Acta Biologica et Medica Germanica: Band 36, Heft 10 [Reprint 2022 ed.] 9783112650103

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ACTA BIOLOGICA ET MEDICA GERMANICA

ISSN

0001-5318

Zeitschrift für funktionelle Bio Wissenschaften Chefredaktion H. Bielka • W. Scheler Herausgeber: R. Baumann • H. Dutz A Graffi • F. Jung O . Prokop • S. M Rapoport

Unter Mitarbeit von: H. Ambrosius • H. A n k e r m a n n G . Dörner • H Drischel H A. Freye • H. Frunder E G o e t z e • H. Hanson E Hofmann • F Klingberg W Kohler • F Markwardt H Matthies • W O e l ß n e r G Pasternak • A. Schellenberger E. Schubert • F. Schwarz G Sterba A. W o l l e n b e r g e r

Band 36 Heft 10 • lgyy Seite

1363—1501

E V P 24, - M

A B M G A J 36 (10) 1 3 6 3 - 1 5 0 1 (1977)

31002

AKADEMIEVERLAG BERLIN

Aufnahmebedingungen 1. Die ACTA BIOLOGICA ET MEDICA GERMANICA, Zeitschrift für funktionelle Biowissenschaften, publiziert Arbeiten aus den Fachgebieten Biochemie, Molekular- und Zellbiologie, Physiologie (einschließlich Pathophysiologie), Pharmakologie und Immunbiologie. Es werden nur Arbeiten angenommen, die nicht an anderer Stelle mit demselben Inhalt veröffentlicht oder zur Veröffentlichung angeboten werden. Der Autor verpflichtet sich nach Annahme, die Arbeiten an keiner anderen Stelle zu veröffentlichen. 2. Die Arbeit muß wissenschaftlich wertvoll sein. Bestätigungen bekannter Tatsachen, Versuche und Beobachtungen ohne positives Ergebnis werden, wenn überhaupt, nur in kürzester Form aufgenommen. Nicht aufgenommen werden Polemiken und spekulative Arbeiten, falls sie nicht wesentlich neue Gesichtspunkte enthalten. Die Arbeiten sollen den Charakter wissenschaftlicher Originalarbeiten haben. Als solche gelten alle Mitteilungen, die zur vorwärtsführenden Erweiterung des Erkenntnisstandes auf den genannten Fachgebieten führen. Originalarbeiten sollen 20 Manuskriptseiten nicht überschreiten. Kurzmitteilungen werden bei der Drucklegung zeitlich bevorzugt; sie dürfen 5 Manuskriptseiten nicht überschreiten. Als Kurzmitteilung gelten solche Arbeiten, in denen über neue Ergebnisse berichtet wird, ohne Details einer Originalarbeit zu enthalten. Besonders aktuelle Untersuchungsergebnisse können in kurzer Form (bis 4 Seiten) im Offsetverfahren publiziert werden, wofür reproduktionsreife Manuskripte erforderlich sind. In Form von Ubersichtsarbeiten (Reviews) werden Artikel entgegengenommen, die zu aktuellen Gebieten einen Überblick geben, in dem Fakten dargestellt, besprochen und kritisch bewertet werden. 3. Die Arbeiten müssen so kurz als möglich abgefaßt werden und in einem druckreifen Zustand geschrieben sein. Einleitung (Problematik), Methodik, Befunde und Diskussion sollen deutlich in Erscheinung treten. Der Arbeit ist eine Zusammenfassung der wesentlichsten Ergebnisse voranzustellen, wovon bei deutschsprachigen Manuskripten auch eine englische Übersetzung notwendig ist. Arbeiten werden in Deutsch, Englisch und Russisch angenommen. Die Manuskripte sind in zweifacher Ausfertigung einzureichen. Bei Manuskripten in deutscher Sprache ist die Schreibweise des „Duden" verbindlich; bei eingedeutschten Wörtern ist die ,,K-Z"Schreibweise anzuwenden. Von den Abbildungen sind 2 Kopien sowie 1 Satz reproduktionsreife Vorlagen beizufügen. Genaue Hinweise zur Manuskriptgestaltung sind von der Redaktion der Zeitschrift anzufordern und unbedingt einzuhalten. Manuskripte, die diesen Bedingungen nicht entsprechen, gehen unbearbeitet zur Revision an den Autor zurück. 4. Die Arbeiten werden im Sofortumbruch gesetzt; Korrekturen in Form von Streichungen bzw. Zusätzen sind daher in der Umbruchkorrektur nicht zulässig. 5. Manuskripte sind an die Redaktion der ACTA BIOLOGICA ET MEDICA GERMANICA, DDR-1115 Berlin-Buch, Lindenberger Weg 70, zu senden. 6. Von jeder Originalarbeit werden kostenlos 80 Sonderdrucke geliefert. Chefredaktion

Zeitschrift ACTA BIOLOGICA E T MEDICA GERMANICA Herausgeber: Prof. Dr. R. Baumann, Prof. Dr. H . Dutz, Prof. Dr. A. Graffi, Prof. Dr. F. J u n g , Prof. Dr. O. Prokop, Prof. D r . S. M. Rapoport. Verlag: Akademie-Verlag, DDR-108 Berlin, Leipziger Straße 3 - 4 ; Fernruf 2 2 3 6221 oder 2 2 3 6 2 29; Telex-Nr. 1 1 4 4 2 0 ; Bank Staatsbank der D D R , Berlin, I> O CS 11 00

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1375

1376

U . SCHUHMACHER, E .

GRÜN

in der Leber von Ferkeln LDH-1 und LDH-2 den höchsten Anteil ausmachten, lag in unserem Fall stets LDH-3 am höchsten. Mit zunehmendem Alter der Tiere fanden diese eine Zunahme des Anteils an LDH-3, während aus unseren Untersuchungen hervorgeht, daß bereits in der Leber von 6 Tage alten Ferkeln im wesentlichen die Verteilung der LDH-Isoenzyme vorliegt, die bei Schlachttieren anzutreffen ist und lediglich eine Abnahme des Anteils an LDH-1 während der postnatalen Entwicklung eintritt. Die Veränderung des Enzymmusters ist eng mit der Organdifferenzierung und -reifung verbunden und dient der besseren Anpassung an die sich ebenfalls während der Entwicklung ändernden Stoffwechselbedingungen. Es handelt sich bei diesem Vorgang nicht um ein Wirksamwerden oder eine Ausschaltung von Genen, die entweder H- oder M-Subeinheiten kodieren, sondern um eine graduelle Veränderung der genetischen Aktivität derselben, an der Änderungen der Sauerstoffversorgung, der Körpertemperatur, eine Substratinduktion infolge der Futteraufnahme, hormonelle Einflüsse beteiligt sein können. Es ist schwer, aus diesem komplexen Geschehen einen kausalen Stimulus für die beobachteten Veränderungen zu finden. Verschiedene Beobachtungen deuten jedoch an, daß die Dominanz der H- oder M-Subeinheiten Beziehungen zur Sauerstoffversorgung der Gewebe aufweist, wonach in Organen reicher 0 2 -Versorgung (z. B. Herz) der H-Typ, in denen mit vorwiegend anaerober Stoffwechsellage (z. B. Skelett.muskulatur, Tumorgewebe) der M-Typ überwiegt [1], Die tierartlich spezifische Verteilung der LDH-Isoenzyme der Leber besitzt damit funktionelle Bedeutung für den LeberstoffWechsel. Genaue Stoffwechselbilanzen liegen bisher für die Leber des Schweines nicht vor. Unter Berücksichtigung vorgenannter Gesichtspunkte liegt die Annahme nahe, daß der Leberstoffwechsel des Schweines — im Unterschied zu dem von Mensch, Fleischfressern und Laborversuchstieren — einen aeroben Charakter besitzt, der sich während der postnatalen Entwicklung stärker herausbildet. Literatur [1] [2] [3] [4]

[5] [6] [7] [8] [9] [10]

[11] [12]

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LATNER,

Laktatdehydrogenase in der Ferkelleber

1377

[15]

H E N D E , C . V A N D E N , E . M U Y L L E U. W . O Y A E R T :

Zentbl. VetMed. A15,

[16]

BURCH, H . B.,

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[17] [18] [19] [20]

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A . M . KUHLMAN,

135

(1968)

E.J.DIAMANT,

S.

R.

L O W R Y U.

Anschrift der Verfasser: Dipl.-Biol. 701 Leipzig, Semmelweisstr. 4

URSULA SCHUHMACHER

und Dr. sc. med. vet. E.

GRÜN,

Summary and E . G R Ü N : Lactate dehydrogenase (LDH) and isoenzymes in piglet liver during postnatal development U . SCHUHMACHER

1. LDH-activity in the liver of newborn piglets is 4 times t h a t of adult pig sliver and remains relatively constant at this level during the first 3 weeks of life. 2. 90 percent of L D H is localized in the cytosolic compartment of the liver, independent of age of pigs. 3. In the liver of newborn piglets the isoenzymes LDH-3 and LDH-4 includes the main part of LDH-activity. The typical distribution of L D H isoenzymes in the liver of adult pigs (LDH-3 > LDH-2 > LDH-1 > LDH-4 > LDH-5) is already reached in 6-day-old piglets. Afterwards there follows only a decrease of LDH-1. Therefore, during postnatal development a directed shift from M- to H-type of isoenzyme distribution is observed.

Acta biol. med. germ., B a n d 36, Seite 1379—1391 (1977) 1 2

3

Physiologisch-Chemisches Institut, Karl-Marx-Universität, 701 Leipzig, D D R I n s t i t u t f ü r Physiologische und Biologische Chemie, Humboldt-Universität, 104 Berlin, DDR Zentralinstitut f ü r Molekularbiologie, Akademie der Wissenschaften der D D R , 1115 BerlinBuch, D D R

Regulation of anaerobic glycolysis in Ehrlich ascites tumour cells J . SCHULZ1, and

A. BAUFELD1,

E . HOFMANN1,

T . A . RAPOPORT3,

R.

HEINRICH2

S. M . RAPOPORT2

(Received J a n u a r y 12, 1977; in revised form April 14, 1977)

Summary 1) I n intact Ehrlich ascites t u m o u r cells t h e anaerobic glycolytic flux rate and p a t t e r n of intermediates have been investigated at different pH values of t h e extracellular medium. 2) As predicted f r o m t h e dependence of t h e lactic acid dehydrogenase equilibium on p H a strong negative correlation between log ([lactate]/[pyruvate]) and p H has been found. 3) The steady s t a t e fluxes of glycolysis at p H 8.0 and 7.4 are rather equal, despite significant differences in t h e intracellular concentrations of glycolytic intermediates. A t pli 8.0 t h e concentrations of ATP, glucose 6-phosphate, and fructose 6-phosphate are lower, and the concentrations of ADP, AMP, fructose 1,6-bisphosphate, triose phosphates, phosphoglycerates, and phosphoenolpyruvate are higher t h a n at pH 7.4. 4) F r o m the analysis of t h e pH. dependent changes of metabolites it follows t h a t different mechanisms are responsible for maintaining equal actual activities of hexokinase, phosphofructokinase and p y r u v a t e kinase at pH 7.4 and 8.0. 5) F r o m an application of t h e linear theory of enzymatic chains and a calculation of t h e control strength of t h e regulatory i m p o r t a n t enzymes results t h a t hexokinase is evidently rate-limiting for glycolysis, and phosphofructokinase is also significantly influencing t h e glycolytic flux. P y r u v a t e kinase and glyceraldehyde phosphate dehydrogenase, on t h e other hand, do n o t significantly affect t h e r a t e of the overall glycolytic f l u x in ascites Symbols and abbreviations I n t h e formulae and figures t h e following symbols and abbreviations are used: Symbols (for explanation see Ref. [7]): r, characteristic time of a given enzyme; q, equilibrium c o n s t a n t ; V (maximum activity), capacity of a given enzyme; K, Michaelis constant or inhibition constant of an enzyme; pKe, extracellular pH. Metabolites: Glc-6-P, glucose 6-phosphate; Fru-6-P, fructose 6-phosphate; Fru-1,6-P 2 , fructose 1,6-bisphosphate; GAP, glyceraldehyde 3-phosphate; D H A P , dihydroxyacetone p h o s p h a t e ; triose-P, triose phosphates (sum of G A P + D H A P ) ; glycerate-3-P, glycerate 3-phosphate; glycerate-2-P, glycerate 2-phosphate; P-enolpyruvate or P P y r , phosphoenolp y r u v a t e ; Pyr, p y r u v a t e ; Lac, lactate; glycerol-3-P, L-glycerol 3-phosphate. Enzymes'. GPD, glycerol p h o s p h a t e dehydrogenase or L-glycerol-3-phosphate:NAD oxidoreductase (EC 1.1.1.8); L D H , lactate dehydrogenase or L-lactate: N A D oxidoreductase (EC 1.1.1.28); GAPD, glyceraldehyde phosphate dehydrogenase or D-glyceraldehyde-3p h o s p h a t e : N A D oxidoreductase (EC 1.2.1.12); H K , hexokinase or ATPiD-hexose 6-phosphotransferase (EC 2.7.1.1.); P F K , phosphofructokinase or A T P : D-fructose 6-phosphate 1-phosphotransferase (EC 2.7.1.11); P K , p y r u v a t e kinase or A T P : p y r u v a t e phosphotranserase (EC 2.7.1.40). 90

Acta bio!, med. germ., Bd. 36, Heft 10

1380

J . SCHULZ e t a l .

tumour cells. However, the latter two enzymes play an important role in the adjustment of the intermediate levels in the lower part of glycolysis. 6) During stationary anaerobic glycolysis a continuous accumulation of pyruvate and glycerol 3-phosphate is taking place. This may be due to a dismutation of dihydroxyacetone phosphate in Ehrlich ascites tumour cells. Introduction Ascites tumour cells appear to be very suitable for studying glycolytic regulation, because glycogenolysis does not occur and gluconeogenesis as well as the pentose phosphate pathway can be neglected in these cells [i, 2]. Earlier studies on the pH dependence of aerobic glycolysis of this type of cells performed in our laboratory indicated the operation of a series of control points influencing the levels of glycolytic intermediates [ 3 , 4 ] . In the previous type of approach certain serious limitations existed in the elucidation of the rate-limiting step of the glycolytic pathway, because respiration is affecting significantly the intracellular levels of glycolytic intermediates and the crossover theorem used for the analytical treatment has been shown not to be applicable in its simple form to glycolysis, unless a number of critical points have carefully been analyzed [ 5 , 6 ] . In this contribution anaerobic glycolysis and the respective pattern of glycolytic intermediates in Ehrlich ascites tumour cells at different pYi values of the incubation medium has been investigated. The results were subjected to a quantitative analysis based on the linear steady state treatment of enzymatic chains [5-7]'. Materials and methods Ehrlich ascites tumour cells were grown in mice of the Agnes Bluhm strain, harvested on the 8 th day after inoculation, and washed in a modified Krebs-Ringer phosphate solution as described previously [3, 4]. The cell suspensions (14—16%, v/v) were incubated at 25 °C in an atmosphere of purified nitrogen. After preincubation for 20 min isotonic glucose solution was added to a final concentration of 20 mM. Incubation was performed in the following two ways: 1) For determination of the whole number of glycolytic metabolites in addition to glycolytic flux the washed cells were suspended in the Krebs-Ringer phosphate solution (about 40 ml suspension)"and stirred continuously at constant pH of either 7.4 or 8.0 in a £H-stat-equipment (Radiometer, Copenhagen). 2) For determination of lactate and pyruvate only smaller volumes of cell suspensions (2 ml containing 50 mM Tris, 20 mM phosphate, and 105 mM NaCl) with different pH values were incubated in a thermostated water-bath with continuous shaking. At various times of incubation two samples of different volumes were simultaneously removed from the incubated cell suspensions. The smaller volume was used for checking the pH value of the suspension by application of a microelectrode unit (Forschungsinstitut Meinsberg, GDR) and from the larger one a neutralized perchloric acid extract was produced for the enzymatic determination of the respective metabolites [8]. Results Fig. 1 demonstrates the influence of pH on the lactate/pyruvate ratio in suspensions of glycolyzing Ehrlich ascites tumour cells under anaerobic conditions. A negative correlation between log ([lactate]/[pyruvate]) and the extracellular pK

Regulation of glycolysis in tumour cells

Fig. 1. Dependence of anaerobic [lactate]/[pyruvate] ratio on the extracellular pH of cell suspensions of Ehrlich ascites tumour. Cell suspensions with different pH values were incubated as described in "Materials and methods". pH, lactate and pyruvate were estimated simultaneously at various times between 5 and 27 min after addition of glucose to the cell suspension. The different symbols indicate the values obtained from four independent experiments

1381

6,0

S.5

7.0

Table 1 Concentration of metabolites in Ehrlich ascites tumour cells in the steady state of anaerobic glycolysis. The numbers represent the mean values of metabolite concentrations as determined 15 and 20 min after addition of glucose to the cell suspensions in actually two pH stat experiments at pH 7.4 as well as at pH 8.0, respectively (compare with Fig. 2). Glycerol-3-phosphate was estimated in a separate experiment as shown in Fig. 3- The numbers in parenthesis give the lowest and highest experimentally determined metabolite concentrations ¿ H e = 7.4 Metabolite Glc-6-P Fru-6-P Fru-1,6-P2 Triose-P Glycerate-3-P Glycerate-2-P P-enolpyruvate Pyruvate Glycerol-3-P ATP ADP AMP Z AN A Lac 1

pne

=

s

0

(¿moles per ml of cells 0.86 0.24 1.44 1.18 1.08 0.15 0.42 2.93 2.80 2.28 0.66 0.35 3-29 229

(0.84; (0.23; (1.41; (1.04; (1.02; (0.14; (0.40; (2.88; (2.56; (2.18; (0.52; (0.30; (3-00; (200;

0.87) 0.25) 1.48) 1-31) 1.14) 0.16) 0.48) 2.99) 3.05) 2.38) 0.86) 0.38) 3-36) 248)

0.34 0.08 5-52 1-99 1.92 0.31 0.94 5.28 3-90 0.30 1.00 1.46 2.95 215

(0.29; (0.08; (5-44; (1-95; (1.91; (0.28; (0.88; (4.94; (3.24; (0.26; (0.95; (1.21; (2.42; (202;

0.39) 0.08) 5-60) 2.17) 1-98) 0.34) 1.00) 5.62) 4.55) 0.49) 1.24) 1.67) 3-39) 227)

1 [¿moles lactate/h produced per ml of cells during 15 to 20 min after addition of glucose

90*

7.5

8.0 pHe

1382

J. ScHÚLZ"et al.

is found. This can be predicted from the dependence of the thermodynamic equilibrium of the lactate dehydrogenase reaction [9], and is qualitatively comparable with the pK dependence of the quotient under aerobic conditions [3]. In the following, the glycolytic flux rate and the anaerobic pattern of glycolytic metabolites at two selected p H values, namely at p H 7A and 8.0, will be analyzed in more detail. A quasi steady state of glycolytic flux is attained within \ 5 and 20 min after addition of glucose to the cell suspension .(Fig. 2 A—C). In Table 1 the mean values of the respective concentrations, calculated from the analytical results obtained 15 and 20 min after glucose addition, are summarized. At the two p ü values the stationary rates of lactate production ,are rather equal, however, the profiles in the metabolite levels differ significantly in the two sets of experimental conditions. At pYi 8.0 the stationary concentrations of ATP, glucose 6-phosphate and fructose 6-phosphate are lower, and the concentrations of ADP, fructose 1,6-bisphosphate, trióse phosphates, glycerate 3-phosphate, glycerate 2-phosphate, and phosphoenolpyruvate are higher than at ^ H 7-4 (Table 1 and Fig. 2 B and 2C, respectively). The sum of the adenine nucleotides are similar at both p H values, the differences of which are within the limits of experimental error in the individual determinations. The stationary quotient of [lactate] to [pyruvate] is lower at^>H 8.0 than at ^ H 7.4 (Fig. 2 A), in agreement with the results shown in Fig. 1. At p H 8.0 pyruvate increases rapidly after glucose addition and at the same time a drastic decrease of the lactate pyruvate ratio is observed (Fig. 2A). This effect might either indicate a transient displacement of the lactate dehydrogenase reaction from thermodynamic equilibrium during the initial state of glycolysis or (less likely) a temporal retardation of pyruvate permeation from the cells into the extracellular medium [9]. Regularly it could be noticed that pyruvate and glycerol 3-phosphate do not reach stationary levels.Theconcentrations of these two metabolites increase continuously during the incubation period of 30.min with rates being almost equal both at pH 7-4 and at pK 8.0 (Fig. 3). Also, the levels of phosphoenolpyruvate and glycerate 3-phosphate increase continuously at pH 8.0 (Fig. 2C). This might be due to a progressive inhibition of pyruvate kinase and will be discussed in the next Section. Discussion

Interpretation of the pH-dependent changes of glycolytic metabolites From the lower level of A T P at pYi 8.0 in comparison w i t h ^ H 7.4 and the equality of the glycolytic flux at the two ^ H values, it may be concluded that ATP consuming processes are stimulated at 8.0 although the rate of ATP consumption is equal at both pH. values. The shift of pH from 7.4 to 8.0 and the differences in the composition of the adenylate system influence significantly the kinetic control characteristics of phosphofructokinase. By decrease of ATP and by alkalinization a more active and less inhibited state of phosphofructokinase is favoured with higher affinity to fructose

Regulation of glycolysis in tumour cells

pHe = 7A

1383

pHe=a.O

Fig-. 2. Temporal changes of metabolite concentrations after addition of glucose to anaerobic suspensions of Ehrlich ascites tumour cells. The extracellular pH was kept constant at 7.4 and 8.0, respectively, throughout the incubation. Each value represents the mean of metabolite concentrations obtained from two experiments at the respective pH. 2 A) Production of lactate and pyruvate, respectively, and time dependence of the [lactate]/ [pyruvate] ratio.

1384

J . SCHULZ e t a l .

pHe=7A

pHe = 8.0

10 2 B) Changes of the adenine nucleotides.

15 20 min

AN = [ATP] + [ADP] + [AMPJ.

1385.

Regulation of glycolysis in tumour cells pHe = U

-

p He =8.0

-

Gic-e-p

Gic-e-p Fru-e-P T

!

15

20

«

5-10

0

1

-

'

0

5

I -

Fru-G-P

10

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—4

15

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15

20

15

20

Fru-1.B-P2

-

*

Fru-U-P, f

—«iVi i l l

triose - P,

i

I

I

10

15

20

triose -P

• i-/I

I 10

o S

glycerate-3-P

10 1

' — g/ycerate-3-P | g/ycerate-2-P__

15

20

-

P-eno Ipyru vate

0.5-

Iii i i I

0

5 .

10

15

20

0

5

10

min

2 C) Temporal variations in the levels of glycolytic intermediates

6-phosphate [10—12]. Consequently, at different concentrations of fructose 6phosphate equal actual activities of the enzyme at the t w o different pH values are ascertained. F r o m the equality of the actual steady state rates of hexokinase at the t w o selected pH values it m a y be concluded that the positive kinetic effect originating from the decrease of the inhibitor glucose 6-phosphate at p t t 8.0 and the negative one resulting from the decrease of M g A T P as rate determining substrate of hexokinase when glucose is in excess are counterbalancing each other.

1386

J. SCHULZ e t al.

e

e

H-dependent changes of the kinetic properties of pyruvate kinase mentioned above are mainly responsible for the decreased activity of this

Regulation of glycolysis in tumour cells

W7

;nzyme at alkaline pH. This decrease of pyruvate kinase activity is balanced by the observed increased levels of substrates. The continuous increase of phosphoenolpyruvate at pH 8.0 points to a progressive inhibition of pyruvate kinase. Also pyruvate is increasing especially at p~K 8.0, and it may be supposed that pyruvate participates in the inhibition of pyruvate kinase [18, 19]. The increase of phosphoenolpyruvate is propagated to the phosphoglycerates indicating that the reactants of enolase and phosphoglycerate mutase are in approximate equilibrium. Numerical comparison of their mass action ratios with the thermodynamic equilibria yields good agreement. The rapid initial increase of pyruvate may be explained by a change of the reactants in the lactic acid dehydrogenase equilibrium consisting in an increase of NADH and pyruvate, when the H + -concentration is lowered. The presumed increase of NADH may give rise to an inhibition of glyceraldehyde phosphate dehydrogenase [20], which may cause an increase of triose phosphates and fructose 1,6-bis phosphate. From the respective metabolite levels follows that the glyceraldehyde phosphate dehydrogenase system is obviously not in equilibrium. The continuous increase of pyruvate at the two p H values raises the question for the origin of the necessary oxidation equivalents in the anaerobic cells. Evidently, this is correlated with the continuous increase of glycerol 3-phosphate occurring in the steady state of glycolysis. The simplest explanation is the dismutation of dihydroxyacetonephosphate [9] into glycerol 3-phosphate and pyruvate, being formed with equal rates. The following rough calculation shows that the intracellular activities of pyruvate kinase and glyceraldehyde phosphate dehydrogenase are able to adjust the metabolite levels of the lower part of glycolysis and explain even quantitatively the changes of the triose phosphates. Time periods will be considered in which all metabolites except lactate, pyruvate, and glycerol 3-phosphate attained constant levels 1 . Under these conditions the equation d[Pyr]

dT~

d[glycerol-3-P] =

dt

W

is valid. For the pyruvate kinase, glyceraldehyde phosphate dehydrogenase and glycerol phosphate dehydrogenase the following simplified rate equations are assumed: ^pk = ¿pk • [ADP] • [PPyr]

(2)

^GPD = ¿GPD • [DHAP] • [NADH]

(3)

%APD = ¿GAPD • [GAP]/[NADH] = &gapd • [DHAP]/[NADH]

(4)

The last equation takes the equilibrium of the triose phosphate isomerase reaction into account. 1 For simplification the levels of phosphoenolpyruvate, glycerate 3-phosphate, and glycerate 2-phosphate also are considered to be constant.

1388

J. SCHULZ et al.

From the relation d([Pyr] + [Lac])

¿t

d[Lac]

=

; ( [ P y r ] < [Lac])

(5)

and the equilibrium of the lactate dehydrogenase reactants one obtains d[Pyr] At

wpK [NADH] • ?LDH • [H+] = ^gpd • . [NAD+]

(6)

Further on, for the steady state condition of the phosphoglycerate concentration one may write ®GAPD = ^PK

(7)

and consequently %pd • [NADH] • ? L D H • [H + ]/[NAD + ] = kQAVD • [DHAP]/[NADH] .

(8)

This relation gives [NADH] = (¿GAPD • [NAD+]/£GPD • ?LDH • [H + ]) 1/3 .

(9)

From equation (7) it follows [DHAP] = vPK • [NADH]/^GAPD .

(10)

Taking into account that [NAD + ] [NADH] one would expect a) [DHAP] to be proportional to [H + ] _1/3 , and b) on the basis of an equilibrium of the aldolase and triose phosphate isomerase reactions [fructose 1 ,6-bisphosphate] being proportional to [H+]- 2 ' 3 . When numerical values are inserted into the equations one obtains: a) by taking the measured extracellular p H as a basis = 1 6 IÏOM) - ' and b) by approximative estimation of the corresponding intracellular pH values according to [14, 15] /^y/3 \107-V

Both values are in fair agreement with the experimental finding of [triose-P]j,H 8.0 _ 1-99 __ [triose-PJ^H 7.4

gg

1.18

The expected />H-dependent increase of fructose 1,6-bisphosphate would be 1.62 = 2.6 and 1.42 = 2.0, respectively, as compared with the experimental value of [Fru-l ,6-P2]£H 8.o [Fru-l,6-P 2 ] i H 7.4

5-52 —

1-44

The discrepancy between the experimental and theoretical value has also been found in other cell types. It might be due to a significant difference of free and total concentrations of glyceraldehyde 3-phosphate.

Regulation of glycolysis in tumour cells

1389

Characteristic time and control strength of hexokinase, phosphofructokinase pyruvate kinase

and

F o r considerations of metabolic control simplified rate equations for the three nonequilibrium enzymes will be used according to [5, 6 , 1 3 , 2 1 ] : [ATP] Ï'HK — VHK

t

|

fpFK — ^PFK 1 +

v

pk —

Katp [ATP] Katp [Fru-6-P] K Fn

Vp.K •

[ADP] 1 + •KATP

[ATP] Katp

[ATP] Katp

1

[ADP]

[PPyr]

[Fru-6-P] •KFru-6-P

-KaDP

[PPyr] Kppyr

(11)

[Glc-6-P]

+L-.

ÄPPy

1 +

(12)

[ATP] \4

-Katp j

[Fru-6-P] ' 1 + ÄFru-6-P ,

[ADP] [PPyr] ^ADP • -Kppyr

(cf. Ref. [22]) [ATP] -^ATP

(13)

(cf. Ref.

[13])

Table 2 summarizes the calculated characteristic times and control strengths. The numerical values for Michaelis constants or half-saturation values, respectively, and metabolite concentrations used in the rate equations are also included in the Table 2 Characteristic time and control strength of nonequilibrium enzymes of glycolysis at pH e 7.4 Enzyme

Values inserted into the rate law

Refer.

Characteristic time (s)1

Control strength

Hexokinase

K a t p = 0.54 mM -Kgic-6-p = 0.15 mM [ATP] = 2.28 mM Glc-6-P = 0.86 mM

[23] [24] Table 1 Table 1

117

0.75

Phosphofructokinase

-KFru-6-P = 0.13 mM [Fru-6-P] = 0 . 2 4 mM

[10] Table 1

12

0.25

Pyruvate kinase

ifADP = 0.5 mM Kppyr = 0.4 mM Katp = 5 mM [ADP] = 0.66 mM [PPyr] = 0.42 mM

[13, 16] [13, 16] [13, 16] Table 1 : Table 1

7

1

0

The characteristic time of hexokinase- and phosphofructokinase were calculated according to r = 1 l(dv/ dS) where S are the substrates ATP and Fru-6-P, respectively. For pyruvate kinase the expression x = l/(3w/d.[PPyr] + dv/d [ADP]) was used. Flux of glycolysis : v — 3.8 mM lactate/min and 1.9 mM glucose/min, respectively. The calculations were perfomed according to [6, 13, 21].

1390

J . SCHULZ e t al.

table. For phosphofructokinase it was assumed that inhibition by ATP. is operative under the intracellular conditions. Hexokinase may be considered as the slowest enzyme exerting main flux control and being therefore rate-limiting for the overall glycolytic flux. Phosphofructokinase also possesses a significant influence on the flux whereas pyruvate kinase and glyceraldehyde phosphate dehydrogenase are without any effect on flux regulation. The control strength is slightly changed, when alterations in the concentration of ATP are included into the calculation. The results and conclusions presented in this paper for ascites tumour cells are similar to the ^H-dependent changes of metabolites and glycolytic flux control in erythrocytes [5, 21, 25]. Nevertheless, a few important differences should be emphasized: (1) a dismutation of dihydroxyacetone phosphate into pyruvate and glycerol 3-phosphate is only found in ascites tumour cells but not in erythrocytes due to the occurrence of glycerol phosphate dehydrogenase in these tumour cells [26] and its absence in red cells; (2) the glycolytic flux is manifold greater in ascites tumour cells than in erythrocytes owing to higher capacities of glycolytic enzymes; maximum hexokinase activity for example amounts in tumour cells 476 mmoles • (h • 1 cells) -1 and in erythrocytes to 12 mmoles • (h • 1 cells) -1 ; in consequence, the metabolite patterns are also different; and (3) the overall-equilibrium of the glyceraldehyde phosphate dehydrogenase phosphoglycerate kinase- and lactate dehydrogenase-reactions is not attained in ascites tumour cells, at variance with erythrocytes. References [1]

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Zusammenfassung J . SCHULZ, PORT

A. BAUFELD,

E . HOFMANN,

T . A . RAPOPORT,

R . HEINRICH

und

S. M . RAPO-

: Regulation der anaeroben Glykolyse in Ehrlich-Aszites-Tumorzellen

1. Es wurden die Glykolysegeschwindigkeit und die Konzentration der Glykolyseintermediate einschließlich der Adeninnukleotide von anaerob bei verschiedenen ^H-Werten inkubierten Ehrlich-Aszites-Tumorzellen bestimmt. 2. Zwischen dem ^ H - W e r t und dem Logarithmus des Laktat/Pyruvat-Quotienten besteht eine negative Korrelation, wie sie auf Grund der ^)H-Abhängigkeit des thermodynamischen Gleichgewichts der Laktatdehydrogenasereaktion erwartet werden kann. 3. Das glykolytische Metabolitmuster bei pH 8,0 unterscheidet sich von dem bei pH 7,4, obwohl die stationäre Glykolysegeschwindigkeit bei beiden ^H-Werten annähernd gleich ist. Bei pH 8,0 sind die Konzentrationen von ATP, Glukose-6-phosphat und Fruktose-6-phosphat niedriger und die Konzentrationen von ADP, AMP, Fruktose-l,6-diphosphat, der Triosephosphate, Phosphoglyzerate und von Phosphoenolpyruvat höher als bei pH 7,4. 4. Aus den erhaltenen Metabolitmustern wird abgeleitet, daß unterschiedliche Mechanismen für die Aufrechterhaltung gleicher aktueller Aktivitäten von Hexokinase, Phosphofruktokinase und Pyruvatkinase beim Übergang von pH 7,4 nach pH 8,0 verantwortlich sind. 5- Unter Anwendung der linearen Theorie von Enzymketten wurde die Kontrollstärke der regulatorisch bedeutsamen Glykolyseenzyme berechnet. Den Ergebnissen zufolge bestimmt das Hexokinase-Phosphofruktokinase-System die Glykolysegeschwindigkeit. Pyruvatkinase und Glyzerinaldehydphosphatdehydrogenase haben keinen wesentlichen Einfluß auf den glykolytischen Fluß in Ehrlich-Aszites-Tumorzellen, sind jedoch an der Regulation der Intermediatkonzentrationen im unteren Glykolyseabschnitt beteiligt. 6. I m stationären Zustand der anaeroben Glykolyse werden P y r u v a t und Glyzerin-l-phosp h a t kontinuierlich akkumuliert. Die Ursache hierfür ist eine Dismutation von Dihydroxyazetonphosphat in den Ehrlich-Aszites-Tumorzellen.

Acta biol. med. germ.. Band 36, Seite 1393 — 1402 (1977) Sektion Biologie, FG Allgemeine Botanik und Pflanzenphysiologie Ernst-Moritz-ArndtUniversität Greifswald, 22 Greifswald, D D R

Einfluß von Cordycepin auf die Aktivierung der RNA- und Protein-Synthesen mit Quellungsbeginn von Agrostemma githago-Embryonen M. HECKER, D. BERNHARDT u n d A.

HUTH

(Eingegangen am 24. August 1976; nach Revision am 15. April 1977)

Zusammenfassung In den ersten drei Quellungsstunden konnte nach gelelektrophoretischer Trennung die Transkription von prä-rRNA, 25 und 18 S-rRNA, t R N A sowie heterogener RNA nachgewiesen werden. Ein bedeutender Teil der RNA-Synthese entfällt auf die Bildung von mRNA, die als Poly(A)+-RNA erfaßt wurde. Cordycepin hemmt in geringen Konzentrationen die Polyadenylierung von RNA, mit zunehmender Konzentration auch die Bildung der ribosomalen RNA. In Gegenwart von Cordycepin läßt sich das Ausmaß des Einbaus von [ 3 H]-Leuzin in Protein während der ersten drei Quellungsstunden nur geringfügig vermindern. Diese Befunde erlauben die Schlußfolgerung, daß die frühe Proteinsynthese quellender Samen weder von einer mRNA-Synthese noch von einer Polyadenylierung abhängig ist, sondern an stabiler, in Samen gespeicherter m R N A abläuft. Einleitung

Lufttrockene pflanzliche Samen befinden sich in einem Zustand außerordentlich geringer Stoffwechselintensität, in welchem sie häufig mehrere Jahre verharren können, ohne ihre Keimfähigkeit einzubüßen. Mit der Wasseraufnahme wird dagegen eine Vielzahl von Stoffwechselprozessen eingeschaltet, deren Aktivierungsmechanismen zunehmendes Interesse unter Entwicklungsbiologen und Molekularbiologen finden. Bereits wenige Minuten nach Quellungsbeginn von Agrostemma githago-Embryonen (Caryophyllaceae) lassen sich Proteinbiosyntheseprozesse nachweisen, die für die weitere Entwicklung der Samen von ausschlaggebender Bedeutung sein müssen (vgl. [1,2]). Dabei stellte sich die Frage, ob ausschließlich unmittelbar nach Quellungsbeginn neu synthetisierte oder langlebige, im trockenen Samen gespeicherte mRNA zur Translation gelangt. Solche stabile mRNA, die bereits während der Reifephase transkribiert wurde und bis zum Abschluß der Samenreife translationsinaktiv im Kern vorliegt, wurde bei pflanzlichen Samen mehrfach nachgewiesen [3, 4, 5]- Die in den frühen Quellungsphasen gebildeten Proteine sollen bei einigen Samen ausschließlich an langlebiger mRNA synthetisiert werden [6, 7, 8]. Nach neueren Befunden verfügt die Mehrzahl pflanzlicher m R N A an ihrem 3'Ende über Poly(A)-Sequenzen, so daß sie sich durch Affinitätschromatographie getrennt bestimmen läßt [7, 8, 9]. Wir haben an anderer Stelle mitgeteilt, daß

1394

M . HECKER, D . BERNHARDT, A. HUTH

ungequollene Embryonen von Agrostemma githago relativ wenig Poly(A) + -RNA speichern, während mit beginnender Quellung eine intensive Synthese Poly(A)haltiger RNA einsetzt (jeweils bezogen auf die Gesamtmenge bzw. auf die Syntheserate [10]). Es galt zu prüfen, ob diese mRNA-Synthese, ihre Polyadenylierung oder eine Polyadenylierung stabiler mRNA (vgl. [5]) an der Regulation der frühen Proteinsynthese quellender Agrostemma-Embryonen beteiligt ist. Zur Untersuchung dieser Problematik bot sich der Einsatz von Cordycepin an, das, wie an tierischen Objekten gezeigt wurde, spezifisch die Polyadenylierung und nicht die Synthese von HnRNA hemmt [11], Da der Einfluß von Cordycepin auf die Polyadenylierungsprozesse pflanzlicher Organismen nur unzureichend analysiert ist, wurde zunächst untersucht, ob bei quellenden Embryonen von Agrostemma githago die gleiche Wirkungsspezifität vorliegt und ob sich somit der Hemmstoff für die Klärung der oben beschriebenen Fragestellung als geeignet erweist oder nicht. Material und Methodik Untersuchungsobjekt Als Untersuchungsobjekt dienten nachgereifte Samen von Agrostemma githago, Sorte Gatersleben, die 1975 im Greifswalder Botanischen Garten geerntet und bis zur Durchführung der E x p e r i m e n t e (März bis J u l i 1976) trocken bei Zimmertemperatur aufbewahrt wurden. D a die I n t e n s i t ä t und Natur der frühen RNA-Synthese quellender Agrostemma githago-Embryonen in erheblichem Maße v o m physiologischen Zustand der Samen abhängig sind (Nachreife- bzw. Alterungsgrad [vgl. 12, 13]), mußten die Untersuchungen in einem begrenzten Zeitraum durchgeführt werden, um einheitliches Yersuchsmaterial zu benutzen. Bestimmung

der frühen

RNA-

und

Proteinsynthese

J e 5 E m b r y o n e n wurden aus trockenen Agrostemma-Samen isoliert und 3 Std. mit 10 [xCi[ 3 H]-Urazil-(5) (spez. A k t i v i t ä t 19Ci/mMol) bzw. 10 (¿Ci[ 3 H]-L-Leuzin-(4,5) (spez. A k t i v i t ä t 55 Ci/mMol) unter Zusatz von 30 [¿g/ml Chloramphenikol (zur Ausschaltung von Bakterienwachstum) inkubiert. Die Inkubation erfolgte unter emersen Bedingungen (Inkubation im Sputumröhrchen, 0 = 24 mm, Inkubationsvolumen 0,3 ml), die Bestimmung der [ 3 H]Urazil- bzw. der [ 3 H]-Leuzin-Aufnähme sowie ihr Einbau in Trichloressigsäure-fällbare Substanzen wie an anderer Stelle beschrieben [14]. Die Aufnahme- und Einbaurate wurden in Impulsen pro Minute und E m b r y o bzw. in % Einbau bezogen auf die Gesamt-Aufnahme angegeben. Präparation

der

RNA

J e 20 E m b r y o n e n wurden aus ungequollenen Samen isoliert und 3 Std. unter emersen B e dingungen (Esmarchschale, 0 = 3 5 mm, Inkubationsvolumen 1 ml) mit 200 jiCi [ 3 H]-Uridin(5) (spez. Aktivität 26,7 Ci/mMol, Prag) unter Zusatz von Chloramphenikol (30 Hg/ml) inkubiert. Die Inkubationsansätze enthielten weiterhin unterschiedliche Mengen an Cordycepin (10, 50 und 100 [ig/ml). Die R N A wurde mit eiskaltem 0,1 M Tris-HCl-Puffer, p~R 9,0, 1 % Na-Dodezylsulfat, 0,01 M MgCl 2 , 0 , 5 % Bentonit, 0 , 2 5 % 8-Hydroxychinolin in Anlehnung an die von P E R R Y et al. [15] und B R A W E R M A N [16] beschriebenen Verfahren extrahiert und präpariert. Die Deproteinisierung erfolgte mit einem Phenol-Chloroform-Gemisch ( 1 : 1 , v/v) bei 4 und 20 °C. R e s t e der schwer extrahierbaren K e r n - R N A wurden durch eine R e e x t r a k t i o n der Zwischenschicht und der Phenol-Chloroform-Phase bei 60 °C gewonnen, die Nukleinsäuren (2%ige Na-Azetatlösung) im Anschluß daran mit Äthanol gefällt und im Elektrodenpuffer für die Gelelektrophorese (0,04 M Tris, 0,02 M Na-Azetat, 1 mM N a 2 - E D T A , p~& 7,2) bzw. im Bindungspuffer für die Affinitätschromatographie (0,05 M Tris-HCl-Puffer, pH 7,6, 0,4 M NaCl, 5 mM N a 2 - E D T A , 0 , 1 % Na-Dodezylsulfat) aufgenommen.

Cordycepinwirkung auf RNA-Synthese

1395

Affinitätschromatographie an Poly(U)-Sepharose Zur Anreicherung der Poly(A)+-RNA wurden die Nukleinsäuren auf eine Poly(U)-SepharoseSäule (etwa 150 mg in Mikrosäulen) gegeben und die nicht hybridisierte RNA mit Bindungspuffer von der Säule heruntergewaschen. Die Elution der Poly(A)+-RNA erfolgte mit Elutionspuffer (Bindungspuffer ohne NaCl) zunächst bei Zimmertemperatur (Poly(A) — 20 °C), eine zweite Fraktion wurde durch Elution bei 50 °C gewonnen (Poly(A) — 50 °C). Reste einer sehr fest gebundenen RNA lassen sich durch Formamid (90%) eluieren. Dieser geringe Anteil fand in der vorliegenden Analyse keine Berücksichtigung. Aliquote Teile der Fraktionen wurden auf Filterpapierscheiben aufgetragen, die vor der Radioaktivitätsmessung wie früher beschrieben [14] mit Trichloressigsäure, Äthanol und Äther gewaschen wurden. Die Radioaktivität wurde mit Hilfe eines Flüssigkeitsszintillationsspektrometers TriCarb 3320 (Pakkard) gemessen. Trennung der RNA durch Polyakrylamid-Gelelektrophorese Die Trennung der im Elektrodenpuffer aufgenommenen RNA durch Gelelektrophorese, die nach Bishop et al. [17] durchgeführt wurde, erfolgte an 2,4- sowie 8%igen Polyakrylamidgelen (Tandem-Gele). Die 2,4%igen Gele enthielten 0,4% Agarose und 0 , 2 % Na-Dodezylsulfat. Nach der Elektrophorese (3 Std. im Kühlraum) wurden die Nukleinsäuren in einer 0,01%igen Lösung von Methylenblau gefärbt, die Gele auf Trockeneis gelegt und mit Hilfe eines selbst gefertigten Gelschneiders nach Matsumura und Nöda [18] in 1 mm starke Scheiben geschnitten. Die Scheiben konnten durch Zugabe von 0,2 ml H 2 0 2 (30%ig, 1 %ig an konz. NH 4 OH) bei 50 °C in dicht verschlossenen Meßküvetten aufgelöst werden. Nach Zugabe von 16 ml Szintillator(l0 ml POPOP/PPOinToluol, 6 ml Methanol dest.) wurde die 3 H-Aktivität bestimmt. Ergebnisse

Unmittelbar mit Quellungsbeginn von Agrostemma-Embryonen beginnen RNASyntheseprozesse (Einbau von [ 3 H]-Urazil), deren Intensität bereits durch geringe Konzentrationen von Cordycepin gehemmt wird (Abb. 1), während die Aufnahme von 3 H-Urazil bedeutend weniger beeinflußt ist. Im Doppelmarkierungsexperi100 WM

50fxg

so iV-

0

A

E

A

E

Abb. 1. Einfluß von Cordycepin auf die frühe RNA-Synthese quellender Embryonen von Agrostemma githago. Die Hemmung des Einbaus (E) wurde in % bezogen auf die unbehandelte Kontrolle ( = o%) angegeben; vergleichsweise ist auch die Hemmung der [ 3 H]-Urazil-Aufnahme-Rate (A) dargestellt. 10, 50, 100 ^g = ¡xg/ml Cordycepin 91

Acta biol. med. germ., B d . 36, Heft 10

1396

M. HECKER, D . BERNHARDT, A.

HUTH

ment ([3H]-Urazil und [14C]-Adenin) wird der Einbau von Adenin in RNA etwas stärker reduziert als der von Urazil (Ergebnisse nicht dargestellt). Die in den ersten drei Quellungsstunden gebildete RNA enthält zu einem beträchtlichen Anteil solche mit Poly(A)-Sequenzen (Abb. 2). Es fällt auf, daß der größere Teil der Poly(A) + -RNA erst bei 50 °C von der Poly(U)-Sepharose eluiert werden kann. Wahrscheinlich enthält die bei 20 °C gewonnene Fraktion RNA mit kürzeren, die bei 50 °C eluierte solche mit längeren Poly(A)-Sequenzen [vgl. (19]). Den Einfluß von Cordycepin auf die Synthese der Poly(A)~- sowie der Poly(A) + RNA zeigt Abb. 3. Niedrige Konzentrationen von Cordycepin (10 y.g/ml und darunter) hemmen die Synthese der Poly(A) + -RNA spezifisch, während mit zunehmender Hemmstoffkonzentration auch die Poly(A)~-RNA bedeutend niedriger

cpmxlO

• 40 Hybn 19,4 % 100

20

100fig Cordycepin 20° 50°

II

50-

Gesamt

Abb. 2

A

A+?0o

A+5Qo

A+Gesamf

Abb.

Abb. 2. Hybridisierung der in den ersten 3 Quellungsstunden von Agrostemma-Embryonen synthetisierten RNA an Poly(U)-Sepharose. A - = Poly(A)--RNA (RNA ohne Poly(A)-Sequenzen), A+ = Poly(A)+-RNA (Poly(A)-enthaltende RNA). Die Poly(A)+-RNA wurde zunächst bei 20, danach bei 50 °C eluiert. Jeder Säule entsprechen 2 ml Elutionsvolumen Abb. 3. Einfluß von Cordycepin auf die Synthese der Poly(A)-- und Poly(A)+-RNA quellender Embryonen von Agrostemma githago. Die H e m m u n g des [ 3 H]-Urazil-Einbaus wurde in % bezogen auf die Kontrolle (emerse Inkubationsbedingen, vgl. Abb. 1) angegeben. Folgende Fraktionen wurden getestet: Gesamt-RNA; A - : Poly(A)--RNA; A+ 20°, 50°: bei 20 bzw. 50° eluierte Poly(A)+-RNA, A+ Gesamt: gesamte Poly(A)+-RNA

Cordycepinwirkung auf RNA-Synthese

1397

markiert ist. Dabei nimmt der Anteil der Poly(A) + -RNA mit längeren Poly(A)Sequenzen (Elution bei 50 °C) an der Gesamt-Poly(A)-Fraktion charakteristisch ab (Abb. 4, Verkürzung der Poly(A)-Sequenzen infolge teilweiser Hemmung der Polyadenylierung). Ganz ähnliche Befunde wurden bei Markierung der RNA mit [ 14 C]-Adenin erhalten (Ergebnisse nicht dargestellt). Zur genauen Charakterisierung der markierten RNA, besonders der Poly(A)~-RNA, wurde die in den ersten drei Quellungsstunden transkribierte RNA elektrophoretisch in Polyakrylamidgelen aufgetrennt (Abb. 5)- In der unbehandelten Kontrolle sind neben 2 rRNA-Vorstufen (möglicherweise 2 , 9 - 1 0 6 D und 2,2- 106 D, vgl. [20]) besonders die beiden zytoplasmatischen rRNAs (ein Teil der Markierung liegt unmittelbar vor der 25S-rRNA) markiert. Weiterhin fällt auch ein hoher Anteil heterogener RNA auf, der sich vermutlich neben unfertigen rRNA-Molekülen aus HnRNA sowie mRNA zusammensetzt, und in dem auch die Poly(A)haltige RNA-Fraktion zu vermuten ist. Bereits niedrige Konzentrationen von Cordycepin beeinflussen die Synthese der ribosomalen RNA; bedingt durch den vorzeitigen Kettenabbruch fallen die Markierungen nicht mehr mit den nach Färbung mit Methylenblau visuell sichtbaren rRNA-Banden zusammen (vgl. Abb. 5)- Bei einer Konzentration von 10 [xg/ml treten kürzere RNA-Moleküle vermehrt auf, bei 50 [J-g/ml erheben sich die rRNAPeaks fast nicht mehr über das Niveau der „heterogenen RNA". Bei noch höheren Konzentrationen (100^g/ml und mehr) wird die Synthese aller RNA-Klassen (vermutlich auch der HnRNA) vermindert, wobei die kurzkettigen RNA an der Grenze vom nieder- zum hochprozentigen Gel angereichert werden. Die Poly(A)-haltige RNA, die nicht durch Spuren von ribosomaler RNA verunreinigt ist, zeigt ein heterogenes Profil, dessen Markierung bereits bei niedrigen Cordycepin-Konzentrationen deutlich vermindert ist und durch Erhöhung der Cordycepin-Menge nur noch geringfügig abnimmt (Abb. 6).

100 Kontrolle

Cordycepin

10/j.g

c

0

50/xg

100fig

IMI 20° 50°

20° 50°

20° 50°

20°

50°

Abb. 4. Anteile der bei 20 °C und 50 °C von der Poly(U)-Sepharose eluierten RNA-Fraktionen an der Gesamt-Poly(A)+-RNA in % . Poly(A)+-RNA Gesamtfraktion = 100% (Kontrolle). Emerse Inkubationsbedingungen 91*

1398

M . HECKER, D . BERNHARDT, A.

c.prn

Kontrolle

H75

HUTH

10p.g

Cordycepin.

100¡ig

Cordycepin

800

400

50fig

Cordycepin

800

400

j I L L_ DNA

25S

18S

-J I I L tm

'4/5 S

•

•

- 2,4 %

8%

Abb. 5- Einfluß von Cordycepin auf die frühe RNA-Synthese mit Quellungsbeginn von Agrostemma-Embryonen. Die aus 3 Std. unter emersen Bedingungen gequollenen Embryonen,präparierte R N A wurde elektrophoretisch in 2,4- und 8%igen Polyakrylamidgelen aufgetrennt. 80 |j.g RNA pro Gel

Unmittelbar mit Quellungsbeginn lufttrockener Embryonen beginnen auch Proteinsyntheseprozesse, die sich durch den Einbau von [ 3 H]-Leuzin erfassen lassen. Das Ausmaß des in den ersten drei Quellungsstunden gezeigten [ 3 H]-Leuzin-Einbaus wird durch Cordycepin bis zu einer Konzentration von 200 [ig/Ansatz nur geringfügig vermindert (Tab. 1). Diskussion

Über die Aktivierung der Transkriptionsprozesse mit Quellungsbeginn von Samen liegen sehr widersprüchliche Befunde vor. Während auf der einen Seite eine ausschließliche Transkription von ribosomaler RNA beschrieben wurde [21, 22], teilen andere Autoren eine bevorzugte Synthese heterogener RNA sowie von mRNA mit ([23, 24], zusammenfassende Diskussionen bei [25]). Wir konnten zeigen, daß ein bedeutender Teil der frühen Transkriptionsprozesse auf die Bildung Poly(A)-

Cordycepinwirkung auf RNA-Synthese

1399

Abb. 6. Einfluß von Cordycepin auf die Synthese der Poly(A)+-RNA quellender Embryonen von Agrostemma githago. Poly(A)+-RNA wurde nach Affinitätschromatographie mit Äthanol nach Zugabe von HefeR N A gefällt und plektrophoretisch in 2,4%igen Polyakrylamidgelen aufgetrennt

Tabelle 1 Einfluß von Cordycepin auf den [ 3 H]-L-Leuzin-Einbau emers inkubierter Embryonen von Agrostemma githago. [ 3 H]-Leuzin-Einbau während der ersten 3 Quellungsstunden. Inkubationsvolumen 0,5 ml. Angabe in % H e m m u n g des [ 3 H]-L-Leuzin-Einbaus Cordycepin ([¿g/Ansatz)

H e m m u n g des [ 3 H]-L-LeuzinEinbaus

•10 50 100 200

0 11 19 21

1400

M. HECKER, D . BERNHARDT, A .

HUTH

haltiger RNA, wahrscheinlich mRNA entfällt [10]. Andererseits läßt sich auch eine intensive Synthese von ribosomaler und tRNA messen (ausführliche Darstellung vgl. [26], siehe auch [27, 28]). Um die Beteiligung der Polyadenylierung von Hn-mRNA an der Regulation der frühen Proteinsynthese quellender Agrostemma-Samen zu analysieren, suchten wir einen Hemmstoff, der diesen posttranskriptionellen Prozeß spezifisch hemmt. Der Einsatz von Cordycepin bietet sich an, das, wie bei einer Reihe tierischer Objekte gezeigt wurde, die Polyadenylierung und nicht die Transkription von HnRNA verhindert [11], Diese Befunde deuten darauf hin, daß die einzelnen RNA-Polymerasen (RNAPolymerase II und Poly(A)-Polymerase) zu einem unterschiedlichen Ausmaß befähigt sind, das phosphorylierte Cordycepin vom ATP zu unterscheiden [29, 30]. Über den Einfluß von Cordycepin auf die RNA-Synthese pflanzlicher Objekte liegen nur vereinzelte und keineswegs einheitliche Befunde vor. Eine bevorzugte Hemmung der Synthese ribosomaler RNA beschreiben D E L S E N Y et al. [ 3 1 ] bei Radieschen-Keimlingen, JACOBSON und Z W A R [ 3 2 ] in Aleuronzellen der Gerste und H A R R I S und D U R E [19] bei quellenden Baumwollembryonen. Lediglich aus der letztgenannten Untersuchung kann geschlußfolgert werden, daß die Transkription der HnRNA bei Samen durch Cordycepin nicht beeinflußt wird. Eine ausschließliche Hemmung der rRNA-Synthese beschrieben FOUQUET et al. [ 3 3 ] bei Physarum polycephalum; überraschenderweise sollen weder die Synthese von prä-rRNA noch die nukleare Polyadenylierung durch den Inhibitor beeinflußt werden. Wir konnten wahrscheinlich machen, daß Cordycepin bei quellenden AgrostemmaEmbryonen zunächst die Polyadenylierung von RNA hemmt, wobei unsere Befunde gleichzeitig die Vermutung nahe legen, daß die noch gebildeten Poly(A)Segmente unter Einfluß des Hemmstoffs erheblich kürzer werden (vgl. Abb. 4; siehe auch [34]). Zum Nachweis dieser kurzen Poly(A)-Stränge dürfte Poly(U)Sepharose besser geeignet sein als die zunächst eingesetzte 01igo(dT)-Zellulose, da die etwa 100 bis 200 Nukleotide langen Poly(U)-Stränge mit kürzeren Poly(A)Sequenzen leichter hybridisieren als die nur 10 bis 20 Nukleotide langen Oligo(dT)Reste. Bei Einsatz von Oligo(dT)-Zellulose haben wir geringere Hybridisierungsraten gemessen, wobei einschränkend erwähnt werden muß, daß sich nicht alle Poly(U)-Sepharose-Präparate gleich verhielten. Nicht ganz geklärt ist, ob in der bei Zimmertemperatur gewonnenen Poly(A)-Fraktion auch RNA mit Oligo(A)Segmenten, die sich nicht am 3'-Ende befinden, enthalten sind [35, 3 61. Neben der Synthese Poly(A)-haltiger RNA wird auch die Transkription von ribosomaler RNA — besonders bei höherer Cordycepin-Konzentration — gehemmt. Andererseits sprechen unsere Befunde dafür, daß die Transkription der heterogenen RNA durch geringe Cordycepin-Mengen nicht beeinflußt wird, wobei der exakte Beweis für diese Annahme wegen der unzureichenden Charakterisierung der HnRNA noch aussteht. Eine Hemmung der Polyadenylierung wird nach vorliegenden Befunden, die allerdings bisher ausschließlich an tierischen Objekten erhalten wurden, voraussichtlich auch bei quellenden Samen den Transport der mRNA in das Zytoplasma und damit ihre Translation verhindern (vgl. Übersichten bei [37, 38]), während

Cordycepinwirkung auf RNA-Synthese

1401

andererseits Poly(A)~-mRNA das Zytoplasma erreichen und dort auch translatiert werden könnte. Trotz starker Hemmung der Synthese Poly(A)-haltiger mRNA durch Cordycepin sowie durch a-Amanitin (vgl. [39]) läßt sich in den ersten drei Quellungsstunden keine oder nur eine unbedeutende Verminderung des [ 3 H]-L-Leuzin-Einbaus feststellen. Folglich wird der überwiegende Teil der Proteine in frühen Quellungsstadien in Übereinstimmung mit den an Weizenembryonen erhobenen Befunden [7] an langlebiger, in trockenen Samen gespeicherter mRNA synthetisiert. Die Regulation der frühen Proteinsynthese quellender Samen konzentriert sich daher auf die Frage nach den Aktivierungsmechanismen dieser langlebigen mRNA. Eine für quellende Baumwollembryonen postulierte Polyadenylierung stabiler mRNA ([5], siehe auch [39]) scheint für den Start der Proteinsynthese bei Agrostemma githago ohne Bedeutung zu sein, wie der Einfluß von Cordycepin auf den Leuzin-Einbau zeigte. Danksagung Herrn Dr. E. S E R F L I N G (Gatersleben) danken wir für freundliche Hilfe, Frau L. und Frl. G. D A B E R S für sorgfältige Assistenz.

BERNSCHEIN

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Summary and A. H U T H : The influence of cordycepin on the activation of RNA and protein synthesis at the early inhibition stages of Agrostemma githagoembryos

M . H E C K E R , D'. B E R N H A R D T ,

In embryos of Agrostemma githago pre-rRNA, ribosomal, heterogeneous, and transfer RNA is transcribed at 0 to 3 hrs of inhibition. An essential amount of hnRNA/mRNA is polyadenylated and can be prepared by affinity chromatography on poly(U)-sepharose colums. At very low concentrations of cordycepin synthesis of poly(A)+-RNA is especially inhibited. At increasing concentration of cordycepin the synthesis of ribosomal RNA is inhibited too. According to these results cordycepin is a suitable inhibitor to study the function of posttranscriptional polyadenylation of mRNA at the regulation of early protein synthesis of imbibing Agrostemma embryos. Incorporation of [ 3 H]-leucine into protein occurring from 0 to 3 hrs of imbibition is not remarkably inhibited by cordycepin. These results may indicate t h a t neither synthesis of m R N A nor its polyadenylation nor the polyadenylation of stable mRNA is involved in the regulation of early protein synthesis.

Acta biol. med. germ., Band 36, Seite 1403 — 1411 (1977) Physiologisch-chemisches Institut 1 und Zentrallabor 2 der Medizinischen Akademie Magdeburg, 301 Magdeburg, D D R und Abt. Klinische Biochemie des Bereiches Medizin (Charité) 3 der Humboldt-Universität Berlin, 104, Berlin, D D R

Phospholipidzusammensetzung und Fettsäuremuster der isolierten Phospholipide von Mitochondrien aus Kaninchenretikulozyten* G . LUTZE2, D . KUNZE3, G. REICHMANN3, I. WISWEDEL1 u n d H . W .

AUGUSTIN1

(Eingegangen am 29. September 1976; nach Revision am 18. April 1977) Zusammenfassung Mitochondrien aus Kaninchenretikulozyten wurden hinsichtlich ihrer Phospholipidzusammensetzung sowie der Fettsäurezusammensetzung der isolierten Phospholipide untersucht. Verglichen mit Lebermitochondrien haben Retikulozytenmitochondrien etwa den doppelten Phospholipidgehalt. Das Phospholipidmuster der Retikulozytenmitochondrien (Phosphatidylcholin, Phosphatidyläthanolamin, Phosphatidylinosit und Kardiolipin) ist hinsichtlich der Verteilung mit anderen Mitochondrienspezies vergleichbar. Jedoch besitzt dieRetikulozytenmitochondrienfraktion zusätzlich einen hohen Sphingomyelinanteil. Das Sphingomyelin der Mitochondrienfraktion unterscheidet sich in seiner Fettsäurezusammensetzung von dem Sphingomyelin der Plasmamembranen. Die Fettsäuremuster der übrigen Phospholipide entsprechen sowohl weitgehend dem der Mitochondrien anderer Organe als auch dem Fettsäuremuster der Phospholipide von Retikulozytenmembranen. Einleitung

Die Kenntnis der Lipidzusammensetzung von Membranen ist für das Verständnis der Membranfunktionen von wesentlicher Bedeutung. Während über die Lipide der Erythrozytenmembrah viele Untersuchungen vorliegen [1—7], ist außer über den Phospholipidgehalt der gesamten Zellen [8, 9] und den Gesamtphospholipidgehalt von Retikulozytenmitochondrien [10] unseres Wissens nichts über die Lipidzusammensetzung von Mitochondrien und Plasmamembranen aus Retikulozyten bekannt. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Phospholipidzusammensetzung von Mitochondrien aus Kaninchenretikulozyten sowie mit der Fettsäurezusammensetzung der isolierten Phospholipide mit dem Ziel einer näheren Charakterisierung dieser subzellulären Bestandteile. Dadurch werden einerseits Vergleiche mit anderen Organen und Objekten möglich, andererseits ist die Kenntnis der Phospholipidzusammensetzung eine notwendige Voraussetzung für Untersuchungen des Lipidstoffwechsels der Retikulozyten und seiner Besonderheiten. Über die Plasmamembran der Retikulozyten und ihre Lipidzusammensetzung wurde in einer vorläufigen Mitteilung berichtet [11], * Herrn Prof. Dr. Dr. Dr. h. c. S. M.

RAPOPORT

zum 65. Geburtstag gewidmet.

1404

G . LUTZE, D . KUNZE, G . REICHMANN, I . W I S W E D E L , H . W . AUGUSTIN

Material und Methodik Chemikalien Kieselgel G, Mannit, 2,7-Dichlorfluoreszein und B H T (2,6-Di-tert.butyl-p-hydroxytoluol) s t a m m t e n von Merck, (Darmstadt), Tris von Boehringer (Mannheim) und H E P E S von Serva (Heidelberg), EGSS-X (Äthylenglykolsukzinatmethylsilikon), Gas-Chrom Q 100/120 mesh und die Referenzsubstanzen (Fettsäuremethylester und NIH-Testmischungen) wurden von Applied Science Laboratories über Serva (Heidelberg) bezogen. 14%iges Bortrifluorid-Methanol wurde nach eigener Arbeitsvorschrift hergestellt. Die sonstigen verwendeten Chemikalien waren analysenrein und lipidfrei, die Lösungsmittel wurden vor Gebrauch zweifach destilliert. Gewinnung des Untersuchungsmaterials Retikulozyten wurden durch tägliches E n t b l u t e n von Kaninchen über einen Zeitraum von 4 Wochen erzeugt. Nach dieser Zeit bestand eine Retikulozytose von 40—50%. Die E n t fernung der Leukozyten erfolgte mittels Filtration durch Baumwolle [12]. Die gewaschenen Zellsedimente wurden durch vorsichtiges Zerreiben mit kleinen Glasperlen aufgeschlossen und die Mitochondrien durch nachfolgende Differentialzentrifugation isoliert (modifiziert nach [13]). Über die Verunreinigung der verwendeten Mitochondrien mit Plasmamembranen gibt Tab. 3 Auskunft. Messungen lysosomaler Enzymaktivitäten (P. B O H L E Y und H . W . AUGUSTIN, unveröffentlicht) weisen auf eine mögliche Kontamination der Mitochondrienfraktion mit sekundären Lysosomen hin. Extraktion der Lipide aus dem Untersuchungsmaterial Die isolierten Mitochondrien wurden in 300 mM Mannit + 20 mM H E P E S , pH 7,4, suspendiert. Die Suspensionen enthielten 20 —30 mg Protein/ml Suspensionsflüssigkeit. Die Lipidextraktion erfolgte entsprechend den Angaben von F O L C H et al. [14] durch Zusatz von 7 ml Methanol und 14 ml Chloroform zu 1 ml Mitochondriensuspension und anschließende Homogenisierung mit einem U l t r a t u r r a x der Fa. J a n k e und Kunkel (Stauffen i. Br.) 1 . Das mit dem Extraktionsmedium nachgewaschene Filtrat wurde mit 0,9%iger NaCl-Lösung (1/9 des Filtratvolumens) geschüttelt. Nach Absaugen der Oberphase wurde die Unterphase im Stickstoffstrom zur Trockne eingeengt und mit 0,2 ml Chloroform:Methanol = 2:1 aufgenommen. Dünnschichtchromatographische Trennung der Phospholipide Die zweidimensionale H a u p t t r e n m m g erfolgte in Anlehnung an R O U S E R et al. [15] auf Kieselgel G mit einer Schichtdicke von 0,75 mm nach 30minütiger Aktivierung der Platten bei 100° (Abb. 1 A). Die Sichtbarmachung der Fraktionen erfolgte durch Besprühen mit einer 0,2%igen äthanolischen Lösung von 2,7-Dichlorfluoreszein und Betrachtung unter einer UV-Lampe. Bei nachfolgender Phosphatbestimmung (Wiederfindung > 9 5 % ) wurden die Fraktionen auch durch Bedampfen mit Jod sichtbar gemacht. Die Identifizierung der Substanzen erfolgte außer mit Hilfe der Rf-Werte auch durch Spezialfärbungen und die Verwendung authentischer Standardsubstanzen. Nicht ausreichend wurden in diesem System Kardiolipin von den freien Fettsäuren sowie Phosphatidylinosit von Phosphatidylserin getrennt. Diese Fraktionen wurden nach quantitativer Abtragung dreimal mit Chloroform: Methanol = 2:1, wobei Verluste nicht ausgeschlossen werden können, der Gesamtextrakt danach mit ca. 9%igem N H 3 (1/5 des Extraktvolumens) zur Entfernung des 2,7-Dichlorfluoreszeins ausgeschüttelt. Nach Absaugen der grüngelben Oberphase wurde die Unterphase mit 1 / 5 des Volumens verdünntem Methanol (1 Teil Methanol + 1 Teil 0,9%ige NaCl-Lösung) geschüttelt. Nach erneutem Absaugen der Oberphase wurde die Unterphase im Stickstoffstrom zur Trockne eingeengt und in Chloroform: Methanol = 2:1 aufgenommen. Die Trennung der E x t r a k t e erfolgte gemäß Abb. 1 B und 1 C. F ü r die gaschromatographischen Untersuchungen wurden sämtliche abgetragenen Fraktionen unter Stickstoff in Ampullen eingeschmolzen. Um genügend Material f ü r eine einwand1

Bei jedem Arbeitsgang vom Beginn der Extraktion bis zur gaschromatographischen Trennung wurde zu den Lösungsmitteln eine kleine Menge B H T (etwa ein Drittel der Menge an extrahierten Lipiden) als Antioxydans hinzugefügt.

1405

Phospholipide in Retikulozytenmitochondrien Abb. 1. Dünnschichtchromatographische Trennung der Phospholipide [IS, 16]. A) Zweidimensionale H a u p t t r e n n u n g . L a u f m i t t e l I = Chloroform: Methanol: 28% N H 3 = 130:50:10; L a u f m i t t e l I I = Chloroform: Azeton: Methanol: Essigsäure: Wasser = 6 0 : 8 0 : 2 0 : 2 0 : 1 0 . B) Trennung von Kardiolipin und freien F e t t säuren. L a u f m i t t e l = P e t r o l ä t h e r : Ä t h e r : Essigsäure = 180:20:15C) Trennung von Phosphatidylinosit und Phosphatidylserin. Lauf mittel = Chloroform: Methanol: 28% N H 3 : Wasser = 120:70: 5: 5 (vor Anfärbung mit 2,7-Dichlorfluoreszein m i t essigsaurem Laufmittel besprühen). 1 = Lysophosphatidylcholin; 2 = Sphingomyelin; 3 = Phosphatidylcholin; 4 = Phosphatidylinosit; 5 = Phosphatidylserin; 6 = Phosp h a t i d y l ä t h a n o l a m i n ; 7 = Kardiolipin; 8 = freie F e t t s ä u r e n ; 9, 10, 11 = nicht näher charakterisierte Lipide (9 = Cerebroside (?), 10 = apolare und wenig polare Lipide). Lösungsmittelfront nach Beendigung der Trennung; x S t a r t p u n k t bei A; Startlinie bei B und C

f

10

®

© C D

®

-I

© 11 o

B

37 freie gaschromatographische Identifizierung der F e t t s ä u r e n zu erhalten, wurden die identischen dünnschichtchromatographisch getrennten Phospholipide von jeweils 5 Mitochondrienpräparationen vereinigt. Die E r m i t t l u n g des Phosphatidgehaltes und der Phosphatidverteilung erfolgte durch eine Phosphatbestimmung im Ausgangsextrakt und in den abgetragenen Fraktionen nach dünnschichtchromatographischer Trennung. Hierzu wurde eine Veraschung mit 70%iger Perchlorsäure vorgenommen; die Phosphatbestimmung wurde über Phosphormolybdänsäure nach E x t r a k t i o n mit Benzol/Isobutanolmit SnCl 2 als Reduktionsmittel durchgeführt [17]. Gaschromatographische Trennung der Fettsäuren der Phospholipidfraktionen [18 — 20] Die ampullierten Kieselgelfraktionen wurden zur Spaltung der Phospholipide und Veresterung der F e t t s ä u r e n mit 14%igem Bortrifluorid-Methanol bei 100° umgesetzt [20]. Nach Wasserzusatz wurden die Fettsäuremethylester mehrmals mit H e x a n extrahiert und die vereinigten E x t r a k t e mit N a , S 0 4 sicc. getrocknet. Nach Einengung wurde der Rückstand in wenig H e x a n aufgenommen und eine dünnschichtchromatographische Reinigung angeschlossen (Laufmittel = H e x a n : Ä t h e r : E s s i g s ä u r e = 90:1:4). Die mit Hilfe authentischer Referenzsubstanzen eindeutig identifizierte Methylesterfraktion wurde q u a n t i t a t i v abgetragen und dreimal mit Chloroform extrahiert. Methylester von Hydroxyfettsäuren konnten nicht nachgewiesen werden. Nach Einengung wurde der E x t r a k t r ü c k s t a n d in wenig H e x a n aufgenommen. Die gaschromatographischen Analysen wurden mit einem Gaschromatograph Modell 2100 der Firma Varian AG unter folgenden Bedingungen durchgeführt: Glastrennsäule 6 f t x 2 mm, Füllung mit 1 0 % EGSS-X auf Gas-Chrom Q, T h e r m o s t a t t e m p e r a t u r f ü r die Identifizierung 175°, T h e r m o s t a t t e m p e r a t u r für die quantitative Auswertung program-

1406

G . LUTZE, D . KUNZE, G. REICHMANN, I. W I S W E D E L , H . W .

AUGUSXIN

miert von 150° —195° mit einer Heizrate von 1°/min, Trägergas 20 ml Reinststickstoff/min, Flammenionisationsdetektor. Ausgewertet wurde der Fettsäurebereich der Kettenlänge C 16 bis C 26 . Zur Peakflächenauswertung wurde ein elektronischer Integrator Modell 480 der Firma Yarian AG benutzt. Die qualitative und quantitative Auswertung wurde mit authentischen Fettsäuremethylestern, NIH-Standardmischungen und mit dem gut bekannten Fettsäurespektrum der Gesamtphospholipide von Erythrozyten [4] kontrolliert. Ergebnisse

Der Gesamtphospholipidgehalt von Mitochondrien aus Kaninchenretikulozyten betrug 0,34 ± 0,04 ¡xMol P • mg" 1 Protein (n = 4). Tab. 1 enthält die relative Verteilung der Phospholipide von Retikulozytenmitochondrien. Als Hauptfraktionen wurden Phosphatidylcholin, Phosphatidyläthanolamin, Sphingomyelin, Kardiolipin und Phosphatidylinosit nachgewiesen. Der Phosphatidylseringehalt in den Mitochondrien betrug weniger als 2 % der Gesamtphospholipide, Kardiolipin war nur in den Mitochondrien, nicht aber in den Plasmamembranen, nachweisbar. In Tab. 2 ist die prozentuale Fettsäureverteilung der wesentlichen isolierten Phospholipide aus Retikulozytenmitochondrien dargestellt. Bei Phosphatidylcholin, Phosphatidyläthanolamin und Phosphatidylinosit ist die prozentuale Fettsäureverteilung sehr ähnlich. Es herrschen folgende Fettsäuren vor: 16:0, 18:0, 18:1, 1 8 : 2 und 20:4. Eine Ausnahme bildet lediglich der niedrige 18:0Gehalt des mitochondrialen Phosphatidylcholins. Die Summe der C lg -Fettsäuren liegt bei oder über 50%. Die ungesättigten Fettsäuren überwiegen, so daß der Quotient gesättigte Fettsäuren/ungesättigte Fettsäuren unter 1 liegt. Die Sphingomyeline weichen in einigen Punkten von diesem annähernd identischen Bauplan ab. Es sind zwar ebenfalls die 16:0, 18:0- und 18:1-Fettsäuren vorherrschend, jedoch kommt die 24:1 /22:4-Fraktion als weitere Hauptkomponente hinzu, die sonst bei den anderen Phospholipiden eine völlig untergeordnete Rolle spielt. Die 18:2- und 20:4-Fettsäuren stellen nur kleine Fraktionen dar. Die Summe der Ci 8 -Fettsäuren ist bei den Sphingomyelinen im Vergleich zu den andeTabelle 1 Phospholipidverteilung 1 bei Mitochondrien aus Kaninchenretikulozyten (n = 4) Phospholipid Phosphatidylcholin Phosphatidyläthanolamin Sphingomyelin Kardiolipin Phosphatidylinosit Lysophosphatidylcholin

Prozent des Gesamtphospholipid-P 39.0 31,4 12,5 8,9 7,6 0,6

± ± ± ± ± ±

4,5 3,6 5,3 2,0 2,6 0,4

1 Phosphatidylserin und nichtidentifizierbare Fraktionen, deren P-Gehalt insgesamt nicht mehr als 2 % des Gesamtphospholipidphosphors betrugen, sowie die nur in minimalen Anteilen nachgewiesenen Plasmalogene [21] blieben unberücksichtigt.

Phospholipide in Retikulozytenmitochondrien

1407

Tabelle 2 Fettsäuremuster der Phospholipide von Mitochondrien aus Kaninchenretikulozyten (Angaben in Prozent der Gesamtfettsäuren) Sphingomyelin

Fettsäure 16:0 l6:m-9 17:0 18:0 18: ln-9 19:0 18:2n-6 20:0 20: ln-9 1 21:0 20: 2n-6 20:3n-6 22:0 20: 4n-6 2 23:0/22:23 20: 5n-3 24:0 24: ln-9/22:4n-6 4 22: 5n-6B 22:5n-3 22:6n-3 6 gesättigte F S (%) ungesättigte F S (%)

Phosphati- Phosphatidylcholin dyläthanolamin

Phosphatidylinosit

24,4 1,9 1,4 15,4 9,3 0,6 3,8 1,0 1,1 0,2 0,3 0,1 3,0 2,1 2,0 0,7 1,4 27,8 2,9 0,3 0,3

37,5 2,2 0,9 4,5 15,0 0,2 29,4 0,2 2,3 Spur 1,3 Spur 0,3 3,8 Spur 0,7 0,1 0,2 Spur 0,9 0,5

16,8 1,6 1,2 12,0 18,6 Spur 26,9 0,1 2,5 0,1 2,0 0,3 0,5 8,0 Spur 0,9 Spur 1,0 0,4 4,1 3,0

7,4 0,7 1,2 28,5 10,2 0,6 18,5 0,4 2,5 Spur 5,7 Spur 2,0 12,8 0,2 0,8 0,1 1,7 0,4 4,1 2,5

28,5

48,9

57,5

57,2

0,90

0,78

0,44

0,67

Kardiolipin 2,2 1

3,3 1,2 25,2 Spur 60,3 0,1 1,8 0,1 2,5

0,1

2,0 0,1 Spur 0,1 0,3 0,1 0,4 0,2 0,1 86,7 0,06

Spuren von 18: 3n-3; Spuren von 22:1 n-9; 22: 2n-9 und 22: 2n-6 (Frakfc vurde zu den ungesättigten Fettsäuren gezählt): 4 vorwiegend 24:1 n-9; 8 wechselnde Antt^e von 24:2n-9 und 24:2n-6; 6 wechselnder Anteil von 2 6 : 0 1

2

3

ren Phospholipiden niedriger, jedoch bestehen nur geringe Unterschiede bei dem Quotienten gesättigte Fettsäuren/ungesättigte Fettsäuren. Das in tierischen Zellen nur mitochondrial vorkommende Kardiolipin [22] weist beim Vergleich mit den übrigen Phospholipiden eine völlig andere Fettsäurezusammensetzung auf. Als wesentliche Komponenten existieren nur die beiden ungesättigten Fettsäuren 18:1 und 18:2, so daß die Summe der C 18 -Fettsäuren sehr hoch ist, der Quotient aus gesättigten und ungesättigten Fettsäuren dagegen sehr klein wird. Diskussion

Der Retikulozyt enthält wesentlich mehr Phospholipide als der reife Erythrozyt [23—26]. Offensichtlich kommt es bei der Reifung.des Retikulozyten zu einem Abbau von Phospholipiden. Während des Übergangs vom Retikulozyten zum Erythrozyten verschwinden die im Retikulozyten vorhandenen Mitochondrien

1408

G . LUTZE, D . KUNZE, G . REICHMANN, I. WISWEDEL, H . W . AUGUSTIN

[27—30]- Damit einhergehend sind im Normozyten auch keine mitochondrialen Phospholipide (Kardiolipin) mehr nachweisbar. Während der reife Erythrozyt Phospholipide nicht mehr de novo synthetisieren kann, ist der Retikülozyt hierzu, wenn auch in begrenztem Umfange, befähigt [23, 31—33']Die Phospholipide des Retikulozyten sind vorwiegend in den Plasmamembranen und Mitochondrien lokalisiert. Mit 0,34 ¡iMol P • m g - 1 Protein gehören die Retikülozyt enmitochondrien zu den Mitochondrienspezies mit einem hohen Phospholipidgehalt [10]. Für Rattenlebermitochondrien ermittelten wir 0,17 ¡¿Mol P • m g - 1 Protein und stimmen hiermit gut mit anderen Autoren überein [34—36]. Bei Mitochondrien aus Herz wurden teilweise niedrigere Werte [36], aber auch vergleichbare Werte [37] erhalten. Über die relative Phospholipidzusammensetzung der Mitochondrien aus Retikulozyten sowie ihr Fettsäuremuster liegen bisher keine Untersuchungen vor. Die prozentuale Zusammensetzung der Phospholipide von Retikulozy tenmitochondrien aus Phosphatidylcholin, Phosphatidyläthanolamin, Phosphatidylinosit und Kardiolipin entspricht weitgehend den für andere Mitochondrienarten beschriebenen Werten, wobei Phosphatidylserin in den Retikulozytenmitochondrien ebenso wie in anderen Mitochondrien praktisch nicht nachgewiesen werden konnte [34, 35, 37—40]. Dieses bedeutet gleichzeitig, daß in unseren untersuchten Mitochondrienpräparationen keine wesentlichen Beimengungen an phosphatidylserinhaltigen Mikrosomen bzw. Plasmamembranen vorlagen. Der geringe Gehalt an Lysophosphatiden (Lysophosphatidylcholin und Lysophosphatidyläthanolamin) in den Retikulozytenmitochondrien zeigt, daß unter unseren Präparationsbedingungen offensichtlich keine nennenswerte Spaltung durch die in Retikulozyten nachweisbare Phospholipase A [11, 41] eingetreten ist. Damit steht auch unsere Beobachtung, daß Zusatz von Nupercain, einem Phospholipasehemmstoff [42], keine Veränderung des Phospholipidmusters hervorruft, in Einklang. Retikulozytenmitochondrien weisen einen hohen Sphingomyelingehalt auf. In Mitochondrien anderer Organe ist der Sphingomyelinanteil wesentlich geringer. Bei Rattenlebermitochondrien fanden wir nur 2% Sphingomyelin. Zu ähnlichen Ergebnissen kamen «auch andere Autoren [34, 35, 38, 43]. Jedoch wurde auch über relativ hohe Sphingomyelingehalte in Nierenmitochondrien neugeborener Ratten berichtet [44]. BERGELSON [45] beschreibt für Mitochondrien aus Hepatomen und Sarkomen ebenfalls einen beträchtlichen Gehalt an Sphingomyelinen. Ein eigenständiges mitochondriales Sphingomyelin ist wahrscheinlich, da in unseren Mitochondrienpräparationen die Verunreinigung mit Membrananteilen im Mittel nur 10% betrug und eine alleinige Herkunft der Sphingomyeline aus den Membranen nicht erklären könnte. Diese Aussage wird durch Tab. 3 verdeutlicht, die neben den Sphingomyelingehalten auch den Gehalt an NAD-Glykohydrolase als Leitenzym der Plasmamembranen [11] und an Zytochromoxydase als mitochondrialem Leitenzym in den beiden Fraktionen enthält. Außerdem bestehen bei den Spingomyelinen aus Mitochondrien und Plasmamembranen deutliche Unterschiede in der Fettsäurezusammensetzung. Dieses betrifft die Summe der C ]g -Fettsäuren (Mitochondrien 28,5%, Plasmamembranen 40,7%) und den Qutoienten aus gesättigten und ungesättigten Fettsäuren (Mitochondrien 0,90, Plasmamembranen 0,63). Besonders auffällig sind die Unterschiede im Gehalt an Palmitinsäure

Phospholipide in Retikulozytenmitochondrien

1409

Tabelle 3 Leitenzymverteilung (mU • m g - 1 Nichthämoglobinprotein) und Sphingomyelingehalt (Prozent des Gesamtphospholipid-P) bei Mitochondrien u n d P l a s m a m e m b r a n e n aus Kaninchenretikulozyten NAD-Glykohydrolase

Zytochromoxydase

Mitochondrien

7,3 ± 1,7 (n = 21)

Plasmamembranen

67 ± 13 (n = 18)

460 ± 1 1 9 (n = 16) 1,0 ± 1,9 (n = 12)

Sphingomyelin 12,5 ± (n = 31,0 ± (n =

5,3 4) 4,5 4)

(Mitochondrien 24,4%, Plasmamembranen 12,3%) sowie an Linolsäure (Mitochondrien 3,8%, Plasmamembranen 14,8%). Untersuchungen über die Fettsäurezusammensetzung mitochondrialer Sphingomyeline liegen infolge des geringen Anteils dieser Phospholipidfraktion an den Gesamtphospholipiden unseres Wissens bisher nicht vor. Bisher wurden die Fettsäuremuster der Phospholipide von Mitochondrien vor allem von Rattenleber [34, 35, 38, 46—53], aber auch von Schweine- und Rinderherz [37, 39, 40] ermittelt. Die aus den Retikulozytenmitochondrien isolierten Phospholipide Phosphatidylcholin, Phosphatidyläthanolamin und Phosphatidylinosit lassen in ihrer Fettsäurezusammensetzung keine wesentlichen Unterschiede im Vergleich zu der Fettsäurezusammensetzung der entsprechenden Phospholipide anderer Mitochondrienspezies erkennen. Das gleiche gilt auch hinsichtlich des für die innere Mitochondrienmembran spezifischen Kardiolipins, welches entsprechend den Kardiolipinen anderer Mitochondrien nur sehr wenig gesättigte Fettsäuren aufweist/Beim Vergleich der Fettsäuremuster der Phospholipide, die sowohl in der Mitochondrienfraktion als auch in den Plasmamembranen der Retikulozyten vorkommen, sind nur relativ geringe Abweichungen zu verzeichnen. Dies steht im Einklang mit der Vorstellung, daß die Fettsäurezusammensetzung eines Phospholipids eher für das entsprechende Phospholipid selbst als für den Typ der Membran spezifisch ist [39]- Abweichend davon verhalten sich die Sphingomyeline. Wenn man einerseits ein mögliches Vorkommen von autophagen Vakuolen bzw. sekundären Lysosomen in der Mitochondrienfraktion der Retikulozyten in Rechnung stellt und andererseits die beobachtete große Stabilität von Sphingomyelinen im Vergleich zu den anderen Phospholipiden bei Inkubationsversuchen in Betracht zieht (I. W I S W E D E L und W . AUGUSTIN, unveröffentlichte Befunde), so könnte der hohe Sphingomyelingehalt der Retikulozytenmitochondrien auch als sekundärer Bestandteil einer sich im Abbau befindlichen Mitochondrienpopulation angesehen werden. Um zu diesen Fragen begründete Aussagen machen zu können, sind jedoch weitergehende Untersuchungen erforderlich. Literatur Biochim. biophys. Acta 49, 2 8 6 ( 1 9 6 1 ) in: T \ e Red Blood Cell. C. B I S H O P S U R G E N O R (Hrsg.) Academic Press, New York, London 1 9 6 4 , S . 2 4 3 [3] N E L S O N , G. J . : Biochim. biophys. Acta 144, 221 (1967) [4] D O D G E , J . T., U. G. B. P H I L L I P S : J . Lipid Res. 8, 6 6 7 (1967)

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composition and fatty acid pattern of individual phospholipid classes from rabbit reticulocytes

The phospholipid composition and fatty acid patterns of individual phospholipid classes were determined in mitochondria from rabbit reticulocytes. Compared to mitochondria from rat liver reticulocyte, mitochondria exhibit about twice the amount of phospholipids. The phospholipid pattern of reticulocyte mitochondria (phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylinositol and cardiolipin) is comparable with other mitochondrial species. Mitochondrial fractions from reticulocytes are characterized, however, by an additional content of sphingomyelin. This sphingomyelin differs in its fatty acid composition from the sphingomyelin of the plasma membrane. The fatty acid patterns of all other phospholipids essentially correspond to those of mitochondria from other sources and to those of plasma membranes as well.

92

Acta biol. med. germ., B d . 36, Heft 10

Acta biol. med. germ., Band 36, Seite 1413 — 1421 (1977) Zentralinstitut für Herz- und Kreislauf-Regulationsforschung der Akademie der Wissenschaften der DDR, Bereich f ü r zerebroviszerale Kreislaufforschung, 1115 Berlin-Buch, DDR-und I n s t i t u t für Biophysik im Biologischen Forschungszentrum der Ungarischen Akademie der Wissenschaften, H-6701 Szeged, Ungarische V R

Zum Nachweis von Elementen in Epon-eingebetteten tierischen Geweben mittels Röntgenstrahl-Mikroanalyse: Eine vorläufige Studie 1 C. H . BECKER u n d A . G . S.

JÄNOSSY

(Eingegangen am 22. 3. 1977)

Zusammenfassung Es wurden röntgenmikroanalytische Untersuchungen an 6 Ratten, von denen 4 zuvor einer einwöchigen experimentellen Stoffwechselstörung ausgesetzt waren (NaCl- bzw. Ca-Vitamin D,-Überangebot) vorgenommen. Es zeigte sich, daß selbst nach konventioneller elektronenmikroskopischer Präparation und E p o n - E i n b e t t u n g in den Wänden von Colon-, Herz- und Nierenarteriolen die Elemente Cl, Si, P, S, Ca und geringfügig auch Fe quantitativ nachweisbar sind. Nach der Vorbehandlung entstanden z. T. erhebliche Abweichungen der Meßwerte zwischen den Tiergruppen. Die Zuverlässigkeit dieser Befunde bedarf der Bestätigung an einem größeren Tiermaterial. Einleitung

Die ortsgetreue Nachweisbarkeit von Elementen und Präzipitaten im Gewebeschnitt wird bei der Röntgenstrahl-Mikroanalyse ebenso wie bei der Anwendung herkömmlicher Methoden vor allem durch die Dislokation von Ionen während des Präparationsvorganges stark beeinträchtigt. Schon während der Gewinnung der Probe kommt es zu Quetschungen und Zerrungen des Gewebes, die zumindest auf die extrazellulären Gewebssäfte Einfluß haben dürften. Weit stärker wirken sich das relativ langsame Eindringen der Fixationslösungen, die nachfolgenden Waschungen, die Dehydrierung und schließlich die Imprägnation mit dem Einbettungsmedium auf den Standort bzw. das Verbleiben der Elemente überhaupt [4, 9] in der Gewebsprobe aus. Eine Reihe von Präparationstechniken für die Röntgenstrahl-Mikroanalyse sind bekannt. Die wohl einfachste Methode wäre 1. die konventionelle Ultradünnschnittherstellung (Fixierung, Dehydration und Kunstharzeinbettung), obschon die Eignung gerade dieser Methode für die Röntgenmikroanalyse noch nicht systematisch untersucht worden ist [11]. Einschränkend muß allerdings auf obengenannte Schwierigkeiten verwiesen werden, so daß mit Sicherheit kaum Ionen, sondern nur kovalent gebundene Elemente nachweisbar sind. Dafür bietet diese Methode neben anderen, noch zu diskutierenden Vorteilen vor allem eine gute und dem Elektronenmikroskopiker geläufige morphologische Erkennbarkeit, die bei allen nachfolgend aufgezählten Methoden mehr oder minder beeinträchtigt ist. 1

Herrn Prof. Dr. D.

92;

MATTHIAS

zum

65.

Geburtstag gewidmet.

1414

C. H . B E C K E R , A . G . S. JÄNOSSY

Weitere — auch zum Nachweis von Ionen geeignete — Präparationsmöglichkeiten sind 2. die Lyophilisation [2], 3- Lyophilisaten und Kunstharzeinbettung [7], 4. getrocknete Gefrierschnitte [1], 5- Gefriersubstitution [10, 12], 6. hydratisierte Gefrierschnitte mit nachfolgender Analyse bei tiefen Temperaturen [3], 7. Präzipitation von Ionen [8] und 8. Ausstrichtechnik („spread and dried") [13]. Keine dieser Methoden ist jedoch problemfrei; sowohl der apparative Aufwand als auch die notwendige technische Erfahrung des Präparierenden übersteigen bei weitem die entsprechenden Leistungen bei der herkömmlichen Einbettung zur elektronenmikroskopischen Untersuchung, ohne deren relativ sichere Reproduzierbarkeit zu erreichen. Zweifellos wäre es trotz der erwähnten methodischen Problematik besonders reizvoll, an der gleichen routinemäßig für die morphologische Untersuchung vorbereiteten Gewebeprobe auch eine Analyse der chemischen Zusammensetzung bestimmter Organellen vornehmen zu können. Systematische Untersuchungen zur Klärung der Frage, ob vielleicht restliche freie Ionen oder nur kovalent gebundene Elemente nach der Kunstharzeinbettung noch in aussagekräftiger Menge im Gewebe enthalten sind, fehlen im Schrifttum. Wir führten daher als einen ersten Schritt zunächst Röntgen-Mikroanalysen an in Epon eingebetteten Organen von Ratten durch, deren Stoffwechsel auf unterschiedliche Weise gestört worden war, und variierten außerdem das Vorgehen bei der Gewebspräparation. Material und Methodik Während eines 7tägigen Versuchszeitraumes erhielten 2 R a t t e n anstelle des Trinkwassers ausschließlich physiologische Kochsalzlösung und täglich eine s. c. Injektion von 2,0 ml dieser Lösung. 2 weitere R a t t e n wurden mit einer 10%igen Kreidesuspension in aqua dest. getränkt, von der sie täglich 1,0 ml s. c. injiziert erhielten; zusätzlich wurden ihnen in täglichen Gaben insgesamt 15 mg Vitamin D 2 intramuskulär appliziert. 2 Kontrolltiere wurden nicht behandelt und wie die Versuchsratten nach 7 Tagen getötet. Unmittelbar nach der Dekapitierung wurden Colon, Niere und Herz entnommen und in der üblichen Weise über Immersionsfixierung mit 2%igem Glutaraldehyd — jedoch bis auf die Kontrolltiere ohne Osmiumtetroxid-Nachfixierung — der Entwässerung durch Alkohol und Epon-Einbettung zugeführt. Neben der Frage nach der Ablesbarkeit von Stoffwechselstörungen wurde auch untersucht, ob die W a h l unterschiedlicher Puffer f ü r die Mikroanalyse am Epon-Schnitt bedeutungsvoll sein kann. Dazu wurden die Proben unter Verwendung von Na-Phosphat-, Kaliumphosphatund Collidinpuffer fixiert und gewaschen. Schließlich wurden Fixationslösungen unterschiedlicher Osmolarität (zwischen 3 70 und 600 mOsm) verwendet, für den Fall, daß dadurch die Geschwindigkeit der Ionenverdrängung beeinflußt wird. Die nicht kontrastierten Schnitte von ca. 200 nm Dicke wurden auf mit Formvar beschichteten Kupfernetzchen (150 mesh) präparatseitig kohlebedampft und im TransmissionsElektronenmikroskop JEOL-JEM 100B bei 80 kV unter einem Röntgen-Abnahmewinkel von — 35° und einem Elektronensondendurchmesser von maximal 300 nm 200 s lang im Energiebereich 0 - 4 0 keV mit dem energiedispersiven System EDAX 707B analysiert. An 6 zuvor festgelegten Lokalisationen in jeweils mehreren Arteriolen aus den 3 Organen der 2 Tiere jeder Behandlungsgruppe wurden je Lokalisation (Lumen, Erythrozyten, Endothelplasma und -kern, Mediaplasma und -kern) zwischen 12 und 22 Messungen vorgenommen. Die Auswertung erfolgte unter Zugrundelegung der hintergrundabgezogenen Peak-Intensitäten nach der von HALL [5] vorgeschlagenen Absolutwertberechnung 1 . Als Standards f ü r die quantitative Auswertung wurden NaCl, KCl, MgS0 4 , FeS0 4 , Si0 2 und Dentin verwendet. 1

E s wurden nur Peak-Intensitäten zur Auswertung herangezogen, die mindestens dem 2(J-Signifikanz-Kriterium genügten (Peak-Intensität > 2 ]/Untergrund — Intensität).

Röntgenstrahl-Mikroanalyse in Gewebeschnitten

1415

Ergebnisse

Unabhängig von der experimentellen Einwirkung zeigten sich bei allen Versuchsgruppen in den Gefäßwänden übereinstimmende Befunde insofern (Abb. 1), als die Elemente Kalium, Magnesium und Eisen in den drei Organen stets selten und nur in geringen Mengen nachweisbar waren (0,006—0,025 Gewichts %), häufiger Schwefel, Kalzium und Phosphor auftraten (0,073 —0,426 Gewicht %), und hohe Werte bei Silizium und vor allem Chlor gemessen wurden (0,279—4,044 Gewichts%). Dabei lagen die Meßresultate in den Gefäßlumina, die als lokale Kontrollen stets im blutkörperchenfreien Raum getestet wurden (Abb. 2), beim Nachweis der reichlicher auftretenden Elemente stets sehr niedrig und machten weniger als ein Zehntel des in der Gefäßwand und den Erythrozyten gemessenen Betrages aus. Allein Silizium (Abb. 3), das in allen Meßpunkten etwa in gleicher Menge auftrat, und in geringerem Maße Schwefel und Eisen waren im Lumen nachweisbar (Abb. 4 u. 5). Nach NaCl- und Ca-Vitamin-D 2 -Überangebot unterscheidet sich der KalziumNachweis (Abb. 6) nicht signifikant. Kalzium findet sich bei den unbehandelten 0s0 4 -fixierten Kontrollen jedoch doppelt so reichlich wie bei den behandelten Tieren beider Gruppe, die ihrerseits nicht signifikant voneinander abweichen. — Sehr charakteristisch ist das Verhalten von Schwefel und Phosphor (Abb. 4). Gew. NaCl% Uberschußdiät

Ca-Vit. D2Überschußdiät

Kontrolle

4,044

4,0

3,738

r

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K FeMgS Ca PSi CL K Fe MgSCaPSi Cl

KFeCaCl

Abb. 1. Vergleich der in den 3 Versuchsgruppen nachgewiesenen E l e m e n t e

1416

C. H . BECKER, A . G. S. JÁNOSSY

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