Acta Biologica et Medica Germanica: Band 16, Heft 5 [Reprint 2021 ed.] 9783112540725, 9783112540718

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AC1ABIQL0GICA ETMEDICA GERMANICA HERAUSGEBER:

R . B A U M A N N , H. D U T Z , A. G R A F F I , H . G U M M E L , F. J U N G L.-H. K E T T L E R , S. M. R A P O P O R T U N T E R M I T A R B E I T VON:

W . B E l E I i , H. D R I S C H E L , H . F R U N D E R , M. GE U S C H , E. GOE'l'ZE, H. H A N S O N , F. H A U S C H I L D , G . H O L L E , F. M A C H , H. M A T T H I E S , G. MOHN I K E f , O. P R O K O P , K. S C H U B E R T , F. S C H W A R Z , G . S T E R B A , A. W O L L E N B E R G E R SCHRIFTLEITUNG:

W. S C H E L E R , H. B I E L K A

AKADEMIE-VERLAG

• BERLIN

• B A N D 16 • H E F T 5 • S E I T E 4 6 5 - 5 7 3 • 1966

AUFNAHMEBEDINGUNGEN

1. Es werden nur Arbeiten angenommen, die nicht an anderer Stelle mit demselben Inhalt veröffentlicht oder zur Veröffentlichung angeboten werden. Der Autor verpflichtet sich nach Annahme, die Arbeit an keiner anderen Stelle zu veröffentlichen. 2. Die Arbeit muß wissenschaftlich wertvoll sein.

Bestätigungen bekannter T a t -

sachen, Versuche und Beobachtungen ohne positives Ergebnis werden, wenn überhaupt, nur in kürzester Form aufgenommen. Nicht aufgenommen werden Arbeiten referierenden Charakters, Polemiken und rein spekulative Arbeiten, falls sie nicht ganz wesentliche neue Gesichtspunkte enthalten. 3. Kurzmitteilungen für experimentelle Ergebnisse werden bei der Drucklegung zeitlich bevorzugt. Für ihren Inhalt ist ausschließlich der Autor verantwortlich. 4. Die Arbeiten müssen kurz und klar geschrieben und gegliedert sein. Problematik (Einleitung), Methodik, Befunde und Diskussion, evtl. Schlußfolgerungen sollen deutlich in Erscheinung treten. Der Arbeit soll ein Kurzreferat der wesentlichsten Ergebnisse vorausgestellt werden. Neben einer anderssprachigen erscheint auf jeden Fall eine deutsche Zusammenfassung. Die Arbeiten werden in folgenden Sprachen angenommen: Deutsch, Russisch, Englisch und Französisch. 5. Die Arbeiten werden im Sofortumbruch gesetzt; größere Korrekturen in Form von Streichungen bzw. Zusätzen sind daher in der Umbruchkorrektur nicht mehr möglich. 6. Genaue Hinweise zur Manuskriptgestaltung sind von der Redaktion der Zeitschrift anzufordern und sind unbedingt einzuhalten. 7. Manuskripte sind an die Herausgeber zu senden oder direkt an die Redaktion der Acta biologica e t medica germanica. 1115 Berlin-Buch, Lindenberger Weg 70. 8. Von jeder Originalarbeit werden kostenlos 80 Sonderdrucke geliefert.

Darüber

hinaus können bis zu 100 Sonderdrucke gegen Berechnung bezogen werden.

Die Herausgeber

ACTA BIOLOGICA ET MEDICA GERMANICA Herausgeber : R. B a u m a n n

• H. D u t z

• A. G r a f f i • H . G u m m e l • F . J u n g • L . - H . K e t t l e r S. M. R a p o p o r t

B a n d 16

1966

Heft 5

A c t a biol. m e d . german., B a n d 16, Seite 465 — 473 (1966) Aus d e m I n s t i t u t f ü r Biophysik der D e u t s c h e n A k a d e m i e d e r W i s s e n s c h a f t e n zu Berlin (Direktor: Prof. Dr. rer. n a t . habil. KH. LÖHS) Berlin-Buch

Die Ribonuklease A nach UV-Bestrahlung (A = 254 nm): Spektrale Eigenschaften H.-G.

MÜLLER

(Eingegangen a m 9. 11. 1965)

Zusammenfassung U n t e r d e m E i n f l u ß m o n o c h r o m a t i s c h e n UV-Lichtes der Wellenlänge 254 n m verm i n d e r t sich die e n z y m a t i s c h e A k t i v i t ä t der R i b o n u k l e a s e bei gleichzeitigem Ansteigen der U V - A b s o r p t i o n zwischen 240 u n d 400 n m . Mit wachsender L i c h t i n a k t i v i e r u n g n i m m t a u c h die T h e r m o s t a b i l i t ä t der R N a s e a b u n d die n a t ü r l i c h e K o n f o r m a t i o n geht verloren. I m E r g e b n i s der B e s t r a h l u n g e n t s t e h t eine verä n d e r t e Seitenkette, die sich ähnlich wie d a s Tyrosin t i t r i e r e n l ä ß t .

Mit den Fortschritten der Eiweißchemie entstand die Möglichkeit zu eingehenderen Untersuchungen über den Einfluß der verschiedenen Strahlungsarten auf Proteine. Etwas überraschend ist dabei die Tatsache, daß die moderne automatische Aminosäureanalyse einstweilen keine aufschlußreichen Resultate erbrachte [2] —[5]. Auch unter der Annahme, daß die Veränderungen der Primärstruktur gering sind, dürfte eine wesentliche Ursache dafür in den gegenwärtig noch nicht zu umgehenden Unzulänglichkeiten der Vorbehandlung des Analysenmaterials zu suchen sein. D u r c h die salzsaure H y d r o l y s e bei 110 °C w e r d e n einzelne A m i n o s ä u r e n völlig zerstört, andere teilweise [6]. Einige D e r i v a t e v o n E i w e i ß a m i n o s ä u r e n , die bei Radiolysevorgängen e n t s t e h e n können, werden in die b e t r e f f e n d e n A m i n o s ä u r e n z u r ü c k v e r w a n d e l t [7], [7 a], Die E r f a s s u n g der verschiedenen niederen O x i d a t i o n s p r o d u k t e des Zysteins u n d Zystins ist schwierig, d a diese wie die A m i n o s ä u r e n selbst weitgehend instabil sind. H i e r bleibt n u r die Möglichkeit, die S u m m e beider A m i n o s ä u r e n n a c h vorheriger vollständiger O x i d a t i o n als Zysteinsäure zu b e s t i m m e n [6] oder eine alleinige B e s t i m m u n g v o n Zystein u n d Zystin v o r z u n e h m e n [8]. Leichter dagegen sind V e r ä n d e r u n g e n der biologischen u n d physikochemischen E i g e n s c h a f t e n n a c h z u 31

Acta biol. med. german., Bd. 16, H e f t 5

466

H.-G.

MÜLLER

weisen. Neben der enzymatischen [3] —[5], [7] oder hormonellen [9] —¡"11] geht auch immunologische Aktivität [9], [12] verloren oder beim Fibrinogen z. B. läßt die Gerinnungsfähigkeit nach [13]. Die Löslichkeit kann sich ändern [3], [15], ebenso wird das chromatographische [3], [15], [16] und optische [4], [17] —[19] Verhalten beeinflußt.

In diesem Beitrag wird über die Wirkung ultravioletten Lichtes (A = 254 nm) auf die spektralen Eigenschaften der RNase in Relation zur Aktivitätsabnahme berichtet. Material und Methodik Als Untersuchungsobjekt diente Ribonuklease A (RNase A), die nach A Q V I S T und A N F I N S E N [20] durch Ammonsulfatpräzipitation und anschließender Chromatographie über Carboxymethylzellulose isoliert und danach über Amberlite I R C 50 ( X E 64) nach H I R S et al. [21] rechromatographiert wurde. Zur Entsalzung schloß sich eine Gelfiltration über Sephadex G 25 (60X4 cm) mit 0,1 n Essigsäure als Elutionsmittel an. Die RNase-A-haltigen Fraktionen wurden lyophilisiert, zwecks Disaggregation nochmals gelöst, auf 65 °C erwärmt und wieder lyophilisiert. Das so gereinigte Material war in beiden chromatographischen Systemen homogen. Die Aminosäureanalyse nach 12 S P A C K M A N et al. [1] ergab nach 22 Std.-Hydrolyse in 5,7 N HCltridest ' : Asp Pro Val Phe

14,49 (15) 4,08 (4) 9,04 (9) 2,98 (3)

Thr Gly Heu Lys

8,51 (10) 3,24 (3) 2,90 (3) 10,43 (10)

Ser Ala Leu His

11,19 (15) 12,42 (12) 2,24 (2) 4,37 (4)

Glu % Cys Tyr Arg

12,50 (12) (8) 5,00 (6) 3,93 (4)

Die bestrahlten RNase-Lösungen waren 0,2 % ig in tridest. Wasser und wurden stets frisch hergestellt. Ihr £ H - W e r t lag, bedingt durch Essigsäure-Reste im Lyophilisat, bei 5,0. Bestimmungen der enzymatischen A k t i v i t ä t erfolgten nach A N F I N S E N et al. [22] m i t R N S als Substrat. Die Konzentration ermittelten wir m i t Hilfe des molaren E x t i n k tionskoeffizienten von E278 = 9,8 • 103 unter Zugrundelegung des Molekulargewichtes von 13 700. Die als Substrat benutzte R N S gewannen wir aus einem R o h p r ä p a r a t des Arzneimittelwerkes Dresden. Der wasserlösliche Anteil der Ausgangssubstanz wurde im 20 fachen Volumen zweimal mit Phenol jeweils 16 — 20 Std. gerührt und die R N S aus der wäßrigen Phase m i t zweifachem Volumen 96%igen Äthanol unter Zusatz von etwas 2 M NaCl-Lösung ausgefällt. Nach nochmaligem Umfällen mit Alkohol folgten eine 5 tägige Dialyse gegen mehrmals gewechselte dest. Wasser und die abschließende Lyophilisation. Die Ausbeute lag bei 2 — 3%. Alle verwendeten Chemikalien waren p.a. Die Ionenaustauscher waren P r o d u k t e des Serva-Entwicklungslabor Heidelberg, Sephadex von P h a r m a c i a (Uppsala/Schweden). Als Bestrahlungsquelle diente eine Quecksilber-Niederdruck-Lampe H N U 6 vom Berliner Glühlampenwerk. Mit einem Chlor-Brom-Filter (50 mm) und einem UG 5Filter (2 mm, Schott & Gen. Jena) wurde die Wellenlänge von 254 n m herausgefiltert. Die auf die Fermentlösung auffallende Energie betrug 103 erg/cm 2 /sec. Davon entfallen 99,5% auf die Wellenlänge 254 nm, der Rest auf 265 n m (Abb. 1). Bei der benutzten Konzentration und dem Volumen der Bestrahlungsproben (5 ml, 0,2%ig) wird der größte Teil der eintretenden Energie absorbiert, so daß die Forderung nach 1

Die Analyse f ü h r t e freundlicherweise Herr Diplom-Chemiker R. G L A E S M E R , I n s t i t u t für Pharmakologie der DAW, Berlin-Buch, mit einem Auto-Analysator der F i r m a Phoenix Prec. Instr. Comp, durch. I h m sei bestens gedankt. 2 Die W e r t e f ü r T h r und Ser sind nicht korrigiert.

Ribonuklease A nach UV-Bestrahlung

467

einer Durchlässigkeit von > 95% nicht erfüllt ist. Um trotzdem eine gleichmäßige Schädigung zu erreichen, wurde die Fermentlösung während der Bestrahlung magnetisch gerührt. Die Bestrahlung erfolgte unter Luftzutritt. Für die Aufnahme der UV-Spektra stand ein registrierendes Spektralphotometer UNICAM S P 800 zur Verfügung, Extinktionsmessungen wurden mit dem sowjetischen 10 IT) CN to Csj

t^CN er» OlO CNiV} pr,

0.2

0,6. 1.0

2 .c

Ic

6

Q 10 240 nm beträchtlich zu, also in jenem Bereich, in dem bei nativen Proteinen der Hauptanteil der Absorption auf die Aminosäurereste Tyrosin und Tryptophan entfällt. Bemerkenswert ist, daß sich dieser Anstieg auch 31*

468

H . - G . MÜLLER

auf den nahen UV-Bereich erstreckt, wo normalerweise nur eine sehr schwache Proteinabsorption auftritt (Abb. 2). Noch klarer treten die Veränderungen im Differenzspektrum hervor (Abb. 3)- Gegen native RNase entsprechender Konzentration als Vergleichslösung ergibt sich zwischen

Abb. 2. UV-Spektra nativer und bestrahlter R N a s e mit unterschiedlicher Restaktivität (c = 2 mg/ml)

240 und 400 nm ein positives Differenzspektrum. Hauptmaxima entstehen bei 275, 283 und 292,5 nm neben weniger hervortretenden zwischen 250 und 270 nm. Deutliche Minima zeigen sich bei 287 und 278,5 nm. Im kurzwelligeren UV sind die spektralen Unterschiede relativ gering, ihre Feinheiten gehen infolge der sehr hohen Absorption von Vergleichs- und Probelösung im Rauschen des Gerätes unter. Lineare Beziehungen zwischen

Ä

Abb. 3. UV-Differenzspektra bestrahlter R N a s e gegen native (c = 2 mg/ml)

Ribonuklease A nach UV-Bestrahlung

469

dem Anstieg der maximalen Absorption bei 278 nm und dem Aktivitätsverlust bestehen nicht, wohl aber zwischen der Höhe der Differenzmaxima und diesem (Abb. 4). Erwärmt man RNase-Lösungen, so ändert sich das Spektrum in charakteristischer Weise. Besonders deutlich sind die Unter-

Abb. 4. Beziehungen zwischen Restaktivität und spektralen Veränderungen von RNase (c = 2 mg/ml) a : Beziehungen zur maximalen Absorption bei 2 / 8 m/j.; b : Beziehungen zu zwei Differenzmaxima. -I H /l£ 292i5 ; o O Ae2%z

schiede bei 287 nm. Zwischen 45 und 65 °C kommt es zu einer Abnahme der molaren Extinktion. Dieser Vorgang ist reversibel. Durch die Erwärmung bedingte Schädigungen des Enzyms sind nicht nachweisbar. Das Tabelle 1 Wärmedenaturierung bestrahlter RNase-Proben (Restaktivitäten in % ) nach Bestrahlung 95 67 65 38 32 22 13

nach 10 min nach 30 min bei 70° bei 70° 57 42 21 18 1 11 1

17 29 8 15 inaktiv

nach 5 min bei 100° 35 34 -

18 inaktiv

—

—

inaktiv

inaktiv

ändert sich jedoch unter dem Einfluß ultravioletten Lichtes (Abb. 5). Schon bei geringen Aktivitätsverlusten kommt es bei Erwärmung auf über 40 °C zu einem Anstieg von e287, worauf aber der für die thermische Entfaltung nativer RNase charakteristische Extinktionsabfall folgt. Oberhalb 65 °C steigt die Absorption dann weiter. Reversibel ist dieser Vorgang nicht mehr. Bei höheren Inaktivierungsraten wächst e287 bei Erwärmung über 40 °C mit steigender Temperatur ständig, der Abfall bei anschließender Abkühlung ist gering. Enzymatisch weitgehend inaktive Proben zeigen bei

470

H . - G . MÜLLER

bereits sehr hohen Ausgangswerten nur noch geringfügige Änderungen von e287 unter dem Einfluß der Temperatur. Diese thermische Denaturierung spiegelt sich auch in einer weiteren Abnahme der Fermentaktivität wider. Native RNase ist sehr hitzestabil, kurzfristiges Erwärmen auf 100 °C beeinträchtigt das Enzym nicht. Anders jedoch verhalten sich die Photolyseprodukte der RNase (Tab. 1). Sie werden durch Temperaturein Wirkung weiter inaktiviert. Titriert man die OH-Gruppe am Benzol-Ring des Tyrosins mit Lauge, so tritt eine Rotverschiebung im Spektrum ein. Das bei 278 nm liegende Maximum geht in ein sehr breit gezogenes über, mit der größten Absorption bei 295 nm. Das trifft auch für Tyrosin-Reste in Eiweißen zu. Allerdings sind einige erst nach einer weitgehenden Denaturation des Proteinmoleküls der Titration zugänglich. Bei nativer RNase 1.6 £287 \ 1.5 1.3-

350

Abb. 6. Differenzspektrum einer bestrahlten RNase-Lösung gegen native RNase (c = 0,5 mg/ml), a : nach Bestrahlung; b : nach Bestrahlung, anschließender Erwärmung auf 75 °C und Abkühlung auf 20 °C

/

1.2

1.1 -i

0.8

-

07

-

y

66% f

06

05

nm

/

95%

97%. -

s

nat"

0 k -

0

30 50 steigend—

70_ 70 Temp^C

' 50

¿0 faltend—

Abb. 5- £287 bestrahlter RNase mit unterschiedlicher Restaktivität unter dem Einfluß der Temperatur

25

&¿235-10"3

hängigkeit von der Restaktivität nach Bestrahlung

Ribonuklease A nach UV-Bestrahlung

471

beträgt die Differenz des molaren Extinktionskoeffizienten 17 • 103 [24]. Titriert man die mit ultraviolettem Licht von 254 nm bestrahlten RNaseProben spektralphotometrisch, so kommt man auf Werte, die höher als die nativer RNase liegen. Beim Vergleich mit der Inaktivierungsrate ergab sich eine Korrelation zwischen dieser und dem Ansteigen von llfi295 nach Titration. Diese Größe nähert sich mit fallender Restaktivität einem Wert von 29 • 103 (Abb. 7). Diskussion

Ultraviolette Strahlung von 254 nm inaktiviert RNase, wobei gleichzeitig bezeichnende spektrale Änderungen oberhalb 250 nm auftreten. Die Proteinabsorption in diesem Bereich wird fast ausschließlich durch die Aminosäuren Tyrosin und Tryptophan hervorgerufen, alle anderen sind ohne oder nur von untergeordneter Bedeutung. Dem RNase-Molekül fehlt aber Tryptophan, so daß im Nativzustand allein das Tyrosin für die Absorption im genannten Bereich verantwortlich zu machen ist. Schon B A R R O N et al. [17] sahen in ähnlichen spektralen Veränderungen verschiedener Proteine nach Röntgenbestrahlung den Ausdruck für Oxidationsvorgänge am Tyrosin. Welcher Art die entstehenden „Oxidationsprodukte" sind, konnte bis heute nicht geklärt werden. },4-Dihydroxyphenylalanin ( = DOPA) scheidet sicherlich aus. Hierfür sprechen auch eigene Untersuchungen. Die Annahme, daß in unseren Versuchen tatsächlich Veränderungen am Tyrosin vor sich gegangen sind, wird durch das zwar modifizierte, aber doch dem Tyrosin ähnliche Spektrum und durch das für diesen Aminosäurerest charakteristische Verhalten bei spektralphotometrischer Titration unterstrichen. Zu dem gleichen Befund kamen auch M C L A R E N und L U S E [25] in ihrer umfangreichen Arbeit über die Wirkung ultravioletten Lichtes von 2537 A . Andere Untersuchungen von SMITH und A D E L S T E I N [ 1 9 ] an röntgenstrahlen-inaktivierter RNase machen das gleiche wahrscheinlich. Die Modifikation einzelner Aminosäurereste führt zum völligen Verlust der natürlichen Konformation. Die mit der Erwärmung nativer RNase einhergehende Abnahme der Extinktion bei 287 nm ist Ausdruck der Entfaltung des Eiweißmoleküls, bei der im Innern des Moleküls nicht-kovalent gebundene chromophore Gruppen nach außen gelangen. Bei inaktivierter RNase kann dieser Vorgang nicht mehr beobachtet werden, woraus zu schließen ist, daß die durch Photolyse entstandenen Chromophoren nicht im Innern des Proteinmoleküls gelegen sind, ebenso alle evtl. unverändert gebliebenen Tyrosin-Reste. Ihrer Ursache nach unklar bleiben die Veränderungen bestrahlter RNase nach zusätzlicher Erwärmung. Die seit langem bekannte Steigerung der Hitzelabilität [26] von Proteinen kann auf verschiedene Weise gedeutet werden. L U Z I K O W [ 2 7 ] , [ 2 8 ] postuliert, daß durch Bestrahlung Wasserstoffperoxid, Hydroperoxide oder stabile Radikale entstehen, die bei steigender Temperatur wirksam werden und eine schnelle Inaktivierung herbeiführen.

472

H . - G . MÜLLER

Andererseits kann der Grund dafür aber im Proteinmolekül selbst gesehen werden. Unter dem Einfluß von Strahlung lockert sich die natürliche Konformation von Eiweißen [3], [5], [18], [29]. Eine folgende Erwärmung wird zur Lösung einer wesentlich größeren Anzahl nicht-kovalenter Bindungen führen als beim intakten Molekül. Mit fortschreitender Moleküldeformation steigt der Grad der Irreversibilität jener Spaltungen. Ähnliche Vorstellungen entwickelten auch Smith und Adelstein [19]. Zur Klärung dieser Frage bedarf es weiterer Untersuchungen unter Berücksichtigung beider Gesichtspunkte. Für vorbildliche technische Assistenz danke ich Frau

D.

BENENS

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Ribonuklease A nach UV-Bestrahlung

473

Summary H.-G. MUELLER: properties

Ribonuclease A

after U V irradiation

(Â = 254 n m ) :

spectral

Monochromatic U V light at a w a v e length of 254 nm was found to lower the enzymatic activity of ribonuclease, at the same time increasing the U V absorption between 240 and 400 nm. Thermostability of the R N a s e is also reduced with increasing light inactivation and the natural conformation gets lost. Irradiation produces a modified side chain which may be titrated in a similar w a y as tyrosine. Pe3ioMe X.-F. Miojijiep: CBeTOM (A = non

BJiHHHHeM

PHÔ0HyKJiea3a

A

254 n m ) : c n e K T p a j i b H b i e MOHOxpoMaTHqecKoro

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2 5 4 n m y M e H b i n a e T C H 3 H 3 H M a T H H e c K a H a K T H B H O C T b p H Ô 0 H y K n e a 3 H c OHHOBpeMCHHbiM y B e j i H ^ e H H e M Y B

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KOH-

H3MeiieiinaH

Acta biol. med. german., Band 16, Seite 474 — 479 (1966) Aus dem Physiologisch-chemischen Institut der Karl-Marx-Universität Leipzig (Kommiss. Direktor: Doz. Dr. W. R O T Z S C H )

Ausscheidung von Dimethylamin unter Zufuhr methylierter Stickstoffverbindungen R.

DARGEL

(Eingegangen am 2. 12. 1965)

Zusammenfassung Kaninchen scheiden im Harn DMA in einer durchschnittlichen Tagesmenge von 3,2 mg aus. Zufuhr von DMA verursacht eine hohe Steigerung der DMA-Ausscheidung. TMA bedingt eine geringe, TMO eine deutliche Erhöhung der DMA-Ausscheidung. Zufuhr von Carnitin erhöht weder bei Kaninchen noch beim Menschen die DMAAusscheidung.

Flüchtige biogene Amine sind schon des öfteren im Tierkörper und seinen Ausscheidungen nachgewiesen worden [1], [2]. Unter ihnen interessierte uns besonders das Dimethylamin, weil es in verhältnismäßig reichlichen Mengen im Harn ausgeschieden wird. Seine Entstehungsweise ist nicht gesichert, doch wird angenommen, daß es aus Trimethyl-N-Verbindungen durch Entmethylierung entsteht. Bei unseren Untersuchungen über den Abbau des Carnitins, das die Bildung von Trimethylamin und seinem Oxid beeinflußt [3], [4], vermuteten wir, daß ein Teil dieser Stoffe vom Körper demethyliert wird. Wir untersuchten deshalb die Ausscheidung von Dimethylamin im Harn bei Zufuhr einiger Trimethyl-Stickstoff-Verbindungen. Methodik Das ( — )-Carnitin wurde synthetisch gewonnen [5] und als freies Betain verabreicht. TMA wurde nach A D A M S und M A R V E L [6], TMO entsprechend den Angaben von D U N S T A N und G O U L D I N G [7] dargestellt. Beide Amine wurden als Hydrochloride verabreicht. DMA gewannen wir aus käuflicher Dimethylaminlösung. Die Versuchstiere waren 5 Kaninchen (I —V) mit Gewichten zwischen 3 und 3,8 kg. Sie wurden 8 Tage vor Versuchsbeginn in Stoffwechselkäfige gesetzt. Während der gesamten Versuchsperiode erhielten sie täglich 250 g Kleie-Kartoffelfutter und 100 g Mohrrüben. Der spontan entleerte Urin wurde in täglichen Perioden gesammelt; nur Abkürzungen: TMA = Trimethylamin; TMO = methylamin; G-T = Gesamttrimethylamin

Trimethylaminoxid; DMA =

Di-

Ausscheidung von Dimethylamin

475

in vereinzelten Fällen mußten die Tiere katheterisiert werden. Der Tagesharn wurde in Behältern mit Schwefelsäure aufgefangen, so daß der £>H-Wert niemals 3 überschritt. Die jeweils angegebenen Substanzen wurden einmal täglich mittels Magensonde zugeführt. DMA wurde nach dem von uns gering modifizierten Verfahren von D O W D E N [8] bestimmt. 0,2 — 0,5 ml des filtrierten Urins wurden im Mischzylinder mit dest. Wasser auf 10 ml aufgefüllt. Nach Zugabe von 1 ml Cu-Reagenz wurde mit 10 ml einer Lösung von 5% Schwefelkohlenstoff in Benzol überschichtet. Das Reaktionsgemisch wurde 1 5 min bei 40 °C im Wasserbad gehalten, anschließend 3 min geschüttelt, dann 1 ml 30%ige Essigsäure zugegeben und erneut 3 min geschüttelt. 20 min später wurde die obere Phase abgehebert und zentrifugiert, um die Benzolschicht zu klären. 40 min nach Beendigung des Schütteins wurde im Spektralphotometer bei 440 nm abgelesen. Während tertiäre Amine nicht mit Schwefelkohlenstoff reagieren, bilden primäre Amine den Dithiokarbamatkomplex mit Cu, allerdings beträgt die Farbintensität der Verbindungen nur ein Hundertstel verglichen mit der der sekundären Amine [9]. Da im H a r n neben DMA weitere sekundäre Amine auftreten können [10], sicherten wir papierchromatographisch [11], [12], daß es sich bei dem ausgeschiedenen Amin um DMA handelt. TMA, TMO und G-T wurden nach einer früher ausführlich beschriebenen Methode bestimmt [3], Ergebnisse

Bei fünf Kaninchen bestimmten wir mehrere Tage lang die tägliche Ausscheidung von DMA. Aus 37 Tageswerten ergab sich die durchschnittliche Ausscheidung von 1,0 mg DMA-N/Tag mit einer Standardabweichung s = ± 0,35In Abbildung 1 wird die DMA-Ausscheidung nach Zufuhr von 3mal 29,2 mg DMA dargestellt. Schon am ersten Tage werden 86% bzw. 54% ausgeschieden, wenn man die durchschnittliche Normalausscheidung der 3tägigen Vorperiode in Abzug bringt. Am folgenden Tage beträgt die Ausscheidung 84% bzw. 88%, am 3. Tage 76% und 68%. Den gleichen Kaninchen wurde zwei Wochen später an 3 Tagen Carnitin (14 mg N/kg/Tag) peroral verabreicht (Tab. 1). Die Ausscheidung von DMA wird durch dieses Trimethylbetain nicht erhöht. Auffällig ist dagegen eine Senkung der Ausscheidung von DMA auf 0,3 bzw. 0,2 mg N am

Abb. l. DMA-N-Ausscheidung nach peroraler Gabe ( f ) von DMA-Hydrochlorid (29,15 mg/Tag)

476

R.

DARGEL

Tage nach der letzten Carnitinzufuhr. An den folgenden Tagen steigen die Ausscheidungen wieder auf Normalwerte an. Eine bloße Harnretention ist nicht als Ursache für die vorübergehende Senkung der Ausscheidung von Tabelle 1 Dimethylamin-N-Ausscheidung nach peroraler Verabreichung von Carnitin. (14 mg Carnitin-N/kg/Tag. Kaninchen I = 483,6 mg Carnitin; Kaninchen I I = 543,2 mg Carnitin) Versuchstage

Zufuhr von Carnitin

1

2

T

Harnmenge [ml]

5 6

DMA-N [mg]

_

80

1,2

—

85

1,4

115

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3 4

TT

[ml]

DMA-N [mg] 1,6

195 40(?)

0,4

1,5 0,4

110

0,8

80

0,8

100

1,2

160

1,1

190

95 40

0,2

115 100

0,8

30(?)

7

—

90

0,3 1,4

8

—

115

1,4

9

—

140

1,0

—

Harnmenge

0,5 0,8

DMA anzusehen. Um zu klären, ob im menschlichen Organismus DMA als Abbauprodukt des Carnitins entsteht, verabfolgten wir } gesunden Versuchspersonen, die sich während der gesamten Versuchsperiode bei sonst normaler Kost fischfrei ernährten, über mehrere Tage Carnitin und verfolgten die DMA-Ausscheidung im Harn (Tab. 2). Signifikante Änderungen konnten nicht beobachtet werden. Tabelle 2 Tages-Ausscheidung von DMA [mg] bei 3 männlichen Versuchspersonen von 30 Jahren. Während der Hauptperiode werden täglich 1,0 g ( —)-Carnitin in 3 Portionen verabreicht. V P 1 = 12 Tage; V P 2 und 3 = 14 Tage. Dauer der Vorperiode 5 Tage, der Nachperiode 3 Tage Versuchspersonen

Vorperiode Hauptperiode Nachperiode

1

2

3

20,0 + 4,8 20,2 + 3,9 19,2 + 2,2

23,1 ± 2,7 28,0 + 5,7 21,9 ± 1,3

25.5 ± 1,3 26.6 ± 3,9 23,2 ± 3,7

Tabelle 3 zeigt die Ausscheidungen von DMA, TMA und TMO nach Verabreichung von TMA. Während Tier I I I eine geringe, aber gleichbleibende Erhöhung der Ausscheidung von DMA aufweist, ist sie beim Tier IV schwankend und niedriger. Die Ausscheidungen von TMO sind wesentlich angestiegen. Bei Tier IV ist sowohl die Ausscheidung von TMA als auch die

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477

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504

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1,778 ±0,454

59

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HeneHb

MbllllUbl

0,533 ±0,075

99 ± 5 >0,1

2,504 ±0,488 >0,2

0,533 ±0,053 >0,5

1,126 ±0,066

0,701 ±0,099

70 ±14 >0,5

1,369 ±0,295 >0,2

0,754 ±0,1 >0,5

88 ±17

0,947 ±0,284

0,621 ±0,177

72 ±14 >0,2

1,103 ±0,296 >0,5

0,692 ±0,121 >0,5

98 8

3,607 ±0,383

1,424 ±0,118

138 + 8 0,2

1,171 ±0,129 >0,1

114 ± 7

5,303 ±0,412

1,229 ±0,211

179 ±18 0,2

1,068 ±0,196 >0,5

107 ±12

3,323 ±0,570

0,661 ±0,92

199 ±25 i ¡3 fef-ap-

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P-5-p P-5-P PAM PAM Pyr. Pyr. PAM-p PAM-p PAL PAL

17) 1,6- 10" 3 8,0 • 10" 4

(n

=

1,6 • 10" 3 8 , 0 - 10" 4 • 10" 3

1,6 8,0 • 10" 4

1 , 6 - 10" 3 8 , 0 - 10" 4 1,6 • 10" 3 8,0 • 10" 4

152,8 57,1 129,8 100,6 43,2 53,1 102,2 58,2 53,3 100,6 41,4 40,5 89,8 51,1 53,3

+ + + +

2,18 2,14 6,18 3,99 1,55 + 3,61 + 11,14 4- 3,27 + 1,83 -L 0,87 1,06 + 4,89 + 0,95 2,92 + 3,30

±

5,0 >5,0 >5,0 >5,0

Dihydralazin und Pyridoxalphosphat

551

vator im Hauptraum waren und die Reaktion durch Zugabe von Glutaminsäure aus dem Seitenarm gestartet wurde, erfolgte bei unseren Versuchen die Zugabe des Koenzyms aus einem zweiten Seitenarm. Da bei uns außerdem der Inhibitor gemeinsam mit dem Substrat aus dem ersten Seitenarm gekippt wurden und damit die Reaktion gestartet wurde, konnten hier keine unkontrollierten Reaktionen vor Versuchsbeginn stattfinden. Auf Grund dieser dosisabhängigen Hemmung (Abb. 4) Pyridoxal-5-phosphat-abhängiger Fermente muß man eine wesentliche Störung des Aminosäurestoffwechsels erwarten. Die von uns bereits früher für einige Hydra100,0

Inhibitorendkomintration [Mol/l] Abb. 4. Dosisabhängigkeit der Fermenthemmung durch Depressan. |[if: = Dopa-dekarboxylase; • = Glutaminsäure-Dekarboxylase

zinoverbindungen beschriebene Senkung der Körpertemperatur [19], [20], als Ausdruck des gestörten Hirnstoffwechsels war unter Depressan ebenfalls ausgeprägt nachzuweisen [24]. Die Aufhebung der Fermenthemmung durch Pyridoxal-5-phosphat und die bereits in früheren Arbeiten gefundene Reduktion pharmakologischer Hydrazineffekte durch B 6 führten uns zu ähnlichen Versuchen über die Beeinflussung der hypotensiven Wirkung des Dihydralazin. 2. Als erstes in vivo-Modell für die Antagonisierung der hypotensiven Wirkung durch P L P benutzten wir den DOCA-Hochdruck. An Ratten kommt es unter unseren Versuchsbedingungen nach 15—20 Tagen zu einem Blutdruckanstieg um 60 mm Hg. Erhalten die Tiere jetzt zusätzlich Depressan, so ist der Blutdruck bereits nach 4— 5 Tagen wieder um 40 mm Hg abgefallen. Durch vorherige PLP-Gabe kann man den Depressaneffekt abschwächen und die Blutdruckwerte nähern sich wieder dem Ausgangsdruck. Bei Absetzen der PLP-Gabe tritt der Depressaneffekt wieder auf. Pyridoxal-5-phosphat selbst hat keinen Einfluß auf den experimentellen Hypertonus (s. Abb. 5).

552

P . O E H M E , E . GÖRES, C. SCHWARZ, G .

PETSCH

Abb. 5- Depressanwirkung an der chronisch hypertensiven Ratte mit und ohne Pyridoxal- 5 -phosphat-Vorbehandlung. x x = DOCA s.c.; O O = DOCA + P L P 100 mg/kg s.c.; O O = DOCA + Depressan 10 mg/kg i.p.; A A = DOCA + Depressan 10 mg/kg i.p.; DOCA + P L P (30 min vor Depressan) j 20 mg/kg, ab ^ 100 mg/kg s.c.

Bei diesen chronisch-hypertensiven Tieren ist der Dihydralazineffekt analog der fermentinhibitorischen Wirkung deutlich abzuschwächen. j . Bei akuten Versuchen an Katzen erwies es sich aus methodischen Gründen als günstiger, über einen mittelbaren Effekt zu gehen. Durch Epinephrin und Norepinephrin kommt es wie erwartet an der Katze zu einem deutlichen Blutdruckanstieg (erster Kurventeil der Abb. 6a), der nach Dihydralazininjektion deutlich abgeschwächt ist. Eine zusätzliche PLP-Gabe verstärkt den Blutdruckanstieg wieder. Umgekehrt f ü h r t Depressan nach vorheriger PLP-Applikation ebenfalls nicht zur Reduktion des Epinephrinund Norepinephrinblutdruckanstieges (Abb. 6b). In der Zusammenstellung zeigt sich deutlich der statistisch gesicherte Unterschied (Abb. 7). In Analogie zu der Präparation des Dihydralazin-hydrazons wurden P L P und Depressan 15 min vor der Injektion in der Spritze gemischt. Nach dieser Vorbehandlung ist es nicht mehr in der Lage den aminbedingten Blutdruckanstieg zu verhindern. Dabei ist der Unterschied noch deutlicher als bei der in vivo-Inaktivierung (Abb. 8). Auch bei Gabe der äquivalenten Menge des präparierten Hydrazons ist keine derartige pharmakologische Wirkung mehr nachweisbar. Diskussion

Aus diesen Befunden geht eindeutig hervor, daß Depressan auf Grund seiner Hydrazinstruktur in der Lage ist, PLP-abhängige Fermente zu hemmen. Dabei konnten wir zusätzlich zu der bereits beschriebenen Hemmung der Dopa-dekarboxylase eine deutliche inhibitorische Wirkung auf die wesent-

Dihydralazin und Pyridoxalphosphat

553

554

P . OEHME, E . GÖRES, C. SCHWARZ, G . PETSCH

lieh am Hirnstoffwechsel beteiligte Glutaminsäuredekarboxylase nachweisen. Diese Fermenthemmung läßt sich analog zu anderen Hydrazinen durch PLP-Gabe aufheben. Als Ursache dafür wird von Autoren eine

Norepinephrin 1/ug/kg i.v.

Bpinephrin 2/jg/kg iv.

Abb. 7. Zusammenstellung der akuten Versuche an der Katze, a = vor der Behandlung; b = nach Gabe von Depressan (2mg/kg i.v.); c = nach anschließender Gabe von Pyridoxal-5'-phosphat (32 mg/kg i.v.)

50

SO 40 [30 &20 6 6 10

I n-6

l

40 30

i

20

n-3

10

I

Norepinephrin 1/jg/ftg i. v.

0

1 !

1

,-t

I Epinephrin 2/ug/kgi.v.

Abb. 8. Zusammenstellung der akuten Versuche an der Katze bei vorheriger Mischung von Dihydralazin und P L P . a = vor der Behandlung; b = nach Gabe von Depressan (2 mg/kg i.v.) + P L P (32 mg/kg i.v.) (15 min vorher gemischt); c = nach anschließender Gabe von Depressan (2 mg/kg i.v.)

Reaktion mit der Aldehydgruppe des Pyridoxyl-5 -phosphats und Bildung eines entsprechenden Hydrazons angenommen (Übersicht [23])Diese Reaktion kann man spektrophotometrisch, wie von uns auch andere Hydrazinokarbonsäuren berichtet wurde [15], gut verfolgen auch das entsprechende Hydrazon ist darstellbar.

die bei für und

555

Dihydralazin und Pyridoxalphosphat

Analog zur Aufhebung der Dihydralazinhemmung wird auch der hypotensive Effekt am Ganztier abgeschwächt. Diese Befunde zeigen, daß auch in vivo eine Reaktion mit PLP möglich ist und daß für den hypotensiven Effekt die Hydrazingruppierung wesentlich ist. Das ist in Übereinstimmung mit Befunden von DENYS et al. [3] und unseren früheren Ergebnissen [7], [20], daß pharmakologische Effekte von MAOHemmern des Hydrazidtypes durch B 6 -Derivate abzuschwächen sind. In diesen Untersuchungen konnten wir für andere Hydrazinoverbindungen einige pharmakologische Wirkungen durch PLP-Vorbehandlung ebenfalls reduzieren [20]. Inwieweit die durch Reaktion mit der Aldehydgruppe des PLP hervorgerufene Fermentinaktivierung über eine gestörte Amin-Synthese zur Blutdrucksenkung führt oder über eine Stoffwechselsenkung, insbesondere durch Eingriff in den Glutaminsäurestoffwechsel, kann daraus natürlich nicht geschlossen werden. Bei der Diskussion des Wirkungsmechanismus muß aber auf Grund der Befunde eine Störung des B6-Metabolismus als wesentlich diskutiert werden. F r a u HARTMANN möchten wir für ihre fleißige und interessierte Assistenz danken. Literatur [1] GROSS, F . , J . DRUEY U. R . MEIER: E i n e neue Gruppe blutdrucksenkender Substanzen von besonderem Wirkungscharakter. Experientia [Basel] 6, 19 (1950). [2] SCHROEDER, H. A . : T h e Pharmacology of Hydralazine. I n : Hypertension. T h e First Hahnemann Symposium on Hypertensive Disease. Edited b y J . H. Moyer. Philadelphia and London 1959, S. 331. [3] D E N Y S , A . , I . L E V Y U. E . M I C K E L - B E R : C o n t r i b u t i o n  l ' é t u d e d u

mécanisme

de l'action antidépressive des inhibiteur de la monoaminooxydase (IMAO) au niveau du système nerveux central de la souris. 2. Influence de quelques dérivés de la pyridoxine sur l'action antidépressive des IMAO. J . de Phvsiol. 55, 381 (1963).

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Guanyl-

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pharma-

zum

Wir-

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O E H M E , P . U. C . S C H W A R Z :

(unveröffentlicht).

Summary P . O E H M E , E . G Ö R E S , C . S C H W A R Z a n d G . P E T S C H : T h e role of h y d r a z o n e f o r m a t i o n in t h e h y p o t e n s i v e e f f e c t of d i h y d r a l a z i n e (depressan)

I n the present s t u d y the PLP-dihydralazine reaction has been demonstrated spectrophotometrically and the corresponding hydrazone been prepared. The observed i n h i b i t i o n of P L P - d e p e n d e n t e n z y m e s ( d o p a - a n d g l u t a m i c acid d e c a r b o x y l a s e ) could b e cancelled b y s u b s e q u e n t a d d i t i o n of t h e c o e n z y m e . A n a l o g o u s l y , t h e h y p o t e n s i v e e f f e c t of d i h y d r a l a z i n e i n v i v o c o u l d b e lessened in b o t h t h e a c u t e a n d c h r o n i c a l experiment by pretreatment with P L P . Relations between the antihypertensive effect a n d t h e i n t e r f e r e n c e w i t h p y r i d o x a l - 5 - p h o s p h a t e a r e discussed.

Dihydralazin und Pyridoxalphosphat

557

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Acta biol. med. german., B a n d 16, Seite 558 — 565 (1966) Aus dem Pathologischen I n s t i t u t der Medizinischen Akademie „Carl Gustav Carus" Dresden (Direktor: Prof. Dr. med. habil. H . S I M O N )

Wachstumsverzögerung und Akzeleration von Mammatumortransplantaten des Mäusestammes CBA/Bln durch Vorbehandlung der Empfänger mit vitalen Tumorzellen oder Milch zweier Mäusestämme M. MÜLLER u n d E . - R .

WELCKER

(Eingegangen a m 5. 12. 1965)

Zusammenfassung Die Vorbehandlung von CBA-Mäusen u n d F j - H y b r i d e n m i t lebenden M a m m a tumorzellen f ü h r t e entweder zur H e m m u n g oder Akzeleration des nachfolgenden Testinokulum. Durch empirische Variationen des Vorbehandlungsmodus hinsichtlich Zelldosis, Injektionsschema, Intervall zwischen Vorbehandlung u n d Testinokulation sowie Testdosis gelang es nicht, die jeweils f ü r H e m m u n g oder Akzeleration entscheidenden F a k t o r e n zu finden. Die N a t u r des Inhibitionseffektes im u n t e r suchten System bleibt unklar, da eine passive Ü b e r t r a g u n g mittels i m m u n k o m p e t e n t e r Zellen bisher nicht gelang. T u m o r w a c h s t u m s f ö r d e r u n g war weiterhin sowohl d u r c h V o r b e h a n d l u n g der E m p f ä n g e r mit Milch eines M a m m a t u m o r - b e l a s t e t e n als auch eines nicht belasteten S t a m m e s zu erzielen. Als E r k l ä r u n g f ü r den Akzelerationsmechanismus werden neben immunbiologisch vermittelten Reaktionen im Sinne des „immunological e n h a n c e m e n t " unspezifisch ausgelöste W a c h s t u m s s t i m u l a t i o n e n diskutiert.

Die Vorbehandlung isologer Empfängertiere mit vitalen Mammatumorzellen führte in verschiedenen Versuchen nicht zu der erwarteten Hemmung, sondern zu einer Wachstumsbeschleunigung des Tumortestinokulum [8]. Dieser Akzelerationseffekt erwies sich hinsichtlich der zur Vorbehandlung verwendeten Geschwulstzellen als unspezifisch. Das Wachstum des Karzinom MT 32472 war sowohl durch eigenes Zellmaterial als auch durch Vorbehandlung mit MT 34436 zu fördern. Serum von Mäusen mit akzeleriertem MT32472 ermöglichte eine passive Übertragung des wachstumsstimulierenden Effektes auf unvorbehandelte Rezipienten. Bei weiteren Versuchen, durch Vorbehandlung mit lebenden Mammatumorzellen gegen nachfolgende T r a n s p l a n t a t e zu immunisieren, fielen die Ergebnisse in den einzelnen Serien recht unterschiedlich aus. Neben der genannten Akzeleration waren deutliche H e m m e f f e k t e zu beobachten. U m die zur Erzielung einer T u m o r h e m m u n g günstigsten Bedingungen abgrenzen zu können, modifizierten wir den Vorbehandlungsmodus rein empirisch hinsichtlich Zellzahl, Zahl u n d Abstand der Einzeldosen sowie Intervall

H e m m u n g u n d Akzeleration v o n T u m o r t r a n s p l a n t a t e n

559

zwischen Vorbehandlungsbeginn u n d Testdosis. Der Einfluß der Vorbehandlung w u r d e weiterhin mit unterschiedlich hohen Zelldosen getestet. D a die in letzter Zeit f ü r M a m m a k a r z i n o m e der Maus mitgeteilten, im Sinne einer erzielten I m m u n i t ä t positiven Untersuchungen [3], [4], [6], [7], vorwiegend m i t Tieren d u r c h g e f ü h r t wurden, die von A m m e n oder M ü t t e r n eines S t a m m e s mit niedriger M a m m a t u m o r frequenz gesäugt worden waren, dehnten wir unsere Versuche auf ( X V I I $ x CBA O

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