Acta Biotechnologica: Volume 7, Number 4 1987 [Reprint 2021 ed.] 9783112581681, 9783112581674

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Acta Biotechiologica •

^ A ^

Journal of microbial, biochemical and bioanalogous technology

Akademie-Verlag Berlin ISSN 0138-4988 Acta Biotechnol., Berlin 7 (1987) A, 2 9 3 - 3 8 6

Volume 7 • 1987 • Number 4

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Journal of microbial, biochemical and bioanalogous technology

Volume 7

Edited by the Institute of Biotechnology of the Academy of Sciences of the G.D.R., Leipzig and by the Kombinat of Chemical Plant Construction Leipzig—Grimma by M. Ringpfeil, Leipzig and G. Vetterlein, Leipzig

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1987 Number 4

A K A D E M I E - V E R L A G

B E R L I N

"Acta Biotechnologica" publishes original papers, short communications, reports and reviews from the whole field of biotechnology. The journal is to promote the establishment of biotechnology as a new and integrated scientific field. The field of biotechnology covers microbial technology, biochemical technology and the technology of synthesizing and applying bioanalogous reaction systems. The technological character of the journal is guaranteed by the fact t h a t papers on microbiology, biochemistry, chemistry and physics must clearly have technological relevance. Terms of subscription for the journal "Acta Biotechnologica" Orders can be sent — in the GDR: to Postzeitungsvertrieb or to the Akademie-Verlag Berlin, Leipziger Str. 3 - 4 , P F 1233, D D E -1086 Berlin; — in the other socialist countries: to a book-shop for foreign languages literature or to the competent news-distributing agency; — in the FRG and Berlin (West): to a book-shop or to the wholesale distributing agency Kunst und Wissen, Erich Bieber, Wilhelmstr. 4—6, D-7000 Stuttgart 1; — in the other Western European countries: to Kunst und Wissen, Erich Bieber GmbH, General Wille-Str. 4, CH-8002 Zürich; — in other countries: to the international book- and journal-selling trade, to Buchexport, Volkseigener Außenhandelsbetrieb der DDR, P F 160, DDR - 7010 Leipzig, or to the Akademie-Verlag Berlin, Leipziger Str. 3—4, P F 1233, D D R -1086 Berlin. Acta Biotechnologica Herausgeber: Institut f ü r Biotechnologie der AdW, Permoserstr. 15, DDR - 7010 Leipzig (Prof. Dr. Manfred Ringpfeil) und V E B Chemieanlagenbaukombinat Leipzig—Grimma, Bahnhofstr. 3 - 5 , D D R - 7 2 4 0 Grimma, (Dipl.-Ing. Günter Vetterlein) Verlag: Akademie-Verlag Berlin, Leipziger Straße 3 - 4 , P F 1233, D D R -1086 Berlin; Fernruf: 2236201 und 2236229; Telex-Nr.: 114420; Bank: Staatsbank der DDR, Berlin, Konto-Nr.: 6836-26-20712. Redaktion: Dr. Lothar Dimter (Chefredakteur), Martina Bechstedt, Käthe Geyler (Redaktion) Permoserstr. 15, D D R - 7 0 5 0 Leipzig,; Tel.: 2392255. Veröffentlicht unter der Lizenznummer 1671 des Presseamtes beim Vorsitzenden des Ministerrates der Deutschen Demokratischen Republik. Gesamtherstellung: V E B Druckhaus „Maxim Gorki", D D R - 7 4 0 0 Altenburg. Erscheinungsweise: Die Zeitschrift „Acta Biotechnologica" erscheint jährlich in einem Band mit 6 Heften. Bezugspreis eines Bandes 180,— DM zuzüglich Versandspesen; Preis je Heft 30,— DM. Der gültige Jahresbezugspreis für die D D R ist der Postzeitungsliste zu entnehmen. Bestellnummer dieses Heftes: 1094/7/4. Urheberrecht: Alle Rechte vorbehalten, insbesondere der Übersetzung. Kein Teil dieser Zeitschrift darf in irgendeiner Form — durch Photokopie, Mikrofilm oder irgendein anderes Verfahren — ohne schriftliche Genehmigung des Verlages reproduziert werden. — All rights reserved (including those of translation into foreign languages). No part of this issue may be reproduced in any form, by photoprint, microfilm or any other means, without written permission form the publishers. © 1987 by Akademie -Verlag Berlin. Printed in the German Democratic Republic. AN (EDV) 18520 03000

Acta Biotechnol. 7 (1987) 4, 2 9 5 - 2 9 7

Leipziger Biotechnologiesymposium 1986 MEYER, D . , TENCKHOFF, V .

Akademie der Wissenschaften der D D R Institut für Biotechnologie, Leipzig Permoserstraße 15, Leipzig, 7050 D D R

Das Leipziger Biotechnologiesymposium 1986 „Biotechnology of Recycling" wurde vom 14.—18. September 1986 in Leipzig durchgeführt. Veranstalter waren die Gesellschaft für Allgemeine und Technische Mikrobiologie in der Biologischen Gesellschaft der D D R , die Biochemische Gesellschaft der D D R , das Institut f ü r Biotechnologie der Akademie der Wissenschaften der D D R und die Sektion Biowissenschaften der KarlMarx-Universität Leipzig. Der Rektor der Karl-Marx-Universität hatte die Schirmherrschaft übernommen. Mit der Tagung wurde eine Veranstaltungsreihe fortgesetzt, die in Leipzig seit 1973 als Vortragstagung der AG Technische Mikrobiologie, und ab 1982 als Leipziger Biotechnologiesymposium im Zweijahresrhythmus durchgeführt wird. Ausgehend von der Erkenntnis, daß die Vorräte an fossilen Energie- und Kohlenstoffträgern sowie an reichen Erzen in überschaubaren Zeiträumen sich schrittweise verringern werden, hat weltweit die Suche nach neuen Lösungen f ü r die Rohstoffbereitstellung eingesetzt. Schwerpunkt dabei bilden der Einsatz von regenerierbaren Kohlenstoffquellen f ü r unterschiedliche Synthesen von Spezial- bis zu Massenprodukten und die Nutzung armer Erze, Halden, Aschen und Abwässer f ü r die Gewinnung ausgewählter Metalle. Bei beiden Richtungen wird in zunehmendem Maße versucht, die in den entwickelten Industriegesellschaften verstärkt anfallenden Abprodukte einer Wertstoffgewinnung zuzuführen, bei gleichzeitiger Umweltentlastung. Die Entwicklung geschlossener Stoffkreisläufe bei unterschiedlichen Prozessen und Verfahren steht dabei auf der Tagesordnung. Das große Interesse an der Thematik beweist die Teilnahme von über 150 Wissenschaftlern an der Tagung. Darunter befanden sich 30 Fachleute aus der UdSSR, der VR Polen, der VR Bulgarien, der CSSR, der VR Ungarn, Österreich, der B R D und der Schweiz. Das Tagungsprogramm umfaßte 39 Vorträge bzw. Kurzvorträge, eine Posterdiskussion und zwei Rundtischgespräche zu den Themen „Ausbildung und Einsatz von Biotechnologen" und „Cellulase". F ü r das wissenschaftliche Programm der Tagung wurden aus dem umfangreichen Komplex der dargestellten Probleme 3 Schwerpunkte ausgewählt: 1. Biokonversion von Lignocellulosen 2. Mikrobiologische Produktion und Anreicherung von Metallen 3. Biologischer Abbau und Detoxifikation von Abprodukten. 1*

296

Acta Biotechnol. 7 (1987) 4

Lignocellulosenutzung Generell f a n d e n alle Beiträge zur Lignocellulosenutzung das große Interesse der Tagungsteilnehmer. Dies zeigte a u c h die intensive und engagierte Diskussion. Die Biokonversion zu mikrobiellem Eiweiß bei gleichzeitigem S t u d i u m der dabei gebildeten E n z y m a k t i v i t ä t e n bildete gegenwärtig in vielen R G W - L ä n d e r n das Hauptziel der Forschungsarbeiten. W ä h r e n d f ü r die Submersfermentation eine theoretisch beg r ü n d e t e Darstellung zur Leistungsgrenze und zu Möglichkeiten der kontinuierlichen F e r m e n t a t i o n gegeben wurde, fehlte eine solche Betrachtungsweise in den Vorträgen über die Solid-State-Fermentation. I n den Vorträgen zur Cellulasebildung k a m deutlich z u m Ausdruck, d a ß das erreichte hohe Aktivitätsniveau durch Erzeugung und Einsatz phänotypisch optimierter Hochleistungsmutanten bestimmt wird. Skeptisch bis negativ werden zur Zeit die Vorhaben zum Genetic Engineering von Cellulasebildnern beurteilt, da offenbar die Möglichkeiten der klassischen Mutantenerzeugung und Protoplastenfusion mit anschließender Selektion u n d phänotypischer Optimierung noch nicht ausgeschöpft sind. Beim Vergleich des Celluloseabbaues d u r c h Säurebzw. enzymatische Hydrolyse, wurde der Säurehydrolyse eine zeitweise Renaissance eingeräumt, die Z u k u n f t gehört aber dem enzymatischen Abbau. Insgesamt bestätigte sich, d a ß die Cellulaseherstellung u n d -applikation sowie der enzymatische Celluloseabbau von der E n t w i c k l u n g ökonomischer Lösungen a b h ä n g t , auf die die Forschungsarbeit konzentriert bleibt.

Geobiotechnologie I n den Vorträgen wurden Probleme der Metallanreicherung durch Mikroorganismen u n d deren Behandlung zur Metallabtrennung sowie zur T r e n n u n g von Metallgemischen und speziell zur Eisenentfernung behandelt. Das mikrobielle Recycling mineralischer A b p r o d u k t e wurde umfassend vorgestellt. E s wurden sowohl a u t o t r o p h e als a u c h heterot r o p h e Mikroorganismen als Träger dieser Prozesse beschrieben. D e r Einsatz a u t o t r o p h e r Mikroorganismen ist f ü r viele Anwendungsfälle (z. B. L a u g u n g von K u p f e r und Uran) bereits Bestandteil der Technik und über weitere Untersuchungen wird relativ wenig berichtet. Demgegenüber werden gegenwärtig f ü r eine Vielzahl von Metallen die Laugungsmechanismen mit heterotrophen Mikroorganismen u n t e r s u c h t . Von Interesse sind international die Nickelgewinnung und die Aluminiumgewinnung aus Alumosilikaten/Bauxiten sowie die Eisenentfernung aus Kaolin, Ton, L e h m u n d Quarz.

Abpro duktverwertung Die Vorträge u n d Diskussionen zur A b p r o d u k t Verwertung waren neben der Vermittlung von neuen Ergebnissen, insbesondere der praktischen N u t z u n g dieser R e s u l t a t e gewidm e t , was a u c h seinen Ausdruck in der starken Beteiligung von Vertretern aus I n d u s t r i e u n d L a n d w i r t s c h a f t f a n d . Die dargelegten Ergebnisse und Vorstellungen bestätigten die der L i t e r a t u r der letzten J a h r e zu e n t n e h m e n d e Tendenz, die Abwasserreinigung u n m i t t e l b a r einer P r o d u k t i o n s a n l a g e anzuschließen, um die xenobiotischen Abwässer oder Schlämme einer selektiven Degradation mit Mikroorganismen-Spezialisten zu unterwerfen.

M E Y E R , D . , TENCKHOFF,

V., Biotechnologiesymposium

297

Eine sich immer mehr durchsetzende Methode in der Abwasserreinigung ist die Immobilisierung oder Rückhaltung von Mikroorganismen. D a f ü r wurden verschiedene naturwissenschaftliche Ergebnisse vorgelegt und auch apparative Lösungen vorgeschlagen. Dem Management wird in der Abwasserbehandlung international zunehmend Beachtung gewidmet, da durch die Kombination bekannter Verfahren und Lösungswege ohne Eigenentwicklungen schnelle Inbetriebnahmen neuer Anlagen und effektive Verfahren erstellt werden können.

Acta Biotechnol. 7 (1987) 4, 298

Book Review Primary and Secondary Metabolism of Plant Cell Cultures.

K . - H . NEUMANN,

W . BARZ,

E . REINHARD.

Springer-Verlag,

Berlin/Heidelberg/New

York/Tokyo 1985. 377 S. 188 DM Die in-vitro Kultivierung pflanzlicher Zellen und Gewebe h a t sich zu einem rel. eigenständigen Arbeitsgebiet entwickelt, dem wichtige Erkenntnisse auf pflanzenphysiologischem und pflanzengenetischem Gebiet zu verdanken sind. Anwendung in der Praxis haben diese Techniken bisher in erster Linie bei der Pflanzenzüchtung gefunden. Die seit langem angestrebte biotechnologische Nutzung des Synthesepotentials von Pflanzenzellen f ü r eine Fermentor-Produktion von Naturstoffen h a t sich dagegen als recht schwierig erwiesen und steht noch in den Anfängen. Diese Problematik war Gegenstand eines in Rauischholzhausen bei Gießen abgehaltenen Symposiums, das durch die Teilnahme prominenter Fachleute aus international führenden Arbeitsgruppen ausgezeichnet war. Dementsprechend sind die im vorliegenden B a n d publizierten 38 Symposiumsbeiträge durchweg von hohem Niveau und großer Aktualität. I m Vordergrund des Interesses stand auf dem Symposium der Zusammenhang zwischen Primärund Sekundärstoffwechsel pflanzlicher Zellkulturen. In diesem R a h m e n befassen sich zunächst 5 Beiträge mit photosynthetisierenden Zellkulturen. Die nachfolgenden 20 Beiträge sind dem Sekundärstoffwechsel gewidmet. Dabei wird ein breites Spektrum von Stoffen (Anthocyane, Alkaloide, Cardenolide, Kaffeesäure-Derivate, Pyrethrine, Chinone, Sesquiterpene, Phytoalexine, Cancerostatika) hinsichtlich der Biosynthese, des Stoffwechsels und der Nachweisverfahren in den Zellkulturen besprochen. Die Diskussion kreist um das Kardinalproblem der unzureichenden Synthesefähigkeit sehr vieler Zellkulturen. Die Ursachen dafür werden in erster Linie in Genrepressionen und genetischer Instabilität, in der Asynchronie von Zellwachstum und Zelldifferenzierung sowie im relativ geringen Organisationsgrad der pflanzlichen Zellkulturen gesehen. Die Bedeutung des zuletzt genannten Faktors wird bei einigen in-vitro Systemen mit höherem Organisationsgrad (embryoidale Strukturen, multiple Sproßsysteme, Agrobacterium-transformierte "hairy roots") deutlich, die wesentlich produktiver sind. Weiterhin werden die Möglichkeiten der ProtoplastenTechnik zur genetischen Leistungssteigerung von Zellkulturen dargelegt. I m nächsten Abschnitt demonstrieren U L B R I C H und Mitarbeiter (Köln) eine ungewöhnlich hohe Syntheseleistung (Rosmarinsäure im 100 g-Maßstab) mit einer Coleus-Fermentorkultur. Sorgfältige Medien-Optimierung und Einsatz neuartiger Fermentoren werden als Voraussetzung dafür genannt. Möglichkeiten zur Steigerung der P r o d u k t i v i t ä t pflanzlicher Zellkulturen bietet nach den Ergebnissen von L I N D S E Y und Y E O M A N (Edinburgh) auch das bei Mikroorganismen bewährte Verfahren der Zell-Immobilisierung. Weitere Beiträge befassen sich mit der Zellkulturvermittelten Biotransformation billiger Vorstufen zu hochwertigen E n d p r o d u k t e n sowie mit der Gefrierkonservierung der Zellkulturen. E s folgen 3 Beiträge zur hemmenden Wirkung von Aminosäure-Analogen u n d Herbiziden auf den Stoffwechsel pflanzlicher Zellen und den in resistenten K u l t u r e n entwickelten Mechanismen der Vermeidung oder Überwindung dieser Hemmungen. I m letzten Beitrag f a ß t F O W L E R (Sheffield) die erkennbaren Trends bei der auf Stoffproduktion ausgerichteten Kultivierung pflanzlicher Zellen zusammen. Wichtigste Aufgabe der Grundlagenforschung ist hier die Aufklärung der so häufig zu verzeichnenden Blockierung der Sekundärstoffsynthese. In technologischer Hinsicht k o m m t der Weiterentwicklung immobilisierter in-vitro Systeme, der konstruktiven Verbesserung der Fermentoren und der Optimierung der Kulturbedingungen Priorität zu. P . DÖBEL

Acta Biotechnol. 7 (1987) 4, 299—306

Use of Heterotrophic Microorganisms in Mineral Biotechnology GROUDEV, S.

N.

Research and Training Centre of Mineral Biotechnology, Higher I n s t i t u t e of Mining and Geology, Sofia 1156, Bulgaria Paper, presented a t Leipzig Symposium on Biotechnology 1986, Sept. 14 to 18, 1986

Summary A process for biological removal of iron from quartz sands, kaolins and clays was developed in which these industrial minerals were leached a t 90 °C with lixiviant produced as a result of the cultivation of acid-producing heterotrophic microorganisms, mainly strains of Aspergillus niger, a t 30 °C in a nutrient medium containing molasses as a source of carbon and energy. The lixiviant, i.e. the fermentation fluid, contained oxalic and citric acids as main components and after the cultivation was acidified t o a p H of 0.5 b y means of hydrochloric acid. The leaching was carried o u t in mechanically stirred acid-resistant vats for a period of from 1 t o 5 hours. The iron content of some sands treated by this method was lowered from 0.035—0.088 to below 0.012% F e 2 0 3 making t h e m suitable for t h e preparation of highquality glass. The iron content of different kaolins was lowered f r o m 0.65 — 1.49 t o 0.44—0.75% F e 2 0 3 and as a result of this their whiteness was increased from 55 — 87 to 86—92%. The iron content of a clay was lowered from 6.25 to 1.85% F e 2 0 3 and this increased t h e fireproofness of the clay f r o m 1670 to 1750°C. Similar process was used for leaching of aluminium from aluminosilicates, mainly clays and kaolins. However, after t h e cultivation the fermentation fluid was acidified either by means of sulfuric or hydrochloric acid or by means of different mixtures of inorganic acids. For enhancing aluminium solubilization the aluminosilicates were heated before leaching a t 600 —650°C for 1—2 hours. Over 9 0 % of the aluminium present in different clays and kaolins was leached within 3 — 6 hours in this way. "Silicate" bacteria related t o t h e species Bacillus circulans and B. mucilaginosus were used to leach silicon from low-grade bauxite ores containing aluminosilicates as impurities. The bacterial action was connected with the formation of mucilaginous capsules consisting of exopolysaccharides. The solid residues after leaching were characterized by higher values of alumina content and were suitable for processing b y means of the BAYER process for recovering aluminium. Heterotrophic bacteria were used to leach manganese from oxide ores using different organic compounds as reducing agents. D i f f e r e n t heterotrophic microorganisms are w i d e l y used under laboratory conditions for releasing m e t a l s f r o m various mineral raw materials. I n contrast t o t h e a u t o t r o p h i c bacteria, t h e heterotrophic bacteria a n d f u n g i require organic carbon for g r o w t h a n d energy-generation a n d d o n o t derive a n y b e n e f i t f r o m t h e d e g r a d a t i o n of t h e minerals w h i c h occurs because of their presence. T h i s m a k e s t h e heterotrophs less a m e n a b l e for commercial operations t h a n t h e a u t o t r o p h s . H o w e v e r , s o m e leaching processes c o n n e c t e d w i t h t h e a c t i v i t y of different heterotrophic microorganisms s e e m promising for a real application. I n t h i s paper s o m e of t h e s e processes are presented.

300

Acta Biotechnol. 7 (1987) 4

Microbial Removal oi Iron from Mineral Raw Materials The iron oxides contained as impurities in quartz sands, kaolins and clays can greatly lower the quality of these mineral raw materials. Various non-biological methods are used independently or in different combinations to remove the iron. However, some of these methods, e.g. magnetic separation and flotation, are not fit for universal application and their efficiency greatly depends on the properties of the mineral raw material being treated. The chemical methods consisting in leaching with mineral or organic acids and treatment with reducers usually are suitable for achieving a higher extent of iron removal but at the same time they are more expensive, the operating conditions are very difficult, and the processes are environmentally dangerous. The leaching of iron from oxide minerals by means of microorganisms is well-known. Solubilization is connected with the formation of organic acids and other metabolites acting as complexing agents [1], as well as with enzymatic and nonenzymatic iron reduction [2], The ability of microorganisms to leach iron from oxide minerals can be used for the removal of this element from different mineral raw materials containing iron oxides as impurities. Different heterotrophic bacteria and fungi capable of dissolving iron from oxide minerals were isolated from soils, freshwater pipeline deposits and iron ores by using the nutrient medium of B R O M F T E L D with goethite, limonite or hematite as iron substrates [3]. Most of the bacteria were related to the Bacillus and Pseudomonas genera and most of the fungi were related to the Aspergillus and Penicillium genera. The most active strains were also related to these genera (Table 1). The iron was solubilized from limonite more slowly than from goethite but more rapidly than from hematite. Some strains of Bacillus and Clostridium were able to dissolve iron anaerobically but the rates of iron release were lower than those achieved by most strains aerobically. The rates of iron release from the minerals were not constant. The dissolved iron concentration usually fell in some instances after reaching a maximum and this was due to reoxidation and precipitation of Tab. 1. Iron solubilization from limonite, goethite and hematite by means of different microorganisms Microorganism

Limonite

Goethite

Hematite

Iron solubilized for 14 days, [ % ] Aspergillus niger Penicillium sp. Mueor pyriformis Pseudomonas sp. Bacillus sp. Bacillus polymyxa Micrococcus lactilyticus Bacillus circulans Micrococcus sp. Rhodopseudomonas sphaeroide•s Enterobacter cloacae Enterobacter aerogenes Candida lypolitica Escherichia coli

5.1 2.1 2.0 1.9 1.2 1.0 1.0 0.8 0.7 0.6 0.5 0.5 0.3 0.3

8.6 4.4 4.1 3.7 1.7 1.7 1.5 1.2 1.3 1.2 1.0 0.9 0.8 0.7

1.4 1.0 0.9 0.8 0.6 0.5 0.5 0.3 0.3 0.3 0.2 0.1 0.1 0.1

The leaching was performed in agitated flasks containing 45 ml of the BKOMFIELD'S medium, 2 g of iron oxide and 5 ml of inoculum, at 30°C.

301

GROTJDEV, S. N., Mineral Biotechnology

some solubilized iron and/or to adsorption of some iron to the residual mineral. However, the iron concentrations in cultures of some fungi fell only slightly during the cultivation and leaching. This was connected with the reaching a low pH (below 3), which prevented the chemical reoxidation of iron, as well as with the formation of large amounts of secreted complexing agents, which prevented the precipitation of the dissolved iron. No iron was solubilized in the absence of microorganisms. I t was found that the leaching carried out by the most active strains as well as by some other strains was due to the action of their soluble metabolic products, while the chief role of the rest of the strains in solubilizing iron was an enzymatic one. The best results were achieved by microorganisms producing culture solutions in which oxalic and Tab. 2. Removal of iron from sands by means of leach solution containing microbial metabolites Sand,

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

FC»03 content, [ % ]

FE20:L

Before leaching

After leaching

released, [ / 0 ]

0.035 0.045 0.051 0.056 0.056 0.062 0.068 0.071 0.080 0.083 0.083 0.088

0.009 0.008 0.008 0.010 0.016 0.014 0.010 0.009 0.009 0.018 0.014 0.012

74.3 82.2 84.3 82.1 71.4 77.4 85.3 87.3 88.8 78.3 83.1 86.4

citric acids were the main components. A two-stage process was developed in which quartz sands, kaolins and clays were leached at 90°C with lixiviant produced as a result of the cultivation of an appropriate acid producing strain of Aspergillus niger at 30 °C in a nutrient medium containing molasses as a source of carbon and energy. After the cultivation the lixiviant, i.e. the fermentation fluid, was separated from the mycelium by filtration, diluted with water and acidified to a pH of 0.5 with hydrochloric acid. The concentration of organic acids in the solution, i.e. the extent of dilution of the fermentation fluid with water, depended on its intended use. For example, to remove iron from sands, which normally contained less than 0.1% F e 2 0 3 , solutions containing 5 —10g/l organic acids were found to be very efficient. Such solutions were also used for treatment of kaolins, which normally contained about 1% F e 2 0 3 . However, for removal of iron from some rich-in-iron clays the concentration of organic acids was higher than 50 g/1. The extraction efficiency of these solutions was similar to that of solutions containing commercial organic acids of equal molarity. The leaching was carried out in mechanically stirred glass wats for a period of from 1 to 5 hours. The iron content of some sands treated by this method was lowered from 0.035—0.088 to below 0.012% F e 2 0 3 (Table 2) making them suitable for the preparation of highquality glass. The iron content of different kaolins was lowered from 0.65 — 1.49 to 0.44—0.75% F e 2 0 3 (Table 3) and as a result of this their whiteness was increased from 55—87 to 86—92%. The calcium was also removed during the leaching. Such kaolins can be used for the preparation of high-quality china-ware as well as in paper industry.

302

Acta Biotechnol. 7 (1987) 4

The iron content of a clay was lowered from 6.25 to 1.85% F e 2 0 3 (Table 3). The fireproof ness of the clay was increased from 1670 to 1750 °C making it suitable for preparing fireproof materials. Only small amounts of aluminium (about 1%) were leached together with iron from the kaolins and the clay. It must be noted that only the iron not included in the crystal lattice of the minerals is removed by this method. The biological removal of iron can be combined with such conventional methods as flotation and magnetic separation, i.e. prior to leaching, part of the iron is removed by means of flotation or magnetic separation. Tab. 3. Removal of iron from kaolins and clay by means of different microorganisms Mineral raw material

Fe203 content, [ % ]

Fe203 released

Ain content, [ % ]

A1 2 0 3 released

Before leaching

After leaching

[%]

Before leaching

After leaching

[%]

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

1

0.65 0.80 0.91 1.05 1.13 1.16 1.22 1.27 1.32 1.40 1.49

0.44 0.51 0.50 0.44 0.47 0.52 0.55 0.60 0.60 0.68 0.75

32.3 36.3 45.1 58.1 58.4 55.2 63.1 52.8 54.6 51.4 49.7

32.0 34.2 33.5 32.7 32.3 34.3 34.7 32.7 34.1 33.2 35.2

31.7 34.0 33.2 32.3 32.0 34.0 34.3 32.3 33.8 32.9 34.8

0.9 0.6 0.9 1.2 0.9 0.9 1.2 1.2 0.9 0.9 1.1

Clay

6.25

1.85

70.4

33.8

33.2

1.8

Kaolin, Xo.

Microbial Leaching of Aluminium from Mineral Raw Materials Different methods for extraction of aluminium from mineral raw materials are known but the B A Y E R process is the only one which has been widely used on an industrial scale. However, only high quality bauxite ores can be treated by this method and despite some recent modifications, it still presents several shortcomings [4], The geographical distribution on a world scale of the high quality bauxite ores is quite uneven and their reserves deplete rapidly. On the other hand, different aluminiumbearing non-bauxite raw materials such as clays, kaoline, etc. have an almost ubiquitous distribution. Some of them, especially those rich in alumina, can be regarded as aluminium ores. At the present time, the recovery of aluminium from such raw materials is not competitive to that based on the bauxite treatment by the B A Y E R process. This is due not only to their lower alumina content in comparison with that of the bauxites but also to the lack of efficient processing methods. A wide range of microorganisms has been reported to be capable of leaching aluminium from different minerals and rocks, generally through the production of organic acid compounds [5], The organic acid attack on minerals involves both H + ion attack on the mineral matter and chelation of the dissolved metals, with the mechanisms applying to both silicates and non-silicates. The most effective acids seem to be citric and oxalic, though some other acids are also effective in some cases.

GBOITDBV, S. N., Mineral Biotechnology

303

The ability of microorganisms to leach aluminium can be utilized for the extraction of this metal from mineral raw materials, not amenable to treatment by means of the BAYER m e t h o d .

A flow sheet for microbial leaching of aluminium from such mineral raw materials was proposed [6], The flow sheet is very similar to that for microbial removal of iron and includes the follwing major steps : preparation of leaching solution, leaching of aluminium and extraction of aluminium from pregnant solution. The leaching solution was obtained by cultivation of Ian appropriate strain of A. niger capable of producing substantial amounts of citric and oxalic acids under certain conditions. After the cultivation the fermentation fluid was separated from the mycelium by filtration, diluted with water and acidified to a p H of 0.5 either by hydrochloric or sulfuric acid or by a mixture of mineral acids. The mixture contained sulfuric, hydrochloric and phosphoric acids in a volume ratio of 2 : 1: 1. Potassium nitrate was also added at a concentration of 1%. The resulting fluid was used as leaching solution. The concentration of organic acids in the solution depended mainly on the alumina content of the raw material intended for leaching but usually was in the range 50—100 g/1. Different aluminium-bearing raw materials such as clays, kaolins, anorthosites, alunites, etc. were targets for the microbial leaching process. The leaching was performed in acid-resistant reactors with mechanical stirring, at a temperature of about 90 —100 °C. The leaching was performed as batch or continuous process. A counter current leach unit consisting of 2—4 reactors was very suitable. The susceptibility of the different clays to biodégradation was quite different. The dioctahedral clay minerals (kaolinite, halloysite, illite, montmorillonite, etc.) were more stable than the trioctahedral clay minerals (vermiculite, serpentine, chrysotile, genthite, etc.). Chlorites were intermediate in behaviour. The susceptibility was increased considerably by heating the clays and kaolins at 600—650°C for 1—2 hours. This treatment

100

U8 Time [h]

0 100

o

-o Fig. 1. Biological leaching of aluminium and iron from untreated (up) and thermieally activated (down) clay

0

i

u Time [hi

6

304

A c t a Biotechnol. 7 (1987) 4

caused amorphication of the raw material due to the separation of water from the hydroxylic groups in the crystalline structure of clay minerals. The heat treatment not only enhanced the aluminium leaching but also inhibited the iron leaching (Fig. 1). The latter effect was considered very important as iron impeded the subsequent extraction of aluminium from pregnant solution. Under optimum conditions, as much as 90—95% of aluminium was extracted within 3—5 hours from some thermically pretreated clays. The aluminium in the pregnant solution was recovered initially as a precipitate of A l ( O H ) 3 or A1C13 • 6H 2 0 and then as alumina by calcination of these precipitates.

Microbial Removal of Silicon from Low-Grade Bauxite Ores Different strains of "silicate" bacteria were used to leach silicon from low-grade bauxite ores in which the silica connected with alumina in the form of aluminosilicates was the main impurity [7], The strains were isolated from soil and rock samples by using BOGDANOVIC'S nutrient medium and taxonomically were related to the species Bacillus circulans and B. mucilaginosus. The leaching of silicon by these bacteria greatly depended on the way of treatment (Table 4). The bacterial action was connected with the formation of mucilaginous capsules consisting of exopolysaccharides. Tab. 4. B a u x i t e treatment b y means of " s i l i c a t e " bacteria W a y of treatment

Extraction, Si02

Washed cell suspension without glucose and mineral salts

A1 2 0.

3.29

0.09

Washed cell suspension H- 1 % glucose

60.26

12.92

Washed cell suspension + 1 % glucose -f- mineral salts

71.80

14.23

Washed cell suspension + 1 % glucose -f mineral salts + solution replacement

76.43

15.05

Culture solution without cells Spent nutrient medium containing cells ASHBY'S sterile nutrient medium

1.35

1.94

36.87

10.07

0.03

0.01

The leaching was performed in agitated flasks, at 30°C for 10 days. W h e n necessary, the solution replacement b y fresh solution was carried out after the 5th day of treatment.

A continuous leaching process for aluminosilicate biodégradation was developed in which the lag time associated with batch fermentation was eliminated and the inhibition of bacteria by the products of their metabolism was avoided. The leach unit consisted of five vessels of 5 1 capacity each agitated by stirring. Bauxite ore and solution at the required ratio were fed into the first vessel which overflowed to the next and so on. The solution contained the mineral salts of the ASHBY'S nutrient medium and 1% glucose as a source of carbon and energy. The leaching was performed at 30—35°C and the residence time was from 5 to 7 days. The concentrates produced by means of this method were characterized by higher values of alumina content and silicon module

305

GROUDEV, S. N., Mineral Biotechnology

t h a n those produced by the conventional methods (Table 5) and were suitable for processing by means of the B A Y E R process for recovering aluminum. During leaching some alumina went into solution from where the aluminum could be extracted. Tab. 5. Bauxite dressing by means of Bacillus circulans under continuous leaching conditions Product

Recovery [%]

Component, [%]

Extraction, [%]

A1 2 0 3

Si0 2

A1 2 0 3

Ms*

Si0 2

Way of treatment

Bauxite ore

100

43.4

25.9

100

100

1.7

Concentrate Solution

57.6 42.4

63.9 15.5

9.1 48.7

84.8 15.2

20.2 79.8

7.0 0.3

Biological

Concentrate Solution

63.5 36.5

47.9 35.6

21.8 33.1

70.1 29.9

53.4 46.6

2.2 1.1

Flotation

Ms is the silicon module, i.e. the A1 2 0 3 : Si0 2 ratio.

Microbial Leaching oí Manganese from Oxide Ores Different bacteria and fungi capable of leaching manganese from Mn0 2 were isolated from soils, fresh- and seawter pipeline deposites and manganese oxide ores [8]. The different microorganisms leached manganese from an oxide ore containing 31.4% Mn at different rates. The effectiveness of leaching markedly depented upon the way of treatment (Table 6). The leaching by preliminary grown cultures of most saprophytic bacteria (related to the genera Alcaligenes, Bacillus, etc.) was less efficient than the leaching by cultures growing in the presence of the ore being leached but was more efficient t h a n the leaching by culture solutions without biomass. These data denote t h a t these saprophytic bacteria leached manganese mainly by enzymatic reduction using organic compounds, e.g. glucose, as reducing agents. Some metabolites secreted by these bacteria also leached manganese. The best results in this study were achieved by using such microorganisms. Some strains of Bacillus and Clostridium were able to leach manganese anaerobically but a t rates lower t h a n those achieved by most strains aerobically. Some strains of Bacillus leached manganese from ore suspended in liquid media made up with sea water. However, the rates were lower than those achieved by most strains in media made up with fresh water. The leaching by means of the fungi and the rest of the saprophytic bacteria was connected mainly with the action of secreted metabolites. The efficient leaching achieved by means of secreted metabolites (mainly organic acids) gives the possibilitiy to use such microbial strains which are specially selected as producers of organic acids. Furthermore, it is possible to carry out the leaching as a separate stage under such conditions, e.g. high temperature and high pulp density, which are much more favourable for achieving high rates and extents of manganese solubilization t h a n those which are needed for the optimum growth of microorganisms. However, the processing of pregnant solutions which contain manganese dissolved as complexes with organic compounds is more complicated t h a n t h a t of solutions containing free manganese ions. I t appears t h a t microbial strains-producers of organic acids m a y be used to leach high-grade oxide ores in stirred vats, while low-grade oxide ores m a y be leached in dumps or in situ by means of microorganisms possessing the ability to cause enzymatic reduction of Mn 4 + . I t must be noted t h a t some autotrophic bacteria, e.g. Thiobacillus thiooxidans, m a y be also

306

Acta Biotechnol. 7 (1987) 4

Tab. 6. Microbiological and chemical leaching of manganese f r o m oxide ore Microorganism

Nutrient medium

Time of leaching, days

W a y of microbial leaching 1 1

II

Chemical leaching III

Manganese released, % Alcaligenes

sp.

BPB

glucose

14

77.4

51.2

14.1

3.2

Alcaligenes

sp.

BROMFIELD'S

14

63.5

36.1

9.9

0.6

18

16.3

10.9

4.5

3.0

sea water

18

24.5

15.0

4.4

1.2

Nutrient medium [8] with 300 g molasses

14

14.0

24.4

21.9

1.2

14

9.1

16.9

15.2

3.2

Bacillus

sp.

3

+

BPB +

1%

1%

glucose (anaerobically) Bacillus

sp.

TRIMBLE

and

EHRLICH'S

Aspergillus

Pseudomonas

niger

sp.

BPB +

with

1%

glucose 1

— W a y of microbial leaching: I — By means of cultures growing in the presence of ore; I I — B y means of previously grown cultures containing biomass; I I I — By means of biomass-free culture solutions. 2 — The leaching is carried out by the relevant sterile nutrient media. 3 — B P B = Beef-peptone broth. All experiments were performed in agitates flasks, a t 30 °C. used in leaching m a n g a n e s e . O n l y a n e x a c t e c o n o m i c analysis can s h o w w h i c h of t h e possible w a y s for leaching of m a n g a n e s e is t h e m o s t suitable for e a c h concrete e x a m p l e . H e t e r o t r o p h i c microorganisms m a y be used for leaching of copper f r o m rich in carbonat e s ores a n d of g o l d f r o m goldbearing mineral raw materials. I n commercial scale heterotrophs are used t o r e m o v e u s e f u l or h a r m f u l m e t a l s f r o m solutions [9]. References A.: Rev. Bcol. Biol. Sol. 1 1 ( 1 9 7 4 ) , 4 9 9 . A., M A H O N Y , W . B . : Bacterial ferric iron reduction: the involvement of specific enzymes, in G. R o s s i and A. E. TOBMA, Eds., Recent Progress in Biohydrometallurgy, Associazione Mineraria Sarda, Iglesias, 1983, 55. G R O U D E V , S . N . , G K O U D E V A , V . I., G E N C H E V , F. N . , M O C H E V , D . J . , P E T R O V , E . C . : X V International Mineral Processing Congress, Cannes, 1985, vol. I I , Flotation, Hydrometallurgy, 378. HUANG, W. H . : U.S.Patent No. 3958982, 1976. DACEY, P. W., WAKERLEY, D. S., LE R o u x , N. W . : Warren Spring Laboratory Report No. L R 380 (ME), 1981. GROTJDEV, S . N . , G R O U D E V A , V . I . : Workshop on Biotechnology for t h e Mining, Metal-Refining and Fossil Fuel Processing Industries, Troy, NY, May 28 — 30, 1985. GROUDEVA, V. I., GROUDEV, S. N.: Third European Congress on Biotechnology, Munich, September 1 0 - 1 4 , 1984. GROUDEV, S. N., GROUDEVA, V. I . : X V I I I Traditional Scientific Conference on Mineral Processing, Institute of Mineral Processing and Utilization, Cracow, November 21 — 23, 1984. B R I E R L E Y , J . A., B R I E R L E Y , C. L., G O Y A K , G . M.: International Symposium on Biohydrometallurgy, Vancouver, August 21—24, 1985.

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Acta Biotechnol. 7 (1987) 4, 3 0 7 - 3 1 3

Continuous Ethanol Production by Zymomonas mobilis on an Industrial Scale SAHM, H . , BRINGER-MEYER, S t .

Institut für Biotechnologie der Kernforschungsanlage Jülich GmbH, Postfach 1913, D-5170 Jülich, F.R.G. Paper, prepared at Leipzig Symposium on Biotechnology 1986, Sept. 14 to 18, 1986

Summary The specific growth rate of the ethanol producing bacterium Zymomonas mobilis was lower in the presence of oxygen than under anaerobic conditions. Aerobically, considerable amounts of acetaldehyde and acetic acid were formed in addition to the normal fermentation products, ethanol and carbon dioxide. This bacterium contains considerable amounts of pentacyclic triterpenoids, mainly 1, 2, 3, 4-tetrahydroxypentane-29-hopane. It seems that stability and permeability of the cytoplasmic membrane of this rather ethanol tolerant organism is achieved by the hopanoid content. A continuous culture of Zymomonas mobilis produced 60 g/1 ethanol over a test period of 39 days. This strain was used for ethanol production from an enzymatically hydrolyzed wheat starch fraction on an industrial scale of 100 m 3 .

Introduction Ethanol fermentation is mainly limited by end product inhibition which causes a decrease in growth rates of the microorganisms. A main target of ethanol is the cytoplasmic membrane [1] whereas enzyme activities are less affected [2], In Saccharomyces cerevisiae, sterols with an unsaturated side chain in conjunction with multiply unsaturated fatty acyl residues [3], and lipid-sterol-protein complexes [4] have a protective effect against ethanol. Oxygen which is essential for the synthesis of sterols [5] and also for the synthesis of unsaturated fatty acids in yeast renders [6] this organism more ethanol tolerant [7], Among prokaryotes, the Gram-negative bacterium Zymomonas mobilis has recently been found to be a very potent ethanol producer with an ethanol tolerance comparable to that of yeasts [8], It could be demonstrated that the main fatty acids of Zymomonas are: 14 : 0, 16 : 0, and 18 : 1 [9, 10], and the pattern of the phospholipids is typical to those of Gram-negative bacteria [11], BABROW et al. [12] detected the pentacyclic triterpenoids hopene and hopanol in the neutral lipid fraction in this bacterium instead of the sterols occurring in yeasts. Since growth and fermentation proceed preferentially in the absence of air [13] it can be assumed that the synthesis of membrane lipids in Z. mobilis is oxygen-independent. The ability to grow rapidly in the absence of oxygen suggested the use of Z. mobilis in a continuous fermentation process for commercial ethanol production. Initial fermentation experiments were conducted to determine the conditions suitable for stable

308

Acta Biotechnol. 7 (1987) 4

continuous operation. The effects of oxygen at high substrate concentrations, the maximal ethanol concentration accessible under steadystate conditions and the long term stability of the cultures were examined. Finally, an industrial process using Z. mobilis on a 100 m 3 scale was started and results are described.

Materials and Methods Zymomonas mobilis subsp. mobilis (ATCC 29191) was used throughout this work. Cultivation, assay systems, and analytical methods were described previously [14, 15, 16].

Results and Discussion Effects

of

oxygen

Since oxygen has an important influence on yeast and since Z. mobilis is not strictly anaerobic, the growth yields and the products formed were determined in the bacteria culture grown in the absence and presence of oxygen. As shown in Tab. 1, under aerobic conditions considerably more acetaldehyde was formed. Cell suspensious of Z. mobilis showed considerable oxygen consumption when glucose, fructose, or ethanol was added (Q0l = 0.10 — 0.13 (j.mo! • m i n - 1 • mg dry wt _ 1 ). The specific oxygen uptake rates of cells grown anaerobically were similar to those of cells grown under aeration. Therefore, the enzyme responsible for this reaction is probably constitutive. With cell-free extracts of Z. mobilis, an oxygen-dependent oxidation of NADH with a stoichiometry of 2 N A D H : 1 0 2 was measured. This activity is membranebound [17, 14] and, as also observed for whole cells, intracellular oxidase activity was inhibited by cyanide. The cyanide sensitivity of oxygen uptake by Z. mobilis led B E L A I C H and S E N E Z [18] to the suggestion that a complete respiratory chain was present. Presence of a respiratory chain in addition to the protective enzymes, catalase [13] and superoxide dismutase [14] should render Z. mobilis as aerotolerant as yeast or facultative anaerobic bacteria [19]. In fact, however, oxygen inhibits growth as can be judged from its effect on the growth yield (Tab. 1). Since oxygen diverts a part of the reducing power of the organism from its normal metabolic functions, less N A D H is available for the reduction of acetaldehyde to ethanol and therefore acetaldehyde is accumulated (Tab. 1). The oxydation of acetaldehyde by an aldehyde dehydrogenase (aldehyde: NAD + oxidoreductase), present in yeast, Acetobacter, and Pseudomonas [20] could not be demonstrated in the strain of Z. mobilis used in this study. The fact that cell yields of aerated cultures decreased a t high sugar concentrations could be explained by such an incapability of acetaldehyde detoxification.

Tab. i. Influence of oxygen on growth yield and product formation Culture conditions*

Ethanol [g • l"1]

Acetaldehyde [g • l"1]

Growth yield g cell DW mol glucose

Anaerobiosis Aerobioais

63.4 20.1

0.24 1.31

2.3 1.4

* Continuous cultures at D = 0.08 h _ 1 and 14% (w/v) glucose

SAHM, H., BRINGER-MEYER, St., Continuous Ethanol Production

309

Influence of Ethanol Z. mobilis tolerates about the same ethanol concentration as yeast — up to about 12%. So far this one of few bacteria known which are resistant to such high ethanol concentration. The independence of growth of Z. mobilis from oxygen leads to the conclusion that anaerobic mechanisms for stabilization of membranes against ethanol exist in this organism. Pentacyclic triterpenoids, hopanoids, have been proposed to be phylogenetic precursors of steroids, because of their similar structure to steroids, their anaerobic biosynthesis, the simple cyclization reaction of squalene, and their wide distribution in procaryotes [21]. In fact the cell membrane of Z. mobilis was found to contain hopanoids [11, 12, 16]; 1, 2, 3,4-tetrahydroxypentane-29-hopane (THBH) is the major hopanoid component in Z. mobilis [16]. Fig. 1 shows that hopene and THBH

0

J

I

L

10

20

30

Retention time

[mini

Fig. 1. Gas liquid chromatographic hopanoid pattern of Z. mobilis on a OV'/Gas Chrom Q column (0.2 by 180 cm) a t a temperature gradient from 180—300°C at 4°C/min

hopanol were also present in smaller amounts. Continuous cultures of Z. mobilis were used to establish more defined growth conditions for the examination of changes in the lipid patterns of the cells in response to ethanol. As demonstrated in Fig. 2, the contribution of T H B H to the total lipid fraction strongly depended on ethanol, as can be judged from the 8-fold higher relative amount of T H B H at an ethanol level of 63 g • 1 _1 , compared to the value obtained with cells which produced only 5 g • I - 1 ethanol. Likewise, the amounts of hopene and hopanol increased a little with increasing ethanol concentrations. Hopanoids are known to exert a strong influence on the properties of membranes [22], I t was shown that they efficiently condense model membranes by increasing V A N D E E W A A L S forces between lipid molecules [ 2 3 , 2 4 , 2 5 ] , thus diminshing the penetration of small molecules [26]. Our results indicate that this property of hopanoids is advantageous for cells of Z. mobilis living in the presence of high ethanol concentrations as a means to stabilize cell membranes in a culture fluid of increased hydrophobicity. I t seems that hopanoids have similar functions in bacteria as steroids have in yeasts. 2

Acta Biotechnol. 7 (1987) 1

310

Acta Biotechnol. 7 (1987) 4

THBH u

Fig. 2. Hopanoid content of Z. mobilis in anaerobic continuous cultures with different glucose feed concentrations. The dilution rate was 0.08 h- 1 20 Endogenous

Application

W

60 ethanol

80

Cgl'1]

of Zymomonas mobilis on an Industrial

Scale

To eliminate the unproductive lag phase of the batch process, the feasibility of using Z. mobilis for continuous ethanol production was studied. For the evaluation of the long-term stability of anaerobic continuous Zymomonas cultures, fermentations were conducted over several weeks. In Fig. 3, data are given for a 5 1 culture maintained for 39 days at D = 0.07 h - 1 . The concentration of glucose in the effluent solution remained lower than 0.1 g • l - 1 , as long as the product concentration did not exceed 64 g • 1 _1 ethanol. Between 20 and 100 h fermentation, this concentration was exceeded and the conversion of the carbon source was incomplete. Thus, the continuous Zymomonas fermentation is stable as long as end-product inhibition is controlled. After the studies of glucose fermentation in the standard medium containing yeast extract, the production of ethanol from an industrial waste starch fraction was investigated. This starch fraction (B-starch) is formed in the course of the production of glucose syrup from wheat fluor. After separation of the main starch fraction and the gluten, the B-starch remains associated with the bulk of the other nonstarch material of the wheat

mo

Glucose

feed

ooo—o-oo c

120

^ 100

I

80

Ethanol

° 60• ttj O a h0

5

20

0

A

100

Glucose

200

300

WO

500 Time

in

effluent

"T-

600

700

800

900

1000

[hj

Fig. 3. Continuous ethanol production with Z. mobilis at a dilution rate of 0.07 h _ l

311

SAHM, H., BRINGER-MEYER, St., Continuous Ethanol Production

flour (Tab. 2). Since the refining is too costly, the B-starch is discarded and collected together with fibers and wastewater from starch and gluten washings. Therefore, this fraction, which contains 12—13% of the total wheat starch, is a cheap source of glucose for ethanol production. Because this substrate has a high viscosity and contains insoluble fibres, the following experiments were carried out without retention or recycle of the cells. Tab. 2. Composition of B-starch obtained from wheat flour Component

g / 1 0 0 0 of B-starch suspension

Total dry substance Starch Protein Lipids Pentoses

134-150 96-120 9 - 13 2 3 57

Results of continuous fermentations of hydrolyzed B-starch in culture volumes of 5 and 15 1 are shown in Tab. 3. Fermentation without additional mineral salts and pantothenic acid resulted in an incomplete conversion of glucose to ethanol. In the presence of these medium components, 99% of the glucose was consumed at dilution rates of 0.06—0.08 h _ 1 . Under these conditions, the volumetric ethanol productivities ranged from 3.6 to 4.5 g X l - 1 • h _1 . Similar to the previous experiments with a yeast extract medium containing Tab. 3. Data of continuous fermentations of hydrolyzed B-starch with Z. mobilis Fermentation parameters Dilution rate (h - 1 ) Culture volume (1) Glucose feed (g • l - 1 )

B-starch hydrolysate without additions 0.06

0.06

B-starch hydrolysate with medium components 0.07

0.08

4

4

15

15

120.5

123.0

118.5

118.5

Glucose in effluent (g • I" 1 )

44.9

0.30

0.09

0.96

Ethanol in effluent (g • I" 1 )

36.1

60.1

56.8

Ethanol productivity (g • I" 1 • h" 1 )

2.2

3.6

4.0

Ethanol yield (g • g _ 1 )

0.30

0.49

0.48

56.0 4.5 0.47

glucose (cf. Fig. 3) fermentations of the B-starch hydrolyzate could be conducted over several weeks. This showed that, except for pantothenic acid, the B-starch hydrolyzate contains sufficient organic nutrients to replace yeast extract, and that no substances inhibitory to the continuous growth of Z. mobilia are present in the waste starch fraction. Because of the viscous consistence of the B-starch hydrolyzate, a continuous Z. mobilis fermentation without biomass retention was planned for the industrial production of ethanol from this raw material. Fig. 4 shows the process scheme for continuous starch hydrolysis and fermentation. At a concentration of 15—20% (w/v) dry substance, the B-starch slurry is liquefied by the addition of «-amylase (0.15% v/w) at pH 6.0, a tem2*

312

Acta Biotechnol. 7 (1987) 4

Fig. 4. Process scheme for ethanol production from the B-starch fraction of wheat flour.

perature of 90 — 95 °C, and a residence time of 2 h. Saccharification is achieved by the addition of amyloglucosidase (0.15% v/w) at pH 5.0, a temperature of 65 °C, and a residence time of 48 h. After this pretreatment the substrate is fed to a continuous fermentation with an operational scale of 50 m 3 . I t has been possible to conduct this fermentation over time periods of up to 20 days. Problems are caused by pentose-utilizing lactic acid bacteria which are in the substrate stream leaving the saccharification tank. B y heat treatment of the substrate lactic acid formation could be eliminated on a 3 m 3 fermentation scale and reduced to maximum levels of 5—6 g • 1 _1 on the 50 m 3 scale. Further work is in progress to eliminate its formation completely. Using this process with two 50 m 3 fermenters, a daily production of 10 m 3 of 96% (v/v) ethanol can be achieved. Finally, the stillage of the ethanol process is treated in a biogas plant and the biogas produced is used for heating the distillery.

Acknowledgements We wish to thank Prof. R . K . FINN for many valuable contributions, and Ms. Doris RITTMANN and Ms. Marlis KERRES for expert technical assistance. Fermentations of starch hydrolysates were conducted in cooperation with Pfeifer & Langen a t their plant in Dormagen, F . R . G .

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demic Press, New York, London, pp 203 (1963). [21] PORALLA, K.: FEMS Microbiol. Lett. 13 (1982) 131. [22] OURISSON, G., ALBRECHT, P., ROHMER, M.: Scientific American, August, (1984) 34. [ 2 3 ] PORALLA, K . , KANNEBERG, E . , BLUME, A . : F E B S L e t t . 1 1 3 (1980) 107. [ 2 4 ] KANNEBERG, E . , BLUME, A . , PORALLA, K . : N a t u r w i s s e n s c h a f t e n 6 7 ( 1 9 8 0 ) , 4 5 8 .

[25] BENZ, R . , HALLMANN, D., PORALLA, K . , EIBL, H . : Chem. P h y s . Lipids 3 4 (1983), 7.

[26] KANNENBERG, E.: Membraneigenschaften von Hopanoiden und Lipiden, die Fettsäuren mit endständigen Verzweigungen und w-Cyclohexanringen enthalten. Dissertation, EberhardKarls-Universität Tübingen, F.R.G. (1983).

A c t a Biotechnol. 7 (1987) 4, 314

Book Review Population Genetics in Forestry

P r o c e e d i n g s of t h e M e e t i n g of t h e I U F R O W o r k i n g P a r t y " E c o l o g i c a l a n d P o p u l a t i o n

Genetics", held in Gottingen, Aug. 21—24, 1984, Editor: H.-R. Springer-Verlag, Berlin/Heidelberg/New York/Tokyo, 1985, 287 S., 45 Abb:, 70 Tab. 43 DM

G r e g o r i u s .

D a s vorliegende B u c h ist der B a n d 60 der Serie " L e c t u r e Notes in B i o m a t h e m a t i c s " (Managing E d i t o r : S. Levin) u n d ist dem so wichtigen T h e m a der Populationsgenetik in der F o r s t w i r t s c h a f t g e w i d m e t . Diesem T h e m a galt e r s t m a l s ein geschlossenes S y m p o s i u m u n d es wird in 19 Übersichtsarbeiten dieser Themenkreis u m f a s s e n d in F o r m einer B e s t a n d s a u f n a h m e analysiert. I n drei großen H a u p t g r u p p e n v o n Arbeiten beschäftigen sich die A u t o r e n der Beiträge m i t d e n Themenkreisen Z ü c h t u n g von F o r s t b ä u m e n (2 Arbeiten), Mating Systems (10 Arbeiten) u n d der genetischen Differenzierung innerhalb u n d zwischen d e n P o p u l a t i o n e n (7 Arbeiten). Es werden d a b e i sowohl Übersichten gegeben über den gegenwärtigen E r k e n n t n i s s t a n d als a u c h a n h a n d experimenteller Details Möglichkeiten der weiteren B e a r b e i t u n g dieses Gebietes aufgezeigt. Alle A r b e i t e n sind flüssig geschrieben u n d berücksichtigen die L i t e r a t u r bis z u m Z e i t p u n k t der Drucklegung (1984/1985). D u r c h die vielen Tabellen, die klaren Abbildungen u n d eine n u r geringe Zahl a n D r u c k f e h l e r n gewinnt dieser ansprechend a u f g e m a c h t e P a p e r b a c k - B a n d sicher schnell seinen Leserkreis. E r e n t h ä l t eine wertvolle F a k t e n s a m m l u n g u n d sollte d a h e r alle interessierten Wissenschaftler ansprechen. H.-P.

SCHMAUDER

Acta Biotechnol. 7 (1987) 4, 315—322

Eiweißbiosynthese aus Lignozellulose enthaltenden Rohstoffen I l n i c k a - O l e j n i c z a k , 0 . , C z a j k o w s k a , D . , T a r g o n s k i , Z.*

I n s t i t u t f ü r Gährungsindustrie, Abteilung f ü r Technische Mikrobiologie und Biochemie Rakowiecka 36, 02532 Warszawa, Polen *Landwirtschaftliche Hochschule, Lublin, Polen Vortrag gehalten auf dem Leipziger Biotechnologiesymposium 14. —18. September 1986

Summary The object of the presented studies was to determine the conditions of protein biosynthesis from lignocellulosic raw material using filamentous fungi. I t was found t h a t on beet pulp + 50% wheat straw, strain A. niger (A.n./61) shows the highest effectivity of protein biosynthesis. Using this strain, after 48-hour incubation the following results were obtained: increase in protein 4.43 g/100 g DM, daily protein increase coeffizient 2.22 g/100 g DM x 24 h, protein yield (based on the decrease in dry matter) 22.3% and cellulose utilization

'•170/

Upon use of a new strain CEL 2 and milled wheat straw as the substrate, the best results obtained after 74-hour incubation were as follows: increase in protein 1.82 g/100 g DM, daily protein increase coefficient 0.61 g/100 g DM X 24 h, protein yield 15,8% and cellulose utilization 22.0%. For rape straw and strain Sporotrichum pulverulentum, after 192-hour cultivation t h e following results were obtained: increase in protein 5.4 g/100 g DM, daily protein increase coefficient 0.68 g/100 g DM x 24 h, protein yield 14% and cellulose utilization 50.2%.

Einleitung In den Jahren 1981 —1985 wurden im Rahmen des Zentralen Forschungsprogramm P R 4 in Polen Untersuchungen über die Möglichkeit einer Verwertung von Zellulose enthaltenden Nebenprodukten der Landwirtschaft und Lebensmittelindustrie als Viehfutter durchgeführt und zwar nach einer vorherigen Anreicherung mit Pilzeiweiß (Schimmelpilze bzw. Mikropilze). Diesbezügliche Untersuchungen wurden parallel an den Landwirtschaftlichen Hochschulen in Lublin und Poznan sowie im Institut für Gärungsindustrie (IGI) in Warszawa durchgeführt und von dem IGI koordiniert. In diesem Beitrag werden die von den 3 Forschungsgruppen erhaltenen Ergebnisse [1, 2, 3, 4, 5] vorgestellt und diskutiert. Während der ersten Etappe der erwähnten Untersuchungen wurden durch Selektionsarbeiten 16 Stämme erhalten, die sich zur Verpilzung von Zellulose enthaltenden Rohstoffen eigneten. Sie gehörten den Arten Sporotrichum thermophile und pulverulentum,, Trichoderma album, Fusarium sp., Phanerochaete chrysosporium und Aspergillus sp. an und eigneten sich vor allem zur submersen Kultivierung in Medien mit maximal 4% Trockensubstanz.

316

Acta Biotechnol. 7 (1987) 4

Ein ökonomischer Vergleich der submersen Kultivierung und der auf einem festen Medium (Solid State Fermentation) zeigte, daß die submerse Methode weniger effektiv ist. Ein zusätzlicher Vergleich der Submerskultivierung mit der Verhef ung der gleichen Rohstoffe erbrachte ebenfalls einen beträchtlichen Nachteil der Pilzsubmerskultivierung (Reineiweißzuwachsrate 2mal niedriger; der Prozeß dauerte 6mal länger). Interessant dagegen war die SSE mit den o. g. Pilzen. Bei der Anwendung eines Substrates, bestehend aus 80% Abfällen der Getreideindustrie und 20% Rübenschnitzel waren die Rohstoffkosten ca. 5 mal niedriger als bei der Verhefung bei beispielweise Getreidemaische. Aus diesem Grund konzentrierten wir uns während der zweiten Etappe auf die Eeststoffermentation. Zielstellung Das Ziel nachstehender Untersuchungen war die Entwicklung einer Technologie der Eiweißanreicherung von Lignozellulose enthaltenden Nebenprodukten der Landwirtschaft und Lebensmittelindustrie mit Hilfe von meso- und thermophilen SchimmelpilLuftverteiler

Medium

Abb. 2. Schema des Rotationsfermentors 1 - Untergestell, 2 - Behälter (Werkstoff 1H18N9T), 3 - Motor, 4 - Gummirollen des Antriebes, 5 — Belüftungskopf, 6 — Thermometergehäuse, 7 — Manometer

ILNICKA-OLEJKICZAK, 0 . , CZAJKOWSKA, D. et al., Eiweißbiosynthese aus Lignozellulose

317

Als Rohstoffe wurden Rübenschnitzel sowie Weizen- und Rapsstroh eingesetzt. Die Untersuchungen wurden im Labormaßstab in 12 g Substrat enthaltenden Petrischalen, in 200 g Substrat enthaltenden Erlenmeyerkolben oder in einem Mehrfachkultivierungssystem durchgeführt. (Abb. 1) Desweiteren wurden die Untersuchungen in dünner (3—4 cm) und dicker Schicht (ca. 30 cm) und auch in einem Rotations-Bioreaktor (Abb. 2) mit innerem Rührgerät und einer Kapazität von Ü5 1 durchgeführt. Die Kultivierungsparameter waren unterschiedlich, abhängig von Rohstoff und Mikroorganismus.

Ergebnisse Die Selektion der Mikroorganismen wurde nach folgenden Kriterien durchgeführt: — — — —

tägliche Zuwachsrate des Reineiweißgehaltes in 100 g Substrat Trockensubstanz, Zellulose-Utilisation, berechnet auf 100 g TS, Reineiweiß- und Zellulosegehalt im P r o d u k t , verglichen mit dem im Substrat sowie Verhältnis von Reineiweiß zu Zellulose in Rohstoff und Produkt.

Es wurde festgestellt, daß die tägliche Reineiweißzuwachsrate abhängig sowohl von dem benutzten Rohstoff wie auch dem Mikroorganismen-Stamm (Tab. 1) sehr unterschiedlich war. Die höchsten täglichen Eiweißzuwachsraten wiesen die Stämme Cel 2 und A.n. 61 auf. Sie betrugen 3,2 g/24 h • 100 g TS und 2,9 g/24 h • 100 g TS. I m Verlaufe des Prozesses stieg das Verhältnis von Reineiweiß zu Zellulose f ü r S t a m m A.n. 61 von 0,38 auf 0,63 (32 Stunden) oder 0,85 nach 42 Stunden; f ü r S t a m m Cel 2 betrugen diese Werte entsprechend 0,50 und 0,64. Die weiteren Stämme T. albwm und Sp. thermophile erbrachten niedrigere Zuwachsraten. Sie betrug beispielsweise f ü r T. album I, abhängig von der zugesetzten Stickstoff quelle 1,7 oder 1,1 g/24 h • 100 g TS. Der höchste Anstieg Tab. 1. Effektivität der Eiweißanreicherung von Rübenschnitzeln Stamm

Zeit

Reineiweiß Tageszuwachsrate g/24 h • 100 g TS

Reineiweiß .

Substrat

Produkt

Zellulose

in:

Zunahme des Reineiweißgehaltes im Produkt verglichen mit dem Substrat

A. niger A.n.61*

32 42

2,9 1,7

0,38

0,63 0,85

87 87

A. sp. Cel 2*

32 42

3,2 1,0

0,38

0,50 0,64

73 75

72 72

1,1. 1,7

0,28 0,28

0,63 0,97

101 179

T. album. II**

72

0,3

0,28

0,44

21

Sp.

72

1,0

0,28

0,55

77

T. album I** Ca(N0 3 ) 2 -Zusatz NH4H2P04-Zusatz thermophile**

* im Bioreaktor Substrat - 35% TS - 9,7% TS Eiweißgehalt p H - 6,0 Temperatur — 30 °C Belüftung — 4 1/h • 25 g Substrat

** in Erlenmayerkolben Substrat - 19,2% TS 6,3% TS Eiweißgehalt pH - 3 , 5 - 4 , 0 Temperatur — 32 °C (50 °C bei Sp. SZEBIOTKO u . a .

[4]

thermophile)

318

Acta Biotechnol. 7 (1987) 4

des Reineiweißgehaltes im Produkt im Vergleich zum Substrat, wurde f ü r den Stamm T. album I festgestellt. Er betrug 101% und 179% abhängig von der Stickstoffquelle. F ü r die Stämme A.n. 61 und Cel 2 betrugen diese Werte 87% und 73%, aber nach 42 oder 48 Stunden. Die beste Zellulose-Utilisation von 30% wurde f ü r die Stämme A.n. 61 und Cel 2 nach 42stündiger Kultivierung festgestellt. Mit T. album I wurde das gleiche Niveau (aber erst nach 72 Stunden) erreicht (Tab. 2). Zur Steigerung der Effektivität des Prozesses wurden Untersuchungen mit einem Zusatz von Weizenstroh oder 1 bzw. 2% Melasse zu den Rübenschnitzeln durchgeführt (Tab. 3). Der Zusatz von Weizenstroh zu den Rübenschnitzeln erhöhte sowohl den Wert der Zellulose-Utilisation, als auch die Effektivität der Eiweißbiosynthese. Nach 48stündiger Kultivierung betrug die Tages-Reineiweißzuwachsrate 2,2 g/24 h • 100 g TS. Das war zwar um die Hälfte weniger als in der Kontrolle, ging jedoch auf Kosten von 37% der Tab. 2. Utilisation von Trockensubstanz und Zellulose Stamm

A.n. 61 Cel 2 T. album I* mit Ca(N0 3 ) 2 -Zusatz mit NH 4 H 2 P0 4 -Zusatz

Zeit h

Trockensubstanz g/100 g TS

32 42 32 48

24,3 30,0 18,0 30,7

7,6

29,6

72 72

23,5 34,7

7,0 10,4

31,4 47,0

T. album II* Sp.

thermophile*

72

Zellulose g/100 g TS 3,9 7,7 —

/o 15,1 30,0 —

51,4

5,8

26,4

16,2

5,2

23,2

* SZEBIOTKO u . a. [ 4 ]

im Substrat enthaltenen Zellulose (Tab. 4). Das Verhältnis Reineiweiß : Zellulose stieg von 0,2 im Substrat, auf 0,51 im Produkt. Der Eiweißgehalt im Produkt war doppelt so hoch wie im Substrat, der Zellulosegehalt aber um 20% geringer. Befriedigend auch war die Eiweißausbeute, berechnet auf die verbrauchte Trockensubstanz. Sie betrug 22,3%. Der Zusatz von Melasse hatte keinen positiven Effekt auf den untersuchten Prozeß, sowohl in Hinblick auf die Eiweißzuwachsrate als auch auf die Zellulose-Utilisation. Der Stamm A.n. 61 war charakterisiert durch einen verhältnismäßig hohen Eiweißverdauungskoeffizienten von 77% ; sein Eiweiß enthielt 5,91 g/16 g N Lysin, 0,61 g/16 g N Methionin und 4,28 g/16 g N Threonin. (Für Sojaeiweiß betragen diese Werte entsprechend 6,6, 1,1 und 3,9 g/16 g N.) Weitere Untersuchungen wurden mit Raps- und Weizenstroh als Rohstoff durchgeführt. Die besten Ergebnisse wurden nach folgender Vorbehandlung der Rohstoffe erhalten: Weizenstroh wurde in 0,5 cm lange Stücke zerhäckselt und mit 5% NaOH (1 : 1,5) versetzt. Nach 24 Stunden Lagerung bei Zimmertemperatur wurde es 1 Stunde bei 121 °C autoklaviert und bis zu p H 6.1 neutralisiert. Rapsstroh wurde in einer Schlagschrotmühle zerkleinert, dann 20 Minuten lang mit 0,5 N H 2 S0 4 behandelt ( 1 : 4 ) und schließlich 30 Minuten lang bei 121 °C autokla viert. Es wurde festgestellt (Tab. 5), daß unabhängig von dem eingesetzten Rohstoff die Tages-Reineiweißzuwachsrate zwischen 0,51 bis 0,68 g/24 h • 100 g TS schwankte; f ü r A.n. 33/2 betrug sie jedoch nur 0,31 g.

I l n i c k a - O l e j n i c z a k , 0 . , Czajkowska, D. et al., Eiweißbiosynthese aus Lignozellulose

319

Tab. 3. Effektivität der Eiweißanreicherung von Rübenschnitzeln (R) mit einem Zusatz von Weizenstroh (W) 1 : 1 oder 1 bzw. 2 % Melasse (M) Stamm

Zeit

Reineiweißzuwachsrate

Reineiweiß . Zellulose m

h

g/24 h • 100 g TS

R + W

48 72

2.2 1.3

0,2

0,51 0,53

R

22 48

4.4 0,4

0,34

0,50 0,66

72 72 72

1,1 1,3 0,7

0,31 0,28 0,28

0,71 0,73 0,53

Substrat

Produkt

Zunahme des Reineiweißgehaltes im Produkt verglichen mit dem Substrat %

A.n.U* 105 106 65,0 69,2

T. album I** R + 1% M R + 2%M R

* Bioreaktor Substrat: R + W 5 9 % TS 6,9% TS Reineiweiß R 57,4% TS 9,2% TS Reineiweiß pH 5,6-5,8 Temp. 30°C Belüftung 4 1/h • 25 g Substrat

77 102 51

** Szebiotko u. a. [4] Erlenmeyerkolben, Substrat: ca. 2 0 % TS R + 1 % M 6,9% TS Reineiweiß R + 2 % M 6,4% TS Reineiweiß R 6,3% TS Reineiweiß pH 3 , 5 - 4 , 0 Temp. 30°C

Tab. 4. Utilisation von Trockensubstanz und Zellulose Stamm

Zeit h

Trockensubstanz g/100gTS

48 72 22 48 72 72 72

Zellulose g/100gTS

%

19,9 24,3 12,8 35,5

12,7 14,3

36,5 41,1

11,6

43,4

17,5 20,4 9,9

8,1 8,0 6,1

36,5 36,3 27,4

A.n.QX R + W R

T. album I R + 1% M R + 2% M R

—

—

24 h • 100 g TS. Bei Anwendung der Stämme A.n. 33/2 und Cel 2 stieg das Verhältnis Reineiweiß : Zellulose von 0,09 bis 0,15 und 0,17 im Produkt (Bioreaktor, natives Weizenstroh, 74 Stunden). Ein bedeutender Anstieg dieses Verhältnisses von 0,07 bis 0,37 und 0,32 konnte bei Anwendung der Stämme Sp. pulverulentum und Ph. chrysosporium auf Rapsstroh erhalten werden. Der Reineiweißgehalt im Produkt war um 300 bzw. 269% höher als im Substrat, der Zellulosegehalt um 21% bzw. 14% geringer. Die Utilisation der Trockensubstanz (Tab. 6) schwankte zwischen 11,7% — Cel 2 und 27% Sp. thermophile und 27,7% Cel 2 (gehäckseltes Stroh), wobei im Falle des letztgenannten ca. 80% der TS-Zellulose war.

320

Acta Biotechnol. 7 (1987) 4

Tab. 5. Effektivität der Eiweißanreicherung von vorbehandeltem Weizen- und Rapsstroh Stamm

Zeit

Reineiweiß . Zellulose

Reineiweiß Tageszuwachsrate g/24 h • 100 g TS

Substrat

Produkt

Zunahme des Reineiweißgehaltes im Produkt verglichen mit dem Substrat 0/

Weizenstroh * A. niger A.n. 33/2

74

0,31

A. sp. Cel 2

74

0,61

** A. sp. Cel 2

74 168

0,51 0,12

0,09

144

0,58

192 192

0,68 0,66

*** Sp.

thermophile

0,09

0,15

42,0

0,17

65.0

0,15 0,16

66.1 70,5

0,07

0,22

200,0

0,07 0,07

0,37 0,32

300,0 269,0

Rapsstroh *** Sp. Ph.

pulverulentum chrysosporium

* Laborf ermentor : ** Erlenmeyerkolben : *** Petrischalen: * * * : B u j a k u. a. [1]

Substrat TS 38,7%; pH 6,4; Temp. 30°C Belüftung 4 1/h • 25 g Substrat Substrat TS 27,3%; pH 6,1; Temp. 30°C Substrat TS 18%; pH 6,5; Temp. 37 °C Sp. thermophile 45 °C

Tab. 6. Utilisation von Trockensubstanz und Zellulose Stamm

Zeit h

Trockensubstanz g/100 g TS

Zellulose g/100 g TS

/o

Weizenstroh 74 74

12,9 11,7

9,2 9,2

21,8 21,8

A. sp. Cel 2

74 168

15,5 27,7

6,7 13.4

15,8 31,4

Sp.

144

27,0

11.5

27,0

192 192

37,0 32,0

22,6 18,7

50,2 41,6

A. niger A.n. 33/2 A. sp. Cel 2

thermophile

Rapsstroh Sp. Ph.

pulverulentum chrysosporium

Legende wie in Tab. 5 Zur Bestimmung des Einflusses der Kultivierungsmethode wurden Modellproben auf Rübenschnitzeln mit dem Stamm A.n. 61 durchgeführt und zwar in: — dicker Schicht, ca. 30 cm hoch, — dünner Schicht, 3—4 cm hoch und — im Rotations-Bioreaktor mit innerem Rührgerät.

ILNICKA-OLEJNICZAK, O., CZAJKOWSKA, D . e t al., E i w e i ß b i o s y n t h e s e a u s L i g n o z e l l u l o s e

321

Sowohl die Zusammensetzung des Substrates als auch das Inokulum waren gleich, die Belüftungsrate betrug 160-1801/h • 1000 g Substrat. Wie Tab. 7 zu entnehmen ist, unterschieden sich die in Dick- und Dünnschicht-Kultivierungen erhaltenen Ergebnisse nicht. Im Bioreaktor waren sie um ca. 30% niedriger, was vor allem durch Temperaturschwankungen verursacht wurde. Ökonomische Analysen zeigten, daß der mit A.n. 61 auf Rübenschnitzeln durchgeführte Prozeß der vorteilhafteste war. Dabei erhielt man die höchste Eiweißmenge: 0,546 g/h aus 1kg Substrat (die restlichen Varianten 0,047—0,255 g/h); der Rohstoffverbrauch pro kg Reineiweiß betrug 24,4 kg, seine Kosten 167 zl. Für die restlichen Varianten schwankten die Rohstoffkosten zwischen 319 und 415 zl (Verhefung von Kartoffelmaische 336 zl, Getreidemaische 323 zl und Getreideschrot 198 zl). Tab. 7. Einfluß der Kultivierungsmethode auf die Effektivität der Zellulose-Utilisation Kultivierungsmethode

Dickschicht Dünnschicht Bioreaktor (25 1)

Trockensubstanz Abnahme /o

Cellulose-Utilisation

Cellulolytische Aktivität

g

%

CMC-ase U/g TS

42,5 44,5 49,7

16,4 15,8 11,6

61,0 58,7 45,3

116,5 107,0 65,1

Substrat: Trockensubstanz 34,9% Zellulose 26,9% TS

Kultivierungsbedingungen: Temperatur 30 °C Zeit 48 h Belüftung 160 - i 80 1/h • 1000 g

Mit dem gleichen Stamm A.n. 61 und aus Rübenschnitzeln und Weizenstroh (1:1) gemischtem Substrat erhält man aus 1 kg TS 52,4 g Reineiweiß. Würde man beispielsweise die Dickschicht-Methode (Emerskultivierung) und die in dem Betrieb "Pektowin" Jaslo vorhandenen Kultivierungskammern benutzen, könnte man aus 1 Kammer (600 kg Substrat TS), während 1 Charge (48 Stunden), 31,5 kg Reineiweiß erhalten. Für 1 Mastschwein benötigt man täglich 57 g Reineiweiß. Das bedeutet, daß man mit der erhaltenen Eiweißmenge ca. 11000 Schweine mästen könnte (bei einem 5%igen Zusatz des durch die Feststoffermentation erhaltenen eiweißangereicherten Produktes zur Futterration) oder 5500 Schweine bei einem 10%igen Zusatz. Die Angaben sind Hochrechnungen der Ergebnisse des Labormaßstabes. Um exakte technische und ökonomische Analysen vornehmen zu können, ist der Prozeß im halbtechnischen Maßstab zu erproben.

Literatur [1] BUJAK, St. u. a.: Auswahl der Pilzstämme für die Eiweißbiosynthese aus Zellulose des Rapsstrohs in Abhängigkeit von seiner Vorbehandlung. Dokumentation der Landwirtschaftlichen Hochschule, Lublin, 1985. [2] CZAJKOWSKA, D., HORNECKA, D.: Einfluß verschiedener Kultivierungsmethoden auf festen Medien auf die Eiweißbiosynthese aus zellulosehaltigen Substraten mit Hilfe von Schimmelpilzen. Dokumentation des IGI, Teil 01-1984, Teil 02-1985.

322

Acta Biotechnol. 7 (1987) 4

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Acta Bioteohnol. 7 (1987) 4, 323—325

Einfluß der Aufbewahrungsmethode auf die Stabilität der biotechnologischen Eigenschaften von Zellulose utilisierenden Pilzen HORNECKA, D . , CZAJKOWSKA, D . , ILNICKA-OLEJNICZAK,

0.

Institute of Fermentation Industry, Department of Technical Microbiology and Biochemistry Rakowiecka 36, 02532 Warszawa, Poland Vortrag gehalten auf dem Leipziger Biotechnologiesymposium 14. —18. September 1986

Summary The influence of long-term storage on the stability of the cellulolytic enzyme and protein biosynthesis ability, was determined. Microorganisms belonging to genera Aspergillus, Fusarium, Penicillium, Sporotrichum, Allescheria and Mucor were used. The strains were stored on wort agar slants, on SAUNDER'S medium and on a medium according to MANDELS-WEBER, under paraffin oil or without it. After 3 years storage no influence of the storage method on the biosynthesis of cellulolytic enzymes (strain A. niger 33/2 and 33/20) was found. A systematic increase in the cellulolytic activity was exhibited by strains A.n. 33/2 and A.n. 33/20 on wort agar (40 and 98%, respectively) and on SAUNDER'S medium (79 and 66%, respectively), as well as by the new strain CEL 2 on Saunder's medium without paraffin oil.

Zielstellung D a s Ziel der obigen Arbeit war die Auswahl eines hochaktiven, Cellulasen synthetisierenden Aspergillus niger Stammes, sowie die B e s t i m m u n g der Stabilität dieser biotechnologischen Eigenschaft in Abhängigkeit von der A u f b e w a h r u n g s m e t h o d e .

Methoden Die Selektion aktiver Monokulturen — aus dem S t a m m A.niger (AM./33) — wurde mit Hilfe eines von uns entwickelten Schnell-Tests d u r c h g e f ü h r t [2], welcher auf dem Verhältnis des Durchmessers der Klarzone (R) (SAUNDEBS-Medium mit Glycerin und kolloidaler Zellulose) zu dem der Kolonie (r) beruhte. Bei einem R / r 1,32 b e t r u g die A k t i v i t ä t der Endo-l,4-beta-glukanase ca. 14,1 E / c m 3 (Abb. 1). Die aktiven Monokulturen wurden auf Würzeagarschrägröhrchen unter P a r a f f i n ö l (oder ohne Öl), sowie auf SAUNDERS-Medium a u f b e w a h r t . Die Fähigkeit z u r E n d o - 1 , 4 beta-glukanase-Synthese wurde submers, in Schüttelkulturen, in einem Medium n a c h B E R N A T [1] untersucht (V x = 10.99%), bei 30°C und in einer Zeit von 84 bis 88 S t u n d e n . Die E n z y m a k t i v i t ä t wurde mittels der viskosimetrischen Methode ermittelt (V x = 6,63%).

324

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1,0

8

10 12 % 16 18 Cetlulolylische Aktivität iE/cm3]

Abb. 1. Beziehung zwischen B/r und der cellulolytischen Aktivität

Ergebnisse

Als Ergebnis der ersten Selektionsstufe wurden 100 Monokulturen erhalten, welche sich durch eine gesteigerte Cellulasensynthese charakterisierten. Während der weiteren Selektion wurden 12 Monokulturen gewonnen, deren Aktivität — im Vergleich mit dem Mutterstamm A.n./33 von 41 bis 156% gesteigert war (Abb. 2). Diese 12 Monokulturen wurden bis zu 48 Monaten auf den verschiedenen Medien aufbewahrt. In Abb. 3 wurden die erhaltenen Ergebnisse am Beispiel von 4 Monokulturen dargestellt. E s wurde festgestellt, daß die Monokulturen A.n./33/2 und A.n./33/20 sich durch eine gute Stabilität der Cellulasensynthese auszeichneten und zwar auf allen Medien. Sie zeichneten sich durch eine positive Autoselektion aus, ausgedrückt durch einen Anstieg der Endo-l,4-beta-glukanase Aktivität während der ersten 24 Monate. Im Falle der Monokultur A.n./33/20 — auf Würzeagar — stieg sie von 11,6 bis 21,3 E/cm 3 an, also um 8 4 % , auf Würzeagar unter Paraffinöl dagegen bis zu 26,7 E/cm 3 , um 130%. Die späteren, geringen Aktivitätsschwankungen waren im Bereich der Fehlergrenze. Ähnlich verhielt sich die auf dem SAiwDERS-Medium aufbewahrte Monokultur, deren Aktivität nach 42 Monaten 19,7 E/cm 3 betrug. A.n./33

1

A.n./33/.

~]

A.n./33/6

I

A.n./33/7

I

A.n./33/1S

I

A.n./33/20

~l

A.n./33/7/1

1

A.n./33/7/2

~1

A.n./33/7/3 A.n./33/7/

I

4

I

A.n./61

l

A.n. /61/1

.

~~l

Cet. 2 0

4

8

12

Abb. 2. Aktivität der Monokulturen 16

Cellulolytische Aktivität

20 lE/cm3]

325

HORNECKA, D., CZAJKOWSKA, D., Zellulose utilisierende Pilze

&

Anfangsaktivität

m

Bewahrungsmethode Wurieagar

m

Würieagar

unter

m

Saunders-Medium

Paroffinöl

Abb. 3. Einfluß von Zeit u n d Aufbewahrungsmethode auf die Biosynthese der cellulolytisehen E n z y m e

Durch eine gute Stabilität der untersuchten Eigenschaft charakterisierte sich die Monokultur A.n.¡33/2 und zwar unabhängig von der Bewahrungsmethode. Die Endo-1,4beta-glukanase Aktivität stieg bis zu 21,0 E/cm 3 an, also um ca. 75%. Eine geringere, aber auch noch befriedigende Stabilität wiesen die Monokulturen A.n./ 33/7/2 und Aw./33/7/4 auf dem SAUNDEKS-Medium auf. Der Aktivitäts-Anstieg betrug 27% und 37%. Würzeagar war zu ihrer Aufbewahrung nicht geeignet. Die auf dem Saunders-Medium aufbewahrten Stämme A.n.¡33/15 und A.n./?>?>/() wiesen — nach anfangs verminderter Aktivität — einen langsamen Anstieg auf (um 15% und 10%). Die Monokulturen A.n./33/7, A.n./33p/l, A.n./33/lß, A.n./ßl und A.n./ßl/l waren labil und so als Produktionsstämme ungeeignet. Schlußfolgerungen — Die Aufbewahrungsmethode der zu industriellen Zwecken angewandten Mikroorganismen sollte individuell ausgewählt werden, unter Berücksichtigung nicht nur der Überlebensrate des Stammes, sondern auch der jeweiligen zu schützenden Eigenschaft. — Zur Aufbewahrung von hochaktiven, Csllulasen synthetisierenden Aspergillus niger Stämmen eignete sich das SAUNDEKS-Medium am besten; von den 12 untersuchten Monokulturen wiesen 8 einen Anstieg der Cellulaseaktivität auf. — Die auf dem Verhältnis R/r basierende, schnelle Selektionsmethode (SAUNDERSMedium mit Glycerin und kolloidaler Zellulose) eignet sich zur Selektion aktiver, Cellulasen synthetisierender Stämme. Die Aktivität der 12 Monokulturen war um 41% bis 156% höher als die des Mutterstammes. Literatur [1] BERNAT, J. A.: D o k u m e n t a c j a pracy. Otrzymywanie preparatow celulolitycznych. Warszawa 1972. [ 2 ] HORNECKA, D . , IILNICKA-OLEJNICZAK, 0 . , SOLAK, G . : P r a o e I n s t , i L a b . B a d P r z . S p o z . 1 9 8 3 ,

t . 37, s. 7 3 - 8 8 . 3

Acta Biotechnol. 7 (1987) 4

Acta Biotechnol. 7 (1987) 4, 326

Book Review Biotechnology in Agriculture and Forestry 2 Crops I Ed. Y.P.S. BAJAJ/Springer-Verlag Berlin/Heidelberg/New York/Tokyo 1986, 144 Abb., 608 S., 348 DM Im 2. Band zu „Biotechnology in Agriculture and Forestry" wird erstmals über die Anwendung biotechnologischer Methoden für die Erhöhung der Getreideproduktion berichtet. Grundlage aller Betrachtungen ist die genetische Manipulation in Verbindung mit der Zellkulturtechnik. Mit der Beeinflussung der genetischen Information sind sowohl Veränderungen hinsichtlich der Ertragssteigerung bei bestehenden Pflanzen als auch die Kreation neuer Pflanzen und neuer Getreidearten möglich mit kurzen Vegetationszeiten, hohen Ernteerträgen und Widerstandsfähigkeit gegenüber Krankheiten und Umwelteinflüssen. Das vorliegende Buch bringt umfangreiche Zusammenfassungen von Literaturerkenntnissen, verbunden mit praktischen Erfahrungen bei in vitro Vermehrungen. Es umfaßt 33 Kapitel, die sich mit Getreidepflanzen, mit Gemüsepflanzen und Leguminosen sowie mit einigen potentiellen neuen landwirtschaftlichen Getreidearten beschäftigen. Sehr ausführlich wird im Buch auf Verbesserung der Eigenschaften von Weizen und Reis eingegangen. Die Vielzahl der Autoren widerspiegelt dabei die Vielfalt des Eigenschaftsspektrums, das sich biotechnologisch bzw. genetisch verändern läßt. In Sektion I I I werden in sechs Kapiteln Neuzüchtungen näher betrachtet, wobei eindeutig der große Fortschritt gegenüber bisher genutzten Getreidearten erkennbar wird. Das Buch ist besonders Forschern auf dem Gebiet der Getreidezüchtung, aber auch Genetikern und Biotechnologen mit Spezialrichtung Zellkulturtechnik sowie allen mit der Anwendung biotechnologischer Methoden in der Landwirtschaft verbundenen Wissenschaftlern zu empfehlen. R . PÄTZ

Acta Biotechnol. 7 (1987) 4, 3 2 7 - 3 3 0

Wachstumskinetik von Aspergillus niger A.n./61 in einem festen Medium CZAJKOWSKA, D . , ILNICKA-OLEJNICZAK,

0.

Institute of Fermentation Industry, Department of Technical Microbiology and Biochemistry, Rakowiecka 36, 02532 Warszawa, Poland Vortrag gehalten auf dem Leipziger Biotechnologiesymposium 14.— 18. September 1986

Summary Growth kinetics of Aspergillus niger strain A.n.¡61 on a solid medium containing beet pulp were examined. Solid state fermentation was carried out in laboratory microfermenter (aerated packed columns). During the experiments the C0 2 evolution, protein biosynthesis, as well as cellulose and sucrose utilization were determined. It was found that C0 2 evolution evidently increased in the logarithmic phase, together with the protein biosynthesis. Between 30 —32 h of culture C0 2 evolution and protein content in product were the greatest. Subsequently, C0 2 evolution decreased. During 28 h of culture, cellulose was slightly utilized, the strain using mainly sucrose. Intense utilization of cellulose was paralleled by a drop in C0 2 evolution.

Zielstellung Das Ziel der Untersuchungen war die Bestimmung der Wachstuniskinetik von A.n.j61 in einem festen Medium mit Rübenschnitzeln als alleinige Kohlenstoffquelle, sowie ein Vergleich der Wachstumskurve von A.n./dl mit der des auf einem Medium aus Roggenschrot und Rübenschnitzeln wachsenden Stammes Aspergillus oryzae A.or./11. Methoden Mikroorganismen Angewandt wurden der Zellulose zersetzende Stamm Aspergillus niger A.n./ßl sowie der Stärke hydrolysierende Stamm A.or.j\ 1. Die als Inokulum benutzten Konidien stammten aus 7 — 10 Tage alten Züchtungen auf Würzeagar. Das Inokulum betrug 7—9 108 Konidien pro 100 g Medium. Nährmedien Der Stamm A.n./dl wurde auf einem nur aus Rübenschnitzeln bestehenden Medium gezüchtet, der Stamm A.or./il dagegen auf einem aus 80% Roggenschrot und 2 0 % Rübenschnitzeln bestehenden. 3*

328

Acta Biotechnol. 7 (1987) 4

Zu beiden wurde 2,1% Stickstoff (60% (NH 4 ) 2 S0 4 + 40% Harnstoff) sowie 0,7% Phosphat (KH 2 P0 4 ) dazugegeben. Gezüchtet wurden die Pilze in einem Bioreaktor (Abb. 1). Während der ganzen Zeit wurden die C0 2 -Bildung, die Eiweißbiosynthese sowie der Verbrauch der im Medium enthaltenen Trockensubstanz und der Polysaccharide bestimmt. (Abb. 1, Abb. 2, Abb. 3)

Abb. 1. Bioreaktor zur Züchtung von Pilzen in einem festen Medium

WO 26,7

. 90

Ol

80

o o

• 10

70

60

— ^ 16

2k Zeit

32 Chi

Abb. 2. Wachstumskinetik von Aspergillus niger A.n.¡dl in einem festen Medium aus Rübenschnitzeln. • Eiweiß • C0 2 O pH • Trockensubstanz • Zellulose A Saccharose

CZAJKOWSKA, D . , ILNICKA-OLEJNICZAK, O.,

Wachstumskinetik von A.n.¡61

329

Abb. 3. Wachstumskinetik von Aspergillus oryzae A.or./i 1 in einem festen Medium aus Roggenschrot und Rübenschnitzeln • Eiweiß • C0 2 O PH • Trockensubstanz p totale Polysaccharide

Analytische

Methoden

B e s t i m m t wurden : — Trockensubstanz, — der Rein-Eiweißgehalt gemäß K J E L D A H L nach vorheriger E n t f e r n u n g des Mineralstickstoffes und nach Prezipitation des löslichen Eiweißes mit 5 % TCA (N-ges X 6,25), — totale Polysaccharide, kolorimetrisch mit D N S , nach 3stündiger Säurehydrolyse bei 100 °C, — Saccharosegehalt = (Zucker nach Inversion — reduzierende Substanzen) X 0,95. Der Zuckergehalt nach Inversion wurde kolorimetrisch mit DNS, nach 5 Minuten langer Säurehydrolyse bei 68—70°C bestimmt.

Schlußfolgerungen 1. Bei beiden S t ä m m e n d a u e r t e die P h a s e der intensiven Eiweißbiosynthese und C0 2 Bildung ea. 22 Stunden. Unterschiede bestanden in der D a u e r der Gleichgewichtsphase, d. h. der Zeit der höchsten C0 2 -Bildung bei gleichbleibendem Niveau der Eiweißzuwachsrate-Netto. Sie d a u e r t e im Falle des S t a m m e s A.n.¡61 ca. 10 S t u n d e n , f ü r S t a m m a.or.j 11 dagegen n u r 2—4 S t u n d e n . Bei beiden S t ä m m e n war die P h a s e der sich vermindernden Eiweißzuwachsrate-Netto mit einer sinkenden C0 2 -Bildung verbunden. 2. Die Biomassesynthese von verlief in der intensiven P h a s e auf K o s t e n der leichter assimilierbaren Polysaccharide des N ä h r m e d i u m s , u. a. der Saccharose. Die Zelluloseverwertung begann erst in der Gleichgewichtsphase und scheint also ein sekundärer Prozeß zu sein.

330

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3. Zwischen dem Eiweißgehalt und der Menge des entstandenen C02 besteht eine wesentliche positive Korrelation, welche durch folgende Regressionsgleichungen ausgedrückt werden kann (Abb. 4):

7

A.n.,61

= 1,483 X C02 + 0,323

(r = 0,994 « = 0,05)

= 1,146 X C02 - 0,002

(r = 0,995