Acta Biologica et Medica Germanica: Band 20, Heft 1 [Reprint 2021 ed.] 9783112544624, 9783112544617

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ACIABIOLOGICA ll\IH)ll\ GERMANICA HERAUSGEBER:

R. B A U M A N N , H. D U T Z , A. G R A F F I , H. G U M M E L , F. J U N G , A.-H. K E T T L E R , S. M. R A P O P O R T U N T E R M I T A R B E I T VON:

VV. B E I E R , H. D R I S C H E L , H. F R U N D E R , M. G E R S C H , E. G O E T Z E , H. H A N S O N , F. H A U S C H I L D , G. H O L L E , F. M A C H , H. M A T T H I E S , G . M O H N I K E f , O . P R O K O P , K. S C H U B E R T , F . S C H W A R Z , G. S T E R B A , A. W O L L E N B E R G E R SCHRIFTLEITUNG:

W. S C H E L E R , H. B I E L K A

AKADEMIE-VERLAG

• BERLIN

• B A N D 20

• HEFT 1

.•

SEITE 1-119

•

1968

AUFNAHMEBEDINGUNGEN

1. E s werden nur Arbeiten angenommen, die nicht an anderer Stelle mit demselben Inhalt veröffentlicht oder zur Veröffentlichung angeboten werden. Der Autor verpflichtet sich nach Annahme, die Arbeit an keiner anderen Stelle zu veröffentlichen. 2. Die Arbeit muß wissenschaftlich wertvoll sein. Bestätigungen bekannter

Tat-

sachen, Versuche und Beobachtungen ohne positives Ergebnis werden, wenn überhaupt, nur in kürzester Form aufgenommen. Nicht aufgenommen werden Arbeiten referierenden Charakters, Polemiken und rein spekulative Arbeiten, falls sie nicht ganz wesentliche neue Gesichtspunkte enthalten. 3. Kurzmitteilungen für experimentelle Ergebnisse werden bei der

Drucklegung

zeitlich bevorzugt. F ü r ihren Inhalt ist ausschließlich der Autor verantwortlich. 4. Die Arbeiten müssen kurz und klar geschrieben und gegliedert sein. Problematik (Einleitung), Methodik, Befunde und Diskussion, evtl. Schlußfolgerungen sollen deutlich in Erscheinung treten. Der Arbeit soll ein Kurzreferat der wesentlichsten Ergebnisse vorausgestellt werden. Neben einer anderssprachigen erscheint auf jeden T'all eine deutsche Zusammenfassung. Die Arbeiten werden in folgenden Sprachen angenommen: Deutsch, Kussisch, Englisch und Französisch. 5. Die Arbeiten werden im Sofortumbruch gesetzt; größere Korrekturen in Form von Streichungen bzw. Zusätzen sind daher in der Umbruchkorrektur

nicht mehr

möglich. 6. Genaue Hinweise zur Manuskriptgestaltung sind von der Redaktion der Zeitschrift anzufordern und sind unbedingt einzuhalten. 7. Manuskripte sind an die Herausgeber zu senden oder direkt an die Redaktion der Acta biologica et medica germanica, 1 1 1 5 Berlin-Buch, Lindenberger Weg 70. 8. Von jeder Originalarbeit werden kostenlos 80 Sonderdrucke geliefert.

Darüber

hinaus können bis zu 100 Sonderdrucke gegen Berechnung bezogen werden.

Die Herausgeber

ACTA BIOLOGICA ET MEDICA GERMANICA Herausgeber : R . B a u m a n n • H. D u t z • A. G r a f f i • H. G u m m e l • F . J u n g • L.-H. K e t t l e r S. M. R a p o p o r t Band 20

1 968

Heft 1

Acta biol. med. germ., Band 20, Seite 1 —6 (1968) Aus dem Institut für Krebsforschung der Deutschen Akademie der Wissenschaften zu Berlin, Experimenteller Bereich (Direktor: Prof. Dr. A. GRAFFI), Berlin-Buch

Über Unterschiede in der Aktivität und intrazellulären Lokalisation der Hexokinase zwischen n o r m a l e r Rattenleber und Hepatomen G.

SYDOW

(Eingegangen am 31. 7. 1967)

Zusammenfassung Es wurde die Aktivität und intrazelluläre Lokalisation der Hexokinase in der normalen und präkanzerösen Rattenleber sowie in primären und transplantierten Hepatomen ermittelt. Die Aktivität des Enzyms ist in der normalen Rattenleber sehr niedrig; in der präkanzerösen Leber und in den primären Hepatomen ist sie im Vergleich zur Normalleber um SO bzw. 100% erhöht. Ein starker Aktivitätsanstieg ist in den transplantierten Hepatomen zu verzeichnen. Während sich in der Leber und in primären Hepatomen der überwiegende Anteil der Hexokinase im strukturfreien Zytoplasma nachweisen läßt, ist in den transplantierten Hepatomen der größere Prozentsatz des Enzyms partikulär gebunden. Die Mitochondrienfraktion der Leber und der primären Hepatome enthält nur etwa 8 % , die der transplantierten Hepatome dagegen bis zu 5 0 % der Gesamtaktivität. Einführung

In den letzten Jahren wurde von verschiedenen Autoren [1—7] über Unterschiede in der Hexokinaseaktivität zwischen normaler Rattenleber und Hepatomen berichtet. Weitere Publikationen [8—12] deuteten auf die limitierende Rolle der Hexokinase für das Ausmaß der Glykolyse in diesen Geweben hin. Neben der in vielen Fällen nachgewiesenen Erhöhung der Hexokinaseaktivität in Homogenaten und hochtourigen Überständen aus Hepatomen konnte von uns eine hohe Aktivität dieses Fermentes auch in der Mitochondrienfraktion dieser Gewebe festgestellt werden [1, 13]. Im Gegen1

Acta biol. med. germ., Bd. 20, Heft i

2

G.

SYDOW

satz hierzu zeigte die Mitochondrienfraktion der normalen Rattenleber nur eine sehr geringe Hexokinaseaktivität. Um Hinweise über die Bedeutung der intrazellulären Lokalisation der Hexokinase für die Regulation des Stoffwechsels in Normal- und Tumorzellen zu erhalten, wurden in der normalen und präkanzerösen Rattenleber sowie in einer Anzahl verschiedenartiger Hepatome die Verteilungsmuster für dieses Ferment ermittelt. Methodik Die E r z e u g u n g der Präkanzerosen u n d P r i m ä r h e p a t o m e erfolgte a n W i s t a r - R a t t e n (Durchschnittsgewicht ca. 200 g) d u r c h tägliche Applikation von 1 m g Diäthylnitrosa m i n (DÄNA) pro Tier mit d e m Trinkwasser über einen Zeitraum von 2 Monaten. Die verabreichte Gesamtdosis betrug somit ca. 60 m g D Ä N A pro R a t t e bzw. 300 m g p r o kg Körpergewicht. D a n a c h w u r d e n die Tiere e t w a 10 Monate ohne Kanzerogenb e h a n d l u n g gehalten u n d d a n n getötet. Der T r a n s p l a n t a t i o n s t u m o r 432 war mit D Ä N A , der T u m o r Bg 3223 mit B u t t e r g e l b auf R a t t e n des R - S t a m m e s erzeugt worden. Beide H e p a t o m e wurden auch weiter auf Tiere dieses S t a m m e s t r a n s p l a n t i e r t . Der D Ä N A - T u m o r 7330 w a r uns freundlicherweise v o n H e r r n Professor D R U C K R E Y , Freiburg, überlassen worden u n d wurde auf W i s t a r - R a t t e n transplantiert. Die Tiere w u r d e n d u r c h D e k a p i t a t i o n getötet, die Gewebe schnell e n t n o m m e n und, falls erforderlich, v o m Bindegewebe u n d nekrotischen Anteilen befreit, mit der Schere vorzerkleinert u n d 1 g Gewebe u n t e r Zusatz von 9 ml SO mM Trispuffer, pH 7,8, in einem PoTTER-Homogenisator m i t Teflon-Pistill aufgeschlossen. H i e r n a c h w u r d e n weitere 10 ml Trispuffer hinzugefügt. W ä h r e n d des Gewebeaufschlusses u n d der Zent r i f u g a t i o n w u r d e auf den Zusatz anorganischer Salze verzichtet, u m eine Ablösung der p a r t i k u l ä r gebundenen Hexokinase zu verhindern [14]. Die H o m o g e n a t e w u r d e n fraktioniert zentrifugiert, u n d zwar f ü r 10 min bei 600g = Ü b e r s t a n d I, f ü r 15 min bei 4500g = Ü b e r s t a n d I I u n d f ü r 30 min bei 105 000g = Ü b e r s t a n d I I I . Die Zentrifugationen erfolgten in der Kühlzentrifuge P 1 5 (Phywe AG, Göttingen) bzw. in der U l t r a zentrifuge Omega (M. Christ, Osterode). F ü r die B e s t i m m u n g der E n z y m a k t i v i t ä t e n wurden sowohl die G e s a m t h o m o g e n a t e als auch die Ü b e r s t ä n d e 1:10 mit einer 50 mM Tris-, 150mM KCl-Lösung v e r d ü n n t . Die B e s t i m m u n g der H e x o k i n a s e a k t i v i t ä t erfolgte nach der bereits beschriebenen Methodik [11]. Die A k t i v i t ä t e n w u r d e n aus der bei 340 n m gemessenen N A D P H a Bildung errechnet u n d sind in ¡¿Mol p r o min f ü r 1 g Gewebe bei 25 °C angegeben, wobei die W i r k u n g der 6PG-dehydrogenase (E.C. 1.1.1.44) unberücksichtigt blieb. Die Ber e c h n u n g der prozentualen Verteilung der Hexokinase auf die einzelnen Zellfraktionen (Kerne, Mitochondrien, Mikrosomen u n d Zytoplasma) erfolgte f ü r jedes Gewebe auf G r u n d der gemessenen A k t i v i t ä t s v e r ä n d e r u n g e n zwischen d e m G e s a m t h o m o g e n a t u n d den Ü b e r s t ä n d e n I bis I I I . Ergebnisse

In der Tab. 1 sind die Aktivitäten der Gesamthomogenate und der verschiedenen Überstände sowie die sich daraus ergebende prozentuale Verteilung der Hexokinase auf die einzelnen Zellfraktionen wiedergegeben. Bei den Gesamthomogenaten weist die normale Leber die niedrigste Aktivität auf. Bereits im präkanzerösen Lebergewebe ist eine Erhöhung der Hexokinaseaktivität vorhanden, die jedoch eventuell auf kanzeröse Gewebeanteile zurückzuführen sein könnte. Eine Verdopplung der Aktivität ist in den pri-

Mikrosomen

xokinase auf die onen

Überstand

Hexokinase in Leber u n d H e p a t o m e n

Hu

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1g de Zell!

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Kerne

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10 Fr./Reizeinheit; schwach = > 5 Fr./Reizeinheit

i

16

M. LINDEMANN,

g56h

W . RÜDIGER, K . - D . NOLL, W .

Jml

Reaktion

1 0 1 2 h v o n 2

10 0h

1ml keine

i

155

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LAHL

^

1ml 2'/»Medicain Reaktion

t

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1ml beginnende

l

-Lösung

Reaktion

t

Abb. 3. Atem- u n d Herzfrequenz vor (obere beide Linien), 8 min (mittlere beide Linien) u n d 18 min (untere beide Linien) nach Medicain-Instillation in die Gallenblase

gen der Herz- und Atemtätigkeit sowie der bioelektrischen Aktivität der Hirnrinde. Der Beginn der Messungen erstreckte sich von 3—18 min nach Instillation von Pantocain in die Gallenblase; der Versuch dauerte meistens 30 min. Kontrolluntersuchungen erfolgten 3— 4 Std. nach Gabe des Pharmakons. In bezug auf die Herzfrequenz wurden bei gleichen Druckstärken 88 Reize vor und 127 nach Medicaingabe beurteilt. Die Abb. 3 und 4 A zeigen die typische Wirkung dieses Pharmakons. Die Atmung zeigte ein ähnliches Reaktionsbild; die vorher starken Reaktionen (Frequenzerhöhung um 10 Atemzüge durch den Reiz) fielen entscheidend ab (Abb. 4 B). Unter der Medicainwirkung konnten auch keine starken motorischen Reaktionen mehr bei den Tieren beobachtet werden (Abb. 4 C). Bei zwei Versuchstieren wurden die kortikalen Makropotentiale vor und nach Medicaingabe überprüft. Dabei kam es zu einer deutlichen Abnahme der vorher in Erscheinung getretenen Desynchronisation des ECG auf den interozeptiven Reiz (Abb. 5 und 6).

Anaesthetika-Wirkung auf viszero-viszerale Reflexe %

100-

EKG vor der Gabe 2 %

-5%

tor

TmT, % Medicain 10056%

N=S6M0T°rm O-Wert

jjjill

73%

54%

50-

50

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17% 10%

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54%

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17

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111111

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C)

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71..

\\vSx hin Ulli

Abb. 4. Reizbeantwortung der Herztätigkeit (A), der Atmung (B) und der Motorik (C) in Prozent vor und nach Medicaingabe. Zeichenerklärung wie Abb. 2

Occ re - Ind.

,

Par Ii - Ind.

Pur. re - Ind.

Bipor.

Biocc.

¡10- ISO

ISS

Abb. 5. Ausschnitt aus der Registrierkurve 15 min nach Gabe von Medicain Von oben nach unten: E E G , Atmung, Kardiotachogramm (Herzfrequenz/min)

N'31 100

vor der Gabe/ 0- Wert

s% 73%

•m. 50

EEG N = 43 lml,2%MEC

I starke

47%

schwache

Reaktion

Reaktion

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Ü liiPi:: m ,

|

| keine

Reaktion

16%

Abb. 6. Veränderungen der bioelektrischen Aktivität vor und nach Medicaingabe. Reize zwischen 30—100 mm Hg; A 1 —4,5 ml 2

Acta biol. med. germ., Bd. 20, Heft 1

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M . L I N D E M A N N , W . RÜDIGER, K . - D . NOLL, W .

LAHL

Diskussion

Die Ergebnisse zeigen, daß die durch Gallenblasendehnung hervorgerufenen Änderungen der Herzfrequenz, Atembewegungen und der Motorik nach intravesikaler Gabe von Lokalanaesthetika gehemmt werden. Das war sowohl der Fall nach intravesikaler Instillation von Jenacain als auch Medicain, d. h. die Zahl der nichtbeantworteten Reize nahm zu. Das gleiche gilt für die Untersuchung der kortikalen Makropotentiale; nach Gabe von Medicain traten nur noch selten Weckreaktionen auf. Unsere Beobachtungen stimmen mit denen der Literatur überein, daß nach Anaesthesie von Interozeptoren viszero-viszerale Reflexe gehemmt oder ausgeschaltet werden ([3, 1 3 , 1 5 ] u. a.). J A B O N E R O [16] u. a. sprechen von einem AuERBACHschen und MEissNERschen Plexus der Gallenblase, der von einem dreidimensionalen Maschenwerk aus Dendriten intramuraler Ganglienzellen gebildet wird, deren Funktion im einzelnen noch umstritten ist. R O D I O N O W [ 1 7 ] nimmt eine sympathische und parasympathische Innervation der Gallenblase an. Aus der Literatur läßt sich entnehmen, daß eine zentrale Novocainwirkung bei intravesikaler Schleimhautapplikation nicht auftritt, da bei der kurzen Verweildauer und der geringen Dosis keine erhebliche Resorption des Pharmakons vor sich gehen kann ([8, 18] u. a.). Wie oben betont wurde, hemmte auch Medicain die in Kontrollversuchen beobachteten Veränderungen der vegetativen Reaktionen, des EEG und der Motorik bei mechanischer Reizung der Gallenblase. Jedoch finden sich Unterschiede in der Wirkung von Jenacain und Medicain auf viszeroviszerale Reflexe. Zunächst ist die Zeitkonstante der Pharmakonwirkung verschieden. Während sich die maximale Wirkung des Medicains nach 8 min zeigte und die Erstbeantwortung 16 min nach der Instillation beobachtet werden konnte, hielt die Wirkung von Jenacain bis zu 30 min an. Aber auch die Wirkungsstärke auf die viszero-viszeralen Reflexe war unterschiedlich. Unter Medicain wurden alle noch unter Jenacaineinfluß verbliebenen Reaktionen weiter herabgesetzt. Betrachtet man die einzelnen „Effektoren" der Komplexreaktion nach ihrer Reaktionsempfindlichkeit, muß man feststellen, daß die Veränderungen der bioelektrischen Aktivität bei Gallenblasendehnung an erster Stelle stehen. Bei abklingender Medicainwirkung kam es in 50% der Fälle zu einer Reizbeantwortung (arousal reaction). An zweiter Stelle steht die Reaktion der Herztätigkeit, die ebenfalls bei nachlassendem Pharmakoneinfluß wieder ihren Frequenzanstieg zeigte. Zusammenfassend läßt sich feststellen, daß die bei der Gallenblasendehnung ausgehenden afferenten Impulse zu Komplexreaktionen führen, die einen unterschiedlichen „Afferenzbedarf" zeigen. Die zu erzielenden ECoG-Veränderungen haben den kleinsten Afferenzbedarf, d. h. sie verschwinden erst, wenn relativ viele Mechanorezeptoren der Gallenblasenwand ausgefallen

Anaesthetika-Wirkung auf viszero-viszerale Reflexe

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sind. I n der A u s s c h a l t u n g der K o m p l e x r e a k t i o n e n h a t sich Medicain wirkungsvoller als J e n a c a i n erwiesen. W e l c h e B a h n e n die Impulse durchlaufen (direkt über spinobuläre S t r u k t u r e n oder über das Zwischenhirn) k a n n aus den v o r g e l e g t e n E x p e r i m e n t e n noch nicht b e a n t w o r t e t werden. D a z u sind weitere p h a r m a k o l o g i s c h e sowie chirurgische Ausschaltungsversuche notwendig. Literatur [1] [2] [3] [4] [5]

[6] [7]

[8]

[9] [10] [11]

[12] [13] [14] [15]

[16] [17]

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Anschrift der Verfasser : Physiologisches Institut der Humboldt-Universität, 104 Berlin, Hessischestr. 3 — 4 Summary M. L I N D E M A N N , W. R U E D I G E R , K.-D. N O L L and W. L A H L : The influence of local anaesthetics on viscero-visceral reflexes from the gall-bladder, considering the bioelectrical activity of the cerebral cortex (ECoG) in cat. In chronic experiments on cats the influence of local anaesthetics was investigated on viscero-visceral reflexes from the gall-bladder with special reference to the bioelectrical activity of the cerebral cortex. 2»

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M. LINDEMANN, W . RÙDIGER, K . - D . NOLL, W .

LAHL

A f t e r having operated a gall-bladder fistula and implanted epidural electrodes the influence of distension of the gall-bladder on heart frequency and respiratory movements, on E E G and motoric réactions was studied. T h e observed changes of the vegetative functions and the cortical macropotentials were inhibited or eliminated by instillation of procaine or tetracaine into the gall-bladder. T h e tetracaine was more effective than procaine.

I'C3IOMC M . J Ï H H s e M a H , B . P i o n n r e p , K.-JH. HOJIJI H B . J l a j i : BjiHHHue MCCTHOanecTe3npyioiunx rsemecTB Ha BHCuepo-BHCuepajibHbie peijwieKCbi c HiejiqHoro ny3bipH y KOUIKH, yHHTbiBan 5H03JieKTpHHecKyio aKTHBHOCTb Kopbi rojioBHoro M03ra. B xpoHHiecKHx o n b i T a x H a K o i i m a x ô b i j i o HCCJIEAEBAHO BJIHHHHC MecTHoaHecïe3iip y i o m n x B e m e c T B tia BHCiiepo-BHCuepajibHbie pecjwieKCbi c H Th

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Abb. 3. Auftreten von Spindelentladungen (Sp) in der Hemmphase des abgerückten bedingten Nahrungsreflexes bei der Ratte. Beim Lösen des Türriegels (Signal für das Loslaufen zum Futternapf; Marke nach unten in S) Abbrechen der Sp. Th = anteromedialer Thalamus; R = Atmungsregistrierung. Marken auf S : Lichtblitze

Spindelentladungen und Verhalten

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dienten in diesem Experiment als Vorsignal, während dessen Dauer die Ratte warten mußte, bis die verriegelte Tür zur Nahrungskammer freigegeben wurde [17]. Im Laufe der Ausarbeitung und Festigung des bedingten Nahrungsreflexes wurde während dieser Periode die motorische Aktivität des Tieres gehemmt. Im Augenblick der Lösung des Türriegels, die von einem Geräusch begleitet war (Marke unter der Linie S in Abb. 3), kam es zu einer Verhaltensaktivierung, die in einer motorischen Reaktion mit Loslaufen zum Futterplatz, geringer Atembeschleunigung und im Auftreten des langsamen hippokampischen Rhythmus zum Ausdruck kam. Im abgebildeten Beispiel war die Hemmung während des Vorsignals stärker als sonst. Es traten Sp auf, die aber sofort beim Lösen des Riegels abgebrochen wurden. Dieses Auftreten der Sp in der Vorsignalperiode kam nicht häufig vor, war aber stets mit einer besonders starken Hemmung in der Hemmphase des abgerückten bedingten Reflexes verbunden. Der Zusammenhang des Auftretens der Sp mit Hemmungsprozessen ist ganz offensichtlich. Dauer und Häufigkeit des Auftretens war stets um so größer, je stärker das Tier relaxiert war. Meist beobachteten wir ein Maximum unmittelbar vor dem Einschlafen. Während d'es Ablaufes von Sp waren automatisierte Verhaltensakte stets unterbrochen; das Tier saß dann unbeweglich wie bei einer Arrestreaktion da und indifferente Reize hatten keine Wirkung auf das Verhalten und den kortikalen Potentialablauf. In den betroffenen Hirnteilen sind unter diesen Bedingungen durch sensorische Reize nur sehr kleine (überlagerte) oder gar keine Potentiale auslösbar. Bisweilen werden sehr schwache, im Rhythmus der Entladungen ablaufende generalisierte Muskelzuckungen beobachtet (Abb. 2b und 2c; Registrierung der Motorik in M). Manchmal wird auch nur jedes zweite, dritte oder vierte Spindelpotential von einer solchen oder einer größeren Zuckung begleitet; und manchmal treten einzelne Zuckungen überhaupt nur bei Spindelpotentialen mit besonders steiler, spike-ähnlicher Komponente auf. Die Annahme, daß es sich bei den Sp um epileptiforme Entladungen handeln könnte, die durch kleine Gehirntraumen beim Implantieren der Elektroden verursacht wären, kann ausgeschlossen werden. Einerseits fanden wir meist keine histologischen Veränderungen in der Umgebung der epiduralen Elektroden, obwohl Sp auftraten, zum anderen hätten sich die Herde an all jenen Stellen, an denen wir Elektroden implantierten, befinden müssen. Die Lokalisation der Spindelentladungen war jedoch in allen Fällen gleich; sie zeigte ein Maximum über dem prämotorischen und motorischen Kortex bzw. am vorderen temporalen Kortex. In einigen Fällen traten Sp mit viel kleinerer Amplitude nur über dem vorderen temporalen Bereich auf (Abb. 4). Die isoliert in diesem Bereich auftretenden Sp zeigten meist Arkadenform. Ihre Frequenz betrug 7—8/s, ihre Amplitude ging selten über 3 00 ¡aV. Außerdem waren sie niemals von Muskelzuckungen begleitet. Offensichtlich waren bei dieser Form wesentlich weniger Neurone beteiligt. 4

Acta biol. m e d . gerni., Bd. 20, H e f t 1

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F. KLINGBERG, L.

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PICKENHAIN

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Abb. 4. Isoliertes Auftreten von Spindelentladungen mit geringer Amplitude und Arkadenform im auditorischen Kortex der R a t t e während des Auslöschens eines bedingten Reizes (Lichtblitze auf S). R = Atemregistrierung vom Bulbus olfactorius

In anderen, seltenen Fällen beobachteten wir Potentialgruppen isoliert über dem visuellen Kortex, deren Form Frequenz, Amplitude und Entladungsdauer genau den P h N E entsprachen. Obwohl diese spontanen Entladungen ebenfalls nur im relaxierten Zustand auftraten, kann man annehmen, daß sie durch einen unkontrollierten, sehr schwachen Lichtreiz aus der Umgebung ausgelöst wurden, der bei bestimmten Kopfbewegungen über die Retina glitt.

Diskussion

Die eigentlichen Ursachen und Mechanismen, die dem Auftreten der geschilderten Spindelaktivität bei der Ratte zugrunde liegen, sind uns unbekannt. Es bestehen jedoch zahlreiche Analogien zu anderen, sehr ähnlichen Phänomenen, woraus gewisse Schlußfolgerungen nahegelegt werden. Die Bezeichnung „Spindelentladungen" (Sp) wählten wir einerseits als beschreibenden Terminus, der vor allem dann zutrifft, wenn die Entladungsdauer unter 2 sec liegt, andererseits in Analogie zu ähnlichen kortikal ableitbaren Rhythmen bei anderen Tierarten. Bedenken gegen diese Analogie entstehen einerseits durch die sehr große Amplitude und den „spike-wave"Charakter der Sp bei Ratten, andererseits dadurch, daß wir Sp nur bei maximal 2 0 % unserer Ratten fanden. Für die Analogie spricht die Lokalisation, die bei der Ratte und bei anderen Tierarten etwa die gleichen kortikalen Gebiete umfaßt mit dem Schwerpunkt über der motorischen und prämotorischen Rindenregion und dem vorderen Parietal- und Temporalbereich. Die gleiche Lokalisation hat die vom unspezifischen Thalamus durch elektrische Reizung ausgelöste „recruiting response" (unspezifische Rekrutierung). Auch bei anderen Tierarten stimmt die Lokalisation der Sp weitgehend mit der Lokalisation der unspezifischen Rekrutierung überein. Die Frequenz der Sp liegt bei den meisten anderen Tierarten zwischen 8—14/s, d. h. nur wenig höher als bei der Ratte. Der spike-wave-Charakter und die hohen Amplituden der Sp bei der Ratte weisen ähnlich wie der spike-wave-

Spindelentladungen und V e r h a l t e n

51

Charakter und die hohen Amplituden der P h N E bei der Ratte im Vergleich zu anderen Tierarten auf einen sehr hohen Grad von Synchronisierung kortikaler Neurone hin. Zusammenhänge zwischen der unspezifischen Rekrutierung und den „spontanen" Sp, ihre etwa gleiche kortikale Lokalisation und ihr gemeinsamer thalamischer Ursprung wurden bereits von MORISON und DEMPSEY [13] u n d DEMPSEY u n d MORISON [3, 4] d e m o n s t r i e r t . W ä h r e n d des A u f t r e t e n s

spontaner kortikaler Sp werden synchron im Thalamus langsame Wellen beobachtet und die Aktionspotentiale kortikaler und thalamischer Einzelneurone treten synchron mit diesen Wellen in Gruppen auf [22], [23]. E n t sprechende Wellen fokaler Positivität in thalamo-kortikalen Radiationen [1] und in der subkortikalen weißen Substanz [20, 21] werden von PURPURA und COHEN [18] als fortgeleitete thalamische I P S P gedeutet. Solche I P S P treten im Thalamus ebenfalls während der unspezifischen Rekrutierung auf. Es handelt sich hierbei um das gleiche Prinzip wie bei der Generierung der P h N E und der P h R [10, 11]. Auch das Auftreten von „Schlafspindeln" im EEG steht in engem Zusammenhang mit den Funktionen der unspezifischen thalamischen Strukturen [2, 5, 6]. Es ist nach dem Gesagten sicher nicht falsch, die Spindelaktivität, soweit sie die gleiche kortikale Verbreitung hat wie die unspezifische Rekrutierung, als einen funktionellen Ausdruck des unspezifischen thalamischen Rekrutierungssystemes aufzufassen. Die auslösenden Ursachen für das „spontane" Auftreten sind dabei noch unbekannt. Es ist durchaus denkbar, daß die „Ruheaktivität" von Einzelzellen bereits zur Auslösung genügt, wenn einer Synchronisation der Neurone sonst nichts im Wege steht. Der Spindelcharakter (d. h. die „spontane" Rekrutierung) spricht dafür. Der Grad der Synchronisation und Rekrutierung hängt dann von anderen regulierenden Einflüssen ab. So nimmt bei Hebung des Aktivitätsniveaus das Ausmaß der Okklusion der Zellen zu und der Grad ihrer Synchronisation ab. Werden kortikale oder thalamische Zellen mit sehr vielen Impulsen oder Impulsgruppen („bursts"), deren Intervall viel kürzer als 80 ms ist, bombardiert, so werden die I P S P reduziert und schließlich bei wachsender Depolarisation eliminiert [19]. Die Entladungsrate der Einzelzellen nimmt zu, aber ihre Synchronisation und die Rekrutierung verschwinden. Das ist z. B. bei retikulo-kortikaler und retikulo-thalamischer Aktivierung der Fall. Einer der Einflüsse, die die Spindelaktivität auf diese Weise verhindern können, geht offenbar über die von NAUTA und WHITLOCK [14] beschriebene retikulothalamische Bahn. Die Veränderungen der Sp der Ratte in den verschiedenen Phasen des Lernens und beim Auslöschen sprechen für solche Zusammenhänge. Andererseits ist eine sehr starke Dämpfung des unspezifischen aktivierenden Einflusses überhaupt erst eine Voraussetzung für ihr spontanes Auftreten. Im Vergleich dazu können z. B. P h N E schon bei mäßiger Dämpfung des aktivierenden Einflusses auftreten, da sie durch die von einem Lichtblitz ausgelöste synchrone afferente Salve getriggert werden. Das wird wahrscheinlich auch der Grund dafür sein, daß spontane 4*

52

F . KLINGBERG, L .

PICKENHAIN

Sp nur bei einem geringen Teil der Tiere auftreten, während z. B. P h N E bei allen Ratten im relaxierten Wachzustand ausgelöst werden können. Bei einmal auftretender Sp können durch sehr starke Synchronisation und Rekrutierung der Neurone so starke Gruppenentladungen (bursts) entstehen, daß durch diese auch andere Neuronengruppen, selbst in anderen Hirnstrukturen, rhythmisch angestoßen (getriggert) werden. Die auf diesem Wege erfolgende Ausbreitung des Rhythmus kann unter Umständen auch motorische Endstrecken erreichen, so daß im gleichen Rhythmus mehr oder weniger starke Zuckungen auftreten können. Die Zuckungen gehen synchron mit besonders steilen Spitzen im EEG, die durch die Entladungssalven hervorgerufen werden, während die nachfolgenden großen langsamen Wellen mit einer Hemmung korreliert sind (Bremswelle nach JUNG und TÖNNIES [7]). Somit ergibt sich, daß es sich bei den Sp der Ratte möglicherweise um ein Phänomen an der Grenze zwischen Physiologischem und Pathologischem handelt, das zum epileptischen Formenkreis überleitet. Literatur : R e c r u i t i n g response in cortical a n d s u b c o r t i c a l s t r u c t u r e s . A r c h s ital. Biol. 96, 1 — 16 (1958). CLARK, S. L. U. J . W . WARD: E l e c t r o e n c e p h a l o g r a m of d i f f e r e n t cortical regions of n o r m a l a n d a n e s t h e t i z e d c a t s . J . N e u r o p h y s i o l . 8, 9 9 — 1 1 2 (1945)• D E M P S E Y , E . W . u. R . S . M O R I S O N : T h e i n t e r a c t i o n of c e r t a i n s p o n t a n e o u s a n d i n d u c e d cortical p o t e n t i a l s . A m . J . P h y s i o l . 135, 301 —308 (1942). DEMPSEY, E . W . U. R . S. MORISON: T h e electrical a c t i v i t y of a t h a l a m o - c o r t i c a l r e l a y s y s t e m . A m . J . P h y s i o l . 138, 283 — 296 (1943). H E S S , R., W . R . K O E L L A U. K . A K E R T : Cortical a n d s u b c o r t i c a l r e c o r d i n g s in n a t u r a l a n d a r t i f i c a l l y i n d u c e d sleep in c a t s . E l e c t r o e n c e p h . clin. N e u r o p h y s i o l . 5, 7 5 - 9 0 (1953). HESS, W . R . : T h e d i e n c e p h a l i c sleep c e n t e r . I n : B r a i n m e c h a n i s m s a n d consciousness. J . F . D E L A F R E S N A Y E (Hrsg.) S. 117-136. Blackwell, O x f o r d 1954. JUNG, R . u. J . F . TÖNNIES: H i r n e l e k t r i s c h e U n t e r s u c h u n g e n ü b e r E n t s t e h u n g u n d E r h a l t u n g v o n K r a m p f e n t l a d u n g e n : D i e V o r g ä n g e a m R e i z o r t u n d die B r e m s f ä h i g k e i t des G e h i r n s . A r c h . P s y c h i a t . N e r v K r a n k h . 185, 701 — 735 (1950).

[1] A J M O N E - M A R S A N , C.

[2] [3] [4] [5]

[6] [7]

[8] KLINGBERG, F . u . L . PICKENHAIN: E l e k t r o p h y s i o l o g i s c h e u n d

Verhaltensunter-

s u c h u n g e n ü b e r die A u s a r b e i t u n g eines b e d i n g t e n A b w e h r r e f l e x e s auf e l e k t r i s c h e R e i z e o h n e F l u c h t m ö g l i c h k e i t b e i R a t t e n . A c t a biol. m e d . g e r m . 14, 749—763 (1965). [9] K L I N G B E R G , F . u. L . P I C K E N H A I N : Ü b e r die V e r w e n d b a r k e i t d e r R a t t e f ü r kombinierte elektrophysiologische u n d Verhaltensuntersuchungen. W i s s . Z. K a r l - M a r x - U n i v . L p z . , m a t h . - n a t u r w i s s . R . 14, 6 4 7 - 6 5 1 ( 1 9 6 5 ) [ 1 0 ] K L I N G B E R G , F . u. L . P I C K E N H A I N : D i e p h o t i s c h ausgelöste R e k r u t i e r u n g u n d i h r e B e z i e h u n g zu d e n p h o t i s c h a u s g e l ö s t e n N a c h e n t l a d u n g e n . P f l ü g e r s A r c h , ges. P h y s i o l . 2 9 2 , 1 6 1 — 1 7 6 ( 1 9 6 6 ) . [11] KLINGBERG, F . u . L . PICKENHAIN : D e r E i n f l u ß d e r L i c h t r e i z p a r a m e t e r a u f

[12]

das

A u f t r e t e n d e r p h o t i s c h e n N a c h e n t l a d u n g e n . A c t a biol. m e d . g e r m . 18, 5 7 — 7 0 (1967). L I B O U B A N , S . U. E . O s w A L D O - C R U Z : Q u e l q u e s o b s e r v a t i o n s r e l a t i v e s a u x a c t i v i t é s é v o q u é e s et s p o n t a n é e s d u c e r v e a u d u r a t b l a n c . J . Physiol., P a r i s 50, 380 — 383 (1958).

Spindelentladungen und Verhalten

53

[13] MORISON, R . S. U. E . W . DEMPSEY: A s t u d y of t h a l a m o - c o r t i c a l r e l a t i o n s . A m . J . P h y s i o l . 2 8 1 — 2 9 2 (1942). [ 1 4 ] N A U T A , W . J . H . U. D . G . W H I T L O C K : A n a n a t o m i c a l a n a l y s i s of t h e n o n s p e c i f i c thalamic projection system. I n : Brain mechanisms a n d consciousness. J. F. D E L A F R E S N A Y E (Hrsg.) S . 8 1 — 1 0 4 . B l a c k w e l l , O x f o r d 1 9 5 4 . [ 1 5 ] P I C K E N H A I N , L. U. F . K L I N G B E R G : B e h a v i o r a l a n d e l e c t r o p h y s i o l o g i c a l c h a n g e s d u r i n g a v o i d a n c e c o n d i t i o n i n g t o l i g h t f l a s h e s in r a t . E l e c t r o e n c e p h . clin. N e u r o p h y s i o l . 18, 4 6 4 - 4 7 6

(1965).

Charakterisierung unterschiedlicher Stadien des W a c h z u s t a n d e s bei d e r R a t t e d u r c h e l e k t r o p h y s i o l o l o g i s c h e u n d V e r h a l t e n s d a t e n . A c t a p h y s i o l . h u n g . 29, 253 — 260 (1966).

[16]

PICKENHAIN,

L.

U. F . K L I N G B E R G :

[17] PICKENHAIN, L . U. F . KLINGBERG: V e r ä n d e r u n g e n v e r s c h i e d e n e r

[18] [19] [20]

[21] [22] [23]

elektrophysio-

logischer u n d V e r h a l t e n s p a r a m e t e r w ä h r e n d d e r A u s a r b e i t u n g b e d i n g t e r N a h r u n g s r e f l e x e bei d e r R a t t e . V e r h . d t . Ges. e x p . M e d . 15, 190-196 (1966). P U R P U R A , D . P . u. B . C O H E N : I n t r a c e l l u l a r r e c o r d i n g s f r o m t h a l a m i c n e u r o n s d u r i n g r e c r u i t i n g r e s p o n s e s . J . N e u r o p h y s i o l . 25, 6 2 1 — 6 3 5 (1962). PURPURA, D . P. u. D . J . SHOFER: I n t r a c e l l u l a r r e c o r d i n g f r o m t h a l a m i c n e u r o n s d u r i n g r e t i c u l o c o r t i c a l a c t i v a t i o n . J . N e u r o p h y s i o l . 26, 4 9 4 — 5 0 5 (1963). S P E N C E R , W . A . u. J . M . B R O O K H A R T : E l e c t r i c a l p a t t e r n s of a u g m e n t i n g a n d r e c r u i t i n g w a v e s in d e p t h of s e n s o r i m o t o r c o r t e x of c a t . J . N e u r o p h y s i o l . 24, 2 6 - 4 9 , (1961). SPENCER, W . A. u. J . M. BROOKHART: A s t u d y of s p o n t a n e o u s s p i n d l e w a v e s in s e n s o r i m o t o r c o r t e x of c a t . J . N e u r o p h y s i o l . 24, 50 — 65 (1961). VERZEANO, M. U. J . CALMA: U n i t - a c t i v i t y in s p i n d l e b u r s t s . J . N e u r o p h y s i o l . 17, 4 1 7 - 4 2 8 (1954). V E R Z E A N O , M . u. K . N E G I S H I : N e u r o n a l a c t i v i t y in c o r t i c a l a n d t h a l a m i c n e t w o r k s . J . gen. P h y s i o l . 43, 177 — 195 (1960).

F ü r die V e r f a s s e r : Doz. D r . m e d . h á b i l . F . KLINGBERG, A b t e i l u n g f ü r klinische N e u r o p h y s i o l o g i e , 701 Leipzig, H ä r t e l s t r . 16/18

Summary F . K L I N G B E R G a n d L . P I C K E N H A I N : T h e o c c u r r e n c e of „ s p i n d l e d i s c h a r g e s " in t h e r a t in r e l a t i o n t o t h e b e h a v i o u r

Electrophysiological investigations on rats with i m p l a n t e d chronical electrodes h a v e s h o w n t h a t in a b o u t 15 t o 20 p e r c e n t of t h e a n i m a l s p o t e n t i a l s a p p e a r s p o n t a n e o u s l y i n r h y t h m i c g r o u p s a t f r e q u e n c i e s of 7 —10/s a n d w i t h a m p l i t u d e s u p t o 1000 (xV d e p e n d i n g o n t h e m o d e of l e a d i n g off. T h e i n d i v i d u a l p o t e n t i a l s h a v e s p i k e - w a v e c h a r a c t e r w i t h s p i n d l e - s h a p e d i n c r e a s e a n d d e c r e a s e of a m p l i t u d e s . T h i s s p i n d l e a c t i v i t y is localized o n t h e p r e m o t o r i c , m o t o r i c a n d a n t e r i o r t e m p o r a l c o r t e x . I t a p p e a r s o n l y in t h e r e l a x e d or i n h i b i t e d c o n d i t i o n of w a k e f u l n e s s of t h e a n i m a l s , a n d is a b o l i s h e d b y s t r o n g e n v i r o n m e n t a l s t i m u l i or b y s t i m u l i w h i c h a c t i v a t e t h e b e h a v i o u r of t h e a n i m a l s . I t is a s s u m e d t h a t u n s p e c i f i c t h a l a m i c s t r u c t u r e s a r e t h e p a c e m a k e r s of this neocortical activity. Pe3H>Me .

KJIHHRSEPR

H

JI.

ÜHHEHXEHH:

IIOHBJIEHHE

,,BEPETEHH006PA3HTIX

P A 3 P H H O B " Y KPBICBI B O T H O U I E H H H K N O B E N E H H I O 3JIEKTP0({)H3H0JI0RMIECKHE

HCCJIENOBAHHH

HA

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C XPOHHIECKH

P O B A H H B I M H A J I E K T P O N A M H N O K A 3 A J I H , *ITO N P H 6 J I H 3 H T E J I B H O Y 1 5 NO 2 0 %

HMNJIAHTHJKHBOTHMX

N O T E I I M I A J I L I BOAIINISAIOT C N O H T A H H O B BUME P I I T M I M E C K N X R P Y N N , NACTOTA K O T O P B I X

F. Klingberg, L. Pickenhain

54

h aMnjiHTy.ua K O T o p b i x ¿ j o c r a r a e T 1 0 0 0 mkb b 3aBHCHM0CTH ot OTBeaeHHH. O T H e j i b H b i e noTeHLtnaJibi hmbiot iiiHnoBHnHOBOJiHHCTbiH x a p a n npH^eM a M i u i H T y H b i B 0 3 p a c T a i 0 T h n a g a i o T b BepeTeHHOo6pa3HOü $ o p M e .

paBHa

7—10/s

cnocoôa Tep,

3 T a BepeTeHHan HbiM

aKTHBHOCTb j i 0 K a j i H 3 0 B a H a n a n n p e j W B H r a T e j i b H M M ,

hjih nepegHHM T e M n o p a j i b H M M

CHpOBaHHOM CHHMaeTCH

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aKTHBHpyiomHMH BHOCTH.

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JKHBOTHOrO

H

pa3Hpa>KHTejIflMH,

jkhbothoto . U p e a n o j i a r a e T C H , hto iiecneiiii-Aminobenzoesäure ( P A B ) ermittelt, die nach Trennung (s. u.) vom nicht umgesetzten Prokain (Procainum hydrochloricum D A B 6, V E B Jenapharm) diazotiert und mit BRATTONMARSHALL-Reagenz (N-/J-Naphthyläthylendiaminhydrochlorid) als Kupplungsfarbstoff kolorimetriert wurde [8]. Inkubationsansatz: 1 ml 10%iges Leberhomogenat, 200 (ig Prokain = 0,733 (zMol, gelöst in 0,4 ml M/15 Phosphatpuffer, pH = 7,4, und 1,4 ml M/15 Phosphatpuffer, pH = 7,4. Die Inkubation erfolgte 2 Std. bei 37 °C. D a n a c h wurde die Enzymreaktion durch Zusatz von 6,6 ml 1 0 % Trichloressigsäure unterbrochen und der Eiweißniederschlag durch Filtration entfernt. 4,7 ml des Filtrates wurden mit 0,3 ml 2 5 % Natronlauge versetzt und durch nachfolgende Doppelextraktion (jeweils 10 min Schütteln) mit einem Gemisch an Isopropanol/Chloroform ( 1 : 3 ) vom nicht umgesetzten Prokain getrennt. 2,5 ml der wäßrigen Schicht wurden zur Durchführung der Diazotierung mit 1,1 ml einer 2 N Salzsäure versetzt, mit Wasser auf 5 rnl aufgefüllt und mit 0,2 ml einer 0 , 5 % N a N 0 2 - L ö s u n g versetzt. Nach 2 min wurde die Reaktion durch Zugabe 1

W i r danken Herrn Dr.

K.

H.

CHEMNITIUS

für die Bereitstellung der Tiere.

E s t e r a s e in der R a t t e n l e b e r

57

von 0,5 m l einer 1 % i g e n A m i d o s u l f o s ä u r e v o m überschüssigen N a N 0 2 b e f r e i t u n d n a c h e r n e u t e m U m s c h ü t t e l n m i t 2 ml einer 0,05%igen N - / 3 - N a p h t h y l ä t h y l e n d i a m i n d i h y d r o chlorid-Lösung in Ä t h y l a l k o h o l g e k u p p e l t . Die kolorimetrische Messung erfolgte bei 546 n m . Mit steigenden L e b e r h o m o g e n a t k o n z e n t r a t i o n e n bis zu 160 m g L e b e r / A n s a t z (erw a c h s e n e Tiere) k o n n t e ein linearer A k t i v i t ä t s z u w a c h s gemessen w e r d e n . Bei U n t e r s u c h u n g e n zur A b h ä n g i g k e i t der R e a k t i o n v o n der S u b s t r a t k o n z e n t r a t i o n k o n n t e m i t 100 m g L e b e r bis zu K o n z e n t r a t i o n e n v o n 2000 (xg/2,8 m l A n s a t z keine S u b s t r a t s ä t t i g u n g erreicht werden. D a die S p o n t a n h y d r o l y s e des P r o k a i n s m i t steigender K o n z e n t r a t i o n s t a r k z u n a h m , k o n n t e nicht i m S u b s t r a t s ä t t i g u n g s b e r e i c h g e a r b e i t e t werden. Die n i c h t e n z y m a t i s c h e P r o k a i n h y d r o l y s e w ä h r e n d der 2stündigen I n k u b a t i o n bei 37 °C w u r d e b e r ü c k s i c h t i g t u n d ebenso evtl. Verluste a n P A B b e i m E x t r a k t i o n s v o r g a n g sowie d u r c h unspezifische A d s o r p t i o n bei der D e n a t u r i e r u n g . Die in der L i t e r a t u r angegebene s p e k t r o p h o t o m e t r i s c h e B e s t i m m u n g der P E - A k t i v i t ä t in der M i k r o s o m e n f r a k t i o n [9] k o n n t e aus technischen G r ü n d e n n i c h t a n g e w a n d t werden. Die R e i n h e i t der n a c h Zellfraktionierung der R a t t e n l e b e r e r h a l t e n e n subzellulären F r a k t i o n e n w u r d e d u r c h folgende R e f e r e n z e n z y m e b e s t i m m t : E n d o p l a s m a t i s c h e s R e t i k u l u m : G l u k o s e - 6 - P h o s p h a t a s e (G-6-P-ase) [10]; L y s o s o m e n : /?-Glyzerophosphats p a l t u n g d u r c h die saure P h o s p h a t a s e [11]; M i t o c h o n d r i e n : S u k z i n a t d e h y d r o g e n a s e (SDH) m i t K a l i u m f e r r i z y a n i d als E l e k t r o n e n a k z e p t o r [12]. Als weitere K r i t e r i e n zur C h a r a k t e r i s i e r u n g der subzellulären F r a k t i o n e n w u r d e n die R N S - u n d P h o s p h o l i p i d verteilung herangezogen. I h r e B e s t i m m u n g erfolgte d u r c h A u f t r e n n u n g des G e s a m t p h o s p h a t e s der subzellulären F r a k t i o n e n d u r c h S ä u r e f ä l l u n g in d a s säurelösliche u n d d a s säureunlösliche P h o s p h a t . A u s l e t z t e r e m w u r d e d u r c h E x t r a k t i o n d a s P - L i p i d gewonnen. Die z u r ü c k b l e i b e n d e R N S w u r d e h y d r o l y s i e r t . N a c h V e r a s c h u n g eines Aliquot der P - L i p i d - u n d R N S - F r a k t i o n w u r d e ihr P h o s p h a t g e h a l t b e s t i m m t [13]. Alle P r o t e i n b e s t i m m u n g e n w u r d e n n a c h der M e t h o d e v o n L O W R Y e t al. [ 1 4 ] durchgef ü h r t . Als S t a n d a r d d i e n t e R i n d e r s e r u m a l b u m i n der B e h r i n g w e r k e .

Bestimmung der LD50 Auswertung nach M I L L E R und T A I N T E R [15], Beobachtungsdauer t e m p e r a t u r : 22 — 24 °C, relative L u f t f e u c h t i g k e i t > 5 0 % .

48

Std.,

Raum-

Auswertung der Versuche P E - A k t i v i t ä t : Die A k t i v i t ä t der P E wird in (¿Mol h y d r o l y s i e r t e s P r o k a i n / g L e b e r f e u c h t g e w i c h t f ü r jeweils 2 S t d . I n k u b a t i o n s d a u e r angegeben. Alle E r g e b n i s s e w e r d e n m i t d e m a r i t h m e t i s c h e n Mittel u n d S t a n d a r d f e h l e r angegeben. Signifikanz w u r d e bei einer I r r t u m s w a h r s c h e i n l i c h k e i t v o n p K6T npOHCXOflHTb OTJlOJKCHHe KajIblJHeBblX COJieft B MHTOXOHHpHHX. XoTH H npH 3KCTp6MajIbHOH THnepTepMHH in vivo JIOCTHraiOTCH TOJibKO TeMnepaTypbi OT 4 3 , 5 no 4 4 °C, npn KOTOPMX B MHTOXOHHPHHX ne^eHH in vitro nocjie 3 — 7 MHHyT HOCTOBepHbix noBpemneHHii eme He OTMeqaeTCH, TO npHxomrrcH yHHTBIBaTb 3HaHHT6JIbHO BblCIIiyiO flJIHTCJIbHOCTb B 3 0 50 M H H y T . B CBH3H C 3THM HeoSxoHHMbi HCCJienoBaHHH, KOTOpbie n o S j i H w e H 3 y n a j i H HeHHH B y c j i O B H H x i n

vivo.

6bi CTpyKTypHbie

H3Me-

A c t a biol. med. germ., B a n d 20, Seite 77 — 89 (1968) Aus der Abteilung f ü r Elektronenmikroskopie der Charité (Leiter: Prof. Dr. H . DAVID) a m Pathologischen I n s t i t u t der H u m b o l d t - U n i v e r s i t ä t Berlin (Direktor: Prof. Dr. L. H .

KETTLER)

Granuläres endoplasmatisches Retikulum und Ribosomen von Leberzellen nach Erwärmung bis 50 °G in vitro und in vivo H . DAVID u n d I. UERLINGS

(Eingegangen a m 26. 7. 1967)

Zusammenfassung Das granuläre endoplasmatische R e t i k u l u m von Leberzellen, die in vitro in physiologischen Lösungen f ü r 3 — 7 min auf 37 — 50 °C e r w ä r m t wurden, zeigt schon bei 42 °C erste Veränderungen. E s k o m m t zur A u f h e b u n g der regelrechten L a g e r u n g der Membranstapel, zur vesikulären U m w a n d l u n g u n d zur Ablösung der angelagert e n Ribosomen. W ä h r e n d bei Kontrolltieren u n d bei 37 °C je |im M e m b r a n s t r e c k e 22 Ribosomen mit einem durchschnittlichen A b s t a n d der R i b o s o m e n m i t t e l p u n k t e von 454 Ä angelagert sind, ä n d e r t sich ihre Zahl bei 42 °C auf etwa 1 5 u n d der Abs t a n d auf 672 Ä. Bei höheren T e m p e r a t u r e n bleiben diese W e r t e mit geringen Schwankungen erhalten. Die vesikuläre T r a n s f o r m a t i o n n i m m t zu. Bei 4 7 - 5 0 °C sind a u ß e r d e m osmiophile Verdichtungen umschriebener Membranbereiche zu finden, die auf ein Schmelzen der Lipide der M e m b r a n e n z u r ü c k g e f ü h r t werden könnten. Bei überlebenden Tieren k o m m t es nach der E r w ä r m u n g von Lebergewebe auf 48 bis 49 °C innerhalb von 1 Std. zu einer v a k u o l ä r e n U m w a n d l u n g des granulären endoplasmatischen Retikulums, was z u s a m m e n mit den Mitochondrienveränderungen als Zeichen einer irreversiblen Zellschädigung zu b e t r a c h t e n ist. Die in v i t r o - B e f u n d e werden als Folge einer beschleunigten Autolyse gedeutet, die u n t e r der T e m p e r a t u r e r h ö h u n g eine erhebliche Z u n a h m e zeigen. Einführung

In einer vorhergehenden Arbeit [21] haben wir die Strukturveränderungen der Mitochondrien bei Erwärmung in vitro und in vivo beschrieben. Sie sind besonders eindeutig und stellen bei der Diskussion der Extremhyperthermie im Rahmen der Krebsmehrschritt-Therapie einen wichtigen Punkt dar [1—3]. Im Verlaufe unserer Untersuchungen konnten wir jedoch feststellen, daß im Bereich des granulären endoplasmatischen Retikulums und der freien Ribosomen der Leberparenchymzellen ebenfalls Veränderungen auftreten, die bei weiteren Arbeiten über die Folgen der Hyperthermie berücksichtigt werden müssen.

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H . DAVID, I . U E R L I N G S

Material und Methodik Als U n t e r s u c h u n g s m a t e r i a l diente Lebergewebe der R a t t e , das f ü r 3 — 7 min in physiologischen Lösungen in vitro auf verschiedene T e m p e r a t u r e n zwischen 37 °C u n d 100 °C e r w ä r m t wurde, sowie in vivo auf 48 — 49 °C erwärmtes Gewebe, das nach Überlebenszeiten zwischen 5 und 60 min u n t e r s u c h t wurde. Über Einzelheiten der Methode s. [21], N a c h Fixierung in 1 %iger, isotonischer 0 s 0 4 - L ö s u n g bei pH 7,2 u n d E n t w ä s s e r u n g in Azeton w u r d e in Vestopal W eingebettet. Die Schnitte wurden mit einem U l t r o t o m ( L K B - P r o d u k t e r Stockholm) hergestellt u n d mit Bleizitrat kontrastiert. Die Aufn a h m e n erfolgten mit einem Siemens-Mikroskop Elmiskop I A bei Vergrößerungen von 2000 bis 40000 mit photographischen Nachvergrößerungen. Zur B e s t i m m u n g der Zahl der den M e m b r a n e n des granulären endoplasmatischen R e t i k u l u m s angelagerten Ribosomen wurden an auf 100000 : 1 vergrößerten Abbildungen mit Hilfe eines Kurvimeters jeweils eine Strecke von 50 (im Oberfläche abgemessen und die in diesem Bereich anliegenden Ribosomen gezählt. Ergebnisse

In

vitro-Versuche

Kontrolle und Befunde bei 37 0 C: Das granuläre endoplasmatische Retikulum zeigt eine regelrechte Anordnung in großen Stapeln mit paralleler Lagerung der Membranen und einzelnen Zügen in der Umgebung der Mitochondrien. Die Ribosomen sind in unregelmäßigen Abständen angelagert (Abb. 1). Im Grundplasma liegen reichlich freie Ribosomen.

Abb. 1. Granuläres endoplasmatisches R e t i k u l u m aus einer Rattenleberzelle nach 7minutigem A u f e n t h a l t in physiologischer Lösung von + 37 °C.

Normale A n o r d n u n g der M e m b r a n e n mit unregelmäßig angelagerten Ribosomen von typischer Größe, x 100000

W ä r m e i n d u z i e r t e V e r ä n d e r u n g e n des E . R .

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42—43 °C: Die parallele Lagerung der Membranen ist in einzelnen Bereichen aufgehoben. Selten liegt eine vesikuläre Umwandlung vor. Die Ribosomen erscheinen teilweise vergrößert oder verklumpt. In einigen Membranbereichen ist nur eine einseitige Anlagerung der Ribosomen erkennbar (Abb. 2). 45 ° C: Deutliche Aufhebung der Parallellagerung der Membranstapel (Abb. 3). Vielfach sieht man eine kleinvesikuläre Umwandlung. Die Ribosomen sind in einigen Bezirken abgelöst, in anderen unregelmäßig gelagert oder verklumpt. Um einzelne Mitochondrien sind die umgebenden Membranen des endoplasmatischen Retikulums frei von Ribosomen. 4J—4g °C: Die Membranstapel des granulären endoplasmatischen Retikulums haben sich zum größten Teil aufgelöst. Es finden sich zisternenärtige Erweiterungen oder vesikuläre Umwandlungen. Die Ribosomen sind in einigen Bereichen abgelöst, unregelmäßig angelagert oder verwaschen (Abb. 4). Die freien Ribosomen zeigen eine verwaschene S t r u k t u r oder Verklumpungen. Innerhalb der Membranzüge treten osmiophile Verdichtungsherde auf (Abb. 5). 50 °C: Die Befunde entsprechen denen bei 47—49 °C. 100 °C: Die Membranen sind noch angedeutet zu erkennen, die Ribosomen sind zu großen osmiophilen Klumpen verbacken (Abb. 6), so daß Einzelformen nicht mehr identifizierbar sind. In vivo-Versuche 48—4g °C, nach 5 min: Das granuläre endoplasmatische Retikulum ist zum größten Teil vesikulär oder vakuolär umgewandelt. Nur selten sind Bezirke mit erhaltenen Membranstapeln zu sehen. Die Ribosomen sind teilweise abgelöst. Die Membranen zeigen verwaschene osmiophile Herde innerhalb ihres Verlaufes. 48—4g °C, nach 60 min: Das granuläre endoplasmatische Retikulum ist zu großen leeren oder mit granulärem Material angefüllten Vakuolen (Abb. 7) sowie kleinen Vesikeln umgewandelt. Dadurch werden die Mitochondrien z. T. verdrängt oder zeigen Einstülpungen. Verhalten der Ribosomen Zu den vorliegenden Meßergebnissen (Tab. 1) ist ein Kommentar insofern zu geben, weil es sich dabei um Durchschnittswerte von vorhandenen Membrankomplexen handelt. Es konnte dabei nicht berücksichtigt werden, ob und welcher Prozentsatz an Membranen zugrunde gegangen ist oder soweit verändert ist, daß er nicht mehr dem granulären endoplasmatischen Retikulum zugeordnet werden kann. Wie schon in einer früheren Arbeit angeführt [20], ist auch unter Normalbedingungen infolge der unterschied-

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H . DAVID, I. UERLINGS

Abb. 2. Granuläres endoplasmatisches Retikulum aus einer Rattenleberzelle nach 7minutigem Aufenthalt in physiologischer Lösung von + 4 3 °C. Die Membranen verlaufen parallel und zeigen keine Erweiterungen des Innenraumes. Die Zahl der angelagerten Ribosomen scheint herdförmig rarefiziert. x 100000

Wärmeinduzierte Veränderungen des E . R.

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Abb. 3. Granuläres endoplasmatisches Retikulum aus einer Rattenleberzelle nach 3minutigem Aufenthalt in physiologischer Lösung von + 4 5 °C. Beginnende Aufhebung der regelrechten Lagerung der Membranstapel ohne wesentliche Erweiterung der Innenräume. Unregelmäßige Lagerung und herdförmige Ablösung der Ribosomen. X 100000

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Acta biol. med. genn., Bd. 20, H e f t 1

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H . DAVID, I. UERLINGS

A b b . 4. G r a n u l ä r e s e n d o p l a s m a t i s c h e s R e t i k u l u m a u s einer Rattenleberzelle n a c h 3 m i n u t i g e m A u f e n t h a l t in physiologischer L ö s u n g v o n + 4 8 °C. A u f h e b u n g der regelr e c h t e n L a g e r u n g der M e m b r a n s t a p e l des g r a n u l ä r e n e n d o p l a s m a t i s c h e n R e t i k u l u m s m i t zisternenartiger E r w e i t e r u n g (z) der I n n e n r ä u m e . Ü b e r große P a r t i e n der Memb r a n o b e r f l ä c h e Ablösung der R i b o s o m e n . x 100000

A b b . 5- G r a n u l ä r e s e n d o p l a s m a t i s c h e s R e t i k u l u m aus einer Rattenleberzelle n a c h 7 m i n u t i g e m A u f e n t h a l t in physiologischer L ö s u n g bei + 4 9 °C. Vielfach noch regelr e c h t gelagertes R e t i k u l u m (a u. b). M e m b r a n s t r u k t u r e n noch erhalten. Keine w e s e n t liche E r w e i t e r u n g der Zwischenräume. R i b o s o m e n streckenweise abgelöst. A u f t r e t e n einzelner osmiophiler V e r d i c h t u n g s h e r d e i m M e m b r a n v e r l a u f (o). I n c A u f l ö s u n g d e r M e m b r a n e n bei E r h a l t e n b l e i b e n oder V e r k l u m p u n g der R i b o s o m e n . x 100000

Wärmeinduzierte Veränderungen des E. R.

Abb. 5 (s. S. 82)

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H . DAVID, I. UERLINGS

Abb. 6. Granuläres endoplasmatisches Retikulum aus einer Rattenleberzelle nach 1S sec dauernder Einwirkung von Wasser von + 1 0 0 °C. Verklumpung der Ribosomen (R) zu großen Komplexen mit starker Osmiophilie. Die Membranen sind noch angedeutet sichtbar, x 100000

Wärmeinduzierte Veränderungen des E. R.

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Abb. 7. Granuläres endoplasmatisches Retikulum aus einer Rattenleberzelle nach Aufenthalt in physiologischer Lösung von + 4 9 °C für 7 min und nachfolgendem Überleben für 60 min. Vakuoläre Umwandlung (VA) des Retikulums, herdförmige Ablösung der Ribosomen. x 100000

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H . DAVID, I.

UERLINGS

Tabelle 1 Ergebnisse der Messungen

Temperatur

37 °C und Kontrolle 42

°C

43 °C 45 °C 4 7 - 4 9 °C 48 — 49 °C für 60 min in vivo

22,0 14,9 15,7 13,6 13,6

14,3

454 672 637 735 735 699

liehen Konfiguration der den Membranen angelagerten Polysomen nicht damit zu rechnen, daß die Abstände zwischen den einzelnen Ribosomen gleichmäßig sind. Die durchschnittlichen Mittelpunktabstände geben deshalb nur darüber Auskunft, daß die Zahl der Ribosomen insgesamt verringert ist. Das Verhältnis der freien zu den membranständigen Ribosomen und Polysomen läßt sich aus dem Schnitt nicht einwandfrei bestimmen. Diskussion

Eine Ablösung von Ribosomen bzw. Polysomen von den Membranen des granulären endoplasmatischen Retikulums erfolgt unter zahlreichen pathologischen Bedingungen [16]. Dabei sind besonders solche Vorgänge hervorzuheben, bei denen das Primärereignis eine Schädigung der DNS-abhängigen mRNS-Synthese mit nachfolgender Beeinflussung der Eiweißbildung darstellt. Der dabei eintretende Zerfall der Polysomen und ihre Ablösung von den Membranen ist durch den Untergang bzw. die fehlende Neubildung von mRNS bedingt [14, 18, 19, 31, 33]. Auch in regenerierendem Lebergewebe [12] und in Hepatomen [32, 38] sind mehr Polysomen von den Membranen abgelöst. Für den Zerfall der Polysomen und die Lösung vom Membransystem kommt entweder der Zerfall der mRNS infolge einer metabolischen Störung oder eine direkte toxische Wirkung in Frage. Da für die mRNS der Leber eine Halbwertszeit von 4—6 Std. bis zu 3 Tagen angenommen wird [9, 25, 28, 31, 33], scheint eine direkte Einwirkung bei der kurzdauernden, in unseren Versuchen angewendeten Erwärmung wahrscheinlicher. Von S M U C K L E R et al. [28—30] wird auch der schon nach 1 Std. eintretende CCl 4 -Effekt auf eine Direktwirkung zurückgeführt. Wie wir in früheren Untersuchungen [20] dargestellt haben, sind die membranständigen Polysomen der Leberzellen spiralförmig, helixartig oder kreisrund konfiguriert und mit allen Ribosomen an die Membranen angeheftet. Daraus ergibt sich, daß im Querschnitt eine unregelmäßige Anlagerung an

Wärmeinduzierte Veränderungen des E. R.

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die Membranen erkennbar wird. 50% der Polysomen sollen den Membranen angelagert sein [5]. Die membranständigen Polysomen werden dabei als stoffwechselmäßig aktiver als die freien angesehenen [4]. Der Abstand zwischen den Ribosomen ist bisher nur sehr selten gemessen worden. Für Wurzelzellen von Pflanzen wird ein Zentrum: Zentrum-Abstand von 275 A angegeben [10]. Innerhalb von Polysomen der Leber soll die Entfernung der Ribosomen voneinander 3 00 A betragen [6]. 3 Tage vor der Geburt werden von DALLNER et al. [13] zwischen den einzelnen membranständigen Polysomen Entfernungen von 500 A, zum Zeitpunkt der Geburt von 3 50 A gemessen. Zwischen den Einzelribosomen sind Werte von 250 Ä festgestellt worden. Für erwachsene Tiere liegen bisher keine Messungen vor, so daß wir unsere Ergebnisse nicht vergleichen können. Wenn auch die Membranen die Polysomen nicht gegen äußere Einwirkungen, wie z. B. gegen Ribonuklease, schützen, so bleiben die einzelnen Ribosomen auch nach Zerstörung der Polysomen noch an den Membranen angeheftet [32]. Über den Einfluß von Temperaturveränderungen auf das granuläre endoplasmatische Retikulum ist bisher nur wenig bekannt. In den Leberzellen von Regenbogenforellen kommt es bei Senkung der Außentemperatur von 18 °C auf 5 °C zu einer hochgradigen Dilatation des gesamten Systems [8]. Einfrieren und Auftauen von Lebergewebe führt zur Fragmentierung und vesikulären Transformation des granulären endoplasmatischen Retikulums mit Ablösung der Ribosomen [35, 37]. Schon eine Inkubation von 2,5 bis 5 min bei 35 °C bewirkt eine Vermehrung der Monomeren auf Kosten der Dimeren [38]. Bei der Deutung unserer Befunde an den Lebermitochondrien [21] haben wir als wesentlichen Faktor eine erhöhte und beschleunigte Autolyse angenommen. Wir möchten auch für die Veränderungen des granulären endoplasmatischen Retikulums diese Erklärung in den Vordergrund stellen. Sowohl bei der postmortalen Autolyse als auch bei der Necrosis in vitro wurden ähnliche Befunde erhoben [11, 15, 16, \7, 24, 26, 34, 36]. Die bei 100 °C gefundenen Erscheinungen sind durch eine Zerstörung der Eiweiße und Phospholipide hervorgerufen, deren Abbaustufen sich zu den osmiophilen Komplexen zusammenlagern. Für die Deutung der osmiophilen Verdichtungen der Membranen muß ebenfalls ein Schmelzeffekt als wichtig angesehen werden, da ähnliche Befunde bei der Autolyse allein nur sehr selten beobachtet werden. Dagegen sind solche Veränderungen auch bei toxischen Wirkungen, wie nach CCl 4 -Vergiftungen [22, 23] zu sehen, wobei eine Lipidperoxydation angenommen wird. Der bei den überlebenden Tieren auftretende Befund einer exzessiven Dilatation des granulären endoplasmatischen Retikulums ist im Zusammenhang mit den früher beschriebenen Mitochondrienveränderungen [21] als Zeichen eines irreversiblen Unterganges der betroffenen Zellen zu betrachten. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, daß im Gegensatz zu den erst bei 47 °C eindeutig erkennbaren Strukturveränderungen der Mitochondrien das granu-

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läre endoplasmatische Retikulum schon bei 42 °C Befunde aufweist, die anfangs wahrscheinlich noch reversibel sind. Jedoch ist in Analogie mit zahlreichen anderen derartigen Befunden [16] damit zu rechnen, daß die mit den Ribosomen/Polysomen verbundene Proteinsynthese Zeichen einer Störung zeigen wird, was jedoch durch biochemische Untersuchungen noch bewiesen werden müßte. Literatur [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12]

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Warmeinduzierte Veranderungen des E. R .

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Summary H . DAVID a n d I . UERLINGS: T h e granular e n d o p l a s m a t i c r e t i c u l u m a n d r i b o s o m e s

of liver cells after warming up to 50 °C in vitro and in vivo The granular endoplasmatic reticulum of liver cells warmed up in vitro in physiologic solutions for 3—7 minutes to 37—50 °C undergoes first changes already at 42 °C, such as disturbance of the regular arrangement of the membrane stacks, vesicular transformation and release of the attached ribosomes. Whereas in control animals and at 37 °C, one pun of membrane length contains 22,0 ribosomes spaced apart 454 A centre to centre, these values change to 14.9 and 672 A at 42 °C. A t higher temperatures the values do not change essentially. The vesicular transformation increases. A t 47 —50 °C osmiophilic condensation of circumscribed membrane regions are found, which are possibly caused by melting of the membrane lipids. In surviving animals after warming of the liver tissue to 48 — 49 °C within 1 hour the granular endoplasmatic reticulum undergoes a vacuolar transformation, which is to be regarded, together with the changes of mitochondria, as a sign of irreversible damage of cells. The in vitro data are interpreted as a cons ;quence of an accelerated autolysis which is considerably increased at elevated temperatures. Pc3IOMe X . JUaBHH H H . l O p j i H H r c : r p a H y j i n p H b i i i 3HH0njia3MaTHqecKHii p e T H K y j i y M H PH6OCOMM neieHOHHbix KJIETOK n o c n e o S o r p e B a HO 50 ° C i n v i t r o H i n v i v o r p a H y j i H p H B i i i BHAonjiaaMaxH'iecKHii p e T H K y j i y M n e i e i i o ' i H b i x KJieTOK, o S o r p e T t i x i n v i t r o B H3H0Ji0rHiecKHX p a c T B o p a x B T e q e m i e 3 — 7 MHHyT HO 3 7 — 5 0 ° C , n o K a 3 a j i n nepBbie H3MeHenHH y m e npH T e M n e p a T y p e 42 ° C . H a S j u o n a e T C H y c T p a HeHHe p e r y j i H p H o r o p a c n o j i o j K e H H H MeMSpaiiHbix i i r r a n e j i e i i , B e 3 H K y j i H p H o e n p e B p a m e H H e h o T n e j i e m i e npHcoeHHHHBiiiHxcH PH6OCOM. B TO BpeMH K a n y KOHTpojibHHX JKHBOTHblX H npH 37 °C Ha OHHOM MKM HJIHHbl MeMCpaHbl IipHCOeflHHHIOTCH 2 2 , 0 PH6OCOMH c o cpenHHM paccTOHHHeM HX q e w r p o B B 454 A , HX HHCJIO y M e H b rnaeTCH n p H 42 °C no 14,9 c paccTOHHHeM 672 A . r i p n S o j i e e BHCOKOH T e M n e p a T y p e 3TH BejIHIHHbl OCTaiOTCH TCMe )Ke C HeGOJIblUHMH KOJieSaHHHMH. B e 3 H K y j i H p Han TpaHC$opMauHH yBejiHHHBaeTCH. K p o M e T o r o , n p H 4 7 — 5 0 ° C HMeeT MecTO ocMHKneHHH KJICTOK. JUaHHbie, nojiyneHHbie in v i t r o , HHTepnpeTHpyiOTCH KaK nocneHCTBHe y c K o p e H H o r o aBT0jiH3a, KOTopbie 3HaHHT6jibHo yBejiH^HBaioTCH c noBbiuieHHeM T e M n e p a Typbi.

Acta biol. med. germ.. Band 20, Seite 91 —95 (1968) Aus der Medizinischen Universitätsklinik Rostock (Direktor: Prof. Dr. M. G Ü L Z O W )

Die Laktaseaktivität im Dünndarm bei experimenteller Pankreatitis K . DIWOK und H. J.

HÜTTER

(Eingegangen am 26. 5- 1967) 1

Zusammenfassung Da im Verlauf verschiedener Abdominalerkrankungen ein sekundärer Laktasemangel bekannt, jedoch bei akuten Pankreaserkrankungen diese Frage noch nicht untersucht ist, wurde am Modell der Taurocholat- und Äthionin-Pankreatitis der R a t t e geprüft, wie sich die Laktaseaktivität in der Schleimhaut des oberen Dünndarms verhält. 3, 6, und 37 Tage nach einer einmaligen i.p. Äthioningabe befindet sich der ß-Galaktosidasegehalt der Dünndarmschleimheit im Bereich der Norm. 2 — 8 Std. nach Injektion von Natriumtaurocholat in das Pankreasgangsystem liegen die Enzymaktivitäten bei mehr als der Hälfte der Versuchstiere, nach 24 und 48 Std. bei knapp der Hälfte unterhalb der bei einer Reihe von Kontrolltieren ermittelten unteren Normgrenze. Einführung

In den letzten Jahren wurde als Ursache von Durchfallerkrankungen im Erwachsenenalter ein mehrere gastroenterologische Krankheiten begleitender sekundärer Laktasemangel beschrieben (ausführliche Literatur bei [2]). Bei der Behandlung von Patienten mit Pankreasnekrosen und akuter Pankreatitis war uns aufgefallen, daß es im Verlauf des stufenweisen Kostaufbaus nach Abklingen der akuten Krankheitsphase häufig zu diffusen krampfartigen Leibschmerzen und Durchfällen kam, wenn die Kranken aus entrahmter Milch hergestellte Breie (Kohlenhydratkost mit geringem Eiweißgehalt) erhielten, wohingegen die Kostformen vorher und danach beschwerdefrei toleriert wurden. Es lag nahe, für die Unverträglichkeit einen vorübergehenden Laktasemangel verantwortlich zu machen, der auch bei anderen Abdominalerkrankungen beschrieben ist. Da ein größeres entsprechendes Krankengut in kürzerer Zeit nicht zur Verfügung steht, sich Dünndarmbiopsie und auch orale Kohlenhydrattoleranztests in der akuten und auch postakuten Phase der Erkrankung verbieten, gingen wir der Frage des pankreatitisbedingten Laktasemangels in der Dünndarmschleimhaut zunächst in Versuchen an Ratten nach. 1

Nach Revision am 26. 7. 1967.

92

K . DIWOK, H . J.

HÜTTER

Methodik Bei 93 vorwiegend männlichen Wistar-Ratten eigener kontinuierlich fortgeführter Zucht im Gewicht von 200 —250 g wurde experimentell eine Pankreatitis erzeugt. Bei 52 Tieren geschah dies nach der Methode von H E I N K E L [3] durch transduodenale Injektion von 0,6 ml3%igem Natriumtaurocholat in den für 2 min leber- und darmwärts unterbundenen Gallengang, bei 41 Tieren durch i.p. Verabreichung von 10 ml einer 2%-igen Äthionin-Lösung. Die Tiere wurden in bestimmten Zeitabständen nach Erzeugung der Prankreatitis in Äthernarkose getötet und die vom Duodenum und oberen Jejunum (proximale 10 cm des Dünndarms) abgeschabte Mukosa auf ihren Laktasegehalt nach der von uns modifizierten Methode [4] nach D A H L O V I S T [ 1 ] untersucht. 21 unbehandelte Ratten, die 16 Std. vor der Tötung das letzte Futter erhielten, jedoch nach Belieben Wasser trinken konnten, dienten als Kontrolltiere. Die Mukosa wurde mit 0,9%iger Kochsalzlösung im PoTTER-ELVEJHEM-Homogenisator unter Eiskühlung homogenisiert. Der Protein-N wurde nach K J E L D A H L bestimmt, die Enzymaktivität als U/mg Protein errechnet (1 U = 1 (¿Mol umgesetztes Substrat/min unter den von uns ermittelten Optimalbedingungen). Zusammensetzung der Enzymansätze: Gesamtvolumen 3 ml, Substratkonzentration 0,046 Mol Laktose im Ansatz, 1 ml Enzym, 1 ml 0,4 M Zitonensäure-Na 2 HP0 4 -Puffer (pH 4,1). Ergebnisse

Zunächst wurden die Normalwerte der Laktaseaktivität im oberen Dünndarm der Ratte bestimmt. Bei 21 Tieren lagen sie zwischen 0,0122 und 0,0348 U/mg Protein, lassen also eine große Streubreite erkennen (x = 0,0202, s = + 0,0068; siehe auch Abb. 1). Die Tiere aus der Gruppe der Äthionin-Pankreatitis wurden 72 und 144 Std. sowie 3 7 Tage nach der i. p. Pankreatitis

Normaltiere U/mg Protein

3

:

6 Tage

-

Tiere

Natrium-Taurochojat

Äthionin 37

12 34 5 67 8 24 Stui den

48

0,030

• •

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•

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•

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•

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0,010 •

n = 21 0,005

•

•

•

7 = 0,0202 S = *0,006B

Abb. 1. Laktase-Aktivität in der Dünndarmmukosa von gesunden und pankreasgeschädigten Ratten

Laktaseaktivität im Dünndarm

93

Gabe von Äthionin getötet. Die äthioninbedingten Veränderungen an Pankreas und Leber waren bei den Ratten nach 3 und 6 Tagen deutlich, nach 37 Tagen fiel lediglich eine leichte Atrophie des Pankreas auf. Wie aus der Abb. 1 zu erkennen ist, bewegen sich die Laktaseaktivitäten in der Dünndarmschleimhaut bei allen drei Untergruppen der mit Äthionin behandelten Tiere im Normbereich. Äthionin führt in der hier verwandten Versuchsanordnung nicht zu einer Veränderung der /?-Galaktosidase-Aktivität. Ein Teil der Tiere, bei denen die Pankreatitis durch Taurocholat erzeugt war, wurde 24, ein anderer 48 Std. nach Injektion von Taurocholat in das Pankreasgangsystem getötet. Anschließend wurde die Laktaseaktivität im Darm bestimmt. Die Letalität in diesen Gruppen war hoch, so daß nur etwa 50% der in den Versuch genommenen Ratten überlebten und für die Untersuchungen verwendet werden konnten. Eine weitere Gruppe von Tieren wurde 2—8 Std. nach Taurocholatinjektion getötet. In dieser Gruppe liegen bei etwa der Hälfte der Tiere die Laktasewerte unterhalb der unteren Normgrenze, 24 und 48 Std. nach Taurocholatinjektion noch bei einzelnen Tieren (s. Abb. 1). In dieser Gruppe fand sich auch der geringste Aktivitätswert mit 0,0036 U/mg Protein. Diskussion

Bei der Pankreatitis ist die Frage eines sie begleitenden sekundären Laktasemangels bisher nicht untersucht. Lediglich bei einem Patienten mit Pankreaskarziom fand WELSH et al. [8] normale Laktaseaktivität im Jejunum. Bei der engen topographischen Beziehung des Pankreas besonders zum Duodenum, aber auch zum oberen Jejunum, wäre eine Veränderung der Enzymaktivität in der Dünndarmmukosa denkbar. Da die Relation der Disaccharidasen Maltase: Isomaltase: Saccharase: Laktase annähernd 6 : 2 : 2:1 beträgt, ergibt sich, daß in erster Linie der Mangel an Laktase bei einer Schädigung der Dünndarmmukosa klinische Erscheinungen hervorruft. Wie die vorliegenden tierexperimentellen Untersuchungen zeigen, liegt die Laktaseaktivität im oberen Dünndarm bei etwa der Hälfte der Tiere nach Injektion von Natriumtaurocholat in den Pankreasgang unterhalb der unteren Normgrenze. Nach einer Äthioninschädigung fanden sich in keinem Fall erniedrigte Laktaseaktivitäten. Dafür dürfte die Art der Pankreatitiserzeugung (metabolische Pankreatitis) und die Schwere der Organschädigung die Ursache sein. Die Letalität der Tiere bei der Taurocholat-Pankreatitis ist außerordentlich hoch. Toxische Veränderungen — vorwiegend durch die proteolytischen Fermente — sowie Störungen der Durchblutung in unmittelbarer Nachbarschaft des entzündeten Organs möchten wir für den Laktaseaktivitätsverlust in der Dünndarmschleimhaut verantwortlich machen. Wie weit bei der akuten Pankreatitis etwa als Folge der Diät oder der Erkrankung selbst Abwesenheit oder Vorhandensein einer bestimmten intestinalen Mikroflora auf die ß-Galaktosidase-Aktivität von Einfluß ist,

94

K . DIWOK, H . J.

HÜTTER

kann auf Grund dieser Untersuchungen nicht beantwortet werden. Über die Einflußnahme der intestinalen Mikroflora auf Disaccharidase-Aktivitäten liegen jedoch ausgedehnte Untersuchungen vor, obwohl über den endgültigen Mechanismus noch keine Klarheit herrscht. Von R E D D Y und W Ö S T M A N N [7] wird eine Durchströmung der Mukosazellwand mit bakteriellen Produkten diskutiert, wobei von den Autoren eine Erniedrigung der DisaccharidaseAktivitäten bei keimfrei aufgezogenen Ratten beobachtet wurde, wenn diese mit Zökalinhalt üblicher — also nicht keimfreier — Ratten versetzt wurden. Die von M O N O D bereits 1951 gefundene Induktion der /9-GalaktosidaseSynthese bei E. coli nach Wachstum auf Laktose und die weiteren Untersuchungen von J A C O B [ 5 ] und M O N O D et al. [ 6 ] postulieren die Existenz eines zytoplasmatischen regulierenden Faktors für die Bildung der Partikelenzyme. Die bei der akuten Pankreatitis klinisch am Menschen beobachtete Laktoseintoleranz könnte also in diesem Sinne als Folge eines Substrat-(Laktose-) Mangels bei laktosefreier Diät angesehen werden, wobei die später zu beobachtende Normalisierung als erfolgreiche Enzymsynthese einer gesunden Schleimhaut nach Induktion durch erhöhtes Substratangebot im Rahmen des Diätaufbaues postuliert werden dürfte. Literatur [1] [2] [3] [4] [5] [6]

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K.

U. H . J . H Ü T T E R :

Anschrift der Verfasser: Dr. med. K. D I W O K , Dr. med. Med. Univ.-Klinik, 25 Rostock, Ernst-Heydemann-Str.

H.

J.

HÜTTER,

Summary K. D I W O K and H . J . mental pancreatitis

HUETTER:

Lactase activity in the small intestine in experi-

A secondary lactase deficiency which after oral administration of large amounts of lactose is leading to abdominal pain and diarrhoea has been observed in a number of gastrointestinal diseases. Those phenomena have not been described so far for acute pancreatic diseases. Clinical observations of pancreatitis patients suggest a transient lactase deficiency to take place also in this disease. Therefore, rats with pancreatitis induced by taurocholate and ethionine were tested for lactase activity in the mucosa of the upper small intestine. 3, 6 and 37 days after one single intraperitoneal injection of ethionine the /?-galactosidase content of the small intestine mucosa is within the normal range. Two to eight hours after injection of sodium taurocholate into the pancreatic duct system the enzymic activities in more than the half of the experimental animals, and after 24 and 48 hours in hardly the half of them, are below the lower normal limit determined in a number of normal animals.

Laktaseaktivität im Dünndarm

95

Pe3H»MC K.

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Acta biol. med. germ., Band 20, Seite 97 — 102 (1968) From the Central Drug Research Institute, Lucknow, India (Director: Dr. M . L . D H A R )

Calcification of the seminiferous tubules of the r a t testis after cadmium administration: prevention by zinc and selenium* G. L. TAKKAR, S. R . CHOWDHURY,

AMIYA B.

KAR and V. P.

KAMBOJ

(Received 28. 7- 1967)

Summary A single subcutaneous injection of cadmium chloride (10 mg./kg. body weight) to rats causes acute and irreversible destruction of the seminiferous epithelium and progressively severe calcification of the tubules between 7 and 90 days posttreatment. This effect is apparently selective since no calcium deposition is seen in the interstitium. Concurrent administration of zinc acetate (2 mg./kg. body weight) or selenium dioxide (4 mg./kg. body weight) prevents cadmium chlorideinduced calcification of the tubules. Zinc and selenium salts per se have no effect on the seminiferous epithelium. Introduction

It has been reported that cadmium chloride and several other metallic salts cause calcification of the site at which they are injected [1, 2, 3]. Since cadmium chloride is known to exert remarkable selective damaging effect on the seminiferous epithelium [4, 5, 6], it has been considered worthwhile to examine whether this is accompanied by a deposition of calcium in the tubules. Such destruction of the seminiferous epithelium can be achieved by a single subcutaneous or intratesticular injection, or even scrotal inunction of the salt in an aqueous-glycerine medium [4, 5 , 6 ] . Zinc and selenium, and to a lesser extent cesium, strontium and cobalt salts afford protection to the seminiferous epithelium against the damaging effects of cadmium chloride [4, 7—10]. Accordingly, it seemed to be of added interest to investigate whether zinc sulphate and selenium dioxide prevent any calcification of the tubules provoked by cadmium chloride. Methods Colony bred male hooded rats of the Institute weighing 200 — 250 gm. were used in this investigation. The animals were maintained in airconditioned quarters (temperature: 75 + 2 °F) under uniform husbandry conditions throughout the experimental period. * Communication no. 1173 from the Central Drug Research Institute, Lucknow, India. 7 Acta biol. med. germ., Bd. 20, Heft 1

98

G . L . T A K K A R , S . R . CHOWDHURY, A . B . K A R , V . P . K A M B O J

The animals received a single subcutaneous injection of cadmium chloride (10 mg./kg. body weight) and were sacrificed 3, 7, 15, 30 and 90 days post-treatment. Zinc acetate (2 mg./kg. body weight) was injected similarly either alone, or in combination with cadmium chloride. The calculated total dose of zinc acetate was divided into 3 equal doses and administered 5 hours before, concurrently, and 19 hours after cadmium chloride injection. The rats were sacrificed 90 days after administration of the salts. Selenium dioxide (4 mg./kg. body weight) was injected by the subcutaneous route either per se or in combination with cadmium chloride. The animals were sacrificed 90 days post-injection. The controls received sterile distilled water alone in a similar manner. The testes were dissected out, weighed to the nearest 0.1 mg. in a Roller-SMiTH balance and fixed in freshly prepared 1 0 % formalin. The serial paraffin sections of the organ (10 (¿) were stained with VON KOSSA [11] method for histochemical demonstration of calcium, andEHRLicHS hematoxylin and eosin for gross histological observations. The quantitative determination of calcium was carried out by Flame Photometry.

Results

The testis of control rats presented typical adult features with successive stages of transformation of the seminiferous epithelium into spermatozoa. The tunica propria was normal. The interstitium contained L E Y D I G cells and fibroblast-like elements. The vascularity was normal. Staining reaction for calcium was negative. This was also the case with 3 days post-injection group, even though there was histological evidence of hyperaemia and degeneration of the epithelial and interstitial elements. The tubular diameter was reduced and the tunica propria was disorganised. There were extensive desquamation and cytolysis of the seminiferous epithelial elements. The changes in the interstitium included edema, vascular engorgement, focal hemorrhage, deposition of fibrin and mass degeneration of the cellular elements. At 7 days the seminiferous epithelium was a debris and the tunica propria was disintegrated. The interstitium was degenerated as before with destruction of cellular elements, edema, vascular engorgement with frequent thrombus formation, and deposition of fibrin. Histochemically, only about 5% of the tubules located at the periphery showed mild and patchy deposition of calcium (Fig. 1); the interstitium and other elements were negative. The picture was the same at 15 days with few peripheral tubules showing mild calcification. Histologically, the tubules were defunct as before. However, proliferation of fibroblasts was seen underneath a thickened tunica albuginea and they were seen to migrate into the inter-tubular space mostly at the peripheral areas. Formation of new blood vessels was also seen in the interstitium. At 30 days all of the tubules showed varying degrees of calcium deposition. Some were totally and severely calcified; in others a relatively less deposition was observed (Figs. 2 and 3). The nuances included marked calcification of the peripheral region of some tubules with the central portion showing less intense staining reaction. However, as before no calcium deposition was seen in the interstitium. Histologically, the tubules were a debris. The inter-

Effect of cadmium on seminiferous tubules

99

Fig. 1. Testis of a rat 7 days after cadmium chloride injection. Note mild and patchy calcium deposition in some of the peripherally located tubules Fig. 2. Testis of a rat 30 days after cadmium chloride injection. Note varying degrees of calcification of the tubules Fig. 3. Testis of another rat 30 days after cadmium chloride injection. All of the tubules are calcified. Note variable pattern of calcium deposition in the tubules. Fig. 4. Testis of a rat 90 days after cadmium chloride injection. All of the tubules are severely calcified. All figures are photomicrographs and magnified x 80

100

G . L . TAKKAR, S. R . CHOWDHURY, A . B . KAR, V . P .

KAMBOJ

stitium contained fibroblasts and occasional L E Y D I G cells. The vascularity was virtually normal. At 90 days all of the tubules were totally and severely calcified (Fig. 4). The interstitium was regenerated and presented normal features; no calcium deposition was observed. Zinc acetate and selenium dioxide either per se or in combination with cadmium chloride did not cause calcification of the tubules. The histological features of the organ were also normal. The results of biochemical analyses showed that the calcium concentration of the testis increased progressively between 7 and 90 days post-injection; the highest level ( + 59%) was recorded at 90 days (Table 1). The concentration of calcium in the rest of the treatment groups was virtually similar to that of the controls. However, the difference in calcium value of the various salt treated versus control animals was not statistically significant. Table 1 Calcium concentration of the rat testis after cadmium, zinc and selenium injection Treatment Controls Cadmium chloride 3 days Cadmium chloride 7 days Cadmium chloride 1 5 days Cadmium chloride 30 days Cadmium chloride 90 days Zinc acetate 90 days Cadmium chloride + Zinc acetate 90 days Selenium dioxide 90 days Cadmium chloride + selenium dioxide 90 days

j

Calcium concentration* [mg./100gm.] 4.62 4.67 5.02 5.42 6.12 7-34 4.41 4.15 4.85

+ 1.12** + 0.34 ± 1.13 ±0.12 ± 1.67 ± 1.34 + 0.17 + 1.16 ± 0.62

4.50 + 1.68

% increase

—

+ 8.6 + 13 + 32 + 59 — — —

-

* Data based on 8 testes per experimental group. ** Mean ± S.E. Discussion

The results of the present study show that cadmium chloride causes deposition of calcium not only at the site of injection [1, 2, 3], but also in a tissue for which it has selective affinity. The acute and irreversible destruction of the seminiferous epithelium by this salt is now well documented [4, 5,6], and it appears that progressive calcification of the tubules is a manifestation of such damaging effect. The specificity of these effects on the seminiferous epithelium is further indicated by the consistent absence of calcium deposits in the interstitium; the histophysiologic changes provoked by the salt in this component of the testes is acute but reversible [4, 5].

E f f e c t of c a d m i u m on seminiferous tubules

Further evidence to the selective tubular effects of cadmium is provided by the results of experiments with zinc acetate and selenium dioxide. These salts afford complete protection to the seminiferous epithelium against the destructive effects of cadmium chloride [4, 7—10]. It his pertinent t h a t such protection includes prevention of calcium deposition in the tubules. In the context of the present study, the effect of zinc acetate on the seminiferous epithelium merits a comment. It has been reported that like cadmium, zinc causes calcification at the site of injection [1], However, no such effect on the tubules is observed. It is worth noting that as a physiologic microelement, zinc enjoys wide distribution in the body [12]; it is present in the seminiferous epithelium and is believed to play an important role in spermatogenesis [4]. It is possible that zinc does not cause calcification of the seminiferous epithelium because of its physiologic status. Conversely, it is conceivable that cadmium is effective since it is a selective toxic agent to the seminiferous epithelium. Apparently, such a view does not adequately explain the efficacy of selenium in preventing cadmium-induced calcification of the tubules. Acknowledgements This investigation was s u p p o r t e d b y a grant f r o m t h e F o r d F o u n d a t i o n . T h e a u t h o r s are g r a t e f u l to Dr. M. L . D H A R for his interest in this s t u d y . T h a n k s are due t o Mr. K. N A R A I N for technical assistance a n d Mr. S. K. N A T H for t h e photomicrographs. Literature S E L Y E , H . , B. T U C H W E B E R U. G . G A B B I A N I : Oncologia, Basel 17, 1 6 1 ( 1 9 6 4 ) . 2] S E L Y E , H . : Perspectives in Biology. Elsevier P u b l . Co., A m s t e r d a m 1 9 6 5 . T3] S E L Y E , H . : Calciphylaxis. Univ. of Chicago Press, Chicago 1962. [4] P A R I Z E K , J . : J . Reprod. Fert. 1, 294 (1960). [5] KAR, A. B. u. R. P. DAS: Acta biol. med. germ. 5, 1 5 3 (196O). [6] K A R , A. B. u. V. P. K A M B O J : Proc. of t h e 7th int. Conf. planned P a r e n t h o o d , Singapur 1963- E x c e r p t a Medica Foundation, A m s t e r d a m . [ 7 ] K A R , A . B . , R . P. D A S u. B . M U K E R J I : Proc. n a t n . I n s t . Sei. India. 2 6 , 4 0 ( 1 9 6 0 ) . [8] G U N N , S. A . , T . C. G O U L D U. W . A . D. A N D E R S O N : Archs P a t h . 7 1 , 274 (1961). [9] M A S O N , K . E . , J . A. B R O W N , J . O . Y O U N G U. R . N . N E S B I T : A n a t . Ree. 149, 1 3 5 (1964). [ 1 0 ] K A R , A. B. U. V. P. K A M B O J : I n d i a n J . exp. Biol. 3, 45 (1965). [ 1 1 ] K Ö S S A , J . V O N , zit. nach P E A R S E , A . G . E . : Histochemistry, theoretical a n d applied. J. a n d A. Churchill Ltd., L o n d o n 1961. [12] P A S S O W , H., A. R O T H S T E I N u. T. W . C L A R K S O N : P h a r m a c . R e v . 13, 185 (1961). [1] r

Zusammenfassung G. L . T A K K A R , S. R. C H O W D H U R Y , A M I Y A B . K A R a n d V . P . K A M B O J : Kalzifikation der H o d e n k a n ä l c h e n der R a t t e nach Gabe von K a d m i u m . V e r h ü t u n g d u r c h Zink u n d Selen Eine einmalige s. c. I n j e k t i o n u r s a c h t bei R a t t e n a k u t e u n d f ü h r t zu schweren progressiven nach der Behandlung. Dieser

von K a d m i u m c h l o r i d (10 m g / k g Körpergewicht) verirreversible Zerstörung des Samenblasenepithels u n d Kalzifizierungen der T u b u l i zwischen d e m 7. —90. T a g E f f e k t ist offenbar selektiv, da im I n t e r s t i t i u m keine

102

G. L. TAKKAR, S. R. CHOWDHURY, A . B . KAR, V. P. KAMBOJ

Kalziumablagerungen zu beobachten sind. Gleichzeitige Applikation von Zinkazetat (2 mg/kg) oder Selendioxid (4 mg/kg) verhindert die Kalziumchlorid-induzierten Kalzifizierungen der Tubuli. Zink- und Selen-Salze allein haben keine W i r k u n g auf das Samenepithelgewebe.

PC3W1WC r . Jl. T a K K a p , C. P . X o n 3 p H , A M H H B . K a p H B . IT. K a M ö o ä : K a j i b UHijiHKauHH ceMeHHbix KaHajibueB HH^eK Kpwcbi nocjie BBe«eHHH KajiMH« H ee npenoTBpameHHe UHHKOM H cejieHOM ONHOHPATHAA NOHKOHTHAN HHTEKUHH upbicaM x j i o p n u a KANMHH (10 MT/KT Beca Tejia) Bbi3biBaeT ocTpoe H HeoöpaTHMoe pa3pymeHHe ariHTejiHH ceMeHHbix ny3bipen H npHBOHHT K THHiejlblM npOrpeCCHBHHM KajIbUH(j)HKaLlHHM TpyßoneK OT 7 HO 90 HHH nocjie BBEAEHHH. JUAUHBM 3(j>eKT OHeBHgHO HMeeT H36HpaTejibHbiii x a p a K Tep, Tan Kau B MHTepcTHUHyMe He Ha6jii0iiai0TCH OTJIOJKGHHH KajibUHH. OnHOBpeMeHHoe BBeneHHe aqeTaTa UHHKA (2 Mr/nr) H OKHCH cejieHa (4 mr/nr) npeflOTBpamaeT KajibUH XJIOPHHOM KajibUHH. ILPHMEHEHHE OHHHX TOJIbKO UHHKOBblX H CejieHOBblX COJieH He HMeeT neÜCTBHH Ha TKaHb CeMeHHoro anHTejiHH.

Acta biol. med. germ., Band 20, Seite 1 0 3 - 1 1 0 (1968) Aus dem Institut für Krebsforschung der Deutschen Akademie der Wissenschaften zu Berlin, Experimenteller Bereich (Direktor: Prof. Dr. A. GRAFFI), Berlin-Buch

Über das plötzliche Auftreten von Spontan-Tumoren in einer Goldhamster-Koloniezucht K . - H . HORN u n d R.

SIEWERT

(Eingegangen am 4. 9. 67)

Zusammenfassung In einer ursprünglich spontantumorfreien Goldhamster-Koloniezucht treten seit November 1966 in ständig steigender Zahl Tumoren auf. In einem Zeitraum von 8 Monaten entstanden folgende Tumoren: 35 Lymphosarkome, 4 Papillome (2 Tiere), 1 Adeno-Karzinom der Leber und 1 lymphatisch-histiozytäre Leukose. Die Morphologie, Lokalisation und Histologie der Tumoren werden beschrieben. Versuche zur Klärung der Ätiologie dieser Tumoren werden durchgeführt und demnächst publiziert.

Die kontinuierliche Ermittlung der Spontantumorquoten ist für das in der experimentellen Krebsforschung eingesetzte Tiermaterial von größter Bedeutung. Das gilt besonders für die Tierbestände, die unter konventionellen Bedingungen gehalten werden, weil neben den verschiedensten Faktoren, die quantitative Änderungen bewirken können, auch mit qualitativen Veränderungen der Tumorquoten durch Infektion der Tiere mit onkogenen Viren gerechnet werden muß. Über ein sprunghaftes Auftreten von Tumoren in einer separat gehaltenen Goldhamster-Koloniezucht wird in der vorliegenden Arbeit berichtet. In dieser Zucht, die seit i960 besteht [1] und von 1962 an einen durchschnittlichen Bestand von ca. -1500 $$ und etwa 500 SS aufweist, konnten bis zum November -1966 keine Spontantumoren nachgewiesen werden [2], 1. Zeitliches Auftreten der Spontantumoren und Ermittlung der Tumorquoten unter besonderer Berücksichtigung der Tumor art, des Alters und des Geschlechts der Tiere Wie die Tab. 1 zeigt, befanden sich durchschnittlich etwa 1630 ?? und ca. 760 SS unterschiedlichen Alters in der Zucht. Da bereits bei 2 Monate alten Tieren Tumoren auftraten, wurden alle Tiere mit einem Mindestalter von 2 Monaten in die Ermittlung der Spontantumorquote einbezogen. (Die in der Tabelle für die jeweiligen Altersstufen angegebenen Prozentsätze sind auf den laufenden Tierbestand bezogen.) Die tatsächlichen Tumorquoten

104

K . - H . HORN, R .

SIEWERT

Tabelle 1 A n z a h l u n d A r t der a u f g e t r e t e n e n T u m o r e n u n t e r besonderer B e r ü c k s i c h t i g u n g des Alters u n d des Geschlechts der T u m o r t i e r e u n d der d u r c h s c h n i t t l i c h v o r h a n d e n e n Z u c h t p o p u l a t i o n e n . L y = L y m p h o s a r k o m ; P = P a p i l l o m e ; Ca = L e b e r t u m o r ; Leu = Leukämie Alter d e r Tiere 2 3 4 5 6 7

Monate Monate Monate Monate Monate Monate

Anzahl Zuchttiere

Anzahl Tumortiere

66

99

66

200 100 140 70 140 110

280 230 400 180 430 110

1 Ly 4 Ly

Insgesamt

760

1

1630

— — —

—

5 Ly

66

99 3 20 1 2 3 1

Ly Ly 1 Ca Ly Ly 1 Pa 1 Leu Ly Ly

| 30 L y 1 P a

P r o z e n t s a t z an Tumortieren

1 Ca 1 L e u |

1

1,1 8,7 0,5 2,2 0,9 0,9

0,5 4,0 — — —

0,7

99

|

2,1

von 0,92% bei weiblichen und 0,29% bei männlichen Tieren wurden errechnet aus der Anzahl der Tiere, die in dem 8monatigen Beobachtungszeitraum (November 1966 bis Juli 1967) die angegebenen Altersstufen durchliefen und als „auswertbare Tiere" bezeichnet werden müssen (3700 99 und 1750 N0 2J CS2 Rauchröhrchen z u r R a u c h e r z e u g u n g z w e c k s M a r k i e r u n g von Luft- und G a s s t r ö m u n g e n (Abzugsvorrichtungen

etc.)

Alcolor-Röhrchen z u r o b j e k t i v e n und s c h n e l l e n Feststellung der nach

Fahrtüchtigkeil

Alkoholgenuß

Anorganische Salze in analytischer Reinheit Organische Nachweis- und Fällungsreagenzien Reagenzien zur Chromatographie

VEB L A B O R C H E M I E APOLDA Laborchemikalien

• Industriechemikalien

Acta biol. med. germ. 20, K1 - K4 (1968) Aus dem Institut für Krebsforschung, Experimenteller Bereich (Direktor: Prof.Dr.A. GRAFFI) und dem Institut fUr Zellphysiologie (Direktor: Dr.habil.H. BIELKA) der Deutschen Akademie der Wissenschaften zu Berlin, Berlln-Buoh Veränderungen In der .Aktivität einiger Leberenzyme nach teilweiser Denervatlon der Rattenleber und nach Unterblndung des Ductus oholedoohus 0. SYDOW und F. NOLL (Eingegangen am 30.11.1967) I U I N und SHANIGINA beriohteten Uber Veränderungen von Enzymaktivitäten In der Rattenleber nach teilweiser Denervatlon. Diese Befunde erschienen Insofern von Bedeutung, als hierbei einige Veränderungen auftreten, die z.T. denen Im Hepatomgewebe, verglichen mit normaler Leber, ähnlich sind. Diese Ergebnisse waren daher für unsere Untersuchungen an der kanzerlslerten Rattenleber von besonderem Interesse. Wir führten deshalb gleiche Versuche unter Einbeziehung weiterer Enzyme duroh. Methodik FUr die Versuche wurden 3-4 Monate alte männliche Ratten unserer R-Zuoht verwendet. Die Tiere der ersten Gruppe waren unbehandelte Eontrollen. Bei den Tieren der zweiten Gruppe wurde auf operativem Wege eine Denervlerung der Leber durchgeführt. Das Ligamentum hepatoduodenale wurde naoh dem Herausibsen des Gallenganges, der Pfortader und der Leberarterie teilweise durchtrennt. Die peritonealen Häute des Gallenganges und der Gefäße wurden ebenfalls durchtrennt, was allerdings nloht vollständig gelang. Den Tieren einer dritten Gruppe wurde mittels einer Ligatur der Gallengang unterbunden, nachdem dieser aus dem Ligamentum hepatoduodenale herausgelöst war. In den folgenden Wochen wurde bei diesen Tieren ein zunehmender Ikterus beobachtet. Alle operativen Eingriffe erfolgten In Aethernarkose. Die tlberlebens^uote war bei beiden Eingriffen mit etwa 30 relativ gering. Drei Woohen nach der Operation wurden die Tiere oa. 20 Std. nüchtern gehalten und 3 Std. vor der Tötung per os mit 2 g Glukose belastet. Sofort naoh Dekapitatlon wurde die Leber entnommen und im Gewiohts-/Volumen-

K2 Verhältnis 1:4 mit eiskalter 150 mffi KCl + 50 mll Trislösung, pH 7,8 , homogenisiert. Von jedem Homogenat wurde ein Teil zur Bestimmung des Glykogengehaltes sowie der Arginase- und G6PaseAktivität entnommen. Sie Bestimmungen erfolgten nach schon beschriebenen Methoden £5^. Ein weiterer Teil der Homogenate wurde nochmals 1 : 3 mit Homogenisationsmedium verdünnt und 30 min bei 105 000g zentrifugiert. In den Uberständen wurden die Phosphofruktokinase (EC 2.7.1.11) nach SH0HK und BOXER [6], die G6P-dehydrogenase (EC 1.1.1.49) und 6PG-dehydrogenase (EC 1.1.1.44) nach »LOCK und MoLEAJT (jj und die Hexokinase (EC 2.7.1.1) und Glukokinase (EC 2.7.1.2) wie bereits beschrieben

ermittelt.

Der Proteingehalt wurde nach ITZHAKI und GILL £9} bestimmt. Die Enzymaktivitäten sind in jiMol bzw. mMol Substratumsatz pro min für 1 g Gewebe bei 25° C bzw. 37° C angegeben (siehe Legende zu Tab. 1). Ergebnisse Die Resultate unserer Untersuchungen sind in Tabelle 1 zusammengefaßt dargestellt. Denervatlon der Leber führt zu teilweisen Veränderungen verschiedener biochemisoher Parameter. Deutlioh ist eine Abnahme im Glykogengehalt sowie In der Aktivität der Glukokinase und Arginase erkennbar. Die

Glukose—6-phosphat—dehydro-

genase hingegen zeigt eine geringe, die Hexokinase eine stärkere Erhöhung ihrer Aktivität. In dem zur Auswertung zur Verfügung stehenden Tiermaterial waren einige Ratten mit auffallendem Stauungsikterus enthalten. Bei diesen Tieren traten Änderungen der Enzymaktivitäten in besonderem Maße auf. Bei der Ermittlung der Ergebnisse der Denervatlon wurde dieses Tiermaterial nloht berücksichtigt. Dies veranlagte uns, In getrennten Versuohen den Einfluß der U n terblndung des Ductus oholedoohus zu prüfen. In der lkterisohen Leber treten Veränderungen der Enzymaktivitäten besonders stark auf. So sind die organspezlfisohen Enzyme

(Glukose-6-phosphatase

und Glukokinase) stark reduziert, die Aktivitäten der anderen untersuchten Enzyme hingegen sind erhöht. Der Proteingehalt und Glykogengehalt in den stark vergrößerten Lebern sind erniedrigt.

K3 Tabelle 1

Enzymaktivitäten in normaler, teilweise denervierter und ikterischer Rattenleber

Bestimmung

normal Absolutwert $>

denerviert Absolutwert # '

ikterisch Absolut, wert %'

Gewicht der Tiere

138+191^ CS)

1 37+17

129+23

g Leber pro 100 g Körpergewicht

3,0+0,2 (8)

100

2,9+0,4 (7)

98+ 8 CS)

II

99+14 (5)

II

1,7+1,1 (7)

n

Glukose-6— 1 phosphatase ' Phosphofruktokinase^O

mg Protein2^ % Glykogen

2

y Arginase3")

»§£M CS) 77+10 CS)

4,5+1,9 (5)

150

82+ 9 CD

84

61

0,2+0,1 (5)

7

58+10 (7)

75

60+12 (5)

78

n

1,49+0,29 CT)

96

0,82+0,21 (5)'

53

n

1,7+0,2 CS)

90

97

101

-

-

Hexokinase^

0 ,32+0,08 CS)

n

0,42+0,14 CT)'

131

0,42+0,17 C5)

131

Glukokinase^

1 ,17+0,26 CS)'

n

0,95+0,34 C7)

81

0,49+0,37 C5;

42

Glukose-6, ,06+0,22 phosphatOD dehydrogenase ^

Ii 1,24+0,26 CF)'

117

1,81+1,13 C5)

171

6-Phospho— ,,58+0,30 glukonat,n (5) dehydrogenase '

Ii 1,56+0,31 C°)

99

2,28+0,44 (5)

144

^ Mittelwert mit Standardabweichurig,C) Anzahl der untersuchten iiei-o i< mg Protein der Überstandfraktion • g Gewebe f< mMol Substratumsatz • Std."*1 • g Gewebe" bei 37 C pHol ßubstratumsatz • min~1 • g Gewebe-1 bei 25° C •>J % des Kontrollwertes

u Diskussion Wie die Ergebnisse zeigen, führt die teilweise Denervlerung der Rattenleber zu gewissen Veränderungen einiger Stoffweohsellelstungen. Die Abweichungen von den Normalwerten sind allerdings nloht so groß, wie die ron ILJIK und SHANIGINA [1-4] angegebenen. Wesentlich stärkere Veränderungen treten Jedoch naoh Unterblndung des Gallenganges auf. Da auoh bei der Denerrlerung der Leber eine Beschädigung des Ductus oholedoohus während des operativen Eingriffs nloht Immer zu vermelden Ist, lassen sloh möglicherweise die Differenzen zwlsohen den Ergebnissen der oben zitierten Autoren und unseren Befunden hieralt erklären. Die von uns durchgeführten Yersuohe und die dabei erhaltenen Ergebnisse lassen Im Moment eine klare Entscheidung Uber eine mögliche nervale Regulation zumindest der Aktivität der untersuohten Enzyme nicht eindeutig zu. Der auffallendste Befund, nämlich die Verminderung des Glykogengehaltes, steht evtl. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen von SHDtAZU Qlo] , wonach die Glykogensynthetase (EC 2.4.1.11) der Regulation duroh nervale Einflüsse unterliegen soll. Für die In der Einleitung kurz skizzierte Frage der Beziehung zum Tumorstoffwechsel ergibt sloh Im Hinblick auf die starken Stoffwechseländerungen In dem autonom waohsenden Hepatomgewebe, daß diese nicht primär und ausschließlich auf Störungen der nervalen Regulation zurückgeführt werden können. Literatur [1] [2] £3] [4] [53 [6] [7] [8] [9] [10]

ILJIK, S.V.: Blol.Neonat. 9, 215 (1965/66). I U I » , S.V.: Vopr.med.ohlm. 12, 3 (1966). SHANIGINA, K.I.: Zurn. evol.biooh.iflziol. 2, 537 (1966). SHANIG1NA, K.I.j Vopr.med.ohlm. 258 (1966). SYDOW, G.: European J. Canoer 3, Im Druok. SHONK, C.E. und G.E. BOXER: Canoer Res. 24, 709 (1964). GLOCK, G.E. und P. MoLEAN: Bloohem. J. 55, 400 (1953). SYDOW, G.: Z. Naturforsoh. 21b, 232 (1966). ITZHAKI, R.F. und D.U. GILL: Anal. Blochem. 9, 401 (1964). SHIMAZU, I.: Solenoe 156, 1256 (1967).

Aufnahmebedingungen und Anleitung

zur Manuskriptgestaltung für die Zeltschrift "Acta blologica et medlca germanica"

A. Aufnahmebedingungen a) Es werden nur Arbelten angenommen, die nicht an anderer Stelle mit demselben Inhalt -veröffentlicht oder zur Veröffentlichung angeboten worden sind. Der Autor verpflichtet sich, naoh Annahme die Arbelt an keiner anderen Stelle zu veröffentlichen. b) Die Arbeit muß wissenschaftlich wertvoll sein. Bestätigungen bekannter Tatsachen, Versuche und Beobachtungen ohne positives Ergebnis werden, wenn Uberhaupt, nur in kürzester Form aufgenommen. Nicht aufgenommen werden Arbelten referierenden Charakters, Polemiken und rein spekulative Arbelten, falls sie nicht ganz wesentliche neue Gesichtspunkte enthalten. c) Einsendungen von Arbeiten ist eine Erklärung des Klinik- bzw. Institutsdirektors beizulegen, daß er unter Berücksichtigung der unter a) und b) aufgeführten Bedingungen mit der Veröffentlichung einverstanden ist. d) Kurzmittellungen Uber experimentelle Ergebnisse werden bei der Drucklegung zeltlich bevorzugt. Für Ihren Inhalt ist ausschließlich der Autor verantwortlich. B. Manuskriptgestaltung I. Allgemeines Die Manuskripte sind in 2facher Ausfertigung an die Redaktion der Zeitschrift einzureichen. Die Arbelten werden auf Sofortumbruoh gesetzt. Daher ist es erforderlich, die Manuskripte in einem sauberen, druckreifen Zustand zu schreiben (einseitig im Format A 4 mit Schreibmaschine 11/2zellig). Am linken sowie am unteren Rand sind 5 cm freizulassen. Die Beiträge sollen so kurz und klar wie möglich gehalten werden. Eine doppelte Darstellung der gleichen Versuchsergebnisse in Tabellen und Abbildungen ist zu vermeiden. Größere Korrekturen in Form von Streichungen oder Zusätzen in der Umbruchkorrektur sind unzulässig. Die Arbeiten können in deutscher, englischer, russischer und französischer Sprache abgefaßt werden.

Bei eingedeutschten Wörtern ist die "K - Z"-Schreibweise anzuwenden. Besonders aktuelle Untersuchungsergebnisse können in kurzer Form im Offsetverfahren publiziert werden. Diese Arbeiten erscheinen jeweils am Ende des Heftes. II. Gliederung der Arbeit Die nachfolgend aufgeführte Reihenfolge Ist zu berücksichtigen: 1. Name bzw. Bezeichnung des Institutes, aus dem die Arbeit stammt, und,in Klammern)Titel und Name des Direktors. 2. Titel der Arbeit, der nicht zu umfangreich, jedoch aussagekräftig sein soll. 3. Name des Autors bzw. der Autoren (Vornamen abgekürzt). 4. Zusammenfassung. Diese sollte 5 f> des Gesamttextes der Arbeit nicht überschreiten und in der Sprache abgefaßt sein, in der die Arbelt geschrieben ist. Ungebräuchliche Abkürzungen sind im Text der Zusammenfassung nicht zu verwenden (siehe VI, VII und VIII). Die Autoren werden gebeten, nach Möglichkeit von der Zusammenfassung sowie vom Titel der Arbeit eine englische und russische Übersetzung mit einzureichen. 5. Einführung. Dieser Abschnitt sollte kurz gehalten sein (etwa 10 des Gesamttextes der Arbelt) und das Ziel der Arbelt klar und deutlich herausstellen. 6. Material und Methodik, beide evtl. als getrennte Abschnitte. Die Angaben hierzu sollen kurz, jedoch genügend Informativ sein, so daß eine Durchführung der Versuche nach diesen Angaben möglich ist. 7« Ergebnisse 8. Diskussion 9. Literaturverzeichnis (siehe IX).

III. Tabellen Die Tabellen müssen klar und Ubersichtlich abgefaßt werden und sind auf einem besonderen Blatt zu schreiben. Sind Linien erforderlioh, so sind diese einzuzeichnen. Geschieht dies nicht, werden Tabellen ohne Linien gesetzt. Die Legende zur Tabelle, die den wesentlichen Inhalt derselben wiedergeben soll, ist Uber dieselbe zu setzen. Weitere Erklärungen über in der Tabelle enthaltene Versuchsdaten, methodische Hinwelse usw., sind unter die Tabelle zu schreiben. Dimensionen und Definitionen von Zahlenwerten (z.B. yug/ml, min, $ usw.) müssen in den Kolumnen enthalten sein, so daß sie nicht hinter jeder Zahl in einer entsprechenden Zahlenreihe stehen. Die Tabellen sind fortlaufend zu numerleren. Am Rand des Manuskriptes ist zu vermerken, an welcher Stelle im Text die Tabellen eingefügt werden sollen. IV. Abbildungen Die ebenfalls in doppelter Ausfertigung einzureichenden Abbildungen sind nicht im Text einzukleben, sondern der Arbeit separat beizulegen. Am Rand bzw. auf der Rückseite der Abbildungen sind fortlaufende Numerierung und der Name des Autors zu vermerken. Für Strichzeichnungen sind saubere Vorlagen einzureichen; Abkürzungen sind nach den Punkten VI, VII und VIII einsuzelohnen. Weiterhin ist auf den Abbildungen der vom Autor gewünschte Verklelne1 rungsmaßstab anzugeben (z.B. /2, 1/3 usw.), der bei der redaktionellen Bearbeitung der Manuskripte weltgehend Berücksichtigung finden kann. Alle Zeichnungen oder Abbildungen sollten in den Originalen so dimensioniert sein, daß sie nach einem einheitlichen Maßstab auf die Endgröße gebracht werden können. Am Rande des Manuskriptes ist zu vermerken, an welcher Stelle Im Text die Abbildungen eingefügt werden sollen. Die Legenden zu den Abbildungen sind auf ein separates Blatt zu schreiben. Die Legenden sollen sich auf den wesentlichen Inhalt der in den Abbildungen dargelegten Befunde erstrecken. Bei Strichzeichnungen, z.B. in Form von Koordinatensystemen mit Kurven verschiedener Darstellungen,sind die Kurvenbezeiohnungen (z.B. Kreuze, Funkte, Kreise usw.) in die Legende aufzunehmen und nicht In die Zelohnung selbst einzutragen. Solche Darstellungen und andere Er-

gänzungen sind den eigentlichen Legenden, abgetrennt durch einen Absatz, anzufügen. Y. Signlflkanfibereohnungen Beobachtungen an biologischem und medizinischem Material sollen mit Zahlenangaben Uber die Signifikanz der Ergebnisse belegt «erden. 71. Nomenklatur Folgende Nomenklaturquellen sind zu verwenden: 1. Chemische Nomenklatur a) Organische Chemie: International Union of Pure and Applied Chemistry: "Nomenclature of Organio Chemistry." Butterworths Soi. Publ., London 1998 oder Journal of the American Chemical Sooiety 82, 5545 (1960). b) Anorganisohe Chemie: International Union of Pure and Applied Chemistry: "Nomenclature of Inorganic Chemistry." Butterworths Sol. Publ., London 1999 oder Journal of the American Chemical Sooiety 82, 5523 (1960). 0) Physikalische Chemie: International Union of Pure and Applied Chemistry: "Manual of Physloo-Chemical Symbols and Terminology." Journal of the American Chemioal Sooiety 82, 5517 (1960). 2. Biochemische Nomenklatur a) Fermente und Kofermente: "Enzyme Nomenclature." Comprehensive Biochemistry. Hrsg.: M. FLORKIN u. E. H. STOTZ. Vol. 13, 2. Aufl. Elsevier Publ. Comp., Amsterdam 1965. "Report of the Commission of Enzymes of the International Union of Biochemistry"(Pergamon Press, Oxford 1961).

b) Polypeptide, Proteine, Kohlehydrate, Nukleinsäuren, Nukleotide , Koenzyme: International Union of Pure and Applied Chemistry - International Union of Biochemistry. Combined Commission of Bioohemioal Nomenclature: "Abbreviations and Symbols for Chemical Names of Speoial Interest in Biological Chemistry. Revised Tentative Rules ( 1 9 6 ? ) . " Journal of Biological Chemistry 241. 527; 2491; 2987 ( 1 9 6 6 ) . c) Hémoglobine: "Nomenclature of Hemoglobins." Blood 25, 126 (1965) oder Lancet 1 9 6 4 / 1 1 . 957. d) Steroide: "Definitive Rules for the Nomenclature of Steroids." Journal of the American Chemical Society 82, 5577 ( 1 9 6 0 ) . e) Vitamine: "Definitive Rules for the Nomenclature of Vitamins." journal of the American Chemical Sooiety 82, 5581 (1960) und Journal of Biological Chemistry 241, 2987 ( 1 9 6 6 ) . f) Lipide: International Union of Pure and Applied Chemistry International Union of Biochemistry. Commission on Biochemical Nomenclature (CBN): "The Nomenclature of Lipids." European Journal of Biochemistry 2, 127 ( 1 9 6 7 ) . g) Alle nicht festgelegten Abkürzungen, die vom Autor nach eigenem Ermessen getroffen werden, sind als Fußnote auf der ersten Seite der Arbeit anzuführen. V I I . Abkürzungen 1 . Gewichtsangaben: Kilogramm = kg; Gramm •» g; Milligramm = mg; Mikrogramm - yug; Nanogramm • ng; Pikogramm = pg; Mol (Grammoleküle) « Kol; Millimol » mMol; Mikromol - ^iMol; Nanomol • nMol; Grammatom - Grammatom; Mikro(Gramm)atom =• ^latom.

2. Längenangaben: Ueter » m; Zentimeter