Acta Biotechnologica: Volume 7, Number 2 [Reprint 2021 ed.] 9783112581520

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Acta BiotecMigica Journal of microbial, biochemical and bioanalogous technology

Akademie-Verlag Berlin ISSN 0138-4988 Acta Biotechnol., Berlin 7 (1987) 2 , 1 0 1 - 2 0 6

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Acta Blottdrntoiica Journal of microbial, biochemical and bioanalogous technology

Edited by the Institute of Biotechnology of the Academy of Sciences of the G.D.R., Leipzig and by the Kombinat of Chemical Plant Construction Leipzig—Grimma fe

y

M. Ringpfeil, Leipzig and G. Vetterlein, Leipzig Editorial Board: P. Moschinski, Lodz A. Moser, Graz M. D. Nicu, Bucharest Chr. Panajotov, Sofia L. D. Phai, Hanoi H. Sahm, Jülich W. Scheler, Berlin R. Schulze, Halle B. Sikyta, Prague G. K. Skrjabin, Moscow M. A. Urrutia, Habana J . E. Zajic, El Paso

1987

A. A. Bajev, Moscow M. E. Beker, Riga H. W. Blanch, Berkeley S. Fukui, Kyoto H. G. Gyllenberg, Helsinki G. Hamer, Zurich J . Hollo, Budapest M. V. Iwanow, Moscow F. Jung, Berlin H. W. D. Katinger, Vienna K. A. Kalunjanz, Moscow J . M. Lebeault, Compiegne D. Meyer, Leipzig

Number 2

Managing Editor:

L. Dimter, Leipzig

Volume 7

AKAD EMI E - V E R L A G

BERLIN

"Acta Biotechnologica" publishes original papers, short communications, reports and reviews from the whole field of biotechnology. The journal is to promote the establishment of biotechnology as a new and integrated scientific field. The field of biotechnology covers microbial technology, biochemical technology and the technology of synthesizing and applying bioanalogous reaction systems. The technological character of the journal is guaranteed by the fact that papers on microbiology, biochemistry, chemistry and physics must clearly have technological relevance. Terms of subscription for the journal "Acta Biotechnologica" Orders can be sent — in the GDR: to Postzeitungsvertrieb or to the Akademie-Verlag Berlin, Leipziger Str. 3 - 4 , P F 1233, DDR -1086 Berlin; — in the other socialist countries: to a book-shop for foreign languages literature or to the competent news-distributing agency; — in the FRG and Berlin (West): to a book-shop or to the wholesale distributing agency Kunst und Wissen, Erich Bieber OHG, Wilhelmstr. 4—6, D-7000 Stuttgart 1; — in the other Western European countries: to Kunst und Wissen, Erich Bieber GmbH, General Wille-Str. 4, CH-8002 Zürich; — in other countries: to the international book- and journal-selling trade, to Buchexport, Volkseigener Außenhandelsbetrieb der DDR, P F 160, DDR-7010 Leipzig, or to the Akademie-Verlag Berlin, Leipziger Str. 3—4, P F 1233, DDR -1086 Berlin. Acta Biotechnologica Herausgeber: Institut für Biotechnologie der AdW der DDR, Permoserstr. 15, DDR - 7050 Leipzig, (Prof. Dr. sc. Manfred Ringpfeil) und VEB Chemieanlagenbaukombinat Leipzig—Grimma, Bahnhofstr. 3 - 5 , 7240-DDR Grimma, (Dipl.-Ing. G.Vetter lein). Verlag: Akademie-Verlag Berlin, Leipziger Straße 3 - 4 , PF 1233, DDR-1086 Berlin; Fernruf: 2236201 und 223 6229; Telex-Nr.: 114420; Bank: Staatsbank der DDR, Berlin, Konto-Nr.: 6836-26-20712. Redaktion: Dr. Lothar Dimter (Chefredakteur), Käthe Geyler (Redakteur), Permoserstr. 15, DDR-7050 Leipzig; Tel.: 2392255. Veröffentlicht unter der Lizenznummer 1671 des Presseamtes beim Vorsitzenden des Ministerrates der Deutschen Demokratischen Republik. Gesamtherstellung: VEB Druckhaus „Maxim Gorki", DDR-7400 Altenburg. Erscheinungsweise: Die Zeitschrift „Acta Biotechnologica" erscheint jährlich in einem Band mit 6 Heften. Bezugspreis eines Bandes 180,— DM zuzüglich Versandspesen; Preis je Heft 30,— DM. Der gültige Jahresbezugspreis für die DDR ist der Postzeitungsliste zu entnehmen. Bestellnummer dieses Heftes: 1094/7/2. Urheberrecht: Alle Rechte vorbehalten, insbesondere der Ubersetzung. Kein Teil dieser Zeitschrift darf in irgendeiner Form — durch Photokopie, Mikrofilm oder irgendein anderes Verfahren — ohne schriftliche Genehmigung des Verlages reproduziert werden. — All rights reserved (including those of translation into foreign languages). No part of this issue may be reproduced in any form, by photoprint, microfilm or any other means, without written permission from the publishers. © 1987 by Akademie-Verlag Berlin. Printed in the German Democratic Republic. AN (EDV) 18520 03000

Acta Biotechnol. 7 (1987) 2, 1 0 3 - 1 0 9

Production of Single-Cell Protein with Cellulomonas sp. on Hempstalk Wastes JEDER, H . , DESCHAMPS, A. M . * , LEBEAXJLT, J . M.

Université de Technologie de Compiègne Division des Procédés Biotechnologiques 60206 Compiègne Cedex, B. P. 233, France

Summary Strains of Cellulomonas isolated from enrichment cultures with cellulose powder were cultivated with hempstalk wastes as the sole carbon source in a mineral medium. The yields of protein were not significantly different using the crude or alkali pretreated substrate in flasks experiments. Up to 12.5% protein was obtained on the untreated substrate with the best strain cultivated in a small fermenter.

Introduction Several papers have been published these last few years on the utilization of bacteria for prodution of SCP from lignocellulosic wastes in aerobic cultures. Bacteria have a faster growth and a higher rate of proteins than fungi. Most of the recent papers published concerned strains of the genera Cellulomonas [1—3], Pseudomonas [4] or complex undefined mixed cultures [5] but the genus Cellulomonas is generally considered as the best cellulolytic one [6]. Bacteria of this genus can degrade microcrystalline cellulose [7] as well as fungi, but also hemicelluloses [8] with high yields of protein, over than 5 5 % [9] of the dry weight. A process has been developed and patented for valorisation of bagasse with this bacterium [10]. Some interesting results have been also reported for mixed cultures of Cellulomonas with Trichoderma sp. [9], Bacillus subtilis [11] and Xanthomonas sp. [12]. I t was suggested that the Cellulomonas bacteria require some growth factors such as biotin and thiamin provided by the other microorganism in mixed cultures [12]. No toxicity was found by the different authors during feeding experiments with rats [2, 10]. Several other genera of cellulolytic bacteria have been recently reviewed [13] including several Bacillus which are also known as producers of a wide range of polysaccharide hydrolases [14]. In some previous papers we reported the isolation of hemicellulolytic strains of Bacillus [15] and Cellulomonas [16] from decaying bark and wood or compost samples. These strains were cultivated as pure cultures on hempstalk wastes in preliminary experiments for SCP production. The hemp (Cannabis sativa vulgaris) is a major culture in some parts * Author to whom reprints must be requested.

1*

Acta Biotechnol. 7 (1987) 2

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of France for production of special papers, particleboard, bird-feeding, fishing, cattle litter and feeding. The stalk of hemp is an abundant waste and a good cellulosic substrate for cultivation of microorganisms. This paper reports the preliminary experiments obtained with bacteria grown on hempstalk wastes in shaken flasks and bench-scale fermenters. Materials and Methods Bacterial

Strains

Strains identified as Cellulomonas sp. (C 16, C 19, C 28, C 29) except strain C 6 identified as C flavigena [16] were isolated from enrichment culture using cellulose powder (WHATMAN n° 3) as the sole carbon source in a mineral medium [17]. Frequent sterile dilutions and fast agitation prevented the growth of protozoa at the beginning of the enrichment. Strains X 9 (Bacillus circulans) and X 12 (Bacillus coagulans) have been previously described [15]. Substrate The mean composition of the hempstalk waste and the methods utilized were as follow (on a dry weight basis): 16% hemicelluloses [18], 50% cellulose [19], 25% lignin [20] and 9 % as ashs. The chemical hydrolysis (pretreatment) was obtained by leaving for 3 days 20 g of hempstalk in one liter of 2.5 N NaOH at 35 °C. The hydrolysate was glass-filtered, washed several times to neutrality and dried at 50 °C. Cultures The mineral cultivation medium was composed of [g/1]: NaCl, 3; (NH 4 ) 2 S0 4 , 2; K 2 H P 0 4 , 1; K H 2 P 0 4 , 1; CaCl2, 00.5; MgS0 4 , 0.05; yeast extract, 0.1; hempstalk (crushed and dried), 20. The pH was adjusted to 7.0 before autoclaving (25 min, 121 °C). This medium was also used with agar to check the growth of the strains with different wood components. Cultures were realized in 500 ml baffled flasks with 100 ml of medium on a rotary shaker (200 rpm) at 40 °C for 7 days. The strain C 28 was cultivated in a 2 liters jar fermenter (Biolafitte) with the same cultivation medium (1.2 1 of broth), agitation of 300 rpm, 35°C and aeration (air, 1 vvm). Analytical

Procedures

Samples of fermentation broth were analyzed daily after centrifugation (10,000 rpm, 15 min). The reducing sugars were estimated in the supernatant by a dinitrosalisylic method [21] and expressed as OD 545 . The pellet was dried overnight at 105 °C and was used for the percentage of crude protein which was obtained by the difference between total nitrogen and mineral nitrogen (as N X 6.25) using a modified micro-KJELDAHL procedure [22]. Enzymatic

Activity

Carboxymethyl-cellulase (CMCase) was measured by the release of glucose [23] from CMC (WHATMAN) and expressed as international units (u. Mole of glucose released per minute). Results Nutritional

Capacities

of the Different

Strains

T h e seven strains selected for this investigation were checked for their capacity to assimilate the different wood components. The results (Table 1) showed that each strain was highly efficient on cellulose-azure [24] but no strain utilized kraft-lignin or pectin (Sigma). Four strains were also able to assimilate xylan (Fluka).

JEDER,

H.,

DESCHAMPS,

A. M. et al., Single-Cell Protein from Hempstalk Wastes

105

Table 1. Nutritional characters of the seven strains selected for growth on hempstalk waste Pectin

Lignin

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

—

Strain

Cellulose

Xylan

X 9 X 12 C6 C 16 C 19 C 28 C 29

+ + + + + + +

+ + —

+ +

Growth on Crude Hempstalk Wastes Cultures were realized in the conditions described earlier in shaken flasks. The remaining reducing sugars and protein concentrations were compared for the seven strains (Table 2). The best results were obtained with four Cellulomonas strains (C 16, C 19, C 28, C 29) selected for more precise investigations. The best yield was obtained with strain C 28 (5.4% protein) and a low content of reducing sugars. No relation was found Table 2. Growth of the different strains on crude ground hempstalk (seven days of incubation) Strain

X 9 X12 C6 C 16 C 19 C 28 C 29

Standard mineral medium Protein [%]

Reducing sugars [OD 545 ]

2.3 1.5 2.1 4.9 5.1 5.4 5.5

0.159 0.314 0.072 0.075 0.262 0.021 0.084

between the protein and the sugar values. The kinetics of protein production and reducing sugar (RS) content with the four best strains (Fig. 1) showed that the R S content decreased rapidly in strains C 16, C 28 and C 29, but was quite constant in the culture C 19. The protein content increased rapidly the first 3 days and remained quite stable or increased slowly the 4 following days. Growth and Protein Production on Pretreated Hempstalk Cultures in shaken flasks were realized with 2% pretreated hempstalk as the sole carbon source, and analyzed every day for protein production and RS content. The kinetics obtained (Fig. 2) were slightly different. The protein content increased regularly for a longer time (4 to 5 days, except 3 days with C 29) and did not increased afterwards. The protein content was higher with each strain compared to cultures on crude waste. The best yields were obtained with the strain C 28 (7.4% protein). In this case the RS content was very low because of the procedure followed (washing the residue several times with water). After a short increase the first day, the RS decreased the second day and increased once again the next days, in three of the cultures (except C 28). This kind

106

Acta Biotechnol. 7 (1987) 2

0.5

0.3

X/" •

0.1

S

0.5

y.—•

•Q CC

0.1 0 6 Time [d ]

t

I

1

Fig. 1. Production of proteins and reducing sugars content in cultures of Cellulomonas strains on untreated hempstalk (A: strain C 16, B : C 19, C: C 28, D: C 29; protein [%], c - reducing sugars [OD M5 ]).

Fig. 2. Production of protein and release of reducing sugars in cultures of Cellvlomonas strains on pretreated hempstalk (legend see Fig. 1; A — CMCase was checked for strain C 19 and expressed as [IU/ml]).

JEDER, H., DESCHAMPS, A. M. et al., Single-Cell Protein from Hempstalk Wastes

107

of depression was investigated by R O D R I G U E Z and VOLFOVA [ 1 ] and interpreted as a first degradation of hemicelluloses followed by a derepression of the cellulolytic enzyme system after the second day resulting in an accumulation of reducing sugars from hydrolyzed cellulose. One strain, C 19, checked for carboxymethylcellulase showed no activity during the days 1 and 2, and a rapid increase during the following days that explained the increase of the RS content. The absence of "depression" in the R S content with the strain C 28 could be the result of a lack of repression, the RS increased as soon as the first day of incubation (the strain was not further analyzed). This strain C 28 also showed the higher yield of protein obtained in these experiments. Such conclusions were also suggested from cultures on pretreated sugarcane bagasse of Cellulomonas sp. [1]. Protein Production with Cellulomonas C 28 in Jar Fermenter The strain C 28 was grown in 2 1 fermenter with 2% (w/v) untreated ground hempstalk. The inoculum was a 12 h old exponential culture of the same strain cultivated in the mineral medium with glucose (1%) as the carbon source. The final volume of culture

0

2

3 h 5 Time id 1

6

7

0

Fig. 3. Protein production and reducing sugar content in j a r fermenter culture of Cellulomonas C 28 on untreated hempstalk (legend see Fig. 1).

was 1.2 1. The pH was not controlled and decreased slowly from 7.0 to 6.7 after 7 days of cultivation. The reducing sugars content decreased (Fig. 3) for three days and remained quite constant. The growth and protein production increased rapidly to a maximum after 3 to 4 days of cultivation. The protein content reached 12.3% on day 3 and 12.5% on day 4 and remained at this level. The same kind of growth was obtained during repeated experiments. Discussion and Conclusions The results reported in this paper with new isolates of Cellulomonas show that this bacteria is well adapted to botanical environments and is a suitable tool for biotechnological processes of bioconversion of lignocellulosics. Some strains of Bacillus isolated in the same time were not so efficient despite of their polysaccharide-hydrolysing capacities.

108

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The alkali pretreatment of hempstalk waste did not increase significantly the yield of protein obtained with the Cellulomonas bacteria to use such a pretreatment in a largescale process according to the equipment and time needed for this hydrolysis. The pretreatment was useful to analyze the diauxic growth of the bacteria in presence of small amounts of reducing sugars at the beginning of the culture except with strain C 28. The yields of protein were not improved when the nitrogen content (as ammonium sulfate) was increased in the cultivation medium. Some other nitrogen sources were checked but were poorly used by the bacteria. These experiments were not developed in this paper but confirmed the results published in the different papers mentioned in the introduction section. The fairly good yields of protein obtained during these preliminary experiments with pure cultures should be increased in mixed cultures according to the fact that smaller yields of protein were reported in the literature with Cellulomonas strains alone [1, 9], A smaller yield (10.5%) was reported for mixed cultures of Cellulomonas sp. and Alcaligenes faecalis [27]; the same yield was obtained with C. flavigena and Xanthomonas sp. [25] but was more recently increased to 1 8 % with the same strains [12]. According to the lignin content (25%) of this lignocellulosic waste and the results published in a previous paper [16] which showed the synergistic ability of these strains of Cellulomonas to degrade bark chips in mixed cultures with lignolytic strains of Bacillus in order to delignify substantially the substrate and increase the access of the cellulases to cellulose, further mixed cultures now in progress should increase the protein yields to demonstrate the feasibility of such a bacterial process.

Acknowledgement This research was supported by funds of the "Agence Régionale pour l'Information Scientifique et Technique" (ARIST), Champagne-Ardennes. Received June 19, 1986

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Book Review Bruce J.

WEST

An Essay on the Importance of Being Nonlinear Lecture Notes in Biomathematics, Vol. 62 Berlin, Heidelberg, New York, Tokyo: Springer-Verlag, 1985. 204 S., 36DM Wenn Peter H A C K S in seiner „Urpoesie" schreibt: „Solange eine Entdeckung noch nicht in unterhaltender Form vorgetragen werden kann, ist sie auch noch nicht wissenschaftlich", so ist diesem B. J . W E S T ' S Essay verpflichtet. Wissenschaft ist immer noch auch Naturphilosophie, betrieben aus ihrer Geschichte heraus. Das mathematische Modell ist eben nicht nur ein praktisches Werkzeug, sondern Abbild des Maßes an Verständnis, das wir f ü r das Objekt der jeweiligen Wissenschaft entwickelt haben. B. J . W E S T läßt in wohl geordneter, aber doch lockerer F o r m all die Dinge an uns vorüber ziehen, die es offenbar machen, daß die Welt eben nicht linear (oder anders gesagt: nicht ganz so einfach) funktioniert, wie es N E W T O N S Physik und G A U S S ' Statistik voraussetzen. Der Bogen spannt sich von Datenanalyse, Statistik über Fragen der Irreversibilität, fractale I r r f a h r t e n und Wachstumsmodelle bis zum deterministischen Chaos. Sicherlich liest sich der von einem Physiker verfaßte Text f ü r den Fachkollegen leichter als f ü r den Biologen oder Mediziner. B. J . W E S T behält aber doch einen Grad der Allgemeinverständlichkeit bei, der das Buch auch f ü r den Fachfremden als Essay lesbar bleiben läßt. Da Spekulationen und Unbewiesenes nicht fehlen, wird der Leser sicher an manchen Stellen widersprechen. Ich denke, er t u t B. J . WEST damit einen Gefallen. Wenn trotz der Freude, die der Essay stiftet, etwas kritisch bemerkt werden soll, dann das: Manche Abbildungen sind wohl doch etwas zu sehr „Lecture Notes", eine bessere grafische Gestaltung h ä t t e ihren Wert erhöht. Auch die im Inhaltsverzeichnis versprochenen Computerprogramme wird der Leser vergeblich suchen. Biotechnologie befaßt sich mit lebenden, also sehr nichtlinearen Systemen. Wird sie mit linearem Denken betrieben, setzt man ihr Grenzen, die ihrem Wesen nicht entsprechen. "An Essay on the Importance of Being Nonlinear" beantwortet keine biotechnologischen Fragen, aber er zeigt, in welcher Richtung neue Antworten liegen. T h . BLEY

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Selection o! Distiller's Yeasts with Particular Respect to non-Saccharomyces Strains LAUBE, K . 1 , WESENBERG, J . 1 , LIETZ, P . 2

1

2

VEB Getrankekombinat Neubrandenburg, Stamrabetrieb Ihlenfelderstr. 142, Neubrandenburg, 2000 D D R VEB Kombinat Spirituosen, Wein, Sekt Alt-Stralau 54/55, Berlin, 1017 D D R

Summary The investigations demonstrate that in addition to Saccharomyces also strains Candida and Hansenula can be used for ethanol production. Their efficiences are at the standard level and the first phase of fermentation is considerably accelerated with results in suppression of bacterial contamination in cold mashing. In the future efficiency optimisations will be expected based on mixed strain populations as well as on technological improvement. Furthermore, genetic modifications present actually a real prospect to secure "made-to-measure' strains for special processes of corn mash fermentation.

In 1985 the world production of ethanol came up to 46% from cereals (rye, wheat). The average yield was 1 hi from 310 kg of corn. The present international level corresponds to 66 1 of ethanol from 100 kg of starch what gives a fermentation efficiency of 92.4%. The mentioned yields can be achieved only in a low-pressure degradation process using a suitable substrate. Corn should be a good enzyme source and have a low starch hydrolysis resistance at about 57 °C (cold mashing). Corn which does not meet these requirements causes a yield loss of about 3% in comparition to thermomechanical degradation processes and needs an elevated temperature (68 °C) and a higher enzyme dosage. The latter deficiency can be compensated only partially because of complex inhibitory effects present in the corn. Due to the incomplete degradation an increase of viscosities is observed as well as a fermentation delay coupled with the risk of bacterial contamination and incomplete saccharification. The ethanol fermentation is considerably influenced also by the nature of yeast. In addition to the conventional distiller's yeasts of the genus Saccharomyces, other yeasts are suitable for ethanol production, e.g. other genera, thermotolerant and modified yeasts from which optimum industrial strains have been developed through selection and genetic manipulation. Their advantages are: high degradation degree of substrate into fermentable sugars, favourable fermentation rate and yield of ethanol, high tolerance to ethanol and other metabolic products at elevated temperatures etc. [1—3]. Strain Selection The collection of strains was of biological origin and came from the Ernst Moritz Arndt University of Greifswald, Department of Biology, Section of Industrial Microbiology and Genetics, from Kombinat Spirituosen, Wein, Sekt, Department of Research and

112

Acta Biotechnol. 7 (1987) 2

Development, from the Humboldt University of Berlin, Department of Food Technology, Section of Microbiology and from VEB Getränkekombinat of Berlin. Among the strains were species of Saccharomyces, Candida, Hansenula, Pichia, and Schizosaccharomyces.

Strain Efficiency On the basis of literature data [4, 5] it was possible to divide all the strains in three efficiency categories (Table 1). This simplified classification allows to predict their suitability grade for ethanol production at elevated fermentation temperatures. If the sum of the efficiency categories remains low, these species are the best for use (Table 2). Table 1. Efficiency categories Parameter

Categorie 1

2

Carbohydrates

Glucose, maltose, sucrose, raffinose

Main sugars are not fermented or low amylolytic activity

Ethanol formation

Able to reach the theoretic value (in relation to glucose)

Theoretic value not achieved or fermentation delayed

Slow

Optimal growth temperature [°C]

> 40

37

< 37

3

Table 2. Strains and their efficiency categories Microorganism

Carbohydrates

Ethanol formation

Growth temperature

Sum

Schizosaccharomyces Sacch. cerevisiae* Sacch. uvarum* Sacch. diastaticus* Candida Hansenula Pichia

1 1 1 2 2 2 2

1 1 1 1 2 3 3

1 2 2 2 1 2 2

3 4 4 5 5 7 7

* According to [6] these species belong to

Saccharomyces cerevisiae

Methods Among investigations of strain specific parameters such as cell surface, dry matter and nitrogen content we determined the efficiency of fermentation including its dynamics and the spectrum of fermentable carbohydrates and by-products. Additionally serological methods were used. Errors of these methods are given in Table 3.

113

L a u b e , K., W e s e n b e r g , J. et al., Yeasts for the Distillery Table 3. Errors of the test methods Investigation of

Method

Error [ % ]

Morphology

Estimation of cell size

20

Propagation

Cell counting

20

Biomass

Estimation of dry matter

20

Fermentation curve

Fermentation test (laboratory)

Fermentation efficiency

Method of H l a v a c e c (modified)

Fermentable carbohydrates

Gas chromatography

Formation of by-products

Gas chromatography

Serological differentation

6.5 15 10 4 (esters, alcohols) 15 (volatile fatty acids) 15 (vicinal diketons)

Agglutination Immunofluorescence (Sandwich-method)

10 1

Table 4. Cultivation schema Growth in culture tube I Plating on worth agar I Incubation (30°C, 48 h) I Decantation (10 ml of steril tap water) I Addition to 100 ml of corn mash (15%, centrifugated, tyndalized) Standardization of cell number (107 cells • ml - 1 ) Incubation (30° C, 48 h) i Cultivation (to 300 ml of yeast mash in 16 h) I Centrifugation and washing (3 times with 3 % NaCl) Addition of Na 2 HP0 4 /KH 2 P0 4 -buffer ( p H 5) I Standardisation of cell size (22 • 10» [xm2 • ml- 1 )

I

Cultivation (to 300 ml of yeast mash in 16 h) Centrifugation and washing (3 times with 3 % NaCl)

i

Addition of Na 2 HP0 4 /KH 2 P0 4 -buffer ( P H 5) . Y

Estimation of dry matter — N-content — fermentation efficiency by the modified HLAVACEC-method

Standardisation of cell number (40 • 106 cells • ml" 1 ) JFermentation test in corn mash with chloroamphenicole (8 mg • l-i)

Acta Bioteohnol. 7 (1987) 2

114 Cultivation

The first selection step was the cultivation. Strains which grew slowly in corn mash were not submitted for further experiments. The cultivation of the standard baker's yeast was optimized (Table 4), so the lag-phase was shorten from 6 to 1 h. All the strains were cultivated according to this schema, except of slowly growing Schizosaccharomyces. The preculture (liquid culture) age was of great importance for special investigations. After 16 h of cultivation a relatively homogeneous material was obtained during the exponential growth phase. Periodical comparisions of strain-specific characteristics on different days indicate that differences in well-adapted strains were within the errors of the test methods used. Only these strains which grew slowly in rye mash showed some difficulties. Efficiency Parameters of the Standard Yeast The standard yeast was Saccharomyces cerevisiae strain which has properties given in Table 5. Searching for mathematical relations we found a correlation between the ethanol yield and the dry matter. However, there was no correlation between the cell surface and the ethanol production. The nitrogen content affected the product yield negatively (r = —0.71). The formation of by-products did not depend on nitrogen compounds present but there was a small correlation between the cell surface and the by-product yields (r = 0.73). A very slight positive trend was observed for the ethanol and byproduct formation. I t is to mention that lactic acid produced by bacteria had a positive effect on the ethanol yield (r = 0.64). Table 5. Efficiency parameters of the standard Saccharomyces cerevisiae strain Product

Ethanol after 72 h [1/100 kg starch] By-products [mg • l - 1 ]: Ethylacetate Propanol-1 2-Methylpropanol-l Amylalcohols Diacetyl n-Valeric acid Lactic acid

Yields in rye mash at 30 °C

30 °C autosugared

37 °C non-adapted

68.1 ± 2.6

51.0 ± 1.3

50.7 ± 4

27 ± 57 ± 163 ± 142 ± 0.4 ± 185 ± 184 ±

8 45 57 61 0.1 50 90

Strain-specific Characteristics Fermentation results are shown in Table 6. In order to keep them reproducible the cell surface was maintained in suspension at 22 • 10 8 jxm2 • ml" 1 . The comparisons of cell surface, dry matter, and nitrogen content of the standard strain with those of other strains show a specific qualification of Saccharomyces, Candida and Hansenula for the ethanol fermentation. These results agree with theoretical predictions, except of Schizosaccharomyces.

LAUBE, K . , WESENBERG, J .

115

et al., Yeasts for the Distillery

Table 6. Comparison of strain-specific qualities Parameter

Quality

Strain

Cell size

> Standard

Sacch. diastaticus 14 Candida tropicalis 94 Candida tropicalis 545

Dry matter

< Standard

Sacch. cerevisiae (IfG 5775) Sacch. diastaticus 14

N-content

Si Standard

Sacch. cerevisiae (IfG 5775) Sacch. diastaticus 14 Hansenula sp. 582

Fermentation Efficiency The fermentation efficiency is the most important criterion for the strain evaluation. For the standard strain it corresponds to a value of 25 ¡ul C0 2 during the first and 185 [A C0 2 • mg HTS" 1 • h" 1 after the third hour. The elevation of cultivation temperature from 30 to 37.8 °C resulted in a 4.5-fold rise of fermentation efficiencies in the first and in a 3.5-fold rise in the third hour. This indicates how sensitive are the strains to temperature changes. All the results for the selected thermoadapted strains are given in form of efficiency diagrams in Figures 1—3.

0

20

U0

60

80

100

120

H0

160

180

Time [min] Fig. 1. Fermentation efficiency of Saccharomyces cerevisiae (standard). n = 20

In comparison with the standard strain lower fermentation rates were observed, associated with great yield variations. In Fig. 1, representing the efficiency dynamics of the standard at 30 °C the reproduction of results is characterized by the tolerance degree s of 20 generations on 10 different test days. Fig. 2 and 3 compare the efficiencies between the tested strains. Saccharomyces diastaticus and Saccharomyces sp. IfG 5775 were not well-adapted, but with their 71 and 56% of the standard efficiency still interesting for large scale use. Candida tropicalis was also of particular interest because of its superior efficiency in the period from 60 to 120 min. However, the fermentation efficiency gives informations on the actual physiological state of yeast the substrate, so only limited yield predications can be made.

116

Acta Biotechnol. 7 (1987) 2

Fig. 2. Fermentation efficiency i — Standard, 2 — Saccharomyces cerevisiae (IfG 5775), 3 — Saccharomyces tiens 14

diasta-

Time [ min 1 Fig. 3. Fermentation efficiency. 1 — Standard, 2 — Candida tropicalis 545, 3 — Candida tropicalis 94, 4 — Hansenula sp. 242

Ethanol yields Ethanol yield is the target function for selection of distiller's yeasts and related to all efficiency parameters. Results for the 72 h-fermentation at 30 °C are given in Table 7. A special attention should be paid to strains Saccharomyces diastaticus and Hansenula anómala and Hansenula sp. Our experiments at higher temperatures were associated by some difficulties, since the growth without the intermediate adaptation stage did not proceed properly at 37.8 °C. Also the tendency towards yield variation was greater at higher ethanol contents. At this elevated temperature four adapted strains gave lower and only one strain gave comparable yields with these of the standard yeast (in this case the ethanol formation was at 30 and 37.8 much higher than at 22°C). Out of eight strains tested, three of them produced ethanol in the standard range between 30 and 37.8 °C. The rate of ethanol formation was determined by means of sample weighing (loss of C0 2 ). In the first fermentation

L A U B E , K . , WESESTBERG, J .

et al., Yeasts for t h e Distillery

117

Table 7: Ethanol yields Strain

EtOH [1/100 kg starch]

Sacch. cerevisiae (Standard)

68.1

Sacch. diastaticus

14

Hansenula

anomala 581

Hansenula

sp. 242

Candida tropicalis T 401 Sacch. cerevisiae IfG 5775 Candida tropicalis 545 Candida tropicalis 94

± 2.6

± 5.1 64.4 ± 4.9 64.3 ± 6.5 61.2 ± 14.7 60.4 ± 5.3 59.6 ± 0.2 57.9 ± 5.0

68.9

s

s*

EtOH [v/v]

s*

4.1

6.71 ± 0.2

0.4

1.8

6.8 ± 0.4

0.1

1.7

6.08 ± 0.4

0.1

2.2

6.33 ± 1.2

0.4

5.0

6.08 ± 1.1

0.4

0.9

6.09 ± 1.4

0.3

0.03

5.94 ± 0.6

0.1

1.7

5.96 ± 0

0

* Tolerance grade

phase two thermoadapted strains and Saccharomyces IfG 5775 gave better results as the standard. However, Hansenula and Candida tropicalis produced more ethanol in the last fermentation phase. These strains have their efficiencies comparable with the standard and should be taken for this reason into account. By-Product Formation In order to achieve a better rectifícate quality the resulting by-products were determined in relation to ethanol formation. Of particular interest can be (Table 8): high diacetyl and lactic acid yields for thermoadapted strains, large quantities of esters produced by Hansenula anómala as well as lactic acid formation by Candida tropicalis. Table 8. By-product formation* Strain

Ethylacetate

Higher alcohols

Diacetyl

Lactic acid

[mg • l-i]

[mg • l-i]

[mg • h1]

[mg • l-\]

Sacch. cerevisiae (Standard) Sacch. diastaticus

1 14

1

1

1

0.86

0.86

1.0

0.74

Hansenula

anomala 581

2.1

1.19

1.3

0.70

Hansenula

sp. 242

4.0

0.96

1.7

3.65

Candida tropicalis T 401

0.73

0.76

1.7

0.97

Sacch. cerevisiae IfG 5775

0.8

0.93

3.1

1.14

Candida tropicalis 545

0.6

0.96

1.9

4.4

Candida tropicalis

0.93

1.3

2.9

6.66

0.91

0.73

4.8

7.16

Sacch. cerevisiae T 102 (37.8)

94

+ related to ethanol formation and standardized on the standard basis 2

A c t a Biotechnol. 7 (1987) 2

118

Acta Biotechnol. 7 (1987) 2

Serological Strain Differentiation One can expect that synergistic effects in mixed "made-to-measure" populations make possible additional efficiency optimisations. In order to choose.the best strain proportions it is necessary to use suitable methods. One possibility offers the differentiation by means of serological methods [7, 8]. I t was interesting to observe high intensity deviations in the course of the direct sandwich-immunofluorescence test with Saccharomyces. All other strains didn't give any changes. During agglutination tests Candida, Hansenula and Schizosaccharomyces showed a different behaviour in cross-comparisons. These results have to be confirmed by immunofluorescence. An increase of specifity by means of separation of the IGG-f raction is required in order to optimize the injection procedure. Received January 5, 1986

References [ 1 ] PANCHAL, C. J . : B i o t e c h n o l . L e t t . 4 ( 1 9 8 2 ) 1, 3 3 .

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[8] BOCAVORA, N. N.: Mikrobiologiya 40 (1971) 5, 844.

Acta Biotechnol. 7 (1987) 2, 119-125

Comparative Trace Element and Organic Growth Factor Requirements of Five Hansenula Species KAMRA, N . 1 , MADAN, M . 2

1

2

Department of Biology Guru Nanak Dev University Amritsar-143005, India Centre for Rural Development and Appropriate Technology Indian Institute of Technology Hauz Khas, New Delhi-110016, India

Summary A comparative response of specific trace elements and organic growth factors for the growth of five Hansenula species (H. anomala, H. beijerinckii, H. cijerrii, H. polymorpha and H. sydowiorum) has been studied. Out of twenty three trace elements tested, Fe, Zn, Mn and Cu were found to be essential for the growth of all yeast species studied here, whereas the rest of the elements exhibited variable essentiality. From fifteen organic growth factors tested, thiamine, biotin, pyridoxine and inositol are the most commonly required growth factors by the yeasts, whereas the rest of the organic growth factors showed variable essentiality. All species of yeasts investigated required different concentrations of trace elements and organic growth factors for their optimum growth. Concentrations higher than the optimum have been found to be inhibitory for the growth of all the yeasts studied.

Introduction Y e a s t s need certain elements, which act as f u n c t i o n a l c o m p o n e n t s or stabilizers of p r o t e i n s or a c t i v a t o r s of enzymes. Some trace elements, although unnecessary for p r o pagation, m a y s t i m u l a t e t h e growth of yeasts. Y e a s t s need certain g r o w t h f a c t o r s also f o r n o r m a l growth, reproduction a n d other vital processes. D i f f e r e n t yeasts have e x t r e m e l y divergent d e m a n d s with respect to their growth factors. Some are a u x o a u t o t r o p h i c i.e. capable of synthesizing these factors, while others are a u x o h e t e r o t r o p h i c i.e. i n c a p a b l e of synthesizing these factors for their needs. The auxoheterophic yeasts are t h u s d e p e n d e n t wholly or partially on t h e external s u p p l y of such f a c t o r s for their growth. I n culture, it was noticed t h a t t h e growth of some yeasts was enhanced by t h e a d d i t i o n of t r a c e elements a n d organic growth factors. Therefore, it was our objective to s t u d y t h e r e q u i r e m e n t of these t r a c e elements and factors for five Hansenula species n a m e l y , H. anomala, H. beijerinckii, H. cijerrii, H. polymorpha a n d H. sydowiorum. Such investigations on trace elements a n d organic growth factors are likely to reveal n u t r i t i o n a l p a t t e r n s with bearing on t a x o n o m y of yeasts. A knowledge of such studies will also p r o vide a n insight i n t o t h e physiology of industrially i m p o r t a n t y e a s t strains suitable f o r f e r m e n t a t i o n a n d biomass production.

2*

120

Acta Biotechnol. 7 (1987) 2

Materials and Methods Yeasts employed in this s t u d y were isolated f r o m various fruits. Isolated yeast cultures were identified according t o LODDER [ i ] a n d BARNETT a n d PANKHURST [2], Isolates were maintained on yeast e x t r a c t - m a l t e x t r a c t agar slants [3]. T h e basal medium employed for cultivation contained t h e following compounds in each liter of t h e solutions: glucose 10 g, (NH 4 ) 2 S0 4 5 g, K H 2 P 0 4 2 g, M g S 0 4 7 H 2 0 0.5 g, NaCl a n d CaCl 2 0.2 g, L-histidine monohydrochloride 10 mg, DL-methionine a n d D L - t r y p t o p h a n e 20 mg each. Trace elements were added t o t h e medium in vitamin studies, in ppm, as follows: Fe 0.2, Mo 0.2, Mn a n d Zn 0.4, Cu 0.05, I 0.1 a n d B 0.5. I n trace element studies vitamins were added in ¡xg as follows: biotin 20, calcium p a n t o t h e n a t e 2000, folic acid 2, inositol 10000, niacin, pyridoxine HC1 a n d thiamine HC1 400 each, P A B A a n d riboflavin 200 each. W a t e r used was obtained after passing copper distilled water t h r o u g h columns with beds of ionexchange resins a n d t h e n distilling twice in an all pyrex glass still, adding 0.5 g/1 of t h e disodium salt of ethylene-diamine-tetra acetic acid each time. I n vitamin studies, the basal medium (except microelement), for purification was t r e a t e d with 5 g/1 of activated charcoal a t 7 lb, steam pressure for 15 min [4] a n d t h e n filtered t h r o u g h sintered pyrex glass BUCHNER funnel. The chemicals use were either of Anala R grade, B D H or Sigma. T w e n t y three trace elements were tested t o find out their essentiality for t h e growth of Hansenula species. The following salts of these elements were used: F e ( N 0 3 ) 3 • 9 H 2 0 , Z n S 0 4 - 7 H 2 0 , MnCl 2 • 4 H 2 0 , C u S 0 4 • 5 H 2 0 , Na 2 Mo 4 • 2 H 2 0 , 3 C d S 0 4 X 8 H 2 0 , H 3 B 0 3 , K I , K 2 C r 2 0 „ N a 2 W 0 - 2 H 2 O , S n C l 2 - 2 H 2 0 , HgCl 2 , (CH 3 COO)Pb • 3 H 2 0 , Li 2 S0 4 • H 2 0 , RbCl, V 2 0 5 , U 3 0 8 , T h ( N 0 3 ) 4 , NiCl 4 , Sr • (N0 3 ) 2 , BaCl 2 , CoCl2 • 6 H 2 0 , CsCl. The a m o u n t s of various salts were a d j u s t e d so as t o provide t h e following quantities (in mg) of t h e trace elements in one litre of t h e m e d i u m : F e a n d Mo 0.2 each, Zn a n d Mn 0.4 each, Cu 0.04, B 0.4, I 0.1 a n d t h e remaining 16 trace elements 0.02 each. Fifteen organic growth factors, viz. thiamine HC1, d( + ) biotin, pyridoxine HC1, i-inositol, riboflavin, pantothenic acid, niacin, folic acid, p a r a a m i n o benzoic acid, ascorbic acid adenine sulp h a t e , guanine HC1, choline chloride, uracil a n d x a n t h i n e were investigated. The concentrations of growth factors employed in p p m were as follows: thiamine HC1, pyridoxine HC1 a n d niacin 0.4, biotin a n d riboflavin 0.02, folic acid 0.002, inositol 10.0 a n d t h e remaining 0.2 each. Stock solutions of all organic growth factors except biotin were prepared in double distilled water. Biotin was first dissolved in 4 ml of 5 0 % ethanol a n d made u p t h e required volume with distilled water The stock solutions were stored at 4°C in t h e dark. T h e basal medium without trace element/growth factors was divided into different lots a n d t o each lot were added all t h e trace elements/growth factors except one. Two controls were k e p t in each case. One with no trace element/growth factor a n d a second containing all t h e trace elements/growth factors. 25 ml of t h e basal medium were poured into each 100 ml conical flask. T h e various media were sterilized a t 7 lb pressure for 30 min. The yeast inocula were prepared by transferring a minimal n u m b e r of cells with an inoculating needle from a 96-h yeast e x t r a c t - m a l t e x t r a c t agar slant t o 25 ml of sterile basal medium free of all trace elements (in trace element experiments) or growth factors (inorganic growth factor studies). Care was t a k e n not t o touch t h e inoculating needle with t h e agar medium. After 24 h incubation a t 28 °C on an EMENVEE R o t a r y Shaker a t a speed of 200 r p m , 0.05 ml of this culture was passed to a second flask containing 25 ml of medium free of all t r a c e elements/growth factors a n d again i n c u b a t e d for 24 h. This process was repeated 2 — 3 times until t h e growth factor/trace element impurities were minimized in t h e inoculum. The growth f a c t o r on trace element assays were inoculated with 0.05 ml of t h e growth factor or trace element free inoculum. The inoculum contained a b o u t 104 cells. Growth of yeasts was allowed to proceed for 72 h a t 25 °C. Turbidimetric measurements of growth recorded as optical density (OD) were m a d e with an ELICO colorineter model CL 20 A a t 540 IJ.M with uninoculated medium serving as control. The a m o u n t of growth resulting from a particular growth factor varied with t h e individual y e a s t . To correlate a n d interpret t h e results obtained, t h e degree of trace elements/growth factors dependence were categorized as follows: essential, 0 . D. below 0.10, partial between 0.10 a n d 0.20; a n d independent, OD above 0.20. Conclusive results were obtained generally within 72 h of incubation, b u t all t h e tests were m a i n t a i n e d for a m i n i m u m of 10 days. F u r t h e r experiments were p e r f o r m e d t o know t h e o p t i m u m a n d toxic concentrations of trace elements/organic growth fact o r s f o u n d t o be essential for t h e g r o w t h of yeasts studied here. The different concentrations selecte d w e r e : 0 . 0 0 0 1 , 0 . 0 0 1 , 0 . 0 1 , 0.1, 1.0, 10.0, 100.0, 2 0 0 . 0 a n d 4 0 0 . 0 .

Kamba, N., Mad an, M., Requirements of Hansenula Species

121

Results and Discussion The present study has revealed a wide variation in yeasts with respect to their organic browth factor, and trace element requisites. The data presented in Table 1 shows that all the species of yeasts studied manifested suppressed growth, with the omission of Fe, Zn, Mn and Cu. All these elements are reported to be essential for the growth of yeasts as well as for the growth of a large majority of fungi which have been critically studied. The essential metallic elements are constituents of various enzymes and coenzymes. It follows that yeasts fail to grow in the absence of one or more essential metallic ions because various key enzymes are not formed or are unable to function under these conditions. It is well-known that iron is a constituent of respiratory enzymes and is found chiefly in association with porphyrin in the form of heme compounds. Zinc is also reported to be essential for fungal growth [5 — 11] and is toxic only at high concentrations. The deficiency of zinc upsets the metabolism. Manganese is an essential element for fungi and higher plants; its main role being as an activator of phosphate transferases and decarboxylases especially those associated with Kreb's cycle. Although trace concentrations of copper are essential for fungi, higher levels of this element are known to be toxic and can be used as fungicides [12]. Molybdenum is essential for the growth of H. polymorpha and H. sydiwiorwn. Similarly, it has been reported to increase the biomass production of beer yeast [13], Sacch. cereTable 1. Effect of omission of different trace elements omitted singly, from the basal medium on the growth of yeasts. The values represent turbidity units of cultures grown for 72 h at 28 °C. Element Omitted

H. anomala

H. beijeririichii H. eiferri i

All None Fe Zn Mn Cu Mo Cd B I Cr W Sn Hg Pb Rb Li V U Th Ni Sr Ba Co Cs

0.05 0.40 0.06 0.07 0.08 0.08 0.37 0.09 0.38 0.39 0.37 0.38 0.39 0.38 0.40 0.38 0.39 0.37 0.37 0.38 0.39 0.38 0.39 0.38 0.39

0.06 0.35 0.08 0.07 0.06 0.08 0.34 0.35 0.34 0.33 0.32 0.33 0.32 0.33 0.32 0.08 0.33 0.32 0.33 0.34 0.35 0.34 0.07 0.35 0.34

0.06 0.30 0.08 0.07 0.06 0.06 0.28 0.27 0.30 0.28 0.29 0.08 0.28 0.29 0.30 0.08 0.28 0.30 0.28 0.29 0.30 0.28 0.30 0.28 0.29

H. polymorpha

H. sydowiorum

0.07 0.50 0.08 0.09 0.08 0.08 0.09 0.49 0.48 0.49 0.48 0.50 0.49 0.50 0.48 0.50 0.49 0.48 0.49 0.50 0.48 0.49 0.50 0.48 0.49

0.06 0.35 0.07 0.08 0.08 0.09 0.08 0.34 0.33 0.32 0.33 0.32 0.32 0.32 0.08 0.32 0.35 0.34 0.35 0.34 0.35 0.32 0.34 0.32 0.34

122

Acta Biotechnol. 7 (1987) 2

visiae and C. utilis [14]. Cd was found to be essential for the growth of H. anomala. I t has been reported as toxic element [15]. Its toxicity is well documented and numerous studies on the biochemical effects are available [16 — 18]. W is reported to be essential for H. ciferrii. Pb was essential for H. sydiwiorum. R b was shown to be essential for H. beijerinckii and H. ciferrii. Ba was essential for H. beijerinckii only. Practically no information is available on the essentiality of these elements for the growth of yeasts or filamentous fungi. Other trace elements like B , I, Cr, Sn, Hg, Li, V, U, Th, Ni, Sr, Co, Cs have not been found to be essential for any of the yeast species studied here. The concentration of an essential element affects many life processes besides growth, which is usual criterion of essentiality. The concentrations of various essential ions influence the formation of pigments, the synthesis of vitamins and other products, and the dissimilation of carbohydrates. All the species of yeasts investigated in study require different concentrations of trace elements for their optimum growth. The biomass production of almost all the yeasts is increased after the addition of optimum amounts of trace elements. The optimum amount of an essential trace element discovered in the first experiment was used in the later experiments, so by the end of experiments the growth was appreciably increased as is evident from Fig. 1. Concentrations higher than the optimum have been found to be inhibitory for the growth of all the yeasts studied here. This is also true of other yeasts and filamentous fungi studied from this point of view [6, 7, 9, 10, 13, 19]. The data presented in Table 2 indicate that from the various vitamins tested, thiamine, biotin, pyridoxine and inositol are the most commonly required organic growth factors H.polymorpho

H. beijerinckii

Element

concentrations

[ppml

Fig. 1. Growth of Hansenula species on different concentrations of essential trace elements. •

-»

•

-A

•

Fe

Ho, -o A- Cd;

•

Zn j

•

o- Ba;

•

f- W.

•

Mn ,•

•

Hb; -*

•

•

Cu

*- Pb;

K a m r a , N., Mad a n , M., Requirements of Hansenula

123

Species

Table 2. Growth of yeasts in a chemically defined medium with varying supplements of vitamins. The values represent turbidity units of cultures grown for 72 h at 28 °C. Vitamin omitted

H. anomala

H. beijerinckii

H. ciferrii

H. polymorphe/,

All None Thiamine Biotin Pyridoxine Inositol Riboflavin Niacin Folic acid Panthothenic acid PABA Ascorbic acid Adenine Salphate Guanine HCl Choline Chloride Uracil Xanthine

0.18 0.40 0.15 0.16 0.38 0.39 0.38 0.37 0.38 0.39 0.38 0.39 0.38 0.38 0.37 0.38 0.18

0.16 0.35 0.15 0.16 0.17 0.34 0.33 0.32 0.33 0.34 0.32 0.34 0.32 0.33 0.34 0.35 0.32

0.05 0.32 0.05 0.07 0.28 0.05 0.06 0.06 0.29 0.16 0.30 0.32 0.29 0.30 0.29 0.30 0.31

0.10 0.48 0.47, 0.46 0.47 0.48 0.47 0.48 0.47 0.46 0.47 0.46 0.47 0.46 0.46 0.47 0.16

H. sydowiorum 0.10 0.35 0.15 0.18 0.34 0.32 0.33 0.32 0.33 0.32 0.34 0.33 0.32 0.34 0.34 0.33 0.32

by the yeasts studied. H. ciferrii is completely while H. anomala, H. beijerinckii and H. sydiwiorum are partially auxoheterotrophic for thiamine. Thiamine heterotrophy has also been reported in Bhodotorula yeasts [20, 21], Zygosaccharomyces jafonica and Kloeckera brevis [22], Eremothecium ashbyii [23] and Candida parakrusei [24]. Complete deficiency for biotin has been observed in H. ciferrii, while H. anomala, H. beijerinckii and H. sydowiorum are partially deficient for it. Biotin heterotrophy is more common among the yeasts than in the filamentous fungi. In yeasts it is reported in Torula spherica [25], Eremothecium ashbyii [23], Hansenula anomala [3], G. parakrusei [24], species of Rhodotorula [26], C. albicans [27], and C. parapsilosis [21].

Organic

growth

factor

concentrations

[ppml

Fig. 2. Growth of completely auxoheterotrophic yeast (Hansenula ciferrii) on different concentrations of essential growth factors. • —*

•

thiamine ; *— riboflavin/ -*

• •

biotin *-

niacin .

—•— — inisitol ;

Acta Biotechnol. 7 (1987) 2

124

The partial deficiency for pyridoxins has been observed in H. beijerinckii only. In requiring an external supply of pyridoxine, it resembles Sacch. carlsbergensis [28] and C. parakrusei [24]. The complete deficiency for inositol has been observed in H. ciferrii only. Inositol heterotrophy has been reported in Z. priorianus, Z. japonicus, K. brevis [22], E. ashbyii [23], Schizosaccharomyces octosporus [29] and Sacch. carlsbergensis [30, 31]. More complex and diversified requirements such as complete deficiency for riboflavin and niacin, and partial deficiency for pantohenic have been observed in H. ciferrii only-. Of special interest is partial deficiency for xanthine in H. anomala and H. polymorpha, which is exhibited by the yeasts for the first time. Like the trace element studies, yeasts have been found to require different concentrations of vitamins for their optimum growth. There is an increase in biomass production of H. ciferrii, after the addition of optimum amounts of essential vitamins, as is evident from Fig. 2. Concentrations higher than the optimum have been found to be inhibitory for the growth of yeasts.

Acknowledgement Acknowledgements are due to the Council of Scientific and Industrial Research, New Delhi for the award of fellowship to Neelam Kamra. Received April 25, 1986

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Species

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Acta Biotechnol. 7 (1987) 2, 126

Book Review S . L . NEIDLEMANN, J . GEIGEKT

Biohalogenation Principles, Basic Roles and Applications Chichester: Ellis Horwood Ltd., Publishers, 1986. 203 S., 25 £ Verständnis und die Kenntnisse über die Biohalogenierung sind im Vergleich zur Phosphorylierung oder zur Oxidation relativ gering vorhanden, obwohl Halogenierung und Dehalogenierung in der lebenden Materie eine wichtige Rolle spielen. Über mögliche technische Applikationen von Chloroperoxidase bzw. Chlorohydrinepoxidase war in den letzten J a h r e n durch den Cetus-Prozeß zur Gewinnung von Propylenoxid diskutiert worden. Der gegenwärtige Stand des Wissens zur Biohalogenierung wird in der vorliegenden Monographie zusammengefaßt. Nach einer systematischen Aufstellung der bekannten Halometabolite in Bakterien, Pilzen, Algen, höheren Pflanzen und Tieren werden das Vorkommen und die Reaktionen der Haloperoxidasen beschrieben und Hinweise auf ihre Isolation und Reinigung gegeben. Ein weiteres Kapitel beschäftigt sich mit den Eigenschaften der halogenierenden Enzyme, zeigt deren Strukturen auf, diskutiert Mechanismen, die Bildung möglicher aktivierter Zwischenverbindungen und f a ß t in Reaktionscyclen zusammen. Konkretisiert werden diese an Beispielen des Stoffwechsels von marinen Organismen und an Abwehrmechanismen von Säugetieren. In einem Kapitel über industrielle Anwendungen werden Synthesemöglichkeiten unter Verwendung von Haloperoxidasen aufgezeigt und die Anwendung als pharmazeutische Agentien und in der analytischen Diagnostik vorgestellt. Es zeichnet sich ab, daß weniger die Halogenierung als die peroxidatische Wirkung der Haloperoxidasen die Anwendung bestimmen wird. Der anfangs zitierte Cetus-Prozeß findet als Denkmöglichkeit Erwähnung. Der Vollständigkeit dient ein Kapitel über die Hauptwege der Biodehalogenierung, hierbei wird besonders der Abbau halogenierter xenobiotischer Substanzen berücksichtigt. Es kann eingeschätzt werden, daß in der Z u k u n f t das neue Gebiet der Biohalogenierung auch durch Kenntnisse bereichert werden wird, die aus der Untersuchung von Organismen aus extremen Umwelten gewonnen werden. Die Anwendung der Erkenntnisse steht erst an einem Anfang. U . STOTTMEISTER

Acta Biotechnol. 7 (1987) 2, 1 2 7 - 1 4 0

Effects of Temperature on Microbial Ethanol Production II. A Thermodynamic Interpretation of the Temperature Profile Curve of Ethanol Production RICHTER,

K.

Academy of Sciences of the G.D.R. Institute of Biotechnology, Leipzig PermoserstraBe 15, Leipzig, 7050 G.D.R.

Summary An attempt is made to give a thermodynamic interpretation of the complete temperature profile curve of ethanol formation. Taking into consideration an enhancing competition between thermal activation and thermal deactivation of ethanol formation at increasing temperatures and supposing t h a t the ethanol production is affected by a reversible and an irreversible term of thermal deactivation a modified A R R H E N I U S equation being current for the total biokinetic sphere may be derived :

•n (vjvj) =

(Ajl^m

- AHDT> - AH»')

-

The quantities A H a n d AH^f are identical with the temperature functions of the change of entropy caused by reversible and irreversible deactivation of ethanol formation, respectively. Accordingly for the yeast strain Saccharomyces cerevisiae Sc 5 the calculated entropy coefficients of reversible and irreversible thermal deactivation of ethanol formation amount to C f T = (0.245 ± 0.013) k j / m o l • deg. 2 and = (1.657 ± 0.046) k j / m o l • deg. 2 .

Introduction The specific ethanol formation rate of microorganisms depends on the temperature to a high degree. First of all it increases with increasing temperature, runs through a maximum and then decreases down to nought. A typical temperature profile curve of ethanol production was discussed previously [1]. In the cited paper we could point out that the biokinetic temperature sphere for ethanol production of the strain Saccharomyces cerevisiae SC 5 consists of 5 different ranges, the limits of which are given by 6 characteristic temperatures. Within the first suboptimum temperature range the ethanol formation exclusively is thermally activated and the r / T - p l o t s are exactly fitted by Bill A R R H E N I U S equation. A thermodynamic interpretation of the remaining parts of the temperature profile curve is obliged to give in this paper.

128

A c t a Biotechnol. 7 (1987) 2

Materials and Methods All of the considerations made in this context are based on results obtained with the yeast strain Saccharomyces cerevisiae Sc 5 cultivated at different temperatures in batch processes using a mineral salt medium enriched by yeast extract as described in [1]. For the superoptimum temperature interval the maximum specific ethanol formation rates v0' (referring to an ethanol concentration P = 0) were obtained from experimental data by means of a special computer-aided regression program. The estimation of ethanol in the medium took place gaschromatographically and the biomass was determined gravimetrically as reported previously [1—4].

Theoretical Considerations The course of the temperature profile curve of ethanol production can be interpreted as a result of competition between activating and deactivating components of the thermal influence on the cells. A schematic representation of these relationships is shown in Fig. 1.

r

Fig. 1. Schematic representation of activating and deactivating thermal effects in ethanol formation. plot 1 : course of the function v'0 = f(T) on conditions of a thermally non-retarded ethanol formation plot 2 : course of reversible thermal deactivation of ethanol formation a t increasing temperatures plot 3 : course of irreversible thermal deactivation of ethanol formation a t increasing temperatures plot 4 : resulting t e m p e r a t u r e profile curve of ethanol formation.

RICHTEB, K . , Ethanol Production

129

The curve 1 represents the temperature function of the non-retarded ethanol production : V+ =

" ^ E t O H 11 R vx • e

i\ T>)

(1)

This equation describes exactly the thermal fermentation behaviour of microorganisms within the temperature interval < T < T'{h. Compared to it the plots 2 and 3 correspond to the thermal deactivation curves starting f r o m different temperature levels. Since the deactivation reactions are opposed to the thermal activation of ethanol formation, the function values of the corresponding equations get a negative sign, and thus we can write: i

-a»t1! v~ =

-

v- =

-vt-e

V l

•e

^

R

i\ (2)

T'>,

i\

-¿HT'ii R

(3)

where AHj,1 and AH?' are assumed as the activation energies of both the deactivations which begin at the temperature T'/h and T%t, respectively. The temperature curve of the measurable specific ethanol formation rate is the resultant of the plots 1, 2, and 3. T h a t is expressed b y the equation (4)

V = V++Vi+V2, the following restrictions are valid f o r : vY = 0

for

T
0 extrapolierter Verbrauch von ca. 0,5 mMol NaOH/g gefunden. Der WRV-Wert lag bei Weizenstroh I I im gehäckselten Zustand bei 125%, nach Längsspaltung bei 129%, wobei in beiden Fällen ein grob gemahlenes Material eingesetzt wurde. Der geringe, aber u. E. signifikante Unterschied deutet auf eine etwas bessere Zugänglichkeit nach Längsspaltung hin, die wahrscheinlich mit den morphologischen Unterschieden von „Halmaußenseite" und „Halminnenseite" zusammenhängt. Eine Übersicht über den morphologischen Aufbau des Halmes vermittelt die REM-Querschnittsaufnahme in Abb. 1. Wie die in Tabelle 1 jeweils mit angegebenen Zahlenwerte ausweisen, f ü h r t eine 24stündige Behandlung von Roggen- und Weizenstroh mit 1 %iger Natronlauge zu einer merklichen Delignifizierung unter Anstieg des Zellulosegehaltes. Die Ausbeute an Auf schlußstroh lag dabei, bezogen auf die Einsatzmenge, bei 70—75%. Der Aschegehalt ist gegenüber dem des Ausgangsstrohs nur dann erniedrigt, wenn in einer technisch nicht realisierbaren Weise sehr gründlich ausgewaschen wird. Ansonsten können je nach dem Grad der Entfernung der anhaftenden Lauge durch Abtropfen,

138

Acta Biotechnol. 7 (1987) 2

Abb. 1. REM-Übersichtsauf nähme eines Halmquerschnittes von Weizenstroh.

Abpressen oder Abspülen recht unterschiedliche oberhalb von dem des Ausgangsstrohs liegende Aschegehalte gefunden werden, so z. B. bei Weizenstroh I I (Ausgangswert 3% Asche) zwischen 4 und 14%, wobei Na-Gehalte zwischen etwa 0,4% und 1,8% festgestellt wurden (Ausgangsstroh 0,01---0,03% Na). Obwohl mit zunehmendem Aschegehalt generell auch der Na-Gehalt wächst, ist diese Korrelation nach unseren Erfahrungen zu lose, um im Einzelfall den Na-Gehalt aus einer Aschebestimmung mit ausreichender Zuverlässigkeit abschätzen zu können. D a ß bei der Laugenbehandlung in erheblichem Maße N a O H bzw. N a + an Inhaltsstoffe des Strohs gebunden wird, geht aus acidimetrischen Titrationsergebnissen an getrocknetem Aufschlußstroh hervor, die neben dem erwarteten Na 2 C0 3 '-Anteil auch Na-Salze schwacher organischer Säuren in erheblichem Umfang auswiesen. Dies wird durch die in Tabelle 2 wiedergegebenen Titrationsergebnisse bestätigt, wobei hier 10 g gespaltenes Weizenstroh mit 100 ml Lauge behandelt wurden. Tabelle 2. Titratationsergebnisse zur Alkalianreicherung im Aufschlußstroh [Gew.-% Lauge vor der Behandlung

freies N a O H Gesamt-NaOH

0,99 1,03

Lauge nach der Behandlung

freies N a O H Gesamt-NaOH

0,64 0,98

Flüssigkeitsanteil im alkalifeuchten Stroh

freies N a O H Gesamt-NaOH

0,68 1,60

Der WRV-Wert steigt nach 24stündiger Behandlung mit l % i g e r Natronlauge von ca. 130% auf 185-•-200% a n ; eine Erhöhung der Laugenkonzentration von 1% auf 3 % f ü h r t zu einer vergleichsweise geringen weiteren Zunahme auf etwa 230%. Wie die R E M Querschnittsaufnahme in Abb. 2 zeigt, wird durch den mit der Alkalibehandlung verbundenen Quellprozeß das Zellgefüge deformiert und teilweise zerissen. I n den ursprünglich sehr ligninreichen, wenig strukturierten Zwickeln zwischen den Zellen weist die morphologische Differenzierung auf die partielle E n t f e r n u n g des Lignins hin. Der Aufschlußeffekt im Hinblick auf die enzymatische Abbaubarkeit in vitro geht aus Tabelle 3 f ü r verschiedene Einsatzstrohproben hervor. I n allen Fällen wird eine Erhöhung des gelösten Anteils unter den hier angewendeten Bedingungen auf das 3- bis 5fache nach der Alkalibehandlung beobachtet. Der über eine Rückstandsbestimmung ermittelte gelöste Anteil stimmt gut mit dem über den RS-Wert ermittelten überein. Im

MIETZ, M., BERG, F .

U. a., Mechanisch-chemisches Strohaufschlußverfahren

139

Abb. 2. REM-Aufnahme vom Teil eines Halmquerschnittes von alkalibehandeltem Weizenstroh. Tabelle 3. Einfluß einer Alkalibehandlung auf die Abbaubarkeit von Stroh durch Cellulase (Behandlung mit l%iger Natronlauge, 24 h enzymatischer Abbau mit Pc. citreoviride) Einsatzstroh

Roggenstroh Weizenstroh I (gespalten) Weizenstroh I I (gehäckselt) Weizenstroh I I I (gehäckselt, lufttrocken) Weizenstroh I I I (gehäckselt, bei 50 °C 8 d gelagert)

Gelöstes nach Enzymbehandlung [%] ohne Alkalibehandlung

mit Alkalibehandlung

22 12-18 12-18 10

73 74---77 71 60

9

53

Falle von Weizenstroh I wurden 74% über die Rückstandsbestimmung und 72% Gelöstes über R S gefunden. Eine Lagerung des Strohs bei höherer Temperatur wirkt sich ungünstig aus. Eine vorherige Längsspaltung verbessert den Aufschlußeffekt, wobei allerdings die Ausbeute an Aufschlußstroh um einige Prozent sinkt. Der Hydrolyserückstand weist einen Ligningehalt von ca. 50% und einen Pentosangehalt von ca. 10% auf; der WRV-Wert lag bei 120 — 130%. Erwartungsgemäß sind die Veränderungen der Morphologie des Zellverbandes durch den Angriff des Enzymsystems viel ausgeprägter, wenn dem Abbau eine Alkalibehandlung vorausgeht, wie die Abb. 3a—d anhand der Längsschnitte enzymatisch abgebauter Proben mit und ohne Alkalivorbehandlung demonstrieren. Selbst die wenig zugängliche Halmaußenseite zeigt nach Laugenbehandlung und Enzymeinwirkung zahlreiche lochfraßartige Korrosionsstellen. Hinsichtlich weiterer Einzelheiten sei auf unsere ausführliche Darstellung in [19] verwiesen. Der Einfluß der Auf Schlußdauer mit l%iger Natronlauge auf WRV-Wert und Abbaubarkeit des Aufschlußstrohs geht aus Abb. 4 hervor, wobei für diesen Modellversuch Weizenstroh I I in gemahlener Form eingesetzt wurde. WRV-Wert und enzymatische Abbaubarkeit steigen gleichsinnig erst rasch und dann zunehmend langsamer an. Bereits früher [16] hatten wir auf den Zusammenhang zwischen WRV-Wert und Abbau

140

Acta Biotechnol. 7 (1987) 2

c)

'

d)

Abb. 3. REM-Aufnahmen der Längsschnitte von Weizenstroh nach Behandlung mit Cellulase. a) b) c) d)

Halminnenseite Halmaußenseite Halminnenseite Halmaußenseite

ohne Alkalivorbehandlung ohne Alkalivorbehandlung mit Alkalivorbehandlung mit Alkalivorbehandlung

so

200

5 cc

180

ho,

160

30:

1h 0

20 10

120

_J I 1 1 l I I I I 1 1 I 1 1_J L. 10 Time

15 Chi

20

0 2h

Abb. 4. W R V - W e r t und enzymatische Abbaubarkeit ( % Gelöstes) in Abhängigkeit von der Behandlungsdauer mit l % i g e r Natronlauge # — W R V - W e r t , X--- enzymatische Abbaubarkeit

MIETZ,

M., B E R G , F. u. a., Mechanisch-chemische Strohaufschlußverfahren

141

barkeit hingewiesen. E r w ä h n t sei hier auch die kürzlich von G R E T H L E I N [17] publizierte Beobachtung einer engen Korrelation zwischen Abbaubarkeit und Porenanteil des Substrats, wobei letzterer wiederum mit dem WRV-Wert zusammenhängt. Abb. 5 bestätigt f ü r Getreidestroh den früher f ü r Zellulosesubstrate festgestellten Zusammenhang zwischen WRV-Wert und Abbaubarkeit. Der Aschegehalt des Aufschlußstrohs steigt unter den hier angewandten Bedingungen während der ersten 15 min. Behandlungsdauer von 3% auf 6,7% an und fällt d a n n wieder auf Werte zwischen 6,1% und 6,3% ab, indem offenbar lösliche Inhaltsstoffe in Form ihrer Na-Salze aus dem Stroh herausdiffundieren. r

220

»-1 200 1 180 i» tt: 160

1h0 120 -

T. 0

10

20

30 Gelöstes

üO

50

(%]

Abb. 5. Zusammenhang zwischen enzymatischer Abbaubarkeit (% Gelöstes) und WRV-Wert für Weizenstrohproben nach unterschiedlicher Alkalibehandlung

Der relativ geringe Auf Schlußeffekt (nur ca. 45% Gelöstes nach Enzymbehandlung) hängt einerseits mit der Trocknung des Auf schlußstrohs und andererseits mit der geringen Aktivität der hier verwendeten Enzymcharge zusammen. Untersuchungen zum Einfluß verschiedener Auf Schlußparameter auf den Aufschlußeffekt mit der enzymatischen Abbaubarkeit als Kriterium lassen sich f ü r gehäckseltes und gespaltenes Stroh dahingehend zusammenfassen (ausführliche Darstellung vergl. [19], daß — eine Erhöhung der Laugenkonzentration auf 2 % bzw. 3% zu keiner wesentlichen Erhöhung des Aufschlußeffektes f ü h r t , während bei Konzentrationserniedrigung auf unter 1% der Auf Schlußeffekt deutlich sinkt, — die Art des Alkali (NaOH, K O H , Guanidoniumhydroxid) den Aufschlußeffekt nicht signifikant beeinflußt, und daher NaOH/KOH-Mischlaugen ohne weiteres eingesetzt werden können, — eine Verkürzung der Auf Schlußdauer von 24 h auf 6- • -8 h ohne wesentliche Einbuße an Aufschlußeffekt möglich ist, — eine Erniedrigung der Aufschlußtemperatur von 20- • -22 °C auf 10- • • 12 °C bei Verwendung von l % i g e r Lauge und einer Aufschlußdauer von 24 h zu einer Abnahme des gelösten Anteils von ca. 75% auf 65% f ü h r t , also den Auf Schlußeffekt merklich verringert. Eine mechanische Nachbehandlung des Auf schlußstrohs (Tabelle 4) erhöht offensichtlich den bei nachfolgender Enzymbehandlung gelösten Anteil, offenbar infolge weitergehender Zerstörung der morphologischen S t r u k t u r des Zellgefüges und einer dadurch bedingten Akzessibilitätserhöhung f ü r das Enzymsystem. Wie ein Vergleich der mit aufgeführten, in vitro nach [21] bestimmten Futterwerte ausweist, ist ein Abpressen in einer Stempelpresse hierbei annähernd ebenso wirksam, wie ein energieaufwendiges Defibrieren. Im Vergleich zu einem nach dem Sprühverfahren mit starker Alkalilauge behandelten Weizenstroh (581 E F r / k g TS) liegen alle hier betrachteten Varianten von

142

Acta Biotechnol. 7 (1987) 2 Tabelle 4. Einfluß der mechanischen Behandlung von Aufschlußstroh auf dessen enzymatische Abbaubarkeit und dessen Futterwert (gespaltenes Weizenstroh 24 h bei Raumtemperatur mit l % i g e r Natronlauge behandelt, Abbau mit Trichoderma-Cellulase)

Stroh ohne Alkalibehandlung Aufschlußstroh, defibriert Aufschlußstroh, in Schneckenpresse abgepreßt Aufschlußstroh, in Stempelpresse abgepreßt Aufschlußstroh, nicht gepreßt

Gelöstes nach Enzymbehandlung

Futterwert

[%]

[EFr/kg TS]

18,0 74,0 71,0

320 581 563

71,0---74,0

567--581

68,0

514

Aufschlußstroh recht günstig in ihrem Futterwert. Wie die in Tabelle 5 aufgeführten Daten zeigen, ist eine mehrfache Wiederverwendung der Aufschlußlauge ohne merkliche Einbuße an Auf Schlußeffekt (gelöster Anteil nach Enzymbehandlung als Kriterium) durchaus möglich, wenn der Gehalt an freiem NaOH jeweils wieder auf 1% ergänzt wird. Ohne dieses Aufkonzentrieren der Aufschlußlauge sinkt mit der Abnahme an freiem Alkali auch der Aufschlußeffekt erheblich ab. Tabelle 5. Enzymatischer Abbau von gespaltenem Weizenstroh bei mehrfacher Verwendung der Aufschlußlauge (Vorbehandlung mit l % i g e r Natronlauge bei 24 h Kaumtemperatur, Abbau mit Penicillium-Cellulase (Charge geringerer Aktivität) Behandlungszyklus

Lauge nicht aufkonzentriert NaOH in der Lauge

Gelöstes nach Enzymbehandl.

1,00 0,76 0,52 0,29

66,0 61,0 54,0 25,0

[%] 1 2 3 4 5

—

[%]

—

Lauge jeweils wieder auf 1 % NaOH aufkonzentriert Gelöstes nach Enzymbehandlung

[%]

66,0 65,0 61,0 65,0 61,0

Herstellung von Aufschlußstroh im kleintechnischen Maßstab und Ergebnisse von Fütterungsversuchen Zur Bestätigung der in Abb. 4 wiedergegebenen Laborbefunde zum Anstieg der enzymatischen Abbaubarkeit von mechanisch-chemisch behandeltem Weizenstroh wurde in einer Pilotanlage hergestelltes Versuchsfutter an Hammeln im Verdauungsversuch getestet. Herstellung und Charakterisierung des Aufschlußstrohs Langes unbehandeltes Weizenstroh wird mit Hilfe eines Futterreißers längs gespalten und dabei zerkleinert. Der Anteil der Partikelgrößen und gespaltenen Halmstücke ist in Tabelle 6 dargestellt. Danach hatten rd. 8 0 % des mechanisch aufbereiteten Strohs

Mietz, M., Bbbo, F. u. a., Mechanisch-chemisches Strohaufschlußverfahren

143

Tabelle 6. Teilchengrößenzusammenstellung und Anteil gespaltener Halmstücke Partikelgrößenklasse [mm]

Anteil der Halmstücke [%]

Anteil gespaltener Halmstücke [%]

g 15 >15 >30 > 50

44,9 23,1 12,8 19,2

97,7 79,8 68,0 53,3

100,0

81,2

^30 ^ 50

Summe

eine Teilchengröße u n t e r 5 0 m m . R u n d 81% der Strohhalme waren längsgespalten. D a s so vorbereitete Stroh wurde in Stahlbehältern zu Chargen von je 6 kg in l % i g e r Lauge unterschiedlich lange gequollen. Die Lauge bestand entweder aus Natronlauge oder einem Gemisch aus Natronlauge—Kalilauge zu gleichen Anteilen. N a c h Ablauf der vorgesehenen Quelldauer wurde die überschüssige Lauge mittels K o l b e n p u m p e abgesaugt und das Aufschlußstroh in einer Stempelpresse m i t 23 MPa langsam abgepreßt. I n diesem aufgeschlossenen Z u s t a n d wurde das Stroh v e r f ü t t e r t . Aus Tabelle 7 ist zu e n t n e h m e n , wie sich die Gehaltswerte des Strohs nach dem Aufschluß verändert haben. D a n a c h h a t t e d a s Aufschlußstroh nach d e m Abpressen mit hohem D r u c k noch einen Feuchtegehalt von ca. 5 8 % . I n der Trockensubstanz betrug der Anteil Gerüstsubstanz ca. 85%. D a v o n entfielen 50% auf Rohfaser, 2 1 % auf Pentosane und 14% auf Lignin. Der Na-Gehalt lag mit ca. 1,3% relativ niedrig, hingegen der Aschegehalt m i t ca. 7 % hoch. D a r a u s ist ersichtlich, d a ß mit Lauge aufgeschlossenes Stroh durch d a s Abpressen nicht a n F u t t e r w e r t verliert. D a s Gegenteil t r i t t ein. D u r c h die chemische und anschließende mechanische Behandlung werden die d e n F u t t e r w e r t positiv beeinflussenden Inhaltsstoffe k a u m die den F u t t e r w e r t m i n d e r n d e n I n h a l t s s t o f f e jedoch merklich reduziert. Tabelle 7. Gehaltswerte des im Verdauungsversuch eingesetzten Materials Versuch

Behandlungsdauer

Aufschlußmedium

[h] 1

0

2

1

1% NaOH

TS

Lignin

Asche

Rohfaser Na

K

Pentosan

[%]

[%]

[%]

[%]

[%]

[%]

[%]

88,5

14,8

3,6

46,3

0,12

—

22,9

44,3

14,5

6,8

47,9

1,43

-

22,2

3

2

1% NaOH

45,7

14,5

6,7

48,6

1,34

-

21,5

4

4

1% NaOH

42,4

14,4

6,0

49,5

1,23

-

21,0

5

8

1% NaOH

39,8

13,9

7,3

51,2

1,58

-

20,6

6

24

1% NaOH

38,3

13,4

6,6

54,0

1,22

-

20,1 21,4

7

3

0,5% NaOH + 0,5% KOH

46,0

14,4

6,7

48,1

0,68

1,16

8

6

0,5% NaOH 43,7 + 0,5% KOH

14,2

6,7

50,1

0,72

1,22

20,9

9

10

0,5% NaOH 41,6 + 0,5% KOH

14,0

6,8

51,2

0,74

1,25

10,5

10

16

38,2 0,5% NaOH + 0,5% KOH

7,4

52,5

0,86

1,46

19,9

13,1

144

Acta Biotechnol. 7 (1987) 2

Verdaulichkeit des Strohs in vivo Der Nachweis über die Aufschluß Wirkung des mit Laugen behandelten Strohs wurde nicht nur auf enzymatischem Wege mit Hilfe von Zellulasen geführt, sondern direkt am Tier über Verdaulichkeitsuntersuchungen. Das Versuchsfutter wurde im Vergleich zu Rohstroh im Differenzversuch an jeweils 4 Hammeln je Variante geprüft. Erste, vorläufige Ergebnisse dieser Versuche zeigen, daß die im Stroh enthaltene Futterenergie durch die Behandlung mit Natronlauge wesentlich erhöht wird. Wurde beim Feuchtaufschluß von Stroh mit Natronlauge, der zu einer hohen Na-Belastung der Tiere führte, die Verdaulichkeit der im Stroh enthaltenen Futterenergie um mehr als 30% erhöht und die Energiekonzentration von 350 EFr/kg TS auf 450 EFr/kg TS gesteigert, so liegt kein Ergebnis, das mit der neuen Verfahrenslösung erzielt wurde, darunter. Der hohe Aufschlußeffekt, der bei dieser Verfahrenslösung bereits nach wenigen Stunden eintritt, wird auf den intensiven Quellprozeß zurückgeführt, wodurch die Zellverbände bereits so stark gelockert werden, daß es mit einer geringen Laugenkonzentration zum Lösen bzw. Sprengen der Lignin-Hemizellulose-Bindung kommt. Hinsichtlich der Art des Aufschlußmediums ist festzustellen, daß es bezüglich der Aufschlußwirkung praktisch keine Unterschiede in der Verdaulichkeit in vivo zwischen l%iger NaOH und einer Mischlauge aus 0,5% N a O H + 0,5% K O H gibt. Das Aufspalten des Strohs bewirkt ein schnelleres und besseres Eindringen der Natronlauge vor allem von der Innenseite des Halmes, die nicht wie die Außenseite durch eine Wachsschicht geschützt ist.

Zusammenfassende Diskussion Aufgrund seiner chemischen Zusammensetzung und seiner morphologischen Beschaffenheit stellt Getreidestroh nach entsprechender Vorbehandlung ein geeignetes Material f ü r die Wiederkäuerernährung dar. Wegen der leichten Entfernbarkeit eines erheblichen Anteils des Lignins und der relativ geringen Resistenz der Strohstruktur bietet sich nach unseren hier dargelegten Ergebnissen eine Kombination mechanischer Verfahrensschritte mit einer milden chemischen Aufschlußbehandlung an. Durch einen bei Raumtemperatur durchgeführten „Aufschluß" mit l%iger Natronlauge lassen sich ca. 30% des Lignins entfernen, während nur ca. 3% der vorhandenen Zellulose herausgelöst werden. Mit dem hier vorgestellten Aufschlußprinzip wird nicht nur eine erhebliche Anreicherung der tierernährerisch wertvollen Polysaccharide bewirkt, sondern durch die mit dem Prozeß verbundenen Quellung und die teilweise Zerstörung der morphologischen Struktur des Zellgefüges auch deren Zugänglichkeit f ü r einen nachfolgenden zellulolytischen Abbau in vitro und in vivo erhöht. Sicher trägt die Art und Weise der mechanischen Aufbereitung des Strohs (Längsspaltung) merklich dazu bei, infolge weitergehender Zerstörung der Zellmorphologie die Akzessibilitätszunahme f ü r zellulolytische Enzymsysteme weiter zu vergrößern. Vom Standpunkt der Nutzung des Aufschlußstrohs als F u t t e r f ü r Wiederkäuer ist einzuschätzen, daß mit Hilfe des beschriebenen Verfahrensprinzips ein im Verdauungsversuch nachgewiesener Futterwertzuwachs möglich ist, der die Energiekonzentration des Strohs auf die von mittlerem Heu aufbessert. Hierdurch bahnen sich neue Möglichkeiten an, Stroh noch umfassender als Futter zu nutzen. Aus der Sicht der Tiergesundheit ist die Verfütterung von natriumangereichertem Stroh noch nicht vollständig geklärt. Dies betrifft jedoch fast ausschließlich Tiere mit sehr hoher Milchleistung und hier die Gabe erhöhter Na-Mengen. Doch ist bei einer derart niedrigen Na-Belastung, wie sie hier erzielt wurde, der Einsatz von Aufschlußstroh bei

MIETZ, M., BEEG, F . U. a., M e c h a n i s c h - c h e m i s c h e s S t r o h a u f s c h l u ß v e r f a h r e n

145

Mast- und weiblichen J u n g r i n d e r n sowie bei K ü h e n mittlerer Leistung völlig u n b e d e n k lich. Gegenüber d e m Strohaufschluß m i t 5%iger bis 4 8 % i g e r N a t r o n l a u g e , wie er derzeit praxisreif gelöst ist, stellt die Verwendung einer l % i g e n Natronlaugelösung einen wesentlichen F o r t s c h r i t t hinsichtlich minimaler Belastung der Tiere d u r c h N a t r i u m d a r . Es ist aber n i c h t n u r die geringe N a O H - K o n z e n t r a t i o n , die f ü r den S t r o h a u f s c h l u ß eingesetzt wird, es k o m m t hinzu, d a ß sich die mechanische Teilentlaugung des alkalisierten Strohs als geeignetes Prinzip erwissen hat, einen Großteil dieser Lauge aus d e m Stroh zu e n t f e r n e n und d a m i t gleichzeitig d e n Trockenmassegehalt des E n d p r o d u k t e s zu erhöhen. Die in d e n U n t e r s u c h u n g e n g e p r ü f t e A n w e n d u n g eines Laugengemisches f ü h r t gegenüber der Anwendung reiner N a t r o n l a u g e zu einem gleichguten Aufschlußerfolg und bietet eine weitere Möglichkeit zur R e d u z i e r u n g der Belastung der Tiere m i t N a t r i u m . Letztlich ist es eine ökonomische Frage, ob reine N a t r o n l a u g e v e r w e n d e t wird oder das wesentlich teurere Laugengsmisch. Hinsichtlich der V e r f a h r e n s p a r a m e t e r wie K o n z e n t r a t i o n , Quelldauer, Applikationsform oder Teilentlaugung ä n d e r t die Anwend u n g einer Mischlauge nichts. E r s t e Ergebnisse zur Lagerung des Aufschlußstrohs zeigen, d a ß a u c h u n t e r den e x t r e m sten A u ß e n t e m p e r a t u r e n , wie sie in der D D R a u f t r e t e n k ö n n e n , eine Kurzzeitlagerung bis zu einer Woche ohne Befall schädigender Mikroben möglich ist. D a r a u s ergibt sich f ü r die A n w e n d u n g des Verfahrens in der P r a x i s die Möglichkeit, a n einem Tag während der normalen Arbeitszeit d a s f ü r den n ä c h s t e n Tag erforderliche Aufschlußstroh zu produzieren. Z u s a m m e n f a s s e n d wird eingeschätzt, d a ß die in der Pilotanlage konzipierte Verfahrenslösung sowie der in Labor- u n d Verdauungsversuchen g e f ü h r t e Nachweis des höheren F u t t e r w e r t e s so positiv sind, d a ß sie zu darauf a u f b a u e n d e n technisch-technologischen U n t e r s u c h u n g e n zur G e s t a l t u n g eines k ü n f t i g e n Verfahrens berechtigen. Eingegangen: 1.7. 1986

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A c t a Biotechnol. 7 (1987) 2, 146

Book Reviews P.-A.

ALBERTSSON

Partition of Cell Particles and Macromolecules New York, Chichester, Brisbane, Toronto, Singapore: JohnWiley 8c Sons, 1986. Third Edition, 346 pp., 61.35 £ Seit der zweiten Auflage v o n " P a r t i t i o n of Cell Particles a n d Macromolecules" von P.-A. A L B E R T S SON im J a h r e 1971 sind f ü n f z e h n J a h r e vergangen. Die 1986 erschienene dritte Auflage spiegelt die erstaunliche E n t w i c k l u n g wider, welche die Methode der Verteilung von Makromolekülen u n d P a r t i k e l n in wäßrigen M e h r p h a s e n s y s t e m e n in dieser Zeit erfahren h a t . Dies gilt sowohl f ü r die Erschließung neuer Anwendungsbereiche in solchen entscheidenden Gebieten der biologischen Grundlagenforschung wie der Biochemie, der Molekularbiologie u n d der Zellbiologie als a u c h f ü r die A n w e n d u n g über das L a b o r hinaus zur E n z y m r e i n i g u n g in industriellem M a ß s t a b . Mit der E n t w i c k l u n g der Affinitätsverteilung, d. h. der N u t z u n g der spezifischen Wechselwirkung m i t den entsprechend modifizierten P h a s e n , stellen H y d r o p h o b i e u n d L a d u n g nicht mehr die einzigen Kriterien dar, n a c h denen m i t Hilfe der Mehrphasen Verteilung T r e n n u n g u n d Reinigung v o n Makromolekülen oder Zellpartikeln in wäßrigem Milieu v o r g e n o m m e n werden k ö n n e n . Diese u n d noch andere E n t w i c k l u n g e n sowie viele experimentelle Beispiele bereichern die d r i t t e Auflage, die n a t ü r l i c h den gesicherten Wissensstand der zweiten Auflage nahezu u n v e r ä n d e r t e n t h ä l t . Das B u c h stellt die einzige u m f a s s e n d e Beschreibung der Grundlagen u n d A n w e n d u n g e n der Verteilung in wäßrigen M e h r p h a s e n s y s t e m e n dar, dessen A u t o r im übrigen die E n t w i c k l u n g der Methode m i t eigenen Beiträgen entscheidend b e f ö r d e r t h a t . E s k a n n einem breiten Interessentenkreis, A n f ä n g e r n wie auch m i t der Methode schon V e r t r a u t e n , empfohlen werden. H.

Y . P . S.

WAND

BAJAJ

Biotechnology in Agriculture and Forestry Trees I Berlin, Heidelberg, New York, Tokyo: Springer-Verlag, 1986. 150 figs., 515 pp., 298 DM h a t in seinem B u c h eine Reihe v o n A u t o r e n zu W o r t k o m m e n lassen, die entscheidend z u m F o r t s c h r i t t der A n w e n d u n g biotechnologischer Methoden beigetragen h a b e n . N a c h einer ausführlichen Darlegung der Möglichkeiten, mit biotechnologischen Mitteln die V e r m e h r u n g u n d Biomassebildung entscheidend zu beeinflussen, ist in sieben K a p i t e l n der neueste Wissensstand zu verschiedenen P r o b l e m e n der Z ü c h t u n g virusfreier Sorten d u r c h Zellkulturtechnik, symbiotischer V e r ä n d e r u n g e n d u r c h Zellkulturen u n d die Konservierung sowohl von Pflanzenpollen als a u c h v o n Zellplasma dargestellt. I m K a p i t e l 9 ist f ü r die einzelnen Obstsorten g e m ä ß i g t e r u n d subtropischer Gebiete die A n w e n d u n g der M e r i s t e m - K u l t u r t e c h n i k beschrieben u n d auf Besonderheiten hingewiesen. Das letzte K a p i t e l b e i n h a l t e t die Ü b e r t r a g u n g der E r k e n n t n i s s e auf forstwirtschaftliche N u t z p f l a n z e n . D a m i t wird ein umfassender Überblick über den neuesten S t a n d der Zellkulturtechnik in L a n d - u n d Forstw i r t s c h a f t gegeben. Eine L i t e r a t u r z u s a m m e n f a s s u n g von 60 Seiten r u n d e t das Bild a b . D a s B u c h von B A J A J ist allen denjenigen zu empfehlen, die sich m i t biotechnologischen Methoden in der Land- und F o r s t w i r t s c h a f t beschäftigen wollen, aber auch den bereits auf diesem Gebiet Arbeitenden ist es d u r c h seine umfangreiche L i t e r a t u r s a m m l u n g ein wertvolles Arbeitsmittel. D a das vorliegende B u c h der erste B a n d einer zwanglosen Folge darstellt, darf m a n g e s p a n n t sein auf die weiteren Bücher in dieser Reihe. BAJAJ

R . PÄTZ

Acta Biotechnol. 7 (1987) 2, 147-155

Zur Wechselwirkung zwischen einer Penicillium-Cellulase und wasserlöslichen Cellulosederivaten KASTORE, U . 1 , PHILIPP, B.1, POLTEK, E . 2

1

2

Akademie der Wissenschaften der DDR Institut für Polymerenchemie Kantstraße 55, Teltow-Seehof, 1530 DDR Akademie der Wissenschaften der DDR Institut für Biotechnologie Permoserstraße 15, Leipzig, 7050 DDR

Summary Employing anionic and non-ionic cellulose ethers, differing in type of substituent and degree of substitution, as substrates, the pH-profile of enzyme activity and the parameter Km and F m a x of the MICHAELIS-MENTEST kinetics have been determined with Pénicillium, citrioviride cellulase in an homogeneous system. Within rather wide limits, a linear correlation was found between the DS of the substrate and K m or F m a x , respectively. Also the pH-profile was found to depend on DS mainly, being bimodal at higher DS. On the other hand, no significant difference was observed between anionic and non-ionic cellulose ethers of about the same DS with regard to the parameters determined. It is assumed, that substrate-enzyme interaction is governed mainly by the length of nonderivatized chain sequences mainly and not by Coulomb interactions. I n f r ü h e r e n Arbeiten h a t t e n wir ü b e r den E i n f l u ß von S u b s t i t u t i o n s g r a d (DS) und A r t des S u b s t i t u e n t e n wasserlöslicher Cellulosederivate auf deren homogene e n z y m a t i s c h e H y d r o l y s e d u r c h K u l t u r f i l t r a t e von Trichoderma viride und Gliocladium sp. berichtet [1—3]. Unsere in [4] z u s a m m e n g e f a ß t e n Versuche zum E i n f l u ß der Art des S u b s t i t u e n ten, insbesondere seines L a d u n g s z u s t a n d e s , auf die Enzym-Substrat-Wechselwirkung d u r c h Sorptionsversuche m i t Pénicillium citrioviride-QeWvù&se a n oberflächenmodifizierten Cellulosepartikeln u n t e r Heterogenbedingungen, h a t t e n wegen Überlagerung solcher S u b s t i t u e n t e n e f f e k t e m i t dem dominierenden E i n f l u ß einer v e r ä n d e r t e n physikalischen S t r u k t u r der S u b s t r a t o b e r f l ä c h e n u r zu recht begrenzten Aussagen g e f ü h r t . I n weiteren U n t e r s u c h u n g e n m i t Gliocladium, sp.-Cellulase h a t t e n wir g e p r ü f t , wie sich bei verschiedenen wasserlöslichen Cellulosederivaten die A r t des S u b s t i t u e n t e n und der Substitutionsgrad auf die A k t i v i t ä t des E n z y m k o m p l e x e s auswirken [5]. Die Lage des p H - O p t i m u m s wurde bei diesem Cellulasesystem d u r c h den L a d u n g s z u s t a n d des Subs t r a t e s beeinflußt. I m folgenden Beitrag werden Ergebnisse zur B e s t i m m u n g der K o n s t a n t e n d e r M I C H A ELis-MENTEN-Kinetik (K m u n d F m a x ) f ü r eine größere Anzahl verschiedenartiger Cellulosederivate dargestellt u n d hinsichtlich des Einflusses von D S u n d Art des Substituent e n diskutiert, wobei wir als E n z y m s y s t e m die Cellulase von Pénicillium citrioviride einsetzten. Zur Festlegung o p t i m a l e r Versuchsbedingungen f ü r die E r m i t t l u n g von K m u n d F m a x b e s t i m m t e n wir d a s p H - P r o f i l der E n z y m w i r k u n g gegenüber den verwendet e n Cellulosederivaten.

148

Acta Biotechnol. 7 (1987) 2

Versuchsmethodik Als Substrate dienten die in Tabelle 1 aufgeführten wasserlöslichen Cellulosederivate im DS-Bereich 0,2 bis 1,8, wobei es sich zumeist um im Laboratorium hergestellte P r ä p a r a t e handelte. Als Enzymlösung stand ein Kulturfiltrat von Penicillium citrioviride [6] zur Verfügung. Zur Bestimmung des pH-Profils der Enzymwirkung wurde dieses Filtrat in einer Verdünnung von 1 : 50 eingesetzt, wobei der p H - W e r t des Reaktionssystems mit 0,1 M Citronensäure-Phosphat-Puffern im pH-Bereich von 3 — 10 variiert wurde. Die Versuche wurden mit einer Substratkonzentration von 1% bei 40 °C ± 0,1 °C durchgeführt. Nach Vortemperieren der entsprechenden Lösungen wurde die Hydrolyse durch Zugabe der Enzymlösung gestartet und nach 30 min Reaktionszeit mit Ferricyanidreagens [7] bzw. — im Falle einer sehr schnellen Bildung reduzierender Zucker bei den niedrig substituierten Proben — mit 0,5 N Natronlauge abgebrochen. Tabelle 1. pH-Optima der Cellulase von Penicillium Cellulosederivaten

citrioviride bei verschiedenen

Probe

DS

pH-Optimum

Carboxymethylcellulose (CMC) Carbocymethylcellulose (CMC) Carboxymethylcellulose (CMC) Carboxymethylcellulose (CMC) Carboxyethylcellulose (CEC) Carboxyethylcellulose (CEC) Cellulosesulfat (CS) Cellulosesulfat (CS) Hydroxyethylcellulose (HEC) Hydroxyethylcellulose (HEC) kationisierte Hydroxyethylcellulose (K-HEC) Methylcellulose (MC) Hydroxypropylcellulose (HPC)

0,63 0,70 1,00 1,36 0,30 0,52 0,20 0,50 ~ 0,3 ~ 0,9 ~ 0,3

3,8 3,8 4,2 und 7,65 4,2 und 7,50 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 4,3 und 7,65 3,8

~ 1,4 ~ 1,8

4,0 und 7,65 4,5 und 8,00

Die Parameter der Mtchaelts-Menten-Kinetik (K M und F m a x ) ermittelten wir f ü r jedes Substrat sowohl beim wirkungsoptimalen p H - W e r t als auch bei einem konstanten Wert von p H = 5. Zur Festlegung geeigneter Reaktionsbedingungen („linearer Hydrolyseverlauf") wurde jeweils die Zeitabhängigkeit der RS-Bildung bei einer Verdünnung des Kulturfiltrates auf 1 : 50, 1 : 100 und 1 : 250 verfolgt. Zumeist reichte eine Verdünnung von 1 : 100 aus, um bei einer Reaktionszeit von

j-

tt-g-'l

Abb. 1. LiiTEWEAVEK-BuRK-Auftragung zur Bestimmung der Konstanten in der MlCHAELIS-MENTEN-Kinetik. • - CMC DS 0,63; o - CEC DS 0,52

KASULKE, U . , PHILIPP, B . U. a . , P e n i c i l l i u m - C e l l u l a s e u n d w a s s e r l ö s l i c h e C e l l u l o s e d e r i v a t e

149

30 min 10% des maximal erreichbaren RS-Wertes nicht zu überschreiten. Die Bestimmung von K m und F m a x erfolgte zumeist unter Verwendung von 5 verschiedenen Substratkonzentrationen. Die Auswertung nahmen wir nach L I N E W E A V E R - B U R K [8] vor (Abb. 1 ) .

Versuchsergebnisse Wie aus den Abb. 2 bis 4 sowie Tabelle 1 hervorgeht, stellt der DS die entscheidende Einflußgröße auf das pH-Profil der Pénicillium citrioviride-Cellulase dar, während die Art des Substituenten bzw. der Ladungszustand des Cellulosederivates eine untergeord-

Abb. 2. pH-Profilkurven der Pénicillium citrioviride-Cellulase an höher substituierten Cellulosederivaten. — H PS DS 1,8; MC DS 1,4; HEC DS 0,9

Abb. 3. pH-Profilkurven bei unterschiedlich substituierten Carboxymethylcellulosen. DS 0,63; 0,70; DS 1,00; DS 1,36 4

Acta Biotechnol. 7 (1987) 2

Abb. 4. pH-Profilkurven der Pénicillium citrioviride-Cellulase an niedrig substituierten Cellulosederivaten. - C S DS 0,20; - •- CEC DS 0,3; CEC DS 0,52

150

Acta Biotechnol. 7 (1987) 2 \

nete Rolle spielen. Bei DS-Werten oberhalb von 0,9 wird bei nichtionischen ebenso wie bei anionischen Substraten, eine bimodale Kurve für die Abhängigkeit der Enzymwirkung vom pH-Wert des Mediums erhalten, wobei das erste Wirkungsmaximum bei pH 4,0 bis 4,5, das zweite zwischen pH 7,5 und p H 8,0 lag (siehe Abb. 2 und 3). Eine gewisse Abhängigkeit der Lage der beiden Wirkungsmaxima von der Art des Substituenten ist nicht auszuschließen, ließ sich jedoch unter Berücksichtigung der für höher substituierte Proben größeren Fehlerbreite der Messungen nicht sicher nachweisen. Diese Feststellung gilt zugleich hinsichtlich eines möglichen Einflusses des Ladungszustandes des Substrates auf das pH-Profil der Enzymwirkung, da die geringfügige pH-Verschiebung in Richtung des alkalischen Bereichs bei den beiden Wirkungsmaxima der Hydroxypropylcellulose im Vergleich zu den anderen verwendeten Cellulosederivaten mit DS-Werten 0,9 noch nicht als signifikant anzusehen ist. Bei niedrig substituierten Substratproben (DS iS 0,7) findet man hingegen nur ein Wirkungsmaximum (Abb. 3 und 4). Dieses liegt unabhängig von der Art des Substituenten, des Ladungszustandes des Derivates und des DS der Proben bei pH 3,8 ± 0 , 1 . Die pH-Profile der Kurven weisen annähernd eine symmetrische Form auf. Bei den höher substituierten Derivaten wird ein ausgeprägtes Wirkungsminimum des hier untersuchten Cellulasesystems im pH-Bereich von 5 bis 6 beobachtet (Abb. 2 und 3). Die nach 30 min Reaktionszeit gebildete Menge an reduzierenden Zuckern im pH-Optimum nimmt verständlicherweise mit steigendem DS ab. Dies stimmt mit früher publizierten Ergebnissen übereiri, bei denen nach 100 h Hydrolyse mit Cellulase von Trichoderma viride [1] und Gliocladium sp. [2, 3] eine starke Abhängigkeit der maximal gebildeten R S - bzw. Glucosemenge vom DS festgestellt wurde. Die Parameter der MiCHAELis-MENTEN-Kinetik (K m und F m a x ) wurden im pH-Optimum und bei dem in der Literatur oft angewandten pH-Wert von 5,0 ermittelt. Für die hochsubstituierten Cellulosederivate (DS >; 0,9), die bimodale pH-Kurven aufwiesen, bestimmten wir die Konstanten der MiCHAELis-MENTEN-Kinetik bei den im sauren Bereich liegenden Maxima. Auf Grund des ausgeprägten Wirkungsminimums bei pH 5 konnten wir keine Konstanten erhalten. Wie aus Tabelle 2 und Abb. 5 hervorgeht, zeigen die KmWerte eine lineare Zunahme mit steigendem DS (Korrelationskoeffizient r > 0,98). Ein Einfluß der Art des Substituenten bzw. des Ladungszustandes des Derivats war nicht nachweisbar. Auch für die maximale Abbaugeschwindigkeit F m a x ist als entscheidende Einflußgröße die Höhe des DS und nicht die Art des Substituenten anzusehen (vgl. Tabelle 2. Konstanten der Michaelis-Menten-Kinetik der Cellulase von Penicillium citrioviride bei verschiedenen Cellulosederivaten Probe

CMC CMC CMC CMC CEC CEC CS CS HEC HEC K-HEC MC HPC

DS

~ ~ ~ ~ ~

0,63 0,70 1,00 1,36 0,30 0,52 0,20 0,50 0,3 0,9 0,3 1,4 1,8

v

K-m [g/1] pH op t.

pH 5

1,92 2,03 3,35 3,72 0,46 1,34 0,20 1,03 0,19 3,18 0,21 4,32 5,50

1,84 2,20 — —

0,43 1,71 0,52 1,21 0,42 —

0,48 — —

y max • min] [10- 3 • g/1. pH 5 pH opt .

40 43 1 1 67 61 79 52 69 1 71 1 1

37 36 — —

57 51 72 50 67 —

68 — —

KASULKE, U., PHILIPP, B. U. a., Penioillium-Cellulase und wasserlösliche Cellulosederivate

0

0,5

1,0

1,5

05

Abb. 5. Linearisierung des Zusammenhanges zwischen K m und DS. 0-pHopt.;

pH 5

20 -

10 I Ö

0,5

o