Taschenatlas der Biotechnologie und Gentechnik [3 ed.] 3527335145, 9783527335145

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Inhaltsverzeichnis Decken Abkürzungen Titel Autor Copyright Vorwort zur 1. Auflage Vorwort zur 2. Auflage Vorwort zur 3. Auflage Einführung Einleitung Frühe Entwicklungen Biotechnologie heute Mikrobiologie Viren Bakteriophagen Mikroorganismen Bakterien Hefen Pilze Algen Einige biotechnologisch wichtige Bakterien Mikroorganismen: Isolierung, Stammhaltung, Sicherheit Stammverbesserung von Mikroorganismen Biochemie Aminosäuren, Peptide, Proteine Enzyme: Aufbau, Funktion, Kinetik Zucker, Glykoside, Polysaccharide Lipide, Membranen, Membran-Proteine Stoffwechsel Gentechnik DNA: Aufbau und Struktur

DNA: Funktion RNA Gentechnik: Allgemeine Arbeitsschritte Präparation von DNA Weitere Enzyme zur Bearbeitung von DNA PCR: allgemeine Methode und praktische Anwendungen PCR: Labormethoden DNA: Synthese und Größenbestimmung DNA: Sequenzierung Einführung von DNA in lebende Zellen (Transformation) Klonierung und Identifizierung von Genen Genexpression Abschalten von Genen Epigenetik Genbanken und Genkartierung Genome von Prokaryoten Genome von Eukaryoten Metagenom Zellbiologie Stammzellen Blutzellen und Immunsystem Antikörper Reporter-Gruppen Oberflächen-Fermentation Mikroorganismen: Anzucht Wachstumskinetik und Produktbildung Zulauf-, kontinuierliche und Hochzelldichte-Fermentationen Fermentationstechnik Fermentationstechnik: Maßstabsvergrößerung Kultivierung tierischer Zellen Kultivierung tierischer Zellen im größeren Maßstab Enzym- und Zellreaktoren Aufarbeitung von Bioprodukten Aufarbeitung von Bioprodukten: Chromatographie

Ökonomische Gesichtspunkte bei industriellen Verfahren Alkoholische Getränke Bier Fermentierte Lebensmittel Lebensmittel und Milchsäure-Gärung Präbiotika und Probiotika Backhefe und Futterhefen Futterhefen aus Chemie-Rohstoffen, Einzelleröl Aminosäuren L-Glutaminsäure D,L-Methionin, L-Lysin und L-Threonin Aspartam™, L-Phenyl-alanin und L-Asparaginsäure L- und D-Aminosäuren durch enzymatische Transformation Vitamine Nucleoside und Nucleotide Industrieprodukte Bio-Ethanol Butanol Höhere Alkohole und Alkene Essigsäure Citronensäure Milchsäure, 3-Hydroxy-Propionsäure Gluconsäure und andere „grüne“ Zucker-Bausteine Dicarbonsäuren Biopolymere: Polyester Biopolymere: Polyamide Polysaccharide Biotenside Fettsäuren und Ester Enzymtechnologie Biotransformation Enzyme in der Technik Angewandte Enzymkatalyse Regio- und enantioselektive enzymatische Synthesen

Enzyme als Verarbeitungs-Hilfsmittel Enzyme und Waschmittel Enzyme zum Stärkeabbau Enzymatische Stärkehydrolyse Enzyme und Süßkraft Enzyme zum Abbau von Cellulose und Polyosen Enzymatische Verfahren bei der Zellstoff- und Papierherstellung Pektinasen Enzyme und Milchprodukte Enzyme zur Bearbeitung von Backwaren und Fleisch. Neue Enzyme für Lebensmittel und Tierfutter Enzyme zur Leder- und Textilbehandlung Neue Wege zu technischen Enzymen Protein Design Antibiotika Antibiotika: Vorkommen und Anwendungen Antibiotika: Screening, Herstellung und Wirkungsmechanismus Antibiotika-Resistenz β-Lactam-Antibiotika: Struktur, Biosynthese und Wirkungsmechanismus β-Lactam-Antibiotika: Herstellung Aminosäure- und Peptid-Antibiotika Glykopeptid-, Lipopeptid-, Polyether- und Nucleosid-Antibiotika Aminoglykosid-Antibiotika Tetracycline, Fluorochinolone, andere aromatische Antibiotika Polyketid-Antibiotika Neue Wege zu Antibiotika Medikamente und Medizintechnik Insulin Wachstumshormon und andere Hormone Hämoglobin, Serumalbumin, Lactoferrin Gerinnungsfaktoren Antikoagulanzien und Thrombolytika Enzym-Inhibitoren Interferone

Interleukine Erythropoietin und andere Wachstumsfaktoren Andere therapeutische Proteine Monoklonale Antikörper Rekombinante Antikörper Therapeutische Antikörper Vakzine Rekombinante Vakzine Steroid-Biotransformationen Enzyme für die Analytik Enzym-Tests Biosensoren Immunanalytik Glykobiologie Landwirtschaft und Umwelt Tierzucht Embryotransfer, geklonte Tiere Genkartierung Transgene Tiere Züchtung, gene pharming und Xenotransplantation Pflanzenzucht Pflanzliche Zellkulturen: Oberflächen-Kulturen Pflanzliche Zellkulturen: Suspensionskulturen Transgene Pflanzen: Methoden Transgene Pflanzen: Resistenz Transgene Pflanzen: Wertstoffe Aerobe Abwasserbehandlung Anaerobe Abwasser- und Schlammbehandlung Biologische Reinigung von Abluft Biologische Reinigung von Böden Mikrobielle Erzlaugung (Biolaugung) und Biokorrosion Megatrends Human-Genom Funktionsanalyse des Humangenoms

Pharmakogenomik, Nutrigenomics DNA-Analytik Gentherapie Induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) Tissue Engineering Wirkstoff-Screening Hochdurchsatz-Sequenzierung Proteomics DNA- und Protein-Arrays Metabolomics und Metabolic Engineering Synthetische Biologie Systembiologie Bioinformatik: Sequenz- und Struktur-Datenbanken Bioinformatik: Funktionsanalysen C-Quellen Bioraffinerien Sicherheit und Ethik Sicherheit in der Gentechnik Zulassung bio- und gentechnischer Produkte Ethik und Akzeptanz Patente in der Biotechnologie Biotechnologie im internationalen Leistungsvergleich Literatur Sachverzeichnis Bildquellen End User License Agreement

Abkürzungen Abkürzung Lesung

Bedeutung

µg

Mikrogramm

10–6 Gramm

µs a A

Mikrosekunden annum Adenosin

10–6 Sekunden Jahr Nucleotid in DNA oder RNA

b

Basen

bp C CEPH d Da EtBr ex-vivo

Anzahl von Nucleotid-Basen in RNA oder einzelsträngiger DNA Basenpaare Anzahl von Nucleotid-Paaren in einer DNA Cytosin Nucleotid in DNA oder RNA Centre d’Etude du französisches Projekt zur Humangenetik mit Zelllinien Polymorphisme Humain von etwa 100 Familien aus drei Generationen day Tag Dalton 1 Dalton = Masse-Equivalent eines Wasserstoffatoms Ethidiumbromid Farbstoff zum Nachweis von DNA nach Entnahme eines Organs

kbp kDa L M

10–12 Sekunden Nucleotid in DNA oder RNA Stunde durch Berechnung am Computer „im Reagenzglas“, außerhalb der Zelle in der Zelle, im Organismus βbei gentechnischen Experimenten Induktor für βIsopropylthiogalactosid Galactosidase (lacZ-Genabschnitt) Kilobasen tausend Nucleotid-Basen in RNA oder einzelsträngiger DNA Kilobasenpaare tausend Nucleotid-Basenpaare in DNA Kilodalton Masse-Equivalent von 1000 Wasserstoffatomen Liter molar g (Molmasse in Gramm)/L

Mbp

Megabasenpaare

fs G h in-silico in-vitro in-vivo IPGT kb

Femtosekunden Guanosin hour

Millionen Nucleotid-Basen in genomischer DNA

mg

Milligramm

10–3 Gramm

min Mio.

minute Millionen

Minute

mL mM

Milliliter millimolar

10–3 Liter mg (Molmasse in Gramm)/L

MR

relative Molmasse

Masse in Dalton, d

Mrd.

Milliarden

ms

Millisekunden

10–3 Sekunden

ng

Nanogramm

10–9 Gramm

nm

Nanometer

10–9 Meter

ns ORF ori PCR

Nanosekunden open reading frame origin of replication PolymeraseKettenreaktion

10–9 Sekunden für ein Genprodukt kodierender Abschnitt Replikationsursprung extrachromosomaler DNA Methode zur Vervielfältigung von DNA

pg pM s t T U

Pikogramm picomolar second Tonnen Thymidin Uridin

10–12 Gramm P g (Molmasse in Gramm)/L Sekunden metrische Tonnen Nucleotid in DNA oder RNA Nucleotid in RNA

Rolf D. Schmid

Taschenatlas der Biotechnologie und Gentechnik Dritte Auflage 171 Farbtafeln von Ruth Hammelehle

Autor Prof. Dr. Rolf D. Schmid Bio4Business Jagdweg 3 70569 Stuttgart Grafikerin Ruth Hammelehle Marktplatz 5 73230 Kirchheim unter Teck Cover DNA Helix von fotolia ©A-Mihalis

3. Auflage 2016 Alle Bücher von Wiley-VCH werden sorgfältig erarbeitet. Dennoch übernehmen Autoren, Herausgeber und Verlag in keinem Fall, einschließlich des vorliegenden Werkes, für die Richtigkeit von Angaben, Hinweisen und Ratschlägen sowie für eventuelle Druckfehler irgendeine Haftung. Bibliografische Information der Deutschen Nationalbibliothek Die Deutsche Nationalbibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen Nationalbibliografie; detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über abrufbar. © 2016 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Boschstr. 12, 69469 Weinheim, Germany Alle Rechte, insbesondere die der Übersetzung in andere Sprachen, vorbehalten. Kein Teil dieses Buches darf ohne schriftliche Genehmigung des Verlages in irgendeiner Form – durch Photokopie, Mikroverfilmung oder irgendein anderes Verfahren – reproduziert oder in eine von Maschinen, insbesondere von Datenverarbeitungsmaschinen, verwendbare Sprache übertragen oder übersetzt werden. Die Wiedergabe von Warenbezeichnungen, Handelsnamen oder sonstigen Kennzeichen in diesem Buch berechtigt nicht zu der Annahme, dass diese von jedermann frei benutzt werden dürfen. Vielmehr kann es sich auch dann um eingetragene Warenzeichen oder sonstige gesetzlich geschützte Kennzeichen handeln, wenn sie nicht eigens als solche markiert sind. Print ISBN 978-3-527-33514-5

Vorwort zur 1. Auflage Die Biotechnologie, eine der Schlüsseltechnologien des 21. Jahrhunderts, ist in besonderem Maße interdisziplinär. Je nach Aufgabenstellung erfordert sie Wissen aus der allgemeinen Biologie, der Molekulargenetik und der Zellbiologie, der Humangenetik und der molekularen Medizin, der Virologie, Mikrobiologie und Biochemie, der Enzymtechnologie, der Bioverfahrenstechnik und der Kybernetik; dazu in immer stärkerem Maße auch umfangreiche Computer-Kenntnisse, vor allem für die Bioinformatik und die Systembiologie. Vor diesem Hintergrund nimmt es nicht wunder, dass es so gut wie keine kurz gefassten Lehrbücher gibt, die das gesamte Gebiet abdecken. Selbst vielbändige Monographien lassen meist wichtige Teilgebiete wie Tier- und Pflanzenzucht oder Bioinformatik außer acht. Andererseits habe ich selbst als lebenslang Lernender und über viele Jahre hinweg auch bei meinen Studenten erlebt, wie anregend und motivierend der Blick aufs Ganze sein kann, gerade wenn das Studium die Aufnahme Tausender anscheinend zusammenhangloser Einzelheiten erfordert. Mit dem Taschenatlas Biotechnologie/Gentechnik liegt nun ein kleines Handbuch vor, das eine Lösung für dieses Dilemma sucht. Die verschiedenen Themen dieses Buches, die von „Bier“ und „Ethanol“ über „Rekombinante Vakzine“ bis zu „Humangenom“ und „Proteomics“ reichen, lassen sich zwar fast nicht auf einer einzigen Text- und Bildseite zutreffend darstellen; schließlich findet man für jedes dieser Einzelthemen ganze Monographien, Buchkapitel und Hunderte von wissenschaftlichen Veröffentlichungen (einige davon werden jeweils im Literaturverzeichnis zitiert). Andererseits ist gerade der Zwang zur knappen Darstellung die rechte Herausforderung, die wesentlichen Gesichtspunkte jedes Einzelthemas herauszuarbeiten und in einen größeren Zusammenhang zu stellen. Ich hoffe, dass mir dies wenigstens teilweise gelungen ist und dass ich dem Leser hier und dort den roten Faden in die Hand geben kann, der ihn aus dem Labyrinth einer von Anglizismen geprägten Kunstsprache wieder sicher in den Alltag einer zwar anspruchsvollen, aber durchaus zugänglichen und faszinierenden Wissenschaft herausführt. Sollte dies gelingen, so wäre es auch das Verdienst von Ruth Hammelehle, die mit großem Gespür für den logischen Aufbau von Schemazeichnungen (und für deren Ästhetik) dem knappen Text eine zweite Dimension verliehen hat. Auch den am Entstehen dieses Buchs beteiligten Redakteurinnen Barbara Frunder, Ute Rohlfs und Karin Dembowsky, möchte ich herzlich für ihre Sorgfalt und ihre Kommentare danken. Mein besonderer Dank gilt den zahlreichen Kollegen, die einzelne Themen oder Abschnitte des Buchs kritisch durchgesehen und durch Anregungen und Kommentare ganz entscheidend verbessert haben. Dies waren: Max Roehr, Wien; Frank Emde, Bonn; Maria-Regina Kula und Hermann Sahm, Jülich; An-Ping Zeng, Braunschweig; Volker Kasche, Hamburg-Harburg; Peter Dürre, Ulm; Ulf Stahl, Edeltraud Mast-Gerlach und Dietrich Knorr, Berlin; Udo Graefe, Jena; Günter Schmidt-Kastner, Wuppertal; Karl-Heinz Maurer, Düsseldorf; Wolfgang Barz und

Alexander Steinbüchel, Münster; Frieder Scheller, Potsdam; Bertold Hock und Wolfgang Ludwig, Weihenstephan; Reinhard Krämer, Köln; Thomas von Schell, Hans-Joachim Knackmuss, Karl-Heinrich Engesser, Jörg Metzger, Peter Scheurich, Ulrich Eisel, Matthias Reuss, Peter Stadler, Klaus Mauch, Christoph Syldatk, Michael Thumm und Joseph Altenbuchner, Stuttgart; Helmut Geldermann, Rolf Claus, Gerd Weber und Rolf Blaich, Stuttgart-Hohenheim; Helmut Uhlig, Breisach; Joachim Siedel, Claus Wallerius, Anton Haselbeck und Ulrich Behrendt, Penzberg; Wolfgang Wohlleben und Claus Schuldt, Tübingen; Rolf Werner, Biberach; Wieland Wolf und Andreas Lorenz, Laupheim; Frank-Andreas Gunkel, Wuppertal; Michael Bröker, Marburg; Bernhard Hauer, Wolfgang Pressler und Dieter Jahn, Ludwigshafen; Dieter Man-gold und Julia Schueler, Mannheim; Frank Zocher und Paul Habermann, Hoechst; Tilmann Spellig, Bergkamen; Dieter Oesterhelt, Friedrich Lottspeich und Bernd Gänsbacher, München. Unter den vielen Mitarbeitern meines Instituts, die mir geduldig auf zahllose Fragen antworteten, möchte ich stellvertretend Jutta Schmitt, Isabelle Kaufmann, Markus Enzelberger, Till Bachmann und Jürgen Pleiss danken. Es wäre ein Wunder, wenn trotz dieser vielfältigen Hilfe nicht Unklarheiten und Fehler geblieben wären. Um diese in Zukunft auszumerzen, bitte ich meine geneigten Leser, mir Unklarheiten oder Fehler unter der Web-Adresse meines Instituts, www.itb.unistuttgart.de/taschenatlas mitzuteilen, um das Buch ständig verbessern zu können. Rolf D. Schmid Stuttgart, Dezember 2001

Vorwort zur 2. Auflage In den 5 Jahren, seit die 1. Auflage dieses kleinen Buchs erschien, haben sich Biotechnologie und Gentechnik stürmisch weiterentwickelt. Abzulesen ist dies zum einen an der gesteigerten Mengenprodukten fast aller traditionellen Fermentationsprodukte. So verdoppelte sich beispielsweise die Jahresproduktion von L-Glutamat in nur 5 Jahren auf ca. 1,5 Millionen to, was auf veränderte Ernährungsgewohnheiten, aber auch auf den Eintritt Chinas in die Weltwirtschaft hinweist. Zum anderen hat sich die Entschlüsselung von Genomsequenzen fortgesetzt. Unser Wissen um ihren Aufbau beruht heute auf der Sequenzinformation von mehr als einem Dutzend Pflanzen und Tieren und hunderten von Mikroorganismen. Die funktionelle Analyse von Genomen hat zu grundlegend neuen Erkenntnissen geführt, beispielsweise zur Aufklärung der Rolle von small interfering RNAs (siRNA); in Verbindung mit Proteomics und Metabolomics hat sie eine ganzheitliche Analyse der Lebensvorgänge mit Hilfe der Systembiologie ausgelöst. Und sollte die Vorhersage einer individuellen Genomanalyse zum Preis von etwa 1500 € eintreffen (und bis dahin um grundlegende kausale Kenntnisse für Erkrankungsursachen, Altersvorgänge und Stoffwechselstörungen erweitert werden können), so wäre der Weg für eine personenbezogene Diagnose, Therapie und Ernährungsberatung offen. In der industriellen Biotechnologie haben die in den letzten Jahren dramatisch gestiegenen Erdölpreise und die mit der Industrialisierung des Planeten einhergehende Erwärmung der Atmosphäre in Industrie und Wissenschaft das Gefühl verstärkt, dass zum Erhalt des „Raumschiffs Erde“ neue, nachhaltige Technologien zur Energie-Erzeugung und zur Versorgung mit Grundchemikalien entwickelt werden müssen. Bioethanol und Biodiesel als Treibstoffe, die vergleichende Bewertung von Prozessen der Chemie-Produktion mittels Ökobilanzen und der Bau der ersten „Bioraffinerien“, in denen Chemieprodukte aus nachwachsenden Rohstoffen erzeugt werden, geben klare Signale für das große Entwicklungspotenzial der „weißen Biotechnologie“. Neben einer grundlegenden Überarbeitung aller Einträge enthält die 2. Auflage dieses Buchs deshalb auch 4 neue Stichworte: Tissue Engineering, RNA, Systembiologie und „Weiße Biotechnologie“. Mein Dank für sehr wertvolle Informationen aus der biotechnologischen Industrieforschung gilt den Herren Waander Riethorst (Sandoz), Bernhard Hauer und Uwe Pressler (BASF), Andreas Leuchtenberger (Degussa) und Karlheinz Maurer (Henkel). Für aktuelle Informationen aus der akademischen Forschung danke ich besonders Frau Susanne Grabley (Jena), Frau Sibylle Thude (Stuttgart) und den Herren Wolfgang Wohlleben (Tübingen), Matthias Reuss, Klaus Pfizenmaier und Klaus Mauch (Stuttgart). Mein Dank geht auch erneut an Frau Ruth Hammelehle und Herrn Bernhard Walter von der Firma epline, Kirchheim/Teck, für die ausgezeichnete grafische und drucktechnische Gestaltung sowie an Frau Dr. Romy Kirsten für die hervorragende verlagsseitige Betreuung. Rolf D. Schmid Stuttgart im Herbst 2005

Vorwort zur 3. Auflage In den 14 Jahren seit der 1. Auflage dieses Bands hat sich die Entwicklung der Biotechnologie weiter beschleunigt. Das gilt sowohl für die Wissenschaft, die mit neuen Methoden zur „synthetischen Biologie“, zum Editieren ganzer Genome oder mit big data aus der Massensequenzierung von Genomen die belebte Welt immer genauer erschließt, wie auch für industrielle Anwendungen – im Pharma-Bereich stehen dafür immer zahlreichere Beispiele für therapeutische Antikörper, für companion diagnostics, also Bausteine einer individualiserten Medizin und für aus induzierten Stammzellen regenerierte Körperzellen, im technischindustriellen Bereich der Megatrend zu einer Bioökonomie auf Basis nachwachsender Rohstoffe. Eine grundlegende Überarbeitung aller Einträge wird in der dritten Auflage begleitet von einer Neugliederung: die grundlegenden Disziplinen der Biotechnologie, Mikrobiologie, Biochemie, Molekulargenetik, Zellbiologie und Bioverfahrenstechnik, werden nun in einer Einleitung dargestellt – darüber hinaus werden zahlreiche neue Trends wie Algentechnologie, Epigenetik, Metagenomics, oder Glykobiologie in eigenen Einträgen behandelt. Unter „Megatrends“ finden sich nun genauere Beschreibungen der Hochdurchsatz-Sequenzierung und der „synthetischen Biologie“, aber auch Beispiele für eine individualisierte Medizin oder die Bedeutung der Kohlenstoffquellen für die Bioökonomie. Es versteht sich von selbst, daß die kurze Form eines Taschenatlas derartige Themen nur anreißen kann. Ich habe versucht, dieses Defizit durch aktuelle Hinweise auf weiterführende Literatur auszugleichen. Mein herzlicher Dank gilt erneut meinen Kollegen und Freunden, die mich bei der Ausarbeitung der einzelnen Kapitel beraten haben. Ergänzend zu meiner Danksagung im Vorwort der 1. und 2. Auflage möchte ich hier nennen: Wolfgang Wohlleben, Universität Tübingen; Karin Benz, NMI Reutlingen; Ulrike Konrad, Protagen; Karl Maurer, ABEnzymes, Darmstadt; Bernhard Hauer, Georg Sprenger und Jürgen Pleiss, Universität Stuttgart; Ulrich Behrendt, München; Dirk Weuster-Botz, Universität München; Jörn Kalinowsky, Universität Bielefeld; Vlada Urlacher, Universität Düsseldorf und Frieder Scheller, Universität Potsdam. Mein Dank geht erneut an Frau Ruth Hammelehle und Herrn Bernhard Walter von der Firma epline, Kirchheim/Teck, für die ausgezeichnete grafische und drucktechnische Gestaltung, sowie an Herrn Dr. Cicchetti, Herrn Dr. Sendtko und Frau Dr. Ley für die hervorragende verlagsseitige Betreuung. Frau Dr. Alexandra Prowald danke ich für die Erstellung eines ausgezeichneten Index. Rolf D. Schmid Stuttgart, im Herbst 2015

Einführung Dieser Taschenatlas wendet sich an Studierende der Biologie, Biochemie und Bioverfahrenstechnik, die einen Einstieg in die vielen Arbeitsgebiete der modernen Biotechnologie suchen. Es soll aber auch Pädagogen, Patentanwälten, Managern und Investoren ermöglichen, sich schnell ein aktuelles Bild zu machen über ein gerade interessierendes Thema der industriellen Biotechnologie und ihrer wissenschaftlichen Grundlagen. Auf 171 Farbtafeln wird dazu Wissen aus zahlreichen Einzeldiszip-linen angeboten, auf der dazugehörigen Textseite erläutert und mit einem umfangreichen Literaturverzeichnis ergänzt. Viele Seitenangaben in den Texten erlauben es zudem, Grundlagenwissen und Anwendungsgebiete besser miteinander zu verbinden. Diese grundlegend überarbeitete und um viele neue Themen ergänzte 3. Auflage ist noch immer modular aufgebaut, aber anders gegliedert. Nach einem kurzen historischen Überblick beginnt das Buch nun mit knappen Abrissen der Grundlagen der modernen Biotechnologie: Mikrobiologie, Biochemie, Molekulargenetik, Zellbiologie und Bioverfahrenstechnik. Im zweiten Teil des Buchs folgen dann Übersichten zu den vielfältigen Anwendungen der Biotechnologie bei Lebensmitteln und Lebensmittelzusatzstoffen, bei Industrieprodukten, bei der Enzymtechnologie sowie, besonders umfangreich, auf vielen Gebieten der Medizin, z. B. bei der Herstellung von Antibiotika, anderen Medikamenten, aber auch in der Medizintechnik. Abgeschlossen wird dieser zweite Teil mit vielen Beispielen für die Anwendung der Biotechnologie in der Landwirtschaft und beim Schutz der Umwelt. Ein dritter Teil des Buchs behandelt die großen aktuellen Megatrends der Biotechnologie: dazu gehören Genomanalysen und die Methoden der Bioinformatik zur Beherrschung von “big data” ebenso wie die großen Fortschritte bei der Zelltechnologie und Gentherapie, aber auch die Fortschritte hin zu einer „Bioökonomie”, die eines Tages das Erdöl-Zeitalter ablösen wird. Den Abschluss des Buchs bilden fünf Seiten zu den Themen Sicherheit und Ethik, die sich u. a. mit Patent- und Zulassungsfragen beschäftigen. Ich hoffe, dass es gelungen ist, die wichtigsten Grundlagen, Ergebnisse und Trends dieser sich so schnell entwickelnden Querschnitts-Technologie auf wenig Raum zusammenzufassen und dem Leser/der Leserin nicht nur eine ansprechende und stimulierende Lektüre zu bieten, sondern ihn oder sie zu vertieften Studien anzuregen.

Einleitung Frühe Entwicklungen Geschichte. Die Ursprünge dessen, was wir heute Biotechnologie nennen, reichen in die Vorgeschichte zurück. Vermutlich standen am Anfang Erfahrungen um den Verlust von Nahrungsmitteln durch mikrobiellen Verderb und um deren Konservierung durch Trocknen, Salzen oder Zuckern, wahrscheinlich auch der „heilige Rausch“ nach dem Genuss vergorener Getränke. Wie frühgeschichtliche Dokumente belegen, entstanden mit der Entwicklung arbeitsteiliger Stadtkulturen erste Verfahrensvorschriften, in Europa zur Herstellung von Brot, Bier, Wein und Käse und zum Gerben von Haut zu Leder, in Asien zur Gewinnung von Essig, Reiswein und fermentierter Lebensmittel wie Sauerkraut (China), Kimchi (Korea) oder Gari (Indonesien). Im Abendland waren es die Klöster mit ihrer guten Infrastruktur, die seit dem 6. Jahrhundert die Kunst des Brauens, Kelterns und Backens weiterentwickelten. Der Devise Liquida non fragunt ieiunium („Flüssiges bricht nicht das Fastengebot“) verdanken wir die kräftigen und alkoholreichen Starkbiere. Die moderne Biotechnologie nahm ihren Ausgang von der stürmischen Entwicklung der Mikrobiologie im späten 19. Jahrhundert und wurde im Schatten der beiden Weltkriege durch die Leistungen von Chemikern, Mikrobiologen und Ingenieuren im Umfeld der Lösemittel- und Antibiotika-Herstellung industriell etabliert. Viele großartige Entdeckungen der Biochemie, der Genetik und der Zellbiologie legten den Grundstein für die molekulare Biotechnologie, die seit ca. 1970 mit der Gentechnik, seit ca. 1980 mit der Zelltechnologie, seit ca. 1990 mit der Bioinformatik und in jüngster Zeit mit der Genom- und Proteomforschung eine Querschnitts- und Schlüsseltechnologie für das 21. Jahrhundert bildet. Frühe Pioniere und Produkte. Die Biotechnologie ist eine anwendungsbezogene Wissenschaft – viele ihrer Aufgabenstellungen haben wirtschaftliche Motive. Louis Pasteur, ein französischer Chemiker, setzte erstmals 1864 das Mikroskop zur Verlaufskontrolle der Weinund Essigherstellung ein. Mit zwei technischen Kunstgriffen – der Reinkultur von Mikroorganismen und der Sterilisation ihrer Nährmedien (Pasteurisieren) – legte er den Grundstein für die angewandte Mikrobiologie und weitete sie mit seinen Schülern auf die Erforschung und Bekämpfung pathogener Mikroorganismen aus. Zu Beginn des 20. Jahrhunderts kamen der deutsche Chemiker Otto Röhm und der Japaner Jokichi Takamine auf die Idee, Enzyme aus Schlachttierabfällen bzw. aus Kulturlösungen von Schimmelpilzen als technische Hifsmittel einzusetzen. Röhm revolutionierte damit die Lederverarbeitung (als Enzymquelle wurde bis zu diesem Zeitpunkt Hundekot verwendet), Takamine die Verarbeitung von Malz und Stärke. Im öffentlichen Bereich war die Einführung der aeroben und anaeroben Abwasserreinigung um 1900 ein Meilenstein bei der Prävention von Seuchen. Während des 1. Weltkriegs entwickelte Carl Neuberg in Deutschland die Herstellung von Glycerin mit Backhefe, Charles Weizmann, ein russischer Emigrant jüdischer Herkunft, in England die fermentative Herstellung von Aceton durch anaerobe Fermentation von Clostridien-Stämmen.

Beide Rohstoffe waren kriegswichtig zur Herstellung von Sprengstoffen (Nitroglycerin bzw. Cordit) und gaben der Fermentations-Industrie einen ersten Auftrieb. Die Balfour-Deklaration und die spätere Gründung des Staates Israel, dessen erster Präsident Weizmann wurde, geht unmittelbar auf dessen Verdienste im 1. Weltkrieg zurück. In der Nachkriegszeit erreichte das Koppelprodukt der Aceton-Fermentation durch Clostridien, 1-Butanol, als Lösemittel für Autolacke große Bedeutung. Die Zufallsentdeckung der antibakteriellen Wirksubstanz Penicillin durch Alexander Fleming (1922), durch Howard Florey erstmals als chemische Substanz isoliert, löste während des 2. Weltkriegs die industrielle Produktion von Antibiotika aus. 1950 hatte man bereits über 1000 verschiedene Antibiotika isoliert, von denen viele in großer Menge für die Humanmedizin und zunehmend auch für die Tierproduktion und den Pflanzenschutz eingesetzt wurden. Seit ca. 1950 begann die Industrialisierung der analytischen Biotechnologie, bei der man für die hochselektive Detektion von Metaboliten in Körperflüssigkeiten oder Lebensmitteln zuerst Enzyme, später Antikörper verwendete. Ab ca. 1965 diskutierte man, im Schatten der Ölkrisen und der Bevölkerungsexplosion, die Konversion von Biomasse zu den Energieträgern Ethanol und Methan und die Herstellung von Einzellerprotein. Auch jetzt, 2014, sind Bioraffinerien und Biotreibstoffe aktuelle Themen.

Biotechnologie heute Gentechnik und Zellbiologie. 1973 gelang es Stanley Cohen und Herbert Boyer in San Francisco zum ersten Mal, ein fremdes Gen gezielt in einen Wirtsorganismus zu übertragen und dort zur Expression zu bringen. Von da ab dauerte es etwa 10 Jahre, bis das erste gentechnisch erzeugte Medikament zugelassen wurde. Heute sind hunderte gentechnisch hergestellter Medikamente und Therapeutika zugelassen, darunter Produkte wie Insulin (bei Diabetes),

Erythropoietin (bei Blutarmut), Faktor VIII (bei Bluterkrankheit) und β-Interferon (bei multipler Sklerose), rekombinante Antikörper und Vakzine – und viele weitere befinden sich in der Entwicklung. Stand in den Anfangsjahren die medizinische Forschung im Mittelpunkt, so verfiel man bald darauf, die neuen gentechnischen Methoden auch auf landwirtschaftliche Fragestellungen anzuwenden. So züchtete man transgene Pflanzensorten, die ResistenzFaktoren gegen Herbizide oder Insektenfraß enthalten. In der chemischen Industrie wächst die Zahl der Syntheseschritte mit Hilfe von Mikroorganismen oder Enzymen (Biokatalyse), seit diese gentechnisch an die industriellen Erfordernisse angepasst werden können. Aus nachwachsenden Rohstoffen erzeugte Biopolymere beginnen, petrochemisch erzeugte Kunststoffe zu ersetzen und begründen damit eine „Bioökonomie“, zu der auch neue Energieträger wie Bioethanol, Biogas oder Biodiesel gehören werden. Sie verändern das Gesicht der Landwirtschaft in großem Stil. Im Mittelpunkt des wissenschaftlichen wie auch des medizinischen Interesses stehen heute die Genomforschung und die Zelltechnik. Angetrieben von immer leistungsfähigeren Geräten und der Rechenkraft von Supercomputern, ist die Sequenzierung eines menschlichen Genoms bereits fast Routine. Man nutzt Genom-Daten, um durch funktionelle Genomforschung Aufschluss über die molekularen Ursachen komplexer Krankheitsbilder zu erhalten, und mit Gentherapie unternimmt man Versuche, kranke durch gesunde Gene zu ersetzen. Auch die Tier- und Pflanzenzucht kommt durch genomische Informationen immer schneller voran. Können Pflanzen bereits seit ca. 50 Jahren aus undifferenzierten Zellkulturen regeneriert werden, so ist das bei menschlichen Zellen seit einigen Jahren mit embryonalen oder induzierten pluripotenten Stammzellen ebenfalls möglich, woraus sich völlig neue Ansätze für eine „Reparatur“ kranker Gewebe ergibt. Akzeptanz. Das 1998 geborene Schaf Dolly war das erste aus den Körperzellen der Mutter klonierte und mit dieser genetisch identische Lebewesen. Die Stoßrichtung derartiger Forschungsrichtungen, z. B. der Embryonenforschung, und die atemberaubende Schnelligkeit des Fortschritts hat viele gesellschaftliche Diskussionen in Gang gesetzt. In welchem Zellstadium soll der Schutz menschlichen Lebens beginnen? Wie soll der Einzelne, die Gesellschaft und die Versicherungswirtschaft mit deterministischen Einsichten in das Krankheitsrisiko eines Individuums umgehen? Wie verändern erfolgreiche genetische Therapien die Altersstruktur einer Gesellschaft? Welche ökologische Risiken lösen wir mit einem mutwilligen, vorrangig ökonomisch begründeten Eingriff in die biologische Diversität aus? Welche Konsequenzen haben Biotechnologie und Gentechnik für die Entwicklungsländer? Grundlagen. Die vielfältigen und ständig zunehmenden Anwendungen der Biotechnologie und der Gentechnik werden im Hauptteil dieses Taschenbuchs behandelt, gefolgt von aktuellen „Megatrends“ (2014), zu denen auch die Bioinformatik gehört. Im ersten Teil sollen dagegen die multidisziplinären Grundlagen der Biotechnologie skizziert werden. Der historischen Entwicklung entsprechend, ist dies zuerst einmal die Mikrobiologie. Ihr folgen wesentliche Aspekte der Biochemie, der Lehre von der Chemie lebender Organismen, von ihrem Stoffwechsel und dessen Regulation. Eine wesentliche Eigenschaft von Lebewesen ist ihre Fähigkeit zur Vermehrung – deshalb werden die Grundlagen der Molekulargenetik und der Gentechnik ausführlich dargestellt. Die Biologie höherer Zellen und um ihr Zusammenspiel in vielzelligen Organismen ist thematischer Schwerpunkt der Zellbiologie. Schließlich benötigen

alle industriellen Anwendungen der Biotechnologie und der Gentechnik einen Produktionsschritt – dies ist die von Ingenieuren geprägte Disziplin der Bioverfahrenstechnik. Es versteht sich von selbst, dass diese umfangreichen Wissensgebiete in einem Taschenbuch nur angerissen werden können. Zu beinahe jeder Themenseite wird deshalb auf weiterführende Literatur verwiesen.

Mikrobiologie Viren Allgemeines. Viren sind infektiöse Partikel ohne eigenen Stoffwechsel. Ihr genetisches Programm ist entweder in DNA oder RNA niedergelegt, deren Replikation mit Hilfe lebender Wirtszellen erfolgt. Bei der Vermehrung des Virus wird meist eine Protein-Hülle (Capsid) gebildet, die außerhalb der Wirtszelle die virale Nucleinsäure umschließt (Viruspartikel, Nucleocapsid). Viren können die meisten lebenden Organismen infizieren, sind dabei aber fast immer wirtsspezifisch und oft sogar auf bestimmte Gewebe oder Zellen spezialisiert. Man unterscheidet Viren nach ihrer Wirtsspezifität, ihrer Morphologie, dem Nucleinsäure-Typ (DNA/RNA) und dem Aufbau des Capsids. In der medizinischen und veterinärmedizinischen Forschung spielt die Diagnose und Behandlung von Virus-Erkrankungen wie AIDS (HI-Virus), Vogelgrippe (H5N1-, H7N9-Virus), hämorrhagischem Fieber (Ebolavirus) oder Rinderpest (Morbillivirus) eine sehr wichtige Rolle (→248). In der Biotechnologie verwendet man Viren zur Entwicklung von Komponenten-Vakzinen (→250) und zur Herstellung von Vektoren und Promotor-Elementen, z. B. für die Gentherapie und die Expression von Genen in tierischen Zellkulturen. Viren für Experimente am Tier. Die ersten Klonierungsexperimente mit Tierzellen führte man 1979 mit einem Vektor auf der Grundlage des simian virus 40 (SV40) durch (→98). Das Virus infiziert verschiedene Säugetiere und kann dabei lytische (Zell-lysierende) oder lysogene (verzögert Zell-lysierende) Cyclen durchlaufen. Sein ca. 5,2 kb großes Genom enthält „frühe Gene“ für die DNA – und „späte Gene“ für die Capsid-Synthese. Expressionsvektoren auf der Grundlage des SV40-Virus enthalten dessen Replikationsursprung (ori), häufig auch eine von diesem Virus abgeleitete Promotor- und Transkriptions-Terminationssequenz (PolyAdenylierungssequenz). Für die Transfektion von Mauszellen haben sich Konstrukte auf der Grundlage des bovinen Papillomvirus (BPV) bewährt. Sie verwandeln sich bei der Infektion in ein Viel-Kopien-Plasmid, das bei der Zellteilung auf die Tochterzellen weitergegeben wird. Bei der Gentherapie mit attenuierten Viren bevorzugt man Retro-, Adeno- und Herpesviren (→304). Retroviren, z. B. das HIV-Virus, enthalten ein RNA-Genom. Sie infizieren sich teilende Zellen, wobei eine von ihrem Genom kodierte reverse Transkriptase das RNA-Genom in cDNA umschreibt. Diese wird dann im Wirtsgenom integriert und dirigiert dort mittels starker Promotoren die Bildung von Capsid-Proteinen und viraler mRNA. Mit replikationsdefekten Retrovirus-Vektoren wurden bereits mehrere hundert GentherapieVersuche erfolgreich abgeschlossen, die verpackbare Fremd-DNA (insert) ist aber klein. Demgegenüber liegt die Klonierungskapazität von Adenoviren für fremde DNA bei 28 kb. Adenoviren infizieren auch Zellen, die sich nicht teilen, ihre DNA integriert aber nicht in das Chromosom der Wirtszelle. Für die Gentherapie neuronaler Zellen bei Krankheitsbildern wie Alzheimer- und Parkinson-Krankheit untersucht man Herpes simplex-Vektoren. Ihr großes DNA-Genom von 152 kb erlaubt den Einbau fremder DNA-Abschnitte > 20 kb. Auch

Vaccinia-Viren kommen bei der Gentherapie zum Einsatz. Sie haben eine ähnlich große Klonierungskapazität und befallen viele Zelltypen. Viren für Experimente an Pflanzen. Die meisten Pflanzenviren bestehen aus RNA (→280). Man kennt nur zwei Gruppen von DNA-Viren, die höhere Pflanzen infizieren: Caulimoviren haben ein sehr enges Wirtsspektrum: sie infizieren nur Kreuzblütler wie Rüben und einige Kohlsorten. Ihr geringes Capsid-Volumen beschränkt die Gesamtgröße des Genoms und damit der verpackbaren Fremd-DNA. Geminiviren infizieren wichtige Nutzpflanzen wie Mais und Weizen, was das Risiko ihrer Nutzung erhöht. Außerdem macht ihr Genom während des Infektionscyclus zahlreiche Umordnungen und Deletionen durch, wodurch die intakte Expression fremder DNA-Inserts erschwert wird. Baculoviren infizieren Insekten, nicht aber Wirbeltiere. Nach Infektion verursachen sie die Bildung eines kristallinen Proteins (Polyhedrin), das dann über 50 % des Gesamtproteins der Insektenzelle ausmacht. Der Polyhedrin-Promotor wird deshalb in Verbindung mit Zellkulturen von Spodoptera (einem Schmetterling) zur heterologen Expression von Proteinen verwendet. Vorteilhaft ist dabei, dass die posttranslationale Glykosylierung (→262) derjenigen bei Wirbeltieren ähnelt. Zur Züchtung transgener Seidenraupen (Bombyx mori) wird das Kernpolyedervirus BmNPV eingesetzt.

Bakteriophagen

Allgemeines. Viren, die Bakterien befallen, nennt man Bakteriophagen oder kurz Phagen. Sie werden vom International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV) klassifiziert. Wie Metagenom-Analysen (→74) gezeigt haben, kommen sie in großer Zahl in der Umwelt vor. Der Einsatz von Phagen wird seit langem als Therapie bei Infektionskrankheiten untersucht. Bei der Fermentation, z. B. bei der Herstellung von Starterkulturen (→114), muss ein Befall mit Phagen verhindert werden. Dazu selektiert man meist Phagen-resistente Stämme. In der Gentechnik leisten Phagen wertvolle Dienste bei der Entwicklung von Vektoren und Promotoren für die Klonierung, bei der Gen-Sequenzierung und bei der Herstellung von Genund Protein-Bibliotheken (→62, 64, 68). Da viele Klonierungsarbeiten mit Escherichia coli als Wirtsorganismus durchgeführt werden, spielen dort E. coli-spezifische Phagen (λ, M13, Qβ, T-Phagen) eine besonders wichtige Rolle. Der λ-Phage befällt E. coli. Als temperenter Phage kann er dabei 2 Wege einschlagen: entweder wird seine lineare Doppelstrang-DNA (48,5 kbp, ca. 1 % des E. coli-Chromosoms) extrachromosomal vermehrt, wobei es zur Lyse kommt („lytischer Cyclus“), oder sie wird in das E. coli-Genom integriert (lysogene Zellen mit latenten Pro-Phagen) und mit diesem repliziert. Durch Temperaturerhöhung, UVStrahlen oder andere Stressfaktoren wird der Prophage aus dem E. coli-Genom ausgegliedert und virulent, die Zelle lysiert. Eine für die Gentechnik wichtige Eigenschaft ist, dass sowohl die Bildung der ringförmigen λ-DNA wie ihre Integration ins E. coli-Genom an den cos-Stellen erfolgt (kohäsive oder klebrige Enden von je 12 ungepaarten Nucleotiden, die auch als Erkennungssignal für das Genprodukt A, eine Endonuclease, dienen). Nach Replikation der λ-DNA zu einem Concatemer aus linearen, aneinandergereihten λ-Genomen schneidet die Endonuclease A an den cos-Stellen und leitet damit die Verpackung der DNA in sein Capsid ein. Vom λ-Phagen abgeleitet sind die Cosmide zur Herstellung von Genbanken und die Familie der λ-Vektoren, z. B. λEMBL4, die durch Temperaturerhöhung induziert werden können. Der M13-Phage befällt ebenfalls E. coli, ist aber völlig anders aufgebaut. Er enthält einen DNA-Einzelstrang von ca. 6,4 kb, der nach Infektion von E. coli die Synthese des komplementären Strangs dirigiert. Die doppelsträngige Phagen-DNA wird nicht in das E. coliGenom eingebaut, sondern im Cytoplasma repliziert und kontinuierlich freigesetzt (1000 Phagenpartikel/Zelle). Bei der Zellteilung wird sie an die Tochterzellen weitergegeben (ca. 100/Zelle). Gene, die in einen M13-Vektor einkloniert wurden, kann man als einzelsträngige DNA erhalten – eine wertvolle Eigenschaft für die klassische DNASequenzierung (→56). Vor der Einführung der PCR-Methoden dienten M13-Vektoren auch zur gerichteten Mutagenese von Proteinen. T-Phagen kommen in sieben unterschiedlichen Typen vor. In der Gentechnik verwendet man häufig zwei vom Genom der T-Phagen kodierte Enzyme: die DNA-Ligase des T4-Phagen, die DNA-Fragmente sowohl mit klebrigen wie mit glatten Enden verknüpft, und die DNAPolymerase des T7-Phagen, die DNA am Einzelstrang polymerisiert und bei der Gensequenzierung nach Sanger-Coulson zum Einsatz kommt. Den Promotor der T7-RNAPolymerase verwendet man u. a. zur Expression in E. coli. Phagen anderer Bakterien. Unter den weit über 1000 klassifizierten Phagen (Viren

insgesamt: über 2800) finden sich > 300 für Enterobakterien, > 230 für Bacteriococcen und jeweils > 150 für Actinomyceten und Bacillen. Für Pseudomonaden wurden ca. 100, für Lactobacillen ca. 40 Phagen beschrieben. Eine erst jüngst beschriebene Gruppe von insgesamt 13 Phagen, die Ligamenvirales, infizieren Archaebakterien. Nach Bau und Funktion entsprechen diese Phagen den verschiedenen Bakteriophagen von E. coli und anderen Viren. Wie diese können sie virulent oder temperent sein. Phagen für Lactobacillen sind in MolkereiBetrieben ein großes Risiko bei der Herstellung von Milchprodukten. Resistente Starterkulturen sind durch Plasmid-kodierte Mechanismen in der Lage, die Adsorption oder Replikation dieser Phagen zu verhindern. Unter den 5 Gruppen der Bacillus-Phagen wurden 105 und SPO2 häufig für Transformationsversuche, PBS1 dagegen zur Erstellung der Genkarte von B. subtilis verwendet. Phage M3112 ist der bevorzugte Vektor für die Transformation von Pseudomonaden, SV1 und C31 für die Transformation von Streptomyceten.

Mikroorganismen Allgemeines. Mikroorganismen spielen eine Schlüsselrolle im Stoffkreislauf. Sie sind als Destruenten am Abbau vieler Verbindungen beteiligt. Dieser Vorgang erfolgt sowohl in der Umwelt wie in Symbiose mit anderen Lebewesen (Beispiele: Flechten, Darm- und Pansenbakterien). Als Pathogene bedrohen Mikroorganismen die Gesundheit anderer Organismen. In der Biotechnologie dienen für den Menschen ungefährliche Mikroorganismen zur Herstellung zahlreicher Produkte wie Citronensäure, Antibiotika, Xanthan oder Enzyme, zur aeroben und anaeroben Reinigung von Abwasser, Klärschlamm, Böden und Luft und als Wirtsorganismen zur Synthese rekombinanter Proteine. Aufgrund ihres verhältnismäßig einfachen Aufbaus, des breiten Methodenspektrums zur Herstellung von Mutanten und der kurzen Generationszeit dienen sie als Modell-Organismen für die Untersuchung biochemischer, genetischer und physiologischer Vorgänge und als bevorzugter Wirt für die technische Herstellung rekombinanter Produkte. Ihr völlig unterschiedlicher Zellaufbau erlaubt eine Unterscheidung in prokaryotische und eukaryotische Mikroorganismen. Die Prokaryoten unterteilt man weiter in Eubakterien und Archaebakterien (> 10 000 vollständig charakterisierte Stämme).

Eubakterien sind einzellige Lebewesen. Sie vermehren sich durch Teilung. Ihr Zelldurchmesser liegt meist in der Größenordnung von 1 μm. Sie besitzen keinen Zellkern, ihre DNA ist in einem Nucleoid geknäuelt. Häufig ist ein Teil ihrer genetischen Informationen auf nichtchromosomalen Elementen, sog. Plasmiden, niedergelegt (→44). Plasmide können durch horizontalen Gentransfer auf andere Bakterien übertragen werden – ein für den Menschen nützlicher Effekt bei der natürlichen Evolution von Abbaupotenzialen für xenobiotische Verbindungen in der Umwelt und der Klärtechnik, aber eine große Gefahr bei der Entwicklung von Resistenzen gegen Antibiotika. Ihre aus Peptidoglykan aufgebaute Zellwand ist bei Gramnegativen Bakterien komplexer aufgebaut als bei den Gram-positiven und ist häufig von einer Schleimschicht umgeben, aus der bei vielen Bakterien Geißeln herausragen, die die Beweglichkeit des Organismus sicherstellen. Im Cytoplasma können Speicherstoffe eingelagert sein, z. B. Polyhydroxybuttersäure oder Polyphosphat. Eubakterien zeichnen sich durch das Potenzial zu ungewöhnlich zahlreichen Varianten des Stoffwechsels aus, wodurch sie in der Lage sind, eine große Zahl von Lebensräumen zu besiedeln. Dabei überraschen sie immer wieder mit einzigartig evolvierten Proteinen und Cofaktoren. So ist beispielsweise die Purpurmembran der Halobakterien eine auf diese begrenzte funktionelle Einheit, die Ähnlichkeiten zur Photosynthese und zum Sehvorgang bei höheren Organismen aufweist. Archaebakterien. (Archaea) stehen vermutlich den ältesten Formen des Lebens auf der Erde nahe. Ihre Spuren wurden in mehrere hundert Millionen Jahre alten Formationen nachgewiesen. Sie leben häufig ohne Sauerstoff und sind meist auf die Besiedlung sehr spezieller Biotope spezialisiert. Beispielsweise sind sie die wichtigste Gruppe von Bakterien, die aus Essigsäure Methan bilden – ein wichtiger biotechnologischer Schritt bei der anaeroben Schlammfaulung (→288). Von den Eubakterien unterscheiden sie sich durch strukturelle und genetische Merkmale, beispielsweise durch den Aufbau ihrer Zellmembranen aus Etherlipiden anstelle der sonst üblichen Phospholipide. Die Funktion ihrer Enzyme ist oft an extreme Standorte angepasst, was man in der Technik ausnutzen kann. So wird eine DNA-Polymerase aus einem Tiefseebakterium (Pyrococcus furiosus) für besonders fehlerarme PCR-Reaktionen eingesetzt (→50). Hefen und Pilze. Alle Hefen und Pilze (ca. 70 000 Stämme) sind Eukaryoten. Im Gegensatz zu den Bakterien ist ihre Zellwand aus Chitin, selten auch aus Cellulose aufgebaut. Fast alle Pilze sind heterotroph und leben aerob. Die großen Unterschiede in ihrer Vermehrung bieten den besten Ansatz zu ihrer Klassifizierung. Der Vegetationskörper der Pilze ist ein aus Hyphen bestehendes Fadengeflecht (Mycel), das sich asexuell oder sexuell vermehren kann. Die asexuelle Vermehrung geschieht meist durch Sporenbildung, gelegentlich auch durch Knospung. Die sexuelle Vermehrung der niederen Pilze (Phycomyceten) erfolgt durch Gameten, der höheren Pilze durch Fruchtkörper, die als Schlauch (Ascomyceten) oder Ständer (Basidiomyceten) geformt sind. Hefen und Pilze begleiten die heutigen Verfahren der Biotechnologie schon seit der Frühgeschichte des Menschen.

Bakterien

Allgemeines. Bakterien kann man durch eine Vielzahl morphologischer, biochemischer und genetischer Analysenmethoden sowie durch ihre Nährstoffansprüche unterscheiden. Sie können nach einem seit 1980 international vereinbarten Bacteriological Code verbindlich in Genera und Species eingeteilt werden. Er enthält derzeit etwa 2200 Genera- und 11 500 SpeciesNamen. Molekulargenetische Analysen von ribosomaler RNA aus Umweltproben lassen allerdings vermuten, dass die Zahl der bisher nicht kultivierten und charakterisierten Bakterien wesentlich größer ist (→74). Eubakterien. Die älteste Einteilung der Eubakterien beruht auf ihrer Morphologie. Bereits mit Hilfe des Lichtmikroskops kann man Stäbchen, Kokken und Spirillen unterscheiden, ferner die Bildung von Zellverbänden (Filamente, Kolonien) und strukturelle Details wie Sporen und Geißeln. Färbemethoden erlauben eine weitere Differenzierung. So gelingt mit der Anfärbung nach H. C. Gram bei den Prokaryoten eine Unterscheidung nach Zellwand-Strukturen: Grampositive Bakterien haben eine dicke Murein-Zellwand und nur eine Zellmembran, Gramnegative dagegen eine äußere und eine innere Zellmembran, die einen periplasmatischen Raum einschließen. Auf der äußeren Zellmembran sitzt eine dünne Murein-Zellwand, aus der Lipopolysaccharide herausragen. Physiologische und biochemische Kriterien führen zu einer noch genaueren Unterteilung. Die wichtigsten Merkmale sind: Verhalten gegenüber Sauerstoff: man unterscheidet, ob die Zellen unter aeroben, anaeroben oder unter beiden Bedingungen wachsen. Form der Energiegewinnung: sie kann durch Photosynthese (phototroph), Atmung oder Gärung (chemotroph) erfolgen. Bevorzugte Wasserstoff-Donatoren: organotrophe Mikroorganismen verwenden organische, lithotrophe anorganische Verbindungen wie H2, NH3, H2S, S, CO, Fe2+ usw. Kohlenstoff-Quelle: autotrophe Mikroorganismen fixieren CO2, heterotrophe beziehen Kohlenstoff aus organischen Verbindungen, Verhältnis zu anderen Organismen: man unterscheidet zwischen saprophytischem (autonomen) und parasitischem Stoffwechsel (abhängig von einem Wirtsorganismus). Auch der Befall durch bestimmte Phagen kann zur Differenzierung dienen (phage typing). Anpassung an Standorte: mesophile Mikroorganismen wachsen unter normalen Bedingungen, während Extremophile an Standorte mit extremen Bedingungen (Temperatur, Druck, pH, Salzgehalt usw.) angepasst sind. Zelleinschlüsse, Pigmentierungen, chemische Komponenten der Zellwand und der Zellmembran (Fettsäure-Zusammensetzung), die immunologische Differenzierung der Oberflächenantigene (Serologie) und die Empfindlichkeit gegen Antibiotika bieten weitere phänotypische Differenzierungsmöglichkeiten. Daneben treten immer häufiger genetische Charakterisierungsmerkmale. Eröffnet die Basenzusammensetzung der DNA (GC-Gehalt) bereits Anhaltspunkte für eine grobe Differenzierung, so ermöglicht die nahezu exponentiell zunehmende Sequenzierung vollständiger Bakterien-Genome eine Differenzierung in allen Details. Als eine besonders wertvolle Methode zur Klassifizierung und zur Bestimmung evolutiver Zusammenhänge wurde bereits 1972 die Sequenzierung ribosomaler RNA erkannt, vor allem der 16S-, 18S- und 23SrRNA, die während der gesamten

Evolution stark konservierte Bereiche aufweist (→74). Sie legt drei Grundtypen des Lebens nahe: die Archae- und Eubakterien (die Prokaryoten), und die Eukaryoten. Charakterisierung und Taxonomie. Der schnellen Identifizierung von Mikroorganismen kommt im klinischen Alltag, aber auch in der Veterinärmedizin, bei der LebensmittelHerstellung und als Voraussetzung für das sichere Arbeiten im Labor eine große Bedeutung zu. Neben mikroskopischen und biochemischen Untersuchungen wie der „bunten Reihe“, der Charakterisierung aufgrund der Fähigkeit zum Wachstum auf verschiedenen Nährböden, benutzt man zunehmend die DNA-Analytik, z. B. mit Taxon-spezifischen DNA-Sonden. Die taxonomische Einordnung eines Stamms ist nicht immer trivial und erfordert die Abwägung zahlreicher Merkmale. Genomsequenzierung. 2013 war die Sequenzierung von über 2100 Bakterien- und mehr als 140 Archaea-Genomen abgeschlossen. Darunter befinden sich auch zahlreiche pathogene Mikroorganismen wie z. B. Mycobacterium tuberculosis. Die Genomsequenzierung hat gezeigt, dass es zahlreiche Varianten des Stoffwechsels gibt.

Hefen Allgemeines. Hefen sind eine Untergruppe der Schlauchpilze (Ascomyceten). Da sie sich durch Sprossbildung vermehren können, bezeichnet man sie auch als Sprosspilze. Hefen wachsen heterotroph bei vorzugsweise sauren pH-Werten (pH 3,5–5,0) und bilden meist kein Mycel. Ihre Zellwand besteht aus Chitin. Einige biotechnologisch wichtige Hefen sind Saccharomyces cerevisiae, verschiedene Candida-Arten, Schizosaccharomyces pombe, Hansenula polymorpha und Pichia pastoris. Saccharomyces cerevisiae. (Synonyme: Backhefe, Bäckerhefe, Bierhefe) (→120) kann sich sowohl haploid wie diploid vermehren und bildet damit ein hervorragendes Objekt für genetische Untersuchungen. Haploide Laborstämme gehören zu einem von zwei Paarungstypen (MATa oder MATα), die nur wechselseitig kreuzen. Die Fortpflanzung erfolgt sowohl asexuell durch Bildung von Sprosszellen, in die ein diploider oder haploider Kern einwandert, oder sexuell durch Kopulation zweier haploider Sprosszellen mit anschließender Meiose und Bildung von vier haploiden Ascosporen, deren Phänotyp leicht visuell erkennbar ist (TetradenAnalyse) und Rückschlüsse auf genetische Veränderungen erlaubt. Dank der leichten Kultivierbarkeit in haploider und diploider Form, der vollständigen Sequenzanalyse des haploiden Genoms (12 Mbp auf 16 Chromosomen), der Abwesenheit von Introns und der geringen Verdopplungszeit von 90 min ist S. cerevisiae ein bevorzugtes Objekt der molekulargenetischen Forschung. Vorteilhaft ist auch, dass mit dem 2μ-Ring (60–100 Kopien im Zellkern) ein natürliches Plasmid und mit dem killer-Virion ein weiteres extrachromosomales Element für Rekombinationsversuche vorliegt. Für die Transformation von Hefe stehen viele unterschiedliche Klonierungsvektoren zur Verfügung, mit denen fremde Gene extrachromosomal repliziert (YRP = yeast replicating plasmids und YEP = yeast expression plasmids) oder ins Chromosom integriert (YIP = yeast integrating plasmids) werden können (→72, 296). Künstliche Hefe-Chromosomen (YAC = yeast artificial

chromosomes) erlauben die Klonierung riesiger DNA-Stücke (600 –1400 kbp). Die etwa 6000 Gene der Hefe weisen oft eine hohe Homologie zu Genen des Menschen auf und sind deshalb ein beliebtes eukaryotisches Modellsystem für die molekulargenetische Analyse des Stoffwechsels. Biotechnologisch wird Backhefe zur Herstellung von Lebensmitteln, alkoholischen Getränken (→110, 112), Ethanol (→138) sowie als Wirtsorganismus zur industriellen Produktion rekombinanter Produkte benutzt, z. B. von α-Interferon (→234) und von Vakzinen (→250) (Beispiel: Hepatitis-B-Oberflächen-Antigen). Anders als bei E. coli als Wirtsorganismus erfolgt dabei auch die posttranslationale Modifikation heterolog exprimierter Proteine, vor allem durch Glykosylierung (→262). Candida utilis bildet, im Gegensatz zu S. cerevisiae, ein Mycel, pflanzt sich aber nur asexuell durch Sprossung fort. Manche Candida-Gene weisen eine nicht-kanonische Codon-Nutzung auf (z. B. CUG für Serin anstelle von Leucin), was ihre heterologe Expression sehr erschwert. Einige Candida-Stämme haben biotechnologische Bedeutung für die Produktion extrazellulärer Enzyme, für Biotransformationsreaktionen und als Futterhefen. Sie können auf unkonventionellen C-Quellen wie Sulfit-Ablaugen, Candida tropicalis auch auf ErdölFraktionen wachsen (→122). Manche Candida-Stämme sind humanpathogen (Candida albicans). Pichia pastoris und Hansenula polymorpha sind methylotrophe Hefen, die auf Methanol als einziger C-Quelle wachsen können. Sie wurden, wie viele andere Methanol-Hefen, im Zusammenhang mit der Erzeugung von Einzellerprotein intensiv untersucht. Heute sind sie vor allem attraktive Wirtsorganismen für die Expression eukaryotischer Gene. So wurden mit Pichia pastoris so unterschiedliche Proteine wie Lipasen, β-Interferon und AntikörperFragmente in Ausbeuten bis zu > 10 g rekombinantes Protein/L Kulturlösung exprimiert. Das relativ kleine Genom von ~ 9,4 Mbp wurde 2009 sequenziert. Schizosaccharomyces pombe wurde erstmals aus ostafrikanischem Bier (Suaheli: pombe) isoliert. Das Genom dieses Ascomyceten ist seit 2002 sequenziert. Mit 12,6 Mbp ist es etwa so groß wie das von S. cerevisiae, besitzt aber nur 3 Chromosomen, auf denen ca. 5000 Gene angeordnet sind. Mittlerweile stehen Stämme zur Verfügung, die nach Deletion von ProteaseGenen in hohen Ausbeuten Fremdproteine bilden und diese bei Bedarf auch ins Nährmedium sekretieren.

Pilze Allgemeines. Pilze spielen eine herausragende Rolle im Kreislauf der Natur, z. B. beim Abbau von Holz und bei der Bildung von Humus. In der Lebensgemeinschaft mit Pflanzen (Mycorrhiza-Pilze) helfen sie bei der Aufnahme von Nährstoffen, sind aber auch gefürchtete Pflanzen-Pathogene (z. B. der Mehltau). In der Biotechnologie haben sie eine große Bedeutung beim Verderb, aber auch bei der Verarbeitung von Lebensmitteln und bei der Herstellung von Antibiotika und Enzymen. Unter den ca. 70 000 klassifizierten Pilzen bilden die Schlauchpilze (Ascomyceten) mit ca. 20 000 Arten die größte Gruppe. Als Beispiele werden hier Penicillium notatum und Aspergillus niger erwähnt. Bei den Niederen Pilzen (Phycomyceten) haben Rhizopus- und Mucor-Arten die größte biotechnologische Bedeutung. Einige der ca. 12 000 Ständerpilze (Basidiomyceten) sind essbar (Champignon, Shiitake, Pfifferling, Steinpilz), andere sind am Abbau von Holz beteiligt (Weiβ- und Rotfäulepilze). Etwa 300 Pilz-Arten haben für den Menschen pathogene Eigenschaften. Alle Pilze sind heterotroph. Ihre Zellwand besteht aus Chitin und Glucan, in Einzelfällen kommt auch Cellulose vor. Vermehrungsformen. Die Vermehrungsformen der Pilze sind sehr vielfältig und werden hier am Beispiel eines Ascomyceten beschrieben. Die Zellmasse (Thallus) besteht aus einem Mycel, das aus Hyphen aufgebaut ist. Bei der asexuellen Vermehrung bilden sich an den Spitzen des Mycels Konidiophoren, die sich teilen und Sporen freisetzen (Konidien). Aus diesen bildet sich neues Mycel. Wie viele Pilze können sich Ascomyceten aber auch sexuell fortpflanzen. Dabei nehmen sie eine andere Erscheinungsform an (Dimorphismus), was ihre Klassifikation erheblich erschwert: Die Hyphen bilden männliche und weibliche Geschlechtsorgane (Antheridien und Ascogonien), die in der Plasmogamie zu dikaryoten Hyphen mit einem Ascocarp („Fruchtkörper“) auswachsen. In den endständigen Zellen der dikaryoten Hyphen fusionieren die dikaryoten Kerne zu einer diploiden Zygote (Karyogamie). Nach Meiose bilden sich 8 haploide Ascosporen (Ascomyceten) bzw. 4 Basidiosporen (Basidiomyceten), die wieder zum Mycel auswachsen. Penicillium chrysogenum wächst als Mycel. Er bildet Fruchtkörper, aus denen Sporen (Konidien) freigesetzt werden. Diese haben allerdings die Fähigkeit zur sexuellen Fortpflanzung verloren (Fungi imperfecti). Im Labor führt man deshalb die Rekombination des genetischen Materials mittels Protoplasten-Fusion verschiedener Kerntypen durch (Heterokaryose, parasexueller Cyclus). P. chrysogenum und der verwandte Acremonium chrysogenum bilden die besonders wichtigen Lactam-Antibiotika (→206), andere Penicillium-Arten wie Penicillium camembertii spielen eine Rolle bei der Käse-Reifung (→188). Das Genom von P. chrysogenum ist ca. 32 Mbp groß, seine Sequenz wurde 2008 veröffentlicht. Aspergillus nidulans unterscheidet sich morphologisch von Penicillium durch die unterschiedliche Form der Konidien. Sein Genom ist 30,5 Mbp groß und sequenziert, aber erst teilweise annotiert (2014). A. niger ist der bevorzugte Produktionsstamm zur Herstellung von Citronensäure (→146) und Gluconsäure (→150). Aspergillus oryzae und A. niger spielen im asiatischen Raum eine wichtige Rolle bei der Herstellung von Lebensmitteln (Sojasauce, Miso) (→86, 114) und werden weltweit zur Produktion extrazellulärer Enzyme (Proteasen,

Amylasen) verwendet (→178, 182, 186, 192, 194). Wie bei Penicillium verwendet man zur Stammverbesserung Protoplastenfusion und Selektion. Die Genom-Sequenzen von A. nidulans, A. niger, A. oryzae und acht weiteren Aspergillus-Stämmen liegen vor (2014) und erlauben zunehmend gerichtete molekulargenetische Transformationen. Rhizopus oryzae wächst auf Reis, Rhizopus nigricans, der „schwarze Brotpilz“, auf Brot. Seine Hyphen wachsen rasch aus und bohren sich in das Nährsubstrat. Die asexuelle Fortpflanzung erfolgt durch die Bildung von Sporen, die sich in differenziertem Mycel (Sporangien) bilden. Rhizopus und die nahe verwandten Mucor-Arten leben auch auf faulendem organischen Material und bilden zu dessen Aufschluss zahlreiche extrazelluläre Enzyme. Sie sind wichtige Organismen für die Herstellung extrazellulärer Enzyme, z. B. von Lipasen und Proteasen. Das Genom von R. oryzae ist 45,2 Mbp groß und seine Sequenzierung wurde 2009 abgeschlossen. Auch von Mucor circinelloides liegt eine Genom-Sequenz vor.

Algen Allgemeines. Algen leben meist im Wasser, assimilieren CO2 und entwickeln O2 durch Photosynthese, bilden aber im Gegensatz zu Landpflanzen keinen Embryo. Prokaryotische

Algen werden als Blaualgen oder Cyanobakterien bezeichnet und etwa 100 Gattungen zugeordnet. Die über 20 000 Arten eukaryotischer Algen werden in Grün-, Braun-, Rot-, Kieselalgen und andere Gattungen unterteilt. Einige Cyanobakterien und Algen bilden hochgiftige Toxine (Microcystine, Saxitoxin), andere werden schon lange für die Erzeugung von Nahrungszusatzstoffen und für die Herstellung von Spezialchemikalien wie z. B. Alginat, Agar oder Astaxanthin verwendet. Da Algen überwiegend photoautotroph sind, d. h. wie höhere Pflanzen CO2 als einzige C-Quelle verwerten und mit Lichtenergie aktivieren, da sie ferner im Wasser leben und keine Konkurrenz zu landwirtschaftlich genutzen Landflächen bilden, sind sie in den letzten Jahren als Lieferanten von Bio-Treibstoffen populär geworden, sei es durch Abbau ihrer Biomasse zu Biogas, sei es durch Eingriffe in ihren Stoffwechsel zur optimierten Bildung von Biodiesel (→328). Länder mit viel Sonnenstrahlung und langen Küsten wie z. B. die USA, Australien, Israel, Japan und China treiben derartige Projekte intensiv voran. Eukaryontische Algen können in ihrer Wuchsform Einzeller von einigen μm Durchmesser (Chlorella) oder Vielzeller von bis zu 30 m Länge sein (Kelp). Die Zellen sind kompartimentiert und bilden Chloroplasten, die Chlorophyll a und b und häufig auch Carotinoide enthalten. Einige Arten, z. B. Euglena, können vollständig heterotroph leben und verlieren dann ihre Chloroplasten. Die Zellwand vieler Algen besteht aus Cellulose-Fibrillen, die mit anderen Polysacchariden wie z. B. Alginsäure verstärkt sind. Die Gruppe der Diatomeen bildet ihre Zellwand aus Silikaten, die auf einer Protein-Matrix aufgebaut werden. Laminaria und andere marine Braunalgen sind eine wichtige Quelle für Alginate (→158). Die Viskosität einer Alginat-Lösung ist vom Ca2+ Gehalt abhängig. Alginate werden in der Lebensmittelindustrie als Verdickungsmittel, in der Medizin als Wundauflage und neuerdings auch als Textilfasern verwendet. Chlorella sind einzellige Süßwasseralgen, die sich ungeschlechtlich vermehren. Sie enthalten einen Chloroplasten und wenige Mitochondrien. Sie können verhältnismäßig einfach kultiviert werden und finden als Nahrungsergänzungsmittel Verwen-dung. Botryococcus braunii ist ebenfalls eine grüne Mikroalge, die in Kolonieform im Süßwasser lebt und bis zu 60 % Kohlenwasserstoffe in Form von Alkanen, Terpenen und Squalen bildet und einlagert (→162). Das Öl wird als Flüssigtreibstoff untersucht. Haematococcus fluvialis ist eine kokkenförmige Süßwasseralge, die das Tetraterpen Astaxanthin in hohen Ausbeuten bildet. Astaxanthin vermittelt über die Nahrungskette die rötliche Farbe von Lachs, Shrimps usw. Es ist ein starkes Antioxidans, für den Menschen sehr gut verträglich und wird deshalb als Nahrungsmittelzusatz und in der dekorativen Kosmetik verwendet. Crypthecodinium cohnii ist eine marine Rotalge aus der Gruppe der Dynoflagellaten. Sie reichert bis zu 20 % (als % Trockenmasse) Dodosahexaensäure an, eine ϖ-3-Fettsäure (→162), die als Nahrungsergänzungsmittel verwendet wird. Dunalilla sind halophile marine Mikroalgen. Sie bilden hohe Konzentrationen an β-Carotin und Glycerin zur Anpassung an ihre salzreiche Umgebung. Neochloris oleoabundans ist eine Mikro-Grünalge, die bis zu 30 % Triglyceride (als % Trockenmasse) anreichert. Das Öl wird als Treibstoff untersucht. Nannochloropsis-Arten gehören zum Phytoplankton. Sie sind gut transformierbar und bilden Einzelleröl. Cyanobakterien sind Prokaryonten, die häufig auch heterotroph leben können. Sie weisen eine

große morphologische Diversität auf, auf Grund deren sie in 5 Klassen eingeteilt werden können. Die Zellwand besteht aus Peptidoglykan, und ihr photosynthetische Membransystem ist vielschichtig und komplex. Es enthält neben Chlorophyll a noch Phycobiline als Pigment. Viele Cyanobakterien enthalten sog. Heterocysten zur N2-Fixierung und Cyanophycin, ein AspartatArginin-Copolymer, als C/N-haltigen Reservestoff. Die Genome von etwa 35 Cyanobakterien wurden ganz oder teilweise sequenziert – der bestuntersuchte Organismus ist Synechocystis sp.. Spirulina ist eine Gattung von 1–3 μm langen Cyanobakterien, die in stark alkalischen Salzseen wachsen. Sie bilden mehrzellige gewendelte Mikrofilamente. Spirulina-Biomasse wird in Aquakulturen produziert und kommt als Nahrungs- und Tierfutter-Zusatz in den Handel.

Einige biotechnologisch wichtige Bakterien Allgemeines. Als Beispiele für einige biotechnologisch bedeutende Bakterien werden hier besprochen: Escherichia coli, Pseudomonas putida, Bacillus subtilis, Streptomyces coelicolor und Corynebacterium glutamicum. Escherichia coli lebt im Darm von Säugern und gehört zur Gruppe der Enterobakterien. Es bildet begeißelte Stäbchen. Die Zellwand färbt Gram-negativ; unter ihr liegen zwei Membranen und dazwischen ein periplasmatischer Raum. Unter anaeroben Bedingungen gewinnt E. coli Energie durch Gärung und scheidet Säuren aus. In Gegenwart von O2 erfolgt die Energie-Gewinnung über die Atmungskette. Die Generationszeit beträgt unter optimalen aeroben Wachstumsbedingungen ca. 20 min. Das Genom von E. coli ist ca. 4,6 Mbp groß, der GC-Gehalt beträgt 51 %. Obwohl E. coli K-12 MG1655 bereits 1997 vollständig sequenziert wurde und dieser Organismus zu den bestuntersuchten Lebewesen gehört, versteht man noch immer nicht die Funktion aller Genprodukte, die von den etwa 4300 ORFs („open reading frames“) gebildet werden. Biotechnologisch wird E. coli vor allem als Wirtsorganismus für die Expression nicht-glykosylierter Proteine verwendet, z. B. von Insulin, Wachstumshormonen und Antikörper-Fragmenten. Da E. coli Wildstämme in die Sicherheitsgruppe S2 fallen, weil sie den menschlichen Darm besiedeln, benutzt man für Klonierungsexperimente attenuierte E. coli-Stämme (z. B. E. coli K12), bei denen alle Risikofaktoren eliminiert sind; sie fallen deshalb in die Sicherheitsgruppe S1 und sind unter normalen mikrobiologischen Sicherheitsvorkehrungen kultivierbar (→332). Zur Klonierung fremder Gene in E. coli gibt es

zahlreiche Vektoren, von denen für die Anlage von Genbanken der BAC-Klonierungsvektor (BAC = bacterial artificial chromosome) besonders wichtig ist (→68). Pseudomonas putida hat die Form eines polar begeißeltes, aeroben Stäbchens und lebt aerob im Wasser. Die Zellwand besitzt zwei Membranen, die einen periplasmatischen Raum einschließen, und färbt Gram-negativ. Das Genom von P. putida ist ca. 6,1 Mbp groß, der GCGehalt beträgt 61 %. Pseudomonaden haben ein großes genetisches Potenzial zum Abbau aromatischer Verbindungen, das über Plasmide übertragen wird (→292). Biotechnologisch werden sie deshalb vor allem für Aufgaben des Umweltschutzes untersucht. Bacillus subtilis ist ein aerobes Bodenbakterium. Das unbegeißelte Stäbchen bildet unter ungünstigen Wachstumsbedingungen thermoresistente Sporen als Dauerform. Die Zellwand färbt Gram-positiv; unter ihr liegt nur eine Membran. Die Energie-Gewinnung erfolgt über die Atmungskette. Die Generationszeit beträgt unter optimalen Wachstumsbedingungen ca. 20 min. Das Genom von B. subtilis ist ca. 4,2 Mb groß und wurde vollständig sequenziert. Der GCGehalt beträgt 44 %. Mit Bacillus-Stämmen werden biotechnologisch vor allem extrazelluläre Enzyme, z. B. Proteasen, Cellulasen und Amylasen, hergestellt (→174, 176, 190, 194). Corynebacterium glutamicum gehört zu den coryneformen Bakterien, die zahlreiche Lebensräume besiedeln und auch pathogene Spezies bilden (z. B. C. diphteriae). Die keulenförmigen Zellen wachsen aerob und färben Gram-positiv. Das Genom von C. glutamicum ist ca. 3,1 Mbp groß, seine Sequenzierung wurde 2003 abgeschlossen. Der GCGehalt beträgt 56 %. Deregulierte und Stoffwechsel-optimierte Mutanten von C. glutamicum sind wichtige Produktionsstämme für L-Glutaminsäure (→126) und L-Lysin (→128). C. glutamicum gehört zu den bevorzugten Organismen der „synthetischen Biologie“, und Mutantenstämme wurden beschrieben, die Milchsäure, Bernsteinsäure, 1,2-Propandiol oder Anilin aus Glucose oder hydrolysierter Biomasse bilden. Das Corynex®-System ermöglicht die kostengünstige Herstellung von Pharma-Proteinen. Streptomyces coelicolor ist ebenfalls ein Bodenbakterium aus der Gruppe der Actinomyceten. Es wächst in Form eines Mycels und bildet dabei Lufthyphen, von denen Sporenbildende Konidien abgeschnürt werden. Die Zellwand besitzt eine Membran und färbt Gram-positiv. S. coelicolor baut, wie viele andere Streptomyceten, Cellulose und Chitin ab. Sein Genom ist mit ca. 8,7 Mbp fast doppelt so groß wie das von E. coli, der GC-Gehalt ist mit 72 % sehr hoch. Die Sequenzierung ist abgeschlossen und weist auf knapp 8000 Strukturgene hin. Wahrscheinlich benötigen Streptomyceten einen großen Teil der im Genom gespeicherten Informationen zur Biosynthese von Produkten des Sekundär-Stoffwechsels, z. B. von Antibiotika. (→200)

Mikroorganismen: Isolierung, Stammhaltung, Sicherheit Allgemeines. Für die meisten Untersuchungen verwendet man Reinkulturen von Mikroorganismen. Bei biotechnologischen Anwendungen handelt es sich dabei in der Regel um Stämme, die durch Mutation und Selektion für die gewünschte Anwendung optimiert wurden. Man lagert und konserviert sie in Stammsammlungen. Ihre Anzucht erfolgt auf festen oder flüssigen Nährmedien unter sterilen Bedingungen. Die meisten in der Biotechnologie verwendeten Mikroorganismen sind heterotroph und wachsen aerob. Für die Anzucht photosynthetischer Mikroorganismen gibt es spezielle Arbeitsprotokolle unter Licht, für Anaerobier unter O2-Ausschluss. Reinkulturen erhält man aus Stammsammlungen oder durch Anreicherung der Mikroorganismen aus ihren natürlichen Standorten (z. B. Boden, Wasser, Lebensmittel, andere Organismen). Die bevorzugte Methode ist ein Verdünnungs-Ausstrich auf sterilem, Nährstoffhaltigem Agar, einem vernetzten Polysaccharid aus Meeresalgen („ausplattieren“). Dabei kann man Einzelkolonien isolieren. Meist wählt man die Wachstumsbedingungen (→88) so, dass der gewünschte Mikroorganismus einen Wachstumsvorteil hat (Selektion) (→24): so kann man bei O2-freiem Arbeiten unter Licht mit CO2 als einziger C-Quelle und N2 als N-Quelle Cyanobakterien anreichern. Mit einem schwach sauren pH-Wert eines Zucker-reichen Mediums isoliert man bevorzugt Pilze, durch erhöhte Bebrütungstemperatur thermophile Mikroorganismen, und durch Zusatz von Casein als einziger organischer NQuelle ProteaseBildner. Nach Maßgabe der 16S-rRNA-Analytik erfasst man mit diesen Methoden allerdings

weniger als 5 % der in Wasser und Erdproben vorkommenden Mikroorganismen (→74). Stammhaltungen dienen der Konservierung von Reinkulturen, die dabei ihre Identität, Lebensfähigkeit und Funktionsfähigkeit behalten müssen. Die konventionelle Methode besteht im regelmäßigen Überimpfen auf Agarplatten oder Schrägagar-Röhrchen. Dabei können allerdings genetisch bedingte Degenerationserscheinungen auftreten. Für Typstämme oder wichtige Produktionsstämme bevorzugt man deshalb folgende Methoden: a) Aufbewahrung unter chemisch inerten Flüssigkeiten, z. B. unter Paraffin (geeignet für Hyphenpilze), b) Einfrieren bei –196 °C und Aufbewahren unter flüssigem N2 oder bei –70 °C (Tiefkühltruhe); Einfrieren und Auftauen müssen rasch und in Gegenwart von Glycerin oder DMSO erfolgen, um eine Zerstörung der Zellen durch Eiskristalle zu verhindern (diese Methode wird vor allem für Bakterien und Hefen verwendet), c) Eintrocknen von Suspensionen im Vakuum auf Träger (Silicagel, Sand) in Gegenwart eines Emulgators (Magermilch, Serum) und Aufbewahren bei – 70 °C. Dabei ist sicherzustellen, dass die Stämme reaktiviert werden können. Weltweit stehen mittlerweile umfangreiche öffentliche Stammsammlungen zur Verfügung, von denen Reinkulturen abgerufen werden können. Sie sind entweder universell (Beispiele: ATCC: American Type Culture Collection; DSMZ: Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen) oder auf bestimmte Gruppen von Mikroorganismen, z. B. auf Pilze spezialisiert (Beispiel: CBS: Centralburau voor Schimmelkultuuren). Viele Industrieunternehmen unterhalten umfangreiche eigene Stammsammlungen. Liegt der Wert eines Stamms in einer Plasmid-kodierten Eigenschaft (häufig z. B. bei der Herstellung von Enzym-MutantenBibliotheken), so tritt neben die Stammsammlung die Aufbewahrung von Plasmiden, die als sogenannte „Plasmid-Preps“ bei –20 °C sehr lange gelagert werden (nuclease-frei!) und auch leicht transportiert oder versendet werden können. Sicherheit. Jeder Umgang mit Mikroorganismen muss nach den Regeln der biologischen Sicherheit erfolgen (→332), denn schließlich gibt es in nahezu jeder Gattung auch gefährliche Krankeitserreger (Beispiele: Bacillus subtilis: harmloser Produzent technischer Enzyme – Bacillus anthracis: Milzbranderreger; Aspergillus oryzae: Sojasauce-Fermentation – Aspergillus flavus: Bildner lebertoxischer, carcinogener Aflatoxine). Mikroorganismen sind in Positiv-Listen vier Risikogruppen zugeordnet. Die Ausstattung der Labors und die Arbeitsrichtlinien entsprechen dem biologischen Risiko. Zur Risikogruppe 1 zählen vor allem solche Mikroorganismen, die seit alters her zur Nahrungsmittel-Herstellung eingesetzt werden, z. B. Backhefe. Die meisten biotechnologisch verwendeten Mikroorganismen gehören in diese Gruppe.

Stammverbesserung von Mikroorganismen Allgemeines. Aus der Umwelt isolierte Mikroorganismen weisen nur selten optimale Eigenschaften für technische Anwendungen auf. Sie werden deshalb meist durch eine Kombination von Mutations- und Selektionsschritten optimiert. Die wichtigsten Ziele einer Stammoptimierung sind: a) die Ausbeute-Steigerung eines Produkts, b) die Entfernung von Nebenprodukten, und c) verbesserte Eigenschaften des Mikroorganismus bei der Produktion (z. B. verkürzte Fermentationsdauer, keine störende Pigmentbildung, Resistenz gegen Bakteriophagen). Ein großer Vorteil der Mikroorganismen ist ihre kurze Generationszeit (oft < 1 h). Sie erlaubt es, eine sehr große Zahl von Mutanten herzustellen und zu analysieren. Bei eukaryotischen Mikroorganismen, z. B. bei Pilzen, müssen dabei Rekombinations-Ereignisse berücksichtigt werden. Mit zunehmender Kenntnis des Stoffwechsels, seiner Regulation und seiner Codierung im Genom werden immer häufiger gentechnische Methoden zur gezielten Ausschaltung oder Amplifikation von Stoffwechselschritten eingesetzt (metabolic engineering). Mutation. Die spontane Mutationshäufigkeit (Veränderung der DNA-Sequenz infolge natürlicher Mutationsereignisse und Fehlern bei der Replikation) liegt für ein Gen normaler Stabilität bei 10–6–10–7. Derartige Mutationen bleiben meist stumm, revertieren genetisch oder funktionell oder werden durch DNA-Reparatur behoben. Für die industrielle

Stammverbesserung ist eine drastischere Mutationsauslösung erforderlich. Dazu setzt man vor allem UV-Strahlung und mutagene Chemikalien ein. Durch Wahl des Mutagens und der Dauer seiner Einwirkung kann man Mutationstyp und -häufigkeit beeinflussen. Je nach Aufgabenstellung liegt dabei die Abtötungsrate bei 90 bis > 99 %. Man selektiert dann im Phänotyp der Überlebenden auf die gewünschten Eigenschaften. Selektion in Oberflächenkultur. Zur Auswahl von Mikroorganismen mit verbessertem Phänotyp wird meist die selektive Isolierung von Hochleistungsmutanten verwendet. Entscheidend dafür ist, ob eine gut erkennbare Indikatorreaktion zur Verfügung steht. So kann beispielsweise die Resistenz von Mutanten gegenüber Antibiotika, Hemmstoffen oder Phagen durch Ausplattieren auf ein Nährmedium erprobt werden, das dieses abtötende Prinzip enthält. Auch die Replika-Plattierung auf kompletten und Selektionsmedien, ggf. nach einem PenicillinAnreicherungsschritt (Penicillin tötet nur wachsende Zellen ab), leistet wertvolle Dienste, z. B. bei der Selektion auxotropher Mutanten. Sollen Mutanten isoliert werden, die einen biologisch aktiven Metaboliten (z. B. ein Antibiotikum oder ein Enzym) in höheren Ausbeuten bilden, so können Hemmhoftests oder Lysehöfe als Indikatorreaktion verwendet werden. Beispielsweise lässt sich bei einem Screening nach Lipase-Bildnern der klare Lyse-Hof eines Agars verwenden, der durch den Zusatz des Triglycerids Tributyrin opaque ist. Die beiden großen Vorteile dieses Selektionsverfahrens liegen einmal in der großen Flexibilität bei der Auswahl des Selektionsprinzips, zum andern in der großen Zahl von Mutanten (einige 100 pro Agarschale), die durchmustert werden können. Aufgrund des unspezifischen Mutationsverfahrens sind die dabei erhaltenen Mutanten allerdings meist in mehreren Genen verändert, sodass sie in aufwändigen Versuchen auf ihre Eignung als Produktionsstamm untersucht werden müssen. Man überprüft sie deshalb zuerst im Schüttelkolben, dann unter möglichst produktionsnahen Bedingungen auf Wachstum, Stoffproduktion und Handhabbarkeit und optimiert durch stufenweise Auslese der besten Stämme in mehreren Mutations- und Selektionsschritten. Durch das Einkreuzen von Wildstämmen oder wenig mutierter Produktionsstämme versucht man, die negativen Folgen ausgedehnter Mutationsverfahren zu reduzieren. Selektion in Submerskultur. Kontinuierliche Fermentationen können zur selektiven Auslese von Mutanten benutzt werden. Dabei unterwirft man in einem Chemostaten wachsende Mikroorganismen in Gegenwart eines Mutagens einem Selektionsdruck (beispielsweise dem langsamen Ersatz einer gut verwertbaren C-Quelle (→88) gegen eine schlechtere). Bei kontinuierlichem Wachstum setzen sich diejenigen Mutanten durch, die den veränderten Nährstoffbedingungen besser angepasst sind. Diese Methode lässt sich allerdings nicht zur Ausbeuteerhöhung von Metaboliten verwenden.

Biochemie Allgemeines. Die Biochemie beschreibt die Bausteine lebender Zellen, ihren Auf- und Abbau, ihren Stoffwechsel, seine Regulation und seine energetischen Grundlagen (Bioenergetik). Insofern bildet die Biochemie auch die Grundlage für die Molekulargenetik und die Zellbiologie, und das Verständnis ihrer Grundlagen ist unerlässlich für eine Beschäftigung mit der Biotechnologie und Gentechnik. Auf den nächsten Seiten folgt eine knappe Einführung in die Biochemie, die ein gründliches Studium aber keinesfalls ersetzen kann. Bausteine. Wichtige Bausteine von Organismen sind Aminosäuren (→124) und daraus abgeleitete Peptide und Proteine, Zucker und daraus abgeleitete Glykoside, Fettsäuren (→162) und ihre Ester (Triglyceride, Phosphoglyceride), und Nucleoside (→136) und davon abgeleitete Substanzen. Viele der genannten Stoffe sind chiral, d. h., es wird nur eine bestimmte Auswahl möglicher enantiomerer Verbindungen genutzt. So haben beispielsweise die Protein-bildenden Aminosäuren alle L-Chiralität. Der Aufbau, Umbau und Abbau dieser Substanzen erfolgt durch katalytisch aktive Proteine, die Enzyme (→166). Viele der genannten Verbindungen werden auch industriell verwendet und sind deshalb Gegenstand der Biotechnologie. Stoffwechsel. (→36) Der Aufbau aller Bausteine des Lebens erfolgt letzten Endes aus CO2, anorganischem Stickstoff und Phosphat, und Wasser. Diese umfassende Biosynthese können vor allem Pflanzen und autotrophe Mikroorganismen leisten, die CO2 mit Hilfe von Sonnenlicht assimilieren (Photosynthese) und mit Wasser in Kohlenhydrate umwandeln. Die meisten Organismen haben diese Fähigkeit nicht. Sie nehmen Zellbausteine mit ihrer Nahrung auf und bauen sie um. Den Aufbau der Zellbausteine nennt man Biosynthese oder Anabolismus, ihren Abbau und die Zerlegung der Nahrung in verwertbare Bausteine wird als Katabolismus bezeichnet. Beide Begriffe werden in der Bezeichnung Metabolismus zusammengefasst. Obwohl es > 50 0000 Stoffwechselprodukte (Metabolite) und eine große Zahl unterschiedlicher Stoffwechselwege gibt, verwenden die meisten Organismen ähnliche zentrale Stoffwechsel-Module wie beispielsweise den Abbau von Glucose zu aktivierter Essigsäure (Glykolyse), den Aufbau von C-6-Verbindungen aus aktivierter Essigsäure und Oxalacetat (Tricarbonsäure-Cyclus) oder den Umbau von Fettsäuren zu Glucose (Gluconeogenese). Diese Tatsache und die Universalität des genetischen Codes erlauben es den Biotechnologen, künstliche Stoffwechselwege aufzubauen und für die Herstellung von Wertstoffen in Wirtsorganismen (oft in Mikroorganismen) zu optimieren (synthetische Biologie (→320)). In eukaryontischen Organismen sind viele dieser Funktionen auf verschiedene Organellen (Kompartimente) verteilt. So findet die Glykolyse im Cytoplasma statt, der CitronensäureCyclus und die oxidative Phosphorylierung in den Mitochondrien, und der Abbau von Zellbausteinen in den Lysosomen. Stoffwechsel-Regulation. Die räumliche, zeitliche und von den Umgebungsbedingungen abhängige Regulation dieser Vorgänge findet sowohl auf der Ebene der zellulären Genetik statt

(Induktion, Genexpression, Repression) wie auch durch Steuerung der Aktivität von Enzymen durch Metabolite. So werden viele Schlüsselenzyme des Stoffwechsels durch die von ihnen gebildeten Produkte gehemmt (Endprodukt-Hemmung) oder ganze Verzweigungen des Stoffwechsels durch induzierende oder hemmende Metabolite aktiviert oder abgeschaltet. Diese Regulation erfolgt auf dem Niveau der Enzyme durch Konformationsänderung nach Bindung eines Metaboliten (allosterische Regulation). Bei vielzelligen Organismen kommt eine weitere Regulationsebene durch Botenstoffe hinzu, die an Rezeptoren in der Zellmembran binden und dabei Regulationskaskaden auslösen. Bioenergetik. Der Anabolismus benötigt Energie, beim Katabolismus wird (meist) Energie gewonnen. Die „Währung“ für den Energiebedarf der Zelle sind energiereiche PhosphorsäureEster wie das Adenosintriphosphat (ATP). Die Hydrolyse von ATP ist exergon und ermöglicht endergone (Energie-verbrauchende) Reaktionen wie z. B. die enzymatische Übertragung einer Phosphatgruppe auf einen Zucker, wodurch dieser seinerseits für weitere Reaktionen aktiviert wird. ATP wird in aerob lebenden Organismen vor allem durch oxidative Phosphorylierung, in Pflanzen durch Photophosphorylierung aus ADP und Phosphat gebildet; die chemische Energie dieser hoch endergonen Reaktion stammt aus einem Protonen-Konzentrationsgefälle an Membranen. Das System der Übertragung energiereicher Gruppen bestimmt den gesamten Stoffwechsel und macht Stoffwechselwege irreversibel. Auch die Redoxprozesse des Stoffwechsels erfolgen stufenweise über Co-faktoren unterschiedlichen Redox-Potenzials.

Aminosäuren, Peptide, Proteine Aminosäuren. Fast alle Peptide und Proteine sind aus nur 20 verschiedenen Aminosäuren aufgebaut (→124); 19 davon sind chiral („optisch aktiv“) mit L-Konfiguration. Mehrere Aminosäuren kondensieren zu Peptiden, und lange Peptidketten falten zu Proteinen. Die räumliche Anordnung von Peptiden und Proteinen ergibt sich aus der Abfolge und den Eigenschaften der Seitenketten ihrer Aminosäuren. Diese können polar (Hydroxyl-, Amid- oder Thiol-Gruppen) oder geladen sein (Carboxyl- oder Aminogruppen) und intermolekulare ionische Wechselwirkungen oder Wasserstoffbrücken bilden, oder sie können unpolar sein (Alkylgruppen, aromatische Reste, sekundäre Amide, Thiol-ether) und zu intermolekularen hydrophoben Wechselwirkungen führen. Alle Aminosäuren haben mindestens zwei, manche auch drei ionisierbare Gruppen, die je nach pH-Wert geladen oder ungeladen sein können. Am isoelektrischen Punkt pI tritt keine äußere elektrische Ladung auf (die Aminosäure wandert nicht im elektrischen Feld). Auch Peptide und Proteine mit vielen ionisierbaren Gruppen weisen einen isoelektrischen Punkt pI auf. Außer den 20 „proteinogenen“ Aminosäuren kommen in manchen Proteinen besondere Aminosäure-Derivate vor, z. B. 4-Hydroxyprolin und 5-Hydroxylysin im Kollagen. Nicht-proteinogene Aminosäuren wie γ-Aminobuttersäure (GABA) oder Aminosäure-Folgeprodukte wie Histamin wirken als Neurotransmitter. Peptide werden bei der Biosynthese meist aus aktivierten Aminosäuren an den Ribosomen aufgebaut. Bei Peptiden aus über 100 Aminosäuren (Faustregel) spricht man von Proteinen. Peptide übernehmen viele Aufgaben bei der Signalübermittlung. Sie bilden Antioxidantien wie Glutathion, Hormone wie Insulin und Wachstumsfaktoren wie das Granulocyten-CSF. Peptide bilden sich aus Aminosäuren mittels planarer cis-Peptid-Bindungen, die nur begrenzte Rotationsfreiheiten aufweisen und damit die Zahl der möglichen Konformationen einer PeptidKette beschränken. Die erlaubten Konformationen eines Peptids werden im RamachandranDiagramm wiedergegeben. Peptide weisen eine Sekundärstruktur auf: infolge intermolekularer

Wasserstoffbrücken zwischen N-H und C=O Gruppen ist eine helikale PolypeptidKonformation mit 3,6 Aminosäuren pro Windung (Länge p pro Windung: 0,54 nm) besonders stabil (α-Helix). Die länger gestreckte 310-Helix hat dagegen nur 10% Anteil. Findet die Ausbildung von Wasserstoff-brücken dagegen zwischen zwei benachbarten PolypeptidAbschnitten statt, so entstehen ß-Faltblattstrukturen. Die Topologie eines Peptids (Tertiärstruktur) folgt aus Sequenz und Struktur seiner Aminosäuren. Proteine bestehen aus einer oder mehreren Peptidketten, die über nicht-kovalente Wechselwirkungen eine einzigartige Struktur ausbilden. Globuläre Proteine bestehen im Mittel zu ~ 31% aus α-Helix- und zu ~ 28% aus ß-Faltblatt-Anteilen. Die restlichen ~ 40% sind random coils (Knäuel) und Schleifen. ß-Schleifen bestehen aus 4 Aminosäuren mit Glycin an Position 3; sie verbinden oft Faltblatt-Strukturen und leiten eine Richtungsänderung der Peptidkette ein. Bei der Analyse von Proteinstrukturen spricht man von Primär- (= Sequenz), Sekundär- (= α-Helix- und ß-Faltblatt-Anteil), Tertiär- (Raumstruktur) und Quartärstrukturen (Überstrukturen bei mehreren Peptidketten). 2014 waren die Raumstrukturen von etwa 100.000 Proteinen aufgeklärt, meist durch Röntgenstruktur-Analyse von Protein-Kristallen. Auf dieser Grundlage können heute mit Hilfe bioinformatischer Methoden (→324) aus Sequenzinformationen bereits gute Vorhersagen über die Struktur oder zumindest von Teilstrukturen neu aufgefundener Proteine gemacht werden. Diese Methoden sind insbesondere wichtig für die Entwicklung von Strukturmodellen von Membran-Proteinen, die meist nicht kristallisiert werden können und deshalb einer Röntgenstruktur-Analyse nicht zugänglich sind. Die Größe von Proteinen wird in kilo-Dalton (kDa) angegeben, ihre Sequenz in einem Dreioder Ein-Buchstabencode. Proteine sind häufig mit weiteren Elementen ausgestattet (z. B. Häm-Gruppen, Nukleotiden, Metall-Ionen, Zucker-Seitenketten). Spezialisierte ProteinStrukturen haben viele wichtige Funktionen im Organismus: so übernehmen Serumalbumin, Hämoglobin und Ferritin (→226) wichtige Funktionen im Blutserum. Im Immunsystem (→80) regulieren und koordinieren Proteine Abwehrreaktionen. Andere Proteine wie Myosin (Muskel) und Collagen (Bindegewebe) sind am Körperaufbau beteiligt. Katalytisch aktive Enzyme (→166) sind die „Biokatalysatoren“ des Stoffwechsels.

Enzyme: Aufbau, Funktion, Kinetik

Allgemeines. Enzyme sind Proteine mit katalytischer Aktivität. Sie setzen Substrate (Edukte) in Produkte um, oft mit hoher Geschwindigkeit (Wechselzahl) von >1000 Umsetzungen/sec. Manche Enzyme benötigen dazu Cofaktoren wie NADH/NADPH, FADH, Pyridoxalphosphat, ATP, Häm oder Metall-Ionen. Enzyme bilden die Grundlage des Stoffwechsels (Metabolismus) und sind meist regio-, oft auch stereoselektiv. Ihre Reaktionsprodukte im Stoffwechsel heißen Metabolite. Ihre Aktivität im Stoffwechsel wird neben genetischen Mechanismen (Induktion, Repression) auch über Wechselwirkungen mit Metaboliten reguliert (Produkthemmung, allosterische Kontrolle). Viele Enzyme setzt man in technischen Verfahren ein (Enzymtechnologie (→166)). Im Gegensatz zu vielen chemischen Katalysatoren benötigen sie für ihre Reaktion weder erhöhten Druck noch hohe Temperaturen. Einteilung. Nach internationaler Vereinbarung teilt man Enzyme nach ihrem Reaktionstyp (Hydrolysen, Redox-Reaktionen usw.) in 6 Klassen ein und klassifiziert mit einer 4-teiligen EC-Nummer (→166), 2014 waren es etwa 6500 Enzyme. Enzymkatalyse. Enzyme beschleunigen chemische Reaktionen durch Erniedrigung der Aktivierungsenergie. Dies kann erreicht werden: a) durch Säure-Base-Katalyse b) mittels kovalenter Katalyse, c) durch Metallionen-Katalyse, d) durch elektrostatische Katalyse, e) mit Hilfe von Nachbargruppen- und Orientierungseffekten, und f) durch bevorzugte Bindung des Übergangszustands. Serin-Proteasen (→174) erniedrigen beispielsweise nach Mechanismus a), b) und e) die Aktivierungsenergie für die Hydrolyse einer Amidbindung durch drei Faktoren: 1. die Ausbildung eines „aktiven Zentrums“, welches das zu spaltende Peptid über elektrostatische Wechselwirkungen spezifisch bindet, 2. die Aktivierung der Carbonylgruppe des zu spaltenden Amids mit der Hydroxylgruppe des katalytisch aktiven Serins, das dazu über Wasserstoffbrücken eine „katalytischen Triade“ mit zwei räumlich benachbarten Aminosäuren Histidin und Asparagin bildet, die zu einem energetisch begünstigten tetraedrischen Übergangszustand führen, und 3. den Ablauf dieser Reaktion in einer Umgebung hydrophober Aminosäure-Seitenketten, also in einem wasserarmen Milieu. Unser Wissen um die Enzymkatalyse beruht vor allem auf Röntgenstruktur-Analysen von Enzymen, von EnzymEnzyminhibitor-Komplexen, von Vergleichsuntersuchungen mit gentechnisch hergestellten Enzymmutanten und aus chemischen Modellreaktionen. Enzymkinetik. Enzymreaktionen lassen sich durch chemische Reaktionsgleichungen beschreiben. Ihre Kinetik wird vereinfacht durch die Michaelis-Menten-Gleichung beschrieben: sie beruht auf der Messung des Verlaufs von Enzymreaktionen 0-ter Ordnung (Geschwindigkeit ist unabhängig von der Substratkonzentration) nach der Gleichung Enzym (E) + Substrat (S) Enzym-Substrat- oder Michaelis-Komplex (ES) Produkt (P) + Enzym (E), mit der Gleichgewichts-Annahme dES/dt = 0 Meist stellt man den Reaktionsverlauf von Enzymreaktionen in einem Diagramm dar, das die experimentell leicht bestimmbare Anfangsgeschwindigkeit in Abhängigkeit von der Substratkonzentration darstellt. Die maximale Reaktionsgeschwindigkeit Vmax ist erreicht, wenn das Enzym mit Substrat gesättigt ist, also als Enzym-Substrat-Komplex (ES) vorliegt. KM, die Michaeliskonstante, beschreibt die Substratkonzentration, bei der halben maximale

Reaktionsgeschwindigkeit. KM und Vmax können grafisch mit der Lineweaver-Burk Darstellung bestimmt werden. Substratkonzentration und Reaktionsgeschwindigkeit werden doppelt reziprok aufgetragen; die Schnittstelle mit der Ordinate ergibt dann 1 /Vmax, mit der Abszisse – 1/KM. Definiert man die Umsatzzahl kcat eines Enzyms als kcat = Vmax / ET so erhält man mit kcat / KM ein Maß für die katalytische Effizienz eines Enzyms (ET: Enzymkonzentration). Einige Enzyme nähern sich mit diesem Wert den Grenzen diffusionskontrollierter Reaktionen, d. h., jede Kollision von Enzym und Substrat führt zu einer Reaktion. Anders als bei der Michaelis-Menten-Gleichung angenommen finden 60% aller Enzymreaktionen mit zwei Substraten statt (bei zwei Substraten und zwei Produkten: „bibiReaktion“) und werden durch komplexere kinetische Gleichungen beschrieben. Ihre Auswertungen geben wertvolle Hinweise auf die Mechanismen von Enzymreaktionen und deren Hemmung (kompetitive, nicht-kompetitive Hemmung) (→254).

Zucker, Glykoside, Polysaccharide Allgemeines. Die Grundeinheiten der Zucker sind die Monosaccharide, die im Stoffwechsel entweder durch Gluconeogenese oder von phototrophen Organismen, z. B. den Pflanzen, aus CO2 und H2O durch Photosynthese aufgebaut werden („Kohlenhydrate“). Glucose, eine Hexose, nimmt dabei eine Schlüsselstellung ein. Ribose und Desoxyribose, zwei Pentosen, sind Zuckerkomponenten der Nukleinsäuren. Oligosaccharide bestehen aus wenigen, Polysaccharide aus vielen Monosacchariden. Mono- und Oligosaccharide sind häufig mit Proteinen (Glykoproteine) oder Lipiden verknüpft (Lipoproteine); derartige Verbindungen heißen „Glykokonjugate“ und haben häufig strukturelle oder regulatorische Funktionen. Viele biotechnologisch hergestellten Enzyme sind Glykoproteine, und der Aufbau korrekter Glykokonjugate in einem Wirtsorganismus (Glykobiologie) (→262) ist keine einfache Aufgabe. Monosaccharide sind Aldehyd- (Aldosen) oder Ketonderivate (Ketosen) von geradkettigen Polyhydroxyalkoholen. Zucker der Kettenlänge 3 (C-3) haben ein Stereozentrum und können deshalb 21 = 2 Stereoisomere bilden. Die absolute Konfiguration richtet sich nach der Konfiguration der einfachsten Vertreter, D- und L-Glyceraldehyd. C-4-Zucker haben zwei Stereozentren (4 Stereoisomere), C-5-Zucker drei (8) und C-6-Zucker vier (16 Stereoisomere). Nur einige dieser Stereoisomeren sind zentrale Produkte des Stoffwechsels, aber die meisten der möglichen D- und L-Zucker wurden bereits in Naturstoffen gefunden, z. B. als Bausteine von Antibiotika (seltene Zucker). C-3- und C-4-Zucker liegen offenkettig vor, C5- und C-6-Zucker bilden cyclische Halbacetale oder Halbketale (C-5: Furanosen, C-6: Pyranosen); dabei entsteht am Halbacetal-/Halbketal-Kohlenstoff ein neues Stereozentrum (anomerer Kohlenstoff), das mit α- oder β- bezeichnet wird. Bei der Umsetzung des anomeren

Kohlenstoffs mit Alkoholen entstehen Acetale oder Ketale, Zucker werden meist mit planaren Haworth-Formeln geschrieben, ihre tetraedrischen sp3-Kohlenstoffe bilden aber in Wirklichkeit meist Sessel-, gelegentlich auch Wannen-Konformationen aus, bei denen die polaren Hydroxylgruppen bevorzugt „auf Lücke“ stehen und äquatorial ausgerichtet sind. Mit Hilfe der NMR-Spektroskopie lassen sich die bevorzugten Konformationen ermitteln. DGlucose liegt nahezu ausschließlich als β-D-Glucopyranose vor, D-Ribose zu 75% als β-DRibopyranose und zu 25% als β-D-Ribofuranose. Zucker-Derivate. Monosaccharide werden im Stoffwechsel häufig enzymatisch an C1 zu Aldonsäuren oxidiert; so bildet D-Glucose D-Glucuronsäure. Vitamin C (L-Ascorbinsäure) (→134) ist eine teiloxidierte Pentose, die als interner Ester vorliegt. Durch Reduktion der Aldehyd- oder Ketongruppe erhält man Alditole. Dazu gehören die wichtigen LipidKomponenten Glycerol (C-3) und myo-Inosit. Die Reduktion einer Hydroxylgruppe führt zu Desoxyzuckern wie 6-Desoxy-L-Mannose (α-L-Rhamnose), einem Baustein von Pektin (→186). Einzelne Hydroxylgruppen können durch Aminogruppen substituiert und derivatisiert sein (N-Acetyl-Mannosamin) Durch Aldolkondensation mit Pyruvat entsteht daraus N-Acetylneuraminsäure, ein Bestandteil von Glykoproteinen. Biochemisch sehr wichtige Verbindungen sind Phosphorsäure-Ester von Zuckern (Zuckerphosphate). Als energetisch „aktivierte Zucker“ spielen sie bei der Biosynthese, aber auch als Signalstoffe in der Zellbiologie eine wichtige Rolle (→76). Oligosaccharide werden durch glykosidische Bindungen verknüpft und durch Glykosidasen gespalten. Der Aufbau einer glykosidischen Bindung erfolgt meist über aktivierte Zuckervorstufen, z. B. über Nukleotid-Zucker wie Uridindiphosphat-Glucose, und führt zu optisch aktiven Glykosid-Bindungen, die wie bei den Halb- oder Vollacetalen mit α- oder βbezeichnet werden. Die einfachsten Oligosaccharide sind Disaccharide wie beispielsweise Sucrose oder Lactose (→116, 188). Polysaccharide (Glykane) (→158) sind Gerüst- und Energiespeicherstoffe und bestehen aus Monosaccharid-Ketten, die über glykosidische Bindungen gekoppelt sind. Man unterscheidet, je nach den Bausteinen, Homo- und Heteropolysaccharide und, je nach den beteiligten Monosacchariden, z. B. Glucane (Glucose-Polymere) oder Galactane (Galactose-Polymere). Polysaccharide können unverzweigte (z. B. Cellulose) (→182) oder verzweigte Polysaccharide (z. B. Stärke) (→176) bilden. Sie werden durch Glykosidasen abgebaut und spielen eine wichtige Rolle in der Biotechnologie. Wichtige Speicherstoffe sind Stärke und Glykogen, Gerüststoffe sind Cellulose, Chitin und Glykoproteine wie das bakterielle Murein.

Lipide, Membranen, Membran-Proteine

Allgemeines. Lipide werden eingeteilt in Triglyceride (→162), Phospholipide, Sphingolipide und Sterole. Im wässrigen Milieu aggregieren sie und bilden dabei Mizellen, Doppelschichten und Membranen, die sowohl eine Zelle umhüllen wie häufig auch im Zellinneren Kompartimente (Organellen) ausbilden. Sterole sind Bestandteile vieler biologischer Membranen und regeln deren Fluidität. Einige Steroide wirken in höheren Organismen als Hormone (→252). Lipide und Lipoproteine (nicht kovalent verbundene Aggregate von Lipiden und Proteinen) sind an vielen biologischen Transport- und Signalvorgängen beteiligt. Triglyceride (Fette und Öle) (→162) sind Ester von Glycerol mit Fettsäuren und dienen meist als Speicherstoffe (Reservestoffe). Die meisten Fettsäuren haben Kettenlängen von C-12 bis C-18 und können gesättigt, einfach oder mehrfach ungesättigt sein. Ihr Schmelzpunkt richtet sich nach dem Anteil ungesättigter Fettsäuren. Triglyceride sind nachwachsende Rohstoffe und spielen eine wichtige Rolle bei der Entwicklung einer regenerativen Rohstoffbasis (Bioökonomie) (→328). Phosphoglyceride sind Diester von sn-Glycerol-3-Phosphat mit Fettsäuren (Phosphatidinsäuren); die Phosphatgruppe ist mit Glycerin und einem weiteren Alkohol oder Amin verestert. Sie haben Tensidcharakter, da sie aus einer polaren Kopfgruppe und hydrophoben Resten (Acylketten) aufgebaut sind (amphiphil), und bilden deshalb Micellen und Membranen. Micellen und Liposomen. In wässriger Lösung bilden Fettsäuren beim Überschreiten einer Grenzkonzentration Micellen (kritische Micell-Konzentration). Die Raumerfüllung der beiden Acylketten der Phosphoglyceride verbietet die Ausbildung einer derartigen Struktur. Statt dessen kommt es zur Bildung von Doppelschichten, die bei Ultraschall-Behandlung zu Liposomen umlagern: Tröpfchen (Vesikel) von einigen 100 Å Durchmesser, deren wässriger Inhalt von einer einzigen Doppelschicht von etwa 60 Å Dicke umgeben ist. Diese Membran ist nach außen und innen polar, im Zentrum jedoch hydrophob. Doppelschichten bilden die strukturelle Grundlage fast aller Zell-Membranen. Biologische Membranen bestimmen das „innen“ und „außen“ von Zellen und auch der in den eukaryotischen Zellen eingeschlossenen Organellen (Mitochondrien, Plastide, Peroxisomen usw.). Ihre lipophilen Bestandteile (z. B. Phospholipide) diffundieren nur sehr langsam durch die Doppelschicht („Flip-Flop“, Dimension: Tage), aber sehr schnell in lateraler Richtung (Dimension: Minuten). Da die Kopfgruppen der Phospholipide unterschiedliche Ladungen tragen, können lokale Inseln eines Ladungstyps entstehen, was beispielsweise die Einlagerung von Lipoproteinen wie z. B. Porinen, Rezeptoren oder Glykolipiden erleichtert. Unter der Fluidität einer Membran versteht man ihren Übergang von einer ungeordneten, fluiden (hohe laterale Mobilität der Phospholipide) in einen stärker geordneten gelartigen Zustand. Die Übergangstemperatur vom einen in den anderen Zustand hängt von der Struktur der Fettsäureketten ab (Kettenlänge, Doppelbindungen) und liegt bei den Membranen der Säugetiere unter ihrer Körpertemperatur, sie haben fluiden Charakter. Bakterien und Kaltblütler (Fische) verändern durch Abbau und Neusynthese von Phospholipiden die Zusammensetzung ihrer Membranen abhängig von der Umgebungstemperatur, um deren Fluidität zu erhalten. Membranproteine führen spezifische Aufgaben beim Stofftransport und bei der

Kommunikation von Zellen aus. Man unterscheidet integrale und Membran-gebundene Proteine. Integrale Proteine geben sich bereits in ihrer Aminosäure-Sequenz durch längere Abschnitte hydrophober Aminosäuren zu erkennen, deren Sekundärstrukturen (α-Helix oder βFaltblatt) antiparallel angeordnet sind. Membran-gebundene Proteine weisen dagegen Ankergruppen wie Isoprenoide, Fettsäuren oder Glykosylphosphatidylinosit (GPI) auf, die posttranslational angefügt werden. Wichtige Gruppen integraler Membranproteine sind die Porine der Gramnegativen Bakterien, der Mitochondrien und Chloroplasten, das Photosynthese-Protein (Photoreaktionszentrum) pflanzlicher und das Sehpigment Rhodopsin tierischer Zellen. Mit Hilfe von gap junctions zweier Connexine bilden die Membranen zweier Zellen eine Verbindung, die den Austausch von Signalen und kleinen Molekülen erlaubt. Beispiele für membranständige Proteine sind die Rezeptoren, die sich entweder als Ionenkanäle bei der Bindung eines Liganden öffnen, oder als Signal-Überträger durch eine nachgeschaltete Reaktionskaskade das Verhalten von Zellen modulieren. Membranständige Glykoproteine und Glykolipide haben wichtige Funktionen im Immunsystem.

Stoffwechsel Allgemeines. Obwohl sich die vielfältigen Formen des Lebens auf der Erde über einen langen Zeitraum von ca. 4 Mrd. Jahren entwickelt haben, beruht ihre Replikation, ihr Bau- und Energie-Stoffwechsel auf der Variation weniger Grundprinzipien. Die Zahl der beschriebenen Arten liegt bei > 1 Million, der Enzyme aber nur bei etwa 6000, und selbst der Mensch kommt mit etwa einer Million Protein-Varianten aus, von denen sich die meisten nur durch

posttranslationale Modifikation unterscheiden und viele eine hohe Sequenz- und StrukturHomologie zu einfachen Eukaryoten wie Saccharomyces cerevisiae aufweisen. Über ihren Stoffwechsel bilden alle Lebewesen auf der Erde ein labiles ökologisches Netzwerk, in dem es Spezialisten für fast jede erdenkliche Kombination von Umweltbedingungen gibt („ökologische Nischen“) (→12). Dabei unterscheidet man zwischen autotrophen (können Metabolite aus CO2 aufbauen) und heterotrophen Organismen (benötigen dafür eine organische C-Quelle). Ein weiteres Unterscheidungsmerkmal ist die Fähigkeit, in einer O2-Atmosphäre (aerob, Gegensatz: anaerob) zu überleben. Trotz vieler Gemeinsamkeiten gibt es dabei auch zahlreiche Varianten, wie schon ein Blick auf die verschiedenen Möglichkeiten des GlucoseAbbaus über Fructose-1,6-bisphosphat-, Pentosephosphat- und 2-Keto-3-desoxy-6phosphogluconat-Weg zeigt. Der nun mögliche Vergleich ganzer Genome eröffnet dabei atemberaubende neue Einsichten in die Details der Bau- und Funktionspläne von Organismen, die an unterschiedliche Umweltbedingungen angepasst sind. Auch das Verständnis für die komplexen Regelvorgänge innerhalb einer Zelle, eines vielzelligen Organismus oder seiner Wechselwirkung mit der Umwelt (Systemdynamik, Biokybernetik) nimmt stürmisch zu und lässt sich immer besser in silico modellieren (→326). Bei biotechnologischen Aufgabenstellungen will man Stoffwechsel-Vorgänge meist beeinflussen, sei es zur Ausbeutesteigerung eines Produkts oder zur Eliminierung einer für die Züchtung oder die Produktion störenden Eigenschaft. Die traditionellen Methoden, Kreuzung und Zuchtwahl bzw. Mutation und Selektion, werden dabei nachhaltig durch die Möglichkeiten der Gentechnik ergänzt, mittlerweile auch durch Technologien, um Stoffwechselschritte unterschiedlicher Organismen in einem Wirtsorganismus zu einem neuen Syntheseweg zu kombinieren (synthetische Biologie) (→320). Autotropher Stoffwechsel. Organismen dieses Typs reduzieren CO2 zu C-Quellen (primär Zucker) und benötigen dazu Energie. Phototrophe Organismen (Pflanzen, Algen, Cyanobakterien und andere) verwenden dazu verschiedene Formen von Photoreaktionszentren, die Lichtenergie in die chemische Energie von Adenosintriphosphat (ATP) umwandeln (ATP: „universelle biochemische Energiewährung“). Lithotrophe Organismen oxidieren zu diesem Zweck anorganische Stoffe (S, N, Metallionen). Autotrophe Organismen mit Bedeutung für die Biotechnologie sind beispielsweise nitrifizierende Bakterien, Algen (→18) und transgene Pflanzen. Bei der mikrobiellen Erzlaugung (→294) setzt man lithotrophe Bakterien ein. Heterotropher anaerober Stoffwechsel. Organismen dieses Stoffwechseltyps setzt man zur Herstellung von Ethanol (→138), Aceton, Butanol (→140) und Milchsäure (→148) ein. Sie gewinnen ATP aus dem Abbau von Zuckern. Die bei der anaeroben Schlammfaulung (→288) beteiligten Methanbildner gehören zu den Archaebakterien und verfügen über einige sehr spezielle Stoffwechselleistungen. Die Energie-Gewinnung durch anaeroben Stoffwechsel verläuft mit einer geringen Energie-Ausbeute, was zu geringeren Produkt-Ausbeuten pro Zeiteinheit äußert. Heterotropher aerober Stoffwechsel. Die meisten in der Biotechnologie verwendeten Organismen gehören zu diesem Stoffwechsel-Typ. Der Großteil der Energie wird über die Elektronentransport-Kette gewonnen, die sich aus dem Citronensäure-Cyclus speist. Mit 26–38

Mol ATP/Mol Glucose ist die Energieausbeute dieses Stoffwechseltyps hoch. Aus dem Citronensäure-Cyclus werden auch zahlreiche Vorstufen für die Biosynthese abgezweigt (Oxalessigsäure, Bernsteinsäure usw.), viele Hochleistungsstämme für die Produktion von primären Stoffwechselprodukten (Citronensäure (→146), Glutaminsäure (→126)) benutzen dazu Auffüllreaktionen (anaplerotischer Stoffwechsel). Sekundär-Stoffwechsel. Viele Organismen bilden Metabolite, deren Bedeutung im Stoffwechsel noch unvollkommen verstanden wird. Oft handelt es sich dabei um industriell sehr wertvolle Verbindungen wie Antibiotika (→200), Alkaloide, Farbstoffe und Aromen.

Gentechnik DNA: Aufbau und Struktur Allgemeines. Bei der Vererbung wird die genetische Information einer (Prokaryoten, Zellteilung) oder zweier Elternzellen (Eukaryoten, sexuelle Fortpflanzung) innerhalb der Art (homolog) übertragen. Die genetische Information ist festgelegt in der Erbsubstanz DNA (Desoxyribonucleinsäure), einem hochmolekularen Doppelstrang (Doppelhelix), der Molmassen von > 109 Da erreichen kann. Die meisten Lebewesen speichern ihre genetische Information in dieser chemisch einheitlichen Form. Das macht einen („heterologen“) Austausch von Erbmaterial zwischen nicht verwandten Spezies möglich, z. B. bei Virusinfektionen. Seit 1971 entwickelte man Methoden, mit denen dieser natürliche, aber seltene Prozess im Labor nachgeahmt werden kann (Gentechnik). Damit wurden völlig neue Untersuchungen in der Grundlagenforschung und neue Screening- und Produktionsmethoden in der Industrieforschung möglich. Strukturelemente und Aufbau von DNA. Die Einzelbausteine der DNA nennt man Nucleotide. Sie bestehen aus zwei Komponenten: Desoxyribose-5′-phosphat und einer der 4 Basen Adenin (A), Guanin (G) Thymin (T) oder Cytosin (C), die über eine N-glykosidische Bindung an Position 1′ des Desoxyribose-5′-phosphats gebunden sind. In der DNA sind diese Nucleotid-Bausteine durch eine Phosphat-Brücke zwischen dem 5′-C-Atom des einen und dem 3′-C-Atom des benachbarten Nucleotids verknüpft (Zucker-Phosphodiester-Polymere). Diese Polymere bilden eine Doppelhelix, bei der die Purin- bzw. Pyrimidin-Basen nach innen gerichtet sind und über Wasserstoffbrückenbindung hochspezifisch binden („Hybridisierung“). Aus räumlichen Gründen bindet immer eine Purin- an eine Pyrimidin-Base und aus energetischen Gründen (Anzahl der Wasserstoffbrücken) immer Adenin an Thymin (2 HBrücken) sowie Guanin an Cytosin (3 H-Brücken). Zwei hybridisierende DNA-Einzelstränge sind also in ihrer Basensequenz komplementär. Das dabei entstehende supramolekulare Polymer (die DNA-Doppelhelix) hat folgende Eigenschaften: a) die Molmasse ist außerordentlich hoch, b) die Abfolge der Basen erlaubt die lineare Speicherung von Informationen, c) die beiden Polymerketten sind gerichtet, d. h. es gibt pro Kette nur ein einziges 5′- und ein 3′-Ende, und d) jeder der beiden Einzelstränge kann als Matrize dienen, um die in ihm enthaltene Information auf eine Kopie mit komplementärer Basenanordnung zu übertragen. Struktur von DNA in Organismen. Die Größe des DNA-Polymers und seine Funktion als Informations-Matrize hat zu speziellen Strukturierungen geführt. In höheren Organismen findet man DNA meist auf verschiedene Chromosomen aufgeteilt. So hat die Backhefe (Saccharomyces cerevisiae) 16, der Fadenwurm (Caenorhabditis elegans) und die Taufliege (Drosophila melanogaster) jeweils 4, und der Mensch 23 unterschiedliche Chromosomen. Die Gesamtheit der DNA eines Organismus nennt man sein Genom. Die Chromosomen sind im Zellkern lokalisiert und bilden dort das Chromatin [Komplex von DNA mit basischen

Proteinen (Histonen) im Verhältnis von etwa 1:1]. Die Länge der DNA wird üblicherweise in Basenpaaren (bp) angegeben. Das Chromosom 3 des Menschen enthält beispielsweise ein DNA-Molekül von ca. 160 Mio. bp („160 Mbp“). Da sich 3 · 106 bp eines DNA-Strangs rechnerisch zu etwa 1 mm Länge addieren, würde die Länge des isolierten und gestreckten DNA-Moleküls aus Chromosom 3 etwa 5 cm betragen. Würde man die DNA des Menschen (ca. 3 · 109 bp, MR = 1,8 · 1012) aller 23 Chromosomen in einer einzigen haploiden Samenoder Eizelle aneinanderreihen (unsere 1013 Körperzellen haben den doppelten, diploiden Chromosomensatz), so käme man auf ca. 1 m DNA pro Zelle. Bei jeder Zellteilung werden die 46 DNA-Doppelstränge des diploiden Chromosomensatzes repliziert und wieder in 46 Chromosomen verpackt. Die DNA der Prokaryoten ist einfacher aufgebaut: da Prokaryoten keinen Zellkern besitzen, liegt die DNA in Form eines Nucleoids im Cytoplasma vor. Selbst das in einem einzigen zirkulären Doppelstrang von DNA niedergelegte Genom von Escherichia coli (MR = 2,4 · 109) hätte mit seinen 4,6 Mio. bp in gestreckter Form eine Länge von 1,5 mm. Die Replikation dieses riesigen Moleküls benötigt unter günstigen Wachstumsbedingungen weniger als 20 min (Verdopplungszeit von E. coli). Mehrere Chromosomensätze pro Zelle (Polyploidie) treten vor allem bei Pflanzen auf; Weizen ist hexaploid, Erdbeeren sind dekaploid.

DNA: Funktion Allgemeines. Die in der DNA gespeicherte Erbinformation kodiert für die Biosynthese von Proteinen und deren Lokalisation in den verschiedenen Kompartimenten der Zelle. Dieser Vorgang verläuft bei Prokaryoten in zwei Schritten: der Transkription, bei der ein GenAbschnitt auf der DNA in Ribonucleinsäuren (messenger RNA, mRNA) umgeschrieben wird, und der Translation, bei der die nun auf die mRNA übertragene Information zur Synthese von Proteinen an den Ribosomen dient. In Eukaryoten ist dieser Ablauf komplexer. Zum einen kodiert nur ein Teil der DNA für die Biosynthese von Proteinen (Exons). Der nicht-kodierende Anteil der DNA (Introns) kann bei höheren Organismen über 90 % betragen; seine Funktion ist nur teilweise bekannt. Nach Transkription der DNA in die mRNA (Primärtranskript) werden die darin enthaltenen Introns durch Spleißen entfernt. Während Translation und Spleißen im Zellkern stattfinden, erfolgt die Translation der gespleißten (reifen) mRNA ebenfalls an den Ribosomen, die bei den Eukaryoten im Cytosol oder am endoplasmatischen Retikulum lokalisiert sind. Mittels Steuersequenzen werden die Proteine von hier aus zu den verschiedenen anderen Kompartimenten der Zelle dirigiert und dabei ihre Eigenschaften noch durch chemische Modifizierung verändert, beispielsweise durch Glykosylierung oder Phosphorylierung (posttranslationale Modifikation). Man schätzt, dass aufgrund derartiger Mechanismen die 20 300 Gene des Menschen für über eine Million verschiedene Proteine kodieren. Damit wird eine große Differenzierung der Proteinfunktion erreicht (Proteomics) (→314). Genetischer Code. Der genetische Code, den Lebewesen bei der Übersetzung von DNASequenzen in Aminosäure-Sequenzen verwenden, ist weitgehend universell. Eine bestimmte Folge von drei Nucleotiden der DNA und der daraus abgeleiteten mRNA kodiert am Ribosom immer für eine bestimmte Aminosäure. Durch diese Einheitlichkeit über die Artgrenzen hinweg wird eine Übertragung genetischer Information auf einen anderen Organismus möglich. Dieser Vorgang findet beispielsweise bei viralen Infektionserkrankungen statt. Auch bei der Gentechnik überträgt man fremde DNA in einen Wirtsorganismus (→44). Dabei ist allerdings zu beachten, dass der genetische Code „entartet“ ist: kombinatorisch ergeben sich aus einer Folge von drei Nucleotiden mit vier Variationsmöglichkeiten für die Base (A, T, G und C) 43 = 64 unterschiedliche Triplet-Codons. Da zum Aufbau der Proteine nur 20 Aminosäuren verwendet werden, können bis zu 6 verschiedene Tripletts für den Einbau der gleichen Aminosäure kodieren (z. B. für Leucin: UUA, UUG, CUU, CUC, CUA und CUG). Die tatsächliche Nutzung dieser Codons in unterschiedlichen Organismen ist allerdings sehr verschieden und führte früher bei gentechnischen Experimenten gelegentlich zu Problemen. Durch den schnellen Fortschritt bei der Sequenzierung (→56) ganzer Genome kennt man heute die Codon-Nutzung vieler Organismen und kann kostengünstig synthetische Gene herstellen, die perfekt an die Codon-Nutzung des Wirtsorganismus angepasst sind. Synthetische Gene (→54) sind derzeit (2014) zu einem Preis von ca. 0,3 €/bp und innerhalb weniger Tage erhältlich, sodass selbst für den Umbau ganzer Stoffwechsel-Passagen (synthetische Biologie) heute meist synthetische Gene eingesetzt werden. Synthetische Oligonucleotide (→54) werden für viele Experimente der Gentechnik benötigt,

beispielsweise als „Primer“ (Startsequenz für DNA-Polymerase), als Sonden für Hybridisierungen, und für die ortsgerichtete Mutagenese von Proteinen. Ein gut ausgewählter Primer hybridisiert spezifisch mit DNA, die aus einem Organismus isoliert, fragmentiert und in Einzelstränge zerlegt wurde, und erlaubt z. B. die Klonierung oder Vervielfältigung einzelner Gene. Bei derartigen Experimenten kennt man häufig nur Teilsequenzen eines gereinigten Proteins, dessen DNA man aus dem Organismus klonieren möchte. Die Degenerierung des genetischen Codes hat in diesem Fall zur Konsequenz, dass es eine Vielzahl möglicher Primer gibt. Experimentell hilft man sich damit, dass man tatsächlich alle möglichen Primer chemisch synthetisiert und für das Klonierungsexperiment einsetzt („degenerierte Primer“). Beobachtet man mit dem Primer-Gemisch tatsächlich einen Hybridisierungsvorgang (bevorzugte Methoden: Southern Blot (→60) und PCR-Amplifikation (→50)), so kann man die gewünschte DNA isolieren und mittels DNA-Sequenzierung daraus ihre tatsächliche Sequenz ableiten.

RNA Allgemeines. Es gilt als gesichert, dass das DNA-Genom, die genetische Grundlage der heutigen Biosphäre, auf eine einfachere Lebensform folgte, die sich mit Hilfe von RNA replizierte. Auch bei den heutigen Lebensvorgängen spielen RNA-Moleküle eine sehr wichtige Rolle, beispielsweise in Form der ribosomalen, transfer und messenger RNA. In der Biotechnologie wird RNA verwendet 1) in Form von Aptameren (Affinitätsliganden), 2) zur in-vitro Biosynthese toxischer Proteine, 3) als Vektor in der Gentherapie und 4) als interfering

RNA zum knock-out von Genfunktionen. Aptamere sind im Labor hergestellte RNAoder DNA-Stränge, die hydrophile Moleküle wie Peptide oder Medikamente mit hoher Affinität binden. Im SELEX-Verfahren (systematic evolution of ligands by exponential enrichment) screent man das Bindevermögen großer kombinatorischer Bibliotheken synthetischer RNA- oder DNA-Stränge (1014 bis 1015 unterschiedliche Sequenzen) gegen das Zielmolekül. Die besten Kandidaten werden über (RT-) PCR amplifiziert und in-vitro transkribiert, wodurch eine Tochterbibliothek mit weiter verbesserten Bindeeigenschaften entsteht. Aptamere können Bindekonstanten im nanomolaren Bereich erreichen. Sie werden kommerziell für diagnostische und therapeutische Anwendungen untersucht (→258), z. B. als Aptamer-Array für die Proteom-Analyse (SomaScan™). Zellfreie Proteinsynthese. An einer DNAMatrize können Proteine auch durch zellfreie Transkription hergestellt werden. Dazu benötigt man E. coli-Lysat, das RNA-Polymerase, tRNAs, Ribosomen und Aminosäuren enthält. Bei Zugabe von ATP erhält man einige mg Protein in 24 h. Die Methode ist kommerzialisiert (ProteoMaster™) und eignet sich besonders zur Herstellung von Proteinen wie Toxine oder Proteasen, deren Überproduktion toxisch für den Wirtsorganismus ist. Gentherapie. Die Verwendung viraler RNAVektoren für die Gentherapie (→304) wird andernorts beschrieben. mRNA-Extrakte menschlicher Tumoren wurden erfolgreich eingesetzt, um Monocyten des Patienten zu transformieren. Die daraus in-vitro expandierten reifen dentritischen Zellen waren mit Tumor-spezifischer RNA beladen und stimulierten nach Infusion die Bildung Tumor-spezifischer cytotoxischer T-Lymphocyten im Spender. Interfering RNA (RNAi). Das posttranskriptionale Gen Silencing (→64) wurde erst vor einigen Jahren als wichtiger Mechanismus erkannt, der sowohl die Genexpression reguliert wie auch Resistenz gegenüber schädlicher endogener und exogener RNA vermittelt (z. B. gegenüber RNA-Viren). Man bezeichnet RNAi deshalb auch als „Immunsystem des Genoms“. In einigen dieser Fälle kann RNA in Form von Ribozymen katalytisch aktiv sein und beispielsweise Phosphodiester-Bindungen in Abwesenheit von Nucleasen spalten. In der medizinischen Forschung werden Ribozyme bereits zur Therapie von Virusinfektionen (HIV, Hepatitis B) und von Tumoren klinisch untersucht. In vielen, wahrscheinlich allen eukaryotischen Zellen kann mRNA durch RNAInterferenz zerstört werden (→64, 282, 284). Dabei aktiviert eine kurze doppelsträngige RNA (dsRNA) eine RNase (DICER, „Würfelspieler“), die daraus RNAi von 21–23 bp erzeugt („guide RNA“). Im sog. EffektorSchritt binden diese nach Amplifikation in einer ATP-abhängigen Aktivierung an einen RNAinduced silencing complex (RISC), der Helicase, Endo- und Exonuclease sowie eine „Homologie-suchende Aktivität“ enthält. Enthalten mRNA-Moleküle Homologie-Sequenzen zu der im RISC-Komplex gebundenen guide RNA, so wird diese mRNA an den RISC-Komplex gebunden und durch dessen Nucleasen zerstört. Man vermutet, dass dieser wahrscheinlich durch die in den Introns niedergelegte DNA gesteuerte Mechanismus einen entscheidenden Beitrag zur Regulation des Expressionsmusters des Genoms leistet, d. h. dass er darüber bestimmt, in welchem Zelltyp welche Gene exprimiert werden. Da sich mit Hilfe komplementärer RNAi im Prinzip jedes beliebige Gen ausschalten lässt, werden RNAi-

Präparate in klinischen und präklinischen Tests intensiv als Wirkstoffe untersucht. Dazu muss das RNAi-Molekül über den Blutkreislauf an seinen Zielort in einen Zelltyp gebracht werden. Zu den potenziellen Anwendungen der small interfering RNA (siRNA) gehört auch die VirusTherapie. So konnte man nach Expression einer geeigneten synthetischen Doppelstrang-RNA hinter einem RNA-Polymerase III (Pol III)-Promoter die Expression von HIVspezifischen Genen in kotransfizierten Zellen weitgehend verhindern.

Gentechnik: Allgemeine Arbeitsschritte Allgemeines. Die verschiedenen Anwendungen der Gentechnik setzen die Beherrschung verschiedener Techniken voraus. Dazu gehören insbesondere 1. die Isolierung, Vervielfältigung, enzymatische Modifikation, Charakterisierung, Sequenzierung und chemische Synthese von DNA, und 2. die Klonierung und Expression von DNA in pro- und eukaryotischen Zellen. Isolierung, enzymatische Modifikation und Vervielfältigung. DNA liegt zwar in jeder Zelle nur in sehr niedriger Konzentration vor (in Prokaryoten und in jedem Chromosom der Eukaryoten je ein Molekül), kann aber mit physikalischen und chemischen Methoden aus der Zelle präpariert werden. Für die weitere gentechnische Bearbeitung sind diese DNA-Stränge zu lang. Man kann sie aber mit Hilfe von Enzymen in vitro („im Reagenzglas“) selektiv schneiden, modifizieren, verbinden, vervielfältigen oder in mRNA übersetzen. DNA lässt sich auch durch automatisierte chemische Synthese herstellen. Für die meisten Aufgabenstellungen reicht die aus einer Zelle isolierte und fragmentierte DNA-Menge nicht aus. Von großer Bedeutung ist es deshalb, dass man DNA-Abschnitte bis zu einigen tausend Basenpaaren Länge mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) (→50) vervielfältigen (amplifizieren) kann. Diese Methode erlaubt es beispielsweise, DNA-Abschnitte unterschiedlicher Herkunft (aus

unterschiedlichen Organismen oder aus der chemischen Synthese) zu rekombinieren. Charakterisierung und Sequenzierung. Man charakterisiert DNA durch 1. ihr Schmelzverhalten (ein DNA-Doppelstrang mit einem hohen Anteil an G-C-Basenpaarungen schmilzt bei höheren Temperaturen als DNA mit einem hohen Anteil an A-T-Basenpaarungen), 2. ihre Molmasse, die man heute meist durch Gelelektrophorese bestimmt, 3. durch Sequenzierung der Nucleotide, 4. durch Charakterisierung der in ihr codierten Funktionselemente, und 5. durch Kartierung der Sequenzabschnitte, an denen sie enzymatisch aufgeschnitten werden kann (Restriktionsstellen). Klonierung. Die für die Bildung eines gesuchten Proteins kodierenden DNA-Abschnitte aus dem Genom von Prokaryoten können mit geeigneten Methoden direkt isoliert (kloniert) werden. Bei DNA-Abschnitten aus eukaryotischen Genomen müssen dagegen erst die Introns entfernt werden. Hierzu wird die reife mRNA isoliert und daraus mit dem Enzym reverse Transkriptase (RT) in einer sogenannten RT-PCR komplementäre doppelsträngige DNA erzeugt (cDNA). Dafür stehen RT mit unterschiedlichen Eigenschaften zur Verfügung (→48). Häufig verwendet man hitzestabile DNA-Polymerase von Thermus aquaticus, die in Gegenwart von Mn2+ wie eine reverse Transkriptase arbeitet und sowohl RNA wie DNA als Matrize akzeptiert. Der bei der Reaktion entstandene mRNA-DNA-Hybridstrang wird anschließend mit RNase zu einzelsträngiger DNA abgebaut. Diese kann in gewohnter Weise als Matrize dienen, um durch PCR einen DNA-Doppelstrang herzustellen. Für die unspezifische Amplifikation eukaryotischer mRNAs kann auch deren Eigenschaft genutzt werden, am 5′-Ende PolyadeninSequenzen (polyA) zu tragen: als Primer für die Synthese des mRNA-cDNA-Hybrids dient dann Thymidin-Oligomer (PolyT). Expression. Fremde DNA oder cDNA kann mit mehreren Methoden in die DNA anderer Zellen einkloniert (→58) und mit dieser bei der Zellteilung repliziert, in mRNA transkribiert und weiter in Proteine translatiert werden (Gen-Expression) (→62). Empfängerzellen für fremde Gene bezeichnet man als Wirtsorganismus. Häufig verwendet man als Wirtsorganismen Bakterien, da 1. ihr Genom nur aus einer einzigen DNA-Doppelhelix besteht, 2. für die Übertragung fremder DNA Phagen oder Plasmide (→8) als Vektoren zur Verfügung stehen, 3. die Molekulargenetik vieler Bakterien gut bekannt ist, und 4. sie sich schnell vermehren und in großen Mengen im Bioreaktor gezüchtet werden können. Die am häufigsten verwendeten Wirtsorganismen für die Klonierung und Expression fremder DNA sind Sicherheitsstämme von Escherichia coli (→20), doch werden auch andere Bakterien (z. B. Bacillus, Lactobacillus, Pseudomonas, Streptomyces) erfolgreich benutzt. Fremde DNA kann auch in höhere Organismen übertragen werden, z. B. in Hefen (→14), Pilze (→16), lebende Tiere (→272) und Pflanzen (→284). Zur industriellen Herstellung vieler rekombinanter Proteine, die als pharmazeutische Wirkstoffe eingesetzt werden („Biologics“, z. B. EPO oder therapeutische Antikörper), werden fremde Gene in geeigneten Tierzellen exprimiert (z. B. CHO-Zellen).

Präparation von DNA

Allgemeines. Die Präparation, Bearbeitung und Charakterisierung von DNA aus lebenden Zellen ist meist der erste Schritt eines gentechnischen Experiments. Restriktionsenzyme sind unersetzliche Werkzeuge bei der Kartierung von DNA und für die Bearbeitung von DNA in gentechnischen Experimenten. Präparation von DNA. Je nach Organismus und Zelltyp liegt die DNA in verschiedener Form vor, die unterschiedliche Varianten der Präparation erforderlich macht. Die DNA von Prokaryoten ist nicht in einem Zellkern eingeschlossen. Sie kann nach enzymatischem Aufschluss der Zellwand und Ausfällen der Proteine durch Phenol/Chloroform aus dem Überstand durch kaltes Ethanol ausgefällt werden. Bakterien enthalten häufig zusätzlich zur genomischen DNA wesentlich niedermolekularere DNA in Form von Plasmiden, die für gentechnische Experimente sehr wichtig ist. Man erhält Plasmid-DNA mit folgender Methode: nach Aufschluss der Zellen werden durch Zugabe von NaOH die Proteine denaturiert und superhelikale DNA fragmentiert und linearisiert. Plasmid-DNA bleibt dagegen als Doppelstrang erhalten und kovalent geschlossen. Nach Entfernen der Zelltrümmer durch Zentrifugation bleibt Plasmid-DNA im Überstand und kann nun durch Zentrifugation im Dichtegradienten (Sucrose oder Cäsiumchlorid), durch Ethanol-Fällung und Zentrifugation oder durch Auftrennen an einem Anionen-Ionenaustauscher isoliert werden. Bevorzugt wird heute die Feststoff-Chromatographie (mini colums, spin columns), bei der DNA zunächst bei hohen Salz-Konzentrationen an Silikat gebunden und bei niedriger Salz-Konzentration eluiert wird. Durch Verwendung magnetischer Silikat-Partikel lässt sich diese Methode automatisieren. Je nach Menge der isolierten DNA spricht man von Minipreps (ca. 20 μg DNA) oder Maxipreps (einge mg). Die DNA von Phagen reichert man aus infizierten Bakterien-Kulturen an, indem man die Bakterien durch Zentrifugation abtrennt, die Phagenpartikel mit Polyethylenglykol fällt, die Proteinhülle der Phagen durch PhenolExtraktion entfernt und die Phagen-DNA mit Ethanol ausfällt. Die DNA von Eukaryoten ist auf Chromosomen aufgeteilt, die ihrerseits in einen Zellkern eingeschlossen sind. Gesamtzell-DNA aus tierischen Zellen gewinnt man durch Lyse der Zellen mit SDS, verdaut mit RNase und Proteinase K, entfernt SDS und Proteine durch Salzfällung und fällt die DNA im Überstand mit Ethanol. Meist verwendet man bei vielzelligen Organismen allerdings gespleißte mRNA als Quelle für cDNA. Diese isoliert man aus Organen oder Zellkulturen, in denen die gesuchten Gene angeschaltet sind. Dazu zentrifugiert man die Zellkerne nach Zelllyse ab und isoliert die cytoplasmatische, gespleißte RNA aus dem Überstand durch Phenol-Extraktion und EthanolFällung. Mitochondrien und die Plastiden photosynthetischer Organismen enthalten eigene DNA, die unabhängig von der chromosomalen DNA repliziert wird. Sie lässt sich in analoger Weise durch Aufschluss und Alkoholfällung gewinnen, nachdem man zuvor die Organellen durch Zentrifugation isoliert hat. Restriktionsenzyme (Restriktionsendonucleasen) werden von Bakterien gebildet, um artfremde DNA nach ihrem Eindringen zu zerstören. In der Gentechnik dienen sie dazu, die langen natürlichen DNA-Fäden in definierte Abschnitte zu zerlegen. Sie binden an eine Erkennungssequenz, die zwischen 4 und 10 Nucleotide lang ist, und spalten den DNADoppelstrang am 5′- oder 3′-Ende der Erkennungssequenz entweder gleichmäßig („glatte Enden“) oder unter Ausbildung eines einzelsträngigen Überhangs („klebrige“ oder kohäsive

Enden). Spaltet man gereinigte DNA mit Hilfe von Restriktionsenzymen unterschiedlicher Selektivität, bestimmt dann die Größe der Fragmente durch Gel-Elektrophorese oder sequenziert die DNA, so erhält man eine Restriktionskarte der DNA, die als Grundlage von Strategien zur Klonierung und Expression fremder DNA-Abschnitte dienen kann. Die Häufigkeit von Schnittstellen innerhalb eines DNA-Fragmentes lässt sich rechnerisch abschätzen: so schneidet ein Restriktionsenzym, dessen Erkennungssequenz aus allen 4 Basen zusammengesetzt ist, z. B. Alu I (AGCT) im Abstand von (1/4)4 = (1/256) oder alle 256 Basenpaare. Da Sequenzinformationen auf einem DNA-Strang allerdings nicht statistisch gleichverteilt sind, weicht die tatsächliche Häufigkeit von Schnittstellen von dieser mathematischen Regel ab. Die Häufigkeit von Basenfolgen hängt auch vom GC-Gehalt der DNA ab und kann zur Charakterisierung eines Organismus verwendet werden.

Weitere Enzyme zur Bearbeitung von DNA Allgemeines. Für die Bearbeitung von DNA in vitro stehen folgende Enzymtypen zur Verfügung: 1. Hydrolasen, die DNA spezifisch schneiden, 2. Lyasen, die DNA-Fragmente verknüpfen, 3. Synthetasen, die DNA-Stränge an einer Einzelstrang-Matrize aufbauen, 4. Enzyme, mit denen Modifikationen am 3′- oder 5′-Ende von DNA durchgeführt werden können, und 5. Methyltransferasen. Hydrolasen. Eine sehr wichtige Gruppe sind die bereits besprochenen RestriktionsEndonucleasen. Sie stehen in einer großen Auswahl kommerziell zur Verfügung und unterscheiden sich in ihrer Erkennungssequenz und in ihrer Eigenschaft, in Nachbarschaft zur Erkennungssequenz glatt oder „klebrig“ (mit einzelsträngigem Überhang einiger Nucleotide) zu schneiden. Eine zweite, häufig verwendete Hydrolase ist die Nuclease S1, die aus dem Pilz Aspergillus oryzae gewonnen wird: sie spaltet einzelsträngige DNA oder DNA-Doppelstränge an einzelsträngigen Lücken.

Lyasen, Transferasen. Das wichtigste Enzym dieser Gruppe ist die DNA-Ligase. In der Zelle repariert das Enzym alle Brüche, die in einem Strang eines doppelsträngigen DNAMoleküls auftreten können. Da solche Brüche durch zufällige Spaltung der zelleigenen DNA-Moleküle entstehen können, aber auch das natürliche Ergebnis der Replikation und Rekombination von DNA sind, kommt DNALigase in allen lebenden Zellen vor. In der Gentechnik wird DNALigase zur Konstruktion rekombinanter DNA-Moleküle verwendet (beispielsweise zum Einbau klonierter DNA in einen Vektor). DNA-Ligase kann sowohl glatte wie klebrige Enden von DNA miteinander verbinden. Da die Ligation klebriger Enden wesentlich effizienter verläuft (die zu verknüpfenden Enden der DNA werden hierbei durch Hybridisierung bereits miteinander nichtkovalent verbunden), überführt man häufig glatte Enden von DNA-Fragmenten vor der Ligation in klebrige Enden. Dies kann durch Linker, Adapter oder das Anhängen von Polymerschwänzen (tailing) mittels terminaler Desoxynucleotidyl-Transferase geschehen. Eine detaillierte Beschreibung der Arbeitsschritte ist hier aber nicht möglich. DNA-Ligase wird meist aus Escherichia coli-Zellen gewonnen, die mit dem Bakteriophagen T4 infiziert sind (T4-DNA-Ligase), terminale Transferase aus Kalbsthymus-Gewebe. Synthetasen. Die beiden wichtigsten Enzyme dieser Gruppe sind die DNA-Polymerase I und die reverse Transkriptase. In der Zelle heftet sich die E. coli-DNA-Polymerase I in Gegenwart eines Primers an einzelsträngige DNA an und synthetisiert daraus in 5′→3′-Richtung eine doppelsträngige DNA. Das Enzym besitzt außer der Polymerase- auch 3′→5′ und 5′→3′ Exonuclease-Aktivität. Es erkennt auch kurze Einzelstrangabschnitte („Nick“) in einem ansonsten doppelsträngigen DNA-Molekül als Matrize. Entfernt man die ersten 323 Aminosäuren des aus E. coli gewonnenen Enzyms, so geht die 5′→3′ Nuclease-Aktivität verloren. Das verbleibende Klenow-Fragment besitzt nur noch 3′→5′ Nuclease- sowie Polymerase-Aktivität und füllt einzelsträngige Lücken einer doppelsträngigen DNA auf. Beide Enzyme werden auch dazu benutzt, um DNA radioaktiv zu markieren und sie damit durch Autoradiographie (Schwärzen eines Röntgenfilms) sichtbar zu machen (→60). Bevorzugt wird dazu eine Methode, klebrige 5′-überhängende Enden von DNA-Fragmenten in Gegenwart von 32Pmarkierten Nucleotiden mit Hilfe des Klenow-Fragments aufzufüllen. Thermophile DNAPolymerasen werden für die PCR-Reaktion eingesetzt. Reverse Transkriptase ist ein Schlüsselenzym von Retroviren. Das Enzym benutzt RNA als Matrize zur Synthese eines komplementären DNA-Strangs und ist damit auch das Schlüsselenzym für die cDNAKlonierung. Es wird aus Tierzellen gewonnen, die mit Retroviren wie dem AffenMyoblastosis-Virus (AMV) oder dem Moloney-Maus-Leukämie-Virus infiziert wurden. Endgruppen-modifizierende Enzyme. Oft ist es für Klonierungsexperimente erforderlich, eine terminale Phosphat-Gruppe am 5′-Ende einzuführen oder zu eliminieren. Dafür stehen mehrere Hydrolasen bzw. Transferasen kommerziell zur Verfügung. Methyltransferasen modifizieren DNA durch kovalente Bindung von Methylgruppen. Als Produkte entstehen 5-Methylcytosin, N6-Methyladenin und N4-Methylcytosin (s. Epigenetik →66). Durch Methylierung kann man synthetische DNA-Fragmente vor dem Angriff bakterieller Endonucleasen schützen.

PCR: allgemeine Methode und praktische Anwendungen Allgemeines. Die von Kary Mullis entwickelte Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist eine der praktisch wichtigsten Entdeckungen auf dem Gebiet der Gentechnik; ihr Erfinder wurde mit dem Nobelpreis ausgezeichnet. Bei der PCR wird ein kurzer, vorausbestimmbarer Abschnitt eines DNA-Moleküls viele Male von einer DNA-Polymerase kopiert. Mit anderen Worten: ein gewünschtes Genfragment kann selektiv amplifiziert werden. Eine derartige Technik ist sowohl bei der Identifizierung von DNA-Abschnitten wie bei der gentechnischen Bearbeitung von DNA von großem Wert. Methode. Für das Standardprotokoll benötigt man zwei Oligonucleotide (Primer) für die beiden Enden desjenigen DNA-Zielbereichs, den man amplifizieren möchte (eines für jeden der beiden Stränge). Die fragliche DNASequenz muss also entweder bereits bekannt sein oder aus der Übersetzung einer Proteinsequenz abgeleitet werden können (hierbei ist die Degeneration des genetischen Codes zu beachten). Außer der DNA-Matrize und den beiden Primern benötigt man noch ein Gemisch der 4 Desoxy-Nucleotide und T7-DNAPolymerase. Die PCR-Reaktion läuft dann in drei Schritten ab. Schritt 1: bei 94 °C wird der DNADoppelstrang aufgeschmolzen (Denaturierung), Schritt 2: nach Absenken der Temperatur auf 40–60 °C lagern sich die Primer an (Annealing), Schritt 3: nach Erhöhung der Temperatur auf 72 °C werden zwei neue Komplementärstränge des DNA-Zielbereichs synthetisiert (Extension). Erhitzt man erneut auf 94 °C, so lösen sich die neugebildeten Stränge wieder von der Matrize, und beim Abkühlen beginnt die Reaktion auch an den neuen Strängen erneut. Dieser Cyclus wird unter Verwendung automatisierter Thermocycler meist 25–40mal wiederholt (je nach Matrize wenige Sekunden bis Minuten pro Cyclus) und führt dazu, dass das gewünschte DNA-Fragment in wenigen Stunden in 225–40 Kopien vorliegt. Voraussetzung für die Anwendung der PCR-Methode ist, dass die verwendete DNAPolymerase die hohe Schmelztemperatur der DNA-Stränge ohne Inaktivierung übersteht. Man verwendet deshalb Polymerasen aus thermophilen Bakterien, z. B. aus Thermus aquaticus, Pyrococcus furiosus oder Thermotoga maritima (Taq-, Pfu- bzw. Tma-Polymerase). Die Fehlerrate (Mutationshäufigkeit/bp pro Verdopplung) der Taq-Polymerase liegt bei 8 · 10–6. Die anderen genannten Polymerasen sind genauer, da sie im Gegensatz zur Taq-Polymerase „Korrektur lesen“. Die Molmasse und die Ausbeute des PCR-Produkts bestimmt man mittels GelElektrophorese oder, in Echtzeit, durch den Einschluss von Reportergruppen („Light-Cycler“). Praktische Anwendungen. Mit Hilfe der PCR können einzelne Abschnitte aus einer DNA sehr schnell kloniert und sequenziert werden. Da man mit PCR einzelne DNAMoleküle bearbeiten kann, wie z. B. durch Amplifikation von DNA-Fragmenten aus einer vereinzelten Samenzelle gezeigt wurde, hat die Methode Eingang in die Gerichtsmedizin, die Archäologie und Paläontologie gefunden (→302). In der klinischen Diagnostik kann sie immer dann verwendet werden, wenn bereits ein Zusammenhang zwischen Krankheitsbild und DNA-Sequenzen bekannt ist. Dies ist für viele Infektionskrankheiten und in zunehmendem Maße auch für genetisch bedingte Erkrankungen der Fall (→302). Auch im Bereich der Lebensmittel- und Umweltanalytik überprüft man auf diese Weise beispielsweise die Anwesenheit von Material

aus transgenen Pflanzen oder die Gegenwart von infektiösen Keimen. Kennt man KonsensusSequenzen einer Proteinfamilie, so kann man durch Vorgabe entsprechender Primer nach unbekannten Mitgliedern dieser Familie suchen (reverse Genetik). Mittels gezielt veränderter Primer oder durch absichtliche Erhöhung der Fehlerrate bei der PCR-Reaktion führt man positionsspezifisch oder statistisch Mutationen in Gene ein. Schreibt man RNA mit reverser Transkriptase in cDNA um, so kann sie nach dem üblichen Schema amplifiziert werden (RTPCR). Häufige Anwendungen der RT-PCR sind a) die Bestimmung der Mengenverhältnisse von mRNA und b) der Nachweis von RNA-Viren, z. B. dem HIV-Virus. PCRTechniken wurden erfolgreich miniaturisiert: In Mikrosystemen („lab-on-a-chip“) gelang es, DNA-Proben 220fach in < 1 h zu amplifizieren. Mit sequenzspezifisch mit unterschiedlichen Fluorophoren markierten Primern kann man „Multiplex“-Assays für mehrere Gene durchführen, in klinischen Proben z. B. für SNPs (Polymorphismen) (→298, 300).

PCR: Labormethoden

Allgemeines. Die PCR-Reaktion kann außer zur DNA-Amplifikation bei einer außerordentlich großen Zahl molekulargenetischer Fragestellungen eingesetzt werden. Nachfolgend die wichtigsten Anwendungsbeispiele. Einbau von Funktionselementen. Funktionselemente sind beispielsweise: Start- bzw. Stopcodons, Klonierungsstellen (DNA-Erkennungssequenzen für Restriktionsenzyme) tags (Sequenzen, die nach der Translation zur Markierung von Proteinen dienen), oder ein N- oder C-terminales Oligo-Histidin zur schnellen Reinigung des Proteins mittels Metallaffinitätschromatographie (→106). Nachweis von RNA (RT-PCR). Mithilfe dieser Methode kann man mRNA nachweisen. Man synthetisiert einen entsprechenden Primer aufgrund der bekannten (Teil-)Sequenz von mRNA und hybridisiert diesen an die aus einer Zelle isolierte mRNA. Danach wird mRNA mithilfe einer RNA-abhängigen DNAPolymerase (reverse Transkriptase) in cDNA umgeschrieben. Die resultierende einzelsträngige cDNA kann anschließend als Ausgangsmaterial in einer StandardPCR verwendet werden, um spezifische Sequenzen zu amplifizieren. RT-PCR führt man in einem oder in zwei Schritten mit Pufferwechsel durch. Fusion von zwei DNA-Fragmenten. Zur Fusion von zwei DNA-Fragmenten oder Genen werden die gewünschten Bereiche mit Hilfe von jeweils zwei Primern in zwei getrennten PCR-Reaktionen amplifiziert, wobei PCR-Produkte entstehen, die überlappende Bereiche an der vorgesehenen Fusionsstelle besitzen, die durch die innenständige Primer eingefügt wurden. In einer dritten PCR-Reaktion werden die beiden PCR-Produkte als Matrize unter Zugabe der terminalen Primer eingesetzt, wobei die komplementären Stränge des überlappenden Bereichs hybridisieren und das Fusionsprodukt mittels der Primer weiter amplifiziert wird. Dabei ist darauf zu achten, dass das Leseraster für die gewünschten Tripletts korrekt gewählt wird. Häufig fügt man zwischen den beiden kodierenden Genen Abstandshalter ein (spacer, z. B. für Poly-l-alanin kodierende Genabschnitte), um eine freie Beweglichkeit der beiden verknüpften Proteine zu ermöglichen. Einbau oder Entfernung neuer Genabschnitte. Analog zur Genfusion können durch geschickte Auswahl und Kombination terminaler und innenständiger Primer Genabschnitte entfernt oder eingefügt werden. Positionsgerichtete Mutagenese. (→198) Gentechnische Methoden zur Mutagenese bestimmter Aminosäuren in einem Protein sind äußerst nützlich. Man verwendet diese Methode beispielsweise, um Aufschlüsse über den Reaktionsmechanismus eines Enzyms zu erhalten oder seine Aktivität oder Substratspezifität gezielt an ein technisches Erfordernis anzupassen. Da DNA-Fragmente auch noch dann hybridisieren, wenn einzelne Nucleotide nicht mehr passen, kann der Triplett-Code einer gewünschten Zielsequenz modifiziert und durch PCRReaktion amplifiziert werden. Eine bevorzugte Methode zur positionsgerichtete Mutagenese nutzt zwei komplementäre, die Mutation tragende Oligonucleotide und ein doppelsträngiges Plasmid als Matrize. Hierbei wird mit Hilfe der Primer und einer DNA-Polymerase (z. B. PfuPolymerase) das gesamte Plasmid in vitro amplifiziert. Die Abtrennung der vorher methylierten Matrizen-DNA (die in vitro hergestellte DNA ist nicht methyliert) erfolgt anschließend durch Verdau mit der Restriktionsendonuclease DpnI, die nur methylierte DNA

spaltet. Die neu synthetisierte DNA, die die Mutation trägt, kann direkt in E. coli transformiert werden, und zeitraubende Klonierungsschritte entfallen. Multiplex PCR. In einer einzigen PCR-Reaktion können durch Verwendung geeigneter PrimerKombinationen mehrere Sequenzen amplifiziert werden. PCR mit degenerierten Primern (DP). DP sind Familien homologer Sequenzen einer synthetischen, einzelsträngigen DNA, in der eines oder mehrere Nukleotide entweder durch ein beliebiges Nukleotid oder durch Desoxy-inosin (dI) ersetzt sind. dI paart mit allen anderen Basen und kann deshalb immer dann eingesetzt werden, wenn die korrekte DNA-Sequenz unbekannt ist, z. B. wenn sie aus einer Protein-Sequenz abgeleitet werden muss (ungewisse Codon-Nutzung). Bei DP handelt es sich somit um ein Gemisch aus ähnlichen Primersequenzen. Mithilfe DP können mehrere homologe Gene mit einem Primer-paar amplifiziert werden.

DNA: Synthese und Größenbestimmung Allgemeines. Kurze einzelsträngige DNAFragmente bis zu ca. 100 Basen (Oligonucleotide) sind Chemikalien, die einfach, kostengünstig und schnell im chemischen Labor synthetisiert werden können. Man benötigt sie für zahlreiche Arbeitsschritte der Gentechnik, beispielsweise als primer für die PCRReaktion. Zur Molmassenbestimmung von DNA-Fragmenten bis ca. 30 kbp benutzt man meist die Gelelektrophorese in Gegenwart von Eich-DNA bekannter Größe (→106). DNA-Synthese. Die Methode der Wahl ist das Phosphoramidit-Verfahren, das meist in Syntheseautomaten durchgeführt wird. Alle vier Nucleotidbasen (A, C, G und T) liegen dazu

als Phosphoramidite vor, bei denen die 3′-Phosphit-Gruppe mit einer Diisopropylamin- und einer Methyl-Gruppe, die 5′-Hydroxy-Gruppe der Desoxyribose und die Amino-Gruppen der Purin- und Pyrimidinbasen mit anderen Gruppen geschützt sind. Man bindet Nucleosid 1 an ein unlösliches Trägermaterial. Chemische Deblockierung der 5′-Hydroxy-Gruppe führt zu einem nucleophilen Angriff auf die mit Tetrazol aktivierte Phosphoramidit-Gruppe des zudosierten Nucleosids 2. Die entstandene Phosphittriester-Bindung wird anschließend mit Iod zum 5wertigen Phosphatester oxidiert. Dieser Cyclus, der im Gegensatz zur biologischen DNASynthese von 3′→5′ verläuft, wird für jede Base wiederholt, am Ende alle Schutzgruppen abhydrolysiert und das einzelsträngige Oligonucleotid durch Gelelektrophorese oder HPLC gereinigt. Selbst bei 98 %iger Ausbeute für jeden Cyclus sinkt die Gesamtausbeute bei 20meren auf 67 %, bei 40meren auf 45 % und führt zu schwer analysierbaren und schwer zu reinigenden DNA-Gemischen. Für die Synthese längerer DNA-Abschnitte oder ganzer Gene aus Oligonnucleotiden werden daher komplexere, meist auf der PCR-Reaktion beruhende Strategien erforderlich. Oligonucleotide benötigt man 1. zur Synthese von Genfragmenten oder kürzeren Genen, 2. als Sonde oder primer zum Nachweis oder zur Isolierung von Genfragmenten oder Genen aus genomischer oder cDNA mittels Hybridisierung oder PCR, 3. zur positionsgerichteten Mutagenese und 4. für die DNA-Sequenzierung. Die Synthese von DNA-Fragmenten erfolgt heute in aller Regel durch spezialisierte Firmen, die gute Qualität, schnelle Lieferung und niedrigen Preis garantieren. Größenbestimmung von DNA. (→198) Aufgrund ihrer negativen Ladung läßt sich DNA leicht durch Gelelektrophorese auftrennen. Die dazu verwendeten Gele aus Agarose (großporig), Polyacrylamid (kleinporig) oder Mischungen beider Materialien ermöglichen dabei aufgrund ihres Maschencharakters eine Auftrennung nach der Molmasse und die schnelle Bestimmung der Molmassenverteilung von DNA-Fragmenten bis ca. 30 kb mit hoher Präzision. Die DNA wird dazu mit Ethidiumbromid (EtBr) oder durch Autoradiographie nach radioaktiver Markierung sichtbar gemacht. Die Molmasse kann aus der Wanderungsstrecke errechnet werden. In der Regel führt man jedoch eine Eichung des Gels mit DNA-Markern unterschiedlicher Größe durch und wertet visuell aus. Ethidiumbromid ist gentoxisch und muss unter entsprechenden Sicherheitsvorkehrungen verwendet und entsorgt werden. Die Empfindlichkeit der Methode ist auf > 25 ng DNA begrenzt. Bei der weitaus empfindlicheren Autoradiographie werden mit 32P-Isotopen-markierte Nucleotide eingesetzt; die Versuche können aber nur in Isotopenlabors und unter Sicherheitskontrollen durchgeführt werden. Als weniger aufwändige Verfahren zur DNA-Visualisierung (→84) setzen sich deshalb zunehmend Methoden durch, die auf der Markierung mit Fluoreszenzfarbstoffen beruhen (SYBR-Green, Sensitivität 25–100 mal höher als EtBr, Nachweis von > 250 pg DNA möglich). Die Detektion erfolgt dann im Phosphoimager nach Anregung zur Fluoreszenz. Die Ermittlung der Molmasse von DNA-Fragmenten ist beispielsweise wichtig bei der Restriktionsanalyse unbekannter DNA und der daraus abgeleiteten Restriktionskarte und bei der PCR-Klonierung von Genen oder Genfragmenten aus chromosomaler, Plasmidoder viraler DNA. Synthese von Genen und Genomen. Durch Kombination der chemischen Synthese von Oligonukleotiden und deren Zusammenbau mittels PCR-Methoden lassen sich längst vollständige Gene, Multi-Gen-Stoffwechselwege oder Gene für Antikörper-Varianten

synthetisieren. Auch das Genom von Mycoplasma capriolum mit 106 bp wurde 2007 auf diesem Weg synthetisiert (→320).

DNA: Sequenzierung Allgemeines. Bei der Sequenzierung von DNA konkurrieren die Methoden nach SangerCoulson und nach Maxam-Gilbert. Beide erlauben es, einzelsträngige DNA-Fragmente bis zu einer Länge von etwa 600 b zu sequenzieren. Längere DNA-Abschnitte müssen aus kürzeren, überlappenden DNA-Sequenzen abgeleitet werden. Für die Sequenzierung umfangreicher DNA-Proben, wie sie bei den Genomprojekten anfallen, verwendet man heute hochautomatisierte Methoden, bei denen anstelle der klassischen radioaktiven Markierung Fluoreszenzmarker zum Einsatz kommen. Derartige Sequenzierungsprojekte stellen hohe Anforderungen an den Computer-gestützten Vergleich der Sequenzierungsergebnisse und haben dazu beigetragen, die Bioinformatik voranzubringen (→324). Sanger-Coulson-Methode. Dabei wird die zu untersuchende Einzelstrang-DNA in einen vom Phagen M13 abgeleiteten Vektor einkloniert. In einem Reaktionsgemisch aus Klenow-Fragment oder, mittlerweile weit bevorzugt, T7-DNA-Polymerase, einem kurzen, synthetischen Oligonucleotid (Primer) und den vier Desoxynucleotiden dATP, dTTP, dGTP und dCTP lässt sich dann an der Einzelstrang-Matrize der DNA-Doppelstrang aufbauen. Gibt man zu vier getrennten Ansätzen dieser Reaktionsmischung in geringen Konzentrationen jeweils eines der vier Didesoxynucleotide ddATP, ddTTP, ddGTP und ddCTP, so verursachen diese an der Stelle ihres Einbaus einen Kettenabbruch. Dieser Vorgang ist statistisch, so dass man ein Gemisch aller denkbaren Kettenlängen erhält. Auftrennung der vier Ansätze durch Gelelektrophorese ergibt über die Molmasse der Fragmente die Sequenzabfolge der Nucleotide. Zur Visualisierung verwendet man die Autoradiographie nach Zusatz eines 32Poder 35S-markierten Nucleotids. Maxam-Gilbert-Methode. Diese heute weit seltener verwendete Methode beruht auf der partiellen chemischen Spaltung doppelsträngiger DNA in vier unabhängigen chemischen Reaktionen nach einseitiger endständiger Markierung. Die dafür ausgearbeiteten Reaktionsschritte (z. B. Behandlung mit Ameisensäure, Dimethylsulfat, Hydrazin usw.), sind 2– 3-stufig und führen zu einer (teil-)selektiven Abspaltung der jeweiligen Base und anschließendem Strangbruch, wobei unterschiedliche lange, an einem Ende markierte DNAFragmente entstehen, die ebenfalls durch Gelelektrophorese und Autoradiographie sichtbar gemacht werden können. Durch Entwicklung eines Festphasen-Prozesses und Fluoreszenzmarkierung der endständigen Base gelang es, auch diese Methode zu automatisieren. Hochautomatisierte Methoden. Die lange bevorzugte Methode beruhte auf den Arbeitsschritten von Sanger-Coulson, wobei allerdings mehrere Modifikationen verwendet wurden: 1. Sequenzierung von doppelsträngiger DNA mit Hilfe eines spezifischen Primers in einer PCR-ähnlichen Reaktion (cycle sequencing), 2. die Markierung der vier Typen von Kettenabbruchfragmenten erfolgt nicht mit radioaktiv markierten Didesoxynucleotiden, sondern direkt mit Hilfe von vier Didesoxynucleotid-Derivaten, an die ein für die jeweilige Base spezifischer Fluoreszenzmarker gekoppelt ist. Diese Technik ermöglichte die Sequenzierung aller vier Nucleotide in einem einzigen Reaktionsansatz und erlaubte nach Auftrennung der

unterschiedlich langen DNA-Fragmente mittels Gelelektrophorese die zeitaufgelöste Detektion der Molmassen der Fragmente, aus denen sich direkt die DNA-Sequenz ergab. Die Leseweite betrug ~ 900 b, die Dauer eines Cyclus 13 h + 2 h Rüstzeit. Bei Verwendung hochparalleler Geräte (96 DNA-Fragmente in Parallel-Ansätzen [lanes]) betrug der Durchsatz ca. 10 000 b/15 h pro Gerät. Mit der Einführung der Kapillarelektrophorese anstelle der Gelelektrophorese zur Trennung erreichte man bei der zeitaufgelösten Detektion von DNAFragmenten eine weitere Beschleunigung. Bei einer Leseweite von 650 b und einer CyclusDauer von nur 3 h + 1 h Rüstzeit analysierte man in einem derartigen Gerät mit 96 Kapillaren ca. 6500 Nucleotide in 4 Stunden oder ca. 40 000 Nucleotide am Tag pro Gerät. Geräte mit 384 Kapillaren wurden entwickelt, sind aber durch neue Konzepte bereits wieder überholt. Aktuelle Trends des „high-throughput sequencing“ (HTS) werden im Kapitel „Megatrends“ beschrieben (→312). Wegen der Lesefehler bei der Sequenzierung von Genomen sind Mehrfachbestimmungen jeder Sequenz erforderlich. Genom-Analysen werden deshalb meist in spezialisierten „Sequenzierfabriken“ durchgeführt, die Hochleistungs-computer zum Sequenzabgleich vorhalten.

Einführung von DNA in lebende Zellen (Transformation) Allgemeines. In der Natur kann DNA auf mehrere Arten in lebende Zellen eingeschleust werden: 1. Übertragung mit Plasmiden, Viren oder Phagen (Konjugation, Transduktion, Infektion) (→8, 38) oder 2. durch direkte Aufnahme (Transformation). Haben Zellen fremde DNA aufgenommen, so spricht man von transformierten Zellen. Mit Hilfe der Gentechnik überträgt und exprimiert man meist fremde (heterologe) Gene in Wirtszellen. Plasmide kommen fast ausschließlich in Bakterien vor (→38). Es sind meist ringförmige, doppelsträngige DNA-Moleküle, die sich extrachromosomal replizieren, aber auch in das Bakterienchromosom integrieren können (Episome). Plasmide enthalten einen ReplikationsStartpunkt und fast immer ein oder mehrere für das Bakterium nützliche Gene (Beispiel: Antibiotika-Resistenz). Plasmid-DNA lässt sich leicht von chromosomaler DNA abtrennen und wie diese mit Hilfe von Enzymen bearbeiten. Dabei entstehen Klonierungs- und ExpressionsVektoren für die Gentechnik. Die wichtigsten Funktionsmerkmale eines Plasmid-Vektors sind 1. ein Replikations-Ursprung für die Replikation im Wirtsorganismus (ori = origin of replication), 2. optional: Replikations-Startpunkte für andere Wirtsorganismen („shuttleVektor“); dies ermöglicht genetische Experimente in leicht handhabbaren Organismen wie E. coli und die Übertragung des optimierten Vektors in den gewünschten Wirtsorganismus, 3. nur einmal vorkommende Restriktionsschnittstellen, um fremde Genabschnitte zu integrieren (MCS, multiple cloning sites), 4. einen oder mehrere Resistenzoder Auxotrophie-Marker. Reporter-Gene erleichtern das Screening transformierter Klone. Beim so genannten „blauweiß-Screening“ werden pUC-Plasmide verwendet, bei denen die MCS vom α-Peptid der βGalactosidase (lacZ′) flankiert wird; dieses komplementiert das chromosomale lacZ-Gen eines E. coli-Wirtsstamms, dem der lacZ′-Genabschnitt fehlt. Deshalb bilden nur transformierte Klone funktionelle β-Galactosidase. Sie geben sich bei Zugabe des Leuko-Farbstoffs 5-Brom-

4-chlor-3-indolyl-β-d-galactopyranosid (X-Gal) durch Bildung von tiefblauem 5,5-Dibrom4,4-dichlor-indigo zu erkennen. Wurde dagegen ein Gen erfolgreich in die MCS eingefügt, bleiben die Kolonien weiß. Plasmid-Vektoren sind meist < 10 kbp groß, um eine leichte Handhabung zu ermöglichen und einem negativen Selektionsdruck bei der Zellteilung zu entgehen. Die meisten Plasmid-Vektoren wurden für E. coli entwickelt, aber auch für Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces, Lactobacillen und einige andere Bakterien stehen für die Gentechnik geeignete Plasmide zur Verfügung. Bei Eukaryoten sind Plasmide selten. Zu den wenigen Beispielen gehört das 2μ-Plasmid von Saccharomyces cerevisiae (→14). Mit Vektoren, die vom Ti-Plasmid (→280) des Bodenbakteriums Agrobacterium tumefaciens abgeleitet sind, werden vor allem dikotyledone Pflanzen transformiert. Bakteriophagen und Viren erlauben, dank ihrer Infektiosität, die Übertragung von genetischem Material auf Wirtszellen. Will man sie als Vektoren verwenden, so attenuiert man (schwächt man) sie durch Eliminierung der für die Zell-Lyse oder andere Pathogenitätsmechanismen verantwortlichen Genabschnitte. Für die meisten Bakteriengattungen sind spezifische Phagen bekannt; viele von ihnen werden in der Gentechnik verwendet, darunter der E. coli-spezifische λ- und M13-Phage (→8). Auch für die Transformation von tierischen Zellkulturen, von Pflanzen und für die Gentherapie (→304) bei Mensch und Tier hat man Vektoren auf der Basis attenuierter Viren entwickelt. Nicht-biologische Methoden umfassen chemische und physikalische Verfahren. Eine bei E. coli häufig verwendete Methode ist die „Hitzeschock-Transformation“, bei der mit CaCl2 oder RbCl2 vorbehandelte Zellen durch kurze Temperaturerhöhung (42 °C für 60 sec) für die Aufnahme fremder DNA „kompetent“ gemacht werden. Bei der Elektroporation induziert man durch einen kurzen elektrischen Impuls die Bildung DNA-durchlässiger Poren in der Zellmembran. Die bei der Transformation von Pflanzen bewährte Biolistik (→280) wird dort beschrieben. Für die Transformation der zellwandlosen Tierzellen oder von zellwandfreien Pflanzen-Protoplasten präzipitiert man DNA als Ca-Salz an der Oberfläche der Zellen und löst damit Endocytose aus. Auch die Fusion mit Liposomen, die DNA enthalten, hat sich bewährt (Lipofektion), ebenso wie die Mikroinjektion von DNA in den Zellkern eukaryoter Zellen (→266).

Klonierung und Identifizierung von Genen Allgemeines. Die Klonierung eines Gens, dessen Sequenz bekannt ist oder aus AminosäureTeilsequenzen des von ihm kodierten Proteins abgeleitet werden kann, gelingt meist mit PCRMethoden (→52). Zur Klonierung eines Gens unbekannter Sequenz erstellt man meist eine Genbibliothek aus genomischer (Prokaryoten) oder cDNA (Eukaryoten) und transformiert damit Wirtszellen. Dann identifiziert man diejenigen Klone, die den gesuchten DNA-Abschnitt enthalten. Man sucht direkt nach einem klonierten Gen, nach der davon transkribierten mRNA oder nach dem Gen-Produkt.

Klonierung mit PCR-Methoden. Liegen genügend Sequenzinformationen über das gesuchte Gen oder das Gen-Produkt vor, so können daraus synthetische Primer für die PCR-Reaktion abgeleitet werden. Man modifiziert diese meist so, dass der amplifizierte DNA-Abschnitt, um Restriktionsschnittstellen ergänzt, direkt in eine Expressionskassette ligiert werden kann. Genbibliotheken. Dazu werden Wirtszellen (Bakterien, Tier-, Pflanzen-, Insektenzellen) mit den in einen Vektor einklonierten Genfragmenten einer Gen- oder cDNA-Bank transformiert (→68). Da bei dieser Methode eine große Zahl verschiedener Klone entstehen, benötigt man leistungsfähige Selektionsverfahren. Dazu enthält der Vektor Marker-Sequenzen, die eine Identifizierung der transformierten Zellen auf einem Selektionsagar erlauben. Verwendet man z. B. als Marker-Gen eine Antibiotika-Resistenz, so überleben auf einem Antibiotika-haltigen Selektionsagar nur die Transformanden. Beim marker rescue-Verfahren wird eine auxotrophe Mutante eines Wildstamms mit DNA-Fragmenten aus einer Genbank transformiert, unter denen sich das für die Auxotrophie verantwortliche Gen befindet. Komplementierte Transformanden können wieder auf Minimal-Medium ohne Zusatz wachsen. Meist verwendet man zwei Marker-Gene; das eine dient zur Selektion von Transformanden, das andere enthält eine Klonierungsstelle für fremde DNA (multiple cloning site). Der erfolgreiche Einbau eines fremden Gens in diese Klonierungsstelle gibt sich durch den Verlust des entsprechenden Phänotyps, z. B. den Verlust der Antibiotika-Resistenz, zu erkennen. Nach dieser biologischen Vorauswahl, die das Durchmustern großer Zellbanken erlaubt, werden positive Transformanden weiter analysiert. Nachweis von Genen und Genprodukten. Die wichtigsten Nachweismethoden beruhen 1. auf genspezifischen Hybridisierungssonden für DNA bzw. RNA und 2. auf der Expression des Genprodukts, einem Protein oder Protein-fragment. Zur ersten Gruppe gehört die Hybridisierung einzelsträngiger DNA-Fragmente des Transformanden mit einer genspezifischen DNA-Sonde, die radioaktiv oder anderweitig markiert ist (Southern Blot). Alternativ kann man auch die von einem einklonierten Gen transkribierte mRNA mit einer komplementären, markierten DNA- oder RNA-Sonde nachweisen (Northern Blot). Häufig kennt man die DNA-Sequenz des Genprodukts noch nicht. In diesem Fall stellt man die Genbank in einem Vektor her, der die Expression des Genprodukts ermöglicht. Das gesuchte Protein kann dann häufig direkt mit Hilfe spezifischer Antikörper (Western Blot) identifiziert werden. Oft gelingt es mit dieser Methode auch, Fragmente des gesuchten Proteins zu erkennen. Das ist nützlich, weil das klonierte Gen bei der Herstellung der Genbank zerschnitten worden sein kann und nun verteilt auf zwei oder mehr Transformanden vorliegt. Sucht man in einer Genbank nicht nach funktionellen Proteinen (kodiert in „offenen“ Leserastern), sondern nach DNA-kodierten Regulationselementen, z. B. Promotoren, so verwendet man Vektoren, die nach der Klonierungsstelle ein Reportergen (z. B. Luciferase) tragen. Ein klonierter Promotor gibt sich dann durch Expression des Reportergens zu erkennen. Weitere Nachweismethoden. Zum Nachweis heterologer DNA bekannter Sequenz, die in ein großes Genom einkloniert wurde, verwendet man PCR-Methoden mit genspezifischen Primern. Bei unbekannter Sequenz kann man die Restriktionsmuster von Wildtyp- und TransformandenDNA bei der Gelelektrophorese vergleichen und darauf achten, ob neue DNA-Spezies auftauchen.

Identifizierung von Genen. Zur Identifizierung der wahrscheinlichen Genfunktion dienen Methoden der Bioinformatik, vor allem die BLAST-Analyse (Basic Local Alignment Search Tool) in Genbanken (→326). Identifizierung von Genen. Zur Identifizierung der wahrscheinlichen Genfunktion dienen Methoden der Bioinformatik, vor allem die BLAST-Analyse (Basic Local Alignment Search Tool) in Genbanken (→326).

Genexpression Allgemeines. Die funktionelle Expression eines Gens oder eines Operons (mehrere koordiniert exprimierte Gene) ist ein Hauptziel gentechnischer Arbeiten. Man kann Gene durch homologe Rekombination in das Genom eines Wirtsorganismus integrieren (bei fast allen eukaryotischen Wirtssystemen) oder mit Hilfe von Expressionsvektoren extrachromosomal replizieren (häufigere Methode in Bakterien, z. B. Escherichia coli). Expressionsvektoren enthalten neben dem gewünschten Gen meist induzierbare Promotoren, die ein An- und Abschalten des übertragenen Gens durch die Wahl der Außenbedingungen erlauben. Bei höheren Organismen wie Pflanzen oder Tieren kann man fremde Gene unter der Kontrolle spezifischer DNA-Sequenzen in ein bestimmtes subzelluläres Kompartiment lenken (z. B. in den Chloroplasten) und sie dort exprimieren. Expressionsvektoren für Prokaryoten. Ein typischer Vektor für Bakterien, z. B. für E. coli, enthält neben dem origin of replication (ori) und einem Resistenzgen ein Strukturgen (offenes

Leseraster oder open reading frame, ORF) oder Operon, das mit dem Startcodon ATG beginnt und mit einem Stopcodon endet. Eine Reihe von Erkennungssequenzen geben dem Transkriptions- und Translationsapparat der Zelle die Befehle zur Bildung des Genprodukts. Bei E. coli bindet das Transkriptions-Enzym RNA-Polymerase an die stromaufwärts des ORF gelegenen sogenannte –35 und –10-Boxen des Promotors und beginnt mit der Transkription des Gens in mRNA. Die Transkription endet an einem stromabwärts des ORF gelegenen Transkriptionsterminator, manchmal in Form von Stammschleifen-Regionen der mRNA. Für Expressionsvektoren wählt man in der Regel induzierbare Promotoren aus. Beispielsweise kann der Promotor für das Lactose-Operon (lac) von E. coli durch Zugabe des Induktors Isopropyl-β-d-Thiogalactosid (IPTG) zum Medium „eingeschaltet“ werden; dabei löst der Induktor ein Repressorprotein vom Promotor ab, so dass die RNA-Polymerase binden kann. Viele Expressionsvektoren sind kommerziell erhältlich. Sie enthalten eine MehrfachKlonierungsstelle (multiple cloning site MCS) mit im Vektor nur einmal vorkommenden Restriktionsschnittstellen, in die das fremde Gen enzymatisch ligiert wird. Expressionsvektoren für Eukaryoten sind prinzipiell ähnlich aufgebaut. Sie besitzen Selektionsmarker, einen meist induzierbaren Promotor mit Konsensussequenzen (TATA-, CCAAT-, GC-Boxen), ein Startcodon (ATG), daran anschließend eine MehrfachKlonierungsstelle (MCS) für die Ligation von Genen und eine Terminator-Sequenz. Die bei der Transkription entstehende mRNA ist am 3′-Ende polyadenyliert (PolyA-Sequenz). Weitere spezifische Signal-Sequenzen führen zum Transport und zur Expression des Gens in dem gewünschten Zellkompartiment. Eukaryotische Expressionsvektoren für höhere Organismen replizieren selten autonom und werden durch Rekombinationsprozesse in ein Chromosom des Wirtsorganismus eingebaut. Um Klone transformierter Tierzellen mit hoher Kopien-Zahl des heterologen Gens zu selektionieren, kloniert man häufig zusätzliche Resistenz-Gene ein, z. B. Dihydrofolat-Reduktase (DHFR) oder Neomycin-Phosphotransferase (→98); nur Zellen mit hoher Kopien-Zahl dieser Resistenzgene haben dann die Eigenschaft, in Gegenwart hoher Konzentrationen von Inhibitoren wie Metho-trexat oder Neomycin zu wachsen. Promotoren. Man kennt starke und schwache Promotoren. In der Gentechnik verwendete Promotoren sollen die gewünschte Stärke besitzen und „dicht“, d. h. durch äußere Maßnahmen zuverlässig ein- und abzuschalten sein. Typische Promotoren für E. coli sind die lac-, trp-, tac- oder rha-Promotoren, die durch Zugabe von Reagenzien zum Medium induziert werden (beispielsweise L-Rhamnose beim rhaPBAd-Promotor). Der λPLPR-Promotor, kann durch Temperaturerhöhung von 30 auf 42 °C induziert werden. Für die Klonierung und Expression in Pilzen verwendet man beispielsweise den Galactose-Promotor GAL10 (Saccharomyces cerevisiae), den Alkohol-Oxidase-Promotor AOX (Pichia pastoris) sowie den GlucoamylasePromotor (Aspergillus), für tierische Zellkulturen den Metallothionein-Promotor (→98). Bei transgenen Tieren und Pflanzen wählt man häufig Promotoren aus, die vom Wirtsorganismus reguliert werden. So kloniert man bei transgenen Tieren das Zielgen häufig hinter den starken Lactalbumin-Promotor der Milchdrüse (→272); das rekombinante Produkt wird dann bei induzierter Lactation in großen Mengen gebildet.

Abschalten von Genen Allgemeines. Das gezielte Abschalten von Genen ist ein wichtiges Hilfsmittel der biotechnologischen Forschung, ist doch die Eliminierung unerwünschter Eigenschaften eine wichtige Aufgabe bei der züchterischen Verbesserung von Tieren und Pflanzen, bei der Stammentwicklung von Mikroorganismen und in der Medizin (Beispiel: Tumortherapie). Anders als bei der ungezielten Auslösung von Mutationen durch mutagene Chemikalien oder Bestrahlung haben gentechnische Methoden das Potenzial, ein oder wenige Gene gezielt abzuschalten (gene silencing, knock-out). Mit dem genome editing mittels Endonukleasen wurde in den letzten Jahren eine neue Methode entwickelt, um Gene oder ganze Operons aus einem Genom zu eliminieren. Knock-out durch Einklonieren von DNA. Für die Transformation von Pflanzen und Tieren benutzt man DNA-Vektoren, die homolog zu einem Exon-Bereich des Zielgens sind, aber durch Mutation oder Deletion nicht mehr für ein funktionsfähiges Protein kodieren. Für eine

eindeutige Rekombination muss die Länge des Insertionsfragments ca. 150 bp betragen. Da Rekombinationsereignisse selten sind (< 10–3), benötigt man analog zur Klonierung in Prokaryoten Marker für die Selektion. Meist werden dazu Wachstumshemmer verwendet, gegen die erfolgreich transformierte Zellen resistent sind (Beispiel: Methotrexat, hemmt die Dihydrofolat-Reduktase) (→98). Antisense-Technik. Hierbei ligiert man das Gen, das gehemmt werden soll, in umgekehrter Richtung in einen Expressionsvektor und benutzt diesen zur Transformation. Die bei der Transkription dieses Vektors entstehende mRNA (Antisense-RNA, asRNA) ist komplementär zur mRNA des normalen Gens und verhindert die Synthese des Genprodukts. Wahrscheinlich kommt es dabei durch Hybridisierung zur Bildung eines RNADoppelstrangs, der entweder nicht mehr an die Ribosomen anheften kann oder schnell von zelleigenen Ribonucleasen abgebaut wird (→42). Die Antisense-Technik eröffnet in der Medizin einen interessanten Therapieansatz, der die Gentherapie ergänzt: liegt eine Krankheitsursache in der fehlerhaften Regulation der Bildung eines Genprodukts, so hätte der Ersatz des Gens (Gentherapie) geringere Aussichten auf Erfolg als das Ausschalten des Gens. Tatsächlich gelang es im Tierversuch, die krebsauslösenden Eigenschaften von Hirntumorzellen (Glioblastom), deren maligne Eigenschaften auf eine gestörte Regulation des Gens für den insulinähnlichen Wachstumsfaktor zurückgehen, durch Expression von asRNA zu unterbinden. Während bei dieser Methode der RNA-Interferenz (RNAi) doppelsträngige small interfering RNA (siRNA) gebildet wird, die in einem RISC-Komplex die Ziel-mRNA abbaut, versucht man auch, asRNA direkt therapeutisch einzusetzen. RNA wird allerdings schnell durch Ribonucleasen abgebaut. Man untersucht deshalb RNase-resistente Analogverbindungen (z. B. Phosphorthioate). 2012 befanden sich über 40 asOligonukleotide und siRNAs in der klinischen Erprobung. 2014 waren zwei davon in den USA zugelassen: Fomivirsen, ein Therapeutikum gegen Cytomegalievirus-Infektionen bei immunsupprimierten Patienten, und Mipomirsen, das die Bildung von Apolipoprotein B verhindert (Behandlung der homozygoten familären Hypercholesterinämie). Ein historisches Beispiel der antisense-Technik in der Pflanzenzucht ist die FlavrSavr™-Tomate, die länger reift und dabei mehr Aroma bildet (→282). Transformierte Pflanzen enthalten allerdings noch die als Marker verwendeten Antibiotika-Resistenzgene. Kritiker befürchten zum einen allergene Wirkungen dieses fremden Genprodukts, zum anderen einen horizontalen Transfer der Antibiotika-Resistenz im ökologischen System. Genome Editing. Verschiedene Methoden erlauben die Editierung von Genabschnitten; sehr effizient ist die homologe Rekombination mit doppel- oder einzelsträngiger DNA. Die selektive Erkennung der Zielsequenzen im Genom erfolgt dabei durch an DNA bindende und durch Protein Engineering veränderte Nucleasen, Zinkfinger (ZFNs)- oder TAL-EffektorNucleasen (TALEN). Auch das RNAabhängige CRISPR/Cas9-Nuklease-System erlaubt das gezielte Engineering großer Genome. Die Methode hat ein großes Potenzial für die Gentherapie, aber auch für die Pflanzen- und Tierzucht (→264, 274). So gelang es bereits, in iPS-Zellen von Duchenne-Muskeldystrophie-Patienten das Dystrophin-Gen zu reparieren bzw. die Biosynthese des toxischen Lectins Ricin im Wunderbaum (Ricinus communis) zu unterbinden.

Epigenetik

Allgemeines. Der Begriff “Epigenetik“ wird benutzt, um vererbliche und nicht vererbliche Veränderungen bei Genfunktionen zu beschreiben, die nicht auf Veränderungen in der DNASequenz zurückzuführen sind. In höheren Organismen wird die Zellteilung begleitet von Differenzierungsvorgängen zu unterschiedlichen Zelltypen. Bei diesem epigenetischen Prozess kommt es zu kovalenten Veränderungen an der DNA und an den Histonen, die zu einem Abschalten von DNA-Regionen führen und von da ab die funktionelle Identität dieses Zelltyps während seines gesamten Lebenszyklus fixieren. Auch DNA-Schäden (beim Menschen ~ 10 000 pro Zelle pro Tag) führen zu epigenetischen Veränderungen, obwohl die meisten Schäden repariert werden. Mechanismen. Epigenetische Veränderungen erfolgen a) durch post-translationale Veränderungen an Aminosäuren der Histone, und b) durch Methylierung von DNA. HistonModifikationen umfassen Acetylierungen, Methylierungen, Ubiquitinylierungen, Phosphorylierungen oder Sumoylierungen (Modifikation durch ein SUMO1-Protein), die Form und/oder Ladung einer Histon-Domäne verändern und damit Einfluss auf die Expression von Genen nehmen, die von dieser Domäne eingeschlossen werden. Mehrere Enzyme, die solche Veränderungen durchführen, sind gut beschrieben, z. B. die Histon-Lysin Methyltransferase (KMT) die auf die Histone H3 und H4 einwirkt. Daneben gibt es Enzyme, die Histone demethylieren, z. B. die Histon-Lysin Demethylase (KDM), die bis zu 3 Methylgruppen von Histonen H3 oder H4 entfernen kann. Die Methylierung von DNA durch DNAMethyltransferasen (→48) erfolgt häufig in GpC-Wiederholungssequenzen. Das Produkt, 5Methyl-cytosin, kann spontan zu Thymin desaminieren, wodurch dauerhafte Mutationen ausgelöst werden. Die Methylierung von nur einem Strang der DNA-Doppelhelix erfolgt während der Meiose, um den maternalen oder paternalen DNA-Strang abzuschalten (epigenetisches Imprinting). Bei der Mitose überträgt eine DNA-Methyltransferase, DNMT1, bei der DNA-Replikation das Methylierungs-muster auf jeden neu synthetisierten Strang („maintenance transferase“). Nicht-kodierende RNAs sind wahrscheinlich durch Modulation von Promotoren bei der Gen-Expression ebenfalls an epigenetischen Regulierungsvorgängen beteiligt. Funktionen. Epigenetische Veränderungen lassen sich in vorbestimmte und zufällige Ereignisse unterteilen. Vorbestimmt ist die zelluläre Differenzierung multizellulärer eukaryotischer Organismen. Zufällig sind dagegen Erbanlagen, wie sie über das genomische Imprinting auf die Nachkommen übergehen (Vater und Mutter tragen unterschiedliche epigenetische Muster in ihren Geschlechtszellen). Bei Mäusen wurde gezeigt, dass traumatische Erlebnisse mittels epigenetischer Veränderungen über zwei Generationen hinweg vererbt werden können: so wiesen Nachkommen von Mäusen, die einem Kirschblüten-Aroma ausgesetzt waren und dabei Elektroschocks erhielten, dieses Aroma wesentlich heftiger zurück als untrainierte Vergleichstiere. Eine Vererbung umweltbedingter Erkrankungen beim Menschen wurde bei einer Studie in dem schwedischen Dorf Överkalix gezeigt. Medizinische Relevanz. Tumorzellen weisen häufig von gesundem Gewebe abweichende Methylierungsmuster auf. So ermöglicht z. B. die Diagnose spezifischer Mutationen im TumorSuppressor-Gen BRCA2 (für breast cancer 2, early onset) eine Risikoprognose für Brustkrebs oder ein erbliches Brust-Ovar-Carcinom. Mutationen am BRCA2-Gen als Folge epigenetischer

Veränderungen können zu einer verringerten DNAReparaturleistung eines Protein-Komplexes führen, der unter anderem vom BRCA2-Protein gebildet wird. Mikroorganismen. Bakterien methylieren DNA an Adenin-, nicht an Cytosin-Resten. Dieser Vorgang ist wichtig für die Fehlerkorrektur frisch replizierter DNA. Ein verändertes Methylierungsmuster steuert aber auch die Virulenzpathogener Mikroorganismen, wie bei E. coli, Salmonellen, Vibrien, Yersinien und Brucellen gezeigt wurde. So stellte sich heraus, dass der Stamms E. coli O104:H4, der 2011 in Deutschland über 50 Todesfälle verursacht hatte, sowohl das Gen für die Synthese des Shiga-Toxins, als auch die DNA-Methyltransferase eines Phagen erworben hatte, der das „Methylom“ und damit die Virulenz dieses Stamms völlig veränderte. Analytische Methoden. Die Methylierung bakterieller Genome bestimmt man durch Sequenzierung (→56, 312) oder PCR-Methoden (→52). Eine klassische Methode ist die Vorbehandlung von DNA mit Natriumbisulfit, bei der nicht methyliertes Cytidin in Uracil umgewandelt werden. Die Methylierungspositionen erhält man durch einen Vergleich der Sequenzen vor und nach der Umsetzung.

Genbanken und Genkartierung Allgemeines. Selbst die kleinen Genome von Phagen und Viren sind für eine direkte Sequenzierung der DNA oder RNA um ein Vielfaches zu groß. Man zerlegt genomische DNA deshalb in sequenzierbare Fragmente, kloniert diese in Vektoren, kommt schrittweise zu sequenzierbaren Fragmenten und setzt deren Sequenzinformation am Computer wieder zur vollständigen DNA- oder RNA-Karte des Genoms zusammen (physikalische Kartierung). Wegen der Redundanz von Basensequenzen können größere Genome erst dann zuverlässig sequenziert werden, wenn aus genetischen Untersuchungen genügend Markierungspunkte (Marker) vorliegen (Genkartierung). Von besonderer praktischer Bedeutung sind dabei sequence-tagged sites (STS). Genbanken. Unter einer Genbank versteht man eine Sammlung von DNA-Fragmenten, die möglichst das gesamte Genom umfasst. Sie wird hergestellt, indem man genomische DNA zerlegt und die DNA-Fragmente in Vektoren einbaut. Um zu großen Fragmenten zu gelangen,

bevorzugt man Restriktionsenzyme (→46), die nur an selten vorkommenden Sequenzen schneiden, z. B. Not I, das spezifisch die äußerst seltene Sequenz 5′-GCGGCCGC-3′ erkennt. Die statistische Häufigkeit einer Sequenz hängt vom GC-Gehalt der DNA und vom Auftreten repetitiver DNA-Sequenzen ab. Vektoren. Zur Erstellung von Genkarten und für die Sequenzierung kloniert man genomische DNA-Fragmente in Vektoren, aus denen sie durch Transformation in Wirtszellen wieder leicht isoliert und amplifiziert werden können. Die Größe der genomischen DNA ist dabei entscheidend für die Anzahl der Klone, die man zur Ablage einer kompletten Genbank benötigt. Für große eukaryotische Genome werden häufig Cosmide (→8) oder „künstliche Chromosomen“ wie das yeast artificial chromosome (YAC) (→14) für Genbanken in Hefe oder das bacterial artificial chromosome (BAC) (→20) für Genbanken in E. coli verwendet. Sie erlauben die Verpackung von DNA-Stücken bis zu 300 kbp. Für eine Sequenzierung sind diese Fragmente noch viel zu groß. Die Subklonierung erfolgt meist in Cosmiden; man kann darin 30–45 kbp fremder DNA integrieren. Genkartierung. Die klassische Methode der Genkartierung besteht in der Beobachtung gekoppelter Merkmale im Phänotyp. Beispielsweise lassen sich physikalische Genkarten von Ascomyceten wie Neurospora crassa oder Saccharomyces cerevisiae durch Tetradenanalyse gewinnen, da in diesem Fall die Tochterzellen im Ascus in der Reihenfolge vorliegen, wie sie bei der Meiose entstanden sind; sie lassen sich leicht isolieren und auf phänotypische Merkmale analysieren. Molekulargenetische Methoden haben diese Möglichkeiten stark erweitert. Durch die Erzeugung und Sequenzierung von Restriktionsfragmenten kann man kleine Genome oft direkt kartieren und erhält bei größeren Genomen Markierungspunkte. Mit Hilfe gut ausgewählter Sonden für PCR oder DNA-Hybridisierung markiert man auch große Genome sehr spezifisch, beispielsweise durch fluorescence in-situ hybridization (FISH) (→84). Eine hohe Auflösung (10 kb) erhält man dabei durch „DNA-Kämmen“. Dazu taucht man einen Polylysin-beladenen Objektträger in eine Lösung mit großen DNAFragmenten. Beim langsamen Herausziehen (0,3 mm/s) ordnen sich die DNA-Fragmente parallel zueinander und lassen sich gut markieren. Zur Analyse großer eukaryotischer Genome werden zuvor oft Chromosomenspezifische Bibliotheken erstellt. Diese erhält man nach Färbung mit einem Fluoreszenzfarbstoff und Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) (→84), da die Menge an gebundenem Farbstoff für die einzelnen Chromosomen variiert. STS (sequence tagged sites) sind bereits sequenzierte spezifische DNA-Abschnitte von 100– 500 bp Länge, die nur einmal im Genom vorkommen (→296). Das setzt voraus, dass STS keine repetitiven DNA-Sequenzen enthalten. STS werden oft aus Klonbibliotheken großer Genomfragmente erhalten, z. B. aus YAC- oder BAC-Bibliotheken. Hat man bei einer Genomsequenzierung erst einmal eine Kollektion solcher STS erstellt, so kann man mit von ihnen abgeleiteten Primern schnell herausfinden, ob sie im Genom benachbart oder weit voneinander entfernt vorliegen: sind zwei STS benachbart, so findet man nämlich in einer Kollektion überlappender Genfragmente aus einer Genbank („mapping reagent“) mehr hybridisierende DNA-Fragmente, die beide die gleichen STS tragen. STS-Marker eignen sich somit ausgezeichnet für die molekulare Kopplungsanalyse von Genabschnitten.

Genome von Prokaryoten

Allgemeines. Zur Herstellung genetischer Karten von Mikroorganismen-Genomen verwendet man phänotypische Veränderungen in der Nachkommenschaft nach Konjugation (Übertragung von DNA von einer Spender- in eine Empfängerzelle), Transduktion (Übertragung von DNA zwischen Bakterien durch einen Phagen), und Transformation (Aufnahme „nackter“ DNA durch eine Empfängerzelle). Physikalische Genomkarten (vollständige DNA-Sequenzen) kennt man erst seit 1995. Sie werden entweder durch das sogenannte Clone contig-Verfahren oder durch Shotgun-Sequenzierung erstellt. Genetische Karten. Viele phänotypische Veränderungen können an sich vermehrenden Bakterien leicht und schnell beobachtet werden. Beispielsweise kann der Verlust der Fähigkeit zur Ausbildung von Geißeln oder Sporen, die Ausbildung von Antibiotika-Resistenzen als phänotypisches Merkmal (Marker) dienen. Bei der Aufklärung von Biosynthese-Wegen verwendet man Mutanten, die in einem Schritt der Biosynthese blockiert sind („Blockmutanten“) (→24) und gibt Vorstufen des Biosynthese-Produkts zum Medium. Die kurze Generationszeit vieler Bakterien (oft < 1 h) kommt derartigen Untersuchungen entgegen. Kombiniert man solche Beobachtungen des veränderten Phänotyps einer Empfänger-Zelle mit der Bestimmung der Zeit, die bei der DNA-Übertragung durch Konjugation vergeht, so kann man daraus auf den Abstand der für den jeweiligen Phänotyp kodierenden Gene im Genom schließen (Kopplungsanalyse). Prokaryotische Genkarten werden deshalb in Minuten oder Centisomen (n/100 auf einer Chrosomenlänge von 100) dimensioniert. Die vollständige Übertragung des E. coli-Genoms in eine Empfänger-Zelle beträgt bei 37 °C 100 min. Physikalische Genomkartierung: clone contig-Karten. Eine wichtige Aufgabe ist die Identifizierung von Klonen in einer Genbank, die benachbarte DNA-Abschnitte enthalten (contiguous: benachbart). Will man solche clone contigs für ein ganzes Genom zusammenstellen, so verwendet man dazu clone fingerprinting-Techniken. Beispielsweise können gemeinsame Restriktionsmuster und sequence-tagged sites (STS) zweier Klone zur Erkennung ihrer Nachbarschaft und zum Aufbau der DNA-Sequenz am Computer herangezogen werden. Wo immer möglich, orientiert man sich dabei an Markierungspunkten aus der genetischen Kartierung. Für die positionelle Klonierung eines Gens von einem benachbarten Marker aus wird häufig das chromosome walking verwendet. Dabei hybridisiert man entweder mit markierter RNA, die man sich vom Insert des Start-Klons hergestellt hat, oder man nutzt, sofern vorhanden, die sequenzierten Endfragmente eines Inserts als PCR-Primer für die Suche nach der gleichen Sequenz in anderen Klonen. Bei diesem systematischen Vorgehen bildet man also die DNA-Sequenz des Genoms Abschnitt für Abschnitt auf der virtuellen Matrize der genetischen Karte ab. Physikalische Genomkartierung: shotgun-Verfahren. Diese wesentlich schnellere Methode beruht darauf, dass mit den derzeit vorhandenen Techniken zur DNA-Sequenzierung Sequenzen von ca. 600 b direkt bestimmt werden können. Man zerlegte deshalb genomische DNA früher mit verschiedenen Restriktionsenzymen, heute mit Ultraschall oder hydrodynamischen Methoden („Nebulizer“) (→312) in kleine überlappende Fragmente, bestimmt deren Sequenz und setzt daraus am Computer die Genom-Sequenz wieder zusammen (Assemblierung kurzer sequenzierter Fragmente zu längeren contigs). Mit der Leistungsfähigkeit heutiger Computer ist dieses Verfahren für typische bakterielle Genome (< 1 bis 5 Mbp) die Methode der Wahl. Da

aus den genetischen Karten meist bereits Informationen über die Abstände genetischer Marker bekannt sind [bei Escherichia coli waren es zu Beginn der Sequenzierung (1990) über 1400, entsprechend einem mittleren Abstand von 3300 bp auf dem 4,64 Mbp großen Genom], können die am Computer erhaltenen Ergebnisse ständig überprüft (validiert) werden. Bioinformatik. Die für die Genom-Projekte verwendeten Computer-Programme sind vor allem auf eine zuverlässige Bestimmung von Sequenz-Homologien ausgerichtet. Selbst seltene Sequenzierfehler (99 % Genauigkeit) führen dazu, dass praktisch alle Gensequenzen mit Fehlern behaftet sind, und machen Mehrfach-Sequenzierungen erforderlich. Die Annotierung der Genome erfolgt mit standardisierten bioinformatischen Methoden (z. B. Prokaryotic Genome Automatic Annotation Pipeline).

Genome von Eukaryoten Allgemeines. Genetische Karten von Eukaryoten erstellt man wie bei den Prokaryoten durch Kopplungsanalyse genetischer Merkmale. Infolge ihres diploiden oder polyploiden Chromosomensatzes kann ein phänotypisches Merkmal allerdings auf unterschiedlichen Genotypen (homozygot, heterozygot) beruhen und bei der Vererbung (Meiose) infolge natürlicher Rekombinationsereignisse bei der Kopplungsanalyse aufspalten (Mendelsche Gesetze). Bei der Erstellung physikalischer Genkarten (Genom-Sequenzierung) ist zu berücksichtigen, dass Genome von Eukaryoten wesentlich größer sind als diejenigen der Prokaryoten. Ferner enthalten sie Introns und repetitive DNA-Sequenzen, die eine Suche nach einzigartigen Sequenzen behindern. Trotz dieser Schwierigkeiten ist die Genom-Analyse zahlreicher Eukaryoten bereits abgeschlossen und macht mittlerweile „Giga-ScienceProjekten“ wie der Erforschung der Diversität innerhalb einer Spezies (human diversity project) oder komplexen medizischen Fragestellungen Platz (human cancer genome project) (→298). Genetische Kartierung. Sie beruht bei experimentell zugänglichen Organismen auf der Beobachtung, wie phänotypische Merkmale beim crossing over während der Meiose miteinander gekoppelt sind (→ Genetik-Lehrbücher). Liegen zwei Merkmale nahe benachbart auf einem DNA-Abschnitt, so werden sie häufiger gemeinsam vererbt als Merkmale auf weiter voneinander entfernt liegenden Genabschnitten. Aus der Beobachtung der Rekombinationshäufigkeit von Merkmalen kann man deshalb eine virtuelle genetische Karte ableiten, die in [% Rekombinationsfrequenz] dimensioniert ist. Diese klassische Methode wird heute durch zahlreiche molekulargenetische Methoden ergänzt. So kann man den „Fingerabdruck“ verschiedener DNA-Fragmente mittels Restriktionskartierung bestimmen. Mit Fluoreszenz-markierten Primern kann man große DNA-Fragmente oder Chromosomen in-situ hybridisieren (FISH, Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung) (→84). Genom-Sequenzierung. Die Genome höherer Organismen enthalten repetitive DNASequenzen (→296, 298) (Satelliten-DNA, Alu-Sequenzen, Retrotransposons usw.), die eine eindeutige Lokalisierung von Genen im Genom behindern: Satelliten-DNA macht bei Säugergenomen etwa 5 % der gesamten DNA aus, die SINE (short interspersed repetitive elements von 100–500 bp, z. B. Alu-Sequenzen bis zu 20 % und die LINE (long interspersed

repetitive elements) mit 6000 – 7000 bp bis zu 10 %. Dazu kommt noch Mini- und Mikrosatelliten-DNA. Letztere bestehen aus 10 bis 50 Kopien von sehr kurzen SequenzWiederholungen wie AC, ACCC usw., die häufig vorkommen (> 10 000 beim Menschen) und über das Genom verteilt sind. Da jedes Individum einzigartig in seiner Verteilung von Mikrosatelliten ist, sind sie hervorragende genetische Marker, z. B. bei der Züchtung von Nutztieren (→268) und Pflanzen oder in der prähistorischen Forschung (Ethnogenomics) und der Forensik beim Menschen (→302). Aufgrund der großen Redundanz repetitiver Sequenzen führt die bei Prokaryoten bevorzugte Shotgun-Methode der Genomanalyse bei höheren Organismen nicht allein zum Ziel. Man greift deshalb auf die Identifizierung und Sequenzierung überlappender Klone zurück, die man durch chromosomales Wandern, Vergleich ihrer Restriktionsmuster oder durch Identifizierung von sequence tagged sites (STS) (→70) in den umfangreichen genomischen DNA-Bibliotheken ermittelt hat. Ein weiteres wertvolles Verfahren ist die Analyse von expressed sequence tags (EST) (→296), das sind von der mRNA abgeleitete cDNA-Sequenzen. Bereits gespleißte mRNA enthält fast keine repetitiven Sequenzen, sodass ESTs meist nur einmal im Genom vorkommen. Hybridisiert man von solchen ESTs abgeleitete Primer mit der genomischen Genbank, so umgeht man deshalb sowohl Introns wie repetitive Sequenzmuster und identifiziert zudem solche Klone, die Fragmente exprimierter Gene enthalten. Hat man mit einer oder mehreren dieser Methoden die Klone in einer Genbank zu einer physikalischen Karte des Genoms geordnet und Restriktionsstellen bzw. Nucleotidsequenzen als Marker identifiziert, so folgt die Subklonierung der Cosmid- (→8), YAC- (→14) oder BAC-Klone (→20) in Form von λPhagenbibliotheken und deren Sequenzierung (→68). Überlappende Sequenzen führen dann am Computer zur Zuordnung benachbarter Subklone (Sequenz-Contig) und schließlich zur Gesamtsequenz der DNA einzelner Chromosomen oder des gesamten Genoms. Die Überprüfung der Genomkarte erfolgt dann durch Vergleich mit der genetischen Karte.

Metagenom

Allgemeines. Unter dem Metagenom eines Biotops versteht man die Gesamtheit der genomischen Informationen seiner Lebensgemeinschaften („Biozönose“). Lebensgemeinschaften eines größeren Biotops auf der Erdoberfläche werden meist als „Biom“ bezeichnet. Man versucht hier, durch genetische Kartierung von Markergenen eindeutig beschriebener Spezies mittels DNA Barcoding eine taxonomische Referenz-Datei zu schaffen. Vorwiegend mikrobielle Lebensgemeinschaften kommen dagegen im Klärschlamm (→286, 288), im Verdauungstrakt von Mensch und Tier („Mikrobiom“, Pansenflora) (→118), aber auch in nährstoffreiche Boden- oder Wasserproben vor. Die meisten der dort lebenden Mikroorganismen konnten bisher nicht kultiviert werden, ihre Erbinformation ist dagegen aufgrund der großen Fortschritte der DNA-Sequenziertechnik (HTS) und der Bioinformatik zugänglich und kann als Genpool zur Klonierung und Expression neuer Enzyme oder Genkassetten dienen. Methoden. Die Bearbeitung einer metagenomischen Bibliothek (z. B. Schlamm-, Stuhl-, Bodenprobe) beginnt mit der Isolierung der in der Probe enthaltenen DNA. Diese wird mit Restriktionsenzymen (→46) in DNA-Fragmente zerlegt, die entweder sequenziert oder in Wirtsorganismen, meist E. coli, exprimiert werden. Beim funktionellen Ansatz folgt nun eine funktionelle Überprüfung der exprimierbaren Proteine. Lipasen können beispielsweise erkannt werden, wenn der Wirtsorganismus auf einem durch einen hohen Triglycerid-Gehalt getrübten Nähragar kultiviert wird und sich im Umfeld des Wirtsorganismus transparente HydrolyseZonen zeigen. Die Bildung von Amylasen erkennt man in gleicher Weise an einer Aufhellung des in den Agar eingebetteten braunen Jod-Stärke-Komplexes. Aktive Klone werden dann vermehrt, die meist in Plasmide integrierte Fremd-DNA isoliert und sequenziert und das darin enthaltene, aus dem Metagenom stammende Strukturgen für die weitere Bearbeitung optimiert. Wesentlich vielseitiger ist die Bearbeitung metagenomischer DNA-Banken durch Sequenzierung (Zufallsmethode). Dabei versucht man im ersten Schritt, möglichst die gesamte DNA in einer umfangreichen Genbank abzulegen und diese zu sequenzieren. Eine shotgunSequenzierung dieser Genbank führt dann zu einem großen Sequenzraum, in dem SequenzInformationen der für die ribosomale 16S-RNA (Prokaryonten) und 18S-RNA (Eukaryonten) kodierenden DNA-Fragmente bereits Auskunft über die Diversität der in der Probe enthaltenen Organismen geben; sie können zu einem RNA-Dendrogramm zusammengestellt werden. Weiter kann mit bioinformatischen Methoden durch einen Homologie-Vergleich mit bereits bekannten Sequenzen gezielt nach ganz bestimmten Proteinen gesucht werden. Auch Genkassetten (z. B. neue Operons für die Biosynthese von Antibiotika) konnte man auf diesem Weg ermitteln. In Einzelfällen gelang es mit dieser Methode auch, das gesamte Genom von bisher nicht kultivierten Mikroorganismen zu entschlüsseln. Anwendungen. Die Kenntnis von Lebensgemeinschaften und ihren Wechselwirkungen hat in den letzten Jahren insbesondere bei der Analyse der Artengemeinschaften in den menschlichen Körperhöhlen (→118) („Mikrobiom“ von Mundhöhle, Darm, Vagina usw.) zu großen Fortschritten geführt. Mehrere internationale Konsortien haben durch sequenzielle MetagenomAnalysen die hohe Artenvielfalt solcher Mikrobiome weitgehend entschlüsselt, ihre Veränderungen über die Lebensalter hinweg analysiert und wertvolle Hinweise auf ihre Zusammensetzung in Abhängigkeit von Ernährungsgewohnheiten und Wechselwirkungen mit

dem menschlichen Wirt bei Gesundheit und Krankheit erhalten (→298). Ein Meilenstein der Metagenom-Forschung ist auch die Global Ocean Sampling Expedition, bei der das Craig Venter-Institut seit 2003 auf den Weltmeeren alle 200 Seemeilen einige 100 L Wasser entnimmt und das in der Probe enthaltene Metagenom bestimmt. Bereits 2004 erhielt man nach einer Beprobung der Sargasso-See 1,6 Gb genetischer Sequenzen (in GeneBank veröffentlicht), die auf fast 2000 Spezies und > 1 Million potentiell translatierter Proteine hinwiesen. Ein großer Teil dieser Proteine war neu. Mittlerweile hat das Forschungsschiff dieser Expedition, Sorcerer II, Proben in allen Weltmeeren genommen, aktueller Schwerpunkt der Arbeiten (2014) ist im Amazonas-Gebiet. Auch für industrielle Anwendungen hat sich die Metagenomik bereits als sehr nützlich erwiesen: so verfügt beispielsweie die Fa. B.R.A.I.N. in ihrem BioArchiv neben Sammlungen von Stammkulturen auch über metagenomische DNABibliotheken mit Millionen einem Screening zugänglichen Genen aus unterschiedlichen mikrobiellen Habitaten. Aus diesem Ansatz wurden bereits mehrere neue, patentierte technische Enzyme entwickelt.

Zellbiologie Allgemeines. Die Zellbiologie ist ein sehr umfangreiches Wissensgebiet geworden und kann in diesem Format nur marginal abgebildet werden: im Hinblick auf die Biotechnologie wird die eukaryotische Zelle vielzelliger Organismen und des Menschen skizziert, mit einem Abriss der Zellbiologie des menschlichen Immunsystems (→80). Zellen, Gewebe, Organe. Der prinzipielle Aufbau eukaryotischer Zellen und einiger Elemente ihrer Biochemie wurde bereits an anderer Stelle skizziert, wenn auch zahlreiche wichtige Aspekte der Zellbiologie in dieser kurzen Einführung nicht berücksichtigt werden konnten. Nicht ausgeführt wurde beispielsweise die innere Organisation der Zelle, die wichtige Rolle des Cytoskeletts, ihre Energieversorgung, der intrazelluläre Vesikelverkehr und die Mechanismen zur Zerstörung körpereigener Zellen durch Apoptose. Auch die Vorgänge bei der Zellteilung, die man im Zellzyklus zusammenfasst, werden in diesem auf die Biotechnologie ausgerichteten Taschenatlas nicht dargestellt. Vor dem Hintergrund der Erfolge der Stammzell-Forschung (→78, 306) ist dagegen eine ausführlichere Behandlung der Gewebebildung und -spezialisierung geboten, besonders im Hinblick auf die Bildung der Blutzellen und der Immunabwehr (→80). Der Aufbau und das Zusammenspiel eines vielzelligen Organismus (ein erwachsener Mensch hat etwa 1014 Zellen) erfolgt nach sehr komplexen Mechanismen. Dabei geht es zum einen um Vorgänge bei der Zell-Differenzierung, zum anderen um den Stoff- und Signaltransport. Zell-Differenzierung. Im Verlauf der Entwicklung einer befruchteten Oocyte zum Embryo und weiter zum fertigen Organismus (Ontogenese) werden durch komplexe Vorgänge (Reifung) spezialisierte Zelltypen gebildet. Beim Menschen sind es etwa 200 (Fibroblast, Myoblast, Osteoblast, Erythrocyt usw.). Zellen gleichen Zelltyps verbinden sich zu Geweben. Dazu bilden sie entweder eine extrazelluläre Matrix aus Proteinen und Polysacchariden (Beispiel: Bindegewebe), oder, über ihr Cytoskelett, eine Zellmatrix (Beispiel: Epithel). Die richtige Auswahl von Zellen für einen Gewebe-Verbund wird von einer Familie von MembranProteinen, den Cadherinen, getroffen. Gewebe unterschiedlicher Differenzierung verbinden sich zu Organen, beispielsweise zur Epidermis, den Sinnesepithelien, den Alveoli der Lunge oder zur Darmschleimhaut. In jedes Gewebe sind Gewebe-typische Stammzellen eingelagert. Sie sind noch nicht endgültig differenziert, können sich unbegrenzt teilen und sorgen für die Erneuerung des jeweiligen Gewebes durch ständigen Nachschub an differenzierten Zellen. Stoff- und Signaltransport. Die Durchlässigkeit der Lipid-Doppelschichten von Zellmembranen (→34) ist für die meisten Stoffe gering. Erst die Ausstattung der Membran mit Kanälen und Transportern (gebildet aus membranständigen Proteinen) erlaubt den Import und Export von Ionen und Molekülen. Meist benötigen Transportvorgänge Energie, z. B. durch Spaltung von ATP (ATP-getriebene Pumpen) (→26). Zum Signaltransport verfügen höhere Organismen über mehrere hundert Arten von Signalmolekülen. Darunter fallen Proteine, Peptide, Aminosären, Nucleotide, Steroide usw. Zellen enthalten in ihrer Plasmamembran Rezeptoren (meist ein Transmembranprotein), die ein Signalmolekül spezifisch binden und

dabei eine Reaktionskaskade im Inneren der Zelle auslösen, wodurch sich das Verhalten der Zelle ändert. Dabei kann es sich um Veränderungen im Stoffwechsel (→36), in der Genexpression (→62) oder in der Form oder Bewegung der Zelle handeln. Bei den Signalgebenden Zellen unterscheidet man nach Reichweite der Signale zwischen parakrinen Zellen (sezernieren Signalstoffe in die umgebende extrazelluläre Flüssigkeit) und endokrine Zellen, deren Signalstoffe, die Hormone, vom Blutstrom transportiert werden und eine große Reichweite haben. Am höchsten organisiert sind die Neuronen, deren lang gestreckte Enden (Axone) über Synapsen auch noch mit weit entfernten Zielzellen Kontakt aufnehmen und über Neurotransmitter auf die Rezeptoren postsynaptischer Zielzellen einwirken. Der Transport elektrischer Signale (Aktionspotentiale), von Ionen und kleinen Metaboliten zwischen Zellen erfolgt über gap junctions (Zell-Zell-Kanäle), die aus membranständigen Proteinkomplexen, den Connexonen, bestehen. Sie erlauben benachbarten Zellen eine gemeinschaftliche Beteiligung an Signalinformationen. Jeder Zelltyp ist mit einer spezifischen Ausrüstung an Rezeptoren ausgestattet, sodass die Antwort auf extrazelluläre Signalmoleküle unterschiedlich ausfällt (→310).

Stammzellen Allgemeines. Stammzellen haben die Fähigkeit, sich in Kultur unbegrenzt zu teilen und sich später zu spezialisierten Zellen zu entwickeln. Embryonale Stammzellen kommen in befruchteten Eizellen während einer frühen Entwicklungsstufe vor, adulte Stammzellen findet man in vielen Geweben des erwachsenen Tiers oder des Menschen. Stammzellen sind ein sehr wichtiges Objekt der Grundlagenforschung, vor allem zum Studium der molekularen Vorgänge bei der Zelldifferenzierung (Entwicklungsbiologie). Sie haben aber auch ein großes Anwendungspotenzial bei der Heilung von Gewebe- oder Organerkrankungen (Zelltherapie).

Mit der Entdeckung von Methoden, ausdifferenzierte Körperzellen in multipotente Stammzellen zurückzuverwandeln (iPS = induced pluripotent stem cells, →306) und diese therapeutisch einzusetzen, hat sich ein großes neues Forschungsfeld eröffnet. Embryonale Stammzellen. Während der ersten Teilungsvorgänge haben alle Zellen, die sich aus einer befruchteten Eizelle entwickeln (Morula), noch die unbegrenzte Fähigkeit, sich in beliebige differenzierte Zellen zu entwickeln („totipotente Zellen“). Wenn sich auf dieser Entwicklungsstufe zwei totipotente Zellen aus einer Morula auf natürliche Weise separieren, entstehen daraus eineiige (homozygote) Zwillinge. Etwa vier Tage nach der Befruchtung bildet sich nach mehreren Zellteilungen aus der Morula der Blastocyst mit ersten differenzierten Zellen (→266). Die inneren Zellen des Blastocysten sind noch multipotent (pluripotent) – sie können in zahlreiche Zelltypen differenzieren. Bei der weiteren Zellteilung entsteht daraus ein Reservoir multipotenter embryonaler Stammzellen. Sie differenzieren in zahlreiche Zelltypen aus, z. B. in unterschiedliche Blut- oder Hautzellen. Beim menschlichen Embryo ist dieser Vorgang etwa 8 Wochen nach der Befruchtung beendet; die meisten embryonalen Stammzellen sind nun ausdifferenziert. Man kann embryonale Stammzellen des Menschen also gewinnen 1. aus menschlichen Blastocysten, die bei einer in-vitro-Fertilisation (IVF) unfruchtbarer Paare nicht benötigt werden, 2. aus Fötus-Gewebe bei Aborten oder Abtreibungen, 3. durch Transfer des Zellkerns einer diploiden Zelle in eine Eizelle, deren Zellkern man entfernt hat, und Kultivierung dieser Zelle bis zum Blastocysten (s. auch „Geklonte Tiere“ →266). Adulte Stammzellen. Multipotente Stammzellen im Knochenmark des Kindes wie des Erwachsenen sind seit langem bekannt. Sie gelangen in niedriger Zahl in den Blutstrom und differenzieren zu den verschiedenen Blutzellen aus. Man hat adulte Stammzellen auch in vielen anderen Geweben des Erwachsenen gefunden, z. B. neuronale Stammzellen in resektiertem Hirngewebe. Schon länger gab es Hinweise, dass auch aus spezialisiertem Gewebe gewonnene adulte Stammzellen sich nach Transplantation in ein anderes Gewebe umdifferenzieren, also multipotent sind. So beobachtete man bei Herzinfarkts-Patienten nach Infusion eigener Stammzellen aus dem Knochenmark eine verbesserte Herzleistung. Auch Leukämie-Patienten konnten erfolgreich mit adulten Stammzellen therapiert werden. Ein Durchbruch gelang Ende 2007 mit der Beobachtung, dass bereits ausdifferenzierte Zellen durch künstliche Reprogrammierung in multipotente Stammzellen zurückverwandelt werden können (iPS-Zellen, →306). Ein großer Vorteil adulter Stammzellen ist ihre Immunkompatibilität, da Spender und Empfänger identisch sind. Sie besitzen allerdings die angeborenen oder im Lauf des Lebens gewonnenen genetischen Defekte des Spenders. Anwendungen. Embryonale Stammzellen erlauben es, die molekularen Grundlagen bei der Entwicklung eines Individuums zu erforschen und pathologische Abweichungen zu erkennen. Sie können auch dazu dienen, ein Arsenal unterschiedlicher Zelllinien für die Testung neuer pharmazeutischer Wirkstoffe bereitszustellen. Schließlich eröffnet sich die Möglichkeit, durch Zelltherapie Krankheiten zu behandeln: beispielsweise könnte die Transplantation pankreatischer Inselzellen, aus Stammzellen gewonnen, Kinder mit Diabetes Typ-I-Erkrankung heilen. Ethische Bedenken, ob menschliches Leben bereits im Mehrzellstadium einer Morula oder

einer Blastocyste beginnt und befruchtete Zellen in diesem frühen Stadium bereits den verfassungsrechtlichen Schutz auf Leben genießen, sind mit der Entwicklung der iPSZelltechnologie in den Hintergrund getreten, da diese Methode erlaubt, Körperzellen des Empfängers in körpereigene (autologe) Stammzellen zurückzuverwandeln und therapeutisch einzusetzen (→336).

Blutzellen und Immunsystem Allgemeines. Das Immunsystem schützt höhere Organismen vor Infektionen und verleiht ihm gegen viele Pathogene Immunität. Es besteht aus spezialisierten Zellen (zelluläre Immunantwort) und mit diesen kommunizierenden Botenstoffen. Cytotoxische Zellen des Immunsystems zerstören nicht nur in den Körper eingedrungene Krankheitserreger, sondern auch irreversibel geschädigte körpereigene Zellen, z. B. Krebszellen (Apoptose). Sie sind auch an der Immunabwehr gegen transplantierte Organe beteiligt (→272). Um veränderten Umweltbedingungen Rechnung tragen zu können, zeichnet sich das Immunsystem durch eine hohe Plastizität aus, die genetisch determiniert ist. Fehlsteuerungen können zu vielfältigen Erkrankungen wie ungenügender Immunantwort, Allergien, Auto-immun-Erkrankungen oder zur malignen Entartung führen. Das Immunsystem wird über zahlreiche Botenstoffe (Cytokine, Wachstumsfaktoren) gesteuert, von denen mittlerweile viele in rekombinanter Form zugänglich sind und für den therapeutischen Einsatz untersucht werden. Zelltypen. Alle Zelltypen des Bluts mit so unterschiedlichen Funktionen wie SauerstoffTransport oder Antikörperbildung werden aus einem gemeinsamen Stammzell-Typ (→78) gebildet: der multipotenten hämatopoetischen Stammzelle im Knochenmark. Aus ihr stammen sowohl die roten Blutkörperchen (Erythrocyten), die in den Blutgefäßen bleiben und an Hämoglobin gebundenen Sauerstoff transportieren, wie auch die weißen Blutkörperchen (Leukocyten), die Infektionen bekämpfen und in die Gewebe einwandern können. Die multipotente hämatopoetische Stammzelle differenziert in myeloide und lymphatische Stammzellen. Aus den Myeloid-Stammzellen bilden sich u. a. die roten Blutkörperchen, die Granulocyten und Makrophagen. Die lymphatischen Stammzellen differenzieren dagegen zu Lymphocyten und wandern ins Blut- und Lymph-system aus. Der gesunde Erwachsene besitzt etwa 1012 dieser „naiven“ (d. h. noch nicht mit Antigenen in Kontakt gekommenen) Lymphocyten. Werden diese durch ein Antigen (und weitere Signale) aktiviert, so bilden sie durch klonale Selektion eine große Zahl Antigen-spezifischer Tochterzellen. Lymphocyten differenzieren weiter zu B-Zellen und T-Lymphocyten. B-Zellen bilden nach ihrer Reifung im Knochenmark in den Lymphknoten oder in der Milz nach Kontakt mit einem Antigen Antikörper (humorale Immunantwort). T-

Zellen reifen dagegen im Thymus, wo sie in Wechselwirkung mit auf der Zelloberfläche exprimierten Molekülen des major histocompatibility complex (MHC), einem Proteinkomplex der Zellmembran, differenzieren und spezifische Oberflächenstrukturen ausbilden. Man unterscheidet sie nach ihrer Funktion. T-Zellen sind die Hauptträger der zellulären Immunantwort; dabei sezernieren sie unterschiedliche Cytokine. Beispielsweise unterstützen THelferzellen durch die Ausscheidung verschiedener Interleukine (→236) die Aktivierung, Vermehrung und Differenzierung von B-Zellen; sie tragen auf ihrer Oberfläche das Glykoprotein CD4. Cytotoxische T-Lymphozyten dagegen tragen auf ihrer Oberfläche das Glykoprotein CD8. Sie lysieren Virus-infizierte Zellen und scheiden u. a. die Cytokine Interferon-γ und Lymphotoxin-α aus. Immunantwort und Cytokine. Die Immunantwort auf eine Infektion mit Viren, Bakterien oder Parasiten verläuft unterschiedlich. Extra-zelluläre Pathogene oder deren Toxine werden durch Antikörper markiert und lösen damit das Signal für die Aufnahme und den Abbau durch Makrophagen aus. Intrazelluläre Pathogene wie Mykobakterien oder Viren sowie transformierte Zellen werden auf andere Weise zerstört: sobald sie einen der allgegenwärtigen Makrophagen infizieren, präsentiert er lysierte Fragmente des Pathogens auf der Oberfläche und löst damit in einer komplizierten Reaktionskaskade die Zerstörung infizierter Zellen durch cytotoxische T-Lymphocyten aus. Beim Diabetes Typ II, einer Autoimmunerkrankung, werden beispielsweise Proteine körpereigener β-Zellen der Bauchspeicheldrüse als fremd missdeutet und durch CD8-T-Lymphocyten zerstört. Die Koordinierung der Immunantwort erfolgt durch Cytokine und deren Rezeptoren auf den Oberflächen der Zellen des Immunsystems. Sie ist sehr komplex reguliert. Zellspezifische Wachstumsfaktoren und deren Rezeptoren steuern spezifisch die Neusynthese der an der Immunantwort beteiligten Zelltypen. Die Möglichkeit, Cytokine und Wachstumsfaktoren als rekombinante Proteine herzustellen, hat in einigen Fällen bereits zu neuen Therapieformen geführt.

Antikörper Allgemeines. Antikörper sind spezifische Abwehrproteine des Immunsystems, die in Blut und Lymphe von Vertebraten zirkulieren. Sie binden mit hoher Affinität an Antigene. Körperfremde Proteine, Polysaccharide und Lipopolysaccharide aus den Oberflächenstrukturen (Epitopen) von Viren, Mikroorganismen und Parasiten, aber auch Toxine können vom Immunsystem als Antigen erkannt werden. Antigene wirken als Immunogene: sie lösen im Körper die Bildung von Antikörpern aus – bei Autoimmun-Erkrankungen können dies auch körpereigene Proteine sein. Selbst gegen niedermolekulare Verbindungen (Haptene) lassen sich Antikörper erzeugen, wenn sie dem Immunsystem gebunden an ein starkes Immunogen präsentiert werden. Antikörper werden seit langem zur Therapie von Infektionen und Toxin-Vergiftungen eingesetzt (passive Immunisierung, →248). Sie haben ebenfalls große Bedeutung in der Immunanalytik (→260) und als Reportergruppen (→84). Man setzt sie industriell zur Reinigung von rekombinanten Proteinen durch Immun-Chromatographie ein (→106). Struktur. Antikörper gehören zu den Immunglobulinen. Sie werden beim Menschen in fünf Klassen unterteilt (IgG, IgM, IgA, IgE und IgD) und haben unterschiedliche Abwehrfunktionen. Der im Serum dominierende IgG-Typ ist ein glykosyliertes Heterodimer aus je zwei

identischen leichten (L) und schweren (H) Ketten, die durch Cystin-Brücken verbunden sind. Strukturell werden die konstanten (CH, CL) und die variablen Domänen (VH, VL) der schweren und leichten Kette unterschieden, funktionell bindet die Fc-Region an Rezeptoren, während die Bindung an das Antigen durch die Fab-Region erfolgt. Diese ist hyper-variabel: Die 6 komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDRs) bestehen aus jeweils etwa 20 Aminosäuren und erlauben demnach theoretisch 206 · 20 oder 20120 Permutationen. Biosynthese. Antikörper werden von den B-Lymphocyten gebildet. Dazu stehen knapp 1000 Sätze von Gensegmenten zur Verfügung, die durch zufällige Rekombination (gene shuffling, →198) zu funktionellen Gruppen zusammengesetzt werden, welche für die variablen Regionen der H- und L-Ketten codieren. Zusätzlich treten bei der Expansion der B-Zellklone Mutationen derjenigen Gene auf, die für die variable Region der Immunglobuline codieren. Damit erhöht sich die phänotypische Diversität des relativ kleinen Genotyps erheblich. Herstellung. Polyklonale Antikörper sind Gemische verschiedener Antikörper, die gegen verschiedene Epitope eines Antigens gerichtet sind. Man gewinnt sie durch Immunisierung von Tieren (Kaninchen, Schafe, Ziegen, Pferde). Durch wiederholte Immunisierung im Abstand von 1–2 Wochen und Blutentnahme können aus großen Spendertieren (Pferd, Rind, Schaf) wiederholt ähnliche Chargen polyklonaler Antikörper gewonnen werden. Man reinigt durch Fällungsreaktionen und chromatographische Verfahren. Für die Herstellung hochreiner Antikörper werden häufig affinitätschromatographische Verfahren mit Protein A eingesetzt; Protein A aus Staphylococcus aureus, Molmasse MR = 42 kDa, bindet mit hoher Spezifität und Affinität an die Fc-Region von IgG. Die gereinigte IgG-Lösung füllt man steril ab und lyophilisiert unter Luftausschluss. Bei Lagerung im Kühlschrank beträgt die Haltbarkeit einige Jahre. Die industrielle Herstellung erfolgt nach den Prinzipien der GMP. Risiken. Antikörper werden parenteral gegeben, da sie bei der Magen-Darm-Passage nicht stabil sind. Aus Versuchstieren gewonnene Antikörper werden vom Immunsystem des Menschen als körperfremd erkannt und können deshalb, besonders bei mehrfacher Gabe, eine Immunabwehr auslösen. Man hilft sich therapeutisch mit dem Wechsel zwischen Antikörpern, die aus unterschiedlichen Spendertieren gewonnen wurden. Alternativ können Antikörper auch durch die Fraktionierung von Spenderblut gewonnen werden. Obwohl bei den Blutbanken der Industrieländer das Spenderblut nachhaltig analysiert wird, besteht bei diesem Verfahren ein Rest-Risiko von Virus-Kontaminationen. Mit Hilfe der Biotechnologie lassen sich mittlerweile monoklonale (→242) und rekombinante Antikörper (→244) oder Antikörper-Fragmente herstellen. Ihr Vorteil liegt in der reproduzierbaren Produktion eines definierten AntikörperMoleküls in einem Bioreaktor und in der Möglichkeit, hybride Strukturen mit Epitopen und Zucker-Seitenketten des Menschen zu bilden („humanisierte Antikörper“), die weniger immunogen sind. Auch humane Antikörper sind mittlerweile technisch zugänglich. Sie werden therapeutisch eingesetzt, z. B. bei Krebserkrankungen (→246).

Reporter-Gruppen Allgemeines. Reporter-Moleküle spielen eine herausragende Rolle in der Grundlagenforschung und in der angewandten Biotechnologie. Sie werden verwendet 1. für die histound cytochemische Untersuchung von Zellen, 2. zur Sortierung von Zellen im Zellsorter, 3. zur Visualisierung von Bindungsvorgängen, z. B. bei Antikörpern oder DNA (→60, 260), 4. bei zahlreichen gentechnologischen Arbeitsschritten (z. B. bei der Klonierung von Promotoren). Häufig verwendete Reporter-Moleküle sind radioaktive Isotope, Fluorophore, Enzyme, das Biotin-Streptavidin- bzw. das Digoxigenin-System sowie, als genetische Marker, die Gene für β-Galactosidase, Luciferase und GFP (green fluorescent protein). Radioaktive Markierungen. Radio-Immunassays (RIA) beruhen auf der Markierung von Proteinen mit 131I oder 35S und Bestimmung der Radioaktivität im Szintillationszähler. Bei gentechnischen Untersuchungen führt man häufig mit DNA-Polymerase I, dem KlenowFragment oder RNA-Polymerase 32Pmarkierte Phosphat-Gruppen in DNA oder RNAFragmente ein und kann dann Hybridisierungsvorgänge durch Autoradiographie oder schneller im Phosphoimager™ nachweisen (→48). Weil diese Methoden sehr empfindlich sind, verwendet man sie trotz aufwendiger Strahlenschutz-Auflagen und der Entwicklung schnellerer Methoden noch immer. Fluorophore. Mit Fluorophoren wie Fluorescein oder Rhodamin erreicht man Empfindlichkeiten im pikomolaren Bereich. Fluorophor-markierte Antikörper werden häufig für histo- und cytochemische Untersuchungen verwendet. In Verbindung mit einem Zellsorter (FACS = fluorescence-activated cell sorter) erlauben sie die schnelle Trennung (1000 Zellen/min) markierter von unmarkierten Zellen. Man benutzt diese Methode beispielsweise in der Zellbiologie, um verschiedene Typen von B- und T-Zellen mittels ihrer auf der Oberfläche exprimierten Antigene zu markieren und zu trennen, sowie zur Analyse der 16SrRNA von Bakteriengemischen durch Hybridisierung mit Fluoreszenz-markierten Sonden (FISH = fluorescence in situ hybridization) (→74). Fluoreszenz-Reporter für DNA sind SYBRGreen™ und Ethidium-Bromid (→50). Enzyme. Enzyme als Reporter-Gruppen haben den Vorteil, dass sie katalytisch aktiv sind und durch Amplifikation des Signals dessen Empfindlichkeit verstärken. Diese Eigenschaft ist besonders bei analytischen Fragestellungen von Bedeutung. Häufig verwendete ReporterEnzyme sind alkalische Phosphatase und Meerrettich-Peroxidase (→256). Ihre Reaktion kann

mit Hilfe geeigneter Substrate elektrochemisch (Biosensoren, →258), photometrisch oder, mit besonderer Empfindlichkeit, durch Chemilumineszenz oder Fluoreszenz quantifiziert werden. Man erreicht dabei Empfindlichkeiten im piko- bis attomolaren Bereich. Digoxigenin und Biotin-Streptavidin zählen zu den indirekten Reportern, d. h. sie sorgen für die Kopplung der eigentlichen Reporter-Gruppe an das Biomolekül. Digoxigenin beispielsweise ist ein Steroid (MR = 390,52), das über seine Hydroxy-Gruppe leicht an Nucleotide gekoppelt werden kann und Bindungsvorgänge, z. B. die Hybridisierung von DNASonde und Ziel-DNA, nicht behindert. Es bindet mit hoher Affinität (10–9 M) an einen Antikörper, der seinerseits mit Reporter-Gruppen markiert werden kann und damit den empfindlichen Nachweis von Hybridisierungsereignissen an der DNA erlaubt. Genmarker. Durch den Einbau von Genen, die für Reporter-Proteine kodieren, können Klonierungsvorgänge schnell analysiert werden. Beim „Blau-weiß-Screening“(→62) benutzt man dazu beispielsweise ein Genfragment der β-Galactosidase, das Schnittstellen für den Einbau fremder DNA trägt. Wird fremde DNA eingebaut, so unterbleibt die Bildung funktionsfähiger β-Galactosidase, und das zugesetzte Substrat 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-Dgalac-topyranosid (X-Gal) wird nicht mehr zu einem tiefblauen Farbstoff hydrolysiert. Besonders einfach nachzuweisen ist auch die Expression von GFP (green fluorescent protein), dessen Gen aus einer Qualle stammt und ohne weitere Zusätze die Bildung fluoreszierenden Proteins kodiert. Das GFP-Gen wird häufig als Reporter verwendet, um die Funktion von Promotoren, die Expression oder Regulation von Genen sichtmar zu machen. Luciferase-Gene können in gleicher Weise eingesetzt werden, benötigen aber im Gegensatz zu GFP den Zusatz der Substrate Luciferin/ATP (Glühwürmchen) oder Dekanal (Photobakterium).

Oberflächen-Fermentation

Allgemeines. Oberflächen-Fermentation („solid state fermentation“, SSF) wird oft definiert als „Fermentation ohne Wasser“. Beispiele sind die Herstellung von Sojasauce, Miso oder Tempeh (→114). Früher wurde das Verfahren auch für Produkte wie Citronensäure (→146) oder Lebensmittelenzyme (→172) eingesetzt, dann aber von der Submers-Fermentation verdrängt. Heute erlebt die Methode eine Renaissance, beispielsweise bei der Herstellung von Bioethanol aus Biomasse (→138). Rohstoffe. SSF ist eine bewährte Methode, um Abfallstoffe wie Weizenkleie, Soja- oder Ernte-Rückstände zu veredeln. Dazu müssen sie manchmal vorbehandelt werden, um bei der Beimpfung mit Starter-Kulturen (→114) oder bei spontaner Besiedelung zu genügend verwertbarem Kohlenstoff zu führen. Mikroorganismen. SSF ist eine Domäne für Pilze (Aspergillus, Rhizopus) und Hefen (→16, 18). Die Hyphen-Bildung von Pilzen erlaubt einen ausgezeichneten Zugang zu unlöslichen Substraten und damit gute Produkt-Ausbeuten. Lactobacillen (→116) (Yoghurts) oder BacillusStämme (Natto) werden aber ebenfalls verwendet. Technologie. Bei der Herstellung traditioneller Lebensmittel wie Sauerkraut (→116), Tempeh oder Kakao werden meist traditionelle, handwerkliche Methoden benutzt. Zur industriellen Herstellung von Produkten wie z. B. Enzymen oder Bioethanol liegen aber auch umfangreiche Untersuchungen zur Verfahrenstechnik und Prozesskontrolle vor. Kritische Parameter bei der SSF sind der Massentransfer (→94), die Entfernung der Reaktionswärme, analytische Methoden, um die Prozessführung zu verfolgen, und die Prozeß-Modellierung. Der Massentransfer bezieht sich meist auf den Zugang der Mikroorganismen zum Substrat und, bei aeroben Prozessen, auch zum Sauerstoff. Oft werden Substrat und Mikroorganismen auf durchlöcherte Bleche aufgebracht und diese sanft bewegt. Die Entfernung von Reaktionswärme gelingt durch Luftkühlung, interne Wärmetauscher oder externe Wasserkühlung. Auf einem Feststoff-Substrat muss auch die Wasser-Aktivität kontrolliert werden, da diese oft kritisch für das Wachstum von Mikroorganismen und die Produktbildung ist. Schließlich ist die Prozessanalytik (→96) in einem Feststoff-System anspruchsvoll und wird mit Methoden wie Mikrokalorimetrie, Fourier-Transform- oder Nahe-Infrarot-Spektroskopie (FTIR, NIR) bearbeitet. Aromen-Detektion durch GC oder GC-MS, die Quantifizierung des Wassergehalts durch Mikrowellen-Analyse sowie Bildbearbeitungs-Methoden werden ebenfalls eingesetzt. Experimentelle Reaktor-Designs wurden beispielsweise mit einem horizontalen Schaufelreaktor an der Universität Wageningen (NL), mit dem Zymotis-Reaktor des ORSTOM Center in Montpellier oder beim Platotex Bioreaktor des CNRS in Gif-sur-Yvette verwirklicht. Alle diese Entwürfe sind ein Versuch, SSF zu einer gut reproduzierbaren Methode weiterzuentwickeln, die auch eine Modellierung umfasst – im Vergleich zu Submers-Verfahren ist diese aber noch nicht ausreichend entwickelt und behindert die Skalierung. Die Vorteile von SSF liegen bei den preiswerten Rohstoffen, den einfachen Reaktor-Konzepten (meist Tabletts) und der einfachen Aufarbeitung (→108) (meist Extraktion mit Wasser). SSF wird vor allem für die Herstellung von Lebensmittelenzymen (z. B. für Stärke-abbauende Enzyme, Pektinasen) und einiger wichtiger Lebensmittel-Zusatzstoffe, z. B. von Sojasauce, benutzt. Herstellung von Sojasauce (Japan). (→114) Die traditionellen Rohstoffe für Sojasauce sind

ein Extrakt von Sojabohnen mit heißem Wasser und eine gleiche Menge gerösteten Weizens. Dieses Gemisch wird mit einer Starter-Kultur von Aspergillus oryzae vermischt (manchmal auch mit A. sojae oder A. tamari) und führt zu einem „Koji“, der auch Bacillus-, Lactobacillusund Hefestämme enthält. Sobald sich eine mikrobielle Biozönose entwickelt hat, mischt man den Koji mit grobem Salz (SSF) oder Salzwasser (Flüssig-Fermentation) und fermentiert in Tanks einige Monate lang („Moromi“). Während der Moromi-Phase depolymerisiert Aspergillus oryzae die Polysaccharide des Weizens und das Sojaprotein in Zucker, Oligopeptide und Aminosäuren, die nun in einer Maillard-Reaktion zu Würzstoffen und dunkelbraunen Farbstoffen abreagieren. Milchsäure-Bakterien bilden aus den Zuckern Milchsäure, und Hefen bilden etwas Ethanol. Durch Alterung und Sekundärfermentationen entstehen daraus zahlreiche Aromastoffe. Die meisten Einzelschritte dieses komplexen Verfahrens sind heute gut verstanden und für eine optimierte Herstellung standardisiert.

Mikroorganismen: Anzucht Allgemeines. Mikroorganismen werden sowohl auf festen Nährböden wie in Flüssigkulturen angezogen. Für Arbeiten im Labor benutzt man meist Agarplatten und Schüttelkolben. Im technischen Bereich kommen meist Bioreaktoren zum Einsatz. Die Zusammensetzung und Zudosierung des Nährmediums hat einen großen Einfluss auf die Produktbildung. In den meisten Fällen wird kontaminationsfrei gearbeitet, um unerwünschte Keime fernzuhalten. Schüttelkolben enthalten ein steriles flüssiges Nährmedium (Submerskultur). Meist verwendet man gekerbte Erlenmeyerkolben (Füllvolumen ca. 50–500 mL), die durch Reziprok- oder Kreisbewegung auf thermostatierten Schüttelmaschinen („Schüttelinkubatoren“) eine ausreichende O2-Versorgung gewährleisten. Zur Kultivierung anaerober Mikroorganismen müssen die Nährlösungen dagegen ausgekocht, entlüftet und in O2-freier Atmosphäre in Gegenwart von Reduktionsmitteln (Thioglykolat) hantiert werden. Bioreaktoren (Fermenter) sind geschlossene Reaktoren, deren Volumen von 1 L bis zu 500 m3

reicht. Die häufigste Version ist der Rührreaktor, bei dem der Massentransfer, bei aeroben Prozessen auch die Verteilung des zugeführten O2 durch ein Rührwerk erfolgt. Bioreaktoren können als Satzreaktor, als Satzreaktor mit Nährstoff-Zulauf oder als kontinuierlicher Reaktor betrieben werden. Industriell verwendet man vorwiegend die beiden ersten Varianten; für die Grundlagenforschung ist dagegen auch die kontinuierliche Kulturführung von Bedeutung, da sie es erlaubt, eine konstante spezifische Wachstumsrate von Zellen über einen längeren Zeitraum (Tage bis Wochen) aufrecht zu erhalten. Da bei vielen mikrobiellen Produktionsprozessen die Produktbildung erst in der stationären Phase erfolgt, setzt man häufig am Ende der Wachstumsphase weitere Nährstoffe zu (Zulaufverfahren, fed batch). Zum einen verlängert man damit die Produktionsphase und erhöht die Endprodukt-Konzentration. Zum anderen gelingt es auf diese Weise oft, eine Substrat-Hemmung zu verhindern, die häufig beim Wachstum von Mikroorganismen in Gegenwart höherer Glucose-Konzentrationen beobachtet wird („Katabolit-Repression“). Medienoptimierung. Die meisten für technische Prozesse eingesetzten Mikroorganismen wachsen aerob und heterotroph. Sie benötigen organisch gebundenen Kohlenstoff als Energieund C-Quelle sowie Stickstoff, Salze und Spurenstoffe (z. B. Ionen einiger Übergangsmetalle, Vitamine) (→12). Die Optimierung des Nährmediums führt man meist in Schüttelkolben durch. Zielparameter sind die Steigerung der Ausbeute des gewünschten Produkts und die Minimierung der Rohstoff-Kosten, die bei Produkten wie Ethanol oder Citronensäure > 50 % der Herstellkosten ausmachen (→108). Aus Kostengründen bestehen die meisten industriellen Nährmedien aus nicht sehr gut definierten Bestandteilen wie Maisstärke, Melasse oder Sojamehl (komplexe Medien), während man in der Forschung definierte Medien (z. B. Glucose, Aminosäure-Mischungen) bevorzugt. Sterilisation. Im Labor sterilisiert man meist durch Autoklavieren. Nach 15 min bei 121 °C sind dabei auch die Sporen thermophiler Bakterien abgetötet (Testorganismus: Bacillus stearothermophilus). Hitzeempfindliche Nährstoffe (z. B. Glucose, Vitamine) gibt man über Bakterienfilter sterilfiltriert zu. Bei Bioreaktoren > 10 L sterilisiert man die Anlage mit Dampf von 1,4–3 bar. Die Methode ist zeitraubend (Aufheiz- und Abkühlzeiten von mehreren h) und führt wegen der langen Hitzeeinwirkung zu Veränderungen des Nährmediums. In der industriellen Praxis hat sich deshalb bei großvolumigen Fermentern die kontinuierliche Sterilisation durchgesetzt. Dabei wird die Nährlösung mit Dampf 2–3 min lang (Haltezeit) bei 140 °C erhitzt. Mittels Gegenstromverfahren verhindert man dabei die Bildung von Dampfkondensat und gewinnt ca. 90 % der eingesetzten Energie zurück. Die zugeführte Luft wird durch Tiefenfilter gereinigt (1 m3 Frischluft kann bis zu 2000 Keime enthalten, davon 50 % Pilzsporen und 40 % Gram-negative Bakterien). Für einen Bioreaktor mit 100 m3 Arbeitsvolumen werden bei einer Belüftungsrate von 1 vvm (Volumen Luft/Volumen Flüssigkeit · min) 6000 m3 steriler Luft/h benötigt! Eine neue Entwicklung sind EinwegBioreaktoren aus Kunststoff. Sie sind im Maßstab von 500 ml –3000 L erhältlich und werden bereits steril ausgeliefert. Durch Wegfall der Sterilisations- und Abkühlzeiten erlauben sie einen höheren Durchsatz an Versuchen.

Wachstumskinetik und Produktbildung Allgemeines. Die Gesetzmäßigkeiten des Wachstums von Mikroorganismen sind besonders für Einzeller gut beschrieben. Schwieriger ist die Beschreibung des Wachstums Mycel-bildender Organismen (Streptomyceten, Pilze). Bei der Produktbildung unterscheidet man mehrere Fermentationstypen. Wachstumkinetik einzelliger Mikroorganismen. Zu dieser Gruppe gehören die meisten Bakterien, aber auch Hefen. Sie vermehren sich durch Zweiteilung. Die Erhöhung der Zellzahl lässt sich durch optische Methoden, z. B. durch Trübungsmessung, kontinuierlich bestimmen. In einer statischen Kultur, z. B. in einem Schüttelkolben oder einem Satzreaktor, folgt einer Anlaufphase (lag-Phase), in der die für das Wachstum wichtigen Enzyme induziert werden, nach einer ersten Übergangsphase I eine Phase exponentiellen Wachstums (log-Phase), deren Kinetik einer Reaktion 1. Ordnung entspricht. Die nachfolgende Übergangsphase II wird erreicht, wenn ein Substrat limitierend oder ein Produkt inhibierend wird. Die stationäre Phase

stellt sich dann ein, wenn Substratbegrenzung, hohe Populationsdichte, niedriger O2Partialdruck oder die Ansammlung toxischer Stoffwechselprodukte zu einem Ende des Wachstums führen. Meist schließt sich eine Absterbephase an, die Zellzahl nimmt dann ab. Wichtige Parameter zur Charakterisierung einer Wachstumskurve sind: 1. die Anlaufzeit. Sie ist abhängig vom Mikroorganismus, von seinem physiologischen Zustand im Impfmaterial und von der Nährlösung und wird in [h] dimensioniert, 2. die spezifische Wachstumsrate μ. Ihre Dimension ist [h–1]; sie stellt den Zusammenhang zwischen Zellbildungsrate und Zellkonzentration im Bioreaktor während der exponentiellen Phase her. Als Maß für die Geschwindigkeit des Zellwachstums kann sie mit der Gleichung μ = μmax · S/(KS + S) (Monod-Gleichung) bestimmt werden. Dabei entspricht die Sättigungskonstante KS derjenigen Substratkonzentration in [mg/L], bei der 50 % der maximalen Wachstumsrate erreicht werden. Formal entspricht sie damit der Michaelis-Konstante der Enzymkinetik. Die Wachstumsrate hängt zusammen mit der Generations- oder Verdopplungszeit. Diese gibt in [h] an, wie schnell sich eine Bakterienkultur in der exponentiellen Wachstumsphase verdoppelt. Der Ertragskoeffizient Ys ist ein Maß für den zur Bildung von Zellmasse erforderliche Substrat-Verbrauch. Man verwendet verschiedene Ertragskoeffizienten, da die Bildung der Zellmasse von chemischen (z. B. pO2, C/N-Verhältnis, Phosphat-Gehalt) und physikalischen (z. B. Temperatur) Parametern abhängt. Bei komplexen Nährmedien beobachtet man häufig zwei durch eine lag-Phase getrennte log-Phasen. Diese sogenannte Diauxie erklärt man durch die Induktion neuer Enzymen bzw. Stoffwechselwege zur Verwertung der zweiten C-Quelle, sobald die besser verwertbare C-Quelle (meist Glucose) erschöpft ist. Wachstumskinetik mycelbildender Mikroorganismen. Bei Pilzen, aber auch bei Mycelbildenden Prokaryoten wie den Streptomyceten erfolgt das Wachstum nicht durch Verdopplung, sondern durch Längenwachstum des Mycels. Die Bestimmung von Wachstumskurven erfolgt meist durch Auswägen der Biomasse und führt zu komplexen Kinetiken. Produktbildung. Bei den meisten Fermentationsprozessen erfolgt die Produktbildung entweder Wachstums-gekoppelt oder -entkoppelt. Wachstums-gekoppelt ist beispielsweise die Produktion von Zellmasse (Backhefe, SCP, Algen) und die Bildung von Ethanol, Milchsäure, Gluconsäure usw. Wachstums-entkoppelt, d. h. nach Abschluss der logarithmischen Phase, werden Produkte des Sekundär-Stoffwechsels gebildet, beispielsweise Antibiotika (→166, 200) und extrazelluläre Enzyme. Bei gentechnisch optimierten Mikroorganismen erfolgt die Produktbildung mittlerweile häufig durch Hochzelldichte-Fermentation und anschließende Induktion des gewünschten Stoffwechselwegs durch Aktivierung eines reprimierbaren Promotors. Häufig wird das zu aktivierende Gen beispielsweise hinter einen lac-Promotor einkloniert, der sich durch allo-Lactose (6-O-β-D-Galactopyranosyl-D-glucose) oder isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) aktivieren lässt (→62). Verwendet man anstelle des lac-Promotors einen λPLPRPromotor, so erfolgt die Induktion mittels Temperaturerhöhung von 30° auf 42 °C. Bei Einklonierung des Gens ohne Promotor ins Chromosom des Wirtsorganismus erfolgt die Produktbildung dagegen Wachstums-gekoppelt.

Zulauf-, kontinuierliche und HochzelldichteFermentationen Allgemeines. Beim Zulaufverfahren wird im Bioreaktor die Produktionsphase durch Zugabe von Nährmedium verlängert. Diese Betriebsweise ist, neben der Hochzelldichte-Fermentation, die industriell bevorzugte Form von Fermentationsverfahren. Kontinuierliche Fermentationen sind wichtige Labortechniken für das Verständnis der Gesetzmäßigkeiten des bakteriellen Wachstums und Stoffwechsels. Zulaufverfahren. Diese auch fed batch genannten Verfahren bieten zwei wichtige Vorteile: zum einen gelingt es damit, bei den vielen aus dem sekundären Stoffwechsel stammenden Fermentationsprodukten (Antibiotika, Enzyme, Polysaccharide usw.), deren Bildung ja erst nach dem Ende der logarithmischen Phase einsetzt, durch Zugabe von frischen Nährstoffen oder von intermediären Bausteinen der Biosynthese die Konzentration des gewünschten Endprodukts oft dramatisch zu erhöhen. Zum anderen lässt sich durch dosierte Zugabe von Glucose, der häufigsten C-Quelle, eine Substrathemmung des Zellwachstums unterdrücken. So findet man bei der Biosynthese von Antibiotika häufig eine Katabolit-Regulation der Produktbildung; für eine hohe Produktivität des Prozesses ist es deshalb erforderlich, die Cund Energiequelle durch ein Zulaufverfahren zu limitieren. Gleiche Erfordernisse können bei der Stickstoffoder Phosphat-Quelle auftreten. Bei der Backhefe-Produktion (→120) führt eine höhere Zuckerkonzentration zu einer höheren spezifischen Wachstumsrate μ, die Ausbeute an Biomasse YS nimmt aber wegen der zunehmenden Bildung von Ethanol ab („Crabtree-Effekt“), was durch ein Zulaufverfahren unterbunden werden kann. Kontinuierliche Fermentationen. Stellt der Satzreaktor ein geschlossenes System dar, so ist der Reaktor bei einer kontinuierlichen Fermentation ein offenes System, dem kontinuierlich sterile Nährlösung zugeführt und die gleiche Menge Kulturlösung entnommen wird. Dabei unterscheidet man homogen gemischte Bioreaktoren, die entweder mit konstantem Nährstoffzufluss (Chemostat) oder mit konstanter Zellzahl (Turbidostat) betrieben werden. Beim plug-flow-Reaktor fließt die Kulturlösung ohne Rückvermischung durch einen Röhrenreaktor, die Zellmasse wird am Reaktorauslass zurückgehalten und am Zufluss wieder zugegeben. Dabei stellen sich entlang der Fließrichtung Unterschiede in der Zusammensetzung des Mediums, der Konzentration der Biomasse und der Produktkonzentration ein, die in einem Satzreaktor dem Zustand bei unterschiedlichen Inkubationszeiten entsprechen würde. Ist eine kontinuierliche Fermentation im Gleichgewichtszustand, so wird der Zellverlust beim Abfluss durch die spezifische Wachstumsrate μ des Organismus gerade ausgeglichen. Substratkonzentration S und Produktbildungsrate QX ändern sich nicht. Unter diesen Bedingungen ist die Produktbildungsrate QX in erster Näherung nur noch von der Durchflussrate abhängig. Sind Wachstums- und Produktbildungsphase allerdings entkoppelt (sekundäre Stoffwechselprodukte) (→200), so ist die Konzeption eines kontinuierlichen Fermentationsprozesses wesentlich schwieriger. Kontinuierliche Fermentationen sind sehr nützlich, um Zellwachstum und Produktbildung systematisch zu optimieren, oder um den limitierenden Einfluss einzelner Medienkomponenten zu ermitteln. In der industriellen Praxis

konnten sich kontinuierliche Fermentationsverfahren nicht durchsetzen. Zu den wenigen Ausnahmen gehören die aerobe und anaerobe Abwasserreinigung (→286, 288), Verfahren zur Herstellung von Bier und die Herstellung von Human-Insulin mit rekombinanter Backhefe (→222). Bei den meisten technischen Verfahren steht einer kontinuierlichen Betriebsweise entgegen, dass im Vergleich zum Zulaufverfahren wirtschaftliche Vorteile erst bei einer Fermentationsdauer von 500–1000 h erreicht würden, so lange Zeiträume aber Probleme bei der Sterilhaltung, der gleichmäßigen Zusammensetzung technischer Nährmedien und der genetischen Stabilität rekombinanter Stämme Probleme aufwerfen. Hochzelldichte-Fermentation. Von Hochzelldichte wird ab einer Biotrockenmassekonzentration von 50 g/L im Bioreaktor gesprochen. Escherichia coli lässt sich mit Hilfe geeigneter Zulaufverfahren bis zu Zelldichten von rund 150 g/L Biotrockenmasse im Rührkessel-Reaktor kultivieren, wobei Glucose oder Glycerin als Kohlenstoffquellen eingesetzt werden. Zur effizienten Genexpression sind eine Vielzahl von Vektoren mit unterschiedlichen Induktionsstrategien verfügbar.

Fermentationstechnik Allgemeines. Für die wirtschaftliche Herstellung biotechnologischer Produkte im Bioreaktor spielt die von Ingenieuren geprägte Bioverfahrenstechnik eine ebenso große Rolle wie die von Biologen und Biochemikern geprägten Biowissenschaften. Kernaufgaben der industriellen Bioverfahrenstechnik sind Betriebssicherheit und Minimierung der Investitions- und Betriebskosten. Wichtige Teilaufgaben einer verfahrenstechnischen Optimierung sind 1. die Durchmischung des Nährmediums durch Rührwerke, 2. die Temperaturführung, und 3. die Optimierung des O2-Eintrags bei aeroben Prozessen. Durchmischung im Bioreaktor wird durch Rührwerke oder Pumpen erreicht. Bei den meist aeroben Verfahren trägt auch der Lufteintrag zur Durchmischung bei. Dabei entsteht eine turbulente Strömung, die in unmittelbarer Nähe der Rührorgane durch die Reynolds-Zahl Re des Rührers charakterisiert wird. In ihre Berechnung geht die Viskosität η ein, die bei Mycelbildenden Mikroorganismen von deren Konzentration und von den Eigenschaften des Produkts beeinflusst wird (Beispiel: Xanthan). In einem ideal durchmischten Bioreaktor sollte die Turbulenz im Reaktionsraum homogen verteilt sein. Dieses Ziel wird nur annähernd erreicht, da die Empfindlichkeit des biologischen Materials enge Grenzen setzt. So limitiert beispielsweise die mechanische Empfindlichkeit eines Pilz-Mycels die Rührergeschwindigkeit. Optimiert werden müssen die Geometrie des Reaktors, mechanische Einbauten (Prallbleche), Rührerform und -zahl oder, bei ungerührten Reaktoren, die Anordnung der Pumpen und die Konfiguration bzw. Anordnung der Luftbegasung (Lochplatte, Ejektor). Die Leistungskennzahl Ne beschreibt den Energiebedarf gerührter Reaktoren und ist im unbegasten Zustand mit der Reynolds-Zahl korreliert. Für die industrielle Praxis stehen zahlreiche optimierte Rührorgane zur Verfügung, z. B. Scheiben- und Turbinenrührer sowie MIG- und Inter-MIGRührer, die gute Durchmischung und O2-Eintrag gewährleisten. Die Maßzahl für den Gaseintrag ist kLa, der spezifische volumetrische Stoffübergangskoeffizient Temperaturführung. Für optimale Ergebnisse müssen Fermentationen bei konstanter Temperatur gefahren werden. Dazu muss nach anfänglichem Aufheizen auf die optimale

Wachstumstemperatur vor allem gekühlt werden, um die aus dem Stoffwechsel der Mikroorganismen produzierte Wärme und den Energieeintrag des Rührers auszugleichen. In die Wärmeproduktion gehen neben der Zellbildungsrate und dem Energieeintrag des Rührers noch die Wärmeübergangszahl (bzw. Wärmedurchgangszahl) und die Austauschfläche im Reaktor ein. Meist reicht es, die Wärme durch Wasserkühlung des Fermentermantels abzuführen; bei sehr hohen Ertragskoeffizienten, beispielsweise bei der Verwendung von Alkanen oder Methanol als C-Quelle, benötigt man noch zusätzlich Wärmetauscher im Inneren des Bioreaktors. Lufteintrag. Das Wachstum aerober Kulturen wird unterhalb einer kritischen O2Konzentration vom O2-Gehalt der Lösung begrenzt. Bei der Optimierung müssen biologische und technische Gesichtspunkte berücksichtigt werden. Zum einen errechnet sich der optimale O2-Transfer in den Bioreaktor aus der spezifischen maximalen O2-Aufnahmerate qO2max eines Mikroorganismus. Zum anderen muss O2 im Dreiphasensystem Gas/Nährstoff-lösung/Zelle optimal transportiert werden. Dabei sind mehrere Widerstände zu überwinden: 1. von der Gasblase durch die gasseitige Phasen-Grenzschicht, 2. durch die Phasengrenzschicht auf der Seite der Flüssigkeit, 3. beim Transport durch die Flüssigkeit zur Grenzschicht um den Mikroorganismus, und 4. beim Transport in die Zelle. Bei Einzel-Zellen ist dabei oft die zweitgenannte, bei Zellflocken oder Mycelien der Transport in die Zelle der geschwindigkeitsbestimmende Schritt. Der O2-Transfer hängt von technischen (Reaktordimensionen, Füllhöhe, Rührleistung, Belüftungssystem, Belüftungsrate), chemisch/physikalischen [Nährlösung, Salzgehalt, Dichte, Viskosität, Temperatur, Oberflächenspannung (Antischaummittel!)] und biologischen Kenngrößen (Wuchsform der Mikroorganismen) ab. Eine wichtige Kenngröße für den O2-Übergang im Bioreaktor ist der volumenbezogene Sauerstoffübergangskoeffizient kLa. Er kann mit verschiedenen Methoden experimentell bestimmt werden und liegt bei Laborfermentern typischerweise bei 800–1200 h–1. Bei Produktionsfermentern reduzieren sich diese Werte auf 500–800 h–1.

Fermentationstechnik: Maßstabsvergrößerung

Allgemeines. Bei der Übertragung von Prozessen aus dem Technikum in die Produktion sind veränderte Verhältnisse bei der Maßstabsvergrößerung (scale up) zu berücksichtigen. Abhängig vom Prozess und vom angestrebten Produktionsvolumen stehen unterschiedliche Bioreaktor-Typen zur Verfügung, wobei der Rührreaktor am weitesten verbreitet ist. Traditionell erfolgt die Maßstabsvergrößerung in 10er-Schritten (30 L → 300 L → 3000 L → Produktionsmaßstab). Maßstabsvergrößerung. Bereits im Technikums-Maßstab sind Bioreaktoren mit Rührern, Turbinen, Prallblechen, Pumpen und Belüftungsmodulen so ausgestattet, dass eine gute Durchmischung gewährleistet ist. Im Produktionsmaßstab ist darüber hinaus zu berücksichtigen, dass die Mischzeiten mit einer Volumenvergrößerung stark ansteigen und die für eine schnelle Durchmischung erforderlichen Rührergeschwindigkeiten bei Reaktorvolumina > 150 m3 schwer erreichbar und ihre Energiekosten nicht mehr bezahlbar sind. Dieser Sachverhalt spricht auch gegen die Verwendung von Plasmiden, die einen λ-Promotor tragen: die zur Induktion erforderliche Temperaturänderung (→62) würde in einem Produktionsfermenter die Ausarbeitung eines standardisierten Prozesses erschweren. Auch die mechanische Empfindlichkeit von Mycelbildnern (Streptomyceten, Aspergillus- oder Penicillium-Stämme) setzt Grenzen. Gleiche Argumente gelten für die Verteilung der Gasblasen beim Lufteintrag und für die Abfuhr der im Reaktor gebildeten Wärme durch Wärmetauscher. Bioreaktor-Typen. Historisch bedeutend ist der Oberflächen-Reaktor (→86) für die Herstellung von Citronensäure und der Rieselfilmreaktor (Tropfkörper in der aeroben Abwasserreinigung). Beide sind einfach zu bedienen, führen aber zu verhältnismäßig geringen Raum-Zeit-Ausbeuten. Der am häufigsten verwendete Bioreaktor ist der Rührreaktor. Er ist thermostatiert, verfügt über Rührwerk und Begasung, sterile Zuleitungen und ProbenahmeStutzen. Meist findet man mehrstufige Rührwerke mit Prallblechen, in Einzelfällen auch einstufige Rührer mit Umwurfsystemen und Leitrohr. Bei der Essigsäure-Produktion (→144) und der aeroben Abwasser-Reinigung (→286) verwendet man selbstansaugende Rührer. Bioreaktoren für Forschungszwecke reichen von 1 – 300 L. Im sogenannten „upstream“Bereich (Medien-Optimierung) haben sich sowohl parallele Bioreaktor-Systeme mit geringeren Volumina als auch Einweg-Bioreaktoren aus Kunststoff durchgesetzt. In der industriellen Produktion findet man Rührreaktoren bis zu einem Arbeitsvolumen von ca. 500 m3. Bei größeren Volumina steigt der für die Durchmischung und Wärmeabfuhr erforderliche Leistungseintrag stark an. Für großvolumige Bioprozesse (Glutaminsäure (→126), AbwasserReinigung (→286), Herstellung von SCP (→122)) mit Bioreaktoren bis zu 1500 m3 bevorzugt man deshalb Schlaufen- oder Airlift-Reaktoren, bei denen die Durchmischung durch MammutPumpen erfolgt. Mess- und Regeltechnik. Sowohl für die Optimierung eines Fermentationsverfahrens im Technikum als auch für die Betriebssicherheit eines Produktionsverfahrens ist eine zuverlässige Mess- und Regeltechnik von entscheidender Bedeutung. Routinemäßig werden bestimmt: Gewicht, Temperatur der Lösung, Drehzahl und Leistungsaufnahme des Rührers, O2Gehalt in der Lösung und pH-Wert. In der Regel ermittelt man auch CO2 (mit IRSpektroskopie) und O2 (mit paramagnetischer Resonanzspektroskopie), oder beide mit

Massenspektrometrie, in der Zuluft und im Abgas. Aus dem dabei gebildeten Respirationsquotienten (RQ) gewinnt man wertvolle Hinweise auf den Wachstums-Zustand der Kultur. Substratverbrauch und Produktbildung analysiert man meist nach steriler Probenahme außerhalb des Bioreaktors. Wegen des hohen Werts der Fermenterlösung in einem Bioreaktor (selbst bei einem Produkt mit einem Marktwert von nur 10 €/kg und einer EndproduktKonzentration von 100 g/L beträgt der Füll-Wert eines 100 m3-Bioreaktors 100 000 €) werden die Methoden zur zuverlässigen Betriebs- und Sterilitätskontrolle von Bioreaktoren laufend verbessert. Schaumzerstörung. Bei der Belüftung Protein- oder Tensid-haltiger Lösungen entsteht Schaum. Er wird meist durch mechanische Schaumzerstörer (Schaumzentrifugen) auf der Rührwelle entfernt. Bei starker Schaumentwicklung setzt man chemische Schaumzerstörer (Erucasäure, Silicone) zu, die allerdings Aufarbeitungsschritte stören können.

Kultivierung tierischer Zellen Allgemeines. Kulturen tierischer Zellen verwendet man vorwiegend in zwei Einsatzgebieten: 1. um Vakzine (→248, 250) zu produzieren, und 2. um therapeutische und diagnostische Proteine herzustellen, die mit rekombinanten Mikroorganismen nicht gewonnen werden können. Dazu gehören solche Proteine, die entweder zahlreiche Disulfid-Brücken enthalten, erst nach umfangreicher posttranslationaler Modifikation (z. B. Glykosylierung) wirksam sind, oder aufgrund falscher Glykosylierung (→262) bei Langzeitgabe Immunreaktionen auslösen. Beispiele sind therapeutische Antikörper (→246), Faktor VIII (→228), Erythropoietin (→238) und Cytokine (→234). Die Produktion von Proteinen mit tierischen Zellkulturen ist technisch anspruchsvoll und teuer. Man hat deshalb auch Methoden entwickelt, derartige Proteine mittels transgener Tiere oder Pflanzen herzustellen. Dafür fehlt aber in Europa die Akzeptanz. Humane Zellkulturen, insbesondere Kulturen von Stammzellen (→78), dienen zur Herstellung von Gewebeersatz (→308) für die Transplantationsmedizin oder zur Austestung von Medikamenten. Humane Zellkulturen. Aus menschlichem Gewebe entnommene und in Nährmedien vermehrte („expandierte“) Zellpopulationen setzt man seit Jahrzehnten für den Nachweis und die Vermehrung von humanpathogenen Viren ein. Sie können in der Gasphase von Kryobehältern bei –196 °C gelagert werden, und man kann aus einer derartigen master cell bank über längere Zeit hinweg einheitliche Zellkulturen anlegen. Die Lebensspanne von primären Zellen ist allerdings derzeit auf etwa 50 Zellteilungen begrenzt, ferner benötigen sie zum Wachstum unbedingt eine feste Oberfläche, sodass die Ausbeute an Zellmaterial bei dieser Methode begrenzt ist. Unterschiedliche Zelltypen des Menschen können auch kombiniert in Kultur vermehrt werden, um daraus Ersatz-Gewebe, z. B. Knorpelgewebe, Knochen oder eine „künstliche Haut“ zu bilden („tissue engineering“) (→308). Von großem Interesse sind humane Stammzellen (embryonale Stammzellen oder induzierte pluripotente Stammzellen) (→306). Sie können aus ausdifferenzierten Zellen eines Patienten hergestellt werden, und bilden nach Ausdifferenzierung wieder spezialisierte Körperzellen. Viele Säugerzellen

wachsen nur adhärent: wenn sie an Oberflächen haften. Die Vermehrung dieser Zellen („Expansion“) erfolgt deshalb entweder auf geeigneten Oberflächen oder suspendiert in Mikrocarriern, z. B. in Dextran, Gelatine, porösen Materialien. Zelllinien. Zur Produktion therapeutischer Proteine verwendet man vorwiegend gut charakterisierte immortalisierte („kontinuierliche“) Zelllinien aus Säugern. Sie sind unbegrenzt vermehrungsfähig und weisen folgende Eigenschaften auf: 1. eine kurze Generationszeit (20–30 h), 2. verhältnismäßig anspruchslose Kulturbedingungen, 3. sie können, anders als die meisten primären Säugerzellen, auch in Suspension bis zu einer hohen Zelldichte wachsen, sind gegenüber Scherkräften wenig empfindlich und lassen sich deshalb im Bioreaktor vermehren, 4. sie lassen sich leicht transformieren. Zur Produktion von Proteinen werden in der industriellen Praxis heute vor allem genutzt: 1. Hybridoma-Zellen vom Menschen oder von der Maus zur Herstellung monoklonaler Antikörper, 2. Fibroblasten aus dem Ovar des chinesischen Hamsters (Chinese Hamster Ovary-, CHO-Zellen) und 3. Tumorzellen aus dem Nierengewebe des syrischen Hamsters (Baby Hamster Kidney, BHK-Zellen). Klonierungsvektoren. Zur Herstellung genetisch stabiler, rekombinanter Tierzellen haben sich einige Grundtypen von Vektoren durchgesetzt. Sie integrieren ins Genom der Zielzelle und können meist durch Promotoren angeschaltet werden. Meist handelt es sich um shuttleVektoren, die auch in E. coli transformiert werden können, wo man die Optimierung des Vektors durchführt. Als Selektionsmarker für den Nachweis der Integration werden für Laborversuche oft Genprodukte verwendet, die toxische Medienbestandteile wie Neomycin oder Cadmium-Salze entgiften. Für industrielle Anwendungen bevorzugt man DihydrofolatReduktase (DHFR) (→62) in dhfr-negativen Zellen (z. B. CHO-K1), die durch die FolsäureAnalogverbindung Methotrexat kompetitiv gehemmt wird und damit in die ThymidinBiosynthese eingreift. Für Thymidin auxotrophe dhfr-negative Zellen können in Gegenwart eines Minimalmediums mit Methotrexat nach Transfektion wachsen. Sie amplifizieren die dhfr-Genkassette, die die für die Produktion des Wirkstoffs kodierende cDNA enthält. Beispiele für industrielle Produktionsvektoren für tPA (→230) und Faktor VIII (→228) mit CHO-Zellen werden in diesem Buch aufgeführt.

Kultivierung tierischer Zellen im größeren Maßstab Allgemeines. Zur Kultivierung von tierischen Zellen im Labormaßstab wurden in den letzten Jahrzehnten zahlreiche Methoden entwickelt, die heute zur Routine zellbiologischer Labors gehören. Einige therapeutische verwendete Proteine wie humane oder humanisierte Antikörper (→246), Faktor VIII (→228) oder EPO (→238) können nur mit tierischen Zellkulturen in der gewünschten Qualität und in genügender Menge hergestellt werden. Dazu optimierte man sowohl die Nährstoffbedingungen wie auch die Prozesstechnik. Für derartige Prozesse gibt es heute Herstellverfahren in Zellreaktoren bis zu 20 000 L Arbeitsvolumen. Dabei spielen für die

Bioreaktor-Technologie typische Gesichtspunkte wie Durchmischung und Luftzufuhr eine wichtige Rolle (→94). Die Aufreinigung von zellbiologischen Produkten stellt extrem hohe Anforderungen, sowohl im Hinblick auf die Abreicherung unerwünschter Begleitproteine wie auch wegen der Forderung, selbst Spuren von fremder DNA oder RNA retroviraler Partikel aus dem Produkt zu eliminieren. Nährmedien. Neben einer ausreichenden Versorgung mit Sauerstoff ist eine gute Nährstoffversorgung von großer Bedeutung. Im Gegensatz zu Mikroorganismen expandiert man Tierzellen in einem eng umgrenzten Temperatur- und pH-Bereich (meist 37 °C, pH 7,0). Zur pH-Regelung setzt man meist Bicarbonat ein oder arbeitet unter einer CO2-Atmosphäre. Als CQuelle wird Glucose bevorzugt. Daneben müssen Aminosäuren, Vitamine, Nucleotide, Proteine, Fettsäuren, anorganische Salze und andere Wuchsstoffe zugeführt werden. Bei den meisten Rezepturen verwendete man früher fötales Kälberserum, das zahlreiche für ein gutes Wachstum erforderliche Proteine enthält. Die heute gebräuchlichen Serum-freien Medien müssen anspruchsvoll supplementiert werden, z. B. mit Transferrin, Insulin, pflanzlichen Peptonen und Lipoprotein. Einige dieser Medienbestandteile werden ihrerseits rekombinant hergestellt. Laborverfahren. Im Labor züchtet man tierische Zellen bevorzugt in Roller- oder TFlaschen (tissue flasks), in etwas größerem Maßstab in Spinnerflaschen bis zu etwa 10 L Volumen. Man erreicht dabei Zellkonzentrationen von 1–2 Mio. Zellen pro mL. Zellreaktor. Bei der Maßstabsvergrößerung im Zellreaktor ist zu beachten, dass sich bei einer Batch- oder Zulauf-Kultivierung toxische Stoffwechselprodukte anreichern können, die die Bildung des gewünschten Produkts hemmen. Bei der Perfusionskultur wird dagegen verbrauchtes Medium durch frisches ersetzt. Im industriellen Maßstab wird aus Sicherheitsgründen (geringeres Infektionsrisiko) meist eine Zulauf-Kultivierung (→92) bevorzugt. Wichtig ist eine gute Ausnutzung der teuren Nährmedien. Gasversorgung und Scherempfindlichkeit der Zellen sind ebenfalls wichtige, oft gegenläufige Parameter. Der kLaWert für die Sauerstoff-Versorgung (→94) von Tierzellen liegt mit 2,2/h um Größenordnungen niedriger als für Mikroorganismen. Man entwickelte zahlreiche indirekte Begasungssysteme, z. B. mittels semipermeabler Membranen aus Silicon. Bei modernen industriellen fed-batch Verfahren, die bis zum 20 000 L-Maßstab reichen und etwa 14 Tage benötigen, verwendet man im Zulaufverfahren ausschließlich suspendierte Zellen und Serum-freie Medien. In Perfusionsverfahren bis etwa 100 L erntet man verbrauchtes Medium mit hemmenden Stoffwechselprodukte wie Milchsäure und Ammoniak kontinuierlich, führt aber die Zellen nach Filtration durch mikroporöse Membranfilter zurück. Ist die gewünschte Zelldichte von 15–20 Mill. Zellen/mL erreicht, beginnt die Aufarbeitung (→106) des Produkts. Derartige Kultivierungen können über 30 Tage lang im Gleichgewicht gehalten werden. Auch auf Mikropartikeln aufgewachsenen Zellen werden verwendet. Reinigung der Produkte. Im Gegensatz zur Aufarbeitung mikrobieller Fermentationen entfällt bei tierischen Zellkulturen die Notwendigkeit zum Zellaufschluss, da die gewünschten Produkte sezerniert werden. Andererseits muss ein erheblicher Aufwand für die Qualitätskontrolle des Produkts getrieben werden, einmal zum Identitätsnachweis (z. B.

Peptid-Mapping, terminale Sequenzanalyse, MALDI-TOF, 2D-Proteinanalyse), zum anderen, um die Abwesenheit onkogener oder transformationsfähiger DNA im Produkt zu belegen. Das pharmazeutische Endprodukt darf nicht mehr als 100 pg (10–10 g) DNA pro Dosis und keine retroviralen Nukleinsäuren, Proteine der Wirtszelle oder Endotoxine enthalten.

Enzym- und Zellreaktoren Allgemeines. Die Herstellung von Enzymen ist seit der Entwicklung der Gentechnik einfacher und billiger geworden. Auch ganze Zellen können mit den Methoden des metabolic engineering (→318) heute so optimiert werden, dass sie ein gewünschtes Produkt in hohen Ausbeuten bilden. Technische Reaktionen mit Enzymen oder Zellen werden entweder im Rührreaktor oder mit an Trägern immobilisierten Enzymen (→164) in verschiedenen Reaktortypen durchgeführt. Die Immobilisierung auf oder in Trägermaterial erfolgt dabei durch Adsorption, Einschluss oder kovalente Bindung. Beispiele für großtechnische Prozesse mit immobilisierten Enzymen sind die Spaltung von Penicillin G zu 6-Aminopenicillansäure (→208) und die Lipase-katalysierte Herstellung von chiralen Aminen (→170). Immobilisierte Zellen werden z. B. bei der Glucose-Isomerisierung (→180) und bei der Synthese von LAsparaginsäure (→130) verwendet. Chemie der Immobilisierung. Für die Adsorption werden häufig Ionenaustauscher verwendet; sie binden Enzyme oder Zellen aufgrund ihrer Oberflächenladungen. Mikro-/mesoporöse Materialien aus Cellulose, Glas, Keramik oder Kunststoffe werden ebenfalls verwendet. Zur kovalenten Immobilisierung setzt man vor allem drei Methoden ein: 1. die Vernetzung mit Glutardialdehyd, die zu Azomethinen führt und durch Reduktion mit Natriumborhydrid stabilisiert werden kann, 2. die Vernetzung mit Diisocyanaten, und 3. die Bindung an polymere Epoxide (Oxirane). Als Matrix wurden zahlreiche organische und anorganische Trägermaterialien beschrieben. Auch zur Quervernetzung von Enzymen werden meist Glutardialdehyd oder Diisocyanate eingesetzt. Für den Einschluss von Enzymen oder Zellen in Gele verwendet man radikalisch oder photochemisch vernetzbare Präpolymere. So können Enzyme in Gegenwart von N, N′-Methylenbisacrylamid und Kaliumpersulfat als Starter in Acrylamid einpolymerisiert werden. Auch die photochemische Polymerisation von UrethanPräpolymeren wird zu diesem Zweck verwendet. Bei der Mikroverkapselung polymerisiert man Enzyme oder Zellen an der Grenzfläche einer mit Wasser nicht mischbaren organischen Phase ein. Häufig verwendet man auch ionotrope Gele wie Alginat (→18), die in einem Ca2+haltigem Medium polymerisieren. Auch die Einpolymerisierung von Biokatalysatoren in

natürliche Polymere wie Collagen wurde beschrieben. Eigenschaften immobilisierter Biokatalysatoren. Immobilisierte Biokatalysatoren (→164) weisen im Vergleich zu freien Enzymen oder Zellen veränderte Eigenschaften auf, denn der Stoffumsatz bei der heterogenen Katalyse wird nicht nur durch die Eigenschaften des Katalysators, sondern auch durch den Transport des Substrats und des Produkts zum und vom Katalysator bestimmt. Zur Optimierung der Auslegung von Enzym- und Zell-Reaktoren und ihrer Raum-Zeit-Ausbeuten erarbeitete man deshalb Rechenformeln, die neben den intrinsischen Eigenschaften des Katalysators (Vmax, Km) weitere Parameter berücksichtigen, z. B. die Partikelgröße des Immobilisats und den Stofftransport. Ein praktisch sehr wichtiger Gesichtspunkt ist die Stabilität eines immobilisierten Biokatalysators. Sie kann unter Betriebsbedingungen mehrere Monate betragen (bei Aspartase, Glucose-Isomerase, usw.). Reaktortypen und Prozesstechnik. Enzym- und Zell-Reaktoren werden meist als Rührkessel (diskontinuierlich und kontinuierlich) (→94) oder Rohrreaktoren (Festbettreaktor, Fließbettreaktor, Hohlfasermembran-Reaktor) ausgelegt. Neben der Optimierung des Biokatalysators (Stabilität) und des Enzym- oder Zellreaktors (z. B. durch Berücksichtigung der unterschiedlichen Diffusionseigenschaften hoch- oder niedermolekularer Substrate) ist auch die Auslegung des Verfahrens von entscheidender Bedeutung für eine hohe Produktqualität bei wirtschaftlichem Betrieb. Dazu gehört die Vorbereitung der Ausgangsstoffe, die Unterbindung von Nebenreaktionen und eine der Qualität des Produkts angemessene Aufarbeitung (→104). Einfach zu handhabende, mess- und regeltechnisch optimierte und dabei kostengünstige Auslegungen eines Prozesses sind bevorzugt. Für Produkte mit großem Produktionsvolumen (z. B. Isomerose, 6-Aminopenicillansäure) bevorzugt man kontinuierlich betriebene Anlagen, bei denen mehrere Enzymreaktoren unterschiedlichen Beschickungsalters parallel geführt sind und modular ausgetauscht werden, wenn die Katalysatoraktivität erschöpft ist. Für Produkte mit kleinerer Tonnage (Asparaginsäure) genügt dagegen häufig ein einziger Reaktor, der in Produktionskampagnen beschickt wird.

Aufarbeitung von Bioprodukten Allgemeines. Bioprodukte können bei Beendigung einer Fermentation entweder zellulär (Zellmasse, intrazelluläre Enzyme, rekombinante Einschlusskörper) oder extrazellulär vorliegen. Bei klassischen Verfahren sind die Konzentrationen meist gering (< 10 %, oft < 1 %). Mit der Verwendung rekombinanter Mikroorganismen in der industriellen Produktion werden heute höhere Konzentrationen von bis zu 50 % erreicht. Zur Isolierung und Reinigung von Bioprodukten sind meist mehrere Konzentrierungs- und Reinigungsschritte erforderlich. Der Reinigungsaufwand richtet sich nach den Anwendungen des Produkts. So sind für pharmazeutische oder diagnostische Präparate umfangreiche Reinigungsoperationen erforderlich, während technische Enzyme nur geringfügig gereinigt werden. Die Reinigungsverluste können > 50 % betragen, sodass die Erarbeitung eines guten Aufarbeitungsverfahrens („down stream processing“, DSP) wirtschaftlich immer von großer Bedeutung ist. Die sichere und kostengünstige Entsorgung der abgereicherten Fraktionen, z. B.

der Zellmasse, ist ebenfalls eine regulatorisch und ökonomisch wichtige Aufgabe. Zellmasse. Ein Beispiel für die Isolierung von Zellmasse ist die Herstellung von Backhefe (→120). Nach Abschluss der Fermentation trennt man die Zellen mittels selbstentschlammender Zentrifugen ab, wäscht und filtert erneut im Vakuumtrommel-Drehfilter oder Plattenfilter und verpackt die halbtrockene Ware. Trockenbackhefe wird zusätzlich im Wirbelschichttrockner getrocknet und weist eine höhere Lagerstabilität auf. Zur Gewinnung von Zellmasse kann man auch die Kreuzstromfiltration einsetzen. Intrazelluläre Produkte. Dabei wird die abgetrennte Zellmasse schonend aufgeschlossen. Technisch arbeitet man dazu meist mit mechanischen Methoden wie HochdruckHomogenisatoren oder Kugelmühlen. Bei der Plasmolyse der Backhefe zur Herstellung von Hefeautolysat erfolgt der Zellaufschluss vorwiegend durch zelleigene Enzyme. Im Labormaßstab setzt man zum Zellaufschluss Ultraschall oder enzymatische Methoden ein (bei E. coli beispielsweise Lysozym in Gegenwart nichtionischer Tenside). Als Einschlusskörper vorliegende rekombinante Proteine haben häufig falsch gepaarte Cystin-Brücken. Sie können je nach verwendeter Leader-Sequenzen im Cytosol oder im periplasmatischen Raum vorliegen. Man isoliert die Einschlusskörper nach schonendem Zellaufschluss durch Zentrifugation, führt eine oxidative Sulfitolyse durch, reduziert die S-Sulfonate mit Thiol-Reagenzien und lockert die Raumstruktur des Proteins durch Wasserstoff-Brücken zerstörende Reagenzien wie Harnstoff auf (→222). Bei anschließender Dialyse unter oxidierenden Bedingungen entfernt man den Harnstoff und erlaubt damit eine korrekte Faltung des Proteins und seiner Disulfidbrücken. Die weitere Reinigung intrazellulärer Enzyme und umgefalteter Einschlusskörper erfolgt wie bei den extrazellulären Enzymen. Extrazelluläre Produkte. Niedermolekulare Bioprodukte wie Citronensäure (→146) oder Aminosäuren (→124) fällt man nach Abtrennung der Zellen und reinigt sie durch Umfällung und Kristallisation. Bei Antibiotika (→208) führt häufig eine mehrstufige Lösemittelextraktion mit Essigsäurepentylester oder n-Butylacetat zum Erfolg. Zur Isolierung von Proteinen, z. B. von Enzymen (→166), erfolgt nach Zellabtrennung zuerst eine Konzentrierung der Lösung, meist durch Membranfiltrationsverfahren. Aus dem Retentat kann man das gewünschte Protein dann durch Salzzugabe [(NH4)2SO4 oder Na2SO4] fällen, wobei die Fällungskonzentration des Salzes für jedes Protein spezifisch ist und zwischen 10 und 50 % liegt. Alternativ verwendet man auch geringe Konzentrationen (2–10 %) gekühlter organischer Lösemittel wie 2-Propanol. Technische Enzyme werden direkt als Flüssigkonzentrat verwendet oder sprühgetrocknet. Integrierte Verfahren. Unter den zahlreichen Versuchen, die aufwendigen und teuren Isolierungsverfahren zu vereinfachen, ist die expanded-bed Chromatograpie erwähnenswert; dabei erfolgen Zellabtrennung und Produktreinigung simultan im Dichtegradienten eines Fließbetts. Ebenfalls interessant sind wässrige Zweiphasensysteme. Sie bestehen aus nichtmischbaren wässrigen Lösungen von Salzen bzw. wasserlöslichen Polymeren und erlauben es, intrazelluläre Proteine aus Zellaufschlüssen schnell anzureichern.

Aufarbeitung von Bioprodukten: Chromatographie

Allgemeines. Einen sehr wichtigen Platz unter den Reinigungsverfahren für biotechnologisch hergestellte Produkte nimmt die Chromatographie ein. Die für eine Trennaufgabe optimale Auslegung von Chromatographie-Säulen kann mit der van Deemter-Gleichung berechnet werden. Beim Säulenmaterial unterscheidet man je nach Trennmechanismus 1. die GelChromatographie (trennt nach Molmasse), 2. die Adsorptionschromatographie (trennt aufgrund hydrophiler oder hydrophober Wechselwirkungen), 3. die Ionenaustausch-Chromatographie (trennt nach Ladung), 4. die Chromatofokussierung (trennt nach dem isoelektrischem Punkt), und die 5. Affinitätschromatographie (trennt nach spezifischer Wechselwirkung mit Liganden). Sie wird häufig bei gentechnisch modifizierten Proteinen eingesetzt, kann aber auch mit den Methoden des „molecular imprinting“ kombiniert werden. Für jede dieser Methoden stehen eine Fülle kommerzieller Trennmaterialien und Geräte zur Verfügung. So kann beispielsweise mit dem Äkta-System™ innerhalb weniger Stunden eine optimale Aufarbeitungsstrategie für ein Protein erarbeitet werden. Viele chromatographische Trennverfahren für Proteine werden im Labor bei Mittel- oder Hochdruck ausgeführt (FPLC: fast protein liquid chromatography). Bei der Maßstabvergrößerung zur industriellen Herstellung wertvoller Proteine kommen dagegen keine Hochdruck-Verfahren zum Einsatz. Gelchromatographie. Wichtige kommerziell verfügbare Trägermaterialien sind Dextran(→158) bzw. Agarose-Gele, deren Porengröße durch Quervernetzung festgelegt werden kann. Nach partieller Alkylierung der Hydroxy-Gruppen des Trägermaterials können sie auch mit organischen Lösemitteln betrieben werden, nach Addition geladener Gruppen kombinieren sie die Eigenschaften von Molekularsieben und Ionenaustauschern. Adsorptionschromatographie. Ein gebräuchliches hydrophiles Material ist Hydroxylapatit. Für die häufig verwendete hydrophobe Chromatographie verwendet man Sepharose-Gele, die mit Butyl- oder Phenyl-Resten derivatisiert sind. Sie erlauben die Trennung hydrophober Proteine durch Wechselwirkung hydrophober Oberflächenbereiche mit dem Trägermaterial. Ionenaustausch-Chromatographie. Ionenaustauscher sind die am häufigsten verwendeten Materialien bei der Aufarbeitung von Proteinen. Für dieses leicht im Maßstab zu vergrößernde Verfahren verwendet man sulfonylierte (Kationenaustauscher) oder mit quartären AminoGruppen modifizierte (Anionenaustauscher) Polysaccharide oder synthetische Polymere und nutzt zur Trennung die unterschiedlichen Netto-Ladungen verschiedener Proteine bei einem vorgegebenen pH-Wert oder in einem pH-Gradienten aus. Affinitätschromatographie. Diese elegante Methode beruht auf der spezifischen Wechselwirkung des Proteins mit einem an das Trägermaterial immobilisierten Liganden. Beispielsweise wurden zur Reinigung von Dehydrogenasen erfolgreich Dextran-Farbstoffe eingesetzt, die in die NADH-Bindungstasche des Proteins passen. Die Elution des Enzyms erfolgt durch Zugabe eines kompetitiven niedermolekularen Liganden. Bei der industriellen Reinigung von Pharmaproteinen setzt man gelegentlich die Immunchromatographie (→82) ein. Dabei wird Säulenmaterial mit monoklonalen Antikörpern beschichtet, die das gewünschte Protein spezifisch binden. Die Elution erfolgt durch Erhöhung der Salzkonzentration oder Senkung des pH-Werts. Zur Reinigung rekombinanter Proteine im Labor führt man häufig Affinitätsliganden künstlich ein. So kann beispielsweise auf gentechnischem Weg ein

Fusionsprotein mit einem leicht zu reinigenden zweiten Protein (z. B. Streptavidin, nachfolgende Reinigung über Biotin-Säulen) hergestellt werden. Weit verbreitet ist auch die Noder C-terminale Einführung eines Polyhistidin-Rests (Hisn, n = 4–6, „his-tag“) mit gentechnischen Methoden. Ein mit diesem Rest modifiziertes Protein kann mit hoher Selektivität an einer Nickel-haltigen Polysaccharid-Matrix gereinigt werden (IMAC = ion ligand affinity chromatography). Auch die Einführung eines Peptid-Liganden mit hoher Bindungsaffinität zur Biotin-Tasche des Streptavidin führt zu hohen Reinigungsausbeuten. In vielen Fällen ist das modifizierende tag-Protein oder Peptid so gewählt, dass es nach der Reinigung mit Hilfe spezifischer Peptidasen wieder entfernt werden kann.

Ökonomische Gesichtspunkte bei industriellen Verfahren Allgemeines. Bei der industriellen Nutzung biotechnologischer Verfahren steht die Optimierung eines Prozesses unter wirtschaftlichen Gesichtspunkten im Vordergrund. Wichtige Gesichtspunkte sind dabei 1. möglichst einfache und robuste Prozesse zu entwickeln, 2. den Personal- und Kapitaleinsatz möglichst niedrig zu halten, 3. mit günstiger Energiebilanz und billigen, gleichförmigen und jederzeit verfügbaren Rohstoffen hohe Ausbeuten in möglichst kurzer Zeit zu erhalten, und 4. Folgekosten, z. B. für die Entsorgung von Zellmasse und die Abwasserreinigung, niedrig zu halten. Einfache und robuste Prozesse. Bei Herstellverfahren über viele Verfahrensstufen, wie sie für biotechnologische Prozesse typisch sind, kann schon die Einsparung einer einzigen Verfahrensstufe große Vorteile bieten. So hat sich beispielsweise bei der AntibiotikaProduktion (→208) der sog. Westphalia-Dekanter durchgesetzt, weil er die Aufarbeitungsschritte der Zellabtrennung und der Lösemittelextraktion kombiniert. Zur Reinigung saurer Produkte (Milchsäure, Citronensäure) sind Ionenaustauscher besser geeignet als Fällungsverfahren, da bei letzteren gefährliche Chemikalien (z. B. konzentrierte Schwefelsäure) eingesetzt werden und große Mengen an Abfallstoffen (Gips) anfallen. Robuste Prozesse sind erforderlich, weil Produktionsverfahren oft im Mehrschichtbetrieb mit Facharbeitern durchgeführt werden. Auch die Infektionsgefahr biologischer Medien mit unerwünschten Keimen stellt ein Dauerproblem dar. Ein unsteriler Produktionsfermenter kann den Verlust vieler Tonnen Produkt mit einem Wert von hunderttausenden von Euro bedeuten! Niedriger Personal- und Kapitaleinsatz. Zwischen 10 und 40 % der Produktionskosten von biotechnologischen Produkten entfallen auf den Personaleinsatz. Ein typisches Fermentationsverfahren mit Aufarbeitung benötigt eine Woche; dabei wird der Prozess meist im Mehrschichtbetrieb rund um die Uhr kontrolliert. Der Kapitaleinsatz für eine biotechnologische Produktionsanlage liegt, je nach Verfahren, zwischen 107 und 108 Euro. Abschreibungen und Versicherungen können sich zu 10 % oder mehr der Herstellkosten

summieren. Energiebilanz und Rohstoffe. In die Energiekosten gehen vor allem die Kosten für Sterilisation, für die Kühlung des Fermenters und für den Betrieb des Rührwerks ein. Bei industriellen Prozessen erfolgt die Sterilisation (→88) der Großfermenter mittels Durchlauferhitzer (140 °C während 4 min). Beim Zellwachstum wird etwa die Hälfte des Energiegehalts der Kohlenstoffquelle in Wärme umgewandelt. Dazu kommt der Wärmeeintrag durch das Rührsystem. Bei Produktionsfermentern verwendet man Kühlmäntel und Kühlschlangen zur Ableitung dieser Wärme (→94). Sowohl bei der Sterilisation wie bei der Thermostatisierung des Fermenters gewinnt man durch Wärmeaustauscher 90 % der eingesetzten Energie wieder. Bei den klassischen Fermentationsverfahren machen die Rohstoffe (→88), vor allem die C-Quelle, zwischen 30 und 60 % der Herstellkosten aus. Häufig handelt es sich dabei um komplexe Materialien, z. B. Melasse oder Sojamehl, deren Zusammensetzung von Charge zu Charge schwanken kann. Der Standardisierung und Qualitätskontrolle der Rohstoffe kommt deshalb eine große Bedeutung zu. Zellmasse und Abwasserreinigung. Bei allen Fermentationsprozessen fällt Zellmasse und Abwasser (→286) mit hohem BSB5-Gehalt an. Bei der Produktion von Citronensäure (→146) in einem 300 m3-Bioreaktor bleiben beispielsweise über 3 t Zellmasse (Feuchtgewicht) von Aspergillus niger als Filterkuchen zurück. Man entsorgt sie heute aus Umweltschutz-Gründen durch Verbrennen, ein teures Verfahren für Feststoffe mit hohem Wasseranteil. Am Ende eines Fermentationsverfahrens liegt das Produkt in stark verdünnter Lösung vor; selbst bei sehr gut ausgearbeiteten Verfahren erreicht man nur selten > 10 %ige Lösungen. Bei der Reinigung des Produkts entstehen deshalb nährstoffreiche Abwässer aus der Fermentation und weitere belastete Abwässer aus der Aufarbeitung (z. B. Ca2SO4-oder Lösemittel-haltig), deren Entsorgung zu Abwasserabgabengebühren führt. Sensitivitätsanalysen. Jedes Verfahren lässt sich in einzelne Verfahrensschritte aufgliedern, für die eine betriebswirtschaftliche Kalkulation erstellt werden kann. Man erkennt dann, welche Stufe kostenintensiv ist und optimiert werden muss. Dazu verwendet man Tabellenkalkulationsprogramme, die die Einflussfaktoren in vernetzter Form enthalten.

Alkoholische Getränke

Allgemeines. In allen Kulturen haben sich alkoholische Getränke entwickelt. Im westlichen Kulturkreis sind dies vor allem Bier (→102), Wein, vergorene Obstsäfte, Schaum- und Branntweine, während das traditionelle alkoholische Getränk des asiatischen Raums der Reiswein (Sake) ist. Auch andernorts gibt es zahlreiche regionale Spezialitäten wie z. B. Kumys (aus Sauermilch, Mittelasien), Kwass (aus Getreide, vorderer Orient), Pombe (aus Hirse und Sorghum, vorderer Orient) und Pulque (aus Agavensaft, Mittel- und Südamerika). Wein entsteht durch Vergärung von Most aus den Trauben der Weinrebe mit Hefen. Das Genom der Weinrebe (Vitis vinifera) wurde erstmals 2007 sequenziert, genetische Informationen helfen nun bei der Charakterisierung verschiedener Weinsorten. Für die Qualität des Weins spielen Standort, Rebsorte und Technologie der Weinbereitung eine ausschlaggebende Rolle. Die Weinherstellung umfasst die Traubenlese, Kelterung, Mostbehandlung, Mostgärung und Kellerbehandlung. Die witterungsabhängige Weinlese ist ein entscheidender Faktor für die Weinqualität. Bei der Kelterung werden die Beeren meist von Rappenkämmen befreit und ohne Zerdrücken der Kerne zur Maische zerquetscht. Beim Weißwein wird daraus sofort Most abgepresst, während die Rotweinmaische traditionell bei einer Temperatur von ca. 20 °C einige Tage lang vergoren wird, um die in den Beerenhülsen lokalisierten Anthocyane im Gärungsalkohol zu lösen. Bei modernen Verfahren wird die Rotweinmaische zuvor auf 40–50 °C erwärmt; bei Zusatz von Pektinasen sind die Anthocyane innerhalb von 2–4 h aus den Beerenhäuten gelöst und es kann abgekeltert werden. Die Mostbehandlung erlaubt in gewissen Grenzen, auch in schlechten Reifejahren sortentypische Mostzusammensetzungen zu erreichen. Länderspezifisch darf dabei Zucker oder Säure zugesetzt, Säure durch CaCO3 neutralisiert und mit SO2 oder Kaliumpyrosulfit geschwefelt werden. Man harmonisiert damit den Geschmack, unterbindet die Braunfärbung des Mosts durch Hemmung der Phenol-Oxidase, schützt O2empfindliche Farbstoffe und Aromen und unterdrückt das Wachstum aerober Mikroorganismen wie Essigsäurebakterien (→144), wilden Hefen und Schimmelpilzen. Die Mostgärung erfolgt anschließend in Holz-, heute meist in Edelstahl- oder Polyesterfässern spontan oder durch Zusatz von Reinzuchthefen (Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus) (→14) und benötigt je nach Mostart und Temperatur einige Tage bis Monate. Sie kann über die Gärtemperatur gesteuert werden. Restzuckergehalt (max. 9 g/L: „trocken“; max. 18 g/L: „halbtrocken“; > 18 g/L: „lieblich“) und Alkoholgehalt (7–15 %vol) lassen sich mittels künstlicher Unterbrechung der Gärung oder durch Zusatz von Most („Süßreserve“) einstellen, den man mittels CO2 bei 8 bar konserviert. In der anschließenden Kellerbehandlung des Jungweins tragen nur teilweise steuerbare chemische, biochemische, biologische und physikalische Vorgänge zur Reifung und Harmonisierung des Weins bei. Entscheidend ist es dabei, einen pHWert > 3,2 zu erreichen, um günstige Wachstumsbedingungen für Milchsäurebakterien (→116) einzustellen: diese wandeln durch Malo-Lactat-Fermentation Äpfelsäure in die wesentlich schwächere Milchsäure und CO2 um. Schaumweine werden aus Tafel- bzw. Qualitätsweinen gewonnen, indem man 1–3 % Saccharose zusetzt und diese durch zugesetzte Hefekulturen in Flaschen oder Tanks zu Ethanol und CO2 vergären läßt. Schaumweine müssen in der Flasche einen Überdruck von mindestens 3 bar bei 20 °C aufweisen.

Branntweine stellt man durch Vergärung zuckerhaltiger Extrakte von Getreide, Gemüse und Obst und anschließende Destillation mit einem Alkoholgehalt von 30–60 % her. Als Rohstoffbasis für Branntweine dienen u. a.: Wein (Weinbrand, Cognac, Armagnac), Zuckerrohrsaft oder Melasse (Arrak, Rum), Getreide (Korn, Whisky), Kartoffeln (Wodka), Obst (Obstwasser, Obstgeist) oder Agavenpulpe (Tequila). Reiswein. (Sake) wird im Gegensatz zu Bier und Wein durch aerobe Feststofffermentation (→86) gewonnen. Dabei wird gequollener und gedämpfter Reis mit Aspergillus oryza (→16) beimpft und bei ca. 30 °C bebrütet. Bei hoher Luftfeuchtigkeit entsteht in etwa 2 Tagen Koji, in dem die Reisstärke weitgehend verzuckert ist. Koji wird dann mit weiterem gekochtem Reis und Wasser und mit Hefe-Starterkultur (moto) zu einer Maische (moromi) versetzt, die ca. 20 Tage lang bei 25 °C fermentiert wird. Nach Filtration und Pasteurisierung erhält man Sake.

Bier Allgemeines. Bier ist eines der ältesten und das wahrscheinlich am weitesten verbreitete alkoholische Getränk. Es entsteht durch Vergärung von Gersten-Maische mit Bierhefe (Saccharomyces cerevisiae) (→14). Die Weltproduktion lag 2011 bei 1,9 Mrd. hL oder ca. 190 Mio. t; die wichtigsten Erzeugerländer sind China, die USA und Brasilien. In Deutschland dürfen zur Bierherstellung nach dem Reinheitsgebot von 1516 nur Gerstenmalz, Hopfen, Wasser und Hefe verwendet werden, für Weißbiere auch Weizen anstelle von Gerste. In anderen Ländern sind als Stärke- und Enzymquelle auch andere Getreidearten sowie Zusätze erlaubt, z. B. Brauerei-Enzyme. Durch technologische Kunstgriffe können heute auch Leichtbiere mit verringertem Alkohol-Gehalt sowie alkoholfreie Biere hergestellt werden. Der Marktanteil alkoholfreier Biere in Deutschland beträgt etwa 3,5 %. Herstellung. Gerste wird durch Keimen und Trocknen („darren“) in lagerstabiles, kohlenhydrat- und enzymreiches Malz umgewandelt. Das geschrotete Malz wird durch die beim Keimen gebildeten Enzyme verzuckert und durch einen Kochprozess konzentriert („Würze kochen“). Die Zugabe von Hopfen gibt dem Bier den charakteristischen Bittergeschmack; die Gerbstoffe des Hopfens dienen als Konservierungsmittel und erleichtern die Filtrierbarkeit. Die so entstandene „Stammwürze“ wird mit Reinkulturen von Hefe beimpft und einige Tage lang fermentiert. Der Alkoholgehalt von Bier liegt je nach Fermentationsverfahren zwischen 2 und > 18 % Stammwürze (Trockengehalt des Extrakts vor der Gärung in g/100 g). Die endgültige Reifung erfolgt im Lagerkeller bei Temperaturen um 0 °C und dauert einige Tage bis mehrere Wochen. Dabei setzen sich Trubstoffe ab und ein auf der Bildung von Biacetyl beruhendes unerwünschtes Nebenaroma verschwindet durch Bildung von Acetoin und 2,3-Butandiol. Ferner finden enzymatische Umsetzungen statt, die großen Einfluss auf das Bieraroma haben. Nach der Filtration werden Exportbiere noch pasteurisiert. Biertypen. Man unterscheidet einerseits untergärige (Lager, Pilsener) und obergärige Biere

(Weißbier, Altbier, Kölsch, Porter, Ale und Stout), anderseits je nach Stammwürze-Gehalt Starkbiere (> 16 %), Vollbiere (11–14 %), Schankbiere (7–8 %) und Einfachbiere (2–5,5 %). Sie unterscheiden sich durch a) die zur Gärung verwendeten Rohstoffe und deren Aufschluss, b) die verwendeten Hefekulturen (vor allem „obergärige Hefen“, die bei der Fermentation in Schwebe bleiben und das aus der Würze stammende Disaccharid Melibiose nicht vergären können, und „untergärige Hefen“, die sich nach der Hauptgärung am Boden absetzen und Melibiose vergären), und c) die Temperaturführung und die Dauer der Gärung und Nachgärung. Für Dunkelbiere wird stark gefärbtes Malz verwendet („Maillard-Reaktion“ beim Erhitzen von Zuckern mit Aminosäuren) (→192). Leichtbiere und alkoholfreies Bier. Zu ihrer Herstellung wird entweder bei Leichtbieren mit 7–8 % Stammwürze die Gärung bei Erreichen eines Alkoholgehalts von 0,5 % vorzeitig gestoppt oder normalem, 12–13 %igem Vollbier der Alkohol durch verfahrenstechnische Schritte (Vakuumverdampfung oder Membranverfahren) entzogen. Im Versuchsstadium ist die Verwendung immobilisierter Hefen im Festbettreaktor, deren Gärverlauf auf die Bildung von 0,5 % Ethanol eingestellt ist. Biotechnologische Ansätze. Aktuelle Entwicklungen zielen auf folgende Eingriffe: a) Züchtung transgener Gerste mit verbesserter Enzymaktivität, vor allem thermostabiler βGlucanase, b) die Verwendung von Milchsäurebakterien als Starterkulturen (→114) beim Mälzen, um mikrobielle Kontaminationen des Malzes durch Fusarium-Arten und Bakterien zurückzudrängen, c) Verkürzung der Lagerzeit, die zum Abbau des unerwünschten BiacetylAromas im Lagerkeller erforderlich ist, durch Zugabe von bakterieller α-AcetolactatDecarboxylase, die α-Acetolactat direkt in Acetoin umwandelt, d) Verwendung gezüchteter oder transgener Stämme von S. cerevisiae, die beispielsweise α-Acetolactat-Decarboxylase oder Glucanasen bzw. Amylasen (→172) exprimieren. Mit derartigen Stämmen kann man Bier mit niedrigem Kohlenhydrat-Gehalt brauen. Schließlich wird intensiv an Kosteneinsparungen bei den Rohstoffen („low-malt beer“) und an Verbesserungen der Fermentationstechnologie gearbeitet. So lässt sich die Aroma-Optimierung beim Lagerprozess auch durch kurzzeitiges Erhitzen auf 90 °C und anschließende 2-stündige Reifung in einem Bioreaktor mit immobilisierten Hefen erreichen.

Fermentierte Lebensmittel

Allgemeines. In allen Kulturen werden Lebensmittel durch mikrobielle Fermentation verändert. Im Mittelpunkt stehen dabei tradierte Erkenntnisse zur Konservierung, beispielsweise durch Absenkung des pHWerts mittels Bildung organischer Säuren (Sauerkraut, Pickles), die Verbesserung der Verdaulichkeit durch enzymatische Hydrolyse (Sauerteig, Wurstwaren, Tempeh), die Geschmacksverbesserung (bei Sauermilch-Produkten, →116) oder die Gewinnung von Würzen (Sojasauce (→86), Miso aus Reis). In den Industrieländern sind etwa 1/3 der täglich verzehrten Nahrungsmittel fermentiert. Zu ihrer Herstellung werden meist definierte Mikroorganismen-Stämme als Starterkulturen verwendet. Starterkulturen stehen in der Lebensmitteltechnologie für eine große Zahl von Fermentationsverfahren zur Verfügung. Sie spielen eine wichtige Rolle bei der Herstellung von Sauermilchprodukten (→116) („Säurewecker“), von Brotsorten (Sauerteig) und Backwaren (Backhefe) (→120), beim Bierbrauen (→112) („Stellhefe“) und bei der Weinherstellung (→110) („Reinzuchthefen“). Dabei unterscheidet man Einstamm-, Einart- und Mischkulturen. Die wichtigsten Anforderungen an eine Starterkultur sind eine rasche und sichere Fermentationsführung, eine zuverlässige Produktion der gewünschten Stoffe sowie Stabilität gegenüber Antibiotika und Phagen. Der Produktionswert von Starterkulturen weltweit wird auf 1 Mrd. US-$ geschätzt. Die Zulassung von Mikroorganismen für Starterkulturen unterliegt einem internationalen Regelwerk, das auf pragmatischen Richtwerten beruht (z. B. „Stamm wird traditionell in fermentierten Nahrungsmitteln verwendet“). Gemäß einer Inventarliste der International Dairy Federation gelten derzeit 195 Bakterien- und 69 Hefe- und Pilz-Spezies als unbedenklich. Wurst. Rohwürste (ungekühlt lagerfähige streichfähige oder schnittfeste Würste) werden meist durch Zugabe von Starterkulturen (Staphylokokken, z. B. Staphylococcus carnosus; evtl. auch Lactobacillen und Penicillium-Arten) hergestellt. Die aus Muskelglykogen fermentativ gebildete Milchsäure erniedrigt den pHWert auf < 5, wodurch eine Kontamination mit säureempfindlichen Keimen verhindert wird und das Muskelprotein (isoelektrischer Punkt: pH 5,3) in einen gelartigen Zustand übergeht. Metabolite der fermentativen Ab- und Umbaureaktionen von Fetten und Proteinen tragen maßgeblich zum Geschmack bei. Auch bei gepökelten Wurstwaren (Konservierung durch Zugabe von Kochsalz, Nitrat oder Nitrit) werden vielfach Starterkulturen aus salztoleranten Staphylokokken und Lactobacillen zugesetzt. Käse. 2010 wurden ca. 14,3 Mio. t Käse hergestellt, davon ca. 6,8 Mio. t in den EU-Ländern und 4,6 Mio. t in den USA. Die Zahl der europäischen Käsesorten liegt bei über 1000. Die Käseherstellung erfolgt durch eine spontane oder mittels Starterkulturen ausgelöste Infektion von „dickgelegter“ Milch (mit Lab oder rekombinantem Chymosin (→188) ausgefällter Dickmilch, der zur Härtung Molke entzogen wird). Es kommen eine Vielzahl von Mikroorganismen zum Einsatz, häufig aus den Gattungen Penicillium (Camembert, Roquefort), Streptococcus (Emmentaler) oder Lactococcus (Harzer). Die tradierten Herstellmethoden umfassen zahlreiche Varianten im Hinblick auf die eingesetzte Milch (Kuh, Ziege, Schaf), die Herstellmethode (aerob, anaerob, aerob/anaerob) und die Zugabe der Starterkultur (Oberflächen- oder Gesamtbeimpfung). Außereuropäische Fermentationsprodukte. Ang-kak ist ein aus China stammender „roter

Reis“, der durch Beimpfung von feuchtem Reis mit Sporen von Monascus purpureus entsteht und als Würze, wegen seines Antibiotikumgehalts, aber auch als Therapeutikum bei Verdauungsstörungen verwendet wird. Kishk ist eine Speisenbeilage des Orients, die durch Fermentation von gequollenem Weizen mit gesäuerter Milch hergestellt wird. Miso, eine japanische Speisewürze, erhält man durch Bebrüten von gedämpftem Reis mit Aspergillus oryzae. Sojasauce (→86) ist ein vor Jahrtausenden in China entwickeltes aromaintensives Protein-Hydrolysat. Es wird heute aus einer Mischung von Sojamehl und Weizenkleie hergestellt. Nach Beimpfen mit Aspergillus oryzae bei hoher Luftfeuchtigkeit und ca. 35 °C entsteht eine Oberflächenkultur, die, zu gleichen Teilen mit Salzwasser (> 13 %) vermischt, als Maische (Moromi) bis zu einem Jahr lang bei Raumtemperatur mit Milchsäurebakterien und Hefen fermentiert wird. In Indonesien und Malaysia stellt man das Grundnahrungsmittel Tempeh durch Fermentation gedämpfter Sojabohnen und Reis mit Rhizopus oligosporus (→16) her.

Lebensmittel und Milchsäure-Gärung Allgemeines. Die Säuerung von Milch (Sauermilch), von Gemüse (Sauerkraut), aber auch von Futtermitteln (Silage) durch Fermentation ist seit Jahrhunderten, teils seit Jahrtausenden überkommen. Mit der Entdeckung der Milchsäurebakterien legte Louis Pasteur 1856 die Grundlage zum Verständnis der Milchsäure-Gärung, die diesen Zubereitungstechniken zugrundeliegt. Sie führt neben der geschmacklichen Verbesserung des Lebensmittels zur Säuerung des Milieus auf einen pH-Wert von ca. 4, wodurch ein Befall mit anderen Keimen weitgehend ausgeschlossen wird. Milchsäurebakterien. Obwohl morphologisch uneinheitlich, sind Milchsäurebakterien physiologisch gut zu charakterisieren: sie sind Gram-positiv und obligate Gärer, die keine Häm-Proteine (Catalase) enthalten, aber trotzdem in Gegenwart von O2 wachsen können. Sie spalten den Milchzucker Lactose zu Glucose und Galactose und vergären diese Kohlenhydrate unter Bildung von Milchsäure (→148). „Homofermentative“ Milchsäuregärer wie Streptococcus pyogenes, Lactobacillus casei oder Lactococcus lactis bilden dabei 2 Mol Lactat pro Mol Glucose, „heterofermentative“ wie Leuconostoc mesenteroides oder Lactobacillus brevis nur 1 Mol. Von der Stamm-spezifischen Gegenwart einer LactatRacemase hängt es ab, wieviel L-(+)-Milchsäure (meist 50–90 %), D-(–)-Milchsäure oder D,L-Milchsäure gebildet wird. Fermentierte Milchprodukte enthalten außer Milchsäure bereits schwach anhydrolysierte Proteine, eine für die Verdauungsorgane günstige Mikroflora und keine Lactose und sind deshalb ernährungsphysiologisch sehr wertvoll. Sauermilchprodukte. Die in Europa wichtigsten Produkte sind Sauermilch und -rahm, Joghurt, Kefir und Buttermilch (Fettgehalt < 1 %). Sie entstehen durch spontane Infektion unbehandelter Milch. In der Molkerei werden sie aus pasteurisierter Frischmilch durch Zugabe von Starterkulturen hergestellt. Die bei der Fermentation erfolgende Milchsäure-Bildung führt zur Säuerung auf einen pH-Wert von 4–5. Joghurt-Produkte mit > 95 % L-(+)-Milchsäure

(Lactobacillus acidophilus), evt. mit dem streng anaeroben L. bifidus angereichert, der in der Darmflora brustgefütterter Säuglinge vorkommt, sollen besonders gut verdaulich sein und das Immunsystem anregen (→118). Von der Starterkultur gebildete Proteasen und Lipasen können zur Bildung weiterer Geschmacksstoffe führen. Die wichtigsten an diesem Vorgang beteiligten Mikroorganismen sind Streptokokken, Lactobacillen, Leuconostoc, in manchen Fällen auch Hefen. Lactofermentierte Gemüse und Obstsäfte. Die in Deutschland wichtigsten Produkte dieser Kategorie sind Sauerkraut und saure Gurken. Das aus Weißkohl hergestellte Sauerkraut (in Deutschland ca. 200 000 t/a) wird in Fässern oder Stahltanks von bis zu 100 t Gewicht noch immer bevorzugt durch Spontangärung hergestellt, wobei sich eine artenreiche Mischflora aus Bakterien, Hefen und Schimmelpilzen ausbildet. Mit Starterkulturen wird experimentiert. Weitere Beispiele für lactofermentierte Gemüse sind Borscht (vergorene rote Beete; Polen und Rußland), Gari (vergorene zerriebene Maniok-Knollen; Westafrika) und Kimchi (vergorener Chinakohl oder Rettich; Korea). Lactofermentierte Gemüsesäfte sind haltbar, reich an Vitaminen und Mineralstoffen und sehr gut verdaulich. Beliebte Beispiele sind Karotten- und Tomatensaft. Sauerteig. Anders als Weizenmehl im Hefeteig quillt Roggenmehl erst bei pH-Werten < 4,3 optimal auf – eine Voraussetzung für die Bildung elastischer und bekömmlicher Krusten von Misch-, Roggen-, Schrot- und Vollkornbrot. Man stellt aus Roggenmehl deshalb durch geeignete „Teigführung“ Sauerteig mit einem pH-Wert von ca. 4,2 her, der durch die kombinierte Wirkung von Milchsäurebakterien und Backhefe backfähig geworden ist. Silagen sind durch natürliche Milchsäure-Gärung haltbar gemachte Futtermittel, vor allem Futterrüben. Dazu werden diese in Silos unter Luftabschluss einer Milchsäure-Gärung unterzogen. Bei ungenügender Milchsäure-Bildung können Buttersäure-bildende Clostridien oder Hefen aufkommen und die Silage-Qualität beeinträchtigen. Durch Verwendung von Starterkulturen kann die Silage-Qualität verbessert werden. Silage enthält fast immer das psychrotrophe Pathogen Listeria monocytogenes, das sich bei ungenügend pasteurisierten Lebensmitteln bei langer Lagerung im Kühlschrank stark vermehren kann (in Weichkäsen, Hackfleisch, Krautsalat).

Präbiotika und Probiotika Allgemeines. Präbiotika sind teils unverdauliche Nahrungsmittelzusätze, die eine günstige Auswirkung auf die Darmflora haben. Probiotika enthalten lebende Mikroorganismen, z. B. Lactobacillen, die ebenfalls oral aufgenommen werden und positive Gesundheitseffekte zeigen (→116). Die Wirkung erfolgt hauptsächlich im Darm. Dort befindet sich eine Lebensgemeinschaft unterschiedlicher Mikroorganismen, die wesentlich am Aufschluss der Nahrungsmittel beteiligt sind. Ihre Zusammensetzung hat große Auswirkung auf Gesundheit und Wohlbefinden des Menschen und ist deshalb das Ziel groß angelegter Untersuchungen („Mikrobiom“, →298). Prä- und Probiotika unterliegen in ihrer Zulassung strengen gesetzlichen Regulierungen. Führend auf diesem Gebiet ist Japan mit etwa 1000 FOSHUArtikeln („Food of Specified Health Use“), zu denen auch viele Prä- und Probiotika gehören.

Darmflora. Die Darmflora des erwachsenen-Menschen (etwa 1011 Keime) besteht aus etwa 1000 verschiedenen Spezies von Mikroorganismen, worunter 40–60 Arten dominieren (→298). Das Gewicht der im Verdauungstrakt eines erwachsenen Menschen siedelnden Bakterien wird auf ~1 kg geschätzt. Besteht die Darmflora des Säuglings hauptsächlich aus Bakterien, die aus dem urogenitalen Trakt der Mutter stammen (bei Kaiserschnitt vor allem von deren Haut), so entwickelt sich mit der Umstellung auf Mischkost eine andere „Mikrobiota“, die sich zwar durch Umwelteinflüsse (z. B. Fehlernährung, Antibiotika, Reisen) verändern kann, in ihrem Kern aber lebenslang erhalten bleibt (robuste „Enterotypen“) und erst im hohen Alter ihre Diversität verliert. Sie wird während der ersten Lebensjahre durch genetische Faktoren des Individuums und seine Ernährung festgelegt. Die Darmwand bleibt steril und wird durch Peptid-Antibiotika („Defensine“) (→210) gegen Infektionen geschützt. Mit den durch die Darmbakterien freigesetzten Nahrungsstoffen, z. B. Peptiden und Aminosäuren, können allerdings auch bakterielle Toxine durch die Darmwand in den Blutkreislauf gelangen, sodass an dieser Grenze eine intensive Immunabwehr erfolgt. Molekulargenetische Methoden, insbesondere die Transkriptom-Analyse und Sequenzierung von 16S rRNA in Metagenomen (→74), haben unsere Kenntnisse über die Zusammensetzung des menschlichen Mikrobioms bei Gesundheit und Krankheit nachhaltig vorangebracht. Auch die Profilierung der Metaboliten im Darm, bestimmt durch hochaufgelöste Massenspektrometrie oder NMR (Metabolomics, Metabonomics) erlaubt zunehmend eine rationale Bewertung von Prä- und Probiotika. Präbiotika. Typische Präbiotika sind Fructooligosaccharide, Inulin, Galactooligosaccharide und Lactulose. Die beiden erstgenannten kommen natürlich vor in pflanzlichen Lebensmitteln wie Chicorée, Topinambur oder Schwarzwurzeln; Galactooligosaccharide und Lactulose werden aus Lactose industriell hergestellt. Sie wirken als selektive Wachstumsförderer für erwünschte Darmbakterien wie z. B. Bifidobakterien und Lactobacillen. Probiotika enthalten lebensfähige Bifidobakterien und Lactobacillen und werden meist in Form fermentierter Lebensmittel, häufig aber auch als Nahrungsergänzungsmittel aufgenommen. Da die meisten Stämme dieser Art bei der Passage durch den sauren Magen inaktiviert werden, ist ihre Wirkung umstritten. Es werden auch säurestabile Probiotika angeboten. Regulierungen. Seit Juli 2007 sind in der Europäischen Union sogenannte Health Claims untersagt (Health-Claims-Verordnung). Demnach sind gesundheitsbezogene Aussagen zu Lebensmitteln, zu diesen zählen auch Probiotika, nur noch erlaubt, wenn sie auch wissenschaftlich belegt sind. Derzeit wird für Probiotika eine Liste erstellt, in der alle gesundheitsbezogenen Aussagen gesammelt werden. Diese wird dann der EFSA (European Food and Safety Authority) vorgelegt, die über deren wissenschaftliche Fundiertheit entscheiden muss (→334). Für einige probiotische Stämme wurden bereits negative Bescheide der EFSA veröffentlicht. FOSHU ist ein Status japanischer Nahrungsmittel, die nachweislich die menschliche Gesundheit erhalten oder fördern. Dieser Status wird nach Vorlage umfangreicher Untersuchungen von einer staatlichen Agentur für Verbraucherfragen evaluiert und muss vom japanischen Gesundheitsministerium anerkannt werden. Neben „Foods to modify gastrointestinal conditions“ (Prä- und Probiotika) gibt es auch viele andere Claims, z. B. Förderung der Osteogenese oder Regulation des Blutdrucks.

Backhefe und Futterhefen

Allgemeines. Die Herstellung von Teig aus Mehl ist bis zurück ins Altertum dokumentiert. Von ägyptischen Tontafeln kennt man das Backen von „Bierbroten“ aus angefeuchter Gerste, die einer Hefegärung ausgesetzt war. Bis zum 19. Jahrhundert wurde auch in Europa zum Backen Bierhefe verwendet, die nach dem „holländischen Verfahren“ (um 1750) aus Malztrub gefiltert oder nach dem „Wiener Verfahren“ (um 1800) vom Gärbottich abgeschöpft wurde. Um 1870 erkannte Louis Pasteur, dass hohe Ausbeuten an Backhefe (Saccharomyces cerevisiae) (→14), bei geringer Ethanol-Bildung, nur unter aeroben Bedingungen erzielt werden. Seither stellt man Backhefe in gerührten Kesseln unter Lufteintrag her. Als C-Quelle dient meist Melasse (→88). Verschiedene Stamm-Varianten von Saccharomyces cerevisiae werden industriell als Backhefe oder Trockenbackhefe, als Brauer-Hefen, als Starterkulturen (→114) für die BioethanolHerstellung und als Zusatz zu Gesundheitsprodukten und Tierfutter hergestellt. Die ersten Verfahren zur Herstellung von Hefen als Tierfutter („Futterhefen“) wurden in den 1930er Jahren mit dem Ziel wirtschaftlicher Autarkie entwickelt. In der Nachkriegszeit stand dagegen die Schließung der Eiweißlücke in den Entwicklungsländern und die Verwertung wasserbelastender Abfallstoffe im Vordergrund. In jüngster Zeit liegt der Schwerpunkt auf einer nachhaltigen Wirtschaftsweise (Bioraffinerien) durch Verwertung von BiomasseAbfällen. Backhefe-Fermentation. Aufgrund ihres günstigen Preises und ihres hohen Anteils an gut verwertbaren N-haltigen Verbindungen, Vitaminen und Spurenelementen haben sich als CQuelle (→114) Melassen (aus Rübenoder Rohrzucker) durchgesetzt. Sie verbleiben nach der Heißwasserextraktion zerkleinerter Zuckerrüben oder Zuckerrohrs und enthalten ca. 40–50 % Saccharose (→180), die von S. cerevisiae durch das Enzym Invertase in fermentierbare Glucose und Fructose gespalten wird. Technologie. Um einen hohen Ertragskoeffizienten YS (→92) für die Umwandlung von Melasse in Zellmasse zu erzielen, ist außer einer guten Belüftung zur Unterbindung der Ethanol-Bildung die strikte Limitierung von Zucker im Zulauf entscheidend, da bei GlucoseKonzentrationen > 1 g/L eine verminderte Atmungsaktivität und die Bildung von Ethanol auftritt (Katabolit-Repression, „aerobe Gärung“, „Crabtree-Effekt“) (→92). Moderne Verfahren zeichnen sich deshalb durch optimierte Begasungs- und Rührsysteme (→94) und eine rechnergesteuerte Zulaufkontrolle der Melasse aus. Bei guter Prozessführung wird 1 kg H27 pro kg Melasse gebildet. H27 ist eine relative Größe, die in der Hefeindustrie zur Berechnung von Ausbeuten herangezogen wird; man versteht darunter Presshefe mit 27 % TS-Gehalt. Da Melasse 50 % Zucker enthält und die maximale Ausbeute an Backhefe aus Zucker erfahrungsgemäß 54 g TS pro 100 g verbrauchtem Zucker beträgt, erhält man 1 kg H27/kg Melasse. Die frühere Aufarbeitung durch Filtration zur Presshefe, die wenig lagerfähig ist und deshalb zahlreiche regionale Hefebetriebe erforderlich machte, ist weitgehend einer schonenden Trocknung im Wirbelschicht-Trockner zur Trockenbackhefe gewichen. Diese ist über Monate lagerstabil und treibt bei Zusatz von Wasser und Zucker in wenigen Minuten. Futterhefen konkurrieren im Preis mit anderen proteinreichen Rückständen, z. B. mit Fischmehl, vor allem aber mit Sojamehl. Die Kosten der C-Quelle sind deshalb für die Wettbewerbsfähigkeit von Fermentationsverfahren von entscheidender Bedeutung. Die

Verhefung zahlreicher C-Quellen wie Erdölfraktionen, Erdgas, Ethanol, Methanol, Cellulosen, Polyosen, Stärken und Molke wurde untersucht. Beim schwedischen Symba-Prozess verzuckert die Hefe Endomycopsis fibuliger Kartoffelstärke, und die Hefe Candida utilis (→14) bildet daraus Einzellerprotein. Beim finnischen Pekilo-Prozess bildet der Pilz Paecilomyces variotii Zelleiweiß aus Kohlenhydrat-Rückständen der Zellstoff-Herstellung, und beim kanadischen Waterloo-Prozess wächst der Pilz Chaetomium celluloyticum auf Cellulosen und Hemicellulosen aus land- und forstwirtschaftlichen Abfällen (Stroh, Bagasse, Stalldung, Sägemehl). Ähnliche Prozesse werden zur Gewinnung von Futterhefen aus BioraffinerieRückständen diskutiert. Für die menschliche Ernährung eingesetzt wird der Rank-Hovis McDougall-Prozess, bei dem der Schimmelpilz Fusarium venenatum auf Glucose angezüchtet wird. Quorn™, die Zellmasse dieses Pilzes, gilt als vegetarische Spezialität mit gutem Geschmack und interessanter Textur und wird in vielen Ländern vertrieben.

Futterhefen aus Chemie-Rohstoffen, Einzelleröl Allgemeines. In der Nachkriegszeit führten der zeitgleiche Aufschwung der Petrochemie und der Fermentationstechnologie zur Idee, die befürchtete Eiweißlücke – Folge der exponentiell zunehmenden Weltbevölkerung – durch die Erzeugung von Einzellerprotein (Single Cell Protein, SCP) zu schließen. Einzelleröl-Synthesen wurden während des 2. Weltkriegs in Deutschland intensiv bearbeitet, um den von der alliierten Seeblockade ausgelösten Zusammenbruch der Pflanzenöl-Importe aus Asien und Amerika zu kompensieren. Die Suche nach Energieträgern hat dem Arbeitsgebiet neue Impulse gegeben. Einzellerprotein: Rohstoffe und Mikroorganismen. Zwischen 1965 und 1975 stand der Einsatz hochsiedender Erdöl-Fraktionen als C-Quelle im Vordergrund, die von Erdölabbauenden Hefen (Candida tropicalis, C. bombicola (→14) und andere) verwertet werden können. Der Alkan-Abbau in Hefen erfolgt in den Peroxisomen durch terminale Oxidation und β-Oxidation über den Citronensäure-Cyclus. Ab 1972 etablierten sich zunehmend Verfahren auf der Basis von Methanol unter Verwendung methylotropher Hefen und Bakterien (→14) (Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Candida boidinii, Methylophilus methylotrophus, Methylomonas clara). Methanol wird nach Oxidation zu Ameisensäure und Formaldehyd als C1-Baustein meist in den Pentosephosphat-Cyclus eingeschleust. Alkan-Verhefung. Hochsiedende Alkane sind nur wenig wasserlöslich; der Einsatz von Emulgatoren ist aber wegen Schaumbildung bei der Fermentation und Rückständen im Produkt problematisch. Einem gut ausgelegten Rührsystem kommt deshalb große Bedeutung zu. Bei der erforderlichen intensiven Belüftung (16 Mol-Äq. O2/Mol-Äq. Hexadecan, Lufteintrag 10 vvm) ist darauf zu achten, dass übermäßige Schaumbildung vermieden wird. 40 m3-Anlagen in

Grangemouth (BP) und eine 100 m3-Anlage in Sardinien waren mit Intermig-Rührern und mechanischen Schaumabscheidern ausgelegt. Bei Zulauf-Fermentationen von 5 Tagen Dauer erzielte man 0,9 kg Hefe-Feuchtmasse (Candida tropicalis)/kg Erdöl. Die Abtrennung der Hefe erfolgte durch Separatoren. Den gesundheitlich bedenklich hohen Anteil an RNA (4 %) (Gicht!) (→137) senkte man mittels vorsichtiger Autolyse ab. Durch schonende WirbelschichtTrocknung wurde die Hefe versandfertig gemacht. Technologie der Methanol-Verhefung. Das niedrigsiedende Methanol (Sdp 45 °C) ist in Konzentrationen > 100 mg/L auch für methylotrophe Mikroorganismen toxisch. Durch die Entwicklung schlanker, hoher Blasensäulen-Fermenter (ICI in Billingham: 8 · 60 m) mit bis zu 600 rechnergesteuerten Einspritzdüsen wurde die Verteilung von Methanol im Bioreaktor und gleichzeitig seine Lösungsgeschwindigkeit infolge des hohen hydrostatischen Drucks optimiert. Die hohe erforderliche Belüftungsrate erzielte man durch Umlauf des Reaktionsmediums in einer Schlaufe. Mit dem Bakterium Methylophilus methylotrophus konnten in einem kontinuierlichen Verfahren bei einer Prozessdauer von 2 Tagen 0,5 kg Biomasse/kg Methanol gewonnen werden (PRUTEEN™). Die Abtrennung der Zellmasse erfolgte mittels Separatoren. Nach Reduktion des RNA-Gehalts durch schonende Autolyse wurde das Eiweißprodukt im Wirbelschicht-Trockner in eine versandfertige Form gebracht. Akzeptanz und Wirtschaftlichkeit. Gegen die Verwendung von Alkan-Hefen als Nahrungsmittelzusatz wurde schnell Kritik laut, deren Kernpunkt befürchtete Rückstände von carcinogenen Polyaromaten aus dem Erdöl war. Trotz umfangreicher Rückstandsanalytik und toxikologischer Versuche erreichte man 1974 lediglich eine begrenzte Freigabe als Futtermittelzusatz für Haustiere. Die Verteuerung des Erdöls führte schließlich zu einer Aufgabe der Projekte. Die Markteinführung von Methanol-Hefe – vom Beginn weg als Tierfutterzusatz deklariert – hatte mit derartigen Problemen nicht zu kämpfen, wohl aber mit erhöhten Methanol-Preisen und einer EU-weiten Subventionierung von Magermilchpulver als Futtermittelzusatz. Einzelleröl. (Single Cell Oil) kann aus Glucose mit Hefen wie Rhodotorula glutinis und Pilzen wie Mortierella isabellina, aber auch aus CO2 mit Cyanobakterien (→18) hergestellt werden. Dabei erreicht man Ausbeuten von > 60 % der Zelltrockenmasse. Die Zusammensetzung der Triglyceride (→162) lässt sich mit Hilfe gentechnischer Methoden in verschiedene Richtungen lenken (z. B. Biodiesel, ω-3 Fettsäuren).

Aminosäuren Allgemeines. Seit man vor etwa 50 Jahren ihre wichtige Stoffwechselfunktion erkannte, werden Aminosäuren für medizinische Anwendungen, z. B. für Infusionslösungen, hergestellt. Andere wie D,L-Methionin, L-Lysin und L-Threonin dienen als Futtermittelzusatz. Die Erkenntnis, dass L-Glutamat eine geschmacksverstärkende Wirkung und das Dipeptid Aspartam™ eine hohe Süßkraft besitzen, erweiterte die industrielle Produktion beträchtlich. Die 20 proteinbildenden (proteinogenen) Aminosäuren sind die Bausteine der Proteine und Enzyme (→28). Die meisten höheren Organismen sind auf die Zufuhr einzelner Aminosäuren mit der Nahrung angewiesen (essentielle Aminosäuren). Beim Menschen und bei vielen

Nutztieren sind dies L-Methionin, L-Lysin, die aromatischen Aminosäuren L-Phenylalanin, LTyrosin und L-Tryptophan sowie die hydrophoben Aminosäuren L-Valin, L-Leucin und LIsoleucin. Nicht proteinbildende Aminosäuren, beispielsweise mit D-Konfiguration am CαAtom, kommen in Naturstoffen vor. Sie dienen als chirale Synthone in der Synthesechemie, z. B. für die Herstellung halbsynthetischer Antibiotika (→132). Wirtschaftliche Gesichtspunkte. Die Jahresproduktion von Aminosäuren beträgt ca. 5 Mio. t/a (2012), ihr Marktwert nähert sich an 10 Mrd. US-$. Viele Herstellfirmen sind im Nordasiatischen Raum beheimatet. Das wichtigste Produkt ist Natrium-L-Glutamat (ca. 2,5 Mill. t) (→126), gefolgt von L-Lysin (ca. 1,5 Mill. t) und D,L-Methionin (ca. 900 000 t) (→128). LAsparaginsäure und L-Phenylalanin, Ausgangsprodukte zur Herstellung des Süßstoffs Aspartam™, werden in Mengen von je ca. 15 000 t produziert (→130). Nur ein kleiner Anteil der Aminosäuren wird, in hoher Reinheit und Pyrogen-frei, medizinisch-therapeutisch eingesetzt, z. B. bei Infusionslösungen, oder gelangt als Zusatzstoffe in kosmetische Präparate. Ein großer und weiter steigender Anteil der industriell hergestellten Aminosäuren wird dagegen Tierfutter zugesetzt (Lysin, Methionin, Threonin, Tryptophan) oder gelangt in Nahrungsmittel (Glutamat, Aspartam, Alanin). Herstellverfahren. Bei der Herstellung von Aminosäuren konkurrieren vier Verfahren: 1. Extraktion aus Proteinhydrolysaten, 2. chemische Synthese, 3. Umwandlung chemischer Vorstufen im Enzymreaktor oder Zellreaktor, und 4. mikrobiologische Herstellung mittels Fermentation. Die Extraktion aus Proteinhydrolysaten (dem „chiralen Pool“) wurde lange für L-Cystein, L-Cystin, L-Leucin, L-Asparagin, L-Arginin und L-Tyrosin wirtschaftlich genutzt. Als Ausgangsmaterial dienten meist Pflanzenproteine oder Schlachttier-Abfälle. Nach saurer Hydrolyse wurden zuerst die hydrophoben Aminosäuren L-Phenylalanin, L-Leucin und LIsoleucin durch Fällung und Alkohol-Extraktion abgetrennt. Danach erfolgte durch Ionenaustausch-Chromatographie die Auftrennung der wasserlöslichen Aminosäuren in eine basische, saure und neutrale Fraktion und deren weitergehende Reinigung durch Kristallisation bzw. chromatographische Verfahren. Die chemische Synthese führt in aller Regel zum Racemat. Sie kommt in Betracht, wenn dieses direkt eingesetzt werden kann, wie z. B. beim D,L-Alanin (zur Geschmacksabrundung von Fruchtsäften), vor allem aber beim D,L-Methionin als Futtermittelzusatz. Mit Enzym- oder Zellreaktoren (→102, 164) wird am Cα-Atom racemischer Aminosäure-Derivate durch Biotransformation ein chirales Zentrum eingeführt. Als Biokatalysator setzt man dabei entweder isolierte Enzyme oder diese enthaltende ganze Zellen ein. Aus wirtschaftlichen Gründen verwendet man meist immobilisierte Biokatalysatoren, die eine kontinuierliche Reaktionsführung bei hoher Lebensdauer des Katalysators ermöglichen. Der wirtschaftliche Erfolg beruht meist auf einer kostengünstigen chemischen Synthese der Vorstufe. Zur Herstellung nahezu aller proteinogenen Aminosäuren werden aber mittlerweile Fermentationsverfahren mit Hochleistungsstämmen eingesetzt, die in der Regel die wirtschaftlich beste Alternative bieten. Gentechnisch optimierte Produktionsstämme spielen dabei eine wichtige Rolle. Die Genom-Sequenzierung von Corynebacterium glutamicum (→20), dem Produktionsorganismus für Glutaminsäure und Lysin, wurde 2003 von verschiedenen konkurrierenden Gruppen abgeschlossen und hat mittlerweile der Leistungssteigerung von Produktionsstämmen weiteren Auftrieb gegeben. Auch bei

Produktionsstämmen anderer Aminosäuren liegen komplette Operons der AminosäureBiosynthese kloniert vor. Sie erlauben, durch metabolic engineering (→318) den Stofffluss in die gewünschte Richtung umzulenken.

L-Glutaminsäure Allgemeines. Bereits 1908 wurde in Japan die geschmacksverbessernde Wirkung („umami“) von Natrium-Glutamat (G.), einem Inhaltsstoff von Konbu-Algen, entdeckt. 1909 begann die japanische Firma Ajinomoto mit der industriellen Herstellung dieser Aminosäure aus sauren Hydrolysaten von Weizengluten und Sojaprotein. 1957 entdeckten Mitarbeiter der japanischen Firma Kyowa Hakko, dass Corynebacterium glutamicum (→20) beim Wachstum auf Zucker L-Glutaminsäure ins Medium ausscheidet. Seither gelang durch Stammverbesserung und Optimierung der Fermentations-technologie eine Ausbeutesteigerung auf bis zu 150 g/L. Organismen und Biosynthese. C. glutamicum bildet Glutaminsäure als Folgeprodukt des Citronensäure-Cyclus durch Transaminierung von 2-Oxoglutarsäure, die ihrerseits durch Oxidation von Isocitronensäure entsteht. Im Wildstamm ist das Verhältnis von GlutaminsäureBiosynthese zum oxidativen Abbau von C2-Einheiten im Citronensäure-Cyclus streng reguliert. Die technisch verwendeten Mutanten weisen demgegenüber verschiedene Besonderheiten auf: 1. die Sekretion von Glutamat ins Nährmedium ist stark erhöht, 2. einige Schlüsselenzyme auf dem Biosyntheseweg sind dereguliert, 3. mehrere anaplerotische Stoffwechselwege (Auffüllreaktionen) sind aktiviert. Zu 1.: Die Glutamat-Überproduktion ist vor allem über ihre Ausscheidung geregelt und damit abhängig von der Zellpermeabilität, die durch verschiedene Maßnahmen wie reduzierte Verfügbarkeit von Biotin, Mangel an Ölsäure bei Ölsäureauxotrophen oder Glycerin-Mangel bei Glycerin-auxotrophen Stämmen und Penicillin-Zusatz beeinflusst werden kann. Zu 2.: In Produktionsstämmen von C. glutamicum ist die Aktivität der 2-Oxoglutarat-Dehydrogenase im Vergleich zur L-Glutamat-Dehydrogenase deutlich verringert (Km ca. 70fach, vmax ca. 150fach). Zu 3.: Die beiden wichtigsten anaplerotischen Reaktionen sind die Carboxylierung von Phosphoenolpyruvat (PEP) mit PEP-Carboxylase und die Aktivierung des Glyoxylat-Cyclus. Beide Reaktionen führen zur Bildung von Oxalessigsäure, der Vorstufe von Citronensäure, und schleusen damit weitere C2-Einheiten aus der Glykolyse in den Citronensäure-Cyclus ein. Da PEPCarboxylase Biotin benötigt, muss dieser Cofaktor in genügender Menge zur Verfügung stehen. Viele der beteiligten Enzyme werden ferner durch die Konzentration von Metaboliten, Endprodukten, NH4+ und den NAD+/NADH-Pool reguliert. Klassische Methoden der Stammverbesserung werden heute durch gentechnische Maßnahmen ergänzt – die Genomsequenz von C. glutamicum liegt seit 2003 vor. So versteht man mittlerweile die Bedeutung eines regulatorischen Proteins (OdhI) und seines Phosphorylierungszustands für die Glutamat-Bildung ebenso wie den Einfluss von Mutationen im mechanosensitiven Ausscheidungskanal (YggB) auf den Export dieser Aminosäure, und macht sich diese Kenntnisse bei der Herstellung von Hochleistungsmutanten zunutze. Fermentation und Aufarbeitung. Als C-Quellen (→88) werden vor allem Melasse oder Stärkehydrolysat verwendet. Unter optimierten Kulturbedingungen setzen Hochleistungsstämme von C. glutamicum etwa 60–70 % der C-Quelle zu Glutamat um. Als N-Quelle dient Ammoniak. Der Biotin-Gehalt des Mediums ist optimiert, der pH wird auf 7,8 einreguliert. Eine optimale Sauerstoffversorgung ist kritisch (optimaler kd-Wert 3,5 · 10–6 mol O2/atm min mL). Die Produktion erfolgt in Fermentern bis 500 m3. Meist wird in Vorfermentern

zunehmenden Volumens beimpft und bei der Hauptfermentation ein Zulaufverfahren (→92) bevorzugt. Um Katabolitrepression zu vermeiden, wird nach Bildung der Zellmasse (ca. 14 h) der Glucose-Gehalt im Medium durch CO2-Bestimmung in der Abluft auf 0,5 % gehalten. Die Isolierung von Ammonium-Glutamat aus dem Nährmedium (ca. 150 g/L nach 60 h) erfolgt nach Abtrennung der Zellen mittels Ultrafiltration und Anionen-Austauscher als Natriumglutamat, das Ammoniak wird wieder in den Prozess rückgeführt. Wirtschaftliche Gesichtspunkte. Mono-Natrium-Glutamat (MSG) wird überwiegend als Geschmacksverstärker in der Nahrungsmittel-Industrie eingesetzt, meist in Kombination mit Nucleosiden. 2009 wurden ca. 2,3 Mill. t MSG durch Fermentation hergestellt. Der Preis liegt um 1000 US-$/t, sodass sich ein Marktvolumen von ca. 2,3 Mrd. US-$ ergibt. Die meisten Hersteller sind im asiatischen Raum beheimatet (China: > 700 000 t), wo auch der größte Teil von MSG verbraucht wird.

D,L-Methionin, L-Lysin und L-Threonin Allgemeines. Alle drei Aminosäuren werden vor allem als Futtermittelzusatz verwendet. Sie sind für den Menschen und viele Haustiere essentielle Aminosäuren, die nicht durch Biosynthese erzeugt werden können. In vielen für die Ernährung genutzten pflanzlichen Proteinen wie Mais, Soja, Hafer, Gerste, Weizen und Reis kommen sie nicht in den für eine gesunde Ernährung erforderlichen Mengen vor. Bei vorwiegend vegetarischer Ernährung

empfiehlt es sich deshalb, pflanzliche Proteine durch Zusatz dieser Aminosäuren aufzuwerten. Bei Tierfutter spielt dieser Gesichtspunkt eine wichtige Rolle: die Gewichtszunahme bei der Mast erreicht bei Verfütterung von Weizen oder Reis erst durch Zusatz von L-Lysin und LThreonin, bei Verfütterung von Mais durch Zusatz von D,L-Methionin, L-Lysin und LTryptophan den Futterwert von Casein. Die industrielle Herstellung erfolgt durch chemische Synthese und mikrobielle Fermentation. D,L-Methionin. Die Synthese erfolgt chemisch in 5 Stufen aus Acrolein, Methanthiol und Blausäure, wobei intermediär ein Hydantoin gebildet wird. Da D-Methionin im Tier zu LMethionin racemisiert wird, kann race-misches D,L-Methionin verfüttert werden; eine Racematspaltung ist nicht erforderlich. L-Lysin wird fermentativ mit Hochleistungsstämmen von Corynebacterium glutamicum (→20) hergestellt. Es entsteht aus Diaminopimelinsäure, die ihrerseits aus dem Oxalacetat des Citronensäure-Cyclus in einer Mehrstufenreaktion durch Kondensation von Asparaginsäure und Pyruvat entsteht (DAP-Weg). Verzweigungen auf diesem Biosyntheseweg führen auch zu LThreonin und L-Methionin, die mittels Endprodukthemmung die Bildung von L-Lysin unterdrücken können. Bei L-Lysin-Überproduzenten ist dieser Regulations-prozess ausgeschaltet, was entweder durch regulationsdefekte Mutantenstämme oder durch Umgehung stark regulierter Enzyme mit Hilfe von auxotrophen Mutanten erreicht wird. Eine besondere Rolle spielen dabei S-Aminoethylcystein (AEC)-resistente Mutanten: der Antimetabolit bindet wie Lysin an das allosterische Zentrum der Aspartatkinase, sodass AEC-resistente Mutanten auch nicht mehr vom Endprodukt Lysin gehemmt werden und höhere Lysin-Ausbeuten erreichen. Da alle Gene des Stoffwechselwegs bereits kloniert wurden und auch die Genomsequenz von C. glutamicum seit 2003 bekannt ist, spielen gentechnologische Methoden auf der Grundlage einer Stoffflussanalyse eine entscheidende Rolle bei der AusbeuteVerbesserung. Die Ausbeuten liegen heute über 100 g/L in 60 h, wobei wie im Fall von LGlutamat Zulaufverfahren (repeated batch) in Bioreaktoren bis 750 m3 zum Einsatz kommen. Als C-Quelle dienen vor allem Zuckerlösungen, der Substrat-Umsatz kann 75 g Lysin pro 100 g Glucose betragen. Der Biotin-Gehalt muss über 30 μg/L liegen. Die Aufarbeitung erfolgt entweder durch Sprühtrocknung und Granulierung ohne Zellabtrennung, oder durch Kristallisation nach Zellabtrennung und Ionenaustauschchromatographie. Interessant, aber nicht mehr wettbewerbsfähig ist die Herstellung von L-Lysin aus D,L-α-Amino-ε-caprolactam (ACL) mit acetongetrockneten Zellen von Cryptococcus laurentii im Zellreaktor. Bei diesem Verfahren wurde L-Lysin durch selektive Hydrolyse des kostengünstigen Ausgangsmaterials für Nylon™ und Racemisierung des zurückbleibenden D-α-Amino-ε-caprolactams mit DAminocaprolactam-Racemase aus Achromobacter obae gewonnen. L-Threonin. Produktionsorganismen der Wahl sind deregulierte Hochleistungsmutanten von Escherichia coli. Die besten Stämme bilden in nur 30 h über 100 g/L. Das Threonin-Operon wurde vollständig kloniert und dient zur weiteren Stammverbesserung. Die Aufarbeitung erfolgt nach Entfernung der Zellmasse durch Kristallisation aus dem Ultrafiltrat. Wirtschaftliche Gesichtspunkte. 2009 wurden ca. 850 000 t D,L-Methionin, 1,3 Mill. t LLysin und ca. 190 000 t L-Threonin hergestellt. Das bevorzugte Verfahren für Methionin ist die

chemische Synthese des Racemats. L-Threonin und L-Lysin werden ausschließlich durch Fermentation hergestellt. Der Preis der drei Aminosäuren liegt zwischen 1000 und 4000 US$/t, sodass sich insgesamt ein Marktvolumen von etwa 3 Mrd. US-$ ergibt. Mittelfristig dürfte der Zusatz industriell hergestellter Aminosäuren zu Futtermitteln mit der Erzeugung transgener Futter-Pflanzen mit einem veränderten Aminosäure-Spektrum konkurrieren.

Aspartam™, L-Phenyl-alanin und L-Asparaginsäure Allgemeines. Aspartam™ (L-α-Aspartyl-L-phenylalanin-methylester) ist ein kalorien-armer synthetischer Süßstoff, dessen Süßkraft (→180) die von Rohrzucker um das 200fache übertrifft. Er wurde 1965 bei der Firma G. D. Searle entdeckt und 1981 von der FDA lebensmittelrechtlich zugelassen (NutraSweet®). Von dem mittlerweile patentfreien Mengenprodukt werden derzeit ca. 20 000 t/a (2009) hergestellt. Marktführer ist Ajinomoto. Ausgangsprodukte für Aspartam sind L-Asparaginsäure und L-Phenylalanin. Die chemische Synthese erfordert die Verwendung von Schutzgruppen und ist im Vergleich zur enzymatischen Herstellung nicht konkurrenzfähig. L-Asparaginsäure kann durch Extraktion von Proteinhydrolysaten gewonnen werden. Bevorzugt ist aber die Synthese aus Fumarsäure durch Addition von Ammoniak mit Hilfe des Enzyms Aspartase in ganzen Zellen von Escherichia coli. Meist wird dazu ein Zellreaktor (→102) benutzt, bei dem die Bakterien z. B. an κ-Carrageenan oder Polyacrylamid immobilisiert sind. Die Produktivität eines derartigen Systems liegt bei 140 g/(L · h), die Betriebsstabilität (Halbwertszeit des Katalysators) erreicht 2 Jahre. Mit freien induzierten Zellen nach Gefriertrocknung wurden Ausbeuten bis zu 166 g/L erreicht. Durch Plasmidkodierte Expression des Aspartase-Gens (aspA) in E. coli K12 erhöhte man die AspartaseBildung 30-fach. Fermentationsverfahren mit Hochleistungsstämmen sind nicht wettbewerbsfähig. L-Phenylalanin. Die industrielle Herstellung erfolgte lange mit Hilfe von Enzymreaktoren aus gut zugänglichen chemischen Vorstufen. In den letzten Jahren sind durch die Entwicklung von Hochleistungsstämmen jedoch Fermentationsverfahren wettbewerbsfähig geworden. Über die wirtschaftliche Präferenz dieser Alternativen entscheiden u. a. Zugänglichkeit und Preis der synthetischen Edukte und die Raum-Zeit-Ausbeuten der Verfahren. Die besten Ergebnisse mit Enzymreaktoren wurden bei der Addition von Ammoniak an trans-Zimtsäure durch Phenylalanin-Ammonium-Lyase aus Rhodotorula glutinis erzielt. Im Zellreaktor mit induzierten Mikroorganismen lagen die Ausbeuten bei 50 g/L bei einem Umsatz von 83 %. Auch die Spaltung von D,L-5-Benzylhydantoin mittels L-Hydantoinase und L-N-Carbamoylase aus Flavobacterium ammoniagenes wurde eingesetzt (→132). Heute verwendet man

vorwiegend Hochleistungsmutanten von E. coli. Da die Biosynthese von L-Phenylalanin aus Erythrose-4-phosphat und Phosphoenolpyruvat über die Zwischenstufen Shikimi-, Chorisminund Prephensäure auf einem verzweigten Biosyntheseweg erfolgt, der auch zu den Aminosäuren L-Tryptophan und L-Tyrosin führt, werden zur Umgehung hochregulierter Schlüsselenzyme auxotrophe Mutanten eingesetzt: die Produzentenstämme sind auxotroph für L-Tyrosin, sodass ihr Wachstum über die Zugabe von L-Tyrosin zum Medium gezielt gesteuert werden kann. Fast alle Gene des Stoffwechselwegs sind mittlerweile kloniert und erlauben mit gentechnischen Methoden die Herstellung dereprimierter Varianten. Mit rekombinanten Stämmen von E. coli erreicht man Ausbeuten von etwa 50 g/L L-Phenylalanin in 60 Stunden. Der Fermentation im Zulaufverfahren (→92) (Verhinderung von Essigsäure-Bildung) mit kontrollierter Zudosierung von L-Tyrosin folgt die Aufarbeitung durch Zellabtrennung und Konzentrierung des Filtrats, meist durch Ultrafiltration, danach die Reinigung des Produkts durch Kristallisation oder Adsorptionschromatographie. Aspartam™. Die chemische Synthese von Aspartam aus den beiden konstituierenden Aminosäuren erfordert die Einführung und spätere Eliminierung von 5 Schutzgruppen. Im Vergleich dazu verläuft die Protease-katalysierte Synthese einfacher; bei geschützter AminoGruppe reagiert nur die α-Carboxyl-Gruppe der L-Asparaginsäure (der isomere L-β-AspartylL-phenylalanyl-methylester schmeckt bitter). Die Enantioselektivität vieler Proteasen erlaubt im Prinzip auch den Einsatz racemischer Aminosäuren. In der Praxis wird immobilisierte Protease Thermolysin aus Bacillus thermoproteolyticus in t-Amylalkohol verwendet. Sie ist sehr temperaturstabil und erlaubt eine Prozessführung bei 70 °C, wodurch sehr hohe RaumZeit-Ausbeuten von 30 g/(L · h) erzielt werden. Der entstehende Dipeptid-Ester ist bereits von hoher Reinheit und wird durch Ionenaustauschchromatographie von Resten der Vorstufen gereinigt. Als Nachfolgeprodukt entwickelt Ajinomoto Advantame™, ein asp-phe DipeptidDerivat, das in Japan bereits zugelassen ist (2014).

L- und D-Aminosäuren durch enzymatische Transformation Allgemeines. Wie bereits an einigen Beispielen gezeigt wurde (Lysin (→128), Asparaginsäure (→130), Phenylalanin (→130)), können enantiomerenreine Aminosäuren auch durch enzymatische Umwandlung synthetischer Vorstufen hergestellt werden. Anders als die Fermentation eröffnet dieses Verfahren auch die Möglichkeit, nicht-proteinogene und unnatürliche Aminosäuren herzustellen. Meist verwendet man Hydrolasen, die enantioselektiv racemische Vorstufen spalten. Beispiele dafür sind Esterasen, Aminoacylasen, Amidasen und Hydantoinasen. Nachteil dieser Vorgehensweise ist die Notwendigkeit, das „falsche“ Enantiomer in einer gekoppelten Reaktion zu racemisieren und damit der Reaktion wieder zuzuführen. Als Alternative wurden deshalb gekoppelte Reaktionen mit Racemasen, Additionsreaktionen mit Lyasen (Oxynitrilasen) und Redoxreaktionen mit Oxidoreduktasen ausgearbeitet, die nur zu einem gewünschten Enantiomer führen. Enantioselektive Hydrolysen. Besonders gut untersucht und bereits industrieller Standard sind Enzymreaktoren (→102, 164) auf der Basis von Aminoacylasen und Hydantoinasen. Bei der Acylase-Reaktion dient das trägergebundene Enzym (z. B. aus Aspergillus oryzae oder

Bacillus thermoglucosidius) zur Hydrolyse racemischer N-Acyl-aminosäuren. Dabei wird nur das L-Enantiomer umgesetzt. Die im Reaktionsgemisch verbleibende N-Acyl-D-aminosäure wird durch Kristallisation abgetrennt, thermisch racemisiert und das entstehende Racemat erneut gespalten. Auf diesem Weg werden im Maßstab von einigen 100 t/a L-Methionin, LTyrosin, L-Prolin und L-Valin für klinische Anwendungen (Infusionslösungen) hergestellt. Obwohl man auf diesem Syntheseweg auch D-Aminosäuren synthetisieren kann, bieten die leicht zugänglichen Hydantoine noch größere Freiheitsgrade bei der Herstellung von Vorstufen. Racemische Hydantoine können mit Hydantoinasen der gewünschten Spezifität gespalten werden. Dabei entsteht primär eine N-carbamoylierte Aminosäure, die chemisch oder mit Hilfe von Carbamoylasen in die gewünschten enantiomerenreine Aminosäure überführt wird. Das „falsche“ Hydantoin lässt sich enzymatisch racemisieren und führt mit einer gentechnisch optimierten Enzymkaskade, die in einen Wirtsorganismus wie E. coli integriert sein kann, zu quantitativen Ausbeuten vieler nicht-biogener L- und D-Aminosäuren. Die Methode wird beispielsweise zur industriellen Herstellung von D-Phenylglycin und 4-Hydroxyphenylglycin eingesetzt – den Seitenketten der halbsynthetischen Penicilline Ampicillin und Amoxicillin. Enantioselektive Additionsreaktionen. Oxynitrilasen kommen vor allem in Pflanzen vor und zeigen entweder R- oder S-Selektivität. In beiden Fällen stehen mittlerweile in Escherichia coli oder in Hefen exprimierte rekombinante Enzyme zur Verfügung, so z. B. für die ROxynitrilase aus Maniok oder die S-Oxynitrilase aus Mandeln. Die Raumstruktur beider Enzyme ist bekannt und man versucht derzeit, durch Protein Engineering ihre Substratspezifität für attraktive industrielle Ausgangsprodukte zu verbessern. Enantioselektive Redoxreaktionen. Am Beispiel der stereoselektiven Synthese von L-Leucin aus synthetischer α-Oxo-isocapronsäure wird deutlich, dass für die reduktive Aminierung mit immobilisierter L-Leucin-Dehydrogenase aus Bacillus sp. neben NH3 auch NADH benötigt wird. Die hohen Kosten von NADH machten zu Beginn allerdings dessen Regenerierung im Prozess erforderlich. Besonders elegant gelang dies mit Formiat-Dehydrogenase aus Candida boidinii, wobei das als Gas entweichende Reaktionsbeiprodukt CO2 die Gleichgewichtsreaktion in die Richtung des L-Leucins verschob. Bei Verwendung von mit Polyethylenglykol (PEG) molmassenvergrößertem NADH konnten in einem Enzymmembranreaktor bis zu 600000 Moläquivalente Produkt/Mol NADH erreicht werden. Die industrielle Regenerierung von NADH oder NADPH bei Redox-Reaktionen erfolgt mittlerweile mit unveränderten Coenzym im batchweisen Betrieb unter Verwendung von Hilfsenzymen wie Alkohol- oder Glucosedehydrogenase als Hilfsenzym (→170). Dabei entstehen Koppelprodukte wie Acetaldehyd oder Gluconsäure. Eine immer größere Zahl derartiger Prozesse wird mit einklonierten, durch Protein-Design (→198) oder gerichtete Evolution veränderten Enzymen in gentechnisch optimierten Mikroorganismen durchgeführt („Designer Bugs“).

Vitamine

Allgemeines. Vitamine finden als medizinische Präparate Verwendung. Sie werden vielen Nahrungsmitteln und Futtermitteln zugesetzt. Die meisten Vitamine lassen sich durch chemische Synthese oder Extraktion von Pflanzenmaterial gewinnen. Biotechnologische Verfahren haben sich bei der Herstellung von Vitamin B2, B12 und C durchgesetzt. Das Produktionsvolumen fermentativ hergestellter Vitamine liegt bei > 200 000 t/Jahr (Welt), woran Vitamin C den größten Anteil hat. Vitamin B2 (Riboflavin). Riboflavin ist in Form von FAD oder FMN Coenzym zahlreicher Redox-Enzyme. Es kommt in freier Form nur in der Milch vor. Sein Mangel führt im Tierversuch zu Dermatitis, Wachstumsstörungen und Augenschädigungen. Die Biosynthese erfolgt auf einem komplexen Weg aus Guanosintriphosphat und Ribulose-5-Phosphat. Riboflavin kann durch chemische Synthese hergestellt werden, aus ökonomischen und ökologischen Gründen haben sich aber in den letzten Jahren zwei Fermentationsverfahren durchgesetzt. Mit molekulargenetisch optimierten Hochleistungsmutanten des filamentösen Pilzes Ashbya gossypii erreicht man im Satzreaktor (C-Quelle: Pflanzenöl; N-Quelle: z. B. Sojamehl) und mit fed-batch-Verfahren > 20 g/L Riboflavin in 72 h. Die Aufarbeitung erfolgt nach Zellautolyse durch Hitzeschock, Zellabtrennung und chromatographische Verfahren. Beim Herstellverfahren mit Bacillus subtilis werden Hochleistungsstämme eingesetzt, die aus ungerichteter Mutagenese und gentechnischen Eingriffen stammen. Entscheidend dabei ist eine aufeinander abgestimmte Optimierung der Biosynthese der Bausteine Riboflavin, Ribulose-5′Phosphat und GTP. Vitamin B12 (Cyanocobalamin). Vitamin B12 ist als Coenzym an Methylierungs- und Isomerisierungsreaktionen beteiligt. Vitamin B12-Mangel führt zu Anämien (perniziöse Anämie). Es wird in der Medizin (Leberschutzpräparate) und in Diätetika verwendet; etwa die Hälfte der Jahresproduktion von über 20t (Welt) gelangt in Futtermittel für die Tierhaltung. Die Biosynthese verläuft über 5-Amino-4-oxovaleriansäure (δ-Aminolävulin-säure), einem Kondensationsprodukt aus Succinyl-CoA und Glycin, über ca. 30 Stufen zum 5′Desoxyadenosyl-cobalamin, wobei es stammspezifische Varianten gibt. Die industrielle Herstellung erfolgt fast ausschließlich durch Fermentationsverfahren mit Pseudomonas denitrificans im Satzreaktor (Rohstoffe: Melasse – enthält das wichtige Cosubstrat Glycinbetain, Ammoniumsalze; Zusatz von Cobalt-Salzen und 5,6-Dimethylbenzimidazol als Vorstufe), wobei nach 120 h Ausbeuten von 200 mg/L erreicht werden. Aus dem Produktionsstamm Propionibacterium shermanii, wurden alle 22 an der Biosynthese beteiligten Enzyme kloniert. Moderne Produktionsstämme sind bereits durch metabolic engineering (→318) für die Bildung des Vitamins optimiert. Vitamin C (L-Ascorbinsäure). Ascorbinsäure ist ein „physiologisches Reduktionsmittel“, das als Cofaktor an einigen Enzymreaktionen beteiligt ist, darüber hinaus aber auch für die reduktive Entfernung von Sauerstoffradikalen sorgt. Vitamin-C-Mangel führt zu Haut- und Gefäßschädigungen (Skorbut). Vitamin C kommt als Vitaminpräparat in den Handel, wird aber auch zahlreichen Nahrungsmitteln als Vitamin und Antioxidans zugesetzt. Die Jahresproduktion liegt über 100 000 t (Welt) und hat sich weitgehend nach China verlagert. Die Synthese erfolgt aus D-Glucose, die in einem ersten Schritt chemisch zu D-Sorbit hydriert wird. Beim

Reichstein-Grüssner-Verfahren oxidiert man D-Sorbit mit Gluconobacter oxydans zu LSorbose. Man führt diese subterminale Oxidation kontinuierlich in zwei Stufen mit immobilisierten Zellen durch. Sie erfordert starke Luftzufuhr. Die Ausbeuten sind nach etwa 24 h nahezu quantitativ. Beim 2-KGS-Verfahren wird L-Sorbose mit Ketogulonicigenium vulgare in hohen Raum-Zeit-Ausbeuten zur 2-Oxo-L-gulonsäure (2-KGS) oxidiert, die leicht zu LAscorbinsäure lactonisiert. Für diesen Prozess ist aus unbekannten Gründen eine KoKultivierung von Bacillus megaterium oder eine Kombination mit der Sorbit-Oxidation durch G. oxydans erforderlich. Die Klonierung der an allen Umsetzungen beteiligten Enzyme und ihre funktionelle Expression in einem geeigneten Wirts-Organismus dürfte der nächste Schritt sein. Beim Genentech-Verfahren gelang bereits 1983 die einstufige Umwandlung von D-Glucose zu 2-Oxo-L-gulonsäure in Erwinia herbicola, die industrielle Nutzung scheiterte aber an der zu geringen Glucose-Toleranz des rekombinanten Stamms.

Nucleoside und Nucleotide Allgemeines. Vor etwa 100 Jahren wurden in Japan 5′-Nucleotide als geschmacksgebende Komponente in Pilzen, getrocknetem Fisch, Seetang und anderen Würzstoffen erkannt. Ein Zusatz geringster Mengen (0,0005–0,001 %) zu Suppen und Saucen, besonders in Verbindung mit Na-Glutamat (→126), verbessert deren Geschmack und schaltet unerwünschte Geschmacksrichtungen aus, z. B. den metallischen Geschmack von Konserven. Inosin-5′monophoshat, Guanosin-5′-monophoshat und Xanthin-5′-monophoshat (IMP, GMP und XMP) zeigen die stärkste Wirkung, während Adenosin-5′-monophosphat, die 2′- und 3′-Isomeren, 5′Desoxyribonucleotide und Nucleoside nicht geschmacksverstärkend wirken. Seit etwa 1960 werden 5′-IMP und 5′-GMP im industriellen Maßstab in Mengen von > 10 000 t/a (2014) vor allem in Asien hergestellt. Herstellverfahren. Die beiden wichtigsten Herstellverfahren sind die enzymatische Hydrolyse von RNA und direkte Fermentationsverfahren mit Blockmutanten. Enzymatische Hydrolyse von RNA. Hefen weisen das günstigste RNA/DNA-Verhältnis auf und werden deshalb bevorzugt zur Gewinnung von RNA eingesetzt. So bildet Candida utilis (→14) in Medien mit niedrigem C/N-Verhältnis (Melasse, Zellstoffabfälle) in der frühen exponenziellen Wachstumsphase etwa 10–15 % RNA im Trockengewicht, deren Anteil durch Zusatz von Zn2+ und Phosphat weiter erhöht werden kann. Die aerobe Fermentation wird meist kontinuierlich im Airlift-Bioreaktor (→96) durchgeführt. Nach Abtrennung der Zellmasse erfolgt die Extraktion der RNA mit heißer, alkalischer Kochsalzlösung (5–20 % NaCl, 100 °C, 8 h). Die weitere Reinigung erfolgt durch Umfällung mit HCl oder Ethanol. Zur enzymatischen Hydrolyse werden Nuclease P1-Präparate aus Penicillium citrinum oder Streptomyces aureus eingesetzt, aus denen unspezifische 5′-Nucleosidasen und Phosphatasen zuvor entfernt wurden. Die Isolierung von 5′-IMP und 5′-GMP erfolgt durch Adsorption an Aktivkohle, Ionenaustauschchromatographie und fraktionierte Fällung mit Methanol. Fermentation von 5′-IMP. Das klassische Verfahren ist die Bildung von Inosin durch Bacillus sp. und andere Gram-positive Organismen. Inosin wird ins Medium ausgeschieden und kann bei pH 11 ausgefällt werden. Adeninauxotrophe Mutanten mit genetisch verbesserter Transportleistung führen in optimierten Fermentationen zu Ausbeuten von 35 g/L. Umkristallisiertes Inosin wird anschließend chemisch mittels PCl3 in 5′-IMP überführt.

Bevorzugte Verfahren führen aber heute direkt zu 5′-IMP. So werden Blockmutanten von Corynebacterium ammoniagenes nicht mehr durch Anwesenheit anderer Nucleoside reprimiert, bauen 5′-IMP nicht ab, sind unempfindlich gegen den Mn2+-Gehalt des Mediums und ihre Plasmamembran zeigt nach Permeabilisierung eine hohe Ausscheidungsaktivität für 5′IMP. Bei einem neueren Verfahren wird C. ammoniagenes mit permeabilisierten Zellen von E. coli co-kultiviert, die mittels überexprimiertem Inosinkinase-Gen 5′-IMP aus Inosin und ATP bilden. C. ammoniagenes liefert dazu Inosin und regeneriert ATP aus ADP und billigem Phosphat. Ein weiteres japanisches Verfahren nutzt rekombinante E. coli-Zellen, in die eine Phosphatase/Phosphotransferase aus Escherichia blattae einkloniert wurde. Mittels protein engineering (→198) wirkt dieses Enzym vorwiegend als Phosphotransferase und ermöglicht die Phosphorylierung von Inosin mit Phosphat-Salzen in sehr hohen Ausbeuten. Fermentation von 5′-GMP. Der bevorzugte Weg ist die Bildung von 5-Amino-4imidazolcarboxamid-1-ribosid-5′-phosphat (AICAR) mit Purin-auxotrophen Stämmen von Bacillus megaterium und dessen chemische Umwandlung in 5′-GMP. Mit im Abbau von 5′GMP blockierten und Xanthin-monophosphat-reichen Stämmen von Bacillus und anderen erfolgt die Bildung von 5′-GMP aus intermediärem 5′-XMP. Die Ausbeuten liegen um 40 g/L. Andere Nucleotide. Nucleotide wie ATP, cAMP, NAD+/NADH, NADP+/NADPH, FAD, Coenzym A und Nucleotidzucker sind wichtige Biochemikalien, die auch für spezielle Biotransformationen Bedeutung erlangt haben. Sie werden entweder durch Fermentationsverfahren mit Blockmutanten oder mit Enzymen aus chemischen Vorstufen hergestellt. Beispielsweise lassen sich sowohl NAD+ wie Coenzym A durch Mutanten von Brevibacterium ammoniaenes in Ausbeuten von etwa 2 g/L in einem Fermentationsverfahren gewinnen.

Industrieprodukte Bio-Ethanol Allgemeines. Ethanol ist ein wichtiges Lösemittel und ein bedeutender Ausgangsstoff zur Synthese chemischer Verbindungen (z. B. für Ethen und Polyethylen). In vielen Ländern wird der Energieträger auch Benzin als Treibstoff beigemischt („Bioalkohol“), mit den „Flex-FuelMotoren“ in beliebigen Mischungsverhältnissen. 2012 wurden etwa 85 Mrd. l (2014) (~ 67 Mio. t) Bio-Ethanol hergestellt, davon 77 % in Nord- und Südamerika. Etwa 95 % der Weltproduktion erfolgt biotechnologisch aus Glucose oder Saccharose mittels anaerob wachsender Hefen und Bakterien. Die Herstellung ist derzeit (2014) nur bei sehr niedrigen Preisen für die C-Quelle (→328) oder staatlich regulierten Energie-Preisen wettbewerbsfähig zur Petrochemie und erfolgt in Brasilien aus Saccharose (Zuckerrohr-Melasse), in den USA aus Glucose (verzuckerte Maisstärke) (→178). Da Mais auch zur menschlichen Ernährung und als Tierfutter dient (Konflikt „Teller oder Tank“), wird die Herstellung von Ethanol aus Biomasse (Stroh, Bagasse, Sorghum usw.) (→182) in Bioraffinerien (→330) intensiv bearbeitet. Organismen und Biosynthese. Der klassische Organismus der alkoholischen Gärung ist die Backhefe Saccharomyces cerevisiae (→14). Sie bildet durch Glykolyse aus 1 Mol D-Glucose 2 Mol Ethanol, ebenso wie Zymomonas mobilis, ein aus Agavensaft isoliertes Bakterium, das dazu aber den Ketodesoxyphosphogluconat-Weg (KDPG-Weg) benutzt. Saccharose wird verwertet, Stärke aber nicht, da beide Organismen nicht über Stärke-abbauende Enzyme verfügen. Als C-Quelle verwendete Stärke muss deshalb zuvor enzymatisch verzuckert werden. Fermentation und Aufarbeitung. Die Herstellung von Ethanol erfolgt meist diskontinuierlich in großvolumigen Bioreaktoren (→96) von bis zu 500 m3. Der Organismus der Wahl ist Saccharomyces cerevisiae, der bei der üblichen aseptischen Prozessführung weniger empfindlich gegen Lactobacillus-Infektionen ist als Zymomonas mobilis. Zur Kultivierung wird eine mit weiteren Nährstoffen angereicherte Zuckerlösung als Vorkultur beimpft. Nach 14–20 h ist die maximale Alkohol-Bildung erreicht. Sie liegt bei 90 % des theoretisch möglichen Maximalwerts. Zuckerkonzentrationen > 0,1 % Glucose führen zur Hemmung des Prozesses durch Katabolit-Repression, was durch Zulaufverfahren („fed-batch“) (→92) verhindert werden kann. Der Hemmung des Hefewachstums durch höhere AlkoholKonzentrationen begegnet man durch kontinuierliche Entfernung des Ethanol (≥ 8 Vol.-% nach 72 h) mittels azeotroper Destillation, die zu einem 95 %igen Produkt führt, der als Treibstoff geeignet ist. Absolutes Ethanol kann daraus durch extraktive Destillation, MolekularsiebTechniken oder Membrantrennverfahren (Pervaporation) gewonnen werden. Zellrückführung verkürzt die Fermentationszeit; im Melle-Boinot-Prozess dient die abzentrifugierte Hefe als Vorkultur für den nächsten Bioreaktor. Die kontinuierliche Herstellung von Ethanol im Bioreaktor oder mit immobilisierten Hefen im Zellreaktor (→102) ist möglich, stellt aber

erhöhte technologische Anforderungen. Wirtschaftliche Gesichtspunkte. Weltweit sind > 700 Großanlagen zur fermentativen Herstellung von Ethanol in Betrieb. In Brasiliens Proalcool-Programm (> 100 Anlagen) produziert man zur Drosselung der Erdölimporte seit 1975 Ethanol als Treibstoff aus Zuckerrohr-Melasse (2012: ca. 21 Mrd. L) mit einfacher Technologie (Batch-Verfahren, Destillation). In den USA ist seit 1975 Benzin mit 10 % Ethanol (Gasohol) erhältlich, das durch Hefe-Gärung aus verzuckerter Maisstärke hergestellt wird (2012: ca. 50 Mrd. L). Die verwendete Technologie ist anspruchsvoller (Zulauf-Verfahren, Pervaporation). In beiden Ländern werden die Fermentationsrückstände als Futtermittel verwertet. Ethanol aus Biomasse. Zur Gewinnung des Fermentationsrohstoffs Glucose aus Biomasse (→182, 328) muss diese physikalisch (z. B. thermisch), chemisch (z. B. mit Phosphorsäure, Ammoniak) und enzymatisch (mit Cellulasen und Hemicellulasen) aufgeschlossen werden. Dabei entstehen neben Glucose auch Pentosen (Xylose, Arabinose) (→182), die von Backhefe nicht verwertet werden können, und Hemmstoffe wie Furfural. Entwicklungsschwerpunkte sind deshalb effiziente und preiswerte Aufschlussverfahren, preiswerte und Hemmstoff-resistente rekombinante Cellulasen und Hemicellulasen, z. B. aus Trichoderma reesei, und robuste rekombinante Hefe- oder Bakterienstämme (S. cerevisiae, Kluyveromyces marxianus, Pichia stipitis, Z. mobilis, E. coli) die neben Glucose auch Pentosen als C-Quelle verwerten können.

Butanol Allgemeines. 1-Butanol (Weltproduktion 2011: ca. 3 Mio. t) ist ein wichtiges Lösemittel für Autolacke, ein Chemie-Grundstoff für Veresterungen (Butylcellulose) und ein flüssiger Treibstoff. Aceton, das Nebenprodukt der Butanol-Fermentation (Weltproduktion 2010: ca. 6,7 Mio. t) wird ebenfalls als Lösemittel eingesetzt. Die Synthese beider Verbindungen erfolgt heute in den westlichen Industrieländern aus petrochemischen Rohstoffen. Bis etwa 1950, und heute wieder in China, wird 1-Butanol dagegen vorwiegend fermentativ aus Melasse oder Stärke mit Hilfe anaerober Bakterien der Gattung Clostridium hergestellt. Aufgrund molekulargenetischer Stamm-Verbesserungen und prozesstechnischer Optimierung ist dieses Verfahren als Reserve-Technologie wieder attraktiv geworden. Organismen und Biosynthese. Unter den wenigen Aceton- und 1-Butanol-bildenden anaeroben Bakterien ist die Gattung Clostridium am wichtigsten. Bei der Fermentation wird ein Wechsel von der Säure-Bildung („Acidogenese“) zur Alkohol-Bildung beobachtet, der am Ende der Wachstumsphase einsetzt und mit einem Absinken des pH-Wertes unter 5,0 verbunden ist. Die Produktzusammensetzung variiert bei verschiedenen Spezies. Am besten untersucht ist Clostridium acetobutylicum, das die höchste Produktivität und Toleranz gegenüber diesen zelltoxischen Stoffwechselprodukten aufweist. Es bildet aus 100 g D-Glucose bis zu 38 g Aceton und Butanol im Verhältnis 1:3, daneben noch Ethanol („ABE-Fermentation“). Viele

Clostridien bilden Amylasen, Amyloglucosidasen und andere extrazelluläre Depolymerasen. Zur Fermentation können deshalb billige C-Quellen (→328) wie Stärke eingesetzt werden. Bearbeitet wird auch die Verwendung von Lignocellulose aus Biomasse. Die an der Biosynthese der Lösemittel beteiligten Enzyme sind gut untersucht und liegen alle kloniert vor. Pyruvat entsteht aus Glucose durch Glykolyse. Es wird durch Pyruvat-FerredoxinOxidoreduktase oxidativ zu Acetyl-CoA decarboxyliert, das unter Verwendung der bei der Glykolyse entstehenden Reduktionsäquivalente (vor allem NADH) weiter in C2-, C3- oder C4Stoffwechselprodukte umgewandelt wird. Eine Hydrogenase überträgt ferner einen Teil der Elektronen auf Protonen unter Bildung von Wasserstoff. Die Regulation dieser Enzyme ist Gegenstand intensiver Untersuchungen mit dem Ziel, Einfluss auf die Zusammensetzung des Produktgemischs zu nehmen (metabolic engineering). Das Genom von C. acetobutylicum wurde vollständig sequenziert. Der Organismus ist deshalb für molekulargenetische Arbeiten gut zugänglich; es stehen Schaukelvektoren für Escherichia coli und Bacillus subtilis sowie spezifische Phagen und Transposons zur Verfügung. Durch Transformation von Produktionsstämmen, die Aceton in den Aromastoff Acetoin umwandeln, konnte die ButanolBildung auf Kosten der Bildung von Aceton auf 15 % (w/v) gesteigert werden. Fermentation und Aufarbeitung. Mehr als 40 Jahre lang wurde die fermentative Herstellung von Aceton und 1-Butanol mit C. acetobutylicum im technischen Maßstab in Satzfermentern von > 100 m3 durchgeführt. Dabei gingen die Substratkosten mit ca. 60 %, die Energiekosten für die Produktisolierung durch Destillation mit ca. 12 % in die Herstellkosten ein. Entscheidende Parameter für ein wirtschaftliches Verfahren sind Rohstoffausnutzung (kg Lösemittel kg–1 Zucker) und Produktivität (g Lösemittel L–1 h–1). Moderne Verfahrensentwicklungen zielen auf Zweistufen-Verfahren mit Zellrückführung bzw. BiofilmReaktoren sowie verbesserte Produktisolierung durch Pervaporation. Wirtschaftliche Gesichtspunkte. Der mehr als 40 Jahre lang vor allem in den USA und Südafrika durchgeführte Batch-Prozess mit Maisstärke oder Melasse als C-Quelle ist aufgrund der Konkurrenz zu petrochemischen Verfahren derzeit nicht wettbewerbsfähig. Nur in China sind größere Anlagen bis zu 200 m3 in Betrieb, die etwa 30 000 t 1-Butanol produzieren und derzeit ausgebaut werden. Als C-Quelle dient Maisstärke, als Organismus der durch metabolic engineering (→318) optimierte Stamm Clostridium acetobutylicum EA2018 (insbesondere Deletion des Gens adc für Acetoacetyl-Decarboxylase). Die Ausbeuten liegen bei 14 g L–1, die Produktzusammensetzung bei 2:7:1 (ABE). Kleinere Versuchsanlagen in den USA (Cobalt Technologies) werden in kontinuierlicher Kultur von C. acetobutylicum mit Glucose aus aufgeschlossener Biomasse betrieben. Hohe Ausbeuten wurden auch für Stämme von E. coli berichtet, die man durch metabolic engineering (→318) verändert hatte.

Höhere Alkohole und Alkene Allgemeines. Mit steigenden Erdölpreisen ist es attraktiver geworden, auch andere Alkohole als Ethanol (→138) und 1-Butanol (→140) industriell aus nachwachsenden Rohstoffen (Zucker, Glycerin) herzustellen. Dabei kommen chemische und biotechnologische Methoden zum Einsatz, letztere häufig unter Einsatz der synthetischen Biologie (→320). Höhere Alkohole sind häufig Bausteine für chemische Produktfamilien und für Biopolymere, z. B. für „BioPolyethylen“. Zahlreiche Herstellmethoden für „Bio-Alkohole“ und abgeleitete Alkene befinden sich noch im Entwicklungsstadium. Größere Produktionskapazitäten gibt es bereits für 1,3-Propandiol, iso-Butanol und Butan-2,3-diol. 1,3-Propandiol (1,3-PDO) ist ein Baustein für die Herstellung von thermoplastischen Polyestern (→154). DuPont führte 2007 unter dem Markennamen Sorona® einen aus 1,3-PDO und Terephtalsäure bestehendes Polymer für die Textil- und Teppich-Herstellung ein. Die industrielle Herstellung von 1,3-PDO war ein Meilenstein der Biotechnologie, weil erstmals die Entwicklung eines E. coli-Industriestamms gelang, der einen künstlichen Stoffwechselweg aus Genen von E. coli, S. cerevisiae und Klebsiella pneumoniae stabil exprimiert; die Ausbeuten an 1,3-PDO liegen deutlich über 150 g/L. Entscheidend für die Konstruktion eines Produktionsstamms waren folgende Maßnahmen: 1. Veränderung der Metabolit-Flüsse an der Triosephosphat-Isomerase-Zweigstelle der Glykolyse durch Deletion der Glycerokinase (glpK) und Glycerol-Dehydrogenase (gldA), 2. Eliminierung des Glucose-Transportsystems über Phosphotransferase (PTS) und 3. Herunterregulierung der Glyceraldehyd-3-phosphatDehydrogenase (gap). 2-Methyl-1-Propanol (i-Butanol) ist ein Lösemittel, das chemisch z. B. durch

Hydrocarbonylierung von Propen hergestellt wird. Seine Folgeprodukte kommen in der LackIndustrie zum Einsatz. Es kann auch als Zusatz zu Treibstoffen verwendet werden. Ein bevorzugter fermentativer Weg beruht auf Hefestämmen mit modifiziertem Stoffwechsel. Isobutanol ist auch ein Rohstoff für die Herstellung von p-Xylen, einem „grünen“ Ersatzstoff für die Terephtalsäure in PET Biopolymeren (→154). „Bio-Terephtalsäure“ konkurriert mit 2,5-Furandicarbonsäure (FDC), die chemisch aus D-Glucose hergestellt werden und ebenfalls als Dicarbonsäure-Baustein für die Herstellung von PEF-Polyestern (Polyethylen-FuranPolyester) verwendet werden kann. 2,3-Butandiol (2,3-BDO) ist ein chirales Ausgangsprodukt für chemische Synthesen und ein interessanter Ausgangsstoff für die Herstellung von cis-1,3-Butadien, einem Baustein von synthetischem Kautschuk. Butadien kann z. B. aus nachwachsenden Rohstoffen durch Dimerisierung von Bio-Ethanol bei hoher Temperatur („Lebedev-Prozess“) oder durch oxidative Dehydrogenierung von Buten-1-en oder Buten-2-en (aus 1- bzw. i-Butanol) erhalten werden. 2,3-BDO ist ein Stoffwechsel-Endprodukt bei der gemischten Säuregärung vieler anaerober und fakultativ anaerober Mikroorganismen. Für die industrielle Herstellung sind Stämme der Gattung Enterobacter bzw. Klebsiella besonders gut geeignet. Mit geeigneten Medien und streng kontrollierter Sauerstoff-Zufuhr konnten Ausbeuten von über 150 g/L in 38 Std erreicht werden. Auch an der Verwertung von Xylose (Hemicellulosen aus Biomasse) wird gearbeitet. Noch nicht vollständig gelöst ist die Bildung weiterer Endprodukte wie Ethanol und Milchsäure, die abgetrennt werden müssen. Isopren, der monomere Baustein von Kautschuk, ist eine leicht flüchtige Verbindung (Sdp. 34 °C) und wird in Pflanzen meist über den Mevalonsäure-Weg, seltener, und auch in manchen Bakterien, über Methylerythritol-phosphat gebildet. Der im Kautschukbaum (Hevea brasliensis) gebildete Naturkautschuk besteht vor allem aus cis-1,4-Polyisopren, für dessen regio- und stereoselektive chemische Synthese besondere Katalysatoren erforderlich sind. Genencor und Dupont haben in E. coli einen synthetischen Stoffwechselweg (→320) eingefügt (Expression einer pflanzlicher Isopren-Synthase, Überproduktion der Vorstufe 3,3Dimethylallyl-Pyrophosphat, DMAPP) und daraus ein industrielles Verfahren zur Herstellung von Isopren aus Glucose entwickelt. Flüchtiges Isopren wird dabei mit der Abluft aus dem Bioreaktor transportiert und fällt nach Kondensation in hoher Reinheit an. Ajinomoto arbeitet mit dem japanischen Reifenhersteller Bridgestone an einem ähnlichen Verfahren, ebenso Michelin mit Amyris (USA) und Bio-XCell, Malaysia, mit GlycosBio (USA).

Essigsäure

Allgemeines. Die Verwendung von Essig zur Erfrischung und zur Säuerung und Konservierung von Nahrungsmitteln geht bis in die Antike zurück. Auch in Asien verwendet man Essig als Würze und zur Konservierung. Traditionell wurde Essig mit handwerklichen Rezepten meist aus Wein gewonnen. Ein bekanntes Beispiel ist Modenas Balsamico-Essig. Im frühindustriellen Frankreich (18. Jahrhundert) stellte man erstmals Essig nach einem „FesselVerfahren“ her, wobei verdünnter Wein über mit Essigsäurebakterien kontaminierten Reisig rieselte. Louis Pasteur erkannte 1856 die Bedeutung der Essigsäurebakterien für die EssigBildung. 1868 gelang es ihm, selektive Wachstumsbedingungen auszuarbeiten und damit die Voraussetzungen für eine technologische Herstellung von Weinessig zu schaffen (ca. 6 % Essigsäure). Speiseessig oder Spritessig enthält dagegen nur 5 % Essigsäure; man gewinnt ihn durch Fermentation von rektifiziertem Ethanol. Die Weltproduktion liegt bei einigen Mrd. L. In den USA wird aus Biomasse hergestelltes Calcium-Magnesium-Acetat (Schmp. –7,7 °C) als Ersatz für Streusalz bei der Enteisung propagiert („Cryotech CMA™“). Es ist weniger korrosiv als Streusalz. Die wichtige Industrie-Chemikalie „Eisessig“ (99,7 %ig, pKa beträgt 5,6), stellt man dagegen ausschließlich durch Oxidation von Ethylen oder Carbonylierung von Methanol her. Organismen und Biosynthese. Nur wenige Spezies der Bakteriengattungen Gluconobacter und Acetobacter sind in der Lage, Ethanol durch „subterminale Oxidation“ zu Essigsäure zu oxidieren. Die Taxonomie der Gattungen ist wegen des bei Kultivierung schnell wechselnden Phänotyps kompliziert und erfolgt meist durch Analyse der 16S-RNA, neuerdings auch durch Analyse des Plasmid-Profils. Essigsäurebakterien sind äußerst empfindlich gegen Sauerstoffarme Lebensbedingungen. Die Oxidation von Ethanol erfolgt durch die sequentielle Reaktion von membranständiger Alkohol-Dehydrogenase (ADH) und Aldehyd-Dehydrogenase (ALDH). Sowohl ADH wie ALDH von Acetobacter enthalten als prosthetische Gruppe Pyrrolochinolinchinon (PQQ), ADH daneben noch Häm C, und übertragen die bei der Oxidation freigesetzten Elektronen mittels Ubichinon auf eine membranständige terminale Oxidase. Sie bauen Zucker sowohl über die Glykolyse wie über den Entner-Doudoroff-Weg zu Pyruvat und weiter über den Citronensäure-Cyclus ab. Die Abhängigkeit der AcetobacterStämme von einer guten Sauerstoff-Versorgung (→94) zeigt sich daran, dass bereits eine Unterbrechung von Minuten zu einer nachhaltigen Abnahme der Ethanol-Oxidation führt. Steht kein Ethanol zur Verfügung, wird Essigsäure zu CO2 oxidiert. Fermentation und Aufarbeitung. Zur Inbetriebnahme der Anlage zieht man eine Starterkultur (→114) von Acetobacter sp. mit Maische (Wein oder Alkohol, ca. 1 % Essigsäure, Nährstoffe) in einem Pilotfermenter an. Nach beginnender Säurebildung fährt man im repeated fed-batch (→92): wenn die Alkohol-Konzentration auf etwa 0,2 % abgefallen ist (AlkoholSensor!), zieht man etwa 50 % der Fermenterlösung ab und gibt frische Maische zu. Der hohe Sauerstoffbedarf von Acetobacter sp. macht ein spezielles Rührwerk erforderlich („FringsBelüfter“: selbstansaugendes Rotor/Stator-System), mit dem intensiv und feinblasig belüftet wird (0,1 vvm, d. h. 1/10 Volumen Luft pro Fermentervolumen min–1). Während der schnell einsetzenden Säurebildung entsteht Wärme, die man durch Kühlwasser abführt. Die mittlere Produktivität eines 100 m3-Fermenters liegt bei diesem Verfahren bei 1,6 g/L · h. Den Rohessig zieht man durch Membranverfahren ab, pasteurisiert und verdünnt mit Wasser zu

Speiseessig. Bei Verwendung spezieller Starterkulturen und Steuerelemente erhält man etwa 17,5 %igen, bei zweistufigen Verfahren sogar für die Konserven-Industrie benötigten > 20 %igen Speiseessig. Der „Frings-Acetator“ (Fa. Frings, Bonn) ist ein für die EssigsäureHerstellung ausgelegter Bioreaktor. Andere Verfahrensvarianten, z. B. die Verwendung immobilisierter Essigsäurebakterien in einem Airlift-Bioreaktor (→96), weisen eine z. T. höhere Produktivität auf (bis zu > 100 g/L · h), konnten sich aber industriell nicht durchsetzen. Die Herstellung von Speisesessig erfolgt durch langsame Fermentation ausgesuchter Moste über Wochen oder Monate. Neben Traubenmost werden regional auch andere Moste wie Datteln, Kokosnuß-Wasser oder Fruchtweine verwendet. Das gewünschte Aroma kommt durch die Reifung zustande, die Jahre dauern kann. Häufig bleiben die Essigsäurebakterien als Schleim im Produkt.

Citronensäure Allgemeines. Citronensäure wurde 1822 von Carl W. Scheele aus Zitronensaft isoliert und in ihrer Konstitution aufgeklärt. Viele Früchte bilden große Mengen an Citronensäure. Hans Krebs fand 1934, dass Citronensäure ein zentraler Metabolit des aeroben Stoffwechsels ist (Citronensäure-Cyclus, →26): im Stoffwechsel eines erwachsenen Menschen werden täglich 1,5 kg Citronensäure als Intermediärprodukt gebildet. Citronensäure ist eine starke dreibasische Säure. Die pKa-Werte der drei Dissoziationsstufen betragen 3,13, 4,78 und 6,43 (25 °C), eine 1 %-ige Citronensäure-Lösung weist einen pH-Wert von 2,2 auf. Mit einer Hydroxy- und drei Carboxy-Gruppen ist Citronensäure ein ausgezeichneter Komplexbildner für zwei- und dreiwertige Kationen. Sie wird ausschließlich durch Fermentation hergestellt. Über 2/3 der Jahresproduktion von 2 Mill. t (2012) erfolgen in China, der Marktwert liegt bei 1,8 Mrd. US-$. Citronensäure dient als Säuerungs- und Konservierungsmittel von Lebensmitteln, als Komplexbildner bei der Metallbearbeitung, zur Entfernung der Wasserhärte in Waschmitteln und als Therapeutikum bei Schwermetallvergiftungen in der Notfallmedizin. Organismen und Biosynthese. Einige Schimmelpilze, z. B. Aspergillus niger (→16), scheiden in und nach der späten logarithmischen Wachstumsphase bei hoher Glucose- und Sauerstoff-Zufuhr große Mengen an Citronensäure aus. Obwohl viele Zwischenprodukte aus dem Citronensäure-Cyclus in den Stoffwechsel abfließen, ist die Überproduktion von Citronensäure in A. niger aus zwei Gründen möglich: einmal bildet Pyruvat-Carboxylase, die bei A. niger im Cytoplasma lokalisiert ist, durch Addition von CO2 an Pyruvat Oxalessigsäure und füllt damit den Citronensäure-Cyclus aus der Glykolyse auf („anaplerotische Reaktion“). Zum anderen wird Citronensäure aus ihrem Bildungsort, den Mitochondrien, ins Cytoplasma und aus der Zelle ausgeschleust, weil eine Malat-Dehydrogenase im Cytoplasma aus Oxalessigsäure Äpfelsäure bildet, die durch einen Antiporter in der Mitochondrien-Membran gegen Citronensäure ausgetauscht wird. Der geschwindigkeitsbestimmende Schritt für die Citronensäure-Biosynthese ist die Aufnahme von Glucose mit anschließender Phosphorylierung. Technische Herstellung aus Zuckern. Zur industriellen Herstellung von Citronensäure wird ausschließlich A. niger verwendet. Bei der vereinzelt noch immer durchgeführten Feststoff-

Fermentation (→86) beschickt man Blechwannen aus säureresistentem Material mit Zuckerlösung, beimpft mit Sporen von A. niger und belüftet mit bis zu 10 vvm, vor allem zur Wärmeabfuhr in der Wachstums- und Produktionsphase. Nach 5 Tagen hat sich ein dichtes Pilzmycel gebildet, in dem die Säurebildung erfolgt (Gesamtprozess ca. 8 Tage). Nach Abtrennen des Mycels und Extraktion mit heißem Wasser reinigt man die Citronensäure durch Umfällung. Die Ausbeuten betragen etwa 50 g/kg Zucker. Industriell wird Citronensäure in sterilen, belüfteten Rühroder Turmfermentern (→96) von 100–500 m3 aus Edelstahl (Erntelösung: pH 2,0!) mit A. niger hergestellt. Als preiswerte C-Quelle (→88) nutzt man Stärkehydrolysat oder billige Saccharose-Quellen. Mn2+-arme Medien (< 2 μg/L) führen zu hohen Citrat-Ausbeuten; das Mycel formt dabei kleine feste Pellets mit einem Durchmesser < 0,5 mm aus – ein lockeres Mycel führt dagegen zu reduzierter Citrat-Produktion. Die Bildung der Zellmasse ist bei pH 5 nach 48 Stunden abgeschlossen. Abfall des pH-Wertes auf < 2,5, ggf. Zugabe von Zucker im Zulaufverfahren und Erhöhung der Belüftung führen zur Bildung von Citronensäure, die ins Nährmedium ausgeschieden wird. Die Ausbeuten liegen bei ca. 150 g/L und > 80 % Citronensäure bezogen auf eingesetzte Glucose. Zur Isolierung des Produkts filtrierte man das Mycel ab, fällte in der Lösung Citronensäure mit Ca(OH)2 und brachte CaCitrat mit Schwefelsäure wieder in Lösung. Behandlung des Rohprodukts mit Aktivkohle und Ionenaustauschern ermöglicht die Kristallisation sehr reiner Citronensäure. Bei diesem Herstellungsprozess fielen > 1 t Gips/t Citronensäure an, was erhebliche Entsorgungskosten verursachte (→108). Man bevorzugt heute deshalb die Extraktion der Fermenterlösung mit einer Mischung aus Alkanen und 1-Octanol nach Komplexierung der Citronensäure mit Trilaurylamin. Lösemittel und Reagenzien werden zurückgewonnen. Die Herstellung von Citronensäure aus hochsiedenden Erdöl-Fraktionen mit Alkanhefen wurde bis zum PilotMaßstab intensiv ausgearbeitet, ist aber bei den aktuellen Rohölpreisen wirtschaftlich nicht wettbewerbsfähig.

Milchsäure, 3-Hydroxy-Propionsäure Allgemeines. 2013 wurden etwa 300 000 t Milchsäure (→116) hergestellt, meist durch Fermentation. Aufgrund ihres angenehm säuerlichen Geschmacks und ihrer konservierenden Eigenschaften wird sie seit langem Lebensmitteln und Getränken zugesetzt. Ein weniger reines technisches Produkt verwendet man in der Leder- und Textil-Industrie. Seit einigen Jahren nimmt die Erzeugung von L- und D-Milchsäure vor allem zu, weil sie zu biologisch abbaubarem Polylactid (→154) – einer Polyesterfaser – verarbeitet wird (NatureWorks™). 3Hydroxypropionsäure (3-HP) ist eine nicht in der Natur vorkommende Hydroxysäure, die durch metabolic engineering (→318) mit E. coli-Stämmen industriell hergestellt werden kann. Wie Milchsäure ist sie ein attraktiver Baustein für Polymere, aber auch eine Vorstufe für Acrylsäure, deren Polymere für die Herstellung von Windeln, Anstrich- und Beschichtungsmitteln, Textilien usw. eingesetzt werden. Milchsäure: Organismen und Biosynthese. Zur technischen Produktion von Milchsäure werden Lactobacillus-Arten eingesetzt. Die Auswahl des Stamms richtet sich nach der

verfügbaren C-Quelle. Für eine vollständige Umwandlung des Substrats zu L-Milchsäure verwendet man homofermentative Milchsäure-Vergärer (→116), die D-Glucose durch Glykolyse zu 2 Moläquivalenten abbauen. D-Milchsäure erhält man beispielsweise mit Sporolactobacillus laevolacticus. Mit Hilfe des metabolic engineering (→318) kann auch mit Pilzen (Aspergillus niger) und Backhefe eine Überproduktion von Milchsäure erfolgen, die Raum-Zeit-Ausbeuten sind aber derzeit noch geringer als bei den Lactobacillus-basierten Verfahren. Fermentation und Aufarbeitung. Die fermentative Herstellung von Milchsäure steht in Konkurrenz zur chemischen Synthese (Wasseranlagerung an Acrylsäure oder HCNAnlagerung an Acetaldehyd). Für verschiedene C-Quellen (→88) werden unterschiedliche Organismen bevorzugt, so für Dextrose und Zuckerlösungen Lactobacillus delbrueckii oder L. leichmannii, für Molke L. bulgaricus. Das Fermentationsmedium enthält neben 12–18 % Zucker eine N-Quelle, Phosphat und Vitamine der B-Gruppe. Milchsäurebakterien sind nur bis etwa pH 4.5 gäraktiv, sodass bei konstanten pH-Werten zwischen 5,5 und 6,0 gearbeitet wird. Nach Fermentation bei 45–50 °C unter luftarmen Bedingungen in Gegenwart von CaCO3 als Säurebinder erfolgt, abhängig von der Substratkonzentration, nach 2–6 Tagen die Aufarbeitung. Nach Abtrennung der Zellmasse wird Ca-Lactat entweder durch Zugabe von H2SO4 in Milchsäure überführt, die man durch Ionenaustauscher weiter aufreinigt. Alternativ reinigt man über Veresterung mit Methanol und destilliert Milchsäuremethylester ab. Im Versuchsstadium sind Reinigungsverfahren über Lösemittelextraktion, Flüssigmembranen oder direkter Einsatz von Ionenaustauschern ohne vorherige Säurefällung des Ca-Salzes. 3-Hydroxypropionsäure. Für die Synthese dieser in der Natur nicht vorkommenden Verbindung aus Fermentationsrohstoffen wie Glucose oder Glycerin wurden mehrere Stoffwechselwege künstlich konstruiert (→320). Ein bevorzugter Weg aus Glucose in rekombinanten E. coli-Stämmen führt vom Pyruvat über L-Alanin zum β-Alanin, das in zwei Enzymschritten durch Transaminierung der β-Aminogruppe zum Malonsäure-Semialdehyd und dessen Reduktion zur 3-Hydroxypropion-säure führt. Dieser Weg ist insofern bemerkenswert, als eine Alanin-2,3-Aminomutase für die Umwandlung von L- in β-Alanin bisher nicht beschrieben wurde. Dieses Enzym wurde deshalb mittels protein engineering (→198) durch Mutagenese aus Lysin-2,3-Aminomutase evolviert. Die industrielle Optimierung dieses E. coli-basierten Verfahrens hat mittlerweile die Stufe von Pilot-Anlagen erreicht (2014). Als Verfahrens-Alternativen werden untersucht: die Verwendung von Glycerin als C-Quelle, ebenfalls in E. coli, über das Zwischenprodukt 3-Hydroxypropionaldehyd (einklonierte Glycerin-Dehydratase aus Klebsiella pneumonia) und α-KetoglutarsemialdehydDehydrogenase aus Azospirillum brasilense. Bei diesem Weg wird Vitamin B12 als Medienbestandteil benötigt; da K. pneumonia Vitamin B12 bildet, versucht man auch, den Zusatz dieses teuren Hilfsstoffs dadurch zu umgehen, dass K. pneumonia als Wirtsorganismus dient. Die Ausbeuten liegen allerdings noch im Bereich von 40 g/l. Die Herstellung von 3-HP ist ein Beispiel für eine „synthetische Biologie“ (→320), die sich von vorgegebenen Stoffwechselwegen löst.

Gluconsäure und andere „grüne“ Zucker-Bausteine Allgemeines. Gluconsäure wird schon seit langem fermentativ durch Selektiv-Oxidation von D-Glucose hergestellt. In die Reihe der Zuckersäuren als Bausteine für Biopolymere gehört auch ein synthetisches Folgeprodukt von D-Glucose, 2,5-Furan-Dicarbonsäure. Weitere chemisch aus Glucose oder Sorbit hergestellte Produkte wie Lävulinsäure-Ketalester, Glucarsäure oder Isosorbid werden als Wertstoffe von Bioraffinerien (→330) diskutiert. Gluconsäure. Na-D-Gluconat, D-Gluconsäure und das damit im Gleichgewicht befindliche δLacton werden in Mengen von etwa 70 000 t hergestellt. Das δ-Lacton findet in der Lebensmittel-Industrie als mildes Säuerungsmittel Verwendung. Ca2+- und Fe2+-Gluconate dienen aufgrund ihrer geringen Toxizität und hervorragenden Löslichkeit als Infusionspräparate bei entsprechenden Mangelkrankheiten. Etwa 50 % der Gluconsäure wird als Na-Salz bei der Flaschenreinigung, der alkalischen Entrostung, als Lockerungsmittel bei der Zementbearbeitung und zur Verhinderung von Eisen-Niederschlägen bei der Textilbehandlung eingesetzt. Ausschlaggebend ist hierbei die hervorragende Komplexbildung mit Ca2+- und Fe2+ in Gegenwart von Alkali. D-Gluconsäure weist einen pKa-Wert von 3,7 auf. D-Gluconsäure ist wie die Essigsäure Endprodukt einer subterminalen Oxidation, in diesem Fall von D-Glucose. Einige Pilzstämme (Aspergillus niger, Penicillium-Arten) (→16), aber auch Essigsäurebakterien der Gattung Gluconobacter, transformieren Glucose zu Gluconsäure. Im Fall der Pilze geschieht dies durch das Flavoenzym Glucose-Oxidase, das in der pilzlichen Zellwand lokalisiert und bei Fermentationen auch im Nährmedium zu finden ist. GlucoseOxidase ist ein Schlüsselenzym für Biosensoren zur Messung von Blutzucker. GluconobacterStämme verwenden dagegen eine membranständige D-Glucose-Dehydrogenase, die wie die Alkohol- und Aldehyd-Dehydrogenasen der Essigsäurebakterien über den Cofaktor Pyrrolochinolinchinon (PQQ) verfügen. D-Gluconsäure wird aus D-Glucose hergestellt, wobei

man entweder elektrochemische Verfahren oder einen Fermentationsprozess mit Aspergillus niger in Großfermentern verwendet. Der Pilz bildet bei pH-Werten > 3 zellwandständige Glucose-Oxidase, die D-Glucose zu D-Gluconsäure-5-lacton oxidiert. Das Lacton hydrolysiert sowohl spontan wie Enzym-katalysiert (Lactonase) zu D-Gluconsäure. Natrium- oder CalciumGluconat erhält man nach Anzucht von Zellmasse bei pH 4,5–6,5 (eingestellt mit Na2CO3/NaOH bzw. CaCO3) durch Zugabe von 11–25 % Glucose unter starker Belüftung. Aus der gefilterten Fermenterlösung gewinnt man das Salz durch Einkonzentrieren und Trocknen. Die freie Säure und das Lacton erhält man daraus durch Ionenaustauschchromatographie. 2,5-Furandicarbonsäure (FDC) wird aus D-Glucose durch Dehydratisierung zu Alkoxymethyl-Furfural und anschließende Oxidation mit Luftsauerstoff hergestellt. FDC ist potenziell ein Ersatz für die petrochemisch gewonnnene Terephtalsäure und kann unter Verwendung von Bio-Ethylenglykol (aus Bioethanol) zu Polyethylen-Furandicarbonsäure (PEF) polykondensiert werden, einem vollständig aus nachwachsenden Rohstoffen hergestellten und biologisch abbaubaren Biopolymer (→154). Die sogenannte Y-X-Y-(„iksy“)Technologie wird von Fa. Avantium in den Niederlanden vorangetrieben. Sie ist für die Herstellung von Kunststoff-Flaschen, Fasern und Folien geeignet und wird beispielsweise von Coca-Cola und Danone unterstützt. Isosorbid ist ein Material, das durch zwei Dehydratisierungsschritte chemisch aus D-Sorbit gewonnen wird. Wegen seiner stark hygroskopischen Eigenschaften findet es bereits als Feuchthaltemittel und Diuretikum Verwendung. Isosorbid-Polycarbonat (Durabio™) hat ähnliche Eigenschaften wie petrochemisch erzeugte Polycarbonate. Glucarsäure („Zuckersäure“) lässt sich durch selektive chemische Oxidation von Glucose gewinnen. Die Dicarbonsäure enthält vier chirale Zentren und erlaubt die Herstellung zahlreiche chiraler Folgeprodukte. Sie wird beispielsweise in der Kosmetik zum schonenden Peeling der Haut eingesetzt. Levulinsäure-Derivate stellt man her durch Erhitzen von Glucose in verdünnten Säuren in Gegenwart von Alkoholen, beispielsweise Glycerin oder Methanol. Sie können petrochemische Verbindungen ersetzen; Anwendungsbeispiele sind Weichmacher, Lösungsmittel, Polyurethan-Bausteine und Agrochemikalien wie δ-Aminolevulinsäure.

Dicarbonsäuren Dicarbonsäuren sind industriell wichtige Bausteine für Polyester (→154), Polyamide (→156) und andere Industrieprodukte. Die meisten Dicarbonsäuren werden petrochemisch durch Oxidation von Alkanen oder Cycloalkanen hergestellt. Eine Ausnahme ist die Sebacinsäure (Octan-1,8-Dicarbonsäure); man erhält sie durch alkalische Spaltung von Ricinolsäure (9Z, 12R)-12-Hydroxy-9-octadecensäure), einem Baustein des RicinusÖls. Einige Dicarbonsäuren lassen sich durch Fermentation herstellen. Das Arbeitsgebiet wird stimuliert durch einen erhöhten Bedarf an unterschiedlichen Dicarbonsäure, z. B. für die Synthese von Biopolymeren. Bernsteinsäure ist ein Zwischenprodukt des Zitronensäure- und des Harnstoffzyklus (Argininosuccinat). Sie ist lebensmittelrechtlich als Säuerungsmittel zugelassen, aber auch eine wichtige Plattform-Chemikalie: aus ihr lassen sich Polyester, Polyamide, Polyfurane und viele andere Biopolymere herstellen. Als petrochemische Vorstufe dienen C-4-Verbindungen wie z.

B. Fumarsäure. Industriell wird Bernsteinsäure aus Mutanten der Backhefe, von E. coli, mit dem Gram-negativen Pansen-Bakterium Basfia succinoprodugenes oder anderen Stämmen gewonnen. Für die Herstellung mit E. coli nutzt man eine Mutante, bei der die Bildung unerwünschter Nebenprodukte wie Essigsäure, Formiat und Milchsäure durch Deletion der Gene für Pyruvat-Formiat-Lyase und Lactat-Dehydro-genase unterbunden ist. Durch Einbau eines Pyruvat-Carboxylase-Gens aus Rhizobium etli wird ferner der Tricarbonsäure-Zyklus anaplerotisch aufgefüllt. Der industriell verwendete Backhefe-Stamm produziert Bernsteinsäure bei niedrigeren pH-Werten als E. coli, was die pH-Korrektur bei der Fermentation erleichtert und zu geringeren Salzlasten bei der Aufarbeitung führt. Mittels Deletion der Gene sdh3 (koppelt in Hefe Bernsteinsäure mit der Bildung von Biomasse) und von ser3/ser33 (zweigen 3-Phosphoglycerat in den Serin-Stoffwechsel ab) und weiteren Verbesserungen gelang hier eine 30fache Erhöhung der Succinat-Ausbeute. Itaconsäure ist ein Nebenprodukt des Zitronensäurezyklus, das bei der Fermentation von Zucker durch verschiedene Aspergillus-Arten (→16) gebildet wird, z. B. von Aspergillus terreus. Die Biosynthese verläuft über Citronensäure, die zu cis-Aconitsäure dehydratisiert wird. Decarboxylierung führt zur Itaconsäure. Die Herstellung folgt den Methoden der Citronensäure-Produktion. Die Ausbeuten liegen bei 80 g/L. Die Aufarbeitung erfolgt durch Kristallisation einer konzentrierten Itaconsäure-Lösung bei 15 °C. Itaconsäure ist chemisch verwandt mit der Methacrylsäure, enthält aber eine funktionelle Gruppe mehr und eignet sich als Baustein für die Synthese von Polyacrylaten, Harzen und Tensiden. 2009 wurden 50 000 t Itaconsäure hergestellt. Höhere Dicarbonsäuren. Viele Hefen der Gattung Yarrowia, z. B. Yarrowia lipolytica oder Candida (→14), z. B. Candida tropicalis, wachsen auf Alkanen als einziger C-Quelle. Dabei wird das Alkan diterminal oder subterminal mit Monooxygenasen hydroxyliert, zur Carbonsäure weiteroxidiert und danach über β-Oxidation zu Schlüsselverbindungen des Stoffwechsels wie Acetyl-CoA abgebaut. Auch Fettsäuren können durch monoterminale Oxidation in Dicarbonsäuren überführt und durch β-Oxidation weiter verstoffwechselt werden. Durch Blockierung der β-Oxidation ist es gelungen, Hefe-Mutanten zu entwickeln, die Alkane oder Fettsäuren in Hydroxycarbonsäuren oder diterminale Dicarbonsäuren überführen. Fettsäuren als Ausgangsstoff erlauben so einen auf nachwachsenden Rohstoffen beruhenden Prozess, haben allerdings den Nachteil, dass Fettsäuren unterhalb einer Kettenlänge von C-12 (Laurinsäure) nicht in industriellen Mengen zur Verfügung stehen, sodass sich die fermentative Herstellung von Dicarbonsäuren auf diesem Weg auf die Kettenlängen C-12 bis C-18 beschränkt. Für Polyamid-Fasern werden kürzerkettige Dicarbonsäuren benötigt, z. B. Adipinsäure, eine natürlich nur selten vorkommende Dicarbonsäure, die man chemisch durch Oxidation von Cyclohexen oder Cyclohexenon herstellt. Hexandicarbonsäure ist ein wichtiger Baustein von Nylon 66 (Polyester aus Adipinsäure und Hexamethylendiamin). Mittels metabolic engineering (→318) gelang es, Hefen zu entwickeln, die aus Alkanen, Fettsäuren oder Glucose Adipinsäure bilden (Verdezyne, USA). Dabei ist, neben zahlreichen Deletionen, im Fettsäureabbau-Komplex des Wirtsorganismus eine Acyl-CoA-Synthase durch eine Hexanoat-CoA-Synthase aus Aspergillus parasiticus ersetzt.

Biopolymere: Polyester Allgemeines. Eine große Gruppe von Kunststoffen wird aus petrochemisch erzeugten Säuren und Alkoholen über Ester-Bindungen aufgebaut: die Polyester. Beispiele sind die PolyethylenTerephtalate (PET), aus denen man z. B. Folien und Kunststoff-Flaschen herstellt, und die Polycarbonate (PC), die beispielsweise als Trägermaterial für CDs oder für Flugzeugfenster verwendet werden. Biopolymere („Bio-Kunststoffe“) eröffnen einen neuen Weg zur nachhaltigen Erzeugung derartiger Materialien aus nachwachsenden Rohstoffen. Manche Biopolymere sind auch besser biologisch abbaubar als ihre synthetischen Homologen, da für ihre Herstellung chirale Bausteine verwendet werden. Beispiele für Bio-Polyester sind vor allem Polylactate (PLA), Polyhydroxy-Alkanoate (PHA) und „Bio-PET“-Produkte. Auch an Bio-Polycarbonaten aus Isosorbid (→150) wird gearbeitet. Die Herstellkosten für Biopolymere sind meist noch höher als für Polyester aus petrochemischen Rohstoffen (2014), und bei den anwendungstechnischen Eigenschaften gibt es ebenfalls noch Entwicklungsbedarf. Preisgünstiger und deshalb im Markt bereits erfolgreich sind Naturstoff-Derivate wie z. B. „thermoplastische Stärke“ (mit Weichmachern wie Sorbit und Glycerin behandelte Stärke). Polylactide (PLA) werden bereits seit vielen Jahren im industriellen Maßstab aus LMilchsäure (→148) hergestellt (NatureWorks™). Das Fermentationsprodukt L-Milchsäure wird dabei meist als Dimer gewonnen und über eine Ringöffnungspolymerisation mit MetallKatalyse zu PLA verarbeitet. Nach Vermischen mit Zuschlagstoffen erfolgt die Verarbeitung für die gewünschten Anwendungen, z. B. als Mulch-Folien, Verpackungsmaterial oder CateringArtikel. Für Anwendungen in der Automobil-Industrie und beim Gerätebau werden teilweise andere Materialeigenschaften gefordert (höherer Schmelzpunkt, bessere Schlagfestigkeit usw.), die sich durch Copolymerisation von 1:1-Mischungen von L- und D-Lactid erzielen lassen („stereo-complex“ sc-PLA, Smp. ca. 230 °C). Verbesserte technische Verfahren zur Herstellung von D-Milchsäure wurden für diese Anwendung bereits ausgearbeitet. Polyhydroxyalkanoate (PHA). Viele Mikroorganismen, z. B. Ralstonia eutropha, reichern

unter geeigneten Bedingungen Poly-(-R)3-hydroxybuttersäure) (PHA) in Mengen von bis zu 90 % der Zelltrockenmasse an. Die Zusammensetzung des Polymers kann Stamm-spezifisch durch Zugabe von Vorstufen moduliert werden. Das PHA-Operon besteht aus nur 3 Genen und wurde in Escherichia coli, Pseudomonas putida und in andere Mikroorganismen und Pflanzen transformiert. Technisch interessant sind auch Copolymere von (R)-3-Hydroxybuttersäure und (R)-3-Hydroxyvaleriansäure (Biopol®), die Polypropylenähnliche Eigenschaften aufweisen, aber aus nachwachsenden Rohstoffen gewonnen werden und biologisch abbaubar sind. Sie werden in kleinen Mengen für Spezialanwendungen in der Medizin produziert. Ein weiteres kommerzielles Produkt ist Aonilex®, ein Copolymer aus (R)-3-Hydroxybuttersäure und (R)-3Hydroxyhexansäure (PHBH). Das Biopolymer erreicht, je nach Compoundierung, Schmelzpunkte bis zu 160 °C und hat günstige anwendungstechnische Eigenschaften. Als CQuelle (→328) für die fermentative Herstellung durch Cupriavidus necator, ein Gramnegatives Bakterium, dient Pflanzenöl, die Rohstoff-Verwertung ist sehr hoch und die Ausbeuten an Polymer betragen > 1 kg/kg Zellmaterial. Das intrazellulär gebildete Polymer lässt sich durch Extraktion, durch enzymatischen Aufschluss oder, einfacher, durch Trocknung der Zellen und Pelletierung gewinnen. „Bio-PET“ ist ein Copolymer aus biotechnologisch hergestelltem Diol mit Terephthalsäure (→142). Ein Copolymer aus Terephtalsäure und biotechnologisch erzeugtem 1,3-Propandiol wurde bereits als Sorona® für die Herstellung von Textilfasern und Teppichen in den Markt eingeführt. Ein Copolymer aus Terephtalsäure und Ethylenglykol (aus Bio-Ethanol) wird für die Herstellung der „green bottle“ von Coca-Cola eingesetzt. In beiden Fällen kommt die Terephtalsäure aber noch aus der petrochemischen Produktion, sodass der „Bio“-Anteil des Copolymers nur bei etwa 30 % liegt. Mittlerweile gibt es aber sowohl Entwicklungen, um Terephtalsäure durch Dimerisierung von biotechnologisch hergestelltem i-Butanol aus nachwachsenden Rohstoffen herzustellen, wie Möglichkeiten zum Ersatz von Terephtalsäure durch 2,5-Furandicarbonsäure (FDC) (→150), die sich durch Dehydratisierung und anschließende Oxidation von Glucose synthetisieren lässt.

Biopolymere: Polyamide Allgemeines. Peptide, Proteine und Enzyme sind Polyamide. Das Polyamid Seide wird im Orient seit Jahrtausenden als Textilmaterial verwendet. Biotechnologisches Potential als Spezialmaterialien haben Polyamide, die den Fangfäden von Spinnenfäden, den Adhäsionsproteinen von Seepocken oder den Komposit-Materialien von Perlmutt nachgebildet sind („molekulare Bionik“). Aus petrochemisch erzeugten Polyamide stellt man thermoplastische Kunstfasern her, z. B. Nylon oder Perlon, aber auch Werkstoffe wie Seile, Dübel und Isolationsteile. Auch für die Herstellung von Polyamid-Kunstfasern gibt es biotechnologische Alternativen wie das „Bio-Nylon“, die allerdings noch zu teuer für einen breiten Einsatz sind. Seide besteht aus der Strukturkomponente Fibroin, die sich aus sich wiederholenden Einheiten von Hexapeptiden und spacern zusammensetzt. Der hohe Anteil von Glycin und die Ausbildung zahlreicher Wasserstoff-Brücken führt zu einer dichten und sehr stabilen Packung von βFaltblättern (→28). Fibroin wird von der Raupe des Seidenspinners Bombyx mori erzeugt und zusammen mit dem Hilfsprotein Sericin sekretiert. Die hohe Sekretionsleistung dieses Organismus wurde bereits für die Herstellung transgener Proteine wie Erythropoietin, Ferritin oder Spinnenseide genutzt, eine technische Nutzung dieser Verfahrensweise wird vor allem in Japan intensiv vorangetrieben.

Spidroine sind variantenreiche Polyamide aus den Spinndrüsen von Spinnen (z. B. von Nephila claviceps). Ihr technisches Potential ist groß, denn die Fangfäden einer Spinne können sich um > 30 % dehnen, bevor sie reißen. So hat man versuchsweise schusssichere Westen mit diesem Material ausgerüstet („Bio Steel™“). Wie Seiden-Fibroin sind auch die SpinnenFibroine aus replizierenden Polypeptid-Einheiten aufgebaut und können mit Hilfe synthetischer, repetitiver Gen-Kassetten in E. coli, Pichia pastoris oder in der Milch transgener Tiere exprimiert werden. Die Ausbeuten an rekombinanten Fibroinen und Spidroin liegen allerdings erst in der Größenordnung von einigen g/L Kulturlösung. Die größte Herausforderung für die Herstellung verspinnbarer Fasern ist eine technische Simulation der Spinndrüse; sie wurde mittlerweile industriell realisiert (AMSilk, Spiber). Adhäsionsprotein. Muscheln (Mytilus edulis) haften mit Hilfe eines unter Wasser härtenden Polyamids an Krebsen oder Schiffskörpern an und werden auf diese Weise über weite Strecken transportiert. Das Vorläufer-Protein dieses natürlichen Klebstoffs ist ca. 130 kDa groß und besteht hauptsächlich aus polaren Aminosäuren. Tyrosin- und Prolin-Reste werden bei der Sekretion posttranslational zu 3- oder 4-Hydroxy-l-Prolin bzw. zu o-Hydroxytyrosin (DOPA) hydroxyliert. An Luft erfolgt dann die Bildung des Dichinons, das die Polymerisation der Peptidketten einleitet. Mit synthetischen Genabschnitten gelang es, ein 25 kDa großes Vorläuferprotein des Polyamids in guten Ausbeuten in E. coli zu exprimieren. E. coli ist allerdings nicht zur posttranslationalen Oxidation des Proteins imstande. Man isolierte deshalb das Vorläuferprotein und setzte zum Zeitpunkt der Verwendung das Enzym Tyrosinase zu, das Tyrosin zu DOPA hydroxyliert und dadurch die Quervernetzung einleitet. Das Produkt wird als medizinischer Klebstoff und als Zahnfüllungsmasse untersucht. „Bio-Nylon“. Petrochemisch erzeugtes Nylon ist meist ein Polymer aus zwei C-6 Bausteinen: Adipinsäure und Hexamethylendiamin (Nylon 6,6). Pentamethylendiamin kann günstig durch Decarboxylierung von L-Lysin (→128) erzeugt und mit Adipinsäure zu Nylon 5,6 polykondensiert werden, das ähnliche Eigenschaften wie Nylon 6,6 aufweist. Adipinsäure wird petrochemisch aus Cyclohexen oder Cyclohexanol erzeugt, es gibt aber bereits biotechnologische Verfahren auf der Basis von Glucose oder Fettsäuren (→152). Ein „grünes“ Nylon 5,6 ist also technisch möglich, aber derzeit noch zu teuer. Längerkettige Dicarbonsäuren wie Sebacinsäure (C-12) (aus Ricinolsäure (Rhizinusöl) durch alkalischen Abbau erzeugt) oder Dodecan-Dicarbonsäure (durch terminale Oxidation von Laurinsäure) (→152) stehen bereits kommerziell zur Verfügung, sodass auch Nylon 5,10 oder 5,12 sowie andere Polyamide aus biologischen Bausteinen prinzipiell zugänglich sind. Der höhere Preis dieser Produkte wird derzeit allerdings noch nicht durch anwendungstechnische Vorteile ausgeglichen, sodass diese Prozesse noch im Versuchsstadium sind.

Polysaccharide Allgemeines. Pflanzliche und marine Polysaccharide (Stärke, Cellulose, Gummi arabicum, Guar, Pektine, Alginate (→18), Agar usw.) und daraus abgeleitete halbsynthetische Derivate haben große Bedeutung in der Technik, vor allem zur Eindickung und Stabilisierung von Nahrungsmitteln und als Flutpolymere bei der tertiären Erdölgewinnung. Sie werden industriell hergestellt. Extrazelluläre mikrobielle Polysaccharide weisen zwar ebenfalls ein großes Produktspektrum auf, konnten sich wegen ihrer höheren Produktionskosten aber bisher

nur in speziellen Anwendungsbereichen durchsetzen. Die wichtigsten Produkte sind Xanthan, Dextran und mikrobielle Cellulose. Hyaluronsäure ist Bestandteil der extrazellulären Matrix von Wirbeltieren und wird in Medizin und Kosmetik genutzt. Xanthan ist ein aus Bausteinen von 5 Hexose-Resten aufgebautes saures Heteropolysaccharid mit einer Molmasse zwischen 2 und 12 · 106 Da. Die Anzahl der Pyruvat-Reste bestimmt die Viskosität des Polymers. Es wird von dem pflanzenpathogenen Mikroorganismus Xanthomonas campestris gebildet. Da es pseudoplastische Eigenschaften aufweist (bei Scherbelastung nimmt die Viskosität einer Xanthan-Lösung ab), ist es leicht zu verarbeiten und eignet sich deshalb hervorragend zur Verdickung technisch prozessierter Lebensmittel (z. B. von Salatsaucen). Wegen seiner Unempfindlichkeit gegenüber Elektrolyten wird es bei der Erdölförderung zum Polymerfluten salzhaltiger Formationen verwendet. Die Herstellung erfolgt im Batch-Verfahren (C-Quelle: Glucose; N-Quelle: Pepton, Ammoniumnitrat, Harnstoff). Durch Einklonierung von Genen aus Escherichia coli, die für die Enzyme βGalactosidase (lacZ) und Lactosepermease (lacY) codieren, gelang die Herstellung von Stämmen, die Xanthan aus dem Abfallstoff Molke bilden können. Sie haben aber noch keine industrielle Bedeutung. Die Bildung von Xanthan gibt sich durch eine starke Erhöhung der Viskosität auf bis zu 10 000 cP zu erkennen. Um einen guten Sauerstoff-Übergang in diesem hochviskosen Medium zu erzielen, kommt der Konfigurierung der Rührer besondere Bedeutung zu. Die Isolierung erfolgt meist durch Ausfällung mit 2-Propanol. Die Produktion beträgt über 100 000 t/a (2013). Dextran. Dextrane sind wichtige Blutplasma-Ersatzstoffe. Sie werden auch in der Lebensmittelindustrie eingesetzt und aufgrund ihrer definierten Porengrößen nativ oder nach chemischer Derivatisierung zur Protein-Reinigung (→106) verwendet. Die nur aus Glucose aufgebauten Glucane, bei denen die α-1,6-glykosidische Bindung überwiegt, haben eine Molmasse von ca. 5 · 107 Da. Sie werden von verschiedenen Bakterien als extrazelluläre Matrix gebildet. Ein Beispiel ist die Dextranbildung durch Streptococcus mutans in der Mundhöhle des Menschen, die zu Plaques an den Zähnen führt. Zur technischen Herstellung von Dextranen verwendet man Leuconostoc mesenteroides, der während der Produktionsphase aus Saccharose innerhalb von 24 h etwa 200 g/L Dextran bildet. Das durch Ethanol-Fällung gewonnene Rohdextran wird mit Säure anhydrolysiert und mit Ethanol fraktioniert gefällt. Dextran mit einer Molmasse um 75 000 Da wird als Plasma-Expander, mit einer Molmasse um 40 000 Da als Antithrombolytikum bei Operationen verwendet. Andere mikrobielle Polysaccharide. Pseudomonas aeruginosa und Azotobacter vinelandii bilden mikrobielle Alginate (→18), deren Zusammensetzung marinen Alginaten ähnelt. Gluconoacetobacter xylinus und andere Bakterien wandeln C-Quellen in bis zu 50 Gewichts% Cellulose um, die zu Folien von hoher Elastizität und Reinheit verarbeitet werden können. Diese werden in der Wundbehandlung, Hauttransplantation und als Diaphragma in hochwertigen Kopfhörern eingesetzt. Das von manchen Basidiomyceten gebildete Scleroglucan besteht aus Bausteinen von β-1,3-verknüpften Glucose-Ketten und einer lateral β-1,6verknüpften Glucose-Einheit. Es weist ebenso wie Gellan aus Auromonas elodea pseudoplastische Eigenschaften auf und wird in kleinen Mengen in Lebensmitteln und beim Polymerfluten verwendet. Das von verschiedenen Bakterien gebildete Pullulan ist ein α-1,4-

verzweigtes Glucan mit etwa 10 % α-1,6-glykosidischen Bindungen. Es kann zu Folien verarbeitet werden, die Sauerstoff-undurchlässig sind und sich deshalb zum Schutz oxidationslabiler Lebensmittel oder anderer Materialien eignen. Die hohen Herstellkosten der genannten Produkte verhindern aber bisher einen technischen Einsatz in größerem Umfang.

Biotenside Einige Mikroorganismen bilden in Gegenwart von Alkanen, teilweise auch auf Pflanzenölen Verbindungen, die unter der Bezeichnung „Biotenside“ zusammengefasst werden. Im Vergleich zu synthetischen Tensiden, die in Mengen von einigen Mio. t hergestellt werden, konnten sich die teureren Biotenside bisher nur bei wenigen Anwendungen, z. B. als kosmetische Wirkstoffe, durchsetzen. Aufgrund ihrer guten biologischen Wirksamkeit und Abbaubarkeit werden Böden und Wässer untersucht. Vorkommen. Biotenside werden von zahlreichen pro- und eukaryontischen Mikroorganismen in Gegenwart von Alkanen oder Pflanzenölen gebildet. Zu den am besten untersuchten Biotensiden gehören die Zuckerester Rhamnose-Lipid, Trehalose-Lipid, Mannosyl-ErythritolLipide, das Lipopeptid Surfactin und das Heteropolysaccharid Emulsan. Unter den von Hefen gebildeten Biotensiden wurde das Sophorose-Lipid besonders gut untersucht. Es handelt sich dabei um ein Gemisch eines sauren Glykolipids und seines Lactons, das von der Hefe Starmerella bombicola in Gegenwart von Triglyceriden in Ausbeuten > 400 g/L gebildet wird. Das Gencluster für die Bildung dieses Biotensids wurde kloniert. Es enthält 5 Gene: eine P450-Monooxygenase zur Bildung der Hydroxy-Fettsäure, zwei Glucosyl-Transferasen, eine Acetyltransferase und einen Transporter. Die Aufarbeitung der Fermentationslösung erfolgt vorteilhaft über Umnetzverfahren. Die Tendenz des Produktgemischs zur Micell-Bildung, eine Kenngröße für Tenside (CMC = kritische Micell-Konzentration), liegt in der Größenordnung synthetischer nichtionischer Detergentien. Auch der Pilz Pseudozyma hubeiensis SY62 bildet in Gegenwart von Triglyceriden große Mengen von acetyliertem Mannosyl-Erythritol-Lipiden (MEL-B). Sein Genom wurde sequenziert. In Gegenwart von Alkanen oder Triglyceriden bilden der Brandpilz Ustilago maydis Cellobiose-Lipide. Unter den Bakterien bildet Rhodococcus erythropolis Trehalose-Tetraester und einige Pseudomonaden Rhamnolipide. In einigen Fällen wird die Fettsäure-Zusammensetzung des Glykolipid-Gemischs dabei durch die Kettenlänge der angebotenen Alkane oder Triglyceride beeinflusst. Versuche zum Einsatz mikrobieller Biotenside bei der tertiären Erdölförderung (microbial enhanced oil recovery, MEOR) und bei der Reinigung verschmutzter Wattböden mit einer Biotensid-Produktion vor Ort ergaben günstige Resultate. Mit einer Fermentationslösung aus Pseudomonas aeruginosa MM1011, die 120 mg/L Rhamnose-Lipide enthielt, wurden in einem Laborversuch 27 % des in

Sand absorbierten Rohöls entfernt. Dieser Stamm synthetisierte Rhamnose-Lipide mit Sonnenblumenöl als einziger C-Quelle. Emulsan ist ein polyanionisches Heteropolysaccharid (Lipopolysaccharid), das bei der Fermentation von Acinetobacter calcoaceticus in Gegenwart von Triglyceriden gebildet wird und durch Lösemittelextraktion isoliert werden kann. Es wirkt als Öl-in-Wasser-Emulgator und reduziert die Viskosität von Öl durch Bindung an die O/WGrenzfläche. Man setzte es versuchsweise zum verbesserten Transport von Öl in Pipelines und zur Reinigung von Tankerschiffen ein. Bacillus subtilis bildet nach Induktion mit hydrophoben Verbindungen Surfactin, ein acyliertes Heptapeptid, das zwar eine hohe CMC aufweist, wegen seiner hämatotoxischen Eigenschaften aber nicht eingesetzt wird. Die Ausbeuten in einem optimierten Fermentationsverfahren betrugen 110 mg/L. Mit keinem der bakteriellen Biotenside werden jedoch die hohen Ausbeuten des Sophorolipids und des MEL-Lipids erreicht. Industrielle Produkte. Derzeit (2014) werden zwei Biotenside industriell hergestellt: Sophorose-Lipid aus Starmerella bombicola durch Ecover (Belgien), und MEL-B aus Pseudozyma hubeiensis durch Toyobo in Japan. Ecover verwendet Sophorose-Lipid in Wasch- und Reinigungsmitteln und weist auf die hervorragende Ökobilanz des nichtionischen Tensids hin. Allerdings steht mit den Alkylpolyglucosiden (APG) ein strukturell ähnliches Tensid aus der Umsetzung von Glucose mit Fettalkoholen zur Verfügung, das aus Naturstoffen durch chemische Synthese hergestellt wird und bei vergleichbar vorteilhafter Ökobilanz (→330) billiger produzierbar ist. MEL-B von Toyobo wird bei Fa. Kanebo, Japan, als Naturstoff in Hautpflegemitteln eingesetzt. Es weist ähnliche Eigenschaften auf wie das Wachs Ceramid, ein natürliches Hautfeuchtemittel. Dieser feuchtigkeitsregulierende Effekt wurde auch in Hautmodellen nachgewiesen.

Fettsäuren und Ester Fette und Öle. Fette und Öle werden in einer Menge von ca. 190 Millionen t (2012) aus Schlachttierabfällen und Ölpflanzen isoliert. Sie dienen vorwiegend zur Herstellung von Lebens- und Futtermitteln; ein kleiner Anteil wird industriell zur Synthese industrieller Produkte wie Tenside oder Emulgatoren genutzt („Oleochemie“). Fette und Öle dienen Tieren und Pflanzen als Energiespeicher und bestehen aus Triglyceriden, die aus wenigen Typen von Fettsäuren aufgebaut sind (Kettenlängen vorwiegend C-12 bis C-20, gesättigt oder 1–3 Doppelbindungen). Fischöle enthalten längere und höher ungesättigte Fettsäuren (DHA und EPA), die begehrte Nahrungsmittelzusatzstoffe sind (→34). Biotechnologisch können Triglyceride synthetisiert, hydrolysiert oder umgeestert werden. Die Enzyme der Wahl sind dabei Lipasen. Einige Hefen, Pilzen und Algen speichern hohe Mengen an Triglyceriden, die direkt oder nach enzymatischer Modifikation als Energieträger („Biodiesel“) oder als Nahrungsmittelzusatz verwendet werden. Biodiesel. Als „Biodiesel“ bezeichnet man Fettsäure-Methyl- oder Ethylester, die durch Umesterung von Triglyceriden mit Methanol oder Ethanol entstehen. Sie können als Zusatz zu herkömmlichem Diesel verwendet werden. Anstelle von NaOH/Methanol bei der chemischen Umesterung setzt man auch Enzyme ein, beispielsweise Lipase aus Yarrowia lipolytica. Die enzymatische Spaltung ist vorteilhaft bei der Aufarbeitung von Küchenöl-Abfällen (Frittieröl).

Biodiesel wird auch als Flugtreibstoff (Kerosin-Ersatz) untersucht. Kakaobutter wird aus der Kakaobohne gewonnen, einer tropischen Frucht. Zur Herstellung zerreibt man geröstete Kakaobohnen und separiert hydraulisch oder durch leichtes Erwärmen etwa gleiche Mengen von Kakaobutter und Kakaopulver. Kakaobutter besteht aus einem Gemisch von Triglyceriden (Fettsäuren: vor allem Palmitin-, Stearin- und Ölsäure) und schmilzt bei etwa 37 °C, der Körpertemperatur des Menschen. Sie lässt sich deshalb zu feiner Schokolade verarbeiten, die schnell auf der Zunge zergeht, sowie zu Suppositorien-Massen für rektale Wirkstoff-Applikationen. Anstelle des Naturstoffs kann Kakaobutter auch durch enzymatische Umesterung von Palmöl (Fettsäuren: hauptsächlich Palmitin- und Ölsäure) mit Stearinsäuremethylester erzeugt werden. Das entstehende Produkt gilt aber nicht als „natürliche Kakaobutter“ und muss als Zusatzstoff deklariert werden. Höherwertige Glyceride durch Enzymkatalyse. Mit Hilfe von regioselektiven Lipasen (1,3spezifisch: beispielsweise Lipase aus Rhizomucor miehei) lässt sich ein vorwiegend 1,3Diglyceride enthaltendes Öl herstellen (ECONA®), das im Körper weniger stark gespeichert wird. BETAPOL® ist ein Triglycerid der annähernden Struktur Glycerol-1,3-oleat-2-palmitat („OPO“), das in dieser Struktur der Zusammensetzung des Fetts der Muttermilch nahe kommt. Es dient deshalb zur Herstellung von Milchpulver für nicht gestillte Babies. Die Herstellung erfolgt durch Lipase-katalysierte Umesterung von Triglyceriden geeigneter Zusammensetzung oder über die Lipase-katalysierte Addition von Ölsäure an 2-Palmitoyl-Monoglycerid. Ein weiteres Beispiel für ein synthetisches Triglycerid ist TONALIN®, das den Einbau von Fettsäuren in das Körperfett durch Lipoprotein-Lipase hemmt und deshalb als Schlankheitsmittel angeboten wird. Die für die Wirkung maßgebliche Fettsäure dieses Triglycerids ist CLA, ein Gemisch aus cis-9-trans-11- und trans-10-cis-12-Linolensäure. Ölspeichernde Mikroorganismen werden seit langem untersucht, beispielsweise zur Erzeugung von Fetten in Krisenzeiten. Mittlerweile liegen mit Hefen (→14) wie Mortierella alpina, Rhodosporidium toruloides, Lipomyces starkey und Algen (→18) wie Botryococcus braunii oder Neochloris oleoabundans Organismen vor, die bis zu 80 % ihrer Feuchtmasse als Triglyceride speichern (meist mehrfach ungesättigte Fettsäuren) und deshalb zur Gewinnung von Nahrungsmittelersatzstoffen oder von Biodiesel untersucht werden. Die Genome vieler dieser Organismen wurden bereits sequenziert, sodass molekulargenetische Eingriffe und metabolic engineering Ansätze möglich sind. Hoch ungesättigte Fettsäuren mit einer (ω-3)-Doppelbindung wie DHA (Docosahexaensäure) oder EPA (Eicosapentaensäure) kommen im Fischöl vor (→34) und gelten als Schutzsubstanzen gegen Atheriosklerose. Um sie durch Biotransformation aus Standard-Fettsäuren zu gewinnen, sind Schritte zur Kettenverlängerung und zur Einführung von Doppelbindungen erforderlich. Die meisten dieser Enzyme wurden mittlerweile kloniert und in ölspeichernden Hefen wie beispielsweise Mortierella alpina funktionell exprimiert, sodass dieser Organismus hohe Konzentrationen von EPA bildete.

Enzymtechnologie Biotransformation Allgemeines. Die Biotransformation ist eine Schlüsselfunktion von Organismen und dient zum Auf- oder Abbau von Metaboliten, aber auch zur Entgiftung toxischer oder in der belebten Natur nicht vorkommender (xenobiotischer) Stoffe. Die Einzelschritte werden von Enzymen katalysiert. In der Biotechnologie versteht man unter Biotransformation meist Biokatalyse, d. h. die Umwandlung natürlicher oder synthetischer Vorstufen in Produkte mit wertvolleren Eigenschaften. Sie kann durch Mikroorganismen, Tier- oder Pflanzenzellen oder deren Organen/Organellen im Bioreaktor (Fermentation), mit isolierten Enzymen oder mit an Trägermaterialien immobilisierten Zellen oder Enzymen erfolgen. Die Verwendung rekombinanter Mikroorganismen bzw. gentechnisch modifizierter Enzyme bei Biotransformationen hat das Anwendungspotential der Biotransformation stark erweitert. Die Terminologie einer biokatalytischen Umsetzung als Fermentation, Biotransformation oder Enzymkatalyse ist fließend. Alle Verfahren können auf einem einzigen oder einer Folge mehrerer enzymatischer Schritte beruhen. Die Verwendung isolierter Enzyme erleichtert die Prozessoptimierung wegen höherer Temperaturtoleranzen, Verzicht auf sterile Bedingungen und schnellerer Diffusion von Edukt und Produkt, ist aber immer dann zu überprüfen, wenn das Enzym nicht leicht zu gewinnen oder nicht ausreichend stabil ist oder wenn die Biotransformation mehr als einige wenige Reaktionsschritte umfasst und teure Cofaktoren benötigt. Mikroorganismen können sowohl zur Herstellung natürlicher Metabolite durch Fermentation (z. B. Glutaminsäure, →126) wie auch zur Umsetzung von nicht in ihrem Stoffwechsel vorkommenden Metaboliten (z. B. Steroid-11β-Hydroxylierung, →252) verwendet werden. Als typische Stoffwechselvorgänge erfolgen diese Umwandlungen fast immer regio- bzw. stereoselektiv. Durch Einklonierung fremder Gene oder ganzer Genkassetten konnte man diese Möglichkeiten dramatisch erweitern (Beispiel: Indigo). Metabolic engineering (→318) und Protein Design (→178), ergänzt durch das Design neuer Stoffwechselwege (→320), haben bereits dazu beigetragen, den Anteil von Biotransformations-Reaktionen in der chemischen Industrie weiter zu steigern. Tierzellen werden technisch in großem Umfang zur Produktion von Biopharmazeutika und Antikörpern, aus Kostengründen jedoch nicht für die Biokatalyse eingesetzt. Untersucht wird z. B. eine künstliche Leber, die Giftstoffe aus dem Blut dialysiert und sie nach Biotransformation in einem Entgiftungskreislauf an Albumin bindet. Pflanzenzellen. Gut untersucht wurden positionsspezifische Hydroxylierungen und Glykosylierungen im Pflanzenzell-Reaktor, beispielsweise die 12-Hydroxylierung von Digitoxin zu Digoxin mit Zellkulturen von Digitalis lanata (→278). Pflanzen-Bioreaktoren werden aber nur bei wenigen Prozessen technisch genutzt, z. B. zur Synthese von Taxol

(Paclitaxel™) mit Zellkulturen von Taxuis brevifolia (→278). Enzymkatalyse. Hierbei stehen Einschrittreaktionen im Vordergrund, die entweder mit isolierten Enzymen in-vitro oder mit einem Zielenzym in einem inaktivierten Mikroorganismus durchgeführt werden können (Beispiel: Glucose-Isomere im Streptomyces-Erzeugerstamm, →180). Die meisten industriellen Beispiele betreffen Enzyme, die keine Cofaktoren benötigen, z. B. positions- oder stereospezifische Hydrolysen oder Ester-Synthesen. Enzymatische Isomerisierungen sowie Additionsreaktionen an Doppelbindungen, Carbonyl-Gruppen oder aktivierte CH-Bindungen haben ebenfalls industrielle Anwendungen gefunden. Rekombinierte Stoffwechselwege. Diese Technologie hat sich industriell schnell durchgesetzt. Ältere Beispiele sind die Herstellung von Ascorbinsäure mit einer Mutante aus Corynebacterium sp. (→134) oder von Indigo mit einer Mutante von Escherichia coli. Dazu wurde die Naphthalin-Dioxygenase des TOLPlasmids (→292) aus Pseudomonas sp. in E. coli einkloniert und durch weitere gentechnische Eingriffe (metabolic engineering, →318) der Stoffwechselfluss des Wirtsstamms in Richtung der Tryptophan- bzw. Indol-Produktion gelenkt. Für die Herstellung beliebiger D- und L-Aminosäuren aus synthetischen Hyndantoinen werden bereits E. coli-Wirtsorganismen mit modular aufgebauten Genkassetten rekombinanter Hydantoinasen (→132) und Carbamoylasen industriell eingesetzt („synthetische Biologie“, →320). Auch bei der Herstellung von Bausteinen für Biopolymere wie 1,3-Propandiol (→142) oder 3-Hydroxypropionsäure (→148) werden synthetisch aufgebaute Stoffwechselwege eingesetzt.

Enzyme in der Technik Allgemeines. Seit etwa 100 Jahren haben sich Enzyme tierischer, pflanzlicher und mikrobieller Herkunft zu bedeutenden technischen und analytischen Hilfsreagenzien entwickelt. Seit etwa 1970 werden immobilisierte Enzyme (→102) zunehmend als Biokatalysatoren für chemische Umsetzungen verwendet (Enzymtransformation, →164). Die Möglichkeit, gentechnisch veränderte Proteine industriell herzustellen und ihre Eigenschaften mittels „Protein Design“(→198) und „gerichteter Evolution“ an die gewünschte Umsetzung anzupassen, hat zu einem weiteren Aufschwung der Enzymtechnologie geführt. Enzymklassifikation. Einer internationalen Vereinbarung folgend, werden Enzyme nach ihrer Funktion in 6 Klassen eingeteilt (→30). Man kennt einige tausend Enzyme unterschiedlicher Funktion, von denen es, Organismen-spezifisch, zahlreiche Varianten gibt. Meist weisen sie Eigenschaften auf, die einen Einsatz in der Technik erschweren. So sind etwa ein Drittel aller bekannten Enzyme mit biologischen Membranen verbunden und in isolierter Form wenig stabil. Viele Oxidoreduktasen, Transferasen, Ligasen und Synthasen benötigen zu ihrer Funktion Cofaktoren wie beispielsweise NADH, ATP oder Coenzym A, die aus Kostengründen eine technische Anwendung des Enzyms erschweren. Hydrolasen und Isomerasen haben diese Nachteile nicht und werden deshalb für technische Prozesse bevorzugt. Bei vielen analytischen oder diagnostischen Aufgabenstellungen rechtfertigt dagegen die große Selektivität von Enzymen die hohen Einsatzkosten, sodass Enzyme aus allen Enzymklassen eingesetzt werden.

Gewinnung. Die Herkunft aus tierischem, pflanzlichem Material oder aus Mikroorganismen, der Verwendungszweck und die Größe des Versuchsansatzes bestimmen die Wahl von Zellaufschluss- und Reinigungsverfahren ebenso wie die Eigenschaften des Enzyms (löslich oder membrangebunden, stabil oder labil). Bei der Isolierung großer Enzymmengen für technische Prozesse (Beispiel: Waschmittel-Proteasen) werden meist extrazellulär sekretierte Enzyme eingesetzt. Zur Aufarbeitung eines derartigen Enzymprodukts kommen einfache Verfahrensschritte (→104) wie Zellabtrennung, Konzentrierung der Enzymlösung durch Ultrafiltration oder Fällung, schonende Trocknung im Sprüh- oder Wirbelschichttrockner und Endkonfektionierung mit Zuschlagstoffen zum Einsatz. Die so erhaltenen Enzympräparate sind oft von geringer Reinheit und enthalten häufig enzymatische Nebenaktivitäten. Bei Enzympräparaten für therapeutische Anwendungen (z. B. TPA (→230), DNAse (→240)) sowie für diagnostische (→254) oder analytische Verfahren, die in der Regel aus dem intrazellulären Stoffwechsel stammen, sind die Ansprüche wesentlich höher; nach Aufschluss der Zellen, der Entfernung der Zellfragmente und nach Konzentrierung der Enzymlösung werden unerwünschte Nebenaktivitäten meist durch eine Folge chromatographischer Schritte (→106) abgereichert oder völlig eliminiert. Die Reinheit des Enzympräparats wird kontrolliert durch a) die Bestimmung der spezifischen Aktivität, b) die Bestimmung von Nebenaktivitäten und c) die Kontrolle der Reinigungsschritte mit elektrophoretischen Methoden. Viele der heute in der Technik und Analytik verwendeten mikrobiellen Enzyme stammen aus Fermentationsverfahren mit rekombinanten Mikroorganismen, die naturgemäß weniger Nebenaktivitäten bilden und deshalb in weniger Aufarbeitungsschritten zu reineren Endprodukten führen. Zulassungsfragen. (→334) Lebensmittel-Zusatzstoffe, die aus Naturstoffen mit Hilfe von Enzymen hergestellt werden, die nicht im Produkt verbleiben, gelten als „natürlich“ und müssen nicht deklariert werden (Beispiel: Isoglucose). Enzyme sind selbst Naturstoffe, müssen aber für den Einssatz in Lebensmitteln und in der Humantherapie zugelassen werden. In Europa geschieht dies für Lebensmittel- und Futtermittelenzyme aufgrund von Dossiers, die detaillierte Angaben über ihre Herstellung, Gesundheits- und Sicherheitsaspekte und ihre Wirksamkeit enthalten. Zuständig ist die European Food Safety Agency (EFSA), die Zulassung erfolgt aber teilweise noch auf nationaler Ebene (z. B. in Frankreich und Dänemark). Dabei spielt eine Rolle, ob sie als Zussatzstoffe oder als Verfahrenshilfsmittel verwendet werden. Gentechnisch hergestellte oder veränderte Enzyme unterliegen speziellen Vorschriften. Technische Enzyme (z. B. für Waschmittel) müssen in Europa als Chemikalien durch die European Chemical Agency im Rahmen des REACH-Programms zugelassen werden. Die internationalen Regelwerke sind noch im Fluss.

Angewandte Enzymkatalyse

Allgemeines. Für chemische Synthesen können Enzyme Vorteile aufweisen, da sie Umsetzungen meist regio- und stereoselektiv katalysieren (→170). Enzymkatalyse kann mit isolierten Enzymen erfolgen oder mit für die Umsetzung optimierten Enzymen in (rekombinanten) Mikroorganismen (s. unter „Biotransformation“, →164). Für Umsetzungen mit isolierten Enzymen bevorzugt man solche, die keinen externen Cofaktor benötigen. Dazu gehören vor allem Hydrolasen, Lyasen, Isomerasen und einige Oxidoreduktasen. Viele Enzyme liegen heute in klonierter Form vor. Sie können einfach in reiner Form ohne Nebenaktivitäten hergestellt und durch Protein Engineering (→198) für industrielle oder andere Anforderungen optimiert werden. Die Beschreibung technischer Anwendungen erfolgt in der Reihenfolge der Enzymklassifikation (→166). Oxidoreduktasen. Die Zahl der klassifizierten Oxidoreduktasen liegt bei 2000 (Stand 2014). Oxidasen besitzen meist fest gebundenes FAD und werden vor allem für analytische Aufgaben eingesetzt. Dehydrogenasen sind für analytische und präparative Zwecke sehr wertvoll, da man sie je nach Gleichgewichtslage zur enantioselektiven Reduktion von Carbonyl-Gruppen oder zur regioselektiven Oxidation von Hydroxy-Gruppen einsetzen kann. Für einen technischen Einsatz ist allerdings die Bereitstellung der teuren Cofaktoren NAD(P)+ oder NAD(P)H oder alternativ eine preiswerte enzymatische Koppelreaktion erforderlich, mit dem der verbrauchte Cofaktor regeneriert wird. Ein Durchbruch gelang erstmals mit dem Enzym-Membranreaktor (→132). Mittlerweile erlaubt die Verbilligung technischer Enzyme durch gentechnische Produktion den Einsatz gekoppelter Enzymsysteme (z. B. Glucose- oder AlkoholDehydrogenasen) zur Cofaktor-Regenerierung (→170). In jüngster Zeit wächst das Interesse an Peroxidasen, Dioxygenasen und P450-Monooxygenasen (→324), die regio- bzw. stereospezifische Hydroxylierungen am Aromaten oder an nicht aktivierten C-H-Bindungen katalysieren. Technisch nutzbare Varianten enthalten meist fest gebundenes FAD, Fe–S-Cluster oder Häm-Gruppen als Cofaktoren. Transferasen. Ihre Zahl liegt bei 1700. Sie werden derzeit nicht für technische Zwecke genutzt. Hydrolasen. Diese Klasse umfasst ~1700 Enzyme, unter denen Proteasen, Lipasen und Esterasen die größte technische Bedeutung haben. Sie haben vielfache Anwendungen in der Technik gefunden. Durch Steuerung der Wasseraktivität im Reaktionsgemisch können sie sowohl zur regio- und enantioselektiven Hydrolyse wie zur Synthese von Estern oder Amiden verwendet werden. So setzt man Thermolysin aus Bacillus stearothermophilus ein zur Synthese von Aspartam (→130), Penicillin-Amidase aus E. coli zur Hydrolyse von Penicillin G zu 6-Aminopenicillansäure (→208). Lipase aus Burkholderia cepacia dient zur industriellen Synthese chiraler Amine aus den Amid-Vorstufen, Lipase aus Serratia marcescens zur enantioselektiven Hydrolyse einer Oxiran-Vorstufe des Blutdrucksenkers Diltiazem (→170), und Lipase aus Rhizomucor miehei zur Herstellung synthetischer Kakaobutter (→162). Aminosäure-Acylase aus Aspergillus oryzae wurde zur enantioselektiven Hydrolyse von N-Acylaminosäuren eingesetzt (→132). Lyasen. Für die etwa 680 Cofaktor-unabhängigen Lyasen gibt es ebenfalls Beispiele großtechnischer Anwendungen. Mit Aspartase aus Escherichia coli wird im technischen Maßstab

L-Asparaginsäure aus Fumarsäure gebildet (→130), wozu man aus Kostengründen ganze Zellen von E. coli anstelle des isolierten Enzyms verwendet. Acrylnitril-Hydratase aus Pseudomonas chloraphis katalysiert die Addition von Wasser an Acrylnitril zu Acrylamid, einem wichtigen Ausgangsprodukt für Polymere. Oxynitrilasen erlauben die stereoselektive Addition von HCN an Aldehyde; Hydrolyse der Nitrile führt zu D- oder L-Aminosäuren (→132). Mit Aldolasen, z. B. aus Kaninchenleber, wurde die stereoselektive Bildung von Zuckern aus C3-Bausteinen erfolgreich demonstriert. Isomerasen. Bisher beschrieb man etwa 280 Isomerasen. Sie benötigen keinen Cofaktor. Die Isomerisierung von D-Glucose zu D-Fructose durch das Enzym Glucose-Isomerase dient in einem großtechnischen Prozess zur Herstellung von Isoglucose-Süßstoff (→180). Das intrazelluläre Enzym wird meist in Form inaktivierter und immobilisierter Zellen von Streptomyces eingesetzt. Ligasen. Alle etwa 200 Ligasen sind ATP-abhängig. Sie werden in technischen Prozessen unter Regenierung dieses Cofaktors derzeit nicht verwendet.

Regio- und enantioselektive enzymatische Synthesen Allgemeines. Wie bereits am Beispiel einiger Aminosäuren gezeigt wurde, sind chirale Verbindungen oft durch Enzymreaktionen zugänglich. Im Rahmen dieses kurzen Texts können nur wenige wichtige Beispiele aufgezählt werden: 1. die Synthese chiraler Amine mit Lipasen oder Transaminasen, 2. die Synthese chiraler Hydroxylgruppen mit Lipasen, Esterasen, Ketoreduktasen, Epoxid-Hydrolasen, Dehalogenasen oder Aldolasen, 3. die Synthese chiraler Carbonsäuren mit Esterasen, Lipasen oder Nitrilasen, und 4. die Bildung von Säureamiden mit Nitril-Amidasen. Viele dieser Reaktionen werden bereits in der industriellen Synthese eingesetzt, z. B. für die Herstellung von Synthese-Bausteinen (Synthonen). Chirale Amine. Die enzymatische Acylierung racemischer sekundärer Amine mit Methoxyessigsäure durch Lipase, beispielsweise aus Burholderia cepacia, verläuft mit hoher Enantioselektivität, wobei das nicht umgesetzte Amin in hoher optischer Reinheit zurückbleibt. Das entstandene chirale Amid kann ebenfalls zum enantiomeren Amin hydrolysiert werden. Ggf. muss das nicht gewünschte Amin erneut racemisiert werden. Transaminasen können KetoVerbindungen mit hoher Regio- und Enantioselektivität in chirale Amine umwandeln. Die Reaktion benötigt als Cofaktor Pyridoxalphosphat. Verwendet man als Aminogruppen-Donor Isopropylamin, so entsteht als Koppelprodukt Aceton. Chirale Hydroxylgruppen. Lipasen und Esterasen spalten racemische Ester häufig mit hoher

Enantioselektivität. Für derartige Reaktionen stehen heute zahlreiche rekombinante Lipasen und Esterasen zur Verfügung, die bei Bedarf über gerichtete Evolution und protein design (→198) für die gewünschte Reaktion optimiert werden können. Eine ebenfalls breit einsetzbare Reaktion nutzt die Enantioselektivität von Dehydrogenasen oder Ketoreduktasen. Diese NADPH-abhängigen Enzyme werden meist als Ganzzell-Katalysator mit E. coli als Wirtsorganismus eingesetzt, da so das bei der Reaktion verbrauchte NADPH über ein ebenfalls einkloniertes Hilfsenzym, z. B. Glucose-Dehydrogenase, regeneriert werden kann. Die genannten Reaktionen können auch zur Darstellung von chiralen Hydroxycarbonsäuren genutzt werden. Zu chiralen Diolen gelangt man beispielsweise mit Hilfe von Epoxid-Hydrolasen, die chemisch synthetisierte racemische Epoxide enantioselektiv hydrolysieren. Auch Aldolasen werden für diese Reaktion verwendet – von dieser Enzymklasse stehen ebenfalls zahlreiche Varianten unterschiedlicher Edukt- und Substratspezifität zur Verfügung. Der geschickte Aufbau eines vicinalen Diols mit Hilfe einer Ketoreduktase- und einer Haloalkan-Dehalogenase Reaktion gelang beispielsweise für Atorvastatin (Lipitor®). Chirale Carbonsäuren. Enthält ein Ester eine prochirale Gruppe im Säureteil, lässt sich die entsprechende enantiomerenreine Verbindung meist ebenfalls durch Lipase- oder EsteraseKatalyse darstellen. Für die Synthese chiraler Hydroxycarbonsäuren häufig eingesetzt werden Nitrilasen, da sie nur ein Enantiomer eines chemisch hergestellten racemischen Nitrils verseifen. Säureamide. Nitril-Hydratasen verseifen Nitrile zu Säureamiden. Dabei wird kein chirales Zentrum erzeugt, die Reaktion ist aber von hoher wirtschaftlicher Relevanz: durch PartialHydrolyse von Acrylnitril lässt sich beispielsweise Acrylamid herstellen, ein bisher chemisch-katalytisch in großen Mengen hergestellter Baustein für die Synthese von Polyacrylamid. Mit Nitrilhydratase aus Rhodococcus chloraphae im Ganzzell-Katalysator gelingt die Hydratisierung von Acrylnitril zu Acryl-amid schonend, selektiv und in sehr hohen Raum-Zeit-Ausbeuten, und die enzymatische Synthese hat sich mittlerweilen weitgehend gegenüber der konventionellen chemisch-katalytischen Umwandlung durchgesetzt. Reduzierte Alkene. Die asymmetrische Reduktion von C=C-Bindungen gehört zu den wichtigsten Reaktionen in der organischen Synthese, da hierbei bis zu zwei chirale Stereozentren erzeugt werden können. Biokatalytisch kann diese Reaktion durch Enreduktasen erfolgen. Als Oxidoreduktasen benötigen diese Enzyme Reduktionsäquivalente für ihre katalytische Aktivität. Typischerweise werden diese direkt durch die reduzierten Nikotinamidkofaktoren bereitgestellt. Aufgrund des breiten Substratspektrums erfreuen sich diese Biokatalysatoren eines stetig wachsenden Interesses für präparative Anwendungen.

Enzyme als Verarbeitungs-Hilfsmittel Allgemeines. Enzyme werden in vielen Bereichen der Anwendungstechnik verwendet, z. B. in Waschmitteln (→174), in der Lebensmitteltechnologie, bei der Papier-, Textil- und Lederbehandlung. Auch für chemische Synthesen bezieht man immer häufiger Enzymkatalysierte Schritte ein, da viele Enzyme inzwischen in rekombinanter Form rein erhältlich sind und Umsetzungen oft mit höherer Regio- und Stereoselektivität katalysieren als chemische Katalysatoren. Aus dem gleichen Grund hat sich die Analytik mit Enzymen (→256) vor allem in der Untersuchung von medizinischen Proben und Nahrungsmitteln stürmisch entwickelt. Viele Enzyme liegen heute in klonierter Form vor und können deshalb durch Protein Engineering (→198) für industrielle oder analytische Anforderungen optimiert werden. Diese Technologien werden allerdings für Nahrungsmittelenzyme, die im Produkt verbleiben, nur in Ausnahmefällen beschritten, da die Lebensmittel dann entsprechend deklariert werden müssten (→334) und ihre Verbraucher-Akzeptanz (→336) verlieren könnten. Für anwendungstechnische Aufgaben werden vor allem solche Enzyme verwendet, die keinen externen Cofaktor benötigen. Dazu gehören Hydrolasen, Lyasen, Isomerasen und einige Oxidoreduktasen. Ziele. Der Einsatz von Enzymen konnte sich überall dort durchsetzen, wo wichtige anwendungstechnische Ziele wie Qualitätsverbesserung oder Verringerung der Prozesskosten zu einem akzeptablen Einstandspreis erreicht werden. Proteasen in Waschmitteln erfüllen mit der Ablösung von Proteinverschmutzungen von der Faser eine Aufgabe, die von keinem anderen Waschmittelbestandteil gelöst werden kann. Die enzymatische Stärkehydrolyse ist der sauren Hydrolyse im Hinblick auf die Bildung unerwünschter Nebenprodukte überlegen. Durch

den Einsatz von Pektinasen lässt sich die Saftausbeute bei der Früchteverwertung deutlich erhöhen. Zudem werden die Energiekosten für die Filtration gesenkt. Glutaminasen ermöglichen es, die Konsistenz von Fleisch-, Wurst- und Sojaprodukten durch den Einbau von Isopeptid-Bindungen zu verbessern. Proteasen und Collagenasen erlauben bei der Lederbehandlung eine selektive Entfernung von Haaren und Hautbestandteilen; die Entdeckung ihres Potenzials trug entscheidend zur Verbesserung der Arbeitsbedingungen der Gerber bei. Die Gerinnung von Milch durch Zusatz mikrobiellen oder rekombinanten Labs ist wesentlich kostengünstiger und hygienischer als das klassische Verfahren mit Extrakten aus Kälbermägen. In all diesen Fällen handelt es sich allerdings, anders als bei der Enzymkatalyse, um die Wirkung von Enzymen auf Stoffgemische, die zudem häufig polymer und schlecht charakterisierbar sind. Da der anwendungstechnische Effekt im Vordergrund steht, setzt man deshalb auch Enzym-Mischpräparate ein, die zudem den Vorteil geringerer Herstellkosten aufweisen. Sowohl die Messung der Aktivität eines Enzympräparats wie die quantitative Bestimmung seines anwendungstechnischen Effekts ist in der Regel besonderen Normen vorbehalten, die sich in einer mehr handwerklich geprägten Tradition in den verschiedenen Anwendungsbereichen über lange Zeiträume etabliert haben. An das Screening nach besseren Enzympräparaten stellt das insofern besondere Anforderungen, als die Ergebnisse biochemischer Tests im Enzymlabor häufig nicht direkt auf die anwendungstechnischen Tests übertragen werden können, deren Auswertung andererseits eine große Erfahrung voraussetzt. Zulassung. (→334) Die Herstellung von Enzympräparaten für die Anwendungstechnik muss nach den Regeln der good manufacturing practice (GMP) erfolgen. Mit gentechnischen Methoden hergestellte oder veränderte Enzyme spielen vor allem in der Waschmittel-Industrie eine große Rolle. Bei den kleineren Marktsegmenten der Lebensmittel-Technologie stehen die kostspieligen Voraussetzungen für eine Zulassung und die Deklarationspflicht meist in keinem Verhältnis zum wirtschaftlichen Erfolg; dieser Weg wurde deshalb nur in Ausnahmefällen begangen, z. B. beim rekombinanten Chymosin (→188). Kosten und Märkte. Der anwendungstechnische Nutzen eines Enzympräparats im Verhältnis zu seinem Preis bestimmt, ob ein Enzym zum technischen Einsatz kommt. Er liegt bei sehr geringen Beträgen (Cents bis einige Euro) pro t umgesetzten Rohstoffs oder verbesserten Produkts. Das Marktvolumen von Enzymen liegt bei 4–5 Mrd. US-$ (2013) und wächst mit 4–5 % jährlich.

Enzyme und Waschmittel Allgemeines. Vor etwa 100 Jahren entwickelte Otto Röhm erste Spezialwaschmittel mit einem Zusatz von Pankreas-Enzymen zur Lösung von Eiweißschmutz (Blut, Ei, Kakao, Grasflecken usw.). Mit der Verfügbarkeit alkalischer Proteasen aus Bacillus-Stämmen um 1960 setzte eine stürmische Entwicklung dieses Gebiets ein. Durch Protein engineering (→198) sind diese Enzyme inzwischen optimal an den Waschprozess angepasst. Rekombinante Bacillus-Proteasen

(→20) werden in Mengen von > 10 000 t Reinenzym/a hergestellt. Auch andere Enzymtypen wie Cellulasen, Lipasen, Amylasen, Hemicellulasen, Mannanasen und Pectatlyasen werden in Waschmitteln, Proteasen und Amylasen auch in maschinellen Geschirrspülmitteln eingesetzt. Waschmittel und Waschprozess. Waschmittel enthalten meist anionische und nichtionische, manchmal auch kationische Tenside. Anionische Tenside werden durch die Ca2+- und Mg2+Ionen harten Wassers mittels Fällung inaktiviert, sodass Waschmittel Komplexbildner zur Wasserenthärtung enthalten. Anstelle des früher üblichen Pentanatriumtriphosphats setzt man dazu heute meist Natriumaluminiumsilicate und kleinere Mengen organischer Komplexbildner ein (Citronensäure, Phosphonate). Bleichmittel für gefärbte Anschmutzungen sind Natriumpercarbonat und Bleichaktivatoren (z. B. Tetraacetylethylendiamin, TAED), aus denen im Waschprozess organische Persäuren erzeugt werden. Die Lösung eines Vollwaschmittels weist einen pH-Wert von 10,0 auf; der Waschprozess findet bei 30–90 °C statt und dauert 30 Minuten. Waschmittelenzyme müssen demnach bei alkalischem pH und Temperaturen bis etwa 60 °C wirksam und ausreichend stabil gegenüber Komplexbildnern, Oxidationsmitteln und Tensiden sein. Ferner sollten sie eine geringe Spezifität aufweisen. Proteasen. Es werden ausschließlich Serin-Proteasen (Subtilisine) aus Bacillus-Stämmen (→20) verwendet. Die Stämme sind durchweg rekombinant mit Mehrfachkopien des ProteaseGens und starken Promotoren (→62). Durch gezielte Mutagenese sind moderne WaschmittelProteasen stabiler gegen die Prozessbedingungen. So führte der Austausch des oxidationslabilen Methionin222 zu Vorteilen in maschinellen Reinigern. Im Verlauf der Fermentation wird nach Anzucht der Zellmasse die Protease-Bildung meist durch Zugabe des promoterspezifischen Induktors eingeleitet; sie ist nach spätestens 72 Stunden abgeschlossen. Nach quantitativer Abtrennung der Zellmasse durch Separatoren (→104) und Filtrationsverfahren (meist mit Membrantechnologie) wird das extrazelluläre Enzym durch Fällungen und Ultrafiltration konzentriert und partiell gereinigt. Da Enzyme nach wiederholter Inhalation allergische Reaktionen auslösen können, setzt man sie in Pulverprodukten als verkapselte und staubfreie Granulate ein. Hierzu wird das Enzymkonzentrat entweder mit Zuschlagstoffen (Salze, Wachse, Stabilisatoren) in schnelllaufenden Mischern und Extrudern granuliert oder in einem Wirbelschichtverfahren auf Kernpartikel aufgesprüht. Abschließend wird jede Granulatform mit einer Coatingschicht aus Wachs und Pigment verkapselt. In umfangreichen Studien konnten keine über Hautexposition ausgelösten Allergien nachgewiesen werden. Cellulasen. Endo-Cellulasen (→182) mit einem geeigneten pH-Optimum hydrolysieren beim Waschen Cellulose-haltiger Textilien (Baumwolle) von der Faser abstehende Mikrofasern, wodurch die Textilien im Griff weicher und farblich frischer bleiben. Außerdem wirken sie schmutzablösend bei Pigmentschmutz. In Waschmitteln werden Cellulasen aus Humicola insolens, Bacillus sp., Melanocorpus sp. und Thielavia sp. zugesetzt, die in Aspergillus oryzae oder Bacillus subtilis einkloniert wurden. Lipasen. Die Waschwirkung von Lipasen mit alkalischem pH-Optimum beruht weniger auf der Spaltung von Triglyceriden als auf der Entfernung schwer emulgierbarer langkettiger Wachsester (z. B. in Lippenstift). Die wichtigste derzeit in Waschmitteln verwendete Lipase

stammt aus dem Pilz Humicola insolens und wird mit rekombinanten Stämmen von Aspergillus oryzae hergestellt. Amylasen. Amylasen (→176) lockern Stärkehaltigen Schmutz durch hydrolytischen Angriff auf. Sie werden in Konzentrationen bis zu 0,1 % Amylaseprotein in maschinellen Geschirrspülmitteln eingesetzt. In nahezu allen Wasch- und Reinigungsmitteln setzt man alkalitolerante und thermostabile, häufig durch Protein Design (→198) modifizierte Amylasen aus verschiedenen Mikroorganismen ein, die mit rekombinanten Bacillus-Stämmen produziert werden.

Enzyme zum Stärkeabbau Allgemeines. Stärke ist nach Cellulose das zweitwichtigste Polysaccharid und neben DGlucose die wichtigste C-Quelle (→328) für Fermentations-Verfahren. Die landwirtschaftliche Produktion dieses nachwachsenden Rohstoffs beträgt ca. 75 Mio. t (2012); davon stammen 70 % aus Mais, die nächstwichtigen Stärke-Lieferanten sind Kartoffeln und Maniok. Nur ca. 20 % der isolierten Stärke verwendet man direkt; 30 % wird chemisch modifiziert, etwa 50 % verzuckert man zu oligomeren Dextrinen oder D-Glucose. Dies kann durch Enzyme mit weit weniger Nebenreaktionen als bei saurem Aufschluss geschehen. Stärke ist ein Polymer (Polymerisationsgrad 200–5000), das aus linearer Amylose (Polyα-1,4-D-glucose) und verzweigtem Amylopektin besteht. Amylose ist pseudokristallin, ihr Anteil kann mittels der Iod-Stärke-Reaktion bestimmt werden. Beim Amylopektin ist die

lineare Amylose-Kette in Intervallen von ca. 20 Glucose-Resten α-D-1,6-glykosidisch verzweigt. Je nach Herkunft der Stärke ist das Verhältnis von Amylose zu Amylopektin variabel und bestimmt ihr physikalisches und chemisches Verhalten. Stärke ist in kaltem Wasser unlöslich. Beim Erwärmen löst sie sich in dem Maß, wie intramolekulare WasserstoffBrücken zerstört werden. Im „Verkleisterungsbereich“ quillt Stärke durch Aufnahme von Wasser unter starker Viskositätszunahme auf (sie „geliert“) und kann dann chemisch modifiziert oder enzymatisch abgebaut werden. Beim Abkühlen von verkleisterter Stärke rekristallisiert die Amylose rasch durch Ausbildung intermolekularer Wasserstoff-Brücken („Retrogradation“). Stärke ist ein wichtiger Bestandteil oder Rohstoff vieler Grundnahrungsmittel (z. B. Brot, Bier, Gari). Traditionelle Verfahren zu deren Herstellung werden in immer stärkerem Maße technologisch optimiert, wobei auch der Verarbeitung der Stärke eine wichtige Rolle zufällt. Stärke-abbauende Enzyme. Für die enzymtechnologische Bearbeitung von Stärke stehen folgende Enzyme zur Verfügung: 1. α-Amylase (Synonym: endo-Amylase): sie spaltet Stärke an α-1,4-Bindungen innerhalb der Kette, 2. β-Amylase (Synonym: exo-Amylase): sie spaltet Maltose oder Maltotriose vom nichtreduzierenden Ende ab, 3. Glucoamylase (Synonyme: γAmylase, Maltase, Amyloglucosidase): sie spaltet D-Maltose zu 2 Molekülen D-Glucose und, mit geringerer Geschwindigkeit, auch α-1,6-Bindungen, 4. Pullulanasen: sie spalten bevorzugt die α-1,6-Bindungen des Pullulans, aber auch die α-1,6-Bindungen von Amylopektin, 5. Isoamylasen: sie hydrolysieren bevorzugt die α-1,6-Bindungen des Amylopektin, mit geringerer Geschwindigkeit auch die des Pullulan. α-Amylase. Dieses Aspartyl-Enzym wurde in vielen Organismen nachgewiesen. Man kristallisierte die Enzyme aus Malz, Pankreas, Aspergillus oryzae (→16) und Bacillus subtilis (→20). Von α-Amylase aus Bacillus amyloliquefaciens und anderen Amylasen liegen Kristallstrukturen vor. Mehrere α-Amylasen wurden kloniert und in Produktionsstämmen überexprimiert. Bakterielle α-Amylasen weisen ein wesentlich höheres Temperaturoptimum auf (B. licheniformis: 78 °C) und sind alkalistabiler als Pilz-Amylasen. Damit hat man für den technischen Einsatz je nach pH- und Temperaturvorgaben die Wahl unter verschiedenen Enzymen. β-Amylase, ein Sulfhydryl-Enzym, steht zur Herstellung von Maltose-Sirup als Präparat aus Weizenmalzmehl, vor allem aber aus Bacillus stearothermophilus technisch zur Verfügung. Amylasen, die α-1,6-Bindungen spalten. Das wichtigste Enzym dieser Gruppe ist Glucoamylase aus Aspergillus niger (→16); daneben kommt noch ein Enzym aus Rhizopus sp. (→16) zum Einsatz. Pullulanase wird mit Stämmen von Klebsiella pneumoniae oder Bacillus cereus industriell hergestellt. Herstellung. Für Anwendungen in Lebensmitteln werden Amylasen mit den Original-Stämmen und gelegentlich noch in Oberflächen-Kulturen (→86) hergestellt. Amylasen für technische Anwendungen sind meist in rekombinante Bacillus-Produktionsstämme einkloniert. Für die Produktion kommen großvolumige Bioreaktoren (30–200 m3) und Submersverfahren zum Einsatz. Die Enzyme werden ins Fermentationsmedium ausgeschieden, sodass nach Abtrennung der Zellmasse eine verdünnte Enzymlösung vorliegt. Da es sich um Mengenprodukte handelt,

die nur niedrige Preise erzielen, beschränkt sich ihre Isolierung aus der Fermentationslösung auf einfache Verfahrensschritte wie Zellabtrennung durch Separatoren (→104), Ultrafiltration der Überstände, Fällung und Konfektionierung mit Zuschlagstoffen.

Enzymatische Stärkehydrolyse Allgemeines. Etwa die Hälfte der jährlich isolierten Stärke (ca. 75 Mio. t/a) wird enzymatisch verzuckert. Ein beträchtlicher Teil (ca. 15 %) dient zur Herstellung von Isoglucose (auch HFS = high fructose syrup) (→178), der Rest wird in Form von Dextrinen und Maltose-Sirups für vielfältige Einsatzgebiete eingesetzt, u. a. als C-Quelle (→328) für Fermentationen. Als Stärke-haltige Getreidearten verwendet man vor allem den in den USA und Kanada extensiv angebauten Mais und Weizen. Die meist aus intensiver Landwirtschaft stammende Kartoffel- und Reisstärke haben im Vergleich eine geringe Bedeutung. Während der Kontinental-Sperre unter Napoleon entwickelte Kirchhoff in St. Petersburg eine Methode zur Zuckerherstellung aus Kartoffelstärke mit verdünnter Schwefelsäure (Ersatz importierten Rohrzuckers). Sie führt zur Bildung farbiger Nebenprodukte und ist heute nicht konkurrenzfähig. Enzymatische Stärke-Verflüssigung. Mais- oder Weizenstärke wird durch nasses oder trockenes Vermahlen von Getreide gewonnen. Wertvolle Nebenprodukte sind Maiskeimöl, Mais- bzw. Weizengluten und Futtermittelmischungen. Die Stärke wird in großvolumigen Reaktoren (Arbeitsvolumen > 100 m3) (→96) mit Dampf in Gegenwart thermostabiler bakterieller α-Amylase für wenige Minuten auf 105–140 °C erhitzt (Stärkekocher), um die Stärke zu quellen und zu entkleistern. Nach 2–3 Stunden bei 95 °C in Verflüssigungstanks mit Bacillus-α-Amylase ist die Umsetzung zu Maltodextrin (Dextrose-Äquivalent DE 15–25) zu 98 % abgeschlossen. Maltodextrin ist ein Gemisch aus Oligosacchariden mit geringen Anteilen von Mono-, Di- und Trisacchariden und stellt ein hervorragendes Substrat für die nachfolgende enzymatische Verzuckerung dar. Maltodextrine werden aber auch als Nahrungsmittelbestandteil von geringer Süße verwendet, z. B. in Baby- und Krankennahrung oder Trockensuppen. Enzymatische Verzuckerung. (→180) Sie führt wahlweise zu Dextrose, Glucose-, Hochmaltose- oder Hochkonversions-Sirup. Für diesen Prozess werden Glucoamylasen (→176) aus Aspergillus niger, Aspergillus oryzae (→16) oder Trichoderma reesei eingesetzt, die entweder in nativer Form gebildet werden oder, durch Protein Engineering (→198) optimiert, nach Selbstklonierung in den Originalstamm in hohen Ausbeuten anfallen. Für den Prozess kühlt man das bei der Stärke-Verflüssigung erhaltene Maltodextrin auf ca. 60 °C herunter und stellt auf pH 4 ein. Bei den meist verwendeten kontinuierlichen Prozessen sind mehrere Tanks erforderlich, um ein Rückmischen der Sirups mit entsprechender Ausbeuteminderung zu verhindern. Die Verzuckerung zu einem Glucose-Sirup von sehr hohem DE-Wert (97–98) dauert ca. 48–72 Stunden. Ein Zusatz von Pullulanase (→176) oder Isoamylase führt zu noch höheren DE-Werten und erlaubt die Verringerung zugesetzter Glucoamylase. Der Einsatz immobilisierter Enzyme hat sich aufgrund des Diffusionswiderstands im hochviskosen Substrat und der leichten Bildung von Reversionsprodukten nicht bewährt. Die Aufarbeitung zu kristallinem D-Glucose-Monohydrat („Hydratdextrose“) erfolgt durch Kristallisation. Zwischen den Extremfällen Maltodextrin und Dextrose liegen „maßgeschneiderte“ Sirups; sie lassen sich durch Dosierung der Glucoamylase und Wahl der Verzuckerungszeit herstellen. Glucose-Sirups mit niedrigem bis mittlerem DE finden bei der Herstellung von Süßwaren jeder Art Verwendung. Zur Herstellung

von Maltose- und Hochkonversionssirups, die eine hohe Viskosität, aber geringe Bräunungsund Kristallisationsneigung aufweisen, wird häufig α-Amylase aus Aspergillus niger verwendet. Cyclodextrine. Bei der Einwirkung von Cyclodextrin-Transferasen entstehen aus Dextrinen 5-, 6- oder 7-gliedrige Ringe (α-, β- oder γ-Cyclodextrine). Sie sind gut wasserlöslich, weisen aber je nach Typ hydrophobe Hohlräume von 0,5–0,75 nm Durchmesser auf, die Gastmoleküle wie Vitamine, wohl- oder übelriechende Duftstoffe oder Pharmaka einzulagern vermögen. Sie finden deshalb Anwendung für die Löslichkeitsverbesserung, Stabilisierung oder das Abfangen derartiger Verbindungen. Chirale Derivate von Cyclodextrinen werden als stationäre Phasen zur chromatographischen Trennung optisch aktiver Verbindungen eingesetzt. Technische Verfahren zur Herstellung von Cyclodextrinen konzentrieren sich vor allem auf die β-Form. Dafür geeignete Cyclodextrin-Glykosyltransferasen (Cyclodextrinase) wurden vor allem in mesound alkalophilen Bacillus-Arten beschrieben. Die technische Herstellung erfolgt aus Stärke oder Dextrinen im Bio- oder Enzymreaktor (→102).

Enzyme und Süßkraft Allgemeines. Zucker (D-Saccharose) ist seit dem 18. Jahrhundert im westlichen Kulturkreis ein wichtiges Genussmittel. Ursprünglich aus tropischem oder subtroptischem Zuckerrohr gewonnen („Rohrzucker“), setzte sich in der Folge von Napoleons Kontinentalsperre in Europa die Gewinnung von Zucker aus Zuckerrüben durch. Mit enzymtechnologischen Methoden wird heute in großem Umfang Mais- und Weizen-Stärke zu Glucose-Fructose-Sirup („Isoglucose“) verarbeitet. Unter diätetischen Gesichtspunkten (Kalorienreduzierung, Diabetes, KariesProphylaxe) wurden zahlreiche Zuckeraustauschstoffe entwickelt, die man z. T. ebenfalls durch Enzymkatalyse herstellt. Wichtigstes subjektives Bewertungsurteil für einen Süßstoff ist seine Süßkraft im Vergleich zu Saccharose, jweils in 10 %-iger Lösung. Invertzucker. Saccharose lässt sich mit Invertase zu Invertzucker spalten, der als Sirup anfällt. Invertzucker besteht zu je 50 % aus D-Glucose und D-Fructose und weist eine ähnliche Süßkraft wie Rohrzucker auf. Da Invertzucker nicht kristallisiert, wird er zur Herstellung von Bonbon- und Pralinenfüllungen eingesetzt. Invertase gewinnt man aus der Zellmasse von

Backhefe Saccharomyces cerevisiae (→120). Das Enzym ist im Cytoplasma lokalisiert und kann nach Zellaufschluss in der Kugelmühle in wenigen Schritten rein gewonnen werden. Die Herstellung von Invertzucker erfolgt aus 70 %igem Saccharose-Sirup im Enzym-Reaktor (→102) mit immobilisierter Invertase. Der Reaktor kann mehrere Tage kontinuierlich bei 55 °C betrieben werden Isoglucose. Das aus Streptomyceten, Actinoplanes oder Bacillus coagulans isolierte Enzym Glucose-Isomerase (systematisch: D-Xylose Aldose-Ketose Isomerase, EC 5.3.1.5) isomerisiert in einer Gleichgewichtsreaktion D-Glucose zu D-Fructose. Bei der bevorzugten Reaktionstemperatur von 60 °C entsteht ein Gemisch aus 42 % D-Fructose und 55 % DGlucose (Isoglucose, high-fructose syrup, HFS), das eine etwas geringere Süßkraft als Saccharose aufweist. Durch chromatographische Abtrennung der Glucose und ReIsomerisierung erhält man die noch süßere Isoglucose 55 mit einem Fructose-Anteil von 55 %, deren höhere Süßkraft für die Herstellung gekühlter Soft-drinks besonders günstig ist. Die jährliche Produktion von Isoglucose 42 und 55 in den USA, dem mit Abstand größten Erzeugerland, betrug 2010 etwa 7,5 Mio. t, etwa 37 % des gesamten kalorischen ZuckerVerbrauchs. Der Verbrauch nimmt allerdings leicht ab, wegen einer immer größeren Verwendung von Zucker-Austauschstoffen. Aufgrund staatlicher Regulierungsmaßnahmen werden in der EU lediglich 690 000 t/a Isoglucose hergestellt (etwa 5 % der Produktion an Rübenzucker) (2013). Herstellung. Das Enzym Glucose-Isomerase kommt in zahlreichen Mikroorganismen vor. Es ist ein Homodimer. An der katalytischen Reaktion sind zweiwertige Metallionen wie Co2+, Mn2+ oder Mg2+ beteiligt. Für die industrielle Herstellung des Jahresbedarfs von ca. 1500 t Glucose-Isomerase werden vor allem Streptomyceten und Bacillus coagulans eingesetzt. Die Gewinnung erfolgt im Bioreaktor mit einem Zulaufverfahren (→92), das nach 72 Stunden abgeschlossen ist. Um die teure Isolierung des intrazellulären Enzyms zu vermeiden, setzt man bei einem bevorzugten Verfahren im Enzymreaktor ganze Zellen der Glucose-Isomerasebildenden Streptomyceten ein, die mit Glutaraldehyd vernetzt und an ein Trägermaterial gebunden sind (→102). Innerhalb von 30 min Kontaktzeit stellt sich ein Gleichgewicht zwischen zugesetzter D-Glucose und isomerisierter D-Fructose ein. Bei einer Prozesstemperatur von 60 °C liegt dieses Gleichgewicht bei 42 % D-Fructose (Isomerose 42). Die Betriebsstabilität des Enzymreaktors ist sehr hoch; die Halbwertzeit der katalytischen Aktivität liegt bei 60 °C bei 50 Tagen. Bei modularer Bauweise ist damit ein kontinuierlicher Schichtbetrieb möglich. Durch Stammoptimierung ist bei modernen Verfahren kein Zusatz des Cofaktors Co2+ mehr erforderlich. Das Reaktionsprodukt enthält Spuren von Karamellzuckern und wird über Aktivkohle gereinigt. Isoglucose kommt als Sirup in den Handel. D-Fructose, einen Zucker von hoher Süßkraft, kann man aus Invertzucker oder Isoglucose durch Chromatographie gewinnen. Topinambur, auch Jerusalem-Artischocke genannt, enthält in ihrer Knolle bis zu 75 Gew.-% Inulin (→118), ein Fructose-Polymer. Fructose kann daraus durch enzymatische Hydrolyse mit Inulinase gewonnen werden. Meist wird dazu ein Enzym aus Aspergillus niger (→16) verwendet.

Enzyme zum Abbau von Cellulose und Polyosen

Allgemeines. Cellulasen und Hemicellulasen werden in vielen Bereichen der Biotechnologie eingesetzt. Intensive Entwicklungen fanden in den letzten Jahren im Bereich der BiomasseNutzung (→328) statt, z. B. für die Herstellung von Bio-Ethanol (→138). Dabei muss die Biomasse zuerst in eine für Enzyme zugängliche Form überführt werden. Nach Einklonierung von Cellulasen und Hemicellulasen in oder auf der Oberfläche von Wirtsorganismen, z. B. Corynebakterium glutamicum (→20) oder S. cerevisiae (→14), können Aminosäuren oder Ethanol auch aus gelöster Biomasse statt aus Glucose erzeugt werden. In Waschmitteln und bei der Textilbearbeitung verwendet man Cellulasen als Glättungsmittel für Baumwoll-Fasern (→174). In der Nahrungsmittel-Industrie werden sie zur Pürierung von Gemüsen und Früchten eingesetzt (→186). Anwendungsmöglichkeiten ergeben sich auch bei der Zellstoff- und Papierherstellung (→184). Cellulose. Cellulose ist der formgebende Bestandteil der pflanzlichen Zellwand und mengenmäßig der bedeutendste nachwachsende Rohstoff. Die Jahresproduktion der Biosphäre wird auf 20 Mrd. t geschätzt. Cellulose besteht aus linearen Ketten von β-1,4-verknüpften DGlucose-Einheiten (durchschnittlicher Polymerisationsgrad ca. 10 000), die mittels Wasserstoff-Brücken zu parallelen Bündeln angeordnet sind (Mikrofibrillen). Polyosen. (Hemicellulosen) sind eine heterogene Gruppe von Polysacchariden aus Pentosen, Hexosen, Desoxyhexosen und Hexuronsäuren. Sie machen etwa 20 % der Zellwand aus. Xyloglucane (Xylan) sind über Wasserstoff-Brücken direkt an die Cellulose-Mikrofibrillen gebunden und bestehen aus einem Rückgrat β-1,4-verknüpfter Glucose-Reste, die in β-1,6Verzweigung zahlreiche Xylose-Reste tragen. Arabinogalactane binden die Glykoproteine der Zellwand und besitzen ein Rückgrat aus alternierenden, β-1,4-verknüpften Galactose- und Arabinose-Resten, die unterschiedliche Verzweigungen aufweisen. Pentosane bestehen aus alternierenden Ketten von Xylose und Arabinose. Biologischer Abbau. Der biologische Aufschluss von Cellulose erfolgt in der Natur durch Bakterien und Pilze. Unter letzteren nehmen die Weißfäulepilze (→16) eine herausragende Stellung ein. Sie hydrolysieren Cellulose und Polyosen synchron zur Lignin-Oxidation. Dazu sind, neben einer mechanischen Auflockerung durch das wachsende Pilzmycel, zahlreiche Enzyme erforderlich. In manchen Organismen, z. B. den Clostridien, sind diese auf einer Plattform, dem Cellulosom, vereint. Cellulasen lassen sich aus zahlreichen Mikroorganismen isolieren. Gut bearbeitet sind einige bakterielle (Cellulomonas, Clostridium) und pilzliche Cellulasen (Trichoderma reesei, Aspergillus niger, Humicola insolens). Die Herstellung der extrazellulären Enzyme im Bioreaktor folgt dem üblichen Muster für extrazelluläre Enzyme. Das durch Zellabtrennung und fraktionierte Fällung angereicherte Enzym enthält noch Nebenaktivitäten von Hemicellulasen, die unter anwendungstechnischen Gesichtspunkten erwünscht sein können. Für die Herstellung von Cellulasen zur Holzverzuckerung wurde vor allem der Weißfäulepilz Trichoderma reesei untersucht. Die Herstellung erfolgte früher durch Oberflächen-Fermentation, heute submers im Bioreaktor. Zur Anreicherung des extrazellulären Enzymgemischs extrahiert man den Koji mit Wasser; bei Submersverfahren trennt man die Zellen ab und fraktioniert das Filtrat mit Ethanol. Hemicellulasen. β-Glucanase-Präparate werden aus Bacillus subtilis, Penicillium emesonii,

Aspergillus niger und anderen Organismen gewonnen. Mannanasen und Galactomannanasen stammen z. B. aus Aspergillus niger und Trichoderma reesei. Die Herstellung folgt dem üblichen Schema für extrazelluläre Enzyme. Glucose und Xylose. Für die Wirtschaftlichkeit eines Abbaus Cellulose- und Polyose-reicher Abfallstoffe (Holzspäne, Bagasse, Reisstroh usw.) zu den Fermentations-Rohstoffen Glucose und Xylose sind einmal die Kosten für den Transport und die Vorbereitung des Substrats, zum anderen die Enzymkosten entscheidend. Zum Substrataufschluss werden, analog zur Zellstoffherstellung, Lignin-Bestandteile durch Hitzebehandlung unter alkalischen Bedingungen herausgelöst und dabei Polyosen bereits partiell abgebaut. Die Herstellkosten für Cellulasen konnten in den letzten Jahren im Rahmen verschiedener Projekte zur Herstellung von Ethanol aus Biomasse bereits drastisch gesenkt werden.

Enzymatische Verfahren bei der Zellstoff- und Papierherstellung Allgemeines. Zellstoff ist ein faserartiges, hauptsächlich aus Cellulose bestehendes Material, das durch Entfernung von Lignin und Polyosen aus Holz gewonnen wird. Er wird zu Papier, Pappe und Chemieprodukten verarbeitet. 2011 produzierte man ca. 180 Mio. t Zellstoff und ca. 400 Mio. t Papier und Kartons; davon entfielen 25 % auf China und 22 % auf Nordamerika. Bei der Herstellung von 1 t Papier werden 3,3 t Holz und 0,4 t Erdöl verbraucht; die Abwässer sind mit 1 kg AOX und 55 kg CSB pro t Zellstoff hochbelastet. Material-, Energie- und Umweltschonende Technologien werden deshalb intensiv bearbeitet. Die Eigenschaften der Endprodukte Zellstoff und Papier hängen stark vom Holztyp und vom Herstellprozess ab. Abgesehen von einigen Harthölzern (Eukalyptus, Pappel), die besonders schnell wachsen, bevorzugt man Weichhölzer (Birke, Fichte, Tanne) wegen ihrer längeren Fasern, die sich besser verarbeiten lassen. Im Vergleich zu Harthölzern enthalten sie weniger Polyosen (14–17 %), aber mehr Lignin (26–32 %). Man versucht deshalb mittels pflanzlicher Zellkulturen und durch Züchtung transgener Pflanzen, den Lignin-Gehalt von Weichhölzern zu verringern (→284). Zellstoff-Herstellung. Nach der Fällung der Bäume, dem Entrinden und der Zerkleinerung in Holzspäne wird daraus Zellstoff mechanisch, thermomechanisch oder chemisch gewonnen. Das dominierende chemische Verfahren beruht auf der alkalischen Depolymerisierung von Lignin mittels Na2S/NaOH unter hohem Druck bei 170 °C (Kraft-Prozess, 80 % der Weltproduktion). Alternativ schließt man sauer mit einem Überschuß an SO2 auf (Sulfit-Zellstoff). Enzymtechnologische Ansätze bei der Herstellung und Bearbeitung von Zellstoff und Papier

bestehen vor allem beim Biopulping und bei der Bleiche. Verrottungsprozesse (biopulping). Zur Vorbehandlung der mechanischen ZellstoffHerstellung untersucht man die Behandlung der Holzspäne mit Lignin-abbauenden Mikroorganismen, vor allem mit Weißfäule-Pilzen (→16). Ein Beispiel ist der Cartapip®Prozess (Clariant). Dabei werden Holzspäne mit Sporen des Weißfäule-Pilzes Ophiostoma piliferum beimpft und für einige Wochen inkubiert. Das Verfahren wurde bis zum Maßstab von 100 t untersucht; es führte beim anschließenden Kraft-Prozess zu höheren Ausbeuten und qualitativ besseren Zellstoff-Produkten. Enzymatische Verbesserung der Bleiche (biobleaching). Der beim Kraft- oder SulfitProzess entstehende Zellstoff ist von lockerer Struktur und für Enzyme leicht zugänglich. Er wird mit ClO2 behandelt, um die meist vom Lignin-Abbau herrührenden farbigen Komponenten auszubleichen. Eine Vorbehandlung mit Xylanasen und/oder Laccasen führt hierbei, besonders bei der Verwendung von Harthölzern, zu einer verbesserten Bleiche bei geringerem Verbrauch von Chlor-Verbindungen. Bei Untersuchungen in verschiedenen Papiermühlen wurden Xylanasen (→182) zur Vorbereitung der Bleiche im Kraft-Prozess eingesetzt, zum Teil im Produktions-Maßstab. Der Einsatz von ClO2 konnte dabei um 5 kg/t Zellstoff reduziert werden, was bei einem Enzympreis von ca. 2 US-$/t Zellstoff zu Einsparungen in der gleichen Größenordnung führte; die Abwasserbelastung ging um ca. 1/3 zurück. Unter den vielen untersuchten Xylanasen findet man Enzymkomplexe aus Clostridium thermocellum, Streptomyces roseiscleroticus und ein rekombinant hergestelltes Enzym aus dem thermophilen Tiefsee-Stamm Thermotoga maritima (Temperaturoptimum 95 °C). Kommerziell erhältlich sind u. a. Enzyme aus Trichoderma longibrachiatum und T. reesei. Pitch-Kontrolle. Einige Hölzer, z. B. Kiefernholz, haben einen hohen Gehalt an Triglyceriden, der unter den drastischen Bedingungen der Zellstoff-Herstellung die Bildung von Pechen (pitch) begünstigt, die sich auf Maschinenteilen ablagern können. Darunter leidet die Qualität und der Weißgrad des erzeugten Papiers. Durch Vorbehandlung mit mikrobiellen Lipasen wird dieses Problem umgangen und zudem die Bildung chlorierter Triglyceride während der Chlorbleiche verhindert. Laccase aus Trametes versicolor in Verbindung mit einem Mediator (z. B. 1-Hydroxybenzotriazol) entfernt auch Pech-bildende Sterine. Entfernung von Druckerschwärze. Beim Recycling von Altpapier kann die Druckerschwärze nach Vorbehandlung mit einem Gemisch aus Cellulase, Xylanase und Lipase leichter entfernt werden.

Pektinasen

Allgemeines. Pektinasen – eine Gruppe verschiedener Hydrolasen und Lyasen – bauen Pektin ab und modulieren dadurch unter Erhalt der natürlichen Farbstoffe die Textur und den GelCharakter von Fruchtfleisch und Gemüse. Sie spielen anwendungstechnisch eine wichtige Rolle bei der Verarbeitung von Gemüse und Früchten und werden in Mengen von ca. 1000 t (Welt) produziert. Pektine. Pektine sind saure Polysaccharide vom MR 30 000–300 000. Ihr Aufbau ist sehr heterogen; Hauptbausteine sind δ-1,4-verknüpfte Einheiten von D-Galacturonsäure, die mit Methanol verestert sein können. Daneben kommen D-Rhamnose-reiche Regionen mit Seitenketten aus D-Arabinose, D-Xylose und D-Galactose vor. Stark veresterte Pektine mit hohen Molmassen bilden in Pflanzen die wasserunlösliche Mittellamelle der primären Zellwand (Protopektin, „Zellzement“). Durch Hydrolyse der Esterbindung und Depolymerisation entstehen daraus kürzerkettige Pektine, die als anionische Polymere mit Ca2+-Ionen Quervernetzungen und feste Gele bilden. Dieser der Reifung von Gemüse und Obst zugrundeliegende Prozess führt zu erheblichen Strukturveränderungen im Gewebe. Ein schonender Pektin-Abbau ist entscheidend bei der Herstellung von Pürees und Fruchtsäften. Pektinasen. Als Pektinasen fasst man folgende Enzyme zusammen: 1. Endopolygalacturonasen [EC 3.2. 1. 15] 2. Exopolygalacturonasen [EC 3.2. 1. 67] 3. Pektat-Lyase [EC 4.2.2.2] 4. Exopektat-Lyase [EC 4.2.2.9] 5. Pektin-Lyase [EC 4.2. 2. 10] 6. Pektin-Esterase [EC 3.1. 1. 11] Die für die Gemüse- und Fruchtbehandlung verwendeten Pektinasen enthalten unterschiedliche Mischungsverhältnisse dieser Enzyme, wodurch das gewünschte anwendungstechnische Ergebnis erzielt wird. Technische Herstellung. Alle Handelspräparate werden mit Hilfe lebensmittelrechtlich zugelassener Schimmelpilze (Aspergillus, Rhizopus) hergestellt (GRAS-Status) (→166). Viele Pektinase-Präparate gewinnt man durch Oberflächen-Kultur (→86) von Aspergillus oder Rhizopus. Das Nährmedium kann z. B. aus Weizenkleie mit hohem Feuchtigkeitsgehalt bestehen. Nach etwa 100 Stunden Kultivierungsdauer wird der Nährboden mit Pufferlösung extrahiert. Ultrafiltration des Extrakts führt zu einem konzentrierten Enzympräparat, das entkeimt und mit stabilisierenden Zuschlagstoffen (Glycerin, Sorbitol) standardisiert wird. Im Handel sind flüssige, granulierte oder sprühgetrocknete Präparate. Die Standardisierung der verschiedenen Pektinase- und der Nebenaktivitäten (Cellulase, Hemicellulasen, Glykosidasen usw.) ist schwierig. Mit gentechnisch optimierten Stämmen könnte ein genau definiertes Enzymmuster hergestellt werden – die Vorbehalte der Verbraucher (→336) gegenüber einem Einsatz gentechnisch erzeugter Rein-Enzyme für die Herstellung von Nahrungsmitteln behindert aber derartige Entwicklungen.

Anwendungen. Pektinasen werden eingesetzt a) bei der Maceration (Erweichung) von Gemüsen und Früchten („Macerasen“), b) bei der Behandlung von Maischen zur Fruchtsaftgewinnung (Apfel, Beeren, Steinobst) oder Weinbereitung, häufig im Hinblick auf eine erhöhte Ausbeute und eine bessere Filtrationsleistung, c) bei der Verarbeitung von Mango, Ananas und Citrusfrüchten zur Verhinderung der Gelbildung, und d) bei der Entfernung von Trubstoffen aus Traubenmost. Die macerierende Wirkung von Pektinasen kommt beispielsweise bei der Herstellung von Frucht- und Gemüsezubereitungen wie Babynahrung, Joghurt-Fruchtpürees oder trüben Fruchtsäften zum Einsatz. Durch den Zusatz von Pektinasen kann bei der Saftherstellung die Saftausbeute um 5–10 % gesteigert und die Filtrationsleistung um den Faktor 1,5–5 erhöht werden. Bei der Weinherstellung werden Pektinasen beispielsweie eingesetzt zur Macerierung, verbesserten Extraktion und Klärung, zur schnelleren Reifung und Filtration. Cellulasen und Hemicellulasen (→182) kommen im Lebensmittelbereich beispielsweise bei der Gewinnung von Stärke aus Maiskleber oder bei der Extraktion von Kaffee und Tee zum Einsatz, in Kombination mit Proteasen auch zur Reinigung von Ultrafiltrations-Membranen. Die Wirkung von Pektinasen bei der Obst- und Gemüseverarbeitung kann durch den gleichzeitigen Zusatz von Cellulasen und Hemicellulasen verbessert werden. Bakterielle oder pilzliche Glucanasen verbessern durch Aufschluss von Malz die Herstellung der Maische in der Brauerei (→112) – ein in Deutschland nicht zugelassenes Verfahren (Reinheitsgebot).

Enzyme und Milchprodukte Allgemeines. Bei der Herstellung von Milch und Milchprodukten kommen vor allem Proteasen, Lactasen und Lipasen zum Einsatz. 1. Mengen- und wertmäßig am bedeutendsten ist die Verwendung hochspezifischer Proteasen (Lab, Rennin) bei der Käseherstellung: der Jahresbedarf liegt bei einigen 1000 t zur Herstellung von ca. 18 Mill. t Käse (Welt, 2011). 2. Durch Zusatz von Lipasen und Proteasen kann man Einfluss auf das Käsearoma nehmen. 3. Die Spaltung von Milchzucker durch β-Galactosidase (Lactase) führt zu zahlreichen Spezialprodukten für die menschliche und tierische Ernährung. 4. Von wirtschaftlichem Interesse ist auch die Verwertung von Molke, die bei der Quark- und Käseherstellung in Mengen von über 2 Mio. t (2011, Welt) als Trockenpulver anfällt und ein guter Fermentationsrohstoff ist. 5. In einigen Entwicklungsländern sterilisiert man Milchprodukte enzymatisch mit Lysozym oder H2O2/Katalase. Milch. Milch ist eine Öl-in-Wasser-Emulsion mit einem Wassergehalt von etwa 90 %. Die Triglyceride (→34) der Milch („Butterfett“) enthalten 2–4 % Buttersäure. Der Anteil von Milchzucker (Lactose) und der Proteine beträgt jeweils etwa 3 %. Casein, die HauptKomponente der Protein-Fraktion, ist ein Gemisch von Phosphoproteinen von Molmassen zwischen 20 und 30 kDa. Sie lagern sich zu Aggregaten von ca. 1 Mio. Da zusammen, wobei

κ-Casein als Schutzkolloid wirkt. Die für die Verdaubarkeit der Milch erforderliche Denaturierung wird durch verschiedene Mechanismen ausgelöst: durch Ca2+-Ionen in Konzentrationen > 6 mM, durch Erniedrigung des pH-Werts auf < 4,6 und durch Spaltung der Peptidbindung von κ-Casein zwischen 105Phe-106Met mittels Chymosin (Rennin), einer Protease des oberen Verdauungstrakts von Säugern. Casein-spaltende Proteasen. Im Magen von Säugern wird Casein durch die kombinierte Wirkung von Chymosin und Säure gespalten und damit dem weiteren proteolytischen Abbau zugänglich gemacht. Die verwandte Methode, aus Milch mittels Chymosin (Lab) Dickmilch oder Käse herzustellen, ist eine der ältesten Methoden zur Konservierung dieses verderblichen Lebensmittels. Zur Herstellung von Käse wurden traditionell Präparate aus den Labmägen von Schlachtkälbern eingesetzt, die allerdings oft unrein und schwer zu standardisieren sind. Anstelle von Lab bevorzugt man heute deshalb mikrobielle Proteasen oder rekombinantes Chymosin. Das mikrobielle Enzym aus Mucor miehei besitzt die gleiche Spezifität (Spaltung von 105Phe-106-Met) wie tierisches Chymosin. Es wird deshalb in großem Stil als „mikrobielles Lab“ eingesetzt. 1987 wurde Kälberchymosin cloniert und in E. coli als Prochymosin exprimiert. Als Wirtsorganismus werden heute Kluyveromyces lactis oder Aspergillus niger (→16) bevorzugt. Seit 1992 ist rekombinantes Chymosin in den USA, seit 1997 auch in der EU und Japan zur Käseherstellung zugelassen. In Mitteleuropa gibt es allerdings Widerstände der Verbraucher, während in den USA und Großbritannien > 80 % aller Käsesorten mit rekombinantem Chymosin hergestellt werden. Spaltung von Lactose (Milchzucker). Lactose wird von Säugern, auch vom Menschen, meist nur während der Stillzeit gut vertragen. Viele Erwachsene – mit der bemerkenswerten Ausnahme der meisten Kaukasier – weisen eine Lactose-Intoleranz auf, die darauf beruht, dass zu wenig Lactase gebildet wird und nicht gespaltene Lactose im Dickdarm von der Darmflora vergoren wird, was Flatulenz verursacht. Davon verschieden ist die seltene Galactosämie, ein autosomal-rezessiver Gendefekt auf Chromosom 9, der sich phänotypisch in einer Blockade der Bildung von UDP-Galactose äußert und zu einer Überschwemmung des Organismus mit toxischen Umwandlungsprodukten der Galactose führt, vor allem mit Galactit. Während bei Galactosämie eine Galactose-freie Diät verabreicht werden muss, helfen bei LactoseIntoleranz Produkte, bei denen Milchzucker bereits enzymatisch in Glucose und Galactose gespalten wurde. Derartige enzymbehandelte Produkte, die zudem einen höheren Süßgrad als Milch aufweisen, werden auch bei der Herstellung fermentierter Milchprodukte wie z. B. Joghurt (→116) und zur Gewinnung von Lactose-Sirup für die Back-Industrie verwendet. Käsearoma. Die in Milch vorkommenden kurz- und mittelkettigen Triglyceride können mittels Lipase zu Käsearomen verarbeitet werden (enzyme-modified cheeses, EMC). Je nach Kettenlängenspezifität der dabei verwendeten Lipasen sind unterschiedliche Geschmacksnoten möglich.

Enzyme zur Bearbeitung von Backwaren und Fleisch. Allgemeines. Die wichtigsten biotechnologischen Methoden bei der Zubereitung von Backwaren sind die Herstellung von Hefeteig sowie von Sauerteig. Bei letzterem erhöht eine kombinierte Milchsäure-/Hefegärung die Verdaulichkeit von Roggenmehl. Darüber hinaus werden bei der Verarbeitung von Teig und Backwaren auch isolierte Enzyme wie Amylasen, Xylanasen, Lipasen, Glucose Oxidase und Proteasen eingesetzt. Während spezifische Xylanasen vor allem die durch Pentosane ausgelöste Gelbildung unterbinden und damit die Viskosität von Roggen- und Weizenmehlteigen verringern, beeinflussen Amylasen, Lipasen, Glucose Oxidase und Proteasen sowohl das Gärverhalten wie die viskosen Eigenschaften von Mehl und Kleber und können bei sämt-lichen Mehltypen vorteilhaft verwendet werden. Maltogene β-Amylase (→176) setzt man zur Frischhaltung von Brot ein. Der industrielle Bedarf an Enzymen für die Bäckerei liegt bei 1000 t (Welt). Für die Verarbeitung von Wurstwaren setzt man häufig Starterkulturen ein (s. Starterkulturen, →114). Sie beeinflussen Aroma und Haltbarkeit. Die Konsistenz von Fleisch kann durch den Zusatz von Proteasen günstig beeinflusst werden (tenderizer); dazu wird vor allem Papain verwendet. Mehlverarbeitung und Enzyme. Die Vermahlung des Getreidekorns führt zu Mehl, das je nach Herkunft (Weizen, Roggen, Dinkel usw.), Bodenbeschaffenheit, Klima und Reifezustand des Korns unterschiedliche Anteile an Stärke, Pentosanen und Proteinen aufweist. Durch Enzymeinwirkung kann man die Zusammensetzung des Mehls modulieren. Amylasen (→176) depolymerisieren die Stärke des Mehls zu Dextrinen (α-Amylase), Maltose (β-Amylase) und schließlich zu Glucose. Sie haben damit Einfluss auf Teigbearbeitbarkeit, Aroma und Teigvolumen (Backhefe kann nur Di- und Monosaccharide vergären). Eine maltogene βAmylase aus Bacillus stearothermophilus hat sich als hervorragendes Hilfsmittel erwiesen, um das „Altbacken“ werden von Brot zu reduzieren und die Brotkruste länger rösch zu halten. Das Klebereiweiß (Gluten) des Getreides bindet bei der Teigbereitung einen Teil des Wassers und bildet ein Gel-Gerüst aus. Durch Zusatz von Proteasen kann man dieses partiell zerstören und damit die Dehnbarkeit des Teigs erhöhen – Voraussetzung für ein gutes Gasrückhaltevermögen für das CO2, das bei der Hefegärung den Teig auftreibt. Ein Übermaß an Proteasen führt allerdings zu einer Abnahme der viskoelastischen Eigenschaften des Klebers und damit zu einer Erweichung der Struktur. In der Praxis werden α-Amylasen aus Malz, Bacillen und Schimmelpilzen eingesetzt, aus letzteren auch Glucoamylasen (→176). Da alle Enzyme im Backprodukt verbleiben, werden gentechnisch erzeugte oder modifizierte Enzyme für diesen Anwendungsbereich nicht eingesetzt. Die Produktionsstämme züchtet man

auf Oberflächen- oder in Submerskulturen. Das Enzymprodukt, das Nebenaktivitäten enthält, wird beispielsweise durch Ausfällung isoliert, charakterisiert und in einer geeigneten Zubereitungsform mit stabilisierenden Zuschlagsstoffen, z. B. Puffersubstanzen, eingesetzt. Analysenmethoden. Anwendungstechnische Methoden stehen hierbei im Vordergrund. So wird beispielsweise die Gasbildung im Gärröhrchen und die Senkung der Viskosität mittels einer Fallzahlmethode bestimmt. Zur Bestimmung der Protease-Wirkung verwendet man Farinographen, Extensogramme oder Alveogramme, die alle Hinweise auf die viskoelastischen Eigenschaften des Klebers geben. Fleisch und Enzyme. Fleisch entsteht aus Muskel durch komplexe biochemische Vorgänge nach Beendigung der Sauerstoff-Zufuhr, wobei Proteasen (Cathepsine) eine wichtige Rolle spielen. Für den Verbraucher sind Saftigkeit, gute Kaubarkeit bei fester Struktur, Farbe und Geschmack die wichtigsten Qualitäts-Kriterien. In unserem Kulturkreis wird das Ablagern und Marinieren, bei manchen Naturvölkern das Einwickeln in Papayablätter oder Einlegen in Papaya- oder Ananassaft zum Zartmachen von Fleisch verwendet. Durch Besprühen von Fleisch mit Papain, der Sulfhydryl-Protease von Papaya, lässt sich dieser Effekt nachahmen. Alternativ kann man dem Schlachttier auch kurz vor oder nach der Tötung eine Lösung von inaktiviertem Papain injizieren; dessen mit H2O2 oxidierte Sulfhydryl-Gruppen werden im toten Fleisch durch Reduktion reaktiviert und bewirken einen partiellen Abbau von Muskelprotein.

Neue Enzyme für Lebensmittel und Tierfutter Allgemeines. Einige Enzyme haben in den letzten 10 Jahren zu bedeutenden neuen Anwendungen geführt. Dazu gehören Transglutaminase und Asparaginase, die beide in der Lebensmittel-Industrie eingesetzt werden. Futtermitteln setzt man häufig Phytase, Cellulasen (→182) und Xylanasen (→182) zu. Transglutaminase [EC2.3. 2. 13] bildet inter- oder intramolekulare Peptidbindungen aus zwischen Protein-gebundenen Acylgruppen und ε-Aminogruppen Protein-gebundener Lysine. Dabei entstehen Isopeptid-Bindungen. Factor XIII (→228) im Blutgerinnungssystem hat beispielsweise Transglutaminase-Aktivität: es trägt durch die Bildung von IsopeptidBindungen zur Verfestigung des Fibrin-Blutkuchens bei („Retraktionsphase“). Isopeptidbindungen verleihen einem Protein hohe Stabilität gegenüber Proteolyse. Ein mikrobielles Enzym aus einem GRAS Organismus, Streptomyces mobaraensis, katalysiert die gleiche Reaktion. Es wird in der Lebensmittelindustrie eingesetzt, um Textur und andere

Eigenschaften zu modifizieren. Die Einführung von Isopeptid-Bindungen führt beispielsweise zur Gelierung konzentrierter Lösungen von Soja- und Milchproteinen, aber auch von Gelatinen und Myosinen, die aus Abfällen der Fleischverarbeitung von Rind, Schwein, Huhn oder Fisch stammen. Auch zur Herstellung von Krebsfleisch-Imitat, von Fleischbällchen und „restrukturierten“ Fleischprodukten wie Schinken wird es benutzt. Ein kommerzielles Produkt ist Activa TG™ von Ajinomoto. Transglutaminasen sind Thiol-Enzyme und bilden Thioester als Intermediärverbindungen, die mit den ε-Aminogruppen Protein-gebundener Lysine abreagieren. Asparaginase [EC3.5.1.1]. Wenn Stärkereiche Nahrungsmittel beim Backen, Frittieren, Rösten oder Toasten stark erhitzt werden, reagieren einige der L-Asparaginase-Reste des Proteins über eine Maillard-Reaktion zu Acrylamid ab, einer potenziell carcinogenen Verbindung. Durch Zugabe von Asparaginase zu verarbeiteten Lebensmitteln werden viele der LAsparagin-Reste zu L-Asparaginsäure hydrdolysiert, die beim Erhitzen kein Acrylamid bildet. Da die Verarbeitung von Lebensmitteln meist bei erhöhter Temperatur erfolgt, sind für diesen Schritt Temperatur-stabile Asparaginasen erforderlich. Acrylaway HighT™ von Novozymes, eine kommerzielle L-Asparaginase, wurde aus dem anaeroben Tiefsee-Bakterium Pyrococcus furiosus isoliert, wird aber rekombinant in E. coli hergestellt. Phytate and Phytase. Phytate sind Salze von myo-Inosit Hexakisphosphat mit Kalium, Magnesium und Calcium. Sie dienen u. a. als Phosphat-Quelle bei der Reifung von Saatgut. Wiederkäuer schließen Phytat mit Hilfe von Phytasen auf, die von im Rumen lebenden Mikroorganismen (Mikrobiota) gebildet werden. Monogastrische Tiere wie Schweine oder Hühner produzieren keine Phytasen, sodass sie Phytate nicht als P-Quelle verwerten können. Da bis zu 80 % des Phosphatanteils in Futtermitteln als Phytat-Komplex vorliegt, kann ein Zusatz von Phytase zu Körner-basierten Futtermitteln deshalb die Verfügbarkeit von Phosphat und damit die Wachstumsgeschwindigkeit von monogastrischen Nutztieren erheblich steigern. Ein weiterer Effekt ist die Verringerung von Phytat-gebundenem Phosphat in der Gülle und damit eine Reduktion des Eutrophierungsrisikos von Gewässern. Phytasen wurden aus vielen Pflanzen und Mikroorganismen isoliert, und von einigen Phytasen liegen RöntgenstrukturModelle vor. Mechanistisch gehören sie zu den sauren Phosphatasen, im aktiven Zentrum sitzen Histidin und Asparaginsäure. Die meisten Phytasen hydrolysieren 5 der 6 Phosphatgruppen der Phytinsäure, allerdings mit verschiedenen Geschwindigkeiten. In der EC-Nomenklatur [EC3.1.3.n] werden sie aufgrund der zuerst gespaltenen Phosphatgruppe eingeteilt; die meisten gut charakterisierten Phytasen gehören zur Gruppe der 3- oder 4-Phytasen. Als Futtermittelzusatz kommen vorwiegend Pelletier-stabile Phytasen aus Pilzen wie Aspergillus oryzae oder Pichia pastoris zum Einsatz. Sie sind durch Screening oder protein engineering (→198) für eine schnelle Phosphat-Freisetzung sowie für eine Kurzzeit-Temperatur-Toleranz bis zu 95 °C optimiert. Cellulasen und Xylanasen. (→182) Cellulose und Xylane sind Bestandteile der Zellwand sowohl von „viskosen“ (Weizen, Roggen, Gerste) wie „nicht-viskosen“ Getreidearten (Mais und Sorghum). Ein Zusatz von Cellulasen und Xylanasen zu Getreidefutter führt bei monogastrischen Tieren wie Hühnern oder Schweinen zu einem besseren Aufschluss und schnellerer Freisetzung von Zuckern („Energie“) und Proteinen. Kommerzielle Xylanasen

(endo 1,4-β-Xylanase) werden meist aus Trichoderma reesei gewonnen und sind thermostabil genug, um die Pelletierung des Futters zu überstehen.

Enzyme zur Leder- und Textilbehandlung Allgemeines. Die Gewinnung von Leder aus Tierhäuten lässt sich bis zur Antike zurückverfolgen. Wegen der dabei eingesetzten aggressiven Hilfsstoffe wie Kalk, Alkali und Schwefel und der Verwendung von Kot und Urin als „Enzympräparat“ galt die Gerberei als unreines Gewerbe. Otto Röhm gelang es 1904, die wissenschaftlich-technischen Grundlagen für eine chemisch-enzymatische Lederbehandlung zu entwickeln und damit dieses Handwerk aufzuwerten. Proteasen zur Lederbehandlung werden heute in einem Umfang von mehreren 100 t (Welt) verwendet. Leder. Die tierische Haut besteht zu etwa 60–65 % aus Wasser, zu etwa 30 % aus Proteinen (davon > 90 % Collagen, daneben Keratin, Elastin und andere) und zu 2–10 % aus Fett. In die Epidermis (Oberhaut) sind Haarwurzeln, Fettund Schweißdrüsen eingelagert. Sie macht nur 1 % der Haut aus und wird weiter unterteilt in die nach außen gelegene Hornschicht (Stratum corneum), die Körnerschicht und die Schleimschicht. Die Cutis/das Corium (Lederhaut) macht 85 % der Hautdicke aus; sie besteht hauptsächlich aus der Papillarschicht mit CollagenFibrillen und der Retikularschicht, die aus Bindegewebe gebildet wird. Darunter liegt die Unterhaut, die etwa 15 % zur Hautdicke beiträgt und Binde-, Muskel- und Fettgewebe enthält. Leder ist die von Haaren, Fettgewebe, nichtfibrillärem Eiweiß („Narbenspalt“) und Wasser befreite und durch verschiedene Verfahrensschritte stabilisierte Lederhaut. Nichtstabilisierte Häute faulen in der Feuchtigkeit schnell durch Bakterienbefall und verlieren beim Trocknen ihre Geschmeidigkeit. Lederbehandlung und Enzymeinsatz. Unmittelbar nach der Gewinnung werden die Häute durch Wasserentzug konserviert (z. B. durch Salzen), um einen mikrobiellen Angriff zu verhindern. Darauf folgen in der sog. „Wasserwerkstatt“ mehrere Schritte: Bei der Weiche werden durch Zusatz von Wasser, Tensiden und Reduktionsmitteln Blut, Schmutz, Salz, Fettrückstände und nichtfibrilläres Eiweiß entfernt. Die Lederhaut nimmt dabei wieder Wasser auf. Proteolytische Enzyme unterstützen die Weichwirkung ganz wesentlich. Dabei werden auch Pigmentzellen, Fettund Schweißdrüsen der Haut („Grund und Gneist“) entfernt – Voraussetzung für die Gewinnung hochwertigen „Anilinleders“ mit klarem Narbenbild. Die verwendeten Enzyme müssen eine hohe proteolytische Aktivität aufweisen, dürfen aber Collagen nicht angreifen. Trypsin (Pankreasextrakt) und Proteasen aus Bacillus subtilis (→20) oder Aspergillus sojae (→16) sind hierfür besonders geeignet. Im Äscher werden Epidermis und Haare entfernt und durch alkalische Schwellung für die Gerbung aufgeschlossen. Kalk und Natriumsulfid sind dafür besonders geeignet und wurden früher mit der Hand auf der Fleischseite aufgetragen. Heute verwendet man stark alkalische Rezepturen von Calciumhydroxyd und Natriumsulfid sowie alkalistabile Proteasen, z. B. aus Bacillus alkalophilus. In der anschließenden Beize wird mit Ammonium-Salzen oder organischen Säuren „entkälkt“. Dabei helfen Pankreasenzyme, neutrale und alkalische Bakterien- und Pilzproteasen, nicht-collagenes Resteiweiß zu entfernen und das Collagen für die Färbung zu lockern. Auch zur Lockerung chromgegerbter Leder („wet-blue“) setzt man Pilzproteasen ein. Versuche, Weiche, Äscher und Beize in einem Arbeitsgang mit intensiver Enzymbehandlung zusammenzufassen, waren bisher nicht erfolgreich. Die Zahl der Arbeitsgänge, die

Behandlungsdauer und den Wasserverbrauch reduzierte man aber durch den Einsatz von Enzymen jeweils um ca. 50 %. Behandlung von Textilien. Das Weben von Textilien ist mit einer starken mechanischen Beanspruchung verbunden. Um das Reißen der Ketten-Fäden zu verhindern, werden diese meist mit einer „Schlichte“ verbunden; aus Kostengründen wählt man dafür meist Stärke. Vor dem nachfolgenden Färben, Bleichen oder Ausrüsten muss diese Schlichte wieder entfernt werden. Bei der Stärke-Entschlichtung verwendet man dafür α-Amylase (→176), die heute in der Regel aus Bacillus-Stämmen gewonnen wird. Mit „stone wash“-Verfahren wird Textilien, beispielsweise Jeans, ein gebleichter, gealterter Anschein gegeben. Anstelle von Bimsstein setzt man zu diesem Zweck heute Aspergillus-Cellulasen ein – die Küpen-Farbstoffe werden auf diesem Weg zwar partiell entfernt, das Gewebe aber nur wenig angegriffen. Cellulasen werden auch zum „Depilieren“ überstehender Cellulose-Fasern eingesetzt (BioBlast®) (→174).

Neue Wege zu technischen Enzymen Allgemeines. Die Gewinnung neuer Enzyme für die Technik hat durch verbesserte ScreeningMethoden (→22), gentechnische Übertragung in einfacher zu handhabende Produktionsorganismen, gentechnische Ausbeutesteigerung und die Erschließung synthetischer Stoffwechselwege einen hohen Stand erreicht. Trotzdem setzen sich enzymtechnologische Verfahren nur langsam gegenüber chemischen Synthesen durch. Zum einen stehen für wichtige Reaktionstypen, z. B. für die Bindung von C-C-Verknüpfungen ohne Verwendung kostspieliger biochemischer Cofaktoren, nur wenige Enzyme zur Verfügung (z. B. Aldolasen), zum anderen ist der Zeitbedarf für die Entwicklung und Optimierung eines neuen Enzyms oft zu hoch, um Synthese-Verfahren für GMP-attestierte Stoffsynthesen für die Pharma- und Agrochemie rechtzeitig festzuschreiben (→334). Aktuelle Konzepte, um dieses Defizit zu beseitigen, sind: a) das rationale Protein Design (→198), b) die gerichtete Evolution (→198) technisch besser geeigneter Enzyme und c) neue Methoden zur Erschließung der großen natürlichen Diversität von Enzymen, z. B. aus dem Metagenom (→74). Neue Standorte. Lebewesen besiedeln sehr unterschiedliche Lebensräume (ökologische Nischen) und haben dabei Enzyme evolviert, die diesen Umweltbedingungen angepasst sind. Mikroorganismen sind besonders vielseitig in der Adaptation an ein weites Spektrum von pHBereichen, Temperaturen, osmotischen Bedingungen und anderen Gegebenheiten. Ein systematisches Screening in ungewöhnlichen Lebensräumen (hochalkalische oder stark saure Standorte, Tiefsee-Sedimente, heiße oberirdische oder Tiefsee-Quellen, Salzwüsten usw.)

erlaubten es, eine große Zahl neuer Mikroorganismen zu identifizieren und aus ihnen neuartige Enzyme zu isolieren. Beispielsweise stammt die für die PCR-Reaktion meist verwendete DNA-Polymerase I (Taq-Polymerase) aus dem thermophilen Prokaryonten Thermus aqaticus, der aus dem 90 °C heißen Geysir Old Faithful des Yellowstone-Parks isoliert wurde. Tauchboot-Expeditionen an heißen Quellen im Sediment des Mittelmeers bei ca. 1500 m Tiefe („hydrothermal vents“) ermöglichten die Isolierung bisher unbekannter Mikroorganismen aus der Gruppe der Archaebakterien, deren DNAPolymerasen aufgrund der extremen Umweltbedingungen (110 °C bei 150 bar) eine noch wesentlich bessere Qualitätskontrolle bei der Replikation aufweisen. Einige dieser Enzyme sind mittlerweile im Handel (z. B. die Pfuund die Tma-Polymerase) (→50). Neue Screening-Methoden. Neben dem traditionellen Screening ermöglichen die gentechnische Modifikation von Enzymen durch Protein Design (→198) oder gerichtete Evolution die Optimierung von Enzymen für technische Anwendungen. Besonders die gerichtete Evolution erlaubt es, die Stabilität von Enzymen (Temperatur-, Alkali-, pHStabilität) zu optimieren. Auch die Flut neuer Gensequenzen für Enzyme aus Genom- und Metagenom-Analysen und die Bioinformatik eröffnen vielfältige Möglichkeiten für ein beschleunigtes Screening nach neuen Enzymen. So wurden in den bereits vollständig sequenzierten Genomen von mehreren 1000 Mikroorganismen aufgrund von Sequenzinformationen (Homologie zu Enzymen bekannter Funktion) tausende neuer Enzyme mit unbekannter Spezifität identifiziert. Sie lassen sich mittels PCRMethoden relativ einfach isolieren. Die Suche nach deren natürlichem Substrat kann sich allerdings als schwierig erweisen. Eine Analyse der Bakterien-Diversität auf der Grundlage konservierter Bereiche in der 16S-rRNA erlaubt die Abschätzung, dass bisher weniger als 1 % aller Mikroorganismen kultiviert und klassifiziert werden konnten (→74). Man versucht deshalb auch, Enzyme bisher nicht-kultivierter Mikroorganismen durch Isolierung und Expression von DNA-Fragmenten aus dem Metagenom von Umweltproben zu erhalten. Dies erfordert eine schonende Isolierung von DNA, ihre enzymatische Zerlegung in Fragmente gut exprimierbarer Größe, die Expression in geeigneten Wirtsorganismen und ihre Funktionsanalyse oder Sequenzanalyse. Auch Methoden der Bioinformatik (→324) können dabei helfen, Enzyme für technische Zwecke zu selektionieren: aus den in Genbanken abgelegten Sequenzen einer Enzym-Familie lassen sich unter Verwendung bekannter Raum-Strukturen dieser Familie Enzym-Modelle am Computer herstellen und mit dem gewünschten Substrat für die Umsetzung docken. Man erhält so Vorschläge, welches Enzym dieser Familie der beste Kandidat für eine experimentelle Bearbeitung ist.

Protein Design Allgemeines. Unter Protein Design oder Protein Engineering versteht man die willkürliche Änderung einer Proteinsequenz mit gentechnischen Methoden. Man will damit 1. Hinweise auf den katalytischen Mechanismus eines Enzyms erhalten, 2. Bindungsstellen für Substrate oder Antigene gezielt modifizieren, oder 3. globale Eigenschaften eines Proteins (Temperatur-, pH-, Protease-Stabilität, Allergenität, Löslichkeit) verändern. Geht man dabei von einer bekannten Proteinstruktur aus und verändert gezielt einzelne Aminosäuren oder Sequenzabschnitte, so spricht man von rationalem Protein Design. Führt man dagegen einen Zufalls-gesteuerten Austausch von Aminosäuren durch und selektiert die „Treffer“, so spricht man von gerichteter

Evolution. Allgemeine Methoden. Für beide Methoden wird das für das Protein codierende Gen, Methoden zu seiner Mutagenese und ein für die Expression der Mutanten geeignetes Wirtssystem benötigt. Beim rationalen Protein Design benötigt man darüber hinaus StrukturInformationen (→28), z. B. in Form einer Kristallstrukturanalyse, eines NMR-Strukturmodells oder eines Strukturmodells, das mit den Methoden der Bioinformatik aus HomologieBetrachtungen zu bereits bekannten Raumstrukturen abgeleitet wurde. Mutagenese. Für den spezifischen Austausch einzelner Aminosäuren oder die Deletion einer Aminosäure-Sequenz beim rationalen Protein Design verwendet man heute meist PCRMethoden (→52). Es stehen zahlreiche Protokolle zur Verfügung, die die gewünschten Modifikationen schnell, einfach und zuverlässig bewerkstelligen. Für die Zufalls-Mutagenese kloniert man das Gen in einen in seiner DNAReparatur geschädigten E. coli-Wirtsstamm ein und kultiviert unter Mutations-auslösenden Bedingungen. Alternativ erzeugt man bei der PCRReaktion z. B. durch Zugabe von Mn2+-Ionen und veränderte Reaktionsbedingungen eine künstlich hohe Fehlerrate bei der Amplifikation einer DNA (1–3 %). Das gene shuffling beruht auf dem Konzept, homologe Gene (Voraussetzung: Sequenzidentität > 80 %) enzymatisch in kleinere Abschnitte zu zerlegen und diese statistisch mit PCR-Methoden zu rekombinieren. Rationales Protein-Design. Die Raumstruktur des Proteins erhält man entweder aus einer Datenbank oder ermittelt sie selbst durch röntgenkristallographische oder NMRUntersuchungen. 2014 waren die Raumstrukturen von > 100 000 Proteinen in der ProteinDataBase (PDB) abgelegt. Bei Proteinen unbekannter Struktur, aber mit einer Sequenzhomologie von > 30 % zu Proteinen, deren Struktur bekannt ist, kann man durch Modellierung der unbekannten an der bekannten Struktur ein Näherungsmodell für das bearbeitete Protein ermitteln (molecular modelling). Bis vor kurzem waren derartige Simulationen nur als Näherungsrechnungen im Vakuum möglich. Mit heutigen Supercomputern und Rechnerclustern ist es dagegen möglich, Proteinstrukturen und ihre Wechselwirkung mit Substraten oder Antigenen auch in Wasser zu berechnen. Derartige molekülmechanischen Kraftfeld-Berechnungen erfordern oft die Berechnung von einigen zehntausend Atomen. Die Ergebnisse solcher „in-silico“-Methoden müssen immer durch mehrfache Zyklen von Simulation und Validierung durch gentechnische Experimente validiert werden („protein engineering cycle“). Protein-Design wird häufig mit der Permutation aller proteinogenen Aminosäuren verbunden, die aufgrund von Strukturmodellen oder Analogiebetrachtungen als Substratbindestellen in Betracht kommen („Sättigungsmutagenese“ weniger Positionen). Gerichtete Evolution. Im Gegensatz zum rationalen Protein Design sind hierfür Strukturmodelle nicht erforderlich. Im Fall von Enzymen unterwirft man das kodierende Gen einer Zufallsmutagenese und prüft die entstehenden Protein-Varianten mit einem schnellen Funktionstest auf Verbesserungen. Für die Optimierung der Bindungseigenschaften von Antikörpern hat sich die phage display-Technik (→244) bewährt, die das schnelle Screening großer (1010) Mutanten-Bibliotheken erlaubt. In beiden Fällen entscheidet die Qualität des meist im Hochdurchsatz-Screening verwendeten Assays über den Erfolg. In den letzten Jahren

erzielte man mit gerichteter Evolution hervorragende Ergebnisse bei der Verbesserung industrieller Enzyme: man veränderte erfolgreich die Substratspezifität, die Thermo- und Alkalistabilität. Zum Hochdurchsatzscreening verwendet man in aller Regel Roboterunterstützte Pipettier-Straßen (→310).

Antibiotika Antibiotika: Vorkommen und Anwendungen Allgemeines. 1928 entdeckte Alexander Fleming auf einer Staphylococcen-Kultur eine Pilzinfektion, die das Wachstum der Staphylococcen hemmte. Die Reinigung des dafür verantwortlichen Antibiotika-Gemischs und die Strukturaufklärung von Penicillin gelang mehr als 10 Jahre später Howard Florey. Erfolgreiche Tierversuche und Therapieerfolge bei einem an einer Streptokokken-Infektion erkrankten Patienten lösten ein britisch-amerikanisches Großprojekt aus, das im Schatten des 2. Weltkriegs stand. 1945 konnte Benzyl-Penicillin bereits in kg-Mengen hergestellt werden. Es wirkt allerdings nur gegen Gram-positive Mikroorganismen. 1947 fand Selman Waksman in einer Kultur von Streptomyces griseus ein auch gegen Gram-negative Erreger wirksames Antibiotikum (A.), das Streptomycin. In den folgenden Jahren wurden durch systematisches Screening zahlreiche neue A. entdeckt und die technologischen Voraussetzungen für eine industrielle Herstellung geschaffen. Der unkritische Einsatz bei Bagatellerkrankungen und bei der Massentierhaltung beschleunigte das Auftreten A.-resistenter Krankheitserreger (→204), die man mit der Entwicklung neuer A. und durch Zulassungsbeschränkungen auf definierte Einsatzgebiete einzudämmen versucht. Durch Screening, Zellfusion verschiedener Antibiotika-Bildner, kombinatorische Biosynthese oder chemische Modifikation von bereits bekannten, aus ökonomischen Gründen nicht zur Industriereife entwickelten Leitstrukturen sucht man derzeit sowohl neue Antibiotika wie auch neue systematische Ansatzpunkte für die Verbesserung bekannter antimikrobieller Wirkstoffe. Antibiotika als bioaktive Wirkstoffe. Antibiotika gehören zur großen Gruppe der sogenannten Sekundär-Metabolite (→36), die zwar aus Bausteinen des Zentralstoffwechsels gebildet werden, aber häufig komplex aufgebaut sind (mittleres Molgewicht 400–600). Sie dienen dem Organismus zur Verteidigung, Regulation und Kommunikation. Sie übernehmen Aufgaben z. B. als Enzym-Inhibitoren, Hormone, Pheromone, Farbstoffe oder Toxine. Bisher wurden über 500 000 bioaktive Naturstoffe aufgefunden, die meisten davon in höheren Pflanzen. Die antimikrobielle Wirkung von bisher etwa 30 000 dieser Verbindungen ist dabei nur ein Aspekt ihrer Funktionen; tatsächlich zeigen mehr als die Hälfte aller Antibiotika auch andere biologische Funktionen. Vorkommen. Bis heute wurden etwa 10 000 A. aus Mikroorganismen, weitere 10 000 aus Basidiomyceten und niederen Pilzen und weitere 10 000 aus höheren Organismen wie Flechten, Landtieren und marinen Invertebraten, vor allem aber aus Pflanzen isoliert. Actinomyceten und Pilze sind die mit Abstand vielseitigsten A.-Bildner. Anwendungen. Industriell hergestellt werden etwa 300 A.; bei den meisten handelt es sich um halbsynthetische A., in denen die ursprünglich gefundene biologisch aktive Leitstruktur mit chemischen oder biotechnologischen Methoden variiert wird. Die β-Lactam-A (→206). (Penicilline und Cephalosporine) tragen bei einem geschätzten Weltmarkt von > 42 Mrd. US-$

(2009) und > 50 000 t etwa die Hälfte zum Wert und 2/3 zur Menge bei. Die meisten A. werden als antimikrobielle Wirkstoffe für die Chemotherapie hergestellt. Dabei unterscheidet man Breitband-A. mit einem großen Wirkungsspektrum gegen verschiedenste Krankheitserreger (Beispiel: Cephalosporine, Tetracycline) im Gegensatz zu selektiven A., die gegen ganz bestimmte Erreger wirken (Beispiel: Rifampicin bei Lungentuberkulose, Amphotericin B bei Pilzerkrankungen). Antitumor-A. werden als Cytostatika eingesetzt; ihre Toxizität ist erheblich. Ein Beispiel ist Adriamycin. Pflanzenschutz-A. wirken meist in geringeren Konzentrationen als Pestizide und weisen gegenüber Warmblütlern eine geringe Toxizität auf. Beispiele sind Blasticidin S und Kasugamycin. Nur wenige A. (Pimaricin, Nisin) werden zur Lebensmittelkonservierung eingesetzt, z. B. Pimaricin bei der Käseherstellung gegen PilzBefall. Fütterungs-A. führen zu einer besseren Futterverwertung und schnelleren Gewichtszunahme bei der Massentierhaltung. Um Kreuzresistenzen gegenüber klinisch verwendeten Antibiotika zurückzudrängen, favorisiert man heute ausschließlich für diesen Zweck entwickelte A. (Beispiel: Monensin in der Geflügelmast). In der biochemischen und molekularbiologischen Forschung dienen A. als selektive Inhibitoren für die verschiedensten Zellfunktionen.

Antibiotika: Screening, Herstellung und Wirkungsmechanismus Screening. Zum Antibiotika-Screening wird die Wachstumshemmung von Mikroorganismen in Gegenwart des Teststamms oder seines Kulturfiltrats verwendet. Liegt eine interessante biologische Aktivität vor, so erfolgt die Reinigung und Strukturaufklärung des Antibiotikums (A.). Dabei werden heute in der großen Mehrzahl aller Fälle bereits bekannte Strukturen wiederentdeckt. Um die Treffer-quote zu erhöhen, sucht man deshalb intensiv nach neuen Screening-Methoden, z. B. durch Verwendung anders gestalteter biochemischer oder biologischer Assays, chemisch-analytischer Screeningverfahren oder Target-orientierter Methoden (Vorlage mikrobiologischer Angriffsziele und deren biochemische Durchmusterung mit Bibliotheken synthetischer Verbindungen oder mit Naturstoffen).

Stammverbesserung. Ist eine Weiterbearbeitung vielversprechend, so müssen frühzeitig Maßnahmen zur Ausbeute-Verbesserung des Produktionsstamms eingeleitet werden, da A. als Metabolite des Sekundär-Stoffwechsels in sehr niedrigen Konzentrationen gebildet werden (einige mg/L Kulturlösung oder weniger). Die Stammverbesserung erfolgt meist empirisch durch arbeitsintensive Wiederholungen von Mutations- und Selektionsverfahren, wobei gelegentliche Rückkreuzungen zu robusteren Produktionsstämmen führen. Mit derartigen Methoden konnte die Ausbeute vieler wichtiger Antibiotika auf das 103–106-fache des Wildstamms gesteigert werden. Gentechnische Methoden, beispielsweise die Erhöhung der Genkopien (→62) von Schlüsselenzymen bei der Biosynthese des gewünschten Antibiotikums, führten ebenfalls zu Ausbeuteerhöhungen. Fermentation und Aufarbeitung. Der chemische Aufbau der meisten A. ist komplex. Sie enthalten in der Regel mehrere Stereozentren, wodurch chemische Syntheseverfahren äußerst aufwändig werden und in vielen Fällen als Spitzenleistungen der Synthese-Chemie gewürdigt wurden. Die industrielle Herstellung der meisten A. erfolgt deshalb durch Fermentationsverfahren im Bioreaktor. Als Nährmedium (→88) werden preiswerte Cund NQuellen wie Melasse, Lactose, Sojamehl und Maisquellwasser verwendet. Da die meisten A.Bildner einer Katabolit-Repression unterliegen, wird die C-Quelle meist zudosiert (→92). Dienen Pilze oder Actinomyceten als Produktionsorganismen, so muss neben der üblichen Optimierung des Nährmediums vor allem der guten O2-Versorgung der als Mycel wachsenden und scherempfindlichen Zellen Rechnung getragen werden. A. sind meist sekundäre Stoffwechselprodukte, deren Bildung erst erfolgt, wenn die Zellen bereits die stationäre Wachstumsphase erreicht haben (→90). Im Regelfall sind A. extrazelluläre Produkte des aeroben Stoffwechsels und meist nur mäßig wasserlöslich. Sie werden am Ende der Fermentation gewonnen, indem man die Zellmasse abtrennt, die Nährlösung mit Lösemitteln extrahiert (→104) (diese beiden Schritte können auch kombiniert werden) und die Rohprodukte durch Kristallisation oder chromatographische Verfahren reinigt. Die Herstellung, Reinigung und Konfektionierung medizinisch verwendeter A. unterliegt umfangreichen Sicherheitskontrollen nach zertifizierten Richtlinien (GMP, ISO 9000). Wirkungsmechanismus. A. können einwirken 1. auf die Biosynthese und Funktion des genetischen Materials, 2. auf die Biosynthese von Zellbausteinen, 3. auf die Biosynthese und Funktion von Proteinen, 4. auf die Biosynthese und Funktion der Cytoplasma-Membran oder, bei Gram-negativen Bakterien, der äußeren Zell-Membran, und 5. auf die Biosynthese der Zellwand. Die Wechselwirkungen sind dabei äußerst vielseitig. Als Teil ihres genetisch programmierten Anpassungsmechanismus an wechselnde Umweltbedingungen und ihrer kurzen Generationszeit werden Mikroorganismen leicht resistent gegen A., sodass ein ständiger Wettlauf von A.-Entwicklung und dem Auftreten resistenter Keime zu beobachten ist. Target-Screening. Die Genomsequenz von über 2000 Mikroorganismen ist mittlerweile bekannt (2014), darunter sind auch viele Pathogene. In der Hoffnung, in den Genomen pathogener Mikroorganismen spezifische Ziele (targets) für die Entwicklung synthetischer Wirkstoffe zu finden, erforschte man 7 Jahre lang die Wirkung von Millionen von WirkstoffKandidaten auf 300 Kandidaten-Zielproteine im Hochdurchsatz-Screening, fand

dabei aber nur 5 geeignete Leitstrukturen.

Antibiotika-Resistenz Resistenz. Die Verbreitung Antibiotikaresistenter Mikroorganismen ist ein großes medizinisches Problem; multiresistente (d. h. gegen zahlreiche A. resistente) Stämme von Salmonella, Escherichia coli, Streptococcen, Staphylococcen und neuerdings auch des Tuberkulose-Erregers Mycobacterium tuberculosis nehmen teilweise dramatisch zu: die Zahl der mit dem ruhenden Erreger belasteten Menschen wird auf knapp 2 Mrd. geschätzt. Mehr als 70 % aller pathogenen Bakterien tragen heute Resistenzen gegen die Mehrzahl der klinisch genutzten Antibiotika, die Zahl der weltweiten Todesfälle beträgt etwa 2 Millionen Menschen (2013), und die Sterblichkeit bei schweren Infektionen mit Meticillin-resistenten Staphylococcus aureus Stämmen (MRSA) oder Carbapenem-resistenten Enterobakterien (CRE) liegt bei 20 bzw. 40 %. Weltweit sind deshalb heute Überwachungssysteme eingerichtet, um die Ausbreitung von Resistenzen zu verfolgen: in Europa das European Antibiotic Resistance Surveillance System (EARSS), in den USA das National Antimicrobial Resistance Monitoring System (NARMS) der FDA. Resistenz-Mechanismen sind genetisch codiert, und Resistenz-Gene können über Plasmide, Phagen oder Transposons zwischen verschiedenen Mikroorganismen übertragen werden. Neben der Entwicklung neuer A. wird deshalb auch ihr gezielterer Einsatz gefordert: so sind in den Industrieländern bereits viele früher in der Massentierhaltung zur Wachstumsverbesserung und Prophylaxe eingesetzten A. verboten, weil sie sehr wahrscheinlich auch Resistenz gegen medizinisch verwendete A. auslösen können („Multiresistenz“). Resistenz-Mechanismen. Die wichtigsten Resistenz-Mechanismen sind a) eine Störung der Aufnahme oder schneller Export des Antibiotikums (z. B. durch Modulation der Membranpermeabilität), b) der Umbau des Targets (z. B. durch Variation der Bindungsstelle am Ribosom oder der DNA), und c) eine enzymatische Modifikation des Antibiotikums. Auf der Ebene mikrobieller Lebensgemeinschaften in Biofilmen, wie sie im gastrointestinalen Trakt, in Kläranlagen und in der Umwelt vorkommen, besteht ein weiterer Mechanismus im Quorum Sensing zur Informationsübertragung über chemische Signalstoffe, der zum „Anschalten“ von Resistenz-Mechanismen führen kann. Bei Antibiotika, die nur an einem Target angreifen (z. B. Makrolide), beobachtet man eine schnellere Resistenzbildung als bei solchen, die mehrere Angriffsorte haben (z. B. Glykolipid-Antibiotika). Bei der Entwicklung neuer Antibiotika versucht man deshalb, eine Resistenzbildung zu umgehen oder wenigstens zu verlangsamen. Dies kann gelingen durch chemische Optimierung der Grundstruktur des Wirkstoffgerüsts, entweder mit Methoden der synthetischen Chemie oder durch precursordirigierte oder kombinatorische Biosynthese (→220). Klinische Aspekte. Krankenhausinfektionen („nosokomiale Infektionen“) sind häufige und gefürchtete Ereignisse, denen man durch rigo-rose Hygiene-Maßnahmen, medizinische Leitlinien zur Auswahl von Antibiotika, aber auch durch eine Schnelldiagnostik multiresistenter Keime bei neu aufgenommenen Patienten vorzubeugen versucht. Wichtige Maßnahmen sind dabei vor allem Tests auf Meticillinresistenten S. aureus (MRSA), Carbapenemresistente Enterobakterien (CRE), ferner auf Mycobakterium tuberculosis, Clostridium difficile, Rifampicin-resistente Keime und auf infektiöse Viren (Norovirus,

Adenovirus). Diagnostische Methoden. Der Nachweis einer A.-Resistenz erfolgt traditionell durch Kultivierung des Erregers in einem mikrobiologischen Labor. Dabei isoliert man in einem ersten Schritt den verdächtigen Keim auf einem selektiven Nähragar und prüft dann im AgarHemmtest seine Wachstumsfähigkeit in Gegenwart von Teststreifen, die mit verschiedenen Antibiotika getränkt sind (→202). Diese Methode benötigt trotz zahlreicher Automatisierungsschritte noch mindestens 2 Tage, was bei akuten Infektionen in der Klinik kritisch sein kann und auch bei der Einweisung neuer Patienten keine Vorab-Diagnose erlaubt. Wesentlich schnellere Ergebnisse erhält man mit RT-PCR-Methoden nach Isolierung der DNA des Verdachtkeims (→302). Zur Durchführung dieser molekulargenetischen Tests gibt es mittlerweile vollautomatische Geräte, in deren Kartuschen die Isolierung der DNA, PCRAmplifikation der relevanten DNA-Abschnitte mit Hilfe von primern, quantitative Bestimmung der Amplikons und bioinformatische Auswertung der Ergebnisse in weniger als zwei Stunden erfolgt.

β-Lactam-Antibiotika: Struktur, Biosynthese und Wirkungsmechanismus Allgemeines. Aufgrund ihrer hohen Wirksamkeit, ihrer geringen Toxizität und der Möglichkeit, sie mit chemischen und enzymatischen Methoden zu derivatisieren, sind β-Lactam-Antibiotika (Pename: Penicillin-Derivate. Cepheme: Cephalosporin-Derivate) die mengen- und wertmäßig wichtigsten Anti-biotika. Die weltweit produzierte Menge liegt über 60 000 t. Cephalosporine (C.) machen etwa 50 % des gesamten Antibiotika-Marktes aus. Sie werden nur in der Humantherapie eingesetzt, Penicilline (P.) finden dagegen auch in der Veterinärmedizin Verwendung. Wichtigste Primärprodukte sind Penicillin G und Cephalosporin C, aus denen halbsynthetische P. und C. hergestellt werden. Durch Veränderungen am Molekül kann man sowohl das Wirkungsspektrum wie auch die pharmakologischen Eigenschaften verändern. Weitere Kriterien sind die für eine orale Verabreichung (Magen-passage) erforderliche Säurefestigkeit und die Stabilität gegen das Plasmid-kodierte Enzym β-Lactamase, das Hauptenzym der bakteriellen Lactam-Resistenz. Penicilline. Penicillium chrysogenum (→16) bildet als Primärprodukt Isopenicillin N, das als Seitenkette eine nichtproteinogene Aminosäure (l-α-Aminoadipinsäure) enthält. Gibt man in der späten Wachstumsphase von P. chrysogenum Säuren vom Typ Phenylessigsäure zum Kulturmedium, so katalysiert eine N-Acyltransferase deren Einbau zu biosynthetischen

Penicillinen, die veränderte pharmakologische Eigenschaften aufweisen. So entsteht beispielsweise bei der Zufütterung von Phenoxyessisgsäure zu Kulturen von P. chroysogenum Penicillin V (Phenoxymethyl-penicillin), das säurestabil ist und deshalb oral verabreicht werden kann. Penicillin G und die daraus hergestellte 6-Aminopenicillansäure (6-APA) sind wichtige Zwischenprodukte für die Synthese halbsynthetischer Penicilline und Cephalosporine. Cephalosporine. Von Acremonium chrysogenum (früher Cephalosporium acremonium) gebildet, wurde Cephalosporin C 1953 als neuer Typ eines β-Lactam-Antibiotikums identifiziert. A. chrysogenum verfügt nicht über eine N-Acyltransferase, sodass im Gegensatz zur Penicillin-Biosynthese keine Möglichkeit besteht, durch Zufütterung von Vorstufen biosynthetische C. zu erhalten. Halbsynthetische C. werden deshalb ausschließlich aus den Intermediärprodukten 7-Aminocephalosporansäure (7-ACA) und dessen 3-Desacetoxy-Derivat (7-ADCA) hergestellt. Man unterscheidet derzeit drei Generationen von C., die sich vor allem durch ihre biologische Wirksamkeit unterscheiden. Vertreter der 2. und 3. Generation weisen eine hervorragende Breitband-Wirkung gegenüber zahlreichen Gram-positiven und Gramnegativen Pathogenen bei guter Verträglichkeit auf. Sie sind deshalb die heute wichtigste Gruppe der β-Lactam-Antibiotika. Biosynthese. P. chrysogenum enthält drei für die Synthese von Isopenicillin N verantwortliche Gene, die als Gencluster vorliegen. Die Bausteine L-α-Aminoadipinsäure, L-Valin und LCystein werden durch eine einzige Synthase zu einem Tripeptid verknüpft, das durch eine zweite Synthase zum bicyclischen Isopenicillin N umgewandelt wird. Schließlich erfolgt durch Acyl-CoA:Isopenicillin-N-Acyltransferase der Austausch der L-α-Aminoadipyl-Seitenkette gegen andere Acyl-Gruppen. Der Biosyntheseweg ist kompartimentiert. C. entstehen aus intermediärem Isopenicillin N nach Epimerisierung der Seitenkette und enzymkatalysierte oxidative Ringerweiterung (Expandase), gefolgt von Reaktionen an Substituenten des Lactamund Thiazin-Rings. Die O-Acyltransferase aus A. chrysogenum erlaubt Modifikationsreaktionen an der 3-Acetoxymethyl-Gruppe, nicht jedoch an der N-Acyl-aminoGruppe. Im Gegensatz zu P. chrysogenum sind die 6 Gene für die Biosynthese von Cephalosporin C in zwei verschiedenen Gen-Clustern gruppiert. Ihre Transkription ist stark reguliert. Die an der Biosynthese beteiligten Gene wurden kloniert und erleichtern die gezielte Beeinflussung der Biosynthese zur Ausbeute-Erhöhung. Wirkungsmechanismus. β-Lactam-Antibiotika verhindern die Bildung der PeptidQuervernetzungen in der bakteriellen Zellwand (Murein) (→202, 204). Sie wirken damit spezifisch auf Prokaryonten mit Mureinhaltiger Zellwand. Unerwünschte Nebenwirkungen beim Menschen beschränken sich deshalb auf Störungen der Darmflora und auf allergische Reaktionen.

β-Lactam-Antibiotika: Herstellung

Herstellung von Penicillinen. Der Penam-Ring der Penicilline enthält 3 Stereozentren, und nur eines der 8 möglichen Stereoisomere (3(S):5(R):6(R)) ist biologisch aktiv. Im Vergleich zur chemischen Synthese ist die Herstellung durch Fermentation mit optimierten Hochleistungsstämme wesentlich kostengünstiger. β-Lactam-Antibiotika werden sowohl von Bakterien wie von Pilzen gebildet, technisch durchgesetzt haben sich aber Pilze als Produktionsstämme. Mit Penicillium chrysogenum (→16) erhält man nicht nur Isopenicillin N, sondern durch Zugabe aliphatischer oder aromatischer Carbonsäuren zum Medium auch biosynthetische Penicilline, unter denen Penicillin G und V die größte Bedeutung haben. Penicillin G dient zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure (6-APA), einem wichtigen Zwischenprodukt für die Synthese halbsynthetischer Penicilline und Cephalosporine. Penicillin G und 6-APA. Industriell stellt man Penicillin G mit Hochleistungsstämmen von P. chrysogenum in Bioreaktoren (→92) von bis zu 200 m3 Arbeitsvolumen her. Zur Umgehung der Katabolitrepression werden Zulaufverfahren eingesetzt. Die Sauerstoffversorgung (→94) ist kritisch und erfordert wegen der Bildung von viskosem, scherempfindlichen Pilzmycel eine sorgfältige Optimierung von Rührer und Belüftung. Das komplexe Nährmedium (→88) enthält als C-Quelle Glucose oder Saccharose, als N-Quelle Maisquellwasser. Die AntibiotikaBildung erfolgt erst nach Abschluss der Wachstumsphase, die etwa 40 h dauert. Während der Produktionsphase von ca. 100 h füttert man Phenylessigsäure zu. Penicillin G wird ins Nährmedium ausgeschieden. Nach Abtrennung des Mycels durch Filtration oder Zentrifugation erfolgt die Aufarbeitung des Filtrats innerhalb weniger Minuten durch zweistufige Extraktion (→104) mit Amyl- oder Butylacetat bei pH 2,5–3,0 und 0–3 °C. Durch Direktextraktion der Fermentationsbrühe mit zwei im Gegenstrom arbeitenden Extraktionsdekantern lassen sich beide Schritte zusammenfassen. Das Rohprodukt (3 t/d im Fall eines 110 m3-Bioreaktors) wird durch Umkristallisieren gereinigt. Durch schonende chemische Hydrolyse erhält man 6-APA, ein wichtiges Ausgangsprodukt zur Herstellung halbsynthetischer Penicilline und vieler Cephalosporine. Heute wird es allerdings kaum noch chemisch, sondern im Maßstab von mehreren tausend Tonnen durch enzymatische Hydrolyse von Penicillin G mit immobilisierter Penicillin-G-Amidase aus E. coli bei 35–40 °C und pH 7,5–8,0 hergestellt. Die Fahrweise ist meist diskontinuierlich, die Stabilität des Enzyms erlaubt eine bis zu 1000fache Wiederverwendung. Ausfällung, Filtration und Waschen führt zu einem sehr reinen Produkt, das entweder durch chemische Acylierung in 6-Position zu halbsynthetischen Penicillinen oder durch chemische Ringerweiterung zu 7-ADCA, dem Grundkörper der Cephalosporine, weiterverarbeitet wird. Cephalosporine und 7-A(D)CA. Die fermentative Herstellung von Cephalosporin C mit Acremonium chrysogenum ähnelt dem Verfahren zur Herstellung von Penicillin, verläuft aber mit etwas schlechteren Ausbeuten. Da A. chrysogenum keine N-Acyltransferase enthält, werden alle halbsynthetischen Cephalosporine über die Intermediärprodukte 7Aminocephalosporansäure (7-ACA) oder deren Desacetoxy-Derivat 7-ADCA hergestellt. Zu 7-ACA gelangt man durch schonende Hydrolyse. Aus ökonomischen und ökologischen Gründen wird dafür zunehmend ein zweistufiges enzymatisches Verfahren bevorzugt, das mit einer immobilisierten D-Aminosäure-Oxidase beginnt. In diesem Schritt entsteht durch oxidative Deaminierung α-Ketoadipyl-7-ACA, die spontan zu Glutaryl-7-ACA decarboxyliert. Durch

eine immobilisierte Glutary-7-ACAAcylase gelangt man zu 7-ACA als Ausgangsprodukt für die Synthese von etwa 50 halbsynthetischen Cephalosporinen. Eine 1-stufige Hydrolyse mittels „Cephalosporin-C-Acylase“ wird bearbeitet, beispielsweise durch protein engineering (→198) von Glutaryl-7-aminocephalosporansäure-Acylase. Zu 7-ADCA und daraus abgeleiteten Cephalosporinen gelangt man dagegen elegant mit Hilfe eines rekombinanten Stamms von Penicillium chrysogenum, in den die Expandase aus Acremonium chrysogenum oder Streptomyces clavuligerus einkloniert wurde. Das dabei entstehende Adipyl-ADCA wird mit einer Amidase, z. B. aus Pseudomonas diminuta, gespalten. Der Ringerweiterungsschritt von Penicillin zu Desacetoxycephalosporinen ist mittlerweile auch zellfrei mit immobilisierten Enzymen (→102) möglich.

Aminosäure- und Peptid-Antibiotika Allgemeines. β-Lactam-Antibiotika, die humantherapeutisch wichtigsten Peptid-Antibiotika (A.), wurden bereits besprochen. Unter den etwa 500 anderen, aus dem AminosäureStoffwechsel abgeleiteten A. haben einige ebenfalls praktische Anwendungen in der medizinischen Therapie, der Wundbehandlung und in der Landwirtschaft gefunden. Zu dieser Gruppe gehören Cycloserin und Phosphinothricin, cyclische Peptid-A. (Gramicidin, Bacitracin), chelatbildende (Bleomycin) und Chromopeptide (Actinomycine) sowie Depsipeptide (Virginiamycin). Man unterscheidet zwischen ribosomal und nicht-ribosomal gebildeten Peptid-A. Sie wurden meist aus Streptomyceten oder Bacilli isoliert. Aminosäure-Derivate. D-Cycloserin wird von Streptomyces orchidaceus gebildet. Es ist eine Analogverbindung des D-Alanins, einem Bestandteil des Mureins der bakteriellen Zellwand, und hemmt die für die Murein-Biosynthese erforderliche Alanin-Racemase. Aufgrund seiner ausgezeichneten Wirkung gegen Mycobacterium tuberculosis wurde es in Kombination mit Rifampicin zur Therapie von Lungentuberkulose eingesetzt, wird aber in Europa nicht mehr verwendet. Das zuerst aus Streptomyces viridiochromogenes isolierte Alanyl-alanylphosphinothricin ist ein Herbizid („Bialaphos“), es wird in Pflanzen zu Phosphinothricin abgebaut, das als Analogverbindung von L-Glutamin die Glutamin-Synthetase von Pflanzen hemmt. Phosphinothricin (→282) wird industriell durch chemische Synthese hergestellt (Glufosinat, Basta®). Mit einer einklonierten Acetyltransferase aus S. hygroscopicus können Nutzpflanzen gegen Phosphinothricin resistent gemacht werden. Peptid-Antibiotika bestehen aus 10–50 Aminosäuren mit hohem Anteil hydrophober und

positiv geladener Seitenketten, was zu einer starken Affinität zu cytoplasmatischen Membranen führt. Ihre Biosynthese verläuft ribosomal oder nicht-ribosomal. Die ribosomale Synthese führt zu einem linearen Präpeptid, das post-translational modifiziert wird, z. B. durch Epimerisierung von L- zu D-Aminosäuren oder durch Bildung von Lanthionin, einem CystinAnalogen, das zu über Thioether verbrückten Peptidketten führt. Ein Beispiel für vom Lanthionin abgeleitete A. (Lantibiotika) ist Nisin, das durch Lactobacillen gebildet wird und in jedem Sauermilch-Erzeugnis enthalten ist. Es lysiert die Cytoplasma-Membran Gram-positiver Bakterien und hat damit einen konservierenden Einfluss auf Milch-Produkte. Defensine (→118) (35–45 Aminosäuren) sind ein wichtiger Bestandteil des unspezifischen Immunsystems; sie schützen die Darmschleimhaut vor den Darmbakterien. Durch nichtribosomale Biosynthese an einem löslichen Thiotemplat-Multienzymkomplex entstehen meist kürzerkettige lineare Polypeptide, die weiter in cyclische Verbindungen umgewandelt werden können (z. B. Gramicidin S). Sie sind kleiner als ribosomal gebildete Peptid-A., enthalten aber ebenfalls ungewöhnliche Aminosäuren und Strukturelemente. Wegen ihrer ausgeprägten Toxizität ist der Einsatz meist auf lokale Anwendungen eingeschränkt, z. B. beim Bacitracin zur Behandlung von Wunden und Verbrennungen. Bacitracin wird auch als Zusatz bei Tierfutter verwendet. Das von Tolypocladium inflatum gebildete Cyclosporin ist das Immunsuppresivum der Wahl bei Organ-transplantationen. Die von Bacillus polymyxa gebildeten Colistine (Polymycine) sind wichtige Reserve-Antibiotika bei Infektionen mit Gram-negativen Bakterien. Die von Streptomyces verticillus gebildeten Bleomycine gehören zu den wichtigsten Antitumor-A. in der Klinik. Ihr 1:1-Komplex mit Fe2+ wirkt in Gegenwart von Triplett-Sauerstoff wie eine DNAse und führt zu DNA-Kettenstrangbrüchen. Actinomycin, ein Peptid-Derivat des Phenoxazinons, wird von verschiedenen Streptomyces-Stämmen gebildet. Es interkaliert mit 5′-TGCA-3′-Palindrom-sequenzen der DNA und blockiert dadurch die Transkription, in hohen Konzentrationen auch die Replikation. Diese zelltoxische Wirkung wurde eine Zeitlang in der Tumorbehandlung verwendet. Die von Streptomyces virginiae gebildeten Virginiamycine wurden in großem Umfang bei der Geflügel-, Schweine- und Kälbermast angewendet, sind aber in der EU aufgrund zunehmender A.-Resistenzen (→204) nicht mehr zugelassen. Die Siderochrome sind Fe-haltige oder -bindende Peptid-A. mit Hydroxamsäure-Gruppierung und finden bei Eisenspeichererkrankungen Anwendung in der Humanmedizin. Valinomycin ist ein Ionophor, das Kalium selektiv transportiert und damit das Membranpotential zerstört.

Glykopeptid-, Lipopeptid-, Polyether- und NucleosidAntibiotika Allgemeines. In diese Kategorie fallen unter den praktisch bedeutenden Antibiotika (A.) vor allem das für die Behandlung Methicillin-resistenter Staphylococus aureus-Stämme („MRSA“) (→204) unentbehrliche Glykopeptid-A. Vancomycin, das acylierte Glykopeptid-A. Gemisch Teicoplanin und das Lipopeptid-A. Daptomycin. Das Polyether-A. Monensin wird zur Prophylaxe gegen Protozoen bei der Hühnerzucht eingesetzt. Obwohl Nucleosid-A. natürlich vorkommen, werden medizinisch nur Synthese-Produkte eingesetzt, so das GuanosinAnalogon Acyclovir für die Therapie der viralen Meningitis. Blasticin S wurde als ReisFungizid von Kasugamycin abgelöst. Gegen Gram-positive Enterobakterien gut wirksam ist das Veterinär-A. Lincomycin. Glyko- und Lipopeptid-A. Vancomycin wird von dem Actinomyceten Amycolatopsis orientalis gebildet. Man setzt es gegen Penicillin-resistente Enterokokken ein, z. B. bei septischer Endocarditis. Auch bei Patienten, die unter β-Lactam-Allergie leiden, findet es Verwendung. Da es nephrotoxisch ist und früher in Kombination mit den ebenfalls nierenschädigenden Aminoglykosid-Antibiotika und Cyclosporin verwendet wurde, muss eine sorgfältige Kontrolle auf nephrotoxische Nebenwirkungen erfolgen. Die Wirkung von V. beruht wie bei den β-Lactam-Antibiotika auf der Hemmung der bakteriellen Zellwandsynthese (Bindung an UDP-Muramylpentapeptid). Resistente Stämme bilden eine veränderte ZellwandVorstufe, die nicht mehr mit V. reagiert. Diese Resistenz kann sehr wahrscheinlich horizontal über Transposons zwischen Menschen, Nutz- und Haustieren übertragen werden. Teicoplanin ist ein Glykolipid-Gemisch mit verschiedenen Acyl-Seitenketten. Sein Wirkungsspektrum ähnelt dem des Vacomycin. Daptomycin ist ein cyclisches Peptid aus 11 Aminosäuren mit einer Decanoyl-Seitenkette. Es wird von Streptomyces roseosporus gebildet und gehört zu den stärksten (d. h., am wenigsten durch Resistenz unwirksam gemachten) A., mit dem auch noch Vancomycin-resistente Infektionen behandelt werden können. Es wirkt durch Bildung von

Poren in der bakteriellen Zellmembran, durch die K+-Ionen ausfließen und die Membran depolarisieren. Wie Vancomycin muß es intravenös verabreicht werden. Ciclosporin A ist ebenfalls ein cyclisches Lipopeptid. Es wirkt als Immun-Suppressivum und hat die Transplantationsmedizin revolutioniert. Monensin ein Polyether-Antibiotikum, wird durch Fermentation von Streptomyces cinnamoensis hergestellt. Die Biosynthese erfolgt analog zu den Polyketiden aus Acetat, Propionat und Butyrat. Monensin lagert sich als Ionophor in Membranen ein und führt durch Einströmen von Na+-Ionen zur Osmolyse der Zelle. Dieser Wirkungsmechanismus macht es zum Breitband-Antibiotikum, das nicht nur gegen Bakterien und Pilze wirkt, sondern auch gegen Protozoen, so gegen Eimeria sp. und Toxoplasma sp., die bei der Massentierhaltung auftreten. Die Human-Toxizität von Monensin ist allerdings hoch. Von Hühnern und Rindern, nicht jedoch von Pferden wird es dagegen in der vorgeschriebenen Dosierung gut vertragen und ist deshalb zum wichtigsten Fütterungsantibiotikum in der Geflügel- und Rinderzucht geworden, wo es zusammen mit dem strukturell verwandten Salinomycin einen Marktanteil von ca. 80 % hält. Es wird in Mengen von mehreren 1000 t hergestellt. Lincomycin, ein von Streptomyces lincolnensis gebildetes Antibiotikum, wirkt gegen Grampositive Krankheitserreger und wird in der Veterinärmedizin eingesetzt. Wie Chloramphenicol bindet es an die 50S-Untereinheit des Ribosoms und hemmt die Verlängerung der wachsenden Peptid-Kette. Resistente Stämme treten häufig auf. Sie verfügen entweder über eine durch Methylierung veränderte rRNA oder entgiften L. durch enzymatische Umwandlung. Nucleosid-Antibiotika haben bisher nur begrenzten Einsatz gefunden. Das Cytosin-analoge Blasticidin S aus Streptomyces griseochromogenes wurde als fungistatischer Wirkstoff gegen Mehltau beim Reisanbau eingesetzt, aber von Kasugamycin verdrängt. Es verhindert die Bindung von Aminoacyl-tRNA ans Ribosom. Ein in der Humantherapie wichtiges PurinDerivat ist das synthetische Guanosin-Analogon Acyclovir. Es wirkt gegen Herpes-Viren und kann deshalb bei viraler Encephalitis eingesetzt werden. Man gewinnt es durch chemische Synthese.

Aminoglykosid-Antibiotika Allgemeines. Die Entdeckung des Streptomycins durch Selmon Waksman (1943) war ein wichtiger Meilenstein bei der Entwicklung der Antibiotika. Es erlaubte erstmals eine Therapie von Tuberkulose-Erkrankungen durch den Tuberkulose-Erreger Mycobacterium tuberculosum, die aufgrund der nieren- und ohrenschädigenden Eigenschaften von Streptomycin (und der meisten Aminoglykosid-Antibiotika) heute allerdings vorzugsweise mit anderen Antibiotika

(Isonicotinsäurehydrazid, Bedaquilin, Rifampicin) durchgeführt wird. Die Grundstruktur der meisten Aminoglykosid-Antibiotika besteht aus einem Aminocyclitol-Ring, z. B. 2Desoxystreptamin, der mit weiteren Aminozuckern (→32) glykosidisch verknüpft ist. Aminoglykosid-Antibiotika haben ein breites Wirkungsspektrum und sind auch gegenüber Gram-negativen Krankheitserregern aktiv. Bei schweren Infektionen sind sie die Antibiotika der Wahl und nehmen deshalb, trotz ihrer relativ hohen Toxizität und zunehmender Resistenzerscheinungen, sowohl in der Humantherapie wie im Pflanzenschutz einen festen Platz ein; ihr Anteil am Weltmarkt für systemische (sie müssen über die Blutbahn verabreicht werden) Antibiotika liegt bei etwa 1 Mrd US-$ (2009). Für die medizinische Therapie werden vor allem Tobramycin, ferner die Gentamicine, Neomycine, Kanamycin, halbsynthetische Produkte wie Sisomicin oder Amikacin, gelegentlich auch noch Streptomycin verwendet. Spectinomycin setzt man zur Bekämpfung von Penicillin-resistenten Stämmen von Neisseria gonorrhoe-Infektionen ein. Im Reisanbau verwendet man Kasugamycin (wirksam gegen den Reismehltau). In der Schweine- und Hühnermast fand das von S. hygroscopicus gebildete Hygromycin als Wurmmittel Verwendung, ist aber in der EU wegen der Gefahr einer Kreuzresistenz-Auslöung nicht mehr zugelassen. Biosynthese. Aminoglykosid-Antibiotika werden überwiegend von Prokaryonten der Gattungen Streptomyces und Micromonospora gebildet. Ihre vielstufige Biosynthese (Streptomycin: 24 Schritte), die immer von D-Glucose ausgeht und über Nucleotid-Zucker verläuft, führt meist zu einem Aminocyclitol-Rest, der mit weiteren ungewöhnlichen Zuckern (C-verzweigt, Aminozucker) glykosidisch verknüpft ist. Die insgesamt 33 der an der Streptomycin-Biosynthese beteiligten Proteine liegen auf einem etwa 30–40 kbp großen Gencluster des Chromosoms von S. griseus. Sie wurden zum großen Teil bereits kloniert, die Regulation des Stoffwechselwegs ist aber noch nicht in allen Einzelheiten verstanden. Herstellung. Wie bei anderen industriell erfolgreichen Antibiotika erfolgte eine umfangreiche Stammentwicklung. Durch sukzessive Mutation und Selektion gelang es, den Antibiotika-Titer von einigen mg/L der Wildstämme auf einige g/L Kulturmedium zu steigern (Streptomycin: > 10 g/L nach 120 h Kulturdauer). Die industrielle Herstellung erfolgt in großvolumigen Bioreaktoren. Als C-Quelle dienen Glucose oder Dextrin, als N-Quelle Sojamehl. Mycelgebundene Aminoglykosid-Antibiotika wie Gentamycin werden durch Ansäuern auf pH 2 freigesetzt. Nach Abtrennung der Zellmasse erfolgt die Konzentrierung und Reinigung durch Ionenaustauschchromatographie. Wirkort und Resistenz. Ihre Wirkung (→202) entfalten Aminoglykosid-Antibiotika durch Bindung an die 30S-Untereinheit von Ribosomen. Sie verursachen damit Ablesefehler bei der Translation und schließlich eine Hemmung der Protein-Biosynthese. Einige AminoglykosidAntibiotika binden spezifisch an Typ-I-Introns der RNA. Ein Nachteil ist die rasch und in einem Schritt einsetzende Resistenz (→204). Resistente Stämme verändern entweder durch Mutationen am Ribosom die Aminoglykosid-Bindungsstelle oder sind durch Übertragung von Resistenzplasmiden in der Lage, für die Bindung an das Ribosom wichtige Hydroxyl-Gruppen des Antibiotikums mittels enzymatischer Acetylierung, Phosphorylierung oder Adenylierung zu blockieren.

Halbsynthetische Aminoglykosid-Antibiotika. Durch chemische Derivatisierung vorzugsweise der Amino-Gruppen konnten wirksame semisynthetische AminoglykosidAntibiotika erhalten werden (z. B. Sisomicin, Amikacin). Ihre Modifikation mittels kombinatorischer Biosynthese gestaltet sich dagegen bisher noch schwierig, obwohl viele der für die Biosynthese von Aminoglykosid-Antibiotika verantwortlichen Gene kloniert vorliegen und Expressionskassetten zur Verfügung stehen. Die Regulation der Synthese der Bausteine und des gesamten Biosynthesewegs ist noch nicht in allen Details verstanden.

Tetracycline, Fluorochinolone, andere aromatische Antibiotika Allgemeines. Die Tetracycline sind aufgrund ihrer Breitbandwirkung wirtschaftlich bedeutende Antibiotika. Sie werden bei Mensch und Tier eingesetzt (2009: 1,6 Mrd US-$). Die synthetischen Abkömmlinge der Nalidixinsäure (Fluorochinolone) haben ebenfalls ein breites Wirkungsspektrum und gehören zu den in der Humanmedizin am häufigsten eingesetzten Antibiotika (Marktwert 2009: 7,1 Mrd. US-$). Tetracycline. (T.). Seit 1945 erstmals Chlortetracyclin als Stoffwechselprodukt von Streptomyces aureofaciens beschrieben wurde, haben sich T.-Derivate als BreitbandAntibiotika von geringer Toxizität durchgesetzt. Sie wirken sowohl gegen Gram-positive wie negative Bakterien, Rickettsien, Mycoplasmen, Leptospiren, Spirochaeten und einige große Viren. Leider werden sie außerhalb der EU und den USA in großem Umfang als nutritive Antibiotika in der Geflügel- und Schweinemast eingesetzt, was der Verbreitung resistenter Keime (→204) Vorschub leistet. Häufig beobachtete Resistenzmechanismen beruhen auf verminderter Penetration durch die äußere Membran Gram-negativer Zellen (veränderte Porine), Modifikationen der Zielstruktur (→202) (30S-Unterheinheit des Ribosoms) oder Plasmid-codierter Synthese von sog. tet-Proteinen, die einen aktiven Export von T. aus der Bakterienzelle bewirken. Semisynthetische T. wie Doxycyclin oder Tigecyclin umgehen diese Resistenz-Mechanismen. T. hemmen die Protein-Biosynthese durch Bindung an die 70SRibosomen. Sie werden ausschließlich von Streptomyceten gebildet, Primärprodukt ist meist Oxytetracyclin. Ihre Biosynthese erfolgt in vielen Einzelschritten aus Glucose über PolyketidZwischenstufen und weitere Enzyme, die das Polyketid-Grundgerüst cyclisieren und modifizieren. Das Gencluster aus S. rimosus umfasst dazu > 21 Gene, darunter 3 Resistenzgene. Zur industriellen Herstellung kultiviert man Hochleistungsstämme verschiedener Streptomyceten in großvolumigen Bioreaktoren. Für Ausbeuten von > 80 g/L ist eine gute O2-Versorgung und eine sorgfältige Kontrolle der Phosphat-Konzentration im Medium erforderlich. Die Isolierung erfolgt, nach Abtrennung der Zellmasse, durch Mehrstufenextraktion mit n-Butylacetat oder Ausfällung mit quaternären Ammoniumsalzen. Anthracycline. (A.). A.-Glykoside wie Doxorubicin (Adriamycin) hemmen die Replikation der DNA durch Interkalierung und Hemmung der Topoisomerasen. Sie werden klinisch zur Tumorbehandlung eingesetzt. Ihre Herstellung erfolgt durch Fermentation. Fluorochinolone (F). Der bereits 1962 entdeckte bakterizide Effekt von Nalidixinsäure, einem Nebenprodukt der chemischen Synthese des Antimalariamittels Chloroquin, konnte 1977 auf

eine Hemmung der bakteriellen Topoisomerase II (Gyrase-A-Untereinheit) zurückgeführt werden. Da die in Struktur und Funktion sehr verschiedenen Topoisomerasen höherer Organismen nicht gehemmt werden, sind F. wenig humantoxisch. Sie haben ein sehr breites Wirkspektrum (Gram-positive und Gram-negative Bakterien, Mykobakterien, Clamydien, Anaerobier). Die Entstehung von Resistenz durch Modifikation der Gyrase oder verminderte Membranpermeation erfolgt nur langsam und ist nicht Plasmid-codiert. Unter den mehr als 5000 Chinolon-Derivaten, die ausschließlich durch chemische Synthese hergestellt werden, werden deshalb einige häufig verwendet, z. B. das auch gegen Bacillus anthracis wirksame Ciprofloxacin (Ciprobay®). Chloramphenicol wurde 1950 aus Streptomyces venezuelae isoliert, wird heute aber ausschließlich durch chemische Synthese hergestellt. Die Biosynthese erfolgt als Abzweig aus der Bildung aromatischer Aminosäuren auf der Stufe der Chorisminsäure. Dieses erste Breitband-Antibiotikum wirkt auf ein großes Spektrum Gram-positiver und -negativer Bakterien, Actinomyceten, Rickettsien und große Viren, wird aber wegen seiner knochenmarksschädigenden Nebenwirkungen nur noch als Reserveantibiotikum bei Typhus, Shigellosen und Rickettsien-Infektionen eingesetzt. Es bindet an die 50S-Untereinheit der 70SRibosomen und blockiert die Peptidyl-Transferase. Griseofulvin, ein Benzofuran-Derivat, ist ein fungistatisches Antibiotikum, das den Spindelapparat und die Mitose von Pilzen hemmt – erkennbar an einer Stauchung und Kräuselung der Hyphen. Es wird durch Fermentationsverfahren hergestellt und zur Behandlung von Dermatomykosen, vor allem aber im Pflanzenschutz als Blattfungizid gegen Mehltau-Arten eingesetzt.

Polyketid-Antibiotika

Allgemeines. Zu dieser großen Gruppe zählt man u. a. die Makrolid- und Polyen-Antibiotika, die Makrotetrolide und die Ansamycine. Gemeinsam ist ihnen ein makrocyclischer Lactonoder Lactam-Ring, der aus einer lang-kettigen Polyhydroxyfettsäure mit terminaler Hydroxyoder Amino-Gruppe gebildet wird. Er kann mit ungewöhnlichen Zuckern glykosyliert sein (Makrolide), konjugierte Doppelbindungen (Polyene) bzw. ein aromatisches Chromophor enthalten (Ansamycine) oder als Polylacton aufgebaut sein (Makrotetrolide). Die meisten Polyketid-Antibiotika wurden aus Streptomyceten isoliert. Sie finden vor allem Anwendung in der Humanmedizin, aber auch in der Tiermast und der Lebensmittel-Herstellung. Der Marktwert von klinisch verwendeten Makrolid-Antibiotika lag 2009 bei etwa 5 Mrd. US-$. Makrolid-Antibiotika sind lipophile, häufig basische Verbindungen. Bestimmende Strukturelemente sind 10- bis 60-gliedrige makrocyclische Lactone, die an einem der Fettsäure-Synthase ähnlichen Multienzymkomplex durch Kondensation von AcylCoAStartereinheiten mit Malonyl-CoA bzw. dessen Methyl- oder Ethylhomologen über eine hypothetische Polyketid-Zwischenstufe gebildet werden, sowie ungewöhnliche Zuckerreste mit Amino-Gruppen, C-Verzweigungen und Desoxy-Funktionen. Makrolid-Antibiotika sind wenig toxisch und werden deshalb auch bei Kindern verwendet. Sie hemmen vorwiegend Grampositive Mikroorganismen, indem sie an die 50S-Untereinheit bakterieller Ribosomen binden und dadurch die Translokation der wachsenden Peptid-Kette unterbrechen. Die häufig beobachtete Resistenzbildung geht vor allem auf die enzymatische Methylierung von ribosomaler 23S-RNA zurück. Azithromycin, Clarithromycin, Erythromycin und Spiramycin verabreicht man häufig bei bakteriellen Infektionen der Atemwege. Ein neues, kurz vor der Zulassung stehendes Macrolid-A. ist das Cethromycin. Das dem Erythromycin strukturell verwandte Tylosin war wegen seiner hohen Wirksamkeit gegen Mykoplasmen ein beliebter Zusatz bei der Schweinemast. Das Risiko einer Resistenzentwicklung (→204) hat in der EU aber dazu geführt, dass Tylosin nur noch vom Tierarzt verschrieben werden darf. Polyen-Antibiotika werden vorwiegend von Streptomyceten gebildet. Sie bestehen aus 26-bis 38-gliedrigen Lacton-Ringen mit 3–7 konjugierten Doppelbindungen, die zusätzliche Bausteine enthalten können, z. B. glykosidisch gebundene Aminozucker. Einige Polyen-Antibiotika werden als Fungistatika verwendet, so Amphotericin B und Nystatin in der Humantherapie von Candida albicans und Pimaricin (Natamycin) als Konservierungsmittel bei der KäseHerstellung. Polyen-Antibiotika komplexieren mit nur in Hefen und Pilzen vorkommenden Mykosterolen wie Ergosterol und sind deshalb gegenüber Bakterien unwirksam. Sie sind nephro- und hepatotoxisch, ihre Anwendung ist deshalb schweren Erkrankungen vorbehalten. Als Fungizide im Pflanzenschutz sind sie chemisch zu labil. Ansamycine sind Makrolactam-Antibiotika mit einem aromatischen Chromophor. Der wichtigste Vertreter, das Rifamycin, wird von Amycolatopsis mediterranei gebildet. Es ist hochwirksam gegen Gram-positive Bakterien und Mycobakterien. Rifampicin, ein halbsynthetisches Derivat, ist ein wichtiges Antibiotikum für die Therapie der Tuberkulose (Erreger: Mycobacterium tuberculosum) und wird auch bei der Lepra-Bekämpfung und bei Legionella-Infektionen eingesetzt. Es hemmt die DNA-abhängige RNA-Polymerase von Bakterien durch Bindung an deren β-Untereinheit. Da eukaryontische RNA-Polymerase Rifampicin nicht bindet, wirkt das Antibiotikum nicht toxisch auf den Menschen. Bei

resistenten Keimen ist die RNA-Polymerase durch Mutation strukturell verändert. Fermentation und Aufarbeitung. Die industrielle Herstellung der wirtschaftlich erfolgreichen Polyketid-Antibiotika erfolgt mit Hochleistungsstämmen in großvolumigen Bioreaktoren. Meist werden komplexe Medien eingesetzt. Bei der Erythromycin-Fermentation füttert man Propionsäure als wichtigen Baustein der Biosynthese zu. Die Ausbeuten für Erythromycin von Saccharopolyspora erythraea (früher: Streptomyces erythreus) liegen bei 10 g/L nach 72 Stunden Kulturdauer. Die extrazellulären Produkte werden nach Abtrennung der Zellmasse durch Lösungsmittelextraktion (→104), beispielsweise mit Essigsäurebutylester im Gegenstrom, isoliert und durch chromatographische Verfahren und Umkristallisation gereinigt.

Neue Wege zu Antibiotika Allgemeines. Trotz der Erfolge der Antibiotika-Therapie und der Entwicklung immer neuer antibiotischer Wirkstoffe sind bereits besiegt geglaubte Infektionskrankheiten heute wieder auf dem Vormarsch und immer schwerer zu behandeln. Dazu gehören die Tuberkulose, immer öfter aber auch Bagatell-Infektionen mit Streptococcen oder Staphylococcen. Die diesem Phänomen zugrundeliegende Resistenz (→204) pathogener Bakterien gegen einzelne oder mehrere Antibiotika (Multiresistenz) ist eine große medizinische und wissenschaftliche Herausforderung. Resistenz ist häufig auf Plasmiden und/oder Transposons kodiert und kann durch Konjugation, aber auch durch Phagen horizontal, d. h. zwischen verschiedenen Mikroorganismen übertragen werden. Ein weiteres Problem ist die geringe Zahl der für den Menschen ungefährlichen Antibiotika mit Wirksamkeit gegen pathogene Pilze, Hefen und Protozoen: der Stoffwechsel dieser Eukaryoten weist eine größere Nähe zum menschlichen Stoffwechsel auf als derjenige der Bakterien, sodass spezifische Wirkstoffe meist auch für den Menschen toxisch sind. Es gibt also gute Gründe, nach neuen Konzepten für die Synthese von Antibiotika zu suchen. Neue Screeningverfahren. Bei der Anwendung klassischer Screeningverfahren, vor allem beim Bioassay, isoliert man heute unter 100 Treffern 99 bekannte Strukturen. Man sucht deshalb intensiv nach unkonventionellen Wegen, um zu neuen Antibiotika-Leitstrukturen zu gelangen. Beispiele sind: a) die precursor-dirigierte Biosynthese, bei der die Zugabe synthetischer Vorstufen zum Nährmedium zu halbsynthetischen Antibiotika führt, b) ein Screening in bisher wenig beachteten Gattungen, z. B. Myxobakterien, seltenen Actinomyceten, Flechten Schwämmen oder in Mikroorganismen, die im Inneren von Pflanzen oder Tieren leben (Endophyten) c) Veränderungen des Screening-Verfahrens durch Vorgabe neuartiger assays, d) die genetische Rekombination unterschiedlicher Antibiotika-Bildner, und e) eine kombinatorische Biosynthese durch in-vitro-Rekombination der an der Biosynthese beteiligten Gene. Reverse Genetik. Aufgrund der großen Fortschritte bei der Gen- und Genomsequenzierungen sind heute bereits sehr viele Gencluster analysiert worden, die für die Biosynthese von Antibiotika kodieren. Sind für Enzyme, die typische Biosynthese-Schritte bei der Antibiotika-

Bildung katalysieren (z. B. bei der Hydroxylierung, Glykosylierung oder Halogenierung), genügend Gen-Sequenzen bekannt, so können häufig Konsensus-Sequenzen ermittelt und für ein genetisches Screening analoger Enzymaktivitäten in der genomischen DNA anderer Organismen oder in Metagenom-Banken verwendet werden. Diese Methode wurde beispielsweise erfolgreich zum Screening nach neuen Halogenasen eingesetzt. Kombinatorische Biosynthese. Die Biosynthese der meisten Antibiotika wird durch Gencluster kodiert. Sie bestehen aus a) Strukturgenen für den Biosyntheseweg, b) Resistenzgenen zum Selbstschutz, c) Genen für die spezifische Regulation der Produktbildung, und d) Genen für die Export-Maschinerie. Viele dieser Module sind bereits in Datenbanken ausgewiesen (s. antiSMASH-Datenbank) und können für ein zufallsbedingtes oder vorselektiertes gene shuffling (→198) eingesetzt werden. Aufgrund des in Streptomyceten relativ hohen Plasmid-Transfers durch Konjugation zweier Stämme ist insbesondere in diesem Organismus eine kombinatorische Biosynthese aus verschiedenen modularen „Gen-Baukästen“ gut möglich („in-vivo synthetische Biologie“) (→320). Mit dieser Methode konnten mittlerweile viele in der Natur noch nicht gefundene Antibiotika synthetisiert und überprüft werden. Neue targets aus der Genomanalyse. Die Zahl der pathogenen Mikroorganismen, deren Genom vollständig sequenziert wurde, nimmt von Jahr zu Jahr zu. So liegen z. B. die GenomSequenzen von Hemophilus influenzae (1,83 Mbp; chronische Bronchitis), Helicobacter pylori (1,67 Mbp; Ulkus), Borellia burgdorferi (0,91 Mbp; Borelliose), Mycobacterium tuberculosum (4,41 Mbp; Tuberkulose), Treponema pallidum (1,14 Mbp; Syphilis) und Chlamydia trachomatis (1,04 Mbp; Augeninfektionen) vor. Die Hoffnung, aus Stoffwechselwegen oder Signalketten, die spezifisch für das Pathogen sind und deshalb als target zum Auffinden von Wirkstoffen dienen können, haben sich aber leider nicht erfüllt: bei einem 7-jährigen Industrie-Projekt mit Millionen von Wirkstoff-Kandidaten und 300 Kandidaten-Zielproteine im Hochdurchsatz-Screening fand man nur 5 geeignete Leitstrukturen.

Medikamente und Medizintechnik Insulin Allgemeines. Insulin ist ein Polypeptid-Hormon (→28), das in Wirbeltieren den GlucoseGehalt des Bluts regelt. Es ist ein unersetzliches Medikament zur Behandlung des Diabetes mellitus („Zuckerkrankheit“). Ursprünglich durch Extraktion von Schlachttier-Abfällen gewonnen, setzten sich seit 1982 gentechnische Herstellverfahren mit rekombinanten Stämmen von Escherichia coli und Saccharomyces cerevisiae durch. Der Weltmarkt wird für 2018 auf einen Wert von 32 Mrd. US-$ prognostiziert (geschätztes Mengenvolumen 2012: > 100 t). Diabetes mellitus. Beim Krankeitsbild des Diabetes mellitus ist die Bildung und Freisetzung von Insulin gestört. Beim Diabetes Typ I findet infolge genetischer Defekte, Virusinfektionen oder Autoimmunerkrankung keine Insulin-Bildung mehr statt, sodass zur Kontrolle des Glucose-Haushalts im Blut Insulin regelmäßig transcutan oder intramuskulär injiziert werden muss. Der häufigere Diabetes Typ II (Altersdiabetes) ist überwiegend eine Zivilisationskrankheit (Überernährung, Bewegungsmangel) und beschreibt eine verringerte oder versiegende Insulin-Produktion. Die körpereigene Insulinbildung kann zunächst durch Medikamente stimuliert, später muß auch hier Insulin verabreicht werden. Fast 400 Mio. Menschen (2012, Welt) leiden unter Diabetes, davon über 90 % an Diabetes Typ II (in Deutschland etwa 7 Millionen Menschen). Biosynthese von Insulin. Die β-Zellen des Pankreas bilden Präproinsulin, prozessieren es intrazellulär zu Proinsulin und speichern es im Golgi-Apparat. Bei Glucose-Mangel wird Proinsulin durch membranständige Proteasen zu drei Polypeptid-Ketten A, B und C hydrolysiert; dabei vereinen sich die A- und B-Kette (21 bzw. 30 Aminosäuren) mittels drei Cystin-Brücken zum aktiven Insulin, die C-Kette (31 Aminosäuren) wird freigesetzt und abgebaut. Herstellung. Insulin wird seit 1928 therapeutisch verwendet. Zu seiner Gewinnung extrahierte man Bauchspeicheldrüsen von Rindern oder Schweinen mit n-Butanol, fällte daraus das leicht kristallisierende Zink-Insulin und reinigte es mittels Gelchromatographie weiter auf. Der Insulin-Gehalt eines Schweinepankreas deckt den Bedarf eines Diabetikers allerdings nur für 3 Tage, das aus einem Rinderpankreas isolierbare Insulin reicht lediglich für 10 Tage. Da sich Schweine- und Rinderinsulin vom Humaninsulin um eine bzw. zwei Aminosäuren unterscheiden, können sie bei Dauergabe Immunreaktionen auslösen. Die Totalsynthese von Humaninsulin gelang zwar bereits 1964, ist aber unökonomisch. 1975 fand man eine wirtschaftlich tragbare Lösung für das Allergie-Problem mit der Umwandlung von Schweinein Humaninsulin durch Enzymkatalyse (Austausch der C-terminalen Aminosäure Ala30 der BKette des Schweine-Insulin mittels immobilisierter Carboxypeptidase Y gegen Thr30). Seit 1982 hat sich die gentechnische Herstellung von Humaninsulin durchgesetzt. Obwohl die für das Präproinsulin kodierende cDNA aus Kulturen humaner β-Zellen isoliert werden kann (75

% der mRNA-Fraktion), stellte man die für das Präproinsulin codierende DNA synthetisch her (→54), weil man sie so für die Codonnutzung (→40) des Wirtsorganismus E. coli K12 optimieren konnte. Während ursprünglich aus Sicherheitsgründen A- und B-Kette getrennt exprimiert, gereinigt und anschließend mit chemischen Methoden oxidativ zum aktiven Insulin verbrückt wurden, stellt man heute rekombinantes Proinsulin als Fusionsprotein mit Tryptophan-Synthase her und arbeitet in mehreren chemischen und enzymatischen Schritten zum Insulin auf. Optimierte E. coli-Produktionsstämme bilden bis zu 40 % ihrer Zellmasse an Proinsulin-haltigem Fusionsprotein; aus einem 40 m3-Fermentationsansatz erhält man nach Reinigung durch RP-HPLC etwa 100 g Humaninsulin. Ein anderes Verfahren geht von der Expression eines verkürzten „Mini-Proinsulin“ in rekombinanten Stämmen von S. cerevisiae aus. Insulin kann vom Diabetiker über eine „Insulin-Pen“ selbst appliziert werden. Bei Diabetes Typ I setzt man auch tragbare Insulin-Pumpen mit Katheter ein. Moderne Insulin-Typen. Humaninsuline mit veränderter Aminosäure-Sequenz wirken schneller oder länger anhaltend. So ist z. B. lispro-Insulin (Lys28Pro29 anstelle der korrekten Sequenz Pro28Lys29 in der B-Kette) nach Injektion schneller bioverfügbar und erleichtert dem Diabetiker die Planung der Mahlzeiten. Insulin glargin (Lantus®) mit Thr30Arg31Arg in der BKette und Asn21Gly in der A-Kette wirkt dagegen länger anhaltend und muss seltener appliziert werden, ebenso wie ein mit Fettsäure acyliertes Thr30delLys29 Insulin Detemir.

Wachstumshormon und andere Hormone Allgemeines. Wachstumshormon (growth hormone = GH, auch Somatotropin) wird vom Hypophysen-Vorderlappen gebildet und unterstützt viele Stoffwechselphänomene. Dabei stehen zwei Wirkungsmechanismen im Vordergrund: GH hemmt bei reichlicher Nahrungsaufnahme die Fettsynthese und erhöht so die Verfügbarkeit von Energie für die Proteinsynthese, z. B. in der Milchdrüse. GH fördert also beim Tier die Milchleistung und hat eine anabole Wirkung, die sich in der Mast durch vermehrte Protein- und verringerte Fettbildung äußert. Ein zweiter Effekt von GH wird durch den insulinartigen Wachstumsfaktor IGF-1 vermittelt, der in der Leber gebildet wird und in fast allen Geweben die Zellteilung induziert, wodurch er die

wachstumsfördernde Wirkung von GH unterstützt. Wachstumshormon und andere Hormone lassen sich mit gentechnischen Methoden herstellen. Humanes Wachstumshormon (hGH) ist ein Polypeptid aus 191 Aminosäuren mit 2 DisulfidBrücken. Es zeigt bei parenteraler Gabe wachstumsfördernde Wirkung bei zwergwüchsigen Kindern mit Mangel an GHSekretion durch die Hypophyse (0,1 % Häufigkeit), nicht aber, wenn die Wachstumsstörung auf Defekten am Wachstumshormon-Rezeptor beruht. Eine Überproduktion von GH führt zu Riesenwachstum und beim Erwachsenen zur Acromegalie, einem übermäßigen Wachstum von Fingern, Zehen, Nase und Ohren. hGH ist ein beliebtes Anabolikum beim Bodybuilding. Das Marktvolumen für hGH liegt bei 3 Mrd. US-$ (2012). Tierisches Somatotropin. Rekombinant hergestelltes Rinderwachstumshormon (bGH) unterscheidet sich von hGH durch 67 Aminosäuren. Seit 1990 ist es in den USA und verschiedenen anderen Ländern, nicht aber in der EU, Kanada und Japan, zur Erhöhung der Milchproduktion von Kühen zugelassen, aber auch dort umstritten. Sein Effekt beruht auf einer vermehrten Energiezufuhr zum Euter. In der Schweinemast wird porcines Wachstumshormon (pGH) zur Leistungssteigerung eingesetzt; diese beruht auf dem fetthemmenden Effekt von pGH und der vermehrten Protein-synthese. Es wird bei Schweinerassen eingesetzt, die einen hohen Fett- und geringen Fleischansatz aufweisen. bGH und pGH lösen beim Menschen keine biologischen Effekte aus. Das Rückstandsrisiko für den Verbraucher ist also gering, zumal Proteine im Verdauungstrakt des Menschen durch Proteolyse inaktiviert und nicht im Gewebe angereichert werden. In der Fischzucht arbeitet man an transgenen Lachsen, die durch Einklonierung des salmon growth hormone (sGH) hinter den Promotor für ein antifreezeProtein 3–10mal größer werden. Aufgrund der geschlossenen Haltung und verschiedener Chromosomen-Manipulationen, die zur Infertilität führen, erwartet man keine ökologischen Folgen. Eine Zulassung durch die FDA steht bevor (2014). Fermentation und Aufarbeitung hGH wurde vor der Entwicklung gentechnischer Methoden durch Extraktion menschlicher Hypophysen gewonnen und war deshalb nur in sehr begrenzten Mengen und unreiner Form zugänglich. Seit 1984 wird es mit gentechnischen Methoden durch Fermentation, meist mit E. coli, hergestellt. Die Klonierung gestaltete sich ursprünglich schwierig, da zum einen das Hormon und die dafür codierende mRNA nur in geringen Mengen gebildet wird, die daraus abgeleitete cDNA zum anderen nur eine einzige RestriktionsSchnittstelle enthält. Man löste das Problem mit einem halbsynthetischen Gen, das in E. coli K12 exprimiert wurde. Im Unterschied zum natürlichen hGH enthält rekombinantes hGH, wegen der Anwesenheit eines AUG-Startcodons am 5′-Ende der cDNA, noch ein N-terminales Methionin. Wegen des immunologischen Risikos wird bei neueren industriellen Verfahren authentisches hGH gebildet. Die Reinigung erfolgt aufwendig mit einer Abfolge chromatographischer Verfahren (→106). Andere rekombinante Hormone. Zahlreiche andere Hormone wurden kloniert und werden derzeit untersucht. Sie eröffnen neue therapeutische Möglichkeiten, so z. B. rekombinantes Exendin-4 (BYETTA®), ein die Insulin-Ausschüttung stimulierendes Hormon, oder Teriparatid, ein Fragment des menschlichen Parathormons zur Behandlung der Osteoporose. Humanes Follikel-stimulierendes Hormon (FSH) wird bei verschiedenen Indikationen der

Unfruchtbarkeit von Paaren eingesetzt. Das heteromere Glykoprotein wird mit CHO-Zellen (→98) rekombinant hergestellt.

Hämoglobin, Serumalbumin, Lactoferrin Allgemeines. Blut besteht aus Plasma und darin suspendierten Zellen. Es ist bei vielzelligen Organismen das wichtigste Medium für den Stofftransport, die Pufferung des pH-Werts, die Regulation von Körpertemperatur und Wasserhaushalt und die Abwehr von Krankheitserregern. Beim Menschen kodieren ca. 20 % aller Gene für Proteine des Bluts (→80). Das Hämoglobin der Erythrocyten bewirkt den Transport von O2 zu den etwa 1013 Zellen unseres Organismus. Schwer wasserlösliche Stoffe werden für den Transport im Blut oft an Serumalbumin gebunden. Viele Blutproteine können heute mit gentechnischen Methoden hergestellt werden. Dazu gehören α1-Antitrypsin (→232), ein im Blut transportierter Inhibitor, der das Lungengewebe vor dem Abbau durch Elastase schützt, und Lactoferrin, ein antibakterielles Protein der Muttermilch. Die Vermehrung der für die Immunabwehr erforderlichen Zellen und die Synthese von Antikörpern wird von Cytokinen (→80) gesteuert. Hormone regulieren mit hoher Selektivität viele Zell-Funktionen, Wachstumsfaktoren das Wachstum einzelner Zelltypen. Die Viskosität des Bluts wird durch eine komplexe ProteinKaskade geregelt, die die Bildung aggregierter Blutplättchen verhindert (Antikoagulantien, →230), andererseits aber bei Verletzungen mittels Gerinnungsfaktoren (→228) die Aggregation von Blutplättchen zu Fibrin auslöst. Bei einer Fehlfunktion dieser komplex gesteuerten Abläufe können zahlreiche Erkrankungen auftreten. Mit der Entwicklung der Gentechnik wurde es erstmals möglich, viele der beteiligten Proteine in größeren Mengen herzustellen und im therapeutischen Einsatz zu erproben.

Hämoglobin ist das Hauptprotein der Erythrocyten. Es ist ein unglykosyliertes, aus je 2 identischen Untereinheiten aufgebautes Tetramer α2β2 vom MR 64 kDa, das 4 Häm-Gruppen trägt. Durch allosterische Regulation erhöht die Bindung eines O2-Moleküls die Affinität der verbleibenden Häm-Gruppen für O2. Hämoglobin wird bei starkem Blutverlust in Form von Bluttransfusionen oder Erythrocyten-Konzentraten verabreicht, was allerdings Risiken infolge viraler Kontamination und immunologischer Unverträglichkeitsreaktionen mit sich bringt. Menschliches Hämoglobin wurde deshalb cloniert, in Escherichia coli, Backhefe, Pflanzen oder transgenen Schweinen exprimiert und durch chromatographische Verfahren gereinigt. Das isolierte Protein ist allerdings nierentoxisch und außerhalb des Erythrocyten nicht sehr stabil: es zerfällt leicht in αβ-Dimere, die einem raschen proteolytischen Abbau unterliegen. Man versucht, diese Nachteile durch protein engineering sowie durch Mikroverkapselung in den Griff zu bekommen. Serumalbumin. Dieses unglykosylierte Protein (MR 69 kDa), in der Leber als Präproalbumin gebildet, macht etwa 60 % des gesamten Plasmaproteins aus. Es trägt deshalb entscheidend zum osmotischen Druck des Bluts bei. Ferner bindet und transportiert es wasserschwerlösliche Verbindungen, z. B. Lipide. Bei verschiedenen Leber- und Nierenerkrankungen, vor allem aber bei Schockzuständen durch Blutverlust, wird es als „Plasmaexpander“ eingesetzt. Dazu gewinnt man es, ähnlich wie Hämoglobin, durch Fraktionierung von Spenderblut in einer Serie von Fällungs- und Chromatographie-Schritten. Durch Erwärmung des sterilfiltrierten Produkts auf 60 °C während mehrerer Stunden tötet man Viren und andere Pathogene ab. Trotzdem kam es in der Vergangenheit nach Bluttransfusionen immer wieder zu Infektionen. Das Protein lässt sich auch rekombinant durch Fermentation herstellen. Es wurde bereits in Bacillus subtilis, E. coli Backhefe, Pichia pastoris, aber auch in transgenen Pflanzen und in der Milch transgener Ziegen (→272) funktionell exprimiert. Ein in Saccharomyces cerevisiae exprimiertes humanes Serumalbumin (albucult®) wird von Novozymes für die tierische Zellkultur (→100) und die Formulierung pharmazeutischer Präparate vertrieben. Aufgrund der Herstellmethode ist es frei von tierischen Begleitproteinen. Lactoferrin. (MR 77 kDa) ist ein antibakterielles und entzündungshemmendes Protein, dessen Wirkung wahrscheinlich auf die hochaffine Bindung von Fe3+-Ionen zurückgeht. In der Muttermilch erreicht es Konzentrationen von ca. 100 mg/L. Lactoferrin wurde hinter dem αs1Casein-Promotor in Rinder oder Ziegen exprimiert (→272) und damit eine Zucht transgener Tiere aufgebaut. In der Milch transgener Kühe fand man bis zu 10 g/L dieses wertvollen Proteins. FDA und EMEA haben dem rekombinanten Produkt GRAS-Status bescheinigt.

Gerinnungsfaktoren

Allgemeines. Bei inneren oder äußeren Verletzungen von Blutgefäßen erfolgt die rasche Bildung eines Blutkuchens, um die Wunde abzudichten. Dieser Hämostase genannte Vorgang ist durch komplizierte Kaskaden (Zymogen-Aktivierung, Proteolyse und Proteolyse-Hemmung) funktionell ineinandergreifender Schritte reguliert, die eine Thrombenbildung im gesunden Organismus verhindert. Dabei wird lösliches Fibrinogen durch Umladung bei der Proteolyse in unlösliches Fibrin überführt und so die Bildung eines „weichen“ Thrombus ausgelöst, der mittels zusätzlicher Amid-(„-Isopeptid“-)Bindungen in einen „harten“ Thrombus übergeht. Dafür verantwortlich ist Faktor XIIIa, eine Transglutaminase (→192). Die Proteolyse des Fibrinogen erfolgt durch die Serin-Protease Thrombin. Deren Freisetzung aus Prothrombin wird durch eine Protease Faktor Xa katalysiert und durch den Faktor VIII-Komplex moduliert. Bei den zwei häufigsten genetisch bedingten Bluterkrankheiten, Hämophilie A und B, liegen Mutationen des Faktor VIII-Komplexes vor. Hämophilie. Die Bluterkrankheit wurde bereits auf alt-ägyptischen Tontafeln beschrieben. Es gibt 3 häufige Krankheitsbilder bei der Blutgerinnung: Hämophilie A, Hämophilie B und die von Willebrand-Krankheit. Hämophilie A tritt mit einer Frequenz von 1:5000 nur bei Männern auf. Sie beruht auf einer defekten Biosynthese des Faktor VIII-Komplexes: unter 1 % des normalen Werts kommt es häufig zu spontanen Blutungen mit geringer Überlebenschance. Man findet häufig eine ungewöhnliche Inversion auf dem Intron F8A des auf dem XChromosom lokalisierten Faktor VIII-Gens, wodurch die Biosynthese von Faktor VIII in der Leber unterbleibt. Faktor VIII ist ein Glykoprotein (MR ca. 300 kDa), das aus einer einzigen Kette von 2332 Aminosäuren aufgebaut ist. Mit 25 möglichen Glykosylierungsstellen weist es einen Zuckergehalt von ca. 35 % auf. Die Röntgen-Struktur des Protein-Anteils liegt vor. Die Biosynthese von Faktor VIII erfolgt durch Splicing eines ca. 186 kbp großen Genabschnitts mit 26 Exons und posttranslationaler Glykosylierung vor allem der B-Domäne, die bei der Aktivierung mittels Thrombin wieder eliminiert wird. Die von-Willebrand-Krankheit beruht auf der fehlerhaften Synthese des von Willebrand-Faktors (vWF) auf der Innenwand der Blutgefäße. Das Gen für den vWF ist auf Chromosom 12 kodiert. Männer und Frauen erkranken mit einer Häufigkeit von 1:1000 gleich oft. Der vWF ist ein noch größeres und ebenfalls hoch glykosyliertes Genprodukt. Etwa 100 Moleküle vWF binden ein Molekül Faktor VIII zum Faktor-VIII-Komplex (VIII: vWF), der durch Aktivierung des Faktor X/Faktor IXa-Systems die Aggregation von Blutplättchen um ein Vielfaches beschleunigt. Hämophilie B tritt mit einer Häufigkeit von 1 auf 25 000 Männern auf und beruht auf der fehlerhaften Synthese des Gerinnungsfaktors IX, einem Glykoprotein mit einem MR von ca. 55 kDa. Faktor IX ist wie der Faktor VIIIKomplex an der Aktivierung von Faktor X zur aktiven Faktor-Xa-Form beteiligt. Sein Gen ist auf dem X-Chromosom (Xq27) lokalisiert. Klonierung. Die Klonierung von Faktor VIII gelang 1982 bei Genentech und zeitgleich bei Genetic Institutes. Erschwerend war das geringe Vorkommen des mRNA-Transkripts (nur 10–5 der mRNA der Leber). Aus einer Lymphom-Zelllinie konnte schließlich durch genome walking (→70) eine komplette cDNA gewonnen und mittels eines aus Elementen von SV40 und Adenovirus konstruierten Vektors sowohl in CHO- wie in BHK-Zellen (→106) exprimiert werden.

Herstellung. Seit etwa 1964 isolierte man Faktor VIII, Faktor IX und vWF aus Spenderblut (→226) durch Kryopräzipitation und fraktionierte Immunchromatographie (→106) in reiner Form und verwendete es parenteral für die Therapie. Da jährlich Blut von mehreren tausend Spendern erforderlich ist, um einen einzigen Hämophilie A-Patienten mit Faktor VIII zu versorgen, ist das Infektionsrisiko hoch und man schätzt, dass über 60 % der behandelten Patienten infiziert wurden. Die gentechnische Herstellung von Faktor VIII und IX seit 1992 ist deshalb ein großer Fortschritt. Der hohe Glykosylierungsgrad (→262) macht allerdings die Expression in CHO-Zellen erforderlich. Die Ausbeuten sind gering und liegen bei einigen mg Produkt/L Zellkultur. Das Marktvolumen wird deshalb trotz der niedrigen Zahl von Bluterkranken (ca. 500 000, Welt) wegen der hohen Herstellkosten auf > 2 Mrd. US-$ geschätzt (2006). Aktuelle Entwicklungen zielen auf einen „long-acting factor VIII“ durch protein engineering (→198), Veränderung der Zuckerketten (→262) oder Umsetzung mit Polyethylenglykol (PEGylierung).

Antikoagulanzien und Thrombolytika Allgemeines. Die Bildung von Thromben (Venenverschluss, Herzinfarkt, Schlaganfall) gehört zu den häufigsten Todesursachen in den Industrienationen. In Deutschland beispielsweise erlitten 2011 mehr als 51 000 Menschen einen Herzinfarkt. Antikoagulanzien verhindern die Bildung primärer Thromben (z. B. bei Operationen), Thrombolytika lösen Thromben proteolytisch auf. Zu den therapeutisch eingesetzten Antikoagulanzien gehören Heparin und Cumarin-Derivate, ferner die gentechnisch hergestellten Thrombin-Inhibitoren Hirudin aus dem Blutegel und humanes Antithrombin-III (AT-III). Als Thrombolytika stehen bakterielle Streptokinase und die gentechnisch erzeugten Präparate Urokinase und Gewebe-PlasminogenAktivator (tPA) zur Verfügung. Heparin ist ein polydisperses sulfatiertes Glucosaminoglucan vom MR 5–40 kDa. Man gewinnt es durch Extraktion von Schweinedarm oder Rinderlunge. Es wird von Mastzellen gebildet und ins Blutplasma ausgeschieden, wo es AT-III aktiviert, das seinerseits mittels Bindung an Thrombin die Bildung von Fibrin hemmt. Hirudin ist ein Thrombin-Inhibitor aus dem Speichel des Blutegels. Es wurde in Escherichia coli und anderen Wirtsorganismen exprimiert und kann durch Fermentation hergestellt werden. Wie AT-III hemmt es die Fibrin-Bildung durch Bindung an Thrombin.

Gewebe-Plasminogen-Aktivator. (tissue plasminogen activator, tPA). Der bei der Wundheilung einsetzende Abbau von Fibrin wird maßgeblich von der Serin-Protease Plasmin katalysiert. Diese Reaktion läuft allerdings nur ab, wenn Plasmin aus seinem Zymogen Plasminogen durch den Gewebe-Plasminogen-Aktivator (tPA), einer Serin-Protease, freigesetzt wird. tPA hat eine Molmasse von MR 72 kDa und spaltet hochspezifisch die PeptidBindung Arg561-Val562 des Plasminogen. tPA ist aus 5 Domänen aufgebaut, deren Funktion aus ihrer Homologie zu anderen Proteinen abgeleitet wurde. Die beiden „Kringel-Domänen“ (benannt nach ihrer brezelförmigen Struktur) binden an das Substrat Fibrin, die ProteaseDomäne enthält das aktive Zentrum des Enzyms. Menschlicher tPA wurde 1982 erstmals kloniert und ist seit 1988 kommerziell erhältlich. Die 8 Disulfid-Brücken und drei für die Substratbindung wesentliche Zuckerketten (ca. 25 % der Molmasse) machen eine funktionelle Expression in Bakterien unmöglich. Die Produktion des rekombinanten Proteins erfolgt deshalb durch Expression in CHO-Zelllinien (→98) und einer aufwendigen Reinigung durch Fällung, Ionenaustauschchromatographie und Affinitätschromatographie (→106). Eine Mutante des Enzyms mit künstlich veränderter Glykosylierungsstelle (→262) und 4 weiteren AminosäureSubstitutionen (Tenecteplase, TNK-tPA™) bindet stärker an Fibrin und weist eine längere Halbwertszeit im Serum auf, sodass anstelle einer Infusionsbehandlung eine Einmalgabe als Bolus erfolgen kann. Eine nichtglykosylierte Mutante des Enzyms ohne Kringel-1- und eGFDomäne (Reteplase, Repalysin™) wird in E. coli hergestellt, muss allerdings aufwändig aus Einschlusskörpern umgefaltet werden (→104). Sie weist im Vergleich zu tPA eine 3–4fach höhere Verweilzeit im Serum und geringere allergene Eigenschaften auf. tPA wurde auch in der Milch transgener Ziegen und Schafe sekretiert, nachdem man sie mit einem Vektor transformiert hatte, in dem tPA-cDNA hinter den Lactalbumin-Promotor kloniert wurde (→272). Andere Thrombolytika. Urokinase ist eine im Urogenital-Trakt gebildete Serin-Protease und wird als Pro-Urokinase in Plasma und Urin gefunden. Wie tPA hydrolysiert sie Plasminogen zu Plasmin. Zwei Varianten ähnlicher biologischer Aktivität (MR 54 kDa und 30 kDa) können getrennt gereinigt werden, die leichtere entsteht aus der schwereren durch Autolyse. Urokinase kann präparativ aus Urin, aus Zellkulturen menschlichen Nierengewebes oder rekombinant aus E. coli hergestellt werden. Streptokinase ist ein katalytisch inaktives Protein der Molmasse MR 45 kDa, das von hämolytischen Streptokokken gebildet wird und eine Konformationsänderung des Plasminogen induziert, wodurch dieses autolytisch in Plasmin überführt wird. Streptokinase gewinnt man aus dem Überstand von Streptokokken-Kulturen durch chromatographische Verfahren (→106). Den günstigen Herstellkosten steht eine verhältnismäßig starke Immunogenität mit dem Risiko allergischer Reaktionen gegenüber. Im Speichel der Vampirfledermaus findet man verschiedene Plasminogen-Aktivatoren (bat-PA, Desmoteplase), deren Sicherheit und Effektivität aber noch nicht ausreichend geprüft sind.

Enzym-Inhibitoren

Allgemeines. Enzym-Inhibitoren haben einen festen Platz in der medizinischen Therapie. So wird der aus Schlachttier-Abfällen gewonnene Protease-Inhibitor Aprotinin bei bestimmten Schockzuständen eingesetzt. In Zukunft könnte bei Lungen-Emphysemen rekombinant hergestelltes α1-Antitrypsin (→226) zum Einsatz kommen. Unter den zahlreichen aus Mikroorganismen isolierten Protease-Inhibitoren (Leupeptine, Pepstatin, Antipain, Chymostatin, Elastinal) werden Oseltamivir (Influenza, Vogelgrippe), Acarbose (Antidiabetikum) und Tetrahydrolipstatin (Fettleibigkeit) eingesetzt. Aprotinin ist ein Polypeptid aus 58 Aminosäuren (MR 6511), das verschiedene Proteasen wie Trypsin, Chymotrypsin und Plasmin hemmt (Pankreas-Trypsin-Inhibitor). Die Inhibitionskonstante Ki für Trypsin liegt bei 10–11 M. Aprotinin wird vor allem bei Pankreatitis, unter scharf kontrollierten Bedingungen auch bei starken Blutungen, Schockzuständen und Organverpflanzungen eingesetzt. Ein weiteres Anwendungsgebiet sind Fermentationsverfahren mit tierischen Zellkulturen; Aprotinin unterbindet dabei die proteolytische Zerstörung der rekombinanten Produkte. Man isoliert es aus Rinderpankreas oder -lunge durch Extraktion und reinigt chromatographisch. Es ist nicht glykosyliert und kann auch rekombinant in Escherichia coli hergestellt werden. α1-Antitrypsin (αAT). (→226) Das Glykoprotein (MR 54 kDa), auf Chromosom 14 codiert, wird in der Leber gebildet und macht mit ca. 2 g/L über 90 % der α1-Globulinfraktion des Blutserums aus. Es hemmt die von den neutrophilen Granulocyten des Immunsystems gebildete Elastase und verhindert damit den proteolytischen Abbau des vorwiegend aus Elastin bestehenden Lungengewebes. Bei einem vor allem in Nordeuropa vorkommenden genetischen Defekt des αAT, einer Mutation Lys53→Glu („Z-Typ“), erfolgt die Sekretion von αAT aus den Leberzellen wesentlich schlechter, sodass der Serumspiegel nur 15 % des Normalwerts erreicht. In der Folge kommt es durch Elastase-Einwirkung auf das Lungengewebe zu lebensbedrohlichen Emphysemen und dem meist tödlichen adulten respiratorischen DistressSyndrom. Raucher mit αAT vom Z-Typ sind besonders gefährdet, da Bestandteile des Tabakrauchs das für die Elastase-Hemmung essentielle Met358 oxidieren. Durch intravenöse Gabe des Inhibitors (ca. 200 g/Patient und Jahr) kann das Fortschreiten der Erkrankung verlangsamt werden. αAT wird überwiegend durch Plasma-Fraktionierung von Spenderblut gewonnen. Der Inhibitor wurde aber auch in rekombinanter Form hergestellt. Da er ein komplexes Glykosylierungsmuster für seine biologische Funktion benötigt, führte die Expression in Saccharomyces cerevisiae zu einem besseren Produkt als in E. coli (→262). Auch die Expression des rekombinanten Glykoproteins als Fusionsprodukt mit β-Lactoglobulin in der Milch transgener Schafe wurde bearbeitet (→272). Oseltamivir (Tamiflu®) ist ein Prodrug für einen synthetischen Inhibitor mit virostatischer Wirkung. Es wird bei oraler Aufnahme durch Leber-Esterasen zur Säure hydrolysiert, die das auf der Oberfläche von Adenoviren lokalisierte Enzym Neuraminidase hemmt. Das Virus kann nun nicht mehr Sialin hydrolysieren, welches die Oberfläche der Wirtszellen bedeckt, und die Infektion verläuft weniger virulent. 2007 empfahl die WHO den Einsatz des Inhibitors gegen die Vogelgrippe H5N1 (→250).

Acarbose (Glucobay®), ein Pseudotetrasaccharid aus dem Actinomyceten Actinoplanes utahensis, ist ein kompetitiver Inhibitor von α-Glucosidasen. Weil es den Glucose-Gehalt im Gastrointestinaltrakt verringert, wird es als orales Antidiabetikum eingesetzt. Seine Herstellung erfolgt durch mikrobielle Fermentation. Einige der an der Biosynthese beteiligten Gene wurden kloniert. Lipstatin ist ein von Streptomyces toxytricinii gebildeter lipophiler Ester mit mittelständigem β-Lacton-Ring und einer N-Formyl-L-leucin-Seitenkette. Durch katalytische Hydrierung wird es in Tetrahydrolipstatin (Xenical®) überführt. Beide Stoffe binden kovalent an den Serin-Rest im aktiven Zentrum vieler Lipasen. Nach oraler Gabe wird durch Hemmung der PankreasLipase im Gastrointestinaltrakt die Triglycerid-Hydrolyse unterbunden, ohne die Aufnahme freier Fettsäuren zu beeinflussen; Tetrahydrolipstatin wird deshalb bei Fettsucht verabreicht. Man stellt es durch Totalsynthese oder durch Fermentation von S. toxytricinii mit anschließender Lösemittelextraktion und chromatographischer Reinigung (→106) her. Der Patentschutz für Xenical ist 2009 ausgelaufen.

Interferone Allgemeines. Interferone (IFN) werden von verschiedenen Zellen des Immunsystems (→80) als Signalstoffe gebildet und lösen durch Bindung an IFN-Rezeptoren eine Immunantwort aus. Säugetiere bilden mindestens drei Typen: IFN-α, IFN-β und IFN-γ. Sie sind an der Regulation von etwa 20–30 Genen beteiligt und zeigen ein breites Spektrum immunmodulierender, antiviraler und antiproliferativer Eigenschaften. IFN-α und IFN-β sind bei pH 5 stabil und binden an den gleichen Rezeptor (Typ I-IFN). IFN-γ ist dagegen säurelabil und bindet an einen anderen Rezeptor-Typ (Typ II-IFN). Eigenschaften und Anwendungen. α-Interferone (IFN-α) werden in Leukocyten als Familie von > 20 nicht-allelen Genen codiert, die allerdings eine hohe Sequenzhomologie aufweisen. Die Molmasse der Protein-Kette (165–166 Aminosäuren) beträgt 16 kDa, kann aber durch Glykosylierung auf bis zu 26 kDa anwachsen. Das bisher wichtigste klinische Anwendungsgebiet ist die Behandlung von Hepatitis B und C. Kleinere Indikationsgebiete sind Krebserkrankungen wie Blasenkrebs, Melanome, Leukämie und Lymphome. β-Interferon (IFNβ) wird in Fibroblasten gebildet. Die Protein-Kette besteht aus 166 Aminosäuren, infolge Glykosylierung beträgt die Molmasse ca. 20 kDa. Es wird zur Behandlung der multiplen Sklerose eingesetzt. γ-Interferon (IFN-γ), auch als Immun-Interferon bezeichnet, wird von aktivierten TLymphocyten gebildet und aktiviert seinerseits Makrophagen. Seine Peptid-Kette aus 143 Aminosäuren ist in unterschiedlichem Ausmaß glykosyliert, sodass die Molmassen zwischen 15 und 25 kDa schwanken. IFN-γ1b ist zugelassen für die Therapie von chronischer Granulomatose. Weitere Therapie-Formen mit Interferonen befinden sich in verschiedenen Stufen der klinischen Erprobung, z. B. die Therapie mehrerer Krebserkrankungen (IFN-α, -β und -γ), von Autoimmunkrankheiten (IFN-α und -β), von Virusinfektionen (IFN-α und -β) und von rheumatoider Arthritis und Asthma (IFN-γ). Das Weltmarktvolumen für alle Varianten von Interferonen wird für 2014 auf ca. 10 Mrd. US-$ geschätzt. Klonierung und Expression. Obwohl man das therapeutische Potential der Interferone früh erkannte, erlaubten die klassischen Herstellverfahren durch Fraktionierung von Spenderblut

(→226) kaum klinische Versuche. Erst die Gentechnik führte ab 1986 zur industriellen Herstellung reiner Interferone als klinische Präparate. Die Klonierung dieser nur in sehr geringen Konzentrationen gebildeten Proteine gelang erstmals 1982 für IFN-α auf folgendem Weg: a) Isolierung von Leukocyten-mRNA und Ablage der daraus umgeschriebenen cDNA in ca. 6000 Klonen von Escherichia coli, b) Hybridisierung gepoolter cDNA-Fraktionen mit ungereinigter IFN-α-mRNA, c) Translation der hybridisierenden mRNA in einem zellfreien System und Prüfung auf antivirale Aktivität, d) Expression der cDNA-Fraktionen aus den Treffern. Da das Glykosylierungsmuster der Interferone keinen großen Einfluss auf den Therapie-Erfolg zu haben scheint, benutzt man häufig E. coli als Wirtsorganismus. Aktive Interferone wurden aber auch in zahlreichen anderen Wirtszellen wie Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, in tierischen Zellkulturen und in der Milch transgener Tiere exprimiert. Herstellung und Aufarbeitung. Seit etwa 1978 begann man mit der industriellen Herstellung von IFN-α durch Sendai-Virus-induzierte humane Lymphoblastom-Zelllinien (NawalmaZellen), wobei allerdings mindestens acht verschiedene IFN-α-Isoformen gebildet wurden. Heute stellt man Interferone meist mit rekombinanten E. coli-Stämmen her. Eine Ausnahme bildet Interferon-β1a, das in rekombinanten CHO-Zellen (→98) hergestellt wird. Mit E. coli erreicht man durch Hochzelldichte-Fermentation (→92) hohe Ausbeuten. Kostenbestimmend ist die Aufarbeitung, die durch Chromatographie (→106) erfolgt. Beispielsweise erzeugt die Roche AG Interferon-α2a (Roferon A®) mit rekombinanten E. coli K12-Zellen. Durch Tiefgefrieren zerstört man die Zellen und macht die Pellets mit den rekombinanten Einschlusskörpern lagerfähig. Nach Rühren in einem Puffer entfernt man Bakterientrümmer durch Zentrifugation und reinigt das Proteingemisch in mehreren Chromatographie-Schritten. Erstmals seit 2001 sind verschiedene durch Umsetzung mit Polyethylenglykol modifizierte Interferone durch die FDA und die EMEA zugelassen („PEGylierte Interferone“ IFN- α2a, IFN- α2b und IFNß1a). Die Aufenthaltsdauer im Körper wird durch PEGylierung auf etwa eine Woche verlängert.

Interleukine

Allgemeines. Die Interleukine (IL) (→80), oft als „Hormone des Immunsystems“ bezeichnet, werden von verschiedenen Zelltypen des Immunsystems gebildet und modulieren durch Bindung an spezifische Rezeptoren anderer Immunzellen deren Aktivität. Beim Menschen wurden bisher mehr als 30 Interleukin-Typen gefunden (IL-1 bis IL-31), von denen aufgrund der starken Nebenwirkungen aber nur wenige (IL-2) als Therapeutikum zugelassen sind; weitere wie z. B. IL-21 befinden sich in der klinischen Prüfung. Eigenschaften und Anwendungen. Interleukin-1 (IL-1) wird in zwei Formen (IL-1α und IL1β) von den phagocytischen Zellen des Immunsystems (Makrophagen, Monocyten) als Präprotein der Molmasse 31 kDa gebildet und proteolytisch zu biologisch aktivem IL-1 der Molmasse 17,5 kDa prozessiert. Es weist proinflammatorische Aktivität auf und stimuliert das Wachstum von Lymphocyten, Fibroblasten, hämatopoietischen Zellen und Thymocyten. IL-1Rezeptoren wurden auf der Oberfläche von T-Zellen und Fibroblasten (Typ I) sowie von BLymphocyten (Typ II) gefunden. Wahrscheinlich lösen Makrophagen die vermehrte Bildung (Expansion) dieser Antigen-spezifischen Immunabwehr-Zellen aus, indem sie nach der Aufnahme und Proteolyse eines Antigens IL-1 als Botenstoff sekretieren. Bei der weiteren Amplifikation der Immunabwehr spielt Interleukin-2 (IL-2, „T-Zell-Wachstumsfaktor“) eine wichtige Rolle. Dieses bestuntersuchte Interleukin wird von Antigen-aktivierten T-Zellen gebildet und stimuliert das Wachstum und die Differenzierung von Tund B-Lymphocyten. Durch die Ausbildung eines IL-2-Rezeptors auf der Oberfläche der TZellen wird dieser Prozess weiter amplifiziert. Ferner potenziert es die Aktivität von Killer-zellen (NK-Zellen) und Monocyten; diese verfügen bereits konstitutiv über einen IL-2-Rezeptor. Die Kristallstruktur des hydrophilen Glykoproteins vom MR 15,5 kDa (133 AS) ist bekannt. IL-2 ist für die Behandlung von Nierenzell-Carcinomen zugelassen. Interleukin-3 (IL-3) ist ein Glykoprotein aus 133 Aminosäuren. Es wird von aktivierten T-Lymphocyten gebildet und induziert die Differenzierung von Knochenmark-Stammzellen zu reifen Leukocyten sowie die Differenzierung anderer Zelltypen des Immunsystems. Es wird deshalb auch als „multipotenter Koloniewachstumsfaktor“ bezeichnet. Interleukin-4 (IL-4), ein Glykoprotein der Molmasse 20 kDa, stimuliert nicht nur wie IL-1 die Bildung von B- und TLymphocyten, sondern auch die Sekretion der Immunglobuline IgG und IgE und erhöht die Antigen-Präsentation von Monocyten. Auch Interleukin-6 (IL-6) wirkt wie IL-1 und IL-2, induziert aber anders als diese auch die Expression verschiedener akute-Phase-Proteine in Hepatocyten und ist wahrscheinlich an einer Reihe von Autoimmun-Erkrankungen beteiligt. Interleukin-10 (IL-10) greift inhibierend in die Biosynthese anderer Interleukine ein („Cytokin-Synthese-inhibierender Faktor“). Interleukin-12 (IL-12) stimuliert die Synthese von γ-Interferon in T-Lymphocyten und NKZellen und scheint an der Orchestrierung der Immunabwehr maßgeblich beteiligt zu sein. Ein Großteil der klinischen Prüfungen rekombinanter Interleukine betrifft die Tumor-Therapie. Ein weiteres Anwendungspotenzial besteht in der Wundheilung, der Verbesserung der Immunabwehr von AIDS-Patienten, in der Immunsuppression bei KnochenmarkTransplantationen, und in der Entwicklung zahlreicher Interleukin-Antagonisten. Zu den sogenannten „Anti-Interleukinen“ zählen monoklonare Antikörper (→242) gegen Interleukine und/oder Interleukin-Rezeptoren, die mit Darm-Erkrankungen (Morbus Crohn) oder autoimmun-bedingten rheumatischen Entzündungen in Zusammenhang gebracht werden.

Beispielsweise ist Kineret®, ein Antikörper gegen den IL-1 Rezeptor, bereits für die Therapie der rheumatoiden Arthritis zugelassen. Herstellung und Aufarbeitung. Interleukin-2 wird mit transformierten Zellen von Escherichia coli hergestellt, da das Glykosylierungsmuster (→262) für den Therapieerfolg nicht entscheidend ist. Durch Mittel- oder Hochzelldichte-Fermentation (→92) erhält man hohe Konzentrationen von Einschlusskörpern, die zuerst über eine Gelchromatographie gereinigt und dann in üblicher Weise unter reduzierenden Bedingungen solubilisiert und unter oxidierenden Bedingungen rückgefaltet werden (→104). Zur weiteren Reinigung dienen HPLC, Fällungsreaktionen und Gelfiltration. Die Aktivitätsbestimmung erfolgt in einem aufwändigen Assay durch die Aufnahme 3H-markierten Thymidins in IL-2-abhängige T-Zellen der Maus.

Erythropoietin und andere Wachstumsfaktoren

Allgemeines. Die Entwicklung der Zellkultur-Technik führte zur Entdeckung zahlreicher Wachstumsfaktoren (colony-stimulating factors, CSF), die in Wechselwirkung mit den Rezeptoren anderer Zellen deren Wachstum stimulieren. Es handelt sich dabei um Cytokine (→80), die in geringsten Konzentrationen gebildet werden. Erst die Gentechnik machte es möglich, sie in größeren Mengen herzustellen, ihre Zusammensetzung zu untersuchen und ihr therapeutisches Potential auszuloten: die gezielte Beeinflussung des Wachstums definierter Zellen (Haut, Nerven, Erythrocyten, Knochen usw.) ist natürlich von großem medizinischen Interesse. Mit dem Erythropoetin (EPO), dem Granulocyten- und dem GranulocytenMakrophagen-Wachstumsfaktor (G-CSF und GM-CSF) gelang es, drei dieser Faktoren mit großem wirtschaftlichen Erfolg in die medizinische Therapie einzuführen. EPO induziert die Bildung von Erythrocyten, G-CSF vor allem von neutrophilen Granulocyten, und GM-CSF die Bildung eosinophiler und neutrophiler Granulocyten sowie von Monocyten und Makrophagen. Die Präparate werden deshalb bei Anämie eingesetzt, wie sie sich vor allem bei Dialysepatienten einstellt. In Deutschland gibt es mehr als 57 000 Dialysepatienten (2013), die EPO erhalten. Der Weltmarkt von EPO wird auf 12 Mrd. US-$, von G-CSF und GM-CSF auf ca. 3 Mrd. US-$ geschätzt (2012), ist aber rückläufig, da die Basispatente abgelaufen sind und immer mehr Biosimilars auf den Markt gelangen. Erythropoietin ist ein Wachstumsfaktor für Erythrocyten. Seine Biosynthese in den Endothelzellen der Niere und den Kupfferschen Zellen der Leber wird vom SauerstoffPartialdruck des Bluts reguliert. Er induziert in den hämatopoietischen Stammzellen des Knochenmarks den Verlust von Zellkernen und die Bildung von Hämoglobin; diese werden damit zu Erythrocyten. EPO stimuliert also die Blutbildung und wird deshalb therapeutisch bei Blutarmut eingesetzt, vor allem bei sekundärer Anämie infolge einer Blutdialyse („künstliche Niere“). Als Kombinationspräparat mit den Knochenmark-Wachstumsfaktoren GM-CSF oder G-CSF, Wachstumsfaktoren für Granulocyten, Eosinophile und Monocyten, ist EPO zu einem unentbehrlichen Aufbaumittel für Dialyse-Patienten geworden. EPO ist auch als Doping-Mittel im Hochleistungssport weithin bekannt geworden. Das Gen für EPO wurde erstmals 1984 aus menschlichem Knochenmark kloniert. Dem Glykoprotein der Molmasse 34 kDa liegt eine Peptidkette von nur 165 Aminosäuren zugrunde; vier Zuckerketten an drei N- und einer OGlykosylierungsstelle tragen ca. 40 % zur Molmasse bei. Wegen des hohen und sehr spezifischen Glykosylierungsgrads (→262) gestaltete sich die Suche nach einem geeigneten Expressionssystem als schwierig. Die Verwendung rekombinanter CHO-Zellen (→98) erlaubte schließlich die Herstellung des glykosylierten Produkts im technischen Maßstab. Die Kristallstruktur von EPO, an seinen Rezeptor gebunden, liegt mittlerweile vor. Wachstumsfaktoren. Diese große Gruppe von Proteinen stimuliert die spezifische Vermehrung und Differenzierung von Nerven-, Haut-, Bindegewebs-, Knochen- und anderer Zellen. Zahlreiche Wachstumsfaktoren wurden kloniert und klinisch erprobt, haben sich aber nur in wenigen Fällen therapeutisch durchgesetzt. Häufiger verwendet man sie als Target zur Entwicklung von Antikörpern gegen unkontrolliertes Zellwachstum. Mit der StammzellTherapie (→78, 306) wird mittlerweile ein neueres Konzept für den Aufbau spezifischer Zelltypen verfolgt. In Australien ist ein Epithel-Wachstumsfaktor für die biologische Schafschur im Markt erhältlich.

Herstellung und Aufarbeitung. Die Herstellung von EPO erfolgt in Bioreaktoren (→100) von 5000 L und mehr mit tierischen Zellkulturen, bevorzugt mit rekombinanten Chinese Hamster Ovary-Zellen (CHO-Zellen). Die Fermentation ist nach etwa 30 Tagen abgeschlossen. EPO wird durch ein vier-stufiges Chromatographie-Verfahren (→106) gereinigt. Von großer Bedeutung für die therapeutische Funktion ist ein authentisches Glykosylierungsmuster des rekombinanten Produkts. Bei anderen Wachstumsfaktoren hat das Glykosylierungsmuster (→262) dagegen keine Auswirkung auf die pharmakologische Wirkung, sodass zur Produktion rekombinante Mikroorganismen verwendet werden können. So kann sowohl GM-CSF wie GCSF industriell mit rekombinanten Stämmen von E. coli hergestellt werden.

Andere therapeutische Proteine Allgemeines. Von den hunderten rekombinanter Proteine, die man derzeit für therapeutische Anwendungen untersucht, werden hier das Cytokin Tumor-Nekrose-Faktor (TNF), DNase I und Glucocerebrosidase besprochen. Tumor-Nekrose-Faktor. Die Entdeckung des TNF geht auf frühe Beobachtungen zurück, wonach sich bestimmte Tumoren nach bakteriellen Infektionen der Patienten zurückentwickeln können. Der Effekt beruht auf der durch bakterielle Endotoxine (Lipopolysaccharide) ausgelösten Bildung von TNF in aktivierten Makrophagen, Monocyten, natürlichen KillerZellen (NK-Zellen) sowie in Leber- und Hirnzellen. TNF kommt in zwei Varianten vor, die weniger als 30 % Sequenzhomologie aufweisen, sich in ihren biologischen Eigenschaften aber ähneln. TNFα (MR 17,3 kDa, 157 Aminosäuren) wird von Makrophagen gebildet. Seine Kristallstruktur zeigt ein aus ungewöhnlich vielen β-Faltblättern (→28) aufgebautes längliches Molekül. Man kennt zwei Typen spezifischer TNFα-Rezeptoren unterschiedlicher Verbreitung. TNFβ (171 Aminosäuren) wird durch Lymphocyten gebildet („Lymphotoxin“) und bindet an die gleichen Rezeptoren. Das Glykoprotein ist weniger gut untersucht. Das ursprüngliche klinische Interesse konzentrierte sich auf den Befund, dass TNFα in vitro cytotoxisch auf transformierte Zellen wirkt und diese Eigenschaft durch Interferone potenziert werden kann. Klinische Untersuchungen bestätigten diese Befunde allerdings nicht und ergaben hohe toxische Nebenwirkungen. In der Tat scheinen viele unerwünschte Nebenwirkungen der Cytokine (→80) (Entzündungszustände, Arthritis, Bluthochdruck usw.) auf die Bildung von TNFα zurückzugehen. TNF spielt somit eine vielfältige Rolle bei unerwünschten und erwünschten Reaktionen, z. B. beim septischen Schock (der ebenfalls durch Lipopolysaccharide ausgelöst wird), bei Cachexie- (Auszehrungs)-Zuständen in der Folge chronischer Infektionen oder bei der Tumorentwicklung. Er ist regulierend an der Bildung anderer Cytokine beteiligt und scheint auch bei der Entwicklung von Autoimmunkrankheiten wie rheumatoider Arthritis sowie bei der Abstoßung von Transplantaten eine Rolle zu spielen. Dieses interessante ambivalente Funktionsbild sowie die mittlerweile einfache gentechnische Produktion von TNFα und TNFβ (z. B. in Escherichia coli) haben dazu geführt, dass Hemmstoffe von TNF intensiv untersucht werden. Dazu gehören monoklonale Antikörper (→242) wie Infliximab (Remicade®) und Adalimumab (Humira®), aber auch Rezeptor-Fusionsproteine wie Etanercept (Enbrel®). DNase I (Pulmozyme®). Cystische Fibrose (Mukoviszidose), eine Erbkrankheit, führt durch exzessive Bildung von Schleim zu einer dramatischen Behinderung der Atmung. Die Viskoelastizität des Sputums wird dabei durch extrazelluläre DNA drastisch erhöht, die aus den Leukocyten stammt. Zur Therapie dient die Inhalation eines Aerosols mit rekombinanter

humaner DNase I (260 Aminosären). Allein in den USA gibt es etwa 30 000 Patienten, das USMarktvolumen liegt bei > 800 Mill. US-$ (2014). DNase I wird mit CHO-Zellen (→98) als Wirtsorganismus produziert. Durch gleichzeitige Einklonierung von Dihydrofolat-Reduktase (→98) und Zusatz von Methotrexat zum Medium erreicht man hohe Ausbeuten. Da das Enzym durch G-Actin im Sputum gehemmt wird, erzeugte man durch protein engineering (→198) Muteine, die Actin-resistent sind und deshalb im Sputum eine 10–50-fach höhere Aktivität aufweisen. Da die cystische Fibrose eine monogenetische Erkrankung ist, wird ihre Behandlung auch mittels Gentherapie (→304) untersucht. Glucocerebrosidase. Die Gaucher-Krankheit ist eine Erbkrankheit, bei der infolge eines Mangels an Glucocerebrosidase in bestimmten Zelltypen große Mengen an Cerebrosiden abgelagert werden. Die autosomal-rezessive Krankheit ist bei etwa einem unter 40 000 Menschen kodiert und ist bei etwa 10 000 Menschen manifest. Aufgrund der klinischen Symptome unterscheidet man 3 Typen. Die Symptome der häufigsten Form 1, die durch Schmerzen im Knochengerüst und im Verdauungstrakt charakterisiert ist, aber nicht zu Nervenleiden führt, können durch regelmäßige intravenöse Gabe des rekombinanten menschlichen Enzyms zurückgedrängt werden. Humane β-Glucocerebrosidase (Cerezyme™) wird aus menschlicher Placenta isoliert oder rekombinant im Zellreaktor mit transgenen CHOZellen (→98) hergestellt. Das Marktvolumen liegt bei 200 Mill. US-$ (2012).

Monoklonale Antikörper

Allgemeines. Polyklonale Antikörper (→82) gewinnt man aus Blutspenden (→226) und setzt sie zur Behandlung von Immundefekten ein. So sind beispielsweise Immunoglobin Base (Privigen® und Gamunex®) gepoolte Fraktionen polyvalenter IgG-Antikörper von jeweils mehr als 1000 Blutspendern, die 2011 Umsätze von jeweils knapp 1 Mrd. US-$ erzielten. Auch die durch Immunisierung eines Tiers gewonnenen Antikörpern sind polyvalent, d. h. Gemische von Antikörpern unterschiedlicher Selektivitäten. Im Gegensatz dazu sind monoklonale Antikörper homogen: sie bestehen aus nur einem einzigen Antikörper-Typ derselben Selektivität und Aktivität und lassen sich, im Gegensatz zu polyklonalen Antikörpern, aus definierten Hybridoma-Zelllinien gewinnen. Hybridoma-Technik. Dem Versuchstier (meist einer Maus) wird das Antigen eingespritzt. Es wird geopfert, sobald die Immunantwort vorliegt. Man isoliert Lymphocyten aus der Milz und fusioniert sie in vitro mit Myelom-Zellen (Zellen eines Lymphocyten-Tumors) der Maus, die sich unbegrenzt teilen und in Kultur gehalten werden können. Ein Teil der dabei entstehenden Hybridoma-Zellen exprimiert auf der Oberfläche Antikörper gegen das verabreichte Antigen und kann mit Hilfe immunologischer Zellklonierungsverfahren selektioniert werden. Die besten Klone werden tiefgefroren und sind über viele Jahre hinweg haltbar. Die Methode erlaubt die reproduzierbare Gewinnung reiner, monoklonaler Antikörper gegen nahezu beliebige Antigene und Haptene. Herstellung monoklonaler Antikörper. (→98) Hybridoma-Zellen teilen sich unbegrenzt. Man kann sie über in-vitro-Kulturen vermehren. Dazu verwendet man ein sogenanntes HAT-Medium aus Hypoxanthin, Thymidin und dem Antimetaboliten Aminopterin, welcher die NukleinsäureBiosynthese hemmt. Hybridoma- und B-Zellen können diese Blockade mittels Hypoxanthin und Thymidin umgehen und sekretieren monoklonale Antikörper ins Kultur-Medium (10 –30 mg/L). Größere Mengen gewinnt man durch Kultivierung der Zellen im Bioreaktor in einem komplex zusammengesetzten Nährmedium. Neben Glucose und Glutamin wurde lange fötales Kälberserum als Nährstoff verwendet, weil es wichtige Cytokine und Wuchsstoffe enthält. Mittlerweile haben sich aber synthetische Medien aus Glucose, Glutamin, Vitaminen, Salzen, Spurenelementen und rekombinanten Wachstumsfaktoren (u. a. Insulin, Lactoferrin) durchgesetzt. Hybridoma-Zellen wachsen aerob auf Oberflächen, können aber auch an das Wachstum in Suspension adaptiert werden. Sie benötigen die Zufuhr von Sauerstoff und von CO2. Die Herstellung im Labormaßstab erfolgt in langsam rotierenden Spinner-Kulturen oder Rollflaschen. Im industriellen Maßstab werden Bioreaktoren verwendet. Dabei muss neben dem Medium auch die Luftbegasung der Scherkraft-empfindlichen Zellen optimiert werden. Im technischen Maßstab bevorzugt man Rührreaktoren und Airlift-Reaktoren (bis zu 20 m3) (→100). Die Verfahrensentwicklung begann mit Zellen, die auf großen inneren Oberflächen von makroporöser Keramik oder in Hohlfaser-Modulen vor mechanischer Zerstörung geschützt waren. Heute gelingt die Produktion in Suspensionskulturen, meist mit CHO-Zellen (→98). Die Prozessführung erfolgt meist semi-kontinuierlich mit Zulaufverfahren, bei denen sich die Ausbeute bei der Ernte bis auf einige Gramm Antikörper/L steigern lässt. Ein typisches Reinigungsprotokoll sieht die Konzentrierung des Fermentationsmediums vor, z. B. durch Ultrafiltration. Danach wird durch Bindung an Protein A vorgereinigt; die Feinreinigung erfolgt durch Ionenaustausch-Chromatographie (→106) und Abreicherung aggregierter

Antikörper und Fremdstoffe durch Gel-Chromatographie. Katalytische Antikörper können durch die Immunisierung von Versuchstieren mit Analogverbindungen des Übergangszustands einer Enzym-katalysierten Reaktion erzeugt werden. Man erhält dabei monoklonale Antikörper, die je nach Auswahl des angebotenen Haptens selbst nicht in der Natur vorkommende Reaktionen wie beispielsweise Diels-AlderAdditionen katalysieren. Röntgenstruktur-Analysen von CDR-Regionen katalytischer Antikörper zeigten Ähnlichkeiten zum aktiven Zentrum (→30) funktionell ähnlicher Enzyme auf. So enthält der katalytische Antikörper 17E8, der Formyl-norleucinphenylester hydrolysiert, eine katalytische Diade aus Ser-His anstelle der katalytischen Triade Ser-HisAsp/Glu der Serin-Hydrolasen. Die Effizienz katalytischer Antikörper (bestimmt als kcat/KM) erreicht bisher bei weitem nicht diejenige von Enzymen.

Rekombinante Antikörper Allgemeines. Gentechnische Methoden erlauben es, Antikörper-Gene nativ oder in veränderter Form in fremden Wirtsorganismen zu exprimieren. In Mikroorganismen erhält man dabei bisher lediglich Antikörper-Fragmente, vor allem single-chain Antikörper (scFv) und Fab-Fragmente (→82). Komplette IgG Antikörper lassen sich mit eukaryotischen Zellkulturen (→98), mit Baculoviren (→6), in der Milch transgener Tiere (→272) und mit transgenen Pflanzen (→284) herstellen (plantibodies). Rekombinante Antikörper haben eine breite Anwendung in Diagnostik und Therapie gefunden. Bispezifische und bifunktionelle Antikörper könnten als Antigen gebundene Wirkstoffe an den gewünschten Wirkort leiten (targeting), z. B. bei Entgiftungsprozessen, bei der Immunsuppression und in der Krebstherapie. In der ProteomicsForschung (→314) werden kombinatorisch erzeugte Antikörper verwendet, um die große Zahl von Proteinen auf 2D-Elektrophorese-Gelen oder in Protein-Arrays (→316) zu identifizieren und quantitativ zu bestimmen. Herstellung. Als genetisches Ausgangsmaterial dient entweder cDNA aus immunisierten Versuchstieren, meist aus Lymphocyten der Maus, oder cDNA aus naiven humanen BLymphocyten. Durch Expressions- oder PCR-Klonierung in Wirtsorganismen lassen sich daraus Antikörper-Fragmente gewinnen. Beispielsweise wird zur Expression korrekt gefalteter scFv- oder Fab-Fragmente in Escherichia coli die für die VL- und VH-Ketten codierende cDNA in λ-Klonierungsvektoren überführt und nach Transfektion von E. coli im periplasmatischen Raum als Fab-Fragment exprimiert. Derartigen Fragmenten fehlen allerdings zwei Effektorfunktionen: das Fc-Fragment und die Glykosylierung der CH2-Domäne. Therapeutische, z. B. bifunktionelle Antikörper, stellt man deshalb bevorzugt in tierischen Zellkulturen her, z. B. mit CHO-Zellen (→98). Alternativ untersucht man auch die Produktion in transgenen Tieren und Pflanzen (plantibodies). Kombinatorische Modifikation. Im Gegensatz zur Hybridoma-Technik ermöglicht es die gentechnische Herstellung von Antikörper-Fragmenten, umfangreiche Antikörper-Bibliotheken herzustellen. Die Methode der Wahl ist dabei das phage display (→198). Dazu wird über

PCR-Methoden das gesamte Repertoire von B-Lymphocyten als cDNA isoliert und in M13Expressionsvektoren verpackt. Die kombinatorische Bibliothek wird dann mit einem Gen fusioniert, das für ein virales Hüllprotein codiert. Nach einer Infektionspassage in E. coli entstehen bis zu 1010 Helfer-Phagen, die im Genom ein Gen für ein Fab- oder scFv-Fragment enthalten (je nach gewähltem Konstrukt) und das Genprodukt auf ihrer Oberfläche präsentieren. Antikörper-Fragmente hoher Affinität und ihre Gene können damit leicht durch immunochromatographische Methoden (→106) isoliert werden. Wiederholte Mutations- und Selektionsschritte mittels chain shuffling, PCR-Zufallsmutagenese oder Mutationsstämmen von E. coli führen in kurzer Zeit zu Antikörpern von teils bemerkenswerter Affinität. So konnte durch stufenweise Mutagenese der CDR-Regionen (→82) die Bindungsaffinität eines HIV-1 neutralisierenden Antikörper-Fragments (gp120) 420-fach auf 15 pM verbessert werden. Das Konzept wurde bereits erfolgreich auf die Isolierung hochaffiner humaner Antikörper (→246) übertragen, wobei man von naiven Antikörper-Bibliotheken aus B-Lymphocyten ausging. Antikörper-Arrays. Rekombinante Antikörper-Bibliotheken sind wertvolle Werkzeuge für die Hochdurchsatz-Analyse von Proteomen (→314, 316). Diese Methode hilft beispielsweise, Protein-Muster von Geweben oder im Serum im Sinn eines „Fingerabdrucks“ zu ermitteln, aber auch bei der Suche nach Biomarkern für die Frühdiagnose von Krankheiten. Zur Herstellung der Antikörper-Bibliotheken werden dazu meist Fab-Fragmente benutzt, die rekombinant z. B. mit der phage display Methode (→198) hergestellt wurden. Die zusätzlich mit einer jeweils einzigartigen („zipcode“) Bindesequenz für Oberflächen ausgestatteten FabFragmente (→82) (> 1010 Varianten) lassen sich in hoher Dichte und mit hoher Selektivität auf entsprechend präparierten Glas- oder Kunststoff-Chips binden (~106 Varianten pro mm2). Durch vorherige Oberflächenbehandlung sind unspezifische Bindevorgänge nahezu ausgeschlossen, das Signal-Rauschverhalten ist exzellent. Die Detektion von Bindungsvorgängen mit Proteinen aus der Proteom-Probe erfolgt meist durch Markierung des gesamten Proteoms mit einem Fluoreszenzmarker (→84); mit dieser Methode wird eine Erfassungsgrenze im piko- bis femtomolaren Bereich erreicht. Auch markierungsfreie Methoden wie die Massenspektrometrie werden untersucht.

Therapeutische Antikörper Allgemeines. Therapeutische Antikörper gehören zu den erfolgreichsten biologischen Wirkstoffen, die in der Klinik verwendet werden. Ihre Haupteinsatzgebiete sind die Krebstherapie und die Behandlung von Entzündungskrankheiten. Sie werden intravenös verabreicht und können deshalb Immunreaktionen auslösen. Aus diesem Grund werden bevorzugt chimäre, humanisierte oder humane Antikörper verwendet, die menschlichen Antikörpern ähneln oder damit identisch sind. Herstellung. Zur Herstellung chimärer, humanisierter oder humaner Antikörper werden drei unterschiedliche Methoden eingesetzt. Chimäre Antikörper erhält man durch Herstellung transgener Mäuse mit menschlichem Fc- und murinem Fab-Anteil (→82). Bei humanisierten Antikörpern beschränkt sich der murine Anteil nur noch auf das Aufpropfen von murinen CDRs („complementarity-determining regions“) (→82) auf menschliche Antikörper. Humane Antikörper erhält man aus dem genetischen Repertoire menschlicher Lymphozyten, das in-vitro kombinatorisch verändert wird. Die „Treffer“ expandiert man dann in Zellkulturen. Chimäre Antikörper erhält man durch Spleißen von Genen, die für humane Fc-Segmente kodieren, mit Genen für murine Fab-Segmente. Man erhält solche Antikörper beispielsweise, indem man in yeast artificial chromosomes (YACs) (→14) eine Kombination der menschlichen und murinen Gen-Anteile für die Bildung des gewünschten Antikörpers kombiniert, damit embryonale Stammzellen (→78) von Mäusen transfiziert, deren Antikörper-Bildung genetisch

unterbunden wurde, und daraus transgene Mäuse herstellt. Der humane Anteil dieser Antikörper liegt im Bereich von 60 %, sodass eine Immunantwort bei therapeutischer Nutzung nicht ausgeschlossen ist. Humanisierte Antikörper erhält man durch den Einbau muriner CDRs (→82) in ein humanes Antikörpersynthese-System. Die Synthese dieser Antikörper erfolgt ebenfalls in transgenen Mäusen, deren Gene, die für die Bildung der schweren und leichten Ketten der Antikörper kodieren, zerstört sind und an deren Stelle das genetische Repertoire zur Erzeugung menschlicher Antikörper implantiert worden ist. In die leichten Ketten werden dabei Sequenzen der murinen CDRs eingebaut. Der humane Anteil der mit dieser Methode gebildeten Antikörper liegt bei 90 %. Humane Antikörper werden aus dem Genrepertoir menschlicher B-Lymphocyten durch die Methoden der klonalen Selektion gewonnen. Dazu wendet man entweder die phage-displayTechnik (→198) an, die auf E. coli-spezifischen Phagen beruht, oder die verwandte HefeSurface Display-Technik, bei der die Antikörper-Bibliothek mit dem Gen für das Oberflächenprotein Aga2p fusioniert wird. In beiden Fällen gibt es umfangreiche Bibliotheken, beispielsweise die HuCal-Bibliothek der Firma Morphosys, die mehrere Milliarden vollständiger menschlicher Antikörper enthält, die auf Bindungsereignisse mit Antigenen ausgelesen werden können. Bei einer noch neueren Technik (Ylanthia®) kombiniert man die hohe Diversität von humanisierten Maus-Antikörpern mit einer Expression in humanen BLymphocyten und erhält so eine Bibliothek von > 100 Mrd. menschlichen Antikörpern hoher Diversität, Kompatibilität und guter Löslichkeit. Anwendungen. Unter den umsatzstärksten Pharmazeutika befinden sich mehrere Antikörper oder Antikörper-Fragmente. Adalimumab (Humira®) ist, ebenso wie das Konkurrenzprodukt Infliximab (Remicade®), ein gegen den Tumor-Nekrose-Faktor TNF-α (→240) gerichteter Antikörper und wird zur Behandlung von rheumatischer Arthritis, Psoriasis, Morbus Crohn und Colitis ulcerosa eingesetzt (Umsätze 2012: zusammen ca. 16 Mrd. US-$). Bevazicumab (Avastin®) unterdrückt die Neubildung von Blutgefäßen (Angiogenese) und wird zur Behandlung verschiedener fortgeschrittener Tumoren verwendet (Umsatz 2013: > 7 Mrd. US$). Trastuzumab (Herceptin®) bindet an den HER2/neu-Rezeptor und unterbindet dadurch das Wachstum von Krebszellen, die diesen Rezeptor exprimieren; er wird bei einem Nachweis dieses Typs von Mamma- und Magen-Karzinomen eingesetzt (Umsatz 2013: 7 Mrd. US-$). Ranibizumab (Lucentis®), ein Fab-Antikörper-Fragment, bindet an den EndothelWachstumsfaktor und dient zur Behandlung von altersbedingter Macula-Degeneration (Umsatz 2013: 4,3 Mrd. US-$). Palivizumab (Sinagis®), ein monoklonaler Antikörper, wird zur passiven Immunisierung gegen RSV-Infektionen (Respiratory Syncytial Virus) von Kindern eingesetzt.

Vakzine

Allgemeines. Bei der „passiven Immunisierung“(→80) zum Schutz gegen Viren, Bakterien oder Toxine (oder zur Therapie von bereits ausgebrochenen Erkrankungen) verabreicht man entsprechende Antikörper. Bevorzugt wird aber die „aktive Immunisierung“ durch Schutzimpfung mit Vakzinen; man verwendet sie seit über 200 Jahren zur Stimulierung des Immunsystems (→80) gegen pathogene Mikroorganismen. Durch Schutzimpfung werden gebildet: B-Lymphocyten, die Pathogen-spezifische Antikörper ausscheiden, T-Lymphocyten, die Körper-fremdes antigenes Material zerstören, und langlebige B- und T-Memory-Zellen, die auf eine erneute Gegenwart des Pathogens schnell mit einer Immunantwort reagieren. Als Vakzine verwendet man inaktivierte oder abgeschwächte (attenuierte) Keime, die nicht mehr pathogen sind, aber noch immunogen wirken. Dabei kann es sich um ganze Zellen, um Zellkomponenten, z. B. um Polysaccharide, oder um toxische Proteine (Toxine) handeln. Attenuierte Viren (→6) gewinnt man durch eine große Zahl von Zellpassagen. Eine Vielzahl von Vakzinen für Mensch und Tier, z. B. gegen Masern, Diphterie, Wundstarrkrampf, Keuchhusten, Tuberkulose, Cholera und Kinderlähmung, beim Tier z. B. gegen die Maul- und Klauenseuche, werden seit Jahrzehnten produziert und für Schutzimpfungen verwendet. Leider gibt es aber noch immer Erkrankungen, für die keine Vakzine zur Verfügung stehen. Dazu gehören viele Tropenkrankheiten, aber auch AIDS. Auch Infektions-Krankheiten, die man bereits für besiegt hielt, sind wieder im Vormarsch, z. B. die Tuberkulose. Die zunehmende Resistenz gegen Antibiotika (→204) hat an dieser gefährlichen Entwicklung einen maßgeblichen Anteil. Gentechnische Methoden eröffnen die Möglichkeit, neuartige und hochreine Vakzine herzustellen. Herstellung von Vakzinen. Die konventionelle Methode besteht darin, inaktivierte oder abgeschwächte (attenuierte) Antigene herzustellen und für die parenterale, intramuskuläre oder orale Anwendung zu formulieren. Häufig verwendet man Erreger-Stämme, die nicht mehr pathogen sind, aber noch eine hinreichende Immunantwort auslösen. Alternativ kultiviert man das Pathogen im Labor und inaktiviert es mit Formaldehyd oder durch Hitze-Behandlung, wobei seine Immunogenität ebenfalls erhalten bleibt. Zur Herstellung von Vakzinen gegen Mikroorganismen oder gegen deren Toxine verwendet man Fermentations-Verfahren im Bioreaktor. Viren kultivierte man bis ca. 1970 bevorzugt in Hühnereiern und reicherte daraus das Virus-Hüllprotein als Vakzin an. Heute ist die Methode der Wahl, tierische Zellkulturen (→98) im Bioreaktor mit Viren zu infizieren. Auch hierbei verwendet man meist attenuierte Viren (→6), die nach der Anreicherung aus der Zellkultur durch Hitzeoder FormaldehydBehandlung inaktiviert oder abgeschwächt werden. Im Hinblick auf das potentielle Risiko des kultivierten Mikroorganismus oder Virus erfolgen Fermentation, Aufarbeitung und Formulierung unter hohen Sicherheitsmaßnahmen (→332). Aktivität und Stabilität der Produkte werden im Tierversuch überprüft. Beispiele. Der von Clostridium tetani ausgelöste Wundstarrkrampf beruht auf der Infektion einer Wunde mit dem Erreger. Dieser sezerniert bei seinem anaeroben Wachstum ein neurotoxisches Protein in den Blutstrom, das zur spastischen Paralyse führt. Zur Gewinnung dieses Toxins kultiviert man einen hypertoxinogenen Stamm (Harvard-Stamm) im Fermenter. Nach Beendigung des Wachstums lässt man die Mikroorganismen autolysieren, entfernt die Zelltrümmer durch Filtration und inaktiviert das Toxin mit ca. 0,5 % Formaldehyd über 4

Wochen. Das entstehende Protein nennt man Toxoid. Man reinigt es durch Diafiltration und Salzfällung, adsorbiert es zur Erhöhung seiner Immunwirkung an Aluminiumsalze (Adjuvans) und prüft seine Wirkung und Gefahrlosigkeit im Tierversuch. Zur Gewinnung des MasernVakzins beimpft man tierische oder menschliche Zellkulturen mit einem Rubella-Virus (Edmonton-Stamm) geringer Virulenz. Nach Lyse der Wirtszellen isoliert man das Virus und führt das Präparat durch Gefriertrocknung in eine lagerstabile Form über. Haus- und Nutztiere werden ebenfalls geimpft. Gegen die Maul- und Klauenseuche muss in der EU zwar nicht mehr geimpft werden, aber noch 2008 impfte man in großem Stil gegen die Blauzungenkrankheit von Schafen, Ziegen und Rindern (Erreger: Blauzungenvirus, durch Insekten übertragen). Als Impfstoff diente ein inaktiviertes Virus-Präparat. Veterinär-Impfstoffe tragen ca. 20 % zum Vakzin-Weltmarkt bei.

Rekombinante Vakzine Allgemeines. Gentechnische Methoden eröffnen neue Möglichkeiten zur Herstellung von Vakzinen. Sie erlauben die Herstellung besonders reiner Komponenten-Vakzine, könnten aber auch zu völlig neuen Immunisierungskonzepten führen; Beispiele sind der Einbau von VakzinKomponenten in die Hülle harmloser Viren (→6), die Expression von Vakzinen in transgenen Pflanzen (→284) oder in der Milch transgener Tiere (→272) (Immunisierung über die Ernährung), sowie eine „Schutzimpfung“ durch direkte Transfektion mit DNA oder RNA. Durchgesetzt haben sich bisher rekombinante Komponenten-Vakzinen zur Prophylaxe von Hepatitis B-Infektionen, zur Diphterie-Prophylaxe und zur Borreliose-Vakzinierung. Strategien. Mit gentechnischen Methoden kann man Komponenten-Vakzine herstellen, die gegen einzelne Komponenten eines Erregers gerichtet sind, z. B. gegen seine OberflächenProteine. Dieses Verfahren setzt allerdings voraus, dass man die immunogenen Strukturen des Pathogens kennt. Ein erfolgreiches Beispiel dieser Strategie ist rekombinantes Hepatitis-BVakzin. Hepatitis B ist in vielen Ländern Asiens eine endemische Erkrankung. Sie verläuft in 90 % aller Fälle unerkannt und führt bei 5 % der Erkrankten zu chronischen Leberschäden. Man schätzt, dass weltweit etwa 1 Mrd. Menschen an Hepatitis B erkrankt sind. Zur Herstellung des rekombinanten Produkts reinigte man das Oberflächenantigen HBsAg des Hepatitis-B-Virus (→6) aus dem Plasma infizierter Individuen und exprimierte es in E. coli oder Säugerzellen, bevorzugt aber in Backhefe (→14). Die Reinigung erfolgte durch chromatographische Verfahren. Versuche zur Immunchromatographie an HBsAg-Antikörpern waren zwar erfolgreich, die Methode ist aber zu teuer. Eine weitere Strategie besteht darin, mit gentechnischen Methoden attenuierte Stämme für die Vakzinierung herzustellen. Ein Beispiel ist

die Entwicklung neuer Impf-Stämme zur Immunisierung gegen Vibrio cholerae, den Erreger der Cholera. Seine Pathogenität beruht auf dem Cholera-Toxin, einem Fusionsprotein mit Adenylat-Cyclase-Aktivität. Es löst im Dünndarm die Bildung von cAMP aus und bewirkt damit einen massiven Verlust von Flüssigkeit und Elektrolyten, was sich klinisch in heftigen Durchfällen äußert. Mit gentechnischen Methoden konnte man Deletionsmutanten von V. cholerae herstellen, die wie der Wildstamm eine Immunantwort auslösen, aber keine Adenylat-Cyclase-Aktivität mehr enthalten. Als dritte Strategie diskutiert man Vektor-Vakzine. Darunter versteht man eine Impfung mit viraler DNA, die so modifiziert wurde, dass sie nicht mehr pathogen wirkt, sondern nur noch die gewünschte Immunantwort auslöst. Als Genfähre wählte man das Rinderpocken-Virus (→6) (Vaccinia) aus, weil es sehr gut untersucht und hochinfektiös, aber für den Menschen harmlos ist. Es gelang, die DNA zahlreicher viraler Antigene in das Vaccinia-Genom zu integrieren und nach Infektion in den meisten Fällen eine Immunantwort auszulösen, beispielsweise gegen das G-Protein des Rabies-Virus, gegen Hepatitis-B-Oberflächen-Antigene, gegen NP- und HAProteine des Influenza-Virus und gegen verschiedene Glykoproteine von Herpes simplex. Das Konzept gilt allerdings als nicht sicher genug (man denke an Säuglinge und immunsupprimierte Patienten). Pandemien der Vogelgrippe (Influenza-A-Virus Typ H5N1 und weitere Varianten) beunruhigen seit 1997 die Gesundheitsbehörden. Mit den Methoden der reversen Genetik gelang die Herstellung wirksamer Vakzine gegen H5N1, die auf einer Immunantwort gegen das virale Hämagglutinin und/oder Neuraminidase beruhten. Transgene Pflanzen werden für Vakzinierungsprogramme in der dritten Welt diskutiert („essbare Vakzine“). Das Vakzin wird dabei wie bei einer Schluckimpfung oral aufgenommen, und die Wirksamkeit hängt davon ab, ob es den Magen-Darm-Trakt passieren und das Immunsystem zur Bildung von Antikörpern anregt. Das Konzept löst auch eine Fülle regulatorischer Fragen aus (konsistente Produktion der Früchte und ihre Verarbeitung). DNA-Vakzinen. Nach der Injektion von DNA, die für Oberflächenstrukturen des MalariaErregers Plasmodium falciparum codiert, in die Milz von Mäusen produzierten diese Antikörper gegen diesen Parasiten. Versuche mit der Expression eines Genom-Verdaus von Mycobacterium tuberculosis in Mäusen führte ebenfalls zu einer T-Zell-Antwort; es konnten Gene identifiziert werden, die eine Immunreaktion auslösen. In beiden Fällen hatte man die Antigen-spezifische DNA in Plasmide eingebaut. Die Methode ist noch nicht praxisreif.

Steroid-Biotransformationen

Allgemeines. Industriell relevante Beispiele für Biotransformationsreaktionen (→164) sind auch die Umwandlung von Sterolen zu Steroid-Hormonen und von Gallensäure zu Ursodesoxycholsäure. Steroide. Die große Gruppe von Verbindungen umfasst über 10 000 natürlich vorkommende und synthetische Verbindungen, von denen viele pharmazeutisch eingesetzt werden. Beispiele sind Vitamin D (→134) (Calciferol), Entzündungshemmer (Corticosteroide), Ovulationshemmer (Estrogene und Gestagene), Digitalis-Glykoside, Diuretika (Spironolacton) und Gallenstein-Therapeutika (Ursodesoxycholsäure). Bei der industriellen Synthese werden verschiedene Biotransformations-Reaktionen eingesetzt. Beispiele sind der Seitenkettenabbau von β-Sitosterol zu Androsta-4-en-3,17-dion (AD) und Androstadien-1,4-dien-3,17-dion (ADD), die Desaturierung von AD zu ADD mit Arthrobacter simplex und die 11βHydroxylierung von Cortexolon („Reichstein-S“). Mit rekombinanter Hefe und Methoden der „synthetischen Biologie“ (→320) gelang eine Totalsynthese von „Bio-Hydrocortison“ aus Zucker. Seitenkettenabbau. Lange Zeit war der hauptsächlich in Mexiko gewonnene pflanzliche Naturstoff Diosgenin das wichtigste Ausgangsprodukt für die industrielle Steroid-Synthese. Daneben konnten sich Gallensäuren aus Schlachttierabfällen und Stigmasterol, ein Nebenprodukt der Vitamin-E-Gewinnung aus Sojaöl, behaupten, dessen Seitenkette durch Ozonolyse abgebaut werden kann. Die Umwandlung dieser Ausgangsstoffe in Corticosteroide, Sexualhormone oder Spironolacton erfordert eine große Zahl chemischer Schritte. Deshalb ist der kontrollierte Abbau der Seitenkette von Phytosterinen, z. B. von β-Sitosterol aus Rapsoder Sojaöl unter Verwendung von Bakterien der Gattungen Mycobacterium, Nocardia, Arthrobacter und Corynebacterium eine attraktive Alternative. Er führt zu den Intermediärprodukten Androsta-4-en-3,17-dion und Androsta-1,4-dien-3,17-dion (Ausgangsprodukten für die Synthese von Estrogenen und Gestagenen), aus denen sich durch chemischen Aufbau der Seitenkette in Position 17 auch Corticosteroide synthetisieren lassen. Andere Sterol-Rohstoffe wie Cholesterol oder Gallensäuren können ebenfalls für derartige Umwandlungen eingesetzt werden, sind aber wirtschaftlich weniger attraktiv. Hydroxylierungen. Aus jahrzehntelanger Arbeit liegen heute in Stammkultur-Sammlungen Mikroorganismen vor, die nahezu alle Positionen des Steroid-Gerüsts selektiv zu hydroxylieren vermögen. Industriell wichtige Beispiele sind die Hydroxylierung von AD in Position 9α und von Progesteron in 11α, Zwischenprodukte, die die Synthese von Corticosteroiden abkürzen. Eine 11β-Hydroxylierung führt dagegen direkt in die PregnenolonReihe. Sie wird mit dem Schimmelpilz Curvularia lunata durchgeführt. Da die Hydroxylase CYP11B2 auch an Position 7α und 14α hydroxyliert, wird als Substrat der 17α-Acetat-Ester des Zwischenprodukts Reichstein-S eingesetzt. Die Biotransformation dieses Substrats in einem Fermentationsprozess erfolgt mit hoher Regio- und Stereospezifität, dauert wegen der geringen Wasserlöslichkeit von Substrat und Produkt aber mehrere Tage durch Nachlösung des suspendierten Substrats. Biosynthese von „Bio-Hydrocortison“ aus Zucker. Ein neuer Ansatz besteht in der Herstellung eines rekombinanten Backhefe-Stamms, der Hydrocortison aus Zuckern bildet.

Hefe bildet durch Biosynthese das Mykosterol Ergosterol. In dem rekombinanten Stamm wurde zum einen durch Ausschalten eines Gens die für den weiteren oxidativen Abbau der Seitenkette ungünstige Δ22-Desaturierung unterbunden, zum anderen Gene des Rinder-SteroidStoffwechsels und eine Δ7-Reduktase aus der Pflanze Arabidopsis thaliana einkloniert und auf Chromosomen XIII, XV und III funktionell zur Expression gebracht. Der rekombinante Stamm bildet aus D-Glucose als einziger C-Quelle Pregnenolon, nach Coexpression humaner 3βHydroxysteroid-Dehydrogenase auch Progesteron. Nach Einklonierung von Genen aus SäugerDNA, die für selektiv hydroxylierende P450 Monooxygenasen kodieren, wird Progesteron in Positionen 11β- 17α- und 21 hydroxyliert. Der rekombinante Hefestamm ist damit in der Lage, aus Zucker Hydrocortison zu synthetisieren. Diese außerordentliche Leistung der molekularbiologischen Grundlagenforschung wurde bei Sanofi-Aventis durch Optimierung des Hefestamms mit den Methoden des metabolic engineering (→318) zu einem kommerziell wettbewerbsfähigen Verfahren ausgebaut.

Enzyme für die Analytik Allgemeines. Für analytische oder diagnostische Zwecke werden Enzyme aller Enzymklassen (→166) eingesetzt. Man macht sich dabei die Spezifität der Enzyme zunutze, die in einer komplexen Matrix eine einzelne Komponente selektiv erfassen können. Um Fehlmessungen zu vermeiden, darf das jeweilige Enzympräparat keine störenden Begleit-Enzyme aufweisen; analytische Enzyme sind deshalb in der Regel von hoher Reinheit (→106). Analysen mit Hilfe von Enzymen werden meist mit Laborautomaten oder Teststreifen, z. T. auch mit Biosensoren (→258) durchgeführt. Enzyme können auch als Reporter (→84) für Bindungsreaktionen zwischen bestimmten Molekülen wie Antikörpern oder Nucleinsäuren dienen (Immun- bzw. DNA-Analytik) (→260, 302); in Gegenwart eines Überschusses an Enzymsubstrat lassen sich hohe Signalverstärkungen für die Bindungsreaktionen erzielen. Anwendungen der Enzymanalytik umfassen die Enzym-Diagnostik (Enzym-Tests mit Laborautomaten, point-ofcare Testkits, Glucose-Biosensoren, Enzymimmunoassays usw.) und Enzymtests im Lebensmittelbereich (→256). Messmethoden. Für die enzymatische Analyse verwendet man meist photometrische, fluorimetrische oder luminometrische Messmethoden (→84). Ist der Substratumsatz nicht direkt nachweisbar, werden eine oder mehrere – ebenfalls meist enzymatische – Hilfsreaktionen nachgeschaltet. Häufig benutzt man hierzu Dehydrogenasen und bestimmt deren Cofaktor NAD(P)H bei 334, 340 oder 366 nm. Entscheidend für den Erfolg dieser Messverfahren war, neben der Bereitstellung reiner Enzyme, die Entwicklung von hochpräzisen Labormodulen und Photometern, die das Arbeiten im μL-Maßstab erlauben (Mikroliter-Technik).

Bestimmungsmethoden. (→30) Zum Einsatz kommen a) Endpunktmethoden, b) kinetische Bestimmungen, und c) katalytische Methoden. Bei den Endpunktmethoden bestimmt man einen Analyten, der als Substrat oder Cosubstrat bei der Enzymreaktion quantitativ umgesetzt wird. Beispiele sind die Bestimmung von Ethanol mit Alkohol-Dehydrogenase oder, in einer gekoppelten Reaktion, die Decarboxylierung von Citronensäure mit Citrat-Lyase zu Oxalessigsäure und dessen Reduktion unter NADH-Verbrauch zu L-Äpfelsäure. Endpunktmethoden benötigen einige Minuten; der Endpunkt wird umso eher erreicht, je niedriger der Km-Wert oder je höher Vmax bzw. die Konzentration des Enzyms ist. Ein Beispiel für die Bestimmung eines Substrats unter Verwendung einer enzymatischen Hilfsreaktion ist die Bestimmung von Glucose mit Hexokinase und Glucose-6-phospat-Dehydrogenase. Glucose z. B. lässt sich mit der gleichen Reaktion jedoch wesentlich schneller mittels einer kinetischen Methode (→30) bestimmen. Dabei wartet man nicht das Erreichen des Reaktionsendpunkts ab, sondern misst die anfängliche Umsatzrate, die – sofern die Substrat-Konzentration deutlich niedriger ist (< 1/10) als der Km-Wert des geschwindigkeitsbestimmenden Enzyms – ersterer linear proportional ist. Da hier die Reaktionsbedingungen besonders genau eingehalten werden müssen, sind kinetische Bestimmungen die Domäne von Analysenautomaten. Bei den katalytischen Methoden lässt sich die Nachweisgrenze des Tests dadurch senken, dass der Analyt als limitierender Faktor in einer cyclischen Mehrenzymreaktion kontinuierlich abgebaut und regeneriert wird, also letztlich als Katalysator wirkt, und der dabei erfolgende Verbrauch des Regenerierungsmittels über eine definierte Zyklisierungsdauer gemessen wird. Ein Beispiel ist die Bestimmung von Coenzym A mit den gekoppelten Reaktionen von Phosphotransacetylase, Citrat-Synthase und Malat-Dehydrogenase. Herstellung und Eigenschaften. Diagnostische und analytische Enzyme werden in relativ kleinen Mengen, aber in hoher Reinheit hergestellt. Meist handelt es sich um intrazelluläre Enzyme (→166), die nur in geringer Konzentration vorliegen und mit dem reichhaltigen Methodenarsenal der Protein-Isolierung angereichert und von störenden Nebenaktivitäten befreit werden müssen (→106). Mittlerweile haben sich auf breiter Front rekombinante Enzyme durchgesetzt, da sie von Wirtszellen in höherer Konzentration gebildet werden, mittels Protein Engineering (→198) in ihren Eigenschaften verbessert werden können und ihre Herstellung billiger und umweltschonend sind. Neben Spezifität und Reinheit eines Präparats ist seine Haltbarkeit wichtig: Um den Aktivitäts-Erhalt während der Lagerung und dem Versand sicherzustellen, erfolgt die Konfektionierung meist durch Zuschlagstoffe, die einen Aktivitätsverlust von < 20 %/a bei Temperaturen von bis zu 40 °C gewährleisten müssen.

Enzym-Tests Allgemeines. Seit etwa 1950 hat sich die Labor-Diagnostik zuerst mit Hilfe der Bestimmung von Enzymen bzw. der enzymatischen Substratanalytik, später ergänzt um Immunoassays (→260) und neuerdings die DNA-Analytik, zu einem unentbehrlichen Hilfsmittel des Arztes entwickelt. Bei der klinischen Enzymdiagnostik bestimmt man niedermolekulare Metabolite wie Glucose oder Milchsäure mit Hilfe von Enzymen selektiv in der komplexen Matrix Blutplasma; man kann aber auch mit Hilfe spezifischer Indikatorreaktionen die Konzentration einzelner Enzyme im Serum bestimmen und so Aufschluss über Organerkrankungen erhalten. Im Gefolge der klinischen Enzymdiagnostik hat sich auch die enzymatische Analytik von Lebensmitteln, von Fermentations-Prozessen (→96) und von Umwelt-relevanten Parameter

etabliert. Das unterschiedliche Adsorptions- bzw. Fluoreszenzspektrum von NAD(P)+ und NAD(P) H wurde schon frühzeitig zur biochemischen Bestimmung niedermolekularer Analyte mit Hilfe von Dehydrogenasen verwendet („optischer Test“). Glucose und Ethanol können auf diesem Weg direkt, Fettsäuren und Glycerin durch Kopplung mit enzymatischen Hilfsreaktionen quantitativ bestimmt werden. Unter praktischen Gesichtspunkten ist es wichtig, mit möglichst wenig Indikator-Reaktionen, meist mit Hilfe der NAD(P)+ oder NADPHBestimmung, alle relevanten Parameter zu erfassen. In der Lebensmittelanalytik werden zahlreiche Zucker (Glucose, Galactose, Maltose) und Säuren (Citrat, Malat) enzymatisch bestimmt. Die kontinuierliche Bestimmung von Glucose in mikrobiellen Fermentationen oder von Lactat in tierischen Zellkulturen ist für die Analytik und Steuerung von Fermentationen von Bedeutung (→96). Auch die Hemmung von Enzymaktivitäten wird analytisch genutzt; so gibt beispielsweise eine Hemmung des an der Nervenreizleitung beteiligten Enzyms Acetylcholinesterase Aufschluss über die Anwesenheit von Kampfstoffen oder Pflanzenschutzmitteln (Organophosphate, Carbamate). Bestimmung von Enzymaktivitäten. Die Bestimmung von Enzymaktivitäten im Blutserum ist ein besonders wichtiges diagnostisches Hilfsmittel, da verschiedene Zellen (Herz, Muskel, Leber) und deren Kompartimente (z. B. Mitochondrien) mit unterschiedlichen Enzymen bzw. Enzym-Subtypen (Isoenzyme) ausgestattet sind und diese beim Zerfall (Infarkt, Dystrophie, Virus-Hepatitis, Cirrhose) in den Blutstrom freisetzen. So dienen bei Leberschäden Transaminasen, bei Pankreas-Erkrankungen α-Amylase und Lipase PL, und bei Herzinfarkt früher Creatin-Kinase als diagnostische Leitenzyme (heute durch Immunassays von kardialem Troponin t (TNT) weitgehend ersetzt) (→260). Ihre Bestimmung erfolgt meist kinetisch mit Hilfe von Substraten, die keine oder nur eine geringe Reaktivität gegenüber anderen Enzymen aufweisen. Laborautomaten. Enzymbestimmungen erfolgten ursprünglich mit manuell beschickten Photometern, die mit Filtern geeigneter Wellenlängen ausgestattet waren. Die Probenvorbereitung (z. B. die Gewinnung von Serum aus Vollblut) erfolgt auch heute noch häufig manuell. Die große Zunahme klinischer Enzymtests löste die Entwicklung von Laborautomaten aus, bei denen alle Pipettier- und Messvorgänge selbstständig über computergesteuerte Programme ablaufen und die > 1000 Einzelbestimmungen/h durchführen können. Oft sind auch verschiedene Messprinzipien wie Enzymtests, immunologische Tests (ELISA) (→260) in einem Vollautomaten integriert. Die Probenzuordnung und -auswertung erfolgen mit Hilfe von Barcodes und aufwändiger Software. Teststreifen. Enzymatische Bestimmungen lassen sich schneller als im Zentrallabor am point of care mit Teststreifen durchführen („Trockenchemie“). Dazu wird die Probelösung (z. B. Vollblut) auf ein mehrschichtiges Vlies aufgebracht, dessen Zusammensetzung sowohl die Probenvorbereitung wie die Farbreaktion ermöglicht. Als Enzymkomponenten für die Nachweisreaktion verwendet man häufig Oxidasen, deren primäres Reaktionsprodukt, Wasserstoffperoxid, mit einem Hilfsenzym (Peroxidase) einen Leukofarbstoff oxidiert, was zu einer der Enzym- bzw. Substratkonzentration proportionalen Farbreaktion führt (→258). Die Auswertung erfolgt entweder visuell anhand einer Farbvergleichsskala oder mittels eines Remissions-Photometers. Auch zur Bestimmung der Frische von Fisch wurden bereits solche

Teststreifen entwickelt. Sie beruhen auf der Messung freigesetzter Amine, die in Gegenwart von Aminoxidase Wasserstoffperoxid bilden.

Biosensoren Allgemeines. In einem Biosensor wird ein biologisches Erkennungselement (Enzym, Antikörper, DNA, Aptamer, Mikroorganismus usw.) mit dem Transducer, einem physikalischen Signalgeber (Elektrode, Optrode, Lichtleiter, Quarzschwinger usw.) räumlich integriert. Von den zahlreichen experimentellen Konzepten haben sich im Markt bisher Enzym- und Mikroorganismus-Elektroden sowie optische Interaktionsmessgeräte durchgesetzt. Das Marktvolumen lag 2011 bei 9 Mrd. US-$. Elektrochemische Biosensoren. Bei den Enzymelektroden werden als Enzyme Oxidasen oder Hydrolasen verwendet. Im Fall von Hydrolasen bestimmt man die bei der Reaktion ablaufende pH-Änderung mittels ionenselektiver Elektroden oder Feldeffekt-Transistoren. Bei Oxidasen lassen sich sowohl das Cosubstrat O2 wie das Coprodukt H2O2 amperometrisch gut bestimmen. Oft senkt man das Redox-Potential durch Verwendung sogenannter Mediatoren. Für Dimethylferrocen beträgt es + 100 mV, sodass unspezifische Redoxreaktionen mit Bestandteilen der Probe ausgeschlossen werden können (Redoxpotential von L-Ascorbinsäure: + 170 mV). Das wirtschaftlich erfolgreichste Beispiel für Enzymelektroden sind GlucoseElektroden, die als stand-alone-Gerät zur Blutzucker-Bestimmung in der Klinik, im TaschenFormat zur Selbstüberwachung von Diabetes-Patienten (→222), aber auch zur Kontrolle des Nährmediums beim Betrieb von Bioreaktoren zum Einsatz kommen (→96). Für DiabetesPatienten wird die Entwicklung implantierbarer Glucose-Elektroden in Verbindung mit tragbaren Insulinpumpen (→222) intensiv bearbeitet, Messstabilität und GewebeInkompatibilität der implantierten Messfühler erfordern aber einen Austausch innerhalb weniger Tage sowie tägliche konventionelle Vergleichsmessungen. Immobilisiert man Mikroorganismen auf einer O2-Elektrode, so kann man mit dieser „mikrobiellen Elektrode“den O2-Verbrauch der Kultur kontinuierlich verfolgen. Man verwendet dieses Prinzip vor allem in einem kommerziell erhältlichen BSB-Sensor für die Abwasser-Technik (→286), der in wenigen Minuten ein Ergebnis liefert, das mit dem üblicherweise nach 5 Tagen bestimmten BSB5-Wert qualitativ korreliert. Enzymimmunoassays (→260) können anstelle von Farbreaktionen auch mit elektrochemischen Reporter-Reaktionen quantifiziert werden. Die Interkalierung elektrochemisch aktiver Verbindungen mit DNA erlaubt es, in einem DNABiosensor (→302) Hybridisierungsereignisse elektrochemisch zu bestimmen. Beide Methoden haben sich in der Praxis aber bisher nicht durchgesetzt. Optische Biosensoren. Die bei der Wechselwirkung eines Antikörpers mit einem Antigen erfolgende Massenvergrößerung lässt sich als Veränderung der optischen Oberflächeneigenschaften im evaneszenten Feld eines Lichtleiter bestimmen. Geräte, die auf diesem Prinzip beruhen, haben eine gute Akzeptanz im Markt gefunden, da sie eine sehr empfindliche (10–10 g/L) kinetische Bestimmung von Wechselwirkungen zwischen Analyt und Antikörper erlauben. Sauerstoff-zehrende Reaktionen lassen sich über die Fluoreszenzlöschung von Pyren-Excimeren quantitativ bestimmen, pH-Änderungen über das Fluoreszenzspektrum von Fluorescein. Koppelt man diese Reaktionen beispielsweise mit der Oxidation von Glucose mit Glucose-Oxidase oder der Bildung von 5-Aminopenicillansäure beim Abbau von

Penicillin G durch Penicillin-Amidase, so erhält man optische Glucose- bzw. PenicillinSensoren („Optoden“). Fließinjektionsanalyse. (FIA). Obwohl die FIA im strengen Sinn nicht zur Biosensorik gehört – biologische Komponenten und Transducer sind voneinander getrennt – hat sich diese Methode sowohl für Enzym- wie für Immuno- und DNA-Assay bewährt. Sie kombiniert den eigentlichen Analysenvorgang mit der automatisierten Behandlung flüssiger Proben und ist damit für sich häufig wiederholende Messungen eines oder weniger Analyte hervorragend geeignet. Das Konzept der FIA lässt sich auf Mikrosystemtechnik bzw. Nanotechnologie übertragen. Natürliche Biosensoren. Die Chemorezeptoren von Bakterien und die Sinnesorgane höherer Lebewesen sind interessante Beispiele natürlicher Biosensoren. Im Gegensatz zu technischen Biosensoren sind sie in der Lage, komplexe Muster vieler verschiedener Effektoren (z. B. Rosenduft, Weinaroma) zuverlässig zu erkennen und sich verändernde chemische Reize in schneller Abfolge zu analysieren. Die Reizverarbeitung wird technisch durch chemometrische Mustererkennung simuliert, die man auch in der Biosensorik nutzt.

Immunanalytik Allgemeines. Erlaubt bereits die Enzymdiagnostik (→256) die schnelle Bestimmung von Einzelkomponenten in einer komplexen Matrix, so ist ihr die Immundiagnostik im Hinblick auf Empfindlichkeit und Vielseitigkeit noch deutlich überlegen. Mit der Entwicklung der Radiound Enzymimmunoassays und der Hybridoma-Technik (→242) wurden seit ca. 1970 die Grundlagen für eine Analysentechnik geschaffen, deren Marktvolumen 2012 auf > 17 Mrd. US$ geschätzt wurde. Methoden. Die Bindung von Antigenen oder Haptenen an poly- oder monoklonale Antikörper erfolgt mit hoher Affinität (kdiss von 10–6–10–8 Mol/L), lässt sich aber nicht auf einfache Weise direkt bestimmen. Beim Wettbewerb von Antigen oder Antikörpern um Bindungsstellen kann dagegen mit Hilfe von Reporterreaktionen (→84) schnell eine quantitative Auswertung erfolgen. Man unterscheidet verschiedene Assay-Formate: homogene Immunoassays, die ohne Trennschritt auskommen, und die aufwendigeren, aber sensitiveren heterogenen Immunoassays, bei denen in einem Zwischenschritt überschüssiges Reagenz sowie störende Matrix eliminiert werden. Mit zahlreichen Test-Formaten kann die Selektivität und Empfindlichkeit den Bedürfnissen angepasst werden. Dazu trägt auch die Wahl der Reportergruppe („label“) bei: bei der Verwendung radioaktiver Nuklide (Radioimmunoassay, RIA) oder von Fluoreszenzfarbstoffen wie Phycoerythrin erfolgt die Signalbildung im Verhältnis 1:1; bei der Verwendung von Enzymen (Enzym-Immunoassay, ELISA) findet darüber hinaus noch eine zusätzliche Verstärkung des Signals durch die Enzymreaktion statt. Bei gut ausgearbeiteten Enzym-Immunoassays können deshalb Erfassungsgrenzen im Pikobis Attomol-Bereich (10–12 bis 10–15 Mol/L) erreicht werden. Als Reporterenzyme setzt man häufig MeerrettichPeroxidase oder alkalische Phosphatase ein. Auch DNA-Fragmente können als amplifizierbare Reportergruppen verwendet werden: in Verbindung mit real-time PCR-Bestimmungen (RTqPCR) (→50) erlauben sie sehr empfindliche Immunanalysen, z. B. von Prion-Proteinen. Auswertung. Die Auswertung von Immunoassays erfolgt über Standardkurven. Als Geräte dienen häufig Mikrotiterplatten mit 96 oder 394 bereits vorbeschichteten Näpfchen (wells) und dazu passende Mikrotiterplatten-Lesegeräte (Photometer, Fluorimeter, bevorzugt Luminometer), da die Messung von Standardkurven einfach in derartige hochparallele Ansätze integriert werden kann.

Teststreifen. Analog zur Enzym-Analytik können auch Immunoassays mit Teststreifen erfolgen. Ihre Anwendung erfolgt z. B. in Apotheken. So bestimmt man beim Schwangerschaftstest die Konzentration des Hormons HCG (Human-Chorion-Gonadotropin) im Urin, dessen Konzentration nach dem Einnisten eines befruchteten Eies in der Gebärmutter in Blut und Urin stark ansteigt. Teststreifen werden aber auch in klinischen Notfallsituationen eingesetzt (point of care-Analytik). In einem typischen Beispiel (Analyse von Troponin T, einem bei Herzmuskel-Verletzungen/Infarkt freigesetzten Protein) befreit man eine auf den Teststreifen aufgebrachte Blutprobe durch Anwendung geeigneter Fließschichten zuerst von Erythrocyten. Der Analyt wird durch Kapillarkräfte über die Reaktionszone bewegt, eluiert dort spezifische Antikörper-Konjugate und bildet mit diesen einen Sandwich-Komplex. Dieser wird in einer weiteren spezifischen Reaktion abgefangen und führt zu einer roten Signallinie. Eine qualitative Auswertung des Tests ist mit dem bloßen Auge, eine quantitative Auswertung mit Hilfe einer CCD-Kamera möglich. Ähnlich ausgelegt ist ein Immunassay auf das Fettsäurebindende Protein FABP, ein 15 kDa-Protein, dessen Freisetzung ins Serum eine Frühdiagnose des Herzinfarkts ermöglicht. Weitere Beispiele. Immunoassays nehmen in der klinischen Diagnostik einen breiten Raum ein. Mit den ungestüm wachsenden Erkenntnissen über die Regulationszusammenhänge im Stoffwechsel ergeben sich immer neue Ansatzpunkte für eine Frühdiagnose von Erkrankungen. In der Lebensmittelanalytik erlauben es Immunoassays, eine unerlaubte Beimengung fremden Eiweißes (z. B. von Casein in Wurstwaren) eindeutig und quantitativ zu diagnostizieren. Auch die Anwesenheit pathogener Mikroorganismen oder Toxine lässt sich immunologisch schnell und sicher nachweisen. Für den Umweltschutz werden Immunoassays angeboten, die eine schnelle Kontrolle auf Verschmutzung von Wasser und Böden mit Pflanzenschutzmittel oder Xenobiotika erlauben.

Glykobiologie Allgemeines. Zuckerketten (Glykane) (→32) kommen in vielen biologischen Strukturen vor und spielen eine wichtige Rolle in der Strukturbiologie. Die Gesamtheit aller GlykanStrukturen in einem Organismus nennt man „Glykom“. Glykosylierungsgrad und -muster sind wichtige Eigenschaften vieler Biomoleküle, z. B. von Antikörpern. Glykoproteine (ProteinAnteil überwiegt) oder Proteoglykane (Zucker-Anteil überwiegt) werden durch posttranslationale Modifikation von Proteinen im endoplasmatischen Reticulum (ER) oder im Golgi-Apparat gebildet. Glykolipide sind wichtige Strukturlipide in Pflanzen (Monogalactosyldiglycerid) und Tieren (Glykosphingolipide, Cerebroside). Auch viele sekundäre Stoffwechselprodukte von Pflanzen (z. B. Flavonoide) und Mikroorganismen (z. B. Antibiotika) sind glykosyliert. Die Analyse von Glykanen kann aufwändig sein, da die vielen chiralen Hydroxylgruppen der Zucker eine hohe Regio- und Stereoisomerie ermöglichen.

Glykosylierungsmuster. Häufige für den Aufbau von Glykanen verwendete Zucker sind Mannose, Galaktose, Glucose, Xylose und Fukose, ferner N-Acetylglucosamin, NAcetylgalactosamin, N-Acetylneuraminsäure und N-Glykolylneuraminsäure (jeweils die DAnomeren). Sie werden in aktivierter Form (z. B. als Uridindiphosphat-Glucose (UDPGlucose)) regio- und stereoselektiv zu einer Oligosaccharid-Kette verbunden. Im Fall der Glykoproteine unterscheidet man N- und OGlykosylierungen des Peptids. Die NGlykosylierung erfolgt am freien Stickstoff der Säureamidgruppe zugänglicher AsparaginReste innerhalb einer Peptidsequenz –Asn-X-Ser/Thr- durch Übertragung einer Kette aus 14 Hexosen am Isoprenoid-Trägermolekül Dolichol, das in der ER-Membran vorliegt. Dieses Bauprinzip ist in allen Eukaryonten konserviert. Die O-Glykosylierung erfolgt dagegen im Golgi-Apparat als Konkurrenzreaktion der Phosphorylierung durch den sequenziellen Aufbau einer Zuckerkette vorzugsweise an Serin und Threonin und ist daher viel heterogener. Analytik. Zur schonenden Ablösung der NGlykane von ihren Konjugaten verwendet man Glykosidasen, O-Glykane werden chemisch durch Beta-Elimierungen abgetrennt. Die quantitative Analytik der Zuckerbausteine erfolgt nach Hydrolyse durch Chromatographie. Für die Analyse der Glykan-Sequenz verwendet man 2D-NMR-Methoden, ElektronensprayMassenspektrometrie oder komplexere massenspektrometrische Methoden (CAD-MS/MS). Darüber hinaus stehen viele weitere Methoden zur Verfügung, z. B. die Auftrennung durch isoelektrische Fokussierung nach Behandlung mit Glykan-abbauenden Enzymen. Bei ProteomAnalysen (→314) werden Glykoproteine, die etwa die Hälfte aller Proteine ausmachen, meist massenspektrometrisch analysiert (Glykoproteomics). Funktionen von Glykoproteinen. Zuckerreste an Proteinen tragen zur Stabilität, zur Viskosität und zur Kompartimentierung der Proteine bei. Glykoproteine sind strukturelle Bestandteile von Zellmembranen und von Gleitmitteln (Mucine). Sie sind an Zell-Zell-Wechselwirkungen beteiligt, z. B. im Immunsystem (→80), wo Glykoproteine des major histocompatibility complex (MHC) auf T-Zell-Rezeptoren einwirken. Biotechnologische Anwendungen. Die für die heterologe Expression von Proteinen verwendeten Wirtssysteme können entweder keine Glykoproteine bilden (E. coli) oder erzeugen andere Glykosylierungsmuster als der Mensch (Backhefe, Schizosaccharomyces, Aspergillus). „Falsche“ Glykosidmuster rekombinanter Bio-Pharmazeutika können Immunreaktionen auslösen; man versucht daher, die Glykosylierungsmuster biotechnologisch hergestellter Wirkstoffe den menschlichen Glykosylierungsmustern anzupassen. Durch Deletionen und Einklonierung geeigneter Glykosyl-Transferasen ist es bereits gelungen, in mikrobiellen Wirtssystemen „humanisierte“ Glykosylierungsmuster zu erzeugen (GlycodExpress®, Aspex®) Da viele Bio-Pharmazeutika in Tierzellen, z. B. in CHO-Zellen (→98) erzeugt werden, wurden auch für diese Expressionssysteme Modifikationen entwickelt. So erzeugte man Fucose-freie Antikörper mit erhöhter Cytotoxizität in rekombinanten CHO-Zellen mit deletierter Fucosyl-Transferase (Fut-8). Zur Erzeugung humaner Glykosylierungsmuster sind menschliche Zellen besonders geeignet. Mittlerweile gibt es auch humane Zelllinien, die kommerziell für die industrielle Herstellung von Antikörpern und anderen Bio-Pharmazeutika angeboten werden.

Landwirtschaft und Umwelt Tierzucht Allgemeines. Seit der „neolithischen Revolution“ vor etwa 11 000 Jahren domestiziert der Mensch Hund, Schaf und Ziege, seit etwa 8000 Jahren Rind und Schwein. Standen zu Beginn die Zähmung und Vermehrung dieser Haustiere im Vordergrund, so sind vorrangige Ziele der modernen Tierzucht die Erzeugung von tierischen Produkten (Fleisch, Milch, Eier, Wolle) mit verbesserter Qualität. In den letzten 30 Jahren hat sich die Leistung eines Fleischbullen mit > 300 kg/a Fleisch und einer Milchkuh mit > 10 000 L Milch/a etwa verdoppelt. Kreuzung und Selektion erfolgen seit Urzeiten nach phänotypischen Merkmalen, deren Ausprägung genetisch oder umweltbedingt sein kann. Die klassischen Methoden populationsgenetischer und biometrischer Analysen werden dabei zunehmend durch bio- und gentechnologische Methoden ergänzt. Dazu gehören: 1. künstliche Besamung, 2. invitro-Fertilisation (IVF) und Embryotransfer, und 3. die Erstellung von Genkarten (→68) für Zuchtmerkmale. Transgene und geklonte Tiere werden bisher nur in der medizinischen Forschung eingesetzt, nicht in der Tierzucht. Man untersucht aber die Erzeugung von Pharma-Produkten in transgenen Seidenraupen und in der Milch transgener Kühe, Schafe und Ziegen (s. Gene Pharming, →272). Künstliche Besamung. Die künstliche Besamung wurde bei der Hunde-Zucht schon 1729 durch Spallanzani beschrieben und wird heute breit eingesetzt. 1942 gab es in Deutschland die erste Besamungsstation für die Rinderzucht. Die Methode ist nicht mit hohen Kosten verbunden und erlaubt es vor allem, männliche Zuchttiere mit hohem Zuchtwert zu selektionieren. Aus dem Ejakulat eines Zuchtbullen gewinnt man 400 Portionen Samen mit je 20 Millionen Spermien, die, mit Gefrierschutzmittel versetzt, in Samenbanken bei –196 °C tiefgefroren werden. Die Auswahl geeigneter Zuchttiere beginnt mit Jungbullen, die aufgrund ihrer Fleischleistung (Gewichtszunahme), der Milchleistung der Mütter, der Körperform und der Spermaqualität eine Vorselektion bestanden haben (Testbullen). Während einer Testdauer von ca. 4 Jahren (Wartebullen) entscheidet es sich dann aufgrund der Milch- und Fleischleistung der Nachkommen (Töchterleistung), ob aus dem Wartebullen ein Zuchtbulle wird. Ein Besamungsbulle kann etwa 1000 Natursprungbullen ersetzen. Die Besamung der weiblichen Tiere erfolgt nach dem Auftauen des Spermas im Stall durch den Tierarzt, einen Besamungstechniker oder den Züchter. In den Industrieländern werden heute etwa 90 % der Milchkühe durch künstliche Besamung trächtig. Beim Schwein werden etwa 60 % der Sauen künstlich besamt. In-vitro-Fertilisation (IVF) und Embryotransfer (ET) können zur Erhöhung der Vermehrungsrate weiblicher Hochleistungstiere angewandt werden. Bei der ET-Methode werden Muttertiere durch Hormonbehandlung zu einer Superovulation angeregt und künstlich besamt. Dabei entstehen bis zu 8 transfertaugliche Embryonen, aus denen nach Übertragung in scheinträchtige Leihmütter im Mittel 4 Kälber entstehen. Die Methode ist praxisreif, aber auch

aufwändig und teuer. Sie hat sich deshalb beim landwirtschaftlichen Nutztier nur begrenzt durchgesetzt. Gut untersucht ist auch die in-vitro-Fertilisation (IVF) von Eizellen außerhalb des weiblichen Geschlechtstrakts, die Methoden zur Kultivierung und Konservierung der dabei entstehenden Embryonen voraussetzt. Die Eizellen werden beim Rind unblutig durch Ultraschall-gestützte Follikelpunktion gewonnen, bei anderen Tieren (Schaf, Schwein) dagegen durch operativen Eingriff. Die Geschlechtsbestimmung der Embryonen gelingt mit PCRMethoden (→50) innerhalb von 3–6 Stunden (Sexing). Die IVF hat beim Rind soweit Praxisreife erreicht, dass geschlechtssortierte Embryonen für den Embryotransfer in Leihmütter angeboten werden. Genetische Karten. Die Genomsequenzierung ist für viele Haus- und Nutztiere (Hund, Katze, Pferd, Rind, Schwein usw.) bereits abgeschlossen. Seit langem arbeitet man an der Herstellung von Genkarten (→68, 268) für Haustiere, vor allem an der Kartierung von Genen, die Einfluss auf landwirtschaftliche Leistungsmerkmale haben. Bei monogenen (von einem Gen abhängigen) Leistungsmerkmalen kann man dabei deren Vererbung durch PCR- und RFLP-Methoden gut verfolgen. Beispiele für praxisrelevante monogene Merkmale sind der Ryanodin-Rezeptor des Schweins, einem Merkmal für die Stressbelastbarkeit, und Varianten von Milchproteinkodierenden Genen beim Rind. Die meisten Leistungsmerkmale sind allerdings polygenen Ursprungs; ihre Vererbung ist wesentlich schwieriger zu analysieren.

Embryotransfer, geklonte Tiere Allgemeines. Bei diesen Arbeitstechniken ist zu unterscheiden zwischen Methoden zur Superovulation und zur Embryonen-Kultivierung, Methoden zum Transfer von Embryonen in Leihmütter, zur Herstellung geklonter oder transgener Embryonen, und zur Herstellung geklonter Tiere. Embryonal-Entwicklung des Säugetiers. (→78) Das Ei der Säugetiere wird während der Metaphase der zweiten Reifeteilung als Oozyte II aus dem Ovar entlassen. Erfolgt bei einer Befruchtung die Fusion mit dem Spermium, so wird die Reifeteilung beendet und der zweite Polkörper abgegeben. Die beiden, vom Vater und von der Mutter stammenden haploiden Vorkerne verdoppeln ihre DNA und vereinigen sich zum diploiden Kern der Zygote; die erste Furchungsteilung schließt sich an. Bei den weiteren Teilungen bis zur Morula nimmt die relative Größe des Zellkerns zu. Im Stadium der Morula beginnt auch die erste

Zelldifferenzierung zur Blastocyste. Diese nistet sich nach Auflösung der Zona pellucida in die Uterusschleimhaut ein und es entsteht ein Embryo (Fötus). Superovulation und Embryonen-Kultivierung. Bei den meisten Tierarten kann die Zahl der Embryonen durch Hormonbehandlung des Muttertiers erhöht werden (Superovulation). Oft gelingt es auch, Eizellen zu entnehmen, in-vitro zu befruchten (IVF) und durch Kultivieren in geeigneten Nährmedien im Labor (ex vivo) bis zum Embryo zu entwickeln. Aus wirtschaftlichen Gründen wurde besonders viel mit Rinder- und Schaf-Embryonen experimentiert; man konnte zeigen, dass beide bei –196°C nahezu unbegrenzt konservierbar sind (Kryokonservierung). Embryotransfer (ET) und Embryonensplitting. Man versteht darunter die Verpflanzung fremder Embryonen der gleichen Art in Leihmütter. Die Embryonen können aus superovulierenden und künstlich besamten Spendertieren stammen. Beim Embryonensplitting isoliert man dagegen mit mikrochirurgischen Methoden aus einer Morula mehrere Blastomeren, die sich nach Transfer in eine Leihmutter zu genetisch identischen Tieren entwickeln. Von einem einzigen weiblichen Rind erhält man zwischen 6 und 20 transfer-fähige Embryonen, die zu ca. 50 % erfolgreich ausgetragen werden. Embryonensplitting wird in der Tierzucht bereits angewandt. Transgene Embryonen. Im Oocyten- oder Blastocysten-Stadium eines Embryos kann man synthetische Genkonstrukte in die Vorkerne oder in embryonale Stammzellen einführen, meist durch Mikroinjektion (→58). Mit dieser Methode gelingt es, Gene auszuschalten (knock-out, →64) oder fremde Gene einzuführen (funktionelles replacement). Die daraus sich entwickelnden transgenen Embryonen transferiert man in Leihmütter und gelangt so zu transgenen Tieren. Pionierarbeit wurde hier vor allem mit der Maus als wichtigem Versuchstier in der Pharma- und Grundlagenforschung geleistet. Das Verfahren wird aber auch bei der Zucht von landwirtschaftlichen Nutztieren angewendet und spielt eine Schlüsselrolle beim Konzept des Gene Pharming (→272). Geklonte Tiere. Die ungeschlechtliche Art der Vermehrung ist bei Einzellern, Pflanzen und niederen Tieren weit verbreitet. Bei höheren Tieren treten dagegen identische Klone nur selten natürlich auf, nämlich bei homozygoten (eineiigen) Mehrlingen (Häufigkeit beim Menschen: 0,3 %). Zur künstlichen Herstellung monoklonaler Tiere wird dem Versuchstier eine Eizelle (haploider Chromosomensatz) entnommen und deren Zellkern mit einer Mikropipette entfernt. In somatischen Zellen des gleichen Tiers (z. B. in Zellkulturen des Euter-Epithels) wird die G0-Phase induziert, bei der keine Zellteilung stattfindet, und eine G0-Zelle mit der entkernten Eizelle fusioniert (diploider Chromosomensatz). Man vermehrt sie in Zellkultur oder im Eileiter eines sterilisierten Muttertiers bis zum Embryonalstadium, überführt den Embryo dann in eine Leihmutter und lässt von dieser austragen. 1997 gelang mit dem Schaf Dolly erstmals die Erzeugung eines aus diploiden, somatischen Zellen eines Elters geklonten, d. h. mit dem Zellspender genetisch identischen Tiers. Das Klon-Schaf Dolly war das einzige ausgetragene Lamm eines Versuchs mit 277 entkernten Eizellen und 29 daraus entstandenen Embryonen. Das Verfahren wurde mittlerweile verbessert und erfolgreich auf mehr als zwei Dutzend Tierarten wie Mäuse, Ziegen, Schweine und Rinder übertragen Es wird für die Erzeugung monoklonaler

Tierherden diskutiert, die mit der Milchdrüse Wertstoffe sezernieren (Gene Pharming, →272), aber auch zum Erhalt gefährdeter Arten.

Genkartierung Allgemeines. Die traditionellen Methoden der Tierzucht mittels Kreuzung und Selektion beruhen auf Erkenntnissen der Genetik. Seit langem benutzt man dazu statistische Methoden, die Umwelt- und genetische Einflüsse einzuschätzen erlauben. Darüber hinaus erstellt man für die wichtigsten Nutz- und Haustiere (Pferd, Rind, Schwein, Schaf, Ziege, Huhn, Hund, Katze) auf der Grundlage der nunmehr bekannten Genomsequenzen immer genauere Genkarten (2005: Huhn und Hund, 2007: Pferd, 2009: Rind). Genetische Karten werden aufgrund der Kopplung von Merkmalen bei der Vererbung erstellt. Physikalische Genkarten geben dagegen die Lage von Genen auf der DNA einzelner Chromosomen an (→72). Die Genome der meisten Haustiere sind ca. 3 Gbp groß und ähnlich komplex aufgebaut wie das menschliche Genom. Für viele Haus- und Nutztiere gibt es bereits genomweite Kopplungskarten, in denen man tausende von Mikrosatelliten als Marker und hunderte funktioneller Gene pro Spezies erfasst. Dadurch ist es möglich, mit PCR-Methoden die allelen Varianten dieser Gene bei Zuchttieren zu analysieren und genetische Eigenschaften mit Zuchtergebnissen zu verknüpfen. Genetische Verbesserung. Die Zuordnung von züchterisch erwünschten Merkmalen (z. B. hohe Fleisch- oder Milchleistung) zu den dafür verantwortlichen Genen gleicht der Aufgabe, ein Puzzle aus zehntausenden von Bausteinen großer Ähnlichkeit, aber unterschiedlicher Herkunft (Eltern und Nachkommen) zusammenzusetzen. Man versucht deshalb, durch standardisierte Tierhaltung die Umweltbedingungen bei der Zucht zu vereinheitlichen und so die genetische Analyse zu vereinfachen. In der züchterischen Praxis können mit komplexen statistischen Methoden (BLUP, best linear unbiased prediction) Umwelt- und genetische Einflussgrößen bei der Variation von Merkmalen eingeschätzt werden. Durch künstliche Besamung und Embryotransfer (→264, 266) gewinnt man darüber hinaus Tiergruppen, bei denen der Einfluss eines bestimmten Elters auf die genetische Ausstattung des Nachwuchses wesentlich genauer analysiert werden kann. Keine dieser Methoden erlaubt allerdings eine einfache Vorhersage der Wirkung einzelner Genvarianten auf komplexe Merkmale. Genetische Karten und Genomsequenzierung. Die Genomanalyse von Säugetieren ist wegen der Größe des Genoms und der Beschränkung der DNA-Sequenzier-Technik auf etwa 600 bp pro Ansatz sehr aufwändig. Man benötigt deshalb Markierungspunkte auf der DNA (Marker), die in definierten Abständen zu einem Gen oder Genabschnitt stehen, aber bereits bei den Eltern polymorph sind (aus verschiedenen Allelen bestehen) und bei der Vererbung aufspalten (→72). Diesen Anforderungen genügen vor allem Mikrosatelliten (VNTR, variable number of tandem repeats). Sie spielen deshalb eine große Rolle bei der genetischen und physikalischen Kartierung des Genoms. Mikrosatelliten machen etwa 20 % der DNASequenzen im Genom der Säugetiere aus (→72, 298). Eine weitere Methode für die Analyse von DNA-Markern ist die RFLP-Analyse (Restriktionsfragment-Längenpolymorphismen). Dazu führt man mit genomischer oder cDNA von Eltern und Nachkommen einen Verdau mit Restriktions-Endonucleasen durch und vergleicht das Spaltmuster nach Gelelektrophorese. Man erhält auf diese Weise Restriktionskarten für Polymorphismen, die in günstigen Fällen mit Merkmalen korrelieren und für die Zucht verwendet werden können. Ist die Position eines für die Zucht bedeutsamen Polymorphismus in der genomischen DNA-Sequenz erst einmal

bekannt, so kann man auch mit PCR-Methoden den entsprechenden DNA-Bereich amplifizieren und im PCR-Produkt die Sequenzunterschiede analysieren. Dabei ist allerdings sicherzustellen, dass genügend Informationen über die Intron-Exon-Struktur des betreffenden Gens vorliegen, vorzugsweise über die nach dem Spleißen gebildete mRNA (bzw. cDNA). Für ökonomisch wichtige Haustiere wie Huhn, Rind und Schwein liegen heute genetische Karten vor, die auf der züchterischen Beobachtung der Vererbung von Merkmalen, Genen oder DNA-Markern beruhen (Rekombinations-Ereignisse beim crossing over während der Meiose) Durch Kopplungsanalyse erhält man Hinweise auf die relative Lage von Genen/Markern in der chromosomalen DNA. Im internationalen „1000 bull genomes project“ hat man 2014 bereits über 200 Rinder verschiedener Rassen sequenziert und versucht, über eine Genom-weite Kartierung von SNPs Allele herauszufiltern, die für die Züchtung relevant sind.

Transgene Tiere Allgemeines. Transgene Tiere, bei denen fremde Gene exprimiert (knock-in) oder eigene Gene ausgeschaltet wurden (knock-out) (→64), untersucht man für die Grundlagenforschung, als Tiermodelle für Erkrankungen des Menschen, für die Tierzucht und für die Produktion von Pharmaproteinen in der Milchdrüse (gene pharming) (→272). Das medizinisch wichtigste Tiermodell ist wegen der einfachen Zucht und der physiologischen Nähe zum Menschen die Maus (Mus musculus, Adjektiv murin). Transgene Tiere. Um Nebeneffekte durch heterozygote Erbmerkmale zu minimieren, geht man bei der Herstellung transgener Tiere möglichst von Inzuchtlinien aus. Inzuchtlinien von Mäusen beispielsweise sind weitgehend homozygot nach 7–10 Bruder-Schwester-Verpaarungen. Für die Übertragung fremden genetischen Materials (knock-in) benutzt man meist die Mikroinjektion von Genkonstrukten in die Vorkerne embryonaler Stammzellen (ES) (→78). Die Methode ist schnell, wird allerdings nur von wenigen Embryonen überlebt. Als Vektoren verwendet man Genkonstrukte, die einen Promotor, das gewünschte Gen in Exon/IntronStruktur und eine PolyA-Signalsequenz enthalten. Die Rekombination solcher Vektoren in das Tiergenom erfolgt oft an mehreren Stellen und in mehreren Kopien. Zum Ausschalten von Genen (knock-out) wird deshalb die Transfektion embryonaler Stammzellen in vitro bevorzugt. Mit replacement- oder Insertions-Vektoren, die homologe Sequenzen zum untersuchten Gen enthalten, aber nicht mehr für ein funktionsfähiges Genprodukt codieren, löst man durch crossing over oder durch induzierten Doppelstrangbruch die Rekombination aus und inaktiviert damit das natürliche Gen. Mitklonierte Selektionsmarker oder gene trap-Vektoren, bei denen ein Reporter-Gen in Exons oder regulatorische Sequenzen des endogenen Gens hineinkloniert wird, erleichtern die Erfolgskontrolle. Bei diesem gene targeting ist der Integrationsort eindeutig und es wird meist nur eine Genkopie integriert. Das Ausschalten von Genen gelingt auch durch genome editing (→270). Nachkommen, die das neu rekombinierte oder das ausgeschaltete Gen in einigen ihrer Geschlechtszellen enthalten (Keimbahn-chimäre Tiere), benutzt man für die Weiterzucht und erhält so Founder-Tiere. Transgene Mäuse. Man verpaart superovulierte Weibchen eingezüchteter Linien nach

einmaliger intraperitonealer Injektion von Gonadotropin (HCG). Aus dem Eileiter erhält man je nach Präparations-Zeitpunkt Mehrzeller, Morula oder Blastocysten, die durch Transfektion oder Mikroinjektion transformiert werden. Bei der Transfektion gewinnt man aus den Blastocysten embryonale Stammzellen (ES) (→78), die pluripotent und in Zellkultur vermehrbar sind, transformiert diese mit DNA-Vektoren und injiziert wieder in Blastocysten. Bei der Mikroinjektion injiziert man einen Vektor mit Fremd-DNA in den größeren männlichen Vorkern, der in befruchteten Eizellen im Einzellstadium sichtbar wird. Die transformierten Blastocysten oder Eizellen implantiert man dann in den Uterus eines Weibchens, bei dem man durch Verpaarung mit einer vasektomierten männlichen Maus Scheinträchtigkeit ausgelöst hat. Anwendungen. Großes Aufsehen erregte 1982 ein Versuch, bei dem man durch Mikroinjektion des Gens für Wachstumshormon (→224) in den Vorkern eines besamten Mäuse-Eis eine transgene „Supermaus“ erzeugte. Vermutet man die Mutation eines bestimmten Gens als Krankheits-Ursache, so kann man überprüfen, ob sich die Fehlfunktion durch Einfügen des intakten Gens (knock-in) kompensieren lässt. Stellt sich dabei im Tierversuch der gesunde Phänotyp ein, so ist eine Beteiligung des Gens an der Erkrankung sichergestellt. Bei der oncomouse ist das aktivierte ν-Ha-ras Onkogen an einen embryonalen Promotor gekoppelt, der bei Verletzung der Epidermis die Bildung von Hauttumoren induziert. Sie werden zum dermalen Test von Mutagenen verwendet. Transgene Mäuse mit Mutationen im β-amyloid precursor protein (APP) dienen als Tiermodell für die Alzheimer-Krankheit, die SCID-Maus mit genetischer Immundefizienz als Modell für Immunerkrankungen. Ende 2013 waren in der Mouse Genome Informatics (MGI) Datenbank knapp 50 000 Mäuse-Genotypen mit PhänotypMerkmalen beschrieben, und es gab Mausmodelle für 1274 menschliche Krankheiten. Da die Genomanalyse vieler Mäusestämme mittlerweile abgeschlossen ist, erleichtert die Analyse transgener Mäuse auch die Funktionsanalyse des menschlichen Genoms.

Züchtung, gene pharming und Xenotransplantation Allgemeines. Gentechnische Methoden wurden in der Zucht landwirtschaftlicher Nutztiere für Forschungszwecke breit eingesetzt. Ziele waren beispielsweise Fett- oder Allergen-arme und Lactose-freie Milch (transgene Rinder), mehr Wollebildung durch erhöhte Cystein-Biosynthese (transgene Schafe), bessere Phosphat-Verwertung von Futter durch einklonierte Phytasen (→192) (transgene Schweine) oder Spezialseiden (→156) (transgene Seidenraupen). Die aufwändige Züchtungstechnik und die nicht gesicherte gesellschaftliche Akzeptanz (→336) verhinderten bisher umfangreichere praktische Anwendungen. Beim Gene Pharming erzeugt man pharmazeutisch nutzbare Proteine in der Milch transgener Mäuse, Schafe, Ziegen oder

Kühe, aus der dann das rekombinante Protein isoliert wird. Ähnlich wie bei der Herstellung in transgenen Pflanzen sind die dabei erzielten Ausbeuten erstaunlich hoch und können oft mit der technischen Herstellung rekombinanter Proteine im Zell- oder Bioreaktor konkurrieren. Für die Bereitstellung von Organen zur Xenotransplantation (vor allem zur Herzverpflanzung) entwickelt man transgene Schweine. Tierzucht. Bei der Erzeugung transgener Nutztiere stand zuerst die Steigerung des Wachstums im Vordergrund, die man durch erhöhte endogene Produktion von Somatotropin mittels Gentransfer erreichen kann. Heute kommen oft Resistenzfaktoren gegen Stress und Krankheit sowie Qualitätsmerkmale hinzu. Beim Säuger erfolgt die Genübertragung meist durch Mikroinjektion in die Vorkerne von Eizellen und Embryotransfer (→264, 266), bei Geflügel durch rekombinierte Retroviren oder durch Befruchtung von Eiern mit Spermien, die Genkonstrukte enthalten. Transgene Fische erhält man beispielsweise durch Elektroporation von Eizellen mit DNA. Anwendungsbeispiele sind: die Verringerung der Krankheitsanfälligkeit (z. B. das Stressresistenz-Gen ryr1 des Schweins) (→268), die Verbesserung der Kälteempfindlichkeit von Fischen mittels einklonierter Antifreeze-Proteine. Gene Pharming. Biomedizinisch wichtige Proteine können als Bestandteil der Milch transgener Tiere sekretiert werden. Man klonierte dazu das gewünschte Gen hinter dem β- oder αS1-Casein-Promotor in den Vorkern einer besamten Eizelle ein und überträgt das Ei oder den ex-vivo gebildeten Embryo in eine Leihmutter. Zwar sind die Ausbeuten an transgenen Tieren bei diesem Verfahren gering (oft < 0,1 % der behandelten Eizellen). Bei erfolgreichem Verlauf erhielt man aber bereits transgene Tiere, die Pharmaproteine wie α1-Antitrypsin (→232), tPA (→230), Urokinase, IGF-1, IL-2 (→236), Lactoferrin oder humanes Serumalbumin (→226) in Ausbeuten von bis zu 35 g/L Milch bildeten. Die Produkte können aus der Milch isoliert oder direkt in Milch verabreicht werden. Da eine gute Milchkuh bis zu 10 000 L Milch/Jahr gibt, würden diese Ausbeuten beispielsweise genügen, um den Bedarf der USA an Faktor VIII (→228) (120 g) mit einer einzigen transgenen Milchkuh zu erzeugen. Auf diese Weise erzeugtes humanes Antithrombin (→230) (ATryn) ist von der FDA und von der EMEA zugelassen . Xenotransplantation. Organ-Transplantationen zählen fast zu den Standard-Operationen (> 500 000 Nierentransplationen bis 2012), es fehlt aber oft an Organspendern. Vor diesem Hintergrund untersucht man transgene Tiere als Organspender. Das Schwein ist dafür besonders geeignet, weil seine Organe eine ähnliche Größe, Anatomie und Physiologie wie die menschlichen Organe aufweisen. Bei der Xenotransplantation muss vor allem immunologisch bedingten Abstoßungsreaktionen (→80) des fremden Organs entgegengewirkt werden. Man unterscheidet dabei a) die hyperakute Abstoßung (Sekunden bis Minuten), die auf einer schnellen Aktivierung des Komplementsystems im Empfänger beruhen, b) die akute Abstoßung (Tage), die auf Reaktionen von T-Zellen beruhen und auch bei Transplantationen von Menschzu-Mensch auftreten, und c) die chronische Abstoßung (bis zu mehreren Jahren), deren genaue Ursachen unbekannt sind. Bei der Übertragung von Organen aus anderen Arten ist die Vermeidung der hyperakuten Abstoßung das vorrangige Ziel. Man hat dazu transgene Schweine gezüchtet, deren Komplementkaskade teilweise durch humane Faktoren ersetzt ist. Dabei handelt es sich vor allem um hCD55 (decay accelerating factor, DAF). Primaten, denen

Herzen transgener Schweine mit diesem Faktor eingepflanzt wurden, zeigten eine Überlebensrate von etwa 40 Tagen, während die nicht transgenen Kontrollen innerhalb weniger Minuten starben.

Pflanzenzucht Allgemeines. Vor etwa 11 000 Jahren, in der „neolithischen Revolution“, begann der Mensch, Pflanzen anzubauen und ihren Ertrag durch züchterische Maßnahmen zu erhöhen. Als Ergebnis einer langen Selektion entstanden die heutigen Kulturpflanzen, die bedeutend mehr Biomasse, Frucht und Samen liefern als ihre wildlebenden Urformen. Die Ernährung des Menschen und seiner Haustiere beruht überwiegend auf diesen Kulturpflanzen. Bereits heute (Anfang 2014) sind allerdings etwa 1/4 der über 7,2 Mrd. Menschen nicht ausreichend ernährt. Da man mit einem Zuwachs der Weltbevölkerung bis 2100 auf 12 Mrd. Menschen rechnet, kommt der Steigerung der pflanzlichen Produktion eine entscheidende Bedeutung zu. Pflanzenzüchtung. Das Ergebnis der Pflanzenzüchtung ist eine Sorte: ein angebauter Pflanzenbestand mit sortentypischen Merkmalen, die bei der Fortpflanzung beibehalten werden. Eine Sorte entsteht durch Kreuzung und Selektion. Man unterscheidet nach Art der Vermehrung, der Befruchtungsart und der genetischen Struktur und Zusammensetzung Linien-, Populations-, synthetische, Klon- und Hybrid-Sorten. Genetisch einheitliche Linien-Sorten erhält man von selbstbefruchtenden Pflanzenarten wie Weizen, Reis, Gerste und Zuckerrohr. Die meisten Blütenpflanzen wie Mais, Kartoffeln, Soja und Zuckerrübe sind dagegen fremdbefruchtend und hochgradig heterozygot. Lassen sie sich vegetativ vermehren wie z. B. Kartoffeln und Zuckerrohr, kann man daraus synthetische bzw. Klon-Sorten mit eingeengtem Genotyp erhalten. Durch erzwungene Selbstbefruchtung (Inzucht) können auch aus fremdbefruchtenden Pflanzenarten hochgradig homozygote Hybrid-Sorten gezüchtet werden. Bei einigen Pflanzen wie Mais werden dazu die männlichen Blütenstände mechanisch entfernt. Sind männliche und weibliche Organe dagegen in einer Blüte vereint, ist diese Manipulation schwierig. Eine Lösung bieten männlich-sterile Elterlinien, die auf zwei Wegen bereitgestellt werden können: aus Varianten mit cytoplasmatischer männlicher Sterilität (CMS, vom mitochondrialen Genom codiert) oder durch selbst-inkompatible (SI) Linien, einem weitverbreiteten Mechanismus zur Verhinderung der Selbstbestäubung. Heterozygote Individuen sind allerdings oft kräftiger als homozygote, vermutlich, weil ihre beiden allelischen Genprodukte mit geringerer Wahrscheinlichkeit inaktiviert werden oder eine größere Reaktionsbreite aufweisen. Man nutzt diese Heterosis züchterisch zur Rückkreuzung aus, ähnlich wie bei Antibiotika-Produktionsstämmen. Ähnliche Vorgehensweisen gelten für den Gartenbau, der über 11 000 Arten umfasst und in Deutschland allein ein Wirtschaftsvolumen von etwa 12 Mrd. € erzielt (2013). Forstwirtschaft. Der Raubbau an den Wäldern führte bereits in der Antike zur Verkarstung und Verwüstung großer Landstriche; er wiederholt sich heute bei den tropischen Regenwäldern. In Mittel- und Nordeuropa wurde erst um 1800 eine nachhaltige Forstwirtschaft etabliert (Alter vor dem Einschlag bei Fichten ca. 100 Jahre, bei Eichen ca. 300 Jahre). Holz (Jahresproduktion ca. 7 · 1010 t) ist ein wertvoller nachwachsender Rohstoff und dürfte in der Zukunft verstärkt für die Produktion chemischer Grundstoffe durch Fermentation verwendet werden („Bioökonomie“, holzbasierte Bioraffinerie) (→330). Heute wird es vor allem als Schnittholz, für Spanplatten und für die Papier- und Zellstoff-Industrie verarbeitet. Moderne biotechnologische Verfahren. Die für die Züchtung homozygoter Hybriden wichtige

männliche Sterilität kann auch mit gentechnischen Methoden ausgelöst werden, indem man durch Einklonierung einer hochaktiven RNase, z. B. aus Bacillus amyloliquefaciens, unter Verwendung eines Pollen-spezifischen Promotors das Absterben des Pollens auslöst. Mit einem Restorer-Gen, das als Inhibitor an die RNase bindet, kann dieser Vorgang moduliert werden. Die Herstellung von Kallus-, Meristem-, Protoplasten- und Haploiden-Kulturen (→276) und deren Regenerierung zu intakten di- und monoploiden Pflanzen hat die Pflanzenzüchtung bereits revolutioniert, da sie in vielen Fällen die klassischen Selektionsschritte erheblich beschleunigt. Transgene Pflanzen können Resistenzfaktoren (→282) gegen Viren, Pilze, Bakterien, Herbizide und Insektizide, aber auch Wertstoffe (→284) exprimieren. Die Fortschritte bei der Sequenzierung von Pflanzen-Genomen und die Erstellung genauer Genkarten bringen die auf molekulargenetischen Informationen beruhende „Präzisionszucht“ weiter voran.

Pflanzliche Zellkulturen: Oberflächen-Kulturen

Allgemeines. Seit etwa 40 Jahren versteht man es, Gewebe und Zellen von Pflanzen-Organen (Wurzel, Blatt usw.) in Form von Organkulturen zu vermehren. Durch Behandlung mit Pflanzenhormonen können aus solchen Laborkulturen häufig wieder intakte, vermehrungsfähige Pflanzen zurückgebildet werden. Die Methode wird in der Grundlagenforschung eingesetzt, aber auch, um 1. Pflanzen mit verbesserten Eigenschaften zu züchten, 2. Zierund Gartenpflanzen Pathogen- bzw. Virus-frei (→6) zu vermehren, 3. transgene Pflanzen herzustellen, und um 4. bedrohte Pflanzenarten als regenerierbare Zellkultur (germ plasm) zu konservieren. Auch die präparative Gewinnung sekundärer Metabolite aus pflanzlichen Zellkulturen ist möglich. Methoden. Man isoliert aseptisch Gewebe aus dem gewünschten Organ einer steril aus Samen gezogenen Pflanze (Explantat) und überführt es in ein festes oder flüssiges Nährmedium. Die meisten Zellen und Gewebe sind heterotroph (→12), sodass zum Wachstum eine C-Quelle wie Glucose oder Saccharose und Nitrat als N-Quelle benötigt wird. Das meist synthetische Medium enthält ferner Vitamine, Spurenelemente, pflanzliche Cytokinine wie Kinetin und Zeatin und Wuchsstoffe wie 3-Indolylessigsäure, (2,4-Dichlorphenoxy) essigsäure und Abscisinsäure. Bei schwer kultivierbaren Zellen werden auch komplexe Medien eingesetzt. Man züchtet die Kulturen steril unter kontrollierten Bedingungen (Licht, Luftfeuchtigkeit, Temperatur) in Klimakammern. Je nach Kultivierungsart der Organkulturen unterscheidet man Kallus- und Suspensionskulturen, nach dem Zelltyp des Ausgangsmaterials Meristem- und Haploiden-Kulturen. Kalluskulturen. Als Kallus bezeichnet man unorganisiert wachsendes Wund-Gewebe, das bei Pflanzen aus den Schnittflächen der Explantate entsteht. Kalli lassen sich auf Agarschalen als Oberflächenkulturen züchten und sind das Ausgangsmaterial für die Herstellung von Kulturen undifferenzierter, omnipotenter Pflanzenzellen. Aus nicht zu alten Kallus-Kulturen entstehen bei Behandlung mit Phytohormonen wieder vollständig ausdifferenzierte Pflanzen, die genotypische, manchmal auch phänotypische Veränderungen im Vergleich zur Ausgangspflanze aufweisen (somaklonale Variation) und für die Züchtung eingesetzt werden können. Suspensionskulturen. Ähnlich wie Mikroorganismen oder tierische Zellen kann man auch isolierte Pflanzenzellen in flüssigen, sterilen Nährmedien vermehren (→278). Meristemkulturen. Meristeme sind die Embryonal-Zellen der Pflanzen; sie können sich unbegrenzt teilen. Man isoliert sie unter sterilen Bedingungen als blattlose Vegetationskegel aus Spross, Wurzel oder Axillarknospen und lässt sie als Kallus- oder Suspensionskulturen wachsen. Unterzieht man Meristemzellen einer kurzen Wärmebehandlung bei 40 °C, so erhält man, wahrscheinlich durch Bildung von Hitzeschock-Proteinen, hohe Ausbeuten an Pathogen/Virus-freien Kulturen, aus denen Pathogen-/Virus-freie Jungpflanzen regeneriert werden können. Diese sind allerdings nicht resistent und können deshalb wieder neu infiziert werden. Meristemkulturen von Weinreben, Erdbeeren, Kartoffeln, aber auch von Zierpflanzen wie Nelken, Lilien und Chrysanthemen haben die gärtnerische Praxis revolutioniert. Der Weltmarkt wird auf mehrere Mrd. US-$ geschätzt. Haploidenkulturen sind Zellkulturen der pflanzlichen Geschlechtsorgane, vor allem der Mikrosporen (Pollen, Antheren) und Makrosporen (Ovarien). Nach Vermehrung in Oberflächenkultur können sie entweder zu unfruchtbaren haploiden Pflanzen mit nur einem

Chromosomensatz oder, in Anwesenheit des Mitosegifts Colchicin oder durch ProtoplastenFusion (→278), zu reinerbigen (homozygoten) diploiden Pflanzen regeneriert werden. Für den Züchter sind derartige Pflanzen von großer Bedeutung, da in den Folgegenerationen immer wieder die gleichen Merkmale auftreten. Haploidenkulturen werden bei der Züchtung von Kartoffeln, Gerste, Raps, Tabak und Arzneipflanzen verwendet. Somaklonale Variation (SV). Gelegentlich treten bei der Kultivierung von Pflanzengeweben spontan genetische Veränderungen auf, die auf Punktmutationen, Genverlusten oder der Umstrukturierung von Chromosomen beruhen. Sie können zu gewünschten oder ungewünschten veränderten Merkmalen führen. Bei Tomaten, Kartoffeln und Zuckerrohr gibt es sogar Sorten, die aus SV hervorgingen.

Pflanzliche Zellkulturen: Suspensionskulturen Allgemeines. Pflanzliche Zellen können, ähnlich wie Mikroorganismen oder tierische Zellen, in sterilen flüssigen Nährmedien (Suspensionskultur) unter Luftzufuhr vermehrt werden, wenn man dem Medium geeignete Phytohormone (→276) zusetzt. Durch Ausplattieren auf feste Nährmedien erhält man daraus gelegentlich Embryoide, die wieder zu neuen Pflanzen auswachsen können. Suspensionskulturen von Pflanzenzellen werden angewandt 1. zum schnellen Screening von Varianten mit vielversprechenden Eigenschaften, 2. zur Herstellung von Protoplasten-Kulturen und transgenen Pflanzen, und 3. zur Erzeugung sekundärer Metabolite im Bioreaktor. Methoden. Man überführt Pflanzen-Zellen aus Stamm- oder Kallus-Kulturen in flüssige Nährmedien, wo sie heterotroph, d. h. in Gegenwart von C- und N-Quellen, Mineralstoffen und Pflanzenhormonen wachsen. Für Suspensionskulturen verwendet man Schüttelkolben, zur Bildung von Sekundärstoffen Bioreaktoren bis zur Größe von einigen m3. Suspensionskulturen. Suspensionskulturen eignen sich im Prinzip hervorragend zum Screening auf neue Eigenschaften (z. B. erhöhte Salz-Toleranz, verbesserte Resistenz gegen Herbizide, Bildung von Sekundär-Metaboliten). Da ein derartiges Screening wesentlich schneller verläuft als die klassische Pflanzenzucht mit Aussaat über mehrere Vegetationsperioden, hat man diese Methode in der Pflanzenzucht intensiv untersucht, z. B. bei Sojabohnen, Citrus-Arten, Zuckerrohr, Mais, Weizen und Kartoffeln, dabei vor allem zur Herstellung Stress- und Pathogen-toleranter Pflanzen-Hybriden. Als Nachteil hat sich dabei herausgestellt, dass unerwünschte Mutanten angereichert werden, dass die Regenerierung intakter Pflanzen aus der Zellkultur nicht einfach ist, und sie auch oft nicht die gewünschten Eigenschaften aufweisen. Suspensionskulturen werden auch zur Herstellung transgener Pflanzen verwendet, wobei man die gewünschte züchterische Verbesserung statt durch Rekombination und Selektion durch gezielten Gentransfer auslöst. Protoplastenkulturen. Hydrolysiert man in einer isotonen Lösung die PolysaccharidZellwand von Pflanzenorganen oder kultivierten Pflanzenzellen vorsichtig mit Cellulasen,

Hemicellulasen und Pektinasen ab, so erhält man Protoplasten. Sie können durch chemische oder elektrische Methoden verschmolzen werden (Protoplasten-Fusion), wobei eine Rekombination der Gene zu somatischen Hybriden erfolgt. Fusioniert man Protoplasten mit Zellkern-freien Cytoplasten, so kann man Erbeigenschaften aus den Organellen des Cytoplasmas übertragen. Diese Methode wird erfolgreich bei der Übertragung der cytoplasmatisch bedingten männlichen Sterilität eingesetzt, die züchterisch von großer Bedeutung ist, weil sie vollständige Fremdbefruchtung gewährleistet. Die Fusion zwischen Protoplasten verschiedener Pflanzen wird untersucht, da auf diesem Weg die Rekombination von Erbgut zwischen Arten möglich sind, die nicht gekreuzt werden können (Tomate und Kartoffel → Tomoffel); neue Pflanzensorte sind dabei aber bisher nicht entstanden. Bioreaktoren mit Pflanzenzellen. Die Vermehrbarkeit von Pflanzenzellen in Form genetisch omnipotenter Zellkulturen eröffnet in Einzelfällen auch die Möglichkeit zur Produktion von Wertstoffen. So stellt man einige Sekundärmetabolite wie Shikonin, Berberin oder Paclitaxel mit pflanzlichen Zellkulturen im Maßstab von bis zu mehreren m3 industriell her. Einstufige enzymatische Biotransformationen mit Pflanzenzellen, z. B. Glykosylierungs- oder Hydroxylierungsreaktionen, haben sich dagegen nicht durchgesetzt, da sie einfacher mit rekombinanten Mikroorganismen durchgeführt werden können. Bei einem typischen Verfahren zur Produktion eines Sekundärmetaboliten überführt man Phytohormon-behandelte Zellen aus Kalluskulturen in einzellige Suspensionskulturen und überimpft sie unter stufenweiser Maßstabsvergrößerung in größere Bioreaktoren (→94). Dabei setzt man Rührreaktoren, Airlift-Fermenter, Blasensäulen oder andere Reaktortypen ein. In jüngster Zeit sind auch vermehrt Einweg-Bioreaktoren aus Kunststoff eingesetzt worden. Während die verfahrenstechnische Behandlung der Fermentation ohne größere Probleme gelingt, bereitet die geringe Stabilität hochproduktiver Zelllinien noch große Schwierigkeiten, da die Biosynthese und Regulation der meisten sekundären Stoffwechselprodukte (→36) noch nicht ausreichend verstanden wird.

Transgene Pflanzen: Methoden Allgemeines. Fremde DNA lässt sich mit mehreren Methoden in das pflanzliche Genom übertragen. Vor allem bei zweikeimblättrigen Pflanzen (Dikotyledonen) wie Tomate, Tabak, Kartoffel, Erbse, Bohne ist das Ti-Plasmid (→58) aus Agrobacterium tumefaciens die Methode der Wahl. Bei ein- oder zweikeimblättrigen Pflanzen, die aus Protoplasten regeneriert werden können, sind auch Elektroporation oder Transformation von Protoplasten geeignet. Intakte Pflanzenzellen können durch Mikroinjektion von DNA oder durch Biolistik transformiert werden. Zum Nachweis einer erfolgreichen Transformation werden ReporterGene und PCR-Methoden benutzt. Ti-Plasmid. Das Bodenbakterium A. tumefaciens kann zweikeimblättrige Pflanzen infizieren und löst dabei die Wurzelhalsgallen-Krankheit aus, eine krebsartige Zellvermehrung am

Wurzelhals. Dabei wird das etwa 200 kbp große Ti-Plasmid (→58) (tumor inducing) in die Pflanzenzelle eingeschleußt und ein 15–30 kbp großes Fragment, die T-DNA, in die chromosomale DNA der Pflanze integriert. Zur Transformation von Dikotyledonen verwendet man modifizierte Ti-Plasmide, die zwar noch infektiös sind, aber keine Virulenz-Gene mehr enthalten. Sie bestehen neben dem Gen, das man klonieren möchte, aus T-DNA, einem Replikationsursprung für Escherichia coli oder für einen anderen, im Labor gut zu handhabenden Wirtsstamm und einem Reporter-Gen. Die Transformation geschieht in Gewebekultur durch Animpfen mit rekombinanten Stämmen von A. tumefaciens. Mit Organspezifischen Promotoren und leader-Sequenzen kann man heute T-DNA nicht nur zum gewünschten Ort der Gen-Expression dirigieren (Blatt, Wurzel, zu verschiedenen subzellulären Kompartimenten wie z. B. zum Chloroplast oder in die Mitochondrien), sondern die Expression auch von äußeren Induktionsbedingungen wie z. B. hohen Temperaturen, Trockenheit, Pathogenbefall, der Lichtqualität oder vom Tag/Nacht-Rhythmus abhängig machen. In analoger Weise verwendet man das Ri-Plasmid von A. rhizogenes („hairy roots“). Pflanzenviren wie Caulimo-Viren oder Gemini-Viren (→6) sind dagegen als Vektoren nicht gut geeignet: sie haben entweder eine zu geringe Aufnahmekapazität für fremde Gene, ein zu enges Infektionsspektrum oder ein zu kompliziertes Replikationsschema. Transgene Monokotyledonen. Viele einkeimblättrige Pflanzen (Weizen, Gerste, Reis) sind besonders wichtige Kulturpflanzen, werden aber durch A. tumefaciens nicht gut transformiert (Ausnahme Reis: in jüngster Zeit durch die Zugabe des Induktors Acetosyringon als chemisches Signal für die Aktivierung der Virulenzregion auch andere Monokotylen). Mit derartigen Protokollen lassen sich über T-Plasmide zwar Protoplasten von Monokotyledonen transfizieren; deren Regenerierung zu intakten rekombinanten Pflanzen ist jedoch schwierig und behindert alle von Protoplasten abhängige Methoden wie Mikroinjektion, Elektroporation und Liposomen-Verschmelzung. Die Methode der Wahl ist deshalb die Biolistik. Dabei bombardiert man Pflanzen-Embryonen mit stark beschleunigten winzigen Gold- oder Wolframpartikeln, auf denen man die zu übertragende DNA ausgefällt hat. Der Gentransfer ist bei dieser Methode allerdings häufig recht instabil („transiente Expression“). Unterbindung der Genexpression. Für diese praktisch sehr wichtige Aufgabe werden drei Methoden untersucht. Einmal kann man, analog zur Technik bei der Gewinnung transgener Tiere, durch Integration einer Fremdsequenz in das Ziel-Gen mittels homologer Rekombination dessen Expression verhindern (knock-out-Pflanzen) (→64). Die Effizienz des Verfahrens ist bei Pflanzen, im Unterschied zu Tieren, allerdings äußerst gering. Erfolgreicher ist die Einklonierung des Ziel-Gens in umgekehrter Leserichtung hinter einem geeigneten Promotor. Transformierte Pflanzen bilden dann außer der vom Gen transkribierten mRNA noch eine antisense-RNA, die mit der mRNA komplexiert und als funktionsunfähiger Komplex durch RNase zerstört wird (→42). Bedeutende Erfolge erzielt man auch mit Methoden des genome editing (→64). Pflanzengenome. Mehrere pflanzliche Genome wurden mittlerweile vollständig sequenziert. (Arabidopsis thaliana, Reis, Mais, Soja, Kartoffel, Weizen, Gerste, Baumwolle, Tabak, Erdbeere usw.). Erschwert wird die Genomsequenzierung von Pflanzen durch deren große Genome (Mais: 2,5 Gbp), ihre Polyploidie (Saatweizen: hexaploid), zahlreiche repetitive

Sequenzen (Weizen: 80 %) und Transposons.

Transgene Pflanzen: Resistenz Allgemeines. 2014 wurden weltweit in 28 Ländern mehr als 10 transgene NahrungsmittelPflanzen auf einer Fläche von 181,5 Millionen ha angebaut. 73 Millionen ha davon entfielen auf die USA. Angebaut wurden vor allem Soja, Mais und Baumwolle, ferner Raps, Zuckerrüben, Papaya, Tomaten, Luzerne, Pappeln und weitere Pflanzen. Vorwiegend klonierte man Gene zur Herbizid-Toleranz, ferner Gene gegen Insekten- oder Virusresistenz. Im fortgeschrittenen Entwicklungsstadium befinden sich transgene Pflanzen mit erhöhter Stresstoleranz und veränderter Blütenfarbe. Herbizid-tolerante Pflanzen. Etwa 10 % der weltweiten Ernten gehen durch Verkrautung verloren. Das ideale Herbizid sollte in geringen Konzentrationen wirksam sein, das Wachstum der Kulturpflanze nicht beeinträchtigen, rasch abgebaut werden und nicht ins Grundwasser gelangen. Transgene Pflanzen mit Herbizid-Toleranz sind genetisch so verändert, dass sie entweder das Herbizid-empfindliche Protein in großen Mengen enthalten, das Herbizid weniger gut oder gar nicht mehr am Wirkort binden oder es durch Abbau inaktivieren. Beispielsweise wurden Sojabohnen mit Toleranz gegen Glyphosat (Roundup™) dadurch erzeugt, dass man Glyphosat-resistente Stämme von Escherichia coli isolierte, daraus das Gen für 5-O-Enolpyruvylshikima t-3-phosphat-Synthase (EPSP-Synthase, das Target des Herbizids) klonierte und es unter der Kontrolle eines pflanzlichen Promoters in Sojabohnen einklonierte. Resistenz gegen Phosphinothricin (→210) (Glufosinat, Basta™), einem Hemmer der Glutamin-Synthase, erhielt man durch Einklonieren einer Phosphinothricin-Acetyltransferase (PAT) aus Streptomyces hygroscopicus in Tabak, Kartoffeln, Raps und andere Pflanzen. Insekten-resistente Pflanzen. Bacillus thuringiensis bildet ein Protein vom MR 250 kDa (δEndotoxin, BT-Toxin), das im Insektendarm durch Proteolyse in ein hochwirksames Toxin übergeht. Von Pflanzen und Säugetieren wird es nicht zum Toxin prozessiert. Man hat deshalb BT-Toxin als Fressgift in zahlreichen Nutzpflanzen exprimiert. Durch Codon-Optimierung und Verwendung starker, konstitutiver Promotoren, z. B. des 35S-Promoters des Blumenkohlmosaikvirus, konnte die Expressionsrate etwa 100fach erhöht werden. Auch mit einklonierten Protease-Inhibitoren als Fress-gift wurden Erfolge erzielt. Pilz-resistente Pflanzen. Pilzerkrankungen führen zu großen Ernteschäden. Ein auch historisch wichtiges Beispiel ist die Kartoffelfäule (Phytophthora infestans), die im 19. Jahrhundert in Europa, z. B. in Irland, zu großen Hungersnöten führte. Durch Expression von pflanzeneigenen Chitinasen oder Glucanasen, die gegen die pilzliche Zellwand gerichtet sind, konnte die Pilzresistenz von Tabak erhöht werden. Gute Erfolge erzielte man auch mit der Expression Ribosomen-inaktivierender Proteine (RIP). Virus-resistente Pflanzen. Viren (→6) können erhebliche Ernteverluste bewirken, z. B. das Potato-Virus 4 bei der Kartoffel oder das Rhizomania-Virus bei der Zuckerrübe. Man versucht deshalb, durch Expression nicht mehr funktioneller Virus-Proteine in der Pflanze in den Replikationsmechanismus des Virus einzugreifen (cross protection). Ebenfalls untersucht werden die Expression antiviraler Antikörper und von Hammerkopf-Ribozymen (→42). Pflanzen mit erhöhter Stresstoleranz. Viele Arten von physiologischem Stress (grelles

Licht, UV-Strahlung, Hitze, Trockenheit) gehen einher mit der Bildung von SauerstoffRadikalen, vor allem des Sauerstoff-Radikalanions. Man transformierte Pflanzen deshalb mit dem Gen des Enzyms Superoxid-Dismutase unter der Kontrolle des 35S-Promoters des Blumenkohlmosaikvirus. Die transformierten Pflanzen waren nicht nur resistenter gegen physiologischen Stress, sondern welkten auch langsamer. Veränderte Blütenfarbe, Alterung. Bei dekorativen Pflanzen sind Form und Farbe, bei Früchten Haltbarkeit und Aroma wesentliche Leistungsmerkmale. Diese Eigenschaften können durch den Einbau fremder Gene oder die Ausschaltung vorhandener Gene beeinflusst werden. Zur Bildung veränderter Farbstoffe, meist Flavonoid- und Anthocyanglykoside, benötigt man für eine Erweiterung des genetischen Repertoirs Gene aus dem Sekundärstoffwechsel anderer Pflanzen. Ein Beispiel ist die „blaue Rose“ Applause™. Zum Ausschalten von Genen bietet sich die antisense-Technik an: sie wurde erfolgreich bei der Flavr-Savr™-Tomate eingesetzt („Anti-Matsch-Tomate“) (→42, 64).

Transgene Pflanzen: Wertstoffe Allgemeines. Die Bearbeitung von Pflanzen mit gentechnischen Methoden umfasst nicht nur die Verbesserung ihrer Resistenz (→282), sondern auch die Modifikation Pflanzen-eigener Stoffe, („nachwachsende Rohstoffe“) sowie die Synthese von Wertstoffen mit Hilfe transgener Pflanzen. Beispiele sind: 1. die Modifikation der Aminosäure-, Stärke- oder ÖlZusammensetzung und die Veränderung des Lignin-Gehalts von Hölzern, 2. die Expression Pflanzen-fremder Stoffe wie Antikörper oder A.-Fragmente (plantibodies), Vakzine, menschlichem Serumalbumin oder von Biopolymeren. Modifikation Pflanzen-eigener Stoffe. Um dem Mangel vieler Pflanzenproteine an essentiellen Aminosäuren (→124) (meist L-Lysin und L-Methionin) abzuhelfen, wurden mehrere Wege erfolgreich eingeschlagen: a) die Expression günstiger zusammengesetzter Speicherproteine aus anderen Pflanzen, b) die positionsgerichtete Mutagenese eigener Speicherproteine zum Ersatz nicht-essentieller durch essentielle Aminosäuren, c) die Einklonierung von Genen deregulierter Schlüsselenzyme für verzweigte Stoffwechselwege, z. B. der Aspartokinase aus Escherichia coli und der Dehydrodipicolinsäure-Synthase aus Corynebacterium für eine verstärkte Biosynthese von L-Lysin (→128). Ein anderes Ziel ist es, Anteil und die Zusammensetzung von Stärke zu erhöhen. Einen Ansatzpunkt dafür bietet die Aktivität der ADP-Glucose-Pyrophosphorylase, einem Schlüsselenzym der StärkeBiosynthese, das in vielen Pflanzen allosterisch reguliert wird. Durch Einklonieren des nicht regulierten Gens aus E. coli erzeugte man Tomaten mit einem um ca. 20 % erhöhten StärkeGehalt. Das Verhältnis von linearer Amylose zu verzweigtem Amylopektin bestimmt die Eigenschaften der Stärke bei der Herstellung von Lebensmitteln und in der Technik. Die Expression des für die α-1,6-Verknüpfung von Stärke-Bausteinen verantwortlichen Gens glgB aus E. coli unter Kontrolle des granule bound starch synthase (GBSS)-Promotors in der

Kartoffel führte zur Bildung von Stärke mit einem um 25 % erhöhten Anteil von Amylopektin. In einem weiteren Ansatz konnte die Bildung von Amylase durch Hemmung der Transkription der GBSS mit Hilfe einer spezifischen antisense-RNA sogar vollständig ausgeschaltet werden (Amflora™-Kartoffel) (→42, 64). Die Fettsäure-Zusammensetzung von Ölpflanzen wurde ebenfalls nachhaltig modifiziert. Beispielsweise kommt Laurinsäure (C12), ein wichtiger nachwachsender Rohstoff für die Herstellung Kaltwasser-löslicher Tenside, nur in tropischen Ölen (Kokos, Palmkern) in Form des Triglycerids (→162) in großen Mengen vor. Durch Einklonierung Kettenlängen-spezifischer Fettsäure-ACP-Thioesterasen aus Lorbeer (Umbellularia california) (und andere Maßnahmen) in züchterisch bereits hochwertige RapsLinien gelang es, transgenen Raps zu erzeugen, dessen Saatöl 50 Mol-% Trilauroylgycerin enthält. Den Lignin-Gehalt von Hölzern reduzierte man durch die Modulation von Genen der Lignin-Biosynthese (Shikimisäure-Synthase, Coumaryl-3′-Hydroxylase) (→184). Expression Pflanzen-fremder Stoffe. Die meisten Untersuchungen wurden bisher in Tabakpflanzen oder in Arabidopsis thaliana durchgeführt, da sich diese Organismen besonders gut transformieren lassen. So gelang die Expression menschlichen Serumalbumins ebenso wie die Bildung vollständiger IgG-Antikörper („plantibodies“) (→244), die mit Blick auf eine Karies-Prophylaxe gegen das Adhesin von Streptococcus mutans gerichtet waren; man erreichte dabei Konzentrationen von bis zu 1 % des Gesamtproteins. Die preiswerte Expression von Antigenen in Pflanzen eröffnet möglicherweise die Chance, in Entwicklungsländern eine Vakzinierung mit der Nahrungsaufnahme durchzuführen. Im Modellversuch gelang es, das Oberflächen-Antigen des Hepatitis B-Virus (→250) in Tabak in einer Konzentration von 0,01 % des löslichen Proteins zu exprimieren, und die Verfütterung des Tabakmehls führte in Mäusen zu einer Immunantwort. Der Verzehr von Kartoffeln, die ein Fragment des zu Durchfällen führenden hitzelabile Enterotoxin B aus E. coli exprimierten, bewirkte im Menschen ebenfalls eine Immunantwort. Exprimiert man das für die Synthese von Polyhydroxybuttersäure (→154) verantwortliche Operon von Alcaligenes eutrophus, das aus drei Genen besteht, in den Chloroplasten von Arabidopsis thaliana oder Raps, so erhält man diesen abbaubaren Kunststoff preiswert durch Photosynthese. Die Aufarbeitung dieses Polymers aus Pflanzen ist allerdings noch unökonomisch, und eine kritische Öffentlichkeit gilt es noch von den Vorteilen des Anbaus gentechnisch modifizierter Pflanzen zu überzeugen.

Aerobe Abwasserbehandlung

Allgemeines. Die aerobe Abwasserbehandlung wurde vor etwa 100 Jahren eingeführt (Tropfkörper, Belebungsbecken) und hatte, in Verbindung mit der bereits früher begonnenen Kanalisation von Abwässern, einen dramatischen Rückgang von Seuchen und eine Zunahme der allgemeinen Lebenserwartung zur Folge. Heute wird in den meisten Industrieländern der überwiegende Teil der Abwässer biologisch geklärt. In Deutschland sind knapp 10 000 Kläranlagen in Betrieb, 95 % mit biologischer Klärstufe. Sie versorgen etwa 95 % der Gesamt-Bevölkerung. Die chemische Industrie entlang dem Rhein klärt allein etwa 15 Mrd. m3 Abwasser/a. Ein Nachholbedarf besteht noch in vielen Küstenregionen der Mittelmeerländer (Einleitung ungeklärter Abwässer ins Meer) und bei vielen Entwicklungs- und Schwellenländern, besonders wenn dort Industrialisierung und schnelles Bevölkerungswachstum zusammentreffen. Zusammensetzung von Abwasser. Man unterscheidet zwischen häuslichem und industriellem Abwasser. Während letzteres von der das Abwasser erzeugenden Industrie abhängt, ist häusliches Abwasser trotz zeitlicher Schwankungen relativ konstant zusammengesetzt. Der Abwasser-Anfall pro Einwohner und Jahr beträgt etwa 82 m3 (davon ist etwa die Hälfte Regen- und Sickerwasser) und enthält im Mittel eine organische Belastung von 60 g BSB5/(Einwohner und Tag) (Einwohner-Gleichwert, EW). Der BSB5 (biochemischer Sauerstoffbedarf innerhalb von 5 Tagen) wird dabei nach Einheitsverfahren über die Sauerstoffzehrung einer Probe gemessen. Dagegen bestimmt man mit der Analyse des chemischen Sauerstoffbedarfs (CSB) und/oder des total organic carbon (TOC) die gesamte organische Belastung und die oxidierbaren anorganischen Bestandteile eines Abwassers, ferner noch Gesamt- und organisch gebundenen Stickstoff (TKN, Norg) und Phosphorgehalt. Der EW ist unabhängig vom Trinkwasser-Verbrauch. EW und Abwassermenge benötigt man zur Auslegung einer Kläranlage. Viele Abwässer enthalten sowohl häusliche wie industrielle Anteile. Mikrobiologische Gesichtspunkte. Im Belebtschlamm der aeroben Abwasserreinigungsanlagen befinden sich eine Vielzahl symbiontisch lebender Mikroorganismen, Algen und Protozoen (Biozönose). Bei der Einleitung häuslichen Abwassers ist diese Population oft über lange Zeiträume stabil, während der Zufluss industrieller Abwässer einen nachhaltigen Einfluss auf die Zusammensetzung der Lebensgemeinschaft nehmen kann. Durch Bestimmung der 16S-RNA mittels FISH-Methoden (→74) konnte die Analyse solcher Biozönosen erheblich verbessert werden. Neuerdings sind spezielle StarterKulturen (→114) auf dem Markt erhältlich, die in der Mischkultur überleben und die Abbauleistung für chemische Abwässer verbessern sollen. Tropfkörper-Verfahren. Man lässt mechanisch vorgereinigtes Abwasser in einem Turm über Materialien mit großer Oberfläche (z. B. Lavasteine) rieseln. Dabei bilden sich Lebensgemeinschaften aus, die für den biologischen Abbau verantwortlich sind. Die Abbauleistung ist durch Diffusions-Limitierung des Sauerstoffs begrenzt. Überschussschlamm kann man durch Ausspülen unter Druck entfernen und in der Schlammfaulung behandeln. Belebungsanlagen. Beim Bau neuer Anlagen werden Belebungsbecken wegen ihrer höheren Durchsatzleistung bevorzugt. Der aerobe Abbau der organischen Abwasser-Fracht erfolgt

dabei durch Einblasen von Luft. Die gebildete Zellmasse (Belebt-Schlamm) trennt man durch Sedimentation ab und überführt sie in die Schlamm-Faulung. Die Leistung dieses KläranlagenTyps liegt etwa 5fach höher als bei Tropfkörper-Anlagen und kann durch Eintrag von O2 anstelle von Luft weiter verbessert werden. Nachteile sind die offene Bauweise mit eingeschränkten Möglichkeiten der Prozessführung und Geruchsbelästigung. In Deutschland ist eine 3. Reinigungsstufe Standard; in ihr wird der Eutrophierungs-Faktor Phosphat biologisch oder durch chemische Fällung, der Trinkwasser-Risikofaktor Nitrat biologisch durch Nitrifikanten und Nitrat-Reduzierer (Denitrifikanten) eliminiert. Turmbiologie. Zur Reinigung der Abwässer chemischer Großbetriebe wurden bei Bayer und Hoechst mehrere dieser Anlagen gebaut. In den ca. 30 m tiefen geschlossenen SchlaufenReaktoren (→196) erreicht man durch gute Sauerstoff-Versorgung und ausgefeilte Dosierung der Zuläufe eine hohe Abbauleistung bei verringerten Kosten und ohne Geruchsbelästigung. Zur Verbesserung der Abbau-Leistung mischt man häusliche Abwässer bei.

Anaerobe Abwasser- und Schlammbehandlung Allgemeines. Der bei der aeroben Abwasserreinigung gebildete Schlamm wird in der Regel einer anaeroben Behandlung (Ausfaulung) unterzogen, bevor man ihn deponiert, verbrennt oder landwirtschaftlich nutzt. Die Schlammfaulung ist einer der bedeutendsten Fermentationsprozesse: allein in Deutschland entsteht in ca. 5000 Schlammfaulungsanlagen mit einem Arbeitsvolumen von ca. 1 Mio. m3 jährlich ca. 100 Mio. m3 Biogas. Abwasser kann im aneroben Festbett-Reaktor (→86) auch direkt anaerob behandelt werden. Man erzielt mit dieser Methode vor allem bei der Behandlung gut abbaubarer Industrie-Abwässer (z. B. aus der Lebensmittel-Industrie) große Erfolge. In technologisch weniger entwickelten Ländern erfolgt die Entsorgung von Abfällen in anaeroben Faulbehältern häufig vor allem unter dem Gesichtspunkt der Energie-Gewinnung durch Biogas. Biogas-Erzeugung aus Abfällen gewinnt aber neuerdings auch in den Industrieländern wieder an Bedeutung (Bioökonomie) (→330). Mikrobiologische Gesichtspunkte. An der Methan-Bildung aus Schlamm sind drei Gruppen

von Bakterien (→10) beteiligt: 1. verschiedene obligate und fakultativ anaerobe Bakterien (Clostridien, Streptokokken, Enterobakterien) bilden aus Stärke, Fetten und Proteinen organische Säuren, H2 und CO2, 2. acetogene Bakterien wandeln höhere organische Säuren in Essigsäure, H2 und CO2 um, 3. methanogene Bakterien bilden aus Essigsäure CO2 und Methan; sie sind obligate Anaerobier und gehören taxonomisch häufig zu den Archaea. Messgrößen. Die wichtigsten Messgrößen für die Schlammfaulung sind die Abnahme des chemischen Sauerstoffbedarfs (CSB) und die Biogas-Bildung. Der CSB ist die zur vollständigen chemischen Oxidation einer Mischprobe (hier: Schlamm) zu CO2 und H2O benötigte Sauerstoff-Menge. Die CSB-Abnahme gibt damit Aufschluss über den Grad der Mineralisierung einer Probe. Zur CSB-Bestimmung oxidiert man meist mit Dichromat. Biogas ist das Endprodukt der anaeroben Schlammfaulung und besteht zu etwa 2/3 aus CH4 und zu 1/3 aus CO2. Es enthält Spuren von H2, N2, H2S und anderen Gasen. Man bestimmt die Zusammensetzung durch Gaschromatographie. Technische Gesichtspunkte. Im Vergleich zur aeroben Behandlung von Abwässern verläuft der anaerobe Abbau wesentlich langsamer (Verweilzeit > 20 d). Die für eine gute Ausfaulung von Schlamm erforderliche bakterielle Mischpopulation entwickelt sich nur in engen Temperatur- und pH-Grenzen, sodass diese Parameter sorgfältig eingehalten werden müssen. Vorteilhaft ist andererseits, dass das organische Substrat ohne Geruchsbelästigung nahezu vollständig (> 90 %) in Methan und CO2 übergeht und die Biomasse-Bildung gering bleibt; ausgefaulter Schlamm wird in Deponien gelagert, verbrannt oder als Düngemittel verwendet. Das bei der Faulung gebildete Methan deckt weit mehr als den Energiebedarf der Faulanlage. Anaerober Festbett-Reaktor. Organisch hochbelastete Abwässer können auch direkt, d. h. ohne vorherigen aeroben Abbau in einer Belebungsstufe, anaerob gereinigt werden. Man verwendet dazu Säulenreaktoren (→96), in denen sich die bakteriellen Mischpopulationen entweder von selbst oder durch Zusatz von Oberflächen-reichen Partikeln zu gut sedimentierenden Schlamm-Partikeln zusammenlagern. Dadurch entsteht im unteren Teil des Reaktors eine hohe Bakteriendichte. Das Abwasser strömt von unten nach oben; die BiogasBildung bewirkt eine zusätzliche Durchmischung. Am oberen Teil des Reaktors befindet sich ein Gasabscheider, an dem Partikel von Gasblasen getrennt werden und wieder nach unten sinken. Bei speziellen Abwässern, z. B. aus der Zucker-, Zellstoff- oder Stärke-Industrie, erreicht man mit derartigen Reaktoren bei hoher Abwasserkonzentration eine CSBReduktion im Abwasser von mehr als 95 % bei kurzer Verweilzeit und gleichbleibend hoher BiogasBildung. Biogas. Man schätzt, dass in China und Indien allein jeweils mehr als 100 000 Biogas-Anlagen einfachster Technologie im Einsatz sind. Aufgrund des Erneuerbare-Energie-Gesetzes werden auch in Deutschland Biogas-Anlagen gefördert. Sie vergären Stärke-haltiges Pflanzenmaterial, z. B. Mais, und decken bereits den Energiebedarf von 3 Millionen Haushalten. 2013 waren in Deutschland über 7 700 Biogas-Anlagen installiert, die mit Gülle, Abfällen und Energiepflanzen (Mais, Getreide, Zuckerrübe) betrieben wurden und 2,2 Mrd. m3 Biogas erzeugten.

Biologische Reinigung von Abluft

Allgemeines. Die verschärften gesetzlichen Auflagen zur Abluft- und Abgas-Reinigung haben in den letzten Jahrzehnten zur Entwicklung biologischer Abgas-Reinigungsapparaturen geführt, denn Mikroorganismen können gasförmige Stoffe (VOCs = volatile organic compounds, auch Geruchsstoffe) nach Übergang in die wässrige Phase metabolisieren. In Biofiltern baut man schlecht wasserlösliche, in Biowäschern gut wasserlösliche Abgas-Bestandteile ab. Abluft und Abgase. Schon seit Jahrzehnten setzt man Biofilter zur geruchlichen Verbesserung von Abluft in Kläranlagen (→286) ein, besonders bei der Abluft-Behandlung von Faultürmen. Auch die Abluft zahlreicher anderer Betriebe, z. B. von Gießereien, Kautschuk- und Kunststoff-Industrien, Lackierbetrieben, Brauereien, Lebensmittel-Fabriken, Betrieben der Massen-Tierhaltung oder der Tierkörper-Verwertung, kann biologisch behandelt werden. Typische Geruchskomponenten sind dabei niedere Fettsäuren, Amine und Mercaptane (Schweinekot, Tierkörper-Verwertung), Phenole und niedermolekulare Amine, Aldehyde und Ketone (Gießerei), aromatische Verbindungen (Lackierbetriebe) und Furfural (LebensmittelBetriebe). Auch in Deponien, bei der Deponie-Gasentsorgung und bei der Sanierung kontaminierter Böden werden Biofilter eingesetzt. Biofilter sind meist sehr einfach aufgebaut. Als Trägermaterial verwendet man Kompost, Rinden, Torf, Lava, Schlacke und andere Materialien mit großer Oberfläche; anorganische Zusatzstoffe verringern die Packungsdichte. Beim Durchleiten befeuchteter Abluft bilden sich Konsortien von Mikroorganismen aus, die Geruchsstoffe oxidieren. Nach einigen Jahren haben sie häufig auch die organischen Trägermaterialien zersetzt, was sich durch Druckanstieg und abfallende Leistung zu erkennen gibt. Mit neuer Füllung wird die alte Leistung wiederhergestellt. Der Form nach unterscheidet man Flächen- und Etagenfilter. Biowäscher sind komplizierter als Biofilter aufgebaut: die Geruchs- oder Schadstoffe werden zuerst in einer flüssigen, meist mit Nährstoffen angereicherten wässrigen Phase absorbiert und in einem zweiten, räumlich getrennten Schritt durch Mikroorganismen metabolisiert. Diese können sich auf einem Biorieselbettreaktor (biotrickling filter), in einer Belebungsanlage oder einem Bioreaktor befinden. Dieses zweistufige Prinzip macht eine aufwändigere Ausstattung der Anlage erforderlich. Die Reinigungsleistung von Biowäschern ist höher als die von Biofiltern, da unter anderem auch toxische Zwischen- und Endprodukte mit dem im Kreislauf umgepumpten Wasser abgeführt werden. Bei der Reinigung von H2S-haltiger Abluft versäuern Biofilter schnell, da sich im Konsortium der Mikroorganismen Thiobacillen anreichern, die H2S zu H2SO4 oxidieren. Biowäscher, die mit einer in den Kreislauf integrierten Mess- und Regeltechnik ausgestattet sind, erlauben dagegen eine kontinuierliche Neutralisation der gebildeten Schwefelsäure und haben deshalb sehr lange Standzeiten. Ihr Energieverbrauch hält sich durch die geringe Menge des umlaufenden Wassers in wirtschaftlich akzeptablen Grenzen. Für gut abbaubare Lösemittel, z. B. Alkohole, liegen die Aufenthaltszeiten der Abluft im Bereich von 1–2 Minuten. Enthält die Abluft sowohl gut wie schlecht abbaubare Komponenten, so verwendet man zweistufige Biowäscher oder eine Kombination von Wäscher und Tropffilter. Beispielsweise werden in einem zweistufigen Biowäscher für die Reinigung von Abluft aus der Lackverarbeitung in der ersten Stufe die gut wasserlöslichen und gut abbaubaren aliphatischen Alkohole und Ester, in der zweiten Stufe die schwerer löslichen und auch

schwerer abbaubaren aromatischen Komponenten (Xylol, Toluol) oxidiert. Die Umwälzung von Stallluft bei der Massen-Tierhaltung dient der Entfernung von CO2 und der Zufuhr von O2, der Temperatur-Regelung, der Entkeimung und der Eliminierung geruchsintensiver Stoffwechselprodukte, vor allem von Ammoniak. Dieser Schritt erfolgt im Biowäscher durch Nitrifikanten, die NH3 zu Nitrat oxidieren. Die gebildete Salpetersäure wird ausgewaschen und neutralisiert, die Wärme der Abluft durch Wärmetauscher zurückgewonnen. In einem typischen Fall konnte die NH3-Konzentration auf 2–4 ppm verringert und der NH3-Ausstoß von 5,3–5,7 kg auf 0,2 kg pro Tier und Jahr reduziert werden. Moderne Anlagen werden durch intelligente Mess- und Regelungssysteme, z. B. durch Feuchtesensoren im Filtermaterial, überwacht und gesteuert.

Biologische Reinigung von Böden Allgemeines. Mischpopulationen von Mikroorganismen leisten durch den Abbau von Biomasse und die Mineralisaton biologisch abbaubarer Substanzen in der Umwelt einen wichtigen Beitrag zum ökologischen Gleichgewicht. Während man diese Eigenschaft bei der Abwasser-Reinigung schon lange technisch nutzt, wird die mikrobielle Reinigung von Böden (biologische Bodensanierung) erst seit ca. 40 Jahren untersucht. Sie konkurriert mit chemischen und thermischen Verfahren. Für den biologischen Abbau von Verschmutzungen können natürliche oder gentechnisch veränderte Mikroorganismen verwendet werden; die Freisetzung gentechnisch veränderter Mikroorganismen in die Umwelt wird aber derzeit nicht genehmigt (→334). Verfahrenstechnisch reinigt man entweder in situ oder nach Auskofferung der Böden. Verunreinigungen und Bodenstruktur. Als anthropogene Verunreinigungen treten vor allem auf: Mineralöl-Kohlenwasserstoffe (MKW), Benzol, Toluol, Xylol und Ethylbenzol (BTXE), polyaromatische Kohlenwasserstoffe (PAK), Chlorkohlenwasserstoffe (CKW) und, auf

Militärgeländen, Trinitrotoluol (TNT). MKW und BTXE sind meist gut biologisch abbaubar. Höher kondensierte PAK und höher chlorierte CKW werden dagegen nur schlecht abgebaut. Dabei spielt ihre Bioverfügbarkeit eine Rolle, in die u. a. Wasserlöslichkeit und Bodenstruktur eingehen (durchlässige, sandige Böden sind leicht, tonige und lehmige schwer biologisch zu reinigen). TNT lässt sich bislang biologisch nur durch Kombination anaerober und aerober Schritte immobilisieren. Bodensanierung in situ. Dabei werden in Gegenwart der Verunreinigung angereicherte Mischkulturen von Mikroorganismen mit hoher Abbauleistung zusammen mit Nährstoffen über Bohrlöcher eingespült, mit dem Grundwasser transportiert und belüftet, ggf. über DrainageSysteme oder Druckluft-Begasung. Bei tonigen und lehmigen Böden ist eine gute Belüftung nicht möglich; anstelle von O2 setzt man deshalb gelegentlich Nitrat als Elektronenakzeptor ein. Die Ökobilanz ist allerdings aufgrund der Grundwasser-Belastung mit Nitrat problematisch. Bodensanierung ex situ. Mit biologisch gut abbaubaren Fremdstoffen verunreinigte Böden reinigt man meist nach Auskofferung und Aufschichtung der Erde in langen Zelthallen. Man selektioniert dazu in Vorkulturen Konsortien von Mikroorganismen mit hoher Abbauleistung und beimpft die ca. 2 m hohen Beete unter Zugabe von Nährmedium. Bei guter Belüftung und Durchmischung erreicht man in günstigen Fällen > 90 % Reinigungsleistung in 2 Wochen. Die Kosten betragen zwischen 75 und 150 €/m3 Boden. Humifizierung von TNT. Mit zahlreichen elektronegativen Gruppen substituierte Xenobiotika wie Tri- und Tetrachlorethen oder Trinitrotoluol sind im aeroben Stoffwechsel sehr schwer abzubauen, werden dagegen von einigen Anaerobiern gut transformiert. Für die biologische Sanierung TNT-verunreinigter Böden aus Militärlagern wurde deshalb ein zweistufiges Verfahren erarbeitet: im ersten Prozessabschnitt betreibt man einen 25 t-Reaktor anaerob mit Saccharose als Elektronendonator. Nach ca. 18 Tagen ist das TNT durch anaerobe Mikroorganismen soweit zu Triaminotoluol reduziert, dass es bei anschließender Luftzufuhr irreversibel und kovalent an Bodenbestandteile, insbesondere an Huminstoffe bindet. Rekombinante Mikroorganismen. Durch gentechnische Rekombination von StoffwechselSchritten aus verschiedenen Mikroorganismen kann man rekombinante Mikroorganismen erzeugen, die Xenobiotika besser abbauen als die zugrundeliegenden Wildstämme. Diese Methode wurde mit z. T. beträchtlichem Erfolg für den Abbau von Chloraromaten, Monochlordibenzofuranen und aliphatischen CKW untersucht. Häufig verwendete man dazu Pseudomonaden (→20), die am biologischen Abbau aliphatischer und aromatischer Kohlenwasserstoffe in der Umwelt überproportional beteiligt sind und einen Teil der dazu erforderlichen genetischen Information auf Plasmiden tragen, beispielsweise dem TOLPlasmid (→20, 58). Aufgrund ökologischer Bedenken bei einer Freisetzung genetisch modifizierten Mikroorganismen (genetically engineered microorganisms, GEMs) wurden derartige Versuche in geschlossenen Reaktorsystemen durchgeführt; die Bedenken gegen eine Freisetzung von GEMs sind bisher nicht entkräftet (→336).

Mikrobielle Erzlaugung (Biolaugung) und Biokorrosion Allgemeines. Das Auslaugen von Metallen aus minderwertigen Erzen mit niedrigem Metallgehalt (Leaching) durch Beimpfen mit Thiobacillen wird vor allem in Kanada, den USA, Mexiko und Australien durchgeführt. Etwa 25 % der Weltproduktion an Kupfer, > 10 % des Goldes und Urans und etwa 3 % des Cobalts und Nickels werden mit Verfahren der Biolaugung durchgeführt. Mikrobiologie und Physiologie. Die Erzlaugung ist die Domäne der Thiobacillen, Gramnegativer Stäbchen, die obligat chemolithautotroph (→12) und in der Regel auf CO2-Fixierung angewiesen sind. Zur Energie-Gewinnung oxidieren sie reduzierte Schwefel-Verbindungen, z. B. Sulfide, und bilden daraus als Endprodukt Schwefelsäure. Bei der Synthese von 1 g Zellen setzt Thiobacillus ferrooxidans 156 g-Äquivalent Fe2+ um. Im Gegensatz zu T. thiooxidans kann T. ferrooxidans nicht nur reduzierte Schwefel-Verbindungen, sondern auch lösliche Fe2+Verbindungen oxidieren. Beide Bakterien sind an stark saure Wachstumsbedingungen angepasst und tolerieren pH 2. Sulfidische und oxidische Erze wie Pyrit (FeS2), Chalkosin (Cu2S), Covellin (CuS), Zinkblende (ZnS), Blei-, Molybdän- und Antimonglanz (PbS, MoS2, Sb2S3), Cobaltsulfid (CoS) und Haarkies (NiS), aber auch Oxide wie Pechblende (UO2) können durch Thiobacillen aufgeschlossen werden. Bei der direkten bakteriellen Laugung besteht dabei ein unmittelbarer Kontakt zwischen Bakterien und Sulfid-Mineral, und die Oxidation zum Sulfat erfolgt nach Gleichung

über mehrere Zwischenstufen. Bei der indirekten bakteriellen Laugung werden sulfidische Mineralien durch Zugabe von Fe(III)-sulfat nach der Gleichung

auf rein chemischem Wege in ihre löslichen Sulfate und Schwefel umgewandelt. Das

entstehende Fe2+ wird anschließend durch die Bakterien wieder zu Fe3+ oxidiert und steht damit für den Oxidationsprozess bei saurem pH erneut zur Verfügung; bei pH 2–3 ist die bakterielle Oxidation von Fe2+ etwa 105 bis 106-fach schneller als die chemische Fe2+Oxidation. In der Praxis überlagern sich wegen der komplexen Zusammensetzung der Erze häufig beide Verfahren. Die Erzlaugung mit heterotrophen Mikroorganismen wird ebenfalls untersucht. Sie beruht auf der Sekretion starker Chelatbildner wie Citronensäure oder Gluconsäure, z. B. durch Penicillin-Stämme, die allerdings zum Wachstum eine organische CQuelle benötigen. Technische Gesichtspunkte. Für eine gute Wirksamkeit des Verfahrens sind zu optimieren: die chemische Zusammensetzung und Korngröße des Minerals, mineralische Nährstoffe, ein stark saurer pH und ein positives Redoxpotential, Temperaturen um 30 °C und eine ausreichende O2-Versorgung. Die technische Durchführung kann in situ auf den Erzhalden oder auf vorher angelegten Erzhaufen erfolgen. Alternativ können stillgelegte Stollen für eine in situ Laugung geflutet werden. Technologisch am besten ausgearbeitet ist das kontrollierte TankLeaching, das im Wettbewerb zu den pyrometallurgischen Röstverfahren immer dann Chancen hat, wenn im Mineral feindisperse Konzentrate der Metalle vorliegen und UmweltschutzGesichtspunkte eine Rolle spielen. Biokorrosion. Der wichtigste mikrobielle Prozess bei der Korrosion von metallischem Eisen ist dessen anaerobe Oxidation zu FeS, die durch anaerobe Sulfat-Reduzierer wie Desulfovibrio vulgaris nach der Gleichung

ausgelöst wird. Fe wird auch unter anaeroben Bedingungen nach der Gleichung

oxidiert. Der dabei gebildete H2-Film schützt jedoch das Eisen vor weiterer Zersetzung. In Gegenwart von Sulfat oxidiert jedoch Desulfovibrio H2 nach der Gleichung

wodurch es zu der Ausfällung von Eisensulfid und Eisenhydroxid kommt:

Auch aerobe Bakterien wie Acidithiobacillus thiooxidans, Thiobacillus thioparus oder Thiobacillus concretivorus können an Korrosionsvorgängen beteiligt sein, indem sie anaerob gebildeten Schwefelwasserstoff zu Schwefelsäure oxidieren. Die Ausbildung von Biofilmen spielt dabei eine ausschlaggebende Rolle.

Megatrends Human-Genom Allgemeines. Genetische Karten für Prokaryoten oder höhere Organismen werden mit Hilfe von Experimenten erstellt. Genetische Experimente am Menschen sind aber weder erwünscht noch zugelassen. Als Folge der Bevölkerungsexplosion leben allerdings gegenwärtig ca. 6 % aller jemals geborenen Menschen; deshalb ist auch für das menschliche Genom ein umfangreicher Genpool zugänglich. Humangenetische Analysen von Erbgängen in Familien haben über Jahrzehnte hinweg zu einer Chromosomenkarte geführt, auf der bereits viele hundert genetische Erkrankungen lokalisiert sind. Eindeutig zugeordnete phänotypische Markierungspunkte sind aber noch immer selten. Das menschliche Genom, das mit einer Größe von ca. 3 Mrd. bp auf 23 Chromosomen verteilt ist, enthält nur zu einigen Prozent Sequenzinformation für Proteine. Der größte Teil der Genom-Information entfällt auf repetitive Sequenzen unbekannter Funktion. Anhand einer Kartierung von SNPs = single nucleotide polymorphisms in der mitochondrialen und genomischen DNA heute lebender Individuen konnte die Migration des Menschen über die letzten 50 000 Jahre aufgeklärt werden („Genographic Project“) (→298). Genetische Kartierung. Als phänotypische Merkmale dienen beim Menschen vor allem vererbte Erkrankungen, die mit den Methoden der Humangenetik (Familienanalyse, Chromosomenanalyse, funktionelle und positionelle Klonierung einzelner Gene) zur Lokalisierung einzelner Gene beigetragen haben. Das 1984 gegründete Centre d’Etude du Polymorphisme Humain (CEPH) (→298) in Paris hält Zelllinien von ca. 100 Familien aus drei Generationen vor, die sich in der Regel aus vier Großeltern, zwei Eltern und durchschnittlich acht Kindern zusammensetzen. Seit vielen Jahren untersucht man auch verstärkt Populationen mit geringer Mobilität (Island, Tasmanien) in der Hoffnung, durch die Korrelation genetischer Polymorphismen mit den Erbgängen beim Phänotyp zu einer funktionellen Kartierung von Genen zu kommen. Als genetische Marker für solche Untersuchungen sind Mikrosatelliten besonders gut geeignet: einmal kommen sie genügend häufig und etwa gleichförmig verteilt vor; zum anderen sind sie sehr variabel, sodass die Wahrscheinlichkeit für ein Individuum bei 70 % liegt, heterozygot für Mikrosatelliten zu sein und damit die Unterscheidung eines gekoppelten Genlocus zu erlauben. 1994 gelang es, durch Analyse von 291 Meiosen (304 Individuen aus 20 Familien der CEPH-Sammlung), 2335 Mikrosatelliten chromosomalen Positionen zuzuordnen und damit eine genetische Karte mit einem Marker pro ca. 600 kbp zu erstellen. Diese Karte wurde mittlerweile weiter verfeinert. Genomanalyse. Das 1990 begonnene internationale und öffentlich geförderte HumangenomProjekt verfolgte methodisch den Weg der Contig-Sequenzierung überlappender Klone. Aus der sehr großen genomischen Genbank (ca. 300 000 BAC-Klone) (→68), die aus den einzelnen, vorher aufgetrennten Chromosomen stammte, ermittelte man Klone mit benachbarter DNA durch Restriktionsanalysen, chromosomale Wanderung und sequence tagged sites (STS),

sequenzierte benachbarte Klone (mehrfach und in beide Richtungen, um Sequenzierfehler auszumerzen) und setzte am Computer anhand genetischer Karten die genomische Sequenz zusammen (→72). Seit 1996 ergänzte man diese Arbeiten durch die Sequenzierung von ca. 50 000 nicht-redundanten expressed sequence tags (EST). Seit 1998 gab es zu dieser Strategie privatwirtschaftliche Konkurrenz durch die Firma Celera, die einer shotgun-Strategie folgte. Dazu zerlegte man menschliche DNA in 60 Mio. Sequenzen von ca. 2000 bp und 10 Mio. Sequenzen von ca. 10 000 bp Länge, die von beiden Enden auf ca. 500 bp ansequenziert wurden (die Ansequenzierung der 10 kbp-Fragmente soll dabei garantieren, dass repetitive DNA-Sequenzen von bis zu 5 kbp Länge nicht falsch zugeordnet werden). Die Gesamtlänge sequenzierter DNA beträgt bei diesem Experiment ca. 35 Mrd. bp, was einer etwa 10fachen Redundanz entspricht. Beide Projekte sind abgeschlossen. Ein Entwurf der Sequenz des Humangenoms lag Mitte 2000 vor, die vollständige Sequenz 2004. Dabei fand man überraschenderweise nur etwa 20 500 Gene, etwa soviel wie bei der Maus. Bemerkenswert ist der hohe Gehalt an Sequenz-Duplikationen. Die Arbeiten konzentrieren sich seither auf Zelltyp-spezifischen Unterschiede bei der Translation dieser Gene (Proteomics) (→314) und auf das Verständnis individueller genetischer Unterschiede beim gesunden und kranken Menschen und seiner Organe (→300).

Funktionsanalyse des Humangenoms Allgemeines. Seit der Veröffentlichung der vollständigen Sequenz des Humangenoms (2004) wurden zahlreiche weitere Programme durchgeführt, um die Diversität des menschlichen Genoms zu kartieren und in seine Evolution einzuordnen. Dazu gehören das HapMap-Projekt (2005–2010), das die genetische Varianz in unterschiedlichen menschlichen Populationen erkundete, das „1000 Genomes“ Projekt (2007–2012), das sich auf die Analyse häufiger genetischer Varianten konzentrierte, das Neanderthal-Genomprojekt (Genom-Entwurf 2010), und das Schimpansen-und Bonobo-Genomprojekt (Genom-Entwürfe 2005 und 2012). Zahlreiche weitere Projekte erkunden spezielle Fragestellungen, z. B. das menschliche Mikrobiom-Projekt (vor allem Darmbakterien, seit 2008) (→118), das Krebsgenom-Projekt (seit 2007), oder das menschliche Connectom-Projekt (genetische Ursachen neuronaler Erkrankungen, seit 2009). Neben dem Erkenntnisgewinn über die molekulare Physiologie und Pathophysiologie des Menschen ist dabei das vorrangige Ziel, die genetischen Grundlagen monogener und polygener Erkrankungen aufzuspüren und mit diesem Wissen Therapien für ihre Heilung zu entwickeln. Der Weg dahin ist schwierig. Für manche Erbkrankheiten ist es bereits gelungen, das oder die für die Erkrankung kodierenden Abweichungen einer Gensequenz zu identifizieren. So beruht z. B. bei der cystischen Fibrose (→240) die Erkrankung auf dem Austausch eines einzigen Nucleotids (SNP, single nucleotide polymorphism). Weit häufiger sind aber polygenetische Erkrankungen, bei denen eine Kombination verschiedener

Polymorphismen die Erkrankung unmittelbar, infolge von Fehlverhalten, Alterungsprozessen oder durch epigenetische Veränderungen (→66) auslösen kann. Für eine molekularbiologische Analyse dieser Vorgänge stehen zur Verfügung 1. die Transkriptionsanalyse (→316) (DNAArrays) („welche Gene werden unter welchen Bedingungen transkribiert?“), 2. die Analyse des Proteoms (→314) („welche Proteine werden aus dem Transkriptom gebildet, und wie werden sie prozessiert?“), 3. die Analyse des Stoffwechsels (Metabolom) (→318), und weitere Verfahren. Vergleichende genetische Analysen. Man schätzt die Zahl der SNPs eines Menschen auf etwa 6 Millionen (im Mittel etwa 1 pro 500 b pro DNA-Einzelstrang). Im Rahmen des internationalen HapMap-Projekts wurden jeweils über 1 Mio. SNPs europäischer, chinesischer, japanischer und nigerianischer Individuen in Datenbanken abgelegt. Aus dem „1000 Genomes“-Projekt liegt seit etwa 2012 eine Genomkarte mit den genetischen Varianzen von 1092 Menschen vor (Herkunft: Europa, Afrika, Nord- und Südamerika, nord- und südasiatische Länder), die für die Eingrenzung von Erkrankungen auf bestimmte Genregionen genutzt werden kann. Die meisten SNPs sind phänotypisch „stumm“. Ihre Zuordnung zu monogenen (z. B. Bluterkrankheit, Kurzfingrigkeit), erst recht zu polygenen phänotypischen Merkmalen (z. B. Haarfarbe, Intelligenz, Krebsrisiko) ist schwierig und erfordert humangenetische Methoden, vor allem eine genetische Analyse der Kopplung von Merkmalen bei der Vererbung. Liegt ein SNP innerhalb der Erkennungssequenz eines Restriktionsenzyms, so führt eine Restriktionsanalyse zu einem veränderten Fragmentmuster (RFLP, restriction fragment length polymorphism). Viele nützliche Informationen erhält man auch durch Vergleiche mit anderen Genomen. Selbst die Genome phylogenetisch weit entfernter Lebewesen wie Fliege, Wurm oder Hefe (Drosophila, Caenorhabditis, Saccharomyces) weisen bereits zahlreiche Gen-Funktionen auf, die dem Bau- und Funktionsplan des Menschen ähneln und, anders als beim Menschen, im Experiment verändert werden können. Das Genom der Maus (3,3 Mrd. bp) nimmt hierbei eine besondere Stellung ein, da die genetische und physiologische Verwandtschaft der Maus zum Menschen relativ groß ist. Knock-out-Mäuse, bei denen einzelne Gene oder Regulationselemente experimentell ausgeschaltet wurden, spielen deshalb als Krankheitsmodelle („Alzheimer-Maus“, SCID-Maus) und in der Grundlagenforschung eine herausragende Rolle (→270). Das Ergebnis dieser Studien steigert die Möglichkeiten, bereits aus der Sequenz eines oder mehrerer Genabschnitte Voraussagen über das Erkrankungsrisiko eines Individuums oder seiner Nachkommen abzuleiten und weist der Diagnostik völlig neue Wege. Dabei werden allerdings auch ethische Fragen (→336) aufgeworfen.

Pharmakogenomik, Nutrigenomics

Allgemeines. Patienten reagieren unterschiedlich auf Medikamente, was zu ausgedehnten klinischen Studien und umfangreichen Untersuchungen über Risiken und Nebenwirkungen bei bestimmten Patientengruppen führt. Unterschiede im individuellen Genom tragen zu diesen Unterschieden bei. Mit dem schnellen Fortschritt der Genom-Sequenzierung und der Genanalytik (→302) sind die Erwartungen gestiegen, in Zukunft genetisch bedingte individuelle Unterschiede nicht nur bei monogenen, sondern auch bei polygenen Erkrankungen (also die im individuellen Einzelfall in ihrer Funktion gestörten targets) sowie individuelle Unterschiede bei der Metabolisierung von Arzneimitteln zu erkennen und zur Grundlage einer Patientenspezifischen Therapie zu machen („personalisierte Medizin“). Auch für eine Anpassung der Ernährungsgewohnheiten an das individuelle Genom gibt es ähnliche Überlegungen („Nutrigenomics“). In diesem Fall muss auch noch die Wechselwirkung der individuellen Stoffwechselleistungen mit den Mikroorganismen des Darms („Mikrobiom“) (→118) berücksichtigt werden. Medikamenten-Stoffwechsel (Pharmakokinetik). Es ist seit langem bekannt, dass verschiedene Patienten unterschiedlich auf Medikamente ansprechen. Wesentliche Unterschiede können bereits bei der Aktivierung oder beim Abbau des Wirkstoffs durch das Cytochrom-System der Leber entstehen, dem etwa 80 % aller Medikamente unterliegen. So ist beispielsweise die Monooxygenase Cytochrom P4502D6 eines der wichtigsten Enzyme für die Aktivierung und Entgiftung von Fremdstoffen (sie werden dabei hydroxyliert und, nach weiterer Umsetzung mit hydrophilen Verbidnungen wie Glycin oder D-Glucuronsäure, wasserlöslich). Liegt dieses Enzym, auf Chromosom 22 kodiert, in einem Patienten homozygot vor (je ein funktionsfähiges Allel von Vater und Mutter), so ist er ein „schneller Metabolisierer“ (Normalfall). Bei Genduplikation kommt es zu einem extrem schnellen Metabolismus, bei Fehlen eines der beiden Allele zu sehr langsamer Aktivierung/Entgiftung, bei Mutationen im Enzym zu Zwischenformen. Derartige individuelle Unterschiede wirken sich auf die Pharmakokinetik aus (ADME (→310) = Absorption, Verteilung, Umbau, Exkretion) und können dazu führen, dass Medikamente in ihrer aktiven Form zu hoch oder zu niedrig konzentriert oder überhaupt nicht am Wirkort ankommen bzw. zu schnell oder zu langsam ausgeschieden werden. Medikamenten-Wirkung. Für die Wechselwirkung des Wirkstoffs mit seinem Rezeptor gelten ähnliche Überlegungen. So wirkt Enalapril, ein Hemmstoff des angiotensin-converting enzyme (ACE), bei bestimmten Genotypen dieses Enzyms stärker und länger. Trastuzumab, ein therapeutischer Antikörper zur Behandlung von Brustkrebs, wirkt nur bei dem Drittel von Patientinnen, die im Tumorgewebe das Zielprotein, den Her2-Rezeptor, überexprimieren. Bei der Chemotherapie von Tumoren mit Nucleosid-Analoga wie 5-Fluorouracil, 6-Mercaptopurin und anderen Verbindungen ist auf Polymorphismen beim Patienten für DihydropyrimidinDehydrogenase (DPD), Varianten der UDP-Glucuronosyltransferase (UGT1A1) usw. zu achten, da eine verlangsamte Ausscheidung dieser toxischen Metabolite zu schweren Schädigungen führen kann. Therapie-begleitende Diagnostika. Mit zunehmender Kenntnis über Polymorphismen bei genetisch verursachten Erkrankungen und über angepasste Therapie-Formen kommt der Diagnose der im Einzelfall vorliegenden Polymorphismen eine wachsende Bedeutung zu.

Beispielsweise kann ein Test auf das Vorliegen der Mutation V600 des Proto-Onkogens B-Raf bei Patienten mit metastasierendem Melanom (50 % aller Fälle) vorab zeigen, ob eine orale Behandlung mit dem Proteinkinase-Inhibitor Vemurafemib aussichtsreich ist. Nutrigenomics. In diesem noch recht jungen Gebiet versucht man, die Wechselwirkung von Nährstoffen und bioaktiven Nahrungsmittelbestandteilen mit der individuellen genetischen Ausstattung eines Konsumenten zu entschlüsseln und dabei auch Polymorphismen zu berücksichtigen. Dabei könnte eine individuell optimierte Ernährungsweise entstehen. Beispielsweise können Polymorphismen im Gen für Leptin zu Fettleibigkeit führen, und im Gen von MTHFR (Methylentetrahydrofolat-Reduktase), deren Aktivität große Bedeutung für den Folsäure-Stoffwechsel hat, zu schweren allgemeinen Gesundheitsstörungen.

DNA-Analytik Allgemeines. Die intra- oder intermolekulare Hybridisierung von zwei Nucleinsäure-Strängen (→38) (DNA-DNA, DNA-RNA, RNARNA) durch Basenpaarung über Wasserstoff-Brücken lässt sich durch Markierung eines Strangs mit einer radioaktiven, fluoreszierenden, Chemolumineszenz auslösenden oder anderweitig reaktionsfähigen Reporter-Gruppe sichtbar machen (→84). Meist wird der analytisch relevante DNA-Abschnitt zuvor mittels PCR (→50) amplifiziert. Um falsch-positive oder falsch-negative Hybridisierungsereignisse zu minimieren, sind Probenvorbereitung (Isolierung von DNA oder RNA aus Urin, Blut, Gewebe, Pflanzenmaterial, Fossilien) sowie die Wahl der Hybridisierungssequenz und -bedingungen von großer praktischer Bedeutung. DNA-Analytik wird beispielsweise eingesetzt zum Genotyping pathogener Organismen, zur Gendiagnostik von Erkrankungen, zum Nachweis gentechnisch veränderter landwirtschaftlicher Produkte, zum Vaterschaftsnachweis und in der Kriminalistik. Das Marktvolumen für DNA-Tests liegt bei mehreren Mrd. US-$ und wächst jährlich mit > 10 %. Gerätetechnik. Standardverfahren der DNA-Analytik sind 1. die vergleichende Gelelektrophorese (→54), 2. Hybridisierungsassays mit optischen oder elektrochemisch

aktiven Reportergruppen (→84), und 3. DNA-Arrays (→316). Bei der Elektrophorese bestimmt man das ungefähre Molekulargewicht eines DNA-Strangs durch Vergleich mit DNAFragmenten bekannter Größe. Für Hybridisierungs-Assays koppelt man mit StandardTechniken Reportergruppen an einen der Stränge, beispielsweise mittels Biotin/Avidinoder Biotin/Stretavidin-Kopplung. Beim LightCycler™-Verfahren (→50) zur quantitativen DNABestimmung in Echtzeit interkaliert ein fluoreszierender Farbstoff (SYBR Green™) in die amplifizierte DNA. Der TaqMan™-Assay rüstet eine kurze DNA-Sonde an ihren hybridisierenden Enden mit einem Fluorophor und mit einem fluoreszenzlöschenden Farbstoff (Quencher) aus. Ist in der Probe eine hybridisierende DNA-Sequenz zugegen, so bindet die Sonde und das Fluorophor wird aktiviert. Aufgrund der schnellen Fortschritte bei der Hochdurchsatz-Sequenzierung (→312) konkurrieren diese Methoden zunehmend mit Sequenzanalysen von größeren DNA-Fragmenten. So wird bei der „liquid biopsy“ bereits zirkulierende Tumor-DNA aus Metastasen im Blut nachgewiesen. Genotyping wird beispielsweise in der Forensik zum Vaterschaftsnachweis und in der Gerichtsmedizin angewandt („genetischer Fingerprint“). Man vergleicht dazu in der genomischen DNA der untersuchten Personen (bzw. aus biologischem Material am Tatort) das für jedes Individuum typische Muster von Tandem-Sequenzwiederholungen der Mikrosatelliten („genetischer Fingerabdruck“). Die Wahrscheinlichkeit, dass zwei Personen das gleiche Muster aufweisen, ist äußerst gering (Ausnahme: eineiige Zwillinge) und verringert sich weiter mit der Anzahl der verglichenen Mikrosatelliten-Loci. Die SNP-Analyse von Patienten könnte zu einer wichtigen diagnostischen Methode werden, um die individuelle Verträglichkeit und Wirksamkeit von Medikamenten zu bestimmen (Pharmakogenomik) (→300). In der dbSNP Database des US National Center for Biotechnology Information (NCBI) waren 2014 etwa 113 Millionen humane SNPs gespeichert. Man wird aber wohl noch Jahre brauchen, den zahlreichen Genotypen des Menschen auch medizinisch relevante Phänotypen (z. B. eine Unverträglichkeit) zuzuordnen. SNP-Analysen werden auch zur Abstammungsanalyse in der Pflanzen- und Tierzucht verwendet (→264, 274). Mit einer Genotypisierung können Produkte aus transgenen Pflanzen ebenso empfindlich nachgewiesen werden wie pathogene Mikroorganismen in Nahrungsmitteln, Blut oder Urin. 1 μL Blut genügt für den Nachweis einer Infektion mit dem Malaria-Erreger Plasmodium falciparum. Pränatales Screening erlaubt bereits heute mit Ultraschall-Diagnostik und biochemischen Markern zwischen der 9. und 12. Schwangerschaftswoche eine Frühdiagnose monogener Erkrankungen, z. B. von Trisomie 21 (Down-Syndrom, „Mongolismus“). Alternativ kann DNA aus dem Extrakt einer Embryonalzelle, die mit dem Katheder aus einer Chorionzotte gewonnen wird, mittlerweile aber auch bereits fetale DNA im Blut der Mutter gezielt auf relevante SNPs sequenziert werden. Die Erweiterung dieser Methode auf eine Risikoanalyse polygener Erkrankungen im präembryonalen Stadium in-vitro (Präimplantationsdiagnostik nach künstlicher Befruchtung, PID) ist technisch möglich, ethisch aber umstritten (→336).

Gentherapie

Allgemeines. Unter den etwa 15 000 beschriebenen Erkrankungen des Menschen, von denen über 90 % nicht kausal therapierbar sind, haben die meisten ihre Ursache in vererbten oder erworbenen genetischen Defekten. Mit Hilfe der Gentherapie versucht man, kranke Gene durch gesunde zu ersetzen. Bis Ende 2013 wurden dazu über 1700 klinische Versuche an tausenden von Patienten durchgeführt, > 60 % davon in den USA. Die Gentherapie an somatischen Zellen ist von den Behörden erlaubt; ein Gentransfer in die Sperma- oder Eizellen des Menschen (Keimbahn), die zu vererbbaren Eigenschaften führen könnte, unterliegt dagegen beim Menschen (nicht beim Tier) einem Moratorium (→336). Man unterscheidet Gentherapie ex vivo, bei der Zellen außerhalb des Körpers transformiert, vermehrt (expandiert) und dem Patienten wieder zugeführt werden, und die direkte Behandlung von Patienten mit genetischem Material (Gentherapie in vivo). Allgemeine Konzepte. Für die meisten Erkrankungen sind die genetischen Ursachen noch unbekannt. Selbst bei der Gentherapie monogener Krankheiten sind große Schwierigkeiten zu meistern: die Immunbarriere des Körpers und die zellulären Kontrollmechanismen gegen fremde Nucleinsäuren müssen überwunden werden. Untersucht werden 1. die Rekombination defekter Gene mit zugeführter cDNA korrekter Sequenz, 2. die Ausschaltung von Genen mittels Antisense-RNA, und 3. die Reparatur defekter Genabschnitte mit Chimären aus RNA und DNA. Als Vektoren verwendete man vor allem Retroviren (ca. 20 %), Adenoviren (ca. 23 %) und Vaccinia-Viren (ca. 8 %) (→6). 18 % aller Versuche erfolgten mit nackter oder PlasmidDNA, ca. 5 % mit kationischen Liposomen (Lipofektion) (→58). Dies erlaubt den Transfer größerer cDNA-Fragmente, während der Platz für fremde DNA (insert) in Viren begrenzt ist und zwischen 4 (Adenovirus) und 30 kbp (Herpes) liegt. Liposomen (→34) können beispielsweise als Aerosol über die Atemwege appliziert werden und gelangen dann über Endocytose in die Zelle. Virale Vektoren appliziert man meist subkutan, intramuskulär oder direkt in einen Tumor. Auch die Übertragung genetisch behandelten eigenen Knochenmarks (autologe Zelltherapie) wurde beschrieben. Einzelne Protokolle. Etwa 2/3 aller Protokolle sind auf die Gentherapie von Tumoren gerichtet. Man appliziert dazu Tumor-Suppressor-Gene wie BRCA1 oder p53, Cytokin-Gene wie IL-2, Gene, die für Histocompatibilitäts-Antigene wie HLA-B7 kodieren, sogenannte Suizid-Gene oder, mittlerweile sehr häufig (14 %), Gene, die für gegen den Tumor gerichtete Antikörper (→244) kodieren. Protokolle zu monogenen Erkrankungen betreffen häufig die human severe combined immunodeficiency (SCID), die durch Gendefekte der AdenosinDesaminase (ADA) ausgelöst wird. Die Gentherapie der cystischen Fibrose ist ein weiteres umfangreiches Arbeitsgebiet. Gentransfer ex vivo. Die Methode knüpft an Erfolge bei der Knochenmarks-Transplantation an. Ein bevorzugter Zelltyp ist deshalb die hämatopoetische Stammzelle, Vorstufe für alle Zellen des Immun- und Blutsystems. Würde es gelingen, einen Gendefekt dieser noch undifferenzierten Zellen außerhalb des Körpers durch Gentransfer zu beseitigen, so sollten, nach Rückführung in den Patienten, die daraus abgeleiteten, ausdifferenzierten Zellen eine „gesunde“ DNA besitzen. Entsprechend zahlreich sind aktuelle Versuche mit autologen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) (→306).

Gentransfer in vivo. Bei einigen der zahlreichen Versuche zum Ersatz kranker Gene nach Transfektion mit Vektoren, Liposomen oder DNA konnte der Nachweis erbracht werden, dass ein Teil der Zielzellen transformiert worden war. In einigen Fällen von ParkinsonErkrankungen, Bluterkrankheit, akuter und chronischer Lymphocyten-Leukämie usw. verbesserte sich das klinische Krankheitsbild. Bilanz. Obwohl der Nachweis erbracht wurde, dass eine Gentherapie monogener Erkrankungen des Menschen grundsätzlich möglich ist, gibt es noch viele praktische Probleme. Bis 2013 waren insgesamt drei Todesfälle zu beklagen, die aber nur in einem Fall auf den verwendeten Adenovirus-Vektor zurückzuführen war. Andererseits ist ein erstes gentherapeutisches Produkt bereits in den USA und Europa zugelassen: Glybera™, ein über ein Adeno-assoziiertes Virus eingeschleustes Gen für humane Lipoprotein-Lipase zur Behandlung von Lipoprotein-Lipase-Mangel (LPLD).

Induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) Allgemeines. 2007 gelang es einer japanischen Forschergruppe um Shin’ya Yamanaka, ausdifferenzierte Mauszellen durch Expression bestimmter Gene in pluripotente Stammzellen (→78) umzuwandeln. Dieses Ergebnis wurde später an somatischen menschlichen Zellen bestätigt. Damit war der Grundstein für Experimente gelegt, aus körpereigenen Zellen pluripotente Stammzellen zu generieren, die sowohl für eine personalisierte Testung von Medikamenten wie auch für eine individualisierte Zelltherapie genutzt werden können. Die Methode wirft weniger medizinische und ethische Fragen auf als die Verwendung von Stammzellen aus der Nabelschnur von Embryonen (EMS) und wird deshalb weltweit intensiv weiterentwickelt; die ersten Versuche am Menschen zur Therapie von Herz-, Augen-, Nervenund Blut-Erkrankungen finden bereits statt. Yamanaka erhielt 2012 den Nobelpreis für Medizin. Methoden. Yamanaka führte seine Schlüsselexperimente mit Maus-Fibroblasten durch, in die er mittels eines Retrovirus eine Auswahl von Genen einklonierte, die für Transkriptionsfaktoren kodieren. Bei gleichzeitiger Einklonierung der vier folgenden Gene erhielt er pluripotente Stammzellen: c-Myc (ein Transkriptionsfaktor, der die Expression aller gerade aktiven Gene einer Zelle verstärkt), Klf-4 (ein Transkriptionsfaktor, der mit StammzellEigenschaften in Verbindung gebracht wird), Oct-4 (ein für die normale Embryonalentwicklung wichtiger Transkriptionsfaktor), und Sox-2 (ein wesentlicher Transkriptionsfaktor für die Selbsterneuerung undifferenzierter embryonaler Stammzellen). Ein Nachteil dieses ersten Versuchskonzept war allerdings das Risiko einer Bildung von Krebszellen infolge der

Verwendung von c-Myc, das auch ein Protoonkogen ist, und von Retroviren, die das Genom der Empfängerzelle verändern. Durch Verwendung von Adenoviren zur Zelltransformation minimiert man diese Gefahr. Bei Protein-induzierten iPS-Zellen (PiPS) vermeidet man beide Risiken, indem man die Transkriptionsfaktoren als rekombinante Proteine direkt in die zu transformierenden Zellen einschleust. Auch mit synthetischer, modifizierter RNA gelang es, ausdifferenzierte menschliche Zellen in pluripotente Stammzellen umzuwandeln (RiPS). Mittlerweile können durch Auswahl geeigneter somatischer Zellen, Transkriptionsfaktoren und Transformationsmethoden nahezu beliebige iPS-Zellen generiert werden. Die Transformationsausbeuten sind allerdings noch immer sehr gering (< 1 %). Eigenschaften und Risiken. iPS-Zellen haben sehr ähnliche Eigenschaften wie embryonale Stammzellen (EMS) (→78). Sie zeigen das gleiche Differenzierungs-, Genexpressionsverhalten und Methylierungsmuster (Epigenetik) (→66). Da sie im Vergleich zu EMS modifiziert sind, und viele der dafür verwendeten Gene auch einen Bezug zur Krebsentstehung haben, ist die Sicherheit ihrer Verwendung noch nicht abschließend geklärt. Expansion von iPS-Zellen. iPS-Zellen sind adhärente Zellen. Man kultiviert sie auf Oberflächen, die mit wachstumsfördernden Substanzen ausgerüstet sind, z. B. mit dem Adhäsionsprotein Cadherin. Zum Wachstum werden komplex zusammengesetzte Serum-freie Medien benötigt; Bestandteile außer Zucker, Aminosäuren und Salzen sind rekombinante Wachstumsfaktoren und γ-Aminobuttersäure. Nach ihrer Vermehrung werden die Zellen durch schonende Ablöseverfahren, z. B. durch Zusatz von EDTA, geerntet. Der gesamte Prozess kann bereits in Roboter-unterstützten work stations durchgeführt werden. Anwendungen. Die beiden wichtigsten Anwendungen sind die regenerative Medizin (→308) und die personalisierte Testung von Pharmaka. Beide Anwendungsgebiete dürften zu großen und innovativen Märkten führen. Im Bereich der regenerativen Medizin wurden beispielsweise in Japan bereits klinische Versuche an Menschen genehmigt, die an Makula-Degeneration (iPS aus Retinapigment-Epithelzellen), Parkinson (iPS aus Dopamin-Neuron-Progenitorzellen) oder Kardiomyopathie (iPS aus Kardiomyozyten) leiden. In allen Fällen wurden eigene Zellen des Patienten in iPS-Zellen überführt, in sogenannte cell sheets expandiert und dem Patienten wieder eingesetzt. Zur Testung von Pharmaka sind die oben erwähnten menschlichen Zelltypen ebenfalls bereits kommerziell erhältlich, ebenso wie Hepatozyten. Intensiv bearbeitet wird die Herstellung von Zellen des Blut- und Immunsystems, z. B. von T-Zellen.

Tissue Engineering Allgemeines. Mit Hilfe des Tissue Engineering versucht man, zerstörtes Gewebe mittels Implantation zu ersetzen. Ursprüngliche Techniken zum Hautersatz nach Brandverletzungen wurden in den letzten Jahrzehnten dramatisch erweitert durch die Verfügbarkeit von künstlich gezüchtetem Gewebe vieler Organe, z. B. Knochen, Knorpel, Bänder, Hornhaut des Auges, Muskel und Blutgefäße. Biokompatible Trägermaterialien und Stammzellforschung spielen dabei eine große Rolle. Chirurgische Methoden. Bei der autologen Transplantation wird Gewebe innerhalb eines Patienten übertragen. Beispielsweise ersetzt man in Bypass-Operationen verengte Venen am Herzen durch Beinvenen (Deutschland 2012: ca. 40 000 Fälle). Alternativ stellt man Gewebe

auch künstlich aus zuvor vermehrten eigenen Zellen her. Matrix-gestützte Gewebe-Regenerierung. Extrazelluläre Matrizen, z. B. das Fasernetz des Kollagen im Knochen, dienen in Organismen häufig als formgebende Einheiten für den Aufwuchs von Zellen und beeinflussen auch die Gestalt des menschlichen Körpers. Synthetische und biologische Matrizen wie Keramiken, Kohlenstoff-Nanoröhren, KollagenRöhrchen, aber auch Filme, Membranen oder Perlen können ähnliche Aufgaben übernehmen. Sie werden als Trägermaterialien verwendet, auf denen die ein Gewebe bildenden Zellen in Gegenwart geeigneter Wachstumsfaktoren (→238) aufwachsen („expandieren“) und sich mit weiteren Zelltypen zu einem künstlichen Gewebe verbinden, das in Patienten übertragen werden kann. Zur Formgebung solcher Gewebe wurden erfolgreiche Methoden der Ingenieurstechnik eingesetzt, beispielsweise CAD/CAM-Methoden zum Design komplexer Formen. Auch 3D-Drucktechniken wurden bereits zur Herstellung von Körperteilen verwendet. So konnte man beispielsweise ein komplettes Ohr aus echtem Gewebe herstellen, indem man einen 3D-Scan eines Ohrs anfertigte und als Vorlage für einen 3D-Drucker nutzte, der damit ein dreidimensionales, hohles Ohr aus Kunststoff erzeugte. Diese Form füllte man mit Knorpelzellen und Kollagen. Ein zentrales Problem bei künstlichem Gewebe ist die Nährstoffversorgung der nicht an der Oberfläche liegenden Zellen durch Bildung von Kapillargefäßen („Angiogenese“). 3D Zellkulturen. Eine große Zahl von Vorläuferzellen und Primärzellen kann mittlerweile durch Wahl der Kultivierungsbedingungen auf einer Matrix kultiviert werden, sodass sich komplexere Gewebeäquivalente ergeben. So gelingt es beispielsweise, durch Expansion von Hautepithel-Zellen in Gegenwart von Keratinocyten eine künstliche Epidermis zu erzeugen. Ein 3D-Hautäquivalent (verhornte Epidermis) erhält man, indem man Haut-Fibroblasten mit Keratinocyten in einer Kollagen-Matrix züchtet. Stammzellen. Pluripotente menschliche Stammzellen (→306) haben ein bedeutendes Potenzial für das Tissue Engineering, weil sie, abhängig vom eingesetzten Wachstumsfaktor und von den physikalischen und chemischen Bedingungen beim Wachstum, zu einer großen Vielzahl von Zelltypen ausdifferenzieren können. Adultes Knochenmark ist seit langem die wichtigste Quelle für adulte Stammzellen, mit geringen ethischen Einschränkungen. Auch aus der eigenen Nabelschnur gewonnene und in Sammlungen hinterlegte Stammzellen können für die Regenerierung eigenen („autologen“) Gewebes genutzt werden. Sehr viele Stammzellen enthält auch das Fettgewebe. Induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) eröffnen ein weiteres breites Anwendungspotenzial. Anwendungen. Künstliche Gewebe werden derzeit in großem Umfang eingesetzt, um Testsysteme für pharmazeutische und kosmetische Untersuchungen bereitzustellen. So verwendet man beispielsweise 3D-Gewebekulturen aus menschlichen Zellen bei HautVerträglichkeitsprüfungen von Kosmetika und Medikamenten als Ersatz für Tiermethoden. Für Transplantationen steht ebenfalls menschliches Hautgewebe bereit. Beispielsweise ist Dermagraft® ein künstlich hergestelltes Hautgewebe aus menschlichen Fibroblasten auf einer biokompatiblen, absorbierbaren Matrix. Das Präparat wird verwendet, um Brandverletzungen zu versorgen und um die Wundheilung bei Geschwüren einzuleiten (diabetischer Fuß, venöser

Ulkus, Druck-Ulkus), bis genügend Hautmaterial des Patienten für eine homologe Transplantation zur Verfügung steht. Auch Knochen- und Knorpelgewebe wird bereits künstlich hergestellt und für die Versorgung von Patienten verwendet.

Wirkstoff-Screening Allgemeines. Die Suche nach neuen Medikamenten oder Agrochemikalien wurde traditionell mit den Methoden des trial and error durchgeführt. Die Erkenntnisse der Lebenswissenschaften und die technischen Möglichkeiten der Gentechnik erlauben neuerdings eine rationalere Vorgehensweise. Dabei geht man davon aus, dass Wirkstoffe auf eines oder mehrere Zielproteine (→26) eines Organismus (targets) einwirken. Häufige targets sind Enzyme, Rezeptoren oder Ionenkanäle, bei Pflanzen-Wirkstoffen auch Proteine, die z. B. an der Photosynthese beteiligt sind. Als Konsequenz der Genomforschung und der proteomics kann man solche targets immer besser identifizieren, mit gentechnischen Methoden herstellen und ihre Wechselwirkung mit Naturstoffen oder synthetischen Substanzen experimentell überprüfen. Hauptziel ist es dabei, Leitstrukturen in die Hand zu bekommen, deren chemische Variation, verbunden mit dem Grundwissen der medizinischen Chemie über ADME (→300) (Absorption, Verteilung, Metabolismus, Exkretion), zu neuartigen, maßgeschneiderten Wirkstoffen führt. Identifizierung und Herstellung von Targets. Die Identifizierung von targets ist, insbesondere bei Erkrankungen mit polygenen Ursachen, noch immer sehr schwierig. Durch die Kombination humangenetischer Befunde (→296), z. B. in genetisch isolierten Populationen wie Island oder Tasmanien, mit der SNP-, Allel- und Proteom-Analyse (→314) erkrankter Individuen haben sich die Erfolgschancen in den letzten Jahren erhöht. Werden Defekte an einem Enzym, einem Ionenkanal, einem Rezeptor oder eine Kombination davon erst einmal mit einem Krankheitsgeschehen in Zusammenhang gebracht, so versucht man, diese Genprodukte durch knock-out- bzw. antisense-RNA-Experimente im Tierversuch zu validieren (→64). Wurde beispielsweise ein G-gekoppelter Rezeptor als target erkannt, so kann er in der Membran von Maus-Fibroblasten exprimiert werden. Als Reporter dient im Cytoplasma exprimierte Glühwürmchen-Luciferase. Sobald ein Ligand an den Rezeptor bindet, bewirkt die Signaltransduktion einen Anstieg von cAMP im Cytoplasma, das in Gegenwart des LuciferaseSubstrats Luciferin zu einem quantifizierbaren Lumineszenz-Signal führt. Auch mit ReporterGenen, durch Calcium-Mobilisierung oder Zell-Impedanzmessungen können Bindevorgänge detektiert werden (→84). Substanzbibliotheken sind große Sammlungen chemischer Substanzen oder Naturstoffe. Mit kombinatorischen Synthese-Methoden kann man die Zahl unterschiedlicher chemischer Strukturen in derartigen Bibliotheken fast unbegrenzt erhöhen. Hochdurchsatz-Screening. Eine derzeit sehr weit verbreitete Methode in der

Wirkstoffforschung benutzt das Roboter-unterstützte Screening großer Substanzbibliotheken gegenüber targets (> 100 000 Verbindungen). Entscheidend für den Erfolg ist ein aussagekräftiger und schneller Assay, mit dem die Wechselwirkung von Substanz und target untersucht werden kann. Derartige Messungen werden oft in 96- oder 384-Loch Mikrotiterplatten durchgeführt. Nanoliter-Reaktionskammern auf geätzten Silicium-Wafern in Verbindung mit konfokaler Laserspektroskopie erlauben > 100 000 Messvorgänge pro Tag. Rationales Wirkstoffdesign. Obwohl die Raumstrukturen der meisten targets nicht bekannt sind, versucht man, aus dem Vergleich der Bindungseigenschaften verschiedener Analogverbindungen eines Wirkstoffs dessen Bindungsstellen im target zu postulieren (QSAR, quantitative structure-activity relationship). Aufgrund dieses Bindungsmodells versucht man dann, die Struktur von Wirkstoffen am Computer zu optimieren (drug design). Ausblick. In der pharmazeutischen Industrie kommt derzeit auf ca. 50 000 untersuchte Einzelsubstanzen nur ein Treffer, d. h. eine bis zur Markteinführung gelangende Verbindung. 2008–2012 wurden weltweit nur etwa 20 NCEs (new chemical entities) pro Jahr als neue Pharma-Wirkstoffe eingeführt. Die Pharma-Industrie hofft, diese Zahl mittels targetorientierter Wirkstoffsuche drastisch zu erhöhen. Durch die Analyse von Krankheits-relevanten Polymorphismen erwartet man darüber hinaus, genetisch bedingte individuelle Abweichungen von targets von der „Norm“, die bei der Wirkstoff-Aktivierung und Metabolisierung eine wichtige Rolle spielen, durch Gendiagnostik frühzeitig zu erkennen („companion diagnostics“) (→300) und damit unerwünschte Nebenwirkungen von Medikamenten durch eine „individualisierte Therapie“ besser in den Griff zu bekommen (Pharmacogenomics) (→300).

Hochdurchsatz-Sequenzierung Allgemeines. Mehrere Jahrzehnte lang sequenzierte man DNA hauptsächlich nach der Methode von Frederick Sanger (→56). Mit dem Beginn des Humangenom-Projekts 1990, aber auch mit der wachsenden Bedeutung von DNA-Sequenzen für die Forschung und die Klinik, wuchs das Bedürfnis nach schnelleren Sequenzierungsmethoden. 2013 konnte ein Genom von 109 Basen an einem Tag sequenziert werden (die Zeit für die Auswertung der Sequenzier-Ergebnisse ist darin allerdings nicht enthalten!). Das Marktvolumen für Geräte und Software des „next generation sequencing“ wurde für 2013 auf 1,5 Mrd. US-$ geschätzt. Unter den vielen Methoden werden hier besprochen: a) das 454-Sequenziergerät von Roche, b) der HiSeqAnalyzers von Illumina, c) der Solid Analyzer von Life Technologies, d) der RSII Sequenzer von Pacific Biosciences, und e) die Nanopore-Methode von Oxford Bio. 454-Sequenzierer von Roche. Bei diesem ursprünglich von der 454 Corporation entwickelten Verfahren wird genomische DNA in kleine Fragmente geschert und endständig mit Linkern versehen. Über einen der Linker erfolgt dann die Bindung an Mikroperlen, an denen die Fragmente amplifiziert werden. Die Mikroperlen werden dann einzeln in Picoliter-Platten abgelegt und in jeder Kavität eine Pyrosequenzierung durch primer extension durchgeführt. Die Leselänge beträgt etwa 1 kb. HiSeq-Analyzer von Illumina. Auch hier schert man genomische DNA zu Fragmenten von 200–300 bp. Durch Ligation geeigneter Adapter erhält man in einer Durchflusszelle verbrückte Cluster der Fragmente, die über Festphasen-PCR amplifiziert werden. Mit Hilfe

basenspezifisch Fluoreszenzmarkierter reversibler Terminatoren werden nun hochparallel die Doppelstränge aufgebaut, wobei sich die jeweils addierte Base durch ihre spezifische Fluoreszenz zu erkennen gibt. Solid-Analyzer von Life Technologies. Bei dieser Technologie werden die durch Scherung erhaltenen DNA-Fragmente in „klonale“ Fragmente aufgetrennt und jeweils an eine magnetische Mikroperle gebunden. Alle Fragmente werden dann mit der gleichen P1Adaptersequenz ausgerüstet, durch Emulsions-PCR amplifiziert und an einen Glasträger gebunden. Mit Hilfe eines Primers für den P1-Adapter ligiert man spezifisch Fluoreszenzmarkierte Basen und liest die Sequenz über die Fluoreszenzsignale aus, die bei der Ligation entstehen. Mittels Parallelbestimmungen unter Verwendung von n-1 bis n-4 versetzten Primern wird die Genauigkeit stark erhöht. RSII Sequencer von Pacific Bio. Anders als bei den vorgenannten Methoden findet die Sequenzierung hier an einem einzigen DNAStrang statt, der eine sog. SMRT-Zelle durchläuft (für „single-molecule real-time“). Darin befindet sich DNA-Polymerase, der die 4 für den Aufbau von DNA erforderlichen Nukleotide zur Verfügung stehen, jeweils mit einem unterschiedlichen Fluoreszenzmarker bestückt. Beim Einbau der markierten Base wird der Fluoreszenzmarker freigesetzt und das Signal mittels eines nullmodalen Wellenleiters abgeleitet. Eine Amplifikation der DNA ist nicht erforderlich. Da in einer Versuchskammer eine Million SMRT-Zellen untergebracht sind, erlaubt das Verfahren hochparallele Sequenzierungen auch großer Genome. Zudem betragen die Leselängen über 20 kb. GridION-Sequenzierer von Oxford Nanopore Technologies. Bei diesem System wird einzelsträngige DNA mittels Elektrophorese durch eine biologische (Porin in einer Doppelmembran) oder chemische (Graphen, Siliciumnitrid) Nanopore bewegt. Bei Anlegen einer Spannung an die Pore erfolgt beim Durchtritt jeden Nukleotids eine Veränderung des Stroms, der von der Geometrie des Nukleotids abhängt und deshlab unterschiedlich ist für jedes Nukleotid. Damit wird eine Aussage über die Basensequenz möglich. Selbst methylierte Basen (Epigenetik) können über ihr Stromsignal identifiziert werden. Die Lesegeschwindigkeit eines Nanoporen-Sequenzierers liegt bei ~ 300 Basen/sec. Bioinformatik. Ein unerlässlicher Bestandteil von Hochdurchsatz-Sequenzierungen sind Bioinformatik-Programme, die die Genomsequenz durch Analyse überlappender Teilsequenzen am Computer wieder zusammensetzen. Die Zahl fehlerhafter experimenteller Bestimmungen nimmt mit der Größe eines Genoms proportional zu, sodass zum Ausschluss von Lesefehlern Mehrfach-Bestimmungen durchgeführt werden müssen (bis zu 50fach). Da auch die Zahl repetitiver Sequenzen mit der Größe eines Genoms ansteigt, sind weitere Maßnahmen erforderlich.

Proteomics

Allgemeines. Der Begriff „Proteom“ wurde 1995 vorgeschlagen und beschreibt die Gesamtheit der von einem Genom codierten Proteine. Bei höheren Organismen werden von einem Gen bei der Transkription und aufgrund posttranslationaler Prozesse (→40) im Mittel 10 verschiedene Proteine gebildet. Unter Proteomics versteht man Untersuchungen zur Expression, Funktion und Wechselwirkung von miteinander verschalteten Proteinen auf der Basis eines Genoms (functional genomics). Methoden. Die Kernmethode der proteomics-Forschung ist die Auftrennung und Identifizierung einer großen Zahl von Proteinen. Das Proteom von Escherichia coli enthält beispielsweise ca. 4000 Proteine. Die Probenvorbereitung ist kritisch und erfordert z. B. für Membranproteine ein anderes Protokoll als für cytoplasmatische Proteine. Bei eukaryotischen Organismen verwendet man meist Protein-Extrakte aus Kulturen einzelner Zelltypen und erhält damit Hinweise auf unterschiedliche Expressionsmuster. Die wichtigste Methode zur Auftrennung der Proteingemische ist die zweidimensionale Gelelektrophorese, wobei in der ersten Dimension nach dem isoelektrischen Punkt, in der zweiten nach der Molmasse aufgetrennt wird. Durch Spreizung des pH-Bereichs kann man die Auflösung verbessern. Die halbquantitative Auswertung der 2D-PAGE-Gele erfolgt nach Protein-Anfärbung durch Gelscanner und Computer-Analyse. Hochleistungssysteme verarbeiten bis zu 100 Gele pro Woche. Die Identifizierung gering exprimierter Proteine (10–1000 Kopien pro Zelle), die Zuordnung post-translational modifizierter Proteine zu einem Ausgangs-Protein und ihre Quantifizierung macht noch große Schwierigkeiten. Ein Weg zur Quantifizierung bekannter Proteine in einem Proteom sind Antikörperoder Aptamer-Bibliotheken. Häufig muss man jedoch unbekannte Proteine identifizieren. Bei Mengen von > 1 μg exprimierten Proteins reicht zur Charakterisierung die Ansequenzierung des N-terminalen Bereichs (wenn der N-Terminus nicht acetyliert vorliegt!) und ein Vergleich dieser Teilsequenz mit Informationen aus Datenbanken. Schwächer exprimierte Proteine werden durch Massenspektrometrie bestimmt. Mit der MALDI-TOF-Massenspektrometrie (matrix-assisted laser-desorptionionizationtime-of-flight) erhält man jedoch nur ungefähre Molmassen. Deshalb bestimmt man zusätzlich die Massenzahlen der Peptide eines Spots im 2D-Gel, die nach Trypsin-Verdau entstehen (Trypsin spaltet Peptide nur bei Lysin und Arginin), und vergleicht sie in silico mit einer Computer-generierten Liste von Proteinen nach simuliertem Trypsin-Verdau. Die Methode kann man natürlich nur dann einsetzen, wenn das zugrundeliegende Genom komplett sequenziert wurde und alle Protein-Sequenzen des Proteoms vorhergesagt werden können. Ist dies nicht der Fall, so können mit der Elektrospray-Massenspektrometrie (ESITOF) Abbaufragmente unbekannter Proteine als sogennante protein sequence tags (PST) identifiziert und über Datenbanken Proteinen zugeordnet werden. Die Empfindlichkeit der Methode liegt im unteren Femtomol-Bereich pro Protein-Spot. Es können also nur Proteine detektiert werden, die in hunderttausenden Kopien pro Zelle vorliegen. Eine aussichtsreiche Verbesserung ist die MeCAT-Kodierung, bei der unterschiedlich schwere Metallionen zur Markierung eingesetzt und mit der ultrasensitiven Elementmassenspektrometrie (ICP-MS, Nachweisgrenze im attomolaren Bereich) detektiert werden. Anwendungen. Mit den Methoden der Proteomics kann man zellspezifische oder induzierte Veränderungen im Muster der exprimierten Proteine bestimmen. Beispiele sind: 1.

Unterschiede im Expressionsmuster des Proteoms von E. coli beim Wachstum auf Glucose oder Milchsäure, 2. der Vergleich des Protein-Musters von β-Zellen des Pankreas gesunder und an Diabetes erkrankter Patienten, 3. veränderte Protein-Muster und toxikologische Untersuchungen an der Leber nach Gabe von Medikamenten. Oft geht es dabei um die Identifizierung von „Marker-Proteinen“ für bestimmte Erkrankungen. Mit Proteomics kann man auch die Protein-Funktion in einer Zelle bestimmen. Man versucht dazu, eine Proteom-Karte des untersuchten Zelltyps aufzustellen und Aufbau und Funktion der „Zell-Fabrik“ durch Entschlüsselung der Wechselwirkungen zwischen ihren Protein-Komplexen besser zu verstehen. Eine nützliche Methode dazu besteht in der Markierung einzelner Proteine mit einem genetisch eingeführten tag und der Identifizierung damit wechselwirkender Proteine durch Massenspektrometrie.

DNA- und Protein-Arrays Allgemeines. DNA-Mikroarrays auf festen Oberflächen („Gen-Chips“, „DNA-Chips“) erlauben die parallele Bestimmung einer großen Zahl von Hybridisierungsereignissen und sind deshalb geeignet 1. für die Untersuchung der Genregulation in unterschiedlichen Zelltypen oder in einem Zelltyp bei verschiedenem Stoffwechsel (functional genomics), 2. zur Sequenzierung von DNA, und 3. zur hochparallelen Schnellerkennung von Polymorphismen. Kommerziell erhältlich sind „Genfilter“ aus Nylon oder Nitrocellulose, auf denen cDNAFragmente der Hefe, der Maus, des Menschen oder anderer Organismen angeboten werden. Dabei erreicht man Dichten von einigen 100 Oligonucleotiden/cm2. Wesentlich höhere Dichten von einigen zehn- bis hunderttausend Oligonucleotiden/cm2 erzielt man auf glatten Oberflächen (Glas, Kunststoff) mit zwei alternativen Techniken: 1. dem stufenweisen photolitographischen Aufbau eines Oligonucleotid-Mikroarrays durch chemische Synthese, und 2. der Mikrodeposition von DNA, cDNA oder Oligonucleotiden mit einem sogenannten Spotter. DNA-markierte, gefärbte Microbeads sind eine weitere attraktive Möglichkeit für hochparallele DNA-Analysen. Oligonucleotid-Mikroarrays. Die Herstellung erfolgt durch Licht-gesteuerte Entschützung von Phosphoramiditen mit Nucleotidspezifischer photolabiler Schutzgruppe und nachfolgender Nucleotid-Kopplung. Mittels photolitographischer Maskentechnik kontrolliert man bei jedem Einzelschritt die Verteilung der Synthesereaktionen auf dem Chip. Man hat mit dieser Methode bereits Arrays mit 250 000 Oligonucleotiden/cm2 hergestellt. Auf einem Wafer von 20 cm Durchmesser immobilisierte man 60 Millionen DNA-Sonden für die Analyse menschlicher SNPs. Wegen der bei den vielen Schritten drastisch abnehmenden Synthese-Ausbeute kommt man allerdings nicht über eine Länge von ca. 25 Oligonucleotiden hinaus. Die Herstellung der photolitographischen Masken für den Prototyp des Chips ist außerdem sehr teuer. Mikrodeposition. Anstatt DNA in-situ zu synthetisieren, können synthetische Oligonukleotide, einzelsträngige DNA- oder cDNAFragmente auch auf Oberflächen wie z. B. Glas abgeschieden werden. Für den Kopplungsschritt stehen Standard-Methoden der Oberflächenchemie zur Verfügung. Der Nukleotid-Strang wird entweder über Nadeln (pins) direkt aufgebracht, oder als Mikrotropfen aufgesprüht (Tintenstrahldrucker-Prinzip). Kommerzielle Geräte („Microspotter“) erreichen dabei Geschwindigkeiten von > 10 000

DNAoder cDNA-Fragmenten/h. Die mit dieser Methode erreichbare Dichte liegt bei etwa 10 000 Oligo-nukleotiden/cm2. Sie werden zum Genotyping, zur Expressionsanalyse, aber auch zur SNP-Detektion mittels Resequenzierung von DNA eingesetzt. Dazu muss der Array eine komplette Einzelstrang-Sequenz der Ziel-DNA in Form überlappender Sequenzen enthalten. Mit einem Array von 16 000 20-meren Oligonukleotiden gelang es beispielsweise, in einem einzigen Hybridisierungsexperiment 179 der 180 bekannten Polymorphismen der mitochondrialen DNA des Menschen zu ermitteln. Detektion. Die Detektion von Hybridisierungsereignissen erfolgt meist mittels fluorogener Cyanine (rot: „Cy3“, grün „Cy5“), die – als Reporter-Gruppen kovalent häufig an dCTP gebunden – während des Amplifikationsschritts in die einzelsträngige Proben-DNA eingebaut werden. Die Detektion erfolgt durch Fluoreszenzmessung mit einem Laser-Scanner oder mittels CCD-Bildanalyse. Alternativ werden auch biotinylierte Nucleotide eingebaut, die man nach Hybridisierung mit Gold-markiertem Avidin reagieren lässt. Die Gold-Markierung lässt sich dann noch mit kolloidalem Silber um das 50fache verstärken. Die Detektion erfolgt in diesem Fall kostengünstig durch Absorptionsmessung. Massenspektrometrische Verfahren (MALDITOF) erlauben eine Marker-freie, schnelle, annähernd quantitative Analyse von Hybridisierungsereignissen. Protein-Mikroarrays. Anstelle von DNA können auch unterschiedliche Proteine auf einen Chip aufgebracht werden. Mit einem Array einer Bibliothek rekombinanter Antikörper (→244) oder Aptameren (→42) lassen sich beispielsweise die in einem Zell-Lysat enthaltenen Proteine quantitativ bestimmen. Immobilisiert man dagegen bekannte Proteine, so können Protein-Protein-, Protein-DNA-, Protein-Lipid- und weitere Bindevorgänge analysiert werden. Hauptanwendungen für Protein-Mikroarrays sind die Diagnostik von Seren, die Analyse von Proteinmustern in Zell-Lysaten und die Analyse von Protein-Wechselwirkungen.

Metabolomics und Metabolic Engineering Allgemeines. Die vertieften Kenntnisse über den Stoffwechsel, seine Module und deren Regulation erlauben es, mit effizienten Messtechniken, mathematischer Modellierung und Computersimulationen Stoffflussverteilungen in Zellen zu analysieren. Mit quantitativen Metabolit-Analysen, die man über HPLC-MS oder hochaufgelöste NMR-Studien erstellt (metabolomics, in der Ernährungsforschung metabonomics), will man gezielt Veränderungen in Stoffwechsel-, Regulations- und Signalnetzwerken vornehmen, beispielsweise um Probandengruppen für Ernährungsstudien festzulegen, um in Pflanzen und Mikroorganismen mit

gentechnischen Methoden spezifische Produktivitäten zu erhöhen oder das Substratspektrum zu erweitern (metabolic engineering). Metabolic flux analysis. Bei bekannter Biochemie lässt sich ein metabolisches Netzwerk (→36) als ein System von Bilanzgleichungen für die Reaktanden formulieren, das in einer stöchiometrischen Matrix abgebildet wird. Unter bestimmten Bedingungen gelingt es, hieraus die Stoffflussverteilung innerhalb des Netzwerkes zu bestimmen. Dazu muss man auf jeden Fall die über die Zellmembran mit der Umgebung ausgetauschten Stoffflüsse (aufgenommene Substrate und ausgeschiedene Produkte) messen. Dies reicht aber häufig nicht aus, um das System von Bilanzgleichungen eindeutig zu lösen. Zusätzliche Informationen, insbesondere bei Fragen zu alternativen Stoffwechselwegen, liefert dann die Messung von Enzymaktivitäten, die Bestimmung von Expressionsprofilen mit Hilfe von DNA-Arrays (→316), meist aber mit Markierungsexperimente mit Isotopen-markierten Meta-boliten. Die Zellen werden hierzu auf definiert markierten Substratgemischen gezüchtet und Metabolite, gelegentlich auch Makromoleküle, mit Hilfe der Kernresonanzspektroskopie (NMR) oder der Massenspektroskopie (MS) auf ihre Markierungsmuster analysiert. Eine Ausweitung normaler Metabolit-Bilanzen auf derartige „Isotopomere“ (Isotopen-Isomere) ermöglicht es in günstigen Fällen, ein mathematisches Modell für einen verzweigten Stoffwechselweg oder sogar für eine ganze Zelle zu erstellen. Metabolic Control Analysis. Zur Ermittlung der Enzyme, die den Stofffluss zum Produkt begrenzen, ist es wünschenswert, die Hierarchie der Stoffflusskontrolle zu ermitteln. Hierunter versteht man den Einfluss der fraktionellen Änderung der Aktivitäten der beteiligten Enzyme auf den interessierenden Stofffluss. Die Kontrolle verteilt sich dabei in der Regel auf mehrere Enzyme. Zur Ermittlung der Kontrollkoeffizienten kann man die Gendosis einzelner Enzyme im Netzwerk modifizieren und die veränderte Stoffflussverteilung quantitativ bestimmen. Alternativ kann man die Kontrollkoeffizienten mit Hilfe mathematischer Modelle berechnen, die die Dynamik des interessierenden Stoffwechsels hinreichend genau beschreiben. Zur experimentellen Validierung dieser Modelle misst man dann intrazelluläre Metabolite bei transienten Prozessbedingungen. Hierzu kann man beispielsweise eine Kultur im stationären Zustand durch einen Stimulus (z. B. Glucose-Puls) anregen und die Systemantwort durch Messung der zellinternen Poolkonzentrationen erfassen. Dies setzt schnelle Roboterunterstützte Probenahmen in weniger als einer Sekunde voraus. Anwendungen. Bei Mikroorganismen wurde die Methode bisher hauptsächlich eingesetzt a) zur Erweiterung des Substratspektrums, b) zur Erweiterung ihres Abbau-Potentials in der Umwelt und c) zur Erhöhung der Ausbeuten bei der Produktion von Metaboliten. So klonierte man zur Verwertung von Molke als C-Quelle erfolgreich das Lactose-Operon in Zymomonas mobilis (Ethanol-Produktion), Corynebacterium glutamicum (Glutaminsäure-(→126) und Lysin-Produktion (→128)) und andere Stämme ein. Durch Einklonieren geeigneter Gene für Enzyme des Aromatenabbaus in Pseudomonas sp. B13 erhielt man Stämme, die, anders als der Wildstamm, sowohl chlorierte wie methylierte Aromaten abbauen können. Eine Steigerung der Produktausbeute mittels metabolic engineering untersucht man an zahlreichen Beispielen des primären (Aminosäuren, Ethanol, Alkohole, Biopolymere, Vitamine) und sekundären Stoffwechsels (Antibiotika). So gelang es beispielsweise durch Analyse der konkurrierenden

Stoffwechselschritte bei der Biosynthese und Sekretion von Lysin durch C. glutamicum, durch gezielt eingesetzte gentechnische Maßnahmen Ausbeutesteigerungen von > 50 % zu erzielen.

Synthetische Biologie Allgemeines. Unter diesem Begriff werden mehrere Arbeitsrichtungen subsummiert, beispielsweise die chemische Erweiterung des genetischen Codes, das Design neuer Enzyme am Computer oder die Kodierung biologischer Schaltkreise auf Plasmid-DNA („biobricks“), die nach Art eines Lego-Baukas-tens in einem Wirtsorganismus (meist E. coli) zu höheren Systemeinheiten zusammengefügt werden können. Unter dem Gesichtspunkt einer technischen Anwendung sind folgende Aspekte einer synthetischen Biologie besonders interessant: a) die Herstellung von Wirtsorganismen mit reduzierten Genomen, und b) die Konstruktion neuer Stoffwechselwege. Wirtsorganismen mit reduziertem Genom. Ein frühes Beispiel für diese Arbeitsrichtung ist die Entwicklung des Sicherheitsstamms E. coli-K12 (→20), der keine Plasmide mehr enthält und in dessen Genom alle potenziell pathogenen Faktoren wie z. B. Fimbrien-Adhäsine,

Oberflächen-Antigene) eliminiert wurden. In den letzten Jahren wurden auch Mikroorganismen, mit denen durch Fermentation Wertstoffe erzeugt werden, in ihrem Genom reduziert. Corynebacterium glutamicum (→20), der Erzeugerstamm für Glutaminsäure und Lysin, wurde mit Hilfe verschiedener Deletionen zu einem universellen Expressions-system entwickelt, mit dem Enzyme (z. B. Transglutaminase) oder therapeutische Proteine (z. B. hEGF) korrekt gefaltet ins Medium sezerniert werden (CORYNEX™). Bei der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe (→14) entfernte man viele der im Genom kodierten Proteasen und konnte mit Produktionsstämmen dieses Organismus therapeutische Proteine wie z. B. menschliches Wachstumshormon oder Transferrin in hoher Reinheit ins Medium sekretieren (ASPEX™). Das Genom eines Bacillus subtilis-Stamms (→20) wurde um 21 % reduziert und in Bereichen der Stoffaufnahme und -sekretion modifiziert; als Ergebnis stieg die Sekretion einklonierter Cellulase (eines Waschmittel-Enzyms) um 250 %. Andere, mehr in den Bereich der Grundlagenforschung gehörende Projekte sind die Herstellung „künstlicher“ oder chimärer Mikrorganismen. So wurde 2010 ein Mycoplasma mycoides JCVI-syn1.0 beschrieben, dessen 1,08 Mbp großes Genom synthetisch hergestellt und in ein von DNA befreites M. capricolum übertragen worden war. Das „künstliche“ Bakterium wuchs und vermehrte sich. Ein chimäres Bakterium entstand 2012 durch Einklonierung des gesamten Genoms des Cyanobakteriums Synechocystis PCC6803 in Bacillus subtilis Stamm 168. Konstruktion neuer Stoffwechselwege. Ein frühes Beispiel (2005) ist die industrielle Herstellung von 1,3-Propandiol (→142) aus einem E. coli-Stamm, dem zwei Gene aus Backhefe und ein Gen aus Klebsiella pneumoniae einkloniert wurden und dessen Stoffwechsel durch metabolic engineering optimiert worden war. Ein aktuelles Beispiel (2014) ist die industrielle Herstellung von Hydrocortison (→252) aus dem Zellwandbaustein Ergosterol der Backhefe. Um diesen Stoffwechselweg zu ermöglichen, mussten der Backhefe mehrere Gene aus dem Rind, dem Menschen und einer Pflanze einkloniert und deren Regulation wie auch die kompartimentierten Einzelschritte optimiert werden, was etwa 15 Jahre in Anspruch nahm. Ein weiteres Beispiel ist die Synthese von Artemisinin. Der Malaria-Wirkstoff wird vom Einjährigen Beifuß (Artemisia annua) synthetisiert, lässt sich aber aus der Pflanze oder aus pflanzlichen Zellkulturen nur in unzureichenden Mengen gewinnen. Durch Konstruktion neuer Stoffwechselwege in E. coli oder Backhefe gelang es unter Einklonierung eines Gens aus Haematococcus pluvialis, die Vorstufe Amorphadien in guten Ausbeuten herzustellen. Auch an Cyanobakterien wird mit Methoden der synthetischen Biologie gearbeitet: erhält man bereits durch metabolic engineering hohe Ausbeuten an Triglyceriden, die in Fettsäure-methylester („Biodiesel“) umgewandelt werden können, so erlaubt die Einklonierung einer Fettsäure-CoAReduktase und einer Fettaldehyd-Decarbonylase die Bildung von Alkanen (→18). Risiken und ethische Bedenken. Mit den Methoden der synthetischen Biologie wurden bereits humanpathogene Viren synthetisiert (Polio, spanische Grippe), sodass Schutzmaßnahmen gegen einen Missbrauch dieser Technologie erforderlich sind und auch bereits bearbeitet werden (→332). Ethische Fragen ergeben sich beispielsweise bei der gezielten Veränderung von Stammzellen (→334). Ökologische und patentrechtliche Fragen entstehen, wenn Saatgut verändert oder modifizierte Mikroorganismen in die Umwelt entlassen werden – dafür gilt derzeit ein Moratorium. (→332)

Systembiologie

Allgemeines. Systembiologie ist ein neues Forschungsfeld der Biologie, das auf eine holistische (ganzheitliche) Beschreibung der Funktionen einer Zelle oder eines Organismus zielt. Dazu werden funktionelle Elemente des Metabolismus und daran beteiligte Steuer- und Signalmoleküle zu funktionellen Modulen aggregiert, die in ihrer Gesamtheit die Zelle abbilden. Dieses Zellmodell beruht also auf experimentellen Befunden, erlaubt aber auch eine interaktive Vorhersage von Zellfunktionen. Eine derartige kybernetische Beschreibung einer Zelle ist mit einer dynamischen Kartierung vergleichbar, die Verkehrsströme der Metaboliten, ihre Herkunft und die Netzwerke ihrer Regulierung analysiert. Kernkomponenten. Bevor eine Zelle oder ein biologisches System beschrieben werden kann, müssen Daten zur Struktur des Systems erhoben werden. Diese umfassen die Funktion und Wechselwirkung der Gene, der Proteine, der Stoffwechselwege und ihrer SteuerungsMechanismen. Zellen reagieren dynamisch auf interne oder externe Faktoren. Derartige Reaktionen versucht man mit Simulationsstudien zu beschreiben, um das Verhalten von Zellen unter ganz bestimmten Bedingungen zu verstehen. Dazu müssen bespielsweise die Kontrollfaktoren herausgefunden werden, die Fehlfunktionen minimieren. Schließlich versucht man das Systems Design zu entschlüsseln, nach dem alle Module zu einer funktionierenden Zelle integriert sind. Messtechnik. Jede Art der Analyse von Regulationsvorgängen in einem komplexen biologischen System erfordert umfangreiche Datenbanken. So muss beispielsweise die Sequenz und das Expressionsprofil der Gene bekannt sein (Genom und Transkriptom), (→316) ferner die daraus abgeleiteten Proteine (Proteom) und die von dieser Zellmaschinerie gebildeten Metabolite (Metabolom) (→318). Transkriptome misst man mittels der Expressionsprofile von mRNAs unter Verwendung von DNA-Arrays. Proteome (→314) werden durch 2D-Gelelektrophorese bestimmt, wobei die Untersuchung von Signalnetzwerken beispielsweise durch massenspektrometrische Bestimmung der Phosphorylierungskinetik der daran beteiligten Proteine unterstützt wird. Veränderungen der Konzentrationen hunderter von Metaboliten nach einem Stimulus (z. B. der Gabe von Glucose) erfordern oft Messungen im Millisekunden-Bereich. Dazu bedient man sich Roboter-unterstützter Probenahmen und HPLCMS-Bestimmungen der Metaboliten unter streng definierten Bedingungen bei hohem Durchsatz. Oft sind die Vorstufen mit stabilen Isotopen (13C, 15N) markiert, um die Analytik der Metaboliten mittels Massenspektrometrie oder NMR zu erleichtern (Metabolomics). Robustheit. Biologische Systeme zeichnen sich durch eine hohe Robustheit aus, die die Zelle oder einen Organismus auch dann schützt, wenn eines der Module außer Kontrolle gerät. Phänotypen dieser Robustheit sind beispielsweise 1. die Fähigkeit einer Zelle oder eines Organismus, sich an eine veränderte Umwelt anzupassen, 2. eine verhältnismäßig geringe Empfindlichkeit der kinetischen Parameter, und 3. bei starken Schäden ein allmähliches Abklingen der Lebensfunktionen anstelle von abrupten Blockaden. Dieses Verhalten wird erreicht durch zahlreiche Kontrollsysteme, beispielsweise durch negative und positive Rückkopplungen, durch Redundanz und strukturelle Stabilität vitaler Funktionen und durch einen modularen Aufbau, d. h. durch physikalische oder funktionelle Isolierung der Untersysteme: die Zelle ist auch noch dann lebensfähig, wenn ein Untersystem ausfällt.

Rechner-Werkzeuge der Systembiologie stammen häufig aus den Ingenieurswissenschaften. Sie umfassen Datenintegration, Management, Visualisierung und die Analyse komplexer Systeme. Dazu wurden zahlreiche integrierte Modellierungs- und Simulations-Softwaremodule entwickelt. Die Systems Biology Mark-Up Language (SBML) ist ein Beispiel für ein XMLbasiertes Format, das speziell für die Systembiologie entwickelt wurde und sich bereits weitgehend als Standard für die Speicherung und den Austausch von in-silicoNetzwerkmodellen durchgesetzt hat. Anwendungen. Systembiologische Fragestellungen werden weltweit bearbeitet und werden u. a. erfolgreich zur Optimierung von Produktionsverfahren eingesetzt. Sie reichen von Untersuchungen zur Funktion von Mikroorganismen (E. coli, Hefe, COS-Zellen) über tierische und menschliche Zelltypen (COSZellen, Leberzelle, Neuronen) bis hin zu ernährungswissenschaftlichen und pharmakologischen Fragestellungen.

Bioinformatik: Sequenz- und Struktur-Datenbanken Allgemeines. Der rasante Fortschritt der Molekularbiologie wäre undenkbar ohne die schnellen Entwicklungen in der Computer-technik und der Telekommunikation, die Speicherung, Sortierung und globalen Vergleich großer Datenmengen sicherstellen. Aus dem seit 1980 für wissenschaftliche Zwecke entwickelten Internet ist in den letzten 25 Jahren das World-Wide Web mit > 25 Mrd. indexierten Webseiten (2009) und > 2 Mrd Nutzern (2010) entstanden, das die Welt umspannt und noch immer stark wächst. Neben zahlreichen kommerziellen Nutzungen macht es den globalen Austausch großer wissenschaftlicher Datenmengen und deren individuelle oder kollektive Bearbeitung möglich. In der Bioinformatik (biocomputing) sind dies vor allem Informationen über DNA- und ProteinSequenzen sowie Proteinstrukturen, über Enzyme und Stoffwechselwege. Sequenzinformationen. Die breite Anwendung und die hohe Geschwindigkeit der DNASequenzanalyse haben dazu geführt, dass sich die Zahl der in internationalen Datenbanken zugänglichen DNA-Sequenzen derzeit etwa alle 2 Jahre verzehnfacht. Der Datenbestand lag Mitte 1998 bei 2 Mrd., Ende 2014 bereits bei 174 Mrd. Basen. Mit der Entwicklung der Hochdurchsatz-Sequenzierung (→312) ist die Datenmenge exponentiell angestiegen und überstieg bereits 2011 1014 Basen (100 Tb). Die Ablage dieser Daten in einer einzigen globalen Datenbank („GenBank“) mit drei dezentralen „mirror sites“ in den USA, Japan und

England und die weltweite Datenvernetzung über das Internet erlauben es in kürzester Zeit, im eigenen Labor sequenzierte DNAAbschnitte auf Identität oder Homologie mit bereits abgelegten Sequenzen zu prüfen, beispielsweise mit Hilfe von BLAST (→326) (basic local alignment search tool), das in einzelnen Genomen oder auch über den gesamten DNASequenzraum hinweg ähnliche Sequenzen ermittelt und damit Hinweise auf die Identität und Funktion der klonierten Sequenz gibt. Protein-Sequenzinformationen und Annotationen werden vom UniProt Konsortium betreut, in dem sich die SwissProt Datenbank in Genf, das European Bioinformatics Institute in Hinxton (UK) und die Protein Information Resource PIR in Washington DC zusammengschlossen haben. Die UniProt Knowledge Database enthielt Anfang 2014 über 500 000 annotierte Proteinsequenzen. Strukturinformationen. Im Vergleich zur Sequenzinformation haben sich die Informationen über Proteinstrukturen (→28) langsamer entwickelt. Sie setzen als wesentliche Arbeitstechnik die Herstellung von Protein-Einkristallen und die Röntgenstrukturanalyse ihrer Schwermetallkomplexe voraus, was beispielsweise für große Proteinkomplexe oder für membranständige Proteine beträchtliche experimentelle Schwierigkeiten aufwirft. Die 2DNMR-Analyse von Proteinen in Lösung ist derzeit auf Proteine von ca. 30 kDa Molmasse beschränkt, liefert aber Strukturinformationen von Proteinen in Lösung. Trotz dieser Beschränkungen waren 2014 in der wichtigsten Proteinstruktur-Datenbank, der Protein Data Bank (PDB, Research Collaboratory for Structural Bioinformatics RCSB), die Raumstrukturen von beinahe 100 000 Proteinen und Proteinvarianten abgelegt. Ihre Zahl steigt um ca. 8000 pro Jahr. Die Möglichkeiten des Internet erlauben es, eine beliebige DNAoder Proteinsequenz mit den diesen Raumstrukturen zugrundeliegenden Sequenzen zu vergleichen. Beträgt die SequenzIdentität zu einem strukturell bekannten Protein 30 % oder mehr, so lässt sich daraus ein Strukturmodell für das unbekannte Protein ableiten (Homologie-Modellierung). In anderen Strukturdatenbanken (SCOP, CATH) findet man eine Klassifizierung von Proteinen anhand ihrer „Architekturen“: dabei werden Teilsequenzen eines unbekannten Proteins nach Sekundärstruktur-Motiven (→28) wie α-Helix, β-Faltblatt, β-Schleife oder strukturlos markiert und mit einem Lexikon bekannter Strukturen (DSSP) verglichen. Ab initio-Vorhersagen der Struktur aus der Sequenz sind vielversprechend und für kleine Proteine und Proteindomänen bereits erfolgreich. Eine für das protein engineering (→198) breit anwendbare und erfolgreiche Methode ist die Erstellung von Struktur-Funktions-Datenbanken. In der Cytochrom P450 (CYP) Engineering Database (CYPED) wurden beispielsweise über 13 000 CYPSequenzen und 741 annotierte Strukturen abgelegt, die wertvolle Hinweise für die Bearbeitung unbekannter CYPs geben.

Bioinformatik: Funktionsanalysen

Allgemeines. Neben Datenbanken über Sequenzen und Strukturen stellt die Bioinformatik auch wertvolle Informationen über biochemische Funktionen bereit. Unter den zahlreichen Beispielen werden hier behandelt a) Methoden zur Genom-Annotierung, b) die Stoffwechseldatenbank KEGG, c) das FANTOM-Konsortium, das beispielsweise PromotorFunktionen (→62) analysiert, d) die Enzymdatenbank BRENDA, und e) genomweite Assoziationsstudien. Genom-Annotierungen weisen DNASe-quenzen biologische Funktionen zu. Sie bestehen meist aus drei Schritten: 1. der Eliminierung von nicht-Protein-kodierenden DNA-Sequenzen, 2. der Vorhersage von Genen, und 3. der Zuordnung von biologischen Eigenschaften zu diesen Genen. Zur Vorhersage von Genen hilft die Identifikation von open reading frames (ORFs) aufgrund der Abwesenheit von Stop-Codons und der Identifikatikon regulatorischer SequenzMotive. Ein wesentliches Werkzeug für die Vorhersage von Funktionen ist BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), das eine neue DNA-Sequenz mit Sequenzen aus Datenbanken (meist GenBank) vergleicht und über deren Ähnlichkeit vermutete Funktionen vorschlägt. Eine Gen-Ontologie-Datenbank erlaubt es darüber hinaus, für die Gen-Funktionen eine Organismusunabhängige, universell gültige Beschreibung festzulegen – auch für die von diesen Genen katalysierten biologischen Schritte. KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) hat zum Ziel, Zellen und Organismen mit Hilfe der Bioinformatik abzubilden. Die sehr umfangreiche Enzyklopädie enthält Informationen über Strukturen, Reaktionsgleichungen, Stoffwechselwege und funktionale Hierarchien, ferner Informationen über Krankheiten des Menschen und Medikamente zu ihrer Behandlung. Mit der KEGG Pathway Datenbank ist es beispielsweise möglich, aus den Sequenzinformationen eines Genoms die darin kodierten Stoffwechselwege abzuleiten und als metabolisches Netzwerk darzustellen (→36). Stoffwechselwege verschiedener Organismen können maschinell verglichen werden (KEGG Orthology (KO) system). Ebenso können zelluläre Prozesse, z. B. der Transport zwischen verschiedenen Kompartimenten, oder organismische Systeme, beispielsweise die T-Zell-Rezeptor- oder die Insulin-Signalkaskade, aus genomischen Informationen abgeleitet und graphisch dargestellt werden. In der KEGG Disease Datenbank sind zahlreiche Krankheiten in Form von Gendefekten oder gestörten molekularen Netzwerken dargestellt, oft gemeinsam mit den Angriffsorten therapeutischer Interventionen. FANTOM (functional annotation of the mammalian genome) ist ein von Japan aus koordiniertes internationales Konsortial-Projekt, das die Transkriptionsfaktoren, Promotoren (→62) und anderer an der Transkription beteiligte genetische Elemente in gesunden und kranken menschlichen und Mäuse-Zellen mit Hilfe der CAGE-Methode analysiert (cap analysis of genetic elements). Anfang 2014 wurde beispielsweise eine umfassende Kartierung der Gentranskription in allen menschlichen Zelltypen veröffentlicht. BRENDA (Braunschweig Enzyme Database) ist ein online-Informationssystem über Enzyme und Stoffwechselwege. Es enthält zu etwa 6 500 nach EC-Nummern klassifizierten Enzymen durch text mining in PubMed aufgefundene und manuell annotierte Eigenschaften aus etwa 130 000 Veröffentlichungen und erlaubt auch die Suche nach ihren Liganden (> 1,4 Millionen

Enzymliganden wie Substrate, Co-substrate, Cofaktoren, Inhibitoren). Genomweite Assoziationsstudien dienen dazu, einen bestimmten Phänotyp – meist eine Erkrankung – mit ihren genetischen Markern, z. B. SNPs, zu verknüpfen. In einigen Fällen reicht die Auflösung auch bereits aus, um Polymorphismen des krankheitsverursachenden genetischen Elements (Strukturgen, Promotor) zu beschreiben (→298). Die Fortschritte und der Preisverfall bei der Hochdurchsatz-Sequenzierung (HTS) haben bereits zu ersten kommerziellen Angeboten für eine genetische Dispositionsanalyse geführt (z. B. 23andMe), die allerdings keine FDA-Zulassung erhielt (2013). Eingeschränkte Verfahren, z. B. auf SNP’s in mitochondrialer DNA, eignen sich bereits zur molekularbiologischen Ahnenforschung wie auch für anthropologische Studien über die prähistorischen Wanderzüge des Menschen (human genographic project von National Geographic und IBM).

C-Quellen Allgemeines. Die absehbare Verknappung fossiler Rohstoffe hat umfangreiche Untersuchungen ausgelöst, in welchem Umfang nachwachsende Rohstoffe oder CO2 als zukünftige Energieträger und Chemie-Rohstoffe entwickelt werden können. Stärke und Rohrzucker werden bereits heute zur Erzeugung von Bioethanol (→138) und Fermentationsprodukten, Fette und Öle zur Herstellung von Biodiesel (→162) eingesetzt. Dies hat eine lebhafte Diskussion über die Verwendung von Nahrungsmittel-Rohstoffen für technische Zwecke ausgelöst („Tank oder Teller“) und zu einer Suche nach neuen Kohlenstoff-Quellen geführt, die nicht in Konkurrenz zur Nahrungsmittel-Produktion stehen. Derzeit stehen im Mittelpunkt des Interesses: 1. die Umwandlung von CO2 in Biomasse und Wertstoffe durch autotrophe Mikroorganismen bzw. Algen (→18), 2. der Aufschluss von Biomasse zu fermentierbarem Zucker, gefolgt von Fermentationsverfahren, 3. die Verwertung von Lignin, und 4. die Verwertung von nicht zur Ernährung verwendeten Fetten und Ölen, beispielsweise zu Biodiesel. CO2 als C-Quelle. Der größte Teil der Biomasse wird durch Pflanzen bzw. Algen aus CO2 unter Verwendung von Sonnenlicht gebildet. Bei den Algen (→18) konzentriert sich derzeit (2014) das Interesse auf die Synthese von flüssigen Energieträgern wie z. B. Squalen oder

Farnesen, es wird aber auch an der Biosynthese von Alkanen/Alkenen geforscht. Mit den Methoden der Gentechnik kann auch der Stoffwechsel höherer Pflanzen umgesteuert werden. So wurden beispielsweise Eukalyptus-Bäume und Pappeln gezüchtet, die schneller wachsen, einen höheren Anteil an Polysacchariden und weniger Lignin enthalten. Sie eignen sich zur Herstellung von Zellstoff (→184), aber auch als Biomasse zur weiteren Verwertung als CQuelle. Synthesegas als C-Quelle. Mit Clostridien-Stämmen (C. ljungdahlii) gelang es, Synthesegas (ein Gemisch von CO und H2 aus der Kohlevergasung) für die Erzeugung von Wertstoffen einzusetzen. Beispielsweise konnte Evonik im technischen Maßstab reine 2Hydroxyisobuttersäure herstellen, ein Vorprodukt für das Polymer Methacrylat („Plexiglas“) Nachwachsende Rohstoffe. Die Erde produziert große Mengen stofflich und energetisch verwertbarer Biomasse, davon ~ 50 % im Meer. Theoretisch könnte damit neben der Ernährung auch der Bedarf der Menschheit an Energie und chemischen Rohstoffen gedeckt werden. Die Resourcen sind allerdings sehr ungleich verteilt, und die Technologien zu ihrer nachhaltigen Nutzung noch unvollständig entwickelt. In einer nachhaltigen globalen Energieund Chemiewirtschaft werden biotechnologische Verfahren und Bioraffinierien (→330) eine wichtige Rolle spielen. Direkte Verwertung von Biomasse. Bei der Verbrennung trockener Biomasse (z. B. Erntestroh) in Kraftwerken können erhebliche Strommengen gewonnen werden. Aufwändig ist die Entfernung giftiger bzw. geruchsintensiver Gase. Zucker aus Biomasse. (→182) Die biotechnologisch wichtigsten Verfahren haben zum Ziel, aus der Cellulose und den Hemicellulosen der Biomasse fermentierbare Zucker, vor allem Glucose, Xylose und Arabinose zu gewinnen. Dazu werden Holz, Ernterückstände usw. in einem ersten, meist physikalischen Schritt (z. B. Hochdruck-Dampfbehandlung) aufgeschlossen und die dabei freigesetzten Polysaccharide mit Cellulasen und Hemicellulasen enzymatisch abgebaut. Lignin ist ein wichtiger Gerüstbaustoff verholzter Pflanzen (20–30 % der Trockenmasse, ca. 20 Mrd t/a). Da es durch radikalische Polymerisation von Zimtsäure, einem Folgeprodukten des L-Phenylalanin, gebildet wird, enthält dieses Biopolymer einen hohen Anteil aromatischer Verbindungen. Bisher sind Verfahren zu einer Umsetzung von Lignin zu Wertstoffen aber nur in Nischen erfolgreich. Ökonomische Bewertung. Die Erdöl-Wirtschaft beruht derzeit (2012) auf 3,9 Mrd. to Rohöl (C-Gehalt: 85 %), das zu 60 % auf > 4000 Öltankern und zu 40 % auf Pipelines zu den Raffinerien gebracht wird. 92 % des Rohöls wird zur Energie-Erzeugung verwendet, nur 8 % für die chemische Synthese. Biomasse enthält weit weniger Kohlenstoff, ihre Energie-Dichte ist damit geringer, sie ist feucht, divers und biologisch abbaubar. Deshalb, und wegen der schwierigeren Transport-Logistik (Ernte-Zyklen) wird man viele lokale Bioraffinerien benötigen, um große, regionale Erdölraffinerien zu ersetzen. In Deutschland produzieren etwa 8 000 Biogas-Anlagen (→288) etwa 4 000 MW, der Energieproduktion von nur 5 KohlekraftAnlagen.

Bioraffinerien

Allgemeines. Die technische Chemie hat in den vergangenen 100 Jahren Verbundsysteme zur kostengünstigen Herstellung von Energieträgern und Chemie-Rohstoffen aus Erdöl, Erdgas und Kohle entwickelt. Die Verarbeitung erfolgt in Raffinerien und führt, neben der Produktion von Treibstoffen wie Benzin, Diesel und Kerosin, zu „Stammbäumen“ von C1-, C2-, C3-, C4-, C5und aromatischen Verbindungen. In Bioraffinerien wird versucht, dieses Konzept mit dem Ausgangsstoff CO2 oder Biomasse nachzubilden (z. B. Holz, Stroh, Abfälle, Klärschlamm) und aus den fermentativ verwertbaren Folgeprodukten wie Glucose, Pentosen und Triglyceriden neue Stammbäume aufzubauen. Viele Produkt- und Energieströme könnten zukünftig aus Bioraffinerien stammen, die mit biologischen Katalysatoren (Enzymen, Mikroorganismen) arbeiten (“weiße Biotechnologie”). Zur Bestimmung der Nachhaltigkeit dieser Prozesse dienen Ökoeffizienz-Analysen. Bioraffinerien. Das Konzept geht von nachwachsenden Rohstoffen aus (Cellulose, Lignin, Hemicellulosen, Stärke, Pflanzenöle), wobei auch genetisch modifizierte Pflanzen betrachtet werden, die z. B. weniger Lignin, modifizierte Stärke oder veränderte Triglyceride bilden. Man unterscheidet a) Bioraffinerien auf Basis von Erntepflanzen wie Mais, Roggen und Weizen, die auch zur Erzeugung von Lebensmitteln dienen, b) Lignocellulose-basierte Bioraffinerien (LCF), bei denen Stroh, Ried, Holz, Papierabfälle oder Bagasse (Überreste der Zuckerrohr-Produktion) als Rohstoff dienen, und c) Grüngut-Bioraffinerien, die grüne Biomasse wie Luzerne, Klee oder Grasschnitt als C-Quelle verwenden. 2014 waren bereits etwa 200 Bioraffinierien im experimentellen Betrieb. Bioethanol oder Biobutanol sind dabei neben Polymerbausteinen wie Milchsäure oder Bernsteinsäure die bevorzugten Produkte. Bioenergie. Als Energiequellen auf der Grundlage nachwachsender Rohstoffe werden vor allem Bioethanol (→138), Biodiesel (→162) und Biogas (→288) bearbeitet. Längerfristige Untersuchungen zielen auf die Gewinnung von Biowasserstoff zum Betrieb biologischer Brennstoffzellen. Aufgrund der zunehmenden Energieknappheit haben die meisten Industrieländer umfangreiche Programme zur Bioethanol-Gewinnung aufgelegt. Die USA planen gemäß ihrer “roadmap to biomass technology in the US”, bis 2020 den Anteil von Bioethanol von derzeit 0,5 % auf 10 % zu steigern. Ähnliche Planungen gibt es in der EU, in Japan und China. Biodiesel wird durch Methanolyse von Triglyceriden (Abfall-Fetten, z. B. verbrauchte Frittierölen, und Pflanzenölen) hergestellt. Die Umesterung kann durch Lipasen katalysiert werden, ist aber wirtschaftlicher mit alkalischem Methanol. Biodiesel wird bereits als Treibstoff verwendet, in den USA, China, Frankreich und Finnland ist auch die Herstellung von Biodiesel als Flugzeug-Kerosin zertifiziert (2014). Die Bildung von Biogas (einem Gemisch aus 2/3 CH4 und 1/3 CO2) durch anaerobe Vergärung von Biomasse ist eine etablierte Technologie in der Klärtechnik (“anaerobe Schlammfaulung”), die zunehmend in der Landwirtschaft zur Gewinnung ortsgebundener Energie eingesetzt wird. In Deutschland waren 2012 über 7100 Mio. US-S kostet (nur 1 von 5000 präklinischen Präparaten wird zugelassen), wird das Herstellverfahren standardisiert und für die Freigabe dokumentiert. Dabei ist der Nachweis zu führen, dass das Produkt frei ist von chemischer, mikrobiologischer und genetischer Kontamination. Nahrungsmittel. Das Potenzial biotechnologisch und gentechnisch erzeugter oder veränderter Nahrungsmittel umfasst transgenes Obst, Gemüse, Fleisch und Fisch oder Grundnahrungsmittel (Mehl, Zucker, Milch), die mit gentechnisch veränderten Organismen hergestellt wurden, wie auch Zusatzstoffe, z. B. Enzyme, Dextrine oder Xanthan, die mit aus der Natur isolierten oder mit rekombinanten Organismen erzeugt wurden. In den USA gibt es seit 1996 für keinen dieser Fälle eine Deklarationspflicht. Die Novel Food-Verordnung der EU schreibt dagegen vor, Nahrungsmittel, die auf gentechnologischem Weg verändert wurden oder gentechnisch erzeugte Komponenten enthalten, auf der Verpackung zu kennzeichnen. Natürliche oder rekombinante Enzyme (z. B. Chymosin) dürfen dagegen ohne Kennzeichnung verwendet werden. Freisetzung transgener Lebewesen. In den USA dürfen seit 1995 nach mehr als 20-jährigen Kontrollen transgene Mikroorganismen, Pflanzen und Tiere nach Anmeldung bei der Landwirtschaftsbehörde i. d. R. ohne weitere Auflagen freigesetzt werden. Das Inverkehrbringen und die Benutzung von transgenem Saatgut ist erlaubt. In Europa wurden seit 2004 gentechnisch veränderte (gv) Pflanzen und daraus erzeugte Lebens- und Futtermittel zugelassen. Sowohl für die Freisetzung von gv-Pflanzen wie für die Zulassung von Produkten aus gentechnisch veränderten Organismen und deren Kennzeichnung (GVO) gelten allerdings strenge Regeln. Verantwortlich für die wissenschaftliche Bewertung ist die European Food Safety Authority (EFSA) in Parma. Das deutsche Gentechnik-Gesetz vom Februar 2005 folgt den europäischen Vorgaben, z. B. bei der Kennzeichnung und Rückverfolgbarkeit von GVOLebens- und Futtermitteln, Genehmigungsverfahren, eingeschränkte Verwendung von Antibiotikaresistenz-Genen und einer Zulassungsbegrenzung auf 10 Jahre. Federführend in Deutschland ist das Bundesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (BVL).

Ethik und Akzeptanz Allgemeines. Verschiedene Aspekte und Zukunftsaussichten der Biotechnologie, insbesondere der Gentechnik, werfen wissenschaftsphilosophische und ethische Fragen auf. Zu letzteren gehören vor allem 1. der Umgang mit den genetischen Informationen eines Individuums, 2. die ethische Rechtfertigung der Gentherapie am Menschen, besonders in der Keimbahn, 3. das Klonen menschlicher Embryos, 4. der Stellenwert des Tierschutzes bei der genetischen Manipulation von Tieren und der Erzeugung von Klonen, und 5. die militärische Verwendung

von Bio- und Gentechnik. Eine gesellschaftliche Akzeptanz der Gentechnik ist grundsätzlich vorhanden, wird aber vom erkennbaren Nutzen bestimmt. Genetische Informationen. Mit den Fortschritten der Gendiagnostik (→302), vor allem aber nach der tausendfachen Sequenzierung menschlicher Genome (→298), ist abzusehen, dass genetisch bedingte Erkrankungsdispositionen individuell vorhergesagt werden können, beispielsweise durch pränatale Diagnostik. Damit erhebt sich die Frage, wie der Patient, der behandelnde Arzt und die Gesellschaft mit diesen Informationen umgeht (ist z. B. eine Abtreibung erlaubt, wenn bei einem Ungeborenen das Risiko einer unheilbaren Erbkrankheit diagnostiziert wird?). Klärungsbedürftig ist ferner, welchen Anspruch die Öffentlichkeit (beispielsweise bei der Verbrechensbekämpfung), Versicherungsunternehmen und Arbeitgeber (Abschätzung von Erkrankungsrisiken) auf die Freigabe oder Erhebung derartiger Informationen haben. In Deutschland sichert das Gendiagnostik-Gesetz das Recht auf „informationelle Selbstbestimmung“. Gentests an Embryonen (Präimplatationsdiagnostik, PID) sind seit 2013 mit Einschränkungen erlaubt. Gentherapie. (→304) Da die Durchführung einer somatischen Gentherapie in einem Rechtsstaat von der Zustimmung des Patienten abhängt, ist bei ausreichender Aufklärung des Patienten ein Missbrauch nicht zu befürchten. Bei der Gentherapie in der Keimbahn wird die veränderte Eigenschaft dagegen auf die Nachkommen ohne deren Zustimmung übertragen. In Deutschland ist das gemäß Embryonen-Schutzgesetz verboten. Genetische Manipulation. Während die biotechnologische Verwendung und die gentechnische Veränderung von Mikroorganismen zur Erzeugung von Produkten kaum umstritten ist und sich Bedenken bei genmanipulierten Pflanzen im wesentlichen darauf beschränken, ob daraus erzeugte Lebensmittel unbedenklich sind und die ökologischen Langfristfolgen abgeschätzt werden können, wird der gezielte genetische Eingriff am Tier emotional kritischer bewertet. Dabei spielt es nur eine untergeordnete Rolle, ob damit die Produktionsleistung erhöht oder fremde Proteine heterolog exprimiert werden. Die Zucht transgener Tiere (→270) unterliegt in Deutschland dem Tier-schutzgesetz und ist genehmigungspflichtig. Tierische und menschliche Klone. Die Erzeugung von mit dem Spender identischen Individuen, die bei Schaf, Maus, Schwein, Rind und Ziege gelang, wirft insbesondere im Hinblick auf das Klonen von Menschen (reproduktives Klonen) große ethische Fragen auf. Diese umfassen auch populationsgenetische Präferenzen (z. B. Geschlechtswahl der Nachkommen). Europaweit gibt es Rahmen-Richtlinien gegen ein Klonen von Menschen. Militärische Verwendung. Biotechnologische Standardverfahren können zur Herstellung biologischer Kampfstoffe, z. B. zur Massenproduktion von Sporen von Bacillus anthrax verwendet werden. Mit gentechnischen Methoden könnten Biowaffen hergestellt werden, gegen die die natürliche Immunabwehr verringert ist. So zerstört ein Interleukin-4 exprimierendes Mäuse-Pockenvirus das Immunsystem der Mäuse vollständig. Obwohl B-Waffen nach der Genfer Konvention weltweit geächtet sind, gilt es als sicher, dass sie in einigen Ländern weiter hergestellt werden. Gesellschaftliche Akzeptanz. Die medizinische Nutzung der Bio- und Gentechnik stößt in den

meisten Industrieländern auf breite Zustimmung. Auch die Stammzell-Therapie, insbesondere die Nutzung eigener („autologer“) embryonaler (ES) oder induzierter pluripotenter Stammzellen (iPS), wird überwiegend positiv eingeschätzt. Dagegen sind genmanipulierte Tiere und Pflanzen wesentlich stärker umstritten. Mit transgenen Pflanzen (z. B. Weizen, Mais, Soja) werden in vielen Ländern Ernteausfälle bekämpft, daraus hergestellte Lebensmittel haben aber in Europa nur geringe Akzeptanz. Gegen den Einsatz genetisch veränderter Enzyme in der industriellen Produktion gibt es derzeit keinen Widerstand.

Patente in der Biotechnologie Allgemeines. In allen Industrieländern werden auf technische Erfindungen durch nationale oder regionale Patentämter zeitlich befristete Monopole erteilt (sog. „gewerbliche Schutzrechte“ wie Patente oder Gebrauchsmuster). Vor Patenterteilung unterzieht man die beanspruchten Erfindungen meist einem Prüfungsverfahren. Dabei werden die Patentansprüche auf Neuheit, erfinderische Tätigkeit, Nacharbeitbarkeit sowie auf gewerbliche Anwendbarkeit geprüft. Stoffpatente können erteilt werden auf chemische Verbindungen aller Art (auch auf Biomoleküle wie Proteine und Nukleinsäuren, Medikamente), auf Mikroorganismen, Stoffgemische (Pharmaka), und technische Vorrichtungen. Verfahrenspatente können insbesondere erteilt werden auf die Herstellung von Stoffen oder Nachweisverfahren. Verwendungspatente werden erteilt auf neuartige Anwendungen an sich bekannter Stoffe oder Vorrichtungen. Es gibt auch Ausnahmen von der Patentierbarkeit: nicht patentfähig sein können Entdeckungen, wissenschaftliche Theorien, Informationssammlungen, Software, Behandlungsverfahren am menschlichen und tierischen Körper; Tierarten und Pflanzensorten, sowie Erfindungen, die gegen die öffentliche Ordnung oder gute Sitten verstoßen. Verfahren. Jede natürliche oder juristische Person ist berechtigt, eine Patentanmeldung beim zuständigen Patentamt einzureichen. Die Einschaltung eines Patentanwalts, sowohl für die Verfassung des Anmeldungstextes, als auch für die Vertretung vor dem Patentamt ist zu empfehlen. Wichtig ist die Erlangung eines möglichst frühen Zeitrangs (Prioritätsdatums) für die Erfindung. Dafür reicht die wirksame Ersteinreichung der Patentanmeldung bei einem nationalen/regionalen Patentamt. Innerhalb des folgenden Prioritätsjahres (12 Monate ab Prioritätsdatum) kann eine Folgeanmeldung der gleichen Erfindung z. B. als Internationale Patentanmeldung (PCT-Anmeldung) oder Regionale Patentanmeldung (z. B. Europa) erfolgen. 18 Monate nach dem Prioritätsdatum wird die Patentanmeldung veröffentlicht. Eine Prüfung erfolgt stets auf Antrag, wofür je nach Anmeldeamt unterschiedliche Fristen bestehen. Der Anmelder erwirbt erst durch Patenterteilung den wirksamsten Schutz für seine Erfindung. Gewöhnlich besteht für Dritte die Möglichkeit, gegen ein erteiltes Patent Rechtsmittel einzulegen. So besteht unmittelbar nach Erteilung die Möglichkeit, Einspruch gegen ein Patent einzulegen. Zu einem späteren Zeitpunkt kann ein Patent nichtig geklagt werden (Gründe: Neuheit, erfinderische Tätigkeit, Nacharbeitbarkeit fehlen). Die Laufzeit eines erteilten Patents beträgt 20 Jahre, ist aber in einzelnen Ländern bei Patenten im Pharma- und

Pflanzenschutzbereich um bis zu 5 Jahre verlängerbar. Die Kosten für Ausarbeitung und Einreichung einer Patentanmeldung und die Erteilung eines Patents können einige < 1000 bis 20 000 € betragen, auch ihre Aufrechterhaltung (Jahresgebühren) und Verteidigung (im Falle von Einspruch oder Nichtigkeitsklage) können sehr teuer werden. Mit geeigneten Patentstrategien kann man das anfängliche Kostenrisiko minimieren. Hierzu bietet sich an, eine Patentanmeldung zunächst über das sogenannte PCT-Verfahren einzureichen, eine vorläufige internationale Prüfung zu beantragen, und erst dann (30 Monate nach dem Prioritätstag) zu entscheiden, in welchen Ländern nationale/regionale Patentanmeldungen folgen sollen. Patente in der Biotechnologie. Aus Lebewesen isolierte oder biotechnologisch produzierte Stoffe sind im Rahmen der oben genannten Kriterien ebenso patentfähig wie aus natürlichen Quellen isolierte Stoffe oder Mikroorganismen. Auch speziell für wirtschaftliche Zwecke gezüchtete Lebewesen sind patentierbar, z. B. Produktionsstämme oder Zelllinien. Als Problem bei biotechnologischen Erfindungen kann sich die „ausreichende Offenbarung“, d. h. die Nacharbeitbarkeit der Erfindung, herausstellen. Deshalb wird es oft erforderlich, eine Probe eines beanspruchten Organismus bei einer anerkannten Hinterlegungsstelle aufzubewahren und Dritten zugänglich zu machen (Budapester Vertrag, 1965). Für den Schutz von Proteinen oder Genprodukten reicht dagegen die Beschreibung der entsprechenden Sequenzinformation und die Angabe der spezifischen Funktion aus. Ggf. ist noch deren Herstellungsverfahren zu beschreiben. Auch mutierte Gene oder Proteine können patentiert werden, soweit sie die Patenterfordernisse erfüllen. Gensequenzen von expressed sequence tags (ESTs) sind nicht patentfähig, solange keine spezifische Eigenschaft der Sequenz offenbart wird. Transgene Pflanzen und Tiere können dagegen patentfähig sein.

Biotechnologie im internationalen Leistungsvergleich Allgemeines. Wie die meisten technischen und wissenschaftlichen Erfolge der Menschheit ist auch die Biotechnologie und Gentechnik aus einem Mosaik vieler nationaler Beiträge entstanden. Oft haben dabei Quantensprünge in der Grundlagenforschung und wirtschaftliche Krisensituationen Pate gestanden und beispielsweise der Fermentationstechnologie in Europa und Japan entscheidende Impulse gegeben. Die Gentechnik ist dagegen eine sehr stark von den USA geprägte Technologie. Seit etwa 1976 gründete eine wachsende Zahl akademischer Kleinunternehmer, zuerst in den USA, mittlerweile auch in Europa und Japan, Venture-Firmen, die in vielen Fällen erfolgreich an der Börse platziert oder an Großunternehmen verkauft werden konnten. In den USA und Europa gab es 2013 etwa 2500 Startup-Unternehmen im Bereich von Biotechnologie, Gentechnik und Bioinformatik.

USA. Die ersten bio- und gentechnologischen Firmen-Gründungen waren die Firmen Cetus (1971), Genentech (1976), Genex (1977), Biogen (1978) und Amgen (1980). Der Firmengründung lagen meist neue, patentrechtlich abgesicherte Methoden zugrunde (z. B. bei Genentech die heterologe Expression von Genen nach dem sog. „Cohen- Boyer-Patent“). Einigen dieser Firmen gelang es, in wenigen Jahren eine große Zahl von Innovationen zu patentieren. So schützte Genentech z. B. die gentechnische Herstellung von Humaninsulin in E. coli (1976), von humanem Faktor VIII (1978) und von humanem TPA in rekombinanten Tierzellen (1980). Lizenzeinnahmen aus diesen Patenten sowie die z. T. auch eigenständige Vermarktung der Produkte führten zu einer erheblichen Zunahme von Umsatz und Börsenwert. 1990 erwarb Roche, Basel, 60 % der Aktien von Genentech für 2,1 Mrd. US-$, wenig später auch die weltweit patentierte PCR-Technologie von Cetus. Seit 2000 war es vor allem der öffentliche Kapitalmarkt, der neue Technologien wie die Immuntherapie, Gentherapie und die Stammzellforschung vorangetrieben hat. Die großen international operierenden PharmaUnternehmen, z. B. Novartis, Roche, Sanofi-Aventis, Glaxo-Smith-Kline, Merck-Sharp & Dohme, Bayer, Monsanto, Dupont usw. betreiben überregional große Entwicklungszentren, um das Potential von Genomanalysen und Gentechnologie für die Entwicklung neuer Wirkstoffe zu nutzen, übernehmen aber auch immer wieder Start-ups, um Produktlinien abzurunden oder vielversprechende Wirkstoffe oder Technologien in einer frühen Phase einzukaufen. Europa. Kam die Entwicklung von Venture-Kapital-Firmen in den meisten kontinentaleuropäischen Ländern nur langsam voran, so gibt es heute in vielen europäischen Ländern eine große Zahl erfolgreich arbeitender Kleinunternehmen, wobei Großbritannien und Deutschland an der Spitze liegen. Bei der Entwicklung neuer Pharma-Wirkstoffe hat Großbritannien mit Abstand die Nase vorn. Auch die Europäische Union unterstützt nachhaltig biotechnologische Forschungsprogramme. Japan. Mit der Privatisierung der japanischen Universitäten hat auch die Zahl von Startups zugenommen. Sie lag 2011 bei 500 (Bio- und Gentechnik). Ferner haben zahlreiche Großunternehmen in das Gebiet der „neuen Biotechnologie“ diversifiziert, wobei allerdings außerhalb der Pharma-Industrie nur wenige Firmen, z. B. Ajinomoto, Takara Bio oder Kirin Beer, rentable neue Geschäftsfelder erobern konnten. China hat die Entwicklung der Biotechnologie massiv vorangetrieben und gehört bei Publikationen und Patentanmeldungen mittlerweile weltweit zur Führungsgruppe (2014). Innovationen und Leistungsvergleich. Die meisten der für die moderne Biotechnologie und die Gentechnik wichtigen Innovationen kommen aus den Industrienationen Europas, aus Japan, vor allem aber aus den USA. Greift man als Indikator die Zahl der Veröffentlichungen auf Kerngebieten wie z. B. der molekularen Genetik heraus, so wird schnell die führende Rolle der USA sichtbar (ca. 40 % aller Veröffentlichungen). Staatliche Programme. Die Biotechnologie wird als „Megatechnologie“ des 21. Jahrhunderts in den meisten Industrieländern und in vielen Schwellenländern durch umfangreiche staatliche Programme gefördert. Dabei spielt die Entwicklung von Kernkompetenzen eine ebenso große Rolle wie die Ausbildung von Nachwuchs, der den Anforderungen dieser QuerschnittsTechnologie aus Biologie, Chemie, Ingenieurs- und Wirtschaftswissenschaften und Informatik

gewachsen ist.

Literatur Für dieses kleine Buch wurde eine sehr große Zahl von Büchern, wissenschaftlichen Reviews und Fachartikeln, “grauer Literatur” und persönlicher Mitteilungen von Fachkollegen ausgewertet. Ich verzichte darauf, in jedem Einzelfall eine Literaturstelle anzugeben. Im Hinblick auf die vermuteten Interessen meiner Leser habe ich statt dessen vorgezogen, eine begrenzte Auswahl weiterführender Literaturzitate anzugeben, die entsprechend der Reihenfolge der Beiträge in diesem Buch geordnet sind. Sie enthalten auch noch Buchangaben der früheren Ausgaben, soweit diese einen besonders guten Überblick zum Stand der Technik etwa um das Jahr 2000 geben. Zusätzlich wurden die folgenden Sammelbände und Review-orientierten Zeitschriften als Literaturquellen besonders bevorzugt: Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, 4th Edition, Wiley Online Library Ullmann‘s Encyclopedia of Industrial Chemistry, 5th Edition, Wiley-VCH Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Springer-Verlag Advances in Biotechnological Processes, Wiley Online Library Applied Microbiology and Biotechnology, Springer-Verlag Biochemical Society Transactions, Portland Press Biotechnology – A Comprehensive Handbook, 2nd Edition, Wiley-VCH Biotechnology and Bioengineering, Wiley Online Library Chemical & Engineering News, American Chemical Society Current Biology, CellPress Current Opinion in Biotechnology, Current Biology Publications Current Opinion in Immunology, Current Biology Publications Current Opinion in Microbiology, Current Biology Publications Current Opinion in Structural Biology, Current Biology Publications Current Opinion in Genetics and Cell Biology, Current Biology Publications Journal of Biotechnology, Elsevier Publishers Nature Biotechnology, Nature Publishing Group

Trends in Biochemical Sciences, Elsevier Publishers Trends in Biotechnology, Elsevier Publishers Trends in Cell Biology, Elsevier Publishers Trends in Microbiology, Elsevier Publishers Das Internet ist eine sehr wertvolle Quelle für wissenschaftliche Informationen geworden. Insbesondere Wikipedia hat sich in den letzten 10 Jahren zu einer oft exzellenten Basis für spezialisierte Informationen auch auf dem Sachgebiet dieses Buchs entwickelt und werden hier auch entsprechend zitiert, in aller Regel in der meist ausführlicheren englischsprachigen Version. Da nicht alle Webseiten so consequent gepflegt werden wie Wikipedia, zitiere ich andere Internet-Quellen nur begrenzt in der Annahme, daß mein Leser/meine Leserin solche Quellen ohnehin zu Rate ziehen.

Allgemeine Lehr- und Handbücher zum Thema (Auswahl) Atkinson, B., Maviura F. (1991) Biochemical Engineering and Biotechnology Handbook, 2nd Edition, Mamillan Publishers, ISBN 1-56159-012-6 Demain, A., Davies J. (1999) Industrial Microbiology and Biotechnology, 2nd ed., ASM Press, ISBN 1-55581-128-0 Walsh, G. (2002) Protein Biotechnology and Biotechnology, John Wiley & Sons, ISBN 9780471899075 Rehm, H. J., Reed, G., Pühler, A., Stadler, P. eds., Biotechnology – A Multi-Volume Comprehensive Treatise, 2nd Edition. Wiley-VCH, ISBN 1-56081-602-3 Brown, T. A. (2010) Gene Cloning and DNA Analysis: An Introduction, 6th edition, Wiley etext, ISBN 9781405181730 Soetaert, W., Vandamme, E. J., Demain, A. L. eds., (2010) Industrial Biotechnology: Sustainable Growth and Economic Success, Wiley VCH, ISBN: 978-3-527-31442-3 Thiemann, W. J., Palladino, M. A., Cummings, B. (2014) Introduction to biotechnology, 3rd ed. Pearson Education, ISBN 9781292027616 1292027614 Sahm, H., Antranikian, G., Stahmann, K. P., Takors, R. eds. (2013) Industrielle Mikrobiologie, Springer Spektrum, ISBN 978-3-8274-3039-7 Renneberg, H., Berkling, V. (2013) Biotechnologie für Einsteiger, 4. Aufl., Springer Spektrum, ISBN 978-8274-3047-2 Renneberg, R. (2008) Biotechnology for Beginners, Academic Press, ISBN 978-0-12373581-2

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Sachverzeichnis A Abbau-Weg ABE-Fermentation Abgas Abluft – biologische Reinigung Abstoßungsreaktion Abwasser Abwasser-Reinigung – aerobe – anaerobe 7-ACA, siehe 7-Aminocephalosporansäure Acarbose Acetobacter – pasteurianus Aceton Acetyl-CoA N-Acetylgalactosamin N-Acetylglucosamin N-Acetylneuraminsäure Achromobacter obae Acidithiobacillus thiooxidans Acidogenese Acinetobacter calcoaceticus ACL-Hydrolase ACL-Racemase Acremonium chrysogenum

Acrylamid – Kartoffelchips Actinobacteria Actinomycin Actinoplanes utahensis Acyclovir N-Acyl-Aminosäure Acylase-Reaktion N-Acyltransferase 7-ADCA, siehe 7-Amino-desacetoxycephalosporansäure Addition – enantioselektive Adenin (A) Adenosin-Desaminase (ADA) Adenosindiphosphat (ADP) Adenosintriphosphat (ATP) Adenovirus Adenylat-Cyclase-Aktivität Adhäsionsprotein Adhesin Adipinsäure Adjuvans ADME (Absorption, Verteilung, Umbau, Exkretion) Adriamycin Adsorptionschromatographie adulte Stammzelle Advantame™ Affinitätschromatographie Aflatoxin Agar

Agar-Hemmtest Agarose-Gel Agrobacterium – rhizogenes – tumefaciens AIDS Airlift-Reaktor Aktionspotential aktives Zentrum Alanin – α-Alanin – β-Alanin Alanin-2,3-aminomutase Alanin-Aminotransferase (GPT) β-Alanin-Weg Alanyl-alanylphosphinothricin Albumin Aldehyd-Dehydrogenase (ALDH) Aldose Algen – eukaryontische – industrielle Gewinnung Alginat Alginsäure alkalische Phosphatase (AP) Alkaloide Alkan – Fettsäure – Verhefung

Alken – asymmetrische Reduktion Alkohol – chiraler – höherer – sekundärer Alkohol-Dehydrogenase (ADH) Alkohol-Oxidation Alkohol-Sensor alkoholfreies Bier alkoholische Gärung alkoholische Getränke Alkylpolyglucoside (APG) Allergie – allergen-arm allosterische Regulation – Aktivierung – genetische – Hemmung – Stoffwechsel alpha (α)-Helix Amid – chirales Amid-Bindung Amidase



Aminierung – reductive D,L-α-Amino-ε-caprolactam (ACL) 7-Amino-desacetoxycephalosporansäure (7-ADCA) 5-Amino-4-imidazolcarboxamid-1-ribosid-5′-phosphat (AICAR) Aminoacylase L-α-Aminoadipinsäure γ-Aminobuttersäure (GABA) 7-Aminocephalosporansäure (7-ACA) S-Aminoethyl-Cystein (AEC) Aminoglykosid Aminoglykosid-Antibiotika – Biosynthese – halbsynthetische – Herstellung – Resistenz – Wirkort δ-Aminolävulinsäure 6-Aminopenicillansäure (6-APA) Aminosäure – Biosynthese – enantiomerenreine – geladene – Herstellung – optisch aktive – polare – proteinogene – unpolare Aminosäure-Antibiotika Aminosäuresequenz

Ammoniumsulfat-Fällung Amorphadien Amoxicillin amphiphil Ampicillin Amplifikationsmarker Amycolatopsis – mediterranei – orientalis Amylase – α-Amylase – β-Amylase – γ-Amylase Amyloglucosidase β-amyloid precursor protein (APP) Amylopektin Amylose Amyris Anabolismus Analytik – enzymatische Anämie – perniziöse Ananas anaplerotische Reaktion Androsta-4-en-3,17-dion (AD) Androstadien-1,4-dien-3,17-dion (ADD) Ang-kak Angiogenese angiotensin-converting enzyme (ACE)

Anilin Anionenaustauscher Anlaufphase anomerer Kohlenstoff Anreicherungskultur Ansamycine Antheridien Anthocyane Anthocyanglykosid Anthracyclin Anti-Interleukin Antibiotika – Angriffsort – Anwendung – aromatische – chelat-bildende – Fermentation – Klassifizierung – Produktion – Screening – Selektivität – Stammverbesserung – Target-Screening – Vorkommen – Wirkungsmechanismus Antibiotika-Resistenz – diagnostische Methode – klinische Aspekte – Mechanismus Antifreeze-Protein

Antikoagulanz Antikoagulation Antikörper – Anwendung – Array – bifunktionelle – Biosynthese – bispezifische – chimäre – Chromatographie – diagnostische – Fluorophor-markierte – Herstellung – humane – humanisierte – Hybride – katalytische – klonale Selektion – monoklonale – polyklonale – rekombinante – single chain – Struktur – therapeutische Antioxidantien Antiporter Antischaummittel Antisense-RNA (asRNA) Antisense-Technik Antithrombin-III (AT-III)

α1-Antitrypsin (αAT) Antitumor-Antibiotika 6-APA, siehe 6-Aminopenicillansäure Apfelsaft Apoptose Aprotinin Aptamer – Herstellung Arabidopsis thaliana Arabinogalactan Arabinogalacturonan Arabinose Archaebakterien (Archaea) Arginin Armagnac Aromen Arrak Artemisia annua Artemisinin Arthritis – rheumatische Ascocarp Ascogonien Ascomyceten – Vermehrungscyclus Ascorbinsäure L-Ascorbinsäure – Synthese Ascosporen Ashbya gossypii

L-Asparagin Asparaginase L-Asparaginsäure – Herstellung Aspartam™ – Synthese Aspartase Aspartat-Aminotransferase (GOT) Aspergillus – flavus – nidulans – niger – oryzae – parasiticus – sojae – tamari – terreus Assoziationstudie – genomweite Astaxanthin Atheriosklerose Atmung Atorvastatin ATP, siehe Adenosintriphosphat ATP-getriebene Punpe Auromonas elodea Autoimmunerkrankung Autoradiographie Auxin Axon

Azithromycin Azospirillum Azotobacter vinelandii

B B-Zelle BAC (bacterial artificial chromosome) BAC-Klonierungsvektor Bacillen Bacillus – alkalophilus – amyloliquefaciens – anthracis – anthrax – cereus – coagulans – licheniformis – megaterium – polymyxa – sphaericus – stearothermophilus – subtilis – thermoproteolyticus – thuringiensis Bacillus-Phage Bacitracin Backhefe (Bäckerhefe, Saccharomyces cerevisiae) – Fermentation – Produktion Backware

Bacteroides Baculoviren Bakterien – aerobe Bedingungen – anaerobe Bedingungen – chemolithotroph – enzymbildende – Gentechnik – Gram-negative – Gram-positive – heterotrophe – phototroph – probiotische – Risikogruppe Bakterien-DNA Bakterien-Genom Bakteriophage Basensequenz Basfia succinoprodugenes Basidiomyceten Basta Batch-Kultur Bedaquilin Belebungsanlage Belüftungsrate Benzol-Derivat Benzol, Toluol, Xylol und Ethylbenzol (BTXE) Bernsteinsäure – Biosynthese beta (β)-Faltblatt

beta (β)-Galactosidase Beta-Lactame, siehe β-Lactam-Antibiotika Bialaphos Bier – Herstellung Bierhefe Bio-Hydrocortison Bio-Nylon Bio-PET Bio-Pharmazeutika – Glykosidmuster Bio-Terephthalsäure Bioalkohol biobleaching biobricks Biochemie biocomputing Biodiesel Bioenergetik Bioenergie Bioethanol Biofilter Biogas Bioinformatik – Funktionsanalyse – Websites Biokatalysator – immmobilisierter Biokatalyse Biokorrosion

Biolaugung Biolistik biologische Membran biologischer Pflanzenschutz biologisches Risiko Biomasse – Zucker Bioökonomie Biopolymer Bioprodukt – Aufarbeitung biopulping Bioraffinerie – holzbasierte Bioreaktor – Mess- und Regeltechnik – Pflanzenzelle – Typ Biorieselbettreaktor (biotrickling filter) Biosensor – elektrochemischer Biosynthese – kombinatorische – precursor-dirigierte Biotechnologie – Entwicklung – internationaler Leistungsvergleich – ökonomische Gesichtspunkte biotechnologische Produkte – Zulassung

Biotensid – Mel-B Biotin Biotin-Streptavidin Biotransformation Biotropfkörper Bioverfahrenstechnik Biowäscher Biowasserstoff Biozönose Blasensäulenreaktor BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)-Analyse Blasticidin S Blastocyste Blau-weiß-Screening Blaualge Blauzungenkrankheit Bleiche – enzymatische Verbesserung Bleomycin Blockmutante Blut Blutbank Bluterkrankheit Blutkörperchen Blutserum Blutzelle Blutzucker

Boden – biologische Reinigung – Sanierung ex situ – Sanierung in situ Bombyx mori Borellia burgdorferi Borscht Botenstoff Botryococcus braunii Branntwein Brauerei Brauhefe – rekombinante Brevibacterium ammoniaenes Breitbandantibiotika BRENDA (Braunschweig Enzyme Database) Bromelain Brot Brustkrebs – familiär bedingter Burkholderia cepacia 1,3-Butadien 1,4-Butandiol 2,3-Butandiol (2,3-BDO) Butanol – 2-Butanol – Biosynthese – i-Butanol Butylcellulose

C C-Quelle – Kohlendioxid – Synthesegas Cadherin Caenorhabditis elegans CAGE (cap analysis of genetic elements)-Methode Calciferol Camembert Candida – albicans – antarctica B – boidinii – bombicola – rugosa – tropicalis – utilis Capsid Carbamoylase Carbapenem-resistente Enterobakterien (CRE) Carbonsäure – chirale Cardiomyozyt κ-Casein Cathepsin Caulimoviren CD4+ T-Zelle CD8+ cytotoxische T-Zelle CDR (complementarity determining regions) Cefaclor

Cefotaxim cell sheet Cellobiose-Lipid Cellulase Cellulomonas Cellulose Cellulose-Fibrillen Centromer Cephalosporin – halbsynthetisches Cephalosporin C Cephalosporin-C-Acylase Cephem Ceramid Cethromycin Chaetomium celluloyticum chain shuffling Chemilumineszenz chemischer Sauerstoffbedarf (CSB) Chemorezeptor Chemostat Chinolon Chitin Chlamydia trachomatis Chloramphenicol Chlorbleiche Chlorella Chlorierung Chlorkohlenwasserstoff (CKW) Chlorophyll a

Chlortetracyclin CHO-Zelle Cholera Cholesterol Cholin-Esterase (CHE) Chorionzotten-Analyse Chorisminsäure Chromatin Chromatin-Histon-Schleife Chromatographie Chromopeptid Chromosom – diploider Chromosomensatz – Metaphase – Nomenklatur chromosome walking Chymosin Cidre Ciprofloxacin Citrat-Cyclus, siehe Citronensäure-Cyclus Citrat-Lyase Citrat/Malat-Antiporter Citrat-Synthase Citronensäure – Biosynthese – technische Herstellung Citronensäure-Cyclus Citrusfrüchte CLA (Gemisch aus cis-9-trans-11- und trans-10-cis-12-Linolensäure) Clarithromycin

clone contig-Verfahren clone fingerprinting-Technik Clostridien-Stämme Clostridium – acetobutylicum – difficile – ljungdahlii – tetani Codon-Nutzung – nicht-kanonische Cofaktor Cognac Colistine Colitis ulcerosa Collagen Concatemer Conolly-Struktur contig Contig-Sequenzierung Cortexolon Corticosteroid Cortison Corynebacterium – ammoniagenes – diphteriae – glutamicum Corynebakterien Corynex®-System Corynomycolat cos-Stelle

Cosmid Crabtree-Effekt CRE, siehe Carbapenem-resistente Enterobakterien Creatin-Kinase (CK) Creatininnase CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9-Nuklease-System Cross-flow-Filtration crossing over Crypthecodinium cohnii Cryptococcus laurentii CSF (colony-stimulating factor) Cupriavidus necator Curvularia lunata Cyanobakterien Cyanocobalamin Cyanophycin cycle sequencing Cycloalkan-Derivat Cyclodextrin Cyclodextrinase Cycloserin CYP Cystein Cystin-Brücke Cystische Fibrose Cytochrom-System Cytokin – therapeutisches Potential Cytokinin Cytosin (C)

Cytostatika cytotoxische Zelle

D Daptomycin Darmflora – Entwicklung über die Lebensstufen Defensine Dehydrodipicolinsäure-Synthase Dehydrogenase Degenerierung Delta (δ)-Aminolävulinsäure Dendrogramm Depsipeptid Desacetoxycephalosporine Designer Bug Desmoteplase Desoxycholsäure Desoxyhexose Destillation Desulfovibrio vulgaris Deuteromycetes Dextran – Biosynthese – Fermentation Dextrin Dextrose Diabetes mellitus Diagnostik Diauxie

Dicarbonsäure DICER Didesoxynucleotide Differentialdiagnose Digitalis lanata Digitalis-Glykoside Digitoxin 1,3-Diglycerid Digoxigenin Dihydrofolat-Reduktase (DHFR) 3,4-Dihydroxy-L-phenylalanin (DOPA) Dikotyledonen Diltiazem 3,3-Dimethylallyl-Pyrophosphat (DMAPP) Dimorphismus Diosgenin Diphterie Diplokokken Disaccharid Disulfidbrücke Diuretika Diversität – Lipase

DNA (Desoxyribonucleinsäure) – Abbau – Aufbau – Charakterisierung – enzymatische Modifikation – Expression, siehe Expression – Funktion – glattes Ende – Größenbestimmung – in vitro Rekombination – Isolierung – klebriges Ende – Klonierung, siehe Klonierung – komplementäre – Methylierung, siehe Methylierung – radioaktive Markierung – Sequenzierung, siehe Sequenzierung – Struktur – superhelikale – Vervielfältigung, siehe auch PCR DNA-Analytik DNA-Array DNA-Barcoding DNA-Biosensor DNA-Chip DNA-Filterassay DNA-Ligase DNA-Methyltransferase DNA-Polymerase DNA-Sequenzierung

DNA-Sonde DNA-Synthese – chemische Festphasen-Synthese – Gen –Genom – Primer DNA-Vakzin DNAse I Docosahexaensäure (DHA) Dodecandicarbonsäure DOPA, siehe 3,4-Dihydroxy-L-phenylalanin Doppelhelix Doppelschicht down stream processing (DSP) Doxorubicin Doxycyclin Drehfilter Drosophila melanogaster Druckerschwärze Druckschlaufen-Reaktor drug design Drüsenzelle Dunaliella salina DuPont Durchmischung – Rührreaktor Dyneflagellaten

E Ecurasäure

EGF-Rezeptor Eicosapentaensäure (EPA) Einzelleröl Einzellerprotein, siehe auch SCP Eisen Eisenspeichererkrankung Eizelle Elastase Elastin Elektrophorese – 2D-PAGE (Polyacrylamid-Gelelektrophorese) – Blutplasma Elektroporation Elektrospray-Massenspektrometrie (ESITOF) elektrostatische Katalyse ELISA (Enzym-Immunoassay) Embryo – transgener Embryonal-Entwicklung – Säugetier embryonale Stammzelle (ES) Embryonen-Kultivierung Embryonenforschung Embryonensplitting Embryotransfer (ET) Emmentaler Emulsan Emulsions-PCR En-Reduktase

Enantiomer – L- und D-Aminosäure enantioselektive Addition enantioselektive Hydrolyse enantioselektive Redoxreaktion Endo-Cellulase Endocytose endokrin Endomycopsis Endomycopsis fibuliger Endopolygalacturonase Endprodukt-Hemmung Endpunktbestimmung Energie Energiebilanz energiereiche Verbindung Energiespeicherstoff Enterobacter

Enzym – Analytik – diagnostisches – DNA-Modifikation – Endpunktbestimmung – Einteilung – enantioselektive Synthese – Fleisch – Gewinnung – Klassifikation – Lebensmittel – regioselektive Synthese – Reinheit – Reporter – Stärkeabbau – Stärkeumwandlung – Süßkraft – Technik – Technologie – Verarbeitungshilfsmittel – Waschmittel – Zulassung Enzym-Elektrode Enzym-Immobilisierung Enzym-Inhibitor Enzym-Membran-Reaktor Enzym-Reaktor Enzym-Substrat-Komplex Enzymaktivität

enzymatische Synthese – enatioselektive – regioselektive enzymatische Transformation enzyme-modified cheese (EMC) Enzymkatalyse – angewandte Enzymkinetik Enzymtechnologie epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) Epigenetik Epithel Epitop Epoxid-Hydrolase Erdöl Erkrankung – monogene – Organerkrankung Ernährung Ertragskoeffizient Erwinia herbicola Erythrocyt Erythromycin Erythromycin A – Biosynthese Erythropoietin (EPO) Erzlaugung – mikrobielle Escherichia blattae Escherichia coli

Escherichia coli K12 – DNA – Insulin Essig Essigsäure – Biosynthese – Fermentation EST (expressed sequence tags) Ester Esterase Estrogene Ethan-1,2-diol Ethanol – aus Biomasse – Bestimmung – Biosynthese Ethen (Ethylen) Etherlipide Ethidiumbromid ethische Fragen – Gentechnik – synthetische Biologie – Teller oder Tank Ethylenglykol Eubakterien Euglena Eukaryot – DNA – Genom – Klonierung von Genen

Eumycetes Evolution – gerichtete exo-Amylase Exon Exonuclease-Aktivität Exopektat-Lyase Exopolygalacturonase Expandase expanded-bed Chromatograpie Explantat exponentielle Phase Expression – Analyse – Vektor für Eukaryoten – Vektor für Prokaryoten Expressionskassette extrazelluläre Matrix extrazelluläre Produkte

F FACS (Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung) FAD Fadenwurm Faktor VIII Faktor IX Faktor Xa β-Faltblatt FANTOM (functional annotation of the mammalian genome) Farbstoff

β-Farnesen Faulturm FDC (2,5-Furandicarbonsäure) fed batch Feldeffekt-Transistor Fermentation – 5′-GMP – 5′-IMP – kontinuierliche – ohne Wasser – Typ Fermentationstechnik – Maßstabsvergrößerung Fermenter Ferritin Festbett-Reaktor – anaerober Feststoff-Fermentation Fette Fettsäure – Alkan Fettsäureethylester Fettsäuremethylester Fibrin Fibrinogen Fibroblast Fibroin Filtration Firmicutes

Fisch – transgener Fischöl FISH (fluorescence in-situ hybridization) Flavonoid Flavonoidglykosid Fleisch – Enzym Flex-Fuel-Motor Fließbettreaktor Fließinjektionsanalyse (FIA) Fluorescein Fluoreszenz Fluoreszenzfarbstoff Fluorochinolone Fluorometrie Fluorophor Flüssig-Fermentation FMN Follikel-stimulierendes Hormon (FSH) Forensik Forstwirtschaft FOSHU (Food of Specified Health Use) FPLC (fast protein liquid chromatography) Fraktionierung – Albumin aus Blut freie Enthalpie Freilandpflanze – transgene Freisetzungsversuch

Fructooligosaccharide (FOS) Fructose D-Fructose Fructosebisphosphat-Weg Fukose Fumarsäure functional genomics Fungi imperfecti funktionelles replacement 2,5-Furandicarbonsäure, siehe FDC Furanose Fusarium venenatum Fusion – DNA-Fragment Futterhefe – Chemie-Rohstoff Futtermittel Fütterungsantibiotika

G GABA (γ-Aminobuttersäure) Galactan Galactit trans-Galactooligosaccharid (GOS) Galactosämie Galactose Galactose-Promotor GAL10 β-Galactosidase D-Galacturonsaure Gallensäure

gamma (γ)-Aminobuttersäure, siehe GABA gap junction Gari Gärtasse Gärung – aerobe – alkoholische Gaucher-Krankheit GC-Gehalt Gebrauchsmuster Gelchromatographie Gelelektrophorese Gellan Geminiviren Gemüse – lactofermentiertes Gen – Abschalten – Identifizierung – Klonierung, siehe Klonierung – Struktur – Synthese Gen-Addition Gen-Chip Gen-Deletion Gen-Insertion Gen-Inversion Gen-Korrektur Gen-Ontologie-Datenbank Gen-Zerstörung

Genbank GenBank Genbibliothek Gendiagnostik Gene Pharming gene shuffling gene silencing gene targeting Genentech-Verfahren Generationszeit Genetik – reverse genetisch veränderter (Mikro-)Organismus (GVO, genetically engineered microorganism, GEM) – Risikobewertung genetische Karte genetische Kartierung genetische Manipulation genetische Verbesserung genetischer Code genetischer Fingerprint genetisches Screening Genexpression – Unterbindung Genkartierung – Chromosom Genkassette Genmarker

Genom – Eukaryot – physikalische Kartierung – Prokaryot – Sequenzierung – Synthese Genom-Annotierung Genomanalyse – Antibiotika genome editing genome walking Genomforschung Genotyping ‚Genschaf ‘ Dolly Gentamicin Gentechnik – Polymerasekettenreaktion, siehe PCR – Sicherheit – Transformation gentechnische Produkte – Zulassung Gentherapie – Akzeptanz – Ethik – Vektor Gentransfer – ex vivo – in vivo Gerben Gerinnungsfaktor

germ plasm Gerste – transgene Gerüstspeicherstoff Geschirrspüler – Enzym Gestagen Gewebe – autologes – Expansion – Matrix-gestützte Regenerierung Gewebe-Plasminogen-Aktivator (tPA) Gewebeersatz GFP (green fluorescent protein) Giemsa-Färbung Glasoberfläche – Immobilisierung Global Ocean Sampling Expedition Glucagon Glucan Glucarsäure Glucoamylase Glucocerebrosid Glucocerebrosidase Gluconeogenese D-Glucono-δ-lacton Gluconoacetobacter xylinus Gluconobacter – oxydans

Gluconsäure – Biosynthese – D-Gluconsäure Glucose – Abbau – Bestimmung – Bioverfahrenstechnik – Glykan – Industrieprodukt – Penicillin-Produktion Glucose-Dehydrogenase Glucose-Elektrode Glucose-Fructose-Sirup Glucose-Isomerase Glucose-Isomerisierung D-Glucose-monohydrat Glucose-Oxidase Glucose-6-phosphat Glucose-6-phospat-Dehydrogenase Glucose-Sirup Glucosid α-Glucosidase α-Glucosidase-Inhibitor Glucuronomannan Glucuronsäure Glufosinat Glutamat L-Glutamin Glutaminase Glutaminsäure

L-Glutaminsäure – Aufarbeitung – Biosynthese – Fermentation Glutaminsäure-Dehydrogenase (GLDH) γ-Glutamyltranspeptidase (γ-GT) Gluten Glycerid Glycerol Glycerol-1,3-oleat-2-palmitat Glycerophospholipid Glycin GlycosBio Glykan Glykobiologie – Analytik Glykogen Glykokonjugat Glykol Glykolipid Glykolipid-Antibiotika N-Glykolylneuraminsäure Glykolyse Glykom Glykopeptid Glykoprotein – Funktion Glykosid Glykosidase glykosidische Bindung

N-glykosidische Bindung Glykosylierung – N-Glykosylierung – O-Glykosylierung Glykosylierungsmuster Glykosylphosphatidylinosit (GPI) Glyoxylat-Cyclus Glyphosat Gonadotropin (HCG) gonadotropin-releasing hormone (GnRH) good manufacturing practice (GMP) GOT, siehe Aspartat-Aminotransferase GPT, siehe Alanin-Aminotransferase Gram-Färbung Gramicidin Gramicidin S – Biosynthese Granulocyt Granulocyten-CSF (G-CSF) Granulocyten-Makrophagen-CSF (GMCSF) Griseofulvin growth hormone (GH) Guanin (G) Guanosin-5′-monophoshat (GMP) guide RNA

H Haematococcus pluvialis Halbacetal Halbketal

Haldenlaugung Hämatokrit Hämoglobin Hämophilie – A – B Hanglaugung Hansenula polymorpha Haploidenkultur Hapten Harnsäure Harnstoff Harzer Käse Haut Haworth-Projektion HCG (Human-Chorion-Gonadotropin) Hefe – alkoholische Getränke – obergärige – Risikogruppe – technische Anwendung – untergärige Hefe-Chromosom Hefegärung Helicobacter pylori α-Helix Hemicellulase Hemicellulose

Hemmung – kompetitive – nicht-kompetitive Hemophilus influenzae Heparin Hepatitis B – Vakzin Herbizid – Resistenz Herbizid-tolerante Pflanze Herpes simplex Herpes simplex-Vektor Herpesviren Herzinfarkt Heterocysten Heterokaryose heterologer Austausch Heterosis Hevea brasiliensis Hexokinase Hexose Hexuronsäure HFS (high fructose syrup) Hinterlegungsstelle Hirudin His-Tag-Chromatographie Histamin Histidin Histon-Acetylierung Histon-Lysin Demethylase (KDM)

Histon-Lysin Methyltransferase (KMT) Histon-Modifikation Hitzeschock-Transformation HIV Hochdruck-Homogenisator Hochdurchsatz-Screening Hochdurchsatz-Sequenzierung (HTS) Hochkonversions-Sirup Hochleistungsstamm Hochmaltose-Sirup Hochzelldichte-Fermentation Hohlfasermembran-Reaktor Holz Homologie-Modellierung Homologie-Sequenz Hormon, siehe auch Botenstoff HTS (high throughput sequencing), siehe Hochdurchsatz-Sequenzierung human cancer genome project human diversity project human genographic project (prähistorischen Wanderzüge des Menschen) human severe combined immunodeficiency (SCID) Human-Genom – Funktionsanalyse humane Stammzellen humane Zellkultur humanes Papillomavirus (HPV) Humanes Wachstumshormon (hGH) – Fermentation Humaninsulin humanisierte Antikörper

Humicola insolens humorale Immunantwort Huntington-Krankheit Hybridisierung – in situ – radioaktive DNA-Sonde Hybridom-Zelle Hybridoma-Technik Hydantoinase Hydrocortison Hydrolase Hydrolyse – enantioselektive (R)-3-Hydroxybuttersäure 3-Hydroxycapronsäure (R)-3-Hydroxyhexansäure Hydroxylierung 4-Hydroxyphenyl-D-Lactat 4-Hydroxyprolin 11α-Hydroxyprogesteron 3-Hydroxypropionsäure (3-HP) 3β-Hydroxysteroid-Dehydrogenase o-Hydroxytyrosin (R)-3-Hydroxyvaleriansäure Hygromycin Hyphe

I ICP-MS (inductively coupled plasma-Massenspektrometrie) IGF, siehe Wachstumsfaktor

IMAC (ion ligand affinity chromatography) Immobilisierung – Chemie – Enzym – Material – Zelle Immun-Affinitätschromatographie Immunanalytik Immunantwort Immunassay Immunglobulin (Ig) Immunisierung – aktive – passive Immunsystem – Hormon – Interaktion Impfung – rekombinante Vaccinia-Viren Imprinting in situ Hybridisierung in vitro Fertilisation (IVF) Indigo Induktion Induktor Industrieproduktion Infektion – DNA-Diagnostik – Krankenhausinfektion Influenzaviren

Inosin-5′-monophoshat (IMP) Insekten-resistente Pflanzen Insulin – Biosynthese – Herstellung – rekombinantes – Struktur Interaktom Interferon (IFN) – α-Interferon – β-Interferon – γ-Interferon – Herstellung – PEGyliertes Interferon-Rezeptor Interleukin – 1 (IL-1) – 2 (IL-2) – 6 (IL-6) – Anwendung – Herstellung interzelluläre Kommunikation intrazelluläre Produkte intrazelluläre Signalubertragung Intron Inulin Invertzucker Inzucht Ionenaustausch-Chromatographie Ionenkanal

iPS (induced pluripotent stem cells)-Technologie IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactosid) Isoamylase Isobutanol isoelektrischer Punkt Isoenzym Isoglucose Isoglucose-Süßstoff Isoleucin Isolierung – DNA Isomalt Isomerase Isomerisierung Isonicotinsäurehydrazid Isopenicillin N Isopeptidbindung Isopren Isoprenoide Isosorbid Isotopomer (Isotopen-Isomer) Itaconsäure

J Joghurt

K Kaffee Kakaobohne Kakaobutter

Kälbermagen Kallus-Kultur Kanamycin Kapillargelelektrophorese Kardiomyozyt Karotte Kartoffelstärke Karyogamie Karyogram Käse – Aroma Kasugamycin Katabolismus Katabolit-Repression katalytische Effizienz katalytische Methode katalytische Triade Kationenaustauscher Kautschuk KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) Kelp Kernpolyedervirus BmNPV Kernresonanzspektroskopie (NMR) Ketogulonicigenium vulgare Ketoreduktase Ketose Keuchhusten 2-KGS-Verfahren Kimchi Kinderlähmung

kinetische Methode Kishk Kläranlage – biologische Klebereiweiß Klebsiella pneumoniae Klenow-Fragment Klon – menschlicher – tierischer Klon-Schaf Dolly Klonen – reproduktives Klonierung – eukaryotisches Gen – PCR – Prokaryot Klonierungsvektor Kluyveromyces – fragilis – lactis – marxianus Knochenmark Knochenzelle knock in knock out Knock out-Maus Knospung Kohlendioxid – Fixierung

Kohlenhydrat Kohlenstoff-Quelle, siehe C-Quelle Koji kombinatorische Biosynthese Kompartiment Kompetenz – Zelle komplementär Konfektionierung Konfiguration L-Konfiguration Konformation Konidien Konidiophoren Konjugation Konsensus-Sequenz konstante Domäne kontinuierliche Fermentation Kontrollfaktor Kopplungsanalyse kovalente Katalyse Krankenhausinfektion Kreuzstromfiltration Kreuzungsexperiment – Genkarte kritische Micell-Konzentration (CMC) Kultivierbarkeit

Kultivierung – Labor – Reinigung der Produkte – Technikum – tierische Zelle Kulturpflanze künstliche Besamung

L Lab lab-on-a-chip Laborautomat Laccase β-Lactam-Antibiotika – Biosynthese – Herstellung – Struktur – Wirkungsmechnismus Lactam-Resistenz Lactase Lactat Lactat-Dehydrogenase (LDH) Lactid Lactit Lactobacillen

Lactobacillus – acidophilus – bifidus – brevis – bulgaricus – casei – defensis – delbrueckii – helveticus – leichmannii – salivarius Lactococcus – lactis lactofermentierter Obstsaft lactofermentiertes Gemüse Lactoferrin δ-Lacton Lactose – Milch Lactose-Intoleranz Lactose-Operon (lac) Lactose-Sirup Lactosepermease Lactulose lacY lacZ lag-Phase Lambda-Phage (λ-Phage) – Bibliothek Laminaria

Landwirtschaft Lanthionin Lantibiotika Laugung – direkte bakterielle – indirekte bakterielle Laurinsäure Leader-Sequenz Lebedev-Prozess Lebensmittel Lebensmittelenzym Lebensmittelzusatzstoff Lederverarbeitung – Enzym Leichtbier leichte Kette Leihmutter Leitenzym Leucin Leucin-Dehydrogenase Leuconostoc – mesenteroides Leukocyt Levulinsäure-Derivat Ligamenvirales Ligand Ligase Ligation Light Cycler™ Lignin

Lignin-Abbau Lignocellulose Lincomycin LINE (long interspersed repetitive elements) Lineweaver-Burk-Darstellung Lipase – Amidierung Lipase-Inhibitor Lipid Lipiddoppelschicht – Transport Lipofektion Lipopeptid Lipoprotein Liposom Liposomenfusion Lipstatin Listeria monocytogenes Lithospermum erythrorhizon lithotrophe Organismen log-Phase Lösemittel-Extraktion Luciferase Lufteintrag Luminometrie Lux Lyase Lymphotoxin Lysin L-Lysin

lysogener Zyklus lytischer Zyklus

M M13-Phage – Infektionscyclus Macerase Macerationstank Macula-Degeneration Maillard-Reaktion maintenance transferase Mais Maische Maisstärke Makrolactam-Antibiotika Makrolid-Antibiotika Makrophage Makrosatellit Malat-Dehydrogenase MALDI-TOF-Massenspektrometrie (matrixassisted laser-desorption-ionization-timeofflight) Maltase Maltit Maltodextrin Maltose Maltotriose Malz Mammut-Schlaufen-Reaktor Mango Maniok

Mannan-Oligosaccharid (MOS) Mannit Mannase Mannose Mannose-6-phosphat-Isomerase Mannosyl-Erythritol-Lipid mapping reagent Marker marker rescue-Verfahren Marker-Protein Marker-Sequenz Masern Massenspektroskopie (MS) – ESI-TOF – ICP-MS – MALDI-TOF-MS Massentierhaltung Maßstabsvergrößerung – Fermentationstechnik master cell bank Mastzelle Maul- und Klauenseuche Mäusestamm MCS (multiple cloning site) Medienoptimierung Medikament – iPS – Stoffwechsel – Wirkung

Medizin – personalisierte Medizintechnik Meeresalge Meerrettich-Peroxidase Mehl Mehlverarbeitung Meiose – Ascomyceten Melanocorpus sp. Melasse Melle-Boinot-Prozess Membran Membran-Protein Membranverfahren Mendelsche Gesetze menschliches Genom Meristem-Kultur messenger RNA (mRNA) Messtechnik metabolic control analysis metabolic engineering metabolic flux analysis Metabolismus, siehe auch Stoffwechsel Metabolit Metabolom metabolomics – Analyse mit NMR metabonomics

Metagenom – Analyse – Diversität Metallionen-Katalyse Metallothionein-Promotor Methan Methanol – Verhefung Methicillin-resistente Staphylococcus aureus (MRSA) D,L-Methionin L-Methionin 2-Methyl-1-propanol (i-Butanol) 5-Methylcytosin Methylierung – Histon Methylomonas clara Methylophilus methylotrophus Methyltransferase 5-Methyluracil MHC (major histocompatibility complex) Micell-Bildung Micelle Michaelis-Menten-Gleichung Michaeliskonstante microbial enhanced oil recovery (MEOR, tertiäre Erdölförderung) Microcystine Micromanospora purpurea Miesmuschel mikrobielle Elektrode mikrobieller Sensor

Mikrobiologie mikrobiologische Sicherheitsvorkehrung Mikrobiom Mikroinjektion Mikrokokken Mikroliter-Maßstab Mikroorganismen – acidophile – alkalophile – Anzucht – autotrophe – Biotransformation – Charakterisierung – chemotrope – DNA-Gehalt – Evolution – extrem thermophile – extremophile – Fermentation – Genomsequenzierung – heterotrophe – hyperthermophile – Isolierung – lithotrophe – mesophile – neutrophile – Oberflächen-Fermentation – organotrophe – psychrophile – Reinkultur

– rekombinante – Risikogruppe – RNA-Gehalt – Sicherheit – Stammhaltung – Stammverbesserung – Taxonomie – thermophile – Wachstumskinetik Mikrosatellit Milch – Enzym – Erzeugung – Lactose-frei Milchpulver Milchsäure – Biosynthese – D-(–)-Milchsäure – Fermentation – L-(+)-Milchsaure Milchsäurebakterien Milchsäuregärung – heterofermentative – homofermentative Milchzucker Militärische Verwendung Mineralöl-Kohlenwasserstoff (MKW) Minisatellit Miso

Mitose – Ascomyceten Modellorganismen molecular imprinting molecular modelling Molke Molmassenbestimmung – DNA Monensin Mono-Natrium-Glutamat (MSG) Monocyt Monod-Gleichung monoklonale Antikörper – Fermentation – Herstellung Monokotyledonen Monosaccharid Morbus Crohn Morbus Gaucher Moromi Mortierella – alpina – isabellina Morula Most MRSA, siehe Methicillin-resistente Staphylococcus aureus MS2 Phage MTHFR (Methylentetrahydrofolat-Reduktase)

Mucor – circinelloides – miehei – pusillus multiple Sklerose Multiplex-Assay multipotente Zelle multipotenter Koloniewachstumsfaktor Multiresistenz Murein Murein-Zellwand Muskelzelle Mutagen Mutagenese – positionsgerichtete Mutante – auxotrophe – katabolische – regulatorische – Temperatur Mutasynthese Mutation Mutiline Mycel Mycobacterium tuberculosis Mycoplasma capriolum Mycorrhiza-Pilze myeloische Zelle myo-Inosit Myosin

Mytilus edulis Myxomycetes

N N-Quelle nachwachsender Rohstoff NAD+ NADH NADP+ NADPH Nährmedien – Selektion Nahrungsmittel Nalidixinsäure Nannochloropsis-Art Nanopore-Methode Natamycin Natto NCE (new chemical entity) Neisseria gonorrhoe-Infektion Neisseria meningitides Neochloris oleoabundans neolithische Revolution Neomycin Neomycin-Phosphotransferase Nephila claviceps Nervenzelle Netilmicin Neurotransmitter next generation sequencing

nick Nikotinamidkofaktor Nitrat Nitril-Hydratase Nitrilase Nitrit NK-Zelle Norovirus Northern Blot nosokomiale Infektion Nuclease Nucleocapsid Nucleosid Nucleosid-Antibiotika Nucleosid-Base Nucleosomen-Kern Nucleotid/Nukleotid Nukleotid-Zucker NutraSweet® Nutrigenomics Nutzpflanze – transgene Nylon 5,6 Nylon 5,12 Nylon 6,6 – Synthese Nylon 6,10 Nystatin

O

Oberflächen-Fermentation (solid state fermentation, SSF) Oberflächenkultur obergärige Hefe Obstsaft – lactofermentierter Ökoeffizienz-Analyse Öle Oligonucleotid Oligonucleotid-(Mikro-)Array Oligosaccharid – präbiotisches Ölsäure omega (ω) 3-Fettsäure oncomouse Ontogenese Operon Opin Ophiostoma piliferum optischer Sensor optischer Test Optode Optrode ORF (open reading frame) Organ Organerkrankung Organismus – DNA – Stoffwechsel eines heterotrophen, aeroben Organismus ori (origin of replication) Orotsäure

Oseltamivir Oxazolidinone Oxazolidone β-Oxidation oxidative Phosphorylierung Oxidoreduktase α-Oxocarbonsäure Oxynitrilase Oxytetracyclin

P P450 P450-Fettsäure-Hydroxylase P450-Monooxygenase Paarungstyp Paecilomyces variotii Palatinit Palmitinsäure 2-Palmitoyl-Monoglycerid Palmöl Panax ginseng Pankreas-Extrakt Papain Papierherstellung – enzymatische Verfahren Papillomaviren Paraffin parakrin parasexueller Cyclus Parkinson

passive Immunisierung Pasteurisieren Patent Patentamt Patentschutz PCR (Polymerasekettenreaktion) – Anwendung – degenerierte Primer (DP) – Einbau von DNA-Abschnitten – Einbau von Funktionselementen – Entfernung von DNA-Abschnitten – Epigenetik – fehlerarme – fehlerhafte – Fusion von DNA-Fragmenten – Methode – Multiplex PDB (Protein Data Bank) Pech PEF-Polyester (Polyethylen-Furan-Polyester) PEGylierung Pekilo-Prozess Pektat-Lyase Pektin Pektin-Esterase Pektin-Lyase Pektinase Penam

Penicillin – Biosynthese – halbsynthetische – Produktion – Wirkungsmechanismus Penicillin G Penicillin N Penicillin V Penicillin-Acylase Penicillin-Amidase Penicillin-Methode Penicillium – camembertii – chrysogenum – citrinum – griseofulvum – notatum Pentosan Pentosephosphat-Weg PEP-Carboxylase Pepsin Peptid Peptid-Antibiotika – cyclische Peptidbindung Perfusions-Kultur Periplasmatischer Raum Peroxidase Peroxidation

PET – Bio-PET Pflanze – Bioreaktor – Genom – Resistenz – erhöhte Stresstoleranz – Expression pflanzen-fremder Stoffe – Kulturpflanze – Modifikation pflanzen-eigener Stoffe – Transformation – transgene – Zelle – Zellkultur – Zellwand Pflanzenpathogene Pflanzenschutzantibiotika Pflanzenzucht Pfu-Polymerase Phage phage display-Technik phage typing Phagen-DNA Pharmakogenomik Pharmaprodukt – Zulassung PHBH (Copolymer aus (R)-3-Hydroxybuttersäure und (R)-3-Hydroxyhexansäure) L-Phenylalanin – Herstellung L-Phenylethylamin

Phenylketonurie Phosphat – radioaktiv-markiertes Phosphatidinsäure Phosphatidylcholin Phosphatidylethanolamin Phosphatidylglycerol Phosphatidylinositol Phosphatidylserin Phosphinothricin Phosphinothricin-Acetyltransferase (PAT) Phosphoenolpyruvat (PEP) Phosphoglycerid Phosphoimager™ Phospholipid Phosphonate Phosphoramidit-Verfahren Phosphorsäure-Ester Phosphorylierung – Histon Photometrie Photoreaktionszentrum Photosynthese phototrophe Organismen Phycobiline Phycoerythrin Phycomyceten Phylogenetik phylogenetischer Stammbaum Phytase

Phytat Phytinsäure Phytohormon Phytophthora infestans Pichia – pastoris – stipitis Piezosensor Pilz – morphologische Merkmale – Oberflächen-Fermentation – Risikogruppe – Stammhaltung Pilz-resistente Pflanze Pimaricin Pitch-Kontrolle plantibody Plasmamembran Plasmid Plasmidvektor Plasmodium falciparum Plasmogamie plug-flow-Reaktor pluripotente Zelle Pocken point of care-Analytik Poly-Adeninsequenz (polyA) Poly-Adenylierungssequenz Polyacrylamidgel – 2D-PAGE

Polyacrylat Polyamid polyaromatischer Kohlenwasserstoff (PAK) Polycarbonat (PC) Polydextrose Polyen-Antibiotika Polyester Polyether-Antibiotika Polyethylen-Furandicarbonsäure (PEF) Polyethylen-Terephtalat (PET) Polyethylenglykol (PEG) Polygalacturonase Polygalacturonsäure Polyhedrin Polyhydroxyalkanoat (PHA) Poly-(R)-3-hydroxybuttersäure (PHA) Polyketid-Antibiotika polyklonale Antikörper Polylactat/Polylactid (PLA) Polymer – Biopolymer – Immobilisierung Polymer-Matrix Polymorphismus Polymycin Polymyxin Polynucleotid-Kinase Polyose Polypeptid Polyploidie

Polysaccharid porcines Wachstumshormon (pGH) Porin posttranslationale Modifikation Potato-Virus Präbiotika – Regulierung Präimplantationsdiagnostik nach künstlicher Befruchtung (PID) Pränatales Screening Präzisionszucht pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) Pregnenolon Primärstruktur Primer – degenerierter – Design – PCR – Sequenzierung – Synthese primer extension Probiotika – Regulierung Produktbildung Produkthemmung Produktivität Produktpatent Progesteron Prokayot – DNA – Genom

Prolin L-Prolin Promotor – Induktion Promotorsequenz 1,2-Propandiol 1,3-Propandiol (1,3-PDO) 1-Propanol 2-Propanol Propionibacterium shermanii Prostaglandin Protease – Casein-spaltende – Inhibitor – Reinigungswirkung Protein – chiraler Pool – design – elektrophoretische Fraktionierung – engineering – Herstellung – in vitro Biosynthese – rekombinantes – Struktur – therapeutisches – zellfreie Synthese Protein A protein engineering cycle protein sequence tag (PST) Protein-Array

Protein-induzierte iPS-Zelle (PiPS) Protein-Mikroarray Proteobacteria Proteoglykan Proteom Proteomanalyse/Proteomics Prothrombin Protopektin Protoplasten-Fusion Protoplasten-Kultur Provirus PRUTEEN™ Pseudomonaden Pseudomonas – aeruginosa – chloraphis – denitrificans – diminuta – putida Pseudozyma hubeiensis SY62 Psoriasis Pullulan Pullulanase Purin-Base Pyranose Pyrimidin-Base Pyrococcus furiosus, siehe auch Pfu-Polymerase Pyrosequenzierung Pyrrolochinolinchinon (PQQ) Pyruvat

Pyruvat-Carboxylase

Q QSAR (quantitative structure-activity relationship) Quartärstruktur Quencher Quorum Sensing

R Radio-Immunassay (RIA) radioaktive Markierung Ralstonia eutropha Ramachandran-Diagramm random coil Rank-Hovis McDougall-Prozess Raps Raum-Zeit-Ausbeute (RZA) real-time PCR-Bestimmung (RT-qPCR) Redoxprozess – enantioselektiver Reduktion – asymmetrische – Ketoreduktase Reduktionsmittel reduktive Aminierung Regeltechnik Reichstein S Reichstein-Grüssner-Verfahren Reinkultur Reinzuchthefe

Reisstärke Reiswein rekombinante Antikörper rekombinantes Protein – Materialkosten RepalysinTM Replika-Plattierung Replikation Reporter-Gen Reporter-Gruppe Repression reproduktives Klonen Resistenz – transgene Pflanzen Resistenzfaktor Resistenzgen 62 Respirationsquotient (RQ) Restriktionsendonuclease (Restriktionsenzym) – DNA-Komplex – glattes Ende – klebriges Ende Reteplase Retrogradation Retroviren – Vermehrungscyclus reverse Genetik reverse Transkriptase (RT) reverse Transkription Reynolds-Zahl Rezeptor

RFLP (Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus) – Vererbung Rhamnogalacturonan α-L-Rhamnose Rhamnose-Lipid rheumatische Arthritis Rhizobium etli Rhizomania-Virus Rhizomucor miehei Rhizopus – nigricans – oligosporus – oryzae Rhodamin Rhodococcus – chloraphae – erythropolis Rhodopsin Rhodosporidium toruloides Rhodotorula glutinis Ribitol Riboflavin Ribonuclease Ribonucleinsäure, siehe RNA Ribose Ribosom Ribozym Ribulose Ricinolsäure Rieselfilm-Reaktor

Rifampicin – Resistenz Rifamycin RNA (Ribonucleinsäure) – doppelsträngige (dsRNA) – enzymatische Hydrolyse – Nachweis RNA-Dendrogramm RNA-induced silencing complex (RISC) RNA-Interferenz RNA-Polymerase RNA-Sonde RNAi (interfering RNA) RNase Roggen Rohrzucker Rohrzucker-Melasse Rohstoff – nachwachsender Rollerflasche Roquefort Rotationstrommel-Fermenter RSV-Infektion (Respiratory Syncytial Virus) RT-PCR Rubella-Virus Rübenzucker-Melasse Rühr-Reaktor – Durchmischung Rum

S Saccharin Saccharomyces Saccharomyces cerevisiae – α1-Antitrypsin (αAT) – humanes Serumalbumin – Reproduktionscyclus Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus Saccharopolyspora erythraea Saccharose Saft-Herstellung Sake Salinispora tropica salmon growth factor (sGH) Salmonella Sarcinen Satelliten-DNA Sättigungskonstante Sättigungsmutagenese Satzfermentation Satzreaktor Sauerkraut Sauermilch Sauerstoffelektrode Sauerstoffübergangskoeffizient Sauerteig Säureamid Säurewecker Saxitoxin SBML (Systems Biology Mark-Up Language)

Schaufelmixer Schaumwein Schaumzerstörer Schistosoma mansoni Schizosaccharomyces pombe Schlammbehandlung Schlammfaulung – anaerobe Schlaufen-Reaktor Schotten-Baumann-Reaktion Schüttelkolben Schutzimpfung Schwefel Schweine-Insulin schwere Kette Scleroglucan SCP (single cell protein) Sebacinsäure Seide Seitenkettenabbau Sekundär-Stoffwechsel Sekundärstruktur Selektion Selektionsmarker SELEX (systematic evolution of ligands exponential enrichment)-Verfahren Sensitivitätsanalyse Sephacryl Sephadex Sepharose Sepharose-Gel

Sequenz Sequenz-Contig Sequenz-Information Sequenzierung – Automatisierung – Epigenetik – Genom – Hochdurchsatz – Maxam-Gilbert – Metagenom – Sanger-Coulson Serin-Protease Serratia marcescens Serumalbumin Sessel-Konformation Sexualhormon Sherwood-Zahl Shotgun-Sequenzierung Shoyu Sichelzellanämie Sicherheit Siderochrome Signalnetzwerk Signalstoff Signaltransport Silage Silicone Simian Virus 40 (SV40) Simulationsstudie SINE (short interspersed repetitive elements)

Sirup Sisomicin β-Sitosterol Skorbut Slurry-Reaktor small interfering RNA (siRNA) SMRT (single-molecule real-time)-Zelle SNP (single nucleotide polymorphism) Soja Sojabohne Sojamehl Sojasauce Somaklonale Variation (SV) Somatotropin Sonde – genspezifische – radioaktiv-markierte Sophorose-Lipid Sorangium cellulosum L-Sorbose Southern Blot spacer Speicherstoff Spermazelle spezifische Wachstumsrate Sphingolipid Spidroine Spinne Spinnenfibroin Spinnerflasche

Spiramycin Spirillen Spironolacton Spirulina Spodopetra Sporangien Sporenbildung Sporolactobacillus laevolacticus Spotter Sprosspilze SSF, siehe Oberflächen-Fermentation Stäbchenbakterien Stammhaltung Stammzell-Forschung Stammzelle – adulte – embryonale (ES) – Gentherapie – iPS Stammzelltherapie Staphylococcus aureus – MRSA Staphylokokken Stärke – enzymatische Hydrolyse – enzymatische Verflüssigung Stärkeabbau – Enzym Starmerella bombicola

Starterkultur – Herstellung Stellhefe Stereoisomer Sterilisation Steroid Steroid-Biotransformation Steroid-Hormon Sterole Steviosid Stickstoff-Quelle, siehe N-Quelle Stigmasterol Stofftransport Stoffwechsel, siehe auch Metabolismus – aerober – anaerober – autonomer (saprophytischer) – autotropher – biotechnologische Bedeutung – heterotropher – Medikament – parasitischer – Regulation Stoffwechselprodukt – sekundäres Stoffwechseltyp – biotechnologische Bedeutung Stoffwechselweg – rekombinierter Streptavidin

Streptococcus – mutans – pyogenes Streptogamine Streptokinase Streptokokken Streptomyces – aureofaciens – aureus – avermitilis – cinnamoensis – coelicolor – fradiae – griseochromogenes – griseus – hygroscopicus – kanamyceticus – kasugaensis – lincolnensis – mobaraensis – orchidaceus – peucetius – rimosus – roseosporus – tenebrarius – toxytricinii – venezuelae – verticillus – viridiochromogenes Streptomyceten

Streptomycin Strömungscharakterisierung Strukturinformation STS (sequence tagged sites) Submerskultur Substanzbibliothek Substrat Substratbilanz Subtilisin Subtilisin Carlsberg Succinat-Folgeprodukt Sucralose Sucrose Sulfat Sulfat-Verfahren Sulfid Sulfit-Ablaugung Sulfit-Verfahren Sumoylierung Supermaus Superovulation Surfactin Suspensionskultur SYBR® Green Symba-Prozess synaptisch Synechocystis sp. Synthase Synthesegas Synthetase

synthetische Biologie – ethische Bedenken synthetisches Oligonukleotid Synthon Systembiologie – deduktiv – induktiv Süßreserve

T T-DNA T-Flasche T-Helferzelle T-Lymphocyt T-Phage – T2 – T4 – T7 T-Zelle T4-DNA-Ligase T7-DNA-Polymerase Tabakmosaikviren Tabakpflanze Tagatose tailing Talg Tamiflu® Tandem-Sequenzwiederholung Taq Polymerase target

Taufliege Taxol Taxus – brevifolia – spp. Tee Teicoplanin Teilungsrate Tempeh Temperaturführung Tenecteplase Terephthalsäure Teripatid terminale Desoxynucleotid-Transferase Tertiärstruktur Teststreifen Tetracyclin Tetraden-Analyse Tetrahydrofuran Tetrahydrolipstatin Textilbehandlung – Enzym Thallus Thermocycler Thermococcus litoralis Thermotoga maritima – Tma-Polymerase Thermus aquaticus, siehe auch Taq-Polymerase Thielavia sp. Thiele-Modul

Thiobacillus – concretivorus – ferrooxidans – thiooxidans – thioparus Thioglykolat L-Threonin Thrombocyt Thrombolyse Thrombolytika Thymidin-Oligomer (PolyT) Thymin (T) Thyroid-stimulierendes Hormon (TSH) Ti (tumor inducing)-Plasmid Tier – geklontes – transgenes Tierfutter – Enzym tierische Zelle – Kultivierung Tierzucht – biotechnologische Methode – konventionelle Methode Tigecyclin tissue engineering tissue flask tissue plasminogen activator (tPA), siehe Gewebe-Plasminogen-Aktivator Tma-Polymerase TNF-α

TNT, siehe Trinitrotoluol Tobramycin Tofu Togaviren Tolypocladium inflatum Topoisomerase TOPRINA Torulopsis totipotente Zelle Toxin Toxoplasma sp. Trametes versicolor Transferase Transformation – nicht-biologische Methode transgene Maus transgene Pflanzen – Freisetzung – Methoden – Monokotyledonen – Resistenz – Wertstoff transgene Tiere – Freisetzung transgener Embryo Transglutaminase Transkription Transkriptions-Analyse Transkriptions-Terminationssequenz Translation

Transmembranprotein Transplantation – autologe Traubensaft Trehalose-Lipid Treponema pallidum Tricarbonsäure-Cyclus Trichoderma – reesei Triglycerid Trinitrotoluol (TNT) – anaerob-aerober Abbau – Humifizierung Triolein Triplett Trisomie Trockenbackhefe Tropfkörper-Verfahren Troponin T Trypanosoma sp. Tryptophan Tuberkulose Tumor Tumornekrosefaktor (TNF) – TNFα – TNFβ Turbidostat Turmbiologie Turmfermenter Typhus

Tyrosin L-Tyrosin

U Übergangsphase Ubiquitinylierung UDP-Glucuronosyltransferase (UGT1A1) Ultrafiltration Umbellularia california Umkehrosmose untergärige Hefe Uranlaugung Uridindiphosphat-Glucose (UDP-Glucose) Urokinase Ursodesoxycholsäure Ustilago maydis

V Vaccinia-Viren Vakuum-Drehfilter Vakzin – essbares – Fermentation – Herstellung – rekombinantes Valin L-Valin Valinomycin Van Deemter-Gleichung Vancomycin

Vanilla planifolia variable Domäne VEGF (vaskularer endothelialer Wachstumsfaktor) Vektor Verarbeitungshilfsmittel – Enzym Verdopplungszeit Verdünnungsausstrich Verdünnungsrate Vererbung – RFLP Verfahrenspatent Verrottungsprozess Verzuckerung – enzymatische Vesikel Vibrio cholerae Vibrionen Virginiamycin Virus – attentuiertes – DNA-Viren – Gentechnik – Pflanzen – RNA-Viren – Tier Virus-resistente Pflanze Virus-Vakzin Virusinfektion Viruspartikel

Vitamin – B2 – B12 – C – D – D3 – E Vitis vinifera VNTR (variable number of tandem repeats) VOC (volatile organic compound) Vogelgrippe-Virus (Influenza-A-Virus Typ H5N1) Vollacetal Von Willebrand Faktor (vWF) Von Willebrand Krankheit

W Wachstum Wachstumsfaktor – insulinartiger (IGF) – Isolierung – therapeutisches Potential Wachstumshormon Wachstumskinetik – einzellige Mikroorganismen – mycelbildende Mikroorganismen Wannen-Konformation Wärmeübergangszahl Waschmittel – Enzym Wasserstoff-Donator

Wasserstoffbrücke Waterloo-Prozess Wechselzahl Wein Weißfäulepilz Weizen Weizenstärke Western Blot Westphalia-Dekanter Whisky Wirbelschicht-Reaktor Wirkstoff-Design – rationales Wirkstoff-Screening Wodka Wundstarrkrampf Wurst

X X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid) Xanthan – Fermentation Xanthin-5′-monophoshat (XMP) Xanthomonas campestris Xenical® Xenobiotika Xenotransplantation Xylan Xylan-Abbau Xylanase

Xylase p-Xylen Xylit Xylitol Xyloglucan Xylooligosaccharid (XOS) Xylose Xylulose

Y YAC (yeast artificial chromosome) Yarrowia lipolytica YEP (yeast expression plasmid) YIP (yeast integrating plasmid) YRP (yeast replicating plasmid)

Z Zell-Differenzierung Zell-Zell-Kanal Zellbausteine Zellbiologie Zelle – dendritische – endokrine – Einführung von DNA – Kultivierung – myeloische – pluripotente – tierische – totipotente

zellfreie Proteinsynthese Zellkultur – 3D – Pflanzen Zelllinie Zelllyse Zellmasse Zellreaktor Zellstoffherstellung – enzymatische Verfahren Zelltherapie Zelltyp – Blutbildung – Immunantwort Zellwand – Gram-negative – Gram-positive Zellzement Zentrifugation Ziege – transgene Zitronensäure-Zyklus, siehe Citronensäure-Cyclus Zona pellucida Züchtung

Zucker – aktivierte – Biomasse – Citronensäure – D-Zucker – Enzym – L-Zucker Zuckeraustauschstoff Zuckerkrankheit Zuckerphosphate Zuckerrohr Zuckerrübe Zuckersäure Zulassung – bio- und gentechnische Produkte – Enzym – Kriterium – Pharmaprodukt Zulaufverfahren – L-Glutamat Zuschlagstoff Zwilling – homozygotischer – monozygotischer Zyklussteuerung Zymomonas mobilis

Bildquellen Material aus den folgenden Arbeiten inspirierte einige der Abbildungen in diesem Buch: S. 3: Renneberg, R., (1990). Biohorizonte Urania Publisher, ISBN 3-332-00320-8 S. 7, 11, 13, 15, 17: Black, J. (1999). Microbiology – principles and explorations Prentice Hall, ISBN 0-13-920711-2 S. 23, 121: Schlegel, H. G. (1992). Allgemeine Mikrobiologie Thieme Publisher, ISBN 3-13444607-3 S. 37, 319: Stephanopoulos, G. N. et al. (1998). Metabolic Engineering – principles and Methodologies Academic Press, ISBN 0-12-666260-6 S. 39, 41, 51: Knippers, R. (2001). Molekulare Genetik Thieme Publishers, ISBN 3-13477008-3 S. 55, 61: Brown, T. (1996) Gentechnologie für Einsteiger Spektrum Akademischer Verlag, ISBN 3-8274-0059-7 S. 65: Life Technologies: Genome Editing With Engineered Nucleases, Poster S. 71, 73, 297, 301: Brown, T. A. (1999). Genomes John Wiley Sons, ISBN 1-85996-201-7 (S. 73: the genetic map of Drosophila is from Arthur Sturtevant) (S. 297: data from the following publications have been used: Oliver et al. (1992). Nature 357, 38 San Miguel et al. (1996). Science 274, 765 Blattner et al. (1997). Science 277, 1453) S. 75: Global Ocean Sampling Expedition: http://www.jcvi.org/cms/research/projects/gos/overview S. 81, 237: Janeway, C., Travers, P. (1997) Immunobiology, Current Biology Publisher, ISBN 0-443-05964-0 S. 103: Buchholz, K., Kasche, V. (1997). Biokatalysatoren und Enzymtechnologie, VCH Publishers, ISBN 3-527-2831-7 S. 119: Ottman, N., Smidt, H., de Vos, W. M., Belzer, C. (2012). The function of our microbiota: who is out there and what do they do? Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, 2, 104. S. 123: Präve, P. et al. (1994). Handbuch der Biotechnologie, R. Oldenbourg Publisher, ISBN 3-486-26223-8 S. 157: Heslot, H., Biochemie (1998). 80, 19 S. 169: Faber, K. (2000). Biotransformations in Organic Chemistry, Springer Publisher, ISBN 3-540-66334-7 S. 183, 187, 191, 195: Uhlig, H., Enzyme arbeiten für uns (1991). Hanser Publisher, ISBN 3-

446-15702-6 S. 204: die Landkarte zu MRSA stammt von: ECDC/EARS-Net: Proportion of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) Isolates in Participating Countries in 2012. In: Antimicrobial resistance interactive database (EARS-Net) für das Europäisches Zentrum für die Prävention und die Kontrolle von Krankheiten. European Centre for Disease Prevention and Control (ECDC), 2012, abgerufen am 29. Mai 2014. S 229: Tuddenheim, E. G. D. (1997). in Molecular Biology in Medicine, Cox, T. M., Sinclair, J. (ed.). Blackwell Science Publisher, ISBN 0-632-02785-1 S 231: Bode, W., Renatur, H. (1997). Current Opinions in Structural Biology 6, 865 S 241: Mange, E. J., Mange, A. P. (1992). Basic Human Genetics Sinauer Associates, ISBN 0-87893-495-2 S. 269, 273: Schenkel, J. (1995). Transgene Tiere, Spektrum Akademischer Verlag, ISBN 386025-269-0 S. 303, 317: Primrose, S. B. (1966). Genomanalyse, Spektrum Akademischer Verlag, ISBN 3– 8274–0116-X S 309: Thude, S., Fraunhofer Institute for Bioprocess and Membrane Technology, Stuttgart, personal communication S. 315: Lottspeich (1999). Angewandte Chemie Int. Ed. 38, 2476 S. 327: KEGG-generierter Stoffwechsel: http://www.genome.jp/kegg-bin/show_pathway? map00020 S. 329: Die Landkarte zum Rohstoffhandel wurde nachgezeichnet aus dem World Forum Bioeconomy Report 2010 http://www3.weforum.org/docs/WEF_FutureIndustrialBiorefineries_Report_2010.pdf S. 331: Ökoeffizienz Indigo: Schulte, D. (2000). Nachr. aus der Chemie 626 Genehmigungen zum Abdruck wurden eingeholt für die folgenden Abbildungen: S. 17: Black, J. (1999). Microbiology – principles and explorations, Prentice Hall, ISBN 013-920 711-2 S. 19: Scenedesmus-Algen: Qingdao Institute for BioEnergy and Bioprocess Technology, VR China S. 19: Dunaliella-Algen: Cognis – BASF Australia S. 19: Neochloris abundans: Sapphire Co., USA S. 99: Atkinson, B. et al., Biochemical Engineering and Biotechnology Handbook (1992), p. 459, plate C S. 67 Epigenetics of homozygous twins, Abb. von Zachary A. Kaminsky, Science Watch, http://sciencewatch.com/dr/erf/2010/10-augerf/10augerfKami/

S. 163: Mortierella alpinea: Kyoto University, http://www.kyotou.ac.jp/en/research/forefronts/archives/shimizu.html S. 175: Waschmittel-Prills: aus dem Archiv des Autors S. 239: CSIRO, Clayton, Australia, cited from Science 281, p 511 (1998) S. 241: Cox, T. et al., Molecular Biology in Medicine, plate 25 (1997) S. 271: Nature 300 (5893) (1982) Titelbild, Macmillan Magazines Ltd. S. 283: Büchting, A. J., Biologie in unserer Zeit 28, p 16 (1998) S. 283: Krczal, G., Transgene Pflanzen in der landwirtschaftlichen Produktion, Nachr Chem Tech Lab 45, p 867 (1997) S. 285: Susan Colburn/Monsanto, cited from Science 282, p 2178 (1998) S. 285: Sainsbury Tomatenpuree-Dose http://www.ncbe.reading.ac.uk/ncbe/gmfood/tomato.html S. 307: Fotos iPS-Zellen: https://www.reprocell.com/en/reprocardio/product-list/cardio2/ S. 331: Cargill Biorefinery Blair: http://greenchemicalsblog.blogspot.de/2009_03_01_archive.html Aus Wikipedia-Artikeln wurden folgende Abbildungen verwendet

S. 15: Hefen http://de.wikipedia.org/wiki/ Hefen http://img2.wikia.nocookie.net/__cb20130326194932/getyourscienceon/images/e/e5/Saccharomycescerevisiae.jpg S. 19: Spirulina: http://de.wikipedia.org/wiki/Spirulina Euglena: http://en.wikipedia.org/wiki/Euglena Botryococcus: http://en.wikipedia.org/wiki/Botryococcus Chlorella: http://de.wikipedia.org/wiki/Chlorella S. 31: Abb. Katalytische Triade: http://en.wikipedia.org/wiki/Catalytic_triad, modifiziert S. 35: Liposom: http://en.wikipedia.org/wiki/Lipid_bilayer S. 41: Elektronenmikroskopie: Knippers, R. (2006) Molekulare Genetik 9. Aufl., ThiemeVerlag S. 47: Restriktionsenzym ausProtein Databank, http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do S. 67: Foto Agouti mice: http://en.wikipedia.org/wiki/Randy_Jirtle S. 163: Kakaopflanze http://en.wikipedia.org/wiki/Cocoa_bean S. 163: Kakaobutter http://en.wikipedia.org/wiki/Cocoa_butter Die Strukturmodelle auf Seiten 29, 43, 47, 67, 175, 211, 223, 225, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241 stammen aus der Protein Databank, http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do Trotz sorgfältiger Recherchen ist es denkbar, daß nicht alle Eigentümer von Druckrechten

identifiziert werden konnten. Sollte dem Verlag gegenüber der Nachweis der Rechtinhaberschaft geführt werden, wird die bei wissenschaftlichen Verlagen übliche Vergütung gezahlt.

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