, UK David Burnett Micropathology Ltd. University of Warwick Science Park, Sir William Lyon’s Road, Coventry CV4 7EZ, UK Joan Butler Honorary Lecturer, Guy’s, King’s and St. Thomas’s School of Medicine, London Catherine Caveen Department of Haematology, Warwick Hospital, Lakin Road, Warwick CV34 5BJ, UK G S Challand Department of Clinical Biochemistry, Royal Berkshire Hospital, Reading, Berkshire RG1 5AN, UK Susan M Chambers Department of Clinical Biochemistry, Kings College Hospital, Denmark Hill, London SE5 9RS, UK Ian Chant Department of Heamatology, Warwick Hospital, Lakin Road, Warwick CV34 5BJ, UK

John Crocker Department of Cellular Pathology, Birmingham Heartlands Hospital, Bordesley Green East, Birmingham B9 5SS, UK Roger P Eglin National Transfusion Microbiology Laboratories National Blood Service, Colindale Ave Colindale, London NW95BG Mohammad S Enayat Molecular Heamostasis Laboratory, Birmingham Children’s Hospital NHS Trust, Ladywood, Birmingham B16 8ET, UK Brian Eyden Department of Histopathology, Christie Hospital NHS Trust, Manchester M20 4BX, UK Stephen Finn Department of Histopathology, Trinity College, Dublin, Dublin, Ireland Richard Flavin Department of Histopathology, Trinity College, Dublin, Dublin, Ireland Cheryl E Gillett Hedley Atkins/Cancer Research UK Breast Pathology Laboratory, Guy’s Hospital, St. Thomas Street, London SE1 9RT, UK Robert WA Girdwood formerly Scottish Parasite Diagnostic Laboratory, Stobhill Hospital, Balornack Road, Glasgow, G21 3UW Ian M Gould Department of Medical Microbiology, Medical School, Foresterhill, Aberdeen AB9 2ZB, UK Trevor Gray Histopathology Department, Queen’s Medical Centre, University Hospital NHS Trust, Nottingham NG7 2UH, UK Peter W Hamilton Department of Pathology, The Queens University of Belfast, Grosvenor Road, Belfast BT12 6BL, UK Neil Hand Histopathology Department, Queen’s Medical Centre, University Hospital NHS Trust, Nottingham NG7 2UH, UK Mark Hathaway National Blood Service, Vincent Drive, Selly Oak, Birmingham B15 2SG, UK Andrew J Hay Department of Microbiology, Raigmore Hospital, Old Perth Road, Inverness IV2 6DJ, UK

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LISTA DE COLABORADORES

Ivor Hickey School of Biology and Biochemistry, Medical Biology Centre, Queen’s University Belfast, 97 Lisburn Road, Belfast BT9 7BL, UK Alan D Hirst Department of Biochemistry, Bradford Royal Infirmary, Duckworth Lane, Bradford BD9 6RJ, UK Richard E Holliman Department of Medical Microbiology, St. George’s Hospital and Medical School, Blackshaw Road, London SW17 0QT, UK Darrel Ho-Yen Department of Microbiology, Raigmore Hospital, Old Perth Road, Inverness IV2 6DJ, UK AP Huissoon Regional Immunology Department, Birmingham Heartlands Hospital, Bordesley Green East, Birmingham B9 5SS, UK Mervyn Humphries Northern Ireland Regional Genetics Centre, Leukaemia Cytogenetics Laboratory, Floor A, Belfast City Hospital, Tower Block, Lisburn Road, Belfast BT9 7AB, UK

Siraj A Misbah Department of Immunology, Churchill Hospital, Old Road, Headington, Oxford OX3 7LJ, UK Jonathan North Department of Immunology, City Hospital, Dudley Road, Birmingham B18 7QH, UK Marie M Ogilvie Division of Medical Microbiology, College of Medicine and Veterinary Medicine, University of Edinburgh, Edinburgh, UK John O’Leary Department of Pathology, The Coombre Women’s Hospital Dublin, Ireland; and Department of Histopathology, Trinity College Dublin, Dublin, Ireland Esther O’Regan Department of Histopathology, Trinity College Dublin, Dublin, Ireland Jacqueline C Osipiw Department of Clinical Biochemistry, Royal Berkshire Hospital, Reading, Berkshire RG1 5AN, UK Alan Pawley Virology Laboratory, Queen’s Medical Centre Trust, Nottingham, UK

William L Irving Department of Virology, University of Nottingham, Nottingham, UK

Steven J Picton Affymetrix UK Ltd, Wooburn Green, Hight Wycombe HP10 0HH, UK

Nick Jackson Department of Heamotology, University Hospital Coventry and Warwickshire NHS Trust, Clifford Bridge Road, Coventry, UK

Paul Revell Department of Haematology, Staffordshire General Hospital, Weston Road, Stafford ST16 3SA, UK

Julie D Johnson Department of Medical Microbiology, St. George’s Hospital and Medical School, Blackshaw Road, London SW17 0QT, UK

Bernard F Rocks Department of Clinical Pathology, Royal Sussex County Hospital, Brighton, Sussex BN2 5BE, UK

Alex WL Joss Microbiology Department Raigmore Hospital NHS Trust, Perth Road, Inverness IV2 3UJ, UK

Peter E Rose Department of Haematology, Pathology Laboratory, Warwick Hospital, Lakin Road, Warwick CV34 5BJ, UK

Paul E Klapper Department of Virology, Health Protection Agency, Leeds Laboratory, Bridle Path, York Road, Leeds LS15 7TR, UK

Jessica Schroeder Department of Clinical Biochemistry, Royal Berkshire Hospital, Reading, RG1 5AN

Goura Kudesia Department of Virology, Northern General Hospital NHS Trust, Herries Road, Sheffield S5 7BQ, UK William J Marshall Consultant Clinical Biochemist, The London clinic, 20 Devonshire Place, London W79 6BW

Anne Sermon Department of Haematology, Nottingham City Hospital, Hucknall Road, Nottingham NG5 1PB, UK Orla Sheils Department of Histopathology, Trinity College Dublin, Dublin, Ireland Jon Sherlock

Applied Biosystems, Applera, UK

Cara M Martin Department of Histopathology, Trinity College Dublin, Dublin, Ireland

Roy A Sherwood Department of Clinical Biochemistry, King’s College School of Medicine and Dentistry, Bessemer Road, London SE5 9PJ, UK

Graham Martin Heamotology Department, Gloucester Hospitals NHS Trust, Great Westerm Road, Gloucester GL1 3NN

Barrie Sims Department of Histopathology, Staffordshire General Hospital, Weston Road, Stafford ST16 3SA, UK

LISTA DE COLABORADORES

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Paul J Smith Department of Cellular Pathology, Birmingham Heartlands Hospital, Bordesley Green East, Birmingham B9 5SS, UK

Adrian T Warfield Department of Histopathology, Birmingham Heartlands Hospital, Bordesley Green East, Birmingham B9 5SS, UK

Paul Smyth Department of Histopathology, Trinity College Dublin, Dublin, Ireland

Janine L Warfield Birmingham Heartlands Hospital, Bordesley Green East, Birmingham B9 5SS, UK

Jane Starczynski Department of Cellular Pathology, Birmingham Heartlands Hospital, Bordesley Green East, Birmingham B9 5SS, UK

David W Warnock Division of Bacterial and Mycotic Diseases, National Center for Infectious Diseases, Center for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA 30333, USA

Andrew Taylor Trace Element Laboratory, School of Biological Sciences, University of Surrey, Guildford, Surrey GU2 5XH, and Clinical Laboratory, Royal Surrey County Hospital, Guildford Surrey GU2 5XX, UK Steven Walton Department of Haematology, Warwick Hospital, Lakin Road, Warwick CV34 5BJ, UK

Frank Wells Biochemistry Department Warwick Hospital, Lakin Road, Warwick, CV34 5BJ Keith Whaley Department of Immunology, Leicester Royal Infirmary, Leicester LE1 5WW, UK

SECCIÓN 1 HISTOPATOLOGÍA

1 Manipulación y preparación de la muestra para el diagnóstico histopatológico de rutina PJ Smith y JL Warfield

Introducción La histopatología diagnóstica es una especialidad que, incluso hoy en día, no ha dejado de ser una labor en particular intensa, sobre todo si se considera que en esta área el desarrollo de la tecnología automatizada ha sido discreto y aún toman tiempo sus procedimientos. Las máquinas que procesan y tiñen cortes, como parte integral de cualquier laboratorio de histología común, son cada vez más complejas en términos de su aplicación y contribución a un ambiente de salud y seguridad. El registro manual de casetes para procesar tejidos y el portaobjetos del microscopio se ha vuelto en poco tiempo obsoleto desde la introducción de sistemas de transcripción independientes conectados a una computadora. Los sellos herméticos y automatizados también son comunes en muchos laboratorios y hacen posible minimizar la exposición del personal a los solventes orgánicos; en consecuencia, los laboratoristas pueden concentrarse en las tareas manuales del departamento y no en las labores de montaje. El moderno laboratorio de histopatología, aunque se ha beneficiado en cierto grado con la automatización y el continuo desarrollo de mejoras del equipo estándar, es todavía un área sensible a las cargas de trabajo. La posibilidad de renovación se relaciona de manera directa, primero, con la capacidad de procesamiento y, segundo, con el personal disponible para realizar las tareas requeridas para obtener los cortes histopatológicos teñidos necesarios para el examen microscópico subsiguiente y el diagnóstico patoló-

gico. Muchos laboratorios modernos han experimentado aumentos notables de la carga de trabajo en los últimos años, como resultado de nuevos lineamientos y fusiones, sin un aumento correspondiente de la contratación de personal. De manera inevitable, estos laboratorios han mejorado sus metodologías y técnicas para no sucumbir a las exigencias del alto rendimiento y proporcionar un servicio de calidad eficiente. La intención de este capítulo es proporcionar una sinopsis de la preparación de tejidos en el moderno laboratorio de histopatología, con énfasis en la eficiencia y calidad del servicio. Rebasa los límites de este estudio explicar, en cualquier grado, la química o los pormenores de la preparación del tejido. La descripción debe ser suficiente para conocer de forma general las técnicas y estandarizar la histopatología de rutina en el diagnóstico de laboratorio. La preparación de las muestras de tejido para el diagnóstico se analiza bajo los siguientes títulos: 1. Sistemas de control de la muestra. 2. Recepción y manipulación de la muestra. 3. Fijación y descalcificación. 4. Procesamiento e impregnado. 5. Microtomía. 6. Técnicas especiales.

The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker, © 2005 John Wiley & Sons, Ltd.

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CAP. 1

MANIPULACIÓN Y PREPARACIÓN DE LA MUESTRA PARA EL DIAGNÓSTICO HISTOPATOLÓGICO DE RUTINA

Sistemas para manipular la muestra La mayor parte de los laboratorios modernos de histopatología tiene su propia tecnología de información departamental para almacenar y obtener los datos demográficos y muestrales del paciente. El sistema de registro manual o computarizado del enfermo se debe situar dentro del área de reserva del laboratorio. Esta ubicación debe separarse del cuarto de “corte” y, en condiciones ideales, localizarse en un ambiente de oficina, integrada al área administrativa del laboratorio. Sistemas de información computarizados Una de las funciones esenciales de un sistema de control computarizado de la muestra consiste en facilitar la asignación de los identificadores específicos del hospital y de la muestra: número de registro hospitalario y número del laboratorio de referencia. El primero debe tener el formato de solicitud histológica y colocarse en la muestra de acompañamiento. El segundo lo asigna de manera automática el sistema, pero también es posible el procedimiento manual. El número del laboratorio permanece con la muestra en todo el proceso histológico y se transfiere a la forma de solicitud, el (los) contenedor(es) de la muestra, el (los) casete(s) del tejido, el portaobjeto(s) del microscopio y el informe final del diagnóstico. Los patólogos, el responsable del laboratorio, las secretarias y las áreas del laboratorio requieren terminales para facilitar el ingreso y la codificación de los informes diagnósticos, datos muestrales, generación de la lista de trabajo, procedimientos técnicos adicionales, seguimiento de la muestra (fases del procedimiento), relación específica de tejido, y trastornos y recolección de datos para determinar la carga de trabajo, las condiciones laborales y los costos. Ingreso manual de datos El ingreso manual de datos, mediante un libro diario quirúrgico, y el etiquetado de los casetes del tejido y los portaobjetos del microscopio tienen más desventajas que un sistema de laboratorio computarizado. Los sistemas manuales confían en la letra legible y clara, y la asignación exacta de los números progresivos del laboratorio para una persona. Los errores de transcripción pueden ocurrir durante la transferencia del número de laboratorio a los casetes del tejido y portaobjetos del microscopio si la letra asentada en el libro diario, o en la solicitud, es confusa. El marcado impreciso o ilegible de los casetes del tejido puede ocasionar que los bloques del tejido se vinculen mal con las formas de solicitud y portaobjetos, y por lo tanto, es

posible, en el mejor de los casos, establecer un diagnóstico equívoco si dos tejidos son similares o perder un tiempo valioso en el laboratorio mientras se resuelve la situación. Es esencial en todos los laboratorios, tanto si se utiliza un sistema manual o uno computarizado, que medidas de control rigurosas garanticen la integridad del informe diagnóstico final. Los sistemas manuales requieren la disposición de un archivo de referencia cruzada, un registro diagnóstico y amplias instalaciones para almacenar los informes y las formas de solicitud. La calidad de la información que procesa el departamento de servicio depende de la solicitud o los informes que proporcione la administración hospitalaria (o los sistemas de comunicación si es que se dispone de una red por computadora). Al realizar el ingreso de datos, manual o computarizado, las formas de solicitudes se anexan a su respectivo contenedor(es) de la muestra y los recipientes se marcan de modo indeleble con el número de laboratorio. Algunos centros asignan el número de laboratorio, antes de asentarlo en el registro, mediante rollos preimpresos de números secuenciales autoadhesivos. Marcadores de casete y portaobjetos automáticos Los marcadores de casete y portaobjetos están disponibles en el comercio y pueden utilizarlos todos los laboratorios. Las instituciones que efectúan el ingreso manual de los datos confían también en el ingreso manual de estas máquinas, del mismo modo que los laboratorios que tienen sistemas informáticos genéricos menos comunes. Los laboratorios con sistemas más complejos pueden interconectarse con estas máquinas, de tal modo que el marcado del casete y el portaobjetos se convierte en un procedimiento automático ligado, por ejemplo, al registro de datos y la generación de la lista de trabajo, respectivamente. El advenimiento de estas máquinas ha permitido el etiquetado preciso de casetes y portaobjetos y reducido el error de transcripción a márgenes mínimos (fig. 1-1).

Recepción y manipulación de la muestra Cuarto de corte La estancia diseñada para la práctica de los cortes debe estar disponible para la recepción y manipulación de todas las muestras tisulares que requieren un diagnóstico histopatológico. Esta sala debe estar por completo separada de otras adaptaciones del laboratorio, contar con buena iluminación y ventilación y proporcionar las áreas para el desempaque,

FIJACIÓN Y DESCALCIFICACIÓN

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acero, un cuchillo cerebral, tijera, tijeras intestinales, sondas, una fuente de luz amplificadora, pinzas atraumáticas intestinales y pinza de disección para la manipulación de biopsias y cortes de tejido. El equipo de protección personal debe incluir batas u overoles, mandiles, guantes quirúrgicos y resistentes al corte, gafas, viseras, cubrebocas y respiradores (usados en la etapa de desechar la muestra). La sala de corte puede, donde hay espacio disponible, alojar las máquinas que procesan tejidos. Los procesadores pueden ser por completo cerrados, aprobados por Health and Safety, o “abiertos”, y deben incluirse en un gabinete ventilado para contener los vapores del solvente.

Fijación y descalcificación

Figura 1-1 Marcadores Leica IP C e IP S para casete y portaobjetos.

correlación y disección de la muestra. El almacenamiento de los tejidos fijados con formalina (“mojados”), después de la disección, puede también ser una función del cuarto de “cortes”. Los almacenadores para muestras construidos a la medida y ventilados están disponibles en el mercado y se pueden incorporar a las salas de “corte” más grandes o alojarse de modo conveniente en un área separada, usada de forma específica para guardar las muestras. Las precauciones con el formaldehído son la primera preocupación en esta área y se legislan de manera conjunta en las secciones Health and Safety Act (1974) y Containment of Substances Hazardous to Health (COSHH) Regulations. El formaldehído es el fijador más usado en el laboratorio moderno de histología y se discute más adelante. Hasta la fecha, el área de corte de la muestra debe contar con un equipo de extracción que incluya un banco de disección adaptado a un sistema de extracción que haga circular los humos lejos del usuario. El banco debe incluir un lavabo integral, con agua corriente caliente y fría, para lavar las muestras y limpiar el área después de la desinfección con el agente químico apropiado. El área de disección del banco debe inclinarse hacia el lavabo para facilitar el drenaje de la formalina lejos de las muestras fijadas e incluir un tablero de disección de polipropileno, o resistente al corte, para el examen y corte de las biopsias fijadas y de órganos enteros. Un equipo estándar de corte debe incluir una regla de acero inoxidable, un bisturí y un mango con hojas de corte intercambiables y láminas PM40, cuchillos de mano de

Cuando se retiran los tejidos del cuerpo experimentan diversos cambios degenerativos, como la autólisis y la putrefacción. La primera es la descomposición de las células y los componentes del tejido por acción de enzimas propias del cuerpo; la segunda es el cambio degenerativo del tejido como consecuencia de la acción bacteriana. Objetivos de la fijación La fijación debe detener la autólisis y la putrefacción y preservar las células y los componentes tisulares en un estado tan “natural” como sea posible. El fijador no debe propiciar la contracción, inflamación o endurecimiento del tejido y debe estabilizarlo pese al rigor del proceso. Por último, el fijador debe complementar y mejorar los subsecuentes procedimientos histológicos de tinción, inmunohistoquímicos y de biología molecular. En términos amplios, éstas son las exigencias de un fijador “ideal”. Sin embargo, la fijación depende en realidad de la conjunción de estos requisitos. Fijadores Los fijadores simples son soluciones de un solo químico, por ejemplo metanol, etanol, ácido acético glacial y formaldehído; éstos, que carecen de aditivos, pueden inducir algunos de los artefactos ya mencionados si se usan solos. Los fijadores compuestos son mezclas de fijadores simples que se han formulado para compensar y reducir al mínimo los artefactos de la fijación, como el líquido de Carnoy (etanol-cloroformo-ácido acético), que se recomienda para la fijación de ácidos nucleicos. Ambos tipos de fijadores reaccionan con las proteínas de dos maneras. Los coagulantes, como lo sugiere su nombre, coagulan la proteína del tejido, por ejemplo el etanol. Los fijadores no coagulantes, como el formaldehído, for-

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CAP. 1

MANIPULACIÓN Y PREPARACIÓN DE LA MUESTRA PARA EL DIAGNÓSTICO HISTOPATOLÓGICO DE RUTINA

man enlaces cruzados (reticulaciones) con la proteína del tejido. Duración de la fijación La fijación adecuada es esencial para todas las técnicas histológicas posteriores. Una demora en la colocación de un tejido en el fijador o la infiltración inapropiada del fijador antes del proceso pueden afectar la interpretación morfológica y el análisis histoquímico o inmunohistoquímico. La extensión de la fijación depende de la densidad del tejido y la velocidad de penetración del fijador. Tejidos más blandos y menos densos se penetran en menos tiempo que los tejidos fibrosos y óseos. El grado de penetración de los fijadores varía entre uno y otro; por ejemplo, el glutaraldehído y el líquido de Carnoy son más rápidos en su acción que el formaldehído. Para facilitar la fijación minuciosa, en los laboratorios de histología es común describir primero y seccionar después muestras densas grandes. De modo alternativo, el fijador se puede inyectar en un órgano entero y se calienta en un horno de microondas o una incubadora. Formaldehído como fijador de rutina El fijador utilizado de forma más extensa en los departamentos de histopatología es la formalina al 10% (formaldehído al 4%) y sus derivados. El formaldehído es soluble en agua a un máximo de 40% por peso (formalina al 100%) y está disponible en el comercio como solución al 40%, con la adición de 10 a 14% de metanol como estabilizador. En condiciones normales se diluyen 10 partes de formalina al 100% con 90 partes de agua, amortiguador salino fisiológico o de fosfato para obtener la solución de trabajo al 10%. La formalina no amortiguada puede adquirir acidez permanente debido a la formación de ácido fórmico. Éste reacciona con la sangre en tejidos muy vascularizados, como el bazo, para producir un pigmento negro llamado hematina formalina ácida. Esto ocurre casi siempre después de una fijación prolongada; las soluciones amortiguadas de formalina resuelven este artefacto de la fijación. La formalina tiene un olor acre y es un intenso irritante de los ojos, la piel y las membranas mucosas; en algunos trabajadores puede causar dermatitis por contacto. El personal que manipula esta sustancia debe someterse a una valoración respiratoria anual de sensibilización. Los límites máximos de exposición recomendados son una parte por millón y los grados de exposición deben supervisarse con regularidad. Las soluciones de formalina deben manipularse de forma cuidadosa en cuartos bien ventilados que dispongan de extractores para vapores; asimismo, debe usarse ropa protectora, como guantes, capas de laboratorio, gafas y respiradores.

La formalina reacciona para formar enlaces cruzados (reticulaciones) entre las proteínas. Las proteínas solubles se fijan a las estructurales y ello suministra fuerza al tejido y hace posible el proceso siguiente. La formalina no fija los carbohidratos sino el glucógeno cuando se adhiere a una proteína fijada. Es un buen fijador para los lípidos complejos. El calor y la agitación aceleran el proceso de fijación. El tiempo recomendado para la fijación de tejidos en formalina es de 24 a 48 horas; el tiempo óptimo es de siete a 10 días. Las máquinas modernas cerradas que procesan tejido pueden calentar los reactivos (40 a 45°C) durante el procedimiento y, por lo tanto, el proceso de fijación puede acelerarse. Los tejidos recibidos en el laboratorio se deben sumergir por completo en el fijador cinco a 10 veces su volumen. No existe un fijador ideal, pero la formalina al 10% tiene la ventaja de preservar una amplia variedad de tejidos. La formalina es tolerable y permite llevar a cabo con posterioridad una histoquímica adecuada. El tejido se puede almacenar por largos periodos sin sufrir efectos dañinos en el núcleo, el citoplasma o la morfología total de la muestra. No es el fijador de elección para la inmunohistoquímica o biología molecular, pero muchos de los problemas derivados de su uso pueden superarse con los pretratamientos apropiados del tejido. Otros fijadores de uso general

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El glutaraldehído es a menudo el fijador de elección para el tejido que requiere la microscopia electrónica, ya que proporciona una buena preservación de la ultraestructura celular. Es un sensibilizador respiratorio y tiene un vínculo evidente con la denominada asma industrial. Deben observarse las medidas de seguridad adecuadas al usar glutaraldehído. Su uso como desinfectante en las cañerías se ha proscrito en muchos hospitales.

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El tetraóxido de osmio se emplea como fijador secundario en microscopia electrónica, por lo regular después de la fijación primaria en glutaraldehído. Fija los lípidos y también preserva la estructura fina de la célula. El tetraóxido de osmio es tóxico y exige también la institución de medidas de seguridad adecuadas.

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El dicromato de potasio se puede utilizar para identificar tumores medulares suprarrenales, macroscópicos y microscópicos. Reacciona con las catecolaminas medulares suprarrenales y produce un precipitado negro o marrón que es insoluble en agua. No conviene como fijador general cuando penetra el tejido lentamente y causa contracción.

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El alcohol penetra el tejido con rapidez y se puede usar junto con otros fijadores para aumentar la velocidad de

PREPARACIÓN E INCLUSIÓN DEL TEJIDO

la fijación. El etanol absoluto preserva al glucógeno, pero distorsiona el contorno nuclear y altera la contracción del citoplasma. El fijador de Carnoy es un buen fijador para los ácidos nucleicos, si bien propicia la contracción del tejido y la lisis de los eritrocitos; consiste en etanol absoluto, cloroformo y ácido acético glacial.

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Pueden emplearse diversos aditivos en los fijadores. Por ejemplo, las soluciones de ácido tánico, fenol o metales pesados se pueden adicionar a la formalina para incrementar el grado de penetración y de esa manera mejorar la preservación o favorecer los procedimientos subsecuentes de teñido.

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La fijación por vapor mediante fijadores volátiles permite la retención de sustancias solubles in situ y las convierte en productos insolubles antes de que entren en contacto con los solventes. Este método es de uso frecuente junto con la liofilización. Los fijadores convenientes para esta técnica incluyen al formaldehído, el tetraóxido de osmio y el alcohol.

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Los hornos de microondas son recursos en la fijación para conservar el tejido mediante la acción del propio calor o acelerar el proceso de fijación, como se describió con anterioridad.

Descalcificación El hueso o los tejidos que contienen material calcificado requieren la descalcificación antes del proceso para permitir la microtomía estándar (es posible realizar el corte en huesos aún calcificados cuando es necesario cuantificar este elemento). Se pueden emplear varios líquidos descalcificantes, incluidos ácidos como el nítrico, agentes quelantes como el ácido diaminotetraacético de etileno (EDTA), una combinación de ambos, o soluciones disponibles en el comercio. El calor aplicado a las soluciones descalcificantes, mediante un horno de microondas o la incubadora, se puede aplicar para acelerar el proceso de la descalcificación. El tiempo prolongado en un líquido descalcificante, en especial en las soluciones ácidas, puede dañar la morfología del tejido y afectar de manera adversa la calidad de las técnicas subsecuentes. El límite de la descalcificación puede determinarse con la prueba química de la solución, los rayos X o, con más frecuencia, la evaluación manual.

Preparación e inclusión del tejido El tejido fijado y estabilizado se somete a continuación a la microtomía, que implica la preparación de cortes gruesos de 1 a 6 µm del tejido para el examen microscópico. Para

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facilitar este proceso, el tejido debe apoyarse de modo interno y externo. Aunque los protocolos congelantes están disponibles para las muestras fijadas y sin fijar de tejido, estos métodos se emplean casi siempre para la demostración de componentes de fijación lábil o las técnicas de diagnóstico rápidas. Para el diagnóstico histopatológico general, los tejidos se someten a diversos reactivos, a su infiltración y por último al recubrimiento con un medio de apoyo rígido. Casi todos los fijadores son variaciones de la formalina acuosa al 10% y, en consecuencia, son el objetivo de la preparación del tejido para sustituirlos, dentro de la muestra, por la cera de parafina inmiscible en agua. Para lograr esto, el espécimen se somete a las etapas siguientes: 1. Deshidratación: el alcohol sustituye al fijador acuoso dentro del tejido. 2. Clarificación: un antimedio, como el xileno, reemplaza al alcohol. 3. Infiltración: la cera de parafina sustituye a la sustancia clarificante y se infiltra en el tejido. 4. Inclusión: la cera de parafina encapsula al tejido infiltrado y le proporciona un soporte rígido para la microtomía. Para asegurar una buena preparación del tejido es esencial que los cortes no sean mayores de 2 a 3 mm de grosor para las programaciones rápidas o urgentes y de 3 a 5 mm para las programaciones comunes durante la noche o el fin de semana. Es posible una preparación deficiente si el tejido se acumula en el casete del procedimiento, lo que impide a los reactivos circular con propiedad. Las biopsias minúsculas se pueden colocar en bolsas o casetes de malla para biopsia, disponibles en el mercado, que pueden dejarse dentro del casete (fig. 1-2a, b).

Factores que afectan el proceso tisular Temperatura Los reactivos para la preparación a bajas temperaturas son más viscosos y por tanto su difusión tisular es más lenta. Una temperatura de proceso elevada aumenta la energía cinética de las moléculas del reactivo, disminuye la viscosidad del reactivo e incrementa la difusión del reactivo en el tejido. La calefacción ligera de los reactivos para la deshidratación y la clarificación, en límites de 37 a 45°C, acorta en proporción sustancial los tiempos de preparación, pero puede aumentar la contracción del tejido debido al efecto del calor sobre la colágena.

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CAP. 1

MANIPULACIÓN Y PREPARACIÓN DE LA MUESTRA PARA EL DIAGNÓSTICO HISTOPATOLÓGICO DE RUTINA

(b)

(a)

Figura 1-2 a) Casete y bolsa de biopsia para la preparación tisular. b) Contenedor seguro de biopsia celular.

Las temperaturas elevadas en la etapa de la infiltración pueden provocar la contracción y el endurecimiento indebidos del tejido. Esto puede prevenirse con el uso de temperaturas de 2 a 3°C sobre el punto de fusión de los medios de la infiltración para reducir al mínimo estos efectos. Sin embargo, la sangre y el músculo pueden aún tornarse frágiles durante la infiltración y, en consecuencia, debe también considerarse el efecto combinado del tratamiento de la fijación, el deshidratante y el tipo de tejido. Vacío y presión Las máquinas modernas de preparación tisular incorporan un ciclo intercambiable de vacío y presión. En la práctica, la aplicación de presión durante la deshidratación y la clarificación ejerce poco efecto sobre la difusión de los reactivos, aunque puede tener un efecto creciente en la etapa de la infiltración. No obstante, la aplicación de vacío mejora la deshidratación, la clarificación y la infiltración. Agitación El área superficial máxima del tejido debe estar disponible para el intercambio y la circulación de líquido y reactivo durante el procedimiento. Éste no es el caso cuando los casetes tisulares permanecen en el fondo del recipiente, se hallan estáticos en el reactivo o se envasan de forma hermética en la cesta de procesamiento. El área superficial máxima para el intercambio de líquido se daña y es imposible la circulación del reactivo alrededor del tejido; el efecto es el estancamiento, es decir, el reactivo que circunda al tejido permanece a una concentración más baja y se requiere un tiempo mucho mayor para la preparación satisfactoria. Para conseguir resultados constantes, los casetes tisulares se deben envasar, suspender y agitar en el reactivo para

prevenir la inmovilización y posibilitar la circulación del medio. La agitación se puede facilitar con los agitadores y rotores magnéticos para el procesamiento manual, mientras que las máquinas modernas aplican cualquier movimiento rotatorio, de arriba abajo, de lado a lado o de marejada.

Deshidratación, clarificación, infiltración e inclusión Deshidratación La mayor parte de los fijadores tisulares se elabora en solución acuosa y la función del deshidratante es eliminar las moléculas de agua libres y unidas de la muestra. El deshidratante más empleado para el procesamiento de rutina en parafina es el etanol al 99.85% que, en virtud de su alto costo, los laboratorios adquieren en la forma menos costosa de alcohol desnaturalizado industrial (IMS, por sus siglas en inglés) al 99%, que contiene metanol al 2%. Ciertos lípidos y proteínas solubles en agua se eliminan del tejido durante esta etapa. Los tejidos se procesan por medio de una concentración creciente de etanol hasta 99% de IMS (etanol absoluto). El método de fijación empleado y el tipo de tejido determinan la resistencia del primer baño con IMS. Las programaciones comunes del proceso histológico emplean IMS al 70% como el primer paso en la deshidratación del tejido. Los tejidos delicados pueden necesitar IMS al 50% para un proceso lento, mientras que los tejidos fijados en un reactivo alcohólico, como el fijador de Carnoy, se pueden sumergir directamente en varios cambios de IMS al 99%. El tiempo de deshidratación depende del tamaño y el tipo de muestra tisular. En general, los bloques de tejido de 1 mm de espesor requieren 30 minutos en cada gradua-

PREPARACIÓN E INCLUSIÓN DEL TEJIDO

ción de alcohol y los bloques de tejido de 5 mm hasta 90 minutos. Clarificación El agente clarificador es un reactivo que puede mezclarse con la cera de parafina y actúa como un enlace entre el deshidratante (no miscible) y la cera de parafina. Los agentes clarificadores más empleados para las técnicas habituales son los hidrocarburos, como el xileno, el tolueno, el cloroformo y los solventes del petróleo. Estos reactivos, que regula el COSHH, son sustancias inflamables, eliminan la grasa de la piel y tienen grados variables de toxicidad. El tolueno es un posible agente carcinógeno, el cloroformo tiene un efecto narcótico y el xileno, aunque no está demostrado que sea un carcinógeno, puede causar dolores de cabeza como efecto secundario de la inhalación del vapor, cuando el laboratorio carece de las instalaciones adecuadas de extracción (sobre todo en áreas desprotegidas y de tinción manual). Por tales razones, el xileno es quizá el agente clarificador más utilizado. Pueden usarlo todos los procesadores tisulares importantes y es relativamente barato. El xileno se debe adquirir como reactivo libre de benceno (carcinógeno) y azufre. La exposición prolongada al xileno puede causar endurecimiento tisular excesivo y deben formularse las programaciones del procesamiento para reducir al mínimo este efecto. Los tejidos de 1 a 2 mm de espesor requieren dos o tres cambios de xileno en 30 a 60 minutos y los bloques de 3 a 5 mm de espesor exigen tres cambios en un lapso de dos a cuatro horas para el proceso normal. Las funciones de calor y vacío en las máquinas modernas reducen de forma sustancial estos tiempos. Infiltración La cera de parafina es el medio de elección para la infiltración e inclusión en la histopatología común. Es una mezcla de hidrocarburos policristalinos de cadena lineal producida a partir de la destilación y separación del aceite mineral crudo. La cera de parafina se caracteriza por su punto de fusión, que refleja la mezcla de pesos moleculares de sus hidrocarburos constitutivos. Los puntos de fusión, aunque no son exactos del todo, se hallan en los límites de 39 a 68°C; como regla general, cuanto más alto sea el punto de fusión, más dura es la cera. Los tejidos más blandos se benefician con la infiltración de ceras con puntos de fusión más bajos y los tejidos más duros, con la infiltración de aquéllos con un punto de fusión más alto. Empero, el procesamiento histopatológico de rutina es en parte una dificultad debido a la variación de tamaño y la dureza de las muestras tisulares y el agente clarificador elegido. Para este

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fin se emplea la cera de parafina con un punto de fusión de 56 a 58°C. Los tiempos de la infiltración se ilustran en el cuadro 1-1. Estos tiempos se reducen de forma considerable si se utiliza vacío, el que resulta esencial para las muestras del pulmón, en las cuales el vacío fuerza a las moléculas de aire atrapadas a abandonar el tejido. En algunas ceras de parafina se incluyen aditivos para mejorar su consistencia cristalina, atenuar su dureza y fragilidad y, por lo tanto, mejorar las características de corte (microtomía). Entre estas sustancias figuran, entre otras, las resinas termoplásticas, los polímeros plásticos y el sulfóxido de dimetilo, que ayuda a la infiltración y permite un corte fino. Inclusión La cera de parafina para la inclusión tisular debe estar limpia, filtrada y mantenida a 2 a 4°C alrededor de su punto de fusión. Al término de la técnica, la cesta del tejido se transfiere a un depósito calentado o un baño fijo libre de cera. Los tejidos se remueven de sus casetes, uno a la vez, con pinza calentada y la cara colocada abajo en un molde con cera de parafina fundida. El molde se aplica en una superficie refrigerada o un recipiente congelado para facilitar la adhesión del tejido a su base. Está disponible una gran variedad de moldes, entre ellos los moldes de acero inoxidable de capacidades graduadas que reciben el casete del procesamiento/inclusión que actúa como la plataforma de soporte del tejido; las piezas L de Leuckhart; los recipientes congelados; los botes de metal, y los recipientes de plásticos desmoldables. Los moldes se dejan en la placa fría hasta que la cera se solidifica; si no se cuenta con una forma de refrigeración, se puede sumergir en agua fría una vez formada una corteza bastante gruesa en la superficie de la cera. En la actualidad están disponibles los centros de infusión comerciales, que combinan un almacén de molde calentado, un depósito/dispensador de cera fundida y una placa fría (fig. 1-3). Una vez que la cera se solidifica, los bloques del tejido se pueden desprender con suavidad de sus moldes y prepararse para la microtomía. Para la orientación apropiada de las muestras de tejido, una regla general señala que la superficie inferior del tejido en el casete debe colocarse cara abajo en el molde. La orientación es en extremo importante para el diagnóstico efectivo. Una biopsia de piel se debe impregnar en sentido perpendicular a su superficie para suministrar un plano correcto de corte. El tejido cilíndrico/tubular, como las trompas de Falopio o los vasos deferentes, se debe impregnar en su extremo, de modo que puedan practicarse cortes transversales a sus paredes y luz. Es posible utilizar tinturas especiales para marcar los planos de la resección y observar la orientación correcta del tejido.

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CAP. 1

MANIPULACIÓN Y PREPARACIÓN DE LA MUESTRA PARA EL DIAGNÓSTICO HISTOPATOLÓGICO DE RUTINA

(a)

Figura 1-3 Centro de impregnación tisular Shandon Histocentre 3 ⫻.

Procesadores tisulares automáticos Los procesadores tisulares tipo carrusel “abiertos” (fig. 1 -4a) se han sustituido sobre todo con los “cerrados” (fig. 1-4b), esto es, máquinas de procesamiento que satisfacen los lineamientos de Health and Safety y tienen capacidades mayores para casetes. Los procesadores abiertos liberan los vapores del reactivo a la atmósfera cuando la cesta del tejido se mueve entre las fases y, por lo tanto, deben estar instalados en un área de extracción bien ventilada. La agitación se efectúa por un movimiento rotatorio o de riego y el vacío está disponible en la impregnación final de la infiltración de cera. Los tejidos se procesan mediante solventes a temperatura ambiente. Los procesadores cerrados son las unidades indepedientes (modulares) que retienen por completo los vapores del reactivo durante el procedimiento del tejido por medio de trampas de agua o vapor y filtros de adsorción con carbón. Los reactivos se bombean hacia dentro y fuera de un compartimiento/retorta del procesamiento. La agitación se proporciona bajo la forma de flujo de marejada de los reactivos dentro y fuera del recipiente o mediante un movimiento rotatorio de lado a lado. El ingreso de los reactivos se puede mejorar si se alternan los ciclos programables de vacío y presión, de los cuales el primero es el más eficaz. Las etapas de deshidratación y clarificación se pueden reducir en grado notorio por la capacidad para calentar los reactivos (25 a 45°C). La tecnología de microprocesadores permite que múltiples programaciones del procesamiento se almacenen y recuperen y, en algunas máquinas, hacen posible el uso simultáneo de unidades adicionadas para diversas programaciones bajo el control de un módulo regulador. Programaciones “de rutina durante la noche” y “rápidas” del procesamiento tisular El cuadro 1-1 muestra una comparación de las programaciones “de rutina durante la noche” y “rápidas” para los pro-

(b)

Figura 1-4 a) Procesador de tejido Leica TP1020. b) Procesador de tejido cerrado Shandon Excelsior.

cesamientos tisulares automáticos abierto y encerrado. El reabastecimiento de los reactivos y los medios de infiltración de la técnica son dependientes del volumen de reactivo usado por etapa y el número de casetes procesados.

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MICROTOMÍA

Cuadro 1-1

Programaciones “de rutina durante la noche” y “rápida” para el procesamiento de tejidos Procesador de tejido abierto

Reactivo

Procesador de tejido cerrado

Rutina durante la noche (minutos)

Rápida (minutos)

Vacío

Rutina durante la noche (minutos)

Rápida (minutos)

Vacío

60 60 60 60 60 60 60 30 60 60 60 60 90

30 0 0 15 15 30 30 15 15 30 30 30 30

No No No No No No No No No No No Sí Sí

30* 30* 30* 30* 30* 60* 60* 30* 30* 30* 30* 60* 60*

15 0 15 15 15 15 15 10 15 15 15 30 30

Sí Sí Sí Sí Sí Sí Sí Sí Sí Sí Sí Sí Sí

Formol salino al10% Alcohol al 70% Alcohol al 95% Alcohol al 100% Alcohol al 100% Alcohol al 100% Alcohol al 100% Xileno Xileno Xileno Cera de parafina Cera de parafina Cera de parafina

* La temperatura del procesamiento es de 45°C.

Deben considerarse medidas de seguridad apropiadas y es esencial el uso del equipo de protección personal al decantar estas soluciones.

de consumir demasiado tiempo, algo inadecuado en una era en la que las cargas de trabajo exigen la fluidez de los servicios de histopatología.

Procesamiento por microondas

Micrótomos

La utilización de la tecnología de microondas para el procesamiento rápido de los tejidos se adoptó hace ya tiempo. Es en particular útil en procedimientos simples, cuando se requiere un resultado diagnóstico expeditivo de la biopsia, antes que el paciente egrese de la institución. Las biopsias urgentes y las del mismo día también se benefician de esta tecnología y, lo que es de gran importancia, sin perder la calidad de la preparación final.

El micrótomo rotatorio (fig. 1-5) es una máquina de uso general para la producción de cortes de tejido semifinos

Microtomía La microtomía es la ejecución de cortes finos, de uno a cinco micrones (µm) de grosor, a partir de bloques de tejido embebidos en cera de parafina. Este proceso emplea un micrótomo y un cuchillo o una hoja de micrótomo desechable, además del mango de la hoja. Los micrótomos son de la variedad “rotatoria” o “de base deslizable” y están disponibles en el comercio por innumerables proveedores de equipos de laboratorio. La hoja desechable del micrótomo ha reemplazado al cuchillo del micrótomo en las prácticas de los departamentos de histopatología. Estos instrumentos deben estar afilados, sea de modo manual (un procedimiento calificado) o por máquina; esta última pue-

Figura 1-5 Microtómo rotatorio Shandon Finesse E.

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CAP. 1

MANIPULACIÓN Y PREPARACIÓN DE LA MUESTRA PARA EL DIAGNÓSTICO HISTOPATOLÓGICO DE RUTINA

para microscopia ligera. La rotación manual de la rueda montada en un plano lateral hace que el mecanismo de avance mueva al sostenedor del bloque hacia el cuchillo fijado rígidamente a un espesor preestablecido de corte (grosor). El bloque se mueve de arriba abajo contra el cuchillo en un plano vertical con la ejecución de cortes planos, casi siempre de un espesor de 3 a 5 µm para propósitos histológicos de rutina. La velocidad del bloque contra el cuchillo la controla el ritmo al que gira la manivela. Los micrótomos rotatorios y motorizados de uso industrial también están disponibles para usarse en cortes semifinos (0.5 a 1 µm) impregnados en resina para la microscopia de luz; en estos casos la velocidad constante del bloque contra el cuchillo puede controlarse de forma automática. Por lo general, los límites de grosor del corte de estos micrótomos fluctúan entre 0.5 y 60 µm. El micrótomo de deslizamiento, aunque es más conveniente para el corte de tejidos duros y algunas resinas más blandas, es también útil para el corte y formación de tiras de tejidos y biopsias blandas. La pesada estructura de estas máquinas impide la vibración y el mango del cuchillo puede angularse lejos de la dirección del corte, lo cual resulta de utilidad en caso de tejidos duros. El sostenedor del bloque se monta sobre dos corredores paralelos y el sostenedor del bloque discurre por el avance manual de la muestra sobre la misma manivela o por una palanca ensamblada sobre el borde del transportador del bloque, que se mueve contra un soporte estático. El bloque se pasa hacia delante y atrás contra el cuchillo, mediante movimientos de empuje y tracción. Los cortes son de 3 a 5 µm para la histología común. Cuchillos del micrótomo En general, las hojas desechables para la práctica histopatológica de rutina reemplazaron a los cuchillos convencionales de acero del micrótomo. Los cuchillos de acero se fabrican a partir de un carbón de alto grado o acero de gran calidad y deben estar libres de impurezas y ser inoxidables. Los cuchillos se templan (endurecimiento) de un extremo al otro y el grado de dureza se mide mediante la escala de Vickers (casi siempre 400 a 900). Los grados de dureza pueden variar entre los fabricantes y entre los propios cuchillos del mismo fabricante. Se recomienda una dureza de 700; la de 400 es muy blanda y la de 900 demasiado quebradiza para el uso de rutina. Los cuchillos de acero pueden dividirse en perfiles, según sea el uso para el que estén destinados (fig. 1-6):

•

El perfil A corresponde a dispositivos bicóncavos y se emplean para el corte de tejidos impregnados en celoidina. Rara vez se usan en histopatología común.

Figura 1-6 Perfiles de los cuchillos de micrótomo.

•

El perfil B incluye instrumentos planos y cóncavos y pueden utilizarse para seccionar tejidos blandos embebidos en cera y tejidos y muestras botánicos impregnados en celoidina. Este perfil y el anterior poseen los bordes más afilados.

•

El perfil C se refiere al dispositivo acuñado y es el cuchillo de acero de empleo más común en histopatología de rutina. Los cuchillos son más rígidos respecto de los perfiles A y B y se utilizan para el corte de cera de parafina de todos los tejidos y en los crióstatos para el corte de material congelado (véase más adelante). Los instrumentos de esta categoría no son tan afilados como los de los perfiles A y B.

•

El perfil D corresponde a herramientas más anchas y planas y se usa para seccionar materiales duros, como resinas, y bloques de tejidos en cera de parafina de extrema dureza. Este cuchillo produce el borde menos agudo cuando se aplica.

Se sugiere la consulta de varios métodos manuales y automatizados disponibles para el afinado y afilado de los cuchillos mencionados. Las hojas desechables se modificaron y engrosaron a partir de hojas de afeitar; se fabrican con acero inoxidable de alta calidad y permiten hacer cortes reproducibles, sin compresión y de buena calidad. La hoja fina se sujeta con rigidez en su propio sostenedor especial para minimizar la vibración durante la microtomía. Las hojas pueden recubrirse con platino o cromo para otorgarles una vida más larga. Hoy en día, estas hojas son la primera opción para la histopatología común. Otros cuchillos incluyen carburo de tungsteno para trabajar la resina y cortar hueso sin descalcificarlo; los cuchillos de vidrio, diamante y zafiro se usan con materiales tratados con araldita y resina epóxica en microscopia electrónica o para obtener bloques pequeños y estrechos de tejidos impregnados en acrílico o resina de poliéster para la microscopia de luz.

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TÉCNICAS ESPECIALES

Corte de la cera de parafina

Corte de un macrobloque

Para la práctica de un corte se requiere un cuchillo recién afilado del micrótomo o una hoja desechable nueva con un borde agudo sin defectos. Todas las operaciones referentes a la colocación o retiro del bloque dentro y fuera del sostenedor del bloque se deben efectuar con firmeza y seguridad. Las hojas son en extremo peligrosas y deben tratarse con mesura. Debe sujetarse el mango de los micrótomos rotatorios; el transportador del bloque se coloca en los micrótomos de deslizamiento y se sujeta de donde se disponga en el extremo del micrótomo, lo más alejado de la lámina. Algunos laboratorios emplean un micrótomo de “corte áspero” para recortar el bloque del tejido hasta obtener un área representativa seccionada de forma transversal. Las muestras se remueven en intervalos de 10 a 15 µm, hasta que la faz del tejido está disponible; luego se practican varios cortes a 4 o 5 µm para asegurar un bloque de superficie lisa (que evita el artefacto del corte burdo). El sostenedor del bloque del cortador burdo se coloca en el mismo plano que el resto de los micrótomos del laboratorio. El corte burdo puede realizarse con el mismo micrótomo o incluso con la misma lámina. El corte de la sección se debe efectuar en un área separada de la hoja o el cuchillo utilizados para los propósitos del corte general. Los bloques extraídos para el diagnóstico se preenfrían en un recipiente congelado o una placa más fría antes del corte. El enfriamiento propicia la compresión del bloque y opone una faz más rígida del bloque al cuchillo para facilitar el corte. El grosor de la sección es casi siempre de 3 a 5 µm. Cuando el filo del cuchillo pasa a través de la superficie del bloque, los cortes del tejido se desplazan hacia arriba (micrótomo de deslizamiento) o abajo (micrótomo rotatorio) de la cara del cuchillo. Cuando el bloque golpea el filo del cuchillo, la fricción producida crea una “superficie que se derrite” en la cera y, en consecuencia, las secciones subsecuentes se adhieren una a otra y forman una cinta. Ésta se sostiene, se retira del filo del cuchillo y se hace flotar sobre un baño de agua a 48 a 50°C con la pinza cortante. Las secciones se separan de sus puntos de adhesión y se fijan a los portaobjetos de vidrio del microscopio por sumergimiento parcial del portaobjetos en el agua. El exceso del agua se elimina del portaobjetos, que se deja secar sobre una placa caliente a 60°C, no en contacto directo, hasta que todos los restos de agua se eliminen. Sólo entonces el portaobjetos se pone en contacto con la placa caliente por cinco a 10 minutos para facilitar la adherencia de la sección de cera de parafina al cristal. Los cortes quedan listos para la tinción con hematoxilina y eosina o un sinfín de métodos de tinción e inmunocitoquímica que el histólogo tiene a su disposición. El montaje, como se mencionó con anterioridad, puede ser automatizado.

El informe del laboratorio y el suministro de un mínimo de datos establecen la base del diagnóstico histológico. El muestreo, procesamiento y cortes transversales enteros de un tumor son ahora técnicas histológicas adoptadas y proporcionan información más precisa sobre la naturaleza del tumor y las distancias de los márgenes de resección. El método tiene una aplicación extensa, pero es en particular útil en las afecciones de la mama, próstata e intestino. El procesamiento de macrobloques requiere megacasetes, portaobjetos grandes e instalaciones especiales. Los tiempos de la técnica se incrementan y las muestras se resecan con micrótomos rotatorios o de deslizamiento modificados. La tinción se facilita sobre todo de manera manual.

Técnicas especiales Corte por congelamiento de tejidos frescos La mayor parte de los laboratorios histológicos de rutina incluye en su inventario un servicio de diagnóstico que recurre al corte por congelamiento para pacientes con sospecha de tumor. El diagnóstico puede notificarse al cirujano por teléfono 10 a 20 minutos después de tratar la muestra del tejido; por consiguiente, es de gran ayuda para la atención clínica del paciente. Para este procedimiento se utiliza el crióstato (fig. 1-7), un micrótomo rotatorio u oscilatorio

Figura 1-7 Crióstato Leica CM3050S.

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CAP. 1

MANIPULACIÓN Y PREPARACIÓN DE LA MUESTRA PARA EL DIAGNÓSTICO HISTOPATOLÓGICO DE RUTINA

alojado dentro de una cámara refrigerada. La temperatura de la muestra y el sostenedor del espécimen, el cuchillo y la cámara pueden fijarse de modo independiente o bien puede seleccionarse una sola temperatura para todo el conjunto. El tejido fresco para diagnóstico rápido se envía desde el quirófano, congelado en el contenedor de la muestra con dióxido de carbono, nitrógeno líquido o un aerosol congelante, y se transfiere al crióstato para cortarlo. Si las condiciones tisulares son óptimas, es posible obtener cortes tan delgados como de 1 µm. Los tejidos frescos se deben disecar y congelar en un gabinete de seguridad microbiológica. La mayoría de los crióstatos modernos incorpora un ciclo de descontaminación de cuatro horas con formalina para la desinfección de la cámara después de casos de cortes infecciosos insospechados (algunas lesiones tuberculosas pueden parecer a simple vista tumoraciones). El micrótomo congelante (fig. 1-8) puede aplicarse para cortes semifinos de tejidos frescos, cuando apremia demos-

superficie del tejido tanto como el sostenedor de la muestra avanza de acuerdo con un espesor preestablecido. El tejido se congela in situ por medio de un cilindro adjunto de dióxido de carbono o un refrigerante que circula. Los cortes delgados consistentes son difíciles de obtener. Cortes de hueso sin descalcificar Este procedimiento exige la producción de cortes de 4 a 5 µm de hueso sin descalcificar embebidos en una resina acrílica o de poliéster. Aunque un micrótomo de deslizamiento puede usarse para este propósito, es más común emplear un micrótomo motorizado industrial (fig. 1-9). Los cuchillos del perfil D (herramienta con filo), de tungsteno, vidrio o diamante, se emplean con frecuencia para los cortes de ese tejido.

Figura 1-9 Micrótomo rotatorio motorizado de uso industrial Leica RM2255.

Microscopia electrónica

Figura 1-8 Micrótomo congelante Leica 1325.

trar sustancias que de manera habitual se eliminan durante el procesamiento de rutina (p. ej., lípidos). Este tipo de micrótomo tiene un recipiente estático para la muestra y el propio cuchillo discurre de forma manual a través de la

La microscopia electrónica requiere practicar cortes ultrafinos impregnados de resina y usar un ultramicrótomo. Las resinas epóxica o de araldita se usan con regularidad y el grosor de la sección se mide en nanómetros (nm). El corte se facilita con el uso de cuchillos de vidrio o diamante y el grosor de la sección se vigila al observar el color de la interferencia que produce la sección en contacto con el agua, es decir, oro (90 a 120 nm), plata (60 a 90 nm) y gris (< 60 nm). Los cortes se recuperan y tiñen sobre rejillas especiales de cobre o rodio. Las tinturas emplean sales

RECONOCIMIENTOS

de metales pesados, como el citrato de plomo y el acetato de uranilo, que impregnan a ciertas estructuras tisulares. Estos metales pesados desvían un haz de electrones que emite el microscopio electrónico. Esto crea áreas de tonos negros y grises dentro del corte tisular, donde los elementos ultraestructurales se impregnaron de metales pesados. El microscopio electrónico incorpora un sistema de cámara que puede fotografiar áreas de interés dentro de la sección; el resultado final es la micrografía electrónica. Ésta es una revisión en extremo general de la microscopia electrónica.

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Lectura adicional Bancroft JD, Gamble M. Theory and Practice of Histological Techniques, 5th ed. Edinburgh: Churchill Livingstone 2002.

Reconocimientos Fotografías por cortesía de Thermo Electron Anatomical Pathology, Leica UK Ltd, y Dr AT Warfield, Histopathology, University Hospital Birmingham, UK.

2 Tinciones generales Barrie Sims

¿Por qué la tinción? Cuando se examinan al microscopio, los cortes finos de tejido muestran una diferenciación muy sutil entre las estructuras compuestas. La tinción de los tejidos con colorantes contrastantes permite que las estructuras se visualicen bajo el microscopio de luz. Además, la demostración de varios productos, inclusiones o microorganismos celulares exige el uso de procedimientos de tinción especializados. La mayor parte de la histopatología diagnóstica de rutina se realiza sobre tejidos impregnados en cera de parafina. Los cortes por congelamiento son una excepción. Estos procedimientos son necesarios para el diagnóstico de urgencia o para demostrar sustancias perdidas, destruidas o inhibidas en el proceso de fijación e impregnación. Después de la microtomía, el corte en parafina aún está infiltrado con cera. La cera presente en las secciones oscurece la estructura del tejido y es impermeable en grado notable a los colorantes. Casi todos los métodos de tinción se basan en agua o alcohol y, por lo tanto, la remoción de la cera es imprescindible. Una vez que los cortes se secan sobre el portaobjetos, las secciones se tratan con xileno para eliminar la cera. Clarificar las muestras en alcoholes graduados elimina el xileno y hace posible la hidratación de los especímenes. Este proceso se conoce a menudo en la metodología con diversos términos: cortes desencerados, secciones al agua, hidratación de muestras.

vital, es decir, cuando el colorante se aplica a tejidos vivos, se utiliza sólo de modo ocasional, si acaso). Solubilidad electiva Éste es el mecanismo por el cual los colorantes disueltos en un solvente son más solubles en el componente del tejido que en el solvente mismo. Este mecanismo se emplea sobre todo en la demostración de grasa en cortes congelados. Por lo general, los tintes usados son del tipo Sudán (III, IV). Impregnación metálica Es posible la aplicación de plata metálica a los elementos del tejido para demostrar una amplia variedad de estructuras y sustancias. Las células que tienen la capacidad de reducir una solución amoniacal de plata, sin la necesidad de un agente de reducción externo, se conocen como “argentafines”. La melanina y las células de Kultschitzky del aparato digestivo son ejemplos típicos. Las células o las estructuras que requieren un agente de reducción externo se llaman “argirófilas”. Se recurre con regularidad a la impregnación metálica en la demostración de fibras reticulares, membranas basales, hongos, inclusiones celulares y células nerviosas y sus axones.

Mecanismos básicos de tinción

Reacciones histoquímicas

En la histopatología diagnóstica, los métodos de tinción se pueden agrupar en cuatro procesos principales (la tinción

Éstos son los métodos en los cuales existe una comprensión clara de los mecanismos que intervienen. La reacción final

The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker, © 2005 John Wiley & Sons, Ltd.

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CAP. 2

TINCIONES GENERALES

puede usar un colorante o inducir por sí misma una reacción coloreada. Por ejemplo, el reactivo de Schiff, utilizado en la demostración de aldehídos, emplea la fucsina de tinción básica en la reacción, que tiñe de magenta los sitios que tienen aldehído; por su parte, en la reacción de Perl para los depósitos de hierro férrico (fig. 2-1), la interacción entre el ferrocianuro de potasio (un componente de la solución de Perl) y el hierro férrico en los tejidos produce el pigmento azul de Prusia en el sitio donde se halla el hierro férrico.

dos comprenden a la gran mayoría de los colorantes usados en las técnicas histológicas (p. ej., eosina, azul de metileno y fucsina básica). Los colorantes se pueden también agrupar como ácidos, básicos o neutros. Colorantes ácidos y básicos De forma sinóptica, los colorantes ácidos (aniónicos) sufren atracción de los elementos del tejido con propiedades básicas, por ejemplo el citoplasma de las células. Los colorantes básicos (catiónicos) experimentan atracción de las estructuras que poseen una naturaleza ácida, como el DNA del núcleo celular. Mediante una combinación de colorantes ácidos y básicos de un color contrastante pueden diferenciarse el núcleo y el citoplasma. Ésta es la base de la tinción con hematoxilina y eosina (H-E), un método de tinción usado en la mayor parte de los laboratorios de histopatología diagnóstica para demostrar la estructura general. Colorantes neutros

Figura 2-1 Reacción de Perl para el hierro férrico. Los depósitos de hierro férrico están teñidos de azul.

Muchas enzimas se pueden demostrar por la incubación de los cortes (congelados o en cera) en los sustratos que contienen una sustancia con la cual reacciona la enzima, lo que induce un producto de reacción primaria. A continuación, un segundo reactivo interactúa con el producto de reacción primaria para formar un depósito coloreado en el sitio de la actividad. Las muestras de control que tienen o no la sustancia (positivas o negativas) se usan para determinar la especificidad de la reacción. Las sustancias que inhiben la reacción también pueden emplearse para mejorar la especificidad de la reacción. Tinción con colorantes Casi todos los procedimientos de tinción en patología diagnóstica pertenecen a este grupo. En muchos casos, la comprensión del mecanismo de tinción no es completa y los resultados dependen con frecuencia de la capacidad y el conocimiento del clínico. Clasificación Los colorantes se pueden clasificar como naturales o sintéticos. Los primeros incluyen a la hematoxilina; los segun-

Los colorantes neutros se elaboran al combinar soluciones ácidas y básicas. El producto resultante de la combinación tiñe las estructuras ácidas y básicas con una solución única. Los colorantes de Romanowsky, aplicados por ejemplo en la demostración de células de la médula ósea, son una combinación de azul de metileno y eosina. Metacromasia Los colorantes que se combinan con ciertos elementos tisulares y que producen un color que es diferente al del colorante original se denominan “metacromáticos”. Los métodos de tinción metacromática se pueden emplear para la demostración de mucinas, gránulos de mastocitos, amiloides y cartílago del tejido conectivo. La metacromasia se pierde casi siempre durante la deshidratación de los especímenes antes del uso de los cubreobjetos. Por lo regular, lo anterior puede prevenirse con la utilización de un medio acuoso para el montaje. Existen algunas variaciones en los métodos metacromáticos que conservan la metacromasia durante la deshidratación. Fluorescencia Casi todos los métodos de tinción se observan con la luz visible. Los colorantes que tienen la capacidad de absorber la luz ultravioleta y luego transmitirla dentro del espectro visible se conocen como “fluorescentes”. Éstos pueden utilizarse para demostrar el amiloide de Mycobacterium

MECANISMOS BÁSICOS DE TINCIÓN

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tuberculosis (y antígenos tisulares cuando se aplican en las técnicas inmunocitoquímicas). Para ver las preparaciones se requieren microscopios fluorescentes y un cuarto oscuro para conseguir una claridad óptima. La tinción fluorescente es a menudo de breve duración y en tal caso se recurre a la fotografía para proporcionar un registro permanente.

celulares. Hay varias formulaciones disponibles, por ejemplo las de Harris, Ehrlich, Mayer, Delafield, Cole y Gill. Las hematoxilinas de alumbre deben ser “azuladas” (véase más adelante) para que los núcleos se tiñan de azul.

Colorantes directos

Se obtienen tras agregar cloruro férrico o sulfato férrico y amonio a la solución de hematoxilina. La solución resultante produce un colorante negro e intenso que se puede utilizar para demostrar núcleos celulares, elastina, estriaciones musculares y mielina. El colorante es más resistente a la extracción ácida que las hematoxilinas de alumbre y está indicado cuando se emplean las contratinciones ácidas, por ejemplo en el método de Gieson para tejidos conectivos. La estructura demostrada depende del reactivo usado para diferenciar (eliminación del exceso de colorante del fondo de la muestra hasta que sólo se delinea la estructura requerida). Los diferenciadores ácidos eliminan el colorante necesario para perfilar los núcleos de la célula. Al reaplicar la solución mordiente a la sección se observa una eliminación progresiva de hematoxilina de la muestra; esto permite que puedan observarse la mielina, elastina y estriaciones musculares. Las hematoxilinas de alumbre se pueden convertir a hematoxilinas de hierro mediante el tratamiento del corte con una solución de hierro antes de la hematoxilina. Un ejemplo es la secuencia azul celeste-hemalum.

Los colorantes que tienen la propiedad de combinarse con las estructuras tisulares a partir de soluciones acuosas simples o alcohólicas se llaman colorantes “directos”. La eosina y muchos otros colorantes anilínicos poseen esta característica. Colorantes indirectos Los colorantes que no poseen ninguna afinidad directa por las estructuras tisulares y requieren una sustancia intermediaria para permitir la tinción se llaman colorantes “indirectos”. La sustancia intermediaria se conoce como “mordiente” (similar a un catalizador). El colorante se combina con el mordiente y a su turno con el elemento del tejido, lo que produce un complejo colorante-mordiente-tejido. La hematoxilina, sin el uso del mordiente, es un colorante tisular débil. La adición de metales a la solución de hematoxilina, como el sulfato de aluminio y potasio o el cloruro férrico, puede crear colorantes potentes para usos diversos.

Hematoxilinas de hierro

Hematoxilina de plomo Tinción con hematoxilina Las soluciones de hematoxilina necesitan oxidarse (algunas veces se dice “madurarse”) antes de emplearlas para teñir tejidos. La oxidación se puede realizar por medios químicos con la adición de agentes oxidantes, como yodato de sodio o, desde luego, mediante la luz solar (lo que puede tomar varios meses). El proceso de la oxidación convierte a la hematoxilina en hemateína. Por lo general, las preparaciones de hematoxilina se oxidan sólo en parte y la oxidación adicional prosigue con el tiempo. El uso de la oxidación incrementa la vida de la solución. Según sea el mordiente utilizado, la hematoxilina puede demostrar diversas estructuras. Hematoxilinas de alumbre Éstas se producen por la adición de sulfato de aluminio y potasio o amonio a la solución de hematoxilina. Las hematoxilinas de alumbre se usan para teñir de azul a los núcleos

Las soluciones de hematoxilina que contienen plomo revelan células endocrinas. Hematoxilina de ácido fosfotúngstico Esta tinción perfila estriaciones musculares, fibrina, núcleos, mielina, cilios, células neurogliales y amebas. El ácido fosfotúngstico se utiliza tanto como el mordiente y la hemateína o la hematoxilina como colorante. El uso de la hemateína elimina la necesidad de la oxidación. Preparaciones comerciales Ahora están disponibles muchas soluciones de hematoxilina en el comercio. Esto evita la necesidad de la preparación, que consume tiempo en el laboratorio y la manipulación de sustancias tóxicas. Las nuevas fórmulas eliminan el uso de sustancias dañinas o tóxicas (p. ej., mercurio) de la preparación y se elaboran soluciones menos perjudiciales.

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CAP. 2

TINCIONES GENERALES

Tinciones regresivas y progresivas Regresivas Una tinción regresiva se aplica casi siempre al corte por un periodo que tiña de manera inicial todas las estructuras del tejido. Al eliminar de modo selectivo el exceso de colorante se revelan los elementos de interés. El retiro del exceso del colorante se llama “diferenciación”. Esto puede conseguirse con el uso de solventes (alcohol), ácido diluido y soluciones ácidas o alcohólicas o la solución mordiente. Progresivas Una tinción progresiva tiñe de manera creciente elementos del tejido, de acuerdo con el tiempo en la solución de tinción. Las tinciones progresivas no tiñen los tejidos de modo excesivo y el periodo de impregnación se suspende después de un lapso determinado. La hemalum de Mayer es una tinción nuclear progresiva de uso frecuente como contratinción nuclear en otras técnicas, por ejemplo el método del ácido peryódico de Schiff (PAS).

Métodos comunes de tinción Los métodos de tinción habituales se pueden agrupar en nueve categorías (véase el cuadro 2-1).

Cuadro 2-1 Categorías de los métodos comunes de tinción Estructura general Fibras de tejido conectivo Carbohidratos y mucosustancias Pigmentos Microorganismos Sustancias extracelulares (fibrina, amiloide) Lípidos Gránulos citoplásmicos Células neurológicas

Figura 2-2 Corte de riñón teñido con hematoxilina y eosina que muestra un glomérulo de situación central. Los núcleos están teñidos de azul (las intensidades que difieren dependen de la cantidad de cromatina nuclear presente) y la estructura general de rosa. Los eritrocitos son de color rosa salmón.

Cuadro 2-2 Protocolo para la tinción de H-E 1. Desencerar los cortes con xileno, tratar con alcoholes graduados y lavar en agua 2. Teñir los núcleos con una hematoxilina de alumbre (p. ej., Harris, Gill, etc.) 3. Clarificación en agua para eliminar el exceso de colorante 4. Eliminar el exceso de colorante de los tejidos (diferenciar) hasta que sólo se delineen los núcleos (se utiliza con frecuencia una mezcla de ácido clorhídrico al 0.5 a 1.0% en alcohol al 70%) 5. Lavar las muestras hasta que los núcleos sean azules. El término “azulado” se utiliza para describir el proceso por el cual los núcleos celulares teñidos con una hematoxilina de alumbre se lavan en agua o un álcali débil hasta que los núcleos cambian del rojo al azul. La reacción es análoga a los cambios de color mostrados por el tornasol 6. Teñir el citoplasma celular con la eosina (hay un buen número de formulaciones que se pueden utilizar para ajustar las condiciones locales y el pH del agua) 7. Después de una breve clarificación en agua (o directamente en alcohol) las muestras se devuelven al xileno y se aplica un cubreobjetos

Estructura general El método con hematoxilina y eosina (designado a menudo como H-E) es uno de los más utilizados para la tinción de estructuras generales en histopatología diagnóstica (véase fig. 2-2). El procedimiento sigue el orden mostrado en el cuadro 2-2. Los procesos de lavado y deshidratación efec-

tuados luego de la tinción con eosina eliminan a ésta de la muestra. El control cuidadoso de este proceso permite que varias estructuras (músculo, colágena y eritrocitos) se muestren de forma selectiva en diversas intensidades, desde el rosa hasta el rojo.

MÉTODOS COMUNES DE TINCIÓN

Soluciones simples para tinción Una solución acuosa al 0.5 a 1% de azul de metileno, por ejemplo, tiñe de azul todas las estructuras del tejido. La eliminación selectiva del colorante mediante clarificación y alcoholes revela los elementos tisulares en intensidades que se diferencian del azul. Colorante de Romanowsky Se trata de un colorante neutro (véase antes) que puede inducir una reacción de tinción similar a la de H-E cuando se aplica a los cortes con cera de parafina. Fibras y músculos del tejido conectivo

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jación basada en mercurio produce mejores resultados que los del formaldehído. La tinción requiere habilidad para su práctica. Los principios teóricos del tricromo son complejos y rebasan los alcances de este capítulo. Hematoxilina fosfotúngstica ácida (PTAH) De uso frecuente en la demostración de tejidos musculares, la tinción PTAH tiñe las estriaciones y las miofibrillas musculares de azul. La colágena se delinea en rojo. Fibras reticulares Impregnación con plata Las fibras reticulares se demuestran en particular con los métodos de impregnación en plata (fig. 2-4). Existe una amplia variedad disponible

Colágena y músculo van Gieson van Gieson y sus variantes son los colorantes más comunes para colágena y músculo. La solución que tiñe es una mezcla de ácido pícrico y fucsina ácida. Debido a la naturaleza ácida de la solución de van Gieson, se utiliza una hematoxilina de hierro para la tinción nuclear. El músculo y los eritrocitos se tiñen de amarillo, mientras que la colágena lo hace de rojo; los núcleos son negros. Tricromos Delinean la colágena y el músculo de manera diferenciada (fig. 2-3). El músculo teñido es rojo, en tanto que la colágena puede adoptar un tono azul o verde, de acuerdo con el orden de tinción usado. Por lo regular, la fiFigura 2-4 Impregnación de plata de fibras reticulares en una sección del hígado. Una fina red negra de fibras envuelve a las células. El teñido más burdo (derecha inferior) es colágena.

de estas técnicas; empero, su metodología es similar (véase el cuadro 2-3). La contratinción de los núcleos es opcional. Se ennegrecen las fibras reticulares y otras estructuras emiten sombras de tono marrón (a menos que de suyo sean oscuras). También pueden impregnarse los núcleos. La preparación de la solución de plata amoniacal debe estar fresca y requiere habilidad. La reacción del ácido peryódico de Schiff (PAS) también perfila fibras reticulares.

Figura 2-3 Para la demostración de los tejidos conectivos se utiliza un método de tricromo (o tricrómico). Las fibras del músculo se tiñen de rojo, la colágena de azul, los núcleos de negro y las células sanguíneas rojas de rojo brillante.

Membranas basales Es necesaria la demostración de membranas basales glomerulares durante el diagnóstico de la enfermedad glomerular. Los cortes se oxidan con ácido peryódico y se impregnan con una solución de metenamina de plata. La reacción es progresiva y se detiene en el punto

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CAP. 2

TINCIONES GENERALES

Cuadro 2-3 Protocolo para la tinción con impregnación de plata

Glucógeno

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.

La reacción de PAS se usa con frecuencia para la demostración del glucógeno. Para identificar los sitios de acumulación del glucógeno es necesario pretratar un corte duplicado con diastasa. Ésta extrae el glucógeno y, cuando se tiñen ambas muestras, la digerida señala una ausencia de PAS al teñir los sitios del glucógeno. La metenamina de plata se puede utilizar de una manera similar y reconoce al glucógeno como producto ennegrecido. El carmín de Best es otro método difundido para el glucógeno.

Desencerar los cortes y clarificar en agua destilada Oxidar con permanganato de potasio Blanquear con ácido oxálico Sensibilizar con el alumbre de hierro Impregnar con una solución de nitrato de plata amoniacal Reducir con formaldehído Fijar con el tiosulfato de sodio Tonificar (opcional) con ácido cloroáurico (cloruro de oro) Lavar, deshidratar con alcohol, tratar con xileno y montar

deseado de impregnación. Se requiere el corte de las muestras en 1 a 2 µm para que se visualicen las estructuras finas de la membrana basal. La reacción con PAS también puede emplearse para delinear las membranas basales. Elastina Varios colorantes se pueden usar para demostrar tejido de elastina, entre ellos la hematoxilina (método de Verhoeff), fucsina de rescorcina (método de Weigert o Miller) y aldehído de fucsina y orceína. El método de Verhoeff, aunque es común, tiene dificultades para demostrar fibras gruesas y finas en el mismo corte. La variante de Miller de la tinción de Weigert para la elastina produce resultados buenos y confiables de modo consistente. Las calificaciones de este método son superiores de manera constante respecto de otros métodos en estudios de calidad (United Kingdom National Quality External Quality Assurance Service for Cellular Pathology Technique [UKNEQAS-CPT]; portal: www.ukneqas-cpt.co.uk). La orceína tiene éxito razonable para demostrar la elastina de la piel. Se usa con frecuencia la tinción de van Gieson del tejido conectivo para la contratinción de la elastina.

Mucosustancias Por lo general, las mucosustancias se encuentran en la forma de mezclas de tipos diversos e incluyen a las mucinas. Éstas se localizan en muchos sitios tisulares (p. ej., tejidos glandular y conectivo). La demostración de las diversas mucinas depende de sus propiedades particulares. Las mucinas neutras se pueden teñir por la reacción de PAS (fig. 2-5), mientras que las mucinas ácidas lo hacen con el azul alciano.

Carbohidratos y mucosustancias Reacción de ácido peryódico de Schiff (PAS) La reacción del PAS se emplea en patología para demostrar una amplia gama de sustancias. El ácido peryódico rompe los enlaces de carbono de los grupos adyacentes de glicol 1:2 por oxidación y forma aldehídos. Éstos inducen al reactivo incoloro de Schiff para recolorear y teñir los sitios de actividad de un tono magenta oscuro. Dado que muchas sustancias contienen grupos glicol 1:2, la tinción no es muy selectiva. Para mejorar la selectividad de la reacción para algunas sustancias es necesario extraer o bloquear esa sustancia en una muestra duplicada mediante enzimas o productos químicos.

Figura 2-5 Demostración de mucina que se tiñe mediante una combinación del método de ácido peryódico de Schiff (PAS) y azul alciano. Las mucinas neutras se tiñen de magenta, las mucinas ácidas de azul y las mezclas, de azul púrpura intenso.

El azul alciano, preparado a diferentes pH, diferencia las mucinas ácidas generales de las sulfatadas. Esta tinción preparada con concentraciones que difieren del cloruro de magnesio revela mucosustancias como el ácido hialurónico, el sulfato de condroitina, el sulfato de queratina y la heparina.

MÉTODOS COMUNES DE TINCIÓN

Las mucinas del tejido conectivo se pueden también reconocer con colorantes metacromáticos como el azul de toluidina, en tanto que la mucicarmina de Southgate perfila las mucinas carboxiladas o débilmente ácidas. Las técnicas de bloqueo para prevenir la tinción de grupos químicos particulares (p. ej., carboxilo) se aplican para mejorar la especificidad por la ausencia de tinción en las secciones tratadas. Demostración de pigmentos Los pigmentos se pueden encontrar en material normal y patológico y se forman de modo natural o como artefactos de la fijación o la tinción del tejido. Artefactos Por lo regular, los artefactos ocurren durante la fijación y pueden deberse a las soluciones ácidas del formaldehído que reaccionan con la sangre (pigmento de formalina). Pueden evitarse con el uso de soluciones neutrales amortiguadas de formalina. Los fijadores basados en el mercurio (p. ej., Zenker) dejan un depósito de sales de mercurio dentro de los tejidos. Ambos pigmentos se eliminan con facilidad antes de aplicar la tinción. El cuadro 2-4 enlis-

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ta algunos pigmentos comunes y los métodos usados para demostrarlos. Microorganismos Los microorganismos que pueden delinearse en el plano histológico incluyen bacterias, inclusiones víricas, hongos y espiroquetas. Los colorantes simples como el azul de metileno proporcionan a menudo medios rápidos y fáciles de identificar la presencia de agentes patógenos dentro de una muestra; sin embargo, el azul de metileno suministra información sólo en relación con la morfología. Bacterias Las bacterias se dividen en grampositivas o gramnegativas, según sea su reacción de tinción con el colorante cristal violeta de Gram. Las bacterias grampositivas conservan la tinción después de la diferenciación en acetona o alcohol, mientras que las bacterias gramnegativas se decoloran. Luego de aplicar el colorante cristal violeta, en el cual el yodo se utiliza como mordiente o “agente atrapador”, que precipita el colorante dentro del citoplasma de las bacterias grampositivas, se emplea una contratinción roja para mostrar las bacterias gramnegativas. La técnica requiere destreza, dado que es posible una sobrediferenciación del cristal violeta que produce bacterias grampositivas rojas.

Cuadro 2-4 Demostración de algunos pigmentos comunes

Bacilos rápidos para el ácido y el alcohol Pigmento

Método de demostración

Hemosiderina Pigmento de la bilis Melanina Lipofucsinas

Azul prusiano de Perl Gmelina Masson Fontana Ferrocianuro férrico de Schmorl PAS Masson Fontana Negro de Sudán Ziehl-Neelsen largo Hematoxilina de plomo Masson Fontana Diazo Grimelius Bodian

Digestión del precursor de la amina y descarboxilación de gránulos celulares en células neuroendocrinas Células cromafines Cobre Asbesto

Reacción cromafín Giemsa Ácido rubeánico Rodanina Azul prusiano de Perl Birrefringencia

Estos patógenos se demuestran casi siempre mediante el método de Ziehl-Neelsen (ZN). La fucsina básica y el fenol se mezclan para producir “carbol fucsina intensa”. La siguiente tinción (con o sin el uso de calor) de la muestra se diferencia con una solución de alcohol ácido hasta decolorar el espécimen. Una contratinción (azul o verde) demuestra otros microorganismos y la estructura general. También es posible emplear un método fluorescente (auramina-rodamina). Visto bajo un microscopio fluorescente, el microorganismo emite luz fluorescente amarilla o verde. Este método es más sensible que el ZN estándar puesto que los agentes patógenos aislados se identifican con mayor facilidad. Casi siempre es necesario desarrollar el método con un ZN estándar una vez que se identifica la localización de los microorganismos. Inclusiones víricas No hay métodos de tinción específicos para las inclusiones víricas ya que muchas de las técnicas tiñen a otras estructu-

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CAP. 2

TINCIONES GENERALES

ras. Se ha usado la tartracina floxina para demostrar cuerpos víricos en la inclusión y la orceína para la identificación de la hepatitis B. Los métodos inmunocitoquímicos han reemplazado en buena medida al reconocimiento de las inclusiones víricas. Hongos Los hongos pueden ser evidentes en muestras teñidas con H-E, pero pueden teñirse de forma más selectiva mediante PAS, metenamina de plata de Grocott (fig. 2-6), mucicarmina de Southgate (para Cryptococcus), tinción de Gram, Ziehl-Neelsen y Giemsa.

colorante a la hematoxilina fosfotúngstica ácida. “Fibrinoide” es un término aplicado a una sustancia hialina que induce reacciones de tinción similares a las de la fibrina. El método azul de escarlata de Matius-Lendrum delinea a los eritrocitos en tono amarillo, a la fibrina y fibrinoide en rojo y a la colágena y fibrina menos reciente en azul. El método requiere una hábil diferenciación. El método original recomendó la fijación basada en el mercurio; empero, pueden alcanzarse resultados aceptables con soluciones de formaldehído sin mercurio. Amiloide El amiloide se tiñe de rosa en cortes con H-E, es positivo en moderada medida al PAS y se tiñe de amarillo o marrón con la tinción de van Gieson. El amiloide se revela de rutina si se utiliza el rojo Congo. Un gran número de formulaciones tiñe al amiloide en tonos rosados a rojos. Bajo luz polarizada, el amiloide teñido con rojo Congo es dicroico y emite birrefringencia amarilla o verde. El violeta de metilo o el azul de toluidina tiñen al amiloide de manera metacromática (rojo púrpura a violeta). La tioflavina T es un colorante fluorescente que posee fluorescencia amarilla brillante. Este método no es específico pero sí muy sensible. Lípidos

Quizá las espiroquetas sean los microorganismos más difíciles de demostrar en cortes tisulares. El método de Levaditi se realizó en bloques de tejido impregnados con plata. La impregnación y el corte subsiguientes revelaron que las espiroquetas aparecían en tonalidad negra. Se han descrito varios métodos con plata para demostrar espiroquetas en muestras tisulares. Todos requieren un grado sustancial de habilidad para obtener buenos resultados. Algunos de ellos se han adaptado para revelar Helicobacter.

Los lípidos se pueden encontrar en tejidos normales y patológicos. En condiciones normales, los lípidos simples se pierden durante el procesamiento con cera de parafina y se requieren cortes congelados para probar su presencia. Se demuestran los lípidos simples mediante colorantes solubles en grasa (p. ej., colorantes de Sudán). El principio de la tinción se basa en la presunción de que el colorante es más soluble en la grasa que en el solvente del que está compuesto (solubilidad electiva). Los lípidos compuestos, en los cuales están presentes otros productos (p. ej., fosfolípidos), pueden resistir el procesamiento y los revelan diversos métodos en cortes de parafina. La mielina (fosfolípido) se puede perfilar con azul Luxol rápido o colorantes basados en hematoxilina.

Sustancias extracelulares (fibrina y amiloide)

Gránulos citoplásmicos

Fibrina

Gránulos de mastocitos

La fibrina se tiñe de forma intensa con eosina y es positiva al PAS en grado moderado. La fibrina fija con solidez el

Los gránulos de mastocitos son metacromáticos y se pueden demostrar mediante azul de toluidina, tionina o azul ce-

Figura 2-6 de Grocott.

Impregnación de plata de hifas micóticas. Método

Espiroquetas

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AGRADECIMIENTOS

leste A. Los gránulos poseen metacromasia púrpura o roja con los núcleos y otras estructuras teñidas de azul. También pueden reconocerse otros tejidos conectivos y algunas mucinas epiteliales. De igual modo, puede emplearse el azul alciano para reconocer los gránulos. Bancroft recomendó la esterasa de cloracetato como el método de elección.

Cuadro 2-5 Algunas tinciones neurológicas comunes Estructura

Método

Neuronas y axones Sustancia de Nissl Mielina

Impregnación en plata Cristal violeta rápido Azul Luxol rápido Cianina solocrómica PTAH Hematoxilina de hierro

Gránulos celulares de Paneth Los gránulos celulares de Paneth son acidófilos y se observan con facilidad y diferenciación en muestras teñidas con H-E. El método de tartracina floxina de Lendrum tiñe los gránulos rojos contra un fondo amarillo. Gránulos celulares pancreáticos Los más específicos métodos inmunocitoquímicos sustituyeron en gran medida a la tinción de las células insulares del páncreas. Algunos métodos tradicionales incluyen hematoxilina con alumbre-cromo y aldehído de fucsina para las células B, Grimelius para las células A y el método de Hellerström y Hellman para las células D. Gránulos celulares pituitarios De nueva cuenta, los métodos inmunocitoquímicos reemplazaron en buena medida a los métodos tradicionales de tinción. El PAS-anaranjado G era un método aceptado y se realizaba lo mejor posible sobre fijadores basados en dicromato (líquido de Helly). El PAS teñía a los basófilos pituitarios de magenta, el anaranjado G a los acidófilos de anaranjado y los cromófobos permanecían sin tonalidad. Los tricromos también se han utilizado para reconocer los tipos celulares.

Conclusiones Los métodos convencionales de tinción aún tienen una función relevante en el diagnóstico de la patología tisular. En la actualidad, los laboratorios de diagnóstico usan una combinación de tinción y tinción inmunocitoquímica para proporcionar la información necesaria que permita establecer un diagnóstico informado. El aspecto morfológico del tejido teñido con H-E representó el precursor para las investigaciones subsecuentes. Aunque la inmunocitoquímica ha sustituido a un número notorio de métodos de tinción históricos, existe todavía una gran cantidad de investigaciones que confían sólo en la tinción habitual con colorantes.

Lecturas adicionales Este capítulo sólo proporciona una introducción muy sinóptica a los aspectos relacionados con las tinciones. Para una información más profunda se recomiendan los siguientes libros: Bancroft JD, Gamble M. Theory and Practice of Histological Techniques. 5th ed. Edinburgh: Churchill-Livingstone, 2002. Culling CFA, Allison RT, Barr WT. Cellular Pathology Technique. 4th ed. London: Butterworths, 1885.

Eosinófilos Lectura avanzada Los eosinófilos son acidófilos y la tinción de H-E los delinea y diferencia con claridad. También se han empleado las tinciones Cromotrope y de Romanowsky.

Horobin RW, Kiernan JA (eds.), Conn’s Biological Stains. A Handbook of Dyes, Stains and Fluorochromes for use in Biology and Medicine. 10th ed. Oxford, UK: Bios Scientific, 2002.

Tejidos neurológicos

Agradecimientos En la histopatología diagnóstica de rutina, la demostración de elementos neurológicos por métodos de tinción convencionales se reduce a las neuronas, axones y mielina. Los métodos inmunocitoquímicos reemplazaron en gran parte a algunas de las técnicas más difíciles de impregnación en plata (cuadro 2-5).

Quisiera expresar mi agradecimiento al Dr. Stephen Harris, consultor histopatólogo del Staffordshire General Hospital, por su ayuda durante la preparación del manuscrito, y a Jim Elsam de HTEQA Services por facilitar las imágenes digitales.

3 Histoquímica de las enzimas Trevor Gray y Neil Hand

Introducción Las enzimas son grandes proteínas terciarias que actúan como catalizadores de la mayor parte de las reacciones biológicas y son vitales en el metabolismo celular, puesto que mantienen la homeostasis en el hombre. Existen alrededor de 700 enzimas conocidas y cada una cataliza una reacción particular al actuar sobre moléculas específicas (sustratos). El producto de la reacción puede actuar como un nuevo sustrato para una enzima diferente, según lo ilustra el ciclo de Krebs. Después de cada reacción metabólica, la enzima de cada caso permanece inalterada para intervenir en reacciones futuras. Los bioquímicos estudian de rutina las concentraciones enzimáticas de las soluciones derivadas de líquidos corporales, cultivos tisulares y tejidos resecados con fines de diagnóstico y durante las investigaciones. Esto suministra evidencia valiosa en la detección y vigilancia de los procesos de la enfermedad y la evaluación de los cambios fisiológicos que induce un medicamento. Sin embargo, los resultados obtenidos por análisis bioquímicos se relacionan con una población heterogénea de las células que se encuentran en los tejidos y no proporcionan valores celulares específicos. Es posible llevar a cabo una valoración más precisa de la localización intracelular de la enzima y su actividad biológica si se recurre a la histoquímica de la enzima. Ésta se basa en la aplicación de un sistema de detección enzimático en los cortes de tejido o en un frotis. La técnica ofrece el producto final de una reacción coloreada que se localiza en las células con una intensidad proporcional a la actividad de la enzima. A diferencia de los métodos bioquímicos, esta intensidad es difícil de cuantificar, pero los aspectos microscópicos cualitativos como los que observa un patólogo experimentado son más relevantes en la detección y determinación histológicas de los procesos patológicos.

El principal problema con la histoquímica enzimática es la retención de la función de la enzima durante la preparación del tejido y la tinción histoquímica. Se han desarrollado numerosos métodos histológicos para enzimas específicas, y si bien estos métodos no son difíciles, los procedimientos no estandarizados de manipulación de los tejidos requeridos han obligado a realizar con regularidad estas técnicas en laboratorios especializados. Otros métodos histoquímicos no enzimáticos para la detección de la enzima en cortes estándar de parafina incluyen la inmunohistoquímica y la hibridación in situ del mRNA. Estos métodos pueden identificar la presencia o producción de enzimas celulares, pero ninguno puede mostrar la actividad biológica de la enzima.

Estructura y clasificación Estructura Las enzimas son proteínas globulares de alto peso molecular que pueden hallarse libres dentro del citoplasma (lisoenzimas) o fijarse en las membranas celulares (desmoenzimas). Los componentes no proteínicos (grupos prostéticos) pueden unirse a la enzima, lo cual puede ayudar a formar una estructura cuaternaria activa. La propiedad funcional de la enzima depende de mantener la forma y carga de su “sitio activo” en el punto de la interacción enzima/sustrato. Se necesitan varios cofactores para la mayor parte de las reacciones. Activadores como los iones de calcio, magnesio, manganeso, sodio, potasio y otros ayudan a transferir el electrón durante la reacción enzimática. Las coenzimas son moléculas que se combinan con una “apoenzima” inactiva y crean un sitio activo en términos estéricos por la

The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker, © 2005 John Wiley & Sons, Ltd.

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CAP. 3

HISTOQUÍMICA DE LAS ENZIMAS

alteración de la estructura cuaternaria de la apoenzima. La coenzima puede también combinarse con el sustrato y desempeñar una parte activa en la reacción metabólica. Casi todas las vitaminas B son coenzimas. Clasificación Se puede clasificar a las enzimas de varias maneras; la más precisa se basa en el código de cada una, de acuerdo con el nombre sistemático de la enzima. Éste contiene el nombre del sustrato específico sobre el que reacciona, seguido por una palabra con el sufijo “-asa”, y se especifica el tipo de reacción participante. En el diagnóstico histoquímico de la enzima se utiliza un nombre más corto debido al pequeño número de enzimas investigado. Los seis grupos mayores de enzimas se clasifican según sea su efecto sobre el sustrato: oxidorreductasas, transferasas, hidrolasas, liasas, isomerasas y ligasas. Probablemente, los grupos más importantes para el diagnóstico histoquímico de la enzima son las oxidorreductasas (antes conocidas como oxidasas y deshidrogenasas) e hidrolasas. Éstas se llaman a menudo enzimas “oxidativas” e “hidrolíticas”, respectivamente.

Conservación y preparación Conservación de la enzima Los efectos acumulativos de las etapas del procesamiento requeridas en la producción de un bloque de tejido impregnado en parafina, como la fijación, deshidratación e inclusión en cera de parafina, no son favorables para la preservación funcional de las enzimas. Por lo general, estos procedimientos dan lugar a la pérdida completa de la actividad enzimática, aunque la esterasa de cloracetato y la peroxidasa son resistentes en grado suficiente al daño del procesamiento de la parafina. Por lo tanto, las demostraciones de la mayor parte de las enzimas se llevan a cabo casi siempre en cortes congelados, pero también pueden emplearse otras preparaciones como los frotis. Es importante recordar que diversas enzimas reaccionan de manera diferente a las influencias externas, pero la mayor parte de las enzimas se pierde con rapidez si el tejido fresco se deja a temperatura ambiente. Muchas enzimas oxidativas que poseen relevancia diagnóstica para investigar una enfermedad del músculo se localizan en la mitocondria. Cuando se sustrae el oxígeno del tejido fresco, las membranas mitocóndricas se dañan en poco tiempo y se observa la reducción de la actividad de la enzima. En consecuencia, es importante congelar a la brevedad el tejido, que está fresco, ya que casi ninguna enzima oxidativa

puede soportar la fijación convencional. Las enzimas hidrolíticas están contenidas en los lisosomas, pero se alteran por el congelamiento y el subsiguiente descongelamiento de los bloques o cortes con liberación de enzimas. La difusión de las enzimas hidrolíticas puede minimizarse y la localización mejorarse si el tejido se trata con un fijador antes de la criotomía, aunque es posible alguna pérdida de la actividad enzimática. En la práctica, la tinción histoquímica de la enzima se efectúa sobre las muestras desmontables del crióstato, sobre todo en circunstancias clínicas en las que un retraso diagnóstico es indeseable o cuando se necesita reconocer diferentes enzimas en la misma muestra. Empero, la localización de algunas enzimas puede resultar un poco mejor si se fija el espécimen de tejido después de la criotomía. Si se recurre a la fijación, los fijadores deben estar a 4°C y utilizarse por el menor tiempo posible. Con frecuencia se recomienda el formol de calcio para los bloques de tejidos, ya que ayuda a mantener la integridad de la membrana celular, aunque la formalina amortiguada o la salina formal son satisfactorias en casi todos los casos. La criotomía y la actividad de la enzima pueden mejorarse al lavar el tejido fijado en una solución amortiguadora de sucrosa antes del congelamiento. Para resultados óptimos es importante mantener estas soluciones cercanas al pH fisiológico del tejido. Se ha empleado una variedad de fijadores, además del formol de calcio, en frotis y secciones de crióstatos, entre ellos acetona, vapor de formalina y mezclas de formalina-alcohol. La opción del fijador depende de la enzima particular investigada y de la relación entre la actividad enzimática y el aspecto morfológico. Aun después de tiempos de fijación cortos, la mayoría de las enzimas oxidativas se torna inactiva pero, según se mencionó ya, la fijación puede emplearse en la demostración de estas enzimas al ayudar a preservar la morfología celular y la localización del producto final de la reacción. Preparación del tejido Varios métodos están disponibles para el examen de las enzimas, pero en este capítulo sólo se consideran los cortes congelados, frotis y secciones de parafina. Como se ha señalado, las enzimas que deben revelarse determinan el tipo de preparación empleada. Cortes congelados La preparación más común de la muestra en la histoquímica de la enzima es el uso de cortes congelados, casi siempre practicados con un crióstato. Es necesario que el tejido se congele con rapidez, ya que el congelamiento lento induce artefactos de cristal de hielo: el congelamiento más rápido forma cristales de hielo más pequeños. Las biopsias muscu-

TÉCNICAS HISTOQUÍMICAS

lares se consideran para la mayoría de las muestras histoquímicas de la enzima de diagnóstico, aunque son muy propensas a los artefactos de cristal de hielo. El método óptimo para el congelamiento del músculo incluye el uso del isopentano congelado con nitrógeno líquido y el descongelamiento gradual. La fracción sólida actúa como un amortiguador térmico y mantiene la temperatura de la fracción líquida estable (–150°C) durante el congelamiento del tejido. El tejido (fijado o sin fijar) se orienta sobre un disco de corcho en gel de OCT y se sumerge en el isopentano descongelado hasta que el gel y la muestra se congelan. De igual modo, el corcho se une al bloque sostenedor mediante el compuesto de OCT y entonces se coloca dentro del crióstato listo para la sección a –23°C. El nitrógeno líquido solo no puede emplearse, ya que tiene un índice bajo de conductividad térmica y produce una barrera térmica gaseosa alrededor del tejido, lo cual provoca daño celular al permitir la formación de grandes cristales de hielo. Frotis Los frotis pueden prepararse por varios métodos a partir de suspensiones de sangre, médula ósea y células de tejido. Los frotis impresos de tejido, por ejemplo los ganglios linfáticos, son también útiles si el tejido fresco se corta y la nueva superficie se coloca suavemente otra vez en un portaobjetos limpio. La mayor parte de los frotis se seca al aire y se fija (según sean las enzimas requeridas) por pocos segundos, casi siempre con acetona fría, antes de la tinción citoquímica de las células. Secciones de cera de parafina Casi ninguna enzima resiste los efectos del procesamiento de cera de parafina estándar, por lo cual este modo de preparación no suele ser útil. La peroxidasa y la esterasa de cloracetato son lo suficiente fuertes para sobrevivir a la inclusión en cera de parafina y pueden demostrarse con facilidad. Algunas otras enzimas pueden preservarse de modo parcial al usar medidas especiales con ceras de bajo punto de fusión, pero esto sólo es ocasional.

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ción primario (PRP). Este PRP puede entonces reaccionar con un químico conocido como agente de captura para formar un producto de reacción final (PRF), que debe ser insoluble y estar en el sitio de la enzima. Numerosos factores modifican las reacciones y todos deben controlarse de manera cuidadosa. El pH de las soluciones de incubación es crítico para la mayoría de las reacciones de la enzima y debe mantenerse con los amortiguadores apropiados. Al cambiar la temperatura puede alterarse la tasa de reacción de la enzima; algunos métodos requieren incubación a 37°C, mientras que otros se realizan a temperatura ambiente. La temperatura ambiente subóptima permite más tiempo para la terminación de la formación del PRF y el agente de captura, lo cual mejora la localización del PRF en el sitio de la enzima y reduce la tasa de reacción. Los sustratos y los agentes de captura deben elegirse para prevenir interacciones y ambos deben difundirse con facilidad a través de las membranas celulares. El sustrato y el agente secuestrador deben usarse a una concentración que prevenga el agotamiento durante la rápida actividad de la enzima, pero no a una concentración que podría inhibir la reacción de la enzima. La selección de un agente de captura depende del método enzimático utilizado y el tipo de tejido en el cual se encuentra la enzima. Por ejemplo, cuando se usa el método de precipitación de metal sobre el músculo, se prefiere la sal de calcio a la sal de plomo, dado que la segunda puede ligarse de modo inespecífico al músculo. Además, muchas veces hay una elección de sustratos, aunque muchos sustratos que ocurren de forma natural, si bien económicos, pueden ser inespecíficos o producir PRP que no sean del todo insolubles. Los sustratos especialmente sintetizados casi siempre ofrecen resultados superiores. Es importante incluir un control positivo del tejido durante la tinción histoquímica de modo que puedan examinarse la calidad de los reactivos y la exactitud del protocolo empleado. La omisión del sustrato del medio de incubación o la inclusión de inhibidores específicos actúan como un control negativo. Métodos de reacción de la enzima En histopatología, la mayor parte de las enzimas se demuestra mediante: a) acoplamiento simultáneo o b) acoplamiento posincubación.

Técnicas histoquímicas Estos métodos histológicos son los únicos en los que las enzimas nunca se tiñen; sólo los productos de reacción se delinean. Para obtener resultados relevantes son esenciales la cuidadosa optimización de la reacción de la enzima y la coloración del producto de reacción. El proceso implica el desdoblamiento de un sustrato por la enzima ligada al tejido para formar un producto de reac-

Acoplamiento simultáneo El acoplamiento simultáneo sólo requiere una solución que contenga el sustrato y un agente secuestrador con el cofactor requerido. La enzima ligada al tejido reacciona con el sustrato en la solución para producir un PRP. Éste puede ser insoluble o soluble, ya que el agente secuestrador (tam-

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HISTOQUÍMICA DE LAS ENZIMAS

bién en solución) se liga con el PRP de forma instantánea para formar un PRF. Este PRF insoluble se liga al sitio de la enzima y puede colorearse o permanecer incoloro, aunque lo último podría requerir un paso de coloración adicional para la visualización. Acoplamiento posincubación Algunas veces no es posible tener el sustrato y el agente secuestrador en una solución, ya que las condiciones necesarias para la producción del PRP pueden ser diferentes respecto de las requeridas para la elaboración del PRF. En ocasiones, el agente secuestrador puede además interferir con la función de la enzima o inhibirla. En los métodos de acoplamiento posincubación, la solución inicial sólo contiene al sustrato y algunos cofactores necesarios. El PRP debe ser insoluble puesto que son posibles falsos negativos o la difusión densa del PRF. Una solución secundaria que contiene al agente secuestrador se aplica entonces para producir el PRF, como se indicó. En la práctica es difícil encontrar los sustratos convenientes para los métodos de acoplamiento posincubación, con un resultado que se utiliza rara vez. Métodos de demostración En condiciones normales, los PRF coloreados se producen por uno de los siguientes métodos: 1. Precipitación del metal. 2. Diazo. 3. Sal de tetrazolio. 4. Método indigogénico. Otros métodos incluyen: 5. La oxidación de 3,3-diaminobencidina (DAB) por la oxidasa de citocromo o las peroxidasas para formar un pigmento marrón. 6. El metabolismo del glucógeno por la fosforilasa para producir un polisacárido que se colorea de azul/negro con yodo. Métodos de precipitación de metal Los métodos de precipitación de metal se usan de rutina para identificar fosfatasas, por ejemplo fosfatasa ácida, fosfatasa alcalina y trifosfatasa de adenosina (ATPasa; fig. 3-1).

Figura 3-1 Los cortes congelados muestran la tinción diferencial de fibras musculares para ATPasa tras la incubación a pH 4.2 con una técnica de precipitación de metal.

Éstos dependen de la liberación de iones de fosfato del sustrato, que entonces reaccionan con el plomo o las sales de calcio en la solución (agente de captura) para formar el PRF insoluble de plomo o fosfato de calcio. El fosfato de plomo es incoloro pero se ennegrece con solución de sulfuro de amonio para formar sulfuro de plomo. El fosfato de calcio es insoluble a un pH alcalino y debe convertirse en fosfato de cobalto con solución de cloruro de cobalto, tratado antes con sulfuro de amonio para formar sulfuro de cobalto negro. Con el tiempo, estos métodos son propensos a desteñirse, pero pueden recolorearse con sulfuro de amonio. El método con la acetilcolinesterasa que usa el sustrato acetilcolina puede considerarse un método de precipitación metálica que produce un PRP de tiocolina, el cual reacciona con el sulfato de cobre y el ferrocianuro de potasio, respectivamente, para formar ferrocianuro de cobre marrón. Métodos diazo Los métodos diazo se utilizan para identificar las fosfatasas alcalinas y ácidas, la esterasa inespecífica y la esterasa de cloracetato. Los diferentes sustratos contienen un grupo naftol que puede atacar a una de las enzimas anteriores. Varias sales de diazonio o la pararrosanilina hexazotizada se emplean para reaccionar con el grupo naftol y formar un diazo insoluble coloreado. De manera característica, las sales de diazonio usadas incluyen rojo rápido TR, azul rápido RR, azul rápido B y Garnet rápido GBC, que deben montarse en medio acuoso. El diazo, formado a partir de la pararrosanilina hexazotizada, es el método de opción, ya que puede practicarse en una resina sintética, lo que mejora la localización óptica en la microscopia de luz. Las sales

APLICACIONES DIAGNÓSTICAS DE LA HISTOQUÍMICA ENZIMÁTICA

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de diazonio pueden usarse con métodos simultáneos o de acoplamiento posincubación. Métodos con sales de tetrazolio Las sales de tetrazolio, que son incoloras y solubles en agua, aceptan hidrógeno liberado de modo enzimático del sustrato para formar depósitos microcristalinos coloreados insolubles en agua, los llamados formazanes. Muchas enzimas oxidativas, como la deshidrogenasa succínica, se identifican mediante sales de tetrazolio, como el metil-tiazolildifenil tetrazolio (MTT; fig. 3-2) y el tetrazolio nitroazul (NBT). Como en el caso de las sales de diazonio, varios

Figura 3-3 Corte congelado de yeyuno que muestra la actividad de la lactasa sobre la microvellosidad, teñida de turquesa mediante el método indigogénico.

2. Sospecha de enfermedad de Hirschsprung en nervios y ganglios. 3. Valoración de la malabsorción del tejido gastrointestinal. 4. Demostración de células linfoides y mieloides. 5. Identificación de degeneración temprana del hígado. Las dos primeras aplicaciones son las más comunes, pero se remiten inusualmente a los centros de diagnóstico especializados. Figura 3-2 Corte congelado de músculo teñido para diaforasa de NADH con la sal de tetrazolio MTT.

factores modifican su selección, pero el NBT se usa más a menudo que el MTT, de modo que puede montarse en una resina sintética. Método indigogénico Los sustratos contienen un grupo indoxilo, que se libera como un PRP; éste, a su vez, se oxida por acción del agente de captura ferrocianuro de potasio para formar PRF turquesa (fig. 3-3). La solución de incubación también incluye ferrocianuro de potasio, que previene la sobreoxidación del PRF.

Aplicaciones diagnósticas de la histoquímica enzimática La histoquímica de la enzima puede ser de utilidad en varias aplicaciones diagnósticas, entre ellas las siguientes: 1. Tipificación de la fibra muscular esquelética.

Músculo esquelético Se ha establecido con firmeza el uso de la histoquímica enzimática en el diagnóstico de las enfermedades neuromusculares y miopatías congénitas; en realidad, muchos aspectos histopatológicos sólo se reconocieron y describieron después de la introducción de la histoquímica de las enzimas. La tinción tradicional del músculo estriado es suficiente para mostrar las reacciones inflamatorias y la variación del tamaño de la fibra, pero es incapaz de diferenciar entre los diversos tipos de fibra muscular. Esto es importante porque muchas enfermedades se limitan a tipos específicos de fibras musculares o muestran alteración de éstas. La anomalía puede asumir la forma de atrofia o hipertrofia y, en ciertas afecciones, de alteración de la estructura celular interna. La aplicación de los métodos de histoquímica enzimática al músculo esquelético cortado en sentido transversal facilita la distinción de los tipos de fibras; esto, junto con el examen de su distribución y tamaño, puede ser de utilidad diagnóstica. En general, las fibras del músculo estriado pueden dividirse en los tipos 1 y 2, de acuerdo con el nivel de actividad de la ATPasa mostrada a un pH de 9.4. Si la tinción de la ATPasa se aplica después de la preincubación en un amortiguador a

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CAP. 3

HISTOQUÍMICA DE LAS ENZIMAS

un pH de 4.2 o 4.6, es posible establecer una diferenciación adicional de las fibras de tipo 2 en los subtipos 2A, 2B y 2C (fig. 3-1). Otra enzima importante para demostrar es la fosforilasa, que en la enfermedad de McArdle es deficiente en las células del músculo estriado, pero no desaparece del músculo liso de los vasos sanguíneos, y por tanto es útil como control. La diaforasa de NADH (dinucleótido de nicotinamida y adenina reducido) se utiliza para el estudio de la estructura interna de las células musculares, dado que delinea a la mitocondria y a la red del retículo sarcoplásmico (fig. 3-2). Cuando esto se compara con la distribu-

ción miofibrilar de la ATPasa pueden reconocerse varias anomalías. Los patrones anormales de la distribución de la enzima se describen a menudo en términos de sus aspectos, que son específicos de una enfermedad particular, como “fibras objetivo”, “fibras anulares” y “núcleos centrales”. La oxidasa del citocromo, deshidrogenasa succínica y deshidrogenasa de lactato son más específicas para la mitocondria y pueden proporcionar ayuda en la identificación de miopatías mitocóndricas. En el cuadro 3-1 se muestra un resumen de la tinción diferencial enzimática del músculo esquelético.

Cuadro 3-1 Histoquímica enzimática diagnóstica Tejido Músculo estriado

Enzima

Método

Sustrato

pH

Color

Identificación

ATPasa miofibrilar

Precipitación metálica (cloruro de calcio)

Trifosfato de adenosina (ATP)

9.4

Negro/marrón

Fibras tipo 1: pálidas Fibras tipos 2a, 2b y 2c: oscuras

Preincubación de precipitación metálica (cloruro de calcio) @ pH 4.6

Fibra tipo 1: oscuras Fibras tipos 2b y 2c: intermedias Fibras tipo 2a: pálidas

Preincubación de precipitación metálica (cloruro de calcio) @ pH 4.2

Fibras tipo 1: oscuras Fibras tipo 2c: intermedias Fibras tipos 2a y 2b: pálidas

NADH diaforasa

Sal de tetrazolio (MTT)

NADH

7.0

Negro

Mitocondria (fibras tipo 1: más oscuras) Retículo sarcoplásmico

Deshidrogenasa succínica

Sal de tetrazolio (MTT)

Succinato de sodio

7.0

Negro

Para mitocondria (fibras tipo 1: más oscuras)

Oxidasa de citocromo

Oxidación de DAB

Citocromo c

7.4

Marrón

Anormalidades mitocóndricas

Miofosforilasa

Metabolismo de glucógeno (yodo)

Glucosa-1 fosfato

5.9

Púrpura/negro

Tinción negativa de las fibras musculares en la enfermedad de McArdle

Desaminasa de mioadenilato

Sal de tetrazolio (NBT)

Adenosina 5monofosfato (AMP)

6.1

Azul

Ausente en algunos trastornos metabólicos

Fructosa disódica 1,6 difosfato

8.6

Rojo/marrón

Fibras y células del nervio En recto, colon (Hirschsprung) y enfermedades musculares

Turquesa

Reducido o negativo con malabsorción

Aldolasa

Fosfofructocinasa

Fructosa 6-fosfato

Nervios

Acetilcolinesterasa

Ferricianuro de potasio —reacción de sulfato de cobre (precipitación metálica)

Yeyuno

Lactasa

Método indigogénico (ferrocianuro de potasio) Diazo (pararrosanilina)

Sucrasa

7.0 Yoduro de acetiltiocolina 6.0

d-Fucosida de 5-bromo- 6.0 4-cloro-3-indoxil-␤ d-Glucosida de 6-bromo- 6.0 2-naftil-␣

Rojo

APLICACIONES DIAGNÓSTICAS DE LA HISTOQUÍMICA ENZIMÁTICA

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En fecha reciente, los métodos inmunohistoquímicos se han desarrollado para la tipificación confiable de la fibra muscular del tejido procesado con parafina. Si bien éste puede tener un importante potencial diagnóstico para tales tejidos procesados, no permite la identificación de las otras enzimas relevantes desde el punto de vista diagnóstico o la capacidad para mostrar su actividad metabólica. Nervios y ganglios En el colon y recto normales, las células ganglionares y nervios relacionados se encargan de la motilidad del colon. En la enfermedad de Hirschsprung infantil se reconoce la ausencia ganglionar en la unión de las capas circular y longitudinal del músculo liso (plexo mientérico) y en la submucosa. Existe también un incremento marcado del número y grosor de las fibras nerviosas no argirófilas en la submucosa y la lámina propia. En la actualidad, las células ganglionares pueden identificarse sobre un corte con H-E, pero esto es mucho más difícil con las fibras del nervio. Las células ganglionares y las fibras del nervio contienen colinesterasa, la cual puede reconocerse con el método rápido de la acetilcolinesterasa. En condiciones normales se requiere la identificación de la enfermedad de Hirschsprung para confirmar el diagnóstico inicial y más tarde, durante la operación correctiva, cuando los límites de la resección deben precisarse antes de la eliminación del intestino anormal. Como ésta se lleva a cabo durante la intervención mediante biopsias pequeñas de aspiración rectal, la rapidez es esencial. Las muestras obtenidas con crióstato y teñidas con H-E suelen ser suficientes para detectar la presencia o ausencia de células ganglionares grandes; no obstante, puede utilizarse cualquier biopsia superficial que no descarta el método de la acetilcolinesterasa para mostrar las fibras del nervio anormales en la lámina propia (fig. 3-4). El mismo método puede usarse para demostrar anormalidades motoras de la placa terminal en biopsias de músculo estriado. Tejido gastrointestinal Para determinar un diagnóstico definitivo en las biopsias gastrointestinales con sospecha de mala absorción, la información morfológica es insuficiente. Varias enzimas en el contorno de la vellosidad son útiles, pero las disacaridasas, lactasa, trehalasa y sucrasa son en particular importantes. Estas enzimas reflejan cambios observados al dañarse el enterocito; la lactasa (fig. 3-3) es la más sensible, mientras que la sucrasa es la más resistente y por lo tanto la tinción histoquímica para estas dos disacaridasas es de utilidad. Estos métodos pueden también emplearse para

Figura 3-4 Corte congelado de tejido rectal con enfermedad de Hirschsprung teñido para acetilcolinesterasa que demuestra las fibras engrosadas del nervio.

detectar deficiencias primarias de lactasa o sucrasa, aunque en clínica la prueba bioquímica de estos disacáridos es más importante que la identificación histoquímica. La fosfatasa ácida encontrada en los lisosomas de los enterocitos y en macrófagos de la lámina propia puede también ser una enzima útil para demostrar malabsorción. Para evaluar y vigilar de modo apropiado la malabsorción se requiere que el yeyuno se oriente de tal forma que las vellosidades se seccionen en sentido longitudinal. Células linfoides y mieloides Diversas enzimas, incluidas la esterasa inespecífica, la fosfatasa ácida y la esterasa de cloracetato, se usan para la identificación citoquímica y evaluación de células en preparaciones para frotis, como se muestra en el cuadro 3-2. Además de la actividad enzimática, las células específicas pueden diferenciarse por su patrón de tinción, es decir, focal o difuso. La inmunohistoquímica es ahora el método optativo para

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CAP. 3

HISTOQUÍMICA DE LAS ENZIMAS

Cuadro 3-2 Tinción histoquímica enzimática de los leucocitos Enzima

Método

Sustrato

pH

Color

Comentario

Esterasa de cloracetato

Diazo (pararrosanilina)

Cloracetato de naftol AS-D

6.3

Rojo

Fosfatasa ácida

Diazo (pararrosanilina)

Fosfato de naftol AS-BI

5.0

Rojo

Fosfatasa alcalina

Diazo (rojo rápido TR)

8.0

Rojo

Primero se tiñen las células cebadas, luego los eosinófilos y neutrófilos Las células T de los monocitos difusamente teñidos tienen una sola mancha pequeña Neutrófilos

Esterasa inespecífica

Diazo (pararrosanilina)

7.6

Rojo

Monocitos

Acetato de ␣-naftilo

la identificación de estas células en la histopatología, pero algunos departamentos de hematología todavía utilizan los métodos enzimáticos histoquímicos. La esterasa de cloracetato, que resiste la inclusión en parafina, como se mencionó con anterioridad, puede distinguir células linfoides y mieloides. Los mastocitos se reconocen con facilidad por su tinción intensa, morfología y granularidad mediante este método histoquímico de la enzima (fig. 3-5).

Conclusión La histoquímica de la enzima todavía desempeña un papel vital en la histopatología, sobre todo en la detección y diagnóstico de la enfermedad muscular, incluso si están ahora disponibles nuevos métodos inmunohistoquímicos. En la inmunocitoquímica y la biología molecular, las técnicas histoquímicas de la enzima se utilizan de rutina en los sistemas de detección. El método del formazán para la deshidrogenasa succínica se ha usado de manera exitosa en macrocortes frescos del corazón tras identificar post mortem el infarto del tejido. El científico forense también ha usado los métodos histoquímicos de la enzima para determinar la fecha y el tiempo en que se cometió una herida. En la investigación se estudia un espectro mucho más amplio de enzimas con técnicas diversas, entre ellas microscopia electrónica y citometría de flujo, además de la microscopia de luz.

Referencias Figura 3-5 La muestra en parafina de la piel muestra mastocitos de la dermis teñidos de rojo para esterasa de cloracetato con cloracetato de naftol AS-D y pararrosanilina de hexazonio.

Degeneración hepática La ausencia de actividad enzimática en los cortes congelados de hígado puede ser útil en la identificación temprana del daño al hepatocito y los cambios cirróticos. Donde existe un cambio cirrótico notorio, es importante el control de la muestra en ausencia de algunos hepatocitos normales presentes que actúen como control interno. La redistribución de la actividad enzimática, como la fosfatasa ácida localizada en los núcleos, es también una señal temprana de daño celular y necrosis eventual debido a la degeneración lisosómica.

Bancroft JD. Enzyme histochemistry and its diagnostic applications. In: Theory and Practice of Histological Techniques, 5th ed. Bancroft JD, Gamble M (eds). London: Churchill Livingstone 2002:593-620. Bancroft JD, Hand NM. Enzyme Histochemistry. RMS Microscopy Handbook No. 14. Oxford: Oxford University Press 1987. Behan WMH, Cossar DW, Madden HA, McKay IC. Validation of a simple, rapid, and economical technique for distinguishing type 1 and 2 fibres in fixed and frozen skeletal muscle. J Clin Pathol 2002;55:375-380. Dawson IMP. Fixation: what should the pathologist do? Histochem J 1972;4:381-385. Filipe MI, Lake BD. Histochem in Pathology. 2nd ed. Edinburgh: Churchill Livingstone 1990. Hayhoe FGJ, Quaglino D. Haematological Cytochemistry. 2nd ed. Edinburgh: Churchill Livingstone 1988.

4 Inmunohistoquímica Jane Starczynsky y John Crocker

Introducción En términos de la función normal y los estados de enfermedad, el estudio de la morfología simple de cortes o células casi siempre es suficiente para el análisis. Según se describe en los capítulos 3 y 5, las técnicas auxiliares como la histoquímica, histoquímica enzimática y microscopia electrónica pueden ser las más provechosas para entender mejor la naturaleza y el estado funcional de una célula o un tipo de tejido. Sin embargo, en el decenio de 1970 resultó evidente que era necesaria y posible una valoración más detallada de los productos de la función celular. En histopatología, el advenimiento de la inmunohistoquímica (IHQ) fue emocionante y abrió grandes y nuevas perspectivas en la investigación de biopsias y las muestras quirúrgicas de escisión. El principio que subyace a la IHQ es la demostración del antígeno por medio de su enlace a un anticuerpo que, a su vez, se une a una marca que puede visualizarse en forma histológica (fig. 4-1). En consecuencia, puede delinearse el sitio del antígeno en cuestión. Los métodos de IHQ se pueden clasificar en tres grupos principales, directos, indirectos y complejos, desde aquellos que usan la fluorescencia ultravioleta activada hasta los cromógenos. Además, el material particulado, como el metal pesado, se puede utilizar en los microscopios de luz y electrónico.

Métodos directos En los métodos directos, el anticuerpo dirigido contra cierta molécula o parte de ella (epitopo) se une a un espécimen. El anticuerpo tiene un “agente indicador” unido a él y entonces se visualiza de manera directa. El método es relativamente

insensible en tanto que no haya ninguna “amplificación” de la señal antigénica. La técnica directa se ha abandonado en gran parte en los procedimientos IHQ; empero, aún es el método de elección para la citometría de flujo (véase cap. 8).

Métodos indirectos Los métodos indirectos implican el uso de capas del anticuerpo para demostrar el antígeno en cuestión. Esto lo ilustra de forma típica la acumulación de estratos de anticuerpos dirigidos contra antígenos de especies que difieren en especificidad, lo que crea un “cono invertido” de moléculas, de tal modo que se amplifica en grado notable la señal original. Por ejemplo, como primer paso se reactiva mejor el antígeno de conejo antihumano con un anticuerpo de cerdo anticonejo marcado. Esto proporciona mayor sensibilidad que los métodos directos, pero los métodos más complejos lo han reemplazado en gran proporción.

Métodos de múltiples etapas Estos métodos emplean capas de anticuerpos y marcas para amplificar la señal en el sitio de enlace del anticuerpo. Son ejemplos los métodos del puente enzimático, la peroxidasaantiperoxidasa (PAP) y las técnicas de la fosfatasa alcalinaantifosfatasa alcalina (APAAP), además de los basados en avidina/estreptavidín-biotina. En todas estas reacciones la sensibilidad de la señal es mucho mayor que en las técnicas directas e indirectas y el “cono invertido” de la amplificación es mucho más grande con las capas múltiples de moléculas.

The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker, © 2005 John Wiley & Sons, Ltd.

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CAP. 4

INMUNOHISTOQUÍMICA

Figura 4-1 Diagrama esquemático para mostrar algunas de las secuencias más comunes en IHQ. a) Método directo: el anticuerpo primario marcado reacciona con el antígeno del tejido. b) Método indirecto de dos pasos: el anticuerpo secundario marcado en forma enzimática reacciona con el anticuerpo primario unido al antígeno del tejido. c) Método indirecto de tres pasos: el anticuerpo terciario marcado de modo enzimático reacciona con el anticuerpo secundario marcado. d) El complejo APAAP reacciona con el anticuerpo secundario. El anticuerpo primario y el anticuerpo del complejo inmunitario deben ser de la misma especie. e) En el método CAB, el complejo avidina o estreptavidina-biotina-enzima reacciona con el anticuerpo secundario biotinilado. f) En la secuencia catalizada de la amplificación de la señal (CSA), el anticuerpo primario antecede a un anticuerpo secundario biotinilado, luego sigue el complejo (estrept)avidina, después el reactivo de la amplificación y, por último, el complejo (estrept)avidina-enzima. g) Tinción dual para dos epitopos mediante la metodología CSA. Se aplica el primer anticuerpo, le sigue la primera molécula de la “espina” y a continuación un cromógeno apropiado. Después se aplica un agente de bloqueo. Se utiliza luego el segundo anticuerpo primario, con una segunda molécula “espina” y un segundo cromógeno. h) Simbología para a) a f). Reproducido con autorización de DAKO Cytomation Ltd.

MÉTODOS DE MÚLTIPLES ETAPAS

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Moléculas fluorescentes Anticuerpo primario

Anticuerpo secundario

Anticuerpo secundario (anticonejo)

Anticuerpo secundario (antirratón)

Antígeno tisular primario

El indicador original fue la tinción fluorescente, que marcaba al anticuerpo apropiado. A continuación se podía visualizar el antígeno por microscopia fluorescente (véase cap. 6). Una limitación del uso de las moléculas fluorescentes indicadoras es su fotoinestabilidad, esto es, la señal se decolora de manera gradual al exponerse a la luz del día. Debe advertirse que las propiedades antigénicas, no tanto las fluorescentes, de la fluorescencia se utilizan ahora por el buen efecto sobre los sistemas de detección que no se basan en la biotina por IHQ. En la actualidad se dispone de fluoróforos múltiples con diversas frecuencias de excitación y emisión que puedan emplearse para permitir el marcado simultáneo de antígenos múltiples dentro del mismo tejido. La inmunofluorescencia tiene un uso relativamente limitado en el laboratorio de diagnóstico, pero todavía se considera en la valoración de las biopsias de riñón (fig. 4-2) y

Antígeno tisular secundario Enzina PR Enzima FA Bloqueo de tinción doble

Rojo sensible

Polímero (molécula espinal)

Figura 4-1 (Continuación)

“Moléculas indicadoras y de acoplamiento” Para visualizar el antígeno, si bien de modo indirecto, es necesario producir una señal visual para localizar el sitio de unión en las células o los tejidos. Por consiguiente, se ha desarrollado una gama de sistemas “indicadores” a través de los años. Éstos se describen a continuación en un orden cronológico aproximado.

Figura 4-2 Micrografía de un glomérulo de una biopsia renal. El paciente padecía una glomerulopatía IgA y la delicada inmunotinción se puede reconocer en este corte congelado, reactivado con IgA (verde fluorescente). Reproducido por cortesía del Dr. Aarnoud Huissoon.

piel, quizá porque el material favorece la demostración del antígeno lineal o membranoso. Todavía se utiliza extensamente para la localización del antígeno en la investigación; además, con la capacidad simultánea de localizar los antígenos múltiples dentro del mismo tejido o célula, proporciona la información útil sobre las interacciones celulares y proteínicas. Peroxidasa La peroxidasa de rábano (PR) es una molécula que se adapta de modo extraordinario para la investigación de la enfermedad humana. En primer lugar, no es de origen mamífero,

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CAP. 4

INMUNOHISTOQUÍMICA

sino que se deriva, por supuesto, de una planta. Esto significa que las oportunidades de una reacción cruzada antigénica se reducen; no obstante, debe notarse que la actividad enzimática de la PR es similar a la de los mamíferos y esto puede causar problemas cuando la enzima se demuestra en tejidos o células (véase más adelante). En segundo lugar, puede revelarse con facilidad a través de su reacción con diversos sustratos y se forma un producto teñido de la reacción que puede visualizarse al microscopio, por ejemplo la 3,3’-diaminobencidina (DAB) en presencia de peróxido de hidrógeno. Por último, es una molécula que puede usarse en el plano ultraestructural. El marcado de PR se ha utilizado en técnicas directas, indirectas y de múltiples etapas. Por algunos años, la principal técnica de los laboratorios de histopatología fue el método de la peroxidasa-antiperoxidasa (PAP). Sin embargo, la técnica de la avidina-biotina (CAB) “más amplificadora” ha desplazado en buena medida a aquélla. Un problema con el uso de la PR es que arroja resultados falsos en presencia de actividad peroxidásica endógena en tejido humano u otros, lo que conduce a una reacción positiva; por ejemplo, los neutrófilos polimorfonucleares tienen actividad peroxidásica endógena. Afortunadamente, esta actividad se puede “bloquear” en gran parte mediante pretratamiento de la muestra con reactivos bloqueadores, sobre todo peróxido de hidrógeno o ácido clorhídrico en metanol y azida de sodio. Incluso con esta medida, ciertas células, en particular neutrófilos polimorfonucleares y mastocitos, que son muy ricos en peroxidasa, pueden expresar resultados positivos falsos.

nada con la plata a partir de compuestos argentosos, en virtud de la diferencia de electropositividad. Esto suministra una secuencia muy sensible de la reacción, que encontró un uso extendido en la microscopia de luz hace unos 10 años, cuando se utilizó en estudios como método de marcado para los epitopos de baja expresión, como aquellos de superficies celulares. Sin embargo, debe indicarse que el método nunca encontró una amplia aplicación diagnóstica y sólo se limitó a su uso en investigación. Además, lo ha sustituido en buena medida la serie de métodos del complejo avidina-biotina (CAB). Pese a ello, un uso importante de la técnica inmunoáurica se reconoce en el campo de la microscopia inmunoelectrónica, en la cual las partículas metálicas se pueden ver al localizarse en sitios antigénicos; en realidad, es posible demostrar más de un antígeno en la misma preparación con los anticuerpos ligados a las partículas de oro de tamaños diversos. Avidina-biotina Los métodos de avidina-biotina se basan en la unión de alta afinidad entre avidina (o estreptavidina) y biotina. Esta afinidad en extremo elevada es esencial para su aplicación como una etapa intermedia de los métodos de amplificación y extrema sensibilidad, como el CAB (fig. 4-3). Los anti-

Fosfatasa alcalina La fosfatasa alcalina (FA) es otra enzima que ha encontrado amplio uso en la IHQ, en especial en las preparaciones celulares. Esto último se debe en gran medida a la gran sensibilidad de la interacción fosfatasa alcalina-antifosfatasa alcalina (APAAP) resultante. La FA puede proporcionar productos de reacción de color vivo con ciertos sustratos, pero en general éstos manifiestan el problema de que, al contrario del producto de reacción de la DAB, son solubles. Esto significa que las muestras se deben montar en medios acuosos; anteriormente, éstos eran líquidos y creaban problemas con el almacenamiento por largo tiempo, pero en la actualidad se dispone de montajes permanentes. Una vez más, puede haber problemas con la fosfatasa alcalina endógena tisular, pero esto puede bloquearse con agentes como el levamisol. Oro-plata Los anticuerpos se pueden unir a los agregados uniformes y finos del oro elemental y éste reacciona de forma alter-

Figura 4-3 Micrografía de un linfoma folicular, inmunoteñido para la oncoproteína bcl-2, mediante la metodología CAB.

cuerpos secundarios se biotinilan, con la capa terciaria de avidina conjugada a una molécula indicadora, por ejemplo PR o FA. El método CAB ha encontrado un uso extenso en laboratorios de diagnóstico e investigación y es tal vez el estándar actual. Un problema potencial con los sistemas basados en CAB es que la avidina y la biotina se pueden en-

MÉTODOS DE MÚLTIPLES ETAPAS

contrar en tejidos normales. Es importante considerar esto cuando se analizan estos especímenes y puede recurrirse al uso de los bloques de avidina/biotina para contrarrestar este problema. Amplificación de la señal de la tiramina Este método muy sensible amplifica en grado notable la señal, hasta 103 veces más respecto de otros métodos. En este sistema, la PR actúa como catalizador en la sedimentación de la tiramida, ligada a un fluorocromo o la biotina en las reacciones directas e indirectas. Lo anterior es de gran valor cuando el antígeno objetivo se expresa en grados bajos y puede ser inferior al umbral para la detección con métodos estándar de IHQ.

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tripsina. La base exacta de tales procesos es incierta, pero se admite que ciertos grupos antigénicos son “desenmascarados” en términos bioquímicos por la eliminación de las cadenas laterales que oscurecen, lo cual hace posible el acceso del anticuerpo primario. Las enzimas son muy líticas y la “titulación” antes del uso regular es esencial para evitar la alteración del tejido. Pretratamiento con microondas

Se ha observado ya que puede haber problemas con la actividad enzimática endógena y moléculas endógenas dentro del tejido normal. Se han desarrollado métodos más recientes mediante marcas que no se encuentran habitualmente en el tejido normal. La fluoresceína encontró aceptación reciente como reactivo acoplador, no en virtud de su fluorescencia sino como antígeno: esta molécula presenta la ventaja obvia de que carece de un análogo humano. Un acercamiento novedoso para la amplificación de la señal ha sido la introducción de sistemas basados en polímeros. Éstos permiten que las marcas múltiples enzimáticas (PR/FA) se unan al anticuerpo secundario a través de la columna vertebral del polímero. Este tipo de sistema es un procedimiento de dos etapas y de ese modo ahorra tiempo en relación con los sistemas convencionales de avidina/biotina, mientras que las marcas múltiples enzimáticas mantienen la sensibilidad.

En el decenio de 1990 resultó evidente que ciertos epitopos se podían “desenmascarar” con el uso de la radiación de microondas controlada de las secciones del tejido en medio acuoso. Como en el caso del pretratamiento de la enzima, el mecanismo que subyace a esto se encuentra lejos de ser claro; no obstante, esta técnica encontró una aplicación muy amplia en los últimos años. Como los métodos enzimáticos, el tratamiento con microondas no sólo mejora la visualización en algunos casos de ciertos antígenos, sino que también puede permitir la detección, cuando antes ninguna era posible. Como en el tratamiento enzimático, es necesaria la “titulación” de la sincronización de la microonda. Otro desarrollo reciente ha sido el uso del cocimiento a presión de las secciones para mejorar la inmunotinción. Esto es algo más peligroso que el uso cuidadoso de los hornos de microondas. En algunos centros también se utilizan el cocimiento a presión mediante hornos de microondas, la esterilización, el cocimiento con vapor y ebullición simple. Con la metodología de la recuperación, es esencial utilizar portaobjetos microscópicos precubiertos para evitar la pérdida de tejido de la superficie del portaobjetos. Los portaobjetos cargados de modo positivo están disponibles en el comercio; las alternativas incluyen recubrimiento de los portaobjetos con poli-l-lisina, APES o Vectabond.

Enlace inespecífico del anticuerpo

Controles

Los lectores deben observar que los anticuerpos primarios pueden ligarse de forma inespecífica a muestras de tejido, en gran parte por medio de sus fracciones Fc. Es mucho más probable que el problema se suscite con policlonales y menos con reactivos monoclonales. Esto puede superarse casi siempre por medio del “bloqueo” con el suero no inmunitario apropiado.

Es muy importante instituir ciertos controles esenciales antes de probar cualquier anticuerpo nuevo y, en condiciones ideales, por lo menos algunas de estas exigencias se deben aplicar sobre una base de diagnóstico diario. Los controles positivos implican la inclusión de las muestras conocidas para tener elementos reactivos con el anticuerpo en cuestión. Éste es el control más importante y usado con regularidad en el diagnóstico diario IHQ. Es útil algunas veces preparar un bloque tisular compuesto incluido en cera de parafina que contenga una combinación de piezas pequeñas de los controles positivos conocidos y montarlo en el mismo portaobjetos como la muestra de prueba. Esto permite al patólogo ver ambas estructuras teñidas, de forma positiva o negativa, al mismo tiempo.

Sistemas sin biotina

Métodos de “recuperación de antígeno” Pretratamiento de la enzima A finales de la década de 1970 se reconoció que la inmunotinción se podía mejorar con el pretratamiento de las muestras con ciertas enzimas proteolíticas, como la pronasa o la

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CAP. 4

INMUNOHISTOQUÍMICA

Figura 4-4 Cortes teñidos de forma doble para demostrar la reactividad citoplásmica en marrón (DAB, Menarini) para la cadena ligera  de Ig y la actividad citoplásmica (Vector SG) de gris acero para la cadena ligera . En a), las células plasmáticas en una amígdala “reactiva” muestran una mezcla de células, en la que algunas contienen una cadena y otras la restante. En b), todas las células plasmáticas (en una biopsia de piel) contienen la cadena  y son, por lo tanto, clonales.

Cuando un anticuerpo nuevo se halla bajo evaluación antes de su uso diagnóstico o de investigación, se requiere una gama de controles más rigurosos, entre ellos los siguientes: “bloqueo” con el antígeno/epitopo puro (es decir, el anticuerpo preadsorbente con su antígeno objetivo); la omisión del anticuerpo primario (o reemplazo con un control igualado de modo isotópico) u otros anticuerpos en la secuencia y aplicación de la reacción cromógena sola. Tales controles comprueban la especificidad de la unión primaria del anticuerpo y la necesidad de su presencia en el resultado positivo de la reacción. Métodos de marcación dual A menudo es importante poder demostrar más de un antígeno o epitopo en una célula o tejido particular. Un ejemplo es la demostración de las cadenas ligeras  (kappa) y  (lambda) para determinar la clonalidad en una lesión linfocitoide (fig. 4-4). La pregunta es, por supuesto, “¿se trata de una muestra de tejido linfoide benigno o maligno?” La exposición de monoclonalidad en las células o sobre ellas de un corte debe indicar malignidad; la capacidad para demostrar esto debe modificar el control del paciente. Para identificar más de un antígeno/epitopo se utilizan los sustratos cromógenos de diversos colores y por consiguiente se determina la preparación. La IHQ también se puede combinar con otras técnicas, como el método de “AgNOR”

(véase cap. 8), histoquímica convencional e hibridación in situ. Anticuerpos policlonales y monoclonales El trabajo inicial sobre IHQ se llevó a cabo mediante antisueros policlonales inoculados en mamíferos contra preparaciones antigénicas. Estos antisueros fueron politípicos y por tanto tendieron a proporcionar patrones de tinción que no estaban muchas veces “claros” en los cortes, con la unión de diversos anticuerpos constitutivos a sitios microscópicos más bien variables. El método de “purificación de afinidad”, en el cual el anticuerpo policlonal se hizo pasar a través de una columna que contenía el antígeno objetivo unido a la matriz, mejoró la especificidad de los reactivos. Con el advenimiento de los anticuerpos monoclonales resultó posible la localización mucho “más clara” y específica de epitopos y por consiguiente una mejor delineación de las especies celulares y tisulares. Pese a ello, un problema inicial de peso fue que, a diferencia de muchos anticuerpos policlonales, la mayor parte de los anticuerpos monoclonales no podía aplicarse con éxito de forma regular a las muestras incluidas en cera de parafina guardadas. Por consiguiente, la mayoría de los estudios iniciales dependió de la disponibilidad de material congelado de la sección, con su preservación morfológica relativamente pobre. Sin embargo, hoy, con la llegada de los anticuerpos

PROYECCIÓN DE IMAGEN

monoclonales de afinidad más alta, muchos se pueden aplicar a los cortes en parafina, sobre todo tras el uso de los métodos de recuperación del antígeno. No obstante, las secciones congeladas pueden ofrecer una ventaja sobre las muestras en cera de parafina dado que pueden suministrar una mejor visualización de los antígenos de superficie.

Aplicaciones de la inmunohistoquímica Rebasa los límites de este libro delinear una explicación comprensiva de los innumerables usos de la IHQ en el laboratorio de diagnóstico. Basta con señalar que esta tecnología se puede utilizar en el diagnóstico y como indicador del pronóstico en patología celular común. La IHQ ha permitido distinguir entre los linfomas y carcinomas celulares pequeños, melanomas y seminomas, mesoteliomas y adenocarcinomas, y linfomas de células B y T. Además, es posible identificar microorganismos muy diversos, desde Cytomegalovirus hasta Toxoplasma y, como se discute en el capítulo 8, se puede determinar la proliferación celular y el estado apoptósico. Además, pueden demostrarse las hormonas, los receptores de la hormona, los factores del crecimiento, las moléculas de adhesión y los productos oncógenos, al igual que los ligandos para ciertas moléculas. No obstante, como advertencia debe subrayarse que los epitopos compartidos no indican en todos los casos orígenes comunes. Por ejemplo, las células de Reed-Sternberg de la enfermedad de Hodgkin y las células del adenocarcinoma expresan CD15, sin que ello indique que estos tipos de célula posean un linaje común. Un campo cada vez más importante para el uso de la IHQ se sitúa en la valoración del pronóstico, que puede ayudar al clínico a prescribir con mayor precisión el tratamiento más conveniente para una enfermedad maligna en particular. Los ejemplos se hallan en la valoración de la fracción del crecimiento por medio del anticuerpo Ki67. Asimismo, la expresión de la oncoproteína bcl-2 confiere un pronóstico relativamente pobre en linfomas de alto grado. La investigación del receptor de estrógeno y progesterona y el estado HER2 son también de gran importancia en el tratamiento de los carcinomas de mama.

Control de calidad En el mundo actual que exige estándares de laboratorio cada vez más estrictos, son del todo recomendables el control externo de la calidad y la vigilancia interna de rutina. Muchos países cuentan con esquemas externos de aseguramiento de la calidad que, en general, dependen de la evaluación de la tinción de los antígenos seleccionados por el laboratorio “objetivo”. Las muestras son una combinación de casos directos indudables y cortes de ineludible dificul-

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tad (p. ej., la tinción de las cadenas ligeras superficiales de Ig sobre las células que presentan antígeno). Esto debe permitir a los laboratorios mejorar y estandarizar su técnica a la luz de las revisiones.

Automatización La inmunohistoquímica llegó al campo de la automatización relativamente tarde (fig. 4-5), quizá porque pocos

Figura 4-5 Aparato automático de inmunotinción del fabricante Dako Cytomation Ltd. Reproducido con autorización de DAKO Cytomation Ltd.

anticuerpos que eran convenientes para su uso de rutina estaban disponibles. No obstante, en poco tiempo cualquier laboratorio dispondrá de un panel grande de reactivos aplicados a numerosos cortes en cualquier procedimiento diagnóstico; la automatización sólo es cuestión de tiempo. Los dispositivos anteriores eran semiautomatizados y servían en gran parte para ahorrar tiempo y manipular grandes volúmenes de reactivos; esto atenuaba, por ejemplo, el tedio de los lavados múltiples con amortiguadores. Más adelante aparecieron en el mercado máquinas más automatizadas, por supuesto mucho más costosas que sus precursoras. Los aparatos recientes poseen microprocesadores, controlados y programables a las exigencias del usuario, que permiten procesar de modo simultáneo muestras que emplean distintos tipos de tinción.

Proyección de imagen Hoy en día cada vez más es posible cuantificar la tinción IHQ. En el pasado, ello resultaba difícil debido al pobre

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CAP. 4

INMUNOHISTOQUÍMICA

SL-50 (fig. 4-6), que permite la cuantificación y análisis de portaobjetos IHQ con instrumentos de alta eficacia de procesamiento y programas de análisis de imagen. Esto también permite crear una “red virtual” gracias a la cual los patólogos pueden evaluar paneles de portaobjetos que analizan el sistema y poner a disposición los resultados de manera directa en los sistemas del hospital.

Lecturas adicionales

Figura 4-6 Applied Imaging’s Ariol SL-50. Reproducido con autorización de Applied Imaging.

entendimiento de la estequiometría de las reacciones IHQ, en particular en la unión cromógena. Sin embargo, ahora se cuenta con sistemas como el Applied Imaging’s Ariol

Leong AS-Y, Cooper K, Leong FJW-M. Manual of Diagnostic Antibodies for Immunohistology. London: Greenwich Medical Media 2003. Polak JM, van Noorden S. Introduction to Immunocytochemistry. Oxford: Bios Scientific 1997. Boenisch T (ed.). Immunochemical Staining Methods, 3rd ed. California: DAKO Corporation 2001. Dabbs DJ. Diagnostic Immunohistochemistry. New York: Churchill Livingstone 2002.

5 Microscopia electrónica en patología Brian Eyden

Introducción Los tejidos o líquidos humanos que contienen células se muestrean sobre todo con propósitos diagnósticos, es decir, para la identificación de las categorías patológicas que pueden reconocerse y tratarse. A menudo es necesario un diagnóstico microscópico para optimizar el control del paciente y, cuando menos en el campo del cáncer, muchos diagnósticos clínicos se modifican tras la investigación microscópica histopatológica. El examen microscópico de luz de las muestras teñidas con hematoxilina y eosina (H-E) de tejidos embebidos en cera de parafina es el procedimiento técnico más importante para el diagnóstico sólido de especímenes humanos. En este punto, un patólogo determina aspectos de la célula y la matriz, incluida la estructura, en el contexto de hallazgos generales y datos clínicos para precisar un diagnóstico. Mientras que la microscopia de luz de los cortes con H-E es aún la base del diagnóstico histológico, técnicas más nuevas, como la microscopia electrónica (ME), inmunohistoquímica, tinción AgNOR, citometría de flujo, además de las técnicas citogenéticas y “moleculares” (análisis de reconfiguración génica, hibridación de fluorescencia in situ y la reacción en cadena de la polimerasa [PCR]), pueden en la actualidad proporcionar información adicional para depurar el conocimiento de la enfermedad y el diagnóstico. La microscopia electrónica de diagnóstico ha resultado importante desde finales de la década de 1960 y principios del decenio de 1970. Sin embargo, a partir de los inicios de los años de 1980, la inmunohistoquímica en particular se ha convertido en una técnica imprescindible y ha propiciado cierta declinación en la práctica de la ME. Dado que la inmunohistoquímica se reconoce como la técnica más

conveniente y útil, atrajo recursos que antes se destinaban a la ME. Empero, la ME proporciona una información única (sobre la morfología subcelular) y puede proporcionar por tanto nuevos datos sobre la enfermedad, parte de los cuales tienen aplicaciones diagnósticas. Esto es así porque en algunas afecciones bastan las características puramente morfológicas para establecer el diagnóstico (cuadros 5-1 y 5-2), aunque también porque la inmunohistoquímica tiene limitaciones, si bien es una técnica de particular importancia en el diagnóstico oncológico. La bibliografía actual atestigua el valor de la continuación de la ME en la investigación y el diagnóstico de los casos de la enfermedad humana que son problemáticos para la microscopia de luz (Dar et al., 1992; Hashimoto, 1994; Kandel et al., 1998; Mierau, 1999; Eyden, 1999, 2002; Lloreta-Trull et al., 2000; Tucker, 2000; Al-Sarraj et al., 2001). La carencia de información ultraestructural disminuye el rendimiento de un departamento de diagnóstico, puesto que la ME puede confirmar o descartar de modo continuo las interpretaciones de los patólogos basadas en la microscopia de luz; de esa manera aumenta la confianza con la cual se sustenta un diagnóstico. Se suele decir con cierta razón que la ME hace mejores a los patólogos. El grado al cual se emplea la ME en un departamento de diagnóstico de rutina depende de la experiencia disponible (técnica e interpretación) y, en grado notorio, de los lineamientos y antecedentes del jefe de servicio. Algunos utilizaron la ME en el pasado, pero ahora no confían más en ella y prefieren la inmunohistoquímica y las técnicas moleculares nuevas para solucionar los problemas diagnósticos (pese a que la inmunohistoquímica continúa su transformación en términos tecnológicos y existen dudas acerca de la especificidad de muchos de los anticuer-

The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker. © 2005 John Wiley & Sons, Ltd.

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CAP. 5

Cuadro 5-1

MICROSCOPIA ELECTRÓNICA EN PATOLOGÍA

Marcadores ultraestructurales de diferenciación celular usados en la identificación de tumores

Tipo celular

Características ultraestructurales

Epitelio escamoso Epitelio glandular Neumocito tipo 2 Mesotelio Célula neuroendocrina Célula de Schwann Adipocito Célula del músculo estriado Célula del músculo liso Miofibroblasto Fibroblasto Endotelio Neurona

Desmosomas, tonofibrillas, lámina basal Complejo apical conjuntivo, microvellosidades, gránulos mucígenos Cuerpos amortiguadores (mielinosomas) Microvellosidades lisas, largas, sinuosas Gránulos neuroendocrinos (“núcleo denso”) Proyecciones finas cubiertas con lámina externa Gotas de grasa, lámina Sarcómeros consistentes en formaciones de actina y miosina y discos Z Miofilamentos finos con densidades focales, lámina externa Retículo endoplásmico rugoso, miofilamentos, articulaciones fibronexales Retículo endoplásmico rugoso, gránulos con secreciones de colágena Cuerpos de Weibel-Palade Gránulos neuroendocrinos, retículo endoplásmico liso, microtúbulos, conexiones sinápticas Melanosomas Gránulos romboidales Cristales, lípidos, retículo endoplásmico liso, crestas tubulares Desmosomas Gránulos de Birbeck Aparato de Golgi, retículo endoplásmico rugoso Lisosomas, proyecciones filopodiales Célula “indiferenciada” (organelos indistinguibles)

Melanocito Célula yuxtaglomerular Célula de Leydig Célula granulosa Célula de Langerhans Célula plasmática Macrófago Linfocito Adaptado según Cameron and Toner (1998).

pos usados). Por el contrario, otros recurren a la ME en mayor grado y ocupan casi siempre posiciones en las instituciones grandes o especializadas en las cuales la carga de trabajo ingente o la referencia de muchas de las muestras representan números más grandes de casos difíciles. La cuantificación del valor de la ME es difícil. Se ha dicho que hasta 5% de todos los tumores, por ejemplo, puede ser bastante problemático para beneficiarse de la investigación con ME, mientras que 25% de las muestras renales no neoplásicas puede necesitar ME (Pearson et al., 1994). Cualesquiera que sean los números, la ME debe aplicarse siempre que haya una dificultad en la interpretación del corte con H-E. La ME es siempre digna de practicarse en estas circunstancias porque nunca es posible predecir en un caso individual qué resultados pueden obtenerse y algunas veces se experimenta el placer de reconocer hallazgos del todo inesperados y nuevos. Además, la ME y la inmunohistoquímica (y todas las técnicas más recientes) se deben considerar como complementarias; es una idea generalizada admitir que la información proveniente de la inmunohistoquímica y la ME pueden delinear un cuadro más completo de una lesión que cualquier técnica sola. El cuadro se complica a veces por el uso de ambas técnicas (pueden ser excluyentes), pero esto puede considerarse un estímulo para la investigación suplementaria.

Principios de la técnica y la organización de la ME Microscopia electrónica de transmisión: energía de resolución Casi todo el trabajo de diagnóstico ultraestructural utiliza la microscopia electrónica de transmisión (MET) para demostrar las propiedades celulares específicas o las características de la matriz, que pueden contribuir a la comprensión y el diagnóstico de la enfermedad (cuadros 5-1 y 5-2). Además de la MET existen algunas aplicaciones, aunque no demasiadas, que pueden denominarse técnicas “especializadas”, por ejemplo la ME “de barrido”, que es otra clase “morfológica” de ME, y otras técnicas que suministran información sobre el contenido elemental (microanálisis de rayos X) o la composición biomolecular (inmunocitoquímica e histoquímica ultraestructurales) (cuadro 5-3). También se han desarrollado las “versiones” ME de los procedimientos de la microscopia de luz, como la morfometría, para proporcionar la información cuantitativa ultraestructural (p. ej., la irregularidad nuclear en los linfomas). Pese al desarrollo de las técnicas “funcionales” ultraestructurales más recientes, la ME es aún un método esencialmente morfológico, como la histopatología con H-E.

PRINCIPIOS DE LA TÉCNICA Y LA ORGANIZACIÓN DE LA ME

Cuadro 5-2 Enfermedad renal

Padecimientos neuromusculares Trastornos cutáneos

Enfermedades del tejido conectivo Alteraciones hematopoyéticas Errores innatos del metabolismo Biopsias pediátricas hepáticas Biopsias endomiocárdicas Enfermedades respiratorias Trastornos del sistema nervioso central y periférico Medicina reproductiva Agentes infecciosos

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Aplicación de la microscopia electrónica en trastornos no neoplásicos Espesores de la membrana capilar basal (p. ej., enfermedad de la membrana basal delgada) Presencia y localización de depósitos inmunitarios (p. ej., glomerulonefritis [GN] membranosa) Presencia de fibrillas extracelulares (p. ej., amiloide), inclusiones celulares (p. ej., figuras de mielina en la enfermedad de Fabry), estadificación de ciertas enfermedades (p. ej., GN membranosa), procesos de apoyo (la fusión extensa puede ser indicativa de GN de cambio mínimo) Mitocondrias, miopatías congénitas y metabólicas Afecciones de queratinización Dermatosis mecanobulosa Defectos del cabello y las uñas Trastornos estrómicos que incluyen alteraciones de la colágena, proteoglucanos y amiloidosis de la elastina Enfermedades plaquetarias Anomalías granulocíticas Acumulación de metabolitos Potencial para la detección prenatal Enfermedad metabólica del hígado Síndrome de Reye Cardiomiopatías, amiloidosis Anormalidades ciliares Identificación de partículas pulmonares Demencias, neuropatías, CADISIL* Anormalidades de los espermatozoides Virus, bacterias, protozoarios, hongos

*Arteriopatía cerebral autosómica dominante con infartos subcorticales y leucoencefalopatía. Adaptado según Cameron y Toner (1998).

Cuadro 5-3

Técnicas y procedimientos ultraestructurales especializados

• Microscopia electrónica de barrido • Microscopia inmunoelectrónica • Histoquímica ultraestructural • Microanálisis por rayos X y difracción electrónica • Fractura y delineado por congelación • Hibridación in situ ultraestructural • Morfometría ultraestructural

Como la microscopia de luz, la ME utiliza muestras sometidas a una forma de radiación para observarlas. La radiación (haz electrónico) interactúa con el material interno del corte para emitir una imagen, que se puede interpretar para obtener información sobre la naturaleza de la muestra. La importancia de la ME radica en que utiliza un haz electrónico. Puesto que la energía de resolución depende de la longitud de onda de la radiación, la energía de resolución de un microscopio electrónico es en la práctica cerca de 100 veces mayor respecto de un microscopio de luz. En

consecuencia, pueden proyectarse detalles estructurales de la célula y la matriz tan pequeños como de tan sólo algunos nanómetros en tamaño, lo cual rebasa de forma notable la capacidad de la microscopia de luz. Por lo tanto, a través de los años se han identificado las estructuras celulares y de la matriz que son distintivas o específicas de una célula o enfermedad, y esta abundancia acumulada de información representa la base de la microscopia electrónica de diagnóstico en los tumores y la enfermedad no neoplásica (cuadros 5-1 y 5-2). Formación de la imagen En la MET, los electrones en el haz que ilumina (“incidente”) producen un número importante de interacciones al entrar en contacto con la muestra. Muchos pasan simplemente a través del espécimen casi sin cambio alguno. Otros se desvían de su trayectoria (“se dispersan”) por áreas o puntos de mayor densidad electrónica en el corte y se filtran hacia afuera del haz incidente final por una abertura (fig. 5-1a). Por consiguiente, el haz incidente final posee

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CAP. 5

MICROSCOPIA ELECTRÓNICA EN PATOLOGÍA

Figura 5-1 Formación de la imagen en el microscopio electrónico de transmisión. Los electrones en el haz incidente entran en contacto con el corte ultradelgado (a). Algunos pasan sin desviarse a través de su trayectoria incidente (a), mientras que los que se impactan sobre un punto denso de la muestra (p. ej., un átomo de metal pesado) se desvían fuera de la trayectoria incidente (dispersados de forma elástica) y no avanzan hacia la pantalla de visualización por una abertura del metal (a). Por lo tanto, el haz incidente final contiene la información que resulta de la combinación de electrones sin desviar y de otros que sufrieron dispersión elástica (b). Representación de Paul Chantry.

áreas que carecen de electrones en comparación con el haz incidente inicial (fig. 5-1b) y esta diferencia establece la base de la imagen. La densidad dentro de una muestra puede ser natural, como en un concentrado de mineralización, o el tratamiento químico del tejido en el espécimen puede introducirla. Por lo general, lo anterior se lleva a cabo con la solución de tetraóxido de osmio (véase la técnica más adelante), en la cual los átomos del osmio se unen de manera selectiva a los materiales biológicos, como las membranas. En consecuencia, una fila de átomos de osmio unidos a una membrana celular produce una imagen que refleja

esta línea de electrones “ausentes” en el haz incidente final (fig. 5-1b), que a su vez se convierte en una línea sobre la pantalla del microscopio electrónico cuando los electrones chocan con el recubrimiento fluorescente de la pantalla que se visualiza y se convierten en luz visible.

Técnica Las técnicas empleadas para preparar el tejido para la MET de corte fino se han estandarizado bastante en los últimos

PRINCIPIOS DE LA TÉCNICA Y LA ORGANIZACIÓN DE LA ME

años. Como en la microscopia de luz, el tejido necesita fijarse con rapidez para evitar la autólisis y primero se fija en un aldehído, es decir, un fijador con el que predominan las uniones cruzadas con proteínas. Se acepta que el glutaraldehído, entre una variedad de aldehídos disponibles en el comercio, ofrece el mejor desempeño para la conservación ultraestructural. No obstante, la fijación de una biopsia o una muestra de resección en glutaraldehído requiere personal y tiempo para atender un problema quirúrgico. Según sean las condiciones del laboratorio, puede ser necesario recuperar tejido de la muestra principal en formalina histológica. Resuelto lo anterior, se amortigua a un pH fisiológico; la muestra es bastante pequeña y no debe recogerse para la ME de la profundidad de un espécimen grande (donde la autólisis puede alterar la estructura del tejido); la conservación puede ser muy buena. La opción de muestreo del tejido en formalina histológica imposibilita la inclusión de la muestra entera en cera y requiere una pieza representativa pequeña para retenerse, dado que es posible la eventualidad de un problema diagnóstico identificado en la investigación con H-E. Esto puede no ser factible en una institución con grandes cargas de trabajo. La muestra fijada en glutaraldehído o recuperada a partir de formalina necesita cortarse en piezas pequeñas (“milímetros cúbicos”), puesto que los reactivos del proceso subsecuentes tienden a penetrar con lentitud. Las muestras pequeñas disponibles para el estudio constituyen una de las limitaciones principales de la ME. Después de la fijación en aldehído, el contraste selectivo se incorpora mediante una solución de tetraóxido de osmio y algunas veces también con una solución de acetato de uranilo. Estos átomos del metal pesado se unen de modo selectivo a las estructuras de la célula y proporcionan la energía de dispersión electrónica y el contraste. Aunque las reacciones de estos reactivos con los componentes biológicos son complejas, el tetraóxido de osmio se conoce por ser un fijador de lípidos y una de sus funciones principales es delinear las membranas al depositar los átomos de osmio en los intersticios bimoleculares. El acetato de uranilo es un fijador de fosfolípidos y también realza la delineación de la membrana, aunque fija además los ácidos nucleicos y de este modo proporciona densidad a los ribosomas y a la desoxirribonucleoproteína (“cromatina”) nuclear. Después de la tinción y fijación en bloque, el tejido se deshidrata en etanol o acetona y se infiltra con una resina epóxica líquida, en ocasiones con un solvente transitorio como el óxido de propileno, tolueno o el limoneno, que es el menos usado pero también el menos tóxico. El bloque del tejido infiltrado en resina epóxica entonces se polimeriza por medio de calor a un estado sólido. Los pasos de la infiltración se pueden realizar de forma manual con el tejido en frascos pequeños, encapsulados, de cristal, con reactivos

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recolocados con pipeta o mediante un procesador automatizado de tejido. Los instrumentos basados en microondas, de reciente introducción, pueden procesar el tejido hasta un bloque polimerizado en cuestión de algunas horas, algo comparable con los procedimientos típicos de la inmunohistoquímica. Los bloques de resina epóxica tienen las propiedades físicas que permiten que las secciones se corten con un ultramicrótomo manual sobre el cristal disponible o con cuchillas permanentes de diamante. Las secciones con un espesor de alrededor de 80 nm son bastante delgadas para el paso de los electrones requeridos para la formación de la imagen, y aun bastante fuertes para soportar el efecto térmico de la exposición a electrones de alta energía. Las secciones se recolectan casi siempre en rejillas de malla de cobre de 3 mm de diámetro, teñidas para el contraste adicional en soluciones de acetato de uranilo y citrato de plomo (Maunsbach y Afzelius, 1999) y entonces se encuentran listas para el examen en el microscopio electrónico. Manipulación de los tejidos antes de la fijación Los procesos de muestreo y manipulación del tejido previos a la fijación pueden ser cruciales para obtener un tejido bien seleccionado y preservado. Esto es de lo más importante, puesto que la interpretación se facilita en gran medida por la calidad de la conservación estructural. A pesar de los deseos de usar el glutaraldehído o incluso la formalina histológica amortiguada, a veces es necesario recuperar el tejido a partir de un bloque de cera. Ésta es la directriz de rutina en algunas instituciones de diagnóstico, es decir, conformar todo en bloques en cera, lo cual se aplica en especial a las muestras pequeñas, un tratamiento en particular inapropiado para la muestra de ME con el fin de no poner en peligro el examen con la microscopia de luz. El tratamiento bastante radical con xileno y cera calientes daña de modo inevitable algunas ultraestructuras, pero ciertos componentes de la célula pueden sobrevivir en la cera: desmosomas, tonofibrillas, miofilamentos, filamentos intermedios, luces, gránulos de Birbeck, gránulos neuroendocrinos y melanosomas. Ciertas estructuras exclusivamente membranosas, como el retículo endoplásmico liso y la mitocondria, suelen preservarse mal, pero algunas membranas del plasma se pueden conservar o delinear bien y así reconocerse. Una variación en la recuperación de cera es el método llamado “pop-off”, en el cual una sección de H-E se puede procesar para la microscopia electrónica, sometida al osmio, deshidratada e infiltrada con resina sobre el portaobjetos de cristal. La muestra se puede entonces tratar (“popped-off”) en un molde convencional con resina epóxica para el corte ultrafino subsiguiente (véase la sección de Lecturas adicionales). Esta técnica se puede

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CAP. 5

MICROSCOPIA ELECTRÓNICA EN PATOLOGÍA

también aplicar a los frotis, pero es exigente desde el punto de vista técnico. El tejido secado o congelado sin agentes criopreservadores, o dejado durante la noche antes de la fijación, puede ser inútil para la ME (con la salvedad de que ciertos microorganismos pueden sobrevivir; véase la fig. 5-7b). Sin embargo, el tejido crioprotegido, que se congela y después se descongela, puede suministrar buenos resultados ultraestructurales. Muchas otras muestras pueden o necesitan fijarse en glutaraldehído. Los especímenes de sangre periférica, semen, de cepillados nasales y bronquiales y los fragmentos pequeños de tejido que pueden verse en una muestra aspirada con aguja fina en una jeringa se fijan con facilidad, desde el punto de vista del proceso, se trate de glutaraldehído o formalina. Algunas muestras no necesitan fijarse. El síndrome de Hermansky-Pudlak, una afección compleja que implica disfunción plaquetaria, puede demostrarse tan sólo al secar una preparación de la plaqueta en una rejilla revestida con película y examinarla de forma directa en el microscopio electrónico para reconocer los gránulos distintivos y el número de gránulos anormales (véase fig. 5-9d). Preliminares para examinar cortes ultrafinos En la histopatología tisular, rara vez se realiza la ME sin tener en cuenta otras fuentes de información diagnóstica. El patólogo necesita disponer de toda la información clínica apropiada, conocer los aspectos histológicos detallados de la lesión y, en el caso de tumores, contar con los hallazgos inmunohistoquímicos a la mano cuando se efectúa la ME. La idea de ejecutar la ME antes de la inmunohistoquímica para eliminar inmunotinciones innecesarias puede ser útil y tal vez lógica, pero carece al parecer de aceptación general. Es usual realizar la ultramicrotomía con cortes “semifinos”. Por lo general, éstos son de 1 a 2 µm de espesor, se tiñen con azul de toluidina o una tinción similar y se examinan en el microscopio de luz. Las muestras confirman que el tejido posee una morfología comparable a la obtenida con H-E o que las células son las esperadas a la luz del antecedente clínico cuando no hay muestras con H-E de una contraparte sólida del tejido (p. ej., en un espécimen de líquido corporal). Con este procedimiento pueden evitarse los focos indeseados de colágena o necrosis hallados a menudo en los tumores. Por último, los cortes semifinos pueden suministrar información sobre la calidad de la conservación del tejido. La tinción pálida de células y núcleos indica casi siempre una buena preservación, mientras que los núcleos delineados de forma aguda con espacios interiores claros suelen señalar una pobre conservación (Eyden, 2002). Por lo tanto, en la investigación de un tumor los cortes semifinos

de varios bloques deben dividirse y el más apropiado se elige con base en el contenido celular del tumor y la calidad de la preservación. En lesiones complejas es deseable cortar muestras ultrafinas a partir de los bloques que representen a todas las áreas histológicamente diferentes. Al asegurar la selección apropiada para ultramicrotomía, el patólogo o bien el científico examinan los cortes ultrafinos para las estructuras celulares o los componentes de la matriz considerados como característicos o específicos de ciertos padecimientos. La identificación de estas estructuras depende de una interpretación detallada de la ultraestructura de la célula y el tejido, así como de un conocimiento de las características ultraestructurales de las enfermedades específicas: ésta es una experiencia que tiende a acumularse a través de los años. Cuando los científicos clínicos o los biomédicos examinan cortes ultrafinos bajo la instrucción de patólogos, son esenciales el enlace y la comunicación cercanos entre estas partes, como sucede en el Reino Unido. En el trabajo arduo de un tumor complejo las ideas diagnósticas pueden cambiar en el curso de pocos días a medida que las inmunotinciones se hallan disponibles.

Aplicaciones de la microscopia electrónica de transmisión Tumores En el diagnóstico de una tumoración, la caracterización acertada de la neoplasia depende del hallazgo de las estructuras distintivas de la célula o la matriz. Debe determinarse si son iguales o no respecto de las encontradas en la “célula normal correspondiente”. En tal caso, por ejemplo, un carcinoide intestinal se puede diagnosticar por los gránulos neuroendocrinos hallados en las células enteroendocrinas normales (fig. 5-2); un carcinoma mamario por los desmosomas, tonofibrillas, lámina basal, luces y gránulos de mucígeno (figs. 5-3a y 5-5), como en el epitelio normal de la mama, y un melanoma maligno por el hallazgo de los melanosomas típicos de los melanocitos normales (fig. 5-3b). Esto no significa que estos procesos malignos se originen a partir de esas células normales diferenciadas; más bien se piensa que proceden de las células embrionarias diferenciadas de forma más primitiva. Una amplia variedad de tumores se puede identificar con base en su ultraestructura distintiva o específica (cuadro 5-1). Los ejemplos de los organelos específicos útiles en el diagnóstico del tumor se muestran en las figuras 5-2 a 5-5. Hay obstáculos en el diagnóstico ultraestructural de los tumores. Desde luego, muchos tumores pierden las propiedades esperadas y se vuelven menos diferenciables. En un protocolo de revisión típico se examina de forma cuidadosa un bloque (una rejilla de cortes ultrafinos) por una hora. No

APLICACIONES DE LA MICROSCOPIA ELECTRÓNICA DE TRANSMISIÓN

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Figura 5-2 a) Célula normal enteroendocrina del intestino delgado humano normal. Las inclusiones muy electrodensas cerca del polo basal de la célula (*) son gránulos neuroendocrinos que contienen hormonas. Obsérvense los gránulos redondeados y en forma de barra (8 700 ⫻). b) Tumor carcinoide del intestino delgado (hace metástasis a un ganglio linfático mesentérico). Nótese la misma clase de morfología del gránulo neuroendocrino (60 700 ⫻).

obstante, los tumores con grados decrecientes de diferenciación pueden ameritar una valoración más extensa (varias horas y múltiples bloques, según sean la percepción del patólogo, la necesidad clínica, el resultado del diagnóstico, etc.). Como complicación adicional, los tumores pueden también expresar características inesperadas y mostrar así una diferenciación “divergente” o “anómala”. Por lo tanto, el clínico debe tener un conocimiento de estas propiedades tumorales a partir de la experiencia personal y bibliográfica. No obstante, la ME es de un valor mayor respecto de la sección H-E, en la cual los tumores aparecen apenas diferenciados y revelan casi siempre una inmunotinción tenue o negativa para los marcadores previstos; en consecuencia, la confirmación inmunohistoquímica de un diagnóstico con H-E puede ser incompleta. La ME es también en extremo importante cuando la inmunotinción no puede reconocer un fenotipo definido con claridad, sea por la especificidad incierta del anticuerpo, la incertidumbre interna si la tinción es levemente positiva o negativa o una tinción inesperada (“aberrante”). Por ejemplo, las variantes del melanoma, el linfoma y el sarcoma malignos son tales que se tiñen de modo positivo el filamento epitelial intermedio y la citoqueratina y, en consecuencia, puede ser necesaria la investigación ultraestructural para dilucidar la diferenciación. Es importante considerar la posibilidad de encontrar células no neoplásicas en el tejido tumoral. En la bibliografía

se notifican micrografías de células y pericitos endoteliales en paredes vasculares, malinterpretados como células tumorales. Deben también distinguirse como no neoplásicas las células de los tejidos normales invadidos por el tumor o las células normales del tejido que se regeneran (p. ej., células estriadas del músculo), además de las células inflamatorias o reactivas (p. ej., macrófagos, linfocitos, células del plasma, miofibroblastos). Estas células tienden a diferenciarse bien y se deben observar con sospecha, en particular si se localizaron en un tumor de escasa diferenciación. Aunque cualquier tumor que demuestre cierta incertidumbre por microscopia de luz merece la valoración por ME, la técnica ha demostrado utilidad particular en un buen número de grupos tumorales (tumores “anaplásicos” epitelioides de células redondas; tumores de células redondas pequeñas; tumores de células falciformes, y la extensa categoría de lesiones mesenquimatosas o del tejido blando, incluidos los sarcomas). Uno de estos últimos lo representan las neoplasias fibroblásticas y puede esperarse que muestren poca inmunopositividad, con excepción de la vimentina, un marcador bastante inespecífico. La microscopia electrónica puede también ayudar a sugerir el sitio primario de una masa metastásica, mientras que en los tumores del sistema nervioso central la identificación de las características de tumoraciones meníngeas, schwannomas y

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CAP. 5

MICROSCOPIA ELECTRÓNICA EN PATOLOGÍA

Figura 5-3 Sistemas membranosos intracitoplásmicos 1. a) Gránulos de mucígeno en un carcinoma ductal de mama. Tienen un centro denso proteináceo en un espacio claro. En concordancia con su naturaleza exocrina, se encuentran a menudo cerca de la luz, en la cual descargan su contenido (24 000 ⫻). b) Los melanosomas constituyen el sello ultraestructural para la diferenciación melanocítica. Este melanosoma es un melanoma maligno de células fusiformes sin pigmento y se encuentra libremente en la matriz citoplásmica (98 000 ⫻). Los melanosomas múltiples dentro de un lisosoma secundario (un melanosoma compuesto) son evidencia de la digestión de melanosomas sometidos a exocitosis y se encuentran a menudo dentro de macrófagos o fibroblastos. c) Los lisosomas son marcadores de macrófagos pero muchos tumores (“tumores de células granulares”) pueden mostrar lisosomas secundarios abundantes. Esta figura delinea lisosomas secundarios en un tumor estrómico gastrointestinal (36 000 ⫻). d) Gránulo de Birbeck en una granulomatosis de las células de Langerhans (69 000 ⫻).

APLICACIONES DE LA MICROSCOPIA ELECTRÓNICA DE TRANSMISIÓN

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Figura 5-4 Sistemas membranosos intracitoplásmicos 2. Adenoma negro de la corteza suprarrenal en un paciente con síndrome de Cushing. El fenotipo esteroidogénico consiste en lípido (a), retículo endoplásmico liso (* en b) y mitocondria con crestas tubulares (véase la mitocondria gigante en b), y se encuentra sobre todo en las células de Leydig, células hiliares y tumores adrenocorticales. La lipofuscina es también común en estos tumores y a ella se atribuye la pigmentación en este tumor. Nótense también los apilados cortos del retículo endoplásmico rugoso (a, 10 000 ⫻; b, 30 000 ⫻).

cánceres neuronales, gliales o ependimarios por ME es importante para el neuropatólogo, puesto que la inmunohistoquímica tiene un valor limitado para discriminar entre estos tumores (Cameron y Toner, 1998; Al-Sarraj et al., 2001). Por último, no debe subestimarse el valor de la ME en la confirmación simple de un diagnóstico sospechoso. Diagnosticar una lesión no es una edición en blanco y negro: los patólogos efectúan diagnósticos con cierto grado de seguridad y éstos pueden incrementarse por hallazgos ultraestructurales. Enfermedad no neoplásica En la actualidad, la ME aplicada a la enfermedad no neoplásica está quizás en una posición más segura que la ME aplicada a los tumores, ya que en la patología oncológica las técnicas inmunohistoquímicas y moleculares se apropiaron del territorio ultraestructural. Mientras que en el diagnóstico del tumor el objetivo primario es a menudo la determinación de la diferenciación celular de la masa, en la enfermedad no neoplásica hay muchas aplicaciones en las cuales se pueden identificar las múltiples formas del cambio estructural dentro de un solo organelo, célula o tejido (cilio, epitelio glomerular, célula del músculo estriado, ner-

vio periférico), que son indicativas de diversas afecciones. Por lo tanto, en esta área la ME puede tener un papel más crítico y quizás se dependa menos de la inmunohistoquímica y la biología molecular. Las figuras 5-6 a 5-9 incluyen ejemplos de la ME diagnóstica aplicada a la enfermedad no neoplásica. Puntos similares del procedimiento son válidos para examinar la enfermedad no neoplásica si el objetivo es confirmar la presencia de células afectadas y su calidad de conservación a partir de cortes semifinos, como en los tumores. No obstante, muchas enfermedades no neoplásicas se estudian a partir de líquidos y es preciso llevar a cabo una valoración de las células esperables en los cortes semifinos con base en el antecedente clínico. La ME tuvo por mucho tiempo un valor en la identificación de microorganismos. Entre los más significativos en clínica respecto de la incidencia numérica están los virus, los cuales se identifican por tradición mediante la técnica rápida y precisa de la tinción negativa (véase el cap. 18 para revisar más detalles). La ME puede reconocer otros agentes patógenos microscópicos o detalles de su estructura, entre ellos bacterias como las espiroquetas (fig. 5-7a), protozoarios como Cryptosporidium, microsporidios y Leishmania (en el sida) y hongos como Candida y Pneumocystis (fig. 5-7b).

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CAP. 5

MICROSCOPIA ELECTRÓNICA EN PATOLOGÍA

Figura 5-5 Características citoesqueléticas y superficiales. a) Las tonofibrillas son la contraparte ultraestructural de inmunotinción con citoqueratina que pueden ayudar a reconocer la diferenciación epitelial en los tumores. Las tonofibrillas se ponen a menudo en contacto con los desmosomas y promueven de tal modo la cohesión celular, una característica típica de los carcinomas. Carcinoma celular escamoso seudoangiosarcomatoso (31 900 ⫻). b) El desmosoma es la unión intercelular más importante para identificar la diferenciación epitelial. Tiene placas submembranosas, una “línea intermedia” en el espacio entre las membranas opuestas del plasma, y las tonofibrillas adhieren las placas al citoesqueleto perinuclear. Mesotelioma epitelial (99 000 ⫻). c) La lámina es una capa distintiva de células como el epitelio, el endotelio, las células de Schwann y las perineuriales, los adipocitos y las células del músculo. Carece de fibroblastos, miofibroblastos, condroblastos, osteoblastos y neuronas, y por tanto tiene importancia diagnóstica. En este schwannoma benigno, las capas múltiples de lámina rodean a los procesos de la célula (30 000 ⫻). d) Los miofilamentos del músculo liso con sus densidades focales distintivas son marcadores importantes de la diferenciación celular del músculo liso. También se reconocen en células mioepiteliales, pericitos, miofibroblastos y células intersticiales de Cajal, y sus tumores. Obsérvense los miofilamentos más finos (flecha) en contraste con los filamentos más gruesos de la citoqueratina que forman tonofibrillas en este carcinoma escamoso de células fusiformes (20 100 ⫻).

APLICACIONES DE LA MICROSCOPIA ELECTRÓNICA DE TRANSMISIÓN

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Figura 5-6 Microscopia electrónica de una enfermedad no neoplásica: patología tisular. a, b) Glomerulonefritis membranosa. a) Depósitos inmunitarios después de la microscopia de luz e inmunofluorescencia mediante un anticuerpo anti-IgG marcado con fluoresceína. b) Micrografía electrónica de transmisión correspondiente a tejido fijado en glutaraldehído que demuestra los depósitos inmunitarios subepiteliales (flechas) de una organización discreta que refleja la microscopia de luz. Nótese el engrosamiento de la membrana basal y la pérdida de las proyecciones de apoyo del podocito (25 000 ⫻). Fotografías cortesía del Dr. Alan Curry. c) Miopatía de bastones de nemalina en una mujer de 15 años. La presentación clínica incluyó retraso en la motricidad, deambulación sobre los dedos del pie, caídas frecuentes y dolores de pierna después del ejercicio. El bastón de nemalina es denso, demuestra las estriaciones transversales y se considera una anormalidad del disco Z. Los discos Z normales y los sarcómeros se muestran para fines de comparación (60 000 ⫻). Fotografía cortesía del Dr. Liz Curtis. d) Síndrome de discinesia ciliar primaria. Obsérvese la ausencia de brazos de dineína de los dobletes periféricos (160 000 ⫻). Fotografía cortesía de Ann Dewar.

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CAP. 5

MICROSCOPIA ELECTRÓNICA EN PATOLOGÍA

Figura 5-7 Microscopia electrónica de una enfermedad no neoplásica: microorganismos infecciosos. a) Espiroquetosis en una biopsia de intestino grueso (8 800 ⫻). b) Pneumocystis recuperado de la necropsia de tejido pulmonar. De forma inadvertida, este tejido se dejó toda la noche sin fijación. Por lo tanto, aunque su mayor parte se preservó mal (según se esperaba), los agentes patógenos aún son identificables por sus perfiles curvos distintivos. Aquí, el aspecto en un paciente inmunocomprometido con cáncer sugiere una infección oportunista (7 500 ⫻).

La distinción entre el diagnóstico, por un lado, y el desarrollo de la investigación tecnológica, por otro, es a veces imprecisa y la ME posee una función en tal desarrollo. Tiene utilidad, por ejemplo, en la determinación de la calidad de la conservación estructural de los ovocitos en la corteza del ovario extirpado y criopreservado in vitro en las mujeres jóvenes con cáncer durante la quimioterapia. El diagnóstico prenatal se puede realizar a partir de las células obtenidas del líquido amniótico (Cameron y Toner, 1998), al tiempo que existe un interés cada vez mayor en la caracterización ultraestructural de las células embrionarias en el campo emergente de la ingeniería tisular.

Técnicas y procedimientos especializados El cuadro 5-3 enumera las técnicas señaladas como “especializadas” y que no se utilizan de modo tan amplio en los laboratorios de diagnóstico como la MET, por lo cual tienen pocas aplicaciones diagnósticas reales. En muchos casos, las imágenes de estas técnicas confirman un diagnóstico bastante seguro que se basa sobre todo en resultados clínicos e histopatológicos; empero, muchas veces ofrecen nuevos detalles que pueden mejorar la comprensión

de la enfermedad. Son sin duda de un valor potencial en la investigación y debe recordarse que los hallazgos de la investigación son en ocasiones precursores de pruebas diagnósticas. Estas técnicas suelen encontrarse en laboratorios que efectúan también trabajos de investigación; en estos centros, la investigación genera experiencia con la técnica y se dispone de personal con entrenamiento y experiencia en la técnica para aplicar el procedimiento a casos diagnósticos raros (véase la sección de Lecturas adicionales). Microscopia electrónica de barrido (MEB) La MEB suministra información tridimensional, en particular de las características superficiales y, en consecuencia, las imágenes son a menudo más fáciles de interpretar (fig. 5-8a) en comparación con las de la MET, en las cuales es necesario extrapolar una interpretación a partir de cortes finos y es posible una interpretación difícil debido a la orientación subóptima. Por lo general, el tejido se fija como en la MET, pero al final de la fase de deshidratación el etanol se sustituye por dióxido de carbono líquido, casi siempre bajo presión en un secador de punto crítico. En el punto crítico, el líquido y el dióxido de carbono gaseoso forman

TÉCNICAS Y PROCEDIMIENTOS ESPECIALIZADOS

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Figura 5-8 Técnicas especiales 1. a) Microscopia electrónica de barrido. Eje del pelo humano. El paciente se valoró por cabello retorcido, afección en la cual el eje del cabello se tuerce y es frágil, pero el análisis de MEB indicó tricorrexis nudosa, con supuesto daño secundario al traumatismo mecánico o químico (830 ⫻). b) Microscopia inmunoelectrónica. MET de doble tinción de la región mesangial de un glomérulo de un individuo con nefropatía mesangial por IgA que demuestra doble inmunolocalización de colágena de tipo IV (10 nm de oro) dentro de la matriz e IgA mesangiales (20 nm de oro) dentro del depósito electrodenso (33 000 ⫻). Micrografías cortesía del Dr. Jill Moss y Ian Shore.

una serie continua, que permite el secado del espécimen de una manera que evita las distorsiones de la célula y la estructura del tejido que de otra manera se presentarían con el secado convencional. El espécimen seco se cubre entonces con una capa delgada del metal evaporado (oro, paladio, platino o cromo), que ayuda a eliminar la acumulación de la carga durante la exposición al haz electrónico. El tejido, fijado habitualmente a una base metálica (un trozo), se encuentra entonces listo para colocarse en el microscopio electrónico de barrido. En contraste con el haz incidente en la MET, el haz electrónico en la MEB se aplica al espécimen como rastreador. Esto da lugar a la emisión de electrones secundarios, que recolecta un detector de electrones y los convierte en una imagen observable en un tubo de rayos catódicos. Además del contorno y el detalle superficiales, los microscopios electrónicos de barrido ofrecen la ventaja de suministrar una ampliación más baja (10 o 100 veces) comparada con las técnicas tradicionales disponibles para la MET y por tanto se pueden utilizar para los especímenes patológicos completos.

Las aplicaciones diagnósticas de la MEB son limitadas. Incluyen la valoración del cabello humano (fig. 5-8a) y la identificación de las partículas respiratorias, en especial las fibras de asbesto, que se pueden también estudiar por microanálisis con rayos X para identificar la composición química o elemental. Los resultados pueden tener relevancia legal respecto de la exposición industrial (Ingram et al., 1989). La capacidad exigida para distinguir las células B y T y el mesotelioma y el adenocarcinoma a partir de la morfología diferenciada de la superficie celular no se ha explotado de manera extensa en la práctica de rutina. En el cuadro 5-4 se dan algunos de los múltiples ejemplos de la MEB aplicada a las células y tejidos humanos que han contribuido con datos para la comprensión de la enfermedad sin conducir a la creación de pruebas diagnósticas. Microscopia inmunoelectrónica La microscopia inmunoelectrónica (inmunomarcación ultraestructural) proporciona de manera simultánea los datos

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CAP. 5

MICROSCOPIA ELECTRÓNICA EN PATOLOGÍA

Figura 5-9 Técnicas especiales 2. Histoquímica ultraestructural. a) Procedimiento de uranafina para los gránulos neuroendocrinos en un carcinoma mucoide de mama (25 700 ⫻). b) La tinción de Grimelius para ME distingue los gránulos neuroendocrinos de los gránulos de secreción láctica en un carcinoma anficrino de mama (39 600 ⫻). c) Tinción de Warthin-Starry modificada para que la ME demuestre la melanina en un melanoma maligno (45 000 ⫻). d) Plaquetas enteras, desmontadas y sin teñir en una rejilla revestida con Formvar. El paciente tenía una anomalía similar al síndrome de Hermansky-Pudlak secundario a una enfermedad mielodisplásica. Los gránulos (flechas) son ricos en calcio, que proporciona densidad electrónica inherente. La cuenta de los gránulos fue de 3.8 por plaqueta (valor normal, 5.3). Obsérvense los gránulos densos en una plaqueta y la ausencia en la plaqueta adyacente y un gránulo con “colas” (17 700 ⫻). Micrografías cortesía de Bart E. Wagner.

TÉCNICAS Y PROCEDIMIENTOS ESPECIALIZADOS

Cuadro 5-4

Aplicaciones de la MEB en material clínico humano

• Fibras de asbesto y otras partículas respiratorias • Distingue las células B y T a través de la morfología de la superficie celular • Microvellosidades mesoteliales y adenocarcinomatosas • Anormalidades de espermatozoides • Urotelio y carcinoma urotelial • Hiperplasia endometrial • Hiperplasia prostática benigna y cristales intraluminales en carcinoma prostático • Papilas renales/conductos de Bellini • Superficies esofágicas e intestinales • Giardia lamblia en la superficie duodenal • Espiroquetosis • Cryptosporidium • Enfermedad de Crohn • Apendicitis aguda • Tejidos y células sinoviales en artritis reumatoide y gota • Cristales de pirofosfato de calcio en cartílago y tejido del menisco • Mitocondria en oncocitos • Superficies de la célula leucémica (célula del cabello)

Cuadro 5-5

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morfológicos de la MET convencional y la información sobre la composición biomolecular, como en la inmunohistoquímica microscópica de luz. Los datos de la microscopia inmunoelectrónica, como los de la MEB, son casi siempre confirmatorios o se suman a la comprensión científica de un padecimiento clínico; empero, el potencial de la técnica para confirmar un diagnóstico, al eliminar incertidumbre de interpretación y acentuar la probabilidad de un diagnóstico, es muy grande. Pero, en la práctica, los requerimientos de personal y financiamiento para la ME comprometen el uso de la microscopia inmunoelectrónica diagnóstica, que también exige más atención para su práctica. La gama de proteínas identificables en material clínico con la microscopia inmunoelectrónica se resume en el cuadro 5-5. Una de las formas más simples de microscopia inmunoelectrónica se observa al desparafinar y procesar una muestra teñida por medios de microscopia inmunohistoquímica a partir de un portaobjetos de cristal. Esto representa un desafío técnico y tiende a ofrecer una preservación estructural mala. Algunas veces también, al identificar la inmunotinción, que es densa en electrones como resultado de la exposición al tetraóxido de osmio, puede ser menos que clara. Las mejores técnicas utilizan un anticuerpo específico marcado con partículas de oro coloidal. Las partículas

Aplicaciones de la microscopia inmunoelectrónica en anormalidades clínicas y patológicas

• Contenido hormonal en los gránulos neuroendocrinos en los tumores • Depósitos de inmunoglobulinas y complemento en las células plasmáticas, linfoma, enfermedad renal y queratopatía cristaloide; amiloide en plasmacitoma • Proteínas citoesqueléticas (actina del músculo liso, actinina alfa, citoqueratina, vimentina, desmina y neurofilamento proteínico) en células no neoplásicas y tumorales • Fibronectina en la superficie de los miofibroblastos • Laminina y colágena tipo IV en membranas basales • Moléculas de adhesión intercelular (p. ej., ICAM-1, CD44) en células reactivas y neoplásicas • Moléculas de superficie celular (CD4, CD8, CD56) en enfermedad de injerto contra huésped aguda • El vasopresor y la proteína vasoconstrictora, endotelina 1, en glándula suprarrenal • La diferenciación del antígeno, receptor de la urocinasa, en neutrófilos • La proteína antiapoptósica, BCL2, en tumores tiroideos • Factor de von Willebrand en cuerpos de Weibel-Palade en el endotelio • Lisozimas y mucinas en lesiones epiteliales glandulares • Lactoferrina y lisozima en leucemia mielomonocítica • Mieloperoxidasa en leucemia mieloide • Proteína cristalina de Charcot-Leyden (lisofosfolipasa) en basófilos • Catepsina D en lisosomas en las células vasculares del músculo liso en anastomosis arteriovenosas • Sintasa del óxido nítrico en la vesícula seminal humana • Rotavirus en extractos fecales humanos

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CAP. 5

MICROSCOPIA ELECTRÓNICA EN PATOLOGÍA

de oro son en su mayor parte de 5, 10 o 20 nm de diámetro y, una vez localizadas en los cortes del tejido, se identifican con facilidad en la pantalla del microscopio electrónico por su contorno agudo, que también facilita el enfoque y la fotografía (fig. 5-8b). Es preciso tener precaución al aprovecharla para mejorar la conservación del antígeno. Las proteínas varían en grado considerable en la conservación de su inmunorreactividad y, por lo tanto, en el grado al cual pueden demostrarse por microscopia inmunoelectrónica. El tejido que acaba de obtenerse ha de fijarse en una solución de reciente preparación de paraformaldehído. Aunque el tejido pueda recuperarse del espécimen histológico principal, muchos antígenos sobreviven en la formalina histológica. Los fijadores de metal pesado no se usan para evitar la desnaturalización adicional de la proteína, y a menudo la deshidratación no se lleva a cabo con un etanol de más de 70% antes de la impregnación en una resina hidrófila como LR White®. Luego, la muestra se somete a una polimerización térmica mínima antes de la sección de los cortes ultrafinos y la aplicación de los reactivos apropiados que soportan el oro. Lowicryl® es una resina hidrófila alternativa de cierta demanda que proporciona conservación ultraestructural superior; este agente, dado que es una resina hidrófila a baja temperatura, conserva mejor al antígeno. La forma más exigente de la microscopia inmunoelectrónica utiliza los cortes ultrafinos congelados (crioultramicrotomía). La microscopia inmunoelectrónica se puede también realizar en cortes ultrafinos a partir de tejido impregnado en resina epóxica procesado de modo convencional para MET, a menudo con el uso de reactivos que develen la resina y expongan sitios antigénicos. Histoquímica ultraestructural La histoquímica ultraestructural (histoquímica electrónica) es análoga a la histoquímica de la microscopia de luz típica, pero proporciona información sobre la naturaleza química o bioquímica de células y tejidos en el plano ultraestructural. Para ello, las técnicas requieren un marcador electrodenso, las más de las veces un compuesto que contiene los átomos del metal que dispersa a los electrones. Se ha identificado una amplia gama de sustancias en las células y los tejidos, incluidas las enzimas, mediante histoquímica ultraestructural (cuadro 5-6). Como en la microscopia inmunoelectrónica, los estudios publicados que identifican estas sustancias se sitúan en el campo de la investigación, en vez de tener un valor real en la histopatología diagnóstica. Sin embargo, como en el caso de la microscopia inmunoelectrónica, los individuos o los laboratorios con intereses, experiencia o líneas de investigación tal vez encuentren aplicaciones diagnósticas para estas técnicas.

Cuadro 5-6 Histoquímica ultraestructural: aplicaciones en material clínico • Reacción de uranafina (acetato de uranilo) para gránulos neuroendocrinos • Acetato de uranilo modificado-citrato de plomo para la tinción selectiva de ácidos nucleicos • Tinción de Grimelius (tinción con plata) para gránulos neuroendocrinos • Técnica de Warthin-Starry para la melanina • Reacción L-DOPA modificada para ME y tirosinasa y melanosomas • Peroxidasa plaquetaria en el diagnóstico diferencial de leucemias • Ácido fosfotúngstico etanólico para sinapsis • Procedimiento de ferrocianuro de osmio-potasio para glucógeno • Imidazol-tetraóxido de osmio amortiguado para lípidos • Fosfatasa ácida para lisosomas (p. ej., en linfocitos granulares grandes) • Rojo de rutenio, azul cuprolínico, metenamina de plata, diamina de hierro para porciones de polisacáridos

La práctica de las técnicas varía en grado considerable, según sea la sustancia que se revela. Para las enzimas, como la peroxidasa plaquetaria, pueden requerirse fijadores especializados (p. ej., uno que contenga ácido tánico, formaldehído y una concentración baja de glutaraldehído). Para el glucógeno, el fijador tetraóxido de osmio se puede modificar con la adición de ferrocianuro de potasio, mientras que para los lípidos, que se pierden durante el procesamiento de MET típico, puede emplearse una solución de imidazol-tetraóxido de osmio amortiguada. Por el contrario, en la reacción de uranafina para los gránulos neuroendocrinos (fig. 5-9a) es preferible el glutaraldehído a la formalina histológica, puesto que las moléculas pueden perderse del tejido recuperado a partir de la formalina, lo que genera una reacción débil. El procedimiento con uranafina es una tinción útil de la ME para los gránulos neuroendocrinos, dado que éstos muestran heterogeneidad ultraestructural y pueden algunas veces ser difíciles de distinguir de los lisosomas primarios, gránulos pequeños de secreción láctica y gránulos pequeños serosos. La técnica se basa en la hipótesis según la cual el centro granular neuroendocrino consiste en un complejo de hormonas, proteínas y nucleótidos (Payne, 1993). Las cargas negativas de los últimos se unen a los iones uranilo de carga positiva para proporcionar electrodensidad. Todo el fosfato libre debe eliminarse después de la fijación con aldehído, antes que el tejido pase a la solución concentrada de acetato de uranilo (hasta por dos días) y no debe usarse ninguna otra tinción que confiera electrodensidad. Los

RECONOCIMIENTOS

ribosomas y la cromatina nuclear, en virtud de su contenido de nucleótidos, pueden actuar como controles internos positivos. Las técnicas de tinción con plata en el plano ultraestructural están también disponibles para gránulos neuroendocrinos y melanina (fig. 5-9b, c).

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En la técnica de fractura y delineado por congelación, el tejido se congela con rapidez y después se fractura por impacto con un borde agudo dentro de un instrumento específicamente diseñado y disponible en el comercio. La fractura plana pasa a través de sistemas membranosos y proporciona una superficie para la observación posterior del sombreado metálico. El sombreado puede retardarse después del delineado, para revelar áreas más grandes de superficies reales de la membrana además de superficies membranosas hendidas. No existen aplicaciones diagnósticas reales, pero la técnica se aplica a células y tejidos humanos para suministrar nueva información sobre la organización de la membrana celular, por ejemplo exocitosis de los gránulos neuroendocrinos de las células y espacios alterados y uniones estrechas en los tumores oncocíticos de la tiroides humana (Cochand-Priollet et al., 1998).

tico de rutina en el campo de la patología. Se han delineado algunos principios de la teoría científica de estas técnicas ultraestructurales prácticas para facilitar la interpretación de las imágenes micrográficas electrónicas. A pesar del desarrollo continuo de nuevas técnicas, sobre todo en la inmunohistoquímica y la biología molecular, el microscopio electrónico aún es valioso en el diagnóstico de lesiones problemáticas en la investigación clínica o la microscopia de luz. Es una cuestión de experiencia directa de quienes practican la microscopia electrónica que las lesiones se encuentren todavía donde los hallazgos clínicos e inmunohistoquímicos son contradictorios o inútiles, al grado de establecer un diagnóstico impreciso: esto se puede, en algunas circunstancias, modificar por microscopia electrónica, incluso a pesar de la propia limitación del muestreo de la técnica. En el campo del diagnóstico tumoral, algunas de estas dificultades se deben a las limitaciones de la inmunohistoquímica, en la que hoy día confía el patólogo tumoral; es una técnica que, a diferencia de la microscopia electrónica, todavía no alcanza la etapa de estabilidad tecnológica. En el campo más grande de las anomalías no neoplásicas —enfermedad renal y neuromuscular, microorganismos infecciosos, enfermedades ciliares, dermatopatología, para mencionar quizás las principales— la microscopia electrónica ejerce una influencia más notoria dado que es menos dependiente de la inmunohistoquímica; en este caso, la microscopia electrónica puede identificar una multiplicidad de cambios estructurales dentro de una célula o tejido que se pueden relacionar con diversas enfermedades. En gran medida, la mayoría de las aplicaciones morfológicas tiene lugar en la microscopia electrónica de transmisión. Sin embargo, aunque existen diversas técnicas especializadas que han contribuido a mejorar la comprensión de la biología estructural de la célula, tejidos y lesiones humanas, se conocen pocas aplicaciones reales al diagnóstico. Por último, la microscopia electrónica es una técnica esencial para el análisis diagnóstico de las lesiones humanas. En este contexto, es necesario enfatizar que mientras el análisis de la expresión del gen es fundamental para comprender la enfermedad, dicha comprensión sólo será completa si se acepta que las afecciones observadas en los cortes con H-E o los ultrafinos resultan no sólo de la expresión del gen, sino también de actividades posgenómicas: estas actividades pueden constatarse de modo más efectivo con las técnicas fenotípicas, como la demostración inmunohistoquímica de proteínas funcionales y su elaboración dentro de las estructuras funcionales de la célula por microscopia electrónica.

Resumen

Reconocimientos

Este capítulo tiene como objetivo transmitir una perspectiva contemporánea de la microscopia electrónica en el diagnós-

En la preparación de este capítulo merecen un reconocimiento especial los colegas siguientes por su inestimable

Microanálisis con rayos X y difracción electrónica Una de las interacciones de los electrones con átomos de un espécimen físico conduce a una reconfiguración de los niveles energéticos en las órbitas del electrón alrededor de los átomos, con la consecuente emisión de rayos X. Éstos son característicos del número atómico y por tanto establecen la naturaleza química elemental del material bajo investigación. Una variedad de elementos con importancia clínica se puede identificar mediante esta técnica; los más importantes son las partículas respiratorias, incluidas las diversas formas de la fibra de asbesto (Ingram et al, 1989; Cameron y Toner, 1998). Con frecuencia puede ser necesario digerir el tejido para liberar las fibras para el análisis. La técnica de difracción electrónica puede ser útil para demostrar una periodicidad y por consiguiente la naturaleza cristalina dentro de un objeto expuesto a electrones, como un resultado en el cual se observan los patrones de difracción, que consisten en puntos de alta intensidad dispuestos con precisión en el espacio. Esta información puede discriminar sustancias de composición química diferente. Fractura y delineado por congelación

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CAP. 5

MICROSCOPIA ELECTRÓNICA EN PATOLOGÍA

colaboración: Dr. Alan Curry (Manchester Royal Infirmary), Dr. Liz Curtis (Queen Elizabeth Hospital, Birmingham), Ann Dewar (Royal Brompton Hospital, Londres), Dr. Jill Moss y Ian Shore (Charing Cross Hospital, Londres), y Bart E. Wagner (Northern General Hospital, Sheffield), por proporcionar los micrógrafos electrónicos; y Paul Chantry y Elizabeth White (ambos del Christie Hospital) por trazar la figura 5-1 y la recopilación bibliográfica de investigación y la impresión fotográfica, respectivamente. Asimismo, estamos en deuda con el Dr. Jill Moss, Dr. Alan Curry y el profesor Peter Toner por los comentarios valiosos sobre el manuscrito y nuestro reconocimiento a la importancia del capítulo original del Dr. Stuart Cameron y el profesor Peter Toner como el punto de partida para este trabajo.

Bibliografía Al-Sarraj S, King A, Martin AJ et al. Ultrastructural examination is essential for the diagnosis of papillary meningioma. Histopathology 2001; 38: 318-324. Cameron CHS, Toner P. Electron microscopy in pathology. In The Science of Laboratory Diagnosis, Crocker J, Burnett D (eds). 1998: Isis Medical Media, Oxford, 45-66. Cochand-Priollet B, Raison D, Molinie V et al., Altered gap and tight junctions in human thyroid oncocytic tumors: a study of 8 cases by freeze-fracture. Ultrastruct Pathol 1992; 22: 413420. Dar AUH, Hird PM, Wagner BE, Underwood JCE. Relative usefulness of electron microscopy and immunohistochemistry in tumour diagnosis: 10 years of retrospective analysis. J Clin Pathol 1992; 45: 693-696. Eyden B. Electron microscopy in tumour diagnosis: continuing to complement other diagnostic techniques (part of “Expert Opinion” Feature: Electron microscopy for tumour diagnosis: is it redundant?). Histopathology 1999; 35: 102-108. Eyden B. Electron microscopy in the diagnosis of tumours. Curr Diagn Pathol. 2002; 8: 216-224. Hashimoto K. Diagnostic electron microscopy in dermatology. Dermatol Clin 1994; 12: 143-159. Kandel R, Bedard Y, Fan Q-H. Value of electron microscopy and immunohistochemistry in the diagnosis of soft tissue tumors. Ultrastruct Pathol 1998; 22: 141-146. Lloreta-Trull J, Ferrer L, Ribalta T et al. Electron microscopy in pathology articles: a retrospective appraisal. Ultrastruct Pathol 2000; 24: 105-108. Mierau G. Electron microscopy for tumour diagnosis: not redundant—resurgent! (Part of “Expert Opinion” feature: Electron microscopy for tumour diagnosis: is it redundant?). Histopathology 1993; 35: 99-102. Payne CM. Use of the uranaffin reaction in the identification of neuroendocrine granules. Ultrastruct Pathol 1993; 17: 49-82. Pearson JM, McWilliam LJ, Coyne JD, Curry A. Value of electron microscopy of renal disease. J Clin Pathol 1994; 47: 126-128. Tucker JA. The continuing value of electron microscopy in surgical pathology. Ultrastruct Pathol 2000; 24, 383-389.

Lecturas adicionales Dickersin GR. Diagnostic Electron Microscopy. A Text/Atlas, 2nd edn. 2000: Springer Verlag, Heidelberg. Erlandson RA. Diagnostic Transmission Electron Microscopy of Human Tumors, 1994: Raven, New York. Eyden B. Organelles in Tumor Diagnosis: an Ultrastructural Atlas. 1996: Igaku-Shoin, New York and Tokyo. Ghadially FN. Ultrastructural pathology of the cell and matrix, 4th edn. 1997: Butterworth-Heinemann, Boston, MA. Griffiths G. Fine Structure Immunocytochemistry. 1993: Springer-Verlag, Berlin. Ingram P, Shelburne JD, Roggli VI. Microprobe Analysis in Medicine. Ultrastructural Pathology Publication Series. 1989: Hemisphere, New York. King R. Atlas of Peripheral Nerve Pathology 1999: Arnold, London. Lewis PR, Knight DP. Cytochemical Staining Methods for Electron Microscopy. Elsevier Science, Amsterdam. Maunsbach AB, Afzelius BA. Biomedical Electron Microscopy. Illustrated Methods and Interpretations. 1999: Academic Press, San Diego, CA. Papadimitriou JM, Henderson DW, Spagnolo DV. Diagnostic Ultrastructure of Non-neoplastic Diseases 1992: Churchill-Livingstone, London. Polak JM, Priestly JV. Electron Microscopic Immunocytochemistry. Principles and Practice. 1992: Oxford University Press, Oxford. Schröder JM. Pathology of Peripheral Nerves. 2001: SpringerVerlag, Heidelberg. Society of Ultrastructural Pathology Handbook Committee. Handbook of Diagnostic Electron Microscopy for Pathologists-intraining. 1996: Igaku-Shoin Medical Publishers, New York and Tokyo, in conjuction with the Society for Ultrastructural Pathology.

Artículos especiales de revistas dedicados a la microscopia electrónica • Curr Diagn Pathol 2002; 8(4): contiene un minisimposio sobre microscopia electrónica de diagnóstico. • Semin Diagn Pathol 2002; 20(1): se dedica a la microscopia electrónica de tumores. • Hum Pathol 1998; 29(12): contiene un simposio de la microscopia electrónica sobre tumores. • Ultrastruct Pathol 1992; 16: contiene los artículos sobre técnicas de ME especializadas, incluidas la microscopia inmunoelectrónica, hibridación in situ ultraestructural, técnica “pop-off” y morfometría ultraestructural.

Artículos sobre técnicas ultraestructurales especializadas Las técnicas y los procedimientos como los enumerados en el cuadro 5-3 se pueden encontrar en diarios especializados, como Ultrastruct Pathol, J Submicrosc Cytol Pathol y Med Electron Microsc.

6 Microscopia de luz Brian Boullier

Introducción El microscopio de luz apareció hace mucho tiempo, cuando Hans y Zacharias Janssen crearon el primer microscopio “compuesto”, en 1590. A diferencia de una simple lupa, el instrumento consistía en un tubo con una lente particular en cada extremo. Los científicos clínicos se beneficiaron de forma subsecuente con las mejoras radicales en el diseño, construcción y técnica del microscopio, en particular durante los últimos 100 años. El microscopio de luz compuesto es el caballo de batalla de todo laboratorio clínico y con él se observa la mayor parte de las muestras con la ayuda de la iluminación de campo brillante. Sin embargo, la disponibilidad cada vez mayor de herramientas diagnósticas, como los anticuerpos monoclonales marcados con fluorescencia, obliga al científico clínico a adquirir destreza con múltiples técnicas microscópicas en los años recientes. Este capítulo introduce los conceptos básicos del diseño del microscopio, explica de forma sinóptica los principios que subyacen a los procedimientos actuales más comunes del laboratorio clínico y discute varias áreas de aplicación. El lector puede consultar las referencias adicionales (Bradbury y Bracegirdle, 1998; Determan y Lerpusch, 1988; Lacey, 1999) para una descripción más extensa y una explicación más completa de cada técnica.

Diseño básico del microscopio El más simple, el microscopio compuesto, se conforma con dos sistemas de lentes, la lente objetivo, que forma una imagen real de la muestra, y la ocular, la cual crea una ima-

gen al infinito que puede observar el operador. La ampliación total es el producto de la magnificación de estos dos grupos de lentes. En la práctica, el microscopio típico de laboratorio contiene de forma adicional grupos de lentes, prismas y divisores de la imagen, lo cual puede o no afectar la ampliación total, pero en forma invariable mejora el funcionamiento óptico del instrumento o la conveniencia de operación, por ejemplo, al inclinar los oculares hacia el operador. El funcionamiento del microscopio se describe de modo más correcto en términos de poder de resolución (la capacidad del microscopio para distinguir dos puntos separados por una distancia diminuta). En el mejor de los casos, el ojo humano puede resolver sin ayuda dos puntos tan próximos como 150 µm uno del otro. El límite de la longitud de onda de la luz visible y la abertura numérica de las lentes del microscopio se combinan para precisar la resolución teórica máxima del microscopio de luz a 0.22 µm, al margen de la ampliación máxima. Casi todos los microscopios modernos son modulares en su construcción. Esto ofrece varios beneficios para el usuario, incluida la facilidad para ampliar las capacidades del microscopio y satisfacer demandas futuras. Lo más importante es tal vez que el presupuesto inicial incline la compra por la obtención de la más alta calidad óptica posible; después de todo, un microscopio completo es tan bueno como la calidad de sus sistemas de lentes. Las mejoras futuras pueden incluir fuentes alternativas de iluminación y sistemas ópticos accesorios o quizá la adición de una computadora personal, programas y cámara digital fija o de video (la integración de computadoras personales con los microscopios ópticos facilita la optimización automatizada de los ajustes del microscopio y la obtención de la

The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker. © 2005 John Wiley & Sons, Ltd.

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CAP. 6

MICROSCOPIA DE LUZ

Figura 6-1 Corte transversal de un microscopio típico de laboratorio (cortesía de Leica UK Ltd).

imagen conveniente, además del almacenamiento de datos y el análisis de imágenes de gran alcance). La figura 6-1 ilustra las partes principales del microscopio típico de laboratorio. Varias partes merecen explicación: las lentes objetivo, los oculares, el condensador, el diafragma de campo y la(s) fuente(s) de luz. Las lentes objetivo son la parte más importante del microscopio, dado que determinan las diversas ampliaciones posibles y definen la calidad óptica alcanzable. De manera característica, las lentes objetivo de 10, 40 y 100 ⫻ están sujetas a una torreta giratoria. Esto ofrece ampliaciones totales de 100, 400 y 1 000 ⫻, respectivamente, cuando se usan oculares de 10 ⫻. Las propiedades de cada lente objetivo están casi siempre inscritas sobre el cañón de la lente. Las marcas incluyen lo siguiente:

• • •

p. ej., Ph 2, que especifica la abertura del condensador de contraste de fase a usar).

•

“Plan”, que señala que la lente produce una imagen de “campo plano” en la cual todo se enfoca a través del campo entero de visión.

•

“Apo”, es decir, que la lente es corregible para aberración cromática, lo que de otra manera produce franjas de color visible alrededor de los puntos finos en la imagen.

•

Ampliación de la lente y abertura numérica (en esencia el poder de recolección de luz de la lente), como “40 ⫻/0.85”.

•

Longitud del tubo (que es la distancia efectiva entre el ocular y el objetivo, casi siempre de 160 mm) y grosor requerido del cubreobjetos (en mm), como “160/0.17”.

“Floutar”, “Fluor”, “Neofluar” o “UV”, lo cual significa que la lente transmite luz ultravioleta y por lo tanto es conveniente para la microscopia de fluorescencia.

•

“Oel”, “Imm” u “Oil”, esto es, que la lente está diseñada para el uso con aceite de inmersión entre el elemento final de la lente y el cubreobjetos.

“Phaco”, “Phase” o “Ph”, que indica la presencia de un anillo de fase y que la lente es conveniente para la microscopia de contraste de fase (un número lo acompaña,

•

“CDI”, que significa que la lente está diseñada de manera específica para “contraste diferencial de interferencia” de Nomarski.

Nombre del fabricante.

TIPOS DE MICROSCOPIA

Los oculares amplían además la imagen producida por las lentes objetivo, por lo regular por un factor de 10⫻. La imagen que producen se enfoca en el infinito, lo que permite al operador verla como si estuviera en la distancia. Los oculares son útiles para los usuarios de anteojos debido a que se diseñan para permitir que la imagen completa se observe desde varios centímetros arriba del ocular. El condensador es una parte importante del sistema de iluminación. Cuando se ajusta de forma correcta, enfoca un cono uniforme de luz sobre la muestra (en ampliaciones bajas, una lente “desplazable” situada por encima del condensador puede removerse respecto de la trayectoria de la luz para asegurar que el campo de visión esté iluminado). El ajuste correcto del diafragma del condensador asegura un equilibrio óptimo de la resolución de la imagen, el contraste y la profundidad del campo. El diafragma del campo se centra y su abertura se ajusta para que sólo la región observada de la muestra se ilumine. Esto minimiza la dispersión de luz innecesaria, que se produce dentro de las regiones exteriores inadvertidas de la muestra. La fuente de luz utilizada en los microscopios modernos del laboratorio es un bulbo de tungsteno/halógeno de bajo voltaje; éste proporciona iluminación intensa y estable en el espectro visible. El bulbo puede alojarse dentro del cuerpo del microscopio o en un bastidor externo. Por lo general, la microscopia de fluorescencia explota las características espectrales más adecuadas de la lámpara de arco de mercurio de alta presión, que se emite con intensidad en la región ultravioleta (UV) del espectro. Los láseres proporcionan una fuente de luz monocromática de alta intensidad, que en condiciones ideales satisface a la microscopia confocal, así como también a varias técnicas de investigación como el fotoblanqueamiento y la fluorescencia de reflexión interna total.

Tipos de microscopia La iluminación de campo brillante es aún la forma más empleada de la microscopia en el laboratorio clínico. Otros métodos, incluidas las microscopias fluorescente y la de contraste de fase y, cada vez más, las microscopias de campo oscuro, luz polarizada y de Nomarski, tienen diversas aplicaciones en el diagnóstico de laboratorio. Sin embargo, el costo y la relativa complejidad del microscopio confocal han restringido mucho su uso para aplicaciones de investigación. Cada uno de estos tipos de microscopia se comenta a continuación. Como su nombre lo señala, la iluminación de campo brillante presenta al observador una imagen del conjunto de la muestra contra un fondo brillante. Para trabajar de manera eficiente, la muestra debe absorber suficiente luz para producir un grado aceptable de contraste. Las tinciones se

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emplean de manera habitual para incrementar el contraste de la muestra y revelan además detalles estructurales. La iluminación de Köhler, que introdujo de forma inicial en el siglo pasado August Köhler, se ha convertido en la forma universal utilizada de iluminación de campo brillante debido a la calidad de la imagen producida. No obstante, la calidad de la imagen óptima requiere el reajuste regular del microscopio. Infortunadamente, muchos instrumentos no se utilizan a su máxima capacidad debido a que se soslaya la necesidad de reajustar el microscopio al cambiar las lentes objetivo y se desconoce en general la técnica requerida. En la iluminación de Köhler, dos conjuntos de rayos de luz contribuyen a la imagen final, uno de ellos llamado “rayos iluminadores” y el otro “rayos formadores de la imagen”. Ambos se derivan del filamento de la lámpara incandescente (en la práctica, un filtro de vidrio molido se fija frente al filamento de la lámpara para proporcionar una fuente más uniforme de los rayos iluminadores). La figura 6-2 ilustra las trayectorias separadas seguidas por los rayos iluminadores y los rayos formadores de la imagen en un microscopio dispuesto de modo correcto para la iluminación de Köhler. Más notable aún es lo siguiente: 1. Los rayos que iluminan son paralelos al plano de la muestra para proporcionar la amplia área de iluminación requerida. 2. Los rayos iluminadores se enfocan con precisión sobre el cristalino antes de divergir para proporcionar una gran área de iluminación sobre la retina. 3. Los rayos formadores de la imagen convergen sobre el plano de la muestra y crean una imagen magnificada pero invertida de la muestra en el plano de la imagen primaria debajo del ocular. 4. Las lentes oculares invierten de nueva cuenta los rayos formadores de la imagen de la muestra antes de que entren al ojo y se enfocan sobre la retina para producir una imagen de la muestra. De esta manera, la iluminación de Köhler proporciona un gran campo de visión iluminado de modo uniforme sobre la retina del observador, junto con una imagen enfocada y ampliada de la muestra. La microscopia de fluorescencia aprovecha la propiedad de las moléculas llamadas fluorocromos para emitir luz de una longitud de onda particular cuando se excitan por luz incidental de longitud de onda más corta. Estos fluorocromos pueden ser naturales de la muestra bajo estudio, pero por lo regular la muestra se trata de manera directa o indirecta con colorantes fluorescentes. Por ejemplo, el 4’6-diamidino-2-fenilindol específico de DNA (DAPI)

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MICROSCOPIA DE LUZ

Figura 6-2 Montaje de los componentes del microscopio para la iluminación de Köhler: a) trayectorias de los rayos formadores de imagen; b) trayectorias de los rayos de iluminación.

puede usarse de forma directa para revelar la presencia extracelular del micoplasma que contiene DNA, el que contamina con frecuencia los cultivos celulares. Los componentes celulares, por ejemplo el citoesqueleto, pueden teñirse de manera indirecta mediante sondas muy específicas creadas por la conjugación de fluorocromos, como el isocianato de fluoresceína con anticuerpos monoclonales. La microscopia de fluorescencia requiere una modernización relativamente simple del microscopio de luz convencional. Las lámparas de arco de mercurio de alta presión suelen utilizarse para proporcionar iluminación intensa en la región ultravioleta (UV) del espectro, lo cual excita la fluorescencia en muchos fluorocromos importantes. El uso de UV también exige el empleo de lentes objetivo especiales capaces de transmitir la UV. Esto se debe a que en la configuración típica del microscopio de fluorescencia, las lentes objetivo también sirven para enfocar los rayos de iluminación sobre la muestra. Dado que los rayos de iluminación pasan a través del objetivo e inciden sobre la muestra (más que transmitirse a través de éste desde abajo), esta técnica se conoce como epiiluminación. Debe utilizarse una combinación apropiada del filtro de excitación, el divisor del haz cromático y el filtro de barrera para cada uno de los fluorocromos en uso (fig. 6-3). El filtro de excitación está situado enfrente de la lámpara de mercurio y se selecciona para permitir la transmisión de un espectro estrecho de longitudes de onda de la luz, incluida la longitud de onda necesaria para excitar la fluorescencia. El divisor de haz monocromático debe reflejar las longitudes de onda excitatorias de la luz sobre la muestra y detener la luz incidente reflejada que alcanzaría los oculares.

Figura 6-3 Trayectoria de la luz en un microscopio epifluorescente.

Como su nombre lo sugiere, el filtro de barrera asegura que sólo la luz emitida por el fluorocromo alcance los oculares (la luz UV puede dañar los ojos y la piel desprotegida).

TIPOS DE MICROSCOPIA

La microscopia de contraste de fase permite el estudio de muestras biológicas sin teñir con contraste inherente pequeño (incluidas muestras vivas). La técnica explota las diferencias de fase que se presentan entre la luz que pasa a través de una muestra biológica y la luz que pasa de forma ininterrumpida a través del medio circundante (en los materiales biológicos esta diferencia es cercana a 1/4λ). El microscopio de contraste de fase requiere un condensador especial con una serie de aberturas anulares en su plano focal delantero y lentes objetivo alineadas con los anillos de fase en su plano focal posterior (fig. 6-4). Estas disposiciones introducen otro desplazamiento relativo de fase de 1/4λ a la luz ya difractada a través de la muestra y el resultado es un total de 1/2λ de retraso de fase en relación con la luz de fondo. La interferencia destructiva producida da lugar a que los detalles refractivos en la muestra aparezcan más oscuros que el fondo, un efecto conocido como “contraste de fase positivo”. Por el contrario, el “contraste de fase negativo”, en el cual los detalles de la muestra aparecen más brillantes que el fondo, surge cuando se produce interferencia constructiva al retardarse la luz de fondo por 1/4λ. Los microscopios de contraste de fase son excelentes para observar muestras vivas con la mínima distorsión, incluidas las células animales cultivadas en contenedores estériles y cerrados y la motilidad del espermatozoide en cajas de Petri. La microscopia de campo oscuro revela detalles estructurales como objetos brillantes sobre un fondo oscuro. Se usa un condensador especial para proporcionar iluminación oblicua que, si la muestra no la altera, no puede entrar a las lentes objetivo. Sólo aquellas partes de la muestra que desvían la luz hacia la lente objetivo presentan una imagen a los oculares. Dos tipos de condensador facilitan la

Figura 6-4 Trayectoria de la luz en la microscopia de contraste de fases.

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Figura 6-5 Trayectoria de la luz en la microscopia de campo oscuro.

iluminación de campo oscuro. Una simple “pieza de detención” puede usarse para oscurecer la porción central de la iluminación que proporciona un condensador convencional y que deja sólo que los rayos oblicuos incidan sobre la muestra (fig. 6-5). Los “condensadores de espejo” especiales proporcionan la mejor calidad de imagen, pero sólo son apropiados para la iluminación de campo oscuro. La microscopia de campo oscuro no proporciona una imagen por completo representativa de la muestra (muchas estructuras intracelulares pueden no ser evidentes). Sin embargo, el método es útil para revelar detalles adicionales de estructuras de borde fino que son difíciles de observar con la iluminación de campo brillante debido a su carencia de contraste. Además, puesto que la tinción es innecesaria (como con la microscopia de contraste de fase y de Nomarski), este método de iluminación es útil para observar muestras vivas, los espermatozoides y protozoos flagelados ofrecen imágenes fascinantes cuando se observan de esta manera. La microscopia de luz polarizada representa otra modificación del microscopio de luz convencional. La luz que emana desde una fuente de luz puede ser el reflejo de las numerosas ondas sinusoides que oscilan en alguno de los planos de número infinito alrededor de un eje central; en otras palabras, no está polarizada. El microscopio de polarización incluye dos filtros polarizantes: primero, el “polarizador”, que por lo general puede rotarse, se localiza entre la lámpara y el condensador y además proporciona rayos de iluminación a la muestra que oscilan en un solo plano, y, segundo, el “analizador”, que suele estar fijo, y se halla entre la lente objetivo y el ocular. Si se asume que la muestra no está en la trayectoria de la luz, entonces hay una sola posición del polarizador donde coinciden los planos transmitidos y la imagen aparece mucho más brillante. En cambio, a 90° de esta orientación los dos planos transmitidos se cruzan y el resultado es la extinción de la luz que alcanza los oculares. El microscopio polarizante explota la característica “birefringente” de las muestras para dividir la luz polarizada

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MICROSCOPIA DE LUZ

incidente en dos componentes, que oscilan en planos paralelos respecto de las dos direcciones del índice refractivo. Los dos componentes se retardan de forma distinta dentro de la muestra, lo que introduce una diferencia de fase. Puesto que estos componentes no comparten el mismo plano no conducen a la interferencia. Sin embargo, al alcanzar el analizador, sólo los componentes paralelos al analizador se transmiten, y dado que comparten entonces el mismo plano, pueden interferir. Rotar el portaobjetos de la muestra permite que la cantidad de interferencia constructiva se modifique, con el cambio consiguiente de la luminosidad de las estructuras birrefringentes bajo observación. Los objetos de birrefringencia conocidos, llamados “compensadores”, incluidos el cuarzo y el filtro “placa roja de primer orden”, se pueden insertar en la trayectoria de la luz y usarse para calcular las características birrefringentes de estructuras desconocidas, lo que contribuye a su identificación. El microscopio de polarización se beneficia también del uso de las lentes objetivo especializadas “libres de tensión”, que minimizan la cantidad de birrefringencia introducida por el propio sistema óptico. La microscopia polarizante ha encontrado aplicación, por ejemplo, en la diferenciación entre el urato ácido de sodio y el de pirofosfato de calcio deshidratado del líquido sinovial; empero, casi siempre las aplicaciones de la microscopia polarizante en el diagnóstico de laboratorio son limitadas e infrecuentes. La microscopia de contraste diferencial de interferencia (CDI) de Nomarski representa una combinación de la microscopia de polarización y la de contraste de fases y es más adecuada para las muestras finas transparentes sin teñir. La aplicación acertada requiere un instrumento diseñado especialmente, que incluye los filtros cruzados del polarizador y analizador y dos divisores de haz del prisma de Wollaston. Junto con las diferencias de fase introducidas por los divisores del haz, el retardo adicional de luz impuesto por la muestra produce una imagen en la cual el fondo es gris, los bordes de la mano izquierda son brillantes, las áreas centrales son grises y los bordes de la mano derecha son oscuros. Esto da a los objetos en la trayectoria de la luz un aspecto casi tridimensional, con organelos como la mitocondria y los núcleos definidos con claridad. En condiciones ideales, la microscopia de CDI satisface el estudio de los organismos vivos. Asimismo, ha encontrado apoyo en el estudio de rutina de muestras húmedas como el sedimento urinario. La descripción de la técnica microscópica moderna no estaría completa sin al menos hacer una referencia breve a la microscopia confocal, la cual representa una modificación importante de la microscopia epifluorescente. La diferencia principal entre la microscopia confocal y los métodos ya explicados radica en que aquélla depende de la iluminación de punto más que de la iluminación de campo.

Figura 6-6 Trayectoria de la luz en un microscopio confocal que realiza el escrutinio con láser.

Esta última la proporciona un rayo láser enfocado, que se aplica a la muestra a una profundidad específica (fig. 6-6). La imagen que se produce es un compuesto generado por computadora formado por las intensidades que difieren de la luz emitida por las diferentes regiones de la muestra. En consecuencia, la calidad de la imagen depende al final de la sensibilidad de la luz y la resolución de la cámara electrónica, así como también de la calidad de los elementos ópticos del microscopio y el montaje del instrumento. La microscopia confocal puede proporcionar imágenes muy nítidas desprovistas de la imagen desenfocada relacionada con la observación convencional de fluorescencia y desde el interior de muestras relativamente gruesas ( 1.5 mm), con un porcentaje de supervivencia libre de enfermedad de 100, 70 y 40, respectivamente. Biopsia del hueso El análisis morfométrico puede suministrar datos en extremo valiosos para el diagnóstico de la enfermedad metabólica ósea. Las biopsias del hueso se toman de la cresta iliaca y el análisis se realiza con cortes sin descalcificar y microscopia con luz transmitida, polarizada cruzada y ultravioleta. Se pueden realizar y utilizar las mediciones del volumen trabecular y osteoide, superficies osteoides y mineralizadas y el grosor del osteoide para diagnosticar la osteoporosis y la osteomalacia (fig. 7-12). Son posibles mediante rejillas de punto/línea y procedimientos estereológicos. En la actualidad, el uso del análisis computarizado de imagen se ha convertido en un medio más atractivo para medir esas características. Biopsia muscular La valoración de las características de la fibra muscular en cortes longitudinales y transversales es central para el diagnóstico de los trastornos neuromusculares, incluidas las miopatías congénitas, metabólicas y destructivas y la distrofia muscular. La medición morfométrica del tamaño y el número de fibras del músculo se realiza sobre cortes transversales, teñidos de modo diferencial para el tipo de

Figura 7-11 Medida de Breslow para calcular la invasión del melanoma en la piel. Se muestra el ocular graduado (unidades principales en milímetros) sobrepuesto en la sección del tejido canceroso.

Figura 7-12 El cálculo cuantitativo del hueso, el osteoide y la médula en biopsias de hueso permite identificar el hueso normal (N), la osteomalacia (Om) y la osteoporosis (Op).

APLICACIONES DE LA MEDICIÓN EN LA PATOLOGÍA DIAGNÓSTICA

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Figura 7-13 Morfometría de la biopsia de músculo en la valoración de los trastornos neuromusculares. La imagen izquierda muestra una biopsia teñida con la reacción de la ATPasa para distinguir las fibras musculares tipos I y II. No sólo puede contarse el número de fibras, sino también se puede medir la superficie menor de la fibra muscular (derecha) para determinar la hipertrofia y la atrofia de la fibra.

fibra mediante la reacción de la APTasa de miosina (fig. 7-13). La atrofia y la hipertrofia de la fibra se determinan por la medición del tamaño de la fibra, que se toma por convención como el diámetro de la fibra muscular que cruza la superficie menor del contorno. Cáncer de mama

Porcentaje de pacientes sobrevivientes

El método de Bloom y Richardson para clasificar el cáncer de mama es un intento de introducir criterios “semicuantitativos” simples al diagnóstico histopatológico. Esto requiere la clasificación subjetiva del pleomorfismo nuclear, esto es, un cálculo del porcentaje del tumor que muestra formación de túbulos y una cuenta de mitosis por 10 campos de alto poder. El número de mitosis parece ser en particular relevante en el pronóstico de sujetos con cáncer de mama (fig. 7-14). Se ha demostrado en ensayos clínicos a gran escala que el cálculo de un índice pronóstico mul-

IAM = 0

IAM = 4

IAM = 16

IAM = 36 IAM = 81

tivariado basado en cuentas mitóticas, tamaño del tumor y estado linfático del ganglio puede proporcionar una medida valiosa del pronóstico en el cáncer de mama, sobre todo en mujeres premenopáusicas. El análisis cuantitativo de la estructura del conducto y la valoración del patrón epitelial pueden también suministrar datos de utilidad para la discriminación de la hiperplasia intraductal y el carcinoma ductal in situ.

Endometrio La medición del tamaño y la forma nucleares es de gran valor en la diferenciación del endometrio normal respecto de la hiperplasia atípica y el carcinoma endometrial. Estas ventajas pueden completarse con el análisis cuantitativo de las características estructurales que, en combinación, permiten la identificación de casos de hiperplasia atípica que progresan hacia una entidad maligna. Un sistema de clasificación morfométrica multivariado ha demostrado una correlación sólida con la profundidad de la invasión miometrial y es más específico que los esquemas de clasificación subjetiva, como el de Kurman. En los Países Bajos, el análisis de la morfometría endometrial por curetaje o de muestras de histerectomía se efectúa de modo sistemático en un intento por reducir el sobretratamiento de estas lesiones. Se ha considerado que esto podría ahorrar alrededor de 15 millones de dólares por año en Estados Unidos. La combinación del eje nuclear medio más corto, ploidia del DNA y profundidad de la invasión miometrial también ha demostrado tener un valor pronóstico de importancia, en especial en cánceres endometriales de etapa I de la FIGO (International Federation of Gynecology and Obstetrics).

Meses después del diagnóstico

Figura 7-14 Esta figura ilustra el papel de las cuentas mitóticas en la predicción de la supervivencia en pacientes con cáncer de mama. Mientras el índice de actividad mitótica (IAM = número de mitosis por 10 campos de alto poder) aumenta, el porcentaje de los pacientes que sobreviven por periodos más largos dentro de ese grupo disminuye.

Citología cervical automatizada La citología cervical automatizada representa uno de los esfuerzos principales en los últimos 30 años para introducir la automatización en un proceso diagnóstico de gran exigencia visual. Esta técnica se ha desarrollado luego de

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CAP. 7

MÉTODOS CUANTITATIVOS EN PATOLOGÍA TISULAR

reconocer, primero, la notoria reducción de la mortalidad del cáncer cervical tras la introducción de los programas de detección de cáncer cervical y, segundo, la demandante carga de trabajo que ésta propició. Resultó claro que los técnicos con trabajo excesivo y los citólogos clínicos podían diagnosticar casos difíciles de modo erróneo. El desarrollo de dispositivos de escrutinio computarizados comenzó a finales del decenio de 1950, pero sólo en fecha reciente han salido al mercado sistemas con capacidades automatizadas en esta área. En esencia, estos sistemas se basan en el mismo principio: las imágenes se proyectan en un microscopio, se someten a una exploración mecánica, se ordena en forma secuencial y se graban en formato digital; las células se identifican y segmentan, y después se sujetan al análisis cuantitativo (fig. 7-15). Se registran múltiples propiedades, como tamaño, forma, densidad y textura nucleares. Cada núcleo se

Control de calidad La exploración de la citología cervical exige una valoración de la calidad para la reexploración sistemática de al menos 10% de los portaobjetos o la rápida revisión de todos los portaobjetos. Esto lo realizan por convención individuos experimentados del equipo de citología y es un proceso que consume tiempo. Se puede utilizar un sistema de exploración cervical automatizado para someter a escrutinio una proporción de portaobjetos, lo cual exime al citólogo de efectuar esta tarea. Se delinean discrepancias entre la clasificación humana y la de la máquina del mismo caso y se formula una explicación posible. Puesto que la máquina posee una exactitud definida de clasificación, se asegura el mantenimiento de la calidad de los procedimientos diagnósticos. Preescrutinio Hasta 95% de los frotis cervicales es normal. Los sistemas automatizados pueden seleccionar una gran proporción de frotis normales y dejar las muestras visuales más complejas para la valoración del citólogo humano. De nueva cuenta, esto podría representar una reducción notable de la carga de trabajo de un laboratorio y un enriquecimiento del trabajo de exploración, dado que el citólogo sólo analizaría los casos más conflictivos. Automatización completa

Figura 7-15 Identificación automática de núcleos celulares cervicales a partir de un frotis. La caracterización cuantitativa permite la clasificación del tipo de célula y el reconocimiento de células malignas.

clasifica entonces como normal o potencialmente anormal. Esta información se puede procesar de varias maneras. Algunos sistemas están diseñados para almacenar todas las imágenes de anormalidades, que más adelante revisa el citólogo para confirmar un diagnóstico de enfermedad maligna. Esto requiere experiencia humana en el proceso de tomar decisiones finales, pero reduce en grado significativo la carga de trabajo, dado que la máquina selecciona los campos sospechosos de manera automática. Como alternativa, el sistema puede determinar una clasificación diagnóstica sin requerir la intervención humana. Esta clasificación por completo automatizada de frotis cervicales se puede utilizar con varios propósitos.

Los dispositivos por completo automatizados, que proporcionan un diagnóstico definitivo de todos los frotis presentados, reclamados por tantos años, ahora son una posibilidad. Existen aspectos medicolegales que deben superarse, pero la automatización completa podría ser importante en el abastecimiento de servicios de exploración cervical en los países en los que no existe un programa de investigación. Es probable que en los próximos años se desarrolle con rapidez el uso de sistemas automatizados con proyección de imagen en la citología diagnóstica del cervix y otros sitios. Dichos sistemas se introdujeron ya en algunos laboratorios como dispositivos del control de calidad y se promueven ahora como sistemas de preescrutinio. Con los avances de la tecnología informática, la detección de la computadora y los procedimientos de clasificación, es probable que los sistemas por completo automatizados funcionen a niveles que superen las mejores cualidades humanas. Fenotipo de la cromatina y cambios vinculados con la malignidad (CVM) Las características cuantitativas del fenotipo de la cromatina se han demostrado en muchas situaciones para proporcionar

AUTOMATIZACIÓN EN HISTOLOGÍA

Índice del fenotipo de la cromatina

indicios únicos de procesos celulares subyacentes y pueden utilizarse como un medio objetivo para clasificar la enfermedad y, más importante aún, para predecir resultados clínicos. El análisis de la textura de la cromatina parece tener un papel relevante en el diagnóstico, la clasificación y el pronóstico de las neoplasias vesicales. Además, la evidencia sugiere que el análisis de la medición del fenotipo de la cromatina antes del tratamiento se pueda emplear para anticipar la reacción a la quimioterapia y radioterapia en el cáncer de vejiga. La textura de la cromatina nuclear también se puede usar para discriminar entre los carcinomas de próstata, los sensibles a hormona y los resistentes a la misma, y ha demostrado ser útil en el pronóstico predictivo del cáncer metastásico de la próstata. Las alteraciones sutiles de la configuración nuclear de la cromatina se han demostrado no sólo en las células malignas, sino también en las células de apariencia “normal” de sujetos con un tumor maligno. Estas transformaciones se han llamado “cambios vinculados con la malignidad” o CVM. Tales cambios pueden cuantificarse de modo confiable mediante el análisis automatizado de la textura de

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los núcleos (fig. 7-16) y destacar a menudo las características nucleares que no son evidentes al ojo humano. Por ejemplo, se ha demostrado en citología cervical que en un análisis de tan sólo 30 células que parecían normales por muestra podría identificarse hasta 70% de muestras con displasia moderada o grave. Esto subraya su papel en los dispositivos cervicales automatizados de exploración y muchos de los sistemas actuales emplean la textura nuclear como una característica diagnóstica. Los CVM también se han demostrado en el colon, la vejiga, la mama y el pulmón (fig. 7-16). No es del todo preciso si estos cambios en las células al parecer normales indican un cambio premaligno primario en la célula o si se trata de cambios secundarios atribuibles a la exposición de células circundantes a los factores relacionados del tumor. El hecho que los CVM pueden desaparecer después de la eliminación de un tumor se inclina por esto último, al menos en algunos tejidos. El trabajo reciente sugiere que los CVM se pueden emplear como un método potencial para la exploración del cáncer de pulmón. El análisis de los CVM en biopsias histológicas normales del pulmón permitió la identificación correcta superior a 80% de los pacientes con cáncer. Además, se ha defendido en la exploración de los pacientes para el cáncer de pulmón la identificación de texturas alteradas en células que parecían normales a partir de muestras de esputo.

Adenocarcinoma

Adenoma

Adenocarcinoma adyacente

Adenocarcinoma lejano

Recto “normal”

Automatización en histología

Figura 7-16 Esta gráfica muestra el índice del fenotipo de la cromatina cuantificado mediante el análisis de la textura en la mucosa normal a una distancia (lejana) a partir del adenocarcinoma colorrectal y en su contigüidad. Puede observarse que hay una tendencia monotónica con el aumento de anormalidades a medida que es mayor el acercamiento a la tumoración. Esto destaca los cambios vinculados con la malignidad (CVM) en la organización de la cromatina en las células normales que circundan a una lesión maligna. La gráfica también muestra las alteraciones principales de la organización de la cromatina dentro de adenomas y adenocarcinomas.

El análisis automatizado de las preparaciones en la citología es una tarea exigente. Aún más difícil es la interpretación y el análisis automatizados de las muestras histológicas debido a la complejidad de las imágenes. Hasta hace poco tiempo, el análisis automatizado de las imágenes histológicas se consideraba una tarea insuperable, excepto en las aplicaciones más simples. Sin embargo, con el desarrollo de los poderosos procesos de computadora y el uso de la metodología experta del sistema, ahora es posible el desarrollo de los sistemas con visión para las tareas complejas de proyección de imágenes. Esto requiere la definición del conocimiento referente a los componentes que comprenden la imagen y sus interrelaciones. Éstos se definen en un archivo y se utilizan para conducir las acciones de un sistema experto de la segmentación de la muestra. Los objetos se aceptan o rechazan como componentes histológicos con base en criterios cuantitativos explícitos. Los objetos rechazados se pueden seleccionar para el proceso de imagen adicional y facilitar su identificación. Una vez que se identifican todos los objetos, la muestra histológica se reconstruye y ello permite la medición de características histométricas relevantes. Esta metodología ahora se aplica con éxito al análisis de colon, próstata y mama (fig. 7-17).

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CAP. 7

MÉTODOS CUANTITATIVOS EN PATOLOGÍA TISULAR

Figura 7-17 Automatización en histología. Con un sistema experto de visión se pueden identificar de manera automática las glándulas colorrectales y sus componentes; se segmentan y se efectúan mediciones que pueden emplearse para medir de modo objetivo el grado de displasia colorrectal.

Inmunohistoquímica cuantitativa Uno de los avances principales en patología diagnóstica durante los últimos 30 años es la visualización microscópica de proteínas mediante métodos inmunocitoquímicos (véase cap. 4). A pesar de ello, evaluar la reacción de tinción es aún subjetivo, no sólo para evaluar el número de células inmunopositivas sino también en la determinación de la intensidad de la reacción de marcado. Las técnicas visuales se basan en un sistema de marcación numérico para el porcentaje de células positivas y la intensidad con la cual se suman para proporcionar una inmunomarcación total en casos específicos. Incluso este acercamiento bien definido acusa una mala reproducibilidad cuando se compara la marcación generada por un experto y la de otro clínico en la misma muestra de tejido. Por esta razón, muchos fabricantes del instrumento comercializan ahora equipos con análisis de imagen, que pueden extraer datos cuantitativos inmunohistoquímicos a través del análisis de la información densitométrica de imágenes digitales de color. Como la molécula indicadora primaria tiene un color específico, es importante que el sistema de la proyección de imagen

sea capaz de identificar este color en preparaciones celulares y distinguirla de cualquier otra contratinción. Existen también problemas relacionados con la estandarización y el control de calidad en la inmunocitoquímica cuantitativa y se recomienda el uso de controles sobre el portaobjetos de inmunorreactividad definida. El punto principal en el desarrollo de la inmunohistoquímica cuantitativa ha sido la evaluación cuantitativa de los receptores de estrógeno y progesterona y positividad de HER2/neu en el cáncer de mama. La automatización es también la fuerza impulsora principal y ahora se dispone de muchos sistemas comerciales enfocados en el procesamiento rápido de las microconfiguraciones de tejido para la identificación de biomarcadores inmunocitoquímicos potenciales para diagnóstico, pronóstico y respuesta a la terapia. El portaobjetos digital Los avances recientes en proyección de imagen digital proporcionan la capacidad de analizar y registrar de forma digital un portaobjetos microscópico completo (fig. 7-18).

Figura 7-18 Portaobjetos digital. A la izquierda se muestra la exploración de un corte completo de tejido de la próstata. La muestra original del tejido era de 27 ⫻ 9 mm. Con exploración a 40 ⫻ se obtuvo una imagen digital de 58 877 ⫻ 42 336 pixeles en 24 bites de color. La imagen final fue de 456 megabites de tamaño. La caja pequeña enmedio de la imagen se puede agrandar de manera electrónica para mostrar el detalle en el cual se registró la imagen (derecha).

LECTURAS ADICIONALES

Esto se puede realizar a gran amplificación para conservar el detalle microscópico de la muestra y el portaobjetos puede verse a cualquier amplificación digital si se agranda o reduce la imagen sobre la pantalla. Las dimensiones completas de la imagen habrían hecho de esto una tarea imposible hace apenas algunos años. En la actualidad, con el procesamiento rápido se ha desarrollado el programa que permite el análisis y la revisión rápidos de estas imágenes en megapixeles. Esto permite que los casos de patología se distribuyan entre los centros de forma digital, ya no más en las diapositivas. El análisis de portaobjetos completos también facilita el estudio automatizado de las características del tejido y la célula con la observación de la computadora, esto último cada vez más importante en la evaluación de las microconfiguraciones de tejido. El análisis de imágenes completas de esta manera todavía es exigente, pero con la utilización automatizada de portaobjetos, dado que es posible sin la intervención humana, tiene un potencial enorme para facilitar el análisis automatizado en la investigación y la práctica de la patología.

Conclusión Sin duda alguna, la medición en patología mejora la interpretación visual convencional. Sin embargo, la incorporación de técnicas a la práctica común ha sido lenta y lo es todavía. Esto se atribuye a diversos factores y a la carencia de pruebas clínicas a gran escala para probar la eficacia de la medición de problemas diagnósticos. La mayor parte de los estudios se ha realizado en una cantidad relativamente pequeña de casos bajo condiciones semicontroladas. Aun cuando los estudios a gran escala han ilustrado el valor y

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la relación costo-beneficio de la medición de la muestra tisular, pocos centros han adoptado estas técnicas. Esto se debe muchas veces a las restricciones financieras y de tiempo impuestas a los patólogos, lo cual limita el esfuerzo adicional necesario para generar datos numéricos a partir de las muestras del enfermo. Las escasas instituciones que ofrecen la medición en la patología de rutina (sobre todo en los Países Bajos y Estados Unidos) cobran este servicio adicional. Dicho costo lo absorbe el paciente, el asegurador o el proveedor del cuidado médico y las mediciones las efectúa sobre todo el personal técnico. La promoción del fabricante de equipo y la introducción de técnicas más automatizadas, en combinación con la necesidad de cuantificar nuevos marcadores desarrollados por las compañías farmacéuticas, pueden ser cuestiones que definan el futuro de la medición en la patología diagnóstica de rutina. Esto podría modificar en grado notable la forma de practicar la patología y complementar la capacidad diagnóstica del patólogo; con ello se proporcionaría el soporte objetivo para tomar decisiones diagnósticas y delinear el pronóstico.

Lecturas adicionales Baak JPA, Janssen E. Expert Opinion: DNA Ploidy analysis in Histopathology. Histopathology 2004; 44: 603. Bartels PH. Future directions in quantitative pathology: digital knowledge in diagnostic pathology. J Clin Pathol 2000; 53: 31-37. Grohs HK, Husain OAN. Automated Cervical Cancer Screening 1994: Igaku-Shoin, New York. Hamilton PW, Allen DC (eds). Quantitative Clinical Pathology. 1995: Blackwell Science, Oxford. Marchevsky AM, Bartels PH (eds). Image Analysis. A primer for pathologists. 1994: Raven Press, New York.

8 Marcadores de proliferación en histopatología Cheryl E Gillett y Diana M Barnes

Introducción En los tumores, la tasa a la cual las células proliferan tiene un efecto significativo sobre el pronóstico. Puesto que la actividad proliferativa se calculó primero de modo muy general al medir el cambio del tamaño de una masa durante un periodo, el tema completo de la proliferación y la forma de medirla han prosperado y ahora se dispone de centenares de publicaciones sobre el tema. Existe una corriente continua de trabajos que ha introducido nuevos marcadores, combinado marcadores establecidos, modificado las técnicas de demostración y promovido técnicas novedosas de evaluación. Tal información es una perspectiva desalentadora para la persona inexperta que desea medir la proliferación y obliga a formular la pregunta: “¿cuál es la mejor manera de hacerlo?” Antes de describir algunas de las diversas maneras de cuantificar la proliferación es importante tener una comprensión básica del ciclo celular, ya que todos los marcadores demuestran un aspecto particular. El ciclo celular completo o la etapa “fracción de crecimiento” tiene cuatro fases: Gap 1 (G1), síntesis del DNA (S), Gap 2 (G2) y mitosis seguida por citocinesis (M). Durante la fase del ciclo celular completo, la célula produce de manera secuencial las proteínas necesarias para posibilitar la réplica del DNA y división nuclear y celular subsiguientes. Los puntos de comprobación existen en todas las fases del ciclo para determinar el estado de la célula antes de ingresar a la fase próxima. En condiciones normales, sólo las células con DNA normal progresan a la siguiente fase. Las células defectuosas de cierta manera se detienen hasta que se repara el DNA o se dirigen hacia la muerte programada de la célula (apoptosis). Todas las células pueden ingresar a

una fase de no proliferación o aciclicidad, que se conoce como Gap 0 o (G0). Las células conservan su viabilidad y pueden moverse de nueva cuenta dentro del ciclo cuando sea necesario. El término “tasa de proliferación” se utiliza con frecuencia para describir la “cantidad” de un marcador de proliferación en material clínico. Por lo regular, estas mediciones se realizan en una pieza de tejido en un momento específico y, por lo tanto, el término “tasa” es inadecuado. “Actividad” proliferativa es una expresión más exacta de esta clase de evaluación y el concepto “tasa” debe reservarse para los métodos que miden el cambio respecto del tiempo.

Marcadores de proliferación El número de los llamados marcadores de proliferación sigue en aumento. Se describen a continuación los que están razonablemente bien establecidos y han proporcionado información pronóstica. Cuenta mitótica o índice de actividad mitótica (IAM) Las mitosis son los únicos marcadores proliferativos que se pueden identificar y cuantificar en un corte teñido con hematoxilina y eosina (H-E) convencional (fig. 8-1). Sin embargo, no son siempre fáciles de reconocer y pueden confundirse con los núcleos hipercromáticos o los núcleos en las fases iniciales de la apoptosis. La fijación inadecuada, corte deficiente de la sección y el sobreteñido pueden conducir a dificultades en el reconocimiento de las mitosis y pueden incluso afectar el número de las mitosis identificadas.

The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker. © 2005 John Wiley & Sons, Ltd.

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CAP. 8

MARCADORES DE PROLIFERACIÓN EN HISTOPATOLOGÍA

Otra forma de identificar figuras mitóticas consiste en emplear anticuerpos como el MPM2. Estos métodos se dirigen a reducir las ocasiones de incluir cuerpos apoptóticos en una cuenta mitótica y también son susceptibles al análisis automatizado. Regiones organizadoras del nucleolo (RON)

Figura 8-1 Figuras mitóticas en una muestra teñida con hematoxilina y eosina (H-E) convencional (400 ⫻).

Calcular la actividad proliferativa de una pieza de tejido de acuerdo con el número de mitosis presentes puede parecer al principio una tarea sencilla. No obstante, se han desarrollado varios métodos de evaluación a través de los años, y a pesar del valor reconocido de las mitosis como marcadores de la proliferación, no ha dejado de ser controversial el método “correcto” de evaluación. El primer método formal de evaluación usado fue una “cuenta” mitótica, esto es, una escala de cálculo (0, +, ++) usada por muchos patólogos. Una cifra mitótica cuenta el número de mitosis presentes en un número de campos de alto poder (CAP) y presenta los resultados como el número medio de mitosis por CAP. Para hacer más reproducible el método se han hecho algunas depuraciones, incluidas la evaluación de las células en la periferia de la lesión, realización de la cuenta en campos consecutivos y definición del área de los CAP. La cuenta mitótica es una parte integral de la clasificación de la infiltración de los carcinomas mamarios, mediante los criterios modificados de Bloom y Richardson; también se utiliza en la determinación del diagnóstico y el pronóstico de los sarcomas de tejido blando. Para superar algunas de las inconsistencias relacionadas con una cuenta mitótica se introdujo el índice de la actividad mitótica. Con este método de evaluación el número de mitosis se expresa como una proporción del número de células en interfase. El número total de células en interfase y las figuras mitóticas se cuentan en CAP consecutivos hasta que el corte se muestrea lo suficiente. Puesto que el IAM mide la proporción de mitosis en la lesión, no se relaciona o lo afecta el área del CAP. También considera variaciones de la celularidad de la lesión y el tamaño de la célula. Un índice de actividad mitótica dura alrededor de 10 minutos más que una cuenta mitótica, pero es una manera más exacta de comparar la proporción de mitosis presentes en los tumores.

Las RON son los sitios de los genes del rDNA y están presentes en grupos o asas sobre un número de cromosomas específicos. Al tener varios sitios de transcripción, la célula puede continuar con la demanda de los ribosomas siempre que sea necesario. Las proteínas relacionadas con RON, como lo indica su nombre, se sitúan muy cerca de las RON y se ha demostrado que funcionan como marcadores de la proliferación. Las proteínas relacionadas con RON son argirófilas, se demuestran con una técnica de plata y

Figura 8-2 Las regiones organizadoras del nucleolo (AgNOR) relacionadas con proteínas se demuestran mediante una técnica de plata (1 000 ⫻).

se les conoce entonces como AgNOR. Éstas pueden verse como puntos negros pequeños dentro del núcleo (fig. 8-2). Se considera que el número de AgNOR presente refleja la producción de ribosomas y por tanto la síntesis proteínica dentro de la célula. La valoración de las AgNOR resultantes se ha considerado no sólo como un marcador de la actividad proliferativa, sino también como un método para distinguir entre lesiones benignas y malignas, una medida del tumor ploide y del grado de malignidad. Las AgNOR son en extremo difíciles de contar y algunos autores anteriores también se refirieron a su patrón dentro del nucleolo como “racimos” y “AgNOR satélites”. La evaluación no era reproducible, lo que explicó en buena medida la variación notificada de su valor pronóstico. Diversas publicaciones describen el uso de los analizadores de

MARCADORES DE PROLIFERACIÓN

imagen para cuantificar la presencia de AgNOR y muchas han demostrado que el área media ocupada por las AgNOR dentro del núcleo proporciona información pronóstica. Demostración inmunohistoquímica de la proliferación El primer anticuerpo que se reconoció como marcador de la actividad proliferativa fue el Ki67 monoclonal (mKi67). El significado funcional de la proteína Ki67 es aún impreciso, a pesar de que se la ha estudiado bien en el plano molecular. Pese a ello, se ha establecido que la proteína se expresa durante todas las fases del ciclo celular, pero no durante la etapa de aciclicidad. El mKi67 se ha usado en muchos estudios y la medida resultante de la actividad proliferativa se equipara bien con otros marcadores establecidos para la proliferación, entre ellos las cuentas mitóticas y el índice de marcado con timidina (fig. 8-3a,b). No obstante, la desventaja con el anticuerpo mKi67 consiste en que el área del antígeno que reconoce es muy sensible a la fijación y la antigenicidad se pierde después de los procedimientos estándar de fijación con formaldehído e infusión en parafina. En consecuencia, es posible llevar a cabo de forma prospectiva estudios pronósticos con mKi67 en muestras de tejido fresco congelado. El potencial del mKi67 como marcador de la proliferación proporcionó el impulso para producir anticuerpos similares a las proteínas que eran funcionales durante el ciclo celular, pero lo suficientemente resistentes para sobrevivir a la fijación con formalina y al procesamiento con parafina, lo cual dotó al marcador de una aplicación mucho más amplia. Cuando se desarrolló un anticuerpo contra el antígeno nuclear de la célula en proliferación (PCNA), se lo consideró el equivalente resistente al fijador de mKi67 (fig. 8-4). Sin embargo, después del entusiasmo inicial, se encontró que el PCNA (también conocido de forma con-

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fusa como ciclina en algunos trabajos) desempeñaba un papel en la réplica del DNA y la reparación del DNA. Esta dualidad condujo a la gran variación en cuanto a su valor como marcador de proliferación. Su expresión parece relacionarse con la proliferación en tejidos que tienen células embrionarias activas, pero la relación es menos clara en las lesiones epiteliales. La proteína también tiene una vida media larga y por tanto se detecta aún más tiempo después de su periodo funcional dentro del ciclo celular. Otro anticuerpo, KiS1, también se consideró de manera inicial como sobresaliente contra el antígeno Ki67 y un equivalente resistente al fijador de mKi67. Pese a ello, la evaluación subsiguiente del anticuerpo ha demostrado que detecta la topoisomerasa II alfa, una de las enzimas que controla los rompimientos de trenzado simple y doble en el DNA durante la replicación y la transcripción. A pesar de este nuevo hallazgo, el KiS1 todavía se utiliza como un marcador de la actividad proliferativa cuando se expresa en

Figura 8-4 El antígeno nuclear de la célula en proliferación se identificó por el anticuerpo de la PC10 en tejido fijado en formalina impregnado en parafina (400 ⫻).

Figura 8-3 El antígeno Ki67 se reconoce con el anticuerpo monoclonal Ki67 en tejido congelado a partir de un tumor que prolifera con rapidez (a) y lentitud (b) (200 ⫻).

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CAP. 8

MARCADORES DE PROLIFERACIÓN EN HISTOPATOLOGÍA

Figura 8-5 La topoisomerasa II alfa se detectó mediante el anticuepo KiS1 en tejido fijado en formalina impregnado en parafina a partir de un tumor que prolifera con rapidez (a) y lentitud (b) (400 ⫻).

todas las fases del ciclo celular (fig. 8-5a,b). Sin embargo, el KiS1 es apenas menos específico que el mKi67, dado que detecta un cierto nivel de proteína después que la célula completa el ciclo y se halla en una fase acíclica. Varias publicaciones, que son necesarias para proporcionar una información proliferativa más exacta y reproducible, han notificado el uso de estos anticuerpos con modificaciones para el método y el procedimiento de evaluación. Los anticuerpos establecidos para detectar Ki67, y por consiguiente las células en proliferación, son el Ki67 policlonal (pKi67) y el MIB1 monoclonal. Ambos reconocen la parte de la proteína estructural Ki67 y pueden continuar la unión al antígeno después de la fijación y la impregnación en parafina (fig. 8-6). El MIB1 y la expresión de pKi67 han demostrado un nexo cercano con el anticuerpo mKi67 y su información de la actividad proliferativa se correlaciona bien con otros marcadores. Se han añadido al desarrollo de estos anticuerpos las mejoras recientes de los métodos de recuperación del antígeno más allá de la digestión proteolítica. La recuperación con mediación de calor del antígeno es esencial para el uso de ambos anticuerpos en material embebido en parafina y fijado en formalina. Incluso el mKi67 se puede utilizar en material impregnado en parafina después de la recuperación del antígeno, aunque los resultados no son tan constantes como en los casos de pKi67 o MIB1. Índice de marcado con timidina (IMT) y bromodesoxiuridina (IMB) Ambas técnicas implican la incorporación de un nucleótido durante la fase S que puede demostrarse a continuación. En el caso del IMT, la timidina se gradúa y se demuestra su incorporación mediante autorradiografía (fig. 8-7). Para la bromodesoxiuridina, la incorporación se evidencia

Figura 8-6 Antígeno Ki67 reconocido mediante anticuerpo MIB1 en tejido fijado en formalina e impregnado en parafina de un tumor que prolifera con rapidez (400⫻).

tras emplear la inmunocitoquímica con un anticuerpo antibromodesoxiuridina (fig. 8-8). Una desventaja es que ambos métodos necesitan material viable para incorporar los nucleótidos dentro del DNA. Además, la detección de la timidina radiomarcada trae consigo problemas de equilibrio con la velocidad del desarrollo de las autorradiografías y con aspectos de seguridad de la técnica. No obstante, los resultados son buenos cuando los realizan médicos experimentados y proporcionan una evaluación exacta de la proporción de células en la fase S. Éstas son técnicas especializadas y no se incorporan con facilidad en laboratorios de histopatología con cualquier grado de confiabilidad. En fecha reciente se ha empleado el marcado de bromodesoxiuridina en combinación con la citometría de flujo para medir la proliferación in vivo y ha proporcionado una medida real de la “tasa” de proliferación. A los pacientes se les inyecta bromodesoxiuridina, que se incorpora en las células durante la síntesis del DNA. De la lesión se recoge

MARCADORES DE PROLIFERACIÓN

Figura 8-7 Detección autorradiográfica de la timidina incorporada dentro del núcleo de células en proliferación (200 ⫻).

Figura 8-8 Detección inmunohistoquímica de bromodesoxiuridina incorporada dentro del núcleo de células en proliferación (400 ⫻).

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puede crear un histograma que revela los números de células con cantidades similares de DNA. El análisis automatizado de estos histogramas permite calcular la proporción de células en cada fase del ciclo celular. En consecuencia, la información de la actividad proliferativa es la proporción de células en la fase S, o la fracción de la fase S, que es de enorme interés. La citometría de flujo es uno de los métodos más objetivos de evaluación de la actividad proliferativa, pero como el tejido tiene que desagregarse antes del análisis, los resultados no se pueden relacionar con la morfología y la muestra puede incluir elementos normales, benignos e inespecíficos del tejido bajo estudio. Además, al usar el material incluido en parafina, una proporción sustancial del tejido es necesaria e incluso entonces el número de núcleos incompletos o mal preservados en la muestra significa que alrededor de una cuarta parte de los histogramas no se puede interpretar con exactitud. Se han desarrollado en grado considerable las capacidades del citómetro de flujo desde los inicios al medir un solo parámetro, el contenido de DNA. Ahora se dispone de instalaciones para realizar las mediciones múltiples y su uso se ha especializado aún más. La medición del contenido de DNA es más probable que se realice junto con la medición de una o más proteínas inmunofluorescentes detectadas, lo cual suministra información sobre la relación entre la fase del ciclo celular y la expresión de la proteína. La técnica de la citometría de flujo y el análisis automatizado de los resultados sugieren un acercamiento más “científico” para determinar la proliferación; empero, un buen número de estudios ha demostrado que puede obtenerse información similar por conteo cuidadoso de las mitosis y positividad al Ki67 o MIB1, que se puede obtener en laboratorios de histopatología sin equipo especial.

Otros marcadores una biopsia de varias horas después de la inyección y a partir de este tejido se pueden medir en células individuales la presencia de la incorporación de bromodesoxiuridina y el contenido de DNA. La relación entre tiempo, inyección y muestreo, incorporación de bromodesoxiuridina y contenido de DNA determina la tasa a la cual las células en la lesión proliferan para determinarse. Citometría de flujo La citometría de flujo es uno de los métodos más confiables y reproducibles para medir la actividad proliferativa y se puede usar en material citológico, fresco o fijado, impregnado en parafina. Al cuantificar la cantidad de DNA en los núcleos individuales separados de una muestra de tejido se

No han dejado de aparecer otros marcadores potenciales de la proliferación; muchos de ellos son anticuerpos cultivados contra las proteínas que presentan un nivel creciente de expresión durante el ciclo celular. En una manera similar al Ki67 y PCNA, se ha aceptado que si un antígeno está presente durante una fase específica o fases del ciclo celular, entonces su detección significa que puede utilizarse para identificar las células que se encuentran en proliferación. Entre estos supuestos marcadores figuran diversos miembros de la familia de la ciclina y sus cinasas dependientes de la ciclina (cdks) y la proteína del retinoblastoma (pRb). Otras proteínas relacionadas con la replicación del DNA también se han identificado como marcadores potenciales, incluidas proteínas de mantenimiento del minicromosoma (Mcm). Estas proteínas Mcm (de las cuales hay seis, Mcm 2, 3, 4, 5, 6

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CAP. 8

MARCADORES DE PROLIFERACIÓN EN HISTOPATOLOGÍA

y 7) intervienen en el inicio de la replicación del DNA y la prevención de la re-replicación de un solo ciclo celular. Infortunadamente, muchos de estos marcadores celulares relacionados con el ciclo poseen una expresión alterada en células malignas, debido a los cambios del trayecto regulador de las proteínas que controlan el ciclo celular y no son marcadores convenientes de la actividad proliferativa. Como consecuencia del gran interés en identificar las proteínas que controlan el ciclo de la célula, se desarrollan con frecuencia nuevos anticuerpos y se comercializan a gran escala. Esto sobrepasa el ritmo al cual su potencial como marcadores de la proliferación puede evaluarse del todo. Por consiguiente, debe tenerse cuidado al usar cualquier anticuerpo nuevo para asegurar una validación adecuada antes de aceptarse como marcador de proliferación. No obstante, muchos de los anticuerpos son de interés como blancos relacionados con tratamientos biológicos específicos, no tanto como herramientas para medir la proliferación. La hibridación in situ también se utiliza para demostrar la actividad proliferativa. La expresión del mRNA de la histona 3 (H3) se ha reconocido bien como tal marcador por varios años y se equipara con otros marcadores que proporcionan información pronóstica. Las histonas son el componente proteínico principal de la cromatina y desempeñan la función de empaquetar filamentos de DNA en una forma compacta, el nucleosoma. Como las histonas se vinculan de modo tan estrecho con el DNA, también se producen durante la síntesis del DNA. Por lo tanto, la de-

NA

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2-7

AgNOR Topoisomerasa II Ki-67 y KiS5

tección de niveles crecientes del mRNA de la H3 en la fase S refleja la actividad proliferativa de los tejidos. Se conoce que los valores del mRNA de H3 disminuyen con rapidez durante la G2 y ninguna síntesis ocurre una vez que la célula entra a la fase G0, lo que las convierte en uno de los marcadores más específicos de la actividad proliferativa. Empero, este método no se emplea de forma extensa, sobre todo porque la técnica de hibridación in situ requerida para detectar el mRNA no es asequible para la mayor parte de los laboratorios; además, tampoco los resultados son significativamente mejores que los de otros marcadores que no requieren un método de detección especializado. Las técnicas de hibridación in situ, y en especial las no isotópicas, se han introducido de modo gradual en más laboratorios, así que tal vez los datos de la proliferación se obtengan en el futuro con más frecuencia mediante el mRNA de la H3. La figura 8-9 muestra cómo los diferentes marcadores de la actividad proliferativa se relacionan uno con otro y con las diferentes fases del ciclo celular.

Uso práctico de marcadores La elección del método de medición para la actividad proliferativa depende en buena medida del tipo de material que se evalúa. Si un estudio retrospectivo se conduce con material impregnado en parafina, no pueden utilizarse los métodos como IMT, IMB y mKi67.

M

Cu PM2 ent am itót ica /ín dic e

Muerte de ac tiv id

ica tót mi ad

G0

Cíclico

Acíclico

Figura 8-9 Relación de diferentes marcadores de proliferación con las fases del ciclo celular.

MÉTODO DE EVALUACIÓN

Los puntos a considerar para la preparación del tejido incluyen el tipo de fijador usado, puesto que éste influye en todos los marcadores, y el efecto que puede causar un retraso de la fijación. Las figuras mitóticas son muy difíciles de distinguir de los cuerpos apoptóticos en algunos fijadores con base de alcohol; asimismo, también puede ser difícil identificar la AgNOR. La expresión del antígeno se reduce e incluso se pierde en algunas soluciones fijadoras, a pesar del uso de la recuperación del antígeno regulada por calor. Aun en la citometría de flujo los colorantes nucleares son incapaces de ligar la cromatina cuando se utiliza un fijador que contiene metal. Algunos estudios muestran que un retraso de la fijación reduce el número de mitosis en el tejido y, por consiguiente, se subestima la actividad proliferativa. Por último, casi nunca se considera que el espesor de la muestra tenga un efecto importante sobre la demostración y evaluación de los marcadores. No obstante, así como se altera la calidad de la tinción, las cuentas mitóticas y de AgNOR varían según sea el espesor de la sección y en la inmunohistoquímica la tinción resultante cambia de intensidad, un factor importante si ésta se incluye como parte de la evaluación. Todos los cortes que se someten a la recuperación del antígeno regulada por calor deben montarse en portaobjetos cubiertos con adhesivo y calentarse; de otra forma las muestras se levantan y algunas se desprenden por completo.

Método de evaluación Una vez que se selecciona el marcador más conveniente de la proliferación y se pone en práctica el método, la siguiente pregunta es: “¿cómo se efectúa la cuenta?” Esto se considera a menudo como la etapa final y más fácil de la técnica, pero requiere un acercamiento metódico para obtener resultados constantes y reproducibles. En esta fase la citometría de flujo tiene una ventaja sobre otros marcadores, ya que miles de células se pueden determinar con rapidez con un grado satisfactorio de consistencia entre una muestra y otra. El resto de los métodos en los cuales se demuestra un marcador de proliferación en un corte histológico tiene varios criterios similares que deben cumplirse. Primero, el tiempo tomado para realizar la evaluación debe equilibrarse contra el valor de la información obtenida. Sería inútil tomar 20 minutos para llevar a cabo una cuenta formal sobre una muestra si puede conseguirse tal información del pronóstico mediante un método semicuantitativo que toma una fracción de ese tiempo. En segundo lugar, cualquier método de evaluación empleado debe ser confiable y consistente. Casi todos los métodos de evaluación usados con los marcadores descritos aquí son cuentas o cálculos convencionales, pero existe en el mercado un número creciente de

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sistemas basados en el análisis de la imagen que usan un método diferente de evaluación. Con métodos manuales, varios criterios tienen que cumplirse para reducir la subjetividad relacionada con la evaluación, de tal modo que sean posibles las comparaciones, sea entre las muestras o los evaluadores. Los siguientes puntos siempre deben considerarse antes de emprender cualquier valoración y no deben soslayarse durante el curso del estudio. ¿Qué áreas de la muestra deben evaluarse? Por tradición, el “borde creciente” de un tumor se considera el área más apropiada para la evaluación. Ésta tiende a ser la más proliferativa y es con frecuencia el área en la que se calcula la cuenta mitótica para un grado histológico. Una alternativa consiste en utilizar el área “peor” o más mal diferenciada, pero ello proporciona deficientes características para el pronóstico. Seleccionar el borde creciente es virtualmente imposible en algunas formas de preparación del tejido, como las biopsias con aguja fina o las resecciones transuretrales de la próstata. Por otra parte, el IMT y los métodos del IMB requieren que el tejido fresco esté cortado en piezas muy pequeñas para permitir el acceso de los nucleótidos al núcleo. De nueva cuenta, es casi imposible evaluar el “borde creciente”. Si se lleva a cabo una cuenta formal, entonces debe evaluarse un número suficiente de células para ser representativo de la muestra y de ese modo se reduce el efecto de la selección del área; si se realiza un cálculo de la frecuencia del marcador, entonces se evalúa la sección completa. Los sistemas automatizados tienen el beneficio de efectuar una evaluación formal en áreas seleccionadas a través de la muestra completa. ¿Qué método de valoración debe usarse? Ya no es muy apropiado llevar a cabo una valoración de proliferación sin definir los criterios utilizados para alcanzar el resultado final. Es importante decidir si la intensidad de la tinción es una característica importante. Desde luego, ésta no es una consideración para evaluar las mitosis o las AgNOR, pero con marcadores basados en la inmunohistoquímica puede representar un aumento de la expresión de la proteína sobre su nivel basal habitual, como en el caso del PCNA. Si la intensidad de la tinción es relevante, entonces debe combinarse con una cuenta o un cálculo de la proporción de células teñidas. La cuantificación exacta de cualquier marcador exige hacer una cuenta formal de las células que expresan el marcador y de aquellas que no lo hacen, de tal manera que se obtiene un “índice proliferativo”. Una mirada

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MARCADORES DE PROLIFERACIÓN EN HISTOPATOLOGÍA

rápida a las publicaciones que notifican una cuenta revela la considerable variación del número total de células evaluadas. Para ser estadísticamente correctos es necesario evaluar suficientes números de células para reducir el error de conteo a un nivel aceptable; en condiciones normales, se considera que éste debe ser menor de 5%. Si tan sólo se evalúan algunas células, el resultado podría sobrestimar o subestimar en grado notorio la actividad proliferativa verdadera. Al aumentar el número de las células incluidas en la evaluación se reduce este error de manera gradual. Una cifra universal para el número de células a contar no puede aplicarse a todos los marcadores y a los diversos tipos de tejido. En general, las cuentas necesitan incrementarse en tejidos heterogéneos y cuando es baja la incidencia de la demostración del marcador. Por ejemplo, el MIB1 detecta células en todas las fases del ciclo celular excepto en la G0, mientras que un índice mitótico “detecta”sólo en una parte limitada del ciclo celular. Por lo tanto, en cualquier pieza del tejido la proporción de células que expresan MIB1 es mucho más alta respecto de las que experimentan mitosis. Por consiguiente, para alcanzar el mismo nivel aceptable de error para ambos marcadores, el número total de células evaluadas por el índice de la actividad mitótica necesitaría ser más grande en comparación con la cuenta MIB1. Existe poco trabajo publicado enfocado en comparar métodos de conteo, pero en general las cuentas superiores a 1 000 células parecen reducir el error de conteo a márgenes aceptables. Algunas veces, la cuenta de tantas células puede ser un problema en muestras muy pequeñas, por ejemplo, biopsias de aguja fina, o cuando la lesión de interés forma sólo una parte pequeña del tejido examinado, como el carcinoma ductal mamario in situ u otras neoplasias intraepiteliales. En tales casos puede ser necesario evaluar muestras múltiples del tejido para conseguir un registro exacto de la actividad proliferativa. Como ya se mencionó, es importante equilibrar el tiempo gastado en evaluar un marcador proliferativo con la cantidad de información proporcionada. Aunque la determinación de más células incrementa la exactitud, muchas veces no es práctico y desde luego no suscita la disposición de un histopatólogo ocupado. Han ganado aceptación las valoraciones semicuantitativas debido a su velocidad relativa de valoración y porque correlacionan bien con marcadores evaluados de modo más cuantitativo. Por muchos años se han contado y expresado las mitosis por campo de alto poder, que es en verdad una valoración semicuantitativa. La información pronóstica para la mama y los tumores de músculo liso ha mejorado con una técnica más rigurosa para contar las mitosis, aunque conserva el uso de campos de alto poder. Ahora existen pautas en cuanto a los CAP a examinar y el área de la muestra bajo evaluación. También

se observa considerable variación del tamaño de los CAP entre diferentes microscopios, por lo que es importante citar el área del CAP utilizada para efectuar la cuenta mitótica. Con apego a estas pautas generales se ha alcanzado una reducción considerable de la variabilidad del observador. Si se utiliza una valoración semicuantitativa, es importante recordar que tan sólo se trata de una estimación y que los resultados no deben ser tan precisos; en condiciones normales es suficiente el uso de cuartiles. La ventaja con este tipo de evaluación radica en que puede hacerse con bastante rapidez para el conjunto de la muestra que se evalúa, sin la necesidad de definir el área del corte examinada. Si es apropiado, una medida de intensidad de la tinción puede combinarse con la proporción de células teñidas para suministrar un registro total. En el cuadro 8-l se muestra una comparación directa de los diversos métodos de evaluación y el tiempo que toman la técnica y la evaluación para marcadores establecidos.

Controles Como en cualquier técnica, es importante tener controles durante el procedimiento. No sólo se necesitan las muestras de control metodológico sino también deben realizarse revisiones para asegurar la consistencia de la demostración y la evaluación de los marcadores entre las muestras. El material de control debe siempre incluirse al demostrar un marcador de proliferación. Las mismas muestras de control deben utilizarse a través de un estudio para supervisar la consistencia del interanálisis. Los controles internos, cuando se conocen los patrones de la tinción de los elementos específicos del tejido, también son muy útiles para constatar la calidad de la demostración. Pueden emplearse también para hacer ajustes al “registro” cuando los cortes son más gruesos (y por lo tanto la tinción es más intensa) o cuando el método de fijación es subóptimo. La reproducibilidad del procedimiento de evaluación también debe incluirse como parte del aspecto del “control de calidad” de cualquier estudio o caso individual. Si se introduce un marcador o un método de evaluación nuevo, o bien no se ha determinado antes la actividad proliferativa, entonces un “evaluador” experimentado debe realizar la valoración. La comparación de los datos de ambos asesores proporciona una guía para la variabilidad entre un clínico y otro. Cualquier valor discordante se puede reexaminar con la consulta común. Las habilidades del evaluador tienden a mejorar con la práctica; por lo tanto, lo que se determina al principio de un estudio debe repetirse al final para asegurar que el resultado es el mismo y que el método de evaluación ha permanecido consistente.

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MÉTODO DE EVALUACIÓN

Cuadro 8-1 Comparación del tiempo consumido para demostrar y evaluar diferentes marcadores de la actividad de proliferación

Marcador Métodos de conteo Mitosis pKi67/mKi67/MIB1/KiS5 KiS1 PCNA IMT IMB Histona 3 de mRNA AgNOR Métodos automatizados Fracción de fase S (citometría de flujo) Métodos de análisis de imagen pKi67, MIB1 AgNOR

Método de evaluación

Tiempo para la técnica

Mitosis/10 CAP Mitosis/2 000 células Núcleos positivos/1 000 células Núcleos positivos/1 000 células Núcleos positivos fuertes/2 000 células Núcleos marcados/2 000 células Núcleos positivos/2 000 células Núcleos positivos/2 000 células Número medio/100 células

Tiempo para la evaluación (minutos)

5 minutos 5 minutos 2 horas

5 15 5-10

2 horas 10 a 14 días 3 horas 24 horas 15 a 45 minutos

15-20 15-20 15-20 15-20 20-35

Cantidad de tinción nuclear/ célula en > 10 000 células

2 a 3 horas

>5

Porcentaje de tinción positiva en relación con todos los no positivos en un área seleccionada Área media de AgNOR que ocupan núcleos en 150 células

2 horas

15-20

15 a 45 minutos

15-20

Ahora existen diversos sistemas automatizados de análisis de imagen disponibles en el comercio, con los programas específicos diseñados para detectar y cuantificar marcadores de proliferación relacionados con Ki67. Por otra parte, éstos pueden adaptarse para el uso con cualquier antígeno nuclear detectado por medios inmunohistoquímicos. La evaluación de los marcadores de proliferación puede ser más exacta y confiable con la ayuda de sistemas automatizados, y la evaluación de AgNOR se ha beneficiado en particular del análisis semiautomatizado. Los AgNOR son en extremo difíciles de contar con grado de confiabilidad y su valor de proliferación se ha objetado. La medición del área media total de sedimentación de plata por núcleo mediante el análisis de imagen muestra una relación constante con la actividad proliferativa medida por otros medios y ha mejorado de modo considerable la credibilidad de los AgNOR. El reconocimiento de células individuales en una sección histológica es todavía una tarea difícil para un analizador de imagen y para distinguir una célula débilmente inmunoteñida positiva de una célula negativa; aunque parezca fácil para el ojo humano, es difícil para un sistema de análisis. Si una pieza se toma a través de una esfera, por ejemplo cuando se secciona un núcleo, entonces los bordes internos de la esfera son menos densos que las áreas centrales. Si esto se considera en el contexto de un núcleo teñido por medios inmunohistoquímicos, el núcleo

posee una intensidad de color reducida en la periferia, que puede ser difícil de distinguir del citoplasma sin teñir. Infortunadamente, los programas que pueden reconocer las diversas características vinculadas con los núcleos que experimentan mitosis todavía no están disponibles. Uno de los problemas principales que debe superar la progresiva adopción de los métodos automáticos de evaluación es la necesidad de romper con la idea de que el análisis de imagen debe proporcionar la información en un formato idéntico al de una valoración visual. En varios estudios, en los cuales los “marcadores” inmunohistoquímicos han demostrado ser útiles en términos del pronóstico, los sistemas del análisis de imagen compararon áreas de color. Por ejemplo, en cada CAP o área específica marcada, el analizador compara el área total de marrón, que revela DAB de un anticuerpo relacionado con la proliferación, con el área total de azul, que muestra los núcleos teñidos con hematoxilina. Estos parámetros se miden dentro de esas áreas seleccionadas y la actividad proliferativa resultante se muestra por el cociente del área total del marcador de la proliferación en relación con el área total de los núcleos. A condición de que sólo los grupos de células malignas se seleccionen, algunos sistemas de análisis transforman los resultados para presentarlos en una forma convencional, es decir, como porcentaje de células positivas.

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CAP. 8

MARCADORES DE PROLIFERACIÓN EN HISTOPATOLOGÍA

Conclusión La confusión inicial que padecen los principiantes en la medición de la actividad proliferativa puede remediarse con facilidad si se considera cada aspecto del procedimiento a un tiempo. En primer lugar, algunos de los marcadores, como TLI o mKi67, pueden descontinuarse si los tejidos de interés están fijados e impregnados en parafina. La elección del marcador también depende de los recursos disponibles en el laboratorio. Los proyectos específicos, con un número limitado de casos, pueden emprenderse a menudo junto con un laboratorio con instalaciones especializadas. Esto permitiría aplicar métodos como el análisis citométrico de flujo o la autorradiografía con timidina marcada. Sin embargo, si la medición de la proliferación es una necesidad continua, entonces el tipo de método usado para detectar las células que proliferan debe satisfacer al propio laboratorio. Por esta razón se observa una inclinación por los métodos “morfométricos” más convencionales, como las mitosis y AgNOR o los métodos inmunohistoquímicos, para utilizarse en laboratorios de histopatología. Los mejores métodos para medir la actividad proliferativa en cortes histológicos se basan aún en el examen de la proporción de mitosis o células que expresan MIB1. Ambos están bien documentados en diversos trastornos, son fáciles de demostrar en términos técnicos, y siempre que las muestras estén bien preparadas, son relativamente fáciles de determinar. También suministran resultados reproducibles que se comparan bien con otros métodos más laboriosos o dependientes de una máquina, como el IMT y la citometría de flujo. Persiste la gran discusión acerca de cómo las mitosis y el MIB1 sirven como marcadores de la actividad proliferativa. Las mitosis demuestran sólo una parte relativamente pequeña del ciclo celular y a partir de la cuenta mitótica o índice mitótico resultante ninguna inferencia puede hacerse alrededor del resto del ciclo celular; empero, no hay problemas con la falta de especificidad con este marcador. El MIB1 identifica una proteína presente a lo largo del ciclo celular, aunque algunas células no expresan el antígeno con rapidez en G1 y este efecto representaría de modo equívoco la actividad proliferativa en esos tejidos particulares. Al igual que la detección de muchas proteínas expresadas durante el ciclo de la célula, el MIB1

puede también detectarse si la célula ha dejado apenas el ciclo celular. Se han realizado algunos intentos por desarrollar nuevos marcadores, en particular anticuerpos, para superar algunos de los problemas de especificidad. Estos marcadores novedosos deben proporcionar datos de la proliferación y el pronóstico, más allá de lo que proporcionan las mitosis o el MIB1 si se aceptaran como alternativas viables. Un desarrollo reciente consiste en que la mayoría de los antígenos relacionados con el ciclo celular, que alguna vez se evaluaron como marcadores de proliferación, ahora se han examinado por su potencial como blancos relacionados con terapias. Al parecer, el debate de la evaluación continuará durante algún tiempo más. Por ejemplo, las mitosis se han reconocido como marcadores de proliferación por décadas y aún se promueven nuevos métodos “mejorados” de evaluación. Empero, no debe olvidarse que una vez que se aplica alguno de los criterios de evaluación, sin importar cuál sea el método de valoración elegido, la “regla de oro” consiste en ser consistentes entre un caso y otro. Por supuesto, el análisis automatizado mejora la exactitud y la consistencia al cuantificar algunos marcadores de proliferación, pero todavía no es conveniente para todos los casos. Mientras tanto, pueden obtenerse resultados suficientemente exactos mediante una cuenta formal o una evaluación semicuantitativa, siempre que se practique una técnica consistente y se utilicen los controles adecuados.

Lecturas adicionales Baak JPA. Mitosis counting in tumors. Hum Pathol 1990; 21: 683-685 Rüschoff J, Plate KH, Contractor H et al. Evaluation of nucleolus organizer regions (NORs) by automatic image analysis: a contribution to standardization. J Pathol 1990; 161: 113-118. Cattoretti G, Becker MHG, Key G et al. Monoclonal antibodies against recombinant parts of the Ki67 antigen (MIB-1 and MIB-3) detect proliferating cells in microwave-processed formalin-fixed paraffin sections. J Pathol 1992; 168: 357-363. Quirke P. Flow cytometry in the quantitation of DNA aneuploidy and cell proliferation in human disease. In JCE Underwood (ed.) Current Topics in Pathology—Pathology of the Nucleus. 1990: Springer-Verlag, New York, 215-256.

SECCIÓN 2

CITOLOGÍA

9 Citopatología Adrian T Warfield

El capítulo proporciona una sinopsis de los principios generales de la citopatología diagnóstica. Éste es, en buena medida, un tema visual y por lo tanto se incluyen abundantes ejemplos e ilustraciones. No es de ninguna manera un tratado técnico o diagnóstico. Para la cobertura sistemática y detallada se remite al lector interesado a consultar uno de los trabajos de referencia, algunos de los cuales se enumeran en la parte final de este capítulo.

Introducción La citología es el estudio científico de la estructura y la función celulares. La citopatología es una rama de la medicina de laboratorio relacionada con el examen de células, en la salud y la enfermedad, para propósitos de exploración, diagnóstico e investigación. La exploración implica la revisión de las muestras de individuos asintomáticos para detectar cambios premalignos o malignos tempranos. El trabajo diagnóstico supone la valoración del material de los pacientes con signos o síntomas establecidos de enfermedad. Es una premisa básica que el contenido de una muestra de la citología debe representar de forma exacta y reproducible la población celular del tejido o la lesión. En realidad, un buen número de variables de confusión atenta algunas veces contra esta suposición en mayor o menor grado. Una cuidadosa valoración citomorfológica por microscopia de luz es fundamental para la práctica de la citopatología de diagnóstico y mucha información se deriva de la comparación directa de las muestras celulares con las muestras histológicas correspondientes. Sin embargo,

ciertas limitaciones son inherentes en tales estudios de extrapolación, incluso en muestras apropiadas, bien preservadas y teñidas. El cultivo celular utiliza líneas de células inmortalizadas para detectar efectos citopáticos víricos y otros tóxicos. Esto y las novedosas técnicas especializadas de microscopia, microaspiración y microdisección permiten el discernimiento en la fisiología dinámica del protoplasma vivo. No obstante, en la actualidad éstas se consideran marginales en la citopatología diagnóstica corriente y se reservan por lo regular para el trabajo de diagnóstico o investigación de virus.

Tipos de muestra citológica La mayor parte de las muestras clínicas de la citología procede de uno de los procesos siguientes.

Exfoliación Las células muestreadas se toman (exfoliadas) de una superficie epitelial. Los ejemplos incluyen las células presentes en esputo (expectorado), orina (expulsada o mediante catéter o cistoscopio) y secreción del pezón (exprimido) (figs. 9-1 y 9-2). De manera espontánea, las células exfoliadas difieren en su aspecto de las sustraídas por medios mecánicos, que tienden a desagregarse y disponerse de manera individual o en racimos pequeños. Tales células adoptan a menudo una forma esférica, según sean los factores, como la membrana celular, fuerzas citoesqueléticas inhe-

The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker. © 2005 John Wiley & Sons, Ltd.

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CITOPATOLOGÍA

Figura 9-1 Muestra de esputo. a) Esputo mucoide teñido con sangre obtenido por aspiración directa (“trampa de esputo”). Esto ofrece menos contaminación por secreciones bucofaríngeas que una muestra expectorada. b) Las células epiteliales bronquiales y los macrófagos alveolares pulmonares indican un muestreo más bajo de las vías respiratorias. Las barras terminales y las microvellosidades superficiales se pueden ver en los ápices de las células bronquiales en medio de un fondo mucoinflamatorio ralo (Pap, 250 ).

rentes, tensión de superficie, naturaleza del microambiente local y tiempo transcurrido desde la obtención. Tales células son susceptibles a una serie de cambios degenerativos que alteran al citoplasma y al núcleo, como se delinea más adelante. Abrasión

Figura 9-2 Células transicionales superficiales normales en orina. Estas células uroepiteliales exfoliadas muestran multinucleación variable correspondiente a “células en paraguas” en cortes histológicos. Obsérvese el fondo sin rellenar (“limpio”) (Pap, 100 ).

Las muestras celulares son el resultado del muestreo de células a partir de la exfoliación por fuerza física (abrasión). Ejemplos: cepillado (p. ej., bronquio, cervix), raspado (p. ej., pezón, piel, cervix) o lavado (p. ej., bronquio); en tales casos se instila una solución salina isotónica y el líquido reaspirado se somete a revisión. En contraste con las células exfoliadas de forma natural, estas células tienden a conservarse mejor, a menudo en grupos más grandes o agregados cohesionados.

TIPOS DE MUESTRA CITOLÓGICA

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Figura 9-3 Aspirados pleurales malignos. a) Muestra teñida con sangre de un derrame pleural unilateral en un paciente sometido a mastectomía por carcinoma de mama. La microscopia (b y c) demuestra las células pleomórficas sin cohesión del adenocarcinoma; muchas tienen una morfología de “sello anular” con abundante mucina intracitoplásmica a la que indenta el núcleo periférico (b, Pap, 100 ; c, MGG, 100 ).

Aspiración Existen pocos órganos o sitios del cuerpo que representan un acceso difícil para recoger con aguja cierta clase de material celular para su examen. Las técnicas radiológicas de proyección de imagen pueden ayudar a localizar pequeñas lesiones profundas y móviles que de otra manera es difícil delinear. Las células se obtienen a través de una aguja, con o sin aspiración, de una cavidad llena de líquido o un tejido sólido. Son ejemplos los tumores, los líquidos pericárdico, pleural o peritoneal (paracentesis) y cefalorraquídeo (punción lumbar o cisternal) y el humor vítreo (figs. 9-3 y 9-4). La aspiración con aguja fina utiliza un instrumento de calibre fino (19 a 25) unido con firmeza a una jeringuilla y se introduce en una lesión. El émbolo de la jeringuilla se retira de modo parcial, de tal manera que se crea un vacío y se aspiran las células de la lesión. Hay que realizar varios movimientos en diferentes direcciones a través de la lesión mientras dura la aspiración para aumentar la recolección celular. Al término de esto, el émbolo se libera para

igualar la presión anterior a la extracción de la aguja de la lesión. Varios accesorios para “tomar la pistola”, diseñados para facilitar la sujeción con una sola mano, están disponibles en el comercio (la mano opuesta se libera para la palpación; fig. 9-5). Algunos clínicos prefieren el muestreo por aguja sin aspiración para las lesiones localizadas en un plano superficial. La aspiración con aguja fina ha ganado gran aceptación, en gran parte porque es económica, rápida y mucho menos traumática y, por lo tanto, se tolera bien con pocas complicaciones y contraindicaciones. Las lesiones percutáneas casi nunca requieren anestesia local. Las vías transrectal, transvaginal, transpleural y transperitoneal mediante un endoscopio también pueden aspirarse. Las aspiraciones de la médula ósea son el campo del hematopatólogo de diagnóstico. El fracaso para obtener una aspiración satisfactoria no es atribuible en todos los casos a una técnica deficiente. Las lesiones desmoplásicas, hialinizadas o vasculares, la necrosis extensa, el cambio cístico o la hemorragia pueden imposibilitar el muestreo celular adecuado (fig. 9-6).

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CITOPATOLOGÍA

Figura 9-4 Líquido ascítico. a) Alícuota de líquido ascítico turbio y maloliente, aspirado de un paciente con peritonitis fecal poco antes de morir. Las microscopias b y c muestran innumerables bacterias variformes con células de pus. El detrito y el pigmento son de origen estercoráceo (b, Pap, 100 ; c, MGG, 100 ).

Tumor viable

Inflamación perilesional

Necrosis y cambios quísticos

Figura 9-5 Accesorio de la pistola para la aspiración con aguja fina. Preparación de la jeringuilla desechable cargada con la aguja de calibre 23; este dispositivo permite la manipulación con una sola mano, de manera que se libera la otra mano para la palpación.

Hemorragia intralesional

Figura 9-6 Diagrama esquemático de un tumor durante la aspiración con aguja fina. La porción sólida viable del tumor se perfora con la aguja 1 para proporcionar el material potencialmente diagnóstico; la aguja 2 cruza áreas con necrosis, hemorragia o cambios quísticos; la aguja 3, que recoge muestras de tejido perilesional, es poco probable que se utilice de esta manera.

TÉCNICAS DE CONCENTRACIÓN CELULAR

Técnicas para la preparación de frotis El frotis ideal debe extenderse sin relieves, de modo uniforme, fino y liso, para permitir un secado y una fijación rápidos y facilitar la penetración óptima del colorante. Las técnicas directas para preparar un frotis implican extender el material fresco a través de un portaobjetos, mediante otro portaobjetos, instrumento punzante o espátula (fig. 9-7). Las técnicas indirectas para preparar un frotis emplean el material suspendido en líquido, por ejemplo una solución salina o medio de transporte. Puede realizarse un procedimiento de concentración celular como un paso intermedio para aumentar el rendimiento de una muestra hipocelular. La formación de un coágulo puede retener en gran medida el componente celular de una muestra y ello impide la transferencia adecuada del material a un portaobjetos. Si un coágulo no se puede dispersar por medios mecánicos, debe procesarse como bloque celular o someterse a una histología convencional y examinarse a fondo (fig. 9-8). Los depósitos celulares de trasudados, lavados con solución salina y de orina pueden no adherirse bien a los portaobjetos de cristal. Los adhesivos, casi siempre del tipo proteínico (p. ej., albúmina de suero bovino) o iónico (p. ej., poli-l-lisina), pueden efectuar la adherencia y maximizar el material celular para el examen. Otras técnicas empleadas menos comunes incluyen las impresiones de tacto, el raspado y las preparaciones concentradas; esta última tiene aceptación en el diagnóstico neuroquirúrgico preoperatorio y se prefiere a la histología convencional en cortes congelados.

Fijación de la muestra

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sobre el portaobjetos, más que de forma pasiva. Este método tiende a aplanar las células con un alargamiento evidente en comparación con la fijación húmeda (figs. 9-9 y 9-10). Las preparaciones secadas al aire se fijan después casi de manera invariable en metanol luego de secarse para prevenir peligros de infección cruzada. Los materiales como el líquido de quiste o de lavados con aguja fina por aspiraciones pueden recogerse en un medio de transporte. Debe recordarse que cualquier muestra biológica fresca constituye un peligro biológico potencial para el personal del laboratorio y deben acatarse siempre las medidas recomendadas de salud y de seguridad.

Técnicas de concentración celular Centrifugación Este método es aconsejable para muestras voluminosas, como los derrames serosos, orina o muestras lavadas con solución salina. Citocentrifugación La citocentrifugación utiliza alícuotas pequeñas de esputo líquido sobre el portaobjetos del microscopio para formar una monocapa localizada de células (figs. 9-11 a 9-13). Es aconsejable para muestras de poco volumen con celularidad moderada; no obstante, parte del material se pierde de modo inevitable dentro de la tarjeta del filtro. Las muestras viscosas o celulares son inapropiadas.

Fijación húmeda

Filtración con membrana

La fijación húmeda deshidrata el protoplasma y coagula las proteínas, casi siempre con empleo de un líquido basado en alcohol, sea por inmersión o cobertura. Tal fijación induce un grado de contracción celular en la preparación final. El líquido de Carnoy lisa de forma selectiva a los eritrocitos y puede ser provechoso en muestras teñidas de sangre con intensidad. Otros fijadores, como el glutaraldehído o la formalina, pueden preferirse bajo ciertas circunstancias. El glicol de polietileno en alcohol proporciona una capa cerosa protectora para el envío postal, que debe eliminarse antes de una tinción subsiguiente.

La presión positiva o la filtración al vacío se emplean con varios tipos de filtro y un poro de tamaño predeterminado, por ejemplo acetato de celulosa o policarbonato. Es conveniente para una amplia gama de muestras de gran volumen o líquido hipocelular y permite obtener mayor captura de células que los métodos de centrifugación.

Secado al aire El secado al aire se basa en la evaporación, que debe ser rápida, y se facilita con el movimiento del aire forzado

Preparación del bloque celular Las células se agrupan en un estado parecido a un tejido que permite cortar las secciones de forma similar a como se hace en la histología convencional. Los métodos incluyen coagulación con trombina plasmática y plasma y el bloque celular con agar caliente. Son convenientes para la mayor parte de las suspensiones celulares y hacen posible una tinción especial, incluida la inmunocitoquímica.

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CITOPATOLOGÍA

Figura 9-7 A, Técnica directa para la preparación de frotis para muestras mucoides. a) Una gota de la muestra se aplica sobre un portaobjetos. b) Un segundo portaobjetos se coloca encima con ligera presión para extender el líquido de manera uniforme. c) Los portaobjetos se separan en un solo movimiento y se fijan de inmediato. d) Un método alternativo consiste en extender la muestra tan uniformemente como sea posible con un instrumento agudo o una espátula. B, Método de la película de sangre para muestras no mucoides. a) Se aplica una gota de la muestra a un portaobjetos. b) Un portaobjetos esparcidor se desliza hacia la muestra. c) El frotis se realiza con suavidad. d) Los agregados celulares tienden a distribuirse hacia la periferia y el extremo del frotis. C, Método de la presión para muestras no mucoides. a) Una gota de la muestra se aplica a un portaobjetos. b) Un portaobjetos esparcidor se coloca encima de éste y con presión uniforme al extender el frotis. c) Los agregados celulares tienden a distribuirse de modo uniforme en toda la preparación.

TÉCNICAS DE CONCENTRACIÓN CELULAR

Figura 9-8 Tumor mucinógeno benigno del ovario. Este coágulo de fibrina secuestra virtualmente todo el epitelio aspirado del líquido de este ovario quístico. Las citopreparaciones correspondientes consistieron casi en forma exclusiva de sangre y, en el aislamiento, se juzgaron poco satisfactorias para propósitos diagnósticos. Esto ilustra la importancia de examinar cualquier coágulo presente en líquidos aspirados (H-E, 25 ).

Citología basada en líquido La depuración de las técnicas anteriores para el procesamiento y preparación de muestras citológicas ha sido graCitoplasma Núcleo

Figura 9-9 Efecto de la fijación húmeda y el secado al aire sobre las células. a) Una célula desmontada en solución adopta a menudo una forma esférica. b) La célula se coloca sobre un portaobjetos y se aplana de manera parcial. c) Al final, la fijación húmeda contrae en cierto grado a la célula. d) El secado al aire causa aplanamiento y extensión de la célula con el alargamiento evidente en su estado final. Una célula esférica puede presentar un diámetro dos veces mayor respecto de su tamaño original, mientras que una célula escamoide madura revela poco aumento evidente de tamaño.

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dual durante un largo periodo. No obstante, las mayores expectativas en años recientes condujeron a la revaloración de muchos aspectos de la metodología tradicional, sobre todo en busca de formas de aplicar los últimos avances tecnológicos. La citología basada en líquido se ha desarrollado al margen del deseo de aumentar la sensibilidad y la especificidad de la citología, como una modalidad de investigación y diagnóstico. En la actualidad están disponibles varios sistemas basados en manuales específicos del fabricante, protocolos semiautomatizados o por completo automatizados. Pese a ello, los principios de operación son muy similares, con el objetivo de que se produzca una muestra homogénea, más limpia y plana, que cubra un área más pequeña del portaobjetos. Esto facilita un examen más fácil y rápido, con una atenuación concomitante de la frecuencia de muestras insatisfactorias. La tecnología se ha adaptado con éxito en ginecología y otras áreas médicas. Por lo general, las muestras se recolectan de la manera usual y se transfieren dentro del líquido especificado de transporte o preservación para formar una suspensión celular. Algunos sistemas emplean cepillos o escobas patentados, que agitan el líquido, con lo cual se asegura la obtención de la muestra completa, mientras que otros utilizan un procedimiento de depuración para recolectar la población celular designada. En el laboratorio, el material se procesa para eliminar el exudado sanguíneo, inflamatorio y proteínico. Una alícuota de la suspensión se deposita al final como una capa fina y uniforme sobre un portaobjetos de cristal. La dispersión uniforme, la buena preservación de la célula, la célula constante que se tiñe, el detalle microscópico mejorado y la disminución de artefactos se comparan de manera favorable con los frotis preparados por técnicas convencionales. Todas las capas y grupos de la célula tienden a ser más pequeños y hay menos imprecisión por los elementos de fondo. El método ThinPrep (Cytyc Corporation) emplea un tubo de plástico desechable abierto y forrado con un filtro. La muestra se recolecta en un medio que contiene metanol y se centrifuga. Una muestra del centrifugado celular se transfiere entonces a un líquido preservador que contiene metanol. Hay tres etapas principales más de la preparación: primero, dispersión celular, en la cual la máquina inserta el tubo filtrador en el vial de la suspensión celular y lo agita para dispersar mucosidad y cualquier agrupación celular; segundo, recolección celular, en la que un pulso leve de vacío desplaza el líquido hacia el tubo a través del filtro, sobre el cual se deposita una capa de material celular; un poco de sangre, células inflamatorias y detritos celulares pueden pasar a través del filtro y el flujo del líquido se vigila para optimizar la captación celular; tercero, transferencia celular, cuando el tubo del filtro se invierte y se presiona con suavidad contra un portaobjetos cargado en sentido

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CITOPATOLOGÍA

Figura 9-10 Células apocrinas metaplásicas de un quiste de mama. Estas células epiteliales benignas estaban presentes en el líquido de un quiste e ilustran la naturaleza complementaria de las tinciones de Papanicolaou y May-Grünwald-Giemsa. La disparidad evidente en el tamaño de las células en la ampliación idéntica es por las fijaciones húmeda y seca, respectivamente (a, Pap, 50 ; b, MGG, 50 ).

electrostático. El portaobjetos se sumerge inmediatamente en el fijador y queda listo para la tinción subsiguiente, manual o automatizada. El procedimiento completo es relativamente rápido, menor de 30 minutos, y requiere poco tiempo técnico. El área de la sedimentación celular mide 1.9 cm de diámetro y contiene alrededor de 100 000 células. El método SurePath Prep (TriPath Imaging Inc.) comienza con la recolección de la muestra en un medio con etanol. En el laboratorio se agita el vial para dispersar las células y la suspensión experimenta una fase de enriquecimiento celular mediante centrifugación por gradiente de densidad. Esto también elimina la sangre y otros detritos contaminantes. Se elimina el líquido sobrenadante, el sedimento celular se suspende de nuevo y se centrifuga por segunda vez. Una alícuota del sedimento celular se transfiere entonces por medios robóticos a un compartimiento de asentamiento,

donde las células se sedimentan por gravedad para crear una capa delgada en un portaobjetos de microscopio cubierto con poli-l-lisina. La máquina tiñe a continuación los portaobjetos de modo automático. Este proceso toma alrededor de 60 minutos y requiere un grado de intervención manual. El depósito circular mide más o menos 1.3 cm de diámetro e incluye alrededor de 100 000 células. El método de citoexploración es un proceso manual que se basa en la fotometría para evaluar la celularidad de la suspensión celular antes de la centrifugación sobre un portaobjetos de cristal. El Labonard Easy Prep es otro método manual en el que una alícuota de líquido de la muestra se carga en un compartimiento de separación unido a un portaobjetos de cristal, que contiene papel absorbente. Las células se colocan en una capa delgada y la preparación se tiñe mediante procedimientos normales de laboratorio.

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MÉTODOS DE TINCIÓN

Tarjeta de filtro

Suspensión celular

Portaobjetos de vidrio

Dirección de la fuerza centrífuga

Burbuja de aire Cámara para la muestra

Figura 9-13 Diagrama esquemático del montaje de la citocentrífuga. La fuerza centrífuga conduce la suspensión celular a través de la tarjeta del filtro y sobre el portaobjetos de cristal. Esto es inconveniente para las muestras mucoides.

Figura 9-11 Una moderna máquina citocentrifugadora.

La citología basada en medio líquido no utiliza la muestra completa y en consecuencia ofrece la oportunidad de efectuar procedimientos con pruebas auxiliares, por ejem-

Figura 9-12 Componentes de la cámara citocentrífuga. Cámara de aspiración, tarjeta del filtro, portaobjetos de vidrio y gancho del resorte antes del ensamblaje.

plo hibridación in situ o técnicas de captación híbridas para detectar virus del papiloma humano u otros agentes infecciosos. Las preparaciones son tan favorables respecto de otros procedimientos de tinción, como la inmunocitoquímica, como las técnicas convencionales, con la ventaja adicional de que el fondo limpio es menos susceptible de teñirse en falso. En ciertas muestras no ginecológicas, en que la pérdida de material del fondo y la variación de las características estructurales pueden ser un problema, los procedimientos basados en medio líquido se pueden emplear junto con técnicas tradicionales como un complemento útil.

Métodos de tinción Muchas técnicas aplicadas a los cortes tisulares se pueden también realizar sobre las citopreparaciones. En general, la tinción de Papanicolaou se emplea para el material fijado en húmedo. El patrón diferencial de tinción es útil para muestras ginecológicas y no ginecológicas y permite periodos prolongados de microscopia con una tensión mínima del ojo. Las tinciones de Romanowsky (May-GrünwaldGiemsa [MGG], Diff Quik, etc.) se realizan casi siempre en preparaciones secadas al aire y son favorables para ambas técnicas, automáticas y manuales rápidas. Este método se emplea sobre todo en material no ginecológico. La tinción con hematoxilina y eosina es mucho más común en cortes histológicos convencionales. Puede utilizarse una amplia variedad de tinciones histoquímicas auxiliares, como se indicó antes. Los ejemplos incluyen al ácido peryódico de Schiff, con o sin predigestión con diastasa de las mucosustancias neutrales y glucógeno, tinciones tricrómicas, tinciones de Ziehl-Neelsen, Gram y metenamina de plata de Grocott, entre otras más.

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CAP. 9

CITOPATOLOGÍA

Figura 9-14 Linfoma no Hodgkin de grado bajo. a) Este aspirado de humor vítreo del ojo contiene innumerables linfocitos, moderadamente pleomórficos e inmaduros, con cantidades variables de citoplasma (MGG, gran potencia). b) La inmunocitoquímica confirma reactividad extendida de CD45 (antígeno común del leucocito) (inmunoperoxidasa, gran potencia).

El repertorio de técnicas inmunocitológicas es comparable al de las utilizadas en muestras tisulares. La inmunocitoquímica puede ser inestimable para comprobar la presencia de microorganismos o demostrar la diferenciación celular del tumor (fig. 9-14).

Citodiagnóstico El procedimiento citodiagnóstico es un proceso complejo. La consecución de una conclusión depende de muchos factores, entre ellos el conocimiento del sitio específico detallado junto con la experiencia de la normalidad, la familiaridad con los aspectos múltiples de muchos procesos patológicos, el conocimiento de simuladores y artefacto y la conciencia de las limitaciones de la técnica, además de los detalles específicos del paciente y el contexto clínico (véase el cuadro 9-1).

El material abundante y bien preservado siempre produce la mejor oportunidad de alcanzar un diagnóstico definitivo. Sin esta información de fondo, la citopreparación está en peligro de convertirse en un artefacto de dos dimensiones, teñido y brillante, que puede ser tan engañoso como útil. Algunas veces puede ser mejor establecer un diagnóstico morfológico inicial “a ciegas” a partir de los primeros principios para evitar un sesgo preconcebido. Esto puede modificarse, si se consideran tales variables como apropiadas, antes de determinar un diagnóstico y formular cualquier consejo sobre el próximo control del paciente. En condiciones normales, una citopreparación es una mezcla compleja de componentes en proporciones que varían, según sean el tejido o la lesión muestreadas. Las células normales y anormales pueden estar presentes y hay que determinar de manera sistemática el contenido, la disposición y la distribución celular dentro de una muestra.

CITOMORFOLOGÍA

Cuadro 9-1

Variables que pueden modificar la interpretación final de una citopreparación

Detalles específicos del paciente

Detalles específicos del sitio

Población celular

Citomorfología

Información auxiliar

Edad y sexo Estado hormonal, como embarazo Impresión clínica Tratamientos previos, como radioterapia, operación Material previo, como histología, citología Otras pruebas de laboratorio Conocimiento de la anatomía local Características radiológicas Conocimiento de los errores y simulaciones Limitaciones técnicas Grado de celularidad Células presentes, como población bifásica o única Poblaciones ajenas o naturales Morfología normal o anormal Antecedentes Distribución y cohesión celulares Morfología de la célula individual Microscopia electrónica Tinciones histoquímicas Inmunocitoquímica Análisis de imagen Citometría de flujo Citogenética

No todas las características son relevantes para cualquier muestra particular.

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vos secundarios a la influencia hormonal, el envejecimiento o la degeneración, como en la apoptosis. No hay un solo criterio citomorfológico o grupo limitado de criterios que por sí mismos permitan una distinción confiable entre las condiciones biológicamente benignas y malignas bajo todas las circunstancias. Las diferencias citonucleares entre las células regeneradoras o hiperplásicas y las células neoplásicas de grado inferior pueden ser sutiles y en ocasiones indistinguibles. Los cambios posteriores a la radioterapia o quimioterapia, los víricos y otros pueden inducir aspectos que imitan en sumo grado los observados en la neoplasia (fig. 9-15).

Figura 9-15 Atipia de radiación en un frotis de la bóveda vaginal. Células escamosas gigantes anormales (“macrocitos”) después de la radioterapia. Cambios extraños similares pueden aparecer tras la quimioterapia y acompañan a la deficiencia de vitamina B12 o folato y pueden ocurrir en los condilomas víricos. Obsérvense la multinucleación y el aumento en ambas áreas, nuclear y citoplásmica. Las células inflamatorias del fondo y las escamas superficiales son características útiles de referencia (Pap, 100 ).

Citomorfología Celularidad de la muestra Gran parte de la carga del trabajo diagnóstico en la mayoría de los laboratorios se preocupa en diferenciar entre lesiones no neoplásicas, preneoplásicas y neoplásicas. Las células normales se caracterizan por su uniformidad morfológica. La morfología nuclear refleja el estado de proliferación de una célula y su capacidad reproductiva. El citoplasma de una célula casi siempre ofrece una indicación de su origen, estado funcional y grado de diferenciación. La actividad creciente de la célula puede ser fisiológica, como en la hiperplasia, debido a la modulación hormonal, o reconstructiva y regeneradora en respuesta al daño. Un estado de proliferación anormal y descontrolado implica un proceso neoplásico. La disminución de la actividad de la célula puede también ser fisiológica debido a la atrofia, los cambios involuti-

El número y el tipo de células proporcionan información importante sobre el tejido designado. Ambos están sujetos a factores lesionales y no lesionales, en especial el método de muestreo empleado. Por lo general, la hipercelularidad incrementa el índice de sospecha para un proceso proliferativo, hiperplásico o neoplásico. No obstante, de modo inverso, la hipocelularidad no es en todos los casos una característica inocua, debido que la ausencia de células anormales no excluye de ninguna manera una afección grave. Las neoplasias de grado inferior pueden exfoliarse apenas y producir células que muestran una desviación mínima de la normalidad. Una escasez de material adecuado puede ser un factor limítrofe crucial en el grado de confianza de la interpretación de una muestra.

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CAP. 9

CITOPATOLOGÍA

Modelos de citoestructura Con frecuencia no se reconocen en las citopreparaciones muchos de los indicios estructurales presentes en cortes histológicos convencionales. Las acumulaciones más grandes de células (microbiopsias), si bien presentes, a menudo reproducen el modelo histológico del tejido designado (fig. 9-16). El epitelio normal de muchos sitios se caracteriza

Figura 9-16 Glándula parótida normal. Este aspirado con aguja fina contiene una “microbiopsia” que comprende tejido conjuntivo adiposo sumamente mezclado con el tejido secretor acinoso normal de un sujeto de mediana edad (Pap, 80 ).

por conservar la polaridad y la cohesión intercelular. El epitelio glandular produce con regularidad hojas dispuestas en monocapa; éstas, cuando se observan de frente, ofrecen un aspecto de “panal”, y de perfil un modelo en palizada o “vallado” (fig. 9-17a,b). El epitelio hiperplásico y el neoplásico benigno casi siempre conservan también la co-

hesión, pero pueden exhibir un contorno inusual, como una configuración papiliforme, de rosetón o morular. La formación del sincitio con límites celulares mal definidos y alguna orientación errática son sospechosas de neoplasia. Las células epiteliales malignas (carcinoma) se presentan habitualmente como células mal polarizadas, superpuestas, a veces en grupos tridimensionales (esferas de proliferación), con una tendencia a perder cohesión y desagregarse. Las células linfoides normales poseen una cohesión intercelular escasa, al igual que sus contrapartes neoplásicas (linfoma), y el modelo celular dispersado del carcinoma mal diferenciado y el linfoma de grado alto pueden ser indistinguibles sin recurrir a las técnicas auxiliares. Las células estrómicas normales, reactivas o neoplásicas (mesenquimatosas), pueden ser evidentes y los adipocitos, tubos capilares u otros fragmentos del tejido conjuntivo emanan a menudo de un sitio perilesional. Los elementos estrómicos benignos se manifiestan las más de las veces como células ovoides o fusiformes, de pobre cohesión o con núcleos desnudos (células centinelas o bipolares), de acuerdo con las circunstancias particulares. Las células estrómicas malignas (sarcoma) demuestran un modelo similar pero con las características nucleares y citoplásmicas anormales sobrepuestas. Características nucleares Las anormalidades de la morfología nuclear se conocen como discariosis y pueden calificarse como menores o moderadas a graves o bien como de grados alto y bajo según sea el grado de desviación respecto de la normalidad. En la célula diferenciada como terminal normal (madura) el núcleo es relativamente pequeño, en comparación con el volumen

Figura 9-17 Epitelio glandular gástrico normal. a) Las células epiteliales glandulares columnares altas semejan una palizada regular o un “vallado” cuando se ve de perfil. Nótese la polaridad preservada y los núcleos redondos, espaciados con uniformidad, con uno o dos nucleolos pequeños (Pap, 80 ). b) La monocapa del epitelio glandular cohesionado, bien orientada e isomórfica, muestra un modelo de “panal” cuando se observa de frente. Una vez más, están bien delineados los núcleos espaciados de forma regular con nucleolos pequeños ocasionales y el contorno nuclear redondeado (Pap, 40 ).

CITOMORFOLOGÍA

total de la célula, casi siempre de forma redonda u ovoide con un contorno nuclear liso, distribuido de modo uniforme, con cromatina fina y granular y poca variación entre las células de tipo similar (isomórficas o monomórficas). En una citopreparación bidimensional el tamaño nuclear es proporcional al área nuclear relativa y puede expresarse como el índice citonuclear, cociente nuclear:citoplásmico o cuantificarse como un porcentaje. Las células con pobre diferenciación poseen núcleos agrandados (cariomegalia o nucleomegalia) y dado que poseen el mismo volumen citoplásmico absoluto tienen por tanto un cociente nuclear:citoplásmico elevado. La mayoría de las células normales muestra una cromatina nuclear razonablemente homogénea con una distribución fina y granular y una afinidad discreta por los tintes nucleares. El aumento del contenido del DNA nuclear propicia una mayor densidad de tinción nuclear (hipercromasia). La cromatina distribuida de forma irregular con una textura gruesa y rugosa y un envolvimiento nuclear engrosado se denomina carioteca. La variación de tamaño y forma de los núcleos entre las células se llama anisocariosis o anisonucleosis y con el incremento de la anormalidad la membrana nuclear puede ser irregular en el contorno, con estriación, indentación o crenación. La constelación de variaciones anormales de tamaño, forma e intensidad de la tinción nuclear se conoce como pleomorfismo nuclear (fig. 9-18).

Figura 9-18 Carcinoma celular escamoso con pobre diferenciación. Estas células malignas de vellosidades bronquiales son muy pleomórficas, con pobre polarización, y muestran una membrana nuclear con macronucleolación. La queratinización fue más evidente en las biopsias bronquiales acompañantes (Pap, 100 ).

Los núcleos normales pueden contener nucleolos pequeños, discretos y compuestos por RNA y proteínas relacionadas. Se observan multinucleación y macronucleolos en estados de proliferación, neoplásica y no neoplásica. La cromatina degenerativa puede aparecer como una masa densa, contraída (cariopicnosis), con fragmentos densos

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(cariorrexis) o puede experimentar disolución (cariólisis o cromatólisis). La citólisis puede producir remanentes nucleares expuestos o descubiertos, a menudo hipocromáticos, y la fragilidad de la membrana nuclear inherente a algunas células ocasiona fluidez nuclear o artefacto en el frotis. Esto afecta a menudo a las células linfoides o puede ser una característica del carcinoma anaplásico de célula

Figura 9-19 Carcinoma anaplásico celular pequeño en esputo. Las células apenas cohesionadas del carcinoma, en gran parte degeneradas hasta “células de avena”, yacen dentro de una franja mucosa. En algunas, la cromatina finamente dispersa (“sal y pimienta”) es apenas perceptible, al igual que el moldeado nuclear focal. En su mayor parte, poseen citoplasma mínimo con núcleos hipercromáticos y cariopicnóticos. Las escamas superficiales, eritrocitos y linfocitos representan una indicación del tamaño relativo (Pap, 100 ).

pequeña (fig. 9-19). Lo anterior se puede delimitar de modo estrecho por daño vorticoso cuando las células se expulsan a través de una aguja de calibre fino sobre un portaobjetos. La mayoría de las células posee un solo núcleo aunque algunas, que experimentan actividad de regeneración o reparación, por ejemplo hepatocitos y condrocitos, pueden ser binucleadas. Los osteoclastos y sincitiotrofoblastos son casi siempre polinucleados. La multinucleación puede ser una característica de anomalías inflamatorias y neoplásicas (figs. 9-20 y 9-21). Es inusual encontrar mitosis en citopreparaciones. Un incremento del número de mitosis implica proliferación celular y es difícil identificar formas anormales del huso (tripolar, tetrapolar, etc.) en condiciones benignas. Características citoplásmicas La variación del tamaño y forma de células similares se denomina anisocitosis. El volumen citoplásmico de una célula anormal puede ser más grande o pequeño que su contraparte normal, de tal modo que puede influir en el ín-

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CAP. 9

CITOPATOLOGÍA

Figura 9-20 a) Célula gigante de Langhans en la tuberculosis. Esta célula gigante multinucleada en un aspirado con aguja fina es de origen histiocítico. La orientación periférica en “herradura” de los núcleos es característica. Otros tipos de células gigantes pueden observarse en diversos trastornos inflamatorios y neoplásicos (MGG, 250 ). b) Granuloma celular epitelioide en la tuberculosis. Este grupo notoriamente arracimado de histiocitos epitelioides mal definidos del mismo aspirado con aguja fina es evidencia de una reacción granulomatosa. La necrosis fibrilogranular fue obvia en otra parte y se aislaron bacilos resistentes al ácido y el alcohol a partir de una muestra similar (MGG, 100 ).

Figura 9-21 Linfoma de Hodgkin. La célula central de ReedSternberg muestra la binucleación en “imagen de espejo” con macronucleolos de “ojo de búho” evidentes. El fondo variforme de células plasmáticas polimorfas eosinófilas y neutrófilas, linfocitos e histiocitos es típico de esta tumoración (MGG, 100 ).

dice nuclear:citoplásmico, con independencia de cualquier cambio nuclear acompañante. La composición ultraestructural del citoplasma, esto es, la concentración del aparato de Golgi, ribosomas, retículo endoplásmico, mitocondrias y cualquier producto del metabolismo, ejerce una importante influencia en la afinidad de varias reacciones de tinción. Los productos almacenados, como mucina, lípidos, carbohidratos, hormonas o cristaloides, se pueden destacar por tinciones especiales y apropiadas. Los glóbulos de mucina, microvacuolación espumosa, bordes en cepillo de microvellosidades y cilios pueden ser perceptibles en células normales o bien diferenciadas. La queratinización indica diferenciación escamosa y las células extrañas alargadas o caudadas (no isodiamétricas) pueden ser más evidentes que las de formas redondas o poligonales (isodiamétricas) más frecuentes (fig. 9-22). Las células adyacentes pueden mostrar moldeado citoplásmico o, en casos extremos, engullimiento (abrazamien-

CITOMORFOLOGÍA

Figura 9-22 Carcinoma celular escamoso. Esta célula escamosa alargada y anómala (caudada, célula “renacuajo” o “cometa”) posee un núcleo hipercromático agrandado y yace en medio de la diátesis tumoral y remanentes celulares escamosos disqueratósicos degenerados. Algunas veces pueden verse formas similares a una correa (célula de “fibra” o “serpiente”) y naranjófilas brillantes (célula de “zanahoria”) (Pap, 100 ).

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terial teñido de modo intenso con sangre o una respuesta inflamatoria vigorosa, por ejemplo, a menudo ocultan detalles citonucleares de cualquier población celular epitelial, lo cual limita la cantidad de información disponible. Además de los componentes estrómicos del tejido conectivo, señalados con anterioridad, pueden ser perceptibles el material de la membrana basal, la sustancia granulada, mucosidad, cristales, exudado fibrinopurulento, coloides, líquido rico en proteínas o incluso microbiopsias del tejido condroide (fig. 9-24). La mineralización puede manifestarse como depósitos amorfos del calcio o algunas veces como cuerpos de psamoma (fig. 9-25). El tumor invasivo puede vincularse con detritos sanguíneos, necroinflamatorios y de degeneración (diátesis tumoral) (fig. 9-26).

to o canibalismo celular evidente (fig. 9-23a,b). Esto se reconoce en condiciones benignas y malignas, pero es más común en estas últimas. Los cambios citoplásmicos degenerativos incluyen la hinchazón o cambio hidrópico, vacuolación y pérdida de la integridad de la membrana plasmática con derramamiento del contenido celular (citólisis). Entorno y artefactos del fondo El contenido del fondo de una citopreparación puede incluir material de procedencia celular y no celular. Esto puede ser útil para precisar un diagnóstico o un contratiempo. El ma-

Figura 9-24 Sustancia granulada de un adenoma pleomórfico salival benigno. La sustancia granulada mucomixoide fibrilar (“plumosa”) propensa a la tinción de Giemsa casi oculta a las células epiteliales; la sustancia fue mucho menos notoria con la tinción de Papanicolaou (MGG, 125 ).

Figura 9-23 Células mesoteliales reactivas dispuestas de forma individual o en grupos pequeños. Los bordes en cepillo de las microvellosidades son apenas observables alrededor de algunas células. Los espacios intercelulares vacíos (“ventanas”) son una característica habitual. Pueden verse el moldeado nuclear y el engullimiento (abrazamiento o “canibalismo”) celular evidente (a, Pap, 250 ; b, MGG, 250 ).

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CAP. 9

CITOPATOLOGÍA

Figura 9-25 Cuerpo de psamoma. a) Psamocalcificación central que revela un aspecto típico de laminación concéntrica, apenas retráctil, entre un fondo de linfocitos y células sanguíneas rojas (Pap, 250 ). b) Carcinoma epitelial-mioepitelial de la glándula parótida. Las células epiteliales mal cohesionadas, un poco pleomórficas, rodean a los glóbulos densamente teñidos del material de la membrana basal, lo cual refleja los aspectos histológicos. Modelos similares pueden reconocerse en diversos tumores de origen glandular salival y no salival de la glándula, benignos y malignos (MGG, 250 ).

Figura 9-26 Carcinoma celular transitorio de la vejiga. Se identifica un racimo apenas cohesionado, con pobre polarización, de células pleomórficas uroepiteliales. Existe hipercromasia nuclear, un contorno nuclear irregular y macronucleolación. La biopsia confirmó un carcinoma celular transitorio de grado alto. Obsérvese el fondo citolítico e inflamatorio (“sucio”) (Pap, potencia media).

Algunas veces está indicada una búsqueda de microorganismos o parásitos. Los comensales incluyen Lactobacillus en frotis cervicovaginal y Candida en muestras bucofaríngeas. Los patógenos incluyen virus, bacterias, hongos y protozoarios, entre otros. Algunos pueden ser visibles con el microscopio de luz, mientras que la mayoría de las infecciones víricas está implícita por sus efectos citopáticos. La coilocitosis en el virus del papiloma humano, la multinucleación con nucleoplasma de “cristal granulado” en Herpes simplex y las inclusiones nucleares de “ojo de búho” en infecciones por Cytomegalovirus son ejemplos característicos (figs. 9-27 y 9-28). Un artefacto es un producto artificial o un cambio morfológico en una citopreparación originado en la degradación física de una muestra o durante el muestreo, el transporte o la preparación del frotis. Los contaminantes son “cuerpos ajenos” que se introducen durante estos procesos. Su importancia se debe sobre todo al hecho de que pueden atenuar la exactitud de la interpretación del aspecto microscópico. Los artefactos pueden clasificarse como intrínsecos,

CITOMORFOLOGÍA

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Figura 9-27 Efecto citopático del virus del papiloma humano. a) La histología muestra multinucleación con halos claros alrededor de los núcleos hipercromáticos e irregulares (coilocitosis) (H-E, potencia media). b) Coilocitos similares presentes en un frotis cervical. Nótese de nueva cuenta la multinucleación, clarificación perinuclear del citoplasma y leve condensación citoplásmica periférica (Pap, 100 ).

Figura 9-28 Células epiteliales en un frotis cervical que muestra el efecto citopático vírico de Herpes simplex. Se ha comparado el aspecto general, con agrandamiento nuclear, aglomerado, superposiciones, amoldamiento, plurinucleación y áreas de carioplasma de cristal granulado con semillas de granada.

originados a partir de una fuente endógena, como fibras vegetales o cárnicas y cristales de colesterol (fig. 9-29), o extrínsecos, por ejemplo depósitos del colorante y gránulos de talco o algodón provenientes de los guantes quirúrgicos (fig. 9-30). Una fijación deficiente, en particular por secado al aire seguido de la fijación en alcohol, las preparaciones

Figura 9-29 Cristales romboidales de colesterol aspirados de un quiste tiroideo benigno. Tal sedimentación puede ser una consecuencia de hemorragias anteriores (MGG, 50 ).

teñidas con Papanicolaou, el artefacto de xileno y las burbujas de aire confieren apariencias típicas (fig. 9-31). Elementos inorgánicos, como fibras de asbestos, se reconocen de modo ocasional (fig. 9-32). La transferencia de material celular (contaminación cruzada, “transportadores” o “flotadores”), por el paso de una muestra a otra durante el transporte, la fijación o los procedimientos de tinción, constituye una fuente potencial

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CAP. 9

CITOPATOLOGÍA

Figura 9-30 Numerosos gránulos de almidón que contaminan esta muestra de un lavado bronquioloalveolar, tal vez procedentes del polvo del guante quirúrgico. Su típico aspecto de cruz de Malta se reconoce mejor mediante transiluminación con luz polarizada cruzada (MGG, 50 , polarizada).

Figura 9-31 Células en “hojuela de maíz” en un frotis cervical. Un depósito marrón apenas refráctil cubre los núcleos y el citoplasma de estas células escamosas. Esto es más común en frotis cervicales y se cree que es el resultado del aire atrapado en la superficie celular durante la fijación. Rara vez es tan extenso para producir un frotis del todo indescifrable (Pap, 100 ).

para establecer resultados positivos falsos de la malignidad y se debe evitar a toda costa. Es posible prevenir lo anterior con una técnica rigurosa y una buena higiene del laboratorio. La contaminación ambiental espuria procede casi siempre del agua o el aire y puede ser de naturaleza biológica o no (figs. 9-33 y 9-34).

Exactitud y limitaciones de la citología Es útil alguna medida de la confiabilidad y la exactitud de la citología diagnóstica en varias circunstancias para la

Figura 9-32 Cuerpo ferruginoso en esputo. Un macrófago multinucleado alveolar pulmonar engulle en parte un cuerpo ferruginoso refráctil. El aspecto marrón de cuentas ensartadas se atribuye a la incrustación del pigmento férrico en una fibra decolorada, quizá de asbesto. Los gránulos intracitoplásmicos oscuros comprenden una mezcla de pigmento antracótico y hemosiderótico (Pap, 1 000 ).

comparación y se expresa a menudo en términos estadísticos (cuadro 9-2). La sensibilidad (fracción de verdaderos positivos) es una medida de la eficacia con la cual una prueba reconoce a pacientes con el trastorno bajo consideración. La especificidad (fracción de verdaderos negativos) indica qué tan bien excluye una prueba a esos individuos sin la enfermedad. Los valores predictivos positivo y negativo indican el modo preciso en que la prueba reconoce la presencia o ausencia de la afección, respectivamente. Un resultado falso negativo señala que la prueba no identifica una enfermedad que luego sí se demuestra. Esto puede deberse a los errores de la investigación o las dificultades de la interpretación. Un falso verdadero negativo se presenta cuando la revisión retrospectiva del material confirma la suficiencia de la muestra y corrobora un resultado negativo genuino. Las posibles explicaciones para esto incluyen el muestreo perilesional en lugar del lesional o el inicio de la enfermedad después de practicar el método de la prueba (intervalo de la enfermedad). La sensibilidad de una prueba disminuye mientras el número de falsos negativos aumenta. Un resultado falso positivo aparece si la prueba se informa como positiva pero la enfermedad no puede demostrarse con posterioridad. Esto puede ser consecuencia de dificultades en la interpretación o del aspecto de ciertas anormalidades, que pueden semejarse de forma estrecha. La especificidad de una prueba disminuye mientras el número de falsos positivos aumenta. La eficiencia de una prueba es una medida de cuán bien clasifica a los pacientes que deben recibir el tratamiento y aquellos para los que el tratamiento es innecesario. Los valores estadísticos absolutos de una prueba particular se pueden modular por la inclusión o exclusión de

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CITOPATOLOGÍA GINECOLÓGICA Y EXPLORACIÓN CERVICAL

Figura 9-33 Contaminantes aéreos. Estas condias (“zapatos para la nieve”) micóticas segmentadas de manera interna se hallaban en el borde de un frotis. Tales elementos son consistentes con Alternaria spp. y son presuntos contaminantes aéreos (a, Pap, 250 ; b, MGG, 250 ). Cuadro 9-2 Algunos de los parámetros más útiles para medir la exactitud de la citología y formas de calcularlos Enfermedad positiva (a  c)

Enfermedad negativa (b  d)

Prueba positiva (a  b)

Verdadero positivo (a)

Falso positivo (b)

Prueba negativa (c  d)

Falso negativo (c)

Verdadero negativo (d)

a ac d Especificidad  bd Sensibilidad 

Figura 9-34 Un ácaro libre descubierto como contaminante exógeno en un frotis cervical. No es de consecuencia clínica (Pap, 250 ).

muestras inadecuadas o insatisfactorias. La inclusión de éstas suministra una indicación global de la eficacia clínica de la prueba, en tanto que la exclusión refleja con más exactitud el funcionamiento del laboratorio.

a ab d Valor negativo predictivo  cd ad Exactitud  abcd

Valor positivo predictivo 

Fracción de probabilidad de una prueba positiva 

sensibilidad 1  especificidad

Fracción de probabilidad 1  sensibilidad de una prueba negativa  especificidad

Citopatología ginecológica y exploración cervical Las muestras de citología de la zona genital femenina representan una proporción considerable del procesamiento de rutina de la mayoría de los laboratorios de diagnóstico, en gran parte como resultado de la exploración cervical. El primer objetivo de la prueba del frotis cervical es la detección del carcinoma celular escamoso y sus precursores en mujeres asintomáticas. También se utiliza en la investigación de las pacientes que sufren síntomas ginecológicos y como parte del proceso de vigilancia después del

tratamiento. De importancia secundaria es la detección de lesiones glandulares del cervix u otros sitios ginecológicos, el reconocimiento de una variedad de anomalías inflamatorias y contagiosas, y la valoración del estado hormonal. La exploración cervical ha demostrado ser eficaz en la reducción de la mortalidad y la morbilidad del carcinoma cervical en varios países, aunque no por medio de ensayos controlados aleatorios. Un programa de exploración cervical ha estado en funcionamiento en el Reino Unido desde

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CAP. 9

Unión escamocolumnar “original”

Zona de transformación con “nueva” unión escamocolumnar

CITOPATOLOGÍA

Eversión endocervical (ectropión) con unión escamocolumnar “original”

Unión escamocolumnar dentro del canal endocervical después de la menopausia

S = epitelio escamoso C = epitelio columnar E = fondo de las glándulas endocervicales en el epitelio escamoso metaplásico

Figura 9-35 Diagrama esquemático de la anatomía del cervix. Se ilustra la morfología cambiante de la zona de transformación cervical y la unión escamocolumnar con el paso de los años.

CITOPATOLOGÍA GINECOLÓGICA Y EXPLORACIÓN CERVICAL

1964. La llamada sistemática de la población se introdujo en 1988 bajo auspicios del NHS Cervical Screening Programme (NHSCSP) con el establecimiento de una red de coordinación nacional. Esto propicia la clasificación uniforme de las anomalías, la estandarización de la terminología, el seguimiento de frotis anormales, la institución de mecanismos para el control de calidad, la evaluación de la efectividad del programa mediante el entrenamiento multidisciplinario de auditoría y la vigilancia de los profesionales del cuidado de la salud. Cuando todos los aspectos del proceso de investigación se realizan de forma óptima, la prueba es un método muy sensible para la detección de los precursores del carcinoma celular escamoso, excepto para el carcinoma invasivo. Sin embargo, debe recordarse que como prueba de exploración tiene un margen de error diagnóstico bajo pero de importancia. La erradicación del carcinoma cervical tiene todavía que realizarse por esta vía. El objetivo de un frotis cervical es muestrear de manera representativa la zona de transformación cervical que limita la unión escamocolumnar, que es el sitio con el riesgo más alto de cambio neoplásico (fig. 9-35). Es en última instancia tarea del clínico visualizar el cervix y recoger muestras de la circunferencia cervical entera, sin importar cuál sea la celularidad o el contenido celular del frotis (fig. 9-36). Los indicadores de la probable transformación de la zona que se muestrea incluyen las células escamosas metaplásicas inmaduras o el epitelio glandular endocervical con mucosidad. No existen indicadores confiables de la transformación de la zona que se muestrea en frotis atróficos. El frotis cervical normal La citomorfología de las células escamosas superficiales, intermedias y parabasales refleja en gran parte la estructura histológica del epitelio escamoso estratificado maduro (fig. 9-37). El espesor mucoso y el contenido de glucógeno dependen de la actividad hormonal. En condiciones normales, las células superficiales se exfolian de forma natural y no existe casi nunca queratinización. Las células muestran escasa cohesión y se disponen casi de modo individual. Por su parte, las células glandulares endocervicales poseen una amplia variación en el aspecto, según sean su preservación y orientación. Tienden a conservar la cohesión y pueden mostrar modelos citoestructurales comparables a los de otros sitios glandulares. Las células de la reserva subcolumnar están casi siempre presentes como núcleos descubiertos e isomorfos. Las células escamosas metaplásicas son un componente normal de un frotis durante los años reproductivos. Mientras son inmaduras no se exfolian de modo espontáneo y cuando se eliminan por abrasión

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exhiben a menudo proyecciones citoplásmicas (células en araña). Una vez que alcanzan la madurez completa son indistinguibles de las células escamosas del ectocervix original. Las células estrómicas endometriales, las células glandulares y los histiocitos (éxodo) pueden observarse al principio del flujo menstrual hasta el día 12 del ciclo menstrual. Fuera de este intervalo se consideran anormales y dicha hiperexfoliación puede deberse a irregularidades menstruales y dispositivos anticonceptivos intrauterinos, además de pólipos, hiperplasia y neoplasia. Los leucocitos polimorfonucleares están invariablemente presentes y son más evidentes cerca de la menstruación. Los linfocitos, los eosinófilos, los mastocitos y las células plasmáticas suelen ser escasos. La mera presencia de células inflamatorias no implica infección en todos los casos. Los espermatozoides pueden persistir por varios días después de la unión sexual. El trofoblasto y el estroma deciduoide pueden perderse durante el embarazo o el aborto y las células seudodeciduoides pueden ser el resultado de la terapia hormonal. La queratinización anormal (hiperqueratosis) produce escamas sin núcleo, profundamente naranjófilas en preparaciones con Papanicolaou. La paraqueratosis demuestra espigas (ramitas) o perlas de escamas similares que poseen núcleos picnóticos. Ambos modelos pueden verse en condiciones inflamatorias y neoplásicas. Puede hallarse una variedad de contaminantes, incluidos los helmintos, piojos, hongos, polen y gel lubricante. Citología hormonal La evaluación citohormonal se basa en la maduración del epitelio escamoso vaginal en respuesta a las hormonas gonadotrópicas circulantes en combinación. El epitelio es delgado e inmaduro cuando carece de estrógeno y progesterona. El estrógeno sin oposición promueve el crecimiento y la maduración. La progesterona induce descamación y exfoliación con citólisis y células naviculares. Los andrógenos estimulan la maduración parcial de células intermedias en el epitelio atrófico con un efecto recíproco sobre el epitelio maduro. Los modelos característicos son reconocibles en el periodo posnatal, durante la pubertad, los estados de madurez sexual, de embarazo, el puerperio, la lactancia y la premenopausia y posmenopausia establecidas, con modulación de influencias hormonales exógenas o fuentes hormonales endógenas anormales, como los tumores ováricos. Se pueden utilizar diversos índices para registrar cambios hormonales, entre ellos el índice de maduración, el valor de maduración, el índice cariopicnótico, el índice eosinófilo y el índice celular plegado.

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CAP. 9

CITOPATOLOGÍA

Treponema pallidum, Candida albicans, Herpes simplex virus y virus del papiloma humano; muchas de estas infecciones son de transmisión sexual (figs. 9-38 y 9-39). Las influencias yatrógenas incluyen la ablación con láser, el daño térmico, la operación, la radioterapia, el reemplazo o la manipulación hormonales y los dispositivos

Figura 9-36 Dispositivos cervicales de muestreo. La espátula, en particular la de tipo extendido (Aylesbury), proporciona un mejor rendimiento celular y se recomienda para la exploración. Los dispositivos con cepillo para el muestreo endocervical pueden ser benéficos en caso de un frotis anormal. La técnica de muestreo y la visualización del cervix son de enorme importancia, sea cual sea el diseño empleado. Figura 9-38 “Célula indicadora” en la vaginosis bacteriana. El crecimiento excesivo de cocos confiere un aspecto granular a una célula escamosa superficial (“célula indicadora”) en un frotis cervical. Por lo regular, se debe a la flora bacteriana mixta, incluida Gardnerella vaginalis. Su presencia no es una indicación invariable de síntomas clínicos (vaginosis bacteriana) (Pap, 250 ).

anticonceptivos intrauterinos. Éstos pueden dar lugar a varias hiperplasias y metaplasias, además de complicar la interpretación exacta del frotis cervical. Discariosis, neoplasia intraepitelial cervical y carcinoma cervical Figura 9-37 Maduración epitelial escamosa ectocervical normal. Obsérvense la polaridad desde el estrato basal hasta las escamas superficiales y la ausencia de queratinización superficial (H-E, potencia media).

Inflamación y cambios regenerativos La inflamación en la zona genital femenina tiene un origen infeccioso y puede algunas veces mostrar un patrón agudo, crónico o granulomatoso. Es un proceso dinámico en el que los cambios degenerativos y regenerativos se observan de forma sincronizada. Las infecciones más comunes incluyen cervicitis folicular con notorio vínculo con Chlamydia spp., Lepthothrix spp., a menudo acompañada de Trichomonas vaginalis, vaginosis bacteriana por Gardnerella vaginalis, Actinomyces spp., Neisseria gonorrhoeae, Mycobacterium tuberculosis,

Al carcinoma celular escamoso invasivo del cérvix lo antecede un pródromo de cambios precancerosos (displasia) del epitelio de la zona de transformación cervical, la llamada neoplasia intraepitelial cervical (NIC). Éste es un espectro biológico continuo que se subdivide o se califica de forma arbitraria en cortes histológicos como NIC 1, 2 y 3, de acuerdo con el aumento de la gravedad de la displasia (figs. 9-40 y 9-41). Cada fase representa el potencial para la progresión de la regresión. Estas categorías corresponden a discariosis celular escamosa leve, moderada y grave en las preparaciones de los frotis de transferencia cervical (fig. 9-40). El sistema estadounidense de Bethesda utiliza una nomenclatura apenas diferente para los mismos aspectos citomorfológicos (véase el cuadro 9-3). Cuanto más alto sea el grado de anormalidad, mayor es el riesgo estadístico de progresión al carcinoma invasivo.

CITOPATOLOGÍA GINECOLÓGICA Y EXPLORACIÓN CERVICAL

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Figura 9-39 Tricomonas y Candida en un frotis cervical. a) Trichomonas protozoon binucleadas y flageladas (Pap, 250 ). b) Blastosporos y seudohifas de Candida (Pap, 250 ).

Epitelio maduro normal

Neoplasia cervical intraepitelial Grado 3 Grado 2 Displasia Displasia moderada grave

Grado 1 Displasia leve

Invasión estrómica inicial sobrepuesta o carcinoma microinvasivo

Figura 9-40 Precursores del carcinoma celular escamoso invasivo del cervix. Representación esquemática de la progresión potencial de la neoplasia intraepitelial cervical al carcinoma cervical invasivo.

Figura 9-41 Discariosis celular escamosa moderada. Obsérvense la nucleomegalia desproporcionada, el núcleo que ocupa hasta dos tercios del área citoplásmica, la hipercromasia nuclear, el contorno nuclear irregular y los bordes celulares angulados (Pap, 100 ).

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CAP. 9

CITOPATOLOGÍA

Cuadro 9-3 Comparación amplia de las terminologías más recientes aplicadas a las células escamosas anormales en la citología cervical Contraparte histológica

WHO, 1973

NIC 1 NIC 2 NIC 3

Displasia menor Displasia moderada Displasia grave Carcinoma in situ Carcinoma epidermoide

Carcinoma invasivo

BSCC, 1986*

Bethesda, 1991

Limítrofe Discariosis menor Discariosis moderada Discariosis grave

CEAII LIE grado bajo LIE grado alto LIE grado alto

Discariosis grave ¿Carcinoma invasivo?

Carcinoma escamoso

WHO, World Health Organization; CEAII, células escamosas atípicas de importancia incierta; BSCC, British Society of Clinical Cytology; LIE, lesión intraepitelial escamosa. *Enmiendas propuestas por la BSCC en 2002 para emplear una clasificación simplificada de dos grados (es decir, discariosis de grados bajo y alto), en lugar de la estadificación actual de tres grados de discariosis (esto es, menor, moderada y grave), la cual debe aún ratificarse en el Reino Unido.

La invasión estrómica inicial, la microinvasión y el carcinoma celular escamoso invasivo indican la transgresión de la membrana basal a grados variables, en el caso extremo con tumefacción. Esto se evalúa mejor mediante el examen histológico, en tanto que la discariosis grave NIC 3 puede ser indistinguible en el plano citomorfológico respecto de la discariosis grave que se observa en el carcinoma invasivo. Las células disqueratósicas extrañas y la diátesis tumoral pueden ser características distintivas útiles, pero no son patognomónicas ni están presentes en todos los casos. Se han establecido programas de exploración para detectar carcinoma de mama en mujeres asintomáticas en varios países y los resultados iniciales parecen alentadores. Citología basada en líquidos en la exploración cervical En años recientes, junto con el reconocimiento de la eficacia de la prueba del frotis cervical, también se han identificado de modo más extenso algunas de las limitaciones del proceso. La sensibilidad aceptada de un frotis cervical solo oscila entre 50 y 60%, lo que contrasta en grado considerable con la elevada expectativa pública, muchas veces infundada. Los métodos empleados han cambiado poco en varias décadas y están sujetos al escrutinio creciente, con la finalidad de reducir más la mortalidad del cáncer cervical. Se cree que sólo una pequeña proporción de los frotis falsos negativos son consecuencia del error humano de observación o interpretación durante el examen microscópico por el personal del laboratorio. Los factores de confusión más significativos se reconocen ahora durante las etapas anteriores al muestreo y la preparación. Por ejemplo, la espátula de madera convencional no muestrea las células anormales de manera uniforme y transfiere sólo 10 a 60% de las células recolectadas a un portaobjetos. Por lo tan-

to, la distribución del material puede ser desigual y poco representativa. Esto, y en verdad cualquier factor de la mucosa, inflamación u otro pueden ser perjudiciales para la fijación, dado que provocan artefactos, tinciones insuficientes y pérdida del contorno citonuclear; todo ello representa una proporción inadecuada del frotis global de casi 10%. Las técnicas de citología basadas en líquido reducen al mínimo muchos de estos problemas. A partir de octubre de 2003, el National Institute of Clinical Excellence (NICE) ha recomendado al NHS en Inglaterra y País de Gales que se introduzca la citología basada en líquido como medio primario del procesamiento de muestras en el NHSCSP. Se anticipa que tomará cerca de cinco años para que esto se instituya por completo. Esta decisión incluye la evaluación de dos diferentes sistemas comerciales establecidos, ThinPrep (Cytyc Corporation) y Sure-Path Prep (TriPath Imaging Inc.). Estos productos ganaron la aprobación similar de la US Food and Drug Administration (FDA) varios años antes. Es probable que otros productos comerciales insistan en la validación oficial a su debido tiempo. Estudios piloto predicen efectividad clínica reforzada (mayor sensibilidad y especificidad, menos frotis limitados), mejor relación costo-beneficio (menos frotis inadecuados, tiempos más rápidos de consulta y mejor productividad del laboratorio) y una mejor aceptación (del público y los profesionales del cuidado médico) en comparación con las técnicas convencionales del frotis cervical. Exploración automatizada y análisis de la imagen Los sistemas de análisis de imagen de alta resolución se pueden semiautomatizar o automatizar por completo y conectarse a la poderosa red neural de computadoras. El objetivo de evitar la subjetividad de la valoración manual y

LECTURAS ADICIONALES

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la posibilidad de que las máquinas autónomas reduzcan el error humano durante el proceso de exploración son puntos atractivos. El requerimiento de calidad óptima y muestras uniformes han conducido en gran parte al avance de la citología basada en líquido. Varios paquetes comerciales se han desarrollado y comercializado en poco tiempo. No obstante, hasta la fecha parece discreta la perspectiva de reemplazar a la mayoría de los citólogos expertos y la relación costobeneficio de esta tecnología todavía no se establece. Los dispositivos de la microscopia asistidos por una computadora se han utilizado como adjunto del entrenamiento de los citólogos y para registrar los datos del control de calidad, pero aún no se emplean de rutina en la mayor parte de los laboratorios. La telepatología y la teleconferencia aprovecharon los enlaces remotos en tiempo real con los usuarios, alejados desde el punto de vista geográfico, y ello hizo posible las consultas interactivas para el entrenamiento, revisión grupal o del experto y la valoración de calidad.

La microscopia con láser confocal procesa las imágenes digitales, que pueden manipularse más para reconstruir la microtopografía tridimensional de las células; es conveniente en particular para las preparaciones gruesas y los productos fluorescentes que pueden cuantificarse. La citometría con láser es una técnica híbrida que combina las características de la citometría de flujo con el análisis de imagen estática de células marcadas por los fluorocromos multicolores; puede determinar la ploidia del DNA e incorporar métodos de hibridación in situ fluorescentes mediante citopreparaciones convencionales y basadas en líquido. Las técnicas de microdisección con captura de láser permiten la selección de una subpoblación relativamente pura de células seleccionadas de un portaobjetos de la citología o la histología. Un láser infrarrojo de baja energía se emplea para extender un adhesivo plástico sobre las células seleccionadas, que después se desprenden con suavidad para el estudio adicional.

Técnicas auxiliares

Aseguramiento de la calidad en la citología diagnóstica

En ocasiones, la valoración citomorfológica es un proceso muy subjetivo y por tanto propenso a las diferencias de reproducibilidad entre el propio clínico y entre éste y otro. Se ha tratado de depurarla y cuantificarla de modo más riguroso, con grados variables de éxito. La citometría de flujo implica la valoración automatizada de células en suspensión, las más de las veces para el análisis del DNA o con propósitos de inmunofenotipificación. La microfluorimetría permite el enfoque sobre células individuales en un campo para evaluar la cantidad de actividad fluorescente dentro de núcleos marcados. El análisis citogenético detecta anormalidades cromosómicas, algunas de las cuales son típicas de ciertos tumores, como el t(x:18) en el sarcoma sinovial y el t(11:22) en el tumor de Ewing. No obstante, casi ninguna neoplasia muestra tales translocaciones consecuentes típicas. Las regiones del organizador nucleolar teñidas con plata se incrementan en la mayoría de los núcleos malignos. Infortunadamente, la superposición de anormalidades benignas y malignas es considerable con frecuencia. El escrutinio y la microscopia electrónica de transmisión pueden identificar los detalles ultraestructurales útiles e imperceptibles para la microscopia de luz y ello hace posible una clasificación más exacta de diferenciación celular, como gránulos neurosecretorios de centro denso, uniones firmes, tonofilamentos, etcétera. Las técnicas de hibridación in situ se pueden utilizar para identificar el material nuclear vírico y reconocer la activación oncógena en los tumores.

El propósito de un programa de aseguramiento de calidad es evaluar el proceso diagnóstico en su práctica. El control de calidad interno indica una serie de procedimientos dentro de un laboratorio particular. Esto supone la educación continua, el adiestramiento, la revisión de los procedimientos del laboratorio y su implementación, la reevaluación, la doble valoración y la auditoría. El aseguramiento de calidad externo indica la evaluación de la ejecución contra un grupo externo, ya sea en el plano regional o el nacional, y esto puede ser parte de un esquema de acreditación, voluntaria u obligatoria.

Lecturas adicionales Atkins KA. Liquid-based cytological preparations in gynaecological and non-gynaecological specimens. In Progress in Pathology, vol 6, Kirkham N, Shepherd NA (eds). 2003: Greenwich Medical Media, London, 101-114. Coleman DV. Chapman PA (eds). 1989: Clinical Cytotechnology. Butterworths, London. Gray W, McKee G (eds), 2003: Diagnostic Cytopathology, 2nd edn. Elsevier Science, London. Woods AE, Ellis RC (eds), 1994: Cytopathology. In Laboratory Histopathology—a Complete Reference. Churchill-Livingstone, New York. Young JA (ed). 1993: Fine Needle Aspiration. Blackwell Scientific. London.

SECCIÓN 3 MICROBIOLOGÍABACTERIOLOGÍA KWWSERRNVPHGLFRVRUJ

10 Microscopia en bacteriología: aplicación y preparación de la muestra Dugald R Baird

Introducción A finales del siglo xvii, el tapicero y científico aficionado holandés Antonie van Leeuwenhoek pulió lentes pequeñas de extraordinaria calidad y pudo observar microorganismos por primera vez. Desde entonces, la microscopia desempeña un papel fundamental en la bacteriología clínica. El examen microscópico de una muestra clínica puede ayudar a valorar la propiedad de la muestra (véase la sección sobre esputo más adelante) y puede por sí mismo indicar inmediatamente la probable naturaleza del agente patógeno bacteriano en sitios casi siempre estériles, como el líquido cefalorraquídeo (LCR) o cultivos de sangre. Los métodos en un laboratorio de diagnóstico clínico incluyen las microscopias de luz y fluorescencia; las muestras pueden estar teñidas o carecer de tinción, según sea su aplicación.

Microscopia de luz La microscopia de luz puede emplearse de tres maneras: la forma ordinaria transmitida (campo brillante), la de campo oscuro y la de contraste de fase; la más utilizada, sin duda, es la primera. Un microscopio moderno es capaz de alcanzar una ampliación de mil veces y un poder de resolución aproximado de 0.2 µm. La mayor parte de los microscopios se diseña de tal modo que el observador mira a través de los oculares, que se inclinan a un ángulo conveniente, en dirección del portaobjetos, que contiene el objeto a examinar. Una disposición alternativa (el microscopio de placa inver-

tida) se ideó para observar la muestra desde abajo. La iluminación de campo oscuro aumenta de forma eficaz el poder de resolución del microscopio de luz por abajo de 0.2 µm. Las muestras se iluminan de manera indirecta, dispersan la luz y aparecen brillantes contra un fondo oscuro. Mediante esta técnica es posible visualizar bacterias, como las espiroquetas, que tienen un diámetro cercano a 0.1 µm. La microscopia de contraste de fase permite el examen de estructuras internas finas de tejidos y bacterias vivas sin teñir y las diferentes estructuras aparecen en distintas tonalidades de gris.

Microscopia de fluorescencia La fluorescencia se emite cuando una molécula se somete a la luz de una longitud de onda particular e irradia luz de una longitud de onda más larga. Los fluorocromos (tintes fluorescentes) absorben luz ultravioleta invisible y emiten luz visible. Un microscopio fluorescente utiliza una lámpara de vapor de mercurio que irradia luz ultravioleta de alta intensidad (luz de excitación) y un espejo la dirige hacia la muestra desde un plano superior. Las bacterias teñidas con un fluorocromo absorben esta luz de longitud de onda corta, emiten luz de longitud de onda más larga y se delinean como objetos verdes o amarillos radiantes contra un fondo oscuro. La microscopia de fluorescencia permite el uso de objetivos de poder más bajo y por lo tanto puede analizarse con rapidez un área mucho más grande de la muestra. Esto es importante, por ejemplo, al buscar micobacterias en una muestra de escasos microorganismos.

The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker. © 2005 John Wiley & Sons, Ltd.

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CAP. 10

MICROSCOPIA EN BACTERIOLOGÍA: APLICACIÓN Y PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

Muestras para microscopia Los especímenes pueden ser de dos tipos principales: a) frotis secos de muestras líquidas o escobillados o bien de cultivos bacterianos, extendidos sobre un área de 1 a 2 cm de diámetro en portaobjetos de 31 y fijados por calor (“películas”); b) “preparaciones húmedas” de líquidos, examinadas bajo un cubreobjetos o cámaras especiales. Los escobillados contenidos en un medio de transporte están húmedos y se pueden frotar directamente sobre la superficie de un portaobjetos, mientras las películas de muestras líquidas, como pus, aspirados, LCR, etc., se preparan al extenderse sobre una capa fina. Los especímenes de tejido se presionan sobre las superficies de los portaobjetos para crear las impresiones, o bien pueden suspenderse en un volumen pequeño de agua peptonada. Las colonias de bacterias que crecen en medios sólidos se examinan al remover con un asa la colonia y emulsificar ésta en una gota de solución salina sobre el portaobjetos, de tal manera que se obtenga una suspensión muy ligera para que las células individuales se distingan con claridad.

Examen de muestras sin teñir por transmisión de luz El examen de muestras líquidas en una cámara de conteo sobre un portaobjetos con un cubreobjetos se utiliza para evaluar la presencia de indicios de infección o inflamación en líquidos corporales habitualmente estériles, como la orina, LCR, aspirados y excreciones de diálisis peritoneal. La luz transmitida se emplea con o sin contraste de fase y la muestra se examina mediante el objetivo 25  para eritrocitos y leucocitos, agentes patógenos, cilindros o cristales, según sea apropiado para la muestra. Las cuentas de células pueden expresarse en términos cuantitativos, si se emplea una cámara de conteo, o semicuantitativos (p. ej., “por campo de alto poder”). Las bacterias que crecen en medios de cultivo líquidos pueden examinarse por la motilidad con un objetivo de 50 . Al acercar el condensador aumenta el contraste y la visualización de los microorganismos resulta más fácil; en caso contrario puede ser de utilidad el microscopio de contraste de fase. El examen de monocapas de cultivo de células de tejido para efectos citopáticos es en particular competencia de la virología, pero tiene una aplicación en la bacteriología para identificar la citotoxina de Clostridium difficile en extractos fecales o sobrenadantes de cultivos. Líquido cefalorraquídeo (LCR) En condiciones normales, el LCR es estéril y contiene no más de cinco células blancas por milímetro cúbico, sobre

todo linfocitos. El primer paso en el examen consiste en la microscopia del líquido sin centrifugar para cuantificar el número de células presentes y su tipo. Se usa una cámara de conteo, casi siempre la Fuchs-Rosenthal modificada. Se trata de un portaobjetos que contiene un hueco, el piso del cual está grabado con una rejilla de nueve cuadros grandes, cada uno de 1 mm2 de área. Estos cuadros están a su vez subdivididos en 16 cuadros pequeños. Cuando un cubreobjetos se aplica encima de la cámara de conteo y el líquido se traslada mediante una pipeta de Pasteur, la profundidad del líquido es de 0.2 mm. El volumen del líquido que cubre cinco cuadros grandes es por consiguiente de 1 mm3. Un cubreobjetos se aplica al portaobjetos para crear un sello firme uniforme sobre la cámara de conteo, tras presionar con suavidad sus bordes hasta que los colores del arco iris se ven de manera uniforme alrededor de los lados del cubreobjetos (anillos de Newton); esto confirma que el cierre e incluso el contacto se efectuaron entre el cubreobjetos y la cámara. El LCR se introduce en la cámara con una pipeta de Pasteur fina aplicada de modo cuidadoso en el borde para que el líquido pase al interior y llene por completo la cámara, sin burbujas de aire. Después de unos cuantos minutos de reposo, las células se cuentan con un objetivo de 40 ; los números de cuadros existentes examinados dependen del número de células presentes. El LCR que contiene una gran cantidad de células blancas o el densamente teñido de sangre, en un caso como resultado de hemorragia intracerebral y en otro por la punción accidental de vasos sanguíneos pequeños durante la punción lumbar, debe diluirse antes de realizar un conteo celular exacto. Para este propósito se utiliza un líquido que contenga ácido acético y cristal violeta diluido: se rompen los eritrocitos y se tiñe el núcleo de las células blancas, lo cual las hace más visibles. La identificación de los tipos de células se facilita al centrifugar una alícuota de LCR y crear una película, que se impregna con una tinción diferencial como la de Leishman. Orina No todos los laboratorios realizan la microscopia como una rutina en las muestras de orina. En los especímenes tomados de pacientes mediante catéteres (muestras de catéter de orina) está justificado, ya que la ausencia de células de pus en esos especímenes no excluye la infección. Sin embargo, en las muestras obtenidas con limpieza sin catéteres (orina del chorro medio), la ausencia de piuria sugiere que la relevancia de un aislado es en el mejor de los casos incierta; puede tratarse de un contaminante y en tal caso se aconseja la repetición del muestreo. La microscopia también es útil para detectar eritrocitos, cilindros y cristales, que pueden ser de importancia diagnóstica. En consecuencia, la infor-

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TINCIÓN DE LAS MUESTRAS

mación que se puede obtener de la microscopia de la orina es valiosa y debe solicitarse siempre que sea posible. La microscopia se realiza sobre orina fresca sin centrifugar. La visualización de microorganismos en tales preparaciones es de importancia secundaria puesto que es la cuantificación del crecimiento bacteriano lo que importa en la evaluación de los aislados de una muestra de orina. Los neutrófilos se excretan en números variables en la orina y sólo cifras mayores de 104/ml pueden considerarse anormales en las muestras del chorro medio. Las células rojas se encuentran como contaminantes en la orina de mujeres saludables muy jóvenes, en relación con la menstruación, pero pueden también indicar afecciones graves del sistema renal, como cálculos, neoplasias o enfermedad glomerular. En este último caso, la morfología de los eritrocitos puede ser anormal (dismorfismo) y se reconocen fragmentación, crenación u otras formas extrañas. Los laboratorios que procesan pocas muestras de orina pueden examinarlos en cámaras de conteo, como se describió para el LCR, pero casi todos usan un método semicuantitativo. Éste suele incluir tan sólo un portaobjetos y un cubreobjetos de cristal ordinarios, cámaras de conteo desechables o un microscopio de placa invertida. Este último permite el procesamiento por lotes de muchas muestras en pozos de fondo plano dentro de una placa plástica. Se usa un objetivo 40  y, si se conocen el área de campo (“campo de alto poder”) y la profundidad de la orina, el número de células visibles se puede expresar en cuentas/ml, aunque en la práctica la mayor parte de los laboratorios registra las cuentas sólo como escasas, moderadas o numerosas. Otras muestras Las técnicas descritas para la orina se pueden aplicar a otros líquidos estériles, como los aspirados de articulaciones (en los cuales también es importante el examen de cristales como el ácido úrico), líquidos serosos y secreciones de diálisis peritoneal. La microscopia de heces se emplea para el diagnóstico de infecciones parasitarias, pero no para el diagnóstico de la gastroenteritis bacteriana.

Examen de muestras sin teñir mediante iluminación de fondo oscuro Tiene una aplicación en la bacteriología clínica, sobre todo en el examen de material tomado de un chancro primario cuyos agentes patógenos pueden ser causantes de sífilis (Treponema pallidum). El material se recoge de la lesión sospechosa y se crea una película húmeda bajo un cubreobjetos, que se examina de inmediato para identificar la motilidad de los treponemas.

Tinción de las muestras Se emplea luz transmitida porque el índice de refracción de las bacterias es similar al del fondo oscuro y es necesario incrementar el contraste por el uso de tinciones. El método más utilizado de tinción de bacterias es aún el que introdujo Christian Gram en 1884. Aunque no es un colorante, sino un método de tinción, el término “tinción de Gram” se utiliza de modo universal; la técnica delinea las diferencias de la estructura de la pared celular que existen entre varias clases de bacterias. El material que se tiñe puede ser una muestra clínica, un caldo de cultivo o una suspensión en solución salina de un microorganismo tomado de una placa de agar. En todos los casos se realiza un frotis fino sobre un portaobjetos y se seca de manera natural o con calor de baja intensidad, después de lo cual el frotis se fija al portaobjetos, sea que éste se pase rápidamente tres veces por un mechero de Bunsen o se emplee una placa calentada. El método de tinción de Gram, que tiene varias modificaciones, somete el frotis de modo sucesivo a lo siguiente: a) una tinción básica de carga positiva, casi siempre cristal de violeta; b) mordiente de yodo acuoso; c) decoloración con acetona, y d) contratinción con carbol fucsina o safranina. La mayor parte de las bacterias se tiñe al principio con el cristal violeta y yodo, que forma complejos insolubles dentro de la pared bacteriana. Las bacterias que poseen capas gruesas de peptidoglucano en sus paredes celulares, y en consecuencia retienen la tinción después del tratamiento con acetona y adquieren una tonalidad morada, se definen como grampositivas. Los microorganismos que tienen capas más delgadas de peptidoglucano, que pierden con rapidez el complejo con la acetona y por lo tanto se tiñen con el reactivo de tinción rosa, se conocen como gramnegativos. Los ejemplos de ambos se hallan en el cuadro 10-1. Algunas bacterias se tiñen sólo de modo muy discreto con la tinción de Gram (p. ej., especies de Legionella), algunas son irregulares en el

Cuadro 10-1 Algunos ejemplos de géneros bacterianos clasificados de acuerdo con su morfología y tinción de Gram

Forma

Grampositivos

Gramnegativos

Cocos (esferas)

Staphylococcus Streptococcus Peptococcus*

Neisseria Moraxella Veillonella*

Bacilos (bastones)

Bacillus Listeria Corynebacterium Clostridium*

Enterobacteriaceae Pseudomonas Haemophilus Bacteroides*

*Género anaeróbico.

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CAP. 10

MICROSCOPIA EN BACTERIOLOGÍA: APLICACIÓN Y PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

grado de tinción (gramvariables, como Gardnerella vaginalis) y otras no se tiñen en absoluto (p. ej., micobacterias). Se requieren métodos especiales de tinción para las micobacterias debido a la peculiar composición de sus paredes celulares, que contienen altas concentraciones de ácidos (grasos) micólicos. La tinción de Ziehl-Neelsen implica el tratamiento de las películas con carbol fucsina caliente, seguido por pasos sucesivos de decoloración con ácido sulfúrico concentrado y alcohol; al final se contratiñen con malaquita verde o azul de metileno. Las micobacterias aparecen rojas contra un fondo verde o azul (fig. 10-1). Figura 10-2 Esputo teñido con fenol de auramina y visualizado bajo luz ultravioleta; se reconocen micobacterias radiantes con una fluorescencia de tono verde o amarillo (400 ). Cortesía de B. Watt.

Figura 10-1 Esputo teñido por el método de Ziehl-Neelsen que muestra micobacterias (rojo) contra un fondo azul (1 000 ). Cortesía de J. Winning.

El otro método de tinción usado para las micobacterias es el fenol de auramina. Los frotis secos y fijados por calor (esputo, líquidos pleural y ascítico, primera orina del día, LCR, pus, etc.) se tratan con fenol de auramina y se decoloran con ácido clorhídrico al 1% en alcohol metilado industrial, seguido de solución diluida de permanganato de potasio. Los especímenes se observan bajo luz ultravioleta con el objetivo de 40  y las micobacterias brillan en tonos verdes y amarillos contra un fondo oscuro (fig. 10-2). Esta técnica permite la rápida proyección de un frotis y es útil si el número de bacterias en la muestra es pequeño. Otros dos métodos de tinción se emplean en microscopia de fluorescencia, la acridina naranja y la fluoresceína, que usan anticuerpos conjugados. La tinción con acridina naranja es un método útil para demostrar las bacterias que no pueden destacarse con claridad en una tinción de Gram (como en los cultivos de sangre; véase más adelante). Bajo luz ultravioleta, las bacterias aparecen anaranjadas. Se dispone de dos técnicas inmunofluorescentes principales que usan conjugados de anticuerpos de fluoresceína, las pruebas directa e indirecta de anticuerpo fluorescente (DFAT e IFAT, respectivamente). La DFAT utiliza un

fluorocromo, casi siempre isotiocianato de fluoresceína, conjugado con un anticuerpo específico que se une directamente al antígeno superficial bacteriano. La IFAT es un proceso de dos etapas: el anticuerpo específico (p. ej., preparado en un conejo) se liga al antígeno y lo detecta un anticuerpo conjugado (p. ej., anticonejo). La ventaja de la IFAT es que un solo anticuerpo conjugado puede usarse para identificar una gama entera de anticuerpos específicos. En la bacteriología clínica los principales usos de estas técnicas de inmunofluorescencia son: a) la detección de las especies de Legionella, que son fastidiosas y de lento crecimiento, pero pueden visualizarse con rapidez en esputo, lavados bronquioalveolares y tejido pulmonar (fresco o fijado en formalina), sea con DFAT o IFAT, y b) la demostración directa de clamidias en muestras genitales o respiratorias. A continuación se describen algunos ejemplos adicionales del uso de la microscopia de las preparaciones teñidas en microbiología clínica. Muestras de sitios estériles Con estas muestras, la microscopia es una herramienta poderosa para predecir el probable agente patógeno causal. El hallazgo de microorganismos en el líquido cefalorraquídeo, aspirado o secreciones de diálisis peritoneal, por ejemplo, en particular cuando se acompañan por un infiltrado de células de pus, es un indicador seguro de infección y la apariencia sola de las bacterias puede ser diagnóstica. Debe realizarse una investigación minuciosa de las bacterias, dado que algunas veces son muy escasas en las muestras, y se examinan por centrifugación (p. ej., 3 000 rpm por 10 minutos); se desecha el sobrenadante y se crea una película del depósito, que a continuación se tiñe por el método de Gram o bien con auramina o con tinción de Ziehl-

TINCIÓN DE LAS MUESTRAS

Neelsen, si la situación clínica sugiere una posible infección micobacteriana. Casi todos los laboratorios utilizan ahora alguna forma del sistema de cultivo en sangre semiautomatizado; el primer paso para la identificación del microorganismo es el examen de una gota teñida de Gram del caldo de un tubo que muestra crecimiento. La microscopia puede ser por sí misma diagnóstica; por ejemplo, los estreptococos en la sangre de un paciente con fiebre y un soplo cardiaco apoyan un diagnóstico clínico de endocarditis infecciosa (véase fig. 10-3). Por otro lado, los cocos grampositivos en racimos son casi siempre estafilococos, pero Staphylococcus aureus no se puede distinguir por microscopia de las diversas es-

Figura 10-3 Tinción de Gram de un cultivo en sangre que muestra cocos grampositivos en cadenas largas. El agente patógeno era Streptococcus sanguis y el paciente tenía endocarditis infecciosa (1 000 ). Cortesía del Dr. A McLay.

pecies coagulasa negativas, y puesto que estas últimas son microorganismos de la piel, resultan los contaminantes más comunes de los cultivos de sangre. La relevancia de los estafilococos identificados en un cultivo de sangre deben casi siempre esperar una identificación adicional. Los patógenos gramnegativos en los cultivos de sangre son algunas veces difíciles de visualizar contra la tinción rosada del fondo; cuando los microorganismos no son visibles es a menudo útil solicitar una tinción de acridina. Muestras de sitios con una flora bacteriana residente normal

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ra artificial. Las películas de escobillados bucales muestran muchas células de pus y un gran número de espiroquetas y bacilos fusiformes (aspecto de huso) gramnegativos. Esputo Todas las muestras de esputo se registran como potencialmente peligrosas para el operador, ya que pueden contener bacilos tuberculosos, y la preparación se lleva a cabo en un gabinete de seguridad alojado en un laboratorio de contención de categoría 3. Aunque el esputo se origina en las vías respiratorias inferiores casi siempre estériles, se contamina de forma inevitable antes de la colección por la flora de las vías respiratorias superiores. Es necesario tener cuidado al interpretar los especímenes con tinción de Gram del esputo y sólo de modo ocasional puede predecirse con seguridad el agente patógeno causal de la neumonía con base en la microscopia. No obstante, los especímenes con tinción de Gram son útiles porque las muestras de “esputo” que poseen menos de 10 neutrófilos por célula epitelial escamosa representan probablemente saliva, más que esputo, e indican que el cultivo puede ser engañoso. Cuando se sospecha una infección micobacteriana, se examinan los preparados teñidos de auramina y se confirman positivos con la realización de muestras frescas y teñidas con el método de Ziehl-Neelsen. Las desventajas del esputo se superan en buena medida con la práctica del lavado bronquioalveolar, un procedimiento empleado cada vez más en el diagnóstico de neumonía en los sujetos muy enfermos o inmunosuprimidos. Las muestras obtenidas están libres de la contaminación de la flora de las vías respiratorias superiores y pueden examinarse por las técnicas de tinción de Gram, auramina y Ziehl-Neelsen, además de las técnicas de inmunofluorescencia para las especies de Legionella y un amplio espectro de agentes patógenos protozoarios, micóticos y víricos. Lesiones de la piel Los escobillados de lesiones de la piel encierran escaso valor diagnóstico debido a la presencia de la flora normal de la piel, con una excepción notoria: el examen microscópico del material raspado de las lesiones purpúricas relacionadas con la infección meningocócica. En ésta, la presencia de cocos gramnegativos en pares, con su aspecto característico, es diagnóstica.

Escobillados bucales La microscopia es el único método que diagnostica la angina de Vincent (estomatogingivitis anaeróbica), puesto que los microorganismos causales (que actúan de modo sinérgico para provocar la infección) no se pueden cultivar de mane-

Pus y escobillados de heridas El valor de la microscopia de estas muestras es variable y depende de ciertos factores, más allá del control del

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CAP. 10

MICROSCOPIA EN BACTERIOLOGÍA: APLICACIÓN Y PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

laboratorio. El pus o escobillados de pus de sitios como la piel o infecciones de tejidos blandos puede sugerir infección con estafilococos, estreptococos o anaerobios, mientras que las muestras similares de sitios intraabdominales pueden mostrar un cuadro mezclado, no siempre fácil de relacionar con los hallazgos posteriores del cultivo. En muchos de estos casos, la administración previa de antibiótico puede explicar las discrepancias. Sin embargo, es a menudo útil suministrar un informe provisional indicativo de que es probable una muestra o escobillado de pus, por ejemplo, originada por estafilococos o, de manera alternativa, de que los microorganismos mezclados tienen un probable origen fecal. Escobillados vaginales altos Las muestras con tinción de Gram se utilizan para determinar la presencia de células de pus y también la de células epiteliales cubiertas con pequeños bacilos gramvariables (células indicativas). El hallazgo de estos últimos es un indicador de un trastorno conocido como vaginosis bacteriana. En medicina genitourinaria, los escobillados uretral y endocervical se examinan para reconocer células de pus que contienen cocos intracelulares gramnegativos en pares, esto es, Neisseria gonorrhoeae (véase fig. 10-4).

(b)

Figura 10-4 Espécimen de una supuración uretral que ilustra numerosos cocos intracelulares gramnegativos de Neisseria gonorrhoeae (1 000 ). Cortesía de J. Winning.

Lecturas adicionales Bishop BJ, Neumann G. The history of the Ziehl-Neelsen stain. Tubercle 1970; 51: 196-206. Larsor HE, Price AB. Pseudomembranous colitis: presence of clostridial toxin. Lancet 1977; 2: 1312-1314. Preston NW, Morrel A. Reproducible results with the Gram stain. J Pathol Bacteriol 1962; 84: 241-243.

11 Medios de cultivo en bacteriología Eric Y Bridson

Medios de cultivo en microbiología Bulloch escribió la historia de las plagas y pestes desde los primeros registros del género humano hasta principios del siglo xx. Aunque los términos “contagio” e “infección” se usaban ya en tiempos medievales, el papel de los diminutos agentes infecciosos no pudo probarse sino hasta el trabajo de Louis Pasteur (1822-1895). En buena medida, el trabajo de este científico supuso la demolición de las teorías de Galeno sobre la enfermedad infecciosa y la generación espontánea de la vida microscópica. Sin embargo, el padre de los medios de cultivo fue Robert Koch (1843-1910; fig. 11-1), quien creó los métodos para el cultivo, aislamiento e identificación de las bacterias. Primero Pasteur demostró que éstas eran la causa de la infección en seres humanos, animales y alimentos, pero sólo el trabajo de Koch confirmó que agentes patógenos específicos ocasionaban enfermedades específicas. En esencia, el trabajo de Koch consistió en apartarse de los cultivos líquidos, con sus meticulosas diluciones y frecuente contaminación, y adoptar una simple pero poderosa técnica que usaba un medio “sólido”. Al agregar gelatina, y más tarde agar, a su caldo de extracto de carne creó la placa rayada con sus colonias aisladas. Más tarde demostró que al mezclar de forma cuidadosa material sospechoso dentro del medio fundido y verterlo en una placa se producía una valoración cuantitativa de los números bacterianos, una técnica utilizada ahora en extenso en la forma de la placa rayada. Richard Petri, uno de los asistentes de Koch, reemplazó la placa de vidrio de Koch por la placa de Petri. Este diseño permaneció sin cambio por más de 100 años. Koch fue consciente de que un medio universal para bacterias patógenas era imposible. Mostró también que Mycobacterium tuberculosis no podía crecer sobre el me-

Figura 11-1 Robert Koch (1843-1910), el padre de los medios de cultivo.

dio de agar de infusión de carne. Para este microorganismo utilizó suero coagulado, huevo o papa rebanada. A finales del siglo XIX un libro de texto de bacteriología médica describía siete medios. La adición más importante al caldo de infusión de carne de Koch fue la peptona, un digerido péptico de proteína que sugirió Loeffler. Este último también incorporó 0.5% de peso/volumen de cloruro de sodio y su medio de nutrimentos es a la fecha el cimiento de los medios de cultivo complejos e indefinidos para microorganis-

The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker. © 2005 John Wiley & Sons, Ltd.

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CAP. 11

MEDIOS DE CULTIVO EN BACTERIOLOGÍA

mos quimioheterótrofos (es decir, aquellos que requieren utilizar compuestos de carbón orgánico, en oposición a las bacterias autótrofas, las cuales sintetizan compuestos de carbón a partir del dióxido de carbono). Muchas formulaciones más de medios de cultivo surgieron en las primeras décadas del siglo XX, cuando los medios de enriquecimiento y selección y los indicadores se idearon para agentes patógenos aislados en áreas que no eran médicas, como la agricultura, manufactura de alimentos y bebidas, farmacéutica, etc. Alrededor de 1930, un estudio sobre medios describió 2 540 formulaciones, muchas de ellas variaciones pequeñas de los medios ya publicados. El número creció en proporción enorme desde entonces, pero ningún estudio similar se repitió.

Formulación de los medios de cultivo Las formulaciones empleadas para los diversos medios pueden contener tan poco como tres ingredientes (caldo nutriente de Loeffler) hasta 10, como muchos medios para microorganismos exigentes. El número de ingredientes tiene poca relación con su crecimiento. Un cultivo “simple” puede ser complejo y del todo indefinido. Una estructura común de los medios de cultivo para agentes patógenos quimioheterótrofos es la siguiente: • Base amina-nitrógeno (peptona, proteína hidrolizada, infusión o extracto de proteína). Pocos agentes patógenos pueden utilizar proteínas coaguladas; se proporcionan los derivados predigeridos o ácidos hidrolizados. Los péptidos y aminoácidos se pueden transferir dentro de la célula y usarse como fuentes de carbón para energía o polimerización de las proteínas funcionales. • Factores de crecimiento suplementarios (sangre, suero, extracto de levadura, nucleótidos, vitaminas). Los microorganismos descritos como nutricionalmente exigentes, como Neisseria, Bordetella, Legionella, exigen factores de crecimiento adicionales. El considerable beneficio de la sangre entera en estos microorganismos se atribuyó con anterioridad a los factores de crecimiento agregados. Se considera ahora que el papel principal de la sangre entera es proteger a los agentes patógenos vulnerables de los procesos tóxicos de la oxidación. • Fuentes de energía, excepto péptidos (azúcares, alcoholes y carbohidratos complejos). Estas sustancias casi siempre se agregan a los medios indicadores para realzar los cambios de pH de los microorganismos que pueden fermentar la fuente de energía. Los patógenos quimioheterótrofos pueden metabolizar muchas otras moléculas orgánicas para proporcionar energía.

• Sales amortiguadoras (fosfatos, acetatos, citratos). Los amortiguadores suelen agregarse a las formulaciones con grandes cantidades de carbohidratos (p. ej., las que contienen peptona de soya) para prevenir los cambios excesivos de los niveles de pH. Infortunadamente, muchos amortiguadores tienden a quelar metales esenciales y deben utilizarse con cautela. Los péptidos y aminoácidos pueden actuar como agentes amortiguadores a través del efecto zwitterion de las agrupaciones NH2/COOH. • Sales minerales y metales (fosfatos, sulfatos, Ca++, Mg++, Fe++, Mn++, metales traza). Estas sustancias pueden adicionarse por separado como macrocantidades o microcantidades en los casos en que son evidentes las demandas particulares. Es importante que los metales se hallen en la forma soluble y no formen complejos dentro de las formas insolubles durante el procesamiento de calor. Por lo general se asume que los tejidos de plantas o animales hidrolizados contienen suficientes minerales y metales para el crecimiento óptimo. • Agentes selectivos (químicos, antimicrobianos y algunos colorantes de anilina). Como lo señala su nombre, estos agentes se agregan en una concentración suficiente para inhibir a los agentes patógenos indeseables, pero se permite la multiplicación de microorganismos seleccionados. Se requiere un cuidado extremo al determinar la concentración óptima en el medio. Todos los agentes selectivos poseen cierta toxicidad para algunas especies y es posible que de forma ocasional no supriman a todas las especies indeseables. Una regla general es que cualquier incremento de los nutrimentos en el medio requiere un aumento del agente selectivo y viceversa. Los agentes selectivos pueden interactuar en forma mutua para acentuar o atenuar su selectividad; por ejemplo, las sales biliares disminuyen la toxicidad de los colorantes. Los agentes selectivos pueden también afectarse por sustancias (p. ej., casi todos los amortiguadores) que quelan cationes; por ejemplo, ciertos colorantes y sales biliares pueden volverse más tóxicos. Este efecto puede revertirse con la adición de cationes (Mg/Ca). • Colorantes indicadores (rojo fenol, rojo neutral, bromocresol morado). Estos colorantes indican cambios en el valor del pH posteriores a la fermentación, desaminación o descarboxilación. Los medios de cultivo cromógenos desarrollados para indicar colonias que producen actividades enzimáticas específicas son casi siempre mezclas de colorantes indicadores. Todos los colorantes requieren cuidadosa dosificación para evitar la inhibición selectiva. • Agentes de gelificación (agar, gelatina, alginato, gel de sílice). El agar extraído de las especies de algas marinas

MEDIOS DE CULTIVO DEFINIDOS Y MEDIOS COMPLEJOS INDEFINIDOS

del genero Gelidium es el agente habitual de gelificación para el crecimiento de los microorganismos quimioheterótrofos. Aunque la calidad del agar mejoró mucho desde sus comienzos, no puede considerarse un gel polímero inerte. Éste aporta metales, minerales y piruvatos que pueden influir en el crecimiento de los microorganismos. No todos los agares son similares: las diferencias de la fuente del agarofito y los procesos industriales de extracción pueden inducir un desempeño significativamente diferente en el crecimiento y la difusión del antibiótico. Las ocho categorías de materiales mencionadas cubren casi todas las variaciones de las formulaciones publicadas de los medios de cultivo. Detalles adicionales sobre estos materiales y su manufactura pueden encontrarse en otras obras.

Enriquecimiento y selección en medios líquidos Los procesos de enriquecimiento y selección en medios líquidos no son mutuamente excluyentes. Por lo general, el enriquecimiento se describe como un proceso que incrementa los números de un agente patógeno desde menos de 10 células hasta cantidades detectables. Los caldos enriquecidos pueden contener factores de crecimiento que se adicionan para reducir la fase de retraso de los números bajos de microorganismos. Cultivar sangre es el ejemplo más común de dicho proceso de enriquecimiento. En una población microbiana mezclada, el término “enriquecimiento” también se utiliza cuando una especie se selecciona para el crecimiento preferencial. Para ello se emplean formulaciones específicas, incluidos químicos selectivos o electivos, y ajustes del pH o una temperatura favorable de incubación. En los medios líquidos rara vez es posible incrementar de manera particular el agente patógeno deseado y suprimir a los demás microorganismos presentes. Las dinámicas de crecimiento de cultivos mixtos de agentes patógenos en caldo son complejas. Los microorganismos indeseables pueden retrasarse por un periodo inicial, pero pueden invadir después a los agentes de interés. Aunque los periodos fijos de incubación y subcultivo suelen determinarse por las horas de trabajo del laboratorio, en realidad pueden no ser ideales para la recuperación exitosa de agentes patógenos particulares. La función más importante de los caldos enriquecidos es elevar el número de microorganismos deseados a valores que resulten suficientes para un asa del caldo de subcultivo para producir un número cuantificable de colonias reconocibles sobre placas de agar selectivas. Es probable que 104 microorganismos patógenos/ml en el caldo sea la cifra mínima para la detección por este método. Debe recordarse que la función de los caldos enriquecidos se determina por los resultados del subcultivo para

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un medio sólido selectivo. La interacción entre químicos selectivos en el caldo y aquellos presentes en la placa de agar puede inhibirse para números pequeños de agentes patógenos. El caldo de tetrationato subcultivado con agar de MacConkey puede registrar números más grandes de salmonelas o shigelas respecto de cuando se subcultiva en agar de desoxicolato-citrato. En suma, los siguientes factores afectan en grado significativo el enriquecimiento exitoso de microorganismos particulares de medios líquidos: a) la formulación de los medios y sus agentes selectivos; b) el tamaño del inóculo de los microorganismos deseados; c) los números y la variedad de los agentes patógenos competidores; d) la presencia/ausencia de material orgánico en el caldo; e) la temperatura de incubación; f) el periodo anterior al subcultivo; g) la interacción de los componentes de enriquecimiento del caldo con la placa de agar selectiva usada para el subcultivo. No es de sorprender que las publicaciones muestren demasiadas opiniones contrapuestas en relación con este asunto, si se considera la complejidad de la posible variación de los resultados finales.

Medios de cultivo definidos y medios complejos indefinidos Hasta mediados del siglo xx los microbiólogos aceptaron que los medios de cultivo eran más bien preparados culinarios y no formulaciones científicas. Casi sin excepción, todos los ingredientes empleados eran materiales naturales variables indefinidos. El comportamiento del crecimiento varió en grado amplio y esto suscitó el deseo de crear medios sintéticos o químicamente definidos que reprodujeran un comportamiento estándar. Entre 1950 y 1975, los microbiólogos intentaron fusionar aminoácidos, nucleótidos, vitaminas, minerales y metales seleccionados para que crecieran agentes quimioheterótrofos al mismo ritmo y con las mismas características que en medios indefinidos. Las revistas microbiológicas de ese periodo contenían cientos de fórmulas de medios de cultivo, pero todas ellas mostraban comportamientos del crecimiento inferiores respecto de los medios indefinidos o se limitaban sólo a unas cuantas especies. Ninguna podía recomendarse como un medio de enriquecimiento general para microbios médicos. La dificultad de idear y probar medios definidos, junto con los decepcionantes resultados obtenidos, propició al final una pérdida de interés. Un factor fue el reemplazo de los medios de materia prima preparados en el laboratorio con productos equivalentes deshidratados preparados de modo comercial. Los beneficios de las mejores especificaciones de las materias primas, manufacturas controladas a gran escala y la prueba rigurosa del control de calidad superaron los principales problemas de variación del comportamiento

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CAP. 11

MEDIOS DE CULTIVO EN BACTERIOLOGÍA

del medio. En fecha más reciente, los medios preparados comerciales sustituyeron en gran medida a la preparación elaborada con anterioridad en los laboratorios de microbiología. Aunque resulte paradójico, en 1966 un nuevo medio de agar sangre indefinido apareció bajo el nombre de agar Columbia. Este agente contenía una mezcla precisa de peptonas de diversas fuentes de proteínas, hidrolizadas por enzimas diferentes, lo cual creaba un amplio espectro de péptidos, desde el aminoácido más grande posible (peso molecular [PM] = 5 000) hasta el más simple (PM = 100). Un gramo de almidón, 5 g de cloruro de sodio y 12 g de agar componían la fórmula. El agar Columbia, un complejo medio indefinido, se ha convertido en el medio de enriquecimiento utilizado de forma más amplia, en las formas de caldo y agar, para recuperar una amplia variedad de agentes patógenos exigentes. Esto parecía ser un triunfo de quienes deseaban reemplazar tales medios con formulaciones sintéticas o definidas. El dilema de los medios definidos o indefinidos no se ha resuelto todavía. Al parecer, los hidrolizados de proteína y los factores de crecimiento son los dos grupos de materiales que pueden ocasionar más dificultades. Parecería que las mezclas de aminoácidos no pueden sustituir a una mezcla compleja de péptidos. Es posible que se requiera una selección amplia de varios factores de crecimiento para asegurar la recuperación de microorganismos atenuados o exigentes. Es improbable que un medio definido comparable al agar Columbia pueda desarrollarse o justificarse sobre la relación costo-beneficio.

Factores ambientales de crecimiento La presencia de nutrimentos esenciales del crecimiento no garantiza por sí misma el desarrollo óptimo de los microorganismos deseados. Todos los medios de cultivo son susceptibles a la oxidación si se exponen a la luz, calor y aire, es decir, fotooxidación, termooxidación y quimiooxidación. Alguna vez se consideró que los procesos de oxidación afectaban en grado menor a los microbios patógenos quimioheterótrofos aeróbicos y anaeróbicos facultativos y sólo los anaerobios obligados los padecían. Ahora es evidente que todos, salvo unas pocas especies bien protegidas, son vulnerables a los efectos de la oxidación. Los radicales tóxicos de oxígeno (superóxido, singletos, hidroxilos) formados por los electrones capturados adicionales pueden dañar a los ácidos nucleicos y las enzimas. Para protegerse, los microorganismos producen enzimas protectoras que pueden neutralizar a estos radicales tóxicos. Son ejemplos la catalasa, dismutasa de superóxido y peroxidasa. Algunos aminoácidos son secuestradores efectivos de oxidantes tóxicos. Pueden adicionarse agentes protectores a los

medios de cultivo para el mismo propósito, como sangre completa, carbón vegetal, piruvato y sales de hierro reducidas. Puede ser esencial incluir estos agentes para los agentes patógenos que son en particular vulnerables, por ejemplo Neisseria, Bordetella, Campylobacter, Legionella. Los componentes sulfhidrilo, como tioglucolato y cisteína, se agregan a los medios anaeróbicos para reducir el potencial de oxidación-reducción con grupos -SH, que neutralizan a los agentes tóxicos oxidantes. Algunos medios se autooxidan en el autoclave, sobre todo los medios que contienen cisteína, glucosa, fosfatos y algunos metales.

Actividad del agua Los microorganismos tienen agua “libre” en la cual crecen y esto se aplica en especial a las placas de agar. El traslado de nutrimentos a la colonia y la movilización del residuo tóxico desde ésta dependen del agua libre presente en el agar. El agua puede estar “ligada” o formar complejos con tanta firmeza con las proteínas o polímeros que los microorganismos no pueden utilizarla. El hielo es una forma de agua ligada y otras se refieren a menudo como “cuasi-hielo”. El límite biológico de la actividad del agua es de 0.97 (1.00 si es agua pura) a 0.61 (la superficie del pescado seco salado). Sólo los hongos xerófilos pueden crecer (con lentitud) en la cifra más baja. Los medios líquidos son casi siempre convenientes para el crecimiento de todos los agentes patógenos, a menos que se adicionen solutos al medio (cloruro de sodio o glicerina) para atenuar la actividad del agua y hacerla selectiva para estafilococos u hongos. Las placas de agar recién preparadas tienen concentraciones satisfactorias de agua libre, pero en el almacenamiento la evaporación reduce la actividad del agua de la superficie del agar. Las placas de agar supersecas o demasiado almacenadas pueden ser inhibitorias, muestran colonias pequeñas y no pueden recuperar los inóculos “atenuados” (fig. 11-2).

Almacenamiento de los medios de cultivo Una regla básica señala que los medios recién preparados son mejores que los almacenados. Sin embargo, rara vez es posible preparar medios justo antes de usarse y por tanto es inevitable alguna forma de almacenamiento. Los medios de cultivo almacenados se deben utilizar estrictamente por turnos para evitar almacenamientos demasiado largos. Todos los contenedores de medios deben fecharse y numerarse por lote. Los medios de cultivo deben almacenarse lejos de la luz para prevenir la fotooxidación. Todos los medios líquidos se almacenan en frascos o tubos cerrados, de preferencia con

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PRUEBAS DE CALIDAD

Colonias pequeñas

Gel de gran fuerza

Colonias lenticulares

Colonias grandes

Gel de baja fuerza

Colonias esféricas

Figura 11-2 Efecto de la pérdida de agua en las placas de agar. a) Reducción del tamaño de las colonias superficiales. b) Cambios en la forma de las colonias sumergidas, de esférica a lenticular.

tapones de rosca, a 2 a 8°C, excepto el caldo de tioglucolato, que se preserva mejor a 15 a 22°C. Los medios líquidos, sin antibióticos u otros ingredientes lábiles, pueden almacenarse por muchas semanas en el frío y lejos de la luz. Las placas vertidas deben almacenarse a 2 a 8°C, empaquetadas en película de plástico adherente. Ésta es preferible a las bolsas de polietileno que retienen la humedad en la forma de acumulaciones de líquido en cada bolsa. La vida útil en estantería de las placas preparadas depende de la formulación y las condiciones de almacenamiento y transporte al laboratorio. Con placas empaquetadas en películas semipermeables y almacenadas en cajas de poliestireno expandido en la temperatura correcta, la vida útil de estantería puede ser de muchos meses. No deben conservarse o usarse las placas tras ese lapso. Una inspección útil consiste en medir la pérdida de agua durante el almacenamiento. Una pérdida de peso de 5% sugiere que las placas alcanzaron un estado terminal.

Pruebas de calidad La mayor parte de los laboratorios microbiológicos adquiere medios de cultivo en formas deshidratadas o preparadas. La responsabilidad de la prueba de calidad ha recaído en los fabricantes y éstos deben proporcionar los detalles de su protocolo y resultados de prueba a los compradores individuales. No obstante, debe advertirse que estas pruebas se han llevado a cabo en medios de cultivo recién elaborados y que el tiempo de almacenamiento, antes y después de la entrega, puede reducir la calidad del medio.

El aumento del uso de los medios preparados ha protegido a los medios de cultivo con agar de los efectos oxidativos complejos e impredecibles de la esterilización por autoclave de los medios de cultivo insolubles. El descenso de los valores del pH y el oscurecimiento del color indican sobrecalentamiento, que da lugar a que se formen complejos de carbohidrato-péptido. Cuando se prueban medios de cultivo comprados deben ser suficientes tres cepas seleccionadas de microorganismos apropiados. Pueden adquirirse cepas estándar de microorganismos patógenos y es preciso realizar una valoración cuantitativa. Los medios selectivos deben probarse para la inhibición de microorganismos indeseables, al igual que para el enriquecimiento de cepas seleccionadas. Si se elige un nuevo proveedor o se firmó un gran contrato, entonces puede ser apropiada una prueba más extensa mediante un control de medios inoculados en paralelo. Se utilizan inóculos pequeños e incluso algunos agentes patógenos atenuados en la prueba. Snell y colaboradores (1991) proporcionan más información sobre este tema. La recuperación de microorganismos atenuados en la prueba del control de medios de cultivo se estudia cada vez más. Los aislados microbiológicos clínicos están con frecuencia atenuados puesto que son agentes patógenos aislados de alimentos calentados o procesados. Los microorganismos muy atenuados, viables pero no cultivables, representan una forma extrema de atenuación. Stephens y colegas (1997) usaron Salmonella atenuada de laboratorio y mostraron que la recuperación de estos agentes patógenos variaba entre la misma formulación de medios de cultivo de diferentes fabricantes. Este trabajo demostró una

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MEDIOS DE CULTIVO EN BACTERIOLOGÍA

distribución muy amplia de tiempos de retraso entre las diferentes marcas del mismo medio cuando se utilizó un solo inóculo de células, con algunos tiempos de retraso de más de 20 horas. En el pasado, los fabricantes de medios empleaban una mezcla de aislados clínicos y cepas NCTC/ATCC estándar de microorganismos para probar lotes de medios de cultivo. El uso de aislados clínicos se ha suspendido en la industria y sólo las cepas estándar de agentes patógenos son de uso general. Estos microorganismos no se atenúan cuando se reconstituyen de forma apropiada y pueden ocultar deficiencias en los lotes de medios de cultivo. El uso de cepas estándar, atenuadas en el laboratorio por la exposición a temperaturas altas o bajas, se investiga cada vez más y podrían reemplazar la pérdida de aislados clínicos.

El futuro de los medios de cultivo La placa de agar de Koch, que es barata, simple y muy versátil, es un amplificador muy poderoso de inóculos pequeños. Si la preparación es apropiada, crecen todos los microorganismos esperados y muchos insospechados de las muestras. Los dispositivos modernos de diagnóstico que tal vez sustituyan a la microbiología convencional son costosos, complicados y muy específicos. Es probable que la microbiología convencional no se modifique demasiado en este siglo. Indudablemente, se dispondrá de mejoras metodológicas, como el marcado semiautomático, la inoculación y señalización con tecnología de película mediante microscopia láser confocal para la detección temprana del crecimiento y los marcadores de identificación incorporados para la actividad específica enzimática. Se observará una mejor recuperación de los agentes patógenos dañados en la fase de retraso de crecimiento. Estos procedimientos mejorados de recuperación han de despejar las dudas sobre algunas teorías de esterilización cinéticas existentes y resolverán algunos de los misterios que rodean a los “microorganismos viables pero no cultivables”. El viejo axioma bacteriológico “lo que no crece, no existe” desaparecerá. Es improbable que la microbiología se lleve a cabo por automatización, de modo similar a la bioquímica o la hematología. Gran parte de la actividad en microbiología consiste en igualar imágenes de colonias o campos del microscopio con el banco de datos que contiene la cabeza del microbió-

logo. El cerebro humano es increíblemente mejor en ese quehacer que cualquier computadora.

Microbiología cuántica Las grandes poblaciones de microbios se adecuan a las reglas taxonómicas, pero las células individuales exhiben incertidumbres causadas por la mutación y adaptación a los ambientes locales. Tales células representan variantes que pueden convertirse en los ancestros de la siguiente población seleccionada. Las mutaciones son procesos cuánticos en los que intervienen moléculas que son impelidas sobre una barrera de energía desde una configuración estable a otra diferente. Las sustancias químicas complejas siguen las leyes de la mecánica cuántica y la ciencia de las células microbianas individuales se puede llamar “microbiología cuántica”. Existe una analogía entre la física clásica/mecánica cuántica y la microbiología clásica/microbiología cuántica. Ahora se necesita un sistema para estudiar las células individuales.

Lecturas adicionales Barer MR, Harwood CB. Bacterial viability and culturability. Adv Microb Physiol 1999; 41: 94-138. Bridson EY. The Development, Manufacture and Control of Microbiological Culture Media. 1994: Oxoid Ltd, Basingstoke, UK. Bridson EY, Gould GW. Quantal microbiology. Lett Appl Microbiol 2000; 30: 95-98. British Standard BS EN 12322. In Vitro Diagnostic Devices. Culture Media for Microbiology—Performance Criteria for Culture Media. 1999. British Standards Institution London, UK. Brock TD, Robert Koch—A Life in Medicine and Bacteriology. 1988: Science Tech Publishers, Madison, WI. Bulloch W. The History of Bacteriology. 1938: Oxford University Press, Oxford. Reprinted 1984: Dover Publications, New York. QA for Commercially Prepared Microbiological Culture Media, 2nd edn. Approved Standard: NCCLS M22-A2, vol 16. 1996: Villanova, PA. Stephens PJ, Joynson JA, Davies KW, Holbrook R, Lappin-Scott HM, Humphrey TJ. The use of an automated growth analyser to measure recovery times of single heat-injured Salmonella cells. J Appl Microbiol 1997; 83: 445-455.

12 Identificación de bacterias Andrew J Hay

Introducción La identificación de bacterias en poco tiempo y con exactitud es una capacidad que requiere muchos años de experiencia en el laboratorio. El propósito de este capítulo es describir la técnica que adoptaron los laboratorios clínicos británicos para reconocer bacterias comunes de importancia médica. Se pretende que el lector adquiera una visión básica del proceso y sea capaz de consultar los excelentes textos detallados con más seguridad. Las bacterias pueden identificarse de modo directo en las muestras de los pacientes o, más a menudo, en el crecimiento posterior de los microorganismos en cultivos. Aunque se consideran por separado, estos dos métodos pueden combinarse.

Identificación directa Microscopia Las bacterias pueden visualizarse en muestras clínicas mediante microscopia y uso de colorantes; aunque es útil, proceder de esta manera rara vez permite la identificación completa. En la actualidad, la tinción de Gram es el procedimiento diferencial más utilizado en los laboratorios de bacteriología clínica. Existen muchas modificaciones, pero el principio es el mismo. Se aplica una solución de violeta de metilo seguida por una solución de yodo a una preparación de bacterias fijada por calor en un portaobjetos del microscopio. Después de lavarse, la preparación se expone a un decolorante (alcohol o acetona) por algunos segundos, antes de que se aplique una contratinción roja (p. ej., safra-

nina). Las bacterias grampositivas no se decoloran con alcohol o acetona y se tiñen de púrpura. Las bacterias gramnegativas se decoloran y permiten que las células adquieran la contratinción roja. Esta reacción depende de las diferencias estructurales de la pared celular entre las bacterias grampositivas y gramnegativas. También se tienen en cuenta el tamaño y la forma de las bacterias: redondas (cocos) o en bastones (bacilos). Sin embargo, muchas bacterias se tiñen mal o no lo hacen en absoluto con la tinción de Gram, por ejemplo, las micobacterias como Mycobacterium tuberculosis que requieren tinciones “acidorresistentes”, como la tinción de ZiehlNeelsen. Estas tinciones se basan en el principio de que ciertas bacterias, después de teñirse con soluciones calientes de carbol fucsina, pueden resistir la acción decolorante del ácido clorhídrico y el alcohol. Las modificaciones de estas tinciones permiten visualizar otras bacterias, por ejemplo las especies de Nocardia. En el pasado se usaron tinciones con anticuerpos fluorescentes para detectar bacterias específicas, como Legionella, pero hoy día el desempeño deficiente imposibilita su uso en la bacteriología regular. Detección de anticuerpos y antígenos Estas pruebas son útiles para las bacterias que no se cultivan de rutina en medios sólidos, como las espiroquetas, y los agentes patógenos intracelulares obligados Rickettsia, Coxiella y Chlamydia. Las infecciones consecutivas a estos géneros se diagnostican casi siempre por la detección del anticuerpo en el suero (serología) o, en el caso de la infección genital por Chlamydia, por la identificación del antígeno.

The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker. © 2005 John Wiley & Sons, Ltd.

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CAP. 12

IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS

La detección del antígeno puede usarse para el diagnóstico rápido de infecciones bacterianas graves, como en los casos de meningitis; los antígenos bacterianos en el líquido cefalorraquídeo pueden reconocerse con la aglutinación en látex. Una variación es la detección de un producto bacteriano, por ejemplo, el uso de un inmunoensayo enzimático para identificar la toxina de Clostridium difficile en las heces, un causante de la diarrea relacionada con antibióticos. Métodos moleculares Desde la última edición de este libro se han observado progresos importantes en el campo de la bacteriología molecular diagnóstica. Aunque es verdad que algunas de estas técnicas experimentan la transición de un laboratorio de investigación y referencia a uno de bacteriología clínica, el crecimiento del número de reactivos de prueba disponibles en el comercio representa una posibilidad distinta para el futuro próximo, en particular si el costo relativamente alto de estos métodos moleculares puede reducirse. Algunos ejemplos se proporcionan más adelante. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y las sondas génicas han sido satisfactorias en la identificación rápida de Mycobacterium tuberculosis en muestras clínicas. Los métodos convencionales toman varias semanas para identificar a este agente patógeno de lento crecimiento. De forma similar, las pruebas de amplificación de los ácidos nucleicos, como PCR o reacción en cadena de la ligasa, se recomiendan para el diagnóstico de la infección genital por Chlamydia trachomatis. En muestras de heces, la PCR se utiliza para reconocer genes que codifican a las verotoxinas de Escherichia coli, como E. coli O157. La detección simultánea del DNA de Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae y Haemophilus influenzae en el líquido cefaloraquídeo o sangre completa por PCR múltiple se ha convertido en un procedimiento invaluable en el diagnóstico rápido de la meningitis bacteriana. También se han desarrollado sistemas comerciales para la detección rápida (menos de tres horas) de Staphylococcus aureus resistente a la meticilina y especies de Enterococcus resistentes a la vancomicina mediante PCR en tiempo real (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania). Estos métodos deben permitir el inicio temprano de la quimioterapia antimicrobiana efectiva y las precauciones de control de la infección, con lo cual se mejoran los resultados clínicos. En otros capítulos se discuten de modo más detallado los mismos métodos.

Identificación después del cultivo

conduce a demorar informes o suministrar resultados engañosos de laboratorio. El material clínico debe colocarse en medios primarios de aislamiento, de tal manera que buena parte del crecimiento consista en colonias bien aisladas (fig. 12-1). Las colonias obtenidas deben examinarse de manera cuidadosa con una lente de mano y buena iluminación, y las colonias aisladas se seleccionan y transfieren para la investigación a un medio no selectivo mediante un alambre recto y mano firme. Si este proceso falla para proporcionar un crecimiento adecuado de un cultivo puro, debe repetirse. Acortar el proceso en esta etapa retrasa la identificación, se desperdician reactivos y tal vez se produzcan resultados engañosos; esto es frustrante para el bacteriólogo y el clínico y supone un tratamiento potencialmente incorrecto para el paciente. Debe observarse que en esta etapa se utiliza un medio no selectivo, ya que los medios primarios de aislamiento selectivos o inhibitorios interfieren a menudo con las técnicas de identificación bioquímicas y otras subsiguientes. El arte de la identificación Cuando se analiza una placa de aislamiento primario que contiene hasta una docena de agentes patógenos o especies diferentes de bacterias comensales, y se sabe además que casi cualquier bacteria puede ocasionar la enfermedad, el bacteriólogo principiante puede desesperarse ante el apremio de proporcionar un informe significativo. Sin embargo, la experiencia en examinar estas placas, combinada con el conocimiento del sitio muestreado, el cuadro clínico, los probables agentes patógenos y la flora comensal, suministra una idea razonablemente exacta de los microorganismos que requieren identificación y pruebas de sensibilidad. Este enfoque permite al bacteriólogo elegir las pruebas que pueden conducir a la identificación rápida del agente patógeno. Si lo anterior no puede confirmar al agente causal más probable, el investigador debe actuar con mente abierta y ampliar las investigaciones. Esta conducta, que se conoce como el método progresivo, requiere el establecimiento de algunas características fundamentales del microorganismo y, a partir de éstas, los grupos subsecuentes de pruebas se eligen hasta identificar al agente patógeno. Por último, si todo lo anterior falla, puede adoptarse el método del “trabuco”, en el cual se realiza cada prueba y se compara con las descritas en textos de bacteriología. Rara vez es necesario, pero se requiere para verificar, por ejemplo, una nueva especie.

Cultivo puro

Identificación preliminar

El primer paso en la identificación de una bacteria consiste en establecer un cultivo puro. Esto no siempre es posible y

La capacidad de las bacterias para crecer bajo condiciones aerobias o anaerobias, sus requerimientos de crecimiento,

137

IDENTIFICACIÓN DESPUÉS DEL CULTIVO

Depósito del inóculo Se flamea el asa

Asa de alambre Se flamea el asa El material clínico se aplica en un tercio de la placa con agar

Se flamea el asa

El material se extiende hacia fuera desde el depósito del inóculo. La placa se incuba

Después de la incubación se elige una sola colonia bien aislada mediante un alambre recto a partir del crecimiento mezclado

El microorganismo se extiende hacia fuera como en (b). La placa se incuba

Se transfiere la colonia a una placa no selectiva capaz de mantener el crecimiento

Se obtiene un cultivo puro

Figura 12-1 Forma de establecer un cultivo puro.

morfología de la colonia, efecto sobre el medio (p. ej., hemólisis en agar-sangre), motilidad en medio líquido, capacidad para formar esporas, y aspecto y reacción en la tinción de Gram permiten efectuar una identificación preliminar. El uso subsiguiente de algunas pruebas simples y rápidas indica entonces qué técnicas adicionales (si acaso) se requieren para concluir la identificación.

cuidado cada vez que se realizan, por ejemplo mediante cepas testigo y reacciones conocidas.

Después de la tinción de Gram: la caja de herramientas de los bacteriólogos

1. Prueba de la catalasa. Los microorganismos que producen catalasa, cuando se exponen al peróxido de hidrógeno, producen burbujas visibles en un plazo de 30 segundos. Esta prueba puede ayudar a distinguir a los estafilococos, que son positivos a la catalasa, de los estreptococos, que son negativos.

Como un artesano, el bacteriólogo experto selecciona las herramientas requeridas para completar la identificación basada en los resultados de la morfología de las colonias y la tinción de Gram. Estas pruebas pueden agruparse en amplias categorías, que se enumeran a continuación. Pueden realizarse de forma secuencial o simultánea, según sea el microorganismo a identificar. Deben controlarse con

Detección de enzimas La capacidad de una bacteria para producir una enzima se demuestra al exponerla a un sustrato y detectar el producto resultante. Las pruebas comunes son las siguientes:

2. Prueba de la oxidasa. Esta prueba investiga la presencia de la oxidasa de citocromo. Las bacterias positivas a la oxidasa, como Pseudomonas, pueden oxidar el reactivo

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CAP. 12

IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS

diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina para precipitar un cambio de color. Enterobacteriaceae son negativos a la oxidasa. 3. Prueba de la ureasa. Ciertas especies producen una enzima potente que degrada la urea hasta amoniaco; este último se puede detectar por un cambio de color con un indicador de pH incorporado en el medio de crecimiento. Esta prueba ayuda a diferenciar Proteus mirabilis, positivo a la ureasa, un comensal del intestino, de Salmonella spp. y Shigella spp., agentes patógenos intestinales importantes que son negativos. 4. Prueba de la coagulasa. Staphylococcus aureus posee una enzima que coagula al plasma in vitro. Otros estafilococos son negativos. Esta lista no es exhaustiva. Existen muchas otras pruebas, que a menudo son incorporadas en reactivos comerciales.

Enterobacteriaceae que no la fermentan, y agar de tiosulfato-citrato-bilis-sacarosa (TCBS), que reconoce a Vibrio cholerae que fermenta la sacarosa de otras especies. Otras pruebas detectan la capacidad del agente patógeno para utilizar un carbohidrato como fuente única de carbón, por ejemplo, la utilización del citrato. Los paneles de carbohidratos pueden probarse de forma conveniente y simultánea con reactivos comerciales. Factores de crecimiento El requerimiento absoluto de compuestos definidos para el crecimiento bacteriano en un medio particular se utiliza como herramienta para la identificación; así, las especies de Haemophilus difieren en sus requerimientos por dos factores presentes en la sangre, X (hematina) y V (nucleótido de difosfopiridina), para el crecimiento en agar nutritivo. Sólo Haemophilus influenzae, el agente patógeno más importante del género, requiere de ambos.

Detección del antígeno Metabolismo de proteínas La detección de antígenos celulares por antisueros específicos se utiliza con amplitud en bacteriología para determinar la especie y el tipo de microorganismos. Dos ejemplos son los siguientes: 1. Clasificación de Lancefield. Un antígeno del grupo de la pared celular se extrae a partir de los estreptococos hemolíticos beta por una enzima. El antígeno se detecta entonces por la aglutinación con el antisuero unido a las partículas del látex. 2. Tipificación “O” y “H”. Los antígenos de la pared celular (O) y antígenos flagelares (H) se reconocen en bacilos gramnegativos como Salmonella, tras mezclar suspensiones de microorganismos con antisuero específico sobre un portaobjetos o un tubo de ensayo. Una reacción positiva se observa por la aglomeración de los microorganismos. Metabolismo de los carbohidratos La capacidad de un microorganismo para utilizar ciertos azúcares como glucosa, sea por oxidación (aerobio) o fermentación (independiente del oxígeno), u otros carbohidratos, como almidón, es casi siempre una característica útil en la identificación. La prueba requiere un medio definido que contenga al carbohidrato y un sistema de detección para el producto metabólico, a menudo un indicador de pH. La utilización del azúcar puede incorporarse en medios primarios de aislamiento, como agar de MacConkey, que distingue Enterobacteriaceae que fermentan la lactosa de

Se somete a prueba la capacidad de una especie bacteriana para metabolizar una proteína o un aminoácido a un producto definido. Los sistemas de detección para el producto y la necesidad de un medio específico son similares a los requeridos para la utilización del carbohidrato. Es el caso de diversas especies de Enterobacteriaceae que divergen en su capacidad para lo siguiente: a) licuefacción de la gelatina; b) descarboxilación o desaminación de aminoácidos; c) producción de ácido sulfhídrico a partir de aminoácidos que contienen azufre, y d) elaboración de indol a partir de triptófano. Estas pruebas se realizan a menudo con productos comerciales. Pruebas de susceptibilidad La susceptibilidad de una especie a un compuesto se puede utilizar no sólo para precisar el tratamiento con antibióticos, sino también para contribuir a la identificación. Dos ejemplos de uso general son representativos, ambos probados mediante la colocación de un disco de papel filtro, que contiene el compuesto, sobre una placa de cultivo; la muestra se incuba y después se observa una zona de inhibición. 1. Prueba con optocina. Streptococcus pneumoniae es sensible a la optocina (clorhidrato de etilhidrocupreína). Otros estreptococos similares en agar-sangre son resistentes. 2. Sensibilidad al metronidazol. Los anaerobios verdaderos casi siempre son sensibles a este antibiótico. Los

IDENTIFICACIÓN DESPUÉS DEL CULTIVO

aerobios que pueden crecer de forma anaerobia son invariablemente resistentes. Producción de toxinas Esta importante característica puede ayudar a diferenciar las especies patógenas de las que no lo son. Ejemplos: 1. Prueba de Elek. Esta prueba se utiliza para diferenciar cepas de Corynebacterium diphtheriae productoras de toxinas (por lo tanto patógenas), que causan la difteria, de especies no patógenas. Se coloca una tira del papel filtro que contiene la antitoxina de la difteria sobre un medio definido. El microorganismo se extiende sobre el agar de forma perpendicular a la tira. Después de la incubación pueden verse las líneas precipitantes que representan al complejo antígeno (toxina)-anticuerpo (antitoxina). 2. Citotoxina. Se puede detectar una citotoxina que producen las cepas de Clostridium difficile relacionadas con diarrea y antibióticos por la neutralización de la antitoxina en un cultivo celular. Sistemas de identificación comercial El desarrollo de los sistemas comerciales para la identificación rápida de bacterias patógenas ha simplificado en gran medida la vida del bacteriólogo clínico. Antes de su introducción, cada prueba bioquímica tenía que prepararse de modo individual en un tubo de ensayo o botella de cristal, lo que conducía a la exhibición de una impresionante cristalería de laboratorio. Los sistemas comerciales permiten que muchas pruebas bioquímicas se realicen de manera simultánea a partir de un cultivo puro. El patrón obtenido de los resultados de la prueba se compara entonces con los patrones derivados de bacterias conocidas conservadas en un banco de datos automatizado. Las pruebas estadísticas se utilizan para determinar la identidad probable del aislado clínico. El banco de datos también puede sugerir pruebas adicionales si la identificación es dudosa. Los sistemas de uso general en el Reino Unido son los sistemas API y Vitek, ambos comercializados por Bio Merieux (Bio Merieux UK Ltd, Basingstoke, England), BD Phoenix (BD Diagnostic Systems Europe, Le Pont de Claix, France) y Mastascan elite (Mast Group Ltd, Bootle, Merseyside, UK). 1. Sistema de identificación API (appareils et precedes d’identification). Este sistema consiste en cúpulas de plástico que contienen diversos sustratos y productos químicos indicadores fijados a una tira plástica. Cada cúpula comprende una prueba bioquímica diferente. La adición de un inóculo estándar del agente patógeno de prueba a cada cúpula en la tira, después de la incuba-

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ción, precipita una serie de cambios de color que puede advertirse a simple vista. El patrón de los resultados obtenidos puede interpretarse con facilidad al compararlo con el banco de datos. Se dispone de tiras modificadas para la identificación de estafilococos, estreptococos, bacterias coriniformes, Enterobacteriaceae, anaerobios y bacterias gramnegativas que no fermentan. 2. Sistemas Vitek y BD Phoenix. Estos sistemas se basan en principios similares. Las pruebas bioquímicas se realizan de manera simultánea en celdillas insertadas en una tarjeta plástica (Vitek) o tira (BD Phoenix). Las celdillas se llenan con la suspensión bacteriana mediante aspiración por vacío (Vitek) o vaciamiento (BD Phoenix). Después de la incubación, un lector modificado controlado por computadora analiza las tarjetas y los sistemas automatizados interpretan los resultados. Se produce una gama de tarjetas para identificar bacterias comunes de importancia médica, a menudo en un plazo de cuatro a seis horas. Las ventajas de estos sistemas incluyen la capacidad de realizar la prueba de susceptibilidad antibiótica, la semiautomatización que requiere poco tiempo del operador y un sistema incluido para mayor seguridad del laboratorio. 3. Élite de Mastascan. Este sistema emplea la inoculación de puntos múltiples en medios de identificación con cajas de Petri. Después de la incubación, las placas se exponen a un lector que analiza e interpreta de manera automática las pruebas de identificación incorporadas en los medios de prueba. El sistema también permite la comprobación de la susceptibilidad antibiótica y la inoculación directa de las placas con muestras de orina, de tal modo que se elimina la necesidad del cultivo primario de orina. Todos los sistemas requieren un apego estricto a las instrucciones del fabricante para prevenir errores. La omisión de comenzar con un cultivo puro es una fuente común de error que puede evitarse si se inocula una placa para purificar la tarjeta o la tira mediante la suspensión de inoculación usada. Si la placa muestra un crecimiento inconsistente, las pruebas se repiten. Los bacteriólogos inexpertos aceptan a menudo los resultados de estos sistemas sin objeción, sin importar qué tan improbables pueden ser en clínica. Los trabajadores experimentados interpretan los resultados en su contexto clínico y confirman o repiten identificaciones improbables o inusuales. Nuevos desarrollos Técnicas moleculares Como ya se explicó, los métodos moleculares son útiles para reconocer los agentes patógenos que crecen con

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CAP. 12

IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS

trado la producción de impresiones digitales espectrales características de la masa que permiten la identificación en el lapso de minutos después de remover una colonia de una placa de cultivo. Aunque sólo el tiempo establecerá si esta técnica se ha de incorporar al laboratorio clínico común, representa sin duda un desarrollo interesante.

lentitud y los incultivables en muestras clínicas. Además, se han adoptado estos métodos para la tipificación de bacterias por laboratorios de investigación y de referencia o bien para la caracterización de nuevas especies. Es en particular apasionante el desarrollo de la tecnología de DNA con chip, como los microensayos de DNA, en los cuales se producen los millares de oligonucleótidos localizados en un soporte sólido (chip). Tienen aplicación para secuenciar productos de la PCR. Asimismo, están disponibles los chips bioelectrónicos que utilizan campos eléctricos para mover muestras hacia las diferentes áreas analíticas; visto de cierto modo, se trata de un “laboratorio en un chip”. Para una discusión adicional, véase Nolte y Caliendo (2003).

Identificación de bacterias de importancia médica La siguiente es una breve introducción a la identificación de bacterias de relevancia médica. Para mayor información, véanse las Lecturas adicionales.

Espectrometría de masas

Cocos grampositivos

Los avances en las técnicas de espectrometría de masas han estimulado su aplicación al campo de la identificación bacteriana. Por ejemplo, la espectrometría de masas con ionización por desorción de láser asistida por matriz en tiempo de vuelo de microorganismos intactos ha demos-

La capacidad de un coco grampositivo de producir catalasa es una prueba rápida y útil que diferencia géneros positivos a la catalasa, como Staphylococcus y Micrococcus, de los géneros negativos, como Streptococcus y Enterococcus. La identificación siguiente se relaciona con la figura 12-2.

Cocos aerobios grampositivos Staphylococcus Micrococcus

Positiva

Prueba de la catalasa

Streptococcus Enterococcus

Negativa

β Crecen de forma anaeróbica

Hemólisis en agar-sangre

Ninguna

Sí

Sí

α No Prueba de la coagulasa

Negativa N gea tiive

Estafilococos coagulosa negativos

Hidrólisis de la esculina Tolerancia de 40% a sales biliares

Enterococcus Grupo de Lancefield

Sensible a la optocina Soluble en sales biliares

No

Positiva Sí Micrococos Staphylococcus aureus

Reactivo comercial

Especies individuales

Streptococcus viridans

Strep. pneumoniae

Grupo A = Streptococcus pyogenes Grupo B = Streptococcus agalactiae Grupo C = Streptococcus Grupo G = Streptococcus

Figura 12-2 Identificación de cocos aerobios grampositivos de relevancia médica.

Reactivo comercial

Especies individuales

IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS DE IMPORTANCIA MÉDICA

Staphylococcus y Micrococcus Estos géneros positivos a la catalasa producen de modo característico células dispuestas en racimos cuando crecen en medio líquido. Los estafilococos se pueden diferenciar de los micrococos por su capacidad para crecer bajo condiciones anaerobias. Staphylococcus aureus, una causa común de infección de la piel, las heridas y el pulmón, se puede diferenciar de otros estafilococos comensales de la piel por su capacidad para coagular el plasma y producir la enzima termoestable DNAasa. La actividad de la coagulasa se reconoce en pocas horas, lo que proporciona una identificación rápida y confiable. Las cepas de estafilococos negativas a la coagulasa pueden clasificarse de acuerdo con su especie mediante reactivos comerciales. Streptococcus y Enterococcus En medio líquido estos géneros negativos a la catalasa producen células dispuestas en pares o cadenas. En agar-sangre producen colonias con un diámetro de 0.1 a 1.0 mm después de 24 horas de incubación y el tipo de hemólisis observada alrededor de las colonias suministra una clasificación inicial de utilidad. Los estreptococos hemolíticos beta se demuestran mejor en los cultivos con crecimiento anaerobio. Las cepas que producen aclaramiento completo del medio de crecimiento que contiene sangre alrededor de la colonia (hemólisis beta) incluyen varias especies patógenas importantes que se diferencian por la clasificación de Lancefield. Esto puede realizarse por las pruebas comerciales en menos de una hora. Por lo general, lo anterior es suficiente para completar la identificación, aunque los reactivos bioquímicos comerciales de la prueba se pueden utilizar en casos de duda. Los estreptococos hemolíticos alfa producen hemólisis parcial (hemólisis alfa), una decoloración verdosa del medio de crecimiento que contiene sangre alrededor de la colonia. La especie patógena más importante es el neumococo, Streptococcus pneumoniae. Éste se diferencia de la otra especie hemolítica alfa por el aspecto de su colonia (colonias delineadoras), sensibilidad a la optocina y solubilidad de sus colonias en una solución de sales biliares. Otras especies hemolíticas alfa se encuentran como comensales en las vías respiratorias superiores, pero pueden causar de modo ocasional sepsis grave, como la endocarditis bacteriana subcutánea. Pueden clasificarse de acuerdo con su especie mediante reactivos comerciales. De manera característica, los enterococos no son hemolíticos en agar-sangre, aunque las cepas individuales pueden mostrar hemólisis alfa o beta. Los enterococos, al contrario de la mayor parte de los estreptococos, pueden crecer en

141

un medio que contiene 40% de bilis y pueden hidrolizar la esculina; estas propiedades se utilizan para identificarlos en el laboratorio clínico. Poseen a menudo el antígeno grupo D de Lancefield y pueden clasificarse de acuerdo con su especie, si se requiere, con reactivos comerciales. Bacilos grampositivos Los géneros de relevancia médica se identifican de manera inicial por el aspecto de sus colonias, capacidad para formar esporas y necesidad de condiciones de crecimiento aerobias o anaerobias (fig. 12-3). Bacillus y Clostridium Estos géneros formadores de esporas pueden diferenciarse por la catalasa y las condiciones requeridas para el crecimiento. Las especies de Clostridium, negativas a la catalasa, incluyen anaerobios estrictos. Los bacilos son positivos a la catalasa y todos crecen de forma aeróbica. Clostridium perfringens, la causa de la gangrena gaseosa, se puede identificar de manera preliminar por la prueba de Nagler, que detecta una enzima específica, la lecitinasa, que produce esta especie. Ambos géneros pueden clasificarse de acuerdo con su especie con pruebas bioquímicas. Listeria y Corynebacterium Estos géneros aerobios, no formadores de esporas, pueden confundirse con cualquier otro en medios de aislamiento primario. Listeria monocytogenes, un causante de sepsis y meningoencefalitis, muestra motilidad “en volteretas” característica en caldo de cultivo a temperatura ambiente, pero no a 37°C, puede hidrolizar la esculina y es a menudo hemolítica beta en agar-sangre. Corynebacteria spp. comprende comensales de la piel, patógenos oportunistas y varios microorganismos de importancia. Pocas especies son hemolíticas beta. El agente patógeno más importante es Corynebacterium diphtheriae, que puede aislarse a partir de escobillados de la garganta en medios selectivos que contienen telurito. Las cepas toxígenas se identifican con la prueba de Elek. Cocos gramnegativos Existen tres agentes patógenos humanos importantes en este grupo: Neisseria gonorrhoeae (el gonococo), que provoca la gonorrea; Neisseria meningitidis (el meningococo), un causante de septicemia y meningitis, y Moraxella catarrhalis, un factor de infecciones respiratorias y oculares.

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CAP. 12

IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS

Bacilos grampositivos Sí

No

Forma esporas

• Crece de forma aeróbica • Producción de catalasa

Sí Bacillus

Crece de forma aeróbica

Sí

• Hidrólisis de Positiva la esculina Listeria • Motilidad a temperatura monocytogenes ambiente

No No

Pruebas bioquímicas

Negativo Filamentos ramificados

Clostridium

Reacción de Nagler

Negativa

Positiva Especies individuales

Corynebacterium

• Pruebas bioquímicas • Prueba de la toxina

Reactivos comerciales

Coriniformes

Otras especies Especies de Actinomyces

Clostridium perfringes

Corynebacterium diphtheriae

Figura 12-3 Identificación preliminar de bacilos grampositivos de importancia médica.

Deben distinguirse entre sí y de otras especies que son comensales humanos comunes mediante las características de crecimiento y pruebas bioquímicas (cuadro 12-1). Son positivos a la oxidasa y catalasa. Bacilos aerobios gramnegativos Requerimientos simples para el crecimiento Los sistemas comerciales simplificaron en gran media la identificación de este grupo; empero, todavía se requieren

algunas pruebas simples para el examen externo de la flora comensal de agentes patógenos potenciales y la elección de la tarjeta o la tira correcta de la prueba (fig. 12-4). La prueba de la oxidasa es una investigación preliminar útil que toma apenas algunos segundos. Los géneros negativos a la oxidasa abarcan muchas especies que son comensales y patógenas del tracto gastrointestinal (Enterobacteriaceae). La fermentación de la lactosa se observa casi siempre en el agar de MacConkey que apoya el crecimiento de estos microorganismos en el aislamiento primario. Los no fermentadores de la lactosa pueden examinarse mediante la

Cuadro 12-1 Identificación de cocos aerobios gramnegativos de importancia médica

Ácido de* Glucosa Maltosa Lactosa Sacarosa Crece en agar nutritivo Tributirina** DNAasa

Neisseria gonorrhoeae

Neisseria meningitidis

Especies comensales de Neisseria

Moraxella catarrhalis

      

      

v v v v v  

      

v  variable, según sea la especie. *  prueba realizada en medio libre de suero. **  detecta la capacidad de la bacteria para descomponer el tributirato de glicerilo.

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IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS DE IMPORTANCIA MÉDICA

Bacilos aerobios gramnegativos

Requerimientos para el crecimiento

Fermenta azúcares

Positiva

Exigentes

Simple

Oxidasa

Morfología + cultivo

• Filamentos curvos • Microaerobios • Crece a 43ºC

Negativa No

Sí

No

Fermenta azúcares

Vibrio Pasteurella Aeromonas

Sistemas comerciales

Sí

Fermentación de lactosa Especies individuales

Cocos-bacilos

Especies individuales

Stenotrophomonas

Sí Acinetobacter Negativa Ureasa

Positiva

Campylobacter

Positiva

Negativa Proteus

Pseudomonas

Sistemas comerciales

No

Escherichia Klebsiella Enterobacter

Salmonella Shigella

Sistemas comerciales

Sistemas comerciales + serología

Especies individuales

Especies individuales

Coco-bacilo 5-10% CO2

Haemophilus Bordetella Brucella

Figura 12-4 Identificación preliminar de bacilos aerobios gramnegativos de importancia médica.

prueba de la ureasa o con un reactivo comercial para la presencia posible de Salmonella y Shigella, que luego se confirma con más pruebas bioquímicas y de aglutinación “O” (Salmonella y Shigella) y “H” (sólo Salmonella). Los géneros positivos a la oxidasa pueden diferenciarse: aquellos que fermenten azúcares, como Vibrio y Aeromonas, y los no fermentadores, como Pseudomonas. Pueden requerirse diferentes tiras y tarjetas de pruebas comerciales para fermentadores y no fermentadores.

Haemophilus spp. se aíslan habitualmente a partir de muestras respiratorias. Se clasifican de acuerdo con su especie por sus requisitos distintos de los factores X y V para el crecimiento en agar nutritivo. De modo inicial, Bordetella se puede identificar por la aglutinación con el antisuero específico. El agente patógeno Brucella puede clasificarse de acuerdo con su especie (casi siempre por los laboratorios de referencia por razones de salud y seguridad), susceptibilidad a la fucsina y la tionina de los colorantes, requerimiento para la producción de CO2 y H2S.

Requerimientos estrictos para el crecimiento Anaerobios Dentro de este grupo, Campylobacter spp. se identifica con facilidad por su morfología y capacidad para crecer en una atmósfera microaerobia a 42°C, pero no en el aire a 37°C. Haemophilus, Bordetella y Brucella son bacilos muy pequeños, sobre todo gramnegativos inmóviles que crecen comparativamente mal en agar-sangre y poco o nada en lo absoluto en agar de MacConkey. Esto les permite diferenciarse con facilidad de Pseudomonas y Enterobacteriaceae. Requieren medios enriquecidos, que contienen sangre para el aislamiento primario y la adición de 5 a 10% de CO2 mejora el crecimiento.

Los anaerobios estrictos se diferencian por su incapacidad para crecer en presencia de oxígeno y la sensibilidad al metronidazol, detectada por un disco colocado en la placa de aislamiento primario. Pueden clasificarse en relación con su especie mediante reactivos comerciales o la identificación de sus productos metabólicos por cromatografía de gaslíquido. Sin embargo, esto se realiza rara vez en laboratorios clínicos, a menos que el anaerobio se aísle a partir de un sitio estéril, como sangre o tejido blando. Los géneros grampositivos incluyen Peptostreptococcus (cocos), Clostridium

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CAP. 12

IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS

y Actinomyces (bacilos). Los géneros gramnegativos comunes incluyen Bacteroides, Fusobacterium, Prevotella, Porphyromonas (bacilos anaerobios) y Veillonella (cocos).

Lecturas adicionales Barron GI, Feltham RKA. Cowan and Steel’s Manual for the Identification of Medical Bacteria, 3rd edn. 1993: Cambridge University Press, Cambridge. Bright JJ, Claydon MA, Soufian M, Gordon DB. Rapid typing of bacteria using matrix-assisted laser desorption ionisation time-of-flight mass spectrometry and pattern recognition software. J Microbiol Methods 2002; 48: 127-138.

Collins CH, Lyne PM, Grange JM. (1995). Collins and Lyne’s Microbiological Methods, 7th edn. 1995: Butterworth-Heinmann, Oxford. Gill VJ, Fedorko DP, Witebsky FG. The clinician and the microbiology laboratory. In Mandell, Douglas and Bennett’s Principles and Practice of Infectious Diseases, 5th edn, Mandell GL, Bennett JE and Dolin R (eds). 2000: Churchill Livingstone, Philadelphia, PA, pp 184-221. Nolte FS, Caliendo AM. Molecular detection and identification of microorganisms. In Manual of Clinical Microbiology, 8th edn, Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Pfaller MA, Yolken RH (eds). 2003: ASM Press. Washington, DC, pp 234-256. Stokes EJ, Ridgway GL, Wren MDW. Clinical Microbiology, 7th edn. 1993: Edward Arnold, London.

13 Pruebas automatizadas en bacteriología Paul C Boreland

Automatización: uso del equipo automático para ahorrar trabajo mental y manual. The Concise Oxford Dictionary.

encuentran con regularidad en los laboratorios de microbiología clínica del Reino Unido.

Sistemas de cultivo sanguíneo Introducción Aunque la instrumentación automatizada se introdujo en el laboratorio clínico de microbiología unos 30 años antes, muchos clínicos han mostrado cierta renuencia a aceptar del todo este sistema. Esto se debe en parte a una actitud conservadora entre los microbiólogos, que perpetúan el uso de los métodos para detectar el crecimiento de microorganismos desarrollados a finales del siglo xix. Otros factores relevantes son la variedad y naturaleza de las muestras sometidas a análisis, la mayor complejidad de las pruebas microbiológicas, la dificultad de integrar un instrumento a las prácticas de laboratorio existentes, además de que muchas de las primeras máquinas no se fabricaron de forma adecuada. Pese a ello, los recientes progresos en tecnología y la interconexión bidireccional entre los instrumentos y los sistemas informáticos del laboratorio han hecho ahora de la automatización una alternativa práctica y rentable. En la actualidad, los instrumentos son parte integral de muchos laboratorios de microbiología clínica y el equipo automatizado está disponible para el reconocimiento de cultivos sanguíneos positivos, la comprobación de la sensibilidad antimicrobiana, la identificación de agentes patógenos, el examen de las muestras de orina para bacterias y el aislamiento y la sensibilidad antimicrobiana de Mycobacterium tuberculosis en muestras clínicas. No se describe en este capítulo la totalidad de los sistemas automatizados que pueden hallarse en el mercado mundial, pero sí los que se

La detección rápida de microorganismos en la sangre es importante para el diagnóstico y el pronóstico. Por lo tanto, los cultivos sanguíneos son esenciales en el diagnóstico y el tratamiento de los agentes etiológicos de la septicemia. Como ésta constituye una de las enfermedades infecciosas más graves, la identificación rápida de los patógenos bacterianos de la sangre es una función esencial del laboratorio de microbiología clínica. En consecuencia, en los últimos 30 años se desarrollaron y perfeccionaron los sistemas automatizados del cultivo sanguíneo. El primer instrumento semiautomatizado empleado, el BACTEC 460 (Johnston Laboratories Inc.), reconoció dióxido de carbono radiactivo metabolizado por microorganismos que crecían en un medio líquido con 14C incorporado. Esto condujo pronto al desarrollo del BACTEC 660/730 no radiométrico que utilizó la detección infrarroja del dióxido de carbono. Con posterioridad surgió un buen número de instrumentos por completo automatizados, cada uno de los cuales se compone de tres unidades básicas: una incubadora, un detector y una computadora. Los recipientes o los frascos de cultivo sanguíneo inoculados se colocan en estantes y pueden o no agitarse. Cada envase se vigila de modo continuo en relación con el crecimiento cada 10 a 15 minutos y la computadora analiza los datos por medio de un algoritmo predeterminado e indica cuándo un cultivo es positivo. Si se identifica un recipiente positivo, puede retirarse del sistema para aislar e identificar al agente patógeno. A diferencia de

The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker. © 2005 John Wiley & Sons, Ltd.

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CAP. 13 PRUEBAS AUTOMATIZADAS EN BACTERIOLOGÍA

los instrumentos más antiguos, el crecimiento microbiano se cuantifica por medios no invasivos. La mayor parte de los métodos de detección se basa, directa o indirectamente, en la producción de gases (en particular dióxido de carbono) o los cambios del pH que resultan del crecimiento de microorganismos en el caldo de cultivo. Las series BACTEC 9000 (9240, 9120, 9050) de los instrumentos para cultivo sanguíneo (Becton Dickinson) se diseñan para reconocer en poco tiempo agentes patógenos en muestras clínicas. La muestra se inocula en un frasco, que se introduce en el instrumento para la incubación y la lectura periódica. En la base de cada frasco existe un sensor de pH que contiene fluoroquímicos que reaccionan con el dióxido de carbono insertados en una matriz. El dióxido de carbono que producen los microorganismos al metabolizar los nutrimentos en el medio de cultivo, se difunde a través de la matriz y ello propicia una disminución del pH que detectan los fluoroquímicos. Los fotodetectores del instrumento miden de forma específica el grado de fluorescencia que emite el sensor cada 10 minutos, un aumento el cual es proporcional a la cantidad creciente de dióxido de carbono o a la cantidad decreciente de oxígeno presente en el envase. Las mediciones se interpretan con un programa de computadora de acuerdo con parámetros de positividad preestablecidos. El sistema BacT/Alert 3D (bioMerieux) incuba, agita y vigila de modo continuo el crecimiento de microorganismos en cultivos sanguíneos. Unido a la base de cada recipiente con cultivo sanguíneo, se coloca un sensor colorimétrico cubierto por una membrana de exclusión iónica que es permeable al dióxido de carbono pero impermeable a los iones de hidrógeno libres, los componentes del medio y la sangre completa. Cuando el dióxido de carbono se libera por el crecimiento de los agentes patógenos, se difunde a través de la membrana, disminuye el pH y se inicia un cam-

Figura 13-1 Detección de la producción acelerada de dióxido de carbono a partir del crecimiento microbiano. Reproducido con la autorización de bioMerieux.

bio de color del sensor, de verde a amarillo. Este cambio lo reconoce una luz reflejante a partir de un diodo que emite luz roja fuera del sensor sobre un fotodiodo (fig. 13-1). La señal del voltaje producida es proporcional a la intensidad de la luz reflejada y por tanto a la concentración del dióxido de carbono en el recipiente. Los datos obtenidos por la computadora se trazan como una curva de crecimiento de unidades de reflexión contra el tiempo.

Comprobación de la sensibilidad antimicrobiana y sistemas de identificación La identificación y comprobación de la sensibilidad antimicrobiana de aislados bacterianos son dos de las tareas más importantes del laboratorio de microbiología clínica. Varios sistemas están disponibles, desde los instrumentos semiautomatizados hasta los automatizados por completo, y casi todos ofrecen la identificación de agentes patógenos, así como la comprobación de la sensibilidad antimicrobiana con opciones de incubación convencional o rápida y tiempos de análisis. Algunos instrumentos disponen de tiras que pueden inocularse de forma automática o manual, incubarse externamente y después colocarse en un lector, que interpreta reacciones de color y los puntos finales del crecimiento. Con los sistemas por completo automatizados, las celdillas o las tarjetas de la microdilución se incuban dentro del instrumento que, de manera continua, vigila e interpreta el crecimiento o las reacciones bioquímicas. Cada sistema requiere un paso de estandarización del inóculo en condiciones normales con un densitómetro, para medir la densidad bacteriana, que puede expresarse en unidades McFarland. Para el reconocimiento de los cambios de color o crecimiento en el medio líquido que contiene los sustratos o las diluciones de los antibióticos, la mayor parte de los lectores automáticos emplea una combinación de tres métodos de medición de luz: a) transmisión de la luz en cuatro regiones del espectro, la colorimetría; b) intensidad de la luz transmitida, que es inversamente proporcional a la cantidad de crecimiento bacteriano, la turbidimetría, y c) intensidad de la luz dispersada a 30°, que es directamente proporcional a la cantidad de crecimiento bacteriano, la nefelometría. Las mediciones de la luz se convierten con facilidad en impulsos eléctricos y luego se cuantifican. Algunos instrumentos utilizan la hidrólisis del sustrato fluorógeno para identificar el crecimiento bacteriano y pueden proporcionar resultados en un plazo de cuatro a cinco horas. Todos los sistemas están equipados con una computadora y programas capaces de interpretar los resultados a partir de un lector. Las concentraciones inhibitorias mínimas (CIM) producidas se derivan de un algoritmo o valores de corte; de ese modo se identifican microorganismos a partir de una base de datos que contiene varios biocódigos y efectúa análisis estadísticos y epidemiológicos.

COMPROBACIÓN DE LA SENSIBILIDAD ANTIMICROBIANA Y SISTEMAS DE IDENTIFICACIÓN

El sistema Vitek (bioMerieux) utiliza tarjetas reactivas de plástico del tamaño de una tarjeta de crédito que contienen cantidades pequeñas del medio de crecimiento y antibióticos o medios de pruebas bioquímicas en celdillas de prueba. Las tarjetas están disponibles para la identificación de 300 especies de bacterias y levaduras y una gama de 17 antibióticos a los cuales aquéllas resultan susceptibles (S), intermedias (I) o resistentes (R); también proporcionan resultados de la CIM. Cada tarjeta de identificación cuenta con 30 celdillas de reacción que contienen diversas pruebas bioquímicas, sin la necesidad de agregar reactivos. La tarjeta de la sensibilidad contiene 45 celdillas de reacción que incluyen una gama de 17 antibióticos, cada uno presente sobre límites de concentración. Las pruebas específicas para detección de los mecanismos de resistencia también se incluyen en esta tarjeta. El sistema cuenta con un módulo de llenado y sellado para la inoculación y el cierre hermético de las tarjetas, además de una incubadora y un lector; las tarjetas se sostienen en un carrusel y los cambios de color bioquímico y la densidad óptica se miden por medios fotométricos cada hora. El sistema utiliza mediciones cinéticas determinadas de modo turbidométrico del crecimiento en presencia de antibióticos para realizar análisis de regresión lineal y, por último, para determinar las CIM derivadas del algoritmo. Por lo regular, los resultados están disponibles en un plazo de cuatro a 18 horas, con la identificación y la sensibilidad antimicrobiana de un microorganismo individual que se deriva del análisis computarizado de los datos. El Vitek 2 es una versión automatizada del Sistema Vitek, con procesamiento automatizado y anticipación de la muestra, incluidos la dilución inicial del inóculo, la verificación de la densidad y los pasos de llenado y sellado de la tarjeta. El instrumento transfiere de forma automática las tarjetas al lector-incubadora y las traslada a un compartimiento de eliminación al término de la comprobación. El sistema permite el análisis cinético tras analizar las pruebas cada 15 minutos. El sistema óptico combina las lecturas de multicanales del fluorímetro y el fotómetro para registrar señales fluorescentes de turbiedad y colorimétricas. El sistema Vitek 2 emplea una tarjeta con 64 celdillas y permite el escrutinio hasta con 20 antibióticos. El sistema de microbiología automatizado Phoenix (Becton Dickinson) usa un recipiente de plástico moldeado y sellado mediante autollenado, con los depósitos de inoculación en la tapa para llenado, y contiene 136 microceldillas. Se utiliza con el instrumento para probar la identificación del microorganismo o la sensibilidad antimicrobiana (AST), o una combinación de ambos. Para la identificación bacteriana, el área para la identificación del panel de la máquina Phoenix utiliza una serie de pruebas bioquímicas convencionales, cromógenas y fluo-

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rógenas en 51 celdillas. Los sustratos basados en el crecimiento y las enzimas se emplean para cubrir los diversos tipos de reactividad dentro de los límites establecidos. Las pruebas se basan en la utilización y la degradación microbianas de sustratos específicos detectados por varios sistemas indicadores. La producción de ácido se indica por un cambio en el indicador rojo de fenol cuando un aislado es capaz de utilizar un carbohidrato como sustrato. Los sustratos cromógenos producen un color amarillo sobre la hidrólisis enzimática de los compuestos p-nitrofenilo o pnitroanilida. La hidrólisis enzimática de sustratos fluorógenos resulta de la liberación de un derivado fluorescente de la cumarina. Los microorganismos que usan una fuente específica de carbón reducen el indicador basado en reazurina. Además, existen otras pruebas que detectan la capacidad de un agente patógeno de hidrolizar, degradar, reducir o utilizar en otra forma un sustrato. La prueba de sensibilidad antimicrobiana mediante el sistema Phoenix se basa en la microdilución y usa un indicador redox para la detección del crecimiento del agente patógeno en presencia de un antibiótico. Las mediciones continuas de los cambios del indicador, así como de la turbiedad, se emplean en la determinación del crecimiento bacteriano. Cada configuración del panel de AST contiene varios antibióticos con una extensa gama de concentraciones de doble dilución. La identificación del microorganismo también se utiliza en la interpretación de valores CIM de cada antibiótico. El Sensititre ARIS (AccuMed International Ltd) detecta crecimiento bacteriano por medio de compuestos conocidos como fluoróforos. Éstos consisten en diversos sustratos, como péptidos y ésteres, ligados a los compuestos que emiten luz fluorescente: 4-metilumbeliferona (4 MU) y 7-aminometilcumarina (7 AMC). En condiciones normales, estos complejos no son fluorescentes, pero durante el crecimiento bacteriano se producen enzimas específicas que inciden sobre los sustratos de los fluoróforos, lo que posibilita que la 7 AMC o la 4 MU despidan fluorescencia bajo luz ultravioleta. La sensibilidad a un antibiótico específico se registra como la ausencia de fluorescencia, es decir, ningún crecimiento, y la resistencia como fluorescencia debido a la producción enzimática de bacterias que crecen en forma activa. Por lo regular, los resultados toman sólo cuatro a cinco horas, pero pueden requerir incubación por toda la noche. El sistema se integra con un inoculador, una incubadora, un fluorímetro que lee la fluorescencia a 450 µm y una computadora. Las pruebas se realizan en celdillas sobre bandejas preparadas de microtitulación y los programas emplean un algoritmo que interpreta las señales y produce el punto de corte o los resultados de la CIM. El sistema de identificación trabaja de modo similar e incluye sólo las pruebas bioquímicas que puedan producir fluores-

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CAP. 13 PRUEBAS AUTOMATIZADAS EN BACTERIOLOGÍA

cencia o registrar su ausencia. El microorganismo se identifica con una base de datos de la computadora. Mastascanelite (Mast Group Ltd) es un sistema modular único que utiliza la tecnología de multipunto para inocular en agar una dilución para pruebas de sensibilidad antimicrobiana, punto de corte y CIM, además de pruebas bioquímicas de identificación. Consiste en un analizador que contiene una cámara de video a color, un inoculador de multipunto y una computadora. Las esferillas liofilizadas y predosificadas con antibióticos se emplean para preparar el punto de corte y las placas para CIM y observar también diversos cultivos para el reconocimiento bacteriano. Las placas de agar se inoculan con 96 diferentes microorganismos, se incuban y el crecimiento se visualiza con 19 o 36 macrocolonias. Después, éstas se colocan en el analizador y la cámara de video las inspecciona en los puntos predeterminados. Los tres colores básicos, rojo, azul y verde, se emiten como señal eléctrica cuantitativa al microanalizador, que convierte las señales en números. Para el punto de corte y las placas CIM, en los cuales la sensibilidad o la resistencia se definen como crecimiento o ausencia del mismo, las señales de tres colores se combinan para producir el equivalente de una señal en blanco y negro. Cuando se examinan las placas de agar para la identificación bioquímica, los detalles de los colores medidos se usan para definir resultados positivos o negativos de los diversos microorganismos probados. La tecnología de multipunto puede también utilizarse para examinar la orina. La creciente necesidad de contar con métodos estandarizados y cuantitativos de la AST, como los que recomienda

la British Society for Antimicrobial Chemotherapy (BSAC) o el National Committee on Clinical Laboratory Standards (NCCLS), ha llevado a varios fabricantes a producir los instrumentos semiautomatizados basados en la tecnología de difusión con disco, la cual requiere la medición exacta de los diámetros de la zona de inhibición. Los instrumentos Aura Image (Oxoid Ltd), BIOMIC (Giles Scientific Inc.), Mastascanelite (Mast Group Ltd), Osiris (Sanofi Diagnostic Pasteur) y Sirscan 2000 (i2a Montpellier) son sistemas de análisis de imagen que utilizan una cámara de video para medir el diámetro de la zona de inhibición e interpretar los resultados de las placas de agar para sensibilidad mediante la difusión con disco. La placa de agar se coloca en un recipiente corredizo motorizado y aparece una imagen clara con los diámetros calculados en la pantalla de video. Una zona de inhibición se interpreta como S, I, R de acuerdo con las tablas BSAC/NCCLS para antibióticos. La mayor parte de los sistemas tiene un sistema experto basado en reglas programadas por el usuario y una base de datos epidemiológica detallada.

Sistemas de examen de la orina El examen de las muestras de orina para identificar bacteriuria y piuria representa una proporción considerable de la carga de trabajo y el costo del funcionamiento de un laboratorio de microbiología clínica. Tan sólo 20 a 30% de estas muestras produce resultados clínicos de importancia y, por lo tanto, se han hecho varias tentativas de automati-

Figura 13-2 Análisis de las partículas de la orina mediante citometría de flujo y medición de la impedancia. Reproducido con autorización de Sysmex UK Ltd.

SISTEMAS DE IDENTIFICACIÓN Y SENSIBILIDAD ANTIMICROBIANAS PARA MICOBACTERIAS

zar el proceso para prevenir la obtención de muestras negativas. Es preciso contar con un instrumento que detecte bacterias y otras partículas en la orina, como eritrocitos y leucocitos, procese las muestras con rapidez y tenga un alto valor predictivo negativo. En la actualidad sólo está disponible un instrumento que emplea la tecnología de partícula que satisface estos criterios. El UF-100 (Sysmex UK Ltd) combina la citometría de flujo con la detección de la impedancia para reconocer y contar directamente las células y los microorganismos en la orina (fig. 13-2). Cada muestra de orina se mezcla con un diluyente y se agrega un colorante fluorescente dual con afinidad por el DNA y el RNA. La muestra teñida se envía entonces a una celda de flujo, que irradia un láser de argón. Los rayos láser se dispersan por las células de la muestra y la luz dispersada hacia adelante (fluorescente y no fluorescente), que es proporcional al área de sección transversal de las células, se cuantifica mediante un fotodiodo. Un fotomultiplicador calcula la fluorescencia emitida, que indica el grado de nucleación de la célula. Mediante cinco señales de altura y anchura fluorescentes y no fluorescentes, más las mediciones de la impedancia, el instrumento distingue las estructuras celulares tridimensionales en sus tipos y cantidades celulares apropiadas y cuenta los microorganismos. La distribución celular se puede mostrar en diagramas de dispersión e histogramas, con el programa Adaptive Cluster Analysis.

Sistemas de identificación y sensibilidad antimicrobianas para micobacterias La reaparición de tuberculosos y la incidencia creciente de brotes de cepas de Mycobacterium tuberculosis resistentes a múltiples fármacos ha conducido a la necesidad de contar con sistemas automatizados para las pruebas de detección, identificación y sensibilidad antimicrobiana rápidas de las micobacterias. La mayor parte de los sistemas disponibles en la actualidad se ha desarrollado a partir de la tecnología que cultiva sangre existente y usa una instrumentación similar. Todos los instrumentos tienen características de seguridad diseñadas para proteger al operador y prevenir la contaminación del ambiente. El BACTEC 460 TB (Becton Dickinson) fue el primer instrumento semiautomatizado empleado para la detección rápida de micobacterias. Se trata de un método radiométrico que usa viales con base para caldo Middlebrook 7H12, que contiene ácido palmítico radiomarcado como sustrato y cinco agentes antimicrobianos para reducir la contaminación. El dióxido de carbono radiomarcado se libera en el espacio libre del frasco por las micobacterias de la muestra inoculada y se metaboliza el ácido palmítico. La radiacti-

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vidad en el dióxido de carbono se mide por un contador de centelleo y se convierte a un valor del índice de crecimiento (IC). Un valor de IC de 10 o más indica la presencia de micobacterias. El complejo M. tuberculosis (MTB) puede diferenciarse de otras micobacterias al inocular una alícuota a partir de un vial positivo en un vial BACTEC que contiene fosfato de ácido nucleico (prueba NAP). Ningún aumento o disminución del valor del IC revela la presencia del complejo M. tuberculosis. El sistema puede también utilizarse para la prueba de sensibilidad antibiótica de los aislados de este complejo. El Sistema BACTEC 9000 MB (Becton Dickinson) se diseñó para el aislamiento rápido de micobacterias a partir de muestras clínicas y utiliza tecnología fluorescente para identificar micobacterias que crecen en medio de cultivo líquido. Cada vial de cultivo contiene un sensor fluorescente, que reacciona a la concentración de oxígeno presente. Si hay agentes patógenos, los nutrimentos del frasco se metabolizan y el resultado es un agotamiento del oxígeno en el medio. Los fotodetectores del instrumento miden el grado de fluorescencia, que corresponde a la cantidad de oxígeno consumido. El análisis del grado de disminución del oxígeno, cuando se mide mediante la fluorescencia creciente, permite al instrumento determinar si el vial es un instrumento positivo. Los frascos se acomodan en seis estantes, cada uno de los cuales aloja 40 viales. Los estantes se incuban de manera continua a 37°C y se agitan a intervalos de 10 minutos para la recuperación máxima de microorganismos. Los viales se prueban cada 10 minutos por diodos electroluminosos que activan los sensores fluorescentes. Una determinación positiva indica la posible presencia de micobacterias viables y se indica por medio de una luz que emite el instrumento en el monitor. El módulo de BacT/ALERT 3D (bioMerieux) para las pruebas de crecimiento, detección y sensibilidad de las micobacterias tiene un sistema de detección idéntico al empleado en los cultivos sanguíneos. Un sensor en la base de cada envase detecta el dióxido de carbono como indicador de crecimiento, con el cambio del verde al amarillo que vigila de modo constante un reflectómetro en la unidad de detección. El módulo de la incubación tiene cuatro compartimientos de 60 celdillas cada uno y éstos poseen un mecanismo de agitación independiente para procesar cultivos estáticos o con agitación dentro del mismo sistema. El Sistema BACTEC MGIT 960 (Becton Dickinson) es un instrumento con gran capacidad, completamente automatizado, de vigilancia continua, que puede analizar hasta 960 tubos MGIT de 7 ml para reconocer micobacterias (usa la misma tecnología de fluorescencia incluida en el sistema BACTEC 9000 MB). Los tubos de cultivo contienen un sensor fluorescente que responde a la concentración de oxígeno en el medio de cultivo. Los fotodetectores del

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CAP. 13 PRUEBAS AUTOMATIZADAS EN BACTERIOLOGÍA

instrumento miden la fluorescencia en cada tubo cada 60 minutos. La intensidad de la fluorescencia corresponde a la cantidad de oxígeno que consumen los microorganismos que, a su vez, es proporcional al número de bacterias presentes. El instrumento puede también utilizar el reactivo BACTEC MGIT 960 SIRE como un procedimiento cualitativo rápido para la prueba de sensibilidad de Mycobacterium tuberculosis a partir de un cultivo para estreptomicina, isoniacida, rifampicina y etambutol.

Comentario Para realizar pruebas microbiológicas en “tiempo real”, es decir, envío de la información al médico con un diagnóstico clínico de laboratorio, es inevitable que los microbiólogos incorporen cada vez más la instrumentación automatizada. Esto también contribuirá a aliviar la presión de los presupuestos, cada vez menores, las reducciones de personal y una carga de trabajo siempre creciente. Las numerosas ventajas de las pruebas automatizadas incluyen la liberación del personal calificado del trabajo repetitivo para efectuar tareas complicadas y exigentes, con lo cual mejora la calidad total del trabajo en el laboratorio; tiempos de respuesta menores; mejor estandarización de las pruebas al suprimir la subjetividad y el error humano, y un funcionamiento rentable de las pruebas, al reducir la

proporción de muestras negativas que requieren un procesamiento adicional. Es difícil imaginar la desaparición de la placa de agar y el asa de alambre después de un siglo de uso; empero, se acerca el momento en que el microbiólogo elija como primeras herramientas clínicas los instrumentos automatizados.

Lecturas adicionales Reimer LG, Wilson ML, Weinstein MP. Update on detection of bacteremia and fungemia. Clin Microbiol Rev 1997; 10: 444465. Ferrano MJ, Jorgensen JH. Susceptibility testing instrumentation and computerized expert system for data analysis and interpretation. In Manual of Clinical Microbiology, 7th edn, Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, Tenover FC, Yolken RH (eds). 1999: ASM Press, Washington, DC, pp. 1593-1600. Miller JM, O’Hara CM. Manual and automated system for microbial indentification. In Manual of Clinical Microbiology, 7th edn, Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, Tenover FC, Yolken RH (eds). 1999: ASM Press, Washington, DC, pp. 193-201. Langlois MR, Delanghe JR, Steyaert SR, Everaert KC, De Buyzere ML. Automated flow cytometry compared with an automated dipstick reader for urinalysis. Clin Chem 1999: 45, 118-122. Watterson SA, and Drobniewski FA. Modern laboratory diagnosis of mycobacterial infections. J. Clin Pathol 2000; 53: 727-732.

14 Técnicas de bacteriología molecular: preparación y aplicación de la muestra Richard E Holliman y Julie D Johnson

Necesidad de métodos moleculares

Preparación de la muestra

Con objeto de justificar la importancia de los recursos necesarios para desarrollar y realizar métodos moleculares de diagnóstico, una infección bacteriana debe satisfacer algunos criterios básicos. Primero, debe representar un problema clínico relevante en términos de la cantidad de casos, morbilidad y mortalidad. Segundo, el diagnóstico temprano de la infección debe mejorar el pronóstico del paciente; casi siempre está disponible una terapia específica y eficaz. Por último, la propuesta existente del diagnóstico basado en los métodos tradicionales de microscopia, cultivo y serología debe proporcionar un rendimiento inferior. Existe poca justificación clínica para desarrollar un método de diagnóstico de base molecular para una infección bacteriana que puede identificar y probar con facilidad la sensibilidad antimicrobiana en el laboratorio de rutina. La aplicación de métodos moleculares avanzados debe enfocarse en las bacterias que son exigentes y difíciles para crecer en cultivo; bacterias que se dañan en grado subletal; las que no pueden distinguirse de forma simple de las bacterias no patógenas similares; aquellas en las que no puede evaluarse con seguridad la sensibilidad microbiana, y las especies que no pueden distinguirse con razonable seguridad mediante los méto-dos de tipificación existentes. Este capítulo se concentra en los métodos moleculares relacionados con ácidos nucleicos bacterianos.

El éxito de cualquier técnica empleada para estudiar los ácidos nucleicos bacterianos confía de manera inicial en la liberación y purificación de los ácidos nucleicos designados. No existe hasta ahora un método de aceptación general para la preparación de muestras clínicas, pero hay muchos factores interrelacionados que se deben tomar en cuenta. Luego de seleccionar al agente patógeno, el tipo de muestra clínica lo impone la patogenia de la enfermedad. Para maximizar la posibilidad de detección debe considerarse la carga bacteriana dentro de la muestra (el número de microorganismos por volumen de muestra). En condiciones óptimas, esto es, cuando la carga bacteriana es baja, debe examinarse un volumen de muestra conveniente más grande; empero, las técnicas moleculares utilizan a menudo volúmenes ⬍100 µl. En última instancia, se necesita la concentración de los agentes designados en un volumen pequeño. Esto requiere una concentración elevada en las muestras, como el esputo para Mycobacterium tuberculosis y la sangre para la bacteriemia, pero bajas en muestras como orina para Chlamydia con la finalidad de conseguir la sensibilidad. Los volúmenes grandes de muestra exigen técnicas complejas de extracción, como la precipitación por etanol y la apropiación de los ácidos nucleicos “objetivo”, que propician una disminución de la sensibilidad del análisis. Los volúmenes grandes de muestra pueden tam-

The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker. © 2005 John Wiley & Sons, Ltd.

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CAP. 14

TÉCNICAS DE BACTERIOLOGÍA MOLECULAR: PREPARACIÓN Y APLICACIÓN DE LA MUESTRA

bién contener niveles más grandes de ácido nucleico inespecífico con DNA ajeno, lo cual puede comprometer el análisis. El tipo de muestra y la forma de procesarla durante y después de la colección revisten importancia. Las muestras de líquido cefalorraquídeo, orina y esputo pueden contener inhibidores. El hem (a 0.8 µM) y sus productos metabólicos son inhibidores conocidos de las polimerasas de DNA, debido a la unión del hem o la porfirina a la enzima de amplificación. Los polisacáridos ácidos, componentes de las glucoproteínas en el esputo, son también inhibidores. Pueden ser necesarias medidas adicionales para eliminar los inhibidores de muestras como esputo y sangre en comparación con orina o líquido cefalorraquídeo (Woodford y Johnson, 1998). Para la detección de enfermedades de transmisión sexual, como Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae y Trichomonas vaginalis, las novedosas técnicas de muestreo de autoadministración que usan muestras recolectadas con tampón han resultado más sensibles por PCR que el análisis urinario (Tabrizi et al., 1998). Los reactivos utilizados en la recolección de la muestra, como EDTA y heparina, también inhiben a las enzimas de amplificación. Si el objetivo está presente en abundancia, la dilución de la muestra puede eliminar el efecto inhibitorio, al tiempo que mantiene los ácidos nucleicos a un grado al cual la frecuencia de copias cero analizadas es baja. En contraste, la destrucción química o enzimática de los ácidos nucleicos reduce el número efectivo de objetivos amplificables de ácido nucleico. Los microorganismos objetivo y la durabilidad de su pared celular poseen un efecto notable sobre el procedimiento de extracción; por ejemplo, la pared celular de M. tuberculosis es en particular resistente a la lisis, mientras que la de Mycoplasma spp. se lisa de modo espontáneo. Es también importante proteger al personal del laboratorio que aplica técnicas moleculares cuando agentes patógenos como M. tuberculosis son los agentes de estudio; por tanto, puede ser necesario incluir medidas de esterilización dentro del procedimiento de extracción. Es necesario reducir al mínimo la manipulación de la muestra y acatar protocolos estrictos con requerimientos reducidos de equipo especializado. La amplificación extensa del DNA bacteriano exige el procesamiento de la muestra que libere el DNA desde una matriz de microorganismos “blanco” y abata los factores inhibitorios. Para aumentar la detección de agentes patógenos con paredes celulares de lisis difícil, la purificación del DNA con columnas de filtro de fibra de vidrio, con una medida adicional de sonicación, ha probado ser tan buena como la extracción estándar con fenol-éter de DNA (Rantakokko-Jalava y Jalava, 2002). Los procedimientos de preparación de la muestra contribuyen a la confiabilidad de la detección del objetivo dentro de las muestras clínicas; existen numerosos equipos

comerciales y se recomienda que las técnicas de extracción de DNA se seleccionen de forma cuidadosa, con particular atención en el tipo de muestra. Los equipos comerciales han probado superioridad para la extracción de DNA de muestras fecales (McOrist et al., 2002) y la extracción rápida de DNA en los estudios moleculares epidemiológicos de Plasmodium falciparum (Henning et al., 1999); incluso la lisis no comercial que incluye la serie lavado-álcali-calor ha probado ser el método más sensible y simple para la extracción del DNA de bacterias, levaduras y hongos a partir de material de cultivo en sangre (Miller et al., 2000). Algunos trabajadores han modificado los equipos comerciales para maximizar la recuperación y pureza del DNA extraído, en especial con protozoarios intestinales (da Silva et al., 1999). Si la preparación de la muestra es ineficiente, se generan resultados falsos negativos (cuadro 14-1).

Amplificación Los ácidos nucleicos pueden ser DNA o RNA, de doble hélice o simple, y deben estabilizarse una vez aislados para prevenir la degradación. El RNA es más difícil de estabilizar que el DNA. Es un requisito del aislamiento de RNA la ausencia de DNA contaminante. La extracción o destrucción selectivas de DNA o RNA permite sólo dirigirse al ácido nucleico apropiado. El rRNA puede estabilizarse en soluciones caotrópicas por meses a temperatura ambiente. Son problemáticos los agentes patógenos que tienen una etapa de RNA y una de DNA en su ciclo vital. La reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) detecta mRNA pero también DNA, a menos que se tomen medidas para destruir este objetivo (Dilworth y McCarrey, 1992). La amplificación basada en la secuencia del ácido nucleico puede también usarse para detectar mRNA; ésta es una reacción isotérmica que no requiere un ciclador térmico. En fecha más reciente, la amplificación por desplazamiento de hebra de la transcriptasa inversa (RT-SDA) también se ha utilizado como indicador de la viabilidad bacteriana (Keer y Birch, 2003). Los métodos de amplificación como la replicación de secuencia autosostenida, que en teoría son capaces de usar sólo moldes de RNA, no deben amplificar DNA salvo que se incluya una medida de desnaturalización como parte de la técnica de extracción. Es importante determinar si el DNA de hélice simple interfiere en realidad con este planteamiento de RNA específico. De manera análoga, la PCR reconoce sólo DNA, a menos que un paso de transcripción inversa preceda a la PCR. Las investigaciones con tinciones de sangre y semen en patología forense han mostrado que el DNA y el RNA pueden aislarse de modo simultáneo desde la misma muestra para el análisis median-

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PRÁCTICA ACTUAL

Cuadro 14-1

Solución de problemas en la preparación de la muestra

Contexto clínico

Problema

Solución

Muestras de gran volumen

Grandes cantidades de DNA extraño comparado con volumen pequeño de procesamiento Grados variables de inhibición de enzima Inhibición de la enzima

Extracción rigurosa de DNA Maximizar amplificación de la sensibilidad Individualizar las técnicas de extracción Dilución Agentes quelantes Controles positivos Procesamiento rápido de la muestra Condiciones óptimas de almacenamiento/ transporte RT-PCR

Tipos de muestras clínicas Químicos utilizados en la recolección de la muestra Agentes patógenos para examen

Estabilidad variable del objetivo

Pacientes con tratamiento parcial

Presencia de agentes patógenos viables o inviables La contaminación de muestras crea reacciones falsas positivas

Presencia de muestras clínicas y productos de amplificación previa en el laboratorio

te precipitación con etanol y extracción ácida con fenol y cloroformo (Bauer y Patzelt, 2003). Los métodos de amplificación de ácidos nucleicos estables pueden detectar microorganismos muertos, inactivos y en replicación. El reconocimiento de todas las formas de los agentes patógenos puede ser ventajoso cuando la viabilidad se pierde en poco tiempo durante el transporte o almacenamiento o si el agente no puede cultivarse. Sin embargo, la discriminación de microorganismos muertos y viables representa un problema si los agentes patógenos inviables o inactivos permanecen una vez que la infección activa es evidente.

Control de calidad Cuando se aísla, el blanco debe colocarse en un ambiente acuoso compatible con la amplificación. Muchos reactivos utilizados en biología molecular inhiben a las enzimas de amplificación para la purificación de ácidos nucleicos; éstos incluyen detergentes como el sulfato de dodecilo de sodio o caotrópicos como clorhidrato de guanidinio, que se utilizan para solubilizar la membrana celular o inactivar nucleasas, sobre todo en la extracción del DNA bacteriano y de levadura de productos sanguíneos (Golbang et al., 1996). Se deben tomar medidas adicionales para remover o neutralizar dichos reactivos. El control de calidad de los reactivos y el equipo en las técnicas clínicas de biología molecular es de enorme importancia. Con técnicas tan poderosas y sensibles como la PCR, el riesgo de reacciones falsas positivas debido a la contaminación y falsas negati-

Pipetas de desplazamiento positivo/ taponadas Estaciones de trabajo para el análisis antes y después de la PCR Equipo especializado

vas debido a los inhibidores de reacción ha llevado a idear procedimientos escrupulosos de anulación, que hacen a la técnica relativamente cara y limitada a quienes disponen de tiempo, instalaciones y destreza necesarios. De importancia particular en la microbiología diagnóstica es el uso de controles para anular los falsos negativos; por ejemplo, los controles intrínsecos de DNA de un número bajo de copias de una secuencia de control pueden incluirse en la muestra clínica. Si el control no se amplifica, puede asumirse que la muestra es inhibidora. Los requisitos especiales del equipo incluyen puntas taponadas o pipetas de desplazamiento positivo, estaciones de trabajo separadas, termocicladores y equipo básico de detección. Todo ello requiere un gasto financiero inicial grande. Debido a la falta de validación y protocolos estándar, además de reactivos y equipos de calidad variable, las técnicas moleculares son todavía la herramienta de los laboratorios de referencia y unidades de investigación. La European Commission ha aprobado la investigación en la validación y estandarización del uso del diagnóstico por PCR para la detección de bacterias patógenas en los alimentos (Malorny et al., 2003) y se espera que desarrollos similares en el diagnóstico clínico puedan generalizarse en el futuro.

Práctica actual A principios del año 2000 una cantidad creciente de infecciones bacterianas se convirtió en material para los métodos moleculares de diagnóstico en el curso de la práctica

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CAP. 14

TÉCNICAS DE BACTERIOLOGÍA MOLECULAR: PREPARACIÓN Y APLICACIÓN DE LA MUESTRA

Cuadro 14-2

Aplicación clínica de la metodología molecular

Función

Bacterias

Métodos convencionales

Métodos moleculares

Detección del agente patógeno

Neisseria meningitidis

Identificación de aislados

Staphylococcus spp.

Sensibilidad antimicrobiana

Mycobacterium tuberculosis

Microscopia del cultivo en medios de agar para detectar antígenos Examen de características fenotípicas, como producción de la enzima coagulasa Cultivos sobre/en medios que contienen antibióticos

Tipificación

Streptococcus pyogenes

Amplificación por PCR y sondeo DNA de productos de amplificación Amplificación por PCR con cebadores específicos para especies por secuencias del gen 16S rRNA Electroforesis de los productos de la PCR para detectar diferencias genéticas relacionadas con resistencia Amplificación por PCR de 16S rRNA y examen de los fragmentos del producto de la enzima de restricción

clínica de rutina. Un número más grande de dichos métodos se ha analizado en el laboratorio de investigación y algunos de ellos pueden encontrar un papel clínico en el futuro. Los métodos de laboratorio habituales se emplean en funciones diversas en el proceso diagnóstico; éstos comprenden la detección de microorganismos en una muestra clínica, identificación del aislado, pruebas de sensibilidad y tipificación epidemiológica. Los métodos moleculares se han aplicado a cada una de estas cuatro funciones; el cuadro 14-2 lista los ejemplos representativos. Desde la perspectiva clínica, los métodos moleculares se usan en el diagnóstico de infecciones bacterianas de las vías respiratorias, tejidos blandos, sistema urogenital, aparato digestivo y sistema nervioso central (Mandell et al., 2000). Vías respiratorias Muchas bacterias causantes de la infección de vías respiratorias crecen o se identifican con dificultad en cultivos. En consecuencia, es conveniente la aplicación de métodos moleculares avanzados en estas infecciones. Puede detectarse Mycoplasma pneumoniae en escobillados de garganta mediante la PCR, en tanto que Legionella pneumophila puede identificarse en secreciones profundas del pulmón por PCR y sondas de DNA (Mandell et al., 2000). Se ha desarrollado un anidado de PCR en un tubo simple que incorpora un sistema de detección basado en EIA para el diagnóstico de la infección por Chlamydia pneumoniae (Clewley, 1996). Pueden identificarse con rapidez, por hibridación con sondas específicas de DNA, aislados del complejo intracelular Mycobacterium avium cultivados sobre desperdicios o en

Serotipificación de la proteína M

medios líquidos. Los métodos moleculares pueden utilizarse para reconocer Mycobacterium tuberculosis en muestras clínicas, identificar aislados que crecen in vitro, valorar sensibilidad, vigilar la respuesta a la terapia (por la cuantificación de los valores de mRNA) y distinguir las cepas en los estudios epidemiológicos. Tejidos blandos Los métodos establecidos para la identificación de especies de estafilococos se basan en las características fenotípicas. Dichos métodos no suministran suficiente confiabilidad debido a la variable expresión de estos factores fenotípicos. El gen 16S rRNA posee regiones reservadas y variables. Al diseñar cebadores de PCR para secuencias específicas dentro del gen se logró clasificar, de acuerdo con la especie, los aislados de estafilococos con mayor exactitud (Clewley, 1996). Los aislados de estreptococos del grupo A (Strepto-coccus pyogenes) pueden someterse a genotipificación por el análisis del patrón de la enzima de restricción de 16S rRNA, un proceso conocido como ribotipificación. El gen pirógeno de la exotoxina se puede detectar por amplificación con PCR. Otro esquema de tipificación se basa en la amplificación con PCR y la digestión con la enzima de restricción del regulón de virulencia, un grupo de genes que comprende factores de virulencia como el factor inactivador del complemento y la actividad antifagocítica bajo control de la transcripción de un gen de virulencia (Clewley, 1996). Los exámenes moleculares de muestras de piel han alcanzado una sensibilidad hasta de 68% para el diagnóstico de la enfermedad de Lyme.

PRÁCTICA ACTUAL

Sistema urogenital Es posible detectar Chlamydia trachomatis en muestras genitales mediante prueba de ELISA, técnicas de inmunofluorescencia y sondas de DNA, pero estos métodos son menos sensibles que los cultivos convencionales. En contraste, la amplificación por PCR parece ser más sensible que el cultivo de Chlamydia, al tiempo que conserva alta especificidad y puede aplicarse a muestras de orina y escobillados endouretrales. El diagnóstico de gonorrea se basa aún en el aislamiento de la bacteria por cultivo convencional. Sin embargo, el sondeo de DNA, la amplificación por PCR o la reacción en cadena de la ligasa pueden ser de valor cuando el aislamiento es impráctico debido a las dificultades de transporte del espécimen o la falta de acceso inmediato a un laboratorio con instalaciones de cultivo. Las sondas de DNA para Neisseria gonorrhoeae tienen un límite aproximado de sensibilidad de 103 patógenos por muestra. La precisión de los diversos métodos de amplificación iguala o excede la del cultivo, pero la experiencia clínica es limitada (Mandell et al., 2000). Se han descrito métodos moleculares para el diagnóstico y estudios epidemiológicos de Haemophilus ducreyi y Treponema pallidum, además de agentes patógenos relacionados con la vaginosis bacteriana. Sistema digestivo En general, los métodos moleculares son de valor limitado para el diagnóstico de la infección gastrointestinal. Aunque los métodos convencionales de microscopia y cultivo son relativamente insensibles y consumen tiempo, la mayoría de los pacientes requiere sólo tratamiento de apoyo y un diagnóstico específico, que a menudo no afecta la terapéutica. Una posible excepción es la infección por Campylobacter, en la cual los métodos actuales de identificación se basan en factores bioquímicos poco fiables. Los cebadores de PCR específicos para el género Campylobacter y las especies del género, como C. upsaliensis, C. helveticus, C. fetus, C. hyointestinalis y C. lari, se basan en las regiones conservadas y variables del gen 16S rRNA. La digestión por las enzimas de restricción de los productos amplificados puede utilizarse para desarrollar un esquema de tipificación para seguir la extensión de las cepas en roturas (Mandell et al., 2000). La amplificación molecular también ha encontrado un papel en la detección de Escherichia coli 0157:H7. Sistema nervioso central Las sondas de DNA no han sido capaces de proporcionar un nivel clínico de sensibilidad útil cuando se usan para la detección de bacterias en el LCR; los métodos de ampli-

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ficación de DNA han mostrado mayor utilidad. La PCR para Neisseria meningitidis en las muestras del LCR alcanza grados de sensibilidad y especificidad por arriba de 90% en comparación con los cultivos convencionales. Esta técnica puede ser de particular valor cuando el paciente recibe antibióticos antes de la punción lumbar y representa un avance significativo respecto de los métodos de detección del antígeno. Estudios moleculares de la diversidad de meningococos han identificado linajes hiperinvasivos y posibilitado la introducción de vacunas nuevas. La PCR también se emplea para reconocer Listeria monocytogenes en individuos inmunosuprimidos con meningitis y Treponema pallidum en el diagnóstico de la neurosífilis sintomática. La sensibilidad y especificidad de estas aplicaciones todavía no se establece (Mandell et al., 2000). Amplificación de 16S rRNA y secuenciación Los cebadores universales para la amplificación de los genes 16S rRNA, con la secuenciación subsiguiente de los productos, se pueden utilizar para la identificación de los aislados bacterianos y la detección de agentes patógenos en las muestras clínicas; este planteamiento ha sustentado el diagnóstico de endocarditis infecciosa y el examen de muestras de LCR en el caso de sospecha de meningitis. La principal ventaja de los cebadores universales radica en que las alícuotas de muestras clínicas son innecesarias cuando se buscan con base en un límite particular de agentes patógenos, de tal forma que se conserva el volumen de la muestra y se evitan errores vinculados con la selección específica de microorganismos del análisis. En la actualidad se utiliza esta tecnología para buscar causas infecciosas antes desconocidas de la enfermedad clínica, como la esclerosis múltiple. La causa de la angiomatosis bacilar, Bartonella henselae, se reconoció de esta manera. Microensayos de DNA/RNA Dado que ya se han establecido las secuencias genómicas parciales o completas de muchos agentes patógenos bacterianos, se puede emplear la tecnología de microensayos para medir los grados de transcripción y detectar polimorfismos de la secuencia. Las sondas de DNA se inmovilizan sobre un soporte sólido y se utilizan para reconocer DNA o RNA luego de la amplificación por PCR. Los trozos de baja densidad son más convenientes para las aplicaciones clínicas de rutina debido a su simplicidad, fácil procesamiento de datos, reproducibilidad incrementada y bajo costo. Los microensayos se pueden desarrollar para detectar límites de agentes patógenos en una sola muestra clínica (por ejemplo, LCR) o establecer con rapidez resistencia y sensibilidad antibióticas en un solo aislado. Hoy en día

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TÉCNICAS DE BACTERIOLOGÍA MOLECULAR: PREPARACIÓN Y APLICACIÓN DE LA MUESTRA

tales aplicaciones se restringen a laboratorios de investigación, pero es probable que ingresen al uso diagnóstico en un futuro próximo. Detección molecular de resistencia microbiana Por tradición, la resistencia antimicrobiana se determina con el crecimiento de un agente patógeno bacteriano en presencia de concentraciones apropiadas de agentes terapéuticos seleccionados. Para mala fortuna, las tasas de crecimiento variables de bacterias tienen como efecto un retraso inherente, de modo que los resultados sólo están disponibles muchas horas después del aislamiento inicial del agente. El incremento de la comprensión de la base genética de la resistencia ha permitido el desarrollo de métodos moleculares para detectar en poco tiempo los cambios genómicos hallados en los fenotipos de resistencia. Este principio se ha aplicado a la identificación del gen Mec A que codifica la resistencia a la meticilina en estafilococos, la proteína que liga la penicilina en Streptococcus pneumoniae y varios de los determinantes de la resistencia a la rifampicina en Mycobacterium tuberculosis. No obstante, los métodos moleculares tienen ciertas limitaciones: los mecanismos de resistencia desconocidos o novedosos pueden omitirse, y cuando el número de genes diferentes que inducen la resistencia es grande, los métodos moleculares son costosos. Como resultado, los análisis fenotípicos son todavía el método de opción para analizar a la mayor parte de las bacterias.

Epidemiología y tipificación Los métodos convencionales de tipificación aplicados a las bacterias incluyen fagotipificación y serotipificación. Muchas veces, dichos métodos muestran un poder bajo de discriminación y escasa reproducibilidad, sobre todo cuando se aplican a microorganismos de crecimiento lento, como Mycobacterium tuberculosis. Las secuencias IS 6110 repetidas del DNA muestran suficiente polimorfismo para permitir un esquema de tipificación basado en la amplificación por PCR de la secuencia de inserción y la técnica Southern blotting de los fragmentos de la enzima de restricción. Las cepas que portan sólo una copia única de la secuencia de inserción no pueden separarse por la tipificación de la IS 6110. Tales aislados pueden investigarse con otro elemento repetitivo, la secuencia DR (Clewley, 1996). En cada caso, el gen posee repeticiones directas separadas por secuencias únicas. La variabilidad de estas secuencias únicas conduce a diferentes patrones de bandas después del corte con enzimas de restricción (polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción). El método desarrollado para

amplificar y marcar secuencias de DNA en la región DR se conoce como espaciador de oligotipificación o “espoligotipificación” (Marshall y Shaw, 1996). Estos métodos han revelado microepidemias insospechadas y delinean la importancia creciente de la tuberculosis como enfermedad de reciente adquisición. La tipificación secuencial multilocus ha hecho posible reconocer las vías de diseminación de los tipos individuales de Staphylococcus aureus multirresistente. Tal herramienta tiene ventajas sobre la electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE), entre ellas la facilidad del ingreso de información en una base de datos.

Problemas con los métodos moleculares Aunque los métodos moleculares han conducido a avances en el diagnóstico y tratamiento de la infección, aún son problemas de importancia. Los recursos necesarios de estas técnicas suelen ser más grandes que los de los métodos convencionales que tratan de reemplazar. El equipo especializado y los reactivos, junto con la necesidad de entrenamiento adicional del operador, han limitado la aplicación de los métodos moleculares en los laboratorios de diagnóstico comunes. La importancia clínica de la sensibilidad incrementada de los análisis basados en el sondeo del DNA, en particular la amplificación del DNA, puede ser incierta. Por ejemplo, un frotis positivo de una muestra de esputo en la microscopia habitual puede contener alrededor de 104 bacilos tuberculosos. A pesar de esta falta relativa de sensibilidad, los hallazgos son de gran valor clínico para predecir la infectividad. En contraste, es menos segura la importancia de un análisis positivo con PCR para M. tuberculosis realizado sobre una muestra de esputo tomada de un paciente sometido a terapia apropiada. Está bien documentado el daño de las reacciones falsas positivas debido a la práctica excesiva de la amplificación del DNA. En contraste, los volúmenes limitados de prueba utilizados en estos métodos pueden dar lugar a resultados falsos negativos en virtud del error de muestreo relacionado con la distribución irregular de los agentes patógenos en las muestras clínicas. Por último, los métodos moleculares de primera generación se diseñaron para detectar sólo la presencia o ausencia de un agente patógeno y no suministran información acerca de la viabilidad del microorganismo. Las técnicas convencionales para determinar la viabilidad dependen de la demostración de la integridad o la actividad celulares y es escasa la correlación entre la detección del DNA y la viabilidad. Los objetivos moleculares para valorar la viabilidad incluyen mRNA y rRNA. Las especies de rRNA de vida media más larga y su retención variable secundaria a una variedad de tratamientos bacterianos hacen del rRNA un indicador menos exacto de viabilidad que los objetivos mRNA (Keer y Birch, 2003). Aunque los

APLICACIÓN FUTURA

análisis posteriores corrigieron este defecto, tienden a ser complejos y más difíciles de realizar.

Aplicación futura Es posible que se desarrollen métodos moleculares apropiados para otros agentes patógenos cuyo crecimiento es difícil en cultivo, como las bacterias anaerobias, o en los casos en que la terapia antibiótica antecede a la obtención de las muestras para el diagnóstico, como la infección de las vías respiratorias y la osteomielitis. Los métodos moleculares pueden proporcionar información útil en cuanto a la virulencia probable de los aislados clínicos de estafilococos negativos a la coagulasa y estreptococos hemolíticos alfa. La genotipificación puede ser de utilidad en estudios sobre la extensión de la resistencia antibiótica y los mecanismos de la infección cruzada en los hospitales. Si bien los métodos moleculares no han revolucionado en gran proporción el campo de las enfermedades infecciosas, la introducción de estaciones de trabajo automatizadas mejorará la estandarización, reducirá costos y conducirá a una aplicación más amplia de los métodos moleculares en el laboratorio clínico.

Lecturas adicionales Bauer M, Patzelt D. A method for simultaneous RNA and DNA isolation from dried blood and semen stains. Forens Sci Int 2003; 136(1-3): 76-78. Clewley J. The work of the Molecular Biology Unit at Central Public Health Laboratory. PHLS Microbiol Dig 1996: 13: 4953.

da Silva AJ, Bornay-Llinares FJ, Moura IN, Slemenda SB, Tuttle JL, Pieniazek NJ. Fast and reliable extraction of protozoan parasite DNA from specimens. Mol Diagn 1999: 4(1): 57-64.

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Dilworth DD, McCarrey JR. Single step elimination of contaminating DNA prior to reverse transcriptase-PCR. PCR Methods Applic 1992; 1: 279-282. Golbang B, Burnie JP, Klapper PE, Bostock A, Williamson P. Sensitive and universal method for microbial DNA extraction from blood products. J Clin Pathol 1996; 49(10): 861-863. Henning I, Felger I, Beck HP. Rapid DNA extraction for molecular epidemiological studies of malaria. Acta Trop 1999; 72(2): 149-155. Keer JT, Birch L. Molecular methods for the assessment of bacterial viability. J Microbiol Methods 2003; 53: 175-183. Malorny B, Tassios PT, Radstrom P, Cook N, Wagner M, Hoofar J. Standardization of diagnostic PCR for the detection of foodborne pathogens. Int J Food Microbiol 2003; 83: 39-48. Mandell GL, Bennet JE, Dolin R (eds). Principles and Practice of Infectious Diseases, 5th edn. 2000: Churchill Livingstone, New York. Marshal BG, Shaw RJ. New technology in the diagnosis of tuberculosis. Br J Hosp Med 1996; 55: 491-494. McOrist AL, Jackson M, Bird AR. A comparison of five methods for extraction of bacterial DNA from human faecal samples. J Microbiol Methods 2002; 50: 131-139. Miller BC, Jiru X, Moore JE, Earle JA. A simple and sensitive method to extract bacterial, yeast and fungal DNA from blood culture material. J Microbiol Methods 2000; 42(2): 255. Rantakokko-Jalava K, Jalava. Optimal DNA isolation method for detection of bacteria in clinical specimens by broad-range PCR. J Clin Microbiol 2002; 40(11): 4211-4217. Tabriza SN, Paterson BA, Fairley CK, Bowden FJ, Garland SM. Comparison of tampon and urine as self-administered methods of specimen collection in the detection of Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae and Trichomonas vaginalis in women. Int J STD AIDS 1998; 9(6): 347-349. Woodford N, Johnson A (eds). Molecular Bacteriology: Protocols and Clinical Applications, 1st edn. 1998: Humana Press, Totowa, NJ.

15 Otras pruebas en bacteriología Darrel Ho-Yen

Introducción Una parte importante del trabajo en un laboratorio de bacteriología diagnóstica es el cultivo de bacterias. Tal identificación posibilita el diagnóstico definitivo, sobre todo cuando crecen agentes patógenos; empero, cuando el crecimiento es de microorganismos comensales, su papel no puede relacionarse con la enfermedad. Otros problemas de la técnica de cultivo en relación con el diagnóstico son el difícil crecimiento de algunas bacterias (p. ej., Legionella pneumophila, causante de la enfermedad de los legionarios), la imposibilidad de cultivar algunas (p. ej., Treponema pallidum, que provoca la sífilis) y el peligro notable que entraña el cultivo de otras (como Brucella abortus, que ocasiona la brucelosis). A pesar de estas limitaciones, el cultivo de bacterias es todavía el apoyo principal del laboratorio de bacteriología diagnóstica. Este capítulo considera otros métodos de identificación de bacterias como origen potencial de la enfermedad. Las aproximaciones directas para el diagnóstico son la identificación de bacterias (detección del antígeno) o el reconocimiento de anticuerpos específicos para la presencia de bacterias (detección del anticuerpo). Las técnicas para detectar anticuerpos, IgM, aumentos cuádruples del anticuerpo IgG, baja avidez de IgG o valores elevados de IgA pueden develar la infección en curso. Es importante recordar que si bien los resultados de un anticuerpo pueden delinear la infección, ésta puede no ser la causa de la enfermedad. Por lo tanto, una prueba específica sensible de IgM para Toxoplasma gondii puede ser positiva sin tener relación con los síntomas; puede tratarse tan sólo de una infección pasada. La formación del complejo inmunitario es un proceso natural durante cualquier infección. Por muchas décadas

han existido métodos intrincados e imaginativos que tratan de identificar microorganismos específicos dentro de los complejos inmunitarios. El éxito ha sido limitado, pero esta área constituye todavía un gran desafío intelectual para los microbiólogos. Por último, las pruebas indirectas de la infección bacteriana se realizan en muchos laboratorios de bacteriología. Estas pruebas se incluyen en dos grupos. En el primero, los marcadores de una infección particular pueden utilizarse para reconocer al agente patógeno (como la cromatografía de gas-líquido y las pruebas de respiración). El segundo grupo emplea los marcadores generales de las infecciones y no son específicos de una bacteria particular (como la proteína C reactiva).

Pruebas para el anticuerpo Aunque todos los líquidos corporales se pueden analizar para anticuerpos, en la bacteriología diagnóstica se analiza por lo regular una muestra sérica. En individuos inmunocompetentes, la infección por bacterias produce casi siempre el anticuerpo específico contra ese agente. Los anticuerpos son proteínas elaboradas en el suero (el compartimiento de la sangre libre de células) y conforman moléculas complejas de diversos tipos (llamadas inmunoglobulinas). Las inmunoglobulinas participan en diversos mecanismos de defensa contra bacterias invasivas. Hay cinco tipos de inmunoglobulinas en el ser humano, pero para la bacteriología diagnóstica, IgM e IgG son las de mayor uso (IgA e IgE son mucho menos importantes). El anticuerpo IgM aparece al inicio del curso de la infección (durante la primera semana) y es diagnóstico de la infección en curso. El anticuerpo IgG se forma más tarde en la infección

The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker. © 2005 John Wiley & Sons, Ltd.

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OTRAS PRUEBAS EN BACTERIOLOGÍA

(en la segunda semana) y las más de las veces es indicativo de infección e inmunidad pasadas. El anticuerpo IgG también cruza la placenta y confiere inmunidad al recién nacido. La IgA es la inmunoglobulina mucosa principal y la IgE interviene en particular en reacciones alérgicas; no obstante, ambas son incapaces de cruzar la placenta y tienen utilidad diagnóstica en el recién nacido. La IgM no cruza la placenta, pero una cuarta parte de los neonatos no produce IgM. Los aumentos y descensos de estas inmunoglobulinas (IgM, IgG, IgA e IgE) en el suero son diferentes y tales diferencias pueden usarse para medir el inicio de una infección, por ejemplo el diagnóstico de la infección durante el embarazo. Pruebas más antiguas Pruebas de aglutinación Los anticuerpos específicos presentes en el suero pueden aglutinar a las partículas bacterianas o partículas de látex cubiertas con antígenos bacterianos. Un ejemplo de una prueba de aglutinación es el método de aglutinación directa para la detección del anticuerpo contra Brucella abortus. En esta prueba, una suspensión de B. abortus se agrega a una serie de diluciones con suero del paciente contenida en tubos de ensayo. Los tubos se incuban por una hora o más tiempo, casi siempre a 37°C, y a continuación se interpreta el resultado. Para detectar la aglutinación más tenue, la prueba se puede incubar durante la noche para incrementar su sensibilidad. La aglutinación se observa al golpear con suavidad los tubos para perturbar las células; éstas ascienden en el líquido en la forma de agregados o, como en el caso de los controles negativos, como suspensión fina dispersada. Las pruebas de aglutinación se pueden adaptar con facilidad al uso en portaobjetos y resultan rápidas y fáciles de realizar. Las pruebas de aglutinación son en particular sensibles en presencia de anticuerpos de IgM dado que esta clase de inmunoglobulina se aglutina mejor que otras. No obstante, debe recordarse que el anticuerpo IgM no induce siempre aglutinación y son posibles resultados falsos negativos. Un problema técnico es el efecto prozona, en el cual la aglutinación no se observa a concentraciones más altas del anticuerpo debido a la inhibición estérica en los sitios de unión con el anticuerpo; sólo es obvia cuando se diluye la muestra. Los eritrocitos (como los de oveja) pueden también cubrirse con antígenos bacterianos. El análisis de hemaglutinación de Treponema pallidum (TPHA) se emplea para el diagnóstico de la sífilis. Estas pruebas de la partícula revestida tienen la ventaja de no sufrir ninguna autoaglutinación, es decir, la aglutinación de las partículas se efectúa a través de la simple adherencia de la proteína, lo cual es un problema frecuente con las suspensiones bacterianas.

Pruebas de fijación del complemento El suero del paciente se calienta primero a 56°C para destruir el complemento. En la segunda etapa se mezcla el suero en una gama de diluciones con el agente patógeno o sus antígenos. Se agrega una fuente del complemento, que en condiciones normales es una alícuota de suero fresco de cobayo, y la mezcla se incuba. Los complejos antígeno-anticuerpo formados entre las bacterias y la muestra del paciente activan el complemento del cobayo y por tanto lo eliminan de la mezcla. Al final del periodo de incubación, todas las mezclas se eliminan en la tercera etapa de la prueba, para la cual los reactivos se preparan de eritrocitos de una especie conveniente sensibilizada con el anticuerpo contra los antígenos del eritrocito. De manera característica se utilizan los eritrocitos de la oveja, que se sensibilizan con el anticuerpo del eritrocito antioveja del conejo, de tal forma que los eritrocitos se cubren con el anticuerpo en ausencia del complemento. Si el complemento se encuentra presente en la segunda etapa, los eritrocitos sensibilizados se lisan. Por lo tanto, la lisis indica que las muestras del paciente en la segunda etapa del procedimiento no tenían algún anticuerpo presente, mientras que la ausencia de lisis señala que el anticuerpo estaba presente y que el complemento se utilizó hasta la segunda etapa. Las pruebas de fijación del complemento se han usado con alguna frecuencia para muchos propósitos, como el diagnóstico de la infección por Brucella. Existen muchos problemas potenciales con estas pruebas. Su confiabilidad depende de la estandarización de todos los reactivos de la prueba antes de su realización. Además, no es raro encontrar sustancias en suero que ejercen efectos anticomplemento.

Pruebas de precipitación El principio señala que un anticuerpo, en especial IgG, precipita al antígeno soluble. La precipitación se puede realizar en solución acuosa en tubos de ensayo, pero se efectúa con más frecuencia mediante el método de Ouchterlony. Esta prueba utiliza una placa (placa de Petri) que contiene 1 a 2% de agar común, con celdas perforadas que se llenan de antígeno (del agente patógeno de interés) o el anticuerpo (suero del paciente). El formato general se muestra en la figura 15-1. El antígeno y el anticuerpo se difunden uno hacia el otro a través del agar y donde se encuentran se forma una línea de precipitación. Casi cualquier antígeno puede usarse, a condición de que se difunda con facilidad. Con un anticuerpo de especificidad conocida puede precisarse la identidad de un antígeno desconocido. Esta clase de prueba se puede emplear con las toxinas bacterianas, como las relacionadas con el tétanos y la difteria.

PRUEBAS PARA EL ANTICUERPO

Figura 15-1 Formato de la prueba de precipitación de Ouchterlony.

Pruebas recientes El principio de estas pruebas establece que el anticuerpo del paciente presente en el suero se une a un sustrato que se proporciona bajo la forma de bacterias o sus productos unidos a una superficie sólida. Después, las proteínas indeseables del suero se lavan a partir del sustrato y un segundo anticuerpo, casi siempre cultivado en conejos, ovejas o cabras, que es específico contra el anticuerpo humano y está marcado de forma apropiada, se agrega en la segunda etapa de la prueba. Si el anticuerpo del paciente se une al sustrato en la primera etapa, el anticuerpo de la segunda etapa también se liga. El marcador, o la marca, es variable, pero en cualquier caso debe cuantificarse con facilidad. Por ejemplo, en la técnica del anticuerpo fluorescente, este marcaje se realiza con fluoresceína, que puede visualizarse bajo luz ultravioleta, mientras que en el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) se emplea una enzima que puede actuar con posterioridad sobre un sustrato conveniente para producir un cambio de color mensurable. El número de marcajes disponibles es muy grande e incluye marcados radiactivos, pero el principio es el mismo para todas estas pruebas. Pruebas con anticuerpos fluorescentes Se utilizan portaobjetos especiales, muchas veces cubiertos con teflón, los cuales tienen 10 “lugares” para que puedan examinarse varias muestras en un solo portaobjetos. Una suspensión del microorganismo de la prueba se seca sobre el portaobjetos, se fija en acetona o etanol y se añaden los

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sueros de los pacientes. Después de la incubación (por lo regular 30 min) se lava la laminilla y se agrega la inmunoglobulina antihumana (IgG, IgM o IgA), que se ha marcado con fluoresceína. Después de la incubación y el lavado, se aplican los cubreobjetos y el portaobjetos se examina bajo un microscopio ultravioleta. Si la muestra contiene el anticuerpo contra el patógeno de la prueba, ese anticuerpo se une a él y reacciona con la antiinmunoglobulina marcada para producir microorganismos que emiten fluorescencia verde brillante bajo la luz ultravioleta. Mediante una serie de diluciones del suero del paciente es posible cuantificar la cantidad de anticuerpo presente. Existen varios problemas con estas pruebas; por ejemplo, son muy laboriosas y la lectura del resultado final es subjetiva y depende de la experiencia del observador. Además, la luz ultravioleta da lugar a que la fluorescencia se atenúe, de modo que las observaciones deben ser bastante rápidas. Por lo regular, estas pruebas son mejores con los antígenos de la pared celular, dado que los anticuerpos casi nunca penetran en los agentes patógenos para detectar antígenos internos. La prueba no es fácil de utilizar para la medición del anticuerpo IgM. A pesar de estas dificultades, las pruebas con anticuerpos fluorescentes han sido muy útiles y todavía se usan en el diagnóstico de la sífilis. Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) Este método sumamente difundido puede estar por completo automatizado, pero por lo regular es semiautomático. De manera característica, se usan microplacas de plástico con 96 celdillas, que pueden alojar una gran cantidad de muestras así como controles que pueden lavarse de manera automática y centrifugarse en caso necesario; los resultados los genera y analiza un lector automático. Muchas técnicas de ELISA están disponibles en el comercio. Las muestras se pipetean dentro de las celdillas revestidas con el antígeno, se incuban y se lavan, y se añade la inmunoglobulina antihumana marcada con una enzima. Después de la incubación y el lavado extensos se agrega un sustrato para la enzima. Existe un cambio de color del sustrato si la enzima está presente y el lector automático lo puede analizar. La intensidad del color es proporcional a la cantidad de anticuerpo que se une al antígeno; por lo tanto, el método es del todo cuantitativo. Sin embargo, es importante recordar que esto es verdad sólo si hay un exceso de antígeno unido a la placa y si se proporciona un exceso de inmunoglobulina antihumana en las fases posteriores. Estas condiciones están garantizadas en los dispositivos comerciales, pero es importante atender estos detalles con técnicas internas. La antiinmunoglobulina usada puede ser anti-IgM, antiIgG, anti-IgA, etc., y por tanto la prueba ofrece una ruta fácil para determinar el tipo de anticuerpo presente en las

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OTRAS PRUEBAS EN BACTERIOLOGÍA

diferentes etapas de la infección. El aspecto más valioso de esto es la medición de IgM como marcador temprano de infección aguda. Los métodos de ELISA son fáciles de utilizar, baratos y menos laboriosos que muchos otros métodos serológicos. Como una nota técnica de menor importancia, para los análisis internos es esencial reconocer que las filas externas de las placas de ELISA suelen ser dudosas como adsorbentes. Este problema puede superarse si se usan sólo las filas internas. Métodos radioinmunométricos Éstos fueron los precursores de las pruebas ELISA y el principio es el mismo. Por lo general, se realizan en tubos en lugar de celdillas; la única diferencia significativa radica en que la antiinmunoglobulina agregada está radiomarcada, casi siempre con 131I o 125I. Debido a los peligros potenciales de la radiactividad, estas pruebas se utilizan rara vez hoy día, aunque tienen mayor sensibilidad que la técnica ELISA y pueden emplearse en ciertos trabajos de investigación en los que se requiere una medida meticulosa.

Pruebas para el antígeno Las pruebas para el antígeno microbiano ganan cada vez más aceptación. La razón principal de ello es que el antígeno está presente en fase temprana de la infección y por lo tanto su detección proporciona información clínica de utilidad. Un buen ejemplo es la detección de los antígenos de Legionella pneumophila en la orina de pacientes con la Enfermedad de los Legionarios. Estas pruebas son a menudo positivas cuando el sujeto está grave y agudamente enfermo, si otros procedimientos diagnósticos no son convenientes. Sin embargo, existen otros ejemplos, uno de los cuales, la identificación de los antígenos de Neisseria meningitidis en casos de septicemia o meningitis por este microorganismo, ha funcionado por muchos años. De manera original, este método empleó una técnica llamada contrainmunoelectroforesis, que es una variante de los métodos de precipitación que se presentaron antes. En esencia, el suero del paciente se separa en un gel de agar al pasar un potencial eléctrico a través de él, lo cual da lugar a que las proteínas humanas y el antígeno meningocócico migren a posiciones diferentes y se separen. A continuación, se traza una ranura en sentido longitudinal en el gel junto a las proteínas separadas y se añade en la misma un anticuerpo específico contra el antígeno microbiano de interés. La difusión del anticuerpo hacia las proteínas separadas detecta la presencia del antígeno microbiano, si se encuentra allí. Al igual que otros métodos de precipitación, la contrainmunoelectroforesis es relativamente insensible y la mayor

parte de los ensayos para detectar y medir el antígeno microbiano utiliza ahora los sistemas de ELISA. La modificación requerida a la técnica de ELISA consiste en utilizar el anticuerpo específico para el antígeno de interés en la superficie de las celdillas de la microplaca. Este anticuerpo, las más de las veces un anticuerpo monoclonal, se usa para “capturar” el antígeno de la muestra del paciente. En una segunda etapa, el anticuerpo, que es específico para el antígeno y está marcado por medios enzimáticos, se agrega y se lleva a cabo el resto del procedimiento. Suele aceptarse que la captación del anticuerpo y la detección del anticuerpo deben ser diferentes, aunque la prueba trabaje con el mismo anticuerpo en ambos lados del “emparedado”. Emplear los anticuerpos monoclonales para ambos propósitos o usar uno policlonal y uno monoclonal son, en esencia, una cuestión de ensayo y error. Esta clase de aproximación ha sido en particular útil para el diagnóstico de infecciones víricas como el HIV y los virus de la hepatitis. Para las bacterias se ha observado una tendencia a tratar de simplificar los métodos mediante las partículas de látex en una prueba de aglutinación; las partículas se cubren con el anticuerpo contra el antígeno de interés. Como todas las pruebas de aglutinación, éstas son relativamente insensibles y no han demostrado ser tan útiles, como se pensó al principio. Como nota técnica, si se utilizan muestras de orina o esputo para reconocer un antígeno, muchas veces es necesario eliminar a los “inhibidores”. La naturaleza de éstos no está bien establecida, pero con frecuencia basta calentar la muestra al punto de ebullición por dos o tres minutos para eliminarlos. Esto no tiene casi nunca efectos de deterioro sobre el antígeno. En los próximos años se dispondrá tal vez de mejoras en los métodos de ELISA para la detección del antígeno. En especial, deben usarse no sólo para detectar el antígeno, sino para cuantificarlo por completo, algo que el método puede realizar sin problemas.

Prueba del complejo inmunitario específico del antígeno La figura 15-2 muestra un análisis teórico de los sucesos ocurridos durante una infección. El crecimiento de un microorganismo produce cantidades crecientes de antígeno microbiano a las cuales responde el huésped infectado con la elaboración de anticuerpo específico. Al final, en una reacción eficaz, la cantidad de anticuerpo formada suprime el crecimiento del agente patógeno. Varios puntos merecen cierta consideración a partir de este diagrama. Primero, en una fase inicial hay más antígeno disponible para la medición en comparación con el anticuerpo. En segundo lugar, el anticuerpo mensurable libre sólo aparece de modo tardío en el curso de la infección. Tercero, en el transcurso de

OTRAS PRUEBAS

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prueba supone romper los complejos y reconocer el componente del antígeno. Esto puede lograrse por calentamiento (60°C por 30 min), con la adición de un amortiguador de pH bajo (p. ej., glicina/HCl) o uno de molaridad alta, como fosfato 1 M. Después de la rotura de los complejos, se prueba el antígeno mediante uno u otro de los métodos descritos con anterioridad, como la técnica de ELISA. Medición directa de ELISA

Figura 15-2 Diagrama de los aspectos teóricos de las interacciones antígeno-anticuerpo en una infección.

la mayor parte de la infección, los complejos inmunitarios se forman entre el antígeno y el anticuerpo, según lo representa el área delineada en el diagrama. Dado que estos complejos inmunitarios contienen los antígenos de los microorganismos infectantes, su medición proporciona un medio para el diagnóstico. Se ha conocido por muchos años que la mayor parte de las infecciones microbianas sistémicas produce valores elevados de complejos inmunitarios en la sangre del paciente. Es raro que este reconocimiento se aproveche con fines diagnósticos, quizá porque las técnicas para la medición de los complejos han resultado difíciles en el pasado. En los últimos años se han descrito los métodos para diagnosticar pulmonía neumocócica, endocarditis contagiosa, enfermedad de Lyme, lepra, meningitis tuberculosa e infección por virus C de la hepatitis, que usaban ensayos del complejo inmunitario. Algunas de las técnicas practicadas se discuten a continuación. Métodos que usan polietilenglicol En estas pruebas, los complejos se precipitan a partir del suero por la adición del polietilenglicol. Esto funciona porque los complejos poseen un tamaño diferente de la inmunoglobulina o el antígeno natural. El polietilenglicol se deja actuar por varias horas, casi siempre toda la noche, y al final de ese tiempo la muestra de suero se centrifuga y el precipitado se elimina para el análisis adicional. La etapa siguiente de la

Estas pruebas utilizan anticuerpos monoclonales específicos contra los antígenos de interés unidos a las celdillas de las microplacas y con reactivo de captación. Se agrega la muestra del paciente y se captan los complejos presentes. En una segunda etapa se añade la inmunoglobulina antihumana marcada de forma enzimática y se liga a cualquier anticuerpo humano unido a la superficie de la placa mediante un complejo inmunitario. Esta versión confía en la elevada especificidad de los anticuerpos monoclonales para fijarse sólo a los antígenos de interés. También debe observarse que el diagnóstico por este método se infiere, no se prueba, puesto que se aduce que el anticuerpo del paciente no puede estar presente a menos que se una al antígeno captado en la placa de ELISA. Pruebas que utilizan agentes de unión de complejos inmunitarios Se conocen muchas sustancias que unen de modo específico los complejos inmunitarios, como C1q, separado y purificado (el primer componente del complemento), factor reumatoide (un anticuerpo desarrollado en algunos pacientes y dirigido contra IgG humana) y conglutinina (una proteína del suero vacuno); todas ligan complejos inmunitarios. Estas sustancias se pueden aplicar a las celdillas de la microplaca de la manera descrita para los ensayos de ELISA en general y las sustancias fijan después cualquier complejo inmunitario presente en la muestra del paciente; entonces se determina la naturaleza del complejo con un anticuerpo marcado por medios enzimáticos contra los antígenos de interés. Muchos de los informes sobre el uso de esta clase de análisis son en la actualidad experimentales, pero ofrecen rapidez y economía y muestran ser más sensibles que los métodos ya descritos. Tal vez se empleen con regularidad en el futuro.

Otras pruebas Pruebas cromatográficas Como se describió con anterioridad, se puede utilizar la detección del antígeno de los microorganismos como un

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OTRAS PRUEBAS EN BACTERIOLOGÍA

marcador de su presencia en una infección. De la misma forma, la detección de metabolitos de los agentes patógenos se utiliza para señalar la presencia del microorganismo. La identificación de los metabolitos se realiza por cromatografía de gas-líquido o cromatografía líquida de alta resolución, aunque la primera representa el ejemplo de diagnóstico mejor conocido. La cromatografía de gas-líquido se utiliza para separar e identificar ácidos grasos volátiles y no volátiles al hacer pasar una muestra a través de una sustancia de separación conveniente (p. ej., Chromasorb) mediante un flujo de gas acarreador. Los diferentes ácidos grasos se separan en tiempos diferentes. Una aplicación temprana fue la identificación del arabinitol en el suero de individuos con infección sistémica por Candida albicans. De manera inicial se pensó que las concentraciones elevadas de este metabolito se vinculaban sólo con esa infección, pero investigaciones subsecuentes probaron que la medición fue un marcador diagnóstico poco confiable. Se afirma que la presencia de esos microorganismos en pus y exudados puede determinarse de modo directo, aunque no es práctica común utilizar el método en muestras de rutina. Más acertado ha sido el uso del método para identificar y clasificar bacterias anaerobias, en particular patógenos gramnegativos. Pruebas de respiración Estas pruebas no invasivas se han empleado para identificar Helicobacter pylori, ahora reconocido como causal de úlceras duodenales. H. pylori tiene una enzima de gran alcance, la ureasa, que puede hidrolizar la urea marcada de forma radiactiva e ingerida para liberar el CO2 marcado; a continuación se mide en la respiración exhalada. Para la prueba se usan dos isótopos, 13C y 14C: el primero es más seguro pero más costoso que el segundo. Las pruebas son semicuantitativas, y puesto que la urea se distribuye a lo largo del estómago, no hay error de muestreo. La sensibilidad y la especificidad de estas pruebas se comparan bien con el cultivo y la histología. Las pruebas se pueden emplear para el diagnóstico de H. pylori o supervisar la respuesta al tratamiento.

Desarrollos futuros Existen varios desafíos en el área general de la serología. El primero es tratar la cuestión de la velocidad de los resultados. Un resultado lento (es decir, varios días) es de

interés académico o inútil en términos del diagnóstico y el tratamiento de la infección. Es claro que el antígeno o la detección del complejo inmunitario específico del antígeno ofrecen una vía más rápida para el diagnóstico respecto del reconocimiento del anticuerpo y por lo tanto es deseable el desarrollo de estos análisis. Además, el antígeno y los análisis del complejo inmunitario específico del antígeno pueden ser por completo cuantitativos, y utilizados de forma correcta con mediciones seriadas, pueden valorar la gravedad de cualquier infección y la respuesta a la terapéutica. No deja de ser decepcionante que estos métodos se usen hasta la fecha casi siempre de manera cualitativa; en el futuro se espera más un cambio de esta posición que las mejoras de la tecnología. Un desafío real para el futuro es la aplicación de algunos de los métodos mencionados a las infecciones consecutivas a patógenos comensales. Existen muchos casos, pero el diagnóstico y el control de la infección grave por Escherichia coli sirven como ejemplo útil. Las técnicas convencionales son con frecuencia inútiles y los métodos de PCR, como se emplean hoy día, tienen poco qué ofrecer porque sólo identifican la presencia del microorganismo. El reto consiste en saber lo que hace el agente patógeno. En consecuencia, el futuro debe enfocarse en la cuantificación cada vez más compleja del antígeno, se halle éste libre o en complejos; es probable que los inmunosensores o sus equivalentes participen en este desarrollo. Dado que la mayor parte de los métodos serológicos depende de la interacción antígeno-anticuerpo y ésta ocurre en el lapso de minutos, es sorprendente que casi todas las pruebas disponibles tomen varias horas y deban utilizar suero aislado. Los métodos que pueden cuantificar el antígeno microbiano dentro de cinco minutos, mediante secreciones de sangre completa o del cuerpo, son antiguas y su desarrollo representa un verdadero desafío para el futuro.

Lecturas adicionales Collee IG, Marmion BP, Fraser AG, Simmons A (eds). Mackie & McCartney’s Practical Medical Microbiology, 14th edn. 1996: Churchill-Livingstone, Edinburgh and London. Korpi M, Leinonen M. Pneumococcal immune complexes in the diagnosis of lower respiratory infections in children. Pediatr Infect Dis J 1998; 17: 992-995. Laperche S, Le Harrec N, Simon N, Bouchardeau F, Defer C, Maniez-Montrecial M et al. A new HCV core antigen assay based on dissociation of immune complexes: an alternative to molecular biology in the diagnosis of early HCV infection. Transfusion 2003; 43: 958-962.

16 Control de la quimioterapia antimicrobiana Ian M Gould

Introducción

Los primeros postulados de la quimioterapia

Puede afirmarse que la era moderna de la quimioterapia empezó hace más de 100 años con el trabajo pionero de Robert Koch; él y otros describieron la teoría del germen de la enfermedad que permitió el desarrollo del concepto de “balas mágicas”, es decir, agentes que destruían a los microbios sin dañar al huésped. Las primeras sustancias, derivadas del mercurio, antimonio y arsénico, demostraron ser muy tóxicas para su uso general, aunque encontraron un papel marginal en el tratamiento de la sífilis. Desde entonces se hicieron grandes avances en la mayor parte de las áreas de la quimioterapia antimicrobiana, pero los derivados de estos primeros agentes todavía se emplean para ciertas enfermedades parasitarias, como la leishmaniosis y la enfermedad del sueño. En el decenio de 1930, industriales y científicos alemanes trabajaron juntos para crear los primeros antimicrobianos modernos, las sulfamidas, medicamentos derivados de los colorantes. A éstas les siguió en poco tiempo el descubrimiento de los antimicrobianos naturales (antibióticos), como la penicilina (que descubrió en realidad Alexander Fleming en 1928, aunque primero se usó para tratar las infecciones durante la Segunda Guerra Mundial). Al principio el fármaco era tan escaso que los médicos recolectaban la orina de los pacientes tratados para extraer la “droga del milagro” y reutilizarla en otros enfermos. En consecuencia, la era de la quimioterapia, tal y como se entiende ahora, comenzó durante los decenios de 1940, 1950 y 1960, lapso en el que se hicieron grandes avances con los descubrimientos de nuevos antibióticos, se aprendió a sintetizarlos y se elaboraron fármacos por completo nuevos, como las quinolonas.

Desde la década de 1940 se comprendió que los diversos antibióticos actuaban de forma sinérgica con las bacterias de diferentes maneras, de tal modo que podía afectarse el régimen posológico óptimo. Un decenio más tarde resultó evidente la resistencia a casi cualquier antibiótico desarrollado después de su uso prolongado. Las primeras aplicaciones clínicas de estos dos principios fundamentales de la ciencia de la quimioterapia tuvieron lugar en el tratamiento de la tuberculosis, una enfermedad con una incidencia anual y un índice de mortalidad medidos en millones. El principio original del control de la terapia aprendido en esos primeros días fue la aplicación del conocimiento sobre los parámetros de dosis y respuesta (farmacodinámicos) de la interacción antimicrobiano-microbio, que condujo al tratamiento intermitente (dos veces por semana) con rifampicina e isoniacida. Esto fue factible debido al efecto supresor prolongado de estos antimicrobianos sobre el crecimiento del bacilo tuberculoso mucho después de la excreción de los fármacos y permitió la indicación de regímenes terapéuticos de uso más fácil, lo que se tradujo en notorias mejorías. Esta supresión prolongada del crecimiento se conoce como “efecto posantibiótico”. Cuando se elaboró el primer fármaco antituberculoso, la estreptomicina, se reconoció que la respuesta inicial conducía a la recaída después de algunas semanas debido a que las bacterias sobrevivientes se tornaban resistentes al mismo. En efecto, ahora se entiende que la terapia simultánea con tres fármacos activos (terapia triple) es esencial para la remisión de la tuberculosis sin el riesgo del desarrollo de cepas resistentes. Éste es el segundo principio, de suma relevancia para el tratamiento antimicrobiano de muchas

The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker, © 2005 John Wiley & Sons, Ltd.

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CONTROL DE LA QUIMIOTERAPIA ANTIMICROBIANA

infecciones, e ilustra cuán necesaria resulta la prueba primaria de la sensibilidad de los aislados como guía terapéutica. El uso habitual de esas pruebas de sensibilidad por los laboratorios de diagnóstico clínico empezó en ese momento (finales del decenio de 1950 y principios del de 1960) y ahora tienen un uso extendido en todo el mundo. La observancia de la terapia es otro principio importante del control de la quimioterapia, aprendido en aquellos primeros días del tratamiento de la tuberculosis, y es en particular importante para las enfermedades en las que la curación depende de la terapia prolongada (seis a 18 meses). Para mala fortuna, muchas de las víctimas de la tuberculosis provenían de estratos sociales empobrecidos, lo que hacía difícil la observancia terapéutica. Pronto se conoció que el tratamiento fracasaba con frecuencia en esta situación, a menudo debido al desarrollo de microorganismos resistentes. Por lo tanto, ganó aceptación la terapia de observación directa. De manera alternativa, puede analizarse la orina de los enfermos para reconocer la presencia de fármacos excretados. En fecha reciente, estas lecciones básicas tuvieron que reaprenderse en Nueva York, en donde los recortes de los servicios sociales y médicos condujeron a la cesación de la terapia de observación directa, lo que propició un enorme brote de tuberculosis multirresistente con un alto grado de letalidad. Resistencia antibiótica (cuadro 16-1) Desafortunadamente, el propio éxito de la quimioterapia antimicrobiana condujo a su declinación. Los médicos y pacientes consideran a los antimicrobianos como una panacea que cura toda afección, así que los antimicrobianos se prescriben de manera irrestricta. Este sobreuso se vincula de forma inextricable con la resistencia, bajo la forma de

Cuadro 16-1

un fenómeno de selección natural que permite la supervivencia de cepas resistentes. La mayor parte de la población del mundo puede comprar antibióticos legal o ilegalmente, aunque en muchos países están disponibles sólo con receta médica. Estos medicamentos representan una industria mundial multimillonaria y se ha creado un gran mercado negro con estos fármacos. Los habitantes del Tercer Mundo, que requieren los antibióticos con más frecuencia debido a sus índices de infección muy elevados, no pueden permitirse el consejo médico apropiado, las pruebas de laboratorio o los cursos completos de tratamiento necesarios para erradicar las infecciones; en consecuencia, la resistencia antibiótica es un problema particular en estas áreas del mundo, sobre todo en las zonas urbanas necesitadas. Incluso en los países ricos de Europa occidental y Norteamérica, los clínicos emplean mal los antimicrobianos y en los últimos 10 años se han identificado tendencias muy preocupantes de la resistencia. El mal uso incluye prescripciones en las cuales el agente, la dosis, la duración o la vía de administración no se indican o son incorrectos. Mientras que el uso ejerce una presión acumulativa sobre la selección de cepas resistentes (casi siempre por mutación o adquisición de plásmidos resistentes) en los planos individual y social, las dosis bajas por periodos prolongados suscitan resistencia con más probabilidad que el mismo peso total del fármaco administrado como una dosis más alta por un periodo más corto. Ante esta situación, muchos países han introducido campañas educativas públicas y profesionales. Las del Reino Unido han sido en especial exitosas en la reducción del uso de antibióticos por la comunidad, aunque la utilización hospitalaria continúa quizá en aumento y prosiguen todavía los problemas principales de la resistencia, como el caso del multirresistente Staphylococcus aureus.

Tendencias en los niveles de resistencia (%) 1997

Penicilina/neumococos Penicilina/meningococos Staphylococcus aureus multirresistente Glucopéptido/enterococos Ciprofloxacina/E. coli Gentamicina/Pseudomonas Ceftacidima/Klebsiella Amoxicilina/Haemophilus Amoxicilina/Moraxella Ciprofloxacina/Campylobacter

2003

Reino Unido

Sur de Europa

Reino Unido

Sur de Europa

10 0 5 1 2 3 1 20 80 1

50 40 75 5 15 40 20 30 80 40

5 0 40 5 8 7 10 15 95 10

50 40 75 10 30 50 40 40 95 60

PRINCIPIOS GENERALES DEL CONTROL DEL LABORATORIO DE LA QUIMIOTERAPIA

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Principios generales del control del laboratorio de la quimioterapia En la actualidad existen más de 100 antibióticos autorizados para uso clínico en el Reino Unido y muchos más a escala mundial. El papel principal del laboratorio de diagnóstico de un hospital consiste en definir a los agentes patógenos causantes de la enfermedad en pacientes cuyas muestras se procesan y, en la medida de lo posible, someter el aislado a prueba para determinar la sensibilidad con antibióticos relevantes. En condiciones normales, la prueba se realiza sólo en relación con una serie limitada y predeterminada de antibióticos con importancia clínica para la infección y, de manera presumible, activos contra el agente patógeno aislado. El proceso para determinar los antimicrobianos que se someten a análisis es complejo y debe considerar factores como el sitio y la gravedad de la infección, el método de excreción o el metabolismo del antimicrobiano, la función hepática y renal del paciente, la toxicidad, las vías de administración disponibles, el costo, la necesidad de una terapia de combinación, el beneficio clínico probado, el tratamiento actual con antimicrobianos u otros fármacos y las interacciones del agente. Aunque hay cerca de 100 antimicrobianos autorizados en el Reino Unido, éstos se componen sólo de algunas docenas de clases de fármacos diferentes y a menudo basta probar un agente representativo de cada clase. Muchas veces los pacientes iniciaron ya el tratamiento empírico, antes de contar con los resultados del cultivo y la sensibilidad, con la esperanza de que el laboratorio confirme las muestras. No obstante, aún es importante procesar los especímenes a la brevedad posible y, en caso de que el tratamiento necesite modificarse a la luz de los resultados del cultivo y la sensibilidad, se prescribe un agente más potente o menos tóxico. De igual modo, es importante trasladar con propiedad las muestras y establecer una buena comunicación para obtener con facilidad un dictamen y que éste se transmita con rapidez. También es útil para que el laboratorio publique los resúmenes de las sensibilidades a varios microorganismos, los clínicos elijan la terapia empírica más adecuada y los laboratorios participen en los esquemas de vigilancia con objeto de proporcionar la advertencia oportuna de la aparición de variantes raras o nueva resistencia. Esto permite a los médicos y funcionarios de salud pública utilizar la información y planear el tratamiento apropiado, además de contener la expansión de estas nuevas variantes resistentes; cabe señalar que en el mundo moderno la propagación de un país a otro o de un continente a otro toma muy poco tiempo (fig. 16-1). Existen otras maneras mediante las cuales el laboratorio puede dirigir o controlar de manera provechosa la terapia

Figura 16-1 Un ejemplo de un paciente con notable inmunosupresión que sufre infección en piel y ojo por Pseudomonas, con la circulación sanguínea extendida, después de recibir terapia contra el cáncer que redujo las defensas del cuerpo contra la infección. Alguna vez este tipo de infección mataba a los pacientes; en la actualidad, el tratamiento con antibióticos modernos suele tener éxito. Sin embargo, cada vez son más comunes estos individuos a medida que la medicina moderna es más exitosa y radical. Por lo tanto, los antibióticos se utilizan cada vez más, tanto en el hospital como en la práctica general.

antimicrobiana. La más importante es la medición de las concentraciones sanguíneas, y en ocasiones hísticas, de los fármacos, para asegurar que se obtienen los valores terapéuticos adecuados en pacientes muy graves; de ese modo puede asegurarse una toxicidad reducida al mínimo o nula. Estas mediciones no son necesarias en la mayoría de los pacientes, sólo en aquellos en quienes es necesario utilizar los antimicrobianos en una proporción terapéutica reducida, es decir, agentes cuyas dosis efectivas necesarias se aproximan a las que pueden ser tóxicas. Los aminoglucósidos y los glucopéptidos son los ejemplos más obvios de estos grupos de antibióticos. El uso de dichos medicamentos en particular tóxicos debe reservarse para las infecciones graves en las cuales la elección de agentes activos está limitada, a menudo por problemas de resistencia. No se solicita con frecuencia la medición de la actividad antimicrobiana en el paciente, pero se logra con facilidad al medir la actividad inhibitoria o cidal del antimicrobiano en el suero; para ello se toman casi siempre muestras antes de administrar una dosis (nivel mínimo) y una hora después (nivel máximo). Por lo regular, la distribución del antimicrobiano en los tejidos es completa para entonces. Según sean la farmacodinamia del antimicrobiano y el estado de la enfermedad, puede ser importante alcanzar niveles inhibitorios o cidales altos en los puntos máximos de la muestra; por ejemplo, los aminoglucósidos, como la gentamicina, tienen una actividad dependiente de la concentración. En cambio, en los lactámicos beta es importante tener actividad durante el periodo completo de dosificación debido a su carencia de un efecto posantibiótico contra muchas bacterias (dependencia del tiempo). En individuos muy enfermos suele ser útil evaluar beneficios potenciales de la terapia de combinación en el la-

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CONTROL DE LA QUIMIOTERAPIA ANTIMICROBIANA

boratorio para predecir los regímenes más activos. Estas pruebas pueden ser útiles, sobre todo en la fibrosis quística y en los sujetos inmunosuprimidos o con infecciones como endocarditis o meningitis, casos en los que es necesario aniquilar al microbio con los antibióticos sin la ayuda del sistema inmunitario del huésped.

Comprobación de la sensibilidad El concepto de prueba de sensibilidad se ha conservado desde que se introdujo a una escala amplia hace casi 40 años. Por necesidad, las pruebas deben ser simples, ya que un laboratorio clínico que atiende a una población de 250 000 sujetos efectúa las técnicas en cientos de microorganismos cada año. Pese a su simplicidad, las pruebas han resultado de suma utilidad durante años para orientar la terapia. Esto es lo que más sorprende cuando se considera la complejidad de los casos individuales, en los cuales el microbio interactúa con el sistema inmunitario del huésped en diversas afecciones, quizá sin relación con el trastorno sometido a prueba en el laboratorio. Existen cuatro métodos para la prueba de sensibilidad de uso común: a) difusión en agar (fig. 16-2); b) incorporación en agar; c) macrodilución en caldo, y d) microdilución en caldo. El primero es el más usado en el Reino Unido (en cerca de 85% de los laboratorios es el método habitual). En este método, las cantidades escrupulosamente controladas de los antibióticos se alojan en discos de papel; éstos se colocan de manera previa en una superficie de la placa de agar inoculada con un número controlado de las bacterias sometidas a análisis. Por lo regular se prueban hasta seis antibióticos por placa. Las placas se incuban en condiciones controladas por 18 a 48 horas, según sea el índice de crecimiento bacteriano. Se miden las zonas de inhibición del crecimiento por acción del antimicrobiano difundido y se relacionan con las bacterias sensibles y resistentes conocidas del control. Los resultados se informan como “sensibles” o “resistentes”, con base en el conocimiento de la farmacocinética específica de cada antimicrobiano, incluidas las concentraciones alcanzadas del fármaco en el sitio de la infección. Muchos laboratorios del Reino Unido han adoptado en fecha reciente los métodos de difusión en agar con disco, mucho más estandarizados, con objeto de permitir una comparación más exacta de los resultados para propósitos de vigilancia (British Society for Antimicrobial Chemotherapy y National Committee for Clinical Laboratory Standards; véanse las Lecturas adicionales). De manera alternativa, en la dilución en agar, las concentraciones preestablecidas de un antimicrobiano se incluyen en placas de agar antes de que se vierta y entonces, cuando se solidifica, las bacterias se “observan” sobre la superficie. Hasta 30 microbios pueden probarse con un solo agente

Figura 16-2 Un ejemplo de las pruebas de sensibilidad por disco. Éste es el método más común que prueba la sensibilidad en el Reino Unido. La zona de inhibición del crecimiento de bacterias del huésped se determina por la concentración del antibiótico en cada uno de los discos de papel y la sensibilidad de la bacteria. En este ejemplo la bacteria es totalmente resistente a cuatro antibióticos. Hay zonas pequeñas de inhibición alrededor de dos discos (la bacteria es aún resistente) y zonas grandes de la inhibición alrededor de otros dos discos (sensibles). Este ejemplo de un agente patógeno multirresistente es cada vez más común. La zona impar, no circular, de la inhibición de dos discos se debe a que el disco adyacente entre ellos contiene un antibiótico que interactúa con ellos, lo cual da lugar al antagonismo de la acción (intercepción) y la sinergia (forma de campana), respectivamente.

por placa. La concentración más baja del antimicrobiano que inhibe el crecimiento visible de las bacterias después de la incubación es la concentración inhibitoria mínima (CIM). Las pruebas de dilución en caldo para la sensibilidad antimicrobiana se realizan en tubos de ensayo (macrodilución) o placas de microtitulación (microdilución). Se incuba, a las concentraciones conocidas del antimicrobiano, un inóculo controlado de manera cuidadosa del microbio que se prueba; éste, a diferencia de la prueba en agar, puede ser un virus (si se incluye una variedad celular) o ciertos hongos o parásitos protozoarios, como los parásitos del paludismo, además de las bacterias. La CIM es la concentración más baja que inhibe el crecimiento (según lo revela la turbiedad a simple vista). Casi siempre es adecuado evaluar sólo los valores del antimicrobiano que inhibe el crecimiento; el sistema inmunitario del huésped permite la curación al destruir a la mayor parte de los microbios después de someterse a control por el antimicrobiano.

AUTOMATIZACIÓN

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A diferencia de las pruebas de agar, las concentraciones bactericidas mínimas (CBM) pueden evaluarse si se crea un subcultivo de las concentraciones inhibitorias para buscar cualquier sobreviviente. La concentración más baja con la eliminación de 99.9% del inóculo original es la CBM. Para las infecciones complicadas puede ser importante establecer los valores para agentes patógenos individuales y cerciorarse de que dichos niveles de actividad se logran en el paciente. Las pruebas de CIM, y algunas veces de CBM, se solicitan aun en el tratamiento de infecciones difíciles, como la endocarditis y la osteomielitis. Pruebas con microbios diferentes de las bacterias La comprobación de la sensibilidad para microbios distintos a las bacterias es, por comparación, muy limitada. Hasta hace poco tiempo las investigaciones relativas eran escasas, tal vez debido a la ausencia relativa de antimicrobianos eficaces para muchos de estos microbios. Esto suponía que no había opción terapéutica en caso de resistencia. Desde luego, también se han soslayado de cierta manera los problemas de resistencia. No obstante, en la actualidad se observa una verdadera explosión de nuevos agentes, en particular antimicóticos y antivíricos, en respuesta a las necesidades crecientes generadas por nuevas enfermedades, como el SIDA. Esta enfermedad no sólo requiere terapia antivírica específica para el virus HIV, sino también tratamiento para muchas otras infecciones víricas, micóticas, bacterianas y protozoarias, a las cuales pueden ser más susceptibles los pacientes. Es frecuente prescribir terapia antimicrobiana supresora en los pacientes con HIV por muchos meses o años, puesto que en virtud de la profunda inmunosupresión, es casi imposible erradicar los microbios de la infección. Éste es un ejemplo claro de la aparición de resistencia, como sucedió con la tuberculosis; éstas son también lecciones para mejorar la eficacia terapéutica y prevenir la aparición de la resistencia y, sin duda, serán de utilidad para idear un tratamiento apropiado del SIDA. La resistencia es un problema particular en la terapéutica de la infección vírica primaria por HIV; en ésta, para el momento en que la enfermedad se hace evidente, se advierte una carga vírica enorme con capacidad de desarrollar mutantes resistentes naturales que pueden sobrevivir a la terapia y multiplicarse. Ahora que ya están disponibles nuevos agentes anti-HIV, la detección de esas cepas será importante en el futuro, de tal modo que pueda individualizarse la mejor terapia de combinación para cada paciente. Los recientes desarrollos han permitido la averiguación de CIM de bacterias y hongos en placas con agar mediante el uso de pruebas E®, que contienen gradientes antimicro-

Figura 16-3 Un ejemplo de la prueba “E” ® para la comprobación de la sensibilidad. Las concentraciones graduadas de un antibiótico se incluyen en cada una de las tiras plásticas. Un “microorganismo control” de sensibilidad conocida se coloca en el exterior de cada tira y el agente patógeno de la prueba en el interior. En este caso el microorganismo “prueba” es muy resistente. El grado de resistencia o CIM (véase el texto) puede leerse fuera de la tira.

bianos en tiras plásticas, y el valor inhibitorio puede leerse después de la incubación, casi de la misma forma como se interpretan las zonas de inhibición en la prueba típica de difusión en agar con disco (fig. 16-3).

Automatización Mientras la automatización se generaliza en los laboratorios, se llevan a cabo tentativas para adaptar los métodos de prueba existentes para la sensibilidad. Las pruebas de microdilución en caldo son tal vez las más favorables para la modificación y las placas prepreparadas disponibles pueden interpretarse de modo automático por espectrofotometría. La lectura automatizada de las zonas con inhibición en las pruebas de difusión en agar con disco también es promisoria en cierto grado. Los métodos más recientes para comprobar la sensibilidad son mucho más susceptibles a la automatización y, en realidad, a menudo la requieren. Éstos incluyen la nefelometría, la bioluminiscencia, la impedancia o vigilancia de la conductancia y la citometría de flujo. Mientras estos métodos “directos” no suministren resultados rápidos (dentro de una a dos horas) acerca de la actividad inhibitoria y quizás también de la actividad cidal de los antimicrobianos, por el momento sólo son técnicas de investigación. Muchos de los valores séricos de los antimicrobianos se cuantifican de rutina por métodos automatizados, por

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CONTROL DE LA QUIMIOTERAPIA ANTIMICROBIANA

ejemplo EMIT® y TDX®, que utilizan reacciones y fluorescencia enzimáticas. Los valores de los antimicrobianos más recientes se pueden analizar por cromatografía líquida de alta resolución o por la técnica tradicional con placa, en la cual el suero o la muestra hística del paciente toman el lugar del disco que contiene el antibiótico en la prueba de difusión en agar con disco y el campo del organismo se convierte en una cepa control sensible. Es posible utilizar la concentración del fármaco en el suero (volumen conocido) o el tejido (peso conocido) y el tamaño de la zona de la inhibición para calcular la concentración del fármaco. En tanto el análisis de los valores séricos de ciertos antimicrobianos no se transforme en una prueba de rutina, el análisis de las concentraciones hísticas es sólo una técnica de investigación.

Control del hospital y enlace clínico La base del conocimiento adquirido a partir del trabajo en el laboratorio se puede emplear para coordinar el trabajo de varios grupos de personas relacionadas con la infección que trabajan en la comunidad y los hospitales. Entre estos individuos figuran el equipo de enfermeras y médicos del control de la infección, además de los clínicos de la salud pública encargados del control de la infección en la comunidad. Con una alerta oportuna es posible prevenir con eficacia los brotes. La infección adquirida en el hospital es muy común (quizá cerca de 10% de los pacientes admitidos), de manera tal que cualquier información sobre prevención y actualización de los últimos microorganismos epidémicos puede prevenir muchas infecciones y limitar el uso inadecuado de los antibióticos. Es útil el conocimiento de los patrones locales de sensibilidad con objeto de que los médicos establezcan el tratamiento empírico de la infección, aunque la comunicación rápida de los resultados de pacientes individuales también Cuadro 16-2

es relevante para orientar la terapia antimicrobiana a partir de una base racional. La mayor parte de los hospitales y algunas prácticas generales han redactado lineamientos correspondientes; asimismo, los datos de sensibilidad que ponen a disposición los laboratorios locales crean una base útil para diseñar estas pautas y proporcionan las recomendaciones locales para instituir el tratamiento empírico más apropiado. Está probado que ello evita la exposición innecesaria a los antibióticos, algunos de ellos costosos y tóxicos, y mejora el resultado del paciente. El laboratorio también debe ser una plataforma para la educación de clínicos y público acerca del mejor uso de los antimicrobianos. Este tema apenas si se toca entre los estudiantes universitarios y todavía constituye un campo complejo; además, la cantidad de fármacos crece de forma constante, lo cual hace cada vez más difícil que el clínico los prescriba de forma apropiada. En fecha reciente se ha propuesto que los estudiantes universitarios y posgraduados enseñen la terapia antimicrobiana (www.bsac. org.uk). Otra manera de reducir la exposición antibiótica consiste en disminuir la cantidad de agentes notificados a sólo aquellos que parecen más apropiados (quizá dos o tres) o no divulgar ninguna sensibilidad para aislados que careCuadro 16-3 Nuevos antibióticos (2003)

Grampositivos

Respiratorios

Sinercida Linezolida Daptomicina Dalbavancina Ortavancina Iclaprima Cefalosporinas anti-PBP2’

Cetólidos Quinolonas De amplio espectro Tigeciclina Ertapenem

Prescripción de antibióticos: tipos de intervención y administración

Educativa

Reguladora

Organizacional

Estructural

Restrictiva

Lineamientos* (ACUERDO)

Reembolso

Equipos multidisciplinarios

Prescripción computarizada

Listas limitadas, formularios Sustitución terapéutica (incluido el cambio) Ciclismo Pruebas/informes del límite de sensibilidad Fechas de suspensión automática

Programas Detalles de extensión/ académicos* Auditoría/ retroalimentación* Talleres interactivos* * Revisión de Cochrane.

Formas de orden

CONCLUSIÓN

cen de relevancia clínica. Sin embargo, estas medidas no se han evaluado de manera adecuada y confían demasiado en la información que suministra el médico al laboratorio. El cuadro 16-2 enumera las medidas actuales aplicadas para mejorar la administración antimicrobiana. La base de la evidencia para tales conductas se revisa con frecuencia, sea en los hospitales o en la comunidad (www.cochrane.org). Es importante redoblar los esfuerzos para limitar el uso inadecuado del antibiótico. Esto resulta más importante, ya que en una reunión europea reciente se confirmó que varias compañías farmacéuticas importantes suspendieron o redujeron la investigación en antibióticos. La aparición de nuevos y prometedores antimicrobianos se ha restringido en comparación con 30 años antes (cuadro 16-3). Sólo se introdujo una clase nueva por completo de antimicrobianos en los últimos 40 años.

Conclusión Pasteur o Fleming no se expondrían a ningún apuro en un laboratorio diagnóstico del hospital común en estos años. No se han observado grandes avances en los métodos de prueba, no los imaginables si se considera el trabajo actual de la genética microbiana. Este trabajo ha incrementado en gran proporción el conocimiento y entendimiento de los mecanismos resistentes y, sin duda alguna, tendrá un efecto en la manera de probar la resistencia en el laboratorio de diagnóstico en los próximos 10 o 20 años. Incluso ahora, los laboratorios más grandes pueden probar directamente por sonda de DNA una pequeña selección de genes resistentes, como el mec A que convierte a Staphylococcus aureus en un supermicrobio resistente a todos los antimicrobianos lactámicos beta. De forma similar, se prueba de rutina la presencia de enzimas lactámicas beta en algunas bacterias en vez de evaluar la expresión fenotípica de estas enzimas (que puede ser difícil por métodos de prueba tradicionales para la sensibilidad). Desde luego, las pruebas genotípicas directas se utilizarán de modo más extenso en el futuro, dado que delinean el perfil de resistencia potencial de un microorganismo, en vez de su resistencia al momento de la comprobación y bajo las artificiales condiciones experimentales del laboratorio. Por otra parte, el progreso para establecer estas nuevas pruebas en los laboratorios de diagnóstico ha sido lento. Éste es un perfil optimista y realista del papel futuro del laboratorio en este campo. Empero, no es posible ayudar sin ser pesimista acerca del potencial de las bacterias para tornarse resistentes a todos los antimicrobianos, a menos que se administren de modo mucho más cuidadoso. El des-

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cubrimiento de los mecanismos de los microbios, según lo atestigua el uso de los integrones, transposones, operones, regulones, sinergones, etc., indica que los microbios son muy adaptables y están casi siempre cuando menos un paso adelante de la batalla microbiana-antimicrobiana.

Lecturas adicionales British Society for Antimicrobial Chemotherapy. Antimicrobial susceptibility testing. BSAC Working Party Report, Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2001; 48: S1. European Union Conference. The Microbial Threat; The Copenhagen Recommendations. September 1998: Danish Ministry of Health and Ministry of Food, Agriculture and Fisheries. Finch RG, Greenwood D, Norrby SR, Whitley RJ. Antibiotics and Chemotherapy, 8th edn. 2003: Churchill Livingstone, Edinburgh. Garrett L. The Comming Plague. 1995: Penguin Books, Harmondsworth. Gould IM, van der Meer JWM. Antibiotic Policies: Theory and Practice. 2005: Kluwer Academic/Plenem Publishers, New York. House of Lords Select Committee on Science and Technology 7th Report. The Resistance to Antibiotics and Other Antimicrobial Agents. 1997-1998: The Stationary Office, London. Kucers A, Bennett NM. The Use of Antibiotics, 4th edn. 1987: Heinemann Medical, Oxford. Levy SB. The Antibiotic Paradox, 2nd edn. 2002: Perseus, Cambridge. Lorian V. Antibiotics in Laboratory Medicine, 4th edn. 1996: Williams & Wilkins, Baltimore, MD. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing, Twelfth Informational Supplement. 2002: NC CLS, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, PA 19087-1898, USA. Standing Medical Advisory Committee Sub-group on Antimicrobial Resistance. The Path of least Resistance. 1998: Department of Health, London. World Health Assembly Resolution. Emerging and Other Communicable Diseases: Antímicrobial Resistance, 16 May 1998: WHA 51.16. World Health Organization. The current status of antimicrobial resistance in Europe. Report of a WHO work-shop held in collaboration with the Italian Associazione Culturale Microbiologia Medica, Verona, Italy, 12 December 1997. WHO/EMC/ BAC/98.1. WHO, Geneva. World Health Organization. The medical impact of the use of antimicrobials in food animals. Report of a WHO meeting, Berlin, Germany, 1997. WHO/EMC/ZOO/97.4. WHO, Geneva, pp 13-17.

SECCIÓN 4 MICROBIOLOGÍA Virología, Micología y Parasitología KWWSERRNVPHGLFRVRUJ

17 Microscopia en virología: aplicación y preparación de la muestra Marie M Ogilvie

Introducción La microscopia de luz ha desempeñado un papel significativo en la virología desde su uso más temprano en el examen de las preparaciones teñidas de la célula o los cortes de tejido. Hoy en día ningún microscopio se encuentra en la banca de virología de muchos laboratorios de microbiología, puesto que el trabajo de diagnóstico regional general se basa en el uso de los reactivos de inmunoensayo para la detección del antígeno o anticuerpo víricos. Cada vez más, incluso en el laboratorio de diagnóstico especializado en virus, la microscopia se emplea con menos frecuencia, mientras que los métodos más sensibles de detección de virus, basados en la amplificación del ácido nucleico por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), se introducen junto con métodos existentes de detección del antígeno. Sin embargo, en los primeros años del nuevo milenio los microscopios son aún de uso regular en el trabajo de diagnóstico de virología, ya que los cultivos celulares se examinan para efectos citopáticos debido al crecimiento del virus, y las células teñidas con reactivos fluorocromomarcados se examinan para antígenos del virus.

Histopatología: cuerpos de inclusión y células multinucleadas gigantes El histopatólogo que examina frotis fijos teñidos de células o cortes de tejido observa los cambios morfológicos característicos que se vinculan con la presencia de infecciones específicas de virus. Las más conocidas de estas características

distintivas son los cuerpos de inclusión —partículas acumuladas de virus (como en el cuerpo de Negri común de la rabia) o exceso de proteínas sintetizadas durante la replicación de virus— y las células multinucleadas gigantes. Estas últimas, una consecuencia de la fusión entre las membranas plasmáticas de las células adyacentes, son una característica de infección con los virus envueltos, que poseen una glucoproteína que induce la fusión independiente del pH en la superficie celular, por ejemplo el virus sincitial respiratorio (RSV) y el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV). Los virólogos usan el término sincitio (del griego, syn = unión) para tal célula. Los virus del herpes simple (HSV) y la varicella-zoster (VZV) producen células multinucleadas in vivo e in vitro (“en un cuerpo viviente” y “en vidrio”, es decir, en cultivo). Aún se da el nombre de Tzanck a los frotis de células preparados por este método para obtener raspados de la base de una úlcera o vesícula, que después se tiñen y examinan en busca de células gigantes del herpes (HSV o VZV) (fig. 17-1). El bien conocido cuerpo de inclusión “ojo de búho” visto en las células infectadas con citomegalovirus (CMV) es una inclusión intranuclear rodeada por un halo claro, dentro de una célula considerablemente agrandada (megálica), aunque sólo hay casi siempre un núcleo. El CMV puede producir células multinucleadas gigantes in vivo; éstas son de origen endotelial y su presencia en la circulación representa enfermedad sistémica grave. La evidencia de localización intracelular de CMV es importante en la confirmación del significado patológico del hallazgo de este virus, lo que no siempre puede proporcionar el simple aislamiento del microorganismo.

The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker. © 2005 John Wiley & Sons, Ltd.

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MICROSCOPIA EN VIROLOGÍA: APLICACIÓN Y PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

Figura 17-1 Corte de una lesión herpética de piel, teñido con hematoxilina y eosina. La flecha señala una célula multinucleada gigante. Cortesía del Dr. K McLaren, Department of Pathology, University of Edinburgh.

Virología El éxito del aislamiento del virus (por cultivo) o la detección de antígenos víricos en las células del material clínico depende en gran medida de la obtención de la muestra correcta, su manipulación apropiada y el uso de la gama de cultivos celulares y sondas inmunofluorescentes más convenientes para la detección del virus. No hay recursos disponibles para el examen indirecto de cada virus posible, aunque la inoculación de una gama de cultivos celulares permite que cualquiera se pueda cultivar para su crecimiento. Deben consultarse los textos normativos modernos sobre el trabajo de diagnóstico para obtener detalles más completos de los aspectos discutidos más adelante; uno de ellos, el que editaron Mahy y Kangro (véanse las Lecturas adicionales), proporciona una buena introducción para el investigador.

células. Las muestras no deben congelarse antes del procesamiento, pero deben trasladarse al laboratorio de virus tan pronto como sea posible y mantenerse enfriadas sobre hielo o en un refrigerador si hay algún retraso. Cuando el periodo entre la recolección de una muestra y su inoculación en el cultivo celular se reduce al mínimo, se aumenta el índice de aislamiento y el virus se detecta en menos tiempo. Si no es posible inocular las células apropiadas dentro del mismo día, la muestra se puede guardar a 4°C toda la noche. Un almacenamiento mayor para mantener la viabilidad debe plantearse a temperaturas muy bajas, por lo general en un ultracongelador a ⫺70°C. (Los congeladores más comunes del laboratorio que funcionan a temperaturas de ⫺18 a ⫺20°C no son convenientes para la preservación del virus; se observa un descenso considerable de la infectividad en esos límites de temperatura.) Procesamiento de la muestra e inoculación de los cultivos celulares Las formas de solicitud que acompañan a las muestras deben indicar con claridad el carácter de la enfermedad, la fecha de inicio, la naturaleza de la muestra, el sitio del cual se recolectó y la edad del paciente para efectuar investigaciones apropiadas. El procesamiento de la muestra para la inoculación de los cultivos celulares o la preparación de las células para la tinción inmunofluorescente es casi siempre un procedimiento estandarizado, de acuerdo con la naturaleza de la muestra. Los cultivos tienen que examinarse para cualesquiera de los efectos citopáticos (ECP: el cambio morfológico celular resulta de la replicación del virus), sobre una base diaria durante los primeros cinco días después de la inoculación, para no perder algunas señales, aunque una “lectura” posterior de los tubos en días alternos suele ser suficiente para captar los cambios más graduales de los virus de crecimiento más lento como el CMV y muchos adenovirus.

Recolección y transporte de la muestra Muchas infecciones son relativamente cortas respecto del periodo de replicación vírica activa una vez que se manifiestan los síntomas, de modo que las muestras que contienen el virus infeccioso y las células que expresan el antígeno se obtienen mejor en los primeros dos a tres días de la enfermedad. El material debe contener células del sitio afectado: células epiteliales de la parte posterior de la nariz y la garganta o la base de una úlcera. En lactantes, las secreciones respiratorias se pueden recolectar por aspiración con un catéter fino y en sujetos mayores por enjuague, pero las células recolectadas con una escobilla se colocan en un medio de transporte de virus. Se puede utilizar cualquier líquido isotónico amortiguado que contenga proteína estabilizadora para preservar la infectividad y evitar la desecación de las

Requisitos para el diagnóstico rápido de infecciones víricas Pocos virus pueden identificarse en los cultivos celulares de rutina en menos de tres días (el virus del herpes simple es el único regular). Para la atención clínica son importantes el control de la infección dentro de las salas del hospital (y la terapia antivírica específica donde esté disponible), la confirmación más temprana de un diagnóstico clínico o la identificación de una infección insospechada. Con este fin, las muestras apropiadas se examinan en forma directa para reconocer evidencia de virus específicos, por microscopia de inmunofluorescencia (IF) para infecciones respiratorias, dérmicas y otras en las cuales las células infectadas se obtienen con facilidad. Las secreciones respiratorias primero

INMUNOFLUORESCENCIA

se deben diluir y lavar en una solución amortiguada salina para preparar las células epiteliales respiratorias (libres de moco) que puedan depositarse sobre el portaobjetos. Por lo general se usan varios lugares o celdillas, pero una preparación citocentrifugada es útil y rápida si el agente patógeno de estudio es un virus predominante, como en una influenza epidémica o por RSV de temporada. Una vez que se secan al aire, los portaobjetos se fijan por inmersión en acetona fría por 10 minutos, lo que asegura que las células permanezcan sobre el portaobjetos, retengan antigenicidad y sean permeables al anticuerpo, aunque en la mayor parte de los casos carecen de infectividad residual.

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Un periodo de incubación (en promedio de 15 a 30 min) en una cámara húmeda permite al anticuerpo reaccionar con algún antígeno específico de virus en las células. El anticuerpo separado se elimina al lavarlo con una solución salina amortiguada; antes, el portaobjetos se seca al aire y se monta para observarse en un microscopio especial con una fuente de luz ultravioleta incidente. El líquido de montaje consiste en glicerol de grado analítico (50%) en una solución salina amortiguada de fosfato a un pH óptimo de 8.6 para maximizar la fluorescencia. Ésta se atenúa con rapidez al exponerse a la irradiación ultravioleta, de modo que la observación prolongada no es recomendable y los registros fotográficos deben obtenerse cuando se requieran.

Inmunofluorescencia En los decenios de 1980 y 1990 los laboratorios de diagnóstico de virus ampliaron su uso de la microscopia, en particular como una ayuda para el diagnóstico rápido de infecciones víricas. La disponibilidad comercial de los reactivos de alta calidad en la forma de anticuerpos monoclonales apoya la aplicación de la inmunofluorescencia (IF) para una amplia gama de antígenos víricos. Se puede aplicar el anticuerpo específico (o un conjunto de anticuerpos) conjugado con un fluorocromo colorante a una preparación celular en una prueba directa de inmunofluorescencia (DIF) para el antígeno a detectar. Éste es el método más utilizado para el diagnóstico rápido por microscopia de luz, en especial conveniente para las muestras simples, pero también aplicado a las secreciones respiratorias diarias de lactantes y niños; lo anterior constituye una parte importante del trabajo de un laboratorio de virus que suministra servicio a una unidad pediátrica durante la epidemia anual de enfermedades respiratorias. Los mismos reactivos también pueden ser útiles para la tinción de las células de los cultivos celulares, sea para la confirmación del cultivo, y tipificación en el caso de HSV, o para el examen de la detección temprana (pre-ECP) de antígenos, en particular útil para los virus de crecimiento más lento, como el CMV y los adenovirus. Más adelante se proporcionan ejemplos de la gama y aplicaciones. Algunas pruebas serológicas para los anticuerpos víricos todavía se basan en la inmunofluorescencia indirecta, casi siempre para los anticuerpos del virus de Epstein-Barr, parvovirus humano (eritrovirus B19) o virus humano del herpes 6 (HHV6). En virología, el fluorocromo, colorante más utilizado es el isotiocianato de fluoresceína (FITC), que confiere una fluorescencia verde manzana brillante. Es provechoso si se incluye una contratinción, de modo que las células que contrastan con el fondo negativo sean visibles (teñidas de rojo apagado si se emplea el colorante azul de Evans). El anticuerpo apropiado se aplica a la celdilla o portaobjetos que tiene las células examinadas, un frotis o depósito de células directas de un paciente, células de un cultivo o un cubreobjetos “shell vial”.

Virus respiratorios La inmunofluorescencia directa es el procedimiento de IF más común en la virología diagnóstica para la detección rápida de antígenos y puede ser la única prueba empleada para diagnosticar la infección del RSV en niños; en realidad, en manos experimentadas puede ser tan confiable que ya no se considera necesario el aislamiento paralelo del virus. La mayoría de los lactantes se infecta con RSV en su primera estación invernal y uno de cada 100 recién nacidos admitido en el hospital desarrolla la alarmante complicación de bronquiolitis. Puesto que el RSV temporal de la epidemia anual invernal es con mucho el agente patógeno respiratorio más común en lactantes y niños, es una prioridad principal la prueba rápida para RSV. En la figura 17-2 se muestra la apariencia característica (glóbulos intracelulares que se tiñen de verde manzana) de una

Figura 17-2 Tinción de inmunofluorescencia directa de células epiteliales respiratorias de un lactante con bronquiolitis aguda. La tinción verde manzana brillante de las células marcadas con el anticuerpo fluorescente del RSV indica la infección con este virus; las células no infectadas contrateñidas con el colorante azul de Evans aparecen en rojo apagado en el contraste.

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MICROSCOPIA EN VIROLOGÍA: APLICACIÓN Y PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

prueba positiva de DIF para el RSV en células respiratorias de secreciones de un lactante. Se dispone de tratamiento antivírico específico para la infección por RSV en sujetos con riesgo especial por una enfermedad grave y a menudo se requiere la prueba DIF (o un equivalente marcado de forma enzimática) como procedimiento urgente. Preparaciones celulares de la piel o mucocutáneas Las células raspadas de la base de lesiones vesiculares de la piel se examinan con frecuencia mediante DIF con los anticuerpos específicos para HSV-l, HSV-2 o VZV (si no es obvia en clínica la infección presente). Puesto que está disponible la terapia antivírica específica, y las infecciones por herpes son graves en los huéspedes inmunosuprimidos, es importante un diagnóstico rápido. Para ser efectivos, los fármacos antivíricos deben suministrarse tan pronto como sea posible y la dosificación varía de acuerdo con el virus. La naturaleza contagiosa del VZV es también un problema para el control de la infección (alrededor de 10% de los adultos jóvenes no contrajo varicela y se halla en riesgo si se expone al VZV). Células de cultivo Es un procedimiento muy similar a DIF en las células del paciente. Los beneficios de la confirmación rápida de un ECP supuesto son clínicos y ahorran tiempo y recursos del laboratorio. Como los HSV-l y HSV-2 tienen diferentes relaciones y su tendencia a causar enfermedad recurrente en diferentes sitios es variable, es útil conocer el tipo del virus, lo cual es posible con los anticuerpos de tipo específico. Se puede emplear el anticuerpo monoclonal para los antígenos específicos de grupo comunes presentes en los adenovirus (antígeno hexon) o los enterovirus (antígeno VP1) para confirmar el ECP que producen los miembros de estos grupos, respectivamente.

Antígenos víricos producidos en fase temprana del ciclo de crecimiento Cuando el citomegalovirus se reconoció como un agente patógeno peligroso en los receptores de trasplante que requerían terapia antivírica resultó esencial detectarlo con mayor rapidez que en el pasado. Gleaves en Estados Unidos y Griffiths en el Reino Unido establecieron el valor de reconocer los antígenos tempranos del CMV que aparecen después de unas cuantas horas, en comparación con los días que se toman para el DNA vírico y los antígenos posteriores, y con el tiempo necesario para la aparición de un ECP. En Estados Unidos se acuñó el término shell vial, mientras que en el Reino Unido la prueba se conoció como DEAFF (Detection of Early Antigen Fluorescent Foci). Los antígenos tempranos del VZV también se buscan de manera ocasional. Un uso más amplio del sistema shell vial ha ganado aceptación en Estados Unidos y Europa continental, donde muchos laboratorios lo utilizan, en particular, para la detección respiratoria del virus. En la propia experiencia del autor ha mostrado gran utilidad para la identificación temprana de las infecciones del ojo por adenovirus y también para el índice rápido y mejorado del aislamiento del VZV. Algunos ejemplos de IF por shell vial se ilustran en la figura 17-3.

Examen microscópico de los cultivos celulares Aunque ciertos cambios notables en el cultivo celular son visibles a simple vista, como en el desafortunado caso de la turbiedad o acidez por el crecimiento de bacterias u hongos, es necesario el examen microscópico antes que se reconozcan los cambios que produce el crecimiento del virus. Las observaciones seriadas se realizan por días, y aun por semanas, y quizá deba trasladarse el virus a medios de cultivo frescos para pruebas subsecuentes, de manera que

Figura 17-3 Tinción por DIF de cultivos shell vial HEF infectados 48 horas después de la inoculación con un escobillado de conjuntiva teñido con anticuerpo monoclonal específico del grupo de adenovirus (a); escobillado de la garganta teñido con el anticuerpo específico contra el grupo A de la influenza que muestra tinción nuclear y ninguna extensión fuera de las células originales infectadas (b).

EXAMEN MICROSCÓPICO DE LOS CULTIVOS CELULARES

los cultivos se examinan sin teñirse. Un soporte sostiene el tubo de cultivo sobre la platina del microscopio, mientras que el área entera de la monocapa celular se explora de modo cuidadoso a bajo poder (con objetivos de 4 o 10⫻) con el condensador inferior a la platina hacia abajo. Las áreas focales de células alteradas se examinan entonces a una mayor ampliación. No es difícil notar la diferencia entre una monocapa de células por completo sanas (tubo control sin inocular del mismo lote de células) y una en la cual los hoyos aparecen como células redondeadas y descendidas, o bien grupos de células que forman racimos grandes; esto exige gran experiencia y cuidado y observación constante para desarrollar destreza en el reconocimiento de los efectos citopáticos característicos que producen los virus específicos en cultivos diferentes.

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• ECP sincitial típico: marca característica del RSV que crece en células HEp2 frescas (fig. 17-4), aunque las células multinucleadas gigantes también se observan con el sarampión y el VZV en líneas celulares sensibles. Las características son diferentes para el ojo adiestrado en cada caso. El HIV no se cultiva de rutina, pero su crecimiento se puede reconocer por la aparición del sincitio en los cultivos de células mononucleares sanguíneas que crecen en suspensión, no como monocapas. El virus del herpes humano tipo 6 (HHV6) se descubrió en 1986 cuando produjo ECP sincitial en cultivos de sangre periférica (fig. 17-5) y, en el examen adicional, resultó no ser HIV sino un virus herpes desconocido. El ECP más famoso y reciente fue el observado en los primeros cultivos del desconocido coronavirus humano relacionado con el síndrome respiratorio agudo grave.

Efectos citopáticos en los cultivos celulares comunes • ECP degenerativo: áreas dispersadas con células redondas y contraídas, que degeneran pronto la superficie del tubo (se observan con los enterovirus como poliovirus y rinovirus). • Células redondas, retráctiles y abultadas en grupos: se identifican con adenovirus (“racimos de uvas” en células HEp2) y HSV. Este último crece con gran rapidez, primero en pocas zonas (“placas”) el día posterior a la inoculación y luego se propaga a lo largo de la monocapa al día siguiente. Se reconocen sincitios pequeños, en especial con HSV-2. • ECP del citomegalovirus: aparece por completo único, con progresión muy lenta y focos alargados de células (citomegálica) abultadas en cultivos de fibroblastos humanos.

Figura 17-5 ECP en un sincitio con forma de globo (sin teñir) que produce el virus del herpes humano tipo 6 (HHV6) en cultivo de suspensión de la línea celular linfoblastoide (JJhan).

Crecimiento vírico no citopático en cultivo celular El microscopista de virología sabe que algunos virus se reproducen en los cultivos celulares sin producir citopatología evidente. El mejor ejemplo conocido es el de los virus de la influenza que crecen en las células del riñón del mono, donde la presencia del virus se puede revelar mediante hemadsorción. Una glucoproteína (hemaglutinina) codificada por el virus e insertada dentro de la membrana de células plasmáticas es capaz de atacar a los eritrocitos de la sangre añadidos a la superficie. En las etapas más tempranas de cualquier replicación vírica, cuando sólo se infectan las células individuales, el ECP no es obvio pero los antígenos víricos están presentes.

Figura 17-4 Efecto citopático sincitial típico del RSV al crecer en cultivos de células HEp2 (sin teñir), cinco días después de la inoculación de la muestra respiratoria del paciente.

Investigaciones adicionales de los agentes citopáticos El microscopista no ha acabado cuando ya se observa un ECP reconocible en un cultivo inoculado. Se espera la con-

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MICROSCOPIA EN VIROLOGÍA: APLICACIÓN Y PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

firmación del diagnóstico informada y se puede indicar una identificación adicional. El juicio del microscopista, quien selecciona la prueba de confirmación con base en el ECP, la línea celular, la muestra y otros factores, es crítico para formular un diagnóstico rápido y ahorrar recursos. La confirmación y tipificación del HSV ya se mencionaron. El ECP del adenovirus o el enterovirus se puede ahora confirmar mediante IF de las células, pero la tipificación requiere un ensayo de neutralización porque existen muchos tipos diferentes. Esto exige mezclar alícuotas de un aislado bien desarrollado con celdillas de antisuero que cubran los tipos comunes, tras inocular cultivos frescos y observar el antisuero que inhibe al ECP, es decir, la neutralización de la infectividad vírica. Estos ejercicios de tipificación raras veces afectan el control clínico, pero son importantes para los estudios epidemiológicos.

Desarrollos El virólogo de diagnóstico debe disponer de la mejor de las técnicas para identificar las infecciones víricas. La detección rápida es crítica por las razones ya explicadas. En tanto se emplee la microscopia de IF para las muestras individuales, pueden utilizarse los inmunoensayos o la inmunofiltración enzimática para la captación del antígeno, métodos menos subjetivos, que pueden automatizarse, para el examen de cantidades más grandes de muestra y líquidos de cultivo amplificados. La amplificación molecular del ácido nucleico por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) proporciona el medio más sensible de detección de una gama cada vez mayor de virus y los laboratorios se orientan cada vez más en esa dirección, con menor uso del aislamiento y la microscopia habituales. Todavía se requieren los intentos paralelos al aislamiento del virus en un laboratorio que ofrezca un servicio completo, incluidas la tipificación epidemiológica y las pruebas de susceptibilidad antivírica. Hoy en día se aplica el cultivo mejorado y

se (b) advierte una búsqueda continua de células sensibles, en particular para los virus incultivables. El área que emerge de la ingeniería genética celular puede proporcionar técnicas novedosas, como los sistemas inducidos por virus ligados a enzimas (ELVIS), ya probados para el HSV (Olivo 1996), que combinan tres cultivos celulares (viejos y nuevos), la detección del antígeno y la tecnología de DNA recombinante, sin excluir la microscopia.

Reconocimientos Merecen un agradecimiento especial los siguientes clínicos por las figuras utilizadas en este capítulo: figura 17-1, fotografía del Dr. K McLaren, consultor histopatologista, Universidad de Edimburgo; figuras 17-2 a 17-5, fotografías de AJ MacAulay FIMLS, principal científico biomédico en el Clinical Virology Laboratory, Department of Medical Microbiology, University of Edinburgh. Las copias presentadas de todas las figuras se prepararon como impresos a color en la Medical Photography Unit del Royal Infirmary of Edinburgh, Little France.

Lecturas adicionales Lennette EH, Lennette DA, Lennette ET (eds). Diagnostic Procedures for Viral, Rickettsial and Chlamydial Infections, 7th edn. 1995: American Public Health Association, Washington, DC. Mahy BWJ, Kangro HO (eds). Virology Methods Manual. 1996: Academic Press, London. Olivo PD. Transgenic lines for detection of animal viruses. Clin Microbiol Rev 1996; 9: 321-343. Simmons A, Marmion BP. Rapid diagnosis of viral infections. In Mackie & McCartney’s Practical Medical Microbiology, 14th edn. Collee JG, Fraser AG, Marmion BP, Simmons A (eds). 1996: Churchill-Livingstone. Edinburgh. Zuckerman AJ, Banatvala JE, Pattison JR Griffiths PD, Schoub BD (eds). Principles and Practice of Clinical Virology, 5th edn. 2004 Wiley, Chichester.

18 Microscopia electrónica en virología Hazel Appleton

Introducción Los virus se consideran agentes malignos que causan enfermedad y dolor. Sin embargo, cuando se visualizan en el microscopio electrónico se reconocen diversas estructuras. Los tipos de los múltiples grupos víricos parecen diferentes y es esa morfología característica la base para su identificación mediante microscopia electrónica. Ésta proporciona los medios para detectar e identificar con rapidez los virus en el material tomado directamente de los pacientes (cuadro 18-1). Un diagnóstico rápido puede facilitar la atención y el tratamiento de los enfermos. El diagnóstico tiene también implicaciones de salud pública para el control de brotes y la propagación de las enfermedades infecciosas en la comunidad. A largo plazo, la microscopia electrónica desempeña un papel en la vigilancia epidemiológica de la enfermedad infecciosa. A diferencia de muchas pruebas diagnósticas, que se seleccionan para un agente particular, la microscopia electrónica es un método que puede detectar cualquier virus o una mezcla de virus en la muestra. Esto es en particular útil en el diagnóstico y el estudio de los virus que no pueden cultivarse con facilidad in vitro. El uso de la microscopia electrónica ha conducido al descubrimiento e identificación de muchos agentes víricos nuevos en años recientes y tiene una función principal en el estudio de los virus nuevos.

La preparación de la muestra es simple y los resultados se pueden obtener con rapidez. Empero, la técnica depende de la presencia de números suficientes de partículas del virus en la muestra (se requiere casi siempre un mínimo de 106 partículas del virus por mililitro de muestra) y de la integridad estructural de las partículas del virus que permanecen intactas, de tal modo que puedan reconocerse e identificarse. Algunas veces la sensibilidad se puede acrecentar mediante el uso de sueros inmunitarios (microscopia electrónica inmunitaria, MEI). Los virus que no se delinean con claridad en relación con el material del entorno, por ejemplo los parvovirus, pueden agregarse en grupos si se mezcla la muestra con un antisuero específico de manera que puedan observarse con facilidad. En caso contrario, los virus pueden llevarse a una rejilla revestida con antisuero (microscopia electrónica inmunitaria de fase sólida). Los métodos de MEI se pueden utilizar para la tipificación antigénica de los virus. Cuando un virus se identifica por tinción negativa simple se reconoce como miembro de un grupo o una familia de virus, pero casi nunca es posible distinguir entre los miembros del grupo sin pruebas adicionales; por ejemplo, el virus del herpes causante de la varicela (virus de la varicela-zoster, VZV) posee una apariencia idéntica respecto del virus del herpes causante de ampollas febriles (virus del herpes simple, HSV).

Métodos

Corte fino

Tinción negativa

La microscopia electrónica de corte fino es útil para el examen de muestras en las que hay números escasos de partículas víricas para reconocerlas en las suspensiones negativas teñidas. Algunos virus, como los retrovirus, tienen

Es el método más utilizado en virología diagnóstica y recurre a la tinción del entorno vírico, no tanto al virus mismo.

The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker. © 2005 John Wiley & Sons, Ltd.

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CAP. 18

MICROSCOPIA ELECTRÓNICA EN VIROLOGÍA

Cuadro 18-1 Virus detectados mediante microscopia electrónica Muestras examinadas

Ejemplos de virus detectados

Piel: líquidos vesiculares o raspaduras de lesiones* Heces*

Virus del herpes: herpes simple, virus de la varicela-zoster Poxvirus: ectima, molusco contagioso Virus del papiloma (verruga humana) Virus de la gastroenteritis: rotavirus, adenovirus, astrovirus, norovirus, sapovirus (hepatitis A y E, enterovirus) Suero Parvovirus B19 Hepatitis B Orina Poliomavirus BK Citomegalovirus Adenovirus (cistitis hemorrágica) Hígado Hepatitis B Hígado fetal Parvovirus B19 (hidropesía fetal) Cerebro Virus del sarampión (SSPE) Poliomavirus JC Virus del herpes Tumor Virus de Epstein-Barr Cultivos celulares Cualquier virus cultivado, como de laboratorio para influenza, parainfluenza, sarampión, la identificación paperas, adenovirus, poliomavirus, rápida de los aislados* enterovirus, virus del herpes, retrovirus (virus exóticos, p. ej., Marburg, Ébola)

cífico. El virus se une a las perlas y se recubre con oro. La técnica parece ofrecer poca ventaja respecto de la MEI de tinción negativa y tiene la desventaja de oscurecer la morfología característica del virus, además de que los reactivos son costosos.

Usos de la microscopia electrónica La microscopia electrónica empezó a sobresalir en la virología diagnóstica en el decenio de 1960 con el diagnóstico rápido de la viruela. Las lesiones de piel que se producen en esta enfermedad y las consecutivas de la varicela pueden confundirse en clínica. Las alarmantes implicaciones de la infección de la viruela llevaron en poco tiempo a diferenciar estas infecciones básicas. Las lesiones de piel, y en particular los líquidos de las vesículas, son ricos en partículas víricas. Basta mezclar la muestra con una gota de un colorante negativo para ver con precisión el virus, sin necesidad de recurrir a la concentración. La viruela se debe a un miembro de la familia del poxvirus y la varicela al VZV. Los poxvirus y los virus del herpes tienen morfologías muy diferentes y se pueden distinguir con facilidad mediante el microscopio electrónico (figs. 18-1 y 18-2). El virus de la viruela, variola, y el virus vaccinia utilizados en la vacuna son indistinguibles y se requirieron pruebas

*Principales usos habituales de la microscopia electrónica en virología diagnóstica.

estructuras que se identifican de modo más fácil en cortes finos en comparación con las preparaciones negativas. Aunque la sensibilidad puede acrecentarse, no es una técnica rápida y tiene aplicación limitada en un laboratorio de diagnóstico. Es útil para estudiar la patogenia de la infección y puede emplearse para la confirmación diagnóstica en biopsia y muestras post mortem. Las estructuras del virus son resistentes a la lisis celular y la preservación pobre del tejido; es posible obtener resultados positivos a partir de material que aparenta ser poco prometedor. Microscopia electrónica de barrido Pocos laboratorios de diagnóstico tienen acceso a un microscopio electrónico de barrido o incluso un accesorio de barrido para un microscopio electrónico de transmisión. Este último se utiliza sobre todo como herramienta para investigar la fijación y patogenia del virus y hasta el momento ha tenido poco uso en virología diagnóstica. Se ha observado cierto interés en los inmunoensayos de fase sólida, con perlas de látex cubiertas con el anticuerpo espe-

Figura 18-1 Vaccinia: un ortopoxvirus (180 000 ⫻).

USOS DE LA MICROSCOPIA ELECTRÓNICA

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Figura 18-2 Virus del herpes de una lesión de la piel (180 000 ⫻).

Figura 18-3 Ectima: un parapoxvirus (180 000 ⫻).

para diferenciarlos: por lo regular se realiza la distinción en cultivo de la membrana corioalantoica de los huevos de las gallinas, lo cual toma unos tres días. La detección de un virus del herpes evitó la necesidad de todas las medidas sanitarias públicas que debían activarse en presencia de un caso de viruela.

que causa erupciones benignas en la piel y es similar en apariencia a los virus ortopox. La microscopia electrónica también se utiliza de modo ocasional en la detección del virus del papiloma humano (HPV) que provoca verrugas.

Lesiones de la piel

El descubrimiento de los virus que causan la gastroenteritis condujo a la expansión del uso de la microscopia electrónica en laboratorios de diagnóstico y salud en las décadas de 1970 y 1980. Diversos virus pueden causar gastroenteritis y todos se descubrieron en el examen por microscopia electrónica de muestras fecales. Resultó sorprendente que los virus podían visualizarse en ese complejo material, pero en verdad estos virus se excretan en números inmensos dentro del contenido intestinal y pueden reconocerse con facilidad si las muestras se recogen en el momento apropiado. Los virus de la gastroenteritis no crecen en los cultivos celulares convencionales y la microscopia electrónica ha sido el método principal para su identificación. Algunos virus de la gastroenteritis, como los rotavirus y adenovirus, tienen tales morfologías distintivas que sólo necesitan observarse una o dos partículas para el reconocimiento positivo (figs. 18-4 y 18-5). Las muestras pueden ser tan ricas en virus que no se precisa ninguna concentración (se calculan concentraciones de 1012 partículas/g). A menudo es

En 1980, la Organización Mundial de la Salud declaró que la viruela se había erradicado, pero la microscopia electrónica no ha dejado de tener un papel importante en el diagnóstico rápido de la infección por el virus del herpes. Esto es en particular útil para los individuos inmunocomprometidos, en los cuales el uso de fármacos antivíricos apropiados puede facilitar el tratamiento. Además, puede auxiliar en la atención de los sujetos de las unidades de trasplante, en las cuales un brote de varicela podría tener consecuencias graves y algunas veces mortales. La microscopia electrónica todavía se utiliza en el diagnóstico de otras dos infecciones del poxvirus, el ectima y el molusco contagioso, ninguno de los cuales se puede identificar con facilidad por otros medios. El ectima es una infección zoonótica adquirida de las ovejas, secundaria a un virus parapox, el cual es más pequeño y alargado que los virus ortopox, como el vaccinia y el cowpox (fig. 18-3). El molusco contagioso es un poxvirus humano

Gastroenteritis

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MICROSCOPIA ELECTRÓNICA EN VIROLOGÍA

Figura 18-4 Rotavirus: una causa importante de gastroenteritis en recién nacidos y niños menores. Los “rayos” típicos pueden verse alrededor de las partículas. La partícula del centro perdió su cápside (180 000 ⫻).

suficiente emulsionar una muestra pequeña de heces en una gota de agua destilada, mezclar con colorante negativo y colocar sobre una rejilla. Para otros virus de las gastroenteritis, como astrovirus y norovirus, la identificación es más difícil y deben examinarse más partículas para realizar una identificación exacta (figs. 18-6 y 18-7). En estos casos, por lo general, es necesario concentrar el virus de la muestra. Se han desarrollado pruebas comerciales, como ELISA, técnicas de aglutinación de látex, PCR e incluso pruebas con tira reactiva, y ahora se emplean como técni-

Figura 18-5 Adenovirus: se relacionan en gran medida con las infecciones de las vías respiratorias y oculares. Dos adenovirus se vinculan con la gastroenteritis e infectan sobre todo a niños jóvenes (180 000 ⫻).

Figura 18-6 Astrovirus. Pueden verse estrellas de cinco o seis puntas en la superficie de algunas partículas (180 000 ⫻).

ca primaria en muchos laboratorios de diagnóstico. Esto permite que números más grandes de muestras se sometan a examen, en comparación con la microscopia electrónica, y muchas veces con mayor sensibilidad. Sin embargo,

Figura 18-7 Norovirus. Este virus provoca muchos brotes de gastroenteritis en la comunidad (180 000 ⫻).

USOS DE LA MICROSCOPIA ELECTRÓNICA

estas pruebas tienen limitaciones puesto que son selectivas para un tipo específico del virus y no detectan todas las cepas dentro de un grupo del virus. Las muestras que arrojan resultados negativos o equívocos se pueden examinar posteriormente mediante microscopia electrónica. El Health Protection Agency Centre for Infections reúne los informes de los virus detectados en casos de gastroenteritis en Inglaterra y el País de Gales. Esto ha facilitado que se represente un panorama epidemiológico de los grupos de edad afectados por los diferentes agentes víricos, las distribuciones estacionales, los patrones de excreción y los modos de transmisión. Esta información hace posible proporcionar el consejo apropiado sobre factores como el control de brotes, tiempo que debe apartarse de los alimentos a quienes los manipulan y tiempo óptimo para la recolección de muestras. Rotavirus De los virus de la gastroenteritis, el mejor conocido e identificado con facilidad es el rotavirus (de la palabra latina rota, rueda: la disposición de los capsómeros vistos en la superficie de las partículas del virus se asemeja a los rayos de una rueda) (fig. 18-4). El rotavirus es una causa importante de la gastroenteritis en recién nacidos y niños. En el Reino Unido y otros países desarrollados propicia el número más grande de admisiones al hospital en este grupo de edad, y en países subdesarrollados se calcula que causa alrededor de medio millón de muertes por año. La infección ocurre sobre todo en los meses del invierno en climas templados. Los brotes también se observan entre ancianos, al parecer debido a la declinación de la inmunidad. El rotavirus se encontró primero en los cortes finos de biopsias duodenales de niños en Australia, pero tales técnicas invasivas no son necesarias ya que el virus puede verse en las emulsiones simples de muestras fecales. Los equipos comerciales para la detección de los rotavirus se utilizan con amplitud. No obstante, estos equipos sólo detectan el tipo más común de los rotavirus conocidos, como los rotavirus del grupo A. Otros tipos, como los rotavirus del grupo C, también infectan a los seres humanos, aunque se observan con menor frecuencia. Los rotavirus del grupo C infectan a todos los grupos de edad y se han vinculado con un buen número de brotes en familias y escuelas. En muchos laboratorios, las muestras se examinan sólo por microscopia electrónica si los resultados de una prueba de ELISA o látex son negativos. Los rotavirus que no pertenecen al grupo A se identifican casi siempre cuando surge una discrepancia entre el resultado negativo del equipo y uno positivo hallado con la microscopia electrónica. La caracterización se lleva a cabo por el análisis PAGE o PCR.

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Adenovirus El examen de muestras fecales de niños con gastroenteritis condujo al descubrimiento de dos adenovirus nuevos. Por mucho tiempo los adenovirus se habían relacionado con las infecciones respiratorias y oculares y se aislaban en cultivos celulares. Los dos adenovirus nuevos, los denominados tipos 40 y 41, se vinculan de manera específica con la gastroenteritis y no pueden cultivarse con facilidad. La microscopia electrónica tiene limitaciones y puede indicar sólo la presencia de los adenovirus (fig. 18-5) y no de manera específica los tipos 40 y 41, para los cuales se requieren pruebas adicionales. Los adenovirus respiratorios comunes se aíslan algunas veces de muestras fecales, pero esto se considera un hallazgo incidental. Del mismo modo que para el rotavirus, ahora se dispone de los equipos de ELISA y tira reactiva. Los tipos 40 y 41 de los adenovirus tienen una epidemiología similar al rotavirus dado que infectan sobre todo a jóvenes y se observan durante los meses invernales. Astrovirus Otro virus vinculado con la gastroenteritis es el astrovirus, un virus original, nombrado así por la estrella de cinco o seis puntas delineada en la superficie de una gran proporción de partículas (fig. 18-6). Los astrovirus explican alrededor de 1 a 2% de los informes de virus causales de gastroenteritis en el Reino Unido. La infección se notifica sobre todo en los muy jóvenes y se han descrito brotes en las unidades neonatales; no obstante, se sugiere que la infección en otros grupos de edad se encuentra subestimada. Como el rotavirus, los brotes se reconocen de modo ocasional en los ancianos. En raras ocasiones se refiere la transmisión que producen los alimentos. La microscopia electrónica es todavía el método principal de detección. Norovirus Los norovirus, conocidos antes como virus similares al Norwalk o virus pequeños redondos estructurados (SRSV), se consideran la causa más común de la gastroenteritis en la comunidad. Se reconocen en todos los grupos de edad y se relacionan de modo frecuente con brotes en hospitales, hogares residenciales y escuelas. Los virus de la gastroenteritis casi siempre se transmiten en forma directa de persona a persona a través de la vía fecal-bucal o en gotitas de aerosol. A veces también se pueden transmitir algunos a través del alimento o el agua y en estas situaciones los norovirus son los que se notifican más a menudo. El primer virus del grupo se descubrió por microscopia electrónica

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en 1972. Originado de un brote en la ciudad de Norwalk, en Estados Unidos, se conoció como el agente Norwalk. El término “virus pequeño redondo estructurado” o SRSV se relaciona con el aspecto del virus en el microscopio electrónico (fig. 18-7). Las partículas del virus miden 30 a 35 nm de diámetro y tienen una superficie amorfa y un contorno irregular. Los norovirus se clasifican dentro de la familia Caliciviridae. Hay muchas cepas diferentes y éstas forman dos genogrupos amplios. Hay también un tercero, el genogrupo emparentado de forma más lejana, llamado sapovirus porque se aisló en una guardería en Sapporo, Japón. Los sapovirus tienen el aspecto típico de un calicivirus, con depresiones similares a una taza vistas en la superficie de las partículas del virus. Estas depresiones en forma de taza casi nunca se identifican en los norovirus. La diferenciación entre norovirus, calicivirus y también astrovirus por microscopia electrónica puede ser difícil y requiere la intervención de un microscopista experimentado. Los norovirus no se pueden cultivar y la mayor parte de los diagnósticos se establece por microscopia electrónica. Empero, los norovirus se excretan sólo en números suficientes para la detección por cerca de 48 horas después del inicio de los síntomas y por tanto suele ser difícil obtener muestras apropiadas. Los norovirus tienden a no excretarse en números grandes, como el rotavirus y los adenovirus, y puesto que no tienen tales características morfológicas distintivas, son mucho más difíciles de detectar en términos técnicos. Por lo tanto, los norovirus no aparecen en una enorme proporción de los informes. La microscopia electrónica no es bastante sensible para reconocer el virus en el alimento o muestras ambientales. Se han desarrollado los ensayos de PCR para los norovirus, pero están sólo disponibles en laboratorios especializados. Estos ensayos son muy sensibles: pueden detectar al virus en las muestras clínicas por hasta una semana después del inicio de los síntomas y pueden emplearse para examinar los alimentos y las muestras ambientales. Sin embargo, no detectan todas las cepas del norovirus. En 2003 se dispuso ya de los equipos comerciales de ELISA que identifican una amplia gama de los norovirus de los genogrupos 1 y 2. Éstos tienen sensibilidad similar a la de la microscopia electrónica, pero son mucho más fáciles de usar, pueden procesar números más grandes de muestras y han tenido un efecto significativo en el examen de los norovirus. Existe una gran diversidad dentro del grupo del norovirus y, pese a ello, las técnicas ELISA no detectan todas las cepas. En consecuencia, la microscopia electrónica juega todavía un papel esencial en el diagnóstico. Otras infecciones La microscopia electrónica tuvo un papel importante en el descubrimiento de otros virus, en especial algunos de los

virus de la hepatitis, los papovavirus y el parvovirus B19. Otras pruebas sustituyeron en gran medida a la microscopia electrónica en el diagnóstico. Virus de la hepatitis El virus que causa la hepatitis A se descubrió en 1972 por microscopia electrónica inmunitaria de muestras fecales de los pacientes incluidos en los estudios de voluntarios. Sin embargo, se demostró en poco tiempo que la mayor parte de la excreción del virus ocurre en la fase prodrómica de la enfermedad y el diagnóstico se establece ahora por la detección del anticuerpo IgM específico de la hepatitis A. Aunque no se utilizó para el diagnóstico, fue la microscopia electrónica la que reveló que el otro virus transmitido por vía entérica, el de la hepatitis E, tiene la morfología de un calicivirus. La hepatitis E no se identifica con frecuencia en el Reino Unido, pero se vincula con brotes transmitidos en áreas en vía de desarrollo del mundo y la infección es en particular grave en mujeres embarazadas. La microscopia electrónica fue más útil en el diagnóstico de la infección de la hepatitis B. Las partículas y antígenos víricos, sobre todo el antígeno de superficie de la hepatitis B, están presentes en el suero por periodos prolongados. El diagnóstico puede determinarse con facilidad si se reconocen partículas completas del virus, pero a menudo sólo pueden verse esferas de 22 nm de la capa proteínica del virus (antígeno superficial). El antígeno superficial es difícil de distinguir de otro material de fondo en el suero. Para aumentar la sensibilidad y la identificación del caso, el suero del paciente se mezcla con un antisuero específico en una prueba MEI, la cual no es conveniente para examinar una gran cantidad de muestras y debe emplearse de manera selectiva. Parvovirus B19 Mientras se buscaba el virus de la hepatitis B por MEI del suero se descubrió primero el parvovirus B19. Con posterioridad se reconoció que éste era el agente etiológico del eritema infeccioso, una infección común de salpullido de la niñez que también se conoce a menudo como “síndrome de la cara abofeteada”. La infección en el embarazo puede causar daño fetal. Puede también precipitar crisis aplásica grave en individuos con trastornos hematológicos como la anemia falciforme. La confirmación del laboratorio de la infección por B19 puede modificar en grado notorio la atención de estos pacientes. Aunque no se han utilizado por más tiempo para el diagnóstico de rutina, los resultados contradictorios entre las pruebas para la infección por el parvovirus B19 (p. ej., una PCR positiva pero un resultado negativo de la IgM) se pueden resolver en poco tiempo mediante microscopia electrónica.

REACCIÓN RÁPIDA DE URGENCIA

Cerebro Cuando los fármacos antivíricos estuvieron disponibles para el tratamiento de la encefalitis herpética se realizaron intentos para detectar al herpesvirus en suspensiones teñidas negativas de material cerebral. El diagnóstico rápido y exacto era importante porque los medicamentos antivíricos tempranos eran en extremo tóxicos. Sin embargo, la microscopia electrónica no mostró particular sensibilidad y pronto la sustituyeron la microscopia de fluorescencia y luego las técnicas de PCR. El paramixovirus helix del sarampión se ha identificado en cortes finos de tejido cerebral de personas con panencefalitis esclerosante subaguda. El primer poliomavirus humano, JC, se descubrió en cortes finos de tejido cerebral de pacientes con leucoencefalopatía multifocal progresiva. Aunque la microscopia electrónica fue útil para establecer la causa de estas dos anormalidades, las técnicas de fluorescencia y las pruebas de PCR son más sensibles para examinar material cerebral.

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agente citopático, en especial si están presentes varios tipos víricos. Se utiliza cuando otras pruebas suministran resultados inconsistentes, equívocos o aun negativos; por ejemplo, las pruebas de PCR y ELISA para el norovirus no identifican todas las cepas y la microscopia electrónica puede proporcionar resultados positivos sobre muestras al parecer negativas. La microscopia electrónica también se usa para comprobar los antígenos víricos, como los virus del sarampión y la rubeola y preparados de otras pruebas, y detectar los contaminantes víricos que aparecen de forma natural en los cultivos celulares, como SV40 (fig. 18-8).

Orina Los intentos para hallar virus en las muestras de orina han tenido un éxito variable. Mediante microscopia electrónica se descubrió un segundo poliomavirus humano conocido como virus BK. Éste infecta de manera regular a los individuos sometidos a trasplante y se excreta en la orina. Muestra un crecimiento muy lento en los cultivos celulares y la microscopia electrónica ha sido en extremo útil para el diagnóstico. Se han desarrollado pruebas de PCR y son ahora el método habitual empleado para fines diagnósticos. El citomegalovirus (CMV), un miembro del grupo del virus del herpes, también se elimina en la orina, pero se reconoce sólo por microscopia electrónica cuando está presente una gran cantidad de partículas víricas. Los síntomas de las infecciones con los virus CMV y BK pueden semejar a los del rechazo del órgano. El diagnóstico de una causa vírica da lugar a una mejor atención del paciente, puesto que el uso inadecuado de los agentes inmunosupresores prolongaría en realidad la infección del virus.

Laboratorio de virología Además de su papel primario en el diagnóstico, la microscopia electrónica tiene muchas otras funciones en un laboratorio de virología. Proporciona también apoyo en el desarrollo de nuevas pruebas alternativas de diagnóstico y con frecuencia es útil en proyectos de investigación. La microscopia electrónica se utiliza para la identificación rápida de los virus aislados en cultivos celulares y puede reducir en gran proporción el tiempo invertido en identificar un

Figura 18-8 Poliomavirus encontrado como un contaminante en un cultivo celular (180 000 ⫻).

Reacción rápida de urgencia Los acontecimientos actuales del mundo condujeron a una conciencia del potencial de la actividad bioterrorista, y las agencias de gobierno revisan de forma continua los planes para enfrentar algún acontecimiento de esta naturaleza. La viruela se ha identificado como un agente posible para la liberación intencionada. Puesto que la microscopia electrónica es el método más rápido para detectar un ortopoxvirus, los microscopistas han revisado protocolos y examinado paneles externos de aseguramiento de la calidad para garantizar una respuesta. Después de la erradicación, la vacunación cesó y por lo tanto casi todo el personal del laboratorio carece de vacunación. Mientras que la amenaza de infección sea aún muy baja, se considera que los riesgos relacionados con

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la vacunación pueden tener más peso que los de la viruela. Para proteger al personal que puede enfrentarse inesperadamente a un espécimen de la viruela, se recomienda inactivación del microorganismo antes del proceso. Es esencial que cualquier método elegido no comprometa la capacidad de identificar a los poxvirus y virus del herpes. Se ha observado que una solución de formaldehído al 5% amortiguada con fosfatos inactiva al virus sin enmascarar las características morfológicas identificables. El glutaraldehído se usa muchas veces como un fijador para la microscopia electrónica. Algunos microscopistas prefieren no fijar la muestra, teñir sobre una rejilla y después impregnar la rejilla preparada en una gota de glutaraldehído. No obstante, si la muestra se trata con glutaraldehído antes del procesamiento, la estructura superficial de cualquier virus teñido de forma negativa se oscurece por completo. Si un ortopoxvirus se reconoce por microscopia electrónica, se requieren pruebas adicionales para identificarlo. Por lo regular, esto se realiza mediante PCR en laboratorios especializados. El ortopoxvirus que se presenta más veces en el Reino Unido es el cowpox, que suele adquirirse de gatos domésticos. En 2003 tuvo lugar un brote de una enfermedad con lesiones vesiculares en seres humanos en Estados Unidos que causó preocupación y difusión considerables. Un ortopoxvirus se reconoció en poco tiempo mediante microscopia electrónica y con posterioridad se identificó como el monkeypox, adquirido de roedores domésticos de latitudes lejanas. Aunque la infección por el monkeypox puede ser muy grave, este poxvirus no es por fortuna muy transmisible entre los seres humanos.

Virus de nueva aparición Nuevos virus se descubren y la microscopia electrónica se halla a la vanguardia en la búsqueda y caracterización inicial de estos microorganismos. La facilidad de los vuelos internacionales supone que las nuevas infecciones se pueden transmitir alrededor del mundo a las poblaciones no inmunizadas en un tiempo muy corto. Por ejemplo, en la primavera de 2003 se identificó el síndrome respiratorio agudo grave, que se originó en el Extremo Oriente, como una enfermedad nueva. Se observó un esfuerzo mundial, que coordinó la Organización Mundial de la Salud, para identificar el agente etiológico. La microscopia electrónica desempeñó un papel prominente al identificar con rapidez un coronavirus nuevo como la causa (fig. 18-9).

Conclusiones La microscopia electrónica desempeña un papel esencial en la respuesta pronta a las situaciones de urgencia en las

Figura 18-9 (180 000 ⫻).

El virus del síndrome respiratorio agudo grave

cuales la salud pública se pone en riesgo, tanto si la liberación de un agente biológico es deliberada como si se trata de una nueva infección de surgimiento natural. La microscopia electrónica se utiliza a menudo como método de diagnóstico primario en las etapas tempranas después que un virus se descubre hasta el desarrollo de pruebas más fáciles. La microscopia electrónica implica un trabajo intensivo y no es conveniente para examinar una gran cantidad de muestras. Por lo tanto, si las pruebas alternativas convenientes pueden estar disponibles, la microscopia electrónica tiende a tomar un papel más bien confirmatorio. El énfasis principal de la microscopia electrónica en virología parece enfocarse más en los aspectos de la investigación, donde ha tenido siempre un papel esencial. El costo primario del equipo supone que la microscopia electrónica no está disponible en todos los laboratorios. Además, un servicio satisfactorio requiere personal experto y experimentado y tiempo en el mantenimiento del equipo en condiciones de trabajo óptimas. Si bien la microscopia electrónica ha sufrido una declinación en la virología de rutina, puede ser práctico colaborar con los microscopistas electrónicos en otros campos de la patología y ofrecer una gama completa de técnicas de microscopia electrónica. Esto puede funcionar con eficiencia, siempre que las diferentes necesidades de todos los usuarios se atiendan y haya acceso conveniente y fácil para todos ellos.

LECTURAS ADICIONALES

La microscopia electrónica se ha utilizado en extenso para la detección de virus en las muestras fecales de pacientes con gastroenteritis y en particular para la investigación de lactantes con diarrea. Es probable que la introducción de equipos ELISA comerciales nuevos reduzca los números de muestras examinadas por microscopia electrónica. Estos equipos ofrecen pruebas más baratas y la capacidad de examinar gran cantidad de especímenes, pero tienen limitaciones y no pueden identificar todas las cepas víricas. La microscopia electrónica es todavía el método más rápido para el diagnóstico de lesiones vesiculares por virus y tiene importancia especial en la atención de los pacientes inmunocomprometidos. La microscopia electrónica también posee una función relevante en la identificación rápida de los virus aislados de muestras clínicas en cultivo celular. Muchos virus nuevos se han descubierto gracias al uso de la microscopia electrónica, en especial desde los primeros años de la década de 1970. La microscopia electrónica tiene una contribución importante en el descubrimiento y caracterización de los virus nuevos, junto con los avances recientes de la virología molecular. Por ejemplo, 40% de las infecciones de gastroenteritis todavía permanece sin diagnosticar. Algunos virus de la hepatitis y retrovirus aún requieren la caracterización por microscopia electrónica y ésta se emplea asimismo para buscar virus en tumores. No dejará de utilizarse para comprender la patogenia de las infecciones víricas y el papel de los antígenos víricos,

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que podrían conducir al desarrollo de tratamientos eficaces y vacunas. Tales estudios pueden auxiliarse del desarrollo de técnicas mejoradas y pruebas automatizadas de preparación para el corte fino y la exploración. Los avances recientes en el diseño del microscopio electrónico, como los microscopios ambientales de exploración que no requieren procedimientos de secado complejos y extensos, significan que no sólo las muestras pueden procesarse de modo más rápido y fácil, sino que se evita la contracción y la distorsión de la muestra. Como los microscopios se tornan cada vez más “de uso amable”, la investigación de virus por microscopia electrónica será más fácil.

Lecturas adicionales Appleton H, Field AM. The electron microscope and public health virology. Microsc Anal 1990; 20: 7-9. Caul EO, Appleton H. The electron microscopical and physical characteristics of small round human faecal viruses: An interim scheme for classification. J Med Virol 1982: 9: 257-265. Doane FW, Anderson N. Electron Microscopy in Diagnostic Virology: A Practical Guide and Atlas. 1987: Cambridge University Press, Cambridge. Madeley CR, Field AM. Virus Morphology, 2nd edn. 1988: Churchill- Livingstone, Edinburgh. Field AM. The contribution of the electron microscope. In Public Health Virology: 12 Reports, Mortimer PP (ed.). 1986: Public Heath Laboratory Service, London.

19 Cultivo tisular William L Irving y Alan Pawley

Introducción

Selección de los cultivos celulares

Las partículas víricas consisten en material genético (ácido nucleico) más una pequeña cantidad de proteínas, de ahí la memorable cita de sir Peter Medawar “los virus son problemas envueltos en una capa de proteínas”. Algunos virus, además, poseen un recubrimiento de lípidos. No hay organelos internos, como mitocondrias, ribosomas o aparato de Golgi. Por lo tanto, los virus son parásitos intracelulares obligatorios, es decir, sólo pueden reproducirse dentro de células vivas, de modo que usurpan la generación de la energía y la maquinaria biosintética de la célula huésped. El aislamiento de los virus a partir del material clínico representa entonces varios desafíos del todo distintos de los que se encuentran en un laboratorio de bacteriología, en el cual las bacterias pueden crecer en medios inanimados. La presencia de células vivas en una forma u otra es el primer requisito esencial para el crecimiento exitoso de los virus. Por muchos años, los virus crecieron en huevos de gallinas fecundas. Una alternativa consiste en utilizar animales experimentales completos. Aunque ambas técnicas pueden todavía ser de valor en circunstancias especializadas, las han reemplazado en gran parte los cultivos celulares derivados de una variedad de tejidos en los laboratorios víricos de rutina y crecen como monocapas sobre superficies de cristal o plástico (es decir, tubos o frascos). En este capítulo se discuten los detalles prácticos del funcionamiento de un laboratorio de cultivo celular para el aislamiento de los virus y se resaltan las ventajas y desventajas de esta aproximación al diagnóstico de la infección vírica.

El primer paso en el ciclo de la réplica de cualquier virus es la unión a su célula objetivo. Éste es un proceso muy específico que implica la interacción precisa entre un ligando sobre la superficie del virus y un receptor sobre la superficie de la célula objetivo. En consecuencia, no todos los virus infectan y crecen en todos los tipos celulares; las células que carecen del receptor apropiado para un virus particular son resistentes a la infección por ese virus. Esto crea un problema para el laboratorio de diagnóstico: para proporcionar un servicio detallado para el aislamiento de todos los virus posibles se requeriría la disponibilidad de diversos tipos celulares. En la práctica, la mayor parte de los laboratorios analiza sólo dos o tres diferentes tipos de célula, cada uno de los cuales apoya el crecimiento de una gama de virus todo lo amplia posible. Los cultivos celulares más comunes se enumeran en el cuadro 19-1, que también señala qué virus pueden crecer en cada uno. Aunque esta lista incluye a muchos de los virus comunes hallados en la práctica clínica, algunos virus importantes (por ejemplo, el virus de la inmunodeficiencia humana [HIV], los virus de la hepatitis, los virus de la gastroenteritis, incluidos rotavirus y adenovirus entéricos, y el virus de Epstein-Barr [EBV]) no figuran allí, al igual que otros más. El aislamiento de algunos de estos microorganismos se puede alcanzar por medio de técnicas especializadas de cultivo celular, como el cultivo de órgano. Las características diferenciales del tejido de origen pueden mantenerse en el cultivo de órgano; por ejemplo, los anillos traqueales fetales

The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker, © 2005 John Wiley & Sons, Ltd.

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CAP. 19

Cuadro 19-1

CULTIVO TISULAR

Cultivos celulares comunes

Tipo de cultivo

Virus capaces de crecer

Cultivos primarios/secundarios Virus de la influenza, virus Células renales del mono de la parainfluenza, enterovirus, virus de las paperas Líneas celulares semicontinuas Virus del herpes simple (HSV), virus de la varicela Fibroblastos embrionarios zoster, citomegalovirus, humanos enterovirus, adenovirus, rinovirus HSV, virus de las paperas Líneas celulares continuas Células Vero (derivadas del riñón del mono) Células Hep-2/células HeLa Virus sincitial respiratorio, adenovirus Células renales caninas de Madin Darby (MDCK)

Virus de la influenza

humanos tienen células epiteliales ciliadas que funcionan en el tracto respiratorio capaces de apoyar la replicación de los virus comunes del resfriado. De manera alternativa, pueden utilizarse cultivos celulares especializados, como el HIV y el EBV, que pueden crecer en linfocitos humanos de la sangre periférica, y algunos de los virus de la hepatitis, que crecen en cultivos primarios del hepatocito, o algunos de los virus de la hepatitis, que crecen en cultivos de hepatocitos primarios o estirpes celulares derivadas del hepatoma. Sin embargo, las dificultades de la disposición de una fuente regular de estos cultivos más especializados significa que el aislamiento de estos virus se restringe a los laboratorios de referencia o de investigación. Otros virus (por ejemplo, los virus del papiloma humano, el virus de la hepatitis C) son tan exigentes en sus requerimientos para el crecimiento que el aislamiento en cultivo celular ha demostrado ser casi imposible. El diagnóstico de la infección con estos virus debe apoyarse siempre en otras técnicas distintas del aislamiento en cultivo celular.

Preparación de cultivos celulares El funcionamiento eficiente de un laboratorio de virología diagnóstica requiere la disponibilidad de: a) células comunes que crecen a gran escala y b) células maduras en números pequeños. Estas últimas se preservan en un receptáculo (casi siempre un tubo, aunque las placas de “microtitulación” para cultivo celular son una alternativa) listo para la inoculación con el material clínico apropiado, a medida que dicho material llega al laboratorio. Cuando estos tu-

bos se utilizan, se sustituyen por tubos frescos preparados a partir de los cultivos de reserva. Todos los tipos celulares estándar enumerados en el cuadro 19-1 crecen como células de adhesión, no tanto como suspensiones celulares. Esto significa que se unen a una superficie plana (por lo regular frascos de plástico con cultivo celular) y entonces se multiplican y dividen, a condición de que el medio de cultivo contenga los nutrimentos necesarios, hasta que se cubra la superficie completa. En este punto, casi todas las células dejan de dividirse debido a la inhibición por contacto. Este proceso se conoce como crecimiento de confluencia. Una vez que una placa celular es confluente, las células pueden desprenderse de la superficie mediante una enzima proteolítica como la tripsina diluida en un medio de cultivo, y verterse de nueva cuenta dentro de una cantidad de frascos nuevos (p. ej., tres o cuatro), donde crecen entonces otra vez para confluir. Este proceso se conoce como pasaje celular y, de esta manera, el número de las células disponibles puede ampliarse con rapidez. De forma alternativa, las células de un frasco confluente pueden distribuirse en concentraciones celulares bajas en un estante para tubos con cultivo celular que, una vez que las células se instalan y alcanzan la confluencia, esperan la inoculación con el material clínico. Las células se diferencian en su capacidad de someterse a pasajes repetidos. Los cultivos primarios, es decir, aquellos establecidos de manera directa a partir del tejido (por ejemplo, células renales del mono) no sobreviven más de dos o tres pasajes in vitro. Esto es una desventaja importante para su uso, ya que el suministro continuo de cultivos primarios frescos es costoso e inconveniente. En realidad, existe una considerable preocupación de que el suministro de células renales del mono pueda cesar por varias razones. Estas células se han replicado para el aislamiento de los virus circulantes de la influenza y ha existido un gran esfuerzo para encontrar los sustratos celulares alternativos para estos virus. Por comparación, las líneas celulares tumorales (por ejemplo, células Hep-2, células HeLa) pueden dividirse de modo indefinido cuando se transforman in vitro y por lo tanto se conocen como líneas celulares continuas. Entre estos dos extremos, las células diploides derivadas del tejido embrionario humano (por ejemplo, fibroblastos embrionarios humanos) pueden crecer con éxito en 30 o 40 pasajes antes de cesar y, por lo tanto, se denominan líneas celulares semicontinuas. Las células se cultivan en frascos de cultivo bajo condiciones estériles. La preparación se efectúa a menudo en gabinetes con flujo laminar vertical, pero se puede realizar en un lugar abierto con un mechero de Bunsen y la técnica aséptica apropiada. El medio agregado a los frascos debe ser isotónico y con un pH conveniente (por ejemplo, 7.2 a 7.4), casi siempre basado en soluciones salinas fisiológi-

IDENTIFICACIÓN DEL CRECIMIENTO VÍRICO

camente equilibradas. La composición exacta del medio puede variar de acuerdo con el tipo de célula: las fórmulas detalladas están disponibles en guías prácticas. Es útil agregar un colorante indicativo para permitir el reconocimiento del metabolismo celular por un cambio del color (células sanas que al crecer producen un medio ácido). Para el crecimiento, son necesarios los aminoácidos esenciales y la proteína y éstos se proporcionan bajo la forma de suero procedente de un bovino fetal. Los antibióticos se agregan al medio de crecimiento como precaución adicional contra la contaminación bacteriana o micótica, cuyas fuentes principales son las bacterias flotantes, las levaduras a partir de la fuente de dióxido de carbono y las especies de Mycoplasma a partir de reactivos contaminados o del operador. Estos últimos reducen en grado notable la capacidad de las células para apoyar el crecimiento del virus. Una vez que se alcanza la confluencia, las células se pueden desprender con procedimientos físicos mediante un raspador de caucho de silicón estéril (conocido como “policía de caucho”) o, las más de las veces, mediante el tratamiento con tripsina y EDTA, que interrumpen la adhesión de las células a la superficie plástica y dan lugar a que las células se agrupen y desprendan. En esta etapa las células se pueden contar en un hemocitómetro y se calcula el volumen apropiado para la resuspensión (para proporcionar la concentración de siembra óptima). Sin embargo, con experiencia, es suficiente un cálculo aproximado del volumen necesario. Si las células no se transforman más, como las que se hallan listas en los tubos para la inoculación, entonces el medio de crecimiento se sustituye por un medio de conservación, una vez que se alcanza la confluencia; la diferencia radica en que en el último la concentración de suero está sumamente reducida. Las células confluentes en los tubos de cultivo celular con medio de conservación sobreviven por varios días, pero se atenúan al final con lentitud a pesar de los cambios del medio, punto en el cual deben desecharse. Las células generadas para las investigaciones con virus pueden, cuando se exceden los requisitos, conservarse como reservas de semillas congeladas en nitrógeno líquido. Las células se suspenden en un medio que contiene dimetilsulfóxido, que previene la formación de cristales de hielo que destruyen a las células. Si es necesario, en caso de contaminación bacteriana de las células en uso, las células pueden descongelarse con rapidez y prepararse los cultivos frescos.

Especímenes clínicos para el aislamiento de virus No hay ninguna restricción en la naturaleza del material clínico que impida inocular en cultivo celular para el aislamiento de virus. Las muestras líquidas (por ejemplo, líquido cefalorraquídeo, saliva, orina, líquido vesicular, aspirados nasofaríngeos, líquido de lavado broncoalveolar, sangre,

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heces diarreicas) pueden enviarse al laboratorio en un contenedor estéril y agregarse a tubos de cultivo celular apropiados y limpios o sometidos a dilución en un medio de conservación. Los escobillados (por ejemplo, de conjuntivas, garganta, base de la úlcera, cuello cervical, recto) se deben introducir en el medio vírico de transporte (líquido isotónico más los antibióticos para inhibir el sobrecrecimiento microbiano), puesto que los virus no sobreviven en los escobillados secos. Después de verter la botella para liberar tanto material celular como sea posible a partir del escobillado en el medio, el medio de transporte se inocula sobre las placas celulares. Las biopsias tisulares (por ejemplo, cerebro, intestino, pulmón) se deben también colocar en el medio de transporte vírico. El tejido puede picarse muy fino y el material celular y el sobrenadante inocularse en cultivo.

Identificación del crecimiento vírico Una vez que un espécimen clínico se inocula en los tubos de cultivo celular, éstos se incuban bajo condiciones que se asemejen, tanto como sea posible, a aquellas de las que se obtuvo el material. La mayor parte de los cultivos se mantiene a 37°C, pero algunos virus, sobre todo los de las vías respiratorias superiores, crecen mejor a una temperatura ligeramente más baja, como 33°C, y en presencia de 5% de dióxido de carbono. Los cultivos se pueden rotar lentamente con un tambor de rodillo, que mejora la aireación de la placa celular, o mantenerse inmóviles. El desafío para el microbiólogo consiste entonces en determinar si un cultivo celular dado contiene o no células en las cuales se replica un virus. Existe una cantidad de opciones disponibles para lograr este objetivo. Efectos citopáticos Cuando los virus se replican dentro de las células, éstas pueden experimentar cambios morfológicos como acrecentamiento debido a la alteración de la permeabilidad de la membrana, contracción por la muerte celular o formación de células gigantes multinucleadas por la presencia de una proteína de fusión que el virus codifica. Estos cambios de la morfología celular, visibles bajo el microscopio de luz, se refieren como efecto citopático (ECP) y los virus que inducen estos cambios son citopatógenos. Por consiguiente, la presencia de un virus dentro de un cultivo celular puede determinarse por el examen regular (por ejemplo, cada dos días) del cultivo bajo la lente de bajo poder de un microscopio de luz para reconocer el desarrollo de un ECP. El aspecto exacto de un ECP es variable, de acuerdo con el virus causante y el tipo de célula en que ocurre. Las células pueden aumentar de tamaño con rapidez, secarse o fundirse en el sincitio (células multinucleares gigantes). El efecto puede extenderse a lo largo de la placa celular en-

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CAP. 19

CULTIVO TISULAR

(a)

(b)

(c)

Figura 19-1 Efectos citopáticos. a) Una placa celular normal de fibroblastos. Las células han crecido para confluir y toman la forma de huso. b) Algunas de las células están redondeadas y agrandadas. Este aspecto en focos discretos separados por las células que parecen normales es típico del efecto citopático que induce el citomegalovirus. c) Varias células se han agrupado por toda la placa celular para conferir un aspecto de “salpicadura”. Éste es el aspecto característico del ECP que induce un rinovirus.

tera o puede ser mucho más focal en naturaleza. Puede verse de manera predominante, cuando no exclusiva, en el borde de la placa, tanto como en el centro. El ritmo de desarrollo del ECP puede variar de tan poco como 18 horas hasta incluso cuatro semanas. Si se tienen en cuenta todos estos factores, más los detalles clínicos relevantes de un espécimen particular, un virólogo puede diagnosticar qué virus está presente en el cultivo a través de la observación por microscopia de luz de tan sólo el ECP. En consecuencia, un ECP que se origina en un escobillado de una vesícula, que posee células agrandadas que aparecen después de 24 horas de cultivo y que se extienden con rapidez para destruir la placa celular entera, es muy probable atribuirlo al virus del herpes simple. En cambio, un escobillado de una vesícula que da lugar a que un ECP aparezca sólo después de 10 días de cultivo, en sólo dos o tres focos de células agrandadas en el centro de la placa, y que se extiende en forma lenta durante varios días después, es probable que se explique por el virus de la varicela-zoster. En la figura 19-1 se listan las características de los ECP para virus específicos. Pasaje de los virus La replicación de los virus dentro de una placa celular no es la única causa de un ECP visible. El material inoculado

sobre la placa puede ser citotóxico, un problema en especial frecuente con muestras fecales; puede ocurrir también la contaminación con otros microorganismos, a pesar de todas las precauciones tomadas. Si existe alguna duda en cuanto a los orígenes de un ECP, una manera simple de distinguir entre un virus comparado con un efecto tóxico consiste en procurar el pasaje del virus supuesto. Las células que permanecen en la placa celular se raspan dentro del sobrenadante del cultivo y algunas gotas del material resultante se inoculan en un tubo con cultivo celular fresco. Si había en verdad un virus en el cultivo original, entonces no sólo reaparece el ECP dentro del tubo nuevo, sino que el ritmo de desarrollo debe ser más elevado; asimismo, la cantidad, o el título, del virus se tiene que incrementar de forma significativa luego del crecimiento vírico en el primer cultivo. Empero, si el ECP original surge debido a algún componente tóxico del espécimen, entonces éste se diluye en el segundo tubo y el ECP subsiguiente debe desarrollarse de forma más lenta y extenderse menos, si acaso. El pasaje de virus es útil por otras dos razones. En primer lugar, algunos virus pueden no producir un ECP visible cuando crecen primero en un cultivo, aun cuando, en efecto, la réplica tenga lugar. Sin embargo, en el pasaje repetido en el mismo sustrato celular, un ECP puede ser evidente después de la adaptación del virus al crecimiento en ese tipo particular de célula. El proceso del pasaje de vi-

IDENTIFICACIÓN DEL CRECIMIENTO VÍRICO

rus a partir de células al parecer normales se conoce como pasaje ciego, quizá porque en esa etapa el virólogo no puede reconocer la presencia del virus. La identificación del virus de la rubeola que crece en células renales de conejo (RK13) puede requerir varios pasajes ciegos. En segundo lugar, el pasaje de virus es un buen método que incrementa la cantidad de virus disponibles para otros estudios, como en la prueba de neutralización (véase más adelante).

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rie de tubos y a cada tubo se agrega un antisuero diferente (por ejemplo, antipolio 1, antipolio 2, antipolio 3 a los tubos 1, 2 y 3, respectivamente). Después de la incubación del virus más el antisuero por una hora, las mezclas se agregan a los tubos individuales con cultivo celular y el aspecto del ECP se supervisa durante los días siguientes. La ocurrencia de un ECP típico en los tubos 1 y 3, combinada con la ausencia de un ECP en el tubo 2, indica que el virus original era un poliovirus de tipo 2.

Confirmación del aislamiento del virus En la mayor parte de los casos, el tipo de virus en un cultivo celular se puede determinar con certeza razonable mediante la observación de las características del ECP presente en la placa celular, según lo descrito antes. Pese a ello, hay casos en que puede requerirse la confirmación de la identidad del virus, por ejemplo, si el ECP es atípico, no se realiza bien el pasaje o está ausente o, de manera alternativa, cuando se requiere más información sobre la cepa particular del virus. Esto se puede conseguir con el uso de la microscopia electrónica, la detección del antígeno o las pruebas de neutralización. El proceso del cultivo celular actúa como medio para incrementar el título vírico a un grado suficiente que permita la visualización por microscopia electrónica (ME). De esta manera, a condición de que haya acceso a ME, casi todos los problemas relacionados con ECP atípicos o inusuales pueden resolverse con rapidez por el examen apropiado con ME de las células o el sobrenadante del cultivo. Los virus necesitan tener una concentración ⱖ 106 partículas/ml para utilizar esta técnica con éxito. Las células infectadas con un virus particular expresan los antígenos derivados de ese virus. Estos antígenos pueden detectarse si se tiñen con anticuerpos. Por lo tanto, la identidad específica de un virus que crece en cultivo celular puede determinarse al teñir las células con un panel de anticuerpos monoclonales apropiados, marcados de manera conveniente con una marca inmunofluorescente. Las células pueden rasparse o aspirarse fuera de los tubos con cultivo celular y después secar sobre un portaobjetos de cristal con multisitios cubiertos con teflón o, si se conoce que es necesaria la detección del antígeno, las células pueden crecer sobre una superficie plana, como un cubreobjetos, dentro del tubo con cultivo celular, que puede entonces recuperarse, fijarse y teñirse. La detección del antígeno hace posible la distinción entre, por ejemplo, virus de la influenza A y B o los virus de la parainfluenza 1, 2, 3 o 4, todos los cuales producen una prueba positiva similar a la hemadsorción (véase más adelante). Las pruebas de neutralización se utilizan casi siempre para distinguir entre los diversos enterovirus que crecen en cultivo o para la serotipificación de adenovirus. En principio, el virus aislado en cultivo se distribuye en una se-

Adaptaciones del cultivo celular En condiciones normales, el aislamiento del virus por cultivo celular es mucho más lento que el aislamiento bacteriano en medios inanimados. El crecimiento vírico más rápido, el del virus del herpes simple, puede producir un ECP después de 18 horas, pero casi todos los virus requieren varios días (o aun semanas) para hacerlo. ¡Esto es una desventaja considerable! Así, se han introducido diversas modificaciones del cultivo celular con el propósito de acelerar el proceso. Dos de ellas, adoptadas por los laboratorios de diagnóstico son la hemadsorción y la detección de los focos fluorescentes del antígeno temprano. Algunos virus (por ej., los virus de influenza y parainfluenza y los de las paperas) poseen una hemaglutinina (es decir, una proteína que se une a los eritrocitos). Las células infectadas expresan esta molécula en sus superficies. De esta manera, si los eritrocitos se añaden a un tubo con cultivo celular en el cual el virus se halla bajo replicación, al final se adhieren a la placa celular, un fenómeno conocido como hemadsorción (fig., 19-2a). La hemadsorción es demostrable (al girar con suavidad el tubo con cultivo) por algunos días antes de que el ECP sea evidente. La naturaleza exacta del virus hemadsorbente puede determinarse tras teñir con anticuerpos monoclonales. La detección de focos fluorescentes del antígeno temprano (prueba de DEAFF) se desarrolló de modo específico para acelerar la identificación del citomegalovirus (CMV) en cultivo celular. En esencia, la DEAFF es una adaptación de la detección del antígeno en la cual los antígenos a detectarse se seleccionan como aquellos que aparecen en fase temprana (dentro de las 24 a 48 h) en el ciclo de la replicación del virus (de ahí la denominación de “antígenos tempranos”). Entonces, el material clínico se inocula sobre una placa celular que creció sobre un cubreobjetos u otra superficie plana (un tipo de cultivo conocido como shell vial). Hay un paso de centrifugación (2 500 ⫻ g ⫻ h) que aumenta en grado considerable la infectividad de la placa celular por el virus. Después de 24 horas, la placa se lava y en seguida se tiñe con un anticuerpo monoclonal marcado con fluoresceína dirigido contra un antígeno temprano del CMV. El cubreobjetos se examina entonces bajo luz ultravioleta. Un resultado positivo se indica por la

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CAP. 19

CULTIVO TISULAR

(a)

(b)

Figura 19-2 Adaptaciones del cultivo celular. a) Hemadsorción. La placa celular (riñón del mono) es normal, esto es, ningún efecto citopático visible se ha desarrollado aún. Sin embargo, muchas células dentro de la placa expresan una hemaglutinina codificada de forma vírica sobre su superficie, como los eritrocitos, aquí observados como puntos pequeños que cubren la placa celular, y se han unido a la placa. b) Prueba de DEAFF. La placa celular se tiñe con un anticuerpo monoclonal anti-CMV marcado de modo fluorescente. Un solo núcleo se advierte en tono verde manzana, intenso y brillante, bajo la luz ultravioleta, lo que indica la presencia del CMV en esta célula. Todas las células (contrateñidas con el colorante azul de Evans) son normales en términos morfológicos.

presencia de núcleos fluorescentes en las células aisladas (es decir, focos), que parecen normales desde el punto de vista morfológico (véase la fig. 19-2b). Esta técnica se ha extendido a otros virus de crecimiento lento; por ejemplo, los adenovirus pueden reconocerse mucho antes que sea evidente cualquier ECP si se tiñen con anticuerpos contra antígenos tempranos del adenovirus.

Conclusiones El aislamiento de virus en cultivos celulares es todavía una técnica importante para el diagnóstico de las infecciones víricas. En teoría, una sola partícula vírica dentro de un espécimen clínico puede crecer en cultivo celular y, de ese modo, extenderse por muchos órdenes de magnitud, lo cual permite la detección y caracterización exactas. Los altos grados de sensibilidad y especificidad inherentes al aislamiento del virus son los “estándares de oro” contra los que deben compararse las nuevas técnicas. La metodología es apropiada para una amplia gama de especímenes clínicos y diferentes virus (cuadro 19-2). En raras ocasiones, su uso da lugar a la identificación de virus inesperados o incluso sin identificación previa: el HIV y los virus del herpes humano 6 y 7 se descubrieron primero en cultivo celular y el último virus que se identificó de esta manera es el coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave. Es una técnica que analiza todo y está bien adaptada a la identificación de lo “desconocido” en especímenes clínicos. Los dos inconvenientes principales de esta técnica son, primero, que no todos los virus pueden crecer en cultivo y, segundo, que algunos virus experimentan además crecimiento lento. El desarrollo de los nuevos tipos de cultivo

Cuadro 19-2

Aislados víricos potenciales obtenidos de material clínico

Espécimen clínico Líquido o escobillado de una vesícula Aspirado nasofaríngeo o escobillado de la garganta

Heces Líquido cefalorraquídeo Orina Escobillado conjuntival Sangre (placa leucoplaquetaria)

Virus que pueden aislarse en cultivos celulares comunes Virus del herpes simple (HSV), virus de la varicela zoster Virus sincitial respiratorio, virus de la influenza A y B, virus de la parainfluenza 1-4, adenovirus, rinovirus, enterovirus, HSV, citomegalovirus (CMV) Enterovirus, adenovirus Enterovirus, virus de las paperas CMV, virus de las paperas HSV, adenovirus CMV

celular, que contribuyen a disponer de un arsenal cada vez más extenso de virus, puede superar en cierto grado el problema anterior, aunque hay varias adaptaciones del cultivo celular que pueden acelerar el proceso de identificación vírica.

Lecturas adicionales Lennette EH, Schmidt NJ (eds). Diagnostic Procedures for Viral Rickettsial and Chlamydial Infections, 7th ed. 1996: American Public Health Association, Washington, DC. Cann AJ (ed.). Virus Culture: A Practical Approach. 1999: Oxford University Press, Oxford.

20 Pruebas serológicas en virología Goura Kudesia

Introducción El sistema inmunitario produce los anticuerpos en respuesta a varios estímulos, incluidas las infecciones, y la serología es la ciencia de la cuantificación de estos anticuerpos en el suero. Por convención, el término “serología” también incluye el estudio del suero para el antígeno y, por extensión, se define cualquier prueba que implica una reacción antígenoanticuerpo como prueba serológica. Las pruebas serológicas aprovechan el hecho de que la mayor parte de las infecciones víricas y muchas bacterianas, micóticas y parasitarias obtienen buenas reacciones del anticuerpo. Estas pruebas se han utilizado para el diagnóstico de enfermedades víricas u otras enfermedades en las que los microorganismos no se aíslan con facilidad, por ejemplo Toxoplasma y sífilis. En infecciones víricas como la hepatitis B, en la que hay una fase virémica prolongada, se pueden utilizar técnicas similares para detectar el antígeno del virus. Este capítulo, aunque se limita sobre todo a la serología del virus, también considera otras pruebas serológicas empleadas hoy día en los laboratorios de serología para el diagnóstico de enfermedades infecciosas y describe los principios, técnicas, interpretación y futuro de estas pruebas.

Principios La clase del anticuerpo producido y las propiedades funcionales pueden explotarse para medir la respuesta inmunitaria después de la infección. Las clases de anticuerpo más útiles para la medición son IgM e IgG. La cuantificación del anticuerpo IgA secretorio y sérico puede también ser útil, pero es más exigente en términos técnicos y por lo

tanto no se utiliza de rutina en laboratorios de diagnóstico. El anticuerpo inicial que se produce después de la infección primaria es de la clase IgM y se vuelve casi siempre perceptible uno a dos días después del inicio de los síntomas y así permanece seis a 12 semanas. El anticuerpo IgG específico comienza a aumentar en una a dos semanas y es perceptible por muchos años, cuando no el resto de la vida, después de la infección. Por consiguiente, el anticuerpo IgG específico del virus sólo se relaciona con la infección pasada y en casi todos los casos denota inmunidad para la infección futura. Por otra parte, como el anticuerpo IgM específico del virus suele ser imperceptible después de tres meses, su presencia indica una infección reciente. La figura 20-1 muestra una representación gráfica de la reacción de IgM e IgG después de la infección primaria. La medición de los anticuerpos IgG e IgM específicos del virus en una sola muestra del suero puede por tanto auxiliar en el diagnóstico y ayudar a distinguir la infección vírica reciente de la pasada. Muchas técnicas, como el inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA o EIA), el ensayo inmunofluorescente (IFA, por sus siglas en inglés) y el radioinmunoensayo (RIA, por sus siglas en inglés), se han desarrollado para medir IgG e IgM específicas. En condiciones normales, estas pruebas se usan para resultados “cualitativos”, es decir, un resultado de la prueba positivo o negativo y no son cuantitativas. Tienen principios similares por los cuales la reacción del anticuerpo con el antígeno se detecta por la adición de un segundo anticuerpo dirigido contra la inmunoglobulina humana. La antiinmunoglobulina se marca con la fluoresceína (IFA), la enzima (ELISA) o el radioisótopo (RIA). Estas técnicas se pueden también emplear para la detección del antígeno. El anticuerpo producido en respuesta a una infección puede también ser distinto en su aspecto funcional, esto es,

The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker. © 2005 John Wiley & Sons, Ltd.

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CAP. 20

PRUEBAS SEROLÓGICAS EN VIROLOGÍA

Precipitación El método de doble difusión (DD) de Ouchterlony se puede utilizar para detectar el anticuerpo o el antígeno. En el primer caso se usa un antígeno conocido y en el segundo un anticuerpo de especificidad conocida. El anticuerpo y el antígeno se difunden el uno hacia el otro en gel de agarosa y una línea de precipitación blanca indica una reacción positiva. La contrainmunoelectrofluorescencia (CIE) dirige de manera específica el movimiento del antígeno y el anticuerpo el uno hacia el otro en un campo eléctrico y por lo tanto es más rápido que el DD. La CIE fue el método usado de manera original en la identificación del antígeno superficial de la hepatitis B. Estos métodos se han sustituido sobre todo por técnicas mucho más sensibles, aunque algunos laboratorios todavía las utilizan para las pruebas de anticuerpos de hongos. Figura 20-1 Reacción de IgM e IgG en las infecciones temprana, reciente, convaleciente y pasada.

puede ser fijador del complemento, hemaglutinante o neutralizante. Los antígenos presentes en el virus determinan las características funcionales del anticuerpo producido en respuesta, de modo que sólo los virus (p. ej., rubeola, sarampión o influenza) que poseen hemaglutinina desencadenan anticuerpos hemaglutinantes. Puede utilizarse el conocimiento de la estructura antigénica de los virus para concebir pruebas serológicas convenientes, como fijación del complemento (FC), hemaglutinación (HA) o pruebas de inhibición de la hemaglutinación (IHA). Estas pruebas detectan las clases de IgG e IgM del anticuerpo al mismo tiempo y pueden cuantificar la reacción serológica. Es posible solicitar diluciones seriadas del suero para determinar el título del anticuerpo presente. Se requieren muestras del suero agudas y de convaleciente pareadas para establecer un diagnóstico de la infección reciente: un aumento del cuádruple o mayor en el valor del anticuerpo es diagnóstico.

Técnicas Las técnicas serológicas se pueden dividir con base en la complejidad de la prueba. Las más simples son aquellas en las cuales la presencia del anticuerpo se demuestra por una interacción simple con el antígeno (las pruebas de precipitación o aglutinación). Las siguientes son las que implican sistemas indicadores para reconocer la reacción antígeno-anticuerpo (neutralización o fijación del complemento). Las pruebas más complejas suponen el uso de un segundo sistema con anticuerpo marcado, como el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) o IFA.

Hemaglutinación e inhibición de la hemaglutinación (HA e IHA) La hemaglutinina de ciertos virus, como los virus de la influenza, el sarampión y la rubeola, tiene la propiedad de aglutinar a los eritrocitos de las especies seleccionadas. Las pruebas de HA son las más utilizadas con los virus de la influenza. Las influenzas A y B aglutinan a los eritrocitos del grupo O humano, del cobayo y las gallinas a 4 y 20°C, mientras que la influenza C aglutina sólo a eritrocitos de gallinas. Las pruebas de HA son por tanto útiles en la detección y titulación del antígeno vírico. La IHA utiliza la presencia de la hemaglutinina en el virus para identificar al anticuerpo. La prueba se basa en el principio según el cual el anticuerpo específico se combina con la hemaglutinina e inhibe a la HA. Se permite que diluciones seriadas del suero del paciente reaccionen con una cantidad especificada de hemaglutinina y entonces se agregan los eritrocitos indicadores apropiados. Si el anticuerpo específico está presente, bloquea la hemaglutinina y por consiguiente se advierte una reacción positiva por la ausencia de la hemaglutinación. Donde está ausente el anticuerpo específico, la hemaglutinina vírica está libre para aglutinar a los eritrocitos indicadores (reacción negativa). En el pasado, las pruebas de IHA se usaron de modo amplio para establecer el estado inmunitario y diagnosticar infecciones recientes del virus de la rubeola. Sin embargo, la IHA es complicada por el hecho de que el suero necesita tratamiento anterior para retirar los inhibidores inespecíficos, y por lo tanto se ha reemplazado con técnicas más sensibles y específicas para el diagnóstico de la rubeola. Pese a ello, los laboratorios de referencia todavía utilizan la IHA para la identificación y tipificación de los virus de la influenza. Las técnicas de HA se pueden también emplear para los virus que no poseen

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TÉCNICAS

Figura 20-2 Prueba de aglutinación de partículas de gel con Mycoplasma pneumoniae.

hemaglutinina; esto se logra al hacer acoplar el antígeno vírico a la superficie de los eritrocitos por un agente acoplador como el ácido tánico. Cuando se mezclan con el suero que contiene el anticuerpo específico, los eritrocitos se aglutinan porque el antígeno vírico se liga a su superficie (HA indirecta o pasiva). La HA indirecta se ha usado para el reconocimiento del anticuerpo contra el toxoplasma. No obstante, debido a la inestabilidad de los eritrocitos, en la actualidad se utilizan partículas inertes de portador, como partículas de látex, gelatina y carbón. Pruebas de aglutinación de partículas Muchas pruebas se basan en la aglutinación de la partícula. Estas pruebas se llevan a cabo sobre un portaobjetos o una diapositiva de cartón o bien en celdillas de microtitulación. Lo que sigue no es una lista exhaustiva, sino ejemplos de algunas de las pruebas más comunes de uso actual. Aglutinación de látex (AL) Las micropartículas de látex de poliestireno se sensibilizan o cubren con el antígeno vírico aglutinado cuando se mezclan con el suero del paciente que contiene el anticuerpo específico. Las partículas de látex revestidas con el antígeno se mezclan con el suero del paciente sobre un portaobjetos o en una celdilla de microtitulación. Un patrón visible de aglutinación aparece si el anticuerpo específico está presente. Estas pruebas son de uso amplio en los laboratorios de virus debido a su rapidez, simplicidad y facilidad de uso. En la actualidad están disponibles buenas pruebas de AL para la rubeola, el toxoplasma y el citomegalovirus. Las pruebas

de AL se utilizan para el examen de una sola muestra de suero para establecer inmunidad y los sueros pareados para diagnosticar una infección reciente. Prueba de aglutinación de partícula de gelatina Las partículas de gelatina se cubren con el antígeno y las diluciones seriadas del suero de un paciente se prueban en celdillas de microtitulación. El título del anticuerpo se determina por la dilución más alta del suero que aglutina las partículas revestidas de antígeno. Puede ocurrir la aglutinación inespecífica y por lo tanto las partículas de gelatina sin cubrir se incluyen siempre como controles (fig. 20-2). VDRL VDRL es una prueba serológica para el examen de la infección de sífilis. Una modificación de la prueba utiliza el antígeno que contiene carbón microparticulado para examinar el anticuerpo reagina. El uso de las partículas de carbón incrementa la lectura visual del resultado de la prueba en un fondo blanco. Fijación del complemento (FC) El suero del paciente, después de la inactivación a 56°C por 30 minutos para destruir el complemento nativo, se agrega a una cantidad conocida del antígeno vírico y del complemento de conejo. Si ocurre la reacción anticuerpo-antígeno, entonces se activa el complemento, “se fija” o se liga. Luego se agrega un sistema detector del antígeno y el anticuerpo,

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CAP. 20

PRUEBAS SEROLÓGICAS EN VIROLOGÍA

Figura 20-3 Inmunoensayo de enzimas de IgG e IgM de la varicela zoster.

bajo la forma de eritrocitos de oveja sensibilizados con el anticuerpo del conejo para los eritrocitos de oveja (hemolisina). Si la primera reacción antígeno-anticuerpo “fija” el complemento, los eritrocitos de oveja no se lisan, lo cual indica una reacción y una presencia positivas del anticuerpo específico en el suero. La hemólisis de eritrocitos sensibilizados de las ovejas por el complemento señala una reacción negativa. La prueba FC es cuantitativa. El suero se diluye de modo seriado y el valor del anticuerpo se expresa como recíproco de la dilución más alta del suero que da lugar a la hemólisis de 50% de los eritrocitos sensibilizados. Un aumento del cuádruple del título o la seroconversión entre una muestra aguda y otra de suero de convaleciente son diagnósticos. Esta técnica requiere destreza considerable y mucho trabajo, pero el suero se puede probar contra antígenos múltiples en una sola ocasión con el mismo sistema indicador. Las pruebas de FC se efectúan sólo en laboratorios de virología especializados y son todavía las pruebas de opción para el diagnóstico serológico de las infecciones víricas respiratoria y bacteriana atípicas. Neutralización La interacción del anticuerpo específico con el virus neutraliza la infectividad y previene la infección de un sistema huésped viviente susceptible a ese virus. Una desventaja importante de estas pruebas es que se requiere un sistema huésped vivo, bajo la forma de un cultivo celular o animales vivos y por lo tanto muchas de estas pruebas se han reemplazado con otras técnicas. Las pruebas de neutralización todavía se utilizan para detectar el anticuerpo del poliovirus y ciertas toxinas, como en el caso de Clostridium difficile.

Ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzima (ELISA) Ésta es la prueba serológica más difundida de uso corriente. Se conocen muchas variaciones de la metodología, pero todas implican la fijación del antígeno a una fase sólida, la cual es casi siempre una placa o gota de poliestireno o polivinilo. Se agrega el suero del paciente y después de una extensión apropiada de tiempo para permitir al anticuerpo unirse al antígeno sobre la fase sólida, se eliminan mediante lavado el material ligado de forma inespecífica y el exceso de suero. Entonces se agrega una inmunoglobulina antihumana marcada por la conjugación con una enzima (conjugado). El conjugado se une al anticuerpo en el complejo de antígeno-anticuerpo. El exceso de conjugado se lava entonces para removerlo y la presencia de la inmunoglobulina antihumana marcada ligada se identifica por la adición de un sustrato conveniente para la enzima marcadora. Si han ocurrido las reacciones apropiadas, entonces el sustrato se convierte en un producto absorbente de luz y aparece coloreado. En ausencia del anticuerpo, no se produce ningún color (fig. 20-3). La intensidad del color se relaciona directamente con la cantidad del anticuerpo ligado al antígeno. El cambio del color puede cuantificarse a simple vista o lo registra un espectrofotómetro para revelar la intensidad exacta de la reacción. Los sistemas de enzimasustrato de uso corriente son peroxidasa del rábano (HRP), O-fenilendiamina (OPD) y fosfatasa alcalina y fosfatasa de p-nitrofenilo. Para adaptar la prueba a la detección del antígeno, la fase sólida se cubre con el anticuerpo específico para el antígeno a detectar. Un segundo anticuerpo marcado se añade entonces para detectar cualquier complejo antígeno-anticuerpo en la superficie de la fase sólida. Según sea la secuencia de reacción, las pruebas ELISA se dividen

TÉCNICAS

Figura 20-4 Diferentes formatos de la prueba ELISA. (a) ELISA indirecta: 1. Fase sólida de la capa con el antígeno vírico. 2. Incubar con el suero del paciente. El anticuerpo específico presente se fija al antígeno unido a la fase sólida. 3. Agregar la enzima marcada anti-IgG o anti-IgM. 4. Agregar el sustrato; cambia el color si la reacción es positiva. (b) ELISA de captura: 1. Fase sólida de la capa con anti-IgG o IgM. 2. Incubar con el suero del paciente. Todas las IgG o IgM presentes se capturan en la fase sólida. 3. Agregar el antígeno; éste une a cualquier anticuerpo específico capturado.

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4. Agregar el antivírico IgG marcado con enzima. 5. Agregar el sustrato; cambia el color si la reacción es positiva. (c) ELISA competitiva: 1. Fase sólida de la capa con el antígeno. 2. Agregar el suero del paciente y el anticuerpo específico marcado con enzima. El anticuerpo específico compite con el conjugado para unirse a la fase sólida. 3. Agregar el sustrato. La reacción positiva se muestra sin color en (a), ya que el anticuerpo específico bloqueó al conjugado. La reacción negativa se muestra por el color en (b), ya que el anticuerpo marcado con enzima no se bloqueó.

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PRUEBAS SEROLÓGICAS EN VIROLOGÍA

en directas, indirectas, de captura o competitivas. La figura 20-4 explica algunas de las diferencias entre estos métodos. Las pruebas son específicas para IgM o IgG, según sea que se emplee IgM antihumana o IgG como el segundo anticuerpo. Para una revisión detallada, véase la obra de Booth, 1983 (véanse las Lecturas adicionales). ELISA es una técnica muy sensible porque una cantidad pequeña de enzima puede procesar una cantidad grande de sustrato. Los resultados negativos falsos de IgM pueden ocurrir en presencia de valores altos de IgG específica, que compiten por el antígeno en la fase sólida. Esto puede evitarse si se remueve la IgG antes de la prueba de la muestra. Las reacciones inespecíficas en el ensayo de IgM pueden también ocurrir debido a la presencia del factor reumatoide (RF). El RF de la clase de IgM se une a los antígenos nuevos expuestos debido a los cambios configuracionales en la región Fc de la molécula IgG específica cuando ésta se liga al antígeno en la fase sólida. El RF de la IgM no puede distinguirse de la IgM específica del virus, pero el RF se puede remover por absorción con el agregado de IgG antes del examen para la IgM. Se prefieren los ensayos de captura para IgM, ya que no se afectan con el RF o la IgG específica en el suero del paciente. Las pruebas ELISA tienen la ventaja de ser objetivas, se pueden automatizar con facilidad y no requieren gran destreza técnica. Son pruebas rápidas y la mayor parte de los métodos se pueden completar dentro de dos a tres horas. Casi todos los laboratorios microbiológicos, si no todos, están equipados para realizar ELISA, que son de uso extenso para la investigación y el diagnóstico serológico del HIV, hepatitis vírica, rubeola, citomegalovirus, virus de Epstein-Barr, virus de la varicela zoster, sarampión, paperas, toxoplasma, Chlamydia trachomatis, etcétera. Inmunofluorescencia (IF) En la IF indirecta para la detección del anticuerpo, las células infectadas por virus o el antígeno bacteriano se fijan a las celdillas en portaobjetos cubiertos de teflón, se añade el suero del paciente y se detecta la reacción antígeno-anticuerpo por la adición de la inmunoglobulina antihumana marcada con el colorante fluoresceína (isotionato de fluoresceína). La reacción se registra debajo de un microscopio de luz fluorescente y las reacciones positivas se indican por la fluorescencia verde manzana típica. Se han utilizado por muchos años las pruebas de IF indirectas para la identificación de los anticuerpos IgM e IgG para los citomegalovirus, el virus de Epstein-Barr y el virus de la varicela zoster. Las reacciones positivas falsas secundarias a la expresión de receptores sobre las células infectadas, a las cuales se puede unir el anticuerpo específico no vírico de la clase IgM, son un problema. Las pruebas de IF también

requieren equipo especializado, como un microscopio de fluorescencia, y están sujetas al criterio del operador en la lectura. Por lo tanto, las han sustituido las pruebas ELISA para la detección del anticuerpo. Por otra parte, la disponibilidad de los anticuerpos monoclonales de buena calidad para una variedad de antígenos víricos ha convertido a la IF directa en el método ideal para la detección del antígeno en varios tejidos y muestras. El material infectado se fija encima de un portaobjetos con la ayuda de acetona o alcohol y se tiñe con el anticuerpo monoclonal marcado con fluoresceína dirigido contra el antígeno bajo prueba. La IF directa se utiliza extensamente para el diagnóstico rápido de virus respiratorios por el examen de las células epiteliales de aspirados nasofaríngeos para el virus sincitial respiratorio, los virus A y B de la influenza, los virus 1, 2 y 3 de la parainfluenza y los adenovirus. Radioinmunoensayos (RIA) Éstos se basan en los mismos principios que los métodos ELISA. Las pruebas de RIA usan un radioisótopo marcado en vez de una enzima marcada. Debido a la corta vida útil del radiomarcador y los requisitos especiales para eliminar la radiactividad, las técnicas ELISA los han reemplazado. Western blot (WB) o inmunoensayo en línea (LIA) Representan una herramienta muy específica y sensible para detectar y caracterizar a los anticuerpos contra microorganismos en virtud de su enlace a los antígenos fijados a las membranas de nitrocelulosa. Para la prueba WB se separan las proteínas víricas o bacterianas semipurificadas por electroforesis en un gel de poliacrilamida y después se transfieren de modo electroforético a una membrana de nitrocelulosa. En el inmunoensayo en línea los antígenos víricos, producidos por técnicas moleculares recombinantes o sintetizados de manera artificial (péptidos sintéticos), se unen directamente a la membrana de nitrocelulosa. La membrana de nitrocelulosa se incuba con el suero del paciente para permitir al anticuerpo unirse a los antígenos fijados en la membrana. Se agrega la inmunoglobulina antihumana con enzima marcada con base en un principio similar al de la prueba ELISA. Se siguen los pasos de lavado apropiados. En la adición del sustrato pueden ser visibles las bandas del antígeno para las cuales el anticuerpo específico está presente. La técnica es única en el sentido de que puede identificarse el anticuerpo contra las proteínas víricas o bacterianas simples o los epitopos antigénicos, lo que torna a la prueba muy específica. Se utilizan en extenso como pruebas de confirmación para el HIV y el virus de la hepatitis C y para el diagnóstico de la enfermedad de Lyme.

INTERPRETACIÓN Y USO DE LAS PRUEBAS SEROLÓGICAS

Pruebas de avidez del anticuerpo Las técnicas para medir la avidez del anticuerpo IgG se han desarrollado para ayudar a la cronología de la infección por serología. El anticuerpo de avidez baja se produce de forma inicial después de la infección primaria, mientras que el anticuerpo de avidez alta lo hace después de la reinfección o la recrudescencia. Las pruebas de avidez del anticuerpo se basan en el principio de que los complejos antígenoanticuerpo de avidez alta requieren más energía para la disociación o prevención de la formación del complejo. En la celdilla de prueba, el anticuerpo de avidez baja se remueve por lavado con 8 M de urea (disociación) o los enlaces se previenen desde la formación con el uso del agente desnaturalizante de la proteína clorhidrato de guanidina en el líquido diluyente del suero. Las celdillas control se tratan con lavado normal y líquido diluyente. Los anticuerpos en forma de complejos de la fase sólida se detectan entonces en las celdillas de prueba y control. Si un anticuerpo muestra avidez alta, no hay diferencia significativa entre la lectura de la celdilla de prueba y la de control dado que estos complejos no se disocian ni se previenen con facilidad desde que se forman. Los ensayos de avidez han sido inestimables en la atención de la rubeola e infecciones por Toxoplasma en el embarazo y han contribuido a establecer la cronología de la infección. Serología en muestras no séricas Las pruebas ELISA de captura de IgG e IgM se han adaptado para el examen de muestras de orina y saliva. Puesto que éstas son muestras no invasivas, se prefieren para los niños y otros grupos, como los consumidores de drogas intravenosas, en los que es difícil obtener muestras de sangre. El diagnóstico serológico por el examen de la saliva está disponible ahora para el sarampión, paperas y rubeola. La serovigilancia a gran escala de la infección del HIV se efectúa mediante revisión de orina y saliva.

Interpretación y uso de las pruebas serológicas La capacidad con los métodos ELISA semiautomatizados o automatizados generalizó su disponibilidad para un número extenso de laboratorios. Las pruebas más antiguas eran difíciles desde el punto de vista técnico y las practicaban sólo algunos laboratorios especializados. Las notorias mejorías tecnológicas del método ELISA, junto con el conocimiento de la importancia de las infecciones víricas en muchos grupos vulnerables de pacientes, convirtió a la serología en un pilar fundamental del diagnóstico del virus.

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En la actualidad, la serología se establece para el diagnóstico de las infecciones, en especial enfermedades víricas. La tecnología más reciente significa que muchas de las pruebas diagnósticas comunes se pueden realizar por medio de microbiología general o por otros laboratorios no especializados. Diagnóstico de las infecciones agudas Los estudios serológicos contribuyen en grado notorio al diagnóstico de las enfermedades infecciosas. De manera habitual, una confirmación serológica requiere el examen de una muestra de suero tomada inmediatamente después del inicio de la enfermedad (aguda) y una segunda muestra de una a dos semanas después (convaleciente). Un incremento del cuádruple del anticuerpo o de la seroconversión del estado negativo al estado positivo del anticuerpo entre las muestras aguda y convaleciente indica infección aguda. Sin embargo, las nuevas tecnologías para la detección específica de IgM e IgG permiten al laboratorio precisar un diagnóstico o descartar una infección sospechada en una sola muestra de suero. Para ello, las técnicas ELISA se emplean de forma amplia en los laboratorios de microbiología. Si no se reconocen IgM o IgG, entonces el paciente no estuvo expuesto al microorganismo o la muestra se recogió demasiado pronto. Como el anticuerpo IgM para la mayor parte de los virus se puede identificar dentro de una semana tras el inicio de los síntomas, una muestra tomada en ese tiempo, si es negativa para IgM vírica, es suficiente para descartar una infección reciente o actual. La IgM específica se puede detectar sólo por tres meses, pero algunas pruebas más sensibles pueden reconocer IgM más allá de los 12 meses. Como la IgG está sólo presente más adelante, una reacción positiva de la IgM, con o sin la presencia de IgG específica, indica una infección reciente. La IgG específica permanece positiva por toda la vida y por tanto la presencia exclusiva de IgG con IgM negativa indica una infección pasada y en casi todos los casos inmunidad a la infección futura contra ese agente patógeno específico. Está claro que la selección de la prueba y la interpretación del resultado dependen de la afección clínica y la fecha de inicio de los síntomas, que deben por tanto comunicarse siempre al laboratorio. Detección del anticuerpo para verificar la inmunidad La verificación de la inmunidad a las infecciones se requiere en muchas situaciones clínicas, como el periodo posterior a la vacunación, solicitudes de empleo, embarazo, condiciones anteriores al trasplante o pacientes inmunosuprimidos que pueden entrar en contacto con infecciones. Las pruebas para reconocer al anticuerpo protector tienen

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PRUEBAS SEROLÓGICAS EN VIROLOGÍA

que ser sensibles y requieren el examen para IgG específica. Se utilizan las pruebas víricas ELISA de IgG específica, IFA o anticuerpo total, como la prueba de aglutinación de látex. Las encuestas seroepidemiológicas posteriores a la vacunación para determinar seroconversión e inmunidad después de la vacunación para sarampión, paperas, rubeola y hepatitis B han formado una parte vital de la evaluación de la eficacia de los programas de vacunación. Los métodos ELISA automatizados y sensibles han hecho factible el examen masivo de la etapa posterior a la vacunación. El anticuerpo para la hepatitis B se expresa en unidades internacionales y esta capacidad de cuantificar permite al clínico decidir sobre la cronología de las revacunaciones consecutivas. La inmunidad para la rubeola y la hepatitis B es un requisito de empleo para muchos trabajadores de la atención sanitaria. La inmunidad a otras infecciones, como el virus de la varicela zoster, sarampión y paperas, es también deseable, sobre todo para aquellos que trabajan con niños o pacientes inmunocomprometidos, sea para protegerse o para prevenir la propagación de la infección a los pacientes susceptibles. Quienes son susceptibles a la infección por varicela zoster y los que se exponen a la varicela se deben excluir del trabajo, para no exponer a los pacientes susceptibles a la infección. Durante el embarazo, el examen para identificar el anticuerpo protector contra la rubeola se ofrece a todas las personas y se vacuna a las mujeres susceptibles después del parto. Se recomienda examinar a todas las pacientes para el virus de la hepatitis B y se suministra inmunización de la hepatitis B a los recién nacidos de madres infectadas para prevenir la transmisión vertical de la infección. El examen del HIV para las madres en riesgo permite el tratamiento con el medicamento específico de la madre durante el embarazo y el parto para reducir el riesgo de la transmisión vertical del HIV. El examen del anticuerpo para otros microorganismos, como varicela zoster, toxoplasma y citomegalovirus, permite al clínico aconsejar a pacientes susceptibles acerca de la forma de evitar la infección. Todos estos controles requieren una prueba simple de aglutinación de látex o ELISA de IgG. Sin embargo, en caso de contacto reciente con una infección, los métodos de IgM tienen que realizarse además de asegurarse que la IgG detectada es de una infección pasada y no de una actual. Pacientes sometidos a trasplante e inmunosuprimidos Estos individuos son en particular propensos a desarrollar infecciones por citomegalovirus (CMV). Los pacientes positivos al anticuerpo CMV que reciben un órgano de un donante positivo al CMV requieren profilaxis para prevenir

el desarrollo de la infección por CMV primaria. Además, la infección por toxoplasma adquirida del donante es un problema grave en el receptor del trasplante del corazón, así que todos los donantes y receptores se examinan en relación con el anticuerpo contra el toxoplasma y se aplica profilaxis en los receptores negativos de un corazón de donantes positivos para anticuerpos contra el toxoplasma. Los pacientes inmunosuprimidos también se examinan para las infecciones comunes, como varicela, herpes simple y sarampión, puesto que ellos pueden sufrir enfermedad grave si se exponen a ellas. Examen para la donación de sangre, órganos y tejidos Muchos microorganismos, en especial virus transportados en la sangre, se pueden transmitir por vía sanguínea y productos de la sangre, trasplante de órganos y tejidos. Es esencial que la sangre se examine antes de la transfusión. En el Reino Unido toda la sangre se examina para HIV, hepatitis B, hepatitis C y sífilis. En el caso del HIV y el virus de la hepatitis C, la presencia del anticuerpo significa infección actual y el examen para el antígeno vírico es innecesario. La sangre destinada para pacientes inmunosuprimidos también se examina para CMV. Debido a la importancia de desechar la sangre infectada, sólo se emplean las pruebas más sensibles. Las donaciones que se encontraron positivas se someten a pruebas confirmatorias por los laboratorios de referencia especializados. Para hacer frente al volumen de exámenes requeridos, los laboratorios de transfusión de sangre tienen sistemas ELISA automatizados para el examen microbiológico de la sangre. Los donantes de órganos y tejidos se someten a procedimientos de revisión similares. Diagnóstico de infección congénita Como la IgG materna cruza la placenta y llega al feto, la presencia de IgG con especificidad vírica en la sangre neonatal no indica en todos los casos infección. La persistencia del anticuerpo IgG más allá de los seis meses de edad señala infección congénita, dado que el anticuerpo derivado de la madre desaparece para entonces. La presencia de IgM específica en o poco después del nacimiento supone infección congénita o vertical, ya que la clase IgM del anticuerpo no cruza la placenta.

Futuro de la serología Aunque muchas infecciones se pueden diagnosticar con rapidez por la detección de IgM específica del virus por

FUTURO DE LA SEROLOGÍA

las técnicas descritas en este capítulo, para otras como las infecciones respiratorias del virus sólo es posible un diagnóstico retrospectivo porque se requiere una muestra de suero convaleciente para el examen por CFT. Es posible que muchos pacientes inmunosuprimidos no activen una buena respuesta del anticuerpo y por tanto la ausencia de una reacción de IgM específica para el virus no descarta siempre la infección en este grupo de personas. Los avances en las técnicas de amplificación del ácido nucleico, en especial en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real con tecnología automatizada, han permitido a los laboratorios ofrecer PCR para el diagnóstico común de las infecciones víricas. Los métodos basados en la PCR son rápidos: la PCR en tiempo real puede demorar dos a tres horas. Muchos laboratorios se inclinan ahora por realizar las técnicas de PCR para diagnosticar la infección. En virtud de la detección vírica de RNA o DNA, se puede reconocer la infección mucho antes que se establezca una reacción del anticuerpo (según lo establecen los métodos serológicos). Esto puede ser de utilidad, sobre todo en pacientes inmunosuprimidos. Sin embargo, las pruebas serológicas de IgM se emplean todavía para diagnosticar infecciones recientes en quienes no las manifiestan de inmediato, ya que la IgM se puede detectar más allá de tres meses tras la infección y algunas veces mucho tiempo más. Los procesos serológicos también tienen un papel crucial para establecer evidencia de inmunidad a la infección, como resultado de una infección

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pasada o consecutiva a la vacunación. Son también una herramienta epidemiológica importante en los estudios de serovigilancia, que establecen la prevalencia de la infección. En el futuro, aunque las técnicas de amplificación de ácidos nucleicos rápidas y sensibles (como la PCR) pueden reemplazar a la serología para diagnosticar la infección actual por muchos virus, la serología no dejará de desempeñar un papel importante en el acompañamiento de la PCR para el diagnóstico de una infección reciente. Lo que es más importante, será aún el pilar fundamental en la medicina preventiva al establecer la evidencia de inmunidad posterior a la vacunación, identificar a los individuos susceptibles a la infección para protegerlos y estudiar la epidemiología de las infecciones víricas.

Lecturas adicionales Booth JC. The use of the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) technique in clinical virology. Recent Advances in Clinical Virology, Waterson AP (ed.). 1983: Churchill-Livingstone, Edinburgh, 73-98. James K. Immunology of infectious diseases. Clin Microbiol Rev 1990; 3(2): 132-152. Parry JV, Perry KR, Mortimer PP. Sensitive assays for viral antibodies in saliva: an alternative to tests on serum. Lancet 1987; 2: 72-75. Thomas HIJ. Specific antibody avidity studies in clinical microbiology: past, present and future. PHLS Microb Dig 1995; 12(2): 97-102.

21 Pruebas automatizadas en virología Roger P Eglin

Introducción Durante los últimos 50 años la comprobación diagnóstica en laboratorios clínicos se ha desarrollado a partir de la operación manual de pruebas como el examen de los frotis de sangre y los métodos químicos simples mediante técnicas que requieren cantidades relativamente grandes de sangre, suero o plasma. En el decenio de 1960 se desarrolló el analizador multicanal para la química clínica y se introdujeron métodos de conteo electrónico, como el contador de Coulter. El desarrollo continuo de estas comprobaciones automatizadas comenzó a concentrarse en mejoras de la calidad y la consistencia de los resultados y en reducir los tiempos requeridos para las pruebas y el volumen de la muestra exigido para cada una. Aunque los sistemas automatizados complejos son ya una práctica común en otras áreas de la patología desde los últimos 20 años, la microbiología y en particular los laboratorios de virología han utilizado métodos de comprobación tradicionales. Para la virología, éstos se basaron en el cultivo celular y el aislamiento vírico con las pruebas del anticuerpo mediante reactivos producidos en buena medida en casa. Los inmunoensayos enzimáticos (IEE) aparecieron en la década de 1970 y sus desarrollos comerciales posibilitaron la transición hacia la automatización. El impulso se originó tras el desarrollo de estos equipos a solicitud del Blood Transfusion Service (ahora National Blood Authority) para examinar las donaciones de sangre para una gama limitada pero en aumento constante de infecciones víricas transmitidas por la sangre. Primero se empleó el antígeno HBs en el decenio de 1970, después siguió el anti-HIV en 1984, el anti-CMV selectivo en 1980 y el anti-HCV en 1991. La gran expansión de la gama de IEE comerciales en el decenio de 1980 amplió el

uso de protocolos estándar e impulsó la fabricación de sistemas automatizados. Sólo hasta comienzos de la década de 1990 se desarrolló un equipo ideado de modo específico para el laboratorio de virología diagnóstica. En la actualidad se halla en el repertorio de estas máquinas automatizadas una amplia variedad de pruebas diagnósticas. En términos generales, los métodos disponibles se basan en la técnica de IEE. Los primeros sistemas se desarrollaron para las pruebas de examen solicitadas con más frecuencia, es decir, antígeno de HBs, anti-HBs, IgG de la rubeola y antígeno de Chlamydia trachomatis. Después de la dificultad inicial para comercializar los equipos automatizados en los primeros años del decenio de 1990, el mercado adquirió estabilidad en la época actual. Ahora se han identificado diferentes clases de máquinas y el tipo de carga de trabajo más apropiado para cada clase de instrumento. Las definiciones básicas del tipo de automatización se discuten a continuación. Procesador de líquidos (PL) Un PL completa la preparación de una microplaca que contiene muestras diluidas de forma apropiada y controles específicos de la prueba mediante una hoja de trabajo para identificar las muestras y los protocolos específicos para la prueba requerida; asimismo, completa la separación del suero a partir de un coágulo de sangre y de ese modo prepara un almacén de suero a partir de las muestras de sangre recibidas. Procesador automatizado de IEE Un procesador automatizado de IEE completa un IEE con tan sólo el suministro de las muestras y los reactivos

The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker. © 2005 John Wiley & Sons, Ltd.

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PRUEBAS AUTOMATIZADAS EN VIROLOGÍA

específicos para esa prueba; además, termina un IEE con la simple adición de una microplaca que contiene muestras correctamente diluidas y los reactivos específicos para esa prueba. En consecuencia, el equipo puede subdividirse en las siguientes clases: • Acceso aleatorio/comprobación por lote. Por lo general, los procesadores de IEE se diseñan para pruebas específicas sobre muestras que se acumulan como un lote y se identifican con una hoja de trabajo específica. Algunos procesadores son también capaces de analizar pruebas de muestras únicas para satisfacer la respuesta a la demanda clínica urgente. Estas pruebas únicas requieren calibradores de control para la prueba, además de la muestra para la prueba. Es posible interrumpir la prueba para procesar una muestra urgente o puede introducirse en un momento conveniente entre los lotes de otras pruebas. Estas máquinas de acceso aleatorio requieren módulos de la prueba específicos del fabricante o el uso de controles permanentes sobre el tablero para operar la prueba.

• Formato con tubo único/formato con microplaca. Algunos procesadores llevan a cabo un muestreo directo del tubo y realizan todas las operaciones subsecuentes como pruebas únicas del tubo, por ejemplo los equipos VIDAS, E7001. Otros procesadores aceptan muestras únicas del tubo, pero preparan la prueba con microplacas. Este formato de la placa puede ser específico del fabricante o aceptar cualquier microplaca basada en IEE de uso estándar. • Sistema de prueba específico del fabricante/método de microplaca estándar. El sistema de procesamiento del fabricante es único y el uso del procesador impone la necesidad de utilizar los equipos del fabricante, por ejemplo VIDAS, AXSYM, PRISM. Se han diseñado otros procesadores para analizar cualquier IEE basado en microplaca y la elección depende del laboratorio y de las características de ejecución de la prueba. En el cuadro 21-1 se proporcionan algunos ejemplos del equipo actual disponibles de cada clase.

Cuadro 21-1 ¿Qué equipo automatizado es más apropiado? Tipo de máquina

Ventajas

Desventajas

Acceso aleatorio: pruebas específicas del fabricante

Comprobación rápida de muestras únicas Requiere un grupo completo de muestras control una vez/mes No requiere grupo completo de control para cada prueba, usa calibradores Gama amplia de pruebas disponibles que cubren varias disciplinas Compartir costos con otros usuarios de la máquina (bioquímica, inmunología)

El rendimiento diario puede ser pequeño, p. ej., 300/día El rendimiento del laboratorio total en un día de trabajo normal puede ser >400 muestras Recargo pagado para el mismo proveedor comercial único de los módulos y el equipo de prueba Pueden estar disponibles márgenes limitados de pruebas para enfermedades infecciosas Si se usa como una instalación de laboratorio central, ¿pueden interrumpirse en realidad las pruebas actuales?

Comprobación por lote: sistema basado en dos o tres microplacas

También puede incluir la omisión de la muestra Pueda ser capaz de procesar cualquier sistema basado en microplacas

Deben ser pruebas específicas del fabricante, p. ej., AXSYM (quimioluminiscencia). ¿Está disponible una gama completa de pruebas para enfermedades infecciosas? Puede procesar sólo tres lotes en un día normal de trabajo Puede requerirse la planificación cuidadosa del procesamiento de la prueba

Sistema basado en microplacas de acceso abierto

Usa cualquier prueba de placa de microtitulación basado en IEE Puede aceptar la placa de la próxima prueba en cualquier momento

Puede ser necesario separar la muestra que dispensa el equipo

Sistema que no requiere muestra

Permite la manipulación de pruebas no marcadas o vinculadas Puede usarse para otros propósitos, como alícuotas de la muestra para almacenar suero en recipientes/microplacas, CFT, SRH

Los costos pueden incrementarse

AUTOMATIZACIÓN EN EL LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO

Automatización en el laboratorio de diagnóstico Para discutir este asunto es necesario considerar las siguientes presuposiciones: en primer lugar, el laboratorio utiliza un programa de diagnóstico para procesar la base de datos de los pacientes; en segundo lugar, se identifican mediante un sistema de código de barras las etiquetas que se aplican a la solicitud, el tubo de sangre primario y la muestra de suero archivada, y en tercer lugar, el laboratorio emplea un sistema automatizado que comprende un PL y un procesador de IEE basado en microplaca. Luego de la recepción de la muestra y el formato de solicitud en el laboratorio, muchas veces las primeras dos etapas del procesamiento ocurren de forma simultánea. Hojas de trabajo Se ordena una serie de pruebas en conformidad con los detalles clínicos y la fecha de inicio anotados en el formato de solicitud. Este grupo de pruebas se almacena en la computadora y ello conduce a la creación de hojas de trabajo específicas de la prueba, las cuales pueden cancelarse cuando sea necesario de acuerdo con la hoja de planificación diaria del sistema automatizado. Separación del suero Después de centrifugar el tubo primario con la sangre, para centrifugar el coágulo de sangre, el suero se separa por PL o de forma manual en un tubo de almacenamiento, que se etiqueta con la misma identificación de código de barras que el tubo primario con la sangre. Preparación de las microplacas para el ensayo Si un sistema de acceso aleatorio se halla en uso, entonces el recipiente del almacenamiento con el suero se carga directamente en el sistema con las diluciones requeridas que efectúa la máquina. El PL debe ser capaz de identificar los tubos con la muestra o los tubos primarios con sangre en estantes o carruseles. Verifica que todas las muestras en la hoja de trabajo actual estén presentes y luego lleva a cabo las diluciones apropiadas del suero en las celdillas, según el protocolo específico. La placa se identifica con un código de barras para permitir la identificación positiva y la selección del protocolo correcto por el programa. Esto permite a la computadora ordenar los reactivos apropiados para el IEE específico. Debe también agregar los estándares apropiados, los suministrados por los fabricantes y el laboratorio

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en las muestras internas, y las muestras de calibración cuando sea necesario para permitir el control de calidad (QC) de la práctica de la prueba. Estas muestras de QC se distribuyen en las celdillas designadas en el protocolo. El sistema indica si en una muestra no se recolectó el líquido. Procesador IEE La placa se identifica con un código de barras y el programa reconoce la hoja de trabajo y el protocolo correctos correspondientes a esa práctica específica de la prueba. La máquina revisa la colocación exacta de los reactivos solicitados para el IEE en el sistema y se verifican los volúmenes de estos reactivos con base en el peso. La comprobación incluye la solución amortiguadora de lavado y los reactivos de la prueba y verifica que el volumen del recipiente de desechos es suficiente. El primer paso, que es parte del control de calidad que vigila el sistema, consiste en tomar una lectura espectrofotométrica de la placa para comprobar que se agregó una muestra a cada una de las celdillas previstas. Una lectura discrepante de la densidad óptica (DO) identifica el punto donde no hay muestra. El procesador activa al IEE y a continuación el protocolo se almacena en el programa. Si un sistema de acceso abierto se halla en función, el procesador recalcula los espacios de tiempo para los análisis en proceso y el ajuste en la nueva placa para procesar cuanto antes. El tiempo de inicio aparece junto con una advertencia, si el retraso antes del análisis excede el lapso predefinido por el sistema. Por lo general se evitan los IEE que utilizan incubaciones a temperatura ambiente porque, aunque los periodos de la incubación suelen ser más largos que los de las incubaciones a 37°C, las primeras reacciones de la incubación comienzan inmediatamente después que la muestra diluida se distribuye en las celdillas. Las incubaciones a 37 o 40°C permiten un tiempo de inicio determinado, lo cual es necesario para las máquinas de acceso abierto. El protocolo del IEE debe incluir la vigilancia después de cada paso que requiera la adición de reactivos líquidos y también la revisión de las cabezas de lavado después de cada operación para constatar que todas las celdillas se lavaron de modo apropiado. Debe mostrar la lectura a partir de la vigilancia de cada adición líquida cuando el IEE continúa y cualquier error detectado se señala de inmediato. Si una máquina de acceso abierto se encuentra en uso, cada serie de reactivos de la prueba debe añadirse cuando lo requiera el procesador. Procesamiento de los datos Las lecturas finales de la DO, tomadas al término del ensayo, se envían de forma automática al programa del sistema para el procesamiento que realiza el paquete de reducción de datos. Este paquete requiere, según sea el tipo de prueba,

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CAP. 21

PRUEBAS AUTOMATIZADAS EN VIROLOGÍA

calcular el valor de intercepción a partir de los controles y aplicarlo a los valores de la DO de la muestra; en este caso, los resultados se expresan como positivos, negativos o ambiguos para cada muestra; asimismo, debe generar una curva estándar a partir de los controles y aplicarla a las lecturas de la muestra; esta vez los resultados para las muestras se expresan como unidades/ml. El programa también constata que los calibradores y los estándares del fabricante incluidos en el examen se hallen en los límites permitidos y que no hay indicadores de cualquier discrepancia. Si los calibradores tienen valores aceptables, los valores estándar almacenados se aplican a la DO de las muestras para el examen de la prueba. Después de la validación de los resultados que presenta el técnico experimentado, éstos se transfieren de manera automática a la hoja de trabajo. Ésta se puede imprimir para almacenar la copia dura, que contiene toda la información necesaria para rastrear los detalles de la prueba si se descubre más adelante cualquier problema. Estos pormenores incluyen la placa del análisis y los reactivos relacionados, tipo, número de lote, fecha de caducidad de la placa y reactivos, fecha de la prueba, solicitante de la hoja de trabajo, operador del método y verificador de los resultados. A partir de la hoja de trabajo, los resultados se transfieren por medios electrónicos a los registros individuales de los pacientes en la base de datos del laboratorio. El programa también verifica el control de calidad interno exigido (sistema de control del proceso) en la prueba mediante lo siguiente: a) anotación de los 20 promedios registrados para las muestras de control y marcación de cualquier resultado discrepante y b) proyección de las gráficas de Shewhart (Costongs et al., 1995) con los nuevos resultados del control. A continuación se aplican las reglas de Westgard seleccionadas para verificar que la prueba es válida y puede proporcionarse. Cualquier resultado fuera de los límites de estos criterios activa a los indicadores para realizar una acción inmediata. En la evaluación microbiológica realizada en los laboratorios de comprobación de los NBS Centres puede revisarse un modelo en el cual este procesamiento automatizado y el control de proceso alcanzan un valor muy alto de aseguramiento de la calidad. Estos 10 centros procesan un total aproximado de 10 000 donaciones por día en la evaluación automatizada para HBsAg, anti-HCV y anti-HIV. Todos los reactivos de la prueba deben vigilar la adición de la muestra, con una revisión positiva en cada adición del reactivo como ideal. El índice de error del proceso es menor de 0.1%. Los resultados de la determinación se emiten directamente en el sistema IT nacional alrededor de las 2 pm un día después de la colección, para la publicación de los componentes producidos de la donación de sangre. Estos laboratorios se ajustan a la General Manufacturing Practice y se revisan con regularidad.

¿Debe automatizarse el laboratorio? Las consideraciones anteriores describen la operación de un sistema automatizado dentro del laboratorio. Antes de ello debe tomarse la decisión de adoptar un sistema automatizado para la prueba de IEE. El trabajo preparatorio para alcanzar esta decisión es considerable e incluye varios pasos analíticos. También supone cambios relevantes en los patrones de trabajo del laboratorio y el personal debe intervenir en el desarrollo de este proyecto para adquirir nuevas formas de trabajo. La próxima sección describe algunos de los factores importantes que deben tomarse en cuenta durante este proceso de revisión. Análisis del laboratorio actual Esto incluye pormenorizar la gama de virus, tipos y cantidad de pruebas que realiza el laboratorio y revisar los tiempos de respuesta reales de los resultados requeridos por la suscripción de un contratado. ¿Hay lugar para que la adopción del sistema satisfaga las demandas clínicas con resultados más oportunos?, ¿la comprobación por acceso aleatorio es una opción realista para una pequeña cantidad de cualquier prueba que se realiza por lote para una o dos pruebas a la semana? Si se identifican los volúmenes grandes de algunos análisis de evaluación, ¿se basan estas pruebas en IEE y, si no es así, puede ajustarse la prueba con éxito a IEE sin pérdida de la calidad y quizás con meComprobación antígeno/anticuerpo

Sistema basado en IEE NO

SÍ

¿Es posible adoptar las pruebas IEE? AUTOMATIZAR

SÍ

NO

¿Cómo puede hacerse?

Figura 21-1 Diagrama de flujo de la automatización.

jor sensibilidad y especificidad (fig. 21-1)? Debe decidirse cómo tratar por lotes las pruebas de evaluación regulares para una o dos pruebas al día (unas 30 pruebas es habitualmente el número mínimo por lote por razones económicas); ¿se necesita un procesamiento diario?, ¿se trata de un servicio que proporciona el resultado el mismo día? Hay que definir también los requerimientos para una comprobación externa urgente o en la guardia y calcular cuántas pruebas pueden incluirse en un procesamiento normal sin que se retrase demasiado el resultado (fig. 21-2).

211

¿DEBE AUTOMATIZARSE EL LABORATORIO?

¿Usa en la actualidad el equipo para líquidos en otras pruebas o produce alícuotas séricas?

SÍ

NO

¿Cuántas pruebas de IEE o placas se procesan/día?

9 placas Usa procesador de acceso abierto basado en microplacas

10% son promielocitos para PMN (con frecuencia displásica), 20% de células de la línea mieloide son de linaje monocítico. Además, >5 000/␮L células monocíticas en sangre periférica Como el anterior, con ⱖ5% de eosinófilos anormales que pueden tener núcleos no segmentados y gránulos eosinofílicos y basofílicos grandes >80% de células de la línea mieloide son monoblastos, promonocitos o monocitos; en M5a, 80% de células de la línea mieloide son monoblastos; en M5b, 1 ⫻ 109/L. Los monocitos son a menudo anormales en la morfología. Las características displásicas relacionadas están también presentes en los eritrocitos y en otros leucocitos. Figura 26-21 Leucemia mieloide crónica.

Los neutrófilos muestran un cambio a la izquierda con granulación tóxica. Algunos mielocitos circulantes y mieloblastos ocasionales también pueden observarse. La médula muestra una hiperplasia mieloide con predominancia de promielocitos y mielocitos. El cuadro global suele, en casos graves, asemejarse a un proceso leucémico, que a veces se denomina “reacción leucemoide”. Los antecedentes clínicos del paciente, inmunofenotipificación, estudios cromosómicos y estudios de clonalidad son necesarios para separar esta condición de la leucemia. Estados mielodisplásicos Este grupo heterogéneo de desórdenes se menciona antes (véase pág. 257). Los estados mielodisplásicos graves, en

Megacariocitos y desórdenes plaquetarios Trombocitopenia Una cuenta plaquetaria baja < 150 ⫻ 109/L puede ocurrir por un consumo periférico intenso (inmunitario o no inmunitario) o por una producción medular reducida de plaquetas, es decir, aplasia medular o infiltración. En la púrpura trombocitopénica idiopática (IT), los anticuerpos antiplaquetarios causan una destrucción reticuloendotelial incrementada de plaquetas. En ITP u otros estados físicos, la médula ósea muestra un número normal a un incremento de megacariocitos. Los desórdenes en la producción plaquetaria se diagnostican mejor con la prueba ósea. Aquí los megacariocitos pueden estar ausentes, reducidos, o mostrar morfología displásica. El aspirado de médula ósea también muestra la presencia de una infiltración anormal.

261

EXAMEN Y MORFOLOGÍA DE LA MÉDULA ÓSEA

Trombocitosis Una cuenta plaquetaria persistente elevada sobre 1 000 ⫻ 109/L ocurre en la trombocitemia esencial (ET), una enfermedad mieloproliferativa que implica un predominio del linaje megacariocítico. La presencia de plaquetas grandes o incluso de fragmentos megacariocíticos es también una característica de este desorden. La aspiración de la médula ósea puede ser difícil, pues suele coagularse con facilidad antes de separarse. La biopsia de la médula ósea muestra hipercelularidad con un aumento visible en la cuenta de megacariocitos, con frecuencia atípicos en la morfología medular ósea. También es común un aumento relacionado con la reticulina o la fibrosis medular. La trombocitosis reactiva (por infección o inflamación) suele producir, a veces, un cuadro similar y, ocasionalmente, dificultad para diferenciarla de la trombocitemia esencial sólo por la morfología (véase fig. 26-17).

Desórdenes comunes que afectan el linaje de los linfocitos y de las células plasmáticas Leucemia linfoblástica aguda (ALL) Es una enfermedad neoplásica monoclonal que surge de los precursores linfoblásticos de los linfocitos. Explica cerca de 85% de todas las leucemias agudas por abajo de los 16 años. Los linfoblastos anormales permanecen con frecuencia presentes en la sangre periférica relacionada con anemia y con una cuenta plaquetaria baja. La médula ósea muestra infiltración anormal con linfoblastos que tienen un cociente citoplásmico nuclear más alto que un mieloblasto típico. El grupo FAB clasifica la leucemia linfoblástica aguda en tres subtipos morfológicos (cuadro 26-6). Una distinción morfológica pura entre un linfoblasto y un mieloblasto indiferenciado puede ser difícil en algunos casos. La citometría de flujo y las tinciones especiales son muy útiles en esta situación (véanse cuadro 26-5 y fig. 26-22).

Linfocitos, células plasmáticas y sus desórdenes La variación morfológica en linfocitos y en células plasmáticas cubre una gama mucho más amplia que entre los granulocitos. En las infecciones, en particular infecciones virales, los linfocitos muestran características de activación o inmunoblásticas, con basofilia citoplásmica y el aspecto de nucleolos. Los niños tienen con frecuencia linfocitosis relativa, que disminuye con la edad. Las células plasmáticas tienen un típico citoplasma basofílico más abundante, con un núcleo excéntrico que muestra una cromatina agrupada (con aspecto de “cara de reloj”). La inclusión citoplásmica de inmunoglobulinas puede verse en algunas ocasiones.

Cuadro 26-6

Figura 26-22 Leucemia linfocítica aguda.

Clasificación FAB de la leucemia linfocítica aguda

Citología

L1

L2

L3

Tamaño de la célula Cromatina nuclear Forma nuclear Nucleolos Citoplasma Basofilia citoplásmica Incidencia en niños Incidencia en adultos Marcadores inmunológicos

Pequeño Homogénea Regular Raros Escaso Moderada 85% 35% B temprano o T tímico

Grande Inconstante Irregular Presentes Moderado Inconstante 13% 63% B temprano o T tímico

Grande, homogéneo Finamente revestida De oval a redonda 1a3 Moderado, vacuolado Intensa 2% 2% B diferenciado (SIg positivo), leucemia/linfoma tipo Burkitt

262

CAP. 26

MORFOLOGÍA DE LAS CÉLULAS SANGUÍNEAS Y DE LA MÉDULA ÓSEA

Leucemia linfocítica crónica (CLL) La enfermedad es rara antes que el individuo llegue a una edad media; su incidencia aumenta con la edad. Es típico que se presente con linfocitosis periférica, linfadenopatía y hepatoesplenomegalia. La sangre periférica y la médula ósea muestran muchos linfocitos pequeños que parecen maduros y monomórficos. Es una característica que células en forma de mancha se encuentren presentes en este desorden. Las células de la CLL tienen también un perfil inmunofenotípico distintivo (fig. 26-23).

Figura 26-24 Células de carcinoma metastásico.

Figura 26-23 Leucemia linfocítica crónica.

Mieloma Es una enfermedad que se caracteriza por el crecimiento clonal y neoplásico de las células plasmáticas. Los pacientes se presentan con paraproteína, hipercalcemia, lesiones óseas líticas, anemia e insuficiencia renal. La médula ósea, que es diagnóstica, muestra la presencia de células plasmáticas anormales en una proporción grande (>30%) (véase fig. 26-8).

Figura 26-25 Parásitos del paludismo en sangre.

Linfomas Los linfomas son un grupo complejo, heterogéneo, de enfermedades neoplásicas clonales que surgen de los ganglios linfáticos, pero que involucran a la sangre periférica o a la médula ósea. El linfoma es una enfermedad con muchos subtipos. Las células neoplásicas pueden ser pequeñas y parecer similares a linfocitos pequeños (linfoma de grado bajo). Por otra parte, algunas células del linfoma tienen morfología similar a la de un blasto, grande, muy inmaduro (linfoma de grado alto). La enfermedad de Hodgkin (HD), la que se clasifica como un tipo de linfoma, se caracteriza por la presencia de las células de Reed-Sternberg.

Figura 26-26 Microfilaria en sangre.

LECTURAS ADICIONALES

263

especial en presencia de un cuadro sanguíneo leucoeritroblástico (fig. 26-24). Los parásitos del paludismo se detectan mejor en un frotis de sangre periférica. El parásito microfilaria también puede encontrarse en ella, aunque es poco frecuente (figs. 26-25 y 26-26). La especialización y la confianza en la morfología celular se adquieren con la práctica. Para una revisión más exhaustiva en este tema, véase Hayhoe y Flemans, 1992.

Lecturas adicionales

Figura 26-27 Sideroblastos.

Células no hematopoyéticas y parásitos en sangre y médula ósea Un aspirado y una biopsia de la médula ósea es una prueba útil para detectar células metastásicas de carcinoma, en

Bennet JM, Catovsky D, Daniel MT et al. Proposal for classification of myelodysplastic syndrome. Br J Haematol 1982; 51: 189. Bennet JM, Cartovsky D, Daniel MT et al. Proposal for classification of acute leukaemia. Br J Haematol 1976; 33: 451. Hayhoe FGJ, Flemans RJ. A Colour Atlas of Haematological Cytology, 3rd edn. 1992: Wolfe, London. Holtbrand AV. Pettit JE. Clinical Haematology, 2nd edn. 1994: Sandoz Atlas, London.

27 Principios de los contadores automatizados de células sanguíneas Graham Martin

Introducción

3. Cuantificación de los reticulocitos y de los RBC nucleados. 4. Cuantificación de los leucocitos (WBC).

El conteo sanguíneo completo (FBC) hace grandes progresos a partir de una simple medición de hemoglobina y de componentes celulares en la sangre periférica. El desarrollo y la adaptación de diversas tecnologías ha generado una gran variedad de parámetros celulares, algunos muy útiles; otros todavía tienen que demostrar su valor. En paralelo a la tecnología de medición, se han desarrollado instrumentos automáticos que pueden analizar cantidades muy pequeñas de sangre usando el muestreo del tubo cerrado y tener rendimientos muy altos. Numerosas mediciones que se obtienen por instrumentos automáticos y semiautomáticos son principalmente modificaciones de las técnicas manuales originales; sin embargo, existen varias aplicaciones interesantes de las nuevas tecnologías. Estos instrumentos son precisos y exactos, y las mediciones son reproducibles. Hay diferentes fabricantes de instrumentos que emplean tecnologías y sistemas de medición similares que evalúan el mismo parámetro con ligeras variantes. Existen ventajas y desventajas en todos los sistemas y podría argumentarse que un grupo de problemas puede intercambiarse por otro. En este capítulo se propone revisar las diferentes tecnologías y sus principios de operación. Los principales parámetros son: 1. Cuantificación de la hemoglobina (Hb). 2. Cuantificación de los eritrocitos (RBC).

5. Cuantificación plaquetaria.

Medición de la Hb La medición de la Hb (fig. 27-1) se basa en la relación lineal entre la cantidad de luz que se absorbe en una banda de absorción particular y la concentración de la entidad de absorción en la muestra (ley de Beer) (Skoog DA, West DM, 1965). La mayor parte de los contadores automáticos emplea el método de cianometahemoglobina que lee la absorbancia a longitudes de onda de 525 o 540 nm. Los sistemas Sysmex utilizan lauril sulfato de sodio, con la ventaja de que se elimina el cianuro en los desechos del analizador.

Mediciones de los eritrocitos Los eritrocitos pueden contarse con la impedancia de la abertura, técnicas que dispersan la luz, usando láser LED o tungsteno o una combinación de las dos tecnologías. Impedancia de la abertura Esta técnica la patentó, en 1956, Wallace Coulter y se conoce como el principio de Coulter (fig. 27-2). Se utiliza

The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker. © 2005 John Wiley & Sons, Ltd.

266

CAP. 27

PRINCIPIOS DE LOS CONTADORES AUTOMATIZADOS DE CÉLULAS SANGUÍNEAS

Amplificador

Derivación de la Hb

C Bath

Absorbancia = log10 (VR/Vs), donde VR = el voltaje de referencia y Vs = el voltaje de la muestra

Fuente de luz (láser, LED o tungsteno)

Muestra

el cambio en la resistencia crea un solo pulso alto o un pulso de doble pico. Las correcciones estadísticas se aplican en el software del analizador para corregir esto. Para evitar la recirculación de células alrededor de la abertura, que produzcan mediciones falsas de cantidades y de volumen, las células se inyectan de manera convencional en el compartimiento de la abertura justo en el centro de una corriente de un fluido envolvente o, una vez contadas, se remueven de la zona de detección con un líquido de arrastre.

Detector

Figura 27-1 Cuantificación de Hb.

para contar RBC, WBC y plaquetas. Un flujo de corriente eléctrica se establece a través de una abertura de dimensiones conocidas. Cuando una célula o una partícula pasa a través de la abertura, la célula o la partícula impide el flujo de la corriente y causa un impulso en el voltaje. El voltaje primero se eleva y después cae por debajo de cierto umbral, indicando que una célula o una partícula pasa por la zona de detección. Las células y las partículas se cuentan registrando el número de pulsos de voltaje que ocurren durante un intervalo de medición específico. El volumen celular se determina midiendo la magnitud del pulso que se genera. Se fijan los umbrales o entradas electrónicas, permitiendo al analizador discriminar los pulsos de Cuantificaciones de los eritrocitos de los pulsos más pequeños de las plaquetas, detritus y del ruido eléctrico. Coincidencia La inexactitud puede introducirse por coincidencia. Si dos o más células entran en la abertura de la zona de detección,

Técnicas de dispersión de luz Con la dispersión de luz se estima el tamaño aproximado de la célula con base en la dispersión frontal, la cual es sobre todo una medida más del diámetro transversal. La cantidad de luz que se dispersa es proporcional al área superficial y, por tanto, al volumen de la célula. Los láser tienen características ópticas superiores, al compararse con las fuentes luminosas de tungsteno, y pueden colocarse detectores para recolectar la luz frontal dispersada en ángulo amplio y estrecho (fig. 27-3). La luz láser se utiliza para medir el volumen y la concentración celular de la Hb en los instrumentos Bayer. La cantidad de luz dispersada en ángulo bajo (2 a 3°) depende del tamaño del RBC, y la cantidad dispersada en ángulo alto (5 a 15°) se relaciona con el índice de refracción de la célula. De la manera como se proyecten hacia el láser, las células no esféricas como plaquetas y las cuantificaciones de los eritrocitos pueden dar señales muy diferentes hacia los detectores. Bayer ha superado este problema con una técnica que se conoce como generación de esfera isovolumétrica. El dodecil sulfato de sodio y el

Figura 27-2 Principio de Coulter.

267

MEDICIÓN DE LOS RETICULOCITOS Y RBC NUCLEADOS

Figura 27-3 Sistema óptico de dispersión de luz láser usado por los instrumentos Sysmex.

glutaraldehído en el reactivo para el eritrocito producen fijación parcial y la formación esférica a partir de los eritrocitos y de las plaquetas, eliminando resultados erróneos. ¿Permite esto medir con exactitud el porcentaje de las células hipocrómicas?; no sólo eso, ha demostrado ser un parámetro útil para perfeccionar la terapia con eritropoyetina y hierro (Richardson, et al., 2001).

Medición de los reticulocitos y RBC nucleados Conteo de los reticulocitos Todos los fabricantes de contadores celulares proporcionan el análisis del reticulocito en sus instrumentos. Algunos sistemas miden reticulocitos y los parámetros relacionados usando los colorantes fluorescentes para ácido ribonucleico con luz láser (referencias de ALM en Hp90 Takubo et al., 1989; Tichelli et al., 1990; Davis et al., 1996; Kim et al., 2003). Otros sistemas utilizan colorantes básicos supravitales que producen precipitación y coloración de la sustancia reticular, la cual se mide, en este caso, por absorbancia y dispersión de la luz (referencias de ALM en Hp90 Buttarello et al., 1995, 1996, 1997; Van den Bossche J et al., 2001; Rudenski, 1997; Wysocka J, Turowski D, 2000).

Cuadro 27-1 Técnicas de conteo de reticulocitos

Compañía Analizador

Método

Tinción del RNA

Abbott

Cell-Dyn 4000 + Fluorescencia CD4K530 Sapphire ABX ABX Pentra 120 Fluorescencia Naranja de tiazol Bayer ADVIA 120 + Dispersión y Oxacina 750 2120 absorción en células de luz esféricas Beckman GEN-S + Dispersión Nuevo azul Coulter LH750 de luz de metileno en células esféricas Sysmex XE 2100 Fluorescencia Auramina O

Resumen de los métodos actuales utilizados en los analizadores También es posible medir la madurez del reticulocito, debido al hecho de que los reticulocitos inmaduros tienen una proporción más grande de RNA, y por tanto, se tiñen con más intensidad o reflejan una fluorescencia mayor. La dispersión de la luz monocromática mide el volumen graficado contra la absorción y se usa en el Advia para proporcionar un índice de la maduración del reticulocito y su contenido de Hb.

268

CAP. 27

PRINCIPIOS DE LOS CONTADORES AUTOMATIZADOS DE CÉLULAS SANGUÍNEAS

Eritrocitos nucleados Los fabricantes del instrumento adoptan aproximaciones que difieren para distinguir a los RBC nucleados. Los núcleos se cuentan usando combinaciones de dispersión de la luz e impedancia después de que el citoplasma del RBC ha sido eliminado (Beckman Coulter). El conteo se hace en el canal de WBC y el WBC total se corrige por la presencia de NuRBC. En los analizadores Sysmex, las cuentas de NuRBC se determinan por medio de citometría de flujo y

Cuadro 27-2

luz láser. La muestra se aspira y se mezcla con una tinción para RNA/DNA. En el conteo NucRBC usa fluorescencia lateral, dando información del RNA/DNA y de la dispersión frontal, una medida del tamaño celular. En los analizadores la cuenta de NucRBC se expresa con NucRBC/100 WBC, a partir de la fórmula:

%NucRBC=

NucRBC ⫻ 100 NucRBC ⫹ WBC

Tecnologías de los analizadores comunes

Compañía

Analizador

Tecnología

Abbott

Cell-Dyn 3500

ABX

Cell-Dyn 4000 + Sapphire Pentra 60

Dispersión frontal de la luz Dispersión de la luz en ángulo estrecho Dispersión ortogonal de la luz Dispersión de luz polarizada Todo lo anterior, más cuenta de RBC posterior a la unión con el colorante fluorescente Citoquímica Impedancia por flujo enfocado Absorbancia de luz Citometría de flujo Citoquímica Impedancia-citometría de flujo enfocada y absorbancia Absorción de luz posterior a la tinción de los eosinófilos Impedancia posterior al desprendimiento preferencial del citoplasma de los basófilos a un pH bajo Láser ion-argón Citoquímica Impedancia por flujo enfocado Absorbancia de luz Citometría de flujo Dispersión de la luz posterior a la reacción de la peroxidasa Absorbancia de luz posterior a la reacción de la peroxidasa Dispersión de la luz posterior al desprendimiento del citoplasma de las células, excepto basófilos, por un agente lítico a un pH bajo Medición de la impedancia posterior a la lisis diferencial Mediciones de impedancia y absorbancia citoquímica Impedancia con corriente electromagnética de baja frecuencia Conductibilidad con corriente electromagnética de baja frecuencia Dispersión de luz láser Impedancia con corriente electromagnética de baja frecuencia Impedancia con corriente electromagnética de radiofrecuencia Impedancia con corriente electromagnética de baja frecuencia a pH bajo y pH alto Impedancia con corriente electromagnética de baja frecuencia Impedancia con corriente electromagnética de radiofrecuencia Dispersión frontal de la luz Dispersión lateral de la luz Intensidad de la reacción de fluorescencia posterior a la tinción fluorescente

Pentra 120 Retic

Bayer

Advia 60

ADVIA 120, 2120, H1, H2 y H3

Beckman Coulter

AcT 5diff GEN-S + LH750

Sysmex

SE 9000

XE 2100

MEDICIONES DE LOS LEUCOCITOS

269

Mediciones de los leucocitos Los leucocitos pueden contarse y diferenciarse dentro de un amplio número de categorías por diversas tecnologías. Existen ventajas y desventajas en todas. El desarrollo de sistemas de conteo basado en un líquido vehículo, que permite el pasaje de las células a través de la zona de detección, condujo al análisis multiparámetro en la misma célula combinando las señales de varios sensores. Según el fabricante, la zona de detección puede ser: óptica, de conductancia, de impedancia o una combinación de todas; y los sensores colocarse para observar la dispersión frontal de la luz, la dispersión lateral, la dispersión en ángulo estrecho o amplio, la dispersión de la luz polarizada o la fluorescencia. Las tecnologías de cada una de las aplicaciones de los instrumentos actuales se resumen en el cuadro 27-2. Impedancia de la abertura Al principio cuando el citoplasma es parcialmente eliminado en los leucocitos, la impedancia de la abertura (fig. 27-4), como se describió antes, dará una medición del tamaño NUM. Linfos Monos REL. 50-90 fl 90-160 fl

WBC 50

100

Granulocitos 160-450 fl

200

300

400

fl

Figura 27-4 Una presentación del histograma del canal 256 de la población celular de WBC entre 35 y 450 fl, usando sólo datos de impedancia de la abertura. Reproducida con el permiso de la compañía Beckman Coulter

del núcleo y de la granularidad citoplásmica. Usando este método sólo es posible cuantificar linfocitos, monocitos y granulocitos. Impedancia de la abertura y dispersión de luz Los instrumentos Beckman Coulter realizan la diferenciación de cinco poblaciones con tres mediciones simultáneas sobre cada célula: volumen (v), usando impedancia de la abertura estándar; conductividad (c), empleando ondas electromagnéticas de alta frecuencia; determinación de la complejidad celular y dispersión de luz (s), midiendo las características de la superficie celular y la lobularidad de cada célula (análisis VCS tridimensional grupal, fig. 27-5). Los algoritmos adaptables de análisis grupal desplazan en gran parte el uso temprano de discriminadores fijos

Figura 27-5 Análisis VCS tridimensional grupal. Reproducida con el permiso de la compañía Beckman Coulter.

como demarcadores entre poblaciones celulares. El desarrollo de sistemas de “asistencia diagnóstica” se considera como otra mejora en la capacidad del laboratorio para interpretar hallazgos diferenciales electrónicos. Ambos sistemas diferenciales de tres y cinco partes están provistos con algoritmos indicadores, alertando al usuario de posibles alteraciones morfológicas o de otro tipo, requiriendo la revisión de los datos o de alguna otra forma de intervención, como una revisión de la morfología. Citometría de flujo y dispersión de luz Los conteos de WBC y los diferenciales en los instrumentos Sysmex XE se determinan usando citometría de flujo combinada con un láser semiconductor. Se obtiene información celular usando la dispersión de luz frontal para determinar el volumen celular; la dispersión de luz lateral para evaluar la estructura interna de la célula, y la luz fluorescente lateral para dar información sobre los ácidos nucleicos RNA/DNA. Aspirando la muestra de sangre en seis canales separados con diferentes reactivos, puede aplicarse un análisis complejo del grupo para separar todas las variantes normales y anormales de la célula. Los algoritmos de aprendizaje competitivos permiten la adaptación óptima a las diferencias biológicas entre las muestras, incluyendo las células extremadamente alteradas. El colorante polimetina se combina con los ácidos nucleicos (DNA y RNA nucleares y en organelos citoplásmicos). El Sysmex XE tiene la capacidad de contar reticulocitos,

270

CAP. 27

PRINCIPIOS DE LOS CONTADORES AUTOMATIZADOS DE CÉLULAS SANGUÍNEAS

Figura 27-6 La dispersión frontal se grafica contra la dispersión lateral. Reproducida con el permiso de Sysmex UK Ltd.

de reconocer las plaquetas que contienen RNA, de reconocer y de contar los RBC nucleados y de distinguir células con características de células progenitoras hematopoyéticas (HPC), que pueden utilizarse para predecir un aumento de células CD34⫹. Citoquímica y dispersión de luz Las series de instrumentos de la compañía Bayer derivan un diferencial a partir de dos canales. El canal de la peroxidasa utiliza una reacción citoquímica en la cual la peroxidasa de neutrófilos, eosinófilos y monocitos actúa sobre un sustrato, 4-cloro-l-naftol, para generar una reacción que se transforma en un producto de color negro. La dispersión de luz, que es proporcional al tamaño de la célula, se grafica contra la absorbancia de la luz, que es proporcional a la intensidad de la reacción de la peroxidasa. Los neutrófilos, los eosinófilos, los monocitos y los linfocitos caen en cuatro grupos, separados por umbrales electrónicos. Debido a que los basófilos caen en la región del linfocito, se separan de otras células en un canal aparte con base en su resistencia a la eliminación ácida del citoplasma celular. Los basófilos que son más grandes que otras células se clasifican por dispersión frontal. Este canal también se emplea para detectar blastos. La dispersión frontal se grafica contra la dispersión de luz de ángulo alto para medir la densidad y la lobulación nuclear (fig. 27-6). Conteo plaquetario Desde que se identificaron a mediados del siglo xix como “el polvo sanguíneo”, las plaquetas han presentado un desa-

fío en términos de exactitud de las técnicas de conteo. Las terapias modernas requieren exactitud, no sólo en el rango clínico crítico, sino también en la capacidad para diferenciar eritrocitos pequeños y plaquetas grandes. Las plaquetas pueden contarse y clasificarse por tamaño con impedancia, la dispersión de la luz, una combinación de las dos y la citometría de flujo que usa la fluorescencia (fig. 27-7).

Impedancia Los instrumentos de la compañía Beckman Coulter utilizan impedancia para obtener una cuenta plaquetaria, que se deriva del número de células bajo la curva (fig. 27-8). Usando software apropiado para la curva, la exactitud de esta cuenta se mejora cuando las plaquetas presentes superan el volumen de los 20 femtolitros (fl). La cuenta plaquetaria fuera del límite de 35 ft se amplía hasta 70 fl.

Conteo plaquetario óptico La gama de instrumentos Advia de la compañía Bayer combina las señales de dispersión en ángulo alto (5 a 15°) y en ángulo bajo (2 a 3°) para cada célula. Éstas se transforman en volumen que se grafica sobre un eje vertical y los valores del índice de refracción sobre el eje horizontal para dar un citograma de la dispersión plaquetaria (fig. 27-9). Las líneas curvas representan una cuadrícula del índice de refracción variante a lo largo de la cual las plaquetas caen. También se grafica el índice de refracción contra el rango del volumen plaquetario, pueden separarse las macroplaquetas y los eritrocitos.

LECTURAS ADICIONALES

271

Figura 27-7 Fluorescencia graficada contra dispersión lateral. Reproducida con permiso de Sysmex UK Ltd.

Combinación de impedancia y conteo óptico

Cuenta de partícula RBC PLT

2

10

20

Volumen celular (fl)

Figura 27-8 Gráfica de Coulter que muestra la distribución del tamaño celular de las plaquetas (PLT) y de los eritrocitos (RBC).

La variedad de instrumentos Sysmex XE emplea un canal de impedancia cuando la cuenta y un canal de fluorescencia fallan en situaciones anormales. Las mediciones plaquetarias se realizan usando la dispersión frontal para determinar el tamaño, la dispersión lateral que considera la estructura interna y la fluorescente que mide los ácidos nucleicos RNA/DNA teñidos. Cuentas inmunoplaquetarias De esta manera por conteo óptico y por impedancia, el CellDyn 4000 y el Sapphire cuentan las plaquetas midiendo la fluorescencia verde del CD61. Un anticuerpo monoclonal, presente en uno de los reactivos, se une al antígeno CD61 localizado en todas las plaquetas normales. El isotiocianato de fluoresceína (FITC) es el colorante que se emplea, que fluorece cuando se excita a una longitud de onda de 488 nm. Esta técnica es útil cuando se observan una gran cantidad de fragmentos de RBC o de WBC.

Lecturas adicionales Figura 27-9 Citograma de la dispersión plaquetaria. 1, plaquetas; 2, plaquetas grandes; 3, RBC; 4, fragmentos RBC; 5. detritus; 6, fantasmas de eritrocitos. Reproducida con permiso de Bayer plc.

Buttarello M, Bulian P, Pra MD, Barbera P, Rizzotti P. Reticulocyte quantification by Coulter MAXM VCS (volume, conductivity, ligth scatter) technology. Clin Chem. 1996; 42 (12): 1930-1937.

272

CAP. 27

PRINCIPIOS DE LOS CONTADORES AUTOMATIZADOS DE CÉLULAS SANGUÍNEAS

Buttarello M, Bulian P, Temporin V, Rizzotti P. Sysmex SE-9000 hematology analyzer: performance evaluation on leukocyte differential counts using an NCCLS H20-A protocol. National Committee for Clinical Laboratory Standars. Am J Clin Pathol. 1997, 108 (6): 674-686. Buttarello M, Bulian P, Venudo A, Rizzotti P. Laboratory evaluation of the Miles H.3 automated reticulocyte counter. A comparative study with manual reference method and Sysmex R-1000. Arch Pathol Lab Med 1995; 119 (12): 1141-1148. Davis BH. Diagnostic utility of red cell flow cytometric analysis. Clin Lab Med 2001; 21 (4): 829-840. Kim YR, van’t Oever R, Landayan M, Bearden J. Automated red blood cell differential analysis on a multi-angle ligth scatter/fluorescence hematology analyser. Cytometry, 2003; 56B (1): 43-54. Richardson D, Bartlett C, Will EJ. Optimizing erythropoietin therapy in hemodialysis patients. Am J Kidney Dis 2001; 38 (1): 109-117.

Skoog DA, West DM. Analytical Chemistry. 1965: Holt, Reinhart and Winston. New York. pp. 451-455. Takubo T, Kitano K, Ikemoto T, Kikuchi T, Shimizu A. Ring eosinophils in patients with lowered eosinophill peroxidase activity, Article in Japanese. Rinsho Byori 1993; 41 (4): 468-470. Tichelli A, Gratwohl A, Driessen A, Mathys S, Pfefferkorn E, Regenass A, Schumacher P, Stebler C, Wernli M, Nissen C, et al. Evaluation of the Sysmex R-1000. An automated reticulocyte analyzer. Am J Clin Pathol 1990; 93 (1): 70-78. Van den Bossche J, Devreese K, Malfait R, Van de Vyvere M, De Schouwer P. Comparison of the reticulocyte mode of the Abx Pentra 120 Retic, Coulter General-S, Sysmex SE 9500, Abbott CD 4000 and Bayer Advia 120 haematology analysers in a simultaneous evaluation. Clin Lab Haematol 2001; 23 (6): 355-360. Wysocka J, Turowski D. New reticulocyte indices and their utility in hematologic diagnosis (Article in Polish). Pol Merkuriusz Lek 2000; 8 (49): 498-502.

28 Métodos para la identificación de hemoglobinopatías Nick Jackson y Anne Sermon

Introducción Las hemoglobinopatías y las talasemias son los trastornos genéticos heredados más comunes. Los defectos moleculares se localizan en los genes que codifican para la globina y afectan la síntesis de hemoglobina (Hb) en el eritrocito en desarrollo. Clínicamente se manifiestan como anemia hemolítica y la herencia es del tipo autosómica recesiva o codominante. Por lo general, las mutaciones que generan una hemoglobinopatía son diversas; el estudio y la caracterización del gen humano de la hemoglobina pueden utilizarse como ejemplo para mostrar la mayor parte de los tipos conocidos de mutación genética. Los defectos clínicos significativos se encuentran en los genes ␣ y ␤ (localizados en los cromosomas 16 y 11, respectivamente), pero las mutaciones que es posible identificar en cualesquiera de los genes que codifican para la globina generan alteraciones cualitativas y cuantitativas en la síntesis de Hb. Las hemoglobinopatías producen una variante de Hb estructural anormal; las talasemias surgen de una reducción en la tasa de síntesis en uno o más de los tipos de cadenas de globina. Las mutaciones puntuales que conducen a las sustituciones de aminoácido o a la terminación anormal de la transcripción del gen explican la mayor parte de los defectos del gen que codifica para la globina y son típicas de las hemoglobinopatías y de la ␤-talasemia. La supresión del gen es la causa común de la ␣- y ␦␤-talasemia. En la actualidad hay más de 1 000 variantes identificadas del gen para la globina, que pueden dividirse ampliamente dentro

de los grupos siguientes: a) clínicamente silenciosas (la mayor parte); b) hemoglobinas talasémicas; c) hemoglobinas inestables; d) hemoglobinas con afinidad alterada para el oxígeno; e) efectos atípicos diversos, por ejemplo, de la hemoglobina falciforme (HbS). La HbS es la variante clínica significativa más común de la Hb, y en el estado homocigótico (HbSS) o en combinación con la HbC o el rasgo ␤-talasemia produce problemas graves de salud. La isquemia del tejido, secundaria a la aglomeración de células falciformes aguda resulta en crisis dolorosas y con un potencial fatal. La HbS es la más común en las poblaciones oriundas del sub-Sahara, África, pero también se encuentra en gente de India, de Arabia Saudita y de la cuenca del Mediterráneo. Las talasemias se localizan en poblaciones de todas las áreas tropicales del mundo y del Mediterráneo. El tamizaje se dirige por lo general a aquellas poblaciones étnicas en riesgo de portar estos genes, pero con el aumento del mestizaje étnico el tamizaje puede llegar a aplicarse en forma universal para no omitir algunos casos o individuos portadores.

Técnicas de tamizaje La metodología actual de tamizaje permite la detección rápida y la identificación exacta de los trastornos clínicos significativos de la hemoglobina, así como sus estados heterocigóticos. Estas técnicas también son confiables para aplicarse en el tamizaje de recién nacidos en la detección de una enfermedad que no se sospecha, así como la condición del individuo portador. Es posible determinar el riesgo genético

The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker. © 2005 John Wiley & Sons, Ltd.

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CAP. 28

MÉTODOS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE HEMOGLOBINOPATÍAS

a través de la identificación de los portadores y ofrecer el diagnóstico prenatal del feto. Se establecen políticas en la mayor parte de los laboratorios para el tamizaje de adultos y recién nacidos. Las técnicas para el diagnóstico prenatal de fetos se basan en el análisis de DNA y es una aplicación común en centros nacionales de salud. Para una interpretación integral de los resultados del análisis de Hb en un individuo, la información siguiente debe estar disponible: edad, sexo, origen étnico, condición clínica actual (p. ej., si hay embarazo o no) y conteo sanguíneo completo (FBC). Para aquellos con microcitosis del eritrocito (MCV < 80 fl), una medida confiable del estado de hierro se requiere (p. ej., de la ferritina sérica) para excluir deficiencia de hierro. Las muestras de los pacientes señalados para el tamizaje deben entonces canalizarse a través de un protocolo flexible de las investigaciones de laboratorio, que puede incluir la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) o la electroforesis, la solubilidad falciforme y la medición de los niveles de HbA2 y de HbF. El diagnóstico de la mayor parte de los estados del portador común y de la enfermedad, es decir ␣- y ␤-talasemia, HbS, HbC, HbD y HbE, puede conseguirse comúnmente con la evaluación de estos parámetros. Los laboratorios que manejan una pequeña cantidad de muestras pueden utilizar la electroforesis de Hb y la estimación de HbA2 por microcolumna como sus herramientas primarias del tamizaje. Sin embargo, con políticas cada vez más amplias de tamizaje la mayor parte de los laboratorios ahora tamizan muestras por HPLC. La electroforesis de Hb y otras técnicas se utilizan para confirmar la identidad de las hemoglobinas variantes que se detectan por HPLC. La prueba de la solubilidad de la hemoglobina falciforme se emplea principalmente para la exclusión de los desórdenes de la célula falciforme antes de la cirugía de urgencia en las poblaciones en riesgo.

Diagnóstico de laboratorio de hemoglobinopatías y de talasemias Conteo sanguíneo completo, frotis sanguíneo y ferritina En la mayor parte de los estados de individuo portador con hemoglobinopatía estructural el FBC no muestra alteración, aunque el frotis sanguíneo muestre ciertas características (p. ej., las células “en diana” en los rasgos de HbC y de HbE). El punteado basofílico se halla en el rasgo ␤-talasemia y las células contraídas en forma irregular en el rasgo ␣-talasemia. Los índices de eritrocitos son indicadores importantes en la evaluación para el rasgo de talasemia, que se caracteriza por microcitosis y una Hb normal o casi normal. Un volumen celular medio (MCV) < 80 fl o una Hb celular media (MCH) < 27 pg indican una posible talasemia,

en particular cuando el recuento de RBC es normal o elevado (> 5 ⫻ 1012/L) y la ferritina sérica es normal (> 30 µg/L). Sin embargo, estos parámetros pueden mostrar una variación leve de un laboratorio a otro, según el método de medición automática y de los rangos normales que asigna el laboratorio. En el FBC de los pacientes que son sintomáticos (p. ej., la ␤-talasemia mayor, HbSS) se observan características de la anemia en grados variables y alteraciones morfológicas más graves de los eritrocitos. La policitemia suele encontrarse en los casos de hemoglobinas con afinidad elevada por el oxígeno.

Detección, identificación y cuantificación de hemoglobinopatías Los principios de la detección, identificación y cuantificación de hemoglobinas se basan en la separación física de las hemoglobinas en solución, dependiendo de su carga. Las sustituciones del aminoácido en la mayor parte de las variantes introducen un cambio en la carga superficial total esencial para su detección. Una limitación de estas técnicas, por tanto, ocurre porque las variantes de la Hb no pueden distinguirse de la HbA si tienen la misma carga superficial. Para la interpretación correcta de todas estas pruebas, es importante asegurarse de que la muestra no se obtenga en los tres meses posteriores a una transfusión sanguínea. Detección e identificación Electroforesis La metodología básica de tamizaje descansa en la migración de una molécula cargada (Hb) en un campo eléctrico hacia un cátodo o un ánodo. La fuerza y la polaridad de la carga se determinan por el pH del ambiente amortiguado. La tasa de migración la gobierna el tamaño del poro del medio de la matriz donde se realiza la electroforesis y la magnitud de la carga sobre la molécula. El acetato de celulosa es una matriz de uso general barato y con una vida útil indefinida; el agar es una alternativa muy empleada. El pH para el control preliminar es alcalino, fijo a un pH 8.4 a 8.9 con amortiguadores Tris-borato EDTA o Tris-barbitona. A este pH la mayor parte de las hemoglobinas tienen carga negativa y migran del cátodo hacia el ánodo. En estas condiciones, muchas variantes, aparte de la HbA, hacen visible la detección, es decir, son más obvias tiñéndolas con un colorante específico para proteína, por ejemplo, el Ponceau S o el negro de Amido. El patrón de migración, marcado por controles de referencia, puede entonces compararse con un mapa de variantes de hemoglobina para dar con la identificación probable. Las técnicas de pH fijas son

DETECCIÓN, IDENTIFICACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE HEMOGLOBINOPATÍAS

relativamente insensibles a la separación discreta de los grupos de variantes con cargas similares. A un pH de 8.4, dos grupos de las variantes comunes comigrantes: HbS, HbD y HbG; y HbC, HbE y HbO Arab. Esto hace imposible la distinción entre las variantes de hemoglobina de cada grupo sin investigación adicional. Un cambio diferencial en la carga, en las hemoglobinas, se induce cambiando el amortiguador a ácido (p. ej., a un pH de 6.3, en agar citrato), el cual altera la tasa y el patrón característico de migración. Las movilidades relativas de la variante Hb a un pH ácido y alcalino se refieren en forma cruzada sobre mapas de las hemoglobinas variantes y esto permite su identificación segura, por ejemplo, a un pH de 6.3, la HbC llega a diferenciarse de la HbE y de la HbO Arab, y HbS se separa de la HbD y de la HbG. La identidad de algunas variantes permanece sin resolver, y puede establecerse con análisis adicional por diversas técnicas, por ejemplo, el isoelectroenfoque (IEF) o HPLC. Algunos casos raros requieren la identificación de la mutación a nivel molecular.

Solubilidad de la hemoglobina falciforme La prueba de solubilidad de la hemoglobina falciforme es simple, rápida para la presencia de HbS. Un tamizaje positivo no distingue entre los homocigotos y los heterocigotos y debe tener una sensibilidad debajo de 20% de concentración aproximada de HbS. Esta prueba es más útil cuando se requiere un examen rápido, por ejemplo, antes del anestésico general en un paciente de un grupo étnico “en riesgo” cuyo estado de hemoglobinopatía es desconocido. La detección de HbS se basa en su insolubilidad relativa cuando se desoxigena y en la deformación posterior de la membrana del RBC en la forma clásica de hoz. En el tubo de ensayo, la desoxigenación se induce con ditionito de sodio con trazas de saponina. Si la HbS está presente, entonces la forma desoxi se polimeriza para formar cristales tactoides clásicos. Una prueba positiva conserva un aspecto opaco (debido a los RBC falciformes en suspensión), mientras que la desoxihemoglobina en muestras negativas da una solución clara de hemoglobina. Hay otras seis variantes raras que también tienen características de falciformación. Este examen no es exclusivo para HbS, sino más bien para hemoglobinas “falciformes”. La identidad debe confirmarse siempre por electroforesis. Inversamente, una banda de la variante que emigra en la posición de la HbS debe confirmarse siempre con una prueba de solubilidad falciforme. Este examen es insensible a niveles muy bajos de HbS, como en aquellos encontrados en los recién nacidos, y por tanto sin utilidad alguna como parte del examen neonatal. Sin embargo, es posible emplearla para detectar el gen HbS en individuos donde no está disponible la electroforesis

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como primera línea de investigación, por ejemplo, en países del Tercer Mundo. Isoelectroenfoque (IEF) El isoelectroenfoque es una forma muy sensible y mucho más sofisticada de electroforesis que se basa en la separación de hemoglobinas según su punto isoeléctrico. Los anfolitos de bajo peso molecular portadores con un rango de puntos isoeléctricos se incorporan en el gel o el agar de poliacrilamida para crear un gradiente del pH. Para los propósitos de separación de Hb, se utiliza un rango del pH de 5.5 a 8.5. Como las hemoglobinas emigran a través del gradiente, llegan a ser neutrales en su punto isoeléctrico (pI) y se detiene la migración, es decir se enfocan en su pI. Puesto que el pI es específico en la carga superficial en una molécula, incluso las hemoglobinas con una carga diferenciada muy pequeña se separan en forma discreta. En geles prefabricados, las hemoglobinas de manera reproducible se enfocan en el mismo lugar, para obtener, de tal modo, mayor certeza de la identificación en una sola separación (fig. 28-1). Debido a la sensibilidad elevada del IEF, aun las variantes que están presentes en concentraciones muy pequeñas pueden determinarse, por ejemplo, con Constant Spring, variantes A2, H, de Bart. Esta técnica, por tanto, también es conveniente para efectuar el tamizaje sanguíneo a partir de sangre del cordón umbilical de los recién nacidos. Cuantificación La cuantificación de las fracciones de la Hb se usa principalmente en la distinción de los rasgos ␣- y ␤-talasemia en gente con microcitosis H de RBC y estado normal de hierro. Esto también tiene valor en: a) la caracterización adicional de algunas variantes, por ejemplo, en las variantes de la cadena ␣, HbE; b) el diagnóstico de síndromes compuestos de hemoglobinopatías; c) el diagnóstico de los desórdenes de la persistencia hereditaria de la Hb fetal (HPFH), y d) la supervisión de los regímenes de transfusión en desórdenes de las células falciformes. La estimación de las fracciones de Hb puede conseguirse con una variedad de técnicas, incluyendo la separación de la variante por electroforesis, seguida por elución, cromatografía en microcolumna, HPLC, inmunodifusión radial y ELISA. Cromatografía en microcolumna La cromatografía en microcolumna se emplea mucho para determinar el porcentaje de HbA2 en la detección del rasgo ␤-talasemia, pero puede también modificarse para la cuan-

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CAP. 28

MÉTODOS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE HEMOGLOBINOPATÍAS

Figura 28-1 Representación diagramática del isoelectroenfoque en capa fina de hemoglobinas normales y algunas variantes estructurales de la hemoglobina. IB1 e IB2 son híbridos ferrosos-férricos de la HbA. (Cortesía del Dr. Yves Beuzarda).

tificación de fracciones importantes, por ejemplo, de HbS. El principio de separación depende de la adsorción y la unión de las moléculas de Hb cargadas a una resina con una cadena lateral polar. Durante la adición de un amortiguador desarrollador a la columna, a la proteína ligada se le desplaza con iones cargados más fuertes del amortiguador, de

ahí el término “cromatografía de intercambio iónico”. Las hemoglobinas que se desplazan se lavan después a partir de la resina en la elución. La estimación del porcentaje de concentración de la fracción entonces se mide contra un total diluido por densitometría óptica. La celulosa DEAE (dietilaminoetil) es una resina de intercambio de aniones,

DETECCIÓN, IDENTIFICACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE HEMOGLOBINOPATÍAS

que se acompaña con un amortiguador glicina-KCN o TrisHCl, pH de 8.3. El rango normal para la HbA2 es de 1.8 a 3.5%, con niveles elevados (hasta cerca de 7.5%) indicando el rasgo ␤-talasemia. Los niveles fronterizos (3.3 a 3.7%) necesitan interpretación cuidadosa, y posiblemente un análisis del DNA, para confirmar normalidad o una talasemia (␤+) leve. En el rasgo ␣-talasemia, el nivel de HbA2 puede ser normal o bajo. Los niveles reducidos de HbA2 también se encuentran en la deficiencia de hierro grave, enfermedad de HbH y ␦-talasemia. Medición de HbF La HbF abarca < 1% en adultos normales, y se incrementa un poco en cerca de la mitad de los portadores de ␤-talasemia. La HPFH y la ␦␤-talasemia producen niveles significativos elevados de HbF y se distinguen por mantener normales, en lugar de reducidos, el MCV y el MCH respectivos. La prueba Kleihauer es probable que también sea útil, pues algunos tipos de HPFH son “pancelulares” (con una distribución uniforme de HbF en los RBC), mientras que otros son “heterocelulares” (con una distribución heterogénea de HbF en los RBC). En ␦␤-talasemia, la distribución típica es heterocelular. Sin embargo, puede ser necesario realizar un análisis de DNA para estar seguro de esta distinción, en especial si la ␣-talasemia es una condición coexistente posible que causa un MCV bajo. Un método de uso frecuente en el análisis de HbF lo introdujo primero Betke y se basa en la desnaturalización selectiva de otras hemoglobinas por el álcali, dejando la HbF intacta, que es resistente. Una solución lisada diluida se somete a una incubación fija de 2 min con NaOH, que oxida todas las demás fracciones que contiene. Las metahemoglobinas resultantes se precipitan con una solución de sal saturada, que también neutraliza la oxidación. La HbF, que permanece en la solución puede separarse del precipitado por filtración, o mejor por centrifugación de alta velocidad. La proporción de la fracción de HbF se determina por densitometría óptica contra una dilución de Hb total. Un nivel de HbF < 1% es el rango normal del adulto; 1 a 5% se encuentra en 50% de los portadores de ␤-talasemia; 5 a 20% es característico del rasgo ␦␤-talasemia y algunos casos de HPFH; 20 a 45% es característico de la HPFH pancelular tipo africano. En algunos casos homocigotos, la HbF puede representar > 90% de la Hb total.

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adecuada para examinar una gran cantidad de muestras de manera rápida, exacta y económica. El principio de separación es el mismo de la cromatografía en microcolumna, aunque la resina tiene una cadena lateral de poliaspartato, es un intercambiador catión y la fase fluida es un ion Cl¯. El análisis se automatiza con un automuestreador de inyección sobre la columna y una bomba que ejerce una presión constante del amortiguador de elución en la parte superior del lisado. Esto controla y regula el tiempo de elución. El aumento de la sensibilidad de la separación es enorme con el empleo de dos amortiguadores, que difieren en la concentración del ion o el pH o ambos. Las fracciones de Hb son eluidas en forma secuencial de la columna por la creación de un gradiente de elución, conseguido al mezclar las dos fases fluidas. Esto permite la separación de las variantes de hemoglobina previas sin identificar, es decir, D de G, y E de O. La densidad óptica de los eluidos se mide directo cuando pasan desde la columna y se trazan de forma continua para crear un cromatograma (fig. 28-2). La identificación se consigue por la comparación de los tiempos de retención contra los de las variantes de hemoglobina conocidas. Los componentes principales y menores pueden cuantificarse con exactitud integrando el área bajo cada pico; las ␣- y ␤-talasemias se distinguen con facilidad, pues el nivel de HbA2 se calcula de manera automática. Se recomienda que la identidad de una variante de Hb que se detecta por HPLC se confirme con una segunda técnica (p. ej., electroforesis o solubilidad de la hemoglobina falciforme).

Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) La HPLC combina la detección, la identificación y la cuantificación de hemoglobinas en una sola técnica y es muy

Figura 28-2 Diagrama del empalme de los cromatogramas por HPLC de las variantes comunes de Hb.

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CAP. 28

MÉTODOS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE HEMOGLOBINOPATÍAS

Detección de cuerpos de inclusión de RBC

Prueba de inestabilidad al calor

La reacción redox de la tinción supravital se utiliza para teñir los cuerpos de inclusión del eritrocito que se forman de derivados de Hb. Esta propiedad es útil en la caracterización adicional de los desórdenes de la Hb. La HbH es un tetrámero que se forma con el excedente de cadenas ␤ (␤4) en la ␣-talasemia y es perceptible por electroforesis o HPLC cuando existen cantidades significativas (es decir, en la enfermedad de HbH). La HbH intracelular es soluble pero muy inestable y se precipita por incubación con azul brillante de cresil. El precipitado se fija a la membrana del RBC para dar un aspecto típico de “pelota de golf” a los RBC, con los cuerpos múltiples teñidos. Las inclusiones de HbH están presentes en 1 a 2 células/1 000 en el rasgo ␣-talasemia, pero pueden ser difíciles de detectar al microscopio. Son mucho más numerosas y visibles en la enfermedad de HbH. Los cuerpos de Heinz (véase hemoglobinas inestables) no son perceptibles en un frotis teñido con Romanowsky estándar, pero sí como precipitados intracelulares grandes, redondos y normalmente solos después de la incubación con violeta de metilo. Su presencia común se detecta sólo en la hemólisis aguda y no puede ser obvia si la función esplénica está intacta o si la tinción se realiza sobre sangre muy fresca.

Este control somete la hemoglobina a una incubación de 50°C, lo que ejerce estrés adicional sobre las fuerzas de van der Waals internas ya debilitadas, y producir subunidades al disociar con más facilidad de lo normal.

Detección de hemoglobinas inestables La inestabilidad molecular de la Hb puede surgir de la sustitución del aminoácido en los grupos de unión hem, las áreas ␣␤ de contacto o en el interior del hueco del grupo hem. Estos defectos confieren debilidad en los contactos hem-globina y en las estructuras tetraméricas o helicoidales totales. Esto conduce a una tolerancia reducida a estrés fisiológico, con una tendencia a la oxidación irreversible del hierro del grupo hem y de la precipitación intracelular de Hb bajo la forma de cuerpos de Heinz. Hay más de 180 hemoglobinas inestables conocidas, algunas de las cuales conducen a las anemias hemolíticas congénitas de cuerpos de Heinz, con una gravedad dependiente de la naturaleza y de la posición del defecto molecular. La electroforesis no es en particular útil en el diagnóstico de la enfermedad de Hb inestable, puesto que la mayor parte de estas mutaciones no muestra cambio en la carga neta de la molécula. La inestabilidad se detecta cuando se emplean dos controles de desnaturalización basados en la exposición a un solvente o en la precipitación por calor. Las muestras deben estar frescas, y la sangre del cordón puede utilizarse como un control positivo (la HbF tiene una intolerancia relativa al calor y al estrés hidrofóbico comparada con la Hb normal adulta).

Prueba de estabilidad al isopropanol La incubación con isopropanol induce estrés hidrofóbico. El isopropanol es más polar que el agua y debilita las uniones hidrofóbicas, permitiendo que el agua entre en el hueco del grupo hem y facilite la oxidación del hierro del grupo hem. En ambos controles, la hemoglobina normal permanece en solución, mientras que las variantes inestables se detectan con la floculación y precipitación variables. Análisis molecular Las técnicas estándares de control descritas antes son adecuadas para la detección y la caracterización de las mutaciones comunes, pero se limitan a identificar variantes raras y a especificar los defectos de la talasemia. La identificación de la alteración molecular exacta es esencial para los propósitos de asesoramiento genético, diagnóstico prenatal y, algunas veces, para el manejo clínico. Esto se logra con el análisis del DNA genómico que se extrae, y luego se amplifica, a partir de leucocitos de la sangre periférica, o de muestras de las vellosidades coriales (CVS) para el diagnóstico prenatal. En el desarrollo de las técnicas de diagnóstico para el análisis de DNA se ha logrado un progreso rápido que es reciente. Una descripción con detalle de las técnicas y sus aplicaciones está más allá del alcance de este capítulo. Sin embargo, en seguida se da una breve reseña sobre el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en el diagnóstico de la hemoglobinopatía. Reacción en cadena de la polimerasa La PCR se aplica sobre todo para la detección de las mutaciones puntuales, deleciones y polimorfismos del DNA. Esta técnica amplifica una región del DNA de interés, con sencillez y de manera muy rápida, y en particular es apropiada para el diagnóstico prenatal, puesto que requiere sólo de una muestra muy pequeña que puede obtenerse por CVS cerca de las 12 semanas de gestación. El principio de la PCR implica la síntesis de DNA usando iniciadores sintéticos (secuencias cortas de DNA de cadena sencilla), los cuales flanquean la región del DNA de interés, y una DNA polimerasa termoestable (polimerasa Taq). La

LECTURAS ADICIONALES

amplificación enzimática de cantidades grandes de DNA permite la visualización directa de los fragmentos de DNA teñidos en un gel de agarosa. Una sola sustitución de base puede identificarse por el cambio en el tamaño del fragmento del DNA después de la digestión del producto de la PCR con enzimas de restricción que reconocen secuencias específicas de DNA, seguida por una hibridación del tipo ”Southern blotting”. Sin embargo, esto consume tiempo e involucra el uso de radioisótopos. Se han desarrollado nuevas técnicas, que se basan en la PCR, que permiten la prueba para mutaciones específicas sin el uso de enzimas de restricción o de radioisótopos si el defecto molecular exacto que se busca ya es conocido, permitiendo así que los resultados estén disponibles en un lapso de 24 horas. Una técnica así es el “sistema de amplificación refractaria de la mutación” (ARMS), cuando se emplean iniciadores específicos para el alelo. En esta técnica dos iniciadores diferentes se utilizan, uno complementario al alelo normal y el otro al alelo mutado, que difieren sólo en el sitio de la mutación. Los iniciadores dan un producto de PCR sólo si el iniciador y las secuencias de DNA son complementarios. Así, los iniciadores normal y mutante amplifican los alelos normal y mutante respectivos. Usando esta técnica, el DNA del paciente puede examinarse para una mutación específica del gen, por ejemplo, HbS. Se han sintetizado iniciadores para ␤A, ␤S, ␤C, ␤E y la mayor parte de los genotipos comunes de ␤-talasemia. En ␤-talasemia, un número limitado de defectos se encuentra con frecuencia en cada grupo étnico. Así, el origen étnico del paciente determina primero el empleo de una serie particular de iniciadores en el análisis, con una alta probabilidad de identificación positiva en el primer control. La GAP-PCR es una técnica con la cual se detectan “huecos” grandes (deleciones) en el DNA, y es útil en el diagnóstico de las formas comunes de ␣+ y ␣0 talasemias, que son sobre todo originadas por deleción. También se utiliza en el diagnóstico molecular de Hb Lepore, ␦␤-talasemia y las formas delecionales de HPFH. La PCR multiplex es una técnica útil para la demostración/exclusión simultáneas de un número de mutaciones diferentes (p. ej., en todas las ␣+ y ␣0 talasemias conocidas) en una sola

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prueba. Las técnicas que se basan en la PCR que se mencionan antes se utilizan cuando se examinan mutaciones o deleciones específicas. Sin embargo, si el defecto molecular permanece indeterminado, la mutación supuesta puede identificarse secuenciando de modo directo el gen.

Agradecimientos Gracias a Jaspal Kaeda FIBMS PhD (Leukaemia Unit, Imperial School of Medicine, Hammersmith Hospital, London) por la ayuda con la sección PCR, y a Yvonne Elliott CSI FIBMS (Walsgrave Hospital, Coventry) por la revisión crítica del manuscrito.

Lecturas adicionales Bain BJ. Haemoglobinophathy Diagnosis. 2001: Blackwell Science, Oxford. Huisman THJ, Carver MFH, Efremov GD. A Syllabus of Human Hemoglobin Variants. 1996: Sickle Cell Anemia Foundation, Augusta, GA. International Committee for Standardization in Haematology (ICSH). Recommendations for neonatal screening for haemoglobinopathies. Clin Lab Haematol 1988; 10: 335-345. Thalassaemia Working Party of the British Committee for Standards in Haematology, General Haematology Task Force. Guidelines for the investigation of ␣-and ␤-thalassaemia traits. J Clin Pathol 1994; 47: 289-295. Vulliamy T, Kaeda J. Molecular techniques. In Dacie and Lewis Practical Haematology, 9th edn. Lewis SM, Bain BJ, Bates 1 (eds) 2001: Churchill Livingstone, London, 493-526. Wild BJ, Stephen AD. The use of automated HPLC to detect and quantitate haemoglobins. Clin Lab Haematol 1997; 19: 171176. Working Party of the General Haematology Task Force of the British Committee for Standards in Haematology. The laboratory diagnosis of haemoglobinopathies. Br J Haematol 1998; 101: 783-792. Working Party of the General Haematology Task Force of the British Committee for Standards in Haematology. Guidelines for the fetal diagnosis of globin gene disorders. J Clin Pathol 1994; 47: 199-204.

29 Investigaciones especiales del factor de von Willebrand Mohammad S Enayat

Introducción La enfermedad de von Willebrand (vWD) fue descrita primero por Erik von Willebrand en 1926 en varios miembros de una familia grande del archipiélago Åland, en Finlandia. En 1953, se identifica una relación entre la disminución de la actividad procoagulante del factor VIII (FVIII) y la vWD, lo que condujo a cierta confusión referente a la naturaleza de la proteína responsable de la hemofilia A y de la vWD. Pero sólo hasta finales de la década de 1970 se logró una mejor comprensión de las estructuras inmunológica y molecular del FVIII y del vWF que llevaron al mapeo genético y la clonación del cDNA que codifica para el FVIII en 1986 y del vWF en 1989. La vWD es el más común de los desórdenes sanguíneos congénitos, con un fenotipo heterogéneo. Deriva de defectos cuantitativos (tipos 1 y 3) o cualitativos (variantes del tipo 2) del vWF en plasma o plaquetas, o ambos. Esta glucoproteína multimérica grande (10 a 20 ⫻ 106 kDa) tiene dos papeles importantes en la hemostasis; actuando como portador y protector proteolítico del FVIII, y como mediador de la adherencia plaquetaria al subendotelio, después de una lesión vascular. El vWF se sintetiza en las células endoteliales y en los megacariocitos por medio de la transcripción del mRNA de aproximadamente 9 kb resultante a partir del gen del vWF de 180 kb sobre el extremo telomérico del cromosoma 12 en 12p13.2 S pter (fig. 29-1). Los estudios de localización que usan una sonda de cDNA para la porción media del vWF identifican no sólo el gen auténtico en este cromosoma, sino también una secuencia del seudogén en el cromosoma 22 en 22q11-23. Este seudogén tiene 21 a 29 Kb de longitud, con un DNA genómico que corresponde tanto a exones como intrones de

la región codificante de los exones 23 a 34 del gen del vWF y con sólo 3.1% de divergencia en la secuencia. El gen del vWF tiene 52 exones, mide aproximadamente 178 kb, que codifican un producto de traducción precursor (PreprovWF) de 2 813 aminoácidos (aa) con una repetición interna grande de dominios homólogos. El propéptido (de 763 aa) y la subunidad madura (de 2 050 aa) del vWF se componen de dominios que se repiten en el siguiente orden: D1-D2D´-D3-A1-A2-A3-D4-B1-B2-B3-C1-C2-CK. Antes de la secreción, el vWF experimenta un procesamiento postraduccional extenso, que incluye la eliminación del propéptido D1-D2, seguida por la glucosilación con oligosacáridos, 12 N-ligados y 10 O-ligados, y multimerización. Algunos de los oligosacáridos N-ligados del vWF tienen la característica rara de portar determinantes del grupo sanguíneo del ABO. Varios dominios funcionales (fig. 29-1) se han identificado en la molécula del vWF, y la mayor parte de las mutaciones responsables de varios tipos de la vWD se han mapeado en estas regiones. Los resultados a partir de pruebas fenotípicas y genotípicas forman la base del diagnóstico y de la clasificación de los diferentes tipos de vWD. Sin embargo, como surgen más detalles de estos tipos de pruebas, un diagnóstico más exacto y la clasificación compleja se hacen regularmente. Una clasificación revisada de vWD fue publicada en 1994, pero no se ha modificado y, como de manera continua se identifican más mutaciones responsables de cada tipo de vWD, se ha propuesto una nueva clasificación basada en defectos y mutaciones funcionales. En el año 2003, en el XIX Congreso de la Sociedad Internacional de Trombosis y Hemostasia en Birmingham, Reino Unido, varias ponencias enfatizaron la necesidad de una nueva clasificación de vWD, con base en el diagnóstico molecular y el análisis

The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker, © 2005 John Wiley & Sons, Ltd.

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CAP. 29

INVESTIGACIONES ESPECIALES DEL FACTOR DE VON WILLEBRAND

Figura 29-1 Representación esquemática del gen y de la proteína del vWF humano. De arriba hacia abajo: características estructurales del gen, seudogén y cDNA del vWF; localizaciones y numeración, antigua y nueva, del péptido señal (SP), del vWF prepropéptido y maduro. El vWF prepro contiene 2 813 (2 050 numeración antigua) aminoácidos, de los cuales 1-22 (-22-1 numeración antigua) son péptidos señal, 23-763 son propéptidos y 764-2 813 son subunidades maduras. Las cajas rotuladas denotan regiones de dominios homólogos internamente repetidos; localizaciones aproximadas del grupo de mutaciones responsables de diversos tipos de vWD; puentes disulfuro Al y A3 y posiciones de los dominios funcionales; posiciones de los enlaces disulfuro responsables de la dimerización y de la multimerización del vWF. La glucoproteína de la plaqueta Ilb-IIIa (␣llb␤3) se une a la secuencia Arg-Gli-Asp (RGD) indicada en el dominio C1.

multimérico mejorado del vWF. Con tantos pacientes inclasificables en el grupo tipo 1 de vWD, ahora se sugiere que tal método multimérico mejorado puede ayudar en la clasificación futura de estos pacientes. En este capítulo se describen tres pruebas fenotípicas especiales que se utilizan ahora para el diagnóstico y la clasificación de la vWD. Son el análisis multimérico de vWF: Ag, usado para el diagnóstico diferencial de todos los tipos de vWD variante; la agregación plaquetaria inducida por la ristocetina, esencial para el diagnóstico de la vWD tipo 2B; y finalmente el ensayo de la unión vWF/FVIII para el diagnóstico de vWD tipo N “Normandía”. Aunque no hace mucho tiempo que el gen del vWF fue identificado, las pruebas moleculares ahora se introducen extensivamen-

te, y también se describen una breve metodología y algunas estrategias para la detección de la mutación.

Pruebas fenotípicas Análisis multimérico del VWF En 1981 una electroforesis en gel de SDS, bajo condiciones no reductoras, permitió la alta resolución de los multímeros vWF:Ag y fue divulgada por Ruggeri y Zimmerman. Este método original se ha modificado y mejorado desde entonces, pero el principio del método es el mismo. Las modificaciones incluyen variaciones del método actual, tipo de

PRUEBAS FENOTÍPICAS

medio en el cual se separa la proteína, semiautomatización, y diversos tipos de anticuerpos y métodos de visualización de las bandas del multímero. Todos estos métodos se utilizan para la identificación de alteraciones cualitativas del vWF:Ag, tal como son vistos en la vWD variante o tipo 2, donde hay pérdida de multímeros de peso molecular alto o intermedio, o ambos. Para el análisis comprensivo del multímero del vWF:Ag usado en el diagnóstico y clasificación de la vWD tipo 2, vWF:Ag del plasma y de la plaqueta deben examinarse en geles de agarosa a concentraciones del 1.0 al 2.2%. El método descrito aquí es la modificación de Enayat y Hill (1983) del método original de Ruggeri y Zimmerman (1981). Esta es una electroforesis en gel de agarosa-SDS usando una técnica en gradiente amortiguador. La visualización de la banda del multímero es mediante autorradiografía, usando un anticuerpo anti-vWF mono o policlonal marcado con 125I. También es posible utilizar otros métodos no radiactivos para la visualización de la banda después de transferir las bandas del multímero de los geles de agarosa en diferentes tipos de filtros. Preparación de gel Un sistema de sándwich hecho de una pieza del gel unida a una película (Flowgen), cubierto por una placa de vidrio y separada de una segunda placa de vidrio por un espaciador de plástico en forma de “U” de 1 mm de grueso, se utiliza para preparar los geles. El gel (Agarosa LGT tipo VII; Sigma) se vierte entre las placas de cristal y, después de que se ha fijado, se quita la placa del cristal superior, y una tira de 3 cm de la parte superior de gel se corta y se sustituye por un gel concentrador compuesto de agarosa a 0.8% (Agarosa de SeaKem HGT (P), Flowgen Instruments Ltd). Los pozos de la muestra se cortan en el gel aglomerante. Las muestras que deben aplicarse se incuban por 30 min a 56ºC en un amortiguador que contenga colorante azul de bromofenol, para vigilar la migración molecular, y dodecil sulfato de sodio (SDS) para la dispersión completa de las moléculas del vWF y aportar una carga negativa a todos los multímeros. Condiciones electroforéticas Cada instrumento de la electroforesis se optimiza para este método pero, por lo general, la electroforesis se realiza rápidamente a 2 mA/cm al inicio, para que las muestras se muevan de los pozos al gel concentrador. Los pozos vacíos se llenan de gel concentrador fundido y la electroforesis se realiza durante toda la noche a una velocidad más baja, 1.0 mA/cm. Cuando se completa la electroforesis, los geles se fijan en una solución de isopropanol, se secan con presión y se lavan con una solución de suero de conejo al 10%. La

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autorradiografía se realiza incubando en los geles el anticuerpo (DAKO Ltd) de vWF antihumano marcado con 125I durante la noche. Después de un lavado minucioso para eliminar el anticuerpo sin reaccionar, los geles se secan y se aplican a placas autorradiográficas de rayos X y se almacenan a ⫺7°C de 2 a 5 días antes del revelado. Interpretación de los resultados La autorradiografía es un método muy sensible y, cuando se varía el tiempo de exposición, se pueden obtener diferentes autorradiografías con diversas intensidades de la señal del mismo gel. El patrón normal del vWF:Ag en plasma muestra la gama completa de bandas del multímero que corresponde al factor de von Willebrand. Éste se compone de multímeros de peso molecular alto, intermedio y bajo (fig. 29-2). Cada banda del multímero se integra con un trío de bandas, una central principal y dos bandas satélites borrosas pero también teñidas (a y b). La mejor extensión de los multímeros de vWF:Ag se observa en gel de agarosa de media resolución (1.3 a 1.5%), la pérdida de multímeros de peso molecular alto se investiga mejor en geles de agarosa de baja resolución (1.0 a 1.3%) (fig. 29-2A), y las anormalidades del trío de bandas en geles de agarosa de alta resolución (1.8 a 2.2%) (fig. 29-2B). Por tanto, para un análisis multimérico completo deben usarse dos o tres concentraciones diferentes del gel. Ésta no es una técnica fácil y cada corrida puede variar y necesitar la optimización individual de las condiciones electroforéticas. El análisis densitométrico de cada patrón multímero puede también ayudar en la cuantificación de la cantidad de multímero ganada o perdida en algunos pacientes con vWD tipo 2A (fig. 29-2C). Las bandas del multímero del vWF:Ag en la plaqueta normal son diferentes a aquellas observadas en el plasma. Hay multímeros más grandes presentes en las plaquetas más que en el plasma, y la organización multimérica también es diferente (fig. 29-3). Las bandas de multímeros más pequeñas parecen estar compuestas de un dúo, y las bandas centrales emigran menos que los multímeros correspondientes en el plasma. La información del análisis del multímero de la plaqueta puede ayudar a decidir el tipo de tratamiento de algunos pacientes con vWD tipo 2A y corresponder al tipo de mutación presente en ellos. Ensayo de la agregación plaquetaria inducida por la ristocetina (RIPA) Una de las funciones principales de la glucoproteína del vWF es promover la adherencia de plaquetas al subendotelio en el sitio de la lesión vascular, a través de la interacción profunda

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INVESTIGACIONES ESPECIALES DEL FACTOR DE VON WILLEBRAND

Figura 29-2 Las autorradiografías de diferentes patrones vistos en los multímeros del vWF:Ag en el plasma del tipo 2A (carril 1), 2D (carril 2), 2B (carril 3), normal (carril 4) y vWD tipo 1 (carril 5) sometidos a electroforesis en geles de agarosa al 1.2% (A) y al 1.8% (B). El trío de la banda 2 es marcado por una llave, y las bandas satélites a y b pueden verse mejor en la banda 1 del plasma en la vWD tipo 2A (carril 1). La flecha en la parte superior del gel señala la línea entre los geles concentrador y separador. La dirección de la electroforesis es de arriba hacia la parte inferior. (C) Un gel al 1.0% que muestra la migración de multímeros de gran peso molecular, según lo visto en la Vincenza tipo 2 (1) y algunos pacientes con vWD tipo 2 no clasificados (2). El panel siguiente ilustra el análisis densitométrico de uno de los dos geles anormales y el área de los multímeros de gran peso molecular.

con GPIb en el complejo receptor GPIb-IX (glucoproteína IB-IX) en la membrana plaquetaria. Este dominio funcional que mapea el dominio A1 del vWF desempeña un papel importante en la hemostasis primaria. Los defectos en este dominio dan lugar a aumento en la afinidad del vWF por el GPIb plaquetario. Sin embargo, esto no causa trombosis sino, paradójicamente, sangrado. Este fenotipo raro de una variante del tipo 2 de la vWD se refiere como tipo 2B, y su anormalidad funcional característica se detecta por el ensayo de la agregación plaquetaria inducida por la ristocetina (RIPA). El antibiótico ristocetina induce la unión del vWF al GPIb plaquetario en el plasma rico en plaquetas (PRP) y el grado de aglutinación plaquetaria con diversas concentraciones de ristocetina forma la base de este ensayo. Aparte de esta alteración, 2B vWD también se caracteriza por la ausencia selectiva de multímeros de peso molecular alto (HMWM) en el plasma, y es identificada por el análisis multimérico del vWF:Ag. De hecho, los pacientes con la vWD tipo 2B pueden sintetizar una gama completa de multímeros del vWF, como se muestra por patrones del multímero del vWF:Ag multimérico normal en plaquetas y células endoteliales, pero los HMWM son eliminados de la circulación por la afinidad incrementada del vWF anormal del receptor GPIb plaquetario. La metodología RIPA descrita aquí es una modificación del trabajo original referido en 1977. La ristocetina (Paesel-Lore) se reconstituye en una solución salina Tris amortiguada, pH 7.4, y cinco soluciones diferentes, dando

concentraciones finales de 0.50, 0.1, 0.125 y 0.15 mg/ml, se preparan para usarse en el análisis. La PRP se prepara centrifugando las muestras sanguíneas de la prueba y del control a 800 rpm durante 10 minutos. La cuenta plaquetaria en el supernadante (PRP) se ajusta aproximadamente a 250 ⫻ 109/L. Se añaden 200 µl de la sangre del paciente o del control normal (blanco) a las cubetas que contienen una barra magnética para agitar y se colocan en los bloques de calentamiento a 37°C del agregómetro plaquetario Bio/Data de 4 canales por 2 minutos. Cada cubeta entonces se inserta en uno de los canales del agregómetro y se comienza la agregación. Se añaden 20 µl de ristocetina (comenzando con la muestra menos concentrada) a cada uno de los especímenes. Se permite la agregación durante un mínimo de 3 minutos. Un trazo del patrón de la agregación, que es proporcional a la luz transmitida, se imprime; un patrón típico se muestra en la figura 29-4. Las muestras de vWD tipo 2B requieren menos ristocetina para alcanzar un patrón de agregación comparable a las normales.

Ensayo de la unión vWF/FVIII El vWF y el FVIII mantienen una relación estrecha y en el plasma forman un complejo molecular no covalente. La integridad del dominio de unión del FVIII en la molécula del vWF es un factor importante para la formación de éste, y para la estabilidad y transporte del complejo vWF/FVIII

PRUEBAS GENOTÍPICAS PARA IDENTIFICAR LA MUTACIÓN

Figura 29-3 Autorradiografía que muestra diferentes patrones del multímero observados en el vWF:Ag normal del plasma (Pls) y de la plaqueta (Plt), separación electroforética en agarosa a 1.4%. La flecha en la parte superior del gel señala los pozos donde se colocó la muestra. Dos flechas pequeñas en la parte inferior indican el patrón de la banda doble mejor observada en agarosa al 1.4%. Obsérvese la presencia de los multímeros de peso molecular muy alto en la muestra de la plaqueta.

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en el plasma. En una investigación de varios casos de vWD, se observó que el vWF tiene una capacidad de unión alterada hacia el FVIII, causando la reducción en el nivel de este factor, lo que conduce a una condición similar a la hemofilia A leve. A esta condición se le refiere inicialmente como “seudohemofilia”; más tarde se le reconoce como anormalidad del vWF y se renombra “Normandía” (área de donde provino el primer paciente definido) o vWD tipo 2N. Los multímeros de vWF:Ag en esta variante de la vWD son normales, pues los defectos mutacionales presentes en estos pacientes no afectan el mecanismo de multimerización del vWF. Recientemente se han mapeado mutaciones especí-ficas, dentro del vWF y los responsables de esta condición en los dominios D´ y D3, y la mayor parte de las mutaciones se agrupan en los exones 18 a 24, entre Arg 19 y Cis 297. El método descrito aquí para determinar la unión del FVIII al vWF es la modificación de Nesbitt et al. (1996) del método que se populariza originalmente. Una concentración conveniente de un anticuerpo monoclonal anti-vWF, MAS 533p (de la compañía Sera Lab), se une a las placas de microtitulación (Immulon 4, laboratorios Dynatech) interaccionando durante toda la noche a 4ºC. Las placas se lavan dos veces en 50 mM de Tris, 100 mM de NaCl, a un pH de 8.0 (TBS), conteniendo BSA a 0.1%. Diluciones seriales del plasma del paciente que contienen 1 U/dl, 0.5 U/dl, 0.25 U/dl y 0.125 U/dl del vWF:Ag se agregan al amortiguador TBS que contiene BSA al 3% y se incuba otra vez durante toda la noche a 4°C. Se lavan las placas como antes y el FVIII endógeno en las muestras se elimina incubando con 0.35 M CaCl2 por una hora a temperatura ambiente. Un FVIII recombinante (de la compañía Bioclate, Baxter) a 0.05 U/ml se diluye en TBS/BSA al 1% con CaCl2 10 mM y Tween 20 al 0.002% se adiciona y se incuba por dos horas a 37°C. Después de lavar el FVIII ligado al vWF se determina usando el equipo cromogénico Coamatic FVIII (de la compañía Quadratech) y se realizan lecturas a 405 nm. Los resultados se grafican como porcentaje de dilución del vWF:Ag contra la absorbancia a 405 nm para la vinculación del FVIII. En el ejemplo que se describe aquí (fig. 29-5), las muestras que se usan son de un control normal, un control homocigoto y dos pacientes heterocigotos con vWD tipo 2N (P1 y P2) con la mutación de Thr28Met como controles positivos. Para la determinación de cualquier resultado anormal, debe utilizarse una gama de muestras control normales.

Pruebas genotípicas para identificar la mutación Tamizaje para mutaciones Figura 29-4 Un trazo típico del patrón de agregación en plasma de un individuo normal con plaquetas en presencia de diferentes concentraciones finales de ristocetina.

Las mutaciones relacionadas con todos los tipos de vWD se han identificado desde finales de la década de 1980. Sin

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INVESTIGACIONES ESPECIALES DEL FACTOR DE VON WILLEBRAND

Figura 29-5 Unión del FVIII al vWF de un control normal, de dos pacientes heterocigotos, P1 y P2, con la mutación Thr28Met y un control homocigoto con la misma mutación.

embargo, por el gran tamaño y complejidad del gen vWF y la presencia del seudogén en el cromosoma 22, con la exclusión de grandes deleciones, por lo general existe menos información sobre defectos moleculares de la vWD tipo 1 y tipo 3 que del tipo 2. La investigación de las mutaciones responsables de los subtipos 2A, 2B, 2N y 2M tiene más éxito porque es el resultado de los datos aportados por los estudios del fenotipo. Una región sensible a las proteasas dentro del dominio A2, cercana al sitio de digestión de Tyr 842 a Met 843, se informa como la que genera los cambios estructurales similares a aquellos que se observan en 2A vWD, y este dominio se señala para detectar la mutación en la 2A vWD. En la 2B vWD, donde hay mayor afinidad por el GpIb plaquetario, los estudios de la detección de la mutación se dirigen al dominio A1 del vWF, que contiene el dominio funcional de la unión con el GpIb. De hecho, casi todas las mutaciones responsables de estos dos subtipos de vWD se han detectado en el exón 28, donde mapean los dominios Al y A2 del vWF. De manera similar, los exones 18 a 24 se estudian para detectar la mutación en la vWD tipo 2N. En 1993 se publicó una base de datos de mutaciones puntuales, por inserción y deleción identificadas en la vWD, junto con una gran cantidad de polimorfismos que se encuentran en el vWF. Sin embargo, puesto que esta lista aumenta continuamente mientras más información llega a estar disponible, una nueva base de datos en línea de la mutación y del polimorfismo del vWF se crea y mantiene por un consorcio de investigadores de la vWD en Internet. Este sitio ahora ha cambiado y existe uno nuevo a nombre del Comité Científico y de Normalización de la ISTH para el vWF, que mantiene la Universidad de Sheffield del Reino Unido. Este sitio Web (http://www.she

ffield.ac.uk/vWF) contiene la información actualizada sobre las mutaciones y polimorfismos más recientes que se divulgan sobre el gen para el vWF. Aunque la mayor parte de estas mutaciones reportadas se comprueban con estudios funcionales, donde el vWF recombinante se expresa en un cultivo de la línea celular en la cual la mutación se introduce por mutagénesis dirigida al sitio, otras tienen todavía que expresarse. En algunas de las mutaciones divulgadas el gen completo del vWF no se ha investigado para excluir la posibilidad de cambios en otra parte. En la vWD tipos 1 y 3, donde las mutaciones se podrían encontrar en cualquier parte a lo largo del gen del vWF, se ha reportado el uso de diferentes técnicas para una búsqueda preliminar como son: la detección por medio del corte químico de la unión alterada entre las cadenas de DNA (CMCD), la electroforesis en gel que detecta cambios conformacionales (CSGE) o la electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE). Para el tamizaje de la mutación por CMCD, todo el gen del vWF se amplifica en siete fragmentos del cDNA, que se obtienen por la transcripción inversa del mRNA “ilegítimo” encontrado en linfocitos periféricos por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR). Estos segmentos pueden entonces tamizarse por CMCD para la mutación. La DGGE es tan sensible como CMCD, pero requiere la síntesis de iniciadores especiales y el uso de la técnica de electroforesis en geles. La metodología de CSGE es un método de detección simple y no radiactivo; sin embargo, implica amplificaciones y análisis de hasta 60 fragmentos para el análisis del gen que codifica para el vWF. Detección e identificación de la mutación Secuenciación de DNA Los métodos de tamizaje tales como CSGE y CMCD identifican sólo la posición y a veces el tipo de un cambio molecular en un segmento pequeño del gen, y donde pudieran encontrarse mutaciones. La naturaleza real de la mutación, sin embargo, sólo podría determinarse por la secuenciación directa del DNA. Los métodos más antiguos para la preparación de productos PCR de DNA de cadena sencilla necesarios para la secuenciación (usando cebadores biotinados apropiados y perlas magnéticas revestidas con estreptavidina, o por PCR asimétrica) han sido sustituidos en la actualidad por la secuenciación cíclica. Este método se basa en la síntesis de una hebra nueva de DNA a partir de una cantidad pequeña de la plantilla de doble hebra original en un proceso de secuenciación cíclica, empleando una enzima Taq termoestable especial y dideoxi-dNTP marcados con compuestos fluorescentes. Con la introducción de los analizadores genéticos automáticos con 16 a

LECTURAS ADICIONALES

96 sistemas capilares de electroforesis, es posible ahora realizar centenares de secuenciaciones por día. Después de la detección de una mutación, ésta puede caracterizarse por mutagénesis dirigida al sitio y expresarse en un cultivo de línea celular o por uno de los siguientes métodos: 1. Análisis de la endonucleasa de restricción. Una sola sustitución del par de bases puede crear o eliminar un sitio para la restricción de la enzima endonucleasa. Para la confirmación de tal cambio, los productos de restricción de PCR relevantes obtenidos por el corte de una de las cientos de enzimas de restricción pueden analizarse por electroforesis en agarosa o en gel de poliacrilamida, y las bandas de DNA obtenidas por corte se visualizan por medio de tinción con bromuro de etidio. Dentro del tipo 2NvWD casi todas las mutaciones reportadas pueden detectarse de esta manera. 2. Hibridación con oligonucleótido iniciador específica de alelo (ASO). En mutaciones donde no hay disponible una enzima de restricción para detectar el cambio, un análisis ASO-H o dot-blot puede utilizarse. Aquí se sintetiza un oligonucleótido corto (cerca de 15bp) con secuencias del tipo silvestre y del mutante. Los productos PCR purificados del exón relevantes se desnaturalizan en NaOH. Los productos obtenidos por PCR tanto del alelo normal como del paciente del exón apropiado se aplican a tiras de nylon Hybond N+ (Amersham International), manualmente o con un aparato disponible en el comercio. Las tiras de nylon del filtro entonces se hibridan con los dos diferentes tipos de oligonucleótidos marcados con 32P-ATP, usando el fragmento Klenow (de la compañía Pharmacia) de la DNA polimerasa I. Después de las hibridaciones, las tiras del filtro se lavan tres veces en concentraciones que difieren de SSC con SDS por 10 a 20 min a una temperatura óptima determinada empíricamente para cada sonda del ASO. Por medio de la exposición a una autorradiografía, es posible visualizar muestras positivas (hibridación positiva) y negativas (hibridación negativa). En la actualidad, por lo menos se listan 40 mutaciones de sentido equivocado, cuatro microdeleciones y una inserción, en la base de datos, como las alteraciones causantes de la vWD tipo 2A. Una forma dominante rara de la vWD tipo 2A (formalmente tipo IID) se encontró como causal de una mutación de sentido erróneo en el dominio CK del carboxiloterminal. Una serie de mutaciones de sentido erróneo responsables de la vWD tipo 2B se ha identificado ahora, y todas se agrupan en el dominio 2A del vWF, que contiene el dominio de la unión funcional con el receptor GPIb. Con pocas excepciones, todas se confinan a un péptido corto (540 a 578 aminoácidos). La mayor parte de las

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mutaciones frecuentes son R1306W, R1308W, V1316M y R1341Q, que explican cerca del 90% de las vWD tipo 2B. Quince mutaciones de sentido equivocado, en los dominios D´ y D3 relacionados con los exones 18 a 24, aparecen actualmente en la base de datos para la vWD tipo 2N, siendo la mayor parte mutaciones de sentido equivocado R854Q. Ya que las mutaciones para los tipos 1 y 3 podrían estar presentes en cualquier parte de los 52 exones del gen del vWF, la detección de estas alteraciones en estos tipos de vWD fue lenta y sólo unas pocas, con grandes deleciones, se han reportado al principio de la década de 1990. Sin embargo, en la actualidad con la introducción y la facilidad relativa de secuenciación directa de DNA, una gran cantidad de mutaciones se han comunicado para la vWD tipo 3, sobre todo en forma homocigota en pacientes de familias con matrimonios consanguíneos. Como resultado de un estudio europeo multicentro (MCMDM-1vWD) y de un estudio canadiense en el diagnóstico y el control de la vWD tipo 1, muchas más mutaciones se identifican actualmente. Estos resultados indican que las mutaciones heterocigotas de sentido equivocado en el vWF maduro son una causa importante de la vWD tipo 1, y que varios otros tipos de mutaciones pueden dar lugar a niveles reducidos en la expresión del vWF y contribuir a este fenotipo de la vWD.

Lecturas adicionales Budde U, Drewake E, Mainnusch K, Schneppenheim R. Laboratory diagnosis of congenital von Willebrand Disease. Semin Thromb Hemost 2002; 28: 173-190. Enayat MS. Multimeric analysis of von Willebrand Factor. Methods Mol Med 1999; 31: 187-200. Evan Sadler J, Matsushita T, Dong Z et al. Molecular mechanism and classification of von Willebrand disease. Thromb Haemost 1995; 74: 161-166. Ginsburg D. Molecular genetics of von Willebrand disease. Thromb Haemost 1999; 82: 585-591. Goodeve AC. Laboratory methods for the genetic diagnosis of bleeding disorders. Clin Lab Haematol 1998; 20: 3-19. Jenkins PV. Screening for candidate mutation causing von Willebrand’s Disease. Methods Mol Med 1999; 31: 169-177. Kenney S, Cumming AM. The molecular biology of von Willebrand disease. Clin Lab Haematol 2001; 23: 290-230. Nesbitt IM, Goodeve AC, Guillart AM et al. Characterisation of type 2N von Willebrand disease using phenotype and molecular techniques. Thromb Haemost 1996; 75: 959-964. Ribba AS, Lavergne JM, Bahnak BR et al. Duplication of a methionine within the GPIb binding domain of von Willebrand factor detected by denaturing gel electrophoresis in a patient with type IIB von Willebrand disease. Blood 1991; 78: 17381743. Ruggeri ZM, Ware J. The structure and funtion of von Willebrand factor. Thromb Haemost 1992; 67: 594-599.

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CAP. 29

INVESTIGACIONES ESPECIALES DEL FACTOR DE VON WILLEBRAND

Ruggeri ZM, Zimmerman TS. The complex multimeric composition of factor VIII/von Willebrand factor. Blood 1981;57:11401143. Sadler JE, Mannucci PM, Berntorp E et al. Impact diagnosis and treatment of von Willebrand disease. Thromb Haemost 2000; 84: 160-174.

Schneppenheim R, Budde U, Ruggeri ZM. A molecular approach to the classification of von Willebrand disease. Best Pract Res Clin Haematol 2001; 14: 281-298.

30 Análisis de plaquetas Steven Walton y Peter E. Rose

Introducción Las plaquetas son fragmentos pequeños de citoplasma de megacariocito con un diámetro medio de 1 a 2 µm y un volumen medio de 5 a 8 fl, teniendo una vida media en la circulación periférica de 1 a 10 días. Su función es mantener la integridad de la pared vascular e iniciar la homeostasis al dañarse la red vascular. Su funcionalidad puede dividirse en tres áreas principales: adherencia al endotelio vascular; agregación entre sí, y liberación de productos químicos en el plasma. Este capítulo describe el principio básico de las técnicas usadas para investigar cada una de estas áreas. La pérdida de esta función clínicamente se manifiesta en pacientes con contusión grave, erupciones petequiales o sangrado prolongado posteriores a traumatismos menores, como punción venosa o tratamiento dental. Los pacientes que presentan estos problemas deben sujetarse a una evaluación de la función plaquetaria y a cuantificación de la cuenta plaquetaria.

Estructura y función La función y la estructura de la plaqueta se relacionan estrechamente. La membrana externa de la plaqueta es un organelo muy funcional, que contiene diferentes glucoproteínas que atraviesan la membrana celular bilípida estándar. Varias de estas glucoproteínas activan diferentes vías bioquímicas dentro de la plaqueta para inducir algunas funciones requeridas como respuesta normal de la plaqueta. Se ha demostrado que la función plaquetaria anormal se debe a falta de expresión de una o más de esas glucoproteínas (cuadro 30-1 y fig. 30-1). La adhesión

anormal plaquetaria se observa en el síndrome de BernardSoulier, en el cual la glucoproteína de membrana plaquetaria interna ha mostrado ser deficiente. Esta glucoproteína tiene una capacidad de unión específica por el factor de von Willebrand de la proteína plasmática, cubriendo la matriz subendotelial expuesta al plasma, de tal forma que adhiere las plaquetas al sitio de la lesión vascular por medio de la glucoproteína Ib. La deficiencia del complejo de la glucoproteína IIb/IIIa causa una alteración en la capacidad de las plaquetas para agregarse (fig. 30-1). Esta condición se conoce como trombastenia de Glanzman. Éstas y otras glucoproteínas actúan como receptor fisiológico para varios agonistas plaquetarios de peso molecular bajo y alto. Una vez que uno o más de estos receptores glucoproteínicos se han activado, hay una transducción de señales en los organelos internos de la plaqueta. Esto es común que ocurra vía activación de la enzima fosfolipasa C, la cual está expuesta a los extremos internos de las glucoproteínas transmembranales y a la activación por sus respectivos ligandos. En el citoplasma de la plaqueta se encuentran muchas de las estructuras internas encontradas en otras células secretoras; sin embargo, la plaqueta no tiene una gran capacidad para la síntesis de proteínas. La plaqueta contiene un retículo endoplásmico rugoso y aparato de Golgi muy pequeños (fig. 30-2). Contiene el retículo endoplásmico liso extenso, que se señala con frecuencia como “el sistema tubular denso”. El citoplasma también contiene muchos ␣-gránulos y gránulos densos. Estos gránulos contienen una variedad amplia de compuestos químicos implicados en la respuesta inflamatoria y, principalmente, en la aceleración del proceso de la hemostasia localizada. Los ␣-gránulos contienen los factores de coagulación V, VII y el fibrinógeno,

The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker. © 2005 John Wiley & Sons, Ltd.

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CAP. 30

ANÁLISIS DE PLAQUETAS

Cuadro 30-1 Factores implicados en una respuesta plaquetaria Glucoproteína receptora Ligandos

Función plaquetaria

GP IIb-IIIa

Vitronectina La agregación y Factor de von Willebrand adhesión a índices Fibronectina de flujos altos Fibrinógeno GP Ia-IIa Vitronectina Adhesión Factor de von Willebrand Fibronectina Fibrinógeno GMP 140 Varias glucoproteínas Interacción plaqueta (PADGEM) y glucolípidos a leucocito

Figura 30-2 Representación esquemática de la estructura plaquetaria. El diagrama ilustra las estructuras internas principales de una plaqueta discoide. CS, sistema canalicular conectado a la superficie; M, mitocondria de la plaqueta; DTS, sistema tubular denso; DB, cuerpo denso; G, gránulos de la plaqueta; MT, banda circunferencial de los microtúbulos.

mientras que el ATP tiene un efecto inhibidor sobre el ADP y es, por tanto, una parte del mecanismo de control para localizar la formación del trombo. La 5-HT es otro agregador plaquetario de gran alcance; la membrana de la plaqueta contiene numerosos receptores para 5-HT. Estos receptores son miembros de la superfamilia de las proteínas G, acoplados a un neurotransmisor y un receptor hormonal que se encuentra en las células nerviosas y en el endotelio intestinal en grandes cantidades

Figura 30-1 Representación esquemática de los receptores plaquetarios

junto con factores de crecimiento para ayudar a la reparación vascular, fundamentalmente el factor de crecimiento derivado de la plaqueta (PDGF) y el factor de crecimiento endotelial (EGF). Otra sustancia almacenada en los ␣-gránulos es el factor IV plaquetario; es un compuesto que se analiza y es uno de los principales factores para determinar la respuesta de liberación plaquetaria. Los gránulos densos contienen una proporción grande de nucleótidos plaquetarios disponibles, principalmente difosfato y trifosfato de adenina y guanina, junto con iones calcio y magnesio y 5-hidroxitriptamina (5-HT). El ADP es un acelerador importante para la agregación plaquetaria,

Conteo plaquetario Es importante obtener una cuenta de plaquetas exacta antes de proceder a las pruebas de la función plaquetaria. La cantidad de plaquetas puede estimarse a partir de un frotis sanguíneo analizado por microscopia y teñido con Romanowski. La morfología de la plaqueta que muestre el tamaño y la granularidad es útil en los desórdenes relacionados con plaquetas grandes, como en el síndrome de Bernard-Soulier. Las máquinas automatizadas para cuenta sanguínea con capacidad de conteo de plaquetas forman parte del equipo rutinario de laboratorio (véase el cap. 27). La exactitud más grande de las técnicas manuales permite medir cuentas tan bajas como 5 ⫻ 109/L y superiores a 1 000 ⫻ 109/L.

INVESTIGACIONES DE LA AGREGACIÓN PLAQUETARIA

Anticuerpos plaquetarios La disminución de la cuenta plaquetaria ocurre por una falla en la producción medular (p. ej., después de la quimioterapia citotóxica) o por un aumento en el consumo de la plaqueta. La producción del anticuerpo dirigido en contra de algún componente de la membrana de la plaqueta o para una sustancia asociada a la membrana plaquetaria puede dar lugar a un incremento del secuestro por el bazo. La presencia de inmunoglobulinas dirigidas contra la membrana plaquetaria es, por tanto, una investigación importante. La presencia de la inmunoglobulina plasmática dirigida contra las plaquetas no se correlaciona con la gravedad clínica de la trombocitopenia autoinmunitaria, mientras que la concentración de la inmunoglobulina ligada a la plaqueta es un mejor marcador de la actividad patológica. La demostración de la inmunoglobulina unida a la plaqueta es más difícil que identificar la inmunoglobulina relacionada a la superficie del eritrocito. Debido a las cantidades bajas de plaquetas y a la dificultad para visualizarlas, se recomienda el método que emplea un citómetro de flujo y combinar el reactivo de la globulina antihumana con un colorante fluorescente. Se prepara un plasma rico en plaquetas por centrifugación a baja velocidad. Este plasma se centrifuga a gran velocidad en presencia de un amortiguador que contiene EDTA o algún otro inhibidor plaquetario para formar un botón de plaquetas, el cual es entonces lavado varias veces para eliminar cualquier plasma atrapado que contenga globulinas humanas. Finalmente, las plaquetas son resuspendidas en albúmina bovina al 5%. En seguida una alícuota de plaquetas se mezcla con una globulina antihumana acoplada a isotiocianato de fluoresceína u otro fluorocromo detectable por citometría de flujo. Después de incubar en la oscuridad, las plaquetas se someten a un lavado final con amortiguador PBS EDTA y se resuspenden en una cantidad suficiente de amortiguador para permitir el flujo fácil a través del citómetro de flujo. Las plaquetas del paciente sin colorante fluorescente se usan como un control negativo. Una reacción positiva ocurre cuando el índice fluorescente es más alto en las plaquetas marcadas con el fluorocromo que en aquellas plaquetas sin colorante.

Tiempo de sangrado Una de las pruebas más simples de la función de la plaqueta es el tiempo de sangrado. Se hace una incisión en la piel del antebrazo, con un dispositivo para el sangrado, y se mide el tiempo consumido para que se detenga el sangrado. Para mejorar la reproducibilidad del método, la técnica se realiza haciendo una incisión dual, usando una lanceta cargada por resorte en el área convencional. El resorte tiene una

291

tensión estándar para dar una profundidad reproducible al corte, mientras que un manguito del esfigmomanómetro se infla a una presión seleccionada de 40 mmHg. El tiempo hasta que el sangrado cese es medido por un cronómetro y la detección, limpiando el exceso de sangre del brazo con papel filtro limpio. Cualquier defecto importante de la plaqueta se registra con un tiempo prolongado, como sucede en las alteraciones de la proteína de von Willebrand.

Adherencia plaquetaria La primera etapa fisiológica de la activación plaquetaria es la adherencia de las plaquetas a la matriz subendotelial. La medición de la adherencia de la plaqueta es difícil y es raro que se realice en los laboratorios rutinarios. Se reportan varios métodos que pueden utilizarse para dar una estimación neta de la función de adhesión plaquetaria. El más simple indica tomar una muestra sanguínea citratada sin obstrucción venosa y someterla a un conteo plaquetario. Una alícuota de la muestra se pasa a presión constante sobre un tubo que contiene perlas de cristal estandarizadas, y un segundo conteo plaquetario se realiza en la muestra emergente. Ahora, el porcentaje de adherencia de la plaqueta puede calcularse. Una modificación a esta técnica estándar usa una matriz subcelular como el colágeno y puede semejar un cuadro fisiológico mejor. Los problemas con la reproducibilidad de los resultados restringieron el uso de este método en los laboratorios de investigación, incluso en compañías farmacéuticas que evaluaban la eficacia de los fármacos que modificaban la adherencia o la activación plaquetaria. Un método más complejo implica un sistema para simular la presión venosa normal y requiere la elaboración de un tubo de plástico inerte con un área de matriz subendotelial. La sangre entonces se hace pasar dentro del sistema a tasas fisiológicas normales de flujo sanguíneo.

Investigaciones de la agregación plaquetaria Es probable que la medición de la agregación plaquetaria sea la técnica más común usada en la investigación de los desórdenes plaquetarios. Los estudios de agregación se basan en una técnica fotométrica. La agregación se registra como el cambio en la absorbancia de una mezcla de plasma rica en plaquetas cuando los agregados se forman. Cuanto más grandes son los aglomerados, más pesados son, y cuando se salen de la trayectoria luminosa se detecta una transmisión más alta de la luz. Existen varios agonistas de uso general, incluyendo ADP, adrenalina, colágeno y el antibiótico ristocetina. Esta última es un agonista inusual ya que no tiene ningún efecto directo sobre las plaquetas pero modifica la parte del complejo del factor VIII, conocido

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CAP. 30

ANÁLISIS DE PLAQUETAS

como factor de von Willebrand. Cuando se modifica, esta proteína cambia de una estructura globular a una lineal. La estructura lineal entonces une a varias plaquetas y facilita la seudoagregación. Una respuesta anormal a la ristocetina se observa en pacientes con cambios cuantitativos y cualitativos en la proteína de von Willebrand.

Analizador PFA-100 para la función plaquetaria El dispositivo PFA 100 (Dade) se utiliza cada vez más en laboratorios de manera rutinaria para medir el tiempo de sangrado inducido por colágeno/epinefrina. El dispositivo mide la formación del tapón plaquetario sobre un tubo capilar revestido de colágeno bajo tensión del flujo sanguíneo. La sangre venosa citratada se conduce a través de un tubo capilar para que entre en contacto con una membrana cubierta con epinefrina, y se activen las plaquetas. Entonces la sangre se aspira a través de una abertura de precisión en la membrana, mientras las plaquetas comienzan a adherirse a la circunferencia hasta formar un tapón estable que ocluye la abertura. El tiempo de sangrado es, por tanto, el tiempo transcurrido para que deje de pasar la sangre a través de la abertura, y una medición de la formación del tapón plaquetario ex vivo. Esta metodología representa en la actualidad la primera línea de investigación plaquetaria en muchos laboratorios.

Investigaciones sobre la liberación plaquetaria Las técnicas que estudian la liberación de la plaqueta pueden dividirse en dos, las que utilizan radioisótopos y las que emplean la producción de luz usando la enzima luciferinasa. Las técnicas isotópicas es posible realizarlas en dos formas. Las plaquetas pueden incubarse con un radioisótopo que pueda incorporarse dentro de la molécula bajo investigación, tal como 5-hidroxitriptamina (5-HT) marcada con 14C para observar la liberación de 5-HT. En estos métodos, el plasma rico en plaqueta se incuba durante un periodo con un compuesto radiactivo óptimo. Las plaquetas entonces se separan del plasma y el exceso de radioisótopo se elimina. Para hacer esto, las plaquetas se centrifugan mediante un gradiente de densidad con albúmina, dejando la pastilla de plaquetas en el fondo y el plasma radiactivo en la parte superior. Después la pastilla de la plaqueta se suspende de nuevo en un amortiguador, se lava otra vez y se cuenta. Después de la agregación plaquetaria con un agonista potente, el plasma pobre en plaquetas también se cuenta y la cantidad de radiactividad en el plasma pobre en

plaquetas se expresa como un porcentaje de la actividad de una muestra llena de plaquetas. Una segunda técnica que usa radioisótopos se emplea para realizar un ensayo radioinmunitario (RIA). Con esta metodología el compuesto bajo investigación se mezcla con una porción del mismo compuesto marcado con un trazador radiactivo. Se agrega a esta mezcla un anticuerpo específico para el compuesto bajo investigación. Después de la incubación, el compuesto ligado al anticuerpo se separa del que no está unido, generalmente por la adición de carbón activado y luego por una centrifugación. Es posible cuantificar la radiactividad en el sedimento o en el sobrenadante libre. Debido a que el anticuerpo se liga en muestras radiomarcadas y no radiomarcadas en igual cantidad, la proporción de radiactividad ligada por el anticuerpo es inversamente proporcional a la cantidad del compuesto en el plasma bajo investigación. El método se cuantifica usando concentraciones conocidas de plasma control para construir un gráfico y, entonces, las lecturas para las muestras se miden a partir del gráfico. La quimioluminiscencia es otra técnica usada en la investigación de la reacción de liberación de la plaqueta. Ésta se basa en la misma reacción química que ocurre en la luciérnaga, donde el ATP y la luciferinasa reaccionan con la luciferina para producir fotones de luz. La reacción depende de la cantidad de ATP que se produce. Para la reacción plaquetaria, se agregan luciferinasa y luciferina a un vial de la reacción junto con compuestos que liberan la plaqueta. La cantidad de ATP en el vial de la reacción determina la cantidad de luz producida. Una producción más alta de luz resulta de una liberación más elevada de ATP a partir de las plaquetas.

Citometría de flujo La citometría de flujo se utiliza cada vez más para investigar la función plaquetaria en presencia de anticuerpos dirigidos contra antígenos específicos expresados en las plaquetas. La metodología para la citometría de flujo se discute en el capítulo 32. Para las investigaciones de la plaqueta hay dos proteínas principales que pueden identificarse; las requeridas para la unión de la plaqueta a la pared celular y las proteínas necesarias para formar agregados plaquetarios. La glucoproteína Ib es un antígeno de superficie que se requiere para unir las plaquetas a la matriz subendotelial vía el factor de von Willebrand. La glucoproteína IIb/IIIa es uno de los componentes principales requeridos para la reacción de agregación plaquetaria. Un déficit de la función de la plaqueta se puede, por tanto, identificar usando anticuerpos monoclonales dirigidos contra cualesquiera de estas proteínas. Para investigar las alteraciones en glucoproteínas asociadas a la membrana plaquetaria, se prepara un plasma

TROMBOELASTOGRAMA

rico en plaquetas por centrifugación lenta. El plasma entonces se diluye en fluido plasmático pobre en plaquetas o en albúmina para obtener una cuenta plaquetaria aproximada a 1 ⫻ 109/L. Una alícuota de ésta se mezcla con un anticuerpo monoclonal marcado con fluorescencia específico para la glucoproteína. Después de la incubación, la cantidad completa se diluye otra vez para dar cerca de 0.5 ml. La muestra se analiza, en seguida, con un citómetro de flujo. Para determinar que es positivo, el índice de fluorescencia debe ser más alto que el de la muestra control con las mismas plaquetas del paciente, sin la presencia del fluorocromo. Las plaquetas son el componente celular más pequeño de la sangre, y no es necesario lisar los eritrocitos o eliminar algún detritus de la muestra, pues es simple el acceso con respecto a las plaquetas que se analizan. Está aumentando el interés sobre el papel de las plaquetas en los desórdenes trombóticos. Esto ha conducido a la investigación de plaquetas para identificar poblaciones activas de plaquetas durante episodios trombóticos, por ejemplo, después de reemplazos de la prótesis de válvula del corazón. Se han identificado dos marcadores importantes de la activación. Uno se debe a los cambios en la conformación de las glucoproteínas membranales, notablemente en las proteínas IIb/IIIa. Este cambio expone sitios al ambiente externo que, en la plaqueta inactiva, se ocultan dentro de regiones enrolladas de las moléculas. Muchos anticuerpos se generan dirigidos contra estos epítopos de la activación. Estos antígenos de la activación sólo son demostrables en las plaquetas que se han activado con las soluciones débiles de trombina y son negativos en las plaquetas sin tratar. Un segundo tipo de proteína de activación se identifica cuando las partes de los ␣-gránulos se expresan sobre la membrana superficial de las plaquetas. Esto sucede cuando los gránulos han pasado por el proceso secretorio y la membrana de éstos se ha incorporado a la membrana externa de la plaqueta. Se les ha nombrado como componente granular derivado de la activación plaquetaria para la membrana externa (PADGEM). Usando anticuerpos dirigidos contra estos marcadores, solos o combinados, y un citómetro del flujo con la técnica discutida antes, es posible determinar la proporción de plaquetas activadas.

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Tromboelastograma Un acercamiento más fisiológico y global a la función plaquetaria se evalúa usando un tromboelastograma que mide la coagulación en función de la temperatura, los factores fibrinolíticos y la función de la plaqueta supervisando las características físicas del coágulo y su capacidad para realizar trabajo mecánico a través de su desarrollo y degradación. Se agrega CaCl2 a la sangre venosa tratada con citrato dentro de una cubeta a temperatura regulada (37°C) que oscila en un ángulo de 4° 45´. Un pistón disponible se coloca dentro de la muestra inmediatamente después de la recalcificación. El torque de la cubeta rotante se transmite al pistón sumergido después de que la relación plaquetafibrina acopla a la cubeta y al pistón. La magnitud del movimiento del pistón depende de la fuerza del acoplamiento, con coágulos fuertes que mueven el pistón directamente dentro de la fase con el movimiento de la cubeta. Cuando el coágulo se contrae o disuelve, las uniones se rompen y disminuye la transferencia del movimiento de la cubeta. Se proporciona información sobre el tiempo de formación del filamento de fibrina, la cinética de la formación del coágulo y la disolución del coágulo. Este acercamiento se utiliza cada vez más en el cuidado intensivo que se establece para vigilar el estado de coagulación.

Lecturas adicionales Ahn YS et al. Activated platelet aggregates in thrombotic thrombocytopenic purpura: decrease with plasma infusions and normalisation in remission. Br J Haematol 1996; 95: 408-415. Chand IF, Keiffer NA, Phillips BR. Platelet membrane glycoproteins. In Haemostasis and Thrombosis; 3rd ed. 1994: Lippincott, London. Dacie JV, Lewis SM (eds). Basic haematological techniques. In Practical Haematology, 7th edn. 1991: Churchill Livingstone, London. Rosenfield CS, Nichols G, Bodensteiner DC. Flow cytometric measurement of antiplatelet antibodies. Am J Clin Pathol 1987; 87: 518-522. White JG. Platelet ultrastructure. Haemostasis and Thrombosis, 2nd edn. 1987: Churchill Livingstone, London.

31 Servicio transfusional del hospital Steven Walton y Peter E Rose

Un servicio de transfusion sanguínea del hospital emprende tres investigaciones serológicas importantes: a) identificar el grupo sanguíneo de un paciente; b) detectar e identificar los anticuerpos irregulares, incluyendo aquellos que inducen anemia hemolítica; c) proporcionar componentes sanguíneos compatibles con los pacientes.

Identificación del grupo sanguíneo Los métodos de laboratorio aplicados a la serología de la transfusión están cambiando muy rápido para satisfacer una necesidad creciente de simplificar y automatizar muchos aspectos del servicio. Los principios de la serología, sin embargo, siguen siendo los mismos. Hay aproximadamente 100 antígenos reconocidos en la membrana del eritrocito, la presencia de los cuales pueden identificarse por la aglutinación de los eritrocitos al exponerse con el anticuerpo o el antisuero correspondiente. La mayor parte de los antígenos del grupo sanguíneo surgen naturalmente, y la exposición del antígeno puede estimular una respuesta primaria con anticuerpos en una persona que carece del antígeno. El aloanticuerpo resultante es específico para ese antígeno, y la exposición adicional al antígeno estimula una respuesta rápida y prolongada del anticuerpo, con el potencial de inducir una reacción significativa de transfusión. Una hemólisis intravascular rápida se produce por la unión del anticuerpo (por lo general, IgM) al antígeno y activación de la cascada del complemento. Esto resulta en incompatibilidad ABO cuando el anti-A o el anti-B, naturalmente presente en el suero del receptor, se expone al antígeno apropiado. Es normal que un individuo genere anticuerpos que surgen de modo natural contra los antígenos AB ausentes en sus propios eritrocitos,

debido a la estimulación del mismo antígeno encontrado en otras sustancias biológicas, tales como polen o bacterias. Un grupo sanguíneo individual puede determinarse agregando directamente los antisueros específicos a los eritrocitos de prueba y de manera indirecta con una adición de eritrocitos de especificidad antigénica conocida a los sueros de prueba. Para determinar un grupo sanguíneo de un paciente se requiere la caracterización de los antígenos del eritrocito. Para determinar el grupo sanguíneo de forma rutinaria, es necesario identificar los antígenos A, B y D. La gente que expresa el antígeno A en las células no produce anti-A pero puede producir el anti-B. La gente que expresa el antígeno B no produce normalmente el anti-B pero puede producir el anti-A, mientras que el grupo O no expresa el antígeno A o el B. Históricamente, la identificación del antígeno se realizó usando anticuerpos purificados de pacientes previamente tipificados. Hoy en día, la mayor parte de los anticuerpos de tipificación son anticuerpos monoclonales modificados con químicos. Para su facilidad de empleo, los anticuerpos comerciales tienen un tinte coloreado específico agregado a los anticuerpos anti-A y anti-B. Un método indirecto para comprobar el grupo sanguíneo de un paciente es hacer reaccionar el suero de un paciente, que contiene los anticuerpos, con células de especificidad conocida ABO, lo cual da un grupo contrario o inverso. Así, el suero de un paciente del grupo A reacciona con las células B, los pacientes del grupo B reaccionan con las células A, y los pacientes del grupo O reaccionan con las células A y B. Los escasos pacientes que poseen los antígenos A más B no reaccionan con ninguna célula. Una revisión adicional y parte de la investigación para los anticuerpos irregulares es colocar el suero del paciente con las células del grupo O, que no deben reaccionar, independientemente del grupo sanguíneo del paciente.

The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker. © 2005 John Wiley & Sons, Ltd.

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CAP. 31

Cuadro 31-1 Grupo Rh⫹

A A Rh⫺ B Rh⫹ B Rh⫺ AB Rh⫹ AB Rh⫺ O Rh⫹ O Rh⫺

SERVICIO TRANSFUSIONAL DEL HOSPITAL

Resultados esperados de los grupos sanguíneos comunes

Anti-A

Anti-B

Anti-AB

Células A

Células B

Células O

Anti-D1

Anti-D2

⫹ ⫹ ⫺ ⫺ ⫹ ⫹ ⫺ ⫺

⫺ ⫺ ⫹ ⫹ ⫹ ⫹ ⫺ ⫺

⫹ ⫹ ⫹ ⫹ ⫹ ⫹ ⫺ ⫺

⫺ ⫺ ⫹ ⫹ ⫺ ⫺ ⫹ ⫹

⫹ ⫹ ⫺ ⫺ ⫺ ⫺ ⫹ ⫹

⫺ ⫺ ⫺ ⫺ ⫺ ⫺ ⫺ ⫺

⫹ ⫺ ⫹ ⫺ ⫹ ⫺ ⫹ ⫺

⫹ ⫺ ⫹ ⫺ ⫹ ⫺ ⫹ ⫺

Es importante incluir controles negativos apropiados, como células del propio paciente o células O. Las células que se utilizan como control son necesarias para identificar las reacciones que producen los anticuerpos fríos en la muestra, excepto los anti-A y anti-B. El sistema rhesus (Rh) Es el segundo sistema más importante de grupos sanguíneos por identificar. Diferente a lo que ocurre en el sistema ABO, los anticuerpos no están presentes en forma natural en ausencia del antígeno; sin embargo, los anticuerpos pueden formarse con facilidad después de la exposición de células rhesus positivas (Rh+) en un receptor huésped rhesus negativo (Rh¯). Los anticuerpos formados, por lo general IgG, pueden cruzar la barrera placentaria, ocasionando que en el segundo o subsecuentes embarazos, en los cuales la madre es Rh¯ y el feto Rh+, desarrolle la enfermedad hemolítica del recién nacido (HDN). Es, por tanto, importante que se realicen todos los esfuerzos para evitar la sensibilización de las mujeres en edad de tener hijos al antígeno D. Los exámenes de grupo sanguíneo rhesus se realizan por duplicado, empleando un anticuerpo IgM monoclonal anti-D. Los controles positivos y negativos se incluyen en cada lote de pruebas y los resultados deben evaluarse por microscopia, después de la centrifugación de los tubos, por 1 min a una velocidad baja. En el Reino Unido, las directrices nacionales recomiendan el uso de dos reactivos anti-D diferentes. El antígeno D es un antígeno complejo compuesto de muchos subantígenos (epítopos) diferentes. Los anticuerpos monoclonales tienen una especificidad elevada y pueden reaccionar a epítopos simples; por tanto, si el epítopo particular al cual el reactivo reacciona está ausente se obtiene un resultado negativo falso. Usando estos ocho reactivos (anti-A, anti-B, anti-AB, anti-D, anti-D2, células A, células B y células O), es posible identificar a los grupos sanguíneos comunes (cuadro 31-1).

Métodos para identificar el grupo sanguíneo Hay muchos métodos que usan estos reactivos básicos para conocer el grupo de los pacientes, los cuales pueden dividirse en cinco categorías amplias: a) métodos basados en tubos individuales, convencionales, que requieren cerca de una hora de incubación a una temperatura óptima de 16°C; b) métodos en tubos individuales mejorados (para determinaciones de grupos sanguíneos rápidamente), que requieren siempre centrifugación, se realizan sólo para la tipificación de la célula; c) métodos que usan placas de microtitulación; d) métodos que usan una matriz de fase sólida; e) métodos automáticos basados en los principios de flujo continuo. El método elegido depende del volumen de trabajo que se emprenda y de su urgencia. Los métodos rápidos empleados con regularidad comprueban sólo los antígenos del paciente sin un análisis completo. La visualización de los resultados varía dependiendo del método empleado. Para los métodos de tubo y de microtitulación es necesaria la aglutinación de los eritrocitos, que puede interpretarse micro o macroscópicamente. Las metodologías de microtitulación y de grupo rápido tienden a utilizar la visualización macroscópica, mientras los métodos no realzados se emplean para ser interpretados por microscopia. Métodos de microtitulación Las metodologías de microtitulación permiten que se hagan fácilmente grupos múltiples en lotes. Una placa de microtitulación estándar se forma de 96 celdillas en un bloque plástico sólido, alineado en 12 hileras de ocho. Usando ocho reactivos para un grupo completo, la sangre de 12 pacientes puede concentrarse en una placa. La visualización de todos los grupos sanguíneos en la placa es rápida, usando contraluz para ver los resultados positivos y negativos. Hay sistemas disponibles con computadoras y microrrobótica para automatizar o semiautomatizar los

TAMIZAJE DE ANTICUERPOS

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Figura 31-1 Análisis del grupo sanguíneo ABO del sistema en gel con una muestra del grupo B Rh⫹. Reproducida con permiso de DiaMed-GB Ltd.

sistemas para conocer el grupo sanguíneo por microtitulación. Estos sistemas incorporan lectores de placas de microtitulación que pueden programarse para identificar los grupos sanguíneos por patrón de reactividad de la placa de microtitulación.

el volumen de la carga de trabajo. Las técnicas rápidas se realizan para identificar el grupo sanguíneo del paciente en una urgencia cuando se requiere la sangre para la compatibilidad cruzada (cross-matching), permitiendo que la sangre de un grupo sanguíneo compatible se seleccione sin demora.

Sistemas en gel

Tamizaje de anticuerpos Los sistemas en fase de gel se basan en la captura de células que reaccionan en una matriz sólida o semisólida, con los resultados negativos que se movilizan a través del gel. Esto ocurre para colocar los anticuerpos monoclonales, que se mencionan antes, químicamente unidos a la matriz. Así, las células que contienen el antígeno correspondiente se unen (atrapadas en la matriz) cuando son empujadas para movilizarse en el gel al utilizar centrifugación (fig. 31-1). Este método es en particular útil para conocer el grupo sanguíneo de pacientes en riesgo elevado de portar en la sangre microorganismos, como el de hepatitis o el VIH. El alto costo de fabricar los geles que incorporan los anticuerpos específicos necesita considerarse al incluir esta metodología en la práctica de rutina del laboratorio. Sistemas automatizados Métodos automáticos que usan equipo que puede utilizar la identificación positiva de la muestra y se requieren en laboratorios con mucha carga de trabajo. Al utilizar un equipo automático reduce el tiempo de manipulación de la muestra, y los pacientes se benefician de la eliminación de errores administrativos, ya que los resultados pueden reportarse directo desde la lectura sin transcripción. El gran desembolso de capital requerido encarece los sistemas automáticos, es decir, son demasiado costosos para los laboratorios con una carga de trabajo baja. La mayor parte de los laboratorios utiliza dos técnicas, un sistema rápido para el análisis urgente y un sistema rutinario de lote para

El tamizaje de los sueros del paciente para la presencia de cualquier anticuerpo irregular ahora es una parte rutinaria del banco de sangre de los hospitales. Es raro en la actualidad emprender una identificación del grupo sanguíneo sin el tamizaje del anticuerpo al mismo tiempo, con la excepción posible de las muestras neonatales, donde la producción del anticuerpo no ha comenzado y el tamaño de muestra es pequeño. Para muchos pacientes que se someten a procedimientos quirúrgicos de urgencia y electivos, la investigación del grupo sanguíneo y el tamizaje del anticuerpo es todo lo que se recomienda. Esta política ha reducido mucho el desperdicio de sangre, con la compatibilidad sanguínea cruzada reservada para los procedimientos con una probabilidad mayor de 30% de requerimiento celular. Para los pacientes en quienes un anticuerpo significativo clínico se identifica con el procedimiento de la prueba de tamizaje, una compatibilidad cruzada completa es necesaria. Existen diferentes propiedades fisicoquímicas exhibidas por diferentes anticuerpos que son importantes en su identificación. Primero, diversos anticuerpos del grupo sanguíneo se distinguen uno de otro con base en que algunos anticuerpos aglutinan eritrocitos mejor con bajas temperaturas (anticuerpos fríos), mientras otros son activos a 37°C. Los anticuerpos fríos con frecuencia son anticuerpos IgM, y es posible que no sean detectables o clínicamente significativos a temperaturas más altas. Algunos anticuerpos que surgen en forma natural, como los anti-A y anti-B, aun reaccionan a 37°C; sin embargo, el título será mucho más alto de

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CAP. 31

SERVICIO TRANSFUSIONAL DEL HOSPITAL

Figura 31-2 Ejemplo de células para el tamizaje de anticuerpos. Reproducida con permiso de DiaMed-GB Ltd.

0 a 4°C. Los anticuerpos calientes son, por lo general, IgG y aglutinan eritrocitos más rápido a 37°C. Históricamente, los anticuerpos también se han clasificado como completos o incompletos, dependiendo de la cantidad de aglutinación de eritrocitos suspendidos en una solución salina normal. Los anticuerpos incompletos no aglutinan eritrocitos bajo tales circunstancias, y esto conduce a la búsqueda de otras técnicas para mejorar la sensibilidad. Los eritrocitos suspendidos en 20 a 30% de albúmina bovina pueden ayudar a identificar muchos anticuerpos incompletos. Otros métodos que emplean el polibreno o las células tratadas con enzimas se emplean de rutina. Las enzimas como la tripsina, la papaína, la bromelaína o la ficina se utilizan para eliminar el ácido neuramínico de las superficies de los eritrocitos y reducir la carga negativa, provocando que el anticuerpo incompleto aglutine las células tratadas con enzimas. Las pruebas salinas a temperatura ambiente, los métodos de la albúmina y de la enzima se han reemplazado por la prueba indirecta de antiglobina (IAT). La última prueba muestra una elevada eficacia en identificar clínicamente los anticuerpos significativos, y sin la desventaja de identificar los anticuerpos irrelevantes que pueden dar lugar a un serio retraso en el laboratorio, pues la evaluación y la identificación adicionales del anticuerpo son necesarias. El tamizaje del anticuerpo se emprende al reaccionar los eritrocitos que contienen la mayor parte de los antígenos comunes del grupo sanguíneo con el suero del paciente. Es frecuente mantener una serie de tres muestras celulares, y los antígenos conocidos en cada muestra celular se obtienen de una hoja de información (fig. 31-2). El tamiz del anticuerpo puede realizarse usando cualesquiera de las técnicas que se emplean en el laboratorio, pero con mayor frecuencia la prueba indirecta de antiglobulina se utiliza como el tamiz inicial. Esto es, porque la prueba IAT es la más sensible para la mayor parte de los anticuerpos. Usando los nuevos sistemas en gel, se propone que un tamiz del anticuerpo basado en la IAT negativa y la selección de la sangre ABO Rh compatible sean suficientes para emplear la sangre en un paciente, y la compatibilidad cruzada ya no se requiere tanto. En la mayor parte de los

casos esto es verdad, pero hay un riesgo de que la sangre incompatible pueda usarse en un paciente con anticuerpos a un antígeno raro. Prueba indirecta de antiglobulina La IAT que usa eritrocitos suspendidos en solución salina de baja fuerza iónica (LISS) es el método recomendado para el tamizaje del anticuerpo. En solución salina normal los grupos ionizados tanto en el antígeno como en el anticuerpo se neutralizan parcialmente con iones opuestos cargados en la solución. El tiempo de incubación mínimo para las técnicas de fuerza normal iónica es de 45 min y no es muy recomendado. Si la LISS se utiliza como medio, las reacciones del antígeno y del anticuerpo son más rápidas. La LISS es una solución de glicina más sodio que contiene 0.03 M de cloruro de sodio. Es raro que los autoanticuerpos dependientes de LISS puedan detectarse y, en estas circunstancias, las técnicas de fuerza iónica normal son útiles. Las células de tamizaje que se utilizan en la detección del anticuerpo deben tener expresión homocigota de los antígenos apropiados (Rh, Cc, Ee, Jka, Jkb, Fya, Fyb, Ss). Se espera que el 99.9% de anticuerpos sea detectado, sólo con anticuerpos en los eritrocitos de muy de baja frecuencia que no es posible visualizar. Después de la incubación del suero de prueba con los eritrocitos de tamizaje, las células se lavan para remover cualquier anticuerpo no unido. Cualquier contaminación por globulina libre neutraliza el componente antiglobina en el reactivo antiglobulina, y por tanto debe evitarse. El anti-IgG monoespecífico puede utilizarse sustituyendo un reactivo poliespecífico antiglobulina que contenga sueros anticomplemento, con el método de LISS IAT. Esto evita la susceptibilidad indeseable hacia la interfase de amplitud térmica baja y a los anticuerpos dependientes LISS que están ligados al complemento. Cuando se identifica un anticuerpo irregular, es necesaria la investigación adicional para identificar la especificidad del anticuerpo.

Figura 31-3 Ejemplo de un antigrama mostrando un rango amplio de antígenos. Reproducida con permiso de DiaMed-GB Ltd.

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CAP. 31

SERVICIO TRANSFUSIONAL DEL HOSPITAL

Identificación del anticuerpo Si un resultado positivo se obtiene en cualesquiera de las células de tamizaje del anticuerpo es esencial identificar la especificidad del anticuerpo. Esto requiere hacer reaccionar los sueros con un panel más grande de células tipificadas. Es común que los paneles comerciales contengan 11 tipos de células y se abastezcan con un antigrama de los antígenos correspondientes (fig. 31-3). La identificación del anticuerpo se produce comparando el patrón reactivo del anticuerpo con el patrón de los antígenos. Si la sangre se requiere para transfusión, sólo las unidades negativas para el antígeno correspondiente deben seleccionarse. Como en el tamiz del anticuerpo cualquier método puede utilizarse, pero es mejor comenzar con la misma técnica con la que se obtuvo la reacción positiva en el tamiz del anticuerpo. Con frecuencia esta es la IAT. Si los resultados de este panel son inconcluyentes pueden clarificarse con facilidad repitiendo el panel con una técnica mejorada enzimáticamente. Incluso, si la identificación es aún inconcluyente, debe utilizarse un panel diferente de células. Los resultados no concluyentes pueden requerir la toma de una muestra fresca para verificar que el anticuerpo es verdadero y no un contaminante de la muestra. Si la identidad del anticuerpo continúa como desconocida, es posible que se necesite enviar la muestra al centro de referencia, donde permanece disponible en un panel más grande donador para ayudar a la identificación.

Compatibilidad cruzada La compatibilidad cruzada es el procedimiento realizado para asegurarse que la sangre del donador potencial es compatible con el receptor. Una vez que se obtienen los grupos ABO Rh y el tamiz negativo del anticuerpo, las comparaciones de la sangre pueden hacerse de manera directa. Las unidades donadoras deben, en lo posible, seleccionarse del mismo grupo ABO y Rh. El tipo de producto del eritrocito necesita considerarse; por ejemplo, la sangre completa, el concentrado de eritrocitos, las células con suplemento agregado, pobre o escaso en leucocitos. Esto depende de la condición clínica que se requiere para la transfusión y de la edad del receptor. Además, es necesario verificar que las mujeres menores de 50 años que donan están dando eritrocitos Kell negativos. Esto es necesario porque los anticuerpos producidos contra el antígeno Kell pueden cruzar la barrera placentaria. Las mujeres estimuladas al producir anti-Kell por la transfusión, que se embarazan, pueden tener un bebé que desarrolle anemia hemolítica in utero. Una vez que se selecciona el producto correcto, el procedimiento de compatibilidad cruzada es relativamente

directo, ya que las células del donador recolectadas se lavan y se hacen reaccionar con el suero del receptor. La elección de la técnica es la misma que se emplea para el tamizaje del anticuerpo, pero debe incluir un método indirecto con antiglobulina. Cualquier unidad que da una reacción positiva no debe transfundirse. Son muy raros los casos donde es imposible obtener unidades compatibles, por ejemplo, en pacientes con autoanticuerpos fuertes en el suero. En estos pacientes debe realizarse una autocompatibilidad cruzada (las células del receptor contra el suero del receptor). Las unidades que no exhiben mayor fuerza de reactividad que en el autocruce autoautólogo pueden usarse. Todos los autoanticuerpos deben investigarse más a fondo para identificar especificidad y rango térmico del anticuerpo. Para esto es posible que se requieran técnicas de elución. Métodos de elución Es posible remover los anticuerpos ligados a los antígenos del eritrocito, sin alterar su especificidad antigénica, por un proceso que se denomina elución; son tres procedimientos principales para la elución: temperatura, pH bajo y solventes orgánicos. Temperatura El sistema de temperatura de elución utilizado con más frecuencia consiste en calentar los eritrocitos lavados a 56°C por 5 min. Después de la centrifugación, el sobrenadante contiene los anticuerpos. Con el congelamiento de las células lavadas suspendidas en albúmina se obtiene el mismo sobrenadante hemolizado, que después de la centrifugación está listo para la investigación. Ambos métodos son rápidos y fáciles de montar en cualquier laboratorio. pH bajo Si los eritrocitos lavados se resuspenden en amortiguadores con un pH por abajo de 3.5, los anticuerpos IgG pueden recuperarse de las membranas celulares sin lisis. Aunque el pH bajo es la técnica recomendada de elución, un pH sobre 10 parece dar mejores resultados para los anticuerpos IgM. Solventes orgánicos Aunque los resultados de los eluidos usando éter o xileno son muy buenos para los anticuerpos IgG, los riesgos para

PRÁCTICA DE LA TRANSFUSIÓN

los trabajadores por la exposición a estos solventes restringen su uso a los laboratorios con campanas de extracción. Una vez que la elución está preparada, se le sustituye por el suero en un método de identificación del anticuerpo.

Práctica de la transfusión La práctica actual de la transfusión hospitalaria debe incluir sistemas para minimizar el uso de los productos sanguíneos en lo posible. La transmisión potencial de virus patógenos de la hepatitis B, C, VIH y CMV en productos sanguíneos, junto con un riesgo potencial de la enfermedad de Creutzfeldt Jakob (ECJ), ha promovido la creación de medidas para mejorar la seguridad de los productos sanguíneos. Éstas incluyen sistemas mejorados para la selección del donador, tamizaje viral de rutina, el uso de productos inactivados del plasma y agotamiento de leucocitos de los productos del eritrocito. Las medidas para minimizar el uso de los productos de transfusión incluyen el uso de esquemas de ordenamiento máximo de la sangre, el desarrollo de la práctica de transfusión autóloga y la participación en el sistema que reporta los Riesgos Serios de la Transfusión (SHOT). El último es un sistema de divulgación voluntario del Reino Unido de diversos acontecimientos serios después de la transfusión. Los acontecimientos

301

adversos agudos incluyen las reacciones hemolíticas de la transfusión, infusión de productos sanguíneos contaminados por bacterias, lesión aguda del pulmón relacionada con la transfusión, sobrecarga de fluido, reacciones alérgicas graves o anafilaxis y púrpura postransfusión. Las complicaciones potenciales a largo plazo ocurren por infección viral (véase antes), injerto crónico vs. enfermedad del huésped grave en los inmunosuprimidos, y sobrecarga de hierro. En todos los casos los riesgos de la transfusión necesitan un balance contra los de no recibir los productos sanguíneos. Los pacientes deben, por tanto, tener acceso e informárseles apropiadamente sobre los riesgos.

Lecturas adicionales Guidelines for Pretransfusion Compatibility Procedures in Blood Transfusion Laboratories. Transfusion Med 1996; 6: 273-283. Issitt PD. Applied Blood Group Serology, 3rd edn. 1985: Montgomery Scientific; Miami, FL. Knight RC, DeSilva M. New technologies for red cell serology, Blood Rev 1996; 10: 101-110. Mollison PL, Engelfriet CP, Contreras M. Blood Transfusion in Clinical Medicine, 9th edn. 1993: Blackwell Scientific, Oxford.

32 Citometría de flujo y biología molecular en la hematología Ian Chant

Introducción La utilidad diagnóstica de la citometría de flujo y de la biología molecular continúa extendiéndose dentro de diversas áreas de la hematología clínica. La combinación de una aproximación inmunobiológica y molecular al diagnóstico y a la vigilancia del paciente ha demostrado ser más útil respecto de las neoplasias sanguíneas que en cualquier otra área de la biología del cáncer. En la citometría de flujo, el desarrollo de nuevos analizadores automatizados, de mesa de trabajo y las combinaciones de anticuerpos monoclonales disponibles en el comercio permite una aproximación multiparamétrica al diagnóstico. Con ello se logra una definición exacta de la inmunofenotipificación de células específicas. La acumulación de datos de inmunofenotipificación es importante, no sólo desde un punto de vista del diagnóstico sino también en términos de la evaluación pronóstica. En diferentes neoplasias hematológicas, la expresión o la ausencia de ciertos antígenos muestra una importancia pronóstica. Además, la citometría de flujo ahora se utiliza en la vigilancia del tratamiento, en particular en términos de la detección de enfermedad residual mínima. De manera similar, la biología molecular se continúa extendiendo como herramienta indispensable en el diagnóstico y vigilancia de la enfermedad. Las tecnologías moleculares más importantes de la hematología de diagnóstico son la hibridación in situ fluorescente (FISH) y las metodologías de la reacción en cadena de la polimerasa

(PCR). Las estrategias moleculares son únicas en la detección de alteraciones genéticas específicas que se observan en las neoplasias sanguíneas. Además, la demostración de la clonalidad en los desórdenes linfoproliferativos se consigue con técnicas moleculares. La importancia de un estudio del fenotipo inmunológico y molecular combinado para el diagnóstico de la leucemia y del linfoma se demuestra en una publicación reciente de la Organización Mundial de la Salud (OMS), que las clasifica en neoplasias hematopoyéticas y linfoides. Este sistema relaciona clasificaciones anteriores con nuevos datos generados a partir de la citometría de flujo y de la biología molecular, al incorporarlos dentro de un sistema con importancia clínica. Esto se ejemplifica por el desarrollo de las modalidades del tratamiento enfocadas a las alteraciones genéticas específicas. En otras áreas de la hematología, la citometría de flujo y la biología molecular continúan evolucionando como herramientas indispensables para el diagnóstico clínico. La base genética de las hemoglobinopatías se continúa esclareciendo, mientras que las técnicas moleculares son cada vez más importantes en el diagnóstico de las coagulopatías. En este capítulo se delinean los principales usos de estas dos tecnologías en el laboratorio de hematología y se ilustra cómo la combinación de la información inmunobiológica y molecular produce un profundo impacto sobre el diagnóstico y la comprensión de la biología de las alteraciones hematológicas.

The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker. © 2005 John Wiley & Sons, Ltd.

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CAP. 32

CITOMETRÍA DE FLUJO Y BIOLOGÍA MOLECULAR EN LA HEMATOLOGÍA

Citometría de flujo e inmunofenotipificación El uso más importante de la citometría de flujo en el laboratorio de hematología diagnóstica es la identificación del linaje celular en leucemias y linfomas. La expresión de antígenos de superficie celular que dependen del linaje y de la diferenciación permite el uso de anticuerpos monoclonales específicos, marcados con fluorocromos, para detectar estos antígenos. Los anticuerpos monoclonales que reconocen epítopos específicos de antígenos son identificados por el grupo de designación numérica (CD). En el momento de escribir este capítulo, se han asignado cerca de 250 números de CD y muchos de éstos son en particular importantes en la inmunofenotipificación de células hematopoyéticas. La aproximación al diagnóstico de la leucemia y del linfoma utiliza un panel de anticuerpos monoclonales que identifica el linaje específico de una población celular, y provee un fenotipo inmunológico específico para una supuesta población de células malignas. Junto con la información morfológica y molecular, este dato de la citometría de flujo es una herramienta esencial en la clasificación de la célula maligna.

Inmunofenotipificación de leucemias agudas El objetivo de la fenotipificación inmunológica en una leucemia recién diagnosticada es sobre todo discriminar entre la leucemia mieloide y la linfoide. Esto puede conseguirse usando un panel relativamente pequeño de anticuerpos monoclonales, que detectan antígenos específicos del linaje expresados en células mieloides o linfoides inmaduras, discriminando leucemias mieloides agudas (AML) de leucemias linfoblásticas (ALL). El panel inicial del linaje primero debe diferenciar la célula B de la célula T en ALL y permitir la definición adicional del subtipo, por ejemplo, de marcadores monocíticos y megacariocíticos en AML. El cuadro 32-1 muestra un panel típico de la primera línea del anticuerpo para el diagnóstico de la leucemia aguda. Este panel inicial incluye el linaje B (CD10, CD19, CD20, CD22), el linaje T (CD2, CD3, CD7) y los marcadores mieloides asociados (CD13, CD33, CD117), otros más que ofrecen la información sobre el grado de diferenciación celular (TdT, CD34).

Leucemias mieloides agudas Los marcadores mieloides específicos más útiles usados para discriminar las células mieloides de aquellas de origen linfoide son CD13, CD33 y CD117. La expresión de antígenos linfoides está ausente en células AML, a excepción de CD7 y de Tdt, que pueden ser positivos en pocos casos.

Cuadro 32-1 Un panel de anticuerpos usados como primera línea para determinar el linaje y la diferenciación en leucemias agudas Linaje linfoide

CD3 CD7 CD19 CD10 CD79

Linaje mieloide

Linaje sin restricción

CD13 CD33 CD14 CD64 CD15 CD117 MPO HLA-DR CD34 Tdt

Pan-T (también CD3 citoplásmico) Pan-T Pan-B Pre-B Pan-B (expresión citoplásmica) Granulocitos, monocitos Progenitor mieloide, monocitos Monocitos Monocitos Granulocitos, monocitos Progenitor mieloide Mieloperoxidasa Célula progenitora Célula progenitora (Expresión nuclear)

Cuadro 32-2 Clasificación de leucemias mieloides agudas mediante el sistema Francés-Americano-Británico (FAB) AML M0 AML Ml AML M2 AML M3 AML M4 AML M5a AML M5b AML M6 AML M7

AML con inmadurez AML con maduración mínima AML con maduración Leucemia promielocítica aguda Leucemia monocítica aguda Monoblástica aguda sin diferenciación Monoblástica aguda con diferenciación Eritroleucemia aguda Leucemia megacariocítica

Las AML son clasificadas por el sistema Francés-Americano-Británico (FAB) sobre fundamentos morfológicos y citoquímicos (cuadro 32-2). En AML, aunque no hay marcadores específicos que distingan los subtipos AML M1-M5, la inmunofenotipificación se correlaciona razonablemente bien con el subtipo FAB, algunos marcadores son expresados preferentemente dentro de ciertos grupos. Éstos incluyen los marcadores monocíticos CD14 y CD64 en las categorías M4 y M5, mientras que los subtipos más raros M6 y M7 de AML pueden caracterizarse por su expresión de antígenos específicos para el eritrocito y para la plaqueta, respectivamente. Las células AML M0 carecen de diferenciación y expresan antígenos mieloides más CD34, el marcador hematopoyético de la célula embrionaria, mientras que en AML M1 hay generalmente sólo expresión de antígenos mieloides. El cuadro 32-3 enumera los inmunofenotipos generales vistos en AML en relación con su clasificación FAB.

305

CITOMETRÍA DE FLUJO E INMUNOFENOTIPIFICACIÓN

Cuadro 32-3 CD Linaje mieloide CD11b CD13 CD14 CD15 CD33 Linaje T CD2 CD3 CD5 CD7 Linaje B CD10 CD19 CD20 Linaje eritroide Glucoforina A CD71 Linaje megacariocito CD41 CD42 CD61 Célula embrionaria CD34 CD38 No dependiente de linaje HLA-DR

Inmunofenotipos típicos en AML correlacionados con la clasificación FAB

Anticuerpos

M1, M2

M3

M4, M5

M6

M7

    

    

    

    

    

T11, Leu-5b T3, Leu-4 T1, Leu-1 3A1, Leu-9

   

   

   

   ±

   

CALLA, J5 B4, Leu-12 B1, Leu-16

  

  

  

  

  

D2.10 T9

 

 

 

 

 

gpIIb/IIIa gpIb gp/IIIa

  

  

  

  

  

MY10, HPCA-1 Leu-17

 

 

 

 

 











Mo1, Leu 15 MY7, Leu-M7 MY4, Mo2, Leu-M3 Leu-M1 MY9, Leu-M9

Ia, 13

La clasificación reciente de la OMS de AML pone énfasis sobre las características morfológicas, inmunofenotípicas y moleculares, por lo que la AML se clasifica de acuerdo con las alteraciones genéticas recurrentes específicas, y éstas se relacionan a menudo con perfiles inmunofenotípicos específicos. En casos de AML, donde no son evidentes tales alteraciones genéticas, éstos se describen según su grado de diferenciación y/o de diferenciación a lo largo de linajes monocítico, megacariocítico o eritroide. Así que, el inmunofenotipo es esencial en la caracterización de las células leucémicas de la misma forma que su utilización en el sistema FAB.

de los primeros antígenos superficiales en el desarrollo de la célula T es CD7, presente en todas las células T-ALL. Las leucemias linfoblásticas de célula B pueden clasificarse dentro de tres grupos, de acuerdo a su grado de maduración, que se relaciona con un fenotipo generalmente característico. ALL de célula nula, una leucemia inmadura, tiene células que expresan marcadores de célula B (CD19, CD22) más TdT y CD34. La ALL común se distingue por la presencia de la expresión de CD10, junto con los antígenos de célula B y TdT. Las células B-ALL expresan todos los antígenos de célula B comunes pero se distinguen por la ausencia de TdT y de CD10.

Leucemias linfoblásticas agudas (ALL)

Desórdenes linfoproliferativos crónicos

Las leucemias agudas de origen linfoide se clasifican rutinariamente según su origen, de célula B o de célula T. Las células ALL de célula T expresan uno o más de los antígenos de célula T (CD2, CD3, CD7) y Tdt. El antígeno CD3 se expresa en el citoplasma en los inicios de la maduración de la célula T y es el marcador más útil para T-ALL. Uno

La citometría de flujo es una herramienta esencial en el diagnóstico de desórdenes linfoproliferativos cronicos o maduros. La inmunofenotipificación se diseña para demostrar la naturaleza de la célula B o T de la célula maligna, y para la clonalidad potencial de la expresión superficial de la cadena ligera  o  sobre las células B. La

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CAP. 32

CITOMETRÍA DE FLUJO Y BIOLOGÍA MOLECULAR EN LA HEMATOLOGÍA

aproximación, es para usar un panel de primera línea de anticuerpos específicos para un número de antígenos de célula B y T, que identifican la clonalidad o la expresión del antígeno anormal. Un panel de segunda línea puede aplicarse en forma selectiva de acuerdo a estos resultados, más algunas indicaciones morfológicas o clínicas pertinentes. El cuadro 32-4 ilustra paneles de primera y segunda línea típicos. Las malignidades de la célula B representan la mayor parte de los desórdenes linfoproliferativos maduros, y éstos se relacionan por lo general con patrones particulares de la expresión del antígeno de célula B. Además de la presencia o ausencia de ciertos antígenos, la interpretación de datos inmunofenotípicos necesita considerar la intensidad de la expresión del antígeno, demostrada por

citometría de flujo como intensidad de la fluorescencia. Por ejemplo, en la leucemia linfocítica crónica (CLL), las células B maduras coexpresan CD5 (un antígeno normalmente presente en las células B) más CD23. En CLL, los antígenos CD19 y CD20 de célula B están subregulados, al igual que la expresión de cadena ligera superficial. Por el contrario, las células del linfoma de linaje B muestran fuerte reactividad con CD19, CD20 y con cadenas ligeras superficiales  o . En casos donde un diagnóstico de leucemia de célula pilosa se sospeche sobre bases morfológicas o clínicas, se utilizan anticuerpos para CD11c, CD25 y CD103, mientras en casos potenciales de posible proliferación celular linfoplasmacítica o plasmática, se incluyen anticuerpos contra CD38 y CD138. Los desórdenes linfoproliferativos de la célula T exhiben que un traslape de la expresión del antígeno CD y las células malignas muestran a menudo pérdida del antígeno o la expresión anormal de los marcadores de célula T. Ciertos marcadores son característicos, como la expresión importante de CD25 en la leucemia de célula T del adulto (ATLL), el incremento de reactividad con CD7 en la leucemia prolinfocítica de célula T del adulto, y la expresión de CD56 en la leucemia del linfocito granular grande (LGL). En los desórdenes de las celulas B y T, el diagnóstico se basa no sólo en el patrón inmunofenotípico revelado por los paneles del anticuerpo, sino también refiere los niveles de la expresión del antígeno, como se detecta por la intensidad de la fluorescencia durante el análisis citométrico de flujo. Esto se ilustra en el cuadro 32-5, que muestra los patrones inmunofenotípicos vistos en estos desórdenes.

Cuadro 32-4 Un panel de primera línea para la investigación de una linfocitosis para establecer el linaje celular B y T

Linaje T

Linaje B

Anticuerpo

Linaje

CD2 CD3 CD4 CD8 CD7 CD19 CD20 CD22 CD23 CD103  SIg  SIg

Células T, células NK Pan-T Colaborador T Supresor T Pan-T Pan-B Pan-B B madura B inmadura, CLL Célula pilosa

Cuadro 32-5 Patrones inmunofenotípicos en los desórdenes linfoproliferativos de célula B y T. Desórdenes linfoproliferativos de célula B Desórdenes linfoproliferativos de célula B CLL PLL NHL (difuso) Linfoma de célula manto Linfoma folicular Leucemia de célula pilosa Desórdenes linfoproliferativos de célula T T-PLL L-GL Célula de Sézary

CD5

CD 10

CD19

CD20

CD23

CD25

FMC7

o

     

     

     

(w)  (s)  (s)  (s)   (s)

     

     

     

(w)  (s)  (s)  (s)  (s)  (vs)

CD2

CD3

CD4

CD5

CD8

CD16

CD25

CD56

  

  

  

  

  

  

  

  

Reactividad débil (w); reactividad fuerte (s); reactividad muy fuerte (vs); leucemia linfocítica crónica (CLL); leucemia prolinfocítica (PLL); linfoma no Hodgkin (NHL); leucemia linfocítica granular (L-GL).

307

BIOLOGÍA MOLECULAR EN LA HEMATOLOGÍA

Valoración de la función plaquetaria por citometría de flujo

Biología molecular en la hematología

La disfunción plaquetaria se observa en una variedad de desórdenes sistémicos, incluyendo enfermedad renal, insuficiencia hepática, desórdenes del tejido conectivo, desórdenes mieloproliferativos y mielodisplásicos, malignidad y enfermedad cardiovascular. La disponibilidad de anticuerpos monoclonales que reconocen antígenos específicos tanto en la superficie de plaquetas inactivas como activas proporciona los medios para la evaluación de la función plaquetaria. Esto incluye anticuerpos para P-selectina (CD62P), una molécula de adherencia, que se desplaza a la superficie de la plaqueta durante la activación. Los anticuerpos dirigidos contra esta molécula sólo se unen a plaquetas con degranulación. Los anticuerpos también están disponibles para GPIIb/IIIa (CD41/CD61), un epítopo que aparece cuando se activa la plaqueta. Éste resulta de un cambio conformacional que conduce a la unión del fibrinógeno con la superficie plaquetaria y posteriormente a la agregación plaquetaria. Hasta hoy, el análisis citométrico de flujo de la función plaquetaria no reemplaza a las pruebas clínicas estándares para la función plaquetaria, como el tiempo de sangrado y la agregometría plaquetaria. Esto se debe, en parte, al costo de la prueba y a la destreza del operador, aunque la citometría ofrece varias ventajas como el análisis de la sangre completa, por lo que minimiza la activación plaquetaria y se requieren volúmenes pequeños de sangre (20 µl); por lo tanto, hacen posible los estudios neonatales. Las plaquetas de pacientes con trombocitopenia profunda también pueden analizarse con exactitud.

El impacto más grande de las técnicas de la biología molecular en la hematología ocurre en la identificación de alteraciones genéticas relacionadas con leucemias y linfomas. La identificación de la translocación cromosómica, que da lugar al cromosoma Filadelfia, característica de la leucemia mieloide crónica, fue el primer cáncer humano para el cual se estableció una base genética. De hecho, se entiende más sobre la patogenia molecular de las malignidades hematológicas que sobre cualquier otro grupo de cánceres humanos. El cuadro 32-6 ilustra algunas alteraciones genéticas selectas relacionadas con neoplasias hematológicas. Las herramientas principales de la biología molecular que se emplean para detectar tales aberraciones genéticas son la hibridación in situ, especialmente la FISH y la PCR. Ambas técnicas tienen una sensibilidad muy alta y son más rápidas que el análisis citogenético convencional, el DNA o RNA pueden extraerse a partir de sangre de médula ósea o de una gran variedad de fluidos corporales para análisis molecular. Estas dos técnicas se usan para identificar alteraciones cromosómicas y genes o mRNA anormales, por ejemplo, la expresión de un oncogén. Éstas incluyen rearreglos del gen inducidos por translocación que involucran la activación del oncogén, más los rearreglos normales del gen que implican genes de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina que se utilizan para demostrar la clonalidad en neoplasias linfoides. Los ejemplos delineados adelante ilustran cómo la FISH y la PCR se utilizan para identificar estos rearreglos genéticos en neoplasias hematológicas.

Tabla 32-6 Algunas de las características citogenéticas y moleculares frecuentes observadas en los neoplasmas hematológicos que son útiles en el diagnóstico y como blancos para el monitoreo de la enfermedad Enfermedad

Cariotipo

Gen anormal

Uso diagnóstico

CML AML

t(9;22)(q34;q11) t(8;21)(q22;q22) t(15;17)(q22;q21) inv(16)(p13;q22) t(12;21)(p13;q22) t(4;11)(q21;q23) t(8;14)(q24;q32) t(1;14)(p32;q11) t(7;9)(q34;q32) t(14;18)(q32;q21) t(11;14)(q13;q32)

BCR-ABL AML 1-ETO PML-RARA CBF-MYH11 TEL-AML1 MLL-AF4 MYC desregulado TAL1 desregulado TAL2 desregulado bcl-2 desregulado bcl-1 desregulado

Diagnóstico de CML AML con maduración Promielocítico agudo Mielomonocítico Precursor B-ALL Con frecuencia presentación neonatal Burkitt tipo ALL T-ALL T-ALL Linfoma de centro folicular Linfoma de célula manto

ALL

Linfomas

CML, leucemia mieloide crónica. AML, leucemia mieloide aguda. ALL, leucemia linfoblástica aguda.

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CAP. 32

CITOMETRÍA DE FLUJO Y BIOLOGÍA MOLECULAR EN LA HEMATOLOGÍA

FISH para demostrar el cromosoma Filadelfia en CML El cromosoma Filadelfia es el resultado de una translocación recíproca, t(9;22) (q34;q11), que causa un rearreglo del gen que implica un oncogén celular, c-abl, y el gen BCR (fig. 32-1). Esta reestructuración se observa en 95% de los pacientes con leucemia mieloide crónica (CML), generando un gen híbrido de la fusión BCR-ABL, que codifica para una proteína con actividad creciente de la tirosina cinasa. La activación creciente de las proteínas reguladoras del crecimiento por bcr-abl incrementa el índice mitótico y protege a las células contra la apoptosis. Figura 32-2 Visualización de los genes bcr y abl usando FISH para demostrar el gen bcr-abl fusionado sobre el cromosoma Filadelfia.

Demostración de la clonalidad por estudios de rearreglo del gen El diagnóstico de los desórdenes linfoproliferativos se basa en métodos inmunofenotípicos para demostrar clonalidad y linaje celular. En las malignidades de célula B, la restricción de la cadena ligera  o  puede evaluarse a menudo, pero para las de célula T la clonalidad es más difícil de determinar. Por tanto, el uso de técnicas de la biología molecular para detectar clonalidad en células T o B es un desarrollo diagnóstico importante. Figura 32-1 La translocación recíproca entre los cromosomas 9 y 22 produce un cromosoma 9 más largo (der 9) y el cromosoma Filadelfia Ph1, que contiene el gen fusionado bcr-abl.

Análisis de la clonalidad de la célula B por PCR

La FISH puede usarse para visualizar los genes ABL y BCR por medio de la hibridación con sondas, de ácidos nucleicos, complementarias a las secuencias de DNA en los dos genes (fig. 32-2). Empleando una sonda marcada con biotina para BCR, el gen BCR puede detectarse con avidina-FITC, que une la sonda marcada con biotina y puede visualizarse como puntos verdes por medio de microscopia fluorescente. Una sonda para el gen ABL se marca con digoxigenina y se detecta con antidigoxigenina-rodamina, que emite una luz fluorescente como puntos rojos. La presencia del gen fusionado BCR-ABL sobre el cromosoma Filadelfia, por tanto, se visualiza por los puntos rojos y verdes combinados. Una gran cantidad de sondas marcadas están disponibles en el comercio y se utilizan con frecuencia en alteraciones genéticas observadas en leucemias y linfomas, lo anterior permitirá posiblemente la transferencia de las metodologías FISH dentro del laboratorio de diagnóstico rutinario.

Durante el desarrollo de la célula B existen rearreglos de la cadena pesada de inmunoglobulina (IgH), que involucra regiones V (variable), D (diversidad) y J (acoplamiento), que se fusionan para formar una unidad funcional. En una población normal de célula B, cada célula utiliza una combinación diferente de segmentos V, D y J, aunado a que existe inserción de pares de bases al azar en las uniones V-D y D-J (fig. 32-3). El método de PCR utiliza dos iniciadores, uno que corresponda a una secuencia consenso, encontrada en la mayor parte de los segmentos V, y el otro a una secuencia consenso común a la mayor parte de los segmentos J. Cuando se amplifica el DNA, la longitud del producto de PCR se determina por el número de nucleótidos insertados al azar durante la unión VDJ. En una población normal de células B, cada producto de PCR posee un tamaño ligeramente diferente, de modo que cuando los productos de esta amplificación se separan por electroforesis, un barrido se observa en el gel. En el caso de una población neoplásica de células B, todas con la misma reestructuración VDJ, se

BIOLOGÍA MOLECULAR EN LA HEMATOLOGÍA

309

Figura 32-3 Durante el desarrollo de la célula B, cada uno de los diversos segmentos V, D y J son ligados por rearreglo del gen. Usando iniciadores V y J, el análisis por PCR del DNA del gen de la inmunoglobulina se generan varios productos de PCR en células B normales. En un desorden linfoproliferativo de la célula B, la clonalidad es demostrada por un solo producto o banda de PCR.

crea un producto de PCR de un solo tamaño, que se visualiza por la predominancia de una banda discreta en la electroforesis. El análisis de la clonalidad de la célula B por PCR tiene diferentes ventajas. Puede realizarse en sangre periférica, médula ósea, tejido fresco o congelado y muestras incluidas en parafina. Se requieren muestras muy pequeñas de DNA y, como en la hibridación in situ, los resultados están disponibles mucho más rápido que con el análisis citogenético convencional. Estudios de los rearreglos del gen receptor de la célula T El receptor para el antígeno en la mayor parte de las células T maduras (TCR) comprende dos polipéptidos,  y , que se ligan y relacionan con la molécula CD3. Una población más pequeña de células T tiene un heterodímero diferente, integrado por dos polipéptidos diferentes, designados y , que tienen un grado de homología con las cadenas  y , respectivamente. El desarrollo de la célula T normal implica la reestructuración de estas cadenas para obtener una población heterogénea de genes receptores de la célula T. La clonalidad de las células T es una evaluación común de PCR, usando el sitio TCR . Ésta es la cadena sencilla más apropiada para examinar, puesto que las extensiones inmaduras de la célula T pudieron no experimentar la recombinación , mientras el gen se suprime durante una recombinación del gen. Por lo general, son tres grupos de

iniciadores de secuencia consenso para la cadena TCR los que se usan, y de esta forma los productos amplificados se separan por electroforesis. Una población policlonal de célula T da lugar a un barrido en el gel de los productos de PCR, mientras que una población monoclonal de células T malignas se demuestra por apenas una o dos bandas distintas visibles en la electroforesis en gel. Detección de la enfermedad residual mínima La enfermedad residual mínima (ERM) se define como aquellas células malignas que sobreviven después de la quimioterapia inicial de remisión-inducción. La detección de una población potencial muy pequeña de células malignas, por ejemplo, en una de la médula ósea que está morfológicamente en remisión, puede tener implicaciones pronósticas y terapéuticas importantes. Las técnicas de citometría de flujo y biología molecular se emplean para vigilar la ERM. Uno de los problemas principales con la citometría de flujo es la identificación de un inmunofenotipo específico de tumores. Sin embargo, algunos antígenos hematopoyéticos se encuentran en las células malignas en combinaciones que no están presentes en sangre normal o médula ósea; por ejemplo, en la mayor parte de los casos de leucemia linfoblástica aguda de la célula T (T-ALL), las células malignas expresan TdT nuclear así como CD3, CD5 y CD1. Este patrón no se observa normalmente en células T

310

CAP. 32

CITOMETRÍA DE FLUJO Y BIOLOGÍA MOLECULAR EN LA HEMATOLOGÍA

fuera del timo y puede utilizarse para demostrar células T-ALL en sangre o en médula ósea. Otras combinaciones inmunofenotípicas se utilizan en el análisis de ERM para ALL de célula B y leucemia mieloide aguda (AML), con grados variables de éxito. Un problema importante con las técnicas inmunológicas son las limitaciones en la sensibilidad, y la citometría de flujo capaz de detectar una célula blanco de entre 104 a 105 células. La mayor parte de los estudios de la enfermedad residual, por tanto, utilizan la sensibilidad extrema de la PCR para identificar las alteraciones genéticas conocidas presentes en la malignidad en cuestión. Por ejemplo, la detección de los genes resultantes de la fusión BCR-ABL se utiliza de manera extensa en el seguimiento de pacientes con CML, incluyendo trasplantes de médula ósea posteriores. En desórdenes linfoproliferativos, los rearreglos clonales únicos pueden emplearse como blancos para los análisis basados en la PCR con sondas de ácidos nucleicos específicas para las células malignas de un paciente en particular. Tales aproximaciones requieren de mucho trabajo, pero cuanta más información llega a estar disponible desempeña un papel importante en la evaluación del pronóstico y de la elegibilidad para las diversas modalidades del tratamiento específico. Diagnóstico de hemoglobinopatías La biología molecular tiene ventajas profundas en la identificación de mutaciones comunes específicas que dan lugar a una síntesis alterada de la cadena globina. La PCR se ha aplicado sobre todo a la detección de las mutaciones puntuales, deleciones y polimorfismos del DNA, para proporcionar una prueba de tamizaje rápida que es en particular importante en el diagnóstico prenatal. La opción de una técnica específica depende del grado de la enfermedad definida a nivel genético. Por ejemplo, en enfermedad de célula falciforme el gen afectado se conoce por medio del análisis de la secuencia del DNA, y diferentes estrategias pueden elegirse para amplificar y analizar un perfil del DNA de un paciente por medio de la PCR. El conocimiento de una mutación puntual específica permite el desarrollo de técnicas de amplificación fluorescente para el tamizaje rápido. Estos métodos utilizan iniciadores oligonucleótidos para las secuencias del DNA normales y mutantes, marcadas diferencialmente con moléculas fluorescentes rojas y verdes. Acoplando cada uno con un segundo iniciador no marcado, los productos de PCR se pueden analizar por fluorescencia diferencial roja y verde en un fluorómetro, obteniéndose una técnica de tamizaje rápida. En enfermedades como las talasemias, los genes son clonados y secuenciados, pero las mutaciones genéticas

son heterogéneas. El acercamiento a estudios de la herencia, por tanto, se basa en estudios de ligamiento, usando los polimorfismos de longitud variable de los fragmentos de restricción (RFLP). Éstas son mutaciones del DNA, por lo general en secuencias del DNA no codificantes, que se heredan ligadas con un gen y pueden por tanto convertirse en marcadores útiles para la detección de un gen mutante en el diagnóstico prenatal. Alteraciones genéticas en las coagulopatías En cuanto a las hemoglobinopatías, se ha identificado un número creciente de mutaciones específicas de la enfermedad que conducen a alteraciones relacionadas con la coagulación sanguínea. La detección de mutaciones puntuales en genes que codifican factores de coagulación se utilizan para estudios diagnósticos y de escrutinio familiar. Una prueba muy usada es la detección basada en PCR de la mutación del factor V de Leiden. Se estima que 2 a 6% de la población normal lleva esta mutación, y la homocigosidad de los alelos informa que existe un riesgo incrementado 80 veces de trombosis. La detección de la mutación utiliza iniciadores específicos de la secuencia, un iniciador “sentido”, que es complementario a ambos factores normales V y FV de Leiden, y un segundo iniciador “antisentido” complementario a ambos, el alelo FV normal o el alelo FV de Leiden. La naturaleza del genotipo de FV puede entonces determinarse por el análisis de los productos de la amplificación, puesto que ambos, el iniciador específico normal o el específico a FV de Leiden, amplifican un producto.

Resumen La citometría de flujo y la biología molecular desempeñan conjuntamente un papel fundamental en el diagnóstico de leucemias y de linfomas. El reconocimiento de los marcadores inmunofenotípicos y genéticos anormales que se relacionan con desórdenes hematológicos particulares conducen a un análisis replanteado del sistema de clasificación para las alteraciones hematológicas. El sistema de clasificación reciente publicado por la Organización Mundial de la Salud (OMS) toma más en cuenta estos desarrollos y esfuerzos para utilizar las características inmunológicas y genéticas junto con las observaciones morfológicas. Esto produce un sistema de clasificación que tiene más valor clínico en términos de modalidades del pronóstico y del tratamiento. Los avances futuros en el tratamiento de estos desórdenes deben surgir de las modalidades que pueden apuntar

LECTURAS ADICIONALES

hacia las características inmunológicas o genéticas específicas de la enfermedad. Está claro que incluso dentro de entidades distintas de la enfermedad, la perspectiva pronóstica exacta para un paciente particular depende de una variedad de factores, incluyendo la expresión de muchos genes, algunos todavía no identificados. Un desarrollo inquietante implica la técnica de los microarreglos de DNA, que permiten la cuantificación de miles de genes. Genes distintos que son representados por fragmentos del cDNA sobre un sustrato sólido, miles de los cuales pueden acomodarse en un solo portaobjetos de vidrio. El cDNA o las sondas de RNA marcados están preparados a partir de células del paciente y se hibridan al microarreglo. La cantidad de sonda que hibrida al DNA blanco del microarreglo es proporcional a la expresión del mRNA del gen correspon-

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diente en la célula del paciente. Este cuadro muy amplio, de gran alcance de la expresión del gen, en el futuro, ciertamente nos dará un conocimiento de los factores implicados en el proceso maligno y conducirá a que se encuentre un mejor tratamiento para los neoplasmas hematológicos.

Lecturas adicionales Jennings CD, Foon KA. Recent advances in flow cytometry: application to the diagnosis hematologic malignancy. Blood 1997: 90: 2863-2892. Provan D, Gribben J (eds). Molecular Haematology. 2000: Blackwell Science, Oxford. Stamatoyannopoulous G (ed.). The Molecular Basis of Blood Diseases. 2001 W.B. Saunders, Philadelphia, PA.

33 Investigaciones hemáticas Frank Wells

La anemia puede ocurrir por pérdida de sangre, destrucción de eritrocitos o por una falla en la producción de éstos. El fracaso para producir células sucede con más frecuencia por las deficiencias separadas o combinadas del hierro hematínico, de la vitamina B12 y del folato. La vitamina B12 se conoce más por su nombre químico apropiado, cobalamina, y es como se utiliza aquí. El punto de partida para la investigación de laboratorio de la anemia es el conteo sanguíneo. La macrocitosis y la pancitopenia son hallazgos característicos en las anemias megaloblásticas que producen la deficiencia de cobalamina y de folato, mientras la microcitosis y la hipocromía se caracterizan por la deficiencia de hierro. El examen microscópico de sangre y de médula produce los hallazgos característicos, pero en el caso de la anemia megaloblástica no es posible distinguir la deficiencia de folato y de cobalamina. La medición de las vitaminas y de hierro en la sangre es de valor significativo, pero los resultados requieren interpretación cuidadosa, basada en las interacciones posibles entre el folato y la cobalamina, otras patologías coexistentes, efectos de las proteínas de captación y la posible presencia de estados de deficiencia leve. En el caso del hierro, una deficiencia funcional puede ocurrir en presencia de reservas adecuadas de este elemento. Todos estos factores se discuten de forma breve, junto con los métodos para esclarecer la causa de las deficiencias identificadas y la investigación del exceso de hierro.

Cobalamina (vitamina B12) y folato La cobalamina y el folato son esenciales para un número de transferencias de carbón simple, y en el contexto presente la más importante de éstas se relaciona con la síntesis de DNA.

En la figura 33-1 se muestran de forma simplificada las vías metabólicas que involucran las dos vitaminas. La forma activa del folato, el tetrahidrofolato (THF), transporta y utiliza la unidad de carbón simple en diferentes estados de oxidación como 5-metil THF (>N—CH3), 5,10-metileno THF (>N— CH2—NN—CHO). Se requiere insertar dos veces carbón simple (del formado por la vía 10-formil THF) en la síntesis de las purinas; el metileno THF se utiliza en la conversión de uridina a timidina en la síntesis de pirimidina. El 5-metil THF y la cobalamina se deben agregar juntos para la metilación de la homocisteína a metionina. La mayor parte de la metionina se convierte, además, a S-adenosilmetionina, un donador universal de grupos metilo requeridos en un amplio rango de reacciones de metilación que involucran al DNA, al RNA, a las hormonas, a los neurotransmisores, a los lípidos de la membrana y a la proteína básica de la mielina. La falla de esta última función provoca la degeneración subaguda de la médula espinal relacionada con deficiencia grave de cobalamina. Ésta también es un cofactor esencial para la mutasa, que convierte el ácido metilmalónico a ácido succínico. Tanto la cobalamina como el folato se presentan en las formas unidas a proteínas en la sangre. La proteína principal de unión para la cobalamina es la transcobalamina II. En la leucemia mielógena crónica, la transcobalamina III, que es producida en cantidades grandes por los granulocitos, puede generar falsas medidas de concentracion altas de la cobalamina sérica. Análisis de cobalamina y folato en sangre Los métodos de análisis de laboratorio con frecuencia se afectan por la necesidad de analizar grandes cantidades

The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker. © 2005 John Wiley & Sons, Ltd.

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CAP. 33

S-adenosil metionina como donador Me

INVESTIGACIONES HEMÁTICAS

Homocisteína

5-Me-THF B12

Metionina

Lípidos de la membrana

Proteína básica de la mielina Neurotransmisores

THF

Formas metiladas

Otras especies de un carbono, 5,10metilenoTHF, 10-formilTHF

d-UMP Precursores de la purina

d-TMP y purinas

DNA

Figura 33-1 Transformaciones metabólicas que implican cobalamina (vitamina B12) y folato. Reproducida con permiso de Klee (2000).

de muestras. Esto actúa en contra de los procedimientos que requieren la intervención manual o de los pasos que no pueden incorporarse fácilmente en un proceso automátizado continuo. Los primeros métodos para el análisis de ambas vitaminas dependían del crecimiento de organismos que tienen un requerimiento absoluto por una de las vitaminas. Para la cobalamina se empleó Euglena gracilis o Lactobacillus leichmannii y para el folato Lactobacillus casei, un organismo resistente al cloranfenicol. El crecimiento se mide por un aumento en la turbiedad del medio de cultivo con todos los demás nutrientes requeridos en exceso. Aunque estos ensayos aún tienen valor como una medición de la vitamina biológicamente activa, se sustituyen en la práctica de rutina por los ensayos de unión proteica competitiva. Ensayos de unión proteica competitiva El principio de estos análisis puede resumirse respecto a la cobalamina y se representa de manera esquemática en la figura 33-2. Una proteína debe ligarse a la cobalamina con mucha fuerza y se agrega específicamente a una mezcla natural de esta última (la muestra) y a una forma marcada. La proteína de unión está presente en una concentración significativamente menor que la de la vitamina y su análogo marcado. Las formas naturales y marcadas de la vitamina compiten por el número limitado de sitios de enlace en la proteína durante un periodo de equilibrio. En equilibrio, el cociente natural de la cobalamina marcada ligada a la proteína específica se aproxima a la misma que el cociente natural de la cobalamina marcada en la solución original. La cobalamina ligada entonces se separa de la solución, y la cantidad de cobalamina marcada unida a la proteína de

enlace se mide. El marcador puede ser una especie fluorescente o una enzima, y pueden emplearse técnicas sensibles de medición, como la quimioluminiscencia. La comparación del resultado con una curva estándar permite la cuantificación de la cantidad de cobalamina natural en la muestra original, y tiene en cuenta que la constante de enlace para la cobalamina natural y marcada puede no ser exactamente la misma, y que el enlace no específico puede también ocurrir con otras proteínas séricas. Los detalles de este proceso varían con diferentes analizadores, pero el principio es común en casi todos. Cuando la concentración de cobalamina en la muestra es muy alta, la cantidad marcada ligada a la proteína de enlace se aproxima a cero, y cuando la concentración de cobalamina en la muestra es cero, la unión de esta vitamina alcanza un máximo. Los primeros ensayos competitivos de la proteína de enlace utilizaron radioisótopos para el marcaje de la cobalamina, pero los riesgos implicados y las dificultades en la automatización de tales técnicas causaron que declinara su uso. Ensayo de cobalamina La vitamina se separa de la proteína ligante natural, transcobalamina II, por el hidróxido de sodio (pH 12.9). El cianuro de potasio convierte la vitamina a su forma de cianocobalamina. Los métodos anteriores utilizaban un pH más bajo, pero involucraban la ebullición de la mezcla para liberar la cobalamina de sus proteínas naturales de unión. El factor intrínseco porcino (HIF) se agrega como proteína de unión específica. En una forma particular del ensayo, la cobalamina libre de la muestra compite con la cobalamina que está “marcada” en virtud de ligarse a un soporte sólido (una

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COBALAMINA (VITAMINA B12) Y FOLATO

Marcado

Marcado

Marcado

Marcado

HIF

HIF

Marcado

Marcado

HIF

HIF

= cobalamina HIF = factor intrínseco porcino

HIF

Marcado

Marcado

HIF

El cuadro cortado identifica las especies “ligadas” medidas En equilibrio el cociente de cobalamina natural a cobalamina marcada ligada a la proteína específica (factor intrínseco porcino) será el mismo que el del cociente de cobalamina natural a cobalamina marcada en la solución original. Los “conteos” ligados se comparan con los valores encontrados en una curva de calibración construida usando seis a ocho muestras de cobalamina de concentración conocida.

Figura 33-2 Esquema del principio del ensayo de unión proteica competitiva.

perla de plástico). Estos componentes se incuban con un anticuerpo HIF conjugado con la fosfatasa alcalina (Falc-HIFAb). El Falc-HIFAb se inmoviliza sólo en aquellas perlas que tienen HIF ligado. Las perlas se lavan, con lo que se libran de excesos de reactivos, y la cantidad de HIF ligada se determina por medio de la enzima fosfatasa alcalina ligada. Si hay muy poca cobalamina en la muestra, mucho del HIF será ligado a la cobalamina en las perlas, e inversamente, si la concentración de cobalamina en la muestra es alta, habrá poco HIF, y así poca fosfatasa alcalina ligada a la perla. Aunque la secuencia de eventos difiere levemente, el principio de este proceso puede verse idéntico al del esquema de la figura 33-2. Ensayo de folato El folato puede medirse en el suero o en los eritrocitos. El folato eritrocítico es, potencialmente, la medición más

significativa, ya que representa una visión promedio del tiempo de la disponibilidad de folato sobre el cual los eritrocitos circulantes se formaron, mientras que el folato sérico es muy dependiente de la ingestión dietética reciente. El principio de los ensayos de folato es muy similar al de la cobalamina, descrito antes, aunque los detalles varían considerablemente con los diferentes sistemas analíticos. La proteína de enlace específica usada en el análisis competitivo es la ␤-lactoglobulina (un ligando del folato en la leche). La disociación del folato de las proteínas de enlace se logra otra vez por alcalinización con hidróxido de sodio. Si el folato se mide en el suero y en la sangre completa, los dos resultados pueden utilizarse, junto con el hematócrito, para determinar el folato eritrocítico. El método es más impreciso que en la medición del folato sérico por la naturaleza aditiva del error analítico. En general, el coeficiente de variación de un análisis que implica tres mediciones está dado por:

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CAP. 33

INVESTIGACIONES HEMÁTICAS

CVt ⫽ (CV21 + CV22 +CV23) donde CVt es el coeficiente total de variación del análisis y CV1, CV2 y CV3 son los coeficientes de variación de los análisis individuales implicados, en este caso del folato sérico, del folato de la sangre entera y del hematócrito, respectivamente. La matriz más compleja del hemolizado de la sangre entera puede también causar interferencia. Por ello, los laboratorios pueden elegir medir el folato sérico, porque el análisis es menos impreciso, o el folato eritrocítico, porque el resultado es más significativo, o ambos. La interpretación del ensayo se altera porque la cobalamina, como el folato, tiene poca precisión en el extremo inferior del rango, y también porque los rangos de referencia del folato son a veces inadecuados, particularmente en poblaciones con una ingesta suplementada con folato. Diferentes métodos analíticos para el folato muestran un sesgo que difiere, y los laboratorios deben determinar los rangos de referencia locales. Medidas alternativas del estado de la cobalamina y del folato Aunque los ensayos de estas vitaminas en la sangre dan información valiosa, un número de factores puede causar resultados engañosos. La cobalamina suele incrementarse, ya sea por desórdenes mieloproliferativos, o disminuir por deficiencia de folato (ambas son medidas falsas), por embarazo, carencias de proteínas de enlace y mielomatosis. La deficiencia de cobalamina sólo puede reducir las concentraciones de folato intracelulares, y esto dar lugar a folato sérico normal relacionado con folato eritrocítico bajo y cobalamina sérica baja. Hay también evidencia de que secuelas clínicas significativas pueden seguir a la deficiencia leve de la vitamina con concentraciones séricas en el rango normal bajo. La figura 33-1 muestra el papel de la cobalamina y del folato en la conversión de la homocisteína (HC) a metionina. La cobalamina sola también está implicada en la conversión importante del ácido metilmalónico a ácido succínico. La deficiencia de cualesquiera de las dos vitaminas resulta de este modo en el incremento de las concentraciones séricas de homocisteína, y la deficiencia aislada de cobalamina en incremento de los niveles séricos y excreción del ácido metilmalónico (MMA). La medición de estas dos sustancias, HC del plasma y MMA de la orina o plasma, puede confirmar la deficiencia de las vitaminas, y la comparación de los dos, distinguir las deficiencias simples y combinadas y, en general, mejorar la especificidad de la prueba de diagnóstico, particularmente en los casos con cobalamina o

folato bajo en la línea fronteriza. Hay evidencia de que las concentraciones elevadas de estos dos metabolitos pueden detectar clínicamente deficiencia significativa de la vitamina antes de que ésta sea muy evidente desde la medición de las vitaminas mismas y de que haya evidencia de macrocitosis. Actualmente las dificultades analíticas en la medición del MMA y de la HC impiden su uso extenso, pero ambos mantienen la posibilidad de una valoración funcional del estado de la cobalamina y del folato, que puede ser útil en una variedad amplia de situaciones, pero en particular en los ancianos, en quienes la deficiencia marginal de cobalamina se piensa que es relativamente común.

Investigación de los factores que generan la deficiencia de folato y cobalamina La deficiencia de folato es normal que sea causada por una malabsorción o una ingestión dietética inadecuada (o una combinación de uno de éstos con un mayor requerimiento, como en el embarazo). La suplementación es franca, y en algunos países los alimentos se fortifican de rutina con folato adicionado, pero el cuidado es necesario debido a que la administración de folato a un paciente deficiente en cobalamina puede causar la degeneración combinada subaguda de la médula espinal. Una causa importante de deficiencia de cobalamina es la anemia perniciosa (AP), en la cual las células parietales gástricas no tienen la suficiente capacidad para producir el factor intrínseco esencial para la absorción de cobalamina en el segmento ileal del intestino. La investigación preliminar puede implicar la valoración de los anticuerpos dirigidos en contra de la célula parietal gástrica y los del factor intrínseco. Los primeros son positivos en 90% de los casos de AP, pero tienen especificidad escasa para la condición, y están presentes en 3 a 10% de los sujetos normales. Los anticuerpos del factor intrínseco son completamente específicos para la AP, pero su sensibilidad es baja; hay dos tipos, los que bloquean la unión del FI a la cobalamina y los que bloquean la captación del complejo IF-cobalamina por el íleo terminal. El primer anticuerpo es el único que se mide de rutina y está presente en 50% de los casos de AP. En el pasado, la prueba Schilling (que mide la absorción de cobalamina radiactiva en presencia y ausencia del factor intrínseco agregado) se utilizó para determinar la capacidad de absorber cobalamina administrada e identificar si esto era debido a la deficiencia del factor intrínseco (como en la AP) o por alguna otra causa, como enfermedad ileal. La saturación anterior con cobalamina sin marcar, administrada por inyección intramuscular, asegura que toda la cobalamina marcada que se absorbe es excretada. La prueba Schilling se utiliza menos en la actualidad que en el pasado debido a los problemas implicados

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HIERRO

Cobalamina sérica (vitamina B12)

150 a 300 ng/L > 300 ng/L (sin comprobación adicional) Ensayo del MMA sérico

≤ 0.4 µmol/L

> 0.4 µmol/L

< 150 ng/L

Anticuerpo del factor intrínseco

Negativo

Ensayo de gastrina

> 200 ng/L*

≤ 200 ng/L

Positivo*

Figura 33-3 Un procedimiento de investigación para la anemia perniciosa. *Indica que es consistente con anemia perniciosa.

en el uso de radioisótopos, y la inconveniencia general de la prueba. Casi 80% de los casos de anemia perniciosa tiene incremento de la gastrina sérica como resultado de la aclorhidria debido a la falla de células parietales para producir ácido clorhídrico, de tal modo que la gastrina sérica puede tener valor en la investigación de la AP. La ausencia del ácido gástrico es significativa por sí misma, ya que la falla para liberar la cobalamina dietética (y el folato) de las proteínas naturales de unión en la dieta puede deteriorar la absorción. Una prueba Schilling normal (que mide la absorción de la cobalamina libre) es posible que suceda en un paciente que absorbe mal la cobalamina ligada a la proteína de los alimentos naturales. Un diagrama de laboratorio para la investigación de la anemia perniciosa se muestra en la figura 33-3. Esto evita el uso de la prueba Schilling pero implica mediciones no disponibles de rutina en laboratorios del Reino Unido. El ácido metilmalónico es muy raro que esté disponible, y aunque no se carece de la gastrina, se utiliza poco en este contexto. Debido a que la suplementación oral de cobalamina es ineficaz en el tratamiento de la AP, un diagnóstico exacto es importante.

Hierro El hierro es un elemento importante, involucrado no sólo en la síntesis de hemoglobina sino en muchas metaloproteínas, que contienen y no grupo hem, implicadas en la utilización del oxígeno molecular. El efecto más obvio de su deficiencia es anemia por deficiencia de hierro, pero puede haber cambios más sutiles que resultan de su implicación en otros procesos metabólicos. La existencia del hierro en

dos estados principales de oxidación, Fe(II) y Fe(III), y el caso con el cual puede participar en la transferencia de un electrón, resulta en una fuente potencial de radicales libres del oxígeno, que tienen uso importante en la defensa del huésped contra las bacterias pero que, si no se confina a su ubicación apropiada, son demasiado perjudiciales a los tejidos del huésped. La absorción y el transporte de hierro están así controlados en forma rigurosa para evitar la presencia de hierro libre, y las condiciones de la sobrecarga de hierro tiene consecuencias clínicas serias. Mediciones de laboratorio de la deficiencia y sobrecarga de hierro Aparte de la hemoglobina misma, las mediciones de laboratorio del estado de hierro con más frecuencia utilizadas son el hierro sérico y la capacidad de unión al hierro, la ferritina sérica, la protoporfirina zinc de la célula y, recientemente, la concentración del receptor de transferrina sérico (TfR). Hierro sérico y capacidad de unión del hierro El hierro sérico es la medida más obvia del estado de hierro en el organismo, su concentración es afectada por diferentes factores, incluyendo la concentración de su proteína de unión, la transferrina. Algunas mediciones de la transferrina son, de esta manera, esenciales en la interpretación de la concentración del hierro sérico, tanto por la medición directa de la proteína como para valorar químicamente la capacidad de unión del hierro sérico, que es equivalente a la concentración de transferrina.

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CAP. 33

INVESTIGACIONES HEMÁTICAS

Ferritina La ferritina se compone de 24 subunidades de proteína alrededor de un núcleo, que puede contener hasta 4 500 átomos de hierro y comprende la forma principal de almacenamiento de hierro disponible encontrada en la mayor parte de los tejidos del cuerpo. En la forma desnaturalizada, la ferritina forma hemosiderina. La concentración de ferritina en el plasma se relaciona de manera directa con el nivel de reserva de hierro, con cada µg/L de ferritina sérica que equivale a casi 8 mg del hierro de reserva. Es también, sin embargo, una proteína de fase aguda, la concentración de la cual se eleva en respuesta a la infección, a la inflamación y a la malignidad, y que pueden dar lugar a concentraciones “normales” de ferritina sérica en un paciente con deficiencia de hierro y enfermedad inflamatoria. Protoporfirina zinc (ZPP) En la síntesis de hemoglobina, la enzima ferroquelatasa inserta el hierro (II) dentro del sistema de anillo de la protoporfirina para producir grupo hem. En ausencia del hierro adecuado, el zinc se inserta (otra vez enzimáticamente) y la protoporfirina zinc permanece en el eritrocito durante toda su vida. La concentración de ZPP aumenta cuando el hierro es inasequible en la médula ósea, debido a una deficiencia simple o a una deficiencia de tipo funcional de hierro en presencia de reservas adecuadas de éste. Esta última situación corresponde a la anemia de la enfermedad crónica. La medición de ZPP tiene el mérito de identificar la disponibilidad disminuida de hierro en la médula, pero no siempre proporciona información directa sobre las reservas de hierro. El aumento de ZPP también refleja problemas antiguos en la síntesis del grupo hem (en el orden del periodo de vida de la célula) y puede ser normal en la deficiencia de hierro de inicio rápido que causa la pérdida gastrointestinal de sangre, por ejemplo. Aunque rara vez es un problema interpretativo, la ZPP también aumenta en la toxicidad por plomo. Receptor de transferrina sérico (TfR) Los eritrocitos nucleados en la médula ósea transportan la mayor parte de los receptores de transferrina, aunque también existen en otras células en cantidades que reflejan los requerimientos de hierro de las mismas. Estos receptores, situados en la membrana celular, internan la transferrina y, después de liberar su hierro regresan al fluido extracelular. El receptor de transferrina (TfR) consiste en dos subunidades idénticas de proteína de masa molecular de 95 kDa. La síntesis del TfR es controlada por el suministro de hierro,

disminuyendo cuando la célula está repleta de ion. El TfR está presente en el plasma, ligado a la transferrina, y su concentración en el plasma o suero refleja el número de receptores celulares de transferrina y, siempre que las reservas de hierro sean adecuadas, el TfR refleja el número de eritrocitos en desarrollo en la médula ósea. La deficiencia de hierro produce un incremento en el TfR sérico en paralelo con un aumento en los receptores celulares. El TfR sérico elevado puede reflejar disponibilidad disminuida de hierro, o eritropoyesis elevada, o ambos.

Investigación por sospecha de deficiencia de hierro El conteo sanguíneo es la primera línea de la investigación. Índices hematológicos más específicos, como el porcentaje de células hipocrómicas, son vistos por muchos autores como de las mejores medidas de la deficiencia de hierro.

Medición de la ferritina sérica El análisis de la ferritina sérica utiliza un ensayo de dos sitios o inmunométrico. En contraste con el ensayo de competencia por las proteínas de enlace descrito para la cobalamina y el folato, la concentración de los anticuerpos antiferritina utilizados para capturar ferritina es muy superior a las concentraciones normales de ésta. La que se encuentra en la muestra del suero la capturan eficazmente los anticuerpos antiferritina sobre un soporte sólido (grano o celdilla). Un segundo anticuerpo antiferritina, que se une a un epítopo diferente sobre la molécula de ferritina, se agrega, también en exceso. Este segundo anticuerpo forma un emparedado con la ferritina en el centro. El segundo anticuerpo lleva un marcador; originalmente un radioisótopo, pero ahora es más común que se sustituya con una enzima o una especie fluorescente. Después de lavarlo para remover todos los reactivos no unidos al grano o la celdilla, se agrega el sustrato que reacciona químicamente con el anticuerpo marcado para dar una señal apreciable, que se compara con aquella que se produce por una serie de estándares. Porque el método confía en un exceso de ambos anticuerpos, hay una posibilidad de que las concentraciones excepcionalmente altas de ferritina puedan saturar los anticuerpos y dar valores bajos (el efecto “gancho a dosis-altas” [high-dose hook]). Hay medios de diseño de ensayo que minimizan este riesgo, pero en caso de duda la muestra del suero se analiza en dilución, y si el efecto “gancho” está presente, la muestra diluida exhibe un valor aparente más alto para la ferritina sérica. El ensayo inmunométrico se muestra de manera esquemática en la figura 33-4.

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HIERRO

Anticuerpo antiferritina (1) Ferritina

Anticuerpo antiferritina marcado (2)

El cuadro cortado identifica las muestras marcadas medidas

Figura 33-4 Esquema del ensayo inmunométrico de dos sitios para la ferritina.

Medición de protoporfirina zinc Alguna confusión existe con respecto a la relación de la ZPP y la protoporfirina libre, principalmente porque los primeros métodos de medición de la ZPP implicaron la extracción ácida, que removía el zinc para dar protoporfirina libre. Excepto en porfirinas raras, la protoporfirina libre abarca 5% o menos de la porfirina que no es del grupo hem total en el eritrocito, la mayor parte que existe como ZZP. La protoporfirina zinc absorbe la luz de longitud de onda de alrededor de los 425 nm (banda Soret) y fluoresce, emitiendo luz a una longitud de onda de 595 nm. El método más común de medir la protoporfirina zinc implica emplear la técnica de la fluorimetría de cara frontal. Una gota de sangre entera es pretratada con un reactivo que convierte la hemoglobina a cianohemoglobina y elimina el efecto de interferencia del contenido variable de la oxihemoglobina. La sangre diluida se coloca en un portaobjetos y un haz de luz incidente (415 nm) se dirige sobre el lado más bajo del portaobjetos. La capa de eritrocitos sobre la superficie de cristal plana absorbe la luz incidente, y la ZPP emite luz fluorescente a 595 nm que se dispersa en todas las direcciones. Aquella luz emitida hacia abajo, por detrás del

portaobjetos, sufre reabsorción mínima por la hemoglobina y se detecta con un tubo fotomultiplicador. La concentración de ZPP se expresa como µmol ZPP/mol del hem. La interferencia surge de la hemólisis, de la bilirrubina sérica alta o de las concentraciones de riboflavina. Lavando los eritrocitos se remueven estas interferencias, pero esto consume tiempo. Medición del receptor de transferrina sérico La medición del TfR sérico se realiza con un ensayo inmunométrico de dos sitios, similar en principio al de la ferritina sérica. El análisis es un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA). Desafortunadamente, las diferencias en los procedimientos que se utilizan para purificar los receptores de transferrina ligada a la membrana que se usan como estándares en el ensayo caen en rangos de referencia que varían con el sistema de ensayo particular, aunque las diferencias cualitativas entre los grupos de pacientes son similares, independientemente de la formulación del ensayo. Gran parte del rango de referencia no lo afecta la edad y el sexo (a diferencia de, p. ej., la ferritina), aunque la información en niños y bebés es escasa. La deficiencia de

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CAP. 33

INVESTIGACIONES HEMÁTICAS

hierro resulta en un aumento triple a cuádruple de la concentración de TfR sérico comparada con la normal. Medición del hierro sérico y de la capacidad de unión del hierro El hierro en el suero está en la forma Fe(III) y ligado a la transferrina. A un pH menor de 4.5 y en la presencia de ácido ascórbico como agente de reducción, el hierro trivalente es liberado de la transferrina y reducido a Fe(II). Entonces se forma un complejo con un cromóforo, por ejemplo, fereno [3-(2-piridil)-5,6-bis-2-(ácido 5-furil sulfónico)-1,2,4-triazina] o alternativamente ferrozina. Se mide la absorbancia del complejo hierro-fereno a 700 nm. Este método es homogéneo (no implica precipitación de proteína), la mezcla de la reacción contiene detergente para mantener la proteína en solución, y tiourea para minimizar la interferencia del cobre. La capacidad de enlace del hierro puede medirse al adicionar exceso de solución Fe(III) para saturar totalmente la transferrina y dejar un poco de hierro libre. Después de la reducción con ácido ascórbico, el hierro libre se mide como un complejo fereno a un pH 8.6, pH al cual el hierro ligado a la transferrina permanece inasequible. La solución entonces se acidifica y el ensayo del hierro se repite. El aumento en éste debido a la acidificación es la capacidad de enlace del hierro del suero, que es equivalente al ligado a la transferrina. De manera alternativa, la transferrina puede medirse directo por métodos inmunológicos. Éstos implican la formación de los complejos antígeno-anticuerpo en solución entre la transferrina y los anticuerpos antitransferrina. La concentración de estos complejos se mide por su capacidad para dispersar la luz. O la disminución de la luz transmitida se mide en un espectrofotómetro (turbidimetría) o la luz dispersada real se evalúa con detectores a 90° de la trayectoria de la luz transmitida (nefelometría). La estandarización del ensayo de la transferrina presenta algunos problemas, y hay poco que elegir entre el ensayo de la transferrina y la capacidad de unión del hierro como métodos de medición de la concentración de transferrina. El lugar de las pruebas de laboratorio en la investigación de la deficiencia de hierro En casos sencillos, ninguna otra investigación de laboratorio puede ser necesaria cuando se identifica una anemia microcítica hipocrómica y el tratamiento con hierro oral es acertado, aunque la recurrencia de la anemia en presencia de ingesta normal de hierro de la dieta requiere explicación. Una posible malabsorción o la pérdida oculta de sangre del aparato digestivo pueden requerir endoscopia u otros modos de investigación.

Un problema diagnóstico importante ocurre durante la diferenciación de la anemia por deficiencia de hierro (IDA) y la anemia por enfermedad crónica. Esta última puede presentar un cuadro normocítico, normocrómico o microcítico, hipocrómico, y surgir en presencia o ausencia de reservas adecuadas de hierro. Es posible definirla como una anemia hipoproliferativa que ocurre en relación con la infección, la inflamación o la enfermedad neoplásica. Se caracteriza por valores bajos de hierro sérico, transferrina sérica y porcentaje de saturación de la transferrina, incremento de la ferritina sérica, aumento de las reservas de hierro reticuloendotelial, incremento de la ZPP, elevación moderada del TfR y absorción reducida de hierro. Ocurre también un acortamiento moderado del periodo de vida del eritrocito. El mecanismo exacto del proceso todavía no está totalmente aclarado y el metabolismo desordenado del hierro no es el único elemento, pues la entrega de éste a la médula eritroide se mantiene como una posibilidad y la terapia con eritropoyetina puede corregir la condición, pero no la deficiencia de hierro. El efecto de las citocinas inflamatorias parece central. La anemia por enfermedad crónica puede distinguirse de la anemia por deficiencia de hierro examinando la médula, con la presencia de hierro que se puede teñir en las células reticuloendoteliales, excluyendo la ADH como una causa de anemia, pero esta prueba no es conveniente para un uso extenso. El hierro sérico tiene defectos importantes como prueba de deficiencia de hierro. Muestra variación diurna significativa y también es afectado por la ingesta de comida reciente, lo que da por resultado alta variabilidad intraindividual. En la anemia por enfermedad crónica, el hierro sérico está disminuido y es independiente de las reservas y, aunque el uso de la saturación de la transferrina supera parcialmente esto (como la transferrina o IBC está deprimido en la misma situación), su valor predictivo no es alto. La estrogenización (en embarazo, anticonceptivo oral o terapia de reemplazo de estrógeno) puede confundir la situación al incrementarse la transferrina sérica (e IBC). La ferritina sérica en una persona saludable indica un buen índice de reservas de hierro corporales, pero la inflamación y la enfermedad del hígado causan su aumento, independientemente del estado del hierro, lo cual perjudica su valor diagnóstico. Aunque una ferritina sérica menor de 20 µg/L es congruente con la ADH y una superior a 100 µg/L torna improbable la ADH, incluso en presencia de enfermedad inflamatoria, esto deja a un grupo grande de pacientes con valores intermedios de ferritina en quienes el diagnóstico puede ser incierto. La protoporfirina zinc, a diferencia de la ferritina sérica, no se ve afectada por enfermedad del hígado, ni directamente por la reacción en fase aguda; que sea positiva en la toxicidad por plomo es un problema raro. En la enferme-

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HIERRO

dad reumatoide se correlaciona con el porcentaje de células hipocrómicas, pero se incrementa con frecuencia cuando la demora es normal y en la falla renal se eleva no específicamente cuando el porcentaje de las células hipocrómicas es normal. Esta es una prueba de deficiencia funcional, la cual se incrementa cuando el hierro es inasequible al momento de la eritropoyesis, y esto es cierto en la anemia por enfermedad crónica. Aunque se dice que no es afectada por el rasgo de talasemia, hay evidencia de que 50% de los pacientes con esta condición tiene ZPP elevada; pero no es diagnóstico de deficiencia de hierro, aunque proporciona información sobre la disponibilidad funcional de hierro para el desarrollo del eritrocito, excepto posiblemente en el rasgo de talasemia. El receptor de la transferrina sérica está relacionado con las reservas de hierro en individuos saludables y aumenta cuando existe deficiencia de hierro u ocurre incremento de la eritropoyesis. Esta última situación incluye eritropoyesis ineficaz. En la enfermedad crónica, las concentraciones aumentan, incluso en presencia de reservas adecuadas de hierro, relacionadas posiblemente a la incidencia de eritropoyesis ineficaz. Sin embargo, una relación con las reservas de hierro aún permanece. El cociente de TfR sérico a ferritina sérica ha mostrado ser una medida excelente de las reservas en el estado de salud, y un mejor indicador de la deficiencia de hierro en la anemia por enfermedad crónica que la ferritina sérica sola. El TfR sérico puede ser particularmente útil en el embarazo. El embarazo puede causar anemia por hemodilución, la cual se relaciona con frecuencia con una ferritina disminuida, incluso en presencia de reservas adecuadas de hierro, y con un aumento en IBC causado por los estrógenos puede sugerir deficiencia de hierro. El TfR sérico parece, desde la evidencia preliminar, ser relativamente afectado por el embarazo, permitiendo su uso en la valoración de la deficiencia de hierro. Aunque su naturaleza manual la hace inadecuada en algunos laboratorios, la ZPP es una prueba de primera línea buena y económica para medir la deficiencia de hierro, apreciable en la muestra inicial del conteo sanguíneo completo. La ferritina es una buena prueba de segunda línea, si se reconocen sus deficiencias. El receptor de transferrina sérica puede asumir una mayor importancia cuando está disponible fácilmente en los analizadores principales y su papel es definido con más claridad, pero hay probablemente poco qué ganar en el presente al agregar la medición del TfR sérico al rango existente de las pruebas disponibles en los laboratorios. Es importante, cuando nuevas pruebas de laboratorio se introducen, que los protocolos de investigación sean revalorados, para evitar siempre paneles más amplios de las pruebas que se empleen sin la discriminación correcta.

Investigación sobre la sobrecarga de hierro La sobrecarga adquirida de hierro ocurre conjuntamente con las anemias hemolíticas crónicas, sobrecarga parenteral de hierro, o enfermedad crónica del hígado, pero el origen está establecido desde la historia del paciente, y la investigación y el manejo de esta condición no se describen aquí. La susceptibilidad genética a la hemocromatosis es común en la población general (1 en 100 a 300), aunque la incidencia de la enfermedad sintomática es probablemente un vigésimo de la mutación genética, condición importante que se debe excluir en cualquier incidencia con elevación inexplicada de las enzimas hepáticas, porque su potencial es fatal pero fácilmente tratable, y el descubrimiento de los casos índice permite la investigación de los parientes cercanos para establecer el riesgo futuro. La primera anormalidad que surge es un aumento en la saturación de la transferrina, y valores mayores de 55% en mujeres o 60% en varones sugieren acumulación de hierro. El efecto del alimento y la variación diurna se evitan mejor con el empleo de una muestra en ayuno temprano por la mañana. La ferritina sérica aumenta en una etapa posterior de la acumulación de hierro, cuando el hierro hepático se eleva. Los valores superiores a 500 µg/L son sospechosos de sobrecarga de hierro, pero otras condiciones que implican inflamación deben eliminarse, y la saturación de la transferrina también es una prueba superior en este aspecto, ya que la enfermedad inflamatoria produce una saturación disminuida y menos incertidumbre del diagnóstico. Si la hemocromatosis genética es sugerida por estas investigaciones preliminares, el análisis de la mutación del gen de la hemocromatosis (HFE) debe realizarse, usando una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La forma más común de la sobrecarga heredada de hierro (cerca de 90% de los casos) está relacionada con mutaciones en el gen para la HFE, en particular con la mutación C282Y, en la cual la cisteína (C) en la posición 282 es sustituida por un residuo de tirosina (Y). La otra mutación es H63D, en la cual la histidina (H) en la posición 63 es reemplazada por el ácido aspártico (D). La homocigosidad para la mutación C282Y está relacionada con la sobrecarga de hierro, y hasta 10% de los hombres y 5% de las mujeres con el fenotipo HH/YY desarrollan sobrecarga sintomática de hierro. La situación con los heterocigotos compuestos (p. ej., HD/CY) no es del todo conocida y, del mismo modo, los homocigotos para la mutación H63D (DD/CC) son seriamente menos afectados. La valoración del hierro hepático no es una parte necesaria del proceso diagnóstico, pero puede utilizarse para valorar la gravedad de la enfermedad en pacientes seleccionados.

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CAP. 33

INVESTIGACIONES HEMÁTICAS

El tratamiento es por venodisección regular hasta donde la línea fronteriza de la deficiencia de hierro se alcanza.

Resumen La investigación de las deficiencias hematínicas siempre comienza con el conteo sanguíneo completo. La medición de la cobalamina sérica, y del folato sérico o del eritrocito, o ambos, puede contribuir en la identificación de la deficiencia específica, aunque una comprensión de las limitaciones de las pruebas es necesaria, y de otras pruebas no disponibles con facilidad en la actualidad, pueden volverse más importantes, en particular durante la investigación de la deficiencia marginal. Hay diferentes medidas de suficiencia de las reservas de hierro con ferritina que, a pesar de sus imperfecciones, continúan siendo las mejores pruebas fácilmente accesibles; y aunque la protoporfirina zinc tiene un papel importante, en el futuro el receptor de transferrina sérico puede ser la opción. Si bien el hierro sérico, la capacidad de captación del hierro y la saturación de la transferrina tienen una importancia menor en la valoración de la deficiencia de hierro, son las pruebas más sensibles para la sobrecarga de hierro, y la presencia de hemocromatosis genética puede ser demostrada de manera

precisa determinando la mutación del gen HFE por PCR. La investigación de la sobrecarga de hierro puede suscitarse por anormalidades inexplicables de las pruebas de función hepática. Siempre en las pruebas de laboratorio, la interpretación debe ser en el contexto de una valoración clínica completa del paciente y con un conocimiento basado en la evidencia de las fortalezas y deficiencias de las pruebas de laboratorio individuales.

Lecturas adicionales Scott J M. Folate and vitamin B12. Proc Nutrit Soc 1999; 58: 441448. Klee G G. Cobalamin and folate evaluation: measurement of methylmalonic acid and homocysteine vs. vitamin B12 and folate. Clin Chem 2000; 46 (8B): 1277-1283. Spyvak J L. Iron and the anemia of chronic disease. Oncology 2002; 16: (9) suppl: 25-33. Worwood M. Serum transferrin receptor assays and their application. Ann Clin Biochem 2002; 39: 221-230. Braun J. Erythrocyte zinc protoporphyrin. Kidney Int 1999; 55: S57-S60. Dooley J S. Diagnosis and management of genetic haemochromatosis. Best Pract Res Clin Haematol 2002; 15: 277-293.

34 Investigación de laboratorio de la hemólisis Paul Revell

Introducción En la vida normal, los eritrocitos se reciclan cada 120 días. Los desórdenes hemolíticos son aquellos en que hay destrucción acelerada del eritrocito, acompañados por un aumento compensatorio en la producción eritrocítica. Si la médula no puede “mantener” la demanda creciente para las nuevas células, se produce anemia. La destrucción acelerada ocurre porque el eritrocito es anormal. Las alteraciones relacionadas detectables en el laboratorio se muestran en la figura 34-1 y se resumen en el cuadro 34-1. Algunas de éstas se ilustran en la figura 34-2.

Características clínicas La manifestación en el paciente es con frecuencia muy inespecífica y depende de la velocidad de inicio tanto como de la enfermedad en particular que causa la hemólisis. Las características clínicas principales observadas en anemias hemolíticas se resumen en el cuadro 34-2. En las condiciones iniciales muy rápidas (p. ej., transfusión sanguínea incompatible) hay postración, fiebre y dolor de espalda con hemoglobinuria y malestar, en lugar de las características descritas en el cuadro 34-2. Las condiciones más crónicas alcanzan, con frecuencia, un “estado estable” con destrucción y producción en equilibrio, aunque normalmente algunos resultados de la prueba siguen siendo anormales. Este estado estable puede apreciarse por las exacerbaciones de la enfermedad o “crisis”. Existen cuatro tipos principales de crisis: 1. Una crisis hemolítica la ocasiona un aumento acelerado en la hemólisis, originado a menudo por una enferme-

dad intercurrente, como una infección viral. Esto causa un aumento en la ictericia y la anemia, y salida a la circulación de reticulocitos (y a veces de eritrocitos nucleados) de la médula. Ésta es una faceta de una “crisis falciforme”. 2. En una crisis aplásica la médula deja de trabajar durante algún tiempo, por ejemplo en la infección del parvovirus. En la mayoría de las personas esto tiene poco efecto, pero en condiciones hemolíticas el paciente puede volverse con rapidez muy anémico y enfermo, puesto que la mayor parte del tiempo cuenta con una médula muy activa para “proseguir”. 3. Una crisis de secuestración ocurre en algunas condiciones, como en la enfermedad de la célula falciforme en niños, cuando de repente el bazo se agranda y secuestra las células. El paciente o está muy enfermo o muere al llegar al hospital; este caso, afortunadamente, es raro. 4. Una crisis megaloblástica la causa la médula, que funciona sin folato (normalmente) a partir de la producción excesiva de eritrocitos requeridos para “proseguir”, y una franca anemia megaloblástica se produce. “Megaloblástica” se refiere a un aspecto característico de la médula ósea, donde los eritrocitos nucleados parecen anormales porque la maduración del núcleo y del citoplasma está asincrónica entre las células. Control general del paciente Cuando el paciente se presenta por primera vez, las prioridades del diagnóstico son establecer que la hemólisis está ocurriendo (figs. 34-1 y 34-2 y cuadros 34-1 y 34-2)

The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker. © 2005 John Wiley & Sons, Ltd.

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CAP. 34

INVESTIGACIÓN DE LABORATORIO DE LA HEMÓLISIS

Hemoglobina libre (y matanemalbúmina)

Contiene suero intravascular

Bilirrubina sin conjugar Vasos sanguíneos Extravascular Destrucción prematura en el bazo

Eritrocitos anormales

Descenso en Hb Bilirrubina sin conjugar Riñón

Hígado

Urobilonógeno Hemoglobiona Hemosiderinuria Urobilinógeno

Médula ósea Hiperplasia del eritrocito

Estercobilinógeno Intestino Eritrocitos incrementados

Utilización de hierro y fosfato

Figura 34-1 Características fisiopatológicas de la hemólisis. Si la destrucción ocurre dentro de los vasos sanguíneos, entonces se libera la hemoglobina, y aparece en la orina (véase también la fig. 34-2). Si la destrucción es extravascular (del bazo, a veces del hígado) entonces esto se evita pero se libera excesiva bilirrubina sin conjugar, lo que puede ocasionar que el paciente presente ictericia (tonalidad amarilla; o amarillo claro, si también es anémico, se identifica de manera temprana en la esclerótica ocular) y el producto secundario, urobilinógeno, se detecta en la orina durante la prueba (no decolora la orina). El aumento en la producción crea un cambio de eritrocitos a formas más jóvenes, que genera policromasia, un matiz azul, sobre el frotis de la sangre periférica, que se refleja en una cuenta aumentada de reticulocitos. Los eritrocitos nucleados, por lo general presentes sólo en la médula, también pueden observarse en la sangre en la hemólisis activa.

e intentar determinar si el proceso es lento o rápido, intra o extravascular. Las pruebas para encontrar la causa de la hemólisis entonces continúan de manera lógica. Los pacientes necesitan por lo general vitamina B12 y que se verifiquen los niveles de folato y después se comience a aplicar las dosis del tratamiento con ácido fólico por vía oral. La transfusión es necesaria en estados clínicos extremos. Si se encuentra la causa, entonces el tratamiento específico se inicia, por ejemplo, con corticoesteroides por vía oral para

hemólisis inmunitaria. Las complicaciones pueden necesitar tratamiento, como el retiro de los cálculos biliares formados por el pigmento, que son sintomáticos en la esferocitosis hereditaria. La extirpación del bazo (esplenectomía, para reducir la destrucción) tiene que considerarse en algunos casos. La hospitalización del paciente es necesaria en tiempos de estrés (embarazo, cirugía, etc.), y siempre es necesario apoyar y educar al paciente y a la familia en condiciones

CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS

Cuadro 34-1

Anormalidades de laboratorio en la hemólisis

No todas se encuentran en cada paciente. La gravedad relativa de cada anormalidad depende del estadio que se ha alcanzado de la enfermedad. La vida del eritrocito reducida se mide poco en forma directa (véase la fig. 34-5 como ejemplo). En general: • Hemoglobina baja si está descompensada • Cuenta del reticulocito incrementada • Bilirrubina incrementada (sin conjugar) • Urobilinógeno en orina • Tiempo de vida reducido del eritrocito • Eritrocitos anormales (dependiendo de la causa) Y si hay hemólisis intravascular: • Hemoglobinemia • Metahemalbuminemia • Hemoglobinuria • Hemosiderinuria • Haptoglobina sérica baja

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Cuadro 34-2 Características clínicas de la hemólisis La información clínica proporcionada por el médico puede ayudar en la selección de investigaciones primarias y secundarias cuando se sospecha hemólisis. • Historia de episodios anteriores • Asociación de episodios con: infecciones • Anemia fármacos • Ictericia frío • Cálculo biliar del pigmento alimentos • Úlceras en las piernas • Retraso en el crecimiento • Historia familiar de anemia/ictericia • Bazo alargado • Anormalidades del esqueleto

Figura 34-2 Algunos hallazgos de laboratorio en la hemólisis intravascular. a) La hemoglobina se libera dentro del suero, produciendo un aspecto “turbio-marrón”. Un suero normal se muestra para la comparación. b) Parte se aprecia directamente en la orina, causando una decoloración similar. Esto no debe confundirse con la incidencia, mucho más común, de la hematuria, donde eritrocitos enteros aparecen en la orina. En la hemoglobinuria, por tanto, la prueba de la tira diagnóstica para la sangre es positiva pero ningún eritrocito se muestra en la microscopia de la orina. c) Las células del riñón pasan a la orina (contratinción roja), toman hemoglobina y se presentan como gránulos pequeños de hemosiderina (azules). Véase también el cuadro 34-7.

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CAP. 34

INVESTIGACIÓN DE LABORATORIO DE LA HEMÓLISIS

crónicas. Los estudios de asesoramiento genéticos y sobre la familia pueden ser apropiados en ciertos casos.

tener 45% de HbS y el resto de HbA, pero cada célula será toda HbS o toda HbA.

Desórdenes hemolíticos

Anemia de célula falciforme (SS)

¡Existen centenares de diversas condiciones y se han escrito grandes tomos de ellas! El cuadro 34-3 muestra un panorama general de los amplios grupos y ejemplos comunes o importantes. Una breve descripción de cada uno de éstos se desarrolla para ilustrar dónde se sitúan dentro de este esquema general; los capítulos anteriores dan mayor detalle sobre algunas de las condiciones individuales. Hay también una lista de lecturas al final de este capítulo.

La forma desoxigenada de la Hb anormal es menos soluble que la HbA normal (en un amortiguador de fosfato ésta forma la base de la prueba de tamizaje para HbS). La HbS produce eritrocitos deformes (células falciformes) debido a la formación “tactoide”, y éstos son destruidos en el bazo y periféricamente. Los pacientes tienen una hemoglobina baja (5 a 10 g/dl) y con frecuencia tienen cuentas de neutrófilos y de plaquetas elevadas. Las células falciformes y “con forma de bote” son visibles en el frotis sanguíneo. El diagnóstico se realiza por electroforesis de Hb sobre gel de agarosa a pH ácido o alcalino. Los laboratorios que manejan una cantidad grande de muestras utilizan la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). Una Hb baja es suficiente para dañar el desarrollo en algunos niños. Los fenómenos trombóticos se deben, sobre todo, a la morfología falciforme de los eritrocitos, que causa dolor en los miembros, y también afecta a pecho, abdomen y cerebro. El infarto (destrucción localizada por la carencia de oxígeno) del bazo produce hipoesplenismo con cuerpos de Howell-Jolly en eritrocitos sobre el frotis sanguíneo. Un cuidado médico adecuado tiene un impacto significativo sobre la calidad de vida y mortalidad de pacientes con esa condición. En el rasgo de la célula falciforme (AS) la morfología falciforme no ocurre (ya que hay menos HbS en cada célula) excepto bajo condiciones muy hipóxicas (p. ej., en un avión despresurizado, en anestesia general). Hay poco que ver en el frotis.

Anemias de células falciformes y otras variantes de la hemoglobina El eritrocito contiene hemoglobina formada de cadenas de globina alteradas. La hemoglobina A (HbA) es normal. La HbF es una variante pero es normal en el feto. La hemoglobina S anormal se presenta por un defecto genético que causa la sustitución de un aminoácido en la cadena ␤ de la hemoglobina. En estas condiciones el eritrocito contiene hemoglobinas particulares según los genes que se portan. Por ejemplo, en la enfermedad falciforme homocigótica con dos genes S, el eritrocito contiene principalmente HbS y un poco de HbF pero ninguna HbA. En el rasgo (un gen S) contiene 45% de HbS y el resto de HbA. Vale considerar que estos son los porcentajes en cada célula; en contraste, un paciente con anemia falciforme homocigótica, a quien se transfunde con sangre normal (sólo HbA) también puede

Cuadro 34-3 Desórdenes hemolíticos Esta manera de dividir las condiciones permite, con una cantidad limitada de información clínica, guiar la comprobación subsiguiente. HEREDADOS

Defecto de la síntesis de la hemoglobina, por ejemplo, enfermedad de la célula falciforme o talasemia Anormalidad de la membrana, por ejemplo, esferocitosis hereditaria Deficiencia enzimática, por ejemplo, deficiencia de G6PD o PK

ADQUIRIDOS

INMUNITARIOS

Autoinmunitarios, por ejemplo, AIHA caliente o fría (CHAD) Enfermedad hemolítica del recién nacido Incompatibilidad de la transfusión

NO INMUNITARIOS

Físico-mecánico, por ejemplo, válvulas cardiacas Microangiopatías Hemoglobinuria paroxística nocturna

DESÓRDENES HEMOLÍTICOS

Enfermedad de HbC (CC) Produce hemólisis leve y esplenomegalia, además de problemas adicionales en la deshidratación y en el embarazo. El rasgo (AC) no es significativo para el individuo, excepto en términos genéticos. Enfermedad HbSC (S/C) Crea hemólisis leve pero los pacientes pueden tener problemas de morfología de célula falciforme, especialmente en el embarazo. En algunos, ocurren problemas de retinopatía (infartos en la parte posterior del ojo) y de destrucción ósea (p. ej., de la cabeza del fémur).

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que se condensan como cuerpos de inclusión (cuerpos H, vistos a la tinción con azul de cresilo). Esferocitosis hereditaria La esferocitosis hereditaria es “autosómica dominante”, es decir, con un alelo del gen alterado una persona hereda la condición; se encuentra por lo general en caucásicos. Hay alteración de las proteínas contráctiles de la membrana del eritrocito que conduce a deformabilidad reducida. Las células anormales son secuestradas en el bazo y se destruyen de manera prematura. Es normal que la anemia sea leve y que los esferocitos se observen en el frotis sanguíneo,

Enfermedad falciforme/tal (S/tal) La gravedad depende de la cantidad de Hb normal que se produce, que a su vez depende del gen de la talasemia específica. Sin ninguna, entonces la enfermedad es en todo tan grave como la forma SS homocigota. Talasemias En estas condiciones, existe producción alterada, en cuanto a número, de las cadenas de globina (en lugar de la producción de tipos anormales de la cadena). Éstas comprenden desde la ␤0-talasemia (ninguna cadena ␤) hasta las ␣-talasemias leves, donde hay una reducción mínima en la síntesis de cadena ␣ y ningún problema clínico para expresarlas. Los heterocigotos no se encuentran con el problema pero a menudo muestran alteraciones visibles en el frotis sanguíneo. La ␤0-talasemia homocigota es una alteración seria que requiere de transfusiones por toda la vida y se complica a veces por hiperesplenismo (el bazo hiperactivo que destruye todas las células sanguíneas). Los leucocitos presentan características observables en el frotis. La falta de producción es más importante que la hemólisis de células anormales. La hiperplasia de la médula produce las deformidades óseas típicas de la niñez. Los niños no crecen saludables y mueren sin la transfusión. Los sobrevivientes de la transfusión sufren los efectos de la sobrecarga de hierro. Si la quelación falla, usando cada noche un fármaco quelante oral o desferrioxamina como infusión subcutánea para aumentar la excreción del hierro, entonces ocurren daños en la glándula endocrina (pituitaria, gonadal, pancreática), el hígado e infiltración cardiaca, con resultado fatal, frecuentemente antes de los 25 años. La enfermedad de la hemoglobina H es una forma de ␣-talasemia (¡no una variante anormal de la Hb llamada H!). Aquí la ausencia de algunas cadenas ␣ produce exceso de cadenas ␤ para formar los tetrámeros (␤4),

Figura 34-3 Prueba de fragilidad osmótica. Alícuotas de sangre oxigenada bien mezclada se agregan a una serie de concentraciones salinas amortiguadas, por lo general NaCl en el rango de 0.2 a 1.2%. Las diluciones se incuban a temperatura ambiente por 30 min antes de que los tubos se centrifuguen y la cantidad de hemólisis en el sobrenadante se lee espectrofotométricamente. Los esferocitos son anormalmente sensibles a las soluciones hipotónicas y se lisan en concentraciones más altas que los eritrocitos normales. Una prueba de fragilidad osmótica inconclusa puede repetirse incubando la muestra sanguínea por 24 h a 37ºC, antes de la comprobación. Esta modificación es mucho más sensible en la detección de la esferocitosis leve que el método original. El gráfico para los eritrocitos normales aparece por lo general en el área gris; también se muestra un gráfico representativo para un paciente con esferocitosis hereditaria. Algunos laboratorios utilizan una variación, la prueba del tiempo de lisis en glicerol acidificado.

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CAP. 34

INVESTIGACIÓN DE LABORATORIO DE LA HEMÓLISIS

(¡pero suelen ser fácilmente confundidos!). El diagnóstico se realiza por una “fragilidad osmótica” incrementada (fig. 34-3) y puede confirmarse por un análisis electroforético de los componentes de la membrana del eritrocito usando geles de poliacrilamida SDS. Deficiencia de G6PD (glucosa 6-fosfato deshidrogenasa) El eritrocito tiene una energía reductora que disminuye a partir de una carencia de la primera enzima de la vía de desviación, la pentosa fosfato del metabolismo de la glucosa. Es frecuente que sea una condición recesiva ligada al sexo: la enfermedad se expresa en varones con un alelo del gen afectado en el cromosoma X, pero en las mujeres se necesitan ambos alelos afectados. Las mujeres con un alelo afectado mostrarán expresión variable, dependiendo del cromosoma X inactivo y en qué células, según la hipótesis de Lyon. Esto se observa sobre todo en poblaciones negras y mediterráneas, y afecta a 3% de la población mundial. La actividad de G6PD está presente en los reticulocitos pero cae rápido y prematuramente en estos individuos. La integridad del eritrocito, por tanto, se reduce durante la exposición a químicos oxidantes y fármacos (p. ej., antibióticos de sulfonamida). Los cuerpos de Heinz se observan en los frotis sanguíneos preparados de manera especial. El diagnóstico se realiza mediante el análisis de G6PD, pero sólo en el estado estable (no cuando hay una cantidad excesiva de reticulocitos, p. ej., después de una crisis hemolítica). Algunos de estos episodios son producidos por alimentos (clásicamente por habas: “favismo”) y también por fármacos. Tamizaje para la deficiencia de 6GPD Dentro de la vía de la pentosa fosfato el NADP es reducido por G6PD a NADPH. Este producto fluoresce bajo luz ultravioleta, lo que forma la base de la prueba de la mancha fluorescente. La sangre completa se mezcla con:

de NADPH por G6PD se mide espectrofotométricamente, como un cambio en la densidad óptica a través del tiempo. Deficiencia de piruvato cinasa La deficiencia de piruvato cinasa es una condición “autosómica recesiva” (una persona manifiesta la condición cuando ambos alelos de un gen son anormales) y otro problema enzimático, el más común de las enfermedades raras sin G6PD. Las células llegan a tornarse deformes y lábiles. El frotis sanguíneo muestra poiquilocitos (eritrocitos anormales) que son hemolizados de forma espontánea sin estímulo de algún fármaco. Las transfusiones pueden ser necesarias. Tamizaje para la deficiencia de piruvato cinasa La piruvato cinasa es el catalizador para la reacción: ADP ⫹ fosfoenolpiruvato S ATP ⫹ piruvato El producto de esta reacción, piruvato, avanza dentro de la siguiente reacción, que es catalizada por lactato deshidrogenasa (LDH): Piruvato ⫹ NADH S lactato ⫹ NAD NADH despedirá fluorescencia bajo luz UV de onda larga, mientras que NAD no. Por tanto, cuando la sangre completa es incubada con ADP, fosfoenolpiruvato y NADH, en muestras normales, NADH se oxida a NAD, con una pérdida consecuente de fluorescencia. Las muestras deficientes despedirán luz fluorescente brillante. Una prueba de tamizaje de PK anormal debe confirmarse por un ensayo completo donde la oxidación de NADH a NAD es medida por un cambio en la absorbancia espectrofotométricamente en una cinética basada en el tiempo.

• Glucosa 6-fosfato. • NADP. • Agente lisante (normalmente saponina). • Amortiguador. Esto se incuba de 5 a 10 min antes de colocarse sobre el papel filtro, secarse y examinarse bajo luz UV de onda larga. Las muestras normales despiden luz fluorescente brillante, las deficientes no, o sólo una luz escasa fluorescente. Cualquier prueba de tamizaje anormal debe confirmarse por un ensayo funcional de la G6PD; aquí la producción

Hemólisis inmunitaria Diferentes patologías (como las que se listan en el cuadro 34-4) dan lugar a eritrocitos que son el blanco de anticuerpos en su superficie; por lo tanto, tienen un periodo de vida corto. La hemólisis inmunitaria se divide en el laboratorio en “caliente” y “fría”, dependiendo de la variación de la temperatura en la que existe actividad del anticuerpo (y de la aglutinación) en el laboratorio, clásicamente a 37ºC en caliente y a 4ºC en frío, aunque existe, a veces, un pequeño traslape. Así también como en una prueba de Coombs (antiglobulina) directa de tamizaje amplio, que es positiva

DESÓRDENES HEMOLÍTICOS

329

Cuadro 34-4 Causas de la hemólisis inmunitaria

Hay muchas condiciones diferentes que pueden dar lugar a eritrocitos cubiertos con anticuerpos. Aquí se muestran amplios grupos. La división bajo condiciones “frías” y “calientes” ayuda en la decisión del tratamiento. “Fría”

Desórdenes linfoproliferativos, por ejemplo, linfoma no Hodgkin de grado bajo Infecciones, por ejemplo, Mycoplasma pneumoniae Enfermedad por hemaglutinina-fría (CHAD)

”Caliente”

Desórdenes linfoproliferativos, por ejemplo, leucemia linfocítica crónica Enfermedades del tejido conectivo, por ejemplo, lupus eritematoso sistémico Farmacos, por ejemplo ␣-metildopa, usados para presión sanguínea alta

Figura 34-4 Prueba de Coombs (o antiglobulina) directa. El DCT (o DAGT) detecta eritrocitos cubiertos de anticuerpos. a) A una suspensión de eritrocitos del paciente (ya cubiertas con el anticuerpo) se agrega b) antiglobulina de espectro amplio (p. ej., antihumana de conejo). c) La aglutinación ocurre. El resultado se muestra en un método tradicional con tubo (superior) o con la tecnología de gel (inferior)

330

CAP. 34

INVESTIGACIÓN DE LABORATORIO DE LA HEMÓLISIS

(DCT, fig. 34-4), los reactivos que dan un perfil más específico (IgG, complemento) pueden utilizarse en la hemólisis inmunitaria caliente. Es frecuente, cuando se sospecha hemólisis inmunitaria fría, mantener el espécimen de la sangre a una temperatura mayor a la ambiental hasta que el suero se separe, después se realiza la prueba contra células del adulto (que contiene antígeno I) y del cordón umbilical (que producen antígeno i). La DCT es, por lo general, sólo positiva con el reactivo complemento, y el frotis sanguíneo muestra aglutinación, a menos que se realice en condiciones calientes. La distinción entre condiciones calientes y frías es importante para el tratamiento. En la hemólisis inmunitaria caliente, los esteroides y otros tratamientos inmunosupresivos dirigidos a reprimir, o a interferir con el efecto de la producción del anticuerpo es con frecuencia útil. La esplenectomía a menudo funciona. En la hemólisis inmunitaria fría, sin embargo, la quimioterapia citotóxica (a veces) y mantener caliente al paciente ayuda (casi siempre), pero no los esteroides o la esplenectomía. La transfusión por lo general se evita en la hemólisis inmunitaria, pues la autoaglutinación interfiere con la compatibilidad cruzada. El estado clínico del paciente demanda, de cuando en cuando, la transfusión y no puede permitirse ciertamente sucumbir por la carencia de eritrocitos, en este caso se proporciona la sangre que es “menos incompatible”.

Enfermedad hemolítica del recién nacido (HDN) Las células rhesus positivas del feto Rh+ pasan a la circulación de una madre Rh–, por ejemplo, en la hemorragia durante el embarazo o por amenaza de aborto. Esto causa que la madre produzca anticuerpos anti-D (antirrhesus) que más tarde en este embarazo o en subsecuentes, pasan al feto y se dirigen en contra de los eritrocitos, causando hemólisis si el bebé es Rh+. Las incompatibilidades del grupo ABO pueden causar problemas similares pero de menor gravedad. Altos niveles de bilirrubina sin conjugar después del nacimiento (debido a hemólisis) cruzan la barrera hematoencefálica y producen “kernícterus”, con daño cerebral. El tratamiento, que puede incluir la transfusión de intercambio, previene esto. Pueden verse esferocitos sobre el frotis sanguíneo y el DCT se torna positivo. En casos graves el bebé se vuelve hidrópico (anemia/ictericia/aumento de volumen con edema). En potenciales periodos hemorrágicos feto-maternos, la producción del anticuerpo por la madre puede prevenirse con la administración pasiva de anti-D mediante inyección intramuscular para bloquear células Rh+, antígeno que hace que ella produzca su propia respuesta. El uso profiláctico de anti-D de esta manera es una de las historias exitosas de la medicina científica moderna, así los infantes afectados son ahora escasos; pueden

tratarse por transfusión intrauterina (una maniobra delicada) o en inducción temprana de la labor del parto, con transfusión de intercambio en el recién nacido. Transfusión incompatible La transfusión incompatible crea una hemólisis inmunomediada. En la incompatibilidad de grupo ABO (que ocurra es muy raro y se espera) las células del donador se destruyen en el lecho intravascular debido a que los anticuerpos del paciente anti-A o anti-B (o ambos) se producen de manera natural. El paciente puede enfermarse muy rápido, como se describe antes, y desarrollar hemoglobinuria. Si la transfusión no se detiene o el paciente está bajo anestesia, la condición puede ser fatal. Las reacciones de incompatibilidad a otros antígenos es normal que provoquen hemólisis extravascular con anemia e ictericia. La recuperación es la norma, pero se presentan problemas de compatibilidad cruzada después de esto, por causa de aloanticuerpos para los antígenos del eritrocito. Mecanismos no inmunitarios Éstos pueden dar lugar a eritrocitos anormales (que, por tanto, tienen una vida media corta). El traumatismo físico y mecánico para los eritrocitos normales, como atravesar una válvula mecánica del corazón que se fuga, puede conducir a la fragmentación y lisis intravascular o a su reciclaje precoz por el bazo. La hemoglobinuria paroxística nocturna (PNH) es una enfermedad hematológica adquirida rara. El paciente sufre una típica hemólisis intravascular mediada por el complemento, que resulta en hemoglobinuria, deficiencia de hierro, crisis aplásica y una predisposición a la trombosis venosa. Éste es un desorden de la célula embrionaria que produce células deficientes en proteínas reguladoras del complemento, ocasionando un incremento de la sensibilidad de la membrana del eritrocito a la lisis por el complejo del complemento. Por lo común el diagnóstico se hace usando una variedad de pruebas. Las más sensitivas son las pruebas con suero acidificado (prueba de Hams) y la prueba de la lisis de la sacarosa. Éstas ahora se sustituyeron en gran parte por la introducción de la citometría de flujo para la detección de las moléculas superficiales CD55 (factor acelerador del deterioro-DAF) y CD59 (factor de restricción homocigoto-HRF/proteína ligada a C8 [C8bp]). Estos antígenos están reducidos o ausentes en PNH y la citometría de flujo es la herramienta más sensible y específica disponible para el diagnóstico actual. La alteración puede detectarse en la superficie de los eritrocitos y leucocitos en esta condición.

331

DESÓRDENES HEMOLÍTICOS

Cuadro 34-5

Causas de la microangiopatía

Estos tres grupos amplios contienen todas las causas probables: • Coagulación intravascular diseminada (DIC) (en problemas obstétricos, septicemia, cáncer, etcétera) • Lupus eritematoso sistémico (SLE) y otros desórdenes renales y del tejido conjuntivo • Púrpura trombocitopénica trombótica (TTP) y síndrome urémico hemolítico (HUS)

Cuadro 34-7

Cuadro 34-6 Diagnóstico de laboratorio de las condiciones microangiopáticas La detección de la coagulación, la bioquímica renal y la información clínica normalmente distinguen la causa. Causa

Hb/ plaquetas

Coagulación

Insuficiencia Contexto renal clínico

DIC SLE TTP HUS

Baja Baja Baja Baja

Anormal N N N

⫹ ⫹ ⫺ ⫹⫹⫹

⫹⫹ ⫹⫹⫹⫹ ⫺ ⫹⫹⫹

Investigación de laboratorio de la hemólisis intravascular

Durante la hemólisis, la hemoglobina se libera en el plasma. Ésta se liga rápido a la haptoglobina y a la hemopexina de las proteínas del plasma antes de eliminarse de la circulación por el hígado. Si la hemólisis es grave las concentraciones de haptoglobina y hemopexina se agotan muy rápido, y la hemoglobinuria/anemia y metahemalbuminemia se tornan detectables. • La metahemalbúmina con su apariencia ”turbia-marrón”, que puede medirse fotométricamente, tiene un pico de absorción característico de 624 nm • Los niveles de haptoglobina y hemopexina séricas pueden medirse de varias maneras incluyendo la filtración en gel y métodos electroforéticos, fotométricos e inmunológicos. Los más comunes actualmente son los métodos inmunológicos, que utilizan antihaptoglobina o antihemopexina, que permiten la demostración por inmunodifusión radial o técnicas del cohete de Laurell. • La demostración de la hemosiderina urinaria es por el método de la tinción de hierro con azul Prusia de Perl. Una muestra de orina se centrifuga y el sedimento se extiende a un portaobjetos de vidrio, se seca al aire antes de fijarse en metanol. El hierro férrico presente en el sedimento reacciona con el ferrocianuro de potasio acidificado para producir ferrocianuro férrico que aparece como gránulos teñidos de azul en la microscopia.

Figura 34-5 Marcado del eritrocito. La señora ID, de 76 años, sufría ataques recurrentes de anemia relacionados con palpitaciones, falta de respiración y agotamiento. La conocían por tener una enfermedad cardiaca valvular compleja, incluyendo un reemplazo de la válvula aórtica, que tenía murmullos al escuchar el corazón, que podrían indicar fuga. Se le aplica warfarina y se le distingue por tener aloanticuerpos del eritrocito, haciendo la compatibilidad cruzada difícil. Un cuadro de deficiencia del hierro indica la pérdida de eritrocitos pero, con poca fragmentación sobre el frotis sanguíneo, reducida haptoglobina pero ninguna hemosiderinuria, y confusión para determinar una destrucción intravascular significativa. Ella no tenía algún síntoma intestinal y el examen completo del aparato gastrointestinal no reveló ninguna causa anatómica de la pérdida sanguínea. Sus eritrocitos, por tanto, fueron marcados con 5lCr y se transfundieron nuevamente (día 0). Las muestras de sangre se tomaron todos los días para la actividad isotópica y las heces recolectadas, como se muestra en la gráfica. El día 1 se toma como 100% para permitir pérdidas tempranas inaplicables. Puede observarse que la vida media del cromo (T50Cr) se reduce a 15 días (lo normal es de 25 a 33 días), aunque ella mantuvo su Hb durante el estudio. Esta modesta reducción se explica por la pérdida considerable advertida a partir del aparato gastrointestinal, que se observa en las cuentas del isótopo en las heces. La pérdida es claramente variable y se asume que proviene de una angiodisplasia en el intestino largo (éstas no son demostrables anatómicamente). La paciente necesitó varias transfusiones electivas y de urgencia durante el primer año, pero ninguna a partir de entonces. Parecía que la pérdida de sangre había cesado. La válvula del corazón no necesitó reemplazarse.

332

CAP. 34

INVESTIGACIÓN DE LABORATORIO DE LA HEMÓLISIS

Microangiopatías

Segmento final

Las microangiopatías causan destrucción del eritrocito por los filamentos de fibrina de vasos pequeños y se relacionan con un cuadro sanguíneo característico, que contiene porciones de los fragmentos, algunos glóbulos rojos “alargados” y pocos microesforocitos. La trombocitopenia y los marcadores de la hemólisis (anemia, reticulocitos elevados y bilirrubina) están con frecuencia presentes. Existen varias causas de la microangiopatía, las cuales se resumen en el cuadro 34-5. Los indicadores del diagnóstico que las distingue se muestran en el cuadro 34-6. El diagnóstico debe hacerse de manera correcta porque todas estas condiciones son serias y pueden de otro modo causar la muerte a pacientes sanos jóvenes, aunque a menudo son tratables. La distinción acertada entre ellas es importante porque ciertos productos sanguíneos son en potencia peligrosos en algunas personas, y asimismo el manejo con esteroides es provechoso sólo en algunos individuos. En el cuadro 34-7 se muestra evidencia adicional de hemólisis intravascular que puede obtenerse a partir de las investigaciones que se ejemplifican aquí.

Siempre existen algunos casos difíciles de aclarar y la medición directa mediante el marcaje de eritrocitos con isótopos puede ser necesaria (fig. 34-5). Por último, es probable que algunos pacientes presenten de forma clara la hemólisis, pero en quienes ninguna causa puede encontrarse. La mayoría de ellos presenta un desorden de la estructura o fisiología del eritrocito, hasta ahora no identificado.

Lecturas adicionales Dacie JV. The Haemolytic Anaemias, 3rd edn, vols 1-5. 19881999: Churchill Livingstone, Edinburgh. Greer. JP et al. Wintrobe’s Clinical Hematology. 11th edn. 2004: Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA. Hall R, Malia RG. Medical Laboratory Haematology, 2nd edn. 1991: Butterworth- Heinemann, Oxford. Lewis SM, Brain BJ, Bates I, Dacie and Lewis’. Practical Haematology. 9th edn. 2001: Churchill Livingstone, London.

35 Investigaciones de laboratorio de la hemostasis Peter E Rose y Catherine Caveen

Introducción El flujo sanguíneo en el compartimiento vascular depende del equilibrio entre la actividad anticoagulante y la procoagulante. Bajo circunstancias normales la actividad anticoagulante es la que domina; sin embargo, con el daño a las células endoteliales que revisten los vasos sanguíneos, el subendotelio puede ser expuesto, con el inicio de la formación local del coágulo. La agregación plaquetaria inicial forma un tapón plaquetario, mientras la coagulación local produce un coágulo firme de fibrina. Posteriormente, un sistema de digestión del coágulo (fibrinólisis) previene la extensión del coágulo y restaura la permeabilidad. La investigación de laboratorio se utiliza de rutina para evaluar a los pacientes con elevado riesgo trombótico o hemorrágico. En muchas condiciones médicas agudas el equilibrio normal de la hemostasis se altera y requiere corrección. Además, el monitoreo de los agentes terapéuticos para promover la actividad anticoagulante o los agentes para restaurar la hemostasis normal forma parte de las investigaciones de rutina emprendidas en el laboratorio de hematología. La coagulación in vivo requiere superficies de calcio y de fosfolípidos como un componente integral para la formación del coágulo. Los factores de coagulación circulan como precursores inactivos, que bajo estímulos apropiados se convierten a enzimas y a cofactores activos, con la generación de trombina y la conversión subsiguiente del fibrinógeno a fibrina. Los pasos iniciales en la activación de la coagulación involucran el factor tisular, expresado en las superficies no vasculares de la membrana celular, actuando como un cofactor para la activación de los factores VII a VIIa, con la activación subsiguiente de los factores X y IX y la generación eventual de trombina.

Hay, sin embargo, interacciones hemostáticas numerosas entre los factores de coagulación, permitiendo a una diversidad de ellos actuar como anticoagulantes y, además, como procoagulantes en diferentes circunstancias. Por tradición, las pruebas de coagulación in vitro se han separado de forma conveniente en activación de una vía intrínseca o una extrínseca. La activación no fisiológica de la vía intrínseca ocurre por el contacto con una superficie ajena del factor XII, cininógeno de alto peso molecular y por la activación subsiguiente de los factores coagulantes a través de los factores XI, IX, X y la protrombina. In vivo, sin embargo, las cantidades pequeñas de generación de protrombina después de la activación de la vía extrínseca resulta en una amplificación de la hemostasis vía activación del factor XI (fig. 35-1).

Tiempo de protrombina El tiempo de protrombina se utiliza como medida de la actividad de la vía extrínseca, en la cual la tromboplastina (factor tisular) y el calcio se agregan al plasma, y el tiempo requerido para la formación del coágulo se mide (fig. 35-2). Un tiempo de protrombina prolongado puede deberse a: • Anticoagulantes orales. • Deficiencia del factor I, II, V, VII o X, que puede heredarse o adquirirse, por ejemplo, en la enfermedad del hígado o coagulación intravascular diseminada. • Altos niveles de heparina. • Inhibidores de los factores de coagulación específicos, incluyendo el inhibidor del lupus. La investigación adicional de un tiempo de protrombina prolongado puede

The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker. © 2005 John Wiley & Sons, Ltd.

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CAP. 35

INVESTIGACIONES DE LABORATORIO DE LA HEMOSTASIS

Figura 35-1 La vía de la cascada de la coagulación.

implicar estudios de corrección o ensayos de los factores coagulantes. Un tiempo de protombina prolongado puede corregirse en presencia de plasma normal. El patrón de corrección identifica el factor, o los factores, que son deficientes. Diferentes reactivos se utilizan en los estudios de corrección (cuadro 35-1). Estas pruebas, sin embargo, se han sustituido en gran parte por los ensayos de los factores coagulantes individuales. Control anticoagulante oral El cociente normalizado internacional (INR) es el método recomendado para informar los resultados del tiempo de

protrombina para el control anticoagulante. El sistema del INR se ha desarrollado para compensar la fuente principal de discrepancia en los ensayos del tiempo de protrombina, a saber, la variabilidad en la respuesta a diferentes reactivos de tromboplastina a los cambios en los factores coagulantes dependientes de la vitamina K inducidos por la warfarina. Como los números de los pacientes que requieren terapia oral anticoagulante van en aumento (1 de 80 personas en el Reino Unido) y la necesidad de vigilancia regular del INR, esto representa una carga de trabajo importante. El principio de la anticoagulación oral es proporcionar un nivel de anticoagulación para prevenir problemas trombóticos pero también para evitar problemas de sangrado de la sobreanticoagulación. Para la mayor parte de los problemas trombóticos venosos un INR en el rango de 2 a 3 es satisfactorio.

335

TIEMPO PARCIAL DE TROMBOPLASTINA ACIVADA (TTPA)

Errores de la protrombina Los errores con la estimación del tiempo de protrombina pueden crearse por los problemas con la colección de la muestra, la concentración del anticoagulante y el tipo de tubo de colección utilizado. Además, las diferencias entre los métodos manuales y automáticos son reconocidas; con los últimos se producen tiempos de protrombina más cortos. Mientras se requieren productos manufacturados para producir un valor del ISI para cada lote del reactivo de tromboplastina, la calibración incorrecta de los reactivos de tromboplastina por el laboratorio local o los fabricantes es un problema. Para la calibración de una tromboplastina, se recomienda un reservorio de muestras del plasma de 20 adultos normales y 60 pacientes en warfarina, además, diferentes preparaciones de referencia internacional de distintas especies producen diferencias en el ISI. La media geométrica del tiempo de protrombina normal debe derivarse de un reservorio de 20 muestras de plasma de adultos normales y la media geométrica calculada de éste.

Figura 35-2 Vía extrínseca

Para los pacientes con válvulas mecánicas del corazón, un nivel más alto de anticoagulación INR en el rango de 2.5 a 3.5, es necesario para prevenir la formación del coágulo en la válvula (cuadro 35-2). El INR se expresa como: INR =

PT

Tiempo parcial de tromboplastina activada (APTT) Esta prueba mide la vía intrínseca de la coagulación. Un activador, como el caolín, desencadena la vía al activar los factores de contacto (fig. 35-3). En presencia de iones de calcio y de fosfolípido, esto culmina en la generación de trombina y en última instancia en la formación del coágulo de fibrina. El APTT también se utiliza en el monitoreo de la terapia de heparina. Un APTT prolongado en un paciente con historia de una diátesis hemorrágica requiere investigación adicional, en particular para excluir la hemofilia A o B.

(ISI)

GMNPT donde ISI es el índice de sensibilidad internacional del reactivo de tromboplastina y GMNPT es la media geométrica del tiempo de protrombina normal. Fuentes importantes de error permanecen en la medición del INR y pueden surgir de problemas en la medición del tiempo de protrombina, ISI o GMNPT.

Cuadro 35-1 Plasma normal Suero envejecido ⫹ ⫹ ⫹ ⫹ ⫹ ⫺

⫺ ⫺ ⫺ ⫹ ⫹ ⫺

Estudios de corrección de un tiempo de protrombina prolongado Plasma absorbido ⫹ ⫺ ⫹ ⫺ ⫺ ⫺

Plasma oxalatado Deficiencia del factor ⫹ ⫹ ⫺ ⫹ ⫹ ⫺

I II V VII X Inhibidor

Pruebas adicionales Ensayo de fibrinógeno Ensayo del factor Ensayo del factor Ensayo del factor Tiempo RVV Tiempo de reptilasa Neutralización por protamina

⫹ ⫽ corregido; ⫺ ⫽ sin corregir; RVV ⫽ prueba con veneno de la víbora de Russells (serpiente Vipera russelli). Plasma normal citratado: éste proporciona todos los factores de coagulación. Suero envejecido: la sangre coagulada se incuba por 24 h a 37°C; el suero contiene los factores VII, IX, X, XI y XII. Plasma absorbido: el plasma normal se trata con el hidróxido de aluminio, que absorbe ciertos factores; el plasma resultante contiene los factores I, V, VII, XI y XII. Plasma oxalatado: plasma normal que se agrega a oxalato de sodio y se incuba por 72 h a 37°C; contiene todos los factores excepto el V.

336

CAP. 35

Cuadro 35-2

INVESTIGACIONES DE LABORATORIO DE LA HEMOSTASIS

Anticoagulantes orales para diversas condiciones clínicas

Condición

Rango INR

Tromboembolismo venoso • Trombosis posoperatoria de la vena de la pantorrilla sin algunos factores de riesgo • Trombosis de la vena de la pantorrilla en pacientes no quirúrgicos sin algunos factores de riesgo • Trombosis de la vena de la pantorrilla en pacientes no quirúrgicos con factores de riesgo • Émbolo pulmonar y trombosis de la vena proximal • DVT recurrente y/o PE • DVT recurrente y/o PE aunque sobre warfarina (INR rango 2 a 3) Fibrilación auricular • Fibrilación auricular u otras arritmias de alto riesgo Prótesis de la válvula del corazón y otras indicaciones cardiacas • Válvulas protésicas mecánicas • Válvulas bioprotésicas del corazón (no aórticas) • Cardiomiopatía, trombo mural o segmento acinético

Duración recomendada

2a3 2a3

6 semanas 3 meses

2a3 2a3 2a3 3a4

Indefinida (mientras los factores de riesgo persistan) 6 meses Indefinida Indefinida

2a3

Indefinida

2.5 a 3.5 2a3 2a3

Indefinida 3 meses Indefinida

El ácido acetilsalicílico es la terapia de primera línea para las siguientes condiciones; si está contraindicado, se recomiendan los siguientes rangos del INR para la terapia de warfarina: • Ataque TIA/isquémico 3a4 Indefinida • Trombosis arterial periférica e injertos 3a4 Indefinida • Trombosis de la arteria coronaria 3a4 Indefinida • Trombosis del injerto de la arteria coronaria 3a4 Indefinida • Angioplastia coronaria y stents coronarios 3a4 Indefinida *Interrumpir la warfarina si no hay AF, trombo intracardiaco o embolismo sistémico. Los pacientes que no requieren warfarina deben considerarse para la terapia antiplaquetaria (p. ej., con ácido acetilsalicílico).

Figura 35-3 Vía intrínseca.

TIEMPO DE TROMBINA

337

Investigación de laboratorio de un APTT prolongado

Figura 35-4 Investigación de laboratorio de un APTT prolongado.

Un APTT prolongado puede causarlo la deficiencia de los factores I, II, V, VIII, IX, X, XI o XII, que se heredan o adquieren debido a la enfermedad o a la consunción hepática, como en la coagulación intravascular diseminada. La terapia de heparina, los inhibidores para los factores de coagulación específicos, la presencia del anticoagulante del lupus o los niveles altos de FDP (productos de la degradación del fibrinógeno) también es posible que produzcan un APTT prolongado. Los estudios de corrección también suelen utilizarse para investigar, además, la causa de un APTT prolongado. Si los estudios mezclados muestran corrección del APTT, entonces los ensayos del factor específico se realizan para determinar el factor deficiente. La falla que se pretende corregir requiere investigación adicional para excluir un inhibidor adicional específico o el anticoagulante del lupus (fig. 35-4). El APTT se usa con más frecuencia para monitorear el tratamiento de heparina y ajustar el programa de infusión, según se ilustra en el cuadro 35-3.

Tiempo de trombina El tiempo de trombina se utiliza como un tamiz rápido para las anormalidades del fibrinógeno y evaluar si la heparina es la causa de un APTT prolongado. La trombina se agrega al plasma citratado y se mide el tiempo para la formación de fibrina (fig. 35-5). Un tiempo de trombina prolongado puede deberse a: • Disfibrinogenemias, heredadas o adquiridas, con una molécula de fibrinógeno estructuralmente anormal con las características funcionales alteradas. • Nivel bajo de fibrinógeno (< 1 g/L). • Niveles elevados de los productos de degradación del fibrinógeno. • Terapia con heparina.

338

CAP. 35

INVESTIGACIONES DE LABORATORIO DE LA HEMOSTASIS

Cuadro 35-3 Régimen de infusión de heparina, con monitoreo de laboratorio del tratamiento usando el APTT. El rango terapéutico debe determinarse del rango APTT equivalente a una concentración de heparina del plasma de 0.2 a 0.4 UI/ml Programa de infusión de heparina Bolo IV Infusión IV

5 000 unidades 15 000 unidades/12 h

Verificar el APTT después de 2 a 6 h • Rango aceptable 1.5 a 2.5 • En el embarazo 1.5 a 2.0 Ajustar la heparina como sigue: > 5.0 4.1 a 5.0 3.1 a 4.0 2.6 a 3.0 1.5 a 2.5 1.2 a 1.4 < 1.2

Parar por una hora Disminuir a 6 000 unidades/12 h Disminuir a 3 600 unidades/12 h Disminuir a 1 200 unidades/12 h Disminuir a 600 unidades/12 h Sin cambio Aumentar a 2 400 unidades/12 h Aumentar a 4 800 unidades/12 h

Verificar el APTT en 2 a 6 h Verificar el APTT en 2 a 6 h Verificar el APTT en 2 a 6 h Verificar el APTT en 2 a 12 h Verificar el APTT dentro de 24 h Verificar el APTT en 2 a 12 h Verificar el APTT en 2 a 6 h

Verificar el APTT 2 a 6 h después de circular la heparina. La heparina no debe represcribirse por más de 24 h. La verificación del APTT sobre una base diaria es el mínimo obligatorio para todos los pacientes que reciben heparina intravenosa. Vigilar las plaquetas después de cuatro días del tratamiento con heparina.

heparina en la muestra. El tiempo de reptilasa se prolonga en la disfibrinogenemia e hipofibrinogenemia.

Fibrinógeno

Figura 35-5 Tiempo de trombina.

La presencia de heparina en una muestra se confirma por la corrección del tiempo de trombina con sulfato de protamina, que neutraliza la actividad anticoagulante.

Tiempo de reptilasa La reptilasa es una enzima del veneno de la serpiente Bothrops atrox (Per-de-lana), que coagula el fibrinógeno humano al cortar el fibrinopéptido A del fibrinógeno. La reptilasa no es inhibida por la heparina o la antitrombina III. Un tiempo de protrombina prolongado y tiempo de reptilasa normal está también de acuerdo con la presencia de

Si bien los desórdenes heredados del fibrinógeno son raros, los desórdenes adquiridos son comunes en pacientes con coagulopatías de consumo, enfermedad hepática y, después de una cirugía mayor, derivación cardiopulmonar. Además, la asociación de niveles altos de fibrinógeno y elevado riesgo del corazón isquémico y la enfermedad vascular periférica están bien reconocidos. El fibrinógeno es también un reactor de fase aguda, con niveles elevados observados con frecuencia en las enfermedades inflamatorias. La interpretación de resultados es por tanto difícil, y el método más apropiado depende del objetivo de la investigación. La confirmación de los niveles bajos de fibrinógeno con un método Clauss manual es el más recomendable. Hay muchos métodos que se emplean para medir el fibrinógeno, sobre todo con más frecuencia los de coagulación, que miden el fibrinógeno funcional, basados en la formación de fibrina. En el método del tiempo de trombina (Clauss), el tiempo de trombina es proporcional a la concentración del fibrinógeno en la muestra de prueba. Una curva de calibración se prepara de las concentraciones conocidas de fibrinógeno y se utiliza para convertir el tiempo de trombina a una concentración de fibrinógeno. Hay poca interferencia

ENSAYOS DEL FACTOR

de los FDP o de la heparina, a menos que estén presentes en altas concentraciones. Un título del fibrinógeno puede obtenerse si se emplea una serie de diluciones del plasma, seguidas por la adición de trombina. La dilución en la cual el fibrinógeno se disuelve es una medida de la concentración del fibrinógeno presente. La prueba se efectúa con frecuencia en paralelo con sulfato de protamina y ácido E-aminocaproico (EACA) como indicadores de FDP y de fibrinólisis, respectivamente. Los métodos fisicoquímicos que se usan con menos frecuencia miden el fibrinógeno total y pueden no reflejar la actividad funcional, mientras los métodos inmunológicos miden el antígeno relacionado con el factor presente tanto en el fibrinógeno como en los FDP. El uso creciente de coagulómetros automáticos condujo a la automatización de los ensayos del fibrinógeno como parámetro derivado del tiempo de protrombina, basados en un análisis turbidimétrico con un espectrofotómetro.

Ensayos del D-dímero y de los FDP Los ensayos del D-dímero se utilizan cada vez más en el diagnóstico de la enfermedad tromboembólica venosa. Los fragmentos D-dímero se producen durante la degradación de los coágulos de fibrina generados desde la trombina por la plasmina. Los ensayos se basan en la detección que hacen los anticuerpos específicos de los fragmentos de fibrina entrelazada sin actividad cruzada con fibrinógeno. Estas pruebas se pueden, por tanto, realizar en muestras de plasma. Hay actualmente tres métodos principales para la detección del D-dímero. Un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) tiene una sensibilidad muy alta y proporciona resultados cuantitativos. La desventaja principal es que la técnica consume tiempo y, por tanto, presenta problemas donde este análisis se utiliza en el tamizaje rápido para la enfermedad tromboembólica venosa. Los ensayos de aglutinación de látex son más rápidos, pero tienen una sensibilidad menor a 80%, requiriendo que se utilicen conjuntamente con un tanteo de probabilidad clínica como parte de cualquier procedimiento de tamizaje. Los ensayos de látex automáticos cuantitativos requieren equipo especial para medir la disminución de la transmisión de la luz a 405 nm; éste tiene la ventaja de ser sensible y también rápido. Los ensayos de aglutinación de sangre entera ofrecen el ensayo más rápido, basado en la aglutinación cuantitativa del eritrocito, en la cual el anticuerpo monoclonal para un D-dímero se liga al anticuerpo monoclonal que une a los eritrocitos. Estos ensayos son rápidos pero dependen del operador, y no se obtiene un resultado cuantitativo; asimismo tienen un alto valor predictivo negativo para la enfermedad tromboembólica venosa y, por

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tanto, es frecuente que se combinen con una cuenta clínica predictiva de probabilidad en el tamizaje de los pacientes para excluir trombosis venosa. Los resultados elevados del D-dímero no son específicos para la trombosis profunda de la vena y, especialmente en los ensayos más sensibles, los niveles bajos de fibrina se detectan en una variedad de condiciones, como inflamación, infección, vasculitis, embarazo y en particular durante tres semanas, después de la cirugía. Los niveles elevados de los D-dímeros y de los FDP se observan en la coagulación intravascular diseminada, la cual es un método útil en el monitoreo del progreso de la enfermedad siguiendo la activación in vivo de la plasmina. El ensayo puede utilizarse también para valorar si una respuesta fibrinolítica a un agente fibrinolítico terapéutico, tal como estreptocinasa o urocinasa, se ha conseguido. Como los ensayos del D-dímero son más específicos y distinguen entre la fibrinogenólisis y la fibrinólisis, han sustituido en gran parte los ensayos para los FDP. Los FDP se incrementan después de la degradación de la plasmina del fibrinógeno y de la fibrina no entrelazada, y ocasionan un tiempo de trombina prolongado o uno de coagulación por la reptilasa. Los ensayos del FDP que se emplean con más frecuencia utilizan una técnica de aglutinación de látex, en la cual un anticuerpo que reconoce los FDP es cubierto en la superficie de partículas de látex. Las partículas se aglutinan en presencia de los FDP, y la concentración se determina por la dilución que sostiene la aglutinación. Como los anticuerpos utilizados en este ensayo pueden unirse al fibrinógeno, el último debe eliminarse de la muestra del paciente. Esto se consigue al coagular la muestra con trombina o veneno de serpiente en presencia de un inhibidor de plasmina para prevenir la generación in vitro de productos de digestión. Estos reactivos se incorporan en tubos de colección especiales.

Ensayos del factor Los ensayos específicos del factor de coagulación se basan en el tiempo de protrombina o el APTT. Un rango de diluciones del plasma estándar se agrega a un plasma deficiente del factor específico. Los tiempos de coagulación que se obtienen muestran una relación lineal en la concentración del factor cuando se trazan en el papel de registro. La actividad del factor en el plasma de prueba puede entonces determinarse desde el gráfico. Estos ensayos son particularmente importantes en la identificación de pacientes con desórdenes heredados y también en la observación de la concentración del factor en la terapia de reemplazo. Los factores II, V, VII y X se ensayan con frecuencia usando una fase del tiempo de protrombina, mientras que los factores VIII, IX, XI y XII se basan en un método de APTT.

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CAP. 35

INVESTIGACIONES DE LABORATORIO DE LA HEMOSTASIS

La deficiencia del factor XIII no la detectan algunas pruebas de coagulación de rutina, ya que éste no participa en la reacción que conduce a la formación de fibrina. Una prueba de solubilidad de la urea es el método más utilizado para tamizar la deficiencia del factor XIII. Un coágulo de fibrina se forma, y se agrega acetona o urea a la muestra de plasma, a 37°C. La fibrina unida por la acción del factor XIII es insoluble en estas soluciones, pero en ausencia de la actividad del factor XIII un coágulo de fibrina se disuelve en cerca de una hora.

Fibrinólisis La fibrinólisis produce la rotura del coágulo de fibrina y se inicia la liberación desde el endotelio vascular del activador del plasminógeno tipo tisular (tPA) y del activador del plasminógeno tipo urocinasa (uPA). Estos activadores convierten el plasminógeno en la enzima activa plasmina, la cual degrada la fibrina. Hay también un inhibidor natural para la plasmina, ␣II antiplasmina y el inhibidor del activador del plasminógeno tipo 1 (PAI-1) liberado por el endotelio, que se une al tPA y al uPA libres, y los inactiva.

Anticoagulantes naturales In vivo hay activación de grado bajo continua de la coagulación e inhibidores naturales de los factores de coagulación activos. Una deficiencia de tales factores puede relacionarse con una tendencia protrombótica.

Antitrombina III La antitrombina III es un regulador principal de la trombina in vivo. Se prefieren los análisis funcionales, pues se reconoce que una variedad de formas moleculares produce la cuantificación normal de acuerdo a lo medido por técnicas inmunológicas. La mayor parte de los ensayos funcionales miden la neutralización de la trombina del factor Xa en presencia de heparina adicionada.

Proteínas C y S La proteína C se activa después de la generación de trombina. Ésta se une a la trombomodulina sobre la superficie de las células endoteliales, y liga y activa la proteína C. La trombina en esta situación pierde su actividad procoagulante y es incapaz de convertir el fibrinógeno en fibrina. La proteína C activada actúa como anticoagulante natural degradando los factores V y VIII, limitando la generación adicional de trombina. La proteína S sirve como un cofactor para la proteína C activada. Un hallazgo adicional importante es que la resistencia a la proteína C activada puede ocurrir por un defecto de la molécula del factor V, la mutación Leiden del factor V. Ésta se relaciona con un riesgo aumentado de la trombosis venosa y es el factor de riesgo protrombótico heredado conocido con más frecuencia. El tamiz por PCR se recomienda para los pacientes con una historia protrombótica para excluir este factor. El tamiz, que por PCR detecta la mutación G2020 de la protrombina, también se realiza de rutina como parte de un tamiz de trombofilia.

Marcadores de la coagulación activada En los últimos años ha aumentado el interés en la hipercoagulabilidad y las pruebas disponibles para su detección. Los ensayos para los marcadores de la activación de la coagulación tienen varias aplicaciones potenciales, incluyendo la caracterización de los pacientes con condiciones clínicas que predisponen a la trombosis, ayudando al diagnóstico de casos trombóticos agudos y al monitoreo de la terapia anticoagulante. Esto puede lograrse midiendo las formas enzimáticas de los cimógenos de la coagulación generadas durante la activación de la coagulación, o de forma indirecta, midiendo los péptidos de la activación que se generan cuando se activan los cimógenos. Además, midiendo los complejos que resultan de la inactivación enzimática por los inhibidores naturales del plasma, un planteamiento adicional está disponible; también un número de inmunoensayos para medir los fragmentos que se crean de la activación de factores coagulantes como los péptidos de activación de los factores IX y X. El fragmento 1 + 2 de la protrombina, que resulta de la activación mediada por la trombina de la protrombina y fibrinopéptido A, cortado a partir de la cadena ␣ del fibrinógeno por la trombina, son índices de la generación y de la actividad de la trombina, respectivamente. Los inmunoensayos para cuantificar la proteína C activada o el péptido de activación de la proteína C pueden considerarse como índices de la función de la trombina y de la trombomodulina. Los inmunoensayos están también disponibles para la medición de los complejos inhibidos enzimáticamente, como la trombina, la antitrombina, y otros complejos que resultan de la inhibición de la proteína C activada por el inhibidor de la proteína C y la antitripsina. Actualmente, la utilidad de los marcadores de la activación de la coagulación mejoró la evaluación de la hipercoagulabilidad en el diagnóstico de los acontecimientos trombóticos agudos. Para el último propósito es más eficaz medir los marcadores de activación de la fibrinólisis, tales como el D-dímero.

EVALUACIÓN AUTOMATIZADA DE LA COAGULACIÓN

Evaluación automatizada de la coagulación Los avances recientes en tecnología han anunciado la introducción de instrumentos automáticos para el tamizaje de la coagulación. Un aumento en la carga de trabajo, la demanda de mayor especificidad y la reducción en trabajo manual garantizan que casi todos los laboratorios ahora tengan automatización parcial o total. La mayor parte de los métodos manuales pueden modificarse para la instrumentación, aunque los resultados varían mucho según los instrumentos. Todas las pruebas de rutina de tamizaje de la coagulación, incluyendo los ensayos del factor, pueden analizarse en instrumentos automatizados. Instrumentos más avanzados permiten los ensayos cromogénicos para las pruebas especializadas de la coagulación. Los primeros instrumentos permitieron la detección del coágulo de fibrina a través de electrodos. Un electrodo se mueve dentro y fuera del reactante/plasma. Se agrega calcio y, tan pronto como se forme el primer coágulo de fibrina, el circuito eléctrico se completa y se detiene el temporizador. La mayor

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parte de los instrumentos modernos implican la detección fotoóptica de la terminación. Ya que tiene lugar el proceso coagulante, la luz dispersada de un haz fijo se aumenta. El tiempo de coagulación se obtiene a partir de la curva de coagulación así como el tiempo requerido para que la muestra alcance el porcentaje preestablecido de la intensidad de la luz dispersada. La instrumentación completa incluye muestreo robótico, lectura por código de barra de las muestras, dispensadores automáticos del reactante y un sistema de manejo de datos. Sin embargo, como los tiempos de coagulación varían entre los diferentes instrumentos, dependiendo del método de detección de la terminación, los resultados de la automatización no son estrictamente comparables. Por tanto, las técnicas manuales aún se utilizan como métodos de referencia.

Lectura adicional Lugassy G, Shulman S. Thrombosis and Anti-thrombotic Therapy. 2001: Hartin Dunitz, London.

SECCIÓN 6

CITOGENÉTICA KWWSERRNVPHGLFRVRUJ

36 Bandeo y análisis cromosómico Mervyn Humphreys

Introducción La citogenética implica el estudio de los cromosomas humanos en la salud y en la enfermedad. En el núcleo humano el material genético (DNA) está químicamente ligado a las proteínas y empaquetado en las distintas estructuras llamadas cromosomas. En general las células humanas poseen un total de 46 cromosomas, o 23 pares, un miembro de cada par de cromosomas se hereda del padre y el otro lo hereda la madre. El DNA de cada célula se empaqueta dentro de los cromosomas para facilitar la separación correcta del material genético a ambas células hijas en cada división celular. Cuando células, espermatozoides y huevos del gameto humano se producen, el número de cromosomas se divide en dos hasta formar 23 pares vía división celular meiótica, de tal manera que cuando un nuevo cigoto sea formado, por la fusión de un espermatozoide con un óvulo, las células tengan el número correcto de cromosomas, 46; 1956 es considerado el año en que da principio la citogenética humana moderna, ya que antes de ese año se pensaba que el número de cromosomas en la célula humana normal era de 48. El análisis citogenético permite la detección de alteraciones cromosómicas, que pueden ser numéricas (cromosomas adicionales o faltantes) o estructurales (deleciones, duplicaciones, translocaciones, etc.). Las preparaciones cromosómicas o cariotipos pueden elaborarse y analizarse a partir de diferentes tejidos del organismo, incluyendo sangre periférica, líquido amniótico, piel o médula ósea. Los estudios cromosómicos son un procedimiento diagnóstico de laboratorio importante en numerosas situaciones clínicas. Por ejemplo, los pacientes con defectos de nacimiento múltiples

o retraso mental, o ambos, desarrollo sexual anormal o esterilidad y numerosos tipos de neoplasias que pueden resguardar alteraciones citogenéticas. Es, por tanto, muy importante que los estudios cromosómicos se realicen como parte de las investigaciones rutinarias en tales pacientes. Hasta inicios de la década de 1970 el análisis citogenético sólo se realizó sobre preparaciones cromosómicas sin bandeo, con tinción sólida. Los cromosomas sólo podrían identificarse y clasificarse con base en la forma y el tamaño y, por tanto únicamente las alteraciones numéricas o los arreglos estructurales grandes podían detectarse. Algunas alteraciones numéricas claras no pueden caracterizarse de manera definitiva usando sólo la tinción como tal (fig. 36-1); éste es, sin embargo, aún el método de elección para las investigaciones de inestabilidad cromosómica, posterior a la exposición de los pacientes o de células a agentes clastogénicos. A principios de la década de 1970 se introducen las primeras técnicas de bandeo cromosómico permitiendo una identificación mucho más exacta de cada par cromosómico. Esto, a su vez, permitió la detección de alteraciones estructurales más sutiles relacionadas con condiciones patológicas específicas. Este capítulo describe y explica los principios fundamentales de las diversas técnicas de bandeo cromosómico que están disponibles y destaca sus principales aplicaciones en el laboratorio. También se describe el procedimiento del análisis citogenético.

Bandeo cromosómico Desde que se describieron las primeras preparaciones cromosómicas con bandeo a principios de la década de 1970,

The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker. © 2005 John Wiley & Sons, Ltd.

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CAP. 36

BANDEO Y ANÁLISIS CROMOSÓMICO

utilizan la tinción de Leishmann en lugar de la de Giemsa. Algunos métodos implican el tratamiento previo de los portaobjetos con solución salina (2⫻ SSC). Cada cromosoma exhibe un patrón característico y constante con bandeo G, permitiendo la identificación exacta de cada par cromosómico y la detección de alteraciones estructurales cromosómicas, como deleciones, inversiones y translocaciones. Es esencial que los portaobjetos sean expuestos a diferentes tratamientos antes del bandeo G o dejarlos a temperatura ambiente 3 a 4 días, calentarlos durante la noche a 60°C o tratarlos previamente con peróxido de hidrógeno. El almacenar de manera previa las preparaciones cromosómicas refuerza la integridad de los cromosomas, al hacerlos menos vulnerables a la sobredigestión por la tripsina (fig. 36-2).

Figura 36-1 Metafase cromosómica con tinción sólida de una paciente con el síndrome de Down (trisomía 21). Aunque el cromosoma 21 no puede distinguirse del 22 en las preparaciones con tinción sólida, los cinco cromosomas del grupo G presentes (21s y 22s) están señalados.

ha ocurrido una proliferación rápida de técnicas de tinción cromosómica permitiendo la caracterización precisa del cariotipo humano normal. El método de bandeo con Giemsa, desarrollado a mediados de la década de 1970, es la técnica más utilizada para el análisis cromosómico rutinario. Muchos otros métodos de bandeo por lo general se utilizan sólo para ayudar en la identificación de las alteraciones específicas de un cromosoma, cuya naturaleza exacta es incierta, después del análisis de bandeo G. Aunque se conoce muy poco acerca de la base bioquímica del bandeo cromosómico, los diversos patrones que se obtienen parecen reflejar la mejor manera en que se organiza, por la cual la enorme longitud del DNA humano es empaquetada dentro de los cromosomas. Las técnicas de bandeo cromosómico pueden dividirse en dos grupos: a) aquellas que dan lugar a bandas distribuidas a lo largo de todo el cromosoma, como los bandeos G, Q y R; y b) las que tiñen un número restringido de regiones específicas del cromosoma, como el bandeo C, tinciones NOR y DAPI. Bandeo Giemsa (bandeo G) El bandeo G de los cromosomas puede hacerse con diferentes químicos que producen bandas alternas de intensidad oscura y clara a lo largo de los cromosomas. El método más utilizado implica la digestión de preparaciones cromosómicas con la tripsina, una enzima proteolítica, seguida por una tinción con Giemsa. Muchos métodos de bandeo G ahora

Figura 36-2 Proliferación en la metafase femenina normal teñida por bandeo G.

Mecanismo Aunque ninguna hipótesis satisfactoria explica el mecanismo del bandeo G, parece estar relacionado con la composición del DNA e implica probablemente la eliminación selectiva de proteínas de diversas regiones del cromosoma. Se cree que los cromosomas contienen una estructura básica que se evidencia por medio del procedimiento de bandeo G. Un número aproximado a los 146 pares de bases de la cadena de DNA humano está enrollada alrededor de un centro que consiste en ocho moléculas de la proteína histona, para producir las réplicas de unidades llamadas nucleosomas o cromómeros. Los nucleosomas sucesivos se ordenan como cuentas sobre un collar. Esta fibra elemental de nucleosomas ligados se enrolla sobre sí misma como un solenoide para formar la fibra de cromatina. Las fibras de

BANDEO CROMOSÓMICO

cromatina se unen y se enrollan más dentro de los paquetes finales del cromosoma. Se cree que las bandas G oscuras pueden correlacionarse simplemente con estos cromómeros que parecen cuentas, y el patrón de bandeo G, por tanto, refleja la organización estructural de la cromatina a lo largo del cromosoma. Se ha sugerido, como alternativa, que las bandas G oscuras y claras se correlacionan con el contenido funcional que difiere del DNA en esas regiones del cromosoma. Los estudios de replicación exhiben que las regiones del DNA con tiempos de replicación similares se agrupan con el DNA en las bandas G oscuras y se replican de manera tardía en la fase S, en comparación con el DNA de la banda G clara. Los estudios de hibridación in situ muestran una correlación entre el patrón de bandeo G y la localización de las secuencias repetitivas del DNA. Se ha demostrado que las bandas G oscuras son ricas en secuencias repetitivas del DNA tipo L1, las cuales son relativamente ricas en AT y codifican muy pocos genes expresados. También se ha verificado que las bandas G claras son ricas en secuencias repetitivas del DNA tipo Alu, que son relativamente ricas en GC y codifican para muchos genes que se expresan. Aplicación El bandeo G es en gran medida el método más utilizado para el análisis citogenético rutinario en investigaciones clínicas. Este método permite la identificación de cada par cromosómico y la detección de la mayor parte de las alteraciones cromosómicas numéricas y estructurales. Los laboratorios citogenéticos que no emplean como rutina el bandeo G usan por lo general el bandeo R. Los otros métodos de bandeo cromosómico se utilizan sólo cuando un análisis de bandeo G inicial detecta una alteración cromosómica que requiere investigación adicional para su caracterización exacta. El patrón de bandeo G es, a grosso modo, similar al patrón de bandeo Q. Bandeo con quinicrina (bandeo Q) El bandeo Q, la primera técnica de bandeo cromosómico, se introdujo en 1968, cuando las preparaciones cromosómicas eran teñidas con la mostaza de quinicrina. El bandeo Q en la actualidad se produce por lo general usando el dihidrocloruro de quinicrina, que es menos tóxico. Una serie de regiones brillantes y opacas que despiden luz fluorescente se revelan a lo largo de los cromosomas cuando se observan con microscopia fluorescente (de 450 a 500 nm). El patrón de bandeo Q se asemeja enormemente al patrón de bandeo G, con bandas Q que despiden luz fluorescente brillante que corresponden con las bandas G que se tiñen de

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Figura 36-3 Bandeo Q. La proliferación en la metafase de un paciente con un cromosoma X anormal, derivado de una reestructuración t(X;Y). La flecha pequeña indica el cromosoma Y normal; la flecha grande indica X anormal con heterocromatina Yq ligada a Xp.

oscuro. Excepciones notables incluyen la porción distal del brazo largo del cromosoma Y, que muestra fluorescencia muy brillante. Las regiones satélites de los cromosomas acrocéntricos (13 a 15 y 21 a 22) también muestran los patrones característicos del bandeo Q (fig. 36-3). Mecanismo Debido a que los patrones del bandeo Q y del bandeo G muestran tales semejanzas, los mecanismos tienen influencias claras por los mismos parámetros de la composición del cromosoma (véase bandeo G). El patrón del bandeo Q se explica por la especificidad de las mostazas de nitrógeno por la guanina. La fluorescencia de la quinicrina se realza en las regiones de DNA ricas en secuencias AT y se opaca en las regiones ricas en GC, lo que produce el patrón del bandeo Q. El contenido de DNA en AT/GC variante de las bandas cromosómicas explica, por tanto, las diferencias en la intensidad de la tinción cuando se tratan con quinicrina. Aplicaciones El bandeo Q requiere un microscopio de fluorescencia para el análisis. El bandeo Q en preparaciones cromosómicas no es conveniente para las investigaciones citogenéticas rutinarias, pues la fluorescencia se pierde muy rápido durante el análisis. Este método de bandeo, sin embargo, es útil para el examen específico de los heteromorfismos relacio-

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BANDEO Y ANÁLISIS CROMOSÓMICO

nados con el cromosoma Y y las regiones satélites de los cromosomas acrocéntricos. Los patrones del bandeo Q del brazo corto y de los heteromorfismos satélites pueden, por ejemplo, usarse a veces para determinar el origen parental, y la etapa sin separación meiótica en las trisomías que involucran cromosomas acrocéntricos. Bandeo reverso (bandeo R) El bandeo R cromosómico es complementario de las bandas Q y G, y su primera aparición se reporta en 1971. Las laminillas se incuban en un amortiguador de fosfato a 85 a 89ºC, después se tiñen con Giemsa o con naranja de acridina, lo que produce un patrón de bandas, que es el contrario de los bandeos G o Q. Cuando se tiñen con Giemsa, las bandas son pálidas y requieren contraste de fases para el análisis. Ésta fue la primera técnica de bandeo no fluorescente en desarrollarse. Usando la tinción con naranja de acridina, las bandas R positivas despiden luz fluorescente verde/amarilla, mientras las bandas R negativas emiten una luz fluorescente naranja/roja. El bandeo R es muy exitoso si las laminillas se han envejecido a temperatura ambiente por varios días o a 60°C durante la noche. Las laminillas recién hechas requieren tiempos de incubación más cortos, dentro de un amortiguador (fig. 36-4).

en AT, se replican de manera tardía y no contienen genes housekeeping. El patrón de bandeo R se produce por la desnaturalización diferencial de las regiones cromosómicas ricas en GC y ricas en AT. Las regiones ricas en AT se desnaturalizan a una temperatura más baja y despiden luz fluorescente roja con el naranja de acridina. Este último cuando se intercala entre los pares de bases de las regiones ricas en GC de doble hebra despide luz fluorescente amarilla. No está muy claro, en su totalidad, por qué los tratamientos con Giemsa también producen bandeo R. Puede ser debido a la interacción diferencial de las proteínas con las regiones cromosómicas ricas en AT y en GC. Que las laminillas envejecidas requieran tiempos más cortos de incubación y produzcan un mejor bandeo R sugiere, otra vez, que, como las laminillas están envejecidas, su estructura general llega a ser más estable y menos vulnerable a la degradación mediante diferentes agentes (véase bandeo G). Aplicación Aunque los laboratorios citogenéticos utiliza el bandeo G para investigaciones de rutina, el bandeo R es el método empleado para el análisis rutinario del cromosoma en muchos laboratorios franceses. Esta técnica de bandeo en general no revela ninguna nueva información que no esté disponible siguiendo el bandeo G, pero en ocasiones se emplea para determinar con más exactitud los puntos de rotura de las alteraciones estructurales, sobre todo si existen puntos de rotura cromosómicos en las porciones terminales. Bandeo de heterocromatina constitutiva (bandeo C) El procedimiento del bandeo C implica tratar los cromosomas con ácido clorhídrico (HCl), álcali (BaOH2) y solución salina caliente (2⫻SSC). Las preparaciones cromosómicas del bandeo C por lo general se tiñen ligeramente, excepto las del teñido oscuro de las regiones de heterocromatina constitutiva. Éstas se sitúan en los centrómeros de todos los cromosomas, lo cual no ocurre en el cromosoma Y, que se localizan en la región distal del brazo largo (fig. 36-5).

Figura 36-4 Bandeo R usando naranja de acridina.

Mecanismo Igual que en los bandeos G y Q, el patrón del bandeo R parece reflejar la composición estructural y funcional de los cromosomas. Las bandas R positivas son ricas en bases GC, se replican en forma temprana, y contienen genes housekeeping, mientras las bandas R negativas son ricas

Mecanismo Se piensa que los tratamientos astringentes para la técnica de bandeo C facilitan la pérdida preferencial de DNA y de proteína de las regiones cromosómicas sin banda C. La depuración y la desnaturalización sucesivas de DNA cromosómico ocurren durante los tratamientos con ácido clorhídrico y álcali. Además, los fragmentos pequeños de DNA se pierden durante el tratamiento con sal, dejando

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Tinción de la región organizadora nucleolar (tinción NOR) Los genes ribosómicos que codifican para el RNA, forman y mantienen el nucleolo en núcleos interfásicos, están situados en los brazos cortos de los cromosomas acrocéntricos satélites (13, 14, 15, 21 y 22). Cuando las preparaciones del cromosoma se incuban durante toda la noche con solución de nitrato de plata, estas regiones organizadoras nucleolares (NOR) se tiñen de oscuro (fig. 36-6). Los satélites

Figura 36-5 El bandeo C de una proliferación en la metafase de un paciente con una inversión del cromosoma 4. El cromosoma 4 invertido (flecha grande) tiene la posición del centrómero desplazada hacia el extremo del telómero del brazo corto (punta de flecha). Los cromosomas normales del grupo B (4 y 5) no pueden distinguirse usando sólo bandeo C (flechas pequeñas).

sólo la heterocromatina centromérica muy compactada. Las proteínas no histónicas ligadas a las regiones con banda C pueden prevenir la desnaturalización de DNA que se produce en esos sitios. Aplicaciones Las bandas C de todos los cromosomas, especialmente de los cromosomas 1, 9, 16 y Y, varían de tamaño entre homólogos así como entre individuos. La variación extrema del tamaño de las bandas C no tiene ningún efecto fenotípico, pues estas regiones contienen sólo heterocromatina constitutiva y ningún gen importante. Si es confuso que una banda adicional o un segmento anormal del cromosoma, detectado por bandeo G, represente una variación normal de una región heterocromática o una alteración cromosómica dicromática de posible importancia clínica, el análisis de bandeo C puede proveer información concluyente. El bandeo C puede, en ocasiones, permitir la determinación del origen de la no disyunción en pacientes con trisomías. Cuando el cromosoma implicado tiene una variante heterocromática notable, entonces la comparación de las preparaciones para bandeo C del caso índice y de ambos padres puede indicar en cuál de los padres, y posiblemente en qué etapa de la meiosis, ocurre el error de la no disyunción que causa la trisomía.

Figura 36-6 Metafase teñida con NOR de un paciente con una translocación recíproca entre los cromosomas 7 y 14. La flecha indica el cromosoma 14 anormal con el material del cromosoma 7 translocado sobre la NOR.

de los cromosomas acrocéntricos se ven con frecuencia en grupo dentro de las células. Este fenómeno, llamado relación basada en los satélites, refleja una función común, probablemente, de las diversas NOR en la organización del nucleolo celular. Mecanismo El teñido de NOR implica la extracción de DNA, RNA e histonas a partir de los cromosomas. Realmente son proteínas residuales adyacentes a las NOR, más que NOR sin histona, las que se tiñen selectivamente con este método. Los estudios han demostrado que este método tiñe sólo las NOR activas que participaron en la formación del nucleolo en la interfase precedente del ciclo de la célula.

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Aplicación

Mecanismo

El número de las NOR que se detectan por proliferación en la metafase varía en los individuos porque sólo se tiñen las NOR activas que participan en la formación del nucleolo durante la etapa interfase precedente. El patrón de la tinción de la NOR de cromosomas acrocéntricos es consistente dentro de un individuo y es hereditario. Los patrones de las NOR y el aspecto por el bandeo Q de los satélites acrocéntricos son, por tanto, útiles para determinar el origen parental y/o la etapa sin disyunción meiótica implicada en las trisomías que involucra a estos cromosomas. La tinción de las NOR es útil para la caracterización de cromosomas marcadores pequeños, para confirmar si poseen o no regiones satélite y, por tanto, se derivan a partir de un cromosoma acrocéntrico.

DAPI, que une al DNA, tiene una afinidad por los pares de bases AT. La unión de DAPI, en consecuencia, sólo produce un patrón de bandeo Q débil. Aunque la fluorescencia de DAPI es realzada por ambos pares de bases AT y GC, existe un realce significativo de la fluorescencia en regiones de DNA ricas en AT. Existe también cierta evidencia de que DAPI se une a grupos AT en el surco menor de la hélice doble del DNA. También DA muestra afinidad por la unión al DNA específica de AT. Aunque los dos colorantes usados tienen preferencia de apareamiento con bases similares, poseen diferentes afinidades de unión y estructuras diferentes. La fluorescencia diferencial que se obtiene puede deberse a la unión competitiva entre los dos colorantes, que se unen en sitios similares pero no idénticos. Alternativamente, DA es probable que bloquee el enlazamiento de DAPI en regiones eucromáticas, mientras los sitios de enlazamiento de DAPI permanecen disponibles en regiones heterocromáticas.

Bandeo DA-DAPI Cuando los cromosomas se tiñen con el colorante fluorescente 4,6-diamino-2-fenil-indol (DAPI) y se tratan con distamicina (DA) en una contratinción no fluorescente, un subconjunto de bandas C fluorescentes se revela. Las regiones heterocromáticas de los cromosomas 1, 9, 16 y Y, además de la proximal del brazo corto del cromosoma 15 despiden luz fluorescente muy brillante. Usando sólo DAPI se produce un patrón de bandeo similar al bandeo Q (fig. 36-7).

Aplicaciones El bandeo DA/DAPI es predominante cuando se le utiliza para la interpretación de ciertas alteraciones del cromosoma detectadas al usar los métodos más rutinarios de bandeo (bandeo G o R), por ejemplo, el bandeo DA/DAPI puede usarse donde un cromosoma modificado en su estructura tiene un punto de rotura cercano a una región teñida selectivamente con bandeo DA/DAPI. Este bandeo es útil, en particular, para estudiar cromosomas marcadores satélites pequeños. Esta técnica puede identificar aquellos cromosomas marcadores que involucran la región proximal del extremo del cromosoma 15. La tinción DAPI es también la contratinción normal usada para la hibridización in situ fluorescente de rutina en preparaciones cromosómicas. Bandeo de replicación

Figura 36-7 Metafase masculina teñida usando bandeo DA/ DAPI. Las flechas indican el cromosoma 15s con brazos cortos que despiden luz fluorescente brillante.

Un patrón del bandeo G o R puede producirse sobre preparaciones cromosómicas si se desarrollan en presencia de 5-bromo-2-deoxiuridina (BrdU), análogo de la timidina, y se tiñen con el colorante fluorescente Hoechst 33258. Este método utiliza el hecho de que diversas regiones del complemento del cromosoma se replican en diferentes etapas durante la fase S; también confía en la incorporación de la marca dentro del DNA, así que BrdU se agrega a células vivas en un cultivo tisular. Controlando la sincronización cuando el pulso de BrdU se administra a los cultivos celulares relativa al tiempo de recolección, un patrón de bandeo que se replica temprano o tardíamente puede producirse. Si

BANDEO CROMOSÓMICO

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Figura 36-8 Metafase prolongada después del bandeo de replicación. Esta preparación se obtuvo a partir de cultivos sanguíneos a los cuales se agregó BrdU seis horas antes de la recolección. Los cromosomas muestran un patrón de bandeo R. Este paciente porta una translocación t(X;11). En este caso, X normal es replicado tardíamente. Con cultivos con pulsos tardíos de BrdU, el X que se replica tarde se tiñe ligeramente (flechas).

la BrdU se agrega al iniciar el cultivo, pero se elimina alrededor de 6 h antes de la recolección a las 48 h, se obtiene un patrón de bandeo G. Si la BrdU se agrega sólo cerca de 6 h antes de que los cultivos sean recolectados, se producen bandas R (fig. 36-8). Si las células experimentan dos ciclos completos de replicación en presencia de BrdU, las cromátides hermanas de cada cromosoma se tiñen diferencialmente. El patrón de la coloración doble que se obtiene permite la detección de los intercambios de cromátides hermanas (ICH), que son puntos a lo largo de los cromosomas donde el material de la cromátide se intercambia entre cromátides hermanas. Las preparaciones de ICH se tiñen con el fluorocromo Hoechst 33258. Entonces o son vistos por microscopia de fluorescencia (360 a 400 nm) o, si primero se exponen a la luz UV y en seguida se tiñen con el colorante Giemsa (fluorescencia más tinción Giemsa [FPG]), pueden analizarse por medio de la microscopia de luz (fig. 36-9). Mecanismo El BrdU es un análogo de la timidina que se incorpora muy rápido dentro de los cromosomas. Cuando los cromosomas se tiñen con el fluorocromo Hoechst 33258 (que se une a

Figura 36-9 Prolongaciones de la metafase teñidas para los intercambios de cromátides hermanas (ICH). a) Metafase de cultivos sanguíneos con sólo tres ICH espontáneos señalados. b) Metafase de cultivos sanguíneos del mismo individuo, incubados con el agente intercalante (alquilante) mitomicina C, mostrando un aumento muy significativo en el nivel de ICH (> 100/célula).

pares de bases ricas en AT), las regiones del cromosoma que se replican en presencia de BrdU contienen DNA sustituido con BrdU. Cuando BrdU está presente al inicio del cultivo, sólo se observa durante la parte temprana de un ciclo de la replicación del DNA, y por tanto las regiones cromosómicas que se replican temprano en la fase S (bandas R) llegan a sustituirse con BrdU, y por tanto despiden luz fluorescente débil o se tiñen ligeramente con Giemsa. Las bandas G que se replican tarde en la fase S, después de que BrdU se ha eliminado de los cultivos, y se incorpora la timidina, despiden luz fluorescente brillante, o se tiñen de oscuro con Giemsa (bandeo G). De manera alterna, si sólo se añade BrdU a los cultivos alrededor de 6 horas antes de la recolección, sólo está presente en la última parte de un ciclo de la réplica del DNA y a las regiones que se replican temprano (bandas R) se les incorpora timidina, y despiden luz fluorescente brillante o se tiñe oscuro con Giemsa. Sólo

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BANDEO Y ANÁLISIS CROMOSÓMICO

las regiones que se replican tarde (bandas G) llegan a sustituirse con BrdU y, por tanto, despiden luz fluorescente débil o se tiñen ligeramente con Giemsa (bandeo R). Aunque los cromosomas homólogos muestran patrones similares de replicación, en mujeres pueden distinguirse los cromosomas X que se replican temprana y tardíamente. El cromosoma X que se replica tarde se tiñe más oscuro con bandeo de replicación BrdU de pulso temprano y se tiñe levemente con bandeo de replicación BrdU de pulso tardío (fig. 36-8). El patrón de tinción de dos colores que se obtiene cuando BrdU está presente en los cultivos celulares durante dos ciclos de replicación refleja la incorporación asimétrica de BrdU dentro del DNA cromosómico. Mediante replicación semiconservadora, cada hebra nueva de DNA consiste de una original de DNA y una nueva construida. Después de dos ciclos de replicación en presencia de BrdU, una cromátide contiene DNA con BrdU sustituido dentro de una hebra de DNA, mientras que su cromátide hermana contiene dos hebras de DNA sustituidas con BrdU. Esta diferencia química entre las cromátides hermanas explica la que existe en la intensidad de teñido que se obtiene. La intensidad es proporcional a la cantidad de DNA que contiene timidina presente en cada cromátide. Cuando las preparaciones cromosómicas se tiñen usando la fluorescencia y el método de Giemsa, más DNA se pierde a partir de la cromátide hermana sustituida con BrdU que su contraparte, por eso produce el patrón de teñido oscuro y claro característico.

Aplicación Además de aportar métodos alternativos para los bandeos G y R, los patrones de teñido que se obtienen después de administrar un pulso de BrdU temprano o tardío en el ciclo celular se utilizan sobre todo para los estudios de replicación. En mujeres normales un cromosoma X se inactiva en cada célula por un proceso aleatorio, y este X inactivo siempre es el último cromosoma en completar su replicación en cada ciclo celular. El bandeo de replicación es útil para investigar el patrón de la inactivación X en las mujeres que portan alteraciones estructurales que involucran el cromosoma X, donde el patrón de la inactivación del X por lo general es un evento no aleatorio. El ejemplo ilustrado en la figura 36-8 muestra una paciente que porta una translocación equilibrada t(X;11). La tinción de replicación muestra que el cromosoma X normal se replica tarde en todas las células. Este sesgo del patrón de la inactivación X aleatorio normalmente asegura que los segmentos autosómicos implicados en tales translocaciones autosoma-X no estén también inactivados, lo que tendría un impacto clínico deletéreo.

La producción de patrones de teñido cromosómico de doble color permite la detección de los intercambios de cromátides hermanas. Éstos son puntos a lo largo de las cromosomas donde hay intercambio de material entre las dos cromátides hermanas de cromosomas individuales, creando un aspecto de “tablero de damas”. Las células humanas normales muestran una frecuencia media de 5 a 8 ICH/célula, pero se observa que los niveles de ICH aumentan con la exposición a muchos mutágenos. El uso principal de esta técnica es, por tanto, un método para el monitoreo de daño cromosómico inducido por mutágenos, en pacientes o células. En muchos casos, ICH es más sensible para la detección del daño cromosómico que para la medición de las aberraciones cromosómicas (fig. 36-9). Sin embargo, no todos los mutágenos de la prueba muestran una correlación positiva entre la rotura cromosómica inducida y los ICH inducidos, indicando por ello que estos dos parámetros reflejan expresiones diferentes e independientes del daño inducido por mutágenos. Este método también se utiliza como prueba diagnóstica para el desorden de la inestabilidad cromosómica, el síndrome de Bloom, en el cual las células muestran un aumento significativo del nivel basal normal de los ICH espontáneos. Los ICH también pueden utilizarse para estudiar la cinética celular indicando la duración de las diversas etapas del ciclo celular.

Análisis cromosómico La mayor parte de los análisis citogenéticos rutinarios se realiza examinando las preparaciones en metafase bandeadas (principalmente por bandeo G o R). El análisis citogenético es una disciplina muy especializada del laboratorio y se requiere un entrenamiento de varios años antes de que un citogenetista llegue a ser competente en el reconocimiento del cariotipo normal y en la detección de la variedad de alteraciones cariotípicas que puedan encontrarse.

Clasificación de cromosomas bandeados y nomenclatura Los cromosomas se identifican, se clasifica su cariotipo y describen usando las pautas propuestas por el Sistema Internacional de Nomenclatura Cromosómica (ISCN). Éste es el informe publicado por el Comité Permanente sobre Nomenclatura Citogenética Humana. La terminología básica para describir el cariotipo humano lo propuso este grupo en 1971 (nomenclatura de París). Las características principales que distinguen los cromosomas son longitud, posición del centrómero, presencia de las constricciones secundarias (satélites) y patrón de bandeo. El centrómero es la constricción primaria que divide cada cromosoma en un brazo corto (brazo p) y en uno largo (brazo q). Los

ANÁLISIS CROMOSÓMICO

satélites son constricciones secundarias situadas en los extremos de los cromosomas 13 a 15, 21 y 22. Los autosomas son numerados en pares por tamaño decreciente a partir de 1 a 22, dejando aparte los cromosomas del sexo (X y Y). De acuerdo con la longitud, la posición del centrómero y los satélites, los cromosomas del cariotipo humano sólo pueden clasificarse en siete grupos, A-G (cromosoma X incluido en el grupo C/cromosoma Y incluido en el grupo G) (fig. 36-10).

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una región también se numera en secuencia, iniciando con la banda 1, la más cercana al centrómero. Por tanto, 1p31 indica el cromosoma 1, brazo corto, región 3, banda 1. La calidad de las preparaciones cromosómicas ha mejorado a través de los años, con la producción de cromosomas más alargados. Con esta mejora, se muestra que ciertas bandas, vistas en preparaciones cromosómicas como más cortas, actualmente se resuelven en diferentes bandas más finas. Por esta razón, el ISCN produce actualizaciones de los ideogramas cromosómicos que corresponden a cromosomas con extensiones mejoradas más largas. Donde se encuentra que bandas cromosómicas se subdividen en más bandas, se asignan números a las sub-bandas. Por convenio, un punto decimal se coloca antes de cualquier sub-banda y hasta dos nuevos números se añaden después de esto para describir las nuevas sub-bandas. Por tanto, 1p31.2 describe el cromosoma 1, brazo corto, región 3, banda 1, sub-banda 2 (fig. 36-11).

Figura 36-10 Cariotipo con bandeo G de un paciente con una translocación recíproca equilibrada, que involucra el brazo corto del cromosoma 5 y el brazo largo del cromosoma 14. Los cromosomas anormales están señalados.

De acuerdo con la posición del centrómero, hay tres tipos de cromosoma: metacéntrico (centrómero en el centro), acrocéntrico (centrómero en un extremo) y submetacéntrico (centrómero excéntrico). Los pares cromosómicos individuales pueden, sin embargo, sólo identificarse y clasificarse exactamente a partir de sus patrones de bandeo. El ISCN incluye un sistema completo de mapas cromosómicos diagramáticos (ideogramas). Estos ideogramas ilustran cada cromosoma, dividiéndolos en segmentos convenientes (regiones) de longitud casi igual definiendo varios puntos establecidos (marcas). Estas marcas incluyen los extremos del cromosoma (telómeros), los centrómeros y otras bandas prominentes. Cada región se numera secuencialmente, moviéndose hacia afuera, en cualquier dirección de los centrómeros. Por ejemplo, 1p3 representa el cromosoma 1, brazo corto, región 3. Cada banda importante dentro de

Figura 36-11 Ideograma del cromosoma 1, destacando los brazos p y q, las regiones cromosómicas sobre el brazo p y las marcas sobre el brazo q.

El sistema ISCN permite la descripción exacta de los puntos de rotura en todas las reestructuraciones cromosómicas. Al usar ISCN para describir alteraciones cariotípicas, el citogenetista debe utilizar el ideograma más apropiado que muestre la resolución de bandeo equivalente al cromosoma que se analiza.

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BANDEO Y ANÁLISIS CROMOSÓMICO

Variación cromosómica Para reconocer alguna alteración cromosómica presente en cualquier preparación de los cromosomas humanos, el citogenetista debe estar muy familiarizado con el aspecto del cariotipo humano normal. Esto es complicado por la ocurrencia de variación considerable en ciertas regiones heterocromáticas, incluyendo polimorfismos centroméricos y satélites. Es importante que estas regiones de variación cromosómica normal se reconozcan y distingan de otras alteraciones cromosómicas clínicas significativas. Análisis cromosómico La mayor parte de los análisis rutinarios del cromosoma se ejecuta examinando microscópicamente preparaciones en metafase bandeadas. Las metafases convenientes se localizan primero tamizando las laminillas bandeadas, con microscopia de bajo aumento (magnificación 100⫻). Las metafases convenientes entonces se examinan con una magnificación más alta (generalmente 1 000⫻). Para el análisis de la constitución del cariotipo, sólo cinco o seis metafases de calidad conveniente necesitan examinarse, excepto donde un posible mosaicismo del cromosoma puede esperarse, y más células deben analizarse. La calidad de las metafases seleccionadas para el análisis depende en gran parte del objetivo de la investigación citogenética. Si se verifica una alteración numérica obvia (p. ej., trisomía 21) entonces no se requieren metafases de alta calidad. Sin embargo, si una alteración sutil puede estar presente (como una deleción o reestructuración pequeña que involucre segmentos mínimos), entonces deben examinarse más preparaciones cromosómicas alargadas. Si el citogenetista está satisfecho porque todos los pares cromosómicos muestran el patrón de bandeo normal reconocido, puede informarse un cariotipo normal. Los cariotipos se describen usando la nomenclatura ISCN. En general, ésta tiene el orden siguiente: número total de cromosomas, constitución del cromosoma del sexo, descripción de la alteración (si está presente), y cada uno de éstos es separado por una coma. Así, la fórmula del cariotipo femenino normal es 46,XX y el cariotipo masculino normal es 46,XY. Donde se reconoce una alteración del cromosoma, se asigna la fórmula apropiada del cariotipo. Cada tipo de alteración estructural tiene una abreviatura ISCN asociada, por ejemplo, “t” para la translocación, “i” para la inversión, etc. Los cromosomas implicados y cualquier punto de rotura se incluyen en la fórmula del cariotipo asignada, por ejemplo, el cariotipo anormal ilustrado en la figura 36-10 tiene la fórmula 46,XY,t(5;14)(p15.2;q24.1). Esto indica que el cromosoma 5 está fracturado en el brazo p en la banda 15.2, mientras que el cromosoma 14 presenta una rotura

en el brazo q en la banda 24.1. Si la alteración es indistinta o los puntos de rotura son confusos en el examen microscópico, la preparación de cariotipos puede ayudar a caracterizar la naturaleza exacta de la alteración. Esto habría implicado anteriormente fotografiar las células anormales usando la fotomicroscopia, desarrollar e imprimir la película, cortando y recambiando los cromosomas en el orden del cariotipo estándar. En la actualidad, la producción de cariotipos en los laboratorios citogenéticos de diagnóstico se hace más fácil usando sistemas de análisis de imagen especializados. Estos sistemas acoplan al microscopio con una cámara fotográfica digital que se usa para capturar una imagen digital de la preparación metafásica que se pretende analizar. El software citogenético especializado entonces permite el arreglo de los cromosomas en la pantalla de la computadora para generar un cariotipo final, que puede imprimirse o almacenar, o ambos, electrónicamente. Análisis cromosómico para las alteraciones adquiridas del cromosoma El análisis citogenético de alteraciones malignas (leucemias y tumores sólidos) se realiza de rutina para detectar cualquier alteración cromosómica adquirida asociada. La detección de tales alteraciones proporciona la información vital del diagnóstico de la enfermedad, el pronóstico del paciente y para monitorear la respuesta a la terapia. El análisis cromosómico para las alteraciones cromosómicas adquiridas produce algunas diferencias importantes del análisis de constitución. Las alteraciones cromosómicas adquiridas son clonales, confinadas sólo a las células malignas. Además, las metafases que se obtienen de las células malignas muestran típicamente morfología inferior (bandas cortas y pobres) comparadas con las células benignas. Es importante, primero, que el citogenetista analice un número más grande de células para permitir la detección de alteraciones clonales pequeñas (es decir, no todas las células que se detectan pueden pertenecer al clon anormal), y segundo, que una selección representativa de todas las metafases sea examinada para evitar la selección inadvertida de la mejor calidad, pero posiblemente de las células benignas. Citogenética molecular El desarrollo significativo más reciente en el campo de la citogenética de diagnóstico rutinario ha sido la introducción de técnicas citogenéticas moleculares en la década de 1980. Existe una amplia gama de sondas, disponibles en el comercio, las cuales pueden utilizarse para resaltar regiones específicas del cariotipo humano por la técnica de hibridación in situ fluorescente (FISH). Ésta permite la

LECTURAS ADICIONALES

detección de algunas alteraciones muy sutiles que están más allá de los límites de cualquier técnica de bandeo. Las sondas FISH pueden utilizarse para caracterizar rápido y con exactitud las alteraciones complejas o no identificadas del cromosoma, que se detectan usando técnicas de bandeo. Además, las sondas FISH permiten que sean tamizados especímenes para alteraciones citogenéticas importantes, aún cuando extensiones de la metafase dividiéndose no están disponibles. Esto permite el diagnóstico prenatal rápido, ya que las muestras del líquido amniótico pueden tamizarse para alteraciones específicas por FISH después de 24 horas, en lugar de esperar dos semanas para que suficientes células crezcan en cultivo para producir preparaciones cromosómicas. La FISH también es particularmente útil en los estudios de malignidad donde las células mitóticas pueden ser difíciles de obtener. Todos los laboratorios citogenéticos de diagnóstico rutinario ahora confían mucho en estas pruebas FISH, las cuales complementan los métodos rutinarios de bandeo. En muchos casos las pruebas FISH son realmente más apropiadas que el análisis alternativo del cariotipo completo.

Lecturas adicionales Benn PA, Tantravahi U. Chromosome staining and banding techniques. In Human Cytogenetics Constitutional Analysis:

355

A Practical Approach, 3rd edn, Rooney DE (ed.). Oxford University Press, New York, 99-128. Bickmore A, Sumner AT. Mammalian chromosome banding- an expression of genome organization. Trends Genet. 1989; 5 (5): 144-148. Comings DE. Mechanisms of chromosome banding and implications for chromosome structure. Ann Rev Genet 1978; 12: 25-46. Cross I, Wolstenholme J. An introduction to human chromosomes and their analysis. In Human Cytogenetics Constitutional Analysis: A Practical Approach, 3rd edn. Rooney DE (ed.). Oxford University Press, New York. 1-31. Goldman MA, Holmquist GP, Gray MC et al. Replication timing of genes and middle repetitive sequences. Science 1984; 224: 686-692. Gustashaw KM. Chromosome stains. In The AGT Cytogenetics Laboratory Manual, 3rd edn, Barch MJ. Knutsen T, Spurbeck JL (eds) 1997, Lippincott-Raven, New York. Holmquist G, Gray M, Porter T, Jordan J. Characterization of Giemsa dark and ligth band DNA. Cell 1982; 31: 121. ISCN. An International System for Human Cytogenetic Nomenclature, Mitelman F (ed.). 1995: S Karger Basel. Richardson AM. Chromosome analysis. In The AGT Cytogenetics Laboratory Manual, 3rd edn.Barch MJ , Knutsen T, Spurbeck JL (eds) 1997, Lippincott-Raven, New York. Sumner AT. The nature and mechanisms of chromosome banding. Cancer Genet Cytogenet 1982; 6:59-87. Verma RS, Babu A (eds) Human Chromosomes: Manual of Basic Techniques. 1989: Pergamon, New York.

37 Hibridación in situ fluorescente Ivor Hickey

La hibridación in situ fluorescente (FISH) es una técnica poderosa que desempeña una parte significativa en varias áreas actuales de la investigación genética. Se refiere a una serie de procedimientos relacionados, en los cuales moléculas de ácido nucleico de cadena sencilla (sondas) marcadas con químicos que por sí mismos son fluorescentes o pueden detectarse por microscopia de inmunofluorescencia, son útiles para identificar secuencias específicas del ácido nucleico objetivo en preparaciones citológicas. Esta técnica se deriva directamente de los primeros experimentos originales de hibridación del ácido nucleico iniciados por Speigleman en la década de 1960, que adaptaron varios grupos, usando sondas marcadas con radiactividad para identificar secuencias de ácidos nucleicos en material fijado sobre el portaobjetos que se observa al microscopio. Los ejemplos iniciales incluyeron la identificación de los genes del RNA ribosómico en los nucleolos de los oocitos de Xenopus y del DNA satélite centromérico en los cromosomas en metafase del ratón. Aunque los protocolos avanzaron mucho desde entonces, los pasos básicos permanecen en gran parte inalterados. Todas las variaciones de la técnica incluyen una sonda de ácido nucleico, una preparación citológica y un sistema de detección. Los pasos principales en el sistema se describen en este punto; antes, las variaciones y las aplicaciones de la técnica se comparan.

Elección de la sonda En muchos casos un clon de DNA genómico puede utilizarse, aunque, como se verá más adelante, otras fuentes de DNA también pueden utilizarse para el teñido de cromosomas. En algunas aplicaciones se usan las moléculas de

RNA, aunque es muy raro en la actualidad. La sonda debe marcarse antes de usarse, por orden de detección, el material se hibrida al final del procedimiento. Es importante tomar en cuenta que un factor en la detección de sonda es la longitud de la misma. Bajo los mismos sistemas de marcado y de detección, una sonda más pequeña proyecta siempre una señal más débil que una más larga. Aunque las sondas tan pequeñas como de 500 bases es posible detectarlas en ciertas circunstancias, los cósmidos, vectores derivados del bacteriófago ␭, que contienen casi 40 kb del DNA clonado, son las fuentes más utilizadas de la sonda. El DNA clonado en vectores que transportan insertos más grandes, como los cromosomas artificiales bacterianos (BAC), los cromosomas artificiales P1 (PAC) o los cromosomas artificiales de levadura (YACS), trabaja bien en todos los casos.

Marcación de las sondas Los marcadores que se utilizan con más frecuencia en los experimentos de FISH son los trifosfatos deoxiuridina modificados. Las modificaciones implican la adición de haptenos, grupos inmunorreactivos tales como digoxigenina o biotina, los cuales se enlazan a la posición 5 del anillo de pirimidina por un brazo largo espaciador. Éstos pueden detectarse por técnicas de inmunofluorescencia indirecta. Alternativamente, las sondas se pueden marcar con nucleósidos trifosfatos que contienen un fluorocromo tal como la fluoresceína y detectarse directamente por su propia fluorescencia. Es posible marcar las sondas usando algunos de los sistemas que se emplean con frecuencia en otra parte en biología molecular. Éstos incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (PCR),

The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker. © 2005 John Wiley & Sons, Ltd.

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CAP. 37

HIBRIDACIÓN IN SITU FLUORESCENTE

nick translation y el marcado por medio de iniciadores de secuencia aleatoria (random primer). De éstos, el nick translation es, probablemente, el más popular puesto que produce fragmentos de DNA pequeños y marcados. El tamaño de la sonda es importante, ya que las moléculas de sondas grandes tienen dificultad para difundirse a través del material citológico para alcanzar su DNA objetivo, y su uso resulta a menudo en mucha fluorescencia del fondo. El tamaño óptimo de la sonda está entre 200 y 500 bases. Las sondas que se producen por PCR son cada vez más importantes en las técnicas de pintado del cromosoma y de la FISH de fibra que se describen con detalle más adelante.

Hibridación Aquí los procedimientos siguen ampliamente los de otros protocolos moleculares de hibridación de ácidos nucleicos. Las diferencias se relacionan con las tentativas de mantener la morfología de la preparación citológica en buenas condiciones, y para prevenir la unión de la sonda a las secuencias repetidas distribuidas por todo el genoma. Para mantener la integridad de la preparación citológica, la hibridación se lleva a cabo normalmente a temperaturas reducidas típicas de 35 a 42°C, en formamida a 50%. La mayor parte de los genomas eucariotas contienen abundantes secuencias de DNA repetidas y dispersas. Por esta razón, si el material genómico se utiliza como sonda, es probable que contenga secuencias de DNA que se repiten en otra parte en el genoma. Esto resulta en un nivel de fluorescencia a través de todas las regiones de los cromosomas, lo que reduce la especificidad de la sonda. Para prevenir esto y mejorar la calidad y la sensibilidad de la imagen final, el DNA sin marcar de la fracción repetitiva del genoma (Cot 1 DNA) se agrega a la sonda durante la hibridación.

Detección de la sonda hibridada Cuando las sondas se marcan directamente con los nucleótidos fluorescentes, la detección requiere sólo una sencilla observación del material usando un microscopio de fluorescencia con los filtros apropiados. Puesto que la señal no se amplifica, este método detecta una fluorescencia menos intensa, pero el nivel fluorescente del fondo es bajo. El uso de cámaras con dispositivo acoplado de cargas (CCD) para detectar fluorescencia de nivel bajo puede hacer este método bastante sensible para emplearse con pequeños DNA objetivos. Cuando las sondas se marcan con haptenos, su presencia se detecta con los anticuerpos conjugados con fluorocromos. Las sondas marcadas de biotina y digoxigenina pueden detectarse de esta manera, pero la biotina tiene la ventaja agregada de tener una afinidad en extremo alta por la proteí-

na de la clara de huevo, la avidina. Esto permite el uso de la avidina conjugada con los fluorocromos para utilizarse en la detección. El único defecto de esta técnica se localiza en el tejido a analizar que contiene mucha biotina para dar origen a la fluorescencia del fondo. En el caso de la citogenética esto no es un problema importante. Con frecuencia la señal fluorescente de un objetivo se amplifica usando más de una capa del anticuerpo en el proceso de detección. Una de las ventajas principales de la tecnología de FISH está en que diferentes fluorocromos pueden utilizarse simultáneamente junto con una serie de sondas marcadas con diferentes haptenos. El resultado es una imagen de FISH en dos colores. Por ejemplo, dos sondas pueden hibridarse para la misma preparación del cromosoma. Si una está marcada con biotina y se detecta con los anticuerpos conjugados con fluoresceína, y la otra se marca con la digoxigenina y se detecta usando el rojo Texas, después ambos loci se detectan de manera simultánea como áreas de fluorescencia verde o roja. Este acercamiento puede extenderse también cuando se usan sondas directamente marcadas en el mismo experimento, o cuando las sondas marcadas con una mezcla de dos haptenos se utilizan. Si tales sondas se detectan con los anticuerpos conjugados de dos diferentes fluorocromos, el resultado es una señal de color intermedio; la fluorescencia roja por el rojo Texas y la fluorescencia verde de la fluoresceína emiten una señal anaranjada. Una serie de sondas se pueden marcar con diferentes cocientes de los mismos dos haptenos. La fluorescencia resultante se convierte en una señal digital en una cámara CCD y el software reconoce las diferencias sutiles en la fluorescencia. Éstas entonces serán colores falsos asignados. Este acercamiento condujo al desarrollo del cariotipo espectral, que se describe más adelante. Después de la detección de las sondas, es necesario seguir localizando las áreas restantes de los cromosomas o de los núcleos a los cuales la sonda no ha hibridado. Esto se hace usando los fluorocromos 4,6-diamino-2-fenil-indol (DAPI), Hoechst 33258 o yoduro de propidio. La combinación del yoduro de propidio y del DAPI produce un patrón de bandas que puede ser útil en la identificación del cromosoma. Sin embargo, debido a que el yoduro de propidio es excitado por más de una longitud de onda y fluorescencias de varias longitudes de onda diferentes, puede producir problemas donde las imágenes se capturan usando cámaras CCD monocromáticas.

Aplicaciones en la investigación básica Aunque esta tecnología puede utilizarse potencialmente con todas las especies de eucariotas, este capítulo se concentra en los usos en la genética humana. La FISH puede utilizarse para detectar genes u otras secuencias de DNA

APLICACIONES EN LA INVESTIGACIÓN BÁSICA

de regiones cromosómicas específicas. La precisión requerida por el experimento determina el acercamiento que se utiliza. En el nivel más simple, el proceso es posible emplearlo para identificar cromosomas enteros, una técnica conocida como “pintado cromosómico”. En este caso es necesario aislar el DNA de un solo cromosoma humano para hacer una sonda. Esto se realiza por dos métodos. Por principio, los híbridos celulares somáticos humanos más roedor se utilizaron como una fuente de DNA. En estos híbridos celulares es posible aislar clones que contienen un solo cromosoma humano. El DNA se aísla de tales clones y el DNA humano se amplifica usando iniciadores complementarios a las secuencias alu. Éstas representan una secuencia muy repetida que se encuentra en el ser humano pero está ausente en el DNA del roedor. Ahora es posible aislar cromosomas humanos específicos en metafase directamente, usando la selección celular activada por fluorescencia (FACS). El DNA del sedimento de los cromosomas purificados es amplificado por PCR usando los iniciadores degenerados; es ahora el método de opción para los proveedores comerciales del pintado cromosómico. El pintado cromosómico es en particular útil para el estudio de las translocaciones; se ilustra en la figura 37-1. Aquí pintado de cromosoma se utiliza para identificar los cromosomas implicados en una translocación que se ha presentado en un tumor humano. Los fragmentos translocados pequeños de cromosomas son, con frecuencia, sólo perceptibles con este acercamiento. El refinamiento del principio del pintado de cromosomas condujo a protocolos en los cuales cada par de cromo-

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somas en una célula puede identificarse de manera simultánea. Esto se conoce como “cariotipo espectral”. En esta técnica, los tintes para cada par de cromosomas se hibridan a los cromosomas en la misma reacción. Cada tinte del cromosoma es una mezcla de varios fluorocromos diferentes, combinados en diversos cocientes. Esto significa que la fluorescencia emitida por cada cromosoma tiene un espectro específico, el cual lo detecta el sensor, y el software atribuye un color falso diferente a cada espectro. El resultado es una imagen por computadora en la cual todos los cromosomas pueden detectarse con un color específico. Un uso más sofisticado de la FISH se requiere para mapear la ubicación cromosómica de una secuencia específica de un gen. Para esta tarea, el DNA clonado en YAC, BAC o cósmidos se utiliza normalmente como sonda. Esto emite suficiente fluorescencia fácilmente perceptible. Los ejemplos se muestran en la figura 37-1. Los procedimientos implicados son similares a los que se emplean para el teñido de cromosoma, pero suele requerirse una amplificación más grande de la señal. La FISH es mucho más fructífera para esta tarea que las sondas marcadas con radiactividad previamente utilizadas, debido al fondo reducido y al corto tiempo que se requiere para completar el experimento (dos días, comparado con las varias semanas necesarias para la exposición de autorradiografías). Según lo descrito antes, más de una sonda puede utilizarse simultáneamente. Este acercamiento se emplea de diferentes maneras. Cuando se intenta localizar una sonda en un cromosoma, es a menudo necesario identificar el cromosoma con mucha claridad, al mismo tiempo. Esto se logra usando una sonda para una

Figura 37-1 a) Parte de una metafase de una célula tumoral humana teñida con DAPI. Un cromosoma morfológicamente atípico es indicado por la flecha blanca. b) El mismo cromosoma de una metafase hibridado con tinción del cromosoma 2. Sin duda, la región distal del cromosoma (flecha) está compuesta del material derivado del cromosoma 2. La tinción cromosómica marrón es yoduro de propidio y el tinte está marcado con FITC. Una copia normal del cromosoma 2 está también presente en la estructura. Un acercamiento similar mostró que el resto del cromosoma está compuesto del cromosoma 17. c, d) Cómo la FISH puede utilizarse para mapear el punto de la translocación. Un BAC que mapea la región distal del cromosoma 17, 17q25.3 como se muestra en (c), fue hibridado al cromosoma de translocación en la célula tumoral. El hecho es que se ha visto en (d) mapas la translocación al telómero extremo distal del cromosoma 17. c) y d) Son imágenes digitales que se obtienen usando una cámara CCD.

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HIBRIDACIÓN IN SITU FLUORESCENTE

secuencia de repetición de DNA centromérico específico del cromosoma en cuestión. Para determinar el orden de los genes estrechamente ligados a lo largo del cromosoma, la FISH de doble o triple color puede utilizarse. Debido a los colores que se emplean, este proceso se conoce con frecuencia como “iluminación de semáforo”. La posición de la sonda en un cromosoma puede algunas veces identificarse por el patrón de bandas, pero a menudo se expresa simplemente como unidades F/pter. Éstas representan la distancia mínima del telómero del brazo p del cromosoma, en comparación con la extensión del cromosoma entero. Una limitación importante para mapear los genes por medio de la FISH la produce el estado relativamente condensado de los cromosomas mitóticos en metafase. Esto significa que las señales de los genes falsean en cerca de 1 a 2 Mb, una señal de otra, y ocurre un traslape que impide distinguir las dos señales. Para superar este problema se usan diferentes estrategias. La cromatina está mucho menos condensada durante la interfase, y las secuencias que no es posible separar en los cromosomas en metafase se resuelven con frecuencia por hibridación de las sondas en los núcleos de las células que no se están dividiendo. Una desventaja en este sistema es que no es posible orientar los genes en relación con el centrómero. Un proceso alternativo que permite esto es el uso de las preparaciones meióticas del cromosoma. Éstas son más alargadas que las mitóticas. Sin embargo, tiene inconvenientes al prepararse. Un acercamiento exitoso para producir los cromosomas mitóticos alargados consiste en utilizar las preparaciones de citocentrifugación de metafases sin fijar. Una citocentrífuga es un dispositivo que se emplea frecuentemente en hematología para preparar portaobjetos con células sanguíneas. Este dispositivo usa una centrifugadora modificada en la cual las células se hacen girar de manera directa sobre el portaobjetos. Cuando las metafases sin fijar que se hinchan en solución salina hipotónica se tratan de esta manera, las fuerzas de corte producidas durante la centrifugación estiran los cromosomas hasta veinte veces su longitud normal. Aunque esto causa que muchas de las metafases se interrumpan y que los cromosomas se deformen, tiene una ventaja sobre el análisis de la interfase, en que los cromosomas individuales pueden ser identificados, y la orientación de las señales de la FISH hacia los centrómeros y los telómeros es posible observarlos. El último grado de resolución que se obtiene con el análisis de FISH se encuentra en la técnica de FISH de fibra. Aquí la sonda se hibrida al DNA, que es extendido en un portaobjetos después de la eliminación de la mayor parte o de la totalidad de su cromatina empaquetada. Ninguna información en lo absoluto se obtiene sobre la orientación de la señal en el cromosoma, pero la técnica es muy poderosa para el análisis a escala fina de las regiones pequeñas

del genoma. La dispersión y elongación del DNA se puede conseguir de muchas maneras. Las fibras extendidas de cromatina se pueden obtener de los núcleos de las células en interfase sin fijar tratadas sobre portaobjetos con detergente y sal concentrada para quitar las histonas. Esto causa que la estructura de la cromatina se desenrolle y se extienda el DNA en una longitud comparable con la del DNA puro. Tales técnicas se conocen como “producción del halo” o DIRVISH (hibridización visual directa). Éstas permiten el ordenamiento de la sonda a un límite de resolución más bajo, de 3 a 5 kb. El DNA purificado también puede extenderse sobre el portaobjetos del microscopio para usarse en el análisis de estructura fina. El DNA se entrampa en bloques de agarosa, como los que se usan en la electroforesis en gel de campo pulsado, que se funden y se extienden suavemente en el portaobjetos, o el DNA en solución puede permitir que se extienda en portaobjetos silanizados. En este caso, el extremo de la molécula se une al vidrio y el resto del DNA se rastrea fuera, en un patrón que es más o menos lineal en el menisco de la solución que se evapora. Ambos protocolos facilitan el estudio a escala fina. Los ejemplos típicos incluyen la ordenación de las sondas producidas por PCR a lo largo del DNA clonado en los YAC o los cósmidos. Esto puede ser muy útil en circunstancias donde un contiguo (un grupo de fragmentos de DNA clonados ordenados que se traslapan) está incompleto y el tamaño de los espacios necesita estimarse.

Aplicaciones en la genética médica Como se señala antes, el pintado del cromosoma es particularmente útil para detectar las translocaciones demasiado pequeñas para resolverse con claridad por el bandeo G convencional. Otros usos de la FISH incluyen la detección de aneuploides, particularmente en la amniocentesis. Aquí el análisis de los núcleos en interfase puede emprenderse de nuevo. En lugar de usar el teñido de cromosoma completo para detectar los números de los homólogos, se utilizan las sondas específicas para las secuencias de DNA repetidas encontradas en los centrómeros de diferentes cromosomas. Esto puede detectar la presencia de copias adicionales de los cromosomas implicados en los síndromes aneuploides comunes, como los síndromes de Down, Edward y Pateau. El sexo de un embrión puede determinarse también en las células amnióticas usando las sondas de dos colores para los cromosomas X y Y. En estos procedimientos la FISH permite que un resultado se obtenga en un tiempo mucho más corto que el análisis convencional del cromosoma, donde las células deben cultivarse, y tiene la ventaja agregada que, como sólo las células en interfase son necesarias, el número de las células registradas puede ser muy alto. No obstante, es más costoso

APLICACIONES EN EL DIAGNÓSTICO E INVESTIGACIÓN DEL CÁNCER

y no aporta tanta información sobre la naturaleza de alguna anormalidad citogenética como el bandeo G; por ejemplo, no distingue entre la presencia de un cromosoma adicional intacto y un fragmento del que contiene el centrómero.

Aplicaciones en el diagnóstico e investigación del cáncer La FISH realiza su mayor contribución a la medicina en el estudio y el diagnóstico exacto de los diferentes tipos de cáncer y la leucemia. En la mayor parte de los casos, el tejido maligno muestra al menos algunas aberraciones citogenéticas. La citogenética convencional puede aplicarse sólo con dificultad en estas situaciones, pero la FISH, particularmente sobre los núcleos en interfase, puede producir resultados exactos y en un periodo corto, dos criterios que son de importancia evidente en el cuidado del paciente. Aunque las translocaciones aleatorias son comunes en las células tumorales, muchos tipos de cáncer, en particular leucemias y linfomas, portan translocaciones específicas que pueden utilizarse para hacer un diagnóstico exacto. Éstas son a menudo de la fusión de copias de dos genes diferentes, creando un gen original. Un ejemplo clásico es el cromosoma Filadelfia, que se detecta en la leucemia mieloide crónica. Aquí, las translocaciones específicas altas entre los cromosomas 9 y 22 ocasionan la fusión de los oncogenes abl y BCR para producir una tirosina cinasa original. Aquí el bandeo G convencional es problemático. Esto ocurre porque las células malignas pueden no aportar números significativos de metafases in vitro y la calidad de las extensiones del cromosoma es frecuente que esté muy por debajo de la obtenida de los linfocitos normales. El teñido de cromosoma puede aplicarse incluso donde la calidad de las preparaciones del cromosoma es deficiente, ya que los cromosomas blanco se identifican por la fluorescencia, aun cuando ellos no puedan detectarse claramente por el bandeo G. La ventaja principal de la tecnología de FISH, en este caso, es otra vez la capacidad para obtener información citogenética de las células que no se están dividiendo. El uso de las sondas fluorescentes, con frecuencia cósmidos, para las regiones en cada lado de la translocación específica del tumor permite un diagnóstico exacto. Las dos sondas se marcan con haptenos diferentes, de modo que se detecten con dos colores distintos: rojo y verde. En las células normales, donde no está presente la translocación, dos sitios rojos y dos verdes fluorescentes aparecen en el núcleo. Los puntos se distribuyen aleatoriamente a través del núcleo. En presencia de una translocación, un punto rojo y uno verde se localizan muy cerca uno del otro en cada célula tumoral. El traslape ocurre con frecuencia y una región amarilla de la señal mezclada se observa. Este

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acercamiento permite una detección neta de la translocación en una gran cantidad de células, y es posible distinguir las células normales y las leucémicas en la muestra. Además del trabajo de diagnóstico, este sistema se emplea también para buscar células leucémicas residuales en los pacientes después de la terapia. Los aneuploides específicos pueden detectarse en el tejido leucémico con los mismos métodos descritos antes para las células amnióticas. El análisis citogenético de los tumores sólidos siempre se ha quedado atrás de los cánceres de la sangre. Esto es en parte una consecuencia de la mayor dificultad para obtener preparaciones aprovechables del cromosoma. A pesar de esto, muchos tumores sólidos se han encontrado que portan aberraciones cromosómicas específicas. Éstas pueden buscarse por FISH en la interfase, o bien en preparaciones de contacto, donde el material extirpado del tumor es “contactado” sobre los portaobjetos para dejar un frotis de células, o bien por el uso de frotis citológicos de una pequeña cantidad de células que se obtienen en aspirados con aguja fina. Además de las translocaciones y de los cambios en el número de cromosomas, los tumores contienen con frecuencia copias múltiples de oncogenes o de genes que confieren resistencia a fármacos quimioterapéuticos. Éstos se presentan, o bien como regiones alargadas de los cromosomas donde el gen es amplificado in situ, conocidas como regiones homogéneas teñidas (HSR), o bien como elementos extracromosómicos pequeños, llamados “diminutos dobles” (DM). La amplificación del oncogén es un factor importante en el pronóstico. La FISH tiene en cuenta la detección de la amplificación en los núcleos de interfase de las muestras del tumor. Un ejemplo de esto es el tamizaje de las biopsias de cáncer de mama para la amplificación del oncogén erbB-2 en el cromosoma 17. Las células normales en la biopsia aportan un control, mostrando dos puntos fluorescentes pequeños que corresponden a las dos copias sin amplificar del presente gen, mientras el área de fluorescencia es mucho mayor donde se amplifica. Los ejemplos de esto se muestran en la figura 37-2. Una aplicación algo diferente de la FISH, en la investigación y el tratamiento de cáncer, es el desarrollo de una técnica que aporta una estimación total de ganancias y de pérdidas específicas de cromosomas, o regiones del cromosoma de un tumor particular; se conoce como hibridación comparativa del genoma. Aquí el DNA se extrae del tumor después de la remoción del paciente. Este DNA se marca con un fluorocromo (verde); se mezcla con el DNA extraído de las células normales, las cuales se marcan con rojo, y con la mezcla hibridizada sobre los cromosomas normales en metafase. Las sondas diferentemente marcadas compiten para situar los cromosomas. Si el tumor no muestra ganancia o pérdida de material cromosómico, la hibridación

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CAP. 37

HIBRIDACIÓN IN SITU FLUORESCENTE

Figura 37-2 a) Células en interfase de un aspirado de aguja fina de un tumor de pecho que se ha hibridado con una sonda para el oncogén erbB-2. En este caso las células muestran amplificación del oncogén, mientras en (b) el aspirado contiene células en las cuales el oncogén no se ha amplificado, y cada célula muestra uno o dos puntos, que corresponden a los genes normales. En las preparaciones de frotis hechas de los aspirados por aguja fina las células no se dispersan, lo que se explica porque la señal erbB-2 no está en el mismo plano focal en cada célula. En estos ejemplos la sonda fue directamente marcada con FITC y los núcleos contrateñidos con DAPI. Cortesía del Dr. Damien McManus, Royal Victoria Hospital, Belfast.

in situ resultante contiene 46 cromosomas, la totalidad de los cuales con una fluorescencia amarilla uniforme. Sin embargo, las regiones del tumor que experimentan amplificación están sobrerrepresentadas en el DNA extraído y superan al DNA que emite fluorescencia roja. Tales regiones, por tanto, aparecen verdes. Inversamente, las regiones perdidas del tumor, que es probable que contengan genes supresores, aparecen en rojo fluorescente. El análisis de esta hibridación competitiva a dos colores requiere software del computador sofisticado, pero puede convertirse en una herramienta importante que aporte un análisis molecular de amplio espectro de los tumores individuales. La FISH parece tener un papel establecido en la biología molecular. Cómo se desarrolle en el futuro la técnica depende de la comprensión creciente de los procesos genéticos en esta enfermedad. En algunas de las aplicaciones en las cuales se sitúa puede reemplazarse por técnicas no citogenéticas, tales como la PCR. Áreas donde esto puede suceder incluye la detección de las translocaciones específicas del cáncer, o la determinación del sexo en las células amnióticas. Sin embargo, una de las ventajas más importantes de la FISH es que no destruye las células en las cuales se lleva a cabo. En muchas áreas esta capacidad para obtenerse infor-

mación genética molecular mientras aún puede identificarse la estructura celular y tisular es esencial, por ejemplo, en la patología molecular del cáncer. Además, el acoplamiento de técnicas moleculares y citológicas agrega un control valioso contra los resultados erróneos que se presenten de la contaminación de las muestras. Por estas razones, la técnica es probable que mantenga su importancia en la investigación y las biociencias aplicadas por un tiempo considerable.

Lecturas adicionales Haaf T, Ward D C. Structural analysis of a-satellite DNA and centromere proteins using extended chromatin and chromosomes. Hum Mol Genet 1994; 3: 697-709. Heiskanen M, Hellsten E, Kallioniemi O-P et al. Visual maping by fibre-FISH. Genomics 1995; 30: 31-36. Kallioniemi A, Kaltioniemi O-P, Sudar D et al. Comparative genomic hybridization for molecular cytogenetic analysis of solid turnouts. Science 1992; 258: 818-821. Pardue M L, Gall J G. Chromosomal localization of mouse satellite DNA. Science 1970; 168: 1356-1358. Schrock E, duManoir S, Veldman T et al. Multicolor spectral karyotyping of human chromosomes. Science 1996; 273: 494497.

SECCIÓN 7

QUÍMICA CLÍNICA KWWSERRNVPHGLFRVRUJ

38 Adquisición, aplicaciones e interpretación de los datos bioquímicos clínicos William J Marshall

Introducción Las investigaciones en bioquímica clínica se utilizan ampliamente en la medicina con gran variedad de propósitos (cuadro 38-1). La mayor parte de las investigaciones más familiares implica la medición de un componente de algún fluido corporal, suero (o plasma) u orina. Los ensayos pueden también hacerse en otros fluidos, por ejemplo, el espinal, el obtenido por paracentesis, secreciones intestinales y heces, y sobre muestras de biopsia de tejidos corporales. Los resultados de la mayor parte de las investigaciones bioquímicas clínicas se expresan cuantitativamente como una concentración o con frecuencia, en el caso de mediciones enzimáticas, como una actividad. El análisis genético molecular, aunque aumenta en el repertorio de los laboratorios bioquímicos clínicos, no se discute en este capítulo. El hecho de que los resultados se expresen en forma numérica permite el lujo de una simplicidad evidente: parecen fáciles de evaluar y comparar con rangos de referencia (“normales”) o con resultados que se obtienen previamente en el mismo paciente. Mientras, por ejemplo, un signo sutil sobre una radiografía puede estar abierto a una variedad de interpretaciones (o puede ser ignorado por un observador inexperto), una concentración de sodio sérico de 143 mmol/L parece inequívocamente “normal” (el rango de referencia es 135 a 145 mmol/L) y es sin duda su valor diferente a 147 mmol/L, que es por definición “anormal”. Pero, ¿en realidad lo es? Examinemos estas afirmaciones con cierto detalle. Una concentración de sodio sérico puede

estar dentro del rango normal, pero eso no excluye la posibilidad de que una anormalidad sutil de la homeostasis del sodio o del agua esté presente, tampoco significa que el individuo sea sano. Inversamente, encontrar que un individuo tiene una concentración de sodio sérico de 147 mmol/L no significa que un desorden homeostático del sodio o del agua esté presente; de hecho, el individuo puede estar perfectamente sano. Estas afirmaciones provienen de que, como se discute más adelante en este capítulo, se esperaría que 5% de los individuos “normales” tuviera valores fuera del rango de referencia, aunque es evidente que en cuanto un valor medido esté más alejado de los límites del rango de referencia, es más probable que tenga una importancia patológica. La comparación de un resultado con un rango de referencia puede tener valor cuando la medición se hace en un individuo por primera vez. En la práctica, las mediciones se realizan con frecuencia, por ejemplo, para determinar el progreso de una condición o de una respuesta al tratamiento. Un valor medido establecido puede entonces compararse con uno anterior para considerar si ha ocurrido un cambio significativo. Pero si, por ejemplo, una concentración de sodio sérico de 145 mmol/L en un día es significativamente diferente (es decir representa un cambio fisiológico o patológico verídico) a partir de una de 147 mmol/L del día anterior se requiere un conocimiento de la confiabilidad de los datos, no sólo en términos de calidad analítica, sino también de cualquier variación biológica que afecte la concentración del sodio in vivo. Por último, cualquier conclusión que se arrastre no es confiable si la muestra que

The Science of Laboratory Diagnosis, second edition. Editado por David Burnett y John Crocker. © 2005 John Wiley & Sons, Ltd.

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Cuadro 38-1 Usos

CAP. 38

ADQUISICIÓN, APLICACIONES E INTERPRETACIÓN DE LOS DATOS BIOQUÍMICOS CLÍNICOS

Usos de las pruebas bioquímicas en la medicina Ejemplo

Concentración de la glucosa sanguínea (diabetes) Valoración de la Concentración de la creatinina gravedad sérica (insuficiencia renal) Pronóstico Tiempo de protrombina, gravedad de la acidosis, etc. (insuficiencia hepática aguda) Monitoreo de la Hemoglobina glucosilada enfermedad/tratamiento (diabetes) Seguimiento a largo Algunos marcadores tumorales plazo (cáncer) Tamizaje TSH sanguíneo neonatal (hipotiroidismo congénito) Detección de la Pruebas de la función tiroidea toxicidad del fármaco (para pacientes tratados con litio) Estratificación para Concentración del colesterol en los ensayos clínicos plasma (para ensayos de fármacos que disminuyen el colesterol)

analíticos y posanalíticos, es decir, se presentan en este orden antes de que la muestra se analice, durante el análisis, y una vez que se han generado los resultados.

Diagnóstico

se analiza no se recolecta y maneja antes del análisis de una manera que no afecte la concentración de sodio. A fin de que los lectores dejen de preocuparse porque ninguna conclusión categórica pueden sacarse de los datos bioquímicos clínicos (o, peor, pensar que estas cuestiones son triviales y sin ninguna consecuencia), debe enfatizarse que el personal de laboratorio emprende esfuerzos considerables para asegurarse de que los datos que aporta sean confiables (una medición verdadera de la variable en cuestión) y precisos (reproducibles). También es importante que el analito (componente de interés analítico) pueda medirse sobre un rango de concentración clínica útil, y que los resultados estén disponibles lo suficientemente rápido para informar a la gerencia clínica. Alcanzar esto requiere de metodología e instrumentación apropiadas, y el apego a procedimientos diseñados para maximizar la calidad. Sin embargo, sigue siendo importante que los usuarios de datos del laboratorio bioquímico clínico estén conscientes de las fuentes de error (no todas se encuentran en el laboratorio), y de trampas en la interpretación de los resultados, si se esfuerzan para obtener el máximo de información clínicamente útil. La mayor parte del resto de este capítulo está dividida en dos secciones: la primera se ocupa de la recolección y análisis de la muestra; la segunda, de las aplicaciones e interpretación de los datos bioquímicos.

Recolección y análisis de la muestra Los factores que pueden perjudicar la calidad de los resultados se dividen de manera convencional en preanalíticos,

Factores preanalíticos Las variables bioquímicas son afectadas por muchas de las fisiológicas (cuadro 38-2). Además, todas las variables bioquímicas están sujetas a una variación biológica aleatoria. Cuadro 38-2 Ejemplos de factores fisiológicos que afectan los resultados de pruebas bioquímicas

Factor

Prueba (todas en suero o en plasma)

Edad Sexo

Colesterol, urato, fosfatasa alcalina Esteroides gonadales, gonadotropinas, colesterol HDL Triglicéridos Cortisol (variación diurna) Gonadotropinas (variación del catamenial en mujeres) 25-Hidroxicolecalciferol (variación estacional) Cortisol, prolactina, hormona del crecimiento, catecolaminas, glucosa Renina, aldosterona, proteínas del plasma Glucosa, triglicéridos, fosfato

Masa corporal Tiempo

Estrés Postura Ingesta de alimentos

Para algunos, particularmente aquellos que están sujetos al control rígido de la retroalimentación, la concentración de calcio plasmático puede ser pequeña, pero para otros es un factor significativo que debe considerarse cuando se interpretan los resultados. El efecto de los fármacos sobre las variables bioquímicas in vivo es un problema potencial enorme, aunque en la práctica el número de ejemplos importantes es relativamente pequeño. La hipocalcemia, que ocurre con frecuencia en pacientes tratados con diuréticos, es uno de ellos. Las mediciones bioquímicas también se realizan con frecuencia para evaluar el efecto de los fármacos, por ejemplo, medición de la glucosa y de la hemoglobina glucosilada en pacientes con diabetes tratados con agentes hipoglucemiantes. Los fármacos también pueden convertirse en una fuente potencial del error analítico; por ejemplo, la reacción cruzada de prednisolona con el cortisol en muchos inmunoensayos. Los errores preanalíticos, al final, suelen ocurrir por una recolección incorrecta de la muestra, por ejemplo, al medir la glucosa en una muestra sanguínea que no es recolectada en un envase con fluoruro para inhibir la glucólisis; o por el

INTERPRETACIÓN DE LOS DATOS DE LABORATORIO

manejo, por ejemplo, causando hemólisis o la evaporación del agua. Todos los laboratorios publican manuales que deben incluir la información sobre el tipo de muestra que colecta y cualquier condición especial que deba observar. Los errores pueden presentarse, excepcionalmente, por una identificación errónea de las muestras. La vigilancia extrema es necesaria para prevenir el error en la identificación. Las formas de solicitud deben llenarse con los datos correctos adecuados y cotejarse directo con el paciente, y que las muestras se identifiquen positivamente en todas las etapas de la manipulación, por ejemplo, si el suero tiene que transferirse del envase inicial (primario) a uno secundario para el análisis. En muchos hospitales y clínicas, la sangre y otras muestras las recolectan las enfermeras o los flebotomistas entrenados. Muchos laboratorios encuentran que es más probable que ocurran los errores si las muestras las recolectan los médicos. En medicina de laboratorio, como en la clínica, es buena práctica tener mucho cuidado con procedimientos en apariencia simples, es decir, igual al que se tiene con los complicados.

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aporten un diagnóstico completo. Más bien con frecuencia reflejan procesos patológicos que enfermedades específicas, y pueden incluso no ser determinantes para un proceso, aunque en una situación clínica particular o tomando en cuenta otras investigaciones, es probable que una puede ser mejor que la otra. Por ejemplo, una concentración baja de albúmina sérica tiene muchas causas potenciales, que incluyen disminución de la síntesis, incremento en el volumen de distribución o aumento en la pérdida o catabolismo y cada uno de éstos por sí mismo tiene varias causas potenciales. En un paciente conocido por tener enfermedad hepática crónica, la disminución en la síntesis es probable que sea la causa más importante. Los resultados bioquímicos pueden evaluarse en relación con varios criterios, de acuerdo con las razones de realizar la prueba: el rango de referencia comparable para personas sanas; el rango de valores esperados en condiciones particulares; valores de corte o límites de acción, o resultados obtenidos previamente en el mismo individuo. Rangos normales e intervalos de referencia

Factores analíticos Una discusión detallada de los procedimientos de laboratorio está más allá del alcance de este capítulo. Es una condición de acreditación por CPA (UK) Ltd (Acreditación del Laboratorio Clínico) que los laboratorios usen procedimientos aceptables para el control de calidad interno y el aseguramiento de calidad externa. Los problemas que pueden afectar la calidad de los resultados se discuten en los capítulos sobre técnicas analíticas individuales. Factores posanalíticos Una vez que se han generado y validado los resultados, los errores todavía pueden presentarse antes de que lleguen las anotaciones de los pacientes. Con el uso creciente de la transmisión electrónica de los resultados desde el laboratorio a la sala o clínica, el riesgo de tales errores disminuye considerablemente, pero nunca puede eliminarse del todo. También, es un riesgo particular si los resultados se comunican por teléfono al médico, debido a una urgencia. Es irónico que justo durante el manejo de los resultados es cuando un error podría tener consecuencias específicas perjudiciales.

Interpretación de los datos de laboratorio Aunque los datos bioquímicos se utilizan de manera extensa en el diagnóstico y control de pacientes, es raro que

El término “normal” tiene varios significados. Una distribución normal (gaussiana) describe una distribución simétrica de datos alrededor de una media que puede detallarse con una función matemática específica. Estadísticamente el rango normal es el rango de los valores para tales datos a partir de la media menos dos desviaciones estándar para la media más dos desviaciones estándar, y abarca cerca de 95% de los valores. Para mucha gente, sin embargo, normal significa “conforme al tipo” o, implícitamente, “sano”, puesto que rangos normales para variables biológicas humanas están con frecuencia basados sobre mediciones hechas en una muestra de individuos de una población “normal” (en el sentido de “saludable”). Hay muchas trampas en el uso de rangos normales. Dentro de las disciplinas de la medicina de laboratorio, se discute en forma extensa que el término no debe usarse. En vez de “población normal” se prefiere el término “población de referencia”, puesto que éste no implica ninguna característica específica (p. ej., salud) en la población. (De hecho, no existe razón por la que no deba procurarse definir los rangos característicos de los resultados de la prueba de una población de referencia integrada de pacientes con enfermedades particulares.) Los valores superiores e inferiores de la distribución se llaman “límites de referencia” y el rango entre ellos, “intervalo de referencia”. Pero aunque sea loable este esfuerzo para dirigir un análisis más objetivo de los datos, los términos no se usan de forma amplia fuera de los laboratorios y, en la práctica, muchos los continúan refiriendo como “rangos normales”. Además, los intervalos de referencia se basan con frecuencia

CAP. 38

ADQUISICIÓN, APLICACIONES E INTERPRETACIÓN DE LOS DATOS BIOQUÍMICOS CLÍNICOS

en los mismos datos que se utilizan para calcular rangos normales y son idénticos a ellos. Por definición, puesto que el rango normal abarca sólo 95% de los valores de la población que se estudia, 5% de los valores caen fuera de este rango, 2.5% arriba y 2.5% abajo. Asimismo, algunos valores de la gente sana caen inevitablemente fuera del rango normal para la población, aunque el sentido común nos dice que cuanto más lejos esté un resultado de los límites del rango, es más probable que sea “anormal” en el sentido patológico significativo. Cuanto más variables se midan, es más probable que por lo menos una caiga fuera del rango normal importante. Si 20 analitos independientes fueran medidos, la probabilidad de que uno sea anormal es 0.64, es decir, mejor que constante. Puesto que los analizadores automatizados miden en forma rutinaria este número de analitos, resultados falsos, “anormales”, son una ocurrencia inevitable. Otro problema en la interpretación proviene de que el rango de variación de un resultado de la prueba en un individuo es probable que sea menor al rango observado en la población, ya que la población, aun cuando es comparable en términos, por ejemplo, de edad, sexo y origen étnico, se compone de individuos genéticamente distintos. El rango normal para la concentración de creatinina plasmática en varones adultos es aproximado a 60 a 120 µmol/L, pero el rango de valores que se observa con mediciones repetidas en un solo individuo es mucho menor que ése. Un individuo puede aportar un resultado dentro del rango normal cuando se define para la población que es realmente anormal para él. En seguida se presentan algunos ejemplos específicos, donde los rangos normales no son estándares apropiados contra los cuales juzgar los resultados de los pacientes.

Concentración de creatinina sérica (␮mol/L)

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Eliminación de la creatinina (ml/min)

Figura 38-1 Concentración de la creatinina sérica y eliminación de la creatinina. Debido a que la eliminación (una medida de la tasa glomerular de filtración, GFR) se relaciona de manera inversa con la concentración de la creatinina sérica, la eliminación puede descender a la mitad de su valor normal (casi 120 ml/min) antes de que la concentración de la creatinina sérica llegue a ser anormal. El área sombreada muestra el rango de referencia normal para las concentraciones de creatinina sérica.

normal, pero está bien establecido que el incremento en las concentraciones del colesterol está ligado a un incremento en el riesgo de la enfermedad cardiaca coronaria, incluso dentro de este rango (fig. 38-2). Para el colesterol, por consiguiente, el concepto de un rango normal es engañoso. Más bien, definimos las concentraciones ideales (las cuales hasta cierto punto ellas mismas dependen de la presencia de otros factores de riesgo para la enfermedad coronaria) y valores de umbral para los valores de intervención y del

Ejemplo 1: un resultado dentro del rango normal puede sugerir falsamente una función normal Número de sujetos

La creatinina se mide en suero como índice de la función renal, específicamente de la tasa de filtración glomerular (GFR). La concentración de creatinina es inversamente proporcional a la GFR (fig. 38-1) y en la práctica, la GFR puede caer hacia la media normal (equivalente a la pérdida de un riñón funcionando) antes de que la concentración de la creatinina sérica exceda el límite superior de la normal. La concentración de la creatinina sérica es entonces un índice insensible de la pérdida temprana de la función renal.

Riesgo de enfermedad cardiaca coronaria

Colesterol sérico (mmol/L)

Ejemplo 2: un resultado dentro del rango normal puede sugerir falsamente ningún riesgo de enfermedad Si las concentraciones del colesterol plasmático se miden sobre un grupo de gente sana, es posible derivar un rango

Figura 38-2 Distribución de las concentraciones del colesterol sérico en adultos saludables y el riesgo de enfermedad cardiaca coronaria. Cerca de un tercio de los valores excede la concentración ideal recomendada (5.0 mmol/L) y están relacionados con un riesgo significativo incrementado de la enfermedad coronaria.

INTERPRETACIÓN DE LOS DATOS DE LABORATORIO

blanco para el tratamiento. El valor del blanco para la prevención secundaria de la enfermedad coronaria en el Reino Unido es en la actualidad una concentración de colesterol total de menos de 5.0 mmol/L (LDL menor de 3.0), aunque hay evidencia de que incluso blancos más bajos pueden ser más apropiados. Ejemplo 3: cualquier concentración es anormal Puesto que los fármacos no son componentes fisiológicos del cuerpo, las concentraciones de éstos medidas en pacientes no pueden compararse con rangos normales. En el contexto del monitoreo terapéutico del fármaco, rangos “terapéuticos” y “tóxicos” son más apropiados (aunque incluso estos términos deben interpretarse con cautela), mientras en el contexto del envenenamiento, “niveles de acción” se utiliza para ayudar a determinar el control apropiado. Diferencias críticas La discusión precedente se relaciona con la comparación de datos medidos con valores esperados basados sobre observaciones en otras personas. Cuando se repite una medición, es más pertinente considerarla en relación con el valor anterior. La pregunta adecuada es si los dos valores difieren significativamente. Esto depende de dos factores: la variabilidad innata del parámetro que se mide, aun cuando las condiciones de muestreo sean idénticas (variación biológica), y la variación analítica, es decir, el error concomitante inevitable en cualquier medición (no obstante, debe esperarse que sea muy pequeño). Ambos pueden determinarse a partir de los resultados de mediciones repetidas del mismo y de una serie de muestras similares, y con una función conocida como la diferencia crítica (CD) calculada con la ecuación: CD = 2.8 ⫻ (SDA2 + SDB2 )½, donde SDA y SDB son las desviaciones estándares analíticas y biológicas, respectivas. La CD indica la diferencia mínima entre dos valores, que es improbable que ocurran como resultado de la variación biológica y analítica en una probabilidad de 0.95 (p = 0.05). Si cualquier cambio es clínicamente significativo es otro asunto, pero sin duda que un cambio no puede considerarse que es de importancia clínica potencial si es menor que la CD. El concepto de diferencia crítica no es ampliamente entendido fuera de los laboratorios, aunque es fundamental para el uso de los datos de laboratorio en el monitoreo de la historia natural de la enfermedad y de la respuesta al tratamiento. Los valores para algunas CD deben estar disponibles a partir del laboratorio local. Las diferencias críticas son independientes de rangos normales. De hecho, dos

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resultados pueden ser extremadamente diferentes aunque ambos estén dentro del rango normal. Si se considera, por ejemplo, un incremento en la concentración de la creatinina sérica desde 80 a 100 µmol/L entonces la CD para la creatinina en este rango de concentraciones es cerca de 17 µmol/L. Así, un aumento de 20 µmol/L es de importancia clínica potencial (implicando una disminución en la función renal), aun cuando ambos valores estén dentro del rango normal. Esta discusión acentúa el hecho de que las mediciones seriales en individuos pueden (y en la práctica frecuentemente lo son) ser más informativas que las mediciones “únicas”. Límites de acción, valores del blanco, puntos de corte y valores predictivos Para algunas investigaciones de laboratorio, es apropiado considerar los resultados contra los límites de acción, es decir, valores usados para determinar si una acción específica debe tomarse. Ejemplos obvios incluyen límites de acción de concentraciones de venenos para tratamiento directo, como la concentración de paracetamol sérico para indicar si el tratamiento con N-acetilcisteína debe iniciarse (o continuarse) para prevenir daño hepático. Muchos laboratorios tienen límites de acción para determinar cómo responden a un resultado; por lo común, cuando un valor anormal debe telefonearse al médico que lo requiere, o cuando una investigación adicional se debe realizar para obtener más información, por ejemplo, accionar electroforesis de proteínas del suero para buscar una paraproteína cuando la concentración de globulina total de un paciente es inesperadamente alta. Debido a que para la mayor parte de los datos de laboratorio existe un traslape entre el rango de los valores que normalmente se observan en la gente sana y los que se producen en la enfermedad (sobre todo en las etapas iniciales de esta última, o cuando es relativamente leve), la selección de los puntos de acción es en particular crítica cuando las pruebas se utilizan para el tamizaje (que detecta la enfermedad subclínica). Fijando el límite de acción (con más frecuencia llamado valor de corte en este contexto) demasiado bajo significa que, mientras a todos los pacientes con esta condición se les diagnostica correctamente usando la prueba, se mantiene, a expensas de una mala categorización de un número significativo de personas sanas, a otros como posibles poseedores de la enfermedad (falsos positivos). Fijando el valor de corte demasiado alto excluye a todos los individuos sanos, pero algunos con la enfermedad no serán detectados (los falsos negativos; fig. 38-3). En el tamizaje para una condición seria, pero en potencia tratable, es deseable no tener ningún falso negativo (casos errados). Un ejemplo clásico es el extenso programa de

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CAP. 38

ADQUISICIÓN, APLICACIONES E INTERPRETACIÓN DE LOS DATOS BIOQUÍMICOS CLÍNICOS

Cuadro 38-3 Sensibilidad, especificidad y el valor predictivo (b) de las pruebas Resultado de la prueba Positivo Negativo Estado de la enfermedad

Positivo Negativo

Verdadero positivo (TP) Falso positivo (FP)

Falso negativo (FN) Verdadero negativo (TN)

Sensibilidad (positividad en la enfermedad) ⫽ TP/(TP ⫹ FN) Especificidad (negatividad en la salud) ⫽ TN/(TN ⫹ FP) Valor predictivo positivo (PV⫹) ⫽ TP/(TP ⫹ FP) Valor predictivo negativo (PV⫺) ⫽ TN(TN ⫹ FN)

Figura 38-3 Efecto del movimiento del punto de corte que determina la positividad/negatividad de un resultado de la prueba. Se muestran las distribuciones hipotéticas para la concentración de un analito en pacientes con y sin enfermedad. Debido a que éstos se traslapan, si el corte se selecciona para disminuir la cantidad de resultados falsos positivos (y por tanto aumentar la especificidad) (a), hay cantidades significativas de resultados falsos negativos (sensibilidad disminuida). Si el corte se fija más abajo (b), los falsos negativos se eliminan (maximizando la sensibilidad) pero a expensas de aumentar el número de los falsos positivos (disminuyendo así la especificidad). Las distribuciones de los valores para individuos con enfermedad se muestran por debajo del eje horizontal, para mayor especificidad

tamizaje neonatal para la fenilcetonuria y el hipotiroidismo congénito. Debe enfatizarse que las pruebas de tamizaje no son diagnósticas. Además, en definitiva, las investigaciones se requieren para establecer el diagnóstico, y, en los falsos positivos, para excluirlo. El desempeño de las pruebas de tamizaje puede medirse calculando funciones que se conocen (en este contexto) como la sensibilidad (una medida de la capacidad de la prueba de detectar a la gente que tiene la enfermedad) y especificidad (una medida de su capacidad de identificar a la gente que no la tiene) (cuadro 38-3). Tales cálculos requieren la identificación confiable de verdaderos y falsos positivos y negativos, que a su vez necesitan un “estándar de oro” o prueba de diagnóstico definitiva que identifique,

inequívocamente, la presencia o la ausencia de la enfermedad. El examen histológico del tejido o el análisis genético molecular pueden proporcionar el estándar de oro, pero algunas veces la positividad o negatividad verdaderas pueden determinarse sólo en retrospección, observando el resultado. Las cantidades de resultados positivos y negativos verdaderos y falsos pueden también utilizarse para calcular el valor predictivo (PV) de un resultado positivo o negativo, es decir, la probabilidad de que una prueba positiva (o negativa) clasifique correctamente a la persona que se examina. Los conceptos de sensibilidad, de especificidad y de valores predictivos pueden también utilizarse para describir el desempeño de las pruebas hechas para propósitos de diagnóstico, pero en este caso y en el tamizaje son importantes para apreciar que sólo pueden aplicarse con confianza en pacientes similares a aquellos sobre quienes los datos fueron derivados. Una prueba, por ejemplo para la artritis reumatoide puede parecer tener sensibilidad y especificidad altas cuando se aplica a un grupo de pacientes con la enfermedad establecida. Sin embargo, es probable que la sensibilidad sea mucho más baja en un grupo de personas en quienes la enfermedad tuvo un predominio muy bajo, o en quienes tuvieron la enfermedad en un periodo más temprano. Esto es un inconveniente (y fuente frecuente de error) para el uso de estos conceptos.

Cocientes de probabilidad Estas funciones expresan la probabilidad de que un hallazgo, por ejemplo un resultado de la prueba, ocurriría en una persona con cierta condición, en comparación de sin ésta. El cociente de probabilidad (LR) para un resultado positivo es LRpos = sensibilidad/(1⫺especificidad). La probabilidad que un resultado negativo ocurriera en una persona con una condición particular (LRneg), en comparación

BIOQUÍMICA CLÍNICA BASADA EN EVIDENCIA

en una sin ésta, está dada por LRneg = (1⫺sensibilidad)/ especificidad). Los cocientes de probabilidad pueden utilizarse para convertir la probabilidad de la preprueba (en una prueba de tamizaje, ésta será el predominio de la condición en la población que es tamizada) en la probabilidad de posprueba de la condición que está presente. Tales datos es posible utilizarlos para el control directo y son de gran valor en la auditoría clínica.

Bioquímica clínica basada en evidencia Los resultados bioquímicos y otros de prueba de laboratorio deben interpretarse con cuidado. Muchas pruebas en la actualidad disponibles proporcionan menos información confiable que es a menudo apreciada o asumida, no usualmente debido a problemas analíticos sino, más bien, a sensibilidad y especificidad escasas. Las nuevas pruebas de diagnóstico se desarrollan e introducen todo el tiempo, y por lo regular las promueven con mucho entusiasmo los fabricantes de kits de prueba, con el apoyo de médicos que buscan un desempeño diagnóstico mejorado. Su evaluación, sin embargo, es a menudo pobre. Lo ideal es que todas las pruebas de laboratorio deben evaluarse con un rigor similar al requerido antes de la introducción de nuevos tratamientos, de tal manera que puedan utilizarse de forma racional, sobre la base de evidencia bien fundada científicamente.

Conclusión Las pruebas bioquímicas se han vuelto una parte esencial de la práctica médica moderna. Tienen diversas aplicaciones po-

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tenciales pero, en muchas, la facilidad con que ellas pueden solicitarse y realizarse contradice su complejidad. Deben realizarse con cuidado e interpretarse a través de una apreciación de los principios fisiológicos y patológicos fundamentales, cualquiera que sea el propósito para el cual deben usarse.

Lecturas adicionales Fraser CG, Fogarty Y. Interpreting laboratory results. Br Med J 1989; 298: 1659-1660. Jones R, Payne B. Clinical Investigation and Statistics in Laboratory Medicine. 1997: ACB Venture Publications, London. Marshall WJ. The uses of biochemical data in clinical medicine. The acquistion of biochemical data. The interpretation of biochemical data. In Clinical Biochemistry, Marshall WJ, Bangert SK (eds). 1995: Churchill Livingstone, Edinburgh, 1-24. Moore RA. Evidence-based clinical biochemistry: a personal view. Ann Clin Biochem 1997; 34: 1-7. Oxfor Centre for Evidence-Based Medicine. Likelihood ratios. http://www.cebm.net/likelihood_ratios.asp Price CP. Christenson RH (eds). Evidence-based Laboratory Medicine. 2003. Washington: AACC Press. Read MC, Lachs MS, Feinstein AR. Use of methodological standardized in diagnostic test research: getting better but still not good. J Am Med Assoc 1995; 274: 645-651. Tape TG. Interpreting diagnostic tests. http://gim.unmc.edu/dxtests/ Default.htm

39 Inmunoensayo en bioquímica clínica Joan Butler y Susan M Chambers

Introducción El inmunoensayo utiliza la reacción antígeno-anticuerpo como un medio de cuantificación del antígeno o del anticuerpo. La mayor parte de las aplicaciones en bioquímica clínica utiliza la técnica para cuantificar el antígeno, mientras en inmunología y microbiología también se emplea para cuantificar (o detectar) el anticuerpo circulante. Los anticuerpos se incrementan frente a una amplia variedad de sustancias. Las moléculas pequeñas pueden hacerse inmunogénicas por el acoplamiento químico a una molécula grande, como albúmina o polilisina, y son entonces conocidas como haptenos.

Diseño del ensayo A pesar de la complejidad aparente de los métodos que se publican, hay dos diseños básicos del ensayo: los métodos competitivos o limitados del anticuerpo, que usan el marcado del antígeno con una molécula trazadora o reportera y teniendo el “inmunoensayo” de titulación genérica; y los métodos no competitivos o de exceso del anticuerpo, que emplean anticuerpo marcado y teniendo el ensayo “inmunométrico” de titulación genérica. En un ensayo competitivo, el antígeno en la muestra (o el estándar) compite con el marcado por los sitios de unión en una cantidad limitada de anticuerpo. Es esencial que la cantidad de anticuerpo sea insuficiente para ligar todo el antígeno marcado, de modo que la competición por los sitios de unión ocurra. En equilibrio la cantidad del antígeno marcado ligado al anticuerpo está inversamente relacionado con la cantidad del antígeno sin marcar en la muestra o el control estándar. La determinación del marcador en la

fracción ligada aporta una medida de la cantidad de antígeno, en la comparación de una curva de calibración: Ag ⫹ Ag* ⫹ Ab estado inicial

AgAb ⫹ Ag*Ab ⫹ Ag* estado final

Para determinar la cantidad de antígeno marcado en la fracción ligada (o libre), estas fracciones deben separarse, excepto en los casos raros donde la señal del marcador es modificada por la unión del antígeno marcado al anticuerpo. En un ensayo inmunométrico o no competitivo, las condiciones son tales que el antígeno puede reaccionar con un exceso del anticuerpo marcado. El anticuerpo sin reaccionar entonces se separa, y la cantidad del anticuerpo marcado ligado al antígeno se mide: Ag ⫹ Ab* estado inicial

AgAb* ⫹ Ab* estado final

Este diseño simple es la base para un número de formatos más complejos. Los antígenos que son moléculas grandes pueden reaccionar con otro anticuerpo, denominado el anticuerpo de captura, dirigido contra un epítopo diferente y espacialmente distinto sobre la molécula del antígeno, y usualmente enlazado a una fase sólida: Ab1 ⫹ Ag ⫹ Ab*2 estado inicial

Ab1AgAb*2 ⫹ Ab1 ⫹ Ab*2 estado final

donde Ab1 ⫽ anticuerpo de captura, Ab*2 ⫽ anticuerpo marcado. Este diseño del ensayo es el llamado ensayo inmunométrico sándwich, o ensayo inmunoenzimático de dos sitios, y es el más utilizado en la actualidad para el ensayo de

The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker, © 2005 John Wiley & Sons, Ltd.

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CAP. 39

INMUNOENSAYO EN BIOQUÍMICA CLÍNICA

polipéptidos. El antígeno debe ser bastante grande para la unión simultánea de dos anticuerpos. La adición del anticuerpo a la muestra puede ser simultánea (formato de un paso) o secuencial (con la eliminación de la muestra antes de la adición del anticuerpo marcado, un formato de dos pasos). Es posible utilizar más de un anticuerpo de captura o marcado, dando un ensayo de varios sitios. Al requerir dos epítopos distintos pero conectados, el diseño del ensayo con dos sitios ofrece una especificidad considerable mayor que un diseño competitivo de un solo anticuerpo. Aunque los antisueros policlonales pueden utilizarse en ensayos sándwich, este diseño entró en uso general sólo cuando los anticuerpos monoclonales llegaron a estar disponibles. En los ensayos inmunométricos para los antígenos pequeños, el anticuerpo marcado sin reaccionar es frecuente que sea eliminado por la adición del antígeno acoplado a una fase sólida. La unión a una fase sólida deteriora la reactividad y el antígeno acoplado, por tanto, no competirá con el antígeno libre de la muestra. De forma alternativa, puede utilizarse el anticuerpo específico para el complejo del hapteno y el anticuerpo antiantígeno, y no reactivo a cualesquiera de estos componentes por separado (complejo antiinmunitario o anticuerpo antimetatipo): Ag ⫹ Ab1

AgAb1 ⫹ Ab1 estado inicial

⫹ Ab*2

AgAb1Ab*2 ⫹ Ab1 ⫹ Ab*2 estado final

donde Ab1 ⫽ anti-Ag, Ab2 ⫽ anti-(AgAb1). Con este formato se muestra la diferencia fundamental entre los inmunoensayos competitivos y el de exceso de anticuerpos; el primero mide la señal a partir del anticuerpo no ligado al antígeno y el último, la señal del anticuerpo ligado al antígeno u ocupación del anticuerpo; por lo tanto es más sensible, puesto que es más fácil distinguir un número pequeño desde cero que uno grande de un número levemente más elevado. Por otra parte, los métodos de exceso de anticuerpos son más rápidos, se afectan menos por las variaciones en calidad y cantidad del reactivo y pueden tener un rango de funcionamiento más amplio. La figura 39-1 muestra las curvas de calibración comunes para un inmunoensayo competitivo y uno inmunométrico con dos sitios.

Condiciones del ensayo y calibradores La concentración del anticuerpo o de los anticuerpos que se elige para optimizar el rango de funcionamiento del ensayo para su propósito clínico, en general, iguales concentraciones, más bajas, del anticuerpo y del antígeno. La parte inclinada de la curva estándar y el rango de precisión más alto deben corresponder al rango de la concentración so-

Figura 39-1 Curvas estándar típicas para a) un inmunoensayo competitivo, b) un ensayo inmunométrico con dos sitios.

bre el que los valores son requeridos clínicamente. Se deduce que el rango de funcionamiento tiene limitaciones, por ejemplo, en el ensayo de gonadotropina coriónica humana, que se diseña para la oncología, no es útil en la determinación de concentraciones en el embarazo. Muchos factores, además de las cantidades de los reactivos deben controlarse dentro de y entre los lotes para mantener la optimización de un ensayo. La cinética de la reacción y la posición de equilibrio dependen de la temperatura, pH y fuerza iónica. La reactividad cruzada de moléculas que tiene una relación estructural también será afectada por los cambios en estas variables. En la medida de lo posible, estos factores, en especial la matriz de la muestra, deben mantenerse constantes. Si a una reacción no se le permite alcanzar el equilibrio, la falta de constancia de la sincronización puede conducir a una desviación, es decir, a un error sistemático en el resultado, de acuerdo con la posición de la muestra en el lote. En analizadores automáticos estos factores pueden controlarse de manera precisa, conduciendo a la consistencia de resultados en y entre laboratorios. Los reactivos para calibrar o los estándares pueden plantear una dificultad especial en el inmunoensayo, puesto que para muchas sustancias no hay un sistema de ensayo alternativo practicable. En el caso del polipéptido de las

MARCADORES

hormonas, hasta el advenimiento de la tecnología del DNA recombinante no era posible preparar suficiente material purificado para la medición por métodos fisicoquímicos y de esta forma obtener calibradores para el inmunoensayo. Por esta razón, se adoptaron los estándares internacionales preparados para los bioensayos en los inmunoensayos, con el valor asignado como el consenso de estudios de colaboración que usan diferentes sistemas de bioensayos. Estos estándares contienen algunos microgramos de antígeno o problema con miligramos de albúmina transportadora y de excipientes; y los métodos absolutos de análisis, como el del aminoácido, no pueden utilizarse. Los ensayos de la hormona del crecimiento y de la prolactina en Estados Unidos están calibrados inadecuadamente en términos de masa. La heterogeneidad inherente de la glucoproteína de las hormonas es una barrera importante para la estandarización, y condujo a diferir los cocientes de bioactividad/inmunoactividad en los estándares internacionales sucesivos. El uso de estándares internacionales tiende a minimizar, pero no elimina, las diferencias entre los ensayos. Los materiales de referencia, estándares basados en el suero, o los certificados, no se utilizan como calibrantes primarios, puesto que los inmunoensayos están sujetos a efectos de la matriz. El último objetivo es calibrar los ensayos de proteína en términos de masa o molaridad, un desafío para muchos antígenos. Para una discusión de las dificultades de la calibración, véase Bristow, 1998; Stenman, 2001.

Marcadores Muchos diferentes tipos de moléculas tipo marcador o reportera se usan en la actualidad. Los procedimientos de marcaje se diseñan para no deteriorar la unión de la molécula marcada a su anticuerpo o antígeno apropiado. La medición (detección) del marcador puede requerir otros reactivos o un equipo muy especializado, o ambos. Los tipos de marcador que más se emplean se listan en el cuadro 39-1. Cuadro 39-1

Tipos de marcador de uso corriente

Radioisótopos Quimioluminiscencia Quimioluminiscencia incrementada Electroquimioluminiscencia Fluorescencia Fluorescencia de tiempo resuelto Enzimas Colorimetría, colorimetría cinética Fluorescencia Quimioluminiscencia Amplificación (cascadas)

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Los radioisótopos son fácilmente detectables, pero el peligro que representan es una desventaja, además se requiere de procedimientos específicos de manipulación y de eliminación. También tienen una “vida útil” corta, ya que la molécula marcada se daña por decaimiento radiactivo. Con el advenimiento de la automatización, han llegado a restringirse a ensayos más especializados y de bajo volumen. La polarización de la fluorescencia sólo es conveniente para valorar haptenos pequeños y de fármacos, pero otros métodos fluorescentes se aplican a un amplio rango de antígenos. Los fluoróforos utilizados con más frecuencia incluyen la fluoresceína, la umbeliferona, el luminol y los metales raros. Las técnicas de fluorescencia de tiempo resuelto usan quelatos de lantánido, que producen una fluorescencia relativa duradera; la sensibilidad se mejora tomando las lecturas después que la fluorescencia de fondo de corta duración producida por los componentes endógenos de la muestra ha decaído. La sensibilidad también se incrementa por el cambio de Stokes amplio de los quelatos de lantánido (es decir, la diferencia en la longitud de onda entre los picos de excitación y de emisión) y sus máximos de emisión muy estrechos, que reducen la fluorescencia del fondo. El marcado múltiple, empleando diferentes lantánidos, es también posible, y ofrece gran potencial para el análisis multiplexado y miniaturizado. Los iones del lantánido son también un componente de los marcadores de criptato; los iones se incluyen dentro de una molécula orgánica grande “como jaula”, un criptando, y el criptato que resulta es muy estable e inerte. La técnica de emisión amplificada de tiempo resuelto del criptato se basa en la transferencia no radiactiva amplificada de la energía desde un donante fluorescente (el criptato) a una molécula aceptora espacialmente próxima. Así, el marcador ligado y libre puede distinguirse por sus espectros de emisión, permitiendo un sistema de ensayo homogéneo aplicable a moléculas grandes y pequeñas. En la quimioluminiscencia, la molécula excitada se produce por una reacción química; los sustratos quimioluminiscentes producen fotones (luz), por lo general con una reacción oxidativa. En la electroquimioluminiscencia, la emisión de luz se inicia electrónicamente al aplicar un voltaje a la solución de la reacción, eliminando los problemas relacionados con la adición y mezcla del reactivo. El marcaje con enzimas y la detección con sustratos que dan puntos finales colorimétricos, índices colorimétricos, fluorimétricos o quimioluminimétricos aportan mayor sensibilidad y un rango más amplio de funcionamiento. Esta técnica, cuando se aplica con fluorescencia o quimioluminiscencia, se describe como “enzima realzada” o “enzima amplificada”. Una forma de ensayo de fase sólida heterogénea que ha conseguido aplicación extensa en muchos sistemas antígeno-anticuerpo es el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas, o ELISA. La muestra primero se incuba

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INMUNOENSAYO EN BIOQUÍMICA CLÍNICA

con un anticuerpo que está unido a una fase sólida (por lo común sobre una placa de microtitulación), entonces cualquier antígeno no ligado se elimina por lavado, después, se agrega un segundo anticuerpo acoplado a una enzima. La actividad de la enzima unida a la fase sólida es proporcional a la concentración del antígeno capturado (es decir, el antígeno). La búsqueda para el marcador “ideal” continúa (véase Kricka, 1994); los estudios de desarrollo biotecnológico recientes incluyen marcadores particulares con tamaños submicrométricos acoplados a los agentes de unión específica, que ofrecen mayor sensibilidad.

Ensayos homogéneos El término “homogéneo” se utiliza para los inmunoensayos en los cuales no se requiere la separación del marcador ligado o libre. En tales sistemas la señal es modificada por la unión del anticuerpo, con lo que resulta que el marcador ligado o libre puede distinguirse en la mezcla de reacción, por ejemplo, la unión del antígeno marcado con enzima al anticuerpo puede inhibir la actividad de la enzima, por impedimento estérico o induciendo cambio de conformación del sitio activo. Este sistema (EMIT®, técnica de inmunoensayo multiplicado por enzimas, Syva) puede utilizarse en analizadores de química; en la práctica se emplea ampliamente para la medición de fármacos. La polarización de la fluorescencia también se usa para los ensayos de fármacos. Otro ejemplo es el inmunoensayo turbidimétrico para las moléculas pequeñas, en los cuales la unión del anticuerpo cruzada con las partículas de látex revestidas con el antígeno es inhibida por el antígeno libre de la muestra, causando una disminución en la turbiedad. Si el antígeno es una molécula grande y en la concentración es suficientemente alta, la formación de los complejos antígeno-anticuerpo puede medirse por nefelometría y no es necesario el marcador. Los ensayos homogéneos para los antígenos grandes y pequeños son factibles con los criptatos recién desarrollados (véase la sección sobre Marcadores). Algunos tipos de ensayo homogéneo disponibles se describen en el cuadro 39-2. Sin embargo, la mayoría de estas técnicas casi no se aplican, y gran parte de los inmunoensayos son del

Cuadro 39-2

Inmunoensayos homogéneos

Inhibición o activación enzimática (EMIT®) Polarización de la fluorescencia Transferencia de energía no radiactiva (+ fluorescencia de tiempo resuelto) Nefelometría Turbidimetría

tipo heterogéneo, en el cual se requiere de la separación del marcador ligado y libre.

Métodos de separación Cualquier técnica para separar el antígeno ligado del libre o del anticuerpo no debe perturbar la reacción primaria. La diferencia en el tamaño molecular entre el antígeno libre y el ligado al anticuerpo se aprovecha en los primeros sistemas, como en la precipitación de la proteína con sulfato de amonio o polietilenglicol y la adsorción del antígeno libre con carbón vegetal. La separación inmunológica a través del uso de un anticuerpo antiespecie resultó mucho más confiable. Por ejemplo, ya que los anticuerpos son bio multivalentes, si el anticuerpo primario fue elevado en un conejo, los anticuerpos para las inmunoglobulinas del conejo elevados en un burro producirán complejos con las inmunoglobulinas del conejo que son suficientemente grandes e insolubles para formar un precipitado. Algún suero o inmunoglobulinas de un conejo no inmunizado (suero portador) se agrega regularmente para asegurar la precipitación. Tales reactivos son de aplicabilidad general. Este sistema de separación (en el ejemplo del anticonejo del burro) se llama un “anticuerpo secundario”, y los ensayos que lo usan, métodos de doble anticuerpo, aunque este nombre en ocasiones también se utiliza para describir un ensayo con dos sitios. La formación del precipitado del anticuerpo secundario es lenta, por tanto, en estos ensayos es frecuente que se deje que ocurra el precipitado toda la noche, pero esta etapa puede acortarse en forma considerable agregando polietilenglicol. Después de la centrifugación, el sobrenadante es removido por aspiración o decantación, procedimientos que requieren habilidad y experiencia con los precipitados muy pequeños que se producen. Métodos de separación en fase sólida Estas técnicas, que han reemplazado en gran parte al resto de los métodos, implican ligar los reactivos a las fases sólidas por unión covalente o por adsorción. La fase sólida puede ser la pared de un tubo plástico, la celdilla de una placa de microtitulación o la superficie de perlas grandes o de partículas pequeñas. Las partículas con una base magnetizable ofrecen separación excepcionalmente rápida y eficiente. La separación es por decantación simple y conveniente o aspiración de la fase líquida, seguida normalmente por el lavado de la fase sólida con amortiguador para asegurar la terminación de la separación y reducir la unión no específica (la unión evidente en ausencia del anticuerpo). El ensayo simultáneo de dos o más antígenos es factible ahora con la instrumentación capaz de separar las mezclas

CÁLCULO DE LOS RESULTADOS

de perlas revestidas de anticuerpos dentro de grupos codificados con una tinción específica para el antígeno en la etapa final del ensayo de medición separada. Tal sistema permite, por ejemplo, el inmunoensayo de múltiples antígenos en un solo punto Guthrie para el tamizaje neonatal. La fase sólida puede ser un reactivo multipropósito, realizado al cubrir con el segundo anticuerpo o con estreptavidina, un reactivo específico que se acopla con biotina, la cual tiene una afinidad muy alta con la estreptavidina. Otros pares incluyen fluoresceína con antifluoresceína. Esta técnica tiene la ventaja adicional de que las reacciones específicas ocurren en la fase líquida. El acoplamiento a una fase sólida disminuye la afinidad de un anticuerpo y la velocidad de reacción, y puede alterar otras características. Las técnicas en fase sólida también permiten variaciones del protocolo del ensayo de la forma básica de la adición simultánea de todos los reactivos a la muestra. Tales variaciones pueden resultar en el incremento de la especificidad y otras mejoras. Los reactivos inmovilizados sobre tiras de papel forman la base de las pruebas con tira reactiva, por ejemplo, para la prueba del embarazo. Otros dispositivos también disponibles para inmunoensayo en el lugar de atención incluyen pruebas para los marcadores cardiacos y fármacos.

Automatización La automatización de los inmunoensayos requiere la aplicación de una técnica muy exigente debido a la necesidad de la separación de los marcadores ligado y libre en la mayor parte de los métodos. Los primeros instrumentos eran analizadores de lote que usaban un solo formato del ensayo homogéneo, para un número limitado de antígenos. Los sistemas actuales de alto rendimiento, totalmente automáticos, disponibles a finales de la década de 1980, pueden ser analizadores de lote u ofrecer el acceso aleatorio con calibración poco frecuente (con intervalos de semanas o de meses) derivada de un nivel alto de estabilidad del instrumento y de los reactivos. El acceso aleatorio evita la necesidad del muestreo por lotes incluso para las pruebas solicitadas con poca frecuencia y da tiempos de espera cortos. Formatos de ensayos diferentes, pero con un sistema común de medición, pueden incluirse en un solo instrumento. La sincronización exacta permite tiempos de reacción cortos sin la incubación para el equilibrio. La precisión debe ser siempre superior que la de los ensayos manuales, pero difiere considerablemente entre los diferentes tipos de instrumento. Las desventajas inherentes son la complejidad y la inflexibilidad.

Miniaturización Los desarrollos en otras disciplinas han permitido la miniaturización de los dispositivos del inmunoensayo. A la placa de

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microtitulación de 96 celdillas pueden sucederle placas de alta densidad con muchos múltiplos de este número, requiriendo sistemas especializados de manipulación del líquido para los volúmenes muy pequeños de muestra y de reactivos. De interés particular en áreas de la medicina, donde una gran cantidad de pacientes requiere series idénticas de pruebas, como en el tamizaje de fármacos o del marcador tumoral, es el desarrollo de sistemas que usen microarreglos de reactivos. Tal microarreglo consiste en microgotas discretas múltiples del reactivo impresas o formadas de otra manera en un soporte inerte (p. ej., un arreglo de puntos de 5 ⫻ 5 sobre un sustrato o chip de 1 ⫻ 1 cm, o un arreglo de 8 ⫻ 8 en cada celdilla de una placa estándar de microtitulación). Para el inmunoensayo el reactivo inmovilizado es normalmente un anticuerpo específico, y cada microgota puede ser un anticuerpo diferente, permitiendo la estimación simultánea de antígenos. La incubación con la muestra y una mezcla de los otros reactivos específicos y el resto del procedimiento del inmunoensayo, se lleva a cabo de manera normal, y la señal (con frecuencia fluorescencia o quimioluminiscencia) es detectada o registrada con un dispositivo de cámara fotográfica digital. Algunas microgotas en el arreglo pueden diseñarse para detectar interferencias en la muestra, por ejemplo, anticuerpos heterofílicos, y para garantizar el control de calidad de los reactivos, un nivel de inspección de calidad no se logra fácilmente en sistemas más simples. Estos dispositivos ofrecen ahorros sustanciales de la muestra, de los reactivos y del tiempo comparados con los sistemas automáticos convencionales. En el futuro, los microchips completamente integrados al inmunoensayo pueden llegar a estar disponibles, conteniendo estructuras microfabricadas capaces de llevar a cabo todos los pasos de la preparación de la muestra para la detección de la señal. Para una descripción de los logros en el inmunoensayo con microchip, véase Kricka y Wilding (1998), y para un estudio de la literatura sobre el desarrollo de la miniaturización en general, véase Kricka y Fortina (2001).

Cálculo de los resultados Ya que la curva de calibración para el inmunoensayo (una representación del marcador ligado contra la concentración del antígeno) no es una línea recta, ajustar una curva a los datos, con su imprecisión concomitante, es una cuestión de juicio. Varias manipulaciones empíricas se han empleado para hacer parte o la totalidad del gráfico lineal. El marcador ligado (o el porcentaje ligado si la cantidad total del marcador adicionado es conocida) en comparación con la concentración o log de concentración; el log del marcador ligado contra el log de concentración, y las gráficas logit-log se utilizan normalmente ([logit = log{(B/B0)/L ⫺ (B/B0)}], donde B0 = marcador ligado en el calibrador

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INMUNOENSAYO EN BIOQUÍMICA CLÍNICA

cero). Los papeles graficados lin-log, log-log y logit-log se encuentran disponibles. Los instrumentos modernos diseñados para el inmunoensayo tienen programas de computadora para ajustar la curva, incluyendo métodos complejos como ajustes de la curva por Spline cúbico o por log-logístico de cuatro parámetros.

Exactitud y precisión La exactitud del resultado de un ensayo es la proximidad a la concentración verdadera del antígeno; para muchas sustancias aún es tema de investigación y discusión. La precisión es la variabilidad del resultado que se obtiene, y la imprecisión se puede minimizar por el uso de reactivos apropiados, por ejemplo, un marcador con detectabilidad superior, con la reducción del número de pasos y con el control estrecho de la técnica. El control de calidad interno proporciona información sólo sobre la imprecisión. Los ensayos manuales se realizan por duplicado. La imprecisión varía con la concentración del antígeno. Un ejemplo típico se muestra en la figura 39-2.

Figura 39-2 Un perfil de precisión típico.

El rango de concentración de imprecisión baja debe, idealmente, igualar el rango sobre el cual los resultados clínicos se obtienen, y la imprecisión ser apropiada para una utilidad clínica de los resultados. Algunos trabajadores definen el rango de funcionamiento de un ensayo como aquel sobre el cual el coeficiente de variación (CV) es menor de 10%. La sensibilidad o la concentración mínima perceptible puede definirse de varias maneras, por ejemplo, como la concentración que corresponde a 2, 2.5 o 3 desviaciones estándar (SD) de la señal del calibrador cero arriba de (para los ensayos inmunométricos) o debajo (para los ensayos competitivos) del valor medio para el calibrador cero, la SD que se obtiene de, digamos, 20 réplicas del calibrador

cero en un solo lote. Esto a veces se denomina sensibilidad analítica. Más realista pueden ser el uso de SD entre lote, y el suero antígeno libre, dando el “límite biológico de detección”. Otros utilizan la concentración en la cual el CV entre lote es de 20% en las muestras biológicas, para un valor denominado “sensibilidad funcional”. Cuando el término “sensible” se utiliza en la descripción de un ensayo, implica no sólo que las concentraciones bajas del antígeno pueden distinguirse desde cero, o la ausencia del antígeno, sino también que la precisión a niveles bajos es bastante buena para los cambios pequeños en concentraciones bajas del antígeno para medirse confiablemente. Esto es en particular importante en el campo de los marcadores tumorales. Nótese que “sensibilidad” tiene significados alternativos; es también la pendiente de la curva estándar en cualquier concentración, y la sensibilidad clínica es una medida de la capacidad de una prueba para detectar la presencia de una enfermedad.

Control de calidad El control de calidad interno (CCI) proporciona información sobre la precisión dentro de y entre los ensayos, y sobre la variabilidad de la calidad del reactivo, pero no de la exactitud ni validez, o errores con, o interferencia en, las muestras individuales. El CCI requiere materiales de composición similar (antígeno y matriz) para las muestras clínicas en suficiente cantidad para el uso repetido dentro de y entre los lotes de un ensayo, o para el uso a largo plazo en un analizador automatizado. Los materiales líquidos por lo común se almacenan congelados. Los materiales comerciales de control de calidad se suministran liofilizados. Durante la liofilización (y el almacenaje subsiguiente) algunos componentes se pueden dañar, por ejemplo, los antígenos inestables o las proteínas de unión para los esteroides. Las concentraciones del antígeno elegido para los materiales del control de calidad (con valores bajos, medios y altos) deben corresponder a los puntos significativos del ensayo, como en los puntos de decisión clínicos, pero evitarse las áreas de alta imprecisión, que hagan la interpretación difícil. Con los materiales comerciales del control de calidad se consiguen los valores requeridos por el uso de suero tratado y la adición del antígeno, que pueden limitar la similitud con las muestras clínicas. Los materiales de origen humano deben utilizarse. El registro continuo de los resultados del CCI es esencial; la demostración del desempeño aceptable se requiere para la acreditación del laboratorio, y los registros pueden también ser invaluables en la localización y resolución de problemas (en el local o por el fabricante). El software del ICC se suministra en los instrumentos automatizados pero puede no ser ideal, haciendo necesaria la transferencia de

ESPECIFICIDAD, REACTIVIDAD CRUZADA E INTERFERENCIA

datos a un sistema o programa alternativo. Para las normas sobre el uso de los resultados del control de calidad, véase Westgard (2005) y Price & Newman (1997). Los esquemas externos de la garantía de calidad (EEGC) intentan aportar información sobre la comparabilidad de métodos e investigar la validez, vía recuperación del estándar agregado, linearidad en la dilución, especificidad, rendimiento con el suero bajo antígeno, interferencia y otros factores. Tales esquemas están disponibles sólo para los ensayos establecidos, y es común en los laboratorios que ensayan compuestos esotéricos, posiblemente con poca frecuencia, para cambiar muestras para la comparación y el reaseguramiento.

Especificidad, reactividad cruzada e interferencia La alta especificidad del sitio de unión de un anticuerpo para su antígeno es una ventaja principal de los inmunoensayos. Un solo epítopo en una molécula compleja puede involucrar aminoácidos espacialmente próximos sólo en la estructura terciaria o cuaternaria de la molécula, y un anticuerpo para tal epítopo, por tanto, no reacciona con las formas o los fragmentos desnaturalizados. Sin embargo, un antisuero policlonal contiene anticuerpos de afinidades y de especificidades que difieren. Si la preparación del antígeno que se utiliza para la inmunización es impura, entonces el antisuero contiene anticuerpos para las impurezas, y la falta resultante de especificidad compromete la validez del ensayo, sobre todo si el calibrante y el marcador son también impuros. La selección de los anticuerpos monoclonales puede minimizar la reactividad cruzada, pero las moléculas que se relacionan de manera estrecha pueden aun ser reconocidas por el anticuerpo, en especial en el caso de moléculas pequeñas, tales como esteroides y fármacos. La hiperespecificidad de un ensayo puede ocurrir si un anticuerpo monoclonal se dirige a un epítopo, que ocurre en algunas formas biológicamente activas de un antígeno heterogéneo. La reactividad cruzada en un ensayo competitivo se define de manera arbitraria como aquella concentración del reactivo cruzado que emite 50% de la señal encontrada en ausencia del antígeno, que se expresa como porcentaje de la concentración del antígeno que emite la misma señal. La reactividad cruzada medida varía en diferentes puntos de la curva dosis-respuesta, y también con la presencia o la ausencia del antígeno, y con el formato del ensayo y las condiciones de la reacción, como temperatura y tiempo de incubación. Es, por tanto, imposible calcular la concentración verdadera del antígeno en presencia de una reacción cruzada, aun si la reactividad cruzada se conoce. La interferencia negativa en ciertos diseños del ensayo de reactivos cruzados —en los que se incluyen varios fármacos de uso corrien-

379

te— se reconocen hoy como un problema potencial serio en la vigilancia de la digoxina (Valdes y Jortani, 2002). En ensayos inmunométricos con dos sitios es importante probar los reactivos cruzados potenciales en ausencia y en presencia del antígeno, puesto que el reactivo cruzado puede reaccionar con cualquiera de los dos o con ambos anticuerpos. La reacción de éstos dará un aumento en la señal, mientras la reacción con uno puede producir una disminución en la señal con altas concentraciones del reactivo cruzado, que se pueden detectar sólo en presencia del antígeno. La reactividad cruzada de compuestos conjugados o metabolitos con estructuras relacionadas es un problema específico con los ensayos de esteroides. En algunos casos, por ejemplo, el cortisol y la testosterona en plasma, un método directo se utiliza de rutina (aunque las limitaciones deben considerarse). En otros, con el cortisol en la orina, se requiere un paso preanalítico de extracción en algunos ensayos, pero hay casos en los cuales esto es esencial, por ejemplo, para eliminar los reactivos cruzados potenciales cuando se ensaya la 17-hidroxiprogesterona en los infantes que se sospecha un diagnóstico de hiperplasia suprarrenal congénita. La interferencia de sustancias aparentemente sin relación en muestras clínicas puede ocurrir de distintas maneras. La sustancia, mal caracterizada, denominada inmunorreactiva parecida a la digoxina, que se administra en el suero de pacientes en ciertas condiciones, sin tomar en cuenta la terapia con digoxina, da resultados falsamente altos en los ensayos con digoxina, y parece ser una reactividad cruzada fortuita. Los autoanticuerpos pueden interferir al contribuir con el antígeno del ensayo el cual in vivo es secuestrado por el autoanticuerpo y, por tanto, es biológicamente inactivo, como en el caso de la macroprolactina. De manera alterna, los autoanticuerpos pueden participar en la reacción del ensayo; el efecto sobre el resultado depende del diseño del ensayo (p. ej., antitriyodotironina y antitiroxina en los ensayos para las hormonas tiroideas libres). Para algunos antígenos, la aparición de la interferencia de los autoanticuerpos es muy frecuente para requerir el tamizaje de las muestras, por ejemplo, para el ensayo de tiroglobulina, o el reensayo después de la eliminación del autoanticuerpo, por ejemplo, la prolactina. La unión del complemento puede conducir a la destrucción del complejo antígeno-anticuerpo. Este efecto puede prevenirse con la adición de EDTA para quelar los iones del calcio. Los anticuerpos antianimal, los de suero humano para inmunoglobulinas de otras especies, por ejemplo, anticuerpos humanos antirratón (HAMA) y los heterofílicos, ahora se conoce que ocurren en una proporción alta de pacientes; los HAMA que están presentes en cantidades grandes en los pacientes proporcionan anticuerpos monoclonales para estudios por imágenes y propósitos terapéuticos. Los anticuerpos antianimal y probablemente también

380

CAP. 39

INMUNOENSAYO EN BIOQUÍMICA CLÍNICA

el factor reumatoide pueden ligar un solo anticuerpo, reduciendo su afinidad para su antígeno, o lograr el enlace cruzado de dos anticuerpos, de tal modo se imita al antígeno. Las concentraciones muy altas pueden producir interferencia negativa de una manera análoga al “efecto de gancho” por dosis alta. Estos efectos pueden bloquearse por la adición de inmunoglobulinas de la misma especie animal que los anticuerpos reactivos. Los fabricantes de equipo ahora incluyen de rutina inmunoglobulinas de ratón y de otra especie y anticuerpos bloqueadores específicos en formulaciones del reactivo con el anticuerpo. Una prueba simple para detectar la presencia de un interferente se realiza examinando la linealidad en la dilución con un diluyente de matriz similar. La falta de linealidad sugiere un problema, aunque la buena linealidad no excluye alguno. Para una revisión de todos los tipos de interferencia, véase Selby (1999).

“Efecto de gancho” por dosis alta En un ensayo inmunométrico de dos sitios con la adición simultánea de dos anticuerpos a la muestra (un ensayo de un solo paso), cuando la concentración del antígeno es muy alta y los anticuerpos no son muy superiores, la unión cruzada de los anticuerpos de captura y marcados por el antígeno decrecen, con los sitios de unión en cada anticuerpo ocupados por las moléculas separadas del antígeno. La señal que se observa, por tanto, es débil. En concentraciones extremas altas de antígeno, la señal puede caer por debajo de la del calibrador superior y un resultado falso bajo se lee (fig. 39-3). Este fenómeno se conoce como “efecto de gancho” por dosis alta, o respuesta bifásica, y es importante sólo para aquellos antígenos que ocurren clínicamente

Figura 39-3 El “efecto de gancho” por dosis alta, x = concentración del calibrador más alto; y = concentración arriba de la cual valores falsos bajos se obtienen en muestras sin diluir.

en un rango de concentración de varios órdenes de magnitud, como se observa para los marcadores tumorales como la gonadotropina coriónica humana, la ␣-fetoproteína y la prolactina. La posición de gancho depende de las concentraciones de los anticuerpos. Es difícil mantener la vigilancia constante para la presencia posible de este efecto, pero como un incorrecto (quizás en apariencia “normal”) resultado puede conducir a que se tome la acción inadecuada y posiblemente perjudicial, cada esfuerzo práctico debe realizarse. La dilución de rutina de las muestras con valores en la parte superior de la curva estándar, o aquellas con la información clínica apropiada, por ejemplo, “tumor hipofisario grande”, se utiliza a veces. Los dispositivos individuales, como aquellos para la prueba de embarazo, son también vulnerables. El “efecto de gancho” puede evitarse usando un formato de dos pasos, en el cual la muestra se incuba con el anticuerpo de captura en fase sólida, el exceso del antígeno se elimina con lavado y el anticuerpo marcado se adiciona después. En este formato, las concentraciones muy altas se leen como más “grande que el calibrador superior”, sin la indicación de cuánto más grande. Sin embargo, el paso adicional aumenta la imprecisión total del ensayo, un factor de cierta importancia para los marcadores tumorales. Los sistemas que pueden emplear una lectura cinética muy temprana en el tiempo de reacción permiten una “estimación” del resultado final, la dilución automática y el reensayo, con lo que se elimina prácticamente este problema.

Lecturas adicionales Bristow AF. Standardisation of protein hormone assays: current controversies. Proc UK National External Quality Assurance Schemes Meeting 1998; 3: 66-73. Kricka LJ. Selected strategies for improving sensitivity and reliability of immunoassays. Clin Chem 1994; 40: 347-357. Kricka LJ, Wilding P. Miniaturization of immunoassay devices. Proc UK National External Quality Assurance Schemes Meeting 1998; 3: 166-171. Kricka LJ, Fortina P. Microarray technology and applications: and all-language literature survey including books and patents. Clin Chem 2001; 47: 1479-1482. Price CP, Newman DJ (eds). Principles and Practice of Immunoassay, 2nd edn. 1997: Macmillan, London. Selby C. Interference in immunoassays. Ann Clin Biochem 1999; 36: 704-721. Stenman U-H. Immunoassay standardization: is it possible, who is responsible, who is capable? Clin Chem 2001; 47: 815-820. Valdes R, Jortani SA. Unexpected suppression of immunoassay results by cross-reactivity: now a demonstrated cause for concern (Editorial). Clin Chem 2002; 48: 405-406. Westgard JO. 2005: http://www.westgard.com Wild D (ed.). The Immunoassay Handbook, 2nd edn. 2001: Nature Publishing Group, New York.

40 Electrodos ion-selectivos Alan D Hirst

Introducción La mayor parte de las formas convencionales de medición de la bioquímica clínica se basan en la producción de un compuesto coloreado. La electroquímica difiere en que la medición está fundamentada en la generación de un voltaje (potencial) o corriente, y el sistema que la mide es un voltímetro o un amperímetro en lugar de un fotómetro. Un detector electroquímico, que responde específicamente a un analito, se llama electrodo ion-selectivo (ISE). Los primeros electrodos reaccionaron a los iones, de ahí el nombre, pero en los últimos adelantos, éstos se han desarrollado para responder a metabolitos como glucosa y urea aunque se incluyen normalmente en la misma categoría porque comparten una tecnología común. Los sensores de glucosa que se usan en áreas clínicas son con frecuencia dispositivos de ISE, y todos los analizadores de cuidado crítico se basan en la tecnología de ISE. El fundamento de función de los ISE es que ellos producen una respuesta potenciométrica (cambio de voltaje) o amperimétrica (cambio de corriente) a los cambios en el analito, es decir, existen dos tipos de electrodos primarios. Los electrodos secundarios utilizan otras características, como las enzimáticas, para alcanzar especificidad y liberar un producto que pueda detectarse con un ISE. Los electrodos se emplean en varias aplicaciones clínicas. Los que se usan con más frecuencia son para: • Iones: por ejemplo, hidrógeno (pH), sodio, potasio, cloruro, fluoruro, calcio, magnesio, litio, amonio (NH+4). • Gases: por ejemplo, oxígeno, dióxido de carbono, amoniaco (NH3).

• Electrodos secundarios o complejos: por ejemplo, glucosa, urea, lactato, creatinina. Las ventajas de los dispositivos ISE en aplicaciones clínicas consisten en que: • No son fotométricos, lo que significa que una solución óptica transparente no es necesaria, es decir la sangre completa puede usarse. • Son rápidos y directos, permitiendo la medición de la concentración verdadera o de la actividad biológica.

Teoría Una celda potenciométrica y fuentes de potenciales Cuatro elementos son requeridos para realizar una medición con un ISE potenciométrico: • Una media celda para la medición. • Una media celda de referencia. • Un puente salino o una conexión eléctrica equivalente. • Un dispositivo de medición. Una vista esquemática de este arreglo se muestra en la figura 40-1. Un electrodo funcional (celda) se compone de dos medias celdas, un electrodo medidor y un electrodo de referencia. Cada media celda produce un potencial, pero un “potencial” como tal no puede medirse de manera directa. Es la diferencia de potencial (es decir voltaje) entre las

The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker. © 2005 John Wiley & Sons, Ltd.

382

CAP. 40

ELECTRODOS ION-SELECTIVOS

Milivoltímetro

Electrodo medidor

Electrodo de referencia

V

Puente salino

Solución de referencia

Figura 40-1 Un electrodo simple consistente en una media celda para la medición y una media celda de referencia conectadas por un puente salino.

Solución para la medición

Media celda de referencia

Media celda para la medición

dos medias celdas lo que produce una señal mensurable. La media celda de referencia debe diseñarse para tener un potencial constante, mientras el electrodo medidor tiene un potencial, el cual varía con la concentración de la sustancia que es medida, y así la diferencia de potencial, o el voltaje, varía en una forma reproducible con la concentración de la sustancia. Medición y medias celdas de referencia (que dan lugar a potenciales del electrodo) El potencial de cada media celda se produce a partir de una separación de la carga creada por la migración de iones como sigue. En la superficie del electrodo, o en cualquier unión, líquido o sólido, habrá una tendencia para que los iones pasen de una fase a otra, por ejemplo, esto es, en la superficie del electrodo los iones viajan desde el electrodo, dentro de la solución. Si éstos son iones de hidrógeno, por ejemplo, para un electrodo de pH, y entran en la solución sin un ion con la carga negativa correspondiente, una separación de la carga se crea, con una solución más cargada positivamente (con iones hidrógeno) y un electrodo con más carga negativa (con electrones). A medida que este proceso continúa, el incremento de la separación de la carga produce un aumento en el potencial entre el electrodo y la solución, el cual se opone a la migración iónica adicional, hasta que se alcance un equilibrio, en el cual no hay otro movimiento neto de iones. Este proceso se ilustra con un electrodo de zinc en la figura 40-2.

Figura 40-2 Una media celda de zinc que consiste en un electrodo del metal zinc en contacto con una solución de sulfato de zinc; los iones zinc emigran desde el electrodo dentro de la solución, dejan una pequeña carga negativa sobre el electrodo y producen una solución con carga más positiva.

Si el electrodo permanece en contacto con una solución de concentración iónica baja, se crea una salida grande de iones desde el electrodo, antes que se alcance el equilibrio, y un potencial grande se establece. De manera inversa, una solución concentrada tiende a oponerse a la migración iónica desde el electrodo y produce un potencial más bajo. En otras palabras, el potencial que se produce varía inversamente con la concentración de iones en la solución.

383

TEORÍA

El electrodo de referencia trabaja de la misma forma que el electrodo medidor, pero está en contacto con una solución de concentración constante y debe tener un potencial constante. Puente salino (dando lugar a un potencial de unión) Para poder medir la diferencia de potencial entre dos medias celdas allí debe existir un circuito eléctrico, y un contacto eléctrico entre la solución del electrodo de referencia y la del electrodo medidor. Esto es normal que ocurra por contacto directo o con un “puente salino”, como se muestra en la figura 40-1. Existe migración iónica entre las soluciones en contacto, similar a la migración iónica entre electrodos y soluciones. Si los aniones y cationes en una de las soluciones son de diferentes tamaños, emigrarán a diferentes tasas, como se muestra en la figura 40-3, y esto también produce una se-

Los electrodos descritos hasta ahora son sistemas simples, sin el elemento de selectividad, y de resistencia baja, y son la base de la batería común. Para los propósitos de medición, una membrana selectiva necesita introducirse. Un sistema de trabajo típico se muestra en la figura 40-4. Cuando el electrodo está rodeado por una membrana selectiva —cristal en este ejemplo— existe una separación de carga adicional en la superficie de la membrana. Este es el “potencial de membrana” que se describe con más detalle en la siguiente sección. Potenciales circulantes El movimiento en una de las soluciones, por ejemplo, que se inicia con un mezclador mecánico o con un analizador de flujo continuo, puede también producir un potencial circulante. La mayor parte de los instrumentos toma lecturas estáticas para evitar esta fuente de error. Sistema medidor

Figura 40-3 Ilustración del potencial de unión. La solución 1 es una sal que consiste de un ion de metal relativamente pequeño (M) y un anión grande (X). En la unión líquida, el ion de metal más pequeño se difunde dentro de la otra solución (NY) a una tasa mayor que el anión, causando una separación de la carga, el potencial de unión.

paración de la carga, que crea un potencial que se opondrá a la separación adicional de la carga. Todos los sistemas del electrodo tienen uniones líquidas y, por tanto, potenciales de unión. Una de las características principales del diseño de un electrodo de referencia es reducir al mínimo el tamaño y la variabilidad del potencial de unión. Por esta razón, el electrodo de referencia de “calomel” es el más común (cloruro mercúrico). Éste utiliza cloruro de potasio saturado como solución del electrodo de referencia, porque los iones de potasio y los de cloruro tienen un tamaño iónico similar y emigran a una tasa similar. Sin embargo, esto no elimina por completo el potencial de unión, porque la solución desconocida que está en contacto contiene una composición variable.

La diferencia de potencial se mide con un milivoltímetro, como se muestra en la figura 40-4. Los voltajes típicos medidos son de 59 mV para cada cambio de decena (diez veces) en la concentración para un ion monovalente como hidrógeno y sodio, y 29.5 mV para un ion bivalente como calcio. Un error de medición de 1 mV, a partir de cualquier fuente (p. ej., potencial de unión), produce un error de lectura de 4% para un ion monovalente y de 8% para uno bivalente. Esto significa que se requieren milivoltímetros sensibles estables para la medición. El circuito debe permitir una corriente mínima, porque una corriente grande perturba el equilibrio iónico en las superficies del electrodo. Las membranas del electrodo deben ser teóricamente capaces de conductancia eléctrica, pero en la práctica tienen una resistencia muy alta, del orden de 109 ohmios. De manera similar, el milivoltímetro debe derivar una corriente mínima a partir del circuito que tiene una resistencia de entrada muy alta. Esto requiere el diseño especial del voltímetro, y uno estándar no es el adecuado. Es innecesario mencionar que en un sistema tal, el cual requiere resistencia eléctrica alta y una corriente insignificante para funcionar, la limpieza es muy importante, y necesitan sellarse y aislarse cuidadosamente para dar resultados reproducibles. Calibración Para realizar mediciones útiles con un sistema de funcionamiento del electrodo, como se muestra en la figura 40-4, éste debe calibrarse primero. La respuesta de un sistema

384

CAP. 40

ELECTRODOS ION-SELECTIVOS

V Electrodo de referencia

Calomel (Hg2Cl2)

Electrodo medidor (pH)

Platino Ácido clorhídrico

Figura 40-4 Típico sistema de funcionamiento del electrodo, consiste de un electrodo de pH de vidrio y de uno de referencia de calomel (cloruro mercurioso), ambos sumergidos en una solución cuyo pH es medido. El tapón de cerámica poroso forma el puente salino y controla la pérdida de la solución interna del electrodo de referencia.

Cloruro de potasio saturado (KCl)

Membrana de vidrio

Tapón de cerámica poroso

Solución desconocida

del electrodo es una respuesta logarítmica inversa definida por la ecuación de Nernst: EMF (voltaje) = Ereferencia – Edesconocido (Areferencia) = RT loge (A nF desconocida) donde A = actividad, R = la constante del gas, T = temperatura absoluta, n = carga de la valencia y F = constante de Faraday. Puede verse, a partir de ésta, que hay una relación logarítmica inversa compleja entre la concentración (estrictamente, la “actividad”) de un ion y el voltaje que produce un electrodo. Esto significa que la calibración del sistema y la producción de una lectura no es algo fácil, como lo es, por ejemplo, para un sistema colorimétrico de glucosa sanguínea. La aproximación por lo general es medir la “pendiente” logarítmica del electrodo, y también el voltaje a dos concentraciones. Idealmente éste debe ser de 59 mV para un cambio de diez veces en la concentración. Sin embargo, es raro que los electrodos sean ideales, y la señal se deteriora con el tiempo, así que la pendiente necesita comprobarse regularmente.

Especificidad: cómo los electrodos se hacen selectivos Formas de lograr especificidad (¿cómo mide lo que se necesita?) En los electrodos simples, la especificidad para un ion particular es determinada por una membrana selectiva que

rodea al electrodo, la que actúa por intercambio iónico selectivo, por ejemplo, el electrodo de pH tiene una membrana de cristal, que actúa como intercambiador de ion hidrógeno. El cristal es un enrejado cristalino de silicona complejo, que contiene los iones cargados (sodio para el cristal de sosa). En la superficie hay una capa hidratada muy delgada donde estos iones pueden intercambiarse por los iones en el líquido en contacto (fig. 40-5). El intercambio iónico entre la membrana y el líquido sólo ocurre con la condición de que el tamaño físico del ion y su carga electrostática sean compatibles con la estructura del enrejado cristalino, pero cuando las membranas llegan a ser más complejas otros factores tienen una parte más importante. Con el cristal estándar de silicato de sodio, se favorece el intercambio del ion hidrógeno, pero un “error alcalino” ocurre debido a interferencia de los iones de sodio en pH alcalino. En las condiciones de pH alcalino, cuando la concentración del ion hidrógeno llega a ser muy baja, la contribución relativa a la respuesta del electrodo a partir de los iones sodio llega a ser más significativa hasta que excede la respuesta del ion hidrógeno. Esto se conoce como el “error álcali”. Al variar la composición del cristal se pueden exagerar estos efectos, de modo que el cristal se convierta en un electrodo diferente. Las variaciones comunes en la estructura del cristal se muestran en la figura 40-6. En la práctica, ningún electrodo es absolutamente específico para un solo ion, y la preferencia que demuestra por un ion en particular se llama “selectividad”. En este ejemplo, en el pH neutral/ácido el electrodo de cristal es un electrodo de ion hidrógeno con una alta selectividad para los iones hidrógeno sobre los de sodio, pero en un pH alcalino tiene características inversas. El primer objetivo del

ESPECIFICIDAD: CÓMO LOS ELECTRODOS SE HACEN SELECTIVOS

385

Figura 40-5 Un electrodo de pH opera sobre el principio del intercambio del ion hidrógeno en ambos lados de la membrana. No hay transferencia de iones hidrógeno a través de la membrana —se establece un equilibrio— aunque en teoría debe existir conducción electrónica para que el electrodo forme parte de un circuito de medición. La membrana tiene en la práctica una resistencia de 109 ohmios y una corriente insignificante.

a) Sílice puro

Si(iv)

O

b) Sílice + metal álcali

Si(iv)

O

c) Sílice + alúmina

R(III)

O

Si(iv)

Selectivo pa otros catione

Zr (iv)

O

Si(iv)

Selectivo pa iones divalen

d) Sílice + tierra rara

Si(iv)

Selectivo para H+

Figura 40-6 Diferentes tipos de vidrio que se usan para los electrodos.

diseño de la membrana es maximizar la selectividad para evitar interferencia de otros iones similares. En el caso de haluros, por ejemplo en el cloruro, esto puede alcanzarse fácilmente si se usa una membrana cristalina de cloruro de plata, en la cual sólo un ion cloruro puede alojarse con facilidad en el enrejado cristalino. Problemas más difíciles se presentan al intentar medir el calcio en presencia de magnesio y viceversa (ambos están presentes en concentraciones sanguíneas similares), ya que los dos tienen un tamaño similar. Aún más difícil es el diseño de un electrodo para detectar el litio sanguíneo en una concentración de 1 mmol/L contra un fondo de 140 mmol/L del sodio.

Alterando la composición del cristal, se producen electrodos para que respondan al sodio y al potasio. El mejor electrodo de sodio tiene una selectividad para sodio sobre potasio de 100:1, y esto es clínicamente útil para los fluidos biológicos con concentraciones de sodio altas y de potasio bajas. Sin embargo, el electrodo de cristal de potasio tiene una mejor selectividad para el potasio sobre el sodio de 20:1, que no es ideal para uso en sangre, donde la concentración normal de sodio es alrededor de 30 veces la concentración de potasio. Para estos usos, se necesitan membranas más selectivas. Membranas selectivas a los iones La paradoja al desarrollar membranas selectivas a los iones ocurre porque la membrana debe ser impermeable al agua, de modo que haya una conducción eléctrica insignificante, lo cual evita el corto circuito en el electrodo, pero los iones por su naturaleza tienen una preferencia por las soluciones en agua. La membrana necesita tener un componente por el cual el ion tenga una preferencia equivalente, o por atracción electrostática, como en el caso del intercambio iónico, o por sustitución de la capa de hidratación (aportada por el solvente agua), como en el caso de portadores neutros. Las células vivas utilizan con frecuencia tales portadores para transportar iones y nutrientes flotantes a través de las membranas celulares, que por lo general son barreras hidrofóbicas, y esto ha generado los modelos para el diseño de las membranas ISE. Para tener una membrana funcional que utilice un intercambiador iónico o un portador neutro, ésta necesita un apoyo inerte, que debe ser capaz de contener y retener al

386

CAP. 40

ELECTRODOS ION-SELECTIVOS

Ionóforo O

Alquil

O

O

P Alquil

O

O Alquil P

O

Ca

O

O Alquil

Alquil fosfato Mediador C8 H17 O

O P

C8 H17

C6 H5

di-n-octilfenil fosfonato

Figura 40-7 Portador de calcio.

portador iónico; esto normalmente significa atrapar el solvente en el cual el portador se disuelve. En el caso de los sensores de calcio se ha encontrado que los materiales de intercambio iónico se unen al calcio con una alta selectividad (fig. 40-7). El electrodo consiste de una sal de calcio de un alquil fosfato disuelto en di-noctofenil fosfonato, un solvente que no es volátil e insoluble en agua. Esto se mezcla con PVC disuelto en un solvente volátil, y se vierte sobre una superficie plana, lo que permite al solvente volátil evaporarse. Esto deja una capa fina de PVC en el intercambiador de calcio atrapado dentro de él.

En un electrodo ideal, el portador es en su totalidad insoluble en agua, pero en la práctica es lixiviado a distancia de manera gradual, conduciendo a una pérdida gradual de la respuesta del electrodo, porque las membranas del electrodo tienen que cambiarse con regularidad. Los portadores neutros son una alternativa al intercambio iónico, y el más utilizado es la valinomicina para los electrodos de potasio. Los compuestos éteres corona son estructuras anilladas que contienen varios átomos de oxígeno que pueden imitar la capa de hidratación de un átomo, como se muestra en la figura 40-8. La valinomicina (fig. 40-9) es un compuesto similar a un anillo grande complejo que contiene seis átomos de oxígeno dentro de su estructura; puede también acomplejar al potasio, es decir, el ion intercambia su capa de hidratación acuosa por la valinomicina y emigra de una solución acuosa a una membrana hidrofóbica. Una de las ventajas de los portadores neutros es que tienden a ser menos solubles en agua que los intercambiadores iónicos, que deben tener necesariamente solubilidad leve. Producen membranas, las cuales tienen una vida más larga. Se han desarrollado portadores neutros para varios iones, incluso de sodio, cloruro, calcio, magnesio, litio, amoniaco (fig. 40-10) y carbonato (fig. 40-11). La explicación precedente está relacionada con los electrodos potenciométricos, los cuales se utilizan en la ilustración porque incluyen todos los problemas relacionados con la electroquímica.

Reacciones electroquímicas La descripción de potencial del electrodo mencionada antes es una simplificación de la situación real para ayudar Capa Ion potasio de hidratación interna

H H

O

O H

O

H O

K

+

H

O

H O

O O

H

H

K+

H

H

O

H

H

O

H

O

H O

H

H

O

H

H

O

H

H

O O

H

O O

H

Capa de hidratación externa

H

H

Figura 40-8 a) Un ejemplo de un compuesto éter corona (diciclohexil-18-corona-6) que actúa como capa sustituta de hidratación para un ion como el de potasio, y es capaz de transportarlo a través de una membrana hidrofóbica. b) Un ion potasio en la solución rodeado por una capa de hidratación interna, una de hidratación externa y una de hidratación externa de moléculas de agua.

387

REACCIONES ELECTROQUÍMICAS

H3 C

0

H

0 H N

0

H C

0

3) 2

CH

N

)2

0

3

(CH

(C

CH

)2 H3 (C H C

( CH

0

)2

3

0

0

0 NH

(CH3)2 HC

CH (CH3)2

(C CH H 3) 2

3

C H N H

N H

0

0

CH (CH3)2

0

0

C H3

0

0

0

N H 0

0

CH

)2 H3

(C

Figura 40-9 Estructura de la valinomicina.

Figura 40-10 Un grupo de compuestos ETH usados como ionóforos sobre ISE.

388

CAP. 40

ELECTRODOS ION-SELECTIVOS

OH R

C

H

R

CF3

.. ..

C

CF3

OH

H

p-Decil-,,-trifluoroacetofenona

Electrodos amperométricos

−O

OH

R

C

CF3

C=O

−O

OH

2

−

H R

cas puede ampliarse para incluir otras reacciones químicas, que no ocurren de repente pero se originan por un potencial aplicado. Esto abre la posibilidad del análisis de sustancias que no existen necesariamente como iones en solución sino que dan lugar a una reacción electroquímica en circunstancias convenientes.

C

CF3

C=O

H

Hay otra clase de electrodos, llamados amperométricos porque producen una corriente en lugar de un voltaje. Este tipo de electrodo se diseña para medir una reacción electroquímica —una reacción química que produce o consume electrones— midiendo una corriente eléctrica en vez de medir el voltaje producido por una separación de carga. El más común de éstos, en uso clínico, es el electrodo de oxígeno (pO2). En el caso del electrodo de oxígeno la reacción es: O2  2H2O  2e

H2O2  2OH

Para el electrodo de peróxido relacionado, la reacción es: H2O2

Figura 40-11 Ionóforos usados en un electrodo de carbonato.

a ilustrar cómo funciona el electrodo. Lo que en realidad sucede en la superficie del electrodo es una reacción electroquímica que produce una especie cargada antes de la separación de la carga, por ejemplo: Zn

0.7 V

Zn  2e

En un material que conduce como un electrodo de metal, la estructura del electrón es similar a un “mar” en el cual los electrones están libres para moverse a través del sólido. Las energías de los electrones se llenan a un nivel, llamado de Fermi. En la solución existe una situación diferente. Los iones están rodeados por una capa de hidratación (fig. 40-8), que los separa con eficacia de otros iones, y los electrones se restringen a diferentes bandas de energía (más bajas). Al instante el electrodo entra en contacto con la solución, la diferencia en niveles de energía favorece un flujo de electrones para igualar la energía y un equilibrio se alcanza rápidamente al estado de energía libre más bajo (conocido como el nivel de energía libre de Gibbs). Ésta es la base del potencial del electrodo. Esta reacción electroquímica ocurre de manera espontánea debido a la propiedad del material del electrodo, que es capaz de perder un electrón y formar un ion, así que el uso principal de estos electrodos (potenciométricos) es la medición iónica. El concepto de reacciones electroquími-

0.7 V

2H  O2  2e

La primera reacción se utiliza en el electrodo estándar de oxígeno (pO2) (electrodo de Clarke), mientras el segundo se emplea en algunos electrodos de glucosa, como se describe más adelante, para medir el peróxido producido por la enzima glucosa oxidasa. Puede observarse a partir de estas reacciones electroquímicas que las reacciones son facilitadas por un voltaje aplicado (0.7 V) y éste puede adicionarse a la especificidad de la respuesta del electrodo. La característica principal de estos electrodos es que un voltaje constante se aplica a los electrodos medidores, y la corriente resultante (en microamperios) es proporcional a la cinética de la reacción. Esta es una relación lineal directa, en contraste con la respuesta logarítmica inversa compleja de los electrodos potenciométricos. Ya que se está midiendo la corriente, estos electrodos (p. ej., un electrodo pO2) no necesitan uno de referencia. Sin embargo, la reacción y la corriente también se relacionan con el área superficial del electrodo. Polarografía Es una aplicación de la electroquímica. El voltaje aplicado es polarizante, y la celda electroquímica una celda polarográfica. Para conseguir una medición del analito involucrado o, por ejemplo, del pO2 (la presión parcial del oxígeno no es en sentido estricto “concentración”, pero es equivalente en

ELECTRODOS DE GLUCOSA

389

términos gaseosos), la cinética de reacción debe ser constante y, por tanto, el pO2 también. Un requerimiento clave de este tipo de sistema es que el electrodo no debe consumir el oxígeno en su superficie a una tasa más rápida de lo que el oxígeno puede difundirse a través de la solución del electrodo hacia la superficie de éste, de otra forma la corriente declina cuando el pO2 en contacto con ésta falla. Para mantener un estado constante que permita la medición, las celdas que se miden deben diseñarse de modo que el electrodo en el cual la reacción ocurre sea muy pequeño (p. ej., la punta de una aguja), para consumir una cantidad mínima del analito en la medición. Esto significa que un sistema típico producirá sólo una corriente de proporciones en microamperios, que requiere un amperímetro diseñado específicamente para tal medición. Electrodo de oxígeno Para tener un electrodo funcional, los electrodos en los cuales la reacción electroquímica tiene lugar deben estar en contacto con una solución constante —con una resistencia constante— de modo que no ocurra ninguna variación en la resistencia, lo cual afecta el voltaje aplicado y entonces la corriente producida. El electrodo de oxígeno de Clarke consiste de electrodos en contacto con una solución electrolítica, la cual está contenida por una membrana de caucho de silicona. El oxígeno gaseoso puede pasar libremente a través de la membrana, pero ésta es hidrófoba y no permite que el agua o electrólitos disueltos pasen de un lado a otro y cambien la composición y resistencia de la solución electrolítica. Esto se muestra en la figura 40-12.

Electrodos de glucosa Los electrodos de glucosa emplean una combinación de una enzima y de un voltaje de polarización específicos para generar una respuesta específica para la glucosa. En la actualidad existen dos diferentes enzimas y tres reacciones de transferencia electrónica distintas en uso común. La forma más simple de formar un electrodo de glucosa es utilizar la enzima glucosa oxidasa junto con un electrodo de oxígeno. La glucosa oxidasa cataliza la reacción: glucosa  O2  2H2O

ácido glucónico  H2O2

El electrodo de oxígeno puede medir la caída dentro del pO2 como una medición de la glucosa consumida en la reacción. Desafortunadamente, si la celda está abierta a la atmósfera, se llena de oxígeno atmosférico, y también hay problemas si se utiliza sangre entera, por los efectos que se crean por la unión del oxígeno con la hemoglobina.

Figura 40-12 Un electrodo de oxígeno de Clarke. Éste consiste en un cátodo de platino de área muy pequeña rodeado por un ánodo anular de plata. Ambos están en contacto con un amortiguador interno incluido dentro de una membrana hidrofóbica de caucho de silicona. El oxígeno puede difundirse libremente a través de la membrana y disolverse en el amortiguador interno. Se mide la reacción electroquímica resultante en el cátodo de platino.

Debido a estos problemas, se han desarrollado mejores aplicaciones: • El electrodo glucosa oxidasa/peróxido. Éste se utiliza para detectar el peróxido producido por la reacción, con un potencial aplicado de +0.7 V. • El electrodo glucosa oxidasa/ferroceno. Este electrodo utiliza ferroceno como agente de transferencia electrónica en la reacción electroquímica siguiente: Glucosa gluconolactona glucosa oxidasa   ferricinio ferroceno (Fe2)

80 mv e−  ferricinio (Fe3)

Ésta es la base del ensayo de la cinta de glucosa de Medisense®, y se ilustra en la figura 40-13. • El electrodo de glucosa deshidrogenasa/ferricianuro. Este electrodo funciona de una manera similar, pero con una enzima diferente y un agente de transferencia electrónica: Glucosa glucosa deshidrogenasa ácido glucurónico + + Fe(CN)46− Fe(CN) 36−

80 mv e− + Fe(CN)36−

Esta es la base del ensayo de la cinta de glucosa de Boehringer Mannheim Corporation (BMC) Advantage®.

390

CAP. 40

ELECTRODOS ION-SELECTIVOS

Figura 40-13 Ejemplo de un electrodo de glucosa en estado líquido, sistema Medisense®. Este sistema tiene tres contactos: un electrodo común central, uno en contacto con el ferroceno solamente (para las reacciones no específicas) y otro en contacto con la glucosa oxidasa más ferroceno. La diferencia en las dos señales proporciona una medición de la concentración de glucosa.

Interferencia del fármaco Los tres tipos de electrodo de glucosa descritos antes son de uso común y, en general, aparatos de medición eficaces, pero varias sustancias, incluyendo medicamentos comunes como el paracetamol, pueden interferir y dar una señal con estos sistemas. Esto ocurre porque casi todos los compuestos pueden producir una reacción electroquímica, dando un voltaje polarizante bastante elevado, y esta reacción involucra la mayor parte de los fármacos. Con base en esto los fármacos terapéuticos y muchos otros compuestos biológicos pueden medirse con cromatografía usando una celda polarográfica como detector electroquímico.

Detectores electroquímicos Estos detectores son el resultado de un desarrollo del electrodo polarográfico, para empleo como detectores en cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Una aplicación típica de estos detectores en el laboratorio mide las catecolaminas (adrenalina, noradrenalina) para la detección del feocromocitoma. La reacción electroquímica se muestra en la figura 40-14. Los electrodos descritos funcionan en condiciones estables, por ejemplo, están en contacto con una solución constante. En un sistema cromatográfico, la selectividad se obtiene con la separación cromatográfica (es decir, física)

HO

O

R + 0.5 V

HO

R + 2H+ + 2e

O

Adrenalina

Figura 40-14 Reacción electroquímica por catecolaminas.

de compuestos similares, por ejemplo, adrenalina y noradrenalina (en comparación con el uso de una membrana selectiva), pero los sistemas solventes que se emplean para la separación son variables, así que la resistencia de la solución en la celda de medición es variable, y eso afecta el voltaje aplicado. Para superar este problema, se utiliza un tercer electrodo en la celda de medición HPLC, que tiene la función de supervisar el voltaje aplicado y mantenerlo en un valor constante a través de un circuito de retroalimentación.

Electrodos complejos Éstos consisten de un electrodo dentro de otro, el ejemplo más común es el electrodo pCO2 (dióxido de carbono) encontrado en todos los analizadores de gases sanguíneos.

391

OTROS ELECTRODOS COMPLEJOS MEDIADOS POR LAS ENZIMAS

Electrodo pCO2

Otros electrodos complejos mediados por las enzimas

Este electrodo consiste de un electrodo de pH estándar en contacto con un amortiguador débil de bicarbonato y encajonado en una membrana de cloruro de polivinilo (PVC); se muestra en la figura 40-15.

Electrodo de lactato Éste es de uso general en unidades de cuidado crítico, y por atletas para comprobar el estado anaeróbico después del ejercicio. Funciona de la misma forma que uno de glucosa (por lo común es un electrodo de glucosa modificado) empleando un enzima lactato oxidasa diferente: Lactato + O2 + H2O

piruvato + H2O2

El peróxido formado es medido con un electrodo de peróxido. Electrodo de urea (Roche Diagnostics) Éste es más complejo y utiliza la enzima ureasa; descompone la urea para formar dióxido de carbono y amoniaco; el último se convierte en iones amonio, que entonces se detectan con un electrodo de amonio:

Urea  H2O Figura 40-15 Un electrodo pCO2 que consiste en uno de pH y uno de referencia plata/cloruro de plata interno. El CO2 se difunde a través del PVC y cambia el pH del amortiguador interno.

La membrana de PVC es permeable a los gases, por ejemplo, dióxido de carbono, pero impermeable al agua. El dióxido de carbono se difunde a través de la membrana y se disuelve en el amortiguador cambiando el equilibrio del amortiguador de bicarbonato. CO2  H2O

H2CO3

CO2  H2O  2NH3  H2O

H  HCO3  NH 4  OH

Al contrario del electrodo de amoniaco, el de amonio tiene escasa selectividad, pero se utiliza porque la enzima ureasa puede trabajar sólo a un pH bajo, en el cual el amoniaco se convierte en iones amonio. El electrodo de amonio sufre la interferencia del potasio, así que se emplea en serie con uno de potasio compensador. Esto se muestra en la figura 40-16.

HCO3  H

Al efectuarse lo anterior el pH del amortiguador cambia, y se mide con el electrodo de pH. Los electrodos de amoniaco se hacen de la misma manera, con un electrodo de pH sumergido en un amortiguador. Las diferencias consisten en que el amortiguador que se crea es diferente: NH3  H2O

Ureasa

 NH 4  OH

y la membrana contiene el portador neutro nonactina (véase fig. 40-10f) para ayudar en la transferencia del amoniaco.

Señal amplificada

Muestra

Electrodo de referencia

Urea

NH4 Electrodos

K

Figura 40-16 Diagrama esquemático de los principios analíticos de un sensor potenciométrico para la medición de la urea.

392

CAP. 40

ELECTRODOS ION-SELECTIVOS

Electrodo de creatinina (Nova Biomedical, UK) Éste usa una serie compleja de enzimas: Creatinina + H2O Creatina + H2O

creatinina amidohidrolasa

creatinina amidohidrolasa

sarcosina + O2 + H2O

sarcosina oxidasa

creatina sarcosina + urea formaldehído + glicina + H2O2

El peróxido se mide con un electrodo de peróxido.

Comprobación en los puntos de cuidado (POCT) Los electrodos selectivos a los iones (ISE) son muy utilizados en instrumentos POCT, sobre todo porque emplean sangre completa, en lugar de suero, y pueden producir un resultado en menos de un minuto.

Figura 40-17 Un glucómetro Roche Advantage®.

Analizadores de cuidado crítico Glucómetros Éstos son empleados por enfermeras y médicos y por muchos pacientes. Son baratos (~ 20 dólares) y fáciles de utilizar. Los principios de los componentes del ISE de tales sensores son descritos en la página 389. La figura 40-17 muestra un glucómetro típico (Roche Instruments plc) y la cinta de medición. La última está disponible.

Éstos son instrumentos más complejos, usados en casi todas las unidades de cuidados criticos, por ejemplo, salas de traumatismos y urgencias, unidades de cuidado intensivo/ terapia, de cuidado especial del bebé, de cuidado coronario, y áreas de recepción. Contienen una serie de electrodos y de otros sensores, normalmente en grupos, como se muestra en la figura 40-18.

Amplificador

Electrólito de referencia (KCl)

Indicador

Electrodo de referencia Na, pH, K , Ca, Li , Mg , CI-

Electrodo de Calomel Electrodos Unión líquida Muestra

Figura 40-18 Una serie de electrodos como se utiliza en un analizador típico para el cuidado crítico.

Capilar selectivo de cristal de sodio/H

Membrana ion selectiva

Tierra (GND) de la cámara de medición

393

RESPALDO

• Gases sanguíneos: pH, pO2, pa CO2. Este grupo mide el estado ácido-base de la sangre como un índice de función renal y respiratoria.

mittee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) como estándar NCCLS-POCT-IA.

• Iones: sodio, potasio, cloruro, calcio y magnesio. Este grupo se usa en las unidades de cuidado crítico para la valoración de condiciones como volumen del fluido corporal y la función renal y cardiaca.

Política

• Metabolitos: glucosa, urea, creatinina, lactato. Este grupo se usa para la valoración de condiciones como función renal y hepática. • Co-oximetría: hemoglobina, oxihemoglobina, carboxihemoglobina. Estos componentes se miden usando espectrofotometría en lugar de los ISE. Se combina con otras pruebas porque proporcionan información adicional, en particular sobre la respiración.

Respaldo Conexión de la red Los instrumentos en el lugar de cuidado producen resultados que afectan de manera directa el tratamiento del paciente. Los primeros instrumentos eran independientes, y todo el mantenimiento de registros, manual e inconsistente. Esto se identificó como un problema de control de riesgo mayor, y condujo a una nueva generación de instrumentos, que pueden conectarse vía una red a un controlador central de los datos. Esto tiene varias ventajas: • Los datos se recolectan y almacenan centralmente. Esto incluye los resultados de la prueba, la identificación del paciente y del operador, y la fecha/hora, es decir un rastreo completo de auditoría. • La identificación del operador puede controlarse de modo que sólo los entrenados utilicen los instrumentos. • El funcionamiento del instrumento puede supervisarse centralmente. Es importante que los instrumentos de cuidado crítico sean siempre operacionales. El control de la red permite aportar a los laboratorios apoyos las 24 h para estos analizadores. Uno de los primeros problemas con el control de la red fue que las compañías estaban utilizando diferentes sistemas de comunicación, los cuales eran incompatibles. Este problema fue resuelto cuando las compañías de diagnóstico formaron CIC (Communications Industry Consortium) para resolver el problema. El CIC produjo un grupo de estándares de comunicaciones, que adoptó el National Com-

Una de las principales aplicaciones de ISE es la comprobación en los puntos de cuidado (POCT), donde las pruebas serán hechas por enfermeras y médicos sin el entrenamiento de laboratorio formal. Como existen numerosos problemas que pueden ocurrir con las mediciones ISE, debe haber respaldos incorporados en todo el proceso (no sólo en el sistema de medición) para que esta aplicación sea aceptable, y deben elaborarse por completo dentro de una política del hospital sobre POCT. Sin este respaldo, se coloca en riesgo a los pacientes y la institución tiene un problema de control de riesgos. La entrada de datos principal del laboratorio es la producción de la especificación que el instrumento debe satisfacer (es decir, el desempeño del instrumento). La especificación debe tratar problemas como selectividad de los electrodos. Por fortuna, la tecnología moderna permite elaborar resguardos convenientes, como se perfila más adelante. Verificación del instrumento Los instrumentos modernos son operados por computadoras, que verifican el desempeño del electrodo sobre funciones como señal del electrodo (p. ej., pendiente: mV/ decada) y el tiempo de reacción, y otras verificaciones como temperatura, burbujas de aire, fugas de la membrana, etc. Para un laboratorio apoyado en instrumentos, donde el personal debe entender las características del electrodo, es aceptable tener un alto nivel de facilidad en su manejo para producir mediciones en una situación de urgencia. Para las aplicaciones de POCT, si una respuesta del electrodo cae fuera de los límites especificados, la prueba debe desactivarse hasta que el problema esté resuelto. Existen otras funciones útiles, que están permitidas con un instrumento controlado por computadora: • Identificación del operador. El entrenamiento es una característica importante de POCT, y una función operatoria sólo debe ejecutarse por el personal entrenado y autorizado para operar el instrumento. • Interrupción remota. Esta es una instalación en la que el instrumento está conectado con la computadora del laboratorio, que monitorea el requerimiento del control de calidad del instrumento, y lo bloquea si el CC no cumple los límites predefinidos. La computadora del laboratorio entonces alerta al personal del laboratorio sobre el problema.

394

CAP. 40

ELECTRODOS ION-SELECTIVOS

• Control de calidad (CC) y aseguramiento de la calidad (AC). El control de calidad es la verificación, en tiempo real, del instrumento. Esto implica analizar el material de composición conocido y verificar que los resultados que se obtienen estén dentro de los límites clínicos significativos, según lo definan los organismos profesionales (como los organismos nacionales del aseguramiento de la calidad). El control de calidad lo deben realizar regularmente los operadores (p. ej., enfermeras y médicos) que efectúan las pruebas, y una parte esencial de su entrenamiento se centra en la importancia de realizar el control de calidad, registrando los resultados, y qué acción tomar si la verificación de control de calidad falla. Este entrenamiento deben enseñarlo profesionales laboratoristas experimentados. Para asegurar la calidad se realiza un examen retrospectivo del desempeño del instrumento, el cual se hace con frecuencia como parte de un esquema externo del AC. La agencia británica de acreditación del laboratorio, CPA(UK) Ltd, requiere que los laboratorios participen en un esquema reconocido de CC y mantengan un funcionamiento adecuado. Si los instrumentos de POCT están bajo el control del laboratorio principal, la acreditación del laboratorio se aplica al servicio de POCT, a condición de que se opere en un estándar aceptable. Este acercamiento se recomienda como la mejor manera de aportar calidad al cuidado del paciente con un riesgo mínimo. • Mantenimiento. Las verificaciones de mantenimiento están normalmente planeadas como mantenimiento preventivo, por ejemplo, el reemplazo de la tubería, sello, electrodos, etc. Estas pruebas las realizan mejor los profesionales laboratoristas experimentados, pero si las hace personal no laboratorista, el entrenamiento riguroso sobre la importancia de las verificaciones es vital. • Entrenamiento. El entrenamiento de todos los usuarios es una característica esencial de una política POCT del hospital. Para los instrumentos modernos, el entrenamiento no requiere ser de gran profundidad o consumi-

dor de tiempo, con la condición de que los resguardos adecuados se hayan realizado sobre el instrumento. El entrenamiento debe incluir no sólo la operación del instrumento, sino una comprensión de todas las señales de error, la importancia de los resultados, y la importancia de registrar resultados y los procedimientos del CC.

Reconocimientos Quiero agradecer a Roche Diagnostics por su ayuda con el suministro de un número de diagramas, y en particular a Christoph Ritter, de Nova Biomedical UK, por la información sobre los electrodos, y a Andrew St John por permitirme el uso de varios diagramas. Muchas gracias también a Janet Gourlay por toda la mecanografía y la preparación.

Lecturas adicionales Hirst AD, Stevens JF. Electrodes in clinical chemistry. Ann Clin Biochem 1985; 22: 460-488. Crompton RG, Sanders GHW. Electrode Potentials. Oxford University Press, Oxford. Ed Van Ysek P. Modern Techniques in Electroanalysis. 1996: Wiley, Chichester. Accreditation and point of care testing. Ann Clin Biochem David Burnett 2000; 37: 241-243. Price CP, Hick JM (eds.). Point of care testing. 1999: AACC (www.aaccdirect.org). Kost GJ (ed.). Principles and Practice of Point of Care Testing. 2002; Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelpphia, PA. Management and use of IVD point of care test devices. MDA Device Bull 2002; 3. (www.medical-devices.gov.UK). Annexe D of ISO 15189—Medical Laboratories. Particular requirements for quality and competence. ISO (International Standards Organization), Geneva (Annexe D, wich relates to quality management of point of care testing, is under discussion at the time of going to press, but should be agreed by the time of publication). Structures of ionophores. Fluka catalogue. 2003: Sigma- Aldrich Company Ltd (www.sigma–aldrich.com).

41 Absorción de la luz, dispersión y técnicas de luminiscencia en bioquímica clínica rutinaria Bernard F Rocks

Introducción Algunos de los constituyentes químicos de la sangre, plasma u orina pueden medirse en forma directa. Los químicos analíticos, sin embargo, han desarrollado medios indirectos para detectar y medir de manera cuantitativa muchos de los componentes de interés clínico. El método implica con frecuencia añadir a la muestra diluida una sustancia (el reactivo) que químicamente reaccione en forma específica con el componente particular que se quiere cuantificar (el analito), para formar un producto que pueda medirse con relativa facilidad. Siempre que sea posible, las condiciones del ensayo producen un producto cuya cantidad es proporcional a la concentración original del analito. Cuando la luz incide en la materia de cualquier tipo, la interacción puede cambiar la intensidad, dirección, longitud de onda o la fase de la luz incidente. La absorción, dispersión y luminiscencia de la luz son tres de los muchos efectos ópticos que se han explotado con más frecuencia con propósitos analíticos. La mayor parte de las mediciones cuantitativas hechas en laboratorios de bioquímica clínica se fundamentan en la elaboración de productos de reacción teñidos, así que es muy frecuente que se utilicen dispositivos fotoeléctricos de absorbancia como colorímetros o espectrofotómetros. Otros métodos de amplio uso basados en la medición de la luz incluyen la turbidimetría, nefelometría, fluorimetría y la medición de la quimioluminiscencia. Las características esenciales de estas técnicas se discuten en este capítulo.

Técnicas de absorción de la luz La fotometría de absorción es la base de la mayor parte de los análisis cuantitativos realizados en laboratorios de bioquímica clínica. Las razones primarias para emplear esta técnica son la facilidad de la medición, la exactitud y la precisión satisfactorias, y la instrumentación, la cual es estable, confiable y relativamente económica. Fotómetros y espectrofotómetros Los absorciómetros pueden dividirse en dos tipos básicos: instrumento de haz sencillo y de haz doble. En cada tipo, aunque las trayectorias de la luz son diferentes, muchos de los componentes básicos son similares. Un fotómetro simple de una viga se ilustra en la figura 41-1. Los bioquímicos clínicos se refieren con frecuencia a este tipo de fotómetro como colorímetro. La fuente de luz provee energía radiante sobre las longitudes de onda de interés. Para trabajar en el rango visible, ahora es común utilizar las lámparas de tungsteno-cuarzohalógeno. Estas lámparas también se utilizan para las mediciones cercanas del infrarrojo y ultravioleta (340 a 800 nm). Para el trabajo en longitudes de onda UV más cortas, es común que se utilice una lámpara de descarga de deuterio. Por abajo de 360 nm estas fuentes aportan una continuidad intensa que, junto con las cubetas de sílice fundido, satisface casi todas las necesidades en la región UV. El suministro de energía a la lámpara debe ser de alta estabilidad.

The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker. © 2005 John Wiley & Sons, Ltd.

396

CAP. 41

ABSORCIÓN DE LA LUZ, DISPERSIÓN Y TÉCNICAS DE LUMINISCENCIA EN BIOQUÍMICA CLÍNICA RUTINARIA

Figura 41-1 Componentes básicos de un fotómetro.

La longitud de onda apropiada para el ensayo particular se selecciona con filtros de interferencia de amplitud de banda estrecha y de alta transmitancia. Los filtros de interferencia son costosos y algunos colorímetros económicos utilizan filtros de cristal coloreado o gelatina teñida (intercalada entre las capas del cristal). Los espectrofotómetros generan luz monocromática por medio de un prisma o de un monocromador de rejilla, más bien que por medio de filtros. La cubeta es un recipiente transparente que contiene la solución que se prevé medir. El diseño de la cubeta y los medios de administrar la muestra y posteriormente eliminarla varían con el tipo de instrumento y de analizador. La solución de la muestra, que contiene la cubeta, absorbe una cantidad proporcional de la radiación incidente; el resto se transmite a un detector de luz, donde se genera una señal eléctrica. Muchos tipos de fotodetectores diferentes se emplean en la actualidad. Ahora, con frecuencia se utilizan varios fotodiodos en estado sólido y series de diodos en instrumentos de luz visible y cerca del infrarrojo. Estos detectores son resistentes, baratos y tienen una respuesta lineal sobre varias decenas de intensidad de luz. Sin embargo, dan una respuesta inferior a la luz UV. Donde se requiere sensibilidad alta, y para trabajar con UV, se utilizan tubos fotomultiplicadores de vacío. La salida del detector puede necesitar amplificarse y que se exprese como su logaritmo para que sea relacionada linealmente con la concentración. Ambas operaciones se realizan por medio de un amplificador logarítmico. La señal, después de algunas transformaciones necesarias (a menudo de analógicas a digitales), puede exhibirse en el aparato, imprimirse o almacenarse. Instrumentos de haz sencillo En los instrumentos de haz sencillo un blanco (p. ej., una cubeta que contiene agua) se utiliza para fijar a cero, entonces los estándares y las muestras son leídas. Interferencias por variaciones en la turbiedad de la muestra y los cambios de intensidad de la fuente y otras fluctuaciones del instrumento no se compensan de manera automática. En algunos

diseños modernos, un segundo detector se emplea para monitorear la intensidad de la fuente de luz y compensar electrónicamente la desviación de la lámpara. Los instrumentos de haz sencillo están bien adaptados para las mediciones cuantitativas de absorción en una sola longitud de onda. El fácil mantenimiento y bajo costo son ventajas distintivas de este tipo de fotómetro, que se encuentra en la mayor parte de los analizadores automáticos de la química clínica. Espectrofotómetros de haz doble Un instrumento de haz doble tiene dos trayectorias de luz, ambas se originan a partir de la misma fuente. Un haz pasa a través de la cubeta de la muestra y el otro por la cubeta del blanco o de referencia. Esto normalmente se consigue dirigiendo el haz de luz desde el monocromador hacia un espejo que rota muy rápido o hacia un interruptor que dirige la luz de manera alterna hacia la cubeta de referencia y a la cubeta de la muestra. La luz que emerge de cada cubeta se refleja hacia el detector. La salida del detector es, por tanto, una señal que se alterna con una amplitud proporcional al cociente de las intensidades del haz de la muestra y del haz de referencia. Las señales eléctricas que se producen se procesan electrónicamente para dar la absorbancia en un dispositivo de lectura. Sistemas de haz doble automáticos corrigen los cambios en la intensidad de la luz a partir de la fuente lumínica, fluctuaciones electrónicas en el instrumento y absorción por el blanco. Un instrumento de esta clase se consigue con frecuencia con un monocromador impulsado por motor, de modo que la exploración y la grabación automáticas de un espectro completo sean posibles. Esto permite su uso para el análisis cualitativo (p. ej., identificación del fármaco) y el cuantitativo. Ley de Beer La base matemática para las mediciones cuantitativas se basa en la derivación experimental de la relación Beer-

TURBIDIMETRÍA Y NEFELOMETRÍA

Lambert. La ley de Lambert indica que la proporción de energía radiante absorbida por una sustancia es independiente de la intensidad de la radiación incidente. La ley de Beer indica que la absorción de energía radiante es proporcional al número de moléculas en la trayectoria de la luz. No es posible medir de forma directa la cantidad de radiación absorbida por una sustancia y es normal que se determine midiendo el cociente de radiación incidente que cae sobre la muestra, I0, y la radiación transmitida, que al final emerge de la muestra, I. Usando estas mediciones, la ley de Beer-Lambert se puede expresar como: Log10(I0/I ) ⫽ ecI donde c es la concentración de la sustancia en moles/litro, I es la longitud de la trayectoria óptica en centímetros y e es el coeficiente de absorción molar para la sustancia, expresado en litros/mol/centímetro. Los valores para I y I0 no pueden medirse en términos absolutos y las mediciones se hacen de una forma más conveniente expresando I como un porcentaje de I0. Este valor se conoce como transmitancia porcentual T, y da una relación lineal con la concentración si el logaritmo de su recíproco se utiliza. Esta función logarítmica recíproca de I y de I0, se conoce como absorbancia (A): %T ⫽ (I/I0) ⫻ 100 A ⫽ log10(100/T) ⫽ ⫺ log10 (I0/I) La absorbancia es un parámetro más conveniente puesto que, a partir de la ley de Beer, es directamente proporcional a la concentración de las especies absorbentes. Los espectrofotómetros son por lo común lineales sobre el rango 0 a 2 Å, y los cromóforos pueden medirse en concentraciones tan bajas como 10-6 mol/L. Los valores de la prueba se calculan comparando las lecturas de absorbancia de las muestras de la prueba con las que se obtienen ensayando una serie de estándares o calibradores de valores conocidos.

Aplicaciones En la mayor parte de las determinaciones realizadas en laboratorios de bioquímica clínica se confía en métodos fotométricos. Un laboratorio típico de hospital provee información de casi 5 000 análisis fotométricos/día y puede incluir la medición de algunos de los analitos siguientes: albúmina, bilirrubina, calcio, colesterol, creatinina, glucosa, hierro, fosfato, proteína total, urea, ácido úrico y muchas enzimas, por ejemplo, fosfatasa ácida, fosfatasa alcalina, alanina transaminasa, creatina cinasa y lactato deshidrogenasa.

397

Turbidimetría y nefelometría Estas técnicas relacionadas se emplean mucho en los laboratorios clínicos como los medios de conducir ciertos inmunoensayos. Ambas se basan sobre la medición de la dispersión de la luz inducida por partículas. Cuando la luz se dirige a través de una solución que contiene partículas suspendidas, parte de la luz se dispersa, otra se absorbe y el resto se transmite a través del líquido. Esta interacción puede utilizarse para medir la concentración de partículas en la suspensión por la medición de la luz transmitida (turbidimetría) o midiendo la luz dispersada (nefelometría). La dispersión de la luz implica una interacción directa entre la luz y la partícula que golpea. Cuando un haz de luz golpea una partícula, su campo eléctrico mueve los electrones de la partícula en una dirección próxima al núcleo. Los electrones se mueven hacia adelante y en reversa en fase con la frecuencia de la onda de la luz incidente. Esto produce un dipolo oscilante, cuyo tamaño depende de la fuerza del campo eléctrico (relacionado con la frecuencia) y de la polaridad de los electrones de la partícula. El dipolo oscilante se convierte en una fuente de radiación electromagnética e irradia luz, de la misma frecuencia que la luz incidente pero en todas direcciones. La cantidad y distribución de la luz dispersada también depende del tamaño y de la concentración de la partícula, y de la polarización del haz de luz. Para las partículas más pequeñas que un décimo de la longitud de onda de la luz incidente, las ondas de luz reirradiadas están en fase y se refuerzan una con otra, produciendo un simétrico, aunque no esférico, patrón de luz dispersa. Esto se llama dispersión de Rayleigh. Partículas más grandes (p. ej., complejos inmunoglobulina-antígeno) actúan como fuentes del punto aleatoriamente espaciadas, y la interferencia destructiva entre la luz que emerge de diversos sitios dentro de la partícula ocurre, creando un patrón máximo y mínimo de la luz reirradiada. Se conoce como la dispersión de Rayleigh-Debye y, junto con la dispersión de Rayleigh, se ilustra en la figura 41-2. Entre más luz se dispersa hacia adelante el tamaño de la partícula se incrementa, y la medición de la dispersión de luz asimétrica se puede utilizar para medir el tamaño de la partícula. La luz de longitud de onda corta (azul) se esparce mucho más que la luz de longitud de onda más grande (rojo).

Aplicaciones Los inmunoensayos que implican sistemas de detección nefelométricos o turbidimétricos, o ambos, se utilizan para medir ciertos analitos para los cuales ningún reactivo colorimétrico específico esté disponible, por ejemplo, proteína C reactiva (CRP), componentes C3 y C4 del complemento,

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ABSORCIÓN DE LA LUZ, DISPERSIÓN Y TÉCNICAS DE LUMINISCENCIA EN BIOQUÍMICA CLÍNICA RUTINARIA

e inmunoglobulinas individuales. Se mezclan la solución de la proteína y el anticuerpo apropiado y se dejan que reaccionen para formar complejos grandes que dispersan más luz que un anticuerpo o la proteína. La sensibilidad está por lo común dentro del rango bajo mg/L. La dispersión grande de luz que se produce cuando el cloruro de cetilpiridinio se agrega a la orina que contiene mucopolisacáridos es un ejemplo de un uso no inmunológico de la turbidimetría. Turbidímetros

Figura 41-2 Patrones de la distribución angular bidimensionales para: a) Dispersión de luz Rayleigh a partir de una partícula pequeña. b) Dispersión de luz Rayleigh-Debye a partir de una partícula más grande, inmunoglobulina-antígeno.

En teoría, la turbidimetría puede medirse por cualquier fotómetro o espectrofotómetro estándar. Debido a que un pequeño cambio en la luz transmitida se mide en presencia de una señal grande del fondo, los instrumentos con un cociente señal:ruido alto son deseables. Un turbidímetro especializado simple consiste en una fuente de luz halógena de cuarzo, un filtro de interferencia de banda estrecha, una pinza de sujeción para la cubeta de la muestra y un fotodiodo o un fotomultiplicador (fig. 41-3) de la cubeta de la muestra. El uso de la luz de longitud de onda corta ofrece la ventaja del incremento de la dispersión y por tanto de una señal más grande, pero en soluciones biológicas la absorción de luz también aumentará. Consecuentemente la formación del complejo antígeno-anticuerpo por lo general se mide en el rango 340 a 400 nm. Para una buena medición es necesario una sincronización, la adición, el mezclado y

Figura 41-3 Componentes básicos de un turbidímetro, que mide la luz transmitida, y un nefelómetro que mide la dispersión de luz.

LUMINISCENCIA

la lectura del reactivo. Cuando el tamaño de la partícula aumenta de manera lenta con el tiempo, la tasa de disminución en la luz transmitida se calcula de mejor manera a partir de mediciones multipuntuales. Los analizadores fotométricos discrecionales automatizados son utilizados de manera extensa por inmunoensayos turbidimétricos. Nefelómetros Los nefelómetros comprenden una fuente de luz, un filtro de la luz incidente, un dispositivo de sujeción de la muestra y un detector en ángulo fijo, para evitar la transmisión directa de la luz. Con tal de que los filtros (o los monocromadores) para las luces incidente y emitida se fijen a la misma longitud de onda, pueden usarse fluorómetros en los cuales la luz dispersa se mide a 90°, aunque con sensibilidad limitada. La dispersión de luz medida a 90° es más débil que la dispersión de luz hacia adelante. En teoría, la mejor sensibilidad se obtiene colocando el ángulo del detector tan cerca a 180° como sea posible. Esto requiere un haz de luz incidente enfocado firmemente y una óptica excelente. En la práctica, los nefelómetros clínicos emplean ángulos del detector entre 90° y 170° al eje de la luz del incidente (véase fig. 41-3). Las mediciones nefelométricas en ángulos, excepto el de 90° para la luz incidente se mejoran a partir de cubetas de perfil redondo que sustituyen a las de perfil cuadrado. A estos ángulos del detector, las cubetas redondas reducen al mínimo la reflexión de la luz medida por las paredes de la cubeta. Los nefelómetros con frecuencia se ajustan con un filtro de corte para evitar que la luz fluorescente alcance el detector. Un bulbo de halógeno-cuarzo-tungsteno, se utiliza con frecuencia. Las fuentes alternativas incluyen lámparas de xenón y de arco de mercurio, diodos que emiten luz y láseres. El láser de helio-neón es en especial útil para la nefelometría porque tiene un haz estrecho de alta intensidad, que no requiere enfocarse o una óptica para enfocar. Desafortunadamente, la luz roja de longitud de onda larga (632.8 nm), no se dispersa tanto como la luz de longitud de onda corta. El detector debe blindarse de forma correcta para reducir al mínimo la interferencia a partir de la desviación de la luz. Para la sensibilidad máxima, los nefelómetros especializados emplean detectores fotomultiplicadores de bajo ruido. La longitud de onda para la dispersión óptima por complejos anticuerpo-antígeno en su totalidad formados se acerca a 460 nm. Sin embargo, en inmunoensayos cinéticos se ha demostrado que la longitud de onda óptima cambia mientras los complejos inmunitarios se elevan. Para estos ensayos, muy utilizados, la luz monocromática es indeseable y la luz incidente sobre una banda amplia (entre 450 y 550 nm) aporta tasas máximas más reproducibles.

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El equipo Beckman Immage® es un ejemplo bien establecido de un nefelómetro del laboratorio clínico. La dilución automática de la muestra, la adición del antisuero y la verificación del exceso de antígeno son algunas de las características de este tipo de analizador especializado. La diferenciación electrónica de la señal de luz se utiliza para identificar y registrar la tasa máxima de reacción y, a través de una curva de calibración almacenada, para relacionarla con la concentración. ¿Nefelometría o turbidimetría? En general, la nefelometría tiene el potencial para ser ligeramente más sensible y proporciona resultados más rápidos que la turbidimetría. Ésta, por otra parte, no requiere un detector especial y puede realizarse en muchos de los analizadores clínicos automáticos disponibles en la actualidad que emplean la medición fotométrica.

Luminiscencia La luminiscencia es la emisión de luz o energía radiante que surge cuando un electrón vuelve desde un nivel de energía excitado o más alto a un nivel de energía más bajo. Existen varios tipos de fenómenos luminiscentes, que incluyen la fluorescencia, la fosforescencia y la quimioluminiscencia. Aunque los fenómenos luminiscentes se diferencian en cómo un electrón es activado al estado excitado, producen emisiones similares de energía radiante. Fluorescencia Cuando la luz choca con una sustancia molecular, bastante energía a una longitud de onda específica puede absorberse y ocasionar que la sustancia altere su configuración electrónica colocando algunos de los electrones en un estado excitado. Esta condición es de breve duración y los electrones excitados vuelven rápido al estado fundamental. Si la sustancia es de una estructura química particular, la transición puede ser un proceso multietapa, en cuya etapa principal libera luz emitida con una energía más baja que la luz de excitación. Los otros pasos en la transición al estado fundamental son sobre todo la pérdida de energía vibratoria, debido a las colisiones del electrón. La luz emitida que se produce cuando la sustancia pasa de un estado excitado al estado fundamental se llama fluorescencia. Muchas moléculas muestran fluorescencia (fluoróforos) que proporciona la base de un método sensible de cuantificación. La mayor parte de los compuestos que exhiben fluorescencia contienen por lo general sistemas de unión

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ABSORCIÓN DE LA LUZ, DISPERSIÓN Y TÉCNICAS DE LUMINISCENCIA EN BIOQUÍMICA CLÍNICA RUTINARIA

múltiple conjugado con electrones π sin localización relacionados. Casi todos los fluoróforos que despiden luz fluorescente intensa tienen estructuras planares rígidas y grupos donadores de electrones. Para soluciones diluidas, la intensidad de la fluorescencia es directamente proporcional a la concentración del fluoróforo. Los máximos de longitud de onda de la absorción y de la emisión son también útiles en la identificación de sustancias. La diferencia entre los máximos de la longitud de onda de excitación y de la emisión es conocida como el cambio de Stokes, y la eficiencia del “quanto” es una medida de la cantidad de luz emitida. Si el cambio de Stokes es grande, es más fácil medir la luz emitida sin interferencia de la luz incidente. También, si la eficiencia del quanto es alta, la señal es más fuerte y el ensayo más sensible. El análisis sanguíneo y de orina para porfirinas es un buen ejemplo del uso cualitativo y cuantitativo de la fluorescencia. Fluorescencia en comparación con fotometría Las mediciones de la fluorescencia son más sensibles que las mediciones de la absorbancia y de la dispersión de la luz. La magnitud de la absorbancia de un cromóforo en la solución es determinada por su concentración y la longitud de la trayectoria de la cubeta. La magnitud de intensidad de la fluorescencia de un fluoróforo es determinada por su concentración,

la longitud de la trayectoria y la intensidad de la fuente de luz. Para las soluciones diluidas, la intensidad de la fluorescencia es directamente proporcional a la concentración del fluoróforo. Con el uso de fuentes de luz más intensas, de técnicas de filtración de la señal digital y de fotómetros de emisión sensible, la sensibilidad de las mediciones de la fluorescencia puede ser 100 a 1 000 veces más grande que la sensibilidad de las mediciones de la absorbancia. Aplicaciones de fluorescencia Los ensayos que emplean técnicas de medición fluorescente se utilizan de rutina en el laboratorio clínico para determinar porfirinas, fármacos, hormonas, proteínas específicas y anticuerpos, y para la fenotipificación celular. Los métodos usados incluyen la medición directa de la luz emitida y una variedad de inmunoensayos que usan técnicas como polarización fluorescente, fluorescencia de tiempo resuelto, fluorescencia/citometría de flujo inducida por láser y, en los laboratorios de serología, la microscopia fluorescente. Fluorómetros La figura 41-4 ilustra el arreglo óptico en un fluorómetro simple. La longitud de onda de excitación apropiada se fil-

Figura 41-4 Componentes básicos de un fluorómetro

LUMINISCENCIA

tra desde la fuente y se dirige dentro de la solución contenida en la cubeta. La luz fluorescente resultante se emite en todas las direcciones, pero es importante monitorear la luz que emerge perpendicular al haz incidente, la parte sin absorber que pasa a través de la cubeta y entra a una trampa de luz. La emisión de la longitud de onda se selecciona a partir de luz emitida o secundaria y el haz se dirige hacia el detector, por lo común un fotomultiplicador. La salida de éste se amplifica y procesa tanto como se necesite. Si el aumento del amplificador y la fuente de excitación son constantes, la lectura de la señal fluorescente se relaciona de manera lineal con la concentración. Un espectrofluorómetro emplea monocromadores en vez de filtros para la selección de la longitud de onda. Los fluorómetros de primera generación empleaban con frecuencia lámparas de vapor de mercurio. Estas lámparas tienen su salida concentrada dentro de una cantidad relativamente pequeña de bandas finas muy definidas que limitan la selección de la longitud de onda de excitación. Una fuente de alta intensidad con un espectro casi continuo es el arco de xenón. Sin embargo, esta fuente genera ozono y funciona con una temperatura muy elevada. La mayor parte de los fluorómetros dirigidos al mercado clínico usan una lámpara de halógeno-tungsteno o, para mayor sensibilidad, un tubo de destello de xenón que proyecta rápidamente. Espectrofluorómetros de doble haz. En estos instrumentos, el haz de luz de la fuente se divide y se reparte entre la cubeta de la muestra y una de referencia. La fluorescencia que se produce en cada cubeta es monitoreada por un tubo fotomultiplicador simple colocado eléctricamente en fase con el interruptor. La señal de la diferencia permite la sustracción de la fluorescencia producida en la cubeta de referencia y también compensa la desviación y el parpadeo de la lámpara. Analizadores de polarización fluorescente. Estos instrumentos son básicamente fluorómetros de filtro a los cuales se ha incorporado un grupo de polarizadores de luz de excitación y de emisión. La intensidad de la fluorescencia se mide tanto en paralelo como perpendicular al plano del haz de excitación. El grado de despolarización fluorescente depende de la rotación molecular, que se relaciona con el tamaño molecular. Esta técnica se ha aplicado a los inmunoensayos homogéneos (sin separación). En estas aplicaciones, por lo común se realiza un inmunoensayo de unión competitiva en el cual un antígeno y uno marcado con fluoresceína compiten por los sitios de unión sobre un anticuerpo. El acoplamiento del marcador fluorescente al anticuerpo grande, que rota de manera lenta, ocasiona que la luz fluorescente siga con una polarización muy alta. Y

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en sentido inverso, el antígeno no unido marcado con fluoresceína está libre para rotar más rápido y producir fluorescencia despolarizada. Algunos fluorómetros clínicos de este tipo están especializados para medir sólo una especie fluorescente. Por ejemplo, el sistema del analizador Abbott TDx® usa reactivos de inmunoensayo marcados con fluoresceína de manera exclusiva. Debido a que la fluoresceína se absorbe en la región visible, una fuente de luz halógena de tungsteno puede usarse. Comparado con otras técnicas fluorimétricas, la sensibilidad es baja y es aplicable sólo al ensayo de moléculas pequeñas. El analizador de polarización TDx® es relativamente simple de operar y es muy útil para el monitoreo del fármaco terapéutico. Fluorómetros de tiempo resuelto. Un problema encontrado con frecuencia en los inmunoensayos fundamentados en la fluorescencia (en particular en los ensayos homogéneos) es la alta fluorescencia de fondo causada por algunos de los componentes en las muestras sanguíneas (p. ej., proteínas, bilirrubina y NADH del suero). El uso de mediciones de tiempo resuelto y marcadores con tiempos largos de decaimiento de la fluorescencia (> 500 ns) han mejorado esta limitación. Cuando se emplea esta técnica, la fluorescencia del analito se monitorea sólo después que la de fondo ha declinado. Los sistemas automatizados que usan quelatos de lantánido con una muy elevada fluorescencia están disponibles en el comercio para una amplia gama de inmunoensayos. En el sistema Perkin-Elmer AutoDELFIA®, la medición se realiza con un fluorómetro de tiempo resuelto que, por los quelatos de europio, suministra 1 000 pulsos de luz/segundo. El detector se enciende por 400 microsegundos (µs) después de cada emisión de pulso y recolecta la luz emitida, a 613 nm, por 400 µs (fig. 41-5). Son posibles límites de detección tan bajos como 10-14 mol/L de quelatos de lantánido.

Quimioluminiscencia La quimioluminiscencia difiere de la fluorescencia en que la excitación es causada por una reacción química o electroquímica y no por fotoiluminación. El evento físico de la emisión de luz es similar a la fluorescencia, en que ocurre de un estado singlete excitado, y la luz se emite cuando el electrón vuelve al estado fundamental. La quimioluminiscencia implica normalmente la oxidación de un compuesto orgánico, como luminol, ésteres de acridinio o luciferina, por un oxidante (p. ej., peróxido de hidrógeno, hipoclorito u oxígeno); la luz la emite el producto excitado que se forma en la reacción de oxidación. Estas reacciones se realizan por lo regular en presencia de catalizadores como

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ABSORCIÓN DE LA LUZ, DISPERSIÓN Y TÉCNICAS DE LUMINISCENCIA EN BIOQUÍMICA CLÍNICA RUTINARIA

en inmunoensayos ahora domina este sector importante del mercado de diagnóstico global. Los ejemplos de las técnicas quimioluminiscentes específicas disponibles en el comercio se describen en seguida. Los inmunoensayos quimioluminiscentes son muy utilizados para medir hormonas, proteínas específicas y ciertos fármacos. Para una explicación de inmunoensayos, véase el capítulo 39. Quimioluminiscencia directa. Los ésteres de acridinio son marcadores quimioluminiscentes que pueden unirse de forma directa a los antígenos o a los anticuerpos e incorporarse en diversas estrategias con inmunoensayos. En la etapa de generación de la señal del ensayo, el enlace del éster se rompe bajo condiciones alcalinas para liberar la N-metilacridona, compuesto inestable, que se descompone con la emisión de un flash de la luz. La intensidad máxima ocurre 0.4 seg después de la iniciación, y el periodo del decaimiento a 0.9 seg. Éste es el principio que se emplea en los sistemas Bayer ACS180® y Centaur®.

Figura 41-5 Principio de la fluorometría de tiempo resuelto. El tiempo de declinación largo del marcador es medido después de que la fluorescencia de fondo se extingue.

enzimas (p. ej., fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano), iones metálicos o complejos metálicos. Luminómetros Ya que los inmunoensayos quimioluminiscentes dependen del uso de compuestos luminiscentes que emiten la luz durante el curso de una reacción química, no hay necesidad de una fuente de luz incidente. La única señal que emana de las moléculas luminiscentes y, por tanto, debido a la proporción alta de señal de ruido, estos ensayos son en potencia muy sensibles. En principio, la instrumentación es relativamente simple, consistiendo en una cubeta para la reacción y un dispositivo sensible que mide la luz contenida en un compartimiento hermético a la luz. Aplicación de la quimioluminiscencia La naturaleza de la emisión de luz de ensayos quimioluminiscentes exige adiciones del reactivo exactas y sincronizadas y procedimientos de mezclado muy reproducibles. Por tanto, su uso, por lo menos en el laboratorio rutinario, se confina para utilizarlo en analizadores de inmunoensayos automáticos especializados. Su uso como marcadores

Quimioluminiscencia realzada. La adición de ciertos productos químicos puede aumentar mucho la salida de la luz, por ejemplo, la peroxidasa de rábano, en presencia del peróxido de hidrógeno, causa la oxidación del luminol con la emisión de luz. La salida de la luz se aumenta más de 1 000 veces en presencia de fenoles y de naftoles sustituidos. La luminiscencia realzada es un resplandor más bien que un flash de la luz y persiste por horas, aunque la lectura de la señal ocurre después de algunos minutos. Este tipo de generación de señal se explota en el sistema de inmunodiagnóstico Vitros ECi® (Ortho-Clinical Diagnostics). Inmunoensayos enzimáticos quimioluminiscentes. Existen sustratos que dan lugar a límites luminiscentes para todos los marcadores enzimáticos de uso general, por ejemplo, el adamantil 1,2-dioxetano arilfosfato se utiliza con la fosfatasa alcalina como marcador. La separación del enlace del grupo fosfato produce un anión inestable que se descompone con la emisión de luz, por ejemplo, como se utiliza en el analizador DPC Immulite®. Electroquimioluminiscencia. La electroquimioluminiscencia difiere de la quimioluminiscencia convencional en que las especies reactivas que producen las reacciones quimioluminiscentes se generan de manera electroquímica a partir de precursores estables en la superficie de un electrodo. Los procesos electroquimioluminiscentes se han demostrado en muchas moléculas diferentes por diversos mecanismos, incluyendo una reacción tipo oxidorreducción con rutenio (Ru2+), tris(bipiridil) y tripropilamina. Este principio se emplea en los analizadores Roche Elecsys® y E-170®. Cuando se aplica un potencial eléctrico, el marcador de rutenio se oxida y de forma simultánea la tripropilamina es también oxidada a un catión inestable que pierde de

LECTURAS ADICIONALES

manera espontánea un protón. El radical de tripropilamina resultante reacciona con el rutenio oxidado, produciendo un marcador de rutenio excitado que declina con la emisión de un fotón. La emisión de luz subsiguiente se mide entonces con un fotomultiplicador y se procesa como apropiado para la cuantificación.

403

Lecturas adicionales Skoog DA, Holler FJ, Nieman TA. Principles of Instrumental Analysis. 1997: Thomson Learning, Philadelphia, PA. Wild DG (ed.). The Immunoassay Handbook, 2nd edn. 2001: Stockton Press, New York.

42 Espectrometría atómica analítica Andrew Taylor

Introducción La espectrometría atómica analítica es el término que se emplea para incluir un número de técnicas que se aplican de manera extensa para la determinación de elementos individuales en los líquidos y tejidos corporales. Las más importantes son la espectrometría de absorción atómica y la de masas por plasma inductivamente acoplado, que con la de emisión atómica, la de fluorescencia atómica y la de fluorescencia de rayos X también tienen papeles útiles. Se aplican sobre todo en la medición de minerales esenciales y oligoelementos, por ejemplo, sodio, magnesio, zinc y cobre, y en sustancias tóxicas como aluminio y plomo. Estas técnicas consideran las mediciones exactas de concentraciones muy bajas en muestras biológicas complejas.

Principios La espectroscopia es el estudio de las interacciones entre la radiación de la materia y la electromagnética; cuando se aplica al análisis cuantitativo, se utiliza el término espectrometría. Diferentes tipos de espectrometría conciernen a varias regiones del espectro electromagnético (p. ej., rayos X, luz UV, radiación infrarroja), las propiedades de la materia con las cuales las interacciones suceden (vibración molecular, transiciones del electrón) y las interacciones físicas implicadas (es decir, dispersión, absorción o emisión de radiación). Las técnicas espectrométricas atómicas analíticas cuantitativas incluyen la espectrometría de absorción atómica (AAS), de emisión atómica (AES), de fluorescencia atómica (AFS), de masas inorgánicas y la fluorescencia de rayos

X (XRF). Las AAS, AES y AFS explotan las interacciones entre la luz UV y la visible y los electrones de la capa exterior de átomos libres, gaseosos y no cargados. En la XRF, partículas de alta energía colisionan con los electrones de la capa exterior de los átomos para iniciar las transiciones que culminan en la emisión de los fotones de rayos X. En la espectrometría de masa (MS) inorgánica, un campo magnético separa los átomos ionizados del analito de acuerdo a su masa: proporción de la carga. Emisión, absorción y fluorescencia atómica Cada elemento tiene una estructura atómica característica, con un núcleo con carga positiva rodeado por el número de electrones necesario para mantener una neutralidad. Estos electrones ocupan niveles de energía discreta, pero es posible para un electrón moverse de un nivel a otro, dentro del átomo, por la introducción de energía (figs. 42-1, 42-2 y 42-3). Esta energía puede suministrarse durante colisiones con otros átomos o con electrones libres, o como fotones a partir de la luz. Tales transiciones ocurren sólo si la energía disponible es igual a la diferencia entre los dos niveles (⌬E). Los átomos no cargados pueden existir en el nivel de energía más bajo, o estado basal, o en cualquiera de una serie de estados excitados dependiendo de cuántos electrones se mueven a niveles de energía más altos, aunque es normal considerar sólo la primera transición. Los niveles de energía y las ⌬E relacionadas con las transiciones del electrón son únicas en cada elemento. La ⌬E para los movimientos de los electrones de la capa exterior en la mayor parte de los elementos corresponde a la energía equivalente a la radiación UV visible y son es-

The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker. © 2005 John Wiley & Sons, Ltd.

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CAP. 42

ESPECTROMETRÍA ATÓMICA ANALÍTICA

tas transiciones las que se utilizan en la espectrometría de AA, AE, y AF. La energía (E) de un fotón se caracteriza por: E = hv

(1)

donde h = constante de Planck y v = frecuencia de la forma de onda correspondiente a ese fotón (el concepto dual de la luz como la forma de onda y partículas discretas no se considera más aquí). Además, la frecuencia y la longitud de onda están relacionadas, ya que: v = c␭

(2)

donde c = velocidad de la luz y ␭ = longitud de onda. Por tanto: E = hc / ␭

(3)

donde se deduce que una transición específica, ⌬E, se relaciona con una longitud de onda única. Bajo las condiciones apropiadas, los electrones de la capa exterior de los átomos del estado basal, vaporizados dentro del sistema analítico pueden excitarse por energía térmica (es decir, colisiones con otros átomos). Como estos átomos regresan al estado basal más estable, la energía se pierde, parte de ella en forma de luz emitida, la cual puede medirse con un detector (fig. 42-1). La intensidad de esta

Figura 42-1 Diagrama parcial del nivel de energía mostrando la emisión de energía como luz cuando los átomos descienden desde un nivel excitado hacia el estado basal.

luz es proporcional al número de átomos presentes, y el proceso es una espectrometría de emisión atómica (AES). Cuando la luz (energía radiante) de una longitud de onda característica entra en un sistema analítico, los electrones de la capa exterior de los átomos que están dentro de la trayectoria de la luz se excitan cuando la energía se absorbe (fig. 42-2). Por consecuencia, la cantidad de luz transmitida por el sistema desde una fuente hacia el detec-

Figura 42-2 Diagrama parcial del nivel de energía mostrando la absorción de la energía de luz cuando los átomos se mueven desde el estado basal hacia un nivel excitado. La luz transmitida hacia el detector se ha atenuado.

tor se atenúa. La pérdida de luz es proporcional al número de átomos y se entiende como espectrometría de absorción atómica (AAS). Parte de la energía radiante que absorben los átomos del estado basal puede emitirse como luz cuando los átomos retornan al estado basal. Esta emisión se describe como fluorescencia de resonancia y, de nuevo, su intensidad es proporcional al número de átomos que están en la trayectoria de la luz. La técnica se conoce como espectrometría de fluorescencia atómica (fig. 42-3).

Figura 42-3 Diagrama parcial del nivel de energía mostrando la absorción de la energía de luz cuando los átomos se mueven desde el estado basal hacia un estado excitado, seguido por la emisión de energía (luz) cuando los átomos vuelven a descender al estado basal.

De las ecuaciones (1) y (2) se deduce que las longitudes de onda de la luz absorbida y emitida son las mismas, y únicas, para un elemento dado. Esto es lo que hace a las AAS, AES y AFS específicas, de modo que un elemento puede medirse aun con la presencia de un exceso enorme de un elemento químicamente similar. La ecuación de Boltzmann (Haswell, 1991) relaciona las energías con estados diferentes a la estructura atómi-

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INSTRUMENTACIÓN

ca y, desde la ecuación, la proporción de una población atómica presente, como átomos excitados, comparada con los átomos del estado basal puede calcularse. La proporción está influida por dos características, la temperatura y el elemento. En las temperaturas operativas típicas, la proporción es al menos de 10 –6:1 para la mayor parte de los elementos, y las AAS y AFS proporcionan sensibilidad superior a la AES. Con los sistemas que proveen temperaturas más altas (véase Instrumentación) la proporción cambia y la AES puede ser favorecida. Las estructuras atómicas de los metales alcalinos (p. ej., sodio, potasio, litio) son tales que las ⌬E son relativamente pequeñas, correspondiendo a longitudes de onda más largas, y aunque a unos 2 000°C la proporción de átomos excitados no es alta (de 10–4 a 10–6:1), las concentraciones de sodio y potasio en las muestras biológicas son suficientes para que la AES de flama (también denominada fotometría de flama) sea una técnica conveniente y bien establecida para medir estos metales en los laboratorios clínicos. La espectrometría de absorción atómica puede utilizarse para determinar más de 60 elementos con instrumentos que son relativamente económicos y simples de manejar, y la cual provee suficiente sensibilidad para medir muchos de estos elementos en las concentraciones presentes en las muestras clínicas (Haswell, 1991). Un rango similar de elementos puede medirse con la espectrometría de emisión atómica. La fotometría de flama es conveniente para los metales alcalinos en concentraciones altas, pero la AES es más útil con fuentes de energía de alta temperatura (véase Instrumentación) cuando el análisis multielemento puede emprenderse. La fluorescencia atómica efectiva requiere fuentes de luz intensa, estable y éstas son difíciles de construir fiablemente. El mayor éxito se obtiene con lámparas de descarga sin electrodos para los elementos metaloides de los grupos 4 a 6 de la tabla periódica. Límites de detección muy bajos se alcanzan para estos elementos con la AFS. Fluorescencia de rayos X Cuando los fotones, electrones o protones de alta energía golpean una muestra sólida, un electrón de las capas interiores (K, L o M) de un átomo constitutivo puede ser desplazado. La vacante orbital que surge la ocupa un electrón de la capa exterior; con la emisión acompañante de un fotón de rayos X, esta energía es igual a la diferencia entre los niveles de energía implicados. Esta emisión se conoce como fluorescencia de rayos X (XRF). La energía de emisión, es decir, la longitud de onda, es una característica del átomo (elemento) a partir del cual se origina, mientras la intensidad de la emisión se relaciona con la concentración de los átomos en la muestra. Dependiendo del tipo de espectrómetro que se emplee para medir la emisión, la

XRF se caracteriza como de longitud de onda dispersiva (WDXRF) o de energía dispersiva (EDXRF). La XRF por reflexión total (TXRF) se describe como una técnica, aunque es una variación de EDXRF. Espectrometría de masas inorgánica Puesto que las muestras se toman a altas temperaturas, los componentes orgánicos se destruyen, algunos o la totalidad de los elementos inorgánicos se ionizan. Cuando estos iones se controlan con un espectrómetro de masas, pueden separarse al pasar por un campo magnético establecido por un cuadrupolo o algún otro filtro de masa. Estos iones separados de acuerdo a la masa, cociente (m/z) de carga, se detectan y contabilizan usando un multiplicador de electrones. Este proceso por lo general se describe como espectrometría de masas inorgánica o atómica. Se han empleado varias fuentes de iones, pero para el manejo más reciente del análisis clínico se usa un plasma inductivamente acoplado (ICP-MS). La técnica es un verdadero multielemento y provee límites de detección que están en el rango de µg/L o, en especial para los elementos con número de masa atómica alto, todavía más bajos. Los elementos que hasta la fecha se han determinado pueden ahora ser cuantificados con confianza. La otra característica principal de la espectrometría de masas es la capacidad para medir isótopos diferentes del mismo elemento.

Instrumentación Absorción atómica Un espectrómetro de absorción atómica consiste de los siguientes módulos: Fuente de luz

Atomizador

Monocromador

Detector

Lectura/ visualizador

donde el monocromador, el detector y el visualizador son similares a los de otros espectrómetros. La característica esencial de una fuente de luz óptima para la AAS se consigue suministrando una potencia monocromática de alta intensidad, con lámparas de cátodo hueco, las cuales se construyen con el elemento a medirse como un componente principal del cátodo, de modo que la luz emitida es de la misma longitud de onda que se requiere para la absorción atómica por la muestra. Por consiguiente, se requiere una lámpara diferente para cada elemento que se mide, y por los costos implicados, un rango comprensivo de lámparas se mantiene por lo general en pocos laboratorios especializados.

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CAP. 42

ESPECTROMETRÍA ATÓMICA ANALÍTICA

El atomizador es cualquier dispositivo que genera átomos del estado basal como un vapor dentro de la trayectoria de la luz instrumental. Si se considera el calcio en una muestra de suero, el elemento está presente en la solución, ligado a la proteína, junto con el fosfato y parte del Ca2⫹ inorgánico. La formación del vapor atómico (atomización) requiere de los siguientes pasos: • Eliminación del solvente (secado). • Separación del anión u otros componentes de la matriz Ca2⫹. • Reducción: Ca2⫹ ⫹ 2e⫺

Ca°.

La energía necesaria para realizar estos pasos se suministra como calor, ya sea de una flama o de un horno eléctrico. Al final, dentro del atomizador hay absorción de la energía radiante. Atomizadores de flama La disposición típica de este atomizador implica un nebulizador neumático, cámara de premezclado y una flama de acetileno laminar con una longitud de la trayectoria de 10 cm (fig. 42-4). El flujo de aire de alta velocidad auxiliar causa

la dilución de la muestra al aspirarse de forma continua por capilaridad, debido al efecto Venturi. La muestra emerge del nebulizador, como un aerosol con un amplio rango de tamaños de gotitas, que se mezcla con los gases de la flama y se transporta a la flama para la atomización. Sin embargo, sólo las gotitas menores de 10 µm en realidad entran a la flama, porque aquellas de tamaño más grande caen hacia los lados de la cámara de premezclado y se desperdician. Por consiguiente, menos de 15% de la muestra entra a la flama. Así, con el nebulizador neumático, la muestra original experimenta dilución con los gases de la flama, pérdidas en la cámara de premezclado y considerable expansión térmica (es decir, dilución adicional) dentro de la flama. Además de la dispersión de la muestra a través de la flama, hay pérdidas de átomos debido a la formación de óxidos u otras especies en los márgenes de la flama. La tasa normal de captación de la muestra del nebulizador es de casi 5 ml/min y se necesita una aspiración por varios segundos para lograr una señal constante. Las ventajas y desventajas del sistema de atomización con nebulizador neumático de flama se muestran en el cuadro 42-1. Por su sencillez, velocidad y libertad de interferencias, este planteamiento se prefiere donde la concentración del analito es apropiada. Las concentraciones típicas más bajas que pueden determinarse se aproximan a 1 µg/ml. El aire acetileno se quema a casi 2 000°C, en tanto que la flama de óxido nitroso acetileno es más caliente,

Flama

Mechero Mezclado del aerosol y los gases de la flama

Combustible y oxidante auxiliar Nebulizador

Cámara de premezclado

Muestra Desechos Ampliación de A

Muestra

Aerosol

Gas de soporte

Figura 42-4 Diagrama de un nebulizador neumático, cámara de premezclado y mechero; la imagen inferior muestra el nebulizador con más detalle.

409

INSTRUMENTACIÓN

Trayectoria de la luz Tubo de sílice calentado

Cuadro 42-1 Características de la nebulización neumática con atomización por flama Rápida Reproducible Poca interferencia Señal constante

Sólo 15% de la muestra entra en la flama Amplio rango del tamaño de las gotitas Densidad atómica baja de la muestra en la flama Las condiciones del mechero imponen limitaciones sobre el nebulizador

N2

Hidruro, por ejemplo, AsH3

tiene una temperatura cercana a 3 000°C y se utiliza en los elementos que forman óxidos refractarios y no tienen una atomización eficaz en la flama de aire acetileno. Una mejoría en la sensibilidad se obtiene con dispositivos que superan las limitaciones de los nebulizadores neumáticos listados antes. Estos: a) atrapan átomos para dar una densidad más grande dentro de la trayectoria de la luz, b) circunvalan el nebulizador, de modo que 100% de la muestra se atomiza, y c) introducen la muestra como un impulso simple, rápido, más bien que como un flujo continuo. Algunos emplean una combinación de estas características. Los dispositivos que se utilizan en una flama, por ejemplo, el tubo ranurado de cuarzo y la cubeta de Delves, son más eficaces con los elementos más volátiles, como el zinc, el cadmio y el plomo. Estos tres planteamientos para mejorar la sensibilidad también figuran en otros atomizadores utilizados en las AAS, AES, AFS, ICP-MS. Generación de hidruros Ciertos elementos, como arsénico, selenio y bismuto forman con facilidad hidruros gaseosos, por ejemplo, la arsina (AsH3). Usando instrumentación adicional simple, un reductor, como el borohidruro de sodio, se agrega al matraz de reacción que contiene la muestra acidificada. El hidrógeno se forma y éste reacciona con el analito, se desarrolla el hidruro gaseoso y se transfiere por un flujo de gas inerte hacia un tubo de sílice calentado ubicado en la trayectoria de la luz. El tubo se calienta con una flama de aire acetileno o una corriente eléctrica y la temperatura es suficiente para causar la disociación del hidruro y la atomización del analito (fig. 42-5). Así, no hay pérdida de la muestra, todos los átomos entran a la trayectoria de la luz en unos pocos segundos, y son atrapados dentro del tubo de sílice, que retarda su dispersión. La generación de hidruros por AAS permite la detección de unos cuantos nanogramos de analito a partir de cualquier volumen de muestra que se coloca en el matraz de reacción. Las variaciones de la instrumentación son posibles para procurar una disposición de flujo continuo, que es más sencillo de automatizar.

Matraz de reacción NaBH4

Muestra acidificada

Figura 42-5 Diagrama de un sistema para la generación del hidruro y atomización.

Generación de vapor de mercurio El mercurio forma un vapor a la temperatura ambiente y esta característica es la base para la generación de vapor frío. Un agente de reducción se agrega a la solución de la muestra para convertir el Hg2+ a mercurio elemental. La agitación o el burbujeo del gas a través de la solución producen la vaporización rápida del mercurio atómico, que entonces se transfiere a una celda, a través del flujo, puesta en la trayectoria de la luz (fig. 42-6). Como ocurre en la generación del hidruro, el límite de detección es de unos pocos nanogramos y la instrumentación común para lograr ambos procedimientos la han desarrollado algunos fabricantes.

Trayectoria de la luz

Desechos Aire empujado a través del sistema

Trampa fría para colectar el vapor de agua

Muestra + agente de reducción Hg2+ + 2e– S Hg°

Figura 42-6 Diagrama de un sistema para la generación de vapor de mercurio.

410

CAP. 42

ESPECTROMETRÍA ATÓMICA ANALÍTICA

Atomización electrotérmica La mayor parte de los sistemas utiliza un tubo de grafito calentado eléctricamente; esta técnica a menudo se denomina atomización con horno de grafito, aunque se emplean a veces diversos materiales. El contacto eléctrico se hace con el horno y se aplica un voltaje. La resistencia al flujo de corriente provoca el aumento de la temperatura del horno (como con el elemento de una estufa eléctrica). Una secuencia programada de la temperatura (fig. 42-7) puede

flama, el análisis puede ser automatizado, y los instrumentos modernos se suspenden al final de una corrida, de modo que la operación de toda la noche sin vigilancia es posible. La atomización electrotérmica de la AAS (ETAAS) está sujeta a mayores interferencias que la AAS de flama y se requieren varios procedimientos para eliminarlas o compensarlas. De la misma manera, se utilizan formas diferentes de materiales de grafito (electrografito, grafito pirolíticamente recubierto y grafito pirolítico total), y el diseño del horno y el calentamiento pueden optimizarse para promover la atomización y reducir las interferencias. El establecimiento del detalle metodológico y de la atención cuidadosa cuando el instrumento se suspende cada día es necesario para obtener resultados correctos y precisos. Los estudios de funcionamiento del laboratorio demuestran que tal destreza se encuentra en centros donde el análisis del oligoelemento es una actividad principal. Interferencias

Figura 42-7 Un ejemplo de un programa de calentamiento simple para la atomización electrotérmica.

establecerse de modo que la solución puesta dentro del horno se seque cuidadosamente; el material orgánico entonces se destruye y los iones del analito se disocian de los aniones. Con un aumento rápido en la temperatura, los iones se reducen a átomos del estado basal por la absorción de luz. Un aumento pequeño adicional de la temperatura asegura que el tubo de grafito esté limpio para la muestra siguiente. Las temperaturas de atomización que pueden alcanzarse por esta técnica, hasta 3 000°C, permite que los elementos refractarios como el aluminio y el cromo sean posible medirlos. Por lo común, sólo 10 a 50 µl de la muestra se inyecta en el horno, así las muestras muy pequeñas pueden acomodarse, y porque toda la muestra se atomiza dentro de un volumen pequeño, una población densa del átomo se produce en la trayectoria de la luz. La técnica es, por tanto, muy sensible, lo que permite la medición de las concentraciones en µg/L. Aunque es lento comparado con la AAS de

La mayor parte de las técnicas pueden considerarse razonablemente maduras; en ellas las interferencias se subentienden y hay procedimientos para superarlas. Los dispositivos que implican el flujo de soluciones, como en los nebulizadores o los sistemas de inyección de flujo, proveen resultados erróneos si las muestras y los elementos de calibración tienen viscosidades desiguales, causando diferentes ritmos de introducción en el analizador. Donde ocurre esto, estrategias como la estandarización interna, la incorporación de estándares o la adición de reactivos para igualar los ritmos de flujo proporcionan determinaciones exactas. Las interferencias químicas influyen en el ritmo de la atomización. El calcio ligado al fosfato en el suero no se separa por completo a 2 000°C y envía una señal más baja que una concentración equivalente de un calibrante acuoso. La adición de un agente de emisión, como el La3+, que se liga al fosfato, evita esta interferencia. Las interferencias químicas también ocurren dentro del horno de grafito, como la matriz de la muestra que causa que los átomos del analito se volatilicen y se pierdan durante la fase de incineración. Los modificantes químicos se agregan para estabilizar los átomos o para facilitar la eliminación de la matriz, o ambas, en una etapa temprana del ciclo de calentamiento. Las interferencias más difíciles son aquellas que causan la absorción no atómica del haz de luz y son por lo común un resultado de la naturaleza compleja de los fluidos biológicos. La compensación para la absorción no atómica se logra usando modificantes químicos para promover la destrucción de la matriz orgánica, con dispositivos para establecer las condiciones de la atomización isotérmica y con las técnicas de corrección del fondo (cuadro 42-2).

411

INSTRUMENTACIÓN

Cuadro 42-2

Planteamientos para eliminar la absorción no atómica

Técnica

Motivo

Ejemplos

Modificantes químicos

Promover la destrucción de la matriz de la muestra Retrasar la atomización del analito Reducir las interacciones de la fase de vapor retrasando la atomización hasta que el horno alcance temperatura constante Medir por separado la absorción total y la no atómica; la diferencia = absorción atómica

O2, Mg(NO3)2, (NH4)2HPO4 Pd2+, Ru2+ Plataforma L’Vov, sonda de grafito, hornos originales

Atomización isotérmica

Corrección del fondo

Emisión atómica La instrumentación para la emisión atómica incluye: Atomizador/ fuente de excitación

Monocromador

Detector

Lectura/ visualizador

Como se indica antes, la fuente de calor para la atomización y la excitación a un nivel de energía más alto puede ser una flama. Las alternativas históricas incluyen arcos y chispas, pero los instrumentos modernos utilizan el argón o algún otro gas en un estado ionizado, que se llama plasma.

BC de deuterio, BC efecto de Zeeman, BC Smith-Heijfte

Las lecturas simultáneas es posible hacerlas con el segundo arreglo, como cuando en cada uno de los monocromadores se coloca para transmitir la luz de longitudes de onda predeterminadas. Un instrumento de lectura secuencial es menos costoso que un instrumento de lectura simultánea, pero más muestras se requieren para tomar una serie de lecturas. Para la mayor parte de los elementos, la sensibilidad analítica del ICP-AES es similar a la que se obtiene con la AAS de flama.

Plasmas acoplados inductivamente El plasma se inicia por el sembrado de una chispa de alto voltaje para ionizar los átomos: Ar ⫹ e⫺

Ar⫹ ⫹ 2e⫺

y se sostiene con la energía de una bobina de inducción conectada a un generador de radiofrecuencia. Esto se conoce como plasma inductivamente acoplado (ICP). Los plasmas persisten a temperaturas de hasta 10 000°C y en el instrumento tienen el aspecto de una antorcha (fig. 42-8). Las muestras pueden introducirse vía nebulizador o, en cuanto a la AAS, por la generación de hidruro, la generación de vapor frío o la vaporización electrotérmica desde un atomizador de grafito. La característica principal de la AES es que permite el análisis multielemento. Los sistemas ópticos dirigen la luz emitida ya sea vía monocromador hacia un solo detector o un conjunto de monocromadores y detectores colocados alrededor del plasma. Con el primer arreglo, una serie secuencial de lecturas puede hacerse con los monocromadores guiados para proporcionar, a su vez, cada una de las longitudes de onda de interés.

Figura 42-8 Unidad de la linterna para el plasma inductivamente acoplado.

412

CAP. 42

ESPECTROMETRÍA ATÓMICA ANALÍTICA

Interferencias En las altas temperaturas operativas del ICP, ocurren muchas transiciones de energía, dando lugar al potencial para las interferencias espectrales, donde la emisión de luz de elementos diferentes ocurre en longitudes de onda que están tan juntas que no es fácil que se logre separarlas por el ancho de banda del espectrómetro. La mayor parte de éstas se documentan, de modo que donde se sospecha una interferencia puede utilizarse una línea alternativa de resonancia para la medición. Fluorescencia atómica Pocos instrumentos comerciales para AFS están disponibles, y éstos se confinan a la medición de elementos que forman hidruros y mercurio. Los componentes son similares a los de la AAS. Las lámparas de descarga sin electrodos se utilizan para la fuente de luz y la trayectoria óptica se modifica de modo que sólo la luz emitida fluorescente alcanza el detector. Ciertas interferencias son comunes a la generación del hidruro, cualquiera que sea el detector utilizado. Si un elemento que forma hidruros está presente en la muestra en cantidades grandes, consumirá el agente de reducción de manera que otros elementos no se detecten. Las altas concentraciones de los elementos de transición también inhiben la formación del hidruro. Donde esto puede ser un problema el analito puede separarse de la matriz, por ejemplo, por quelación y la extracción del solvente o por cromatografía. Fluorescencia de rayos X Las muestras son irradiadas por fotones de alta energía, casi siempre el haz policromático primario de los tubos de rayos X. Sin embargo, el uso de isótopos radiactivos como 244Cm, 241Am, 55Fe y 109Cd son las fuentes de interés en las aplicaciones clínicas. El último es en particular importante como fuente en los instrumentos portátiles desarrollados para la XRF in vivo (véase adelante, Aplicaciones). Mientras la matriz de la muestra contribuye de manera considerable a la intensidad de la señal, la calibración puede ser difícil, requiriendo por lo general el uso de diferentes materiales de referencia o de estandarización interna, o ambos. Pocos problemas se encuentran si las muestras son preparadas como frotis muy finos y en la TXRF. Junto con el efecto de la matriz, la sensibilidad también está influida por la longitud de onda, de modo que los elementos más ligeros presentan un desafío analítico difícil. En WDXRF, los rayos X de alta intensidad se utilizan para inducir la emisión de fluorescencia, que es dispersada en líneas espectrales individuales por la reflexión en un cristal del analizador. Los rayos difractados se enfocan y se

dirigen sobre un detector del fotón. Como con el ICP-AES, los espectrómetros pueden funcionar en secuencia con un número de cristales intercambiables para permitir la medición del rango completo de elementos, o en un modo multicanal (simultáneo), normalmente preestablecidos para los analitos específicos. Los límites de detección para los elementos ligeros son 10 a 100 veces más bajos que con la EDXRF. La resolución es buena, aunque menor a tales longitudes de onda más cortas. Los instrumentos secuenciales requieren tiempos de análisis largos para medir varios elementos, comparados con los instrumentos simultáneos o la tecnología de la EDXRF. Para EDXRF, los rayos X emitidos de la muestra se dirigen juntos en un detector de cristal. Un pulso de la corriente se genera con una altura que es proporcional a la energía del fotón de rayos X. Las diferentes energías relacionadas entre varios átomos (elementos) en la muestra se clasifican electrónicamente; se utilizan fuentes de energía más bajas (un tubo de rayos X de bajo poder o una fuente isotópica). El detector tiene que mantenerse a una temperatura muy baja y en un vacío limpio. Los tiempos del análisis son 10 a 30 veces más largos que con la WDXRF pero, con una técnica verdadera multielemento, el tiempo total no es necesario que sea mayor. Cuando un haz enfocante de rayos X se dirige contra una superficie óptica plana en un ángulo de alrededor de 5´ (5/60 de un grado), la reflexión total ocurrirá. Éste es el principio de la TXRF, en la cual la muestra se expone a los rayos primarios y reflejados totales y se excita para fluorescencia. La radiación emitida se resuelve y se mide como un espectro ED. Puesto que de hecho no hay absorción por la matriz, la medición y la calibración son mucho más simples y las sensibilidades son mayores que con otras técnicas de rayos X. Espectrometría de masas inorgánica Los módulos requeridos para la espectrometría de masas inorgánica incluyen: Introducción de la muestra/generación del ion

Enfocamiento del ion

Separación del ion

Detector

Lectura y visualización

Fuentes del ion Según se menciona antes, hay un número de dispositivos de generación de ion, pero el más utilizado es el ICP. Las muestras se introducen por lo común al plasma vía nebulizador o por vaporización química (generación del hidruro y del vapor frío de mercurio). A veces se utilizan la vaporización electrotérmica y la vaporización causada por la ablación láser de una muestra sólida .

APLICACIONES

Analizadores de masa La antorcha del plasma inductivamente acoplado es interconectada al analizador de masas vía dos conos metálicos (colector de la muestra y muestreador), a través de los cuales los iones se extraen dentro de la unidad de focalización del ion, donde un sistema de lentes del ion dirige los iones al analizador de masas. Varias configuraciones del analizador están disponibles en el comercio. Aquellos con un sistema de cuadrupolo tienen un poder de resolución limitado, permitiendo la separación de la especie sobre una base de la unidad m/z. Para explotar la capacidad máxima de la técnica, la fuente del ICP tiene que ser acoplada a un analizador de masas de sector del campo de alta resolución, que puede alcanzar una resolución mucho mayor y con una sensibilidad más alta que con ICP-MS de cuadrupolo. Los espectrómetros de masas por tiempo de vuelo son en particular útiles para el análisis de señales rápidas, transitorias, como las generadas por la vaporización electrotérmica.

Interferencias El ICP-MS está sujeto a muchas interferencias espectrales causadas por el traslape de los isótopos, o de diferentes elementos o iones formados de los componentes de la matriz y del gas del plasma. Ejemplos importantes para los análisis clínicos incluyen 40Ar+ sobre 40Ca, 31P16O2+ sobre 63Cu, 40Ar+35Cl+ sobre 75As y 40Ar + sobre 80Se. El ICP-MS 2 del sector de campo no está sujeto a la mayor parte de estas interferencias, aunque la pérdida de sensibilidad se observa cuando se emplea alta resolución. Esto puede conducir a problemas con algunas aplicaciones. Un desarrollo relativamente nuevo de instrumentos cuadrupolo se está usando en las celdas de colisión, donde una celda llena de gas se incluye en la unidad de focalización. Las colisiones entre los iones poliatómicos y el gas llenador causa que los primeros se disocien y las interferencias espectrales se reduzcan mucho. Otro acercamiento implica la separación de los iones del analito de aquellos implicados en la formación de las especies poliatómicas. La separación puede lograrse con la vaporización de la muestra, por ejemplo, con la generación del hidruro o la vaporización electrotérmica, o preanalíticamente con cromatografía o alguna técnica similar. La adición de nitrógeno, de helio o de metano al gas portador o al solvente orgánico del diluyente reduce algunas de las interferencias basadas en el argón. Las interferencias no espectrales, relacionadas con la introducción de la muestra, con las fluctuaciones del plasma, etc., se eliminan de forma eficaz usando un estándar interno. Éste debe ser un elemento no presente en la muestra original, ni sujeto a las interferencias espectrales, y con una

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masa y energía de ionización próxima a la de los analitos. También se usa con frecuencia para las muestras biológicas en el escandio, para las masas de hasta 80 unidades atómicas (amu); en el indio, de 80 a 150 amu; e iridio, en las masas arriba de 150 amu.

Aplicaciones Se requieren mediciones de minerales y de oligoelementos para investigaciones clínicas diferentes (Taylor, 1996). Ciertos grupos pueden tener ingestas nutricionales deficientes de los elementos esenciales, por ejemplo, los ancianos, los niños desfavorecidos y las mujeres durante el embarazo, y las deficiencias de hierro, zinc y de selenio son frecuentes en estos grupos. La deficiencia de los oligoelementos esenciales también puede ocurrir durante la alimentación parenteral total, por lo que los protocolos para la monitorización regular de pacientes por lo general se recomiendan. En otras situaciones, el envenenamiento yatrogénico puede ocurrir. Las concentraciones séricas de aluminio se miden de manera regular en pacientes con falla renal crónica, debido al uso de agentes orales ligadores de fosfato que contienen aluminio y también por posible contaminación de los fluidos de la diálisis. Los fluidos de la diálisis pueden llegar a contaminarse con otros elementos; en este sentido se han reportado casos tóxicos relacionados con el cobre y el zinc. El diagnóstico y el monitoreo de errores innatos del metabolismo del oligoelemento requiere por lo común mediciones del elemento implicado. La exposición aumentada a los minerales y oligoelementos puede causar morbilidad; algunos son carcinogénicos (Baldwin y Marshall, 1999). Mientras que las funciones de muchos órganos se pueden perturbar por la acumulación de metales; los sistemas del riñón, del hígado, nerviosos, intestinales y hematopoyéticos es más probable que estén implicados. Las exposiciones accidentales (incluso suicidas u homicidas deliberadas) a los oligoelementos se consideran en el diagnóstico diferencial al considerar los signos y síntomas que implican estos sitios. La exposición indebida puede ser resultado de las fuentes dentro del ambiente, o en la casa, relacionado con los pasatiempos, o los cosméticos y los remedios poco comunes. En el escenario ocupacional, puede haber exposición aumentada a los materiales con potencial tóxico reconocido. La determinación de las concentraciones en las muestras adecuadas es un requisito estatutario para el plomo, y la monitorización biológica es también importante en la implementación de regulaciones del UK Control of Substances Hazardous to Health (COSHH). Las muestras habituales para el análisis son los fluidos corporales, sangre, suero y orina (Walker, 1998; www.

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CAP. 42

ESPECTROMETRÍA ATÓMICA ANALÍTICA

sas-centre.org). El pelo y las uñas se toman de cuando en cuando para investigar situaciones de sobreexposición. Las condiciones clínicas en las cuales los tejidos es más probable que se analicen son la enfermedad de Wilson y la hemocromatosis, las concentraciones de cobre y hierro, respectivamente, en el hígado son tales que aun las muestras de biopsia pueden investigarse. Las muestras más grandes de tejidos removidos durante la cirugía o post mortem pueden analizarse para investigaciones especiales. Muchas investigaciones clínicas se relacionan con las mediciones de apenas uno o dos elementos en una muestra: o los síntomas son sugestivos de, o hay perturbación conocida de la exposición a ese elemento. En estas situaciones las AAS y AFS son técnicas ideales sensibles y exactas. Los panoramas donde los análisis multielemento son útiles están llegando a ser más comunes hoy. La AES no es a menudo apropiada para el análisis de los fluidos biológicos pero sí para el análisis multielemento en las muestras de tejidos y alimentos, donde las concentraciones son más altas. Para los estudios que requieren el análisis multielemento de la sangre u orina, o ambas, por ejemplo, posible insuficiencia nutricional, lanzamiento de implantes prostéticos y envenenamientos no identificados, el ICP-MS aporta la técnica más simple, rentable y, con frecuencia, la más sensible. Los resultados pueden ser más informativos cuando se presentan como concentraciones del elemento en proteínas específicas o algún otro complejo o molécula, más bien que como la concentración total en la muestra. Se han descrito varias técnicas para el muestreo; algunas de ellas pueden acoplarse de manera directa al espectrómetro en un arreglo tándem para el análisis. La fluorescencia atómica, el ICP-AES y el ICP-MS se utilizan por lo general para la detección. La facilidad adicional del ICP-MS, para determinar los isótopos estables individuales, se explota en los estudios metabólicos y en las mediciones de la absorción intestinal. Las dosis del trazador con un contenido enriquecido de un isótopo pueden administrarse sin exponer a los sujetos a la radiactividad en potencia dañina, como ocurre cuando los radioisótopos se emplean para tal trabajo. En los elementos, como plomo y estroncio, los isótopos se generan de forma parcial por el decaimiento radiactivo de otros elementos; los cocientes entre los isótopos son característicos en diferentes localizaciones geográficas. A partir de la medición de los cocientes del isótopo en los materiales biológicos y ambientales, las fuentes de la exposición pueden identificarse. La XRF no desempeña un papel importante en las mediciones de los oligoelementos en las investigaciones clínicas, pero los desarrollos recientes abren algunas posibilidades interesantes. Instrumentos convenientes se diseñan para utilizarse al analizar tejidos próximos a las superficies más externas del cuerpo, tales como los huesos en la rodilla, los dedos y el cráneo. Las mediciones in vivo

del plomo se han emprendido para determinar las exposiciones acumulativas en los trabajadores del plomo, y para investigar la remoción desde las reservas del hueso dentro de la circulación durante el embarazo.

Aseguramiento de la calidad Aparte del análisis real, la contaminación adventicia es el factor que tiene el impacto más grande en la calidad de resultados. La contaminación puede ocurrir durante la colecta y el almacenaje de las muestras del procedimiento preparatorio y de la medición espectrométrica. La atención escrupulosa en la limpieza y el detalle metodológico son esenciales para obtener resultados significativos. Los datos de los esquemas de valoración de la calidad indican que, mientras algunos laboratorios generales del hospital obtienen buenos resultados, son los centros especialistas en oligoelementos los que tienden a mantener los estándares más altos de funcionamiento. Esta observación refleja la aplicación continua de prácticas para reducir al mínimo la contaminación, y su destreza y experiencia en asegurar el funcionamiento óptimo del equipo. Tales centros también acumulan experiencia con los casos clínicos raros y están bien posicionados para proporcionar la asesoría y la interpretación. Debido a la estabilidad de los analitos inorgánicos y la pureza con la cual los materiales estándares pueden prepararse, hay una cantidad razonable de materiales de referencia disponibles para emplear en la validación de los métodos y para el control de calidad interno y externo. A diferencia de muchos otros procedimientos clínicos de laboratorio, y en parte como una consecuencia del uso amplio de los materiales de referencia certificados, la exactitud es un concepto directo y no se define en el contexto de metodologías particulares.

Conclusiones Con las mejoras recientes en la confiabilidad del equipo y su desarrollo para reducir las interferencias, la ETAAS y el ICP-MS son las técnicas más convenientes para la medición de los minerales y de los oligoelementos en las muestras clínicas. Para ciertas aplicaciones específicas las AES, AFS y XRF son en particular adecuadas. La importancia clínica de la fotometría de flama disminuye con la introducción de los electrodos selectivos de ion sodio y potasio. La descripción de los principios de las técnicas espectrométricas atómicas y los considerables detalles de la instrumentación y las aplicaciones se encuentran en muchos libros de texto (p. ej., Haswell, 1991; Sneddon, 2002). Una fuente de información valiosa que describe los desarrollos

REFERENCIAS

actuales en la espectrometría atómica analítica para los materiales biológicos y clínicos, los alimentos y las bebidas se da en una revisión anual, por parte del Atomic Spectrometry Update (Taylor et al., 2003).

Referencias Baldwin DR, Marshall WJ. Heavy metal poisoning and its laboratory investigation. Ann Clin Biochem, 1999; 36: 401-407 Haswell S (ed.). Atomic Absorption Spectrometry. Theory, Design and Applications 1991: Elsevier, Amsterdam.

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Sneddon J (ed.). Advances in Atomic Spectroscopy, vol. 7, 2002; Elsevier, Amsterdam. Taylor A. Detection and monitoring of disorders of essential trace elements. Ann Clin Biochem 1996; 33: 486-510. Taylor A, Branch S, Halls DJ, Patriarca M, White M. ASU: clinical and biological materials, foods and beverages. J Anal Atom Spectrom 2004; 19, 505-556. Walker AW (ed.). SAS trace element laboratories. In Clinical and Analytical Handbook, 3rd edn. 1997: Royal Surrey County Hospital, Guildford, UK.

43 Técnicas químicas de reactivo seco JA Schroeder, JC Osypiw y GS Challand

Introducción Química del reactivo seco, química de la capa fina, química de la tira reactiva y química analítica de soporte sólido son sinónimos. Describen técnicas basadas sobre la incorporación de uno o más reactivo químicos en una unidad portátil conveniente, que se puede entonces utilizar para realizar análisis químicos sin la necesidad de preparar y transportar reactivos en forma líquida. El ejemplo probablemente más antiguo y familiar es el papel tornasol, que todavía se emplea en las aulas de química de la escuela, laboratorios analíticos y en el campo para comprobar el pH del suelo. Se elabora incorporando un pigmento vegetal derivado del musgo (descrito primero en inglés en 1502) en los intersticios entre las fibras de celulosa del papel; fue utilizado por Peacham para colorear el papel azul en 1606 (OED, 1989) y es probable que se haya usado como indicador (“la prueba ácida”) por lo menos durante 300 años. Un estímulo profundo al desarrollo de las técnicas químicas de la capa fina fue la invención de la fotografía. La propiedad de los haluros de plata para cambiar de color al exponerse a la luz, la observa por primera vez Fabricius en 1556, y las fotografías en su fase temprana pudo haberlas producido Schultze en 1727 (Stenger, 1939). Las primeras películas y papeles fotográficos prácticos se desarrollaron en el siglo xix, y hoy una película instantánea moderna de impresión a color puede tener hasta 15 capas discretas, cada una incluyendo una reacción química o una función física distintas, incorporadas en una sola unidad, estable y portátil. La primera aplicación de estas técnicas en la bioquímica clínica aparece a mediados de la década de 1950, con el de-

sarrollo de las tiras reactivas para medir la glucosa en orina (Adams y cols., 1957). Un analista, enfermera o paciente comparativamente inexpertos podrían sumergir la tira reactiva dentro de una muestra de orina, y dentro de un par de minutos podrían obtener una medición semicuantitativa de la concentración de glucosa comparando el color desarrollado por la tira con un patrón de color impreso. Esto, junto con la aplicación subsiguiente de tecnología similar al análisis de la glucosa sanguínea (Marks y Dawson, 1965), revoluciona la vigilancia en pacientes diabéticos. La cuantificación exacta se mejora con el desarrollo de fotómetros simples al medir la luz reflejada mediante la lectura de tiras reactivas para la glucosa sanguínea (Mazzaferri y cols. 1970), llamadas medidores de glucosa, y con otros progresos importantes que ocurrieron en la década de 1970, cuando la tecnología de la fabricación de la película fotográfica se aplica a los análisis de la química clínica. Hoy, centenares de análisis están disponibles en formato de película fina, y se han desarrollado máquinas capaces de medir colores u otras señales de una amplia gama de tiras reactivas y de producir un resultado exacto y preciso en segundos. La tecnología tiene el potencial para revolucionar la práctica de la química clínica, tanto en la reducción del requerimiento para las habilidades analíticas tradicionales en análisis comunes, como en la capacidad para que éstos se realicen simple y rápidamente fuera de un laboratorio analítico, por ejemplo, en consultorios o clínicas, en las oficinas del médico de cabecera y en el propio hogar del paciente. Walter y Boguslawski (1988) han revisado el campo de estudio y han descrito la gama y la tecnología de los análisis disponibles.

The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker. © 2005 John Wiley & Sons, Ltd.

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CAP. 43

TÉCNICAS QUÍMICAS DE REACTIVO SECO

Principios de la metodología En su forma más simple, los análisis químicos de capa fina consisten de pigmento u otro reactivo atrapado dentro de las fibras de celulosa de una tira de papel. Éstos producen una reacción visible cuando un analito se difunde dentro de la matriz, o en forma líquida, por ejemplo, papel tornasol y otros papeles indicadores para la valoración del pH de un líquido, o en la forma gaseosa, por ejemplo, papel de hidróxido ferroso para la detección del cianuro de hidrógeno; papel de bromuro mercúrico para la detección de arsina (Curry, 1988). Sistemas más complejos se forman con una serie de capas (véanse los ejemplos específicos, más adelante), cada una de las cuales contiene una o más funciones. Básicamente, éstas son: 1. Una capa de soporte. Ésta sostiene los elementos del reactivo seco. Es por lo general plástico delgado, que puede transmitir o reflejar la luz. 2. Una capa reflexiva. Su propósito es reflejar de nuevo al ojo o al detector mecánico tanto cuanto sea posible la luz emitida por el químico de las capas reactivas. Puede incluirse con la capa de soporte usando un plástico reflexivo. Como una alternativa, puede colocarse una capa de un pigmento, como el dióxido de titanio, o un material reflexivo, como una lámina de metal. 3. Una o más capas analíticas. Éstas por lo general consisten de películas delgadas porosas de gelatina en las cuales uno o más reactivos se han incluido durante la fabricación de la película. Los reactivos deben permanecer estables una vez que la capa de la gelatina se haya secado. Una sola capa es adecuada cuando los reactivos incorporados no interactúan uno con otro en ausencia de un analito. Las capas múltiples (cada una de las cuales se seca antes que se aplique la siguiente) son necesarias para separar los reactivos que interactúan recíprocamente en ausencia de un analito. Así es como la gelatina, o materiales fibrosos como celulosa, pueden emplearse. Éstos suelen funcionar como filtros (p. ej., separar los eritrocitos del plasma) o como tamices moleculares, al separar un producto de reacción de otro. De manera alterna, los reactivos pueden introducirse sumergiendo el material fibroso dentro de una solución apropiada, y secarlos de inmediato. 4. Una capa extendida. Ésta consiste de un material fibroso o una membrana. Cuando una gota de la muestra se aplica, separa muy rápido la muestra hacia fuera, de forma lateral, y permite una difusión uniforme en las capas analíticas.

Las tiras reactivas complejas requieren de una fabricación muy exacta, en particular cuando son para las capas analíticas, en las cuales la concentración de reactivo en la gelatina, el tamaño del poro de la gelatina, el grueso de cada capa, y el grado de secado de cada capa deben ser cuidadosamente controlados (Bevan, 1996). Sin embargo, una vez que está fabricada, cada tira contiene todos los pasos analíticos requeridos para realizar un ensayo. Ninguna reconstitución previa de los reactivos se necesita, la tira es portátil y puede permanecer estable durante semanas o meses, y el analista sólo necesita aplicar la muestra para comenzar el análisis. Resultados semicuantitativos pueden obtenerse igualando el color desarrollado, después de un tiempo fijo, con los patrones de color impresos. Con la luz del día o buena luz artificial, un analista experimentado con visión normal del color debe generar resultados dentro de ±25% del valor verdadero. Para reacciones evaluadas por UV o por detección de fluorescencia, y donde es necesaria una cuantificación más exacta, se requiere un medidor para evaluar el color u otra señal. La mayor parte de los químicos del reactivo seco son vigilados y supervisados por la fotometría reflectante difusa (Kortum, 1969); la fluorescencia frontal (Pesce y cols., 1971) también puede usarse. Vigilancia de las reacciones Puede no ser obvio, con excepción para un artista, fotógrafo o físico, que las propiedades de la luz reflejada son diferentes a las de la luz transmitida y absorbida que es muy conocida por los analistas. Pero los supuestos colores primarios de las pinturas y de otros pigmentos (rojo, amarillo y azul) no son iguales que los de la luz transmitida (rojo, amarillo y verde). En una galería de arte, se mira una pintura de frente, con la iluminación desde arriba. Si una pintura se ilumina en forma directa de frente, el colorante y el detalle se pierden al observador debido a la luz reflejada no coloreada y dispersada de su superficie. Estas son las leyes de la fotometría reflectante. Algo de la luz que cae sobre una tira reactiva simplemente se refleja en su superficie (reflexión especular). Puesto que ésta no ha interactuado con cromóforos dentro de las capas analíticas, tiene las mismas propiedades que la luz de origen, y no puede usarse para vigilar una reacción. Parte de luz se incorpora en las capas analíticas e interactúa con cromóforos antes de regresarse debido a la capa reflectante en la tira. La dispersión y la reflexión de la luz sin la interacción con cromóforos ocurren también dentro de las capas analíticas. La luz que regresa después de la transmisión a través de las capas analíticas (reflexión difusa), que contiene una mezcla de luz interactuada y dispersada, se utiliza para vigilar una reacción. Ésta se detecta midiendo la luz que regresa en un ángulo lejos del haz de reflexión especular principal.

EJEMPLOS ESPECÍFICOS

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Después de la reacción, la concentración del analito en una muestra puede calcularse comparando la cantidad de luz difusa reflejada con una estándar. La relación se rige por la ecuación: Ru ⫽ Rs · Iu /Is donde Ru es la reflectividad porcentual de la muestra, Rs es la reflectividad porcentual del estándar, Iu es la intensidad de la luz reflejada por la muestra, e Is es la intensidad de la luz reflejada por el estándar. Las mediciones de la reflectividad porcentual, como la transmitancia, no son lineales con respecto a la concentración, y en la práctica los algoritmos linearizantes, como los de Williams y de Clapper (1953), se emplean para convertir una medición de reflectividad porcentual a concentración. Los productos fluorescentes de una reacción pueden vigilarse usando la fluorimetría frontal. Los monocromadores se utilizan para separar la luz fluorescente emitida por las capas analíticas de luz reflejada. Si la extinción dentro de la tira reactiva es despreciable, la medición de la fluorescencia es lineal con respecto a la concentración del fluoróforo.

Ejemplos específicos La química del reactivo seco puede utilizarse para medir muchos centenares de analitos urinarios, metabolitos y proteínas sanguíneos. Algunas mediciones se realizan usando una capa analítica, otras requieren capas múltiples o incorporación de estructuras físicas, o ambas, dentro de las capas analíticas. Incluso cantidades traza de analitos, como hormonas y fármacos, pueden medirse utilizando técnicas de inmunoensayo dentro de las capas analíticas. Los desarrollos más recientes que usan anticuerpos monoclonales y sistemas de ensayo inmunométricos son de uso rutinario en la actualidad. La mayor parte de estos ensayos los han desarrollado las compañías comerciales, y las consideraciones de la patente han forzado el desarrollo de diversas soluciones para los mismos problemas: por lo común en las uniones de anticuerpos acoplados a soportes sólidos; y la elección del reactivo para desarrollar una señal de color final. Una selección de ejemplos específicos se describe más adelante.

Figura 43-1 Estructura de una tira reactiva para glucosa Dextrostix® (adaptada de Walter y Boguslaski, 1988).

pacientes con diabetes mellitus. Los métodos modernos de glucosa confían en los análisis enzimáticos que utilizan por lo general la enzima glucosa oxidasa. Un ejemplo típico es la tira reactiva Dextrostix® de tres capas, ilustrada en la figura 43-1. Una muestra sanguínea se aplica a la capa superficial, la cual actúa como una capa difusora y membrana semipermeable que separa las células sanguíneas del plasma. El plasma de la muestra se difunde en la capa analítica del papel, que contiene el sistema amortiguador de la reacción enzimática, activada por el agua del plasma. Dentro de la capa analítica, la glucosa y el oxígeno atmosférico reaccionan con la glucosa oxidasa para producir peróxido de hidrógeno y ácido glucónico. En presencia de la peroxidasa, también contenida dentro de la capa analítica, el peróxido de hidrógeno oxida a un indicador redox para producir un cambio de color visible. La capa de soporte plástico también actúa en forma reflexiva, y después de que las células sanguíneas se retiran de la superficie, el color desarrollado puede leerse en la parte superior, en forma visual (comparando con un patrón de color impreso) o usando un medidor de glucosa. Se han desarrollado muchas alternativas de esta tira reactiva simple para la glucosa, por ejemplo, la tira de Fuji® (Kobyashi y cols., 1982) incorpora una capa enmascaradora y reflexiva que contiene el pigmento blanco dióxido de titanio entre las capas dispersora y analítica. La capa de soporte es transparente, en lugar de plástico reflexivo, y el cambio del color se lee de la parte inferior. Esto elimina la necesidad de retirar las células sanguíneas de la tira. Alanina aminotransferasa

Glucosa La glucosa fue el primer analito biológico en ser medido usando las técnicas del reactivo seco (Adams y cols., 1957; Marks y Dawson, 1965) debido a su presencia en una concentración comparativamente alta, la simplicidad relativa de la reacción usada y su importancia en la vigilancia de

Muchas enzimas plasmáticas pueden medirse usando técnicas de reactivo seco, aunque los sistemas analíticos son más sofisticados, porque las enzimas son moléculas grandes que no se difunden fácilmente a través de matrices. También, en la medición enzimática se confía con frecuencia en reacciones multietapas que son en sí mismas enzimáticas. El control de fabricación cuidadoso tanto de

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Figura 43-2 Estructura de una tira reactiva de creatinina Vitros.

los reactivos enzimáticos como de otros reactivos participantes, como los cofactores, es por consiguiente necesario. Algunas capas del reactivo seco para el análisis enzimático tienen entretejidos abiertos que permiten que las enzimas del suero se incorporen en las capas de una tira reactiva, por ejemplo, Walter y cols. (1983a, 1983b), mientras que otros han cerrado los entretejidos que retienen las enzimas sobre la capa superficial de una laminilla. Un ejemplo típico de un sistema de entretejido cerrado es el método de Vitros (antes Ektachem®) (Eastman Kodak Co., 1992) para la alanina aminotransferasa (ALT). La capa dispersante, que es semipermeable y conserva la enzima sérica, también contiene sustratos de ALT de L-alanina y ␣-oxoglutarato de sodio. La ALT cataliza la transferencia de un grupo amino desde la L-alanina a la ␣-oxoglutarato para producir piruvato y glutamato. Los reactivos sin cambio y los productos de reacción se difunden dentro de la capa analítica, que contiene la lactato deshidrogenasa (LDH) y NADH. El piruvato que produce la ALT en la muestra reacciona con la LDH para producir lactato, mientras la NADH se convierte a NAD⫹. El cambio de absorbancia a 340 nm se mide desde la parte inferior usando la fotometría reflectante. En este sistema, la capa dispersante también se utiliza para iniciar la reacción, y la actividad de la ALT puede medirse sin la misma enzima incorporando la capa analítica tradicional. Aunque el piruvato en la muestra puede participar por sí mismo en la reacción, la concentración normal en el suero es demasiado baja para causar interferencia significativa. Creatinina La creatinina del suero se mide usando una laminilla de varias capas que tenga un dispersante interno (Sunberg y

cols., 1983). La estructura de una típica tira reactiva se muestra en la figura 43-2. Para esta tira, la capa dispersante contiene dióxido de titanio, que permite que también sirva como capa reflectante. Cuando se aplica el suero, la creatinina se incorpora a la primera capa analítica. Aquí, el amoniaco se produce a partir de la creatinina por la enzima específica creatinina iminohidrolasa, la cual está incorporada dentro de la capa. La membrana permeable al gas en la parte inferior de la primera capa analítica permite que el amoniaco se difunda en la segunda capa analítica, pero los componentes como amortiguadores y iones hidroxilo, que podrían interferir con la reacción subsiguiente, no pueden atravesar la membrana y son atrapados en la primera capa analítica. La segunda capa contiene un indicador, el azul de bromofenol, que cambia de color en respuesta al amoniaco. Visto desde la parte inferior, el cambio de color del azul de bromofenol puede relacionarse con la concentración de la creatinina. El amoniaco puede interferir, pero la concentración en suero es, por lo general, demasiado baja para aportar resultados erróneos. Potasio Los electrólitos pueden medirse usando electrodos ion-selectivos (cap. 40) elaborados como tira reactiva. En un típico electrodo ion-selectivo, una membrana eléctricamente conductora separa la muestra de una solución interna de composición constante. Una diferencia en la concentración produce un gradiente electroquímico a través de la membrana, que produce una diferencia potenciométrica. Un electrodo de referencia interno, normalmente plata/cloruro de plata, también se sumerge en la solución llenadora. El

EJEMPLOS ESPECÍFICOS

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Figura 43-3 Estructura de una tira de electrodo selectivo a iones de potasio Vitros

cambio en el potencial en el electrodo de referencia interno se mide comparándolo con un electrodo de referencia externo (Russell y Buckley, 1988). La figura 43-3 muestra la estructura de una tira reactiva del electrodo ion selectivo Vitros. Como en un electrodo ion selectivo convencional, la concentración de un ion se mide por la diferencia potenciométrica entre dos electrodos; el puente forma una unión líquida estable que conecta dos electrodos. Al contrario de un electrodo ion selectivo convencional, una solución de composición conocida se aplica al segundo electrodo (de referencia externa), así que la muestra se refiere directamente a una solución estándar. Diversos iones se miden empleando diferentes membranas selectivas a los iones. Para la medición del potasio, cada electrodo incluye una película hidrofóbica que contiene una alta concentración de valinomicina. Ésta permite el paso de los iones del potasio pero excluye otros cationes y aniones. Una diferencia potenciométrica, entonces, refleja cualquier diferencia en la concentración de potasio entre la muestra y la solución estándar. Los iones potasio también pueden medirse usando una química del reactivo seco más convencional. La capa analítica contiene una fase orgánica hidrofóbica, que excluye todos los iones excepto aquellos cuyo pasaje es mediado por un ionóforo, como la valinomicina para el potasio. El ionóforo media el intercambio de catión H+ entre las fases acuosa (muestra) y orgánica. El cambio resultante en el pH dentro de la fase orgánica modifica el color de un colorante redox incorporado dentro de la capa analítica (Charlton y cols., 1982). Un acercamiento similar también se utiliza para la medición de la “gravedad específica” en tiras reactivas para el análisis de la orina, en la actualidad una medición de la actividad iónica total.

Gonadotropina coriónica humana Es probable que las tiras de la química del reactivo seco más usadas sean aquellas que miden la gonadotropina coriónica humana (HCG). Diseñadas para la lectura visual y disponibles para venta al público, pueden ser bastante sensibles para permitir el diagnóstico del embarazo unos días después de la concepción. Las técnicas clásicas para la medición de las cantidades traza de hormonas como la HCG confiaron en las técnicas de inmunoensayo que se desarrollaron en la década de 1960. Tales técnicas, que confiaban en cantidades limitadas de un anticuerpo y en una diferenciación posterior entre antígenos ligados y libres, se adaptaron para la metodología de capa fina. La estructura de un formato típico para la medición hormonal, el ensayo de la tiroxina sérica total, se muestra en la figura 43-4 (Nagatoma y cols., 1981). La primera capa analítica incorpora la tiroxina marcada con peroxidasa, la cual se transporta con la tiroxina sérica dentro de la segunda capa analítica. Esta última consiste de un anticuerpo para la tiroxina, covalentemente unido a la matriz. La difusión de la muestra, a través de esta capa, proporciona la repartición entre la tiroxina en la muestra y la tiroxina marcada con peroxidasa: cuanto mayor es la concentración de la tiroxina en la anterior, más baja resulta la concentración de la tiroxina marcada con peroxidasa que está unida, y más grande es la concentración de la tiroxina marcada con peroxidasa libre que está disponible para difundir a través de la tercera capa analítica (que contiene la glucosa) y dentro de la cuarta, que incorpora la glucosa oxidasa para generar peróxido de hidrógeno a partir de la glucosa y del oxígeno atmosférico. La peroxidasa de la tiroxina marcada con peroxidasa libre entonces cataliza la oxidación de un colorante redox, que

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Figura 43-4 Estructura de una tira reactiva de tiroxina Fuji®.

produce un cambio de color proporcional a la cantidad del marcador libre, que a su vez se relaciona con la cantidad de tiroxina en la muestra original. Tales tiras reactivas son complejas para fabricar, y porque las técnicas de inmunoensayo clásicas requieren tiempos de incubación largos, la sensibilidad de estos métodos en formatos de reactivo seco (quizás 10 µmol/L) es inadecuada para detectar cantidades traza de hormonas, como la HCG en los inicios del embarazo. La mayor parte de los equipos modernos para prueba del embarazo analizan la orina utilizando técnicas inmunométricas, en las cuales un exceso de anticuerpo está presente y donde los tiempos cortos de incubación son posibles. Las primeras versiones emplearon una mezcla de técnicas con reactivos húmedos y secos. Aquí un anticuerpo monoclonal para la subunidad ␣ de HCG estaba covalentemente unido a una matriz. La muestra se agregaba primero; cualquier HCG se presentaba vinculada a la matriz unida al anticuerpo. Una solución que contenía un anticuerpo marcado enzimáticamente para la subunidad ␤ de HCG se añadía e incubaba durante un tiempo corto, permitiendo la interacción en la cual la HCG intacta se intercalaba entre el anticuerpo ligado a la matriz y el marcado. Después de adicionar una solución amortiguadora para lavar la muestra sobrante y el anticuerpo marcado enzimáticamente libre de la tira, una tercera solución se añadía, conteniendo un sustrato del colorante para el marcador enzimático que generaba un producto coloreado. En ausencia de HCG en la muestra para formar el emparedado, no se desarrollaba ningún producto coloreado unido a la matriz. Un control positivo conveniente para la reacción podría incorporarse uniendo a un área de la tira el primer anticuerpo que ya había

reaccionado con la HCG intacta. Esta área de la tira entonces daba una reacción positiva, incluso en ausencia de HCG en la muestra original. Versiones más recientes de la tecnología del ensayo inmunométrico incluyen todos los componentes de las reacciones del anticuerpo monoclonal en un formato de reactivo seco. Algunas han utilizado técnicas de aglutinación de partículas, confiando en la capacidad de las partículas, como aquellas que contienen un solenoide de oro, para el cambio de color cuando se combinan en presencia de la HCG. Otras han confiado en una región del anticuerpo inmovilizado de la HCG unido covalentemente a una tira reactiva. La orina (que viaja a lo largo de la tira y no a través de ella) moviliza las partículas teñidas amortiguadas y ligadas a un anticuerpo diferente de la HCG. En presencia de la HCG en la muestra de orina, éstas forman un emparedado y producen una región coloreada discreta sobre el anticuerpo inmovilizado. Una vez más, un control positivo puede incorporarse dentro de la tira incluyendo una región del anticuerpo inmovilizado todavía unido a la HCG. Troponina T cardiaca La troponina T, llamada marcador cardiaco, es muy empleada en la actualidad para “confirmar” o “descartar” el infarto del miocardio en pacientes que presentan dolor de pecho (Collinson y cols., 2001). Debido a la velocidad con la cual se obtienen los resultados y la facilidad para usar en el lugar de atención, las técnicas químicas de capa fina se han adoptado ampliamente para su medición. Un ejemplo típico es el inmunoensayo GLORIATM desarrollado por Roche, que utiliza sangre entera. En este inmunoensayo la capa que se separa de la fibra de vidrio atrapa las células sanguíneas. Dos anticuerpos monoclonales para diferentes sitios de la troponina T se incluyen en la primera capa analítica. Uno de estos anticuerpos se conjuga con la biotina, el otro, con las partículas de oro. Los anticuerpos forman un complejo en presencia de la troponina T. La segunda capa analítica contiene estreptavidina ligada al soporte, que se une con la biotina y entonces inmoviliza cualquier complejo de la troponina T. La acumulación de las partículas del oro en el complejo de la troponina T causa la formación de un color púrpura, que puede evaluarse visualmente o usando un medidor de la reflexión (Wilding y Ciaverelli, 1999). Abuso de fármacos El “urinálisis”, el uso de una sola tira reactiva para medir diferentes componentes urinarios, se ha usado por varias décadas. La selección de diversas químicas para usar en tales tiras reactivas se ha regido más por realización técnica

CONTROL DE CALIDAD DE LA QUÍMICA DE REACTIVO SECO

que por utilidad clínica: un buen ejemplo es la incorporación de un soporte de la reacción sensible a la bilirrubina dentro de tales multitiras. Aunque todavía se utilizan mucho, su utilidad clínica dentro de un ambiente hospitalario es polémica (NICE, 2003). Una aplicación moderna de tal tecnología multitira ocurre en el desarrollo de sistemas para la detección de fármacos adictivos en la orina. Una fuerza impulsora importante en la detección son los requerimientos para evaluar asuntos de preempleo o durante el empleo en un rango muy amplio de situaciones. Tales sistemas también se usan en departamentos de accidentes y de urgencia hospitalarios, sobre todo en evaluar la presencia de fármacos adictivos, que contribuyen a una conciencia mental alterada. Muchas variantes de la tecnología existen, pero todas utilizan dos anticuerpos monoclonales, como base, para cada fármaco o grupo de fármacos; uno de ellos es capaz de unirse a un soporte sólido, y el otro, de generar una señal coloreada (Wilding y Ciaverelli, 1999). Un panel típico de fármacos incorporado en una multitira incluye pruebas para los grupos de fármacos, como barbitúricos, benzodiazepinas, narcóticos; aminas simpatomiméticas, como anfetaminas y antidepresivos tricíclicos; y fármacos o metabolitos específicos, como cocaína, metadona y tetrahidrocanabinol. Técnicamente, el desarrollo de esas tiras plantea grandes problemas. Éstos incluyen minimización de interferencia por fármacos muy relacionados; asegurar un límite apropiado de la sensibilidad aun cuando se enfrente con uno de un grupo de fármacos, los cuales pueden tener reactividad cruzada diferente con el anticuerpo incorporado (el grupo de la benzodiazepina es un ejemplo obvio); y la diferenciación entre fármacos recetados o prescritos y fármacos adictivos (p. ej., seudoefedrina y anfetamina). Incluso con controles positivos y negativos incorporados, tales tiras pueden ser leídas en forma errónea, en particular cuando son utilizadas por personal inexperto o sin experiencia en instalaciones alejadas de un laboratorio analítico. Después de encontrar un resultado positivo por este procedimiento de tamizaje debe continuarse con la verificación mediante otro método independiente (Wilding y Ciaverelli, 1999).

Control de calidad de la química de reactivo seco El control de calidad de los resultados dados por las tiras reactivas plantea problemas diferentes a aquellos del análisis de la química húmeda tradicionales. Para la última, pueden elaborarse reactivos nuevos, y las concentraciones del reactivo usadas en el análisis puede modificarlas el analista. Es, por tanto, fácil cambiar los ingredientes del análisis en respuesta al desempeño inaceptable. Pero las tiras reactivas secas no puede modificarlas el analista, y

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rara vez es obvio a partir de la inspección de la propia tira, que el desempeño analítico sea inaceptable. Un problema importante para el control de calidad, por tanto, es la identificación del desempeño pobre y la determinación de su causa. En la práctica, la causa rara vez es la propia tira reactiva. Para el fabricante y el analista, las químicas del reactivo seco plantean otro problema, porque la estabilidad a largo plazo de cada lote de tiras puede predecirse sólo a partir de la estabilidad de lotes anteriores. En la práctica, existe cierta variación de lote a lote en la estabilidad, aun cuando tiras reactivas se almacenan en condiciones ideales. Como parte de un programa para el control de calidad es necesario, por tanto, supervisar tendencias a largo plazo en el desempeño, para poder tomar la acción apropiada antes de que el control de calidad llegue a ser inaceptable.

Identificación del desempeño inaceptable: ensayos semi-cuantitativos adicionales de laboratorio En la actualidad, el área principal del uso clínico para la utilización del reactivo seco semicuantitativo es la comprobación de la orina. Una amplia gama de tiras reactivas está disponible; en ellas pueden incluirse simplemente un analito (p. ej., para glucosa o proteína), o una diversidad de analitos, los colores de cada soporte del reactivo que tienen que igualarse visualmente dentro de una secuencia de tiempo estricta con un patrón de color impresa (fig. 43-5). Aunque los ensayos semicuantitativos para la glucosa sanguínea se han reemplazado en gran parte por el uso de tiras reactivas leídas en los medidores de glucosa sanguínea, estos ensayos plantean problemas similares para el control de calidad. Además, se han introducido muchas pruebas nuevas de las tiras reactivas de laboratorio adicionales, desde la medición de fracciones de lípidos de sangre entera hasta la detección de fármacos adictivos en orina o saliva. Estos ensayos semicuantitativos pueden realizarse en diversos sitios: consultorios, clínicas, prácticas clínicas primarias, escuelas y el hogar. Poca atención se presta al desempeño, debido a que existe una creencia extendida que tales ensayos son seguros, y en una instalación hospitalaria están delegados con frecuencia al miembro más subordinado del personal del consultorio, que puede carecer de experiencia en la química analítica y sin ningún entrenamiento. La primera inspección del desempeño de los análisis de orina en las salas hospitalarias (Challand, 1987) mostró que el resultado correcto (es decir igualando el soporte del color correcto) sólo se obtuvo en casi 50% de los análisis. Alrededor de 5% de todas las mediciones dieron valores absurdos incorrectos. Hallazgos similares se han obtenido en estudios posteriores a partir de diferentes situaciones.

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Figura 43-5 Patrón de color impreso para una tira reactiva de análisis urinario de Bayer Multistix® 8SG. Reproducida con el permiso de Bayer Health Care, LLC.

CONTROL DE CALIDAD DE LA QUÍMICA DE REACTIVO SECO

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Cuadro 43-1 Algunas causas identificadas del pobre desempeño en la realización de ensayos manuales con tira reactiva

Figura 43-6 Sesgo en ensayos de la tira reactiva de proteína en orina. Seis muestras de orina prepreparadas con concentraciones proteicas correspondientes a un bloque de color diferente fueron distribuidas “a ciegas” a 11 enfermeras analistas. La figura compara concentraciones proteicas con el número de analistas que reportan cada bloque de color. Así como en la dispersión prevista de los resultados existe un sesgo sistemático, los analistas tienden a subestimar la concentración verdadera de la proteína con un bloque de color.

Con ensayos cuantitativos, es comparativamente fácil definir el desempeño numérico aceptable, o en términos de realización analítica [la aproximación de la mayor parte de los esquemas del aseguramiento de la calidad (QA) externo] o en términos de utilidad clínica (Fraser y cols., 1993, 1997). Los ensayos semicuantitativos no se prestan a un acercamiento numérico fácil. No es posible utilizar el valor medio obtenido de las distribuciones de QA como la mejor estimación del valor verdadero porque éste tiene con frecuencia un sesgo introducido por la aproximación a igualar el color más cercano o por deficiencias en la técnica (fig. 43-6). Las muestras distribuidas como parte de una inspección o de un programa de QA son, por tanto, en general sintéticas, con componentes ponderados que definen el valor verdadero (aunque esto es difícil para algunos analitos, como bilirrubina o eritrocitos). Cuando el valor ponderado corresponde a la concentración requerida para igualar exactamente un bloque de color impreso para cada analito, en la práctica sólo cerca de la mitad de quienes realizan el análisis logra la igualación correcta; casi 95% alcanza una igualación dentro de un bloque de color en forma correcta. Los resultados fuera de este rango se consideran un desempeño inaceptable. Un acercamiento alternativo es pon-

• Uso de tiras reactivas caducas • Almacenamiento de tiras reactivas en condiciones que acortan la vida media • Retiro de la tapa del envase de la tira, o eliminación del desecante • Cortar la tira por la mitad para ahorrar dinero • Usar un recipiente inadecuado para la muestra (p. ej., un recipiente blanqueado para una muestra urinaria) • Error al sumergir la tira completa reactiva para orina en la muestra • Muestra insuficiente aplicada a la tira reactiva para sangre • Realizar la prueba a una temperatura incorrecta • Lectura del soporte de color demasiado pronto, o demasiado tarde • Lectura del soporte de color equivocado sobre una tira reactiva multianalito • Condiciones insuficientes de iluminación • Visión defectuosa del analista sobre el color • Transcripción errónea de un resultado en la forma del informe • Uso de unidades incorrectas al informar

derar cantidades de componentes que produzcan un color intermedio entre dos bloques del color. Los resultados que correspondan a cualquiera de los dos bloques adyacentes del color se consideran aceptables; en encuestas en el consultorio, 10 a 20% de las entregas son inaceptables por un criterio muy escaso (Tighe P, comunicación personal). Cuando se identifica el desempeño inaceptable, se requiere encontrar la causa; algunas de las posibles causas se enumeran en el cuadro 43-1. Casi todas se deben a deficiencias en la comprensión, en el entrenamiento, o en la técnica (las cuales pueden remediarse de manera local). Es raro que la causa se deba a deficiencias en la fabricación de la tira reactiva, aunque debe mencionarse que las demandas exageradas para la exactitud probable de estas tiras en la comprobación en el lugar de atención son hechas a veces por los fabricantes. Valoración de las tendencias a largo plazo, ensayos cuantitativos Los instrumentos automáticos que usan el análisis químico de reactivo seco han estado disponibles por varios años. Éstos pueden realizar muchos análisis diferentes sobre cantidades pequeñas de suero, con una productividad y precisión de estudio que igualan a los analizadores más tradicionales de química húmeda. Las laminillas reactivas

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se compran en suficientes lotes únicos para seis meses. Si se almacenan en condiciones ideales, cada lote puede necesitar de una simple calibración antes de usarse; la estabilidad, que es bastante buena, mantiene la calidad durante la vida media del lote. Sin embargo, en la práctica, las condiciones de almacenaje pueden no ser las ideales (la diferencia de temperatura entre el piso y el techo de una cámara fría, en ocasiones es suficiente para cambiar la estabilidad) y el deterioro muy lento de las tiras reactivas no es idéntico de lote a lote. El control de calidad, por tanto, está dirigido a asegurar que la calibración inicial sea la adecuada, y vigilar el desvío lento para identificar el punto en el cual se requiere una segunda calibración, o qué laminillas sin usar deben desecharse. Los sueros convencionales para el control de calidad (QC) pueden utilizarse para ambos propósitos, pero sobrellevan desventajas. Son costosos los efectos de la matriz, en particular los relacionados con la viscosidad y con la difusión siguiente a través de las capas de una laminilla; pueden provocar que su comportamiento sea diferente en las muestras de los pacientes, y los resultados para algunos analitos cambiar de manera notable en las primeras horas posteriores a la reconstitución. Los resultados que se obtienen de muestras de pacientes pueden proporcionar información QC más confiable. Aunque dichos resultados están obviamente más dispersos que los de un suero QC convencional, más datos están disponibles para el análisis estadístico. Para la mayor parte de los analitos, los parámetros como el resultado del paciente medio (después de la exclusión de valores extremos) y el número de resultados que caen fuera de un límite preestablecido (como un “límite teléfonico” automático para la concentración del sodio sérico) son suficientemente sensibles y proporcionan casi toda la información QC necesaria. La calibración inicial puede calificarse con la comparabilidad de un promedio diario del paciente posterior a las calibraciones previas. Un desvío en el promedio diario puede utilizarse para calificar el punto en el cual la recalibración o las nuevas laminillas son necesarias. La figura 43-7 muestra una gráfica del promedio diario del paciente para los análisis del sodio sérico, mostrando la recalibración antes y después del periodo. La estadística para el control de calidad con base en muestras de pacientes puede emplearse para asegurar la comparabilidad a largo plazo de los resultados dentro de un laboratorio, pero no se asegura que los resultados sean comparables con aquellos producidos por otros laboratorios. La participación en esquemas externos del aseguramiento de la calidad puede aportar esta información, y dar información más confiable que, por ejemplo, los resultados que se obtienen analizando una muestra por control de calidad de composición conocida. Los esquemas externos del aseguramiento de la calidad están disponibles ahora para

Figura 43-7 Promedios diarios de pacientes, análisis de sodio. La grafica muestra valores promedio diarios sucesivos para los análisis de sodio sérico realizados empleando un analizador Vitros después de la calibración. Una caída en los resultados es evidente, la cual promedia casi 0.04 mmol/L cada día. La recalibración se realiza después del día 34.

los análisis de la química de capa fina realizados en el lugar de atención (Bullock, 1999), y son, es probable, los más utilizados para los análisis de glucosa sanguínea en el consultorio; la participación en tales esquemas ahora se requiere para la acreditación del laboratorio en el Reino Unido (Burnett, 2000). Las temperaturas de la tira reactiva seca y de la muestra afectan la velocidad de difusión de la muestra y la velocidad de reacción dentro de la tira, por ello el buen control de la temperatura es esencial. El funcionamiento global, según lo calificado por datos QA externos, de dos analizadores de la tira reactiva en un periodo de dos años se muestra en la figura 43-8. El control de temperatura en el laboratorio en el cual estaban situados fue menor que el ideal, y su deterioro en los meses cálidos del verano es obvio. Los analizadores automáticos, usando la química del reactivo seco y del húmedo, en ocasiones producen resultados aparentemente correctos pero absurdos. Quizá el predominio de éstos sea < 0.2%. Analizando todas las muestras por duplicado, es mínimo; y tales errores pueden detectarse sólo comparando los resultados con los previos del mismo paciente o estando alertas para detectar discrepancias entre los resultados y la información clínica provista.

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RESUMEN

Figura 43-8 Resultados QA externos globales: tendencias estacionales. Puntaje del índice de variación del funcionamiento promedio global (OMRVIS, un índice de imprecisión) para dos analizadores Vitros idénticos ubicados en el mismo laboratorio sobre un periodo de dos años. La precisión en los meses de verano es deficiente en comparación con los meses de invierno, debido tal vez al control inadecuado de la temperatura en el laboratorio.

Resumen La tecnología de la química del reactivo seco en la actualidad ha avanzado al punto en el cual casi todos los análisis convencionales de la química clínica con reactivos líquidos se pueden reproducir en formato del reactivo seco. Aunque los costos del reactivo son por lo general más altos para el último, ofrece ventajas importantes. Los volúmenes de muestra son bajos, las sensibilidades comparables con las técnicas convencionales, la precisión puede ser por lo menos buena, las técnicas son rápidas y confiables, y realizarlas requiere poca destreza analítica específica; por tanto, son apropiadas en un laboratorio de química clínica, donde su uso libera los recursos técnicos y científicos escasos para el desarrollo de nuevos ensayos y de nuevas técnicas. También se adaptan con facilidad a un ambiente cercano al paciente, por ejemplo, dentro de las aulas, en clínicas, en asistencia primaria y para que los usen los pacientes. A pesar de su evidente simplicidad, esta tecnología no es segura. Sin una atención cuidadosa que asegure la identidad del paciente, la conveniencia de la muestra, el procedimiento correcto del análisis, incluyendo coordinación, temperatura y control de calidad, y el registro exacto y apropiado de la reacción, los análisis pueden proporcionar resultados engañosos. Con una utilización cada vez más amplia de la tecnología, existen beneficios importantes para el paciente

y para el médico en la velocidad con que los resultados pueden obtenerse. El desafío para el fabricante es el desarrollo continuo, no sólo en introducir nuevos análisis sino también en la simplificación de los actuales al verificar que son tan exactos y tan libres de interferencias como sea posible. El desafío para el laboratorio analítico consiste en asegurar que dondequiera que esta tecnología se utilice, el analista está entrenado en los procedimientos analíticos apropiados y educado para estar consciente tanto de las fortalezas como de las limitaciones de la técnica.

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CAP. 43

TÉCNICAS QUÍMICAS DE REACTIVO SECO

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44 Técnicas de separación Roy Sherwood

¿Por qué separar? La mayor parte de los análisis que se realizan en laboratorios clínicos implican la detección y cuantificación de los compuestos individuales en fluidos corporales, por lo común en sangre u orina. Para este propósito, se utilizan métodos químicos o inmunológicos específicos en el compuesto de interés. Si bien tales ensayos explican la mayor parte de los análisis en el laboratorio clínico, a veces una familia de compuestos muy relacionados requiere una medición. Aunque ensayos específicos podrían desarrollarse para cada compuesto del grupo familiar, este acercamiento no es con frecuencia económico o en la práctica es menos viable que usar una técnica que pueda separar y cuantificar todos los compuestos de manera simultánea. Una variedad amplia de técnicas de separación se utiliza en los laboratorios clínicos, pero casi siempre se basa en el principio de la separación cromatográfica o electroforética. La cromatografía en todas sus variantes, por ejemplo, de capa fina (TLC), de alto rendimiento (HPLC) o la gaseosa (GC), puede utilizarse para separar muchos tipos diferentes de compuestos desde moléculas pequeñas, como aminoácidos y fármacos hasta proteínas como la hemoglobina glucosilada. La electroforesis, por otra parte, se emplea para la separación de proteínas, casi cualquier proteína (p. ej., proteínas séricas), o para identificar variantes de una en particular (p. ej., variantes heredadas de hemoglobina).

Cromatografía La cromatografía cumplió 100 años en 2003. M.S. Tswett de la Universidad de Varsovia describió primero el uso de la

adsorción para separar los pigmentos de una hoja de planta en marzo de 1903. El principio de los diferentes tipos de cromatografía es la interacción de las moléculas de interés entre una fase móvil (líquida o gaseosa) y una estacionaria (sólida). Esas moléculas que interactúan con la fase estacionaria se mueven más lento a través de una placa, o de una columna, que las que no interactúan y, por consiguiente, se produce una separación de moléculas desde el interior de una mezcla. El control de estas interacciones, y por tanto de la separación, se alcanza explotando las diferencias sutiles de ciertas propiedades físicas de las diferentes moléculas en las muestras, por ejemplo, su solubilidad en agua o en solventes orgánicos, la carga neta y el tamaño. El cuadro 44-1 detalla las propiedades moleculares que rigen la separación en las diversas formas cromatográficas.

Cromatografía de capa fina (TLC) Principios La TLC reemplazó a la cromatografía de papel en la década de 1960 y en la actualidad se le está sustituyendo en una gran parte por la HPLC. En la TLC la fase estacionaria (por lo común alúmina, gel de sílice o celulosa) se fija sobre una placa de cristal, plástico o metal. Una mezcla solvente (fase móvil) aplicada a un extremo de la placa viaja a lo largo de ella por atracción capilar y produce la separación cromatográfica de los solutos en una muestra aplicada a la placa. A menos que sean fluorescentes, la mayor parte de los compuestos requieren la derivación (modificación química) para que puedan ser visualizados; esto se logra rociando con, o sumergiendo la placa en, reactivos cromogénicos.

The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker. © 2005 John Wiley & Sons, Ltd.

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TÉCNICAS DE SEPARACIÓN

Cuadro 44-1 Propiedades moleculares que gobiernan la separación dentro de las varias formas cromatográficas Propiedad

Tipo de cromatografía

Propiedades de adsorción Partición Interacciones antígenoanticuerpo o enzima-sustrato Tamaño y forma molecular Carga iónica

TLC, HPLC GC, HPLC Afinidad Filtración en gel Intercambio iónico

La información cualitativa puede obtenerse observando simplemente la placa y la identificación de las manchas individuales con mediciones del factor de retención (Rf, distancia recorrida por la muestra dividida por la distancia total recorrida por el frente del solvente). La mayor resolución se obtiene corriendo la placa una segunda vez, pero en la dirección del solvente a 90° de aquella primera corrida (TLC bidimensional [TLC 2-D]). La desventaja de la TLC 2-D es que sólo una muestra se aplica a cada placa. La cuantificación requiere el uso de un densitómetro que pueda examinar la placa, o la elución de la mancha a partir de la fase estacionaria seguida por una medición colorimétrica. La TLC 2-D experimenta, sin embargo, un interesante resurgimiento por los progresos en el campo de los proteómicos. Después de la TLC 2-D, el patrón de las manchas correspondientes a las proteínas individuales se compara entre los individuos con una enfermedad particular y con los controles, y las manchas que difieran en intensidad entre los grupos son eluidas de la placa para identificar la proteína específica implicada. Aplicaciones La TLC se utiliza ahora más como una técnica de tamizaje, ya que es relativamente rápida, económica y fácil respecto a otros métodos cromatográficos. Las aplicaciones para TLC en un laboratorio clínico incluyen ensayos de aminoácidos, fármacos y carbohidratos. Aminoácidos Los programas de tamizaje neonatal existen en muchos países para la detección temprana de niños con fenilcetonuria. Aunque los métodos espectrofotométricos o HPLC específicos existen para la fenilalanina, muchos laboratorios de tamizaje prefieren utilizar un método TLC 1-D que separe los aminoácidos básicos, neutros y ácidos, debido a que este método tiene el potencial para la identificación de otros desórdenes del aminoácido, por ejemplo, tirosi-

nemia, enfermedad de la orina con olor a jarabe de arce, etc. La confirmación de la identidad de un aminoácido incrementado anormalmente puede conseguirse por TLC 2-D o HPLC, por ejemplo, el patrón característico de los aminoácidos con cadena ramificada incrementados de forma anormal (leucina, isoleucina y valina) en la enfermedad de la orina con olor a jarabe de arce. Avances recientes en la tecnología relacionados con la cromatografía líquida, en particular en combinación con espectrometría de masa (LC-MS; véase más adelante), condujeron a una reducción en el uso de TLC en los programas de tamizaje neonatal. Fármacos El tamizaje de fármacos urinarios es complicado por la diversidad de fármacos disponibles para uso “recreacional” o tomados de manera deliberada o accidental en sobredosis, incluyendo compuestos básicos, neutros y ácidos. En el paciente inconsciente o no cooperativo, poca información puede estar disponible sobre el consumo de fármacos específicos. La TLC es con frecuencia la técnica elegida para el tamizaje inicial, y sistemas comerciales, por ejemplo, Toxilab®, están disponibles. Éstos tienden a tener placas separadas y sistemas de solventes para fármacos ácidos y básicos, incluidos los neutros en cualesquiera de los sistemas. La nebulización secuencial de diversos reactivos cromogénicos produce colores diferentes que tiñen a los diferentes fármacos, permitiendo así una identificación más sencilla. En años recientes, sin embargo, surge un movimiento significativo que se dirige a emplear inmunoensayos enzimáticos en analizadores automáticos para el tamizaje de primera línea de fármacos adictivos. Carbohidratos La TLC es la técnica elegida para el tamizaje inicial de muestras de orina o fecales de infantes sintomáticos con desórdenes metabólicos de carbohidratos, por ejemplo, fructosuria, etc. Sólo se requieren resultados cualitativos para esta aplicación, pero el desarrollo de pruebas para la función y la integridad del tracto gastrointestinal que usan azúcares administrados por vía oral crea la necesidad de una TLC cuantitativa de los azúcares. Ocurre, por ejemplo, cuando se emplea una mezcla de mono y disacáridos (xilosa, ramnosa, 3-o-metilglucosa y lactulosa), que cruzan la pared del tracto gastrointestinal vía diversos mecanismos, para evaluar la permeabilidad del intestino por el diagnóstico diferencial de la enfermedad del tracto gastrointestinal. La reducción de la superficie intestinal disponible para la absorción (p. ej., enfermedad celiaca) conduce a una reducción progresiva en la absorción intestinal de monosacá-

CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)

ridos, mientras el daño a la integridad de la pared intestinal (p. ej., enfermedad de Crohn) se perfila como un aumento en la absorción de disacáridos.

Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) Principios La HPLC es la forma más común de cromatografía que se emplea en el laboratorio clínico. Un mejor funcionamiento se logra al contener la fase sólida en columnas estrechas (de 150 ⫻ 5 mm) y bombeando la fase móvil a través de la columna bajo presión (de 1.5 a 2.0 ⫻ presión atmosférica). Aunque los mecanismos de intercambio iónico o de exclusión por tamaño de separación se utilizan de cuando en cuando en la HPLC, la mayor parte de los métodos se basa en la adsorción de las moléculas en la fase sólida. En la HPLC, en fase normal, los grupos de enlace hidrófilos sobre la superficie de un material de embalaje de silicona atraen moléculas hidrofílicas pero no hidrofóbicas, lo contrario es verdad para HPLC en fase inversa. Así, en la HPLC en fase normal una fase móvil de polaridad incrementada remueve con más eficacia moléculas polares de la fase sólida, mientras en la HPLC en fase inversa las fases móviles (orgánicas) remueven más rápido moléculas no polares de la fase sólida. La HPLC en fase inversa, por tanto, favorece la separación de las moléculas neutras, que predominan en los fluidos biológicos. Equipo para HPLC Los componentes de un sistema de HPLC comprenden una bomba o bombas, sistema de introducción de la muestra (inyector de jeringuilla o automuestrador), columna, detector y un sistema de recolección de datos (registrador de gráficas o computadora). Para la mayor parte de las aplicaciones, una sola fase líquida puede utilizarse todo el tiempo a una tasa de flujo constante (1 a 2 ml/min), es decir una elución isocrática. Sin embargo, en algunas aplicaciones complejas donde compuestos que se separan son similares en estructura, es necesario variar la composición de la fase líquida durante el análisis, es decir, la elución por gradiente. Un ejemplo donde ocurre ésta es en la separación de aminoácidos en sangre u orina. La selección del método de detección para HPLC es dependiente del tipo de analito con detección ultravioleta (UV), fluorescente y electroquímica (EC), la que se utiliza de rutina. La detección UV predomina en la HPLC en fase inversa pero es raro que se emplee en métodos de fase normal, ya que la concentración alta del solvente orgánico en

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la fase móvil produce una absorción de fondo grande entre 190 y 230 nm. La detección fluorescente tiene sensibilidad alta, pero requiere compuestos que tengan fluorescencia natural o que químicamente se modifiquen para inducir fluorescencia. La detección electroquímica se basa en la oxidación de los compuestos en un electrodo de carbón o metálico; puede ofrecer sensibilidad y especificidad excelentes para compuestos particulares. La espectrometría de masa (MS) se utiliza como un modo de detección en combinación con la cromatografía gaseosa desde hace muchos años. Los grandes volúmenes de líquido fluyendo a través de un sistema de cromatografía líquida (LC) típico con una velocidad de flujo de 1 ml/min evitaron la combinación de LC y de MS al inicio. La introducción de LC microporo (diámetro interno < 1) y los avances en la producción de los aerosoles líquidos muy finos (electronebulización) han impulsado para que LC-MS se torne una técnica viable. La LC-MS o MS en tándem (MS-MS) es probable que sean las técnicas de separación que crecen más rápido en el laboratorio clínico. Preparación de la muestra para muestras biológicas Una complicación que surge en el análisis de las muestras biológicas usando la HPLC se debe al alto contenido proteico en muchos fluidos corporales (cerca de 70 g/L en plasma y suero); que puede producir interferencia de fondo y conducir a la obstrucción de la columna, así que alguna forma de preparación de la muestra se requiere, por lo regular, antes del análisis. La forma exacta de preparación de la muestra varía con el uso específico, pero por lo común, se realiza la desproteinización o la extracción del compuesto de interés, o ambas. Las extracciones líquido-líquido y en fase sólida se utilizan para los métodos de HPLC que involucran muestras sanguíneas. Cuando se utiliza orina, la interferencia en los métodos de detección UV o fluorescentes suele ocurrir si pigmentos coloreados o fluorescentes están presentes, y alguna forma de extracción es a menudo necesaria, ya sea líquido-líquido o en fase sólida. Aplicaciones La mayor parte de las aplicaciones de la HPLC en la medicina de laboratorio cae dentro del campo de la bioquímica clínica, aunque los hematólogos también utilizan la técnica. Los grupos de compuestos que por lo regular se analizan por la HPLC en el laboratorio clínico incluyen aminas biogénicas, aminoácidos, porfirinas, fármacos, vitaminas, hemoglobina y carbohidratos. Se han descrito muchas otras aplicaciones específicas para propósitos de investigación, incluyendo los nucleósidos, productos de degradación del

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TÉCNICAS DE SEPARACIÓN

colágeno y esteroides, pero éstos no se convierten con frecuencia en parte del repertorio de rutina de las pruebas. Aminas biogénicas Las catecolaminas, adrenalina, noradrenalina y dopamina, y sus metabolitos, se miden en muestras plasmáticas y urinarias para la detección de tumores. Los feocromocitomas secretan cantidades grandes de adrenalina o noradrenalina, o ambas, que se metabolizan con ácido 4-hidroxi-3-metilmandélico (HMMA). El incremento en las concentraciones de catecolaminas y HMMA puede detectarse en la orina de pacientes con feocromocitoma empleando la HPLC en fase inversa con detección electroquímica. Esta técnica se utiliza también para detectar cantidades anormalmente altas de dopamina y de su metabolito el ácido homovanílico (HVA), producido por los neuroblastomas en niños. La serotonina (5-hidroxitriptamina, 5-HT) se sintetiza a partir del triptófano y se metaboliza a ácido acético 5-hidroxiindol (5-HIAA) por monoaminooxidasas. Los tumores carcinoides secretan cantidades anormales de 5-HT y la medición de las concentraciones de serotonina sanguínea/urinaria o de la excreción urinaria de 5-HIAA es útil en la detección de tumores y en la vigilancia de la terapia. Los métodos para la determinación simultánea de HMMA, HVA y 5-HIAA por la HPLC en fase inversa están dentro de los métodos de rutina en los laboratorios clínicos.

redados (porfirias) con deficiencias específicas enzimáticas que conducen a la acumulación de precursores. La presentación clínica de las porfirias es diversa, desde fotosensibilidad crónica a dolor abdominal agudo, y aunque cierta idea del diagnóstico exacto puede conocerse por los síntomas, la caracterización del tipo de porfiria requiere la identificación de su patrón en sangre, orina y heces. Ésta es posible lograrla por la extracción líquido-líquido de las porfirinas, seguida por la HPLC en fase inversa con detección UV o fluorescente, puesto que las porfirinas tienen fluorescencia natural. Un ejemplo de separación de porfirinas por la HPLC se muestra en la figura 44-1. Mezcla estándar de porfirianas HPCL sobre Hipersil SAS con detección fluorimétricas

Aminoácidos El uso de la TLC para la identificación cualitativa de anormalidades en el metabolismo de los aminoácidos se describió antes. La cuantificación de aminoácidos específicos es con frecuencia necesaria, en particular para la vigilancia terapéutica en desórdenes como fenilcetonuria, tirosinemia o enfermedad de la orina de jarabe de arce. El primer sistema HPLC especializado que se crea es el analizador de aminoácidos, que se fundamenta en la detección espectrofotométrica después de la reacción poscolumna con ninhidrina para producir derivados a color. En la actualidad se han creado muchos métodos alternativos de la derivación para separar aminoácidos por la HPLC en fase inversa con detección UV, fluorescente o electroquímica (véanse Lecturas adicionales). Porfirinas Los porfirinas son tetrapirroles cíclicos que se forman por oxidación de los porfirinógenos, intermediarios de la vía biosintética del hem. Existe una clase de desórdenes he-

Figura 44-1 HPLC de una mezcla estándar usada para el análisis de porfirina urinaria. Los picos corresponden a uroporfirina (8COOH), heptaporfirina (7COOH), hexaporfirina (6COOH), pentaporfirina (5COOH), coproporfirina (4COOH) y mesoporfirina (2COOH). Columna, 0.8 ⫻ 15 cm Hipersil SAS (5 ␮m). Elución por gradiente y detección UV (400 nm).

Fármacos Las técnicas de inmunoensayo sustituyen en la actualidad a la HPLC como método de rutina para muchos de los anticonvulsivos establecidos, por ejemplo, fenitoína, fenobarbital, valproato y carbamazepina. Sin embargo, la más nueva generación de anticonvulsivos, incluyendo lamotrigina, vigabatrina, gabapentina, topiramato, leviteracetam y oxacarbazepina, se mide por la HPLC en fase inversa con detección UV. La vigilancia terapéutica del fármaco, sin embargo, se considera que es menos importante para

CROMATOGRAFÍA DE GASES (GC)

muchos de los anticonvulsivos más nuevos respecto de los más antiguos, pues tienen amplias vistas terapéuticas (lamotrigina, topiramato y leviteracetam) o su concentración plasmática se correlaciona de manera escasa con la eficacia clínica (gabapentina, vigabatrina). La vigilancia, por lo tanto, se realiza sobre todo si se sospecha inconformidad con la terapia. Otros fármacos Se han desarrollado ensayos para miles de otros fármacos en fluidos biológicos. Los lectores que buscan información adicional deben consultar la sección Lecturas complementarias al final de este capítulo. El uso de técnicas de separación, que incluyen la LC, tiene una importancia particular cuando un fármaco contiene un metabolito activo que necesite medirse junto al fármaco de origen, por ejemplo, amiodarona, dotiepina, etcétera. Vitaminas Las vitaminas son un grupo diverso de compuestos, pero casi todas se han medido en sangre u orina por la HPLC (véanse Lecturas adicionales para consultar detalles). Hemoglobinas incluyendo la hemoglobina glucosilada Más de 400 variantes estructurales de la hemoglobina se conocen, la mayor parte de las cuales no tiene ninguna secuela clínica para el individuo. Sin embargo, algunas variantes se relacionan con patologías, por ejemplo, HbS (hemoglobina de la enfermedad de la célula falciforme). Un diagnóstico definitivo requiere la identificación de la variante presente. Recientemente, la separación de hemoglobinas se logró por electroforesis, pero han aparecido varios sistemas comerciales de HPLC especializados con base en la cromatografía de intercambio iónico. Éstos tienen una ejecución más rápida de la muestra y son útiles en el tamizaje poblacional para hemoglobinopatías. Las modificaciones a estos sistemas permiten que se les emplee para cuantificar la fracción glucosilada de la hemoglobina, HbA1c, con un tiempo analítico cíclico de 4 a 8 minutos. Una versión de la HPLC del método cromatográfico de afinidad al gel boronato, también disponible, tiene la ventaja de que no lo afecta la presencia de variantes heredadas de la hemoglobina. Un método de referencia establecido para la medición de HbA1c implica la descomposición de la hemoglobina en péptidos que realiza la endoproteinasa Glu-C, seguida por la separación y cuantificación de los hexapéptidos por HPLC-ionización por electronebuliza-

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ción y análisis de espectrometría de masas (ESI-MS) o electroforesis por HPLC capilar.

Carbohidratos La tamización de desórdenes heredados del metabolismo de los carbohidratos se realiza por lo general por TLC, como se describe antes. La cuantificación de carbohidratos específicos no es con frecuencia necesaria, pero el desarrollo de estudios de absorción/permeabilidad intestinal de azúcares hace necesaria la medición exacta de azúcares específicos en orina, por ejemplo, lactulosa, ramnosa, xilosa, cuando se requiere la cuantificación. La separación puede alcanzarse usando la cromatografía de intercambio iónico pero la detección es difícil, pues los carbohidratos no tienen propiedades UV ni fluorescencias utilizables. La aparición de la detección electroquímica amperimétrica pulsada mejora mucho la situación, aunque el progreso es lento.

Cromatografía de gases (GC) Principios En la GC, los compuestos de interés se separan por la partición entre el soluto en una corriente de un gas transportador inerte (nitrógeno, argón o helio) y un líquido de volatilidad baja sujeto a un soporte inerte (de ahí su nombre anterior, cromatografía gas-líquido, o GLC). El soporte inerte es, por lo general, de microperlas de cristal o polímeros halogenados sintéticos y un polialcohol derivado o silicona. Por convención las columnas de GC son de 1 a 3 m de largo con un diámetro interno de 2 a 6 mm, pero en la mayor parte de las aplicaciones clínicas se emplean columnas capilares, que pueden ser de hasta 40 m de longitud con un diámetro interno de 0.2 a 0.5 mm. Las ventajas de la GC capilar son por lo general una resolución mejorada y tiempos de corrida más cortos. Los sistemas de detección disponibles para GC son ionización a la flama (FID), captura de electrones (ECD) y espectrometría de masas (GC-MS). Una comparación de GC normal contra GC capilar y de los detalles de la forma de acción de los tipos de detectores se presenta la en revisión de Lewis y Sampson (1994). Aplicaciones Los compuestos que pueden separarse por GC deben ser volátiles o capaces de convertirse a un estado volátil por derivación. Éstos incluyen alcoholes, esteroides, fármacos, ácidos orgánicos y ácidos biliares.

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TÉCNICAS DE SEPARACIÓN

Alcoholes El etanol y el metanol son compuestos volátiles que se miden muy rápido por GC con FID. Una columna de GC normal puede utilizarse, pues la resolución adicional de la GC capilar es innecesaria. Las mediciones del glicol de etileno en toxicidad sospechada son también factibles. Esteroides El perfil esteroideo urinario proporciona información sobre la producción y metabolismo de esteroides a partir de la glándula suprarrenal, testículos y ovarios. Es en particular importante en la evaluación de niños de género incierto o con desarrollo sexual precoz. También existe considerable interés en esta medición para detectar el abuso de esteroides anabólicos en los atletas. Usando la GC capilar con FID después de la derivación de los esteroides, hasta 25 esteroides y metabolitos pueden detectarse y cuantificar en una corrida (fig. 44-2). La disponibilidad y la reducción más amplias, por el costo de instrumentos GC-MS condu-

cen hacia el reemplazo de la GC capilar convencional de esteroides por GC-MS. Fármacos Los fármacos que no se miden fácil por HPLC, por ejemplo, valproato, antidepresivos tricíclicos, etc., su ensayo se practica con frecuencia por GC, o para la vigilancia de fármacos terapéuticos o para propósitos toxicológicos. La mayor parte de los sistemas utiliza columnas normales de la GC con FID, pero GC-MS tiene un papel particular en la confirmación de exámenes positivos de fármacos adictivos que se obtienen por TLC, EMIT u otros inmunoensayos. Los métodos específicos para varios fármacos se pueden encontrar en el texto de Ghosh (1992). Ácidos orgánicos Las enfermedades heredadas que producen cambios en la excreción ácida orgánica incluyen enfermedades específicas, por ejemplo, acidemia propiónica, y a las relacionadas con anormalidades del ciclo de la urea. Las mediciones de ácido orgánico urinario se realizan por lo común usando GC-MS capilar. La ventaja adicional de MS como detector es la identificación positiva de cualquier compuesto poco común.

Electroforesis Principios

Figura 44-2 Cromatograma típico a partir de un análisis por GC capilar de derivados del éter metil oxima-trimetilsilil (MOTMS) de esteroides en la orina de una mujer adulta normal. Los picos máximos son como sigue: A, B, C, estándares internos; 1, androsterona; 2, etiocolanolona; 3, dehidroepiandrosterona; 4, 11-oxo-etiocolanolona; 5, 11␤-OH androsterona; 6, 11␤-OH etiocolanolona; 7, 16␣-OH dehidroepiandrosterona; 8, pregnanediol; 9, pregnanetriol; 10, androstenetriol; 11, tetrahidrocortisona; 12, tetrahidro-11-dehidrocorticosterona; 13, allo-tetrahidrocorticosterona; 14, tetrahidrocortisol; 15, allo-tetrahidrocortisol; 16, ␣-cortolona; 17, ␤-cortolona; 18,␣-cortol.

La separación electroforética se basa en la migración diferenciada de moléculas cargadas bajo influencia de un potencial eléctrico aplicado. Las moléculas que pueden separarse por electroforesis deben llevar una carga neta positiva o negativa en su estado natural, por ejemplo, muchas proteínas y aminoácidos, o deben aceptar una carga, por ejemplo, carbohidratos acomplejados con iones borato. El ambiente químico alrededor de la molécula, la solución electrolítica, debe ser capaz de conducir una corriente eléctrica, pero también tiene un papel crítico en la determinación del estado de ionización y, por tanto, en la carga de cualquier molécula en contacto con él. La opción del electrólito y de su pH es crítica para alcanzar movilidad y separación óptimas. El movimiento de la partícula cargada es causado por la acción de la fuerza eléctrica. La velocidad de la migración depende de la relación entre el potencial aplicado y la distancia entre los electrodos, la migración más grande puede obtenerse al aumentar el voltaje aplicado o al disminuir la distancia entre los electrodos. El paso

ELECTROFORESIS

de una corriente eléctrica genera calor, y las condiciones óptimas tienen que equilibrarse con la maximización de la separación. Una fuerza que retarda, la cual está en función del tamaño molecular y de la viscosidad de la solución, neutraliza la migración hacia adelante inducida por el campo eléctrico. La velocidad de la migración es, por tanto, directamente proporcional a la fuerza del campo y a la carga neta de la molécula e inversamente proporcional al tamaño de la partícula y a la viscosidad de la solución. La separación electroforética se puede llevar a cabo en solución libre pero por lo general se utiliza alguna forma de medio de soporte sólido, por ejemplo papel, acetato de celulosa, gel de agar o gel de poliacrilamida. En los últimos 10 años, el interés se ha centrado en realizar la electroforesis en tubos capilares estrechos a voltaje alto, es decir, electroforesis capilar. Aplicaciones La electroforesis se empleó por primera vez en el laboratorio clínico en la década de 1950 para la separación de proteínas séricas. Desde entonces, se desarrollan aplicaciones para separar proteínas del suero, isoenzimas (p. ej., creatina cinasa, fosfatasa alcalina, etc.), variantes de la hemoglobina y fragmentos de DNA resultado de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En cuanto a la cromatografía, existen muchas otras aplicaciones, por ejemplo la separación de

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lipoproteínas, pero éstas permanecen en el dominio de la investigación y no se emplean como pruebas de rutina. Electroforesis de proteínas séricas El uso principal de la separación electroforética de las proteínas séricas es para la identificación de gammopatías monoclonales, aunque se continúa utilizando para demostrar los cambios relacionados (no específicos) con una variedad de condiciones, por ejemplo, el síndrome nefrótico. Los métodos iniciales para la electroforesis de proteínas séricas utilizaron acetato de celulosa como medio de soporte, pero éste produjo resolución limitada de las proteínas séricas y se han reemplazado en gran parte por la electroforesis en gel de agarosa. Las proteínas séricas se separan en las bandas principales correspondientes a la albúmina, ␣1-globulinas, ␣2-globulinas, ␤-globulinas (␤1 y ␤2) y ␥-globulinas. Si se utiliza plasma en lugar de suero, una banda adicional de fibrinógeno está presente, por lo común entre las regiones ␤y ␥-globulina (fig. 44-3). La visualización después de teñir con rojo de Ponceau o azul brillante de Coomassie es por lo general adecuada para detectar alteraciones a grosso modo, pero la exploración densitométrica puede emplearse si se requieren datos cuantitativos sobre las fracciones individuales, es decir, si una paraproteína está presente. Incluso la mayor resolución se puede obtener usando los geles de poliacrilamida, pero este valor es raro en el uso clínico de ru-

Albúmina

Figura 44-3 Electroforesis de proteínas séricas en gel de agar: a) patrón normal; b) aumento monoclonal en ␥-globulinas debido a cirrosis hepática; c) gammapatías monoclonales (IgG) con paresia inmunitaria.

436

CAP. 44

TÉCNICAS DE SEPARACIÓN

tina. Los sistemas automatizados para la electroforesis de proteínas séricas están disponibles en la actualidad. Isoenzimas Muchas de las enzimas que se miden de rutina en suero existen como mezclas de isoenzimas, cada una de las cuales puede producirse por un sistema orgánico diferente en el cuerpo, por ejemplo, la creatina cinasa (CK) sérica es una mezcla de CK-MM (del músculo esquelético), de CK-MB (predominante del corazón) y de CK-BB (del cerebro). Con la electroforesis puede distinguirse si la causa de una CK total elevada es un daño del músculo cardiaco o el esquelético. La separación se consigue usando geles de agar recubiertos con un sustrato sintético para la enzima que produce un compuesto fluorescente visible bajo luz UV cuando es activado por la CK. Aunque la medición de las troponinas específicas del corazón ha sustituido en gran parte las mediciones CK-MB en muchos laboratorios, la electroforesis sigue como el único método capaz de detectar la presencia de los complejos macro-CK. La electroforesis también se utiliza para separar la fosfatasa alcalina en formas hepática, ósea, placentaria e intestinal, y para determinar el patrón de isoenzimas de la lactato deshidrogenasa. Hemoglobina Hasta la reciente introducción de los métodos de HPLC para la identificación de las variantes de la hemoglobina, los métodos electroforéticos se emplearon con mucha frecuencia, fundamentados sobre la carga global diferente en la molécula de la hemoglobina causada por las sustituciones del aminoácido. El acetato de celulosa se mantuvo como el medio de soporte normal para los métodos de tamizaje, con la electroforesis del gel de agar citrato usada para la identificación positiva de cualquier variante anormal vista en el tamizaje. La separación de las variantes de la hemoglobina por electroforesis con gel de citrato confía en las interacciones de los aminoácidos sustituidos con agaropectina. Las hemoglobinas variables con sustituciones cerca de la superficie, por ejemplo, HbS y HbC, se retienen, mientras que en las sustituciones más profundas no ocurre, como HbD y HbG. Combinaciones complejas de electroforesis o el enfoque isoeléctrico se requieren para identificar hemoglobinopatías raras. Fragmentos de DNA obtenidos por PCR Aunque fuera del alcance de esta sección, merece la pena recordar que muchas de las técnicas moleculares actuales

introducidas en el laboratorio clínico incluyen la separación electroforética de fragmentos de la restricción del DNA, después de amplificación por PCR. El gel de agar es el medio usado en la mayor parte de las aplicaciones en la biología molecular, con la visualización por radiomarcaje o por tinción con bromuro de etidio. Un ejemplo del empleo de tales técnicas es la detección de las dos mutaciones en el gen HFE relacionado con hemocromatosis genética: los cambios aminoacídicos C282Y y H63D. Electroforesis capilar (EC) Aunque la electroforesis en un capilar estrecho se describió primero en 1937, es desde 1985 que la técnica se emplea de manera independiente. Se utilizan capilares de 25 a 100 µm de diámetro y de 25 a 100 cm de longitud; sus extremos se colocan en viales con amortiguador, que también contienen los electrodos. Voltajes muy altos (10 a 30 kV) se aplican para producir el flujo electroendosmótico dentro del capilar. El tipo pH y la fuerza iónica del amortiguador que llena el tubo capilar son críticos para lograr la separación deseada. Existen cuatro formas importantes de separación por electroforesis capilar: electroforesis capilar de zona (CZE) o separación en solución libre; cromatografía capilar electrocinética micelar (MECC); enfoque isoeléctrico capilar (CIEF) e isotacoforesis capilar. Los principios de estas formas diferentes de separación y los usos potenciales en la medicina de laboratorio fueron revisados hace poco. Se ha desarrollado un instrumento comercial que usa CE para la electroforesis de proteínas séricas (Beckman Instruments). Éste utiliza varios tubos capilares en paralelo para alcanzar un alto rendimiento e incluye la identificación de paraproteínas usando la técnica de inmunosustracción. La CE se convirtió en la metodología dominante en el Proyecto del Genoma Humano, y es la base para la generación actual de los secuenciadores de DNA del banco principal.

Lecturas adicionales Chace DH. Mass spectrometry in the clinical laboratory, Chem Rev 2001; 101: 445-477. Ghosh MK. HPLC Methods in Drug Analysis. 1992: Springer Verlag, Berlin. Lehmann R, Voelter W, Liebich HM, Capillary electrophoresis in clinical chemistry, J. Chromatogr B1997; 697: 3-35. Lewis J, Sampson D. Chromatography for the clinical biochemist. Clin Biochem Rev 1994; 15: 56-63. Sherwood RA. Liquid chromatography: applications in clinical analysis. In Encyclopaedia of Analytical Science, 2nd edn. 2004: pp. 267-76 Academic Press, London.

SECCIÓN 8

INMUNOLOGÍA KWWSERRNVPHGLFRVRUJ

45 Ensayos proteicos David Burnett

Introducción

narios, como los descritos en este capítulo, existen, sin embargo, realmente sólo dos propiedades básicas utilizadas:

Las técnicas cualitativas y cuantitativas para el análisis proteico son herramientas esenciales en el laboratorio rutinario de inmunología, cuya remisión incluye el análisis de algunas proteínas en sangre y en otros fluidos corporales. Entre las proteínas de mayor interés específico para el inmunólogo se incluyen las inmunoglobulinas (anticuerpos), las proteínas del sistema del complemento y, más recientemente, las citocinas, que tienen una función en el sistema inmunitario. El propósito de este capítulo es aportar una descripción breve de los principios de los métodos que se usan para el análisis proteico rutinario. Aunque algunos de los métodos descritos se utilizan para el estudio de las proteínas del sistema del complemento, la naturaleza de este sistema exige consideraciones especiales para la interpretación exacta. Por tanto, los ensayos para las proteínas del complemento se describen con detalle en el capítulo 46. De manera similar, los ensayos para los anticuerpos autoinmunitarios se tratan en el capítulo sobre enfermedades del complejo inmunitario y crioglobulinas (cap. 48). El propósito principal de los análisis rutinarios de laboratorio en inmunología es detectar, caracterizar y medir la cantidad de:

1. Las proteínas individuales tienen una carga eléctrica característica, lo que significa que diferentes proteínas específicas pueden separarse por electroforesis.

1. Deficiencias de proteínas específicas, como en la deficiencia de inmunoglobulinas. 2. Expresión anormal o inadecuada de proteínas, por ejemplo, en gammapatías monoclonales, enfermedad autoinmunitaria o atopía. Los métodos para el análisis de proteínas confían en una variedad de principios. Para la mayoría de los ensayos ruti-

2. Cada proteína humana específica tiene una estructura única, que puede emplearse para generar anticuerpos contra esa proteína, del tipo de los anticuerpos policlonales al inmunizar animales con la proteína en cuestión, o anticuerpos del tipo monoclonal mediante la tecnología del hibridoma. Los anticuerpos específicos para una proteína son la base de los ensayos inmunitarios. La selección de un método de ensayo apropiado depende del requerimiento de un resultado cualitativo o cuantitativo. Además, la concentración de la proteína de interés es crucial para la elección de la prueba, por ejemplo, la detección o medición de inmunoglobulinas monoclonales y oligoclonales en líquido cefalorraquídeo (LCR) y orina puede requerir la concentración de la muestra o la selección de un método más sensible que el elegido para especímenes del suero.

Una breve perspectiva histórica Los principios de la electroforesis, el método de separación molecular en una carga eléctrica, sólo se conocieron por algún tiempo cuando el sueco Arne Tiselius, en 1930, sospechando la naturaleza compleja de las proteínas sanguíneas, comenzó a experimentar con la electroforesis del suero en un medio líquido con amortiguador. En 1937 identifi-

The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker. © 2005 John Wiley & Sons, Ltd.

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CAP. 45

ENSAYOS PROTEICOS

có varias zonas discretas de la proteína, que podrían verse después de la electroforesis del suero; las llamó albúmina, ␣-globulina, ␤-globulina y ␥-globulina, teniendo la primera la movilidad más rápida hacia el ánodo y la ␥-globulina la más lenta. Esta nomenclatura básica sigue vigente (véase adelante). En la década de 1950 desempeñó un importante papel como medio de soporte; posteriormente se introdujo el uso del acetato de celulosa y de los geles como el agar, la agarosa y la poliacrilamida. En la actualidad, la electroforesis, en fase líquida, se reintrodujo para las pruebas rutinarias (véase adelante). Bechhold, en 1905, demostró que un antígeno proteico y un anticuerpo para ese antígeno pueden formar un precipitado. Sin embargo, Oudin, en 1946 describió un desarrollo útil de este principio y en 1948 Elek y Ouchterlony introdujeron la “difusión doble” en un gel independiente. Este método simple, que todavía se utiliza (se describe más adelante), se continúa llamando “método de Ouchterlony”. Grabar y Williams, en 1953, combinaron la separación electroforética de las proteínas séricas con la inmunoprecipitación (inmunoelectroforesis cualitativa), usando anticuerpos policlonales para suero completo, y lograron que la naturaleza verdadera de la heterogeneidad de las proteínas del suero fuese reconocida. Cuando las proteínas específicas comenzaron a purificarse y los anticuerpos para ellas se crearon en animales, se logró realizar análisis inmunitarios cuantitativos específicos. La inmunodifusión radial (técnica de Mancini) se introdujo en 1965 y ésta todavía se emplea de rutina (véase adelante). La sensibilidad del ensayo cuantitativo de la proteína mejoró desde entonces, con radioinmunoensayos e inmunoensayos enzimáticos que permiten mediciones realistas bajo el orden de varios ng/ml.

Técnicas cualitativas Electroforesis La electroforesis de la proteína del suero, aunque presenta una resolución limitada, es un método fundamental para analizar muestras para anormalidades de la proteína a grosso modo. El medio de soporte para la electroforesis en gel es, por lo general, una membrana de acetato de celulosa o gel de agarosa. Los amortiguadores varían pero se basan en barbitona, con un pH cercano a 8.5. Geles o membranas para la electroforesis rutinaria están disponibles en el comercio y se utilizan con frecuencia para minimizar el tiempo de preparación y asegurar resultados constantes. La membrana de soporte se coloca sobre un tanque de electroforesis, conectada en cada extremo a la solución amortiguadora. La muestra que se quiere analizar se carga en el extremo del cátodo y se aplica una corriente eléctrica de 30 min a una hora. Las proteínas en la muestra migran en la corriente con velocidades proporcionales a su carga. Al término de la separación electroforética, se retira el gel o la membrana y las proteínas se insolubilizan por fijación, por lo general en una solución con ácido acético, y se visualizan si se tiñen con un colorante proteico apropiado (fig. 45-1). El gel puede semicuantificarse por densitometría; es decir, el gel se examina usando un densitómetro, que mide la densidad del teñido (fig. 45-1). Sólo las proteínas con una concentración de 0.1 a 0.5 g/L, o mayor, contribuyen a constituir las bandas de las proteínas séricas observadas, de las cuales regularmente se representan seis. Éstas se señalan, en orden de movilidad electroforética, como:

THE BINDING SITE (gel de electroforesis de proteínas del suero)

Figura 45-1 a) Electroforesis en agarosa de muestras séricas, teñidas para proteína. Las muestras fueron cargadas en el cátodo (base). La banda en el extremo superior de cada carril representa la albúmina. Las bandas con teñido denso en el extremo del cátodo representan paraproteínas. b) Escaneo por densitometría de la electroforesis en agarosa del suero de un sujeto sano. El pico alto a la derecha representa la albúmina.

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TÉCNICAS CUALITATIVAS

1. Banda de albúmina (representada por la albúmina del suero).

THE BINDING SITE (gel de electroforesis de proteínas del suero)

2. Banda ␣1 (se representa por ␣1-antitripsina, orosomucoide y ␣-lipoproteína). 3. Banda ␣2 (representada por la haptoglobina y ␣2-macroglobulina). 4. Banda ␤1 (se representa por la transferrina). 5. Banda ␤2 (representada por proteínas y ␤-lipoproteína del complemento). 6. Banda ␥ (se representa por las inmunoglobulinas IgG, IgM e IgA). La mayor parte de las proteínas del suero, cuando están presentes en la sangre en concentraciones inferiores al umbral para este método, no contribuyen a las bandas observadas. Sin embargo, para el inmunólogo quizás la información más relevante que se obtiene de la electroforesis es la detección de la deficiencia de inmunoglobulinas o de gammapatías monoclonales. Debido a que las inmunoglobulinas representan diversas moléculas del anticuerpo son, por naturaleza, heterogéneas y no están representadas por una banda ␥ discreta. Más bien, esta banda se observa como una banda amplia a menos que exista una banda monoclonal (o “M”). En casos de gammapatía monoclonal, hay una producción predominante por un clon expandido de células que producen inmunoglobulinas, de inmunoglobulina de un isotipo (IgG, IgM o IgA) con especificidad discreta. Estas moléculas de inmunoglobulina son idénticas y producen una banda ␥ o M discreta (fig. 45-1). La identificación de la naturaleza de la proteína M monoclonal en el suero y las cadenas ligeras libres (proteínas de Bence-Jones) en orina puede realizarse usando inmunofijación precipitando la proteína en el medio de soporte, después de la electroforesis, con un anticuerpo específico para cada isotipo. Las proteínas no precipitadas se eliminan con un lavado y el precipitado restante se visualiza tiñendo con un colorante proteico (fig. 45-2). La proteína M también se puede caracterizar por inmunodifusión o inmunoelectroforesis y la concentración medirse por inmunoensayo cuantitativo (estos métodos se describen más adelante). Por el contrario, una banda ␥ reducida sugiere una deficiencia de la inmunoglobulina y esto debe investigarse más a fondo por ensayo cuantitativo (véase adelante). Exactamente como la secuenciación de DNA en geles se ha sustituido en gran parte por los sistemas capilares, la electroforesis proteica puede realizarse ahora en tubos capilares que contienen una fase líquida. El modelo CZE 2000 de Beckman-Coulter es un ejemplo. Se le diseña para permitir el análisis rápido de muchos especímenes: 70 mues-

Figura 45-2 Inmunofijación y tinción de proteínas del suero después de la electroforesis. El carril marcado con TSP muestra el patrón de tinción para todas las proteínas. La banda en el extremo superior es albúmina. La banda más cercana al extremo inferior es una paraproteína. La inmunofijación con anticuerpos para IgM, IgA e IgM humanos revela que la paraproteína es IgM. La fijación con anticuerpos para las cadenas ligeras ␬ y ␭ muestra que la paraproteína es IgMk.

tras en 90 min. La resolución es similar a la de los geles. En realidad, el resultado, que tiene el formato equivalente a un escaneo por densitometría del gel, puede ser “invertido” para dar la imagen simulada de un gel teñido. Inmunodifusión de Ouchterlony La inmunodifusión se realiza en geles de agar o de agarosa. Por lo común, una roseta de pozos se corta en el gel con un pozo también cortado al centro de la roseta (fig. 45-3). El pozo central se llena con el espécimen de prueba y los circundantes en la roseta con un antisuero de especificidad diferente. El gel se incuba en una atmósfera húmeda por varias horas. Las proteínas en el pozo central y aquellas de la roseta se difunden en el gel. Si el espécimen contiene una proteína para la cual se obtiene uno de los antisueros, un precipitado comienza a formarse; este precipitado es insoluble a concentraciones de “equivalencia”. Los geles se pueden lavar, secar y teñir para que se archiven. Usando este método, la presencia de varias proteínas puede detectarse simultáneamente en el espécimen de prueba. Como otra alternativa, varias muestras de la prueba se analizan para detectar la presencia de una proteína específica colocando un antisuero específico en el pozo central y una muestra diferente de la prueba en cada uno de los circundantes. Las placas de “Ouchterlony” están disponibles en el comercio, por ejemplo, para identificar el isotipo y la subclase que representa una paraproteína en una muestra sérica.

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CAP. 45

ENSAYOS PROTEICOS

Figura 45-3 Inmunodifusión de Ouchterlony mostrando el patrón clásico de la “roseta” de pozos cortados en el gel de agarosa. Un anticuerpo (generado en un animal como el conejo o la oveja) fue puesto en el pozo central y las muestras del suero en los pozos satélites circundantes. El suero en el pozo superior contuvo bien la proteína de interés. Las moléculas del anticuerpo se han difundido radialmente a través del gel y donde encontraron a la proteína que difundía desde el pozo inferior. Las moléculas proteicas (antígeno) han sido unidas por moléculas del anticuerpo, produciendo un precipitado visible e insoluble.

Inmunoelectroforesis de contracorriente La electroforesis de contracorriente es similar, en principio, a la inmunodifusión, pero el antígeno y el anticuerpo son electroforizados uno hacia el otro en el gel (fig. 45-4). El uso de la electroforesis en lugar de la difusión asegura que los resultados se obtengan más rápido. Se recomienda utilizar la inmunoelectroforesis a contracorriente como un método de tamizaje inicial rápido (p. ej., para detectar anticuerpos para antígenos nucleares extraíbles) y los resultados positivos se confirman por otros métodos, como la inmunodifusión de Ouchterlony. Inmunoelectroforesis La inmunoelectroforesis cualitativa (descrita originalmente por Grabar y Williams) comienza con la electroforesis en acetato de celulosa, agar o agarosa. Un canal se corta en la membrana o en el gel, adyacente al paso de la electroforesis. Después de la electroforesis, el antisuero se coloca en el canal y la membrana/gel se incuba en una atmósfera húmeda por varias horas. Durante este tiempo, las proteínas

Figura 45-4 Electroforesis a contracorriente. Este ejemplo es un equipo comercial diseñado para detectar autoanticuerpos. El antígeno “blanco” está en las secciones cuadradas a la izquierda (cátodo) y el suero del paciente se aplica en el ánodo (lado derecho de la figura). Bajo influencia de una corriente eléctrica, el antígeno y las moléculas de inmunoglobulina del paciente emigran uno hacia el otro. Un inmunoprecipitado, teñido con un colorante proteico, indica la presencia de autoanticuerpos para el antígeno.

separadas por electroforesis y las moléculas del anticuerpo a partir del canal difunden a través del medio de soporte. Si los anticuerpos para las proteínas separadas están presentes, se forma un inmunoprecipitado en el gel, que es insoluble a un punto de concentraciones “equivalentes”. Estos precipitados son con frecuencia visibles en el gel “hidratado”, sin teñir, sólo que la sensibilidad puede incrementarse después de que el gel se lava, se fija y se tiñe (fig. 45-5). Un antisuero que se obtiene para emplearse como suero completo revela arcos precipitados que representan todas las proteínas presentes para las cuales hay anticuerpos en el antisuero. La ausencia de un arco de precipitación (cuando se compara a un espécimen de referencia) indica una carencia de proteínas. La paraproteína monoclonal también es evidente debido a los precipitados anormales formados o pronunciados. La presencia o la identidad de una proteína específica, como una paraproteína, puede confirmarse co-

MÉTODOS CUANTITATIVOS

Figura 45-5 a) Diagrama que muestra el principio de la inmunoelectroforesis cualitativa. La muestra del paciente se coloca en un pozo cortado en el gel y las proteínas se separan por electroforesis. Después de la electroforesis, el antisuero se pone en un canal que corre paralelo a las proteínas separadas. El gel se deja en una atmósfera húmeda para permitir que las proteínas separadas y las moléculas del antisuero difundan una a otra. La presencia de proteínas hacia las moléculas del anticuerpo son resultado de un precipitado en forma de arco. b) Inmunoelectroforesis de dos muestras de suero. Los dos pozos con aplicación de la muestra están en el centro del gel; separados por un canal que contuvo el antisuero de la oveja se incrementan contra las proteínas humanas del suero. La electroforesis fue realizada con el cátodo a la derecha. Los arcos de inmunoprecipitado en el suero de la parte inferior muestran un patrón normal; aquellos para IgG, IgA e IgM se marcan. Obsérvese la ausencia de estos inmunoprecipitados en la muestra superior, esto indica que este paciente era deficiente en las tres inmunoglobulinas.

locando un antisuero específico (p. ej., antisuero específico para cadenas pesadas IgG, IgA o IgM humanas o para cadenas ligeras ␬ y ␭) en el canal.

Métodos cuantitativos Inmunodifusión radial (fig. 45-6) Este método también se conoce como “inmunodifusión radial única” o “método de Mancini”. El agar o agarosa, fundido en un amortiguador conveniente, se deja enfriar alrededor de 55°C y el antisuero precipitante específico para la proteína que se va a medir se añade en la concentración apropiada. El gel que contiene antisuero se vierte sobre una

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Figura 45-6 Inmunodifusión radial sencilla. Este ejemplo muestra un gel de agarosa en el cual se disuelva un antisuero para IgG2 humana. Las muestras de suero humano fueron puestas en pozos que se cortaron en el gel. La placa fue incubada para permitir que las proteínas en las muestras difundieran a través del gel. Las moléculas IgG2 fueron ligadas por anticuerpos para IgG2, que produjo anillos visibles del precipitado insoluble. El área de un anillo del precipitado es proporcional a la concentración de IgG2 en la muestra. Obsérvese la ausencia de anillos en algunas muestras, demostrando la deficiencia en IgG2.

placa o plato de cristal o plástico y se deja enfriar, después de lo cual solidifica el gel. Los pozos se cortan en el gel y cada uno de éstos se llena con varios microlitros de suero de prueba. Una serie de pozos, cada uno lleno con suero de referencia (o solución de referencia) contiene concentraciones conocidas de la proteína con la que se va ensayar. La placa se deja en una atmósfera húmeda para permitir que las proteínas dentro de las muestras y de las soluciones de la referencia difundan en el gel, que contiene antisuero circundante. Cuando las moléculas proteicas que están en el ensayo difunden en el gel forman precipitados con las moléculas del antisuero. Estos precipitados son parcialmente solubles siempre que la concentración del antígeno (proteína) sea superior a la del antisuero. Así, algunas moléculas proteicas continúan difundiendo radialmente desde el pozo hasta que la concentración del antígeno es “equivalente” a la de los anticuerpos. En este punto un anillo de precipitado insoluble se forma alrededor del pozo de la muestra. El área (y por tanto el diámetro) del anillo es directamente proporcional a la concentración de la proteína en la muestra de la prueba. Por supuesto, siempre que la concentración del antisuero en el gel y las concentraciones de la proteína en la muestra estén dentro de los límites apropiados y el proceso de la difusión se ha dejado correr hasta la terminación, el área del anillo inmunoprecipitado es linealmente proporcional a la concentración de la proteína. Ésta requiere que el sistema de la prueba sea titulado por experimentación. También significa que es posible que las placas necesiten un

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CAP. 45

ENSAYOS PROTEICOS

tiempo considerable (quizás varios días) para la difusión y la formación del precipitado al dejar que la corrida se complete. Estos contratiempos pueden ser inoportunos y demasiado lentos para algunos laboratorios con trabajo de grandes volúmenes de muestras, pero las placas de inmunodifusión radial están ahora disponibles en sus formas comerciales para la medición de proteínas clínicamente importantes, incluyendo isotipos, subclases y cadenas ligeras de inmunoglobulinas. Estas placas comerciales se producen dentro de tales tolerancias para obtener resultados exactos y precisos antes de que la difusión haya corrido completa (método de Fahey y McKelvey), aportando resultados en sólo algunas horas. De hecho, las concentraciones del antisuero se incorporan con tanta exactitud que, con una pérdida pequeña y normalmente irrelevante de exactitud, las concentraciones de la proteína pueden ser interpoladas, a partir de los diámetros del anillo, a las curvas estándares de referencia suministradas con el equipo, sin usar soluciones estándares de referencia. El límite de la sensibilidad de un ensayo por difusión radial depende en gran parte de la calidad del antisuero pero está por lo general en el orden de alrededor de 5 mg/L. Algunas placas desarrolladas para el comercio pueden medir proteínas tan bajas como 0.2 mg/L. Turbidimetría y nefelometría Los métodos cuantitativos descritos antes confían en la formación de complejos insolubles proteína-anticuerpo que pueden visualizarse por el ojo en medios con soporte de gel. Si el precipitado se forma con una proteína y un anticuerpo a concentraciones bajas en un medio líquido, un precipitado más fino se forma en la suspensión. Esta propiedad puede utilizarse para medir la concentración de la proteína. La presencia de un precipitado impedirá que un haz de luz atraviese la suspensión (turbidimetría). De manera alterna, la luz dispersada por la suspensión puede detectarse en un ángulo hacia la luz incidente (fig. 45-7). Este método se llama nefelometría. La cantidad del inmunoprecipitado, a una concentración constante del anticuerpo, aumentará en proporción con la concentración de la proteína, hasta que todo el anticuerpo se ha ligado al antígeno. La medición de la dispersión de la luz debe, por consiguiente, hacerse en condiciones de exceso del anticuerpo; se hace como un “punto final” o por un analizador de la velocidad que mida el aumento en la dispersión como las formas del precipitado. Es claro que este acercamiento, a diferencia incluso de métodos más “sencillos” como la inmunodifusión radial, requiere aparatos especializados pero ofrece un grado de automatización y un procesamiento alto de los especímenes. Algunos laboratorios usan analizadores centrífugos en los cuales los reactivos son mezclados durante la centrifugación, reduciendo el tiempo del ensayo. El límite de sen-

Fuente de luz

Partículas dispersas

Detector de turbidez

Cubeta

Nefelómetro

Principio de la nefelometría/turbidimetría

Figura 45-7 Esquema simplificado que muestra los principios de la turbidimetría y de la nefelometría (véase el texto para una explicación).

sibilidad de esta metodología, como en la mayor parte de los inmunoensayos, depende del sistema específico y, sobre todo, de la calidad de antisuero, que debe ser policlonal. En un buen sistema, el límite es alrededor de 10 mg/L, pero puede mejorarse a casi dos órdenes de magnitud usando nefelometría “reforzada con partículas”, cuando los anticuerpos se ligan a las perlas diminutas del poliestireno. Los reactivos para la turbidimetría y la nefelometría de proteínas clínicamente importantes, como isotipos y subclases de inmunoglobulina, están disponibles en el comercio. Ensayos de inmunoabsorbencia ligados a enzimas Los ensayos de inmunoabsorbencia ligados a enzimas (ELISA), también llamados inmunoensayos enzimáticos (EIA), representan un principio versátil y sensible para la medición de la proteína, que ha reemplazado en gran parte a los radioinmunoensayos. Pueden medir proteínas por debajo de concentraciones cercanas a 1 µg/L. Son ensayos convenientes que se emplean si la proteína de interés está presente en una concentración baja. Estos ensayos se realizan en placas de plástico con 96 pozos y el manejo del reactivo se hace normalmente por medio de pipetas de multicanal. ELISA es conveniente para la automatización o semiautomatización y, por tanto, incluso para la proteína que se mide en una concentración alta, haciendo necesaria la dilución de la muestra; si una gran cantidad de muestras está procesando esta técnica puede ser más conveniente que otros métodos más simples, como la inmunodifusión radial. Muchos laboratorios construyen sus propios sistemas internos de ELISA, pero los equipos en el comercio están disponibles para una amplia gama de aplicaciones,

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MÉTODOS CUANTITATIVOS

(a )

(b )

Conjugado enzima-anticuerpo

Conjugado enzima-anticuerpo

Antígeno blanco

Anticuerpo blanco

Anticuerpo inmovilizado

Antígeno

(c )

(d )

Anticuerpo animal conjugado enzimáticamente

IgG de oveja anticonejo conjugado enzimáticamente

Anticuerpo humano contra el antígeno

El anticuerpo de conejo ligado a proteína no puede hacerlo a la proteína sobre la placa

Muestra de suero que contiene la proteína de interés incubada con anticuerpo de conejo para la proteína

Anticuerpo de conejo gado al antígeno sobre la placa

Antígeno

Antígeno

Figura 45-8 a) ELISA indirecto. La figura muestra el principio de esta técnica para la detección de anticuerpos específicos. b) ELISA directo de emparedado para detectar un antígeno específico en una muestra. c) ELISA competitivo para detectar o medir un anticuerpo específico para un antígeno conocido. El método confía en un anticuerpo (conjugado enzimáticamente), que se obtiene de un animal como el conejo o la oveja, que reconoce el mismo antígeno como el anticuerpo “blanco” que se está midiendo. El espécimen se mezcla con el anticuerpo conjugado que compite para ligar al antígeno utilizado sobre la placa de ELISA. d) ELISA competitivo para detectar o para medir una proteína (antígeno). La muestra que se prueba se incuba con un anticuerpo producido para el antígeno de interés (en este caso un anticuerpo de conejo). El anticuerpo de conejo se liga al antígeno blanco en la muestra, que evita a aquellas moléculas del anticuerpo al unirse posteriormente al pozo con ELISA cubierto con el antígeno. Cualquier anticuerpo de conejo que no se una al antígeno en la preincubación es capaz de unirse al pozo ELISA y se le detecta con la adición de un anticuerpo conjugado enzimáticamente para IgG de conejo (en este caso, IgG de oveja anticonejo). La cantidad de producto enzima-sustrato medido será inversamente proporcional a la cantidad de proteína blanco en la muestra original.

incluyendo ensayos para medir proteínas séricas importantes, citocinas, antígenos microbianos (p. ej., Chlamydia trachomatis, antígenos del virus de hepatitis B), anticuerpos de IgE para alergenos y anticuerpos para patógenos. Los diferentes sistemas de ensayo varían en detalles pero los principios esenciales siguen siendo similares. Las formas más simples son “ELISA indirectos” para detectar anticuerpos específicos y “ELISA directos de emparedado” para detectar los antígenos. ELISA indirecto para la detección del anticuerpo (fig. 45-8a) se basa en la microtitulación de pozos de la placa cubiertos con un antígeno blanco apropiado (p. ej., proteína de un patógeno). Las muestras que se prueban se aplican a los pozos, seguidas por un anticuerpo conjugado enzimáticamente para la inmunoglobulina humana. La enzima es por lo común la peroxidasa de rábano (HRP) o la fosfatasa alcalina. La elección de la inmunoglobulina antihumana permitirá la detección de todos los isotipos (usando antisuero que se obtiene contra las inmunoglobulinas humanas

IgG, IgA e IgM), o de un isotipo específico (p. ej., anticuerpos IgE para alergenos). Después de un lavado adicional para eliminar el anticuerpo conjugado no ligado, un sustrato conveniente se agrega a los pozos. Un producto coloreado se detecta usando un lector de ELISA que recolecta a la longitud de onda apropiada (450 nm para HRP; 492 nm para la fosfatasa alcalina), la muestra del anticuerpo blanco en el espécimen original. Estos ensayos pueden ser cuantitativos. Para ELISA directo de emparedado para detectar antígenos (fig. 45-8b), los pozos de microplacas de 96 pozos (también se pueden conseguir como tiras de ocho pozos) se cubren con un anticuerpo para la proteína que se detecta o mide. Éste no necesita ser un anticuerpo precipitante, por lo tanto, los anticuerpos monoclonales se usan con frecuencia. Cada pozo se llena con una muestra de la prueba o bien con una gama de soluciones de referencia de concentración conocida. Los pozos se incuban por un tiempo apropiado (cerca de una hora), después de lo cual

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CAP. 45

ENSAYOS PROTEICOS

se lavan para retirar el material que no es capturado por el anticuerpo en la superficie del pozo. Los pozos entonces se llenan de una solución de otro anticuerpo para la proteína que se mide. Es claro que si el anticuerpo primario fue monoclonal, el mismo anticuerpo monoclonal no puede ser eficaz en este paso porque la proteína blanco podría tener un antígeno determinante (epitopo) reconocido por el anticuerpo. Es aquí donde es necesaria una cierta experimentación, para identificar un segundo anticuerpo que reconozca a la proteína después de que la haya capturado el antígeno primario inmovilizado sobre los pozos de la placa. Este segundo anticuerpo está conjugado con la enzima. La placa se incuba otra vez para permitir que el segundo anticuerpo conjugado enzimáticamente se una con la proteína capturada. La placa se lava de nuevo y el sustrato para la enzima conjugante se agrega a los pozos. El sustrato produce un producto de reacción soluble y coloreado. Puesto que la cantidad de anticuerpo conjugado de forma enzimática que se une es proporcional a la cantidad de proteína capturada por el anticuerpo primario, resulta que la cantidad del producto de la reacción enzimática es proporcional a la concentración de la proteína en la muestra original. La cantidad del producto de reacción se mide usando un lector de placas ELISA, el cual pasa la luz a través de cada pozo a una longitud de onda que absorbe el producto de reacción y, para la cuantificación, los resultados se interpolan a partir de aquellos que se obtienen con las soluciones de referencia. Otro tipo de ELISA es competitivo. Un ejemplo se muestra en la figura 45-8c. Esta muestra ELISA de competición se emplea para la detección de anticuerpos específicos. Los pozos se cubren con el antígeno que se reconoce con la molécula del anticuerpo de interés. Las muestras del paciente se agregan a los pozos junto con las moléculas del anticuerpo generado en animales experimentales, con especificidad para el mismo antígeno, como aquella reconocida por el anticuerpo que es ensayado. Habrá competencia para unir al antígeno. Entre más moléculas del anticuerpo estén en la muestra del paciente, menor es la unión de los anticuerpos conjugados. La figura 45-8d muestra el razonamiento para un ELISA competitivo para la detección o la medición de un antígeno. En este caso, los pozos están cubiertos con el antígeno de interés. La muestra del paciente se preincuba con, o se añade, junto con un anticuerpo conjugado enzimáticamente al antígeno. Cualquier antígeno en la muestra ocupa sitios de unión con el antígeno sobre el anticuerpo disminuyendo su unión con el antígeno que

cubre el pozo. Existen muchas permutaciones sobre estos estilos básicos de ELISA y algunas se describen en la lista de Lecturas complementarias, al final de este capítulo.

Conclusión Los laboratorios que trabajan de manera rutinaria grandes volúmenes de muestras para inmunología tienen a su disposición una gama de métodos para el análisis de la proteína de dónde elegir. Los métodos empleados se determinan a través de consideraciones incluyendo la naturaleza de los especímenes, las identidades de las proteínas que son medidas y sus concentraciones en los especímenes. También, la cantidad de especímenes procesados de rutina determinan si los sistemas automatizados necesitan emplearse. Muchos de los métodos usados en la actualidad han cambiado sólo en detalles desde que las proteínas específicas comenzaron a identificarse y medirse, y algunos de ellos es probable que sigan empleándose por mucho tiempo más. Otros, como ELISA, representan tecnologías más nuevas que desplazan a aquellas con desventajas técnicas o prácticas, como los radioinmunoensayos. Hay muchos progresos en la caracterización de la proteína, en especial en el campo del análisis de datos, como para los proteómicos. Cómo y cuándo, los laboratorios que trabajan grandes volúmenes de muestras de “proteínas” lleguen a adoptar métodos nuevos se tendrá que esperar para descubrirlo.

Reconocimientos Debo agradecer a Roger Drew de la Binding Site Ltd., por algunas de las figuras aquí publicadas.

Lecturas adicionales Chapel H, Haeney M. Essentials of Clinical Immunology, 3rd edn. 1993: Blackwell Scientific, Oxford. Crowther JR. The ELISA Guidebook. Methods in Molecular Biology Series, vol 149. 2002: Humana, Totowa, NJ. Rose NR, Hamilton RG, Detrick B. Manual of Clinical Laboratory Immunology, 6th edn. 2002: ASM Press, Washington, DC. Sheehan C. Clinical Immunology. Principles and Laboratory Diagnosis, 2nd edn. 1997: Lippincott, Philadelphia, PA.

46 Ensayos del complemento J. North y K Whaley

Introducción El complemento es un sistema de las proteínas del suero y de los receptores celulares que tiene varias funciones, la mayor parte de las cuales ayuda al huésped a prevenir o luchar contra la infección. Descrito originalmente como una sustancia sensible al calor que podría, junto con el anticuerpo específico, lisar ciertas bacterias, ahora se sabe que las proteínas del complemento actúan por medio de dos rutas principales. La activación de estas rutas conduce a la deposición de una opsonina potente en la superficie de los microorganismos, además de producir una respuesta inflamatoria que libera factores vasoactivos y quimiotácticos. Otros componentes pueden dañar las superficies celulares, pero aun otro grupo controla la activación espontánea y potencialmente dañina de estas rutas. Los niveles de las proteínas del complemento pueden ensayarse por varios métodos, y es también posible determinar la actividad funcional de la mayor parte de los componentes. Para apreciar de modo completo las condiciones requeridas para estos ensayos, es importante entender el proceso que ocurre. Por consiguiente, una vista general breve del complemento se describe en la sección siguiente, con muchos detalles que se encuentran en las secciones individuales del ensayo.

a la secuencia de activación). La ruta clásica puede activarse por IgG o IgM que se han ligado al antígeno. El C1q se liga a ese anticuerpo y, una vez que está unido, se activa el C1r, que a su vez activa el C1s. El C1s activado es una proteasa cuyo sustrato es C4, que es cortada. El C4 cortado (C4b) liga el C2 y el C1s entonces activa el C2 (para formar C2a) por proteólisis limitada. El complejo activo C4b2a (ruta clásica C3 convertasa) activa el C3, otra vez por proteólisis limitada. Los iones calcio y magnesio se requieren para la activación de la ruta clásica. El C3 activado (C3b) liga covalentemente a las superficies y actúa como ligando de alta afinidad para los receptores de C3b en los fagocitos. Esta ruta se puede también activar con el C1q unido a la proteína C-reactiva, una proteína de fase aguda, similar en forma a la IgM, que se liga al carbohidrato en algunas bacterias. La lecitina unida al carbohidrato manano (MBL) es una proteína funcionalmente similar que se parece a C1q por sí misma; y la MBL forma un complejo macromolecular con las proteasas serinas 1 y 2 relacionadas con MBL (MASP1 y MASP2), que tiene muchas de las mismas propiedades que C1r y C1s. El complejo MBL-MASP puede, por tanto, activar la ruta clásica a través de C4 cuando se liga a un carbohidrato conveniente, como la manosa, la Nacetilglucosamina, la glucosa o la fucosa. La ruta alterna

La ruta clásica La primera ruta que se describe aquí se denomina la “ruta clásica”, y los componentes en este sistema se prefijan con “C“ y lo comprenden C1q, C1r, C1s, C4 y C2 (los números son atribuidos al tiempo de definición de los componentes, no

C3, el factor B, el factor D y la properdina son los componentes de la ruta alterna de activación del complemento. La activación de esta ruta no descansa en alguno de los factores específicos desencadenantes sino en un nivel constante bajo de activación espontánea. Una proporción pequeña de

The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker. © 2005 John Wiley & Sons, Ltd.

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CAP. 46

ENSAYOS DEL COMPLEMENTO

Ruta alterna

Ruta clásica

Patógeno + anticuerpo

Carbohidrato manano en la superficie bacteriana

Activador de superficie

Ruta clásica Convertasa C4

Ruta alterna Convertasa C5

Ruta clásica Convertasa C5

Autoensamblaje

C5b C6 C7 C8 C9n Complejo de ataque a membrana

Figura 46-1 La ruta clásica y la ruta alterna de la activación del complemento. Los componentes con actividad de proteasa se muestran en verde, las colectinas en azul y las anafilotoxinas en rojo.

C3 circulante se hidroliza, y esta forma de C3 puede ligar el factor B en presencia de los iones de magnesio. El factor B ligado es cortado por el factor D para formar Ba y C3Bb; éste puede activar más C3 para formar C3a y C3b. C3b puede ligarse a las superficies y, una vez unido, liga más factor B. El C3b ligado a la superficie de los microorganismos es resistente a la actividad reguladora de los factores H e I, de modo que se favorece la activación. Del mismo modo que el factor B ligado al C3 circulante es cortado, el factor B ligado a C3b sobre las superficies es cortado por el factor D para dar C3bBb. Este complejo es estabilizado por la properdina y tanto C3Bb como C3bBbP pueden cortar

más moléculas C3, amplificando así el proceso. Otra función del complejo C3dBbP es que puede ligar y activar el C5 (véase adelante). Las dos rutas se muestran en la figura 46-1.

El complejo de ataque de membrana Los componentes C5, C6, C7, C8 y C9 del complemento forman la ruta terminal. C5 puede activarse con las enzimas convertasas de la ruta clásica o de la ruta alterna (C4b2a y C3bBbP, respectivamente). El C5 activado se liga a C6 y a

ENSAYOS DE LOS NIVELES SÉRICOS DEL COMPLEMENTO

los componentes restantes; C7, C8 y C9, se ligan a su vez. Seis moléculas de C9 ligan a este complejo y forman un poro en la membrana de una célula en la que está presente. Esto puede conducir a la lisis de la célula y es una propiedad que se emplea en los ensayos hemolíticos descritos más adelante. Productos biológicamente activos de activación del complemento Una de las funciones principales del sistema del complemento es depositar C3b en la superficie de los microorganismos y, como se describe antes, esto puede ocurrir por la ruta clásica o por la ruta alterna. El C3b presente en la superficie de los microorganismos aumenta su captación de fagocitos, como los neutrófilos, vía receptores para C3b, y también estimula las células. La activación de la ruta clásica por los complejos inmunitarios de anticuerpo y antígeno aumenta la solubilidad de tales complejos y ayuda a su eliminación de la circulación por los receptores del complemento en los eritrocitos. Según se mencionó antes, los complejos de C5b-C9 pueden causar la lisis de los microorganismos por la inserción de los polímeros de C9 en la membrana celular. La lisis de las células presentes puede ocurrir a menos que sean protegidas por el receptor CR1 de C3, el factor acelerador de la degradación (DAF), la proteína del cofactor de la membrana (MCP) y el CD59, los cuales previenen la polimerización de C9. La activación de C4, de C2, de C3, del factor B y de C5 crea fragmentos relativamente pequeños que son liberados. Los dos más importantes son las anafilotoxinas C3a y C5a, que son vasoactivas y liberan la histamina de los mastocitos. C5a es también un agente quimiotáctico poderoso que activa los neutrófilos y monocitos. Control de la activación del complemento La activación espontánea del complemento necesita controlarse para prevenir una respuesta inflamatoria innecesaria. La ruta clásica se regula por el inhibidor de las proteínas C1 del suero (C1-inh), C4bp y el factor I y por la proteína del cofactor de la membrana de las moléculas de la superficie celular (MCP), el factor acelerador de la degradación (DAF, CD55) y CR1. La ruta alterna se regula por los factores H e I y la MCP, el DAF y el CR1. Todos estos factores aceleran la degradación de una o más de las proteínas o de los complejos activados del complemento, y por tanto la activación del complemento ocurre sólo si los estímulos activadores pueden generar bastantes productos activos para superar los mecanismos inhibidores.

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Ensayos de los niveles séricos del complemento Preparación y almacenaje de la muestra El almacenaje incorrecto de las muestras para el ensayo del complemento produce niveles disminuidos, ya que algunos componentes son extremadamente lábiles. Para los ensayos de los componentes individuales en el suero, las muestras de sangre deben llegar al laboratorio tan pronto como sea posible después de la venopunción. Debe permitir que la sangre se coagule a la temperatura ambiente por 30 min, después se coloca la muestra sobre hielo por una hora para que la retracción del coágulo ocurra antes de separar el suero a una temperatura de 2 a 4°C. Las muestras se alícuotan y almacenan a ⫺70°C tan rápido como sea viable. Para su uso, las muestras se descongelan a 37°C, después se colocan de inmediato en el hielo: al congelar y deshielar repetidamente disminuyen la actividad hemolítica de los componentes. La sangre colectada en EDTA (que previene la activación adicional del complemento al quelar el calcio y el magnesio y, por tanto, hace que las muestras sean convenientes para los ensayos del producto de activación) se guarda en hielo el tiempo más corto posible antes de centrifugarse para producir el plasma escaso de plaquetas que se almacena, en lo que se refiere al suero. Las muestras del cultivo tisular se benefician de la adición de los inhibidores de la proteinasa, como PMSF. Ensayos inmunoquímicos Estos ensayos utilizan anticuerpos específicos para los componentes individuales del complemento, están disponibles en formas comerciales y pueden utilizarse en los ensayos nefelométricos, ELISA o de inmunodifusión. La elección del anticuerpo es crítica, ya que los anticuerpos policlonales pueden reconocer los productos de desintegración del componente bajo investigación y el valor resultante que se obtiene puede no reflejar el nivel de la proteína funcional presente. El tipo de sistema del ensayo que se emplee depende del número por realizar, del nivel de sensibilidad requerido, del nivel del analito y de la calidad del anticuerpo disponible. Por ejemplo, la nefelometría se utiliza en los laboratorios clínicos rutinarios de inmunología para medir C3, C4, C1inh y C1q en las muestras de pacientes donde los niveles son de 50 µg/ml o más. Para los estudios del cultivo celular, sin embargo, los niveles pueden ser tan bajos como 1 ng/ml y el ELISA, aunque es más laborioso y requiere más tiempo, es más práctico. Las técnicas de inmunodifusión radial y gel rocket, aunque consumen tiempo y no son especialmente sensibles, son relativamente simples y pueden emplearse para identificar los productos de degradación, por ejemplo, la inmunoelectroforesis rocket de doble difusión

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CAP. 46

ENSAYOS DEL COMPLEMENTO

para la detección de C3d, y para las formas anormales de los componentes del complemento, por ejemplo, la inmunodifusión Ouchterlony del suero humano normal (NHS) y del suero deficiente de C8 frente al anti-C8 pueden revelar las líneas de identidad parcial que sugieren la deficiencia de la cadena C8␤. Los amortiguadores intermediarios empleados, que se utilizan por lo general en estos tipos de ensayo, son los óptimos para el anticuerpo de unión y solución salina amortiguada con fosfato (PBS). Ensayos hemolíticos del complemento Ensayos CH5O La lisis de los eritrocitos de la sangre por el complemento ocurrirá si el MAC está montado en la membrana celular y se insertan los polímeros de C9. Los ensayos dependen de la presencia de todos los componentes necesarios y de las condiciones apropiadas para la activación del complemento. El más simple de estos ensayos es el CH50 (fig. 46-2), un procedimiento cuantitativo que depende de una muestra

Volumen sérico (μl).

Figura 46-2 Trazo log-log de y/1 ⫺ y frente al volumen del suero diluido en un ensayo CH50. En el punto de 50% de hemólisis, y(1 ⫺ y) ⫽ 1 y el volumen del suero diluido resultante se muestra en la línea vertical. y ⫽ proporción de las células lisadas. Redibujada de Whaley (1985), con permiso de Elsevier.

que contiene todos los componentes clásicos y terminales del complemento, y de los componentes que son funcionalmente activos. El ensayo se realiza en presencia de los iones calcio y magnesio (requeridos para la activación de la ruta clásica) e iniciando la ruta con la presencia de la IgM sobre la superficie de los eritrocitos de la sangre de ovejas (EA).

Un ensayo similar para la ruta alterna, el APH50, utiliza los eritrocitos del conejo, que proporcionan una superficie para la unión del C3bBb. La adición de EDTA, para la quelación de los iones de calcio pero no los de magnesio, previene cualquier activación concomitante de la ruta clásica mientras permite la activación de la ruta clásica. Estos ensayos necesitan controlarse con muestras conocidas que contienen todos los componentes, por ejemplo, el NHS fresco (control positivo), y por el amortiguador solo (control negativo) para medir la lisis espontánea de los eritrocitos. La cuantificación del ensayo puede realizarse comparando la cantidad de hemólisis (medida por la densidad óptica del sobrenadante celular, que es proporcional a la cantidad de hemoglobina liberada) con un NHS normal conocido en un método de un tubo, o diluyendo toda la muestra de prueba para obtener un rango del porcentaje de hemólisis. Usando la ecuación de von Krogh, que describe la curva que se obtiene trazando el porcentaje de lisis contra la dilución de la muestra, se calcula la dilución de la muestra requerida para obtener el 50% de hemólisis y, después de tomar en cuenta la dilución inicial de la muestra, este valor se traduce a unidades/ml de CH50. La unidad de CH50 que se obtiene depende de la cantidad y la naturaleza del anticuerpo utilizado para sensibilizar las células, la concentración y fragilidad del eritrocito, la fuerza iónica, la concentración del catión divalente y el pH del amortiguador, el tiempo de reacción y la temperatura. Los ensayos CH50 y APH50 se utilizan para determinar si un paciente es o no genéticamente deficiente en un componente del complemento. Un valor cero en un ensayo CH50, pero no en APH50, indica una falta del C1, C4 o de C2, mientras que para un resultado normal de CH50 y un APH50 de cero, una deficiencia de properdina o el factor D pueden estar presentes (la deficiencia del factor B no se ha descrito). La ausencia de lisis en ambos ensayos indica la carencia de C3, C5, C6, C7 o C8. Los niveles bajos de lisis pueden ocurrir por la deficiencia de C9. Los valores bajos cerca de cero sugieren que el nivel de uno o más componentes del complemento está disminuido, debido a la consunción en un proceso de enfermedad, como el lupus eritematoso sistémico, o pueden indicar un estado de deficiencia heterocigota (aunque los niveles del complemento pueden ser variables en estos individuos, ya que muchos componentes son proteínas de fase aguda).

Ensayos hemolíticos para los componentes individuales usando sueros deficientes del complemento Los ensayos por la presencia y la actividad funcional de los componentes individuales se pueden realizar usando el eritrocito sensibilizado y un suero deficiente en el componente

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ENSAYOS DE LOS NIVELES SÉRICOS DEL COMPLEMENTO

elegido. Las diluciones seriales de una muestra de prueba se agregan y la lisis del eritrocito sensibilizado ocurre sólo si el componente que se pretende verificar está presente y es funcional. Otros componentes están presentes en exceso, así que la lisis es proporcional a la cantidad del componente de prueba. Los sueros deficientes pueden obtenerse en presentaciones comerciales y también prepararse en el laboratorio, si los ensayos se realizan regularmente. Tales ensayos son de sensibilidad más baja que los descritos más adelante y no son convenientes para los componentes reguladores (C1-inh, factores H e I, properdina). 1:160⫻104 1:40⫻104 1:20x104

Ensayos hemolíticos para los componentes individuales usando el eritrocito presensibilizado Los eritrocitos pueden presensibilizarse con los primeros componentes de la ruta hasta llegar al que está bajo prueba. Agregando una muestra que contiene un componente de investigación, este componente pueden activarlo o ligarlo a aquellos componentes ya presentes. La adición de los componentes restantes da lugar a la lisis si el componente de prueba está presente y es funcional. Si se asegura que el resto de los componentes está en exceso, el grado de lisis es proporcional a la cantidad del componente de prueba. Los componentes funcionalmente puros pueden prepararse en el laboratorio, pero la mayor parte están disponibles en presentación comercial. Los eritrocitos sensibilizados y presensibilizados que se emplean con más frecuencia son EAC1, EAC4 y EAC14. Los EAC1 se preparan agregando C1 (p. ej., a partir de suero del cerdo de Guinea precipitado con 5 mM de CaCl) al eritrocito sensibilizado en un amortiguador de fuerza iónica baja que contenga calcio y magnesio. La adición de suero humano en presencia de EDTA produce la unión de C4 y C2, y la incubación subsiguiente a 37°C causa la degradación de C1 y C2 desde las células, dejando EAC4. Las células EAC14 se preparan agregando más C1, otra vez en presencia de calcio y magnesio. Las células EAC4 se utilizan para ensayar la actividad de C1 agregando diluciones de la muestra de prueba seguida por C2 del conejillo de Indias. La hemólisis se logra agregando los componentes restantes, en forma de suero de rata que contiene EDTA (Crat-EDTA). La concentración de las moléculas eficaces del componente bajo prueba se mide trazando el valor Z [⫺ln(1 ⫺ % de lisis)] contra la dilución del componente bajo prueba (fig. 46-3). El trazo de línea recta que se obtiene resulta de la ‘Teoría de un golpe’, en que una sola molécula eficaz del complemento (C1-C9) resulta en la lisis celular. Una unidad de complemento se toma como aquella que proporciona 63% de lisis en un ensayo para aquel componente. Si un trazo de línea recta no se obtiene, entonces la concentración de uno o más componentes bajo prueba es limitada.

1:10⫻104

1:5⫻104

Dilución del suero

Figura 46-3 El número de moléculas funcionales por célula (Z) se traza contra la dilución del suero en una titulación hemolítica típica de un componente individual del complemento. La concentración del componente en este caso está dada por y/x ⫻ 50 000. Redibujada de Whaley (1985), con permiso de Elsevier.

C4 se ensaya usando EAC1 agregando diluciones de la muestra de prueba, C2 del conejillo de Indias y Crat-EDTA en lo que se refiere a C1, mientras se mide la actividad C2 usando EAC14. En este caso, el Tmáx para las células (tiempo para la formación máxima de C4b2a) debe conocerse. El Tmáx varía de lote a lote del EAC14 porque depende de la cantidad de C4b presente en las células. Para ensayar la actividad de C3, es necesario formar EAC142. El complejo C4b2a en estas células es más inestable que la mayor parte, por tanto, los EAC14oxy 2 son preparados para proporcionar la actividad hemolítica incrementada del C2 (fig. 46-4). EAC14 forma el punto de arranque de los ensayos funmáx

Tiempo de incubación (min)

Figura 46-4 Trazo del número de sitios hemolíticos (Z) contra el tiempo de incubación a 30°C en un ensayo de Tmáx. Tmáx está indicado por la flecha. Redibujada de Whaley (1985), con el permiso de Elsevier.

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CAP. 46

ENSAYOS DEL COMPLEMENTO

cionales de los componentes de la ruta alterna. El C2 y C3 son agregados a la forma EAC1423, con la eliminación subsiguiente de C1 y C2 con la incubación en el amortiguador EDTA. El EAC43b resultante forma una ruta alterna, la C3 convertasa, si se agrega el factor B, el factor D y la properdina. La hemólisis se logra agregando Crat-EDTA. La actividad del factor B, del D o de la properdina se mide omitiendo el componente puro respectivo y sustituyéndolo con las diluciones de la muestra de prueba aunque este método no es conveniente para ensayar el factor D sérico, sólo las preparaciones puras. Los componentes terminales se ensayan agregando C3 y los componentes terminales elevados para llegar al que está bajo prueba para el EAC14oxy 2. El EAC1-8, utilizado para medir la actividad de C9, sin embargo, experimenta lisis espontánea, así que debe emplearse tan pronto como esté preparado. Otros ensayos de la función del complemento La medición de la actividad de la ruta clásica es posible con equipos comerciales. Algunos de éstos se basan en ELISA, y el complemento sérico es activado por los complejos inmunitarios presentes en la celdilla. Midiendo la cantidad de un neoantígeno del componente terminal, normalmente C9 generado, se valora la actividad. Un sistema automático emplea liposomas que contienen una enzima (G6PDH), que se libera cuando el anticuerpo reacciona con el antígeno en el liposoma, sólo cuando la ruta clásica entera está presente. La reacción de la enzima con un sustrato en la mezcla del reactivo produce un cambio del color proporcional a la actividad de la ruta clásica. Los autores no son conscientes de cualquier método automático para APH50. La MBL puede ensayarse funcionalmente cubriendo los eritrocitos de ovejas con carbohidratos manano y realizando el resto del ensayo en lo que respecta a un CH50. Se ha descrito un ensayo funcional alternativo que mide la capacidad de la lectina de unión a mananos (MBL) para activar el C4. El manano es cubierto en una placa de ELISA y se mide la cantidad de C4c generada del suero agregado, una alta concentración de sal en el amortiguador previene la activación de la ruta clásica. Ensayos funcionales de las proteínas de control del complemento La actividad del inhibidor C1 puede ensayarse con los equipos comerciales que utilizan la capacidad del inhibidor C1 para inhibir un C1s análogo en una reacción colorimétrica. La actividad del inhibidor C1 puede también medirse examinando la capacidad de la muestra de prueba para inhibir un nivel dado de C1 exógeno adicionado al eri-

trocito sensibilizado. Si al suero se le examina entonces C1 primero tiene que ser eliminado, por ejemplo, precipitando todo el C1 usando el amortiguador de fosfato. El inhibidor C1 puede permitirse ligar a C1, o en la fase fluida antes de agregar a EAC4 con C2 o en EAC14, antes de la adición del C2. Para los ensayos hemolíticos del componente inhibidor, una reacción “solitaria” que no contiene inhibidor se corre en paralelo. La actividad inhibidora de la muestra de prueba se expresa en unidades Z’ y se asume que la inhibición de la lisis sigue la misma teoría “de un golpe”, como la lisis. Se toma I como la proporción de la lisis de C1 que z se inhibe y, por tanto, I ⫽ 1 ⫺ e⫺ . Por lo tanto Z’ ⫽ ln(1 ⫺ I) o: Z’ ⫽ ln

y en la muestra de prueba y en solitario

Cuando Z en el tubo solitario está entre 0.5 y 1.5, Z’ varía de forma lineal con la dilución del inhibidor C1. En cuanto al cálculo de Z, Z’ se calcula de la gráfica de la dilución del suero contra Z’, tomando en cuenta la dilución inicial. Los niveles del factor H pueden ensayarse midiendo la capacidad del suero para acelerar la degradación de la C3 convertasa. EAC4b3bBbP son preparados agregando properdina, factor B y factor D a EAC4b3b; la cantidad de actividad hemolítica que permanece después de degradarse la C3 convertasa se compara con un tubo solitario. La actividad del factor I puede ensayarse incubando la muestra de prueba con el factor H agregado a EAC43 y adicionando los factores B y D, y examinar para la actividad hemolítica residual. Detección de los productos de activación del complemento Varias proteínas del complemento sérico son de fase aguda, por lo que durante la consunción del complemento, que puede ocurrir en algunos tipos de infección bacteriana o enfermedades del complejo inmunitario, los niveles séricos pueden permanecer normales. El volumen incrementado del complemento puede determinarse al medir los productos de activación del complemento, usando los anticuerpos que distinguen los productos de activación a partir de la molécula nativa. Los equipos comerciales están disponibles pero los ensayos en el local para los productos de activación se establecen de forma fácil, con la condición de que los anticuerpos apropiados se utilicen. Las pruebas ELISA para C3a, C4a y C5a se establecen, a condición de que los estándares puedan obtenerse, pero la utilidad clínica de estos ensayos es limitada. De más ayuda para los clínicos son los ensayos para C1s-C1-inh, C3bBbP o C5bC9, incrementados, niveles que indican la activación de la ruta clásica, alterna o terminal, respectivamente. Los últimos ensayos utilizan un anticuerpo contra un

LECTURAS ADICIONALES

componente, por ejemplo, C1s, para ligar el complejo a una placa de ELISA y a un anticuerpo contra otro componente del complejo, por ejemplo, C1-inh, para detectar el complejo. Detección de los receptores del complemento Los anticuerpos para los receptores del complemento están disponibles en formas comerciales y se utilizan en la citometría de flujo para detectar la presencia de los receptores en suspensiones celulares. Algunos anticuerpos son también adecuados para la inmunohistoquímica de los cortes de tejido o para la preparación del centrifugado de células si se requiere la morfología celular.

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Lecturas adicionales Whaley K (ed.). Methods in Complement for Clinical Immunologists. 1985: Churchill Livingstone, Edinburgh. This text book provides a comprehensive, detailed account of the majority of complement assays, including the preparation of purified components. Dodds A, Sims R (eds). Complement. A Practical Approach. 1997: Oxford University Press, Oxford. This is an up to date laboratory manual for all aspects of laboratory complement work. Phimster GM, Whaley K. Measurement of complement. In Clinical Immunology. A Practical Approach, Gooi HG, Chapel H (eds) (1990). Oxford University Press, Oxford. This chapter provides guidance as to clinical indications for complement assays as well as methodologies.

47 Inmunología celular Aarnoud Huissoon

Introducción La inmunología celular es el estudio de las células del sistema inmunitario. Estas pruebas normalmente se realizan en el contexto de la investigación de posibles defectos del sistema inmunitario, por ejemplo, en pacientes con infecciones recurrentes o en infantes con insuficiencia en el crecimiento, en quienes pueden sospecharse inmunodeficiencias innatas raras. Por conveniencia, los leucocitos de la sangre periférica se evalúan con regularidad, pero también pueden usarse células de otras fuentes, como ganglios linfáticos y biopsias tisulares (por lo general en el marco de la investigación). Linfocitos y neutrófilos se estudian con más frecuencia, pero otros tipos de células, como los basófilos, también suelen analizarse en algunas circunstancias. Para evaluar las células del sistema inmunitario, puede requerirse la información con respecto a las cantidades de células presentes, su fenotipo y sus funciones. Una amplia gama de herramientas está disponible para estos análisis, y muchas técnicas están surgiendo en el campo clínico rutinario de las aplicaciones de la investigación. La inmunología celular es, por tanto, una ciencia en plena evolución. Inversamente, varias pruebas en uso permanecen en gran parte sin cambios por décadas. Éstas han demostrado ser robustas y confiables en la aplicación clínica, y las técnicas más nuevas son lentas para reemplazarlas.

Pruebas cuantitativas y cualitativas En el nivel más simple, la cantidad real de linfocitos y neutrófilos circulantes proporciona información útil sobre el sistema inmunitario. Éstos se encuentran fácilmente dispo-

nibles a partir de la cuenta diferencial automatizada de las células blancas. La población linfocítica se divide en células T, B y células asesinas naturales (NK), las cuales a su vez se dividen en subgrupos. Se han descrito alteraciones y deficiencias que afectaban prácticamente a todas estas poblaciones, y el análisis del subconjunto y del fenotipo de linfocito es una herramienta valiosa del diagnóstico. Los subgrupos de linfocitos se miden marcándolos con anticuerpos monoclonales. Se ha desarrollado una amplia variedad de anticuerpos que identifica una gama creciente de subpoblaciones de linfocitos. Algunos de los anticuerpos más comunes que se emplean para disecar a esas subpoblaciones se listan en el cuadro 47-1. Antes, los subgrupos de linfocitos se enumeraban manualmente contando las células marcadas con anticuerpos fluorescentes bajo el microscopio. Ahora el citómetro de flujo proporciona una herramienta más precisa para examinar una gran cantidad de marcadores linfocíticos con gran detalle. Citometría de flujo En un citómetro de flujo, las células individuales se conducen en una corriente fina de paso fluido rápido a través de un rayo láser. Los fotomultiplicadores detectan la dispersión de la luz láser por la célula y miden la luz emitida por cualquier marcador fluorescente que se haya agregado a la célula (fig. 47-1). A partir de esta información, el tamaño y la granularidad de la célula, así como el nivel de expresión de la superficie celular o de los antígenos citoplásmicos que se han marcado con anticuerpos fluorescentes, pueden medirse. Millares de células por minuto se analizan de esta

The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker. © 2005 John Wiley & Sons, Ltd.

456

CAP. 47

Cuadro 47-1

INMUNOLOGÍA CELULAR

Marcadores para el subgrupo de linfocito más usados

Subgrupos principales Células T

Linfocitos CD45+

CD3⫹

Células NK CD16/CD56⫹ (CD3⫺) Células B CD19⫹ o CD2⫹

Otros subgrupos Células T auxiliares CD4⫹ Células T citotóxicas CD8⫹

Célula T virgen CD45RA⫹ Células T efectoras/ memoria CD45RO⫹

Antígenos de activación HLA-DR, CD69,CD25 Moléculas coestimuladoras CD28, CD134 (OX40)

Célula B virgen IgD⫹/CD27⫺ Células B de memoria IgD⫺ /CD27⫹

Células B-1 CD5⫹ Células B-2 CD5⫺

Subgrupos y linfoma de la célula B IgM, IgG, ␬/␭ cadenas ligeras Ig, CD23

Células en fluido envolvente Fuente de luz láser PMT 2 PMT 1

Dispersión lateral de luz (SS)

Otros marcadores

Dispersión frontal de luz (FS)

Figura 47-1 Presentación simplificada de un citómetro de flujo. Las células pasan individualmente a través de un rayo láser. Para cada célula, la luz dispersada se mide con sensores de luz delanteros y laterales. Los anticuerpos fluorescentes en la célula son excitados por la luz láser y emiten luz a longitudes de onda diferentes, la cual se mide con los fotomultiplicadores (PMT). En citómetros de flujo más grandes, dos láseres y varios fotomultiplicadores, cada uno midiendo la luz emitida de una longitud de onda diferente, permiten examinar numerosas moléculas celulares diferentes u otras propiedades simultáneamente.

manera, para que una cantidad grande de datos con respecto a las poblaciones celulares pueda recopilarse muy rápido. Linfocitos, monocitos y granulocitos se distinguen por sus propiedades de la dispersión de la luz, solos o en combinación con la expresión de CD45 (fig. 47-2a). Los anticuerpos fluorescentes pueden entonces diferenciarse entre las diversas poblaciones de linfocitos (fig. 47-2b). Es necesario conocer no sólo las proporciones de los subgrupos de linfocitos presentes, sino también las cantidades absolutas de cada subgrupo en la muestra original. Adecuados rangos de referencia, relativos a la edad, están disponibles para los subgrupos principales. Este resultado

cuantitativo puede derivarse a partir de métodos de plataforma, ya sea dual o bien simple. En el primer método la cuenta absoluta del linfocito se obtiene de una cuenta diferencial del leucocito por citometría de flujo y de la cuenta total del leucocito a partir de un analizador estándar de hematología. Un método de plataforma simple puede ser más exacto, en especial cuando hay una proporción muy baja de la población de interés (p. ej., células T CD4+ en el síndrome de inmunodeficiencia adquirida, SIDA). La cuantificación por plataforma simple se logra agregando una cantidad conocida de perlas a un volumen determinado de sangre al principio de la prueba. Las perlas y los linfocitos marcados con anticuerpo se analizan simultáneamente con el citómetro de flujo, y las cuentas absolutas del subgrupo de linfocitos pueden calcularse. Un acercamiento alternativo se obtiene contando los linfocitos en un volumen fijo de sangre pasado a través del analizador, pero éste es dependiente de la confiabilidad de los fluídicos del citómetro de flujo. Los métodos de tinción y lisis del anticuerpo en sangre entera (en lugar de la tinción de los leucocitos separados) deben utilizarse para los análisis cuantitativos del linfocito.

Aplicaciones del análisis del subgrupo de linfocitos Monitoreo de la infección por VIH/SIDA Ésta es la indicación más común para el requerimiento de los subgrupos de linfocitos. Los resultados cuantitativos exactos son esenciales. Típicamente, las cantidades de la célula auxiliar T CD4+ son bajas, y el cociente de células T CD4+ a las CD8+ se invierte (está sobre 1.5:1 en adultos sanos). Sin embargo, no pueden utilizarse para diagnosticar la infección por VIH, puesto que los subgrupos de la

PRUEBAS CUANTITATIVAS Y CUALITATIVAS

457

Granulocitos

Monocitos

Linfocitos

Núm de células

DISPERSIÓN FRONTAL

Figura 47-2 a) Identificación de poblaciones de leucocitos a través de la dispersión de la luz y de la expresión de CD45. Cada punto representa los datos recolectados de una célula. Los linfocitos tienen dispersión frontal moderada (un índice del tamaño), la dispersión lateral baja (SS, un índice de la complejidad o granularidad celular) y expresión CD45 alta. b) Expresión de CD3 y CD4 sobre la población de linfocitos. Las células se han marcado con anticuerpos CD3 conjugados con fluoresceína, detectados sobre PMT1, y anticuerpos CD4 conjugados con ficoeritrina, detectados sobre PMT2. Después de seleccionar la población del linfocito, la expresión de CD3 y CD4 puede verse sola o como histogramas, o bien combinada en un gráfico de punto. El gráfico de punto aporta información adicional, demostrando que las células CD4⫹ son un subgrupo de células CD3⫹.

célula T son normales en un individuo infectado por VIH, y existen también muchas otras causas de perturbaciones de los subgrupos de linfocitos, por ejemplo, estrés, tratamiento con esteroides, infección intercurrente o variación diurna normal. Una vez que la infección por VIH se diagnostique con pruebas serológicas o de la biología molecular, las cuentas CD4 (conjuntamente con las mediciones de la carga vírica medidas con PCR) son esenciales en el monitoreo de la enfermedad. Se utilizan para indicar el nivel de supresión inmunitario, y es cuando el tratamiento con agentes antirretrovíricos y antimicrobianos profilácticos debe iniciarse. El desempeño del monitoreo de la célula T

CD4+ para el VIH en el Reino Unido está sujeto al control de calidad externo por NEQAS.

Investigación de inmunodeficiencia Muchas enfermedades primarias de inmunodeficiencia están asociadas con anormalidades de los subgrupos de linfocitos. Algunos ejemplos se listan en el cuadro 47-2. Mientras una cuenta total baja del linfocito es con frecuencia la primera pista para el diagnóstico de inmunodeficiencia grave, la detección del patrón de la deficiencia puede ayudar

458

Cuadro 47-2

CAP. 47

INMUNOLOGÍA CELULAR

Ejemplos de algunos síndromes primarios de inmunodeficiencia con hallazgos característicos del laboratorio

Diagnóstico

Infecciones

Inmunoglobulinas

Cantidades de linfocitos

Análisis de subgrupo de linfocito típico Estudios funcionales

Agammaglobulinemia unida a X (de Bruton) SCID unida a X

Bacterianas

Bajas/ ausentes

Normales

Células B ausentes

Proliferación normal para mitógenos

Ausentes

Bajas

Deficiencia HLA clase II

Vírica, micótica y bacteriana Vírica, micótica y bacteriana

Normales/bajas

Normales

Síndrome hiperIgM unido a X

Bacteriana / protozoaria

IgM incrementada/ normal; IgG, IgA baja/ausente

Normales

Células T y NK ausentes Células CD4⫹ T reducidas Expresión HLA-DR ausente sobre células B CD154 ausente sobre células T activadas

Proliferación ausente para mitógenos Proliferación normal para mitógenos, pero respuestas antígeno-específicas reducidas Proliferación normal para mitógenos pero respuestas antígenoespecífica reducida

al diagnóstico, por ejemplo, la ausencia de células T y B con células NK preservadas puede sugerir una deficiencia de RAG-1 o de RAG-2 (genes que están implicados en la generación de los receptores del antígeno de las células T y B). Normalmente se requieren estudios funcionales además del análisis del subgrupo de linfocito en la investigación de inmunodeficiencias congénitas graves (véase adelante). En algunas enfermedades de inmunodeficiencia, los números absolutos de poblaciones linfocíticas son normales, pero anormalidades sutiles pueden detectarse con análisis más detallados, por ejemplo, muchos pacientes con deficiencia primaria de anticuerpos (deficiencia inmunitaria variable común) tienen números completos normales de células T, B y NK. Sin embargo, sus células B muestran proporciones anormales de poblaciones vírgenes y de memoria, sugiriendo un defecto en la maduración de la célula B periférica u homeostasis como la causa para que su falta produzca un repertorio normal de anticuerpos. Las células T de pacientes con síndrome hiper-IgM no pueden expresar CD154 (antes llamado ligando CD40). CD154 no se expresa normalmente en la inactividad de células T de sangre periférica, y es necesario estimular primero las células T in vitro y después medir la expresión de la molécula por citometría de flujo. El defecto en la adhesión leucocitaria (LAD) es causado por la falla de los neutrófilos (y de otros leucocitos) para expresar integrinas ␤2 (heterodímeros CD11-CD18). En consecuencia, los neutrófilos del paciente no emigran de la corriente sanguínea al sitio de infección, y las infecciones graves recurrentes (con poco o nada de pus) se producen. La curación de la herida también se deteriora. Esta condición puede diagnosticarse simplemente midiendo la expre-

sión neutrofílica de CD18 y CD11a, b y c por citometría de flujo. Diagnóstico de malignidades linfoides La cuantificación y el análisis del fenotipo de los linfocitos de la sangre periférica (o médula) son esenciales en el diagnóstico de las enfermedades linfoproliferativas de las células B y T. La clonalidad de la célula B en estas condiciones se detecta con frecuencia por la expresión anormal de la cadena ligera de la inmunoglobulina sobre la superficie de la célula B. Las células T no expresan marcadores clónicos sobre la superficie celular, de modo que las malignidades se detecten por la expresión anormal (pérdida o expresión aberrante) de otros marcadores superficiales (p. ej., CD7, CD5, CD25). Mientras que muchas de estas condiciones se caracterizan por aumentos marcados en las cantidades linfocíticas de la sangre periférica, algunas (en particular neoplasmas de la célula T) pueden ser clínicamente sutiles en su manifestación y mantener una cuenta normal de linfocitos. En todos los casos, el inmunofenotipo del linfocito tiene que interpretarse dentro del contexto de otros hallazgos clínicos del paciente y del fenotipo de las células por microscopia. Otras condiciones inflamatorias e infecciones Anormalidades de subgrupos y fenotipos del linfocito en sangre periférica se han descrito en una gama amplia de enfermedades infecciosas e inflamatorias. Sin embargo, estas anormalidades es raro que tengan un diagnóstico útil, y nunca específico.

459

ESTUDIOS FUNCIONALES

Linfocitos a partir de sitios salvo de sangre y de médula ósea

100 000 Incorporación de timidina

De cuando en cuando es útil analizar linfocitos de otros sitios, como del líquido cefalorraquídeo y del líquido de lavado broncoalveolar. En el último caso, las poblaciones linfocíticas predominantes pueden ayudar a distinguir diversas enfermedades intersticiales del pulmón. En el primero, el propósito principal consiste en excluir el linfoma que involucra al sistema nervioso central.

(a )

Estudios funcionales

10 000

1 000

100 Blanco 1:80 1:40

Linfocitos T

Proliferación La medición de la proliferación del linfocito T es un método bien establecido que evalúa su competencia inmunitaria. Antes, se usaron los cambios en la apariencia de las células en la microscopia para evaluar la activación y respuesta de la proliferación a varios estímulos, de ahí el término “transformación linfocítica” que se aplica con frecuencia a esta prueba. Durante varias décadas este proceso se ha cuantificado con más exactitud midiendo la incorporación de la timidina 3H radiomarcada en el DNA de células proliferantes. La timidina titulada se agrega al cultivo celular durante las últimas 16 h de un cultivo de 2 a 7 días, y las células, entonces, se recolectan en un filtro del papel. La cantidad de radiactividad incorporada, cuando se detecta mediante conteo por centelleo, es proporcional a la replicación del DNA que ocurre en las células proliferantes (fig. 47-3a). Ambos, la radiactividad incorporada absoluta (en desintegraciones o cuentas por minuto, después de la corrección de las cuentas originales) y el índice de estimulación (cuentas de células estimuladas divididas entre cuentas de células sin estimulación), deben reportarse. También se han desarrollado métodos alternativos que miden la proliferación del linfocito, aunque ninguno de éstos ha desplazado hasta ahora la incorporación de timidina como la técnica estándar en los laboratorios clínicos. Éstos incluyen la detección por flujo citométrico de la expresión del antígeno de activación (p. ej., CD25, CD69, Ki67), la incorporación de bromodeoxiuridina, o la dilución del colorante intracelular, carboxifluoresceína diacetato succini-

1:10

(b)

Número de células

En el curso de una inmunorrespuesta, las células T normales exhiben varias funciones que pueden evaluarse in vitro. Éstas incluyen la proliferación, la sobrerregulación de antígenos de la superficie celular, la producción de citocina y la apoptosis.

1:20 Dilución del mitógeno

Intensidad de CFSE

Figura 47-3 a) Proliferación linfocítica en respuesta a los mitógenos PHA 250 ␮g/ml (䊏), PWM 100 ␮g/ml (䊉), y OKT3 1 ␮g/ml (䉬). La incorporación de la timidina 3H se indica en las desintegraciones/minuto. Reproducida de Huissoon et al. (2002), con el permiso de Blackwell Publishing Ltd. b) Histograma que representa el principio de la dilución de CFSE para medir la proliferación celular. Las células se cargan con CFSE al inicio del procedimiento. Éste es un colorante citoplásmico que no interfiere con la función celular. Las células se incuban con el mitógeno o el antígeno por un número de días y la intensidad CFSE se analiza con citometría de flujo. En la representación anterior, el pico derecho describe las células que no han experimentado división celular, y por tanto contiene la cantidad inicial completa de CFSE. Con cada división celular la intensidad del colorante se reparte en dos, de tal forma que cada ciclo de la división puede identificarse como un nuevo pico a la izquierda de las células no proliferativas. El bimarcaje de las células con los anticuerpos específicos del linaje puede identificar qué tipos celulares ya respondieron al estímulo y cuáles no.

CAP. 47

INMUNOLOGÍA CELULAR

midil éster (CFSE), por células T activadas y proliferantes (fig. 47-3b). Estos métodos tienen la ventaja de no requerir el uso y la medición de radioisótopos. Las células T pueden estimularse para que proliferen en respuesta a una variedad de estímulos, y éstos normalmente se utilizan en una gama de concentraciones para mostrar una dosis-respuesta (fig. 47-3a). La inducción del flujo de calcio por ionomicina y un ionóforo del calcio estimula muchos tipos de célula, y esta activación es totalmente independiente de la célula normal que señala trayectorias. La fitohemaglutinina, una lectina de la planta identificada primero por su capacidad para aglutinar eritrocitos, y la concavalina A, estimula todas las células T a través de varios receptores superficiales. Infantes con inmunodeficiencia combinada grave heredada (SCID) fallan en producir una respuesta para estos mitógenos. El mitógeno de la fitolaca (pokeweed) estimula ambas células T y B. Un acercamiento “más fisiológico” se consigue imitando la ruta normal de la estimulación de la célula T a través del receptor de la célula T. Esto puede lograrse por el entrecruzamiento del receptor con los anticuerpos anti-CD3 (que activa todas las células T) o añadiendo el antígeno al cultivo. Los antígenos son tomados por los monocitos sanguíneos y los péptidos que estimulan la célula T que se presentan a las células T en el contexto de las moléculas MHC clase II. Tal proliferación antígeno-específica activa sólo una proporción pequeña de células T de la sangre periférica total (alrededor de 1 en 104), y de acuerdo con la estimulación del mitógeno. Extraordinariamente, los pacientes se detectan con la función de la célula T normal a grosso modo pero con defectos sutiles en una comprobación más detallada, por ejemplo, en candidiasis mucocutánea crónica, las células T del paciente responden bien a todos los estímulos mitogénicos y antigénicos, excepto Candida. Este “agujero” notable en el repertorio inmunitario es inexplicable.

cina secretada por las células T está ligada por el anticuerpo en el pozo. Después de un periodo de incubación, las células se lavan y la citocina ligada se detecta por un segundo anticuerpo contra esa citocina. Ésta es visualizada por una reacción enzima-sustrato cromogénica, y cada mancha en el pozo representa una célula T secretora de citocina. La detección intracelular de citocinas por citometría de flujo es menos sensible que el método Elispot, pero permite la caracterización adicional de células productoras individuales usando marcadores superficiales. Las células T son estimuladas por el antígeno o el mitógeno, y hacia el final de la incubación, brefeldina A o monensina se agrega para bloquear el transporte de citocina desde el retículo endoplásmico. Esto produce la acumulación de citocina intracelular suficiente para ser detectada por marcaje directo del anticuerpo. Las células entonces se marcan con anticuerpos fluorescentes contra antígenos de superficie apropiados, por ejemplo, CD3 y CD69, y la membrana celular se fija e impermeabiliza. Esto permite que la citocina intracelular sea marcada con el anticuerpo específico (fig. 47-4).

CD69 PE

460

IFN-␥FITC

Producción de citocina La producción de citocina en respuesta a estímulos mitogénicos y antigénicos también puede medirse. Debido a que la producción de citocina es una función importante de las células T, la detección de la producción defectuosa de la citocina por ciertos estímulos suele tener importancia clínica. Las enfermedades causadas por la producción defectuosa de citocina están ahora comenzando a ser descritas (p. ej., deficiencia de IL-12). La producción de citocina por la célula T se mide en el sobrenadante del cultivo por ELISA, por la técnica de Elispot o por detección directa de citocinas intracelulares en células T individuales con la tinción del anticuerpo fluorescente. En el ensayo de Elispot, las células T estimuladas se colocan en pozos para cultivo de plástico de base plana que se han cubierto con anticuerpos contra una citocina específica (p. ej., interferón-␥). Cualquier cito-

Figura 47-4 Expresión del interferón gamma (IFN-␥) en células T estimuladas con enterotoxina estafilocócica B. CD69 (sobre el eje vertical) identifica células T activadas, y cerca de 10% de éstas se observa que expresan IFN-␥. Reproducida de Huissoon et al. (2002), con el permiso de Blackwell Publishing Ltd.

Apoptosis La apoptosis (muerte celular programada) es una función importante de las células T, en la ontogenia del linfocito y como parte de la involución de una inmunorrespuesta normal. Se ha descrito el síndrome linfoproliferativo autoinmunitario (ALPS) donde la capacidad de los linfocitos de experimentar apoptosis está dañada. Con cada inmunorrespuesta la proliferación de linfocitos no es equilibrada por una muerte correspondiente de linfocitos cuando el estímulo contagioso desaparece. Tales pacientes tienen inmunoglobulinas séri-

ESTUDIOS FUNCIONALES

461

cas incrementadas, enfermedades autoinmunitarias con autoanticuerpos demostrables, ganglios linfáticos agrandados y una cuenta alta de linfocito de sangre periférica con una acumulación anormal de las células T CD4⫺/CD8⫺. Existen varias causas para este cuadro clínico, todas relacionadas con defectos en la superficie celular o con mediadores intracelulares indicadores de apoptosis. El tipo más común de ALPS es causado por mutaciones en la proteína Fas (CD95). Para detectar defectos en apoptosis mediada por Fas, las células T del paciente primero se estimulan in vitro para hacerlas susceptibles a la apoptosis mediada por Fas. Un anticuerpo contra la molécula Fas se agrega al cultivo. En individuos normales una proporción alta de células T sufre apoptosis en respuesta a la unión de Fas en este ensayo. En pacientes con ALPS esto está marcadamente dañado. La apoptosis así inducida puede medirse por varias técnicas, pero la más conveniente es la citometría de flujo. Las características de las células apoptóticas, que pueden ser medidas, incluyen la condensación nuclear (detectada por tinción con yoduro de propidio), la unión de la anexina V a la fosfaditil serina externalizada, fragmentación nucleosómica del DNA (detectada por marcación fluorescente del extremo del nucleótido terminal), o la activación de la caspasa usando PhiPhi Lux como sustrato fluorescente de la caspasa.

es antígeno específica y no se mide en la práctica clínica rutinaria. La citotoxicidad de la célula NK puede determinarse midiendo la lisis de la línea celular K562. Las células K562 carecen de expresión HLA clase I, de tal forma que son un blanco natural para las células NK. Las células se cargan con 51cromo intracelular radiomarcado y se coincuban con los linfocitos del paciente (que contienen células NK efectoras). La lisis citotóxica de las células blanco es identificada por la liberación del cromo en el medio de cultivo. Es también posible evaluar la muerte de las células K562 por citometría de flujo. Las células blanco tienen que ser marcadas con un colorante lipofílico fluorescente antes de la incubación con leucocitos del paciente, de modo que puedan distinguirse de los linfocitos del paciente. La muerte citotóxica es identificada por su permeabilidad al yoduro de propidio, que es excluido por las células viables. Con cualquier método, la muerte debe determinarse sobre un rango de proporciones blanco: célula efectora. Los defectos de la muerte de NK se observan en inmunodeficiencias raras asociadas con albinismo parcial (p. ej., síndromes de Chédiak-Higashi y de Griscelli) y en síndromes hemofagocíticos familiares.

Pruebas in vivo

La función de la célula B es determinada con más facilidad midiendo las inmunoglobulinas y anticuerpos séricos del paciente contra agentes infecciosos específicos o vacunas, o ambas. Si se encuentran niveles bajos del anticuerpo, la respuesta a la vacunación puede aprobarse, lo cual es un indicador global excelente de la función de la célula B. La proliferación de la célula B (y T) se estimula con el mitógeno de fitolaca pokeweed, pero esto no da información sobre la producción de inmunoglobulinas. Esto puede ser probado con un ensayo de la placa inversa, donde las células B estimulantes se cubren con agarosa que contiene eritrocitos que se unen con la inmunoglobulina. Se adiciona el complemento y las inmunoglobulinas unidas a eritrocitos fijan el complemento e inducen hemólisis. Así, cada célula productora de inmunoglobulinas puede identificarse por la placa circundante de hemólisis. Este ensayo consume tiempo y ahora es raro que se realice, puesto que aporta poca información adicional que no se obtiene a partir de pruebas con anticuerpos séricos.

Las pruebas in vivo de la función célular T también son posibles. La hipersensibilidad retardada (tipo IV de Gell y Coombs) para recordar los antígenos es un buen indicador de la competencia inmunitaria de la célula T. Estas pruebas son baratas y rápidas, pero inconvenientes para usarse en niños pequeños. Una cantidad pequeña del antígeno se inyecta en la dermis, y la reacción de enrojecimiento y de hinchazón después de 2 a 5 días indica una inmunorrespuesta positiva a ese antígeno. Esta respuesta es mediada principalmente por las células T y por macrófagos. Se suprime en la desnutrición, infección por VIH y sarcoidosis, y por corticoesteroides u otra terapia inmunosupresiva. Sin embargo, se realiza rutinariamente sólo mediante comprobación por contacto e inmunidad para la tuberculosis (prueba de Heaf o de Mantoux). La interpretación de una prueba negativa es difícil si la exposición anterior o estado de la vacunación BCG no se conoce. Otros antígenos ubicuos, como de paperas, Candida y toxoide de tétanos, también pueden obtener tales respuestas, pero no se emplean en la práctica clínica rutinaria. Células asesinas naturales La citotoxicidad es una función de las células T CD8+ y de las células NK. La citotoxicidad de la célula T CD8+

Linfocitos B

Neutrófilos Los neutrófilos son células de breve duración que engullen y destruyen activamente organismos. El defecto más común del neutrófilo es la reducida cantidad de estas células. Esto puede ser congénito (p. ej., síndrome de Swachmann

462

CAP. 47

INMUNOLOGÍA CELULAR

o el de Kostmann), pero con frecuencia se adquiere después de la insuficiencia de la médula (p. ej., causada por las drogas o neoplasmas). Los defectos funcionales de los neutrófilos son relativamente raros, pero pueden investigarse rápido in vitro. Para eliminar un organismo invasor, los neutrófilos deben emigrar primero desde la circulación al tejido. Esto implica la capacidad de responder a los estímulos quimiotácticos y de adherirse al endotelio vascular. Pruebas de adhesión neutrofílica y de migración quimiotáctica están disponibles. La adhesión a materiales como lana de vidrio, placas de cultivo de plástico y células endoteliales cultivadas es posible medirlas. Sin embargo, los defectos detectados por tales pruebas se deben a síndromes por defecto en la adhesión leucocitaria y son diagnosticados con más facilidad midiendo la expresión de la integrina leucocítica por citometría de flujo (véase antes). La quimiotaxis de neutrófilos se mide por la observación microscópica del movimiento del neutrófilo hacia estimuladores como caseína y el péptido F-met-leu-phe. Esto se realiza empleando una cámara de Boyden, donde los neutrófilos son separados del estímulo quimiotáctico por un filtro microporo, y el frente principal de los neutrófilos que migran a través del filtro se mide. Alternativamente, una suspensión del neutrófilo y los estimuladores quimiotácticos se colocan en pozos adyacentes cortados en gel de agarosa, y el movimiento de neutrófilos en la agarosa hacia el estimulador también se mide. Los desórdenes de la migración del neutrófilo se han descrito en estados de deficiencia inmunitaria primaria, incluyendo el síndrome hiper-IgE y el síndrome de Chédiak-Higashi, así como en algunas otras enfermedades. Sin embargo, las anormalidades no son diagnósticas o consistentes. Después de emigrar al sitio de infección, los neutrófilos eliminan sus organismos blanco por fagocitosis y destrucción intracelular. Ambas funciones pueden probarse usando Candida como el organismo blanco. Las esporas cultivadas de Candida se incuban con neutrófilos aislados y el suero donador normal (el cual opsoniza a Candida). Se agrega al cultivo uridina marcada, y ésta se incorpora sólo por Candida extracelular viable. Los cultivos neutrófilo/Candida se recolectan de los filtros y la uridina 3H incorporada se mide con un contador beta. Cuentas altas (comparadas con los neutrófilos del control normal) indican fagocitosis neutrofílica dañada. Si se asume que la fagocitosis es normal, la destrucción intracelular de Candida puede medirse lisando los neutrófilos y evaluando la viabilidad de Candida por incorporación de 3H-uridina o por la exclusión del azul de metileno. Staphylococcus aureus es un blanco alternativo para los ensayos de la destrucción neutrofílica. En este caso, la destrucción se mide por chapado del sobrenadante de neutrófilos lisados en el medio de crecimiento y contando las colonias bacterianas producidas. Un ensayo por flujo ci-

tométrico que mide la fagocitosis de Escherichia coli marcada con fluoresceína opsonizada también se ha descrito. En gran medida, la causa más común del defecto en la destrucción intracelular neutrofílica es la enfermedad granulomatosa crónica. A pesar de su nombre algo inútil, es un desorden de inmunodeficiencia primaria causado por la deficiencia de una de las enzimas de la cadena NADPH oxidasa, responsable de la generación de superóxidos y peróxidos microbicidas. Estos productos de la “explosión respiratoria” se liberan dentro del fagolisosoma neutrofílico y destruyen organismos fagocitados. La prueba clásica para la detención de la integridad de esta función es la prueba de reducción del nitroazul de tetrazolio (NBT). El NBT es un colorante amarillo soluble que se adiciona a la sangre entera. Los neutrófilos se estimulan con acetato forbol miristato (PMA), y la reducción resultante del NBT por un producto azul insoluble puede observarse microscópicamente; los neutrófilos normales contienen gránulos azules. La incapacidad de los neutrófilos para reducir el NBT (por tanto, aparecen amarillos) indica un diagnóstico de la enfermedad granulomatosa crónica. Existen otras técnicas para medir la explosión respiratoria neutrofílica. La emisión de luz por sustratos quimioluminogénicos, como luminol y lucigenina, activados por la explosión respiratoria neutrofílica, puede medirse con un luminómetro. Un método de flujo citométrico simple basado en la oxidación de la dihidrorrodamina está ganando amplia aceptación, pues es muy elevada su sensibilidad y detecta con facilidad portadores de genes defectuosos (fig. 47-5). Basófilos Los basófilos ligan anticuerpos IgE vía sus receptores Fc␧RI. El entrecruzamiento de este IgE ligado por alergenos produce la activación del basófilo, con la inducción de la expresión de CD63 y la liberación de la histamina y de otros productos. Esto forma la base de novedosos medios de diagnóstico de la alergia. Para muchos alergenos, la prueba de piel punzada y la determinación de IgE alergénico específico en suero son apoyos útiles para el diagnóstico de la alergia. Sin embargo, la comprobación por punción de la piel y la determinación de IgE alergénico específico en suero son útiles para el diagnóstico de la alergia. Sin embargo, las pruebas en piel no siempre son posibles, y los ensayos in vitro para IgE específico no están disponibles para todos los posibles alergenos (en especial cuando el alergeno sospechoso es un fármaco). Por tanto, un medio alternativo para detectar una respuesta alérgica in vitro es agregar el alergeno sospechoso a la sangre del paciente, y medir tanto la liberación de la histamina en el supernadante como la expresión de CD63 en basófilos activados. Estos ensayos están disponibles en el comercio,

EL FUTURO DE LA INMUNOLOGÍA CELULAR

463

Fluorescencia FL1

Figura 47-5 Medición de la explosión respiratoria por la oxidación de la dihidrorrodamina. Los neutrófilos en sangre entera son estimulados por E. coli (B) o por PMA (C), y se agrega dihidrorrodamina (DHR). La explosión oxidativa convierte DHR a rodamina, con un aumento resultante en la fluorescencia medida en FL1 comparado con los neutrófilos sin estimular (A). Los neutrófilos de pacientes con enfermedad granulomatosa crónica no oxidan la DHR, y el cambio en la fluorescencia de la población no se observa. Los portadores sanos de genes defectuosos de la ruta NADPH oxidasa muestran generalmente neutrófilos normales y anormales, produciendo dos picos de fluorescencia.

pero todavía no se han validado con amplitud en la práctica clínica.

y eficiencia en el trabajo para asegurar calidad. El enlace cercano con el personal clínico es también esencial para entender la importancia de las anormalidades observadas.

El futuro de la inmunología celular Éste es un campo que continúa ampliándose indudablemente. Un número creciente de técnicas aparecen a través de las aplicaciones de la investigación al laboratorio clínico rutinario. Las aplicaciones del citómetro de flujo continúan aumentando, por ejemplo, los métodos están ahora disponibles para combinar las mediciones mediante flujo citométrico convencional con la biología molecular in situ, y los nuevos reactivos sin anticuerpos aumentan el alcance de las propiedades celulares que pueden evaluarse por este método eficaz. Los ensayos celulares funcionales derivan en particular de los recientes avances de los procesos básicos de la inmunología y de la enfermedad. Como en todos los métodos de diagnóstico de laboratorio, estas pruebas deben evaluarse cuidadosamente y controlarse de forma apropiada, pero la naturaleza de los ensayos funcionales los hace difíciles de estandarizar. La interpretación de los ensayos funcionales también está saturada de dificultades, y los laboratorios que ofrecen tales ensayos deben tener suficiente experiencia

Lecturas adicionales Rose NR, Conway de Macario E, Folds JD et al. (eds). Manual of Clinical Laboratory Immunology, 5th edn. 1997: American Society for Microbiology, Washington. Baugarth N, Roederer M. A practical approach to multicolour flow cytometry for immunophenotyping. J Immunol Methods 2000; 243:77-97. Brando B, Barnett D, Janossy G et al. Cytofluorometric methods for assessing absolute numbers of cell subsets in blood. European Working Group on Clinical Cell Analysis. Cytometry 2000; 42: 327-346. United Kingdom National External Quality Assessment Service (UKNEQAS) immune monitoring scheme. 2003: http://www. ukneqas.org.uk/Directory/LEUCO/immmon.htm Comans-Bitter WM, de Groot R, van de Beemd R et al. Immunophenotyping of blood lymphocytes in childhood. J Paediatr 1997; 130: 388-393. Primary Immunodeficiency Diseases-Report of an IUIS Scientific Group. Clin Exp Immunol 1999; 118 (SI): 1-28.

48 Enfermedades del complejo inmunitario y crioglobulinas Siraj A Misbah

Introducción Los complejos inmunitarios (CI) se forman cada vez que el anticuerpo encuentra el antígeno. Éste es un proceso fisiológico dinámico que permite que los antígenos exógenos potencialmente dañinos sean depurados por el sistema fagocítico mononuclear del huésped (MPS). La falla para depurar los complejos con éxito puede conducir al depósito del complejo inmunitario en las membranas basales del capilar del plexo glomerular, dérmico, sinovial y coroideo, donde desencadenan una respuesta inflamatoria. La inflamación inducida por los complejos inmunitarios depende de la capacidad de los complejos para activar el complemento (determinada por el isotipo de inmunoglobulina), con la generación consiguiente de los mediadores proinflamatorios potentes (C5a). El C5a es un quimiotáctico poderoso que atrae los leucocitos y monocitos polimorfonucleares circulantes hacia el sitio de depósito del complejo inmunitario, sirviendo para amplificar el daño tisular. El sitio de depósito del complejo inmunitario depende en parte de su tamaño, como se ejemplifica en el riñón, donde los complejos inmunitarios pequeños logran pasar a través de la membrana basal glomerular pero los complejos grandes son incapaces de hacerlo y se acumulan entre el endotelio y la membrana basal. Varios mecanismos aseguran que el depósito del complejo inmunitario no incida en la salud. Éstos incluyen: a) fagocitosis del CI por el MPS, el tamaño del complejo inmunitario es un factor crítico en este sentido, puesto que el MPS sólo es capaz de depurar los complejos pequeños; b) integridad de

la ruta del complemento, las proteínas del sistema del complemento juegan un papel vital porque mantienen el IC en la solución cubriendo los complejos con C3b (opsonización). Esto previene la formación de enrejados del complejo inmunitario grande y de la precipitación inmunitaria; además, el CI cubierto con C3b interactúa con el receptor de C3b (CR1, CD35) en las células rojas circulantes, que actúan como un transportador eficiente de los complejos inmunitarios hacia el MPS en el hígado y el bazo (fig. 48-1). Dado el papel vital de las proteínas del complemento en la depuración del CI, no es sorprendente que los pacientes con deficiencia primaria del complemento (en especial de los primeros componentes del complemento C1, C4, C2) tengan una incidencia alta de la enfermedad del complejo inmunitario. Otros factores que influyen en el depósito del complejo inmunitario incluyen a las propiedades fisicoquímicas del antígeno y del anticuerpo, como carga eléctrica, valencia, avidez de la interacción antígeno-anticuerpo y el isotipo de inmunoglobulina, por ejemplo, el CI que contiene antígenos catiónicos se liga ligeramente a la membrana basal glomerular aniónica, causando lesión tisular. Aunque los complejos inmunitarios circulantes ocurren en una gran cantidad de enfermedades (cuadro 48-1), en la mayoría de los casos estos complejos son un hallazgo tipo epifenómeno o incidental. Este capítulo se limita a aquellas enfermedades donde hay suficiente evidencia para apoyar un papel patogénico de los complejos inmunitarios: enfermedad del suero, lupus eritematoso sistémico (SLE) y crioglobulinemia mixta.

The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker. © 2005 John Wiley & Sons, Ltd.

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CAP. 48

ENFERMEDADES DEL COMPLEJO INMUNITARIO Y CRIOGLOBULINAS

Receptor Fc

Figura 48-1 Transporte de los complejos inmunitarios por los eritrocitos hacia los fagocitos mononucleares en el hígado y bazo.

Cuadro 48-1 Desórdenes relacionados con los complejos inmunitarios circulantes Inmunológicos

Infecciones Bacterianas

Micobacterianas Parasitarias Malignidad Fisiológicos

Lupus eritematoso sistémico Artritis reumatoide Crioglobulinemia mixta Síndrome de Felty Espondilitis anquilosante Esclerodermia Enfermedad del suero Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus sp. M. tuberculosis Tripanosomiasis, oncocercosis Todas las formas Individuos normales saludables Embarazo

Independientemente de la causa subyacente, las enfermedades del complejo inmunitario comparten varias características comunes de importancia clínica: a) participación multisistema debido al depósito de los complejos en los capilares del plexo del riñón, de la piel, sinovial y coroideo; b) hipocomplementemia durante los periodos de la enfermedad activa; c) la reducción en los niveles del complejo inmunitario circulante por terapia (drogas, plasmaféresis) conduce a la mejoría en la actividad de la enfermedad.

Ensayos para los complejos inmunitarios circulantes Cerca de 30 ensayos para la detección de los complejos inmunitarios circulantes fueron descritos en la década de 1970 con la expectativa (posteriormente insatisfecha) de que podrían ser útiles en el diagnóstico clínico y el manejo de la enfermedad del complejo inmunitario. Estos ensayos fueron divididos ampliamente en métodos físicos diseñados para distinguir entre la inmunoglobulina monomérica y los complejos inmunitarios, y los métodos biológicos dependientes de la interacción de los receptores celulares de la superficie o del complemento con los complejos inmunitarios (cuadro 48-2). Los problemas inherentes con los métodos físicos fueron ejemplificados con el ensayo de precipitación con polietileno-glicol (PEG). Además de precipitar los complejos inmunitarios, el PEG, incluso en concentraciones bajas, también precipita una variedad de proteínas séricas, incluyendo IgG, que causa dificultades importantes en la interpretación de los resultados. Los métodos biológicos para la detección de los complejos inmunitarios basados en el reconocimiento de los complejos en los sistemas humoral o del receptor celular también probaron ser poco fiables. El ensayo en células Raji, que utiliza una línea celular linfoblastoide derivada de un paciente con linfoma de Burkitt, se empleó de manera extensa en la década de 1970. Puesto que el ensayo se basa en la capacidad de las células linfoblastoides (que poseen receptores superficiales para C1q, C3b, C3d, pero ninguna inmunoglobulina superficial) de ligar los complejos inmunitarios séricos que también han

ENFERMEDAD SÉRICA

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Cuadro 48-2 Ensayos del complejo inmunitario Métodos físicos (ensayos que dependen de las propiedades físico-químicas del complejo)

Métodos biológicos (ensayos que dependen de) i) Reacción con las antiglobulinas (sujeta a la interferencia por los factores reumatoides endógenos) ii) Interacciones complemento-proteína

iii) Receptores celulares de superficie

Precipitación con polietilen-glicol Crioprecipitación Ultracentrifugación analítica Ensayo policlonal del factor reumatoide Ensayo monoclonal del factor reumatoide* 125C1q fijador* Ensayo dependiente de la conglutinina (una proteína bovina que liga los complejos inmunitarios)* Radioinmunoensayo en células Raji*

*Ensayos que se han encontrado analíticamente aceptables por el grupo de trabajo de WHO/IUS.

ligado el complemento, un índice inaceptablemente alto de positivos falsos se encontró en los pacientes con anticuerpos antilinfocitos, como en el SLE. Aunque un grupo de trabajo conjunto de la Organización Mundial de la Salud y la Unión Internacional de Sociedades Inmunológicas (IUIS) en 1981 encontró cuatro ensayos analíticamente aceptables, ninguno ha soportado la evaluación crítica de su utilidad clínica por su sensibilidad muy variable, especificidad y valor predictivo escaso. Además, la incapacidad de la mayor parte de los ensayos para detectar el antígeno específico dentro de los complejos inmunitarios es una desventaja significativa. El grupo de trabajo conjunto WHO/IUIS concluyó que la detección de los complejos inmunitarios circulantes no es esencial en ninguna enfermedad humana y, más importante, que la demostración de los complejos inmunitarios circulantes no es específica para la enfermedad del complejo inmunitario. En consecuencia, la mayor parte de los laboratorios clínicos de inmunología han abandonado los ensayos del complejo inmunitario y hasta la fecha no hay evidencia que sugiera que los ensayos del complejo inmunitario deban reintroducirse en la práctica clínica de rutina. En aquellos casos donde se sospecha la enfermedad del complejo inmunitario, la demostración de depósitos de inmunoglobulina y del complemento en una biopsia de los órganos afectados (p. ej., piel, riñón) se toma como evidencia implícita de la presencia de depósitos del complejo inmunitario. Los ensayos de los complejos inmunitarios circulantes son un sustituto pobre para el examen inmunohistológico directo y la enfermedad del complejo inmunitario no debe, bajo ninguna circunstancia, diagnosticarse principalmente sobre la demostración de complejos en el suero.

Enfermedad sérica La enfermedad del suero es un buen modelo para explicar las enfermedades del complejo inmunitario. Von Pirquet en

1908 delineó la enfermedad del suero como una entidad distinta en los niños con inmunizaciones repetidas con el suero antidiftérico derivado de caballos. La enfermedad del suero se manifestó de manera clínica como urticaria, fiebre, linfadenopatía, artralgia y proteinuria 8 a 12 días después de la inyección del suero del caballo. El periodo latente de 8 a 12 días reflejó el tiempo necesario para los pacientes para producir los anticuerpos contra las proteínas del caballo. En una concentración suficiente de los complejos del anticuerpo con el antígeno circulante, la carga resultante del complejo inmunitario abruma los mecanismos de control del cuerpo, conduciendo al depósito del complejo inmunitario y a hipocomplementemia. La mejora clínica depende de la depuración de los complejos circulantes, que ocurre de manera espontánea en muchos pacientes después de dos a tres semanas; una minoría puede requerir tratamiento con esteroides para acelerar la recuperación. Más recientemente, la enfermedad del suero se ha estudiado de forma extensa en pacientes con anemia aplásica que reciben globulina antitimocito de caballo (ATG). El síndrome clínico descrito en estos pacientes es casi idéntico a aquel descrito por von Pirquet, con altos niveles de complejos inmunitarios circulantes e hipocomplementemia que coinciden con la incidencia de erupción en la piel y de artralgia. Los estudios inmunofluorescentes de la piel de una biopsia revelan depósitos abundantes de inmunoglobulina y de C3 en las paredes de los vasos sanguíneos pequeños. Con la declinación en el uso de la ATG, las reacciones de hipersensibilidad al fármaco son en la actualidad la causa más común de la enfermedad del suero. Un amplio rango de fármacos puede actuar como haptenos y ligar a las proteínas del plasma con el subsiguiente complejo fármaco-proteína que desencadena una respuesta inmunitaria, por ejemplo, penicilina, sulfamidas y tiouracilos. La enfermedad del suero inducida por fármacos es normalmente autolimitante, condicionada a que el agente causante se retire.

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CAP. 48

ENFERMEDADES DEL COMPLEJO INMUNITARIO Y CRIOGLOBULINAS

Figura 48-2 Inmunofluorescencia de biopsias renales y de la piel en un paciente con SLE. a) Depósitos glomerulares de IgA en una distribución membranosa. b) Depósitos glomerulares de C1q en una distribución membranosa. c) Depósitos granulares de IgG en la unión dermoepidérmica (banda de lupus). Cortesía del Dr. W. Merchant, Leeds General Infirmary. a) y b), cortesía del Dr. P. Harnden, Leeds General Infirmary.

Investigación El diagnóstico de la enfermedad del suero es evidente por la característica presentación clínica en un paciente con el antecedente de ingestión del fármaco. Los desafíos del fármaco no se requieren de manera normal y no deben realizarse de rutina. El papel de la investigación del laboratorio es limitado; si bien las mediciones del complejo inmunitario es probable que muestren altos niveles en la circulación, esto se realiza o se requiere raras veces. Durante la etapa aguda de la enfermedad, la hipocomplementemia marcada (C3, C4 reducidos) es una característica y proporciona un indicador útil del depósito sistémico del complejo inmunitario. Las biopsias del tejido pueden requerirse en los casos de incertidumbre diagnóstica y muestran el depósito de inmunoglobulina y de C3 en la inmunofluorescencia directa del tejido cutáneo y renal.

pacientes pueden tener sólo un órgano implicado al principio de la presentación. Los pacientes que se presentan con enfermedad neurológica predominante plantean problemas de diagnóstico difíciles, los cuales se tratan después en este capítulo. Mucho del daño que causa el lupus en el órgano se liga directamente al depósito extenso de los complejos inmunitarios que ocurre en la piel, los riñones y el plexo coroideo. Como en la enfermedad del suero, la inmunofluorescencia de las biopsias de piel y renales muestra depósitos de inmunoglobulina y de complemento (fig. 48-2), mientras los complejos inmunitarios circulantes se encuentran en una proporción elevada de pacientes con enfermedad activa. De acuerdo con el papel clave del sistema del complemento en el procesamiento de los complejos inmunitarios, un rango de alteraciones del complemento se observa en los pacientes con SLE (se resume en el cuadro 48-3).

Lupus eritematoso sistémico

Investigación de los pacientes con sospecha de lupus eritematoso sistémico

El lupus eritematoso sistémico (SLE) es un desorden humano común del complejo inmunitario con una prevalencia de 200 casos por cada 100 000 en el Reino Unido. En su forma más florida, el SLE afecta la piel, los riñones, las articulaciones y el sistema nervioso central, aunque muchos

El SLE se relaciona con una multitud de anormalidades de laboratorio, incluyendo hipergammaglobulinemia policlonal, leucopenia, hipocomplementemia y una plétora de autoanticuerpos en la sangre. Mientras el aumento policlonal en las inmunoglobulinas del suero es un marcador

LUPUS ERITEMATOSO SISTÉMICO

Cuadro 48-3 en el SLE Primarias

Secundarias

Alteraciones del sistema del complemento

La deficiencia total de los primeros componentes del complemento C1q, C1r-1s, C4, C2 relacionada con la alta incidencia del SLE La deficiencia parcial de C4 con uno a dos alelos nulos de C4 se observa en cerca de 15% de los pacientes con SLE La expresión reducida de CR1 es una característica del SLE avanzado La actividad incrementada de la ruta clásica y alternativa se refleja como hipocomplementemia (TC3, TC4) Los anticuerpos para C1q se relacionan con enfermedad grave, en particular glomerulonefritis

no específico de la activación del sistema inmunitario, se produce una velocidad de sedimentación globular (ESR) elevada que actúa como una pista de diagnóstico útil cuando se combina con una proteína C-reactiva (CRP) normal. Aunque la incapacidad para montar una respuesta de la proteína de fase aguda ante la enfermedad activa se le reconoce de manera extensa como una característica del SLE, ésta no es invariable. Los pacientes con serositis activa, sinovitis crónica e infección bacteriana concomitante son una excepción en este dictamen. Autoanticuerpos como marcadores de enfermedad La presencia de anticuerpos circulantes para los antígenos nucleares es el sello característico del lupus activo. Los párrafos subsiguientes resumen los principios y la utilidad clínica de los ensayos que se emplean para detectar estos anticuerpos. Anticuerpos antinucleares (ANA) En la práctica clínica, la detección de anticuerpos antinucleares (ANA), según lo demostrado por inmunofluorescencia indirecta, es el único signo más útil para el diagnóstico del SLE. Los ANA son detectados al sobreponer células del tejido de roedor o del cultivo tisular derivado de una línea celular epitelial humana (HEp-2) con el suero de prueba, seguido por un segundo anticuerpo, IgG antihumano conjugado con fluoresceína. Usando el tejido del roedor, cerca de 95% de los pacientes con enfermedad activa sin tratar tienen un alto título de ANA (> 1 en 80). Las células HEp-2 exhiben un grado incluso más alto de sensibilidad, con un aproximado de 98 a 99% de positividad en los pacientes con enfermedad sin tratar. Las recientes directrices autorizadas

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Cuadro 48-4 Causas de ANA positiva

Enfermedad del tejido conectivo SLE Síndrome de Sjögren Polimiositis Artritis reumatoide Vasculitis Enfermedades del hígado Hepatitis activa crónica autoinmunitaria Cirrosis biliar primaria Enfermedad del hígado alcohólica Fármacos Infección Malignidad Individuos sanos

del Colegio Americano de Reumatología, el Colegio de Patólogos Americanos, la Sociedad de Inmunología Clínica y los Institutos Nacionales de Salud recomiendan el uso de las células HEp-2 como el mejor sustrato para el tamizaje de ANA (Kavanaugh y cols.). Con el uso generalizado de las células HEp-2, la existencia del lupus ANA negativo como una entidad de diagnóstico se ha puesto en duda (Cross y cols.). Contrariamente, la probabilidad del SLE sin tratar en un paciente con ANA negativo en células HEp-2 es del orden 90%) son superiores a ELISA. Los ensayos ELISA, en virtud de su propensión para detectar anticuerpos de avidez baja, producen resultados falsos positivos del anticuerpo del DNA en una minoría significativa de pacientes sin lupus. A pesar de esta desventaja, los ensayos ELISA se utilizan cada vez más en práctica clínica en vista de su alta sensibilidad, Cuadro 48-5

Lupus y el síndrome antifosfolípido

Cuadro 48-6 Criterios para el diagnóstico del síndrome del anticuerpo antifosfolípido* Clínicos

Laboratorio

Trombosis venosa o arterial, o ambas Pérdida fetal recurrente Trombocitopenia persistente Elevación persistente del anticuerpo IgG o IgM, o ambos, de la cardiolipina (␤2GPIdependiente)† Anticoagulante del lupus

*Al menos un criterio de laboratorio y uno clínico deben estar presentes; las pruebas de laboratorio deben ser positivas en al menos dos ocasiones en un lapso de más de tres meses separados. †La medición del anticuerpo de la cardiolipina puede sustituirse pronto por la medición directa de los anticuerpos para ␤2GPI.

Comparación de los tres ensayos anti-dsDNA muy utilizados en el SLE

Sensibilidad Especificidad Detección de los anticuerpos de avidez alta Detección de los anticuerpos de avidez baja Capacidad para identificar los isotipos del anticuerpo individuales (IgG, IgA, IgM) Conveniencia para la monitorización de la enfermedad activa

Farr

Crithidia

ELISA

Alta Alta +++ + No Sí

Alta Alta ++ ++ Sí No

Alta Moderada ++ +++ Sí Sí

LUPUS ERITEMATOSO SISTÉMICO

Figura 48-7 a) Oclusión de la rama arterial retiniana en un paciente con SLE y con el síndrome antifosfolípidos; el defecto es más pronunciado en el angiograma de sustracción mostrado en (b).

lupus). El término “síndrome antifosfolípido” (APS) fue forjado para delinear a aquellos pacientes con trombosis y niveles elevados de los anticuerpos del fosfolípido (cuadro 48-6). En contraste con otros estados trombofílicos, que resultan en trombosis venosa predominante, los pacientes con el APS pueden desarrollar trombosis tanto en los vasos arteriales como en los venosos. Las manifestaciones clínicas dependen de qué órgano se vuelve isquémico (fig. 48-7). Los APA pueden detectarse por ELISA o por la prolongación de los ensayos de coagulación dependientes de fosfolípidos (tiempo de tromboplastina parcial activado, APTT). Los APA detectados por ELISA utilizando cardiolipina, un fosfolípido ácido, como antígeno pueden no actuar siempre como un marcador verdadero de trombosis, puesto que muchos po-

475

sitivos falsos se han detectado en pacientes con infección (bacteriana, viral, protozoaria), terapia con fármacos y otras enfermedades del tejido conectivo. El positivo falso histórico VDRL se debe a la presencia de APA dirigida contra la cardiolipina presente en el reactivo de VDRL. La incapacidad de los ensayos actuales de ELISA para distinguir entre la trombosis relacionada y la que no lo está con los APA condujo a dificultades para interpretar el significado clínico de los niveles elevados de APA. La distinción es importante, puesto que los pacientes con trombosis relacionada con APA requieren terapia intensiva anticoagulante a largo plazo, tal vez de por vida. La evidencia reciente sugiere que la trombosis relacionada con APA está dirigida, en gran parte, contra la ␤2 glucoproteína I (␤2GPI, un cofactor de proteína sérico que liga fosfolípidos) más bien que los fosfolípidos per se. Dos fuentes de ␤2GPI se encuentran en los ensayos actuales: las muestras de prueba de suero humano y suero bovino utilizadas para bloquear las placas de ELISA. Se piensa que la interacción de la cardiolipina inmovilizada con ␤2GPI altera su conformación, volviéndola inmunogénica. En vista de la incapacidad de los ensayos ELISA convencionales para distinguir entre la trombosis relacionada y la que no lo está con los APA, hay mucho interés en los ensayos que utilizan ␤2GPI purificada como antígeno. Aunque su presencia no se incluye en la actualidad en los criterios de diagnóstico para el síndrome antifosfolípido, los anticuerpos anti-␤2GPI son predictores más fuertes de trombosis que los anticuerpos para la cardiolipina convencionales detectados por ELISA. Los APA que interfieren con los ensayos de coagulación dependientes de fosfolípidos reconocen un complejo fosfolípido-protrombina (se les denomina anticoagulantes del lupus [LAC], en reconocimiento de su incidencia en pacientes con lupus). El término LAC es una denominación impropia, puesto que se relaciona con la trombosis in vivo más bien que con la hemorragia. La presencia de los LAC se sospecha en un APTT prolongado que no se corrige con la adición de plasma normal, sugiriendo así la presencia de un inhibidor. Puesto que la demostración de los anticuerpos para los LAC indica el desarreglo funcional de la coagulación, estos anticuerpos se correlacionan más estrechamente con la trombosis que los APA demostrados por ELISA. La mayoría de los pacientes con lupus es seguro que tengan LAC, además de anticuerpos de la cardiolipina (70%), aunque en una minoría se encuentren anticuerpos de la cardiolipina o de los LAC (15% en cada categoría). Lupus eritematoso sistémico neuropsiquiátrico (NPSLE) El papel de la investigación de laboratorio La implicación neurológica en el SLE es un problema importante que afecta hasta dos tercios de pacientes en algún

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CAP. 48

ENFERMEDADES DEL COMPLEJO INMUNITARIO Y CRIOGLOBULINAS

punto de su enfermedad. Mientras cerca de 20% de estos pacientes continúa en esta condición sobre un segundo plano de la enfermedad sistémica activa, en la mayor parte de los casos es pasiva o sólo ligeramente activa. El médico enfrentado con un paciente con SLE y características neurológicas tiene que realizar la distinción importante entre la enfermedad neurológica debida al lupus (primario), la infección oportunista como una causa secundaria y la psicosis esteroide, puesto que la mayoría están en terapia inmunosupresiva en el momento de la presentación. Un rango diverso de presentaciones clínicas se observa (cuadro 48-7), reflejando mecanismos patogénicos subyacentes múltiples. Por Cuadro 48-7

Manifestaciones neuropsiquiátricas del SLE

Síndrome cerebral orgánico (deterioro cognitivo, psicosis*) Ataques Neuropatía craneal Neuropatía periférica Orden decreciente Accidente cerebrovascular de frecuencia Desorden en el movimiento Mielitis transversal *Puede ser inducida por esteroides.

lo menos tres hipótesis se han propuesto para explicar las diversas presentaciones clínicas: anticuerpos antineuronales, trombosis relacionada con anticuerpos de fosfolípidos, enfermedad conducida por la citocina. Es lamentable que ninguno de los marcadores actuales disponibles de laboratorio del SLE sea suficientemente específico para el diagnóstico del lupus neurológico primario. Varios estudios han mostrado que las anormalidades en los niveles de anti-DNA y del complemento (C3, C4) en el suero o en el líquido cefalorraquídeo (LCR) no discriminan entre la enfermedad neurológica y la no neurológica en el SLE. El entusiasmo inicial por los anticuerpos dirigidos contra las neuronas (anticuerpos linfocitotóxicos, que reaccionan con el tejido cerebral y los anticuerpos directamente señalados contra los antígenos neuronales) como los marcadores específicos para el lupus neurológico fue abatido por los estudios que demostraban su presencia en los pacientes con lupus sin implicación neurológica. Las recientes pretensiones de que los anticuerpos dirigidos contra las proteínas ribosómicas P son marcadores específicos de la psicosis del lupus han sido refutadas por su demostración en 50% de los pacientes con SLE sin psicosis. El examen del LCR es obligatorio en todos los pacientes con SLE neuropsiquiátrico para permitir que los casos de infección que se hacen pasar por NPSLE se diagnostiquen. En un estudio prospectivo reciente de la implicación neurológica en el SLE, la infección (criptocócica, tuberculosis

y meningitis piógena) era la causa subyacente en cerca de 50% de los casos. La presencia de bandas oligoclonales exclusivamente en el LCR favorece al NPSLE pero puede también ocurrir con la infección. En la ausencia de un marcador específico de laboratorio, el diagnóstico del NPSLE sigue dependiendo mucho de la perspicacia clínica tradicional. Valoración de actividad de la enfermedad en el SLE La medición exacta de la actividad de la enfermedad es crucial para el manejo correcto del SLE. Varios índices de la actividad de la enfermedad se han ideado para simplificar esta tarea y asegurar uniformidad en los estudios clínicos. Cuatro sistemas bien validados y en uso en la actualidad son el índice de actividad de la enfermedad del SLE (SLEDAI), medición de la actividad del lupus sistémico (SLAM), la escala del Grupo de Actividad del Lupus de las Islas Británicas (BILAG) y el índice de actividad del lupus (LAI). Junto con la valoración clínica, los marcadores serológicos de la actividad de la enfermedad son una ayuda importante para el médico al determinar la necesidad de terapia inmunosupresiva en el SLE. La enfermedad activa se acompaña en la mayoría de los pacientes por un incremento en los niveles séricos de antiDNA y una caída en los niveles del complemento (C3, C4). En algunos pacientes, sin embargo, las mediciones del complemento no reflejan la actividad de la enfermedad. Puesto que C3 actúa como reactivo de fase aguda, un incremento en la concentración secundaria a la inflamación o a la infección enmascara la consunción debida al SLE activo. Los niveles séricos del C3 son normales en cerca de 50% de los pacientes con enfermedad activa, mientras las mediciones de C4 son de valor limitado en pacientes con alelos nulos de C4. En consecuencia, varios estudios han valorado el papel de los productos de degradación del complemento (C3d, C4d, C5b-9) como marcadores de la actividad de la enfermedad. En general, los productos de degradación del complemento son marcadores más sensibles de la enfermedad activa (60 a 80% de sensibilidad) que las mediciones convencionales de C3 y C4. Su carencia relativa de especificidad (45 a 80% de especificidad), sin embargo, ha impedido su adopción extensa en la práctica clínica. En ausencia del marcador serológico ideal de la actividad de la enfermedad en el SLE, el uso de los niveles del anticuerpo anti-DNA en serie junto con el complemento (C3 o C4, y/o los productos de degradación) y CRP representan el perfil más útil de laboratorio para valorar la actividad de la enfermedad (cuadro 48-8). El lugar de los ensayos de adhesión de la molécula en la valoración de rutina de la actividad de la enfermedad en el lupus está en la actualidad bajo investigación. Los estudios preliminares sugieren que los niveles séricos de VCAM-1

477

CRIOGLOBULINEMIA

Cuadro 48-8

Cambios en los anticuerpos anti-DNA, C3, C4 y CRP en relación con la actividad de la enfermedad en el SLE

Enfermedad activa Enfermedad inactiva Infección bacteriana concomitante

anti-DNA

C3

C4

CRP

c N o sl c N o sl c

T N N, c o T

T N N, c o T

N o sl c N c

N = normal; sl = ligero.

(molécula de adhesión de la célula vascular) están marcados con niveles elevados en la nefritis del lupus y parecen relacionarse con la actividad de la enfermedad; los niveles de E-selectina y de ICAM-I (molécula de adhesión intercelular) son inútiles. Si la medición de VCAM-1 es superior a los marcadores serológicos existentes de la actividad, depende de los méritos de los estudios prospectivos futuros.

III se componen de una mezcla de IgG e IgM policlonales y constituyen el 50% restante. Mientras la mayor parte de las crioglobulinas tienden a precipitarse a temperaturas debajo de 10°C, en ocasiones una crioglobulina termolábil puede precipitarse en la jeringuilla utilizada para la venopunción si no se ha precalentado a 37°C. Las razones exactas de la crioprecipitación de las inmunoglobulinas no se conoce.

Crioglobulinemia

Etiología

Introducción

La crioglobulinemia se relaciona en la mayor parte de los casos con un desorden subyacente bajo la forma de paraproteinemia maligna, linfoma, enfermedad autoinmunitaria o infección. La crioglobulinemia tipo I se asocia con paraproteinemia, sólo en una minoría de pacientes que no pueden mostrar evidencia de enfermedad linfoproliferativa subyacente en la presentación. En la crioglobulinemia mixta (tipos II y III), la investigación clínica detallada no puede descubrir la enfermedad autoinmunitaria o la infección relacionada en hasta un tercio de pacientes. Estos pacientes fueron catalogados originalmente como poseedores de crioglobulinemia esencial idiopática o mixta. Desde 1992, los estudios de Italia, EUA, Francia y Suiza han proporcionado evidencia convincente de que 60 a 80% de los

El término “crioglobulinemia” se utiliza para denotar la presencia de crioglobulinas en la sangre. Las crioglobulinas son inmunoglobulinas que se precipitan de manera reversible en el frío (4°C), y se redisuelven a temperaturas más altas (37°C). Tres tipos de crioglobulinas se reconocen según su inmunoglobulina de composición y enfermedades relacionadas (cuadro 48-9). Las crioglobulinas tipo I se componen de inmunoglobulina monoclonal (IgG o IgM) y constituyen cerca de 25% de todas las crioglobulinas. Las crioglobulinas tipo II, que se componen de una mezcla de IgG monoclonal con actividad de factor reumatoide e IgM policlonal, constituyen otro 25%. Las crioglobulinas tipo

Cuadro 48-9 Clasificación de las crioglobulinas Composición

Enfermedades relacionadas

Tipo I

Inmunoglobulina monoclonal, normalmente IgM o IgG

Macroglobulinemia de Waldenström Mieloma, enfermedad linfoproliferativa

Tipo II

IgM monoclonal factor reumatoide más IgG policlonal

Infecciones • Virales (hepatitis C, hepatitis B, VIH, Epstein-Barr) • Bacterianas (endocarditis) • Espiroquetales (sífilis, enfermedad de Lyme) • Parasitarias (paludismo) • Fúngicas (coccidioidomicosis) • “Idiopáticas” (crioglobulinemia mixta esencial)

Tipo III

Factor IgM policlonal reumatoide más IgG policlonal*

Autoinmunitario • SLE, artritis reumatoide, síndrome de Sjögren “idiopático” • Crioglobulinemia mixta esencial

*Las cantidades traza de las crioglobulinas tipo III pueden encontrarse en algunos individuos normales.

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ENFERMEDADES DEL COMPLEJO INMUNITARIO Y CRIOGLOBULINAS

pacientes con crioglobulinemia tipos II y III tiene infección subyacente de hepatitis C. Aunque algunos pacientes con crioglobulinemia mixta exhiben características de la enfermedad linfoproliferativa, como poblaciones monoclonales de la célula B en la médula ósea y rearreglo del gen de la inmunoglobulina en clones de los linfocitos de la sangre periférica, el linfoma ostensible es raro. La inmunopatogenia de la crioglobulinemia está mal entendida. Un amplio rango de complejos primarios antígeno-anticuerpo se ha detectado en los crioprecipitados de las crioglobulinas tipos II y III, además del complejo del factor reumatoide y de la IgG. Esto llevó a la visión de que la formación de crioglobulinas mixtas es el resultado final de una secuencia de eventos conducida por una respuesta del anticuerpo a los agentes infecciosos o a los antígenos endógenos, como en el SLE.

Características clínicas Las manifestaciones clínicas de la crioglobulinemia se deben a una combinación de la obstrucción vascular y del depósito del complejo inmunitario. Las crioglobulinas del tipo I pueden ocurrir en cualquier sexo y causar principalmente hiperviscosidad y obstrucción vascular. En contraste, las crioglobulinas mixtas (tipos II y III) afectan a las mujeres en particular y se presentan con características clínicas diversas, por el depósito de complejos inmunitarios crioprecipitables en los vasos sanguíneos, causando vasculitis sistémica que afecta la piel, el riñón y articulaciones. Las biopsias de piel de la erupción purpúrica característica observadas en tales pacientes muestran vasculitis leucocitoclástica con depósito de inmunoglobulina y del complemento. La implicación renal debido a la glomerulonefritis

Figura 48-8 Manifestaciones clínicas y de laboratorio de la crioglobulinemia mixta en un paciente con hepatitis C. a) La erupción púrpura característica en miembros más bajos; la flecha indica un área púrpura palpable. Reproducida de Shakil y Bisceglie (1994), con permiso. b) Suero almacenado mostrando el crioprecipitado después de 24 h de incubación a 4°C (derecha), redisolución por el calentamiento a 37°C (izquierda). c) Electroforesis de la zona del suero colectado a 37°C que muestra el crioprecipitado redisuelto como una banda discreta en la región gamma, que en la inmunofijación muestra estar compuesta de IgM monoclonal e IgG policlonal. Observe la ausencia de la banda gamma en la electroforesis de la zona de la muestra colectada a temperatura ambiente (TA) del mismo paciente. d) Biopsia renal mostrando depósitos glomerulares eosinófilos de crioglobulina (seudotrombina) en el examen de H&E de rutina (izquierda) que corresponde a los depósitos gruesos (derecha) de IgG sobre inmunofluorescencia. Reproducida de Graham (Arthrit Rehum 1992;35:1107), con permiso.

CRIOGLOBULINEMIA

membranoproliferativa con depósito de la inmunoglobulina y del complemento ocurre en 50% de todos los pacientes con crioglobulinemia mixta. Las características histológicas distintivas de la glomerulonefritis crioglobulinémica incluyen la infiltración monocítica glomerular marcada, los depósitos eosinófilos rojo Congo negativos amorfos en los capilares y una membrana basal glomerular doble contorneada ocurren por una interposición de los monocitos. La presencia de estas características en la biopsia renal en un paciente con la, así llamada, glomerulonefritis “idiopática” debe estimular una investigación para las crioglobulinas. La función hepática deteriorada con un amplio espectro de anormalidad histológica, que comprende desde la hepatitis persistente crónica hasta la cirrosis, ocurre en 70% de pacientes y es de interés en vista de la asociación fuerte de la infección de hepatitis C y de la crioglobulinemia mixta (fig. 48-8). Investigación de laboratorio de la supuesta crioglobulinemia Procesamiento de la muestra La razón más común del fracaso para demostrar la existencia de crioglobulinas circulantes es la colección y el procesamiento incorrectos de la muestra. La atención meticulosa

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en la colección de las muestras sanguíneas es esencial. La sangre debe colectarse en un tubo sencillo sin anticoagulante y sumergirse en un frasco que contenga agua a 37°C, seguido por el traslado inmediato al laboratorio. El fallo para colectar las muestras a 37°C permite a las crioglobulinas precipitarse con el coágulo de sangre y, por tanto, que escape a la detección. La figura 48-9 ilustra los pasos en la detección de las crioglobulinas en el laboratorio. Otras características del laboratorio que sugieren la presencia de crioglobulinas Los indicadores útiles de la presencia de crioglobulinas mixtas son la depleción marcada de los primeros componentes del complemento del suero (C4, C1q) por la activación de la ruta clásica de los complejos inmunitarios. La combinación de un suero bajo de C4 y del factor reumatoide IgG es un rasgo característico de la crioglobulinemia mixta, que ocurre en más de 90% de los pacientes. Es una regla general útil que los pacientes con un inexplicable C4 bajo del suero y enfermedad renal o de la piel deben ser investigados para la crioglobulinemia. Las crioglobulinas interfieren con las mediciones inmunoquímicas de rutina de las inmunoglobulinas séricas y llevan a niveles artificiales bajos; pueden también interferir con los análisis de rutina del conteo sanguíneo total por los

Figura 48-9 Pasos en la detección de las crioglobulinas en el laboratorio.

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ENFERMEDADES DEL COMPLEJO INMUNITARIO Y CRIOGLOBULINAS

contadores automatizados celulares y conducir a leucocitosis y trombocitosis falsas. La colección y el análisis de las muestras a 37°C evitan estos problemas. Además de caracterizar la crioglobulina, todos los pacientes se investigan para un desencadenante subyacente. En el caso de la crioglobulinemia tipo I, las investigaciones apropiadas para la enfermedad linfoproliferativa deben instituirse. A los pacientes con crioglobulinemia mixta se les practica serología de la hepatitis, incluyendo la PCR para evaluar el RNA de la hepatitis C, para seleccionar aquellos que se benefician de terapia con interferón alfa. La investigación de rutina para otros desencadenantes infecciosos (endocarditis, sífilis, enfermedad de Lyme, paludismo, VIH), según se informa, relacionados con la crioglobulinemia mixta no se justifica en ausencia de evidencias para lo contrario.

Lecturas adicionales ACR Ad Hoc Committee on Neuropsychiatric Lupus Nomenclature. The American College of Rheumatology nomenclature and case definitions for neuropsychiatric lupus syndromes. Arthrit Rheum 1999; 42: 599-608. Beddhu S, Bastacky S, Johnson JP. The clinical and morphological spectrum of renal cryoglobulinaemia. Medicine 2002; 81: 398-409. Bootsma H et al. Prevention of relapses in systemic lupus erythematosus. Lancet 1995; 345: 1595-1599. Bruyn GAW. Controversies in lupus: nervous system involvement. Ann Rheum Dis 1995; 54: 159-167. Buyon JP et al. Assessment of disease activity and impending flare in patients with SLE. Comparison of the use of complement split products and conventional measures of complement. Arthrit Rheum 1992; 35: 1028-1037. Cervera R et al. Systemic lupus erythematosus: clinical and immunologic patterns of disease expression in a cohort of 1000 patients. Medicine (Baltimore) 1993; 72: 113-124. Chapel H, Haeney M, Misbah S, Snowden N. Essentials of Clinical Immunology, 4th Edn. 1999: Blackwell Science, Oxford. Cross LS, Aslam A, Misbah SA. Antinuclear antibody-negative lupus as a diagnostic entity does it no larger exist? Q J Med 2004; 97: 303-308.

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49 Tipificación de HLA Mark Hathaway

Introducción El trasplante ahora es una terapia médica aceptada para reemplazar órganos enfermos. Sin embargo, la respuesta del sistema inmunitario del huésped al órgano trasplantado es un obstáculo permanente importante para obtener un resultado exitoso. Los trasplantes de órgano son destruidos por una inmunorrespuesta adaptable, principalmente por linfocitos T hacia los antígenos ajenos presentes sobre la superficie del tejido injertado. De los diversos antígenos donadores presentes en un tejido aloinjertado que pueden potencialmente obtener una inmunorrespuesta, los antígenos que activan el complejo principal de histocompatibilidad (MHC) son los más importantes. Cuando el donador y el receptor son dispares de MHC, una respuesta inmunitaria se inicia y se dirige contra una molécula o moléculas MHC no propias en el tejido injertado. Aunque otros sistemas del antígeno pueden invocar una inmunorrespuesta dirigida al aloinjerto, los antígenos MHC conocidos como antígenos leucocitarios humanos, o HLA para abreviar, son los más inmunógenos. Esto sucede por la habilidad que poseen para unirse directamente al receptor del antígeno de la célula T, ligando el proceso del antígeno normal que se requiere para estimular respuestas de la célula T; y a la frecuencia alta de células T circulantes en poblaciones periféricas con la especificidad del receptor para MHC ajenos. Puesto que las diferencias en antígenos MHC provocan tal rechazo vigoroso de aloinjertos, una cantidad considerable de trabajo se dirige hacia la compatibilidad MHC donador:receptor. Definiendo la especificidad HLA, en un esfuerzo por minimizar el rechazo, a través de la compa-

tibilidad MHC donante:receptor es un proceso conocido como tipificación HLA.

Estructura y función de HLA Los genes HLA del MHC humano consisten de múltiples sitios clases I, II y III presentes en el brazo corto del cromosoma 6. Ellos comprenden cerca de 4 ⫻ 106 pares básicos, que contienen por lo menos 50 genes. Las proteínas HLA clase I consisten en una cadena alfa (␣) que tiene tres subunidades, cada una se asemeja a un dominio tipo inmunoglobulina (Ig). Cuando se expresan sobre la superficie de la célula, las moléculas HLA clase I están unidas en forma no covalente al péptido ␤-2-microglobulina (␤-2M), que se codifica en un cromosoma separado. Existen actualmente tres genes de cadena ␣ bien definidos, designados HLA-A, HLA-B y HLA-C. HLAA y HLA-B representan los productos principales de la clase I y sirven como blancos para las inmunorrespuestas mediadas por anticuerpos o por células contra tejido trasplantado. Su expresión es diferencial, dependiendo del tipo de célula, con células de linaje linfoide con la expresión más alta y los hepatocitos y los eritrocitos con el contenido más bajo. La expresión puede alterarse por mediadores inflamatorios como citocinas y esto es en particular importante en el trasplante, puesto que la sobrerregulación puede promover inmunogenicidad del aloinjerto, o aumentar su susceptibilidad a una inmunorrespuesta preexistente. Las proteínas HLA clase II difieren de las de la región clase I en términos de estructura, función y distribución. Consisten de dos cadenas, ␣ y ␤, y se expresan sobre la

The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker. © 2005 John Wiley & Sons, Ltd.

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TIPIFICACIÓN DE HLA

superficie celular como heterodímeros ␣␤. Los genes HLA clase II con cadenas ␣ y ␤ se designan HLA-DP, HLA-DQ y HLA-DR, ambas cadenas se codifican dentro la región clase-II y con dos subunidades que parecen dominios de Ig. Los grupos del gen HLA-DR contienen uno extra con cadena ␤, cuyo producto puede aparearse con cualquier cadena ␣ DR. Por consiguiente, tres grupos de genes clase II pueden dar lugar a cuatro tipos de moléculas clase II. La distribución de proteínas clase II está restringida de manera principal a los linfocitos B y las células profesionales presentadoras de antígenos (APC), aunque la expresión en otras células es inducible después de la activación. La función de las moléculas clase II se considera tradicionalmente en términos de su habilidad para estimular las respuestas de la célula T auxiliadora o helper; sin embargo, la más reciente evidencia muestra respuestas citotóxicas importantes de anticuerpos y de la célula T efectora dirigidas contra determinantes de la clase II. También se codifican dentro del MHC dos genes TAP. Éstos se encuentran en la región clase II, estrechamente asociados con dos genes que codifican las proteínas de bajo peso molecular del proteosoma. Los genes de la región clase III codifican, entre otras cosas, los componentes C4 (C4a y C4b), C2 y el factor B, del complemento junto con aquellos para la citocina que son factor de necrosis tumoral (TNF␣ y ␤), la enzima 21-hidroxilasa, que sintetiza esteroides, y dos proteínas de choque térmico, Hsp 70 1 y Hsp 70 2.

Genética del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) Los genes codificantes para HLA cadenas ␣ clase I y cadenas ␣ y ␤ clase II se unen dentro del MHC. Aunque los genes que codifican para cada cadena se encuentran en regiones separadas, varios genes que codificaban por cada cadena se han identificado dentro de cada región. Porque los genes HLA están en proximidad estrecha uno al otro, la recombinación genética es rara. Por lo tanto, la mayoría de los descendientes hereda un grupo intacto de los alelos parentales, uno de cada padre. Tales grupos de genes unidos se conocen como haplotipos. Ciertos alelos, en particular los haplotipos, se forman con mayor o menor frecuencia, lo que podría esperarse si los alelos están en equilibrio genético. Tal fenómeno se conoce como desequilibrio de ligamiento y puede reflejar el origen reciente de algunos alelos, orígenes geográficos y patrones de crianza raciales. Los productos de los genes HLA clase I y clase II son codominantes expresados y, por tanto, los individuos heterocigotos deben expresar dos especificidades distintas de HLA para cada sitio (uno materno, otro paterno). Además, debido a que hay tres genes para HLA clase I y cuatro posibles grupos para la clase II, se esperaría que cada individuo

exprese tres diferentes MHC clase I y cuatro proteínas diferentes clase II. El número expresado es de hecho mucho más alto, debido a la naturaleza polimórfica extrema de los genes clases I y II; incluso, más de 70 alelos en el mismo sitio genético se han identificado para algunas proteínas clase I. Por esta razón, la probabilidad de genes HLA en dos individuos diferentes que codifican el mismo alelo es demasiado pequeña. Porque las proteínas HLA son muy inmunógenas, es necesario conseguir en el trasplante la compatibilidad más estrecha posible entre el aloinjerto y el receptor, reduciendo al mínimo el riesgo de pérdida del injerto por rechazo. El proceso técnico de la identificación de la proteína HLA en un individuo se conoce como tipificación HLA.

La mecánica de tipificación HLA Tipificación serológica A través del tiempo, la reacción mixta del linfocito (MLR) se utilizó para detectar la variabilidad de HLA. En esta técnica, las células de un receptor potencial se cocultivan con las células “estimuladoras” de origen donante que se han irradiado de modo que no puedan responder. Las células T del receptor se estimulan para que proliferen y se diferencien en respuesta a los antígenos HLA dispares, generalmente como un resultado del reconocimiento de la célula T CD4+ de los antígenos HLA clase II y de reconocimiento de los antígenos clase I por células T CD8+. Así, los receptores “compatibles” pueden identificarse rápido con base en su “insensibilidad”. Aunque esta técnica se correlaciona bien con el rechazo, es demasiado sensible y refleja de manera cercana la propia respuesta de rechazo; su aplicación en el escenario clínico es limitada o de ningún valor, puesto que requiere 5 a 10 días para obtener resultados y es incómoda, costosa y técnicamente difícil de realizar. Hasta hace poco, el método “tradicional” que se usaba para distinguir individuos HLA no idénticos empleó anticuerpos. Los antígenos de los sitios HLA-A y B fueron los primeros que se definieron de este modo, usando aloantisueros que se obtienen de los sujetos inmunizados por transfusiones sanguíneas, embarazo o rechazo del aloinjerto renal. Usando esta técnica, llamada ensayo de microcitotoxicidad, linfocitos T de la sangre periférica (antígenos HLA clase I) y linfocitos B (HLA-DR, -DQ) de receptores potenciales del injerto de tipo HLA desconocido se incuban con el antisuero que contiene el anticuerpo HLA de especificidad caracterizada. Estas células entonces se exponen al complemento. Si el anticuerpo reacciona con proteínas HLA expresadas en la superficie celular, el complemento es activado y las células son destruidas, lisis mediada por el complemento. En ausencia de la reacción, ninguna lisis

TIPIFICACIÓN MOLECULAR

ocurre. La destrucción se visualiza en general usando un combinado de bromuro de etidio/naranja de acridina que colorea las células viables de verde y las células muertas de rojo. La destrucción se analiza semicuantitativamente determinando el porcentaje de células muertas en cada pozo. Así, donde la lisis ocurre, la especificidad del anticuerpo identifica qué proteínas HLA se expresan. Diferentes tipos de error son posibles con la tipificación serológica. La falla para identificar un antígeno raro o de reacción cruzada es un problema frecuente. Esto sucede principalmente porque el antisuero pertinente no se utiliza o no está disponible. El desequilibrio de ligamiento, los orígenes geográficos y los patrones de casamiento raciales también son factores que contribuyen. Por otra parte, algunos antígenos se expresan en una frecuencia más baja o nula en ciertas poblaciones. Tales errores ocurren con más probabilidad en laboratorios que usan cantidades limitadas de antisuero. Además, la mala interpretación de las reacciones del antisuero produce errores. El antisuero puede contener más de un anticuerpo, cada uno con especificidades de HLA que difieren, e incluso los anticuerpos HLA monoespecíficos con frecuencia reaccionan en forma cruzada con otros antígenos HLA. Además, la tipificación HLA de antígenos DR que usa la serología es, en particular, susceptible a la mala interpretación, puesto que los linfocitos B presentan más reacciones cruzadas con una amplia gama de antígenos DR y son más susceptibles a la lisis no específica mediada por el complemento y producen resultados “falsos positivos”. Las variaciones técnicas también explican un 15 a 30% del error entre los laboratorios en la tipificación serológica. La variación en la actividad del complemento entre los lotes y la calidad del antisuero son los factores contribuyentes principales. La serología es un método rápido para la tipificación HLA; sin embargo, los reactivos que se emplean no son bastante específicos para determinar la identidad estructural precisa de las moléculas MHC en individuos genéticamente no idénticos. Esto puede alcanzarse sólo por el análisis directo de los genes MHC.

Tipificación molecular Polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) La clonación y el mapeo moleculares intensos de la región clase II del MHC recientemente se consiguieron. El análisis extenso de la organización de las secuencias específicas del gen, usando una técnica que se conoce como Southern blotting, revela la existencia de polimorfismos en los sitios de reconocimiento de un grupo de enzimas llamadas endonucleasas de restricción. Estos polimorfismos en si-

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tios de restricción o corte son, en la mayor parte de los casos, específicos de cada alelo. Por tanto, el mapeo y la aclaración de los patrones del polimorfismo en la longitud del fragmento de restricción (RFLP) asociados con alelos HLA deben facilitar la identificación del alelo en cualquier individuo. La viabilidad de la tipificación HLA mediante detección de RFLP usando sondas de DNA la sugirieron primero Wake y cols. (1982), quienes reportaron polimorfismos en la región HLA-DR usando la longitud completa de un cDNA de DR␤1. La tipificación RFLP de alelos HLA-DR y HLA-DQ usando sondas de cDNA de longitud completa para DR␤, DQ␣ y DQ␤ se utilizan mucho desde entonces en un esfuerzo por definir con exactitud la relación entre RFLP y las especificidades HLA clase II definidas serológica o celularmente. El análisis RFLP se realiza sobre muestras de DNA genómico que por lo común se obtienen de leucocitos con “cubierta brillante”. El DNA de longitud completa se extrae vía digestión de los leucocitos con dodecil sulfato de sodio (SDS)/proteinasa K y se sujeta a la digestión por restricción usando una endonucleasa de restricción Taq-1 o MSP-1. El resultado de la restricción entonces se separa por electroforesis en gel de agarosa al 2% y se transfiere a una membrana de nitrocelulosa, usando Southern blotting. Los patrones del fragmento de restricción se visualizan por hibridación de la banda con sondas de cDNA radiomarcadas en forma correcta, que entonces se exponen a una placa de rayos-X. Los patrones de la señal de hibridación que se generan son entonces comparados con tablas de tamaño de referencia para permitir la identificación de especificidades HLA-DR y HLA-DQ que difieren. Las cualidades de esta técnica son que las muestras múltiples (>30) pueden procesarse en forma simultánea. También, las especificidades alélicas DR␤, DQ␣ y DQ␤ es posible identificarlas a partir de una sola muestra, puesto que los resultados de la restricción pueden transferirse e hibridarse con un cDNA específico del gen HLA (p. ej., DR␤) y la “copia” se despega por medio de lavados y se hibrida con un cDNA de la especificidad HLA diferente (p. ej., DQ␣ o DQ␤). Sus desventajas son que RFLP requiere el manejo muy cuidadoso de la muestra y de la extracción del DNA. El DNA debe ser de longitud completa, sin degradación parcial, puesto que ésta puede alterar radicalmente el patrón de restricción, creando un bandeo incorrecto. Además, no puede utilizarse en circunstancias de un trasplante clínico de donadores cadavéricos tipo HLA por los contratiempos inherentes, ya que es posible que se requieran hasta tres semanas para obtener los resultados. Por otra parte, los patrones del bandeo del fragmento de restricción son de una complejidad elevada y la hibridación cruzada de secuencias compartidas de las sondas de cDNA significa que esta técnica requiere experiencia considerable en la interpretación. Sin embargo, el último problema puede

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TIPIFICACIÓN DE HLA

evitarse usando sondas de cDNA de región corta, o específicas del exón. En términos técnicos, el análisis RFLP no identifica directamente las secuencias del DNA polimórfico en la región codificante para antígenos HLA, sino en sitios de restricción relacionados de manera importante con ellas. Además, confía en el desequilibrio de ligamiento entre los alelos HLADR y HLA-DQ para diferenciar entre ciertos alelos HLA-DR que muestren patrones RFLP similares, por ejemplo, DR3 (DQ2) de DR6 (DQ6) y DR7 (DQ2) de DR9 (DQ9). Tal ejercicio necesita gran precaución al analizar poblaciones no caucásicas, puesto que las asociaciones particulares de HLADR-DQ no son siempre iguales. Una evidencia más reciente muestra, desde entonces, que tales asociaciones no son siempre verdades en algunas poblaciones caucásicas. Reacción en cadena de la polimerasa En la actualidad, el método más conveniente para identificar los alelos MHC emplea una técnica conocida como reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Éste es un método rápido de secuencias particulares del DNA genómico que se amplifican de manera selectiva. Para amplificar regiones específicas de DNA, como un exón polimórfico de un gen MHC particular, cebadores —oligonucleótidos sintéticos—, complementarios a la secuencia de DNA que flanquean la región de interés, tienen que sintetizarse. El DNA genómico, que se extrae en un procedimiento idéntico a aquel para el análisis RFLP, entonces se desnaturaliza a temperatura alta en presencia de concentraciones excesivas de dos oligonucleótidos sintéticos. El enfriamiento permite que las hebras de DNA se unan nuevamente formando la cadena doble, de tal manera que ambos cebadores se unan a su secuencia complementaria sobre el DNA genómico. La enzima DNA polimerasa termoestable (Taq polimerasa), que se obtiene de la bacteria Thermus aquaticus, agregada a la reacción, ahora alarga al cebador, usando DNA genómico entre los dos cebadores como su plantilla. El DNA replicado es entonces desnaturalizado en hebras simples por la temperatura alta y la mezcla se enfría para facilitar nuevos ciclos de templado y replicación. El primer producto de la extensión es incierto en longitud, pero todos los ciclos subsecuentes crean productos de la longitud definida porque la plantilla termina en el primer cebador. Los ciclos entonces se repiten hasta que suficiente DNA está disponible para la secuenciación. Una vez asociado el DNA con un alelo particular definido por la secuencia, se pueden construir sondas del oligonucleótido a partir de regiones donde se presentan diferencias. Este oligonucleótido específico de la secuencia (SSO) o sondas de oligonucleótido específico de alelo (ASO) pueden entonces hibridizarse para el DNA blanco

específico amplificado por PCR Southern blotting, usando una técnica llamada PCR-SSO/PCR-ASO. Tales técnicas son rápidas, económicas y una manera sensible de definir la estructura del gen MHC. Sin embargo, las técnicas de tipificación PCR-SSO/ASO requieren la preparación de transferencias múltiples y de sondas marcadas, por lo menos una sonda para cada alelo en cada sitio. La tipificación RFLP, en cambio, requiere a lo sumo dos transferencias y tres sondas. Los contratiempos al emplear PCR-SSO/ASO son similares a DNA-RFLP pero la preparación del DNA blanco es más rápida (5 a 6 h comparadas con las 24 h); la transferencia y el sondeo requieren un tiempo similar. Así, como en RFLP, esta técnica sólo se emplea en aplicaciones clínicas no urgentes y, por tanto, no pueden usarse en donantes cadavéricos tipo HLA. La tipificación HLA por técnicas moleculares ha revolucionado por la introducción reciente de un método múltiple del cebador específico de secuencia basado en la PCR (PCRSSP). La clonación molecular intensiva de los genes HLA clases I y II facilita la construcción de una serie completa de SSP. PCR-SSP mantiene la especificidad alélica de cada par de cebadores, tanto por el rigor de las condiciones de la reacción PCR como por el diseño de los cebadores del oligonucleótido, que explotan la capacidad de la Taq polimerasa de amplificar secuencias del DNA blanco que son desiguales a la secuencia del cebador. En reacciones donde la complementariedad entre el DNA y el cebador está completa, la eficiencia de la amplificación es 100% y el DNA blanco se replica. Cuando hay uno o más pares de bases desiguales entre el DNA blanco y el extremo 3´ del cebador, la eficiencia de la amplificación es 0% y no hay productos sintetizados. Este sistema para la tipificación HLA clase I y clase II utiliza 192 reacciones de PCR para definir genes HLA-A, HLA-B, HLA-C, DR␤1, DR␤3, DR␤4, DR␤5 y DQ␤1. Los productos de reacción se separan electroforéticamente, usando gel de agarosa al 1% que contiene bromuro de etidio, y se visualizan sobre un transiluminador de luz UV. Completos, los tipos HLA pueden identificarse en una fotografía polaroid, por tanto, a este proceso se le ha llamado “fototipificación”. Esta técnica tiene sensibilidad mayor o igual que la serología, sin problemas de reacción cruzada, y con ella puede distinguirse la mayor parte de las combinaciones alélicas heterocigotas. Tiene la ventaja sobre DNARFLP y técnicas de tipificación basadas sobre PCR-SSO/ ASO en que no se requiere transferencia y sondeo y es por tanto más barata y más rápida de realizar. Por otra parte, la tipificación HLA, de sangre completa a los resultados, puede obtenerse en 3 horas, haciendo esta técnica comparable a la serología y conveniente para la tipificación HLA de donantes cadavéricos. De hecho, PCR-SSP ahora reemplaza a técnicas serológicas en muchos laboratorios de comprobación de la histocompatibilidad. Otra ventaja de DNA-RFLP es que

TIPIFICACIÓN MOLECULAR

la PCR-SSP no confía en el DNA de longitud completa para producir resultados, por tanto, las muestras parcialmente degradadas pueden utilizarse. La tipificación con base en el DNA vía amplificación por PCR ahora es un procedimiento común de laboratorio. La tipificación HLA requiere un segundo análisis para identificar los alelos amplificados. Según lo detallado antes, varios tipos de ensayos pueden utilizarse para efectuar esto, pero recientemente se desarrollaron nuevos equipos de tipificación SSO que utilizan un sistema multiplex homogéneo, de modo que todos los SSO se analizan simultáneamente y por tanto el ensayo completo se realiza en un tubo con la adición de un reactivo. PCR-SSP utiliza concentraciones equimolares de cebadores directos e inversos, así se producen productos de doble hebra. Sin embargo, si un cebador está en exceso, productos de una hebra (así como de doble hebra) surgen en el agotamiento del cebador limitante. Una vez desnaturalizados, ambos pueden hibridizar sondas SSO. El desarrollo más reciente une sondas SSO biotiniladas a microesferas que pueden entonces analizarse usando un fluoroanalizador. Cada microesfera tiene una marca única que puede distinguirse con el analizador, y cada una lleva un diferente SSO biotinilado, por tanto una mezcla de la sonda se distingue en virtud de su asociación con una microesfera particular. La unión de la sonda se visualiza usando estreptavidina-PE. La señal relativa de cada sonda se utiliza para asignar positividad y negatividad con DNA amplificado. Esto proveía la información requerida para asignar un fenotipo HLA y tenía la ventaja de no requerir productos químicos peligrosos. Sin embargo, ésta y otras técnicas basadas en PCR no están desprovistas de problemas. La desviación de los protocolos definidos de PCR, DNA de mala calidad (en términos de pureza) y las máquinas inadecuadas de PCR pueden producir fallas individuales de PCR que dan lugar a la asignación incorrecta o errónea del antígeno. Además, la experiencia molecular de alto nivel de estas técnicas, no menos exigente que en la serología, requiere entrenamiento y experiencia considerables para realizarse correctamente.

Tipificación basada en la secuenciación Las técnicas de secuenciación del DNA se desarrollaron originalmente en la década de 1970, pero ahora han avanzado lo suficiente para considerarse métodos rápidos, económicos y sencillos para la tipificación HLA. Dos técnicas básicas han surgido: la técnica de degradación química desarrollada por Maxim y Gilbert (1977), y el método enzimático, por Sanger y cols. (1977). Varios informes que detallaban datos de la secuencia HLA clase I y los de la clase II se publicaron a mediados de la década de 1980. Sin embargo, en aquel momento, el grado del polimorfis-

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mo de HLA, junto con las técnicas laboriosas requeridas para amplificar regiones del DNA, significó que la secuenciación no podría considerarse realista para la tipificación del tejido. Esta consideración se invierte rápido después de la introducción de métodos basados en la PCR de amplificación del DNA. Los acercamientos iniciales utilizaron el RNA con éxito para secuenciar los alelos clases 1 y 2, que son simples y rápidos de aislar, y simplificaron la amplificación de las regiones cortas del exón requeridas. Su desventaja al principio era el requerimiento de material viable para el aislamiento del RNA. Además, el RNA es inestable, haciendo la extracción, en particular del material de archivo, notoriamente difícil. Al mismo tiempo, las técnicas de tipificación por secuenciación basadas en el DNA también se desarrollaron (éstas se emplean en la actualidad en la mayor parte de los laboratorios que tipifican tejido). El método más popular para la secuenciación del DNA es la técnica de la terminación de cadena mediada por dideoxi, la cual a su vez se desarrolla a partir de una técnica original desarrollada en 1975. De manera breve, esta técnica implica la amplificación de la región que se secuencia, que entonces se desnaturaliza para producir DNA de cadena sencilla (ssDNA). Un cebador que secuencia es entonces templado para el ssDNA y la cadena del DNA se extiende en dirección 5’ a 3’. La extensión termina si un dideoxinucleótido 2’3’ se incorpora en lugar de uno convencional. Se establecen cuatro reacciones, cada una con uno de cuatro nucleótidos dideoxi así como los cuatro deoxinucleótidos. Asimismo, cuatro grupos separados de fragmentos de cadena terminada se producen. Estos fragmentos permanecen complementarios al ssDNA que ha actuado como plantilla y, calentando o usando un agente desnaturalizante, los fragmentos de cadena terminada se pueden liberar de la plantilla y separarse empleando electroforesis de alta resolución en gel desnaturalizante. La secuencia del DNA original entonces se deduce comparando la posición relativa de los productos en los cuatro carriles del gel. Aunque el método básico permanece inalterado, se han hecho varias mejoras que elevan la velocidad, simplicidad y confiabilidad de secuenciación del DNA. Éstas incluyen el uso de fragmentos de PCR, como plantillas, que contribuyen con un método rápido para obtener cantidades grandes de material de la plantilla y el uso de un cebador biotinilado, lo cual significa que el producto PCR marcado con biotina puede extraerse rápidamente usando perlas magnéticas marcadas con estreptavidina. Las mejoras en enzimas que se emplean para la secuenciación también contribuyen. La enzima T7 DNA polimerasa se prefiere ahora sobre la polimerasa del fragmento Klenow porque incorpora bases de DNA en la cadena que se extiende a una tasa más uniforme. La DNA polimerasa derivada de Thermus aquaticus se le diseña para que sea más termoestable, que a su vez crea más

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TIPIFICACIÓN DE HLA

productos. Los nucleótidos radiomarcados se reemplazan cada vez más por métodos de marcaje fluorescente como un medio de detectar productos secuenciales. Además, el uso de colorantes de cuatro colores significa que los productos pueden correrse en un solo carril del gel. Uniendo cada colorante para separar ddNTPS significa también que las reacciones pueden llevarse a cabo en un solo tubo. También está disponible una gama amplia de secuenciadores automáticos que detectan productos marcados con fluorescencia después de electroforesis con gel en lámina o capilar vertical. Es más, todas estas máquinas transfieren datos directos a una computadora desviando la necesidad de un análisis manual de datos brutos, ya que los datos se convierten de manera automática en información de la secuencia. Como con la mayor parte de las técnicas, la secuenciación no está libre de problemas. Las combinaciones ambiguas del alelo son el problema más grande. Esto sucede en todos los sitios y ocurre cuando dos alelos producen una secuencia heterocigota que es idéntica a la secuencia de par de alelos diferente. Pueden existir también problemas con PCR y el diseño del cebador secuenciador. Se pensaba que la secuenciación sostenía una ventaja sobre la otra tipificación de DNA, en tanto que detecta los alelos previamente no identificados. Esto es verdad a menos que el nuevo alelo contenga polimorfismos en las posiciones correspondientes al extremo 3’ de la PCR o cebadores secuenciadores. Además, la tipificación basada en la secuencia debe secuenciar el gen completo bajo estudio, ya que con secuencias más cortas, mayores son las oportunidades de que los nuevos polimorfismos sean errados. El uso de cebadores múltiples para PCR y para la secuenciación puede dar lugar a una amplificación o secuenciación preferencial de un alelo particular. Esto conduce a una asignación incorrecta de homocigosidad. Las técnicas de tipificación con base en la secuenciación requieren aún intenso trabajo y equipo y reactivos costosos. Este es probablemente el obstáculo más grande para su adopción como técnica de línea primaria para los laboratorios de HLA. Por otra parte, aunque la tipificación con base en la secuenciación aporta una tipificación de resolución muy alta, no hay hasta ahora evidencia que sugiera que el tal emparejamiento HLA de alta resolución sea importante en el trasplante del órgano sólido. Para el trasplante de médula ósea, sin embargo, el cuadro es diferente, con evidencia clara que el emparejamiento afecta el resultado.

Resumen Las glucoproteínas de la superficie celular del MHC juegan un papel central en la inmunología del trasplante. El MHC se determina originalmente como la barrera principal para el trasplante debido a la fuerte respuesta de rechazo de los linfocitos T hacia los antígenos MHC presentes sobre el tejido injertado. Las proteínas HLA del MHC humano están entre las más polimórficas conocidas, por consiguiente la probabilidad de dos individuos sin relación que expresen los mismos alelos HLA es muy pequeña. Puesto que el reconocimiento del antígeno de la célula T está profundamente influido por polimorfismo MHC, las proteínas HLA de donadores del trasplante y los receptores potenciales deben identificarse y la posible compatibilidad más estrecha se localiza para minimizar el riesgo de pérdida del injerto por rechazo. La técnica de identificación del HLA, llamada “tipificación de tejido”, se usa en medicina clínica para la compatibilidad del donador con el receptor en programas de trasplante cadavérico, pero también es posible usarla para estudiar el papel del MHC en la determinación de la susceptibilidad hacia condiciones alérgicas y autoinmunitarias. La genotipificación del MHC en humanos se realizó originalmente por la reacción linfocítica mixta y después por la serología. Debido a contratiempos metodológicos inherentes, esos métodos se reemplazaron por técnicas que analizan el nivel de la expresión genética. Los genes -DR y -DQ de la región MHC clase II son los primeros en tipificarse para HLA por DNA-RFLP. Esta técnica se reemplazó, en gran parte, por métodos con base en la PCR más rápidos. La clonación y el mapeo moleculares del MHC condujeron al desarrollo reciente de una nueva técnica basada en la PCR que tipifica los antígenos de las regiones clases I y II. Al emplear esta técnica, la genotipificación del HLA puede realizarse en una sola muestra usando PCR múltiple y un solo gel, con resultados que se obtienen a partir de una fotografía polaroid. Este sistema sustituye, o está sustituyendo, a todos los anteriores procedimientos serológicos/moleculares con base en la tipificación HLA, en la mayor parte de laboratorios de pruebas de histocompatibilidad. Las técnicas con base en la secuencia del DNA aportan un método de tipificación de alta resolución muy empleado en situaciones de trasplante de médula ósea.

SECCIÓN 9 PATOLOGÍA MOLECULAR KWWSERRNVPHGLFRVRUJ

50 Microdisección por láser y captura de tejido Orla Sheils, Paul Smyth, Esther O’Regan, Stephen Finn, Richard Flavin y John O’Leary

Los recientes avances en tecnologías moleculares han revolucionado los estudios genómicos, transcriptómicos y proteómicos. Sin embargo, un inconveniente potencial serio en la aplicación de estas tecnologías es la heterogeneidad inherente de tejidos resecados quirúrgicamente. Resultados erróneos pueden generarse, causando distorsión en los análisis subsiguientes a menos que el material de entrada esté libre de poblaciones celulares excedentes para los requerimientos. La microdisección por láser de los cortes de tejido y de las preparaciones citológicas es un valioso recurso en sentido ascendente para facilitar la obtención de poblaciones celulares y superar la barrera de la complejidad del tejido. Puede acoplarse con una variedad de tecnologías moleculares en sentido descendente para generar resultados válidos y significativos. La microdisección por láser y captura de tejido (LCM) es una técnica que se desarrolló originalmente en el Instituto Nacional de Cáncer. Desde sus inicios sufrió varias modificaciones, en la actualidad se dispone de una gama de instrumentos, los cuales se clasifican en dos categorías, dependiendo del tipo de láser empleado (infrarrojo [IR] o ultravioleta [UV]). La LCM puede aplicarse a una variedad de preparaciones tisulares, desde secciones congeladas hasta secciones fijadas e incluidas en parafina o preparaciones citológicas. La tinción de rutina usando hematoxilina y eosina o azul de toluidina se utiliza, por lo general, para ayudar en la identificación morfológica del tipo celular de interés y para facilitar el recorrido alrededor de una sección tisular. Sin

embargo, las tinciones histoquímicas, inmunohistoquímicas o inmunofluorescentes pueden utilizarse también para permitir la selección de células, según las características fenotípicas y funcionales. Dependiendo del material de inicio y de los requerimientos de los protocolos en sentido descendente seleccionados, el DNA, mRNA o la proteína pueden extraerse y analizarse con éxito. De esta manera la identificación de los biomarcadores celulares específicos de la enfermedad o de blancos terapéuticos potenciales se logra con exactitud. Esta tecnología es útil en la investigación de cáncer. Una barrera importante para los investigadores de cáncer yace en la dificultad de caracterizar los cambios moleculares que se producen durante la progresión del cáncer, donde las células premalignas progresan para formar un tumor maligno. La identificación de proteínas de expresión baja o de sobreexpresión durante la progresión del tumor que pueden ayudar en la detección temprana del cáncer es obstaculizada por la subpoblación celular pequeña en la cual estas proteínas existen. La microdisección por captura láser permite a los investigadores comparar células normales con células enfermas aislando subpoblaciones distintas a partir de secciones de tejido teñidos.

LCM-PixCell® y AutoPix® de Arcturus La LCM facilita el incremento de la sensibilidad y de la exactitud de los ensayos moleculares iniciando con mues-

The Science of Laboratory Diagnosis, Second Edition. Editado por David Burnett y John Crocker. © 2005 John Wiley & Sons, Ltd.

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MICRODISECCIÓN POR LÁSER Y CAPTURA DE TEJIDO

tras de tipo celular homogéneo y de estructuras multicelulares aisladas a partir de muestras tisulares o citológicas completas. Este acercamiento único a la microdisección, desarrollado en 1996 en los Institutos Nacionales de Salud (EUA) y disponible exclusivamente de la compañía Arcturus, asegura que las moléculas biológicas, como RNA y DNA, permanezcan indemnes durante el proceso de microdisección. El análisis molecular en sentido descendente de estas moléculas produjo resultados exactos y seguros que condujeron a más de 300 publicaciones revisadas a fondo por investigadores independientes. La LCM tiene gran flexibilidad respecto a preparaciones tisulares y con fijación celular. Extrae células con eficacia a partir de secciones tisulares incluidas en parafina, congeladas y preparadas usando una amplia variedad de colorantes diferentes, de superficies de laminilla y de protocolos. Con base en la adhesión de las células seleccionadas a una membrana termoplástica, la LCM utiliza un láser infrarrojo de baja potencia para fundir la membrana sobre las células de interés. La parte microscópica del instrumento PixCell II LCM utiliza una palanca de control para dirigir su mecanismo. Los “conos” especiales (fig. 50-1) se car-

de milisegundos y forma un compuesto con el tejido. Los impulsos del láser, por lo general 0.5 a 5.0 ms de duración, pueden repetirse múltiples veces a través de la superficie entera del capuchón, que permite el aislamiento rápido de una gran cantidad de células. Los fragmentos tisulares seleccionados se recoleccionan por la elevación simple del capuchón, el cual entonces se transfiere a un tubo para microcentrifugado que contiene soluciones amortiguadoras requeridas para el aislamiento de las moléculas de interés. El diámetro mínimo del rayo láser del microscopio LCM es actualmente de 7.5 µm, el máximo de 30 µm. Después de este procedimiento, las biomoléculas se extraen de las células usando ácido nucleico propietario o genérico o equipo de extracción de la proteína. El proceso de captura celular es directo y fácil de realizar y existe una gama de productos optimizados para las aplicaciones específicas en sentido descendente. El Sistema PixCell II LCM (fig. 50-2) no utiliza radiación UV pulsada u otras técnicas indirectas de captura, una característica que, los fa-

Figura 50-2 Instrumento PixCell II de Arcturus. Figura 50-1 Fotomicrografía electrónica de barrido de un cono de CapSure LCM con una sola célula capturada con láser sobre el frotis termoplástico. Cortesía de Arcturus.

gan dentro del montaje, a través del cual el láser se enfoca sobre las células de interés. Estos conos, cubiertos con una película termoplástica, son colocados sobre el corte del tejido o sobre la muestra citológica. El cono se suspende en un brazo de transporte mecánico y se coloca sobre el área deseada de la sección deshidratada del tejido bajo presión estándar. Después de la selección visual de las células deseadas, guiada por un haz de posicionamiento, la activación del láser conduce a la fusión focal de la membrana de etileno acetato de vinilo (EVA). La formación de una protuberancia fina del plástico fundido, que tiende un puente sobre el hueco entre el capuchón y el tejido y se adhiere a la célula blanco, significa que cuando el capuchón se levanta, las células seleccionadas siguen unidas y se capturan por análisis adicional. El polímero resolidifica dentro

bricantes afirman, reduce la pérdida potencial de la muestra o la introducción de cargas electrostáticas que hacen la muestra difícil de manejar. La energía baja del láser IR también evita efectos fotoquímicos potencialmente perjudiciales. Existe un sitio de trabajo que archiva la imagen opcional disponible con el Sistema de PixCell II LCM. Este dispositivo provee una interfase de uso fácil para la grabación y almacenaje, tanto de las imágenes pre como de las posmicrodiseccionadas con anotaciones opcionales del usuario. Un avance reciente en el repertorio de Arcturus, dentro de la tecnología LCM, es el sistema automático AutoPix® LCM. La ventaja principal de este instrumento (fig. 50-3) sobre el PixCell II es que toda la parte y los mecanismos ópticos, cámaras fotográficas, filtros y objetivos están totalmente controlados por computadora. Esto permite que áreas dentro de numerosos campos del panorama sean visualizadas, seleccionadas, y capturadas en forma simultánea. Además, la célula y los algoritmos del reconocimiento de la

LCM-PIXCELL® Y AUTOPIX® DE ARCTURUS

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Figura 50-3 Instrumento AutoPix de Arcturus.

Figura 50-4 Pasos involucrados en LCM.

Figura 50-5 Principio básico de LCM de Arcturus.

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MICRODISECCIÓN POR LÁSER Y CAPTURA DE TEJIDO

Figura 50-6 Dibujo animado que representa cómo un rayo láser se enfoca a través de una película para disecar células individuales.

característica incorporados permiten al usuario programar el software para localizar y enfocar células o regiones específicas de interés en varias muestras. El sistema (figs. 50-4, 50-5 y 50-6) también tiene la capacidad de agrupar células o regiones microdiseccionadas, a partir de muestras múltiples, en una sesión facilitando la recolección de material microdiseccionado.

Microdisección con microrrayo láser Otra tecnología avanzada disponible en el comercio de la microdisección láser está disponible bajo la forma de microdisección con microrrayo láser (LMM; PALM-Mikrolaser Technologic, Bernried, Alemania). El principio primordial que distingue entre LCM y LMM es la elección del láser. El sistema PALM utiliza un láser UV con un enfoque muy alto para cortar o eliminar células seleccionadas por ablación de estructuras circundantes. El micro-rayo PALM (fig. 50-7) es un microscopio innovador diseñado para el aislamiento y recolección de tejido, células u organelos biológicos no contaminados, que se cortan directamente de secciones histológicas o de cultivos celulares para el análisis en sentido descendente, típicamente para RNA o contenido proteínico (fig. 50-8). Un láser UV-A pulsado de nitrógeno a 337 nm se acopla a

Figura 50-7 PALM.

Instrumento para microdisección con microrrayo

la trayectoria epifluorescente o de campo brillante del microscopio y se programa para trazar cualquier patrón cortante deseado antes de transferir especímenes, ya sea como fragmentos a partir de portaobjetos histológicos normales, células intactas en portaobjetos revestidos con membranas especiales, o como células vivas en placas de cultivo revestidas con membranas, directamente dentro de un tubo Eppendorf para el análisis adicional. Varias aplicaciones adicionales están disponibles con el sistema PALM®. Éste utiliza un láser UV pulsado con calidad de un haz alto, que se interconecta dentro del microscopio y se enfoca a través de un objetivo a un tamaño del punto del haz