Acta Biologica et Medica Germanica: Band 36, Heft 7/8 [Reprint 2022 ed.] 9783112650141

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R. B a u m a n n • H. Dutz A. G r a f f i • F. Jung O . P r o k o p • S. M. R a p o p o r t Unter M i t a r b e i t v o n : H. Ambrosius • H. A n k e r m a n n G . D ö r n e r • H. Drischel H. A. Freye • H. F r u n d e r E. G o e t z e • H. H a n s o n E. H o f m a n n • F. K l i n g b e r g W. K ö h l e r • F. M a r k w a r d t H. Matthies • W. O e l ß n e r G . Pasternak • A. S c h e l l e n b e r g e r E. Schubert • F. Schwarz G . Sterba A. W o l l e n b e r g e r

Band 36 Heft 718 • i977 Seite g4i — ng8 E V P 48, - M

ABMGAJ 36 (7/8) 941 - 1198 (1977) 31002

AKADEMIE-VERLAG BERLIN

Aufnahmebedingungen 1. Die ACTA BIOLOGICA E T MEDICA GERMANICA, Zeitschrift für funktionelle Biowissenschaften, publiziert Arbeiten aus den Fachgebieten Biochemie, Molekular- und Zellbiologie, Physiologie (einschließlich Pathophysiologie), Pharmakologie und Immunbiologie. Es werden nur Arbeiten angenommen, die nicht an anderer Stelle mit demselben Inhalt veröffentlicht oder zur Veröffentlichung angeboten werden. Der Autor verpflichtet sich nach Annahme, die Arbeiten an keiner anderen Stelle zu veröffentlichen. 2. Die Arbeit muß wissenschaftlich wertvoll sein. Bestätigungen bekannter Tatsachen, Versuche und Beobachtungen ohne positives Ergebnis werden, wenn überhaupt, nur in kürzester Form aufgenommen. Nicht aufgenommen werden Polemiken und spekulative Arbeiten, falls sie nicht wesentlich neue Gesichtspunkte enthalten. Die Arbeiten sollen den Charakter wissenschaftlicher Originalarbeiten haben. Als solche gelten alle Mitteilungen, die zur vorwärtsführenden Erweiterung des Erkenntnisstandes auf den genannten Fachgebieten führen. Originalarbeiten sollen 20 Manuskriptseiten nicht überschreiten. Kurzmitteilungen werden bei der Drucklegung zeitlich bevorzugt; sie dürfen 5 Manuskriptseiten nicht überschreiten. Als Kurzmitteilung gelten solche Arbeiten, in denen über neue Ergebnisse berichtet wird, ohne Details einer Originalarbeit zu enthalten. Besonders aktuelle Untersuchungsergebnisse können in kurzer Form (bis 4 Seiten) im Offsetverfahren publiziert werden, wofür reproduktionsreife Manuskripte erforderlich sind. In Form von Übersichtsarbeiten (Reviews) werden Artikel entgegengenommen, die zu aktuellen Gebieten einen Überblick geben, in dem Fakten dargestellt, besprochen und kritisch bewertet werden. 3. Die Arbeiten müssen so kurz als möglich abgefaßt werden und in einem druckreifen Zustand geschrieben sein. Einleitung (Problematik), Methodik, Befunde und Diskussion sollen deutlich in Erscheinung treten. Der Arbeit ist eine Zusammenfassung der wesentlichsten Ergebnisse voranzustellen, wovon bei deutschsprachigen Manuskripten auch eine englische Übersetzung notwendig ist. • Arbeiten werden in Deutsch, Englisch und Russisch angenommen. Die Manuskripte sind in zweifacher Ausfertigung einzureichen. Bei Manuskripten in deutscher Sprache ist die Schreibweise des „Duden" verbindlich; bei eingedeutschten Wörtern ist die „K-Z"Schreibweise anzuwenden. Von den Abbildungen sind 2 Kopien sowie 1 Satz reproduktionsreife Vorlagen beizufügen. Genaue Hinweise zur Manuskriptgestaltung sind von der Redaktion der Zeitschrift anzufordern und unbedingt einzuhalten. Manuskripte, die diesen Bedingungen nicht entsprechen, gehen unbearbeitet zur Revision an den Autor zurück. 4. Die Arbeiten werden im Sofortumbruch gesetzt; Korrekturen in Form von Streichungen bzw. Zusätzen sind daher in der Umbruchkorrektur nicht zulässig. 5. Manuskripte sind an die Redaktion der ACTA BIOLOGICA ET MEDICA GERMANICA, DDR-1115 Berlin-Buch, Lindenberger Weg 70, zu senden. 6. Von jeder Originalarbeit werden kostenlos 80 Sonderdrucke geliefert. Chefredaktion

Zeitschrift ACTA BIOLOGICA ET MEDICA GERMANICA Herausgeber: Prof. Dr. R. Baumann, Prof. Dr. H. Dutz, Prof. Dr. A. Graffi, Prof. Dr. F. Jung, Prof. Dr. O. Prokop, Prof. Dr. S. M. Rapoport. Verlag: Akademie-Verlag, DDR-108 Berlin, Leipziger Straße 3—4; Fernruf 2236221 oder 2236229; Telex-Nr..ll4420; Postscheckkonto: Berlin 35021. Bank: Staatsbank der DDR, Berlin, Kto.-Nr.: 6836-26-20712. Chefredaktion: Prof. Dr. Heinz Bielka, Prof. Dr. Werner Scheler. Anschrift der Redaktion: DDR-1115 Berlin-Buch, Lindenberger Weg 70. Fernruf: 5697851, App. 222. Veröffentlicht unter der Lizenznummer 1318 des Presseamtes beim Vorsitzenden des Ministerrates der Deutschen Demokratischen Republik. Gesamtherstellung: VEB Druckerei „Thomas Müntzer", DDR-582 Bad Langensalza. Erscheinungsweise: Die Zeitschrift erscheint monatlich. Die 12 Hefte eines Jahrganges bilden einen Band. Bezugspreis je Heft 35,— M (Preis für die DDR: 2 4 , - M); Bandpreis 420,— M zuzüglich Versandspesen (Preis für die DDR 288,— M). Bestellnummer dieses Heftes: 1053/XXXVI/7/8. Urheberrecht: Alle Rechte vorbehalten, insbesondere die der Obersetzung. Kein Teil dieser Zeitschrift darf in irgendeiner Form — durch Photokopie, Mikrofilm oder irgend ein anderes Verfahren — ohne schriftliche Genehmigung des Verlages reproduziert werden. © 1977 by Akademie-Verlag Berlin. Printed in the German Democratic Republic. AN (EDV) 50117

ACTA BIOLOGICA ET MEDICA GERMANICA Zeitschrift

für funktionelle

Biowissenschaften

ISSN 0 0 0 1 — 5 3 1 8 Herausgeber: R . B a u m a n n , H . Dutz, A. Graffi, F . J u n g , O; Prokop. S. M. Rapoport Schriftleitung : H . Bielka, W . Scheler Band 36

1977

Heft 7 — 8

A c t a biol. med. germ., B a n d 36, Seite 941— 960 (1977) I n s t i t u t für Physiologische und Biologische Chemie der Humboldt-Universität 104 Berlin D D R

Berlin,

Elektronentransportpartikel aus Rinderherzmitochondrien als Testsystem auf Hemmstoffe der Atmungskette W . MÜLLER, T . SCHEWE u n d S.

RAPOPORT

(Eingegangen am 6. September 1976)

Zusammenfassung D a Atmungshemmstoffe infolge ihrer Wirkung auf einen Schlüsselprozeß des Zellstoffwechsels eine potentielle biozide Wirkung auf alle aerob lebenden Organismen haben, ist die systematische Suche nach ihnen und die Aufklärung des Wirkungsmechanismus von großem Interesse. Die nichtphosphorylierenden Elektronentransportpartikeln ( E T P ) nach CRANE et al. sind für diese Zielstellung ein geeignetes Testobjekt. E i n e standardisierte Präparation dieser Elektronentransportpartikeln aus Rinderherzmitochondrien wird beschrieben und enzymatisch charakterisiert. Diese E T P weisen Reihe praktisch-methodischer und biologischer Vorteile gegenüber anderen eine für die gleiche Zielstellung in Frage kommenden Objekten auf, wodurch sich für sie ein breites Anwendungsfeld ergibt. Aufgrund der Abwesenheit von Nebenwegen der Atmungskette eignen sich tierische Partikeln besser als pflanzliche auch zur Suche nach die Atmungskette hemmenden Fungiziden und Herbiziden. B e i relativ geringem Abkürzungen: R F , R C : endogene Atmungshemmstoffe aus Kaninchenretikulozyten; E T P : Elektronentransportpartikeln; DCPIP: 2,6-Dichlorphenolindophenol; TMPD: Tetramethyl-p-phenylendiamin-di-HCl; T T F A : Thenoyltrifluorazeton; E D 6 0 : für eine 5 0 % i g e Hemmung erforderliche Konzentration (Halbhemmungskonzentration); E D 9 0 : für eine 9 0 % i g e Hemmung erforderliche Konzentration; F e S P : Eisen-Schwefel-Protein; IITS: Isatin-jS-isothiosemikarbazon 61

Acta biol. med. germ., Bd. 36, Heft 7—8

942

W . MÜLLER, T . SCHEWE, S. RÄPORORT

Aufwand erfassen die beiden vorgeschlagenen Standardmeßsysteme NADH-Oxydase und Sukzinat-Zytochrom c-Oxydoreduktase mit Sicherheit alle Hemmstoffe des H a u p t weges der Atmungskette, so daß sie vor allem f ü r Siebtests größeren Umfangs einsetzbar sind. Die Analyse des genauen Wirkortes und des Wirkmechanismus von Atmungshemmstoffen ist am gleichen Objekt möglich. Die E T P sind weiterhin zur Erfassung von Hydrophobizitätsparametern von P h a r m a k a wie auch für toxikologische Untersuchungen verwendbar. Einleitung

Da die mit der oxydativen Phosphorylierung gekoppelte Atmungskette die hauptsächliche Energiequelle und damit ein Schlüsselprozeß des Stoffwechsels in allen aerob lebenden Organismen ist, können Hemmstoffe der Atmungskette drastische Stoffwechselumschaltungen oder den Untergang von Zellen verursachen. Die weite Verbreitung von endogenen Atmungshemmstoffen im Tierund Pflanzenreich [1,2], spricht für deren biologische Funktionen. So ist z.B. ein Atmungshemmstoff aus Kaninchenretikulozyten (RF) an der Reifung der roten Blutzelle beteiligt, indem er den Abbau der Mitochondrien infolge Atmungshemmung begünstigt [3]. Vermutlich sind Atmungshemmstoffe auch an anderen Reifungs- und Involutionsvorgängen im Tier- und Pflanzenreich, die mit einem Abfall der Zellatmung bzw. der Mitochondrienzahl einhergehen, beteiligt. Eine ubiquitäre Klasse von endogenen Atmungshemmstoffen sind unveresterte Fettsäuren, die in verschiedener Weise das mitochondriale Elektronentransportsystem hemmen [4—6]. Eine weitere biologische Funktion endogener Atmungshemmstoffe in Pflanzen könnte im Schutz gegenüber Fremdorganismen bestehen. Im Einklang damit steht die Tatsache, daß sich Fungizide als hochwirksame Atmungshemmstoffe herausstellten, wie z.B. Karboxin [7, 8], Dexon [9, 10] und Tridemorph [11]. Aus diesen Beispielen geht hervor, daß Atmungshemmstoffe sowohl als Regulatoren des Zellstoffwechsels als auch als Pflanzenschutzmittel ein weites Anwendungsfeld in der Grundlagenforschung und in der Praxis aufweisen. Die gezielte Suche nach Atmungshemmstoffen sowie die Analyse ihrer Wirkungsweise sind daher von großem Interesse. Der Nachweis der Hemmung der Atmungskette durch eine Verbindung zeigt deren potentielle biozide Wirkung an, die eine Nutzanwendung in Aussicht stellt.'Die Analyse des Wirkmechanismus dient der Entwicklung von Wirkstoff-Rezeptor-Modellen, um auf diesem Weg zu Synthesekonzeptionen für neue Wirkstoffe zu gelangen. Die genannten Zielstellungen erfordern ein geeignetes Testsystem der Atmungskette. Gesamtorganismen und intakte Zellen sind hierfür nicht immer geeignet, da die Aussage solcher Testungen durch überlagerte Prozesse wie Permeationsbarrieren, Giftungs- und Entgiftungsmechanismen, indirekte Beeinflussung der Zellatmung durch Wirkungen auf andere Stoffwechselwege, sowie andere sauerstoffverbrauchende Prozesse sehr erschwert sein kann. Isolierte Mitochondrien werden zwar am häufigsten zur Auffindung und Wirkungsanalyse benutzt, jedoch ergeben sich auch hier Probleme des Membrantransportes sowie komplizierte Wechselbeziehungen zwischen Atmungskette und energiekonservierenden Reaktionen. Darüber hinaus sind Mitochondrien nicht lagerstabil. Die nächstfolgende Desintegrationsstufe sind submitochondriale Partikeln,

ETP-Test auf Atmungshemmstoffe

943

die sich sehr gut für die genannten Zielstellungen eignen. Die Anwendung isolierter Atmungsenzyme oder Enzymsysteme ist zwar prinzipiell möglich; sie erfordert jedoch einen hohen präparativen Aufwand, außerdem verändern sich häufig die Eigenschaften der Enzyme bei der Ablösung von der Membran (Allotopie [12]), so daß die Möglichkeit von Artefakten zu Fehlaussagen führen kann. In der Literatur werden verschiedene Arten submitochondrialer Partikeln beschrieben. Phosphorylierende Partikeln, wie z. B. die sog. Ultraschall-Partikeln ( E T P ) [ 1 3 ] oder Digitonin-Partikeln [ 1 4 ] enthalten die mit der oxydativen Phosphorylierung gekoppelte Atmungskette und sind daher komplexer als nicht phosphorylierende Partikel, wie z. B. Keilin-Hartree-Präparationen [15]. Partikeln nach alkalischer Messerhomogenisation (ETP (KOH)) [16] oder Ultraschall-ÄDTA Partikeln (ETP (ÄDTA)) [17]. Bei der Anwendung nichtphosphorylierender Partikeln verzichtet man von vorn herein auf die Erfassung von Entkopplerwirkungen und Hemmungen der oxydativen Phosphorylierung; dafür gewinnt das Testobjekt für die Untersuchung echter Hemmstoffe der Atmungskette wesentlich an Übersichtlichkeit. Die Keilin-Hartree-Präparation ist nicht über längere Zeit lagerstabil; darüber hinaus waren Untersuchungen mit Atmungshemmstoffen in unserem Laboratorium an diesem Objekt nicht immer gut reproduzierbar. Ultraschall-ÄDTA-Partikeln sind nicht geeignet für die Untersuchung von ÄDTAempfindlichen Atmungshemmstoffen, wie z.B. die Hemmstoffe RF und RC aus Retikulozyten [3, 18]. KOH-Partikel haben sich in unserem Laboratorium bei der Auffindung [1, 2] und bei Untersuchungen des Wirkungsmechanismus verschiedener Atmungshemmstoffe [3—8, 10, 11, 19] hervorragend bewährt. Gegenstand der vorliegenden Mitteilung ist die Gewinnung und Charakterisierung von ETP (KOH) aus Rinderherzmitochondrien sowie die universelle Anwendung als multivalentes Testobjekt. H

Material und Methoden Die Bestimmung der Enzymaktivitäten ist in Tab. 1 und der zugehörigen Legende angegeben. Die kinetischen photometrischen Untersuchungen wurden am registrierenden Spektralphotometer Unicam S P 800A durchgeführt. Die differenzspektroskopischen Untersuchungen erfolgen am registrierenden Spektralphotometer Cary (Modell 14). Der Sauerstoffverbrauch wurde manometrisch in der Warburg-Apparatur gemessen. Alle Bestimmungen wurden bei 37 °C und einem Küvettenendvolumen von 1,0 bis 1,1 ml durchgeführt. Die Proteinbestimmung erfolgte nach L O W R Y et al. ['31]. Das IITS-Derivat erhielten wir von Dr. L. H E I N I C H (Friedrich-Schiller-Universität, Jena) 1 und das Ölsäure-1-monoglyzerid von Prof. W . W A C H S (Berlin-Charlottenburg) 1 . Die übrigen Chemikalien waren folgender H e r k u n f t t NADH, N A D P H und NAD+, V E B Arzneimittelwerk Dresden; Ubichinon-5 (KoenzymQj), Ubichinon-10 (KoenzymQ 2 ) und Menadion, Merck Sharp & Dohme Res. Lab. (Rahway, New Jersey); Rotenon, Oligomyzin und CCCP (Karbonylzyanid-m-chlorphenylhydrazon), Sigma, Chemical Company (St. Louis, USA); Bernsteinsäure, L( + )-Askorbinsäure und Ferrizyanid, V E B Laborchemie Apolda; Zytochrom c, Boehringer GmbH Mannheim; T T F A (Thenoyltrifluorazeton) und TMPD (Tetramethyl-p-phenylendiamin-di-HCl), Ferak, (Berlin-West); D C P I P (2,6-Dichlorphenolindophenol), G. Schönert K.-G. (Leipzig); KCN, Chemapol, CSSR; Antimyzin A, Calbiochem (Los Angeles); Natriumdithionit, 1

F ü r die Überlassung der genannten Verbindungen möchten wir an dieser Stelle unseren herzlichen Dank aussprechen. 61*

944

W . MÜLLER, T . SCHEWE, S.

RAPOPORT

Riedel-de Haen AG (Seelze-Hannover); Amytal, Serva, Entwicklungslabor Heidelberg; Natriumdesoxycholat, V E B Chemisches Werk Berlin-Grünau; Humanserumalbumin, Forschungsinstitut f ü r Impfstoffe Dessau. Ergebnisse

Vorschrift zur standardisierten des Verfahrens

Gewinnung

von Rinderherz-ETP

auf der Grundlage

nach CRANE et al. [16]

Die beiden Teile der ETP-Präparation, die Mitochondrienpräparation aus Rinderherzmuskel und die ETP-Präparation aus Rinderherzmitochondrien können an zwei verschiedenen Tagen durchgeführt werden. Das Präparationsmedium ist Saccharose (0,25 M)-Phosphat (K 2 HP0 4 , 10,6 mM), das mit konz. H 3 P0 4 auf einen _/>H-Wert von etwa 7,2 eingestellt wird. Mitochondrienpräparation Zwei Rinderherzen (ca. 2 kg) werden unmittelbar nach der Schlachtung der Rinder in Eiswasser vom Schlachthof in das Labor transportiert. Fett- und Bindegewebe werden bei 4 °C sorgfältig entfernt, die Muskeln in kleine Stücke geschnitten und mit einem vorgekühlten Fleischwolf zerkleinert. Davon werden 750 g mit 750 ml Saccharose-Phosphat-Medium mit einem Quirl (Holz-Plaste) bei 4 °C verrührt. An einem geeichten ^>H-Meter wird diese Mischung durch tropfenweise Zugabe von 1 N KOH im Eisbad unter starkem Rühren auf einen ^>H-Wert von 7,2 eingestellt. Anschließend wird mit einem Messerhomogenisator kurz bis zur Bildung eines grobfaserigen Breis homogenisiert und dann wieder mit 1 N KOH auf pH 7,2 eingestellt. Der Brei wird über öfaches Mull in Portionen abgepreßt, dabei werden Blut und lösliche Eiweiße ausgewaschen. Die Homogenisation darf nicht zu stark sein, da es sonst zu einem größeren Verlust an Mitochondrien kommt. Das abgepreßte Produkt wird in 750 ml Saccharose-PhosphatFußnoten zu Tabelle 1: 1

Endkonzentrationen in 1 ml Meßansatz Da die NADH-Zytochrom c-Oxydoreduktaseaktivität dieser E T P nur etwa zu 50% durch Rotenon hemmbar ist, ist f ü r die Untersuchungen der Atmungskette nur der rotenonhemmbare Anteil der Aktivität auszuwerten. 3 Bei Aktivitäten um 0,300 /l£ 3 4 0 /min im NADH-Ferrizyanid-Oxydoreduktasesystem ist der Zusatz von KCN nicht erforderlich, da bei den hierbei genügenden ETP-Konzentrationen die NADH-Oxydaseaktivität vernachlässigbar gering ist. 1 Oxydiertes T M P D (Wursters Blau) kann durch Oxydation von T M P D mittels der E T P (TMPD-0 2 -System) im Reaktionsansatz erhalten werden. Die störende Oxydation während der Messung wird mit KCN vermieden. Nur frisch hergestellte TMPD-Lösung (in Wasser) ist zu verwenden. 6 Reduziertes Zytochrom c (Ferrozytochrom c) wird durch Reduktion mit wenig Natriumdithionit erhalten. Das Verhältnis E550/E565 m u ß als Maß f ü r den Reduktionsgrad ;> 7 betragen [28], Stören die Zersetzungsprodukte des Dithionits (z.B. S0 2 ), ist die Methode nach W I E S N E R [29] anzuwenden. a) Der im Meßmedium gelöste Sauerstoff oder der im Warburg-Gefäß vorhandene Sauerstoff reicht als Akzeptor aus. TS = Tris-Sulfat, pH 8,0 K P = Kalium-Phosphat, pH 7,4 2

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1004

J . FISCHER e t al.

Tabelle 3 Adsorptions- bzw. Bindungsverhalten verschieden substituierter Gläser und des unsubstituierten porösen Glases gegenüber RSA. 200 mg Glas und 10 ml RSA-Lösung in Phosphatpuffer, pH 7,0, wurden 5 Std. bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde die Proteinmenge im Überstand gemessen Probe RSA-Ausgangslösung A 100/400 y-AP-Glas SI-Glas MI/OH-Glas

RSA-Menge im Überstand [ng/ml]

Adsorbierte bzw. gebundene RSA-Menge (%)

400 240 245 270 70

0 40 39 33 83

Zwar wird auch bei den nichtaktivierten Glasderivaten ein unspezifisches Adsorptionsvermögen gefunden, jedoch unterscheidet sich das Verhalten von SI-Glas kaum vom umsubstituierten bzw. y-AP-Glas, so daß starke hydrophobe Wechselwirkungen ausgeschlossen werden können. Gestützt wird dieser Befund durch Versuche mit Glukoamylase und SI-Glas, die zeigen, daß nur eine relativ geringe Aktivität nach dem Waschprozeß an der Matrix verbleibt (vgl. Tab. 2). In weiteren Experimenten wurde das pU- und Temperaturverhalten von Glukoamylase, gebunden an MI/Cl-Glas und MI/OH-Glas, untersucht (Abb. 3 u. 4).

50

60

Temperatur f°C]

Abb. 3

70

Abb. 4

Abb. 3. £H-Verhalten von Glukoamylase gebunden an MI/OH-Glas o o ; GA gebunden an MI/Cl-Glas x x und von nativer Glukoamylase • •. Als Substrat wurde lösliche Stärke in 25 mM Azetatpuffer verwendet Abb. 4. Temperaturverhalten von GA gebunden an MI/OH-Glas o o ; GA gebunden an MI/Cl-Glas x x und nativer Glukoamylase • •. Die Inkubaktionszeit beim .Test betrug 6 min

Proteinfixierung an makroporöse Gläser

1005

Im Vergleich zum nativen Enzym weisen die immobilisierten Präparate ein verändertes p~R- und Temperaturverhalten auf. Aber auch bei MI/Cl-Glas-GA und MI/OH-Glas-GA — verglichen miteinander — beobachtet man unterschiedliche Eigenschaften, die mit geänderten Bindungsverhältnissen bzw. einer veränderten Konzentration geladener Gruppen (COO~) erklärt werden könnten. Das relativ breite, von p H 5,0—6,0 reichende ^H-Optimum des nativen Enzyms bleibt im Fall der Fixierung an den gemischt funktionalisierten MI/Cl-Träger erhalten, verschiebt sich jedoch um 1 Einheit nach dem sauren Bereich. Im Falle des MI/OH-Trägers wird ein scharfes ji>H-Optimum bei 5,0 gefunden. Das Temperaturoptimum ist beim MI/OH-Komplex um 5 °C und beim mischgebundenen System (MI/Cl-Komplex) um 10 °C im Vergleich zur nativen Glukoamylase nach niederen Temperaturen verschoben. Literatur Nature, Lond. 2 0 6 , 6 9 3 ( 1 9 6 5 ) [2] Z H D A N O V , S. P., B . G. B E L E N K I J U. E. V. K O R O M A L D I : J . Chromat. 7 7 , -149 (1973) [3] F. P. 2.177.782 [4] E. C. N. 25, 671 (1974) [ 5 ] W E E T A L L , H . H . in: Biomaterial Supports. Corning Biological Products Department, Medfield, Mass., USA. 1973 [6] L Y N N , M . in: Enzymology. Bd. 1 : Immobilized Enzymes, Antigens, Antibodies and Peptides. H. H. W E E T A L L (Hrsg.) D E K K E R , New York 1975 [7] T R O M M E R , W . E . , H. K O L K E N B R O C K U. G . P F L E I D E R E R : Hoppe-Seyler's Z . physiol. Chem. 3 5 6 , 1 4 5 5 ( 1 9 7 5 ) [ 8 ] W E E T A L L , H . H . : Science, N . Y . ; 1 6 6 , 6 1 5 ( 1 9 6 9 ) [ 9 ] L O W R Y , D . H . , N . J. R O S E B R O U G H , A . L . F A R R U. R . J. R A N D A L L : J. biol. Chem. 1 9 3 , [1] H A L L E R , W . :

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Summary J . F I S C H E R , W . H E Y E R , F . J A N O W S K I , F . W O L F , and A . S C H E L L E N B E R G E R : Immobilization of proteins on macroporous glasses involving maleinimide as the anchoring group

Macroporous glasses with pore sizes from 400—1000 Ä appropriate for protein binding were produced and characterized by a thermal demixing procedure and alkaline after treatment. To achieve a covalent binding capacity relative to proteins, t h e y-aminopropyl derivative was allowed to react with 4-maleinimido benzoylic chloride to give preparations containing, in addition to maleinimide residues, acid chloride structures for the protein binding. A preparation of 400 Ä pore size was tested for its protein binding capacity relative to bovine serum albumin and trypsin. Furthermore, the capacity of binding glucoamylase from Endomycopsis bispora in active form was studied.

65

Acta biol. med. germ., Bd. 36, Heft 7—8

Acta biol. med. germ., Band 36, Seite 1007—1018 (1977) Institut f ü r technische Chemie der Akademie der Wissenschaften der D D R , 705 Leipzig, D D R

Synthese und Eigenschaften trägerfixierter Enzyme VIII. Kinetische Untersuchungen über die Geschwindigkeit der Bindung von Enzymen an makroporöse Träger C H . FLEMMING, A . G A B E R T , M . GOMOLL u n d P . R O T H

(Eingegangen am 22. J a n u a r 1976; nach Revision am 2. Dezember 1976) Zusammenfassung Die Kinetik der Bindung der Enzyme Glukoseoxydase, Trypsin und Peroxydase sowie von Rinder-y-globulin an die makroporösen Träger Dialdehydzellulose, diazotiertes Aminopolystyrol, Akrolein-Akrylamid-Kopolymerisat und Isothiozyanatgruppen tragendes makroporöses Glas wurde untersucht. Empirisch wurde ermittelt, daß sich die Zunahme des Proteingehaltes und — sofern während der Fixierungsreaktion keine Inaktivierung des Enzyms eintritt — der enzymatischen Aktivität des Enzym-Träger-Komplexes in Abhängigkeit von der Reaktionszeit durch Sättigungskurven (Hyperbeln 1. Grades) beschreiben läßt, die nach geeigneter Transformation als Geraden dargestellt werden können. Dadurch wird es möglich, Proteingehalt oder spezifische Aktivität des Enzym-Träger-Komplexes zu jedem beliebigen Zeitpunkt während der Fixierungsreaktion zu errechnen. Aus den Schnittpunkten der erhaltenen Geraden mit der Ordinate bzw. mit der Abszisse läßt sich die maximale Proteinbindungskapazität bzw. die maximal erreichbare spezifische Aktivität und aus ihrer Neigung die Reaktionsgeschwindigkeit graphisch ermitteln. Wird bei Transformation f ü r die Darstellung der enzymatischen Aktivität des Enzym-Träger-Komplexes in Abhängigkeit von der Fixierungsdauer keine Gerade erhalten, so ist das der Hinweis auf eine partielle Inaktivierung des freien oder des bereits fixierten Enzyms. Aus den kinetischen Messungen folgt, daß in allen von uns untersuchten Fällen der chemischen Fixierung des Enzyms an den Träger ein adsorptives Gleichgewicht vorgelagert ist. Eine Begrenzung der Reaktionsgeschwindigkeit durch Diffusionserscheinungen, wie sie beim Beladen eines Ionenaustauschers auftritt, konnte nicht beobachtet werden. Einleitung

Während der chemischen Bindung eines Enzyms an einen wasserunlöslichen Träger erfolgt außer der Fixierung auch eine Inaktivierung des Enzyms; die einzelnen Reaktionen lassen sich schematisch folgendermaßen darstellen: Enzym (aktiv) + Träger 4- Reaktion 2

Enzym (inaktiv) + Träger

Reakt

'°"J> Enzym-Träger-Komplex (aktiv)

Reakt on

[ Reaktion 4

' ^ Enzym-Träger-Komplex (inaktiv)

Abkürzungen: GOD = Glukoseoxydase, P O D = Peroxydase, DAZ = Dialdehydzellulose, ITZ-Glas = y-Isothiozyanatopropyl-diäthoxysilylgruppen tragendes Glas, CP22 = Kopolymerisat aus Akrolein und Akrylamid, APS = Aminopolystyrol, D A P S = diazotiertes Aminopolystyrol. Definitionen: relative Aktivität = Aktivität des fix. Enzyms/Aktivität der gleichen Menge gelösten Enzyms; spezifische Aktivität = Aktivität der an 1 g Träger fixierten Enzymmenge/Aktivität von 1 mg gelöstem E n z y m ; Nutzungsgrad = am Träger fixierte Aktivität/ zur Fixierung eingesetzte Aktivität; Oxydationsgrad = Zahl der modifizierten Anhydroglukoseeinheiten/Gesamtzahl der Anhydroglukoseeinheiten 65*

1008

CH. FLEMMING, A . G A B E R T , M . GOMOLL, P .

ROTH

Daraus folgt, daß bei der Enzymfixierung die Reaktionsbedingungen so zu wählen sind, daß die Geschwindigkeiten der Reaktionen 2 und 4 möglichst gering gehalten werden, andererseits aber die Reaktion 1 mit genügend hoher Geschwindigkeit verläuft. Für die Optimierung der Enzymfixierung ist deshalb die Bestimmung der Reaktionsgeschwindigkeit, d. h. der Bindungskinetik, eine wesentliche Voraussetzung. Darüber hinaus gestattet die Kenntnis des Verlaufes der Reaktion zwischen Protein und Träger Rückschlüsse auf die für die Enzymbindung in Frage kommende Trägeroberfläche sowie auf die Affinität des Trägers zu den für die kovalente Bindung in Betracht kommenden Aminosäureresten des Proteins und weiterhin auf die zur kovalenten Bindung des Enzyms führenden spezifischen Wechselwirkungen beider Reaktionspartner. Um möglichst verallgemeinerungsfähige Aussagen zu erhalten, untersuchten wir die Kinetik der Bindung verschiedener Enzyme (Trypsin, Glukoseoxydase, Peroxydase) und einer y-Globulinfraktion an unterschiedliche makroporöse Matrizes (Zellulosepulver, synthetisches Kopolymerisat aus Akrolein und Akrylamid, Polystyrol, poröses Glas mit 2000 Ä Porenweite) mit verschiedenen funktionellen Gruppen (zum Halbazetal zyklisierte Dialdehydgruppen, isolierte Aldehydgruppen, Isothiozyanatgruppen, Diazogruppen). Unter makroporösen Trägern verstehen wir solche, deren durchschnittliche Porenweite ein Mehrfaches des Enzymdurchmessers beträgt. Material und Methoden Trypsin: Merck, Darmstadt (vom Rind, krist., lyophilisiert) bzw. Serva, Heidelberg (1 x krist., pharm., salzfrei); GOD: aus Penicillium notatum, V E B Arzneimittelwerk Dresden; P O D : aus Meerrettich, V E B Arzneimittelwerk Dresden; y-Globulin vom Rind: rein, Serva Entwicklungslabor, Heidelberg. Die Herstellung von Dialdehydzellulose (DAZ) aus Zellulosepulver (Schleicher und Schüll, Nr. 123) und von Isothiozyanatgruppen tragendem Glas (ITZ-Glas) aus makroporösem Glas (Corning Glass Works, Porenweite 2000 Ä) wurde in vorangegangenen Publikationen [1, 2] beschrieben. Das vernetzte Kopolymerisat aus Akrolein und Akrylamid (Charge CP 22) wurde nach einem Patent von B E R G E R et al. [ 3 ] sowie G O M O L L [ 4 ] hergestellt. Ausgangsmaterial für Aminopolystyrol (APS) bzw. diazotiertes Aminopolystyrol (DAPS) war ein im Hause hergestelltes, mit Divinylbenzol vernetztes Polystyrol-Perlpolymerisat vom Typ Moore J [5]. Aminierung und Diazotierung erfolgten in üblicher Weise (vgl. [6]). Über die Immobilisierung und die Aktivitätsbestimmung bei den freien und gebundenen Enzymen wurde bereits berichtet (Trypsin [1], GOD [7], POD [2]). Kinetische Messungen der Bindungsgeschwindigkeit: Die gepufferten Enzymlösungen wurden zu den im jeweils gleichen Puffer vorgequollenen Trägern gegeben, danach wurde sofort intensiv gerührt. Nach den entsprechenden Zeiten wurde aus der gut durchmischten Reaktionsmischung mit einer Pipette jeweils eine Probe entnommen und der Enzym-TrägerKomplex vom noch in Lösung befindlichen Protein auf einer Fritte abgetrennt. Vor der Aktivitätsbestimmung wurde der Enzym-Träger-Komplex gewaschen. Filtrat und Waschwasser wurden vereinigt und darin die enzymatische Aktivität bzw. der Proteingehalt nach Lowry bestimmt. Nähere Angaben über die eingesetzten Mengen und die Art der Pufferlösungen sind den Legenden zu den Abbildungen zu entnehmen. Ergebnisse

Kinetik der Fixierung an makroporöse Träger Die für die Enzymbindung in Betracht kommende Trägeroberfläche ist generell begrenzt. Die Geschwindigkeit der Trägerfixierung für ein Enzym wird deshalb

Fixierungskinetik von Enzymen an makroporöse Träger

1009

nicht nur durch die Konzentrationsabnahme des Enzyms in Lösung, sondern auch durch Verringerung der zur Reaktion befähigten Oberfläche des Trägers mit fortschreitender Fixierungsdauer geringer. In allen von uns untersuchten Fällen läßt sich die Fixierungsgeschwindigkeit durch folgende empirisch ermittelte Gleichung beschreiben:

At = zur Zeit t am Träger gebundene Proteinmenge, A oo — zur Zeit t = oo am Träger gebundene Proteinmenge, t = Fixierungsdauer, b = Konstante (Zeit/Menge).

Der Wert A ^ ist entweder durch die zur Fixierung eingesetzte Proteinmenge oder durch die zur Bindung befähigte Trägeroberfläche' limitiert. Übersteigt das Proteinangebot die Proteinbindungskapazität des Trägers, wird für A ^ ein konstanter Wert erhalten, der der zur Enzymbindung befähigten Oberfläche des Trägers direkt proportional ist und somit eine Eigenschaft des Trägers darstellt. Wird dagegen zur Fixierung weniger Protein eingesetzt als der Träger zu binden in der Lage ist, entspricht der Wert A^ der eingesetzten Proteinmenge und erlaubt keine Rückschlüsse auf die maximale Bindungskapazität des Trägers. Die Konstante b ist ein indirektes Maß für die Bindungsaffinität zwischen den Reaktionspartnern; ein geringer J-Wert entspricht einer hohen Affinität des Trägers zum Enzym. (In der Diskussion wird nochmals auf Gl. (1) eingegangen).— Durch Transformation von Gleichung 1 in Gleichung 2 und 3 W bzw. tj At t

J1

Aä[j_ b-Ar

b

(3)

werden Geraden erhalten, die eine graphische Ermittlung von b und Am gestatten. Bei ausreichender Genauigkeit genügen demzufolge 2 Messungen, um die zu einem beliebigen Zeitpunkt am Träger gebundene Enzymmenge ermitteln zu können. Wird während der Fixierungsreaktion weder das freie noch das gebundene Enzym inaktiviert, kann für At bzw. 4 M statt der am Träger gebundenen Proteinmenge auch die Aktivität des Enzym-Träger-Komplexes eingesetzt werden. Kinetik

der Fixierung

von Glukoseoxydase

an

Dialdehydzellulose

An 1 g des bei diesen Versuchen eingesetzten DAZ-Pulvers läßt sich maximal eine Aktivität entsprechend 3,6 mg GOD binden [7]. Die Affinität des Trägers zum Enzym ist bei p H 7,0 relativ gering, so daß Kupplungszeiten von mehreren Stunden notwendig sind. Die verwendete GOD wird unter den Kupplungsbedingungen innerhalb der untersuchten Reaktionszeit nicht inaktiviert. Abb. 1 a zeigt die Zunahme der enzymaiischen Aktivität des GOD-DAZ-Komplexes in Abhängigkeit von der Kupplungszeit. Der Kurvenverlauf als Gerade in Abb. 1 b und Abb. 1 c gestattet die Ermittlung des Wertes ACXJ, d.h. der maximalen Bindungskapazität des Trägers für dieses Enzym. Dieser liegt bei 3,8 bzw. 3,6 mg Enzymaktivität/g DAZ, obwohl nach

1010

C H . F L E M M I N G , A . G A B E R T , M . GOMOLL, P . R O T H Aktivität

Aktivität

Abb. 1. Zunahme der enzymatischen Aktivität eines GOD-DAZ-Komplexes in Abhängigkeit von der Reaktionszeit. a) normale; b) doppelt reziproke Darstellung nach Gl. 2; c) Transformation nach Gl. 3. 100 mg GOD wurden mit 1 g DAZ {ß = 0,1) in 62,5 ml 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,0, bei 3 S °C gerührt

40 Std. nur die Aktivität von 1,9 mg/g DAZ erreicht wurde. Durch Verminderung des Reaktionsvolumens, Erhöhung des Enzymangebotes und Verlängerung der Reaktionszeit konnten in nachfolgenden Versuchen tatsächlich Enzym-TrägerKomplexe erhalten werden, deren Aktivität mit 3,6 mg GOD/g DAZ den theoretisch ermittelten Grenzwert erreichte. Kinetik der Fixierung von Trypsin an Dialdehydzellulose Im Unterschied zur GOD wird das für diese Versuche eingesetzte Trypsin der Fa. Merck unter den Kupplungsbedingungen (p~K 9,0) inaktiviert, wobei die Inaktivierung des gelösten Enzyms in einem weiten Bereich einem Geschwindigkeitsgesetz 1. Ordnung (Halbwertzszeit 220 min) gehorcht. 1 g DAZ bindet maximal 12 mg Trypsin [1], Die Affinität des Trägers ist bei _/>H 9,0 so hoch, daß die chemische Bindung des Trypsins in ca. 5 Std. beendet ist. V e r ä n d e r u n g des V e r h ä l t n i s s e s E n z y m zu T r ä g e r Die graphische Darstellung von 1/Proteingehalt gegen 1/Reaktionszeit ergibt eine Gerade (s. Abb. 2b), dagegen zeigt die Auftragung 1/Aktivität gegen 1/Reaktionszeit in Ordinatennähe eine konkave Biegung (s. Abb. 2b), die typisch für die Inaktivierung des gelösten Enzyms ist. Diese Abweichung von der Geraden ist durch Bindung von inaktiviertem Enzym am Träger bedingt und wird um so deutlicher, je länger die für die vollständige' Bindung des Enzyms erforderliche Reaktionszeit sein muß. Die Optimierung der Reaktionsbedingungen ist von folgenden Gesichtspunkten abhängig: Eine besonders lange Reaktionszeit ist notwendig, wenn gerade so viel Enzym angeboten wird, wie vom Träger gebunden werden kann, d. h. im vorliegenden Fall 12 mg Trypsin/g DAZ. Bei den erforderlichen langen Reaktions-

Fixierungskinetik von Enzymen an makroporöse Träger

1011

Zeiten macht sich die Inaktivierung des Enzyms und somit die Bindung von inaktivem Trypsin am Träger am stärksten bemerkbar. Bei vollständiger Bindung von 10 mg Trypsin/g DAZ müßte der Träger eine Aktivität aufweisen, die der von 4,0—4,2 mg freiem Trypsin entspricht. Als Folge der Inaktivierung des gelösten Enzyms wurde lediglich ein Enzym-TrägerKomplex mit einer Aktivität, die der von 3,0 mg Trypsin entspricht, erreicht. Durch Verminderung des Reaktionsvolumens von 350 ml auf 5 ml und Erniedrigung des Wertes von 9,0 auf 7,5 konnten bei gleichem Enzym-TrägerVerhältnis Komplexe mit einer Aktivität von 4 mg Trypsin/g DAZ erhalten werden. Durch Vergrößerung des Enzymangebotes (unter sonst gleichen Versuchsbedingungen) steigt die Fixierungsgeschwindigkeit (s. Abb. 2); man erhält Enzym-Träger-Komplexe mit hoher spezifischer Aktivität. In diesem Fall wird aber nur ein Teil der eingesetzten enzymatischen Aktivität an den Träger überführt und der Nutzungsgrad sinkt. Wird das Verhältnis Träger zu Enzym erhöht, steigt die Fixierungsgeschwindigkeit ebenfalls an, wodurch die Bindung von inaktiviertem Trypsin verringert wird. Wegen des geringen Proteingehaltes der Enzym-Träger-Komplexe ist allerdings deren spezifische Aktivität gering, obwohl der Nutzungsgrad hoch liegt. Wie bereits berichtet wurde, ist die relative Aktivität des fixierten Trypsins bei niedrigem Proteingehalt höher als bei hohem [1]. Auch diese Tatsache muß bei einer optimalen Reaktionsführung der Enzymfixierung mit berücksichtigt werden.

Abb. 2. Zunahme des Proteingehaltes und der enzymatischen Aktivität von Trypsin-DAZKomplexen in Abhängigkeit von der Reaktionszeit. a) normale; b) doppelt reziproke Darstellung nach Gl. 2; c) Transformation nach Gl. 3o Aktivität Probe 1; • Aktivität Probe 2; • Proteingehalt Probe 1; • Proteingehalt Probe 2. 10 mg (Probe 1) bzw. 50 mg (Probe 2) Trypsin wurden mit 1 g DAZ (ß = 0,1) in 350 ml 0,1 M Boratpuffer, 9,0, bei 25 °C gerührt

1012

CH. F L E M M I N G , A . G A B E R T , M . GOMOLL, P .

ROTH

V e r ä n d e r u n g des O x y d a t i o n s g r a d e s der DAZ Aus den vorausgegangenen Versuchen ließ sich ableiten, daß im Falle eines Enzyms, das unter Kupplungsbedingungen in ungebundenem Zustand inaktiviert wird, der Nutzungsgrad dadurch gesteigert werden kann, daß man bei konstantem Enzym/Träger-Verhältnis das Reaktionsvolumen möglichst gering hält. Es galt jetzt zu untersuchen, welchen Einfluß der Oxydationsgrad ß der DAZ auf die Fixierungsgeschwindigkeit ausübt. Die Geschwindigkeit der Bindung von Trypsin an DAZ steigt mit zunehmendem Oxydationsgrad des Trägers an, wobei bei niedrigen ß-Werten (ß < 0 , 1 ) die Reaktionsgeschwindigkeit weniger, bei höheren ^-Werten stärker steigt als es der zunehmenden Zahl der Dialdehydgruppen entspräche. In Tab. 1 sind die für die Konstanten A ^ und b sowie für die Halbwertszeit r erhaltenen Werte zusammengestellt. Tabelle 1 Kinetische Konstanten A«, und b, Halbwertzeit x der'Fixierungsreaktion sowie initiale Bindungsgeschwindigkeit für die Bindung von Trypsin an DAZ unterschiedlichen Oxydationsgrades ß Oxyd.grad

ß 0,001 0,01 0,1 0,2

Protein 1 Aqo [mg/g] (9,3) 9,5 12,0 17,5

Aktivität 1

b [mg/min]

r [min]

V fix 2

(%)

Aoo [mg/g]

16,1 6,3 2,0 0,8

(150) 60 24 14

12,5 31,5 100 252

1,08 1,59 4,44 8,13

b [mg/min] 89,3 36,0 3,6 1,13

r [min]

Vfix2

90 57 15,8 9,2

4 10 100 317

(%)

Fixierungsbedingungen wie Probe 2 in Abb. 2. Initiale Bindungsgeschwindigkeit (extrapoliert auf t = 0); die für DAZ ß = 0,1 erhaltenen Werte wurden gleich 100% gesetzt. 1

2

Die Ursache für dieses zunächst unerwartete Verhalten dürfte sowohl in einer Veränderung der Mizellenstruktur des Trägers durch die Einwirkung von Perjodat als auch in einer veränderten Wechselwirkung des Trypsins mit hochsubstituierter gegenüber niedersubstituierter DAZ liegen. Die sehr geringe Aktivitätszunahme bei den niedrig substituierten Zellulosederivaten ist einerseits dadurch bedingt, daß die relative Aktivität des fixierten Trypsins vom Oxydationsgrad der DAZ abhängig ist, andererseits sind im Falle der niedrig substituierten DAZ so lange Reaktionszeiten erforderlich (vergl. Tab. 1), daß die Inaktivierung des Enzyms signifikant wird und beträchtliche Mengen inaktiviertes Trypsin am Träger gebunden werden. Demgegenüber konnte in keinem Fall eine Inaktivierung des fixierten Trypsins unter Kupplungsbedingungen beobachtet werden. Kinetik der Fixierung Akrolein und Akrylamid

von Trypsin (CP 22)

an

ein

synthetisches

Kopolymeres

aus

Das von uns hergestellte und in diesen Versuchen eingesetzte Kopolymere aus Akrolein und Akrylamid [3] ist seiner Struktur nach ein poröser, in wäßriger Lösung quellender Träger. CP 22 ist in der Lage, maximal 500 mg Trypsin (der

Fixierungskinetik von Enzymen an makroporöse Träger Proteingehalf [mg/g CP22]

1

/Proteingebalt

1 Ol 3

Proteingehalt Reaktionszeit

a) normale; b) doppelt reziproke Darstellung nach Gl. 2; c) Transformation nach Gl. 3. o pH 8,0; • pH 9,0. 357 mg Trypsin wurden mit 1 g CP 22 in 1 50 ml 0,1 M Boratpuffer, pH 8,0 bzw. 9,0, bei Zimmertemperatur (ca. 23 °C) gerührt

Fa. Serva)/g Träger zu binden [4]. Die chemische Affinität des Trägers zum Trypsin ist mit der von DAZ vergleichbar. Im Unterschied zur kovalenten Bindung von Trypsin an DAZ, die mit steigendem j^H-Wert schneller verläuft, durchläuft die Fixierungsgeschwindigkeit dieses Enzyms an CP 22 ein Maximum bei pH. 8,0. Bei pH 9,0 wurden unter sonst gleichen Bedingungen Enzym-Träger-Komplexe mit geringerer Aktivität als bei pH 8,0 erhalten, da die Geschwindigkeit der Reaktion 1 verkleinert, die der Reaktion 2 dagegen vergrößert wird (s. Einleitung). Wie aus Abb. 3 hervorgeht, liegt der Endwert unabhängig vom gewählten pH-Wert während der Fixierungsreaktion bei 375 mg Protein/g CP 22. Dieser Wert entspricht der eingesetzten Enzymmenge und läßt keine Rückschlüsse auf die Bindungskapazität des Trägers zu. Die maximale Bindungskapazität von CP 22 konnte nur durch Zugabe einer höheren Proteinmenge (1000 mg/g) ermittelt werden [4]. Kinetik der Fixierung von Peroxydase an y-Isoihiozyanatopropyl-diäthoxysilyl-glas Die Affinität des von uns verwendeten ITZ-Glases zu Proteinen ist so hoch, daß exakte Messungen der Bindungsgeschwindigkeit der von uns an ITZ-Glas fixierten Enzyme [2] mit Ausnahme von POD nicht durchgeführt werden konnten. Unter den Kupplungsbedingungen gelang die Bindung von maximal 2,6 mg POD/g ITZ-Glas. Die Reaktion ist b e i ^ H 7,5 in weniger als 1 Std. beendet. Der Einsatz eines Trägers auf Glasbasis sollte zeigen, ob die bei den organischen Trägern ermittelte Kinetik der Enzymfixierung auch Gültigkeit besitzt, wenn das Enzym an einen anorganischen makroporösen Träger — der Porendurchmesser von 2000 Ä beträgt ein Vielfaches des Durchmessers des Enzymmoleküls — gebunden wird. Abb. 4 belegt, daß die für organische Trägermaterialien ermittelte Beziehung (Gleichung 1) auch für makroporöse Glasderivate gilt.

1014

CH. FLEMMING, A . GABERT, M . GOMOLL, P .

ROTH

(a n o r m a l e ; b) d o p p e l t reziproke D a r s t e l l u n g n a c h Gl. 2; c) T r a n s f o r m a t i o n n a c h Gl. 3. 7 m g P O D w u r d e n m i t 1 g ITZ-Glas in 50 ml 0,1 M P h o s p h a t p u f f e r , pH 7,5, bei Z i m m e r t e m p e r a t u r (ca. 23 °C) g e r ü h r t

Kinetik der Bindung von Rinder-y-globulin an Aminopolystyrol und an diazotiertes A minopolystyrol Bei Untersuchungen zur Fixierung einer Antikörper enthaltenden y-Globulinfraktion an verschiedene Träger [6] wurde festgestellt, daß das in diesen Versuchen eingesetzte APS y-Globulin so fest adsorptiv band, daß selbst mit 8 M Harnstofflösung keine Desorption möglich war. Die kinetische Untersuchung dieser Reaktion erbrachte das überraschende Ergebnis, daß die Affinität des zur kovalenten Bindung befähigten DAPS geringer Proteingehalt

Proteingehalt

A b b . 5. Z u n a h m e der f i x i e r t e n y-Globulinmenge bei A d s o r p t i o n a n A P S ( • ) bzw. bei B i n d u n g a n D A P S (o). a) n o r m a l e ; b) d o p p e l t reziproke D a r s t e l l u n g n a c h Gl. 2; c) T r a n s f o r m a t i o n n a c h Gl. 3. 200 m g y-Globulin w u r d e n m i t 1 g T r ä g e r in 100 m l 0,1 M P h o s p h a t p u f f e r , pH 10,5, d e r 0 , 9 % i g an NaCl war, u n t e r E i s k ü h l u n g g e r ü h r t

Fixierungskinetik von Enzymen an makroporöse Träger

1015

war als die des zur Adsorption fähigen APS, während für beide Träger die gleiche maximale Bindungskapazität von 140mg/g Styrolderivat ermittelt wurde (Abb. 5). Diskussion

Bisher untersuchte lediglich MESSING [8] die Kinetik der Enzymbindung am Beispiel der Adsorption verschiedener Enzyme an makroporöses Gias. In diesen Untersuchungen wurde eine Abhängigkeit der Adsorptionsgeschwindigkeit vom Molekulargewicht des Proteins und von dessen isoelektrischem Punkt gefunden. Spezielle kinetische Untersuchungen über die Reaktion von Enzymen mit Trägern wurden bisher nicht publiziert. Bereits früher [10] konnten wir bei der mit sehr geringer Geschwindigkeit verlaufenden chemischen Bindung von POD an DAZ beobachten, daß der chemischen Bindung zunächst ein Adsorptionsgleichgewicht an der Trägeroberfläche vorgelagert ist, für das in erster Näherung die Langmuirsche Adsorptionsisotherme gelten müßte:

bzw.

= kr S+r "c 2 - =

(4)w + -

(5)

a = am Träger adsorbierte Proteinmenge; c = Konzentration des Proteins in Lösung; kx und kz = Konstanten.

Nimmt man an, daß die Geschwindigkeit der kovalenten Bindung der am Träger adsorptiv gebundenen Proteinmenge direkt proportional ist, d. h. k3-a

(6)

/ = kovalent fixierte Proteinmenge; t = Reaktionszeit; k3 — Konstante für Reaktion 1. Ordnung,

so müßte sich die initiale Bindungsgeschwindigkeit (d. h. die Bindungsgeschwindigkeit beim Beginn der Reaktion) in Abhängigkeit von der Proteinkonzentration durch einen der Langmuirschen Adsorptionsisotherme analogen Ausdruck beschreiben lassen. Diese Annahme konnte durch Messung der initialen Bindungsgeschwindigkeit von Trypsin an DAZ bestätigt werden. Die Bindungsgeschwindigkeit eines Proteins hängt demzufolge außer von der Affinität des Trägers zum Protein, von den Reaktionsbedingungen und von sterischen Faktoren auch von der Lage des adsorptiven Gleichgewichts ab. Die kovalente Bindung des Enzyms verläuft also — wie aus den kinetischen Messungen folgt — in-zwei Schritten: Enzym + Träger ^ adsorptiv gebund. Enzym —Enzym-Träger-Komplex Die Geschwindigkeit, mit der sich das adsorptive Gleichgewicht einstellt, ist bei den hier beschriebenen Fällen höher als die der im zweiten Schritt folgenden kovalenten Bindung des adsorbierten Proteins. Bei den für die Einstellung des adsorptiven Gleichgewichts zu kurzen Reaktionszeiten ergeben sich Meßwerte,

1016

CH. FLEMMING, A. GABERT, M. GOMOLL, P. ROTH Fixierungsgeschwindigkeit [% der Maximatgeschw] 100

0,01 *

/ 0

0,1

0,2 QJ Enzymkonz. [ mg/ml]

0,4

0

^o

40

so

so

Abb. 6. Fixierungsgeschwindigkeit von Trypsin an DAZ in Abhängigkeit von der Enzymkonzentration, a) normale; b) doppelt reziproke Darstellung

die vom erwarteten Kurvenverlauf abweichen. Aus diesen Abweichungen läßt sich ableiten, daß nach Reaktionszeiten zwischen 10 und 100 min das adsorptive Gleichgewicht annähernd erreicht ist. In der Literatur finden sich vergleichbare Angaben [dl]. Bei der mit hoher Geschwindigkeit verlaufenden Bindung von Trypsin, Aminoazylase und Glukoamylase an ITZ-Glas [2] konnten allerdings keine exakten kinetischen Messungen durchgeführt werden. Ein Vergleich der von uns erhaltenen Ergebnisse mit den kinetischen Vorgängen am Ionenaustauscher, für die im hier in Betracht kommenden Fall der Filmdiffusion (7)

gelten müßte [9], zeigt, daß sich die Kinetik der Proteinbindung nicht durch diese Formel beschreiben läßt. Für die Gültigkeit von Gleichung 7 ist Voraussetzung, daß die Geschwindigkeit des Ionenaustausches nur durch die Diffusion, nicht aber durch die Geschwindigkeit der chemischen Reaktion begrenzt ist. Diese Voraussetzung gilt folglich bei allen hier beschriebenen Beispielen nicht. Der Vorgang der Proteinfixierung an einen makroporösen Träger unterscheidet sich also grundlegend vom Beladen eines Ionenaustauschers. Die Geschwindigkeit des Ionenaustausches wird im Falle der Filmdiffusion im wesentlichen durch die Diffusion der Ionen zur Matrix bestimmt, während bei der Fixierung makromolekularer Proteine die Geschwindigkeit der chemischen Reaktion und nicht die der Diffusion limitierend wirkt. Wir konnten zeigen, daß sich die Enzymbindungsgeschwindigkeit in allen untersuchten Fällen, auch bei der Fixierung der stark verunreinigten Enzympräparate GOD und POD, mit ausreichender Genauigkeit durch die empirisch ermittelte Gleichung [1] beschreiben läßt. Auch die Ergebnisse von BROWN und JOYEAU [12] an Polyaldehydträgern sowie von TAKASAKI [13] an funktionalisierten Mikro-

1017

Fixierungskinetik von Enzymen an makroporöse Träger

organismenzellen — in der Literatur finden sich nur wenige und zudem kaum ausführliche Angaben zur Enzymbindungsgeschwindigkeit — ergeben in der doppelt reziproken Darstellung eine Gerade und bestätigen damit die hier mitgeteilten Befunde. Zu Gleichung 1 läßt sich auch eine „Halbwertszeit" r definieren, bei der At = Ar = 0,5^4=0 ist. t = A„-b (8) Für ein 75%iges bzw. 90%iges Erreichen des Endwertes A^ sind Reaktionszeiten erforderlich, die die bzw. 9fache Halbwertszeit betragen. Aus den graphischen Darstellungen der transformierten Gleichungen 2 und 3 lassen sich weitere Rückschlüsse auf die Eigenschaften der fixierten Enzyme ziehen. Bei der Darstellung der enzymatischen Aktivität des Enzym-TrägerKomplexes deutet ein Abweichen von der Geraden auf Inaktivierung des Enzyms unter Kupplungsbedingungen hin. Sinkt die relative Aktivität des fixierten Enzyms mit steigendem Proteingehalt des Enzym-Träger-Komplexes, so schneiden sich bei der graphischen Darstellung nach Gleichung 2 die Geraden, die den Proteingehalt und die enzymatische Aktivität des Enzym-Träger-Komplexes widerspiegeln, nicht auf der Abszisse, sondern im 3-Quadranten bzw. verlaufen bei Darstellung nach Gleichung 3 nicht mehr parallel. In Abb. 2 überlagern sich beide Fälle: die relative Aktivität des fixierten Trypsins sinkt mit steigendem Proteingehalt des Enzym-Träger-Komplexes (gepunktete Fortführung der Kurve), außerdem erfolgt während der Fixierung eine Inaktivierung des Enzyms, die bei hohen Reaktionszeiten zu einer beträchtlichen Abweichung von der Geraden führt. Untersuchungen darüber, inwieweit die hier mitgeteilten Befunde auch für die Affinitätschromatographie zutreffen, sind im Gange. Literatur [ 1 ] F L E M M I N G , CH.,

[2]

F L E M M I N G , CH.,

A. A.

G A B E R T U. P . R O T H : G A B E R T U.

H.

Acta biol. med. germ. 30, 1 7 7 (1973) Acta biol. med. germ. 32, 135 (1974)

WAND:

[ 3 ] B E R G E R , R . , A . G A B E R T , M . G O M O L L , G . L A N G H A M M E R U. P . R O T H : D D R - W P

101

168

(1973) [4]

[5] [6] [7] [8] [9] [10]

[11] [12]

[13]

a.: Publikation in Vorbereitung J. C.: J . Polym. Sei. A2, 835 (1964) M O R G E N S T E R N , H . : Diplomarbeit, Karl-Marx-Universität Leipzig, Math.-naturwiss. F a k u l t ä t 1972 F L E M M I N G , CH., A. G A B E R T U. P. R O T H : Acta biol. med. germ. 33, 15 (1974) M E S S I N G , R . : The Brewers' Dig. 4 6 (Dez.), 60 (1971) H E L F F E R I C H , F . : Ionenaustauscher. Bd. 1 ; Grundlagen — S t r u k t u r - Herstellung — Theorie. Verlag Chemie, Weinheim 1959 F L E M M I N G , CH., A. G A B E R T u. P . R O T H : Acta biol. med. germ. 32, 1 2 7 ( 1 9 7 5 ) J A M E S , L. K., U. L. G. A U G E N S T E I N : Adv. Enzymol. 28, 1 (1966) B R O W N , E „ U . R . J O Y E A U : Makromolek. Chem. 1 7 5 , 1 9 6 I ( 1 9 7 5 ) TAKASAKI, Y.: BRD-OS 2410693 (12. 9. 74) G O M O L L , M . U.

MOORE,

Summary A. G A B E R T , M. G O M O L L , and P. R O T H : Synthesis and properties of insolubilized enzymes. V I I I . Kinetic studies of the binding rate of enzymes to macroporous carriers The kinetics of binding the enzymes glucose oxidase, trypsin, and peroxidase and also bovine y-globulin to the macroporous carriers dialdehyde cellulose, diazotized amino polystyrene, CH. FLEMMING,

1018

CH. FLEMMING, A . GABERT, M . GOMOLL, P .

ROTH

acrolein-acrylamide copolymer, and isothiocyanate groups carrying CPG-glass was studied. I t was found empirically t h a t the increase in protein content and — if there occurred no inactivation of enzyme during binding reaction — of enzymatic activity of t h e enzymecarrier complex with the reaction time can be described by saturation curves (first order hyperbolas), which represent straight lines after suitable transformation. Thereby it is possible to calculate protein content or specific activity of the enzyme-carrier complex for any m o m e n t during binding reaction. From intercepts of t h e obtained straight lines with the ordinate and with the abscissa, respectively, one can determine the m a x i m u m binding capacity and t h e m a x i m u m specific activity, and from their slope the reaction rate can be obtained. If there result no straight lines for plotting enzymatic activity of the enzyme-carrier complex against binding time after transformation, then this is an indication for partial inactivation of t h e free or already insolubilized enzyme. F r o m kinetic measurements it is concluded t h a t in all cases studied by us the preceding stage in chemical fixation of t h e enzyme to carrier is an adsorption equilibrium. Limitation of reaction rate by diffusion as in loading an ion exchanger could not be observed.

Acta biol. med. germ., Band 36, Seite 1019—1026 (1977) Physiologisch-Chemisches Institut der Karl-Marx-Universität, 701 Leipzig

Purification and properties of pig kidney glutamate dehydrogenase NGUYEN

Quoc

KHANG, H . - J . BOHME,

and

E.

HOFMANN

(Received October 29, 1976) Summary Glutamate dehydrogenase from pig kidney has been purified to homogeneity by means of affinity chromatography on matrix bound Cibacron Blue F3G-A and gel chromatography on Sepharose 6B. The enzyme exhibits allosteric properties with t h e substrates a-ketoglutarate, ammonium, and NADH, respectively. G T P is a strong inhibitor which strengthened t h e cooperative interactions between the ammonium binding sites. A D P as an activator relieves t h e inhibition b y GTP. Like glutamate dehydrogenase from bovine liver, glutamate dehydrogenase f r o m pig kidney shows the ability of self-association, too. The sedimentation coefficient increases from 13.5 S a t 0.07 mg protein/ml t o 19.4 S a t 1.32 mg protein/ml. In t h e sodium dodecylsulphate gel electrophoresis the enzyme migrates as a single band with a molecularweight of 51 000. Introduction

Glutamate dehydrogenase (EC 1.4.1-3) has been isolated in homogeneous and partly even in crystalline form from a variety of sources (see review of SMITH et. al. [1]). In dependence on its biological origin the enzyme has been found to differ in various kinetic and molecular properties. Animal glutamate dehydrogenase reacts both with NAD(H) and NADP(H), shows the property of self-association and may be allosterically activated or inhibited by a series of nucleotides. On the other hand, the enzyme of nonanimal origin is highly specific for either NAD(H) or NADP(H), respectively, is insensitive towards purine nucleotides and does not exhibit any tendency to associate. Bovine liver glutamate dehydrogenase, being the best studied enzyme of this group, is a hexamer with a molecular weight of 330000 [2], the association of which depends on the protein concentration as well as on the presence of substrates and allosteric ligands. Little is known about the kinetic properties of the isolated kidney glutamate dehydrogenase and their modulation by allosteric effectors. The enzyme is believed to be involved in the renal regulation of metabolic acidosis by taking part in the ammonia generating reactions. To our knowledge, until now only one paper deals with kidney glutamate dehydrogenase, which describes the immunological properties of the crystallized enzyme from rat [3]. In the present communication the isolation of homogeneous pig kidney glutamate dehydrogenase by means of affinity chromatography with Cibacron Blue F3G-A as the crucial purification step and moreover the basic kinetic and molecular properties of the enzyme are described. Dedicated to Prof. Dr. Dr.

E . STRACK

on t h e occasion of his

80TH

birthday

1020

N . Q. KHANG, H . - J . BOHME, E . HOFMANN

Materials and methods Reagents ADP, GTP, and bovine liver glutamate dehydrogenase as well as muscle phosphofructokinase, pyruvate kinase, hexokinase, lactate dehydrogenase, aldolase, and /3-galactosidase used as references for gel chromatography and electrophoretic experiments were purchased from Boehringer Mannheim GmbH. a-Ketoglutaric acid, sodium dodecyl sulphate, Coomassie Brilliant Blue G-250, and the reagents for polyacrylamide gel electrophoresis were obtained from Serva, Heidelberg. Sepharose 4B, Sepharose 6B, and Sephadex G-200 were Pharmacia (Uppsala) products. NADH was obtained from V E B Arzneimittelwerk Dresden, and Cibacron Blue F3G-A from Ciba-Geigy AG, Basel. Other materials The pig kidneys were obtained from V E B Fleischkombinat Leipzig within two hours after slaughtering and were kept frozen at — 20 °C until used. Cibacron Blue F 3 G - A substituted Sephadex G - 2 0 0 was pepared according to B O H M E et al. [4]Buffers for enzyme purification Buffer A: 100 mM potassium phosphate, ^ H 8.0, 2 mM 2-mercaptoethanol, 1 m M E D T A ; Buffer B : 25 mM potassium phosphate, pH 8.0, 2-mercaptoethanol, 0.5 mM E D T A ; Buffer C: 50 ml potassium phosphate, pH 8.0, 5 mM 2-mercaptoethanol, lmM ammonium sulphate; Buffer D : 100 mM potassium phosphate, pH 8.0, 5 mM 2-mercaptoethanol, 1 mM EDTA, 1 M ammonium sulphate. Measurement

of enzyme activity and determination

of protein

concentration

The activity of glutamate dehydrogenase was determined by recording the decrease in absorbance at 334 nm and 25 °C in an Eppendorf-Photometer. The assay mixture in a final volume of 1 ml contained: 50 mM Tris-HCl, oH 7.5, 50 mM (NH 4 ) 2 S0 4 , 0.5 mM a-ketoglutarate, 0.2 mM NADH, and 1 mM ADP. One unit of glutamate dehydrogenase activity is defined as the amount of enzyme that converts 1 (imol of substrate per minute under the conditions of the assay. Protein concentrations were determined either by the method of J A N A T O V A et al. [5] with human serum albumin as standard or by measuring the absorbance at 269 nm by assuming an absorbance of 0-97 per mg of enzyme [6]. Sodium dodecyl sulphate

electrophoresis

Sodium dodecyl sulphate gel electrophoresis was performed according to W E B E R and O S B O R N [7], The gels were stained with 0.25% Coomassie Brilliant Blue G-250 in methanol/acetic acid/water (60/25/15; v/v/v) [8]. Isoelectrofocusing Column electrofocusing experiments were carried out by applying an L B K 8100—10 column. A pH 3 — 10 glycerol stabilized gradient was used at 4 °C and 600 V. Results

Purification

of glutamate dehydrogenase

All stages of the isolation procedure were carried out at 4 °C. After removal of fat, the pig kidneys (usually 500 g) were passed through a precooled meat grinder and suspended in two parts of buffer A. After stirring for two hours the mixture was centrifuged for 50 min at 20000 X g and the insoluble residue discarded. The yellowish supernatant was diluted with buffer B

Properties of kidney glutamate dehydrogenase

1021

(about 40fold) and poured into a suspension of 2 1 Cibacron Blue F3G-A substituted Sephadex G-200 (about 50 g dry weight). The mixture was stirred for 30 min. Then the gel was separated by filtration through a Biichner funnel and washed until the filtrate was free of protein. For elution of the adsorbed glutamate dehydrogenase the gel was suspended in buffer A, containing 2 M ammonium sulphate, stirred for further 30 min, filtered by suction and washed with a small volume of the same buffer. From the combined filtrates the enzyme was collected by ammonium sulphate precipitation (80% saturation). The precipitate was dissolved in buffer C and the protein concentration adjusted to about 18—20 mg/ml. Then, the protein was applied to a Sepharose 6 B column (5 X 100 cm), previously equilibrated with buffer C. The elution pattern is illustrated in Fig. 1 A. The fractions containing glutamate dehydrogenase activity were combined and the protein was precipitated by ammonium sulphate. The enzyme was collected by centrifugation and rechromatographed on Sepharose 6B with buffer D as eluant. Under these conditions glutamate dehydrogenase is eluted near the void volume of the column (Fig. IB).

Fraction no. Fig. 1. Chromatography of kidney glutamate dehydrogenase on Sepharose 6B. A) First chromatography (elution with buffer of low ionic strength) ; B) second chromatography (elution with buffer of high ionic strength). Absorbance at 280 nm, o o glutamate dehydrogenase activity, • • phosphofructokinase activity 66

Acta biol. med. germ., Bd. 36, Heft 7—8

1022

N . Q . KHANG, H . - J . BÔHME, E . HOFMANN

Table 1 Purification scheme of pig kidney glutamate dehydrogenase. Starting material : 500 g pig kidney Step

Protein (mg)

Activity (units)

Extract Affinity chromatography 1. Sepharose 6B 2. Sepharose 6B

34600 1130 SI 12

14 560 5 740 4320 2 300

Specific activity Purification (units/mg) (-fold) 0.42 5-1 84.8 191-7

1 12 202 456

Yield

(%) 100 40 30 16

After this step, the enzyme has been found to sediment as a single peak in the analytical ultracentrifuge and as being homogeneous in sodium dodecyl sulphate gel electrophoresis. It possesses a specific activity of 170—200units/mg protein and is stable at 4 °C for more than one year. A summary of the purification procedure is given in Table 1. General kinetic

properties

At pYi 7.5 and in the absence of ADP the enzyme exhibits sigmoidally shaped concentration velocity curves, when the substrates a-ketoglutarate, NADH, and ammonium, respectively, are varied. The calculated Hill-coefficients have been found to be in the range of 1.2 to 2.8. At 40 mM ammonium and in the presence of 0.05 mM NADH the Hill-coefficient for a-ketoglutarate amounts to 1.3 and increases to 2.8 when NADH is raised to 0.2 mM. The apparent Michaelis-constant for a-ketoglutarate (K M = 0.21 mM) was found to be independent on the concentration of the two other substrates, the apparent Michaelis-constant for NADH, however, increases with increasing ammonium concentrations. At 0.5 mM a-ketoglutarate and in the presence of 40 mM, 100 mM, and 200 mM ammonium apparent K M -values for NADH of 0.03 5 mM, 0.043 mM, and O.O63 mM, respectively, have been found. The ammonium concentration required for half-maximum velocity depends on the NADH as well as on the a-ketoglutarate concentration. Both substrates lower significantly the affinity of kidney glutamate dehydrogenase to ammonium ions (Table 2). At higher concentrations all three substrates cause a slight inhibition of the enzyme. Table 2 Dependence of the K^-value for ammonium on the concentration of NADH and a-ketoglutarate, respectively, at pH 7.5 NADH (mM)

a- Ketoglutarate (mM)

KM for ammonium (mM)

0.2 0.05 0.5 0.2 0.2

0.05 0.5 0.5 0.5 5.0

6.9 8.5 15-1 17-3 25.7

Properties of kidney glutamate dehydrogenase

1023

The ^>H-profile of the enzyme is shown in Fig. 2. At 0.5 mM a-ketoglutarate, 40 mM ammonium, and 0.2 mM NADH the enzyme exhibits an optimum at 7.7 to 7.8. An increase in the a-ketoglutarate concentration causes a shift of the ^>H-optimum towards alkaline ^>H-values (Fig. 2A), whereas an increase in ammonium leads to a shift towards acidic />H-values (Fig. 2B). Similar to liver glutamate dehydrogenase, the kidney enzyme is strongly inhibited by GTP. Ammonium ions are able to abolish the GTP-inhibition (Fig. 3)- The apparent Michaelis-constant for ammonium is l 8 . 4 m M {pVL 7.5, 0.5 mM a-ketoglutarate, 0.2 mM NADH) in the absence of GTP and increased to 350 mM at 0.01 mM GTP. Simultaneously, the cooperative interactions are strengthened; the Hill-coefficient increases from 1.7 in the absence of GTP to 2-3 at 0.01 mM GTP. ADP is able to relieve the GTP-inhibition (Fig. 4).

1.0

0.5

9

pH

8

7

9

pH

Fig. 2. Effect of t h e ^H-value on pig kidney glutamate dehydrogenase. A) Influence of a-ketoglutarate concentration. 20 mM N H + , 0.2 mM N A D H . + 0.05 mM a-ketoglutarate, • 0.5 mM a-ketoglutarate, A 2.0 mM a-ketolutarate. B) Influence of ammonium concentration. 0.2 mM NADH, 0.5 mM a-ketoglutarate. -f- 4 mM ammonium, • 20 mM ammonium, A 100 mM ammonium

iff

o

100

200

300

W (NH^SO^mM]

Fig. 3. Effect of G T P on the ammonium concentration velocity curves of glutamate dehydrogenase a t pH 7.5. 0.2 mM NADH, 0.5 mM a-ketoglutarate. + control, • 5 nM GTP, A 10 (iM G T P 66*

1024

N . Q . KHANG, H . - J . BÖHME, E . HOFMANN

2.0 ADP[mM]

Fig. 4. Activation of kidney glutamate dehydrogenase by A D P and its reversion by G T P . pH 7.5, 0,2 mM NADH, 0.5 mM a-ketoglutarate, 40 mM ammonium. + without GTP, • 10 (xM GTP, A 100 ¡¿M G T P

Basic molecular

properties

The purified glutamate dehydrogenase from pig kidney sediments in the analytical ultracentrifuge as a single boundary. The sedimentation coefficient increases sharply with increasing enzyme concentration (Fig. 5), indicating an association of the enzyme at higher protein concentrations. Extrapolation of the sedimentation constant to infinite dilution results in a value of approximately 13 S. As judged by sodium dodecyl sulphate gel electrophoresis, the enzyme is free of contaminating proteins. By using a series of reference proteins, the subunit

40 Protein

Fig. 5

[mg/ml]

50 60 Fraction no.

Fig. 6

Fig. 5. Dependence of the sedimentation coefficient of kidney glutamate dehydrogenase on the protein concentration. The sedimentation velocity experiments were carried out at 20 °C and 50000 r p m in 100 mM potassium phosphate buffer, pH 7.5, containing 5 mM 2-mercaptoethanol and 1 mM EDTA, using a Phywe U 60 L Analytical Ultracentrifuge Fig. 6. Electrofocusing of purified kidney glutamate dehydrogenase. Absorbance a t 280 nm, o o enzyme activity

Properties of kidney glutamate dehydrogenase

1025

molecular weight has been determined to be 51 000. This value corresponds to the subunit size of liver glutamate dehydrogenase [9, 10]. The molecular weight of the native glutamate dehydrogenase has been estimated at 4 °C by analytical gel filtration on Sepharose 4B in 100 mM potassium phosphate buffer pH 7.5 containing 1 mM EDTA and 5 mM 2-mercaptoethanol. At sufficiently low enzyme concentrations ( < 0.1 mg/ml) a molecular weight of 320000 has been found. Hence, by calculation a hexameric structure can be deduced for kidney glutamate dehydrogenase. Thus, the glutamate dehydrogenases from kidney and liver appears to be similar both in their oligomeric structure as well as in their ability for self-association. Isoelectrofocusing revealed a single activity peak coinciding with the protein peak (Fig. 6); more than 90% of the initial glutamate dehydrogenase activity was recovered after electrofocusing. The isoelectric point of the purified enzyme was found to be p~K 4.8. Discussion

The described procedure allows the preparation of homogeneous glutamate dehydrogenase from pig kidney with a specific activity of about 170—200 units/mg. This high value in comparison to other glutamate dehydrogenases is probably due to the presence of the strong activator ADP in the routine assay. The essential steps in the isolation procedure are the affinity chromatography on Cibacron Blue F3G-A substituted Sephadex G-200 and the twofold chromatography on Sepharose 6B at different ionic strengths. Cibracron Blue F3G-A binds selectively enzymes possessing the "dinucleotide fold" [11] and provides a good separation from other proteins. The twofold gel chromatography is necessary because phosphofructokinase is co-purified together with glutamate dehydrogenase up to the first chromatography step. The separation of both enzymes by rechromatography is brought about by an increase in ionic strength in the elution buffer. Under these conditions glutamate dehydrogenase forms higher molecular aggregates than phosphofructokinase and elutes near the void volume of the column, whereas phosphofructokinase is eluted nearly at the same position as in the first chromatography step. While glutamate dehydrogenase elutes homogeneously after this rechromatography procedure, the phosphofructokinase contains yet a considerable amount of glutamate dehydrogenase. The isolation of homogeneous phosphofructokinase by this method is difficult and needs further purification steps. Homogeneous phosphofructokinase can be obtained more easily by precipitation of glutamate dehydrogenase with ethanol at an earlier stage of the procedure [12]. Regarding its kinetic properties as well as its hexameric structure and its tendency to self-association the kidney glutamate dehydrogenase shows similarities to the enzyme from liver. Whether the allosteric kinetics of the enzyme can be correlated to its presumed regulatory function in renal ammoniagenesis remains to be established. Acknowledgements W e wish to thank Dr. G . K O P P E R S C H L A G E R and Miss centrifugation experiments.

L. WALTER

for carrying out the ultra-

1026

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Zusammenfassung H . - J . B Ö H M E und E. H O F M A N N : Reinigung und Eigenschaften von Glutamatdehydrogenase aus Schweineniere Glutamatdehydrogenase aus Schweineniere wurde durch Affinitätschromatographie an trägerfixiertem Cibacronblau F3G-A und Gelchromatographie an Sepharose 6B bis zur Homogenität gereinigt. Mit den Substraten a-Ketoglutarat, Ammonium und NADH zeigt das Enzym allosterische Eigenschaften. GTP ist ein starker Inhibitor des Enzyms, der die kooperativen Wechselwirkungen zwischen den ammoniumbindenden Zentren verstärkt. Der Aktivator A D P hebt die Hemmung durch GTP auf. Wie die Glutamatdehydrogenase aus Rinderleber besitzt auch die Glutamatdehydrogenase aus Schweineniere die Fähigkeit zur Selbstassoziation. Der Sedimentationskoeffizient steigt von 13.5 S bei 0.07 mg Protein/ml auf 19.4S bei 1.32 mg Protein/ml. In der Natriumdodezylsulfat-Elektrophorese wandert das Enzym in Form einer scharfen Bande mit einem Molekulargewicht von 51000. NGUYENQUOC KHANG,

Acta biol. med. germ., Band 36, Seite 1027 — 1033 (1977) Physiologisch-Chemisches Institut der Karl-Marx-Universität, 701 Leipzig, D D R

Binding of MgATP to yeast phosphofructokinase K . N I S S L E R , W . SCHELLENBERGER, a n d E . HOFMANN

(Received July 16, 1976; in revised form November 11, 1976) Summary Binding of MgATP to yeast phosphofructokinase was investigated by the gel filtration equilibrium dialysis technique. Per subunit of yeast phosphofructokinase two molecules of MgATP are bound in the absence of fructose-6-phosphate, one to a highaffinity and one to a low-affinity site. The experimental data were compared with a kinetic model of yeast phosphofructokinase as described by F R E Y E R et al. [3], Introduction

Phosphofructokinase is considered to be of principal importance in glycolytic regulation. The enzyme from yeast has a molecular weight of approximately 800000 and is composed of subunits with a molecular weight of about 100000 [1, 2]. For interpretation of the kinetic properties of the enzyme a modified allosteric transition model has been developed by F R E Y E R et. al. [3]. In this model assumptions were made about the stoichiometry of fructose-6-phosphate and ATP binding to the enzyme. Especially, two types of ATP binding sites, a catalytic and a regulatory one, have been postulated. For checking these deductions and in order to get knowledge about the real number of ATP binding sites per subunit, direct binding experiments as complementary studies to the kinetic approach appeared to be necessary. In the literature, only data about iigand binding to heart and skeletal muscle phosphofructokinase have been published, however, in distinction from the yeast enzyme the binding and kinetic properties of muscle phosphofructokinase have been shown to depend on its reversible self-association behavior [4—8]. This paper deals with the number and affinity of ATP binding of yeast phosphofructokinase, as evaluated by means of the gel filtration equilibrium dialysis procedure according to H U M M E L and D R E Y E R [9]. Materials and methods Imidazole was purchased from Serva, Heidelberg (FRG); ATP, fructose-6-phosphate, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, glycerol-3-phosphate dehydrogenase, 3-phosphoglycerate kinase, glucose-6-phoshate isomerase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, aldolase, triosephosphate isomerase were from Boehringer, Mannheim (FRG). Phosphofructokinase (spec, activity: 60 U per mg protein) from Saccharomyces cerevisiae was prepared according to D I E Z E L et al. [1]. Fructose-6-phosphate as stabilizing agent in the preparation media was omitted to avoid difficulties in removing this ligand from the enzyme before performing the binding experiments. The enzyme was stored in ammonium sulphate Dedicated to Prof. Dr. Dr. S. M.

RAPOPORT

on the occasion of his 65 l h birthday

1028

K . N I S S L E R , W . SCHELLENBERGER, E . HOFMANN

solution (80 per cent saturation) at — 25 °C. Three hours before initiating the binding experiments the precipitated enzyme was centrifuged at 20 000 X g and dissolved in a small volume of 50. mM imidazole buffer, pH 7.2, containing 5 mM MgS0 4 and 2 mM mercaptoethanol. The solution was dialysed against the same buffer. The dialysed enzyme solution was centrifuged before use at 20 000 x g. y- 3 2 P-ATP was enzymatically synthesized and purified according to GIBBS et al. [10]. The labeled ATP was checked for radiochemical purity by paper chromatography on Whatman 1-chromatography paper with acetone/formic acid (35 g/100 ml): 3/2 (v/v). The impurity by inorganic 32 P-phosphate was less than 1 %. Fructose-6-phosphate was tritiated according to W I L Z B A C H [11] by Isocommerz GmbH, Berlin, and purified by repeated precipitations with ethanol and chromatography on DOWEX 1 in the ammonium borate system according to KHYM and COHN [12]. The purity of this compound was checked by paper chromatography with methanol/isopropanol/ammonia/water: 4.5/3.0/1.5/1.0 (v/v) as solvent. Radioactivity was measured with Tricarb model 3375 with B R A Y ' S solution [13]. The determination of labeled and unlabeled ATP and fructose-6-phosphate was carried out according t o J A W O R E K e t a l . [ 1 4 ] a n d HOHORST [ 1 5 ] ,

respectively.

In spite of the fact that the phosphofructokinase preparation was found to be homogeneous by analytical ultracentrifugation and by sodium dodecyl sulphate gel electrophoresis, very small contaminations of ATPase and glucose-6-phosphate isomerase activities became detectable, which could not be neglected in binding experiments. The determination of ATPase activity was performed by incubation of y- 32 P-ATP with the enzyme solution (0.2 ml) followed by addition of 0.5 ml of ammonium molybdate (4g per 100 ml), 4 N H 2 S 0 4 , 0.05 M silicotungstic acid and extraction of the 32 P-inorganic phosphate with 1.5 ml isobutanol/benzene: 3/1 (v/v). The glucose-6-phosphate isomerase was determined in the optical test using glucosesphosphate dehydrogenase as auxiliary enzyme. Although the contamination of this preparation by ATPase (lOpmoles of ATP split/min per mg protein) and glucose-6-phosphate isomerase (6 nmoles fructose-6-phosphate isomerized/min per mg protein) is very small, binding studies with chamber dialysis techniques [6, 16] were found to give erroneous results due to interfering side reactions of ATP and fructose-6-phosphate when allowed to be in prolonged contact with large amounts of enzyme. Therefore, the gel filtration equilibrium dialysis method [9] was applied and proved to be rapid enough that ATP splitting and isomerizing of fructose-6-phosphate could be ignored. This was checked by means of the sensitive radiochemical methods mentioned. For the equilibrium binding experiments water jacketed chromatography columns (1.2 X 35 cm) were packed with Sephadex gel G 50 (Pharmacia, Uppsala, Sweden) and equilibrated with 50 mM imidazole buffer, pH 7.2, containing 5 mM MgS0 4 , 2 mM mercaptoethanol, 1 mM ammonium sulphate and y- 3 2 P-ATP or 3H-fructose-6-phosphate at the desired concentration. 0.2 —0.3 ml of the dialysed phosphofructokinase solution were applied to the gel and eluted with the same buffer. The flow rate was 30 ml/hr; the temperature was maintained at 20 °C. Fractions of 0.21—0.24 ml were collected in the Tricarb counting vials with a drop counting device, the volumes of which were exactly determined by weighing. The mean relative error of the average fraction volume is less than 0.2%. In the pilot experiments it was established that MgATP binds to the enzyme in the absence of fructose-6-phosphate and vice versa. In Fig. 1 an elution profile of an experiment with MgATP as binding ligand is demonstrated. The amount of substrate bound to the enzyme was determined from the trough in the base line. Under the conditions of the applied equilibrium gel filtration dialysis technique the free MgATP concentration is always equal to that ligand concentration being used for equilibration of the column, independently of the protein concentration with which the column has been charged. Only when the column was overloaded with too high enzyme concentration, the linear dependence of the enzyme bound MgATP on the protein concentration was lost. In this situation the base line between the peak and the trough in the elution profile disappears. As the beginning and the end of the trough, those fractions are taken in which the differences of the radioactivities between the respective fraction and the base line are greater than the average deviation from the mean of the base line radioactivity.

MgATP binding to P F K

1029

300

0 10

50

100

fractions

Fig. 1. Representative elution profile of the gel filtration equilibrium dialysis technique being applied for the measurement of MgATP binding to yeast phosphofructokinase. The Sephadex G 50 column (1.2 x 35 cm) was equilibrated with 50 mM imidazole/CI, p~R 7.2, 3-1 nM y- 3 2 P-ATP (spec, radioactivity 6.7 X 107 cpm/^Mol ATP), 5 mM magnesium sulphate, 1 mM ammonium sulphate, 2 mM mercaptoethanol; 0.2 ml of dialysed phosphofructokinase containing 2.25 mg of the enzyme were applied to the column and elution was performed with the equilibration buffer; the flow rate was 30 ml/hr, the fraction volume 0.24 ml and the temperature 20 °C; determination of MgATP bound to the enzyme (C B ) was carried out as described in "Materials and methods"; CB = 0.36 Mol MgATP/100 000 X g phosphofructokinase The amount of the MgATP bound per subunit of phosphofructokinase (C B ) was calculated according to eqn. 1

CB =

EAR*

Re (w V Rs • P• 10

Mol MgATP 100 000 g protein

(1)

where A i? f is the difference between the base line radioactivity RB and that of the fraction» of the trough, V is the average volume of the fraction i, w is the volume of phosphofructokinase sample applied to the column, v is the partial specific volume of the enzyme (0.743 ml/g, [17]), Rs is the specific radioactivity of y- 3 2 P-ATP (cpm/piMol) and P is the total enzyme protein content (in mg) in the applied enzyme sample. As indicated in eqn. 1 the binding data were referred to an enzyme subunit molecular weight of 100000 [2]. The factor 10 was introduced for obtaining the bound quantity of MgATP per Mol of enzyme subunit. Protein was assayed according to J A N A T O V A et al. [ 1 8 ] with bovine serum albumin as standard. Results and discussion B i n d i n g of A T P w a s i n v e s t i g a t e d in a c o n c e n t r a t i o n r a n g e of 10~ 6 t o 10~ 3 M a t p H 7-2 in t h e p r e s e n c e of 5 m M m a g n e s i u m . D u e t o t h e excess of m a g n e s i u m , A T P is a l m o s t c o m p l e t e l y p r e s e n t in t h e c h e l a t e d f o r m . L i n e a r i t y in t h e a m o u n t of b o u n d s u b s t r a t e t o t h e e n z y m e protein w a s f o u n d t o o c c u r in a r a n g e of e n z y m e c o n c e n t r a t i o n b e t w e e n 1 — 3 5 mg/ml (Fig. 2). F i g . 3 shows t h e a m o u n t of b o u n d M g A T P per s u b u n i t of p h o s p h o f r u c t o k i n a s e i n d e p e n d e n c e on t h e c o n c e n t r a t i o n of free M g A T P . T h e d a t a i n d i c a t e t h a t a t

1030

K . NISSLER, W . SCHELLENBERGER, E .

HOFMANN

Fig. 2. Dependence of MgATP binding on the concentration of yeast phosphofructokinase. MgATP concentration = 3 . 1 nM; the amount of phosphofructokinase protein applied to the column was in the range of 0.5 —7-0 mg/0.2 ml; for experimental details see legend of Fig. 1 and the section "Materials and methods"

20

H5

& ^10

5

0

10

20 30 Enzyme protein (mg/ml)

40

2.0 CB

CF0.it. 1.50.1-

1.0-

\

/

\

\

\

i ^a».?.

10

0.5-

Cg

2.0

/

/

/

/

/

/

/

/

/

v/. °

0.

40q?20

e oI 20 | &

40-

0.1

0.5 1.0

5

10

50

100

500 1000 CFY/IM)

Fig. 3. Binding of MgATP to yeast phosphofructokinase. A) Dependence of the amount of bound MgATP per subunit of phosphofructokinase (CB) on the free concentration of MgATP (Cp). Experimental data are given in Fig. 1. B) Relative error distribution of the data with respect to the proposed model. Insert: Scatchard-plot [19] of MgATP binding to yeast phosphofructokinase

MgATP binding to P F K

1 031

saturation two molecules of MgATP per subunit of the enzyme are bound. The Scatchard-plot [19] of the data (insert of Fig. 3) exhibits non-linearity. Because the characteristics of the data distribution exclude an interpretation of the experiments by assuming only one type of binding site the experimental data were interpreted in terms of the MgATP binding function upon which the kinetic model of F R E Y E R et al. [3] is based. As distinct from the two state model of MONOD et al. [20], four conformational states were assumed (Fig. 4). In this model two different types of binding sites for MgATP are postulated, one being related to the catalytic site, the other to the regulatory one, mediating the inhibitory action of ATP. All conformational states (R1, Tu R2, T2) are assumed to have the same affinity for ATP binding to the catalytic sites, whereas the regulatory (inhibitory) type of binding sites comes into action only in the catalytic inactive conformational states R2 and T2, both of which being considered to have the same affinity to MgATP. Therefore, binding of MgATP to this site does not influence the fructose-6-phosphate dependent equilibrium between the R and T states of the enzyme. For the dependence of the amount of enzyme bound MgATP on the ligand concentration a mathematical relationship is obtained which is nearly isomorphous with the two state model of MONOD et al. [20]. Consequently the following expression for the amount of bound MgATP per subunit of phosphofructokinase (CB) is valid: CB =

1+ a

fo P (1 + 0"-1 + (1 + /„) (1 + /?)«

(2)

a = MgATP/ü" c and /S = MgATP/if^ are the normalized concentrations of MgATP with regard to the affinities of the catalytic ( K c ) and the regulatory (KR) sites. /„ ist the quotient of the enzyme distribution (i?2 + T2) to (i?x + T}) in the absence of MgATP and m denotes the number of subunits per enzyme molecule.

The data distribution of MgATP binding to the enzyme in dependence on the free MgATP concentration was compared with the binding function (eqn. 2) by means of a non-linear regression analysis [21]. Different approaches for evaluating the error distribution were applied: constant relative and constant absolute error as well as minimum %2 error distribution. Most compatible results were obtained by applying the minimum %2 error distribution. The fitted curves of the model as well as the respective residuals are included in Fig. 3 • The residuals are shown to be stochastically distributed (Fig. 3B). In Table 1 the calculated model parameters and the mean relative error of the experimental data as an indication of the quality of the fit are presented.

7?

Fig. 4. Allosteric transition model of yeast phosphofructokinase. (According to F R E Y E R et al. [3])

1032

K . NISSLER, W . SCHELLENBERGER, E . HOFMANN

Table 1 Calculated model parameters according to eqn. 2 K

5 . 2 [IM

C

5 1 . 2 |XM

KR

/O =

r (i?2) + (r2)i L(RI)

1 —

N

0.64

+ (^I)J ATP = 0

"^EXP.

^THEOR.0.13

>_1

NÒ.[ L

^BI

J

B y assuming that the two binding sites for MgATP can be coordinated to the catalytic and regulatory function of this ligand it follows that the computed association constants (K0 = 5-2 (xM; KR = 51.2 ¡J.M) are considerably smaller than the respective affinities calculated from the kinetic experiments (K s for A T P as substrate equal to 30 [iM and KE for A T P as inhibitor (negative effector) equal to 180 ¡JLM, respectively) [3]. These differences may originate from the fact that the values derived from the kinetic approach are more complex quantities than the binding constants, because they include the velocity constants of the isomerization and product releasing steps of the overall enzymatic reactions

[22].

The applied binding function implies the presence of two binding sites for MgATP per subunit. Modification of eqn. 2 by assuming different stoichiometrics did not provide any evidence for additional binding sites for MgATP. As indicated in Table 1 the mean relative error of the experimental data in comparison with the model as described in [3] was computed to be 0.13 showing that experimental data fit sufficiently well to the model. However, the experimental data do not allow to discriminate between different models. For example, the data may also be described by a phenomenological equation considering MgATP binding by two simple saturation functions. This equation reflects also the shape of the MgATP binding curve (mean relative error 0.14), but has evidently no relation to the real kinetic behaviour of the enzyme. References [1] DIEZEL, W . , SCHLÄGER,

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DALZIEL, K . ; F E B S

Lett. 1,

346

(1968)

Zusammenfassung K . N I S S L E R , W . S C H E L L E N B E R G E R und E . H O F M A N N : Bindung von MgATP an Hefephosphofruktokinase Die Bindung von MgATP an Hefephosphofruktokinase wurde mit der Gelfiltrations-Gleichgewichtsdialysetechnik untersucht. Pro Untereinheit Hefephosphofruktokinase werden 2 MgATP-Moleküle bei Anwesenheit von Fruktose-6-phosphat gebunden, das eine an einen hochaffinen und das andere an einen niedrigaffinen Ort. Die experimentellen Daten wurden m i t dem von Freyer et al. [3] beschriebenen kinetischen Modell der Hefephosphofruktokinase verglichen.

Acta biol. med. germ., Band 36, Seite 1035 — 1048 (1977) Sektion Tierproduktion und Veterinärmedizin der Karl-Marx-Universität Leipzig, Fachgruppe Tierbiochemie, 701 Leipzig, DDR

Bestimmung, Eigenschaften und postnatale Entwicklung der Galaktokinase in der Schweineleber L. JÄKEL u n d E .

GRÜN

(Eingegangen am 27. August 1976; nach Revision am 4. November 1976) Zusammenfassung 1. Ausgehend von der-von B A L L A R D [5] beschriebenen spektrophotometrischen Methode wurden durch systematische Untersuchungen die optimalen Meßbedingungen der Galaktokinase in der Ferkelleber ermittelt. Sie sind unter folgenden Bedingungen gegeben (Endkonz, im Test): 100mM Triäthanolamin-HCl-Puffer, 33 mM KCl, 16,5 m l NaF (zur Hemmung der ATPase), 5 mM Zystein-HCl, 0,33 mM NADH 2 , je 1 E Pyruvatkinase und Laktatdehydrogenase, 0,5 mM PEP, 1,5 mM Galaktose, 0,5 mM ATP und 1 mM MgCl2, End-pH-Wert 7,52. Für die Bestimmung der Galaktokinaseaktivität ist im Homogenatüberstand der Schweineleber neben der optimalen Substratkonzentration die Einhaltung des Mg: ATPVerhältnisses von 2:1 und des pH-Wertes sowie der Zusatz der Aktivatoren von ausschlaggebender Bedeutung. 3. Mit Hilfe der optimierten Bestimmungsmethode wurde die Galaktokinaseaktivität der Schweineleber in Abhängigkeit vom Alter unter besonderer Berücksichtigung des perinatalen Lebensabschnittes ermittelt. 4. Die Galaktokinaseaktivität der Leber neugeborener Ferkel ist 7fach höher als die schlacht- bzw. geschlechtsreifer Schweine. Während der Säugeperiode bleibt sie auf diesem hohen Niveau relativ konstant und sinkt — unmittelbar nach dem Absetzen der Ferkel beginnend — nach der Einstellung der Milchaufnahme deutlich ab. 5. Die Unterschiede im kinetischen Verhalten der Galaktokinase der Leber neugeborener Ferkel (niedrigerer KMiür ATP, höhere maximale Reaktionsgeschwindigkeit) im Vergleich zum Enzym in der Leber erwachsener Schweine reichen nicht aus, das Vorkommen von 2 unterschiedlichen Formen des Enzyms eindeutig zu sichern. Einleitung F ü r d a s V e r s t ä n d n i s des E n e r g i e s t o f f w e c h s e l s des n e u g e b o r e n e n F e r k e l s spielt die K e n n t n i s der U m s e t z u n g e n i m K o h l e n h y d r a t s t o f f w e c h s e l eine w e s e n t l i c h e Rolle. N a c h d e m b e r e i t s in v o r a n g e g a n g e n e n U n t e r s u c h u n g e n die e n z y m a t i s c h e K a p a z i t ä t der L e b e r z u r V e r w e r t u n g v o n Glukose u n d Glyzerin n ä h e r c h a r a k t e r i siert w o r d e n ist [1—4], w i r d i m f o l g e n d e n auf die g a l a k t o s e p h o s p h o r y l i e r e n d e F ä h i g k e i t der Schweineleber n ä h e r eingegangen. N e b e n Glukose n i m m t die G a l a k t o s e als E n e r g i e t r ä g e r f ü r die E r n ä h r u n g des N e u g e b o r e n e n eine z e n t r a l e S t e l l u n g ein, d a sie als B e s t a n d t e i l der L a k t o s e einen w e s e n t l i c h e n I n h a l t s s t o f f d e r N a h r u n g des s a u g e n d e n J u n g t i e r e s d a r s t e l l t . D a b e i k o m m t d e m E n z y m G a l a k t o k i n a s e eine Schlüsselstellung f ü r die V e r w e r t u n g der G a l a k t o s e i m tierischen O r g a n i s m u s zu, d a es die P h o s p h o r y l i e r u n g dieses Monos a c c h a r i d s k a t a l y s i e r t , welche alle w e i t e r e n U m s e t z u n g e n der G a l a k t o s e i m

•1036

L. JÄKEL, E .

GRÜN

Organismus ermöglicht. Bisher sind jedoch im Schrifttum keine Angaben über die Galaktokinaseaktivität in der Leber des neugeborenen Ferkels und deren weitere postnatale Entwicklung anzutreffen. Lediglich B A L L A R D [5] berichtet über die kinetischen Eigenschaften des gereinigten Enzyms aus der Leber 2 Wochen alter Ferkel. Ausgehend von diesen Angaben wurden durch systematische methodische Untersuchungen die optimalen Meßbedingungen für das Enzym in der Ferkelleber erarbeitet, welche zugleich zur Ermittlung einiger Eigenschaften und der Charakterisierung des Enzyms der Schweineleber herangezogen wurden. Mit Hilfe der optimierten Bestimmungsmethode wurde sodann die Höhe der Galaktokinaseaktivität in der Schweineleber in Abhängigkeit vom Alter ermittelt, wobei der perinatale Lebensabschnitt besonders berücksichtigt wurde. Material und Methodik Tiermaterial Als Versuchstiere s t a n d e n Schweine unterschiedlichen Alters zur Verfügung, die aus u n t e r schiedlichen H e r k u n f t s b e s t ä n d e n e n t s t a m m t e n , in denen sie u n t e r herkömmlichen Bedingungen gehalten wurden. Insgesamt w u r d e n 60 Ferkel beiderlei Geschlechts von der G e b u r t bis zu 5 Wochen Alter, 10 Läuferschweine (6—12 Wochen alt) u n d 2 1 Schlachtschweine in die U n t e r s u c h u n g einbezogen. Zur E n t n a h m e der Leber w u r d e ein Teil der Ferkel sofort n a c h der G e b u r t getötet. Ferkel im Alter bis zu 14 Tagen wurden zur beliebigen M i l c h a u f n a h m e bis k u r z vor Versuchsbeginn beim Muttertier belassen. Bei Tieren im Alter von 40 bis 90 Tagen erfolgte vor der operativen E n t n a h m e der Organproben ein 24stündiges H u n g e r n . Organproben erwachsener Tiere w u r d e n bei Schlachtschweinen u n d -sauen auf d e m Schlachthof e n t n o m m e n . Das Alter der Schlachtschweine b e t r u g ca. 9 Monate, das Gewicht 110 bis 130 kg. Gewicht und Alter der Schlachtsauen k o n n t e n u r a n n ä h e r n d ermittelt werden. Gewinnung

des

Organmaterials

Die E n t n a h m e des Untersuchungsmaterials erfolgte bei den verschiedenen Altersgruppen n a c h unterschiedlichen Methoden. Bei allen Tieren i m Alter bis zu 3 Monaten w u r d e die Körpermasse d u r c h W ä g u n g ermittelt. Bei Ferkeln i m Alter bis zu 12 Tagen wurde die Leber, wie bereits beschrieben [2], in situ p e r f u n d i e r t u n d d a n n sofort weiter verarbeitet. Bei Tieren der Altersgruppe von 14 Tagen bis zu 3 Monaten w u r d e u n t e r potenzierter Narkose (0,5 ml Combelen p r o 10 kg Körpermasse, 25 m g B r e v i n a r k o n pro kg Körpermasse) eine partielle H e p a t e k t o m i e vorgenommen [6]. Dazu wurde den Tieren in linker Seitenlage n a c h D u r c h t r e n n u n g der B a u c h w a n d entlang des Rippenbogens je n a c h Alter eine unterschiedliche Menge Lebergewebe v o m Lobus sinister lateralis e n t n o m m e n . Die E n t n a h m e erfolgte m i t d e m Elektrochirurgie-Hochfrequenzgerät „ D u o Secarex". Der so e n t n o m m e n e Teil des Leberlappens w u r d e umgehend v o m koaguliert e n Gewebe u n d in eiskalter physiologischer Kochsalzlösung'von Blutbestandteilen befreit. Anschließend erfolgte die A u f b e w a h r u n g des Organmaterials bis zur Herstellung des H o m o genates in einer Gefriertruhe bei — 20 °C f ü r eine Zeitdauer von 3 Wochen. Die Orgariproben von Schlachtschweinen u n d -sauen wurden aus frisch e n t b l u t e t e n Tieren e n t n o m m e n u n d sofort in eiskalter physiologischer Kochsalzlösung gekühlt. Das im Gewebe noch v o r h a n d e n e B l u t w u r d e d u r c h den mehrmaligen W a s c h v o r g a n g größtenteils beseitigt. N a c h einer 20- bis 30minütigen Transportzeit v o m Schlachthof z u m L a b o r erfolgte die weitere Verarbeitung. Herstellung

des Gewebehomogenates

und Gewinnung

des

Zellüberstandes

Die Herstellung des Homogenates erfolgte aus grob vorzerkleinertem Lebergewebe m i t einem Teflon-Rillenhomogenisator (Eigenbau). Bedingt d u r c h den höheren Bindegewebsgehalt der Leber von Schlachtschweinen u n d -sauen w u r d e bei diesen zunächst eine Zerkleinerung m i t

Galaktokinase in der Schweineleber

1037

dem Ultra-Turrax mit anschließender Homogenisation durchgeführt. Als Homogenisierungsmedium diente 0,25 M Rohrzuckerlösung, mit der das Lebergewebe im Verhältnis von 5 bis 8:1 verdünnt wurde. Alle Arbeiten erfolgten in einem Kühlraum bei 4 °C. Die Zentrifugation des Homogenats wurde mit der Ultrazentrifuge VAC 60 für die Zeitdauer von 60 min bei 116 000 X g und — 20 °C durchgeführt. Die Lagerung des so gewonnenen Überstandes erfolgte bis zur Bestimmung der Enzymaktivität in einer Kühltruhe bei —20 °C. Bestimmung

der Aktivität

der Galaktokinase

in der Leber

Zur Ermittlung der Enzymaktivität wird die Menge des in der Reaktion entstehenden A D P bestimmt, in dem unter Verwendung eines Hilfsenzyms, der Pyruvatkinase, unter Einsatz von Phosphoenolpyruvat A T P regeneriert und damit eine Hemmung der Enzymreaktion verhindert wird. Das entstehende Pyruvat wird mittels eines weiteren Hilfsenzyms, der Laktatdehydrogenase, unter NADH 2 -Verbrauch in Laktat überführt. Der NADH 2 -Verbrauch wird bei 366 nm verfolgt und ist der Enzymaktivität proportional, wenn die Konzentrationen der an der Enzymreaktion beteiligten Substrate wie auch der für die Hilfs- und Indikatorreaktion notwendigen Hilfsstoffe so gewählt sind, daß die Aktivität des zu untersuchenden Enzyms den die Geschwindigkeit der Extinktionsänderung pro Zeiteinheit bestimmenden Faktor darstellt. Ausgehend von diesem der spektrophotometrischen Methode von B A L L A R D [5] zugrunde liegenden Prinzip wurden in methodischen Untersuchungen optimale Reaktionsbedingungen für das Enzym in der Schweineleber ermittelt. Meßbedingungen: Meßansatz nach B A L L A R D [5]: 1 0 0 mM Triäthanolamin-HCl-Puffer, £ H 7,5, mit 33 mM KCl und 16,6 mM N a F (zur Hemmung der ATPase), 5 mM Zysteinhydrochlorid (neutralisiert mit 2NNaOH); Pyruvatkinase und Laktatdehydrogenase, 1,1 Einheiten; 0,33 mM NADH 2 ; je 0,66mM Phosphoenolpyruvat, Galaktose, A T P und MgCl2 (Mg: ATPVerhältnis 1:1), End-^H-Wert 7,35. Optimierter Meßansatz: Puffer, Aktivatoren, Hilfsenzyme und Koenzym wie zuvor; 0,5 mM Phosphoenolpyruvat; 1,5 mM Galaktose; 0,5 mM A T P und 1 mMMgCl 2 (Mg:ATP-Verhältnis 2:1), End-£H-Wert 7,5. Die Messung erfolgt in Glasküvetten mit einer Schichtdicke von 1 cm bei einer Wellenlänge von 366 nm in einem Testvolumen von 3,3 ml. Die Bestimmung wurde am Universalspektrophotometer VSU 1 nach vorheriger Erwärmung bei einer Temperatur von 37 °C in einem temperierbaren Küvettenhalter durchgeführt. Der Reaktionsstart wurde mit 0,05 ml Überstand vorgenommen. Im halbminütigen Abstand erfolgte die Registrierung der Extinktionsabnahme für eine Zeitdauer von 3 — 4 min. Der Leerwert enthielt kein Substrat, und die NADH 2 -Konzentration betrug die Hälfte derjenigen des Meßwertes, um eine Extinktionsdifferenz zwischen Meß- und Leerwert zu erhalten. Als Maßeinheit der Enzymaktivität dient die Internationale Einheit (IE), welche den Umsatz von 1 ¡¿Mol Substrat/min angibt. Zur Bestimmung der T r o c k e n m a s s e wurde grob zerkleinertes Lebergewebe in einem Wärmeschrank bei 120 °C bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Die Berechnung des Trockenmasseanteils erfolgte durch Division der Werte der Trockengewichte durch die des Frischgewichtes und wird in % angegeben. Zur Ermittlung des P r o t e i n g e h a l t e s der Leber wurde mittels der Kjeldahl-Halbmikrotechnik der Gesamtstickstoffgehalt des Organmaterials bestimmt und mit dem Faktor 6,25 multipliziert. Die statistische Auswertung der Ergebnisse erfolgte mittels Varianzanalyse und Duncan-Test sowie mittels Korrelations- und Regressionsanalyse [7]. Ergebnisse

Optimale Reaktionsbedingungen der Schweineleber

für die Bestimmung

der Galaktokinaseaktivität

in

Ausgehend von den Angaben bei BALLARD [5] wurden durch systematische Untersuchungen diejenigen Konzentrationen der Reaktionspartner des zusammengesetzten optischen Tests ermittelt, die optimale Bedingungen für die Messung der Aktivität der Galaktokinase in der Schweineleber bieten. 67

Acta biol. med. germ., Bd. 36, Heft 7 - 8

1038

L . JÄKEL, E . GRÜN

Hinsichtlich des Einflusses der von uns geprüften Faktoren auf die Erfassung der Galaktokinaseaktivität können folgende Feststellungen getroffen werden: Bezüglich der Konzentrationen des Puffers (0,1 M TRA), der Aktivatoren (K + , Zystein), der Hilfsenzyme (PK, LDH) und des Koenzyms (NADH2) können die von B A L L A R D [5] gewählten Bedingungen unverändert beibehalten werden. Eine PEP-Konzentration von 0,5 mM führt zu einer ausreichenden Regenerierung des ATP, welche einen maximalen NADH 2 -Umsatz ermöglicht. Sowohl niedrigere als auch höhere Konzentrationen bedingen eine Verringerung desselben (Abb. 1 ) , weshalb die von B A L L A R D [5] angegebene Konzentration von 0,66 mM entsprechend vermindert wurde. Das^H-Optimum des Enzyms liegt in 100 mM TRA-Puffer bei p H 7,5 (7,4—7,7). Sowohl die Verschiebung des pYi-Wertes nach der sauren ( < pYi 7,3) als auch nach der alkalischen Seite ( > pYi 7,8) führt zu einem deutlichen Aktivitätsverlust (Abb. 2). Sowohl bei Variation des ATP-Einsatzes bei konstanter Mg ++ -Konzentration (0,66 mM) (Abb. 3 a) als auch bei Veränderung des Mg ++ -Zusatzes bei konstanter ATP-Konzentration (0,33 mM) (Abb. 3 b) wird die höchste Enzymaktivität bei •einem Mg:ATP-Verhältnis von 2 : 1 erreicht. Mit dem von B A L L A R D [ 5 ] beim gereinigten Enzym angewandten Mg: ATP-Verhältnis von 1:1 erhält man bei Messung im Zellüberstand nur 7 0 — 7 5 % der bei einem Mg: ATP-Verhältnis von 2:1 zu erzielenden Enzymaktivität.

0

0,5

1,0

1,5mMPEP

Abb. 1. Abhängigkeit des NADH 2 -Umsatzes von der die ATP-Regenerierung ermöglichenden PEP-Konzentration

Abb. 2. Abhängigkeit der Galaktokinaseaktivität vom

pH-Wert

1039

Galaktokinase in der Schweineleber

Bei Einhaltung des optimalen Mg: ATP-Verhältnisses wird — unabhängig von der Galaktosekonzentration — bei einer ATP-Konzentration von 0,5 mM und einer Mg ++ -Konzentration von 1 mM maximale Reaktionsgeschwindigkeit erreicht (Abb. 4). Auch eine weitere Erhöhung der ATP/Mg-Konzentration bedingt dann keine Hemmung des Enzyms, wie diese bei einem Mg: ATP-Verhältnis von 1:1 zu beobachten ist. [ATP]:[MgClJ1:2 1,0

1,0mMMgCl2

Abb. 3. Abhängigkeit der Galaktokinaseaktivität vom Mg: ATP-Verhältnis bei Veränderung der ATP- und konstanter Mg++-Konzentration (0,66 mM) (a) und bei Variation der Mg++- bei konstanter ATP-Konzentration (0,33 mM) (b)

1,0 0,8

fe 0,6 .c:

0,25

0,50

0,75

1,0

1,25mM Mg?ATP

Abb. 4. Abhängigkeit der Galaktokinaseaktivität von der ATP-Konzentration bei optimalem Mg: ATP-Verhältnis und unterschiedlichen Substratkonzentrationen 67*

1040

L. JÄKEL, E .

GRÜN

Bei einem Mg: ATP-Verhältnis von 1:1 ermöglicht nur eine Galaktosekonzentration von 1,5 mM optimale Reaktionsbedingungen, so daß das Unter- als auch das Überschreiten derselben eine Abnahme der Enzymaktivität bedingt. Bei der von B A L L A R D [5] angewandten Substratkonzentration (0,66 mM) wird demnach eine um 10—15% niedrigere Enzymaktivität erhalten (Abb. 5a). Bei Einhaltung des optimalen Mg: ATP-Verhältnisses wird bei Galaktosekonzentrationen von mehr als 1 mM im Homogenatüberstand der Leber sowohl des Ferkels als auch des erwachsenen Schweines maximale Enzymaktivität erzielt, ohne daß bei weiterer Erhöhung der Substratkonzentration eine Hemmung des Enzyms eintritt (Abb. 5,b). Zwischen der Menge des Homogenatüberstandes im Test und der Extinktionsänderung bestand bis 0,1 ml Überstand ( = 1 2 mE/mg Leber) eine lineare Beziehung. Unter Einsatz der optimalen Meßbedingungen wird eine um durchschnittlich 42% höhere Enzymaktivität als unter den von B A L L A R D [5] angegebenen Bedingungen erhalten. Zusammenfassend kann festgestellt werden, daß für die Ermittlung der Galaktokinaseaktivität im Homogenatüberstand der Schweineleber neben der optimalen

Abb. 5- Abhängigkeit der Galaktokinaseaktivität in der Leber neugeborener Ferkel (•) und erwachsener Schweine (o) von der Substratkonzentration bei einem Mg: ATP-Verhältnis von 1 : 1 (a) bzw. 2:1 (b) mit Angabe der abgeleiteten Michaelis-Konstanten (im System [S]/V gegen [S])

Galaktokinase in der Schweineleber

1041

Substratkonzentration die Einhaltung des Mg: ATP-Verhältnisses und des Wertes sowie der Zusatz der Aktivatoren von ausschlaggebender Bedeutung sind. Bei Lagerung der Überstände der Leberhomogenate in der Tiefkühltruhe (—20 °C) ist das Enzym bis zu 8 Wochen stabil. Innerhalb der folgenden 2—3 Wochen fällt dann jedoch die Enzymaktivität schnell ab. Bei Lagerung der Überstände im Kühlschrank ( + 4 °C) tritt ebenfalls ein schneller Aktivitätsverlust innerhalb von 3—4 Tagen ein. Extrem instabil ist das Enzym bei Zimmertemperatur, wobei innerhalb von 3—4 Std. ein vollständiger Aktivitätsverlust erfolgt. Deshalb ist das Untersuchungsmaterial bis zur Aktivitätsmessung im Eisbad aufzubewahren. Organmaterial behält seine unveränderte Enzymaktivität bei Lagerung in gefrorenem Zustand bis zu 4 Wochen. A Itersabhängige Veränderungen der Galaktokinaseaktivität in der Leber von Schweinen Einen Überblick über das Verhalten der Galaktokinaseaktivität in der Leber von Schweinen unterschiedlichen Alters vermittelt Tab. 1. Daraus wird ersichtlich, daß die Leber neugeborener Ferkel über eine hohe Galaktokinaseaktivität verfügt, die — sowohl bei Bezug auf die Frisch- als auch die Trockenmasse der Leber — 7fach höher als die erwachsener Schweine ist. Sie steigt bis zur 40. Lebensstunde signifikant (p < 0 , 0 5 ) — bei Bezug auf die Frischmasse um 16%, bei Bezug auf die Trockensubstanz der "Leber um 36% — an und fällt dann auf das Ausgangsniveau ab, welches am 4. Lebenstag wieder erreicht wird. Dieses hohe Niveau bleibt während der Säugezeit im wesentlichen erhalten, wobei am 14. Lebenstag ein Minimum — ca. 24% Abnahme (p < 0,05) — durchlaufen wird. Nach dem Absetzen der Ferkel vom Muttertier (Einstellung der Milchzufuhr) tritt ein signifikanter Abfall (p < 0,01) der Galaktokinaseaktivität der Leber ein, welcher bereits unmittelbar danach deutlich ist (Verminderung um ein Drittel). In der sich anschließenden Aufzuchtperiode der Läuferschweine erfolgt eine

Abb. 6. Verhalten der Galaktokinaseaktivität in der Leber von Schweinen in Abhängigkeit vom Lebensalter. (Jeder P u n k t repräsentiert ein Tier; die Linie verbindet die Mittelwerte der 17 Altersgruppen)

1042

L . JÄKEL, E . GRÜN

t- On ^ «-o -r- CS ^O t1-» ro co tJ- t*" W fO VO^ ON VD ^ fO 00* ^f (S +1+1+1+1+1+[+1+1+1+1+1+1 lO N ON O ^O T- r^ (S r- r- O LO fO N O T-* O ON ^ 00 ^O W O

' t Ol N 1-" o" +1+1+1 O ro co 00

+->

+1 \o ro

O o" +1 Tro

T3

Tt-

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100,0

735

100,0

APÄE

7,5 8,0

20

400

7,3

295

40,0

AT/iE

8,0

20

8,0

5,1 0.3

295 12

40, 0

20

277 16

Ac(Ala)3ME

TAME

1,6

K 32

Die Untersuchungen zur Substratspezifität des kristallisierten Enzyms ergaben eine bevorzugte Spaltung des Elastasesubstrates Ac(Ala)yiE, eine gegenüber dem Rohextrakt verminderte Chymotrypsinaktivität (APÄE, ATÄE) und nur Spuren von Trypainwirkung. Weiterhin ist die mit zunehmendem Reinigungsgrad verminderte (APÄE) bzw. fehlende (ATÄE) Aktivitätssteigerung bei erhöhter Inkubationstemperatur (von 25 auf 55 °C) bemerkenswert. Da die bereits im Rohextrakt nachweisbare Hydrolysewirkung auf natives Elastin mit angereichert wird und das gleiche im alkalischen Bereich liegende pH-Optimum sowie Temperaturverhalten wie gegenüber den Estersubstraten hat (unveröffentlichte Versuche unseres Labors), kann die gereinigte Protease als ein elastaseähnliches Enzym bezeichnet werden. Über das Vorkommen neutraler und alkalischer Proteasen mit elastolytischer Wirkung bei Mikroorganismen wurde bereits mehrfach berichtet (vergl. dazu (8)). Über weitere Eigenschaften dieser mikrobiellen elastaseähnlichen Protease wird in einer späteren Arbeit berichtet (R. Kleine und Mitarbeiter, in Vorbereitung). Herrn Doz. Dr. Dr. H. Schmidt möchten wir für die Anfertigung der Aufnahmen des kristallinen Enzyms herzlich danken.

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K 33

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Acta biol. med. germ. 36, K 35 - K 41 (1977) Department of Molecular Biophysics and Department of Biocataly3is of the Central Institute of Molecular Biology of the Academy of Sciences of the GDR, GDR-1115 Berlin-Buch. Substrate Binding to Solubilized Cytochrome P-450 from Rabbits at Different Temperatures (Received September 9, 1977) R. Misselwitz, G.R. Janig, H. Rein, £. Buder, D. Zirwer and K* Ruckpaul Summary The binding affinities of selected type I - and type II-substrates to partially purified cytochrome P-450 from rabbit liver microsomes were studied and found to differ from those of rats. The temperature dependence of the apparent binding constants qualitatively exhibited the same characteristics compared with that of rats. For type I-substrates endothermic and for type II-substrates exothermic reaction characteristics were observed. Taking into account the partition coefficients of the substrates so far investigated it is obvious that type I substrates with increasing hydrophobicity are bound more strongly while type IIsubstratea show a more complicated behaviour. This may due to the fact that other types of binding are included besides the hydrophobic interactions. Introduction Mainly from a pharmacological point of view a multitude of species, strain and sex differences have been described during the investigations of mammalian mixed-function oxidase systems using spectral (1-4), functional (5-8) and other physicochemical (9-12) methods. Despite of these results the molecular basis of these differences are far from being understood. Studies of such kind, however, may provide also an appropriate approach for analyzing structure and function relationships elucidating the molecular mechanisms of the elementary steps. In pursuance of preceding studies on the temperature dependence of substrate binding to P-450* from rats a further species was investigated

to evaluate factors decisive for substrate protein and/or

x Abbreviationsj "P-450 = cytochrome P-450; P-420 = cytochrome P-420

K 36 lipid, interactions. Material and, methods Partially purified P-450 was obtained from liver microsomes of phénobarbital-pretreated male rabbits by established methods. It contained 4.5 nmoles P-450 per mg protein, 8 % P-420 and 6 % cytochrome b c on the basis of total heme* All determinations of the P-450, P-420 and cytochrome b^ content were performed according to the methods described or cited in the preceding paper (13)• All substances used were of the same grade as described. The spectrophotometric measurements were carried out using a Beckman Acta CV spectrophotometer. The P-450 concentrations in the solutions used for the optical measurements were 2-3^uM. The binding studies were performed in 0.1 M phosphate buffer, pH 7.4, with 20 % glycerol (v/v). Difference spectra were recorded after addition of the substrate solution in 2^ul steps to the sample cuvette. An equal volume of the solvent was put into the reference cuvette. The influence of temperature on substrate binding was investigated in the range from 10°C to 30°C. During the experiments at 30°C the concentration of P-450 showed only a small decrease of about 3 % after 3 hours. The temperature was measured within the cuvette holder by means of calibrated thermistors. Measurements below 15°C were carried out under a stream of dry nitrogen. The spectral dissociation constants (K_) were calculated from EADIE plots because there are considerable uncertainties in the determination of full saturation of the enzyme-substrate complex. A 1:1 stoichiometry of the binding of substrates to cytochrome P-450 was assumed, although two binding constants were found, which probably could be explained by the existence of isoenzymes. The K g -values obtained are not thercodynamical equilibrium constants but only apparent ones. This is due to the dependence of the actual concentration of the substrate on the presence of a lipid phase and on the limited solubility in water. Results Compared with the . K s-values of solubilized rat P-450 for the same group of selected substrates the corresponding values of rabbit P-450 are different for the type I- and type II-substrates as shown in Table 1. It is readily apparent that the complex formation of the type I-

K 37 Table 1 Spectral dissociation constants and K ^ g ) binding of type I- and type II-substrates to solubilized P-450 from rat and rabbit. For the titrations a P-450 concentration of 3.0^uM was used (buffer solution: 0.1 M phosphate, pH = 7.4 with 20 % (v/v) glycerol).

Substrate

benzphetamine aniline hexobarbital imidazole cyanide

Partition coeff.1/ 100 0.9 0.3 0.04 0.01

«¿(1) rat (mil)

Sd)

^(2) rat (mM)

K

0.032 0.49 0.32 0.06 1.0

0.018 0.84 • 0.20

0.07 0.95 0.84 0.18

0.047 2.5

rabbit (mM)

0.24 2.9

2.5

^(2) rabbit (mM)

0.57 7.1

y ' The partition coefficient p was defined as: p =

[ sj in hexane £ aj in burrer solution

substrates benzphetamine and hexobarbital with rabbit P-450 is somewhat higher as compared with that of rats. Por the complex formation of hexobarbital with rabbit P-450 we found only one K value compared with rat P-450. The type II-substrates aniline and imidazole in comparison with the type I-substrate3 show a quantitatively different binding behaviour. Those ligands are bound about 2-4 times more tightly to rat P-450 than to rabbit P-450. The temperature dependence of the apparent binding constants of type I-substrate complexes of rabbit P-450 significantly differ from that of type II-substrate complexes (Pig. 1). A very similar behaviour has been estabilished for rat P-450 in a preceding paper (13). With increasing temperature the reciprocal Ko -values increase in the case of benzphetamine and exhibit almost no temperature dependence with hexobarbital respectively indicating a favouring of complex formation. The binding affinity of type II-substrates (as proved with aniline and imidazole) decreasea with increasing temare perature. These properties described for valid also for K

^(2).

K 38

Pig. 1. Van't Hoff plots of the spectral dissociation constants K K s(1) ^ ^ ^ K s(2) ^ ~ v a l u e s a r ® given i n m M . For the titrations a P-450 concentration of 3.0^uM was used (buffer solution: 0.1 m phosphate, pH 7.4, with 20 % (v/v) glycerol). Prom these apparent K -values thermodynamic parameters were derived. Prom the resulting positive binding enthalpy in connection with an enhancement of entropy one can assume that the binding of benzphetamine is an entropy driven process analogously to benzphetamine and hexobarbital binding of rat P-450. As to be expected from the relative constancy of the K g -values with temperature the binding enthalpy of hexobarbital is lowered but still characterized by a relatively high positive entropy value. The exothermic character of the type II-complexes is more pronounced than the corresponding behaviour of rat P-450 (see Table 2). Charcoal treatment of solubilized rabbit P-450 (14) leads to a decrease of the K ^ ^ - v a l u e s of type I - and type Il-substrates compared with the untreated sample. The K^gj-value of benzphetamine remains unchanged whereas the ( 2)-valuea of aniline and imidazole (type 11-substrates) decrease after charcoal treatment. The complex formation with hexobarbital revealed for untreated rabbit P-450 one and for treated rabbit P-450 two binding constants. These results partially may be explained assuming the removal of an endogeneous substrate (14) but need further studies for being fully understood. The same restrictions as given before (13) concerning solubility

K 39 and distribution of the substrate and lipid content of the enzyme preparation are valid also for the results presented in this paper. Table 2 Changes of the molar binding enthalpy A H, the molar free binding enthalpy A G and the molar binding entropy A S by the binding of type I- and type II-substrates to rabbit P-450. For the titrations a P-450 concentration of 3.0^uM was used (buffer solution: 0.1 M phosphate, pH = 7.4 with 20 % (v/v) glycerol). The association constants related to k___ = 1 Mol"1 were used for the calculation aSS of the thermodynamic values. A G» and & S' are given for 25°C.

Type

AH' (kcal/mole) K

aniline imidazole benzphetamine hexobarbital

II II I I

^(1)

K(2)

-13.2 -5.0 - 7.1 -7.8 16.0 7.5 1.0

AG' (kcal/mole) K

^(1)

-4.2 -4.9 -6.7 -5.1

K

^(2) -3.5 -4.4 -5.9

AS' (cal/deg. mole) K

^(1)

K

£(2)

-30.2 - 5.0 - 7.3 -11.4 76.1 45.0 20.3

Discussion Comparing the binding properties of solubilized partially purified P-450 from rabbits with those of rats it can be established that type I-substrates are better bound to rabbit P-450 whereas type II ligands are better bound to rat P-450. Furthermore from the results it is to be seen that in the type I-substrate series by both species the more hydrophobic substrate benzphetamine is better bound than hexobarbital. These results are in line with earlier findings (15) indicating that besides basicity and the stereochemistry of the ligands also its hydrophobicity determines the binding properties. With respect to species differences the better binding of type I-substrates to rabbit P-450 as compared with that of rat P-450 gives evidence for a more hydrophobic substrate binding site

.n rabbit P-450. Type II-substrates are known to be characterized by a hydrophobic binding portion (16). By Schenkman et al. (2) an ifron linkage has been assumed to be involved in the substrate binding. In -the case of metyrapone one of the pyridine nitrogens is estimated being coordinated to the iron (17). The results in this paper show that

K 40 cyanide is about 10 times more weakly bound, to P-450 of both species compared with imidazole. Thus the question arises by what kind of binding cyanide and imidazole are linked to the enzyme. It was shown that cyanide could displace one of the axial ligands of the heme iron in P-450 only at very high concentrations (18). Supposing this negatively charged ligand can be bound to the iron only by polar interactions then the weak binding may be explained considering (1) the heme iron in P-450 is in the six coordinated low spin state (2) an apolar environment (3)

negative charges in the immediate environment of the ligand binding site of the heme iron which was concluded from infrared studies of the CO-complex of P-450 (19). Imidazole can be coordinated to the heme iron like other type IIsubstrates with nitrogen atoms. Its' more tight binding compared with cyanide, however, might be assumed, to be caused by additional hydrophobic interactions. References (1) Imai, Y. and R. Sato; Biochem. Biophys. Res. Comm. 22, 620

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K 41

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Acta biol. med. germ. ¿6, K 43 - K 52 (1977) Zentralinstitut für Molekularbiologie der Akademie der Wissenschaften der DDR, Abteilung Zellkinetik, 1115 B e r l i n - B u c h , Lindenberger Weg 70 Chalone-like inhibition of Ehrlich ascites cell proliferation 1 in vitro by an ultrafiltrate obtained from the ascitic fluid. W. LEHMANN, H. GRAETZ, M. SCHÜTT and P. LANGEN (Eeceived

August 4, 1977)

Summary A n aqueous ultrafiltrate (10 0 0 0 - 50 000 dalton) prepared from the cell-free ascitic fluid of mice bearing Ehrlich ascites tumour (EAT) in the plateau phase of growth ( 1 2 - 1 6 days after transplantation) was investigated with regard to its inhibitory effects on the proliferation of EAT cells in a 24-hr suspension culture. The following results were obtained: (1) The in vitro proliferation of cells obtained from the plateau phase of in vivo growth was reversibly inhibited. (2) The doseresponse curves show a plateau with a maximum inhibition of about 50 which suggests that not all cells can be affected. (3) Young cells ( 4 - 6 days after transplantation) were not inhibited. (4) Preincubation of plateau phase cells in the culture medium before treatment abolishes the inhibitory effect of the ultrafiltrate. This effect of preincubation is dependent on time and serum concentration. It provides the possibility to differentiate between true "chalone-like" and cytotoxic effects. (5) The inhibitory properties of the ultrafiltrate are destroyed by heating or trypsin treatment. (6) Extracts prepared in the same way from ascitic fluid of mice bearing lymphocytic leukemia L1210 do not inhibit the proliferation of EAT cells. Corresponding extracts from ascitic fluid of mice bearing myelocytic leukemia YM were found to be inhibitory; however, the inhibitory effect was also found on preincubated cells and is therefore considered to be due to an unspecific cytotoxicity. In conclusion, evidence was obtained for a factor from the ascitic fluid of mice bearing EAT, which prevents EAT cells from entering the proliferating state. Introduction Cell proliferation is regulated in a highly complex manner by a variety of stimulating and inhibitory factors. Many of the stimulating factors have been described and characterized (e.g., the epidermis growth factor, fibroblast growth factor, insulin and other polypeptides) (1, 2). In contrast, evidence for inhibitory factors is much less conclusive (3)- Chalones, factors 1

These results were presented at a colloquium in honour of the 80th birthday of Prof. Negelein, on May 18, 1977 (Berlin-Buch)

K 44 discussed in this context, are defined as tissue-specific, noncytotoxic, species-unspecific inhibitors which act by a negative feedback mechanism. Since the introduction of this definition by Bullough (4, 5) and Iversen (6), many chalone-like compounds from a variety of tissues have been described (6). However, none of them has been obtained in a pure state and evidence for their physiological properties is often very incomplete. In many cases, difficulties arise from the fact that simple test systems for the rapid determination of chalone-like effects on cell proliferation with the exclusion of unspecif.ic cytotoxic effects are not available. A method for the investigation of the in vitro proliferation of EAT cells in a 24-hr suspension culture has been described by Negelein et al. (7)' We feel that this system might be ideally suited for the proof and characterization of presumptive chalone(s) from this tumour. EAT cells are mammary carcinoma cells of the mouse. Therefore, investigations on the influence of regulatory factors may be important not only from a theoretical point of view to help understand the control of the cell proliferation, but also from a clinical aspect. Growth characteristics of murine ascites tumours had revealed that a negative feedback mechanism for the control of cell proliferation may exist (8, 9). Bichel (10) and Barfod (11, 12) studied the JB-1 ascites tumour extensively and found good evidence for growth regulation by chalone-like substances. Gonzales and Verly (13) isolated a low molecular weight inhibitor of DNA synthesis from bovine mammary glands, acting specifically on normal and malignant (EAT cells) mammary cells in vitro. Nakai (14) found in conditioned medium o? J£AT cells an inhibitor of DNA polymerases in vitro described as chalone. Whereas Harris et al. (15) could not detect any specific action of ascitic fluid in vivo, Cooper and Smith (16) found that ascitic fluid of EAT was effective in vivo, but not effective without adrenalin and hydrocortisone under in vitro conditions. In the following we describe first results on a chalone-like effect on EAT cells in the above mentioned test system. Materials and methods 1. Preparation of the ultrafiltrate (10 000-50 000 dalton): Cell-free ascitic fluid obtained by centrifugation (1500 x g, 5 min, 4 C) of EAT cells from mice about 14 days after transplantation was ultrafiltrated using a XM 50 Diaflo^ ^membrane. The filtrate was

K 45

separated from low molecular weight compounds (under 10 000 dalton) by repeated washings on a UM 10 Diaflo^®^ membrane and finally concentrated to a volume which corresponds to half the volume of the original ascitic fluid. The isolation process was stopped when UV measurements of the effluent showed no absorption any longer. On the basis of the protein content in the ascitic fluid and the UF determined by the method of LOWRY et al. (17), an about 1000-fold purification can be calculated. In some experiments BAT cells were disrupted by ultrasonic treatment (in the same volume of water). After centrifugation of the homogenate at 100 000 x g for 30 min at 0°C the supernatant was processed in the same way as the ascitic fluid. 2. Test system: A suspension culture of EAT cells according to Negelein et al. (7) was used. The EAT cells were taken freshly from the peritoneal cavity of the mouse for each new experiment. The serum content of the normal medium is 4 %. All samples were incubated in duplicate. The evaluation of the proliferation was performed by counting the increase in cell number in a Fuchs-Rosenthal chamber. The difference between repeated counts of the same sample was below 10 %. The total volume of the samples was 3 ml containing 1 x 1 0 ^ EAT cells. The cells were cultivated for 24 hrs. During this time, the number of young cells (3 or 5 days after transplantation) increased 2 - or 2.5-fold whereas cells from the plateau phase of growth (12 or 14 days after transplantation) increased about 70 %. Plateau-phase cells show a distinct increase in labelling indices after being transferred to culture conditions (unpublished results); this means, they have entered the proliferating state. Therefore such cells are well suited for studying effects on the entry of the cells into the cell cycle. Treatment with ultrafiltrate (UF): For testing the inhibitory activity of UF the cells were suspended in a twofold concentrated normal medium which was diluted with UF in a ratio 1:1. Preincubation experiments: After removal from the mouse the cells were incubated in normal medium for 4 hrs (if not stated otherwise), centrifuged, resuspended and cultured as described before. Reversibility test: Reversibility tests were done by incubation of UF-treated and untreated cells for another 24 hrs in normal medium.

K 46 Results The effect of UP obtained from cell homogenate and ascitic fluid on cell proliferation in two selected experiments is shown in Table 1. The two UF caused a pronounced inhibition of cell proliferation. After removal of the inhibitory UF after 24 hrs the cells recovered completely and resumed normal growth, which shows the reversibility of the inhibitory effect. In many cases we used the trypan blue test in addition and found no differences between treated and untreated cells in the number of dead cells. Surprisingly, after preincubation of the cells in the normal medium (with 4 % serum, for 4 hrs) no inhibition of proliferation by UF was found- We consider this a very important finding, arguing once more against a simple cytotoxic effect and possibly being related to an early step in the activation of old cells to proliferate, induced by the preincubation. In agreement with this, young cells from the active phase of growth were not inhibited by the UF. Table 1 Inhibition of EAT-cell proliferation by UF obtained from cell homogenate (A) and ascitic fluid (B) without and after preincubation (see materials and methods). The assay of reversibility shows the cell increase in percent of the treated and untreated cells in a second incubation period of about 24 hrs. without preincubation Test assay:

A

B

A

B

60

72

64

64

80

control

60*

UF-treated

22

20

% inhibition

63

66

80 75 6

89 76 14

Assay of reversibility: control UF-treated % inhibition

increase in cell number

after pre incubât i on

K 47 The following results were obtained with UF of ascitic fluid, because we consider this a material easier to purify than cell homogenate. Up to now we have prepared UP 14 times from ascitic fluid which gave an average inhibition of 48 % - 14 %. The dose dependence of the inhibitory effect is shown in Fig. 1. Under the given experimental conditions and in the concentration range studied a plateau is found which may be explained by the assumption that not all cells can be affected.

60(— 50b U Oh

__ __ • x

Fig. 1. Dependence of inhibition of cell proliferation on UF-concentration. 1 = undiluted UF with approximately 60 /ig protein per sample. (•; x; •; UF from three different preparations)

j D

30 -

/

v' • ll I I L 1 1 ,11 12

8

4

_L

3 2 Concentration of UF

We were particularly interested in the preincubation effect, namely the prevention of inhibition. Therefore we studied both the effect of preincubation time and of serum concentration in the preincubation medium on the prevention of inhibition. Fig. 2 shows that the preincubation effect is dependent on time; cells preincubated 2 hrs with 4 % serum are no longer inhibited, while after 30 min the inhibiting effect is diminished but not abolished. It follows from Fig. 3 that the serum concentration in the medium plays an important role in the prevention of inhibition by preincubation. In order to get some information as to the specificity of our factor we prepared extracts from the ascitic fluid of mice bearing 2 leukemia L1210 and myelocytic leukemia YM in the same way as EAT UF and tested them in the EAT cell culture. Fig. 4 shows that the 2

1

We are indebted to Prof. Fey and Dr. Arnold for the gift of the YM tumour and L1210 tumour.

K 48

H

CONTROLS

[ Z D UF-treated

0%

31% 66%

Ohrs preincubation

30 min

2 hrs

U hrs

Pig. 2. Effect of preincubation time (medium with 4 % serum) on inhibition of EAT-cell proliferation during the following 24 hrs incubation. Figures on the top of the white columns are percent inhibition.

0 hrs preincubation

2 hrs with 0%CS

2hrs with 2%CS

2hrs with A%CS

Pig. 3. Effect of calf serum (CS) concentration in a 2 hrs preincubation period on inhibition of cell proliferation during the following 24 hrs incubation with UP.

K 49 L1210 extract did not inhibit the proliferation of BAT cells. In contrast, the YM extract inhibited EAT cell proliferation very strongly. However, the effect was also found on preincubated cells and is, therefore, considered to be due to an unspecific cytotoxicity.

without preincubation + UFIL12I0)

after U hrs preincubation + UF(EA)

Fig. 4.

Influence of UF obtained from ascitic fluid of three different tumour cell lines on cell proliferation of EAT cells in vitro (24 hrs) without and after 4 hrs preincubation. In some experiments the L1210 extract mentioned above, not inhibiting the EAT cells, inhibited to 95 % old L1210 cells which showed an increase ih cell number of about 45 %. Again, this effect could be prevented by preincubation. Furthermore UF from EAT did not inhibit these L1210 cells. However, since old L1210 cells did not readily grow in our system, we consider these results as preliminary. Discussion Considering that the dose-response curve shows a plateau, preincubation with serum (growth factors) renders the cells unresponsive and young cells are not inhibited, we tend to interpret our results according to the scheme shown in Fig. 5» Responsive are those cells which are out of cycle (resting compartment ). After being transferred to in vitro conditions they remain "out of cycle" if treated with "chalone", even in the presence of growth factors (serum). It should be mentioned that even an increase in the serum concentration to 10 % changes the inhibitory effect of our UF only

K 50

RESTING COMPARTMENT

+ -

Resting cells r e m a i n resting during t r e a t ment with , , c h a l o n e " ( U F ) and growth factors (serum)

Fig. 5.

growth factors „chalone"

Proliferating cells remain proliferating during treatment with „ c h a l o n e " ( U F ) a n d growth factors (serum)

Scheme demonstrating possible effects of the "chalone" (UF) and growth factors (serum) on resting and proliferating cells.

marginally. In contrast, if exposed to serum (growth factors) only, i.e., in the absence of "chalone", the cells are induced to proliferate (entry into the proliferating compartment ), In this state they do not respond to "chalone", as young cells do not either. Under our culture conditions the outcome of the interplay between growth promoting and growth inhibiting factors is - at least in a certain range - not so much dependent on the relative concentrations of these factors, but is predetermined by the state of the cells. Up to now we could not produce the transition of cells from the proliferating to the resting state in our system (even preincubation of young or proliferating cells with "chalone" in the absence of serum was not effective). In this context, we may discuss the following possibilities: Time dependence of the effect ("chalone" may have to be present or should be stable in our culture system for a longer time period than has so far been investigated), cell density (transition to the resting state may depend on "cell crowding", not occurring in our system) or involvement of other factors which are lost during the isolation procedure or are not present in our culture medium (e.g., hormones such as adrenalin or Cortisol (16)). In any case', the finding that a factor probably involved in the regulation of cell proliferation could not be detected with proliferating cells may be of interest for the methodology in the search for "chalones", which is often done just with such cells. Factors with a direct effect on DNA-synthesis may regulate the length of the S-phase in the cell cycle and not the transition from

K 51 the resting to the proliferating state. However, we think that a factor as indicated by the described experiments preventing the entry of cells in the growth fraction is not contradictory to the definition of a chalone. Another interesting question is the origin and nature of the effective compound(s) in the UP. Its sensitivity against trypsin and heat suggests that we are dealing with a protein or glycoprotein. As to its origin it may be speculated that it stems from the cell surface. It is well known that cell surface proteins and glycoproteins in their turnover are excreted into the environment and that resting cells show an especially high turnover of membrane molecules (18, 19). If proteins responsible for recognition with regard to cell proliferation, after being exported to the environment, do not lose their regulatory functions, they may be isolated as active factors. Then, chalones could be considered as special solubilized recognition proteins of the cell surface. Further work is in progress on the purification of the described factor as well as to get some insight in some of the open questions mentioned in the discussion. References (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11)

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(14) (15) (16) (17) (18) (19)

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Mit diesem Werk soll die vorhandene historisch bedingte Spezialisierung in der Neurobiologie überwunden und ein echter Beitrag zum gegenseitigen Verständnis und zur notwendigen Zusammenarbeit des klinischen und experimentellen Forschers im Bereich der Neurowissenschaften geleistet werden. Primär als Lehrbuch für die postgraduale Ausbildung der Mediziner konzipiert, wird der Informationsreichtum auch von Biologen, Psychologen, Philosophen und Pädagogen genutzt werden. Behandelt werden folgende Fragen: Zelluläre Elemente und Kontakte im Nervensystem; Neurochemie; Erregungsphysiologie; der synaptische Komplex; morphologische, biochemische und physiologische Aspekte der Ontogenese des Nervensystems; Neuroendokrinologie der Wirbeltiere; Neuroanatomie; Neurophysiologie; Adaptions- und Lernvorgänge; Neuropharmakologie; das Verhalten; vergleichende Neurobiologie wirbelloser Tiere; Neurokybernetik. Ein ausführliches Literaturverzeichnis beschließt den reich mit Bildern und Tabellen ausgestatteten Band.

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V E B GUSTAV FISCHER VERLAG J E N A D D R - 6 9 Jena. Villengang 2

CONTENTS Biochemistry and S . R A P O P O R T : Electron transfer particles from beef heart mitochondria a s a test system on inhibitors of t h e respiratory chain T . S C H E W E and C H . H I E B S C H : On the action of respiratory inhibitors on t h e electron transfer system of Escherichia coli W . M Ü L L E R and T . S C H E W E : On t h e mechanism of action of t h e inhibition of pyridine nucleotide-dependent flavine enzymes by t h e systemic fungicide Dexon P . L U D W I G , T . S C H E W E , and S. R A P O P O R T : Slow irreversible inhibition of t h e respiratory chain of non-phosphorylating submitochondrial particles by free f a t t y acids and their methyl esters and monoglycerides J. F I S C H E R , W . H E Y E R , F . J A N O W S K I , F . W O L F , and A . S C H E L L E N B E R G E R : Immobilization of proteins on macroporous glasses involving maleinimide as t h e anchoring group . C H . F L E M M I N G , A . G A B E R T , M . G O M O L L , and P . R O T H : Synthesis and properties of insolubilized enzymes. V I I I . Kinetic studies of t h e binding rate of enzymes to macroporous carriers N G U Y E N Q U O C K H A N G , H . - J . B Ö H M E , and E. H O F M A N N : Purification and properties of pig kidney g l u t a m a t e dehydrogenase K . N I S S L E R , W . S C H E L L E N B E R G E R , and E . H O F M A N N : Binding of MgATP to yeast phosphofructokinase . . . > . L . J Ä K E L and E. G R Ü N : Determination, properties and postnatal development of galactokinase in pig liver K . K O N I T Z E R and S . V O I G T : Metabolism of blood-borne lactate in r a t brain in vivo . . . C H R . V O S S , H . C . S C H O B E R , and N. H A R T M A N N : Influence of lithium on t h e in vitro deiodination of L-thyroxine in rat liver W . MÜLLER, T. SCHEWE,

Page 941 — 960 961—966 967 — 980 981 — 998 999—1005 1007—1018 1019—1026 1027 — 1033 1035 — 1048 1049—1059 1061 —1065

Physiology and F . F R I T S C H : The influence of increased extracellular potassium concentration on t h e efferent vagal effects in isolated rabbit atrium . . . . G . C A F F I E R and C . P F E I F F E R : Action of free f a t t y acids on the h e a r t : Effects of nonanoic acid on contractility and postextrasystolic potentiation in -the r a t papillary muscle . F . K Ö S S L E R and G. K Ü C H L E R : The influence of homologous n-alcanoic acids on functional properties of isolated skeletal muscles. I I I . Contractures by f a t t y acids and relations t o effects of caffeine M . B I E D E R M A N N , G . B Ü T T N E R , H . K A S C H O W I T Z , and I . P I N G E L : The effect of single impulses on the cochlear microphonics of t h e cochlea from guinea pig K. R E Y M A N N , V. B. S H V Y R K O V , and Yu. V. G R I N C H E N K O : On participation of hippocampal single units in consecutive feeding behaviour E . O T T O , D . B R Ä U E R , and M . W I L H E L M : Characterization of E E G activity p a t t e r n s in h u m a n sleep by means of variance and discriminant analyses M. ARYAand N. K. LOHIYA: Estrogenic and antifertility effect of cyproterone acetate in female gerbilis, Meriones hurrianae Jerdon B . NILIUS, C. AUGUST,

1067 — 1075 1077 — 1084 1085 —1095 1097 — 1105 1107 — 1112 1113 — 1131 1133 —1141

Pharmacology U.

D. E H L E R S , R. F E R M U M , and P. M E I S E L : Experiments on the action mechanism of vascular spasmolytics. 4. Action of nitroprusside-sodium, nitroglycerol, prenylamine, and verapamil on calcium u p t a k e of microsomes from smooth vascular muscle 1143 — 1148 W. K L I N G E R and D. M Ü L L E R : Ethylmorphine-N-demethylation by liver homogenate of newborn and adult r a t s : Enzyme kinctics and age course of V m a x and K m 1149 — 1159 D . M Ü L L E R and W . K L I N G E R : The influence of N A D H 011 t h e ethylmorphine-N-demethylation in liver microsomes from control and phenobarbital-treated rats of different ages 1161-1166 KLINNER,

Immunology 1. S C H E R B A U M , and H . A M B R O S I U S : Cell surface immunoglobulin on lymphocytes of carp (Cvprinus carpió L.) 1167—1177

H. FIEBIG,

Short communications Biochemical genetics. U . G R I M M , A . K N A P P , K . S C H L E N K A , and R . H E S S E : Phenylalaninhydroxylase activity in heterozygotic individuals predisposed for t h e phenylketonuria gene 1179—1182 Cell Biology. F . S C H O B E R , U . T R A U T M A N N , W . N A U M A N N , and G . S T E R B A : The oxytocinergic exohypothalamic connections with t h e Medulla oblongata in t h e pigeon and rat . . 1183 — 1186 Physiology. H . D A V I D O W A and D . A L B R E C H T : Electrophysiological studies on single cells of t h e Nucleus lateralis posterior from r a t s 1187 — 1189 Physiology. O . R . A F F O N S O , M . F . L E M O S , S . M . S I M A S , and E. M I T I D I E R I : Effect of large intraperitoneal doses of f a t t y acids on t h e r a t blood serum xanthine dehydrogenase activity 1191 — 1192 Pharmacology. H . - J . M E S T , J . W I N K L E R , and W . F Ö R S T E R : The a n t i a r r h y t h m i c effect of prostaglandin E 2 on catecholamine-induced a r r h y t h m i a s 1193 — 1196 Immunobiology. P . Z I S K A and J . M Ö H R : Affinity chromatography of serum proteins using immobilized lectin from Vicia faba . . . . '. 1197 —1198 Molecular biology. H . D A M A S C H U N , G . D A M A S C H U N , H . F E N S K E , R . L I N D I G K E I T , J . J . M Ü L L E R , V . J . P O S P E L O V , and V . J. V O R O B E V : Small-angle and large-angle X - r a y scattering of individual nucleosomes. Preliminary results K13 — K17 Biochemistry. B . A . F E D O R O V , M . B E C K E R , G . D A M A S C H U N , H . D A M A S C H U N , C H R . G E D E C K E , and D. Z I R W E R : Diffuse large-angle X - r a y scattering of polyglutamic acid in solution K19—K25 Biochemistry. R . K L E I N E and U . R O T H E : Isolation, crystallization, and partial characterization of a cationic protease from Thermoactinomyces vulgaris K27 — K33 Biochemistry. R . M I S S E L W I T Z , G . R . J Ä N I G , H . R E I N , E . B U D E R , D . Z I R W E R , and K . R U C K P A U L : Substrate binding to solubilized cytochroma P - 4 5 0 from rabbits a t different t e m p e r a t u r e s K35 —K41 Cell biology. W . L E H M A N N , H . G R A E T Z , M . S C H Ü T T , and P . L A N G E N : Chalone-like inhibition of Ehrlich ascites cell proliferation in vitro by an ultrafiltrate obtained from t h e ascitic fluid K43 — K 5 2

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1085—1095

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1149-1159

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1161—1166

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