Acta Biologica et Medica Germanica: Band 16, Heft 3 [Reprint 2021 ed.] 9783112587362, 9783112587355

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ACTA BIOLQGIGA ETMEDICA GERMANICA HERAUSGEBER:

R. B A U M A N N , H. D U T Z , A. G R A F FI., H. G U M M E L , F. JUNG L.-H. K E T T L E R , S. M. R A P O P O R T U N T E R M I T A R B E I T VON:

W. B E I E R , H. D R I S C H E L , H. F K U N D E R , M. G E R S C H , E. G O E T Z E , H. H A N S O N , F. H A U S C H I L D , G . H O L L E , F. M A C H , H. M A T T H I E S , G. M O H N I K E , O. P R O K O P , K. S C H U B E R T , F. S C H W A R Z , G. S T E R B A , A. W O L L E N B E R G E R SCHRIFTLEITUNG:

W. S C H E L E R , H. B I E L K A

AKADEMIE-VERLAG • BERLIN • BAND 16 • HEFT 3 • SEITE 235-328 • 1966

AUFNAHMEBEDINGUNGEN

1. Es werden nur Arbeiten angenommen, die nicht an anderer Stelle mit demselben Inhalt veröffentlicht oder zur Veröffentlichung angeboten werden. Der Autor verpflichtet sich nach Annahme, die Arbeit an keiner anderen Stelle zu veröffentlichen. 2. Die Arbeit muß wissenschaftlich wertvoll sein.

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sachen, Versuche und Beobachtungen ohne positives Ergebnis werden, wenn überhaupt, nur in kürzester Form aufgenommen. Nicht aufgenommen werden Arbeiten referierenden Charakters, Polemiken und rein spekulative Arbeiten, falls sie nicht ganz wesentliche neue Gesichtspunkte enthalten. 3. Kurzmitteilungen für experimentelle Ergebnisse werden bei der Drucklegung zeitlich bevorzugt. Für ihren Inhalt ist ausschließlich der Autor verantwortlich. 4. Die Arbeiten müssen kurz und klar geschrieben und gegliedert sein. Problematik (Einleitung), Methodik, Befunde und Diskussion, evtl. Schlußfolgerungen sollen deutlich in Erscheinung treten. Der Arbeit soll ein Kurzreferat der wesentlichsten Ergebnisse vorausgestellt werden. Neben einer anderssprachigen erscheint auf jeden Fall eine deutsche Zusammenfassung. Die Arbeiten werden in folgenden Sprachen angenommen: Deutsch, Russisch, Englisch und Französisch. 5. Die Arbeiten werden im Sofortumbruch gesetzt; größere Korrekturen in Form von Streichungen bzw. Zusätzen sind daher in der Umbruchkorrektur nicht mehr möglich. 6. Genaue Hinweise zur Manuskriptgestaltung sind von der Redaktion der Zeitschrift anzufordern und sind unbedingt einzuhalten. 7. Manuskripte sind an die Herausgeber zu senden oder direkt an die Redaktion der Acta biologica et medica germanica. 1115 Berlin-Buch, Lindenberger Weg 70. 8. Von jeder Originalarbeit werden kostenlos 80 Sonderdrucke geliefert.

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hinaus können bis zu 100 Sonderdrucke gegen Berechnung bezogen werden.

Die Herausgeber

ACTA BIOLOGICA ET MEDICA GERMANICA Herausgeber : R. B a u m a n n

• H . D u t z • A. G r a f f i • H. G u m m e l • F . J u n g S. M. R a p o p o r t

B a n d 16

• L.-H. K e t t l e r

1966

Heft 3

Acta biol. med. german., B a n d 16, Seite 235 — 241 (1966) Aus dem Physiologischen Institut der Universität R o s t o c k (Direktor: Prof. Dr. A. B E C K M A N N )

Der Stoffwechsel von Kaninchen-Exsudatleukozyten bei Aufnahme von Kohle- und Tuschepartikeln J.

BURMEISTER

(Eingegangen am 15. 9. 1965)

Zusammenfassung An Kohlepartikeln wurde nachgewiesen, daß die Stoffwechselsteigerung bei Phagozytose auch bei diesem Objekt von der Größe der Teilchen abhängt. Unterschreitet ihr Durchmesser 0,2 /im, so ist keine Beeinflussung der Atmung mehr feststellbar. Hiermit ist die bisher noch fehlende Erklärung für die ausbleibende Aktivierung der Atmung bei Aufnahme von Tusche, deren Größe unter 0,2 /im liegt, gegeben. I m Vergleich mit Staphylokokken ist die Erhöhung der Atmung durch Kohle geringer. Dies wird sowohl auf einen niedrigeren Phagozytosegrad als auch auf spezifische Eigenschaften der Objekte zurückgeführt. Das Phagozytosevermögen der Exsudatleukozyten gegenüber Kohlepartikeln erwies sich als stark vom Milieu abhängig. B e i absolutem Fehlen des CO, im Gasraum, welches mit einem raschen Anstieg des /)H-Wertes auf etwa 8,0 verbunden ist, unterbleibt die Phagozytose; bei einem Gehalt von 1 % CO, ist sie dagegen gewährleistet. Dies unterscheidet sich von der Aufnahme von Bakterien, Quarzstaub, Stärke und manchen Farbstoffen, bei denen sich keine solche Abhängigkeit vom C 0 2 - G e h a l t bzw. pHW e r t zeigt. S c h o n in d e r A r b e i t v o n B A L D R I D G E u n d G E R A R D [ 1 ] , d i e s i c h z u m e r s t e n M a l mit dem Phagozytosestoffwechsel befaßt, wird berichtet, daß bei Aufnahme v o n T u s c h e keine S t e i g e r u n g des S a u e r s t o f f v e r b r a u c h s erfolgt.

25

Jahre

s p ä t e r w i r d d i e s e r B e f u n d n o c h m a l s v o n B E C K E R e t a l . [2] b e s t ä t i g t .

Über

den Stoffwechsel bei A u f n a h m e von K o h l e , d e m klassischen

Phagozytose-

o b j e k t v o n H A M B U R G E R [ 3 ] , l i e g t e i n e k u r z e N o t i z v o n COHN u n d MORSE [4] v o r , in w e l c h e r s e h r a l l g e m e i n v o n e i n e r A t m u n g s s t e i g e r u n g b e r i c h t e t w i r d . Ü b e r die U r s a c h e des f e h l e n d e n E f f e k t s b e i P h a g o z y t o s e v o n T u s c h e g e b e n 16

A c t a biol. med. german., Heft 3

236

J.

BURMEISTER

die genannten Autoren keinerlei Auskunft. Wir vermuteten nun, daß auch hier eine Abhängigkeit von der Partikelgröße, die STRAUSS [5] für Polysty-

rolkugeln beschreibt, eine Rolle spielt. Außerdem war in vorhergehenden Versuchen die eigenartige Tatsache gefunden worden, daß Kohle in Manometriegefäßen, in welchen NaOH das C 0 2 absorbiert, nur schlecht aufgenommen wird, gut dagegen in solchen ohne Kohlendioxidabsorption. Diese Fragen galt es in der vorliegenden Arbeit zu klären. Material und Methodik Gewinnung der Phagozytoseobjekte. Kohlepartikel wurden folgendermaßen aufbereitet. Zunächst wurde Holzkohlenpulver in Infukoll (6%ige Dextranlösung in 0 , 9 % i g e r NaCl-Lösung) aufgeschwemmt und die groben Teilchen durch 2minütiges Zentrifugieren mit 1750 g als Bodensatz entfernt. Der Überstand wurde nochmals 2 min zentriiugiert; im Bodensatz befinden sich Teilchen von 2—5 jum Größe, sie werden im folgenden als grobe Kohle bezeichnet. Partikel von 0,2 — 0,8 /tm Größe (feine Kohle) waren nach 30miniitiger Zentrifugation bei 1 750 ^ in dem Uberstand enthalten. In der Suspension der groben Kohle befanden sich ca. 5 • 10 6 , in der feinen Kohle ca. 7,5 • 10G Teilchen im /H-Wert nach 2 Std. 9,0. Um diesen Anstieg des ^ H - W e r t e s zu vermeiden, wurde die Methode von D I C K E N S und S I M E R [6] angewandt, wobei der eigentliche Versuch ohne Absorption von CO, abläuft. Die Leukozyten nahmen unter diesen Bedingungen kräftig Kohle auf, der Phagozytosegrad betrug im Durchschnitt 5 0 % . Zur weiteren Absicherung wurde der Ruhesauerstoffverbrauch auch noch nach der direkten Methode bes t i m m t ; dabei ergaben sich zwischen den beiden Methoden keine Unterschiede. Die Versuche dauerten 60— 120 min, ihnen ging ein 1 5miniitiger Vorversuch voraus. Weitere technische Einzelheiten sind unter [7] beschrieben. Ergebnisse

In Tabelle 1 sind die Versuche bei Aufnahme von grober Kohle wiedergegeben. Ausnahmslos kam es immer zu einer Steigerung des Sauerstoffverbrauchs bei Kohlenaufnahme, und zwar im Mittel auf 1 7 7 % . Entsprechend war auch in der Regel die C0 2 -Freisetzung gestiegen, so daß von einer Atmungssteigerung gesprochen werden kann. Die Milchsäurebildung war bei Phagozytose ebenfalls angestiegen; betrug bei den Kontrollen 10,2, bei den Versuchen 11,1. Entsprechende Effekte zeigten sich auch bei allen folgenden Versuchen; wegen ihrer Geringfügigkeit werden sie aber nicht noch einmal erwähnt werden. Durch Versuche mit feiner Kohle sollte weiter festgestellt werden, ob auch bei Kohle eine Abhängigkeit der Stoffwechselsteigerun g von der Partikelgröße besteht, wie sie für Polystyrolkugeln angegeben wird. Vergleichend

Phagozytose-Stoffwechsel von Leukozyten

237

Tabelle 1 Sauerstoffverbrauch bei Phagozytose 2—5 fim großer Kohlepartikel Versuch Nr.

Anzahl der Bestimmungen

0„„2 Kontrolle

Qo 2 Versuch 8,0 6,5 2,8 8,9 9,2 5,2 3,9 11,1 7,4

6,4 4,5 1,9 1,2 5,0 2,7 2,8 2,5 2,5 Mittelwerte

3,9 (100%)

6,9 (177%)

wurde der Stoffwechsel bei Aufnahme von Kohlepartikeln von 0,2—0,8 ,um und von 2—5 ,«rn Größe gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt ; sie lassen erkennen, daß auch bei Aufnahme von 0,2—0,8 /H-Wert keine Kohle phagozytieren. Hierdurch wird die Auffassung von W A R B U R G [16] bestätigt, wonach Reaktionen unter nicht streng physiologischen Bedingungen oft stark abweichend verlaufen. Unser Befund läßt sich vielleicht mit folgendem in Zusammenhang bringen. Nach K A R N O V S K Y [14] ist während der Phagozytose die Lipoidsynthese erhöht, um für die Vesikelbildung das nötige Membranmaterial bereitzustellen. Für diese Synthese ist C0 2 von großer Bedeutung; denn es verbindet sich zeitweilig mit Azetyl-Koenzym A zum Malonyl-Koenzym A, einem Baustein bei der Bildung der Fettsäurekette ( J Ö B S I S [17]). Fehlt das C0 2 , so dürfte die Lipoidsynthese unzureichend sein und die Phagozytose bleibt gering. Schwer verständlich bleibt indessen, daß bei anderen Objekten, wie Staphylokokken, Quarz- und Stärkepartikeln und einigen Farbstoffen, eine solche Empfindlichkeit gegenüber Kohlendioxidverarmung und Anstieg des ^IiWertes nicht zu verzeichnen ist ([7] und unveröffentlichte Befunde). Vielleicht ist im Fall der Kohle auf Grund ihrer Struktur der Bedarf an Membransubstanz besonders groß. Frl. E.

KARLSBURG

d a n k e n wir f ü r die gewissenhaft geleistete technische Hilfe

Anschrift des Verfassers: Gertrudenstraße 9

D r . J . BURMEISTER, P h y s i o l o g i s c h e s I n s t i t u t

Rostock,

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Phagozytose-Stoffwechsel von Leukozyten

241

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A c t a biol. m e d . g e r m a n . , B a n d 16, Seite 242 — 256 (1966) Aus d e m Physiologisch-chemischen I n s t i t u t der Medizinischen A k a d e m i e Magdeburg (Direktor: Prof. Dr. E. HOFMANN)

Eintritt und Phosphorylierung von 2-Desoxy-D-Glukose in Ehrlich-Aszites-Karzinom-Zellen 1 H . W . AUGUSTIN, K . L. NISSLER

und

E . HOFMANN

unter Mitarbeit von

H.

KRESSMANN

( E i n g e g a n g e n a m 22. 10. 1965)

Zusammenfassung E i n t r i t t u n d P h o s p h o r y l i e r u n g v o n 2 - D e s o x v - D - G l u k o s e in i n t a k t e E H R L I C . H - A S z i t e s - T u m o r - Z e l l e n w u r d e u n t e r v e r s c h i e d e n e n B e d i n g u n g e n g e m e s s e n . D e r 2-Deso x y - u - G l u k o s e - E i n t r i t t in d i e Zellen ist s t a r k t e m p e r a t u r a b h ä n g i g , zeigt b e i u n t e r s c h i e d l i c h e n 2 - D e s o x y - D - G l u k o s e - K o n z e n t r a t i o n e n i m M e d i u m eine S ä t t i g u n g s k i n e t i k ( H a l b s ä t t i g u n g s k o n s t a n t e : 2,5 • 1CT3 M) u n d w i r d bei A n w e s e n h e i t a n d e r e r M o n o s a c c h a r i d e wie G l u k o s e o d e r G a l a k t o s e g e h e m m t . B e i 38 °C e r r e i c h t d e r f r e i e Z u c k e r i n n e r h a l b w e n i g e r S e k u n d e n e i n e n K o n z e n t r a t i o n s a u s g l e i c h zwischen Zellen u n d M e d i u m . D e r T r a n s p o r t d e r 2 - D e s o x y - D - G l u k o s e in d i e EHRLICH-AszitesT u m o r - Z e l l e n k a n n a l s ein p a s s i v e r , t r ä g e r v e r m i t t e l t e r T r a n s p o r t p r o z e ß b e t r a c h t e t werden. Zyanid u n d 2,4-Dinitrophenol h e m m e n u n t e r endogenen Bedingungen die P h o s p h o r y l i e r u n g d e r 2 - D e s o x y - D - G l u k o s e u n d ü b e n k e i n e n d i r e k t e n E i n f l u ß auf d e n P c r m e a b i l i t ä t s s c h r i t t a u s . B e i 20 °C b e g r e n z t d i e P e n e t r a t i o n d u r c h d i e M e m b r a n die weitere U m s e t z u n g der 2-Desoxy-D-Glukose durch die H e x o k i n a s e - R e a k t i o n . B e i 38 °C w i r d d i e H e x o k i n a s e - R e a k t i o n n i c h t d u r c h d e n M e m b r a n t r a n s p o r t l i m i t i e r t u n d v e r m a g m i t M a x i m a l a k t i v i t ä t e n zu a r b e i t e n .

T u m o r e n zeichnen sich durch eine hohe aerobe u n d anaerobe Glykolyserate aus [1], [2]. Voraussetzung f ü r den hohen Glukoseverbrauch der T u m o r e n ist neben der erforderlichen K a p a z i t ä t der Glykolysekette [3] eine hohe Membranpermeabilität f ü r Zucker. EHRLICH-Aszites-Tumorzellen n e h m e n , wie bereits von H E L M R E I C H u n d CORI [ 4 ] mitgeteilt wurde, Monosaccharide mit sehr großer Geschwindigkeit auf. Diese Z u c k e r a u f n a h m e ist nach C R A N E et al. [ 5 ] u n d CIRILLO u n d Y O U N G [ 6 ] ein von der T e m p e r a t u r s t a r k a b h ä n giger, stereospezifischer Transportprozeß, der zu einem Konzentrationsausgleich des Zuckers zwischen Zellen u n d Medium f ü h r t . A b k ü r z u n g e n : ATZ = Aszites-Tumor-Zellen; D O G = 2-Desoxy-D-Glukose; DOG-6p = 2 - D e s o x y - D - G l u k o s e - 6 - P h o s p h a t ; A T P = A d e n o s i n t r i p h o s p h a t ; D N P = 2,4-Dinitrophenol; D N F B = 2,4-Dinitrofluorbenzol. 1 Die v o r l i e g e n d e n E r g e b n i s s e w u r d e n a u s z u g s w e i s e auf d e r 2. J a h r e s t a g u n g d e r A r b e i t s g e m e i n s c h a f t B i o c h e m i e in d e r G e s e l l s c h a f t f ü r e x p e r i m e n t e l l e Medizin d e r D D R in M a g d e b u r g , 2 4 . - 2 6 . J u n i 1965, v o r g e t r a g e n .

A u f n a h m e und Phosphorylierung von 2-Desoxy-D-Glukose

243

Die hier mitgeteilten Messungen (siehe auch [7]) des Eintritts und der Phosphorylierung der DOG in ATZ stellen einen Beitrag zum Problem des Monosaccharidtransportes durch die Membran der ATZ dar und erlauben Einblicke in die Beziehungen zwischen Membranpermeabilität und Hexokinasereaktion und die Bedeutung dieser beiden Schritte für die Begrenzung und Regulation der Glykose. Material und Methoden 1. Gewinnung von Aszites-Tumor-Zellert1 ATZ w u r d e n durch i.p. Übertragung von 0,3 ml einer Zellsuspension (Zellvolumen ca. 10%) bei weißen Mäusen (Gewicht 18 —22 g) erhalten. Die zellhaltige Aszitesflüssigkeit wurde etwa zehn Tage nach der Ü b e r i m p f u n g e n t n o m m e n und sofort in eisgekühlte isotone Kochsalzlösung gebracht. Die ATZ jeder einzelnen Maus wurden getrennt bei 150 g 3 min lang in der Kälte abzentrifugiert und 3mal u n t e r gleichen Bedingungen m i t eiskalter physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Anschließend wurden die Zellen vereinigt und m i t isotonem Tris-HCl-Puffer (pH 7,4) gewaschen und in diesem Puffer zu einem Zellvolumen von etwa 25% suspendiert. Der gewählte ¿>H-Wert liegt im ^ H - O p t i m u m der ATZ-Hexokinase ( M C C O M B und Y U S H O K [8]). Durch das beschriebene Vorgehen wurde jegliche Verklumpung während der Zellaufbereitung vermieden und ein Heparinisieren der Waschflüssigkeit umgangen. Der genaue Gehalt der Zellsuspension wurde in jedem einzelnen Versuchsansatz mit Hilfe der Mikrohaemotokrit-Methode in Doppelbestimmungen b e s t i m m t . 2. Messung

des

2-Desoxy-u-Glukose-Transportes

Zur Messung des Monosaccharidtransportes wurden die Zellsuspensionen in Doppelmantelgefäßen aerob mit einer Frequenz von etwa 100 Schwingungen/min geschüttelt. Die Gefäße wurden m i t Hilfe eines HÖPPLER-Thermostaten durchströmt, so d a ß die gewünschten T e m p e r a t u r e n zwischen 0 und 40 °C k o n s t a n t gehalten werden konnten. In einigen Versuchen wurde die Temperierung bei 0 °C durch I n k u b a t i o n in einem Eis-Wasser-Gemisch vorgenommen. Zur Sicherung der Aerobiose bei den relativ konzentrierten Zellsuspensionen wurde Sauerstoff in die Gefäße über die Oberfläche der Zellsuspension geblasen, so daß die Zellen m i t einer 100%igen Sauerstoffatmosphäre im Gleichgewicht standen. U m stationäre Bedingungen herzustellen, wurden die Zellen 15 min u n t e r endogenen Bedingungen vorinkubiert und der Versuch durch Zugabe entsprechend vortemperierter DOG-Lösung gestartet. Die DOG-Lösungen unterschiedlicher Konzentration wurden m i t NaCl jeweils auf Isotonie eingestellt. U m eine rasche und vollständige Durchmischung zu gewährleisten, wurde die DOG-Lösung mit Hilfe geeichter Injektionsspritzen kräftig in die Zellsuspension eingespritzt und der Ansatz kurzzeitig mit einer Frequenz von etwa 300 Schwingungen/min geschüttelt. Nach den gewählten Versuchszeiten wurden m i t einer schnell auslaufenden P i p e t t e (große Ausflußöffnung) jeweils 1,0 oder 2,0 ml abgenommen und rasch in Zentrifugengläser gegeben. Da bei 0 °C k a u m ein M e m b r a n t r a n s p o r t s t a t t f i n d e t T5], wurden die Zellsuspensionen zur H e m mung der Penetration in kürzestmöglicher Zeit auf 0 °C abgekühlt. Das wurde erreicht, indem sowohl die Pipette als auch die Zentrifugengläser m i t Hilfe einer MethanoiTrockeneis-Kältemischung so vorgekühlt wurden, daß die Zellsuspension in ihnen gerade nicht gefror. Die Zellen wurden sofort bei 20000 g 3 min bei 0 °C in der Kühlzentrifuge vom Medium abgetrennt. Das gesamte Verfahren von der E n t n a h m e der Zellsuspensionen aus dem Inkubationsgefäß bis zum Beginn der Zentrifugation dauerte 1

H e r r n Doz. Dr. habil. H. Überlassung des Stammes.

BIELKA,

Berlin, danken wir auch an dieser Stelle f ü r die

H . W . AUGUSTIN, K . L . NISSLER, E .

244

HOFMANN

im D u r c h s c h n i t t 11, höchstens 1 5 sec. U n t e r den beschriebenen Bedingungen wurde keine Zytolyse festgestellt (gemessen in F o r m von freigesetztem löslichem Protein). Der Ü b e r s t a n d wurde möglichst q u a n t i t a t i v abgegossen und die W a n d der Röhrchen mit Zellstoff von a n h a f t e n d e n Resten des Mediums befreit. Ü b e r s t a n d und Zellen wurden anschließend m i t 2,0 ml Trichloressigsäurelösung (LOG/LOOML) versetzt, gut gemischt und die Niederschläge durch Zentrifugation abgetrennt. Der klare Ü b e r s t a n d wurde f ü r die Bestimmungen (s. u.) eingesetzt. D a bei diesem Vorgehen noch Reste des Mediums im Zellsediment extrazellulär v o r h a n d e n sind, m u ß t e n die Meßwerte e n t sprechend korrigiert werden. 3. Bestimmung

des extrazellulären

Raumes

Hierzu wurde in jedem einzelnen Versuch der Raffinose-Verteilungsraum b e s t i m m t . Raffinose dringt nach C R A N K et al. [5] nicht in die Zellen ein u n d k a n n somit als Maß f ü r die im Zellsediment verbliebene extrazelluläre Flüssigkeit dienen. Bei jedem einzelnen Versuch wurde zu diesem Zweck ein Ansatz m i t g e f ü h r t , der anstelle von DOG isotone Raffinoselösung enthielt und der genauso b e h a n d e l t wurde wie die entsprechenden DOG-Werte. Aus der Verteilung der Raffinose im Ü b e r s t a n d und Sediment w u r d e der extrazelluläre R a u m im Sediment berechnet. Dieser schwankte zwischen 12 und 18%, er hing vor allem vom Zellgehalt der Suspension ab. 4.

Bestimmungen

In den E x t r a k t e n von Ü b e r s t a n d und Zellsediment wurde DOG und DOG-6-p nach der Methode von W A R A V D E K A R und S A S L A W [ 9 ] , wie von A U G U S T I N und H O F M A N N [ 1 0 ] ausführlich beschrieben, b e s t i m m t . Raffinose wurde als F r u k t o s e nach KOL; et al.[11 ] ermittelt, P r o t e i n m i t der Biuret-Methode [12]. Ergebnisse

1. Temperaturabhängigkeit

des

2-Desoxy-~D-Glukose-Eintrittes

a) T e m p e r a t u r a b h ä n g i g k e i t

des

Gesamteintrittes

Bei 38 °C t r i t t D O G mit h o h e r Geschwindigkeit in die ATZ ein. Wie aus A b b i l d u n g 1 ersichtlich ist, wird schon n a c h einer Minute ein s t a t i o n ä r e r Z u s t a n d erreicht. D e m g e g e n ü b e r sind bei 0 °C n u r geringe Mengen des Zuckers in den Zellen v o r h a n d e n u n d auch nach 30 min ist, wie schon von C R A N E et al. [5] beschrieben wurde, praktisch kein Zucker in den Zellen nachweisbar. D a s b e d e u t e t , d a ß bei 0 °C kein N e t t o t r a n s p o r t s t a t t f i n d e t . Dieses Verhalten stellt die G r u n d l a g e der f ü r die U n t e r s u c h u n g e n verwendeten Methode d a r . Zwischen 0° u n d 38 °C n i m m t die Geschwindigkeit des N e t t o t r a n s p o r t e s zu. I n den einzelnen T e m p e r a t u r b e r e i c h e n bestehen unterschiedliche Q 1 0 -Werte. Dies k o n n t e in verschiedenen Versuchen gezeigt werden. Die größte Z u n a h m e der Transportgeschwindigkeit war im T e m p e r a t u r i n t e r v a l l zwischen 0° u n d 10 °C zu beobachten (Q 1 0 -Werte bis 5 u n d mehr). I m T e m p e r a t u r i n t e r v a l l zwischen 10° u n d 20 °C b e t r a g e n die Qi 0 W e r t e e t w a 3, i m B e r e i c h von 20°—38 °C lagen die Q 1 0 -Werte f ü r d e n G e s a m t t r a n s p o r t noch niedriger. Genaue Aussagen über den letzteren T e m p e r a t u r bereich sind jedoch nicht möglich, d a wegen der hohen T r a n s p o r t g e s c h w i n digkeit bei diesen T e m p e r a t u r e n eine genaue Messung der Anfangsgeschwindigkeit nicht möglich ist.

A u f n a h m e u n d P h o s p h o r y l i e r u n g von 2-Desoxy-n-Glukose

245

Abb. 1. T e m p e r a t u r a b h ä n g i g k e i t des 2 - P e s o x v - D - G l u k o s e - E i n t r i t t s in Aszites-TumorZellen. ( G e s a m t t r a n s p o r t , S u m m e von freier 2-Desoxv-D-Glukose u n d 2-Desoxy-n-Glukose-6p h o s p h a t ) . — VersuchsbedInnungen: Siehe „ M a t e r i a l und M e t h o d e n " ; D O G - K o n z e n t r a t i o n : 1 0 m M o l / l Suspension. •

•

38 °C; O

O = 30 °C; • • = 20 °C; • A • = 0°C

• = 10 °C;

b) T e m p e r a t u r a b h ä n g i g k e i t d e s A u f t r e t e n s f r e i e r u n d phorylierter 2-Desoxy-D-Glukose

phos-

Nach dem Eintritt wird die zunächst in freier Form in den Zellen vorliegende DOG durch die Hexokinase zu D0G-6-p phosphoryliert. Wie Abbildung 2 zeigt, ist sowohl der Membrandurchtritt als auch die Phosphorylierungsreaktion temperaturabhängig. Der Q 10 -Wert für die Phosphorylierung setzt sich aus der Temperaturabhängigkeit der Hexokinase und der Temperaturabhängigkeit der ATP-regenerierenden Prozesse zusammen. Bei 0 °C ist nicht nur der Membrantransport, sondern auch die Phosphorylierungsreaktion praktisch vollständig unterdrückt. Der Q 10 -Wert für die D0G-6-pBildung ist im Temperaturbereich zwischen 0° und 10 °C höher als der zwischen 10° und 20 °C. Wie die Abbildung 2 zeigt, wird die Phosphorylierungsgeschwindigkeit zwischen 20° und 38 °C nur noch geringfügig erhöht. Bei Inkubationszeiten von einer Minute bei Temperaturen ab 20 °C werden jedoch keine Anfangsgeschwindigkeiten mehr gemessen. Interessant ist das Verhalten der freien DOG. Wie in Abbildung 2 ersichtlich, liegt nach einer Minute bis zu 20 °C praktisch keine freie DOG in den Zellen vor. Oberhalb 20 °C wird auch schon nach einer Minute freie DOG in den Zellen gefunden. Bis zu 20 °C übertrifft demnach die Phosphorylierungskapazität die Kapazität des Membrantransportes, oberhalb von 20 °C ist offensichtlich die Kapazität des Membrantransportes größer als die der Phosphorylierung, so daß schon nach kurzen Zeiten die Zellen mit freiem

246

H . W . AUGUSTIN, K . L . NISSLER, E .

HOFMANN

O'C I0X W'C WC" 38 X " "" OX ' WC " 20X " XX JSX t /[/»/«]

r 30\mm)

A b b . 2. T e m p e r a t u r a b h ä n g i g k e i t des A u f t r e t e n s freier u n d p h o s p h o r y l i e r t e r 2-DesoxyD-Glukose. — V e r s u c h s b e d i n g u n g e n : Siehe A b b i l d u n g 1. = freie D O G ; //// = DOG-6-p • = Gesamt-DOG;

Zucker angefüllt sind. Wie weiter unten beschrieben, tritt bei 38 °C bereits nach 30 sec ein Konzentrationsausgleich von freier DOG zwischen Zellen und Medium ein. Nach 30 min Inkubationszeit ist auch bei 10° und 20 °C freie DOG in den Zellen nachweisbar. 2. Verlauf der 2-Desoxy-n-Glukose-Aufnahme

und -Phosphorylierung bei 20 °C

Bei 20 °C wird, wie Abbildung 3 zeigt, etwa nach 5 min ein annähernd stationärer Zustand erreicht [7]. Wie schon unter 1 b beschrieben, begrenzt bei dieser Temperatur offensichtlich der Permeationsschritt die intrazelluläre Phosphorylierung der DOG. 3. Verteilung von 2-Desoxy-B-Glukose zwischen Zellen und Medium a) K o n z e n t r a t i o n s a u s g l e i c h d e r f r e i e n zwischen Zellen und Medium

2-Desoxy-D-Glukose

Die Zeit bis zum Erreichen des stationären Verteilungsstandes der freien DOG ist temperaturabhängig (Abb. 2 u. 3); bei 38 °C wird dieser Zustand (Tab. 1) schon nach sehr kurzer Zeit erreicht. Der Quotient (freie DOG intrazellulär: freie DOG extrazellulär) strebt dem Wert 1,0 zu. Aus den Daten läßt sich entnehmen, daß das Transportsystem für DOG bei ATZ den Ausgleichssystemen zuzuordnen ist, da kein Zuckertransport entgegen dem Konzentrationsgefälle erfolgt. Meist sind die Werte etwas geringer als der theoretische Wert von 1,0, selten höher. Aus den Zahlen leiten wir nicht ab, daß der intrazelluläre Verteilungsraum des freien Zuckers geringer als 100% ist.

A u f n a h m e und Phosphorylierung von 2-Desoxy-D-Glukose

247

Abb. 3. Verlauf der A u f n a h m e und Phosphorylierung von 2-Desoxy-D-Glukose bei 20 °C. — Versuchsbedingungen: Siehe „Material und M e t h o d e n " ; DOG-Konzentration 10 mMol/1. • • = Gesamt-DOG; • • = DOG-6-p; A • = freie DOG Tabelle l Verteilung der freien 2-Desoxy-D-Glukose zwischen Zellen und Medium bei verschiefreie DOG/ml intrazelluläres Wasser denen T e m pr e r a t u r e n . Angaben d e r O u o t i e n t e n von :—• ^ ^ ^ ,—v , t—r. freie DOG/ml Medium Temperatur

Versuchs-Nr.

10 °C

20 °C

38 °C

1 min

10 min

30 min

14 19 25

0,02 0,00 0,00

0,50 0,32 0,24

0,70 0,73 0,58

Mittelwert

0,01

0,39

0,68

19 21 22

0,08 0,10 0,06

0,74

0,82 0,67 0,97

Mittelwert

0,08

0,74

0,81

0,66 0,54 0,48 0,97 0,97 0,60

0,69 0,70 0,64 1,14 1,15 0,81

0,81 0,72 0,86

12 20 25 I II III

0,5 min

0,62

0,46

60 min

1,18 1,32 0,97

Mittelwert 0,80 0,54 0,70 0,86 1,15 D O G - K o n z e n t r a t i o n = 10mMol/l Suspension; f ü r die Berechnung der W e r t e auf intrazelluläres Wasser wurde ein durchschnittlicher Wassergehalt der Zellen von 80% zugrunde gelegt

248

H . W . AUGUSTIN, K . L . NISSLKK, E . HOFMANN

b) V e r t e i l u n g v o n 2 - D e s o x y - D - G l u k o s e - 6 - P h o s p h a t Zellen und Medium

zwischen

Das DOG-6-p liegt nur intrazellulär vor. Der extrazelluläre DOG-6-pSpiegel ist gegenüber der freien DOG zu vernachlässigen, so daß ohne großen Fehler die DOG im Medium mit freier DOG gleichgesetzt und mit der freien intrazellulären DOG verglichen werden kann. Aus den Zahlen der Tabelle 2 ergibt sich, daß die ATZ für DOG-6-p impermeabel sind. Außerdem Tabelle 2 2 - D e s o x y - D - G l u k o s e - 6 - P h o s p h a t - G e h a l t in d e n Zellen u n d i m M e d i u m D O G - K o n z e n t r a t i o n = l O m M o l / 1 S u s p e n s i o n ; T e m p e r a t u r = 20 °C DOG-6-p/ml intrazelluläres Wasser

l)OG-6-p/ml Medium

Versuchs-Nr.

1 min

10 m i n

60 m i n

1 min

10 m i n

60 m i n

I II III IV

6,4 6,2 4,3 5,6

7,3 8,8 5,8 7,2

5,7 12,0 8,5

0,03 0,04 0,09 0,05

0,14 0,10 0,07 0,09

0,11 0,16 0,36

—

—

zeigen diese Zahlen, daß während des Versuches keine nennenswerte Zytolyse der Zellen eintritt, die ja zu einer Freisetzung von DOG-6-p führen müßte. Dieser Test ist empfindlicher, als die Messung der Proteinfreisetzung. Nach Zusatz von ATP zu ATZ-Suspensionen wurde extrazellulär DOG-6-p gefunden. Das konnte auf die Hexokinaseaktivität zurückgeführt werden, welche durch geringfügige Zytolyse (weniger als 3%) der ATZ unter den Versuchsbedingungen freigesetzt wird. Anhaltspunkte für eine eventuell zu vermutende „Exo-Hexokinase" konnten nicht gefunden werden. Auch zur Suspension intakter Zellen zugesetzte Phosphatester verhielten sich stabil. 4. Konzentrationsabhängigkeit des

2-Desoxy-n-Glukose-Transportes

Zur näheren Charakterisierung des Transportsystems wurde die Aufnahmegeschwindigkeit der DOG bei unterschiedlichen extrazellulären Anfangskonzentrationen an DOG gemessen. Wie schon unter l b ausgeführt, ist bei 20 °C der Transportschritt durch die Membran für die weitere Umsetzung des Zuckers begrenzend. Dadurch können, wie Abbildung 4 zeigt, nach einer Minute die intrazellulären Konzentrationen der freien DOG gegenüber den extrazellulären Konzentrationen noch vernachlässigt werden. Nach den von W I L B R A N D T [ 1 3 ] , W I D D A S [ 1 4 ] und L E F E V R E [ 1 5 ] durchgeführten kinetischen Analysen des Zuckertransportes bei Erythrozyten muß beim Vorhandensein eines Carrier-Systems in diesem Falle eine Sättigungskinetik erwartet werden, die der MiCHAELis-MENTEN-Gleichung genügt. Bei der Auftragung nach LINEWEAVER und BURK (Abb. 5) ergibt sich eine Gerade, an der sich eine Maximalgeschwindigkeit des Transportes von 600 bis

A u f n a h m e u n d Phosphorylierung von 2-Desoxy-D-Glukose

249

700 mMol/1 Zellen • Std. ermitteln läßt; die Halbsättigungskonstante liegt im Durchschnitt bei 2,5 mMol/1. Dieser Wert liegt im gleichen Bereich wie die von CRANE et al. [5] für 3-Methylglykose und Galaktose angegebenen Werte. Diese Konstante ist als ein Maß für die Affinität des Transportsystems der Membran der ATZ gegenüber DOG anzusehen. Der DOGi

ju Mol/ml

Suspension

A b b . 4. A b h ä n g i g k e i t d e r G e s c h w i n d i g k e i t d e s A u f t r e t e n s v o n f r e i e r 2-Desoxy-DGlukose und 2-Desoxy-D-Glukose-6-phosphat von der 2-Desoxy-D-Glukose-Konzent r a t i o n i m M e d i u m . — V e r s u c h s b e d i n g u n g e n : I n k u b a t i o n s z e i t = 60 sec; T e m p e r a t u r = 20 °C. •

• = Gesamt-DOG; •

• = DOG-6-p; •

i ['mW'

A = freie D O G

/]

A b b . 5. T r a n s p o r t g e s c h w i n d i g k e i t in A b h ä n g i g k e i t v o n d e r 2-Desoxy-D-GlukoseK o n z e n t r a t i o n im M e d i u m . E x t r a p o l i e r t e A n f a n g s g e s c h w i n d i g k e i t des G e s a m t t r a n s p o r t e s (freie D O G + D O G - 6 - p ) . — V e r s u c h s b e d i n g u n g e n : wie in A b b i l d u n g 4

250

H . \V. A U G U S T I N ,

K.

L. NISSLKR, E .

HOFMANN-

bzw. Zuckertransport bei den A T Z ist somit nicht als einfacher Diffusionsvorgang, sondern als trägervermittelter Transportprozeß anzusehen. Die Kapazität ( F m a x ) des DOG-Transportes ist bei höheren Temperaturen größer als bei 20 °C. 5. Hemmbarkeit des

2-Desoxy-D-Glukose-Transportes

a) A n a e r o b e B e d i n g u n g e n , D N P u n d

DNFB

Anaerob bzw. nach Zusatz von K C N wird unter endogenen Bedingungen die Phosphorylierungsreaktion der D O G in den A T Z praktisch vollständig unterbunden. Die Ursachen für dieses Verhalten ist die starke Senkung des ATP-Spiegels unter anaeroben Bedingungen infolge Hemmung der unter endogenen Bedingungen nur oxidativ möglichen Resynthese [16], [17]. Wie Abbildung 6 zeigt, werden bei Anwesenheit von K C N nur sehr geringe Mengen DOG-6-p in den 0 I min 0.07 0.33 Zellen gebildet. Die insgesamt in die Zellen 0 1Omm 074 0.78 eingetretene DOG-Menge ist jedoch unter anaeroben Bedingungen wenig geringer als unter aeroben Bedingungen. D e r Gehalt an freier

A b b . 6. H e m m u n g d e r A n f a n g s g e s c h w i n d i g k e i t des 2-Desoxy-D-Glukose-Transportes durch Zyanid. Versuchsbedingungen: Inkubationszeit = 60sec; Temp e r a t u r = 2 0 °C.; S u s p e n s i o n 1 5 m i n m i t K C N ( 2 m M o l / l ) v o r i n k u b i e r t ; D O G - K o n z e n t r a t i o n = 10 m M o l / 1 . D i e Q u o t i e n t e n geben die Verteilung der freien D O G zwischen Zellen und Medium nach einer I n k u b a t i o n s z e i t v o n 1 m i n u n d 30 m i n w i e d e r . • unnp 'yaniil

mt

lynmtt

=

Gesamt-DOG; Q =

=

freie D O G ;

//// =

DOG-6-p.

freie D O G intraz./freie D O G extraz.

D O G liegt unter anaeroben Bedingungen nach einer Minute verständlicherweise wesentlich höher, als unter aeroben Bedingungen. Die beobachtete Hemmung des Gesamttransportes ist allein durch die Hemmung der DOG-6-p-Bildung zu erklären. Infolge der Phosphorylierungshemmung erniedrigt sich der die Penetrationsgeschwindigkeit des Zuckers bestimmende Konzentrationsgradient rasch, wie auch aus den in Abbildung 6 angegebenen Quotienten hervorgeht. Die Folge ist eine Yerlangsamung des Nettotransportes in die Zellen hinein. Das angegebene Experiment zeigt, daß der Membrantransport als solcher bei 20 °C durch KCN wahrscheinlich nicht gehemmt wird. Durch D N P wird die DOG-Aufnahme der A T Z vermindert. Wie Abbildung 7 zeigt, ist dabei die Phosphorylierung der D O G infolge der entkoppelnden Wirkung des D N P verringert, und es liegt mehr freie D O G in den Zellen vor

A u f n a h m e und Phosphorylierung von 2-Desoxv-D-Glukose

251

als in der Kontrolle. Die Wirkung des DNP auf den Gesamttransport ist folglich mit der Wirkung des KCN vergleichbar und gleichermaßen zu erklären. Das bedeutet, daß der Membrantransport durch DNP nicht primär beeinflußt wird. DNFB hemmt spezifisch den Zuckertransport bei verschiedenen Zellarten, insbesondere bei Erythrozyten [18]. Auch bei ATZ ist die Geschwindigkeit 15-

t 1 \min\

t 30 \wirf\

Abb. 7. Wirkung von 2,4-Dinitrophenol und 2,4-Dinitrofluorbenzol auf den 2-DesoxyD-Glukose-Transport. Versuchsbedingungen: Inkubationszeit = 1 min und 30 m i n ; T e m p e r a t u r = 20 °C; DOG-Konzentration = 10 mMol/1; Suspension 15 min mit 2,4-Dinitrophenol (1 mMol/1) bzw. 2,4-Dinitrofluorbenzol (1,7 Mol/1) vorinkubiert. • = G e s a m t - D O G ; = = freie DOG; //// = DOG-6-p. Herstellung der D N F B - L ö s u n g : 50 mg D N F B (Chemapol) wurden in 50 ml einer 12%igen Äthanollösung gelöst, die anschließend m i t NaCl isotonisch gemacht wurde. Im Versuchsansatz ergab sich eine Konzentration an Äthanol von 3,8%. Eine Kontrolle ergab, daß Äthanol in dieser Konzentration auf den DOG-Transport wirkungslos war. Die Lösung wurde vor jedem Versuch frisch bereitet

des Gesamttransportes gehemmt, jedoch konnte ein direkter Angriff auf das Transportsystem nicht nachgewiesen werden. Wahrscheinlich ist die Ursache dafür die kurze Vorinkubationszeit von 15 min, die nicht wesentlich erhöht werden kann, ohne daß es zu größeren Zerstörungen der Zellen kommt. 17

Acta biol. med. german., H e f t 3

252

H . W . AUGUSTIN, K . L . NISSLER, E . HOFMANN

b) G l u k o s e , G a l a k t o s e ,

Phlorizin

Um nähere Hinweise auf die Spezifität des Transportsystems zu erhalten, wurden die Wirkungen von Glukose und Galaktose auf den DOG-Transport gemessen. Abbildung 8 zeigt einen entsprechenden Versuch. Glukose hemmt den DOG-Eintritt in die ATZ fast vollständig (vgl. die Werte nach einer Minute). Nach 30 min ist freie DOG in den Zellen nachweisbar, jedoch

+ Glukose * Galaktose

+Glukose + Galaklose

t

r 30 [min]

l [min]

Abb. S. Einfluß von Galaktose und Glukose auf 2-l)esoxy-D-Glukose-Transport und -Phosphorylierung. Versuchsbedingungen: 20 °C; DOG-Konzentration = 10 mMol/1; Glukose bzw. Galaktose-Konzentrationen = 100mMol/l, isotone Bedingungen • = Gesamt-DOG; ^ = freie DOG; //// = DOG-6-p.

kein DOG-6-p. Die Erklärung für dieses Verhalten ist eine Hemmung sowohl des Transportschrittes als auch der Hexokinasereaktion. Dabei ist die Hemmung der Hexokinase größer als die des Transportschrittes. Galaktose hemmt den DOG-Eintritt ebenfalls. Im Gegensatz zu Glukose ist nach einer Minute die Phosphorylierung nur wenig gehemmt, freie DOG ist in den Zellen nicht nachweisbar. Galaktose konkurriert also vorwiegend oder ausschliei3lich auf dem Niveau des Membrantransportes mit der DOG. Dieser Befund befindet sich in Übereinstimmung mit den Angaben von NIRENBERG und HOGG [19], welche eine Hemmung des Glukoseverbrauches durch Galaktose in intakten Tumorzellen, nicht jedoch im Homogenat feststellen konnten. Phlorizin, welches nach CRANE et al. [5] ebenfalls den Zuckertransport der ATZ hemmt, verursachte in unseren Versuchen in einer Konzentration von 2 • 10~ 3 Mol/1 nach einer Vorinkubationszeit von 15 min eine nur gering-

A u f n a h m e u n d Phosphorylierung von 2-Desoxy-D-Glukose

253

fügige Hemmung des DOG-Transportes bei kurzen Versuchszeiten; bei längerer Inkubation mit DOG war eine Hemmung überhaupt nicht nachweisbar. Diskussion

I. Eigenschaften

des

Zuckertransportes

Aszites-Tumor-Zellen zeichnen sich im Vergleich zu anderen Zellen durch eine hohe Permeabilität gegenüber Monosacchariden aus; unter tierischen Geweben ist diese möglicherweise nur mit der Geschwindigkeit des Zuckertransportes menschlicher und foetaler Erythrozyten vergleichbar [20], [21]. Ob die große Transportkapazität gegenüber verschiedenen Monosacchariden eine Besonderheit von Tumorzellen darstellt, kann erst nach Untersuchung einer größeren Anzahl von Tumoren, insbesondere im Vergleich zu entsprechenden Normalge weben, gesagt werden. Der leichte Durchtritt des Zukkers in das Zellinnere ist eine Voraussetzung für den Stoffwechsel der ATZ bei den niedrigen Glukosekonzentrationen in vivo [22]. Der Zuckertransport der ATZ ist offensichtlich ebenso wie der der Erythrozyten kein aktiver Vorgang, da er zu keiner Konzentrierung des Zuckers in den Zellen gegenüber dem Medium führt und nicht primär durch Stoffwechselgifte wie KCN und D N P beeinflußt wird. Auf Grund der vorliegenden Ergebnisse kann in Übereinstimmung mit CRANE et al. [5] das monosaccharidtransportierende System der ATZ den Ausgleichsystemen zugeordnet werden. Demgegenüber sind die ATZ jedoch durchaus zu aktiven Transportleistungen befähigt, wie beispielsweise gegenüber Ionen [23], [24] und Aminosäuren [25]- Der Zuckertransport der ATZ ist jedoch kein einfacher Diffusionsvorgang durch Poren in der Membran, wie es auch von CRANE et al. [5] diskutiert wurde. Durch Verwendung einer optischen Methode, mit der die Schwellung der Zellen beim Zuckereintritt gemessen wird, kam KOLBER [26] auch zur Formulierung eines trägervermittelten Transportes. Für das Vorhandensein von spezifischen Transportsystemen sprechen 1. die Sättigungskinetik des Transportes [5], [26]; 2. die kompetitive Hemmbarkeit oder Nichthemmbarkeit verschiedener Zucker [5], [26] und 3. der von CIRILLO und YOUNG [6] beschriebene „Counter-flow". Bei sorbosebeladenen ATZ kommt es nach Glukosezusatz zu einem Sorboseaustritt in das Medium gegen das Konzentrationsgefälle. Der Membrantransport der DOG wäre somit als trägervermittelter, passiver Transportprozeß zu interpretieren. Die extrapolierte Transportkapazität der ATZ bei 38 °C beträgt bei Zugrundelegung eines Temperaturkoeffizienten von 2 zwischen 20° und 30 °C etwa 2,5 Mol/1 Zellen • Std. Der für 20 °C gemessene Wert liegt um das Doppelte bis Dreifache höher als die von CRANE et al. [5] angegebene Anfangsgeschwindigkeit der DOG-Penetration. Die Ursache für diese Unterschiede liegt darin, daß diese Autoren das DOG-6-p unberück17*

254

H. W.

AUGUSTIN, K . L . NISSLER, E .

HOFMANN

sichtigt ließen. Es ist anzunehmen, daß sowohl Glukose als auch Galaktose durch das gleiche Transportsystem wie die DOG in die Zelle gelangen. Auch hier besteht Übereinstimmung mit bisherigen Untersuchungen [5], [19]. Wahrscheinlich gehört auch Mannose [27] und Sorbose [6] zu dieser Gruppe [27]. Die Beurteilung dieser Zusammenhänge wird für die phosphorylierbaren Zucker dadurch erschwert, daß Hemmungen an der Hexokinase mit dem Transportprozeß interferieren. Dadurch sind sicherlich auch die Unterschiede zu den Angaben L E T N A N S K Y ' S [28] zu erklären, der offensichtlich nur die Hemmung an der Hexokinase erfaßt hat. I I . Beziehungen zwischen Membrantransport, Hexokinasereaktion und Glykolyserate Die Bildungsgeschwindigkeit von DOG-6-p in intakten ATZ wurde bei 38 °C zu 0,7 Mol/1 Zellen • Std. bestimmt [29]. Dieser Wert stimmt annähernd mit den Angaben von W u und R A C K E R [30] über die Maximalaktivität der Hexokinase im Homogenat überein. Kürzlich wurde von THOMITZEK [ 3 1 ] bei Verwendung einer pW -stat-Methode ein Wert für die Hexokinase intakter ATZ angegeben, der in der gleichen Größenordnung liegt. Aus diesen Ergebnissen muß man den Schluß ziehen, daß die Hexokinase in den intakten Zellen mit Maximalgeschwindigkeit zu arbeiten in der Lage ist. Die extrapolierte Transportkapazität von 2,5 Mol/1 Zellen • Std. Übertrift die Hexokinaseaktivität. Demnach spielt der Membrantransport bei 38 °C keine begrenzende Rolle für die DOG-Phosphorylierung bzw. Glukoseverbrauch der ATZ. Da die Hexokinase bei 38 °C in intakten Zellen die gleiche Affinität gegenüber DOG besitzt wie im Homogenat [32], wird der Glukoseverbrauch von ATZ wahrscheinlich auch bei niedrigen Glukosekonzentrationen [33] nicht durch die Permeabilität begrenzt. Bei niedrigen Temperaturen kann die Hexokinasereaktion durch den Transportschritt begrenzt werden. Bei 20 °C ist die Transportgeschwindigkeit kleiner als die Phosphorylierungskapazität der Zellen für DOG. Membrantransport und Phosphorylierungsreaktion zeichnen sich also durch unterschiedliche Temperaturabhängigkeiten aus, wobei der Q 10 -Wert für den Membrantransport offensichtlich größer ist als der Q 10 -Wert für die Phosphorylierung des Zuckers. Sowohl die Kapazität des Membrantransportes als auch die Hexokinase im Homogenat und in den intakten Zellen liegt um mehr als eine Größenordnung höher als die Glykolyserate der ATZ unter aeroben Bedingungen. Die Zügelung der Hexokinase bei der Glykolyse erfolgt demnach nicht durch das Angebot an Zucker, sondern mittels anderer Mechanismen, möglicherweise über Rückkopplungen [34]. Literatur Über den Stoffwechsel der Tumoren. Springer, Berlin 1 9 3 6 . A. C.: T h e Glycolysis a n d Respiration of Tumors. Academic Press, New York a n d London 1961. [3] H E S S , B . : Funktionelle u n d morphologische Organisation der Zelle. R o t t a c h Egern 1962. Springer-Verlag, Berlin-Göttingen-Heidelberg 1963. [1]

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Aufnahme und Phosphorylierung von 2-Desoxy-D-Glukose

255

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Summary H . W . A U G U S T I N , K . L . N I S S L E R , E . H O F M A N N and H . K R E S S M A N N : E n t r y and phosphorylation of 2-desoxy-D-glucose in E H R L I C H ' S ascites cells

E n t r y and phosphorylation of 2-desoxy-D-glucose into intact E H R L I C H ' S ascites cells was determined under various conditions. E n t r y into cells is highly temperaturedependent, it reveals saturation kinetics (half-saturation constant: 2,5 • 1 0 " 3 M ) with different 2-desoxy-D-glucose concentrations, and is inhibited in presence of other monosaccharides, as glucose or galactose. At 38 °C, free sugar reaches a concentration equilibrium between cells and medium within few seconds. Penetration of 2-desoxy-Dglucose into E H R L I C H ' S ascites cells can be regarded as a passive, carrier-mediated transport process. Cyanide and 2,4-dinitrophenol are inhibitory to 2-desoxy-D-glucose phosphorylation under endogenous conditions and do not exert any direct influence on the permeability step. At 20 °C, penetration through membrane limited further conversion of 2-desoxy-D-glucose by hexokinase reaction. At 38 °C, hexokinase reaction is not limited by membrane transport and may proceed at maximum activities.

256

H . W . AUGUSTIN, K . L . NISSLER, E .

HOFMANN

PCÍIIOMC

X. B. A y r y c T H i i , K. .11. H i i c c J i e p , 3. F o r m a n H F. K p c c c M a i i : Bxo,n H (J)OC(J)opHJiopoBanHC 2-;ie3üi;cH-;í-rJii0K03i)i n aeniiTiibix isjieTKax 3 p ¿ i i i x a OlipC,lCJIHJlHCr> BXOa II ({)OC(()OpiIJIHp 0) 1-H

in

3 H-I

"3 in 3 h-H

W

W

HH CS

0"

+

-H-H H ü o o CO 01 .. 3 (N co « ^ rt I t; o bc o > bo S a

1—1

0)

0

«

+

Q

++

XI ÖS bc 3 Men 1. YpeTan yMennmaeT conepwiaime rjiHKoreHa neienH 11 noBbiiuaeT coaepjKaiiHe c a x a p a b KpoBii y npbic. 2. cPepMeHTH r;iHHOreHOjiH3a ((J)oc({)opi«ia3a, $0C(J)orjiioK0MyTa3a, rjiioi;o3a6-Ke npw na i ic a.ipenojiHTHKa aiirHapoaproTaMHHa OTcyTdByeT neficTBHe ypeTana 11a cojiepHiaiiHe rjiHuoreiia, c a x a p a b KpoBH h oh3hmm imihkoreHOJiM3a. 4. B np0THB0ii0jiO/KHOCTi» k aapcna.iHHy, ypeTan necnocoGen k aKTHBiipoBaHHio MbiiueMHOii H-Wert und Organhomogenat bzw. Serum. Bei den Ansätzen zur E r m i t t l u n g der optischen Eigenschaften des Ni-Triglyzinkomplexes, die ohne Organhomogenat- bzw. Serumzugabe erfolgten, wurde das an 0,5 ml fehlende Volumen durch 0,2 ml H 2 0 ersetzt; besondere Inkubationszeiten wurden hier nicht eingehalten (s. Tab. 1 , 3 . 4 , 5, 6). Nach erfolgter Inkubation bei den enzymatischen Versuchen unter Zusatz von Organhomogenat bzw. Serum wurde 1,0 ml Methanol zugegeben. Bei Verwendung von Serum ist es ratsam, den Eiweißniederschlag abzuzentrifugieren und die Farbentwicklung mit einem entsprechenden Anteil

Quantitative Triglyzinbestimmung

265

des Ansatzes durchzuführen, da sonst der Serumleerwert relativ hohe Extinktionen ergibt. Zu den mit Methanol versetzten Ansätzen (1,5 ml) werden 0,5 ml 0,2 M NiCl2 und 0,5 ml 1 N NaOH gegeben. Die Konzentrationen sind somit: NaOH 0,2 N, NiCl2 0,04 M, Methanol 40%ig. Nach 30 min Stehen bei Zimmertemperatur unter mehrmaligem Umschütteln wird 10 min bei 2000 U zentrifugiert und der klare Überstand im Eppendorf-Photometer bei 436 nm in 1-cm-Küvetten gemessen. Die Messung kann bis zu 20 Std. nach Zentrifugieren und Dekantieren erfolgen, ohne daß es zu Änderungen der Extinktion kommt (s. Tab. 1). Tabelle 1 S t a b i l i t ä t des N i c k e l - B i u r e t - K o m p l e x e s gemessen nach 10 1 4 16 20

min Std. Std. Std. Std.

E.

E2

E,

E4

1,162 1,160 1,167 1,182 1,180

0,935 0,934 0,935 0,945 0,950

0,598 0,603 0,603 0,604 0,605

0,358 0,353 0,353 0,349 0,349

E j (E ä ; E 3 ; E 4 ) = E x t i n k t i o n e n f ü r 25 / 11m

Nierenhomogenat Leberhomogenat

1 :30 1: 6

540

0,004 0,028

11111

0,014 0,090

Tabelle 7 Vergleich der Kupfer- und der Nickel-Biuret-Methode bei der Auswertung der enzymatischenTriglyzin-Hydrolyse durch Serum, Rattennieren- und Rattenleberhomogenat Leberhomogenat

1 b

Inkubationsansatz 1 Eichwert 0 % Eichwert 5 % Eichwert 1 0 % Eichwert 2 0 % Eichwert 3 0 %

Hydr. Hydr. Hydr. Hydr. Hydr.

j a. b a ; a j a ia , a

Nierenhomogenat Cu-Biur.

Serum Cu-Biur. Ni-Biur. v'2 ein

% Hydr.

% Hydr.

% Hydr.

0,997 15,6 1,177 1,118 1,063 0,949 0,839

0,554

0,983 16,9

Cu-Biur. I,*'.» ein

Ni-Biur.

% Hydr.

% Hydr.

1,077

0,592 9,0 0,637 0,612 0,585 0,540 0,495

8,6

1,174 1,128

1,064 0,946 0,840

540 11111

I

15,8

0,630 0,607 0,582

0,533 0,490

1,172 1,108

1,060

0,947 0,835

540 um

%Hydr.

0,553 17,8

0,641 0.617 0,592 0,546 0,507

B e i 0 % Hydrolyse des 'Iriglyzins sind die Eichwertansätze in bezug auf das Substrat 0,025 M und enthalten bei 5, 10, 20 und 3 0 % Hydrolyse die errechneten, noch verbleibenden Triglyzinmengen. Den Eichwertansätzen für die Cu-Biuret-Methode mußten die der Triglyzinspaltung entsprechenden Mengen Glyzin und Diglyzin zugegeben werden. Zusammensetzung der Inkubationsansätze: 0,1 ml Triglyzin 0,125 M (im Ansatz: 0,025 M); 0,2 ml Veronalpuffer pH 7,9; 0,2 ml Homogenat bzw. Serum. Leberhomogenat = 84,7 /ig N/1 ml Ansatz, Nierenhomogenat 13,6 /ig N/1 ml Ansatz (nach LOWRY). Das verwendete Humanserum wurde 1 : 2 mit NaCl-Lösung verdünnt Die Inkubationsdauer für die Ansätze mit Homogenat betrug 1 Std. und mit Serum 4 Std. bei 38 °C. — 'Mittelwert aus 6 Inkubationsansätzen unter Verwendung des gleichen Homogenats bzw. Serums, gegen Wasser gemessen.

Quantitative Triglyzinbestimmung

269

4. Die Empfindlichkeit der Ni-Biuret-Methode ist gegenüber Triglyzin größer als die der Cu-Biuret-Methode: /d£J™'nm = 1 , 1 8 0 ; AEl™ = 0,386 [4] {AE = Extinktionsdifferenz gegen O-Wert; Werte für 0,025 M Triglyzin im Inkubationsansatz). Die Ni-Biuret-Methode eignet sich gut zur quantitativen Bestimmung der enzymatischen Triglyzin-Hydrolyse, wie die repräsentativen Beispiele unter Verwendung von Serum, Nieren- und Leberhomogenat bei Vergleich mit der Cu-Biuret-Methode zeigen (s. Tab. 7). Die Auswertung dieser Inkubationsansätze wurde mit der Cu-Biuret-Methode nach HASCHEN [4] vorgenommen : 0,5 ml Inkubationsansatz; 0,5 ml TCE-Methanol; 3,0 ml Boratlösung pH 9,0; 1,0 ml Cu-Phosphatsuspension, 30 min stehenlassen, 1 0 min bei 2000 U zentrifugieren und innerhalb von 2 Std. am Zeiß-Spektrophotometer bei 540 nm in 2-cm-Küvetten die Extinktion messen. Die Auswertung mit der Ni-Biuret-Methode geschah wie folgt: 0,5 ml Inkubationsansatz; 1,0 ml Methanol; 0,5 ml NiCl 2 0,2 M und 0,5 ml NaOH 1,0 N. Nach 30 min Stehen wurde 10 min bei 2000 U zentrifugiert und nach beliebiger Zeit (s. Seite 265) am Eppendorf-Photometer bei 436nm die Extinktion gemessen. Die prozentuale Spaltung der Inkubationsansätze wurde anhand von Eichkurven ermittelt. Die Eichwertansätze für die Auswertung mit der Ni-BiuretMethode enthielten berechnete Mengen Triglyzin, Puffer und — nach Zugabe von Methanol — dem Inkubationsansatz entsprechende Mengen an Homogenat bzw. Serum. Aus Tabelle 7 ist zu ersehen, daß sich die Eichkurven bei Verwendung von Serum, Nieren- und Leberhomogenat decken, so daß es möglich ist, zur Ermittlung der prozentualen Hydrolyse nur eine Eichkurve zu verwenden. Die Eichwertansätze für die Auswertung mit der Cu-Biuret-Methode enthielten nach den Angaben von LONDON et al. [2] außer den berechneten Mengen Triglyzin, Puffer und — nach Zugabe von TrichloressigsäureMethanol — Homogenat bzw. Serum auch noch die der prozentualen Hydrolyse des Triglyzins entsprechenden Mengen an Glyzin und Diglyzin. E s ergibt sich aus den Meßwerten (s. Tab. 7), daß bei Verwendung von Serum, Nierenund Leberhomogenat drei unterschiedliche Eichkurven resultieren, da die Cu-Biuret-Methode Eiweiß gegenüber empfindlicher ist als die Ni-BiuretMethode (s. Tab. 6). Literatur [1] J E S S E R E R , H . U. F . L I E B E N : B i o c h e m . Z. 2 9 7 , 3 6 9 ( 1 9 3 8 ) . 12] LONDON, M . ,

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18*

270

H . KIRSCHKE, H .

HANSON

Summary H . KIRSCHKE and H . HANSON: A method of determining the enzymatic degradation of triglycine b y means of its nickel complex A method of quantitative determination of the enzymatic triglycine hydrolysis using the triglycine-nickel-biuret complex is described. I t is more simple and less timeconsuming than the copper-biuret procedure. The products of hydrolysis, glycine and diglycine, do not influence this process and m a y be neglected in plotting the calibration curve. T h e method is relatively insensitive to protein and tris-buffer. T h e calibration curves used are linear throughout 0—100% hydrolysis. PeaioMC X . K n p u i K e H X . X a n c o n : Oiipejiejieime aH3HMaTiiiecKoro paciueiuieniiH TpiirjiMUHna iipii Mcii0iib30BaiiHH ero HHKejieBoro KOMiuieKca Mcuojii>3yH HHKejib-fwypeTOBbiii KOMnJienc TpiirJiHunna, aBTopw pa3pa6oTaJin MCTOJI KOJiimecTBeimoro onpe,;ejieiiHn yii3HMaTHiiecr;oro rnapojiM3a Tpni\niimina, itoTopwii Menee Tpy^OEMON, l ieM MejibOiiypeTOBbiH METO;(. IIpw ;>TOM npo;iyKTi.i rHJipOJlM3a - - I'JIHUHH H JUHMIHUHII -— lie MeiliaiOT II MX lie IiyjKHO yMHTIJBaTI. iipn cocTaBJieiiiiii i;ajiH6p0B0 l iH0H KpiiBOii. MeTo,i ^OBOJibHO iieMyBCTBHTejieii K Oejiny H Tpnc-6y({)epy. UpHMCiiHeMbie KaJiiif>p0B0>iiibie npiiBbie npox^HT ¿iHiiciiiio OT 0 «0 100% rH;(pOJIH3a.

Acta biol. med. german., B a n d 16, Seite 271—277 (1966) Aus d e m Physiologisch-chemischen I n s t i t u t der Karl-Marx-Universität Leipzig (Kommiss. D i r e k t o r : Doz. Dr. W . ROTZSCH)

Über die H e m m u n g der mitochondrialen NADH 2 -Oxidation durch D,L-Palmitoylkarnitin R . D A R G E L u n d E . STRACK

(Eingegangen am 6. 11. 1965)

Zusammenfassung D,L-Palmitoylkarnitin h e m m t die NADH 2 -Oxidation in Mitochondrienpartikeln aus R a t t e n h e r z . In Abhängigkeit von der Konzentration an Mitochondrienprotein v e r m a g Palmitoylkarnitin im Bereich von 10" 5 M die NADH 2 -Oxidation zu h e m m e n . R i n d e r s e r u m a l b u m i n k a n n die H e m m u n g a u f h e b e n , sofern es gleichzeitig m i t P a l m i t o y l k a r n i t i n oder vorher zum I n k u b a t i o n s a n s a t z gegeben wird, nicht jedoch, wenn Palmitoylkarnitin erst auf die Mitochondrien einwirken konnte. Der Wirkungsgrad des Serumalbumins ist mengenabhängig. B R E M E R [1] und auch wir [2] sahen, daß das stark oberflächenaktive Palmitoylkarnitin ( = CP) ähnlich wie die langkettigen, freien Fettsäuren die Mitochondrien schädigt. B R E M E R [1] konnte durch Serumalbumin die Zerstörung ihrer Struktur verhindern. Somit verhält sich CP ähnlich wie die Fettsäuren [3] —[9]. F R I T Z und Y U E [10] sowie B R E M E R [ 1 1 ] , [12] h a b e n sowohl in Mikrosomen als auch in Mitochondrien eine spezifische Azyltransferase gefunden, die langkettige Fettsäuren zwischen CoA und ( —)-Karnitin ü b e r t r ä g t u n d besonders die Palmitinsäure transportieren soll. Sie schrieben deshalb dem ( —)-Karnitin generell die F u n k t i o n eines F e t t säurekarriers zwischen extra- und intramitochondrialem R a u m zu. Das Palmitoylk a r n i t i n m ü ß t e somit ein physiologischer Stoff sein, der in den Mitochondrien in wägbarer Menge v o r k o m m t , und es wäre von Interesse, seinen E i n f l u ß auf einzelne F u n k tionsabläufe in den Mitochondrien zu prüfen.

In folgenden Ausführungen berichten wir, wie D,L-P a l m itoylkarnitin die Oxidation des reduzierten Nikotinsäureamid-Adenindinukleotid ( = NADH2) durch Mitochondrienpartikel des Rattenherzens beeinflußt. Methodik Die Herzmuskelmitochondrien wurden m i t geringfügigen, zweckdienlichen Abweichungen nach C L E L A X D und S L A T E R [13] p r ä p a r i e r t . Als Suspensionsmedium diente eine 0,25 M Saccharoselösung mit 5 • 10~3 M E D T A (pH 7,4). Nach einmaligem Waschen wurden die Mitochondrien im POTTER-ELVEHJEM-Homogenisator zerstört. Der P r ä p a r a t i o n folgte u n m i t t e l b a r der Versuch, der im allgemeinen m i t 50 /Jg Mitochondrienprotein ausgeführt wurde. 0,06 M K - P h o s p h a t p u f f e r (pH 7,4)

272

R . DARGEL, E .

STRACK

w u r d e als I n k u b a t i o n s m e d i u m v e r w a n d t ; das Gesamtvolumen b e t r u g 2 ml. Die A b n a h m e des N A D H 2 haben wir bei 334 n m a m Zeiss-Spektralphotometer gemessen. Die Versuchsanordnung wurde f r ü h e r eingehend beschrieben [141. Der S t a r t begann m i t der Zugabe der Mitochondrien; lediglich bei den Präinkubation sversuchen startet e n wir die R e a k t i o n mit der Zugabe von N A D H 2 . C P wurde als Chlorid v e r w a n d t . E s war ein selbst hergestelltes, reinstes P r ä p a r a t . Die anderen Substanzen waren käufliche H a n d e l s p r ä p a r a t e . Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt den Einfluß kleiner Mengen CP auf die NADH 2 -Oxidation der Mitochondrienpartikel. Bereits eine Konzentration von 9,2 • 10"® M hemmt um 27% gegenüber den Kontrollen. Mit zunehmender Konzentration an CP sinkt die NADH 2 -Oxidation, bis sie bei 4,6-10~ 5 M vollständig erloschen ist.

10 mm

Abb. 1. H e m m u n g der NADH 2 -Oxidation durch CP. 43 /ig Mitochondrienprotein/Ansatz. I = Kontrolle ohne C P ; I I = 9,2- « r 1 M C P ; I I I = 2,3 • l C r 5 M C P ; IV = 4,6 • 1 CT5 M C P

Die notwendige Konzentration, die eben noch deutlich hemmt, schwankte für die einzelnen Präparationen merklich. Aus Abbildung 2 geht hervor, daß die Hemmwirkung einer CP-Konzentration abnimmt, wenn man die Menge des zugegebenen Mitochondrienproteins steigert. Bei den meisten Ansätzen tritt die CP-bedingte Hemmung nicht sofort voll ein. Wir fanden vielmehr, daß die Hemmung allmählich zunimmt, bis sie meist nach etwa 2 min vollständig ausgebildet ist. Diese lag-Phase war besonders sichtbar bei CP-Kon•/. zentrationen, die zu 30—60% 100hemmten.

30 60 Mitochondrienprotein

90

120(jg

Abb. 2. E i n f l u ß von C P auf die N A D H 2 Oxidationsrate in Abhängigkeit von der Mitochondrienproteinmenge. C P = 1,4 • 10" 5 M; Kontrolle jeweils als 100% gesetzt

Mitochondriale N A D H 2 - O x i d a t i o n u n t e r P a l m i t o y l k a i n i t i n - W i r k u n g

273

Wurden die Mitochondrienpartikel zunächst mit CP in 0,06 M Phosphatpuffer 5 min bei 20 °C vorinkubiert und dann die Reaktion durch Zugabe von NADH 2 in Gang gebracht, so wurde die NADH 2 -Oxidation wesentlich stärker gehemmt als in Parallelversuchen mit gleicher Konzentration an Mitochondrienprotein und CP (Abb. 3). Vergleicht man die zeitgleichen Perioden nach der CP-Zugabe, so sind auch bei ihnen die Hemmwerte nach

A b b . 3. W i r k u n g von P r ä i n k u b a t i o n m i t C P u n d S u c c i n a t auf die m i t o c h o n d r i a l e N A D H 2 - O x i d a t i o n . 90 fig M i t o c h o n d r i e n p r o t e i n / A n s a t z . I = Kontrolle ohne CP; II = Kontrolle mit CP (1,4 • 1CT5 M;) I I I = 1,4 • 1(T 5 M C P + i r r 2 M Succinat, 5 m i n bei 22 °C p r ä i n k u b i e r t ; IV = 1,4 • 10" 5 M CP, 5 m i n bei 22 °C. p r ä i n k u b i e r t

5 min

Präinkubation größer. Gaben wir zu Beginn der Präinkubation mit CP Succinat (10~2 M) hinzu, wurde weniger deutlich gehemmt. In Abbildung 4 wurde vor Beginn der Messung zum Inkubationsansatz Serumalbumin zugegeben. Die Hemmung wurde abhängig von der Größe der Zugabe an Serumalbumin teilweise oder vollständig aufgehoben. Abbildung 5 zeigt den Einfluß von zugesetztem Serumalbumin zum Inkubationsmedium. Zusatz vor Zugabe der Mitochondrien beseitigte die Hemmung, nachträglicher Zusatz dagegen nicht. In dem dargestellten Versuch wurde das Serumalbumin 3 min nach Beginn der NADH 2 -Oxidation zugegeben. Auch bei zeitigerer Zugabe — frühestens 1 min nach Beginn haben wir geprüft — konnte die Hemmung nicht aufgehoben werden. In weiteren, gleichartigen Versuchen zeigte sich, daß Zugabe von CP nach Beginn der NADH 2 -Oxidation gleich stark hemmte, wie wenn es vor Beginn der Reaktion zugegeben wurde. Auch hier

A b b . 4. E i n f l u ß v o n S e r u m a l b u m i n auf die durch CP gehemmte NADH2-Oxidation. 42 /ig P r o t e i n / A n s a t z . C P - K o n z e n t r a t i o n f ü r K u r v e 2 bis 5 je 2,3 • lCT5 M. 1 = K o n t r o l l e ohne C P u n d S e r u m a l b u m i n ; I I = 2,5; I I I = 0,625; IV = 0,250 m g Serumalbumin/ml; V = ohne Serumalbumin

0

I

2

3

4

5

6

7

8 min

274

R . DARGEL, E .

STRACK

konnte durch gleichzeitige Zugabe von Serumalbumin die CP-Hemmung verhindert werden. Unter gleichzeitig verstehen wir, wenn Serumalbumin und CP zusammengegeben und als Gemisch sofort dem Ansatz zugefügt wird.

A b b . 5. E i n f l u ß v o n S e r u m a l b u m i n auf d i e H e m m u n g der NADH2-Oxidation durch CP.

0

I

2

3

i

S

6

7

8min

I = K o n t r o l l e o h n e C P ; I I = 1,4 • K T 5 M C P -f 5 m g S e r u m a l b u m i n / A n s a t z ; I I I •= 1,4 • 1(T 5 M C P ; b e i j Z u g a b e v o n 5 m g Serumalbumin

ATP beeinflußte den Hemmeffekt des CP nicht; a-Ketoglutarat (2 • 10~2 M) blieb gleichfalls ohne Einfluß auf die Hemmung der NADH 2 -Oxidation. Diskussion

Wenn CP als intrazellulärer [15] oder intramitochondrialer [16] Fettsäurekarrier in der Zelle vorkommt, kann es unseren Untersuchungen nach nur in kleinster Menge frei vorliegen, da höhere Konzentrationen an freiem CP Funktionsabläufe stören. FRIEDBERG und BRESSLER [17] fanden in funktionstüchtigen Ochsenherzmitochondrien nach Inkubation mit C 14 -Palmitat und Karnitin Mengen an Azylkarnitin, die größenordnungsmäßig unseren hemmenden CP-Konzentrationen gleichkamen. Man müßte also schließen, daß diese intramitochondrial synthetisierten Azylkarnitinmengen an bestimmtes Eiweiß gebunden sind und deshalb nicht stören. Ähnliche Überlegungen wurden bereits für die freien Fettsäuren angestellt [18], die in der intakten Zelle nicht die oxidative Phosphorylierung entkoppeln [9], [19] oder zur Schwellung [6], [20] und Stimulierung der latenten ATPase [5], [21] führen. Erst Alterung oder Zerstörung der Mitochondrien setzen störende Mengen von Fettsäuren frei [22]. Während die Azetylgruppe des (—)-Azetylkarnitins leicht von Mitochondrien über Azetyl-CoA veratmet werden kann [23], wodurch vermehrt Wasserstoff zur Atmungskette gelangt [14], schädigen die langkettigen Azylkarnitine in wesentlich geringeren Konzentrationen die Mitochondrien. Bereits 10~ 5 M CP hemmt die NADH 2 -Oxidation von Mitochondrienpartikeln aus Herzmuskel. Vergleicht man mit Befunden von NEGELEIN und Mitarbeitern [7], so ist der Wirkungsgrad des CP etwa gleich groß wie der der ungesättigten freien Fettsäuren, während die gesättigten wesentlich weniger aktiv sind. Serumzusätze verhindern den Einfluß von CP auf die Mitochondrienpartikel, indem das Karnitinderivat vom Albumin gebunden wird. Die Wirkungslosigkeit von Albumin auf die NADH 2 -Oxidation nach der Zugabe von CP

Mitochondriale NADH,-Oxidation unter Palmitoylkarnitin-Wirkung

275

scheint dann darauf zu beruhen, daß CP auch mit dem Protein von Mitochondrien-Fermenten eine Bindung eingeht, die durch Serumalbumin nicht mehr rückgängig gemacht werden kann. Bei freien Fettsäuren konnten N E G E L E I N und Mitarbeiter [7] dagegen zeigen, daß nachträgliche Zugabe von Serumalbumin zum Inkubationsmedium die ursprüngliche NADH 2 -Oxidationsrate wiederherstellt. Nach J A C K S O N und P A C E [24] vermag Serumalbumin während langdauernder Inkubationsversuche nur in ganz geringem Umfang in Mitochondrien zu permeieren. Nach B R E M E R [25] soll CP nur an die Oberfläche der Mitochondrien gebunden sein, wo es bereits mit CoA reagiert; dann wäre also diese Bindung von CP an Mitochondrienprotein so fest, daß Serumalbumin sie nicht mehr lösen kann. Könnte CP aber doch durch die Mitochondrienmembranen dringen, so wäre es dem später zugegebenen Albumin nicht mehr zugänglich. Auf Grund der bisherigen Befunde ist eine Entscheidung nicht möglich gewesen, ob CP in die Mitochondrien eindringt obwohl unser Befund dafür spricht. Obgleich CP auf die Schwellung der Mitochondrien und auf die ATPasen der Herzsarkosomen fettsäureähnlich wirkt [26], müssen wir berücksichtigen, daß es sich beim CP um eine Verbindung handelt, die invertseifenähnlich wirkt. CP hat als Betain sowohl Anion- als auch Kationcharakter. Nach B A K E R [27] hemmen die Invertseifen Atmung und Glykolyse in Bakterien, indem die positiv geladene Gruppe sich mit negativ geladenen Proteidionen verbindet [28]. Auch für CP wäre die Voraussetzung gegeben, derart mit mitochondrialem Eiweiß zu reagieren, aber seine Wirkungsweise als Betain mit dem kräftigen inneren Dipol ist sicherlich andersartig. Da CP bereits in sehr niedrigen Konzentrationen wirkt, könnte ihm ein physiologischer Hemmungsmechanismus durchaus zugeschrieben werden. B R E S S L E R und F R I E D B E R G [29] konnten bei Hemmung der Atmungskette durch KCN in Anwesenheit von ATP und Karnitin beobachten, daß zugefügtes C 14 -Palmitat einerseits vermindert oxidiert, andererseits vermehrt in die Phospholipide eingebaut wird. Somit bedeutet die Hemmung des Wasserstofftransportes, wie wir es beobachteten, ein Umschalten von oxidativen Prozessen auf Synthesevorgänge. In Vorversuchen fanden wir, daß kleine Konzentrationen an CP die Succinatoxidation hemmen. Somit könnte ein genügend hohes intramitochondriales Angebot an CP über die Atmungskette die Synthese der Fette beeinflussen. Ob das von uns beobachtete verzögerte Einsetzen des Hemmeffektes mit einer zunehmenden strukturellen Veränderung der Proteine durch CP zusammenhängt oder aus verzögerter Diffusion resultiert, läßt sich aus unseren bisherigen Befunden nicht entscheiden. W I E L A N D und Mitarbeiter [30] fanden für die Zitratsynthetase ähnliche Konformationsänderungen durch langkettige Azyl-Thioester des Koenzyms A, die durch Serumalbumin zu verhindern waren. Präinkubation der Mitochondrienpartikel mit CP führt zu einer stärkeren Hemmung durch das Azylkarnitin gegenüber nicht vorinkubierten Partikeln.

276

R . DARGEL, E .

STRACK

Die gleichzeitige Zugabe von Succinat mit CP vermindert möglicherweise durch die sofort einsetzende Atmung mit ihren energiereichen Zwischenprodukten die Hemmung. Andererseits kann das zugefügte NADH 2 den irreversiblen Verlust von Co-Faktoren vermindern, denn ein solcher Verlust soll nach A H M E D und S C H O L E F I E L D [ 9 ] bei den Fettsäuren die Wirkung auf die Atmung von Mitochondrien ausmachen. Obwohl CP auf die NADH 2 Oxidation, ATPasen und Struktur von Mitochondrien ähnlich wie Fettsäuren wirkt, scheint ihre Hemmwirkung jedoch eine noch ungeklärte Ursache zu haben. Hierüber, insbesondere über die Wirkung der optischen Isomeren des CP, stellen wir weitere Untersuchungen an. Literatur L1]

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339

Mitochondriale NADH 2 -Oxidation unter Palmitoylkarnitin-Wirkung

277

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Summary and E . S T R A C K : D,L palmitovlcarnitine

R . DARGEL

Inhibition

of mitochondrial

NADH.,

oxidation by

]>,L-palmitoylcarnitine is inhibiting the N A D H 2 oxidation in mitochondrial particles of the rat heart. Depending on the concentration of mitochondrial protein, palmitoylcarnitine can inhibit N A D H 2 oxidation in the region 1CT5M. Bovine serum albumin may cancel this inhibition, when given simultaneously with palmitoylcarnitine or when previously added to the incubation medium, it does not, however, when palmitoylcarnitine was previously allowed to act on mitochondria. The efficiency of serum albumin depends on the quantity applied. I'oaioMe flaprejii. H E . I l l T p a K TopMomeHiie MHTOxoHapnaJibHoro OKCHJICHHH P. N A D H 2 D.L-IiaJIMHTOHJIKapHHTHHOM ]),L-najIMHTOHJIKapHHTHH T0pM03HT OKHCJieHHe N A D H 2 B HaCTHUaX MHTOXOHapnii KpucHHoro cepaua. B 33BHCHMOCTH OT KonuenTpauHH MHTOxoimpHaJii>Horo f>e;iKa najiMHTOHJinapHHTHH MOHieT HHrHÖHpoBaTb OKHCJieHHe N A D H 2 B upeaejiax 10"5 M. CbiBopoTOHHMH ajii>6yMHH KpynHoro poraToro CKOTa MOHieT ycTpaHHTi. •)T0 TOpMOVKCIIHe, eCJIH OH BBOaHTCH OflHOBpeMeHIIO C IiaJIMHTOHJIKapHHTHHOM HJIH H>e aoöaBJiHCTCH 3apanee K HHKyßauHOHHOH cpe^e. Hpn npe^biaymeM B03aeiiCTBHH najlMHTOHJIKapHHTHHa Ha MHTOXOHapHH, TOpMOtfieHHe He HaRjIIOaaeTCH. OreneHb aeiicTBHH cbiBopoTOHHoro ajibßyMHiia 3aBHCiiT OT npiiMeHHeMoro KOJIH'lecTBa.

A c t a biol. med. german., B a n d 16, Seite 278 — 286 (1966) Aus dem Physiologisch-chemischen Institut der Friedrich-Schiller-Universität (Direktor: Prof. Dr. H. FRUNDER)

Jena

Chromatographie der Nukleinsäuren aus Leberzellkernen normaler Ratten an methylierten Albumin-Kieselgursäulen S. MICHEL, G . RICHTER, A . SCHADEBERG u n d H . WAGNER

(Eingegangen am 6. 11. 1965) Zusammenfassung Aus den isolierten Leberzellkernen werden mit der Phenol-Methode bei 0 °C und in Gegenwart von 0 , 4 % S D S D N S und R N S extrahiert. Nach dem angegebenen Verfahren der Chromatographie an MAK-Säulen gelingt es, eine scharfe Auftrennung der Kernnukleinsäuren zu erhalten. Dabei werden zwei Fraktionen gewonnen, die sowohl D N S als auch R N S enthalten. Außerdem werden noch drei R N S Fraktionen eluiert, die sich chromatographisch wie mikrosomale R N A verhalten. Die Basenzusammensetzung aller RNS-Fraktionen entspricht der der r - R N S . Der 3 2 P - E i n b a u in die R N S - F r a k t i o n e n der DNS-RNS-Gipfel ist größer als der 3 2 PEinbau in die r - R N S . B e i 65 °C lassen sich aus der Zwischenschicht der kalten Phenol-Extraktion nochmals geringe Mengen von DNS und R N S extrahieren. Der AU-Gehalt dieser R N S ist höher als der der r - R N S . Auch der 3 2 P - E i n b a u in diese R N S ist erhöht. E s wird diskutiert, daß die hochmarkierte R N S der 0 ° - E x t r a k t i o n ribosomale Vorstufen-RNS darstellt, während es sich bei der 6 5 ° - R N S um m - R N S handelt. Das Auftreten von zwei DNS-Fraktionen könnte auf die Heterogcnität der Leberzellpopulation zurückgeführt werden. D i e M A K - S ä u l e n v o n MANDELL u n d H E R S H E Y [1] s i n d in d e n l e t z t e n J a h r e n oft zur T r e n n u n g von R N S aus Mikroorganismen und Viren b e n u t z t worden. A u ß e r d e m w u r d e n sie m i t E r f o l g z u r S u b f r a k t i o n i e r u n g v o n tionen eingesetzt.

RNS-Präpara-

Die Chomatographie von Nukleinsäuren aus Säugerzellen

an M A K - S ä u l e n ist dagegen nur selten beschrieben worden. U r s a c h e hierfür sind offenbar Schwierigkeiten bei der Chromatographie von S ä u g e r - R N S an den M A K - S ä u l e n .

Zu erwähnen

ist i n s b e s o n d e r e die T a t s a c h e ,

daß

die

e i n z e l n e n R N S - F r a k t i o n e n s c h l e c h t v o n e i n a n d e r g e t r e n n t w e r d e n [2], [3], I n der vorliegenden A r b e i t wird ein V e r f a h r e n b e s c h r i e b e n , d a ß eine scharfe Auftrennung der Nukleinsäuren der Rattenleberzellkerne ermöglicht.

Eine

vorläufige Mitteilung über einen Teil der Ergebnisse erfolgte bereits früher

[4]Verwendete Abkürzungen: MAK-Säule = Säule aus methyliertem Albumin auf Kieselgur; S D S = Natrium-dodezylsulfat; DNS = Desoxyribonukleinsäure; R N S Ribonukleinsäure; m - R N S = Messenger-RNS; r - R N S = ribosomale R N S ; rspA — relative spezifische Aktivität; R Z = Rohrzucker

Chromatographie von Nukleinsäuren

279

Methodik V e r s u c h s t i e r e w a r e n w e i ß e R a t t e n eines I n z u c h t s t a m m e s v o n 140 b i s 200 g G e w i c h t . Sie w u r d e n m i t S t a n d a r d f u t t e r k u c h e n u n d W a s s e r a d l i b i t u m e r n ä h r t . B e i d e n M a r k i e r u n g s v e r s u c h e n e r h i e l t e n d i e R a t t e n 30 m i n v o r V e r s u c h s b e g i n n 1 m C N a 2 H 3 2 P 0 4 ( t r ä g e r f r e i ) i.p. i n j i z i e r t . D i e P r ä p a r a t i o n d e r L e b e r n e r f o l g t e i m K ü h l r a u m bei 0 — 2 °C u n t e r l e i c h t e r Ä t h e r n a r k o s e . Z u r D u r c h k ü h l u n g w u r d e n sie 5 m i n in g e r e i n i g t e m e i s k a l t e n R o h r z u c k e r [5] a u f b e w a h r t . Die v o m s i c h t b a r e n B i n d e g e w e b e b e f r e i t e n u n d g r o b z e r k l e i n e r t e n L e b e r n w u r d e n im R i l l e n h o m o g e n i s a t o r zweim a l 10 sec l a n g in e t w a 5 Vol. 0,25 M R Z h o m o g e n i s i e r t [6]. Dieses H o m o g e n a t w u r d e m i t 0,25 M R Z 1 v e r d ü n n t u n d durch eine vierfache Mullage filtriert. Die K e r n e w u r d e n 10 m i n l a n g b e i 800 g a b z e n t r i f u g i e r t . D e r K e r n n i e d e r s c h l a g w u r d e in 0,25 M R Z r e s u s p e n d i e r t , m i t 0,34 M R Z u n t e r s c h i c h t e t u n d e r n e u t 10 m i n l a n g b e i 800 g z e n t r i f u g i e r t . Die V e r u n r e i n i g u n g d e r so i s o l i e r t e n K e r n f r a k t i o n m i t M i t o c h o n d r i e n b e t r ä g t n o c h 9 % ( b e s t i m m t m i t H i l f e d e r S u k z i n a t d e h y d r o g e n a s e als m i t o c h o n d r i a l e s R e f e r e n z e n z y m [7]). Die K e r n e w u r d e n d a n a c h i m K ü h l r a u m in 0,05 M T r i s - H C l (pH 7,5) r e s u s p e n d i e r t ( K e r n e a u s e i n e r R a t t e n l e b e r in 25 ml), 2 % i g e S D S - L ö s u n g bis zu e i n e r E n d k o n z e n t r a t i o n v o n 0 , 4 % z u g e g e b e n u n d 2 bis 3 m i n k r ä f t i g g e s c h ü t t e l t . D a n a c h w u r d e 1 Vol. f r i s c h d e s t i l l i e r t e s w ä ß r i g e s P h e n o l z u g e g e b e n u n d w e i t e r e 5 bis 8 min geschüttelt. Phenolphase und wäßrige Phase wurden durch Zentrifugation bei 2500 g g e t r e n n t . Die P h e n o l p h a s e u n d d i e Z w i s c h e n s c h i c h t w u r d e n e i n m a l m i t 0,5 Vol. Tris-HCl mit 0,2% SDS ausgewaschen. Die vereinigten wäßrigen Phasen wurden 20 m i n b e i 4 0 0 0 0 ^ z e n t r i f u g i e r t , u m n o c h v o r h a n d e n e E i w e i ß r e s t e zu e n t f e r n e n . Z u m Ü b e r s t a n d w u r d e n 3 bis 4 T r o p f e n 2 0 % i g e s N a t r i u m a z e t a t z u g e g e b e n , u n d d i e N u k l e i n s ä u r e n w u r d e n d u r c h 3 Vol. Ä t h a n o l a u s g e f ä l l t . Die N u k l e i n s ä u r e n w u r d e n ü b e r N a c h t b e i —20 °C a u f b e w a h r t , d a n a c h a b z e n t r i f u g i e r t u n d m i t 0,1 M N a C l in 0,05 M P h o s p h a t p u f f e r (pH 6,7) gelöst. A n s c h l i e ß e n d w u r d e n d i e N u k l e i n s ä u r e n n o c h w e i t e r e zweimal umgefällt. Die C h r o m a t o g r a p h i e d e r b e i 0 °C e x t r a h i e r t e n N u k l e i n s ä u r e n e r f o l g t e a n M A K - S ä u l e n n a c h MAKDELL u n d HERSHEY [1] m i t f o l g e n d e n M o d i f i k a t i o n e n : W i r v e r w e n d e t e n a n s t e l l e v o n m e t h y l i e r t e m R i n d e r s e r u m a l b u m i n m e t h y l i e r t e s E i e r a l b u m i n u n d eluiert e n m i t d i s k o n t i n u i e r l i c h a n s t e i g e n d e r K o c h s a l z k o n z e n t r a t i o n v o n 0,1 — l M N a C l in 0,05 M P h o s p h a t p u f f e r b e i pH 6,7. D i e E l u t i o n e r f o l g t e m i t l e i c h t e m Ü b e r d r u c k b e i 25 °C, d i e D u r c h f l u ß g e s c h w i n d i g k e i t b e t r u g 20 m l / S t d . G e g e n E n d e d e r E l u t i o n n a h m d i e D u r c h f l u ß g e s c h w i n d i g k e i t l e i c h t zu. D i e N u k l e i n s ä u r e - F r a k t i o n e n eines G i p f e l s w u r d e n an S e p h a d e x G 5 0 e n t s a l z t u n d d a n a c h l y o p h i l i s i e r t . D i e R N S w u r d e 18 S t d . l a n g m i t 0,3 N K O H b e i 37 °C h y d r o l y s i e r t . Die A u f t r e n n u n g d e r 2 ' ( 3 ' ) - R i b o n u k l e o t i d e e r f o l g t e d u r c h H o c h s p a n n u n g s e l e k t r o p h o r e s e 90 m i n b e i 15 —20 m A u n d 1 — 2 k V . D i e D N S w u r d e m i t 7 0 % i g e r H C I O , 90 m i n i m k o c h e n d e n W a s s e r b a d h y d r o l y s i e r t u n d i h r e B a s e n d u r c h a u f s t e i g e n d e P a p i e r c h r o m a t o g r a p h i e m i t I s o p r o p a n o l - H C l - W a s s e r [8] g e t r e n n t . Z u r B e s t i m m u n g d e r R a d i o a k t i v i t ä t w u r d e n a l i q u o t e M e n g e n v o n N u k l e i n s ä u r e m a t e r i a l auf A l u m i n i u m s c h ä l c h e n a u f g e t r a g e n u n d d i e R a d i o a k t i v i t ä t d e r P r o b e n im M e t h a n d u r c h f l u ß z ä h l r o h r gemessen. I n e i n i g e n V e r s u c h e n w-urde d i e Z w i s c h e n s c h i c h t d e r P h e n o l e x t r a k t i o n in A n l e h n u n g a n GEORGIEV u n d MANTIEVA [9] w e i t e r a u f g e a r b e i t e t . Sie w u r d e z u n ä c h s t m i n d e s t e n s 3 m a l m i t 1 Vol. w ä ß r i g e m P h e n o l u n d 1 Vol. T r i s - P u f f e r m i t 0 , 2 % S D S 5 m i n bei 0 °C kräftig geschüttelt und danach zentrifugiert. Phenolschicht und wäßrige Phase wurd e n v e r w o r f e n . Die so g e r e i n i g t e Eiweißzw-ischenschicht w u r d e 15 m i n b e i 65 °C m i t w a s s e r g e s ä t t i g t e m P h e n o l ( p H 6,0) u n d 0 , 5 % S D S in 0,14 M N a C l (im V e r h ä l t n i s 1 : 1 ) g e s c h ü t t e l t . N a c h d e m A b z e n t r i f u g i e r e n w u r d e n die N u k l e i n s ä u r e n a u s d e r w ä ß rigen P h a s e m i t 3 Vol. d e s t i l l i e r t e m Ä t h a n o l a u s g e f ä l l t .

280

S. MICHEL,

G. RICHTER, A. SCHADEBERG, H .

WAGNER

Ergebnisse

In Abbildung 1 ist ein typisches Chromatogramm der Kernnukleinsäuren wiedergegeben. Es zeigt 6 UV-absorbierende Gipfel. Der erste Gipfel enthält Reste von Phenol und Eiweißen, Spuren von Mono- und Oligonukleotiden, die bei der Alkoholfällung der Nukleinsäuren mitgerissen werden, und Transfer-RNS. Gipfel I I und I I I enthalten sowohl DNS als auch R N S (I. DNS/RNS-Gipfel und I I . DNS/RNS-Gipfel). Die nachfolgenden Gipfel enthalten nur R N S (RNS I, R N S I I bzw. R N S I I I ) . Die R N S I, R N S I I und R N S I I I sind auf Grund ihres Elutionsverhaltens zumindest zum Großteil r - R N S . Ihre Position im MAK-Chromatogramm entsprechen denen der mikrosomalen R N S (s. Abb. 2). In einigen Versuchen konnte noch ein 4. Gipfel eluiert werden. Die RNS-Menge in diesem Gipfel war jedoch sehr gering. Dieser Gipfel wurde deshalb nicht weiter untersucht. 900

Abb. 1. MAK-Chromatogramm der Nukleinsäuren aus Rattenleberzellkernen. Zur Messung des 3 2 P-Einbaus wurden jeweils zwei 5 ml-Fraktionen vereinigt, 1 ml einer 0,2%igen Hefe-RNS als Träger-RNS zugegeben und die Nukleinsäuren durch 3 Vol. Äthanol ausgefällt. Die Nukleinsäuren wurden auf Rundfilter gesammelt, die Radioaktivität wurde im Methandurchflußzählrohr gemessen. = 32p_Einbau

E s gelang uns nicht, in allen Versuchen die auf die Säule gebrachten Nukleinsäuren vollständig zu eluieren. Dieser auf der Säule zurückbleibende Anteil betrug bis zu 2 0 % . E r konnte erst mit Alkali eluiert werden. Die prozentuale Verteilung der UV-Absorption auf die einzelnen Gipfel ist aus Tabelle 1 zu ersehen. Wegen des Vorkommens von Phenol und Eiweiß sowie von Mononukleotiden in Gipfel I wurde er bei der Berechnung nicht berücksichtigt. Die beiden DNS/RNS-Gipfel machen mit etwa 6 0 % den

281

Chromatographie von Nukleinsäuren

Abb. 2. MAK-Chromatogramm der mikrosomalen R N S aus Rattenleber. Die Mikrosomenfraktion wurde durch Differentialzentrifugation des MitochondrienÜberstandes (10min, bei 15000g) b e i 4 0 0 0 0 g und 9 0 m i n gewonnen. Die R N S wurde aus den Mikrosomen nach Vorbehandlung mit 0,4% SDS nach der Phenol-Methode bei 0 °C extrahiert (siehe auch Methodik) H a u p t t e i l der g e s a m t e n U V - A b s o r p t i o n aus. D e r erste D N S / R N S - G i p f e l e n t h ä l t d e u t l i c h w e n i g e r N u k l e i n s ä u r e n als d e r z w e i t e . D a s V e r h ä l t n i s D N S u n d R N S ist in b e i d e n G i p f e l n gleich u n d b e t r ä g t e t w a 3 :2. D i e r e s t l i c h e n 4 0 % des U V - a b s o r b i e r e n d e n M a t e r i a l s v e r t e i l e n sich e t w a g l e i c h m ä ß i g a u f die n a c h f o l g e n d e n drei R N S - F r a k t i o n e n . D a s Elutionsprofil der 3 2 P - M a r k i e r u n g geht dem Profil der U V - A b s o r p t i o n p a r a l l e l . A u f f ä l l i g ist, d a ß die M a r k i e r u n g d e r D N S / R N S - G i p f e l f a s t e b e n s o Tabelle 1 Verteilung der Extinktion bei 260 nm auf die einzelnen Gipfel im MAK-Chromatogramm der Kernnukleinsäuren in % der Gesamtextinktion und der prozentuale Anteil von DNS und R N S in den DNS/RNS-Gipfeln (Mittelwerte ± s, Zahl der Versuche in Klammern) Extinktionsverteilung bei 260 nm I. DNS/RNSGipfel I I . DNS/RNSGipfel RNS I RNS II RNS III

DNS RNS DNS RNS

25,9 ± 9,9 (10) 36,0 ± 8,6 (10) 10,7 ± 4,3 (10) 15,5 ± 6,7 (10) 12,0 ± 4,4 (10)

Anteil von DNS und R N S in den DNS/RNS-Gipfeln 60,6 38,3 57,3 36,2

± ± ± +

3,3 7,0 9,8 5,6

(4) (4) (3) (3)

282

S. MICHEL, G. RICHTER, A. SCHADEBERG, H .

WAGNER

groß ist wie die Markierung der RNS-Gipfel. Um zu klären, ob die R N S der DNS-enthaltenden Gipfel eine spezifische, an die DNS gebundene R N S darstellt und für diese relativ hohe Markierung der DNS/RNS-Gipfel verantwortlich ist, wurde das Ausmaß des 3 2 P-Einbaus in die DNS und R N S getrennt untersucht. In Tabelle 2 ist die rspA der einzelnen Fraktionen Tabelle 2 rspA der einzelnen Nukleinsäurefraktionen des MAK-Chromatogramms der Kernnukleinsäuren normaler Rattenlebern (Mittelwerte ± s, Zahl der Versuche in Klammern) rspA =

spezifische Aktivität der betreffenden Nukleinsäure spezifische Aktivität der DNS des I I . D N S / R N S - G i p f e l s rspA I. D N S / R N S - G i p f e l

II. DNS/RNS-Gipfel RNS I RNS II RNS III

DNS RNS DNS RNS

! ! | 1

j |

1,4 ± 0,7 31,2 ± 5,4 1,0 18,9 ± 4,8 5,6 d- 1,7 10.8 + 3,0 11,1 ± 4 , 9

(4) (4) (3) (5) (5) (4)

wiedergegeben. Es zeigt sich, daß die rspA der R N S des I. DNS/RNS-Gipfels 3 mal und die rspA der R N S des I I . DNS/RNS-Gipfels etwa 2mal größer ist als die rspA der letzten beiden RNS-Fraktionen. Daraus ist zunächst zu schließen, daß es sich bei der R N S der DNS/RNS-Gipfel um eine R N S mit hoher Umsatzrate handelt. Es ist jedoch denkbar, daß die hohe rspA dieser R N S dadurch vorgetäuscht wird, daß anorganisches Phosphat oder Pyrophosphat an die DNS gebunden ist, bei der Alkalihydrolyse freigesetzt wird und zusammen mit den 2'(3')-Rit>onukleotiden aus R N S im Hydrolysat erscheint. Um diese Möglichkeit zu überprüfen und ausschließen zu können, wurde im Alkalihydrolysat eine Phosphatfällung mit dem Magnesium-ZitratReagenz nach MATHISOX [10] durchgeführt. Dabei ergibt sich, daß nur 2 8 % der 3 2 P-Aktivität bei der Fällung im Phosphatniederschlag erscheint. Dieser Wert ist außerdem sicher noch zu hoch, denn es werden bei der Phosphatfällung auch Mononukleotide mitgerissen [11], [12]. Dieser Befund spricht dafür, daß die R N S der DNS/RNS-Gipfel eine Nukleinsäure mit hoher Umsatzrate ist und nicht R N S darstellt, die zufällig mit der DNS zusammen von der MAK-Säule eluiert wird. Zur weiteren Charakterisierung dieser R N S wurde ihre Basenzusammensetzung bestimmt. Wie aus Tabelle 3 zu ersehen ist, bestehen zwischen den Basenzusammensetzungen der einzelnen RNS-Fraktionen keine wesentlichen Unterschiede. Die R N S der beiden DNS/RNS-Gipfel haben also die gleiche Zusammensetzung wie die r - R N S . Auch die Basenzusammensetzung der beiden DNS-Fraktionen zeigt keine signifikanten Unterschiede. Daraus

Chromatographie von Nukleinsäuren

Da uns im MAK-Chromatogramm der Kernnukleinsäuren der Nachweis von m-RNS nicht gelang, war anzunehmen, daß diese m-RNS auch nach SDS-Vorbehandlung der Kerne nicht bei 0 °C mit der Phenol-Methode extrahiert werden kann. Es wurde deswegen die Zwischenschicht der kalten Phenolextraktion in Anlehnung an GEORGIEV und M A N T I E V A [9] bei 65 °C nachextrahiert (s. Methodik). Es gelingt dabei, noch geringe Mengen — etwa 5 — 10% der gesamten Nukleinsäuren der Leberzellkerne — an DNS und RNS zu erhalten. Wie aus Tabelle 4 zu ersehen ist, beträgt das Verhältnis DNS zu RNS etwa 4:1. Die 65 °CDNS unterscheidet sich in der Basenzusammensetzung und in der rspA nicht von den beiden bei 0 °C extrahierten DNS-Fraktionen. Die Basenzusammensetzung der 65°-RNS weicht dagegen deutlich von der Zusammensetzung aller bei 0 °C extrahierten RNS-Fraktionen ab. Ihr AU-Gehalt ist wesentlich größer. Auch die rspA der 65°-RNS ist wesentlich höher als die aller anderen Fraktionen. Diese hohe Umsatzgeschwindigkeit der 65°-RNS zusammen mit ihrem hohen AU-Gehalt weisen darauf hin, daß es sich hierbei um m-RNS handeln könnte. 19 Acta biol. med. german., Heft 3

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RNS I RNS II RNS III

ist zunächst zu schließen, daß es sich bei der stark markierten RNS derDNS/RNS-Gipfel offenbar nicht um m-RNS handeln kann, denn die Basenzusammensetzung der m-RNS weicht beträchtlich von der der r-RNS ab. Es liegt deshalb die Vermutung nahe, daß es sich bei dieser stoffwechselaktiven RNS um ribosomale Vorstufen-RNS handelt [13].

283

-O £ti N r-i OH

284

S . MICHEL, G . RICHTER, A . SCHADEBERG, H . WAGNER

Tabelle 4 Prozentualer Anteil von D N S und R N S in der 65 "-Fraktion, rspA und molares Basenverhältnis der 65 ^Nukleinsäuren (Mittelwerte ± s, Zahl der Versuche in Klammern) DNS Prozentualer Anteil von D N S und R N S rspA

79,3

(2)

0,95 (2)

Molares Basenverhältnis

C A G U (T)

A_+ G

UJT) • C

21,6 28,4 22.1 28.2 1,29

RNS

(2) (2) (2) (2)

20,7 1

; | I :

105

(2) ±

24,7 (14)

± ± ± ±

0,59 (13) 0,56(13) 1,36(13) 1,30 (13)

24,1 24,9 27,6 23,5 0,94

Diskussion

Bei der Chromatographie der Kernnukleinsäuren aus der Rattenleber an MAK-Säulen werden 2 DNS enthaltende Gipfel gewonnen. Das Vorkommen von zwei chromatographisch unterschiedlichen DNS-Fraktionen war zunächst unerwartet, da allgemein angenommen wird, daß die DNS eines Gewebes homogen ist. In neuerer Zeit ist allerdings das Vorkommen von zwei unterschiedlichen DNS-Fraktionen in der Zelle beschrieben worden. Dabei soll im Zellkern neben der chromosomalen DNS, die den Hauptteil ausmacht, noch eine mengenmäßig kleinere DNS-Fraktion vorkommen, die in das paranukleoläre Chromatin lokalisiert wird. Diese unterscheidet sich in der Basenzusammensetzung ( A + T / G + C nahe 1) [14]) und in der Stoffwechselaktivität [15] von der Chromatin-DNS. Die von uns gefundenen DNS-Fraktionen unterscheiden sich jedoch weder in ihrer Basenzusammensetzung noch in ihrer Stoffwechselaktivität. Außerdem sind beide DNSGipfel etwa gleich groß. Infolgedessen ist es unwahrscheinlich, daß die beiden DNS-Fraktionen unterschiedliche zelluläre DNS representieren. Eine Erklärungsmöglichkeit für das Vorkommen von 2 DNS-Fraktionen ist die Heterogenität der Leberzellpopulation. Parenchymzellen machen etwa 6 0 % der gesamten Leberzellpopulation aus, KuPFFERsche Sternzellen etwa 3 3 % , und die restlichen 7 % sind Gallengangs-, Bindegewebs- und Blutgefäßzellen [16]. Das Verhältnis von Parenchymzellen zu mesenchymalen Zellen entspricht etwa dem Verhältnis der DNS in beiden Fraktionen. E s ist deshalb denkbar, daß die eine DNS-Fraktion den Parenchymzellen und die andere den Zellen des retikulo-endothelialen System zuzuordnen ist. Die DNS, die erst bei 65 °C aus der Zwischenschicht in die wäßrige Phase freigesetzt wird, unterscheidet sich in ihrer Basenzusammensetzung und in ihrer Stoffwechselaktivität nicht von der DNS, die bei 0 °C extrahiert wird.

Chromatographie von Nukleinsäuren

285

Die Unterschiede in der Extrahierbarkeit können deshalb nur auf eine unterschiedliche Organisation oder Lokalisation der DNS im Zellkern zurückgeführt werden. Nähere Auskunft darüber erlauben die vorliegenden Versuche jedoch nicht. Die RNS, die zusammen mit der DNS von der MAK-Säule eluiert werden, unterscheiden sich in ihrer Stoffwechselaktivität deutlich von der r-RNS. Der Einbau von 32 P ist etwa 2- bis 3mal größer. Infolgedessen ist auszuschließen, daß es sich hierbei um RNS handelt, die zufällig zusammen mit der DNS von der MAK-Säule eluiert wird. Das Vorkommen von RNS mit hoher Umsatzgeschwindigkeit zusammen mit DNS im MAK-Chromatogramm in Form von DNS-RNS-Komplexen ist neuerdings beschrieben worden [15], [16]. Unsere Befunde erlauben ebenfalls eine solche Deutung. Im Gegensatz zu R I C H T E R und S E N G E R [17] finden wir, daß die Basenzusammensetzung dieser RNS im Vergleich zur r-RNS unverändert ist. Wir halten es für unwahrscheinlich, daß wir zusammen mit der hochmarkierten RNS auch r-RNS mit geringerer Umsatzrate von der MAK-Säule eluieren. Wir konnten nämlich zeigen, daß bei der Chromatographie von mikrosomaler RNS an den Positionen der DNS/RNS-Gipfel keinerlei UV-absorbierendes Material eluiert wird. Offenbar handelt es sich bei den stoffwechselaktiven RNSFraktionen nicht um m-RNS, denn für m-RNS wird eine Basenzusammensetzung angegeben, die in Richtung der DNS-Basenzusammensetzung verschoben ist [18]. Auf Grund der Basenzusammensetzung, die der r-RNS entspricht, und auf Grund der hohen Umsatzgeschwindigkeit ist es denkbar, daß die RNS der DNS/RNS-Gipfel ribosomale Vorstufen-RNS darstellt. Die stoffwechselaktive RNS, die erst bei 65 °C aus der Eiweißzwischenschicht extrahiert werden kann, hat eine Basenzusammensetzung, wie sie für m-RNS angegeben wird [18]. Es handelt sich hierbei offenbar um m-RNS. Fräulein C. M O H R d a n k e n wir sehr f ü r ihre umsichtige u n d einsatzfreudige Mitarbeit bei der D u r c h f ü h r u n g der Versuche. Literatur [1] M A X D E L L , J . D .

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19*

286

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Summary S. MICHEL,

G . RICHTER,

A . SCHADEBERG

and

H . WAGNER:

Chromatographie

analysis of nucleic acids of n o r m a l r a t s on m e t h y l a t e d albumin-kieselgur columns D N A and R N A are e x t r a c t e d f r o m isolated liver cell nuclei a t 0 °C and in presence of 0,4 per cent of SDS using t h e phenol m e t h o d . The described chromatographic m e t h o d on MAK columns p e r m i t s a s h a r p separation of t h e nucleic acids. Two fractions were obtained t h a t contain b o t h D N A and R N A . Three f u r t h e r R N A fractions were eluted which showed t h e same chromatographic behaviour as microsomal R N A . The base composition of all R N A fractions corresponds t o t h a t of r - R N A . P-32 incorporation into R N A fractions of t h e D N A - R N A peaks is higher t h a n P-32 incorporation i n t o r - R N A . At 65° C, small quantities of DNA and RNA, f u r t h e r m o r e , can be extracted f r o m t h e i n t e r m e d i a t e layer of t h e cold phenol extraction. AU content of this R N A is higher t h a n t h a t of r - R N A . P-32 incorporation into t h i s R N A is increasep, too. I t is suggested t h a t t h e highly labelled R N A of t h e 0° extraction represents ribosomal precursor RNA, whereas t h e 65° R N A m u s t be messenger R N A . T h e occurence of two D N A fractions might be connected with t h e heterogeneity of t h e liver cell population. PeaioMC

3.

M H X C J I I . , r . P n x T e p , A. U l a . i c d e p r H I \ B a n i e p : XpoMaTorpa(j)HH HyKJICMIIOBblX KMCJIOT H3 JUep lieHCIIOHIIblX KJICTOK IIOpMaJIbllblX i;pbic 11a MeTHjiHpoBaiiiibix aJn>f>yMHii-KH3ejii>rypiiMX Kojioiinax (I>enojn»iiLiM MCTO.IOM :)KCTparMpoBaJiHd> JI.HK H P H K 113 H30Jinp0Bamn,ix n;iep KjieTOK neueiiH upw TCMiiepaType 0 ° H B npiicyTCTBHH 0 , 4 % ;io;ieuiiJicyjii.(J)aTa iiaTpHH. Viia3anni>iii xpoMaToi'paf>yMHii-KH3ejibrypiibix i;ojiom;ax. IIpw OTOM aBTopaMH n o j i y i e i i o 2 ([ipaKumi, coaepn-iaiwie h J I . H K h P H K . Kpomc Toro ojnoiipyioTCH eme Tpn (JipaHUHii P H K , HOTopwe noKasbiBaioT TO caMoe xpoMaToi-paimecKoe noBe;ienne, iia>i P H K . IUCJIO'Iiibiii cocTan BCCX pai;nnn P H K IIHI;OB J I H K h P H K ilo;u,iiie, TV P H K TaK>Ke noBbiiiieiio. l[pe;uiojiaraeTC!i, eppH0ijcaMHH0B0r0 (Desferrioxamin B ) h N a 2 - E D T A - T e c T a npw jiaTeiiTHOH (J)opMe nepBHiiioro Hj(HoiiaTHHeci;oro reM0xp0MaT03a OGCVHI.iaeTCH 3na'ienne AE3HiieTHMeci\He HCCJIC^OBaHHH, Tan n a n OH OMeBH/lHO He I I 0 3 B 0 J T H e T H 3 M e p e H H e r O T O B I I O C T H K OTJIO/KeilHM) > K e j i e 3 a . B B H a y i i e f i o j i b i n o r o MHCJICIIHOI O MaTepnajia, p e 3 y j i b T a T b i Na 2 -EDTA-TecTa n o i ; a lie ;u>nyci;aioT n a . i e m i i b i x BbiBo;;oB.

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3iiaMeiiHH.

Acta biol. med. german., B a n d 16, Seite 309 — 312 (1966) Aus d e m Pharmakologischen I n s t i t u t der Medizinischen Akademie Magdeburg (Direktor: Prof. Dr. med. habil. H . M A T T H I E S )

Digitaliswirkung und Noradrenalin \Y. FÖRSTER, V. RÖSLER u n d K .

GRADE

(Eingegangen am 11. 10. 1965)

Zusammenfassung N a c h hohen Dosen von g-Strophanthin, Digitoxigenin und Digitoxin und Einwirkungszeiten bis zu 4 Std., k a m es im Herzen und Gehirn von R a t t e n und Meerschweinchen zu keinen Veränderungen im Noradrenalingehalt, die über Zufallsabweichungen hinausgingen. Auch die depletierende Reserpinwirkung wurde durch vorherige Digitoxingabe nicht beeinflußt.

In mehreren Veröffentlichungen wird nachgewiesen, daß eine Reserpinvorbehandlung [1] —[7] oder die Gabe von /^-Rezeptorenblockern [3], [8] bis [11] den Digitaliseffekt in vivo u n d in vitro abschwächen. Unter Berücksichtigung des hohen Katecholamingehaltes des Herzens [12] — [15] erhebt sich die naheliegende Frage, ob die positiv inotrope Digitaliswirkung eventuell mit einer Freisetzung von Katecholaminen im Zusammenhang stehen könnte. Wir p r ü f t e n daher den Einfluß von subtoxischen Dosen von g-Strophanthin, Digitoxigenin und Digitoxin auf den Noradrenalingehalt des Herzens und Gehirns von R a t t e n u n d Meerschweinchen. Methodik F ü r die Untersuchungen verwendeten wir weibliche R a t t e n im Gewicht von 120— 170 g und weibliche Meerschweinchen im Gewicht von 250— 500 g. g-Strophanthin wurde R a t t e n in einer Dosis von 100 mg/kg, Digitoxigenin in Dosen von 3 — 5 mg/kg, Digitoxin den Meerschweinchen in einer Dosis von 3—5 mg/kg injiziert. U m eine teilweise Amindepletion zu erzielen, verabreichten wir 2 u n d 3 m g / k g Reserpin 1 Std. nach Digitoxin und 3 Std. vor d e m T ö t e n der Tiere. Alle Substanzen wurden i.p. gegeben. Der Noradrenalingehalt im Herzen und Gehirn der Tiere wurde nach einer modifiziert e n Methode n a c h A N T O N u n d S A V R E [ 1 6 ] u n d C O H E N u n d G O L D E N B E R G [ 1 7 ] spektrofluorometrisch b e s t i m m t . Die A u f a r b e i t u n g der Gewebeproben bis zum perchlorsauren E l u a t des Aluminiumoxids erfolgte nach den Angaben von A N T O N u n d S A Y R E . Die Oxidation, Messung u n d Berechnung der P r o b e n geschah nach C O H E N und G O L DENBERG, wobei wir jedoch das Oxidationsmittel — Kaliumferrizyanid — und die alkalische Askorbinatlösung zum A b s t o p p e n der Oxidation nach A N T O N und S A Y R E ü b e r n a h m e n . Die Messung, bei der auch das Adrenalin berechnet werden kann, erfolgte bei den Aktivierungswellenlängen 400 bzw. 436 n m und den Fluoreszenzwellenlängen 510 und 525 n m . Eine ausführliche Darstellung der B e s t i m m u n g s m e t h o d e ist in Vorbereitung (MATTHIES u n d Mitarbeiter).

W . FÖRSTER, V . RÖSLER, K .

310

GRADE

Ergebnisse

1. Noradrenalingehalt im Herzen und Gehirn von Ratten und Meerschweinchen nach i.p. Gabe von g-Strophanthin, Digitoxigenin und Digitoxin Dosen, Zeitdauer der Einwirkung und Toxizität der Digitaliskörper sowie Noradrenalingehalt im Herzen und Gehirn von Ratten und Meerschweinchen sind der Tabelle 1 zu entnehmen. Trotz hoher Dosen, die zwischen maximal verträglichen und LD 50 -Werten variieren und Einwirkungszeiten zwischen 20 min und 4 Std. konnten weder im Gehirn noch im Herzen von Ratten und Meerschweinchen irgendwelche Veränderungen im NA-Gehalt nachgewiesen werden, die über Zufallsschwankungen hinausgehen. 2. Einfluß auf die durch Reserpin erfolgte Depletion der Katecholaminc In einer zweiten Versuchsreihe prüften wir, ob eine Digitoxinvorbehandlung die durch Reserpin erfolgende NA-Depletion zu hemmen vermag. Die ErTabelle 1 N A - G e h a l t im H e r z e n u n d G e h i r n v o n R a t t e n u n d M e e r s c h w e i n c h e n

Substanz

Dosis [mg/kg] i.p.

Zeitdauer der Einwirkung [min]

Toxizität (Zahl d e r g e s t o r b e n e n Tiere/Zahl der injiz i e r t e n Tiere)

100 5 5 4 3

20 45 120 120 120

3/ 9 18/26 21 6 3/ 6

5 5

60 120 240

3/16 4/12 6/14

Ratte g-Strophanthin Digitoxigenin Digitoxigenin Digitoxigenin Digitoxigenin Meerschweinchen Digitoxin Digitoxin Digitoxin Tabelle 2 E i n f l u ß v o n D i g i t o x i n auf d i e N A - D e p l c t i o n d u r c h R e s e r p i n (Digitoxin wurde 1 Std. vor Reserpin,

Substanz

Digitoxin Digitoxin

Dosis [mg/kg] i.p Digitoxin

Reserpin

Toxizität (Zahl d e r gestorbenen/Zahl der injizierten Tiere)

5 3

3 2

13/16 4/11

Versuchstiere Depletion

Herz

Depleti

Gehirn

[ng/g]

n

ro • i L /Oj

[ng/g]

n

[0/ L /o1J

310 403

3 6

85 82

36 106

3 7

89 53

Digitaliswirkung und Noradrenalin

311

gebnisse sind in Tabelle 2 gegenübergestellt. Ähnlich wie in der i . Versuchsserie lassen sich zwischen der deputierenden Wirkung von Reserpin mit und ohne vorherige Digitoxingabe keine überzufälligen Unterschiede nachweisen. Diskussion

In unseren mit zwei Glykosiden und einem Genin durchgeführten Versuchen ließ sich trotz hoher und z. T. toxischer Dosen keine Beeinflussung des NAGehaltes im Herzen und Gehirn von Ratten und Meerschweinchen nachweisen. Auch eine Beeinflussung der NA-depletierenden Wirkung von Reserpin konnte nicht festgestellt werden. Die Ergebnisse überraschen insofern etwas, als frühere Untersuchungen gewisse Beziehungen zwischen der Wirkung von Digitaliskörpern und dem Katecholaminstoffwechsel aufzeigen konnten. POPOV und F Ö R S T E R [ 1 8 ] wiesen mit verschiedenen Substraten bei Ratten, Meerschweinchen und Katzen eine MAO-hemmende Wirkung von Tabelle 1

nach hohen Dosen von g-Strophanthin, Digitoxigenin und Digitoxin Versuchstiere Herz

Kontrollen Gehirn

[ng/g]

W

1320 1471 1315 1012 1400

6 8

2650 2220 2270

Gehirr

Herz

[ng/g]

[n]

[ng/g]

[n]

[ng/g]

[n]

2 4

508 565 675 662 610

6 8 3 3 3

1355 1369 992

6 6 4

500 505 745

6 6 4

13 8 8

267 254 243

13 8 8

2730 2140 2430

—

—

—

—

—

—

—

10 6 6

10 6 6

267 229 254

im Herzen und Gehirn von Meerschweinchen Reserpin 3 Std. vor dem Töten der Tiere injiziert)

Tabelle 2

Kontrolltiere Reserpin Depletion

Herz

[ng/g] 385 402

n

4 | 4

[%] 81 82

NaCl-Kontrollen Depletion

Gehirn

| [ng/g] :

54 100

Herz

Depletion Gehirn [ng/g]

[n]

[%]

[ng/g]

4 4

84 56

2036 2214

[n] 3 i 4

[%] -

| i

341 227

Depletion n

1

3 4 1

[%] -

312

W.

FÖRSTER, V . RÖSLER, K .

GRADE

Digitoxigenin und Digitoxin nach; sie war nach chronischer Vorbehandlung mit Digitoxin am stärksten (ca. 60% Hemmung bei Dopamin als Substrat), aber auch nach einmaliger Gabe statistisch zu sichern. In anderen Versuchen konnten H O P P E und FÖRSTER [19] zeigen, daß eine Anzahl von MAO-Hemmern das durch Strophanthin ausgelöste Erbrechen potenzieren. Diese sowie die in der Einleitung angeführten Literaturbefunde sprechen für eine gewisse gegenseitige Beeinflussung von Digitaliskörpern und Katecholaminen, die jedoch offensichtlich mit der in der vorliegenden Arbeit benutzten Methodik nicht erfaßt werden kann. Literatur K . u.

[1]

PÄVEK,

[2]

P Ä V E K , K . U. F . V . S E L E C K Y :

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Bratislavsk6 Lekärske Listy Bratislavski Lekärske Listy

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40, 551

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40,

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(1962).

Summary W.

FOERSTER, V . ROESLER

and K.

GRADE

: T h e effect of digitalis on n o r a d r e n a l i n e

content H i g h dosages of g - s t r o p h a n t h i n , digitoxigenin a n d digitoxin, a f t e r 4 hours, did n o t p r o d u c e s u b s t a n t i a l c h a n g e s of t h e n o r a d r e n a l i n e c o n t e n t in t h e h e a r t a n d b r a i n of r a t s a n d g u i n e a pigs. T h e d e p l e t i n g e f f e c t of reserpine, too, is l e f t u n c h a n g e d b y p r e v i o u s digitoxin a d m i n i s t r a t i o n . Pe;tioMC B.

fl>epcTep,

B. P e c J i c p

H

K. Fpaae:

J3,CHCTBHC

NAIIEPCTHIIKII

11a

co;u'p-

HiariMe iiopaapeiiaJiHiia IiBeaeilHC

KpbICHM H MOpCIxHM C B H H K a M B b l C O K H X ¿ 0 3 r - C T p O l J j a i l T H I i a , . ( H r H T O K C H -

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OnopoHiiiHiomee

CTBHe pesepiiHiia npH BBe^enHH flHrHTHOHCHiia Taraite ne H3M0iiiieTCii.

iiopiieii-

Acta biol. med. german., Band 16, Seite 313 — 318 (1966) F r o m t h e Central Drug Research I n s t i t u t e , Lucknow, I n d i a (Director: Dr. M . L. D H A R )

Effect of an intra-vas deferens contraceptive suture on fertility of rats A. B. KAR a n d V. P.

KAMBOJ

(Received: 1. 11. 1965)

Summary A nylon suture inserted into t h e vas deferens of r a t s causes disintegration of a s u b s t a n t i a l percentage of spermatozoa a n d reduces fertility. No n o t e w o r t h y a n d consistent histological changes are seen in t h e sector of t h e vas occupied b y t h e suture. At one point of e n t r y of t h e suture a fibrous o u t g r o w t h developes on t h e vasal wall. The spermatozoa e n t e r into t h i s s t r u c t u r e from t h e lumen of t h e vas t h r o u g h a passage and become decapitated. T h e contraceptive effect of t h e suture is reversible. T h e possible modus operandi is discussed.

In a preliminary communication [1] it was reported that an intra-vas deferens contraceptive suture caused disintegration of a substantial percentage of spermatozoa. A nodular growth was also observed frequently at one point of entry of the suture which contained mostly decapitated spermatozoa. The present paper embodies a detailed account of the effect of the contraceptive suture (IVD) on the vas deferens and fertility of rats. Material and Methods Colony bred a d u l t albino r a t s of t h e I n s t i t u t e weighing 150—180 gm were used in t h i s investigation. T h e y were m a i n t a i n e d in airconditioned quarters (temperature 75 ± ±_ 2 °F) u n d e r uniform h u s b a n d r y conditions t h r o u g h o u t t h e experimental period. T h e m e t h o d of insertion of t h e I V D has been described in detail [1]. In brief, a nylon suture was p u t t h r o u g h t h e wall of t h e vas b y an a t r a u m a t i c needle t a k i n g all precautions t o avoid i n j u r y to t h e blood vessels. T h e needle with t h e suture was passed along t h e lumen of t h e vas and b r o u g h t out t h r o u g h t h e same wall a p p r o x i m a t e l y 1 cm below t h e point of e n t r y a t t h e u r e t h a l end. The suture was pulled loosely t h r o u g h t h e site of e n t r y so t h a t it lay freely in t h e vasal lumen. The two ends of t h e suture were tied into a k n o t a f t e r keeping considerable allowance t o p r e v e n t a n y undue pressure on t h e blood vessels (fig. 1). In animals f i t t e d with t h e device on one side only, t h e needle was passed in an identical m a n n e r t h r o u g h t h e contralateral vas without, of course, leaving t h e suture p e r m a n e n t l y . T h e operations were carried o u t under aseptic condition a n d t h e animals were subjected to post-operative antibiotic (terramycin) t h e r a p y for 3 days. T h e animals were sacrificed 1 5, 100 and 250 days a f t e r t h e insertion of t h e IVD. The spermatozoa were collected from t h e vas (portions in between a n d proximal to t h e stitch, and t h e control side in case of t h e unilaterally inserted group) for light and

314

A. B. KAR, V . B.

KAMBOJ

phase contrast microscopic assessment of the proportion of normal and disintegrated forms. For histological studies, portions of the vas from different regions, the nodule, the testes, epididymis (head, body and tail portions), seminal vesicles and the ventral prostate were fixed in B O U I N S fluid and serial paraffin sections were stained with E H R L I C H S hematoxylin and eosin. The fertility performance tests were carried out 15 and 100 days after insertion (bilateral) of the IVD. For reversibility studies, the sterile males of the 100 days group (tab. 1) were laparotomized and the nylon suture was carefully pulled out of the vas. Any nodules present on the vas were also removed surgically. For mating one male was caged with two coeval female rats of proven fertility and the period of cohabitation allowed was 60 days. The other details of the test were the same as described in a previous study [2]. Results

It will be evident from the results presented in table 1 that at 15 days 40 to 4 6 % of the spermatozoa from the portion of the vas in between the two ends of the stitch were disintegrated by a separation of the head and the tail. In contrast, virtually cent percent of the spermatozoa collected from the area of the vas proximal (towards the epididymal end) to the stitch, or from the control side showed normal morphology and motility at all time intervals. The percentage of decapitated spermatozoa was more or less similar at 100 days (42—44%) but at 250 days the figures were somewhat higher (49-58%). Table 1 Effect of I V D on rat spermatozoa yo of decapitated spermatozoa Status

IVD IVD IVD IVD IVI) IVD IVD 1

unilateral, 15 days (10) 1 bilateral, 15 days (12) unilateral, 100 days (10) bilateral, 100 days (10) unilateral, 250 days (12) bilateral, 250 days (12) bilateral after removal, 100 days (5)

No. of animals.—

2

Mean of two sides.—

Control side

Treated side

0,5

46,0 40,o 2 42,0 44,0 2 49,0 58,0 2 2,0 2

—

0,0 —

o,5 I 3

— —

Inside the nodule 95,0 90,0 95,0 90,0 100,0 100,0

(7) 3 (17) (8) (12) (10) (18)

—

Total number of nodules present

Histologically, in some animals the vasal mucosa was found to be disorganised at the point of entry of the suture. The epithelial cells were disquamated and clogged a substantial portion of the vasal lumen (fig. 2). In the area between the two ends of the stitch a compression of the epithelium was seen at certain places in a few animals. A debris of decapitated sperms was observed in the lumen in some (fig. 3)- The serosa, muscularis and the lamina propria were, however, consistently normal. Further, these changes were independent of the duration of residence of the suture in the vas. The area proximal

Contraceptive effect of nylon suture

315

to the stitch or the contralateral duct (in unilaterally inserted groups) presented typically normal features (fig. 4). This was also the case with the testis, epididymis (head, bodv and tail), seminal vesicles and the ventral prostate. The nodular structure developed only at one point of entry of the IYI) usually at the epididymal end (fig. 1). It weighed between 20—200 mg irrespective of the time interval at which the animals were sacrificed. The histological examination revealed t h a t the wall of the nodule contiguous to the vas was confluent with the vasal wall but except at this point a common serosa enveloped the two tissues (fig. 5). The nodule portion of the serosa was particularly well supplied with blood vessels. At one point the vasal lumen and the nodule were connected with a passage through which the spermatozoa entered this tissue (fig. 6). The parenchyma of the nodule consisted

Fig. 1. The genital organs of rat showing the location of the i n t r a v a s deferens contraceptive suture. The arrow points to t h e nodular growth of t h e vas (After I \ a r and K a m b o j ,1 )

of blocks and trabeculae of fibrous tissue on which the spermatozoa were present (fig. 7). The m a j o r i t y (90—100%) of the spermatozoa seen inside the nodules was, however, disintegrated. The results of mating test showed t h a t the IYI) caused 65 — 75% reduction in fertility (tab. 2). In case of fertile matings there was no effect on litter size. However, the contraceptive effect of the IYD was reversible because the fertility recovered to a considerable extent upon removal of the suture although the rate continued to be below normal (tab. 2). Table 2 The fertility performance of r a t s f i t t e d with t h e I V D No. of males m a t e d Status

l'ertile matings

Sterile matings

Mean litter size

Controls (20)' IS (90"„) 2 2 (1o%' 6.3 IYI) bilateral, IS days (50) 12 (2.5,5",,) 39 (76,5' 6,9 IYI) bilateral, 100 days (20) 6.4 7 (35V 13 (65V 6,8 1\"D bilateral a f t e r removal — loo days (13) S (61,5",,) , 5 (3V5' 1 No. of males p u t to mating. — 2 Figure in parenthesis denotes the " 0 of fertile or sterile, matings 21

Acta biol. med. german., H e f t 3

A. B. KAR, V. B. KAMBOJ

316

h s û ë è V «V

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» Fig. 2—7

i c ? ^ -ar •

Contraceptive effect of nylon suture

317

About 9 8 % of the spermatozoa from the area of the vas previously occupied by the suture were found to be normal and motile. The histological features of the vas were also typical (see fig. 4). Discussion

The results of the present study show that a nylon suture (or surgical silk suture [1]) introduced into the vas deferens of rats does indeed reduce the fertility. Evidently, this is achieved by a primary action on the spermatozoa which are disintegrated by a separation of the head and the tail after they enter the particular sector of the vas in which the contraceptive suture is introduced. In the proximal portion of the duct which is not occupied by the suture the spermatozoa are unaffected and remain normal. The situation is comparable to the antiimplantation vis-a-vis antifertility effect exerted by a surgical silk suture inserted in a similar manner into the uterus of rats [3], [4]. Further, as in female rats [4] the antispermatozoal and contraceptive actions of the intra-vas deferens suture appear to be reversible. Presumably, the nodular growth of the vas that develops at one point of entry of the suture serves as a sort of receptacle for the majority of the itinierent spermatozoa. Virtually all of the spermatozoa present inside the nodule are, however, decapitated. A most point therefore is whether the spermatozoa are actually disintegrated inside the nodule or already decapitated forms simply pass into it. I t may be recalled that it is possible to collect normal as well as decapitated spermatozoa from the sutured sector of the vas, but mostly the latter form is visible inside the nodule. It thus appears that the spermatozoa can also undergo disintegration inside the nodule itself. The IVD does not evoke any marked histological changes in the vas which suggests that the spermatozoal disintegration may be brought about by some biochemical changes particularly in the vas luminal fluid. It is pertiFig. 2. The portion of the vas deferens of a rat a t the point of entry of the suture. Note clogging of lumen by disquamated epithelial cells. X 130 Fig. 3. T h e vas deferens of a r a t from the sector occupied b y the contraceptive suture. Note the debris of decapitated sperms in the lumen but otherwise normal features. X 130

Fig. 4. T h e vas deferens of a rat from the control side. Note typical features.

X 130

Fig. 5- T h e disposition of the vas and its nodular growth in a rat fitted with the contraceptive suture which was removed before histological processing. Note common serosa of the two tissues. T h e vas is recognizable b y its characteristic wavy mucosa. X

20

Fig. 6. T h e nodular growth of the vas deferens of a rat fitted with the contraceptive suture. Note blocks and trabeculae of fibrous tissue inside the nodule. T h e passage connecting the nodule with the vasal lumen is marked by an arrow, x 20 Fig. 7. T h e high power view of a portion of fig. 5- Note the presence of innumerable decapitated sperms on a fibrous parenchyma, x 550

318

A. B. KAR, V. B.

KAMBOJ

nent to mention that a similar contraceptive suture evokes marked biochemical changes in the uterine luminal fluid of rats which are detrimental for the survival of the pre-implantation blastocyst [5]. It is, however, interesting that the presence of the suture does not interfere with the uterine passage of the spermatozoa nor the fertilization process [3]. Evidently, the nature of biochemical changes caused by the contraceptive suture is different in the uterus and the vas. No ready explanation can be offered at present for the development of the nodular structure due to the insertion of the IVD. This investigation was supported b y a g r a n t from t h e Ford F o u n d a t i o n . The a u t h o r s are grateful to Dr. M. L. D H A R for his interest in t h i s s t u d y a n d the Editor, Indian J o u r n a l of E x p e r i m e n t a l Biology for permission t o reproduce figure 1. T h a n k s are due t o M r . S. K . NATH f o r t h e p h o t o m i c r o g r a p h s .

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KAR, A . B., A . GOSWAMI, V . P .

KAMBOJ

U. S . R . C H O W D H U R Y :

Steroids

4,

159

(1964). Zusammenfassung A. B. KAR U. V. P. KAMBOJ: Die W i r k u n g eines in d a s Vas deferens eingeführten F a d e n s auf die F r u c h t b a r k e i t von R a t t e n In den Samenleiter von R a t t e n eingeführte Nylonfäden bewirken eine starke Auflösung der Spermatozoen und reduzieren die F r u c h t b a r k e i t der Tiere. Der die F ä d e n u m gebende A b s c h n i t t des Vas deferens zeigte signifikante histologische Veränderungen. An einer E i n t r i t t s s t e l l e des F a d e n s entwickelte sich eine bindegewebige W u c h e r u n g der W a n d u n g . Die Spermatozoen gelangen aus dem L u m e n über eine Passage zu dieser S t r u k t u r und zeigen D e k a p i t a t i o n . Die antikonzeptionelle W i r k u n g der Schlinge ist reversibel. Der mögliche Wirkungsmechanismus wird diskutiert. I*C3I«MC A.

13. K a p

h

B.

II.

KaMRoii:

JHeiicTBHe aimiKOHuenuHoimoro

nma,

BBe.ieii-

I i o r o B C e M H I i p O B O ; i H U l H H I i p O T O K I i p b l C , H a IIJIO;;OBHTOCTI» / K U B O T l I b l X

HeiiJioiioBbie I I H T H , BBe^eHiiwe B ceMfuipoBoamuHii npoTon npbic, Bbi3i.iBaioT pe3I . o e pa3Jio>KeiiHe C N E P M A T 0 3 0 H A 0 B H yMenbiuaioT IIJIO,IOBHTOCTI> >KHBOTIII>IX. B ynacTue iipoToua, oxBaiaJi0ci> coe.iHiiiiTejii.HOTuaiiiioe pa3pacTanne CTCHM cocvaa. CnepMaT030H;ibi nona.iaioT H 3 npocuoTa cocvjia 110 itanajiy B ;>Ty cTpyiiTypy H ^eKaiiHTupyIOTCH. AiiTHivOiiuenniioHiioe ;K'IICTBHE 3Toro LiiBa oiipaTHMü. Oßcyw.iaeTCH B03M0Hiiibiii MexaiiM3M ^eiicTBim.

Kurzmitteilungen

A c t a biol. med. german., B a n d 16, Seite 3 1 9 - - 3 2 2 (1966) Aus dem Physiologisch-chemischen I n s t i t u t der Friedrich-Schiller-Universität (Direktor: Prof. Dr. H . F R U N D E R )

Jena

Veränderungen an den Kernnukleinsäuren der Rattenleber nach Tetrachlorkohlenstoffschädigung G. RICHTER, D.

KATENKAMP, B. OETTINGER u n d

S.

MICHEL

(Eingegangen am 6. 11. 1965)

In einer vorhergehenden Mitteilung [1] wurde über die Chromatographie der mit Phenol und 0,4% SDS bei 0 °C extrahierten Kernnukleinsäuren der Rattenleber an MAK-Säulen berichtet. Nach diesem Verfahren werden 2 DNS-Fraktionen erhalten. Zusammen mit beiden DNS-Fraktionen werden je eine RNS-Fraktion mit hoher Umsatzrate und r-RNS-ähnlicher Basenzusammensetzung eluiert. Es wurde angenommen, daß es sich hierbei um ribosomale Vorstufen-RNS handelt. Eine stoffwechselaktive RNS mit einer Basenzusammensetzung, die der m-RNS entspricht, konnte erst bei 65 °C aus der Zwischenschicht der kalten Phenolextraktion gewonnen werden. Die Heterogenität der DNS kann u. U. auf das Vorliegen von Parenchymzellen und K u P F F E R s c h e n Sternzellen zurückgeführt werden. Nach diesem Verfahren wurden die Kernnukleinsäuren der Rattenleber 18 und 24 Std. nach i.p. CCl 4 -Injektion (0,3 ml CCl 4 /100g Körpergewicht) untersucht, um das Verhalten dieser Nukleinsäuren zu Beginn der Regeneration [2] zu prüfen. Die erhaltenen Elutionsprofile zeigen keine wesentlichen Veränderungen im Vergleich zum MAK-Chromatogramm normaler Kernnukleinsäuren (s. hierzu Abb. 1 in [1]). Zusätzliche Gipfel werden nicht beobachtet. Es kommt lediglich zu einer geringen Verschiebung in der Verteilung der UV-Absorption auf die einzelnen Gipfel (s. Tab. 1), insbesondere verändert sich das Verwendete A b k ü r z u n g e n : MAK-Säule = Säule aus methyliertem Eieralbumin auf Kieselgur; SDS = Natrium-dodezylsulfat; D N S = Desoxyribonukleinsäure; R N S = Ribonukleinsäure; m - R N S = Messenger-RNS; r - R N S = ribosomale R N S ; rspA = relative spezifische A k t i v i t ä t

320

Kurzmitteilungen

Verhältnis der Konzentrationen beider DNS-RNS-Gipfel zueinander. Die relative Zunahme der R N S II und R N S III ist auf eine größere Verunreinigung der geschädigten Kernfraktion durch Mikrosomenmaterial zurückzuführen [2], [3]. Tabelle 1 Verteilung d e r E x t i n k t i o n bei 260 n m auf die einzelnen Gipfel im M A K C h r o m a t o g r a m m d e r K e r n n u k l e i n s ä u r e n in % der G e s a m t e x t i n k t i o n bei n o r m a l e n u n d CC1,-geschädigten R a t t e n l e b e r n . M i t t e l w e r t e i s, Zahl d e r Versuche in K l a m m e r n . Die N o r m a l w e r t e sind a u s Tabelle 1 in [1] e n t n o m m e n N o r m a l (10) I. D N S / R N S - G i p f e l II. D N S / R N S - G i p f e l RNS I R N S II R N S III

25,9 36,0 10,7 15,5 12,0

± ± ± ± ±

9,9 8,6 4,3 6,7 4,4

18 S t d . (7)

24 S t d . (6)

31,6 23,6 7.7 18,7 18,3

23,8 19,4 8,8 21,6 26,5

± ± ± ± ±

4,7 3,8 4,5 2,5 3,9

± ± ± ± ±

8,4 3,2 1,3 6,7 9,6

Das Ausmaß des 3 2 P-Einbaus (etwa 1 mC 32 P pro Ratte 30 min vor Tötung i.p. injiziert) in die einzelnen Kernnukleinsäuren wird durch die CCl 4 -Schädigung wesentlich stärker beeinflußt als die UV-Absorption (siehe Tab. 2). Tabelle 2 r s p A d e r einzelnen N u k l e i n s ä u r e f r a k t i o n e n des M A K - C h r o m a t o g r a m m s bei n o r m a l e n u n d CCl 4 -geschädigten R a t t e n . M i t t e l w e r t e ± s, Zahl d e r Versuche in K l a m m e r n . Die N o r m a l w e r t e sind a u s Tabelle 2 in [1] e n t n o m m e n . rspA

spezifische A k t i v i t ä t d e r b e t r e f f e n d e n N u k l e i n s ä u r e spezifische A k t i v i t ä t der D N S des II. D N S / R N S - G i p f e l s Normal

I. D N S / R N S Gipfel II. D N S / R N S Gipfel RNS I R N S II R N S III 6S°-RNS

DNS RNS DNS RNS

1,4 ±

31,2 ± 1,0 18,9 ± 5,6 ±

18 S t d . (5)

0,7 (4) 5,4 (4)

4.8 1.7 10,8 ± 3,0 11,1 ± 4.9 105,0 ± 24,7

(3) (5) (5) (4) (14)

1 , 6 (2)

62,5 ±

4,2

91,7 ± 33,9 ±

9,7 5,4

1,0

24 S t d . (5) 0,55 (2) 3,0 ± 1,3

1,0

33,0 ± 20,2 43,7 ± 19,9 145 (2)

2,83 ±

2,96 ±

1,6 1,8

8,17 ± 3,9 3,58 ± 1,8 61,0 ± 14,4 (3)

18 Std. nach der Schädigung nimmt der Einbau von 32 P in alle RNS-Fraktionen im Vergleich zum Einbau in die D N S beträchtlich zu. Das steht im Einklang zu früheren Befunden, wonach 18 Std. nach der CCl 4 -Injektion die RNS-Synthese in der Leber bereits erhöht ist, die DNS-Synthese und damit •die Zellteilung jedoch noch nicht begonnen hat [2]. Auffällig ist, daß der

Kurzmitteilungen

321

32

P-Einbau in die RNS des I. DNS-RNS-Gipfels nur verdoppelt wird, während der Einbau in die RNS des II. DNS-RNS-Gipfels auf nahezu das 5fache ansteigt. Während also die RNS des I. DNS-RNS-Gipfels bei normalen Ratten einen größeren Umsatz aufweist, ist zu Beginn der Regeneration die Umsatzgeschwindigkeit der RNS des II. DNS-RNS-Gipfels größer. Dieses unterschiedliche Verhalten der Umsatzraten nach der Schädigung ist ein weiterer Hinweis dafür, daß es sich bei beiden DNS-RNS-Gipfeln um unterschiedliche Nukleinsäuren handelt und nicht um Kunstprodukte, die bei der Chromatographie an der MAK-Säule entstehen. Die Umsatzraten der RNS der DNS-RNS-Gipfel ist auch -18 Std. nach der Schädigung größer als die der mikrosomalen RNS (RNS I, II und III), obwohl auch diese etwa 3 bis 4mal größer sind als normal. Dieses Verhalten steht im Einklang mit der Annahme, daß es sich bei der stoffwechselaktiven RNS der DNS-RNS-Gipfel um ribosomale Vorstufen-RNS handelt. Die rspA der als m-RNS angesprochenen 65 °C-RNS ist nach 18 Std. im Vergleich zu normal nur gering erhöht. Daraus ergibt sich, daß zu Beginn der Regeneration die Neusynthese von r-RNS und damit von Ribosomen weit mehr gesteigert ist als die Synthese von m-RNS. Dieser Befund steht mit der Tatsache im Einklang, daß bei der Regeneration von Zellen, die ein Ribosomendefizit haben, zunächst Ribosomen neugebildet werden und erst nachdem eine bestimmte Ribosomen-Konzentration erreicht worden ist, m-RNS vermehrt synthetisiert wird [4]. Bei der CCl 4 -Schädigung liegt ein solcher Mangel an Ribosomen vor, da frühzeitig etwa 30% aller an den Ergastoplasmamembranen attachierten Ribosomen abgelöst werden [2], [5], [6]. Außerdem ist die Kapazität des verbleibenden Membransystems zur Proteinsynthese reduziert [7]. 24 Std. nach einer Schädigung ist die Beurteilung der rspA schwierig, da zu diesem Zeitpunkt bereits die Neusynthese von DNS begonnen hat. Die DNS ist jetzt kein geeignetes Bezugssystem mehr. Die rspA der RNS ist niedriger als ihre tatsächliche Umsatzgeschwindigkeit. Ihre Werte können deshalb nur untereinander verglichen werden. Hierbei zeigt sich, daß sowohl der Einbau in die RNS des I. und II. DNS-RNS-Gipfels als auch der Einbau in die RNS I und I I I gleich groß sind. Der Einbau in die RNS II ist dagegen fast 3mal so hoch. Die rspA der 65 °-RNS ist wesentlich größer als die rspA der 0°-RNS. Daraus ist abzuleiten, daß 24 Std. nach der Schädigung das Ausmaß der Neusynthese von Ribosomen im Vergleich zur m-RNS-Synthese zurückgeht. Nach 24 Std. sind offenbar die fehlenden Ribosomen ersetzt worden, und es setzt im Anschluß daran eine vermehrte Synthese von m-RNS ein. Die hohe rspA der RNS II nach 24 Std. ist schwer zu deuten. Es ist denkbar, daß diese hohe rspA auf das Vorkommen von m-RNS in dieser Fraktion zurückzuführen ist, denn es ist bekannt, daß r-RNS schwierig oder kaum von m-RNS-Resten zu befreien ist [8], [9]- Eine weitere Denkmöglichkeit ist die, daß in der RNS II neben r-RNS auch Membran-RNS vorliegt, die neuerdings in den Ergastoplasmamembranen der Rattenleber gefunden wurde

Kurzmitteilungen

322

und sich auf MAK-Säulen wie die R N S I I verhält [10]. Es ist denkbar, daß diese Membran-RNS einen stabilen Messenger darstellt. Da die Ergastoplasmamembranen durch die Schädigung selbst beträchtlich alteriert werden [2], [11], ist auch eine Schädigung der Membran-RNS zu erwarten. Infolgedessen muß sie im Verlauf der Regeneration eine erhöhte Syntheserate zeigen. Das unterschiedliche Verhalten der R N S des I. und I I . DNS-RNS-Gipfels 18 und 24 Std. nach der Schädigung möchten wir so deuten, daß die beiden Hauptzellarten der Leber (Parenchym- bzw. KuPFFERsche Sternzellen), die u. U. für das Auftreten von zwei DNS-RNS-Gipfeln verantwortlich sind [1], durch die CCl 4 -Schädigung unterschiedlich stark betroffen werden. Fräulein C. M O H R danken wir sehr für ihre umsichtige und einsatzfreudige Mitarbeit bei der Durchführung der Versuche. Literatur A.

[1]

MICHEL, S., G. RICHTER,

[2]

R I C H T E R , G . U. M . N E U M A N N :

[3]

BLUME,

16, 27KneHiifi TCipax.iop.MeTaiiOM 319—322 1". JJiipHep, r . FpuxTOJiiiK, P. TroTieHpayx H A. IIIyOepT: HoBbie CTepoimw c BUCOKHM MHOTpOIIHO-aHApOreHbIM OTHOIIieHHeM neilCTBHH 323 325 1". BaJibT u: OO aHTH-ArejI y Arion subfuscus 326—328

31002

INHALT

Biochemie

Seite

J . BURMEISTER: Der Stoffwechsel von Kaninchen-Exsudatleukozyten bei Aufnahme von Kohle- und Tuschepartikeln 235—241 I I . W . AUGUSTIN,

K . L . N I S S L E R U. E . HOFMANN

unter Mitarbeit von

H. KRESS-

MANN: E i n t r i t t und Phosphorylierung von 2-Desoxy-D-Glukose in EHRLICHAszites-Karzinom-Zellen K.-U. MÖRITZ U. A. GRISK: Zur Wirkung von Urethan auf den Kohlehydratstoffwechsel 11. KIRSCHKE U. H. HANSON: Bestimmung der enzymatischen Spaltung von Triglyzin unter Anwendung eines Nickelkomplexes R . DARGEL U. E . STRACK: Über die Hemmung der mitochondrialen NADH 2 -Oxidation durch D,L-Palmitoylkarnitin S.MICHEL,

G.RICHTER,

A . SCHADEBERG

U.

H.WAGNER:

Chromatographie

242 — 256 257 — 263 264—27U 271—277

der

Nukleinsäuren aus Leberzellkernen normaler R a t t e n an methylierten AlbuminKieselgursäulen 27S —286

Physiologie A. TAKÄC U. E . LÜDTKE: Zur Beeinflussung von Transportvorgängen in der Niere durch Nj.n-Butylbiguanid 287 — 293 11. BERGNER: In vivo-Dejodierung von 1 3 1 J - l l o s e bengale nach CCl 4 -Gaben an Ratten 294—299 D.MICHAELIS,

A . TAKÄC

u.

W.BRUNS:

Die

diagnostische

Bedeutung

ferrioxamin B 1 -Testes bei der latenten F o r m der primären 1 laemochromatose

des

Des-

idiopathischen

3uu — 308

Pharmakologie W . F Ö R S T E R , V . R Ö S L E R u. K . G R A D E : D i g i t a l i s w i r k u n g u n d N o r a d r e n a l i n

.

.

.

.

309 — 312

Experimentelle Pathologie A. B . KAR u. V. P. KAMBOJ : Die Wirkung eines in das Vas deferens eingeführten Fadens auf die Fruchtbarkeit von R a t t e n 313 — 318 Kursmitteilung G . R I C H T E R , D . K A T E N K A M P , B . O E T T I N G E R U. S . M I C H E L : V e r ä n d e r u n g e n a n

den

Kernnukleinsäurcn der Rattenleber nach Tetrachlorkohlenstoffschädigung . . 319 —322

G . D Ö R N E R , H . G R Y C H T O L I K , R . H Ü T T E N R A U C H U. A . S C H U B E R T : N e u e S t e r o i d e m i t

hoher myotrop-androgener Wirkungsrelation

H. WALTZ: Über Anti-A. , bei Arion subfusens

323 — 325 326—328

Herausgeber und vorantwurtlicli für den Inhalt: R . Baumann, H. Dutz, A. Graifi, H. Guirunel, l r . Jung, L.-H. Kettler, S . M. Kapoport. Schriftleitung: Prof. Dr. Werner Scheler und Dr. habil. Heinz Bielka, 1115 Berlin-Buch, Lindenberger Weg 70. Fernruf: 5 6 9 8 5 1 . App. 222. Verlag: Akadeinie-Verlag GmbH, 108 Berlin, Leipziger Straße 3 — 4 (Fernruf: 2 2 0 4 4 1 ) Telex-Nr. 011 773, Postscheckkonto Berlin 3 5 0 2 1 . Bestellnummer dieses Heftes 1053/XVI/3- Die Zeitschrift erscheint monatlich. Bezugspreis: Einzelheft MDN 14,—, Doppelheft MDN 28,—. Veröffentlicht unter der Lizenznummer 1318 des Presseamtes beim Vorsitzenden des Ministerrates der Deutschen Demokratischen Republik. Gesamtherstellung: V E B Druckerei „Thomas Müntzer", 582 Bad Langensalza. — Alle Rechte vorbehalten, insbesondere die der Übersetzung. Kein Teil dieser Zeitschrift darf in irgendeiner Form — durch Photokopie, Mikrofilm oder irgendein anderes Verfahren — ohne schriftliche Genehmigung des Verlages reproduziert werden.