Acta Biologica et Medica Germanica: Band 18, Heft 1 [Reprint 2021 ed.] 9783112559260, 9783112559253

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U l \ II lllllll.ll \ ETMEDICA GERMANICA HERAUSGEBER:

R. B A U M A N N , H. D U T Z , A. G R A F F I , H. G U M M E L , F. J U N G , L.-H. K E T T L E R, S. M. R A P OP ORT UNTER MITARBEIT

VON:

W. B E I E R , H. D R I S C H E L , H. F R U N D E R , M. G E R S C H , E. G O E T Z E , H. H A N S O N , F. H A U S C H I L D , G . H O L L E , F. M A C H , H. M A T T H I E S , G. M O H N I K E f , O. P R O K O P , K. S C H U B E R T , F. S C H W A R Z , G. S T E R B A , A. W O L L E N B E R G E R SCHRIFTLEITUNG:

W. S C H E L E R , H. B I E L K A

Band 18 1967

A K A D E M I E - V E R L A G

•

B E R L I N

Herausgeber und verantwortlich f ü r den I n h a l t : R. Baumann, H . Dutz, A. Graffi, H . Gummel, F. Jung, Prof. Dr. L.-H. Kettler, S.-M. Rapoport. Schriftleitung: Prof. Dr. Werner Scheler und Dr. habil. Heinz Bielka, 1115 Berlin-Buch, Lindenberger Weg 70. F e r n r u f : 5698 51. App. 222. Verlag: Akademie-Verlag GmbH, 108 Berlin, Leipziger Straße 3 — 4, (Fernruf: 220441) Telex-Nr. 011 773, Postscheckkonto Berlin 35021. Bestell- und Verlags-Nr. dieses Bandes 1053/XVIII. Die Zeitschrift erscheint monatlich. Bezugspreis: Einzelheft 14, — M, Doppelheft 28, — M. Veröffentlicht unter der Lizenznummer 1318 des Presseamtes beim Vorsitzenden des Ministerrates der Deutschen Demokratischen Republik. Gesamtherstellung: V E B Druckerei „Thomas Müntzer", 582 Bad Langensalza. — Alle Rechte vorbehalten, insbesondere die der Übersetzung. Kein Teil dieser Zeitschrift darf in irgendeiner Form — durch Photokopie, Mikrofilm oder irgendein anderes Verfahren — ohne schriftliche Genehmigung des Verlages reproduziert werden.

INHALT Heft 1 Biochemie A.

H A R H A S H : Untersuchungen über die A t m u n g und den Stoffwechsel von Fusarium moniliforme im Hungerzustand R . K L Ö C K I N G , H . F R I E M E L U. D . M Ü C K E : Zur Biochemie der Huminsäuren. V. Die Bindung der Huminsäuren an Serumproteine in vivo (Qualitative und halbquantitative elektrophoretische Untersuchungen) P. K N O L L E : Flüssigkeitsszintillationszählungen 3 2 P, 1 4 C-doppeltmarkierter Saccharosegradientenfraktionen P . K N O L L E : H e m m u n g der zelleigenen RNS-Synthese in fr-infizierten Zellen von Eschericha coli E . K L O P P I C K , G. J A C O B A S C H U. S. R A P O P O R T : Steigerung der Glykolyse durch den Einfluß von Ammoniumionen auf die Phosphofruktokinaseaktivität R . S C H Ö N U. K . - H . M E N K E : Isolierung und enzymatische Eigenschaften der Zellmembran von EHRLICH-Aszitestumorzellen W.

1—7 9—13 15 — 19 21—36 37 — 42 43 — 55

Physiologie L. P I C K E N H A I N : Der Einfluß der Lichtreizparameter auf das Auftreten der photischen Nachentladungen K L I N G B E R G U. L . P I C K E N H A I N : Der Einfluß von a k u t e m Sauerstoffmangel auf die photisch ausgelösten Nachentladungen und die photisch ausgelöste Rekrutierung

F . K L I N G B E R G U. F.

57-69 71-76

Pharmakologie Zur choleretischen Wirksamkeit von p-Chlorphenylalkanolen N. Popov u. H . M A T T H I E S : Die W i r k u n g von Monoaminoxydase-Hemmstoffen und Reserpin auf den y-Amino-Buttersäure-Gehalt des R a t t e n h i r n s A . G R I S K , K . D . T H I E D E U. B . G A L L E :

77 — 90 91 — 98

Mikromorphologie H.

W . K L I N G E R : Untersuchungen zum Mechanismus der E n z y m induktion. X. Die Wirkung von Barbital auf die S u b s t r u k t u r der Leberzellen von R a t t e n verschiedenen Alters

F R A N K E U.

99 — 119

Kurzmitteilung A. W . H A R H A S H : Beobachtungen über E n z y m e im Pilzgewebe von moniliforme

Fusarium 121 — 124

Heft 2 Biochemie W. D U M M L E R , K . J U N G u. D. M Ü C K E : Wirkung von 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure auf die Nukleinsäure-Biosynthese bei der einzellingen Alge Poteriochromonas stipitata 115—130

I . SCHRÖDER,

IV

Inhaltsverzeichnis

: Eine Antimyzin A- und Alkan-empfindliche lösliche N AD ^ - D e h y d r o g e n a s e aus Rattenleber K . M Ü L L E R U. W . S C H E L E R : Untersuchungen zum Hämintransfer zwischen Methämoglobinen verschiedener Spezies und Humanserumalbumin sowie dessen Beeinflussung durch Liganden R . D A R G E L , E. S T R A C K u. W . - D . T H O M I T Z E K : Einfluß von Palmitoylcarnitin auf die ATPase von Mitochondrien B. O S W A L D U. G. D A S S L E R : Die Konzentration von Nukleotiden und anderen säurelöslichen P-Verbindungen im Blut der R a t t e während der Erythrozytenreifung u n d - a l t e r u n g K. S C H U B E R T U. G. S C H U M A N N : Die Ausscheidung von C 19 -Steroiden im Kaninchenharn nach Verabfolgung von 3 H-Dehydroepiandrosteron. . . T. G O E T Z E U. E. G O E T Z E : Isozymmuster und Aktivität der Laktatdehydrogenase und Malatdehydrogenase in Labyrinth und der Verbindungszone von Rattenplazenten R. D A R G E L U. E. S T R A C K : Spezifische Wirkung von L-Palmitoylcarnitin auf die Kontraktion von Mitochondrien V . H A H N U. C . W A G E N K N E C H T

131 — 139 141 — 154 155 — 162 163 — 175 177 —186 187 — 194 195 — 204

Physiologie A. K E M P E R : Gebundene Askorbinsäure im Gehirn von Meerschweinchen und ihr Verhalten bei Skorbut 205 — 208 G . D Y B O W S K I u. W. R Ü D I G E R : Zur Steigerung der Wärmeproduktion der R a t t e bei epiduraler Applikation von KCl-Lösung 209 — 217 H. C H O I N O W S K I , P. B A R T S C H U. W. R Ü D I G E R : Über den Einfluß beidseitiger Hypothalamusläsionen auf die chemische Wärmeregulation der juvenilen Ratte 219 — 232 D . S C H W A R Z , R . G L O W A T Z K I U.

Pharmakologie N.

H.

P O P O V , W . L I E T Z U. H. M A T T H I E S : Die Wirkung von MonoamidaseHemmstoffen auf den Tryptamin-Gehalt des Rattenhirns und den „Tryptamin-Krampf' 233 — 244 B E K E M E I E R U. W. S C H M O L L A C K : Das Aethoxoseoedem der Rattenpfote und seine Beeinflussung durch Azethylsalizylsäure, Damaszenin, Phenylbutazon und Salizylamid 245 — 249

Experimentelle

Pathologie

Komplementbestimmungen und papierelektrophoretische Untersuchungen an Rattenblutserum bei Pasugi-Nephritis 251—257 H . D A V I D U . I . M A R X : Leberparenchymzellveränderungen nach Gabe von Aktinomyzin C und D 259—273 H. D A V I D u. I. U E R L I N G S : Leberparenchymzellveränderungen nach partieller Hepatektomie bei gleichzeitiger Aktinomyzingabe 275 — 290

G. PROTSCH:

Kurzmitteilungen K.

S C H U B E R T , K. H . B Ö H M E U. C. H Ö R H O L D : Über ein neues mikrobielles Abbauprodukt des Progesterons und seine synthetische Darstellung . . K. S C H U B E R T , K. H . B Ö H M E U. C . H Ö R H O L D : Bildung von a-Ketoglutarsäure und Bernsteinsäure beim mikrobiellen Abbau des Steranskeletts . . . . G . B U R K H A R D T , H . - C H . G A B S C H , M . G E R B E R U. M . B Ü C H N E R : Vergleichende polarographische und oszillopolarographische Bestimmung von Hämoglobin-Derivaten R . G I E B E L M A N N U. E. S C H E I B E : Über eine peroxidative Eiweißfraktion im /i-Globulinbereich von Nabelschnurseren

291 — 293 295 — 297 299—301 303 — 304

Inhaltsverzeichnis

V

Heft 3 Biochemie E . K L O P P I C K U. S . R A P O P O R T : Über den Einfluß des anorganischen P h o s p h a t s auf die Glykolyse; seine Unwirksamkeit auf die Hexokinase des Menschenerythrozyten 305 — 313 D. G L Ä S S E R , W . J O H N U. H . S C H Ü T Z L E R : Über die W i r k u n g intravenös injizierter kristallisierter Leuzinaminopeptidase aus Rinderaugenlinsen bei Rindern 315-320 W. B L E C H : Ultrazentrifugenanalytische u n d papierelektrophoretische Untersuchungen der Bluteiweiße nach partieller H e p a t e k t o m i e a n der R a t t e 321 — 327 S . R O S E N T H A L , K . J A G E M A N N , S . P R E H N U. G . H E I N E M A N N : Ü b e r eine alkalische R N a s e aus Ribosomen von Kaninchenretikulozyten: Eigenschaften des gebundenen u n d abgelösten Enzyms, Einfluß ein- u n d zweiwertiger K a t i o n e n 329 — 350 T . G O E T Z E U. K.-P. M Ü L L E R : Die Entwicklung der G l u t a m a t - P y r u v a t - T r a n s aminase in der Leber neugeborener weißer R a t t e n u n d ihre V e r ä n d e r u n g durch Röntgenstrahleneinwirkung w ä h r e n d der Foetalzeit oder d u r c h Kortikoidinjektionen nach der G e b u r t -351—358 H . L Ö W E U. F. J U N G : Analytische Studien zur Bildungsweise mikrosomaler Membransysteme der Leberparenchymzelle in vitro 359—367

G. GERBER,

Physiologie B.

J. J.

S T O J A N , B . P F E F F E R K O R N u. J . S C H M I E D E R : Untersuchungen über den Askorbinsäurespiegel der Nebennieren von R a t t e n nach Muskelarbeit u n t e r normalem u n d erniedrigtem Sauerstoffpartialdruck 369—375 S T R E B E L U. P. S C H W A R X Z E : Über die Verwendbarkeit der Polaritätskorrelationsmethode zur Analyse von Elektronenzephalogrammen 377 — 382 G . R E I C H , U . T I L L U. H . F R U N D E R : B e s t i m m u n g des Blutzell- u n d Blutplasmagehaltes von Leber, Niere u n d Milz der R a t t e 383 — 396

Pathophysiologie A. H E C H T : Das fermenthistochemische Verhalten der Leber n a c h intravenöser Papain-Applikation 397 — 407 G . J A C O B A S C H , W . B I N U S , H . V I E R U S U. C . B O E S E : Störungen des Zahnstoffwechsels bei H u n d e n im experimentellen Magnesiummangel 409 — 422 Pharmakologie L.

U.

R . G L A E S M E R U. B. W I E G E R S H A U S E N : D e r Einfluß verschiedener Hydrazinokörper auf den Gehalt a n Asparaginsäure u n d Glutaminsäure im Gehirn von Meerschweinchen 423 — 427 W A G N E R : Atem- u n d Kreislaufeffekte kleiner Morphindosen a n der R a t t e 4 2 9 — 4 3 8 SAMOCHOWIEC,

Kurzmitteilung K. S C H U B E R T u. W . S C H U M A N N : Zur Biosynthese der Sterine 439—441 H.-D. F I S C H E R U . W . O E L S S N E R : Der Einfluß des Arekolins auf den Azetylcholin-Gehalt des R a t t e n h i r n s 443 — 445 K. K O N I T Z E R U. S . V O I G T : W i r k u n g von Insulin auf den Hirnstoffwechsel. I I I . W i r k u n g von Insulin auf die stationären Konzentrationen einiger NMetaboliten des R a t t e n h i r n s . • 447 — 450 G. S Y D O W : Lösliche u n d p a r t i k u l ä r gebundene Hexokinase in normalen u n d Tumorgeweben der R a t t e . Kl — 5

Inhaltsverzeichnis

VI Heft 4 Biochemie

In vitro-Dejodierung von m J - R o s e bengale durch Rattenleberhomogenat unter verschiedenen Stoffwechselbedingungen L. W I N K L E R : Veränderungen des Lipidhaushaltes von mütterlicher Leber, foetaler Leber, Plazenta und Gesamtfoet der R a t t e nach Ganzkörperbestrahlung mit 800 R R. B E Y E R U. W . S C H E L E R : In vitro-Untersuchungen zur metabolischen Rückbildung von Metverdoglobin zu Hämoglobin in Kanmchenerythrozyten R. B E Y E R U. W. S C H E L E R : Untersuchungen über die Rückbildung von Metverdoglobin in vivo C H R . V O S S , N . H A R T M A N N , B . W I R T H G E N U. H . B E R G N E R :

451—456 457-464 465 — 480 481 — 491

Physiologie W. K L I N G E R U. I . H E I N R I C H : Untersuchungen zum Mechanismus der Enzyminduktion. X I . Die Wirkung von Barbital auf den L-Askorbinsäuregehalt der Leber bei graviden Ratten, ihren Foeten und bei infantilen Ratten 493-497 C H . V O G T M A N N , H . G E R B S T Ä D T U. P . R Ü T H : Strömungsverhalten und Scheinviskosität von heparinisiertem menschlichen Blut und Zitratblut in Glaskapillaren mittlerer Weite 499—505 Pharmakologie H. L I E B M A N N U. H. M A T T H I E S : Der Einfluß des Tetrabenazins auf die Toxizi507 — 511 t ä t von Azetylcholin, Physostigmin und Prostigmin Serologie CH. RITTER:

Familienuntersuchungen zur Vererbung im Duffy-System. .

.

513 — 516

Experimentelle Pathologie E. S C H U L Z E U. H. L Ö W E : Speicherung von Dextran in Leber und Milz der R a t t e bei chronischer Applikation und ihr Einfluß auf Teilfunktionen dieser Organe 517—527 Ultrastrukturforschung H.

D A V I D U . E . M E T Z L E R : Anordnung und Aufbau der Polysomen in der intakten Rattenleberzelle 529—540

Methodisches A. D I T T M E R U. K.-F. T L A C H unter Mitarbeit von W . K I N Z E : Fremdfarbstoffe als Nebenkomponenten verschiedener Amidoschwarz 10 B-Chargen und deren Einflüsse auf die Ergebnisse der Papierelektrophorese 541 — 549 Kurzmitteilungen und H. I G E L : Progesteron und Me

P. KjieKHHr, r . pHMejib H fl. MiOKe: 0 6HOXHMHH r y M H H O B b i x KHCJIOT. V . CBH3HBaHHe r y M H H O B b i x KHCJIOT C S e j I K a M H CHBOpOTKH in vivo ( K a H e C T BeHHHe H noJiyKOJiHMecTBeHHtie 3JieKTpo$opeTHqecKHe

HccjienoBaHHH)

Koeimhie ryMHHOBbie KHCJIOTH, NOJIHKOHNEHCATH H3 aMHHOKHCjioT H $eH0Jii>HHX Teji 0KA3ANHCB iiejiecoo6pa3HHMH HJIH SKcnepHMeHTajibHbix HCCJienoBaHHit ryMHHOBHX KHCJIOT Ha JKHB0THHX, BBHHy HX yAOBJieTBOpHTejIbHOft BHyTpHBeHHOft y j K H B I H B O C T H H H H 3 K 0 H T 0 K C H 1 H 0 C T H (LD S0 = 1127 (939 1352) Mr/Kr, y MbUIIH, BHyTpHBeHHO). H 3 B e C T H O e H 3 HCCJieAOBaHHH in v i t r o C B H 3 b I B a H H e r y M H H O B b i x KHCJIOT C CblBOpOTOHHHM ajIb6yMHH0M M0JK6T CblTb TaKHte n0Ka3aH0 in v i v o . Hepe3 20 MHHyT nocjie HHTpaKapnnajibHoro BBejieHHH Kpbice 200 Mr ryMHH0B0ft KHCJIOTH, B CHBopoTKe oSHapyJKHBaeTCH 67 npoiieHTOB CBH3aHHOH c ajib6yMHH0M H 33 npoueHTa CBOSOHHOH ryMHHOBoii KHCJIOTH. KoJinnecTBo ryMHHOBoii KHCJIOTH HanHeHHoe in vivo SoJiBiue, qeM B KOHTpoJibHbix npenapaTax in vitro.

Acta biol. med. german., Band 18, Seite 15 — 19 (1967) New York University Medical Center New York University School of Medicine

Flüssigkeitsszintillationszählung Saccharosegradientenfraktionen PETER

32

P,

14

C-doppelmarkierter

KNOLLE

(Eingegangen am 11.8. 1966)

Zusammenfassung Es wurde eine Methode entwickelt, die die rasche Analyse von 14C, 32 P aus RNShaltigen Fraktionen des Saccharosegradienten zu bestimmen gestattet.

Bei biologischen Arbeiten erlangen Flüssigkeitsszintillationsspektrometer für die Aktivitätsmessung radioaktiver Isotopen immer verbreitetere Anwendung. In der Literatur mangelt es jedoch an brauchbaren Hinweisen für die vielen biologischen Anforderungen ausreichende Anwendung solcher Geräte. In dieser Mitteilung sollen rationelle Verfahren zur Analyse von 14 C und 32P in größeren Serien von Saccharosegradientenfraktionen dargestellt werden. Materialien RNS-Extrakte, die mit 32 P und 14C doppelt markiert waren, stammten aus Zellen von Escherichia coli K l 2 Stamm 58-161-22 (vergl. [1]). Lineare Saccharosegradienten (5 ml, 5—20% in 0,1 M Azetatpuffer pH 5, 0,1 M NaCl; vergl. [1]) wurden mit 0,2 ml solcher Extrakte (in 0,1 M Azetatpuffer) überschichtet und für 6 Std. bei 35000 UPM in einer Spinco Ultrazentrifuge Modell L zentrifugiert. Die Gradienten wurden in Fraktionen zu je 10 Tropfen ( = 34 — 37 Fraktionen, mit verbesserten Geräten stets 34 Fraktionen) aufgeteilt [2]. Ein Packard 3211 TRI-CARB Flüssigkeitsszintillationsspektrometer wurde benutzt. Die Einstellungen des Gerätes, Zählausbeuten und Kreuzkontaminierungen sind in Tabelle 1 aufgeführt. Als Szintillationsflüssigkeit wurde entweder Lösung A (100 g Naphthalin, 7 g PPO, 0,3 g POPOP, Dioxan ad 1 1) o d e r B (5 g PPO, 0 , 3 g P O P O P pro Liter Toluol) benutzt (vgl. Packard Tech. Bull.). Abkürzungen: PPO = 2,5-Diphenyl-oxazol; P O P O P = l,4-Bis-2-(5-phenyl-oxazolyl)benzol; TCE = Trichloressigsäure; ACE = 0,1 M Azetatpuffer, pH 5 [1], NACI = Natriumzitratpuffer, pH 7 [1]; RSA = Rinderserumalbumin

16

P . KNOLLE

Tabelle 1 Kreuzkontaminierungen der 32 P- und 14 C-Zählkanäle mit 14C- bzw. 32 P-Impulsen bei 2 Einstellungen des Packard 3211 TRI-CARB Flüssigkeitsszintillationsspektrometers zur gleichzeitigen Zählung von 32 P- und 14 C-Impulsen. Proben mit einfach-markierten, TCE-gefällten RNS-Extrakten aus Bakterien wurden benutzt 32

2

1

2

A-B 30-1000

A-B 150 — 1000

C-D 30 — 1000

C-D 50-300

0,4%

10%

15%

62%

45%

100% 7%

100% 8%

0,02%

Verstärkung Zählausbeute

-

-

Kreuzkontaminierung : 14 C-Impulse 32 P-Impulse

"C-Kanal

1

Einstellung Fenster

P-Kanal

0,1% 100%

0,1% 100%

Ergebnisse Direkte

Analyse

in

Dioxanszintillator

Zunächst wurde versucht, die Saccharosegradientenfraktionen direkt in Szintillationslösung A auszuwerten. Dazu wurde der Einfluß von Saccharose und ^>H-5-Azetatpuffer auf die Zählausbeuten untersucht. Tabelle 2 und 3 zeigen die Ergebnisse. Während diese Methode für die kleinen Fraktionen eines 5 -ml-Gradienten noch anwendbar wäre, ist sie für die größeren Fraktionen eines 30-ml-Grädienten nicht geeignet: Da die Zählausbeuten von der Saccharosekonzentration abhängig sind, würden sich für Saccharosegradientenfraktionen systematische Zählverzerrungen ergeben. Die Puffer-bedingte Verringerung der Zählausbeuten (Tab. 3) könnte zwar Tabelle 2 Einfluß der Saccharosekonzentration auf Zählausbeuten. 14CUrazil (1900 m/ic) wurde verdünnt (in 20% bzw. in 5% Saccharose). Je 1 ml solcher Verdünnungen wurde mit 19 ml Szintillationsflüssigkeit A versetzt und im Szintillationsspektrometer gezählt. Der aus einer 10O-min-Zählung ermittelte Hintergrundwert wurde abgezogen. Die Proben wurden jeweils für 10 min gezählt Relative Konzentration 1 1/21 1/440 1/9250

dpm

420000 2000 95 4,5

Ipm in 20% 1 5% Saccharose 28896 1 540 83 4

26666 1628 86 3

Ausbeute [%] in 20% 1 5% Saccharose 69 77 87 89

64 81 91 67

Flüssigkeitsszintillationszählungen durch Zugabe von 0,1 M N a O H korrigiert werden, doch schien diese Methode zu aufwendig und unsicher, u m routinemäßig angewandt zu werden. Deshalb wurde versucht, nach der im Folgenden beschriebenen Methode gleichmäßigere E r g e b nisse zu erzielen.

17

Tabelle 3 Einfluß von Saccharose und Azetatpuffer (0,1 M, pH 5) auf Zählausbeuten. 14C-Urazil (1900 m/jc) wurde den jeweiligen Lösungen zugefügt, welche dann mit Szintillationsflüssigkeit A auf 20 ml aufgefüllt wurden. Die Zählausbeuten wurden wie in Tab. 2 angegeben ermittelt

Analyse in Toluolszintillator nach Säurefällung der Nukleinsäuren

ml

Lösung

Ipm

Ausbeute [%]

1 2 3 5 1 1 1

5% Saccharose 5% Saccharose 5% Saccharose 5% Saccharose ACE ACE/10 20% Saccharose 0,1 M NaOH

26682 23 902 21657 10080 22932 26568 28393

63 57 52 26 55 63 67

Die Nukleinsäuren der Saccharosegradientenfraktionen (je ca. 0,14 ml) wurden mit 2,5 ml 6%iger TCE versetzt und für 20 min im Eisbad gefällt. Das Sediment wurde auf Membranfiltern (Co 5, Membranfiltergesellschaft, Göttingen) gesammelt und mit 5 ml kalter 6%iger TCE gewaschen. Die Filter wurden bei ca. 40 °C getrocknet und in 15 ml Szintillationsflüssigkeit B gegeben. (Da die Filter einen Durchmesser von 3 cm hatten, mußten sie aufrecht in den Zählröhrchen stehen; deshalb waren 15 ml Flüssigkeit erforderlich. Mit Filtern, deren Durchmesser kleiner war als der der Röhrchen, konnten kleinere Mengen Szintillationsflüssigkeit benutzt werden). Die Stellung der Filter in den Röhrchen hatte nur einen geringen Einfluß auf die Zählausbeuten; wurde ein Filter mit einem 32 P- 14 C-markierten Sediment (340 bzw. 225 ipm) in verschiedenen Stellungen nacheinander gezählt, so lagen die Schwankungen bei 2 minZählungen innerhalb der Schwankungsbreite von wiederholten Zählungen bei gleicher Stellung (entsprechende Ergebnisse wurden mit 3H-Urazil-markierten Sedimenten auf Millipore-Filtern erhalten). Ähnliche Verfahren sind verschiedentlich kurz beschrieben worden, doch wurde dabei oft Trägermaterial der T C E - F ä l l u n g zugefügt [3], [4]. E s ist aber nicht klar, ob solcher Zusatz notwendig ist. U n t e r den hier benutzten Bedingungen ist ein Zusatz von Trägermaterial nicht notwendig (Tab. 4). Tabelle 4 Einfluß von Rinderserumalbumin in der TCE-Fällung auf die Filtrierausbeute. Ein RNS-Extrakt aus 1,5 • 1010 Zellen wurde 1/300 in ACE verdünnt. J e 0,4 ml Probenlösung wurde 1,6 ml NACI-Puffer, und einer von ihnen noch 0,2 ml 1 %iges RSA zugefügt. Nach Fällung mit 2 ml 6%iger TCE wurde das Sediment auf Membranfiltern gesammelt, mit 5 ml kalter TCE (6%ig) gewaschen, bei 40 °C getrocknet und die Zählausbeuten ermittelt RSA

+ 2

32p

Impulse • 10" 1 23265 ± 49 23 331 ± 4 8

Acta biol. med. german., Bd. 18, Heft 1

14

C

[%]

Impulse • 10 _ 1

[%]

97 ± 0,21 100 ± 0,21

19837 ± 45 21420 ± 46

93 ± 0,2 100 ± 0,2

18

P . KNOLLE

Ein RNS-Extrakt aus 50 ml Zullsuspension (entsprechend 1,5 • 1010 Zellen) wurde soweit (1/300) verdünnt, daß diese Verdünnung nur etwa 1/20 der RNSMenge enthielt, die im Durchschnitt pro Gradientenfraktion zu erwarten wäre. Nach Fällung mit TCE (mit bzw. ohne Rinderserumalbumin als Träger) sind die Filtrierausbeuten (gemessen als Zählausbeuten) in Gegenwart von Trägermaterial im Vergleich zur trägerlosen Kontrolle nicht verbessert. (Weitere Hinweise dafür, daß ein Träger nicht erforderlich war, können der folgenden Arbeit [1] entnommen werden.) Wiederholte

Benutzung

von

Szintillationsflüssigkeit

Bei der Bestimmung der Radioaktivität größerer Probenserien, deren Aktivitäten innerhalb von 2—3 Zehnerpotenzen liegen, kann sich die wiederholte Benutzung der mit Szintillationsflüssigkeit gefüllten Probenröhrchen als ausreichend und sparsam erweisen. Ein Filter mit einem 32 P-Kontrollsediment wurde in 15 ml Toluolszintillator gezählt (74600ipm), dem Zählröhrchen entnommen und letzteres noch einmal leer gezählt. Dabei waren 31 ipm zurückgeblieben (0,04%). Entsprechend war mit einem 14C-Kontrollsediment (506 ipm) keine Restkontaminierung nachweisbar. Tabelle 5 Zählausbeuten bei wiederholter Benutzung von Szintillationsflüssigkeit B , sowie nach längerer Aufbewahrung der Proben bei ca. 5 °C

Kanal

82p «c 32p 14

1 2

C

in ungebrauchter Szintillationsflüssigkeit

in gebrauchter Szintillationsflüssigkeit 1

490 1245 74600 5947

506 1280

100% 100% 100% 100%,

103% 102%,

—

—

—

—

nach Aufbewahrung von Filtern in Szintillationsflüssigkeit 2

—

71951 6386

96% 107%

8 Tage in Gebrauch, dreimaliger Wechsel der Filterproben 3 Wochen bei ca. 5 °C

In Tabelle 5 sind einige Experimente zusammengefaßt, bei denen Filter mehrfach gewechselt bzw. für längere Zeit in Toluolszintillator aufbewahrt worden waren. Die Abweichungen der Zählausbeuten in benutzter Flüssigkeit liegen innerhalb von 3% im Vergleich zur Kontrolle. Nach 3 Wochen Aufbewahrung in Szintillationsflüssigkeit B sank die Zählausbeute einer 32 P-Kontrolle um 4%, während die Kreuzkontaminierung im 14C-Kanal von 8 auf 9% anstieg. Für die Gradientenanalysen waren diese Abweichungen nicht signifikant (vgl. [1]).

\9

Flüssigkeitsszintillationszählungen Literatur [1]

K N O L L E , P . : H e m m u n g der zelleigenen RNA-Synthese in fr-infizierten Bakterien. Acta biol. med. german., 18, 21 (1967). [2] K N O L L E , P. U. H . J . L Ü D K E : Einfache Geräte zur Herstellung u n d Auslauffrak-, tionierung von Dichtegradienten. Acta biol. med. german. 16, 222 (1966). [ 3 ] E R I K S O N , R . L . , M . L . F E N W I C K U. R. M . F R A N K L I N : Replication of Bacteriophage R N A : Studies on t h e F a t e of P a r e n t a l R N A . J . molecular Biol. 10, 519 (1964). [ 4 ] L O D I S H , H . F . , K . H O R I U C H I U. N. D . Z I N D E R : M u t a n t s of t h e Bacteriophage f2. V. On t h e Production of Noninfectious P h a g e Particles. Virology 27, 139 (1965) •

Die Arbeit w u r d e im ehemaligen Max-Planck-Institut f ü r vergleichende Erbbiologie u n d Erbpathologie, Berlin-Dahlem, begonnen und m i t einem Habilitationsstipendium der Deutschen Forschungsgemeinschaft abgeschlossen. Sie ist Teil von Untersuchungen, die von der Deutschen Forschungsgemeinschaft durch Sachbeihilfen a n H e r r n Prof. Dr. F. K A U D E W I T Z u n d a n den Autor u n t e r s t ü t z t wurden. Frl. U. J A U K E R sei g e d a n k t f ü r technische Assistenz. Gegenwärtige Anschrift des Verfassers: New York University School of Medicine, D e p a r t m e n t of Biochemistry, New Y o r k 16, NY, USA. Summary P . K N O L L E : Liquid scintillation counting of 32 P, 14 C double-labelled sucrose gradient fractions A m e t h o d is evaluated which permits quick analysis of t h e g r a d i e n t fractions containing R N A

14

C,

32

P content of sucrose,

Pe3H)Me

IT. KHOJiJie: J K H H K O C T H H Ü ciiHHTHjijiHiiHOHHbiii MeToa cieTa " C , paKunH B caxap03H0M r p a H H e m e

32

OnHCHBaeTCH MeTOH) n03B0JIHK>mHH SblCTpblfl aHajIH3 COflepjKaHHH $paKUHö B caxap03H0M rpajjueHTe, conepHiaiyHx P H K

2*

P-MeneHbix 14

C H

32

P

Acta biol. med. german.. Band 18, Seite 21 — 36 (1967) New York University Medical Center New York University School of Medicine

Hemmung der zelleigenen RNS-Synthese in fr-infizierten Zellen von Escherichia coli P.

KNOLLE

(Eingegangen am 11.8. 1966)

Zusamm enfassung E s wurde die Bildung von fr-RNS in wachsenden Zellen von E. coli untersucht. I n E x t r a k t e n fr-infizierter Zellen konnten durch Saccharosegradientenzentrifugation mehrere neue RNS-Fraktionen getrennt werden. Phagen-RNS (ca. 27 s) und RNase-resistente R N S (6 s — ca. 10 s) wurden nachgewiesen. Die in diese Fraktionen eingebaute 14 C-Urazil-Pulsmarkierung diente als Kriterium f ü r die phagenspezifische Syntheseaktivität. Ein Vergleich der 3 2 P-prämarkierten und der 14Cpulsmarkierten Peaks gestattete eine Bewertung geringer Mengen phagenspezifischen Materials (ein Rechenverfahren hierzu wird im Anhang dieser Arbeit diskutiert). Mit dieser Methode konnte gezeigt werden, daß die zelluläre RNS-Synthese bereits während des frühen Phagenwachstums beeinträchtigt wird: der Einbau der Impulsmarkierung in die rRNS-Peaks ist vor dem Auftreten intrazellulärer, lebensfähiger Phagen um 20 — 30% vermindert. Das gleichzeitige Auftreten einer 18 s-Fraktion kann als Anzeichen einer Störung der Ribosomenbildung angesehen werden. Dies könnte eine Erklärung f ü r die in der Literatur berichtete geringe H e m m u n g der zellulären RNS-Synthese und die starke H e m m u n g der Ribosomensynthese sein.

Während die Replikation der RNS-Phagen seit einigen Jahren Gegenstand eingehender Untersuchungen ist, wurde der Zusammenhang zwischen der zelleigenen und der Phagen-RNS-Synthese weniger bearbeitet. Zwar wurde die Hemmung der ribosomalen RNS-Synthese für Rl 7-infizierte Zellen postuliert; es wurde jedoch nur der Nachweis für die Hemmung der Ribosomenbildung erbracht [1]. Ein Vergleich der Sedimentationsdiagramme von RNS-Extrakten aus Chloramphenikol-behandelten und -unbehandelten, Rl 7-infizierten Zellen könnte jedoch auch für eine direkte Hemmung der zelleigenen RNS-Synthese während der Replikation von Rl 7-RNS sprechen (vgl. [ 1 ] u. [ 2 ] ) . Andererseits berichteten F E N W I C K et al. [ 3 ] , daß in Rl7infizierten Zellen die zelleigenen RNS-Synthese erhalten blieb. Da selbst bei hoher Phagen-Eingabemultiplizität stets ein Anteil nichtinfizierter Zellen gefunden wird [4], ist zu erwarten, daß auch in infizierten Kulturen zelleigene RNS gebildet wird. Diese erschwert die Abtrennung phagenspezifischer RNS-Komponenten. Deshalb wurden bei Untersuchun-

22

P . KNOLLE

gen über die Vermehrung der RNS-Phagen von einigen Autoren verschiedene Methoden zur Hemmung der zelleigenen RNS-Synthese benutzt: F E N W I C K et al. [3] bestrahlten Zellen vor der Infektion mit ultraviolettem Licht, K E L L Y et al. [ 5 ] behandelten Protoplasten mit Aktinomyzin D. Dabei wurde jedoch auch gleichzeitig die Phagenvermehrung gestört; in beiden Fällen war die Phagenausbeute stark reduziert. In der vorliegenden Arbeit soll die Bildung von fr-RNS in normal wachsenden Zellen verfolgt und im Anhang eine rechnerische Methode zur Abschätzung von Vorläufer- und von phagenspezifischer RNS in Sedimentationsdiagrammen von RNS-Extrakten aus doppelmarkierten Zellen erläutert werden. Die Untersuchung soll Aufschluß über den Einfluß der Phageninfektion auf die zelleigene RNS-Synthese geben. Material und Methodik Phagen und

Bakterien

Der Phage fr wurde von H O F F M A N N - B E R L I N G et al. beschrieben [6], [7]. Die Bakterienstämme sind Abkömmlinge von E. coli K 12: 33001, 3300-141 (leu~his~RCrel) wurde von 3300 abgeleitet, 58-161-22 (met"his _ F + RC rel ) ist ein Abkömmling von 58-161. Medien und

Puffer

T - P u f f e r : Einer Lösung von 3,5 Liter, die 6 g KCl, 18,4 g NaCl, 4 g NH„C1 und 52 g TRIS 2 enthielt, wurde 7 g MgS0 4 • 7 H 2 0 und 40 g K H 2 P 0 4 zugefügt. Die Lösung wurde mit HCl auf pH 7 eingestellt und mit Wasser auf 4 Liter aufgefüllt. T - M e d i u m : Vor Gebrauch wurden auf je 100 ml T-Puffer 0,5 ml einer 40%igen Glukoselösung und 1 ml der jeweils benötigten Aminosäurelösungen (2 mg/ml) zugefügt. PHOT-Puffer und PHOT-Medium entsprechen T-Puffer und T-Medium, jedoch enthalten sie nur 2,67 g K H 2 P 0 4 statt 40 g pro 4 Liter. T R I B E M - P u f f e r 3 enthält pro 500 ml: 0,236 g Bernsteinsäure, 0,606 g T R I S und 1.23 g MgS0 4 • 7 H a O. N A C I - P u f f e r enthält pro 400 ml: 3,5 g NaCl und 1,76 g Natriumzitrat; der Puffer wird mit HCl auf pH 7 eingestellt. 10 • ACE-Puffer enthält 38,5 g Ammoniumazetat pro 500 ml Wasser, eingestellt auf p H 5 mit HC10 4 ; ACE-Puffer wird 1/10 daraus verdünnt. Stammlösungen

für

Saccharose (5% sungen wurden ACE-Puffer auf Refraktometers

und 20%) wurde in ACE-Puffer und 0,1 M NaCl angesetzt. Die Lömit konzentrierter Saccharose in NaCl-ACE-Puffer bzw. mit NaCleinen Brechungsindex von 1,3631 bzw. 1,3411 mit Hilfe eines A B B E eingestellt.

1

Saccharosegradienten

Die Nomenklatur würde auf einen Hfr-Stamm schließen lassen; es liegt jedoch kein Hinweis dafür vor, daß dieser Stamm oder sein Abkömmling Hfr-Eigenschaften hat. 2 Abkürzungen: T R I S = Tris(Hydroxymethyl)aminomethan; EM = Eingabemultiplizität (vergl. [8]); TEC = Trichloressigsäure; S R P = Serum-resistente P B E (Plaquebildende Einheit, vergl. [8]); rRNS = ribosomale RNS; R I = replikatives Intermediärprodukt (vgl. [21] für ausführliche Diskussion) 3 Nach Dr. C. PFAU, Statens Seruminstitut, Kopenhagen

RNS-Synthese in fr-infizierten E. coli Wachstum und Aufarbeitung

23

der Zellen

M a r k i e r u n g u n d I n f e k t i o n : Aus einer Übernachtkultur in T-Medium wurde eine bei 37 °C exponentiell wachsende Kultur in PHOT-Medium angesetzt [9]. Bei einer Zellkonzentration von etwa 5 • 10' Bakterien/ml wurde 3Z P (0,2 mc/100 ml) als Orthophosphat zugefügt. Nach 2 Std. (entsprechend 2V2 Generationen) wurden die Zellen in der Kälte abgeschleudert, mit PHOT-Puffer gewaschen, im gleichen Volumen PHOT-Medium resuspendiert und für eine Generationszeit weiterbelüftet. Dann wurde 1/1000 Vol. einer 1 M CaCl 2 -Lösung zugefügt. Eine Probe (50 ml) wurde als Kontrolle entnommen und getrennt weiterbelüftet. Nach 5 min wurde f r (EM 3 — 5) zugefügt. Zwei Proben (je 50 ml) wurden zur Analyse früher Vermehrungsstadien entnommen. Der Suspensionsrest wurde 32 min nach der Infektion auf 1/10 Vol. P H O T - P u f f e r (bei —20 °C gefroren) gegossen und in der Kälte zentrifugiert. Das Sediment wurde einmal mit kaltem PHOT-Puffer gewaschen, in einem kleinen Volumen Puffer aufgenommen, in je 50 ml vorgewärmte PHOT-Medium-Portionen verteilt und bei 37 °C weiterbelüftet. Für die Pulsmarkierung mit 14 C-Urazil wurde diesen Proben jeweils 2ßC 14 C-Urazil, und 5 min später 2 ml einer nichtmarkierten Urazillösung (2 mg/ml) zugefügt. Nach 10 min wurde die Suspension jeweils auf 10 ml PHOT-Puffer (der 0,032 g Natriumazid enthielt und bei —20 °C eingefroren war) gegossen und in der Kälte zentrifugiert. Das Zellsediment wurde einmal mit PHOT-Puffer gewaschen u n d in 5 ml T R I B E M - P u f f e r aufgenommen. 1 R N S - E x t r a k t i o n : Die Extraktion der R N S erfolgte in Anlehnung an die Methoden von K J E L D G A A R D und K U R L A N D [10] und von S A G I K et al. [11]. Dem in 5 ml T R I B E M Puffer aufgenommenen Zellsediment wurde 0,05 ml Lysozym (1 mg/ml) und 0,02 ml DNase (1 mg/ml) zugefügt. Die Suspension wurde im Azeton-Trockeneisbad eingefroren, aufgetaut (gegebenenfalls wurde die Suspension noch zwei weitere Male eingefroren u n d getaut) u n d f ü r 5 min bei 10°C belassen. Dieses Lysat wurde mit 0,5 ml Dodezylsulfat (1 %) versetzt und 5 min im Eisbad geschüttelt. Nach Zugabe von 150 mg Bentonit wurde das Lysat mit 1 Vol. Phenol (frisch destilliert, gesättigt mit TRIBEM-Puffer) versetzt. Die Suspension wurde mit einem Magnetrührer f ü r 10 min im Eisbad heftig gerührt und deren Phasen durch Zentrifugieren getrennt (5 min, 3000 UPM, Schwingbecherrotor einer gekühlten CHRIST-Zentrifuge). Die Pufferphase wurde mit Hilfe einer Spritze mit weiter Kanüle (2 m m 0 ) abgehoben. Der verbleibende Rest wurde mit 1 ml TRIBEM-Puffer verdünnt, abgehoben und der vorher entnommenen Phase zugefügt. Eine zweite Phenolextraktion (5 min) schloß sich an. Die jeweils zusammengegebenen Pufferphasen wurden mit 1/10 Vol. 10 • ACE-Puffer auf pH 5 gebracht. Die Nukleinsäuren wurden mit 2 Vol. Äthylalkohol bei —20 °C f ü r 2 Std. gefällt. Das abgeschleuderte Sediment wurde in 5 ml ACE-Puffer aufgelöst und nochmals gefällt. Schließlich wurde die R N S in 0,6 ml ACE-Puffer aufgenommen u n d eingefroren. Saccharosegradientenzentrifugierung und Analyse der Gradientenfrakt i o n e n : siehe [12], [13]. R N a s e - B e h a n d l u n g v o n G r a d i e n t e n f r a k t i o n e n : Alternierenden Gradientenfraktionen (etwa 0,07 ml/Fraktion) wurde 1 ml einer Lösung von 6,5 ß g RNase-A/ml NACI-Puffer zugefügt. Das Gemisch wurde für 30 min bei 37°C bebrütet und anschließend gekühlt. Die Nukleinsäuren wurden mit 1 ml 12%iger TCE für 20 min im Eisbad gefällt. Die Aktivitäten der Sedimente wurden wie vorher beschrieben [13] im Flüssigkeitsszintillationsspektrometer gezählt. I n Tabelle 1 ist der Einfluß der Substratkonzentration auf die Zählausbeute RNase-behandelter Proben dargestellt. Da in den Gradientenfraktionen nie mehr als eine der 1/5-Verdünnung entsprechende Substratmenge pro Fraktion vorlag, ist die angewandte Methode adaequat; die Tatsache, daß bei Verdünnungen von 1/5 bis 1/125 die Ausbeute nur geringfügig abnimmt, liefert einen weiteren Hinweis dafür, daß ein Zusatz von Proteinträger zur Erhöhung der Filtrierausbeute nicht erforderlich ist (vgl. auch [13]).

24

P . KNOLLE

Tabelle 1 Einfluß der Substratkonzentration auf die RNase-Behandlung. Ein RNS-Extrakt aus 50 ml Zellsuspension (Probe Nr. 12 (s. [21])) wurde in ACE-Puffer verdünnt. Aus den Verdünnungen wurden Proben von je 0,4 ml entnommen und mit 1,6 ml einer RNase A-Lösung (6,5^ig/ml in NaCl-Puffer) versetzt. Diese Mischungen, sowie je eine mit 1,6 ml NaCl-Puffer verdünnte Kontrolle der ersten und letzten (1/500) Verdünnung wurden für 30 min bei 37° bebrütet und nach Abkühlung mit 2 ml I2%iger TCE versetzt. Das Sediment wurde auf Membranfiltern gesammelt und dessen Radioaktivität bestimmt (Die 1/500 verdünnte, RNase-behandelte Probe ist nicht aufgeführt worden, da die Impulszahlen bei Hintergrundsubtraktion um 0 lagen; die Zähldauer war 10 min) 14

Relative Probenkonzentration

C

[Imp./min] gezählt

X Verdünnungsfaktor

Kontrolle

1 1/500

52814 ± 73 107 ± 3

52814 53 500

RNasebehandelt

1 1/5 1/25 1/125

10812 1315 220 39

10812 6550 5500 4900

± 33 ± 12 ± 5 ± 2

[%] 100 102 20,5 12,5 10,5 9

± 0,14 ± 3 ± ± ± ±

0,06 0,11 0,23 0,5

Biologische Analysen Phagen- und Bakterientiterbestimmungen wurden nach den üblichen Methoden mit DIFCO Nutrient Broth Agar durchgeführt [14]. Die Zahl der intrazellulär gereiften Phagen wurde entsprechend der an anderer Stelle näher beschriebenen Methode [15] bestimmt. Enzyme und radioaktive Präparate Pankreas RNase A, DNase und Lysozym waren Produkte von Worthington Enzymes, Freehold, NJ, USA. 14C-Urazil (spez. Akt. 40,6 mc/mMol) stammte von Radiochemical Centre, Amersham, England, 3 2 P (trägerfreies Orthophosphat) wurde von Fa. Buchler, Braunschweig, bezogen. Ergebnisse l. Darstellung

von fr-RNS

in

Saccharosesedimentationsdiagrammen

Das Molekulargewicht der fr-RNS ist dem der 23s-rRNS ähnlich; radioaktiv markierte fr-RNS konnte jedoch von 23s-rRNS im Saccharosegradienten abgetrennt werden [7]. Ähnlich konnte R 1 7 - R N S in Mischungen von Phagen-RNS und zellulärer R N S als getrennter Gipfel nachgewiesen werden [*]» [31- I n diesen Fällen war eine Unterscheidung möglich, da sich die Phagen-RNS durch ihre radioaktive Markierung vom UV-Absorptionsdiagramm der zellulären R N S unterschied. Die Differenzierung dürfte jedoch bei gleichzeitiger Markierung von fr-RNS und 23s-rRNS (wie sie bei wenig gestörter zelleigenen RNS-Synthese in infizierten Zellen zu erwarten wäre)

RNS-Synthese in fr-infizierten E. coli

25

und insbesondere in Gegenwart eines großen Überschusses von 23s-rRNSMarkierung (in frühen Phagenvermehrungsstadien) schwierig sein. Nach Vormarkierung der Zellen ist jedoch eine Abschätzung der Anteile an zelleigener und an phagenspezifischer RNS in Extrakten infizierter Zellen möglich. Zwei typische Sedimentationsdiagramme der RNS fr-infizierter Zellen von E. coli 3300-141 zeigt Abbildung 1. In diesen Diagrammen entsprechen die 32 P-markierten Gipfel den RNS-Komponenten, die vor der Infektion syn-

Abb. 1. Sedimentationsdiagramme von RNS-Extrakten aus 32 P-vormarkierten, frinfizierten Zellen nach einem 5 min Puls mit 14C-Urazil und 10 min „chase" mit nichtmarkiertem Urazil (Stamm 3300—141). a: 45—50—60 min; b: 60—65 — 75 min nach Infektion. Die Gradientensedimentation (6 Std., 35000 Upm, 5 ml, Spinco Modell L, SW 39 Rotor, ca. 4°) erfolgte in einem 5 —20%igen Saccharosegradienten in ACE-Puffer

thetisiert wurden ( 2 1 6 - und 4s-RNS). Die 14C-markierten Gipfel hingegen entsprechen solchen RNS-Fraktionen, die 45 —60 min bzw. 60 bis 75 min nach der Infektion (während eines 5 min 14C-Urazil-Pulses und anschließendem 10 min „chase") gebildet wurden bzw. die Syntheseaktivität zeigten. Die u C-markierte 23s-Fraktion weist im Vergleich zur 32 P-Referenzmarkierung des 23s-Gipfels anfangs nur eine Verbreiterung zur schwereren Seite auf (Abb. la), später zeigt sie eine der Position der Phagen-RNS entsprechende Verlagerung des Gipfels (Abb. 1 b). Das 14C-Profil zeigt weiterhin einen Gipfel zwischen 4 und 1 6s, der im 32 PDiagramm nicht auftritt. Dieser Komponente entspricht eine RNase-teilresistente Fraktion, die später beschrieben werden soll. Wurde dem Saccharosegradienten NaCl (0,1 M Endkonzentration) zugefügt, konnte eine bessere Abtrennung der 27s-Phagen-RNS nicht erreicht werden, doch wurden die Gipfel schmaler und daher besser ausgeprägt. Steilere

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P.

KNOLLE

Gradienten (z.B. 5—30%) oder Zusatz von Mg++ (0,001 M Endkonzentration; vgl. [1], [3]) verbesserten die Auftrennung nicht. D a m i t diesen Gradienten eine deutliche Abtrennung der 26s-Phagen-RNS von der 23srRNS nicht möglich war, wurde schließlich die Unterscheidung der beiden Anteile nach der im Anhang näher beschriebenen, rechnerischen Methode vorgenommen: Danach wurden die 32 P-Zählwerte der Gradientenfraktionen normiert (bezogen auf die Werte des 14C-Diagramms) und von den 14CZählwerten subtrahiert. Aus den so erhaltenen Differenzwerten ergab sich dann eine neue Differenzkurve. In dieser Kurve traten diejenigen Komponenten, die in Abweichung von der Vormarkierung nach der Infektion 14 C-Einbau aufwiesen, als neue Gipfel auf. 2. Darstellung von RNase-resistenter RNS in Saccharosesedimentationsdiagrammen Ein weiteres Maß für die Phagen-RNS-Synthese ist der Einbau von 14CUrazil in das RI [16]. Dieses RI stellt nach den heute gültigen Vorstellungen eine, nach Phenolextraktion RNase-teilresistente Komponente dar [17]. Diese sollte als RNase-teilresistenter Gipfel im Saccharosesedimentations15000

-

12000

9000

| Q.

E

6000a°

3000

0 20 Fraktion

40

60

A b b . 2. Sedimentationsdiagramme von R N S - E x t r a k t e n aus infizierten Zellen m i t R N a s e - B e h a n d l u n g alternierender Gradientenfraktionen (s. Methodik). Urazilmarkierung (vgl. Abb. 1) a : 20 —25 —35 m i n ; b : 6 6 —71—81 min nach Infektion. Die Gradientensedimentation erfolgte wie in Abbildung 1 beschrieben, jedoch enthielt der Gradient zusätzlich 0,1 M NaCl. o o 3 2 P-Zählwerte; A A 3 2 P-Zählwerte n a c h R N a s e - B e h a n d l u n g 14 14 • • C-Zählwerte; • A C-Zählwerte nach RNase-Behandlung

RNS-Synthese in fr-infizierten E. coli

27

diagramm erkennbar sein, wenn alternierende Fraktionen eines fraktionierten Gradienten mit RNase behandelt werden. Abbildung 2 zeigt 2 solche Diagramme aus einem frühen und einem späten Vermehrungsstadium des Phagen. Die RNase-resistente 32P-Markierung entspricht dabei den Anteilen an zelleigenen, RNase-resistenten Fraktionen, die etwa den 23-, 16und 4s-Gipfeln entsprechen. Deutlich ist eine neu auftretende 14 C-Fraktion erkennbar, die anfangs bei etwa 7 s sedimentiert (Abb. 2 a). In nichtinfizierten Kontrollen tritt diese Komponente nicht auf. Im Diagramm aus der späten Vermehrungsphase (Abb. 2 b) zeigt sich neben der Verbreiterung der Phagen-RNS-Fraktion bei 26 s eine Verschiebung und Vergrößerung der RNase-teilresistenten Fraktion. Aus dem Einbau von 14C-Urazil in die 23-, 16- und 4s-Regionen ist ersichtlich, daß neben phagenspezifischer RNS auch gleichzeitig noch ein beträchtlicher Anteil an zelleigener RNS gebildet wird. Diese Synthese rührt z. T. von nichtinfizierten Zellen her (72% der Zellen waren als infiziert, d. h. als SRP, nachweisbar), z. T. mag sie aber auch der zelleigenen RNS-Synthese in infizierten Zellen zuzuordnen sein. 3. Einfluß der Phageninfektion auf die zelluläre RNS-Synthese in frühen Phagenvermehrungsstadien Wird eine 32 P-vormarkierte Zellsuspension aufgeteilt, verschiedenen Wachstums- oder Infektionsbedingungen ausgesetzt und mit 14C-Urazil pulsmarkiert, so entspricht die Menge der 32 P-Vormarkierung der jeweiligen Zellmenge des Extraktes; damit können die 14C-markierten Komponenten der verschiedenen Zellextrakte, unabhängig von der Menge des Ausgangsmaterials, quantitativ miteinander verglichen werden. In Abbildung 3 sind Sedimentationsdiagramme von RNS-Extrakten aus frühen Vermehrungsstadien des Phagen mit einer nichtinfizierten Kontrolle verglichen. Die 32 P-Zählwerte wurden für den während der Zählungen auftretenden radioaktiven Zerfall so korrigiert, daß sie der Kontrolle entsprechen. Die 14C- und 32 P-Impulsskalen sind so gewählt worden, daß die Gipfel der RNS-Fraktionen im Kontrolldiagramm weitgehend übereinstimmen. Dadurch werden die Veränderungen in den 14 C-Einbauaktivitäten nach der Infektion besonders deutlich: Auch ohne nähere Analyse der Gipfel ist die Abnahme der 14C-Markierung in den zelleigenen RNS-Fraktionen erkennbar. Parallel zum 14C-Einbau wurde auch die Bildung intrazellulärer Phagen verfolgt (Tab. 2). Dabei erschienen die ersten intrazellulären Phagen zwischen 16 und 30 min nach der Infektion; deren Zahl nahm bis 45 min schnell, bis 100 min dann langsamer zu (Zwischenwerte sind in diesem Fall nicht näher analysiert worden). Demnach stammte die RNS desDiagrammsb in Abbildung 3 aus einer Zeitspanne, die bis zur Bildung der ersten reifen Phagen reichte (Puls: 5—10min, „chase": 10—20min nach Infektion), während die RNS des Diagramms c in Abbildung 3 aus der frühen Anstiegs-

28

P . KNOLLE

Abb. 3- Sedimentationsdiagramme von RNS-Extraktion aus nichtinfizierten (a) und aus infizierten (b u. c) Zellen. Urazilmarkierung: a : 5 m i n P u l s , 1 0 m i n , , c h a s e " ; b : 5 —10—20min; c:20—25 —35min nach Infektion. Die 3 2 P-Zählwerte sind normiert (vgl. Text). Sedimentation siehe Abbildung 2. O o 3 2 P-Zählwerte; • • 14 C-Zählwerte; • • Q = 14 C/ 32 P

periode der Phagenreifung stammte (Puls: 20—25 min, „chase": 25—35min nach Infektion). Die Hemmung der zellulären RNS-Synthese tritt also schon vor der Bildung größerer Phagenmengen auf. In den Diagrammen der Abbildung 3 sind außer den Zählwerten auch die jeweiligen Quotienten Q = 14C/32P eingetragen. Die stark erhöhten Werte am Anfang der Gradienten sind durch die relative Ungenauigkeit der sehr niedrigen 32P-Zählwerte dieser Fraktionen erklärbar (sie könnten z. T. auch durch erhöhtes 32 P-markiertes Hintergrundmaterial erklärt werden, doch ergab das Diagramm eines Kontrollgradienten, daß die Zählwerte des Hintergrundmaterials innerhalb der Zählgenauigkeit des Hintergrundzählwertes lagen). Nach der im Anhang beschriebenen Methode wurde aus solchen Werten jeweils eine Differenzkurve berechnet. In Abbildung 4 sind diese Differenzkurven in Diagramme eingetragen, die von entsprechenden (in Abb. 3 dargestellten) RNS-Extrakten gewonnen wurden. In diesem Tabelle 2 Bildung intrazellulärer Phagen im Pulsexperiment Zeit nach Infektion [min] 16 30 45 100

14

C-Urazil-

Intrazelluläre Phagen (• 10"8) 2,01 88 376 3650

RNS-Synthese in fr-infizierten E. coli

29

Falle wurden jedoch auch alternierende Gradientenfraktionen mit RNase behandelt. Zur übersichtlicheren Darstellung sind nur die RNase-resistenten 14 C-Zählwerte, die 32 P-Zählwerte der unbehandelten Fraktionen und die zugehörigen Differenzwerte (14C — Qmin X 32P) eingetragen worden. In Diagramm b ist dabei eine bei ca. 26 s sedimentierende Fraktion (entsprechend der Phagen-RNS) und eine bei etwa 6 s sedimentierende Fraktion (RI) kaum angedeutet, in Diagramm c (15 min später gewonnen) sind beide jedoch ausgeprägt. Dennoch ist die 14C-Markierung in den zelleigenen 2}-, 16- und 4s-Fraktionen in Diagramm b um etwa 20%, in Diagramm c (nach Korrek-

Abb. 4. O

Sedimentationsdiagramme von RNS-Extrakten entsprechend Abbildung 3, jedoch mit RNase-Behandlung alternierender Gradientenfraktionen. O 32 P-Zählwerte; • • "C-Zählwerte; • A 14 C-Zählwerte nach RNase-Behandlung; • • 14C — Qmin • 3 2 P (vgl. Text)

tur für Phagen-RNS Anteile von 26 und 6 s) um etwa 25 —30% reduziert. (Bei diesen Abschätzungen wurden die Summen der Zählwerte jedes Gipfels verglichen). Die zelleigene RNS-Synthese wird also schon gehemmt, bevor 14 C-Urazil in größerem Umfang in Phagen-RNS oder in das RI eingebaut wird. Diskussion

Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit bestätigen erneut die Notwendigkeit, die rRNS-Synthese und die Ribosomenbildung voneinander zu unterscheiden. Es konnte gezeigt werden, daß die zelluläre RNS-Synthese nach fr-Infektion weniger gehemmt war, als die Bildung der ribosomalen RNS nach R e infektion.

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P . KNOLLE

Während ELLIS und PARANCHYCH [ 1 ] als ribosomale RNS die in Ribosomen eingebaute RNS (also Ribosomen-RNS) bestimmten, wurden im vorliegenden Fall RNS-Extrakte ganzer Zellen untersucht. Die Ribosomensynthese nahm nach Rl 7-Infektion schnell um etwa 80% ab (ohne Korrektur für nichtinfizierte Zellen; vgl. [-1]). Nach fr-Infektion wurde die zelleigene RNS-Synthese nur um etwa 25—30% gehemmt. Wie im Anhang beschrieben wird, ergibt ein Vergleich der ()min-Werte späterer Vermehrungsstadien keinen Anhalt dafür, daß diese Hemmung im Verlauf der Phagenvermehrung größer wird. Der reduzierte Einbau von 14C-Urazil in zelleigene RNS nach fr-Infektion könnte damit erklärt werden, daß das exogene Urazil kompetitiv zugunsten der Phagen-RNS-Synthese benutzt wird. Als Einwand kann jedoch geltend gemacht werden, daß der RNS-VorstufenPool sehr groß ist. Dessen Regulation durch „feed-back-inhibition" [18] sollte zusätzliche RNS-Synthese zulassen, eine kompetitive Hemmung der RNS-Synthese sollte deshalb unwahrscheinlich sein. Nach den Vorstellungen von MCCARTHY und BRITTEN [19] kann jedoch exogenes Urazil unter Umgehung des Vorstufen-Pools in RNS eingebaut werden. Wenn dieser „pool-bypass" nicht Gegenstand direkter „feed-back-inhibition" ist, wäre der vorher erhobene Einwand aufgehoben. Es bliebe noch zu prüfen, ob der Einbau von 14C-Urazil in RNS ein zuverlässiges Maß für die RNS-Synthese ist. Dazu wurde nach "C-Urazil-Vormarkierung der Einbau von 32P in Analogie zu den hier wiedergegebenen Experimenten gemessen. Vorläufige Ergebnisse ergaben entsprechende Befunde: Nach Infektion war der Einbau von 32 P in die zelluläre RNS im Vergleich zu nichtinfizierten Zellen reduziert. Bezüglich der größeren Hemmung der Ribosomensynthese ist es naheliegend anzunehmen, daß deren Regulation nach fr-Infektion gestört ist: In Abbildung 4, Diagramm c, ist eine stärker ausgebildete 18 s-Fraktion angedeutet, die in ihren Sedimentationseigenschaften identisch ist mit der Vorstufenfraktion der rRNS, wie sie unter Bedingungen der Proteinsynthesehemmung in Zellen als Bestandteil der Streptomyzin- oder der Chloramphenikol-Partikel gefunden wird [20]. Eine entsprechende Fraktion findet sich auch in Extrakten aus Zellen mit „relaxierter" RNS-Synthesekontrolle in Abwesenheit benötigter Aminosäuren [22], sowie nach Pulsmarkierung in normal wachsenden Zellen [21], [22], [23], [24j. Die beobachtete 18 s-Fraktion könnte also durchaus einem angehäuften Intermediärprodukt der Ribosomenbildung entsprechen. Wenn die Ribosomenbildung auf einer Zwischenstufe gehemmt wird, so wären die Beobachtungen bzw. der relativ gering reduzierten zelleigenen RNS-Synthese (20—30%) und der ausgeprägter gehemmten Ribosomenbildung (bis mehr als 80%) miteinander vereinbar. Eine nähere Charakterisierung der 18 s-Fraktion in fr-infizierten Zellen sollte dazu beitragen, genauere Vorstellungen über den Eingriff der Phageninfektion in die Ribosomenbildung zu erlangen.

R N S - S y n t h e s e in fr-infizierten E . coli

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Anhang

Rechnerische Abschätzung von Vorläufer- und von Phagen-spezifischer aus vor- und pulsmarkierten Zellen

RNS

Mit der 32 P-Behandlung, wie sie in dem im Hauptteil dieser Arbeit beschriebenen Experimenten durchgeführt wurde, ist rRNS (23 s und 16 s) und lösliche RNS (sRNS, 4s), nicht jedoch kurzlebigere Messenger RNS (mRNS) markiert worden. Mit dem 14C-Urazil-Puls und nachfolgendem „chase" wurde neugebildete rRNS, sRNS und deren langlebigeren Vorstufen, sowie gegebenenfalls auch langlebigere mRNS markiert (siehe Abb. 4, Diagramm a). Wenn für jede Fraktion des Gradientensedimentationsdiagramms der Quotient Q = 14C/32P gebildet wird, so sollte eine aus diesen Werten erhaltene Quotientenkurve im Sedimentationsdiagramm einen Hinweis auf das Ausmaß der Abweichung der 32 P- und der 14C-Markierung geben (vgl. auch Abb. 3). Abbildung 5 zeigt eine solche Quotientenkurve im Sedimentationsdiagramm der RNS einer nicht-infizierten Kultur von Stamm 58-161-22 (vgl. Abb. 3a). Die Schwankungsbreiten der Quotienten halten sich in den durch die Symbole bedeckten Bereichen, und nur bei den ersten Fraktionen sind sie größer

20 Fraktion A b b . 5- S e d i m e n t a t i o n s d i a g r a m m einer nichtinfizierten K u l t u r (vgl. A b b . 3, H a u p t teil). Zellen w u r d e n m i t 3 2 P f ü r 2 1 / 2 Generationen m a r k i e r t , in n i c h t m a r k i e r t e m Med i u m f ü r 1 Generation belüftet, f ü r 5 min m i t 14 C-Urazil u n d anschließend f ü r 10 min m i t einem Ü b e r s c h u ß von n i c h t m a r k i e r t e m Urazil versetzt. Die R N S w u r d e e x t r a h i e r t u n d im 5 — 20%igen Saccharosegradienten sedimentiert (vgl. A b b . 2). F ü r jede F r a k t i o n w u r d e der Quotient Q = 14 C (imp/min)/ 3 2 P (imp/min) gebildet. O o 3 2 P-Zählwert; • • 1 4 C-Zählwerte; • • Q = 1 4 C/ 3 2 P

^ 2

P-

KNOLLE

(entsprechend angezeigt), entsprechend den vorher gemachten Beobachtungen (Abb. 3). (Da die 32 P-Werte stets kleiner waren als die 14C-Werte, wurden für jeweils 10 min gezählte Proben die Zählgenauigkeiten für In des 32 P-Wertes errechnet.) Die 32 P-Zählwerte des Sedimentationsdiagrammes wurden mit dem Mittelwert der niedrigsten Quotienten ( = ()min) multipliziert (