Analytiker-Taschenbuch: Band 6 [Reprint 2022 ed.] 9783112651209

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Analytiker-Taschenbuch

Band 6

AnalytikerTaschenbuch Band 6 Herausgeber

Prof. Dr. Wilhelm Fresenius Dr. Helmut Günzler Dr. Walter Huber Prof. Dr. Ingo Lüderwald Prof. Dr. Günter Tölg Prof. Dr. Dr. Hermann Wisser

Mit 113 Abbildungen und zahlreichen Tabellen

A K A D E M I E - V E R L A G B E R L I N 1986

Die Originalausgabe erscheint im Springer-Verlag Berlin • Heidelberg • New York • Tokyo Vertrieb ausschließlich für die D D R und die sozialistischen Länder

Alle Rechte vorbehalten © by Springer-Verlag Berlin • Heidelberg 1985 I S B N 3-540-15037-4 Springer-Verlag Berlin • Heidelberg • New York • Tokyo I S B N 0-387-15037-4 Springer-Verlag New York • Heidelberg • Berlin • Tokyo

I S B N 3-05-500140-0 Erschienen im Akademie-Verlag Berlin, D D R - 1 0 8 6 Berlin, Leipziger Straße 3—4 Lizenznummer: 202 • 100/514/86 Printed in the German Democratic Republic Gesamtherstellung: V E B Druckhaus „Maxim Gorki", 7400 Altenburg L S V 1237 Bestellnummer: 763 604 9 (6963) 11800

Vorwort

Die Analytische Chemie ist eine angewandte Wissenschaft, die weit über Chemie, Biochemie und Lebensmittelchemie hinaus für Biologie, Klinische Medizin, Geowissenschaften, Umweltforschung, Umweltüberwachung und auch für die Physik grundlegende Bedeutung erlangt hat. Eine Fülle neuer analytischer Aufgaben und Möglichkeiten erwuchs aus diesem interdisziplinären Zusammenwirken: insbesondere der Physik und der Physikalischen Chemie verdankt die Analytik neue Verfahren; die Automatisierung der chemischen Analytik ist in rascher Entwicklung begriffen. Aus dieser Situation entstand die Forderung nach einem aktuellen, handlichen Taschenbuch, das am Arbeitsplatz präzise Informationen über Prinzip und Anwendbarkeit der analytischen Verfahren bietet. Das etwa jedes Jahr erscheinende Werk soll, der Entwicklung folgend, in einer Reihe von Einzelbeiträgen neue und bewährte klassische „Grundlagen", „Methoden" und „Anwendungen" beschreiben. Die Auswahl der Themen erfolgt nach dem Prinzip der Aktualität. Im Anschluß an diesen Beitragsteil erscheinen ab Band 2 einige für den Analytiker ständig nützliche Informationen als „Basisteil", der in den Folgebänden laufend ergänzt bzw. überarbeitet wird (er entfiel im Band 4, da die Änderungen gering gewesen wären). Das Taschenbuch hat seine Aufgabe erfüllt, wenn es dem analytisch Arbeitenden ein Hilfsmittel am Arbeitsplatz ist, das ihm täglich auftretende Fragen beantwortet bzw. ihm Hinweise gibt, wo er eine Antwort finden kann. Ein Sachregister erschließt den Inhalt jedes erscheinenden Bandes. Das Autorenverzeichnis wird laufend ergänzt. Um eine optimale Inhaltsübersicht zu gewähren, werden ab Band 4 die Inhaltsverzeichnisse der vorangegangenen Bände abgedruckt. w . Fresenius, H. Günzler, W. Huber, I. Lüderwald, G. Tölg, H. Wisser

Autoren

Dr. D. Behne Hahn-Meitner-Institut f ü r Kernforschung Postfach 390128, 1000 Berlin 39 Prof. Dr. K . Doerffel Technische Hochschule „Carl Schorlemmer" Leuna-Merseburg Otto-Nuschke-Straße, D D R - 4 2 0 0 Merseburg Prof. Dr. S. Ebel I n s t i t u t f ü r Pharmazie u n d Lebensmittelchemie Am Hubland, 8700 Würzburg Prof. Dr. H. Engelhardt Angewandte Physikalische Chemie, Universität des Saarlandes 6600 Saarbrücken Dr. B. Griepink Referenzbüro d. Europ. Gemeinschaft (BCR), 200 Rue de la Loi B -1049 Brüssel/Belgien Prof. Dr. D. Hummel I n s t i t u t für Physikalische Chemie, Universität zu Köln Luxemburger Str. 116, 5000 Köln 41 Dr. G. Y. Iyengar National Bureau of Standards, Gaithersburg, MD 20899, USA Prof. Dr. K . Levsen I n s t i t u t f ü r Physikalische Chemie der Universität Bonn Wegelerstr. 12, 5300 Bonn Prof. Dr. K . H. Lieser Technische Hochschule Darmstadt, Fachbereich Anorganische Chemie u n d Kernchemie, Eduard-Zintl-Institut Hochschulstr. 4, 6100 D a r m s t a d t H. Marchandise, Referenzbüro der Europ. Gemeinschaft (BCR), 200 Rue de la Loi, B-1049 Brüssel/Belgien Dr. R . Matissek I n s t i t u t f ü r Lebensmittelchemie, Technische Universität Berlin Müller-Breslau-Str. 10, 1000 Berlin 12 Dr. H. Runge BASF Aktiengesellschaft, ZAM/P - M 325 6700 Ludwigshafen Dipl.-Chem. A. W u n d r a c k Technische Hochschule „Carl Schorlemmer" Leuna-Merseburg Otto-Nuschke-Straße, D D R - 4 2 0 0 Merseburg

Inhaltsverzeichnis

I. Grundlagen Referenzmaterialien (JB. Griepink und H. Marchandise) Vollautomatische rechnergesteuerte Analysensysteme : Geräteentwicklung und Auswertung. I. Allgemeine Grundlagen (S. Ebel) Korrelationsfunktionen in der Analytik (K. Doerffel und W. Wundrack)

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17 37

II. Methoden IR-Spektrometrie von Polymeren (D. 0. Hummel) On-Line Kopplung HochleistungsflüssigkeitschromatographieMassenspektrometrie (K. Levsen)

67 103

III. Anwendungen Spurenanalyse der Elemente: Anreicherung durch Austauscher und Sorbentien (K. H. Lieser) HPLC von Aminosäuren und Proteinen (H. Engelhardt) Gasspurenanalyse : Messen von Arbeitsplatzkonzentrationen {H. Bunge) Spurenelementanalyse in biologischen Proben (D. Behne und 6. V. Iyengar) Hautbräunung und Sonnenschutz : Chemische, kosmetische und analytische Aspekte (R. Matissek)

. . 125 169 199 237 281

IV. Basisteil Die relativen Atommassen der Elemente 329 Maximale Arbeitsplatzkonzentrationen (1984) 329 Akronyme 330 Prüfröhrchen für Luftuntersuchungen und technische Gasanalyse . . 330 SI-Einheiten 331 Informations- und Behandlungszentren für Vergiftungsfälle im deutschsprachigen Raum 339 Organisationen der analytischen Chemie im deutschsprachigen Raum 343 Sachverzeichnis

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Inhalt der Bände 1—5

Band 1 I. Grundlagen Probenahme an festen Stoffen (G. Kraft) Lösen und Aufschließen (R. Bock) On-line Datenverarbeitung ( W . Eichelberger, H. Günzler) Auswertung quantitativer Analysenergebnisse (G. Gottschalk) II. Methoden Elektrochemische Analysenverfahren (G. Kraft) Grenzen der Atomabsorptions-Spektroskopie (G. Knapp, W. Wegscheider) Tabellen zur Gas-Chromatographie (R. E. Kaiser) Prüfröhrchen (K. Leichnitz) Chiroptische Methoden (F. Snatzke, G. Snatzke) Fehlerquellen bei ionenselektiven Elektroden (K. Cammann) Röntgenspektralanalyse am Rasterelektronenmikroskop, I. Energiedispersive Spektrometrie (R. Klockenkämper) Methoden der Oberflächenanalyse (S. Hofmann) III. Anwendungen Anwendungsbereiche der enzymatischen Analyse (G. Pfleiderer, H. E. Pauly) Mycotoxine, insbesondere Aflatoxine (R. E. Fresenius) Qualitative Untersuchungen von Farbstoffen ( H . Schweppe) Nachweis von Rauschgiften und Dopingmitteln im Urin ( W . Quecksilber- und Organoquecksilber-Verbindungen im Wasser (F. H. Frimmel) Analyse von Plutonium (H. Kutter)

Vycydilik)

Inhalt der Bände 1 — 5

IX

Band 2 I. Grundlagen Größen- und Einheitensysteme; SI-Einheiten (J. F. Cordes) Techniken der Automatisierung chemischer Analysenverfahren (H. Bartels) Ausschütteln von Metallhalogeniden aus wäßrigen Phasen (H. Speaker) II. Methoden Affinitätschromatographie ( W . Brummer) Elektronenspinresonanz organischer Radikale in Lösung (Ch. Wydler) HPLC, Schnelle Flüssigkeitschromatographie (H. Engelhardt, Oertrug M. Ahr) Gas-chromatographische Trenn- und Bestimmungsmethoden in der anorganischen Spurenanalyse (G. Schwedt) Röntgenspektralanalyse am Rasterelektronenmikroskop II. Wellenlängendispersive Spektrometrie (R. Klockenkämper) Neue Titrationen mit elektrochemischer Endpunktsanzeige {E. Schumacher, F. Umland) Differential-Pulspolarographie, Pulsvoltammetrie und Pulsinversvoltammetrie (H. W. Nürnberg) III. Anwendungen Chemischer Nachweis funktioneller organischer Gruppen (W. Huber) Methoden zur Bestimmung von Element-Spezies in natürlichen Wässern (G. Schwedt) Indikatoren und ihre Eigenschaften (F. Schmidt, W. D. Mayer) Filter-Atemschutzgeräte (C. E. von der Smissen) IV. Basisteil

Band 3 I. Grundlagen Genaue Messung schwacher Lichtflüsse mittels Photonenzähltechnik (J.-C. G. Bünzli) Probenahme u n d Probeaufbereitung von Wässern (H. Qudernatsch) Indikatoren und ihre Eigenschaften. Teil I I (V. Schmidt, W. D. Mayer) Blutanalytik (D. Stamm, H. Wisser)

X

Inhalt der Bände 1 — 5

II. Methoden Solubilisationsmethoden (U. Pfüller) Isotachophorese (Th. Stiefel) Massenspektroskopie organischer Verbindungen — Ionisierungsverfahren (H. Budzikiewicz) Raman-Spektroskopie (B. Sehrader) III. Anwendungen Zur Analyse kosmetischer Präparate (H. König) Analytische Pyrolyse von Polymeren und Tensiden (R. Denig) Präparative Schichtchromatographie (6. Szekely) Analytische Anwendungen der UV-VIS-Spektroskopie (H.-Ii. Perkampus) Gasspurenanalyse. Messen von Emissionen und Immissionen (H. Runge) V. Basisteil

Band 4 I. Grundlagen Taschenrechner — Einführung ( W . Hürlimann) Programmierbare Taschenrechner in der Analytik ( W . Huber) Mikroprozessoren — Einführung (W. Heinecke) Forensische Analytik — Einführung (A. Maehly) II. Methoden Thermogravimetrie — Differenzthermoanalyse ( A . Kettrup) Mikrokalorimetrie (0. Höhne) Fluorimetrie und Phosphorimetrie (M. Zander) ESCA: Eine Methode zur Bestimmung von Elementen und ihren Bindungszuständen in der Oberfläche von Festkörpern (R. Holm, 8. Storp) Elektronen-Spin-Resonanz — Anwendungen und Verfahrensweisen (H. 0. Fitzky) Infrarot-Spektroskopie (H. Bäck) Protoneninduzierte Röntgen-Emissions-Spektrometrie (PIXE) — Analytische Anwendungen (R. P. H. Garten) Kapillar-Gas-Chromatographie (E. Schulte) Gas-Chromatographie von Aminosäuren (H. Frank) III. Anwendungen Analyse kosmetischer Präparate (II) — Grundstoffe und Hilfsmittel kosmetischer Präparate (H. König) Gel-Permeations-Chromatographie von Polymeren (R. Brüssau) Spurenanalytik des Thalliums (M. Sager, 0. Tölg)

Inhalt der Bände 1 — 5

Band 5 I. Grundlagen Analytische Methoden in der kulturgeschichtlichen Forschung (J. Biederer) II. Methoden Neutronenaktivierungsanalyse (V. Krivan) Plasma-Emissions-Spektrometrie (H.-J. Hoffmann, B. Böhl) Photo-Akustik-Spektroskopie im UV-VIS-Spektralbereich (H.-H. Perkampus) Massenspektroskopische Analyse ungesättigter Fettsäuren (H. Budzikiewicz) III. Anwendungen Schnelltests in der medizinischen Analytik (W. Majunke, U. Watterodt, B. Proetzsch, G. Brillinger) Schnelltests zur Umweltanalytik (E. Koch) Cadmium-Bestimmung in biologischem und Umweltmaterial (M. Stoeppler) N-Nitroso-Verbindungen in Lebensmitteln (G. Eisenbrand) Weinanalytik ( A . Bapp) IV. Basisteil

I. Grundlagen

Refer en zmaterialien B. Griepink, H. Marchandise Referenzbüro d. Europ. Gemeinsch. (BCR) 200 R u e de la Loi, B -1049 Brüssel

1 Definition

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2 Anforderungen 2.1 Homogenität 2.2 Stabilität . 2.3 Richtigkeit, Präzision und Rückführbarkeit 2.4 Matrix-Ähnlichkeit

5 5 6 7 8

3 Herstellung eines Referenzmaterials

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4 Zertifizierung: Prinzipien und Methoden 4.1 Zertifizierung durch ein einzelnes Laboratorium 4.2 Zertifizierung aufgrund statistischer Übereinstimmung verschiedener Laboratorien 4.3 Zertifizierung durch verschiedene Laboratorien mit unterschiedlichen analytischen Methoden 4.4 Zertifizierter Wert und Unsicherheit 4.5 ,,Inhomogene" Referenzproben

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11 11 13

5 Anwendung von Referenzmaterialien

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6 Quellen f ü r zertifizierte Referenzmaterialien

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Literatur

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1 Definition Bei physikalischen Messungen benützt man Normale (engl.: Standards) zur Kalibrierung und Überprüfung eines Meßverfahrens (z. B. Ur-Meter in Paris). Für physikalisch-chemische Messungen oder in der chemischen Analyse wendet man entsprechend „Referenzmaterialien" an. Der Begriff „Referenzmaterial" kennzeichnet jedoch auch Substanzen oder Produkte, die als Bezugssubstanz dienen, um die Übereinstimmung von analytischen Daten zwischen verschiedenen Laboratorien zu garan-

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B. Griepink, H . Marehandise

tieren, oder u m Meßwerte zu kennzeichnen, die nicht unmittelbar auf SI-Einheiten zurückzuführen sind (z. B. biologische Aktivität). Folgende Typen von Referenzmaterialien sind gebräuchlich: a) Beine Substanzen: sie dienen vor allem zur primären Kalibrierung analytischer I n s t r u m e n t e ; b) Matrix-Referenzmaterialien: sie sollen in ihrer Zusammensetzung weitgehend der zu analysierenden Probe entsprechen. Interessierende Konzentrationen von Komponenten oder Eigenschaften sind zuverlässig untersucht. Mit ihrer Hilfe ist es möglich, die Richtigkeit von Analysenverfahren hinsichtlich unbekannter Proben zu überprüfen. c) Referenzmaterialien zur Kalibrierung relativer Analysenmethoden, wie z. B. in der Festkörper-Massenspektrometrie, der RöntgenfluoreszenzAnalyse oder anderer instrumenteller Bestimmungsmethoden, die in der Regel matrixabhängige Querstörung bei der Erzeugung der analytisch auswertbaren Signale aufweisen. d) Biologische Referenzmaterialien zur Ü b e r p r ü f u n g oder Quantifizierung biologischer Eigenschaften (z. B. Enzymaktivität). Bei diesen Materialien gilt der Meßwert n u r f ü r eine genau definierte Methode. Es besteht kein Bezug zu einem primären Standard. Diese vier Kategorien sind n u r Beispiele f ü r die Anwendbarkeit von Referenzmaterialien. Wenn ein Referenzmaterial Aussagen über die Genauigkeit der Meßgrößen (z. B. Konzentrationsangaben) liefert, spricht man von einem zertifizierten Referenzmaterial (ZRM, engl.: CRM). Das US-Referenzbüro (NBS: National Bureau of Standards, Washington) verwendet dafür die Umschreibung: „Standard reference material" (SRM). Die IUPAC definiert den zertifizierten Wert eines Referenzmaterials als Wert, der auf übereinstimmenden Ergebnissen von mehreren unabhängigen Methoden basiert („based on the consistent results obtained by using independent analytical techniques"). Unseres Erachtens m ü ß t e die Definition noch dahingehend ergänzt werden, daß die eingesetzten unabhängigen Methoden f ü r die spezielle Problemlösung geeignet sind, richtige D a t e n zu liefern, also anwendungsspezifisch sein müssen. Die ISO-Definition (ISO: Internationale Organisation zur Standardisierung) besagt schlechthin, daß ein Referenzmaterial eine Substanz oder ein zu diesem Zweck angefertigtes P r o d u k t ist, von dem eine oder mehrere Eigenschaften ausreichend bekannt sind, um zur Kalibrierung eines Gerätes oder zur Überprüfung eines Verfahrens zu dienen. Hinzugefügt wird, daß zur Zertifizierung eine technisch anerkannte Methode notwendig ist. Auch diese Definition ist heute unzureichend. Ein ZRM sollte die gleiche Richtigkeit und Rückführbarkeit (zu den primären Standards) wie eine Übertragungsnormale (engl.: transfer Standard) f ü r physikalische Messungen besitzen.

Referenzmaterialien

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2 Anforderungen 2.1 Homogenität Im Gegensatz zu physikalischen Standards, die bei der Verwendung nicht zerstört werden, unterliegen Referenzmaterialien für die chemische Analyse in der Regel einem Verbrauch. Deshalb ist der Hersteller solcher Referenzmaterialien gezwungen, eine große Zahl übereinstimmender Proben anzufertigen und langfristig verfügbar zu halten. Jede einzelne Probe muß die Homogenität der Gesamtmaterials besitzen. Auch innerhalb einer Teil-Probe muß das Material homogen sein, weil selten die ganze Probe auf einmal eingesetzt wird. Mit Ausnahme von Reinststoffen (z. B. Einkristallen) nimmt die Homogenität mit abnehmender Probenportion ab. Bei Matrixmaterialien mit mehrphasigen Komponenten muß deshalb nicht nur die Homogenität angegeben werden, sondern auch dieProbenmenge, die eine noch ausreichende Homogenität garantiert. Eine Stoffportion kann als homogen bezeichnet werden, wenn die Unterschiede der Homogenität zwischen Proben einer bestimmten und für die analytische Praxis realistischen Größe vernachlässigbar sind im Vergleich zur Präzision der Verfahren, die zur Zertifizierung oder in der Praxis angewendet werden. Demnach sind kleine Inhomogenitäten tolerierbar, doch dann muß die Präzision der zertifizierten Werte diese Inhomogenitäten auch berücksichtigen. Proben aus inhomogenen Stoffportionen kann man zwar noch zur Überprüfung eines analytischen Verfahrens oder für Ringversuche einsetzen, doch sind sie zur Kalibrierung von Analysenverfahren unzulässig, solange nicht wenigstens der Grad der Inhomogenität genau bekannt bzw. zertifiziert ist. Im Idealfall sollte die Homogenitätsprüfung für jede zertifizierte Komponente eines Materials getrennt erfolgen, dies gilt auch für Spurenkomponenten, da die Verteilung der Spurenbestandteile in den verschiedenen Phasen der Matrix (z. B. mikrokristalline Bereiche in einer Legierung, organische und anorganische Bestandteile in Böden, zelluläre Anteile und Serum im Blut) sehr unterschiedlich sein kann. Eine ausreichende Homogenität der Matrixbestandteile muß nicht mehr für Spurenbestandteile zutreffen. Die Homogenitätsprüfung sollte auch immer solche Bestandteile einbeziehen, die erst zu einem späteren Zeitpunkt zertifiziert werden können, weil z. B. die zur Zeit verfügbaren Analysenverfahren noch kein ausreichendes Nachweisvermögen besitzen. Manchmal genügt ein indirekter Schluß (Beispiel: Cadmium begleitet geochemisch das Zink: wenn die Cd-Konzentration in einem Sediment zu niedrig ist, um bereits mit ausreichender Präzision gemessen zu werden, muß man wenigstens für Zink eine gute Homogenität nachweisen können). Wie erwähnt, muß die Homogenität immer für eine definierte Mindeststoffportion geprüft werden. Sie ergibt sich jeweils aus der Mindesteinwaage, die zur Bestimmung für die einzelnen zu zertifizierenden Komponenten in der Probe erforderlich ist. Demnach sollte die Probeneinwaage zur Homogenitäts-Kontrolle immer etwas niedriger liegen als die später in der Praxis angewandte Stoffportion. Auch muß die Präzision der Homogenitätsbestimmung besser sein als die in der späteren

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B. Griepink, H. Marchandise

Anwendung des Referenzmaterials erforderliche. Die Richtigkeit des anzuwendenden Bestimmungsverfahrens ist allerdings wegen der relativen Betrachtungsweise weniger wichtig. Somit bestimmen in erster Linie die späteren Anforderungen an das Referenzmaterial hinsichtlich Nachweisvermögen u n d Präzision die Wahl der Verfahren zur HomogenitätsKontrolle. Häufig angewandte Methoden sind Röntgenfluoreszenzspektrometrie (RFA), optische Emissions- (OES) u n d Absorptionsspektrometrie (AAS), Neutronen-Aktivierungsanalyse (NAA), aber auch klassische Methoden wie z. B. Titrimetrie u n d Spektralphotometrie [1, 2, 9]. Da die Homogenität nur über statistische Auswertung ermittelt werden kann, die eine große Anzahl von Stichproben benötigt, werden im allgemeinen zerstörungsfreie instrumentelle Bestimmungsmethoden bevorzugt, die jedoch ihrerseits wieder zuverlässige Eichmethoden voraussetzen [7]. Besteht das Referenzmaterial aus mehreren Komponenten unterschiedlicher Dichte und Form (z. B. Böden) [3, 4], ist die Gefahr einer E n t homogenisierung durch Seggregation nicht auszuschließen. Der Hersteller m u ß diese Gefahr erkennen und genaue Anweisungen für eine erneute Homogenisierung der gelieferten Probe vorsehen. Vor allem die Tatsache, daß immer mehr Komponenten in sehr niedrigen Konzentrationsbereichen in einer Probe zertifiziert werden sollen, f ü r die ein Homogenitätstest der Matrixkomponenten keinesfalls mehr genügt, stellt den Hersteller von Referenzmaterialien vor schwierige Probleme.

2.2 Stabilität Der Anwender von Referenzmaterialien muß wissen, wie lange das Material unverändert bleibt (nach Empfang, nach Öffnen des Behälters usw.). Dazu m u ß der Hersteller entsprechende Hinweise geben u n d Vorkehrungen treffen (z. B. darf ein nach dem Öffnen der Verpackung sich veränderndes Material nur in kleinen Portionen angeboten werden). I m Falle auch nur geringster Zweifel über die Stabilität der Probe muß der Hersteller während der Periode des Angebotes die Stabilität überwachen. Bei unerwarteten Veränderungen müssen die Anwender sofort benachrichtigt, und noch gelagerte Vorräte aus dem Angebot gezogen werden. Angaben von Zerfallsdaten sind f ü r weniger stabile Materialien anzustreben. Sie erfordern allerdings Langzeittests (über einige Monate) unter extremen Bedingungen (z. B. erhöhte Lagerungstemperatur, hohe relative Feuchtigkeit, starke Lichteinwirkung) [21]. Der Vergleich einer so behandelten Probe mit einer Probe, die z. B. gut verschlossen im Dunkeln bei sehr niedriger Temperatur aufbewahrt wurde, läßt dann die Beständigkeit der Probe abschätzen. Die Analysenmethoden, die zur Homogenitäts-Kontrolle eingesetzt werden, können auch hier gute Dienste leisten. Besondere Probleme sind vor allem bei sehr komplexen Materialien zu erwarten, wie sie in der Umwelt-, Lebensmittel- oder biomedizinischen Analyse anstehen. Hier empfiehlt es sich — z. B. jährlich — Vergleichsuntersuchungen durchzuführen, zwischen Proben, die unter Argon in Ampullen abgeschmolzen, im Dunkeln tiefgefroren

Referenzmaterialien

I

a u f b e w a h r t w u r d e n , u n d u n t e r n o r m a l e n B e d i n g u n g e n gelagerten P r o b e n . Voraussetzungen h i e r f ü r sind sehr a u f w e n d i g e P r o b e n b ä n k e , die auch kürzlich in der B u n d e s r e p u b l i k D e u t s c h l a n d eingerichtet w u r d e n . Dagegen stellen sich solche Stabilitätsprobleme weniger f ü r anorganische R e f e r e n z p r o b e n (z. B. Erze, Metalle, Gläser, W e r k s t o f f e ) .

2.3 Richtigkeit, Präzision und Rückfiihrbarkcit I n der Terminologie v o n ISO u n d OIML ( I n t e r n a t i o n a l e Organisation f ü r Legale Metrologie) b e d e u t e t R i c h t i g k e i t (engl.: accuracy) den Grad v o n Ü b e r e i n s t i m m u n g zwischen d e m gemessenen u n d d e m „ w a h r e n " W e r t . Der zertifizierte W e r t sollte die beste N ä h e r u n g a n d e n wirklichen W e r t liefern. Man b e n ö t i g t f ü r eine Zertifizierung A n a l y s e n v e r f a h r e n m i t höchster R i c h t i g k e i t , also m i t möglichst geringen Quellen f ü r „systematische F e h l e r " . Dagegen b e w e r t e t der Begriff der „ P r ä z i s i o n " (engl.: precision) n u r die Größe der „zufälligen F e h l e r " . Die Präzision einer M e t h o d e s a g t n i c h t s über ihre R i c h t i g k e i t aus, d. h. ü b e r die Übere i n s t i m m u n g der Ergebnisse, die a n der gleichen P r o b e m i t verschiedenen M e t h o d e n bzw. in verschiedenen L a b o r a t o r i e n e r h a l t e n w u r d e n , wie vor allem die E r f a h r u n g bei der A u s w e r t u n g von R i n g a n a l y s e n lehrt. Allenfalls d e u t e t ein A n a l y s e n v e r f a h r e n , das schlecht reproduzierbare Ergebnisse liefert, also eine schlechte Präzision besitzt, a u c h auf große systematische Fehler, also eine schlechte R i c h t i g k e i t hin. Deshalb m u ß in diesem Z u s a m m e n h a n g dringend darauf hingewiesen werden, d a ß g u t r e p r o d u z i e r b a r e Ergebnisse kein Zeichen f ü r eine g u t e R i c h t i g k e i t sind. E i n e Messung ist der Vergleich einer b e s t i m m t e n Größe m i t einer N o r m a l e . D a b e i müssen zwei F a k t o r e n b e r ü c k s i c h t i g t w e r d e n : — Die Zuverlässigkeit (Richtigkeit u n d Präzision) der N o r m a l e , v o n d e m messenden L a b o r a t o r i u m v e r w e n d e t wird, u n d — die Zuverlässigkeit der Vergleichsmethode.

die

Die R ü c k f ü h r b a r k e i t auf eine f u n d a m e n t a l e E i n h e i t b e d e u t e t , d a ß die A n g a b e der E i n h e i t des gemessenen W e r t e s tatsächlich bis zur I n t e r n a t i o n a l e n E i n h e i t zurückzuverfolgen ist, u n d d a ß der gemessene W e r t richtig m i t der I n t e r n a t i o n a l e n E i n h e i t v e r k n ü p f t ist. D e m n a c h m u ß eine I n s t a n z , welche z. B. die Masse einer P r o b e zertifiziert, es deutlich m a c h e n , d a ß das Vergleichs-Kilogramm identisch ist m i t d e m I n t e r n a t i o n a l e n K i l o g r a m m , u n d d a ß G r a m m oder M i k r o g r a m m g e n a u 10~3 bzw. 1 0 - 9 E i n h e i t e n d a v o n b e t r a g e n . J e d e Abweichung m u ß korrigiert, oder die Größe der Abweichung bzw. Unsicherheit angegeben werden. E b e n s o wichtig ist die K a l i b r i e r u n g des Volumens über die Masse. F ü r die Zuverlässigkeit der K a l i b r i e r u n g v o n P i p e t t e n , Meßkolben usw. sind spezielle M a ß n a h m e n erforderlich (z. B. irreversible A u s d e h n u n g v o n Glasgeräten bei e r h ö h t e n T e m p e r a t u r e n ) . E l e m e n t a n a l y t i s c h e Bestimm u n g e n g e h e n z u r ü c k z u m r e i n e n E l e m e n t . W e n n s t a t t des reinen Elem e n t e s eine V e r b i n d u n g zur K a l i b r i e r u n g eingesetzt w u r d e müssen w i e d e r u m a n d e r e M a ß n a h m e n getroffen werden, u m d e n E l e m e n t g e h a l t der V e r b i n d u n g z u m r e i n e n E l e m e n t z u r ü c k z u f ü h r e n (Gewährleistung d e r R e i n h e i t u n d Stöchiometrie der Verbindung).

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B. Griepink, H. Marchandise

2.4 Matrix-Ähnlichkeit Verwendet m a n das Referenzmaterial zur Überprüfung der Richtigkeit eines analytischen Verfahrens oder zur Kalibrierung, so sollte die Matrix des Referenzmaterials der Matrix der zu untersuchenden Probe weitgehend ähneln. Wenn man mit einem Verfahren mit pflanzlichem Referenzmaterial richtige Ergebnisse erhält, besagt dies keinesfalls, daß m a n auch mit tierischen Proben oder gar Böden mit derselben Richtigkeit analysieren k a n n . Hier stellt sich dem Hersteller von Referenzmaterialien ein weiteres Problem, die Forderung der Matrix-Ähnlichkeit mit jener nach Stabilität u n d Homogenität möglichst weit in Einklang zu bringen. F ü r die Metall- oder Erzanalyse ist dies vergleichsweise leicht möglich, bei der Umwelt- oder Lebensmittelanalyse sowie der biomedizinischen Analyse muß m a n Kompromisse in Kauf nehmen. Hier sind z. B. Gefriertrocknung und Probenzerkleinerung oftmals notwendige Bearbeitungsschritte, bei denen ein Teil der ursprünglichen Matrixkomponenten verlorengehen kann.

3 Herstellung eines Referenzmaterials Bereits bei der Planung u n d noch vermehrt beim Herstellungsprozeß eines Referenzmaterials müssen die im vorherigen Abschnitt diskutierten Forderungen berücksichtigt werden. F ü r Gase und Flüssigheiten spielt die Frage der Homogenität eine nur untergeordnete Rolle, nicht hingegen die Stabilität der Probe (z. B. Veränderungen durch Diffusion), die nur durch geeignete Behälter und Lagerungsbedingungen gewährleistet werden k a n n , die hier näher auszuführen, den R a h m e n dieses Beitrages sprengen würde. Bei Feststoffen bestehen auch hinsichtlich der Homogenität größere Probleme. Außerdem dürfen sich bei der Herstellung weder die Konzentrationen der Elemente — besonders problematisch f ü r sehr niedrige Spurengehalten von Elementen, die in der Umwelt sehr häufig vorkommen (z. B. Si, AI, Ca, Mg, Fe) — noch ihre Bindungsart (engl.: "speciation") (z. B. relevant bei Fe, Cr, As) ändern. Man muß kontaminationsfrei und verlustfrei arbeiten, unter U m s t ä n d e n nach den Regeln der extremen Spurenanalyse, u n d dies im kg-Maßstab. Selten sind Kompromisse zu umgehen, deren erhöhte Risiken genau abzuwägen sind. Alle Herstellungsgeräte müssen aus Materialien bestehen, die nicht in die Zertifizierung einbegriffen sind (z. B. werden bei der Bereitung von tierischen Organu n d Gewebeproben Titanmesser verwendet. Chrom k a n n nicht zertifiziert werden, wenn chromhaltige Edelstahle verwendet werden). Zum Probenzerkleinern sind häufig n u r Kugelmühlen aus Teflon u n d Achat das Mittel der Wahl. U m die Bindungsart einer zu zertifizierenden Komponente nicht zu verändern, darf m a n das Referenzmaterial, z. B. zur Erhöhung einer Elementkonzentration, nicht mit einer Lösung des betreffenden Elementes aufstocken (engl.: spiking), sondern m a n muß von einem Material ausgehen, das einen natürlich erhöhten Elementgehalt bereits besitzt

Referenzmaterialien

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(z. B. Pflanzen, die auf stärker m i t dem Element kontaminiertem Boden gewachsen sind). Trocknen, Mahlen u n d Sieben sind die üblichen Methoden, um ein Material zu homogenisieren. Wenn das Material wenig beständig ist, sind Vorsichtsmaßnahmen erforderlich, die häufig Pilotstudien voraussetzen [19, 20]. Legierungen sind scheinbar einfach zu verarbeiten, indem m a n sie aus den metallischen Komponenten erschmilzt. Beim Erstarren bilden sich jedoch häufig nacheinander mehrere Phasen (Seigerung), so daß auf jeden Fall die metallkundlichen Phasendiagramme zu beachten sind. Oft fehlen die Voraussetzungen gänzlich, eine homogene Legierung in vorgegebenen Konzentrationsbereichen f ü r analytische Referenzzwecke zu bereiten. Auf die Schwierigkeiten hinsichtlich der nachträglichen Entmischung mehrphasiger Proben (z. B. Klärschlämme, Böden) wurde bereits im vorherigen Abschnitt hingewiesen. Die Verpackung h a t Kontaminationen u n d Verlusten vorzubeugen, die Stabilität zu garantieren und möglichst sicher in der H a n d h a b u n g zu sein [17]. Flaschen mit doppeltem Verschluß u n d gegebenenfalls lackiert, Ampullen aus Glas, u. U. auch Quarz, Behälter aus plastifizierter Aluminiumfolie sowie speziell entwickelte Gefäße finden Anwendung u n d bedürfen von Fall zu Fall sehr kritischer Auswahlkriterien.

4 Zertifizierung: Prinzipien und Methoden Bevor m i t der Zertifizierung eines geeigneten Referenzmaterials begonnen werden k a n n , stellt sich die Frage, welche Unsicherheiten in den Angaben maximal tolerierbar sind. I m Idealfall sollte der zertifizierte Wert mit dem „ w a h r e n " W e r t übereinstimmen, was nur selten in der Praxis zutreffen wird. Eine gute realistische Näherung kann es n u r sein, den Grad der Unsicherheit möglichst genau zu quantifizieren [6, 13, 14, 15, 18]. Dies gelingt n u r mit den Mitteln der Statistik. Die statistische Aussage fällt ihrerseits um so zuverlässiger aus, je mehr voneinander unabhängige Informationen zur Auswertung vorliegen. Man k a n n — wie es der IUPAC-Definition entspricht, mehrere unabhängige Methoden einsetzen. „ U n a b h ä n g i g " bedeutet in diesem K o n t e x t , daß die Meßprinzipien völlig verschieden sind. Selbstverständlich müssen dabei die Methoden nach Genauigkeit, Wiederholbarkeit usw. vergleichbar sein. Auch die Rückführbarkeit (engl.: „traceability") muß gewährleistet sein. Die Zertifizierung k a n n von n u r einem Laboratorium oder von einer Vielzahl vorgenommen werden. Bei einfachen Analysenproblemen (z. B. Bestimmung eines säurelöslichen Rückstandes, Wassergehalt) genügt häufig eine einfache Meßmethode, die allerdings genau definiert u n d bereits von mehreren Laboratorien vorher gründlich auf Fehlerquellen und Fehlinterpretationen ü b e r p r ü f t sein m u ß (Standard-Methode). Solche einfachen Referenzmaterialien weisen k a u m Fehler von der instrumentellen Seite oder der Probenvorbereitung auf und sind in der Regel nur mit sehr geringen Unsicherheiten behaftet.

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B. Griepink, H. Marehandise

Zur Zertifizierung komplex zusammengesetzter Proben — vor allem aber, wenn sehr niedrige Spurengehalte anstehen — ist es jedoch unumgänglich, mit verschiedenen unabhängigen Methoden in einer größeren Anzahl von kompetenten Laboratorien eine größere Anzahl von Ergebnissen zu gewinnen, die dann mit viel Sachverstand sehr kritisch auszuwerten sind [5, 6, 10].

4.1 Zertifizierung durch ein einzelnes Laboratorium Eine Zertifizierung durch ein Laboratorium allein setzt erhebliche Erfahrung und Praxis dieses Laboratoriums voraus und erhöht das Risiko für zufällige aber vor allem für systematische Fehler. Deshalb verlangt sie auf jeden Fall den Einsatz verschiedener unabhängiger Methoden durch voneinander unabhängige Analytiker in diesem Laboratorium. Allzuoft ist man vom Nutzen einer „definierten" Methode überzeugt und übersieht, daß vielmehr die Qualifikation der Mitarbeiter entscheidend ist, auch wenn in den letzten J a h r e n die Qualität standardisierter Methoden wesentlich verbessert worden ist, wie Vergleichsuntersuchungen u n d Ringanalysen im Trend erkennen lassen. I m Bereich der ng/g- u n d pg-g-Analytik allerdings wird jedes qualitätsbewußte Laboratorium, das Zertifizierungen vornimmt, noch über einen längeren Zeitraum nicht auf die Unterstützung anderer Laboratorien verzichten können, wenn zuverlässige Ergebnisse garantiert werden sollen.

4.2 Zertifizierung aufgrund statistischer Übereinstimmung verschiedener Laboratorien bei Anwendung der gleichen analytischen Methode Der Weg, die Ergebnisse von verschiedenen Laboratorien einer Zertifizierung zugrunde zu legen, wird ebenfalls beschritten. Hierbei geht man davon aus, daß der gefundene Mittelwert aus dem Kollektiv den „ w a h r e n " Wert um so wahrscheinlicher repräsentiert, je größer die Anzahl der an der Zertifizierung beteiligten Laboratorien ist. Diese Annahme trifft a priori keinesfalls immer zu. Teilnehmer, die nicht zuverlässig arbeiten, können das Resultat wesentlich verfälschen. Besonders problematisch werden die Verhältnisse, wenn Methoden verwendet werden, die mit systematischen Fehlern behaftet sind, die prinzipiell n u r sehr schwierig zu erkennen sind. „Während sich bei der Untersuchung eines großen Kollektivs (Ringanalysen) vereinzelte Ergebnisse, die groben systematischen Fehlern unterliegen, durch Ausreißertestverfahren (z. B. nach Nalimov oder Dixon) erkennen u n d eleminieren lassen, ist große Vorsicht geboten, wenn eine H ä u f u n g von ,Ausreißern' a u f t r i t t . Dies ist ein signifikanter Hinweis dafür, daß in dem anstehenden analytischen System systematische Fehler gegenüber den statistischen überwiegen können. Man muß dann von Fall zu Fall sehr kritisch entscheiden, ob man die Ergebnisse ü b e r h a u p t noch statistisch auswerten darf." Die Gefahr, methodischen systematischen Fehlern zu unterliegen, wächst bei der Bestimmung sehr niedriger Gehalte von Komponenten, je komplexer die Matrix ist (extreme Spurenanalyse). Dann kann es durchaus vor-

Referenzmaterialien

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kommen, daß Werte, die bei der statistischen Auswertung aus dem Rahmen fallen (sog. Ausreißer), den wahren Gehalt besser repräsentieren. I n solchen Fällen darf eine Zertifizierung nur mit größtem Kritikvermögen erfolgen. Sie setzt dann nicht nur die Mittelwerte und Standardabweichungen jedes einzelnen Laboratoriums, sondern auch eine genaue Beschreibung der benutzten Analysenverfahren bis in alle Details voraus, um Hinweise auf systematische Fehler zu erhalten und die Ergebnisse auch in dieser Hinsicht wichten zu können. Aus den erwähnten Gründen ist eine Zertifizierung, die alle individuellen Ergebnisse eines größeren Kollektivs nach den Regeln der Statistik berücksichtigt, nicht verallgemeinerungsfähig und nur in speziellen Fällen zu rechtfertigen.

4.3 Zertifizierung durch verschiedene Laboratorien mit unterschiedlichen analytischen Methoden Eine Zertifizierung, die sowohl unabhängige Methoden und eine Anzahl kompetenter hochqualifizierter Laboratorien berücksichtigt — entsprechend der I U P A C Definition — wird vom Europäischen Referenzbüreau (BCR) vertreten, um vor allem das Problem der systematischen Fehler zu minimalisieren. Den vertraglich zur Zertifizierung gewonnenen Laboratorien ist es freigestellt, zunächst die Methoden anzuwenden, für die sie bereits über eingehende Erfahrungen verfügen. Bereits bei der Rekrutierung wird darauf geachtet, daß ein möglichst breites Methodenspektrum vorliegt. Die im ersten Durchgang anfallenden Ergebnisse werden in Teamarbeit sehr kritisch analysiert und eventuelle Unterschiede eingehend auf eventuelle methodische Unzulänglichkeiten hin untersucht. Gegebenenfalls werden zur Klärung der Fehlerursachen Pilotstudien angesetzt, an denen sich mehrere Laboratorien mit gleichen Methoden beteiligen, um die laboratoriumsspezifischen systematischen Fehler aufspüren zu können. Die „gleiche" Methode bedeutet hier, daß die Laboratorien unabhängig bleiben und nicht nach einem vorher vereinbarten Protokoll arbeiten. Auf diese Weise ist gewährleistet, daß sowohl methodisch als auch laboratoriumsbedingte unwahrscheinliche Ergebnisse verworfen werden können. Die endgültige Zertifizierung wird dann mit den Methoden vorgenommen, die sich im kritischen Vergleich bewährt haben.

4.4 Zertifizierter Wert und Unsicherheit Wie wir gesehen haben, sind für eine Zertifizierung neben statistischen Auswerteverfahren noch zusätzliche Sachkriterien für die Wahl optimaler Analysenmethoden unumgänglich. Mit anderen Worten, wenn die Übereinstimmung der Ergebnisse, die mit verschiedenen Methoden erhalten wurden, unzureichend ist und die Ursachen nicht aufzuklären sind, ist eine Zertifizierung auszuschließen. Sind jedoch die Bedingungen von ausreichender Homogenität der Probe und hinreichender Qualität der Analysenergebnisse erfüllt, so kann die Unsicherheit des zu zertifizierenden Wertes ermittelt werden.

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B. Griepink, H. Marchandise

Eine Anzahl von Ergebnissen, die von einem Laboratorium mittels eines Verfahrens für eine Komponente der Probe und von einem Techniker unabhängig voneinander gefunden wurden (z. B. eine vom Techniker A mittels AAS im Laboratorium y fünffach wiederholte Bestimmung), wird ein „Set" genannt. Wenn die Anzahl der auszuwertenden Sets r ist und wenn x; der Mittelwert des i-ten Sets ist, so wird der zertifizierbare Wert aus den unterschiedlichen Mittelwerten x berechnet: (1)

Voraussetzung hierfür ist, daß die einzelnen Werte x; zusammen eine Normalverteilung aufweisen. Nur wenn die Varianz zwischen den verschiedenen Sets nicht signifikant von der Varianz eines Einzelsets (z. B. F-Test) abweicht, darf man alle individuellen Ergebnisse (die einer Normalverteilung gehorchen müssen) zur Ermittlung des zu zertifizierenden Wertes heranziehen. Für diesen Fall liefert Gleichung 2 den zertifizierten Wert x : _ x

i = ^

r ni E £

x

u

(2)

Xjj bedeutet das j-te Ergebnis vom Laboratorium i; n; die Anzahl der mehrfach-Bestimmungen, ausgeführt vom Laboratorium i (i = 1, 2, . . . , r); und r N die totale Anzahl individueller Ergebnisse, N = £ n; i-l Unter der Bedingung, daß schwerwiegende systematische Fehler aus dem System eliminiert wurden (vgl. Abschn. 4.3.), kann das Vertrauensintervall des zertifizierten Mittelwertes x bereits als gute Basis zur Abschätzung der Unsicherheit dienen. Wenn verschiedene Laboratorien mit unabhängigen Methoden zu einer guten Übereinstimmung der Werte kamen, so darf man davon ausgehen, daß die meisten Unsicherheiten systematischer Art, die in einem Laboratorium auftraten, im Kollektiv der Laboratorien betrachtet, zufälligen Charakter erhalten. Wenn der zertifizierte Wert nach Gl. 1 errechnet wird, kann man das Vertrauensintervall (V r ) des Mittelwertes nach Gleichung 3 errechnen: v r = X ± t ( 1 _oc ) i ( M ) Die Standardabweichung

sjir

(3)

berechnet sich nach:

Wenn man den zertifizierten Wert nach Gl. 2 erhalten hat, wird das Vertrauensintervall (V N ) errechnet nach: V N = X ± t^-a^r-^Sj/l/N

(4)

Referenzmaterialien

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Die Standardabweichung s 2 ergibt sich nach: S2D.2

Vn

nf +

NS?

N2

I n den Gleichungen 3 und 4 ist t ( 1 _ a ) ^ ^ der Wert der Student-t-Verteilung für ein bestimmtes Signifikanzniveau a und r — 1 Freiheitsgrade; die Standardabweichungen S w in den Sets und S b zwischen den Sets errechnen sich nach: r

q2 _—

m

I 2 (Xij-X,)2 i - 1 j-1 S n; i=l

und

SN

r

2 n i ( x i - x) 2 i=l :

—

q2 ö.

2

i-1

(r

n s (r \2

2 n; i-1 /

1) r

- E n ? i-1

4.5 „Inhomogene" Referenzproben Nicht immer sind nicht vollständig homogene Referenzmaterialien wertlos. Dann ist allerdings erforderlich, jede Einzelprobe getrennt zu behandeln und ihre Abweichung vom Mittelwert und der Unsicherheit, die sich hinsichtlich des Gesamtmaterials ergab, zu berücksichtigen. Diese läßt sich aus dem statistisch gefundenen Toleranzintervall ableiten, das mit einiger Wahrscheinlichkeit einem spezifischen Teil derjenigen der Gesamt-Population entspricht (ISO 3534 — 1977). Der Mittelwert dieses Intervalls kommt dann dem Mittelwert des gesamten Materials mit der immanenten Unsicherheit sehr nahe. Mit 95%iger Wahrscheinlichkeit enthält dann das Toleranzintervall der Teilmenge 9 5 % der ursprünglichen Gesamtprobe. Selbstverständlich kann man eine solche Referenzprobe mit zu großem Toleranzintervall nicht mehr zur Kalibrierung verwenden, sondern nur mit Einschränkungen zur Uberprüfung analytischer Verfahren.

5 Anwendung von Referenzmaterialien Zertifizierte Materialien dienen gemäß der ISO-Definition zur Kalibrierung von Meßgeräten und zur Überprüfung von Analysenverfahren. Doch verwenden Laboratorien häufig auch andere nicht-zertifizierte Referenzmaterialien. Zur Kalibrierung und Überprüfung im engeren Sinn sind diese jedoch ungeeignet. Um Mißverständnissen vorzubeugen, sollte man nicht zertifizierte Materialien Test-Materialien nennen, von denen man zwei Typen unterscheiden kann: 1) Test-Materialien, die zwar für analytische Zwecke ausreichend

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B. Griepink, H . Marchandise

homogen u n d stabil sind, jedoch hinsichtlich der Zusammensetzung der Komponenten bzw. der Eigenschaften kaum definiert sind. Sehr oft werden solche Materialien von einem Laboratorium für bestimmte Zwecke selbst hergestellt, z. B. f ü r eine frequente interne Laboratoriumskontrolle. Solche Test-Materialien werden meistens in die RoutineAnalyse einbezogen u n d dienen dann als Indikator f ü r die Konstanz der Parameter eines Analysenverfahrens über einen längeren Zeitraum. 2) Test-Materialien, die ausreichend stabil und homogen sind, jedoch noch zusätzliche Informationen über die Zusammensetzung der Probe liefern: mit ihnen k a n n man nicht nur Trends in der Veränderung eines Analysenverfahrens verfolgen, sondern auch u. U. Aussagen zur Erkennung u n d Eliminierung von systematischen Fehlern gewinnen [5], Solche Materialien können z. B. von mehreren Laboratorien gleichzeitig analysiert und benutzt werden, um die Ergebnisse untereinander auszutauschen und in Einklang zu bringen [8, 17]. Solche Test-Materialien ersetzten aber keinesfalls zertifizierte Referenzmaterialien, deren Daten mit viel Kritikvermögen nach dem neuesten Stand der Technik und Wissenschaft weitgehend von systematischen Fehlern befreit sind. I n den meisten Bereichen der chemischen oder biomedizinischen Analyse werden zunehmend mehr Ringuntersuchungen organisiert, um die Analysenqualität der beteiligten Laboratorien zu verbessern [13, 16]. Oft erfolgt die Auswertung der Ergebnisse leider mit so großer Verzögerung, so daß die Aussagen solcher Bemühungen nicht mehr aktuell sind. Diese sehr aufwendigen Aktivitäten, die dringend zur Verbesserung der analytischen Aussagen [11, 12] notwendig sind, lassen sich mit zertifizierten Referenzmaterialien erheblich abbauen und damit die Kosten wesentlich reduzieren. Die Stahlindustrie, die bereits über ein breit angelegtes Referenzmaterial-System verfügt, k a n n als vorbildlich u n d richtungsweisend betrachtet werden. Auch die Einführung der Methoden und Arbeitsweisen nach G L P (Gute Laboratoriumpraxis) — von der pharmazeutischen Industrie ursprünglich eingeführt — wirkt sich bereits sehr positiv auf viele andere Zweige der Analytik aus. Ein besonderes Anliegen der G L P ist .-eine gewissenhafte und detaillierte Protokollführung f ü r die Vorschriften und Ergebnisse und erleichtert in vielen Fällen auch noch durch eine spätere E i n f ü h r u n g von zertifizierten Referenzmaterialien Nachkontrollen und Korrekturen. Auch sollte man sich noch mehr bewußt machen, daß moderne instrumentelle Analysenmethoden (z. B. R F A , OES, MS), die sehr matrixabhängige Relativmethoden sind, nur dann ihren Vorteil der größeren Wirtschaftlichkeit erfüllen können, wenn sie mit zuverlässigen Referenzproben kalibriert werden können. Dazu benötigt man jedoch f ü r jede Matrixklasse jeweils eine größere Anzahl von zertifizierten Referenzmaterialien ähnlicher Zusammensetzung, jedoch mit sehr breit gestreuten definierten Konzentrationsangaben für die zu bestimmenden Komponenten, u n d dies für immer niedrigere interessierende Konzentrationsbereiche. Die Entwicklung instrumenteller Direktmethoden ist somit unabdingbar mit einer raschen Verbreiterung des Angebotes von zertifizierten Referenzmaterialien — vor allem f ü r niedrige Konzentrationsbereiche — verknüpft [16]. Ebenso wesentlich ist es aber auch, daß der

Referenzmaterialien

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Anwender den Umgang mit Referenzmaterialien richtig zu beherrschen lernt. Dazu gehören, um nur einige Beispiele zu nennen, die sorgfältige Lagerung, vor allem von bereits geöffneten Probenbehältern. Das kontaminationsfreie Öffnen von z. B . Ampullen kann zum Problem werden, wenn nicht die richtigen Werkzeuge verwendet werden (z. B . enthalten übliche harte blaue Glasmesser Cadmium, das in die Probe eingebracht werden kann). Zu einer zertifizierten Referenzprobe gehören deshalb detaillierte Vorschriften, die vom Nutzer genau zu befolgen sind. Dies bezieht sich auch auf die vom Hersteller bei der zur Erstellung der Zertifikation benutzten statistischen Methoden, wenn man die eigenen Ergebnisse mit den zertifizierten vergleichen will. Auch muß man sich genau an die vom Hersteller gegebenen Vorschriften halten, die natürlich eindeutig sein müssen, wenn eine Probe (z. B . lyophilisiertes Vollblut) in der Herstellung reproduziert werden soll. J e d e für den Nutzer zusätzlich erforderliche Operation muß als Fehlerquelle betrachtet werden, die bereits vom Hersteller zu vermeiden ist. Schließlich sind noch einige Bemerkungen zu den relativ hohen Kosten von zertifizierten Referenzmaterialien angebracht, die sich zwangsläufig aus dem hohen Aufwand für ihre Herstellung ableiten. Zertifizierte Referenzmaterialien bilden die höchste Gütestufe der Kontrolle- oder Kalibrierung. Sie tragen somit entscheidend zu einer hohen Zuverlässigkeit von analytischen Informationen und zur optimalen wirtschaftlichen Arbeitsweise, auch im Hinblick auf Einsparungen im Volksvermögen bei. Falsche Analysenergebnisse sind nicht nur unwirtschaftlich, sondern besonders im Hinblick auf die Gesundheit und Sicherheit unverantwortbar. Nachdem die Zuverlässigkeit der Methoden eines Laboratoriums mit Hilfe von relativ teuren zertifizierten Referenzmaterialien belegt ist, können die einfacheren und billigeren Test-Materialien die Kontrolle der täglichen Routine übernehmen, so daß sich in einem gut organisierten Laboratorium die Investitionen von zertifizierten Materialien sehr schnell amortisieren. I n vielen Bereichen der Analytik besteht noch ein großer Nachholbedarf für zertifizierte Referenzmaterialien, die zu schließen eine gemeinsame Verpflichtung der Hersteller von zuverlässigen Referenzmaterialien und ihren Anwendern sein sollte.

6 Quellen für zertifizierte Beferenzmaterialien Die ISO veröffentlicht in regelmäßigen Abständen Übersichten der auf dem Markt befindlichen zertifizierten Referenzmaterialien und deren Hersteller. Die Materialien sind nach den Anwendungsgebieten (z. B . Geochemie, Physikalische Chemie, Umwelt, Werkstoffe, Lebensmittel, Biomedizin) geordnet. Die letzte ISO-Liste (1982) enthält die Namen von über 300 Bezugsquellen, die fast 200 verschiedene Sets von Materialien anbieten (ISO: Directory of Certified Reference Materials, l s t edition 1982 I S B N 92 67 01027; erhältlich bei dem ISO-Sekretariat: Case Postale 56, CH-1211 Genève 20).

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B. Griepink, H . Marchandise

Literatur 1. P . Sohramel, J . Schmolck, H . M u n t a u : J . R a d i o a n a l . Chem. 50, 179 (1979) 2. B. Griepink, E . Colinet, G. Guzzi, L . H a e m e r s , H . M u n t a u : Fresenius' Z. Anal. Chem. (1983) 315: 20 3. B. Griepink, H . M u n t a u , P . Schramel: I n t . Conf. on H e a v y Metals in t h e E n v i r o n m e n t , A m s t e r d a m , April 1982 4. E . Colinet, H . Gonska, B. Griepink, H . M u n t a u : R e p o r t s E U R 8833, E U R 8834, E U R 8835 5. B. Griepink: Fresenius' Z. Anal. Chem. (1984) 317: 210 6. H . Marchandise, E . Colinet: Fresenius' Z. Anal. Chem. (1983) 316: 669 7. J . I n c z e d y : T a l a n t a n (1982) 29: 643 8. M. Stoeppler, H . W . D ü r b e c k , H . W . N ü r n b e r g : J a h r e s b e r i c h t 1979/80 der Kernforschungsanlage J ü l i c h 9. M. v a n Craen, P . v a n E s p e n , F . A d a m s : Mikrochim. A c t a (Wien) (1981) I I : 373 10. M. Stoeppler, P . V a l e n t a , H . W . N ü r n b e r g : Fresenius' Z. Anal. Chem. (1979) 279: 22 11. F . A c k e r m a n n , H . B e r g m a n n , U . Schleichert: Fresenius' Z. Anal. Chem. (1976) 296: 270 12. G. T ö l g : Z. E r z m e t a l l (1975) 28: 390 13. J . M. de Geoy, L . K o s t a , A . R . B y r n e , J . K u c e r a : Anal. Chim. A c t a (1983) 146: 161 14. S. A b b e y : Anal. Chem. (1981) 53: 529 A 15. J . H e i n o n e n : Academic Dissertation, E s p o o 1977 16. K . Ohls, D . S o m m e r : Fresenius' Z. Anal. Chem. (1982) 312: 195 17. J . R . Moody, R . M. S i n d s t r o m : Anal. Chem. (1977) 49: 2264 18. R . Alvarez, S. D. R a s b e r r y , G. H . U r i a n o : Anal. Chem. (1982) 54: 1226 A 19. R . B . L o c k m a n : J . Assoc. Oft. Anal. Chem. (1980) 63: 766 20. B. Griepink, H . M u n t a u , E . Colinet: Fresenius' Z. Anal. Chem. (1983) 315: 193 21. W . J . Buis, B . Griepink, L. H a e m e r s , Y. Le Duigou, F . Sels: Mikrochim. A c t a (Wien) (1981) I : 93

Vollautomatische rechnergesteuerte Analysensysteme: Geräteentwicklung und Auswertung I. Allgemeine Grundlagen* Siegfried Ebel Bayerische Julius-Maximilians-Universität Würzburg I n s t i t u t f ü r Pharmazie und Lebensmittelchemie Am Hubland, D-8700 Würzburg 1 Einführung 2 Hardware

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2.1 Analysengeräte

20

2.2 Rechner

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2.3 Schnittstellen 2.3.1 GP I/O-Schnittstelle 2.3.2 RS 232 C (V 24)-Schnittstelle 2.3.3 BCD-Schnittsteile 2.3.4 I E E E 488 (IEC-Bus)-Schnittstelle 2.3.5 Schnittstellenwandler

24' 25 26 26 28 29

2.4 Interfaces-Steuergeräte 2.4.1 A/D-Wandler 2.4.2 Steuergeräte 2.4.2.1 Decoder 2.4.2.2 Impuls-Steuerung 2.4.2.3 Schrittmotor-Steuerung

29 29 31 31 32 32

2.5 Rechnerverbundsysteme

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Literatur

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3 Anwendung rechnergesteuerter Analysensysteme: Elektrochemische Analysenverfahren, Titrationen, Coulometrie, Polarographie, Arbeiten mit ionensensitiven Elektroden (Band 7) 4 Anwendung rechnergesteuerter Analysensysteme: Chromatographische Analysenverfahren, Dünnschicht-, HochdruckflüssigkeitsChromatographie (Band 7) 5 Anwendung rechnergesteuerter Analysensysteme : Spektroskopische Analysenverfahren (Band 7) 6 Spezielle Aspekte der Datenverarbeitung in der Analytik Digitale Filterung, Ableitungstechniken, Kalibrierung und Validierung (Band 7) * Teil I I „Elektrochemische Analysenverfahren" Kapitel 3 bis 6 folgt im Band 7.

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1 Einführung E t w a im J a h r e 1970 begann mit der Tischrechner-Serie H P 98xx der Firma Hewlett-Packard eine Entwicklung auf dem Rechnersektor, die eine ganz neue Anwendung in der analytischen Chemie erschlossen h a t und deren weitere Entwicklung auch heute noch nicht abschätzbar ist. Erstmals gestattete eine ausgefeilte Interface-Technik mit genormten Schnittstellen den Einsatz kleinerer Rechner für echte Steueraufgaben. W ä h r e n d der H P 9810 noch mit der heute bei Taschenrechnern üblichen Tastenfeldprogrammierung arbeitete und Programme auf Magnetkarten eingelesen und ausgegeben werden konnten, war der H P 9830 bereits in BASIC programmierbar, und als Daten- u n d Programmspeicher wurden handelsübliche Compactcassetten verwendet. Mit diesen Rechnern begann auch eine Entwicklungslinie, die heute noch für alle Hewlett-PackardTischrechner bezeichnend ist. Spezielle ROMs (read only memory) f ü r Ein- u n d Ausgabe (I/O-ROM) oder Statistik bzw. Matrizen-Rechnung erweitern den Rechner praktisch ohne Verlust an freiem Benutzerspeicher. Alle Interfaces der Rechner H P 9810/9820(21)/9830 waren voll austauschbar. Printer, Plotter u n d externe Magnetbandstationen ergänzten die Rechner zu vollen Systemen mit der notwendigen Peripherie. Der Preis eines kompletten Systems mit BASIC, allen ROMs, Drucker und den zum Steuern der Analysengeräte notwendigen Interfaces lag bei ca. DM 45000. —. F ü r den Benutzer standen dabei maximal 8 k B y t e freier Speicher zur Verfügung. Die zweite Generation dieser Tischrechner war vor allem von den Editiermöglichkeiten beim Programmieren ein beachtlicher Schritt nach vorn. Während der H P 9815 wiederum Tastenfeld-Programmierung aufwies, wurden die größeren in der speziellen, aber sehr leistungsfähigen Sprache H P L (9825) bzw. BASIC (9835, 9845) programmiert. Es gibt heute — auch bei den neueren HP-Rechnern — keinen Computer mit besserem Programmier-Komfort, als gerade diese BASIC-Rechner, zumal auch das BASIC weit über das sonst übliche Standard-BASIC hinausgeht. Auch diese Rechner sind wiederum untereinander interface-kompatibel (nicht jedoch mit der 1. Generation) und besitzen schnelle KassettenLaufwerke als sekundäre Programm- und Datenspeicher. Bei voller Ausbaustufe (incl. Doppel-floppy-disk-Laufwerk, Schnelldrucker und Fünffarbenplotter) kostete ein solches System 1978 etwa DM 70000.— u n d besaß bis auf die längere Rechenzeit praktisch gleiche Möglichkeiten wie ein Großrechner 10 J a h r e zuvor. Die 3. Generation dieser Rechner — die sog. Serie 200 mit den Modellen 9816/26/36 ist — z. T. noch k o m p a k t (9826/36) oder aber modular (9816/ 9920) aufgebaut. Als höhere Programmiersprachen stehen BASIC, H P L u n d PASCAL zur Verfügung. Allerdings darf das BASIC dieser Rechner nicht mit dem üblichen BASIC verglichen werden. Es bietet volle Unterstützung bei Matrixoperationen, bei Ein/Ausgaberoutinen, Bildschirmmasken usw. Hinzu k o m m t ein ausgezeichneter Editor, so daß fast alle syntaktischen Eingabefehler bei der Programmierung sofort und nicht erst beim Ablauf des Programms erkannt werden. Neuere Entwicklungen laufen einmal auf den Einsatz der „personal

Vollautomatische rechnergesteuerte Analysensysteme. I

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Computer" oder auf die Verwendung von Mikroprozessoren hinaus. Als Nachteil der personal Computer — die bei geringer Ausbaustufe etwa 25 bis 50%, bei höherer Ausbaustufe jedoch oftmals auch 120—150% eines Tischrechners kosten — seien hier nur die wesentlich schlechteren Programmierungsmöglichkeiten (diese bedingen längere Programmierzeiten u n d die Einsparungen bei Investitionen werden oftmals in wenigen Monaten durch Personalkosten aufgezehrt), die höhere Ausfallquote u n d die Beschränkung bei den Interface-Möglichkeiten angeführt. Diese Einschränkungen gelten weniger f ü r die Serie 80 von Hewlett-Packard (85/ 86/87), wenn eine entsprechende ROM-Bestückung zur Verfügung steht. Allerdings sind auch die Rechenzeiten länger. Jeder Analytiker sollte d a r a n interessiert sein, mit möglichst geringem Aufwand ein Optimum an Präzision u n d Reproduzierbarkeit mit dem angewandten Analysenverfahren zu erreichen. Dabei sollen Geräteaufwand und Zeitbedarf dem Problem angemessen sein. Einerseits soll ein Analysengerät so einfach wie möglich zu bedienen sein, aber andererseits wiederum möglichst flexibel den gestellten Anforderungen gerecht werden. Einmal erarbeitete Analysenvorschriften sollen im Routinebetrieb möglichst per Tastendruck a b r u f b a r sein, neue Analysenvorschriften aber sollen übersichtlich und durchschaubar erstellt werden können. Betrachtet man dieses Pflichtenheft eines Analysengerätes, so sind hier Forderungen aufgestellt, die praktisch nur noch ein rechnergesteuertes System vollbringen k a n n . Hierbei kommen auf der Rechnerseite vier Lösungen in Frage: Großrechner mit Anschlußmöglichkeit mehrerer Analysengeräte, Tischrechner, personal Computer oder Mikroprozessoren. Es ist meistens eine Art Weltanschauung, f ü r welches Rechnerkonzept man sich entscheidet. Nach unserer Auffassung überwiegen die Vorteile der leistungsfähigen Tischrechner. Vor allem wegen ihres Programmierkomforts eignen sie sich besonders zur Methodenentwicklung. Wichtiger als die Entscheidung über den Rechnertyp ist jedoch das von uns vertretene Konzept der echten Rechnersteuerung. Hierunter soll verstanden werden, daß der Rechner nach den ersten Meßwerten aktiv in das Analysengeschehen eingreift, das Analysensystem so steuert, daß nach Möglichkeit nur solche Daten aufgenommen werden, die optimal f ü r das betreffende Verfahren geeignet sind. Als wir uns im J a h r e 1972 zum ersten Male auf verschiedene Anregungen hin mit der Automatisierung und Steuerung von Analysengeräten mit programmierbaren Tischrechnern beschäftigten [1], wurde praktisch Neuland betreten. Damals beherrschten auch in der analytischen Chemie noch Großrechner u n d Rechenzentren die Datenverarbeitung. Aus der Entwicklungsgeschichte dieser Rechner heraus, die vor allem für kontinuierliche Analysenprozesse mit hohem Datenanfall (GC, NMR, F T - I R , MS, GC-MS) konzipiert waren, resultierte auch ihr wesentlichster Nachteil: sie verfügten zwar über sehr schnelle Input-Interfaces, waren jedoch für Steuerungsaufgaben nur bedingt einsetzbar. Hinzu kam, daß die Interfaces fast so viel kosteten wie ein Tischrechner. Hieran h a t sich bis heute übrigens nicht viel geändert. Mit dem Einsatz eines Tischrechners zur Steuerung eines Analysensystems ergibt sich jedoch auch ein ganz neues Konzept der Datenverarbeitung in der analytischen Chemie: Da der Rechner lediglich f ü r e i n Analysengerät eingesetzt wird, eröffnet sich die

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S. Ebel

Möglichkeit, statt reiner passiver Datenverarbeitung eine echte Steuerund Kontrollfunktion zu übernehmen. I m weiteren Verlauf dieser Übersicht sollen analytische Großgeräte (NMR, F T - I R , MS) bewußt ausgeklammert werden, d. h. es wird mehr auf die für Routineanalytik in der Qualitätskontrolle eingesetzten Analysenverfahren eingegangen.

2 Hardware I m Computer-Sprachgebrauch versteht man unter Hardware alle elektronischen Komponenten eines Rechners, wie den Rechner selbst, Einund Ausgabemedien (Tastatur, Bildschirm, Drucker, Plotter), Datenspeicher (Floppy-disk, Magnetplatte, Magnetband) und Interfaces zur Kommunikation zwischen dem Rechner und der angeschlossenen Peripherie. B e i rechnergesteuerten Analysensystemen kommen noch das eigentliche Analysengerät (Meßgerät) und auch die Probenzuführung hinzu. Unabhängig von der Methode besitzt ein vollständiger, rechnergesteuerter automatischer Meßplatz die in Abb. 1 aufgeführte Konfiguration.

Bedienungsplatz

Mefiplatz

Abb. 1. Prinzipieller Aufbau eines rechnergekoppelten/rechnergesteuerten Meßplatzes als Blockdiagramm]

2.1 Analysengeräte I m Prinzip läßt sich jedes Analysengerät an einen Rechner anschließen, doch kann der Aufwand zum Teil beträchtlich groß sein. So mußten anfangs z. B . Fotometer erst auf Schrittmotoren umgerüstet werden, um eine Steuerung durch einen Rechner zu ermöglichen. Heutzutage sind jedoch sehr viele Analysengeräte auf eine Rechnersteuerung oder zumindest auf eine nachträgliche Datenverarbeitung durch einen Rechner vorbereitet. Allerdings kann auch in diesen Fällen die Kopplung doch noch mit beachtlichen Schwierigkeiten verbunden sein. Prinzipiell kann man vier unterschiedliche Typen von Analysengeräten im Hinblick auf eine Rechneranpassung/Rechnersteuerung unterscheiden. I m einfachsten Fall arbeitet das Analysengerät aus dem Blickpunkt des

Vollautomatische rechnergesteuerte Analysensysteme. X

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Rechners als Blackbox (Abb. 2): es gibt lediglich einen unkontrollierten Datenverkehr vom Meßgerät zum Rechner (ausschließlich passive Datenübernahme). Als Beispiel seien hier sehr viele pH-Meter angeführt. In einem bestimmten zeitlichen Rhythmus stehen Meßwerte digital an, die dann vom Rechner übernommen werden können. Ein bestimmtes Steuersignal zeigt dabei an, wenn das Gerät zur Datenübergabe bereit ist. Nur während dieser Zeit ist eine Abfrage möglich. In den meisten Fällen verfügen diese Geräte über einen BCD-Ausgang, d. h. es ist zu beachten, ob für den vorgesehenen Rechner überhaupt ein BCD-Interface (vgl. Abschnitt 2.2.2) zur Verfügung steht. In Zusammenstellung mit z. B. einer rechnersteuerbaren Bürette lassen sich trotzdem leistungsfähige Meßplätze aufbauen (vgl. Abschnitt 3.1.1 und 3.1.2).

Abb. 2. Uni direktioneil angeschlossenes Analysengerät mit ausschließlich passiver Datenübernahme (z. B. pH-Meter mit BCD-Ausgang) Als ansteuerbare Meßgeräte sollen hier solche Analysengeräte bezeichnet werden, bei denen einfache Operationen, wie start/stop/reset, vom Rechner angesteuert werden können. Nach dem start-Befehl werden in vom Meßgerät definierten Abständen Meßwerte an den Rechner übergeben, bis der Übergabezyklus vom Rechner abgebrochen oder vom Meßgerät der stopBefehl gegeben oder generiert wird. Der reset-Befehl stellt schließlich den Ausgangszustand wieder her. Als Beispiel seien hier rechnergesteuerte Arbeitsplätze in der Polarographie angeführt (vgl. Abschnitt 3.3). Früher arbeiteten auch sehr viele UV- und IR-Spektrometer nach diesem Prinzip (Abb. 3) (vgl. Abschn. 5.1). Insgesamt handelt es sich um die einfachste Form eines in ein Labordatensystem integrierbaren Analysensystems. Eine Flexibilität ist nicht gegeben, da jede Methoden- oder Parameteränderung einen manuellen Eingriff voraussetzt.

Abb. 3. Integrierbares Analysensystem mit passiver Datenübernahme durch den Rechner und begrenzter Steuermöglichkeit (z. B. Polarograph) Als steuerbare Meßgeräte sollen hier solche Analysengeräte bezeichnet werden, bei denen vom übergeordneten Rechner alle für den Analysenablauf notwendigen Parameter gesetzt werden können. So würde dies z. B. bei einem IR-Spektrometer beinhalten, daß Start- und Endwellenzahl, Datenintervall (Daten/Wellenzahl), Spaltbreite, Zeitkonstante und Meßbereich in der abhängigen Variablen vom Rechner als Befehlssatz an das Meßgerät übergeben werden und von diesem geräteintern umgesetzt werden. Nach dem Startbefehl werden die gewünschten Daten an den

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S. Ebel

Rechner übergeben (vgl. Abschn. 5.2). Der Datenverkehr erfolgt bidirektionell: bei der Ansteuerung vom Rechner zum Analysengerät und während der Meßphase von Analysengerät zum Rechner. Steuerbare Meßgeräte enthalten fast stets selbst einen Mikroprozessor.

Abb. 4. Steuerbares Analysensystem mit bidirektionellem Datenverkehr (z. B . IR-Spektrometer) Als vollrechnersteuerbare Meßgeräte sollen hier solche Analysengeräte bezeichnet werden, bei denen vor jedem individuellen Meßwert alle Parameter neu gesetzt werden und anschließend vom Rechner eine oder mehrere Daten aktiv übernommen (d. h. vom. Rechner abgefragt) werden können. Dabei kann der Meßablauf im Analysengerät durchaus komplexer Natur sein. Als Beispiel sei hier ein Fotodiodenarray-Spektrometer in einem HPLC-Meßplatz angeführt (vgl. Abschn. 4.2). Das Blockdiagramm entspricht äußerlich dem in Abb. 4 dargestellten System. Darüber hinaus gibt es sshr viele Analysengeräte, die primär nicht über Ansteuerungsmöglichkeiten durch einen Rechner verfügen, aber trotzdem in einen automatischen, rechnerkontrollierten Meßplatz einbezogen werden sollen. I n diesem Falle ist der Bau eines speziellen Steuergerätes (Interface) (vgl. Abschn. 2.4) notwendig, das die Rechnerbefehle an das entsprechend adaptierte Analysengerät weitergibt.

2.2 Rechner Die Anzahl der für wissenschaftliche Zwecke einsetzbaren Rechner ist groß. Es kommen mit einigen Einschränkungen sog. personal Computer in Frage. Darüber hinaus reicht die Palette über komfortable Tischrechner bis zu den Minicomputern. Das Preis/Leistungsverhältnis ist sehr unterschiedlich und oftmals haben DM 1000.— Einsparung bei der Anschaffung des Grundsystems Folgelasten bei den Interfaces von mehreren tausend Mark und Programmiermehraufwand von 2 — 3 Mannmonaten nach sich gezogen. Vor der Beschaffung des Rechners sollte man ein genaues Pflichtenheft aufstellen und dieses als Grundlage für die Angebotserstellung verwenden. Will man selbst Entwicklungsarbeiten auf dem Gebiet rechnergesteuerter, vollautomatischer Analysensysteme betreiben, so sollte man folgende Rechnerkonfiguration zumindest als mögliche Ausbaustufe in Betracht ziehen: 1. Rechner mit höherer Programmiersprache (BASIC, F O R T R A N ; P A S C A L ist für mathematisch wissenschaftliche Probleme etwas schwieriger anwendbar). 2. Volle Unterstützung des Betriebssystems bei der Programmentwicklung (Fehlerkontrolle bei der Eingabe, nicht beim Abarbeiten des Programms!).

Vollautomatische rechnergesteuerte Analysensysteme. I 3. Volle Unterstützung des Betriebssystems gramme), wie z. B .

(oder nachgeladener

23 Pro-

3.1. Graphik auf dem Bildschirm und auf einem angeschlossenen Plotter 3.2. Matrizenbefehle für komplexere Berechnungen 3.3. Volle Unterstützung bei input/output-Befehlen (Interface-Software) 4. Speichergröße: nach L a d e n des Betriebssystems, der Programmiersprache und der unter 3. angeführten Ergänzungen sollten dem B e nutzer noch ca. 256 k B y t e Speicherplatz zur Verfügung stehen, die beliebig für D a t e n und P r o g r a m m genutzt werden können. 5. Zugriffsbreite: 32 bit, D a t e n b u s b r e i t e : 8 bit, Adressbus: 16 b i t (bei 8 b i t werden die Rechenzeiten oftmals problematisch); Fließkommagenauigkeit: 12 Stellen ( E x p o n e n t : ± 9 9 ) (bei weniger Stellen können immense numerische Probleme auftreten). 6. Hardware 6.1. T a s t a t u r m i t ausgelagertem Zehnerblock für numerische E i n g a b e und mit vom Benutzer definierbaren Punktionstasten 6.2. Bildschirm voll graphikfähig (also nicht m i t Pseudographik), Auflösung mindestens 500 X 250 P u n k t e 6.3. Floppy-disk Doppellaufwerk m i t mindestens 2 x 250 k B y t e Speichergröße (2 x 250 sind besser als 1 x 500, da D a t e n und Programme getrennt werden können) 6.4. Drucker, P l o t t e r und Massenspeicher müssen gleichzeitig anschließbar sein 6.5. Zur Gerätesteuerung müssen mindestens zwei weitere Schnittstellen ( R S 232 C) oder besser eine I E E E 488-Schnittstelle zur Verfügung stehen; die R S 232 C-Schnittstelle sollte per Software auf b a u d e - R a t e , paritycheck und Logik umstellbar sein, die I E C Schnittstelle sollte dem entsprechenden S t a n d a r d entsprechen (vgl. Abschn. 2.3). L e g t m a n dieses Pflichtenheft zugrunde, wird man merken, daß die Zahl der in B e t r a c h t kommenden R e c h n e r sehr schnell zusammenschrumpft. Allerdings h a t m a n j e t z t ein enorm leistungsfähiges Entwicklungssystem. Zur Realisierung eines definierten Meßplatzes k a n n m a n anschließend jedoch auf kleinere R e c h n e r m i t weniger K o m f o r t und auch geringerer Peripherie zurückgehen. Hierbei ist allerdings zu beachten, daß 8 bitR e c h n e r sich vor allem in der Rechengeschwindigkeit von 16 b i t - R e c h n e r n unterscheiden, was sich besonders bei Analysensystemen m i t höherem Datenanfall und nachfolgender Verarbeitung bemerkbar m a c h t . E i n e sehr informative Zusammenstellung m i t technischen D a t e n über die interne S t r u k t u r und der möglichen Peripherie wurde von E b e r t und Ederer [2] für wichtige Labor-Computer (allerdings fehlt der wohl verbreitetste R e c h n e r Apple) gegeben. F ü r rechnergesteuerte Analysensysteme sind die heute angebotenen Büro-Computer (Macintosh, H P Serie 100) praktisch k a u m verwendbar.

24

S. Ebel

2.3 Schnittstellen Unter einem Interface versteht man allgemein eine elektronische Schaltung, die es ermöglicht, zwei Geräte miteinander zu verbinden. Das Interface endet in einer Schnittstelle. Zwei Schnittstellen können mit einem mehradrigen Kabel miteinander verbunden werden, wenn sie entsprechend genormt, also untereinander kompatibel, sind. Den allgemeinen Aufbau eines rechnergesteuerten Analysensystems zeigt Abb. 5. I n diesem Abschnitt sollen zunächst die Schnittstellen besprochen werden. Auf Interfaces zum Analysengerät wird in Abschnitt 2.4 eingegangen. Die Interfaces zwischen dem internen Datenbus des Rechners mit der Schnittstelle nach außen wird hier nicht näher erläutert. An den Schnittstellen vom und zum Rechner stehen prinzipiell digitale Daten an. Diese existieren in zwei elektrischen Zuständen, die zwei logischen Zuständen entsprechen: logisch 1 oder „high" A + 5 V und logisch 0 oder „low" OV (bei negativer Logik 0 V und — 5V). Diese Unterscheidung stellt die kleinstmögliche Information dar und wird als bit

Drucker

Plotter Datenspeicher usw.

Abb. 5. Prinzipieller Aufbau eines rechnergesteuerten Analysensystems im Hinblick auf die elektronischen Hauptkomponenten

Vollautomatische rechnergesteuerte Analysensysteme. I

25

bezeichnet. Eine Menge von 8 bit wird als Byte bezeichnet. Soll nun z. B. 1 Byte übertragen werden, so können die 8 zugehörigen bit parallel an der Schnittstelle anstehen oder aber vom Interface nacheinander in einem definierten Zeittakt an die Schnittstelle weitergeleitet werden. Man unterscheidet demzufolge parallele und serielle Schnittstellen. In diesem Zusammenhang sollen hier nur folgende, für die Steuerung von Analysensystemen wichtige Schnittstellen besprochen werden: Parallel-Schnittsteile, RS 232 C (V 24)- und I E E E 488-Bus-Schnittstelle. Bei allen Schnittstellen kommen zu den eigentlichen Datenleitungen noch Kontrolleitungen hinzu. 2.3.1

GP

I[0-Schnittstelle

Bei den parallelen Schnittstellen hat jedes bit eine eigene Datenleitung. Dabei muß zwischen den Leitungen zum Rechner (output am Analysengerät, input am Rechner) und zum Analysengerät (input am Analysengerät und Output am Rechner) unterschieden werden. Bei der Zuordnung input/output wird im weiteren Verlauf grundsätzlich vom Rechner ausgegangen. Die Übertragung erfolgt asynchron, die notwendige Synchronisation wird durch zwei zusätzliche Kontrolleitungen (handshake) erreicht. Mit der Leitung S T R O B E teilt das übergeordnete Gerät (Rechner oder Controller) einem angeschlossenen anderen Gerät mit, daß Daten bereitstehen oder empfangen werden können. Mit der Leitung R E A D Y meldet das Peripheriegerät dem Rechner, daß es die Daten empfangen hat. Die zeitliche Abfolge der Signale für ein einfaches output-Interface geht aus Abb. 6 hervor.

DATA STROBE

X ^

READY

Abb. 6. Prinzipieller zeitlicher Ablauf der Datenübertragung an einer Parallel-Schnittstelle. Zur nächsten Datenübertragung muß der Ausgangszustand (links im Diagramm) wiederhergestellt sein Insgesamt können die Kontrollvorgänge an einem Parallel-Interface noch komplexer sein. So besitzt das universell anwendbare 16 bit ParallelInterface (general purpose Interface HP 98032 A) die in Abb. 7 wiedergegebene Schnittstellen-Konfiguration. Die STATUS-Leitung zeigt grundsätzliche Betriebsbereitschaft an. Hieran erkennt das Interface, ob das Peripheriegerät überhaupt vorhanden und eingeschaltet ist. Die Kontrollleitung I/O legt den Datenfluß fest. Das Peripheriegerät erkennt hieran, ob der Rechner Daten übergeben oder übernehmen will. Der Datenbus umfaßt in beiden Richtungen je 16 bit (Festlegung vom Rechner durch die Kontrolleitung I/O). Beim output setzt der Rechner die Daten am Datenbus; wenn dies beendet ist, wird die STROBE-Leitung gesetzt. Die FLAG-

28

S. Ebel STROBE>

I/O FLAG Rechner

Interface

Schnittstelle

STATUS

C

Peripheriegerät

DATA

Abb. 7. Kontrolleitungen der H P 98032 A-Schnittstelle

Leitung dient nun dazu, dem Rechner anzuzeigen, wenn das Peripheriegerät die D a t e n vollständig abgearbeitet h a t und bereit ist, neue zu übernehmen. B e i den Parallel-Interfaces der Serie H P 85/86/87 sind die Verhältnisse noch komplexer. Hier sind 16 bit ausschließlich Output, weitere 16 b i t können beliebig verwendet werden, wobei verschiedene Kombinationsmöglichkeiten bestehen. 2.3.2

BS 232 C

(V24)-Schnittstelle

B e i der BCD-Schnittstelle handelt es sich ebenfalls um eine Schnittstelle für parallele Datenübertragung, jedoch liegen die D a t e n nicht binär vor (die Zahl 173 würde binär dargestellt 10101101 ergeben), sondern jede Dezimalstelle wird gesondert binär kodiert (binary coded decimals) (die Zahl 173 wird dargestellt als 0001 O l l i 0011). Man sieht sofort, daß die Anzahl der Leitungen, die zur Übertragung der maximal darstellbaren Zahl notwendig ist, bei einer BCD-Schnittstelle größer ist als bei einer binär kodierten Parallel-Schnittstelle. Hinzu kommen noch Leitungen für Dezimalpunkt, Vorzeichen und Uberlauf. BCD-Schnittstellen sind aufwendig und demzufolge auch teuer. Sie werden heute möglichst selten eingesetzt und sind auch nur für wenige R e c h n e r erhältlich. 2.3.3

BCD-Schnittstelle

B e i dieser bereits 1969 von der Electronic Industries Association festgelegten Schnittstelle R S 232 C (internationale Bezeichnung C C I T T . V 2 4 ) handelt es sich um eine Schnittstelle für eine serielle Datenübertragung, d. h. jedes b i t eines B y t e wird einzeln übertragen. F ü r eine einwandfreie Verständigung zwischen Sender und E m p f ä n g e r ist es notwendig, daß der E m p f ä n g e r weiß, wann ein Zeichen in seiner bit-Folge gesendet wird. Hierzu bedarf es einerseits einer bit-Synchronisation — der E m p f ä n g e r muß wissen, wann ein b i t auf der Leitung ansteht — und andererseits einer Byte-Synchronisation (dem E m p f ä n g e r muß b e k a n n t sein, welche Gruppe von b i t s e i n B y t e darstellen soll). Die bit-Synchronisation erreicht m a n dadurch, daß Sender und E m p f ä n g e r mit der gleichen Geschwindigkeit bits senden und empfangen. Diese Geschwindigkeit wird in bit/sec ausgedrückt. Gebräuchlich sind definierte W e r t e zwischen 110 und 9 6 0 0 bit/sec. Meist spricht m a n anstelle von bit/sec von baud. B e i der im hier b e t r a c h t e t e n F a l l der Steuerung und Datenübernahme von Analysengeräten wird fast ausschließlich die sog. asynchrone Datenübertragung angewendet. Die Anzahl der D a t e n - b i t s pro Zeichen muß festgelegt sein

Vollautomatische rechnergesteuerte Analysensysteme. I Störtbit

Datenbl,s

27

Stop bits

8. Datenbit oder Paritatsbit START + 12 V -12V

5 bis 7 Dotenbits

STOP

START

r

logisch 0 logisch 1

" L

b Abb. 8. Bit-Folge bei asynchroner D a t e n ü b e r t r a g u n g einer seriellen Schnittstelle

u n d jedes Zeichen m u ß d u r c h ein S t a r t - b i t u n d ein Stop-bit (manchmal auch 1.5 oder 2 Stop-bits) e i n g e r a h m t sein (vgl. Abb. 8). Zur Ü b e r p r ü f u n g der Ü b e r t r a g u n g auf Ü b e r t r a g u n g s f e h l e r k a n n ein sog. p a r i t y - b i t mitgesendet werden. Der Sender zählt alle auf logisch 1 gesetzten bits. I s t die Zahl ungerade, so setzt er bei gerader P a r i t ä t (even p a r i t y ) das Parität's-bit ebenfalls auf 1. D a m i t wird immer eine gerade Zahl v o n bits ü b e r m i t t e l t . E n t s p r e c h e n d besitzt bei u n g e r a d e r Zahl ( o d d p a r i t y ) in diesem Fall das p a r i t y - b i t den logischen Z u s t a n d 0. E i n Ü b e r t r a g u n g s f e h l e r k a n n somit e r k a n n t werden, da jedes ü b e r m i t t e l t e Zeichen i m m e r eine gerade (bzw. eine ungerade) Anzahl v o n Einzel-bits besitzen m u ß . T r e t e n in einem B y t e zwei Fehler auf, so w e r d e n diese n a t ü r l i c h nicht erkannt. G e n o r m t sind bei der R S 232 C-Schnittstelle a u c h der Stecker u n d die Steckerbelegung. Doch wird diese N o r m n i c h t immer k o r r e k t eingehalten. E s gelingt jedoch immer, d u r c h Zwischenstecker oder d u r c h U m l ö t e n den richtigen Z u s t a n d herzustellen, wenn die nötigen Werkzeuge u n d Meßgeräte v o r h a n d e n sind. D a r ü b e r h i n a u s müssen n a t ü r l i c h die Zahl der D a t e n - b i t s , der Stop-bits, die P a r i t ä t u n d die Geschwindigkeit in bit/sec bei Sender u n d E m p f ä n g e r ü b e r e i n s t i m m e n . Die I n t e r f a c e der H P - R e c h n e r sind so a u f g e b a u t , d a ß alle diese P a r a m e t e r s o f t w a r e m ä ß i g d u r c h das P r o g r a m m in d e m angeschlossenen I n t e r f a c e g e ä n d e r t werden k ö n n e n . Bei der R S 431-Schnittstelle w e r d e n zwei L e i t u n g e n f ü r die D a t e n ü b e r m i t t l u n g eingesetzt u n d die Differenz dieser beiden Spannungspegel zur Signalkodierung v e r w e n d e t . Der Vorteil b e s t e h t in der geringen Störanfälligkeit, da v o n a u ß e n eingestrahlte S t ö r u n g e n sich auf beiden Leit u n g e n gleichsinnig auswirken. I n s g e s a m t ist eine höhere Ü b e r t r a g u n g s geschwindigkeit (106 bit/sec; bei R S 232 C: 2 • 104 bit/sec) bei größeren Ü b e r t r a g u n g s l ä n g e n ( > 150 m ; bei R S 232 C: s í 30 m) möglich. S t r e b t m a n noch längere Ü b e r t r a g u n g s w e g e an, so v e r w e n d e t m a n sog.

28

S. Ebel

Modems (ikfodulator/Z)emodulator). Dabei wird das digitale Signal einem analogen Signal aufmoduliert. Hierfür bieten sich die Frequenz-, Amplituden- oder Phasen-Modulation an. Als Träger kommen Telefonleitungen oder Radiowellen in Frage. Durch Zwischenschaltung von Satelliten ist praktisch eine überkontinentale Datenübertragung möglich. 2.3.4 IEEE

488-(IEC-Bus)-Schnittstelle

Bei dieser Schnittstelle handelt es sich um eine spezielle Kombination beider Formen der Datenübertragung. Die bits werden dabei parallel, die einzelnen Bytes jedoch seriell übermittelt. Der wesentliche Unterschied ist jedoch, daß alle Peripheriegeräte parallel an einem einzigen Datenbus angeschlossen sind (Bus-Interface, Bus-Schnittstelle). Alle Geräte werden von einem Controller über Adressen gesteuert (es kann folglich immer nur einen Controller geben). Die Geräte können dabei als „talker" (sendet Daten) oder als „listener" (empfängt Daten) arbeiten. In diesem System kann immer nur ein Gerät Daten senden, aber mehrere dieser Daten empfangen.

Tabelle 1. Steuerleitungen und hand-shake-Leitungen der I E E E 488 (IEC)Bus-Schnittstelle ATN

attention

H : Daten L : Kontroll- oder Adress-Information auf den 8 Datenleitungen

IFV

interface clear

L : (100 [xs): reset für alle BusBausteine

SRQ

service request

Peripherie hält L, falls Service gewünscht

EOI

end or identify

L : zeigt das Ende eines übergebenen strings an (nur wenn ATN H)

REN

remote enable

Umschaltung intern/extern

NRFD

not ready for data

H : alle listener ready L : mindestens ein listener not ready

NDAC

not data accepted

H : alle listener haben Daten empfangen L : mindestens ein listener hat die Daten nicht empfangen

DAV

data valid

H : Daten sind noch nicht gültig L : Daten sind gültig (okay)

Zur Datenübertragung sind somit zunächst einmal für die 8 bits eines Bytes 8 Datenleitungen notwendig. Hinzu kommen 5 Steuerleitungen (single line messages), die den Datenverkehr der Geräte sowie die Steuerung der Peripheriegeräte bewirken. Drei weitere sog. hand-shake-

Vollautomatische rechnergesteuerte Analysensysteme. I

29

L e i t u n g e n synchronisieren u n d kontrollieren die übergebenen oder zu ü b e r g e b e n d e n L e i t u n g e n . Von allen Schnittstellen ist die I E E E 488 (IEC)-Schnittstelle die universellste, aber a u c h die aufwendigste. Leider f i n d e t m a n deshalb öfters „ a b g e m a g e r t e " Versionen, die auf d e n ersten Blick billiger erscheinen, doch h a t sieh beim Wechsel des Rechners oder beim Anschluß weiterer Geräte herausgestellt, d a ß eine nachträgliche Anpassung u n d A u f r ü s t u n g wesentlich teurer würde. Diese Tabelle zeigt a u f , wie k o m p l e x der D a t e n v e r k e h r sein k a n n . T r o t z d e m ist es problemlos möglich, m i t d e n H P - R e c h n e r n der Serie 200 ü b e r d e n I E C - B u s D a t e n r a t e n v o n 55 kBytes/s, bei f a s t h a n d - s h a k e 130 k B y t e s / s u n d u n t e r V e r w e n d u n g der direct m e m o r y address-hardware 350 k B y t e s / s im i n p u t zu erreichen ( o u t p u t : 75, 120, 290 kBytes/s). 2.3.5

Schnittstellenwandler

N i c h t immer besitzen R e c h n e r u n d Analysengerät gleiche Schnittstellen. Hier k a n n die Zwischenschaltung eines Schnittstellenwandlers v o n Interesse sein. Dies ist vor allem d a n n der einzige Weg, w e n n das Peripheriegerät lediglich über eine BCD-Schnittstelle v e r f ü g t , aber diese f ü r d e n verw e n d e t e n R e c h n e r n i c h t erhältlich ist. Von noch größerem Interesse ist jedoch die W a n d l u n g auf eine I E E E 488 (IEC-Bus)-Schnittstelle, d a d a n n der R e c h n e r n u r ü b e r ein einziges I n t e r f a c e v e r f ü g e n m u ß , a n dessen Schnittstelle d a n n alle Peripheriegeräte parallel angeschlossen werden können. Die W a n d l u n g B C D -s- Parallel-Schnittstelle ist s o f t w a r e m ä ß i g zu erreichen. Alle L e i t u n g e n werden d i r e k t v e r b u n d e n u n d d a n n im R e c h n e r die falsch ü b e r t r a g e n e Zahl wieder in die richtige Zahl u m g e r e c h n e t . So darf d a n n die b i n ä r e Darstellung 000101110011 n i c h t als 378, sondern m u ß ü b e r die Zerlegung 0001, O l l i , 0011 als 173 i n t e r p r e t i e r t werden. Bei einem 3 1 /2 s telligen pH-Meter (maximale Anzeige 1999) w e r d e n d a n n 13 b i t (ohne D e z i m a l p u n k t , Überlauf, Vorzeichen o. ä.) benötigt. Die W a n d l u n g R S 232 C I E E E 488 (IEC-Bus)-Schnittstelle m u ß h a r d w a r e m ä ß i g erfolgen. E s m u ß also quasi ein I n t e r f a c e g e b a u t werden, das auf einer Seite eine R S 232 C- u n d auf der a n d e r e n Seite eine I E E E 488-Schnittstelle besitzt. Solche Schnittstellenwandler sind als fertige P l a t i n e n zu beziehen, wesentliche Bauteile werden auch als integrierte Schaltung angeboten.

2.4 Interfaces-Steuergeräte I n n e r h a l b des Zusammenspiels A n a l y s e n g e r ä t / R e c h n e r / P e r i p h e r i e spielen a n allen e n t s p r e c h e n d e n Schnittstellen I n t e r f a c e s zur gegenseitigen Anpassung eine b e d e u t e n d e Rolle. I n diesem Z u s a m m e n h a n g soll aber lediglich auf I n t e r f a c e s zwischen A n a l y s e n g e r ä t u n d der Eingabe- bzw. Ausgabe-Schnittstelle des Rechners eingegangen werden, d a in m a n c h e n Fällen der B a u oder Kauf eines solchen I n t e r f a c e s n o t w e n d i g sein k a n n . 2.4.1 AI D-Wandler Analog/Digitalwandler (ADO) setzen analoge Signale, wie z. B. die Ausg a n g s s p a n n u n g eines Meßgerätes, in b i n ä r codierte Signale u m , die der nachgeschaltete R e c h n e r über eine Parallel-Schnittstelle (vgl. Abschn.

S. Ebel

30

2.3.1) übernehmen und dann entsprechend weiterverarbeiten kann. Hauptkriterium für diese Wandler sind die Auflösung in bit und die zu einer Wandlung notwendige Zeit. In der folgenden Tabelle ist die Auflösung in bit der erreichbaren Genauigkeit der Wandlung gegenübergestellt, wobei ein Quantisierungsfehler von 1 bit angenommen wurde. Typisch sind Quantisierungsfehler von ± 0 , 5 bit, doch kommen noch andere Bauteile-Toleranzen hinzu. Um einen für den Analytiker anschaulichen Vergleich anzubringen, ist eine weitere Tabelle angeführt, die Genauigkeiten analytischer Operationen und Geräte ebenfalls im Meßsystem bit enthält. Tabelle 2. Auflösung und Genauigkeit bei ± 1 bit Quantisierungsfehler und Vollausschlag von A/D-Wandlern Auflösung

Genauigkeit

bit

relativ

8 10 12 14 16

0.003 906 0.0009766 0.00024414 0.000061035 0.0000152588

0,8% 0,2% 0,05% 0,012% 0,003%

Tabelle 3. Auflösung und Genauigkeit analytischer Geräte Gerät

Bereich

Fehler %

Auflösung bit

Waage Pipette

400 ± 0,01 mg 5 ± 0,01 ml 50 ± 0,035 ml 10 ± 0.08 ml 20 ± 0,004 ml 10 ± 0,008 ml 100 ± 0,05 ml 14,00 ± 0,01 999,999 ± 1 2,000 ± 0,001 200 ± 0 , 2 mm

0,0025 0,2 0,07 0,4 0,02 0,08 0,05 0,07 0,0001 0,05 0,1

15 8 10 8 12 10 11 10 20 11 10

Bürette Kolbenbürette Meßkolben pH-Meter Digitalvoltmeter UV-Fotometer Schreiber

Zu beachten ist, daß beim Arbeiten bei 10% des Arbeitsbereiches des A/D-Wandlers (z. B. 100 mV bei einem lV-Gesamtbereich) der Fehler verzehnfacht wird, also bei einem 8 bit-Wandler bei ca. 8% liegt! Man erkennt deutlich, daß für fast alle analytischen Zwecke ein 12 bit A/D-Wandler ausreichend, ein 14 bit A/D-Wandler jedoch empfehlenswert ist, da der Arbeitsbereich durch Nullpunktsversatz des Meßgerätes oder Blindwerte größer sein kann. Verwendet man jedoch lediglich 8 bitWandler, wird sehr viel analytische Information vernichtet. Lediglich in der Gaschromatographie werden wegen des größeren dynamischen Be-

Vollautomatische rechnergesteuerte Analysensysteme. I

31

reiches mindestens 16 b i t A / D - W a n d l e r n o t w e n d i g . T r o t z d e m wird o f t m a l s eine a u t o m a t i s c h e Bereichsumschaltung n o t w e n d i g sein, u m den dynamischen Bereich des Detektors voll n u t z e n zu können. 2.4.2

Steuergeräte

U n t e r d e m Begriff S t e u e r g e r ä t soll im Z u s a m m e n h a n g m i t d e m T h e m a rechnergesteuerte Analysensysteme ein I n t e r f a c e v e r s t a n d e n werden, das bei n i c h t mikroprozessorgesteuerten Analysengeräten die Rechnerbefehle a u f n i m m t u n d d a m i t den eigentlichen Meßplatz s t e u e r t . Solche Steuerg e r ä t e sind vor allem bei älteren Analysengeräten notwendig, die a u f g r u n d ihrer Leistungsfähigkeit a u t o m a t i s i e r t werden sollen (z. B. Zeiss DC-Fotometer), oder wenn n u r einfache Steueroperationen notwendig sind (z. B. Polarographie). I m weiteren Verlauf wird d a v o n ausgegangen, d a ß eine parallele o u t p u t - S c h n i t t s t e l l e (vgl. A b s c h n i t t 2.3.1) a m R e c h n e r zur Verf ü g u n g s t e h t . Zur V e r w e n d u n g a n einer I E E E (IEC-Bus)-Schnittstelle ist ein entsprechender Schnittstellenwandler erforderlich. 2.4.2.1

Decoder

Als eindeutige Steuerbefehle w ü r d e n sich diejenigen Zeichen eignen, die jeweils n u r eine der Ausgangsleitungen der Schnittstelle aktivieren. Diese Lösung, so einfach sie a u c h scheinen mag, ist aber ä u ß e r s t unbefriedigend, da die o u t p u t - K a p a z i t ä t des Rechners d a d u r c h keineswegs a u s g e n u t z t wird. A u ß e r d e m ergeben sich Schwierigkeiten d u r c h die K o m m a n d o s CR (carriage r e t u r n ) u n d L F (line feed), die v o n vielen R e c h n e r n a m E n d e eines j e d e n o u t p u t - B e f e h l e s zusätzlich ausgegeben werden u n d d a m i t zu F e h l i n t e r p r e t a t i o n e n f ü h r e n . Eleganter ist die Decodierung des ASCIICodes oder aber die dezimale Decodierung v o n 4 bit. Hierzu eignet sich z. B. der BCD-Dezimal-Decoder SN 7442. F e h l i n t e r p r e t a t i o n e n d u r c h CR u n d L F sind n i c h t möglich, d a dieser B a u s t e i n die entsprechenden Äquivalente 10 u n d 13 n i c h t k e n n t . Dieser Decoder a r b e i t e t m i t negativer Logik. A r b e i t e t der R e c h n e r m i t negativer Logik, so müssen die Schnittstellenpegel invertiert werden. Dies geschieht z. B. mittels eines inte-

+ 5V 8,2 k£2

7404 Abb. 9. Prinzipschaltbildeines (10 aus 4)-Decoders (BCD/Dezimaldecoder) mit Invertierung des Rechnersignals

S. Ebel

32

grierten Bausteines SN 7404. A m BCD/Decimal-Decoder stehen n u n 10 Ausgänge Qg bis Q 9 zur Verfügung, die beliebige F u n k t i o n e n erfüllen können. 2.4.2.2

Impuls-Steuerung

Bei vielen Analysengeräten g e n ü g t oftmals, d a ß v o m Rechner ein S t a r t Stop- u n d Reset-Signal ausgegeben wird, u m d e n ganzen Meßvorgang a n l a u f e n zu lassen u n d nötigenfalls das Analysengerät wieder auf den A n f a n g s z u s t a n d zurückzusetzen. I n diesem Z u s a m m e n h a n g wären automatische Probenwechsler oder a u c h komplexe Analysengeräte, die Polarog r a p h e n , zu n e n n e n . D a das Rechnersignal im allgemeinen zu kurz ist, m u ß es e n t s p r e c h e n d v e r l ä n g e r t werden (Abb. 10 A) oder aber es wird ein start- u n d ein stop-Signal zur S t e u e r u n g v e r w e n d e t (Abb. 10 B). E n t weder m a n v e r w e n d e t das auf diesem Wege gewonnene Signal d i r e k t bzw. nach I n v e r t i e r u n g oder m a n schaltet das Gerät über ein entsprechendes Relais.

$8Qi.

Abb. 10. Impulsformung eines Rechnersignals. A : bistabil; B : bistabil. Qj, Qj: Rechnersignale nach Decodierung. S A , Sp: Steuersignale für d a s Analysengerät

2.4.2.3

Schrittmotor-Steuerung

Einige Analysengeräte setzen voraus, d a ß bei einer R e c h n e r s t e u e r u n g b e s t i m m t e mechanische Teile in definierter Weise bewegt werden (z. B. H ä h n e , Kreuztische eines DC-Meßplatzes, Monochromator). Hierzu verw e n d e t m a n zumeist S c h r i t t m o t o r e n , die eine g e n a u definierte Auflösung v o n z. B. 48 oder 50 S c h r i t t e / U m d r e h u n g besitzen. Zur Ansteuerung wird die D r e h r i c h t u n g vorgegeben u n d über einen T a k t i m p u l s der Schritt in der vorgewählten R i c h t u n g a u s g e f ü h r t . Zur S t e u e r u n g werden somit 3 b i t benötigt. E i n e k o m p l e t t e S c h a l t u n g ist in A b b . 11 dargestellt. Diese u m f a ß t einmal die U m s c h a l t u n g R e c h n e r / m a n u e l l u n d die zusätzliche B e n u t z u n g einer Positioniertaste. Die gesamte Motorsteuerung wird dabei von dem Valvo-Baustein SAA 1027 ü b e r n o m m e n . Zur A n p a s s u n g a n die Logik dieses Bausteins ist f ü r d e n T a k t e i n g a n g ein Transistor zwischengeschaltet. Die Ausgänge Q 2 u n d Q 3 des Decoders sprechen ein TransistorFlip-Flop an, das über d e n D r e h r i c h t u n g s e i n g a n g des SAA 1027 die Drehr i c h t u n g des Motors b e s t i m m t . S t e h t der Betriebsartenschalter auf „ m a n u e l l " , wird eine v o n einem Generator-IC L 8083 erzeugte RechteckF r e q u e n z über eine der beiden D r u c k t a s t e n Dr 1 oder Dr 2 d e m T a k t eingang zugeführt, wobei D r 2 die D r e h r i c h t u n g b e s t i m m t . Die F r e q u e n z

Vollautomatische rechnergesteuerte Analysensysteme. I

33

des Rechtecksignals ist einstellbar, so daß z. B. der Kreuztisch eines DCPotometers auf diese Weise sehr genau positioniert werden kann. Über die Ausgänge Q 4 — Q6 u n d Q 7 —Q9 lassen sich ein 2. und 3. Schrittmotor ebenso ansteuern.

Abb. 11. Prinzipschaltbild einer rechner- und manuell-kontrollierten Schrittmotorsteuerung [6]

2.5 Rechnerverbundsysteme Großrechner mit einer Anzahl angeschlossener Analysensysteme oder aber Labordatensysteme mit ähnlichen Aufgaben sind f ü r eine Reihe von Analysenverfahren — vor allem sind hier die GC sowie H P L C anzuführen — Stand der Technik. Ganz anders ist die derzeitige Lage anzusehen, wenn es darum geht, unterschiedlichste Analysenverfahren, wie Titration, Spektroskopie u n d Chromatographie in einem einzigen Datenverbund einzubinden. Betrachtet m a n jedoch das Konzept einer echten Rechnersteuerung mit real time Datenerfassung, Verarbeitung u n d der Konsequenz,

34

S. Ebel

den nächsten Einzelschritt im laufenden Analysenverfahren ausführen zu lassen, kann man ermessen, daß ein Großrechnersystem eine Reihe von Nachteilen aufweisen müßte. Abgesehen von Interface-Technik, Prioritätenliste und Programmierung spricht jedoch vor allem die Betriebssicherheit gegen eine Realisierung eines solchen analytischen Labors. Demgegenüber eignen sich komfortable Tischrechner fast ohne Nachteile, weniger aber einfache personal Computer für eine solche Aufgabe. I n Abb. 12 ist ein solches Tischrechner-Verbundsystem dargestellt [3], [4]. Das gesamte System ist vor allem auf höchste Betriebssicherheit hin konzipiert. So sind dem Zentralrechner (HP 9845 mit 500 k B y t e freiem Benutzerspeicher) zwei identische Ausgabemedien und jeweils zwei identische Speichermedien für aktuelle Programme und aktuelle Daten zugeordnet. Der Massenspeicher dient der Speicherung der Daten auf längere Zeit. Das Zentralprogramm übernimmt alle Arbeiten zur Analysenverwaltung. So sind für jedes Produkt alle notwendigen Analysenmethoden und alle Sollwerte gespeichert. Bei Eingang einer Probe werden demzufolge für jedes anzuwendende Analysenverfahren die notwendigen Angaben und Daten dem methodenorientierten Rechner übermittelt. Gleichzeitig wird ein Protokoll erstellt, welche Probe mit welchem Analysenverfahren untersucht werden muß. Umgekehrt werden alle Ergebnisse von den Subrechnern nach Ausführung an den Zentralrechner übergeben, so daß das fertige Analysenprotokoll mit weiteren Vermerken (wie z. B . Freigabevermerk) erstellt werden kann. Fällt dieser Zentralrechner aus, so übernimmt einer der Analysenrechner mit einem Notprogramm diese

Abb. 12. Tischrechner-Verbundsystem im Routineeinsatz eines Labors zur Qualitätskontrolle [3, 4]

Vollautomatische rechnergesteuerte Analysensysteme. I

35

Aufgabe. Lediglich aufwendigere statistische Rechnungen sind dann nicht durchführbar. Alle Analysenrechner sind untereinander identisch (HP 9835 mit 64 bzw. 126 kByte freiem Benutzerspeicher) und somit bei Ausfall eines Rechners beliebig tauschbar. Bs fällt folglich nur das Analysenverfahren aus, das im Moment den geringsten Arbeitsanfall aufweist. Jedes Analysensystem ist als rechnergesteuertes System völlig autark und kann jederzeit auch losgelöst vom Rechnerverbund betrieben werden. Im methodenzugeordneten Rechner (Subrechner) sind unter der Methoden-Nummer alle notwendigen Analysenparameter (Einwaage und Einwaagetoleranz, Einfach- oder Doppelbestimmung, Meßbereich, Blindwert, alle für die Gehaltsberechnung notwendigen Faktoren usw.) gespeichert. Nach Ausführung der Analyse werden alle wichtigen Informationen (Einwaage, Verbrauch an Maßlösung, Absorption, Peakfläche usw.) sowie der Gehalt der Probe auf dem methoden-orientierten Datenspeicher eingetragen. Kennt der Zentralrechner schließlich alle erforderlichen Analysenergebnisse, so wird das produktspezifische Analysenprotokoll erstellt, das je nach Verwendungszweck weitere Angaben enthält, wie z. B . Formulierungsvorschriften im Falle, daß ein Rohprodukt weiterverarbeitet wird, Freigabevermerk bei Produktkontrolle, Sperrvermerke bei der Analyse von Wareneingängen. Der Datenverkehr der Rechner untereinander kann entweder über den HP-IB-Bus erfolgen oder aber einfach durch den Austausch von Kassetten. Bei Verteilung der Proben durch die zentrale Analysenverwaltung werden den Proben einfach die Kassetten mit den notwendigen Daten an die verschiedenen Analysenstationen mitgegeben. Das hier angeführte System, das noch mit Tischrechnern der 2. Generation verifiziert wurde, läuft in einem Großbetrieb seit mehr als drei Jahren praktisch ohne Ausfallzeiten und beweist damit die Leistungsfähigkeit dieses Konzeptes. Heute würde man Rechner der Serie 200 (HP 9816) und an weniger frequentierten Meßplätzen auch Rechner der Serie HP 85/ 86/87 einsetzen und somit bei praktisch gleicher Leistungsfähigkeit den Preis der Hardware niedriger halten. Selbstverständlich gibt es auch andere Konzepte hierarchischer Rechnersysteme. Hier sind vor allem Konzepte mit Großrechnern und Satellitenrechnern der oberen Preisklasse zu nennen [5], Vor allem, wenn Großgeräte einbezogen werden sollen, ist dies die einzige Möglichkeit. Hingewiesen werden soll aber auch auf die Labordatensysteme LIMS (Perkin-Elmer), PALM (Philips) und LABSAM (Hewlett-Packard), die jedoch alle nicht in der Lage sind, die für die Routine in der Qualitätskontrolle so wichtigen Verfahren wie Titration, DC/HPTLC, einfache TJVSpektrometer, oder im einfachsten Fall auch nur Waagen, einzubeziehen.

Dank Für die Lösung der vielen Probleme beim Anschluß von Analysengeräten an Rechner danke ich besonders den Herren Dr. Hocke (Marburg) und Dr. Reyer sowie Herrn W. Wuthe. Insoweit eigene Arbeiten angesprochen und erwähnt wurden, danke ich der Deutschen Forschungsgemeinschaft

36

S. Ebel

f ü r großzügige Gewährung von Sach- u n d Personalmitteln, dem Fonds der Chemischen Industrie für Sachmittel, ganz besonders aber der chemischen Industrie f ü r vertrauensvolle Zusammenarbeit.

Literatur 1. 2. 3. 4.

S. Ebel: Fresenius Z. Anal. Chem. 262, 349 (1972) K. Ebert und H . Ederer: Nachr. Chem. Techn. 32 (2), S. 1 (1984) E. Weidemann: Dissertation Marburg 1983 S. Ebel, J . Hocke, B. Reyer, V. Walter und E. Weidemann: Fresenius Z. Anal. Chem. 84, 441 (1982) 5. E. Ziegler: Computer in der Chemie; Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, Tokyo 1985 6. J . Hocke: Dissertation Marburg 1976

Korrelationsfunktionen in der Analytik Prof. Dr. K . Doerffel, Dipl.-Chem. A. Wundrack Technische Hochschule „Carl Schorlemmer" Leuna-Merseburg DDR-4200 Merseburg

Einleitung

37

1 Theoretische Grundlagen 1.1 Autokorrelationsfunktion 1.2 Kreuzkorrelationsfunktion 1.3 Berechnung von Korrelationsfunktionen

38 39 41 42

2 Anwendungen 2.1 Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnisses 2.1.1 Charakterisierung von Rauschprozessen 2.1.2 Nachweis von Signalen durch spezielle Auswertungsmethoden 2.2 Verbesserung der analytischen Auflösung 2.3 Dynamisches Verhalten analytischer Systeme 2.3.1 Verbesserung des SRV (Korrelationschromatographie) . 2.3.2 Verbesserung der zeitlichen Auflösung (Fluorimetrie) . . 2.3.3 Verbesserung der räumlichen Auflösung (Photoakustische Spektroskopie)

44 44 44

2.4 Optimale Probenfrequenz — Prozeßanalytik

Literatur

56 58

3 Zusammenfassung Anhang: Weitere Anwendungen in der Analytik bzw. Meßtechnik

46 52 53 53 55

60 .

60 61

Einleitung Analysenwerte fallen häufig als eine Reihe von Meßdaten in Abhängigkeit von der Zeit t (oder vom Ort r) an. Zwischen den Daten einer solchen Reihe besteht ein mehr oder weniger stark ausgeprägter Verbundenheitsgrad. Diesen Verbundenheitsgrad innerhalb einer Meßreihe oder auch zwischen verschiedenen Meßreihen zu beschreiben, gelingt mit Hilfe von Korrelationsfunktionen. Erste Anwendungen von Korrelationsfunktionen finden sich in der Nachrichten- und Radartechnik zum Nachweis periodischer Signale im Rauschen [1]. Vereinzelte Anwendungen werden beschrieben z. B.

K . Doei'ffel, A . Wundrack

38

in der Seismologie oder in der Medizin bei der Auswertung von Elektroenzephalogrammen [2]. Eine breite Anwendung finden Korrelationsfunktionen zur Charakterisierung technischer Systeme (Systemanalyse) [3, 4]. I n der Analytik wurden Korrelationsfunktionen anfänglich zur Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnisses genutzt. Durch Verbindung mit Aspekten der Systemtheorie gelingt es darüber hinaus, die analytische Auflösung oder auch das zeitliche bzw. räumliche Auflösungsvermögen zu verbessern. Der vorliegende Artikel soll eine Einführung in die Theorie der Korrelationsfunktionen geben und Anwendungsmöglichkeiten aufzeigen.

1 Theoretische Grundlagen Zeitabhängig oder raumabhängig registrierte Meß- oder Analysenwerte x ( t ) bzw. x(r) sind häufig zufällig schwankende Funktionen. Zur Charakterisierung der Zeitfunktion x ( t ) bzw. der raumabhängigen Funktion x ( r ) verwendet man den linearen Mittelwert (Moment 1. Ordnung) und den quadratischen Mittelwert (Moment 2. Ordnung) (Gl. l a , l b ) : +T

Mt) =

- ^ J * ( t ) dt

(la)

-T

iw =

+T

J x ( t ) dt 2

(lb)

-T

x(t) T

zeitabhängiger Analysenwert Beobachtungszeitraum

Der lineare Mittelwert x ( t ) (Gl. 1 a) entspricht dem Mittelwert punktueller Messungen. Bei nichtperiodischen Signalen ist für x ( t ) der Grenzwert für T oo zu bilden. Berechnet man für jeden Momentanwert x ( t ) die Differenz zum linearen Mittelwert x ( t ) und anschließend den Mittelwert der Differenzen, so erhält man den linearen Mittelwert des zentrierten Signals. ¿¡(t) = x(t) -

i(t)

(lc)

Für die Analyse stochastischer Prozesse (z. B. Rauschen) werden stets zentrierte Werte vorausgesetzt, d. h. x 2 ( t ) = 0. Solche Prozesse bezeichnet man auch als zentrierte Prozesse. Der quadratische Mittelwert zentrierter Prozesse entspricht der Varianz punktueller Meßwerte. Bei Signalen mit definierten Signalformen ist eine Zentrierung nicht sinnvoll.

39

K o r r e l a t i o n s f u n k t i o n e n in d e r A n a l y t i k

1.1 Autokorrelationsfunktion Innerhalb einer Meßwertreihe (Datenfolge) besitzen die Daten unterschiedliche Verwandtschaft. Diese kann als Funktion des zeitlichen (bzw. räumlichen) Abstandes, die Autokorrelationsfunktion (AKF), dargestellt werden (Gl. 2). +T

+xx(x)=lim

- ¡ L f x(t) x(t

T—>oo ¿J-

T) dt

J -T

(2)

x(t)

Momentanwert zum Zeitpunkt t bzw. Meßwert eines räumlichen Punktes x(t — x) Momentanwert bei t — x T zeitlicher oder räumlicher Abstand zweier Meßwerte T Gesamtzeit Die AKF ist das zeitgemittelte Produkt eines Momentanwertes x(t) mit einem um die zeitliche (oder räumliche) Differenz x verschobenen Wert derselben Datenfolge. Die Funktionswerte xx(x) gegen Null strebt. Zwei Meßwerte x(t) und x(t — x) mit x > T c gelten als unkorreliert, d. h. als statistisch unabhängig. Näherungsweise definiert man die Korrelationszeit für den Funktionswert ^xxM = 'l'xxO7 = 0)/ e - Ein ideal zufälliges Signal (z. B. weißes Rauschen) besitzt die Korrelationsdauer T c = 0. Die A K F ist in diesem Fall eine Delta-Funktion. Sollen stochastische Prozesse durch ihre AKF charakterisiert werden, muß man Stationarität des Prozesses voraussetzen. Stationäre stochastische Prozesse besitzen einen konstanten linearen Mittelwert. Damit ist ihre AKF nur von der Zeitdifferenz x = t 2 — t j der gemessenen Augenblickswerte abhängig. Zur Prüfung auf Stationarität halbiert man die Originaldatenfolge. Aus den % bzw. n2 Werten = n2) berechnet man

x

i = S l

x

u/ni

ni-1

=

2

x

ia/

n

S (xu -

2

X

2) 2

40

K . Doerffel, A. W u n d r a c k

V„(r) At-»C y v ^ M V / V v ^ v v f t

t

weißes Rauschen Vxx M

0 t=Tc

Rauschen V„(t)

Sinus-Signal + Rauschen V„(t)

At

Periode

1 -

Periode Pseudo- zufällige Binärfolge (PRBS.)

JLLA«

A b b . 1. Signale u n d ihre A u t o k o r r e l a t i o n s f u n k t i o n e n

Falls s t «j s2 bildet man -r a2 2

S2 =

f =

%

+ n 8 - 2 FG

und prüft nach t

=

|Xt

-

X2|

Instationarität gilt erwiesen für t > t(P, f). Die Autokorrelationsfunktion

K o r r e l a t i o n s f u n k t i o n e n in d e r A n a l y t i k

41

kann auf ihren Wert für x = 0 bezogen werden. Man bezeichnet diese Form als die normierte Autokorrelationsfunktion. PxxM =

4 ha

>

tí

VII

I Iß 8

tí î >

+

3

I P

ï

M J S c3 s

fi fi g

3

H

o

§

o

S

s

H .

L i e s e r

Spurenanalyse der Elemente

149

gleichem Verhältnis V/m mit einer Trennsäule, insbesondere wenn sie mehrere Trennstufen beinhaltet, eine bessere Abtrennung erzielen kann als durch Schütteln. Man muß dabei allerdings den größeren Zeitaufwand in Kauf nehmen. Wenn die Verteilungskoeffizienten der abzutrennenden Spurenelemente sehr hoch sind (D > 104 ml/g), ist eine Abtrennung durch Schütteln oft ausreichend. Bei niedrigeren Verteilungskoeffizienten (D < 104 ml/g) wird m a n im allgemeinen der Abtrennung in einer Trennsäule den Vorzug geben. Eine Filterschicht entspricht einer sehr kurzen Trennsäule. Der wesentliche Vorteil besteht darin, daß eine solche Filterschicht f ü r die analytische Bestimmung unmittelbar eingesetzt werden kann. Damit erübrigt sich ein zweiter Trennschritt oder eine Elution. Die Nachteile der Verwendung einer Filterschicht sind, daß man im allgemeinen höchstens mit einer Trennstufe rechnen k a n n und mit einer niedrigen Durchflußgeschwindigkeit arbeiten muß, um eine angemessene Verweilzeit und damit wenigstens annähernd Gleichgewichtseinstellung zu erreichen. Aus diesen Gründen wird m a n eine Filterschicht bevorzugt dann verwenden, wenn sich diese durch einen hohen Verteilungskoeffizienten D u n d durch eine rasche Gleichgewichtseinstellung auszeichnet. I m übrigen gelten f ü r die Anreicherung in einer Filterschicht die gleichen Überlegungen wie f ü r eine sehr kurze Trennsäule. I n Tabelle 2 sind die wichtigsten Merkmale der drei besprochenen Anreicherungsverfahren noch einmal zusammengestellt, um die Auswahl zu erleichtern.

5 Sorbentien und Austauscher für die Anreicherung von Spurenelementen (Überblick) Tabelle 3 gibt einen Überblick über die große Zahl von Sorbentien und Austauschern, die f ü r die Anreicherung bzw. Abtrennung von Spurenelementen eingesetzt werden können. Am bekanntesten u n d im Handel seit langer Zeit erhältlich sind die Harzaustauscher, die monofunktionale Ankergruppen tragen und als Kationenaustauscher oder Anionenaustauscher verfügbar sind. Die Bezeichnung „monofunktional" bedeutet, daß die Ankergruppen nur aus einer einbindigen Gruppe bestehen und in ionisierter Form nur eine positive oder eine negative Ladung tragen, wie z. B. — S O j (stark saure Kationenaustauscher), — COO~ (schwach saure Kationenaustauscher), — N i C H ^ J (stark basische Anionenaustauscher), —NHpCHß (schwach basische Anionenaustauscher). Gruppen dieser Art können auch auf einer anorganischen Gerüstsubstanz, wie Silicagel, fixiert werden. Hinsichtlich der Fixierung der Ankergruppen auf der Gerüstsubstanz gibt es zwei Möglichkeiten: — Fixierung durch chemische Bindung — Fixierung durch Adsorption oder Einschluß (Immobilisierung). Am festesten ist die Fixierung der Ankergruppen A durch chemische Bindung. Sie erfolgt durch Synthese, entweder direkt auf der Gerüstsubstanz G: G —A, oder über eine Brückengruppe B, die man einführt,

150

K. H. Lieser

Tabelle 3. Austauscher und Sorbentien für die Anreicherung von Spurenelementen (Überblick) Ankergruppe

Organische Gerüstsubstanz

Anorganische Gerüstsubstanz

Monofunktional Kationen- und AnionenAustauscher (z. B. Harzaustauscher) (Ionenaustausch)

Kationen- und AnionenAustauscher auf anorganischer Gerüstsubstanz (Ionenaustausch)

Multifunktional Chelatbildende organische Austauseher (Komplexbildung)

Chelatbildende Gruppen auf anorganischer Gerüstsubstanz (Komplexbildung)

Keine Ankergruppen

Schwerlösliche Ionenverbindungen Anorganische Austauscher Anorganische Sorbentien (Ionenaustausch, Chemisorption, Phys. Adsorption)

Sorbentien evtl. oberflächlich beschichtet (Phys. Adsorption, Chemisorption, Verteilung)

u m die Variationsmöglichkeiten der S y n t h e s e zu v e r g r ö ß e r n : G — B — A [55]. Auf einem dieser beiden Wege werden die meisten organischen Aust a u s c h e r hergestellt. Die F i x i e r u n g d u r c h Adsorption b r i n g t n a t u r g e m ä ß keine feste B i n d u n g . F ü r die H a f t f e s t i g k e i t sind das Adsorptionsgleichgewicht u n d die Löslichkeit der adsorbierten V e r b i n d u n g m a ß g e b e n d . W e n n die Löslichkeiten a u c h niedrig sind, so g e h t doch immer eine gewisse kleine Menge in Lösung, was sich bei großem Verhältnis V/m b e m e r k b a r m a c h e n k a n n . Man ist deshalb dazu übergegangen, A n k e r g r u p p e n d a d u r c h in die Gerüsts u b s t a n z e n einzuschließen, d a ß m a n die letzteren in Anwesenheit der A n k e r g r u p p e n d u r c h Polymerisation erzeugt. Die so immobilisierten A n k e r g r u p p e n k ö n n e n m a n c h m a l bei starker Quellung der Gerüstsubstanz wieder herausgelöst werden. E i n wesentlicher Nachteil b e s t e h t darin, d a ß die auf diese Weise in der Gerüstsubstanz eingeschlossenen A n k e r g r u p p e n z u m Teil n u r sehr schwer zugänglich sind, w o d u r c h die K a p a z i t ä t u n d insbesondere die Austauschgeschwindigkeit herabgesetzt werden. Multifunktionale A n k e r g r u p p e n sind zur Bildung v o n stabilen Chelatk o m p l e x e n b e f ä h i g t u n d f ü h r e n deshalb im allgemeinen zu erheblich höheren Verteilungskoeffizienten u n d zu höherer Selektivität. D a s Spekt r u m a n m u l t i f u n k t i o n a l e n A n k e r g r u p p e n ist sehr breit. Alle b e k a n n t e n organischen K o m p l e x b i l d n e r k o m m e n in F r a g e , a n g e f a n g e n v o n den „ K o m p l e x o n e n " , die sich d u r c h sehr hohe K o m p l e x b i l d u n g s k o n s t a n t e n , aber nicht d u r c h sehr hohe Selektivität auszeichnen, über viele a n d e r e in der analytischen Chemie v e r w e n d e t e n R e a g e n t i e n , bis zu K r o n e n e t h e r n oder K r y p t a n d e n . E s werden l a u f e n d n e u e A u s t a u s c h e r m i t m u l t i f u n k tionalen A n k e r g r u p p e n synthetisiert, d a r u n t e r auch solche m i t „ m a ß geschneiderten" A n k e r g r u p p e n f ü r spezielle A u f g a b e n .

Spurenanalyse der Elemente

151

I n der letzten Reihe von Tabelle 3 sind die Möglichkeiten zusammengestellt, die sich dadurch ergeben, daß m a n organische oder anorganische Verbindungen als solche (d. h. ohne Ankergruppen) als Sorbentien bzw. Austauscher einsetzt. Die Zahl dieser Möglichkeiten ist sehr groß, die Anwendungsbreite aber jeweils beschränkt. Eine spezielle Gruppe sind Verbindungen mit einer definierten Porenstruktur, die für eine Gelfiltration, d. h. für die Abtrennung bestimmter Fraktionen höhermolekularer Spezies geeignet sind. Feste organische Metallreagentien reagieren beim Schütteln mit einer Lösung mit gelösten Metallionen, die auf diese Weise selektiv gebunden und abgetrennt werden können. Man kann auch ein organisches Trägermaterial mit einer Schicht überziehen, die aus einem organischen Lösungsmittel und einem Komplexbildner besteht. I m K o n t a k t mit einer wäßrigen Lösung stellt sich dann das Verteilungsgleichgewicht der Spurenelemente ein, die auf diese Weise abgetrennt werden können. Verwendet m a n eine Säule, so entspricht das Verfahren dem der Verteilungschromatographie. Mit anorganischen Substanzen ergeben sich folgende Möglichkeiten: — — — —

Ionenaustausch an schwer löslichen Ionenverbindungen Ionenaustausch an anorganischen Austauschern Chemisorption an anorganischen Sorbentien Adsorption an anorganischen Sorbentien.

Diese Anreicherungsverfahren zeichnen sich im allgemeinen durch eine hohe Selektivität für bestimmte Spurenelemente aus. Schwer lösliche Ionenverbindungen tauschen isotope Ionen aus und auch nicht-isotope Ionen, wenn diese die Bedingungen der Mischkristallbildung erfüllen. Der Austausch an der Oberfläche findet rasch statt. E r setzt sich sehr langsam ins Innere der Kristalle fort. Anorganische Austauscher gibt es in größerer Zahl, von denen die meisten auch im Handel erhältlich sind, vor allem Oxidhydrate und Phosphate von Elementen aus der 4. Nebengruppe des Periodensystems, wie Ti und Zr. Viele Oxide der Zusammensetzung M 0 2 - x H 2 0 (M = Si, Ti, Zr, Ce, P b , Mn) besitzen Austauscheigenschaften. Der Übergang von den anorganischen Austauschern zu den anderen anorganischen Sorbentien ist fließend. Die Vorgänge können oft formal als Ionenaustausch oder als Chemisorption beschrieben werden. Meist überwiegt die kovalente Bindung. Typische Beispiele sind S i 0 2 - x H 2 0 und A l 2 0 3 - x H 2 0 . Verantwortlieh für die Sorptionseigenschaften dieser Verbindungen sind die Hydroxylgruppen ^ S i O H bzw. ^>A10H (vgl. Abschnitt 2). Schließlich können Spurenelemente auch durch physikalische Adsorption an anorganischen Sorbentien angereichert werden. E i n häufig angewandtes Sorbens ist die Aktivkohle, an der z. B . Komplexverbindungen von Spurenelementen mit hydrophoben organischen Liganden durch Adsorption verhältnismäßig fest gebunden und so abgetrennt werden können. Alle genannten Verbindungen sind für die Abtrennung durch Schütteln verwendbar. F ü r die Anreicherung in Trennsäulen eignen sich schwerlösliche Ionenverbindungen und anorganische Austauscher bzw. Sorbentien nur dann, wenn die Korngröße nicht zu klein ist (zu geringe Durchflußgeschwindigkeit) und wenn man den zum Teil hohen Zeitbedarf für die

152

K . H . Lieser

Gleichgewichtseinstellung in Kauf n e h m e n k a n n . Zur Herstellung von Filterschichten sind feinkörnige Austauscherharze geeignet, die auch als I o n e n a u s t a u s c h p a p i e r e im H a n d e l sind. Celluloseaustauscher sind wegen ihrer faserigen S t r u k t u r besonders g u t zur Herstellung von Filterschichten geeignet. Aber auch schwerlösliche anorganische V e r b i n d u n g e n u n d anorganische Austauscher bzw. Sorbentien lassen sich als Filterschichten verwenden.

6 Anreicherung an Kationen- und Anionenaustauschern mit monofunktionalen Ankergruppen Die wichtigsten E i g e n s c h a f t e n von K a t i o n e n - u n d Anionenaustauschern m i t m o n o f u n k t i o n a l e n A n k e r g r u p p e n sind in Tabelle 4 zusammengestellt. Die a m h ä u f i g s t e n v e r w e n d e t e n Gerüstsubstanzen sind Polystyrol (PS) oder Polyacrylsäure (PA). Die Polystyrolharze w e r d e n d u r c h Polymerisation von Styrol gewonnen. Dabei wird zur Vernetzung Divinylbenzol (DVB) zugesetzt. Der Vernetzungsgrad des Kopolymerisats wird d u r c h den Gehalt a n D V B angegeben (X8 A 8 % DVB). E i n höherer Vernetzungsgrad bewirkt eine höhere mechanische Stabilität, aber eine geringere Quellfähigkeit, eine v e r m i n d e r t e Selektivität und eine niedrigere Austauschgeschwindigkeit (vgl. Abb. 5). Austauscher auf Basis von P S oder P A unterscheiden sich hinsichtlich ihrer Austauscheigenschaften n i c h t wesentlich. F r ü h e r w u r d e n in größerem U m f a n g Polykondensationsharze verwendet, sie sind aber h e u t e weitgehend v o n den Polymerisationsharzen v e r d r ä n g t .

Tabelle 4. Die wichtigsten Eigenschaften von Kationen- u n d Anionenaustauschern m i t monofunktionalen Ankergruppen GerüstAnkergruppen Substanzen

K a p a z i t ä t Anwendungsbeispiele für (mval/g) Trennungen bzw. Anreicherungen

Polystyrol oder Polyacrylsäure

Kationenaustauscher: — S 0 3 H (stark sauer) - COOH (schwach sauer) - PO(OH) 3 (schwach sauer)

3—5

Kationen versch. L a d u n g : M4+ > M3+ > M2+ > M+ Kationen / Anionen

Anionenaustauscher: - N R'3'3 O H (stark basisch) - N H-nnB3_nOH (schwach basisch) • ( n — 1,2)

2— 3

Anionen versch. L a d u n g : A3- > A2- > A Anionen/Kationen

Spurenanalyse der Elemente

153

Außer Vernetzungsgrad und Korngröße k a n n m a n auch noch weitere Eigenschaften der Harzaustauscher variieren. So unterscheidet m a n Harzaustauscher normaler Porosität u n d makroporöse Austauscher, die infolge eines Porensystems mit einem Durchmesser von der Größenordnung 10 nm, das die gelartige Struktur durchzieht, eine höhere Austauschgeschwindigkeit aufweisen [40, 43]. Wenn man die Austauscher n u r oberflächlich mit Ankergruppen belegt, h a t man zwar eine niedrige Kapazität, aber eine sehr hohe Austauschgeschwindigkeit [56]. Die niedrige K a p a z i t ä t ist f ü r die Abtrennung von Spurenelementen ohne Belang. Die Harzaustauscher lassen sich ferner in Form von Membranen einsetzen (Membranaustauscher) oder man kann Papiere oder Filter damit imprägnieren (Ionenaustauschpapiere oder -filter). Für die Anwendung von Austauschern in der Spurenanalyse spielt die Reinheit eine große Rolle. Die Gehalte an Schwermetallen liegen in Harzaustauschern meist in der Größenordnung von 0,1 — 1 (xg/g. Deshalb ist es wichtig sicherzustellen, daß die in den Harzaustauschern enthaltenen Verunreinigungen die Bestimmungen der Spurenelemente nicht stören. Eine gründliche Reinigung mit Säuren oder Lösungsmitteln ist sinnvoll. Die Selektivität der monofunktionalen Ankergruppen ist nicht hoch (vgl. Abb. 3). Ionen verschiedener Ladung können verhältnismäßig leicht voneinander getrennt werden, Ionen gleicher Ladung im allgemeinen nur in mehrstufigen Trennsäulen. F ü r stark saure Kationenaustauscher gelten etwa folgende Abstufungen in der Selektivität M+: T1+ > Ag+ > Cs+ > Rb+ > K+ sa NH 4 + > Na+ > H+ > Li+ M 2 +: Ra 2 + > Ba 2 + > Pb 2 + > Sr2+ > Ca2+ > Cd2+ g: Zn2+ ^ Cu2+ ^ Ni2+ ^ Co2+ ^ Mg 2+ ig U 0 2 + jg Be2+ 3

M +: Ac3+ > La 3 + > Y3+ > Sc3+ > Al3+ F ü r die Bindung von einfach negativ geladenen Anionen an stark basischen Anionenaustauschern findet m a n die Reihenfolge I - > H S O , > C10 3 - > N < V > B r - > CN- > H S O s - > N 0 2 " > Cl" > O H " > F~. Die Verteilungskoeffizienten von I - , B r _ und Cl - unterscheiden sich jeweils etwa um den Faktor 3, so daß man z. B. Iodidionen aus Salzlösungen anreichern kann [57], Günstig gestaltet sich die Anreicherung an Austauschern m i t monofunktionalen Gruppen, wenn m a n das abzutrennende Spurenelement durch Komplexbildung in einen negativ geladenen Komplex überführen u n d auf diese Weise von den anderen Bestandteilen abtrennen kann. So bilden AI, Ni, Ac, Th, Y und die Lanthanide in salzsaurer Lösung negativ geladene Chlorokomplexe, die an einem stark basischen Anionenaustauscher gebunden werden [58]. Anstelle von Salzsäure kann man auch Alkali- oder Erdalkalihalogenide oder A1C13 verwenden. Durch Wahl der Lösungsmittel und der Säuren kann m a n die Verteilungskoeffizienten s t a r k beeinflussen, wie viele Beispiele aus der Praxis zeigen [58 — 68]. Auch durch Verwendung von Lösungsmittelgemischen kann man Trennungen erzielen. Z. B. lassen sich Alkali- und Erdalkaliionen in Anwesenheit höherer Dioxan-Konzentrationen an stark basischen Anionenaustauschern fixieren [69].

154

K. H. Lieser

Im Anschluß an die Anreicherung bzw. Abtrennung bieten sich folgende Möglichkeiten an — Direkte Bestimmung — Elution — Veraschung des Austauschers und Auflösung des Rückstandes. Die direkte Bestimmung ist besonders vorteilhaft (vgl. Abschnitt 4 und Tabelle 2). Nach der Abtrennung in einer Trennsäule wird meist eluiert. Die Veraschung des Austauschers ist die umständlichste Art der Weiterverarbeitung; sie wird im allgemeinen nur dann verwendet, wenn eine Elution nicht möglich ist.

7 Anreicherung durch chelatbildende Austauscher Die Möglichkeiten der Anreicherung von Spurenelementen an chelatbildenden Austauschern sind sehr vielseitig. Einige dieser Austauscher sind im Handel erhältlich, z. B. Chelex 100 [70], Duolit E S 346 (Chelatharz) [71], Cellulose-Hyphan [72]. Die Zahl der in der Literatur beschriebenen Austauscher ist sehr groß [8, 10, 11, 42, 43, 55, 73 — 85], Sie ergibt sich daraus, daß man eine Vielzahl von Komplexbildnern an einer Gerüstsubstanz fixieren kann, um einen chelatbildenden Austauscher zu erhalten. Gewisse Grenzen ergeben sich durch die Gerüstsubstanzen, weil man nicht jede beliebige Ankergruppe in eine engmaschige Gerüstsubstanz einbringen kann. Die wichtigsten Gerüstsubstanzen für chelatbildende Austauscher sind Polystyrol (bevorzugt makroporös); Polyacrylsäure und Cellulose. Ankergruppen mit kleinem Raumbedarf kann man in Polystyrol oder Polyacrylsäure durch Synthese einführen. Cellulose ist aufgrund ihrer faserigen Struktur besonders gut für die Fixierung von Ankergruppen mit größerem Raumbedarf geeignet. Wenn jedoch sterisch sehr anspruchsvolle Komplexe gebildet werden, findet man die erwarteten hohen Verteilungskoeffizienten nur, wenn die Ankergruppen an der Oberfläche sitzen. Alle bisher in der Literatur beschriebenen Ankergruppen können an dieser Stelle nicht im einzelnen aufgeführt werden. Tabelle 5 enthält eine Auswahl von Beispielen. Die Verteilungskoeffizienten zeigen im allgemeinen eine gewisse Parallelität zu den Komplexbildungskonstanten der 1:1-Komplexe in Lösung. Wegen der besonderen Verhältnisse im Austauscher besteht jedoch keine Proportionalität. Schreibt man für das Austauschgleichgewicht eines Spurenelements M an einem Chelataustauscher mit der chelatbildenden Ankergruppe L : L + M ^ ML

(31)

so erhält man nach dem Massenwirkungsgesetz unter Berücksichtigung der Aktivitätskoeffizienten y [ML] y(ML) [L] Y ( L ) [M] y(M)

(32)

Spurenanalyse der Elemente

155

Tabelle 5. Beispiele für chelatbildende Austauscher Als Gerüst- oder Trägersubstanzen kommen in Frage: Polystyrol (PS), Polyacrylsäure (PA), Cellulose, Polyurethan (PU)

Ankergruppen

Anwendungsbeispiele für Anreicherungen bzw. Trennungen

Aminodiessigsäure (Chelex 100)

Erdalkalien, Lanthanide, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Cd, Pb

Dithiocarbamat

Ti, Y, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Ga, As, Se, Mo, Pd, Ag, Cd, In, Sn, Sb, Te, W, Au, Hg, Tl, Pb, Bi, U, Pu

Amidoxim

Fe, Cu, Zn, Cd, Pb, IT

Tetraphenylborat

Cs, Rb, K/Na und alle anderen Kationen

Salicylsäure

Fe, Cu, U

1,3-Diketon

Be, AI, Sc, Ti, V, Cr, Mn, Fe, Co, Cu, Zn, Ga, Zr, Mo, Ru, Pd, In, Sn, Hf, Hg, Tl, Pb, Bi, Th, U, Pu

1 - (2 -Hy droxyphenylazo) - 2 naphthol (Hyphan)

Cu, IT, Fe, Co, Ni

4 - (Pyri dyl - (2) -azo) -naphthol - 2 (PAN)

Sc, Ti, V, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Ga, Y , Zr, Rh, Pd, Ag, Cd, In, Sn, Lanthanide, Ir, Pt, Hg, Pb, Bi, Th, U

4-(Pyridyl-(2)-azo)-resorcin (PAR)

Sc, V, Fe, Co, Ni, Zn, Ga, Nb, Pd, Ag, In, Lanthanide, Pb, U

Pyrogallol

S b m / S b v ; Ti, Nb, Ta

8-Hydroxychinolin (Oxin)

Be, AI, Sc, Ti, V, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Ga, Y , Zr, Nb, Mo, Pd, Cd, In, Sn, Sb, Lanthanide, W, Hg, Tl, Pb, Bi, Th, Pa, IT, Pu

l,2-Dihydroxy-naphthalin-3,5disulfonsäure (Tiron)

Ti, V, Fe, Zr, Nb, Sn, Lanthanide, Hg, Pb, W, Th, U

5 - (4 -Dimethylamino -benzyli den) - Ag, Pd, Pt, Au, Hg rhodanin (DMBR) 8-Oxa-2,4,12,14-tetraoxopentadekan

IT

Kronenether 1 Kryptanden J

Alkaliionen, Erdalkaliionen, Isotopenanreicherung

Tributylphosphat (TBP) und andere Phosphorsäurederivate

Nb, Te, Ru, W, Re, Os, Au, Hg, Tl, Bi, Th, U, Pu

K . H . Lieser

156 bzw.

(33) Bei sehr niedriger Beladung des Austauschers k a n n man [L] als konstant ansehen, und bei niedriger Konzentration des Spurenelements M in einer verdünnten wäßrigen Lösung ist y(M) rs 1. Damit erhält m a n :

Y(ML)

(34)

Der Einfluß der Umgebung im Austauscher auf die Ankergruppe L bzw. auf die Bildung des Komplexes ML k o m m t in den Aktivitätskoeffizienten y(L) bzw. y(ML) zum Ausdruck. Leider lassen sich diese rechnerisch nicht erfassen. I m allgemeinen sind die Verteilungskoeffizienten D jedoch kleiner als man aufgrund der homogenen Komplexbildungsgleichgewichte in Lösung L + M ^ ML

(35)

erwartet. Dies ist im wesentlichen auf die Behinderung der Komplexbildung im Austauscher zurückzuführen. F ü r die Anreicherung von Spurenelementen aus Lösungen, in denen andere Ionen in höheren Konzentrationen vorliegen, ist die Selektivität des Austauschers entscheidend. So werden an Austauschern mit Aminodiessigsäure als Ankergruppe Erdalkalien, Lanthanide und die meisten anderen Übergangsmetalle verhältnismäßig fest gebunden. Es ist deshalb leicht möglich, alle genannten Elemente von Alkaliionen abzutrennen. Die Unterschiede in den Verteilungskoeffizienten der Übergangsmetalle sind verhältnismäßig niedrig. Deshalb ist die Selektivität im Hinblick auf die Abtrennung bzw. Anreicherung bestimmter Übergangsmetalle von anderen Übergangsmetallen bei Austauschern mit Aminodiessigsäure und ähnlichen Ankergruppen vom Typ der „Komplexone" niedrig. Auch Dithiocarbamat ist ein Komplexbildner, der mit vielen Übergangselementen stabile Komplexe bildet und deshalb gerne in der FliissigFlüssig-Extraktion f ü r die Abtrennung einer Vielzahl von Übergangselementen eingesetzt wird. Ein Nachteil ist die geringe Säurebeständigkeit dieser Ankergruppe. Amidoxim bindet mit verhältnismäßig hoher Selektivität U r a n und andere Übergangselemente, die Stabilität und d a m i t die Regenerierbarkeit sind aber ebenfalls begrenzt. Noch stärker ausgeprägt ist diese Unbeständigkeit im Falle von Tetraphenylborat als Ankergruppe [86], womit schwere Alkaliionen angereichert werden können. Salicylsäure als Ankergruppe ist recht stabil und bindet vorzugsweise Eisen. Bei Austauschern mit 1,3-Diketonen als chelatbildende Gruppe sind die Verteilungskoeffizienten in einer ähnlichen Reihenfolge abgestuft wie die Komplexbildungskonstanten mit Acetylaceton. Der Celluloseaustauscher mit l-(2-Hydroxyphenylazo)-2-naphthoI (Hyphan) als Ankergruppe weist eine sehr hohe Selektivität f ü r U, Cu und Fe auf. Sehr viel tiefer liegen die Verteilungskoeffizienten für alle Elemente mit aufgefüllten d-Zuständen, so daß die genannten Spurenelemente

Spurenanalyse der Elemente

157

auch aus konzentrierten Salzlösungen und aus konzentrierten Lösungen von beispielsweise ZnCl2 quantitativ abgetrennt und angereichert werden können [80]. Ähnliche Eigenschaften haben die Austauscher mit 4(Pyridyl-(2)-azo)-naphthol-2 (PAN) oder 4-(Pyridyl-(2)-azo)-resorcin (PAR) als Ankergruppen [80]. Der Austauscher mit 5-(4-Dimethylaminobenzyliden)-rhodanin als Ankergruppe zeigt erwartungsgemäß eine hohe Selektivität für Silber und andere Edelmetalle [87]. Austauscher mit 8-Oxa-2,4,12,14-tetraoxopentadekan und anderen, 6-zähnigen Ankergruppen sind Beispiele für maßgeschneiderte Austauscher für die Anreicherung bestimmter Spurenelemente, im vorliegenden Falle für die Anreicherung bzw. Abtrennung des Urans [83]. Schließlich eignen sich für spezielle Aufgaben auch Austauscher mit Kronenethern und Kryptanden als Ankergruppen [78, 88]. Man wird dabei die Ringgröße des Kronenethers bzw. den Hohlraum des Kryptanden so auswählen, daß er der Größe des anzureichernden Kations optimal entspricht, und kann so Anreicherungen von Alkali- oder Erdalkaliionen erreichen. Auch eine Isotopenanreicherung ist mit Hilfe von Kronenethern oder Kryptanden möglich, man benötigt dazu allerdings viele Trennstufen. Die Möglichkeit der Isotopenanreicherung beruht darauf, daß bei der Komplexbildung mit Kronenethern und Kryptanden unmittelbar der Raumbedarf der „nackten" Ionen ins Spiel kommt, der bei schweren Isotopen im allgemeinen etwas geringer ist, und nicht der Raumbedarf der hydratisierten Ionen, wie z. B. bei der Trennung an Harzaustauschern. Bei der Verwendung von Kryptanden kann man größere Unterschiede in den Verteilungskoeffizienten (etwa um den Faktor 2), d. h. höhere Selektivität, erreichen als mit Kronenethern als Ankergruppen, muß dafür aber die langsamere Gleichgewichtseinstellung an Kryptanden in Kauf nehmen. Wie bereits in Abschnitt 5 erwähnt, können die Ankergruppen auch adsorptiv aufgebracht oder bei der Polymerisation in der Gerüstsubstanz fixiert (immobilisiert) werden. Als Gerüstsubstanz werden organische oder anorganische Verbindungen verwendet. So wurden Austauscher hergestellt, die Phosphorsäureester wie Tributylphosphat (TBP) immobilisiert in einem Polystyrolgerüst enthalten (Lewextrel der Firma Bayer). Die Eigenschaften entsprechen den Extraktionseigenschaften der Phosphorsäureester. Auf Polyurethan als Gerüstsubstanz können Ankergruppen wie Dithizon, l-Nitroso-2-naphthol, Diethylammoniumdiethyldithiocarbamat oder 4-(Pyridyl-(2)-azo-naphthol-2 (PAN) in der Weise aufgebracht werden, daß man sie in einem Weichmacher (z. B. T B P , Dinonylphthalat, Dioctylphthalat, Dibutyladipat) auflöst und diese Lösung auf einem Polyurethanschaum durch Quellung immobilisiert [89, 90], Auch Polyurethanschäume, die Ionenaustauscher oder anorganische Sorbentien enthalten, sind bekannt. Die Variationsmöglichkeiten sind sehr groß. Beispiele für Anreicherungen sind die Abtrennung von CH3HgCl aus wäßrigen Lösungen an Polyurethanschaum mit —SH-Gruppen [91] und die Abtrennung von Co an Polyurethanschaum mit PAN als immobilisierter Ankergruppe [92], Als anorganisches Trägermaterial werden bevorzugt Silicagel oder Glaskugeln verwendet. Chelatbildende Gruppen werden durch Synthese an die Silanolgruppen gebunden. Beispiele sind Diaminderivate, Dithiocarbamate

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K. H. Lieser

u n d 8-Hydroxychinolin (Oxin) auf Silicagel oder porösen Glaskugeln [93—99]. Auch in diesem Fall können die Austauscher nach Anreicherung der Spurenelemente direkt der R F A zugeführt werden.

8 Anreicherung an anorganischen Austauschern und Sorbentien Tabelle 6 gibt einen Überblick über anorganische Austauscher und Sorbentien. Schwer lösliche anorganische Ionenverbindungen tauschen an der Oberfläche ihre Ionen aus, u n d zwar mit hoher Selektivität Ionen gleicher Ladung, die mit den vorhandenen Gegenionen ebenfalls schwer lösliche Verbindungen bilden. Die Gleichgewichtskonstante K des Austauschgleichgewichts Mi + M j + ^ M2 + MJ + +

[ M J [ M ; ] Y(M 2 ) +

[ M j [M£ ] y d y

(36)

Y(M;

+

)

t(M^

+

)

= K

(37)

ist um so größer, je schwerer löslich die betreffende Verbindung ist. F ü r den Austausch von isotopen Ionen ist K «a 1. Der Austausch ist nicht auf die Oberfläche beschränkt, sondern er setzt sich langsam in das Innere der IonenVerbindungen fort, sei es dadurch, daß die Verbindung einem kontinuierlichen Rekristallisationsprozeß unterliegt oder durch Diffusion.

Tabelle 6. Übersicht über anorganische Austauscher und Sorbentien Schwer lösliche Ionenverbindungen (BaS0 4 , SrS0 4 , Salze von Heteropolysäuren, Natriumtitanat, -zirkonat, -tantalat, -niobat, Silberhalogenide, schwer lösliche Sulfide) — Austausch von Ionen, die Hauptbestandteile des Kristallgitters sind Oxidhydrate ( —OH-Gruppen an bzw. in ZnO, A1 2 0 3 , Fe 2 0 3 , Si0 2 (Silicagel), Ti0 2 , Zr0 2 , MnO a , Ce0 2 , Sb 2 0 5 ) — Chemisorption bzw. Austausch an OH-Gruppen Phosphate, Arsenate (von Ti, Zr u. a.) — Austausch von Protonen gegen andere Kationen Molybdate, Wolframate (von Ti, Zr u. a.) — Austausch von Protonen gegen andere Kationen Hexacyanoferrate (von Ti, Fe, Cu, Co, Ni, AI u. a.) — Austausch von Protonen gegen andere Kationen Natürliche Aluminosilikate (Tonminerale, insbesondere Schichtsilikate wie Kaolinit, Montmorillonit und Illit sowie Silikate mit Hohlraumstruktur wie die Zeolithe) — Austausch von Kationen Künstliche Zeolithe (Molekularsiebe) — Austausch von Kationen Aktivkohle — Adsorption, bevorzugt von großen Molekülen

Spurenanalyse der Elemente

159

Dabei werden die Ionen durch Mischkristallbildung in den Bodenkörper aufgenommen. Die Rekristallisation ist um so lebhafter, je feinteiliger und ungeordneter der Bodenkörper ist. Während die Halbwertzeiten für den Austausch an der Oberfläche in der Größenordnung von 1 Minute liegen, bewegen sich die Halbwertzeiten für die Aufnahme ins Innere einer als Bodenkörper vorliegenden Ionenverbindung zwischen etwa 1 h und vielen Tagen. F ü r die Abtrennung oder Anreicherung von Spurenelementen ist meist die Austauschkapazität der Oberfläche ausreichend, insbesondere wenn es sich u m feinteilige Bodenkörper handelt. Typische Beispiele für die Trennung durch Austausch an anorganischen Ionenverbindungen sind: Bariumsulfat, Strontiumsulfat: R a 2 + > B a 2 + > Pb 2 + > Sr 2 + (Ca 2 + werden nicht im Gitter aufgenommen.) Kaliumtetraphenylborat: Cs+ > R b + > K + sa N H J . Ähnliche Abstufungen in der Löslichkeit zeigen die schwer löslichen Salze von Heteropolysäuren, z.B. das Ammoniummolybdatophosphat [100— 102]. Ammoniumionen können gegen andere Ionen ausgetauscht werden. Entsprechend der Löslichkeit der Verbindungen werden bevorzugt die schweren Alkaliionen gebunden. Darauf beruht die Abtrennung bzw. Anreicherung von Cäsiumionen mit hoher Selektivität, auch aus sauren Lösungen [103 — 107]. Ähnliche Eigenschaften findet man bei Wolframatophosphaten und -Silikaten, ferner bei Natriumtitanat, -zirkonat, -tantalat und -niobat. Wenn keine Mischkristalle gebildet werden, die Löslichkeit der entsprechenden Verbindung aber sehr niedrig ist, findet oft eine chemische Umsetzung statt, wobei ein neuer Bodenkörper entsteht. Ein Beispiel ist die selektive Abtrennung von I~ an AgCl oder anderen Silberverbindungen: AgCl + I - - » A g I + Cl-

(38)

Diese Reaktion verläuft quantitativ von links nach rechts, d. h. AgCl wird durch I - in A g I überführt, weil dieses eine erheblich geringere Löslichkeit hat. Die Reaktion verläuft auch mit Iod quantitativ unter Bildung von A g I und A g I 0 3 . Auf diese Weise lassen sich Spuren von Iodid oder Iod sehr selektiv aus wäßrigen Lösungen oder aus der Gasphase abtrennen [86, 108]. I n ähnlicher Weise k a n n man unter Verwendung von festen Metallsulfiden Spurenelemente anreichern. Auch hier ist die Löslichkeit maßgebend, die in der Reihenfolge H g S < CuS < P b S < CdS < ZnS ansteigt. So können Spuren von Schwermetallen wie Ag, Bi, Cd, Cu, H g und P b abgetrennt werden, indem man die Lösung durch eine dünne Schicht (0,3 bis 0,4 (¿m) von Metallsulfiden (ZnS, MnS, CuS, P b S ) , die sich auf einem Membranfilter befinden, filtriert [109, 110]. Die Filter können direkt der Röntgenfluoreszenzanalyse zugeführt werden. Ein weiteres Beispiel ist die Anreicherung der Spurenelemente Tc und R e an CdS unter Bildung der schwer löslichen Sulfide Tc 2 S 7 bzw. Re 2 S 7 [111]. Sie beruht darauf, daß Tc 2 S 7 und R e 2 S 7 in Wasser schwerer löslich sind als CdS. Die Fähigkeit, Kationen oder Anionen zu binden, findet man auch bei schwer löslichen Oxiden, sofern diese Hydroxylgruppen enthalten [100 — 102]. Der Gehalt an Hydroxylgruppen und damit die Austausch-

160

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kapazität hängen sehr stark von der Vorbehandlung ab. Meist formuliert man die Verbindungen als Oxidhydrate. E s werden überwiegend kovalente Bindungen ausgebildet, die Vorgänge selbst können aber auch als Kationen- oder Anionenaustausch an den OH-Gruppen beschrieben werden, wie bereits in Abschnitt 2 erwähnt. Entscheidend dafür, ob Kationen oder Anionen gebunden werden, sind der isoelektrische Punkt der Verbindungen und der pH-Wert der Lösung. Im pH-Bereich unterhalb des isoelektrischen Punktes, der für die einzelnen Verbindungen verschieden ist, werden Kationen gebunden, oberhalb Anionen. Die bekanntesten als Austauscher verwendeten Oxidhydrate sind in Tabelle 6 aufgeführt. ZnO eignet sich für die Abtrennung und Anreicherung von Phosphat- oder Arsenationen [112], An Al 2 0 3 x H 2 0 können Spuren von Sb(V) aus verdünnten sauren Lösungen abgetrennt werden [113]. An Fe 2 0 : ) • x H 2 0 werden Anionen höherer Ladung angereichert. Phosphat, Sulfat und Chlorid können in einer Säule, die mit pseudomorphem Eisenhydroxid gefüllt ist, getrennt werden [114]; Cr und V werden an F e 2 0 3 angereichert [115], In Silicagel-Säulen lassen sich zweiund dreiwertige Ionen trennen, indem man einen pH-Wert wählt, bei dem die dreiwertigen Ionen bereits Hydroxokomplexe bilden, die zweiwertigen aber noch nicht [34, 35]. Die Reaktion wird auch als hydrolytische Adsorption beschrieben [116], z. B .

>

—)Si—OH + HO—Al 2 + ^ -^Si—O—Al 2 + + H 2 0

(39)

In ähnlicher Weise bindet Silicagel auch Uranylionen und andere Ionen, die in Form ihrer Hydroxokomplexe vorliegen. Wenn die Hydrolyse allerdings bis zu polynuklearen Komplexen fortgeschritten ist, findet keine Bindung nach Gl. (39) mehr statt. Durch Zusatz von Komplexbildnern kann man gegebenenfalls solche Elemente, die nicht abgetrennt werden sollen, als Komplexe in Lösung halten. Ein Beispiel ist die Anreicherung von Spuren von Uranylionen an Silicagel in Anwesenheit von Komplexbildnern bei p H 5 [117]. Höhere Verteilungskoeffizienten für Uranylionen findet man an Titanoxidhydrat (D(U) ss 104 bis 105 im Vergleich zu D(U) sa 102 bis 103 an Silicagel). Titanoxidhydrat wird deshalb für die selektive Abtrennung von Uran aus Meerwasser eingesetzt [118, 119]. Neben den Uranylionen, die als Triscarbonatokomplexe in einer Konzentration von etwa 3 [xg/1 vorliegen, werden auch andere Elemente wie Fe, Co, Ni, Pb und Zn angereichert [120]. Dem Vorteil des hohen Verteilungskoeffizienten für Uranylionen stehen als Nachteile die relativ geringe Austauschgeschwindigkeit und die geringe mechanische Beständigkeit der Titanoxidhydrat-Präparate gegenüber. An Zirkoniumoxidhydrat werden Alkaliionen in der Reihenfolge Cs+ > Rb+ > K + > Na+ abgetrennt [100—102]. Die Unterschiede in den Verteilungskoeffizienten sind jedoch nicht sehr stark ausgeprägt. Auch Ionen höherer Ladung werden gebunden. Oxide bzw. Oxidhydrate können auch als Deckschichten auf einer Metalloberfläche erzeugt und in dieser Form zur Abtrennung von Spurenelementen verwendet werden [121, 122]. Eine weitere Gruppe von anorganischen Ionenaustauschern sind Phosphats und Arsenate von mehrwertigen Elementen, insbesondere Zirkoniumphosphat und Titanphosphat [100—102], Hierbei handelt es

161

Spurenanalyse der Elemente

sich um Verbindungen, die nicht stöchiometrisch zusammengesetzt sind und durch die Formel M I V ( 0 H ) y ( H P 0 4 ) ( 4 _ y ) / 2 - x H a 0 beschrieben werden können (M I V = Ti, Zr). Die Zahl der Hydroxylgruppen y ist im allgemeinen klein. Die Phosphatgruppen tragen im Mittel ein Proton, das für den Austausch verantwortlich ist. Die Selektivität, d. h. der Unterschied in den Verteilungskoeffizienten, ist größer als bei den Oxidhydraten. Am eingehendsten untersucht wurden die Austauscheigenschaften des Zirkoniumphosphats [102]. Die Phosphate anderer Elemente (Ti, Ce u. a.) haben ähnliche Austauscheigenschaften. Stets wird das Proton am Phosphat gegen ein Kation ausgetauscht. Die Austauschkapazitäten liegen in der Größenordnung von 1 mmol/g. Auch die durch Fällung gewonnenen schwerlöslichen Hexacyanoferrate enthalten Protonen, die ausgetauscht werden können. Die Verbindungen der vierwertigen Elemente können durch dieFormelM I V (OH) y [HFe(CN) G ] ( 4 _ y )/ 3 • x H 2 0 beschrieben werden. Näher untersucht wurden die Austauscheigenschaften von Titanhexacyanoferrat [123 — 125]. Als Beispiel für die ausgeprägte Selektivität sind in Abb. 11 die Verteilungskoeffizienten der Alkaliionen als Funktion des pH-Werts aufgezeichnet [124], Aufgrund des hohen Verteilungskoeffizienten können Spuren von Cäsium (und Francium) aus stark verdünnten Lösungen angereichert bzw. abgetrennt werden. Andere schwerlösliche Hexacyanoferrate, wie die des AI, Fe 1 1 1 , Co, Cu, Ni, zeigen ähnliche Austauscheigenschaften. Eisenpulver mit einer Deckschicht von Eisen(III)-hexacyanoferrat(II) zeigt neben der hohen Selektivität für die schweren Alkaliionen auch eine hohe Austauschgeschwindigkeit [126]. Ein schwieriges Problem bei den meisten der bisher genannten Verbindungen ist die Herstellung von Präparaten mit den für die Verwendung als Austauscher wichtigen Eigenschaften, wie möglichst einheitliche Korn6 5 4

'2

Abb. 11. Logarithmus des Verteilungskoeffizienten D von Alkaliionen an Titanhexacyanoferrat [124]

1 .

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große, mechanische Festigkeit, Abriebfestigkeit, große spezifische Oberfläche (d. h. hohe Austauschkapazität) bzw. gute Zugänglichkeit im Innern (d. h. annehmbare Austauschgeschwindigkeit). Fortschritte wurden in den vergangenen J a h r e n erreicht durch Präparation von Xerogelen nach den Verfahren der Gelfällung. Zum Ionenaustausch und zur Sorption befähigt ist auch die große Gruppe der Aluminosilikate einschließlich der Tonminerale. Bei den Schichtsilikaten wie Kaolinit, Montmorillonit und Illit findet man eine Bevorzugung der Ionen höherer Ladung u n d bei gleicher Ladung eine Anreicherung der schwereren Ionen; doch stehen der Anwendung f ü r die Anreicherung von Spurenelementen in der Analytik als wesentliche Nachteile die geringe Austauschkapazität (Größenordnung 0,1 mval/g), die geringe Austauschgeschwindigkeit und die schwierige H a n d h a b b a r k e i t der sehr feinteiligen Tonminerale entgegen. I m allgemeinen stehen Verbindungen mit günstigeren Eigenschaften zur Verfügung. Aluminosilikate mit einem definierten Porensystem (Molekularsiebe) zeigen oft eine sehr hohe Selektivität für Ionen mit einem bestimmten Radius und können aufgrund dieser Eigenschaft für eine Anreicherung oder eine selektive Trennung von Spurenelementen aus einer Lösung eingesetzt werden. Als wesentlicher Nachteil ist die geringe Austauschgeschwindigkeit zu vermerken. Bei der Aktivkohle steht die physikalische Adsorption an der äußeren und inneren Oberfläche im Vordergrund. Sie bindet bevorzugt solche Spurenelemente, die in Form von Komplexen mit möglichst großen organischen Liganden oder als Kolloide in Lösung vorliegen. Dies kann man sich zunutze machen, indem man der Lösung einen geeigneten organischen Komplexbildner zusetzt und mit Aktivkohle schüttelt oder durch eine Filterschicht mit Aktivkohle filtriert. Alle Spurenelemente, die unter den gegebenen Bedingungen (pH-Wert, Temperatur) in Form von organischen Komplexen vorliegen, werden mit Ausbeuten R > 0,9 an der Aktivkohle gebunden. Daraus ergeben sich auch Möglichkeiten f ü r die Abtrennung von Spurenelementen von Hauptbestandteilen oder störenden Nebenbestandteilen. Schüttelt man 0,1 bis 1 1 Lösung mit 0,1 g Aktivkohle, so erhält man Anreicherungsfaktoren F = 103 bis 104. Die mit den Elementspuren beladene Aktivkohle kann anschließend unmittelbar der Messung zugeführt werden, z. B. durch Energie-dispersive R F A oder NAA. In der Literatur sind viele Beispiele für die Anreicherung von Spurenelementen an Aktivkohle beschrieben. Als Komplexbildner werden erwähnt: 8-Hydroxychinolin (Oxin) [127], Diethyldithiocarbamat (DDTC) [128, 129] und Hexamethylendithiocarbamat [130], Dithizon [129], Dithiophosphorsäureester [131, 132] und andere Verbindungen, bevorzugt solche hoher Molmasse, weil diese in größerem U m f a n g an Aktivkohle adsorbiert werden. Neben der Adsorption an Aktivkohle ist das wesentliche Kriterium f ü r die Auswahl der Komplexbildner, daß sie stabile Komplexe mit den anzureichernden Spurenelementen bilden. Auch metallorganische Verbindungen wie Alkyl- oder Dialkylquecksilber werden an Aktivkohle adsorbiert. Das wesentliche Problem bei der Verwendung von Aktivkohle ist ihre Reinheit. Es ist deshalb unbedingt erforderlich, Blindproben zu messen, und außerdem sinnvoll, möglichst kleine Mengen an Aktivkohle einzusetzen.

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Gelegentlich hydrophobisiert man auch die Oberfläche von anorganischen Sorbentien, um die Adsorption von hydrophoben Verbindungen, insbesondere Komplexen von Spurenelementen mit organischen Liganden, zu erhöhen. So silaniert man beispielsweise Silicagel oder Glaskugeln durch Behandlung mit Dimethyldichlorsilan oder mit Octadecyltrichlorsilan. Diese P r o d u k t e adsorbieren Verbindungen, wie den Komplex, den Co mit 2-(2-pyridylazo)-5-diethylaminophenol bildet [133] oder die Oxinate von Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Cd u n d P b aus wäßrigen Lösungen oder Meerwasser [134, 135]. Eine Variante ist die Beladung anorganischer Trägersubstanzen mit organischen Komplexbildnern in einem organischen Lösungsmittel. Auf diese Weise k a n n man eine Anreicherung durch Chromatographie erreichen („Reversed phase" Verteilungs- oder Extraktionschromatographie). Ein Beispiel ist die Beladung von Diatomit mit Dithizon in o-Dichlorbenzol als stationäre Phase für die Abtrennung von Ag und Cu [136]. Eine Variante ist die Beladung von Silicagel mit organischen Reagentien. So können mit Hilfe von 2-Merkaptobenzothiazol oder p-Dimethylaminobenzylidenrhodanin oder l-Nitroso-2-naphthol auf Silicagel die Elemente Cd, Cu, Pb, Zn, Hg, Ag, Au, P d und Co aus Flußu n d Meerwasser abgetrennt und angereichert werden [137 — 139].

9 Anreicherung an organischen Sorbentien Auch organische Sorbentien werden f ü r die Anreicherung von Spurenelementen eingesetzt. Die einfachste Möglichkeit ist die Verwendung von schwerlöslichen organischen Reagentien in pulverisierter Form. Diese reagieren mit Spurenelementen in der Lösung unter Komplexbildung. Die Einstellung des heterogenen Gleichgewichts k a n n durch Ultraschallbehandlung beschleunigt werden. Beispiele sind die Anreicherung von Ag, Fe u n d Co an Dithizon oder l-Nitroso-2-naphthol [140, 141], die Anreicherung von Ni an Naphthalin, das mit l-(2-Thiazolylazo)-2-naphthol versetzt ist [142], u n d die selektive Anreicherung von Ag an frisch gefälltem p-Dimethylaminobenzylidenrhodanin [143]. In allen Fällen ist eine direkte Bestimmung durch Energie-dispersive R F A möglich. Schwer lösliche organische Reagentien können auch auf Filterpapier aufgebracht und als Filterschicht eingesetzt werden. Beispiele sind mit Dithizon oder 5-(4-Dimethylamino-benzyliden)-rhodanin imprägnierte Filter [144, 145], Auch mit Hilfe der Gelfiltration können Anreicherungen durchgeführt werden. So werden an Dextran-Gel (Sephadex G-25) B u n d V aus wäßrigen Lösungen angereichert. Nach der Elution mit verdünnter HCl ist eine spektralphotometrische Bestimmung möglich [146]. Polyurethan-Schäume, die Polyether-Gruppen enthalten, haben interessante Sorptionseigenschaften und werden deshalb in der analytischen Chemie für Trennungen eingesetzt [147 — 154]. Sie binden z. B. Elemente, die unter den gleichen Bedingungen in Ethylether extrahierbar sind, z. B. Fe 3 + , Au 3 + , Tl 3 + aus salzsauren Lösungen oder Fe 3 +, Cr 2+ , Zn 2 + , Cd 2+ aus Thiocyanat-haltigen Lösungen [153]. Sie sind auch, in ähnlicher Weise wie Kronenether, in der Lage, Kationen in den von den K e t t e n

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gebildeten Hohlräumen einzulagern. Gleichzeitig werden die dazugehörigen Anionen gebunden, z. B. [TaF c ] _ [154]. I m Gegensatz zu den Kronenethern ist die Größe der Hohlräume im Gerüst jedoch variabel, so daß keine Selektivität aufgrund der Ringgröße vorhanden ist. Schließlich bietet sich die Möglichkeit an, ein organisches Trägermaterial, einen (vorzugsweise makroporösen) Harzaustauscher oder Polyurethan-Schaum mit einem Komplexbildner zu beladen, sei es durch oberflächliche Beschichtung oder durch Polymerisation in Anwesenheit des Komplexbildners zur Immobilisierung der Ankergruppen. Beispiele f ü r die Beschichtung eines organischen Trägermaterials mit einer komplexbildenden stationären Phase sind makroporöse Harze, die mit einer Lösung eines tertiären Amins in einem organischen Lösungsmittel (z. B. Trioctylamin in Cyclohexan) [155] behandelt sind u n d PolyurethanSchäume, die immobilisierte Komplexbildner wie T B P enthalten. Trennungen bzw. Anreicherungen mit Substanzen dieser Art wurden bereits in Abschnitt 7 besprochen.

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168 146. 147. 148. 149. 150. 151. 152. 153. 154.

K . H . Lieser

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HPLC von Aminosäuren und Proteinen Prof. Dr. Heinz Engelhardt Angewandte Physikalische Chemie Universität des Saarlandes, D-6600 Saarbrücken

1 Chromatographie von Aminosäuren 1.1 Trennsysteme für die Aminosäurenanalytik 1.2 Derivatisierung von Aminosäuren 1.3 Vorsäulen-Derivatisierung 1.3.1 Trennung von Aminosäure-Derivaten 1.4 Nachsäulen-Derivatisierung 1.4.1 Trennung der freien Aminosäuren 1.4.2 Derivatisierungsreagenzien 1.4.3 Aufbau eines Reaktionsdetektors 1.5 Zusammenfassung 2 Chromatographie von Proteinen 2.1 2.2 2.3 2.4

Trennung Trennung Trennung Trennung

an U m k e h r p h a s e n an Ionenaustauschern durch Ausschlußchromatographie durch Aussalzchromatographie

Literatur

169 170 171 172 172 180 180 182 184 188 190 190 192 192 194 195

1 Chromatographie von Aminosäuren Die Trennung von Aminosäuren war das erste vollautomatische chromatographische Verfahren mit Nachsäulenderivatisierung. Die Trennung wurde an einem Kationenaustauscher durchgeführt, u n d der Nachweis erfolgte im E l u a t mittels Ninhydrin nach der Trennung [1]. Dieses Verfahren h a t seinen Platz in jedem Proteinlaboratorium seit mehr als 30 J a h r e n . Daneben wurde jedoch wegen der geringen Nachweisstärke dieses Verfahrens und der relativ großen Analysenzeiten auch die GasChromatographie zur Trennung von Aminosäuren eingesetzt. Zur Verbesserung der Flüchtigkeit und der Stabilität mußten die Aminosäuren vor der Trennung derivatisiert werden. Ein Überblick über die Möglichkeiten der Gas-Chromatographie bei der Analytik der Aminosäuren ist in dieser Reihe erschienen [60]. Mit dem Erscheinen der H P L C und dem Bedürfnis nach sehnelleren und empfindlicheren Trenn- und Nachweisverfahren h a t die Aminosäureanalytik einen weiteren Schritt vorwärts

170

H. Engelhardt

getan. Wurde zunächst nur das klassische Trennverfahren durch Modifikation der Trennharze bzw. Änderung und Verbesserung der Detektionsmethode nach der Trennung an die Gegebenheiten der H P L C angepaßt, so wird in letzter Zeit das gesamte Gebiet der Aminosäureanalytik im Hinblick auf Trennsystem, Derivatisierungsmethode vor oder nach der Trennung, Verbesserung der Nachweisempfindlichkeit bis zur Automatisierung der einzelnen Schritte optimiert. Die Aminosäureanalytik ist ein gutes Beispiel dafür, daß es für analytische Probleme selten ein optimales Trennsystem gibt, sondern daß die Auswahl des geeigneten Trennsystems von der analytischen Fragestellung, z. B. von der Matrix, in der die Aminosäuren bestimmt werden sollen, von der gewünschten und benötigten Naehweisempfindlichkeit und von der benötigten (möglichen) Analysengeschwindigkeit abhängt. Damit stellt sich auch die Frage, ob zunächst Derivate der Aminosäuren hergestellt werden, die dann getrennt werden oder ob die getrennten Aminosäuren nachträglich (on line) in absorbierende bzw. fluoreszierende Derivate umgewandelt werden (z. B. in einem chemischen Reaktionsdetektor, postcolumn derivatisation). Prinzipiell wäre eine Detektion mittels Refraktometer oder im UVDetektor bei 205 nm möglich. Die Nachweisempfindlichkeit u n d die Selektivität ist jedoch bei beiden nicht ausreichend. Nachdem sich die Aminosäuren in ihrer Polarität stark unterscheiden, ist das R e f r a k t o m e t e r f ü r die Detektion wegen der stets notwendigen Gradientelution ungeeignet.

1.1 Trennsysteme für die Aminosäurenanalytik Wegen der leichten Wasserlöslichkeit der Aminosäuren und ihrer Derivate kommen zwei Trennsysteme in Frage, die Trennung an Ionenaustauschern und an Umkehrphasen. Die Ionenaustausch-Chromatographie wurde bei dem von Moore u n d Stein vor mehr als 30 J a h r e n eingeführten ersten vollautomatischen LC-System mit Derivatisierung nach der Trennung eingesetzt u n d findet auch heute noch in den automatischen Aminosäure-Analysatoren Verwendung [1, 2]. Es ist auf HPLC-Systeme übertragbar. Hierbei werden ausschließlich freie Aminosäuren und kleine Peptide getrennt. Der Nachweis erfolgt nach der Trennung im E l u a t der Trennsäule. Hierfür ist mindestens eine zweite P u m p e zur Förderung des Reagenzes erforderlich. Das Gemisch aus E l u a t u n d Reagenz muß solange im System verbleiben, bis die Reaktion abgelaufen ist. Dabei sollte die in der Säule erreichte Trennung nicht durch zusätzliche Bandenverbreiterung zunichte gemacht werden. Für den Nachweis wurden neben dem klassischen Ninhydrinsystem [3] zunehmend sehr schnell verlaufende Reaktionen, wie Derivatisierung mit Fluorescamin [4, 5] und o-Phthalaldehyd (OPA) [6, 7] eingesetzt. Die Chromatographie an Umkehrphasen eignet sich besser für die Trennung von Derivaten als von freien Aminosäuren, jedoch ist die Trennung auch letzterer möglich. Zur Verbesserung der Effizienz und der Selektivität muß über den Eluenten das chromatographische Milieu beeinflußt werden. Eine Herabsetzung des pH-Wertes oder der Zusatz

171

H P L C von Aminosäuren u n d Proteinen

v o n geeigneten Gegenionen (Ionenpaar-Chromatographie) sind einfach h a n d h a b b a r e O p t i m i e r u n g s m e t h o d e n [8]. Die R e p r o d u z i e r b a r k e i t der R e t e n t i o n s d a t e n u n d deren Ü b e r t r a g b a r k e i t v o n Säule zu Säule bei der A m i n o s ä u r e n a n a l y s e u n t e r s c h e i d e n sich n i c h t v o n der a n d e r e r chromatographischer T r e n n s y s t e m e . Von der g e n a u e n Beschreibung von T r e n n s y s t e m e n , d. h. Säule u n d e x a k t e E l u e n t e n z u s a m m e n s e t z u n g w u r d e A b s t a n d g e n o m m e n . Auch l ä ß t bek a n n t l i c h die R e p r o d u z i e r b a r k e i t der s t a t i o n ä r e n P h a s e n i m m e r noch zu wünschen übrig. Einige Modelltrennungen m i t S t a n d a r d g e m i s c h e n sollen jedoch die verschiedenen T r e n n s y s t e m e u n d ihre Möglichkeiten demonstrieren.

1.2 Derivatisierung der Aminosäuren Das P r o b l e m der A m i n o s ä u r e a n a l y t i k k o n z e n t r i e r t sich auf den selektiven u n d empfindlichen Nachweis der A m i n o s ä u r e n . D a die zur V e r f ü g u n g s t e h e n d e P r o b e m e n g e sowohl bei P r o t e i n e n , deren S t r u k t u r a u f g e k l ä r t

Tabelle 1. Vor- u n d Nachsäulenderivatisierung Vorsäulenderivatisierung

Nachsäulenderivatisierung

Vorteile

einfaches Verfahren Chromatograph. System ble unverändert R e a k t i o n s d a u e r unwichtig Reaktionsbedingungen frei wählbar

kontinuierliches on-lineVerfahren leicht automatisierbar T r e n n u n g erfolgt m i t der Ursubstanz Trennung durch überschüssiges Reagens nicht gestört zeitaufwendige u. verlustreiche Probenvorbereitung entfällt R e a k t i o n m u ß nicht vollständig ablaufen Trennung nicht durch A r t e f a k t e gestört bessere Reproduzierbarkeit D e t e k t o r e n in Serie möglich

Nachteile

Probesubstanzen werden im allgemeinen einander angeglichen R e a k t i o n m u ß q u a n t i t a t i v ablaufen T r e n n u n g k a n n gestört werden durch

apparativer A u f w a n d zusätzliche Bandenverbreiter u n g im R e a k t o r Reaktionsbedingungen nicht frei wählbar (Eluent) die d e t e k t i v e n Eigenschaften von Reagens u n d Reaktionsp r o d u k t e n müssen stark unterschiedlich sein

— Reaktionsmedium — Artefaktbildung — mehrere Derivate einer Komponente

172

H. Engelhardt

werden soll, als auch bei ernährungswissenschaftlichen Versuchen sehr gering ist, sollten die Nachweisreaktionen die Detektion im pmol-Bereich erlauben. Die Konzentration der Aminosäuren in Körperflüssigkeiten liegen im ppb-Bereich und darunter. Wie bereits ausgeführt, kann die Derivatisierung vor der Trennung durchgeführt werden. Die Derivatisierung sollte quantitativ zu einheitlichen Produkten führen, überschüssiges Reagenz sollte nicht stören. Durch die Derivatisierung werden die Produkte wohl einander ähnlicher, ihre Trennung stellt aber dank der großen Selektivität der chromatographischen Systeme selten ein Problem dar. Die Vorsäulenderivatisierung kann häufig auch automatisiert unmittelbar vor der Trennung durchgeführt werden. Die Derivatisierung nach der Trennung erfordert allgemein einen größeren apparativen Aufwand. Zur Erzielung höherer Nachweisempfindlichkeit müssen kommerzielle Geräte oftmals optimiert werden. Die Vor- und Nachteile der verschiedenen Derivatisierungsmethoden sind in Tabelle 1 zusammengestellt und werden im folgenden im Zusammenhang mit den Trennsystemen diskutiert.

1.3 Vorsäulen-Derivatisierung 1.3.1 Trennung von 1. Derivatisierung

mit

Aminosäure-Derivaten Phenylisothiocyanat

a) Nach Abbaureaktionen Bei dem Abbau nach E d m a n entstehen durch Umsetzung mit Phenylisothiocyanat die Phenylthiohydantoine (PTH) der Aminosäuren, die ausreichende UV-Absorption zeigen. Obwohl das Absorptionsmaximum bei 269 nm liegt, ist die Empfindlichkeit, die man mit der Detektion bei 254 nm erzielt, ausreichend. Die Nachweisgrenze scheint im Bereich von 5 pmol zu liegen. Die Ausgangsmenge von Protein, mit dem die Sequenzanalyse durchgeführt wird, sollte bei 1 —lOnmol liegen [9]. Mit Mikrosäulentechnik sollte eine Verbesserung bis um den Faktor 10 möglich sein. Die Trennung stellt das größere Problem dar. Bei jedem Abbauschritt entsteht theoretisch wohl nur ein Aminosäure-Derivat (falls der Abbau quantitativ erfolgt), das Trennsystem sollte jedoch die vollkommene Trennung und Identifizierung aller etwa 20 interessanten PTH-Aminosäuren ermöglichen. Die Trennung läßt sich mit BP-Systemen (z. B. Octadecylphasen) und Wasser-Acetonitril-Gemischen als Eluenten durchführen. Zur Trennung aller 18—22 PTH-Derivate ist oft Gradientelution unerläßlich. Jedoch ist auch die isokrate Arbeitsweise erfolgversprechend [61]. Abbildung 1 zeigt eine isokrate Trennung von PTH-Aminosäuren in 15 Minuten im pmol-Bereich. In der gleichen Abbildung ist auch der Gewinn an Nachweisempfindlichkeit bei der Reduzierung des Säulendurchmessers von 4 auf 2 mm demonstriert. Probleme bereiten insbesondere die basischen PTH-Derivate von Arginin und Histidin, deren Retention stark von Restsilanolgruppen der stationären Phase beeinflußt wird. Beide PTH-Derivate sollten, da es sich um sehr polare Komponenten

HPLC von Aminosäuren und Proteinen

173

De

V

IftJ

S J

3

9

12

min 15

Abb. 1. Isokratische Trennung von PTH-Aminosäuren. Trennsäule: 250 x 4 m m ; Superspher CH 8 (Merck, Darmstadt), 4 (im; Eluent: Na-acetatpuffer (21 mmol, p H 4,9)/Acetonitril/l,2 Dichlorethan (68,5/31/0,5); Fluß 2 ml/min; Temperatur 59°C. Detektion: 264 nm, 0,005 aufs; Probemenge 5 (j,l = 5 pmol. Bei Trennung an narrow bore Säule (250 x 2 mm) betrug die Probemenge 500 fmol. (Chromatogramm im Einschub). [64]

handelt, am Anfang des Chromatogramms eluiert werden. Die Elution ist jedoch stark von den Eigenschaften der stationären Phase und der Betriebsdauer der Säule abhängig. Der Zusatz von Ionenpaarbildnern oder von Säuren zur Unterdrückung der Dissoziation kann sich hierbei als nützlich erweisen [11]. Die direkte Kopplung eines automatischen Sequenzers mit HPLC-Trennung erscheint möglich [12]. Bei Abbaüreaktionen werden noch andere Isothiocyanate eingesetzt (z. B. 4-DimethyIaminoazobenzol-4'-isothiocyanat, das die D A B T H -

H. Engelhardt

174

Derivate mit Absorptionsmaximum bei 436 nm ergibt). Die Trennung an Umkehrphasen mit Gradient ist möglich [13]. b) Umsetzung von Aminosäuren mit Phenylisothiocyanat Setzt man freie Aminosäuren mit dem Edman-Reagenz Phenylisothiocyanat um, so entstehen die Phenylthiocarbamylderivate der Aminosäuren [14], die an Umkehrphasen getrennt und mit UV-Detektoren (254 nm) oder elektrochemisch [10] nachgewiesen werden können. Das folgende Reaktionsschema möge den Unterschied der Reaktion von Phenylisothiocyanat mit Peptiden bzw. Aminosäuren verdeutlichen. a) Edman-Abbau

+

h2n-ch-c-nh-r

—"

0

N= C=S

NH F( S=C-NH-CH-C-NH-R Ö

b) Phenylthiocarbamyl-Derivate R h2n-ch-cooh N=C=S

9

»

NH-C-NH-CH-C00H

Die Derivatisierung läßt sich automatisieren und in ein kommerzielles HPLC-System integrieren [15]. Die Derivatisierung benötigt 10—20 min, während die Trennung (Gradient) in ca. 12 min abgeschlossen ist. Sowohl primäre als auch sekundäre Aminosäuren können bis herab zu 1 pmol sicher identifiziert und quantifiziert werden. Die Trennung der Carbamylderivate eines Proteinhydrolisates zeigt Abbildung 2. 2.

Dansyl-Derivate

Durch diese Derivatisierung wird der zwitterionische Charakter der Aminosäuren aufgehoben, was die Probleme bei der Chromatographie herabsetzt. Erstaunlicherweise reichen die Selektivitäten aus, um die durch die Derivatisierung sehr ähnlich gewordenen Verbindungen noch

H P L C von Aminosäuren u n d Proteinen

175

Abb. 2. Trennung der Phenylisothiocarbamyl-Derivate von Aminosäuren. Trennsäule: 250 x 4 m m LiChrosorb R P 18 — 5 [j.m; E l u e n t : A : 0,05 m N a - a c e t a t p u f f e r (pH 6,5); B : 500 ml 0 , 1 m Na-acetat (pH 6,5) + 400 ml Acetonitril + 100 ml Methanol; Fluß 1 ml/min; T e m p e r a t u r 55°C; Detekt i o n : 254 n m , 0,05 a u f s ; Probemenge ca. 500pmol. [65]

zu t r e n n e n . Die Derivatisierung m i t D i m e t h y l a m i n o - n a p h t h a l i n - s u l f o n säure-ohlorid erfolgt a m Stickstoff, die Dissoziation der freien Carboxylg r u p p e l ä ß t sich leicht u n t e r d r ü c k e n , so d a ß eine effiziente Chromatog r a p h i e der D a n s y l - A m i n o s ä u r e n m i t t e l s U m k e h r p h a s e n u n p r o b l e m a t i s c h ist. Allerdings ist ebenfalls Gradientelution erforderlich. Dansyl-Aminosäuren k ö n n e n sowohl im U V als a u c h m i t Fluoreszenzd e t e k t o r (Anregung bei 360 n m , Emission bei 480 nm) nachgewiesen werden. Nachweisgrenzen im fmol-Bereieh mittels Fluoreszenz w u r d e n beschrieben [16]. Analoge D e r i v a t e e n t h a l t e n . d e n Chromophor des Azobenzols (DABS = 4-Dimethylaminoazobenzol-4'-sulfochlorid) und w e r d e n im sichtbaren (436 nm) d e t e k t i e r t . ' Die P r o b l e m e m i t der Dansylierung liegen d a r i n , d a ß es schwierig ist, reproduzierbar eindeutige R e a k t i o n s p r o d u k t e des Dansylchlorids m i t d e n A m i n o s ä u r e n zu e r h a l t e n , insbesondere m i t Lysin u n d Arginin. D a r ü b e r h i n a u s e n t s t e h e n aus dem im Ü b e r s c h u ß zuzusetzenden R e a g e n z P r o d u k t e , die bei der Identifizierung u n d T r e n n u n g stören k ö n n e n . Die D a n s y l d e r i v a t e der Aminosäuren k ö n n e n a n geeigneten chiralen s t a t i o n ä r e n P h a s e n [17] bzw. n a c h Zusatz chiraler R e a g e n z i e n z u m

H. Engelhardt

176

L-otNbu

D-ocNbu

9

min

12

9

min

12

L-Thr

Abb. 3. Enantiomerentrennung von Dansylaminosäuren an chemisch gebundenen chiralen Phasen Trennsäule: 100 X 4 mm L-Prolin gebunden an Liehrosorb Si 100, 10[i.m; Eluent: 0,1 m Ammoniumacetatpuffer pH 7,8/Acetonitril (7/3, v/v), 10 ex —5 m Kupferionen; Fluß 1 ml/min Eluenten [18] in die Enantiomeren aufgetrennt werden. Die Gefahr der Racemisierung der Aminosäuren bei der Umsetzung mit Dansylchlorid ist gering, so daß dieses System zur Überprüfung der optischen Reinheit von Aminosäuren verwendet werden kann. Die Selektivität

177

HPLC von Aminosäuren und Proteinen

der E n a n t i o m e r e n t r e n n u n g ist groß. R e l a t i v e B e t e n t i o n e n über 2 sind keine Seltenheit. Die P h a s e n f ü r die E n a n t i o m e r e n t r e n n u n g sind allerdings n i c h t f ü r die T r e n n u n g der D a n s y l a m i n o s ä u r e n geeignet. E i n e zweidimensionale Arbeitsweise, z. B. z u n ä c h s t T r e n n u n g der Dansylaminosäuren a n R P - S y s t e m e n u n d anschließende E n a n t i o m e r e n t r e n n u n g der einzelnen Dansyl-Aminosäuren a n chiralen P h a s e n ist erforderlich. Die T r e n n u n g einiger Dansyl-Aminosäurenderivate a n einer chiralen s t a t i o n ä r e n P h a s e (Kieselgel modifiziert m i t L-Prolin g e b u n d e n ü b e r 3-Aminopropylsilylgruppen) zeigt A b b i l d u n g 3 [17]. 3. Derivate mit o-Phthalaldehyd

(OPA)

Die R e a k t i o n v o n o - P h t h a l a l d e h y d im alkalischen M e d i u m m i t p r i m ä r e n A m i n e n in Gegenwart v o n M e r k a p t o d e r i v a t e n zu s t a r k fluoreszierenden Isoindolderivaten (OPA-Derivate) v e r l ä u f t a u c h bei R a u m t e m p e r a t u r schnell u n d e i n d e u t i g n a c h folgendem R e a k t i o n s s c h e m a :

hsch r +

OC- - >-

S-CH 2 -R

r

** CCV

o-Phthalaldehyd' Die T r e n n u n g a n U m k e h r p h a s e n m i t anschließender Fluoreszenzd e t e k t i o n stellt eine schnelle, empfindliche u n d selektive Nachweismethode f ü r alle A m i n o s ä u r e n m i t p r i m ä r e n A m i n o g r u p p e n d a r . Die Derivatisierung w u r d e v o n R o t h [ 6 , 7 ] z u n ä c h s t f ü r d e n post-column-Nachweis eingesetzt, wird aber a u c h f ü r die Vorsäulenderivatisierung empfohlen [19, 20]. Hier wird z u n ä c h s t n u r die P r o b l e m a t i k der Vorsäulenderivatisierung besprochen. N e b e n d e m ursprünglich v e r w e n d e t e n E t h y l m e r k a p t a n w e r d e n M e r k a p t o e t h a n o l , E t h a n d i t h i o l , P r o p y l m e r k a p t a n u n d 3Merkaptopropionsäure v e r w e n d e t . Das M e r k a p t a n (es soll a u c h als R e d u k t i o n s m i t t e l wirken) wird in die I s o i n d o l e n i n s t r u k t u r m i t eingebaut, d a h e r unterscheiden sich die verschiedenen O P A - D e r i v a t e a u c h in ihrem R e t e n t i o n s v e r h a l t e n u n d in ihrer S t a b i l i t ä t . Die U m s e t z u n g f i n d e t n u r m i t p r i m ä r e n A m i n o s ä u r e n s t a t t . Prolin u n d H y d r o x y p r o l i n k ö n n e n d a h e r nicht d e t e k t i e r t werden. Die Reaktionsp r o d u k t e m i t Cystein u n d Cystin zeigen n u r schwache Fluoreszenz. I m letzteren Falle h i l f t die Alkylierung des Cysteins m i t Jodessigsäure vor der O P A - R e a k t i o n [21] oder Oxidation zu Cystinsulfonsäure [22], F ü r den Nachweis der s e k u n d ä r e n A m i n o s ä u r e n wird bei der post-columnDerivatisierung die Oxidation m i t Chloramin T (wirksam ist N a t r i u m hypochlorit) v e r w e n d e t . E i n e Modifizierung dieses V e r f a h r e n s f ü r die Vorsäulenderivatisierung, wobei ein zusätzlicher R e d u k t i o n s s c h r i t t m i t N a t r i u m b o r a n a t e i n g e f ü g t wird, w u r d e beschrieben [23]. Die Derivatisierung der A m i n o s ä u r e n geschieht im alkalischem (Boratp u f f e r p H 9,5 — 10) d u r c h Z u g a b e einer methanolischen Lösung des Merk a p t a n s u n d v o n O P A . D a O P A in Alkali n i c h t stabil ist u n d M e r k a p t a n e in diesem Medium leicht o x i d i e r t werden, stellt m a n sich zweckmäßiger-

178

H. Engelhardt

weise die methanolischen Lösungen getrennt her. Nach eigenen Erfahrungen kann die Mischung aus Puffer, OPA und Merkaptan jedoch mindestens 24 Stunden aufbewahrt werden, ohne daß das quantitative Ergebnis beeinflußt wird. Die Lösung sollte wegen der Oxidation von Aldehyd und Merkaptan unter Luftabschluß aufbewahrt werden. Es wurde gezeigt [6], daß die Fluoreszenzausbeute bei pH 9,5 etwa 10- bis 30mal größer ist als bei pH 6,0. Dies dürfte auf die erhöhte Reaktionsgeschwindigkeit im stark alkalischen Medium zurückzuführen sein (Untersuchung mit post-column-Derivatisierung). Die chromatographischen Trennungen werden stets bei pH-Werten zwischen 6 und 7,5 durchgeführt, sicher um die Standzeit der Trennsäule nicht unnötig zu verkürzen. Es gibt in der Literatur keinen Hinweis, ob durch nachträgliche Erhöhung des pH-Wertes (post-column-Addition) die Fluoreszenzintensität merklich verbessert werden konnte. Im Gegensatz zu den PTH- und Dansylderivaten ist die Lebensdauer der OPA-Derivate begrenzt. Schon parallel mit der Bildung beginnt bereits die Zersetzung der Derivate. Die geringe Halbwertszeit der OPADerivate kann einige Probleme bei der quantitativen Bestimmung verursachen. Bei pH 4 —6 wurden Halbwertszeiten zwischen 6 und 60 min bestimmt [24]. Automatisierung mag helfen, diese Fehlerursache zu vermindern. Die Zersetzungsgeschwindigkeit hängt ab u. a. vom Uberschuß an OPA und von der Art des Merkaptans. Es wurde gezeigt, daß unpolarere Merkaptane (Ethylmerkaptan gegenüber Merkaptoethanol) die Lebensdauer erhöhen [25]. Mit tert. Butylmerkaptan soll die Lebensdauer einige Stunden betragen [26], Ganz geklärt scheint dies jedoch noch nicht zu sein, da sehr lange Lebenszeiten auch mit 3-Merkaptopropanol [27] bzw. 3-Merkaptopropionsäure [28, 29] erhalten wurden. Letztere Verbindungen haben den Vorteil des niedrigen Dampfdrucks und der dadurch bedingten geringeren Geruchsbelästigung. Da die Reaktion mit OPA sehr schnell bei Raumtemperatur abläuft, andererseits die Derivate instabil sind, ist diese Methode prädestiniert für die on-line-Derivatisierung unmittelbar vor der Injektion auf die Trennsäule. Reaktionszeiten zwischen 60 und 120 sec sind in allen Fällen ausreichend. Mittels automatischer Probeaufgabesysteme wird nacheinander Reagenz und Probelösung aufgezogen, in einer Mischkammer vermengt und nach Beendigung der Reaktion auf die Säule aufgegeben. In der Zwischenzeit bieten verschiedene Firmen Zusatzeinrichtungen und -programme zur Automatisierung dieser Vorsäulenderivatisierung an. Die Reproduzierbarkeit der automatischen Vorsäulenderivatisierung dürfte besser sein als die manuelle Probenvorbereitung. Mit automatisierter Probevorbereitung wurden für Retentionszeiten Standardabweichungen von 0,8% und für die quantitative Flächenauswertung eine solche von 1,9% angegeben [15]. Die Trennung wird mittels Gradientelution an RP-Säulen durchgeführt. Die Polarität der Derivate ist eine Funktion des eingesetzten Merkaptans, so daß verschiedene Gradientsysteme verwendet werden, z. B. 20% CH3OH zu 80% CH3OH bei Verwendung von Merkaptoethanol. Mit 3-Merkaptopropionsäure reicht ein Gradient zu 50% Acetonitril. Die Derivate können im UV (Absorptionsmaximum 320 — 340 nm), aber besser und empfindlicher mit Fluoreszenz nachgewiesen werden.

HPLC von Aminosäuren und Proteinen

179

Die Anregung k a n n zwar bei 340 nm erfolgen, man erhält jedoch ein wesentlich stärkeres Signal, wenn m a n bei 220 nm anregt. Die Emission erfolgt bei 450 nm. Mit der UV-Absorption können einige nmol nachgewiesen werden. Während mittels Fluoreszenzanregung bei 340 nm die Nachweisgrenze bei 0,5 pmol (500 fmol) liegt, k a n n mittels Anregung bei 220 n m die Nachweisgrenze noch um einen Faktor 10 vermindert werden (40 fmol) [30]. Ähnlich niedrige Nachweisgrenzen sollen mit elektrochemischer Detektion der Isoindoleninderivate möglich sein [26], Die OPA-Vorsäulenderivatisierung scheint augenblicklich die empfindlichste u n d schnellste Analysenmethode für Aminosäuren zu sein, wobei allerdings die Instabilität der Derivate einiger Aminosäuren und die Unmöglichkeit der direkten Derivatisierung von Aminosäuren mit sekundären Aminogruppen Nachteile darstellen. Eine Trennung der OPADerivate von Aminosäuren (1 nmol) mittels Gradientelution zeigt Abbildung 4 [29],

Abb. 4. Vorsäulen-Derivatisierung mit OPA. Trennung eines Proteinhydrolisates Trennsäule: 250 x 4 m m LiChrosorb R P 18 —5(j.m; Gradient-Elution: A: 10% Acetonitril in 12,5 mmol Na-phosphat, p H 7,2: B : 50% Acetonitril in 12,5 mmol Na-phosphat, p H 7,2; Fluß 1,5 ml/min; Detektion: 330 nm, 0,04 aufs; Probemenge 1 nmol [65]

180

H. Engelhardt

4. Andere Derivatisierungsreagenzien

(NBD,

FMOC)

Es werden noch andere Reagenzien eingesetzt und beschrieben (eine ausführliche Zusammenstellung findet sich u. a. bei [59]). Ob diese Derivatisierungen ähnlich preiswert und einfach durchzuführen sind und die OPA-Methode verdrängen können, ist fraglich. So ist z. B . 7-Chlor- bzw. 7-Fluor-4-nitrobenzo-2-oxa-l,3-diazol (NBD) [31, 32] ein Reagenz, das in der Nachweisempfindlichkeit mit OPA konkurrieren kann und dessen Aminosäuren-Reaktionsprodukte einfach an Umkehrphasen zu trennen sind. Ein Problem stellt sich jedoch bei allen Derivatisierungsreagenzien: I m Chromatogramm sollen im interessanten Trennbereich keine zusätzlichen Peaks auftreten, die auf das Reagenz bzw. seine Zersetzungsprodukte zurückzuführen sind. Nur solche Reagenzien sind ideal, wo diese Produkte einfach von den AminosäureDerivaten abzutrennen sind. Bei der Umsetzung mit FMOC (9-Fluorenylmethylchloroformate)

H2N-CH-C00H

R C H2, - 0 - C - N H - C H - C 0 0 H

ii

FMOC

[33, 34], das sowohl mit primären als auch mit sekundären Aminosäuren fluoreszierende Derivate gibt, die sich ebenfalls an Umkehrphasen trennen lassen, werden die zu trennenden Aminosäuren-FMOC-Derivate durch das Reagenz bzw. seine Reaktionsprodukte mit Wasser im Chromatogramm überdeckt. Durch eine Extraktion mit Pentan [35] sollen sich die störenden Produkte nahezu quantitativ entfernen lassen. Die Trennung eines physiologischen Standards von 24 Aminosäuren als FMOC-Derivate zeigt Abbildung 5 [28]. Die relativ geringen Peakhöhen in der Mitte des Chromatogramms könnten auf Mitextraktion der Derivate dieser Aminosäuren zurückzuführen sein. Dieser notwendige Extraktionsschritt erschwert den Einsatz dieser Derivatisierungsreaktion bei der automatischen Vorsäulenderivatisierung. Eine Kombination der OPA- und der FMOC-Derivatisierung soll jedoch automatisierbar den empfindlichen Nachweis sowohl der primären als auch der sekundären Aminosäuren erlauben [36]. 1 . 4 Nachsäulen-Derivatisierung 1.4.1 Trennung

der freien

Aminosäuren

Beim Nachweis mittels Nachsäulenderivatisierung werden stets die freien Aminosäuren als solche getrennt. Die speziell entwickelten automatischen Aminosäureanalysatoren verwenden die Ionenaustauschchromatographie und die Umsetzung nach der Trennung mit Ninhydrin zum Nachweis [1]. Es werden Kationenaustauscher auf Polystyrolbasis verwendet. Wegen der Kompressibilität und der Änderung des Quell-

HPLC von Aminosäuren und Proteinen

181

Abb. 5. Vorsäulen-Derivatisierung mit FMOC Trennsäule: 2 5 0 x 4 m m LiChrosorb CH 8 — 4 fxm; Gradient-Elution: A : 20% Acetonitril in 50 mmol Na-acetatpuffer p H 4,2; B : 70% Acetonitril in 50 mmol Na-acetatpuffer p H 4,2; Fluß: 1,5 ml/min; Detektion: Fluoreszenz, Anregung 260 nm, Emission 310 n m ; Probemenge: 25 pmol/Aminosäure [65]:

Verhaltens (Packungshöhe in den Säulen ä n d e r t sich) k a n n Trennung u n d insbesondere die Regenerierung nur m i t langsamen Flüssen durchgeführt werden. Ein Analysenzyklus (3—4 Stunden) mit Trennung und Regenerierung dauert sehr lange, so daß frühzeitig vollautomatisierte Geräte mit automatischer Probenaufgabe entwickelt wurden. Mit neuen, stärker vernetzten Ionenaustauschern [37], die auch mit kleinen Teilchendurchmessern (10 — 30 (im) hergestellt werden, ließ sich die Zykluszeit verkürzen (1 — 2 Stunden Analysenzeit). Wegen der niedrigen Diffusionsgeschwindigkeiten der Substanzen in den vernetzten Harzen wird zur Verbesserung der Effizienz der Trennung häufig bei höheren Temperaturen gearbeitet. Mit Kationenaustauschern auf Kieselgelbasis [38] (5 —10 [xm Teilchendurchmesser) sind Zykluszeiten um 60 min möglich.

182

H . Engelhardt

da hier wegen der besseren D r u c k s t a b i l i t ä t die Regenerierungszeit wesentlich v e r k ü r z t w e r d e n k a n n [39]. Die B a u e l e m e n t e der H P L C k ö n n e n ohne Schwierigkeiten zu autom a t i s c h e n Aminosäure-Analysatoren zusammengestellt werden. B e n ö t i g t w e r d e n n e b e n a u t o m a t i s c h e r P r o b e n a u f g a b e ein G r a d i e n t e n s y s t e m u n d eventuell die Möglichkeit zur T h e r m o s t a t i s i e r u n g . F ü r das ReaktionsD e t e k t i o n s s y s t e m (s. u.) wird zusätzlich m i n d e s t e n s eine weitere Dosierp u m p e benötigt. N a c h d e m n a h e z u ausschließlich m i t C i t r a t p u f f e r n , die d a r ü b e r h i n a u s Halogenionen e n t h a l t e n , g e a r b e i t e t wird, sollte die Korrosionsstabilität der Edelstahlteile gegenüber Zitronensäure u n d H a l o geniden in schwach s a u r e m Milieu b e a c h t e t werden. L i t h i u m e i t r a t p u f f e r ergeben bessere Auflösung als n a t r i u m h a l t i g e P u f f e r . Der T r e n n m e c h a n i s m u s der I o n e n a u s t a u s c h - C h r o m a t o g r a p h i e ist einfach. Die P r o b e n a u f g a b e erfolgt im sauren Milieu bei einem p H von etwa 2,0. Hier sind die Aminosäuren p r o t o n i e r t u n d werden a m K a t i o n e n austauscher r e t a r d i e r t . D u r c h stete E r h ö h u n g des p H - W e r t e s (Gradient) wird f ü r jede Aminosäure schließlich der p H - W e r t erreicht, a n d e m e n t s p r e c h e n d ihres p K - W e r t e s der Zwitterionstatus erreicht wird u n d sie nicht mehr r e t a r d i e r t wird. Die E l u t i o n folgt eindeutig d e m isoelektrischen P u n k t , allerdings k a n n es a u f g r u n d h y d r o p h o b e r Wechselwirkungen (z. B. m i t Phenylalanin) zu Elutionsverschiebungen k o m m e n . E i n e weitere Möglichkeit zur E r h ö h u n g der E l u t i o n s k r a f t s t e h t in der I o n e n s t ä r k e der Pufferlösung zur V e r f ü g u n g . Die T r e n n u n g v o n freien Aminosäuren a n U m k e h r p h a s e n ist ebenfalls möglich, wobei der störende E i n f l u ß der unterschiedlich geladenen Moleküle d u r c h Arbeiten bei niedrigem p H - W e r t (die Aminosäuren t r a g e n d a n n alle die gleiche L a d u n g ) , oder d u r c h Zusatz v o n I o n e n p a a r b i l d n e r n (meistens Alkylsulfonsäuren) auszuschalten ist [8, 62, 63]. Selbstverständlich ist a u c h bei diesen Systemen eine Nachsäulenderivatisierung möglich. 1.4.2

Derivatisierungsreagenzien

F ü r den Nachweis der Aminosäuren werden drei verschiedene R e a k t i o n e n verwendet: 1. Umsetzung mit

Ninhydrin

Die R e a k t i o n der Aminosäuren m i t N i n h y d r i n v e r l ä u f t n a c h folgendem Schema: 0

0 •OH

? + H2N-CH-C00H

•OH H

0 Ninhydrin

+ R-CHO • C02 + NH; '3

0

0

0

0

0

0

0

0

0

H P L C von Aminosäuren und Proteinen

183

B e i der klassischen Ninhydrinreaktion benötigt m a n nur eine zusätzliche P u m p e zur Reagenzförderung. Die Umsetzung ist relativ langsam, k a n n aber durch Temperaturerhöhung beschleunigt werden (man a r b e i t e t teilweise bei Temperaturen über 1 0 0 ° C ; durch eine Kapillare nach der Detektorzelle kann die Bildung von störenden Gasblasen verhindert werden). D e r Nachweis der violetten Reaktionsprodukte erfolgt photometrisch bei 570 nm. Ninhydrin reagiert auch m i t Prolin und Hydroxyprolin, bei denen allerdings ein gelber F a r b s t o f f e n t s t e h t , der bei 440 nm detektiert wird. E s wird daher entweder ein Detektor benötigt, der gleichzeitig 2 Wellenlängen zu messen erlaubt, oder ein programmierbarer D e t e k t o r , der bei der E l u t i o n von Prolin und Hydroxyprolin auf 4 4 0 nm umgeschaltet werden k a n n . 2. Umsetzung mit

o-Phthaldldehyd

F ü r die O P A - R e a k t i o n reicht, wenn m a n sich auf den Nachweis der primären Aminosäuren beschränkt, ebenfalls ein einfaches S y s t e m m i t nur einer Reagenzienpumpe aus. Die R e a k t i o n läuft bei R a u m tempsratur schnell ab, so daß hier auf Temperierung verzichtet werden k a n n . Will man auch die sekundären Aminosäuren nachweisen, so benötigt man ein doppeltes R e a k t i o n s s y s t e m : Zudosierung von Chloramin T zur Oxidation von Prolin, etc. in einem gesonderten Reaktionssystem, dann in einer 2. Mischkammer Zugabe des OPA-Reagenzes. Die Oxidation vermindert die Nachweisgrenze der primären Aminosäuren, daher erscheint es zweckmäßig, Chloramin nur in der Zeit zu dosieren, bei der Prolin bzw. Hydroxyprolin eluiert werden [40]. W i e bereits bei der Vorsäulenderivatisierung ausgeführt, ist ein Fluoreszenzdetektor für den empfindlichen Nachweis unerläßlich. 3. Umsetzung mit

Fluorescamin

Die R e a k t i o n von Aminosäuren m i t Fluorescamin (Fluram) [3 — 5] zeigt folgendes S c h e m a :

0

C00H

Fluorescamin

F ü r diese R e a k t i o n benötigt m a n ein S y s t e m m i t 2 P u m p e n , von denen eine das Reagenz fördert, die zweite einen stark alkalischen Puffer um die Ausbeute an fluoreszierenden Derivaten zu erhöhen. Die R e a k t i o n verläuft schnell, u. U . k a n n sogar auf eine Reaktionsschleife verzichtet werden. Die P r o d u k t e zersetzen sich im Milieu selbst wieder, so daß die Reaktionszeit sehr genau eingehalten werden muß. Das Reagenz ist ebenfalls nicht zum Nachweis der sekundären Aminosäuren geeignet. Die Problematik der Optimierung und der sehr hohe Reagenzienpreis haben den breiten Einsatz dieses Reagenzes sicher behindert. Die Empfind-

H. Engelhardt

184

lichkeit gegenüber der Ninhydrinreaktion ist um den Faktor 10 — 100 größer und liegt damit in der gleichen Größenordnung wie die OPAReaktion. 1.4.3

Aufbau

eines

Reaktionsdetektors

Für die Nachsäulen-Derivatisierung (chemischer Reaktionsdetektor) ist ein zusätzlicher apparativer Aufwand erforderlich, der von der verwendeten Nachweisreaktion bzw. den Reaktionsbedingungen bestimmt wird. Zusätzlich zum chromatographischen Trennsystem benötigt man zum Bau eines Reaktionssystems folgenden Komponenten: Reagenzienpumpe, Mischkammer, Reaktionssystem mit Möglichkeit, bei höherer Temperatur zu arbeiten und einem photometrischen Detektor. Der Aufbau des Reaktionsdetektors, dessen Bauelemente detailliert besprochen werden, sollte modular sein, um ihn leicht an die verschiedenartigsten Reaktionen anpassen zu können. Bei effizienten Reaktionsdetektoren sollte die Bandenverbreiterung, die zu einer Verdünnung des Probepeaks führt, möglichst gering sein. Da durch Zugabe des Reagenzes die Substanzzone ebenfalls verdünnt wird, sollte ein möglichst kleines Volumen des Reagenzes mit dem Eluat vollkommen und schnell vermischt werden. Das Schema eines typischen Reaktionsdetektors ist in Abbildung 6 wiedergegeben.

Pumpe

L _ ReoklorJ

Abb. 6. Schematische Darstellung eine!IS chemischen Reaktionsdetektors für die Nachsäulen-Derivatisierung Waste

H P L C von Aminosäuren und Proteinen

185

Die Bauelemente eines Reaktionsdetektionssystems sollten folgenden Anforderungen genügen: 1.

Reagenzienpumpe

Ein kontinuierlicher pulsationsfreier Reagenzienstrom ist erforderlich. Die Pulsationsdämpfung kann mit klassischen RC-Gliedern (Bourdonröhre — Restriktionskapillare) erfolgen, da es nicht auf geringes Totvolumen ankommt. Das System sollte beständig gegen die oft sehr korrosiven Reagenzien sein. Die Flußkonstanz der Reagenzienpumpe geht bei der quantitativen Auswertung mit konzentrationsempfindlichen Detektoren über die Peakflächen direkt in die Genauigkeit der quantitativen Analyse sein. Außerdem ändert sich das Verhältnis Reagenz zu Bluent und damit der Umsetzungsgrad bei der Reaktion. Werte in der Kurzzeitflußkonstanz der Pumpe, die schlechter als 1 % sind, erscheinen als nicht tolerierbar. HPLC-Pumpen der unteren Preisklasse eignen sich sehr gut als Reagenzienpumpen. 2.

Mischung

Die Mischung von Säuleneluat und Reagenz erfolgt meistens in einem T-Stück bzw. Y-Stück, wobei im ersten Fall die Ströme im Winkel von 180° aufeinandertreffen. Über die optimalen Zuführungswinkel gab es Diskussionen, doch scheint dies nicht ein grundlegendes Problem zu sein [41]. I n solchen T-Stücken findet, wie auch in offenen Röhren, kaum radiale Durchmischung statt, vielmehr verlaufen die Strömungsfäden von Reagenz und Bluat lange Zeit parallel, so daß die Reaktion nur verzögert einsetzt. Bei dieser Art von Mischern sollten Reagenz und Eluat ungefähr zu gleichen Volumina gemischt werden. Dies führt zu einer 1 :1-Verdünnung und damit zur Herabsetzung der Nachweisempfindlichkeit. Ein weiterer Nachteil ist das große Totvolumen. Wesentlich effektiver wirken Mischer vom Zyklontyp [42], die mit relativ kleinen Totvolumina (10 nl) gebaut werden können. Ein weiterer Vorteil dieses Mischers liegt darin, daß noch gute Durchmischung erfolgt, wenn der Reagenzienstrom nur 1 / 2 5 des Eluentenstromes beträgt [43], wodurch die Verdünnung der Substanzzone verringert wird. 3. Reaktor I m Reaktor muß Eluat und Reagenz während des Ablaufs der Reaktion gespeichert werden, ohne daß die in der chromatographischen Säule bereits erreichte Trennung durch axiale Vermischung im Reaktor wieder zunichte gemacht wird. Drei verschiedene Reaktortypen werden verwendet: a) gepackte Säulen, b) offene Röhren mit Segmentierung und c) offene Röhren ohne Segmentierung, aber mit erzwungener radialer Durchmischung (z. B . durch einfaches Wendeln (coiled open tubes) oder Stricken [42]). In Tabelle 2 sind die Vor- und Nachteile der einzelnen Reaktortypen gegenübergestellt. Die gepackten Reaktoren sind chromatographische Trennsäulen mit 3 —6 mm Durchmesser, um genügend Volumen bei relativ kurzer Länge (zusätzlicher Druckabfall!) unterzubringen. Sie sind mit inertem Material, meistens Glaskugeln gefüllt. Für die stark alkalischen Re-

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H. Engelhardt

Tabelle 2. Reaktortypen gepackt

Vorteile

Luft-segmentiert

apparativ einfach T > 100°C möglich

geringer Druckabfall lange Reaktionszeiten möglich Packung kann an stopped flow Reaktion teilnehmen möglich (aufgebundene mehrstufiger ReakEnzyme, katalyt. tionsdetektor Prozesse) kostengünstiger

Nachteile hoher Druckabfall Verstopfungsgefahr Thermostatisierung problematisch Probleme mit aggressiven Reagentien Lebensdauer der Packung begrenzt

Optimale Teilchengröße 2 0 - 3 0 [im

Bandenverbreiterung beim Blasenentfernen apparativ aufwendig

offene Röhren gewendelt oder gestrickt apparativ einfach T > 100°C möglich (Stahlkap.) gestrickt: Bandenverbreiterung unabhängig vom Fluß Druckabfall um Paktor 2 — 3 höher als bei geraden Röhren

Dampfdruck des Eluenten stört: Reaktionstemp. ^ T s - 30° Materialaus wähl eingeschr. (Benetzung) konstante Reaktionszeit bei Gassegmentierung problemat. elektronische Eliminierung der Gasblasen aufwendig und teuer Optimaler DurchOptimal messer 1 — 2 mm 0 . 2 5 - 0 . 3 5 mm i. d.

agenzien (pH 9—10) bei der Aminosäuren-Analyse ist diese Füllung nur bedingt geeignet. Tantalkügelchen könnten hier eine Alternative sein. Das Problem dieses Reaktortyps liegt in der Gefahr der Verstopfung durch Mikropartikel, die oft bei den Reaktionen entstehen können und im zusätzlichen Druckabfall, da der Beitrag des Reaktors zur Bandenverbreiterung um so geringer wird, je kleiner der Teilchendurchmesser seiner Packung wird. Offene Röhren mit Segmentierung des Stroms durch Luftblasen zur Verminderung der axialen Vermischung (wirkt der bereits erzielten Trennung entgegen) sind in den Auto-Analyser-Systemen weit verbreitet. Für die Kopplung mit HPLC ist dieser Reaktortyp nur bedingt geeignet, da bei der Entfernung der Luftblasen vor dem Detektor eine nicht zu tolerierende zusätzliche Bandenverbreiterung herbeigeführt wird. Dieser Reaktortyp ist bestens für sehr langsame Reaktionen (Reaktionszeiten über 5 min.) geeignet. Die Derivatisierungsmethoden für Aminosäuren

H P L C von Aminosäuren und Proteinen

187

laufen aber alle wesentlich schneller ab (Reaktionszeit um 1 min), so daß er hierfür nicht erforderlich erscheint. Mit den wesentlich einfacher herzustellenden gewendelten oder gestrickten Kapillaren k a n n m a n für die Aminosäurenanalytik einfache Reaktionsdetektionssysteme bauen. Werden offene R ö h r e n ohne Segmentierung verwendet, so führt die axiale Durchmischung zu einer Zerstörung der in der Säule erreichten Trennung. Durch geeignete Verformung k a n n eine Sekundärströmung in der Kapillare angeregt werden, die zu einer radialen Durchmischung führt und die B a n d e n v e r b r e i t e r u n g aus der axialen Dispersion wesentlich herabsetzt. Das Aufwickeln von R ö h r e n (coiled open tubes) führt bereits zu einer wesentlichen Verminderung der Bandenverbreiterung, allerdings erst bei relativ hohen Lineargeschwindigkeiten. Effizienter verformte R ö h r e n , bei denen die Sekundärströmung bereits bei niedrigen Flüssen voll ausgebildet ist, sind die gestrickten [42] bzw. gestickten [43] Kapillaren. Hierbei ist die Bandenverbreiterung niedrig und unabhängig vom F l u ß . W e g e n der guten radialen Durchmischung sind diese gestrickten Kapillaren zugleich effiziente Wärmeaustauscher. D e r optimale Kapillarendurchmesser liegt bei 0 , 2 5 — 0 , 3 5 m m i. D. (Handelsprodukte der Teflonkapillare mit nominell 0,3 m m i. D . h a b e n oft 0 , 3 3 — 0 , 3 8 m m i. D.). E i n e Standardlänge von 10 m ist ausreichend für Reaktionszeiten von bis zu 9 0 sec bei üblichen chromatographischen Flüssen von 0,8 —1,0 ml/min. Derartige R e a k t o r e n sind kompatibel für die Trennleistungen, die man heute mit guten 5 [xm bzw. 7 ¡im Trennsäulen erhält. K u r z e Kapillaren (60 cm) sind als zusätzliche W ä r m e austauscher ausreichend, um den E l u e n t e n auf die Detektortemperatur zurückzubringen (Verminderung des Rauschens, Verbesserung der Fluoreszenzausbeute). Mit Edelstahlkapillaren m i t 0,1 mm i. D . k a n n m a n auch R e a k t o r e n für 3 [im-Säulen bzw. Mikrosäulen m i t 1—2 mm Durchmesser herstellen. E s ist schwierig, die Vor- und Nachteile der verschiedenen R e a k t o r systeme zu diskutieren. Experimentelle Ergebnisse eines derartigen Vergleichs sind nicht b e k a n n t , wohl aber theoretische B e t r a c h t u n g e n [44], die allerdings nur bedingt die R e a k t o r e n unter den für sie jeweils optimalen Bedingungen vergleichen. E i n e ausführliche Monographie über Nachsäulenderivatisierung ist in Vorbereitung [45]. Offene R ö h r e n (coiled oder gestrickt) dürften jedoch für die Aminosäuren-Derivatisierung optimal sein. D a m i t k a n n sowohl die Ninhydrinreaktion als auch die Derivatisierung m i t O P A durchgeführt werden. Mit einem kommerziellen S y s t e m wurde ein Vergleich der Ninhydrin und der O P A postcolumn-Reaktion durchgeführt [ 4 0 ] : B e i der O P A - R e a k t i o n wurde die zusätzliche Oxidation der sek. Amine mituntersucht. Das T r e n n s y s t e m war identisch (Polystyrolkationenaustauscher; dp 9 [im, L i t h i u m c i t r a t puffer), so daß ein echter Vergleich der post-column-Derivatisierung möglich ist. Mit der Ninhydrinreaktion erhielt man Nachweisgrenzen (signalnoise ratio = 2), die unter 100 pmol lagen. F ü r Prolin und Tryptophan wurden Nachweisgrenzen von 2 2 5 — 250 pmol angegeben. U n t e r den verwendeten Bedingungen war die O P A - R e a k t i o n um den F a k t o r 2 0 besser. Nachweisgrenzen um 5 pmol wurden erhalten, für Cystein lag die Nachweisgrenze bei 3 0 pmol. D e r Zusatz von Chloramin T und eine

188

H. Engelhardt

R e a k t i o n (Oxidation) bei 4 0 ° C erlaubten noch 100 pmol Prolin nachzuweisen. Die Autoren empfehlen die O P A - R e a k t i o n , worin Prolin nicht nachzuweisen ist. Die Reproduzierbarkeit der Retentionszeiten lag bei 1 — 4 % relative Standardabweichung, die Peakflächen h a t t e eine solche von 3 % . Mit einem optimierten Reaktionsdetektionssystem (Zyklonmischkammer, effizient verformte „ g e s t r i c k t e " offene Röhren) konnte die Nachweisgrenze m i t der O P A - R e a k t i o n (Anregung bei 220 nm) auf 2 0 pg Aminosäure gesenkt werden [43]. 1.5

Zusammenfassung

I n Tabelle 3 sind zum Überblick die wichtigsten Derivatisierungsreaktionen m i t den angegebenen Nachweisgrenzen zusammengestellt. D e r apparative Aufwand ist für die Yorsäulenderivatisierung unwesentlich höher als der eines üblichen HPLC-Gradientsystems. F ü r die on-lineDerivatisierung m i t OPA sollte es bei der automatischen Probeaufgabe möglich sein, Reagenz und Probe nacheinander aus verschiedenen Gefäßen in eine Speicherschleife aufzuziehen, für eine schnelle u n d vollkommene Durchmischung von Reagenz und Probe zu sorgen und nach standardisierter Reaktionszeit das Gemisch auf die Säule zu geben. Als empfindlicher Detektor k o m m t hierbei nur ein Fluoreszenzdetektor in F r a g e , wobei es wünschenswert wäre, bei 2 2 0 nm die Fluoreszenz anregen zu können.

Tabelle 3. Überblick der wichtigsten Derivatisierungsreaktionen Yorsäulenderivatisierung

Nachweis sek. AS Einfach automatisierbar Stabile Produkte Störung durch Nebenreaktion Detektor Nachweisgrenze (pmol)

Nachw. sek. Amine Stabile Produkte Detektor Nachweisgrenze (pmol)

OPA

Dansyl

Dabsyl

PTH

nein ja nein nein UV Fluoresz. U V 1000 F 0,5

ja nein ja ja UV Fluoresz. 2 0,5

ja nein ja ja sichtbar

ja ja ja nein UV

2

5

—

—

OPA

OPA/Chloramin Ninhydrin

Fluram

nein nein Fluoresz. 5

ja nein Fluoreszenz 10-100

nein nein Fluoresz. 10

ja ja sichtbar 100

HPLC von Aminosäuren und Proteinen

189

Ungleich größer ist der Aufwand für die Nachsäulenderivatisierung. Hier wird neben Mischer und Reaktor mindestens eine zusätzliche HPLCPumpe benötigt. Die Trennung und die Nachweisreaktionen sind eindeutig, allerdings kann der Zeitaufwand für die Trennung größer sein als bei der RP-Trennung nach Vorsäulenderivatisierung. Wegen der unterschiedlichen Fragestellungen in der AminosäurenAnalyse gibt es keine eindeutige Antwort, welches Verfahren universell einsetzbar ist. Bei der Sequenzierung zur Strukturaufklärung von Proteinen entstehen beim Edman-Abbau bereits die PTH-Derivate, die ohne Probleme an RP-Säulen getrennt werden können. Soll der Gesamtanteil der Aminosäure in Proteinen und Peptiden untersucht und eine Peptidsynthese analytisch verfolgt werden, bietet sich die Trennung der OPADerivate nach Vorsäulenderivatisierung an, allerdings entziehen sich alle sekundären Aminosäuren dieser Detektionsmethode. Dieses Verfahren

70

min 6 0

Abb. 7. Trennung der freien Aminosäuren in Rotwein. Nachsäulen-Derivatisierung mit OPA Trennsäule: 250 X 4,1 mm Phenylsulfonsäure gebunden an LiChrosorb Si 100; Gradient-Elution: A: 0 , 1 m Li-citratpuffer pH 2,0; B : 0 , 1 m Licitratpuffer pH 7,5; Fluß 1 ml/min, nach 50 min: 2 ml/min. Detektion mit Reaktionsdetektor 900 x 0,05 cm gestrickter Kapillare, OPA, Reaktionszeit 40 sec; Temperatur 30°C; Probemenge 5 (xl Rotwein [39]

190

H. Engelhardt

gibt schnelle Analysen mit Standard-Chromatographiesäulen u n d -geraten. Die Reproduzierbarkeit bei der quantitativen Auswertung ist wegen der Zersetzung der OPA-Derivate nur dann ausreichend, wenn der Derivatisierungsschritt automatisiert u n d on-line, unmittelbar vor der Probenaufgabe durchgeführt wird, und die Trennung unter standardisierten Bedingungen erfolgt. Zur Untersuchung des Gesamtgehaltes an Aminosäuren in biologischen Flüssigkeiten (Plasma, Urin, etc.) bietet sich immer noch die automatische Aminosäuren-Analyse mit post-columnDerivatisierung als Methode der Wahl an. Als Beispiel möge die Trennung der freien Aminosäuren in Rotwein dienen. Abbildung 7 zeigt diese Bestimmung an einem Kationenaustauscher auf Kieselgelbasis mit Elution mittels eines Puffergradienten. Der Nachweis erfolgte mittels OPA. Die Bauelemente der HPLC-Geräte können ohne Modifikationen eingesetzt werden, bzw. ein Gradient-HPLC-Gerät ist in der Lage, den automatischen Aminosäuren-Analysator zu ersetzen. Die Analysenzeiten sind um den Faktor 3 — 6 größer als bei der RP-Trennung der OPA-Derivate. Mit Ninhydrin können hier ohne Probleme auch die sekundären Aminosäuren nachgewiesen werden, allerdings ist die Ninhydrinreaktion nicht so empfindlich wie die OPA-Derivatisierung. Durch Optimierung der Ionenaustauscher (Kieselgelbasis, Verminderung des Teilchendurchmessers), der Detektoren im sichtbaren Gebiet und der Reaktionsbedingungen (Optimierung von Mischkammer, Reaktor und der Reaktionsbedingungen) sowie durch Verwendung von Mikrosäulen könnte auch bei dieser Methode noch an Analysenzeit u n d Nachweisempfindlichkeit gewonnen werden.

2 Chromatographie von Proteinen Proteine unterscheiden sich in ihrer Molekülgröße, Gestalt, Ladung und in den hydrophoben Eigenschaften. Bei den klassischen Isolierungsu n d Reinigungsverfahren f ü r Proteine werden diese Unterschiede benutzt, um durch Sedimentation (Ultrazentrifuge), Ionenwechselwirkung u n d durch Aussalzen Proteine zu isolieren und zu trennen. Chromatographische Trennverfahren, die nach Größe, Ladung und Hydrophobizität trennen, stehen zur Verfügung und werden zur Trennung und Reinigung von Proteinen mit Erfolg eingesetzt. Die Auswahl der jeweiligen Trennmethode richtet sich nach dem analytischen Ziel.

2.1 Trennung an Umkehrphasen Sollen z. B. nur Abbauprodukte von großen Proteinmolekülen analysiert werden, wobei es auf die Erhaltung der biologischen Aktivitäten nicht ankommt, so bietet sich die Chromatographie an Umkehrphasen an [46, 47]. Die besten Trennergebnisse erhält man dabei, wenn man etwa bei p H 2 arbeitet, da dann alle Proteine gleichförmig geladen sind und Störungen (Elutionsumkehr, asymmetrische Peakformen, u. ä.) durch Ladungsunterschiede vermieden werden. Die Elution wird durch Gradientelution mit steigendem Acetonitrilgehalt erreicht. Als stationäre Phasen eignen sich C 8 oder C 18 Umkehrphasen a m besten mit einem

HPLC von Aminosäuren und Proteinen

191

mittleren Porendurchmesser um 50 nm. Der Einfluß nicht umgesetzter Silanolgruppen macht sich bei hohem Acetonitrilgehalt des Eluenten bemerkbar, besonders wenn dieser über 5 0 % liegt. Hierbei findet man — im Gegensatz zum üblichen Verhalten — eine Zunahme der Retention mit zunehmendem Acetonitrilgehalt [47, 49], was auf Wechselwirkungen der Proteine mit den nicht umgesetzten Silanolgruppen zurückzuführen ist [48]. Eine optimale Umkehrphase sollte so wenig zugängliche Silanolgruppen wie möglich haben (gutes end-capping gefordert), die gesamte Oberfläche sollte für die Proteine ohne Behinderung zugänglich sein (großer mittlerer Porendurchmesser, 30 — 60 nm). Durch die damit verbundene geringe spezifische Oberfläche (damit Kohlenstoffgehalt) pro Einheit Säulenvolumen werden die Proteine bereits mit relativ wenig Acetonitrilzusatz zum wäßrigen Puffer eluiert. Die Trennung eines Standard-Proteingemisches an einer Umkehrphase ist in Abbildung 8 dargestellt [48]. Wenige Prozent Änderung in der Eluentenzusammensetzung führen bei den Proteinen zum Übergang von vollkommener Retention zur inerten Elution. An die Reproduzierbarkeit der Gradient-Elution werden daher sehr hohe Anforderungen gestellt. Eine isokratische Bestimmung von k'-Werten oder Retentionszeiten ist nahezu unmöglich. Am besten erfolgt die Charakterisierung der Retention über die Eluentenzusammensetzung, bei der die einzelnen Proteine innerhalb des Gradienten eluiert werden. Eine Erhöhung der Temperatur führt wohl zu einer Verbesserung der Bandenform (Herabsetzung der Eluentenviskosität, Erhöhung des Diffusionskoeffizienten), aber kaum zu einer Veränderung des Retentionsverhaltens (zu erwarten wäre eine Verkürzung der Retentionszeit). Bei

Si 5 0 0 , C 1 8

Abb. 8. Trennung von Proteinstandards an Umkehrphasen Trennsäule 100 x 4,1 mm, R P 18 auf LiChrosorb Si 500 nachsilanisiert mit B S A ; Gradient-Elution; A : 10 mmol Phosphatpuffer pH 2,0; B : Acetonitril; Programm 10% B bis 6 0 % B in 20 min [48] 5

10

15

min 20

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Temperaturen über 50 °C ist stets Denatuierung (Ausfallen) der Proteine zu befürchten. Da diese Trennungen am besten bei stark sauren pH-Werten gelingen u n d außerdem die Wechselwirkungen zwischen den Probemolekülen und der stationären Phase sehr stark sind, ist bei diesem Verfahren wohl die Trennkapazität sehr gut, aber andererseits die Gefahr der Änderung der Struktur der Proteine sehr groß. Daher ist bei der Trennung von Proteinen an Umkehrphasen der Verlust der biologischen Aktivität der Proteine zu befürchten. Oftmals ist die Elution auch nicht quantitativ, was zu einem Geisterchromatogramm bei einem Blindgradienten ohne Probeaufgabe f ü h r e n kann. Adsorbierte Proteine verändern selbstverständlich die Selektivität der Trennsäule.

2.2 Trennung an Ionenaustauschern Ionenaustauscher f ü r die H P L C auf Kunstharzbasis sind meistens sehr stark vernetzt, um die Druckstabilität zu verbessern. Der Porendurchmesser derartiger Harze ist daher sehr niedrig, so daß diese Harze nur bedingt f ü r die Proteintrennungen verwendbar sind. Außerdem ist im wäßrigen Medium die Trennung nach Ionenaustausch häufig durch hydrophobe Wechselwirkung überlagert bzw. überdeckt, k a n n aber durch Zusatz organischer Eluenten vermindert werden. Ionenaustauscher auf der Basis hydrophiler Harze (Polyether) mit großem Porendurchmesser sind als Anionen- wie auch als Kationenaustauscher seit wenigen J a h r e n im Handel [55]. Die Trennungen können ähnlich wie bei klassischen weichen Gelaustauschern mit Puffern auch in Kombination mit organischen Eluenten erzielt werden. Chromatofokusierung m i t Ampholyten als Puffer ist ebenfalls möglich [56]. Großporiges Kieselgel, das mit Polyethylenimin belegt wurde, ist ebenfalls als Austauscher in der Peptidu n d Proteintrennung beschrieben worden [57], Durch Kombination der HPLC-Säulen-Technologie mit der Affinitätschromatographie dürfte der Anwendungsbereich beider Methoden erweitert werden [58], wobei die vollkommene Abdeckung der Oberfläche der stationären Phasen, um Substanzverluste zu vermeiden, mit das kritischste Problem sein dürfte.

2.3 Trennung durch Ausschlußchromatographie Das schonenste Verfahren f ü r die Proteintrennung stellt immer noch die Ausschlußchromatographie dar, deren Niederdruckversion, die GelFiltration, sehr erfolgreich zur Reinigung und Isolierung von Proteinen verwendet wurde und noch wird. Definitionsgemäß soll bei diesem Trennverfahren zwischen der Oberfläche der stationären Phase und den Probemolekülen keine Wechselwirkung stattfinden. Die Trennung erfolgt ausschließlich nach Molekülgröße aufgrund der Unterschiede in der Zugänglichkeit des Porenvolumens durch die Proteinmoleküle. Leider h a t dieses Verfahren nur eine sehr geringe Trennkapazität, die auf das Porenvolumen der stationären Phase in der Trennsäule beschränkt ist. Chemisch modifizierte Kieselgele stehen für die Trennungen von Proteinen unter den Bedingungen der H P L C zur Verfügung [47, 50, 51].

H P L C von Aminosäuren u n d Proteinen

193

Ionogene Wechselwirkungen zwischen' d e n n i c h t u m s e t z b a r e n Silanolg r u p p e n u n d den Proteinmolekülen, die zu I o n e n a u s t a u s c h bzw. Ionenausschluß f ü h r e n k ö n n e n , lassen sich d u r c h Zusatz v o n Neutralsalzen (0,3—0,5 m) z u m E l u e n t e n v e r m i n d e r n bzw. ausschalten. Als E l u e n t e n k ö n n e n bei der A u s s c h l u ß c h r o m a t o g r a p h i e wäßrige Pufferlösungen v e r w e n d e t werden, d. h. es k a n n u n t e r physiologischen B e d i n g u n g e n g e a r b e i t e t werden. Die W i e d e r f i n d u n g s r a t e n sind hoch u n d die biologische A k t i v i t ä t der P r o t e i n e bleibt bei diesem V e r f a h r e n vollständig e r h a l t e n [51]. Zur Verdeutlichung der Möglichkeiten der AusschlußC h r o m a t o g r a p h i e möge die T r e n n u n g v o n P r o t e i n s t a n d a r d s a n chemisch modifiziertem Kieselgel dienen. Die ausschluß-chromatographische T r e n n u n g a n einer A m i d - P h a s e [50] zeigt Abbildung 9 [53].

0

5

10

15

20

25

3 0 min 3 5

Abb. 9. Ausschluß-Chromatographie von Proteinen Trennsäule: 250 X 4,1 m m Amid-Phase auf Grace Kieselgel 250 A, 7 jxm; E l u e n t : 0,1 m TRIS-HCl-Puffer, p H 7,5, 0,4 m Kochsalz; Fluß 0,1 ml/min; P r o b e n : 1 = Myoglobin; 2 = ß-Lactoglobulin; 3 = Lysozym; 4 = Ovalb u m i n ; 5 = a - C h y m o t r y p s i n ; 6 = Chymotrypsinogen [53]

D a die T r e n n k a p a z i t ä t sehr begrenzt, andererseits das E n d e der Trenn u n g vorhersagbar ist (die Ausschlußchromatographie ist m i t der E l u t i o n des kleinsten Moleküls b e e n d e t , was d e m I n e r t p e a k der sorptiven Chrom a t o g r a p h i e entspricht), müssen andere Optimierungsstrategien angewendet werden als in der r e t e n t i v e n Chromatographie. Wegen der niedrigen Diffusionskoeffizienten m u ß die T r e n n u n g bei wesentlich niedrigeren Eluentengeschwindigkeiten d u r c h g e f ü h r t werden. I s t f ü r P r o b e n m i t Molekulargewichten bis 500 D a l t o n die optimale E l u e n t e n geschwindigkeit u m 1 mm/sec (entspricht bei Säulendurchmessern u m 4 m m etwa einem F l u ß v o n 1 ml/min), so liegt die optimale Flußgeschwindigkeit f ü r P r o b e n m i t Molekulargewichten von 40000 — 100000

H. Engelhardt

194

Dalton um den Paktor 100 niedriger. Die dadurch bedingten erhöhten Analysenzeiten lassen sich durch Verwendung von effizienteren und kürzeren Trennsäulen, die z. B . mit kleinen Teilchen (dp 5 (j.m) gepackt sind, wieder ausgleichen [52], Eine Vergrößerung des Porenvolumens der Kieselgelträger (Erhöhung des Verhältnisses Porenvolumen zu Zwischenkomvolumen in der Trennsäule) führt ebenfalls zu einer Verbesserung der Trennleistung der Ausschlußchromatographie und erlaubt eine weitere Verkürzung der Trennsäule. Leider sind diesem Wege, der Vergrößerung des Porenvolumens natürliche Grenzen gesetzt, da ab einer gewissen Größe dies nur noch auf Kosten des Kieselgelgerüstes und damit der mechanischen Stabilität des Trägers möglich ist.

2.4 Trennung mittels Aussalzchromatographie Ein Trennverfahren, das die nahezu physiologischen Bedingungen der Ausschlußchromatographie mit der Trennkapazität der Chromatographie an Umkehrphasen kombiniert, ist die Aussalzchromatographie, auch als hydrophobic interaction chromatography (HIC) bekannt. Man verwendet dazu Kieselgelphasen, die aber nicht mit unpolaren Alkylgruppen, sondern mit polaren Gruppen, wie N-Acetylpropylamid [50, 51, 53] oder Glykolethern [54] modifiziert wurden. Die hydrophoben Eigenschaften sind gering, in reinen Puffern (I < 0,3) findet keine Sorption der Proteine statt. Dort eignen sich diese Phasen auch für die Ausschlußchromatographie. Bei der Aussalzchromatographie gibt man die Probe in einen Puffer auf, der gleichzeitig eine hohe Konzentration an einem Neutralsalz, z. B .

Abb. 10. Aussalz-Chromatographie von Proteinen Trennsäule: wie in Abb. 9; GradienElution: A: 2,5 m Ammoniumsulfat in 0,1 m Phosphatpuffer pH 7,0; B : 0,1 m Phosphatpuffer pH 7,0; Programm: 15% B auf 80% B in 40 min; Fluß 1 ml/min [53] 30 min 40

HPLC von Aminosäuren und Proteinen

195

Ammoniumsulfat (2 — 2,5 molar) enthält. Durch stetige Verminderung der Ammoniumsulfatkonzentration in einem Gradienten, wobei Eluent B weniger Salz enthält bzw. der reine Puffer ist, wird die Sorption der Proteine an der stationären Phase stetig vermindert und sie werden entsprechend ihrer Hydrophobizität eluiert. Die Trennung der gleichen Standardproteine an der identischen Trennsäule wie in Abbildung 9, jetzt aber nach dem Mechanismus der Aussalz-Chromatographie zeigt Abbildung 10. Da der Trennmechanismus verschieden ist, k e h r t sich auch die Elutionsreihenfolge um. Der p H - W e r t des Puffers k a n n zusätzlich zur Optimierung verwendet werden. I n der Nähe ihres isoelektrischen P u n k t e s ist die Sorption der Proteine stets a m stärksten. Die Wiederfindungsrate der Proteine u n d die Erhaltung ihrer biologischen Aktivität ist hier ähnlich wie bei der Ausschlußchromatographie, jedoch ist letzterer die Aussalzchromatographie an Trenneffizienz überlegen. E s ist zu erwarten, daß HPLC-Technologie in naher Z u k u n f t die präparative Isolierung von Proteinen aus komplexen Matrizes erleichtern wird und daß die schnellen und effizienten analytischen Möglichkeiten der H P L C die Überwachung biotechnologischer Prozesse erlauben wird.

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H P L C von A m i n o s ä u r e n u n d P r o t e i n e n

59. 60. 61. 62. 63. 64. 65.

197

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Gasspurenanalyse Messen von Arbeitsplatzkonzentrationen Dr. H. Runge BASF Aktiengesellschaft Z A M / P - M 325 D - 6700 Ludwigshafen/Rhein

1 Einleitung

200

2 Begriffsbestimmungen

201

2.1 2.2 2.3 2.4

Konzentration Exposition Verfahrens- und stoffspezifische Kriterien Beurteilungsobjekt 2.4.1 Beurteilungszeit 2.4.2 Beurteilungsraum

2.5 Vorwissen 2.6 Meßverfahren 2.7 Meßplanung 2.7.1 Befund 2.7.2 Bezugszeit 2.7.3 Wahl der Meßorte 2.7.4 Wahl der Meßzeiten

201 202 202 202 202 202 203 203 203 203 203 204 204

3 Aufstellen des Überwachungsplans 3.1 Einhaltung von MAK-Werten 3.2 Einhaltung von TRK-Werten 3.3 Anforderungen an das Analysenverfahren 4 Durchführen der Messungen

204 205 207 209 209

4.1 Probenahme 4.1.1 Gasförmige Probenahme ohne Abscheidung der gesuchten Komponente 4.1.2 Probenahme, bei der die gesuchte Komponente abgeschieden wird 4.1.3 Probenahmesonden 4.1.4 Abscheider 4.1.5 Vorrichtung zum Ansaugen der Proben und zur Gasvolumenmessung 4.1.6 Probenaufbereitung

213 213

4.2 Analytische Bestimmung

214

. . .

210 210 211 211 212

200 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8

H. Runge Berechnen des Ergebnisses Analysenverfahren Kalibrierung der Analysenverfahren Herstellung von Prüfgasen Beurteilung von Analysenverfahren Hinweise auf Analysenverfahren f ü r einzelne Komponenten

Literatur

214 214 216 216 216 . 217 235

1 Einleitung Wenn Beschäftigte an ihrem Arbeitsplatz mit Stoffen zu t u n haben, die gas- oder partikelförmig in die L u f t übergehen können, ist die Kenntnis der Konzentration dieser Stoffe in der L u f t erforderlich, u m eine mögliche Gefährdung beurteilen und erforderlichenfalls Abhilfemaßnahmen treffen zu können. F ü r viele der vorkommenden Stoffe sind die toxikologischen Eigenschaften bekannt. Unter Mitverwendung der Kenntnisse über diese Eigenschaften sind Grenzwerte der Konzentration in der L u f t abgeleitet, die am Arbeitsplatz nicht überschritten werden sollen. Wegen der unterschiedlichen Bewertung der toxikologischen Daten in den verschiedenen Ländern sind zum Teil unterschiedliche Grenzwerte festgelegt. I m deutschen Sprachraum werden häufig verwendet — die Maximalen Arbeitsplatzkonzentrationen (MAK-Werte) u n d — die Technischen Richtkonzentrationen (TRK-Werte). Nach der Definition der Kommission zur P r ü f u n g gesundheitsschädlicher Arbeitsstoffe der Deutschen Forschungsgemeinschaft, die jährlich eine auf den neuesten S t a n d gebrachte Liste veröffentlicht [1], ist der MAKWert „die höchstzulässige Konzentration eines Arbeitsstoffes als Gas, Dampf oder Schwebstoff in der L u f t am Arbeitsplatz, die nach dem gegenwärtigen Stand der Kenntnis auch bei wiederholter u n d langfristiger, in der Regel täglich 8-stündiger Exposition, jedoch bei Einhaltung einer durchschnittlichen Wochenarbeitszeit von 40 Stunden im allgemeinen die Gesundheit der Beschäftigten nicht beeinträchtigt u n d diese nicht unangemessen belästigt". Die MAK-Werte sind (bis auf den f ü r Stäube) als 8-Stunden-Mittelwerte festgelegt. Da in der Praxis die Konzentration kürzerfristig sehr stark schwanken kann, müssen zur Vermeidung von Gesundheitsschäden auch die Konzentrationsspitzen begrenzt werden. Aus diesem Grund sind die MAK-Stoffe je nach ihrem Wirkungscharakter einer von fünf Kategorien zugeordnet, in denen eine unterschiedliche Kurzzeitwerthöhe (als Vielfaches des MAK-Wertes), Kurzzeitwertdauer und Häufigkeit pro Schicht der Überschreitung des MAK-Wertes innerhalb dieser Begrenzung festgelegt sind. F ü r krebserzeugende u n d erbgutändernde Arbeitsstoffe können keine MAK-Werte festgelegt werden. Da bestimmte krebserzeugende Stoffe technisch unvermeidlich sind, zum Teil auch natürlich vorkommen, und Expositionen gegenüber ihnen nicht völlig ausgeschlossen werden können, sind f ü r diese Stoffe Technische Richtkonzentrationen festgelegt. Man versteht darunter „diejenige Konzentration als Gas, Dampf

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Gasspurenanalyse

oder Schwebstoff in der Luft, die als Anhalt für die zu treffenden Schutzmaßnahmen und die meßtechnische Überwachung am Arbeitsplatz heranzuziehen ist. Technische Richtkonzentrationen werden nur für solche gefährlichen Arbeitsstoffe benannt, für die z. Z. keine toxikologischarbeitsmedizinisch begründeten maximalen Arbeitsplatzkonzentrationen (MAK-Werte) aufgestellt werden können. Die Einhaltung der Technischen Richtkonzentration am Arbeitsplatz soll das Risiko einer Beeinträchtigung der Gesundheit vermindern, vermag dies jedoch nicht vollständig auszuschließen". T R K - W e r t e sind Grenzwerte, die von den Jahresmittelwerten der Konzentration eines gefährlichen Arbeitsstoffes nicht überschritten werden dürfen. Dabei wird vorausgesetzt, daß die Einwirkung täglich nicht länger als acht Stunden und wöchentlich nicht länger als 40 Stunden dauert. Neben der allgemeinen Fürsorge für die Sicherheit der Beschäftigten am Arbeitsplatz geben in vielen Fällen behördliche Meßverpflichtungen, z. B . auf der Grundlage von Unfallverhütungsvorschriften, den Anlaß für die Durchführung von Messungen an Arbeitsplätzen. Um zu vergleichbaren Ergebnissen zu kommen, ist es sinnvoll, bei der Arbeitsplatzüberwachung überall gleichartig vorzugehen. Soweit Meßverpflichtungen bestehen, ist im allgemeinen die Vorgehensweise verbindlich vorgeschrieben [2], Sie ist z. B . festgelegt in den Technischen Regeln für gefährliche Arbeitsstoffe T R g A 401 B l a t t 1: Messung und Beurteilung von Konzentrationen giftiger oder gesundheitsschädlicher Arbeitsstoffe in der Luft „Anwendung von Technischen Richtkonzent r a t i o n e n - T R K " [3] und T R g A 402: Messung und Beurteilung von Konzentrationen gefährlicher Arbeitsstoffe in der L u f t ; Anwendung von Maximalen Arbeitsplatzkonzentrationen (MAK) [4]. Die Ausgabe getrennter Regeln für die Überwachung der MAK- und der T R K - W e r t e ergibt sich aus der unterschiedlichen Definition dieser Werte (8-Stunden-Mittelwert bzw. Jahresmittelwert errechnet aus 8-Stundenwerten) und der Festlegung von MAK-Kurzzeitwerten. I m folgenden sollen als Beispiele für eine zweckmäßige Vorgehensweise zur Arbeitsplatzüberwachung diese beiden Regeln zugrunde gelegt werden. Wegen ihrer Ähnlichkeit werden sie gemeinsam behandelt.

2 Begriffsbestimmungen Begriffe, die im Zusammenhang mit der Arbeitsplatzüberwachung verwendet werden, sollen definiert oder in ihrer Bedeutung näher erläutert werden:

2.1 Konzentration Der Gehalt eines gefährlichen Arbeitsstoffs in der Luft wird als Volumenkonzentration CT oder als Massenkonzentration ß angegeben. Zweckmäßige Einheiten sind ml/m3 (ppm) bzw. mg/m3. Die Umrechnung geschieht nach der Formel Molvolumen [1] CT [ml/m3] = — — — Molmasse [g]

• ß [mg/m3]

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Das Molvolumen wird üblicherweise auf 20°C u n d 1013 mbar bezogen und beträgt dann 24,11. F ü r Stäube wird die Massenkonzentration ß mit der Einheit mg/m 3 oder die Teilchenkonzentration C mit der Einheit Teilchen/m 3 oder Fasern/m 3 verwendet.

2.2 Exposition Exposition bedeutet das Vorhandensein eines Arbeitsstoffes in der L u f t im Atembereich eines Beschäftigten. Sie wird beschrieben durch den Konzentrationsverlauf in der Beurteilungszeit und dem Beurteilungsraum. Man k a n n unterscheiden zwischen ständiger und nichtständiger Exposition. Letztere liegt vor, wenn der Beschäftigte weniger als 4 Stunden pro Tag bzw. weniger als 24 Schichten pro J a h r dem Arbeitsstoff in der L u f t ausgesetzt ist.

2.3 Verfahrens- und stofispezifische Kriterien Verfahrens- u n d stoffspezifische Kriterien legen Bedingungen fest, bei deren Erfüllung eine d a u e r h a f t sichere Einhaltung des MAK-Wertes angenommen werden k a n n , so daß Kontrollmessungen nicht erforderlich sind.

2.4 Beurteilungsobjekt Beurteilungsobjekt ist die Exposition. Beurteilungszeit u n d Beurteilungsraum können im allgemeinen nicht vollständig durch Konzentrationsmessungen abgedeckt werden. I n der Meßplanung ist daher die zeitliche u n d räumliche Verteilung der zu nehmenden Luftproben so festzulegen, daß aus ihnen eine Beurteilung möglich ist. 2.4.1

JBeurteilungszeit

Die Beurteilungszeit f ü r die Überwachung der Einhaltung von MAKWerten ist eine Schichtlänge (8 Stunden), f ü r die Überwachung der Einhaltung des MAK-Wertes von Stäuben u n d von T R K - W e r t e n ein J a h r . 2.4.2

Beurteilungsraum

Der Beurteilungsraum ist die räumliche Abgrenzung der Orte, die Beschäftigte im Ablauf ihrer normalen Arbeit aufsuchen. Es k a n n sich dabei u m einen Arbeitsplatz oder einen Arbeitsbereich handeln. Nicht dazu gehören Betriebsbereiche, die nur mit besonderen persönlichen Schutzausrüstungen, wie Atemschutzgeräten, betreten werden dürfen. — Arbeitsplatz ist ein definierter Aufenthaltsort, an dem ein Beschäftigter ständig oder zeitweise tätig ist. — Arbeitsbereich ist ein räumlich oder organisatorisch begrenzter Teil eines Betriebes, der einen bis mehrere Arbeitsplätze umfassen kann. Er ist dadurch gekennzeichnet, daß sich der einzelne Arbeitnehmer im R a h m e n seiner Tätigkeit(en) an den verschiedenen Arbeitsplätzen dieses Bereiches unregelmäßig lange aufhält, die Aufenthaltsdauer an

Gasspurenanalyse

203

den einzelnen Arbeitsplätzen nicht genauer bestimmbar und eine weitere Unterteilung des Arbeitsbereiches in kleinere Einheiten daher nicht möglich ist. 2.5 Vorwissen Das Vorwissen enthält alle Fakten, die zur Beschreibung und Präzisierung des Beurteilungsobjekts im Hinblick auf die Auswahl und Festlegung des Meßplanes beitragen. Es wird unterteilt in das Grundwissen, das die technischen und betriebsspezifischen Kenntnisse über den Arbeitsbereich und den Arbeitsablauf sowie die Kenntnisse über das Meßsystem umfaßt und die Vorinformation, die aus den Kenntnissen über die zeitliche und räumliche Verteilung der Konzentrationen in den Arbeitsbereichen besteht. Die Vorinformation beruht immer auf Messungen im zu beurteilenden oder in vergleichbaren Arbeitsbereichen. 2.6 Meßverfahren Das Meßverfahren umfaßt das Analysenverfahren, die Anzahl der zu nehmenden Proben und deren räumliche und zeitliche Verteilung. Das Analysenverfahren enthält die Probenahme und die analytische Bestimmung. 2.7 Meßplanung Unter Meßplanung versteht man die Summe aller Mittel, die im einzelnen Fall über die Messungen zu einer Beurteilung führen. Es gehören dazu die Beschreibung des Beurteilungsobjekts, die Festlegung des Meßverfahrens, einschließlich der Meßorte und -zeiten sowie die Auswerteverfahren, die zum Befund führen. 2.7.1

Befund

Der Befund ist das Ergebnis der Beurteilung. Er kann lauten — Einhaltung — Überschreitung des MAK- oder TRK-Wertes. Bei der Bestandsaufnahme im Rahmen der TRK-Überwachung kann wegen des beschränkten Meßaufwands auch der Befund „keine Entscheidung" auftreten, wenn das Ergebnis im Unsicherheitsbereich des Verfahrens liegt. Ferner ist der Befund „dauerhaft sichere Einhaltung des MAK-Wertes" bzw. „Erfüllung des Verfahrens- oder stoffspezifischen Kriteriums" möglich. 2.7.2

Bezugszeit

Die Bezugszeit ist die Dauer, auf die sich alle in die Auswertung eingehenden Meßergebnisse beziehen müssen. Sie beträgt für Stichprobenmessungen eine Schichtlänge (in der Regel 8 Stunden). Falls die Meßergebnisse diese Bezugszeit nicht schon als Mittelungszeit des verwendeten Analysenverfahrens haben, müssen durch Mittelwertbildung entsprechende Werte

204

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gebildet werden. I n Abhängigkeit von der Mittelungszeit (Probenahmedauer) des Analysenverfahrens ist eine unterschiedliche Mindestzahl von Proben je Schicht zu nehmen (siehe Tab. 1).

Tabelle 1. Zahl der erforderlichen Messungen in Abhängigkeit von der Mittelungszeit des Analysenverfahrens Mittelungszeit (Probenahmedauer)

Probenzahl pro Schicht

10 sek. 1 min 5 min 15 min 30 min lh > 2h

> 30 > 20 > 12 > 4 > 3 > 2 > 1

2.7.3

Wahl der

Meßorte

Zahl und Lage der Meßorte ist je nach Größe des Arbeitsbereichs u n d der Verteilung der zu erwartenden Arbeitsstoffkonzentrationen so festzulegen, daß das Meßergebnis f ü r die Exposition repräsentativ ist. Die Proben sind in Höhe des Atembereichs der Beschäftigten zu nehmen. Personenbezogene Probenahmegeräte, die von Beschäftigten getragen werden, liefern direkt Ergebnisse zur Beurteilung des Arbeitsbereichs, wenn sich die Personen ständig in diesem Arbeitsbereich aufhalten. Bei Dauerüberwachung sind die Meßorte so zu legen, daß das Mittel der Ergebnisse der einzelnen Meßorte der mittleren Arbeitsstoffkonzentration im Arbeitsbereich entspricht. 2.7.4

Wahl der

Meßzeiten

Auch die Meßzeiten sind so festzulegen, daß das Meßergebnis f ü r die Exposition repräsentativ ist. Bei nicht-ständiger Exposition braucht n u r während der Expositionsdauer gemessen zu werden. Bei Dauerüberwachung ist an jedem Meßort mindestens alle drei Stunden zu messen, wobei die Meßzeiten die Schicht gleichmäßig überdecken sollen und nicht täglich zur gleichen Uhrzeit gemessen werden darf.

3 Aufstellen des Überwachungsplans I n den technischen Regeln TRgA 401 u n d TRgA 402 ist eine umfassende Überwachung der Luftverhältnisse festgelegt. Es ist nicht n u r die Bestimmung der Konzentration der luftfremden Stoffe vorgeschrieben, sondern bei Überschreitung des Grenzwertes die Durchführung von technischen Maßnahmen, die sie auf einen zulässigen Wert absenken. Die Einhaltung dieses Wertes wird mit Kontrollmessungen überprüft. Das Vorgehen ist f ü r die MAK- und die TRK-Überwachung etwas unterschiedlich geregelt.

205

Gasspurenanalyse

3.1 Einhaltung von MAK-Werten Bei der Überwachung auf Einhaltung der MAK-Werte werden 5 Schritte unterschieden. Die ersten vier werden als „Arbeitsbereichsanalyse" zusammengefaßt. Es sind — — — —

die die die die

Erfassung der Arbeitsstoffe Beschaffung des Grundwissens Beschaffung der Vorinformation und Festlegung des Meßverfahrens für die Kontrollmessungen.

Für die Beschaffung der Vorinformation ist fast immer die Durchführung von Messungen erforderlich. Der Ablauf der Arbeitsbereichsanalyse ist in dem Fließschema der Abb. 1 dargestellt.

(

Stori

"")

Schritt 1 Arbeitsstoffe erfassen

Erfassung der Arbeitsstoffe

Grundwissen beschatten

Schritt 2 Arbeitsbereiche festlegen

Maflnahme

Messungen

Beschaffung des Grundwissens

Einsatzstoffe, Zwischenprodukte, Endprodukte, Reaktionsprodukte, Hillsstoffe, dazu MAK-Werte mit Kurzzeitwerten, andere Kriterien und Vorschriften Tätigkeilen, Anlagenart Vertahrensweise, Menge,Temperatur, Druck, Schutzeinrichtungen, Lütlungseinrichfungen, Emissionsorte, Aufenthaltsdauern

Vorinformation beschatten .

Einhaltung MAK und Kurzzeitwertanforderungen ?

dauerhaft sichere Einhaltung oder Erfüllung Kriterium oder Dauerüberwachung

Expositionsmessungen, sonstige Messungen, vergleichbare Anlogen oder Tätigkeiten, Beschaffung von Vorinformation Berechnungen

Schritt 3

Befund sichern

- (

Stop

)

Analysenverfohren, Mittelungsdauer (nl, Meflort(e), Schritt 4 Meflzeit (en), Festlegung Rechenverfahren, des Meßverfahrens Anweisungen (kontrollmefiplon)

Abb. 1. Arbeitsbereichsanalyse

Start des Kontrollmeflplans

206

H. Runge

Schritt 5 ist der Kontrollmeßplan. Die Einhaltung des MAK-Wertes liegt vor, wenn die Schichtmittelwerte dauerhaft kleiner als der MAK-Wert sind. Liegen sie dauerhaft unter einem Viertel, bei Stäuben nach Abschnitt IV der MAK-Werte-Liste unter einem Drittel des MAK-Wertes, so kann auf Kontrollmessungen verzichtet werden. Das gleiche gilt, wenn die Einhaltung eines Verfahrens- oder stoffspezifischen Kriteriums gesichert ist. Der Kontrollmeßplan enthält Angaben, in welchen Zeitabständen neue Messungen durchzuführen sind. Der Abstand bis zur nächsten Messung hängt ab vom Ergebnis der letzten Messung. Je niedriger der Meßwert, desto länger ist der Zeitabstand. Näheres dazu ist für die Stoffe des Abschnitts I I der MAK-Werte-Liste dem Fließschema der Abb. 2 zu entnehmen. Für die Stoffe des Abschnitts IV (Stäube) gilt ein ähnliches Schema. Für eine Dauerüberwachung werden fest installierte Meßeinrichtungen so betrieben, daß sie zur Beurteilung der Exposition geeignet sind. Ist der MAK-Wert eingehalten und werden die Meßergebnisse aufgezeichnet, brauchen keine Kontrollmessungen durchgeführt werden. Für die Überwachung der Kurzzeitwerte von MAK-Stoffen sind in der TRgA 402 je nach Kategorie unterschiedliche Regeln enthalten, ebenso für das Vorgehen bei Expositionen, die kürzer als eine Schichtlänge sind und für die Berücksichtigung nicht ständiger Exposition für den Jahresmittelwert.

Abb. 2. Kontrollmeßplan für Stoffe des Abschnitts IX der MAK-WerteListe

Gasspurenanalyse

207

3.2 Einhaltung von TRK-Werten B e i der Überwachung auf E i n h a l t u n g der T R K - W e r t e unterscheidet man n a c h der Festlegung der Fragestellung (Festlegung des Beurteilungso b j e k t s und Einbeziehung des Vorwissens) zwischen der Bestandsaufn a h m e , der Folgemessung und der Kontrollmessung. D e r Ablauf ist auch hierfür in einem Fließschema (Abb. 3) dargestellt. Zur B e s t a n d s a u f n a h m e sind 6 Messungen zu planen, wobei zwischen j e zwei Messungen mindestens zwei meßfreie T a g e vorzusehen sind. F ü h r t sie n i c h t zum B e f u n d „ Ü b e r - " oder „ U n t e r s c h r e i t u n g " , weil das geometrische Mittel der Meßwerte innerhalb des durch eine obere und eine untere Grenze festgelegten Unsicherheitsbereichs liegt, so wird mit weiteren Messungen nach dem Folgemeßplan eine Entscheidung herbeigeführt. Das E r g e b n i s der Bestandsaufnahme geht als Vorinformation in den Folgemeßplan ein. Abb. 4 zeigt ein Folgemeßplanblatt, in das die Meßergebnisse von Bestandsaufnahme und Folgemessungen eingetragen

Abb. 3. Arbeitsablauf zur Messung und Beurteilung von Stoffen mit T R K Wert

208

H. Runge

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der B e s t a n d s o u t n a h m e = Startpunkt für Folgemessung

Abb. 4 . Folgemeßplan für Stoffe mit T R K - W e r t

werden, bei Überschreitung des T R K - W e r t e s in ein Kästchen oberhalb, bei einem Wert gleich oder unterhalb des T R K - W e r t e s in ein Kästchen rechts neben dem Ausgangspunkt oder dem Kästchen der vorhergehenden Messung. Läuft die Folge der markierten Kästchen nach rechts aus dem Rasterfeld hinaus, liegt der Befund „Unterschreitung", läuft sie nach oben hinaus, der Befund „Überschreitung" vor, der technische Maßnahmen, gefolgt von einer erneuten Bestandsaufnahme, nach sich zieht. Mit dem Kontrollmeßplan wird das weitere Einhalten des Befunds „Unterschreitung" überprüft. Der zeitliche Abstand der Kontrollmessungen richtet sich nach der Zahl der nötig gewesenen Folgemessungen bzw. dem Ergebnis der letzten Kontrollmessung, wie in Abb. 5 erläutert: Ausgehend von einem zeitlichen Grundraster von 16 Wochen, angewendet bei Meßwerten zwischen 0,3 T R K und 1,0 T R K , wird bei einem Wert < 0,3 T R K eine Verdünnung der Meßfolge vorgenommen (die drei folgenden Messungen fallen aus), bei einem Wert zwischen 1,0 T R K und 3,0 T R K eine Verdichtung (eine zusätzliche Messung wird eingeschoben). Führt die Verdichtung dazu, daß mehr als1 eine Messung je 2 Wochen durchgeführt werden müßte oder liegt das Meßergebnis über dem dreifachen T R K - W e r t , bedeutet das Abbruch des Kontrollmeßplans und Durchführung technischer Maßnahmen. Danach ist wieder mit einer Bestandsaufnahme zu beginnen. Wird eine Dauerüberwachung durchgeführt, bildet man aus den Meßergebnissen den Monatsmittelwert für den Arbeitsbereich. Liegen drei von zwölf aufeinanderfolgenden Monatsmittelwerten -über dem T R K - W e r t heißt der Befund „Überschreitung", andernfalls „Unterschreitung".

Gasspurenanalyse

209

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Runge

Gasspurenanalyse

235

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Spureneleme ntanalyse in biologischen Proben Professor Dr. D. Behne Hahn-Meitner-Institut f ü r Kernforschung G m b H Berlin D-1000 Berlin 39

Dr. G. V. Iyengar National Bureau of Standards, Gaithersburg, M.D. 20899, U.S.A. Einführung

237

I Spurenelementanalyse in biologischen Materialien I I Schritte der Probenbehandlung I I I Fehlerquellen u n d Möglichkeiten der Qualitätskontrolle . . . .

237 241 243

Probenahme und Probenaufarbeitung

250

I II III IV V VI VII

Das analytische Labor Probenahme Lagerung Fraktionierung Homogenisierung Trocknung Veraschung

250 256 259 262 266 269 271

Schlußbemerkungen

274

Literatur

275

Einführung I Spurenelementanalyse in biologischen Materialien Die lebende Materie besteht zu 96% aus den „Makroelementen" Kohlenstoff, Sauerstoff, Stickstoff u n d Wasserstoff. Weitere 3,6% entfallen auf die „Mineralelemente" Calcium, Chlor, Kalium, Magnesium, Natrium, Phosphor u n d Schwefel. Alle übrigen chemischen Elemente, die am Aufbau der Biosphäre nur mit einem Massenanteil von insgesamt 0,4% beteiligt sind, werden unter dem Begriff „Spurenelemente" zusammengefaßt. Die Gehalte der meisten Spurenelemente liegen, wie aus den in Tabelle 1 zusammengestellten Beispielen für einige biologische Materialien ersichtlich ist, im Bereich zwischen 10 - 6 und 10~9 kg/kg Probe. Die Spurenelemente wurden lange Zeit als nur zufällig vorhandene Bestandteile der Organismen angesehen, bis m a n erkannte, daß zumindest einige von ihnen schon in den sehr geringen Mengen, in denen

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D. Behne, G. V. Iyengar

Tabelle 1. Elementgehalte in einigen biologischen Materialien Kohl a

Gehaltsbereiche

10-2-10-1 10-3-10" 10"

2

-10"

menschliches RinderBlutserum^ leber 0

Tiermuskel d

Lebensmittelgemisch e

Ca, K, S

P

K

Cl, Mg, Na, Cl, Na, S P

Cl, K, Na, S

Cl, Mg, Na

Ca, K, Na, P

Ca, Cu, Fe, Mg, Zn

Ca

Mg

AI, Mn, Rb, Si

Fe, Rb, Zn

AI, Fe, Mn, Zn

B, Br, Mo, Se, Ti

Br, Cu

Cu, Rb, Sr

Fe, Si

Ca, K, P

10"5-10-4

AI, B, Br, Mg Rb, Sr, Zn, Mn

10~6 —10~5

Ba, Cu, F, Li, Mo, P b

10-7-10-6

Ag, As, Cd, Rb, Se Ce, Cr, Hg, J , Pt?, Se, Ti?, Tl, V, Ni, Sn

Cd, Co, J , Pb, Sr

Cs, Mn, Se

Cr, Se

10~8 —10~7

Co, Cs, Ga, F?, J , Li?, Hf, La, Lu, Sn?, Sr? Sb, Sm, Th, U, W

Ag, As, Ce, Cr, Cs, Hg, Sn, V, W

Cr?, Hg, Mo

Co, V

10"9-10-8

Au, Bi?, Eu, Pd?, Ru, Sc, Yb?

Hf, Sc, Sb

Cd, Co

Ag, Hg, Sb

Br, Cu, Fe, Si?, Zn

As, Cs, Hg?, Ni

1 0 " 1 0 - 1 0 - 9 In, Ir?

Ag?, Cd, Co, Cr, Mn, Mo, Pb, Sb, W?

10"n-10-

V

a

Bowen's Kaie, bezogen auf Trockenmasse. Werte aus [1]. Bezogen auf Feuchtmasse. Zusammengestellt aus [2] und ausgewählten Literaturwerten. c NBS SRM-1577, Bovine Liver, bezogen auf Trockenmasse. Zusammengestellt aus [3] und ausgewählten Literaturwerten. d IAEA H-4, Animal Muscle, bezogen auf Trockenmasse. Werte aus [4]. e IAEA H-9, Mixed Diet, bezogen auf Trockenmasse. Werte aus [5] 15

sie in den Geweben vorkommen, biologisch wirksam sind. Seitdem h a t die Untersuchung und die Analyse von Spurenelementen in biologischen Materialien in allen Gebieten der Lebenswissenschaften immer mehr an Bedeutung gewonnen. Der Grund f ü r die Wichtigkeit der quantitativen Analyse bei der Untersuchung von Spurenelementen liegt darin, daß die biologische

239

Spurenelementanalyse in biologischen P r o b e n

Wirkung eines Elementes von seinem Gehalt im Organismus abhängig ist. Wie in Abb. 1 schematisch dargestellt, k a n n innerhalb eines gewissen „Normalbereiches" der Gehalt in einem Gewebe variieren, ohne daß dadurch Lebensvorgänge beeinflußt werden. Bei Gehalten oberhalb dieses Bereiches h a t das Element toxische Wirkungen, die zu Stoffwechselstörungen, Krankheiten und oberhalb eines bestimmten Grenzgehaltes zum Tode des Organismus führen. Solche Effekte bei hohen Gehalten zeigen alle Elemente, die Grenzen f ü r den Normalbereich sind jedoch sehr unterschiedlich. Diejenigen Spurenelemente, bei denen schon geringe Erhöhungen gegenüber den normalerweise im Organismus vorhandenen Mengen ausreichen, u m Lebensfunktionen zu beeinträchtigen, werden als „toxische" Elemente bezeichnet. Bei einigen Spurenelementen werden aber auch bei Gehalten unterhalb des Normalbereiches Störungen von Lebensvorgängen beobachtet. Hierbei handelt es sich u m die sogenannten „essentiellen" Elemente, die wichtige biologische Funktionen haben, z. B. als Cofaktoren von Enzymen.

o

Elementgehalt

Abb. 1. Abhängigkeit einer biologischen Funktion von dem Elementgehalt im Organismus Von Spurenelementmangel oder -Überschuß waren früher vor allem Menschen betroffen, die in Gebieten mit anomalen Spurenelementgehalten in der Umwelt lebten u n d sich ausschließlich von lokal produzierten Nahrungsmitteln ernährten. Pathologische Veränderungen wie z. B. der Jodmangelkropf in den Alpen, eine mit Selenmangel zusammenhängende Herzmuskelschädigung in China, Sterilität u n d Zwergwuchs durch Zinkmangel in einigen Gegenden Persiens und Ägyptens u n d Knochenerkrankungen durch Fluorüberschuß in einer indischen Provinz wurden auf diese Weise hervorgerufen. Durch die Industrialisierung sind jedoch heute große Bevölkerungsgruppen einer Änderung der Spurenelementverteilung in der Umwelt u n d in der Nahrung ausgesetzt. Die Konzentrierung von Elementen aus Rohstoffen, die Düngung des Bodens u n d die Abtrennung einzelner Bestandteile bei der Nahrungsmittelaufbereitung sind Beispiele f ü r in großem Maßstab durchgeführte Prozesse, die besonders bei den nur in sehr kleinen Mengen vorhandenen Elementen beträchtliche Konzentrationsverschiebungen zur Folge haben können. Diese Änderungen

D. Behne, G. V. Iyengar

240

und die Zusammenhänge zwischen Elementgehalt und biologischer Wirkung machen die Spurenelementanalytik zu einem wichtigen Instrument in allen Bereichen von Medizin, Biochemie, Biologie, Umweltforschung und Umweltschutz. Welche Elemente in welchen Probenmaterialien in erster Linie bestimmt werden müssen, hängt, wie in Abb. 2 aufgeführt, von der Problemstellung ab. B e i einem Zusammenhang zwischen Elementmangel und Krankheit steht vor allem die Bestimmung von Spurenelementen im Vordergrund, die wichtige biologische Punktionen besitzen, und bei Störungen durch einen Uberschuß werden vor allem Elemente untersucht, die schon in relativ geringen Gehalten toxisch wirken. Andere Elemente können jedoch durch Interaktionen Mangelsituationen hervorrufen, z. B . durch Verdrängung des biologisch wichtigen Elementes aus einem Gewebe oder durch Beeinträchtigung seiner Resorption bzw. die Toxizität durch antagonistische oder synergistische Effekte stark beeinflussen. Aufgrund dieser Wechselwirkungen solltsn sich Aussagen über Stoffwechselstörungen durch ein Defizit oder einen Überschuß eines Elementes nicht nur auf Einzelelementbestimmungen stützen. Die Möglichkeit, die Änderung eines Gehaltes als Indikator für andere Parameter oder für pathologische Zustände zu verwenden, ist bei allen Elementen denkbar.

Grund

Probenmaterial

Elemente

Krankheiten

durch

Elementmangel

Elemente

mit

Funktion

(z.B.

Se,

Zn)

biologischer Cu,

F, Fe,

und Elemente

J,

mit

synergistischem oder onta gonistischem

Effekt

bei in

vivo-Probenahme

leicht

zu

(z.B.

Urin,

Biopsien),

Haar,

tierische und Gewebe,

Krankheiten

durch

Elementüberschui)

E l e m e n t e mit s t a r k Wirkung

(z.B.

und Elemente schem oder

Cd, mit

entnehmende

Materialien

toxischer Hg,

Blut,

pflanzliche

Nahrungs-

und

Umweltproben

Pb)

synergisti-

antagonistischem

Effekt

Elementgehalt I n d i k a t o r für

als

alle E l e m e n t e

möglich

olle E l e m e n t e

möglich

andere

Parameter

Forschung

Abb. 2. Anwendungen der Spurenelementanalytik in den Biowissenschaften

Da schon eine relativ geringe Abweichung von dem Normalbereich einen Einfluß auf den Lebensvorgang haben und zu Krankheiten führen kann, werden bei der Untersuchung der Wirkung von Spurenelementen hohe Anforderungen an die Richtigkeit und die Genauigkeit der Analysen-

Spurenelementanalyse in biologischen Proben

241

ergebnisse gestellt. F ü r die Bestimmung sehr kleiner Elementmengen stehen jedoch bis jetzt nur in seltenen Fällen Routineverfahren zur Verfügung, bei denen systematische Fehler weitestgehend ausgeschlossen werden. Solche Fehler können das Analysenergebnis um Größenordnungen verfälschen wie am Beispiel von einigen biologisch wirksamen Elementen gezeigt wird von denen angenommen werden kann, daß ihre Konzentrationen im Blutplasma homöostatisch reguliert werden und dadurch n u r relativ geringe regionale Unterschiede bestehen (Tab. 2).

Tabelle 2. Analysenwerte für die Konzentrationen einiger essentieller Spurenelemente im menschlichen Blutplasma oder -serum (Literatur 1971 — 1979)a Element

tiefster Wert (W/1)

höchster Wert Unterhalb der Nachweisgrenze a

V

Homogenisierung

Obwohl bei einer inhomogenen Elementverteilung in einem biologischen Material die Untersuchung der einzelnen F r a k t i o n e n detailliertere und aufschlußreichere Informationen liefert, ist bei vielen Fragestellungen die Analyse des Elementgehaltes in der Gesamtprobe ausreichend und wegen des geringeren Arbeitsaufwandes vorzuziehen. I n diesem Fall muß man, da bei den meisten Methoden zur Spurenelementbestimmung bestimmung nur kleinere Substanzmengen eingesetzt werden können, größere Mengen des Probenmaterials vor der Abnahme der zu analysierenden Teilprobe homogenisieren. I n einem biologischen Material, das sich aus mehreren Gewebearten zusammensetzt, können die Elemente, j e nach ihren Gehalten in den einzelnen Zellsorten, sehr unterschiedlich verteilt sein. Dies wird deutlich aus den in Tabelle 19 aufgeführten W e r t e n für die höchsten und niedrigsten Gehalte, die bei der mehrmaligen E n t n a h m e von Teilproben aus einer Rinderleber gefunden wurden. E s ist demnach wichtig, für jedes E l e m e n t in einer Matrix Tests durchzuführen, um Informationen über

Spurenelementanalyse in biologischen Proben N I

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