Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie: Band 21, Heft 2 1981 [Reprint 2021 ed.] 9783112538746, 9783112538739

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ZEITSCHRIFT FÜR ALLGEMEINE MIKRQ-BIOLOGIE AN INTERNATIONAL JOURNAL ON MORPHOLOGY, PHYSIOLOGY, GENETICS, AND ECOLOGY OF MICROORGANISMS HEFT 2 1981 • BAND 21

AKADEMIE-VERLAG • BERLIN EVP 20, — M

ISSN 0044-2208 34H2

INHALTSVERZEICHNIS

H E F T

2

Geomikrobiologische Untersuchungen. XIV. Schwermetall-Toleranz desulfurizierender Bakterien unter verschiedenen ökologischen Bedingungen Einfluß der Kohlenstoffquelle auf die Reservestoffbildung von Candida spec. H Orotsäure - ein Wuchsfaktor für l'astenrella mutoocida Struktur der Zellwandpolysaccharide in der Futtereiweiß-Hefe Candida spec. H. I. Struktur des alkalistabilen Mannan-Proteins Struktur der Zellwandpolysaccharide in der Futtereiweiß-Hefe Candida spec. H. II. Charakterisierung der Bindung des Phosphats am MannanProtein-Phosphat-Komplex und Identifizierung der als Phosphodiester gebundenen Mono- und Oligosaccharide Respiratorisches Ubichinon-9 aus Ilyphomicrobium spec. Stamm ZV 580 Charakterisierung eines strahlenresistenten Acinetobacter-Stammes Abhängigkeit der a-Amylasebildung bei Bacillus subtilis vom Kohlenhydratstoffwechsel Untersuchungen zur Hemmung der DNA-Polymerasen von T4-Phagen (Wildtyp und Mutante). V. Zusammenfassung von Daten zur Kinetik und Hemmung Geomikrobiologische Laugung von Zinn-Mineralien mit Thiobacillus ferrooxidans und organischen Agenzien Kurze Originalmitteilung Imagination der Cytoplasmamembran als erster Schritt zur Querwandbildung bei Actinomyceten

J . BBECKLINGHAUS, W . SCHWARTZ u n d R . NÄVEKE

65

B . BRÜCKNER u n d R . TRÖGER

77

K . - D . FLOSSMANN, M . H Ö F E R ,

W.

ERLER u n d H . FEIST

85

H . D . GRIMMECKE u n d G . R E U T E R

95

H . D . GRIMMECKE u n d G . R E U T E R

109

J . K Ö H L E R u n d A . C . SCHWARTZ

117

Y . NISHIMURA, E . K A I R I Y A M A , M . SHIMADZU u n d I I . I I Z U K A K . RIEDEL

CORNELIA SCHROEDER u n d J . J A N T SCHAK 141

G . H . T E H , W . SCHWARTZ u n d C . AMSTUTZ

G. 157

169

C . STRUNK

173

Buchbesprechungen

CONTENTS

OF

NUMBER

125 131

2

Geomicrobiological investigations. XIV. Heavy metals tolerance of desulfurizing bacteria under different ecological conditions Influence of the carbon source on the reserve metabolism of Candida spec. H. Orotic acid — a growth factor of Pasteurella multocida Structure of the cell wall polysaccharides in the food protein yeast Candida spec. H. I. Structure of the alkali-stable mannan protein Structure of the cell wall polysaccharides in the food protein yeast Candida spec. H. II. Characterization of the phosphate linkage to the mannan-protein-phosphate-complex and identification of the phosphodiester bound mono- and oligosaccharides Respiratory ubiquinone-9 from Hyphomierobium spec, strain ZV 580 Characterization of a radiation-resistant Acinetobacter

J . BRECKLINGHAUS, W . SCHWARTZ AND R . N Ä V E K E

65

B . BRÜCKNER AND R . TRÖGER

77

K . - D . FLOSSMANN, M . H Ö F E R ,

W.

ERLER AND H . F E I S T

85

H . D . GRIMMECKE AND G . R E U T E R

95

H . D . GRIMMECKE AND G . R E U T E R

109

J . KÖHLER

117

AND

A . C . SCHWARTZ

Y . NISHIMURA, E . K A I R I Y A M A , M . SHIMADZU AND H . IIZUKA 125

Fortsetzung

auf der 3.

Umschlagseite

ZEITSCHRIFT FÜR ALLGEMEINE MIKROBIOLOGIE MORPHOLOGIE, PHYSIOLOGIE, GENETIK UND OKOLOGIE DER MIKROORGANISMEN

ISSN 0044-2208 H E R A U S G E G E B E N VON

F. Egami, Tokio G. F. Gause, Moskau 0 . Hoffmann-Ostenhof, Wien A. A. Imseneckii, Moskau G. Ivanovics, Szeged R. W. Kaplan, Frankfurt/M. G. W. Kidder, Amherst F. Mach, Greifswald 1. Malek, Prag C. Weibull, Lund

unter der Chefredaktion von W. Schwartz, Braunschweig und U. Taubeneck, Jena

UNTER MITARBEIT VON

H. Böhme, Gatersleben M. Girbardt, Jena S. I. Kusnecov, Moskau 0 . Necas, Brno C. H. Oppenheimer, Port Aransas N. Pfennig, Göttingen I. L. Rabotnova, Moskau A. Schwartz, Wolfenbüttel

HEFT 2 • 1981 • BAND 21 REDAKTION

U. May, Jena

AKADEMIE-VERLAG

BERLIN

Die Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie soll dazu beitragen, Forschung und internationale Zusammenarbeit auf dem Gebiet der Mikrobiologie zu fördern. Es werden Manuskripte aus allen Gebieten der allgemeinen Mikrobiologie veröffentlicht. Arbeiten über Themen aus der medizinischen, landwirtschaftlichen, technischen Mikrobiologie und aus der Taxonomie der Mikroorganismen werden ebenfalls aufgenommen, wenn sie Fragen von allgemeinem Interesse behandeln. Zur Veröffentlichung werden angenommen: Originalmanuskripte, die in anderen Zeitschriften noch nicht veröffentlicht worden sind und in gleicher Form auch nicht in anderen Zeitschriften erscheinen werden. Der Umfang soll höchstens IV2 Druckbogen (24 Druckseiten) betragen. Bei umfangreicheren Manuskripten müssen besondere Vereinbarungen mit der Schriftleitung und dem Verlag getroffen werden. Kurze Originalmitteilungen über wesentliche, neue Forschungsergebnisse. Umfang im allgemeinen höchstens 3 Druckseiten. Kurze Originalmitteilungen werden beschleunigt veröffentlicht. Kritische Sammelberichte und Buchbesprechungen nach Vereinbarung mit der Schriftleitung. Bezugsmöglichkeiten der Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie: Bestellungen sind zu richten - in der DDR an den Postzeitungsvertrieb, an eine Buchhandlung oder an den Akademie-Verlag, DDR-1080 Berlin, Leipziger Straße 3 - 4 - im sozialistischen Ausland an eine Buchhandlung für fremdsprachige Literatur oder an den zuständigen Postzeitungsvertrieb - in der BRD und Berlin (West) an eine Buchhandlung oder an die Auslieferungsstelle KUNST UND WISSEN, Erich Bieber, D-7000 Stuttgart 1, Wilhelmstraße 4 - 6 - in Österreich an den Globus-Buchvertrieb, A-1201 Wien, Höchstädtplatz 3 - in den übrigen westeuroäpischen Ländern an eine Buchhandlung oder an die Auslieferungssteil KUNST UND WISSEN, Erich Bieber GmbH, CH-8008 Zürich/Schweiz, Dufourstraße 51 - im übrigen Ausland an den Internationalen Buch- und Zeitschriftenhandel; den Buchexport Volkseigener Außenhandelsbetrieb der DeutschenDemokratischen Republik, DDR-7010 Leipzig Postfach 160, oder an den Akademie-Verlag, DDR-1080 Berlin, Leipziger Straße 3—4. Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie Herausgeber: Im Auftrag des Verlages von einem internationalen Wissenschaftlerkollektiv herausgegeben. Verlag: Akademie-Verlag, DDR-1080 Berlin, Leipziger Straße 3 - 4; Fernruf 2 23 62 29 oder 2 23 62 21 Telex-Nr. 114420; Bank: Staatsbank der DDR, Berlin, Kto-Nr.: 6836-26-20712. Chefredaktion: Prof. Dr. U D O T A T J B E N E C K Prof. Dr. W I L H E L M S C H W A R T Z Anschrift der Redaktion: Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften, DDR-6900 Jena, Beutenbergstr. 11; Fernruf: Jena 885614; TelexNr. 058621. Veröffentlicht unter der Lizenznummer 1306 des Presseamtes beim Vorsitzenden des Ministerrates der Deutschen Demokratischen Republik. Gesamtherstellung: VEB Druckerei „Thomas Müntzer", DDR-5820 Bad Langensalza. Erscheinungsweise: Die Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie erscheint jährlich in einem Band mit 10 Heften. Bezugspreise je Band 250,—M zuzüglich Versandspesen (Preis für die DDR 200,-M). Preis je Heft 2 5 , - M (Preis für die DDR 2 0 , - M ) . Urheberrecht: Alle Rechte vorbehalten, insbesondere die der Übersetzung. Kein Teil dieser Zeitschrift darf in irgendeiner Form — durch Photokopie, Mikrofilm oder irgendein anderes Verfahren — ohne schriftliche Genehmigung des Verlages reproduziert werden. — All rights reserved (including those of translations into foreign languages). No part of this issue may be reproduced in any form, by photoprint, microfilms or any other means, without written permission from the publishers. Erscheinungstermin: April 1981 Bestellnummer dieses Heftes 1070/21/2 ©1981 by Akademie-Verlag Berlin. Printed in the German Democratic Republic. AN (EDV) 75218

Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie

2

21

1981

65-76

(Institut für Mikrobiologie der Technischen Universität Braunschweig)

Ge omikrobiologische Untersuchungen X I V . Schwermetall-Toleranz desulfurizierender Bakterien unter verschiedenen ökologischen Bedingungen J . BEECKLINGHAUS, W . SCHWARTZ u n d R . NÄVEKE

(Eingegangen

am 14.

7.1980)

Tolerance and adaptation to heavy metals of Desulfovibrio- and Desulfotomaculum-strains of different origin have been investigated in enrichment cultures under different conditions of sulphate supply. Three groups of low, medium, and high toxicity were found with As, V, and Mo in the first, Ni, Sb, Co, and Hg in the second, and Cd, Zn, U, and Cu in the third group. If the SO4-supply was restricted to heavy metal sulphates with a relation of 1:1 of heavy metal- and SO'4-ions ( 2 : 3 with Sb 2 (S0 4 ) 3 ) the tolerance was somewhat lowered. Adaptation to higher concentrations of heavy metals was possible, if the strains had not yet been exposed and adapted to higher concentration levels at their natural habitats. The tolerance range of desulfurizers has been compared with the tolerance range of different biochemical types of microorganisms.

Zu den Bakterien, die eine Desulfurikation (dissimilatorische Sulfatreduktion) durchführen, gehören nach BERGEY'S Manual (BUCHANAN U. GIBBONS 1 9 7 4 ) acht Arten der Gattungen Desulfovibrio und Desulfotomaculum, von denen die zweite Sporen bildet. Desulfovibrio desulfuricans und Desulfotomaculum (Clostridium) nigrificans scheinen die am weitesten verbreiteten Arten zu sein, zu denen auch die von uns untersuchten Stämme gehören. Es hat den Anschein, daß es neben den beiden hier genannten noch weitere Gattungen desulfurizierender Bakterien gibt (POSTGATE 1 9 7 9 ) . Das Verbreitungsgebiet der Desulfurizierer erstreckt sich von den Polargebieten bis zum Äquator mit einem breiten Anpassungsbereich an hohe und niedrige Temperaturen, an Süßwasser, Meereswasser und Salzseen, an hohe pH-Werte bis etwa p H 11, an niedrige pH-Werte bis etwa p H 4,5, an hohe hydrostatische Drucke. Desulfurizierer sind obligate Anaerobier. I n der Reinkultur verlangen sie ein E h von wenigstens —100 mV. Der Stoffwechsel der Desulfurizierer ist chemoorganotroph. Fettsäuren, Alkohole, wie Äthanol, Glycerin decken in Reinkulturen den Kohlenstoffbedarf. Die Verwertung von Kohlenwasserstoffen als Kohlenstoff- und Energiequelle ist dagegen noch immer umstritten (POSTGATE 1 9 7 9 ) . I n Anreicherungskulturen scheint die Zahl der verwertbaren Kohlenstoffverbindungen größer zu sein. Wasserstoff kann von einem Teil der Stämme aktiviert werden. Eine strenge, von organischen Kohlenstoffverbindungen unabhängige Autotrophic scheint jedoch nicht vorzukommen. Desulfurizierer sind Leitformen in der Biozönose von Sulphureten, bei denen H 2 S exogener H e r k u n f t ist, im Gegensatz zu hydrothermalen spät vulkanischen Sulphureten, bei denen Desulfurikation als sekundärer H 2 S-liefernder Prozeß auftreten k a n n (WAUSCIIKUHN et al. 1 9 7 7 , SCHWARTZ U. SCHWARTZ 1 9 7 9 ) . Die H 2 S-Toleranz der Desulfurizierer liegt etwa bei 2 — 2 , 5 g/1. Geomikrobiologisch besteht die Bedeutung der Desulfurizierer vor allem darin, daß sie neben den lokal begrenzten spätvulkanischen Solfatarengebieten und den ebenfalls lokal und auf verhältnismäßig kurze Zeit begrenzten Biotopen der Eiweißfäulnis die verbreitetsten H 2 S-Produzenten auf der Erde sind. 5*

66

J . BRECRLINGHATJS, W . SCHWAETZ u n d R . NÄVEKE

Auf das Vorkommen von Desulfurizierern in Schwermetall-Lagerstätten haben ( 1 9 6 2 ) und L Y A L I K O V A U . SOKOLOVA ( 1 9 6 5 ) hingewiesen. Das nahezu regelmäßige Vorkommen im Salzwasser von Erdöl-Lagerstätten ist seit 1926 bekannt ( B A S T I N 1 9 2 6 , G I N S B U R G - K A R A G I T C H E V A 1 9 2 6 ) . Desulfurizierer greifen in Prozesse der sedimentären und hydrothermalen sulfidischen Fällung und Anhäufung von Schwermetallen bis zur beginnenden Lagerstättenbildung ein ( H A T A 1 9 6 0 , B A A S

KRAMARENKO

BBCKING

U. M O O R E

1961,

TEMPLE

U. L E R O U X

1964,

S C H W A R T Z 1 9 6 8 , H A L L B E R G 1 9 7 2 , I L Y A L E T D I N O V et al.

ROBERTS

1967,

SUCKOW

U.

1 9 7 7 , S C H W A R T Z U. S C H W A R T Z

1979 und andere). Am natürlichen Standort kann der Sulfatbedarf, der für eine lang anhaltende Desulfurikation notwendig ist, nicht ausschließlich aus leicht löslichen Sulfaten gedeckt werden. Die Verwertung von schwer wasserlöslichen in großer Menge vorhandenen Sulfatmineralien, wie Gips und Anhydrit, aber auch von Coelestin und Baryt, ist nachgewiesen worden ( R O E M E R U. S C H W A R T Z 1 9 6 5 ) . Wenn die Desulfurikationsleistung zur Schwermetallfällung nicht ausreicht oder wenn im äußersten Fall die Sulfatversorgung ausschließlich durch ein Schwermetallsulfat erfolgt, so daß beide Komponenten gleichzeitig an die Zellen gelangen, könnte die Schwermetalltoleranz der Desulfurizierer zum limitierenden Faktor werden. Die Verwertung von Schwermetallsulfaten in der Desulfurikation ist bis jetzt, wie es scheint, wenig untersucht worden. Unsere Versuche setzen hier ein. Es sollte festgestellt werden, bis zu welchen Konzentrationen Schwermetalle als Sulfat vertragen werden, wenn gleichzeitig ausreichende Mengen von Alkali- und Erdalkalisulfaten zur Verfügung stehen und wenn im zweiten Fall die gesamte Sulfatversorgung ausschließlich über ein Schwermetallsulfat erfolgt. Weiterhin war zu prüfen, ob unter diesen Bedingungen eine Adaptation an höhere Schwermetallkonzentrationen stattfindet. — Von der Verwendung von Reinkulturen haben wir abgesehen, da dies den ökologischen Bedingungen nicht entspricht und da physiologische Veränderungen bei länger dauernder Reinkultur mit größerer Wahrscheinlichkeit zu erwarten sind als in Anreicherungskulturen.

Material und Methoden Desulfuriziererstämme: Folgende Anreicherungskulturen von Desulfurizierern standen uns zur Verfügung, wobei sieh die Bezeichnung „Stamm" auf die Herkunft von verschiedenen Standorten und nicht auf ein bestimmtes genetisches oder physiologisches Merkmal bezieht — mit der stillschweigenden Annahme, daß an räumlich begrenzten Standorten, an denen die Probenahme erfolgte, jeweils nur ein Desulfurizierer-Stamm vorhanden war. Bei Stämmen von Standorten mit wahrscheinlich erhöhten Schwermetallgehalten ist die Kurzbezeichnung unterstrichen; ein Stern bedeutet Sporenbildung: BS*

Philippinen, "burning soil". Hochtemperierter Boden über Lavadecken aus einem Vulkangebiet. J 35/36 Sediment am Ufer eines heißen Schwefelsees; pH 4,8; 40 CC; Noboribetsu, Hokkaido/ Japan. No 5* Sediment aus einem Schwefelsee; Noboribetsu, Hokkaido, Japan (Probe 5). Meg 2 Schlamm aus der Zinkflotation der Grube Meggen (Probe 2). Oker 2* Uferschlamm der Oker in Braunschweig (Probe 2). KS 1* Stollenschlamm aus dem Rammeisberg, Goslar/Harz (Probe 1). RS 2* Stollenschlamm aus dem Rammeisberg (Probe 2). RT 1 Schlamm aus einem Absetzbecken für die Grubenwässer des Bergwerks Rammeisberg (Probe 1). HSW12 Kühlwasser-Kreislauf, Hamburger Stahlwerke. Alle Kulturen wuchsen bei 25 °C und 30 °C, nicht bei 45 °C und 55 °C. Endosporenbildner wurden durch Erhitzen der Kultur auf 100 °C (10 min) und anschließendes Überimpfen auf Desulfurizierer-Nährlösung (ABD-EL-MALEK U. RIZK 1958) und durch Endosporenfärbung nach WIRTZ, modifiziert n a c h SCHAEFFER U. FULTON ( 1 9 3 3 ) , bei den S t ä m m e n N o 5 , B S , R S 1, R S 2,

Oker 2 nachgewiesen. Die Anreicherungskulturen wurden in der Laktat-Nährlösung nach ABD-EL-

Geomikrobiologisohe Untersuchungen. X I V .

67

MALEK U. RIZK (1958) gehalten u n d etwa alle drei Wochen u m g e i m p f t . I n k u b a t i o n bei 30 °C, anaerob, dunkel in Schraubverschlußflaschen (mit Dichtung), die randvoll gefüllt waren. Alle K u l t u r e n enthielten vom S t a n d o r t m i t g e f ü h r t e f a k u l t a t i v anaerobe H 2 S-tolerante Bakterien (nachgewiesen durch aerobe B e b r ü t u n g auf MERCK S t a n d a r d I-Agar). Schwermetalltoleranz: Der Toleranztest erfolgte in Schraubverschlußröhrchen, 160 X 15 m m (Sovirel), so d a ß bei randvoller Füllung anaerobe Verhältnisse gesichert waren. Die Röhrchen enthielten 16,0 ml Nährlösung n a c h ABD-EL-MALEK U. RIZK (1958) 1 ), 1,0 ml Schwermetallösung b e s t i m m t e r K o n z e n t r a t i o n u n d 0,5 ml Desulfuriziererkultur als I m p f m a t e r i a l . Der K e i m t i t e r ist m i t der MPN-Methode in 5 Parallelen e r m i t t e l t worden (MEYNELL U. MEYNELL 1965). Die Zellzahlen in 0,5 ml lagen zwischen 1,1 X 10 8 u n d 8,0 x 10®. Die Teströhrchen wurden etwa 20 Tage bei 30 CC, anaerob, dunkel inkubiert. Ausgehend von der Annahme, d a ß Desulfurikation auch W a c h s t u m bedeutet, erfolgte die Auswertung auf Grund der Schwarzfärbung des Sedimentes. Röhrchen, in denen keine Sedimentschwärzung eingetreten war, w u r d e n auf Überleben der Desulfurizierer g e p r ü f t , indem auf neue Röhrchen, die kein Schwermetall enthielten, u m g e i m p f t wurde. Fiel dieser Test auf Überleben negativ aus, wurde die betreffende Schwermetallkonzentration als baktericid angenommen. Toleranzgrenze w a r die niedrigste Schwermetallkonzentration, die bei Abschluß des Versuchs in den negativ gebliebenen Röhrchen im Ü b e r s t a n d festgestellt werden konnte. Die K o n z e n t r a t i o n der Scßwermetalle wurde m i t den weiter u n t e n beschriebenen Meßmethoden e r m i t t e l t . F ü r folgende wasserlösliche Schwermetallverbindungen wurde die Toleranzgrenze der 9 Desulfurizierer-Stämme ermittelt 2 ): V 0 S 0 4 • 5 H a O (8503) - CoS0 4 • 7 H a O ( 2 5 5 6 ) - N i S 0 4 • 6 H a O (6727) - CuS0 4 - 5 H s O ( 2 7 9 0 ) Z n S 0 4 • 7 H 2 0 (8883) - N a A s 0 2 (6287) - N a M o 0 4 • 2 H 2 0 (6521) — 3 CdS0 4 • 8 H 2 0 (2026) K S b C 4 H 4 0 , • 0,5 H 2 0 (8092) - HgCl 2 (4417) - U 0 2 S 0 4 • 3,5 H 2 0 (12390). Die Schwermetallkonzentrationen lagen in 12 — 18 Stufen bei V zwischen 3,4 u n d 127, bei Co zwischen 4,4 u n d 187, bei Ni zwischen 2,6 u n d 196, bei Cu zwischen 2,9 u n d 102, bei Zn zwischen 5,2 u n d 208, bei As zwischen 4,0 u n d 98,3, bei Mo zwischen 4,6 u n d 110, bei Cd zwischen 5,0 u n d 215, bei Sb zwischen 4,3 u n d 79,2, bei H g zwischen 5,4 und 208 und bei U zwischen 6,3 u n d 666 p p m . Verwertung von Schwermetallsulfaten, Adaptationsversuche: E s sollte u n t e r s u c h t werden, bis zu welchem Schwermetallgehalt W a c h s t u m erfolgt, wenn Sulfat ausschließlich als Schwermetallsulfat vorliegt. Die Nährlösung n a c h ABD-EL-MALEK U. RIZK (1958) wurde f ü r diese Versuche in folgender Weise a b g e ä n d e r t : 0,10 g/1 FeCl 2 • 4 H 2 0 s t a t t 0,10 g/1 (NH 4 ) 2 Fe(S0 4 ) 2 • 6 H 2 0 , 0,50 g/1 MgCl 2 • 6 H 2 0 , s t a t t 2,00 g/1 MgS0 4 • 7 H 2 0 , 0,10 g/1 NaCl s t a t t 0,50 g/1 Na 2 S0 4 . Die Schraubk a p p e n r ö h r c h e n enthielten 16,0 ml Nährlösung, 1,0 ml Schwermetallsulfatlösung bestimmter K o n z e n t r a t i o n , 0,5 ml B a k t e r i e n k u l t u r . Als Sulfat waren ausschließlich die Sulfate von V, Ni, Cu, Zn, Cd oder U vorhanden. Zusätzlich wurde die Verwertung von Sb 2 (S0 4 ) 3 (Ventron 66125) g e p r ü f t , das als schwer wasserlösliche Verbindung vorlag u n d den Röhrchen in definierten Mengen zugegeben wurde. J e d e r S t a m m wurde zunächst m i t einer K o n z e n t r a t i o n eines jeden Schwermetalles inkubiert, die u n t e r der festgestellten baktericidenKonzentration lag, bei V 57,1 p p m , Ni 2,6 p p m , Cu 2,9 p p m , Zn 5,2 p p m , Cd 25,0 p p m , U 6,3 p p m . W a r W a c h s t u m erfolgt, kenntlich an der Sedimentschwärzung, wurde auf Röhrchen m i t einer höheren Schwermetallkonzentration übergeimpft usw. Die I n k u b a t i o n erfolgte m i t jeder K o n z e n t r a t i o n 30 Tage lang bei 30 °C im Dunkeln. Außerdem war die F r a g e zu prüfen, ob die Desulfurizierer an höhere Schwermetallkonzentratinen als die im Toleranztest als baktericid festgestellten a d a p t i e r t werden können, wenn sie längere Zeit ausschließlich m i t Schwermetallsulfaten wuchsen. Die Verwertung des schwer wasserlöslichen Sb 2 (S0 4 ) 3 wurde m i t drei verschiedenen Sulfat- bzw. Schwermetallmengen in je drei aufeinanderfolgenden Passagen getestet: 10 (xmol Sb u n d 15 (Amol SOt", 20 fimol Sb u n d 30 ¡¿mol SO|" u n d 30 jumol Sb u n d 45 (j.mol S 0 | " . Erfolgte in der d r i t t e n Passage m i t den niedrigsten Mengen noch eine Verfärbung des Sedimentes, so wurde auf die erste Passage m i t den erhöhten Mengen übergegangen usw. — Desulfurikation war an einer R o t f ä r b u n g des Sedimentes (Fällung von Sb 2 S 3 ) zu erkennen. Die effektive Schweimetallkonzentration in den Ü b e r s t ä n d e n der Röhrchen, bei denen Desulf u r i k a t i o n w ä h r e n d 30 Tagen ausblieb, wurde nach Abschluß der Versuche e r m i t t e l t . Die Keimt i t e r der 0,5 ml lagen bei diesen Versuchen in der gleichen Größenordnung wie bei den Toleranzversuchen. Messung der Schwermetallkonzentrationen: Bei den Toleranzversuchen sollte das Einsetzen der toxischen W i r k u n g in Abhängigkeit von den in Lösung vorhandenen Schwermetallionen e r f a ß t ') Bei Versuchen m i t U r a n 0,25 s t a t t 0,50 g/1 K 2 H P 0 4 u n d p H 6,5 s t a t t 7,2, u m Uranfällung d u r c h die Nährlösung herabzusetzen (vgl. S. 7) 2 ) I n K l a m m e r n Bezeichnung des b e n u t z t e n MERCK-Präparates. F ü r A n t i m o n s t a n d als wasserlösliche Verbindung n u r das T a r t r a t zur Verfügung. Auf die Entwicklung der Desulfurizierer war T a r t r a t , soweit wir feststellen k o n n t e n , ohne Einfluß.

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J . BEECKLINGHAUS, W . SCHWARTZ u n d R . N Ä V E K E

werden. Hierzu wurde der Inhalt der Röhrchen, in denen kein Wachstum erfolgt war, zentrifugiert (SoEVALL-Zentrifuge RC2-B Superspeed, 27100 X g, 15 min), und die SchwermetallionenKonzentrationen wurden im Überstand bestimmt, bei V, Co, Ni, Cu, Zn, Mo, Cd, Sb und Hg an H a n d von Eichkurven durch Atomabsorptions-Spektrophotometrie (PERKIN-ELMER 400) — bei As durch oxydimetrische Titration mittels Kaliumbromat ( J A N D E R U. J A H B 1973) — bei U nach J O H N S O N U. F L O R E N C E ( 1 9 7 1 ) .

Ergebnisse. G r e n z w e r t e der S c h w e r m e t a l l t o l e r a n z Bei der ersten Gruppe von Versuchen haben wir die Grenzwerte für die einzelnen Schwermetalle in ppm, bezogen auf das Schwermetallatom, unter der Bedingung ermittelt, daß neben den Schwermetallsulfaten andere Sulfate in ausreichender Menge zur Verfügung standen. Bei negativem Ausfall eines Versuchs (Ausbleiben der Desulfurikation) haben wir die aus der Einwaage berechneten Schwermetallkonzentrationen (Inkubationswerte) mit den Meßwerten verglichen, die bei Abschluß des Versuchs in Lösung vorhanden waren. Diese Werte wurden als Grenzwerte der Toleranz angenommen. Daß Unterschiede zwischen Inkubationswert und Meßwert vorhanden waren, beruht darauf, daß mit der Impfmenge von 0,5 ml aus der Vorkultur auch H 2 S mitgeführt wird und mit dem in Lösung vorhandenen Schwermetall reagiert. Auch die Nährlösung selbst kann Schwermetall-fällend wirken, am stärksten bei Uran, das bei p H 7 als U0 2 (OH) 2 ausfällt. Um dies möglichst zu vermeiden, haben wir die auf Seite 67 erwähnten Maßnahmen getroffen. Aus den Ergebnissen der Versuche (Tab. 1) läßt sich für jeden der 9 Stämme eine Reihenfolge der Schwermetalle nach abnehmender Giftwirkung ableiten (Tab. 2). Beziffert man die Plätze der Schwermetalle in diesen Reihen von links nach rechts mit 1 bis 11, so ergeben sich für jedes Schwermetall 9 Zahlen, entsprechend seinem Verhalten gegenüber den 9 Stämmen (Tab. 3, arabische Ziffern), und es lassen sich 12 Summen bilden, aus deren Größe sich eine Vorstellung von der durchschnittlichen Toxizität der Schwermetalle gegenüber den Desulfirizierern ableiten läßt. Cd > Zn > U > Cu > Ni > Sb > Co > Hg > As > V > Mo Vergleicht man bei jedem Metall in Tabelle 1 die Toleranz-Grenzwerte der einzelnen Stämme miteinander und gibt man jedem Stamm einen entsprechenden Platz zwischen I und I X (Tab. 3), so erhält man für jeden Stamm 11 Platz-Ziffern. Ihre Summen ergeben eine Reihe abnehmender Toleranz-Breiten der 9 untersuchten Stämme: BS > RS 2 > Oker 2 > R T 1 > Meg 2 > J 35/36 > No > HSW 12 > RS 1 Für Stamm BS hat sich die größte, für RS 1 die geringste Toleranzbreite ergeben. Der Stamm BS ist von einem Standort spätvulkanischer Erscheinungen isoliert worden, der bei hohen Bodentemperaturen („burning soil") eine ökologische Belastung durch vulkanische Exhalationen und möglicherweise auch durch Schwermetalle in Verbindung mit Vorgängen der Gesteinsverwitterung erwarten läßt. Auch an den Standorten von RS 2, Meg 2, Oker 2 darf eine mehr als durchschnittliche Belastung durch Schwermetalle angenommen werden — bei Stamm Oker 2 aus den in die Oker gelangenden Abwässern der Harzer Hüttenindustrie. Stamm RS 1 mit der geringsten Toleranzbreite entspricht dagegen nicht diesen Vorstellungen. Ob sich die Toleranzbreiten der einzelnen Stämme an ihren Standorten erst entwickelt haben oder bereits vorhanden waren, als die Besiedlung der Standorte erfolgte, muß dahingestellt bleiben. Die Verteilung von Sporen- und Nichtsporen-Bildnern innerhalb der Reihen läßt den Schluß zu, daß Sporenbildung keinen Einfluß auf die Toleranzbreite hat und daß in dieser Beziehung kein Unterschied im ökologischen Verhalten zwischen Desulfovibrio und Desulfotomaculum besteht. Nach den Reihenfolgen, die sich ergeben haben

!1: As

Geomikrobiologische Untersuchungen. XIV.

a

(N^HOOTHOT(I(NO V 0 S 0 4 > ZnS0 4 > NiS0 4 > CuS0 4 > CdS0 4 > U 0 2 S 0 4 . Auch bei dieser Gruppe von Versuchen haben wir bei den 9 Stämmen die Grenzwerte der Schwermetallkonzentrationen ermittelt, bei denen unter den gegebenen Bedingungen die Desulfurikation auch bei einer Versuchsdauer von 30 Tagen ausblieb. Auf Grund der Meßwerte wurde auch hier für jeden Stamm eine Reihenfolge abnehmender toxischer Wirkung der Schwermetalle aufgestellt. Daraus ergab sich folgende Reihe durchschnittlicher toxischer Wirkung: Zn > Cu > U > Cd > Sb > Ni > V . Für das Toleranzverhalten der Stämme gegenüber den 7 geprüften Schwermetallen lautete die Reihe: RS 2 > Oker 2 > RS 1 > R T 1 > No > J 35/36 > Mg 2 > BS > H S W 1 2 , während sich bei zusätzlicher Sulfatversorgung neben den Schwermetallsulfaten die Reihe BS > RS 2 > Oker 2 > R T 1 > Meg 2 > J 35/36 > No > HSW 12 > RS 1 ergab (vgl. S. 68). Übereinstimmungen und Abweichungen sind zu erkennen. RS 2, Oker und R T 1 tolerierten in beiden Fällen die höchsten Konzentrationen von Schwermetallen. Stamm RS 1 hatte die geringste Toleranz, die jedoch durch Adaptation zunahm. Bei den Stämmen RS1, RS 2 und R T 1 dürfte die Sulfatversorgung auch am natürlichen Standort vorwiegend über Schwermetallsulfat erfolgt sein. Die Stämme No, J 35, Oker und HSW nehmen in beiden Reihen etwa den gleichen Platz ein. Vergleicht man die Toleranzgrenzen, die sich aus den Versuchen mit doppelter (vom Schwermetall unabhängiger) Sulfatversorgung (Tx) und mit Schwermetallsulfat allein (T2) ergeben haben, indem man für jedes Schwermetall und für jeden Stamm die Quotienten T J / T J bildet, so zeigt ein Wert > 1 erhöhte und < 1 herabgesetzte Toleranz an, wenn die Desulfurikation an das Schwermetallsulfat gebunden ist (Tab. 4). Im einzelnen hat sich folgendes ergeben: Mit Ausnahme von Meg 2 verwerten alle Stämme V 0 S 0 4 mit höheren V-Konzentrationen; Stamm R T 1 erreichte das Dreibis Vierfache der Grenzwerte von T r Die geringe, vom Standort mitgebrachte, Toleranz (T r Wert) wurde drastisch erhöht. Die Stämme HSW, No und BS tolerierten NiS0 4 Das schwerlösliche Sb-Sulfat war größtenteils als Bodenkörper vorhanden.

J. Buecklinghaus, W. Schwathz und R. Näveke

72

Tabelle 4 Toleranzbereich bei getrennter Versorgung mit Sulfaten (Tj) und bei Versorgung ausschließlich mit Schwermetallsulfaten (T2). Die römischen Ziffern geben die Reihenfolge, das heißt, den Rang der einzelnen Stämme nach der Größe der Quotienten wieder. Metall

HSW

Meg

J3 5

No

RS 2

RT 1

Oker

V VIII IV III IX VI VII 63,0 63,9 63,0 48,0 54,0 72,0 T 2 48,0 V 51,2 64,0 47,3 55,0 45,3 67,0 Ti 39,6 0,98 1,25 1,33 0,87 1,19 1,07 Q 1,21 IX VII III IV VIII II I 29,3 26,4 16,5 39,4 45,3 32,6 T2 25,0 Ni 16,2 16,2 26,4 15,6 57,6 16,6 TI 30,0 0,63 1,81 1,63 0,79 2,09 2,37 Q 0,83 I V III II VI VII IV 14,5 3,2 2,3 2,3 2,0 1,6 T2 13,0 Cu 8,0 6,5 6,5 6,4 12,3 3,1 Tx 4,1 0,32 0,29 0,74 2,23 0,25 0,26 Q 3,17 IV III IV VIII I II VI 1,8 2,4 1,6 4,4 3,3 5,0 T2 3,3 Zn 2,2 2,2 4,3 2,2 3,0 Tj 3,0 2,1 0,82 1,09 1,67 1,57 0,37 2,0 Q 1,1 VII IX II I III V IV 16,0 18,0 14,3 11,0 26,5 11,0 T 2 11,0 0,2 Cd 9,4 0,3 0,7 0,4 0,3 Tx 1,8 1,70 90,0 47,7 15,7 66,3 36,7 Q 6,11 II I IV VII VIII VI IX 18,1 15,4 20,9 15,4 18,5 15,2 Ti 13,4 Sb 40,0 20,0 20,3 48,0 40,0 50,5 T2 18,5 0,89 0,39 1,05 0,32 0,46 0,30 Q 0,72 II I IV IX VIII III VII 4,0 5,2 4,2 3,9 4,9 4,9 Ti 4,6 U 6,2 9,6 5,4 5,2 11,3 11,9 t 2 8,0 0,42 0,72 0,94 0,79 0,35 0,46 Q 0,58 Summen aus den Rängen der Stämme: HSW Meg J 35 No BS RS 1 RS 2 RT 1 Oker 32 35 31 30 47 25 34 39 33 Reihenfolge aus der Summenbildung: RS 1 > No > J 35 > HSW > RS 2 > Oker > Meg > RT 1 > BS

I 70,0 17,1 4,09 VI 40,8 33,6 1,21 VIII 1,2 23,2 0,05 VII 2,1 2,6 0,81 VIII 12,5 4,8 2,60 III 15,7 21,5 0,73 VI 5,4 9,5 0,57

II 67,5 50,6 1,33 V 37,0 23,4 1,58 VI 2,8 10,9 0,26 V 3,0 3,3 0,91 VI 30,0 3,9 7,69 V 12,6 23,5 0,54 IV 5,0 8,6 0,58

BS

RS 1

im Durchschnitt nur bis zu 75% der Grenzkonzentration von T 1; während die übrigen Stämme höhere Werte erreichten. An eine erhöhte Cu-Konzentration ließen sich unter T 2 -Bedingungen nur HSW und No adaptieren; die übrigen Stämme erreichten nur etwa 50% der T r Toleranz. Die Zn-Toleranz war bei HSW, J 35, No, RS 1 und RS2 erhöht; bei den anderen Stämmen fiel im Mittel schon bei 73% Zn der ^-Toleranz die Desulfurikation aus. Für Sb 2 (S0 4 ) 3 gelang nur bei Stamm No eine Adaptation an höhere Konzentrationen von Antimon; alle anderen Stämme erreichten im Durchschnitt nur 54% der TrToleranz. Negativ verliefen alle Versuche mit Uranylsulfat; die 9 Stämme erreichten im Durchschnitt nur 60% der ^-Toleranz. Diskussion Wir haben unsere Versuche zur Frage der Schwermetall-Toleranz desulfurizierender Bakterien in zwei Gruppen durchgeführt. In der ersten Gruppe standen für dissimilatorische Desulfurikation und anaerobe Atmung, neben Schwermetallsulfaten, reichlich Alkalisulfate in Lösung zur Verfügung. Im zweiten Fall war das gesamte Sulfat

Geomikrobiologisclie Untersucliungen. X I V .

73

aequimolar — oder bei Sb im Verhältnis 2 : 3 — an Schwermetall gebunden und mengenmäßig durch den Toleranzbereich des betreffenden Schwermetalles begrenzt. Unter diesen Bedingungen wurde auch geprüft, ob eine Adaptation an höhere Schwermetall-Konzentrationen gelingt als sie am natürlichen Standort vorhanden war und in den Versuchen der ersten Gruppe festgestellt wurde. Noch nicht geprüft, als weitere ökologische Variante, wurde die Kombination kristalliner mineralischer Sulfate (Gips, Anhydrit) mit nicht an SO?" gebundenen Schwermetallen. Wir haben die Versuche mit Anreicherungskulturen unter MPN-Kontrolle der Desulfuriziererzahl anstelle von Reinkulturen durchgeführt, den Verhältnissen am Standort entsprechend. Dort sind neben den Desulfurizierern, wie es scheint ohne Ausnahme, H 2 S-tolerante obligatorisch oder fakultativ anaerobe Bakterien vorhanden, deren Beziehungen zu den Desulfurizierern ebensowenig bekannt sind und höchstens vermutet werden, wie es bei dem Vorkommen acidotoleranter aerober Bakterien und Pilze am Standort und in Anreicherungskulturen von Thiobacillus ferroozidans und T. thiooxidans der Fall ist. Das Verhalten dieser, in den Anreicherungskulturen vorhandener Begleiter bedarf in beiden Fällen noch einer besonderen Untersuchung im Vergleich mit dem Verhalten entsprechender Reinkulturen. Die neun untersuchten Desulfurizierer-Stämme waren von Standorten isoliert, an denen zum Teil mit erhöhten Gehalten an Schwermetallen zu rechnen war. Sie gehören beiden in B E R G E Y ' S Manual (BUCHANAN U. G I B B O N S 1 9 7 4 ) anerkannten Gattungen von Desulfurizierern an. Das Vermögen zur Sporenbildung bei den DesulfotomaculumStämmen hatte auf unsere Versuche keinen erkennbaren Einfluß. Ob Sporenbildung auf das Überleben toxischer Konzentrationen von Schwermetallen von Einfluß ist (was angenommen werden könnte), haben wir nicht untersucht. I n der ersten Gruppe von Versuchen bestand keine Beziehung zwischen Schwermetallen und Versorgung mit Sulfaten. Nach ihrer Toxizität ließen sich die untersuchten Schwermetalle in drei Gruppen hoher, mittlerer und geringer Toxizität anordnen. Zur ersten Gruppe mit der geringsten Toleranz und stärksten Toxizität mit Grenzwerten zwischen 0,2 und 23,2 ppm gehören Cd, Zn, U, Cu, zur mittleren Gruppe mit erheblichen Unterschieden in der Toleranz der einzelnen Stämme Ni, Sb, Co, Hg und zur dritten Gruppe mit der höchsten Toleranz und mit Grenzwerten zwischen 15,0 und 87,0 ppm As, V, Mo. Bei diesen und bei den folgenden Versuchen mußte zwischen eingewogenen Schwermetallmengen (theoretische Werte) und den in der Lösung vorhandenen Mengen (Meßwerte) unterschieden werden, da mit der Impfung unbestimmte Mengen von H 2 S aus der vorhergegangenen Kultur mitgeführt werden und einen Teil der in Lösung vorhandenen eingewogenen Schwermetalle fällen, abgesehen von möglichen Fällungen durch Bestandteile des Mediums. Maßgebend für die Ermittlung der Toleranzgrenzen sind die Meßwerte, die bei Abschluß des Versuchs in der Lösung in den Fällen festgestellt wurden, in denen eine Desulfurikation ausgeblieben war 1 ). In der zweiten Gruppe von Versuchen war die Sulfatversorgung ausschließlich an die Schwermetalle gebunden. Für die 7 hier geprüften Schwermetalle lautete die Reihenfolge zunehmender Toleranz und abnehmender Toxizität: Zn > Cu > U > Cd > Sb > Ni > V . Die Lebensbedingungen waren insofern erschwert als Sulfat- und SchwermetallIon bei jeder Passage im molaren Verhältnis 1:1, bei Sb-III-Sulfat im Verhältnis 2 : 3 x ) Diese Werte könnten zu niedrig sein, wenn etwa eine enzymatische Desulfurikation nach, dem Absterben der Zellen aktiv geblieben wäre. Für eine solche Möglichkeit könnten die zum Teil erheblichen Unterschiede sprechen, die zwischen eingewogenen und in Lösung festgestellten Schwermetallmengen vorhanden waren (vgl. Tab. 1).

J . BRECKLINGHAUS, W . SCHWAETZ und R . NÄVEKE

74

vorlagen. Bei den Versuchen der ersten Gruppe war dagegen das Verhältnis um das Zehnfache oder mehr zugunsten von SO?" verschoben, so daß hier bei Versuchen mit der gleichen Schwermetall-Konzentration in unmittelbarer Umgebung der Desulfurizierer-Zellen S0 4 -Ionen im Überschuß vorhanden waren. E s wäre denkbar, daß in diesen Fällen eine Schutzwirkung des unabhängig von der Schwermetallkonzentration reichlicher entstehenden H 2 S zu einer beschleunigten Schwermetallfällung geführt hat. Die stärkere Belastung im anderen Fall führte zu einem im Durchschnitt um 12 Tage verzögerten Beginn der Sulfidfällung. Außerdem ergab sich bei diesen Versuchen, daß die Schwermetalltoleranz geringer war. Stämme von Standorten, an denen nur mit einer geringen Schwermetall-Belastung zu rechnen war, wie im allgemeinen in marinen oder limnischen Schlammablagerungen, ließen sich meist ohne Schwierigkeiten an höhere Konzentrationen adaptieren. War eine solche Adaptation an Standorten höherer Schwermetall-Konzentrationen bereits vorhanden, weil die Stämme, die dort anzutreffen sind, sie bereits besaßen oder dort entwickelt hatten, so verliefen Versuche mit erhöhten Schwermetall-Konzentrationen negativ oder hatten nur geringen Erfolg. Über bestimmte Art- oder Stammes-spezifische Höchstwerte kann die Adaptation nicht gesteigert werden. An einer kausalen Begründung fehlt es noch, da nicht mit Sicherheit bekannt ist, wo und wie die verschiedenen Schwermetalle die Zellstruktur beeinflussen und im Stoffwechsel wirksam werden. Für Desulfurizierer scheint nur bekannt zu sein, daß sie Schwermetalle stärker im Cytoplasma und in der Zellmembran speichern als Bakterien, die Sulfate nur im assimilatorischen Stoffwechsel reduzieren (JONES et al. 1976). Vergleiche mit der Schwermetall-Toleranz anderer ökologischer oder biochemischer Gruppen von Mikroorganismen werden meist durch Verschiedenheit der Untersuchungsmethoden erschwert. Immerhin hat sich z. B . ergeben, daß die Schwermetall-Toleranz der beiden ökologisch und geochemisch wichtigen Thiobacillus-Avten, T. ferrooxidans und T. thiooxidans, erheblich höher ist, wenn auch nicht bei allen Stämmen (MARCIILEWITZ et al. 1 9 6 1 , E B N E R U. SCHWARTZ 1 9 7 4 ) . Als chemoautotrophe acidophile Aerobier und chemoorganoheterotrophe Anaerobier gehören die beiden Gruppen ganz verschiedenen Stoffwechseltypen an. Zwischen den meist niedrigen pH-Werten in Lösungen von Schwermetallsalzen und der Anpassung der beiden Thiobacillus-Arten an niedrige pH-Bereiche mit Optima bei pH 3 bzw. bei 4,5 könnte insofern eine Beziehung bestehen, als die ökologischen Voraussetzungen für eine Entwicklung hoher Schwermetall-Toleranzen gegeben waren. Vergleicht man bei beiden Gruppen die Reihenfolge abnehmener Toxizität, so ergibt sich nahezu eine Umkehr: T. thiooxidans: Mo > V > Sb > Cu > Ni 1 ) Desulfurizierer: Cu > Ni > Sb > V > Mo . Nicht nur die Breite der Toleranz, sondern auch die relative Toxizität von Schwermetallen ist in beiden Gruppen verschieden. Auch der chemoorganoheterotrophe aerobe N-bindende Azotobacter chroococcum ist auf sein Verhalten gegenüber Schwermetallen untersucht worden mit einer Methode, die auf der Agardiffusion löslicher Schwermetallsalze beruht, jedoch nur einen Vergleich der relativen Toxizität von Schwermetallen zuläßt (DENDOOREN DE JONG 1978). Auch hier ergibt sich eine Reihenfolge abnehmender Toxizität, die mit dem Verhalten der Desulfurizierer verglichen werden kann: Hg > Ni > Co > Zn > Sb > Cu > Cd > V > U > As > Mo (Azotobacter) Cd > Zn > U > Cu > Hg > Sb > Ni > Co > As > Mo > V (Desulfurizierer) ) Nicht veröffentlichte Versuche

x

Geomikrobiologische U n t e r s u c h u n g e n . X I V .

75

Was die Mitwirkung desulfurizierender Bakterien an der Entstehung sedimentärer Lagerstätten sulfidischer Erze betrifft, so hat sieh gezeigt, daß ein breiter Toleranz^ bereich vorhanden ist, zumindest in einem bereits stabilisierten Sulphuretum mit einem Desulfurizierer-Titer, der in unseren Versuchen die Größenordnung von etwa 10 7 /ml (MPN) hatte, und daß selbst Perioden eingeschränkter oder erschwerter Sulfatversorgung innerhalb gewisser Grenzen überstanden werden.

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Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie

2

21

1981

77-84

(Friedrich-Schiller-Universität Jena, Sektion Biologie, Wissenschaftsbereich. Allgemeine Mikrobiologie)

Einfluß der Kohlenstoffquelle auf die Reservestoffbildung von Candida spec. H B . BRÜCKNER u n d R . TRÖGER

(Eingegangen

am, 5.

6.1980)

Various aspects of the carbon energy reserve metabolism of Candida spec. H on glucose in comparison to its metabolism on hydrocarbons were studied in this article. I n the absence of nitrogen for growth cells undergo several changes in their chemical composition. The content of protein and nucleic acids decreases rapidly. At the same time on the glucose medium glycogen and trehalose were markedly accumulated, whereas lipid accumulation was only slight. On the hydrocarbon substrate both carbohydrates and lipid were increased. Also the difference between the f a t t y acid composition of Candida spec. H when grown on glucose and on n-alkanes was studied. The results were discussed.

Die Art der eingesetzten Kohlenstoffquelle ist für Wachstum und Zellzusammensetzung der Mikroorganismen von großer Bedeutung. So erreichen Hefen mit Glucose als Substrat höhere spezifische Wachstumsraten als mit Kohlenwasserstoffen (EnsfSELE et al. 1 9 7 2 ) . Auch Qualität und Quantität der unter bestimmten physiologischen Bedingungen gebildeten Reservestoffe hängen entscheidend vom Charakter der Kohlenstoff- und Energiequelle ab. Eine Möglichkeit der Induktion einer verstärkten Reservestoffakkumulation ist die Kultivierung unter Stickstoffmangel. Glucose als Substrat bietet dabei beste Voraussetzungen für die Anreicherung von Kohlenhydraten, vor allem von Glycogen und Trehalose (HERBERT 1 9 6 1 , SJÖBLOM U. STOLPE 1 9 6 4 ) . Elektronenmikroskopisch konnten eine Vielzahl von Glycogengranula in solchen HefezelJen nachgewiesen werden (LTJDVIK et al. 1 9 6 8 ) . Der Lipidgehalt der Trockenmasse ist dagegen nach Kultivierung auf Kohlenwasserstoffen bei vielen Hefen größer als auf Glucose ( K Ä P P E L I et al. 1 9 7 5 , DIKANSKAYA et al. 1 9 6 7 , OTSUKA et al. 1 9 6 6 ) . Für diese Zellen sind zahlreiche Lipidvakuolen sowie viele Kohlenwasserstoff-Einlagerungen charakteristisch (LITDVIK et al. 1 9 6 8 ) . Die Fettsäuremuster der in Glucose- bzw. w-Alkanmedien kultivierten Hefen weichen meist stark voneinander ab (THORPE U. RATLEDGE 1 9 7 2 , RATTRAY et al. 1 9 7 5 ) . Nach Anzucht in Paraffinmedien zeigen die Fettsäureprofile eine enge Korrelation zum angebotenen Kohlenstoff (HORNEI et al. 1 9 7 2 , ELISEYEVA et al. 1 9 7 7 , MAKULA U. F I N NERTY 1 9 7 2 ) .

I n der vorliegenden Arbeit soll der Einfluß der Kohlenstoffquelle auf die makromolekulare Zellzusammensetzung von Candida spec. H unter Stickstoffmangel untersucht werden. Material

und

Methoden

Candida spec. H erhielten wir vom Institut für technische Chemie der AdW der D D R . Die Kultivierung des Stammes erfolgte in folgendem Medium: 7,0 g (NH 4 ) 2 S0 4 , 2,0 g K H a P 0 4 , 1 , 0 g MgS0 4 X 7 H , 0 , 0,5 g NaCl, 0,5 g CaCI2, aqua dest. 2000 ml; p H 4,3.

78

B . BRÜCKNER u n d R . TRÖGER

Bei Verwendung von Kohlenwasserstoffen als Kohlenstoffquelle genügte ein Hefeextraktzusatz von 1 g/1, dem Glucosemedium wurden 3 g/1 Hefeextrakt zugefügt. Sowohl das Parex-Paraffin I I (CJ0—C20, VEB LEUNA-Werke) als auch die Glucose wurden steril zugegeben und periodisch ergänzt (Anfangskonzentrationen 20 ml/1 Parex-Paraffin I I bzw. 20 g/1 Glucose). Der Einsatz eines Antischaummittels (Silicon-Antischaum-Emulsion M-30, FERRAK Berlin) erfolgte je nach Bedarf. Fermentationsbedingungen: Rührung 1350 U/min; Belüftungsrate 31 pro min und Liter Nährlösung; Temperatur 30°C; automatische pH-Konstanthaltung; Arbeitsvolumen des Fermenters21. Analysemethoden: Für die Analytik wurden Proben von 100 ml aus dem Fermenter entnommen, zentrifugiert und nach mehrmaligem Waschen mit aqua dest. lyophilisiert. Die Bestimmung der Trockenmasse erfolgte mittels Extinktionsmessung bei 590 nm nach einer Eichkurve bzw. zur Bestimmung der Wachstumsrate direkt durch Frittenwägung. Der Proteingehalt der Hefetrockensubstanz wurde nach LOWRY et al. (1951) und die Gesamtkohlenhydrate nach der Methode von DUBOIS et al. (1956) bestimmt. Die Fraktionierung der Kohlenhydrate erfolgte nach einer kombinierten Methode von MANDL et al. (1969) undTREVALYAN u. HARRISON (1956). Für die Gesamtnucleinsäurebestimmung (1958) verwendet.

wurde die Methode v o n SPIRIN

Die Lipide wurden mit Chloroform: Methanol (2:1) in Mikrosoxhlets am Rückfluß 8 Std. extrahiert und nach Abdampfen des Lösungsmittelgcmisches gravimetrisch bestimmt. Zur Verseifung der Fettsäuren wurde das extrahierte Lipid mit 2 g K O H und 20 ml Äthanol 6 Std. am Rückfluß gekocht und mit 30 ml siedendem aqua dest. versetzt. Nach Ansäuern der wäßrigen Lösung (pH 1) mit konzentrierter Phosphorsäure erfolgte das Ausschütteln der Fettsäuren mit Petroläther, deren Gehalt nach Abdampfen der Lösungsmittelphase durch Wägung bestimmt wurde. Zur Vorbereitung der gaschromatographischen und massenspektrometrischen Bestimmungen (GC-MS-Messungen) wurden die Fettsäuren mit Diazomethan verestert. Die GC-MS-Messungen zur qualitativen Bestimmung der Fettsäuren wurden mit einem Massenspektrometer der Firma Jeol JMS-D 100, das mit einem Gaschromatographen JGC-20 K P gekoppelt war, durchgeführt. Es wurde eine 2 m X 2 mm Glassäule verwendet, die mit 3% OV-lOl auf Gas Chrom Q 80/100 mesh gefüllt war. Säulentemperatur: TA 140 °C, TE 200 °C, Aufheizrate 4°C/min; Injektor- und Separatortemperatur: 250 °C; Trägergas: Helium, Flußrate 30 ml/min; Temperatur der Ionenquelle: 200 °C; Elektronenstoßenergie: 75 eV. Die quantitative Bestimmung der Fettsäuren erfolgte mit einem Gaschromatographen GCHF 18.3 des VEB CHROMATRON. ES wurde eine 3 m x 3 mm Glassäule mit 3 % DEGS auf Chromosorb G 80/100 mesh verwendet. Injektortemperatur: 240 °C; F. I. D.: 220 °C; Säulentemperatur: T A 140 °C, T e 260 °C, Aufheizrate 4 °C/min; Trägergas: Stickstoff, Flußrate 40 ml/min. Zur Auswertung der Ergebnisse wurden die Peakf lächen nach der Formel Peakhöhe x Peakbreite n halber Höhe berechnet und die Peakflächenprozente nach der 100%-Methode ermittelt. Ergebnisse E r w a r t u n g s g e m ä ß w ä c h s t Candida spec. H in d e m G l u c o s e m e d i u m m i t einer größeren m a x i m a l e n spezifischen W a c h s t u m s r a t e ([X MAX G I — 0,385 h _ 1 ) als auf K o h l e n wasserstoffbasis (ijLmax K W = 0 , 1 9 3 h - 1 ) . D e r A m m o n i u m s t i c k s t o f f war d e m e n t s p r e c h e n d m i t Glucose als S u b s t r a t s c h o n nach 12 S t u n d e n , m i t w-Alkanen erst n a c h 17 S t u n d e n v e r b r a u c h t (Abb. 1). B e r e i t s w ä h r e n d des e x p o n e n t i e l l e n W a c h s t u m s t r a t e n signifikante U n t e r s c h i e d e in der m a k r o m o l e k u l a r e n Z e l l z u s a m m e n s e t z u n g in A b h ä n g i g k e i t v o n der C- u n d Energiequelle auf (Tab. 1). D e r P r o t e i n g e h a l t der T r o c k e n m a s s e lag m i t Glucose deutlich u n t e r d e m auf K o h l e n w a s s e r s t o f f e n g e m e s s e n e n . A u f f a l l e n d differierten in beiden V a r i a n t e n vor allem die G e s a m t k o h l e n h y d r a t m e n g e n (Tab. 1). Mit Glucose als S u b s t r a t lag der K o h l e n h y d r a t g e h a l t (43%) bereits w ä h r e n d des l o g a r i t h m i s c h e n W a c h s t u m s so h o c h wie der i m K o h l e n w a s s e r s t o f f m e d i u m n a c h 7 S t u n d e n S t i c k s t o f f m a n g e l erreichte Wert. N a c h v o l l s t ä n d i g e m Verbrauch der S t i c k s t o f f q u e l l e änderte sich die Z e l l z u s a m m e n s e t z u n g in beiden F ä l l e n beträchtlich (Tab. 1, A b b . 2). U n a b h ä n g i g v o n der Art der K o h l e n s t o f f q u e l l e f ü h r t e S t i c k s t o f f m a n g e l z u e i n e m rapiden Abfall des Protein- u n d G e s a m t n u c l e i n s ä u r e g e h a l t s der H e f e t r o c k e n s u b s t a n z (Abb. 2). A u f f a l l e n d war der w e s e n t l i c h größere K o h l e n h y d r a t a n t e i l in der T r o c k e n m a s s e der i m G l u c o s e m e d i u m k u l t i v i e r t e n H e f e n zu allen M e ß z e i t e n (Tab. 1, T a b . 4). D i e Er-

Reservestoffbildung bei Candida spec. H

, « 10

I Zeit ih!

79

20

Abb. 1. Wachstumsverlauf bei Kultivierung von Candida spec. H im Glucosemedium ( ) bzw. im Kohlenwasserstoffmedium ( ) unter Stickstoffmangelbedingungen, o Biomasse, • (NH 4 ) 2 S0 4 Tabelle 1 Einfluß der Kohlenstoffquelle auf die makromolekulare Zellzusammensetzung von Candida spec. H bei Kultivierung unter Stickstoffmangel Glucose Kulturzeit (Std.) log. Phase 1 ) 02) 1 3 5 7

Protein ( % der HTS)

.

35,6 33,5 24,6 17,2 16,8 16,9

Lipid ( % der HTS) 13,4 13,6 13,8 15,6 16,0 16,3

Kohlenhydrate ( % der HTS)

.

Gesamtnucleinsäuren (%derHTS)

43,0 45,6 56,2 62,5 63,4 63,9

Summe (%)

7,0 5,8 3,6 2,7 2,3 2,0

99,0 98,5 98,2 98,0 98,5 99,1

7,1 6,7 6,1 5,0 4,2 3,1

92,8 90,8 90,8 93,2 96.0 97,3

Kohlenwasserstoffe log. Phase 1 ) 02) 1 3 5 7

42,2. 40,2 36,2 31,7 24,9 22,6

17,5 18,2 19,1 20,2 23,7 28,0

26,0 25,7 29,4 36,8 43,2 43,6

'

HTS — Hefetrockensubstanz x ) Die in der Spalte log. Phase angegebenen Werte sind charakteristisch für die gesamte exponentielle Wachstumsphase und stellen einen Mittelwert von 3 nahezu gleichen Meßwerten aus dieser Phase dar. 2)

6

Beginn des Stickstoffmangels Z. Allg. Mikrobiol., B d . 21, H. 2

80

B . BRÜCKNER u n d R . TRÖGER

Abb. 2. Änderung der makromolekularen Zellzusammensetzung bei Kultivierung von Candida spec. H im Glucosemedium ( ) bzw. im Kohlenwasserstoffmedium ( ) unter Stickstoffmangelbedingungen • Gesamtkohlenhydratgehalt, o Lipidgehalt, x Proteingehalt, A Gesamtnucleinsäuregehalt, HTS Hefetrockensubstanz Tabelle 2 Quantitative Veränderungen der Kohlenhydratfraktionen von Candida spec. H in Abhängigkeit von der Art der C-Quelle bei Kultivierung unter Stickstoffmangel Glucose Kulturzeit (Std.) log. Phase 1 ) 02) 1 3 5 7

Mannan (% der HTS)

Glucan (% der HTS)

Trehalose (% der HTS)

Glycogen (% der HTS)

Glucan : Mannan

10,6 11,1 12,2 12,5 13,0 13,1

11,8 13,4 18,1 18,5 19,5 19,6

2,8 3,2 5,5 5,6 5.2 6,0

4,2 5,8 9,7 12,8 12,8 12,8

1,11:1 1,21:1 1,48:1 1,48:1 1,50:1 1,50:1

Kohlenwasserstoffe log. Phase 1 ) 02) 1 3 5 7

7,9 7,8 7,3 7,6 7,8 8,1

10,4 10,4 10,9 11,8 12,1 13,7

0,6 0,7 1,0 1,7 1,7 1,8

1,7 1,7 2,9 4,4 5,8 5,8

1,31 1,33 1,48 1,55 1,55 1,68

1 1 1 1 1 1

HTS — Hefetrockensubstanz Die in der Spalte log. Phase angegebenen Werte sind charakteristisch für die gesamte exponentielle Wachstumsphase und stellen einen Mittelwert von 3 nahezu gleichen Meßwerten aus dieser Phase dar. 2

) Beginn des Stickstoffmangels

Reservestoffbildung bei Candida spec. H

81

gebnisse der fraktionierten Kohlenhydratanalyse sind in Tabelle 2 dargestellt. Bei Verwendung beider Substrate führte Stickstoffmangel zu einem erheblichen Anstieg vor allem der Trehalose- und Glycogenfraktionen (Tab. 2). Der relative Zuwachs sowohl des Gesamtkohlenhydratgehalts als auch der Reservestoffe war nach siebenstündigem Stickstoffmangel im Kohlen Wasserstoff medium größer als unter Verwendung von Glucose (Tab. 4). Aus Tabelle 3 ist ersichtlich, daß sich bei Verbrauch der Stickstoffquelle der F e t t säuregehalt der Trockensubstanz in beiden Varianten erhöhte. Mit 9 , 9 % lag er unter Verwendung von Kohlenwasserstoffen signifikant über dem mit Glucose erreichten Wert. Der Anteil der Fettsäuren am Gesamtlipid war mit beiden Substraten annähernd gleich (Tab. 3). Tabelle 3 Einfluß der Kohlenstoffquelle auf den Fettsäuregehalt der Trockensubstanz von Candida spec. H bei Kultivierung unter Stiokstoffmangel Kulturzeit (Std.) log. Phase1) 02) 1 3 5 7

Glucose

Kohlenwasserstoffe

Lipid ( % der HTS)

Fettsäuren ( % der HTS)

Fettsäuren ( % von Lipid)

Lipid ( % der HTS)

Fettsäuren ( % der HTS)

Fettsäuren (%von Lipid)

13,4 13,6 13,8 15,6 16,0 16,3

4,2 4,2 5,8 6,9 6,5 6,6

31,3 30,9 42,1 44,2 40,6 40,4

17,5 18,2 19,1 20,2 23,7 28,0

5,1 5,3 7,1 8,1 8,6 9,9

29,1 29,1 37,1 40,1 36,2 35,4

HTS — Hefetrockensubstanz Die in der Spalte log. Phase angegebenen Werte sind charakteristisch für die gesamte exponentielle Wachstumsphase und stellen einen Mittelwert von 3 nahezu gleichen Meßwerten aus dieser Phase dar. •) Beginn des Stickstoffmangels

In Tabelle 4 ist der relative Anstieg der Lipid- und Kohlenhydratanteile der Hefetrockensubstanz nach siebenstündiger Mangelkultivierung im Vergleich zu den Werten in der logarithmischen Wachstumsphase dargestellt. E s wird deutlich, daß Kohlenwasserstoffe unter diesen Bedingungen einen größeren Zuwachs aller Reservestoffe gewährleisteten, als Glucose. Tabelle 4 Relativer Anstieg der Fett- und Kohlenhydratfraktionen von Candida spec. H bei Stiokstoffmangel (7. Stunde) im Vergleich zur logarithmischen Wachstumsphase (Werte der log-Phase = 100%) in Abhängigkeit von der Kohlenstoffquelle Substrat Glucose Kohlenwasserstoffe

Lipid ( % der HTS)

Fettsäuren ( % der HTS)

Gesamtkohlenhydrate ( % der HTS)

Glycogen (% der HTS)

Trehalose ( % der HTS)

122

157

149

305

215

160

194

168

341

300

HTS — Hefetrockensubstanz 6*

82

B. BRÜCKNER und R. TRÖGER

Die Ergebnisse der vergleichenden qualitativen Analysen der Fettsäurespektren in Abhängigkeit von der Art der C-Quelle sind in Tabelle 5 dargestellt. Mit Glucose bewirkte Stickstoffmangel vor allem eine signifikante Zunahme der Ölsäure (18:1) auf Kosten der Linolsäure (18:2), während sich die Palmitin- und Stearinsäureanteile (16:0 bzw. 18:0) kaum änderten (Tab. 5). Unter Verwendung dieses Substrats dominierten Fettsäuren mit einer Kettenlänge von 16 und 18 C-Atomen. Dagegen lag der Anteil von Fettsäuren mit ungerader Zahl an C-Atomen in Zellen, die auf nAlkanbasis kultiviert wurden, mit 40% wesentlich höher als in „Glucose"-Zellen (6,3%). Die ungesättigten Fettsäuren stiegen bei Verwendung von Glucose stark an, verminderten sich aber mit Kohlenwasserstoffen als Substrat (Tab. 5). Tabelle 5 Einfluß der Kohlenstoffquelle auf das Fettsäurespektram von Candida spec. H bei Kultivierung unter Stickstoffmangel (Werte in % der Gesamtfettsäuremenge) Kultur(Std.)

Kettenlänge der Fettsäuren 12:0

13:0

14:0

14:0

15:0

10:1

17:0

16,8 15,3 17,1 18,9

Sp Sp Sp Sp

17:1

18:0

18:1

18:2

4,8 4,5 4,1 3,8

15.4 27.1 33.2 40.5

28,8 21,7 11,2 7,5

8,0 3,9 3,0 4,5

6,2 6,6 7,6 0,3

6,2 4,2 3,2 3,0

Glucose log. Phase 1 ) 1=) 3 7

1,2 1,1 0,8 0,3

Sp Sp Sp Sp

2,9 3,8 2,0 1,5

2,9 2,7 1,7 Sp

28,5 24,5 24.2 24.3

—

Kohlenwasserstoffe log. Phase 1 3 7

Sp Sp Sp Sp

10,3 5,8 5,2 4,9

6,2 4,4 6,2 5,6

9.8 9,1 10,0 8,7

13,9 27,4 27,4 22,3

19,4 16,1 13,7 14,0

14,1 17,2 20,6 27,3

5,6 3,5 3,2 3,4

Sp — Spuren *) Die in der Spalte log. Phase angegebenen Werte sind charakteristisch für die gesamte exponentielle Wachstumsphase und stellen einen Mittelwert von 3 nahezu gleichen Meßwerten aus dieser Phase dar. 2

) Kulturzeit nach Beginn des Stickstoffmangels

Diskussion Der von uns gefundene signifikant höhere Proteingehalt von Candida sp>ec. H bei Wachstum in Kohlenwasserstoffmedium im Vergleich zu Glucose scheint für viele Hefen charakteristisch zu sein (FRITSCHE 1968, SHIROTA et al. 1970). Wird Candida tropicalis mit Glucose kultiviert, so lag der Gesamtkohlenhydratgehalt, ähnlich wie bei Candida spec. H, bereits während der logarithmischen Wachstumsphase höher als unter Verwendung von Kohlenwasserstoffen (KÄPPELI et al. 1975). Auch die von NABESHIMA et al. (1970) für verschiedene Candida-Arten beschriebenen Kohlenhydratwerte von etwa 45% bei Glucose bzw. etwa 25% bei Kohlenwasserstoffen stimmen gut mit unseren Ergebnissen überein (Tab. 1). Dagegeil lag der Kohlenhydratgehalt von Endomycopsis lipolytica auf Kohlenwasserstoffen über dem für Glucose gefundenen Wert, während er bei Candida tropicalis mit beiden Substraten annähernd gleich war (ROY et al. 1 9 7 4 ) .

Reservestoffbildung b e i Candida spec. H

83

Stickstoffmangel führte unabhängig von der Art der C-Quelle zu einer starken Einschränkung des Protein- und Nucleinsäure-turnovers. Das hatte bei fortgesetzter Kohlenstoffernährung ein „Ausverdünnen" des Proteinanteils an der Hefetrockensubstanz zugunsten von C-Speicherstoffen zur Folge. Die Zunahme der Biomasse nach vollständigem Verbrauch des angebotenen Stickstoffs ist folglich nicht auf ein echtes Wachstum m i t Proteinsynthese sondern ausschließlich auf eine intrazelluläre Produktakkumulation zurückzuführen. Während Candida spec. H mit Glucose als Substrat unter Stickstoffmangel vor allem den Kohlenhydratgehalt stark erhöhte, wurden im Kohlenwasserstoffmedium sowohl Lipide als auch Kohlenhydrate akkumuliert (Tab. 1). Als Reservekohlenhydrate traten bei beiden Substraten Glycogen und Trehalose auf. Mit Glucose als Substrat führte Stickstoffmangel außerdem zu einem beträchtlichen Anstieg des Glucananteils (Tab. 2). Ob Glucan neben seiner Zellstrukturfunktion auch Reservestoff sein kann, bleibt offen. Interessant ist die Tatsache, daß der relative Zuwachs der Reservekohlenhydrate nach siebenstündigem Stickstoffmangel unter Verwendung von Kohlenwasserstoffen größer war als mit Glucose, obwohl der absolute Kohlenhydratgehalt im letzteren Fall zu allen Meßzeiten höher lag (Tab. 4). Dieses Ergebnis stimmt mit den Angaben von KÄPPELI et al. (1975) für Candida tropicalis bei Kultivierung in einem stickstofffreien Medium überein. Während jedoch in diesem Fall der Lipidgehalt in Glucosemedium konstant blieb, zeigte Candida spec. H nach siebenstündigem Stickstoffmangel einen leichten Anstieg sowohl des Gesamtlipidgehalts als auch des Fettsäureanteils an der Hefetrockensubstanz. Ob diese geringe Zunahme der Lipide, vor allem der Fettsäuren, auf eine Reservefunktion zurückzuführen ist, scheint fraglich. In der Literatur ist mit dem Stamm Candida 107 ein Extremfall beschrieben, in dem die Fettsäuren bei Kultivierung in Glucosemedien unter Stickstoffmangel bzw. -Limitation sogar Hauptreservestoffe darstellen (GILL et al. 1977, RATLEDGE 1968). Große qualitative Unterschiede zeigten sich beim Vergleich der Fettsäurespektren von Candida spec. H in Abhängigkeit von der Art der Kohlenstoffquelle. Sowohl in Glucose- als auch in Kohlenwasserstoffmedien führte Stickstoffmangel zu einer starken Abnahme des Linolsäureanteils (Tab. 5). Auch RATLEDGE (1968) beschrieb ein Absinken der C 1 8 : 2 -Fettsäurefraktion. Er bemerkte, daß Stickstoffmangel eine Synthese der Linolsäure stark einschränkt, während die der anderen Fettsäuren unberührt bleibt. Aber auch eine C-Limitation beeinflußt vorrangig den Anteil der Linolsäure und der Ölsäure (18:1), wobei sich die Mengen beider in entgegengesetzter Richtung verändern (GILL et al. 1977). Bei Kultivierung von Candida spec. H in einem Glucosemedium war die Abnahme des Linolsäureanteils unter Stickstoffmangel ebenfalls mit einem Anstieg des Ölsäuregehalts verbunden (Tab. 5). Mit w-Alkanen als Substrat führte Stickstoffmangel neben der Abnahme des Linolsäuregehalts zu einem starken Zuwachs der Heptadekansäure. Generell ist für Kohlenwasserstoffgemische als Substrat im Unterschied zur Glucosevariante ein hoher Anteil an Fettsäuren mit ungerader Zahl von C-Atomen typisch. Das hat seine Ursache im Vorkommen von w-Alkanen entsprechender Kettenlänge im Parex-Paraffin II. Dagegen zeichnet sich das Fettsäuremuster der mit Glucose kultivierten Zellen durch einen wesentlich höheren Anteil ungesättigter Säuren (ca. 65%) aus als die im Kohlenwasserstoff medium kultivierten Hefen (ca. 30%). Zusammenfassend kann festgestellt werden, daß die Art der Kohlenstoff- und Energiequelle entscheidenden Einfluß auf den Gehalt der makromolekularen Zellkomponenten von Candida spec. H sowohl während des exponentiellen Wachstums als auch unter den Bedingungen extremen Stickstoffmangels hat.

84

B . B R Ü C K N E R u n d R . TRÖGER

F ü r die Durchführung der gaschrömatographischen und massenspektrometrischen Untersuchungen möchten wir Herrn Dr. W . S C H A D E vom Zentralinstitut f ü r Mikrobiologie und experimentelle Therapie der AdW, Jena, ganz herzlich danken.

Literatur D I K A N S K A Y A , E . M . , G R I G O R Y A N , A . N . , POPOVA, T . E . , R O B Y S E V A , S . N . i KOROBOVA, L . G . , 1 9 6 7 .

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Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie

21

2

1981

85-93

(Institut für bakterielle Tierseuchenforschung Jena-Zwätzen der Akademie der Landwirtschaftswissenschaften der DDR, Direktor: OVR Prof. Dr. sc. T H . H U B R I G )

Orotsäure — ein Wuchsfaktor für Pasteurella

multocida

K . - D . FLOSSMANN, M . HÖFER, W . ERLER u n d H . F E I S T

(Eingegangen am 23. 6.1980) Orotsäure stellt einen Wuchsfaktor für die Vermehrung von Pasteurella multocida dar. Sie ist mit abnehmender Wirksamkeit durch andere Pyrimidine ersetzbar (Uracil > Cytosin Thymin). Untersuchungen mit 2-, 6-, 7-, U-14C- bzw. 5- 3 H-Orotsäure beweisen, daß die Wirkung der Orotsäure in ihrer zentralen Stellung im Pyrimidinstoffwechsel zu sehen ist. Die Radioaktivität des Pyrimidinringes wird in den Pyrimidinbasen der Bakterienzelle wiedergefunden, während die Aktivität der Carboxylgruppe (7-14C-Orotsäure) hauptsächlich in Bernsteinsäure, einem im Kulturfiltrat auftretenden Metaboliten des Kohlenhydrat- und Aminosäure-Stoffwechsels, auftritt. Die Untersuchungen sprechen dafür, daß die Pyrimidinbiosynthese bei P. multocida in den Anfangsschritten, vermutlich infolge ungenügender C0 2 -Bereitstellung, gestört ist. Für eine Vermehrung in vitro genügen etwa 0,1 mMol Orotsäure pro 1 Nährmedium. Auf Grund des Einbaus des Pyrimidinskeletts in die Bakterienzelle eignet sich am Pyrimidinkern markierte Orotsäure bestens als radioaktives Material zur Markierung von P. multocida- Zellen. Orotsäure, ein zentrales Glied der Pyrimidinbiosynthese, stellt für eine Reihe von Bakterien einen Wuchsfaktor dar bzw. wird als Nährsubstrat verwertet (Beispiele: NAGLE et al.

1 9 6 0 , BAUGH et al.

1 9 6 4 , O'DONOVAN U. N E U H A E D 1 9 7 0 ) .

W i e wir

bei

Nährstoffuntersuchungen zur Entwicklung chemisch definierter Medien für die Kultivierung v o n Pasteurella multocida feststellten, ist Orotsäure auch ein Wuchsfaktor für die Vermehrung dieser Species (FLOSSMANN et al. 1976). I n der vorliegenden Arbeit soll anhand von Untersuchungen mit radiomarkierten Pyrimidinen die Bedeutung der Orotsäure für P. multocida untermauert werden. Material

und

Methoden

Bakterienstämme (Serotyp in Klammern, nach C A R T E R 1955 und NAMTOKA 1970): P. multocida 35 (A), 55 (A), 383 (6:B), 383 ts (6:B), 1297 S, 5345 (A) — Institut für bakterielle Tierseuchenforschung, Jena; P. multocida P 8 (3:A), PM (7: A), Kobe 5 (1: A), K o b e 6 ( 2 : D ) — National Institute of Animal Health, Tokyo; P. multocida B 850 (2:B) — Institut Pasteur, Bukarest; ROBERT's type I I NCTC 10201 (9:A), C A K T E R ' S group A NCTC 10322 (11 :A), C A E T E R ' S group D NCTC 10325 (9:D), C A R T E R ' S group E NCTC 10326 (6:E) — Central Public Health Laboratory, London. Die Kultivierung erfolgte bei 35 (383 ts) bzw. 37 °C in chemisch definierten Medien (PM-CDM, nach F L O S S M A N N et al. 1977) unter Zusatz verschiedener Mengen radiomarkierter Orotsäure (5-3HOrotsäure, spez. Aktivität 11-28,5 Ci/mMol, U-"C-Orotsäure, NH4-Salz, 0,286 Ci/mMol, 7-l4COrotsäure, 48 mCi/mMol, alle Inst. Radioisotop., Prag; 2-14C-Orotsäure 26 —34 mCi/mMol, 6- 14 C-Orotsäure 8-15 mCi/mMol, Inst. Isotop. Budapest) sowie verschiedener Mengen Orotsäure (Endkonzentration Orotsäure, gegeben als Na- bzw. K-orotat bis 5 mMol/1). Das Wachstum der Bakterien wurde durch Bestimmung der Lebendkeimzahl bzw. durch Messung der E 650 ( S P E K O L , VEB C A R L Z E I S S , Jena) nach unterschiedlichen Zeiten verfolgt. Für spezielle Untersuchungen wurden Orotsäure-freie Medien eingesetzt, denen äquivalente Mengen radiomarkiertes Uracil (U-14C-Uracil, 161 mCi/mMol, Inst. Radioisotop., Prag), Cytosin (U14 C-Cytosin, 220 mCi/mMol, Inst. Radioisotop., Prag) bzw. Thymin (U-14C-Thymin, 205 mCi/m Mol Inst. Radioisotop., Prag) zugesetzt worden waren. Am Ende der log-Phase wurde die Kultivierung unterbrochen, die Radioaktivität der Bakterien bzw. des Kulturfiltrates durchFlüssigszintillationsmessung (Aquasol, Fa. N E W , /J-Counter L K B - W A L L A C 8 1 0 0 0 ) bestimmt. Die Identifizierung der

86

K ; - D . FLOSSMANN, M . H Ö F E R , W . E R L E B u n d H . F E I S T

P r o d u k t e im K u l t u r f i l t r a t geschah dünnschichtchromatoeraphisch (Nucleobasen nach FLOSSMANN 1978, Bernsteinsäure: ERLER et al. 1979), der Einbau der Aktivität in die Nucleobasen der Bakterienzelle nachHydrolyse der Zellen mit 70%iger HC10 4 bei 100 °C über 1 h und Basentrennung säulenchromatographisch mit D O W E X 50 nach B U S C H (1968) bzw. dünnschichtchromatographisch (Radioaktivitätsbestimmung in den Fraktionen mittels LSC). Zur Konfrontation der radiomarkierten Substrate bzw. bestimmter Zusätze mit BuhezellSuspensionen wurden diese in 0,1 M Phosphatpuffer, p H 7,5, mit den Substraten bei 37 °C bebrütet (1 bis 24 h, je nach Fragestellung) und wie oben beschrieben, aufgearbeitet. Bei in uiao-Versuchen erhielten Mäusekollektive bis zu 1 mg Na-orotat in 0,5 ml physiol. NaClLösung intraperitoneal und 1 / 2 h danach verschiedene Dosen von P. multocida-Kulturen verabreicht. Die letale Dosis zu 50% (LD 50 ) der K u l t u r e n wurde nach R E E D U. M U E N C H (1938) bestimmt.

•

Ergebnisse und

Diskussion

Die vermehrungsfördernde Wirkung von Orotsäure auf P. multocida-Stämme wurde vor allem in vitro, bei ausgewählten Stämmen auch in vivo, nachgewiesen. Alle 15 getesteten Stämme unterschiedlicher Herkunft und verschiedener Serotypen wurden bei Kultivierung in chemisch-definierten Medien durch Zusatz von Orotsäure in ihrer Vermehrung stark gefördert. Der Orotsäure-Bedarf ist von den Kultivierungsbedingungen abhängig und variiert von Stamm zu Stamm, im allgemeinen reicht jedoch eine Konzentration von etwa 0,1 mMol Orotat in einem Liter Nährlösung aus, um eine optimale Vermehrung zu gewährleisten. Orotsäure ist nicht durch Purine, aber durch Pyrimidine, in abnehmender Wirksamkeit in der Reihenfolge Uracil > Cytosin Thymin, ersetzbar. Daraus folgt bereits, daß die Wirkung der Orotsäure im Pyrimidinstoffwechsel zu sehen ist und zumindest nicht nur in ihrer Bedeutung für die Aufrechterhaltung eines metabolisch wichtigen C02-Spiegels (Decarboxylierung). Bei Tabbelle 1 Einbau markierter Orotsäure in P.

multocida-Zellen

mg/P)

A k t i v i t ä t der K u l t u r nach Bebrütung (Ausgangsaktivität 100%)

Aktivität der Bakterien (%)

0 1,5 15 150

100 100 97 95

36 33 33 3,5

2-uG

5,7 7,2 20,7 155,7

82 83 89 98

88 79 75 4,6

6-"C

9,9 11,4 24,9 159,9

79 92 94 99

84 79 79 7,5

3,2 4,7 18,2 153,2

75 : 81 89 100

3,5 3,5 3,4 0,7

Substrat

5- 3 H

U- 14 C

0,5 100 72 2 84 70 15,5 91 65 150,0 100 4,7 *) Gesamt-Oro-Konzentration (resultierend aus unterschiedlichen Oro-Zusätzen zum Medium sowie aus den unterschiedlichen spezifischen Aktivitäten der radioaktiv zugesetzten Oro-Derivatc bei einer Aktivität von 1 mCi)

Orotsäure — ein Wuchsfaktor f ü r

Pasteurella

87

den in vivo-Versuchen konnte mit dem Stamm 55 nach i. p.-Gabe von 1 mg Orotsäure an Mäuse eine Erniedrigung der LD S0 um eine Zehnerpotenz (von 3 X 103 auf 3 X 102) nachgewiesen werden. Eine Beeinflussung der Virulenz von Pasteurella pestis-Stämmen durch Orotsäure hatten auch BAUGH et al. (1964) festgestellt. 80—100% der eingesetzten Radioaktivität, zugesetzt als 5- 3 H-, 2-14C-, 6-14C- und U- 14 C-Orotsäure wurden in den Bakterienkulturen wiedergefunden (Tab. 1). J e nach Orotsäurekonzentration im Nährmedium liegt der Einbau in die Bakterienzelle zwischen 3 und 90%. Hohe Einbauraten bei der üblichen Konzentration von 15 mg (ca. 0,1 mMol) Orotsäure pro 1 Medium empfehlen Orotsäure als bestens geeignetes radioaktives Substrat ( 3 H, 14 C-Derivate) für die Markierung von Pasteurellen. Die Einbauraten von 2- und 6-14C der Orotsäure sind sehr hoch (bis 90%) und etwa gleich, während die 7- 14 C-Aktivität nur in sehr geringem Maße (bis 7%) eingebaut wird. Dementsprechend ist die Einbaurate von U- 14 C-Orotsäure niedriger als die von 2bzw. 6- 14 C-Orotsäure. Diese Ergebnisse weisen nach, daß der Pyrimidinring intakt in die Bakterien eingebaut wird, während die Carboxylgruppe abgespalten und ihre Aktivität zum größten Teil nicht in der Zelle wiedergefunden wird. Die Bedeutung der Orotsäure als Wuchsfaktor bei Pasteurellen ist somit in ihrer Wirkung für die Pyrimidinbiosynthese zu suchen. Da die Kulturen vor und nach Bebrütung etwa die gleiche Radioaktivität zeigen, kann die Bildung gasförmiger radioaktiver Abbauprodukte ( 14 C0 2 ) nahezu ausgeschlossen werden. Eine Decarboxylierung müßte aber besonders bei 7- 14 C-Orotsäure zu radioaktivem C0 2 führen. Jedoch weisen alle Ergebnisse darauf hin, daß das abgespaltene C0 2 weiter metabolisiert wird. Darauf werden wir noch eingehen. Wie wir bei den Nährstoffuntersuchungen feststellten, ist Orotsäure durch andere Pyrimidinbasen (Uracil, Cytosin, Thymin) ersetzbar, jedoch ist Orotsäure selbst am wirksamsten, während Thymin das ungeeignetste Substrat darstellt. Analoges stellten BAUGII et al. (1964) bei P. pestis für Orotsäure, Uracil und Cytosin fest. Exogenes Thymin wird durch P. multocida nicht weiter metabolisiert, sondern direkt eingebaut. Die Einbauraten liegen relativ niedrig, wenn man radioaktives Thymin (U-14C- oder 6- 3 H-markiert) anbietet (meist unter 1%). Thymin-Aktivität taucht in den Bakterienhydrolysaten nur im Thymin selbst wieder auf, das spezifisch in die DNA eingebaut wird. Im Kulturfiltrat sind keine weiteren Abbauprodukte nachweisbar, sondern nur das nicht umgesetzte Thymin. Anders als bei Thymin ist das Bild bei Uracil, Cytosin und Orotsäure. 14 C-U-Cyt 1 ) (Angebot 15 mg/1) wird bis 85% in die Zellen eingebaut, die Radioaktivität wird in den Pyrimidinbasen wiedergefunden, im Kulturfiltrat taucht 14 C-Ura auf. Uracil wird ebenfalls mit hoher Ausbeute ( 5 0 - 9 0 % bei U- 14 C-Ura, 2 0 - 6 0 % bei 5- 3 H bzw. 6- 3 H-Ura) in die Pyrimidinbasen der Bakterien eingebaut. Im Kulturfiltrat ist nur Uracil nachweisbar. Die Orotsäure-Radioaktivität befindet sich zum größten Teil in den 3 Pyrimidinbasen (Tab. 2), ohne wesentliche Unterschiede bei den 14 C-markierten OrotsäureDerivaten (außer 7-14C). Trotz des bei 3 H beobachteten Isotopenaustauschs findet man auch bei den 3 HDerivaten den größten Teil der Aktivität in den Pyrimidinen wieder. So konnten wir bei Nucleinsäure-Markierungen feststellen, daß 3 H-Thy spezifisch in die DNA, 3 HUra-Aktivität aber sowohl in DNA (Aktivität in Cytosin und Thymin) als auch RNA eingebaut wird (FLOSSMANN et al. 1979). BODMER U. GRETHER (1965) stellten das gleiche bei Bacillus subtilis fest. 1 ) Abkürzungen: Ade = Adenin, Asp = L-Asparaginsäure, Cyt = Cytosin, Gua = Guanin, Oro = Orotsäure, Sue = Succinat, Thy = Thymin, Ura = Uracil

88

K . - D . FLOSSMANN, M . H Ö F E B , W . E R L E E u n d H . F E I S T

Tabelle 2 Einbau der Orotsäure-Radioaktivität in die Nucleobasen von P.

Stamm

383 383 ts 383 383 ts 383

Substrat

U-14C-Oro U-14C-Oro 6- lä C-Oro 6-14C-Oro 2-14C-Oro

multocida

Radioaktivität (in % der eingebauten Gesamtaktivität) Thy

Ura

Cyt

Ade

Gua

15,5 20,4 15,0 19,0 13,6

45,5 41,0 42,5 47,0 45,1

38,2 37,8 36,5 32,3 35,1

0 0 0 0 0

0 0 0 0 0

D e r g r ö ß t e Teil der Orotsäure wird für die P y r i m i d i n b i o s y n t h e s e verwendet, wie durch das bisher Gesagte dargelegt wurde. T r o t z d e m verbleibt ein Teil der R a d i o a k t i v i t ä t im K u l t u r m e d i u m . D ü n n s c h i c h t - u n d säulenchromatographisch lassen sich

Abb. 1. Radiochromatogramme der Kulturfiltrate von P. multocida 383 nach Kultivierung mit markierter Orotsäure (Laufmittel 2, Tab. 3)

Orotsäure — ein Wuchsfaktor für

Pasteurella

89

Tabelle 3 Chromatographische Identifizierung der nach Umsetzung radioaktiver Orotsäure (0,1 mMol Oro/1) im Kulturfiltrat auftretenden Substanzen I, I I , I I I Rir-Werte im Laufmittel 1 ) Substanz

I II III Oro Suc Ura Thy Cyt Dihydro-Oro Ureido-Suc Asp

1

2

0,41 0,88 0,67 0,41 0,88 0,67

0,3 0,92 0,73 0,3 0,92 0,73 0,81 0,13

4

5

6

0,18 0,93 0,68 0,18 0,93 0,68 0,78 0,06

0 0,36 0,2 0 0,36 0,2 0,4 0

0,42

3

0,73 0,73

0,37

0

0,42

0,45 0,53

i) Laufmittel: 1 m-Bu0H/Ac0H/H 2 0 4/1/1; 2 Essigester/Ac0H/H 2 0 8/2/1; 3 (Ph0H-H 2 0, 75/25)/ AcOH 9/1; 4 Essigester/AcOH 4/1; 5 Benzol/EtO H/85% HCOOH 5/3/2, obere Phase; 6 n-BuOH/ E t 0 H / H 2 0 / H C 0 0 H 5/3/1/2 Tabelle 4 Radioaktivitätsverteilung nach Einsatz markierter Orotsäure in P. multocida-'K.xiltm&ci mit einer Ausgangskonzentration von 15 mg Oro/1 Nährmedium Substrat

5- 3 H-Oro 2-14C-Oro 6-14C-Oro 7-14C-Oro U-»C-Oro 5- 3 -H-Oro 2-14C-Oro 6- l4 C-Oro 7-14C-Oro U- 14 C-Oro

Kulturfiltrat 1 ) KF ) 1

I(Oro)

II(Suc)

Bakterienzellen 1 ) Ill(Ura)

B ) 1

Thy

Ura

Säul so as "C -o SOhöO « o H (S

® a

T3 o; m M-S 3 c8 •tí 3 ' S X

o a® co 0) s* s ö a>tí S « S « a es o es m I ß •s« o m M aum uo© cS • « 82 s «

21.6"> 37"

4 dNTPa> stable incorporation

DNA

27»)

80e' 100« 47"

46B)

21") 53e»

85»)

47«

a) Kt, (4 dNTP) is expressed as individual dNTP concentration. For explanation see text. b) computed by linear regression analysis from double-reciprocal data as shown in Figs. 2 and 3 c) computed by linear regression analysis from c • u - 1 versus c plots as shown in Fig. 4 d) G I L L I N and N O S S A L ( 1 9 7 5 ) ; template: denatured salmon-sperm DNA

e) G I L L I N and N O S S A L (1975), 1976b); template polydA • polydT f) Lo and B E S S M A N (1976a); template: denatured E.coli DNA g) N O S S A L and H E R S H F I E L D ( 1 9 7 1 ) ; denatured E.coli DNA

148

CORNELIA SCHROEDER and J. JANTSCHAK

relations among the K m values for stable incorporation correspond to those among the Kms for turnover; it appears t h a t the three antimutator DNA polymerases (CB120, CB121, L141) have lowered affinities to dTTP, in addition to the fact, t h a t the high exonuclease activity of these enzymes enhances the apparent Km for stable substrate incorporation. The apparent MICIIAELIS constant for an equimolar mixture of the four d N T P s was estimated as a precondition for studying the inhibition kinetics with pyridoxal 5'-phosphate (JANTSCHAK and SCHROEDER 1981). This inhibitor acts competitively with all 4 deoxynucleoside triphosphates. Since the affinity of DNA polymerases to noncomplementary d N T P s is negligible and only one d N T P is accepted during each elementary polymerization step (GILLIN and NOSSAL 1975, TRAVAGLINI et al. 1975) the Km (4 dNTP) is expressed as the individual d N T P concentration. Still, this kinetic constant is 2 to 4 times higher than t h a t for d T T P alone. There are probably two reasons for this: First, the constant for d T T P was determined at saturating concentrations of the other three triphosphates. The Km for an individual d N T P is the lower, the higher the concentration of the other three (MCCLURE and JOVIN 1975). However, it is difficult to extrapolate to infinite d N T P concentrations because very high concentration differences between the substrates result in competitive inhibition (MCCLURE and JOVIN 1975). The second cause for the high Km(4 dNTP) is t h a t they must depend on the d N T P species to which the enzyme has the lowest affinity. GILLIN and NOSSAL (1976 b) have shown t h a t the Km values of T4 DNA polymerase differ for each d N T P , and t h a t these differences are magnified in the case of the C B 1 2 0 antimutator polymerase. The K ^ values estimated for the DNA template agree with published data. The differences between our values for T4 + and CB121 DNA polymerase on the one hand and L98 DNA polymerase on the other are significant (probabilities of error: T4+/ L98: < 0.1%; T4+/CB121: < 2 % ; L98/CB121: < 1%). Inhibition

data

Table 5 summarizes and compares inhibition data previously published by us. Distamycin A and actinomycin D, despite their different structures, display the same inhibition pattern (JANTSCHAK and SCHROEDER 1980). This is probably due to the fact t h a t both drugs bind externally (actinomycin D also has an intercalating moiety) and exclusively to double-stranded DNA. The other three DNA-binding drugs, adriaTable 5 Inhibitor sensitivities of T4 wild-type, mutator L98, and antimutator CB121 DNA polymerases

T4+

L98

CB121

Mechanism of action

5.0 7.0

5.0 7.0

5.0 7.0

external binding to DNA

adriamycin daunomycin ethidium

18.0 19.0 20.0

18.0 19.0 20.0

9.0 11.0 12.0

3'-FdTTP

100

200

200

dTTP analog

pyridoxal 5'-phosphate

160

190

30

dNTP analog

0.6 • 103

Zn++ chelator

Inhibitor distamycin A actinomycin D 1 )

1,10-phenanthroline 1

ID50(!XM)

1.3- 103

) for mechanism of action compare text

2.7 • 10s

intercalation between DNA bases

Inhibition of T4 + and mutant DNA polymerases

149

mycin, daunomycin and ethidium also bind to single-stranded DNA. These three intercalating substances have an identical inhibition pattern. The differences between the two types of template-binding drugs is brought out by the different slopes of the double-logarithmic plots in Fig. 5. Our data concerning the latter three drugs are in complete agreement with those published by GOODMAN et al. (1974) for the inhibition of the T4 wild-type, L141 (antimutator) and L56 (mutator) polymerases by intercalating drugs. temp/afe - inhii/tm 0.001 0.01

0.1

(mM> 1

Fig. 5. Patterns of inhibition of T4 DNA polymerases by compounds with different modes of action. • — ethidium, T4+; © — distamycin A, T4 + ; o — 1,10-phenanthroline, T4+; • — 1,10-phenanthroline, L98; A — 1,10-phenanthroline, CB121. Inhibition data were transformed to (v0—v)/v and plotted against c in double logarithmic coordinates

3' -Fluorothymidine 5'-triphosphate (3'-FdTTP) inhibits the T4 DNA polymerases competitively with dTTP. Of all the inhibitors tested, only 3'-FdTTP has a stronger effect on the L98 and the wild-type enzyme compared with the CB121 antimutator enzyme. We have shown that the CB121 DNA polymerase discriminates better against this substrate analog than the other two polymerases, and thus behaves truly as an antimutator enzyme (SCHROEDER and JANTSCHAK 1980). Furthermore, this effect is not due to 3'-5' exonuclease activity which is held responsible for correcting "misincorporated" nucleotides (MUCYCZKA et al. 1972, BESSMAN et al. 1974, GOODMAN et al. 1974), since the base analog 3'-FdTTP is not incorporated into DNA by T4 DNA polymerases (SCHROEDER and JANTSCHAK 1980). Inhibitors of this type are therefore suitable for studj'ing the selectivity of the polymerase function without interference by the exonuclease. Pyridoxal 5'-phosphate (PyP) is the most selective of the inhibitors investigated by us. I t inhibits the CB121 DNA polymerase 5-6 times more strongly than the L98 and T4 + enzymes. P y P acts competitively with all four dNTPs. The kinetic constants document that the CB121 polymerase has a higher affinity to P y P and a lower affinity to the substrates. I n contrast, the L98 enzyme has a lower affinity to P y P than the

150

CORNELIA SCHEOEDEE a n d J . JANTSCHAK

wild-type polymerase. However, the simultaneously reduced substrate affinity of the L98 mutator polymerase compensates its reduced P y P affinity, so that the ID 50 s of the T4 + and the L98 polymerase are almost identical ( J A N T S C H A K and S C H R O E D E R 1981). 1.10-phenanthroline also inhibits the CB121 DNA polymerase more than the other two enzymes. This is the only substance which has a markedly lower effect on L98 DNA polymerase compared to the wild-type enzyme. We worked under heavy metalfree conditions as proved with the dithizone reaction. In the presence of Cu(I) ions, 1.10-phenanthroline inhibits T4 DNA polymerase at much lower concentrations and by another mechanism ( D ' A U R O R A et al. 1978) than under our conditions. I t is probable but not proven that in the absence of heavy metals 1.10-phenanthroline chelates the Zn(II) ion bound to T4 D N A polymerase ( S P R I N G G A T E et al. 1973) and interferes with its catalytic function. However, the high phenanthroline concentration needed to inhibit T4 DNA polymerase suggest that this planar substance which is very similar to ethidium could intercalate into DNA. I t has been shown t h a t 1.10-phenanthroline-Pt(II)-ethylene diamine complex intercalates ( L I P P A R D et al. 1974), however, this complex has two positive charges which facilitate DNA binding ( L E P E C O et al. 1974). The doublelogarithmic plots in Fig. 5 reveal a unique inhibition pattern for 1.10-phenanthroline as compared with the two types of template-binding inhibitors. The slope of the phenanthroline plots below the ID 50 is 1.0, that for ethidium 2.6 and that for distamycin 1.5. Above the ID 5 0 there seems to be a transition to another inhibition mechanism, the slope increases to 3.6. The noncompetivite kinetics of inhibition by 1.10-phenathroline ( S C H R O E D E R and J A N T S C H A K 1978) are quite different from the first competitive, then uncompetitive inhibition of T4 DNA polymerase by adriamycin ( G O O D M A N et al. 1977). Also, the identical effect of intercalating drugs on T4 and L98 polymerase is in contrast to the differential effect of 1.10-phenanthroline. Therefore, at least below the ID 50 , a template-mediated effect of 1.10-phenanthroline should be excluded. However, above the ID 6 0 such an explanation could be valid. The synergism exhibited by the simultaneous presence of 1.10-phenanthroline and Zn + + ions which is strongest a concentration ratio of 2 : 1 (planar complex) also suggests intercalation ( S C H R O E D E R and J A N T S C H A K 1978). The CB121 DNA polymerase is not only most sensitive to inhibition by 1.10-phenanthroline, it is also most rapidly inactivated by dialysis against the chelating agent in the presence of DNA. Furthermore, the low polymerase activity in extracts of CB121infected (but not of T4+-infected) E. coli cells (cp. Table 1) can be enhanced by supplementing the medium of infected cells with 10~4 M ZnS0 4 . These results indicated that the CB121 antimutator DNA polymerase is a defective zinc metalloenzyme ( S C H R O E D E R and J A N T S C H A K 1978). Summarizing the results of the inhibitor study, we find that compounds which do not interact with the enzyme at all, i.e. distamycin A and actinomycin D, have a uniform effect on all three DNA polymerases while, on the other hand, the enzymatic response to inhibitors which bind to the active site, and especially to those which bind in a manner different from normal substrate or DNA binding (pyP and phenanthroline), varies the most. In Table 5 the substances are listed in the order of inhibition strength. Clearly, the inhibition potency of the substances is completely unrelated to their selectivity (i.e. their ability to elicit differential responses in the three DNA polymerase variants) which rises in the order distamycin A = actinomycin D (uniform action)

20 20 20

10 75 20

|/.M 100 100 100

50 50 80

a) data from PRESBER et al. (1976) b) data from SCHROEDER and JANTSCHAK (1980) c) per cent of uninhibited control

inhibitor sensitivities in vivo and in vitro do not run parallel. The extreme sensitivity of in vivo DNA synthesis to 3'-FdT is probably an artifact caused by inhibition of the enzymes responsible for phosphorylating [ 3 H]-thymidine. Pleiotropic effects of inhibitors, b u t also of the is-mutations themselves, lead to the observed differences between the in vitro and in vivo level. The in vivo system therefore tends to yield "false-posit i v e " substances (like chloramphenicol: PEESBEE et al. (1976)), which have an effect on the expression of the mutated gene or inhibit other proteins interacting with the

Inhibition of T4 + and mutant DNA polymerases

153

a l t e r e d e n z y m e . If a collection of isolated enzymes is used t o screen for a n t i v i r a l d r u g s t h e n all substances which require intracellular chemical modification will be overlooked, b u t t h e " p o s i t i v e s " will be substances which directly i n t e r a c t w i t h t h e e n z y m e . S i m u l t a n e o u s testing of m u t a n t a n d wild-type D N A polymerases is t h u s m o r e effective t h a n testing t h e wild-type D N A polymerases alone as is p r a c t i c e d t o d a y (STRIDH et al. 1 9 7 9 , S U N D Q U I S T a n d OBERG 1 9 7 9 , MÜLLER a n d F A L K E 1 9 7 9 ) . I s o l a t e d e n z y m e s are suitable for detecting enzyme-specific c o m p o u n d s a n d finding t h e i r m o s t effective derivatives, b u t t h e proof of selective antiviral a c t i v i t y of a d r u g requires t h e isolation of d r u g - r e s i s t a n t virus m u t a n t s ( H E R R M A N N a n d H E R R M A N N 1 9 7 7 ) a n d t h e d e m o n s t r a t i o n t h a t t h e d r u g does n o t a f f e c t t h e host in t h e a n t i v i r a l c o n c e n t r a t i o n range. As long as conditions for t h e d e v e l o p m e n t of " t a i l o r e d " a n t i v i r a l d r u g s (COHEN 1977) are s u b o p t i m a l it is worthwhile to resort t o m u t a n t systems or their purified enzymes as a m o r e r a t i o n a l w a y of identifying virostatic agents. W h e r e well-defined i s - m u t a n t s are lacking one can use field strains of viruses a n d " c a l i b r a t e " t h e m w i t h inhibitors of k n o w n m o d e of action. This a p p r o a c h has p r o v e d u s e f u l in t h e search for h e r p e t o s t a t i c s (REEESCHLÄGER et al., in p r e p a r a t i o n ) a n d inhibitors of influenza viruses ( P R E S B E R et al., in p r e p a r a t i o n ) . A

cknowledgements

We gratefully acknowledge the gift of bacterial and phage strains by Prof. Dr. W. B. WOOD (Pasadena), Prof. Dr. D. GOLDFARB (Moscow) and of compounds by Prof. P. LANGEN (Berlin) and Prof. K. MADEJA (Greifswald). We thank Prof. H. A. ROSENTHAL for continuous interest and support of this work. References ALIKHANIAN, S. I . , PIRUZIAN, E . a n d KOBETS, N . S., 1974. S t u d i e s of m u t a t o r p r o p e r t i e s in

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Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie

21

2

1981

157-167

(Working Group Geomicrobiology, University of Mineralog.-Petrograph. Institute, University of Heidelberg and Institute of Microbiology, Technical University, Braunschweig)

Geomicrobiological leaching of tin minerals by Thiobacillus jerrooxidans and organic agents G . H . T E I I , W . SCHWARTZ a n d G . C. AMSTUTZ

(Eingegangen

am 24.

4.1980)

Laboratory investigations confirm that it is possible to leach tin from synthetic minerals like stannite, kesterite, stannoidite, herzenbergite, ottemannite and berndtite, and from natural tin minerals which include stannite, cassiterite and varlamoffite, in the presence of Thiobacillus ferrooxidans, and with organic agents of biological origin, especially oxalic acid and oxalic-citric acids mixture. Over a leaching period of 35 days with 0.5%pulp density, initial pH of 2.5, using minus 0.16 mm size fraction a t 32 °C, as much as 54.45, 72.66, 97.13, and 3 1 . 3 0 % Sn were extracted from synthetic stannite, kesterite, stannoidite and natural stannite, respectively. Varlamoffite, found in the dried, leached residues of the tin sulphides, provides evidence t h a t bacterial action can be responsible for the genesis of supergene varlamoffite.

In geologic weathering systems, organic agents such ashumic acids from humus or products of acid fermentations of bacteria and fungi may decompose minerals during biochemical weathering of rocks, dominantly by reacting with polyvalent cations in minerals to form metallo-organic complexes or chelates (HUANG and K E L L E R 1 9 7 2 ) . MUNTZ ( 1 8 9 0 ) was the first to suggest that bacteria are concerned in rock decomposition. Recently, however, attention has been increasingly called to the activity of microorganisms in weathering processes (EHRLICH 1 9 6 4 ) . A possible aspect of the oxidation and dissolution of stannite and related tin minerals can be attributed to the biochemical weathering processes by Thiobacillus ferrooxidans. The availability of high-grade synthetic specimens, coupled with the research interests in the possible oxidation pathways of stannite and related tin minerals in nature and the applicability of the microbiological leaching technique in the recovery of tin from these minerals, low-grade tin deposits or too complex intergrown grains inseparable by mechanical or other sophisticated beneficiation techniques, have prompted a comparative study of application and rates of microbiological leaching of these minerals in the presence of Thiobacillus ferrooxidans and of organic agents. It was as early as 1 9 2 2 that RUDOLFS and RUDOLFS and HEILBRONNER suggested the possible economical extraction of metals from low-grade sulphide ores by microbiological leaching. However, initial scientific interest in this field crystallized only after the isolation of Thiobacillus ferrooxidans, by COLMER and H I N K L E ( 1 9 4 7 ) . This was followed by extensive studies on microbiological leaching and processes applicable to the leaching of metals, especially from sulphidic ores. The literature list on microbiological leaching has in the last 20 years been very extensive and review articles applicable to the present study include MALOUF and PRATER ( 1 9 6 1 ) , DUNCAN et al. ( 1 9 6 6 ) , PINGS ( 1 9 6 8 ) , TORMA ( 1 9 7 1 ) , CORRANS et al. ( 1 9 7 2 ) , TOUVINEN a n d K E L L Y ( 1 9 7 4 ) . DUNCAN ( 1 9 6 7 ) demonstrated the sulphide oxidation ability of Th. ferrooxidans on stannite,

however, a not too significant tin solubilization of 12% in 40 days was reported. Organic agents, for instance organic acids which are produced by bacteria, fungi and lichens (GINZBURG et al. 1 9 6 3 , HUANG and K E L L E R 1 9 7 1 , 1 9 7 2 , ISKANDER and

158

G . H . T E H , W . SCHWARTZ a n d G . C . A M S T U T Z

can involve release of cations from common rock minerals and from ore minerals (BROCKAMP 1974) to form soluble complexes and to affect chemical weathering. The applications to heterotrophic leaching processes of ores, however, are mainly still in the laboratory stage (f. i. PARES et al. 1 9 6 5 , LYALIKOVA and MOKEICHEVA 1 9 6 9 , SYERS 1 9 7 2 )

K I E L 1 9 7 7 , K I E L a n d SCHWARTZ 1 9 8 0 , SCHWARTZ a n d NAVEKE 1 9 8 0 ) .

Materials

and

methods

Minerals a n d samples: Samples were collected m a i n l y f r o m E u Tong Seng Mine, T e k k a a n d H o c k Leong Mine, A m p a n g , a n d in addition f r o m various other tin deposits in Malaysia ( T E H 1 9 7 9 ) . F o r comparison w i t h Malaysian occurrences, cassiterite f r o m Rooiberg Mine, S o u t h Africa a n d v a r l a m o f f i t e f r o m San P e d r o Mine, Tazna, Bolivia, were used. T h e s y n t h e t i c t i n sulphides, herzenbergite (SnS), o t t e m a n n i t e (Sn 2 S 3 ), b e r n d t i t e (SnS 2 ), s t a n n i t e (Cu 2 FeSnS 4 ), kesterite (Cu 2 ZnSnS 4 ) a n d stannoidite (Cu 8 Fe 3 Sn 2 S 12 ), were derived f r o m synthesis in rigid, evacuated, sealed silica glass t u b e s as described b y K U L L E R U D ( 1 9 7 1 ) a n d confirmed b y X - r a y diffraction analysis. B a c t e r i a : A p u r e strain of Th. ferrooxidans used in this s t u d y was originally isolated b y S C H W A B T Z f r o m " K a m b r i s c h e r Alaunschiefer", R a n s t a d , Sweden. I t has been routinely m a i n t a i n e d in m e d i u m 9 K of SILVERMAN a n d L U N D G R E N

(1959).

Culture t e c h n i q u e : A p a r a t f r o m t h e preliminary investigations, for t h e m a i n leaching experim e n t s w i t h Th. ferrooxidans, 0.0375 g of m i n u s 0.16 m m m a t e r i a l u n d e r s t u d y was placed in a 25 ml flask containing 7.5 ml of m e d i u m K . T h e p H was a d j u s t e d w i t h 1 N sulphuric acid t o p H 2.5, 1 ml of inoculum a d d e d a n d t h e flask i n c u b a t e d a t 32 °C on a g y r a t o r y shaker. Organic a g e n t s : I n t h e e x p e r i m e n t s w i t h organic agents, 0.1 g of t h e minus 0.16 m m samples w e r e placed in 7.5 ml of 0.05 M solutions of oxalic acid, salicylic acid, glycolic acid,tannic acid,