Acta Biotechnologica: Volume 6, Number 4 [Reprint 2021 ed.] 9783112581506, 9783112581490

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Volume 6 • 1986 • Number 4

Journal of microbial, biochemical and bioanalogous technology

Akademie-Verlag Berlin ISSN 0138-4988 Acta Biotechnol., Berlin 6 (1986) U, 311-382

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Acta Blotednloiia Journal of microbial, biochemical and bioanalogous technology

Edited by the Institute of Biotechnology of the Academy of Sciences of the G.D.R.; Leipzig and by the Kombinat of Chemical Plant Construction Leipzig — Grimma

M. Ringpfeil, Leipzig and G. Vetterlein, Leipzig

Editorial Board: P. Moschinski, Lodz A. Moser, Graz M. D. Nicu, Bucharest Chr. Panajotov, Sofia L. I). Phai, Hanoi H. Sahm, Jülich W. Scheler, Berlin R. Schulze, K o t h e n B. Sikyta, Prague G. K . Skrjabin, Moscow M. A. Urrutia, H a b a n a J . E. Zajic, El Paso

1986

A. A. Bajev, Moscow M. E. Beker, Riga H. W. Blanch, Berkeley S. Fukui, Kyoto H. G. Gyllenberg, Helsinki G. Hamer, Zurich J . Hollo, Budapest M. V. Iwanow, Moscow F. Jung, Berlin H. W. I). Katinger, Vienna K . A. Kalunjanz, Moscow J . M. Lebeault, Compiegne I). Meyer, Leipzig

Number 4

Managing Editor:

L. Dimter, Leipzig

Volume 6

A K A I) E M I E - V E R L A G

B E R L I N

"Acta Biotechnologica" publishes original papers, short communications, reports and reviews from the whole field of biotechnology. The journal is to promote the establishment of biotechnology as a new and integrated scientific field. The field of biotechnology covers microbial technology, biochemical technology and the technology of synthesizing and applying bioanalogous reaction systems. The technological character of the journal is guaranteed by the fact that papers on microbiology, biochemistry, chemistry and physics must clearly have technological relevance. Terms of subscription for the journal "Acta Biotechnologica" Orders can be sent — in the GDR: to Postzeitungsvertrieb or to the Akademie-Verlag Berlin, Leipziger Str. 3 - 4 , P F 1233, Berlin, 1086 D D R ; — in the other socialist countries: to a book-shop for foreign languages literature or to the competent news-distributing agency; — in the FRG and Berlin (West): to a book-shop or to the wholesale distributing agency Kunst und Wissen, Erich Bieber OHG, Wilhelmstr. 4—6, D-7000 Stuttgart 1; — in the other Western European countries: to Kunst und Wissen, Erich Bieber GmbH, General Wille-Str. 4, CH-8002 Zürich; — in other countries: to the international book- and journal-selling trade, to Buchexport, Volkseigener Außenhandelsbetrieb der DDR, P F 160, Leipzig, 7010 DDR, or to the Akademie-Verlag Berlin, Leipziger Str. 3 - 4 , P F 1233, Berlin, 1086 DDR. Acta Biotechnologica Herausgeber: Institut für Biotechnologie der AdW Permoserstr. 15, Leipzig, 7050 DDR (Direktor: Prof. Dr. sc. Manfred Ringpfeil) und VEB Chemieanlagenbaukombinat Leipzig—Grimma, Bahnhofstr. 3 - 5 , Grimma, 7240 DDR (Generaldirektor: Obering. G. Wohllebe). Verlag: Akademie-Verlag Berlin, Leipziger Straße 3 —4, P F 1233, Berlin, 1086 D D R ; Fernruf: 2236201 und 2236229; Telex-Nr.: 114420; Bank: Staatsbank der DDR, Berlin, Konto-Nr.: 6836-26-20712. Redaktion: Dr. Lothar Dimter (Chefredakteur), Käthe Geyler (Redakteur), Permoserstr. 15, Leipzig, 7050 D D R ; Tel.: 2392255. Veröffentlicht unter der Lizenznummer 1671 des Presseamtes beim Vorsitzenden des Ministerrates der Deutschen Demokratischen Republik. Gesamtherstellung: VEB Druckhaus „Maxim Gorki", Altenburg, 7400 DDR. Erscheinungsweise: Die Zeitschrift „Acta Biotechnologica" erscheint jährlich in einem Band mit 4 Heften. Bezugspreis eines Bandes 120,— DM zuzüglich Versandspesen; Preis je Heft 30,— DM. Der gültige Jahresbezugspreis für die DDR ist der Postzeitungsliste zu entnehmen. Bestellnummer dieses Heftes: 1094/6/4. Urheberrecht: Alle Rechte vorbehalten, insbesondere der Übersetzung. Kein Teil dieser Zeitschrift darf in irgendeiner Form — durch Photokopie, Mikrofilm oder irgendein anderes Verfahren — ohne schriftliche Genehmigung des Verlages reproduziert werden. — All rights reserved (including those of translation into foreign languages). No part of this issue may be reproduced in any form, by photoprint, microfilm or any other means, without written permission from the publishers. © 1986 by Akademie-Verlag Berlin. Printed in the German Democratic Republic. AN (EDV) 42133 03000

3

Contents of Volume 6 (1986) Number 1. 1986 SCHÖNHERR, M . ; GRUNOW, R . ; VETTERLEIN, G . : A R e v i e w of t h e S e c o n d S y m p o s i u m G . D . R .

—U.S.S.R. Genetic Engineering in Biotechnology (in German) A b s t r a c t s of t h e Second Symposium G.D.R. — U.S.S.R. Genetic Engineering in Biotechnology (in German) . . . : i P Ö H L A N D , D . : Second Heiligenstadt Colloquium "Scientific E q u i p m e n t s for Biotechnology" (in German) L E N B U R Y , Y . ; S T E P P A N , J . J . ; P A R K , D . - H . ; T A N N E R , R . D . : Modelling Oscillatory Behavior in B a t c h F e r m e n t a t i o n s B E C K E R , U . ; R I C H T E R , K . ; N I C K E L , A . : Influence of t h e Process P a r a m e t e r s on E t h a n o l Yield in B a t c h Processes using Saccharomyces cerevisiae Strain (in German) BLUMBERGS, E . : Biological Method for E t h a n o l D e t e r m i n a t i o n STOTTMEISTER, U . : Investigations of Oxygen Diffusion in Aqueous Solutions of X a n t h a n (in German) K A F A R O V , V . V . ; V I N A R O V , A. J . ; G O R D E E V , L. S.; S E M E N O V A , E. A.: E x p e r i m e n t a l Investig a t i o n , Modelling a n d Optimal Calculation of a Multistage Tower F e r m e n t e r . I I . E x p e r i m e n t a l D e t e r m i n a t i o n of P a r a m e t e r s a n d Coefficients of t h e Mathematical Model (in German) . . MANSFELD, J . ; SCHELLENBERGER, A.: Investigations of T h e r m a l Stability of Immobilized I n v e r t a s e (in German) KVESITADZE, G . ; KVACHADZE, L . ; ALEKSIDZE, T . ; CHARTISHVILI, D . A . : E x o g e n o u s

3 6 43 45 55 63 69

77 89

Cellu-

lases of Thermophilic Micromycetes. I. Selection of Producers

101

Number 2. 1986 B . ; PAVLASOVA, Industry Environment

SIKYTA,

E.;

STEJSKALOVÄ, E . :

Biotechnology: Health Care, Agriculture,

109 Purification a n d Characterization of two Extracellular /i-Glucosiviride ITCC 1433 115

W I L H E L M , M . ; SAHM, H . :

dases f r o m Trichoderma

BABURIN, L . A . ; SHVINKA, J . E . ; RUKLISHA, M . P . ; VIESTURS, U . E . : G a s B a l a n c e

Method

for Testing of Microbial Growth Efficiency a f t e r Carbon S u b s t r a t e Pulse B Ü T T N E R , R . ; U E B E L , B . ; G E N Z , I . : The S u b s t r a t e - L i m i t e d p H - A u x o s t a t — A New Method f o r t h e Continuous Cultivation (in German) B E C K M A N N , D . ; M E T Z E , J . : A New System of Gassing-Incubation Cabinets (in German) . . MIRONOWICZ, A . ; SIEWINSKI, A.: Biotransformations. X I X . Reduction of Some Terpenic K e t o n e s b y m e a n s of Immobilized Cells of Rhodotorula mucilaginosa B E H A L O V X , B . ; B E R A N , K . : Autolysis of Disintegrated Cells of t h e Yeast Saccharomyces cerevisiae P A S C Z Y N S K I , A . ; R O G A L S K I , J . ; SZCZODRAK, J . ; DAVIDOWTCZ, A . : Xylan-Containing S u p p o r t s Used t o Separate Xylanase from t h e Cellulases of Aspergillus terreus F-413 K A L R A , M . K . ; S A N D H U , D . K . : Optimal Production of Cellulolytic Enzymes and their Location in Trichoderma pseudokoningii K R A M K O W S K A , A . ; F E S N A K , D . ; K O R N A C K I , K . ; BATTMANN, B . : P r o d u c t i o n , Characterization a n d Use of E x p e n d a b l e K e f i r S t a r t e r Culture in t h e K e f i r P r o d u c t i o n Process MINKEVICH, I. G. : The E f f e c t of A u t o m a t i c p H Maintenance on S t e a d y S t a t e Cultivation Regimes a n d Their Stability. A Theoretical S t u d y of t h e Case of a P e r f e c t p H Controller a n d P e r f e c t Stirring MOHR, K . - H . : Mechanisms of t h e W a t e r T r a n s p o r t in Cereal Kernel (in German) S A T T L E R , K . ; B A B E L , W . : Ensiling b y Aerobic Acidification — A Paradoxial I d e a or a Practical Answer (in German)

123 129 133

141 147 153 161 167

175 189 201

Number 3. 1986 Y E E , V . ; W E L L I N G T O N , G . H . ; O L E K , A . ; STEINKRATTS, K . H . : P r o d u c t i o n of a W h i t e Wine a n d a Protein-Rich Soy Flour b y Yeast F e r m e n t a t i o n of Soybean Slurry, Soybean Milk a n d t h e W h e y f r o m Tofu P r o d u c t i o n 209

4

Contents of Volume 6

BABEL, W.: Some Theoretical Considerations on Overflow Production of Metabolites . . . L E R C H E , K . - H . ; K R E T Z S C H M A R , G.: The Particle Electrophoretic Characterization of t h e Surface Properties of Alkane-Utilizing Yeast Cells: The Chemical Composition and t h e Adsorption of Tensides (in German) P U H A K K A , J . ; T U O V I N E N , 0 . H . : Microbiological Solubilization of Metals from Complex Sulfide Ore Material in Aerated Column Reactors R I C H T E R , K . : Inhibitory Effects of Ethanol in Alcoholic Fermentation K Y B A L , J . ; S I K Y T A , B . : Renaissance of t h e Surface Culture: Production of Ergot Alcaloides and Production of Spores (in German)

215 221 233 239

245

RODRIGUEZ, J . A . ; BECHSTEDT, W . ; ECHEVARRIA, J . ; SIERRA, N . ; DELGADO, G . ; DANIEL, A . ;

MARTINEZ, 0 . : Optimization of Solid-State Fermentation of Citrus Dried Peel by Aspergillus niger in a Packed Bed Column S C H U L Z , G.; H I R T E , W . ; J A C O P I A N , V . ; P H I L I P P , B . : Sorption of Cellulase t o W h e a t Straw and its Components (in German) K I R S T E I N , D.; K Ü H N , M.; S C H U B E R T , F . ; M O H R , P . ; S C H E L L E R , F . : Immobilized Glucose Dehydrogenase for Cofactor Regeneration in Heme-Catalyzed Demethylation and Hydroxylation Reactions HUBER, J . ; WEISBACH, F . : The Production of L-Lysine Decarboxylase from Klebsiella pneumoniae (in German) WORBS, M.; VOIGT, B.: Preparation of Ubichinone-10 from Acetobacter methanolicus I M E T B 346 (in German) R O S T O V , V.; P O P O V , B . ; P O P O V A , L . ; K E H L I B A R O V A , L . ; B O R I S O V A , I . : Assimilation of Animal F a t s by Yeasts and Synthesis of Protein by Continuous Cultivation in a Complex Nutrient Medium A B E L , H . ; S T O L L E Y , P . ; D R E Y E R , G . ; W A L T H E R , I . ; J U N G E , C . : Hybridoma Cells P r o d u c e d by Electrofusion in a Homogeneous Electric Field ARORA, D. S.; SANDHU, D. K . : Degradation of Lignocellulosic Residues by Polyporus versicolor and t h e Effect of Moisture Contents and Phenolic Compounds I W U A G W U , Y . 0 . U . ; I Z U A G B E , Y . S . : Evaluation of Nigerian Millet (Pennisetum typhoideum) as a Raw Material for Beer Production BABEL, W.: Increase and Limits of Growth Yields for Heterotrophic Microorganisms . .

253 259 265 273 277 281 287 293 299 305

Number 4. 1986 B A B E L , W . : Theoretical F u n d a m e n t a l s of t h e Auxiliar Substrate Concept and its Practical Conclusions for Biotechnological Processes (in German) P R O K O P E N K O , V . D.; V I E S T U R S , U . E . : Development of t h e Design of F e r m e n t e r s with Energy Introduced by Aerating Gas, Having Contacting Devices G W E N N E R , Chr.; W I T T I G , H . ; GLOMBITZA, F . : Enrichment of Cadmium in Biomasses (in German) PUHAKKA, J . ; TUOVINEN, O. H . : Biological Leaching of Sulfide Minerals with t h e Use of Shake Flask, Aerated Column, Air-Lift Reactor, and Percolation Techniques K E R N S , G.; D A L C H O W , E . ; K L A P P A C H , G.; M E Y E R , D . : Formation a n d Release of /?-Glucosidase b y Aspergillus niger ZIMET 43746 in Correlation to Process Operations

313 325 339 345 355

KVESITADZE, G . ; GOGILASHVILI, L . ; SVANIDZE, R . ; BUACHIDZE, T . ; CHIRGADZE, L . ; NIZHA-

RADZE, D.: Exogenous Cellulases of Thermophilic Micromycetes. I I . Thermostability of Enzyme Preparations 361 K L Y O S O V , A. A.; K U D E , J . ; G O L D S T E I N , G . Ch.; M E Y E R , D . : Role of t h e Components of t h e Cellulase Complex on Hydrolysis of Insoluble Cellulose (in German) 369

Acta Biotechnologica is indexed in Current Contents/ET & A T ; Chemical A b s t r a c t ; Biotechnology Abstracts; Excerpta Medica

Acta Biotechnol. 6 (1986) 4, 3 1 3 - 3 2 3

Theoretische Grundlagen des Auxiliarsubstratkonzeptes und seine praktischen Konsequenzen in biotechnischen Prozessen BABEL,

W.

Akademie der Wissenschaften der DDR Institut für Biotechnologie, Leipzig Permoserstraße 15, Leipzig, 7050 DDR

Summary Raw materials for microbial synthesis of single cell protein and metabolites are chemo-heterotrophic substrates. The growth and product yields are economically very important parameters. Therefore it is necessary to look for methods to optimize these biotechnological processes, i. e. to increase these values up to the theoretically possible limits. In the SCP production the growth yield is determined energetically and in the overflow production the yield is influenced by the amount of biologically useful energy which is produced during the product synthesis. It is demonstrated that the auxiliary substrate concept is appropriate to improving the yield both for SCP- und product synthesis. In the SCP synthesis two (or more than two) substrates must be mixed that way that the biologically useful energy, which is generated along the way from substrates to a central precusor for the cell substance synthesis, becomes a maximum thus no further substrate need to be oxidized merely for the purpose of energy generation. By using a substrate, which operates only as an energy donor in the mixture the carbon metabolism determined upper limit of the carbon conversion efficiency can be attained. For with the overflow production of metabolites the biologically useful energy seems to be responsible for the discrepancy between the metabolism-determined product yield and the experimentally obtained one, the energy liberated during the production of primary metabolites must be kept low. This might be reached by using substrate mixtures. Furthermore it is shown that in this way the specific production rate can be improved as well. SCP-Synthese Chemo-organoheterotrophe Substrate sind solche, die Kohlenstoff- und Energiequelle zugleich sind. Da die biologisch nutzbare Energie im wesentlichen durch die Oxidation von Wasserstoff gewonnen wird, handelt es sich folglich um Kohlenstoff-Verbindungen, die mehr oder weniger stark reduziert sind. Das am stärksten reduzierte Substrat ist Methan und die am stärksten oxidierte heterotrophe Verbindung Oxalat. Wenn biologische Systeme ihren Energiehaushalt im wesentlichen durch Oxidation von Substrat-Wasserstoff decken, dann ist offensichtlich, daß sich die verschiedenen heterotrophen Substrate, da sie sich im C/H-Verhältnis unterscheiden, auch im Kohlenstoff/ Energie-Verhältnis unterscheiden müssen. E s gibt verschiedene physikalisch begründete Möglichkeiten, diese Substrate zu ordnen, z. B. nach der Oxidationszahl, nach den verfügbaren Elektronen oder nach der Verbrennungsenthalpie (Tab. 1). 1*

314

Acta Biotechnol. 6 (1986) 4 Tab. 1. Physikalisch-energetisch begründete Ordnung heterotropher Substrate Substrat

Oxidationszahl

av e~ per C-Atom

Verbrennungsenthalpie

Oxalat Formiat Acetat Glucose Glycerol Ethanol Methanol Hexadecan Methan

-3 -2 0 0 0,67 2 2 2,13 4

1 2 4 4 4,67 6 6 6,13 8

10,25 20,9 35,67 38,5 45,1 55,8 59 54,5 72,6

Verbrennungsenthalpie in KJ pro £; Substrat-C

Beim Wachstum von Mikroorganismen auf den unterschiedlichen Substraten wird n u n nicht etwa das Kohlenstoff/Energie-Verhältnis in der Biomasse reflektiert [1], vielmehr, obwohl die Zellzusammensetzung hinsichtlich der einzelnen Makromolekülklassen nicht k o n s t a n t ist u n d von mehreren Faktoren abhängt, unterscheidet sich die Verbrennungsenthalpie oder der Reduktionsgrad der Zellsubstanz, unabhängig vom verwendeten Substrat, beinahe nicht. Die Verbrennungsenthalpie beträgt etwa 21 K J / g Trockensubstanz [1, 2] u n d die av e~ etwa 4,3/C-Atom in einem fiktiven Biomasse-Molekül [3]. Gemessen daran können die heterotrophen Substrate in 2 Gruppen eingeteilt werden: Energie-Überschuß- u n d Energie-Defizit-Substrate [4], Methan, Methanol, n-Alkane sind in diesem Sinne energie-überschüssig. Verbleibt bei der Assimilation dieser Substrate ein Uberschuß auch unter Beachtung eines Wirkungsgrades, d a n n müssen die lebenden Systeme diesen vernichten (Entkoppelung, verzweigte ineffiziente Atmungsketten, „futile cycles" u. a.). E r sollte nützlich gemacht werden können, indem ein zweites, kohlenstoff-überschüssiges Substrat angeboten wird, wenn es simultan utilisiert/assimiliert werden kann. Die chemostatische Kultivierung bietet die experimentelle Möglichkeit, diese These zu testen, d a die sonst bei zwei heterotrophen Substraten übliche diauxische Verwertung umgangen werden k a n n . Bei energie-überschüssigen Substraten sollte die Wachstumsausbeute, gemessen als „carbon conversion efficiency" (CCE), größer sein als bei Verwendung energie-defizienter Substrate. Bei hinreichendem Energie-Überschuß wäre es sogar denkbar, daß die kohlenstoff-metabolismus-determinierte (CMD) CCE erreicht wird. Sie liegt bei glykolytischen („C 3 -") Substraten bei ca. 85% u n d bei nicht-glykolytischen, gluconeogenetischen („C 2 -") Substraten bei ca. 75% [5], I n der Tab. 2 sind experimentelle CCE f ü r verschiedene Substrate zusammengestellt. W e n n angenommen wird, daß diese Werte im Ergebnis phänotypischer Optimierung erreicht worden sind, so fällt auf, daß aus Methan nicht mehr biologisch nützliche Energie (max. 67% des CMD-Y-Wertes) gewonnen wird als aus Methanol (76% des CMD-YWertes). E s ist weiterhin festzustellen, daß die Ausbeuten auf Methanol f ü r Bakterien u n d Hefen deutlich verschieden sind und d a ß auch die Ausbeuten mit verschiedenen Bakterien auf Methanol unterschiedlich sind. Bei Bakterien sind diese Unterschiede ohne Zweifel auf die primären Bahnen zur Assimilation der reduzierten Ci -Verbindungen zurückzuführen, d a anzunehmen ist, daß sie sich in der Effizienz der Energiekonservierung via E T P nicht wesentlich unterscheiden. Die physikalisch-chemisch begründete Einteilung der Substrate bedarf also einer biochemischen Bewertung [6].

BABEL, W.,

315

Auxiliarsubstratkonzept Tab. 2. Experimentell erhaltene und kohlenstoff-metabolismus-determinierte Wachstumsausbeuten mit Bakterien und Hefen Substrat

Methan Hexadecan Methanol Ethanol Glycerol Glucose Acetat

Experimentelle Bakterien 0,9 1,1 0,3 (Ser) 0,52 (HuP) 0,75 0,5 0,4 0,4

Y-Werte Hefen

CMD 7-Werte Bakterien

Hefen

0,9 0,38 (DHA)

1,35 1,35 0,68

1,27 0,64

0,8 0,55 0,53 0,35

0,83 0,71 0,72 0,64

0,78 0,66 0,68 0,6

—

—

Y in g Trockensubstanz pro g Substrat; Zellmolekül für Bakterien und Hefen: QHgOjN! bzw. C6H10O3N1

Diese gelingt auf der Grundlage des Y A Tp-Konzeptes [7, 8], das den Stoffwechsel, die Art der N-Quelle, den terminalen e-Akzeptor, die Zellzusammensetzung und auch die Medienzusammensetzung berücksichtigen kann. Danach sind alle Substrate mehr oder minder energie-defizient (Tab. 3). Daß sich Methan von Methanol nicht positiv unterscheidet (gleiche Stoffwechselwege vorausgesetzt), daß die Ausbeute auf Methan eher kleiner ist als auf Methanol, erklärt sich allein schon aus dem Mono-Oxygenase-Mechanismus der Methan-Oxidation. Bei Kohlenwasserstoffen mit mehr C-Atomen kommt dieser ausbeutereduzierende Mechanismus mit zunehmender Kettenlänge immer weniger zum Tragen; er macht sich wahrscheinlich gar nicht bemerkbar, da die in die Präkursorsynthese eingeschlossene Decarboxylierung von Oxalacetat zu einem Kohlenstoff verlugt führt, so daß Kohlenwasserstoffe nur dann nicht energie-überschüssig, auch im biochemischen Sinne, sind, wenn z. B . die Reduktionsäquivalente der /J-Oxidation als Substrate für die Elektronentransportphosphorylierung nicht zur Verfügung gestellt werden können (Lokalisation: Peroxisomen) bzw. mit einer deutlich kleineren ATPAusbeute oxidiert werden. So verbleiben in der Liste der energieüberschüssigen Substrate wahrscheinlich nur die Iängerkettigen Kohlenwasserstoffe und Ethanol [6]. Auf dem Hintergrund dieser Kenntnisse zwei Substrate, die beide energie-defizient sind, zu mischen mit dem Ziel, die Wachstumsausbeute zu steigern, erscheint nicht sinnvoll, Tab. 3. Biochemisch-begründete Einteilung heterotropher Substrate Substrat

Theoretische CCE Bakterien

Formiat Methan Acetat Glucose Methanol Glycerol Ethanol Hexadecan

21,8 40,8 47,7 61,4 67,1 66,1 75 75

(Ser) (HuP) (EMP) (HuP) (DH)

CMD CCE Hefen — —

49,2 63,4 (EMP) 55,2 (DHA) 73 (GK) 75 75

CCE in % ; Zellmolekül für Bakterien und Hefen wie in Tab. 2

Bakterien/Hefen 85 85 75 85 85 85 75 75

Acta Biotechnol. 6 (1986) 4

316

wenn nicht der Verdacht besteht, daß durch die Kombination z.B. Bahnen eröffnet werden, die bei Verwendung der einzelnen Substrate verschlossen bleiben [9]. M Ü L L E R et al. [10] konnten mit Hansenula polymorpha MH20 für die Mischung Methanol plus Glucose einen positiven Effekt nachweisen. Die Tabelle 4 zeigt das Ergebnis. Das Ergebnis überrascht insofern nicht, als bei Verwendung von energie-defizienten Substraten die Ausbeute auf einer Mischung zwischen den Werten für beide Substrate liegen sollte. Das ist der Fall. Überraschend ist, daß bei einem Mischungsverhältnis, das weit auf der Seite des Methanols liegt, eine CCE erreicht wird, die nur geringfügig unter der für Glucose allein liegt. Wenn beide Substrate im Gemisch genauso assimiliert würden wie als Einzelsubstrate, dann wäre jedoch nur eine CCE von 58,5% zu erwarten. Tatsächlich wird aber bezogen auf den Kohlenstoff 10% weniger benötigt. Tab. 4. Wachstumsausbeuten mit Hansenula einem Methanol/Glucose-Gemisch MischungsVerhältnis

38,8: 1 (exp) 39 : 1 (theor)

Methanol

Y CCE CCE CCE

0,38 49,9

polymorpha

Glucose

0,52 64,1

auf Methanol, Glucose und

Methanol plus Glucose

61,9 -57,8

„Zellmolekül" C 4 H r , i U O 2 > 0 9 \ 0 i f i 8 . (In einer früheren Publikation [10] wurde mit einem „Zellmolekül" von QHgOaNj gerechnet.)

Worauf ist der gemessene Auxiliarsubstrat-Effekt zurückzuführen? Wenn eine möglicherweise veränderte Zellzusammensetzung dieses Phänomen nicht erklären kann [5, 8], verbleibt nur eine effizientere Energieausbeute als dafür verantwortlich anzunehmen. In der folgenden Tabelle 5 sind die Ergebnisse theoretischer Betrachtungen zusammengefaßt. Für die Berechnung wurde die folgende Zusammensetzung zugrunde gelegt: 3 5 % Polysaccharid, 4 0 % Protein, 7 % Lipid, 12% RNS und 3 % DNS. Daraus ergibt sich ein Zellmolekül von C 4 H 6i41 O 2 ,09N 0i6s . Für fi = 0,2 h - 1 und einem Erhaltungskoeffizienten von 6 • 10- 3 Mol ATP -'g- 1 •' h~x ist die berechnete CCE 49,9% für Methanol und 60,6% für Glucose [5], wenn die für die Assimilation notwendige Energie bei Methanol als alleiniger Kohlenstoff- und Energiequelle via lineare dissimilatorische Sequenz und bei Glucose viaTCC geliefert wird ( P / O N A D H = 2 ) . Wird für mitochondriales NADH ein P/O-Quotient von 3 berücksichtigt, dann erhöht sich für Glucose die CCE auf maximal 67,4%. Werden Methanol und Glucose als einzige Kohlenstoff- und Energiequelle für das HefeWachstum angeboten, so werden selbstverständlich alle Zellbestandteile einer Hefezelle daraus synthetisiert. Ist dies auch der Fall, wenn Methanol und Glucose simultan assimiliert werden? Es ist vorstellbar, daß Glucose direkt, ohne via PGA metabolisiert zu werden, für die Synthese kohlenhydratischer Zellbestandteile, z. B. der Hefezellwand, genutzt wird oder/und daß Glucose phosphoryliert wird und nach oxidativer Decarboxylierung als Akzeptor für Formaldehyd dient, so daß die zyklische Regenerierung von Xylose-5-phosphat entfallen kann, was regulatorisch durchaus plausibel erscheint. Die Phosphofructokinase dürfte wesentlich über die Verteilung des Glucose (-und Methanol)-Kohlenstoffs entscheiden. Mit der von B A B E L und M Ü L L E R [5] praktizierten Methode ist es möglich, bei der Berechnung der CCE die unterschiedlichen Verwendungen der Substrate zu berücksichtigen

317

BABEL, W . , A u x i l i a r s u b s t r a t k o n z e p t

(Tab. 5). Würde Glucose allein für die Zellwandsynthese verwendet werden und lieferte Methanol außer Kohlenstoff für die übrigen Zellbestandteile (40% Protein, 7% Lipid, 12% RNS, 3% DNS) die für die Assimilation notwendige Energie via lineare dissimilatorische Sequenz mit einem P/O für NADH von 2, dann ergäbe sich bei einem Mischungsverhältnis von 30,6 : 1 (Methanol zu Glucose in Mol) eine CCE von 52,9%. Wird jedoch angenommen, daß die Energie durch Oxidation von PGA via TCC erfolgt, das im Verhältnis 1 : 1 aus Methanol und Glucose gebildet wurde, dann kann die Ausbeute auf 54,7% (bei P/O = 2) bzw. sogar auf 61,7% (P/O = mix) gesteigert sein. Auf 60,0% würde die Ausbeute erhöht werden, wenn Methanol via TCC (P/O = mix) oxidiert wird. I n diesem Falle kommt das Mischungsverhältnis mit 26,2 : 1 dem experimentellen wieder nahe. Tab. 5. Theoretische „carbon conversion efficiency" bei Verwendung eines Methanol/GlucoseGemisches in Abhängigkeit von der Art der Verwendung der Glucose Methanol

Polysaccharide Protein Lipid RNS DNS /< = 0,2 h"1 m e = 6 X 10- 3 Mol

Glucose

MischungsVerhältnis

Methanol plus Glucose

30,5: 1

52,9

4,8 : i 5,5: 1

54,7 61,5

26,3: 1

60,0

35% 40% 7% 12% 3% ATP • g"1 • h"1 P/0 = 2 49,9 P/0 = mix

60,6 67,4

1) Glucose liefert Kohlenstoff für Polysaccharide, Methanol liefert Kohlenstoff für alle anderen Zellbestandteile plus Energie (P/0 = 2) 2) Glucose liefert Kohlenstoff für Polysaccharide, Methanol liefert Kohlenstoff für alle anderen Zellbestandteile, Energie wird geliefert durch Oxidation von PGA via TCC, das 1: 1 aus Methanol plus Glucose gebildet wird (P/0 = 2) 3) wie (2), jedoch P/0 = mix 4) wie (1), jedoch Energie wird geliefert durch Oxidation von Methanol via TCC, P/0 = mix

Was eindeutig aus diesen Betrachtungen folgt ist, daß durch die Gegenwart von Glucose der Weg zur Oxidation von Methanol via TCC geöffnet wird (bleibt), worauf wahrscheinlich der Auxiliarsubstrat-Effekt zurückzuführen ist [8, 9, 11]. Nicht auszuschließen ist, daß er auch dadurch positiv beeinflußt wird, daß Glucose als direkter Präkursor für die Zellwandsynthese genutzt und nicht oder eingeschränkt via glykolytische Sequenz metabolisiert wird. Die Feststellung, daß alle Substrate mehr oder minder energie-defizient sind, und die Behauptung, daß die kohlenstoff-metabolismus-determinierte Einbaugrenze bei ca. 85% bzw. ca. 75% [5] liegt, sind theoretisch begründet. Sie können experimentell durch Verwendung von Substratgemischen bestätigt werden, wenn eines der Substrate lediglich die Rolle des Energielieferanten spielt. Dies trifft zu für Formiat, wenn es nur oxidiert, jedoch nicht assimiliert werden kann. In der Tabelle 6 sind die Ergebnisse der Kombination Glucose/Formiat — Hansenula polymorpha dargestellt [12]. Tatsächlich kann mit Hilfe von Formiat die Wachstumsausbeute auf 0,7 g • g 1 gesteigert werden, was einer CCE von ca. 86,3% entspricht.

318

Acta Biotechnol. 6 (1986) 4 Tab. 6. Wachstumsausbeute mit Hansenula polymorpha MH20 und Candida CBS 621 auf Glucose in Gegenwart von Formiat als Energie-Donor Mischungsverhältnis Y CCE

1) 6 , 3 : 1 (EXP)

Glucose

Formiat

0,52 64,1

0 0

Y Y CCE

3 , 3 : 1 (EXP)

Formiat/G l ucose

0,7

CCE 2)

utilis

86,3 0,5 59,6

Y

0,69

CCE

82,2

F in g Trockensubstanz pro g Glucose, CCE in % . 1) H. polymorpha-.

„Zellmolekül" C4H6>41O2

09

N0J68 [12]

2) G. utilis: „Zellmolekül" C 4 H 7I32 O 2I24 N 0I6 ^ [26]

Mit Acinetobacter calcoaceticus wurde experimentell die obere Einbaugrenze für ein nicht-glykolytisches („C 2 -") Substrat, Acetat, bestimmt. Als Energielieferant wurde Glucose verwendet, die lediglich zu Gluconsäure oxidiert wird. Hier konnte die Ausbeute von 0,4—0,42 g • g _ 1 auf 0,6—0,62 g • g _ 1 gesteigert werden [13]. Mit einem angenommenen Zellmolekül von C^H^OaNj ergibt sich daraus eine CCE für Acetat von 72,85%. Das Experiment hat also auch in diesem Falle den theoretischen Wert bestätigt (Tab. 7). Dieser Versuch liefert aber noch eine weitere Information. Aus dem Mischungsverhältnis Acetat/Glucose bzw. aus der aufgewendeten Glucose folgt nämlich, daß die Oxidation der Glucose bei Acinetobacter calcoaceticus nicht wie vermutet 1 ATP (vgl. PQQ-Enzyme, [14]), sondern wahrscheinlich 2 ATP liefert [13]. Untersuchungen zur Interaktion von Glucose-Oxidation vermittels einer PQQ-abhängigen Glucose-Dehydrogenase und Elektronentransport-Kette an ^4cme£o&acfer-Stämmen [15, 16] unterstützen diesen Wert. Tab. 7. Wachstumsausbeute mit Acinetobacter von Glucose als Energie-Donor [13] Mischungsverhältnis

1,6 : 1 (exp) 2 4

: 1 (theor) 1 ' : 1 (theor) 2 '

Y CCE Y CCE

calcoaceticus

auf Acetat in Gegenwart'

Acetat

Glucose

Glucose/Acetat

0,4 46,9

0 0,62 72,9 0,64 75

Y in g Trockensubstanz pro g Acetat, CCE in % . Der Berechnung wurde zugrunde gelegt: „Zellmolekül" C 4 H 8 0 2 N 1 ; P / 0 N A D H = 2, Y A T P = 10,5. Es wurde angenommen, daß die Oxidation der Glucose zu Gluconsäure 1) 2 ATP bzw. 2) 1 ATP liefert. Unter Berücksichtigung des von FEWSON [27] publizierten „Zellmoleküls" C 4 H 6 6 1 O 1 8 2 N 0 J S 8 ergibt sich ein Mischungsverhältnis von 1,78 : 1, wenn angenommen wird, daß 2 ATP aus der Oxidation der Glucose gewonnen werden.

BABEL, W., Auxiliarsubstratkonzept

319

„Overflow-Production" Das Auxiliarsubstratkonzept [1, 9] wurde entwickelt auf der Grundlage der energetischen Bewertung heterotropher Substrate [4] mit dem Ziel, die Wachstumsausbeute, die ein wesentlicher F a k t o r bei der SCP-Produktion ist, zu verbessern. Es wurde postuliert, daß sich simultane Verwertung von Substraten mit unterschiedlichen Kohlenstoff/ Energie-Verhältnissen (und gleichen physiologischen Funktionen) positiv auswirken sollte auf Wachstumsausbeute und -geschwindigkeit. Diese Voraussage wurde experimentell mehrfach bestätigt [17, 6]. Die Verbesserung der Wachstumsausbeute h a t eindeutig energetische Ursachen u n d ist a n bestimmte Bedingungen geknüpft. F ü r die Erhöhung der Wachstumsgeschwindigkeit kommen jedoch mehrere Erklärungen in Frage. Sie könnte energetisch begründet sein. Sie k a n n aber auch ganz einfach durch Überwindung eines Flaschenhalses verursacht werden derart, daß entweder ein Substrat mittelbar als Präkursor f ü r bestimmte Synthesen dient, daß bestimmte bestehende Sequenzen stärker „belastet" werden (MassenWirkungsgesetz, fji ~ [S]) oder daß ein Substrat durch Regelung auf epigenetischer Ebene die K a p a z i t ä t bestimmter Enzyme erhöht. D a unwahrscheinlich ist, daß eine Zelle zwei Substrate mit gleichen physiologischen Funktionen von Anfang bis E n d e unterscheidet, wenn sie diese simultan assimiliert, so als würden sie separat vorliegen, dürfte simultane Utilisation hinreichende Bedingung d a f ü r sein, daß sich eine Mikroorganismen-Population in der Regel auf Substratgemischen schneller vermehren k a n n als es f ü r denselben Genotyp auf der langsamer assimilierbaren Komponente möglich ist. Produktsynthesen sind im wesentlichen StoffWandlungen. Daß die Produktausbeute energetisch beeinflußt sein könnte, ist auf den ersten Blick nicht zu erkennen. Auf der Grundlage des Mischsubstratkonzeptes die Produktausbeute steigern zu wollen, erscheint deshalb sogar eher abwegig. Die theoretisch mögliche Produktausbeute läßt sich f ü r jedes Substrat bei Kenntnis des Stoffwechsels leicht berechnen. I n den meisten Fällen ist jedoch der experimentelle Wert deutlich kleiner als der allein metabolisch bedingte; nur im Falle der sog. unvollständigen Oxidationen, die häufig einschrittige Reaktionen darstellen (z. B. Glucose/ Gluconsäure, Ethanol/Essigsäure), aber auch bei Ethanol-Bildung aus Glucose sind die Abweichungen geringfügig. Was sind die Ursachen dafür? Die Bildung von Metaboliten (des primären u n d Intermediär-Stoffwechsels) aus heterotrophen Substraten verläuft unter Freisetzung von biologisch nutzbarer Energie (ATP plus Reduktionsäquivalente). Abhängig vom Substrat und vom Metabolismus ergibt sich ein bestimmtes, konstantes Verhältnis von P r o d u k t zu biologisch nutzbarer Energie (wenn keine Alternativwege möglich sind). Die im P r o d u k t verbleibende Energie ist f ü r Wachstum u n d Vermehrung verloren, weshalb Produktsynthesen im Sinne des Lebens Energie Vernichtungsprozesse sind [18, 19]. Die freigesetzte biologisch a n sich nutzbare Energie m u ß vernichtet werden, was durch einfache Hydrolyse (ATP) oder nichtgekoppelte Oxidation der Reduktionsäquivalente erfolgen kann. Sie k a n n aber auch in Synthesen u n d letztendlich f ü r begrenztes Wachstum u n d Vermehrung verbraucht werden, sofern Möglichkeiten dazu bestehen. U n t e r den Bedingungen der Produktsynthese sind Chancen dazu mehrfach gegeben. Das eigentliche Substrat steht im Überschuß zur Verfügung u n d k a n n — mehr oder minder unkontrolliert — von der Zelle aufgenommen u n d metabolisiert werden, nicht nur bis zum gewünschten Produkt. Nicht in die Sequenz zur Produktsynthese eingeschlossene Bahnen sind nicht abgeschaltet, zumindest nicht von Beginn an (es sei denn, es wird z. B. mit Auxotrophie-Mutanten gearbeitet). F ü r den Fall, daß es sich nicht um „deadend"-Produkte handelt u n d die Produkte nicht in s t a t u nascendi entfernt werden, können sie selbst oder auf dem Wege auftretende Zwischenprodukte als „Energiefänger"

320

Acta Biotechnol. 6 (1986) 4

benutzt werden. Und tatsächlich werden in Prozessen der Produktsynthese nichtangestrebte Metabolite, Nebenprodukte, gefunden, z. B. Malat bei der alkoholischen Gärung, Isocitrat oder Oxalat bei der Citronensäureüberproduktion usw. Die meisten Prozesse verlaufen auch wachstumsgekoppelt, ohne daß ein zelldifferenzierungsbedingter Zwang zur Produktsynthese existiert bzw. erkennbar ist. Diese Art der Energie-Deponie kann als Ausdruck der Zielstrebigkeit lebender Systeme angesehen werden. Sie kann erwünscht sein, da infolge Erneuerung des Produzenten der Produktbildungsprozeß langzeitstabilisiert werden kann. Sie führt aber auf jeden Fall zur Erniedrigung der Produktausbeute. Das heißt, die auf dem Wege der Produktsynthese freigesetzte Energie ist wesentlich für reduzierte Produktausbeuten verantwortlich. Glucose

GAP ATP

NADH-

EtOH

\

Abb. 1. Ethanol als „dead end" Produkt und Bildung von Malat als N e benprodukt der alkoholischen Gärung

NADH FADH? ATP

Ethanol ist ein metabolisches und energetisches „dead end"-Produkt (Abb. 1) unter den Bedingungen der Ethanolbildung (Anaerobiose). Für die Vernichtung des ATP auf dem Wege des Wachstums und der Vermehrung können bei einem Zellmolekül von CgHjoOaNj, und wenn angenommen wird, daß 85% des PGA-Kohlenstoffs in dieses Molekül eingebaut werden, 0,22 Mol Glucose verbraucht werden, vorausgesetzt Stickstoff und Sauerstoff (bei Hefen) reichen aus. Wird diese Menge als für die Ethanol-Bildung verbraucht angesehen, dann erniedrigt sich die Ausbeute von 0,51 g • g _ 1 auf 0,42 g • g _ 1 (aus 1,22 Mol Glucose werden 92 g EtOH plus 27,42 g HTS gebildet). Die experimentelle Ausbeute liegt im Vergleich dazu bei 0,45 g • g - 1 . Für Citronensäure (aus Glucose) ergibt sich eine Erniedrigung von 1,07 g • g _ 1 auf 0,60 g • g - 1 , wenn ATPSLP und die Reduktionsäquivalente für Wachstum verbraucht würden. (Wenn die experimentelle Ausbeute höher ist auf Glucose als 0,6 g • g - 1 , dann ist in Rechnung zu stellen, daß unter den Bedingungen der Überproduktion Wachstum und Vermehrung infolge Stickstoffmangel reduziert sind und schließlich gar nicht mehr stattfinden). Jedoch ist zu berücksichtigen, daß die Reduktionsäquivalente auch für reduktive Synthesen (Polyole) verbraucht werden können. Im übrigen kann Citronensäure auch einfach oxidiert werden, so daß die Ausbeute reduziert werden kann, indem mehr Substrat als metabolisch bedingt verbraucht wird und schon gebildetes Produkt weitermetabolisiert, sogar endoxidiert, was bei allen nicht „dead end"-Produkten möglich ist.

321

BABEL, W., Auxiliarsubstratkonzept

Mit Hilfe des Auxiliarsubstrat-Konzeptes kann der Ausbeuteminderung entgegengewirkt werden. Bei der SCP-Synthese (bei Wachstum und Vermehrung) kommt es darauf an, durch Mischen von Substraten die für die Synthese der Zellsubstanz notwendige Energie zu optimieren, so daß der Kohlenstoff in Form des zentralen Präkursors für die Zellsubstanzsynthese maximal inkorporiert werden kann, ohne daß zusätzliches Substrat bloß zum Zwecke der Energieproduktion oxidiert werden muß. Wenn die auf dem Wege der Produktsynthese freigesetzte Energie wesentlich die Senkung der Produktausbeute verschulden soll, dann ist bei der Produktsynthese dafür zu sorgen, daß die freigesetzte Energie so klein wie möglich bzw. so groß wie nötig (Transport und Erhaltung müssen gewährleistet sein) gehalten wird, was durch Kombination geeigneter Substrate erreicht werden kann. Citronensäure-Überproduktion auf der Basis eines Gemisches aus n-Alkanen (z. B. Hexadecan) und Glucose ist ein Beispiel dafür: 1 Glucose

-> 1 CiAc + 1 ATP + 3 NAD(P)H

3 Hexadecane

8 CiAc - 3 ATP + 40 NAD(P)H + 29 FADH 2

4 Glucose + 8 C0 2 + 1 Hexadecan -» 8 CiAc - 1 ATP + 16 NAD(P)H + 7 frADH2 1 Glucose

j Hexadecan

r Hexadecan

7Glucose

1C01 Pyr

PEP -C02-

AcCoA

' |

- 0 A A \OÄc] 1-CiAc \ — 2C0?

PEP

2AcCoA •

AcCoA A 20AA^

2\OÄc\ T 1-CiAc

\CiÄc\

.J 2 CO 2

AcCoA

1-CiAc M I V. N

AcCoA -0AA---J II

>1 1J

! I

4!

\ 1

L

>1

! 1 11 ^1

'

2 CO?

Abb. 2. Vergleich der metabolischen Bahnen zur „Überproduktion" von Citronensäure aus Glucose, Hexadecan sowie Hexadecan plus Glucose und Kohlendioxid

Bei diesem und auch bei anderen Mischungsverhältnissen steht tatsächlich weniger Energie zur Disposition als bei Glucose und Hexadecan allein (Abb. 2). I n welchem Maße sich dies auf die Ausbeute auswirkt, gilt es experimentell noch sorgfältig zu untersuchen. Weiter oben wurde ausgeführt, daß bei Verwendung von Substratgemischen die Wachstumsgeschwindigkeit höher sein sollte, was tatsächlich zutrifft [10, 20]. Wenn es gelingt, Substrate für Produktsynthesen so zu mischen, daß der Weg verkürzt, d. h. die Zahl der enzymatisch-katalysierten Schritte geringer wird, dann wird wegen der Proportionalität zwischen der Länge des Weges und der spezifischen Produktbildungsrate [21] auch die Produktbildungsgeschwindigkeit erhöht sein. Da mit einer Verkürzung im allgemeinen eine Linearisierung verbunden ist (Schleifen werden überflüssig; die Mischung Hexadecan/Glucose -> Citronensäure ist ebenso ein Beispiel wie Methanol/Glycin Serin; s. Abb. 3), sollten auch die Ausbeuteverluste geringer sein [18, 19]. Die Ergebnisse zur Citronensäureproduktion haben diese These schon bestätigt [E. W E I S S B R O D T und U. B E H R E N S , persönliche Mitteilung],

322

Acta Biotechnol. 6 (1986) 4 3 Me OH

NH3

T ! 2 Gly

Me OH

t

Gly

LCil

?\ ser

Malat AcCoA

1 Abb. 3: Serin-Bildung aus Methanol bzw. Methanol plus Glycin ([Cx]: aktivierter Formaldehyd)

Mit Hilfe von Substratgemischen sollte es sogar möglich sein, die Überproduktion von Metaboliten zu „provozieren", die mit Einzelsubstraten nicht erreicht wird, indem Imbalancen erzeugt werden, die Produktsynthesen auslösen. Als Beispiel hierfür kann die LSerin-Produktion aus Methanol plus Glycin [22, 23] angeführt werden, die zwar auf Glycin allein, aber nicht auf Methanol als einziger Kohlenstoffquelle möglich ist. Unbedingt genannt werden muß, daß auf der Grundlage des Auxiliarsubstratkonzeptes Produktsynthesen kontinuierlich, nach dem Prinzip des Chemostaten, gestaltet werden können, was für die Synthese von Gluconsäure mittels Acinetobacter calcoaceticus demonstriert werden konnte [24]. Es wurden nur einige wesentliche Konsequenzen des Auxiliarsubstratkonzeptes vorgestellt. Auf qualitative Aspekte (z. B. Zellzusammensetzung beim Wachstum, EnzymMuster der Zellsubstanz, Citronensäure/Isocitronensäure-Verhältnis) wurde verzichtet einzugehen, ebenso darauf, daß es mit Vorteil bei Degradationen und Transformationen anzuwenden ist [1, 9], da letzteres von J A N K E und F B I T S C H E [25] ausführlich behandelt worden ist. Eingegangen: 7. 1. 1986

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Acta Biotechnol. 6 (1986) 4, 324

Book Review M.

MOO-YOUNG

Comprehensive Biotechnology The Principles, Applications and Regulations of Biotechnology in Industry, Agriculture and Medicine Oxford, New York, Toronto, Sydney, F r a n k f u r t / M . , : Pergamon Press. 1985.

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BABEL

Acta Biotechnol. 6 (1986) 4, 3 2 5 - 3 3 8

Development of the Design of Fermenters with Energy Introduced by Aerating Gas, Having Contacting Devices PROKOPENKO, V . D . , VIESTURS, U . E .

August Kirchenstein Institute of Microbiology Latvian SSR Academy of Sciences Kleisti, 226067 Riga, Latvian SSR, USSR

Summary This paper deals with fermenters with energy introduced by gas phase (PG), having contacting devices, of laboratory, pilot and industrial scale. It is an attempt to state the possible use of such apparata in view of the rheological properties of the culture and intensity of mass transfer. There has been proved the necessity to introduce additional energy to speed up the circulation, determined by requirements of rational construction and definite demands set forth by the very process of microorganism cultivation (prevention of oxygen limitation, flotation, foam regulation etc.).

Introduction Energy consumed for stirring and aeration and its distribution in a bioreactor [1] is the main criterion in the evaluation of the effectivity of a biotechnological process, ensured by the design of the apparatus. There has been an earlier review, dealing with the classification of fermenters differing as to the manner of energy introduction [2]. Yeasts (with an exception of feed protein from paraffins and gas) are known to be cultivated in apparata with energy introduced with the gas phase. Numerous other products [3] are obtained mainly in apparata with stirrers; i. e. it is most advisable to use mechanical stirrers in processes of microbiological synthesis, especially on media with a high viscosity. Here the design of the stirrer is of utmost importance, since the structure of the cultures, especially the mycelial ones, is highly sensitive to mechanical damages [4—6]. The said is exemplified in Fig. 1, showing the physiological parameters (Qo,), damages (X L ) and the activity of the main enzymes of metabolism (A) in various cultures, depending on the stirring by a standard turbine stirrer in the fermentation equipment FU-6. I t can be seen that the narrowest stirring optimum as to Q0l is for the micromycete Trichoderma viride about 150 rpm. Bacteria Brevibacterium flavum are more tolerant. Baker's yeast Saccharomyces cerevisiae multiply upon the maximum intensity of stirring in this apparatus. For Polyangium sp. notable damages XL are observed upon 850—900 rpm. In order to reduce such damages of populations it is important to ensure an optimum distribution of consumed energy per each phase transfer for both, micro- and macro-

Acta Biotechnol. 6 (1986) 4

326

,C

8-109

I

120

J 0

0 200

hOO

600

800

n [rpm ]

1000

1200

Fig. 1. Damages of various cultures, manifested in respiration intensity, Q0l, number of living cells, Xl, and activity, A, of the main enzymes of metabolism in dependence on stirring intensity, n 1 — Qq2, Trichoderma viride, 2 — XL, Polyangium sp., 3 — A, Brevibacterium flavum, 4 — Qos< Saccharomyces cerevisiae.

stirring, y e t w i t h o u t locally intensive zones, since it is j u s t these zones, in which t h e abovesaid negative effects can be observed. Table 1 contains comparative p a r a m e t e r s , ensured b y various systems of stirring-aeration, during t h e growth a n d polysaccharide synthesis of mycelial culture Achromatobacter delicatulus. I t can be seen, t h a t self-priming a e r a t o r ensures t h e best synthesis of biomass (the m a x i m u m sulphite n u m b e r , i.e. t h e m a x i m u m gas-liquid interface), while nozzle-conical one t h a t of t h e p r o d u c t . Consequently, factors, t a k e n i n t o consideration u p o n t h e choice a n d designing of t h e bioreactor for a definite process, beside t h e general ones should include: population d a m a ges, energy distribution in p h a s e transfers, oxygen d e m a n d of t h e culture — KVT etc. [7, 8], Fig. 2 pictures a n a t t e m p t a t t h e classification of f e r m e n t e r s a n d microorganisms as t o t h e abovesaid p a r a m e t e r s . F L G are, u n d o u b t e d l y , t h e most universal ones, y e t t h e m o s t complicated ones as well (in construction a n d use), a n d energy-consuming, too. On condition t h a t t h e r e is ensured KVr, F G allow t o m a k e a notable economy of energy expenses u p o n a simultaneous simplification of working conditions. R e q u i r e m e n t s a n d t h e necessary conditions, set f o r t h t o t h e cultures, are t h e following: 1) t h e y do n o t f o r m mycelium, cell aggregations or mucous layers r o u n d cell wall; changes of culture liquid u n d e r b a t c h conditions are negligible; 2) t h e y do not require insoluble n u t r i e n t components, poorly-soluble liquids (paraffins) included; 3) t h e cultures grow a t low a n d m e d i u m a e r a t i o n a n d stirring conditions (upto 4 ~ 4.5 kg 0 2 / m 3 • h). D u r i n g recent years increasing a t t e n t i o n has been paid t o fermenters, based on t h e airlift principle in t h e m o v e m e n t of gas-liquid emulsion. A comparison of t h e h y d r o d y n a m i c characteristics a n d mass t r a n s f e r in a n airlift ferm e n t e r with external loop 10 m high, t h e d i a m e t e r of t h e u p w a r d flow t u b e being 100 m m , a n d in a bubble column in t h e same u n i t [9], d e m o n s t r a t e d t h e a d v a n t a g e s of t h e f o r m e r f r o m t h e point of view of scale-up a n d use. Liquid flow, u p t o one order of m a g n i t u d e higher

Prokopenko, V. D., Viesturs, U. E., Design of Fermenters

2

Acta Biotechnol. 6 (1986) i

327

328

Acta Biotechnol. 6 (1986) 4 Fermenten

I

With energy by gas phase Bubble

introduced I F6I

Self priming

column

Ejection

Airlift With contacting Iplates) Multitube

devices

JET

by

With energy introduced by liquid and gas phase I FLO)

stirrer

With stirring

type

With

devices

vibrostirrers

FO with forced circulation

type

type

With floating

Bacteria, K,r*4--i.5 Minimum damages

With energy introduced liquid phase ( FLI

*

Combined

packing

yeasts kg/m^-h of shear

Bacteria, Kvr* 5-6 Maximum damages

yeasts kg/m3h of shear

Mycellial Kvr

fungi

- or\y

Any

.bacteria,yeasts

value

level of shear

damages of:

Permissible

oresence

- viscous

enproducts,

- insoluble

mbshates

Microorganisms

Pig. 2. Classification of fermenters and their suitability for various cultures

in airlift fermenter, is a characteristic parameter of difference between airlift and bubble column. Increased flow rates in airlift column make the effects of viscosity, surface tension and ion tension on gas content and the time of perfect mixing less marked. Upon equal gas loads the gas hold-up

4.5 kg 0 2 / m 3 • h, upon natural circulation the height of liquid layer in the apparatus must not exceed 12 m. Introduction of additional energy for circulation and relative increase of air flow rate allow to increase the limit H up to the level, conditioned by additional energy expenses N 2 (Fig. 5). Height Diameter

Ratio

The purposefulness of choosing the HID a of the apparatus is set by definite conditions. On the one hand the economic effectivity of FG-type fermenters grows with the increase of the ratio H\D%. On the other hand the tendency, existing in microbiological industry, towards unit volume increase up to 300 m 3 and more, renders the use of apparata with big diameters technically more simple. I t simplifies service, delivery pipe line erection, metal capacity and expenses of industrial workshop construction. Diameter of the Apparatus,

Construction of Draft Tube and Contacting Devices

Upon increasing the diameter of a typical loop construction of an airlift (with a full d r a f t tube), round the lateral surface of the draft tube, both inside and outside it, there may be formed a closed swarm of bubbles with a decreased oxygen content, i.e., a swarm, which undergoes more t h a n one cycle of upward and downward movement.

332

Acta Biotechnol. 6 (1986) 4

Internal

n -Vf;

Along whole height

Local Simultaneous combination

Pig. 5. Types of circulation in F G with contacting devices

This phenomenon can be avoided by mounting a perforated contact plate in the way of upward flow (Figure 3a), under which there is formed a zone with some loci of increased pressure. This causes an intensive stirring in the cross section of upward flow with a full restoration of the interface. Perforated plates increase the total gas content in the apparatus and ensures intensification of oxygen sorption. This is exemplified in Table 2, which presents correlations of hydrodynamic parameters and oxygen mass transfer coefficients K\ S upon a comparative testing of an airlift construction with external loop and with and without contacting plates in the upward flow. Experiments were carried out in a 3.5 m 3 fermenter, the tubes of upward and downward flow were 0.3 m in diameter [24]. Another drawback of the construction with a full draft tube is the increase of the liquid residence time in poorly aerated annular area in the result of twisting of the downward flow due to friction against the walls of the apparatus. This effect, yet, decreases when the scale is enlarged. Increase of diameter also causes additional difficulties in removing the excess heat. A rational solution would be direction of downward flow into several tubes inside the apparatus. Inside the tubes there is spiral exchanger with a freezing agent (Figure 3 c). When the surface of heat exchange is not sufficient, transverse heat exchangers of bent configuration in the cross-section are mounted on contacting plates (Figure 3c, d, e position 4) [28]. Construction Parameters of Contacting Devices In literature [22, 24, 26, 29, 30] there have been described comparative tests of hydrodynamic, mass transfer and energy characteristics of airlift fermenters with and without contacting devices on laboratory, pilot and industrial scale. I t was demonstrated that the effect of construction parameters such as the free section area of perforated plate, the distance between the perforated surfaces, the length of directing tubes for downward flow etc., on process effectivity is significant. I t must be noted that the hydrodynamic pressure of the liquid is not stimulated by excess pressure in the apparatus.

333

PROKOPENKO, Y . D . , VIESTURS, U . E . , D e s i g n of F e r m e n t e r s

Table 2. Example of correlations of hydrodynamic parameters and oxygen mass transfer coefficients upon different construction of riser in an airlift bioreacter* Type of riser

Correlating equations

Condition of experiment

With contacting plates

1. 8 4 % Ni, 31 —39% Cu, 65—79% Co, and 2 8 % Al. The rates were estimated from the linearly increasing phases of leaching with the use of the linear regression analysis (p < 0.05) and were as follows (mg/liter • day): Zn 1 6 . 8 - 1 9 . 9 ; Ni 5.5—6.2; Cu 0 . 8 - 0 . 9 ; Co 0.3; and A1 2 0 3 47—53. Neither the yield nor the rate of leaching could be estimated for iron because of Fe(TII) precipitation. The leach residue from the uninoculated reactor

Acta Biotechnol. 6 (1986) 4

3.S'^^-^sAs^»^

^

'

r

'

2 5 L ^^JinroaaSKJin^g^jasi^S 0

.

*

.

.

,

0

10

20

30

.

.

,

kO 50 60 time [days!

1

,

,

70

80

90

Fig. 4. Leaching of the ore material in aerated column reactors A, Fe; B, Zn; C, Cu; D, N i ; E, Co; F, A1 2 0 3 ; G, pH. Two reactors were used; one was initially inoculated (O —) and the other one was operated without an initial inoculum (& —). A t arrow, ore material was added to 10% final concentration to make up for the partial loss of suspended solids due to sampling.

P u h a k k a , J . , Tuovinen, 0 . H., Microbial Leaching

351

Table 3. Microscopic counts of bacteria from the air-lift reactors Time [days]

2 28 40 50 70 82

a

Counts [cells/ml] Inoculated reactor

1.2 9.5 3.0 1.0 1.6 5.2

x x x x x x

107 107 107 107 107 10«

Uninoculated reactor Nd a

3.6 X 107 4.8 X 107 7.5 x 107 3.1 x 10s 3.5 X 106

Nd, not determined.

contained 2 . 9 % S t , with a mass balance of 5 2 % elemental sulfur, 4 0 % S 0 4 - S , and 8 % sulfide-S. The leach residue from the uninoculated reactor contained 3 . 5 % S t , with a mass balance of 4 6 % elemental sulfur, 5 1 % S 0 4 - S , and 3 % sulfide-S. Aerated Columns To alleviate problems of toxicity associated with the initial evolution of hydrogen sulfide, as observed in the air-lift reactors, the ore material was autoclaved in the leach solution before inoculation. The solubilization of iron started four days after the inoculation (Fig. 4). The lag period was extended to about eight days for zinc solubilization. An initial lag phase was not clearly discerned for the dissolution of either copper, nickel, cobalt, or aluminum (Fig. 4). In the uninoculated reactor, the leaching ensued at an enhanced rate after about six weeks at which time bacteria were detected in the leach solution based upon microscopic examination. The reactors received an additional batch of ore material (final concentration 10% suspended solids) after ten weeks of leaching. The solubilization of both iron and aluminum was subsequently enhanced without a delay. For zinc, the dissolution was first preceded by a precipitation reaction (Fig. 4). Soluble iron concentrations fluctuated in both reactor columns throughout the leaching because of the precipitation of F e ( I I I ) . The final pH value in both columns was pH 2.3. The slopes of the linear portions of the leaching curves prior to the contamination of the uninoculated column indicated the following rates: Inoculated reactor column (mg/liter-day) — F e 64; Zn 10.5; Cu 0.9; Ni 5.9; Co 0.3; A1 2 0 3 38. Uninoculated reactor column (mg/liter-day) — F e 8; Zn 0.2; Cu 0 ; Ni 1.7; Co 0.1; A1 2 0 3 2. After the addition of the ore material, the rate of aluminum solubilization increased to 85 and 79 mg/liter-day in the two reactor columns. The leach residues contained4.5% and 4 . 8 % S t (inoculated and uninoculated, respectively) with the following distribution: Inoculated — 3 3 % elemental sulfur; 5 1 % S 0 4 - S ; 1 6 % sulfide-S. Uninoculated — 4 0 % elemental sulfur; 4 2 % S 0 4 - S ; 18% sulfide-S. Percolation The solubilization of iron and other metals commenced without a lag period after inoculation (Fig. 5). Iron precipitated after about two weeks and its subsequent concentration remained below 1.1 g/liter. The soluble metal concentrations indicated recoveries of 1 0 0 % for Ni, 7 8 % for Zn, 4 7 % for Co, and 1 8 % for Cu. Less than 1 % of aluminum solu-

352

Acta Biotechnol. 6 (1986) 4

Fig. 5. Leaching of the ore material in percolation system. The leach solution was continuously recirculated (see Fig. 1), keeping the ore material flooded. A, Fe (•—), A1 2 0 3 ( • —), Ni (o —), Zn ( ¿ - ) ; B, Cu ( v - ) , Co ( o - ) ; C, pH. 30

60 90 120

150180

time [days1

bilized during the time course. Fe(III) precipitates were readily observed in the top part of the ore material in the percolator. Analysis of the leach residue indicated the following distribution of Fe and S : Top Middle Bottom

Fe 9 . 6 % ; S 6.0% Fe 8 . 0 % ; S 5.9% Fe 6.4%; S 5.4%.

The total sulfur comprised of 3 7 - 4 3 % elemental sulfur, 1 3 - 1 8 % S0 4 -S, and 44 —50% sulfide-S. Discussion

This work utilized mixed cultures of microorganisms for the oxidative leaching of the sulfide ore material. The identification of the microorganisms in these cultures was beyond the scope of the present work. The mixed culture employment was preferred over the use of pure cultures of T. ferrooxidans or other acidophilic thiobacilli because the former was contrued to be more representative of the microorganisms in mine water drainage and in dump and heap leaching operations. While T. ferrooxidans and other acidophilic thiobacilli are invariably associated with acid mine waters, recent work has demonstrated extensive microbial heterogeneity in these environments [7, 9 — 12], Research in this area indicates improved kinetics when mixed cultures are used for ore

Puhakka, J., Tuovixen, 0. H., Microbial Leaching

353

leaching [12] as well as for coal desulfurization [13] although the underlying microbiological and physicochemical interactions are not understood. It also appears that much of the work on mineral leaching biotechnology previously reported in the literature has been performed — intentionally or unintentionally — with mixed (enrichment) cultures rather than with pure cultures of T. ferrooxidans although the heterogeneity and contamination problems of T. ferrooxidans have been recognized over the years in the advent of the molecular and plasmid biology of this bacterium. The mixed culture technique is readily amenable to large-scale tests because extra precautions need not be taken to maintain pure culture conditions. I t should be pointed out in this context that aseptic techniques are difficult, if not impossible, to accomplish in practical operations because of the treatment of large quantities of ore material. In the present work the mixed cultures did not grow and lacked the bioleaching activity in the absence of yeast extract. The concentration of K + in shake flasks decreased during the leaching, suggesting the formation of jarosite precipitates: K + + 3Fe 3 + + 2 H S 0 4 " + 6 H 2 0

KFe 3 (S0 4 ) 2 (0H) 6 + 8H+.

This reaction cannot solely account for the observed decrease in the concentration of soluble iron and therefore other Fe(III) precipitates [14, 15] were also formed as hydrolysis products. Preaeration or sterilization by autoclaving reduced the initial lag period before the onset of the microbiological leaching. In this particular instance, the prolonged lag period manifested the presence of toxic H 2 S which was formed upon suspension and acidification of the ore material. Aseptic conditions were not maintained in all experiments because it was clear from the shake flask experiments that the solely chemical leaching reactions were extremely slow. The subsequent enhancement of the leaching in the uninoculated reactors was attributed to aerosol contamination from the adjacent inoculated reactors. The simple construction of the reactors avails the technique readily for use in on-site leaching tests, for example, in laboratories at mine sites. In these experiments the precipitation of Fe(III) was not sought to be prevented through pH control of the leach solution. In spite of iron precipitation, both nickel and zinc were solubilized completely in some experiments and always at least about 80%. Cobalt recoveries were higher in the reactors than in the percolation leaching. The leaching profiles of nickel, cobalt, zinc, and copper indicated no major differences with respect to (i) the preceding lag period, and (ii) precipitation reactions, although a decrease in the concentration of zinc was observed immediately following the addition of ore material after 70 days in the aerated column reactors. Except for the length of the initial lag period, no other major differences were discerned for the leaching of metals in the inoculated and uninoculated reactors. Aluminum was also a major ion solubilized from the ore material although its concentrations indicated that only 14—28% of aluminium was solubilized in the reactors and only < 1% in the percolation leaching. The dissolution of aluminum suggested the solubilization of silicate minerals but this was not specifically examined by determination of soluble silicate ion. The precipitation of aluminum was apparent only in the air-lift reactors and may have occurred in the form of either alunites or altered Al-silicates. The insoluble sulfate in the leach residues suggested the presence of jarosite type byproducts. The analysis of leach residues indicated the formation of elemental sulfur (33—52% of S t ) during the leaching, suggesting the incomplete oxidation of sulfides which is a typical result of predominantly ferric-ion mediated leaching. The incomplete oxidation of sulfides may lead to the formation of diffusion barriers in the form of elemental and colloidal sulfur coatings of mineral particles and. in the case of chalcopyrite, it favors the formation of secondary copper sulfides. Complete oxidation to sulfate, on

Acta Biotechnol. 6 (1986) 4

354

the other hand, requires a four-fold excess of oxygen as compared with the incomplete oxidation and as an exothermic reaction it liberates heat which may be deleterious to the biological activity if the process is continuous as desired in large-scale leaching a t high pulp densities.

Acknowledgments The work was funded by the Ministry of Trade and Industry, Finland, with additional support from Outokumpu Ltd. and the Emil Aaltonen Foundation. We thank Dr. Seppo H E I M A L A for advice on the design and construction of the reactor types, Mrs. Paula H T L T U N E ^ for help in initiating the experimental work, and Mrs. Sinikka P A H K A L A for excellent technical assistance. Received November 27, 1985

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TORMA,

Acta Biotechnol. 6 (1986) 4, 355-359

Formation and Release of ß-Glucosidase by Aspergillus niger ZIMET 43 746 in Correlation to Process Operations K E E N S , G., DALCHOW, E . , KLAPPACH, G . , M E Y E R ,

D.

Academy of Sciences of the G.D.R. Institute of Biotechnology PermoserstraBe 15, Leipzig, 7010 DDR

Summary The total formation of /3-glucosidase by the wild strain of Aspergillus niger ZIMET 43 746 is nongrowth-associated. In discontinuous culture the total /S-glucosidase activity related to the mycelium is increasing with the age of the mycelium. The complete release of the remaining mycelial-associated /3-glucosidase is dependent on the structure of the mycelium. In the cases of the mycelium forms pellets throughout the growth phase than the release of /J-glucosidase is accelerated compared to the release from loosly branched mycelium. Increasing shear stress caused by increasing of the impeller speed promotes the formation of pellets.

Introduction Cellobiose is formed as intermediate product during the enzymatic saccharification of cellulose to glucose (e.g. [1]). When the /S-glucosidase activity is at low level relative to cellulase, the rate of saccharification is decreased because cellobiose is a stronger inhibitor of cellulase enzymes than glucose. Besides there is the fact that sometimes cellobiose is an undesirable product in the hydrolysis sugars, e.g. in the cases of following fermentation to ethanol. One of the variants for the optimization of the cellulase complex consists in supplementation of the cellulase complex with /?-glucosidase from a separate fermentation. Appropriate fungi as a source for /3-glucosidase are Aspergillus strains and their mutants, respectively. In the case of Aspergillus phoenicis A L L E N and S T E R N B E R G have found a constitutive formation of /9-glucosidase on different carbon sources and besides an effect of the carbon source on the yield of /S-glucosidase [2], In batch culture the ratio of extracellular and cellbound /9-glucosidase is different at different fermentation times. In the present paper we study formation and release of /S-glucosidase by the wild strain A. niger Z I M E T 43 746 in correlation to the structure of the mycelium and to process operations, respectively. Materials and Methods Strain The strain used was A. niger ZIMET 43 746. Stock cultures of the tested strain were maintained on Czapek Dox-or potato-dextrose-agar slants. Only conidia were used for the inoculation to avoid an irreversible loss of the sporulation power. If conidia were used as inoculum for submerged cultures the mycelium was removed by filtration.

356 Production

Acta Biotechnol. 6 (1986) 4

Medium

As carbon sources were used lactose, starch a n d cellobiose a t different concentrations. F u r t h e r m o r e complex media with whey a n d w h e a t b r a n were used. The basic salt medium was composed in t h a t m a n n e r t h a t any limitation in t h e growth phase was avoided (C/N r a t i o < 9; C/P ratio < 55). I n complex media t r a c e elements were n o t added.

Fermentation F e r m e n t a t i o n s were carried out in a 30 1 f e r m e n t e r with an operating volume of 16 1. Fermenters with a smaller operating volume were less useful because of t h e strong wall g r o w t h of the fungi. The dissolved oxygen in t h e bulk phase was controlled a t a level greater t h a n 2 5 % of t h e s a t u r a t i o n value (related to aeration with air) b y means of varying the impeller speed a n d t h e aeration r a t e , respectively. The p H was controlled a t 3.4 in t h e g r o w t h phase a n d a t 6.0 in t h e lysis phase.

Assays E n z y m e activities were measured as described b y GHOSE [3]. The /3-glucosidase was determined b y t h e release of glucose f r o m cellobiose a t 50 °C a n d 30 min incubation time. One u n i t of /?-glucosidase (cellobiase) represents 1 ¡imol/min of s u b s t r a t e converted a n d 2.0 [xmol/min of glucose f o r m e d , respectively. For t h e estimation of the mycelial-associated /S-glucosidase activity the mycelium was separated f r o m t h e culture b r o t h by centrifugation, twice washed with water, lyophilized, a n d dried to cons t a n t weight over P 2 0 5 . Weighted mycelium was suspended in a c e t a t e buffer a n d desintegrated. The activity was estimated in t h e s u p e r n a t a n t a f t e r centrifugation. During the freeze-thaw steps of t h e mycelium suspensions different a m o u n t s of mycelial-associated /?-glucosidase are liberated. Désintégration of the cells of the mycelium was performed b y ultrasonics or „ F r e n c h press" (18000 PSI), respectively. A loss of activity caused by t h e désintégration process was not observed. For t h e estimation of the totaI-/S-glucosidase activity in the f e r m e n t a t i o n b r o t h t h e samples were t r e a t e d with ultrasonics (5 min), the activity was estimated a f t e r centrifugation in the supernatant.

Results and Discussion Highest /3-glucosidase activities by the strain A . niger ZIMET 43746 were obtained with lactose plus starch as carbon source, compared to cellobiose or cellobiose plus starch (Table 1). The investigated strain is able to form CMC hydrolyzing enzymes but not the complete cellulase complex (Table 2). The CMC hydrolyzing enzymes are formed in the presence of a suitable inducer, e.g. wheat bran. Table 1. E f f e c t of carbon source on the yield of /j-glucosidaae f r o m A. niger Z I M E T 43 746 in flask cultures Carbon source

%

/5-glucosidase (extracellular) [IU/ml]

Cellobiose Cellobiose + starch Lactose Lactose + starch Lactose + starch

1.0 1.0 + 0.5 3.0 1.0 + 0.5 2.0 + 1.0

2.1 3.0 1.9 6.1 8.3

KERNS,

G.,

DALCHOW, E .

et al., Formation of /3-Glucosidase

357

Table 2. Effect of carbon source on the yield of /J-glucosidase and endoglucanase from A. niger ZIMET 43746 Carbon source

/o

/?-glueosidase (extracellular) [IU/ml]

Acid swollen cellulose

3.0

Acid swollen cellulose + MKC

2.0 + 1.0

Potato (raw), grated

20.0

Potato + wheat bran

CMCactivity [IU/ml]

cultivation

mycelium structure

1.5

0.11

shake flask

loosly branched

1.2

0.08

shake flask

loosly branched

8.6

0.37

shake flask

pellet

12.5 + 1.5

9.4

0.52

shake flask

pellet

Lactose + wheat bran

2.0 + 1.0

10.9

1.47

shake flask

pellet

whey + wheat bran

4.8 + 1.5

24.9

6.6

fermenter

pellet

whey13 + starch

3.8 a + 1.0

14.1

0.42

fermenter

pellet

a 11

a

concentration of lactose in the whey whey was diluted with water (20%)

A correlation between the /3-glucosidase activity and the CMC activity was not discernible. Highest /3-glucosidase activities in the fermentation broth were found when pellets were formed in the growth phase (Fig. 1). The mean diameter of the pellets was about 1.5 mm. Generally it was possible to form pellets by relatively high impeller speeds, in agreement to results of the basic research [4], Solids as carbon sources in the fermentation broth also promote the formation of pellets, e.g. wheat bran. A possible explanation of this influence of pellets on the yield of /?-glucosidase may be that inside the pellets are mass transfer limitations. At mass transfer limitations the lysis process may be favoured which accelerate the release of ^-glucosidase or which promote its induction.

100

time ChJ Fig. 1. Formation and release of /5-glucosidase in 30-litre fermenter at different mycelial structures ® —, loosely branched mycelium, 4 % lactose + 1 % starch; 0 — , irregular pellets, 4 % lactose + 1% starch; A — , 1.0-"1.5 mm pellets, whey + 1 % wheat bran.

358

Acta Biotechnol. 6 (1986) 4

I n t h e case of loosly branched mycelium in the growth phase about 5 0 % of the total a m o u n t of /3-glucosidase is cellbound even after a fermentation time of 190 h, compared t o about 5---10% cell bound /S-glucosidase in t h e case of pellet formation (Fig. 2).

time

[h]

Pig. 2. Release of /3-glucosidase in relation to different mycelial structures • —, • — , loosely branched mycelium, 1% lactose + 1% starch; # —, o —, pellets, 3% lactose + 1 % wheat bran ,•—, O —, total/?-glucosidase; • —, # —, extracellular /?-glucosidase.

T h e total (extracellular plus cellbound) (i-glucosidase activity related to mycelium-dry weight is increasing with growing age of the mycelium in the growth phase (Fig. 3). T h a t means formation of (total) /S-glucosidase is non growth associated.

time

Chi

Fig. 3. Progress of /S-glucosidase activity related to mycelium (in the case of loosely branched mycelium, 1% lactose + 1% starch) # —, cellbound activity; 0 — , extracellular activity; • —, total activity.

Bacterial contaminations in all cases caused a decrease of extracellular /S-glucosidase activities. The total /3-glucosidase activity in the fermentation broth is increasing with increasing the mycelium concentration, caused b y increasing substrate supply. The amount of carbon sources is limited to about 6 % (e.g. 5 % lactose plus 1% starch), since higher concentrations cause a rapid increase of the effective viscosity in the growth phase and for t h a t reason the process is in agitation hardly to manage. An additional increasing of the total /S-glucosidase activity is realized by fed batch or semicontinuous cultivation (Fig. 4).

K E E N S , G . , DALCHOW,

E. et al., Formation of JS-Glucosidase

359

Fig. 4. Semicontinuous fermentation of /3-glueosidase ® —, /3-glucosidase; • —, Red. sugar (as lactose); Carbon source: 80% whey -j- 1.5% wheat bran.

Acknowledgement The authors thank Dr. G . R . W . ARNOLD and Dr. P. H U B S C H from the Friedrich-Schiller-Universitat Jena, Sektion Biologie-Pilzkulturensammlung, for placing at disposal the selected strain and for many helpful discussions. Received September 3, 1985

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The Bacteria — A Treatise on Structure and Function Vol. VIII. Archaebacteria

Orlando, San Diego, New York, T o r o n t o , Montreal, S y d n e y , T o k y o : Academic Press, Inc., 1985. 581 S. S p ä t e s t e n s seit den 30iger J a h r e n teilt m a n alle lebenden (sich selbst replizierenden) F o r m e n den Pro- u n d E u k a r y o n t e n zu. I n d e n s p ä t e n 70igern t a u c h t e eine „ d r i t t e F o r m " des Lebens auf. S p ä t e s t e n s a b d a m u ß t e m a n viele Vorstellungen über die Verhältnisse von Pro- u n d E u k a r y o n t e n neu ü b e r d e n k e n . Hier liegt uns n u n ein B u c h vor, welches v e r s u c h t , die F l u t n e u e r E r k e n n t n i s s e über A r c h a e b a k t e r i e n zusammenzufassen. Die Herausgeber teilen das B u c h abzüglich einer E i n f ü h r u n g u n d eines Epilogs in drei A b s c h n i t t e ein. I m ersten wird u n t e r einer Vielzahl von Sichtwinkeln die biochemischen Unterschiede u n d die V e r b r e i t u n g der A r c h a e b a k t e r i e n dargestellt. Der zweite b e f a ß t sich m i t d e m T r a n s l a t i o n s a p p a r a t . Dabei m u ß t e n sich die H e r a u s g e b e r auf G r u n d der bisher erschienenen L i t e r a t u r vorrangig auf genetische U n t e r s u c h u n g e n zu r R N A , t R N A , R i b o s o m e n u n d E l o n g a t i o n s f a k t o r e n b e s c h r ä n k e n . Der d r i t t e Teil v e r s u c h t eine allgemeine, molekulare Charakterisierung der A r c h a e b a k t e r i e n (Zellentwicklung, Lipide, P o l y m e r a s e n , G e n o m s t r u k t u r u. a.). Der abschließende Epilog legt eine Reihe offener F r a g e n d a r u n d g i b t einen k u r z e n Abriß der „ A r c h a e b a k t e r i e n g e s c h i c h t e " . J e d e m K a p i t e l ist ein ausführliches u n d aktuelles L i t e r a t u r v e r zeichnis a n g e f ü g t . Die zahlreichen A b b i l d u n g e n sind sehr übersichtlich. Alles in allem ein B u c h , das nicht n u r f ü r jeden, der sich m i t A r c h a e b a k t e r i e n b e f a ß t , sondern auch f ü r jeden Biologen v o n Interesse sein d ü r f t e . E . Spanier

Acta Biotechnol. 6 (1986) 4, 361-367

Exogenous Cellulases of Thermophilic Micromycetes. II. Thermostability of Enzyme Preparations KVESITADZE,

G.,

GOGILASHVILI,

L.,

SVANIDZE,

R.,

BUACHIDZE,

T.,

CHIEGADZE,

L.,

NIZHAEADZE, D .

Academy of Sciences of the Georgian S.S.R. Institute of Plant Biochemistry Tbilissi 380031, U.S.S.R.

Summary The ability of a large number of higher fungi to form extracellular cellulases is investigated. Some representatives of these fungi grow at40 —50 °C, and form extracellular cellulases exceeding cellulases of mesophilic fungi in thermostability. It is shown that cellulases of higher thermophilic fungi differ by their thermostability. The temperature optimum of cellulase action of higher fungi occurs within 60—62 °C.

Introduction As t h e result of photosynthesis, over 200 billion t o n s of carbon, of which a b o u t 100 billion t o n s a p p e a r t o be cellulose, are fixed a n n u a l l y on t h e e a r t h . T h e p o t e n t i a l use of t h e p r o d u c t s of cellulose conversion is exceedingly wide, viz., protein o b t a i n e d b y direct cultivation of microorganisms on solid cellulose s u b s t r a t e s [4, 6, 9]; liquid fuel o b t a i n e d b y f e r m e n t a t i o n of cellulose h y d r o l y s a t e [11]; organic solvents, chemicals, a n d biologically active compounds o b t a i n e d b y cultivation of corresponding producers [15]. I n all t h e s e processes, a n enzyme decomposing cellulose is principal t r a n s f o r m a t i o n agent. Consequently, t h e presence of organisms capable of active cellulase synthesis is t h e m a i n f a c t o r of success. However, t o be used successfully, a p a r t f r o m high activity, t h e cellulase p r e p a r a t i o n s m u s t possess a n u m b e r of properties, primerily t h e i r high thermostability. Although, enzymes of thermophilic organisms are n o t always characterized b y higher t h e r m o s t a b l e properties in comparison with their mesophilic c o u n t e r p a r t s , it is m o r e advisable t o select producers of really t h e r m o s t a b l e enzymes a m o n g thermophiles [8], Recently, more t h a n 50 works concerning cellulases of thermophilic organisms h a v e a p p e a r e d in t h e literature [2, 3, 5]. However, these studies do n o t help t o f o r m a clear idea a b o u t t h e real t h e r m o s t a b i l i t y of cellulases produced b y thermophilic organisms. I n search of t h e r m o s t a b l e cellulase producers, t h e a u t h o r s paid a t t e n t i o n t o micromycetes which, as is known, produce all t h e c o m p o n e n t s of cellulases. F u r t h e r m o r e , several representatives of higher fungi are well a d o p t e d t o life u n d e r high t e m p e r a t u r e s . So, t h e present s t u d y was u n d e r t a k e n with a view t o select t h e e n z y m e p r e p a r a t i o n s f r o m thermophilic micromycetes a n d t o characterize t h e m b y t h e i r t h e r m o s t a b l e properties. 4*

362

Acta Biotechnol. 6 (1986) 4

Materials and Methods Filter paper No. I " W h a t m a n " (U. K.) earboxymethyl cellulose (CMC) — Na salt and D-cellobiose were purchased from " S e r v a " (W. Germany), horseradish peroxidase (activity 34—40 thousand units/g)from " R e a n a l " (Hungary), glucose oxidase (activity 91—134 thousand units/g), potassium ferrocyanide and D-glucose produced in the U S S R , were used in the study. The glucose oxidase — peroxidase reagent for determining glucose was prepared in the following way: 50 mg of glucose oxidase and 30 mg, of peroxidase were, dissolved in 0.4 M phosphate buffer at pH 7.5 up to the volume of 330 ml; then the volume was brought to 500 ml by the solution of 0 . 1 % potassium ferrocyanide [13]. The activity of endoglucanase was measured by a viscometric method which involves measuring of initial rates of decrease in viscosity of the polymer substrate (0.2—0.4% CMC-Na). This method allows to evaluate the endoglucanase activity in absolute terms (|j.M glucosidic bonds broken per minute) [1, 12], Filter paper activity (FPA) was evaluated by determination of the reducing sugars liberated. The method is as follows: a filter paper band (50 mg, approximately 1 x 6 cm) was put into a testtube with 1 ml of 0.05 M acetate buffer (pH 4.5), and 1 ml enzyme solution was added. The reaction continued for 60 min at 55 °C, then 1 ml reactive mixture was transferred to a test-tube containing 1 ml of SOMOGYI reagent [14]. The obtained solution was placed into a boiling water bath for 20 min. Then, the solution cooled in ice water to room temperature, 1 ml of N E L S O N [10] reagent was added, shaked thoroughly, and then 7 ml H 2 0 was added. The amount of reducing sugars was estimated according to the intensity of blue colour obtained at X = 597 nm, calculating it by the calibrating curve. F P A was estimated according to the rate of the enzymatic reaction. The reaction rate at which 1 ¡xM reducing sugars are formed in the reactive mixture per minute was assumed to be a unit of F P A . CMC-ase activity was assayed by measuring the amount of reducing groups (excluding glucose) produced from 1 % CMC-Na solution [7]. After incubation at 60 °C for 30 min, 1 ml of the reaction mixture was taken and put into 1 ml of SOMOGYI'S reagent and then follows as described above. Cellobiase activity is determined by measuring the glucose realeased from cellobiose by the glucose oxidase-peroxidase method. The reaction is consisted of 0.2 ml 40 m l cellobiose, 1.7 ml 0.05 M acetic buffer, pH 4.6 and 0.1 ml enzyme solution. After incubation of the mixture at 55 °C for 10 min, the glucose content was determined according to SHCHERBTJKHIN et al. [13]. 0.2 ml reactive mixture was added to 3 ml glucose oxidase-peroxidase solution and kept at room temperature for 50 min. Cellobiase activity per gramme of preparations was measured by the formula: A =

2 •

*

t • E0

unit of activity g preparation

where G is glucose concentration formed during the enzymatic hydrolysis of cellobiose (¡J.M), t — period of hydrolysis in minutes, E0 — concentration of the preparation hydrolyzing 1 ¿eM cellobiose per minute at 55 °C was assumed to be a unit of cellobiase activity. The concentration of glucose formed during cellobiose hydrolysis was estimated by means of the calibrating curve of dependence of the optical density of glucose solution on its concentration at X = 410 nm. Results From a large amount of higher fungi (over 600), 24 thermophilic cultures forming extracellular cellulases while growing at temperature range 40—50 °C were chosen. A few more cultures of thermophilic fungi were obtained from other collections. This allowed

363

KVESITADZE, G. et al., Thermostability of Enzyme Preparations

to set up a collection of thermophilic fungi of 32 strains — representatives of various genera: Chaetomium, Sporotrichum, Aspergillus, Thielavia, Fusarium, Malbranchea, — and establish some specificities of extracellular cellulase synthesis by thermophilic micromycetes. An important conclusion of this part of the work is the establishment of the fact that thermophilic representatives of micromycetes grow in a medium containing cellulose and synthesize cellulases under temperature conditions up to 50 °C. At higher temperatures (50—60 °C), the same cultures grow well on such an easily metabolizable carbon source as glucose; however, when cellulose constitutes the major carbon source, there is practically no growth. Exo-glucanase activities were found in few investigated cultures. On the whole, judging from the results obtained, it can be assumed that mainly extracellular enzymatic preparations of cellulases, obtained from thermophilic cultures, contain one cellulase component — endoglucanase, or two — endoglucanase and cellobiase. Two cases are possible here: either cellulase secretion at high temperatures markedly decreases, which is reflected in the absence of exoglucosidases in thermophilic cultures, or the realization of genetic information in thermophilic micromycetes is partially limited and at high temperatures the organisms synthesize only those forms of cellulase which are necessary for converting the cellulose substrate into assimilable products. After the growth of'producers (for 72—96 hours), the culture filtrates were evaporated 5—7-fold, cooled to + 4 ° C , and the enzymes precipitated by 3.0—3.5 volume of ethyl alcohol cooled to the same order. At precipitation with aceton or isopropyl alcohol, the yield of cellulase activities was 15 —25 % lower. The activities of dry cellulase preparations obtained by precipitation of ethanol is given in Table 1. In the majority of investigated strains, cellobiohydrolase hasn't been found to be present in the deep culture filtrates studied. Table 1. Activities of cellulase preparations of thermophilic higher fungi. Producers

Chaetomium thermophile Aspergillus wentii A. terreus A. versicolor Sporotrichum pulverulentum

Activity

[units/g]

endoglucanase

CMC

FP

cellobiase

53 4000 220 7000 810

115 195 310 795 1260

7,0 50,0 20,3 48,6 49,3

50 70 70 72 -

Apparently, minimalization of cellulase synthesis observed for thermophilic micromycetes up to two components — endoglucanase and cellobiase — appears to be usual, as simultaneous action of these enzymes on cellulose is enough for production of glucose, finalproduct of hydrolysis. As is known, endoglucanase are the first enzyme of the cellulase complex attacking both soluble and insoluble cellulose. As a result, at first, the degree of substrate polymerization considerably decreases, and then low-molecular fragments of cellulose are hydrolyzedto di-, tri- and tetrasaccharides, which are substrates for cellobiase action. In this case, the mechanism of cellulase hydrolysis must correspond to the following scheme: 1. Cellulose + endoglucanase -> high-molecular products of hydrolysis (fast reaction) 2. High-molecular products + endoglucanase -*• low molecular sugars (slow reaction)' 3. Low-molecular sugars + cellobiase -> glucose

364

Acta Bioteohnol. 6 (1986) 4

According to this mechanism, synergistic action of endogluconase and cellobiase appears to be highly probable. The second stage, consisting in the hydrolysis of large fragments of cellooligosaccharide to low-molecular sugars, limits the rate of hydrolysis reaction. Cellobiohydrolase, splitting cellobiose from cellulose and decreasing the molecular mass of cellooligosaccharides at this stage of reaction, plays an important role in enzyme preparations of mesophilic higher fungi. The cellulase preparation obtained from the culture of Sporotrichum pulverulentum, evokes special interest. No cellobiase or exoglucosidase, producing glucose from cellobiose or other low-molecular cellooligosaccharides, were found in the deep culture filtrate of the strain; however, prolonged incubation of this enzyme preparation with filter paper (1 hour), with the weight ration of preparation to substrate equalling 1 : 20, led to glucose production. I t is not excluded t h a t endoglucanase of this strain has broader substrate specificity, breaking down cellulose to metabolizable sugars, including glucose, or cellooligosaccharides having small molecular weights which penetrate into the cells of Sporotrichum pulverulentum, and then are hydrolyzed enzymatically to glucose.

tim? [mini

time Lmini

time [min]

Tig. 1. Kinetic curves of thermoinactivation towards CMC activity (A), F P activity (B) and endoglucanase activity (C) of cellulase preparations obtained from investigated strains at 65 °C in 0.05 M acetate buffer, pH 4.5 1 — Chaetomium thermophile, 2 — A. wentii, 3 — A. terreus, 4 — A. versicolor, 5 — Sporotrichum, pulverulentum. In B at the bottom instead 4 read 3

Kinetic curves of thermoinactivation towards CMC activity (A), F P activity (B) and endoglucanase activity of cellulase preparations obtained from investigated strains (C) are represented in Fig. 1. Residual activities expressed as a percentage on off as ordinate, 1.e. A/A0 • 100%, where A0 — activities at the initial moment and A — activities at the moment of t period. The preparation characterized by the absence of visible correlations between thermostability of various activities are noted. Particularly, CMC activity of the Sporotrichum pulverulentum preparation appeared to be less dependent on temperature, while this preparation occured to be less stable according to the other two activities. Endoglucanase activities of the A. versicolor and C. thermophile preparations appeard to be most thermostable, though, the Sporotrichum pulverulentum preparation is preferable to CMC activities. Kinetic curve of thermoinactivation of the C. thermophile enzyme preparation on F P activity t h a t increases sharply at the initial stage of thermoinactivation is of graet interest. Cellobiase thermoinactivation of the investigated preparation is shown in Fig. 2. As shown by cellulase thermoinactivation, the enzyme isolated from the culture of Ghaeto-

KVESITADZE, G. et al., Thermostability of Enzyme Preparations

365

Fig. 2. Thermoinactivation of cellobiases at 65 °C and 0.05 M acetate buffer pH 4.5 1 — Chaetomium thermophile, 2 — Aspergillus wentii, 3 — A. terreus, 4 — A. versicolor. time [mm] mium, proved most thermostable and cellobiase of A. terreus least thermostable. And this notwithstanding, the thermostability of cellobiase of A. terreus was almost twice as much as that of the cellobiase of T. viride. Thus, as is seen from the thermoinactivation curves of endoglucanase and cellobiase, the cellulase preparation isolated from a Chaetomium culture is the most stable. The cellulase preparation of an A. terreus culture is characterized by the lowest thermostable properties. Fairly wide variations of the activity of cellulase preparations in thermostability were noted not only among higher thermophilic fungi, but also within the representatives of the genera Aspergillus: A. terreus, A. wentii and A. versicolor. The temperature optimum of the action of above cellulase preparations is within 60 to 62°C under 1 hour incubation. Thus, the A. terreus preparation manifested maximum activity under 1 hour incubation at 60 °C when acting towards Na-CMC, and at 55 °C when cellobiose and filter paper were used. The cellulase preparation obtained from Chaetomium whose activity was measured under the same conditions, possessed highest temperature optimum of action towards CMC, 62 °C, and the value for cellobiase and filter paper being 58 °C. The temperature optimum of other preparations at 1 hour incubation were within these values. The value of the cellulase preparation obtained from Chaetomium is further enhanced by the fact that it possesses high acidstable properties. Fig. 3, Fig. 4 and Fig. 5 show the acidic inactivation curves of the action of all cellulase preparation. On the whole, as shown by the data presented, the cultures of thermophilic micromycetes when grown at the temperature range 40—50°, produce cellulase with higher thermo-

Fig. 3. Inactivation of cellulases towards CMC at pH 2.2 in 0.05 M glycine-HCl buffer 1 — Chaetomium thermophile, 2 — Aspergillus wentii, 3 — A. terreus, 4 — A. versicolor, 5 — Sporotrichum pulverulentum. In the diagram: Instead 1 read 2 Instead 2 read 1 0

SO

time [min ]

100

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Fig. 4. Inactivation of cellulases on filter paper a c t i v i t y at p H 2.2 in 0.05 M glycine-HCl buffer 1 — Chaetomium thermophile, 2 — Aspergillus wentii, •i — A. terreus, 4 — A. versicolor, pulverulentum. ~> — Sporotrichum time [min]

\

^ v^ '—„v

0

v3 I 50

I 100 time [min]

2

Fig. 5. Inactivation of cellobiases at p H 2.2 in 0.05 M glycine-HCl buffer 1 — Chaetomium thermophile, 2 — Aspergillus wentii, 3 — A. terreus, 4 — A. versicolor.

stable properties t h a n cellulases of higher mesophilic fungi. I t should be assumed that most thermostable forms of the investigated cellulase preparations from Chaetomium and A. versicolor are close to the desired thermostability, i.e. they are capable of carrying out continuous substrate hydrolysis at 60—62°C being fully suitable for continuous substrate hydrolysis under a high temperature regime. Thus, further selection of thermophilic higher fungi — producers of cellulases may allow to isolate cultures producing more thermostable forms of cellulases — satisfying the needs of the industry of such an important characteristic as their thermostability. Received J u n e 25, 1985

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Book Review GRUSS, P e t e r

Industrielle Mikrobiologie Ausgewählte Verfahren und Perspektiven für die Zukunft S p e k t r u m der Wissenschaft: Verständliche Forschung Heidelberg: Spektrum der Wissenschaft Verlagsgesellschaft m.b.H., 1984. 198 S.

Die P u b l i k a t i o n e n t h ä l t neben einer E i n f ü h r u n g eine Reihe von populärwissenschaftlich angelegt e n Beiträgen n a m h a f t e r in den USA tätiger Wissenschaftler aus den letzten J a h r e n , die zu d e m T h e m a industrielle Mikrobiologie z u s a m m e n g e f a ß t u n d im S p e k t r u m der Wissenschaft in den letzten 5 J a h r e n publiziert worden sind. I n den Beiträgen wird der zu diesem Z e i t p u n k t erreichte S t a n d auf den Gebieten industrielle Mikrobiologie, industriell n u t z b a r e Mikroorganismen, P r o d u k t i o n von Industriechemikalien u n d P r o d u k t i o n s v e r f a h r e n zur K u l t i v i e r u n g von Mikroorganismen, Baktierien im Bergbau, Speisen u n d Getränke, Medikamente, genetische P r o g r a m m i e r u n g von Mikroorganismen, Proteinproduktion durch Bakterien, I n t e r f e r o n p r o d u k t i o n , Säugerzellenkultivierung, monoklonale Antikörper, P f l a n z e n z u c h t m i t P r o t o p l a s t e n u n d Genmanipulation a n Pflanzen dargestellt. Die Beiträge enth a l t e n n e b e n interessanten I n f o r m a t i o n e n zur Geschichte vor allem die gegenwärtig offenen u n d b e a r b e i t e t e n Probleme. Sie geben d a m i t einen interessanten Überblick über die Leistungsfähigkeit u n d die in n a h e r Z u k u n f t zu e r w a r t e n d e n Erfolge der Biotechnologie. Gleichzeitig vermitteln die Abhandlungen einen Einblick in wissenschaftliche Arbeitsweisen durch die Darstellung exzellenter E x p e r i m e n t e f ü r die Beweisführung. E r g ä n z t u n d vervollständigt werden die A u s f ü h r u n g e n durch eine hervorragende Gestaltung, ausgezeichnete Fotografien, verständliche übersichtliche D i a g r a m m e u n d Darstellungen. Obwohl bei einigen Artikeln wahrscheinlich d u r c h Übersetzungsfehler falsche Angaben v o r h a n d e n sind u n d nicht alle B e h a u p t u n g e n einer P r ü f u n g s t a n d h a l t e n , ist die P u b l i k a t i o n ein gelungener Beitrag, die Leistung, E n t w i c k l u n g u n d z u k u n f t s t r ä c h t i g e Rolle der Biotechnologie darzustellen. F . Glombitza

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Rolle der einzelnen Komponenten des Cellulasekomplexes bei der Hydrolyse unlöslicher Cellulose KLYOSOV, A . A . 1 , K U D E , J . 2 , GOLDSTEIN, G . C h . 1 , M E Y E R , D . 2

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3

A k a d e m i e der W i s s e n s c h a f t e n der U d S S R A . N . B a c h - I n s t i t u t für B i o c h e m i e , Moskau 1 1 7 0 7 1 Moskau, Leninski prospekt 33, U d S S R A k a d e m i e der W i s s e n s c h a f t e n der D D R I n s t i t u t für B i o t e c h n o l o g i e , Leipzig Permoserstraße 15, Leipzig, 7050 D D R

Summary T h e kinetics of the hydrolysis of microcrystalline cellulose (MC) b y a Trichoderma reesei cellulase c o m p l e x a n d b y t h e individual endoglucanase ( p i 4.4 — 5.2) a n d cellobiohydrolase ( p i 4 . 0 — 4 . 2 ) has been studied. A f l o w chart for the e n z y m a t i c hydrolysis of the cellulose has b e e n revealed, which f o r m e d a basis for a c o m p u t e r s i m u l a t i o n of the kinetic regularities observed. A s a result of it, t h e v a l u e s of the c a t a l y t i c rate c o n s t a n t s for t h e individual stages of the e n z y m a t i c degradation of MC h a v e b e e n calculated. T h e n , the synergistic behaviour of e n d o g l u c a n a s e a n d cellobiohydrolase in the hydrolysis of MC has been described b o t h q u a n t i t a t i v e l y a n d graphically. T h e relative efficiency of t h e individual s t a g e s for the MC hydrolysis in t e r m s of glucose a n d cellobiose format i o n for cellulase c o m p l e x e s of various c o m p o s i t i o n has been calculated. I t was q u a n t i t a t i v e l y s h o w n t h a t cellobiohydrolase p l a y s the k e y role in the MC hydrolysis b y T. reesei cellulase preparations, because it g i v e s u p to 8 0 % glucose a n d u p t o 8 0 — 9 0 % cellobiose in t h e presence of endoglucanase which in turn p l a y s a relatively minor role in a direct f o r m a t i o n of b o t h soluble products of the hydrolysis.

Die Biochemie der hydrolytischen Degradation von Cellulose wird gegenwärtig in vielen wissenschaftlichen Zentren der Welt intensiv untersucht (zu letzten Übersichten siehe [1—4]). Ungeachtet dessen bleibt das anteilige Verhältnis der einzelnen Komponenten des Cellulasekomplexes an der Bildung von Hydrolyseprodukten von Cellulose selbst für die am besten untersuchten Cellulasen von T. reesei weiter unbestimmt. Es ist bekannt, daß bei der Wirkung von Cellulasen aus T. reesei die Bildung von Glucose aus der als Zwischenprodukt entstehenden Cellobiose nicht dominiert, und die Glucose hauptsächlich aus den als Zwischenprodukt entstehenden Cellooligosacchariden gebildet wird [5—7]. Es ist jedoch ungeklärt, welchen Beitrag die Endoglucanase und die Cellobiohydrolyse (CBH) in diesen Prozeß leisten. Bekannt ist, daß die Cellobiohydrolase aus dieser Quelle bei der Hydrolyse der Cellulose sowohl Cellobiose als auch Glucose bilden kann [8—9], aber unklar ist, wie das Verhältnis dieser Produkte zueinander im Verlauf der Hydrolyse ist. Weiterhin ist bekannt, daß die Cellobiose das Produkt der Wirkung von sowohl Cellobiohydrolase als auch Endoglucanase auf Cellulose sein kann [10, 11]. Unklar ist aber, welchen Beitrag beide Komponenten im Verlauf der Reaktion erbringen. Schließlich wurde eine derartige wichtige Erscheinung bei der Wirkung von Multienzymsystemen wie der Synergismus [12—16] in der Literatur praktisch ausschließlich hinsichtlich des Grades der Konversion der Cellulose oder der Konzentration der Hydrolyseprodukte zu

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einem bestimmten Zeitpunkt (d. h. in einem Punkt der kinetischen Kurve) untersucht, während eine Erfassung der Reaktionsprodukte in Abhängigkeit von der Zeit nicht durchgeführt wurde. Damit fehlen Möglichkeiten, den Charakter der Anhäufung von Reaktionsprodukten (lag-Phase, F o r m der kinetischen K u r v e usw.) aufzuzeigen, was für die Bestimmung des Mechanismus der enzymatischen Hydrolyse von Cellulose erforderlich ist. Zur Beantwortung der vorliegenden Prägen reinigten wir den Cellulasekomplex von T. reesei, isolierten aus ihm Endoglucanase und Cellobiohydrolase und studierten die Gesetzmäßigkeiten der Hydrolyse mikrokristalliner Cellulose (MKC) sowohl unter der Wirkung des Ausgangskomplexes einschließlich seiner Komponenten als auch unter der Wirkung eines rekonstruierten Cellulasekomplexes.

Untersuchungsmethoden In der Arbeit wurden sowohl der gesamte aus dem Kulturfiltrat von T. reesei (Produktion eines biochemischen Betriebes, UdSSR) isolierte Cellulasekomplex als auch aus ihm gewonnene Endoglucanase und Cellobiohydrolase genutzt. Die Isolierung und Reinigung des Cellulasekomplexes wurde mit Hilfe der Affinitätschromatografie an zerkleinerten Baumwollinters (GOST 3818.0—72, UdSSR) durchgeführt [17]. Die Ergebnisse der Reinigung sind in Tabelle 1 dargestellt. Der gereinigte Cellulasekomplex besaß eine Endoglucanaseaktivität von 7700U/g Präparat bzw. 11600U/g Protein. Die Cellobiaseaktivität des Präparates betrug 50 U/g, was einem Cellobiasegehalt des Präparates von 0,5—0,05% entspricht. Tabelle 1. Reinigung des Cellulasekomplexes von T. reesei und seiner Endoglucanase Stadium der Reinigung

Kulturfiltrat

Protein

Endoglucanaseaktivität

[mg]

[U/mg Protein]

10000

0,35

gesamte Endoglucanaseaktivität [U]

Ausgang

Reinigungsgrad

[%]

[%]

3500

100

1

Cellulasekomplex nach der Affinitätschromatografie

220

11,6

2555

73

33

Endoglucanase nach der Ionaustausch-Chromatografie

108

22,1

2380

68

63

Zur Isolierung der Endoglucanase und Cellobiohydrolase aus dem gereinigten Cellulasekomplex wurde die hocheffektive Ionenaustausch-Chromatografie an DEAE-Spheron in einer Säule (25 x 300 mm; Pharmacia — Schweden), welche mit 0,1 M Na-Acetatpuffer pH 4,5 ausbalanciert wurde, genutzt. Die Endoglucanase wird unter den gegebenen Bedingungen nicht sorbiert und tritt aus (Abb. 1). Die Cellobiohydrolase wurde im Gradient von NaCl mit gleichem Puffer eluiert (Abb. 1). Das unter diesen Bedingungen desorbierte Protein verfügt über eine geringe Endoglucanaseaktivität, ca. 0,095 U/mg Protein, was einer Beimengung von 0,43% Endoglucanase entspricht, und hydrolysiert amorphe Cellulose unter Bildung von Cellobiose und Glucose. Die isoelektrische Fokussierung in einer Platte aus Polyacrylamidgel zeigte, daß die auf diese Weise gewonnene Cellobiohydrolase zwei Banden mit pl 4,0 und 4,2 und die Endoglucanase fünf Banden mit pl von 4,4 bis 5,2 erbringen. Wie bereits beschrieben wurde [18], gehören die isoelektrischen Punkte 4,0 und 4,2 zu der Minor- und Grundform der Cellobiohydrolase I und die isoelektrischen

KLYOSOV, A. A., KUDE, J. et al., Hydrolyse unlöslicher Cellulose

371

10

200

WO Volumen [ml]

600

Abb. 1. Ionenaustauschchromatografie an DEAE-Spheron 0,1 M Na-Acetat-Startpuffer p H 4,5. Elution mit dem linearen Gradienten (punktierte Linie) von NaCl in gleichem Puffer A — Endoglucanaseaktivität, B — Absorption bei 280 nm (Proteine)

P u n k t e 4,3 — 5,4 (bis zu 6 Formen) zu den Endoglucanasen I und II. DEAE-Spheron 1000, ein Erzeugnis von Lachema, CSSR, weist eine Teilchengröße von25—40 [xm auf. Als Substrate für die Bestimmung der cellulolytischen Aktivitäten wurden Carboxymethylcellulose (CMC) (Serva, BRD) mit einem mittleren Polymerisationsgrad 500—520 und einem Substitutionsgrad von 0,7 und D-Cellobiose (Spofa, CSSR) verwendet. Für den Nachweis der Glucose wurden Peroxydase aus Meerrettich (Reanal, UVR) mit einer Aktivität von 350000—400000 U/g Präparat, Glucoseoxydase der Produktion von NPO-Ferment, UdSSR mit einer Aktivität von 100000 U/g Präparat, Glucose und o-Dianysidin rein zur Analyse (Reachim, UdSSR) verwendet. Für die Untersuchungen der Kinetik der Hydrolyse von Cellulose wurde mikrokristalline Cellulose des Typs L K (Lachema, CSSR) benutzt. Zur Unterdrückung der Cellobiaseaktivität im Reaktionssystem diente ö-Gluconolacton aus der Produktion der Firma Sigma, USA [19]. Die Endoglucanaseaktivität. wurde viskosimetrisch [20] unter Verwendung einer 0,4%igen Lösung von CMC bestimmt. Die Cellobiaseaktivität wurde nach der Methode in [20] bei einer Konzentration von 2 mM Cellobiose bestimmt. Alle Aktivitätsbestimmungen erfolgten bei p H 4,5 und 40 °C (eine Aktivitätseinheit entspricht in allen Fällen der Spaltung 1 ¡xM glucosidischer Bindungen pro Minute [20]). Die Glucose wurde nach der Glucoseoxydase-Peroxydase-Methode [20], die reduzierenden Zucker nach der modifizierten SoMOGYi-NELSOir-Methode [20] bestimmt. Protein wurde nach LOWRY [21] bestimmt. Da unter den Versuchsbedingungen in allen Fällen nur Glucose und Cellobiose als lösliche Produkte der enzymatischen Hydrolyse von Cellulose auftraten [5, 6, 10], wurde die Konzentration der sich im Verlauf der Reaktion bildenden Cellobiose als Differenz der entsprechenden Konzentration von reduzierenden Zuckern und Glucose errechnet. Die Untersuchung der Kinetik der enzymatischen Hydrolyse von MKC wurde bei p H 4,5 (0,05 M Na-Aeetatpuffer) und 40 °C in einer temperierten Zelle von 40 ml Volumen, ausgestattet mit Magnetrührer, vorgenommen. Die erste Probe zur Analyse von reduzierenden Zucker und Glucose wurde dem Reaktionssystem 10 s nach Reaktionsbeginn entnommen. Die folgenden Proben wurden in Intervallen von 2 —10 min so entnommen, daß auf einer kinetischen Kurve mit einer Zeitachse von 120 min nicht weniger als 10—12 Punkte vorhanden waren. Die Proben wurden mit einer Suspension der noch nicht umgesetzten Cellulose entnommen, sofort 10 min bei 100°C zur Inaktivierung der Cellulase inkubiert und bei 8000 U/min 10 min zentrifugiuert. I m Überstand wurde der Gehalt an gesamten reduzierenden Zuckern und Glucose bestimmt. I n einem separaten Experiment wurde nachgewiesen, d a ß die vorhergehende Erwärmung der Proben die Resultate der Bildung von Glucose und reduzierenden Zuckern nicht beeinflußt. Die Konzentration der Enzympräparate im Reaktionssystem wurde im Intervall von 0,01 —1,2 g/1, die Konzentration der MKC im Intervall von 5—50 g/1 variiert. Für die mathematische Bearbeitung der experimentellen Daten der Hydrolyse unlöslicher Cellulose wurde in Relation zu dem Hydrolyseschema ein System von Differentialgleichungen numerisch

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Acta Biotechnol. 6 (1896) 4

nach der KuTTA-MEitsoN-Methode 5. Ordnung integriert. Dabei wurden die Größen der kinetischen Konstanten für die einzelnen Stadien der enzymatischen Hydrolyse durch Minimierung der Fehlerquadrate der berechneten und experimentell ermittelten Anfangsgeschwindigkeiten für die Bildung der Reaktionsprodukte gewonnen (Einwirkung auf MKC sowohl des gesamten E n z y m komplexes als auch der Einzelkomponenten).

Experimentelle Ergebnisse Hydrolyse von MKC unter der Wirkung des Cellulasekomplexes von T. reesei Die Bestimmung der Größe der Michaeliskonstante für die Hydrolyse von MKC unter der Wirkung eines mittels Affinitätschromatografie gereinigten Cellulasekomplexes (siehe Untersuchungsmethoden) wurde in einem Intervall der MKC-Konzentration von 5—25 g/1 vorgenommen. Bei höheren Konzentrationen des Substrates, beginnend bei 35 g/1, wurde eine Inhibierung durch das Substrat beobachtet. Die Bildungskurve von Glucose zeigte eine lag-Phase von 14 min Dauer. Alle folgenden Versuche wurden bei MKC-Konzentrationen von 25 g/1 durchgeführt. Um selbst unbedeutende Einflüsse der im verwendeten Cellulasekomplex vorhandenen Cellobiase (siehe Untersuchungsmethoden) auf die Bildung von Glucose unter der Wirkung von CBH und/oder Endoglucanase auszuschalten, wurde die Kinetik der Bildung von Glucose unter der Wirkung des Cellulasekomplexes in Gegenwart von 4 g/1 (5-Gluconolacton als Inhibitor für die Cellobiase [19] untersucht. Die unter diesen Bedingungen bestimmte Konstante für die Hydrolyse von MKC betrug 50 g/1 und wurde für die mathematische Modellierung der Kinetik der Hydrolyse weiter verwendet. Die Anfangsgeschwindigkeit der Bildung von Cellobiose (Maßeinheit ¡xM/min) unter der Wirkung des Cellulasekomplexes (0,1 g/1) übersteigt die Anfangsgeschwindigkeit der Bildung von Glucose (bei einer Konzentration von 25 g/1, Tab. 2) um das 1,7fache. Unter diesen Bedingungen betrug die Anfangsgeschwindigkeit der Bildung von Glucose (20 ± 1) [xM/min bzw. (12 ± 1) ¡xM/min in Gegenwart von 4 g/1 d-Gluconolacton. Hydrolyse von MKC unter der Wirkung der Endoglucanase von T. reesei Bei der Hydrolyse von MKC (25 g/1) unter der Wirkung von Endoglucanase (0,1 g/1) wurden sowohl Glucose als auch Cellobiose ohne lag-Phase gebildet. Unter diesen Bedingungen betragen die Anfangsgeschwindigkeiten für die Bildung von Glucose (5,2 ± 0,1) p.M/min, von Cellobiose (7,2 ± 0,8) ¡¿M/min. Hydrolyse von MKC unter der Wirkung der CBH von T. reesei Die Kinetik der Hydrolyse von MKC zeigt ein spezifisches Verhalten in Abhängigkeit von der Menge an CBH im Reaktionssystem. Bei verhältnismäßig niedrigen Konzentrationen an CBH (0,05 g/1) wird im Verlauf der gesamten Reaktionszeit (120 min) keine Glucose gebildet. Das einzige Produkt der Hydrolyse von MKC ist dann Cellobiose, welche ohne lag-Phase (bei einer Konzentration von 25 g/1 MKC beträgt die Anfangsgeschwindigkeit 0,85 ¡¿M/min) gebildet wird. Bei Erhöhung der Konzentration der CBH (0,1 g/1) ist eine Bildung von Glucose mit lag-Phase von 15—20 min Dauer (bei einer Konzentration von 10 und 25 g/1 MKC) zu beobachten. I n diesem Fall betragen bei einer MKC-Konzentration von 25 g/1 die Bildungsgeschwindigkeiten für Glucose und Cellobiose entsprechend (1,0 ± 0,1) und (2,6 ± 0,2) ¡xM/min. Auf diese Weise verändert sich bei einer Erhöhung der Konzentration an CBH auf das Doppelte der Charakter der kinetischen Abhängigkeit der Hydrolyse und die Anfangsgeschwindigkeit der Bildung von

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KLYOSOV, A. A., KUDE, J . et al., Hydrolyse unlöslicher Cellulose

Tabelle 2. Die Größen der Anfangsgeschwindigkeiten der Bildung von Glucose und Cellobiose bei der enzymatischen Hydrolyse von MKC pH 4 , 5 ; 40°C Enzympräparat aus T. reesei

Konzentration des Enzympräparates

Konzentration an MKC

[g/1]

[g/1]

Anfangsgeschwindigkeit der Bildung von Reaktionsprodukten [(xM/min] Glucose

Cellulasekomplex

0,1 0,1 0,1 0,1

CBH

0,1 0,05 0,1 0,1

Cellulasekomplex CBH

0,1 0,05 0,1 0,1 0,1 0,2

Cellulasekomplex + Endoglucanase Endoglucanase + C B H

0,1 0,1 0,1 0,01 0,1 0,03 0,1 0,05 0,1 0,1 0,0057 0,05 0,017 0,05 0,028 0,05 0,046 0,05 0,057 0,05 0,076 0,05

5 10 15 25 10 25 25 25

7,4 16 19 20 0,72 0 1,0 5,2

25

22

25

27

25

3.0

25

21

Cellobiose

35 0,85 2,6 7,2

30

36

25

6,4

25

8,5

25

10,6

13,3

25

10,5

14

25

0,37

3,1

25

1,2

3,9

25

1,9

6,3

25

4,5

8,2

25

6,3

25

8,23

10,8

Cellobiose wächst um das 3fache. Das zeigt, daß selbst unbedeutende Beimengungen von Endoglucanase im CBH-Präparat (0,43% Protein, siehe Untersuchungsmethoden) bei Erhöhung der CBH-Konzentration auf 0,1 g/1 die Kinetik der Hydrolyse beeinflussen und zu einem bestimmten Synergismus zwischen zwei Komponenten des Cellulasesystems führen. Dieser Tatsache wurde im weiteren bei der Aufstellung eines Schemas der enzymatischen Hydrolyse von Cellulose Beachtung geschenkt.

Acta Biotechnol. 6 (1986) 4

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Eine Zugabe von (5-Gluconolacton in einer Konzentration von 4 g/1 übt auf die Größe der lag-Phase und die Geschwindigkeit der Bildung von Glucose aus MKC (25 g/1) unter der Wirkung von CBH (0,1 g/1) keinerlei Einfluß aus. Hydrolyse von MKC unter der Wirkung eines mit Endoglucanase komplexes

angereicherten

Cellulase-

Bei Zugabe von 0,1 g/1 Endoglucanase aus T. reesei zu 0,1 g/1 des Cellulasekomplexes gleicher Herkunft verändert sich die Anfangsgeschwindigkeit der Bildung von Glucose aus MKC (25 g/1) praktisch nicht (Tab. 2). Das bedeutet, daß der Hauptweg der Bildung von Glucose unter der Wirkung des Cellulasekomplexes mit vorliegender Zusammensetzung (siehe Untersuchungsmethoden) entweder nicht mit der Wirkung der Endoglucanase verbunden ist, oder die Wirkung der Endoglucanase die Geschwindigkeit der Glucosebildung auf diesem Weg nicht limitiert [5]. Hydrolyse von MKC unter der Wirkung eines mit CBH angereicherten

Cellulasekomplexes

Bei aufeinanderfolgender Zugabe von CBH (0,05, 0,1 und 0,2 g/1) zum Cellulasekomplex (0,1 g/1) tritt eine gewisse Erhöhung der Geschwindigkeit der Bildung von Glucose aus MKC (entsprechend um 10, 35 und 5 0 % siehe Abb. 2A) auf. Analog erfolgt auch eine Vertiefung der Konversion von MKC in lösliche Produkte nach einer Reaktionszeit von 120 min. c E

Cellobiohydrolase

[g-l'1J

Cellobiohydrolase

[g-l~1]

Abb. 2. A — Erhöhung der Anfangsgeschwindigkeit der Glucosebildung bei der Hydrolyse von MKC unter der Wirkung des Cellulasekomplexes von T. reesei (bei konstanter Konzentration von 0,1 g/1) unter Zugabe von CBH (g/l-Abszisse] in das Reaktionssystem. B — Erhöhung der Anfangsgeschwindigkeit der Glucosebildung (1) und Cellobiose (2) bei der Hydrolyse von MKC unter der Wirkung von Endoglucanase (in konstanter Konzentration von 0,1 g/1) unter Zugabe von C B H in das Reaktionssystem Versuchsbedingungen: pH 4 , 5 ; 4 0 ° C ; MKC-Konzentration 25 g/1

Anreicherung der Endoglucanase-Komponente

mit CBH bei der Hydrolyse von MKC

Bei wiederholtem Zusatz von CBH zu Endoglucanase, wobei die Konzentration letzterer konstant gehalten wird (0,1 g/1), ist ein deutlicher (bis 2facher) Anstieg der Geschwindigkeit der Glucosebildung bei der Hydrolyse von MKC zu beobachten (Abb. 2B). Die arithmetische Summe der Geschwindigkeiten (unter Wirkung von 0,1 g/1 Endoglucanase und •0,05 g/1 CBH) beträgt hierbei 5,2 fxM/min, die Geschwindigkeit ihrer gemeinsamen Wir-

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KLYOSOY, A. A., Kude, J. et al., Hydrolyse unlöslicher Cellulose

kung bei diesen Konzentrationen 10,6 [xM/min (der Koeffizient des Synergismus ist 2). Die Geschwindigkeit der Bildung von Cellobiose erhöht sich bei gemeinsamer Wirkung beider Komponenten ebenfalls um fast das Doppelte (Abb. 2B), bei Synergismuskoeffizienten von 1,4 oder 1,65 und entsprechender Konzentration an CBH von 0,1 und 0,05 g/1. Anreicherung der CBH-Komponente

mit Endoglucanase bei der Hydrolyse von

MKC

Oben wurde angeführt, daß bei einer Konzentration von 0,05 g/1 CBH im Reaktionssystem keine Glucose aus M K C (25 g/1) gebildet wird. Jedoch ist bei Zugabe von sehr geringen Mengen Endoglucanase (5 X 10' 3 g/1) in das System eine Glucosebildung (0,37fxM/min) mit einer lag-Phase von 12 — 15 min zu beobachten. Bei nachfolgender Erhöhung der Konzentration der zugegebenen Endoglucanase (0,017 g/1) verkürzt sich die lagPhase auf 7—8 min und bei einer Endoglucanasekonzentration von0,028 g/1 verschwindet die lag-Phase. Die Geschwindigkeit der Glucosebildung betrug in den beiden letzten Fällen entsprechend 1,2 und 1,9 ¡xM/min (Tab. 2).

0

0,02

0,0h

0,06

Endoglucanase

0,08

0,1

ig-l'1]

Abb. 3. Erhöhung der Anfangsgeschwindigkeit äer Glucose- (1) und Cellobiosebildung (2) bei der Hydrolyse von MKC unter der Wirkung von CBH mit konstanter Konzentration (0,05 g/1) bei Zugabe von Endoglucanase in das Reaktionssystem Punkte — experimentell gewonnen. Geraden — theoretisch gezeichnet unter Ausnutzung der katalytischen Konstanten der einzelnen Stadien der Hydrolyse von Cellulose (Schema 1).

Abb. 3 zeigt, wie die Geschwindigkeit der Bildung von Glucose aus M K C bei fortlaufen der Zugabe von Endoglucanase zu CBH, deren Konzentration konstant gehalten wird (0,05 g/1), ansteigt. Es wird deutlich, daß bei grafischer Extrapolation der Endoglucanaseaktivität zu Null, die Geschwindigkeit der Glucosebildung ungeachtet des Vorhandenseins von C B H (in einer Konzentration 0,05 g/1) ebenfalls gegen Null strebt. Das steht im Einklang mit den oben angeführten experimentellen Werten zur Hydrolyse von M K C durch eine CBH. Andererseits beträgt die Geschwindigkeit der Bildung von Glucose aus M K C (25 g/1) unter der Wirkung eines Gemisches von Endoglucanase und C B H der entsprechenden Konzentrationen 0,1 und 0,05 g/1 10,6 fj.M/min, was nur unwesentlich weniger als die Geschwindigkeit bei der Wirkung des gesamten Cellulasekomplexes 12 ¡xM/min (in Gegenwart von 4 g/1