MÉTODOS NORMALIZADOS Para el análisis de aguas potables y residuales [17 ed.] 9788479780319

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MÉTODOS NORMALIZADOS Para el análisis de aguas potables y residuales

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APHA, AWWA, WPCF

MÉTODOS NORMALIZADOS Para el análisis de aguas potables y residuales Preparado y publicado conjuntamente por:

AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION AMERICAN WATER WORKS ASSOCIATION WATER POLLUTION CONTROL FEDERATION Comité Editorial Conjunto LENORE S. CLESCERI, WPCF, PRESIDENTE ARNOLD E. GREENBERG, APHA R. RHODES TRUSSELL, AWWA MARY ANN H. FRANSON Directora de Edición

Título original: «Standard Methods» For the Examination of Water and Wastewater. 17 Edition © Copyright, 1989 American Public Health Association American Water Works Association Water Pollution Control Federation © Ediciones Díaz de Santos, S. A., 1992 Juan Bravo, 3-A. 28006 Madrid (España) Reservados todos los derechos. «No está permitida la reproducción total o parcial de este libro, ni su tratamiento informático, ni la transmisión de ninguna forma o por cualquier medio, ya sea electrónico, mecánico, por fotocopia, por registro u otros métodos, sin el permiso previo y por escrito de los titulares del Copyright» ISBN en lengua inglesa: 087553-161-X ISBN en lengua española: 978-84-7978-031-9 Depósito legal: M. 10.447-1992 Diseño de cubierta: Estuart, S. A. (Madrid) Traducción: Diorki, S. A. (Madrid) Fotocomposición: MonoComp, S. A. (Madrid) Impresión: Lavel, S. A. Humanes (Madrid)

PRÓLOGO DE LA EDICIÓN EN ESPAÑOL DEL «STANDARD METHODS» ADECAGUA quiere que sus primeras palabras sean para agradecer a Ediciones DÍAZ DE SANTOS el enorme esfuerzo realizado para la publicación en español del «Standard Methods», libro que ha servido de guía a muchas generaciones de técnicos del agua en todo el mundo. Esta publicación facilitará su conocimiento en nuestro país, donde las sucesivas ediciones han sido siempre libro de consulta, y básico, en los temas de contaminación del medio acuático. No creemos, sin embargo, que la publicación se deba valorar únicamente en relación con el mero conocimiento de los métodos más adecuados de análisis. Muchos de sus capítulos son verdaderos compendios de una información básica, sin la cual es muy difícil obtener, con todas las garantías, el conocimiento completo de un problema de contaminación. No podría ser más oportuna esta edición en español. La creciente complejidad de los análisis para determinar microcontaminantes, especialmente orgánicos, y la aplicación de las Directivas Comunitarias, en su versión española, obliga aún más, si cabe, a un rigor en la analítica que sólo podrá conseguirse si se siguen métodos confirmados y seguros. Las mayores exigencias de la Administración, con la posible aplicación de sanciones cada vez más importantes, o incluso la creciente incidencia del delito ecológico, hace necesario disponer de una metodología segura y fiable para definir, hasta límites preestablecidos, una posible fuente contaminante. Muchas son las razones para recomendar vivamente la utilización de Métodos Normalizados para el análisis de aguas potables y residuales, pero parece lógico señalar las siguientes, como más importantes: La primera es la continua revisión a que están sometidos sus métodos de análisis. A la creciente diversidad de contaminantes que aparecen en el medio ambiente, se debe responder con una sistemática revisión de la técnica que permita afrontar los nuevos problemas, con métodos actuales, utilizando los más modernos procesos de análisis y el desarrollo instrumental existente en el mercado. La implantación continua de los procesos de análisis biológicos, como los ensayos de toxicidad, es también del mayor interés, estableciendo la necesaria coordinación entre análisis físico-químicos y biológicos, estos últimos, desgraciadamente, menos utilizados en nuestro país. La mayor atención que la publicación dedica a esta metodología es una prueba más de su interés y de la dedicación de los editores de mantenerla no sólo al día, sino adelantándose a las necesidades, para la protección del medio ambiente. Estamos seguros que, desde su publicación en castellano de la obra Métodos Normalizados para el análisis de aguas potables y residuales será libro de consulta obligado en nuestros laboratorios, empresas de ingeniería y, en general, de todos aquellos que dedicamos nuestra actividad profesional a estos problemas. GAMALIEL MARTÍNEZ DE BASCARÁN Presidente de ADECAGUA

PREFACIO A LA DECIMOSÉPTIMA EDICIÓN* Edición decimosexta y anteriores La primera edición de Métodos normalizados se publicó en 1905. Cada una de las subsiguientes ediciones introdujo mejoras significativas en el aspecto metodológico y amplió el alcance de la obra con el fin de incluir técnicas adecuadas para el análisis de la gran cantidad de tipos de muestras encontradas durante la evaluación y control de la calidad del agua y de la contaminación de las aguas. Es interesante revisar brevemente la historia de Métodos normalizados por lo actual de su contenido. Una iniciativa para «garantizar la adopción de métodos de análisis de aguas más eficientes y uniformes» dio lugar en la década de 1880 a la organización de un comité especial en la Sección Química de la American Association for the Advancement of Science. En 1889, este comité publicó un informe titulado: «Método parcial para el análisis sanitario de las aguas y para la presentación de resultados, ofrecido para adopción generalizada»**. En él se trataban cinco temas: 1) amonio «libre» y «albuminoideo»; 2) capacidad de consumo de oxígeno; 3) nitrógeno total en forma de nitratos y nitritos; 4) nitrógeno en forma de nitritos, y 5) presentación de resultados. En 1895, miembros de la American Public Health Association (APHA), conscientes de la necesidad de contar con métodos normalizados para el análisis microbiano de las aguas, patrocinaron una convención de bacteriólogos para estudiar el problema. Como resultado de ello se formó un comité en el seno de la APHA encargado de «diseñar procedimientos para el estudio de bacterias de un modo uniforme y con especial referencia a la diferenciación de especies». A partir de su presentación en 1897†, los procedimientos gozaron de una amplia aceptación. En 1899, la APHA creó el Committee on Standard Methods normalizados para Análisis de Aguas, al que se encargó la extensión de los procedimientos estándar a la totalidad de los métodos relacionados con el análisis de aguas. El informe del Comité, publicado en 1905, constituyó la primera edición de Métodos normalizados, titulado por entonces Métodos normalizados para el análisis de aguas. En él se incluían métodos para el análisis físico, químico, microscópico y bacteriológico de las aguas. En su carta de presentación, el Comité afirmaba: Creemos que los métodos de análisis presentados en este informe como «Métodos normalizados» recogen los mejores procedimientos empleados en la actualidad por los analistas de aguas estadounidenses y pueden aplicarse de forma generalizada en relación con los problemas habituales de purificación de aguas, eliminación de aguas residuales e investigaciones sanitarias. Es evidente que no se pueden emplear métodos de análisis idénticos para problemas ampliamente diferentes, y que los problemas especiales exigen la aplicación de los métodos que mejor se adapten a ellos. No obstante, y sin olvidar este extremo, no deja de ser cierto que el trabajo analítico progresará en relación directa con la adopción general de métodos fiables, uniformes y adecuados. En ocasiones se afirma que la adopción de métodos estándar en el campo de la ciencia aplicada * Esta decimoséptima edición en inglés corresponde a esta edición que se realiza por vez primera en lengua castellana. ** J. Anal. Chem. 3:398 (1889). † Proc. Amer. Pub. Health Assoc. 23:56 (1897).

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tiende a esclerotizar las investigaciones y a retrasar el auténtico progreso. No hay razón para que ello sea así, sin embargo, si tales métodos se emplean con la mentalidad adecuada. Este Comité desea fervientemente que se continúen todos los esfuerzos encaminados a mejorar las técnicas de análisis de aguas y, especialmente, a comparar los métodos habituales con los aquí recomendados en los casos en que sean diferentes, de tal modo que los resultados obtenidos sean aún más exactos y fiables de lo que lo son en la actualidad.

La APHA publicó sucesivas ediciones revisadas y ampliadas de Métodos normalizados para el análisis de aguas en 1912 (segunda edición), 1917 (tercera), 1920 (cuarta) y 1923 (quinta). En 1925, la American Water Works Association se unió a la APHA para la publicación de la sexta edición, a la que se dio el título más amplio de Métodos normalizados para el análisis de aguas limpias y residuales. La publicación conjunta se continuó en la séptima edición, fechada en 1933. En 1935, la Water Pollution Control Federation (WPCF), por entonces llamada Federation of Sewage Works Associations, publicó un informe elaborado por uno de sus comités y titulado «Métodos normalizados para el análisis de aguas residuales»‡. Con pequeñas modificaciones, estos métodos se incorporaron a la octava edición (1936) de Métodos normalizados, la cual ofrecía por primera vez métodos para el análisis de «aguas residuales, vertidos industriales y aguas contaminadas con lodos y fangos». La novena edición, que apareció en 1946, también contenía estos métodos, y al año siguiente la WPCF se asoció plenamente a la publicación. Desde 1947, el trabajo de los comités de Métodos normalizados de las tres asociaciones —APHA, AWWA y WPCF— está coordinado por un consejo editorial conjunto con representación de cada una de ellas. La décima edición (1955) incluía métodos específicos para el análisis de aguas residuales industriales, hecho que se reflejaba en el nuevo título: Métodos normalizados para el análisis de aguas limpias, aguas residuales y residuos industriales. Con el fin de describir con mayor exactitud y concisión su contenido, el título de la undécima edición (1960) se abrevió a Métodos normalizados para el análisis de aguas y aguas residuales, título que se mantuvo sin cambios a lo largo de las ediciones duodécima (1965), decimotercera (1971), decimocuarta (1976) y decimoquinta (1981). En la decimocuarta edición se suprimió la separación entre los procedimientos de análisis para aguas limpias y para aguas residuales, de modo que todos los métodos para la determinación de un componente o una característica dada se agrupaban bajo un único encabezamiento. Con ligeros cambios, la organización de la decimocuarta edición se conservó en la decimoquinta y la decimosexta (1985). En esta última se llevaron a la práctica dos importantes decisiones políticas del consejo editorial conjunto: en primer lugar, se incorporó y adoptó el Sistema Internacional de Unidades (SI), excepto en los casos en que los sistemas o prácticas habituales exigían el empleo de unidades inglesas; en segundo lugar, se redujo al mínimo el empleo de nombres comerciales o referencias a productos de marca, para evitar posibles reclamaciones sobre limitación del comercio o favoritismo comercial. ‡ Sewage Works J. 7:444(1935).

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Decimoséptima edición La organización de la decimoséptima edición refleja el compromiso de desarrollar y mantener un sistema de numeración permanente. Se han asignado nuevos números a todas las secciones y se han reservado otros, no empleados en la presente edición, para utilizarlos en el futuro. Se han numerado las distintas partes con múltiplos de 1000, en vez de 100, pero todas ellas conservan su identidad con respecto a la edición anterior, salvo la 6000, dedicada ahora a los métodos para la determinación de compuestos orgánicos específicos; los procedimientos más generales para determinación de compuestos orgánicos aparecen en la parte 5000. La sección introductoria (parte 1000) de la decimoséptima edición ha experimentado una profunda revisión. Las secciones relativas a análisis estadístico, calidad de datos y desarrollo de métodos se han ampliado considerablemente. La sección dedicada al agua como reactivo se ha actualizado para dar cabida al esquema de clasificación actual de los distintos tipos de aguas para reacción. La parte 1000 recoge importante información acerca de la correcta ejecución de los procedimientos y debe ser cuidadosamente estudiada por todos los usuarios de este manual. Las partes restantes se inician con secciones dedicadas a la garantía de calidad y otros temas de aplicación general dentro de cada campo concreto, con el fin de reducir al mínimo las repeticiones en el texto subsiguiente. La escrupulosa observancia de las recomendaciones y precauciones introductorias es fundamental para el éxito del análisis. Antes de emprender un ensayo, el lector debe haber comprendido toda la explicación de cada procedimiento, incluyendo la selección de métodos, los procedimientos de toma de muestras y el almacenamiento de las mismas, así como las posibles fuentes de interferencia. La parte 2000 (propiedades físicas y globales) presenta una nueva sección referente a sobresaturación de gases disueltos; contiene además procedimientos para el análisis de ciertas propiedades globales (acidez, alcalinidad y dureza) que aparecían en otras partes de la obra en ediciones anteriores, así como las pruebas para el gas de digestión de lodos que figuraban en la parte 500 de ediciones anteriores. Se han revisado las secciones referentes a salinidad y saturación de carbonato cálcico para adaptarlas a la práctica actual de análisis de estos parámetros. La parte 3000 (metales) incluye ahora un breve apartado sobre garantía de calidad; se ha actualizado la sección relativa a tratamiento y preparación de las muestras. A continuación se presentan las técnicas instrumentales (espectrometría de absorción atómica y método de plasma de acoplamiento inductivo) útiles para la determinación de numerosos metales; se han revisado los métodos de absorción atómica y se ha incorporado una nueva técnica basada en la generación continua de hidruros. A las secciones dedicadas a análisis para metales específicos se han añadido breves apartados que refieren al lector a las técnicas instrumentales para la determinación de antimonio, arsénico, bismuto, cesio, iridio, molibdeno, osmio, paladio, platino, renio, rodio, rutenio, talio, torio, estaño y titanio. Se ha revisado la sección referente al litio para incluir métodos con umbrales de

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detección más bajos. Se han añadido nuevos métodos para la determinación de compuestos de selenio y aluminio. La parte 4000 (no metales inorgánicos) contiene también una nueva sección dedicada a garantía de calidad. Los métodos analíticos, incluyendo la cromatografía iónica para determinación de varios aniones, así como los métodos para aniones específicos, se mantienen prácticamente sin cambios y se han confirmado por consenso. Para la determinación de cloro residual se han añadido la titulación amperimétrica de bajo nivel y las técnicas de yodometría, eliminándose el método del cristal violeta incoloro. También se han añadido métodos más precisos para la determinación de ozono y dióxido de cloro. Se han suprimido varios métodos para nitratos y se ha añadido un método nuevo para determinación de nitrato mediante cloruro de titanio. La parte 5000 (compuestos orgánicos en general) contiene ahora exclusivamente métodos de determinación de las concentraciones globales de grupos de compuestos orgánicos. Los métodos para determinar compuestos específicos (metano, pesticidas y herbicidas, metanos y etanos halogenados, compuestos causantes de olores y sabores, y contaminantes orgánicos por cromatografía de gases/espectrometría de masas) se han trasladado a la parte 6000 o se han sustituido por procedimientos nuevos. Se han revisado en profundidad los métodos para DOX (anteriormente TOX). Por último, se han incorporado métodos para sustancias procedentes del humus y determinación del potencial formador de trihalometano. La parte 6000 (compuestos orgánicos individuales) es nueva. Contiene información introductoria sobre toma y conservación de muestras para análisis de compuestos orgánicos, así como los principios generales de procedimientos y las fuentes de interferencia para los métodos analíticos instrumentales. Se ha revisado un método de concentración de constituyentes mediante extracción de gases (depuración de bucle cerrado) que se incluía en la parte 500 de la decimosexta edición como método de análisis de compuestos orgánicos causantes de olor o sabor. Cada familia o grupo de compuestos orgánicos se presenta con una introducción sobre su presencia en el medio ambiente y una selección de métodos analíticos para los mismos. La mayoría de los métodos incluidos en la parte 6000 corresponden a procedimientos aprobados por la Agencia del Medio Ambiente, completamente revisados y actualizados, que aparecieron como suplemento a la decimosexta edición. También se incluyen en esta parte varios métodos para la determinación de compuestos específicos que figuraban en la parte 500 en la edición decimosexta. La parte 7000 (radiactividad) no presenta cambios en cuanto a los métodos. Se han revisado las secciones de introducción para aventurar la importancia de la garantía de calidad. La parte 8000 (pruebas toxicológícas) también conserva los métodos de la edición precedente, si bien se ha revisado la introducción y se ha añadido un breve apartado sobre mutagenicidad. La sección de zooplancton de la decimosexta edición ha perdido su carácter unitario, al haberse incluido los métodos

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para protozoos ciliados, Daphnia y Acartia en otras secciones de esta misma parte, con el fin de reflejar las relaciones taxonómicas. La parte 9000 (análisis microbiológicos) ha experimentado una revisión y actualización generales. Se ha añadido un nuevo método para recuento directo y se han separado las pruebas de determinación de protozoos patógenos de las referidas a bacterias patógenas. En relación con la determinación de coliformes, la producción de ácido en un medio de cultivo que contiene lactosa se ha incluido nuevamente como reacción positiva. La sección referente a estreptococos, de nueva redacción, hace hincapié en los procedimientos para enterococos. La parte 10000 (análisis biológicos) contiene revisiones sustanciales de los métodos para determinación de plancton, macrófitos y peces. El principal cambio en la sección de plancton es la inclusión de un procedimiento de cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) para determinación de clorofila. Otros métodos se han sometido igualmente a revisión y a actualización generalizadas. Preparación de reactivos La ejecución estricta de las instrucciones para la preparación de reactivos puede dar lugar a la obtención de cantidades muy superiores a las necesarias. En algunos casos, estos reactivos son tóxicos. Con el fin de favorecer la economía y reducir al mínimo los desperdicios, el analista debe examinar las necesidades y adaptar a ellas las cantidades de solución siempre que resulte apropiado. Esta actitud conservadora debe extenderse igualmente a la política de suministros, de modo que no se acumulen productos químicos sin utilizar de los que haya que deshacerse al expirar su plazo de conservación. Selección y aprobación de métodos En cada nueva edición, tanto los criterios técnicos de selección de métodos como los procedimientos formales de aprobación e inclusión se someten a revisión crítica. Con respecto a los procedimientos de aprobación, se concede especial importancia a garantizar que los métodos presentados hayan sido examinados y se encuentren respaldados por el mayor número posible de personas cualificadas, de modo que constituyan un auténtico consenso entre las opiniones de los expertos. Al preparar la decimocuarta edición, se establecieron grupos de trabajo para cada una de las pruebas, esquema que se mantuvo en cada una de las ediciones subsiguientes. La inclusión de una persona determinada en un grupo de trabajo se basó generalmente en su interés expreso o en el hecho de contar con experiencia reconocida. Fue, en cualquier caso, un esfuerzo encaminado a reunir un grupo con la máxima experiencia posible en cada uno de los métodos de ensayo. A cada grupo de trabajo se le encargó la revisión de los métodos pertinentes de la decimosexta edición, así como de otros procedentes de la literatura, con el

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fin de recomendar los métodos que deberían incluirse en la decimoséptima edición y presentarlos en forma de manuscrito como propuesta de sección. Posteriormente, cada sección, excepto las de la parte 1000, fue ratificada en rotación por los miembros del Committee on Standard Methods que habían solicitado examinar las secciones de determinada parte. Todos los votos negativos y comentarios surgidos durante la votación fueron examinados posteriormente por el consejo editorial conjunto. Se sometieron a resolución las sugerencias más importantes. En los casos en los que ni el grupo de trabajo ni el consejo editorial conjunto consiguieron resolver los votos negativos de la primera ronda, la sección volvió a someterla a votación entre quienes habían votado afirmativa o negativamente en la primera ronda. Solamente en los pocos casos que no pudieron resolverse así, correspondió al consejo editorial conjunto la decisión final. La información general y la relativa a garantía de calidad presentadas en la parte 1000 recibieron un tratamiento diferente. También en este caso se formaron grupos de trabajo a los que se asignó una tarea y se encomendó la preparación de un borrador de consenso. Este borrador fue examinado por el enlace del consejo editorial conjunto y, finalmente, por el propio consejo. Los borradores de las distintas secciones se enviaron al Committee on Standares Methods, y los comentarios resultantes de esta revisión se incorporaron al borrador final. Al igual que en ediciones precedentes, los métodos presentados en esta obra se considera que son los mejores de los procedimientos disponibles para el análisis de aguas limpias residuales y sustancias relacionadas, y gozan de amplia aceptación; son los recomendados por los especialistas y están ratificados por un elevado número de analistas y profesionales de experiencia más general, por lo que constituyen auténticas referencias estándar de consenso, capaces de ofrecer una base válida y reconocida para control y evaluación. Los criterios técnicos para la selección de los métodos los aplicaron los grupos de trabajo y las personas encargadas de revisar las recomendaciones de éstos, en tanto que el consejo editorial conjunto se limitó a proporcionar directrices generales. Además de los conceptos clásicos de precisión, sesgo y concentración mínima detectable, la selección de un método determinado debe tener en cuenta asimismo aspectos como el tiempo necesario para obtener los resultados, la necesidad de contar con equipos especiales o con analistas que hayan recibido una formación especializada y otros factores referentes al coste del análisis y la viabilidad de un uso generalizado del mismo. Clasificación de los métodos Todos los métodos incluidos en la decimoséptima edición están fechados, con el fin de ayudar a los usuarios a determinar qué métodos han sufrido modificaciones significativas con respecto a la edición precedente. El año en que el Committee on Standard Methods aprobó la sección se indica en una nota a pie de página al comienzo de cada sección. Las secciones o métodos que aparecían en la decimosexta edición y permanecen inalterados en la presente, o han sufrido cambios

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formales pero no de contenido, tienen la fecha de la edición anterior, 1985. Las secciones o métodos que se han modificado significativamente o que se han confirmado mediante consenso general del Committee on Standard Methods se han fechado en 1988, mientras que los demás métodos conservan la fecha de 1985. En la decimoséptima edición, los distintos métodos se han clasificado en cuatro clases fundamentales: PROPUESTOS, ESPECIALIZADOS, NORMALIZADOS y GENERALES. Independientemente de la categoría asignada, todos los métodos deben ser aprobados por el Committee on Standard Methods. Las características de cada clase son las siguientes: 1. PROPUESTOS: Un método PROPUESTO debe someterse a un desarrollo y validación que satisfagan los criterios establecidos en la sección 1040 A de Métodos normalizados. 2. ESPECIALIZADOS: Determinado procedimiento llega a convertirse en un método ESPECIALIZADO por una de las siguientes vías: a) El procedimiento se somete a desarrollo y validación, así como a comprobación en régimen de colaboración, de acuerdo con los requisitos establecidos en la sección 1040 B y C, respectivamente, de Métodos normalizados; o b) El procedimiento en cuestión constituye el «MÉTODO DE ELECCIÓN» de los miembros del Committee on Standard Methods que efectúan el análisis y ha aparecido en DOS EDICIONES PREVIAS de Métodos normalizados. 3. NORMALIZADOS: Un procedimiento se convierte en método NORMALIZADO de una de las dos formas siguientes: a) El procedimiento se somete a desarrollo y validación, así como a comprobación en régimen de colaboración, de acuerdo con los requisitos establecidos en la sección 1040 B y C, respectivamente, de Métodos normalizados, y es «AMPLIAMENTE USADO» por los miembros del Committee on Standard Methods; o b) Se trata de un procedimiento «AMPLIAMENTE USADO» por los miembros del Committee on Standard Methods y ha aparecido en DOS EDICIONES PREVIAS de Métodos normalizados. 4. GENERALES: Un procedimiento se considera método GENERAL cuando ha aparecido en DOS EDICIONES PREVIAS de Métodos normalizados. La asignación de un método a una categoría determinada corresponde al consejo editorial conjunto. Para clasificar los métodos, dicho consejo evalúa los resultados de la encuesta que sobre empleo de métodos por el Committee on Standard Methods se efectúa en el momento de la votación general del método. El consejo editorial conjunto tiene en cuenta asimismo las recomendaciones hechas por los grupos de trabajo y por el coordinador general de la parte de que se trate. En los títulos de los métodos clasificados como «PROPUESTOS», «ESPECIALIZADOS» y «GENERALES» figura la designación correspondiente: los métodos en cuyo título no aparece designación alguna son «NORMALIZADOS». El progreso técnico hace recomendable el establecimiento de un programa

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para mantener Métodos normalizados a la vanguardia de los avances en investigación y práctica cotidiana. El consejo editorial conjunto ha desarrollado el siguiente procedimiento para efectuar modificaciones provisionales de los métodos entre ediciones: 1. La categoría asignada a cualquier método en la presente edición puede elevarse por decisión del consejo editorial conjunto, a partir de la publicación de datos que apoyen tal modificación y sean sometidos al comité por el grupo de trabajo correspondiente. La notificación del cambio de categoría se realizará mediante publicación en las revistas oficiales de las tres asociaciones que patrocinan Métodos normalizados. 2. Entre ediciones no puede suprimirse ni rebajarse de categoría ningún método. 3. El consejo editorial conjunto puede decidir entre ediciones la adopción de un nuevo método como propuesto, especializado o estándar, basando su decisión en el procedimiento de consenso habitual. Estos nuevos métodos pueden publicarse en suplementos a las ediciones de Métodos normalizados. Aún más importante para mantener la actual categoría de estos estándares es la intención de los patrocinadores de la publicación y del consejo editorial conjunto de que las próximas ediciones aparezcan con regularidad y a intervalos razonablemente cortos. Los comentarios y preguntas del lector en relación con este manual deben dirigirse a: Standard Methods Manager, American Water Works Association, 6666 West Quincy Avenue, Denver, CO 80235. Agradecimientos El consejo editorial conjunto otorga el mérito de la mayor parte del trabajo de preparación y revisión de los métodos de la decimosexta edición a los Committees on Standard Methods de la American Water Works Association y de la Water Pollution Control Federation, así como al Subcommittee on Standard Methods para el Análisis de Aguas Limpias y Residuales y al Committee on Laboratory Standards and Practices de la American Public Health Association. Miembros de estos comités presiden o forman parte de los grupos de trabajo. Con frecuencia estuvieron ayudados en su labor por consultores que no pertenecían formalmente a los comités ni, en muchos casos, eran miembros de las sociedades patrocinadoras. Deseamos expresar a estos consultores nuestra especial gratitud y reconocimiento por sus esfuerzos. A continuación de estas páginas figura una relación de los miembros y los consultores de los comités. Robert Booth, consultor científico de la Environmental Protection Agency, actuó como enlace entre este organismo y el consejo editorial conjunto; le expresamos nuestro agradecimiento por su interés y ayuda. El consejo editorial conjunto desea manifestar su reconocimiento a

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William H. McBeath, MD, director ejecutivo de la American Public Health Association; a John B. Mannion, director ejecutivo de la American Water Works Association, y a Quincalee Brown, director ejecutivo de la Water Pollution Control Federation, por su cooperación y asesoramiento en el desarrollo de esta publicación. Steven J. Posavec, gerente de Métodos normalizados y secretario del consejo editorial conjunto, proporcionó muy numerosos e importantes servicios, esenciales para la preparación de una obra de estas características. Jaclyn Alexander, directora de publicaciones de la American Public Health Association, actuó como editora, y Brigitte Coulton, también de la APHA, lo hizo como directora de producción. Especial reconocimiento merece la labor de Mary Ann H. Franson, directora de edición, quien hizo frente con absoluta eficiencia a las amplias y detalladas responsabilidades que entraña esta publicación. Deseamos expresar nuestro agradecimiento al anterior director ejecutivo de la American Water Works Association, Paul A. Schulte, por el gran apoyo prestado a esta edición y a las anteriores de Métodos normalizados. El fallecido Robert A. Canham realizó inestimables contribuciones al continuo desarrollo y mejora de Métodos normalizados durante su larga trayectoria como director ejecutivo de la Water Pollution Control Federation; conservamos un grato recuerdo de su sabiduría y su dirección. El consejo editorial conjunto agradece los significativos servicios prestados por Frederick W. Pontius, ingeniero de reglamentación de la American Water Works Association y anterior secretario del consejo editorial conjunto, así como por Adrienne Ash, de la American Public Health Association, que actuó como editora durante las fases iniciales de preparación de esta edición. Consejo editorial conjunto Arnold E. Greenberg, American Public Health Association. R. Rhodes Trussell, American Water Works Association. Lenore S. Clesceri, Water Pollution Control Federation, Presidente.

En distintos lugares de la presente obra se hace referencia a nombres de fabricantes, a marcas comerciales y a reactivos o compuestos químicos. El empleo de tales nombres no tiene otra finalidad que la de servir de referencia rápida a las características funcionales del producto en cuestión. Dichas referencias por tanto no deben interpretarse como recomendaciones de ninguno de esos productos por parte de los editores; en todos los casos pueden emplearse materiales o reactivos de características equivalentes.

CONSEJO EDITORIAL CONJUNTO LENORE S. CLESCERI, Water Pollution Control Federation, Presidente. A RNOLD E. GREENBERG, American Public Health Association. R. RHODES TRUSSELL, American Water Works Association.

COORDINADORES DE LAS DISTINTAS PARTES PARA LA DECIMOSÉPTIMA EDICIÓN Las personas siguientes actuaron como coordinadores de la parte indicada. Lenore S. Clesceri, 1000 David J. Rexing, 2000 Andrew D. Eaton, 3000 J. Owen Callaway, 4000 Stephen J. Randtke, 5000

Joseph J. Delfino, 6000 James W. Mullins, 7000 Patrick R. Parrish, 8000 Betty H. Olson, 9000 Hugh D. Putnam, 10000

COMITÉS PARA LA DECIMOSÉPTIMA EDICIÓN Presidentes de los grupos de trabajo Las personas siguientes actuaron como presidentes de los grupos de trabajo que desarrollaron las secciones indicadas. E. Marco Aieta, 4500-CIO2 Harry J. Alexander, 1060 Frank J. Baumann, 6210, 6220, 6230 Daniel F. Bender, 1090 Stuart C. Black, 1010, 1020, 1030, 1040 Robert H. Bordner, 9020 Robert I. Botto, 3120 Lloyd W. Bracewell, 2530 William H. Bruvold, 2160 Gary B. Collins, 10200 John Colt, 2810 Brian J. Condike, 3113 Wm. Bridge Cooke, 9610 Alfred P. Dufour, 9230 David E. Erdmann, 4500-F – Samuel D. Faust, 5530 John M. Ferris, 9810 Edwin E. Geldreich, 9221, 9222 Cari J. George, 10600 Gilbert Gordon, 4500-O 3

Charles N. Haas, 4500-C1 Earl L. Henn, 3111 Anita K. Highsmith, 1080, 9213 Thomas B. Hoover, 4110 Billy G. Isom, 10500 Walter Jakubowski, 9260, 9711 Martha N. Jones, 4500-NO 3 – y NO 2 – Stuart W. Krasner, 6040 Timothy E. Lewis, 350O-A1 William F. McCoy, 9216 Gordon A. McFeters, 9212 Douglas T. Merrill, 2330 Cari J. Miles, 5510 Frank J. Millero, 2520 Leown A. Moore, 5710 James W. Mullins, 7010, 7020, 7110, 7500-Cs, I, Ra, Sr, 3H y U Betty H. Olson, 9010, 9030, 9040, 9050, 9060 Francés Parsons, 9225 xvii

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Marvin D. Piwoni, 3030, 3110, 3111, 3112, 3113, 3114 Hugh D. Putnam, 10300 Stephen J. Randtke, 5550 Ronald L. Raschke, 10400 Donald J. Reasoner, 9211 David A. Reckhow, 5320 Donald J. Reish, 8510, 10900 Olsen J. Rogers, 4500-Br –

Darrell G. Rose, 3112 Robert S. Safferman, 9250 Kenneth Simon, 8010 Robert D. Swisher, 5540 Jack R. Tuschall, 3500-Li Michael J. Vandaveer, 3030 Hugo T. Victoreen, 9215 Oleh Weres, 3500-Se James C. Young, 5210

Committee on Standard Methods y miembros de los grupos de trabajo Las siguientes personas actuaron como miembros del Committee on Standard Methods y como miembros de los grupos de trabajo que desarrollaron las secciones indicadas. John C. Adams, 9213 V. Dean Adams Rose Adams-Whitehead Cacilda Jiunko Aiba E. Marco Aieta, 4500-ClO2 Katherine T. Alben Harry J. Alexander, 1060 James E. Alleman, 4500-NO3 – yNO2Herbert E. Alien Martin J. Alien, 9212, 9215 Osman M. Aly, 5530 Gary L. Amy, 5510 Charles G. Appleby Neal E. Armstrong John A. Arrington, II Robert M. Arthur Donald B. Aulenbach, 4500-NO3–

y NO 2 Barry M. Austern Warren F. Averill Guy M. Aydlett Robert M. Bagdigian, 1080 * Personas que no son miembros oficiales del Committee on Standard Methods pero realizaron contribuciones a las secciones indicadas.

Rodger B. Baird, 3030, 3110, 3111, 3112, 3113, 3114 L. Malcolm Baker, 6040 Robert A. Baker Gwendolyn L. Ball, 5710, 6040 Roy O. Ball Edmond J. Baratta, 7010, 7020, 7110, 7500-Cs, I, Ra, Sr, 3H, y U Michael J. Barcelona Thomas O. Barnwell, Jr, 5210 Sylvia E. Barrett, 4500-C1 Jerry Bashe*, 6010 Frank J. Baumann, 6210, 6220, 6230 David G. Beckwith, 1080 John W. Beland Daniel F. Bender, 1080, 1090, 4500-C1 y C1O2 Larry D. Benefield Paul S. Berger, 9020, 9215 Thomas Beymer*, 6010 Robert R. Bidigare, 10200 Kenneth E. Biesinger Star F. Birch, 1060, 1090, 9020 Stuart C. Black, 1010, 1020, 1030, 1040

xix

H. Curt Blair, 2520, 7010, 7020, 7110, 7500-Cs, I, Ra, Sr, 3H, y U I. Bob Blumenthal Edwin S. Boatman* DebraK. Bolding, 9211, 9230 Robert L. Booth† Robert H. Bordner, 9010, 9020, 9030, 9040, 9050, 9060 Mark E. Bose, 5540 Harry Boston ‡, 10400 Robert I. Botto, 3120 Gerald R. Bouck, 2810 William H. Bouma, 1060 Theresa M. Bousquet Russell E. Bowen George T. Bowman, 5210 William C. Boyle Lloyd W. Bracewell, 2530 Alvin L. Bradshaw, 2520 Brian M. Brady Blaise J. Brazos Geoffrey L. Brock Joe E. Brown Clifford Bruell William H. Bruvold, 2160 Anthony A. Bulich Steven M. Bupp Gary A. Burlingame, 2160, 6040 J. Owen Callaway Craig D. Cameron, 4500-O3 Raúl R. Cárdenas, Jr. Robert E. Carlson Stephen R. Carpenter Anthony R. Castorina Paul A. Chadik, 5510 Peter M. Chapman, 8510, 10500 Eric J. Chatfield Daniel David Chen

* Fallecido. † Enlace de la EPA con el consejo editorial conjunto. ‡ Personas que no son miembros oficiales del Commitíee on Standard Methods pero realizaron contribuciones a las secciones indicadas.

Mark G. Cherwin, 3030, 3110, 3111, 3112, 3113, 3114 Leonard L. Ciaccio Robert R. Claeys James A. Clark, 9221, 9225 Robert R. Clark William H. Clement, 5530 Dennis A. Clifford Sharon M. Cline John Clugel Colin E. Coggan Robert S. Cohen, 3030, 3110, 3111, 3112, 3113, 3114 Larry D. Cole Gary B. Collins, 10200 Michael Collins, 5510 Tom E. Collins, 6040 John Colt, 2810 Brian J. Condike, 3030, 3110, 3111, 3112, 3113, 3114 Gerald F. Connell Wm. Bridge Cooke, 9010, 9030, 9040, 9050, 9060, 9610, 10900 Sandra D. Cooper, 10300, 10500 Robert C. Cooper, 9225, 9260, 9711 Harold S. Costa C. Richard Cothern, 7010, 7020, 7110, 7500-Cs, I, Ra, Sr, 3H, yU John E. Cowell John V. Crable, 1090 Wendall H. Cross Warren B. Crummett William G. Crumpton, 10200 Nicholas J. Csikai Kenneth W. Cuneo Gregory A. Cutter, 3500-Se Melissa S. Dale, 6040 Richard A. Danforth, 1080 Robert A. Daniels, 10600 Richard-Paul Danner Brian G. D'Aoust, 2810 Patrick H. Davies

xx

Charles O. Davis, III, 3500-Li Ernst M. Davis, III, 10200 Marshall K. Davis, 3030, 3110, 3111, 3112, 3113, 3114 Laurens M. DeBirk Gary L. De Kock, 3120 Joseph J. Delfino Brian A. Dempsey, 5510 W. Michael Dennis*, 10400 Steven K. Dentel Fred L. DeRoos David Diamond Jack C. Dice, 2160 Denise A. Domínguez John H. Dorsey, 10900 Ronald C. Dressman, 5320 Charles T. Driscoll, 3500-A1 Alfred P. Dufour, 9010, 9030, 9040, 9050, 9060, 9213, 9230, 9260, 9711 Bernard J. Dutka, 9211, 9213, 9215 David G. Easterly, 7010, 7020, 7110, 7500-Cs, I, Ra, Sr, 3H, yU Andrew D. Eaton David L. Edelman, Jr. James K. Edzwald, 5710 Lawrence W. Eichler, 3030, 3110, 3111, 3112, 3113, 3114, 3500Al Gunnar Ekedahl William M. Ellgas, 9222, 9225 G. Keith Elmund, 9020, 9211 Mohamed Elnabarawy Alan W. Elzerman David E. Erdmann, 4110, 4500-F– R. P. Esser, 9810 Paul D. Evans

* Personas que no son miembros oficiales del Commiltee on Standard Methods pero realizaron contribuciones a las secciones indicadas.

William S. Ewell Samuel D. Faust, 5530 Andrea F. Feagin James C. Feeley, 9213 John M. Ferris, 9010, 9030, 9040, 9050, 9060, 9810 V. R. Ferris, 9810 James V. Feuss, 4500-C1 Duane H. Fickeisen, 2810 Luis Octavio Figueroa Bradford R. Fisher Robert P. Fisher Marvin J. Fishman, 3030, 3110, 3111, 3112, 3113, 3114, 4500-F– Arthur W. Fitchett Ellen P. Flanagan, 9222 Charles Fogle, 2530 Verlin W. Foltz, 4110 Charles T. Ford John A. Fournier Steven P. Fraleigh Martin S. Frant Marlene Frey Clifford Frith, 1080 John L. Fronk Paul L. K. Fu*, 5510 Roger S. Fujioka, 9230 Leo C. Fung, 4500-O3 Joseph T. Fuss, 2810 Anthony M. Gaglierd, 4500-C1 John E. Gannon M. E. Garza, Jr. Anthony F. Gaudy, Jr. Edwin E. Geldreich, 9010, 9030, 9040, 9050, 9060, 9213, 9221, 9222 Stephen R. Gelman, 5210 Cari J. George, 10600 Vincent A. Geraci Michael H. Gerardi Mriganka M. Ghosh Sambhunath Ghosh E. Gilbert, 4500-O3 James M. Gindelberger Thomas S. Gittelman, 6040

xxi

William H. Glaze Connie Glover C. Ellen Gonter Reginald K. S. Goo Arley L. Goodenkauf Gilbert Gordon, 45C0-ClO2 y O3 Joseph W. Gorsuch James A. Gouck Joseph P. Gould, 4500-C1 W. O. K. Grabow, 9213 Nancy E. Grams, 5320 Robert L. Graves William B. Gray Philip M. Gschwend Robert J. Gussman, 9020 Rufus K. Guthrie, 9213, 9225 Charles N. Haas, 4500-C1 Earl A. Hadfield, II Stephen W. Hager, 4500-NO3– yNO 2 – Gary E. Hahn Bruce A. Hale, 4110, 4500-CIO2 Nancy H. Hall, 9221, 9260, 9711 David J. Hansen Robert W. Hansen Donald W. Harper David J. Hartman, 5710 Thomas W. Haukebo Steven D. Hawthorne, 10500, 10900 Michael K. Hein, 10300 Charles W. Hendricks, 9225, 9260, 9711 Earl L. Henn, 3030, 3110, 3111, 3112, 3113, 3114 Edwin E. Herricks Delbert Hicks, 10400 Anita K. Highsmith, 1080, 9010, 9030, 9040, 9050, 9060, 9213

* Personas que no son miembros oficiales del Comtnitíee on Standard Methods pero realizaron contribuciones a las secciones indicadas.

Albert Hill*, 10400 David R. Hill, 5320 Kenneth M. Hill Phillip A. Hill George D. G. Hilling, 3030, 3110, 3111, 3112, 3113, 3114 George Hoag Laura Mahoney Hodges, 1060 Jimmie A. Hodgeson Robert C Hoehn, 5510, 5710, 9212 Jurg Hoigne, 4500-O3 G. C. Holdren Albert C. Holler, 3030, 3110, 3111, 3112, 3113, 3114 Thomas R. Holm Osmund Holm-Hansen John Homa, Jr, 10600 Thomas B. Hoover, 4110 Peter C. Houle Jack L. Hoyt, 5540 C. P. Huang Wayne B. Huebner, 4500-C1 y C1O2 Donald G. Huggins, 10900 Donald L. Hughes R. DeLon Hull Yung-Tse Hung Joseph V. Hunter Noel M. Hurley Joseph A. Hutchinson, 7010, 7020, 7110, 7500-Cs, I, Ra, Sr, 3H yU Cordelia J. Hwang Verónica Y. Inouye Kurt Irgolic Billy G. Isom, 10500 George Izaguirre, 9250 R. Wayne Jackson, 9222 Walter Jakubowski, 9010, 9030, 9040, 9050, 9060, 9260, 9711 Carol Ruth James Konanur G. Janardan Harían R. Jeche, 9020 S. Rod Jenkins

xxii

J. Charles Jennett, 3030, 3110, 3111, 3112, 3113, 3114 James N. Jensen J. Michael Jeter Isabel C. Johnson J. Donald Johnson, 4500-C1 Stephen W. Johnson Waynon Johnson Donald L. Johnstone, 9213, 9230 Martha N. Jones, 4500-NO 3 – y NO 2 – Robert A. Jung Swiatoslav W. Kaczmar Sabry M. Kamhawy, 5210 Sandra A. Kaptain Irwin J. Katz, 9250, 9260, 9711 Fred K. Kawahara, 5530 Floyd D. Kefford Michael A. Keirn, 10300 Lawrence H. Keith Nabih P. Kelada William J. Kenney, 5210 Lee G. Kent, 3030, 3110, 3111, 3112, 3113, 3114 Zoltan Kerekes, 9211 Harold W. Kerster Troy Edward King, 1090 Riley N. Kinman Joyce S. Kippin, 9212 Norman A. Kirshen Robert L. Klein, Jr. Donald J. Klemm, 10500, 10900 Margaret M. Knight Bart Koch, 5710 William F. Koch, 4500-F' Frederick C. Kopfler Stuart W. Krasner, 2160, 6040 Richard T. Krause Timothy I. Ladd, 9216 Lawrence E. LaFleur, 5320 Leslie E. Lancy Dennis D. Lañe Russell W. Lañe, 2330 Johan Langewis

Alexander Lapteff Richard A. Larson, 5510 Desmond F. Lawler James M. Lazorchak, 10500, 10900 Norman E. LeBlanc Mark LeChevallier, 9212 G. Fred Lee Janet M. Lee Raymond Lee Henry W. Leibee Armond E. Lemke Lawrence Y. C. Leong Raymond D. Letterman Philip A. Lewis Ronald F. Lewis, 9250 Timothy E. Lewis, 3500-A1 Chun-Teh Li Alvin Lieberman Shundar Lin, 9212, 9221 Christopher B. Lind, 9221 Chung-King Liu Larry B. Lobring Stephen R. Lohman, 4500-ClO2 Linda R. Lombardo, 9215 Maxine C. Long, 9225, 9260, 9711, 10200 James E. Longbottom Karl E. Longley, 4500-C1 Marc W. Lorenzen Richard G. Luthy Gerald L. Mahon, 9250 Ronald L. Malcolm, 5510 Joel Mallevialle Bruce E. Manning George Marinenko Leif L. Marking Harold G. Marshall, 10200 Theodore D. Martin, 3120 Margaret Martin-Goldberg Maria T. Martins, 9213 John Y. Masón, 4500-ClO 2 Willy J. Masschelein, 4500-O3 Owen B. Mathre, 3120

xxiii

Howard M. May, 3500-A1 Foster L. Mayer Lawrence M. Mayer, 5510 J. Howard McCormick William F. McCoy, 9010, 9030, 9040, 9050, 9060, 9216 Daniel McDaniel Gerald N. McDermott Gordon A. McFeters, 9010, 9030, 9040, 9050, 9060, 9212, 9222 Gerald D. McKee, 5210 James J. McKeown Gerald L. McKinney, 3120 Roy P. McKnight Daniel A. McLean Lilia M. McMillan, 9250 Dale D. McMurtrey Ann Marie McNamara, 1080 Nancy E. McTigue Jay C. Means Robert O. Megard Robert Meglan Morten C. Meilgaard Joseph L. Melnick, 9211 Lori A. Melroy, 1060 Douglas T. Merrill, 2330 Peter L. Meschi Theodore G. Metcalf E. J. Middlebrooks Cari J. Miles, 5510 Arthur M. Miller Frank J. Mulero, 2520 James R. Millette Roger A. Minear, 4500-Br–, 5530 Marc W. Mittelman, 9216 Harold Moehser*, 3500-Se James G. Moncur William J. Montgomery, Jr. Leown A. Moore, 5710 H. Anson Moye

* Personas que no son miembros oficiales del Commitíee on Standard Methods pero realizaron contribuciones a las secciones indicadas.

Terry I. Mudder James W. Mullins, 7010, 7020, 7110, 7500-Cs, I, Ra, Sr, 3H yU Andrew P. Murray, 10200 Hussein Naimie, 4500-O3 Harry D. Nash, 9020, 9221 Rosemary H. Neal, 3500-Se Stuart Nefft*, 10900 Stanley A. Nichols, 10400 Teresa J. Norberg-King James R. Nugent Gregg Oelker, 3120 Patrick W. O'Keefe Betty H. Olson, 9010, 9030, 9040, 9050, 9060 Cathleen S. O'Neil Joan A. Oppenheimer Edward D. Orme, 4110 John A. Osborne, 10400 Quentin W. Osburn, 5540 Janet G. Osteryoung Edward B. Overton Jeffrey L. Oxenford Arthur T. Palin, 4500-C1 y O3 Sunil P. Pande James M. Pappenhagen Thomas R. Parr, 9225, 9230 Patrick R. Parrish Frances Parsons, 9010, 9030, 9040, 9050, 9060, 9225 Robert A. Paterson, 9610, 10200, 10900 Paul D. Paustian Harry M. Pawlowski, 4500-C1 Richard K. Peddicord Mark E. Peden, 3500-A1 E. Michael Perdue, 5510 Robert K. Pertuit Carol Pesch*, 8510 Deanna L. Peterson, 6040 John Peterson, 9222 William M. Peterson Gary R. Peyton Frederic K. Pfaender JohnD. Pfaff, 4110 Massoud Pirbazari Rodolfo A. Pisigan, Jr., 2330 John T. Pivinski

xxiv

Marvin D. Piwoni, 3030, 3110, 3111, 3112, 3113, 3114 Russell H. Plumb, Jr. Robert B. Pojasek James M. Polisini William B. Prescott Thomas A. Pressley Fred T. Price Hugh D. Putnam, 10300 James G. Quinn Ánsar A. Qureshi, 9215, 9222, 9230 Neil M. Ram, 5710 Raman K. Raman Steven J. Randtke, 5550 Ronald L. Raschke, 10200, 10400 Inayat A. Rashid Judith A. Rawa Bill T. Ray, 1090 William R. Ray Donald J. Reasoner, 9010, 9030, 9040, 9050, 9060, 9211, 9212 David A. Reckhow, 5320 Kurt A. Reimann, 5540 Martin Reinhard Donald J. Reish, 8510, 10900 Vincent H. Resh, 10900 David J. Rexing Eugene W. Rice, 9221, 9222 George G. Richards, 2330 Harry Ridgway Robert W. Rinehart, Sr. Michele F. Rizet, 3030, 3110, 3111, 3112, 3113, 3114 Morris H. Roberts, Jr., 10500 Andrew Robertson, 10200 Sharon M. Roehm Stephen C. Roesch, 1090 Gary L. Rogers Olsen J. Rogers, 4500-BrPeter F. Rogerson R. R. Romine * Fallecido.

† Personas que no son miembros oficiales del Commitiee on Standard Melhods pero realizaron contribuciones a las secciones indicadas.

Darrell G. Rose, 3030, 3110, 3111, 3112, 3113, 3114 Bernard Rosenberg, 9225, 9260, 9711 Joel A. Rosenfield William D. Rosenzweig, 9215, 9610 John R. Rossum*, 2330 Richard B. Rubin Peter P. Russell, 2530 Peggy A. Ryker, 9222 William A. Sack, 2520 Robert S. Safferman, 9010, 9030, 9040, 9050, 9060, 9250 Ana M. Sancha Ernest A. Sánchez, 7010, 7020, 7110, 7500-Cs, I, Ra, Sr, 3H yU Rajkamal Sarin Bernard Saunier, 4500-C1 y O, Larry P. Scanlan, 2330 A. David Scarchilli David J. Schaeffer Bernard Schmall John A. Schmitt, 9610 Michael R. Schock, 3500-Li Frank E. Scully, Jr. Bette Seamonds, 1080 Alberta J. Seierstad Kevin G. Sellner†, 10200 Roland L. Seymour, 9610 Joseph Shapiro B. F. Shema, 9260, 9711 Joseph H. Sherrard Marjorie G. Shovlin, 9212, 9225 Peter J. Shuba, 10300, 10500 Mark Shuman Leonard Sideman, 1080 Kenneth Simón, 8010 Philip C. Singer, 5710 J. Edward Singley, 2330 Robert W. Slater, Jr. John P. Slobogin Robert Smith Mark D. Sobsey

XXV

William C. Sonzogni Charles A. Sorber R. Kent Sorrell David T. Specht Robert L. Spehar Robert G. Spicher Stuart J. Spiegel John B. Sprague Jack R. Stabley, Jr., 3030, 3110, 3111, 3112, 3113, 3114 Vernon T. Stack, 5210 John F. Stafford Alan A. Stevens Raymond M. Stewart Scott Stieg I. H. Suffet, 2160 Makram T. Suidan Bernard F. Sullivan Richard Swartz Robert A. Sweeney, 10200, 10500, 10900 Robert D. Swisher, 5540 James M. Symons John C. Synnott, 4500-NCV Y NO2– Adib F. Tabri Yoshihiro Takahashi, 5320 Lawrence P. Talarico, 5320 Thomas A. Tamayo Mark L. Tamplin, 9260, 9711 Theodore S. Tanaka Donald C. Taylor Raymond H. Taylor, 9215, 9221 Frank Thomas Bruce M. Thomson Earl M. Thurman Robert V. Thurston Edwin C. Tifft, Jr. R. Yucel Tokuz Michael L. Trehy Albert R. Trussell, 6040 * Personas que no son miembros oficiales del Commiitee on Standard Methods pero realizaron contribuciones a las secciones indicadas.

León Tsao*, 3500-Se Jack R. Tuschall, 3500-Li, 5510 Ronald E. Twillman, 6040 Mark D. Umphres George S. Uyesugi, 7010, 7020, 7110, 7500-Cs, I, Ra, Sr, 3H yU Michael J. Vandaveer, 3030, 3110, 3111, 3112, 3113, 3114 Schalk W. van der Merwe William H. van der Schalie M. M. Varma Roy M. Ventullo, 9216 P. Aarne Vesilind Hugo T. Victoreen, 9010, 9030, 9040, 9050, 9060, 9215, 9222 Craig O. Vinson Ronald H. Voss Frank F. Wada, 2530 Johannes E. Wajon, 6040 Gerald E. Walsh, 10200 Lawrence K. Wang Mu Hao S. Wang Wuncheng Wang Timothy J. Ward Barron L. Weand David H. Webb, 10400 James H. Webb, 9222 Flora Mae Wellings Oleh Weres, 3500-Se Warren C. Westgarth, 1060, 2160, 9020, 9211 Theodore F. Wetzler, 9221 Willis B. Wheeler Robert E. White James L. Whitlock Greene R. Whitney, 2330 Donald O. Whittemore, 4500-Br– Raymond C. Whittemore, 5210 George P. Whittle Brannon H. Wilder Robert T. Williams Theodore J. Williams, 9020 Kenneth J. Wills, 1060 Frederic J. Winter

xxvi

John A. Winter, 9020 Charles E. Woelke Roy L. Wolfe Richard E. Wolke, 10600 George T. F. Wong Mark W. Wood Ty R. Woodin Jack Q. Word, 10900 John Wuepper, 2160 * Personas que no son miembros oficiales del Committee on Standard Methods pero realizaron contribuciones a las secciones indicadas.

George Yamate In Che Yang, 7010, 7020, 7110, 7500-Cs, I, Ra, Sr, 3H y U Dennis A. Yates Andrew Yee*, 3500-Se Thomas L. Yohe Roger A. Yorton James C. Young, 5210 Michael Young, 9020, 9213 Matthew J. Zabik Stan S. Zaworski Carol A. Ziel, 9211,9213 Melvin C. Zimmerman

TABLA C PESOS ATÓMICOS RELATIVOS INTERNACIONALES

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TABLA C. PESOS ATÓMICOS RELATIVOS INTERNACIONALES

TABLA C. PESOS ATÓMICOS RELATIVOS INTERNACIONALES

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CONTENIDO PÁGINA

Parte

1000 INFORMACIÓN GENERAL 1010 INTRODUCCIÓN ......................................................................... A. Finalidad y aplicación de métodos ............................. B. Estadística....................................................................... C. Glosario .......................................................................... 1020 GARANTÍA DE CALIDAD............................................................ A. Introducción .................................................................. B. Control de calidad......................................................... C. Evaluación de calidad .................................................. 1030 C ALIDAD DE DATOS .................................................................. A. Introducción .................................................................. B. Sesgo ............................................................................ C. Precisión ....................................................................... D. Incertidumbre total ..................................................... E. Límite de detección del método ................................... F. Valoración de la corrección de los análisis .............. 1040 DESARROLLO Y EVALUACIÓN DE MÉTODOS ............................... A. Introducción .................................................................. B. Validación del método .................................................. C. Prueba en colaboración ................................................ 1050 EXPRESIÓN DE RESULTADOS .................................................... A. Unidades ........................................................................ B. Elementos significativos ................................................ 1060 TOMA Y CONSERVACIÓN DE MUESTRAS...................................... A. Introducción .................................................................. B. Toma de muestras ........................................................ C. Conservación de muestras ............................................ 1070 INSTRUMENTAL, REACTIVOS Y TÉCNICAS DE LABORATORIO .. A. Introducción .................................................................. B. Instrumental ................................................................. C. Reactivos ........................................................................ D. Técnicas .......................................................................... 1080 AGUA DE CALIDAD PARA REACTIVOS ........................................ A. Introducción .................................................................. B. Métodos de preparación de agua de calidad para reactivos ..................................................................... C. Calidad del agua para reactivos................................... 1090 SEGURIDAD .............................................................................. A. Introducción .................................................................. B. Equipo de seguridad ................................................... C. Riesgos en el laboratorio ........................................... D. Prácticas de control de riesgos .................................... xxxi

1-1 1-1 1-2 1-4 1-6 1-6 1-7 1-13 1-15 1-15 1-16 1-16 1-18 1-19 1-22 1-24 1-24 1 -24 1-27 1-30 1-30 1-31 1-33 1-33 1-38 1-45 1-47 1-47 1-47 1-49 1-52 1-63 1-63 1-65 1-66 1-68 1-68 1-69 1-73 1-81

CONTENIDO

xxxii

PÁGINA

Parte

2000 2010 2020 2110 2120

2130

2150

2160

2310

2320

2330

2340

2510

2520

PROPIEDADES FÍSICAS Y DE AGREGACIÓN I NTRODUCCIÓN ....................................................................... C ONTROL DE CALIDAD ........................................................ ASPECTO ................................................................................. C OLOR ...................................................................................... A. Introducción ................................................................. B. Método de comparación visual ................................ C. Método espectrofotométrico ....................................... D. Método de filtro triestímulo ....................................... E. Método ADMI de filtro triestimulo (PROPUESTA) T URBIDEZ ............................................................................... A. Introducción ................................................................ B. Método nefelométrico ................................................ OLOR ........................................................................................ A. Introducción ................................................................. B. Prueba de umbral de olor ........................................... G USTO ...................................................................................... A. Introducción ................................................................. B. Prueba de umbral de sabor (PUS) ........................ C. Evaluación de índice de sabor (EIS) ......................... D. Análisis del perfil de sabor (APS) .......................... A CIDEZ ................................................................................... A. Introducción ................................................................. B. Método de titulación .................................. , ................ A LCALINIDAD .......................................................................... A. Introducción ................................................................ B. Método de titulación ................................................... S ATURACIÓN DE CARBONATO CALCICO (PROPUESTA) ... A. Introducción .................................................................. B. índices representativos de la tendencia de un agua a precipitar o disolver el CaCO 3 ........................... C. índices de previsión de la cantidad de CaCO, que puede precipitarse o disolverse .............................. D. Diagramas y códigos de ordenador para los índices de CaCO, .................................................................. D UREZA ................................................................................... A. Introducción .................................................................. B. Cálculo de la dureza ................................................. C. Método titulométrico de EDTA ............................ C ONDUCTIVIDAD ................................................................... A. Introducción ................................................................. B. Método de laboratorio ............................................. S ALINIDAD ............................................................................. A. Introducción .................................................................

2-1 2-1 2-1 2-2 2-2 2-3 2-5 2-9 2-10 2-12 2-12 2-14 2-18 2-18 2-19 2-26 2-26 2-27 2-30 2-32 2-33 2-33 2-33 2-38 2-38 2-39 2-44 2-44 2-46 2-52 2-53 2-57 2-57 2-57 2-58 2-63 2-63 2-65 2-67 2-67

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Parte

B. Método de la conductividad eléctrica.......................... C. Método de densidad ................................................... D. Algoritmo de salinidad práctica .................................. 2530 MATERIAS FLOTABLES ................................................................ A. Introducción ................................................................. B. Partículas flotables (GENERAL) ................................ C. Grasas y aceites flotables solubles en triclorotrifluoroetano (GENERAL) ................................................ 2540 SÓLIDOS ................................................................................... A. Introducción ................................................................. B. Sólidos totales secados a 103-105 °C .......................... C. Sólidos totales disueltos secados a 180 °C ................ D. Sólidos totales en suspensión secados a 103-105 °C . E. Sólidos fijos y volátiles incinerados a 550 °C.............. F. Sólidos sedimentables ................................................. G. Sólidos totales, fijos y volátiles en muestras sólidas y semisólidas ............................................................... 2550 TEMPERATURA .......................................................................... A. Introducción ................................................................. B. Métodos de laboratorio y de campo .......................... 2710 PRUEBAS EN LODOS ................................................................. A. Introducción ................................................................. B. Tasa de consumo de oxígeno....................................... C. Volumen de lodo sedimentado .................................... D. índice de volumen de lodo ........................................... E. Tasa de sedimentación de zona .................................. F. Gravedad específica ...................................................... 2720 GAS DIGESTOR DE LODO ......................................................... A. Introducción ................................................................. B. Método volumétrico .................................................. C. Método cromatografía) de gases ................................ 2810 SOBRESATURACIÓN DE GAS DISUELTO .................................... A. Introducción ................................................................. B. Método de difusión de membrana directa ................

2-68 2-70 2-71 2-72 2-72 2-72

2-87 2-88 2-88 2-89 2-90 2-90 2-90 2-92 2-93 2-94 2-96 2-97 2-97 2-98 2-101 2-104 2-104 2-105

3000 DETERMINACIÓN DE METALES 3010 INTRODUCCIÓN ......................................................................... A. Discusión general ........................................................... B. Toma y conservación de muestras ............................... C. Precauciones generales .................................................. 3020 CONTROL DE CALIDAD .......................................................... 3030 TRATAMIENTO PRELIMINAR DE MUESTRAS ............................... A. Introducción .................................................................. B. Filtración preliminar .....................................................

3-1 3-1 3-2 3-3 3-4 3-5 3-5 3-6

2-76 2-78 2-78 2-80 2-81 2-83 2-85 2-86

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C.

Tratamiento preliminar de metales extraíbles por ácido ............................................................................ D. Digestión preliminar de metales ................................... E. Digestión por ácido nítrico ........................................... F. Digestión por ácido nítrico-ácido clorhídrico ......... G. Digestión por ácido nítrico-ácido sulfúrico ............... H. Digestión por ácido nítrico-ácido perclórico .............. I. Digestión por ácido perclórico-ácido fluorhídrico . . . J. Combustión seca ......................................................... 3110 DETERMINACIÓN DE METALES POR ESPECTROMETRÍA DE ABSORCIÓN ATÓMICA ................................................................. 3111 DETERMINACIÓN DE METALES POR ESPECTROMETRÍA DE ABSORCIÓN ATÓMICA DE LLAMA ..................................................... A. Introducción .................................................................. B. Método directo de llama de aire-acetileno .................. C. Método de extracción/llama de aire-acetileno ............ D. Método directo de llama de óxido nitroso-acetileno E. Método de extracción/llama de óxido nitroso-acetileno ......................................................................... 3112 DETERMINACIÓN DE METALES POR ESPECTROMETRÍA DE ABSORCIÓN ATÓMICA DE VAPOR FRÍO.................................................. A. Introducción ................................................................. B. Método espectrometría) de absorción atómica de vapor frío..................................................................... 3113 DETERMINACIÓN DE METALES POR ESPECTROMETRÍA DE ABSORCIÓNATÓMICAELECTROTÉRMICA ................................................ A. Introducción ................................................................... B. Método espectrométrico de absorción atómica electrotérmica .................................................................. 3114 DETERMINACIÓN DE METALES POR GENERACIÓN DE HIDRUROS/ESPECTROMETRÍA DE ABSORCIÓN ATÓMICA .................... A. Introducción ................................................................... B. Método manual de generación de hidruros/espectrometría de absorción atómica ................................. C. Método continuo de generación de hidruros/espectrometría de absorción atómica (PROPUESTA) . ............... 3120 DETERMINACIÓN DE METALES POR ESPECTROSCOPIA DE EMISIÓN DE PLASMA .................................................................................. A. Introducción .................................................................. B. Método de plasma de acoplamiento inductivo (PAI) 3-59 3500-A1 ALUMINIO ............................................................................. A. Introducción .................................................................. B. Método espectrométrico de absorción atómica ......... C. Método de plasma de acoplamiento inductivo ........

3-7 3-7 3-9 3-9 3-10 3-11 3-12 3-12 3-13 3-14 3-14 3-21 3-25 3-27 3-30 3-31 3-31 3-32 3-35 3-35 3-39 3-47 3-47 3-48 3-56 3-59 3-59 3-70 3-70 3-70 3-70

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D. E.

Método de eriocromo cianina R ................................ Método automatizado de violeta de pirocatecol (VPC) (PROPUESTA) .............................................. 3500-Sb ANTIMONIO ........................................................................... A. Introducción .................................................................. B. Método espectrométrico de absorción atómica.......... C. Método de plasma de acoplamiento inductivo ......... 3500-As ARSÉNICO ............................................................................. A. Introducción .................................................................. B. Método espectrométrico de absorción atómica.......... C. Método del dietilditiocarbamato de plata ................ D. Método del tinte de bromuro mercúrico .................. E. Método de plasma de acoplamiento inductivo ......... 3500-Ba BARIO .................................................................................... A. Introducción .................................................................. B. Método espectrométrico de absorción atómica.......... C. Método de plasma de acoplamiento inductivo ......... 3500-Be BERILIO .................................................................................. A. Introducción .................................................................. B. Método espectrométrico de absorción atómica.......... C. Método de plasma de acoplamiento inductivo ......... D. Método del aluminen ................................................. 3500-Bi BISMUTO ............................................................................... A. Introducción .................................................................. B. Método espectrométrico de absorción atómica .......... 3500-Cd CADMIO ............................................................................... A. Introducción .................................................................. B. Método espectrométrico de absorción atómica .......... C. Método de plasma de acoplamiento inductivo ......... D. Método de la ditizona................................................... 3500-Ca CALCIO ................................................................................. A. Introducción .................................................................. B. Método espectrométrico de absorción atómica .......... C. Método de plasma de acoplamiento inductivo ......... D. Método titulométrico de EDTA ............................... E. Método titulométrico de permanganato ..................... 3500-Cs CESIO ..................................................................................... A. Introducción .................................................................. B. Método espectrométrico de absorción atómica .......... 3500-Cr CROMO................................................................................... A. Introducción .................................................................. B. Método de absorción atómica para el cromo total . C. Método de plasma de acoplamiento inductivo ......... D. Método colorimétrico ..................................................

3-71 3-75 3-81 3-81 3-81 3-82 3-82 3-82 3-82 3-83 3-85 3-87 3-87 3-87 3-87 3-87 3-88 3-88 3-88 3-88 3-89 3-91 3-91 3-91 3-91 3-91 3-92 3-92 3-92 3-95 3-95 3-95 3-95 3-96 3-98 3-100 3-100 3-101 3-101 3-101 3-102 3-102 3-102

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3500-Co COBALTO ............................................................................. A. Introducción .................................................................. B. Método espectrométrico de absorción atómica.......... C. Método de plasma de acoplamiento inductivo ........ 3500-Cu COBRE .................................................................................. A. Introducción .................................................................. B. Método espectrométrico de absorción atómica ......... C. Método de plasma de acoplamiento inductivo ........ D. Método de la neocuproína ........................................... E. Método de la batocuproína ........................................ 3500-Au ORO ...................................................................................... A. Introducción .................................................................. B. Método espectrométrico de absorción atómica ......... 3500-Ir IRIDIO ...................................................................................... A. Introducción ................................................................. B. Método espectrométrico de absorción atómica ......... 3500-Fe HIERRO.................................................................................... A. Introducción .................................................................. B. Método espectrométrico de absorción atómica ......... C. Método de plasma de acoplamiento inductivo ........ D. Método de fenantrolina.......................................... 3500-Pb PLOMO .................................................................................. A. Introducción .................................................................. B. Método espectrométrico de absorción atómica ......... C. Método de plasma de acoplamiento inductivo ........ D. Método de la ditizona ................................................... 3500-Li LITIO ..................................................................................... A. Introducción .................................................................. B. Método espectrométrico de absorción atómica ......... C. Método de plasma de acoplamiento inductivo ........ D. Método fotométrico de emisión de llama................... 3500-Mg MAGNESIO ........................................................................... A. Introducción ................................................................. B. Método espectrométrico de absorción atómica ......... C. Método de plasma de acoplamiento inductivo ........ D. Método gravimétrico ..................................................... E. Método de cálculo ......................................................... 3500-Mn MANGANESO ....................................................................... A. Introducción .................................................................. B. Método espectrométrico de absorción atómica ......... C. Método de plasma de acoplamiento inductivo ........ D. Método del persulfato ................................................... 3500-Hg MERCURIO ............................................................................ A. Introducción ..................................................................

3-105 3-105 3-106 3-106 3-106 3-106 3-107 3-107 3-107 3-110 3-111 3-111 3-112 3-112 3-112 3-112 3-112 3-112 3-114 3-114 3-115 3-120 3-120 3-120 3-120 3-121 3-124 3-124 3-124 3-.124 3-125 3-127 3-127 3-127 3-127 3-128 3-129 3-130 3-130 3-131 3-131 3-131 3-134 3-134

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B. Método de absorción atómica de vapor frío .............. C. Método de la ditizona................................................... 3500-Mo MOLIBDENO ........................................................................ A. Introducción .................................................................. B. Método espectrométrico de absorción atómica.......... C. Método de plasma de acoplamiento inductivo ......... 3500-Ni NÍQUEL ................................................................................. A. Introducción .................................................................. B. Método espectrométrico de absorción atómica .......... C. Método de fuente de plasma de acoplamiento inductivo ............................................................................. D. Método de la heptoxima (GENERAL) ....................... E. Método de la dimetilglioxima (GENERAL) ........... 3500-Os OSMIO ................................................................................. A. Introducción .................................................................. B. Método espectrométrico de absorción atómica.......... 3500-Pd PALADIO .............................................................................. A. Introducción ................................................................. B. Método espectrométrico de absorción atómica.......... 3500-Pt PLATINO .............................................................................. A. Introducción .................................................................. B. Método espectrométrico de absorción atómica.......... 3500-K POTASIO ................................................................................. A. Introducción .................................................................. B. Método espectrométrico de absorción atómica .......... C. Método de plasma de acoplamiento inductivo ......... D. Método fotométrico de llama....................................... 3500-Re RENIO .................................................................................. A. Introducción .................................................................. B. Método espectrométrico de absorción atómica .......... 3500-Rh RODIO ................................................................................... A. Introducción .................................................................. B. Método espectrométrico de absorción atómica.......... 3500-Ru RUTENIO ............................................................................... A. Introducción .................................................................. B. Método espectrométrico de absorción atómica.......... 3500-Se SELENIO ................................................................................. A. Introducción .................................................................. B. Preparación de la muestra ......................................... C. Método continuo de generación de hidruros/espectrometría de absorción atómica............................... D. Método colorimétrico .................................................. E. Método fluorométrico ..................................................

3-135 3-135 3-137 3-137 3-137 3-137 3-138 3-138 3-138 3-138 3-138 3-140 3-141 3-141 3-141 3-141 3-141 3-141 3-142 3-142 3-142 3-142 3-142 3-143 3-143 3-143 3-144 3-144 3-144 3-145 3-145 3-145 3-145 3-145 3-145 3-146 3-146 3-149 3-153 3-154 3-156

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F. G.

Determinación del selenio volátil................................. Determinación de compuestos orgánicos de selenio no volátiles ................................................................ H. Método de espectrometría de absorción atómica electrotérmica ................................................................. I. Método de plasma de acoplamiento inductivo ........ 3500-Ag PLATA ................................................................................... A. Introducción .................................................................. B. Método espectrométrico de absorción atómica ......... C. Método de plasma de acoplamiento inductivo ........ D. Método de la ditizona................................................... 3500-Na SODIO ...................................................................................... A. Introducción .................................................................. B. Método espectrométrico de absorción atómica ......... C. Método de plasma de acoplamiento inductivo ........ D. Método fotométrico de emisión de llama ................... 3500-Sr ESTRONCIO .............................................................................. A. Introducción .................................................................. B. Método espectrométrico de absorción atómica ......... C. Método de plasma de acoplamiento inductivo ........ D. Método fotométrico de emisión de llama................... 3500-TI TALIO......................................................................................... A. Introducción .................................................................. B. Método espectrométrico de absorción atómica ......... C. Método de plasma de acoplamiento inductivo ........ 3500-Th TORIO ...................................................................................... A. Introducción ................................................................. B. Método espectrométrico de absorción atómica ......... 3500-Sn ESTAÑO .................................................................................... A. Introducción ................................................................. B. Método espectrométrico de absorción atómica ......... 3500-Ti TITANIO .................................................................................. A. Introducción .................................................................. B. Método espectrométrico de absorción atómica ......... 3500-V VANADIO ................................................................................... A. Introducción .................................................................. B. Método espectrométrico de absorción atómica ......... C. Método de plasma de acoplamiento inductivo ........ D. Método del ácido gálico .............................................. 3500-Zn ZINC .................................................................................... A. Introducción .................................................................. B. Método espectrométrico de absorción atómica ......... C. Método de plasma de acoplamiento inductivo ........

3-157 3-159 3-161 3-162 3-162 3-162 3-162 3-163 3-163 3-166 3-166 3-167 3-167 3-167 3-171 3-171 3-172 3-172 3-172 3-174 3-174 3-174 3-175 3-175 3-175 3-175 3-175 3-175 3-176 3-176 3-176 3-176 3-177 3-177 3-177 3-177 3-178 3-180 3-180 3-180 3-181

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D. E. F.

Parte

Método I de la ditizona .............................................. Método II de la ditizona ........................................... Método del zincón .........................................................

4000 DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS 4010 I NTRODUCCIÓN ....................................................................... 4020 CONTROL DE CALIDAD ........................................................... 4110 DETERMINACIÓN DE ANIONES MEDIANTE CROMATOGRAFÍA DE IONES ............................................................................... A. Introducción .................................................................. B. Cromatografía de iones con supresión química de la conductividad del disolvente .................................. 4500-B BORO..................................................................................... A. Introducción .................................................................. B. Método de la curcumina ............................................... C. Método del carmín ........................................................ D. Método de plasma de acoplamiento inductivo .......... 4500-Br– BROMURO ......................................................................... A. Introducción .................................................................. B. Método colorimétrico del rojo de fenol .................... C. Método cromatografía) de iones.................................. 4500-CO2 DIÓXIDO DE CARBONO ..................................................... A. Introducción .................................................................. B. Determinación nomográfica de dióxido de carbono libre y de las tres formas de alcalinidad ................. C. Método titulométrico para el dióxido de carbono libre ........................................................................... D. Dióxido de carbono y formas de alcalinidad mediante cálculo ........................................................................ 4500-CN CIANURO ........................................................................... A. Introducción .................................................................. B. Tratamiento preliminar de muestras ............................ C. Cianuro total después de destilación ........................... D. Método titulométrico..................................................... E. Método colorimétrico .................................................. F. Método del electrodo cianuro-selectivo .................... G. Cianuros susceptibles de cloración después de destilación ........................................................................... H. Cianuros susceptibles de cloración sin destilación (método del atajo) .................................................... I. Cianuro débil y disociable ........................................ J. Cloruro de cianógeno .................................................

3-181 3-184 3-186

4-1 4-1 4-2 4-2 4-2 4-7 4-7 4-8 4-11 4-12 4-12 4-12 4-13 4-14 4-15 4-15 4-16 4-21 4-22 4-23 4-23 4-28 4-31 4-33 4-35 4-37 4-38 4-40 4-43 4-44

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K. Ensayo al toque para selección de muestras ........... L. Cianatos................................................................... M. Tiocianato................................................................ 4500-Cl CLORO (RESIDUAL) ................................................. A. Introducción ............................................................ B. Método yodométrico I .......................................... C. Método yodométrico II ............................................ D. Método amperométrico de titulación ....................... E. Método amperométrico de titulación de bajo nivel . F. Método titulométrico de la DFD ferrosa................. G. Método colorimétrico de la DFD ............................ H. Método de la siringaldacina (PCLD) ...................... I. Técnica yodométrica de electrodo ............................ _ 4500-Cl CLORURO ................................................................... A. Introducción ............................................................ B. Método argentométrico............................................ C. Método del nitrato mercúrico ............................... D. Método potenciométrico........................................... E. Método automatizado del ferrocianuro .................. F. Método de cromatografía de iones ......................... 4500-ClO2 DIÓXIDO DE CLORO ................. ............................... A. Introducción ............................................................ B. Método yodométrico................................................ C. Método amperométrico I ........................................ D. Método de la DFD ................................................. E. Método amperométrico II (PROPUESTA)............... 4500-F– FLUORURO ................................................................ A. Introducción ............................................................ B. Paso de destilación previa ..................................... C. Método de electrodo selectivo de iones .................. D. Método del SFADNS ............................................. E. Método de la complexona ..................................... 4500-H+ VALOR DE PH.............................................................. A. Introducción ............................................................ B. Método electrométrico ............................................. 4500-I– YODO ............................................................................ A. Introducción ............................................................ B. Método del violeta leuco cristal ............................... C. Método amperométrico de titulación ....................... 4500-I– YODURO..................................................................... A. Introducción ............................................................ B. Método del violeta leuco cristal................................ C. Método de reducción catalítica ...............................

4-45 4-46 4-48 4-51 4-51 4-55 4-57 4-61 4-65 4-66 4-70 4-72 4-74 4-76 4-76 4-77 4-78 4-80 4-83 4-85 4-85 4-85 4-86 4-88 4-90 4-91 4-95 4-95 4-97 4-99 4-102 4-104 4-106 4-106 4-107 4-116 4-116 4-117 4-119 4-120 4-120 4-120 4-123

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4500-N NITRÓGENO .............................................................................. 4500-NH3 NITRÓGENO (AMONÍACO) ................................................... A. Introducción .................................................................. B. Paso previo de destilación ......................................... C. Método de la nesslerización (directo y subsiguiente a destilación) ............................................................... D. Método de la sal de fenol ............................................. E. Método titulométrico .................................................... F. Método de electrodo selectivo de amoníaco ............ G. Método de electrodo selectivo de amoníaco con adición conocida ............................................................ H. Método automatizado de la sal de fenol ..................

4-125 4-126 4-126 4-129 4-132 4-136 4-137 4-138 4-140 4-143

4500-NO2– NITRÓGENO (NITRITO) ...................................................... A. Introducción .................................................................. B. Método colorimétrico ................................................. C. Método cromatográfico de iones ................................. 4500-NO3– NITRÓGENO (NITRATO) ...................................................... A. Introducción .................................................................. B. Método espectrométrico ultravioleta selectivo ........... C. Método cromatográfico de iones ................................. D. Método del electrodo de nitrato ................................ E. Método de reducción de cadmio ................................. F. Método automatizado de reducción de cadmio . . . . G. Método de reducción de cloruro titanoso (PROPUESTA) ................................................................. H. Método automatizado de reducción de hidracina (PROPUESTA) ........................................................

4-145 4-145 4-146 4-148 4-149 4-149 4-149 4-151 4-151 4-153 4-156

4500-Norg NITRÓGENO (ORGÁNICO) ....................................................... A. Introducción ................................................................... B. Método macro-kjeldahl................................................. C. Método semi-micro-kjeldahl .........................................

4-162 4-162 4-163 4-166

4500-O O XÍGENO (DISUELTO ) ................................................................ A. Introducción .................................................................. B. Métodos yodométricos ................................................ C. Modificación de azida ................................................... D. Modificación de permanganato ................................... E. Modificación de la floculación de alumbre .............. F. Modificación de la floculación de la combinación sulfato de cobre-ácido sulfámico ............................... G. Método de electrodo de membrana ..........................

4-168 4-168 4-169 4-172 4-177 4-178

4500-O3 OZONO (RESIDUAL) (PROPUESTA) .............................. A. Introducción .................................................................. B. Método colorimétrico de índigo ...............................

4-183 4-183 4-183

4-158 4-159

4-178 4-179

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4500-P FÓSFORO ...................................................................... A. Introducción ............................................................ B. Preparación de muestras .......................................... C. Método colorimétrico del ácido vanadomolibdofosfórico....................................................................... D. Método del cloruro estagnoso ................................. E. Método del ácido ascórbico ..................................... F. Método automatizado de reducción del ácido ascórbico .................................................................... 4500-Si SÍLICE ........................................................................... A. Introducción ............................................................ B. Método espectrométrico de absorción atómica ........ C. Método gravimétrico................................................ D. Método del molibdosilicato .................................... E. Método del azul heteropoli ................................... F. Método automatizado para sílice molibdatorreactiva G. Método de plasma de acoplamiento inductivo ....... 4500-S2– SULFURO .................................................................... A. Introducción ............................................................ B. Separación de sulfuros solubles e insolubles .......... C. Pretratamiento de muestras para eliminar sustancias que puedan interferir o para concentrar el sulfuro D. Método del azul de metileno .................................. E. Método yodométrico................................................ F. Cálculo del sulfuro de hidrógeno desionizado........... 4500 - SO32- SULFITO ................................................................. A. Introducción ............................................................ B. Método yodométrico................................................ C. Método de fenantrolina (PROPUESTA) ................ 4500 - SO 2SULFATO ............................................................... 4 A. Introducción ............................................................ B. Método cromatográfico de iones .............................. C. Método gravimétrico con combustión de residuos . . D. Método gravimétrico con secado de residuos ......... E. Método turbidimétrico .......................................... F. Método automatizado del azul de metiltimol .........

Parte 5000 DETERMINACIÓN DE COMPONENTES ORGÁNICOS 5010 INTRODUCCIÓN .................................................................... A. Discusión general...................................................... B. Toma y conservación de muestras............................

4-187 4-187 4-191 4-195 4-197 4-199 4-201 4-204 4-204 4-206 4-206 4-208 4-211 4-213 4-215 4-215 4-215 4-218 4-219 4-220 4-222 4-223 4-224 4-224 4-225 4-226 4-229 4-229 4-230 4-230 4-232 4-233 4-235

5-1 5-1 5-1

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5020 C ONTROL DE CALIDAD ........................................................... 5210 REQUERIMIENTO DE OXÍGENO BIOQUÍMICO ............................... A. Introducción .................................................................. B. Prueba ROB de 5 días .............................................. 5220 REQUERIMIENTO DE OXÍGENO QUÍMICO (ROQ)........................ A. Introducción .................................................................. B. Método de reflujo abierto............................................. C. Reflujo cerrado, método titulométrico ..................... D. Reflujo cerrado, método colorimétrico ...................... 5310 CARBONO ORGÁNICO TOTAL (COT) ........................................ A. Introducción .................................................................. B. Método de combustión-infrarrojo .............................. C. Método de oxidación persulfato-ultravioleta ............. D. Método de oxidación húmeda .................................... 5320 HALÓGENO ORGÁNICO DISUELTO ........................................... A. Introducción ................................................................. B. Método titulométrico de absorción-pirólisis ........... 5510 SUSTANCIAS ACUOSAS HÚMICAS (PROPUESTA) ................... A. Introducción ................................................................. B. Método del dietilaminoetil (DEAE) ............................ C. Método XAD ................................................................. 5520 ACEITE Y GRASA ....................................................................... A. Introducción ................................................................. B. Método de partición-gravimetría ................................ C. Método de partición-infrarrojo ................................ D. Método de extracción de Soxhlet ............................ E. Método de extracción para muestras de lodo............ F. Hidrocarburos................................................................. 5530 FENOLES ................................................................................. A. Introducción .................................................................. B. Procedimiento de limpiado ........................................... C. Método de extracción de cloroformo ........................ D. Método fotométrico directo ......................................... 5540 SURFACTANTES ......................................................................... A. Introducción .................................................................. B. Separación del surfactante por cancelación ................ C. Surfactantes amónicos como SAAM ............................ D. Surfactantes no iónicos como SATC ........................... 5550 TANINO Y LIGNINA .................................................................. A. Introducción .................................................................. B. Método colorimétrico .................................................. 5560 ÁCIDOS ORGÁNICOS Y VOLÁTILES ................................................

A.

Introducción ..................................................................

5-2 5-2 5-2 5-4 5-12 5-12 5-14 5-17 5-19 5-20 5-20 5-22 5-26 5-29 5-31 5-31 5-32 5-43 5-43 5-44 5-46 5-48 5-48 5-49 5-51 5-52 5-54 5-55 5-56 5-56 5-58 5-59 5-62 5-63 5-63 5-64 5-69 5-74 5-78 5-78 5-78 5-80

5-80

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B.

Método de separación cromatográfica para ácidos orgánicos..................................................................... C. Método de destilación ................................................... 5710 FORMACIÓN DE TRIHALOMETANO (PROPUESTA).................. A. Introducción .................................................................. B. Potencial de formación de trihalometano (PFT) . . . . C. Potencial básico de formación de trihalometano (PBFT) ........................................................................ D. Potencial final de formación de trihalometano (PFFT) ........................................................................ E. Concentración de trihalometano en sistemas de distribución simulados (CTHMSDS)............................

Parte 6000 ANÁLISIS AUTOMATIZADO DE LABORATORIO 6010 INTRODUCCIÓN ......................................................................... A. Discusión general........................................................... B. Toma y conservación de muestras .............................. C. Métodos analíticos ........................................................ 6040 C ONCENTRACIÓN DE COMPONENTES POR EXTRACCIÓN DE

5-81 5-83 5-85 5-85 5-86 5-91 5-93 5-94

6-1 6-1 6-4 6-6

........................................................................................

6-11

Introducción .................................................................. Depuración de ciclo cerrado, análisis por cromatografía de gases/espectrometría de masas ................ C. Técnica de purga y atrapamiento .............................. 6210 COMPUESTOS ORGÁNICOS VOLÁTILES ........................................ A. Introducción ................................................................... B. Método I de purga y atrapamiento con cromatografía de gases en columna de relleno/espectrometría de masas .................................................................... C. Método II de purga y atrapamiento con cromatografía de gases en columna de relleno/espectrometría de masas .................................................................... D. Método de purga y atrapamiento con cromatografía de gases en columna capilar/espectrometría de masas ........................................................................... 6211 METANO ................................................................................... A. Introducción ................................................................... B. Método indicador de gas combustible ...................... C. Método volumétrico ................................................... 6220 COMPUESTOS ORGÁNICOS AROMÁTICOS VOLÁTILES ................. A. Introducción .................................................................. B. Método I de purga y atrapamiento con cromatografía de gases .................................................................

6-11

GAS

A. B.

6-12 6-28 6-29 6-29

6-30

6-47

6-56 6-65 6-65 6-66 6-69 6-70 6-70 6-71

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C.

6230

6321

6232

6410

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Método II de purga y atrapamiento con cromatografía de gases ................................................................ D. Método de purga y atrapamiento con cromatografía de gases/espectrometría de masas ........................... E. Método de extracción líquido-líquido con cromatografía de gases/espectrometría de masas ................. HALOCARBUROS VOLÁTILES ...................................................... A. Introducción .................................................................. B. Método I de purga y atrapamiento con cromatografía de gases en columna de relleno ........................ C. Método II de purga y atrapamiento con cromatografía de gases en columna de relleno ........................ D. Método de purga y atrapamiento con cromatografía de gases en columna capilar ..................................... E. Método de purga y atrapamiento con cromatografía de gases/espectrometría de masas .......................... 1,2-DIBROMOETANO (DBE) Y 1,2-DIBROMO-3-CLOROPROPANO (DBCP) ...................................................................... A. Introducción .................................................................. B. Método de extracción líquido-líquido con cromatografía de gases ......................................................... C. Método de purga y atrapamiento con cromatografía de gases/espectrometría de masas ........................... D. Método de purga y atrapamiento con cromatografía de gases ............................................................................. TRIHALOMETANOS ..................................................................... A. Introducción .................................................................. B. Método de extracción líquido-líquido con cromatografía de gases .......................................................... C. Método de purga y atrapamiento con cromatografía de gases/espectrometría de masas ........................... D. Método de purga y atrapamiento con cromatografía de gases....................................................................... AGENTES BÁSICOS-NEUTROS Y ÁCIDOS EXTRAÍBLES .................. A. Introducción .................................................................. B. Método de extracción líquido-líquido con cromatografía de gases/espectrometría de masas ................. FENOLES .................................................................................. A. Introducción .................................................................. B. Método de extracción líquido-líquido con cromatografía de gases ......................................................... C. Método de extracción líquido-líquido con cromatografía de gases/espectrometría de masas .................

6-77 6-85 6-85 6-86 6-86 6-87 6-95 6-101 6-106 6-107 6-107 6-107 6-112 6-113 6-113 6-113 6-114 6-123 6-123 6-123 6-123 6-124 6-147 6-147 6-148 6-158

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PÁGINA 6431 BIFENILOS POLICLORADOS

............................................................

6-158

Introducción .................................................................. Método de extracción líquido-líquido con cromatografía de gases ........................................................ C. Método de extracción líquido-líquido con cromatografía de gases/espectrometría de masas ................. 6440 HIDROCARBUROS POLINUCLEARES AROMÁTICOS .................... A. Introducción .................................................................. B. Método de extracción líquido-líquido con cromatografía de gases ......................................................... C. Método de extracción líquido-líquido con cromatografía de gases/espectrometría de masas ................. 6630 PESTICIDAS ORGANOCLORADOS ................................................. A. Introducción .................................................................. B. Método I de extracción líquido-líquido con cromatografía de gases ......................................................... C. Método II de extracción líquido-líquido con cromatografía de gases ........................................................ D. Método de extracción líquido-líquido con cromatografía de gases/espectrometría de masas ................. 6640 HERBICIDAS CLORADOS FENOXI ÁCIDOS ................................... A. Introducción .................................................................. B. Método de extracción líquido-líquido con cromatografía de gases .........................................................

6-158

A. B.

Parte

7000 EXAMEN DE LA RADIACTIVIDAD DE AGUAS LIMPIAS Y RESIDUALES 7010 INTRODUCCIÓN ......................................................................... A. Discusión general............................................................ B. Toma y conservación de muestras ............................... C. Cámara de conteo ........................................................ D. Instrumentos de conteo ................................................. E. Reactivos e instrumental de laboratorio ..................... F. Expresión de resultados ................................................. G. Estadísticas .................................................................... 7020 GARANTÍA DE CALIDAD ............................................................ A. Programa básico de garantía de calidad ................. B. Garantía de calidad para muestras de aguas residuales .......................................................................... 7110 RADIACTIVIDADES BRUTAS ALFA Y BETA (TOTALES, EN SUSPENSIÓN Y EN DISOLUCIÓN ) ............................................... A. Introducción .......................................... ,...................... B. Método de conteo ........................................................

6-159 6-159 6-159 6-159 6-160 6-171 6-171 6-171 6-171 6-185 6-197 6-198 6-198 6-198

7-1 7-1 7-3 7-5 7-5 7-13 7-14 7-14 7-16 7-16 7-17 7-18 7-18 7-19

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7500-Cs CESIO RADIACTIVO .................................................................. A. Introducción ................................................................. B. Método de precipitación .............................................. 7500-I YODO RADIACTICO .................................................................. A. Introducción ................................................................. B. Método de precipitación .............................................. C. Método de intercambio iónico..................................... D. Método de destilación .................................................. 7500-Ra RADIO .................................................................................... A. Introducción .................................................................. B. Método de precipitación............................................... C. Método de emanación .................................................. D. Método secuencial de precipitación (PROPUESTA) . 7500-Sr ESTRONCIO RADIACTIVO TOTAL Y ESTRONCIO 90 ................. A. Introducción .................................................................. B. Método de precipitación............................................... 7500-3H TRITIO ..................................................................................... A. Introducción .................................................................. B. Método espectrométrico de centelleo líquido ............. 7500-U URANIO . .................................................................................. A. Introducción ................................................................. B. Método radioquímico (PROPUESTA) ....................... C. Método fluorométrico (PROPUESTA).......................

Parte 8000 MÉTODOS DE PRUEBA DE TOXICIDAD PARA ORGANISMOS ACUÁTICOS 8010 INTRODUCCIÓN ........................................................................ A. Discusión general........................................................... B. Terminología .................................................................. C. Requisitos básicos para las pruebas de toxicidad . . . D. Desarrollo de pruebas de toxicidad ............................ E. Preparación de los organismos para las pruebas de toxicidad ..................................................................... F. Sistemas, materiales y procedimientos en pruebas de toxicidad .................................................................... G. Cálculo, análisis y comunicación de resultados de pruebas de toxicidad ................................................ H. Interpretación y aplicación de resultados de pruebas de toxicidad ................................................................ 8030 MUTAGENICIDAD ..................................................................... A. Introducción .................................................................. B. Prueba de la Salmonella ..............................................

7-25 7-25 7-25 7-28 7-28 7-28 7-30 7-32 7-34 7.34 7-35 7-40 7-52 7-56 7-56 7-57 7-64 7-64 7-64 7-67 7-67 7-68 7-70

8-1 8-1 8-3 8-5 8-6 8-12 8-27 8-39 8-45 8-48 8-48 8-48

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8110 PROCEDIMIENTOS DE PRUEBA PARA ALGAS .............................. 8111 BLOESTIMULACIÓN (PRODUCTIVIDAD ALGAL) ........................... A. Principios generales ...................................................... B. Planificación y evaluación de ensayos en algas .......... C. Instrumental .................................................................. D. Manipulación de muestras .......................................... E. Medio de cultivo sintético para algas .......................... F. Inoculo............................................................................. G. Condiciones y procedimientos de prueba.................... H. Efectos de las adiciones ................................................. I. Análisis e interpretación de datos .............................. 8112 PRUEBAS DE TOXICIDAD EN FITOPLANCTON ........................... A. Introducción ................................................................... B. Inoculo............................................................................. C. Condiciones y procedimientos de prueba.................... 8310 PROCEDIMIENTOS DE PRUEBA DE TOXICIDAD EN PROTOZOOS CILIADOS ................................................................................ A. Introducción ................................................................... B. Selección y preparación de organismos de ensayo . . C. Procedimientos de prueba de toxicidad ..................... D. Evaluación y comunicación de resultados ................. 8410 PROCEDIMIENTOS DE PRUEBA DE TOXICIDAD CON CORAL ESCLERACTINIANO .................................................................. A. Introducción .................................................................. B. Selección y preparación de organismos de ensayo . . C. Procedimientos de prueba de toxicidad ..................... D. Evaluación y comunicación de resultados ................ 8510 PROCEDIMIENTOS DE PRUEBA DE TOXICIDAD PARA ANÉLIDOS A. Introducción .................................................................. B. Selección y preparación de organismos de ensayo .. C. Procedimientos de prueba de toxicidad ..................... D. Evaluación de datos ...................................................... 8610 PROCEDIMIENTOS DE PRUEBA DE TOXICIDAD CON MOLUSCOS A. Introducción .................................................................. B. Selección y preparación de organismos de prueba . . C. Desarrollo de las pruebas de toxicidad....................... D. Comunicación y análisis de resultados ....................... 8710 MICROCRUSTÁCEOS ................................................................... 8711 PROCEDIMIENTOS DE PRUEBA DE TOXICIDAD PARA DAPHNIA A. Introducción .................................................................. B. Selección y preparación de organismos de prueba . . C. Procedimientos de ensayo de toxicidad ................... D. Evaluación y comunicación de resultados ................

8-49 8-49 8-49 8-50 8-51 8-52 8-53 8-54 8-55 8-59 8-60 8-61 8-61 8-61 8-61 8-63 8-63 8-64 8-65 8-66 8-66 8-66 8-67 8-71 8-74 8-76 8-76 8-76 8-81 8-85 8-85 8-85 8-86 8-89 8-94 8-94 8-94 8-94 8-95 8-97 8-98

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8712 PROCEDIMIENTOS DE PRUEBA DE TOXICIDAD PARA EL COPÉPODO CALANOIDE ACARTIA TONSA (DANA) ............................. A. Introducción ................................................................. B. Selección y preparación de organismos de ensayo .. C. Procedimientos de prueba de toxicidad .................... D. Evaluación e información sobre resultados .............. 8720 PROCEDIMIENTOS DE ENSAYOS DE TOXICIDAD PARA MACROCRUSTÁCEOS ......................................................................... A. Introducción .................................................................. B. Selección y preparación de especies de prueba ......... C. Desarrollo de pruebas de toxicidad............................. D. Comunicación de resultados......................................... 8750 PROCEDIMIENTOS DE ENSAYOS DE TOXICIDAD PARA INSECTOS ACUÁTICOS .......................................................................... A. Introducción ................................................................. B. Selección y preparación de organismos de prueba .. C. Procedimientos de prueba de toxicidad ..................... D. Evaluación de datos...................................................... 8910 PROCEDIMIENTOS DE PRUEBA DE TOXICIDAD PARA PECES .. A. Introducción .................................................................. B. Selección y preparación de peces ................................. C. Procedimientos de prueba ............................................

Parte 9000 EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS 9010 INTRODUCCIÓN ........................................................................ A. Discusión general ........................................................... B, Disposiciones de la EPA de Estados Unidos sobre calidad del agua potable........................................... 9020 GARANTÍA DE CALIDAD ........................................................... A. Introducción .................................................................. B. Directrices para el control de calidad intralaboratorio C. Control de calidad interlaboratorios........................... 9030 INSTRUMENTAL DE LABORATORIO ............................................. A. Introducción .................................................................. B. Especificaciones del equipo .......................................... 9040 LAVADO Y ESTERILIZACIÓN ...................................................... 9050 PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO .................................... A. Procedimientos generales ............................................ B. Agua................................................................................ C. Especificaciones de los medios ..................................... 9060 MUESTRAS ................................................................................ A. Recogida ....................................................................... B. Conservación y almacenamiento .................................

8-99 8-99 8-99 8-105 8-105 8-106 8-106 8-106 8-120 8-132 8-132 8-132 8-133 8-136 8-139 8-140 8-140 8-140 8-155

9-1 9-1 9-3 9-5 9-5 9-5 9-27 9-29 9-29 9-29 9-34 9-34 9-34 9-36 9-37 9-38 9-38 9-42

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MÉTODOS DE DETECCIÓN RÁPIDA ..................................................

9-43

A. B.

9-43

Introducción .................................................................. Prueba de coliformes fecales en siete fases (ESPECIALIZADA) ................................................................... C. Técnicas especiales (ESPECIALIZADAS) ................ D. Detección de colífagos (PROPUESTA) ................... ORGANISMOS BN CONDICIONES ANÓMALAS ............................ A. Introducción .................................................................. B. Incremento de la recuperación ..................................... EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE AGUAS EN INSTALACIONES RECREATIVAS ............................................................................ A. Introducción .................................................................. B. Piscinas ......................................................................... C. Baños de hidromasaje .................................................. D. Playas .............................................................................. E. Técnica de filtro de membrana para Pseudomonas aeruginosa .................................................................. F. Técnica de tubos múltiples para Pseudomonas aeruginosa ........................................................................... RECUENTO HETERÓTROFO DE PLACA ...................................... A. Introducción .................................................................. B. Método de placa fluida................................................. C. Método de placa difusa ................................................ D. Método del filtro de membrana ................................... RECUENTO MICROBIANO TOTAL DIRECTO (PROPUESTA) . A. Introducción .................................................................. B. Método microscópico de epifluorescencia ...............

9221 TÉCNICA DE FERMENTACIÓN EN TUBO MÚLTIPLE PARA MIEMBROS DEL GRUPO DE LOS COLIFORMES ..........................

A. B. C. D. E. 9222

Introducción .................................................................. Técnicas estandarizadas de fermentación en tubo múltiple (NMP) de coliformes totales..................... Procedimiento de NMP para coliformes fecales . . . . Estimación de la densidad bacteriana ......................... Prueba de presencia-ausencia (P-A) de coliformes . .

9-43 9-44 9-47 9-49 9-49 9-51 9-53 9-53 9-54 9-58 9-59 9-61 9-63 9-64 9-64 9-69 9-72 9-75 9-76 9-76 9-76 9-78

9-78 9-80 9-87 9-89 9-93

TÉCNICA DEL FILTRO DE MEMBRANA PARA MIEMBROS DEL GRUPO DE LOS COLIFORMES.................................................................

9-95

Introducción .................................................................. Procedimiento estándar de filtro de membrana para coliformes totales ...................................................... Procedimiento de incubación retardada para coliformes totales ............................................................... Procedimiento de filtro de membrana para coliformes fecales ..........................................................................

9-95

A. B. C. D.

9-97 9-106 9-109

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E.

Procedimiento de incubación retardada para coliformes fecales .................................................................. F. Procedimiento de filtro de membrana para Klebsiella 9225 DIFERENCIACIÓN DE BACTERIAS COLIFORMES ............................ A. Introducción .................................................................. B. Purificación de cultivos ................................................. C. Diferenciación................................................................. D. Significación de los distintos tipos de coliformes . . . E. Medios, reactivos y procedimientos ............................. 9230 GRUPOS DE ESTREPTOCOCOS Y ENTEROCOCOS FECALES ............. A. Introducción .................................................................. B. Técnica de tubo múltiple ........................................... C. Técnicas de filtro de membrana................................... 9240 IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS DEL HIERRO Y DEL AZUFRE A. Introducción .................................................................. B. Bacterias del hierro ..................................................... C. Bacterias del azufre ..................................................... D. Enumeración, enriquecimiento y aislamiento de las bacterias del hierro y el azufre (PROPUESTA) . . 9250 DETECCIÓN DE ACTINOMICETOS ................................................ A. Introducción .................................................................. B. Recuento de placa de actinomicetos ........................... 9260 DETECCIÓN DE BACTERIAS PATÓGENAS .................................. A. Introducción .................................................................. B. Procedimientos generales cualitativos de aislamiento e identificación de Salmonella ................................ C. Procedimiento de identificación de Salmonella por inmunofluorescencia .................................................. D. Procedimientos cuantitativos para Salmonella............ E. Shigella ............................................................................ F. Escherichia coli patógenos ............................................ G. Campylobacter jejuni .................................................... H. Vibrio cholerae .............................................................. I. Leptospiras patógenas................................................... J. Legionellaceae ................................................................ K. Yersinia enterocolitica ................................................. 9510 DETECCIÓN DE VIRUS ENTÉRICOS ............................................. A. Introducción .................................................................. B. Concentración de virus a partir de pequeños volúmenes de muestra por adsorción y dilución de filtros de mlcroporo (PROPUESTA) ................................ C. Concentración de virus a partir de grandes volúmenes de muestra por adsorción y dilución de filtros de microporo (PROPUESTA) .................................

9-112 9-113 9-115 9-115 9-116 9-116 9-119 9-120 9-125 9-125 9-127 9-128 9-132 9-132 9-133 9-137 9-139 9-146 9-146 9-148 9-150 9-150 9-151 9-157 9-161 9-162 9-163 9-165 9-167 9-169 9-172 9-177 9-179 9-179

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D.

Concentración de virus por adsorción-precipitación de hidróxido de aluminio (PROPUESTA).............. E. Hidroextracción-diálisis con polietilenglicol (PROPUESTA) .................................................................. F. Recuperación de virus a partir de sólidos en suspensión en aguas limpias y residuales (PROPUESTA) G. Ensayo e identificación de virus en concentrados de muestra (PROPUESTA)............................................ 9610 DETECCIÓN DE HONGOS ......................................................... A. Introducción ................................................................... B. Técnica en placa fluida ................................................. C. Técnica en placa difusa .................................................. D. Técnica de filtro de membrana .................................. E. Técnica para levaduras ................................................. F. Hongos zoospóricos ....................................................... G. Hifomicetos acuáticos ................................................... H. Hongos patógenos para el hombre ............................. 9711 PROTOZOOS PATÓGENOS ............................................................ A. Introducción ................................................................... B. Giardia lamblia ............................................................... C. Entamoeba histolytica .................................................... 9810 EXAMEN NEMATOLÓGICO ........................................................... A. Introducción ................................................................... B. Técnica para nematodos................................................ C. Clave ilustrada para la identificación de nematodos de agua dulce .............................................................

Parte

10000 ANÁLISIS BIOLÓGICO DE LAS AGUAS 10010 INTRODUCCIÓN ......................................................................... 10200 PLANCTON ............................................................................... A. Introducción ................................................................... B. Toma de muestras ......................................................... C. Técnicas de concentración .......................................... D. Preparación ..................................................................... E. Microscopios y calibraciones ....................................... F. Técnicas de recuento para fitoplancton .................... G. Técnicas de recuento para zooplancton .................... H. Clorofila........................................................................... I. Determinación de biomasa (cultivo estacionario) ... J. Medidas de índice metabólico .................................... 10300 PERIFITON .......................................................................... ___ A. Introducción ................................................................... B. Toma de muestras .........................................................

9-196 9-200 9-202 9-204 9-212 9-212 9-217 9-219 9-221 9-222 9-223 9-225 9-226 9-227 9-227 9-228 9-235 9-236 9-236 9-239 9-241

10-1 10-3 10-3 10-4 10-17 10-19 10-22 10-25 10-31 10-34 10-43 10-47 10-53 10-53 10-54

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C. Análisis de muestras ...................................................... D. Productividad ................................................................. E. Interpretación y comunicación de los resultados .... 10400 MACROFITON .......................................................................... A. Introducción .................................................................. B. Estudio preliminar ......................................................... C. Métodos de trazado de mapas de distribución vegetal D. Estimaciones de población ........................................... E. Productividad ................................................................. 10500 MACROINVERTEBRADOS BÉNTICOS ............................................ A. Introducción .................................................................. B. Toma de muestras ........................................................ C. Procesado y análisis de muestras................................. D. Evaluación y presentación de datos .......................... 10600 PECES ........................................................................................ A. Introducción .................................................................. B. Adquisición de datos ..................................................... C. Conservación de la muestra ........................................ D. Análisis de muestras ............................................ , ........ E. Investigación sobre muerte de peces............................ 10900 IDENTIFICACIÓN DE ORGANISMOS ACUÁTICOS ........................... A. Procedimiento en la identificación............................... B. Clave para la identificación de los principales grupos de organismos acuáticos (láminas 1-38) ................. C. Lista de los tipos comunes de organismos acuáticos (láminas 1-38) del nivel trófico ................................. D. Clave para la identificación de las algas de agua dulce comunes en los suministros de agua o en las aguas contaminadas (láminas en color A-F) ..................... E. Cambios recientes en la nomenclatura de las algas.. F. índice de ilustraciones................................................... G. Referencias taxonómicas seleccionadas ....................... Índice analítico.......................................................................

10-57 10-61 10-74 10-76 10-76 10-77 10-79 10-83 10-89 10-106 10-106 10-108 10-122 10-125 10-127 10-127 10-128 10-142 10-145 10-150 10-153 10-153 10-154 10-159

10-200 10-207 10-208 10-211 1-1

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FIGURAS 1010:1 1020:1 1020:2 1020:3 1020:4 1020:5 1030:1 1030:2 1060:1 1070:1 2120:1 2120:2 2150:1 2150:2 2530:1 2530:2 2530:3 2530:4 2710:1 2710:2 2720:1 2810:1 3112:1 3114:1 3114:2 3500-Al:l

Distribuciones normal y desplazada ......................... Gráficos de control para recursos .............................. Análisis duplicados de un estándar ............................ Gráfico de amplitud para concentraciones variables . Gráfico de amplitud para amplitudes variables .......... Gráfico de control de recursos con datos fuera de control (mitad superior) ......................................... Definición de exactitud ............................................ Relación entre límites de detección .......................... Número aproximado de muestras necesarias para calcular una concentración media ............................ Columna de intercambio iónico..................................

1-2 1-11 1-12 1-12 1-12

Sistema de filtrado para determinaciones de color . . Diagramas de cromaticidad ..................................... Generador de agua inodora ..................................... Conjunto terminal del generador de agua inodora .. Dispositivo de toma de muestras de materias flotables Embudo de flotación de material flotable y soporte de filtro......................................................................... Embudos de flotación y unidad de mezclado............. Tubo de aceite flotable, capacidad 1 l........................ Diagrama esquemático de un vaso de sedimentación para pruebas de volumen de lodo sedimentado .. Diagrama esquemático de un vaso de sedimentación para prueba de tasa de sedimentación de zona .. . Aparato de toma de muestras de gases ...................... Tiempo de respuesta para la prueba de difusión de membrana ..............................................................

2-5 2-8 2-21 2-22 2-73

Esquema de disposición del equipo para medida de mercurio por la técnica de absorción atómica de vapor frío ................................................................ Célula manual de reacción para producir hidruros de As y Se .................................................................... Esquema de un generador continuo de hidruros . . . . Curvas de corrección para estimación de aluminio en presencia de fluoruro ..............................................

1-13 1-15 1-21 1-41 1-53

2-73 2-74 2-76 2-92 2-94 2-97 2-106

3-33 3-49 3-57 3-74

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PÁG. 3500-Al:2 3500-A1:3 3500-As: 1 3500-As:2 3500-Se:l 3500-Sr:l 4110:1 4110:2 4500-CO2:l 4500:CO2:2 4500:CO2:3 4500:CO2:4 4500-CN:l 4500-Cl– :1 4500-C1– :2 4500-ClO2:I 4500-F –:l 4500-F – :2 4500-H + :l 4500-H + :2 4500-NH3:l 4500- NO3− :l 4500- NO3− :2 4500- NO3− :3 4500-Norg:l 4500-0:1 4500-0:2

Distribuidor de aluminio para Sistema Automatizado I (analizador de inyección de flujo no segmentado) Distribuidor de aluminio para Sistema Automatizado II (analizador de flujo segmentado) ........................ Generador de arsina y ensamblaje del absorbedor .. .. Generador utilizado con el método del tinte de bromuro mercúrico ...................................................... Esquema general para especiación de selenio en agua Método gráfico para el cálculo de la concentración de estroncio ................................................................ Separación típica de aniones inorgánicos utilizando columna de operacional normal .......................... Separación de columna de operación de rápida . . . . Nomogramas para evaluación de la concentración de ion hidróxido ......................................................... Nomogramas para evaluación de la alcalinidad de bicarbonato .............................................................. Nomogramas para evaluación de la alcalinidad de carbonato .............................................................. Nomogramas para evaluación del contenido en dióxido de carbono ......................................................... Destilador de cianuro ................................................... Ejemplo de curva de titulación diferencial (el punto final está 25,5 ml)..................................................... Diagrama de flujo para análisis automatizado de cloruro ......................................................................... Sistema de generación y absorción de dióxido de cloro ........................................................................... Aparato de destilación directa para fluoruro.............. Distribuidor de fluoruro ............................................ Potencial del electrodo frente a pH.............................. Respuesta típica del electrodo de pH como función de la temperatura ...................................................... Distribuidor de amoníaco ........................................... Columna de reducción ................................................. Distribuidor de nitrato-nitrito ................................... Distribuidor de nitrato-nitrito ................................. Aparato de destilación micro-kjeldahl ......................... Montaje para toma de muestras de OD y ROB____ Efecto de la temperatura en la sensibilidad del lectrodo .......................................................................

3-78 3-79 3-83 3-85 3-148 3-173 4-5 4-5 4-17 4-18 4-19 4-20 4-32 4-82 4-84 4-87 4-98 4-105 4-109 4-109 4-143 4-154 4-156 4-160 4-167 4-171 4-181

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PÁG. 4500-0:3 4500-0:4

Efecto de salinidad a diferentes temperaturas .......... Tendencia característica del efecto de agitación sobre la respuesta del electrodo ....................................... 4500-P:l Pasos del análisis de las fracciones de fosfato ........... 4500-P:2 Distribuidor de fosfato para cada sistema de análisis automatizado ......................................................... 4500-Si:l Distribuidor de sílice .................................................. 4500-S2¯:l Marcha analítica para determinaciones de sulfuro .. 4500-S2¯:2 Proporción de H2S y HS¯ en sulfuro disuelto ......... 4500- SO32 ¯:1 Aparato para desprendimiento de SO 2 a partir de muestras para análisis colorimétrico...................... 4500- SO 24 ¯:l Distribuidor de sulfato .............................................. 5230:1 5540:1

Sistema de análisis del HOD .................................... Aparato de cancelación ..............................................

6040:1

Esquema del instrumental de depuración de ciclo cerrado............................................................................... Botella alta de depuración de un litro .................... Calentador de gas ....................................................... Extracción de filtro .................................................... Tasa de flujo a través de un filtro de carbono activado de 1,5 mg................................................................. Efecto de la resistencia del filtro, medida como flujo, en la recuperación de sustancias de olor terrosomohoso y estándares internos de C1-C10 ............. Espectros de masas de 2-metilisoborneol bajo diferentes condiciones instrumentales ............................... Espectro de masas de geosmina ................................. Dispositivo de purga ................................................. Relleno y construcción de los dispositivos de atrapamiento para incluir capacidad de deabsorción ... Sistema de purga y atrapamiento (modo purga) . . . . . Sistema de purga y atrapamiento (modo deabsorción) Cromatograma de gases de compuestos orgánicos volátiles ...................................................................... Relleno y construcción de los dispositivos de atrapamiento para incluir capacidad de deabsorción ... Cromatograma de gases de compuestos orgánicos volátiles (columna capilar de diámetro ancho) ...... Cromatograma de gases de compuestos orgánicos volátiles (columna capilar de diámetro mega) .......... Cromatograma de mezcla de prueba (columna capilar de diámetro estrecho) ...........................................

6040:2 6040:3 6040:4 6040:5 6040:6 6040:7 6040:8 6210:1 6210:2 6210:3 6210:4 6210:5 6210:6 6210:7 6210:8 6210:9

4-181 4-182 4-189 4-203 4-214 4-217 4-224 4-227 4-236 5-35 5-66 6-14 6-14 6-15 6-16 6-16 6-17 6-24 6-25 6-32 6-33 6-34 6-34 6-38 6-49 6-58 6-60 6-61

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PÁG. 6211:1 6220:1 6220:2 6220:3 6220:4 6220:5 6220:6 6220:7 6230:1 6230:2 6230:3

6231:1 6232:1 6232:2 6232:3 6410:1 6410:2 6410:3 6410:4 6410:5 6410:6 6410:7 6410:8 6410:9 6410:10 6410:11 6410:12 6410:13 6420:1 6420:2 6440:1 6440:2

Circuito indicador de gas combustible y diagrama de flujo ........................................................................ 6-67 Relleno y construcción de los dispositivos de atrapamiento para incluir capacidad de deabsorción ... 6-72 Sistema de purga y atrapamiento (modo purga) . . . . . 6-73 Sistema de purga y atrapamiento (modo secado) .... 6-74 Sistema de purga y atrapamiento (modo de absorción) ........................................................................ 6-74 Cromatograma de gases de sustancias aromáticas depuradas .................................................................. 6-75 Cromatograma de mezcla de prueba .......................... 6-78 Cromatograma de mezcla de prueba .......................... 6-80 Cromatograma de gases de halocarburos depurables 6-90 Cromatograma de gases de halocarburos depurables 6-96 Cromatograma dual de sustancias orgánicas volátiles (columna capilar) con detectores de fotoionización (arriba) y conductividad electrolítica (abajo) ......... 6-104 Extracto de agua para reactivos con adición de 0,114 µg/1 de DBE y DBCP ............................................. 6-110 Cromatograma de extracto de agua terminal.............. 6-117 Cromatograma de extracto de estándar ................... 6-118 Cromatograma de extracto de estándar .................... 6-118 Cromatograma de gases de una fracción básico/neutra ............................................................................ 6-135 Cromatograma de gases de una fracción acida .......... 6-136 Cromatograma de gases de fracción de pesticida . . . 6-136 Cromatograma de gases del clordán........................... 6-137 Cromatograma de gases del toxafeno ........................ 6-137 Cromatograma de gases del BPC-1016....................... 6-138 Cromatograma de gases del BPC-1221....................... 6-138 Cromatograma de gases del BPC-1232...................... 6-139 Cromatograma de gases del BPC-1242....................... 6-139 Cromatograma de gases del BPC-1248....................... 6-140 Cromatograma de gases del BPC-1254....................... 6-141 Cromatograma de gases del BPC-1260....................... 6-142 Cálculo del factor de decantación ............................. 6-143 Cromatograma de gases de los fenoles ....................... 6-153 Cromatograma de gases de derivados PFB de fenoles 6-154 Cromatograma líquido de hidrocarburos polinucleares aromáticos ......................................................... 6-166 Cromatograma líquido de hidrocarburos polinucleares aromáticos .......................................................... 6-167

CONTENIDO

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PÁG. 6440:3 6630:1 6630:2 6630:3 6630:4 6630:5 6630:6 6630:7 6630:8 6630:9 6630:10 6630:11 6630:12 6630:13 6630:14 6630:15 6640:1 6640:2 7010:1 7500-1:1 7500-Ra:l 7500-Sr:l 8010:1 8010:2 8010:3 8010:4 8010:5 8010:6

Cromatograma de gases de hidrocarbutos polinucleares aromáticos ......................................................... Resultados del procedimiento de cromatografía de gases para pesticidas organoclorados .................... Resultados del procedimiento de cromatografía de gases para pesticidas organoclorados ................... Cromatograma de mezcla de pesticidas ................... Cromatograma de mezcla de pesticidas ................... Cromatograma de mezcla de pesticidas .................. Cromatograma de gases de pesticidas........................ Cromatograma de gases del clordán.......................... Cromatograma de gases del toxafeno ....................... Cromatograma de gases del BPC-1016...................... Cromatograma de gases del BPC-1221...................... Cromatograma de gases del BPC-1232...................... Cromatograma de gases del BPC-1242...................... Cromatograma de gases del BPC-1248...................... Cromatograma de gases del BPC-1254 ..................... Cromatograma de gases del BPC-1260...................... Resultados del procedimiento de cromatografía de gases para herbicidas clorados fenoxi ácidos Cromatogramas de mezcla de herbicidas ................. Forma de las curvas de tasa de conteo, voltaje del ánodo....................................................................... Aparato de destilación para análisis de yodo (no a escala) ...................................................................... Montaje para eliminar emanaciones ........................... Actividad del itrio 90 frente al estroncio 90 en función del tiempo ............................................................... Tanque de mantenimiento para peces y macroinvertebrados .................................................................... Equipo para cultivo de algas .................................... Método de iluminación, bastidor, ubicación de la fuente de medio, bombas de aire y otros aparatos para dispositivos de cultivo algal masivo............... Componentes básicos de un sistema de flujo transversal ............................................................................ Ejemplos de determinación de concentración letal media en dos momentos representativos mediante análisis de probit y línea de ajuste optimizado ... Curva de toxicidad obtenida a partir de las CL50 determinadas en la figura 8010:5 ............................

6-168 6-175 6-176 6-177 6-178 6-179 6-191 6-191 6-192 6-192 6-193 6-193 6-194 6-194 6-195 6-195 6-202 6-202 7-8 7-33 7-41 7-61 8-16 8-22 8-23 8-29 8-40 8-42

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8610:1 8712:1 8712:2 8712:3 8712:4 8720:1 8720:2 8720:3 9020:1 9215:1 9215:2 9215:3

9221:1 9221:2 9221:3 9240:1 9240:2 9240:3 9240:4

9240:5 9240:6 9240:7

Diagrama del aparato de flujo constante ................. Sistema de cultivo algal ............................................. Aparato para cultivo masivo de copépodos (estático) Aparato para cultivo masivo de copépodos (fluyente) Jaula de generación (según Heinle) ......................... Vaso de cría y exposición y sifón automático para larvas del cangrejo común del Pacífico ............... Tanque para incubado de huevos para langostas . . . Tanque de Hughes para cría de langosta.................. Curva de frecuencia (con distribución desviada positiva) ....................................................................................... Preparación de las diluciones.................................... Pérdida de peso por secado de placas de agar de 15 ml almacenadas individualmente, invertidas y con las cubiertas colocadas ....................................... Pérdida de peso de placas de agar de 25 ml (100 x 15 mm) secadas por separado en una campana de flujo laminar a temperatura ambiente (24 a 36 °C), humedad relativa (30 a 33 por 100) y velocidad del aire 0,6 m/s ............................................................ Esquema de la fase confirmada .............................. Esquema de la prueba completa para la detección de coliformes totales .................................................. Esquema de las confirmaciones opcionales de P-A para distintos organismos indicadores ............... Filamentos de Crenothrix polyspora que muestran variaciones en el tamaño y forma de las células dentro de la vaina ..................................................... Filamentos de Sphaerotilus natans, que muestran células contenidas en los filamentos y algunas células «pululantes» ......................................................... Cultivo de laboratorio de Gallionella ferruginea, que muestra células, tallos y ramificaciones de los tallos en la zona de división de las células..................... Mezcla de fragmentos de tallos de Gallionella ferruginosa y precipitado de hierro-manganeso inorgánico que se encuentra en las muestras naturales tomadas de pozos .......................................................... Célula única de la bacteria del hierro Siderocapsa treubii...................................................................... Bacterias del azufre purpúreas fotosintéticas ......... Bacterias de azufre filamentosas incoloras .............

8-91 8-101 8-101 8-102 8-103 8-110 8-111 8-113 9-25 9-70 9-73

9-74 9-83 9-84 9-94 9-134 9-135 9-135

9-136 9-136 9-137 9-138

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PÁG. 9240:8 9240:9 9250:1 9510:1 9510:2 9711:1 9711:2 9711:3 9810:1 10200:1 10200:2 10200:3 10200:4 10200:5 10200:6 10200:7 10200:8 10200:9 10200:10 10200:11 10300:1 10300:2 10300:3 10300:4 10300:5 10400:1 10500:1

Bacterias de azufre filamentosas incoloras ............. Bacterias del azufre incoloras no filamentosas ........ Colonias bacterianas ............................................... Método de adsorción-dilución en dos estadios con filtro microporoso para concentrar virus a partir de un gran volumen de agua ................................ Esquema del aparato utilizado en la concentración inicial ...................................................................... Diagrama de flujo del método para Giardia ........ Esquema del dispositivo para toma de muestras de Giardia .................................................................... Dispositivo para toma de muestras de Giardia ...... Ciclo vital de los nematodos..................................... Características estructurales de los dispositivos de toma de muestras de agua comunes ........................ Trampa para plancton de Schindler-Patalas ......... Ejemplos de redes para toma de muestras de placton utilizadas comúnmente ......................................... Ejemplos de dispositivos de toma de muestras de zooplancton de gran velocidad, usados comúnmente . Embudo de filtro para concentrar zooplancton....... Ajuste de micrómetro ocular..................................... Calibración de la cuadrícula de Whipple ............... Célula de recuento (Sedgwick-Rafter) ................... Dispositivo para concentrar el plancton .................. Dispositivo de corte para plancton de Folsom ....... Cromatograma HPLC de fase inversa para una dilución quíntuple de la muestra EPA .................... Dispositivo de toma de muestras de perifiton ........ Procesos en el metabolismo de oxígeno de una sección de un flujo de agua hipotético durante el transcurso de un día sin nubes .......................... Producción perifitica primaria bruta (PG) determinada con la cámara de O'Connell-Thomas ............ Cálculo de la producción primaria bruta en una estación única .............................................................. Cálculo de la productividad perifitica primaria bruta a partir de las curvas diurnas de flujo ascendentedescendente ............................................................. Curva de Allen para una cohorte de una población de macrofitos acuáticos............................................... Pala de Ponar .............................................................

9-138 9-139 9-149 9-191 9-192 9-230 9-231 9-231 9-237 10-7 10-10 10-13 10-14 10-19 10-23 10-24 10-27 10-32 10-33 10-41 10-55 10-65 10-69 10-70 10-70 10-94 10-111

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PÁG. 10500:2 10500:3 10500:4 10500:5 10500:6 10500:7 10500:8 10500:9 10500:10 10500:11 10500:12 10500:13 10500:14 10500:15 10600:1 10600:2 10600:3 10600:4 10600:5 10600:6 10600:7

Pala en gajos de naranja ............................................. Pala de Petersen .......................................................... Pala de Van Veen ........................................................ Pala de Smith-Mclntyre ............................................ Pala de Shipek ........................................................... Pala de Ekman............................................................. Dispositivo de toma de muestras Surber o de piecuadrado ................................................................. Sonda de Phleger ......................................................... Dispositivo de toma de muestras de sondeo de KB . Dispositivo de toma de muestras de Wilding o de tubo de absorción ................................................. Dispositivo de toma de muestras de red de arrastre . Unidad Hester-Dendy de sustrato artificial .............. Dispositivo de toma de muestras de cesta ................. Tomamuestras con banda dentada (visto desde atrás) y banda de cilindro de poliuretano (vista lateral) . Diagrama de una red deslizante sumergida ............... Red barredera utilizada en un arroyo pequeño......... Diagrama de un barco para pesca mediante sistemas electrónicos bien equipado ..................................... Tipos de etiquetas de uso común .............................. Sistema de etiquetado de Transponedor Integrado Pasivo (TIP) ............................................................. Órganos clave y partes corporales externas de peces lisos y espinosos...................................................... Escama de un pez ........................................................

10-111 10-112 10-112 10-113 10-113 10-114 10-115 10-111 10-116 10-117 10-117 10-119 10-119 10-120 10-132 10-135 10-136 10-139 10-140 10-144 10-147 PÁG.

TABLAS 1010:1 1020:1 1020:11 1020:111 1030:1 1030:11

Valores críticos para pruebas de discordancia de 5 por 100 y 1 por 100 para un valor extremo simple en una muestra normal .......................................... Límites de aceptación para muestras duplicadas y adiciones conocidas sobre aguas limpias y residuales ............................................................................ Factores para el cálculo de líneas en gráficos de control de amplitud ..................................................... Verificación de un procedimiento de análisis de suelo Cálculos de precisión mediante el uso de duplicados Cálculos de precisión para adiciones conocidas ........

1-4 1-9 1-11 1-14 1-17 1-18

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CONTENIDO

PÁG. 1050:1 1060:1 1080:1 1080:11 1090:1 1090:11 2120:1 2120:11 2150:1 2150:11 2160:1 2160:11 2320:1 2330:1 2330:11 2330:111 2340:1 2510:1 2530:1 2710:1 2810:1 2810:11 3030:1 3111:1 3111:11

Factores de conversión ............................................ Resumen de requerimientos especiales para toma de muestras o manipulación ................................... Especificaciones del agua para reactivos................... Procesos de purificación del agua ........................... Valores umbral límite (VUL)*10 para los disolventes especificados en Standard Methods ..................... Valores umbral límite (VUL)* 10 para los reactivos especificados en Standard Methods .....................

1-30 1-42 1-64 1-64 1-75 1-76

Ordinales seleccionados para determinaciones espectrofotométricas de color* ................................... 2-7 Matices de color para márgenes de longitud de onda dominante ............................................................... 2-7 Números de umbral de olor correspondientes a varias diluciones................................................................ 2-23 Diluciones para varias intensidades de olor............ 2-24 Números de umbral de sabor correspondientes a varias diluciones .............................................................. 2-27 Diluciones para determinación del ÑUS ............... 2-28 Relaciones de alcalinidad ........................................... 2-42 Estimación de constantes de equilibrio y coeficientes de actividad ............................................................ 2-47 Valores precalculados para pK y A a. temperaturas seleccionadas ........................................................... 2-48 Colección de programas gráficos y de ordenador que pueden utilizarse para calcular los índices de saturación* del CaCO3 ................................................. 2-54 Concentraciones máximas de interferencia permitidas con diversos inhibidores ........................................ 2-58 Conductividad de las soluciones de cloruro de potasio a 25 °C* ................................................................... 2-65 Coeficiente de variación y recuperación para prueba de partículas flotables ............................................ 2-75 Factor de corrección de la temperatura ................. 2-96 Coeficiente Bunsen para oxígeno en agua dulce . . . . 2-108 Presión de vapor del agua dulce ............................. 2-110 Ácidos utilizados junto con HNO 3 para preparación de la muestra ....................................................... 3-7 Margenes de concentración de absorción atómica con absorción atómica de aspiración directa .......... 3-17 Datos de precisión y sesgo interlaboratorios para mé-

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CONTENIDO

PÁG.

3111:111 3112:1 3113:1 3113:11 3113:111 3113:1V 3113:V 3120:1 3120:11 3500-A1:I 3500-A1:II 3500-Fe:I 3500-V:I 4110:1 4500-ClO2:I 4500-F ¯ :I 4500-N + :I 4500-H + :II 4500-NH3:I

todos de absorción atómica. Aspiración directa y metales extraídos ................................................. 3-19 Precisión de un solo operador y niveles de control recomendados para métodos de absorción atómica. Aspiración directa y metales extraídos ........ 3-20 Precisión y sesgo interlaboratorios del método de espectrometría de absorción atómica de vapor frío para el mercurio................................................... 3-34 Modificadores de matrices potenciales para espectrometría de absorción atómica electrotérmica ...... 3-36 Niveles de detección y márgenes de concentración para espectrometría de absorción atómica de atomización electrotérmica........................................ 3-38 Datos de precisión interlaboratorios de un único analista para métodos de atomización electrotérmica 3-44 Datos de precisión global interlaboratorios para métodos de atomización electrotérmica..................... 3-45 Datos de errores relativos interlaboratorios para métodos de atomización electrotérmica..................... 3-46 Longitudes de onda sugeridas, límites de detección estimados, longitudes de onda alternativas, concentraciones de calibración y límites superiores ........ 3-61 Datos de precisión y sesgo de PAI ...................... 3-68 Precisión y sesgo de un solo operador para análisis de aluminio monómero inorgánico.......................... 3-80 Precisión y sesgo de un solo operador en la determinación de alto nivel de aluminio............................ 3-81 Selección de longitud del recorrido de luz para diversas concentraciones de hierro................................. 3-117 Concentración en la que interfieren diversos iones en la determinación de vanadio ............................ 3-178 Precisión y sesgo observados para aniones a distintos niveles de concentración en el agua para reactivos 4-7 Pesos equivalentes para calcular las concentraciones sobre la base de la masa ..................................... 4-94 Concentración de algunas sustancias que producen un error de 0,1 mg/l en 1,0 mg/ f/1 en los métodos de fluoruro ......................................................... 4-96 Preparación de soluciones patrón de pH3 .............. 4-111 Valores patrón del pH3 ........................................................................ 4-112 Datos de precisión y sesgo para los métodos de amoníaco ........................................................................ 4-127

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CONTENIDO

PÁG. 4500-NH3:II Precisión y sesgo del electrodo selectivo de amoníaco 4500-NH3:III Preparación de estándares de color permanente para determinación visual de nitrógeno amoniacal . . . . 4500-NH3:IV Valores de Q frente a AE (pendiente de 59 mv) para cambio de volumen del 10 por 100 ....................... 4500-Norg:I Datos de precisión y sesgo para nitrógeno orgánico, método Macrokjeldahl .......................................... 4500-0:1 Solubilidad de oxígeno en agua expuesta a aire saturado de agua a presión atmosférica (101,3 kPa) .. 4500-P:I Datos de precisión y sesgo para los métodos manuales de fósforo........................................................... 4500-P:II Comparación de precisión y sesgo de los métodos del ácido ascórbico ....................................................... 4500-Si:I Selección de la longitud del recorrido de luz para varias concentraciones de sílice ............................ 4500-Si:II Preparación de estándares de color permanente para determinación visual de sílice................................. 4500-S 2¯ :I Valores de pK' logaritmo de la constante de ionización práctica para sulfuro de hidrógeno ............... 5220:1 5310:1 5320:1 5540:1 5710:1 5710:11 5710:111

6010:1 6010:11 6040:1 6040:11

Cantidades de muestra y reactivos para varios vasos de digestión............................................................. Precisión y sesgo para el carbono orgánico total (COT) por oxidación persulfato-ultravioleta ...... Datos de precisión y sesgo, interlaboratorios, un solo operador halógeno orgánico disuelto (procedimiento de microcolumna) ............................................. Recuperación del surfactante por cancelación ......... Precisión y sesgo de un solo operador para determinar el PFT ........................................................... Datos de precisión y sesgo de un solo operador para determinar el PBFT ............................................... Precisión de un solo operador sobre muestras de río diluidas y filtradas, analizadas para determinar el PBFT.......................................................................

4-129 4-135 4-141 4-166 4-174 4-190 4-201 4-209 4-211 4-223 5-18 5-28 5-42 5-68 5-91 5-92 5-93

Métodos de análisis para compuestos orgánicos específicos ...................................................................... 6-1 Conservación recomendada para sustancias volátiles 6-5 Límites de detección instrumental para compuestos de olor terroso-mohoso mediante ADCC-CG/EM 6-13 Límites de detección instrumental para compuestos orgánicos seleccionados mediante ADCC-CG/EM 6-13

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CONTENIDO

PÁG. 6040:111

Condiciones típicas del funcionamiento para análisis CG/EM de extractos ADCC ................................ 6040:IV Datos CG/EM para tres estándares internos y dos compuestos de olor terroso-mohoso....................... 6040:V Sesgo de un único laboratorio para compuestos orgánicos saporíferos y odoríferos seleccionados ........ 6040:VI Datos de precisión para compuestos orgánicos saporíferos y odoríferos seleccionados ........................ 6040:VII Datos de precisión y recuperación para sustancias contaminantes seleccionadas ................................... 6210:1 Condiciones cromatográficas y límites de detección del método (LDM) .................................................. 6210:11 Criterios de abundancia m/z de clave BFB ............. 6210:111 Estándares internos y sustitutivos sugeridos .......... 6210:1 V Criterios de calibración y de admisión al CC ........ 6210:V Masas características para sustancias orgánicas depurables ....................................................................... 6210:VI Sesgo y precisión del método como funciones de la concentración .......................................................... 6210:VII Condiciones cromatográficas para compuestos orgánicos volátiles en columnas de relleno ................. 6210:VIII Masas características (m/z) para compuestos orgánicos depurables.......................................................... 6210:IX Datos de sesgo y precisión de un único laboratorio para compuestos orgánicos volátiles en agua para reactivos (columna de relleno) ............................... 6210:X Condiciones cromatográficas para compuestos orgánicos volátiles en columnas capilares de diámetro ancho ....................................................................... 6210:XI Condiciones cromatográficas para compuestos orgánicos volátiles en columnas capilares de diámetro estrecho .................................................................... 6210:XII Datos de sesgo y precisión de un único laboratorio para compuestos orgánicos volátiles en agua para reactivos (columna capilar de diámetro ancho) … 6210:XIII Datos de sesgo y precisión de un único laboratorio para compuestos orgánicos volátiles en agua para reactivos (columna capilar de diámetro estrecho).... 6220:1 Condiciones cromatográficas y límites de detección del método ............................................................ 6220:11 Criterios de calibración y de admisión al CC ........ 6220:111 Sesgo y precisión del método como funciones de la concentración .........................................................

6-22 6-24 6-26 6-27 6-28 6-31 6-33 6-37 6-40 6-42 6-45 6-51 6-53 6-55 6-57 6-59 6-62 6-64 6-72 6-76 6-76

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CONTENIDO

PÁG. 6220:1 V 6220:V 6220: VI 6220:VII 6230:1 6230:11 6230:111 6230:IV 6230:V 6230:VI 6230:VII 6230:VIII

Tiempos de retención para compuestos aromáticos . Sesgo y precisión de un único laboratorio para sustancias aromáticas no saturadas en aguas potables cloradas y aguas de fuente natural cloradas ....... Precisión de un único analista, precisión global y sesgo para sustancias aromáticas depurables en agua potable………………………………………… Datos de sesgo y precisión para sustancias aromáticas depurables a partir de estudios de evaluación del rendimiento de laboratorios múltiples Condiciones cromatográficas y límites de detección del método (LDM) ................................................. Criterios de calibración y de admisión al CC ......... Sesgo y precisión del método como funciones de la concentración ........................................................ Tiempos de retención para organohaluros................ Sesgo y precisión de un único laboratorio para organohaluros en agua del río Ohio y en agua potable Sesgo y precisión de un único laboratorio para organohaluros en agua del río Ohio y en agua potable Tiempos de retención para compuestos orgánicos volátiles en un detector de fotoionización (DFI) y un detector de conductividad electrolítica (DCE) . . . . Sesgo y precisión de un único laboratorio para compuestos orgánicos volátiles en agua para reactivos

Condiciones cromatográficas para 1,2-Dibromoetano (DBE) y l,2-Dibromo-3-Cloropropano (DBCP) .. 6231:11 Sesgo y precisión de un único laboratorio para DBE y DBCP en agua del grifo ................................... 6232:1 Tiempos de retención para trihalometanos............... 6232:11 Precisión y sesgo de un único laboratorio ............... 6410:1 Condiciones cromatográficas, límites de detección del método y masas características para extractos básico/neutros ………………………………………... 6410:11 Condiciones cromatográficas, límites de detección del método y masas características para extractos ácidos .......................................................................... 6410:111 . Criterios de masas de clave de DFTFF y de abundancia ........................................................................... 6410:IV Estándares internos y sustitutivos sugeridos .......... 6410:V Criterios de admisión al CC ...................................... 6410:VI Sesgo y precisión del método como funciones de la concentración .........................................................

6-81 6-83 6-84 6-85 6-88 6-91 6-93 6-97 6-100 6-101 6-102 6-105

6231:1

6-111 6-112 6-118 6-122 6-126 6-129 6-131 6-132 6-144 6-146

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CONTENIDO

PÁG. 6420:1 6420:11 6420:111 6420:IV 6440:1 6440:11 6440:111 6440:IV 6630:1 6630:11 6630:111 6630:IV 6630:V 6630:VI 6640:1 6640:11 6640:111

Condiciones cromatográficas y límites de detección del método ............................................................ 6-149 Fraccionamiento de gel de sílice y cromatografía de gases con captación de electrones de derivados PFBB ....................................................................... 6-150 Criterios de admisión al CC ....................................... 6-156 Sesgo y precisión del método como funciones de la concentración ......................................................... 6-157 Condiciones cromatográficas líquidas de alto rendimiento y límites de detección del método ........... 6-161 Condiciones cromatográficas de gas y tiempos de retención ..................................................................... 6-163 Criterios de admisión al CC ....................................... 6-169 Sesgo y precisión del método como funciones de la concentración ......................................................... 6-170 Tasas de retención de varios pesticidas organoclorados en relación con el aldrín ................................ 6-182 Datos de precisión y sesgo para pesticidas organoclorados seleccionados ............................................... 6-183 Condiciones cromatográficas y límites de detección del método ............................................................ 6-186 Distribución de pesticidas clorados y BPC en fracciones de columna de gel de sílice-magnesio.............. 6-190 Criterios de admisión al CC ....................................... 6-196 Sesgo y precisión del método como funciones de la concentración ......................................................... 6-197 Tiempos de retención para esteres de metilo de algunos herbicidas clorados fenoxi ácidos relativos al ester de metilo 2,4-D ............................................... 6-203 Precisión de herbicidas fenoxi ácidos a partir de agua de superficie dosificada ........................................... 6-203 Recuperación de herbicidas fenoxi ácidos a partir de agua de superficie dosificada ................................ 6-204

7010:1

Distribución usual de radioelementos comunes entre las fases líquida y sólida de las aguas residuales .. 7500-Ra:I Composición química y radioquímica de muestras usadas para determinar el sesgo y la precisión del método de radio 226 .............................................. 7500-Ra:II Factores de desintegración de radón 222, crecimiento de radón 222 a partir de radio 226 y corrección de la actividad de radón 222 para recuento durante el deterioro ................................................................

7-4 7-39

7-45

CONTENIDO

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PÁG.

8010:1 8010:11 8010:111 8010:IV.A 8010:IV.B 8010:V 8010:VI 8010:VII 8712:1 8910:1 8910:11 9020:1 9020:11 9020:111 9020:IV 9020:V 9020:VI 9020:VII 9020:VIII 9020:IX 9020:X 9211:1 9215:1 9221:1

Composición recomendada para agua dulce reconstituida ........................................................................ Cantidades de agentes químicos de calidad para reactivos que se añaden al agua dulce reconstituida, blanda y aireada para taponar el pH ........................ Procedimiento para la preparación de agua de mar reconstituida ........................................................... Solución madre de macronutrientes ............................ Solución madre de micronutrientes ............................. Nutrientes para medio de cultivo algal en agua de mar........................................................................... Porcentaje de amoníaco desionizado en agua destilada ............................................................................ Datos experimentales extraídos de una prueba de toxicidad hipotética sometida a un análisis probit …. Composición de la dieta algal y concentraciones recomendadas para alimentación de adultos, naupliar y para puesta de huevos………………………… Tratamientos profilácticos y terapéuticos recomendados para peces de agua dulce utilizados con propósitos experimentales..………………….………….. Fotoperíodo de Evansville, Indiana ............................. Calidad del agua purificada utilizada en pruebas microbiológicas ........................................................... Adición de reactivos para pruebas de calidad del agua Tiempo y temperatura para esterilización en autoclave .......................................................................... Tiempo de mantenimiento para medios preparados . Cultivos de control para pruebas microbiológicas .. Cálculo del criterio de precisión .................................. Comprobaciones diarias de la precisión de los recuentos duplicados.......................................................... Recuentos de coliformes y logaritmos correspondientes ........................................................................... Comparación de las frecuencias de los datos de NMP Comparación de las frecuencias de los datos de log NMP ...................................................................... Técnicas rápidas especiales ........................................ Efecto de la temperatura de secado en la pérdida de peso de placas de agar de 15 ml almacenadas individualmente ............................................................... Preparación del medio líquido de lauril triptosa ....

8-18 8-18 8-19 8-20 8-20 8-21 8-34 8-41 8-103 8-145 8-146 9-12 9-13 9-19 9-20 9-21 9-22 9-23 9-26 9-26 9-26 9-45 9-73 9-81

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CONTENIDO

PÁG. 9221:11 9221:111

9221:IV

9221:V

9222:1 9222:11 9222:111 9225:1 9225:11 9230:1 9250:1 10200:1 10200:11 10300:1 10300:11

10400:1

Preparación del medio líquido de lactosa.................... Índice de NMP y límites de aceptación del 95 por 100 para distintas combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se emplean cinco porciones de 10 ml..................................................................... Índice de NMP y límites de aceptación del 95 por 100 para distintas combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se emplean diez porciones de 10 ml ................................................................... Índice de NMP y límites de aceptación del 95 por 100 para distintas combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se usan cinco tubos por dilución (10 ml, 1,0 ml, 0,1 ml)............................... Volúmenes de muestra recomendados para la prueba de coliformes totales en filtro de membrana ........ Límites de aceptación del 95 por 100 para los resultados del recuento de coliformes en filtro de membrana utilizando una muestra de 100 ml ...................... Volúmenes de muestra recomendados para la prueba de filtro de membrana en coliformes fecales ........ Nomenclatura de las enterobacteriáceas..................... Diferenciación de los microorganismos indicadores potenciales de las enterobacteriáceas ...................... Algunas características bioquímicas clave de las especies de estreptococos pertenecientes a los grupos de estreptococos fecales y enterococos........................... Propiedades macroscópicas generales de las colonias bacterianas en medio sólido.................................... Características de las redes para toma de muestras de plancton utilizadas comúnmente ........................... Tabla de conversión para la técnica de filtro de membrana (basada en 30 campos puntuados) .................. Libro de cálculo de muestras para cómputo de la tasa corregida del cambio de oxígeno a partir de la curva diurna de una única estación ...................... Libro de cálculo de muestras para cómputo de la tasa corregida del cambio de oxígeno a partir de las curvas diurnas de flujo ascendente-descendente de la concentración de oxígeno y temperatura ........... Métodos usados para determinar la producción macrofitica ..................................................................

9-82

9-90

9-90

9-91 9-102 9-105 9-110 9-117 9-118 9-132 9-149 10-11 10-30 10-71

10-72 10-91

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LÁMINAS Láminas en blanco y negro de organismos acuáticos 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31.

Algas azules-verdes: Cocoides (Filum Cyanophyta) ................... 10-162 Algas azules-verdes: Filamentosas (Filum Cyanophyta).............. 10-163 Algas verdes no móviles: Cocoides (Filum Chlorophyta)............ 10-164 Algas verdes no móviles. Filamentosas (Filum Chlorophyta) .. 10-165 Diatomeas. Pennadas (Filum Chrysophyta, clase Bacillariophyceae)................................................................................... 10-166 Diatomeas. Céntricas (Filum Chrysophyta, clase Bacillariophyceae)................................................................................... 10-167 Tipos de algas marinas más grandes (verdes, marrones y rojas) 10-168 Plantas superiores: Plantas flotantes ......................................... 10-169 Plantas superiores: Sumergidas (todas las formas ilustradas son espermatofitas) ........................................................................ 10-170 Plantas superiores: Emergidas (todas las formas ilustradas son espermatofitas)......................................................................... 10-171 Flagelados pigmentados unicelulares (varios filum) ................... 10-172 Flagelados pigmentados tipos coloniales (varios filum) ............. 10-173 Flagelados no pigmentados (Filum Protozoa) ......................... 10-174 Amebas (Filum Protozoa). a) Etapas ameboides; b) etapas flageladas, y c) etapas quísticas .................................................. 10-175 Ciliados (Filum Protozoa) ......................................................... 10-176 Esponjas (Filum Porifera) y Bryozoos (Filum Bryozoa) ........... 10-177 Rotíferos (Filum Rotatoria)......................................................... 10-178 Gusanos (Filum Nemathelminthes) ............................................. 10-179 Tremátodos (Filum Platyhelminthes) y gusanos segmentados (Filum Annelida)...................................................................... 10-180 Crustáceos (Filum Arthropoda, clase crustácea): Tipos de cladóceros (orden Cladocera)........................................................... 10-181 Crustáceos (Filum Arthropoda, clase crustácea): Tipos comunes seleccionados........................................................................... 10-182 Tipos de pupas de insecto .......................................................... 10-183 Plecópteros (orden Plecoptera) .................................................. 10-184 Efímeras (orden Ephemeroptera) ................................................. 10-185 Libélulas (orden Odonata) .......................................................... 10-186 Helgramites y especies afines...................................................... 10-187 Frigáneas (orden Trichoptera)..................................................... 10-188 Moscas de dos alas (orden Díptera)........................................... 10-189 Moscas de dos alas (orden Díptera)........................................... 10-190 Escarabajos (orden Coleóptera) .................................................. 10-191 Chinches (orden Hemiptera, adultos) ......................................... 10-192

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CONTENIDO

PÁG. 32. 33. 34. 35. 36. 37. 38.

Moluscos (Filum Molusco): Caracoles (clase Gastropoda).......... Moluscos (Filum Mollusca): Bivalvos (clase Pelecypoda) ........ Tipos de equinodermos (Filum Echinodermata, marinos).......... Algunos invertebrados ............................................................... Algunos tipos de peces (Filum Chordatd) ................................. Tipos de anfibios (Filum Chordata, clase Amphibia) ................ Bacterias y hongos .....................................................................

10-193 10-194 10-195 10-196 10-197 10-198 10-199

Láminas en color de algas azules-verdes (sección especial en color) . 10-200 A. B. C. D. E. F.

Algas saporíferas y odoríferas Algas de obturación de filtros Algas de aguas contaminadas Algas de aguas limpias Algas de plancton y otras algas de aguas superficiales Algas de crecimiento sobre los muros de reservorios

PARTE 1000 INTRODUCCIÓN GENERAL

1010

1010 A.

INTRODUCCIÓN*

Finalidad y aplicación de métodos

Los procedimientos descritos en estos estándares están destinados al examen de aguas de calidades comprendidas dentro de amplios márgenes, entre los que se incluyen aguas adecuadas para suministros domésticos e industriales, aguas de superficie, aguas subterráneas, aguas de refrigeración o circulación, aguas de calderas, aguas de alimentación de calderas, aguas residuales urbanas o industriales tratadas o no químicamente, y aguas saladas. La unidad entre los ámbitos del suministro de aguas, del control de su calidad, del tratamiento y la evacuación de aguas residuales se expresa en la presentación de métodos de análisis para cada componente en una sección única para todos los tipos de aguas. Se ha realizado un considerable esfuerzo para presentar los métodos de aplicación más general. En los casos en los que se hacen necesarios métodos alternativos para muestras de diferente composición, los fundamentos para la elección de la opción más adecuada se explican con la mayor claridad posible. Sin embargo, muestras que contengan concentraciones extremas o que presenten composiciones inusuales pueden plantear dificultades e impedir el empleo directo de estos métodos. Por ello, puede ser necesario modificar algún procedimiento en casos específicos. Siempre que se modifique uno de tales procedimientos, el analista debe

constatar con claridad la naturaleza de la modificación en el informe de resultados. Algunos procedimientos se destinan a su aplicación en lodos y sedimentos. Una vez más, se ha realizado un importante esfuerzo para presentar los métodos en su más amplio grado de posibles aplicaciones, aunque, cuando se trata de barros o lodos químicos u otras muestras de composición poco habitual, los métodos expuestos en este manual pueden precisar ciertas modificaciones o resultar inapropiados. La mayoría de los métodos tratados han sido refrendados por organismos de control. De hecho, las modificaciones de procedimientos realizados sin aprobación formal pueden resultar inaceptables para un organismo de este tipo. No se incluye en el estudio el análisis de grandes cantidades de productos químicos para el tratamiento de aguas. Un comité de la American Water Works Association prepara y publica estándares al respecto. La información contenida en la parte 1000 tiene utilidad para los laboratorios que desean alcanzar resultados analíticos de una calidad conocida, es decir, de una exactitud conocida y con una incertidumbre conocida dentro de esta exactitud. Para conseguirlo, aplíquense los métodos de garantía de calidad descritos en esta sección a los métodos estándar descritos a lo largo de esta publicación. Otras secciones de la parte 1000 se dedican al equipo de laboratorio, a la seguridad en el laboratorio, a procedimientos de toma de muestras y al desarrollo y la validación de métodos, en todas las cuales se suministra la información necesaria.

* La parte 1000 se remitió al Standard Methods Committee a efectos de «revisión y comentarios», y se ofrece únicamente con carácter informativo. No se considera parte de los procedimientos descritos en estos estándares.

1-1

MÉTODOS NORMALIZADOS

1-2

1010 B. 1.

Distribución normal

Si se repite una medida muchas veces en condiciones esencialmente idénticas, los resultados de cada medida, x, se distribuirán de forma aleatoria en torno a un valor medio (media aritmética) debido a errores incontrolables o experimentales. Si se pudiera acumular un número infinito de estas medidas, sus valores individuales quedarían distribuidos en una curva similar a la que presenta la figura 1010:1. La curva de la izquierda ilustra la distribución normal o gaussiana, descrita de forma precisa por la media, μ, y la desviación estándar, V . La media o promedio de la distribución es sencillamente la suma de todos los valores dividida por el número de valores acumulados, es decir, μ =

 ¦ x / n. Dado que no es posible i

i

repetir un número infinito de veces las medidas, se realiza una estimación de la media, mediante el mismo procedimiento de suma aunque con n igual al número finito de medidas repetidas (10 ó 20, o...). Esta estimación de μ se denota como x. La desviación estándar de la distribución normal se define como:

De nuevo, el analista no puede sino estimar la desviación estándar, ya que el número de observaciones realizadas es

Estadística finito; la estimación de a se denota por , y se calcula del siguiente modo:

La desviación estándar fija la anchura, o dispersión, de la distribución normal, e incluye también una fracción fija de los valores que diseñan la curva. Por ejemplo, el 68,27 por 100 de las medidas está comprendido en μ + 1V , el 95,45 por 100 en μ ± 2V , y el 99,70 por 100 en μ ± 3V . Se puede afirmar con suficiente seguridad que el 95 por 100 de los valores está en + 2V , y el 99 por 100 en ± 3V . Cuando se asignan valores a los múltiplos de + V , existen límites de aceptación. Por ejemplo, 10 + 4 indica que los límites de aceptación son 6 y 14, mientras que los valores entre 6 y 14 representan el intervalo de aceptación. Otra útil variable estadística es el error estándar de la media V ȝ , que es la desviación estándar dividida por la raíz cuadrada del número de valores V / n. Ello representa una estimación de la exactitud de la media e implica que otra muestra de la misma población poseería una media comprendida en un intervalo de múltiplos de este error. Los múltiplos de esta variable estadística incluyen la misma fracción de valores que la declarada anteriormente para V . En la práctica, se dispone de un pequeño número de valo-

Figura 1010:1. Distribuciones normal y desplazada.

INTRODUCCIÓN GENERAL

res promedio, por lo que los intervalos de aceptación de la media se expresan como donde t tiene los siguientes valores para intervalos de aceptación del 95 por 100:

1-3

contrará claramente desplazada, tal como se muestra en la parte derecha de la figura 1010:1, en la que la moda, la mediana y la media son muy diferentes. Para obtener una distribución aproximadamente normal, se convierten los resultados en logaritmos y se calcula x y s. Los antilogaritmos de estos dos valores constituyen estimaciones de la media geométrica y la desviación estándar geométrica, xg y sg . 3.

En caso de un número pequeño de valores, el uso de t compensa la tendencia a subestimar la incertidumbre. Para n > 15, es normal usar t = 2 en la estimación del intervalo de aceptación del 95 por 100. Otra variable estadística es la desviación estándar relativa, también conocida como coeficiente de variación (CV), que se expresa habitualmente en forma de porcentaje. Esta variable estadística se calcula como 100 ı /μ y su estimación es 100 s/ x . Tal variable estadística normaliza la desviación estándar y en ocasiones facilita la realización de comparaciones directas entre análisis que incluyen una amplia gama de concentraciones. Por ejemplo, si los análisis a bajas concentraciones producen un resultado de 10 ± 1,5 mg/1 y a altas concentraciones de 10 ± 8 mg/1, las desviaciones estándar no parecen comparables. Sin embargo, las desviaciones estándar relativas son 100 (1,5/10) = 15 por 100 y 100 (8/10) = 8 por 100, que indican el menor índice de variación obtenido mediante el uso de este parámetro. 2.

Rechazo de datos

En una serie de medidas, sucede con bastante frecuencia que uno o más de los resultados difieren en gran medida de los restantes. En teoría, no debe rechazarse ningún resultado, ya que puede indicar un fallo técnico que infunde dudas sobre la validez de todos los resultados o sobre la presencia de una auténtica variante en la distribución. En la práctica, se rechaza el resultado de cualquier análisis en el que se ha producido un error conocido. En estudios medioambientales, las concentraciones extremadamente altas o bajas de sustancias contaminantes pueden ser indicativas de la existencia de áreas con problemas o zonas sin contaminación, por lo que no deben ser rechazadas de forma arbitraria. Existen descripciones de pruebas objetivas para valores extremos1. Si se ordena de modo creciente un conjunto de datos xi, xw...xs, y se calculan el promedio y la desviación estándar, es posible examinar los valores extremos superior e inferior indicativos de posible error mediante el siguiente procedimiento. Se calcula en primer lugar la variable estadística T:

Distribución logarítmica normal

En muchos casos, los resultados obtenidos a partir de análisis de muestras tomadas del medio ambiente no observan una distribución normal, esto es, la representación gráfica de sus datos se en-

T = (xs – x )/s para un valor superior, o T = (x – xi)/s para un valor inferior

En segundo término, compárese el valor de T con el valor de la tabla 1010:1

MÉTODOS NORMALIZADOS

1-4

para los niveles de significación de 5 por 100 o 1 por 100. Si el T calculado es mayor que el valor de la tabla para el número de medidas, n, entonces xs o xi es un valor extremo a ese nivel de significación. Consultar en otras fuentes informaciones adicionales sobre las técnicas estadísticas2, 3.

4. 1. 2. 3.

Referencias B ARNETT , V. & T. L EWIS. 1984. Outliers in Statistical Data. John Wiley & Sons, Nueva York. NATRELLA, M. G. 1966. Experimental Statistics. National Bur. Standards Handbook 91, Washington, D. C. SNEDECOR, G. W. & W. G. COCHRAN . 1980. Statistical Methods. Iowa State University Press, Ames.

TABLA 1010:1. VALORES CRÍTICOS PARA PRUEBAS DE DISCORDANCIA DE 5 POR 100 Y 1 POR 100 PARA UN VALOR EXTREMO SIMPLE EN UNA MUESTRA NORMAL

1010 C. 1.

Definición de términos

Coeficiente de aceptación: probabilidad, porcentaje, de que el resultado de en una medida esté comprendido en el intervalo de aceptación o entre los límites de aceptación.

Glosario Control de calidad: conjunto de medidas que, según una metodología de análisis de muestras, aseguran que el proceso se encuentra bajo control. Duplicado: normalmente, número mínimo de réplicas (dos), aunque en casos específicos se refiere a las muestras du-

INTRODUCCIÓN GENERAL

plicadas, es decir, dos muestras tomadas en el mismo instante en un lugar concreto. Error aleatorio: desviación en cualquier fase de un procedimiento analítico que puede tratarse mediante técnicas estadísticas estándar. Error de tipo I: también denominado error alfa, es la probabilidad de determinar que un componente está presente cuando en realidad está ausente. Error de tipo II: también denominado error beta, es la probabilidad de no detectar un componente que en realidad está presente. Estándar de comprobación de calibrado: estándar utilizado para determinar el estado de calibrado de un instrumento entre recalibrados periódicos. Estándar de control de laboratorio: estándar, normalmente certificado por un organismo externo, utilizado para medir el sesgo en un procedimiento. Para ciertos componentes y matrices, utilícense los materiales de referencia estándar (Standard Reference Materials) del National Institute of Standards and Technology (NIST)* cuando se encuentren disponibles. Estándar de sustitución: compuesto puro añadido a una muestra en el laboratorio justo antes de su proceso de modo que pueda determinarse la eficacia global de un método. Estándar interno: compuesto puro añadido a un extracto de muestra justo antes del análisis instrumental para permitir la corrección de ineficacias. Evaluación de calidad: procedimiento para la determinación de la calidad de las medidas de laboratorio mediante el empleo de datos a partir de las medidas de control de calidad internas y externas. Exactitud: combinación del sesgo y la precisión de un procedimiento analíti* Anteriormente, National Bureau of Standards (NBS).

1-5

co, que refleja la proximidad de un valor medido a un valor verdadero (véase fig. 1030:1). Garantía de calidad: plan definidor del funcionamiento del laboratorio que especifica las medidas utilizadas para producir datos de una precisión y un sesgo conocidos. Intervalo de aceptación: conjunto de posibles valores en los que el valor verdadero estará comprendido con un grado específico de probabilidad. Límite de aceptación: cada uno de los valores frontera que definen el intervalo de aceptación. Límites de detección: en orden creciente, los diferentes límites son: Límite de cuantificación (LDC): concentración de componente que produce una señal suficientemente mayor que el blanco que puede detectarse en límites específicos por buenos laboratorios durante los acondicionamientos de funcionamiento rutinarios1. Es la concentración típica que produce una señal 10S veces superior a la señal del blanco en agua para reactivos. Límite de detección del método (LDM): concentración de componente que, cuando se procesa a través del método completo, produce una señal con una probabilidad del 99 por 100 de ser diferente del blanco. Para siete réplicas de la muestra, la media debe ser 3,14S superior al blanco, donde s es la desviación estándar de siete muestras. El LDM es mayor que el LID, ya que las repeticiones y las fases de proceso de muestras pueden variar con los componentes y las matrices. Límite de detección instrumental (LDI): concentración de componente que produce una señal superior a cinco veces la relación señal/ruido del instrumento. Similar en muchos aspectos al «nivel crítico» y al «criterio de selección». El último límite se ha establecido en 1,645 veces el valor s de los análisis en blanco.

1-6

MÉTODOS NORMALIZADOS

Límite inferior de detección (LID): concentración de componente en agua para reactivos que producen una señal 2(1,645)s por encima de la media de los análisis en blanco, lo que establece los errores de tipo I y II en el 5 por 100. Otra denominación es «límite de detección» (LDD). Precisión: medida del grado de concordancia entre análisis repetidos de una muestra, expresada normalmente como la desviación estándar. Réplica: operación repetida que tiene lugar en un procedimiento de análisis.

1020.

Dos o más análisis para el mismo componente en un extracto de una única muestra constituyen análisis de extractos de réplica. Sesgo: desviación consistente de valores medidos a partir del valor verdadero, originada por errores sistemáticos durante un procedimiento. 2.

Referencia

1. U.S. ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENCY. 1985. National Primary Drinking Water Regulations, 40 CFR Part 141; Federal Register 50: 46936.

GARANTÍA DE CALIDAD

1020 A. Introducción La garantía de calidad (GC) es un con-junto de principios de funcionamiento que, si se cumplen estrictamente a lo largo de la toma y el análisis de muestras, generarán datos de calidad reconocida y justificable. En consecuencia, podrá declararse con un alto grado de confianza la exactitud del resultado analítico. En la garantía de calidad se incluyen el control de calidad (sección 1020B) y la evaluación de calidad (sección 1020C). 1. Planificación de la garantía de calidad

Establézcase un conjunto de principios de funcionamiento que constituyan un programa de garantía de calidad. Prepárese un plan de GC1 que incluya los siguientes puntos: pliegos de cobertura con

Firmas de aprobación del plan, organización y responsabilidades, control de muestras y procedimientos de documentación, procedimiento estándar de funcionamiento (PEF) para cada método analítico, requisitos de formación de analistas, procedimientos de mantenimiento preventivo del equipo, procedimientos de calibrado, acciones correctivas, actividades de control interno de calidad, verificaciones de rendimiento, procedimientos de evaluación de datos para sesgo y precisión, reducción de datos, validación y conjunto de informes. Los pliegos cobertura con las firmas de aprobación indican que el plan ha sido revisado y juzgado corrió adecuado, y que la organización y la división de responsabilidades esbozan la cadena jerárquica y asignan funciones específicas; s cada una de las personas involucradas

1-7

INTRODUCCIÓN GENERAL

El control de muestras y los procedimientos de documentación permiten seguir la pista de una muestra y de sus derivados a través de todas las etapas, desde la toma de muestras al análisis y la visualización de resultados. Siempre importante, la documentación lo es especialmente en los casos en que se impone la necesidad de hacer un seguimiento. Un procedimiento estándar de funcionamiento para el método analítico describe el método con tal grado de detalle que un analista experto, incluso no familiarizado con el método, puede obtener resultados aceptables. Los requisitos de formación de analistas deben especificarse. El número de análisis necesarios y la incertidumbre de los resultados variarán en función del tipo de análisis, de las características de la muestra y de la experiencia del analista. Es necesario aplicar procedimientos de mantenimiento preventivo del equipo. Un programa estricto de mantenimiento preventivo reducirá los fallos de funcionamiento de los instrumentos, mantendrá el nivel del calibrado y reducirá los períodos de paralización. Los procedimientos de calibrado, las acciones correctivas, las actividades de control de calidad, las verificaciones de

rendimiento y las evaluaciones de datos para sesgo y precisión se exponen en las secciones 1020B y C. La reducción de datos, la validación y el conjunto de informes constituyen los rasgos finales de un programa de GC. La lectura obtenida a partir de un instrumento analítico debe ajustarse a factores tales como la eficacia del instrumento, la eficacia de extracción, el tamaño de la muestra y el valor del fondo antes de llegar a ser un resultado de utilidad. El plan de GC especifica los factores de corrección que han de aplicarse al tiempo que las etapas que se deben seguir en la validación de resultados. Comuníquense los resultados en unidades estándar de masa, volumen o concentración. Utilícese un método prescrito para comunicar resultados por debajo del límite de detección del método. Acompañar cada resultado o conjunto de resultados de la declaración del factor de incertidumbre. 2.

Referencia

1. STANLEY, T. W. & S. S. VERNER. 1983. Interim Guidelines and Specifications for Preparing Quality Assurance Project Plans. EPA-600/4-83-004, U. S. Environmental Protection Agency, Washington, D. C.

1020 B. Control de calidad El control de calidad (CC) puede ser interno o externo. El objeto de esta sección es el CC interno; el CC externo, también denominado «avaluación de calidad», se expone en la sección I020C Todos los analistas utilizar, algunos CC en forma de esfuerzos intuitivos para producir rebultados creíbles. Sin embargo, un buen programa de control de calidad se

compone, al menos, de siete elementos: certificación de la competencia del operador, recuperación de adiciones conocidas, análisis de estándares suministrados de forme interna, análisis de blancos de reactivos, calibrado mediante estándares, análisis de duplicados y mantenimiento de gráficos de control. Las secciones 1010 y 1030 contienen los cálculos necesarios.

MÉTODOS NORMALIZADOS

1-8

1. Certificación de la competencia del operador

Antes de permitir que un analista lleve a cabo trabajos susceptibles de ser comunicados, ha de demostrarse su competencia en la realización de los análisis. Los requisitos son variables, aunque para la mayoría de los análisis químicos orgánicos e inorgánicos es suficiente la demostración de sesgos y precisiones aceptables para operación en solitario. Realícese un mínimo de cuatro análisis de réplica de una muestra de comprobación preparada independientemente con una concentración comprendida entre 5 y 50 veces el límite de detección del método (LDM) para el análisis en ese laboratorio. En la figura 1020:1 se muestran los límites generales para trabajos aceptables; algunos métodos pueden especificar límites más rigurosos.

2. Recuperación de adiciones conocidas

Utilícese la recuperación de adiciones conocidas como parte de un protocolo analítico regular. Empléense adiciones conocidas para verificar la ausencia de efectos de matriz. Cuando se precise analizar un nuevo tipo de matriz, verifíquese la magnitud de la interferencia. En los casos en que no sea posible aplicar duplicados, por ejemplo cuando el componente de interés se encuentra ausente, realícese una recuperación de adiciones conocidas para el 10 por 100 de las muestras. Si también se encuentran en fase de análisis los duplicados, la suma de los duplicados y las adiciones conocidas debe ser igual como mínimo al 10 por 100 del número de muestras. Realícese la adición conocida entre 5 y 50 veces el LDM o entre 1 y 10 veces el nivel ambiental, por elevados que sean. No deben emplearse adiciones conocidas por encima de la amplitud lineal demostrada del método; utilizar solucio-

nes concentradas cuyo cambio de volumen en la muestra sea despreciable. Véanse en la tabla 1020:1 los límites aceptables. 3. Análisis de estándares de suministro externo

Los estándares de suministro externo deben analizarse, como mínimo, en los casos en que el análisis de adiciones conocidas no produce recuperaciones aceptables, o una vez al día, según lo que sea más frecuente. Utilícense estándares de control de laboratorio con una concentración entre 5 y 50 veces el LDM o próxima a los niveles ambientales de muestra, en función de cuál sea mayor. Cuando sea posible, utilícense materiales certificados de referencia como estándares de control de laboratorio. Son preferibles, cuando se pueda disponer de ellos, los materiales de referencia estándar (Standard Reference Materials) del National Institute of Standards and Technology (NIST)*. Si se utilizan materiales internos de referencia, prepárense de forma independiente a partir de los estándares usados para el calibrado. Véase tabla 1020:1 sobre límites aceptables para duplicados de alto nivel. 4.

Análisis de blancos de reactivos

Analícense blancos de reactivos en todos los casos en que se utilicen nuevos reactivos y con la frecuencia que requieran los métodos específicos. Analícese un mínimo del 5 por 100 de la carga de muestra como blancos de reactivos; ello garantiza el seguimiento de la pureza de los reactivos y los blancos de procedimientos globales. Analícese un blanco de reactivos después de cualquier muestra con una concentración superior a la del mayor estándar o que pudiera producir un arrastre de una muestra con la siguiente. * Anteriormente, National Bureau of Standards (NBS).

INTRODUCCIÓN GENERAL

1-9

TABLA 1020:1. LÍMITES DE ACEPTACIÓN PARA MUESTRAS DUPLICADAS Y ADICIONES CONOCIDAS SOBRE AGUAS LIMPIAS Y RESIDUALES

* Adiciones calculadas como % de la adición conocida recuperada; duplicados calculados como la diferencia en porcentaje de la media. † Bajo nivel se refiere a concentraciones inferiores a 20 veces el LDM. Alto nivel se refiere a concentraciones superiores a 20 veces el LDM. ‡ También límites de aceptación para estándares de control de laboratorios independientes y certificación de competencia del operador. F UENTE : N ATRELLA , M. G. 1966. Experimental Statistics. National Bur. Standards Handbook 91, Washington, D.C.

5.

Calibrado con estándares

Como mínimo, se miden tres diluciones diferentes del estándar una vez iniciado el análisis. A continuación, verifíquese diariamente la curva estándar mediante el análisis de uno o más estándares en la amplitud lineal, tal como se especifica en el método individual. Los resultados analíticos comunicables son aquellos comprendidos en la escala de las diluciones estándar utilizadas. No deben comunicarse valores por encima del estándar superior a no ser que se haya realizado una comprobación inicial de la mayor amplitud lineal, no se hayan modificado

los parámetros y el valor sea inferior a 1,5 veces el estándar superior. El valor inferior comunicable es el LDM, siempre que el estándar de calibrado más bajo sea inferior a 10 veces el LDM. Si se retira el blanco, comunicar el resultado incluso si es negativo. 6.

Análisis de duplicados

Cuando la mayoría de las muestras poseen índices medibles del componente en fase de determinación, resulta eficaz el análisis de muestras duplicadas para evaluar la precisión. Analícese el 5 por 100 o

1-10

MÉTODOS NORMALIZADOS

más de las muestras en duplicados. Analícense duplicados y adiciones conocidas en matrices representativas de las muestras analizadas en el laboratorio. Véase tabla 1020:1 sobre límites aceptables para análisis duplicados.

7.

Gráficos de control

En los laboratorios se utilizan normalmente tres tipos de gráficos de control1: un gráfico de recursos para estándares, ya sean estándares de control de laboratorio (ECL) o de control de calibrado (ECC); un gráfico de recursos para resultados de fondos o blancos de reactivos; y un gráfico de rango para análisis de réplicas. Los gráficos constituyen instrumentos básicos para el control de calidad. Los diferentes tipos de gráficos se describen a continuación. a) Gráficos de recursos: Los gráficos de recursos para estándares se construyen a partir de la media y la desviación media de un estándar. Esto incluye niveles de alarma (NA) superior e inferior y niveles de control (NC) superior e inferior. Es práctica corriente utilizar los límites ±2s y +3s para el NA y el NC, respectivamente, donde s representa la desviación estándar. Dedúzcanse estos valores a partir de los valores declarados para materiales de referencia estándar, si se utilizan para estándares de control de laboratorio (ECL) o estándares de comprobación de calibrado (ECC), o a partir de análisis de réplica de ECC. El gráfico puede establecerse mediante el uso de valores calculados para la media y la desviación estándar o de porcentajes. Los porcentajes son necesarios cuando varía la concentración. Constrúyase un gráfico para cada instrumento de análisis. Introdúzcanse los resultados sobre el gráfico cada vez que se analice el ECL o el ECC. En la figura 1020:1 se proporcionan ejemplos de gráficos de control para recursos.

b) Gráfico de amplitud: Si se conoce la desviación estándar del método, utilícense los factores de la tabla 1020:11 para construir la línea central y los límites de alarma y de control tal como se muestra en la figura 1020:2. Una perfecta concordancia entre los duplicados conduce a una diferencia nula cuando se restan los valores, de modo que la línea de base del gráfico es cero. Se convierte la desviación estándar en la amplitud, de manera que el analista no tenga más que restar los dos resultados para dibujar el valor sobre el gráfico de control. La amplitud media se calcula como:

el límite de control como

y el límite de alarma como

donde: D 2 = factor para convertir s en la amplitud (1,128 para duplicados, como se indica en la tabla 1020:11). s(R) = desviación estándar de la amplitud, y D4 = factor para convertir la amplitud media en 3s(R) 3,267 para duplicados, como se indica en la tabla 1020:11).

Un gráfico de amplitud es bastante sencillo cuando se utilizan análisis duplicados de un estándar (fig. 1020:2). Para análisis duplicados de muestras, el dibujo parecerá diferente en virtud de la variación en la concentración de muestras. Si se supone una desviación estándar relativa constante en la amplitud de concentración de interés, los valores R,D4 R, etcétera, pueden calcularse de la forma anteriormente expuesta para varias concentraciones, con una curva suave dibujada a través de los puntos obtenidos, y de esta forma puede determinarse un rango acep-

INTRODUCCIÓN GENERAL

1-11

Figura 1020:1. Gráficos de control para recursos. TABLA 1020:11. FACTORES PARA EL CÁLCULO DE LÍNEAS EN GRÁFICOS DE CONTROL DE AMPLITUD

FUENTE: ROSENSTEIN, M. & A. S. GOLDEN. 1964. Statistical Techniques for Quality Control of Environmental Radioassays. AQCS Rep. Stat-1. Public Health Serv., Winchester, Massachusetts.

table para duplicados para cualquier concentración media. La figura 1020:3 ilustra un gráfico de este tipo. Para el seguimiento de la precisión en el transcurso del tiempo, se hará necesaria una tabla independiente como la sugerida debajo de la figura. Con mayor frecuencia, el rango puede expresarse como una función de la desviación estándar relativa (coeficiente de variación). Normalizar el rango por división por el promedio. Determinar la amplitud media para los pares analizados mediante:

y la varianza (cuadrado de la desviación estándar) como

Dibújense a continuación las líneas sobre el gráfico en R + 2sR y R + 3sR y, para cada análisis de duplicados, calcúlese la amplitud normalizada e introdúzcase el resultado en el gráfico. La figura 1020:4 es un ejemplo de un gráfico de este tipo.

1-12

MÉTODOS NORMALIZADOS

Figura 1020:4. Gráfico de amplitud para amplitudes variables. Figura 1020:2. Análisis duplicados de un estándar.

Figura 1020:3. Gráfico de amplitud para concentraciones variables.

c) Análisis de gráficos: Si los límites

de alarma (LA) se encuentran en un nivel del 95 por 100, un punto de cada 20, como promedio, superará este límite, mientras que únicamente uno de cada 100

superará el límite de control (LC). Empréndanse las siguientes acciones, basadas en estos parámetros estadísticos, que se ilustran en la figura 1020:5: Límite de control: Si una medida supera el límite de control, repítase el análisis inmediatamente. Si la repetición se encuentra dentro del LC, continúese el análisis; si lo supera, hay que interrumpir el análisis y corregir el problema. Límite de alarma: Si dos de cada tres puntos sucesivos superan el LA, analícese otra muestra. Si el siguiente punto es inferior al LA, continúese el análisis; si el punto siguiente supera el LA, hay que interrumpir el análisis y corregir el problema. Desviación estándar: Si cuatro de cinco puntos consecutivos superan 1s, o están en orden creciente o decreciente, analícese otra muestra. Si el siguiente punto es inferior a 1s, o altera el orden, continúese el análisis; en caso contrario, hay que interrumpir el análisis y corregir el problema. Línea central: Si seis muestras sucesivas se encuentran por encima de la línea central, analícese otra muestra. Si el punto siguiente está por debajo de la línea central, continúese el análisis; si el siguiente punto se encuentra en el mismo lado, hay que interrumpir el análisis y corregir el problema.

1-13

INTRODUCCIÓN GENERAL

Figura 1020:5. Gráfico de control de recursos con datos fuera de control (mitad superior).

Las anteriores consideraciones se aplican cuando las condiciones están por encima o por debajo de la línea central, pero no en ambos lados; por ejemplo, cuatro de cinco valores deben superar o bien + ls o bien – 1S. Después de corregir el problema, se vuelve a analizar la mitad de las muestras analizadas entre la última medida controlada y la última fuera de control. Otra función importante en el gráfico de control es la evaluación de las mejoras en la precisión del método. En los gráficos de amplitud y de recursos, si las medidas

nunca o rara vez superan el LA, recalcular el LA y el LC mediante el uso de los 20 puntos de datos más recientes. Las tendencias en la precisión se pueden detectar con mayor prontitud si se investigan promedios corrientes de 20 sobre bases diarias. 8.

Referencia

1. GOLDEN, A. S. 1984. Evaluation of internal control measurements in radioassay. Health Phys. 47:361.

1020 C. Evaluación de calidad La evaluación de calidad consiste en el proceso de utilización de medidas de control de calidad externo e interno con objeto de determinar la calidad de los datos obtenidos en el laboratorio. Incluye apartados tales como muestras de

evaluación de rendimiento, muestras de comparación entre laboratorios, y verificaciones de rendimiento de forma análoga al CC interno descrito en la sección 1020B, que se aplican para examinar la recuperación, el sesgo, la precisión, el lí-

MÉTODOS NORMALIZADOS

1-14

TABLA 1020:111.

VERIFICACIÓN DE UN PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS DE SUELO

Procedimiento

Comentario

1. 2. 3.

Muestra introducida en el cuaderno Muestra pesada Procedimiento de secado seguido

sí sí no

4a. b. 5. 6.

Balanza calibrada Limpia y ajusta en cero Muestra base Molino de bolsas limpio

sí sí sí

sí

Observaciones número de laboratorio asignado peso en seco mantenimiento del horno no realizado una vez al año semanal al pasar 50 retículas debe hacerse después de cada muestra

mite de detección y la adhesión a los requisitos de los procedimientos de funcionamiento estándar.

1. Muestras de evaluación del rendimiento

Utilícense muestras con cantidades conocidas del componente proporcionadas por un organismo externo o muestras aleatorias preparadas en el propio laboratorio para determinar los resultados obtenidos por el analista. En general, deberá establecerse de antemano la incertidumbre del método; una recuperación aceptable está comprendida en el grado establecido de incertidumbre. Por ejemplo, si la amplitud aceptable de recuperación para una sustancia es del 85 al 115 por 100, se supone que el analista debe conseguir una recuperación dentro de dicha amplitud para todas las muestras de evaluación del rendimiento. 2.

Verificaciones del rendimiento

Realizar únicamente verificaciones no planificadas mediante un registro de comprobación que permita establecer el modo en que se trata una muestra desde el momento de la recepción hasta la comunicación final de resultados. El objetivo consiste en detectar cualquier desvia-

ción del procedimiento estándar de funcionamiento de modo que pueden adoptarse medidas correctivas. En la tabla 1020:111 se muestra un formato recomendado en cuyo registro de comprobación se incluyen algunos apartados iniciales. 3. Muestras de comparación entre laboratorios

Los programas comerciales estatales suministran muestras que contienen diversos componentes en diferentes matrices. Para obtener un buen programa de evaluación de calidad es necesario participar en estudios periódicos comparativos de laboratorio. La frecuencia de participación debe ajustarse a la calidad de los resultados obtenidos por los analistas cuyo trabajo está siendo examinado en el estudio. Como procedimiento rutinario es razonable hacer análisis trimestrales. Los organismos oficiales encargados de la dirección de tales estudios se relacionan a continuación. a) Compuestos orgánicos e inorgánicos en agua: Las muestras se hallan disponibles en el Environmental Monitoring Systems Laboratory, EPA, Estados Unidos, 26 West St. Clair, Cincinnati, Ohio 45268. Se pueden utilizar como muestras de evaluación del rendimiento o como estándares para estudios comparativos de laboratorio.

1-15

INTRODUCCIÓN GENERAL

b) Radioisótopos en medios diversos: Estas muestras se hallan disponibles en el Environmental Monitoring Systems Laboratory, EPA, Estados Unidos, P. O. Box 93478, Las Vegas, Nevada 891933478. Pueden suministrarse para su uso como muestras de evaluación del rendimiento; el Laboratorio dirige también los estudios comparativos de laboratorio1. Muestras medioambientales con niveles de fondo de radioisótopos se hallan disponibles en División of Laboratories and

1030

4.

Referencia

1. JARVIS, A. N. & L. Siu. 1981. Environmental Radioactivity Laboratory. Intercomparison Studies Program. EPA-600/4-81-004, U.S. Environmental Protection Agency, Las Vegas, Nevada.

CALIDAD DE DATOS

1030 A. 1.

Research, International Atomic Energy Agency, P. O. Box 100, A-1400 Viena, Austria.

Introducción

Indicadores de calidad

Los principales indicadores de la calidad de datos son su sesgo (sección 1030B) y su precisión (sección 1030C), que, combinados, expresan su exactitud. La relación entre estos términos se muestra en la figura 1030:1. De los cuatro resultados posibles, únicamente es exacta la condición de bajo sesgo y alta precisión

Indicadores auxiliares de calidad de datos son el límite de detección del método (sección 1030E) y la representatividad. Esta última se puede relacionar tanto con la propia muestra como con la población muestreada. Un método determinado puede tener un alto grado de exactitud, pero, si los resultados no son representativos de la muestra o la muestra no representa a la población, los datos no son de utilidad. La representatividad de la muestra alcanza su mejor evaluación mediante el análisis de diversas muestras en el mismo lugar o a partir de una gran cantidad de muestras de muy diversa procedencia. La representatividad del método se determina de manera óptima mediante la combinación de estudios que utilizan métodos diferentes. 2.

Figura 1030:1. Definición de exactitud.

Referencia

1. U. S. E NVIRONMENTAL P ROTECTION A GEN CY. 1980. Health Physics Society Committee Report HPSR-1: Upgrading Environmental Radiation Data. EPA-520/1-80-012, U.S. Environmental Protection Agency, Washington, D.C.

1-16

MÉTODOS NORMALIZADOS

1030 B. El sesgo es una medida del error sistemático. Contiene dos componentes: uno se deriva del método, y el otro, del uso del método en el laboratorio. El sesgo de un método se mide adecuadamente mediante la realización de estudios comparativos de laboratorio en los que dicho sesgo se define como la diferencia entre el promedio general y el valor conocido (o verdadero). El sesgo de laboratorio es la diferencia existente entre media de resultados del laboratorio y los valores verda-

1030 C.

1.

Definición

La precisión es una medida del grado de concordancia entre los análisis múltiples de una muestra dada. Se evalúa mediante análisis de réplicas, análisis repetidos de un estándar estable o análisis de adiciones conocidas sobre las muestras. La precisión se especifica por la desviación estándar de los resultados1. Si se desea obtener la precisión global de un estudio, hay que analizar muestras duplicadas. En esta valoración se incluyen los errores aleatorios implicados en la toma de muestras, así como los errores en la preparación y análisis de muestras. Cuando se emplean sólo algunas repeticiones, por ejemplo, análisis de muestras duplicadas o de extractos duplicados, la amplitud de resultados, R, es aproximadamente tan eficaz como la desviación estándar, ya que las dos medidas difieren en una constante (1,128s = R para duplicados, l,693s = R para triplicados).

Sesgo deros, siendo, por consiguiente, una combinación de dos sesgos. Evalúese el sesgo de laboratorio mediante la valoración de los resultados de adiciones conocidas o por medio del análisis de muestras duplicadas registrando el signo de las diferencias al calcular la diferencia promedio. De este valor ha de sustraerse el sesgo del método de un estudio comparativo para determinar el sesgo debido a las prácticas de laboratorio.

Precisión

2.

Cálculo

La tabla 1030:1 contiene los resultados de análisis duplicados y valores de recuperación de los análisis repetitivos de un estándar estable. La tabla 1030:11 muestra el cálculo de precisión que utiliza adiciones conocidas. Para análisis duplicados, la diferencia promedio, o amplitud media, se calcula como la suma de todas las diferencias (valores absolutos) y su división por el número de observaciones: R = ¦ di / n. Esto se transforma en la desviación estándar al dividirse por 1,128. Para análisis múltiples de un estándar estable, calcúlese la desviación estándar del modo acostumbrado. El valor verdadero del estándar es irrelevante para este análisis. Si se utilizan adiciones conocidas para determinar la precisión, como en el ejemplo de la tabla 1030:11, se resta el valor de la recuperación del valor conocido (restar la columna 3 de la columna 4) y se calcula la desviación estándar según el

1-17

INTRODUCCIÓN GENERAL

método habitual, tal como se muestra en el pie de la tabla. Si la desviación estándar está en proporción constante con la cantidad presente, puede utilizarse entonces el coeficiente de variación (desviación estándar relativa, s/ x ) en lugar de la desviación estándar. TABLA 1030:1.

3.

Referencia

1. AMERICAN SOCIETV FOR TESTING AND MATERIALS. 1977. Standard Practice for Determinaron of Precision and Bias of Methods. Committee D-19 on Water, Designation D2777-77, American Soc. Testing & Materials, Filadelfia, Pennsylvania.

CÁLCULOS DE PRECISIÓN MEDIANTE EL USO DE DUPLICADOS

1-18

MÉTODOS NORMALIZADOS

TABLA 1030:11. CÁLCULOS DE PRECISIÓN PARA ADICIONES CONOCIDAS

1030 D. 1.

Incertidumbre total

Definición y cálculo

Esta variable estadística constituye una apropiada combinación de las incertidumbres sistemática y aleatoria en un sistema dado de medidas. Las incertidumbres aleatorias se evalúan mediante el cálculo de la precisión; se obtienen de forma estadística. Las incertidumbres sistemáticas se refieren en cambio a los sesgos y a aquellas incertidumbres aleato-

rias que no pueden ser evaluadas de forma estadística. Dado que estas últimas pueden estimarse únicamente a partir de un conocimiento profundo de todas las etapas del proceso de medida, según el juicio de un analista experto, existe una considerable vaguedad en la evaluación. Dado que los sesgos pueden ser evaluados, lo habitual es que sólo se consideren éstos en la evaluación de la incertidumbre total. Estos sesgos se pueden produ-

1-19

INTRODUCCIÓN GENERAL

cir en varios puntos del sistema, como por ejemplo en el peso de la muestra, en el resultado producido por el instrumento analítico, en cambios en la calidad de los reactivos o en extractos incompletos. Cuando las incertidumbres aleatorias han sido evaluadas con la desviación estándar (sx) y los sesgos se representan por bi, estas cantidades pueden combinarse de forma cuadrática para calcular la incertidumbre1:

En general, los sesgos de extracción e instrumental (B) son los de mayor magnitud, con lo que la ecuación se simplifica como:

Para expresar la incertidumbre en forma de niveles de aceptación, se supone

1030 E. 1.

que el sesgo es conocido con un pequeño error y se añade a los niveles de aceptación superior de la varianza; por ejemplo, para un nivel de aceptación del 95 por 100:

Si la concentración del componente se encuentra en una amplitud estrecha, utilícese para B y sx unidades de concentración; en caso contrario, empléese el coeficiente de variación para sx y la forma parcial de B. 2.

Referencia

1. U. S. E NVIRONMENTAL P ROTECTION A GEN CY. 1980. Health Physics Society Committee Report HPSR-1: Upgrading Environmental Radiation Data. EPA-520/1-80-012, U.S. Environmental Protection Agency, Washington, D.C.

Límite de detección del método

Introducción

Los límites de detección son objeto de controversia, principalmente por motivo de su inadecuada definición y por cierta confusión de términos. Con frecuencia, el límite de detección instrumental se emplea como límite de detección del método, y al contrario. Independientemente del término que se utilice, la mayoría de los analistas coinciden en que el límite de detección se define a partir de la más pequeña cantidad detectable por encima del ruido en un procedimiento y dentro de un límite declarado de aceptación. Los límites de aceptación se establecen de modo que las probabilidades de que se presenten errores de tipo I y de tipo II sean razonablemente pequeñas. La práctica común identifica varios límites de detección (véase 1010C), cada

uno de los cuales posee un propósito definido. Éstos son el límite de detección del instrumento (LDI), el límite inferior de detección (LID), el límite de detección del método (LDM) y el límite de cuantificación (LDC). Ocasionalmente, el límite de detección del instrumento se utiliza como guía para la determinación del LDM. La relación entre todos estos límites es aproximadamente LDI:LID:LDM:LDC = 1:2:4:10. 2. Determinación de los límites de detección

Un instrumento de análisis en funcionamiento produce normalmente una señal (ruido) incluso cuando no existe ninguna muestra o se analiza un blanco. Dado que todo programa de GC requie-

1-20

re frecuentes análisis de blancos, la media y la desviación estándar llegan a conocerse bien, la señal de los blancos se hace muy precisa, lo que significa que la curva gaussiana de la distribución de blancos llega a ser muy estrecha. El LDI es la concentración del componente que produce una señal superior a tres desviaciones estándar del nivel de ruido medio o que puede determinarse mediante la inyección de un estándar para producir una señal que sea cinco veces la relación señal-ruido. El LDI resulta muy útil para valorar la concentración de los componentes o la cantidad de un extracto necesaria para producir una señal que permita calcular un límite de detección del método estimado. El LID es la cantidad de componente que produce una señal suficientemente grande como para que pueda detectarse en el 99 por 100 de los ensayos realizados con dicha cantidad. Determínese el LID mediante inyecciones múltiples de un estándar a concentración casi cero (concentración no superior a cinco veces el LDI). Determínese la desviación estándar según el método habitual. Para reducir la probabilidad de un error de tipo I (detección falsa) al 5 por 100, multiplíquese s por 1,645 a partir de una tabla normal acumulativa. Para reducir también la probabilidad de un error de tipo II (no detección falsa) al 5 por 100, duplíquese esta cantidad a 3,290. Por ejemplo, si 20 determinaciones de un estándar de bajo nivel produjeron una desviación estándar de 6 μg/1, el LID sera 3,29 x 6 = = 20 μg/11. El LDM se diferencia del LID en que las muestras que contienen el componente de interés son procesadas a través del método analítico completo. El límite de detección del método es mayor que el LID en virtud de los factores de eficacia de extracción y concentración de los extractos. El LDM puede ser obtenido por analistas experimentados mediante el uso de instrumentos bien calibrados

MÉTODOS NORMALIZADOS

sobre una base no rutinaria. Por ejemplo, para determinar el LDM se añade un componente al agua para reactivos o a la matriz de interés, al objeto de obtener una concentración próxima al LDM estimado2. Analícense siete partes de esta solución y calcúlese la desviación estándar (s). A partir de una tabla de distribución desigual de t, selecciónese el valor de t para 7 – 1 = 6 grados de libertad y en el nivel 99 por 100; este valor es 3,14. El producto de 3,14 veces s es el LDM deseado. Si bien el LDC resulta de utilidad dentro de un laboratorio, es mayor la utilidad del límite de cuantificación práctica (LCP) definido como el nivel inferior registrable en los límites especificados a lo largo de las operaciones rutinarias de laboratorio3. El LCP tiene una especial importancia por cuanto que laboratorios diferentes producirán LDM distintos incluso si utilizan idénticos procedimientos de análisis, instrumentos y matrices de muestra. El LPC equivale aproximadamente a cinco veces el LDM y representa un límite de detección práctico y alcanzable de forma rutinaria con una certeza relativamente elevada de que los valores comunicados son fiables. 3.

Descripción de los límites

La figura 1030:2 ilustra los límites de detección expuestos en los apartados anteriores. En esta figura se supone que las señales obtenidas a partir de los instrumentos de análisis poseen una distribución normal y pueden representarse por una curva normal (gaussiana)4. La curva designada por B es representativa de la distribución de señales de blancos o de fondo. Tal como se muestra, la distribución de las señales de blancos es aproximadamente de la misma anchura que las de las restantes distribuciones, es decir, V B V I V L En la medida en que continúe el análisis de blancos, esta curva

1-21

INTRODUCCIÓN GENERAL

Figura 1030:2. Relación entre limites de detección

se estrechará aún más a causa de los grados crecientes de libertad. La curva designada por I representa el LDI. Su valor medio se sitúa a kV B unidades de distancia de la curva de blancos, y k representa el valor de t (de la distribución desigual de t) que corresponde al límite de aceptación elegido para describir el rendimiento del instrumento. Para un límite del 95 por 100 y n = 14, k = 1,782, y para un límite del 99 por 100, k = 2,68. El solapamiento de las curvas B e I indica la probabilidad de no detección de un componente cuando éste se encuentra presente (error de tipo II). La curva en el extremo derecho de la figura 1030:2 representa el LID. Dado que para el cálculo de LDI y LID se utiliza un número finito de determinaciones, las curvas son más amplias que el blanco, aunque semejantes, lo que hace razonable elegir V I  V L . Por consi-

guiente, el LID está a una distancia 2kV L de la curva de blancos. 4. 1.

Referencias AMERICAN SOCIETY FOR TESTING AND MATERIALS. 1983. Standard Practice for Intralabo-

ratory Quality Control Procedures and a Discussion on Reporting Low-Level Data. Designation D4210-83, American Soc. Testing & Materials, Filadelfia, Pensylvania. 2. GLASER , J. A., D. L. F OERST , J. D. M CKEE, S. A. Q UAVE & W. L. B UDDE . 1981. Trace analyses for wastewaters. Environ. Sci. Technol. 15:1426. 3. U.S. ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENCY. 1985. National Primary Drinking Water Standards: Synthetic Organics, Inorganics, and Bacteriologicals. 40 CFR Part 141; Federal Register 50: No. 219, 13 de noviembre, 1985. 4. OPPENHEIMER, J. & R. TRUSSELL. 1984. Detection limits in water quality analysis. In Proc. Water Quality Technology Conference (Denver, Colorado, 2-5 de diciembre, 1984). American Water Works Assoc, Denver, Colorado.

1-22

MÉTODOS NORMALIZADOS

1030 F.

Valoración de la corrección de los análisis

Los procedimientos que se exponen a continuación para la valoración de la corrección de los análisis son aplicables de forma específica a las muestras de agua para las que se han realizado análisis relativamente completos1. Entre ellos se incluyen el pH, la conductividad, los sólidos de disolución total (SDT) y los principales componentes aniónicos y catiónicos, que son indicadores de la calidad general del agua. Las comprobaciones descritas no requieren análisis adicionales de laboratorio. Tres de las valoraciones precisan la realización de cálculos de los sólidos de disolución total y de la conductividad de los componentes medidos. Para calcular los sólidos de disolución total se suman las concentraciones (en miligramos por litro) de los componentes del siguiente modo:

Calcúlese la conductividad eléctrica mediante la ecuación:

donde: G= conductividad de la solución salina, C= concentración de la solución salina, O = conductancia equivalente de la solución salina en una dilución infinita, K1, k2= constantes para la mitigación de los efectos de nube iónica y electroforético relativos a la movilidad de los iones 1 .

litro, deben estar equilibradas, ya que las aguas potables son eléctricamente neutras. El examen se basa en la diferencia porcentual definida del siguiente modo:

y los criterios de aceptación se establecen como sigue:

2.

La concentración medida de sólidos de disolución total debe ser superior a la calculada, ya que es posible que algún contribuyente significativo no haya sido incluido en el cálculo. Si el valor medido es inferior al calculado, ello puede deberse a algún error en la suma iónica superior y en el valor medido, por lo que debería volverse a analizar la muestra. Si la concentración de sólidos medida es superior en un 20 por 100 a la calculada, la suma inferior de iones no es fiable, por lo que deberían volverse a analizar los componentes seleccionados. La relación aceptable es la siguiente:

3. 1. Equilibrio entre aniones y cationes2

Las sumas de aniones y cationes, cuando se expresan en miliequivalentes por

SDT medido = SDT calculado2

CE medida = CE calculada

Si la conductividad calculada es superior al valor medido, hay que volver a analizar la suma superior de iones. Si la CE es inferior a la medida, hay que vol-

1-23

INTRODUCCIÓN GENERAL

ver a analizar la suma iónica inferior. La relación aceptable es:

un valor tan alto como 0,8 veces la CE. El criterio aceptable para esta relación es: SDT calculado/conductividad = 0,55-07

4.

CE medida y sumas iónicas

Las sumas de aniones y cationes deben ser 1/100 veces el valor medido de la CE. Si alguna de las dos sumas no cumple este criterio, dicha suma no es fiable; analícese de nuevo la muestra. Los criterios aceptables son: 100 x suma anión (o catión), meq/1 = (0,9-11) CE

5.

Relación SDT-CE calculada

Si la relación calculada SDT-conductividad está por debajo de 0,55, la suma iónica inferior no es fiable; hay que analizarla de nuevo. Si la relación está por encima de 0,7, la suma iónica superior no es fiable; hay que analizarla de nuevo. Si los nuevos análisis no producen cambios en la suma iónica inferior, algún componente no medido, como amoníaco o nitrito, ha de estar presente en una concentración significativa. Si se encuentran presentes iones calcio o sulfato pobremente disociados, el SDT puede alcanzar

6.

Relación SDT-CE medida

Los criterios aceptables para esta relación comprenden desde 0,55 hasta 0,7. Si la relación SDT-CE se encuentra fuera de estos límites, la SDT o la conductividad medidas no son fiables; hay que analizarlas de nuevo. Existen publicaciones que contienen descripciones más completas sobre las valoraciones del control de calidad 3. 7. 1.

Referencias

ROSSUM, J. R. 1975. Checking the accuracy of water analyses through the use of conductivity. J. Amer. Water Works Assoc. 67:204. 2. F RIEDMAN , L. C. & D. E. E RDMANN , 1982. Quality Assurance Practices for Analyses of Water and Fluvial Sediments. Tech. Water Resources Inc., libro 5, capítulo A6. U.S. Government Printing Off., Washington, D.C. 3. OPPENHEIMER, J. & A. D. EATON. 1986. Quality control and mineral analysis. in Proc. Water Quality Technology Conference (Houston, Texas, 8-11 de diciembre, 1985). American Water Works Assoc, Denver, Colorado.

1-24

MÉTODOS NORMALIZADOS

1040

DESARROLLO Y EVALUACIÓN DE MÉT0B0S

1040 A. Son muchas las fuentes reconocidas a nivel nacional que pueden proporcionar métodos estándar; no obstante, es posible que en algunas situaciones dichos métodos no sean utilizables, o puedan darse casos en los que no existan métodos estándar para un componente con-

1040 B.

Introducción ceto. Por consiguiente, tal vez sea necesario el desarrollo de métodos. El desarrollo de métodos es el conjunto de procedimientos experimentales ideados para medir una cantidad conocida de un componente en diversas matrices.

Validación del método

Cuando se desarrolla un método completamente nuevo mediante procedimientos aceptables de investigación o se modifica un método existente con el fin de reunir requisitos especiales, se precisa de un proceso de validación en tres etapas: determinación del sesgo y la precisión para un orador único, análisis de muestras desconocidas preparadas de forma independiente y determinación de la rigurosidad del método.

1. Características del operador único

Esta parte del procedimiento de validación requiere determinación del límite de detección del método (LDM), de forma análoga a la descrita en la sección 1030; el sesgo del método; y la precisión obtenible por un único operador, es decir, el error aleatorio introdujo en la utilización del método. Para realizar es-

tas determinaciones, se analizan como mínimo siete porciones, aunque es preferible que sean 10 o más, de un estándar para cada una de las diversas concentraciones utilizadas en cada matriz. Utilícese una concentración en el LDM, o ligeramente por encima, y una relativamente alta, de modo que pueda especificarse para la que es aplicable el método. El empleo de varias concentraciones para determinar el sesgo y la precisión revelará la naturaleza de las relaciones existentes entre estas características del método y la concentración de la sustancia. Esta relación puede ser constante, lineal o curvilínea, y constituye una característica significativa del método que requiere una explicación clara. En la siguiente tabla de resultados se muestra el cálculo del sesgo y la precisión para una sola concentración en una única matriz a partir de ocho análisis repetidos de un estándar con una concentración conocida de 1,30 mg/l.

INTRODUCCIÓN GENERAL

1-25

de rendimiento de EPA-Cincinnati (sección 1020). 3.

El sesgo es 0,49/8 = 0,006 mg/1 y la precisión es la raíz cuadrada de 0,2335/ (8-1) = 0 , 03336 , o 0,18 mg/1 (adviértase que se traía de un cálculo similar al de la desviación estándar). 2. Análisis de muestras desconocidas

En esta fase del procedimiento de validación del método es necesario realizar el análisis de estándares preparados independientemente cuyo valor es desconocido por el analista. Analícense las muestras desconocidas en réplicas, según el procedimiento de funcionamiento estándar del método. La cantidad media obtenida debe estar comprendida entre las tres desviaciones estándar (s) del valor medio del estándar, aunque preferiblemente en el rango 2 s. Obténganse muestras desconocidas procedentes de otros operadores del laboratorio mediante el empleo de reactivos comerciales para análisis o de estándares proporcionados por el National Institute of Standards and Technology (NIST) *, la EPA, u otras fuentes adecuadas. Si se hallan disponibles para el componente en particular, resultan de especial utilidad las muestras de evaluación

* Anteriormente, National Bureau of Standards (NBS).

Rigurosidad del método

La etapa final de la validación consiste en un examen de rigurosidad, es decir, de la estabilidad del resultado producido cuando se modifican las distintas etapas del método. La determinación de esta característica resulta de especial importancia cuando un método se va a proponer como estándar o método de referencia. Cuando se realiza de forma correcta un examen de rigurosidad, éste señalará las fases del procedimiento en las que resulta de crítica trascendencia respetar un comportamiento riguroso y aquellas en las que se admite cierto grado de flexibilidad. La Association of Official Analytical Chemists1 ha sugerido un método para este examen en el que pueden utilizarse ocho análisis distintos para determinar el efecto de la variación de siete etapas diferentes en un procedimiento analítico. Para ilustrarlo, supóngase que ha de determinarse el efecto de un cambio en los siguientes factores:

Para realizar la determinación, se denotan los valores iniciales de los factores por letras mayúsculas de la A a la G, y las variaciones con las letras minúsculas correspondientes. A continuación se establece la siguiente tabla de factores:

1-26

MÉTODOS NORMALIZADOS

Si se analiza la combinación 1, el resultado será s. Si se analiza la combinación 2, el resultado sera t, y así sucesivamente hasta que se hayan analizado las ocho combinaciones. Para determinar el efecto de la variación de uno de los factores, se buscan los cuatro resultados en los que el factor se mantuvo como el inicial (mayúsculas) y los cuatro en los que se varió (minúsculas), y se comparan los promedios de los dos grupos. Por ejemplo, para comparar el efecto del cambio de C en c se utilizan los resultados (s + u + w + + y)/4 y (t + v + x + z)/4. Calcúlense los siete pares de resultados para conseguir siete diferencias, las cuales pueden así ordenarse para revelar las que poseen efectos significativos sobre los resultados. Si no se producen diferencias relevantes, calcúlense la media y la desviación estándar de los ocho resultados s a través de z. La desviación estándar es una estimación real de la precisión del método. Este modelo comprueba los efectos principales, no las interacciones. 4.

Prueba de equivalencia

Después de la validación de un nuevo método por los procedimientos anteriormente mencionados, puede resultar recomendable proceder al examen del método en cuanto a su equivalencia con los

métodos estándar, a no ser que no exista ninguno. Ello requiere el análisis de un mínimo de tres concentraciones mediante el método estándar y el alternativo. Si la amplitud de concentraciones es muy grande, se examinarán más concentraciones. Una vez que se ha realizado un conjunto inicial de análisis (cinco o más) para cada concentración elegida, se aplican las siguientes etapas estadísticas2: 1. Examinar la normalidad de la distribución de datos y transformar éstos si es necesario (sección 1010B). 2. Seleccionar un tamaño adecuado de muestra basado en una estimación de la desviación estándar3. 3. Examinar las varianzas de los dos métodos mediante el empleo de la variable estadística de relación F. 4. Examinar los valores promedio de los dos métodos mediante el empleo de una variable estadística / de Student. Existen publicaciones que explican cada una de estas etapas con técnicas adicionales y diversos ejemplos 4. Dado que el número de análisis puede ser bastante alto, los cálculos se vuelven complejos, por lo que es necesario tener algunos conocimientos de estadística básica. Para ello, se encuentra disponible una relación de métodos estándar, de referencia y equivalentes5.

1-27

INTRODUCCIÓN GENERAL

5.

3.

Referencias

1.

YOUDEN , W. J. & E. H. STEINER. 1975. Statistical Manual of AOAC. Assoc. OfTícial Analytical Chemists, Washington, D.C. 2. WILLIAMS, L. R. 1985. Harmonization of Biological Testing Methodology: A Perform ance Based Approach in Aquatic Toxicology and Hazard Assessment. 8th Symp. ASTM STP 891, R. C. Bahner & D. J. Hansen, eds. American Soc. Testing & Materials, Filadelfia, Pennsylvania.

1040 C.

4.

5.

NATRELLA, M. G. 1963. Experimental Statistics. National Bureau of Standards Handbook 91, Washington, D. C. U.S. ENVIRONMENTAL PROTECTION AGEN CY . 1983. Guidelines for Establishing Method Equivalency to Standard Methods. Rep. 600/X-83-037, Environmental Monitoring Systems Lab., Las Vegas, Nevada. U. S. E NVIRONMENTAL P ROTECTION AGEN CY. 1987. Guidelines establishing test procedures for the analysis of pollutants under the Clean Water Act. Interim final rule. 40 CFR Part 136; Federal Register 52:171:33542.

Prueba en colaboración

Una vez que se ha desarrollado y validado un método nuevo o modificado, resulta apropiado determinar si dicho método puede convertirse en un método estándar. El procedimiento para adecuar un método a la categoría de estándar consiste en realizar la prueba en colaboración. En esta prueba, cierto número de laboratorios utiliza el procedimiento estándar de funcionamiento para analizar un número seleccionado de muestras con el fin de determinar el sesgo y la precisión del método, tal como sucedería en la práctica normal. En la planificación de pruebas en colaboración es preciso considerar los siguientes factores: un procedimiento estándar de funcionamiento escrupulosamente descrito, el número de variables que se han de examinar, el número de niveles que se deben examinar y el número de réplicas necesarias. Como la precisión del método se evalúa mediante la desviación estándar, que es en sí misma el resultado de numerosas fuentes de variación, es preciso examinar las variables que la afectan. Entre ellas, pueden incluirse el laboratorio, el operador, el instrumental y la amplitud de concentración.

1.

Variables

Examínense como mínimo las siguientes variables: Laboratorio: Deben participar al menos tres laboratorios diferentes, aunque sería de desear un número mayor con el fin de obtener una mejor estimación de la desviación estándar. Instrumental: Dado que las diferencias de modelo y de fabricante pueden constituir fuentes de error, se analizarán como mínimo dos réplicas de cada concentración por laboratorio. Operadores: Para determinar la precisión global, deberán participar como mínimo seis analistas, no siendo más de dos por cada laboratorio. Niveles: Si el desarrollo del método ha señalado que la desviación estándar relativa es constante, se examinarán tres niveles que cubran toda la amplitud del método. Si no es constante, se utilizarán más niveles uniformemente distribuidos

MÉTODOS NORMALIZADOS

1-28

a lo largo de la amplitud de funcionamiento. Si se desconfía de los efectos de matriz, deberá llevarse a cabo la prueba en cada uno de los medios para los que se desarrolló el método. Si ello no es factible, utilícense calidades adecuadas de agua para reactivos en el grado que estipule la evaluación resultante de las características del método.

2.

Número de réplicas

Calcúlese el número de réplicas después de haber completado la determinación del número de variables que se han de examinar mediante el empleo de la fórmula: r > 1 + (30/P)

donde: r = número de réplicas, y P = producto de diversas variables. El número mínimo de réplicas es dos. Por ejemplo, cuando un solo operador ha de analizar tres niveles de una sustancia, repitiéndose la operación en seis laboratorios distintos con el mismo tipo de instrumental, P se obtendrá a partir del siguiente cálculo: P = 3 x 1 x 6 x 1 = 18 y el número de réplicas será: r > 1 + (30/18) > 2,7 o r = 3.

3. Ejemplo de prueba en colaboración Envíense a cinco laboratorios cuatro concentraciones de un compuesto (4,3, 11,6, 23,4 y 32,7 mg/1), con instrucciones

para que se analicen por triplicado mediante el procedimiento suministrado. Tabular los resultados tal como se muestra en la tabla que se presenta á continuación (se indican los resultados para una única concentración). Dado que no existen valores claramente aberrantes (utilizar el método de la sección 1Q10B para rechazo de los valores extremos), hay que utilizar todos los datos. Calcúlese la media y la desviación estándar para cada laboratorio; utilícense los 15 resultados para calcular una media y una desviación estándar generales. La diferencia existente entre la media de cada laboratorio y la media general revela algunos sesgos significativos, como se aprecia para los laboratorios 1 y 3. La diferencia entre la media general y el valor conocido es el sesgo del método, por ejemplo, 33,0 - 32,7 = 0,3 mg/1 o 0,9 por 100. La desviación estándar relativa de la media general (1,5 mg/1) es 4,5 por 100, que es la precisión del método, y el valor de s para cada laboratorio es la precisión del operador. Tal como se aprecia en la tabla, la suma de las desviaciones desde el valor conocido para los laboratorios fue de 1.3, de modo que la desviación promedio (sesgo) fue 1,3/5 = 0,26, redondeado a 0,3, que es igual a la diferencia entre la media general y el valor conocido. Para las cuatro sustancias desconocidas en este examen, el porcentaje resultante indicó un crecimiento del sesgo y una disminución de la precisión conforme decrece la concentración. Por consiguiente, para describir el método con una enunciación formal, debería proporcionarse la precisión a partir de una línea recta según la fórmula y = mx + b; donde y es la desviación estándar relativa, m la pendiente de la línea, x la concentración y b la desviación estándar relativa para una concentración =J 0. Los valores establecidos a partir de la prueba en colaboración se muestran en la siguiente tabla.

INTRODUCCIÓN GENERAL

Estos resultados indican que el método es aceptable. Sin embargo, las concentraciones inferiores a 10 mg/1, aproximadamente, requieren especial atención en los análisis. 4.

Referencia

1. YOUDEN, W. J. & E. H. STEINER. 1975. Stalistical Manual of the AOAC. Assoc. Official Analytical Chemists, Washington, D.C.

1-29

1-30

MÉTODOS NORMALIZADOS

1050 EXPRESIÓN DE RESULTADOS

1050 A. En el presente texto se emplea el Sistema Internacional de Unidades (SI), y los resultados físicos y químicos se expresan en miligramos por litro (mg/1). Regístrense únicamente las cifras significativas. Cuando las concentraciones son por lo general inferiores a 1 mg/1, puede resultar más conveniente expresar los resultados en microgramos por litro (μg/l). Utilícese μg/1 cuando las concentraciones sean inferiores a 0,1 mg/1. Las concentraciones superiores a 10.000 mg/1 se expresan como porcenta-

Unidades jes, donde el 1 por 100 es igual a 10.000 mg/1 para un peso específico de 1,00. En muestras sólidas y residuos líquidos de alto peso específico, hay que realizar una corrección en caso de que los resultados se expresen como partes por millón (ppm) o porcentaje en peso:

TABLA 1050:1. FACTORES DE CONVERSIÓN* (Miligramos por litro—Miliequivalentes por litro)

* Los factores se basan en la carga iónica y no en las reacciones redox posibles para algunos de estos iones. Los cationes y aniones están clasificados de forma separada por orden alfabético.

INTRODUCCIÓN GENERAL

1-31

En estos casos, si el resultado se da en miligramos por litro, ha de declararse el peso específico. La unidad equivalente por millón (epm), o el término idéntico y menos ambiguo de miligramos-equivalentes, o miliequivalentes por litro (me/1), pueden resultar de gran valor en la realización de cálculos de tratamiento de aguas y en la comprobación de análisis por equilibrio entre aniones y cationes. La tabla 1050:1 presenta los factores para la conversión de concentraciones de iones comunes desde miligramos por litro a miliequivalentes por litro, y vicever-

1050 B.

sa. El término miliequivalente usado en esta tabla representa la porción 0,001 de un peso equivalente. El peso equivalente se define a su vez como el peso del ion (suma de los pesos atómicos que lo componen) dividido por el número de cargas normalmente asociadas con el ion particular. Los factores de conversión de resultados desde miligramos por litro a miliequivalentes por litro se calcularon mediante la división de la carga del ion por el peso del mismo. De modo inverso, los factores de conversión de resultados desde miliequivalentes por litro a miligramos por litro se calcularon mediante la división del peso del ion por su carga.

Elementos significativos

1. Requisitos de comunicación de resultados

Para evitar la ambigüedad en la comunicación de los resultados o en la presentación de las directrices de un procedimiento, es corriente la utilización de «elementos significativos». Todos los dígitos transmitidos en una comunicación de resultados han de ser claramente conocidos, con la salvedad del último dígito, que puede ser dudoso. De dicho número se dice que contiene únicamente elementos significativos. Si se aporta más de un dígito dudoso, el dígito adicional (o dígitos) no es significativo. Cuando se comunica un resultado como «75,6 mg/1», el analista debe estar bastante seguro del «75», aunque puede tener ciertas dudas sobre si el «,6» podría ser ,5 o ,7, o incluso ,8, en virtud de la inevitable incertidumbre del procedimiento analítico. Si se conociera una desviación estándar para un trabajo precedente de ± 2 mg/1, el analista podría, o debería, haber redondeado el resultado a «76 mg/1» antes de

comunicarlo. Por otro lado, si el método fuera tan bueno que pudiera haberse comunicado con seguridad un resultado de «75,61 mg/1», el analista no debería haberlo redondeado a 75,6. Comuníquense únicamente las cifras que estén justificadas por la exactitud del método. No debe seguirse la extendida práctica de poner el mismo número de cifras a la derecha de la coma decimal en las cantidades que figuran en una columna. 2.

Redondeo

Para redondear, se eliminan los dígitos que no sean significativos. Si se elimina un dígito de valor 6, 7, 8 ó 9, hay que aumentar el dígito precedente en una unidad; si el dígito eliminado es 0, 1, 2, 3 ó 4, no se altera el dígito precedente. Si se elimina el dígito 5, se redondea el dígito precedente al número par más próximo: así, 2,25 se convierte en 2,2, y 2,35, en 2,4.

1-32

3.

MÉTODOS NORMALIZADOS

Ceros ambiguos

El dígito 0 puede registrar un valor medido cero o servir simplemente como elemento de espaciado para situar la coma decimal. Si se comunica que el resultado de una determinación de sulfato es de 420 mg/1, el receptor del informe puede dudar sobre si el cero posee o no un valor significativo, ya que no se puede borrar. Si un analista calcula un residuo total de 1.146 mg/1, pero se da cuenta de que el 4 resulta dudoso en algunos casos y, por consiguiente, el 6 no tiene valor significativo, debe redondear la respuesta a 1.150 mg/l y comunicarla de esta manera, aunque tampoco en este caso será capaz e1 receptor de determinar si el cero es significativo o no. Aunque el número pueda expresarse como una potencia de 10 (por ejemplo, 11,5 x 102 o 1,15 x 103), esta forma no suele utilizarse, ya que podría no corresponderse con la expresión de resultados y provocar confusión. En la mayoría de los casos restantes no surgirán dudas sobre el sentido en que se usa el dígito 0. Resulta obvio que los ceros son significativos en números como 104 y 40,08. En un número escrito como 5.000, se entiende que todos los ceros son significativos, pues, en caso contrario, el número debería haber sido redondeado a 5,00, 5,0 ó 5, según lo que fuera más apropiado. En los casos en que el cero pueda resultar ambiguo se recomienda acompañar el resultado de una estimación de su incertidumbre. En ocasiones se eliminan ceros significativos sin una razón válida. Si se lee en una bureta «23,60 ml», debe registrarse como tal, y no como «23,6 ml». El primer número indica que el analista se ha tomado el trabajo de valorar la segunda cifra decimal; «23,6 ml» indicaría una lectura más bien descuidada de la bureta. 4.

Desviación estándar

Si un cálculo produce como resultado «1.476 mg/1» con una desviación están-

dar estimada de ±40 mg/1, deberá comunicarse como 1.480 ±40 mg/1. Sin embargo, si la desviación estándar se valora como ±100 mg/1, la respuesta debe redondearse aún más y comunicarle como 1.500± 100 mg/1. Mediante este sistema ye evita la ambigüedad, y el receptor del informe puede interpretar que los ceros son únicamente elementos de espaciado. Incluso en los casos en los casos en los que no se presenta el problema de la ambigüedad del cero, resulta útil mostrar la desviación estándar, pues proporciona una idea de la fiabilidad.

5.

Cálculos

Como regla práctica de funcionamiento, redondéese el resultado de un cálculo en el que se multipliquen o dividan varios números por el número de cifras significativas que integran el factor que cuenta con un número menor de cifras significativas. Suponer que deben realizarse los siguientes cálculos para obtener el resultado de un análisis: 56 u 0 ,003 462 u 43, 22 1,684

Una calculadora de 10 dígitos suministrará una respuesta de «4,975 740 998». Redondéese este número a «5,0», ya que una de las medidas que intervienen en el cálculo, 56, tiene únicamente dos cifras significativas. Así, fue innecesario medir los tres factores restantes con cuatro cifras significativas, ya que «56» es el «eslabón más débil de la cadena» y limita la exactitud de la respuesta. Si los tres factores restantes se hubieran medido sólo con tres, y no con cuatro cifras significativas, la respuesta no se habría visto afectada y el trabajo habría sido menor. Cuando se suman o restan números, el número que posee la menor cantidad de cifras decimales, y no necesariamente el de menos cifras significativas, establece el

1-33

INTRODUCCIÓN GENERAL

límite en el número de dígitos que pueden desplazarse justificadamente en la suma o la diferencia. Así, la suma

debe redondearse a «4.928», sin decimales, dado que uno de los sumandos, 4.886, no tiene cifras decimales. Adviértase que otro de los sumandos, 25,9, tiene sólo tres cifras significativas y que ello no limita el número de cifras significativas de la respuesta. La cuestión que se acaba de exponer se ha simplificado en exceso necesariamente. Para estudio más detallado se remite al lector a textos matemáticos especializados.

1060 TOMA Y CONSERVACIÓN DE MUESTRAS

1060 A. Según viejo axioma, el resultado de cualquier determinación analítica no puede ser mejor que la muestra sobre la que se hace. No resulta práctico detallar aquí todos los procedimientos específicos de toma de muestras, dada la gran variedad de propósitos y métodos analíticos, por lo que al lado de cada uno de ellos aparecerá una información más concreta. En el presente capítulo se expone una serie de consideraciones generales aplicables sobre todo a los análisis químicos. El objetivo de la toma de muestras es la obtención de una porción de material cuyo volumen sea lo suficientemente pequeño como para que pueda ser transportado con facilidad y manipulado en el laboratorio sin que por ello deje de representar con exactitud al material de donde procede. Este objetivo implica que la proporción o concentración relativa de todos los componentes serán las mismas en las muestras que en el material de donde proceden, y que dichas muestras serán manejadas de tal forma que no se

Introducción produzcan alteraciones significativas en su composición antes de que se hagan las pruebas correspondientes. La persona que recoge una muestra y la lleva a un laboratorio para realizar unas determinaciones específicas es responsable de su validez. Al trabajar con aguas limpias y residuales, el laboratorio suele dirigir u orientar el programa de la toma de muestras, que se determina tras consultar al destinatario de los resultados del análisis. Esta consulta es esencial para asegurar que la elección de las muestras y de los métodos analíticos proporcione una auténtica base para resolver los problemas que plantea la recogida de muestras. 1.

Precauciones generales

La obtención de una muestra que cumpla los requisitos del programa de toma y manipulación implica que aquélla no debe deteriorarse o contaminarse

1-34

antes de llegar al laboratorio. Antes de llenar el envase con la muestra hay que lavarlo dos o tres veces con el agua que se va a recoger, a menos que el envase contenga un conservante o un declorante. Según los análisis que deban realizarse, hay que llenar el envase por completo (en la mayoría de los análisis orgánicos), o dejar un espacio vacío para aireación, mezclas, etc. (análisis microbiológicos). En el caso de muestras que hayan de ser transportadas, lo mejor es dejar un espacio de alrededor del 1 por 100 de la capacidad del envase para permitir la expansión térmica. En las muestras que contienen compuestos orgánicos y vestigios metálicos hay que tomar precauciones especiales. Teniendo en cuenta que muchos de sus componentes pueden tener unas concentraciones de apenas algunos microgramos por litro, cabe la posibilidad de que se pierdan total o parcialmente si la recogida es defectuosa o no se toman las precauciones necesarias para su conservación. En algunos casos, sólo pueden obtenerse muestras representativas si se hacen mezclas de varias tomas obtenidas a lo largo de un determinado período o en muchos puntos distintos de recogida. Los detalles de la toma de muestras varían mucho según las condiciones locales, y no pueden hacerse recomendaciones específicas que sean de aplicación universal. A veces proporciona más información analizar numerosas muestras en lugar de una sola, ya que de este modo no se pierden los valores máximos y mínimos. La toma debe realizarse con cuidado, al objeto de garantizar que el resultado analítico represente la composición real. Entre los principales factores que influyen sobre los resultados se encuentran la presencia de materia suspendida o de turbidez, el método elegido para la recogida y los cambios físicos y químicos producidos por la conservación o la aireación. Es necesario tomar precaucio-

MÉTODOS NORMALIZADOS

nes especiales cuando en el procesado de muestras (división, mezcla, separación, filtrado) se han de analizar componentes residuales, sobre todo metálicos y compuestos orgánicos. Algunos análisis, en especial el de plomo, pueden quedar invalidados por alguna contaminación producida durante el procesado. Hay que tratar cada muestra de forma individual según las sustancias a analizar, la cantidad y naturaleza de la turbidez existente y otras condiciones que puedan influir en los resultados. No resulta práctico proporcionar directrices que abarquen todas las situaciones, pudiéndose dejar al juicio del analista la elección de la técnica idónea para conseguir que la muestra recogida sea homogénea. En general, se separa toda cantidad significativa de materia suspendida mediante decantación, centrifugación o filtración adecuada. A menudo es posible tolerar un grado pequeño de turbidez si se sabe por experiencia que ello no interferirá en los análisis gravimétricos o volumétricos y que puede corregirse su efecto sobre los análisis colorimétri-cos sobre los que potencialmente podría ejercer mayores interferencias. Si la turbidez es notable, hay que decidir si se filtra o no la muestra. Para medir la cantidad total de un componente, no hay que eliminar los sólidos suspendidos, sino tratarlos de forma adecuada. Hay que hacer un registro de todas las muestras recogidas e identificar cada envase, preferiblemente pegando una chapa o etiqueta debidamente señalada. Hay que registrar una información suficiente, de manera que se pueda realizar una identificación positiva de la muestra en fechas posteriores, y en esta información debe constar el nombre del que ha hecho la toma, la fecha, la hora y la localización exacta, la temperatura del agua y cualquier otro dato que pueda resultar necesario para establecer una correlación, como son las condiciones meteorológicas, el nivel del agua, la velocidad de la

1-36

2.

MÉTODOS NORMALIZADOS

Consideraciones sobre seguridad

Habida cuenta que los componentes de la muestra pueden ser tóxicos, durante la toma y la manipulación de las mismas hay que adoptar las precauciones adecuadas. Las sustancias tóxicas pueden penetrar a través de la piel y, en el caso de los vapores, a través de los pulmones. Puede producirse una ingestión accidental mediante un contacto directo con los alimentos o por adsorción de vapores por los mismos. Las precauciones pueden limitarse a llevar unos guantes o a proveerse de batas, delantales u otros sistemas de protección. Siempre hay que llevar una protección ocular. Cuando puedan existir vapores tóxicos, la toma de la muestra sólo se realizará en lugares bien ventilados o mediante el uso de un respirador o dispositivos afines. En el laboratorio, los envases se han de abrir en una campana de gases. Nunca deben colocarse alimentos cerca de las muestras o de los lugares de toma; lávense siempre las manos cuidadosamente antes de manipular alimentos1. Si existe la posibilidad de hallar compuestos orgánicos inflamables, se tomarán las adecuadas precauciones. Quedará prohibido fumar cerca de las muestras, de los lugares de toma y en el laboratorio. Manténganse alejadas de las muesiras y de los lugares de recogida las chispas, las llamas y las fuentes de calor excesivo. Evítese la acumulación de vapores inflamables en el refrigerador donde se conserven las muestras, pues los arcos eléctricos que se forman en los contactos del termostato, la luz de la puerta u otros componentes eléctricos pueden desencadenar un fuego o una explosión. Si se sospecha o se sabe que existen compuestos inflamables que han de ser refrigerados, se utilizarán sólo refrigeradores especialmente diseñados a prueba de explosión1.

Cuando existan dudas sobre la magnitud de las precauciones a adoptar, se

consultará con un especialista en sanidad industrial que posea los conocimientos adecuados. Las muestras con contaminantes radiactivos requieren otras medidas de seguridad; consúltese a un físico especializado en sanidad.

3. Tipos de muestras

a) Muestras de sondeo: Estrictamente hablando, una muestra recogida en un lugar y un momento determinados sólo puede representar la composición de la fuente en ese momento y lugar. Sin embargo, cuando se sabe que una fuente es bastante constante en su composición durante un periodo considerable o a lo largo de distancias sustanciales en todas direcciones, puede decirse que una muestra de dicha fuente representará un periodo de tiempo más largo o un volumen mayor o ambas cosas, con respecto al punto específico en el que fue recogida. En estas circunstancias, algunas fuentes pueden estar muy bien representadas por una simple muestra de sondeo. Es el caso de algunos suministros de agua, algunas aguas superficiales y, más raramente, algunas corrientes de aguas residuales. Cuando se sabe que una fuente varía con el tiempo, las muestras de sondeo recogidas a intervalos adecuados y analizadas por separado pueden mostrar la amplitud, la frecuencia y la duración de tales variaciones. Hay que hacer la recogida de las muestras teniendo en cuenta la frecuencia con que se esperan estos cambios, lo que puede variar desde cinco minutos a una hora o más. Las variaciones estacionales de los sistemas naturales pueden exigir la realización de tomas a lo largo de meses. Cuando la composición de la fuente varía en el espacio y no en el tiempo, hay que hacer la toma de las muestras en los lugares adecuados. Hay que tener gran cuidado al hacer tomas de muestras en aguas residuales impuras, orillas lodosas y fangos. No

INTRODUCCIÓN GENERAL

corriente, la manipulación posterior a la recogida, etc. La etiqueta debe tener espacio suficiente para que puedan ponerse las iniciales de todos los que asumen la custodia de la muestra y para la fecha y el momento del envío al solicitante. Hay que fijar los puntos de recogida mediante una descripción detallada, con mapas o con la utilización de postes, boyas o mojones que permitan su identificación por otras personas sin que éstas tengan que recurrir a la memoria de quién realizó la toma o tengan que ser guiadas al lugar. En los casos en que se prevea la utilización de los resultados de los análisis en litigios, deberán utilizarse procedimientos formales de «cadenas de custodia» (véase, más adelante, el apartado B.l), en los cuales se describirá el historial de la muestra desde su toma hasta el informe final. Las muestras calientes recogidas a presión deben ser enfriadas mientras se mantienen aún a dicha presión. Antes de recoger muestras de un sistema de abastecimiento, hay que dejar que el agua corra por las tuberías al objeto de asegurar que la muestra es representativa del suministro, teniendo en cuenta el diámetro y longitud de la conducción y la velocidad del flujo. La recogida de muestras de un pozo se hará después de haber bombeado una cantidad suficiente como para asegurar que la muestra representa al agua del subsuelo. A veces es necesario bombear a una velocidad determinada para conseguir un descenso de nivel que permita determinar las zonas de donde proviene el aporte al pozo. Se registrarán la velocidad de bombeo y el descenso del nivel. Cuando se analizan muestras recogidas en un rio o arroyo, los resultados pueden variar según la profundidad, la velocidad de la corriente, la distancia de la orilla y la separación entre ambas orillas. Si se dispone del equipo adecuado, se hará una toma «integral» desde la superficie al fondo en la zona media de la

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corriente o de un lado al otro a una profundidad media, de forma que la muestra esté integrada en relación con el flujo. Si sólo puede hacerse una toma pequeña, se hará en el centro de la corriente a una profundidad media. Los lagos y pantanos presentan considerables variaciones debidas a causas normales, como la estratificación estacional, la cantidad de lluvia caída, el desagüe y el viento. La elección del lugar, la profundidad y la frecuencia de las tomas de muestras se hará dependiendo de las condiciones locales y del objetivo del estudio. En cualquier caso, se evitará la espuma superficial. Para determinados componentes es muy importante el lugar en el que se recoge la muestra. Hay que evitar las áreas de turbulencia excesiva, a causa de la posible pérdida de componentes volátiles y presencia de vapores tóxicos. No hay que recoger muestras en vertederos, ya que su localización tiende a favorecer la obtención de compuestos no miscibles más ligeros que el agua. En general, la toma se hará bajo la superficie en áreas tranquilas. Si se necesitan muestras mezcladas, hay que tener cuidado de que al hacer la mezcla no se pierdan los componentes de las mismas a causa de una manipulación inadecuada de las partes que se están combinando. Por ejemplo, el vertido casual de las muestras en lugar de la adición de unas a otras mediante un sifón sumergido puede dar lugar a una volatilización innecesaria. Cuando sea preciso, se refrigerará la mezcla para minimizar la volatilización1. Utilícense sólo muestras representativas (o recogidas según el programa de toma de muestras) para hacer los análisis. La gran variedad de condiciones bajo las cuales han de hacerse las tomas hacen que resulte imposible recomendar un procedimiento único. En general, hay que tener en cuenta las pruebas o análisis que se van a realizar y el fin para el que se requieren los resultados.

INTRODUCCIÓN GENERAL

pueden recomendarse procedimientos definitivos, pero es preciso adoptar todas las precauciones posibles para conseguir que la muestra sea representativa o se ajuste al programa de toma. b) Muestras compuestas: En la mayoría de los casos, la expresión «muestras compuestas» se refiere a una mezcla de muestras sencillas recogidas en el mismo punto en distintos momentos. A veces se utiliza la expresión «compuesto-tiempo» para distinguir este tipo de muestras de otros. Las muestras compuestas-tiempo son las más útiles para determinar las concentraciones medias que se han de utilizar, por ejemplo, para calcular la carga o la eficiencia de una planta de tratamiento de aguas residuales. Como alternativa al análisis separado de un gran número de muestras seguido de la computadorización de los resultados medios y totales, las muestras compuestas representan un ahorro sustancial de trabajo y gasto de laboratorio. Con este objeto, se considera como estándar para la mayoría de los análisis una muestra compuesta que represente un período de 24 horas. Sin embargo, en determinadas circunstancias puede resultar preferible una muestra compuesta que represente una desviación, un período más corto o el ciclo completo de una operación periódica. Para valorar los efectos de descargas y operaciones especiales, variables o irregulares, han de recogerse muestras compuestas que representen los períodos en los que tienen lugar dichas circunstancias. Para determinar componentes o características sujetas a cambios importantes e inevitables durante la conservación, no deben utilizarse muestras compuestas. Los análisis de este tipo se harán en muestras individuales y lo más rápidamente posible después de su recogida, con preferencia en el mismo lugar de la misma. Ejemplos de este tipo de análisis son los de todos los gases disueltos, el cloro residual, el sulfuro soluble, la tem-

1-37

peratura y el pH. Los cambios en este tipo de componentes, como el oxígeno o el dióxido de carbono disueltos, la temperatura o el pH, pueden producir alteraciones secundarias en otros componentes inorgánicos, como hierro, manganeso, alcalinidad o dureza. Sólo se utilizarán muestras compuestas-tiempo para la valoración de componentes cuya inalterabilidad en las condiciones de toma y conservación de la muestra haya quedado comprobada. Las porciones individuales se recogen en envases de abertura amplia, con un diámetro de al menos 35 mm en la boca y con una capacidad de 120 ml como mínimo. Se recogen estas muestras cada hora (en algunos casos, cada media hora o incluso cada cinco minutos) y se mezclan una vez concluida la toma o se combinan en una sola botella a medida que se van recogiendo. Si se utilizan conservantes, éstos se añadirán inicialmente al envase de la muestra de forma que todas las porciones de la mezcla queden protegidas lo antes posible. A veces puede ser necesario analizar las muestras individuales. Resulta conveniente, y a menudo esencial, combinar las muestras individuales en volúmenes proporcionales al flujo. Un volumen final de muestra de dos a tres litros es suficiente para analizar depuradoras, corrientes y aguas residuales. Existen aparatos automáticos de toma de muestra, pero no deben utilizarse a menos que se conserve la muestra de la forma antes indicada. Hay que limpiar a diario los aparatos de toma, incluidos los envases, para eliminar el crecimiento de organismos biológicos y otros depósitos. c) Muestras integradas: En algunos casos, la información necesaria se obtiene mejor analizando mezclas de muestras individuales, recogidas en distintos puntos al mismo tiempo o con la menor separación temporal que sea posible. A veces, las muestras de este tipo se denominan integradas. Un ejemplo de la nece-

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MÉTODOS NORMALIZADOS

sidad de las mismas es el de los ríos o corrientes cuya composición varía según la anchura y la profundidad. Para valorar la composición media o la carga total, hay que recurrir a mezclas de muestras que representen distintos puntos de la sección transversal y que sean proporcionales a los flujos relativos. También puede ser necesario recurrir a muestras integradas cuando se proponen tratamientos combinados para varias corrientes distintas de aguas residuales, cuya interacción puede tener un efecto significativo sobre la tratabilidad o incluso sobre la composición. La predicción matemática de las interacciones puede resultar inadecuada o imposible, de manera que el análisis de una muestra integrada representativa puede proporcionar una información muy útil. Los lagos naturales y artificiales muestran variaciones en su composición, tanto en profundidad como en sentido horizontal. Sin embargo, en muchos casos ni los resultados totales ni los medios resul-

1060 B.

tan especialmente significativos; son más importantes las variaciones locales. En estos casos, en lugar de analizar muestras integradas, hay que estudiar muestras individuales. La preparación de muestras integradas suele precisar un equipo especial para hacer la toma a una profundidad conocida sin que ésta se mezcle con el agua de capas más superficiales. Suele ser necesario conocer el volumen, el movimiento y la composición de las distintas partes del agua a estudiar. Por tanto, la toma de muestras integradas es un proceso especializado y complejo que no puede describirse con detalle.

4.

Referencia

1. WATER POLLUTION CONTROL FEDERATION. 1986. Removal of Hazardous Wastes in Wastewater Facilities—Halogenated Organics. Manual of Practice FD-11, Water Pollution Control Fed., Alexandria, Virginia.

Toma de muestras

1. Procedimientos de cadena de vigilancia

Es esencial asegurar la integridad de la muestra desde su toma hasta la emisión del informe. Ello implica hacer una relación del proceso de posesión y manipulación de la muestra desde el momento en que fue tomada hasta el de su análisis y eliminación final. Este proceso se denomina cadena de vigilancia, y es importante en el caso de que los resultados deban presentarse en un litigio. Si no es éste el caso, el procedimiento de cadena de vigilancia resulta útil como control rutinario de la trayectoria de la muestra. Se considera que una muestra está bajo vigilancia personal si se encuentra

en posesión física de una persona, que es la que se encarga de custodiarla y de protegerla de posibles falsificaciones, o si se encuentra en una zona de acceso limitado al personal autorizado. A continuación se resumen los principales aspectos de la cadena de vigilancia. Existen descripciones más detalladas 1, 2. a) Etiquetado de la muestra: Utilícense etiquetas para evitar falsas identificaciones de la muestra. Suelen resultar adecuadas las etiquetas adhesivas o las chapas. En ella debe constar al menos la siguiente información: número de la muestra, nombre del que ha hecho la toma, fecha y momento de la toma y lugar de la misma

INTRODUCCIÓN GENERAL

Hay que adherir las etiquetas a los envases antes o en el momento de hacer la toma. La etiqueta se rellena con tinta indeleble en el momento de la toma. b) Sellado de la muestra: Se utilizarán sellos para detectar cualquier falsifica ción de la muestra que pueda hacerse antes del análisis. Se recurrirá para ello a sellos adhesivos de papel en los que conste al menos la siguiente información: número de la muestra (idéntico al número de la etiqueta), nombre del que ha hecho la toma y fecha y momento de la misma. También pueden utilizarse sellos de plástico. El sello se colocará de forma tal que sea necesario romperlo para abrir el envase. El sellado ha de realizarse antes de que el envase haya sido apartado de la vigilancia del personal que ha hecho la toma. c) Libro de registro de campo: Toda la información pertinente a un estudio de campo o toma de muestras se registrará en un libro en el que al menos constará lo siguiente: objeto de la toma, localización del punto donde se ha hecho, nombre y dirección del contacto de campo, productor del material del que se ha hecho la toma y dirección de dicho productor, en caso de que sea distinta de la del lugar de obtención de la muestra, y tipo de muestra. Si ésta procede de aguas residuales, hay que identificar el proceso que las produce. También es necesario hacer constar la posible composición de la muestra, incluyendo sus concentracio nes, el número y volumen de las muestras tomadas, la descripción del punto donde se ha hecho la toma y el método de la misma, la fecha y el momento de la toma, el número (o números) de identificación del que ha hecho la toma, referencias del lugar en forma de mapas o fotografías, observaciones y mediciones de campo y firmas del personal responsable de las observaciones. Dado que las situaciones de toma de muestras son muy variadas, no pueden darse reglas generales acerca

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de la información que debe registrarse en el libro, pero en cualquier caso conviene incluir la información suficiente como para que pueda reconstruirse la toma de muestra sin tener que confiar en la memoria del que la ha hecho. El libro de registro debe estar protegido y guardado en lugar seguro. d) Registro de la cadena de vigilancia: Es preciso rellenar el registro de la cadena de vigilancia que acompaña a cada muestra o grupo de muestras. Este registro debe constar de la siguiente informa ción: número de la muestra, firma del que ha hecho la toma, fecha, momento y lugar de la toma, tipo de la muestra, firma de las personas que han participado en la cadena de posesión y fechas de las distintas posesiones. e) Hoja de petición de análisis de la muestra: La muestra irá al laboratorio acompañada por una hoja de petición de análisis. La persona que hace la toma deberá cumplimentar el apartado del impreso referido al trabajo de campo, en el que se incluye gran parte de la informa ción pertinente anotada en el libro de registro. El apartado del impreso que corresponde al laboratorio deberá ser rellenado por el personal de éste, y consta de: nombre de la persona que recibe la muestra, número de la muestra en el la boratorio, fecha de recepción y análisis a realizar. f) Envió de la muestra al laboratorio: La muestra se enviará al laboratorio lo antes posible e irá acompañada del registro de la cadena de vigilancia y de la hoja de petición de análisis. La muestra se entregará a la persona que deba encargarse de su custodia. g) Recepción y almacenamiento de la muestra: En el laboratorio, la persona encargada recibe la muestra e inspecciona su estado y su sello, comprueba la información de la etiqueta y la del sello comparándolas con la del registro de la cadena de vigilancia, le asigna el número de laboratorio, la registra en el libro de

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MÉTODOS NORMALIZADOS

entrada al laboratorio y la guarda en una habitación o cabina de almacenamiento hasta que sea asignada a un analista. h) Asignación de la muestra para ser

analizada: En general, el supervisor del laboratorio es el que asigna la muestra para que sea analizada. Una vez en el laboratorio, el supervisor o el analista son los responsables del cuidado y la vigilancia de la muestra.

2.

Métodos de toma de muestras

a) Toma manual: En la torna manual se supone que no se utiliza equipo alguno, pero este procedimiento puede resultar demasiado costoso en tiempo y dinero para programas de toma rutinaria de muestras o a gran escala. b) Toma automática: Mediante la to ma automática se pueden eliminar los errores humanos en la manipulación, se reducen los costes laborales y se propor ciona la posibilidad de hacer tomas con mayor frecuencia 3, por lo que su uso está cada vez más extendido. Es preciso com probar que el aparato automático no contamine la muestra. Por ejemplo, los componentes plásticos pueden ser incompatibles con determinados compues tos orgánicos solubles en los plásticos. Si se sabe aproximadamente cuáles son los componentes de la muestra, el fabricante del aparato automático puede informar sobre las posibles incompatibilidades de los componentes plásticos. En algunos casos, lo mejor es hacer la toma manual con un envase de vidrio según un procedimiento que garantice la adecuada seguridad3. Los aparatos automáticos de toma de muestras se programan de acuerdo con las necesidades específicas de dicha toma. Hay que controlar con precisión la velocidad de bombeo y el tamaño de los tubos según el tipo de muestra que quiera recogerse.

3.

Envases de las muestras

El tipo de envase que se utilice tiene una importancia capital. En general, los envases están hechos de plástico 0 vidrio, y según los casos puede resultar j preferible uno u otro de estos materia es. Por ejemplo, el sílice y el sodio pueden lixiviarse en el vidrio pero no en el plástico, y los metales pueden dejar residuos absorbidos en las paredes de los envases de vidrio4. Para muestras que contienen compuestos orgánicos, sin embaírlo, conviene evitar los envases de plástico, salvo los fabricados con polímeros fluorados como el politetrafluoretileno (TF3)3. En el caso de muestras que contienen compuestos orgánicos volátiles, algunos de éstos pueden disolverse en las paredes de los envases de plástico o incluso pueden lixiviar sustancias de este «material. Los envases de plástico pueden degradarse y romperse. Algunos compuestos orgánicos son compatibles con el determinados plásticos (véanse las instrucciones de los fabricantes). Sin embargo, aunque se esté seguro de la compatibilidad, hay que tener en cuenta que las paredes dé los envases de plástico pueden resultar porosas para los compuestos orgánicos volátiles. En general, en estos casos es preferible utilizar envases de vidrio3. Los tapones de los envases, que suelen ser de plástico, también pueden plantear problemas al ponerse en contacto con componentes orgánicos. En estos casos se utilizarán de metal o de TFE. Los viales de suero con tabiques de plástico o goma recubierto de TFE pueden resultar útiles.

4.

Número de muestras

Teniendo en cuenta las variaciones aleatorias, tanto en los procedimientos analíticos como en la presencia de componentes en el lugar de la toma de la muestra, una sola de ellas puede resultar insuficiente para alcanzar el nivel de cer-

1-41

INTRODUCCIÓN GENERAL

tidumbre deseado. Si se conoce la desviación estándar global, el número necesario de muestras puede calcularse con la siguiente fórmula4:

donde: N = número de muestras, t = t de Student para un nivel de confianza determinado, s = desviación estándar global, y U = nivel de confianza aceptable.

Las curvas del tipo de las ilustradas en la figura 1060:1 ayudan a hacer el cálculo. Por ejemplo, si s es 0,5 mg/1, U es ± 0,2 mg/1 y se desea un nivel de confianza del 95 por 100, hay que recoger de 25 a 30 muestras.

5.

Para la mayoría de los análisis físicos y químicos se necesitan muestras de 2 1. Para determinadas pruebas pueden requerirse volúmenes mayores. En la tabla 1060:1 se muestran los volúmenes habituales necesarios para análisis. No debe usarse la misma muestra para estudios químicos (orgánicos e inorgánicos), bacteriológicos y microscópicos, pues los métodos de toma y manipulación de las mismas son distintos.

6. 1.

Figura 1060:1. Número aproximado de muestras necesarias para calcular una concentración media. Reproducido de: Methods for the Examination of Waters and Associated Materials: General Principles of Sampling and Accuracy of Results. 1980. Her Majesty's Stationery Off., Londres, Inglaterra.

Cantidad

Referencias

U.S. ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENCY. 1986. Test Methods for Evaluating Solid Waste: Physical/Chemical Methods, 3.a ed., publ. N.° SW-846, Office of Solid Waste and Emergency Response. Washington, D.C. 2. U.S. ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENCY . 1982. NEIC Policies and Procedures. EPA-330/9/78/001/-R (rev. 1982). 3. WATER P OLLUTION C ONTROL F EDERATION . 1986. Removal of Hazardous Wastes in Wastewater Facilities—Halogenated Organics. Manual of Practice FD-11, Water Pollution Control Fed., Alexandria, Virginia. 4. Methods for the Examination of Waters and Associated Materials: General Principles of Sampling and Accuracy of Results. 1980. Her Majesty's Stationery Off, Londres, Inglaterra.

1-42

MÉTODOS NORMALIZADOS

INTRODUCCIÓN GENERAL

1-43

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MÉTODOS NORMALIZADOS

INTRODUCCIÓN GENERAL

1060 C.

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Conservación de muestras

Una completa e inequívoca conservación de las muestras, sean éstas procede aguas residuales domésticas, residuos industriales o residuos naturales, es posible en la práctica. Con independencia de muestras de que se trate, nunca puede conseguirse la estabilidad todos sus componentes. En el menor de los casos, las técnicas de conservación sólo retrasarían los cambios químicos y biológicos que inevitablemente se producen después de la toma.

1. Conservación de la muestra antes del análisis

a) Naturaleza de los cambios de la muestra: Algunos análisis pueden verse 55 con mayor facilidad que otros de la conservación de la muestra. Algunos cationes se pierden por adsorción en las paredes de los envases de vidrio o por intercambio iónico con ellas. Entre estos cationes se encuentran el aluminio, el cadmio, el cromo, el cobre, el hierro, el plomo, el manganeso, la plata y el zinc, por lo que, en estos casos, es mejor utilizar un envase diferente y limpio, y acidificar con ácido nítrico hasta un pH inferior a 2,0 para reducir al máximo la precipitación y la adsorción en las paredes del envase. La temperatura cambia rápidamente; el pH puede cambiar de forma significativa en cuestión de minutos; los gases disueltos pueden perderse (oxígeno, dióxido de carbono). Hay que determinar, pues, la temperatura, el Ph y los gases disueltos en el momento de hacer la toma. Al cambiar el equilibrio pH-alcalinidad-dióxido de carbono, el carbonato de calcio puede precipitar y dar lugar a una disminución de los valores del calcio y de la dureza total.

El hierro y el manganeso son muy solubles en sus estados de menor oxidación, pero relativamente insolubles en sus estados de mayor oxidación; por tanto, estos cationes pueden precipitar o disolverse si se encuentran en un sedimento, dependiendo del potencial redox de la muestra. La actividad microbiológica puede ser la responsable de los cambios en el contenido de nitrato-nitrito-amoníaco, de la disminución en la concentración de fenol y de BOD, o de una reducción de los sulfatos a sulfitos. El cloro residual es reducido a cloruro. Pueden perderse por oxidación los sulfuros, los sulfitos, los iones ferrosos, el yoduro y el cianuro. Pueden aumentar, disminuir o cambiar de calidad el color, el olor y la turbidez. El sodio, el sílice y el boro pueden lixiviarse a partir del vidrio del envase. El cromo hexavalente puede ser reducido a ion crómico. Los cambios biológicos que se producen en una muestra pueden modificar el estado de oxidación de algunos de sus componentes. Los solubles pueden ser convertidos a materiales unidos orgánicamente en las estructuras celulares, o puede producirse una lisis celular que libere materiales celulares a la solución. Los bien conocidos ciclos del nitrógeno y del fósforo son ejemplos de influencias biológicas en la composición de una muestra. Para la conservación de muestras con orgánicos volátiles es importante que no existan espacios vacíos. Se evitará la pérdida de materiales volátiles si se hace la toma llenando por completo el envase con la muestra, para lo cual se hará rebosar aquél antes de taparlo o sellarlo. Los viales de suero con tapón tabicado son especialmente útiles, ya que a través de dicho tapón puede tomarse una porción de la muestra mediante una jeringa1.

1-46

MÉTODOS NORMALIZADOS

b) Intervalo de tiempo entre la toma y el análisis: En general, cuanto menor sea el tiempo que transcurre entre la toma de la muestra y su análisis, más fiable será el resultado del mismo. Para determinados componentes y valores físicos es necesario proceder a un análisis inmediato sobre el terreno. En el caso de muestras compuestas, es habitual considerar el momento en que se acaba de hacer la mezcla como el momento de toma de la muestra. Es imposible establecer con exactitud el tiempo máximo que puede transcurrir entre la toma de la muestra y su análisis; ello depende del carácter de la muestra, del tipo de análisis a realizar y de las condiciones de conservación. Los cambios debidos al crecimiento de microorganismos se retrasan mucho si se mantiene la muestra en la oscuridad y a baja temperatura. Cuando el intervalo entre la toma y el análisis es lo suficientemente largo como para producir cambios en la concentración o en el estado físico de los componentes a medir, se seguirán las instrucciones de conservación que se ofrecen en la tabla 1060:1. Se registrará el tiempo transcurrido entre la toma de la muestra y su análisis y, en el caso de que se haya añadido algún conservante, se identificará éste. 2.

Técnicas de conservación

Para reducir al máximo la posible volatilización o biodegradación entre el momento de hacer la toma y el de proceder al análisis, se debe mantener la muestra a la menor temperatura posible sin que llegue a congelarse. Lo mejor es empaquetar la muestra antes de enviarla en un recipiente con hielo molido o en cubitos o con sustitutos comerciales del hielo. No debe utilizarse hielo seco, pues éste congelaría la muestrario que podría provocar la rotura del vidrio del envase. El hielo seco puede, además, afectar al pH

de la muestra. Mientras se hace la mezcla, las muestras deben mantenerse con hielo o un sistema de refrigeración a 4°C. Las muestras se analizarán lo antes posible una vez llegadas al laboratorio. Si no es posible hacerlo de manera inmediata, se recomienda conservarlas a 4 °C en la mayoría de los casos1. Sólo se utilizarán conservantes químicos cuando se haya demostrado que no van a estropear el análisis. En caso de que se utilicen, deberán añadirse al envase antes de poner la muestra, de manera que todas las partes de ésta entren en contacto con el conservante en el momento en que sean recogidas. No existe ningún método de conservación que sea totalmente satisfactorio. El conservante debe elegirse en función de los análisis a realizar. Un método de conservación útil para un análisis determinado puede ser inadecuado para otros, por lo que a veces es necesario hacer varias tomas y conservarlas por separado para someterlas a análisis múltiples. Todos los métodos de conservación pueden ser inadecuados si se aplican a materias en suspensión. El formaldehído afecta a la mayoría de los análisis, por lo que no debe utilizarse. Los métodos de conservación son relativamente limitados, y están diseñados, en general, para retardar la acción de los microorganismos, retrasar la hidrólisis de los compuestos y complejos químicos y reducir la volatilidad de los componentes. Los métodos de conservación se limitan al control del pH, la adición de productos químicos, el uso de envases ámbar u opacos, la refrigeración, la filtración y la congelación. En la tabla 1060:1 se enumeran los métodos de conservación según los componentes. La exposición anterior no es en absoluto exhaustiva ni completa. Es claramente imposible dar reglas absolutas para evitar todas las alteraciones que puedan producirse. Al abordarse cada

1-47

INTRODUCCIÓN GENERAL

uno de los análisis concretos se encontrarán indicaciones adicionales, pero, en gran medida, la precisión de una valoración analítica se fundamenta en la experiencia y el buen juicio de la persona que hace la toma de la muestra. 3. 1.

4.

Bibliografía

Referencia WATER POLLUTION C ONTROL FEDERATION . 1986. Removal of Hazardous Wastes in

1070

KEITH, L. H., ed. 1988. Principles of Environmental Sampling. ACS Professional Reference Book, American Chemical Soc.

INSTRUMENTAL, REACTIVOS Y TÉCNICAS DE LABORATORIO 1070 A.

En la presente sección se exponen las necesidades de instrumental, reactivos y técnicas de laboratorio que son habituales en muchos de los análisis descritos en este manual. Las necesidades que son más o menos específicas para una valoración particular se describen junto al método con el que se utilizan. Deben observarse, además, las consideraciones gene-

1070 B. 1.

Wastewater Facilities—Halogenated Organics. Manual of Practice FD-11, Water Pollution Control Fed., Alexandria, Virginia.

Envases

Para uso general en el laboratorio, el material más adecuado es el vidrio de borosilicato*, muy resistente. Existen vidrios especiales con características tales como alta resistencia al ataque por álcalis, bajo contenido en boro u opacidad. Los tapones y tapaderas deben soportar bien el contacto con el material contenido en el envase. Los tapones de metal de rosca constituyen una opción inadecua* Pyrex, fabricado por Corning Glass Works; Kimax, Kimble Glass Co., División of Owens-Illinois, o equivalente.

Introducción rales que se presentan. Los requisitos de los métodos radiológicos, bacteriológicos, biológicos y de bioanálisis tienden a diferir en muchos aspectos de los que corresponden a pruebas químicas y físicas. Se presta especial atención a las descripciones de instrumental y procedimientos en las secciones que tratan de esos métodos.

Instrumental da para muestras capaces de corroerlos con facilidad. Los tapones de vidrio no resultan satisfactorios para líquidos muy alcalinos, dada su tendencia a adherirse con rapidez. Los tapones de goma resultan excelentes para los líquidos alcalinos pero son inaceptables para los disolventes orgánicos, en los que se desintegran, o para soluciones con metales residuales, a los que pueden contaminar. Utilícese politetrafluoretileno (TFE o PTFE)† para buretas que contengan líquidos fuertemente alcalinos. Cuando se considere † Teflón o equivalente.

1-48

adecuado, pueden utilizarse otros materiales, como porcelana, níquel, hierro, platino, acero inoxidable y vidrio rico en sílice ‡. Las muestras se recogen y se guardan en envases de vidrio de borosilicato, ebonita, plástico u otro material inerte que sea adecuado para cada tipo de análisis (tabla 1060:1). Para períodos de conservación relativamente cortos o cuando los componentes no se alteran por permanecer en envases de vidrio, como es el caso del calcio, el magnesio, el sulfato, el cloruro y quizás otros, resulta satisfactoria la botella para ácidos con cierre de campana de 2,5 1. Este tipo de cierre consiste en un disco de vidrio o polietileno que se ajusta a la superficie del vidrio o en un tapón de polietileno que se inserta en la boca de la botella asegurando una protección adecuada. Cuando una parte de la mezcla se destine a la determinación de la concentración de sílice, sodio u otras sustancias que pudieran resultar afectadas por un almacenamiento prolongado en vidrio blando, se colocará la parte a analizar en una botella pequeña de plástico, dejando el resto de la muestra en la botella de vidrio. Hay que limpiar cuidadosamente los envases de las muestras antes de cada uso. Las botellas de vidrio se lavan, salvo las que vayan a utilizarse para análisis de cromo o manganeso, bien con una mezcla limpiadora compuesta por 1 litro de H2SO2 conc. que se mezcla, lentamente y agitándolo, a 35 ml de solución saturada de dicromato de sodio, o bien con KMnO2 al 2 por 100 en una solución de KOH al 5 por 100 seguida de una solución de ácido oxálico. También se pueden emplear productos comerciales §.

‡ Vycor, fabricado por Corning Glass Works, o equivalente. § Nochromix, Godax Laboratories, Inc., Nueva York, o equivalente.

MÉTODOS NORMALIZADOS

Para eliminar la materia orgánica, se enjuagará el envase con otros ácidos concentrados. Los detergentes son excelentes limpiadores en muchos casos; pueden utilizarse éstos o HC1 conc. para limpieza de los envases de ebonita y plástico. Una vez limpios, se enjuagan con abundante agua de calidad para reactivos. Para transportarlos, los envases se empaquetan en cajas acolchadas de metal, plástico o fibra prensada, con un compartimento para cada una de las botellas. Las cajas se recubren con material aislante para evitar las roturas. Las muestras en envases de plástico no necesitan protección contra roturas provocadas por golpes o congelación.

2.

Material de vidrio para volumetría

El material de vidrio ha de ser calibrado, o bien se ha de conseguir un certificado de exactitud de un laboratorio competente. El material de vidrio pan volumetría se calibra bien para «contener» (C) o para «verter» (V). Esto último sólo se conseguirá de una forma exacta cuando su superficie interna está tan está tan escrupulosamente limpia que el agua la humedece inmediatamente y forma una capa uniforme al vaciarlo. Se usará, siempre que sea posible, vidrio de boroslilicato. Para trabajos de precisión se utilizará material de vidrio para volumetría de clase A. Los pesos y volúmenes deben medirse con cuidado cuando se preparen soluciones estándar y curvas de calibración. Estas mismas precauciones se mantendrán cuando se midan los volúmenes de las muestras. En caso de que el volumen se designe en el texto con dos cifras decimales (X,00 ml), se utilizarán pipetas o buretas para volumetría. Cuando se especifique, se emplearán matraces para; volumetría, y lo mismo se hará cuando el volumen se indique como 1.000 ml, y no como 1 l.

1-49

INTRODUCCIÓN GENERAL

3.

Tubos de Nessler

A menos que se indique lo contrario, se usarán tubos de Nessler de forma «alta» fabricados con vidrio resistente y seleccionados a partir de un proceso de estiramiento uniforme. El vidrio ha de ser claro e incoloro, y el fondo, plano y recto. Cuando el tubo está lleno de líquido y se observa desde arriba con una luz bajo, no deben aparecer puntos oscuros ni distorsiones ópticas. El extremo ha de ser plano, a ser posible pulido al fuego, y suficientemente liso como para que su tapa quede bien pegada al sellarse. Es posible conseguir tubos de Nessler con tapas cónicas de vidrio y con graduación estándar. Las marcas de graduación deben rodear por completo los tubos. Los tubos de 100 ml deben tener una longitud total de alrededor de 375 mm. Su diámetro interno tendrá unos 20 mm,

1070 C. 1.

Agua de laboratorio

Véase sección 1080. 2.

Calidad de los reactivos

Sólo se utilizarán reactivos de la mejor calidad de química, aunque ello no se indique cuando se describa un método determinado. La American Chemical Society ha publicado especificaciones «ACS» los productos químicos que deben solicitarse. Los demás productos químicos se pe-dirán como «reactivos para análisis» o como «disolventes orgánicos para análisis espectral». En los libros sobre especificaciones de reactivos citados en la bibliografía (véase más adelante el apartado 4) pueden encontrarse métodos pa-

y el externo, 24 mm. La marca de graduación debe estar lo más cerca posible de la medida de 300 mm por encima de la cara superior del fondo. Los tubos que se venden en lotes deben ser muy uniformes, de manera que esta distancia no varíe más de 5 mm. (En algunos lotes comerciales, la diferencia máxima entre los tubos no supera los 2 mm.) Es admisible una marca de graduación a 50 ml. Los tubos de 50 ml deben tener una longitud total de alrededor de 300 mm. Su diámetro interno ha de ser de aproximadamente 17 mm, y el extremo, de 21 mm. La marca de graduación debe estar lo más cerca posible de la medida de 225 mm por encima de la cara superior del fondo. Los tubos vendidos en lotes deben ser muy uniformes, de manera que esta distancia no varíe más de 6 mm. (En algunos lotes comerciales, la diferencia máxima entre los tubos no supera 1,5 mm.) Es admisible una marca de graduación a 25 ml.

Reactivos ra comprobar la pureza de los reactivos poco fiables. Por desgracia, muchos colorantes comerciales, para los cuales no se ha establecido el grado ACS, no cumplen exactamente las necesidades analíticas, a causa de variaciones en la respuesta de color de los distintos lotes. En estos casos, deben utilizarse colorantes certificados por la Biological Stain Commission. Cuando no se disponga de un colorante de grado ACS ni certificado por la Biological Stain Commission, se purificará el colorante sólido mediante recristalización. Las siguientes sustancias estándar, cuyas botellas van acompañadas de un certificado de análisis, son suministradas por el National Institute of Standards

1-50

and Technology (NIST)*, Department of Commerce, Washington, D.C., con el objeto de normalizar las soluciones analíticas:

En la Special Publication 260 (véase bibliografía) constan otros muchos centenares de estándares suministrados por el NIST. Una prueba satisfactoria de ditizona necesita reactivos de la mayor pureza. Se pueden conseguir cloroformo y tetracloruro de carbono cuyo grado se adapta a los métodos de la ditizona. Para los métodos de ditizona descritos en este manual se seleccionarán reactivos de esta calidad. Las sales de sodio hidrosolubles suelen recomendarse para la preparación de indicadores, debido a que pueden conseguirse con facilidad y su precio es razonable. Cuando la preparación de indicadores del tipo de la fenolftaleína requiera la utilización de alcohol o alcohol etílico, se empleará alcohol etílico al 95 por 100. Cuando se especifique el uso de alcohol isopropílico, la concentración será similar. Algunos reactivos orgánicos son algo inestables si quedan expuestos a la ac* Antes National Bureau of Standards (NBS).

MÉTODOS NORMALIZADOS

ción atmosférica. Si la estabilidad de un producto químico es limitada o se desconoce, se adquirirán lotes pequeños a intervalos frecuentes. Los reactivos anhidros necesarios para la preparación de soluciones estándar de calibración y tituladores se secan en una estufa a 105-110 °C durante al menos una o dos horas o, preferiblemente, durante una noche. Después de enfriarlos a la temperatura ambiente en un desecador eficaz, se pesa inmediatamente la cantidad necesaria para la solución. Si se requiere una temperatura de secado distinta, se especificará en cada producto químico concreto. El secado de sales hidratadas se realizará con mayor suavidad en un desecador de horno eficaz.

3. Soluciones habituales de ácidos y álcalis a) Unidades de concentración utilizadas: Las concentraciones de los reactivos se expresan en términos de normalidad, molaridad y volúmenes aditivos. Una solución normal (N) contiene un equivalente gramo de peso del soluto por litro de solución. Una solución molar (M) contiene el peso molecular en gramos de soluto por litro de solución. En volúmenes aditivos (a + b), el primer número, a, se refiere al volumen de reactivo concentrado, y el segundo, b, al volumen de agua destilada necesaria para la dilución. Por tanto, « 1 + 9 HC1» significa que se ha de disolver 1 volumen de HC1 concentrado en 9 volúmenes de agua destilada. Para hacer una solución de normalidad exacta de un producto químico que no puede ser medido como estándar primario, se prepara una solución madre relativamente concentrada y después se hace la dilución exacta a la concentración deseada. También puede hacerse una solución con una concentración lige-

INTRODUCCIÓN GENERAL

ramente mayor que la deseada, estandarizarla y hacer los ajustes necesarios de la concentración mediante dilución; otra posibilidad consiste en utilizar la solución como estandarizada primaria y modificarla por un factor de cálculo. Este último procedimiento es útil, sobre todo, con soluciones que cambian lentamente de concentración y que han de reestandarizarse a menudo, como, por ejemplo, la solución de tiosulfato de sodio. Cuando un laboratorio hace un gran número de análisis con una solución estándar, es recomendable realizar un ajuste a la normalidad exacta especificada. Los análisis se atendrán a las instrucciones de este manual siempre que la normalidad de una solución estándar no dé lugar a una titulación de volumen tan pequeña que impida la exactitud de la medición, o tan grande que provoque una dilución anormal de la mezcla de reacción, y siempre que la solución esté adecuadamente estandarizada y los cálculos sean correctos. b) Preparación y dilución de soluciones: Si se va a preparar una solución de normalidad exacta disolviendo una cantidad pesada de estándar primario o diluyendo una solución más concentrada, mídase el volumen exacto en matraz volumétrico. Prepárense soluciones madre y estándar exactas mediante determinaciones colorimétricas en matraces volumétricos. Cuando no sea necesario que la concentración sea exacta, se mezclará la solución concentrada o el sólido con cantidades medidas de agua, utilizándose cilindros graduados para hacer mediciones. En general, se produce un cambio significativo en el volumen cuando se mezclan soluciones concentradas, lo que hace que el volumen final sea menor que la suma de los utilizados. En el caso de diluciones aproximadas, los cambios de volumen no resultan significativos si las concentraciones son 6N o menores. Las disoluciones se mezclan con cuida-

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do y completamente. Uno de los motivos más frecuentes de error en los análisis en los que se utilizan soluciones estándar diluidas en matraces volumétricos procede de no conseguir una mezcla completa. c) Conservación de las soluciones: Al gunas soluciones estandarizadas se alteran lentamente debido a cambios químicos o biológicos. En estos estándares se indican la vida práctica, la frecuencia de estandarización necesaria y las precauciones de almacenamiento. Otras, como el HC1 diluido, no son reactivas. Sin embargo, también su concentración puede cambiar por causa de la evaporación, que no se evita con un tapón de vidrio. Los cambios de temperatura hacen que las botellas «respiren» y posibilitan cierto grado de evaporación. No debe considerarse válido un estándar de duración superior a un año, a menos que se reestandarice. Sólo será válido para ese período si las condiciones hacen que la evaporación sea mínima y si se ha demostrado previamente que la técnica de conservación es adecuada. Si la botella se abre a menudo o su contenido ocupa mucho menos de la mitad, en pocos meses se produce una evaporación significativa. Hay que comprobar la concentración de las soluciones estándar que han permanecido almacenadas. Utilícense botellas de vidrio de material químicamente resistente, salvo en el caso de que el vidrio sea incompatible (por ejemplo, soluciones de sílice). Para soluciones estándar que no reaccionen con el caucho o el neopreno, se utilizarán tapones de estos materiales; si se ajustan adecuadamente, estos tapones evitan la evaporación durante todo el tiempo que la botella permanezca cerrada. También son eficaces las botellas de tapón de rosca. Si la junta del tapón está hecha de un material suficientemente resistente, puede utilizarse para lo mismo que los tapones de caucho. d) Uso alternativo de los ácidos clorhídrico y sulfúrico: En varias técnicas se

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MÉTODOS NORMALIZADOS

utilizan soluciones estandarizadas de H2SO4 y de HC1. A menudo son intercambiables, y, cuando se menciona una, puede utilizarse la otra, siempre que se sepa que ello es posible. e) Preparación: Aunque en general las instrucciones describen la forma de preparar 1 l de solución, pueden prepararse volúmenes mayores o menores según las necesidades. Las instrucciones para la preparación de Í00 ml suelen limitarse a reactivos de corta vida o utilizados en cantidades pequeñas. Una útil regla general consiste en añadir una cantidad adicional de ácido o álcali concentrado al agua, agitando la solución en un vaso que pueda resistir el cambio brusco de temperatura, para diluirla a continuación hasta conseguir el volumen final una vez enfriada a temperatura ambiente. f) Concentraciones uniformes de reactivo: Se ha procurado establecer un determinado número de concentraciones habituales de ácidos y bases uniformes que pudieran servir para ajustar el pH de

1070 D. Existen numerosos trabajos tanto generales como específicos sobre técnicas analíticas (véase apartado 5, Bibliografía). 1.

intercambio iónico

Las resinas de intercambio iónico tienen un uso muy adecuado y flexible. Utilizadas en columnas de presión atmosférica o de alta presión, efectúan separaciones analíticas de iones orgánicos e inorgánicos. A menudo se presentan en forma de contra-iones de sodio o hidrógeno (unidos a la matriz) para los intercambiadores de cationes, y de contra-iones de cloro, sales fórmicas, acetato e hidróxido para los intercambiadores de aniones. El

las muestras antes de desarrollar el color o de la titulación final. Las siguientes concentraciones de ácido son las recomendadas para su empleo general en laboratorios: reactivo comercial concentrado, 6N, IN, 0,1 N y 0,02/V. Véase la contraportada para las direcciones de preparación de estas concentraciones de ácido, así como para las 15N, 6N y 1N de NaOH, y 5N, 3N y 0,2N de NH4OH.

4.

Bibliografía

R OSIN , J. 1967. Reagent Chemicals and Standards, 5.a ed. D. Van Nostrand Co., Princeton, Nueva Jersey. AMERICAN CHEMICAL SOCIETY. 1974. Reagent Chemicals—American Chemical Society Specifications, 5. a ed. American Chemical Soc., Washington, D. C. The United States Pharmacopoeia. 1975. 19.a rev. U.S. Pharmacopeial Convention Inc., Rockville, Maryland. NATIONAL BUREAU OF STANDARDS. 1988. Catalog of NBS Standard Reference Materials. Nat. Bur. Standards Spec. Publ. 260, 1988-89 ed.

Técnicas usuario puede sustituir otros contraiones pasando soluciones regeneradoras a través de la columna de resina según el procedimiento recomendado por los fabricantes. La forma de uso en cada caso específico depende no sólo de la afinidad relativa de la resina por los contra-iones y los iones simples, sino también de los iones que pueden ser aceptados en los casos en los que los iones concentrados de la muestra sean diluidos. Habitualmente se procede a una disolución secuencial de compuestos orgánicos mediante soluciones tampones cuidadosamente elegidas. En el análisis de agua pueden aplicarse los intercambiadores de iones a: a) la eliminación de los iones que producen interferencias, b) la determinación del

INTRODUCCIÓN GENERAL

contenido iónico total, c) la indicación del volumen aproximado de la muestra para algunas valoraciones gravimétricas, d) la concentración de cantidades residuales de cationes, y e) la separación entre aniones y cationes. En este manual se recomienda el uso de resinas de intercambio iónico para la eliminación de la interferencia en la determinación del sulfato y para la determinación del contenido iónico total. Siempre que pueda aplicarse el intercambio de iones a otras valoraciones, se hará una breve descripción de las operaciones habituales. a) Elección del método: El método de ... mezcla es satisfactorio en muestras de un volumen inferior a 100 ml, aunque no consigue la eliminación o intercambio completo de los iones. El método de la columna puede utilizarse con muestras de cualquier volumen. La técnica de la mezcla consiste en agitar la resina dentro de la muestra durante un tiempo tras el que se retira la resina mediante filtración. El método de la columna es más eficaz, ya que proporciona un contacto conti-nuo entre la muestra y la resina permitiendo una completa reacción de inter-cambio. La solución pasa lentamente por el lecho de resina y los iones son eliminados de la muestra en virtud de pautas cuantitativas, y no cualitativas. La diso-lución de la resina permite recuperar las sustancias intercambiadas.

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Erlenmeyer o un vaso de precipitación de 250 ml y se añade agua destilada suficiente para completar un volumen de 75 ml. Se añaden 2,0 g de resina de intercambio catiónico fuertemente acida y se agita a una velocidad moderada durante 15 minutos. Se filtra a través de un tapón de lana de vidrio colocado en el cuello de un embudo de vidrio de borosilicato de 10 cm. Cuando se ha completado la filtración, se lava la resina con dos porciones de 10 ml de agua destilada y se añade agua destilada hasta completar un volumen total de 100 ml. Para regenerar la resina, se coloca la utilizada en un matraz que contenga 500 ml de HNO3 3N. Cuando se ha acumulado suficiente resina, se lava en la columna (fig. 1070:1) y se regenera pasando HNO3 3N por la columna a una velocidad de 0,1-0,2 ml de ácido/ml de resina/minuto. Se utilizan alrededor de 21 ml de HNO3 3N/ml de resina en la columna. Por último, se lava la resina con suficiente agua destilada hasta que el pH del líquido efluente sea de 5 a 7, utilizan-

b) Procedimiento: Se utilizarán resinas especialmente fabricadas para aplica ciones analíticas. Se prepara el intercambiador de iones lavando la resina con varios volúmenes de agua desionizada (agua destilada de buena calidad), de manera que quede eliminada cualquier materia fina o colorante y otros materiales lixiviantes que puedan afectar a los posteriores procedimientos colorimétricos. 1) Método de mezcla para la eliminación de cationes. Se toma una parte de la muestra que contenga 0,1-0,2 miliequivalentes (me) de cationes en un matraz de

Figura 1070:1. Columna de intercambio iónico.

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do la misma velocidad de flujo que en el paso de regeneración. Se retira la resina de la columna y se guarda en agua destilada dentro de un envase de boca ancha. Si el agua se colorea durante el almacenamiento, se decanta y se sustituye por agua destilada fresca. Antes de utilizarla, se filtra la resina a través de un tapón de lana de vidrio colocado en el cuello de un embudo, se lava con agua destilada y se deja secar. De esta forma la resina está lista para ser utilizada. 2) Método de la columna para la eliminación de cationes. Se prepara la columna como se ilustra en la figura 1070:1 (longitud del lecho de resina, 21,5 cm; diámetro de la columna, 1,3 cm; representa alrededor de 21 ml o 20 g de resina). También pueden utilizarse otras columnas de intercambio de iones. Una de las más sencillas consiste en una bureta con un tapón de lana de vidrio colocado inmediatamente por encima de la llave. Para fabricar el tubo efluente de una bureta, se curva lentamente un tubo TFE de 3,1 mm de DI y 6,2 mm de DE hasta formar una S alargada; se curva en un ángulo de 45° con respecto a la parte recta, se asegura con tiras de goma o esparadrapo y se deja reposar al menos 48 horas para que pierda la tensión. Se repite la operación hasta conseguir la forma deseada. Los extremos curvados se sujetan con tiras de plástico de unos 2 cm x 100 cm x 2 mm con orificios de 4,7 mm dispuestos adecuadamente. (Cualquiera que sea el tipo de columna que se adopte, nunca se debe dejar que el nivel líquido de la misma descienda por debajo de la superficie superior de la resina, ya que el aire atrapado produce velocidades de flujo irregulares y deteriora la eficacia del intercambio iónico. Se ajustará la muestra y la columna a una misma temperatura.) La columna se carga removiendo la resina en un vaso de precipitados con agua destilada y lavando después cuidadosamente la suspensión según se va pa-

MÉTODOS NORMALIZADOS

sando a la columna llena de agua destilada a través de un embudo. Si es necesario, se lava la columna contraflujo introduciendo agua destilada por la parte inferior y haciéndola pasar hacia arriba hasta que queden eliminados todos los canales y burbujas de aire. Se conecta un embudo separador a la parte superior de la columna y se utiliza un matraz volumétrico invertido para introducir la muestra, regenerar o lavar las soluciones; hay que asegurarse de que el diámetro del cuello del matraz es bastante grande como para permitir la alimentación automática. Para una mayor eficiencia, se utilizarán pequeñas bombas peristálticas para colocar las soluciones en la columna. Se deja que la muestra fluya hacia el interior de la columna a una velocidad de 0,2 ml de solución/ml de resina/minuto. Una vez colocada la muestra en la columna, se lava la resina con agua destilada hasta que el líquido efluente tenga un pH de 5 a 7. Se utiliza un pH-neutro o tiras de papel indicador del pH para determinar el momento en que la columna ha quedado sin ácido. Para mayor comodidad, al lavar la columna o al adsorber cationes de la muestra de uno o más litros, se comienza esta operación antes de acabar el trabajo del día y se deja que el proceso de intercambio se realice durante la noche. La columna no se seca debido a su salida curva. Una vez retirada el agua destilada, se extraen los cationes adsorbidos haciendo pasar 100 ml de HNO3 3N a través de la columna a una velocidad de 0,2 ml de ácido/ml de resina/minuto. Teniendo en cuenta que un volumen de 100 ml de HNO 3 3N elimina cuantitativamente 3 me de cationes, se utilizarán incrementos adicionales de 100 ml de HNO3 3N para cantidades de iones adsorbidos que sobrepasen los 3 me. Tras la disolución, se lava la columna para extraer el ácido, utilizando agua destilada suficiente como para producir un líquido efluente con un pH de 5 a 7. El lavado se hace a la

INTRODUCCIÓN GENERAL

misma velocidad de flujo que en el caso de la disolución del ácido. La dilución de éste y el lavado regeneran la columna, dejándola preparada para un uso futuro. Las diluciones de ácidos combinados contienen los cationes que originariamente existían en la muestra.

2. Determinaciones colorimétricas a) Consideraciones generales: Muchas

técnicas se basan en la determinación del color con instrumentos colorimétricos. Para obtener los mejores resultados posibles, es imprescindible conocer los principios y limitaciones de estos métodos, sobre todo para elegir el instrumental y la técnica adecuados. Los métodos fotométricos no están exentos de limitaciones específicas. Un analista puede discernir si algo ha ido mal al ver un color o turbidez anómalos cuando hace la comparación visual; es fácil que esta discrepancia no sea detectada al hacer la lectura fotométrica, ya que el instrumento siempre lee un valor, sea éste coherente o no. Hay que comprobar a menudo la sensibilidad y la exactitud mediante el uso de soluciones estándar, de manera que puedan detectarse problemas eléctricos, mecánicos u ópticos en los aparatos. La comprobación, el mantenimiento y la reparación de los mismos pueden requerir conocimientos especializados. Un fotómetro no tiene una exactitud uniforme en toda la extensión de su escala de medida. En casos de absorbancia muy alta, la escala está saturada, de manera que un cambio considerable en la concentración relativa sólo produce cambios pequeños en la posición del indicador o de la aguja. Con una absorbancia muy baja, cualquier pequeña diferencia entre células ópticas, la presencia de humedad condensada, el polvo, las burbujas, las huellas dactilares o una ligera falta de reproducibilidad al colocar las célu-

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las pueden dar lugar a considerables cambios en las lecturas de las concentraciones. Las dificultades se minimizan si se hace que las lecturas caigan en una absorbancia de 0,1 a 1,0 diluyendo o concentrando la muestra o variando el paso de la luz y seleccionando células del tamaño adecuado. En cada uno de los métodos reseñados en el manual se hacen algunas sugerencias sobre las escalas y los pasos de luz adecuados, pero necesariamente debe confiarse mucho en el conocimiento y juicio del analista. Casi todos los fotómetros alcanzan sus mejores resultados en las lecturas de una absorbancia entre 0,1 y 1 con respecto a un blanco ajustado a una absorbancia de 0. Cuanto más se aproxime la lectura a 0 o 0,3, menos exacta será. Si no es posible utilizar una célula con un paso de luz suficientemente largo (lo que sucede con algunos instrumentos comerciales), concentrar más la muestra o elegir una prueba de color más sensible, puede resultar más exacto comparar colores muy tenues en tubos de Nessler que intentar una lectura fotométrica con una transmitancia próxima al 100 por 100. En general, la mejor longitud de onda o filtro es la que produce la mayor amplitud de lecturas entre un estándar y un blanco, lo que suele corresponder a un color visual para el haz de luz complementario al de la solución; por ejemplo, un filtro verde para una solución roja o un filtro violeta para una solución amarilla. Los poderes de absorción (absorcibidades) son útiles para comparar las sensibilidades de los métodos y para calcular la concentración de las soluciones absorbentes, como la ditizona. Puede calcular la absorción según la ley de Beer de la forma siguiente:

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MÉTODOS NORMALIZADOS

donde: a = Poder de absorción, l/(g · cm), A = absorbancia de una solución, sin dimensiones, b = concentración, g/1, y c = longitud de paso de la célula, cm.

El uso de un instrumento fotoeléctrico hace innecesaria la preparación de lotes completos de estándar para cada lote de muestras a analizar. Sin embargo, debe prepararse un reactivo blanco que contenga agua destilada y todos los reactivos y, al menos, un estándar en el extremo superior de los límites óptimos de concentración para cada grupo de muestras a fin de comprobar la constancia de la curva de calibración. Esta precaución servirá para poner de manifiesto cualquier cambio inesperado en los reactivos, en el instrumento o en la técnica. A intervalos regulares, o cuando aparezca algún resultado dudoso, se preparará un lote completo de estándares (al menos cinco o seis para cubrir los límites óptimos de concentración), al objeto de comprobar la curva de calibración. A este respecto también es útil la información sobre el poder de absorción que se incluye en el presente manual en relación con diversos métodos fotométricos. Hay que comprobar a menudo la exactitud de las curvas o los estándares permanentes comparándola con la de estándares preparados en el laboratorio mediante el uso de los mismos lotes de reactivos, instrumentos y métodos utilizados para el análisis de las muestras. Por muy precisas que sean las curvas de calibración permanente o estándares preparadas por el fabricante, pueden no ser válidas en las condiciones concretas de uso. Los estándares permanentes pueden sufrir un apagamiento o alteración del color, y su validez puede depender también de determinadas condiciones arbitrarias de iluminación. Es posible que los estándares y las curvas de calibración sean incorrectos a causa de pequeñas di-

ferencias entre los reactivos, instrumentos o técnicas que ha utilizado el fabricante y los que se emplean en el laboratorio de análisis. El instrumento ha de ponerse a cero mediante un reactivo blanco o, si es necesario, con agua destilada. No poner nunca a cero con un blanco de muestra. Determínese la absorción en comparación con las concentraciones de los estándares para establecer una curva de trabajo y el grado de igualdad con la ley de Beer. Si las lecturas se efectúan en porcentaje de transmitancia, habrán de convertirse en valores de absorbancia antes de consignarse en papel logarítmico. Existen varios métodos para eliminar la eventual turbidez de la muestra. La elección del que se vaya a utilizar depende de la naturaleza de la muestra, el tamaño de las partículas suspendidas y las razones por las que se lleva a cabo el análisis. Puede por ejemplo coagularse añadiendo sulfato de zinc y una base, como se hace en el método directo de nesslerización para el nitrógeno amónico en forma de amoníaco. En muestras de turbidez relativamente manifiesta puede ser suficiente con centrifugar. En algunos casos es posible utilizar filtros de fibra de vidrio, filtros de papel o filtros de vidrio sinterizado de poro fino. Cuando el tamaño de las partículas es muy reducido, los filtros de membrana pueden proporcionar el necesario grado de retención. Utilizados de forma adecuada, cada uno de estos métodos permitirá obtener resultados satisfactorios. Sin embargo, debe recordarse siempre que no existe un único medio ideal para eliminar la turbidez. Además, hay que operar con la máxima atención ya que todos los procedimientos de filtrado o de floculación pueden determinar pérdida de adsorción. Si no es posible eliminar la turbidez sin comprometer la integridad de la muestra, habrá que realizar una compensación fotométrica para corregir la interferencia. Se medirá la muestra sin añadir

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INTRODUCCIÓN GENERAL

reactivos (blanco de muestra) comparándola con un blanco de reactivo o con agua destilada para determinar la respuesta del instrumento. La respuesta se debe a la absorción de la muestra o a la turbidez originada por elementos distintos del que se va a determinar. Ténganse en cuenta los cambios de volumen derivados de la no inclusión de reactivos. Si la curva de calibración es lineal, puede sustraerse la absorción del blanco de muestra de la absorción de la muestra antes de consignar la concentración o puede computarse la concentración para el blanco de muestra y sustraerla de la de la muestra analizada. Si se utiliza una calibración no lineal, se computará la concentración del blanco de muestra y se restará de la concentración de la muestra analizada. En este caso no es correcto sustraer el valor de absorbancia. Al desarrollar la técnica, gradúese el cero del instrumento utilizando un blanco de turbidez o, de manera alternativa, determínese la absorbancia de este blanco comparándola con la de un blanco de reactivo o con la del agua destilada, y después réstese de la absorbancia de la muestra. Como en el caso anterior, han de corregirse las diferencias de volumen causadas por la inclusión o no de nuevos reactivos. b) Soluciones de ditizona: En varios métodos colorimétricos para metales (Cd, Pb, Hg, Ag, Zn) se utiliza ditizona (difeniltiocarbazona) como extracto coloreado y formador de complejos metálicos. Los métodos que se expondrán más adelante en este texto se basan en tres soluciones madres de ditizona cuya preparación también se describe. La concentración de ditizona en la solución madre se lleva a cabo a partir de un reactivo de ditizona del 100 por 100 de pureza. Algunos preparados comerciales de ditizona están contaminados por el producto de oxidación difeniltiocabodiazona o por metales. Purifíquese la ditizona de la forma que se indica más adelante. Para so-

luciones de ditizona de concentración no superior al 0,001 por 100 (p/v), calcúlese la concentración exacta dividiendo la absorbancia de la solución en una célula de 1,00 cm a 606 nm por 40,6 x 103, la absorcividad o poder de absorción molar. Ajústense las diluciones de las soluciones madre de ditizona hasta conseguir soluciones de trabajo de la concentración deseada, teniendo en cuenta la concentración determinada en la solución madre. 1) Solución madre de ditizona I, 100 mg de ditizona/1.000 ml de CHC13: disuélvanse 100 mg de ditizona en 50 ml de CHC13 en un matraz de 150 ml y fíltrese a través de un papel de 7 cm de diámetro *. Recójase el filtrado en un embudo separador de 500 ml o en un Erlenmeyer de 125 ml a un vacío ligero. Utilícese un dispositivo de filtración que permita manipular el vapor de CHC13. Lávese el matraz con dos porciones de 5 ml de CHCI3 que se filtran. Lávese el papel con tres porciones de 5 ml de CHC13, añadiendo la porción final gota a gota por el borde del papel. Si se ha filtrado a un matraz, pásese el CHC13 a un embudo separador de 500 ml. Añádase 100 ml 1 + 99 de NH4OH al embudo de separación y agítese moderadamente durante un minuto; una agitación excesiva produce emulsiones que tardan en desaparecer. Manténganse separadas las capas moviendo suavemente el embudo para sumergir las gotitas de CHC13 que hayan quedado sobre la superficie de la capa acuosa. Transfiérase la capa de CHC13 a un embudo de separación de 250 ml manteniendo la capa acuosa rojo-anaranjada en el embudo de 500 ml. Repítase la extracción, colocando la capa de CHC13 en otro embudo de separación de 250 ml y pásese la capa acuosa, utilizando NH 4 OH 1 + 99 al * Whatman n.° 42, o equivalente.

MÉTODOS NORMALIZADOS

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embudo de 500 ml que contenía el primer extracto. Trasládese la capa acuosa a un embudo de 500 ml después de repetir la operación. Deséchese la capa de CHC13. Para combinar los extractos en el embudo de separación de 500 ml, añádase 1 + 1 de HC1 en porciones de 2 ml, mezclando después de cada adición hasta que la ditizona precipite y la solución pierda su color rojo-anaranjado. Extráigase el precipitado de ditizona con tres porciones de 25 ml de CHC13. Finalmente dilúyanse los extractos combinados hasta 1.000 ml con CHC1 3 ; 1,00 ml = 100 μg de ditizona. 2) Solución madre de ditizona II, 250 mg de ditizona/250 ml de CHC13: disuélvanse 250 mg de ditizona en 50 ml de CHCl 3 en un matraz de 150 ml y fíltrese con un papel de 7 cm de diámetro*. Recójase el filtrado en un embudo de separación de 1.000 ml o en un Erlenmeyer de 125 ml con un vacío ligero; utilícese un dispositivo de filtración que permita manipular el vapor de CHC13. Lávese el matraz con dos porciones de 5 ml de CHC13 y fíltrese. Lávese el papel con tres porciones de 5 ml de CHC13, añadiendo la última gota a gota en el borde del papel. Si se ha filtrado a un matraz, pásese el CHC13 a un embudo de separación de 1.000 ml. Añádanse 200 ml de NH4OH 1 + 99 al embudo de separación y agítese moderadamente durante un minuto; una agitación excesiva produce unas emulsiones que tardan en desaparecer. Manténganse separadas las capas moviendo suavemente el embudo de separación para sumergir las gotitas de CHC13 que hayan quedado sobre la superficie de la capa acuosa. Transfiérase la capa de CHC13 a un embudo de separación de 500 ml, manteniendo la capa acuosa rojo-anaranjada en el embudo de 1.000 ml. Repí* Whatman n.° 42. o equivalente.

tase la extracción de la capa de CHC13 con 200 ml de NH4OH 1 + 99 pasando la capa de CHC13 a otro embudo de separación de 500 ml. Pásese la capa acuosa a un embudo de separación de 1.000 mi que contenía el primer extracto. Realícese de nuevo la extracción con una tercera porción de 200 ml de NH 4 OH 1 + 99. Deséchese la capa de CHC13 y pásese la capa acuosa a un embudo de 1.000 ml. Añádanse porciones de 4 ml de HCl 1 + 1 a los extractos combinados, mezclando después de cada adición, hasta que la ditizona precipite y la solución pierda el color rojo-anaranjado. Extráigase el precipitado de ditizona con cuatro porciones de 25 ml de CHC13. Diluyanse los extractos combinados a 250 ml con CHC13; 1,00 ml = 1.000 μg de ditizona. 3) Solución madre de ditizona III, 125 mg de ditizona/500 ml CC14: disuélvanse 125 mg de ditizona en 50 ml de CHC13 y procédase como en el caso de la solución II pero extrayendo el precipitado de ditizona con porciones de 25 ml de CC14. dilúyanse los extractos de CC14 a 500 ml; 1,00 ml = 250 μg de ditizona (PRECAUCIÓN: el CCl4 es tóxico, evitar su inhalación, ingestión y contacto con la piel.) 3.

Otros métodos de análisis

El uso de otros métodos instrumentales de análisis no descritos específicamente en el presente manual es admisible siempre que los resultados que se obtengan se comprueben de manera periódica, bien en comparación con uno de los métodos estándar expuestos o con una muestra estándar de composición fiable y contrastada. En el informe de laboratorio hay que especificar, junto a los resultados del análisis, cuál ha sido el método instrumental utilizado. a) Espectrometría de absorción atómica: La espectrometría de absorción ató-

INTRODUCCIÓN GENERAL

mica se ha aplicado a la determinación de metales en el agua, sin necesidad de concentración o tratamientos previos de la muestra. El uso de disolventes orgánicos junto con llamas de oxiacetileno, oxihidrógeno u óxido nitroso-acetileno permite la determinación de metales que forman óxidos refractarios. Entre las técnicas más generalizadas se encuentran métodos de absorción atómica, incluidos algunos sin llama y electrotérmicos (grafito calentado). b) Fotometría de llama: La fotometría de llama se utiliza para determinar sodio, potasio, litio y estroncio. c) Plasma de acoplamiento inductivo (PAI) y sistemas analíticos afines: Se sugiere utilizar PAI para la detección de varios iones metálicos, sobre todo cuando se desconoce si pueden existir posibles interferencias en las técnicas colorimétricas. El PAI ha permitido la determinación de muchos metales a concentraciones de pocos microgramos por litro al reducir a cenizas con HNO3 muestras de 100 ml. También las técnicas de polarografía, como la polarografía por impulsos, la voltametría diferencial por impulsos y la voltametría anódica diferencial de bandas por impulsos, están siendo cada vez más utilizadas para la determinación y especificación de metales pesados en aguas limpias y residuales. Un método muy próximo a la polarografía es la titulación amperométrica, adecuada para determinar cloro residual, dióxido de cloro y yodo, junto con otros métodos yodométricos. d) Titulación potenciométrica: Muchos métodos titulométricos pueden llevarse a la práctica potenciométricamente utilizando milivoltímetros o pH-metros, con electrodos adecuados. e) Electrodos selectivos de iones: Existen electrodos selectivos de iones que permiten una rápida valoración de ciertos componentes del agua. Estos electrodos funcionan de forma óptima en com-

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binación con un pH-metro de escala ampliada o con un milivoltímetro adaptado. En su mayoría, los electrodos operan bajo el principio del intercambio iónico. Existen en la actualidad electrodos selectivos de iones diseñados para medir amoníaco, cadmio, calcio, cobre divalente, dureza del agua, plomo, potasio, plata, sodio, cationes monovalentes y divalentes totales y aniones de bromo, cloro, cianuro, flúor, yodo, nitrato, perclorato y sulfuro, entre otros. Estos aparatos sufren distintos grados de interferencia con otros iones contenidos en la muestra y muchos han de ser aún sometidos a minuciosos estudios antes de ser propuestos y adoptados como métodos estándar. Sin embargo, su valor para el desarrollo de actividades de control es evidente. A fin de eliminar las dudas que puedan existir sobre las variaciones de fiabilidad, debe comprobarse cada electrodo en presencia de interferencias así como con el ion para el que está destinado. En este manual se detallan varios métodos que emplean electrodos. Por su parte, las sondas comerciales de oxígeno disuelto (OD) muestran considerables variaciones de fiabilidad y necesidades de mantenimiento. A pesar de estos inconvenientes, se han aplicado a la monitorización de OD en distintas aguas limpias y residuales. Casi todas ellas llevan un electrodo fijado mediante una membrana permeable al oxígeno. El OD en la solución difunde a través de la membrana y de la capa electrolítica y reacciona con el electrodo, induciendo una corriente proporcional a la actividad y, por tanto, en soluciones de concentración iónica baja o constante, esencialmente proporcional a la concentración de OD. Existen también electrodos de OD sin membrana que ofrecen resultados satisfactorios. En cualquier caso, se debe mantener la superficie del sensor de OD bien agitada y con una compensación de la temperatura que asegure la consecución de datos fiables.

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MÉTODOS NORMALIZADOS

f) Cromatografía de gases (CG) y cromatografía de gases/espectrometría de masas (CG/EM): Son muchos los métodos de CG y de CG/EM para el análisis de aguas limpias y residuales. En el presente manual aparecen los destinados a la determinación de los pesticidas de hidrocarburos clorados, los componentes de gases digestores de bolos, fenoles, volátiles, PAH y compuestos causantes de olores y sabores así como análisis CG/EM generalizados para sustancias volátiles y extractos ácidos o básicos/ neutros. g) Análisis de flujo continuo: Se presentan técnicas automatizadas para cloruros, fluoruros, nitrógeno (amoníaco), nitrógeno (nitratos), fosfatos, sílice y sulfatos. h) Cromatografía de iones (CI): La cromatografía de iones es una técnica para la determinación escalonada de aniones o cationes utilizando intercambio iónico y conductividad, detectores amperométricos o colorimétricos. Véase la sección 4110 para la técnica generalizada para aniones. i) Otros métodos de análisis: Continuamente se asiste al desarrollo de nuevas técnicas instrumentales y métodos analíticos. El analista debe estar al corriente de estos progresos. Con regularidad se publican revisiones de cada rama de la química analítica en Analytical Chemistry y una revisión anual de la literatura referida al tema en Journal Water Pollution Control Federation.

4.

Control de interferencias

Muchos de los métodos analíticos están sujetos a interferencias ocasionadas por sustancias que se encuentran en la muestra. Las más frecuentes son bien conocidas y de ellas se proporciona una detallada información junto a cada uno de los métodos concretos. Es inevitable, sin embargo, que existan interferencias

desconocidas e inesperadas. Ello se debe a la diversidad de naturaleza de las aguas y, sobre todo, de las aguas residuales. Por tanto, es necesario prestar atención a los componentes hasta ahora no detectados, los nuevos compuestos de tratamiento (en especial los agentes combinantes) y los nuevos residuos industriales y su potencial amenaza contra la exactitud de los análisis químicos. Cualquier cambio en la aparente composición de un agua que se haya mantenido constante con anterioridad, cualquier color anormal observado en una prueba colorimétrica o durante una titulación, cualquier turbidez, olor u otro hallazgo insólito deben despertar sospechas. Estos cambios pueden ser debidos a variaciones normales en las concentraciones relativas de los componentes habituales, pero también pueden ser consecuencia de la introducción de una sustancia nunca antes observada. Algunas sustancias tales como el cloro y el dióxido de cloro, la alumbre, las sales de hierro, los silicatos, el sulfato de cobre, el sulfato de amonio y los polifosfatos, son utilizadas con tal profusión que merecen especial atención como posibles causas de interferencia. De todas ellas, la más perniciosa probablemente sea el cloro, ya que blanquea o altera los colores de muchos reactivos orgánicos sensibles que se utilizan como indicadores de titulación y como reveladores de color en métodos fotométricos. Entre los métodos que han demostrado su eficacia en la eliminación de los residuos de cloro se encuentran la adición de mínimas cantidades de sulfuro, tiosulfato o arseniato, la exposición a la luz del sol o a la luz ultravioleta artificial y la conservación prolongada. Siempre que se encuentre o se sospeche de una interferencia y no existan recomendaciones específicas para evitarla, es necesario determinar qué técnica —si es que hay alguna— puede eliminarla sin afectar al propio análisis. Cuando existan

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INTRODUCCIÓN GENERAL

dos o más opciones metodológicas, habrá que establecer cuál es el procedimiento que afecta en menor medida a los resultados. Si distintos procedimientos dan lugar a resultados considerablemente diferentes, es probable que exista una interferencia. La importancia de algunas de estas interferencias puede atenuarse si se diluye la muestra o se utilizan cantidades más pequeñas; cualquier tendencia de los resultados a aumentar o disminuir de manera constante el diluir la muestra indica que es probable que exista una interferencia. a) Tipos de interferencia: Las interferencias pueden hacer que los resultados analíticos sean demasiado altos o demasiado bajos a consecuencia de alguno de los fenómenos siguientes: 1) Una sustancia de interferencia puede reaccionar como si fuera la sustancia buscada produciendo, por tanto, un resultado elevado; por ejemplo, el bromuro arroja títulos similares a los del cloruro. 2) Puede reaccionar con la sustancia buscada produciendo, en consecuencia, un resultado bajo. 3) Puede asimismo combinarse con el reactivo analítico y evitar que reaccione con la sustancia buscada; por ejemplo, el cloro destruye muchos indicadores y reactivos reveladores del color. Casi todas las interferencias corresponden a uno de estos tipos. Por ejemplo, en un método fotométrico, puede considerarse que la turbidez actúa como la sustancia que ha de determinarse; reduce, pues, la transmisión de la luz. Dos o más sustancias interferidoras pueden asimismo reaccionar de forma no aditiva y cada una de ellas contrarrestar o potenciar los efectos de las demás. b) Anulación de las interferencias: La opción preferencial para minimizar las interferencias es eliminar la sustancia que las produce o convertirla en inocua mediante alguno de los siguientes métodos:

1) Eliminar físicamente la sustancia buscada o la que produce la interferencia. Por ejemplo, destilar el fluoruro o el amoníaco dejando la interferencia. También es posible absorber las interferencias mediante una resina de intercambio iónico. 2) Ajustar el pH de forma que la única sustancia que reaccione sea la buscada; por ejemplo, ajustando el pH a 2, los ácidos volátiles desaparecerán de la solución. 3) Oxidar (digestión) o reducir la muestra hasta convertir a la interferencia en una forma inactiva. Por ejemplo, reducir el cloro o cloruro añadiendo tiosulfato, o digerir muestras para análisis mediante espectrometría de absorción atómica con alguno de los distintos reactivos que destruyen la materia orgánica. 4) Añadir un agente adecuado que se una a la sustancia que produce la interferencia de manera que, aunque persista, sea inocua. Por ejemplo, combinar el hierro con pirofosfato para evitar que interfiera con la determinación de cobre; combinar el cobre con cianuro o con sulfuro para evitar que interfiera con la determinación titulométrica de la dureza. 5) Puede utilizarse una combinación de las cuatro técnicas. Así, por ejemplo, pueden destilarse los fenoles de una solución acida para evitar que se destilen las aminas o puede utilizarse tiosulfato en el método de la ditizona para el zinc a fin de evitar la mayoría de los metales que pueden interferir pasando a la capa de CC14. 6) A veces es posible eliminar el color y la turbidez reduciendo a cenizas por métodos secos o húmedos o utilizando un agente floculante. Algunos tipos de turbidez pueden eliminarse mediante filtración. Sin embargo, estos procedimientos introducen el peligro de que también se elimine el componente objeto del análisis. c)

Compensación de la interferencia:

Si no puede utilizarse ninguna de estas

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MÉTODOS NORMALIZADOS

técnicas, habrá de recurrirse a otros métodos de compensación: 1) Si el color o la turbidez inicialmente presentes interfieren en una determinación fotométrica, es posible utilizar la compensación fotométrica. La técnica se describe en la sección 1070D.2a. 2) Es posible determinar la concentración de las sustancias que producen la interferencia y añadir idénticas cantidades a los estándares de calibración, aunque ello supone una gran cantidad de trabajo. 3) Si la interferencia no sigue aumentando a medida que lo hace la concentración de la sustancia que la produce, sino que tiende a estacionarse en un determinado nivel, se puede añadir una gran cantidad de dicha sustancia a todas las muestras y a todos los estándares. Esta técnica se conoce como «inundación». 4) Puede por fin determinarse la presencia de la sustancia buscada en los reactivos químicos llevando a cabo una determinación de blanco.

(reimpresión), Robert E. Krieger Publishing Co., Melbourne, Florida. PECSOK, R. et al. 1976. Modern Methods of Chemical Analysis, 2.a ed. John Wiley & Sons, Nueva York. VOGEL, A. I. 1978. Textbook of Quantitative Inorganic Analysis. Incluye Elementary Instrumental Analysis, 4.a ed. Revisada por J. Basset. Longman, Nueva York.

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5.

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INTRODUCCIÓN GENERAL

Otros métodos de análisis

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1080 AGUA DE CALIDAD PARA REACTIVOS 1080 A.

Introducción

Uno de los aspectos más importantes del análisis es la preparación del agua de calidad para reactivos que han de utilizarse en la dilución de éstos y para los análisis de blancos. Los niveles de calidad cubren un espectro que oscila entre el tipo I, sin concentraciones detectables de los compuestos o elementos a analizar dentro de los límites de detección del método analítico, y el tipo III, para lavados y análisis cualitativos (véase tabla 1080:1). El agua para análisis no debe contener sustancias que interfieran con los métodos analíticos. La calidad del agua está directamente relacionada con el análisis que vaya a efectuarse. Puede diferir, de hecho, en función de los componentes orgánicos, inorgánicos y microbiológicos y del uso que se vaya a dar a dicha agua. Cualquier método de preparación de agua de calidad para reactivos es acepta-

ble siempre que se cumplan los requisitos adecuados, ya que un sistema mal conservado puede dar lugar a la inducción de contaminantes. La osmosis inversa, la destilación y la desionización en distintas combinaciones pueden utilizarse para el mismo propósito si se emplean de forma adecuada. También pueden utilizarse en este proceso la ultrafiltración, el tratamiento con luz ultravioleta o una combinación de ambos. En la sección 1080 se proporcionan normas generales para la preparación de este tipo de aguas. En la tabla 1080:11 se enumeran los procesos más habituales para la purificación del agua y las clases principales de contaminantes que pueden eliminarse mediante esta purificación. Para más detalles sobre la preparación del agua para pruebas microbiológicas, véase la sección 9020B.3c.

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MÉTODOS NORMALIZADOS

TABLA 1080:1. ESPECIFICACIONES DEL AGUA PARA REACTIVOS*

TABLA 1080:11.

PROCESOS DE PURIFICACIÓN DEL AGUA

1-65

INTRODUCCIÓN GENERAL

1080 B.

Métodos de preparación de agua de calidad para reactivos

1. Destilación Puede prepararse agua para análisis destilando agua en un alambique de vidrio de borosilicato, cuarzo fundido o titanio. Para eliminar el amoníaco, se destilará a partir de una solución acida. El CO2 puede eliminarse hirviendo el agua durante 15 minutos y enfriándola rápidamente a temperatura ambiente. Por su parte, el CO2 atmosférico se excluye utilizando un tubo que contenga cal sodada o un agente comercial eliminador del CO2*. Téngase en cuenta que al hervir el agua pueden incorporarse otras impurezas que se desprenden del envase. Es necesario realizar tratamiento previo del agua y mantenimiento periódico para evitar la formación de escamas en el alambique. En los casos en que el agua contiene cantidades significativas de calcio, magnesio o bicarbonato puede ser necesario efectuar un pretratamiento de desmineralización mediante osmosis inversa o intercambio iónico. La resistividad del agua destilada (tipo II) debe ser > 1,0 megaohmio-cm a 25 °C, y para la de tipo I el valor deberá ser de 10 megaohmios-cm. Las mediciones son más exactas si se hacen sobre células en serie. 2.

Osmosis inversa

La osmosis inversa es un proceso en el que se fuerza al agua para que entre a presión a través de una membrana semipermeable, eliminando una parte de los componentes disueltos y de las impurezas suspendidas. La calidad del agua ob-

* Ascarite. Fisher Scientifíc Co., o equivalente.

tenida depende, obviamente, de la del agua original. Es preciso seleccionar el módulo de membrana de osmosis inversa adecuado a las características del agua a tratar y obtener los datos sobre los contaminantes en el agua original, a la presión a que se vaya a trabajar. Es, asimismo, necesario establecer la producción total de agua para economizar al máximo en su uso sin comprometer la calidad final de la operación. La elección de las configuraciones de las hendiduras depende del grado de suciedad del agua a tratar. Con independencia de la configuración utilizada, puede hacerse necesario un pretratamiento para minimizar la contaminación de la membrana por coloides o partículas, así como la introducción de cloro, hierro y otros compuestos oxidantes que puedan degradar las membranas de osmosis inversa. Es necesario hacer una limpieza periódica de los módulos de membrana. 3.

Intercambio iónico

Prepárese agua desionizada haciendo pasar el agua a través de un lecho mixto de intercambiador iónico constituido por resinas aniónicas y catiónicas fuertes. Cuando el sistema no está funcionando continuamente, ha de ponerse de nuevo en circulación el agua producida por el lecho de intercambio iónico. La resistencia del agua de tipo I debe ser de 10 megaohmios-cm (en serie) a 25 °C. En los casos en los que sea rentable proceder a una regeneración de la resina, se utilizarán lechos separados de resinas aniónicas y catiónicas. En estos casos, dispóngase el intercambiador aniónico después del catiónico para extraer los residuos que puedan proceder de la resina

MÉTODOS NORMALIZADOS

1-66

catiónica. Es esencial que las dimensiones del lecho sean las adecuadas para que las resinas ofrezcan el rendimiento requerido. En especial, hay que establecer la relación entre la longitud y el diámetro del lecho según la máxima velocidad de flujo, para asegurar que no se sobrepasa la velocidad máxima y que el agua permanece durante un tiempo suficiente en contacto con la resina. En situaciones en las que el agua de alimentación contiene cantidades significativas de materia orgánica, es preciso eliminar los microorganismos para disminuir en lo posible la contaminación de las resinas. Los posibles tratamientos previos consisten en prefiltración, destilación, osmosis inversa y adsorción. 4. Adsorción La adsorción suele utilizarse para eliminar el cloro y las impurezas orgánicas. Se suele realizar con carbón activado granular. El nivel de eficacia en la eliminación de organismos depende de la naturaleza de los mismos, de las características físicas del carbón activado y de las condiciones de actuación. La eficacia de

1080 C.

la adsorción de organismos es inversamente proporcional a la solubilidad, y, por ello, esta técnica puede resultar inadecuada para la eliminación de compuestos polares de bajo peso molecular. Las diferencias de funcionamiento entre los distintos carbones activados son atribuibles al uso de distintos materiales y a los procedimientos de activación. Selecciónese el carbón activado adecuado teniendo en cuenta estas diferencias. Incluso con un carbón activado óptimo, no se conseguirá un funcionamiento correcto a menos que las dimensiones de la columna permitan obtener velocidad de entrada y tiempo de paso adecuados a la máxima tasa de flujo. El empleo de carbón activado puede producir efectos adversos en la resistividad o resistencia específica. Estos efectos pueden controlarse mediante osmosis inversa, con resinas mixtas o con adsorbentes especiales. Para conseguir el menor nivel posible de organismos contaminantes, se utilizarán mezclas de resinas de pulimentación con carbones especiales en combinación con otros tratamientos adicionales, tales como osmosis inversa, carbones naturales, oxidación ultravioleta o ultrafiltración.

Calidad del agua para reactivos

1. Patrones de calidad Existen varios patrones de calidad del agua para análisis, todos ellos basados en los niveles de contaminantes (véase tabla 1080:1)1–3. Los métodos y usos enumerados proceden del National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS). Utilícese agua de tipo I en los métodos analíticos que requieran un mínimo de interferencias y desviación y un máximo de precisión. El agua de tipo II está

destinada a proporcionar al usuario un agua en la que sea admisible la presencia de bacterias. Se utiliza para la preparación de reactivos, colorantes o tinciones. El agua de tipo III puede utilizarse para la limpieza del material de vidrio o como agua de alimentación para la producción de aguas de mayor nivel de calidad. El agua para análisis de tipo I, con una resistividad mínima de 10 megaohmcm a 25 °C (en serie), se prepara mediante destilación, desionización o tratamiento con osmosis inversa del agua de ali-

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INTRODUCCIÓN GENERAL

mentación, seguidos de acabado con un lecho mixto desionizador y paso a través de un filtro de membrana de 0,2 nm de poro. También puede tratarse con osmosis inversa seguida de adsorción con carbón y desionización. Determínese su calidad en el momento de su producción. Los desionizadores de lecho mixto añaden pequeñas cantidades de materia orgánica al agua, sobre todo si el lecho es fresco. La resistividad del agua de tipo I debe ser > 10 megaohm-cm a 25 °C, medida en serie. La determinación de la resistividad no podrá detectar organismos o contaminantes no ionizados ni proporcionará una valoración exacta de los contaminantes iónicos a nivel de microgramo por litro. Por consiguiente, se harán mediciones distintas para contaminantes del tipo de TOC, SiO2 y recuentos bacterianos. El agua de tipo II se produce mediante destilación o desionización. Su resistencia debe ser > 1 megaohm-cm a 25 °C. Hay que adoptar las mismas precauciones al hacer las determinaciones de los contaminantes. El agua de tipo III debe tener una resistividad mínima de 0,1 megaohm-cm. En la tabla 1080:1 se enumeran otros contaminantes del agua para reactivos. El pH del agua de tipo I y II no puede medirse de manera exacta sin contami-

narse. Para algunos análisis es necesario medir otros componentes. El agua de tipo I no puede ser almacenada sin que sufra una degradación significativa, por lo que debe producirse de manera continua y consumirse de inmediato. El agua de tipo II puede conservarse, pero hay que procurar que su almacenamiento dure el menor tiempo posible y que mantenga la calidad adecuada al uso que se le va a dar. Consérvese sólo en materiales que la protejan de la contaminación, como el TFE y el vidrio para análisis orgánicos o los plásticos para análisis de metales. El agua de tipo III se conservará en materiales que la protejan de la contaminación. 2. 1.

2.

3.

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MÉTODOS NORMALIZADOS

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1090

1090 A. 1.

SEGURIDAD

Introducción

Consideraciones generales

Conseguir un ambiente seguro y saludable de trabajo es responsabilidad de la institución, del director del laboratorio, del supervisor del personal y, por último, del propio personal del laboratorio. Cada trabajador debe hacer todo lo posible para protegerse a sí mismo y a sus compañeros. El director del laboratorio debe tener en cuenta que todo accidente tiene una causa y, por tanto, puede evitarse mediante un adecuado programa de seguridad1. Una vez que un empleado se haya acostumbrado a trabajar con técnicas nuevas y seguras, el director puede estar seguro de que dicho empleado propondrá otras ideas acerca de la seguridad. 2.

Organización de la seguridad

Aunque la responsabilidad del establecimiento y reforzamiento de un programa de seguridad en el laboratorio corresponde, en última instancia, al director, es conveniente, salvo en laboratorios muy pequeños, delegar responsabilidades en un miembro del personal designado como oficial de seguridad2. El responsable de seguridad debe formar parte del equipo de dirección, de forma que tenga capacidad para optimizar el adiestramiento, la inspección y el adoctrinamiento sobre seguridad de los nuevos empleados, y para adquirir una información actualizada sobre el tema. El responsable de seguridad debe inspeccionar periódicamente los equipos de emergencia, como extintores de fuego, sistemas de alar-

ma, lavado ocular y duchas de seguridad; debe realizar inspecciones periódicas del laboratorio para descubrir peligros inadvertidos, y debe observar si el personal cumple las reglas de seguridad y recordarle que se mantenga al tanto de las prácticas recomendadas al efecto. La seguridad sobre radiación es una parte especializada del programa general de seguridad. Debe asignarse una persona técnicamente cualificada, que será el Responsable de Seguridad sobre Radiación (RSR). Éste habrá de comprobar que las fuentes y equipos de radiación se usan de manera adecuada y conforme a todas las regulaciones estatales y locales pertinentes, y que se mantienen vigentes las licencias oficiales necesarias. Debe establecerse un comité de seguridad, el cual contará con el apoyo del director del laboratorio. Las recomendaciones de este comité deben ser tomadas en cuenta y aceptadas rápidamente. En los comités de seguridad participan personas con distintos tipos de experiencia en la toma de decisiones en relación con las prácticas de seguridad. Por ejemplo, los químicos deben aportar sus conocimientos en el tratamiento de los peligros químicos y bacteriológicos, y su participación puede ser de gran valor educativo. Es deseable que los miembros roten periódicamente, de forma que la mayoría del personal tenga la oportunidad de participar. Hay que conservar informes bien hechos sobre todos los accidentes, inspecciones, ensayos, etc., siendo preferible utilizar un único impreso estándar para ello. El informe debe contener información suficiente como para que el respon-

INTRODUCCIÓN GENERAL

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sable de seguridad, el supervisor y el director puedan determinar quiénes se vieron afectados, qué fue lo que sucedió, cómo y cuándo sucedió y qué lesiones se produjeron. La Occupational Safety and Health Act (OSHA; regulación legal norteamericana) obliga a registrar en un libro los accidentes que producen incapacidades importantes, pero lo más conveniente es registrar todos los accidentes para poder evaluar el programa de seguridad. El registro del momento y la naturaleza de cada accidente puede tener importancia en caso de que se produzcan incapacidades y proceda hacer una reclamación a Worker's Compensation (organismo estadounidense de asistencia laboral). Otra parte del programa de seguridad consiste en mantener un archivo de recomendaciones que hayan hecho el responsable o el comité de seguridad, así como de las acciones que se hayan puesto en práctica. Diversas estipulaciones del OSHA especifican un método para notificar a los empleados los peligros existentes en su puesto de trabajo. El personal expuesto debe estar bajo la supervisión directa y la observación regular de una persona técnicamente cualificada, la cual tendrá conocimiento de los peligros existentes, de sus efectos sobre la salud y de los procedimientos de emergencia pertinentes. El supervisor debe entrenar al personal del laboratorio en las prácticas de seguridad en su trabajo. El personal tiene derecho a conocer cuáles son los materiales peligrosos que maneja, los riesgos específicos que presenta el manejo de esos materia-

1090 B. 1.

les y los procedimientos necesarios para protegerse de ellos. El entrenamiento en las técnicas de seguridad exige del director un esfuerzo deliberado. En los laboratorios más grandes es importante realizar seminarios sobre seguridad. Se utilizarán técnicas de enseñanza, incluyendo películas educativas, demostraciones sobre el uso de aparatos tales como extintores de fuego o respiradores, tarjetas donde se indiquen los productos químicos peligrosos y los procedimientos adecuados para manipularlos y manuales de seguridad. Conviene repetir periódicamente los entrenamientos sobre seguridad. Los fabricantes de productos químicos proporcionan hojas de datos sobre seguridad en el manejo de materiales, las cuales tienen una importancia extraordinaria como parte de la información general que puede suministrarse al personal acerca de los peligros de su puesto de trabajo4. Estas hojas de datos deben estar a disposición del personal que utiliza materiales peligrosos.

3. 1. 2. 3. 4.

Referencias INHORN , S. L., ed. 1978. Quality Assurance Practices for Health Laboratories. American Public Health Assoc, Washington, D.C. STEERE, N. V., ed. 1971. Handbook of Laboratory Safety, 2.a ed. Chemical Rubber Co., Cleveland, Ohio. Hazard Communication: Final Rule. 1983. Federal Register 48:53280; 1985. 29 CFR Part 1910.1200. Chemical Safety Data Sheets. Manufacturing Chemists' Assoc, Inc. Washington, D.C.

Equipo de seguridad

Equipo de laboratorio

a) Extintores: Existen tres tipos generales de extintores: 1) Extintores de agua, útiles para fue-

gos con combustibles ordinarios, como lana, papel o tela. 2) Extintores químicos secos, útiles contra la mayoría de los fuegos, pero sobre todo para apagar los producidos por

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líquidos y metales inflamables y los fuegos eléctricos. 3) Extintores de dióxido de carbono, útiles para fuegos pequeños producidos por líquidos inflamables, y con una eficacia limitada al aplicarse sobre instrumentos y equipos electrónicos. Según los peligros potenciales, un laboratorio puede tener más de un tipo de extintor en cada habitación, en lugar fácilmente accesible y apartado de la zona de máximo peligro1–5. Los extintores de halones son útiles en áreas especiales en donde se encuentren equipos electrónicos o computadoras que puedan dañarse con los extintores convencionales. Tanto los extintores de halones como los de dióxido de carbono reducen la cantidad de oxígeno en el aire. Todos los extintores han de utilizarse con cuidado. A menudo, se recomienda la instalación de extintores multiuso (tipo ABC) en los laboratorios, y de extintores de halones en las campanas que contienen material orgánico. Hay que comprobar que los extintores se revisan y recargan de forma periódica. b) Manta ignífuga: Colóquense mantas ignífugas en lugares fácilmente accesibles en cada laboratorio6. c) Duchas de seguridad: Las duchas de seguridad son una parte integrante del laboratorio, y se utilizan en accidentes por ácidos, cáusticos u otros líquidos peligrosos, cuando se prende fuego a las ropas y en otras situaciones de emergencia. Las duchas deben estar convenientemente situadas, preferiblemente cerca de una puerta y sobre un espacio despejado, y hay que comprobar su estado periódicamente6. d) Lavado de ojos: Cuando sea necesario, se quitarán las lentillas de contacto. Lávense inmediata y cuidadosamente (15 minutos) los ojos para evitar alteraciones visuales o incluso la ceguera en caso de que se produzca una salpicadura de un producto químico. Las salpicaduras en la cara se lavan fácilmente con un

MÉTODOS NORMALIZADOS

colirio con aplicación en chorro. Algunos expertos opinan que los chorros de colirio introducen partículas en el ojo (de vidrio o metal, polvo, arena), en lugar de retirarlas. Si ocurre un accidente de este tipo, consúltese a un oculista después de haber hecho un suave lavado con agua. Los colirios deben situarse cerca de los fregaderos, en una zona central y muy visible y lejos de las conexiones eléctricas. Hay que controlar periódicamente los recipientes para comprobar su buen funcionamiento; si se utilizan envases portátiles, hay que limpiarlos semanalmente y cambiar el agua para reducir la posibilidad de contaminación. En otro apartado se ha tratado extensamente el uso de los envases de colirio y algunos de sus problemas2. e) Escudos protectores: El tipo de escudos protectores más utilizados es el que protege contra las distintas formas de radiación, como bombas láser y emisiones ultravioletas. Las campanas químicas convencionales deben estar provistas de vidrios de seguridad y paneles móviles. Considérese la conveniencia de utilizar escudos cuando se trabaja con vidrios de vacío o sistemas presurizados. f) Envases de seguridad: Los envases de segundad están diseñados para minimizar las consecuencias de un accidente o para evitar la diseminación de materiales peligrosos. Se utilizan para transportar productos químicos, sobre todo ácidos y álcalis concentrados. Para disolventes inflamables, empléense envases sometidos a controles de calidad por los organismos pertinentes. Otros envases de seguridad más complejos son las cámaras de manipulación con guantes, las campanas de flujo laminar y los compartimentos manejados por control remoto para material radiactivo o patógenos peligrosos. Deben manejarse en condiciones de presión negativa con filtración primaria a la salida de gas o de aire, que se comunique con un sistema de ventilación de orden superior. Hay que

INTRODUCCIÓN GENERAL

comprobar periódicamente la eficacia del filtro y cambiar y probar los guantes para evitar la liberación accidental de partículas por la acción de bombeo que se produce con su uso. g) Instalaciones de almacenamiento: Para guardar los materiales de laboratorio, hay que conocer sus propiedades, así como las consecuencias de accidentes tales como derramamiento, explosión o fuego. Por regla general, no deben almacenarse grandes cantidades de reactivos en las áreas de trabajo, sino utilizar envases más pequeños que sólo contengan lo suficiente para el trabajo diario o semanal. Evítese la mezcla, en caso de accidente, de productos químicos que puedan combinarse dando lugar a compuestos explosivos, inflamables o peligrosos; para ello deberán almacenarse por separado. Los materiales peligrosos se guardarán en un recinto con recipientes específicos. Los disolventes inflamables se guardarán en cabinas adecuadamente ventiladas y aprobadas por la National Fire Protection Association2 (entidad estadounidense dedicada a la prevención de incendios) o en un frigorífico de seguridad. Utilícense envases especiales para los disolventes inflamables que se guarden en cantidades superiores a 2 1 o cuando la cantidad de disolventes inflamables en una habitación supere los 8 1. (Los disolventes inflamables son líquidos con un punto de ignición inferior a 60 °C a una presión atmosférica superior a 275 kPa y a una temperatura ambiente de 30 °C.) h) Campanas extractoras de emanaciones: Para un trabajo de seguridad en el laboratorio es esencial que existan campanas extractoras de gases y cabinas de seguridad biológica adecuadamente diseñadas7. Utilícense las campanas extractoras para contener y trabajar con materiales peligrosos, pero no como sistema de almacenamiento.

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Se dispone de diferentes tipos de campanas de flujo lento para distintos niveles de peligrosidad. Hay que conocer la capacidad de movimiento de aire que tiene el conjunto del sistema y prestar atención especial al aire que se expela hacia el medio ambiente. Compruébese periódicamente el flujo de aire de las campanas con un anemómetro. Indíquese con una marca de tinta o un esparadrapo la posición necesaria para que el flujo de aire sea de 30 m/min. i) Equipos para el vertido de sustancias: Las zonas de almacenamiento y de trabajo deben disponer de equipos para el vertido de productos químicos; estos equipos pueden comprarse o prepararse en el laboratorio. Utilícense equipos de tamaño adecuado para las cantidades utilizadas de ácidos, bases y disolventes. Es conveniente diseñar y establecer los procedimientos de vertido antes de que se plantee la necesidad. j) Avisos de seguridad en las paredes: Colóquense en un lugar central para informar de las sustancias peligrosas existentes en el laboratorio.

2.

Equipo de protección personal

El equipo y los materiales de protección personal están constituidos por guantes, zapatos, cascos, gafas, escudos protectores contra radiación y otros artículos de seguridad que debe utilizar cada individuo. Su elección y uso dependen de las distintas tareas que hayan de realizarse. Este equipo, importante para la protección, también sirve como recordatorio constante de la necesidad de adoptar medidas de seguridad. Si se considera necesario, corresponde al director y al supervisor la tarea de comprobar su utilización. a) Indumentaria: La ropa crea una barrera entre el individuo y el peligro. Los trabajadores que manipulan material radiactivo, agentes hipotéticamente

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carcinógenos y material patógeno han de cambiar su indumentaria de calle por ropa de laboratorio al entrar en la zona de trabajo, y cambiarse de nuevo a la salida. Con ello, se evita el transporte de materiales peligrosos fuera del laboratorio, y además se facilita la necesaria manipulación y limpieza de la ropa. Las prendas desechables deben ser ignífugas. b) Guantes: Suelen ser importantes. Consúltense las hojas de datos sobre seguridad en el manejo de materiales para conocer el tipo de guantes que resulta más adecuado para un disolvente o reactivo determinado. Los guantes de goma pueden utilizarse para manipular líquidos peligrosos; los de cuero, para los materiales radiactivos, y los quirúrgicos, para el material patógeno. Los guantes aislantes resultan imprescindibles para manipular objetos calientes o extremadamente fríos, pero no deben utilizarse los de amianto. Para la protección de los instrumentos pueden utilizarse guantes de algodón blancos. c) Calzado protector: Es necesario en los laboratorios en los que se trasladan objetos o instrumental pesados. Cuando se trabaje con máquinas situadas en un nivel elevado, puede ser necesario llevar casco protector. d) Gafas protectoras: Aunque la posibilidad parezca pequeña, las consecuencias de un accidente ocular pueden ser extraordinariamente graves. Se debe solicitar el uso de gafas protectoras a todo el personal del laboratorio. En la mayoría de los laboratorios está prohibido el uso de lentillas de contacto con las gafas protectoras, pero existe una gran controversia al respecto, por lo que conviene considerar dicho uso en cada caso. Las gafas de seguridad protegen de las salpicaduras, del impacto de objetos, del polvo y de la exposición a la luz ultravioleta. No obstante, las gafas que suelen emplearse no proporcionan una seguridad total al ojo. Si un determinado trabajo implica peligros especiales, habrá de pensarse en

MÉTODOS NORMALIZADOS

una protección adicional. Por ejemplo, para soplar vidrio, soldar, trabajar con láser o realizar tareas que requieran la exposición a otras formas de radiación, se llevarán gafas con filtros especiales. Si se trabaja en una habitación con radiación ultravioleta, se llevarán gafas protectoras con anteojeras o piezas sólidas laterales. Para ciertas actividades será preciso proteger la piel. Si se manipulan ácidos o materiales cáusticos, se llevará un escudo facial para proteger tanto los ojos como el resto de la cara. e) Respiradores: Conviene disponer de respiradores8 para aquellas situaciones de emergencia en las que se formen gases, humos o aerosoles peligrosos y deba entrarse en la habitación antes de que esté totalmente ventilada. En los laboratorios en los que se utilicen gases tóxicos como el trifluoruro de boro, el cloro, la dimetilamina, el óxido de etileno, el flúor y el bromuro de hidrógeno, se dispondrá de respiradores, preferiblemente dispositivos autónomos de respiración (DAR) u otras fuentes de aporte de aire. 3.

Referencias

1. NATIONAL INSTITUTE FOR OCCUPATIONAL SAFETY AND HEALTH. 1974. The Industrial Environment—Its Evaluation and Control, 3.a ed. U. S. Dep. Health, Education & Welfare, National Inst. Occupational Safety & Health, Rockville, Maryland. 2. U. S. PUBLIC HEALTH SERVICE. 1975. Lab Safety at the Center for Disease Control. U.S. Dep. Health, Education & Welfare, Publ. núm. CDC 76-8118, National Center Disease Control, Atlanta, Georgia. 3. THE MATHESON COMPANY. 1971. Matheson Gas Data Book, 5.a ed. Matheson Co., East Rutherford, Nueva Jersey. 4. MEIDL, J. H. 1970. Flammable Hazardous Materials. Glenncoe Press, Beverly Hills, California. 5. MCKINNON, G. P. 1976. Fire Protection Handbook, 14.a ed. National Fire Protection Assoc, Boston, Massachusetts. 6. STEERE, N. V., ed. 1971. Handbook of Laboratory Safety, 2.a ed. Chemical Rubber Co., Cleveland, Óhio.

INTRODUCCIÓN GENERAL

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7. AMERICAN CONFERENCE OF GOVERNMENTAL INDUSTRIAL HYGIENISTS. 1982. Industrial Ventilation, A Manual of Recommended Practices, 17.a ed. American Conf. of Governmental Industrial Hygienists, Cincinnati, Ohio.

1090 C.

Riesgos en el laboratorio

Aunque muchos de los riesgos del laboratorio son evidentes, es importante identificar todos los peligros potenciales a la hora de desarrollar un programa efectivo de seguridad. Antes de iniciar cualquier trabajo, establézcase un plan de seguridad, el cual se pondrá en conocimiento de todo el personal que trabaja con materiales peligrosos o cerca de ellos. En este plan deben incluirse las hojas de datos sobre seguridad en el manejo de materiales, y en él se describirán todos los procedimientos rutinarios y de emergencia; todos los empleados deben leer el documento y acreditar con su firma el conocimiento del mismo. Para evitar la ingestión de materiales tóxicos o infecciosos, se prohibirá comer, beber y fumar en todas las zonas del laboratorio. Colóquense señales de advertencia adecuadas en el laboratorio, y compruébese que todos los envases tienen etiquetas claras y fácilmente reconocibles. Hay que mantener despejadas las vías de salida y de acceso a los extintores. Evítese el almacenamiento inadecuado en estantes inseguros, o la colocación de objetos de vidrio o pesados en niveles elevados. 1.

8. N ATIONAL INSTITUTE FOR OCCUPATIONAL SAFETY AND HEALTH. 1976. Guide to Industrial Respiratory Protection. Publ. Núm. 76189, U. S. Dep. Health, Education & Welfare, National Inst. Occupational Safety & Health, Cincinnati. Ohio.

Riesgos químicos

Las lesiones químicas pueden ser externas o internas1–8. Las primeras se producen como consecuencia de la exposición a sustancias cáusticas o corrosivas, como ácidos, bases o sales reactivas. Adóptense precauciones para evitar acci-

dentes como salpicaduras y vertido de los envases. Al mismo tiempo, hay que prestar atención a la corrosión del instrumental, cuyo fallo puede resultar peligroso. Las lesiones internas pueden ser el resultado de los efectos tóxicos o corrosivos de sustancias que haya absorbido el organismo. a) Ácidos y bases inorgánicos: Muchos ácidos y bases inorgánicos se ven sometidos a limitaciones de exposición reguladas por ordenaciones como los Occupational Safety and Health Personal Exposure Limits9 y los valores umbral límite de la American Conference of Governmental Industrial Hygienists10. Estos límites admisibles de exposición y umbrales límites indican la concentración aérea máxima a la que pueden estar expuestos los trabajadores. Los gases de estos ácidos y bases son graves irritantes oculares y respiratorios. Los ácidos y bases líquidos y sólidos pueden provocar graves quemaduras en la piel y en los ojos11. Cuando se calientan los ácidos para incrementar su velocidad de digestión de la materia orgánica, aumenta de forma significativa el peligro de que se produzcan gases, y los ácidos calientes reaccionan de una forma muy rápida con la piel. Los ácidos y las bases se almacenarán por separado en zonas bien ventiladas y fuera del contacto con materiales orgánicos volátiles u oxidables. Se utilizarán envases (de goma o plástico) para transportar tanto los ácidos como las bases. El trabajo con ácidos y bases fuertes sólo debe hacerse en campanas de extracción

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de gases químicos que funcionen adecuadamente. Los ácidos y las bases se añadirán de forma lenta al agua (agitando continuamente), para evitar salpicaduras. En caso de que se produzca un contacto con la piel, lávese cuidadosamente la zona afectada con agua, y consúltese a un médico si persiste la irritación12. No deben volverse a utilizar las ropas hasta que no hayan sido lavadas cuidadosamente. Los objetos de cuero (cinturones y zapatos) retienen el ácido incluso después de enjuagarlos con agua y pueden provocar graves quemaduras si vuelven a usarse. Si se produce un contacto con los ojos, deben lavarse ambos de inmediato durante quince minutos con el colirio de aplicación en chorro, y a continuación se consultará a un médico. El ácido perclórico (véanse secciones 3O3OG y H y 4500-P.D) reacciona violentamente o de forma explosiva en contacto con materia orgánica12. No deben emplearse las campanas extractoras que se hayan utilizado con ácido perclórico para trabajar con reactivos orgánicos, sobre todo si se trata de disolventes volátiles. Además de estos peligros, el ácido perclórico produce graves quemaduras al entrar en contacto con la piel, los ojos y el sistema respiratorio13. Lo mejor es disponer de una campana extractora destinada exclusivamente al trabajo con ácido perclórico. Síganse las instrucciones del fabricante para limpiar adecuadamente los conductos de salida, los cuales quedan taponados, por lo que hay que lavarlos de forma periódica. Las lesiones más frecuentes causadas por el hidróxido de sodio son quemaduras cutáneas y de los ojos. Las soluciones de hidróxido de sodio diluidas hasta 2,5N pueden causar graves lesiones oculares14. En solución, tanto el hidróxido de sodio como otras bases producen una cantidad considerable de calor (a menudo suficiente para que el agua hierva). b) Metales y compuestos inorgánicos: En general, hay que considerar como pe-

MÉTODOS NORMALIZADOS

ligrosos todos los productos químicos, por lo que deberán utilizarse sólo de la forma prescrita. Manipúlense en una campana extractora utilizando gafas protectoras y bata de laboratorio. En caso de contacto accidental con la piel, lávese cuidadosamente con agua la zona afectada. Si la irritación persiste, es recomendable consultar al médico. Son muchas las fuentes donde conseguirse información sobre toxicidad, precauciones y primeros auxilios 11–15. Algunos de los peligros que presentan algunos metales y compuestos inorgánicos específicos son los siguientes: determinados productos que contienen arsénico o níquel son altamente tóxicos y pueden ser cancerígenos14–15. Evítese la ingestión, la inhalación y el contacto con la piel. La azida de sodio es tóxica, y reacciona con ácidos para producir el aún más tóxico ácido hidrazoico. Cuando se elimina por un sumidero, puede reaccionar con el cobre o el plomo de las tuberías y formar azidas metálicas extraordinariamente explosivas. Pueden destruirse las azidas añadiéndose una solución concentrada de nitrito de sodio, 1,5 g NaNO2/g de ácido de sodio16. La extrema toxicidad del berilio y sus compuestos se refleja por su bajo valor umbral límite, de 2,0 μg/m3,11. Se cree que puede ser carcinógeno para el hombre9–15. Debe manipularse con extrema precaución y siempre en una campana extractora o en una cámara de manipulación con guantes. Los cianuros se utilizan como reactivos y pueden estar presentes en las muestras. El cianuro de hidrógeno es un gas letal. No deben acidificarse soluciones de cianuro salvo en un sistema cerrado o en una campana con ventilación adecuada, ya que puede formarse y liberarse cianuro de hidrógeno. El mercurio tiene la particularidad, con respecto a los demás metales, de que es líquido a temperatura ambiente y posee una apreciable presión de vapor. Un termómetro roto en una habitación mal

INTRODUCCIÓN GENERAL

ventilada puede dar lugar a que se sobrepase el valor umbral límite del mercurio. Debido a su gran volatilidad y toxicidad, debe manipularse, al igual que sus compuestos, con muchas precauciones, y es preciso disponer de un equipo de limpieza para vertidos. Las sales de perclorato son explosivas si se mezclan con material combustible. También pueden producir irritaciones graves en la piel, los ojos y el sistema respiratorio. Realícense con mucha precaución las tareas de manipulación y almacenamiento de percloratos. El borohidruro de sodio se descompone en el agua liberando hidrógeno, con el consiguiente peligro de explosión. Al igual que otros muchos productos químicos inorgánicos, es un agente fuertemente irritante de la piel y el sistema respiratorio. c) Reactivos y disolventes orgánicos: La mayoría de los disolventes especificados en este manual tienen un valor umbral límite de exposición (véase tabla 1090:1). A diferencia de los disolventes orgánicos, muchos reactivos orgánicos no tienen valor umbral límite (véase la tabla 1090:11 para los que sí lo tienen), pero ello no significa que sean menos peligrosos. Se cree que algunos compuestos son carcinógenos, por lo que deben ser tratados con extrema precaución. Entre ellos se encuentran tanto disolventes como reactivos del tipo del benceno18, el tetracloruro de carbono11, el cloroformo11, el 1,4-dioxano8–11,19, el tetracloroetileno20 y la bencidina21. En los organismos norteamericanos Occupational Safety and Health Administration y National Institute for Occupational Safety and Health proporcionan listas de productos químicos con especiales características de peligrosidad. Las listas de carcinógenos y de productos químicos con evidencia sustancial de ser carcinógenos, son especialmente importantes. La adopción de procedimientos de manipulación a partir de estas listas autorizadas hace

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TABLA 1090:1. VALORES UMBRAL LÍMITE (VUL)*10 PARA LOS DISOLVENTES ESPECIFICADOS EN Standard Methods

que disminuyan las probabilidades de error. Los disolventes utilizados pertenecen a distintas categorías: alcoholes, compuestos clorados e hidrocarburos. La exposición a cada una de estas clases de compuestos puede producir diversos efectos sobre la salud 22–24. Los alcoholes, en

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TABLA 1090:11. VALORES UMBRAL LÍMITE (VUL)10 PARA LOS REACTIVOS ESPECIFICADOS EN Standard Methods

MÉTODOS NORMALIZADOS

ropa protectora. Los compuestos clorados presentan casi los mismos peligros que los disolventes clorados (narcosis y lesión del sistema nervioso central y del hígado). Una etiquetación adecuada, en la que se incluya la fecha para su eliminación según las recomendaciones del fabricante, permite controlar el uso de los productos químicos y eliminar los que hayan caducado.

2.

general, son intoxicantes y pueden provocar irritación en las membranas mucosas y adormecimiento. Mientras que los dioles como el etileno glicol son tóxicos, los trioles como la glicerina no lo son en absoluto. Los hidrocarburos clorados provocan narcosis y lesiones en el sistema nervioso central y en el hígado. Los hidrocarburos, al igual que los otros dos grupos, son irritantes de la piel y pueden causar dermatitis tras una exposición prolongada. Debido a la volatilidad de estos compuestos, pueden producirse concentraciones peligrosas de vapor (peligro de fuego o explosión). Es esencial que la ventilación sea adecuada25. Los reactivos orgánicos citados en este manual pertenecen a cuatro categorías principales: ácidos, compuestos halogenados, colorantes e indicadores y pesticidas. La mayoría de los ácidos orgánicos tienen propiedades irritantes22–24. Son predominantemente sólidos, pero a partir de ellos se pueden generar aerosoles. Los colorantes e indicadores también presentan el problema de formación de aerosoles. Los pesticidas han de ser manipulados con precaución, pues son tóxicos22 y no deben entrar en contacto con la piel, para lo cual se llevarán guantes y

Riesgos biológicos

La seguridad en el laboratorio de análisis de aguas incluye también los riesgos microbiológicos26–30. Los microorganismos patógenos pueden provocar enfermedades por ingestión accidental, inoculación o inyección o por otros medios de penetración a través de la piel. La adopción de unas técnicas adecuadas de seguridad en el laboratorio permitirá controlar estos agentes31. Los peligros fundamentales que entraña la manipulación microbiológica son el contacto manoboca cuando se trabaja con materiales contaminados y la formación de aerosoles al inocular, pipetear, centrifugar o mezclar muestras o cultivos32. No deben mezclarse soluciones soplando a través de una pipeta dentro de un cultivo microbiológico. Cuando se trabaje con muestras muy contaminadas, como residuos o cultivos microbiológicos de alta densidad, utilícese un dispositivo acoplado al extremo bucal de la pipeta para evitar accidentes de ingestión. No pipetear nunca con la boca. Incluso con muestras de agua potable, no es aconsejable hacerlo. Las aguas no tratadas pueden contener patógenos de transmisión hídrica, lo que obliga a colocar todas las pipetas utilizadas en una jarra con una solución desinfectante para que se descontaminen antes de lavar el instrumental de vidrio. Las pipetas utilizadas no deben colocarse sobre mesas, carros de laboratorio o lavabos sin hacer

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INTRODUCCIÓN GENERAL

antes una adecuada descontaminación. Como desinfectantes para las pipetas colocadas en la jarra pueden utilizarse satisfactoriamente compuestos de amonio cuaternario que tengan un detergente compatible o soluciones de hipoclorito de sodio. Se utilizará la concentración más elevada entre las recomendadas para estos productos comerciales siempre que dicha concentración no sea tan fuerte como para borrar las señales o enturbiar las pipetas. Cámbiese a diario la solución desinfectante del envase de limpieza. Los materiales contaminados (cultivos, muestras, instrumental de vidrio, desechos de serología, etc.) han de esterilizarse en autoclave antes de ser eliminados o procesados para un nuevo uso. La rotura de los tubos con cultivos durante la centrifugación también produce aerosoles microbiológicos33, 34. Utilícense mezcladores a prueba de escapes, los cuales se mantendrán perfectamente tapados durante la operación. La introducción de un asa recalentada en un matraz de medio de cultivo supone un grave peligro, debido a la dispersión de microorganismos a modo de aerosol35. Para esterilizar asas o agujas de cultivo, es conveniente realizar una incineración en estufa eléctrica, evitando las descargas que podrían producirse por el contacto del asa con el interior de la estufa36. Para controlar las exposiciones al contacto es importante mantener una adecuada higiene personal. Hay que desinfectar con frecuencia las manos y las superficies de trabajo. El agua para beber debe localizarse fuera del laboratorio, preferiblemente en una fuente manejada con el pie. Es recomendable que el personal del laboratorio se vacune contra el tétanos, y quizá contra la fiebre tifoidea u otros agentes infecciosos si se considera conveniente por la naturaleza del trabajo. Elimínense las moscas y otros insectos para evitar la contaminación del instrumental estéril, los medios, las muestras y los cultivos bacterianos, y para

evitar el contagio del personal por microorganismos infecciosos transportados por estos vectores. Instálense alambreras en todas las ventanas y puertas que comuniquen con el exterior si no existe aire acondicionado, y pulverícense periódicamente con pesticida las áreas de cabinas de aseo y almacenamiento y las vías de servicio. Teniendo en cuenta que en el laboratorio puede haber también una sección química dedicada al análisis de pesticidas en el agua, la pulverización se aplicará con cuidado en las zonas próximás a los lugares donde se desarrolla la actividad microbiológica. 3.

Riesgos de radiación

Todo el mundo está expuesto a radiaciones ionizantes. La dosis media de radiación anual que recibe el organismo procedente de fuentes cósmicas, terrestres e internas, de los rayos X en tratamientos médicos y dentales, etc., es de alrededor de 185 mrems/año37. Hay que evitar cualquier exposición laboral continua o intermitente que no sea necesaria, así como los accidentes que puedan dar lugar a una exposición peligrosa. En los laboratorios debe reducirse al mínimo la emisión de rayos X y de luz ultravioleta y la cantidad de material radiactivo que pueda suponer un riesgo. Todas las personas que trabajen con materiales radiactivos o máquinas generadoras de radiación deberán disponer de un manual de seguridad13, 38, en el que se explique la forma de conseguir la autorización necesaria para utilizar, comprar, manipular y almacenar radionúclidos. El manual debe incluir también los métodos para manipular con seguridad el material radiactivo no sellado y los procedimientos a seguir en caso de accidentes radiactivos, para descontaminar, controlar al personal y al laboratorio y para eliminar los materiales radiactivos.

MÉTODOS NORMALIZADOS

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a) Materiales radiactivos: En el laboratorio se utilizan radionúclidos para desarrollar y valorar métodos analíticos, para preparar estándares de conteo y para calibrar detectores e instrumentos de conteo (véase parte 7000). Son habituales las fuentes selladas como la célula detectora de níquel 63, utilizada en las unidades de cromatografía de gases para captación de electrones. Hay que instruir a todo el personal que tiene contacto con los materiales radiactivos sobre los posibles riesgos sanitarios. Se establecerán procedimientos adecuados y se pondrán en práctica medidas sobre segundad contra la radiación a fin de reducir al mínimo la posibilidad de exposición y accidentes. b) Máquinas generadoras de radiación: Se minimizarán los peligros derivados de los aparatos, como los de difracción de rayos X o los microscopios electrónicos, si se siguen estrictamente las instrucciones de uso proporcionadas por los fabricantes y los métodos referidos en los manuales sobre seguridad que se citan en la bibliografía. c) Radiación ultravioleta (UV): La radiación UV es de uso frecuente. Cuando los instrumentos están bien fabricados y se manejan adecuadamente, los riesgos son mínimos, pero el empleo de dichos instrumentos puede resultar peligroso cuando se aplican al control de microorganismos en las salas del laboratorio o a la esterilización de objetos. Utilícese una protección adecuada, y recuérdese que las superficies metálicas brillantes reflejan esta clase de energía; apáguense las lámparas UV cuando no se estén utilizando. Se instalarán señales de advertencia e indicadores lumínicos como recordatorios constantes mientras estén encendidas las lámparas UV. Se llevarán gafas o anteojos de protección con anteojeras sólidas siempre que exista la posibilidad de exposición a la radiación UV39.

4.

Riesgos físicos

a) Eléctricos: La instalación, las conexiones y los aparatos eléctricos se adaptarán a las normas vigentes sobre instalaciones eléctricas. El uso incorrecto de estos aparatos puede dar lugar a graves peligros, como incendios, explosiones, cortes de fluido y descargas eléctricas. Se conectarán a tierra todos los aparatos eléctricos o se utilizará un doble aislamiento. Siempre que sea posible, se usarán tomas de tierra protegidas por interruptor. No deben colocarse receptáculos eléctricos dentro de campanas extractoras, ni se manejarán aparatos con cordones desgastados o aislamientos deteriorados o que produzcan chispas cerca de disolventes inflamables volátiles. Los frigoríficos habrán de tener la aprobación de seguridad. Se desconectarán los aparatos de la red antes de someterlos a trabajos de mantenimiento o reparación, y nunca se harán derivaciones de los interruptores de seguridad. La reparación del equipo por personas que no sean expertas en electricidad puede dar lugar a situaciones especialmente peligrosas40. b) Mecánicos: Dispónganse protecciones o dispositivos de seguridad en las correas de transmisión, las poleas, los transmisores de cadena, los ejes y otros tipos de aparatos mecánicos de transmisión9. Dentro del equipo del laboratorio, requieren este tipo de protección las bombas de vacío, las mezcladoras, las agitadoras y las trituradoras. También se protegerán las herramientas eléctricas utilizadas en el laboratorio9. Las necesarias medidas de seguridad evitarán que determinados aparatos, como las centrifugadoras, que poseen partes que giran a gran velocidad, produzcan salpicaduras. Todos los aparatos que tengan tendencia a vibrar (por ejemplo, centrifugadoras y compresores de aire) se fijarán para impedir que se muevan, y se colocarán lejos de botellas u otros objetos que puedan

INTRODUCCIÓN GENERAL

caer de estantes o bancos a causa de la vibración13. c) Gases comprimidos: Los cilindros de gas a presión pueden explotar o «salir disparados» si no se manipulan de la forma adecuada. Los escapes de los cilindros pueden dar lugar a explosiones si su contenido es inflamable, presentan riesgos para la salud si el contenido es tóxico y pueden provocar la muerte por sofocación si contienen gases inertes. Las regulaciones OSHA indican la forma de utilizar y almacenar los gases comprimidos9. El transporte se hará en carros, carretillas o plataformas móviles. Durante las tareas de transporte, almacenamiento y manipulación, se asegurarán adecuadamente los cilindros de gas, manteniendo cerrada la válvula de seguridad. Evítese el uso de adaptadores o acopladores. Identifíquese continuamente el contenido de los cilindros.

5. 1.

Referencias

N ATIONAL I NSTITUTE FOR O CCUPATIONAL SAFETY AND HEALTH. 1976. Registry of Toxic Effects of Chemical Substances. U.S. Dep. Health, Education & Welfare, National Inst. Occupational Safety & Health, Rockville, Maryland. 2. AMERICAN CONFERENCE OF GOVERNMENTAL INDUSTRIAL HYGIENISTS. 1976. Documentation of the Threshold Limit Values for Substances in Workroom Air, 3.a ed. American Conf. of Governmental Industrial Hygienists. Cincinnati, Ohio. 3. WINDHOLZ, M. 1976. The Merck Index, 9.a ed. Merck and Co., Rahway, Nueva Jersey. 4. AMERICAN MUTUAL INSURANCE ALLIANCE. 1966. Handbook of Organic Solvents. Tech. Guide No. 6, American Mutual Insurance Alliance, Chicago, Illinois. 5. B RAKER , W. & A. L. M OSSMAN . 1970. Effects of Exposure to Toxic Gases—First Aid and Medical Treatment. Matheson Gas Products, East Rutherford, Nueva Jersey. 6. S AX , N. I. 1968. Dangerous Properties of Industrial Materials, 3. a ed. Van Nostrand Reinhold Co., Nueva York. 7. BROWNING, E. C. 1965. Toxicity and Metabolism of Industrial Solvents. Elsevier Scientific Publ. Co., Nueva York.

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1-81

INTRODUCCIÓN GENERAL

1090 D. 1.

Prácticas de control de riesgos

Monitorización

El establecimiento de medidas, prácticas, procedimientos y métodos para evitar la exposición del personal del laboratorio a los materiales peligrosos ha de formar parte de un programa eficaz de seguridad. No obstante, para asegurar el funcionamiento real de esta protección es esencial establecer, simultáneamente, un sistema de monitorización o retroalimentación. a) Monitores químicos: Se han descrito dispositivos capaces de realizar mediciones directas de concentración dentro del entorno inmediato de respiración de una persona1. Utilícense instrumentos activos basados en el bombeo de aire o aparatos pasivos que se fundamentan en el fenómeno de la difusión. Estos aparatos pueden medir compuestos orgánicos e inorgánicos con el absorbente adecuado. Las partículas pueden recogerse en un filtro cuando se utilizan aparatos activos. Es posible conseguir una detallada descripción del desarrollo y uso de monitores personales para la medición de la exposición a los contaminantes químicos del ambiente1. b) Monitores de biorriesgos: Son parte esencial del control microbiológico. Inclúyase una exploración física previa acompañada de análisis hematológicos y otros relacionados con la exposición. Realícense exploraciones anuales con análisis serológicos, estudios de funciones bioquímicas y radiografías de tórax. Archívense las muestras de suero para posibles referencias futuras. El programa de seguridad se completa con la vigilancia sobre el continuo cumplimiento de las reglas básicas de seguridad en el laboratorio. c) Monitores radioquímicas: Consisten en limpiadores, instrumentos de control portátiles y estudio de muestras de aire. En general, se requieren monitores

múltiples. Mídase la exposición de la radiación externa con dosímetros personales, preferiblemente dosímetros de película, para determinar la radiación acumulada a lo largo de un determinado período. Como complemento de estos dosímetros pueden utilizarse minicámaras de ionización, dosímetros termolumínicos y cámaras de obturación. Los detectores de radiactividad corporal o de detección por espectrometría gamma determinan la existencia de sustancias radiactivas en el organismo, pero se trata de aparatos caros que requieren un aprendizaje específico. También se comprobará la posible presencia de elementos radiactivos en las excreciones. Además de la monitorización personal, se llevará a cabo una monitorización general del laboratorio. Se analizará todo el instrumental junto con el material que haya estado en contacto con las sustancias radiactivas. Para ello se utilizarán pruebas dosimétricas y de frotamiento. Los contadores GM de ventana fina sirven para las muestras de frotamiento y para monitorizar la piel y la ropa. Se necesita un monitor de centelleo alfa para detectar las emisiones alfa. Steere2 hace una excelente exposición de las técnicas de monitorización para radioisótopos.

2. Eliminación de residuos a) Consideraciones generales: Los rigurosos requisitos establecidos para la eliminación de residuos contemplan posibles consecuencias penales y civiles tanto para las organizaciones como para las personas. Estas reglas varían según los estados y lugares y están sujetas a modificaciones. Puede ser necesario obtener licencias, permisos o ambos; consúltese a las autoridades locales o estatales.

1-82

Es importante disponer de un plan para eliminar con seguridad las sustancias químicas y biológicas utilizadas en el laboratorio. Este plan debe discutirse con el supervisor y, si se considera adecuado, con el coordinador de seguridad. Gastón3 ha descrito el cuidado, la manipulación y la eliminación de los productos químicos peligrosos. Se instalarán sistemas adecuados de toma, utilizándose envases adecuadamente etiquetados; el almacenamiento tendrá una protección contra incendios y se dispondrá de una zona separada para los materiales altamente peligrosos o tóxicos. Se utilizarán envases metálicos de segundad para los residuos de disolventes y para los materiales incompatibles. Se considerará la conveniencia de utilizar envases especiales para los residuos extraordinariamente peligrosos o muy tóxicos y se dispondrá de un empaquetado especial que evite la rotura o el deterioro de los envases durante el transporte. Los materiales peligrosos incompatibles se almacenarán por separado4. b) Los métodos de eliminación de residuos son la incineración, el enterramiento, la evaporación, la neutralización, la reacción química, los tratamientos especiales y las técnicas aplicadas por especialistas en la materia. Puede conseguirse una serie de hojas de datos sobre seguridad en el manejo de materiales5, en la que se incluyen los métodos de elección para la eliminación de residuos de compuestos orgánicos e inorgánicos especiales. A veces pueden eliminarse algunos productos químicos peligrosos vertiéndolos por el sumidero si se encuentran a ciertas concentraciones, pero sólo se hará si se dispone de un permiso escrito concedido por las autoridades locales responsables de las aguas residuales y basado en un conocimiento suficiente de dichos productos. 1) Residuos químicos. Una vez utilizados, los disolventes pueden ser destilados y recuperados para nuevo uso. Los

MÉTODOS NORMALIZADOS

disolventes no combustibles pueden evaporarse siempre que sus vapores no provoquen problemas ambientales. Cantidades pequeñas de disolventes y productos químicos inflamables pueden quemarse en el suelo, en envases metálicos poco profundos o en incineradores, siempre que se cumplan las normas sobre contaminación del aire. Los materiales ácidos y básicos se neutralizarán antes de eliminarse definitivamente. Muchos materiales solubles no tóxicos pueden diluirse con precaución en un sistema de desagüe, pero antes es preciso asegurarse de que no resultarán peligrosos para las cañerías o para el medio ambiente. Siempre que sea posible, los materiales peligrosos se convertirán, mediante reacciones químicas u otros procesos, en compuestos inocuos antes de proceder a su eliminación. Si ello no es factible, lo mejor es contratar a un especialista en técnicas de eliminación de materiales peligrosos o altamente tóxicos. Los cilindros de gas no recuperables se eliminarán sólo con ayuda de personal cualificado. 2) Residuos biológicos. Esterilícense todas las sustancias infecciosas o tóxicas y todos los instrumentos y aparatos contaminados antes de lavarlos, guardarlos o tirarlos6. El método de esterilización más recomendable es el tratamiento en autoclave. En general, se usa el autoclave a una presión de 103 kPa con una temperatura en la cámara de al menos 121 °C y durante un mínimo de 15 minutos. El tiempo se mide una vez que el material a esterilizar ha alcanzado los 121 °C. Cuando la esterilización se haga con el material dentro de bolsas de plástico, añádase agua al contenido para asegurar la obtención de un calor húmedo. Para la esterilización de objetos que no son de plástico, se utiliza también el calor seco y el tratamiento químico. Tras la esterilización pueden manipularse los residuos con seguridad mediante los sistemas habituales de eliminación. Los residuos contaminados combustibles y los

1-83

INTRODUCCIÓN GENERAL

cadáveres de animales se recogen en envases impermeables que se eliminan por incineración. 3) Residuos radioquímicos. El National Committee on Radiation Protection and Measurements7 ha desarrollado criterios generales para la eliminación de residuos radiactivos. Estas recomendaciones han sido adoptadas oficialmente en los Estados Unidos mediante su publicación en el Registro Federal8. Dos principios generales constituyen la base de la eliminación de los residuos radiactivos: a) dilución y consiguiente dispersión para reducir la concentración de los radionúclidos mediante dilución de la materia inactiva o dilución en un medio receptor, y b) concentración y confinamiento, lo que suele suponer una reducción en el volumen de los residuos que posteriormente se almacenarán para dejar que se desactiven. Los residuos que se difunden por el aire pueden ser tratados por cualquiera de los dos métodos anteriores. La ventilación supone la salida de la radiación a la atmósfera. Los típicos gases radiactivos son el yodo, el kriptón y el xenón. El yodo puede eliminarse por depuración o haciendo que reaccione con nitrato de plata. Los gases nobles pueden eliminarse por adsorción; para las partículas, pueden utilizarse las técnicas estándar. Los métodos de dilución son adecuados para los líquidos de baja actividad. Los niveles intermedios pueden ser tratados mediante diversos procesos físico-químicos para separar los residuos en una porción no radiactiva y otra de gran actividad que deberá guardarse. Los residuos sólidos pueden consistir en equipos, instrumentos de vidrio y otros materiales. Siempre que sea posible, se descontaminarán para utilizarlos de nuevo. La descontaminación suele dar lugar a residuos líquidos. Los materiales combustibles que no pueden ser descontaminados suelen quemarse con precauciones especiales; puede ser necesario obtener un per-

miso para hacer esta operación. Cuando no exista otra alternativa, se almacenarán los residuos hasta que se desactiven o de forma permanente. 4) Otros residuos especiales. En los Estados Unidos, las normas federales sobre bifenilos policlorados (BPC), dioxinas y amianto obligan a adoptar precauciones especiales con los residuos que contengan dichos materiales.

3. 1.

2. 3.

4.

5. 6.

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MÉTODOS NORMALIZADOS

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PARTE 2000 PROPIEDADES FÍSICAS Y DE AGREGACIÓN

2010

INTRODUCCIÓN

Esta parte del presente manual trata esencialmente de la medición de las propiedades físicas de una muestra, estableciendo las pertinentes distinciones respecto de las concentraciones de componentes químicos o biológicos. Muchas de las determinaciones aquí incluidas, como el color, la conductividad eléctrica y la turbidez, satisfacen inequívocamente esta categoría, pero no siempre pueden separarse totalmente de la composición química. Algunas de las técnicas citadas miden, por otra parte, las propiedades de agregación derivadas de la presencia de algunos componentes. Otras, por ejemplo la saturación de carbonato cálcico, se relacionan o dependen de pruebas químicas. También se incluyen pruebas de

2020

aspecto, olor y sabor que han sido clasificadas tradicionalmente entre las propiedades físicas, criterio que puede ser en ocasiones discutible. En fin, la sección 2710, referida a pruebas en lodos, analiza algunas pruebas bioquímicas; sin embargo, por comodidad, quedan agrupadas con los demás ensayos realizados con lodos. Con estas pequeñas excepciones, el contenido de esta parte del libro guarda una razonable fidelidad a su título. La mayoría de los métodos incluidos son tradicionalmente de naturaleza física a diferencia de los explícitamente químicos, radiológicos, biológicos o bacteriológicos estudiados en otras partes de la obra.

CONTROL DE CALIDAD

La parte 2000 contiene diversos métodos analíticos, muchos de los cuales no se atienen a las técnicas estándar de control de calidad. En la parte 1000 se proporciona información general sobre tal control y las técnicas específicas se describen en la explicación de cada uno de los métodos. A muchos de los métodos estudiados en este capítulo pueden aplicárseles las siguientes normas generales: Evaluación del rendimiento analítico de cada método. Determinación de la competencia mediante análisis de muestras que contengan concentraciones co-

nocidas. Calibración de los instrumentos y confirmación de que las medidas instrumentales no presentarán desviaciones. Evaluación de la precisión de los métodos analíticos, realizados por duplicado al menos en el 10 por 100 de las muestras. Análisis de un mínimo de cada duplicado en cada batería de muestras. Determinación del sesgo del método analítico en cada lote de muestras mediante análisis de blancos, adiciones conocidas con una frecuencia al menos del 5 por 100 de las muestras y, si es posible, un patrón externo.

2110 ASPECTO* Para examinar el aspecto físico general de una muestra, conviene recurrir a términos que describan brevemente sus características más apreciables. Estos tér-

* Aprobado por el Standard Methods Committee, 1988.

minos pueden referirse, entre otras cosas, a la presencia de color, turbidez, sólidos en suspensión, crustáceos, larvas, gusanos, sedimentos, materias flotables o partículas similares detectables a simple vista. Cuando sea posible, utilícense valores numéricos que valoren color, turbidez o sólidos en suspensión. 2-1

2-2

MÉTODOS NORMALIZADOS

2120 2120 A. El color del agua puede estar condicionado por la presencia de iones metálicos naturales (hierro y manganeso), de humus y turbas, de plancton, de restos vegetales y de residuos industriales. Tal coloración se elimina para adaptar un agua a usos generales e industriales. Las aguas residuales industriales coloreadas suelen requerir la supresión del color antes de su desagüe. 1.

Definiciones

El término «color» se asocia aquí al concepto de color puro, esto es, el color del agua cuya turbidez ha sido eliminada. El término «color aparente» engloba no sólo el color debido a las sustancias disueltas, sino también a las materias en suspensión. Tal color aparente se determina en la muestra original sin filtrado ni centrifugado. En algunas aguas residuales industriales muy coloreadas, el color se debe principalmente a materiales coloidales o en suspensión. En estos casos deben determinarse ambos colores, el aparente y el real. 2. Pretratamiento para eliminar la turbidez Para determinar el color mediante los métodos actualmente aceptados, es necesario eliminar la turbidez antes de proceder al análisis. Todavía no se ha encontrado un método óptimo para suprimir la turbidez ni eliminar el color. El filtrado proporciona resultados reproducibles de un día para otro y entre laboratorios; sin embargo, algunos procedimientos de * Aprobado por el Standard Methods Committee, 1988.

COLOR* Introducción filtrado pueden eliminar parte del color real. El centrifugado evita interacciones del color con los materiales del filtro, pero los resultados varían con la naturaleza de la muestra y el tamaño y velocidad de la centrífuga. Cuando es necesaria la dilución de la muestra, tanto antes como después de la eliminación de la turbidez, ésta puede alterar el valor de color registrado caso de que existan corpúsculos coloreados luminosos. En cada método se señalan procedimientos aceptables de pretratamiento. Cuando se informe sobre resultados, ha de definirse el método de pretratamiento. 3.

Selección del método

El método de comparación visual es aplicable a casi todas las muestras de agua potable. La polución por algunos residuos industriales suele producir colores poco habituales que no pueden equipararse. En este caso debe utilizarse un método instrumental. Una modificación de los métodos de triestímulo y espectrofotométrico permite el cálculo del valor de un color simple, representando diferencias de cromaticidad uniforme, incluso cuando la muestra exhibe un color significativamente diferente de los patrones de cobalto-platino. Por comparación de valores de color entre laboratorios, calibrar el método visual mediante procedimientos instrumentales. 4.

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2-3

PROPIEDADES FÍSICAS Y DE AGREGACIÓN

2120 B. 1.

Método de comparación visual

Discusión general

a) Principio: El color se determina mediante comparación visual de la muestra con concentraciones conocidas de soluciones coloreadas. La comparación también puede realizarse con discos especiales de cristal de color, adecuadamente calibrados. El método patrón de medida de color es el de cobalto-platino, siendo la unidad de color el producido por 1 mg de platino/1 en forma de ion cloroplatinato. El índice cobalto-platino puede variarse para equiparar tonalidades en casos especiales; la proporción que se menciona más adelante es satisfactoria por lo general para igualar el color de las aguas naturales. b) Aplicación: El método platino-cobalto es útil para medir el color del agua potable o aquella cuyo color se debe a materiales naturales; no es aplicable en cambio a la mayoría de las aguas residuales industriales de coloración intensa. c) Interferencia: La turbidez, incluso cuando es ligera, hace que el color aparente sea más llamativo que el color real; por tanto, ha de eliminarse la turbidez antes de aproximarse al color real, bien mediante lectura diferencial con filtros de color distintos1, bien por medidas de dispersión diferencial2. Sin embargo, ninguna técnica ha conseguido la calificación de método estándar. Elimínese la turbidez mediante centrifugado o por el método de filtrado descrito como método C. Centrifúguese durante una hora, a menos que se haya demostrado que la centrifugación en otras condiciones pueda dar lugar a una satisfactoria eliminación de la turbidez. El valor del color del agua depende en buena medida y se incrementa invariablemente al aumentar el pH del agua. Cuando se informa sobre un registro numérico referido a color, especifíquese el pH al que fue determinado. Con fines de

investigación o cuando se comparen valores de color entre laboratorios, determínese la respuesta de color de un agua dada sobre un amplio margen de cifras de pH3. d) Método de campo: Dado que el método estándar platino-cobalto no resulta adecuado como método de campo, puede establecerse otro basado en la comparación del color del agua con el de los discos de vidrio situados al extremo de tubos metálicos, que contienen a su vez tubos de vidrio de comparación llenos de agua destilada incolora. Iguálese el color de la muestra con el del tubo de agua destilada más el cristal de color calibrado, mirando a través sobre una superficie blanca, y calíbrese cada disco hasta que se corresponda con el color de la escala platino-cobalto. Los discos de cristal proporcionan resultados sustancialmente coincidentes con los obtenidos mediante el método de platino-cobalto y su uso ha sido admitido como un método estándar de campaña. e) Métodos de laboratorio no estándar: El empleo como patrones de discos de vidrio o de líquidos que no sean agua para el trabajo de laboratorio sólo es permisible si éstos han sido calibrados individualmente frente a los patrones platino-cobalto. Las aguas de color poco usual —como las que aparecen a veces en mezclas de algunos residuos industriales— pueden presentar tonalidades tan diferentes de las del estándar platino-cobalto que la comparación es difícil, cuando no imposible. Para tales aguas, empléense los métodos de las secciones 2120 C y D. Hay que señalar, sin embargo, que los resultados obtenidos con ellos no son directamente comparables a los obtenidos con los estándares platinocobalto. f) Toma de muestras: Recójase la muestra en material de vidrio limpio, realizando la determinación colorimétri-

MÉTODOS NORMALIZADOS

2-4

ca dentro de un plazo razonable, ya que las alteraciones biológicas y físicas producidas durante la conservación pueden afectar al color. En las aguas coloreadas naturalmente, estas alteraciones conducen siempre a resultados defectuosos. 2. Instrumental a) Tubos de Nessler, iguales, de 50 ml y forma alta. b) Medidor de pH, para determinación del pH de la muestra (véase sección 4500-H + ). 3. Preparación de patrones a) Si no puede conseguirse un suministro fiable de cloroplatinato, utilícese ácido cloroplatínico preparado a partir de platino metal. No conviene utilizar ácido cloroplatínico comercial, porque es muy higroscópico y puede variar en su contenido de platino. El cloroplatinato de potasio no es higroscópico. b) Disuélvanse 1,246 g de cloroplatinato potásico, K2PtCl6 (equivalente a 500 mg de Pt metal), y 1,00 g de cloruro de cobalto cristalizado, CoCl2-6H2O (equivalente a unos 250 mg de Co metal), en agua destilada con 100 ml de C1H concentrado, y dilúyanse hasta 1.000 ml del agua destilada. Este material estándar tiene un color de 500 unidades. c) Si no se dispone de K 2PtCl6, disuélvanse 500 mg de Pt metálico puro en agua regia con calor; elimínese el HNO3 mediante evaporación repetida con fracciones de HC1 conc. reciente. Disolver todo ello con 1,00 g de CoCl2-6H2O cristalizado como se dijo anteriormente. d) Prepárense patrones con los colores 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60 y 70, mediante diluciones de 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 6,0, y 7,0 ml del estándar de color con agua destilada, hasta 50 ml, en tubos de Nessler. Protéjanse estos patrones de la evaporación y la contaminación mientras no se utilicen.

4. Procedimiento a) Estimación de una muestra intacta: Obsérvese el color de la muestra llenando con ésta un tubo de Nessler hasta la marca de 50 ml, y compárese con el estándar. Es conveniente mirar verticalmente hacia abajo a través de los tubos sobre una superficie blanca o especular, situada en un ángulo de forma que la luz se refleje hacia arriba a través de las columnas de líquido. Si existe turbidez y no se ha eliminado, anótese «color aparente». Si el color excede las 70 unidades, dilúyase la muestra en agua destilada a proporciones conocidas hasta que el color se sitúe dentro de los márgenes del estándar. b) Mídase el pH de cada muestra.

5. Cálculo a) Calcular las unidades de color por la siguiente ecuación:

donde: A = color estimado de una muestra diluida y

B = ml de muestra tomados para la dilución.

b) Infórmense los resultados de color en cifras completas y regístrense como sigue:

c)

Informe del pH de la muestra.

PROPIEDADES FÍSICAS Y DE AGREGACIÓN

6.

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Método espectrofotométrico

Discusión general

a) Principio: El color de una muestra filtrada se expresa en términos que describen la sensación percibida al observarla. La tonalidad (rojo, verde, amarillo, etcétera) se designa como «longitud de onda dominante», el grado de brillantez como «luminancias» y la saturación (pálido, pastel, etc.) como «pureza». Como mejor se detectan estos valores es a partir de las características de transmisión de la luz de una muestra filtrada, mediante espectrofotometría. b) Aplicación: Este método es aplicable en aguas potables y de superficie, y en aguas residuales, tanto domésticas como industriales. c) Interferencia: Interfiere la turbidez. Más adelante se describe el proceso de eliminación mediante filtrado.

Figura 2120:1. Sistema de filtrado para determinaciones de color.

2-6

2. Instrumental a) El espectómetro tendrá células de absorción de 10 mm, una banda espectral limitada (10 nm o menos) y un margen operativo eficaz comprendido entre 400 y 700 nm. b) Sistema de filtrado, que consta de lo siguiente (véase fig. 2120:1): 1) Matraces de filtrado, 250 ml, con tubos laterales. 2) Soporte de crisol Walter. 3) Crisol de filtro micrometálico, tamaño medio de poro, 40 uní. 4) Auxiliar de filtrado por calcinación*. 5) Sistema de vacío. 3. Procedimiento a) Preparación de la muestra: Tómense dos muestras de 50 ml a temperatura ambiente. Utilícese una a pH original y ajústese el pH de la otra a 7,6 añadiendo ácido sulfúrico (H2SO4) e hidróxido sódico (NaOH), a concentraciones adecuadas para que el cambio de volumen no exceda el 3 por 100. Es necesario un pH estándar debido a la variación de color con el mismo. Elimínese por centrifugado el exceso de materias en suspensión. Cada muestra deberá tratarse por separado según las siguientes indicaciones: Mézclese cuidadosamente 0,1 g de auxiliar de filtrado en una porción de 10 ml de muestra centrifugada y fíltrese hasta formar una precapa en el crisol de filtro. Fíltrese directamente al matraz residual, tal como se indica en la figura 2120:1. Mézclense 40 mg de auxiliar de filtrado en una porción de 35 ml de muestra centrifugada. Todavía en vacío, fíltrese a través de la precapa y pasar el filtrado al matraz de residuos hasta que aparezca limpio; a continuación, diríjase * Celite núm. 505, Manville Corp.. o equivalente.

MÉTODOS NORMALIZADOS

este filtrado claro al matraz limpio por medio de la espita de tres posiciones, y recoger 25 ml para determinación de la transmitancia. b) Determinación de las características de transmisión de la luz: Límpiense meticulosamente las celdas de absorción de 1 cm con detergente y enjuáguense con agua destilada. Aclárense dos veces con muestra filtrada y límpiense las superficies externas con papel para envolver vidrios ópticos y a continuación llévense la celda con muestra filtrada. Determínense los valores de transmirancia (en %) para cada cifra de longitud de onda visible presentada en la tabla 2120:1, utilizando las 10 ordenadas marcadas con asterisco para obtener una aproximación y las 30 restantes para mayor exactitud. Dispónganse instrumentos para leer el 100 por 100 de transmitancia sobre el blanco de agua destilada y realizar todas las determinaciones con una banda de espectro limitada. 4.

Cálculo

a) Tabúlense los valores de transmirancia correspondientes a las longitudes de onda mostradas en las columnas X, Y y Z de la tabla 2120:1. Totalícese cada columna de transmitancia y multiplíquense los totales por los factores adecuados (para 10 ó 30 números) que figuran en la parte baja de la tabla, para obtener valores triestímulo X, Y y Z. El valor triestímulo corresponde al porcentaje de luminancia. b) Calcúlense los coeficientes tricromáticos x e y a partir de los valores triestímulo X, Y y Z, mediante las siguientes ecuaciones:

PROPIEDADES FÍSICAS Y DE AGREGACIÓN

TABLA 2120:1. ORDINALES SELECCIONADOS PARA DETERMINACIONES ESPECTROFOTOMÉTRICAS DE COLOR*

2-7

Localícese el punto (x, y) en uno de los diagramas de cromaticidad de la figura 2120:2 y determínese la longitud de onda predominante (en nanómetros) y la pureza (en porcentaje) directamente a partir del diagrama. Determínese la tonalidad a partir del valor de longitud de onda dominante, de acuerdo con los márgenes de la tabla 2120:11. TABLA 2120:11. MATICES DE COLOR PARA MÁRGENES DE LONGITUD DE ONDA DOMINANTE

* Para significancia de «c», véase figura 2120:2.

5. Expresión de resultados Concrétense las características de color (a pH 7,6 y al pH original) en función de la longitud de onda dominante (nanómetros, para la unidad más próxima), la tonalidad (por ejemplo, azul, azul verdoso, etc.), luminancia (porcentaje, respecto a la decena más próxima) y pureza (porcentaje, respecto a la unidad más próxima). Especifíquense el tipo de instrumento (por ejemplo, espectrofotómetro), el número de ordenadas seleccionadas (10 ó 30) y la anchura de banda espectral (nanómetros) utilizada. * insertar en cada columna el valor de transmilancia (%) correspondiente a la longitud de onda mostrada. Cuando basta una exactitud limitada, utilícense solamente los ordinales marcados con asterisco.

6. Bibliografía HARDY , A. C. 1936. Handbook of Colorimetry. Technology Press, Boston, Massachusetts.

2-8

0,40

MÉTODOS NORMALIZADOS

2-9

PROPIEDADES FÍSICAS Y DE AGREGACIÓN

2120 D.

Método de filtro triestímulo

1. Discusión general a) Principio: Para obtener datos de color útiles para control rutinario pueden emplearse tres filtros especiales de luz triestímulo, combinados con una fuente de luz y una célula fotoeléctrica de un fotómetro de filtro. El porcentaje de luz triestímulo transmitida por la solución se determina para cada uno de los tres filtros y, a continuación, los valores de transmitancia se convierten en coeficientes tricromáticos y valores característicos de color. b) Aplicación: Este método es aplicable a aguas potables y de superficie y a aguas residuales, tanto domésticas como industriales. Excepto en los trabajos en los que se requieren valores muy exactos, ofrece resultados muy similares a los del método C. c) Interferencia: Debe eliminarse la turbidez. 2. Instrumental a) Fotómetro de filtro*. b) Fuente de luz del fotómetro de filtro: Lámpara de tungsteno a una temperatura de color de 3000 °C†. c) Células fotoeléctricas de fotómetro de filtro, 1 cm‡. d) Filtros triestímulo§. e) Sistema de filtrado: Véanse sección 2120C.26 y figura 2120:1. 3. Procedimiento a) Preparación de la muestra: Véase sección 2120C.3a. * Electrofotómetro Fisher o equivalente. † Lámpara General Electric núm. 1719 (a 6V) o equivalente. ‡ Célula fotovoltaica General Electric, tipo PV-1 o equivalente. § Corning CS-3-IO7 (N.° 1), CS-4-98 (N.° 2) o equivalente.

b) Determinación de las características de transmisión de luz: Lávense cuidadosamente (detergente) y aclárense con agua destilada las células de absorción de 1 cm. Ha de enjuagarse dos veces cada célula con muestra filtrada, lavar la superficie con papel para material óptico y llenar las células con muestra filtrada. Colóquese un blanco de agua destilada en otra célula y utilícese ésta para situar el instrumento en un 100 por 100 de transmitancia. Determínese el porcentaje de transmisión de luz a través de la muestra para cada uno de los filtros de luz triestímulo con la intensidad de la lámpara del fotómetro de filtro fijada en una posición equivalente a 4V.

4.

Cálculo

a) Determínese el valor de luminar»cia directamente como el porcentaje de valor de transmitancia obtenido con el filtro triestímulo núm. 2. b) Calcúlense los valores triestímulo X, Y y Z a partir de la transmitancia porcentual (Tl, T2 y T3) para los filtros núms. 1, 2, 3 como sigue: X = T3 x 0,06 + r, x 0,25 Y = T 2 x 0 ,31 6 Z = r3 x 0,374

Calcúlense y determínense los coeficientes tricromáticos x e y, la longitud de onda dominante, la tonalidad y la pureza según se ha señalado anteriormente en la sección 2120C.4b.

5.

Expresión de resultados

Se hará según se indica en la sección 2120C.5.

MÉTODOS NORMALIZADOS

2-10

2120 E. 1.

Método ADMI de filtro triestímulo (PROPUESTA)

Discusión general

a) Principio: Este método es una ampliación del método triestímulo 2120D, y con él puede obtenerse una medida de la muestra de color, independientemente de la tonalidad. Se basa en el empleo de la fórmala de valor cromático de AdamsNickerson1 para el cálculo de valores numéricos simples de diferencias de color, es decir, diferencias de color uniformes. Por ejemplo, si a simple vista dos colores, A y B, se consideran distintos del tono incoloro en un mismo grado, sus valores ADMI de color serán los mismos. La modificación fue llevada a cabo por miembros del American Dye Manufacturers Institute (ADMI)2. b) Aplicación: Este método se aplica tanto a aguas limpias y residuales coloreadas, que tengan características cromáticas significativamente diferentes de los estándares platino-cobalto, como a las que presentan una tonalidad similar a la de los estándares. c) interferencia: Elimínese la turbidez. 2.

Instrumental

a) Fotómetro de filtro*, equipado con filtros triestímulo CIE (véase 2120D.2..7). b) Fuente de luz del fotómetro de filtro: Lámpara de tungsteno a una temperatura de color de 3.000 °C (véase 2120D.2b). c) Celdillas de absorción y soportes de celda adecuados: Para valores de color menores de 250 unidades ADMI, empléense células con paso de luz de 5,0 cm; para valores mayores de 250, utilícense celdas con paso de 1,0 cm. a) Sistema de filtrado: Véanse sección 2120C.26 y figura 2120:1; puede * Electrocolorímetro Fisher. modelo 181. o equivalente.

emplearse también una centrífuga capaz de conseguir 1.000 x g (véase sección 2120B). 3.

Procedimiento

a) Calibrado de instrumentos: Establézcase una curva para cada fotómetro; los datos de un instrumento no pueden aplicarse a otro. Prepárese una curva de calibrado distinta para cada longitud de paso de la celdilla de absorción. 1) Prepárense estándares según el procedimiento descrito en 2120B.3. Para una longitud de célula de 5 cm se dispondrán estándares cen valores de color de 25, 50, 100, 200 y 250. mediante dilución de 5,0, 10,0, 20,0, 30,0, 40.0 y 50.0 ml de estándar de color con agua destilada, hasta 100 ml en matraces volumétricos. Para longitudes de paso más cortas, prepárense estándares adecuados con valores de color más altos. 2) Determínese la transmitancia de luz (véase apartado 3c, más adelante) para cada estándar con cada filtro. 3) Utilizando los cálculos descritos en el apartado 3d, calcúlense los valores triestímulo (Xs, Ys, Zs) para cada estándar, determínense los valores Munsell y calcúlese el valor intermedio (DE). 4) Empleando los valores DE para cada estándar, calcúlese un factor de calibrado Fn para cada estándar, a partir de la siguiente ecuación;

donde: (APHA)n= valor de color APHA para estándar n, (DF) n = valor intermedio calculado para estándar, y b = paso en centímetros de luz de la celdilla.

PROPIEDADES FÍSICAS Y DE AGREGACIÓN

Colocando (DE)n en el eje de abscisas y Fn en el de ordenadas, puntéese una curva para las soluciones estándar. Utilícese la curva de calibrado para derivar el valor F a partir de los valores DE obtenidos con las muestras. b) Preparación de muestras: Prepárense dos porciones de muestra de 100 ml (una a pH original y otra a 7,6), como se describe en la sección 2120C.3a, o por centrifugación. (NOTA: el centrifugado sólo es aceptable si permite lograr una eliminación de la turbidez equivalente a la del filtrado.) c) Determinación de las características de transmisión de la luz: Lávense cuidadosamente con detergente las celdillas de absorción y aclárense con agua destilada. Enjuáguese cada celdilla de absorción dos veces con muestra filtrada. Limpíense las superficies externas con papel para limpiar lentes ópticas y llénese la celdilla con muestra. Determínese la transmitancia de luz de la muestra con los tres filtros para obtener los valores T1 del filtro 1, T2 del filtro 2 y T3 del filtro 3. Estandarizar el instrumento con cada filtro, a 100 por 100 de transmitancia, con agua oxigenada. d) Cálculo de valores de color: Los valores triestímulo para muestras son Xs, Ys y Zs; para estándar, Xr, Yr y Zr; y para agua destilada, Xc, Yc y Zc. Los valores Munsell para muestras son Vxs, Vys y Vzs; para estándar, Vxr, Vyr y Vzr; y para agua destilada, Vxc, Vyc y Vzc. Para cada estándar o muestra, calcúlense los valores triestímulo, a partir de las siguientes ecuaciones:

2-11

Xc = 98,09 Yc = 100,0 Z c = 118,35

Para convertir los seis valores triestímulo (Xs, Ys, Zs, Xc, Yc, Zc,) en los valores Munsell correspondientes, utilícense las tablas publicadas 2, 3, 4*, o mediante la ecuación de Bridgeman3. Los valores intermedios de DE se calculan a partir de la ecuación

donde:

cuando la muestra se compara con agua destilada. Con la curva de calibrado estándar, utilícese el valor DE para determinar el factor F de calibrado. El valor ADMI de color final se calcula como sigue:

donde: b = paso de luz de la celda de absorción (cm).

Infórmese sobre valores ADMI de color a pH original y a 7,6. 4.

Método alternativo

El valor ADMI de color puede también determinarse espectrofotométricamente, utilizando un espectómetro de Los valores triestímulo para el blanco de agua destilada utilizado para estandarizar el aparato son siempre:

* Instrumental Colour Systems, Ltd., 7 Bucklebury Place, Upper Woolhampton, Berkshire RG7 5UD, Inglaterra.

2-12

MÉTODOS NORMALIZADOS

banda espectral limitado (10 nm o menos) y un margen operativo eficaz de 400 a 700 nm. Este método es una ampliación de 2120C. Los valores triestímulo pueden calcularse a partir de las medidas de transmitancia, preferentemente mediante uso del método de ordinales ponderados o de ordinales seleccionados. El método ha sido descrito por Allen y cols.2, quienes incluyen protocolos y ejemplos prácticos.

MAN.

1973. Determination of color of water and wastewater by means of ADMI color values. Proc. 28th Ind. Waste Conf., Purdue Univ., Eng. Ext. Ser. N.° 142:661. BRIDGEMAN, T. 1963. Inversion of the Munsell value equation. J. Opt. Soc. Amer. 53:499.

6. 5. 1.

2.

Referencias

Bibliografía

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2130 TURBIDEZ* 2130 A. 1.

Introducción

Fuentes y significación

La transparencia del agua es importante para la elaboración de productos destinados a consumo humano y para numerosos usos industriales. Los fabricantes de bebidas, los procesadores de alimentos y el tratamiento de las plantas de extracción sobre agua superficial generalmente confían en la coagulación, la clasificación y el filtrado para garantizar productos aceptables. La transparencia de una masa natural de agua es un factor decisivo para la calidad y productividad de estos sistemas. La turbidez del agua es producida por materias en suspensión, como arcilla, cieno o materias orgánicas e inorgánicas

finamente divididas, compuestos orgánicos solubles coloreados, plancton y otros microorganismos. La turbidez es una expresión de la propiedad óptica que origina que la luz se disperse y absorba en vez de transmitirse en línea recta a través de la muestra. La correlación de la turbidez con la concentración en peso de la materia en suspensión es difícil de establecer, ya que en la dispersión luminosa también intervienen el tamaño, la forma y el índice de refracción de las partículas. Partículas ópticamente negras, como las de carbono activado, pueden absorber luz y aumentar significativamente las cifras de turbidez. 2.

* Aprobado por el Standard Methods Committee, 1988.

Selección del método

Históricamente, el método para determinación de la turbidez se basa en el

PROPIEDADES FÍSICAS Y DE AGREGACIÓN

2-13

turbidímetro de Jackson1; sin embargo, el valor más bajo de turbidez que puede medirse directamente con este instrumento es de 25 unidades. Como la turbidez del agua tratada suele situarse en un intervalo de 0 a 1 unidades, también se desarrollaron métodos indirectos. Por desgracia, ningún aparato puede duplicar los resultados obtenidos para todas las muestras con el turbidímetro de Jackson. Debido a las diferencias fundamentales en el sistema óptico, los resultados obtenidos con distintos tipos de instrumentos secundarios a menudo no concuerdan exactamente, aun cuando los aparatos estén precalibrados frente al turbidímetro de bujía. Muchos de los turbidímetros comerciales disponibles para medida de turbidez baja proporcionan datos comparativamente válidos sobre la intensidad de la luz dispersada en una dirección dada, predominantemente en ángulo recto a la luz incidente. Esos nefelómetros se ven escasamente afectados por las pequeñas variaciones de los parámetros de diseño y, por tanto, resultan especialmente útiles como instrumento estándar para medir turbideces bajas. Los turbidímetros no estándar, como los dispositivos de anterodispersión, son más sensibles para las partículas grandes y útiles para monitorización del proceso. Otra de las causas de discrepancia en el análisis de la turbidez es el empleo de suspensiones de tipos distintos de material en partículas para la preparación de las curvas de calibrado de instrumentos. Como las muestras de agua, las suspensiones preparadas tienen propiedades ópticas distintas que dependen de la distribución del tamaño de las partículas, su forma y su índice de refracción. Para la calibración del nefelómetro se

exige una suspensión de referencia estándar que tenga propiedades reproducibles de dispersión luminosa. Dado que no existe relación directa entre la intensidad de la dispersión de luz a un ángulo de 90° y la turbidez de la bujía de Jackson, tampoco existe un fundamento válido para calibración de un nefelómetro en términos de unidades-bujía. Para evitar interpretaciones erróneas, los resultados de las medidas nefetométricas deben expresarse en forma de unidades nefelométricas de turbidez (UNT). Por su precisión, su sensibilidad y su fácil aplicación a un amplio margen de turbideces, el método nefelométrico resulta preferible a los métodos visuales. El método de bujía de Jackson ha sido eliminado de la presente edición de Métodos normalizados.

3.

Conservación de la muestra

Determínese la turbidez el mismo día en que se toma la muestra. Si es inevitable una conservación más prolongada, almacénense las muestras en ambiente oscuro hasta 24 horas. No almacenar largos períodos por la posible aparición de cambios irreversibles de la turbidez. Agítense vigorosamente todas las muestras antes de su examen.

4.

Referencias

1. AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION, AMERICAN WATER WORKS ASSOCIATION & WATER POLLUTION CONTROL FEDERATION. 1985. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 16.a ed. American Public Health Assoc, Washington, D.C.

2-14

MÉTODOS NORMALIZADOS

2130 B.

Método nefelométrico

1. Discusión general a) Principio: Este método se basa en la comparación de la intensidad de la luz dispersada por la muestra en condiciones definidas y la dispersada por una solución patrón de referencia en idénticas condiciones. Cuanto mayor es la intensidad de la luz dispersada, más intensa es la turbidez. Como suspensión patrón de turbidez de referencia se emplea el polímero formacina. Es fácil de preparar y, en cuanto a propiedades de dispersión de luz, más reproducible que la arcilla o el agua turbia natural. La turbidez de una concentración especificada de suspensión de formacina se define como el equivalente a 40 unidades nefelométricas. Esta suspensión tiene una turbidez aproximada de 40 unidades Jackson si se mide en el turbidímetro de bujía; por tanto, las unidades nefelométricas basadas en la preparación de formacina se aproximarán a las del turbidímetro de bujía, pero no serán idénticas. b) Interferencia: La turbidez puede determinarse en cualquier muestra de agua libre de residuos y privada de sedimentos gruesos. La suciedad del vidrio, la presencia de burbujas de aire y los efectos de las vibraciones que alteran la visibilidad superficial de la muestra, conducirán a resultados falsos. El «color verdadero», es decir, el color del agua debido a sustancias disueltas que absorben luz, origina que la turbidez sea más baja. Este efecto, por lo general, no resulta significativo en el caso de aguas tratadas. 2.

Instrumental

a) Turbidímetro, consistente en un nefelómetro en una fuente de luz para iluminar la muestra, y uno o más detectores fotoeléctricos con un dispositivo de

lectura exterior para indicar la intensidad de la luz dispersada a 90° de la vía de luz incidente. Utilícese un turbidímetro diseñado de manera que una parte de la luz desviada alcance el detector en ausencia de turbidez y libre de una desviación significativa después de un breve calentamiento. La sensibilidad del instrumento debiera permitir la detección de diferencias de turbidez de 0,02 UNT o menos, en aguas con cifras de menos de 1 UNT, con margen entre 0 y 40 UNT. Para obtener una cobertura adecuada y una sensibilidad suficiente para turbideces bajas son necesarios varios márgenes. Las diferencias en el diseño del turbidímetro producirán diferencias en los valores obtenidos, aunque se use la misma suspensión para el calibrado. A fin de reducir al mínimo estas diferencias, obsérvense los siguientes criterios de diseño: 1) Fuente de luz: Lámpara de filamento de tungsteno dispuesto para una temperatura de color comprendida entre 2.200 y 3.000 °K. 2) Distancia recorrida por la luz incidente y la dispersada dentro del tubo de muestra: Total que no exceda de 10 cm. 3) Ángulo de aceptación de la luz por el receptor: Centrada a 90° de haz de luz incidente y sin exceder ± 30° a partir de 90°. El detector y el sistema de filtro, si se usa, tendrán una respuesta-pico en el espectro entre 400 y 600 nm. b) Tubos de muestra, de cristal incoloro, transparente. Mantener los tubos escrupulosamente limpios, por dentro y por fuera, descartando los rayados y manchados. No manejarlos cuando están bajo la luz. Utilícense de tipo extralargo, con un estuche protector que facilite su manejo. Llénense las muestras y los patrones después de agitación cuidadosa, dejando tiempo para que se eliminen las burbujas.

2-15

PROPIEDADES FÍSICAS Y DE AGREGACIÓN

3. Reactivos a) Agua libre de turbidez: Es difícil de obtener. Para medir una turbidez alrededor de 0,02 UNT es adecuado el siguiente método. Pásese agua destilada a través de una membrana de filtro con orificios de precisión de 0,2 (μm*; no resultan adecuados los filtros bacteriológicos corrientes. Enjuáguese el matraz de recogida al menos dos veces con agua filtrada y deséchense los 200 ml siguientes. Algunas botellas de agua desmiueralizada de uso comercial están casi libres de partículas. Pueden usarse cuando su turbidez sea más baja que la obtenida en el laboratorio. Dilúyanse las muestras con agua destilada hasta una turbidez no menor de 1. b) Suspensión de turbidez de reserva:

d) Estándares alternativos: Como alternativa a la preparación y dilución de formacina, utilícense estándares comerciales, como los gránulos de estireno-divinilbenzeno†, si se ha demostrado su equivalencia a la formacina de preparación reciente. e) Estándares diluidos de turbidez: Dilúyanse porciones de suspensiones de turbidez estándar con agua libre de turbidez, según se requiera. Prepárese diariamente.

4. Procedimiento

1) Solución I: Disuélvanse 1,000 g de sulfato de hidracina (PRECAUCIÓN: Cancerígeno, evitar inhalación, ingestión y contacto con la piel), (NH2)2·H2SO4, en agua destilada y dilúyanse hasta 100 ml en un matraz volumétrico. 2) Solución II: Disuélvanse 10,00 g de hexametilenotetraamina, (CH2)6N4, en agua destilada y dilúyanse hasta 100 ml en un matraz volumétrico. 3) En un matraz de 100 ml mézclense 5,0 ml de solución I y 5,0 ml de solución II. Manténgase durante 24 horas a 25 ± 3 °C, dilúyase hasta la marca y mézclese. La turbidez de esta suspensión es de 400 UNT. 4) Prepárense soluciones y suspensiones mensualmente. c) Suspensión de turbidez estándar: Dilúyanse 10,00 ml de suspensión madre de turbidez, hasta 100 ml, en agua libre de turbidez. Prepárese diariamente. La turbidez de esta suspensión se considera de 40 UNT.

a) Calibrado de turbidímetro: Síganse las instrucciones del fabricante. A falta de una escala precalibrada, prepárense curvas de calibrado para cada margen del aparato. Utilizando estándares adecuados, compruébese la exactitud de cualquier escala de calibrado de que se disponga sobre un instrumento precalibrado. Verifíquese por lo menos un estándar en cada margen del aparato que se vaya a utilizar. Compruébese que el turbidímetro facilita lecturas estables en todos los márgenes de sensibilidad utilizados. Es probable que las turbideces elevadas determinadas por medida directa difieran apreciablemente de las determinadas por la técnica referida en el apartado 4c. b) Medida de turbideces menores de 40 UNT: Agítese cuidadosamente la muestra. Espérese hasta que desaparezcan las burbujas de aire, y viértase la muestra en el tubo del turbidímetro. Cuando sea posible, viértase la muestra agitada en el tubo y sumérjase en un baño ultrasónico durante 1-2 segundos, obteniendo la eliminación total de las

* Nudepore Corporation, 7035 Commerce Circle, Pleasanton, California, o equivalente.

* Estándar AMCO-AEPA-1, Advanced Polyrner Systems, 3696 Haven Ave., Redwood City, California.

2-16

MÉTODOS NORMALIZADOS

burbujas. Léase directamente la turbidez en la escala del aparato o en la curva del calibrado adecuada. c) Medida de turbideces superiores a 40 UNT: dilúyase la muestra con uno o más volúmenes de agua libre de turbidez hasta que ésta descienda a 30-40 UNT. Calcúlese la turbidez de la muestra original en función de la que tiene la muestra diluida y del factor de dilución. Por ejemplo, si cinco volúmenes de agua libre de turbidez se añaden a un volumen de muestra y la muestra diluida mostró una turbidez de 30 UNT, la turbidez de la muestra original era de 180 UNT. d) Calíbrense soluciones de monitorización continua de turbidez, para cifras bajas de ésta, mediante determinación de la turbidez del agua que entra y sale por ellas, utilizando un turbidímetro modelo de laboratorio. Cuando esto no sea posible, empléese un adecuado estándar diluido (apartado 3e). Para turbideces superiores a 40 UNT, utilícese solución madre no diluida.

5.

Cálculo

Unidades nefelométricas de turbidez (UNT)

donde: A = UNT encontradas en muestra diluida, B = volumen (ml) de agua de dilución, y C = volumen (ml) de la muestra tomada para dilución.

6.

Interpretación de los resultados

a) Infórmese de las lecturas de turbidez del siguiente modo:

b) Para comparar la eficacia del tratamiento de un agua, estímese la turbidez de forma más precisa a como se ha señalado aquí. Las incertidumbres y discrepancias en medidas de turbidez hacen improbable que dos o más laboratorios dupliquen los resultados de una misma muestra con más exactitud que la especificada.

7.

Bibliografía

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MÉTODOS NORMALIZADOS

2-18

2150

2150 A. 1-

OLOR*

introducción

Discusión general

El olor, como el gusto, depende del contacto de una sustancia estimulante con la adecuada célula receptora. Los estímulos son de naturaleza química, y por ello se suele decir que el olfato y el gusto son «sentidos químicos». El agua es un medio neutro que siempre se halla presente en o sobre las membranas que perciben la respuesta sensorial. En su forma pura, el agua no produce sensaciones olfativas o gustativas. Hasta ahora no se ha desarrollado ninguna teoría satisfactoria de la olfacción, aunque se hayan formulado muchas. Debido a la respuesta sensorial adversa, el hombre y los animales pueden evitar muchos aumentos potencialmente tóxicos, y, sin esta primitiva forma de protección, muchas especies no habrían sobrevivido. Hoy en día, estos mismos sentidos proporcionan el primer aviso de virtuales riesgos ambientales. El olor se reconoce1 como un factor de calidad que afecta a la aceptabilidad del agua potable (y de los alimentos preparados con ella), que puede corromperse con la presencia de peces y otros organismos acuáticos y anular la estética de Las aguas de instalaciones de recreo. Muchas sustancias orgánicas y algunas inorgánicas influyen en el gusto y el olor. Estas sustancias pueden tener su origen en vertidos de residuos municipales e in-

* Aprobado por el Standard Methods Commiittee. 1985.

dustriales, en factores naturales, corno la descomposición de materias vegetales, o en una actividad microbiana asociada. La expansión tecnológica verificada en la abundancia y diversidad de materias residuales exige una depuración del agua que permita eliminar contaminantes que antes sólo estaban en el aire, y el crecimiento continuo de la población, con el consiguiente uso repetido del agua disponible, incrementa la posibilidad de deterioro de la calidad sensorial del agua. El consumo doméstico y los procesos industriales, como los de la elaboración de alimentos, bebidas y productos farmacéuticos, requieren el empleo de un agua esencialmente libre de olor y sabor. Algunas sustancias, como ciertas sales inorgánicas, producen sabor sin olor, y se evalúan mediante pruebas de gusto (sección 2160). Muchas otras sensaciones adscritas al sentido del gusto son olores en realidad, aunque la sensación no es percibida hasta que el material no liega a la boca. A pesar de los rápidos avances realizados en lo que respecta a calidades sensoriales para los análisis químicos2, la mayoría de los olores son demasiado complejos y se detectan a concentraciones demasiado bajas como para permitir su definición mediante aislamiento y determinación de las sustancias químicas odoríferas. El dispositivo supremo para la realización de pruebas de olor es la nariz humana. Las pruebas de olor se llevan a cabo para proporcionar descripciones cualitativas y medidas cuantitativas aproximadas de la intensidad del olor. El método de medida de la intensi-

2-19

PROPIEDADES FÍSICAS Y DE AGREGACIÓN

dad que aquí se presenta es la prueba de umbral de olor, basada en un método de límites2. No se estudian aquí los métodos supraumbral. La sección 6040B proporciona un procedimiento analítico para cuantificar varios compuestos orgánicos productores de olor, entre los que se incluyen la geosmina y el metilisoborneol. Las pruebas sensoriales son útiles para indagar la calidad de las aguas tratadas y no tratadas, y para controlar el olor a lo largo de los procesos de tratamiento. Con ellas se puede valorar la eficacia de distintos tratamientos y proporcionar un medio de detectar la fuente de contaminación. 2. 1.

2.

Referencias U. S. ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENCY. 1973. Proposed Criteria for Water Quality. Vol. 1, Washington, D.C. AMERICAN SOCIETY FOR TESTING AND MATERIALS COMMITTEE E-18. 1968. STP 433, Basic principles of sensory evaluation; STP 434, Manual on sensory testing methods; STP 440, Correlation of subjective-objective methods in the study of odors and taste. ASTM, Filadelfia, Pennsylvania.

2150 B. 1.

3.

Bibliografía

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Prueba de umbral de olor

Discusión general

a) Principio: Determínese el umbral de olor mediante dilución de una muestra con agua inodora hasta eliminar totalmente el olor perceptible. No existe una concentración absoluta de olor umbral debido a la variación inherente a la capacidad olfatoria individual. La sensibilidad de una misma persona varía según el momento, apareciendo diferencias de un día para otro a lo largo del día. Además, las respuestas varían en función de las características y de la concentra-

ción del estímulo oloroso. El número de personas seleccionadas para medir el umbral de olor dependerá del objetivo de las pruebas, de factores económicos y del personal disponible. Para las pruebas sensoriales, cuando los resultados tienen que representar al conjunto de la población o se desea una gran precisión, se requiere un amplio número de experimentadores. En estas circunstancias se recomienda un número no menor de cinco personas1, aunque es preferible que sean diez o más. En las plantas de tratamiento de aguas suele resultar necesaria

2-20

la medida de niveles del umbral por una sola persona. La interpretación de los resultados de un solo probador requiere el conocimiento de la agudeza relativa de esa persona. Algunos investigadores han utilizado sustancias olorosas específicas, como el m-cresol o n-butanol, para calibrar la respuesta del probador2. b) Aplicación: Este método de umbral es aplicable a una gama de muestras que incluye desde aguas naturales casi inodoras a residuos industriales con cifras de umbral del orden de varios miles. Estas muestras muy olorosas no presentan dificultades específicas, puesto que su concentración se reduce proporcionalmente antes de ser sometidas a observación. c) Descripciones cualitativas: A pesar de los esfuerzos realizados durante más de un siglo, aún no se ha puesto a punto un sistema satisfactorio para caracterización de un olor. Las ediciones anteriores de este libro contenían una tabla de descripciones de olor, propuesta como guía para expresar la calidad del olor. Las anticuadas abreviaturas de esa tabla pueden resultar muy complicadas para el lector. La 12.a edición ofrece una explicación de esos términos. d) Toma y conservación de muestras: Recójanse las muestras para pruebas de olor en botellas de vidrio, con tapones de cristal o revestidos de TFE. Realícense las pruebas tan pronto como sea posible después de la toma de muestras. Si es necesario conservar las muestras, recójanse por lo menos 500 ml en una botella llenándola hasta el tapón, y refrigérese, comprobando que durante esta refrigeración no puede penetrar en la muestra ningún olor extraño. No deben utilizarse recipientes de plástico. e) Decloración: La mayoría de las aguas de consumo y algunas residuales están cloradas; con frecuencia es deseable determinar el olor de la muestra clorada antes y después de la decloración. Declórese con arsenito o tiosulfato en una can-

MÉTODOS NORMALIZADOS

tidad estequiométrica exacta, tal como se describe en Nitrógeno (amonio), sección 4500-NH3. PRECAUCIÓN: NO utilizar compuestos de arsénico como productos declorantes en muestras que puedan servir para pruebas de sabor. f) Temperatura: Los valores de umbral de olor varían con la temperatura. Para la mayoría de las aguas depuradas o naturales, una temperatura de muestra de 60 °C permite la detección de olores que de otra manera pasarían inadvertidos; esta temperatura es la estándar para pruebas de umbral de calor. Para algunos fines —cuando el olor sea demasiado evanescente o la sensación de calor sea excesiva—, esta prueba no es aplicable; cuando la experiencia aconseje una temperatura inferior, utilícese una temperatura de prueba estándar de 40 °C. En casos especiales pueden emplearse otras temperaturas. Informar acerca de la temperatura a que se hicieron las observaciones.

2. Instrumental Para garantizar la fiabilidad de las medidas de umbral, utilícese material de vidrio inodoro. Lávese este material, inmediatamente antes de su uso, con jabón inodoro y solución acida de lavado, y enjuáguese con agua inodora. Resérvese este material exclusivamente para pruebas de umbral. No deben utilizarse tapones de goma, corcho o plástico, ni vasos de boca estrecha. a) Botellas de muestra, con tapón de vidrio o tapas revestidas de TFE. b) Baño a temperatura constante: Un baño de agua o una placa caliente eléctrica, capaces de controlar una temperatura de + 1 °C para pruebas de olor a temperaturas elevadas. El baño no aportará olor alguno a los matraces de olor. c) Matraces de olor: Erlenmeyer (ST32) de 500 ml, con tapón de vidrio,

PROPIEDADES FÍSICAS Y DE AGREGACIÓN

2-21

para mantener diluciones de la muestra durante la prueba. d) Pipetas: 4) Pipetas de transferencia y volumétricas o cilindros graduados: 200, 100, 50 y 25 ml. 4) Pipetas de medida: 10 ml graduadas en décimas. e) Termómetro: De 0 a 110°C, tipo dial con indicador químico o metálico. 3. Agua inodora a) Fuentes: Prepárese agua inodora mediante paso de agua destilada, desionizada o purificada a través de carbón activado, asegurando que el agua solamente entre en contacto con vidrio o TFE. Si no es posible conseguir un instrumental hecho totalmente de vidrio y TFE, utilícese el modelo que se indica más abajo. Si el agua producida no es inodora, reconstrúyase o purifíquese el sistema. En todo caso, contrólese diariamente la calidad del agua obtenida. b) Generador de agua inodora (figuras 2150:1 y 2150:2): 1) Tubo de vidrio borosilicato, diam. 7,5 cm, long. 45 cm. 2) Arandelas de amianto (dos). (PRECAUCIÓN: cancerígeno, manipúlense con cuidado), para tubo de 7,5 cm. 3) Bridas (dos), para tubo de 7,5 cm. 4) Juntas de estanqueidad* (dos), espesor 2,5/10 cm, con orificio de 2,5 cm ranurado a 7,5/20 cm de profundidad, frente a la rejilla, con 3 perforaciones, de 12,5/40 cm de diámetro, para igualarse a los fijadores. 5) Rejillas de acero inoxidable (dos), malla-40, 7,5-7,5/10 cm de diámetro. 6) Placas de latón (dos), 7,5/40 cm de espesor x 15-2,5/10 cm de diámetro. Agujero central roscado para el manguito

* Neopreno, como el que puede obtenerse de Netherland Rubber Co., Cincinnati, Ohio.

Figura 2150:1. Generador de agua inodora.

de 7,5/10 cm. Lábrese un surco circular (2,5/40 cm de profundidad x 2,5/40 cm de anchura y 2,5-2,5/20 cm de diámetro) en la placa para prevenir escapes. Perfórese 3 orificios de 12,5/15 cm de diámetro que coincidan con los fijadores. 7) Manguitos de unión galvanizados (dos), de 3/4-in. x 3-in. Enroscar el manguito en la piaca y soldar en posición. 8) Pernos y tuercas de aluminio (6), 5/16-in. x 2-in., para mantener fijos los ajustes. 9) Carbón activado, de tamaño de grano de tamiz 12 a 40 aproximadamente**. Los accesorios terminales de la unidad de adsorción se insertan en el tubo de cristal. Levántense ligeramente los pernos, adaptando la placa de latón al tubo de cristal hasta conseguir un adecuado ajuste con la junta de estanqueidad. Llénese la unidad de adsorción con carbón activado, golpeando el cilindro suavemente pero sin apretar el carbón. Los accesorios finales se insertan en la unidad y se conectan a la fuente de agua como se indica en la figura 2150:1. ** Nuchar W-VG, Westvaco, Covington, Virginia; Filtrasorb 200, Calgon Corp., Pittsburgh, Pennsylvania; o equivalente.

MÉTODOS NORMALIZADOS

2-22

variará con la calidad y cantidad de agua filtrada. A menudo se aprecian ligeros olores de origen biológico cuando los filtros de carbón mojado dejan de utilizarse entre períodos de prueba. La detección de un olor en el agua procedente del carbón indica la necesidad de cambiar éste.

4.

Figura 2150:2. Conjunto terminal del generador de agua inodora.

Para evitar la introducción de contaminantes orgánicos, se comprueban las juntas de los tubos. Utilícese cinta tipo TFE o una pasta hecha con mezcla de plomo rojo en polvo y agua. Límpiense todos los accesorios nuevos con queroseno y lávense a continuación con detergente. Enjuáguense bien con agua limpia. c) Operación del generador: Se pasa agua corriente o destilada a través del generador de agua inodora, a un ritmo de 100 ml/min. Cuando el generador se pone en marcha, se aplica un chorro de agua para eliminar restos de carbón y proceder a la descarga. Compruébese diariamente antes de su uso la calidad del agua obtenida del generador a 40 y 60 °C. La vida del carbón

Procedimiento

a) Precauciones: Selecciónense cuidadosamente, mediante pruebas preliminares, las personas que van a hacer las pruebas de sabor y olor. Aunque no se requiere una sensibilidad extremada, excluyanse las personas poco sensibles, concentrando la atención en observadores que muestren un sincero interés por la prueba. Evítense estímulos olorosos extraños, como los que aparecen cuando se ha comido o fumado antes de la prueba, o los producidos por jabones aromáticos, perfumes y lociones de afeitado. Debe comprobarse que el probador no padece resfriado o alergia, lo cual influye en la respuesta olorosa. Limítese la frecuencia de las pruebas a un número inferior al nivel de fatiga, con descansos frecuentes en ambiente inodoro. La sala donde se realicen las pruebas debe carecer de elementos de distracción, corrientes de aire y olores2. Si es necesario, dispóngase un cuarto especial inodoro, ventilado por aire filtrado mediante carbón activado y mantenido a temperatura y humedad confortables y constantes3. Para un trabajo eficaz, el número de experimentadores debe ser de cinco o más. Las personas que realizan medidas de olor no deben preparar mezclas ni conocer las concentraciones de dilución que se evalúan. Conviene que sean instruidas sobre el procedimiento antes de que participen en una prueba de grupo. Preséntese primero la muestra más diluida para evitar la fatiga sensorial que produce la muestra concentrada. Durante la

PROPIEDADES FÍSICAS Y DE AGREGACIÓN

prueba, manténgase la temperatura de las muestras en un margen de 1 °C por encima o por debajo de la temperatura especificada. Dado que muchas aguas naturales y residuales están coloreadas o tienen una neta turbidez que puede sesgar los resultados, utilícense matraces opacos o de color oscuro, como los Erlenmeyer rojo actínico. b) Caracterización: Como parte de la prueba de umbral o como prueba aislada, se ordena a cada experimentador que describa con sus propias palabras el olor característico de la muestra. Regístrese la posible coincidencia de valoraciones entre los ensayistas, lo cual puede proporcionar una pista sobre el origen del contaminante oloroso. El valor de la prueba de caracterización aumenta a medida que los experimentadores adquieren experiencia sobre una categoría de olor particular, como algas, clorofenol o moho. c) Medidas del umbral*: El «número de umbral de olor», designado con las siglas NUO, es la dilución mayor de la muestra en agua inodora capaz de producir un olor netamente perceptible. Llévese el volumen total de la muestra y el agua inodora hasta 200 ml en cada prueba. Háganse nuevas diluciones y anótese el correspondiente NUO señalado en la tabla 2150:1. Estas cifras se han calculado de la siguiente manera:

donde: A = ml de muestra, y B = ml de agua inodora. * Existen numerosos métodos de disponer y presentar las muestras para determinaciones de olor. Los ofrecidos aquí son prácticos y económicos en tiempo y personal y generalmente resultan suficientes. Si se proyectan pruebas más extensas y se requieren análisis estadistidos de los datos, será necesario conocer la prueba del triángulo y los métodos que han empleado ampliamente las industrias de condimentos y similares4.

2-23

TABLA 2150:1. NÚMEROS DE UMBRAL DE OLOR CORRESPONDIENTES A VARIAS DILUCIONES

1) Colóquese el volumen adecuado de agua inodora en el primer matraz, añádase muestra al agua (evitando el contacto de la pipeta o la muestra con el labio o el cuello del matraz), mézclese girando y procédase como sigue: Determínese el rango aproximado del número de umbral mediante adición de 200 ml, 50 ml, 12 ml y 2,8 ml de muestra a Erlenmeyer con tapón de vidrio conteniendo agua inodora hasta un volumen total de 200 ml. Como referencia de comparación utilícese un matraz separado que sólo contenga agua inodora. Caliéntense las diluciones y la referencia hasta la temperatura de prueba deseada. 2) Agítese el matraz que contiene el agua inodora, quítese el tapón y huélanse los vapores, haciendo lo mismo con la muestra de prueba que contiene la cantidad menor de agua portadora de olor. Si puede detectarse olor a esta dilución, prepárense muestras más diluidas, según se describe más adelante (apartado 5). Si no puede detectarse olor en la primera dilución, repítase el procedimiento citado utilizando una muestra que contenga la concentración inmediatamente más alta de agua con olor, y continúese este proceso hasta que el olor se detecte claramente.

2-24

MÉTODOS NORMALIZADOS

TABLA 2150:11. DILUCIONES PARA VARIAS INTENSIDADES DE OLOR

A partir de los resultados obtenidos en la prueba preliminar, prepárese una batería de diluciones utilizándose como guía la tabla 2150:11. Prepárense las cinco diluciones señaladas en la línea apropiada y las tres más concentradas de la línea siguiente de dicha tabla. Por ejemplo, si el olor se notó primero en el matraz que contenía muestra de 50 ml en la prueba preliminar, prepárense matraces conteniendo muestras de 50, 35, 25, 17, 12, 8,3, 5,7 y 4,0 ml, diluida cada una de ellas hasta 200 ml de agua inodora. Es necesario seguir este procedimiento para estimular el margen de sensibilidades de todo el grupo de experimentadores. Incluyanse dos o más blancos en la serie cercana al umbral esperado, pero evitando cualquier modelo repetido. No hay que dejar que el experimentador sepa cuáles son las diluciones olorosa y en blanco. Instrúyasele para que huela cada matraz según una secuencia, empezando con la muestra menos concentrada hasta que el olor se detecte con certeza. 4) Regístrense las observaciones indicando en qué matraz de prueba se percibe olor. Por ejemplo:

cionadas en la tabla 2150:11, prepárese una dilución intermedia consistente en una muestra de 20 ml diluida hasta 200 ml de agua inodora. Utilícese esta dilución para determinar el umbral. Multiplíquese por 100 el NUO obtenido para conseguir la dilución intermedia. Raramente se requerirá un paso de dilución intermedia mayor del décuplo. 5.

Cálculo

El número de umbral de olor es el índice de dilución al que empiezan a detectarse gusto u olor. En el ejemplo anterior (apartado 4c4), el primer olor detectable apareció cuando una muestra de 25 ml se diluyó en 200 ml. Así, el umbral es 200 dividido por 25, es decir, 8. La tabla 2150:1 muestra los números de umbral correspondientes a las diluciones comunes. El NUO más pequeño que puede observarse es 1, como ocurre cuando el matraz contiene 200 ml de muestra no diluida. Si no se detecta olor a esta concentración, anótese «no se observó olor», en vez de un número de umbral. (En aplicaciones especiales se han calculado números de umbral fraccionarios5.) A veces aparecen respuestas anómalas; una concentración baja puede designarse como positiva, y una mayor de la serie, negativa. En tal caso, desígnese el umbral como el punto a partir del cual no aparecen otras anomalías. Por ejemplo:

donde: – significa respuesta negativa, y + respuesta positiva.

5) Si la muestra sometida a prueba exige una dilución mayor que las propor-

Ocasionalmente, un matraz contiene algún olor residual o se ha contaminado

PROPIEDADES FÍSICAS Y DE AGREGACIÓN

inadvertidamente. Si la prueba es exacta, repítase la prueba para determinar si el último matraz marcado con « – » era en realidad un blanco de agua inodora mal etiquetado o si el « + » anterior era una muestra contaminada. Utilícense métodos estadísticos adecuados para calcular el umbral promedio más probable a partir de un número elevado de resultados proporcionados por los experimentadores. En la mayoría de los trabajos, el umbral de un grupo se expresará por la media geométrica de los umbrales individuales. 6.

Interpretación de los resultados

El número de un umbral no es un valor exacto. En el caso de que sólo haya un experimentador, representa una opinión en el momento de la prueba. Los resultados de grupo son más significativos porque las diferencias individuales influyen menos en el resultado. Cuando se realiza una comparación con grupos amplios para comprobar la sensibilidad de uno o dos experimentadores, los datos proporcionados por éstos pueden resultar muy útiles. No deben realizarse comparaciones entre momentos y lugares distintos a menos que todas las condiciones de prueba se hayan estandarizado detalladamente y exista algún fundamento para comparar las intensidades observadas. 7.

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2-26

MÉTODOS NORMALIZADOS

2160 2160 A. 1.

GUSTO* Introducción

Discusión general

El gusto define solamente las sensaciones gustativas que se designan como amargas, saladas, acidas y dulces, resultantes de la estimulación química de las terminaciones nerviosas sensitivas de las papilas de la lengua y del paladar blando. El sabor abarca un complejo de sensaciones olfativas, gustativas y táctiles, originadas por el estímulo de terminaciones nerviosas situadas en la lengua y en las cavidades nasal y bucal1. Las muestras de agua depositadas en la boca para hacer un análisis sensorial siempre producen un sabor, aunque en él puede predominar el gusto, el olor o la sensación bucal, dependiendo del estímulo químico. Los métodos de análisis sensorial que se tratarán a continuación requieren la introducción de la muestra en la boca; es decir, dicha muestra debe someterse al sentido del gusto, pero técnicamente el análisis sensorial exige la evaluación de la sensación compleja llamada sabor. En el sentido que aquí se le da, gusto se refiere a un método de análisis sensorial en el que las muestras son sometidas a valoración bucal, pero las evaluaciones resultantes pertenecen al sabor. Para valoraciones sensoriales de muestras de agua valoradas bucalmente se han desarrollado tres métodos: prueba de umbral de sabor (PUS), evaluación de índice de sabor (EIS) y análisis del perfil de sabor (APS). La PUS es el más antiguo; se ha utilizado con mucha frecuencia y resulta especialmente útil para determinar si el sabor global de una muestra de agua es distinto al de un patrón bien definido. La EIS es particularmente valiosa para determinar si una muestra * Aprobado por el Standard Methods Committee, 1988.

de agua es aceptable para el consumo diario3, y el APS sirve, sobre todo, para identificar y caracterizar los distintos sabores específicos de una muestra de agua4. El APS es un método nuevo, pero aún no ha sido estandarizado4. Las pruebas de sabor solamente se realizarán con muestras inocuas para la ingestión, descartándose las que puedan estar contaminadas por bacterias, virus, parásitos o sustancias químicas peligrosas, las que contengan agentes declorantes, como el arsenito de sodio, o las que procedan de una fuente desconocida. No deben llevarse a cabo pruebas con aguas residuales o fluidos similares no tratados. Obsérvense todas las precauciones sanitarias referidas al instrumental y los recipientes que vayan a entrar en contacto con la muestra. Lávense y esterilícense convenientemente los utensilios antes de su uso. Los análisis se realizarán en un laboratorio libre de olor de fondo que pueda interferir y, si es posible, se dispondrá de aire inodoro filtrado por carbón a temperatura y humedad constantes. Utilícese el método descrito en la sección 2150 referido al agua inodora e insípida que se emplea para preparar agua de dilución y muestras de referencia. 2. 1. 2.

3. 4.

Referencias G ELDARD , F. A. 1972. The Human, Senses. John Wiley & Sons, Nueva York. BAKER, R. A. 1961. Taste and Odor in Water: A Critical Review. Manufacturing Chemists' Assoc, Washington, D. C. BRUVOLD, W. H. 1968. Scales for rating the taste of water. J. Appl. Psicol. 52:245. MALLEVIALE , J, & I. H. S UFFET , eds. 1987. The identification and Treatment of Tastes and Odors in Drinking Water. American Water Works Association Research Foundation, Denver, Colorado.

2-27

PROPIEDADES FÍSICAS Y DE AGREGACIÓN

2160 B. 1.

Prueba de umbral de sabor (PUS)

Discusión general

TABLA 2160:1. NÚMEROS DE UMBRAL DE SABOR CORRESPONDIENTES A VARIAS DILUCIONES

La PUS se utiliza para medir cuantitativamente el sabor detectable. Más exactamente, se emplea para comparar de manera objetiva el sabor de la muestra con el del agua de referencia especificada como diluyente. El número de umbral de sabor (ÑUS) es el valor máximo de dilución de muestra con agua de referencia que obtiene una diferencia significativamente perceptible. El NUS se calcula como sigue:

donde: A = volumen de la muestra, ml, y B = volumen de agua de referencia (diluyente), ml.

La tabla 2160:1 expresa los ÑUS correspondientes a varias soluciones. 2.

Procedimiento a)

Selección del grupo de experimen-

tación: A partir de ensayos preliminares se selecciona cuidadosamente a las personas interesadas en realizar las pruebas de sabor. Quedarán excluidos los sujetos poco sensibles y los que padezcan alergias o resfriados. Es conveniente que los probadores se familiaricen con el método antes de participar en la prueba, pero no deben preparar muestras ni conocer las concentraciones de dilución que van a evaluarse. Para un resultado eficaz, manéjese un grupo de cinco o más observadores. b) Caracterización del gusto: Cada uno de los experimentadores describe el sabor característico de la muestra más concentrada, y a continuación se registra la posible coincidencia de apreciaciones.

El valor de la caracterización aumenta a medida que los experimentadores adquieren más experiencia con una categoría determinada de sabor, como clorofenólico, herbáceo o mohoso. c) Prueba preliminar: Para determinar el intervalo aproximado del ÑUS, añádanse porciones de muestra de 200, 50, 12 y 4 ml a los volúmenes de agua de referencia (véase sección 2150) señalados en la tabla 2160:1, en vasos de precipitados hasta un total de 200 ml en cada vaso, y mézclese suavemente con un agitador limpio. Sepárese un vaso que contenga sólo agua de referencia para comparar. La temperatura de la muestra durante la prueba debe mantenerse dentro de un margen de 1 °C de la temperatura especificada. Preséntense las muestras a cada experimentador de manera uniforme, ofreciendo primero el agua de referencia y a continuación la de la muestra más diluida. Si se detecta algún sabor en esta dilución, prepárese una muestra intermedia diluyendo 20 ml de muestra en 200 ml de agua de referencia. Utilícese

2-28

esta dilución para determinar el valor umbral y multiplíquese el NUS obtenido por 10 para corregir la dilución intermedia. En varios casos se requerirá una dilución intermedia mayor. Si no se detecta ningún sabor en la muestra más diluida, repítase el ensayo con la concentración siguiente, continuando el proceso hasta que se note claramente algún sabor. d) Determinación del ÑUS: En función de los resultados obtenidos en la prueba preliminar, prepárese una batería de diluciones utilizando como modelo la tabla 2160:11. Prepárense las siete diluciones mostradas en la línea correspondiente. Esta ordenación es necesaria para descubrir el margen de sensibilidades de todos los experimentadores del panel. Si la muestra sometida a prueba requiere una dilución mayor de las propuestas en la tabla, realícense diluciones intermedias según se ha indicado en el anterior punto c. Utilícese para cada dilución y muestra de referencia un vaso limpio de precipitados de 50 ml, lleno hasta el nivel de 25 mi, o bien un vaso alto. No debe utilizarse material de vidrio empleado en pruebas sensoriales para otros análisis. Entre las distintas pruebas, limpiar bien los recipientes en un lavavajillas automático con agua a no menos de 60 °C. Manténganse las muestras a 15 i 1 °C. No obstante, si la temperatura del agua del sistema de distribución es mayor de 15 °C, selecciónese una temperatura adecuada, especificando el valor en el informe de resultados. Preséntese a cada experimentador la serie de muestras en orden de concentración creciente, emparejando cada muestra con una referencia conocida. El experimentador saborea un volumen de muestra que resulte cómodo, moviéndolo en la boca durante varios segundos y expulsándolo sin deglutirlo. Deberá comparar la muestra con la referencia, indicando si detecta algún sabor o regusto.

MÉTODOS NORMALIZADOS

Inclúyanse en la serie dos o más blancos de referencia próximos al umbral esperado, pero evítese la repetición del modelo. El experimentador no debe saber cuál de las muestras tiene sabor y cuál es un blanco. Se le proporcionarán las instrucciones necesarias para que deguste cada muestra según una secuencia, empezando por la menos concentrada, hasta que el sabor se detecte con certeza. TABLA 2160:11. DILUCIONES PARA DETERMINACIÓN DEL ÑUS

Recójanse las observaciones indicando cada uno de los vasos de prueba en los que se detectó sabor. Por ejemplo:

donde: – significa respuesta negativa, y + respuesta positiva.

3.

Cálculo

El número de umbral de sabor es el índice de dilución en el que aquél empieza a percibirse. En el ejemplo anterior, el primer sabor detectable apareció cuando 25 ml de muestra se diluyeron en 200 ml: el número de umbral es 8 (tabla 2160:1). Los blancos de referencia no influyen en el cálculo del umbral.

2-29

PROPIEDADES FÍSICAS Y DE AGREGACIÓN

El NUS más bajo que puede observarse es 1, cuando el vaso contiene 200 ml de muestra no diluida. Si a esta concentración no se detecta sabor, indíquese «No observado sabor», en vez de un número de umbral. A veces aparecen respuestas anómalas; una concentración baja puede denominarse positiva, y una más alta de la serie puede llamarse negativa. En estos casos, desígnese el umbral como el punto después del cual no aparecen anomalías. A continuación se ilustra una aproximación a una serie anómala (se excluyen las respuestas a los blancos de referencia):

Calcúlense la media y las desviaciones estándar de todos los NUS si la distribución es razonablemente simétrica; en otro caso, se expresará el umbral de un grupo como la media o media geométrica de los umbrales individuales.

4.

Interpretación de los resultados

Un NUS no es un valor exacto. En el caso de un solo observador representa un juicio en el momento de la prueba. Los resultados obtenidos de un grupo son más significativos debido a que las diferencias individuales tienen menos influencia sobre los resultados de la prueba. Uno o dos experimentadores pueden proporcionar datos útiles si se ha establecido una comparación con grupos más amplios para comprobar su sensibilidad. No deben compararse datos de distintos momentos o lugares, a no ser que se hayan estandarizado cuidadosamente las condiciones de prueba y se disponga de algún fundamento para la comparación de los NUS observados.

5.

Bibliografía

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MÉTODOS NORMALIZADOS

2-30

ROSEN, A. A., R. T. SKEEL & M. B. ETTINGER. 1963. Relationship of river water odor to specific organic contaminants. J. Water Pollut. Control Fed. 35:777.

2160 C.

BRYAN, P. E., L. N. K UZMINSKI , F. M. S AWYER & T. H. FENO. 1973. Taste thresholds of halogens in water. J. Amer. Water Works Assoc. 65:363.

Evaluación de índice de sabor (EIS)

1. Discusión general

3.

Cuando la finalidad de la prueba sea evaluar la aceptabilidad para el consumo diario, utilícese la evaluación de índice de sabor que se describe a continuación. Este método se ha empleado con muestras de fuentes públicas en investigaciones de laboratorio y estudios de consumo a fin de recomendar estándares para la regulación del contenido mineral del agua potable. Se ofrece a cada experimentador una lista de nueve respuestas sobre el agua, en una escala que va desde muy favorable a muy desfavorable. La tarea del experimentador consiste en seleccionar la respuesta que mejor exprese su opinión. El índice individual es el número de escala de la respuesta seleccionada. El índice del grupo sobre una muestra dada es la medida adecuada de la tendencia principal de los números de escala de todos los experimentadores con respecto a esa muestra.

a) Selección y preparación del grupo: A los experimentadores se les proporciona instrucciones completas y sesiones de ensayo y orientación seguidas de preguntas y discusión de los métodos. En las muestras de degustación, los experimentadores actúan por sí mismos. Selecciónese un grupo a partir de los resultados de las sesiones de ensayo. No se permitirá que los observadores conozcan la composición o la fuente de las muestras específicas. b) Prueba de determinación del índice: Para evaluar hasta 10 muestras puede realizarse una sola sesión de determinación del índice, incluyendo las muestras convencionales mencionadas anteriormente en el apartado 2. Concédase un descanso de al menos treinta minutos entre las distintas sesiones de determinación del índice. En cuanto a necesidades de material de vidrio, véase apartado B2d. Preséntense las muestras a la temperatura que según los observadores resulte agradable para beber agua, manteniendo dicha temperatura a lo largo de todo el ensayo. Se recomienda un nivel de 15 °C, pero, en cualquier caso, la prueba rio debe realizarse a temperaturas superiores a las que son habituales en el agua corriente. Esta temperatura se especificará en el informe de resultados. El orden de las muestras se dispone al azar para cada experimentador. De-

2. Muestras Se emplearán muestras de agua lista para consumo humano o de agua tratada experimentalmente, siempre que satisfagan completamente los requerimientos sanitarios expresados en la sección 2160A.1. Utilícese agua inodora e insípida según se describe en la sección 2150, y una solución de 2.000 mg de NaCl/1, preparada con agua inodora e insípida, como muestra convencional.

Procedimiento

PROPIEDADES FÍSICAS Y DE AGREGACIÓN

2-31

ben proporcionarse instrucciones para cumplir los siguientes pasos: 1) degustar aproximadamente la mitad de la muestra manteniendo el agua en la boca durante unos segundos y expulsándola sin tragar; 2) formar un juicio inicial sobre la escala de determinación de índice; 3) realizar de forma similar una segunda degustación; 4) hacer una determinación final y registrar el resultado en el cuestionario adecuado; 5) enjuagar la boca con el agua de referencia; 6) descansar un minuto antes de repetir los pasos 1-5 con la muestra siguiente. c) Caracterización: Si se requiere también la caracterización del sabor, realícese una sesión de determinación final del índice en la que cada experimentador describa el sabor de cada muestra probada. (Véase apartado B2b.)

6) Creo que no aceptaría este agua para beber a diario. 7) No aceptaría este agua para beber a diario. 8) No bebería nunca este agua. 9) No soporto este agua en la boca y no la bebería jamás.

4.

Cálculo

Para la determinación del índice, utilícese la siguiente escala. Regístrense las determinaciones de índice como números enteros entre el uno y el nueve, dando al uno la calidad de determinación más elevada. Calcúlese la media y la desviación estándar de todas las determinaciones si la distribución es razonablemente simétrica; de otro modo, indíquese la determinación más típica de un grupo como la media o media geométrica de las determinaciones indicadas. Escala de tendencia de acción: 1) Me agradaría mucho aceptar este agua para beber a diario. 2) Me agradaría aceptar este agua para beber a diario. 3) Estoy seguro de que aceptaría este agua para beber a diario. 4) Aceptaría este agua para beber a diario. 5) Quizá aceptaría este agua para beber a diario.

5.

Interpretación de los resultados

Los valores que representan la tendencia principal y la dispersión de las determinaciones de calidad en un grupo de laboratorio sólo constituyen aproximaciones de esos valores para una población de consumo definido. 6.

Bibliografía

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2-32

MÉTODOS NORMALIZADOS

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2160 D. 1.

Análisis del perfil de sabor (APS)

Discusión general

El análisis del perfil de sabor se emplea para identificar y caracterizar sabores desagradables en el ámbito de un conjunto de datos sobre calidades sensoriales que puedan considerarse aceptables. Los experimentadores serán seleccionados y adiestrados cuidadosamente para la ejecución de este método, que puede resultar especialmente útil para instalaciones de agua. Es un método publicado1. 2.

Referencias

1. MALLEVIALE , J. & I. H. S UFKET , eds. 1987. The Identification and Treatment of Tastes and Odors in Drinking Water. American Water Works Association Research Foundation, Denver, Colorado.

3.

degree of liking of drinking water. .J. Amer. Water Works Assoc. 64:511. B RUVOLD , W. H. 1975. Human perception and evaluation of water quality. Crit. Rev. Environ. Control 5:153. BRUVOLD, W. H. 1976. Consumer Evaluation of the Cost and Quality of Domestic Water. Univ. California Water Resources Center, Davis.

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PROPIEDADES FÍSICAS Y DE AGREGACIÓN

2-33

2310 ACIDEZ* 2310 A.

Introducción

La acidez de un agua es su capacidad cuantitativa para reaccionar con una base fuerte hasta un pH designado. El valor medio puede variar significativamente con el pH final utilizado en la determinación. La acidez constituye la medida de una propiedad sobreañadida del agua y puede interpretarse en términos de sustancias específicas solamente cuando se conoce la composición química de * Aprobado por el Standard Methods Committee, 1985.

2310 B. 1.

la muestra. Con arreglo al método de determinación, los ácidos minerales fuertes, los ácidos débiles, como el carbónico y el acético, y las sales hidrolizables, como los sulfatos de hierro y aluminio, pueden incrementar la acidez determinada. Los ácidos incrementan también la corrosividad e interfieren los índices de reactividad química, su especificación y los procesos biológicos. La medida también refleja las variaciones de la calidad de la fuente del agua.

Método de titulación

Discusión general

a) Principio: Los hidrogeniones, presentes en una muestra como resultado de la disociación o hidrólisis de los solutos, reaccionan a la adición de un alcohol estándar. Así pues, la acidez depende del pH o indicador finales que se empleen. La confección de una curva de titulación mediante el registro del pH de las muestras, tras la adición sucesiva de pequeñas cantidades medidas de titulante, permite la identificación de los puntos de inflexión y la capacidad tampón y, en su caso, determinar la acidez con respecto a un pH de interés. En la titulación de una especie acida simple, como es la de estandarización de reactivos, el punto final más exacto se obtiene a partir del punto de inflexión de una curva de titulación. Este punto de

inflexión es el pH al que la curva varía de convexa a cóncava o viceversa. Como la identificación exacta de los puntos de inflexión puede ser difícil o imposible en mezclas tamponadas o complejas, la titulación en tales casos se conduce a un pH terminal arbitrario basado en consideraciones prácticas. Para las titulaciones de control habituales o estimaciones preliminares rápidas de acidez puede utilizarse como punto final el cambio de color de un indicador. Las muestras de aguas residuales industriales, drenaje de ácidos minerales u otras soluciones que contienen cantidades apreciables de iones metálicos hidrolizables, como hierro, aluminio y manganeso, se tratan con peróxido de hidrógeno para garantizar la oxidación de cualquier forma reducida de cationes polivalentes, y se hierven para hidrólisis acelerada. Las

2-34

valoraciones de acidez pueden ser muy variables si no se ejecuta el método con exactitud. b) Puntos finales: De una forma ideal, el punto final de la titulación de la acidez corresponde al punto de equivalencia estequiométrica para la neutralización de los ácidos presentes. El pH en el punto equivalente dependerá de la muestra, la elección entre múltiples puntos de inflexión y el uso previsto de los datos. El dióxido de carbono (CO2) disuelto suele ser el principal componente ácido de las aguas de superficie no contaminadas; las muestras procedentes de estas fuentes deben mejorarse con cuidado a fin de reducir al mínimo la pérdida de gases disueltos. En una muestra que contenga solamente CO2-bicarbonatoscarbonatos, la titulación a pH 8,3 a 25 °C corresponde a la neutralización estequiométrica del ácido carbónico a carbonato. Como el cambio de color del indicador de fenolftaleína está próximo al pH 8,3, este valor se acepta en general como un punto final estándar para la titulación de la acidez total, incluyendo el CO2 y ácidos más débiles. El púrpura de metacresol también tiene un punto final a pH 8,3 y proporciona un cambio de color más llamativo. Para mezclas más complejas o soluciones tamponadas, la selección de un punto de inflexión puede ser subjetiva. Por consiguiente, para determinaciones de acidez estándar mediante una titulación potenciométrica de aguas naturales y residuales, en las que no puede aceptarse el simple equilibrio carbonatado que se comentó anteriormente, utilícense puntos finales de pH 3,7 y 8,3. El azul bromofenol presenta un cambio de color muy vivo en su punto final 3,7. Las titulaciones resultantes se identifican tradicionalmente como «acidez naranja metilo» (pH 3,7) y «fenolftaleína» o acidez total (pH 8,3) independientemente del método real de medida.

MÉTODOS NORMALIZADOS

c) Interferencias: Durante la toma de muestras, la conservación o la titulación, pueden perderse o ganarse gases disueltos que contribuyen a la acidez o la alcalinidad, como CO2, sulfuro de hidrógeno o amoníaco. Redúzcanse al mínimo estos efectos mediante titulación al punto final inmediatamente después de abrir el recipiente de muestra, sin agitarlo o mezclarlo enérgicamente, protegiendo la muestra de la atmósfera durante la titulación y manteniéndola no más caliente de lo que estaba durante la conservación. En la titulación potenciométrica, las materias oleosas, los sólidos suspendidos, los precipitados u otros materiales de desecho pueden cubrir el electrodo de vidrio y producir una respuesta lenta. Es probable que aparezcan dificultades de este tipo en una curva de titulación errática. No deben eliminarse las interferencias de la muestra, pues pueden contribuir a su acidez. Hágase una breve pausa entre las adiciones de titulación para que el electrodo se equilibre, o límpiese éste de vez en cuando. En las muestras que contienen iones oxidables o hidrolizables, como hierro ferroso o férrico, aluminio y manganeso, los índices de reacción a temperatura ambiente pueden ser suficientemente lentos como para causar una desviación de los puntos finales. No deben utilizarse titulaciones con indicador de muestras turbias que pueden oscurecer el cambio de color en el punto final. El cloro libre residual de la muestra suele blanquear el indicador. Elimínese esta fuente de interferencia añadiendo una gota de tiosulfato sódico (Na2S2O3) 0,1M. d) Selección del método: Determínese la acidez de la muestra en función del volumen de álcali estándar requerido para titular una porción a un pH de 8,3 (acidez de fenolftaleína) o de 3,7 (acidez naranja metilo de aguas residuales o muy polucionadas). Titúlese a temperatura ambiente utilizando un medidor de pH

2-35

PROPIEDADES FÍSICAS Y DE AGREGACIÓN

convenientemente calibrado, un titulador operado eléctricamente o indicadores de color. Empléese el método de peróxido caliente (apartado 4a) para pretratar las muestras conocidas o que puedan contener iones metálicos hidrolizables o formas reducidas de cationes polivalentes, como líquidos de decapado del hierro, drenaje de ácidos y otros residuos industriales. Los indicadores de color pueden emplearse como método habitual y para titulaciones de control en ausencia de color y turbidez interferentes, y para titulaciones preliminares para seleccionar el tamaño de la muestra y la potencia del titulante (apartado 4b). e) Tamaño de la muestra: La escala de cifras de acidez encontrada en aguas residuales es tan amplia que no puede especificarse un tamaño simple de muestra ni la normalidad de base utilizada como reactivo de valoración. Utilícese un volumen de reactivo suficiente (20 ml o más de una bureta de 50 ml) para obtener una precisión volumétrica relativamente buena, en tanto se mantiene un volumen de muestra suficientemente pequeño como para permitir puntos terminales netos. Para muestras con cifras de acidez menores de 1.000 mg/1, aproximadamente, de carbono cálcico (CaCO3), selecciónese un volumen con acidez equivalente menor de 50 mg de CaCO3, y realícese una titulación con hidróxido sódico (NaOH) 0,02N . Para cifras de acidez mayores, utilícese una porción con una acidez equivalente a menos de 250 mg de CaCO3 y realícese una titulación con NaOH 0,1 N. Si es necesario, realícese una titulación preliminar para determinar el tamaño óptimo de la muestra y/o la normalidad del titulante. f) Toma de muestras y conservación: Recójanse las muestras en botellas de polietileno o vidrio borosilicato y consérvense a baja temperatura. Llénense las botellas por completo y tápense herméti-

camente. Dado que las muestras residuales pueden estar sujetas a la acción microbiana y a pérdidas o ganancias de CO2 u otros gases cuando se exponen al aire, las muestras deben analizarse sin demora, preferiblemente el primer día. Si se sospecha la presencia de alguna actividad biológica, analícense dentro de las seis primeras horas. Evítese la agitación de la muestra y su exposición prolongada al aire. 2.

Instrumental

a) Titulador electrométrico: Utilícese cualquier medidor de pH disponible en el mercado o un titulador eléctrico provisto de un electrodo de cristal y que pueda ser leído hasta unidades de pH 0,05. Estandarícese y equilíbrese con arreglo a las instrucciones del fabricante. Debe prestarse una especial atención a la compensación de la temperatura y al cuidado del electrodo. Si la temperatura no se compensa de forma automática, titúlese a 25 ± 5°C. b) Vaso de titulación: Su tamaño y forma dependerán de los electrodos y del tamaño de la muestra. El espacio que queda libre sobre la muestra debe ser lo más reducido posible, dejando sitio para el reactivo y la inmersión completa de la porción indicadora de los electrodos. Para electrodos de tamaño convencional, llénese un vaso Berzelius sin ranuras, de tipo alto y con una capacidad de 200 ml. Colóquese un tapón con tres orificios, para ajustar los dos electrodos y la bureta. Con un electrodo miniatura de combinación vidrio-referencia, empléese un erlenmeyer de 125 ó 250 ml con un tapón de dos orificios. c) Agitador magnético. d) Pipetas volumétricas. e) Matraces volumétricos, 1.000, 200 y 100 ml. f) Buretas, cristal borosilicato, 50, 25 y 10 ml. g) Botella de poliolefina, 1 l.

2-36

3. Reactivos a) Dióxido de carbono anhidro: Prepárense todas las soluciones de reserva y estándar y el agua de dilución para el método de titulación con agua destilada o desionizada, hervida durante 15 minutos y enfriada a temperatura ambiente. El pH final del agua deberá ser > 6,0 y su conductividad < 2 μmhos/cm. b) Solución de ftalato ácido de potasio, aproximadamente 0,05N: Tritúrense entre 15 y 20 g de estándar primario de KHC8H 4O 4 hasta una malla de 100 y séquese a 120 °C durante dos horas. Enfríese en un desecador. Transfiérase un peso de 10,0 + 0,5 g (miligrámico) a un matraz volumétrico de 1 l, y dilúyase hasta 1.000 ml. c) Reactivo de hidróxido sódico estándar, 0,1 N: Prepárese la solución aproximadamente 0,1 N como se indica en Preparaciones de reactivos de mesa (véase cubierta interior). Estandarícense, mediante titulación, 40,0 ml de solución de KHC8H4O4 (3b), usando una bureta de 25 ml. Titúlese hasta el punto de inflexión (apartado la) que debe estar próximo a un pH 8,7. Calcúlese la normalidad del NaOH:

donde: A = g de KHC 8 H 4 O 4 , pesados en matraz de 1 l B = ml de KHC 8 H 4 O 4 , solución tomada para titulación, y C = ml de NaOH, solución utilizada.

Empléese la normalidad medida en cálculos posteriores o ajústese a 0,1000N; 1 ml = 5,0 mg CaCO3. d) Reactivo de hidróxido sódico estándar, 0,02N: Dilúyanse 200 ml de NaOH 0,1 N hasta 1.000 ml y consérvense en una botella de poliolefina, protegido del CO2 atmosférico por un tubo de cal sodada o

MÉTODOS NORMALIZADOS

un cierre hermético. Estandarícese frente a KHC8H4O4 como se indica en el apartado 3c, utilizando 15,0 ml de solución del ftalato y una bureta de 50 ml. Calcúlese la normalidad como se indicó anteriormente (apartado 3c); 1 ml = 1,00 mg CaCO3. e) Peróxido de hidrógeno, H2O2, 30 por 100. f) Solución indicadora de azul de bromofenol, indicador de pH 3,7: Dilúyanse 100 mg de azul de bromofenol, sal sódica, en 100 ml de agua. g) Solución indicadora de púrpura de metacresol, indicador de pH 8,3: Diluyanse 100 mg de púrpura de metacresol en 100 ml de agua. h) Solución alcohólica indicadora de fenolftaleína, indicador de pH 8,3. i) Tiosulfato sódico, 0,lM: Dilúyanse 25 g de NaS2O3-5H2O y disuélvanse hasta 1.000 ml en agua destilada.

4. Procedimiento Si la muestra está limpia de iones metálicos hidrolizables y de formas reducidas de cationes polivalentes, procédase al análisis de acuerdo con b, c o d. Si se sabe o se sospecha que la muestra contiene tales sustancias, sométase a tratamiento previo según se describe en el punto a. a) Tratamiento con peróxido caliente: Pipetéese una muestra idónea (véase apartado lc) en matraces de titulación. Mídase el pH. Si está alrededor de 4, añádanse incrementos de 5 ml de ácido sulfúrico (H2SO4) 0,02N (sección 2320B, 3c) para reducir el pH hasta 4 o menos. Elimínense los electrodos. Añádanse cinco gotas de H2O2 al 5 por 100 y hiérvase de dos a cinco minutos. Enfríese a temperatura ambiente y titúlese con álcali estándar hasta pH 8,3 con arreglo al procedimiento de 4d. b) Cambio de color: Selecciónese el tamaño y la normalidad de la muestra, titulando según los criterios indicados en

PROPIEDADES FÍSICAS Y DE AGREGACIÓN

2-37

el apartado 1e. Ajústese la muestra a la temperatura ambiente si es necesario, y vacíese con pipeta en un erlenmeyer, manteniendo la punta de la pipeta cerca del fondo del matraz. Si existe cloro residual libre, añádanse 0,05 ml (una gota) de solución de Na2S2O3 0,1M, o destrúyase mediante la aplicación de rayos ultravioleta. Añádanse 0,2 ml (cinco gotas) de solución indicadora y titúlese sobre una superficie blanca hasta conseguir un cambio de color persistente, característico del punto equivalente. Pueden emplearse las soluciones o los sólidos indicadores que se encuentran disponibles en el mercado diseñados para el margen adecuado de pH (3,7 u 8,3). Investíguese el color en el punto final mediante adición de la misma cantidad del indicador utilizado con la muestra a una solución tampón al pH designado.

alcanzó el equilibrio entre las adiciones sucesivas de álcali. Determínese a partir de la curva la acidez relativa hasta un pH determinado. d) Titulación potenciométrica hasta pH 3,7 u 8,3: Prepárese conjuntamente la muestra y la titulación como se especifica en el apartado 4cl. Titúlese hasta el pH de punto final preseleccionado (apartado d) sin registrar valores intermedios. A medida que se aproxime el punto final, hay que reducir las adiciones de álcali y comprobar que se alcanza el equilibrio del pH antes de hacer la adición siguiente.

c) Curva de titulación potenciométrica: 1) Los electrodos y el vaso de titulación se enjuagan con agua destilada y se drenan. Selecciónese el tamaño de la muestra y la normalidad del reactivo según los criterios expuestos en el apartado le. Si es necesario, ajústese la muestra a la temperatura ambiente y, con pipeta, viértase la muestra en el matraz, manteniendo la punta cerca del fondo de éste. 2) Mídase el pH de la muestra. Añádase álcali estándar en incrementos de 0,5 ml o menos, de forma que se produzca con cada incremento un cambio de menos de 0,2 unidades de pH. Después de cada adición, mézclese cuidadosa y suavemente con un agitador magnético. Evítense las salpicaduras. Regístrese el pH cuando se obtenga una lectura constante. Añádase más reactivo y mídase el pH hasta alcanzar 9. Confecciónese la curva de titulación mediante punteado de los valores de pH observados versus mililitros acumulados de reactivo añadido. Debe obtenerse una curva suave con una o más inflexiones. Una curva discontinua o irregular puede indicar que no se

5.

Cálculo

donde: A = ml utilizados de NaOH titulador, B = normalidad del NaOH, C = ml utilizados de H2SO4 (apartado 4d), y D = normalidad del H2SO4.

Infórmese, como se indica a continuación, del pH de punto final empleado: «La acidez a pH ___ = ___ mg CaCO3/l». Si se obtiene un valor negativo, determínese la alcalinidad según se describe en la sección 2320. 6.

Precisión y sesgo

Respecto a la precisión, no puede hacerse ninguna afirmación general, dada la gran variedad de características que presentan las muestras. Es probable que la precisión de la titulación sea mayor que las aproximaciones propias de la toma y manipulación de las muestras antes del análisis.

2-38

MÉTODOS NORMALIZADOS

Cuarenta analistas de 17 laboratorios analizaron muestras de agua sintética que contenia incrementos de bicarbonato equivalentes a 20 mg de CaCO3/l. La titulación, realizada según el método del apartado 4d, dio una desviación estándar de 1,8 mg del bicarbonato, con un sesgo irrelevante. Cinco laboratorios analizaron dos muestras con ácidos sulfúrico, acético y fórmico y cloruro de aluminio según los procedimientos descritos en los apartados Ab y Ad. La acidez media de una muestra (pH 3,7) fue 487 mg de CaCO3/l, con una desviación estándar de 11 mg/1. La titulación con azul bromofenol de la misma muestra fue mayor en 90 mg/1, con una desviación estándar de 110 mg/1. La otra muestra señaló una titulación potenciométrica de 547 mg/1, con desviación estándar de 54 mg/1, mientras el indicador correspondiente resultó ser

2320

85 mg/1 mayor, con desviación estándar de 56 mg/1. La diferencia esencial entre las muestras fue la sustitución de citrato amónico férrico, en la segunda muestra, por cloruro de aluminio.

7.

Bibliografía

WINTER, J. A. & M. R. MlDGETT. 1969. FWPCA Method Study 1. Mineral and Physical Analyses. Federal Water Pollution Control Admin., Washington, D. C. B ROWN , E., M. W. S KOUGSTAD & M. J. F ISH MAN. 1970. Methods for collection and analysis of water samples for dissolved minerals and gases. Chapter Al in Book 5, Techniques of Water-Resources Investigations of United States Geological Survey. U.S. Geological Survey, Washington, D.C. SNOEYINK, V. L. & D. JENKINY 1980. Water Chemistry. John Wiley & Sons, Nueva York.

ALCALINIDAD*

2320 A.

Introducción

1. Discusión general La alcalinidad de un agua es su capacidad para neutralizar ácidos y constituye la suma de todas las bases titulables. El valor medido puede variar significativamente con el pH de punto final utilizado. La alcalinidad es la medida de una propiedad agregada del agua, y solamente puede interpretarse en términos de sustancias específicas cuando se conoce la composición química de la muestra. La alcalinidad es importante en muchos usos y tratamientos de aguas na* Aprobado por el Standard Methods Committee, 1985.

turales y residuales. La alcalinidad de muchas aguas de superficie depende primordialmente de su contenido en carbonatos, bicarbonatos e hidróxidos, por lo que suele tomarse como una indicación de la concentración de estos componentes. Los valores determinados pueden incluir también la contribución de boratos, fosfatos, silicatos y otras bases, cuando se hallen presentes. La alcalinidad por exceso de concentración de metales alcalinoférreos tiene importancia para la determinación de la aceptabilidad de un agua para irrigación. Las determinaciones de alcalinidad se utilizan en la interpretación y el control de los procesos de tratamiento de aguas limpias y residuales. Las

PROPIEDADES FÍSICAS Y DE AGREGACIÓN

aguas residuales domésticas tienen una alcalinidad menor (o sólo ligeramente mayor) que la del suministro. Los digestores anaerobios que actúan adecuadamente presentan alcalinidades sobrenadantes típicas con cifras de 2.000 a 4.000 mg de carbonato cálcico (CaCO3)/11.

2-39

2. Referencia 1. POHLAND, F. G. & D. E. BLOODGOOD. 1963. Laboratory studies on mesophilic and thermophilic anaerobic sludge digestion. J. Water Pollut. Control Fed. 35:11.

2320B. Método de titulación 1.

Discusión general

a) Principio: Los iones hidróxilo presentes en una muestra como resultado de la disociación o hidrólisis de los solutos reaccionan con las adiciones de ácido estándar. Por tanto, la alcalinidad depende del pH de punto final utilizado. Para conocer los métodos de determinación de puntos de inflexión a partir de curvas de titulación y las normas para titulación a puntos finales de pH fijados, véase sección 2310B.la. Para muestras de alcalinidad baja (menos de 20 mg de CaCO3/l), utilícese una técnica de extrapolación basada en la proporcionalidad cercana de la concentración de hidrogeniones y el exceso de reactivo más allá del punto de equivalencia. Se mide con precisión la cantidad de ácido estándar requerida para reducir el pH exactamente en 0,30 unidades. Como este cambio del pH corresponde a una duplicación exacta de la concentración de hidrogeniones, puede hacerse una extrapolación simple para el punto de equivalencia1, 2. b) Puntos finales: Cuando la alcalinidad se debe enteramente al contenido de carbonato o bicarbonato, el pH en el punto de equivalencia de la titulación se determina en función de la concentración de dióxido de carbono (CO2) en esta fase. Esta concentración depende, a su vez, del tipo de carbonato total nativo existente y de cualquier pérdida que pueda haberse

producido durante la titulación. Como puntos de equivalencia de las concentraciones de alcalinidad correspondientes, en mg de CaCO3/l, se sugieren los valores de pH que se expresan a continuación. «Alcalinidad de fenolftaleína» es un término empleado tradicionalmente para designar la cantidad medida mediante titulación a pH 8,3, independientemente del indicador de color utilizado en su caso para la determinación. Las llamativas variaciones de color producidas por el púrpura de metacresol (pH 8,3) y el verde de bromocresol (pH 4,5) conceden utilidad a estos indicadores para la titulación de alcalinidad.

2-40

MÉTODOS NORMALIZADOS

c) Interferencias: Los jabones, las materias oleosas y los sólidos en suspensión o precipitados pueden recubrir el electrodo de vidrio y causar una respuesta retardada. Déjese un tiempo adicional entre las adiciones del reactivo para permitir que el electrodo recupere el equilibrio, o límpiese éste en su caso. No se debe filtrar, diluir, concentrar o alterar la muestra. d) Selección del método: Determínese la alcalinidad de la muestra a partir del volumen de ácido estándar requerido para titular una porción a un pH determinado, según el apartado 1b. Titúlese a temperatura ambiente con un medidor de pH adecuadamente calibrado o un titulador eléctrico, o utilizando indicadores de color. Infórmese de una alcalinidad menor de 20 mg de CaCO3/l solamente si ha sido determinada por el método de alcalinidad baja (apartado 4d). Confecciónese una curva de titulación para estandarización de los reactivos. Los indicadores de color pueden utilizarse para titulaciones habituales y de control en ausencia de color y turbidez que puedan interferir, y en titulaciones preliminares para seleccionar el tamaño de la muestra y la potencia del reactivo (véase más adelante). e) Tamaño de la muestra: Véase la sección 2310B.le para seleccionar el tamaño de la muestra que va a titularse y la normalidad del reactivo, sustituyendo ácido sulfúrico (H2SO4) o clorhídrico (HC1) 0,02 o 0,1 N por el álcali estándar de este método. Si se sigue el método de alcalinidad baja, titúlese una muestra de 200 ml con H2SO4 0,02N, a partir de una bureta de 10 ml. f) Toma de muestras y conservación: Véase sección 231OB.1 f.

2.

Instrumental Véase la sección 2310B.2.

3. Reactivos a) Solución de carbonato sódico, aproximadamente 0,0SN: Séquense entre 3 y 5 g de Na2CO3 estándar primario a 250 °C durante 4 h y enfríense en desecador. Se pesan 2,5 + 0,2 g (miligrámicos) y se transfieren a un matraz volumétrico de 1 l, llenando hasta la marca con agua destilada y mezclando el reactivo. No debe conservarse más de una semana. b) Ácidos sulfúrico o clorhídrico estándar, 0,1N: Prepárese la solución acida de normalidad aproximada a la indicada en preparación de reactivos de mesa (véase cubierta interior). Estandarícese frente a una solución de 40 ml de Na2CO3 0,05N en probeta, con unos 60 ml de agua, titulando potenciométricamente a un pH aproximado de 5. Elévense los electrodos, enjuáguense en la misma probeta y háganse hervir suavemente durante 3-5 min cubriendo con un vidrio de reloj. Enfríese a temperatura ambiente, enjuáguese el cristal en la probeta y conclúyase la operación titulando en el punto de inflexión de pH. Calcúlese la normalidad.

donde: A = g de Na 2 CO 3 , pesados en el matraz de 1 l, B = ml de solución de Na 2 CO 3 tomados para titulación, y C = ml de ácido empleados.

Utilícese la normalidad medida en los cálculos o ajústese a 0,1000N; 1 ml de solución 0,1000N = 5,0 mg de CaCO3. c) Ácidos sulfúrico o clorhídrico estándar, 0,02N: Dilúyanse 200,0 ml de ácido estándar 0,1000N hasta 1.000 ml de agua destilada o desionizada. Estandarícese mediante titulación potenciométrica de 15,0 ml de Na2CO3 0,05N, de acuerdo con el procedimiento del apartado 3b; 1 ml = 1,0 mg de CaCO3.

2-41

PROPIEDADES FÍSICAS Y DE AGREGACIÓN

d) Solución indicadora de verde de bromocresol, indicador de pH 4,5: Disuélvanse 100 mg de púrpura de verde de bromocresol, sal sódica, en 100 mg de agua destilada. e) Solución indicadora de púrpura de metacresol, indicador de pH 8,3: Disuélvanse 100 mg de púrpura de metacresol en 100 ml de agua. f) Solución alcohólica de fenolftaleína, indicada a pH 8,3. g) Tiosulfato sódico, 0,1N: Véase sección 2310B.3i.

vo hasta reducir el pH exactamente a 0,30 unidades, registrando de nuevo el volumen. 5.

Cálculos

a) Titulación potenciométrica a pH de punto final:

donde: 4.

A = ml utilizados de ácido estándar, y N = normalidad del ácido estándar

Procedimiento

a) Cambio de color: Véase sección 2310B.46. b) Curva de titulación potenciométrica: Sígase el método de determinación de la acidez (sección 2310B.4c), sustituyendo la normalidad de la solución acida estándar por NaOH estándar, y continúense las titulaciones hasta un pH 4,5 o más bajo. No se debe filtrar, diluir, concentrar o alterar la muestra. c) Titulación potenciométrica a pH preseleccionado: Determínese el pH de punto final adecuado, según el apartado Ib. Prepárense conjuntamente la muestra y la titulación (sección 2310B.4c). Titúlese a pH de punto final sin registrar valores intermedios y sin provocar retrasos indebidos. A medida que se alcanza el punto final, realícense adiciones de ácido más pequeñas, comprobando que el pH alcance el equilibrio antes de añadir más reactivo. d) Titulación potenciométrica de alcalinidad baja: Para alcalinidades menores de 20 mg/1, titúlense 100-200 ml con arreglo al procedimiento del apartado 4c, antes descrito, utilizando una microbureta de 10 ml y solución acida estándar 0,02N. Deténgase la titulación a un pH del orden de 4,3 a 4,7 y regístrese el volumen y el pH exacto. Añádase más reacti-

o

donde: t = título del ácido estándar, mg CaCO3/ml.

Infórmese de la manera siguiente sobre el pH de punto final utilizado: «La alcalinidad a pH ___ = ____ mg de CaCO3/l» e indíquese claramente si este pH corresponde a un punto de inflexión de la curva de titulación. b) Titulación potenciométrica de alcalinidad baja: Alcalinidad total, mg CaCO3/l

donde: B = ml titulante para primer pH registrado, C = total ml de titulante para alcanzar un pH inferior en 0,3 unidades, y N = normalidad del ácido.

c) Cálculo de relaciones de alcalinidad: Los resultados obtenidos a partir de las determinaciones de fenolftaleina y al-

MÉTODOS NORMALIZADOS

2-42

calinidad total ofrecen un medio de clasificación estequiométrica de las tres formas principales de alcalinidad presentes en muchas aguas. La clasificación adscribe la alcalinidad total a bicarbonato, carbonato e hidróxido, y acepta la ausencia de otros ácidos (débiles) orgánicos e inorgánicos, como el silícico, el fosfórico y el bórico. Presupone, además, la incompatibilidad de las alcalinidades de hidróxido y de bicarbonato. Dado que los cálculos se hacen sobre una base estequiométrica, las concentraciones iónicas en el sentido más estricto no están representadas en los resultados, que pueden diferir significativamente de las concentraciones reales, especialmente a pH > 10. Con arreglo a este esquema:

lese la concentración OH como mg de CaCO3 por litro, y calcúlese la concentración de CO32¯ y HCO3¯ en mg de CaCO3 por litro a partir de la concentración de OH¯ y las alcalinidades de fenolftaleína y total mediante las ecuaciones siguientes:

De igual forma, si se encuentran dificultades con el punto final de la fenolftaleína, o si se desea hacer una investigación de la titulación de ésta, calcúlese su alcalinidad como CaCO3 a partir de los

1) La alcalinidad de carbonato (CO32¯) se presenta cuando la de la fenolftaleína no es 0, sino menor que la total. 2) La alcalinidad de hidróxido (OH¯) se presenta si la de la fenolftaleína supera la mitad de la total. 3) La alcalinidad de bicarbonato (HCO3¯) se presenta si la de la fenolftaleína es menor de la mitad de la total. Estas relaciones pueden calcularse mediante el siguiente esquema, donde P es la alcalinidad de la fenolftaleína y T la total (apartado Ib): Selecciónese el valor más pequeño de P o (T – P). Entonces, la alcalinidad de carbonato es el doble del valor más pequeño. Cuando este valor más pequeño es P, el equilibrio (T – 2P) es bicarbonato. Cuando el valor más pequeño es (T – P), el equilibrio (2P – 7) es hidróxido. Todos los resultados se expresan en CaCO3. La conversión matemática de éstos se muestra en la tabla 2320:1 (Se ha propuesto una modificación de dicha tabla, que es más exacta cuando P  1/2 T3.) La relaciones de alcalinidad también pueden calcularse nomográficamente (véase dióxido de carbono, sección 4500CO2). Mídase exactamente el pH, calcú-

TABLA 2320:1. RELACIONES DE ALCALINIDAD*

resultados de las determinaciones monográficas de concentraciones de iones carbonato e hidróxido:

6.

Precisión y sesgo

Respecto a la precisión del método, no puede hacerse ninguna afirmación general, dada la gran variedad de característi-

2-43

PROPIEDADES FÍSICAS Y DE AGREGACIÓN

cas que presentan las muestras. Es probable que la exactitud de la titulación sea mayor que las aproximaciones propias de la toma de muestras y su manipulación del análisis. En la amplitud de 10 a 500 mg/1, en la que la alcalinidad se debe enteramente a carbonatos o bicarbonatos, pueden lograrse una desviación estándar de 1 mg de CaCO3/l. Cuarenta analistas analizaron en 17 laboratorios muestras sintéticas que contenían incrementos de bicarbonato equivalente a 120 mg de CaCO3/l. Se utilizó el método de titulación del apartado 4b, con un pH de punto final de 4,5. La desviación estándar fue de 5 mg/l, y el sesgo promedio (más bajo que el valor verdadero), de 9 mg/l4. En 12 laboratorios, y con arreglo al método del apartado 4b, se analizaron soluciones de carbonato sódico equivalentes a 80 y 65 mg de CaCO3/l5. Las desviaciones estándar fueron de 8 y 5 ml/l respectivamente, con un sesgo no significativo5. En otros cuatro laboratorios se analizaron seis muestras con alcalinidades totales de alrededor de 1.000 mg de CaCO3/l y conteniendo varios índices de carbonato/bicarbonato, utilizándose ambos métodos, el del apartado 4a y el del 4c. La desviación estándar acumulada fue de 40 mg/l, con diferencias irrelevantes entre ambos procedimientos.

7.

Referencias

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waters. J. Amer. Water Works Assoc. 3.

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2-44

MÉTODOS NORMALIZADOS

2330

SATURACIÓN DE CARBONATO CÁLCICO (PROPUESTA)*

2330 A. 1. Discusión general Los índices de saturación de carbonato cálcico (CaCO3) se utilizan habitualmente para evaluar la tendencia del agua a formar o disolver precipitados. Esta evaluación es útil para los programas de control de corrosión y en la prevención de precipitados de CaCO3 en sistemas de tuberías e instalaciones como intercambiadores térmicos industriales o calentadores de agua domésticos. Las aguas sobresaturadas de CaCO3 tienden a precipitar esta sal, mientras que las infrasaturadas tienden a disolverla. Las saturadas, es decir, aquellas en las que el CaCO3 está en equilibrio, no presentan tendencia a disolverlo ni precipitarlo. La saturación representa la línea divisoria entre precipitación «probable» o «improbable». Para calcular los índices de saturación de CaCO3 que aquí se describen es preciso medir varias características de calidad del agua. Los requerimientos mínimos son la alcalinidad total (2320), el calcio total (3500-Ca), el pH (4500-H + ) y la temperatura (2550). También ha de calcularse o estimarse la potencia iónica en función de la conductividad (2510) o la medida del total de los sólidos disueltos (2540C). Mídase el pH a la temperatura del agua del sistema, utilizando un medidor de pH termocompensado. Si se mide a una temperatura distinta, por ejemplo * Aprobado por el Standard Methods Committee, 1989.

Introducción en el laboratorio, corríjase la medida obtenida1–3. Durante las tomas de pH y alcalinidad, redúzcase al mínimo el intercambio de CO2 entre la muestra y la atmósfera. Lo ideal es cerrar herméticamente la muestra durante las medidas4 y, al menos, debe evitarse cualquier agitación fuerte de las muestras no cerradas. Existen dos tipos generales de índices de saturación del CaCO3: los que determinan si un agua tiene tendencia a precipitar CaCO3 (es decir, si está sobresaturada) o a disolverlo (o sea, infrasaturada), y los que estiman la cantidad de esta sal que puede precipitarse a partir de un agua sobresaturada y la cuantía que disolverá una infrasaturada. Estos últimos índices suelen proporcionar más información, pero son más difíciles de determinar.

2. Limitaciones Se acepta en general que el CaCO3 precipitará en las aguas sobresaturadas y no podrá hacerlo en las infrasaturadas, pero existen excepciones. Por ejemplo, los depósitos de carbonato de aguas sobresaturadas se inhiben por la presencia de fosfatos (preferentemente polifosfatos), de algunas sustancias orgánicas naturales y de magnesio5–7. Estos materiales pueden actuar como agentes secuestrantes y como tóxicos cristalinos. A la inversa, en sistemas de tuberías que conducían agua infrasaturada se han encontrado depósitos de CaCO3. Esta aparente con-

2-45

PROPIEDADES FÍSICAS Y DE AGREGACIÓN

tradicción está causada por un pH elevado (relativo al pH del agua bruta) en la inmediata vecindad de algunas zonas (cátodos) de superficies metálicas corroídas. Aunque la mayor parte del agua se halle infrasaturada, puede presentarse alguna sobresaturación local, pudiéndose depositar una cantidad de CaCO3 pequeña, pero significativa. Los cálculos aquí indicados, e incluso los obtenidos por ordenador, no describen suficientemente esas excepciones. Por ello, los índices de saturación no deben considerarse absolutos. Considérense más bien como orientaciones de la conducta del CaCO3 en sistemas acuosos y, en lo posible, compleméntense con los datos obtenidos experimentalmente. De modo similar, los efectos previstos por los índices no siempre confirman las expectativas. En este caso, resulta ilustrativa la relación entre los índices y las tasas de corrosión. En teoría, el sistema de tuberías está protegido cuando el carbonato cálcico se precipita en su superficie. Se cree que el CaCO3 inhibe la corrosión actuando contra las áreas reactivas y proporcionando una matriz que retiene los productos de la corrosión, lo que proporciona una hermeticidad adicional a esas superficies. Las aguas con índices positivos se han considerado tradicionalmente como protectoras, y las de índice negativo, como no protectoras o corrosivas. La relación esperada se observa a veces 8, 9, pero no siempre 10, 11. Los resultados inesperados pueden deberse en parte a la limitada capacidad para prever la conducta del CaCO3. Asimismo, las características del agua que no se hallan implicadas directamente en el cálculo de los índices (por ejemplo, oxígeno disuelto, intensidad de tamponado, cloruros, sulfatos y velocidad del agua) pueden modificar significativamente las tasas de corrosión 9, 1 2 - 1 6 . Por consiguiente, no deben estimarse las tasas de corrosión solamente en función de los índices de CaCO3.

3. 1.

2.

3.

4.

5. 6.

7.

8.

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10.

11.

12.

13.

Referencias MERRILL, D. T. & R. L. SANKS. 1978, 1979. Corrosión control by deposition of CaCO3 films: A practical approach for plant operators. J. Amer. Water Works Assoc. 70:592; 70:634 & 71:12. L OEWENTHAL , R. E. & G. v. R. M ARAIS . 1976. Carbonate Chemistry of Aquatic Systems: Theory and Applications, Ann Arbor Science Publishers, Ann Arbor, Michigan. M ERRILL , D. T. 1976. Chemical conditioning for water softening and corrosión control. En R. L. Sanks, ed. Water Treatment Plant Design. Ann Arbor Science Publishers, Ann Arbor, Michigan. SCHOCK, M. R., W. MUELLER & R. W. BUELOW. 1980. Laboratory techniques for measurement of pH for corrosión control studies and water not in equilibrium with the atmosphere. J. Amer. Water Works Assoc. 72:304. PYTKOWICZ, R. M. 1965. Rates of inorganic carbón nucleation. J. Geol. 73:196. F ERGUSON , J. F. & P. L. M CC ARTY . 1969. Precipitaron of Phosphate form Fresh Waters and Waste Waters. Tech. Rep. No. 120, Stanford Univ., Stanford, California. M ERRILL , D. T. & R. M. J ORDEN . 1975. Limeinduced reactions in municipal wastewaters. J. Water Pollut. Control Fed. 47:2783. D E M ARIIM . F. 1938. Corrosión and the Langelier calciumcarbonate saturation index. J. Amer. Water Works Assoc. 30:85. LARSON, T. E. 1975. Corrosión by Domestic Waters. Bull. 59, Illinois State Water Survey. JAMES M. MONTGOMERY, CONSULTING ENGINEERS, INC. 1985. Water Treatment Principles and Design. John Wiley & Sons, Nueva York. STUMM, W. 1960. Investigations of the corrosive behavior of waters. J. San. Eng. Div., Proc. Amer. Soc. Civil Eng. 86:27. PISIGAN, R. A., J R. & J. E. SINGLEY. 1985. Evaluation of water corrosivity using the Langelier index and relative corrosión rate models. Materials Perform. 24:26. LANE , R. W. 1982. Control of corrosión in distribution and building water systems En Proceedings AWWA Water Quality Technology Conf., Nashville, Tennessee, dic. 5-8, 1982.

2-46

14.

15.

MÉTODOS NORMALIZADOS

SONTHEIMER, H., W.

KOLLE & V.

L.

SNOEYINK. 1982. The siderite model of the formation of corrosion-resistant scales. J. Amer. Water Works Assoc. 73:572. SCHOCK, M. R. & C. H. NEFF. 1982. Chemical aspects of internal corrosión; theory, prediction, and monitoring. En Proceedings

AWWA Water Quality Technology Conf, Nashville, Tennessee, dic. 5-8, 1982. 16. A MERICAN WATER WORKS ASSOCIATION . 1986. Corrosión Control for Plant Operators. ISBW-O-89867-350-X, Denver, Colorado.

2330 B. índices representativos de la tendencia de un agua a precipitar o disolver el CaCO3 1. Discusión general Los índices que marcan las tendencias a precipitación o disolución de CaCo3 definen si un agua está sobresaturada, saturada o infrasaturada respecto a esta sal. Los más ampliamente utilizados son el índice de Saturación (IS), la Saturación Relativa (SR), también llamado índice de Fuerza de Conducción (IFC), y el índice Ryznar (IR). El IS es, con mucho, el más comúnmente utilizado y el que va a describirse a continuación. El SR y el IS están relacionados (véase ecuación 6, sección 233OD). El IR1 se ha utilizado durante años, a veces con buenos resultados. Debido a su carácter semi-empírico, puede resultar menos fiable que el IS. 2 Índice de Saturación mediante cálculo El IS se determina a partir de la ecuación 1. (1)

donde: pH = pH medido, y pH, = pH del agua si estuviera en equilibrio con el CaCO3 en las concentraciones existentes de ion calcio [Ca2 +] e ion bicarbonato [HCO3- ] .

Un IS positivo significa que el agua está sobresaturada de CaCO3, y uno ne-

gativo, que está infrasaturada; un IS cero representa al agua en equilibrio con esta sal. a) Solución analítica para pHs: Determínese el pHs como sigue: (2)

donde: K2 = constante de segunda disociación para el ácido carbónico a la temperatura del agua, Ks = constante de solubilidad del producto para el CaCO3 a temperatura del agua, 2+ [Ca ] = concentración de iones calcio, moles-g/1, [HCH 3− ] = concentración iones bicarbonato. moles-g/1, y fm = coeficiente de actividad para especies monovalentes a temperatura especificada.

En la ecuación 2, la p que precede a una variable designa el –log10 de esa variable. Calcúlense los valores pK2, pKs y pfm requeridos para resolver la ecuación 2 a partir de las ecuaciones de la tabla 2330:I. Para ahorrar tiempo de cálculo, los valores pK2 y pKs se han calculado previamente para temperaturas seleccionadas (véase tabla 2330:II). Dicha tabla proporciona varios valores para pKs. En los sistemas acuosos pueden formarse distintos isomorfos de la CaCO3, inclu-

2-47

PROPIEDADES FÍSICAS Y DE AGREGACIÓN

yendo calcita, aragonita y vaterita, cada uno de ellos con propiedades de solubilidad diferentes. Estas diferencias pueden ajustarse calculando el pHs simplemente con el empleo del pKs para el compuesto de formación más probable, que para el agua natural es la calcita. Úsese, pues, el pKs para la calcita, a menos que se sepa que es una forma distinta de CaCO3 la que controla su solubilidad. Estímese la concentración de calcio a partir de la medida del calcio total con la ecuación siguiente:

donde:

El calcio asociado con iones pares no es útil para formar CaCO3. Valórese el [ HCO3- ] concentración de ion bicarbonato, a partir de la ecuación 4.

(3)

TABLA 2330:I.

ESTIMACIÓN DE CONSTANTES DE EQUILIBRIO Y COEFICIENTES DE ACTIVIDAD

(4)

2-48

MÉTODOS NORMALIZADOS

TABLA 2330:II.

VALORES PRECALCULADOS PARA pK y A, A TEMPERATURAS SELECCIONADAS

donde: Alk 1 = alcalinidad total, determinada por titulación del punto final de ácido carbónico, equivalentes-g/1, KK = constante de disociación para el agua, en la temperatura de ésta, y Alk 0 = Alcalinidad a la que contribuyen

NH 30 ,

H 3SiO-4 , ¯

HPO 24 ,

B(OH)-4 ,

¯

CH3COO (acetato), HS , e iones pa+ res como CaHCO3 y MgOH+. Estas contribuciones son pequeñas, por lo general, en comparación con las de los componentes considerados normalmente  HCO3- , CO32- , OH - y H + .

Los cálculos pueden simplificarse. Por ejemplo, en la ecuación 4, los términos con exponentes (p. ej., 10 pH  p f  pk m

w

pueden descartarse en general para aguas aproximadamente neutras (pH 6,0 a 8,5) con alcalinidad mayor de unos 50 mg/l como CaCO3. Los términos Caip de la ecuación 3 y Alko en la ecuación 4 son difíciles de calcular sin ordenador. Por tanto, generalmente se descartan para cálculos normales. La versión simplificada de la ecuación 2 en estas condiciones es:

1) Cálculo simple. Se entiende mejor con un ejemplo. Supóngase que la calcita controla la solubilidad del CaCO3 y determínese el IS para un agua de la siguiente composición:

2-49

PROPIEDADES FÍSICAS Y DE AGREGACIÓN

Antes de evaluar pfm en la ecuación 2, determínese la potencia iónica (1) y otra constante (A). La potencia iónica se valora a partir de la primera ecuación de la tabla 2330:1, suponiendo que toda la alcalinidad se debe al ion bicarbonato. Utilícese la concentración de alcalinidad (2,60 x 10-3) y la carga de bicarbonato (–1) para calcular la contribución de la alcalinidad a la fuerza iónica. Supóngase que la sílice es predominantemente H4SiO4. Como éste tiene una carga cero, la sílice no contribuye a la fuerza iónica.

En ausencia de un análisis completo del agua, valórese la fuerza iónica en función de la conductividad o de la cuantía de sólidos disueltos (véanse ecuaciones alternativas, tabla 2330:1). Evaluar A a partir de la ecuación de la tabla 2330:1, después de determinar la constante dieléctrica E aplicando la fórmula de la misma tabla. De forma opcional, utilícense los valores de A calculados previamente en la tabla 2030:11. En ella, A = 0,506 a 20 °C. A continuación, valórese pfm, según la ecuación de la tabla 2030:1:

Determínese [HCO3 ] a partir de la ecuación 4. Se ignorará Alk0, pero como el pH excede a 8,5, se calcularán los otros términos. Según la tabla 2030:11, pK2 = 10,38 y pKw = 14,16. [HCCV]

Por consiguiente, p[Ca2+] = 2,42 A partir de la tabla 2030:II, el pKs para la calcita es 8,45. Determínese el pHs mediante la ecuación 2:

2-50

MÉTODOS NORMALIZADOS

Y, finalmente, determínese el IS a partir de la ecuación 1: IS = 9,00 - 7,27 = 1,73

El IS positivo indica que el agua está sobresaturada de calcita. 2) Efecto de descartar Caip y Alk0. Si se descarta Caip el pHs, es subestimado e IS superestimado en una cuantía de U 1  Yca donde Yca es la fracción



ip



ip

del calcio total en pares de iones. Por ejemplo, si Yca = 0,30, la evaluación de ip

IS es demasiado alta, en 0,5 unidades. Del mismo modo, si se descarta Alk0, el IS se sobreestima en una cuantía de U (1  YAlk , donde YAlko es la fracción 0

de alcalinidad total proporcionada por elementos distintos a HCO3- , CO32 , OH y H+ . Los efectos de descartar Caip y Alk0 son aditivos. Tanto Caip como Alk0 pueden descartarse si los factores YCa y YAlko son peip

queños y no interfieren en la interpretación del IS. En aguas de pH neutro y bajo, estos factores son efectivamente pequeños, pero aumentan a medida que las cifras de pH se aproximan o exceden a 9. A valores altos, sin embargo, el IS es típicamente más amplio que su sobreestimado, por lo que el descarte de Caip y Alko no causa problemas. Volviendo al ejemplo anterior, cuando los cálculos se realizaron con un código computadorizado de química de aguas (SEQUIL) (véase tabla 2030:III), que considera los valores citados, el IS fue 1,48, es decir, 0,25 unidades más bajo que el resultado obtenido en los cálculos manuales. En este caso, el descarte de Caip y Alko no interfirió en la interpretación del resultado. Ambos cálculos mostraron que el agua estaba intensamente sobresaturada. La posibilidad de interpretación errónea es mayor en las aguas cercanas a la saturación, con elevadas concentraciones de sulfato. El agua de los circuitos de refrigeración es un ejemplo. El calcio es secuestrado por el potente par iónico CaSO 04 , y el IS puede ser sobreestimado

en 0,3 a 0,5 unidades como mucho, incluso a pH neutro. En esas condiciones, el IS puede considerarse cero (ni precipitable ni corrosivo), cuando de hecho es negativo. Resuélvase este problema mediante determinación de pHs, utilizando códigos computadorizados de química del agua que tengan en cuenta los pares de iones y otras formas de alcalinidad. La sección 2330D proporciona información sobre códigos de química del agua. Los cálculos más exactos se logran cuando se realiza un análisis mineral completo. Un procedimiento alternativo pero algo menos riguroso consiste en la medida del [Ca2+], actividad del ion cálcico, con un electrodo iónico específico9. Utilícese la ecuación 5 para determinar U[Ca 2+ ] y luego aplíquese éste a la ecuación 2.

Esta aproximación elimina la necesidad de determinar Caip. Sin embargo, no se dispone de un método equivalente para evitar la determinación de Alk0. b) Soluciones gráficas para pHs: Para determinar éste, pueden utilizarse los diagramas de Calwell-Lawrence10-12, especialmente útiles para evaluar las dosificaciones químicas necesarias para conseguir las condiciones hídricas deseadas. Consúltense las referencias para descripción de cómo utilizar los diagramas; véase sección 2330D para información adicional sobre éstos. 3. Índice de saturación mediante determinación experimental a) Saturometría: Los saturómetros se desarrollan para medir la saturación relativa de CaCO3 del agua del mar. En un matraz cerrado provisto de un electrodo de pH se equilibra un agua de contenido cálcico conocido, controlando la graduación térmica con un baño a temperatura constante. Durante el equilibrado, el pH

2-51

PROPIEDADES FÍSICAS Y DE AGREGACIÓN

desciende si el CaCO 3 precipita, y aumenta si se disuelve. Cuando el pH deja de variar, se considera que se ha logrado el equilibrio. Los valores iniciales del pH y del calcio y el valor final de pH sirven para calcular la saturación relativa (SR)13. Entonces puede utilizarse la ecuación 6, sección 2330D, para determinar el IS. Una ventaja notable de este método es la posibilidad de seguir la pista de la aproximación al equilibrio mediante medidas del pH, reduciendo así las vacilaciones en torno del logro del equilibrio. El método presenta una sensibilidad máxima en márgenes de intensidad mínima de tamponado (pH 7,5 a 8,5). Los cálculos no tienen en cuenta los pares de iones y la alcalinidad no carbonada, excepto los boratos. La técnica se ha utilizado en medidas oceanógraficas14 in situ, así como en el laboratorio. Los cálculos de saturometría que se analizan más adelante utilizan el Ks de la fase CaCO3, aceptado para el control de la solubilidad. Surgen algunas dudas si no se conoce la identidad del sólido de control. Resuélvanse esas dudas mediante la medida del Ks de dicho sólido de control, que será el producto de actividad del CaCO3, [Ca2+] x U[CO3 ], en equilibrio. Calcúlese este último a partir del pH en equilibrio y el calcio inicial, la alcalinidad y las medidas de pH15.

producto de actividad inicial por Ks. Calcúlese el IS aplicando la ecuación 6. La ventaja de este método radica en que no presupone nada sobre la fase de CaCO3. Sin embargo, con este método, la determinación del momento en que se ha logrado el equilibrio resulta más difícil que con el de saturometría. Cualquiera que sea el procedimiento utilizado, las temperaturas deben ser las mismas que las de la fuente de agua. Como alternativa, corregir los resultados de prueba respecto a la temperatura citada.

4. 1.

2.

3.

4.

2-

5.

6.

b) Técnica de diferencia de alcalini-

dad16: El IS también puede determinarse equilibrando un agua de pH, calcio y alcalinidad conocidos con CaCO3 en un sistema cerrado y a temperatura constante. El producto de actividad CaCO3 antes del equilibrio se determina en función de los valores iniciales de calcio, pH y alcalinidad (o carbonatos totales). La constante del producto de solubilidad CaCO3 (Ks) se iguala con el producto de actividad CaCO3 después del equilibrio, que se determina utilizando el cambio de alcalinidad producido durante el equilibrado. La SR se encuentra dividiendo el

7.

8.

Referencias RYZNAR, J. W. 1944. A new index for determining the amount of calciumcarbonate formed by water. J. Amer. Water Works Assoc. 36:47. SNOEYINK, V. L. & D. JENKINS. 1980. Water Chemistry. John Wiley & Sons, Nueva York. STUMM, W. & J. J. MORGAN. 1981. Aquatic Chemistry, 2.a ed. John Wiley & Sons, Nueva York. RUSSELL , L. L. 1976. Chemical Aspects of Groundwater Recharge with Wastewaters. Ph.D. thesis, Univ. California, Berkeley. LANGELIER, W. F. 1936. The analytical control of anticorrosion water treatment. J. Amer. Water Works Assoc. 28:1500. ROSSUM , J. R. & D. T. MERRILL . 1983. An evaluation of the calciumcarbonate saturation indexes. J. Amer. Water Works Assoc. 75:95. PLUMMER, L. N. & E. BUSENBERG . 1982. The solubilities of calcite, aragonite, and vaterite in CO 2 -H 2 O solutions between 0 and 90 degrees C, and an evaluation of the aqueous model for the system CaCO 3 CO2-H2O. Geochim. Cosmochim. Acta 46:1011. ELECTRIC POWER RESEARCH INSTITUTE. 1982. Design and Operating Guidelines Manual for Cooling Water Treatment: Treatment of Recirculating Cooling Water. Section 4. Process Model Documentation and User's Manual. EPRI CS-2276, Electric Power Research Inst., Palo Alto, California.

2-52

MÉTODOS NORMALIZADOS

9. GARRELS, R. M. & C. L. CHRIST. 1965. Solutions, Minerals, and Equilibria. Harpe & Row, Nueva York. 10. MERRILL, D. 1 cSi R. L. SANKS. 1978, 1979. Corrosión control by deposition of CaCO3 films: A practical approach for plant operators. J. Amer. Water Works Assoc. 70:592; 70:634 & 71:12. 11. LOEWENTHAL, R. E. & G. v. R. MARAIS. 1976. Carbonate Chemistry of Aquatic Systems: Theory and Applications. Ann Arbor Science Publishers, Ann Arbor, Michigan. 12. MERRILL, D. T. 1976. Chemical conditioning for water softening and corrosión control. En R. L. Sanks, ed., Water Treatment

2330 C.

Índices de previsión de la cantidad de CaCO3 que puede precipitarse o disolverse

El potencial de precipitación de carbonato cálcico (PPCC) prevé ambas tendencias del CaCO3, precipitación y disolución, y la cantidad en que pueden hacerlo. El PPCC también se conoce por otros nombres, por ejemplo, capacidad de precipitación del carbonato cálcico (CPCC). El PPCC se define como la cantidad de CaCO3 que puede precipitarse, en teoría, en las aguas sobresaturadas o disolverse en las infrasaturadas durante el equilibrado1. Es posible que la cuantía que realmente precipita o se disuelve sea menor, debido a que el equilibrio puede no conseguirse. El PPCC es negativo en las aguas infrasaturadas, cero en las saturadas y positivo en las sobresaturadas. 1.

Plant Design. Ann Arbor Science Publishers, Ann Arbor, Michigan. 13. BEN-YAAKOV, S. & I. R. KAPLAN. 1969. Determination of carbonate saturation of seawater with a carbonate saturometer. Limnol. Oceanogr. 14:874. 14. BEN-YAAKOV, S. & I. R. KAPLAN. 1971. Deepsea in situ calciumcarbonate saturometry. J. Geophys. Res. 76:72. 15. PLATH, D. C, K. S. J OHNSON & R. M. PYT K OWICZ . 1980. The solubility of calcite— probably containing magnesium—in seawater. Mar. Chem. 10:9. 16. BALZAR, W. 1980. Calciumcarbonate saturometry by alkalinity difference. Oceanol. Acta. 3:237.

Cálculo del PPCC

Este factor no se presta de por sí a cálculos ordinarios; es preferible calcularlo con modelos computadorizados para química del agua y con diagramas de Caldwell-Lawrence (véase sección 23330).

Los cálculos más fiables tienen en cuenta los pares de iones y la contribución a la alcalinidad de otros elementos además de HCO3- , CO32 , OH - y H + . Los modelos que no toman en consideración estos factores sobreestiman la cantidad de CaCO3 que puede precipitarse y subestiman la que puede disolverse.

2. Determinación experimental del PPCC Estímese mediante una o varias técnicas experimentales. a) Saturometría: Véase sección 2330B. El PPCC se determina formando parte del cálculo de la SR. b) Técnica de diferencia de alcalinidad: Véase sección 2330B. El PPCC equivale a la diferencia entre los valores de alcalinidad (o calcio) del agua inicial y de la equilibrada, expresados en CaCO3. c) Prueba del mármol: Esta prueba 1-5 es similar a la técnica de diferencia de alcalinidad. El PPCC equivale al cambio de los valores de alcalinidad (o de

PROPIEDADES FÍSICAS Y DE AGREGACIÓN

2-53

calcio) durante el equilibrado, cuando éste se expresa en CaCO3. d) Prueba de Enslow: La prueba de Enslow5 es una modalidad continua de las pruebas de diferencia de alcalinidad o del mármol. Se vierte continuamente agua en una cubeta de nivel o embudo de separación parcialmente lleno de CaCO3. El líquido que fluye desde este dispositivo se filtra a través de mármol triturado, de modo que se supone que el filtrado está en equilibrio con el CaCO3. El PPCC equivale al cambio de valor de la alcalinidad (o calcio), que tiene lugar durante el paso a lo largo del aparato. e) Prueba de deposición del carbonato cálcico6. La PDCC es un método electroquímico que mide la corriente eléctrica producida cuando el oxígeno disuelto es reducido en un electrodo rotatorio. Cuando se coloca en el aparato un agua sobresaturada, el CaCO3 se deposita sobre el electrodo. El depósito interfiere el transporte del oxígeno y la corriente disminuye. El índice de deposición del CaCO3 es directamente proporcional al de aminoración de la corriente. La PDCC y el PPCC están relacionados pero no son lo mismo. La PDCC es un índice y el PPCC es una cantidad.

Para determinaciones reales de PPCC (o PDCC), manténgase la temperatura de la prueba al mismo nivel que la de la fuente de agua. Otra posibilidad consiste en corregir los resultados de la prueba hasta la temperatura del origen del agua.

2330 D.

3. 1.

2.

3.

4.

5.

6.

Referencias MERRILL, D. T. & R. L. SANKS. 1978, 1979. Corrosión control by deposition of CaCO 3 films: A practical approach for plant operators. J. Amer. Water Works Assoc. 70:592, 70:634 & 71:12. MERRILL, D. T. 1976. Chemical conditioning for water softening and corrosión control. En R. L. Sanks, ed. Water Treatment Plant Design. Ann Arbor Science Publishers, Ann Arbor, Michigan. D E M ARTINI , F. 1938. Corrosión and the Langelier calciumcarbonate saturation index. J. Amer. Water Works Assoc. 30:85. H OOVER , C. P. 1938. Practical application of the Langelier method. J. Amer. Water Works Assoc. 30:1802. DYE, J. F. & J. L. TUEPKER. 1971. Chemistry of the Lime-Soda Process. En American Water Works Association. Water Quality and Treatment. McGraw-Hill Book Co., Nueva York. MCCLELLAND, N. I. & K. H. MANCY . 1979. CCDT bests Ryzner index as pipe CaCO 3 film predictor. Water Sewage Works 126:77.

Diagramas y códigos de ordenador para los índices de CaCO3

1. Descripción La tabla 2330:111 contiene los diagramas y códigos de ordenador que pueden utilizarse para determinar el IS y el PPCC, incluyendo también una breve descripción de sus características. Muchos códigos de ordenador no calculan directamente el IS, pero en su lugar facilitan la saturación relativa (SR). Cuando se ofrezcan datos de SR, calcúlese el IS a partir de1:

donde: SR = relación de producto de actividad CaCO 3 a constante de producto de solubilidad.

Los diagramas y algunos de los códigos definen el pHs como el pH que el agua exhibiría si estuviera en equilibrio con el CaCO3 a las concentraciones de calcio y alcalinidad total existentes2. Esta definición de pHs se diferencia de la que sigue a la ecuación 1 porque utiliza la alcalinidad en vez del bicarbonato.

2-54

TABLA 2330:III.

MÉTODOS NORMALIZADOS

COLECCIÓN DE PROGRAMAS GRÁFICOS Y DE ORDENADOR QUE PUEDEN UTILIZARSE PARA CALCULAR LOS ÍNDICES DE SATURACIÓN * DEL CACO 3

PROPIEDADES FÍSICAS Y DE AGREGACIÓN

TABLA 2330:III. Continuación

2-55

2-56

MÉTODOS NORMALIZADOS

Dentro de una amplitud de pH de 6 a 9, el pHs basado en la alcalinidad y el basado en el bicarbonato son virtualmente iguales, debido a que la alcalinidad total se debe casi enteramente al ion bicarbonato. Por encima del pH 9 sí se diferencian, y la ecuación 6 ya no se aplica si el IS se calcula con pH basado en la alcalinidad. Sin embargo, si se determina a partir de pHs basado en bicarbonato, la ecuación 6 mantiene su aplicación. Además, el cálculo del IS con pHs basado en la alcalinidad invierte el signo del IS por encima de valores de pH de aproximadamente pK2, es decir, un IS positivo, y no el negativo usual, que significa que el agua está infrasaturada3. Con pHs basado en bicarbonato o con RS no aparece inversión del signo, lo que evita confusiones. Es por esto por lo que se prefieren estos dos cálculos. La tabla 2330:III incluye la definición de pHs utilizada para cada código. Algunos modelos calculan solamente la cantidad de CaCO3 que puede precipitarse, pero no la que puede disolverse, y otros calculan ambas. Los diagramas y códigos pueden utilizarse para determinar muchos más parámetros que los índices de saturación de CaCO3. El software y los gráficos de ordenador merecen un premio. La información de la tabla 2330:III describe los parámetros de cada código utilizados para calcular el IS. Consúltense las referencias citadas en la tabla para actualizar la información.

2. 1.

2.

3.

Referencias SNOEYINK, V. L. & D. JENKINS. 1980. Water Chemistry. John Wiley & Sons, Nueva York. LANGELIER, W. F. 1936. The analytical control of anticorrosion water treatment. J. Amer. Water Works Assoc. 28:1500. L OEWENTHAL , R. E. & G. v. R. M ARAIS . 1976. Carbonate Chemistry of Aquatic Systems: Theory and Applications. Ann

Arbor Science Publishers, Ann Arbor, Michigan. 4. MERRILL, D. T. & R. L. SANKS . 1978. Corrosión Control by Deposition of CaCO 3 Films: A Handbook of Practical Application and Instruction. American Water Works Assoc, Denver, Colorado. 5. M ERRILL , D. T. 1976. Chemical conditioning for water softening and corrosión control. En R. L. Sanks, ed., Water Treatment Plant Design. Ann Arbor Science Publishers, Ann Arbor, Michigan. 6. ELECTRIC POWER RESEARCH INSTITUTE. 1982. Design and Operating Guidelines Manual for Cooling Water Treatment: Treatment of Recirculating Cooling Water. Section 4. Process Model Documentation and User's Manual. EPRI CS-2276, Electric Power Research Inst., Palo Alto, California. 7. BROWN, D. S. & J. D. ALLISON. 1987. MINTEQA1 Equilibrium Metal Specialion Model: A User's Manual. EPA-600/3-87-012. 8. PARKHURST , D. L., D. C. THORSTENSON & L. N. PLUMMER. 1980. PHREEQE—A Computer Program for Geochemical Calculations. USGS WRI 80-96 NTIS PB 81-167801. 9. C ROWE , A. S. & F. J. L ONGSTAFF . 1987. Extension of Geochemical Modeling Techniques to Brines: Coupling of the Pitzer Equations to PHREEQE. En Proceedings of Solving Groundwater Problems With Models, National Water Well Assoc., Denver, Colorado, feb. 10-12, 1987. 10. F LEMING , G. W. & L. N. P LUMMER . 1983. PHRQINPT—An Interactive Computer Program for Constructing Input Data Sets to the Geochemical Simulation Program PHREEQE. USGS WRI 83-4236. 11. E LECTRIC P OWER R ESEARCH I NSTITUTE . SEQUIL-An Inorganic Aqueous Chemical Equilibrium Code for Personal Computers; volumen 1, User's Manual/Workbook, Versión 1.0, GS-6234-CCML. Electric Power Research Inst., Palo Alto, California. 12. K HARAKA , Y. K., W. D. G UNTER , P. K. A GGARWAL , E. H. P ERKINS & J. D. D E BRAAL. 1988. Solmineq.88—A Computer Program for Geochemical Modeling of Water-Rock Interactions. USGS WRIR 884227, Menlo Park, California. 13. B ALL , J. W., D. K. N ORDSTROM & D. W. Z ACHMANN . 1987. WATEQ4F—A Personal Computer Fortran Translation of the Geochemical Model WATEQ2 With Revised Data Base. USGS OFR 87-50.

PROPIEDADES FÍSICAS Y DE AGREGACIÓN

2340

DUREZA*

2340 A. 1.

2-57

Introducción

Definición

Originalmente, la dureza del agua se entendió como una medida de su capacidad para precipitar el jabón. El jabón es precipitado preferentemente por los iones calcio y magnesio. Otros cationes polivalentes también pueden hacerlo, pero éstos suelen estar presentes en formas complejas, frecuentemente con componentes orgánicos, y su influencia en la dureza del agua puede ser mínima y difícil de determinar. De acuerdo con los criterios actuales, la dureza total se define como la suma de las concentraciones de calcio y magnesio, ambos expresados como carbonato cálcico, en miligramos por litro. Cuando la dureza es numéricamente mayor que la suma de alcalinidades de carbonato y bicarbonato, esta cantidad de dureza equivalente a la alcalinidad total se denomina «dureza de carbonato»; la cantidad de dureza que excede a ésta se llama «dureza no carbonatada».

Cuando la dureza es numéricamente igual o menor que la suma de alcalinidades de carbonato y bicarbonato, toda la dureza es de carbonato, estando ausente la de bicarbonato. La dureza oscila entre cero y cientos de miligramos por litro, dependiendo de la fuente y del tratamiento a que el agua haya sido sometida. 2.

Existen dos métodos. El método B, cálculo de la dureza, es aplicable a todas las aguas y proporciona una gran exactitud. Si se realiza un análisis mineral, puede informarse del cálculo de dureza. El método C, de titulación de EDTA, mide los iones calcio y magnesio y puede aplicarse, con las debidas modificaciones, a cualquier clase de agua. El procedimiento descrito facilita un medio de análisis rápido. 3.

* Aprobado por el Standard Methods Committee, 1985.

2340 B. 1.

Selección del método

Informe de resultados

Al informar sobre la dureza, señálese el método utilizado, por ejemplo «dureza (cálc.)» o bien «dureza (EDTA)».

Cálculo de la dureza

Discusión general

El método preferido para determinar la dureza es calcular ésta a partir de los resultados de las valoraciones aisladas de calcio y magnesio.

2.

Cálculo

Dureza, mg equivalente CaCO3 /l = 2,497 [Ca, mg/l] + 4,118 [Mg, mg/l]

2-58

MÉTODOS NORMALIZADOS

2340 C. 1.

Método titulométrico de EDTA

Discusión general

a) Principio: El ácido etilendiaminotetraacético y sus sales de sodio (abreviatura EDTA) forman un complejo de quelato soluble al añadirse a las soluciones de algunos cationes metálicos. Si a una solución acuosa que contenga iones calcio y magnesio a un pH de 10 ± 0,1 se añade una pequeña cantidad de colorante, como negro de eriocromo T o calmagita, la solución toma un color rojo vino. Si se añade EDTA como reactivo de titulación, los iones calcio y magnesio formarán un complejo, y, cuando todos estos iones estén incluidos en dicho complejo, la solución cambiará del rojo vino al azul, señalando el punto final de la titulación. Para obtener un punto final satisfactorio han de estar presentes los iones magnesio. Para asegurar esta presencia, se añade al tampón una pequeña cantidad de sal magnésica de EDTA, neutra desde el punto de vista complexométrico; de este modo se introduce automáticamente una cantidad suficiente de magnesio y evita la necesidad de una corrección de blanco. La nitidez del punto final aumenta con los incrementos de pH. Sin embargo, el pH no puede aumentar indefinidamente debido al peligro de precipitación de carbonato cálcico (CaCO3) o hidróxido magnésico, Mg(OH)2, y porque la tinción cambia de color a pH alto. El valor de pH especificado de 10 ± 0,1 constituye una solución satisfactoria. Se fija un límite de cinco minutos de duración para la titulación, a fin de reducir al mínimo la tendencia a la precipitación de CaCO3. b) Interferencia: Algunos iones metálicos interfieren produciendo puntos finales débiles o indiferenciados, o provocando un consumo estequiométrico de EDTA. Redúzcase esta interferencia añadiendo algunos inhibidores antes de la

titulación. El Mg-EDTA [véase 263)] secuestra selectivamente a los metales pesados, libera magnesio en la muestra y puede utilizarse como sustituto de inhibidores tóxicos o malolientes. Solamente es útil cuando el magnesio sustituido por los metales pesados no contribuye significativamente a la dureza total. Con metales pesados a concentraciones de polifosfato por debajo de las señaladas en la tabla 2340:1, utilícese el inhibidor I o II. Cuando existen concentraciones más altas de metales pesados, el calcio y magnesio se determinan por un método no EDTA (véanse secciones 3500-Ca y 3500-Mg), y la dureza se obtiene mediante cálculo. Las cifras de la tabla deben interpretarse como una orientación aproximada, y se basan en el empleo de muestras de 25 ml diluidas a 50 ml.

TABLA 2340:I. CONCENTRACIONES MÁXIMAS DE INTERFERENCIA PERMITIDAS CON DIVERSOS INHIBIDORES*

2-59

PROPIEDADES FÍSICAS Y DE AGREGACIÓN

Las materias orgánicas coloidales o en suspensión también pueden interferir en el punto final. Elimínese la interferencia mediante evaporación de la muestra por secado en baño de vapor y calentamiento en horno de mufla a 550 °C hasta que se produzca la oxidación completa de la materia orgánica. Dilúyase el residuo en 20 ml de ácido clorhídrico (HC1) 1N, neutralícese a pH 7 con hidróxido sódico (NaOH) lN y complétese hasta 50 ml con agua destilada; enfríese a temperatura ambiente y continúese de acuerdo con el procedimiento general. c) Precauciones en la titulación: Practíquese la titulación a la temperatura ambiente. El cambio de color se hace demasiado lento a medida que la muestra se acerca a la temperatura de congelación. La descomposición del indicador llega a constituir un problema cuando se emplea agua caliente. El pH especificado puede producir un ambiente propicio a la precipitación del CaCO3. Aunque el titulante disuelve lentamente estos precipitados, un punto final desviado suele proporcionar resultados pobres. La realización de la titulación en cinco minutos reduce al mínimo la tendencia a precipitar del CaCO3. Los tres métodos siguientes también reducen la pérdida por precipitación. 1) Dilúyase la muestra con agua destilada para reducir la concentración del carbonato; esta sencilla operación se ha incorporado al método. Si aparece precipitación a esta dilución 1 + 2, utilícense las modificaciones 2) o 3). El empleo de una muestra demasiado pequeña aporta un error sistemático, derivado de la lectura equivocada de la bureta. 2) Si se conoce la dureza aproximada o se determina por una titulación preliminar, añádase a la muestra un 90 por 100 o más de titulante antes de ajustar el pH con un tampón. 3) Acidifíquese la muestra y remuévase dos minutos para expulsar el CO2 antes del ajuste de pH. Determínese la

alcalinidad para indicar la cantidad de ácido que ha de añadirse.

2. Reactivos a) Solución tampón: 1) Disuélvanse 16,9 g de cloruro amónico (NH4C1) en 143 ml de hidróxido de amonio (NH4OH) conc. Añádase 1,25 g de sal de magnesio de EDTA (disponible en el mercado) y dilúyase hasta 250 ml de agua destilada. 2) Si no se dispone de sal magnésica de EDTA, disuélvase 1,179 g de sal disódica de ácido etilendiaminotetraacético dihidrato (grado de reactivo analítico) y 780 mg de sulfato magnésico (MgSO4·7H2O) o 644 mg de cloruro magnésico (MgCl2 · 6H2O) en 50 ml de agua destilada. Para alcanzar la máxima exactitud, ajústese a equivalente exacto por medio de la adición de una pequeña cantidad de EDTA, MgSO4 o MgCl2. Consérvense las soluciones 1) y 2) en un recipiente plástico o de vidrio borosilicato, durante un período no superior a un mes. Tapónese herméticamente para evitar pérdidas de amoníaco (NH3) o captura de dióxido de carbono (CO2). Manipúlese la solución tampón mediante una pipeta de bulbo. Se prescindirá del tampón cuando, al añadirse 1 ó 2 ml a la muestra, éstos no puedan producir un pH de 10,0 ± 0,1 en el punto final de la titulación. 3) También pueden adquirirse en el mercado «tampones inodoros», los cuales constituyen una alternativa satisfactoria. Contienen sal de magnesio de EDTA y tienen la ventaja de ser relativamente inodoros y más estables que los tampones de NH4C1-NH4OH. Por lo general, los tampones inodoros no proporcionan un punto final tan favorable como los de NH4C1-NH4OH a causa de su reacción más lenta, y pueden resultar inútiles cuando el método está automatizado. Prepárese uno de esos tampones mezclando 55 ml de HCl conc. con 400 ml de

2-60

agua destilada y a continuación añádase, lentamente y agitándolo, 300 ml de 2-aminoetanol (libre de aluminio y metales pesados). Agréguense 5,0 g de sal de magnesio de EDTA y dilúyase hasta 1 l con agua destilada. b) Agentes complejantes: Para la mayoría de las aguas, no son necesarios. En ocasiones, cuando el agua contenga iones de interferencia, se deberá añadir un complejante adecuado para lograr un cambio neto y exacto del color en el punto final. Son satisfactorios los siguientes: 1) Inhibidor I: Ajústense las muestras acidas a pH 6 o más con tampón de NaOH 0,1N. Añádanse 250 mg de cianuro sódico (NaCN) en polvo. A continuación, añádase tampón suficiente para ajustar a pH 10,00 ± (PRECAUCIÓN: El NaCN es extremadamente tóxico. Su empleo requiere la adopción de precauciones extraordinarias. Las soluciones que contengan este inhibidor deben drenarse con un chorro de agua en cantidad suficiente para asegurar que no queda ácido capaz de liberar cianhídrico tóxico volátil.) 2) Inhibidor II: Disuélvanse 5,0 g de sulfuro sódico no anhidro (Na2S · 9H2O) o 3,7 g de Na2S · 5H2O en 100 ml de agua destilada. La entrada de aire se evita con un tapón de goma fijado fuertemente. Este inhibidor se deteriora por oxidación del aire y produce un precipitado sulfuro que oscurece el punto final cuando existen concentraciones apreciables de metales pesados. Empléese 1 ml en el apartado 3b, más adelante. 3) MgCDTA: Sal magnésica del ácido 1, 2-ciclohexanodiaminotetraacético. Añádanse 250 mg por 100 ml de muestra y disuélvase completamente antes de aportar la solución tampón. Utilícese este complejante para evitar el uso de inhibidores tóxicos u olorosos cuando existan sustancias interferentes a concentraciones que afecten al punto final pero no contribuyan significativamente al valor de dureza.

MÉTODOS NORMALIZADOS

Pueden adquirirse preparados que incorporan un tampón y un complejante; estas mezclas tienen que mantener un pH de 10,0 ± 0,1 durante la titulación y proporcionar un punto final neto y exacto cuando se titula la muestra. c) Indicadores: Se han propuesto muchos tipos de soluciones indicadoras, que pueden utilizarse si el analista demuestra que proporcionan valores exactos. El principal problema que presentan estas soluciones es que se deterioran con el tiempo, produciendo puntos finales poco netos. Por ejemplo, las soluciones alcalinas de negro de eriocromo T son sensibles a los oxidantes, y sus soluciones acuosas o alcohólicas son inestables. En general, utilícese la menor cantidad de indicador capaz de obtener un punto final neto. Es responsabilidad del analista determinar individualmente la concentración óptima del indicador. 1) Negro de eriocromo T: Sal sódica del ácido l-(l-hidroxi-2-naftilazo)-5nitro-2-naftol-4-sulfónico, n.° 203 en el índice de color. Disuélvanse 0,5 g de colorante en 100 g de 2,2’, 2”-nitrilotrietanol (también llamado trietanolamina) o 2-metoximetanol (también llamado etilenglicol-monometiléter). Añádanse 2 gotas por 50 ml de solución a titular. Si es necesario, ajústese el volumen. 2) Calmagita: Ácido l-(l-hidroxi-4metil-2-fenilazo)-2-naftol-4-sulfónico. Es estable en solución acuosa y produce el mismo cambio de color que el negro de eriocromo T, con un punto final neto. Disuélvanse 0,10 g de calmagita en 100 ml de agua destilada. Utilícese 1 ml por 50 ml de solución a titular, ajustando el volumen si es necesario. 3) Los indicadores pueden utilizarse en forma de polvo seco siempre que se tenga cuidado en evitar su exceso. Existen en el mercado mezclas secas de esos indicadores y una sal inerte. Si el cambio de color de punto final de esos indicadores no es neto y diferenciado, por lo general, eso significa que se

PROPIEDADES FÍSICAS Y DE AGREGACIÓN

2-61

requiere un complejante apropiado. Si el inhibidor NaCN no define bien el punto final, lo más probable es que sea defectuoso. d) Titulante EDTA estándar, 0,01M: Se pesan 3,723 g de etilendiaminotetracetato disódico trihidrato, grado de reactivo analítico, también llamado (etilenodinitrilo) sal disódica del ácido tetraacético (EDTA); a continuación se disuelve en agua destilada hasta 1.000 ml. Estandarícese frente a solución de calcio estándar (apartado 2e) como se describe más adelante (apartado 3b). El titulante extrae cationes productores de dureza de los recipientes de vidrio blando, por lo que debe conservarse en frascos de polietileno (preferible) o vidrio borosilicato. El deterioro gradual se compensa mediante la reestandarización periódica y la utilización de un factor de corrección adecuado. e) Solución de calcio estándar: Se pesan 1,000 g de polvo de CaCO3 anhidro (estándar principal o reactivo especial, bajo en metales pesados, álcalis y magnesio) en un erlenmeyer de 500 ml. Coloqúese un embudo en el cuello del matraz y añádase, poco a poco, 1 + 1 HCl hasta la disolución total del CaCO3. Añádanse 200 ml de agua destilada y hágase hervir durante unos minutos para expeler el CO2. Enfríese, añádanse unas gotas de indicador rojo de metilo y ajústese al color naranja intermedio por adición de NH4OH 3N o 1 + 1 HC1, según se requiera. Transvásese cuantitativamente y dilúyase hasta 1.000 ml con agua destilada; 1 ml = 1,0 mg de CaCO3. f) Hidróxido sódico, NaOH, 0,1N.

b) Titulación de muestras: Selecciónese un volumen de muestra que requiera menos de 15 ml de reactivo EDTA y realícese la titulación en cinco minutos, medidos a partir del momento de la adición del tampón. Dilúyanse 25,0 ml de muestra hasta alrededor de 50 ml de agua destilada en una batea de porcelana u otro recipiente adecuado. Añádase entre 1 y 2 ml de solución tampón. Por lo general, 1 ml será suficiente para dar un pH de 10,0 a 10,1. La ausencia de un cambio de color de punto final neto en la titulación suele significar la necesidad de añadir un inhibidor en este punto (apartado 2b y siguientes), o que el indicador se ha deteriorado. Añádanse una o dos gotas de solución indicadora o una cantidad adecuada del reactivo en polvo seco (apartado 2c3). Poco a poco, añádase titulante EDTA estándar, removiendo continuamente, hasta que desaparezcan los últimos matices rojizos. Añádanse las últimas gotas con intervalos de 3-5 segundos. En el punto final, la solución suele ser azul. Se recomienda utilizar luz natural o una lámpara fluorescente de luz día, ya que las lámparas de incandescencia tienden a producir un matiz rojizo en el azul de punto final. Si se dispone de muestra suficiente y no hay interferencias, puede lograrse una mayor exactitud incrementando el tamaño de la muestra, como se describe más adelante (apartado 3c). c) Muestra de dureza baja: Para fluido intercambiador de iones u otras aguas ablandadas y para aguas naturales de dureza baja (menos de 5 mg/l), tómese para titulación una muestra amplia, de 100 a 1.000 ml, y añádanse cantidades proporcionalmente grandes de tampón, inhibidor e indicador. Añádase lentamente titulante EDTA por medio de una microbureta y realícese un blanco, utilizando agua bidestilada, destilada o desionizada del mismo volumen que la

3.

Procedimiento

a) Tratamiento previo de muestras de aguas contaminadas y residuales: Utilícese la digestión de ácido nítrico-ácido sulfúrico, o bien ácido nítrico-ácido perclórico (sección 3030).

2-62

MÉTODOS NORMALIZADOS

muestra, a la que hay que añadir idénticas cantidades de tampón, inhibidor e indicador. Sustráigase el volumen del EDTA utilizado como blanco a partir del volumen empleado en la muestra.

6.

4. Cálculo Dureza (EDTA) como mg de CaC0 3 1

A x B x 1.000 ml de muestra

donde: A = ml de titulación para la muestra, y B = mg CaCO 3 equivalente a 1,0 ml de titulante EDTA.

5.

56 laboratorios mediante el método titulométrico de EDTA, con una desviación estándar relativa del 2,9 por 100 y un error relativo del 0,8 por 100.

Precisión y sesgo

Una muestra sintética con 610 mg/l de dureza total en CaCO3, constituida por 108 mg Ca/l y 82 mg Mg/l, y las siguientes sustancias suplementarias: 3,1 mg de K/l, 19,9 mg de Na/l, 241 mg de Cl¯/l, 0,25 mg de NO-2 - N/1, 1,1 mg de NO3- N/l, 259 mg de SO 2-4 / 1 y 42,5 mg de alcalinidad total/l (aportada por NaHCO3) en agua destilada, fue analizada en

Bibliografía

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PROPIEDADES FÍSICAS Y DE AGREGACIÓN

2510

2-63

CONDUCTIVIDAD

2510 A.

Introducción

La conductividad es una expresión nuEl recíproco de la resistencia es la conmérica de la capacidad de una solución ductancia, que mide la capacidad para para transportar una corriente eléctrica. conducir una corriente y se expresa en Esta capacidad depende de la presencia ohmios recíprocos o mhos. En los análide iones y de su concentración total, de sis de agua es más conveniente la unidad su movilidad, valencia y concentraciones micromhos. Cuando se conoce y se aplirelativas, así como de la temperatura de ca la constante celular, la conductancia la medición. Las soluciones de la mayo- medida se convierte en conductancia esría de los ácidos, bases y sales presentan pecífica o conductividad, Ks, recíproco de coeficientes de conductividad relativa- la resistencia específica: mente adecuados. A la inversa, las moléculas de los compuestos orgánicos que no se disocian en soluciones acuosas tienen una conductividad muy escasa o nula. La medición física practicada en una Se prefiere el término «conductividad», determinación de laboratorio suele ser de resistencia, medida en ohmios o megaoh- y por lo general se expresa en micromhos mios. La resistencia de un conductor es por centímetro μmhos/cm). En el Sisteinversamente proporcional a su área de ma Internacional de Unidades (SIU), sección transversal y directamente pro- el recíproco del ohmio es el siemens (S) porcional a su longitud. La magnitud de y la conductividad se expresa en milisiela resistencia medida en una solución mens por metro (mS/m); 1 mS/m = acuosa depende, por tanto, de las carac- = 10 μmhos/cm. Para expresar resultados terísticas de la célula de conductividad en unidades SIU, divídanse μmhos/cm utilizada, y sólo tiene sentido si se cono- por 10. El agua destilada tiene recién prepacen esas características. La resistencia específica es la resistencia de un cubo de rada una conductividad de 0,5 a 2 1 cm de lado. En soluciones acuosas, esta μmhos/cm, que aumenta tras unas semamedida es rara, debido a las dificultades nas de almacenamiento a 2-4 μmhos/cm. de fabricación del electrodo. Los electro- Este aumento está producido fundamendos prácticos miden una fracción dada talmente por absorción de dióxido de de la resistencia específica, siendo esta carbono y, en menor grado, de amoníaco. La conductividad de las aguas potafracción la constante celular C: bles en los Estados Unidos oscila generalmente entre 50 y 1.500 μmhos/cm. La conductividad de las aguas residuales domésticas puede estar próxima a la del suministro hídrico local, aunque algunos residuos industriales exhiben conductividades superiores a 10.000 μmhos/cm. En * Aprobado por el Standard Methods Committee, sistemas de conducción, canales, corrien1988.

2-64

tes fluviales y lagos, se utilizan instrumentos de medición de la conductividad, los cuales pueden incorporarse a estaciones de monitorización multiparamétrica con registradores. La medición de la conductividad en laboratorio es relativamente exacta, pero otros medios de determinación menos precisos encuentran numerosas aplicaciones, como son el mareaje del agotamiento de resinas de intercambio iónico y la determinación rápida de cambios significativos en el contenido inorgánico de las aguas potables y residuales. Bien instalados y mantenidos, los dispositivos de monitorización pueden proporcionar registros continuos de la conductividad. La mayoría de los problemas que plantea la obtención de registros adecuados con equipos de monitorización radica en la suciedad del electrodo y en la circulación insuficiente de la muestra. Las mediciones de conductividad en laboratorios se utilizan para: a) Establecer el grado de mineralización para determinar el efecto de la concentración total de iones sobre equilibrios químicos, efectos fisiológicos en plantas y animales, tasas de corrosión, etcétera. b) Determinar el grado de mineralización del agua destilada y desionizada. c) Evaluar las variaciones de la concentración de minerales disueltos en aguas naturales y residuales. La variación estacional mínima que se encuentra en las aguas embalsadas contrasta notablemente con las fluctuaciones diarias de algunas aguas de río contaminadas. Las aguas residuales que contienen cantidades significativas de desechos industriales muestran también una variación diaria considerable. d) Valorar el tamaño de la muestra que se vaya a utilizar para determinaciones químicas comunes y para investigar los resultados de un análisis químico. e) Determinar la cantidad de reactivo iónico necesario en algunas reacciones de

MÉTODOS NORMALIZADOS

precipitación y neutralización, señalándose el punto final por un cambio en la inclinación de la curva como consecuencia del punteo de la conductividad sobre las lecturas de bureta. f) Calcular los sólidos totales disueltos en una muestra multiplicando la conductividad (micromhos por centímetro) por un factor empírico; éste puede variar de 0,55 a 0,9 dependiendo de los componentes solubles del agua y de la temperatura de medición. Para aguas salinas o de caldera pueden requerirse factores relativamente altos, mientras que, si existen cantidades considerables de hidróxido o de ácido libre, se necesitarán factores más bajos. Aunque la evaporación de la muestra produce un cambio de bicarbonato a carbonato, el factor empírico se calcula, para un aporte de agua relativamente constante, dividiendo los sólidos disueltos por la conductividad. Los miliequivalentes por litro, tanto de cationes como de aniones en algunas aguas, se evalúan aproximadamente multiplicando la conductividad (en micromhos por centímetro) por 0,01. La conductividad electrolítica (a diferencia de la metálica) aumenta con la temperatura a un índice de 1,9 por 100/°C aproximadamente. De una medición inexacta de la temperatura pueden derivarse errores significativos. Las soluciones de cloruro potásico (KC1) tienen un coeficiente de conductividad a temperatura más baja que el agua potable común y, por su parte, el cloruro sódico (NaCl) posee un coeficiente que se aproxima mucho al encontrado en la mayoría de las aguas de pozo y de superficie. Nótese que cada ion tiene un coeficiente de temperatura distinto; así pues, un trabajo meticuloso requiere la determinación de la conductividad a 25 °C. El hecho de que la corrección de la temperatura, una parte en 500 para 25 ± 0,1 °C, alcance resultados significativos depende del equipo disponible y de la precisión deseada.

PROPIEDADES FÍSICAS Y DE AGREGACIÓN

2510 B.

1.

Método de laboratorio

Discusión general Véase sección 2510A.

2.

2-65

Instrumental

a) Instrumental de conductividad autocontenida: Utilícese un dispositivo consistente en una fuente de corriente alterna, un puente de Wheatstone, un indicador de valor nulo y una célula de conductividad u otro instrumento que mida el índice de corriente alterna y su voltaje a través de la célula, teniendo este último la ventaja de proporcionar una lectura lineal de la conductividad. Elíjase un instrumento capaz de medir la conductividad con un error que no exceda el 1 por 100 o 1 μmho/cm. b) Termómetro, capaz de marcar hasta 0,1 °C cubriendo una amplitud de 23 a 27 °C. Por la rapidez de su respuesta, resulta conveniente emplear un termómetro eléctrico provisto de un pequeño sensor de temperatura. c) Célula de conductividad: 1) Tipo electrodo de platino. Este tipo de célula se presenta en forma de pipeta o de inmersión. La elección de la célula depende de la amplitud esperada de conductividad y de la amplitud de resistencia del instrumento. Ajústese experimentalmente la amplitud del conjunto total de aparatos, comparando los resultados instrumentales con las conductividades reales de las soluciones de KC1 enumeradas en la tabla 2510:1. Límpiense las células nuevas con una mezcla acida crómico-sulfúrica y platinícense los electrodos antes de su uso. A continuación se lavan y se platinizan de nuevo, siempre que las lecturas sean irregulares, cuando no pueda obtenerse un punto final neto o cuando la inspección muestre que se

han desprendido capas de negro de platino. Para platinizar, prepárese una solución de 1 g de ácido cloroplatínico, H2PtCl6 · 6H2O, y 12 mg de acetato de plomo en 100 ml de agua destilada. Una solución más fuerte reduce el tiempo requerido para la platinización, por lo que puede emplearse cuando el tiempo es un factor decisivo, por ejemplo, cuando la constante celular es de 1,0/cm o más. Sumérjanse los electrodos en esta solución y conéctense ambos al polo negativo de una pila de 1,5 V. Conéctese el polo positivo a un trozo de alambre de platino e introdúzcase en la solución. Utilícese una corriente que sólo desprenda una pequeña cantidad de gas. Continuar la electrólisis hasta que ambos electrodos se recubran con negro de platino. Consérvese la solución para uso ulterior. Enjuagar cuidadosamente los electrodos y, cuando no se usen, mantenerlos inmersos en agua destilada. TABLA 2510:I. CONDUCTIVIDAD DE LAS SOLUCIONES DE CLORURO DE POTASIO A 25 °C *

2-66

MÉTODOS NORMALIZADOS

2) Tipo electrodo no de platino. Utilícense células de conductividad con electrodos hechos de metales comunes duraderos (acero inoxidable entre otros) para monitorización continua y estudios de campo. Calíbrense estas células mediante comparación de la conductividad de la muestra con los resultados obtenidos con un instrumento de laboratorio. Para reducir al mínimo los errores de la constante celular, utilícese una célula y un aparato adecuadamente diseñados y homologados. 3.

Reactivos

a) Agua de conductividad: Se hace pasar agua destilada a través de un desionizador, descartándose el primer litro. La conductividad debe ser menor de 1 μmho/cm. b) Solución estándar de cloruro potásico, KC1, 0,0100M: Disuélvanse 745,6 mg de KC1 anhidro en agua de conductividad, diluyendo hasta 1.000 ml a 25 °C. Ésta es la solución de referencia estándar, que a 25 °C tiene una conductividad de 1.413 μmho/cm. Resulta satisfactoria para la mayoría de las muestras cuando la célula tiene una constante de 1 a 2. Para otras constantes celulares, utilícense las soluciones más fuertes o más débiles enumeradas en la tabla 2510:1. Consérvese en frascos de vidrio borosilicato con tapón de vidrio. 4.

Procedimiento

a) Determinación de la constante de la célula: Aclárese la célula de conductividad al menos con tres porciones de solución KC1 0,01 M. Ajústese la temperatura de la cuarta porción a 25,0 ± 0,1 °C, mídase su resistencia y anótese el valor térmico. Calcúlese la constante celular C: C = (0,001 413) (R KCl ) [1 + 0,0191 (t – 25)]

donde: RKCl = resistencia medida, ohmios, y t = temperatura observada, °C.

b) Medición de la conductividad: Aclárese la célula con una o más porciones de la muestra. Ajústese la temperatura de una última porción a 25,0 ± 0,1 °C. Mídase la resistencia o conductividad de la muestra y anótese la temperatura. 5. Cálculo El coeficiente de temperatura de la mayoría de las aguas es el mismo aproximadamente que el de la solución estándar de KC1; cuando más se desvía la temperatura de 25,0 °C, mayor es la incertidumbre en la aplicación de la corrección de la misma. Comuníquense todas las conductividades a 25,0 °C. a) Cuando se mide la resistencia de la muestra, la conductividad a 25 °C es:

donde: K = conductividad, μmhos/cm, C = constante de la célula, cm -1 , Rm = resistencia medida de la célula, ohms, y t = temperatura de medición.

b) Cuando se mide la conductividad de la muestra, dicha conductividad a 25 °C es:

donde: Km = conductividad medida, mhos a t °C, y otras unidades definidas como se indicó anteriormente.

NOTA: Si la lectura de conductividad se hace en micromhos por centímetro,

PROPIEDADES FÍSICAS Y DE AGREGACIÓN

suprímase el factor 1.000.000 en el numerador. c) Para instrumentos que den sus valores en unidades del SIU, 1

6.

1 mS/m = 10 μmhos/cm, o a la inversa, μmho/cm = 0,1 mS/m.

2-67

7. 1.

ROBINSON, R. A. & R. H. STORES. 1959. Electrolyte Solutions, 2. a ed. Academic Press, Nueva York, pág. 466. 2. LIND , J. E., J. J. Z WOLENIK & R. M. Fuoss. 1959. Calibration of conductance cells at 25 °C with aqueous solutions of potassium chloride. J. Amer. Chem. Soc. 81:1557.

Precisión y sesgo 8.

Se sometieron a prueba tres muestras sintéticas, con los siguientes resultados:

2520

Bibliografía

JONES, G. & B. C. BRADSHAW. 1933. The measurement of the conductance of electrolytes. V. A redetermination of the conductance of standard potassium chloride solutions in absolute units. J. Amer. Chem. Soc. 55:1780.

SALINIDAD

2520 A. 1.

Referencias

Discusión general

La salinidad, que no tiene unidad de medida, es una importante propiedad de las aguas naturales e industriales. Se concibió inicialmente como la determinación de la masa de sales disueltas en una masa dada de solución. La determinación experimental del contenido de sal mediante desecación y pesada presenta algunas dificultades a causa de las pérdidas de algunos componentes. La única manera fiable de determinar la salinidad real o absoluta de un agua natural es realizar un análisis químico completo. Sin embar* Aprobado por el Standard Methods Committee, 1988.

Introducción go, este método es costoso en tiempo y no puede proporcionar la exactitud necesaria para un trabajo detallado. Así pues, para determinar la salinidad se suelen utilizar métodos indirectos que incluyen la medida de una propiedad física como la conductividad, la densidad, la velocidad del sonido o el índice de refracción. Partiendo de una relación empírica entre la salinidad y la propiedad física determinada para una solución estándar, se hace posible calcular aquélla. La salinidad resultante no es más exacta que la relación empírica. La precisión, en la medida de una propiedad física, determinará la exactitud de la salinidad. A continuación se indican las precisiones de varias medidas físicas y la salinidad

MÉTODOS NORMALIZADOS

2-68

resultante; estos datos son hoy asequibles mediante el uso de instrumentos comercializados en el mercado:

Aunque la conductividad presenta la mayor precisión, solamente es útil para solutos iónicos. La densidad, aún menos precisa, responde a todos los solutos. 2.

Selección del método

En el pasado, la salinidad del agua del mar se determinaba por métodos hidro-

2520 B. 1.

métricos y argentométricos, ambos incluidos en las ediciones anteriores de Standard Methods (véase sección 210B y C, 16.a ed.). En los últimos años se han utilizado los métodos de conductividad (2520B) y densidad (2520C) por su precisión y sensibilidad elevadas. Los dos se recomiendan para trabajos precisos de campo y laboratorio.

3.

Garantía de calidad

Calíbrese el salinómetro o densímetro frente a estándar de KC1 o de agua de mar. La precisión esperada es de más de ±0,01 unidades de salinidad, operando con sistemas de operación minuciosos y estándares que cubran el margen de los resultados.

Método de la conductividad eléctrica

Determinación

Véase Conductividad, sección 2510. Debido a su sensibilidad elevada y a su fácil medición, el método de conductividad es el más utilizado para determinar la salinidad 1, 2. Para determinaciones del agua de mar, utilícese la Escala de Salinidad Práctica 1978 3 - 5 . Esta escala se realizó a partir de una solución de KC1. Una muestra de agua de mar con una conductividad a 15 °C igual a la de una solución de KC1 que contiene una masa de 32,4356 g en 1 kg de solución, se define como poseedora de una salinidad práctica de 35. Este valor se determinó como un promedio de tres estudios de laboratorio independientes. Para determinar la salinidad, se estudia la dependencia de ésta con respecto a la conductividad, Rt, en función de la temperatura (t °C, Escala de Temperatura Práctica Internacional 1968) de una muestra da-

da, a un estándar S de agua de mar = 35.

válidas a partir de S = 2 a 42. Para determinar la conductividad, úsese un puente, calibrado con un agua de

PROPIEDADES FÍSICAS Y DE AGREGACIÓN

mar estándar*, con una conductividad relativa al KC1 conocida, siguiendo las instrucciones del fabricante y los métodos anotados en la sección 2510. Si las medidas han de hacerse en aguas de estuario, realícense calibraciones secundarias de agua de mar diluida en peso de conductividad conocida, para garantizar que el puente está midiendo conductividades reales. La Escala de Salinidad Práctica se ha extendido recientemente a salinidades bajas6, para dar una ecuación válida desde salinidad 0 a 40. La ecuación es:

La salinidad práctica rompe con la antigua relación salinidad-clorinidad, S = 1,806 55 Cl. Aunque la escala puede utilizarse para aguas de estuario7-10 y de mar abiertol1-13, no está libre de limitaciones12, 14-22. 2. 1. 2.

3.

Referencias LEWIS , E. L. 1978. Salinity: its definition and calculation. J. Geophys. Res. 83:466. L EWIS , E. L. 1980. The practical salinity scale 1978 and its antecedents. IEEE J. Oceanic Eng. OE-5:3. B RADSHAW , A. L. & K. E. S CHLEICHER . 1980. Electrical conductivity of seawater. IEEE J. Oceanic Eng. OE-5:50.

* Disponible en Standard Seawater Services, Institute of Oceanographic Services, Warmley, Godalming, Surrey, Inglaterra.

2-69

4. CULKIN, F. & N. D. SMITH. 1980. Determination of the concentration of potassium chloride solution having the same electrical conductivity, at 15 °C and infinite frequency, as standard seawater of salinity 35.000 per 1.000 (Chlorinity 19.37394 per 1.000). IEEE J. Oceanic Eng. OE-5:22. 5. DAUPHINEE, T. M., J. ANCSIN , H. P. KLEIN & M. J. PHILLIPS, 1980. The effect of concentration and temperature on the conductivity ratio of potassium chloride solutions to standard seawater of salinity 35 per 1.000 (Cl.19.3740) at 15 °C and 24°. IEEE J. Oceanic Eng. OE-5:17. 6. H ILL , K. D., T. M. D AUPH INEE & D. J. WOODS . 1986. The extension of the Practical Salinity Scale 1978 to low salinities. IEEE J. Oceanic Eng. OE-11:109. 7. MILLERO, F. J. 1975. The physical chemistry of estuarines. En T. M. Church, ed. Marine Chemistry in the Coastal Environment. American Chemical Soc. Symposium, Ser. 18. 8. MILLERO, F. J. 1978. The physical chemistry of Baltic Sea waters. Thalassia Jugoslavica 14:1. 9. MILLERO, F. J. 1984. The conductivity-salinity-chlorinity relationship for estuarine waters. Limnol. Oceanogr. 29:1318. 10. MILLERO, F. J. & K. KREMLING. 1976. The densities of Baltic Sea waters. Deep-Sea Res. 23:1129. 11. FERNÁNDEZ, F., F. VÁZQUEZ & F. J. MILLERO . 1982. The density and composition of hypersaline waters of a Mexican lagoon. Limnol. Oceanogr. 27:315. 12. M ILLERO , F. J. & P. V. C HETIRKIN . 1980. The density of Caspian Sea waters. DeepSea Res. 27:265. 13. M ILLERO , F. J., A. Mucci, J. Z ULLIG & P. C HETIRKIN . 1982. The density of Red Sea brines. Mar. Chem. 11:477. 14. BREWER, P. G. & A. BRADSHAW. 1975. The effect of non-ideal composition of seawater on salinity and density. J. Mar. Res. 33:155. 15. C ONNORS , D. N. & D. R. K ESTER . 1974. Effect of major ion variations in the marine environment on the specific gravityconductivity-chlorinity-salinity relationship. Mar. Chem. 2:301. 16. POISSON, A. 1980. The concentration of the KC1 solution whose conductivity is that of standard seawater (35 per 1.000) at 15 °C. IEEE J. Oceanic Eng. OE-5:24.

2-70

17.

18.

19.

MÉTODOS NORMALIZADOS

POISSON, A. 1980. Conductivity/salinity/ temperatura relationship of diluted and concentrated standard seawater. IEEE J. Oceanic Eng. OE-5:17. M ILLERO , F. J., A. G ONZÁLEZ & G. K. WARD . 1976. The density of seawater solutions at one atmosphere as a function of temperature and salinity. J. Mar. Res. 34:61. M ILLERO , F. J., A. G ONZÁLEZ , P. G. B RE WER & A. BRADSHAW. 1976. The density of North Atlantic and North Pacific deep waters. Earth Planet Sci. Lett. 32:468.

2520 C.

20. M ILLERO , F. J., D. L AWSON & A. G ONZÁ LEZ. 1976. The density of artificial river and estuary waters. J. Geophys. Res. 81:1177. 21. MILLERO, F. J., P. CHETIRKIN & F. CULKIN. 1977. The relative conductivity and density of standard seawaters. Deep-Sea Res. 24:315. 22. M ILLERO , F. J., D. F ORSHT , D. M EANS , J. GRIESKES & K. KENYON. 1977. The density of North Pacific ocean waters. J. Geophys. Res. 83:2359.

Método de densidad

1. Determinación Con un densitómetro de precisión de flujo vibrátil es posible realizar determinaciones rápidas de la densidad de las aguas naturales. Las determinaciones se llevan a cabo haciendo pasar la muestra a través de un tubo vibrante insertado en un manguito de temperatura constante. La densidad  U de la solución es proporcional al cuadrado del período de la vibración W .

donde A y B son términos determinados por calibrado, el B mediante un densitómetro con agua de mar estándar. La diferencia entre la densidad de la muestra y la del agua pura viene dada por:

donde W y W 0 son los períodos de la muestra y del agua, respectivamente. El sistema se calibra con dos soluciones de densidad conocida, siguiendo para la calibración las recomendaciones del fabricante. Esas dos soluciones pueden ser gas nitrógeno y agua o agua de mar estándar y agua. La salinidad de la muestra puede

determinarse a partir de una ecuación internacional de estado a 1 atm para agua de mar. Esta ecuación relaciona  U  U0 a la salinidad práctica (S), como una función de la temperatura1.

donde:

y la densidad del agua es dada por:

Ejecútese una repetición simple ajustando S hasta que se obtenga la determinación p – p0 a una temperatura dada. Si las medidas se toman a 25 °C, la salinidad puede determinarse a partir de la ecuación siguiente:

2-71

PROPIEDADES FÍSICAS Y DE AGREGACIÓN

que tiene una W = 0,0012 en S. También pueden determinarse salinidades aproximadas a partir de densidades o gravedades específicas obtenidas con hidrómetro a una temperatura dada (sección 210B, 16.a edición).

2520 D.

2.

Referencias

1. MILLERO, F. J. & A. POISSON. 1981. International one-atmosphere equation of state of seawater. Deep Sea Res. 28:625.

Algoritmo de salinidad práctica

Debido a que todas las determinaciones de salinidad práctica se llevan a cabo con referencia a la conductividad de agua de mar estándar (corregida para 5 = 35), para los cálculos de salinidad será R, la cantidad disponible. Normalmente, Rt se obtiene directamente con salinómetros de laboratorio, pero las determinaciones in situ por lo general producen la cantidad R, relación de la conductividad in situ a la estándar en S = 35, t = 15 °C, p = 0 donde p es la presión superior a una atmósfera estándar, y la temperatura figura en la Escala Internacional de Temperaturas 1968). R se divide en tres partes,

Rp y r, pueden expresarse como funciones de los valores numéricos de los parámetros in situ, R, t y p, cuando t es expresado en °C y p en columnas (105Pa), como sigue:

donde:

donde: Rp = relación de conductividad in situ a conductividad de la misma muestra a la misma temperatura, pero a p = 0 y rt = relación de conductividad del agua de mar de referencia, con salinidad práctica de 35 y temperatura t, a su conductividad a t = 15 °C. A partir de Rp y rt, calcúlese R, utilizando los resultados in situ, por ejemplo:

donde:

2-72

MÉTODOS NORMALIZADOS

2530.

MATERIAS FLOTABLES*

2530 A.

Introducción

Un criterio importante para la evaluación del posible efecto de la presencia de residuos en las aguas de superficie, es la cantidad de material flotable que hay en dichos residuos. Se encuentran dos tipos generales de material notable: material en partículas, que incluye «bolas de grasa», y componentes líquidos, que pueden dispersarse como una película fina y muy visible sobre áreas extensas. El material flotable en las aguas residuales es importante porque se acumula en la superficie, suele ser muy visible, es susceptible de ser transportado por el viento, puede conte-

* Aprobado por el Standard Methods Committee, 1988.

2530 B. 1.

Partículas flotables (GENERAL)

Discusión general

a) Principio: Este método se basa en la diferencia de gravedad de las partículas que tienen una densidad menor que la del agua circundante. Las partículas que se recogen en la superficie y pueden filtrarse y calentarse a 103-105 °C son definidas por esta prueba como partículas flotables. b) Aplicación: El método puede aplicarse a las aguas residuales, corrientes sometidas a tratamiento primario y secundario, y aguas industriales. Debido a su sensibilidad limitada, no es aplicable a aguas de corrientes con tratamiento ter-

* Teflón o equivalente.

ner bacterias patógenas y/o virus asociados con partículas aisladas y puede concentrar cifras elevadas de metales e hidrocarburos clorados, como pesticidas y PCBs. El aceite y las grasas dispersadas en forma coloidal se comportan como otras materias orgánicas dispersadas y se incluyen en el material medido por las pruebas COD, BOD y TOC. La prueba de aceite flotable indica la fracción fácilmente separable. Los resultados sirven para designar separadores de aceite y grasa, al revelar la eficacia de los separadores operativos, y para monitorizar corrientes de aguas residuales tratadas o sin tratar. Muchas ciudades y distritos cuentan con límites especificados de grasa y aceites flotables para las aguas residuales vertidas por las alcantarillas.

ciario o de depósito, tanto dulces como de mar. c) Precauciones: Variaciones, incluso pequeñas, en la toma de muestras y en su manipulación, durante y después de la recogida, pueden producir grandes diferencias en la cantidad medida de material flotable. Además, para obtener resultados fiables es imprescindible la uniformidad de la capa de TFE* del embudo de separación. Para un análisis reproducible, trátense todas las muestras de manera uniforme, preferentemente mezclándolas según un procedimiento estándar, antes de la flotación, y utilizando embudos de separación lo más uniformemente preparados que sea posible. Como el método se basa en la diferencia de gravedad específica entre el líquido y las partículas

PROPIEDADES FÍSICAS Y DE AGREGACIÓN

2-73

flotables, las variaciones de temperatura pueden afectar a los resultados. Realícese la prueba a temperatura constante, igual a la de la masa de agua recibida, y consígnese esa cifra en los resultados.

tese un pequeño tubo a la parte exterior del desagüe, aplicando una abrazadera, de manera que pueda fluir libremente el líquido. Recúbrase el interior del contenedor con un aerosol de TFE, tan uniformemente como sea posible, para prevenir la adherencia de aceite y grasa a la superficie. b) Embudo de flotación: Se utiliza un cono Imhoff con una espita de TFE en el fondo, de un volumen total de 3,5 1 (figura 2530:2). Recúbrase por dentro con TFE de manera tan uniforme como sea posible, para evitar la acumulación de partículas de grasa flotables despegadas de la pared. Los embudos se montan de

Figura 2530:1. Dispositivo de toma de muestras

Figura 2530:2. Embudo de flotación de material flotable y soporte de filtro.

de materias flotables.

d) Concentración detectable mínima: La concentración detectable mínima reproducible es 1 mg/1, aproximadamente. Aunque puedan medirse niveles mínimos inferiores, los resultados no son significativos dentro de la actual eficacia establecida para la prueba. 2. Instrumental a) Preparador de muestras con mezclador de materiales flotables: Utilícese, en un soporte independiente, un recipiente metálico de 5 1 de capacidad como máximo, equipado con un mezclador propelente (figura 2530:1) y con un tubo de desagüe de 20 mm de diámetro interno insertado en un ángulo de 45 ° en la pared del contenedor en la dirección del flujo. El ángulo de 45 ° asegura que incluso las partículas gruesas fluyan desde el contenedor hacia los embudos de flotación, donde se recoge la muestra. Ajús-

MÉTODOS NORMALIZADOS

2-74

la forma indicada en la figura 2530:3, con una luz en el fondo para ayudar a leer los niveles. c) Soporte de filtro: Se cubre la cara interna del extremo superior con TFE, tomando de nuevo todas las precauciones posibles para obtener un revestimiento uniforme. d) Filtros, de fibra de cristal, porosidad fina*. e) Matraz de vacío, 500 ml. f) Revestimiento de TFE: Síganse las instrucciones incluidas en las cajas de revestimiento disponibles en el mercado. Un revestimiento uniforme es la clave de la fiabilidad de los resultados de la prueba, pero en la práctica es difícil de conseguir. 3.

Procedimiento

a) Preparación de los filtros de fibra de vidrio: Véase sección 2340D.3a. * Whatman GF/C o equivalente.

Figura 2530:3.

Embudos de flotación y unidad de mezclado.

b) Recogida y tratamiento de la muestra: Recójase la muestra en un dispositivo de obtención de flotables, en un punto de mezclado total; transpórtese al laboratorio y deposítense 3,0 1 en el embudo de flotación, dentro de las dos horas siguientes a la toma, para reducir al mínimo las alteraciones del material flotante. Mientras se llena el embudo, mézclese el contenido del colector con el mezclador propelente. Ajústese la velocidad de mezclado para lograr una distribución uniforme de las partículas flotantes en el líquido, pero evitando la formación de un remolino demasiado grande que pueda provocar la captura de gran cantidad de aire. c) Corrección para densidad y efectos de concentración: Cuando el agua recibida tiene densidad y concentración iónica diferentes de la residual, ajústense esas cifras de la muestra a las del agua recibida. Por ejemplo, si el agua recibida es de mar abierto, se vierte 1,5 1 en el embudo de flotación y se añade 1,5 1 de agua de mar filtrada desde la zona de recepción, junto con una mezcla de 39,8 g de NaCl, 8,0 g de MgCl2-6H2O y 2,3 g de CaQ2-2H2O. La mezcla final contiene la cantidad de material flotable en una muestra de 1,5 1, en un medio de densidad y concentración iónica aproximadamente iguales a las del agua del mar. d) Flotación: Mézclese el contenido del embudo de flotación a 40 rpm durante quince minutos, utilizando un mezclador de paletas (figura 2530:3). Déjese reposar cinco minutos, mézclese a 100 rpm durante un minuto y déjese reposar de nuevo treinta minutos. Descárguense 2,8 1 a través de la espita inferior, a un ritmo de 500 ml/min. Durante el desagüe, no debe alterarse la superficie de la muestra en el embudo. Con un bote lavador lleno de agua destilada, límpiese cualquier material flotante adherido a las paletas y al embudo. Déjense reposar los restantes 200 ml durante quince minutos y vacíense los sólidos sedimentados y el líquido

2-75

PROPIEDADES FÍSICAS Y DE AGREGACIÓN

hasta la marca 40 ml del cono de Imhoff. Se deja nuevamente en reposo durante diez minutos y se desagua hasta que sólo queden en el embudo 10 ml de líquido y partículas flotables. Añádanse 500 ml de agua destilada y remuévase manualmente para separar las partículas sedimentables de las flotables. Déjese reposar quince minutos y vacíese hasta la marca 40 ml. Tras un nuevo reposo de diez minutos, vacíese gota a gota hasta la señal 10 ml. A continuación se filtran estos 10 ml y las partículas flotables restantes a través de un filtro de fibra de vidrio previamente pesado. Lávese con agua destilada la superficie del embudo de flotación para reunir en el filtro todo el material flotable. e) Pesada: El filtro de fibra de vidrio se seca y se pesa a 103-105 °C durante dos horas exactamente (véase sección 2540D.3c). 4. Cálculo

donde: A = peso del filtro + mg material flotable, B = peso del filtro, mg, y C = volumen de la muestra, 1. (No incluir el volumen utilizado para corrección de la densidad y la concentración.)

5.

Precisión y sesgo

La precisión varía con la concentración de material suspendido en la muestra. No hay ningún método completamente satisfactorio para determinar el sesgo del método en muestras de aguas residuales, pero puede establecerse una recuperación aproximada realizando una segunda prueba para material flotable en toda el agua vertida durante la aplicación del método, con excepción de los últimos 10 ml. La precisión y el sesgo se resumen en la tabla 2530:1. La experimentación del método en una planta municipal de tratamiento indica que el límite inferior práctico de detección es 1 mg/1, aproximadamente.

6. Bibliografía HEUKELEKIAN, H. & J. BALMAT. 1956. Chemical composition of the particulate fractions of domestic sewage. Sewage Ind. Wastes 31:413. ENGINEERING-SCIENCE, INC. 1965. Determination and Removal of Floatable Material from Waste Water. Rep. for U. S. Public Health Serv. contracts WPD 12-01 (Rl)-63 and WPD 12-02-64, Engineering-Science, Inc., Arcadia & Oakland, California. HUNTER , J. V. & H. HEUKELEKIAN . 1965. Composition of domestic sewage fractions. J. Water Pollut. Control Fed. 37:1142. NUSBAUMI. & L. BURTMAN. 1965. Determination of floatable matter in waste discharges. J. Water Pollut. Control Fed. 37:577.

TABLA 2530:I. COEFICIENTE DE VARIACIÓN Y RECUPERACIÓN PARA PRUEBA DE PARTÍCULAS FLOTABLES

* Material flotante adicional añadido a partir de las escorias de una cubeta de sedimentación primaria.

2-76

MÉTODOS NORMALIZADOS

SCHERFIG, J. & H. F. LUDWIG. 1967. Determination of floatables and hexane extractables in sewage. En Advances in Water Pollution Research, Vol. 3, pág. 217. Water Pollution Control Federation, Washington, D.C, SELLECK, R. E., L. W. BRACEWELL & R. CARTER. 1974. The Significance and Control of Wastewater Floatables in Coastal Waters. Rep. for U. S. Environmental Protection Agency contract R-800373, SERL Rep. Núm. 74-1, Sa-

nitary Engineering Research Lab., Univ. California, Berkeley. BRACEWELL, L. W. 1976. Contribution of Wastewater Discharges to Surface Films and Other Floatables on the Ocean Surface. Thesis, Univ. California, Berkeley. BRACEWELL, L. W., R. E. SELLECK & R. CARTER. 1980. Contribution of wastewater discharges to ocean surface particulates. J. Water Pollut. Control Fed. 52:2230.

2530 C. Grasas y aceites flotables solubles en triclorotrifluoroetano (GENERAL) 1. Discusión general La prueba de grasas y aceites flotantes no mide un tipo exacto de estas sustancias; más bien los resultados vienen determinados por la prueba. La fracción medida incluye aceite y grasa, ambos flotantes y adheribles a las paredes del vaso de prueba. Las porciones adherible y flotante revisten una importancia práctica similar, ya que se presupone que la mayor parte de la porción adherente flotaría en otras condiciones del agua recibida. Se ha comprobado que los resultados representan adecuadamente la cantidad de aceite retirado en separadores con índices de flotabilidad equivalentes a las condiciones de prueba. 2. Instrumental a) Tubo de aceite flotable (figura 2530:4): Antes de utilizarse, límpiese cuidadosamente el tubo cepillándolo con un detergente ligero. El agua debe formar una película suave sobre la superficie interior del vidrio lavado. No debe utilizarse lubricante en la espita. b) Matraz cónico, 300 ml.

Figura 2530:4. Tubo de aceite flotable, capacidad 1I.

PROPIEDADES FÍSICAS Y DE AGREGACIÓN

3.

Reactivos

a) 1,1,2-tricloro-1,2,2-trifluoroetano *: Véase sección 5520B.36. b) Ácido clorhídrico, HCl, 6N. c) Papel de filtro**. 4.

Procedimiento

a) Toma de muestras: Recójanse las muestras en una zona donde haya fuerte turbulencia y el material flotante no esté atrapado en la superficie. Llénese el tubo de aceite flotante para marcar sumergiéndolo en el agua. No deben utilizarse muestras tomadas del laboratorio en un frasco, pues el aceite y la grasa no pueden redispersarse de nuevo en su condición original. b) Flotación: Sosténgase el tubo en posición vertical e iníciese el período de flotación en el lugar de la toma de muestra después de llenar el tubo. El tiempo estándar de flotación es de 30 minutos; si se utiliza un tiempo distinto, indíquese la variación en el informe de resultados. Al final del período de flotación, vacíense con cuidado los primeros 900 ml de agua a través de la espita, parando antes de que escape el aceite u otra sustancia de la superficie. Gírese ligeramente el tubo hacia atrás y adelante alrededor de su eje vertical para despegar el lodo de los lados, y déjese reposar cinco minutos. Descárguese completamente el lodo que se haya depositado en el fondo o que baje por los lados con el líquido. La capa sobrenadante en la parte superior del líquido puede mezclarse con el agua a medida qUe desciende por el tubo. Si sé produce esta mezcla, deténgase la salida del agua antes de haber perdido material flotable. Déjese en reposo durante cinco minutos antes de desechar el agua restante. Después de eliminar el agua, devuélvase * Freón o equivalente. ** Whatman núm. 40 o equivalente.

2-77

el tubo al laboratorio para completar la prueba. c) Extracción: Acidifíquese a pH 2 o menos con unas gotas de HCl 6N, añádanse 50-100 ml de triclorotrifluoroetano y agítese vigorosamente. Déjese en reposo y drénese el solvente en un vaso seco y limpio. Fíltrese a través de un papel de filtro seco en un matraz cónico de tara registrada de 300 ml, teniendo cuidado de que no haya agua sobre el filtro. Añádase una segunda porción de 50 ml de triclorotrifluoroetano y repítase la extracción, el sedimentado y la filtración en el mismo matraz de 300 ml. Si la cantidad de materiales flotantes de la muestra excede 4 mg/1, puede ser necesaria una tercera extracción. Lávese cuidadosamente el papel de filtro con solvente fresco vertido de una botella de lavado á través de una pipeta fina. Evapórese el solvente de la botella como se describe en la sección 5520B.4. Para cada lote de solvente, determínese el peso del residuo que queda tras evaporación a partir del mismo volumen que se utilizó en el análisis.

5.

Cálculos

Desígnense los resultados como «grasas y aceites solubles flotables, 30 minutos (u otro valor especificado) de tiempo de sedimentación, mg/1». Grasa y aceite flotables, solubles en triclorotrifluoroetano, tiempo de sedimentación 30 minutos, mg/1

donde: A = ganancia de peso total del matraz tarado, mg, y B = residuo calculado a partir del blanco de solvente del mismo volumen qué el utilizado en la prueba, mg.

MÉTODOS NORMALIZADOS

2-78

6.

Precisión y sesgo

No existe un estándar con el que pueda compararse esta prueba. La variabilidad de las repeticiones está influenciada por la heterogeneidad de la muestra. Si aparecen partículas gruesas de grasa, el elemento de cambio en la toma de muestras puede ser un factor decisivo. Se ha realizado un análisis triplicado de un desagüe de vertidos residuales municipales y dos desagües de plantas envasadoras de carne, conteniendo ambos partículas de grasa significativas. Los promedios para las tres aguas residuales fueron de

2540

48, 57 y 25 mg/1; la desviación estándar promedio fue del 1 l por 100. Una refinería de aceites hizo determinaciones por duplicado de un drenaje en 15 días consecutivos, obteniendo resultados que oscilaron entre 5,1 y 11,2 mg/1. La diferencia promedio entre pares de muestras fue de 0,37 mg/1. 7.

Bibliografía

P OMEROY , R. D. 1953 Floatability of oil and grease in wastewaters. Sewage Ind. Wastes 25:1304.

SÓLIDOS*

2540 A.

Introducción

Los términos «sólidos», «suspendido» y «disuelto», como se utilizarán de ahora en adelante, reemplazan a los vocablos «residuo», «no filtrable» y «filtrable» de los textos anteriores a la 16.a edición. Sólidos son los materiales suspendidos o disueltos en aguas limpias y aguas residuales. Los sólidos pueden afectar negativamente a la calidad del agua o a su suministro de varias maneras. Las aguas con abundantes sólidos disueltos suelen ser de inferior palatabilidad y pueden inducir una reacción fisiológica desfavorable en el consumidor ocasional. Por estas razones, para las aguas potables es deseable un límite de 500 mg/1 de sólidos disueltos. Las aguas altamente mineralizadas tampoco son adecuadas para muchas aplicaciones industriales o incluso resultan estéticamente insatisfactorias * Aprobado por el Standard Methods Committee, 1985.

para bañarse. Los análisis de sólidos son importantes en el control de procesos de tratamiento biológico y físico de aguas residuales, y para evaluar el cumplimiento de las limitaciones que regulan su vertido. 1. Definiciones «Sólidos totales» es la expresión que se aplica a los residuos de material que quedan en un recipiente después de la evaporación de una muestra y su consecutivo secado en estufa a temperatura definida. Los sólidos totales incluyen los «sólidos totales suspendidos», o porción de sólidos totales retenida por un filtro, y los «sólidos disueltos totales» o porción que atraviesa el filtro. El tipo de soporte del filtro, el tamaño del poro, la porosidad, el área y el espesor del filtro, así como la naturaleza física y el tamaño de las partículas y la

PROPIEDADES FÍSICAS Y DE AGREGACIÓN

2-79

cantidad de material depositado en el filtro son los factores principales que afectan a la separación de los sólidos suspendidos y los disueltos. «Sólidos fijados» es la expresión aplicada al residuo de sólidos totales, suspendidos o disueltos después de someterse a ignición durante un tiempo determinado y a una temperatura especificada. La pérdida de peso por ignición se debe a los «sólidos volátiles». Las determinaciones de sólidos fijados y volátiles no distinguen exactamente entre materias orgánica e inorgánica porque la pérdida de peso por ignición no se limita al material orgánico, sino que incluye también pérdida por descomposición o volatilización de algunas sales minerales. Una óptima caracterización de la materia orgánica puede llevarse a cabo mediante pruebas como la del carbono orgánico total (sección 5310), BOD (sección 5210) y COD (sección 5220). «Líquidos sedimentables» es la expresión aplicada al material que se desprende de la suspensión en un período determinado. Puede incluir material flotable, dependiendo de la técnica (2540F.3b).

general muy ligera. Dado que la eliminación de agua ocluida es marginal a esta temperatura, la obtención de peso constante puede ser muy baja. Los residuos secados a 180 ± 2°C perderán casi toda el agua ocluida. Puede permanecer un poco de agua de cristalización, especialmente cuando hay sulfatos. La materia orgánica puede perderse por volatilización, pero no desaparece por completo. La conversión de bicarbonatos en carbonatos produce pérdida de CO2, y los carbonatos pueden descomponerse parcialmente en óxidos o sales básicas. Pueden perderse algunos cloruros y sales nitradas. En general, la evaporación y el secado de muestras de agua a 180 °C proporciona valores sobre sólidos disueltos que están más próximos a los obtenidos mediante suma de las especies minerales determinadas individualmente que a los valores de los sólidos disueltos, logrados mediante secado a la temperatura más baja. Los resultados para residuos ricos en aceite y grasa pueden ser cuestionables debido a la dificultad que supone el secado a peso constante en un tiempo razonable. Los análisis realizados con algún propósito especial pueden exigir una desviación de los procedimientos establecidos para incluir un componente no habitual en los sólidos medidos. Cualesquiera que sean las variaciones técnicas que se introduzcan, éstas deben registrarse y presentarse con los resultados.

2.

Fuentes de error y variabilidad

La temperatura a la que se seca el residuo incide en gran medida en los resultados, debido a que las pérdidas de peso derivadas de la volatilización de materia orgánica, el agua ocluida, el agua de cristalización y los gases a partir de la descomposición inducida por el calor, así como las ganancias producidas por la oxidación, dependen de la temperatura y tiempo de calentamiento. Los residuos secados a 103-105 °C pueden retener no solamente agua de cristalización, sino también algo de agua ocluida. Como resultado de la conversión del bicarbonato en carbonato, habrá una pérdida de CO2. La pérdida de material orgánico por volatilización será por lo

3. Manipulación y preservación de la muestra Utilícense botellas de plástico o vidrio refractario, teniendo siempre en cuenta que el material en suspensión no debe adherirse a las paredes del recipiente. Iníciese el análisis lo antes posible, pues resulta poco útil preservar la muestra. Refrigérese a 4 °C hasta realizar el análisis,

MÉTODOS NORMALIZADOS

2-80

para reducir al mínimo la descomposición microbiológica de los sólidos.

también para materiales sólidos y semisólidos producidos durante el tratamiento de aguas limpias y residuales.

4. Selección del método

5.

Los métodos B al F son adecuados para la determinación de sólidos en aguas potables, de superficie y salinas, así como para aguas residuales domésticas e industriales, en una amplitud de hasta 20.000 mg/1. El método G es idóneo para la determinación de sólidos en sedimentos y

THERIAULT, E. J. & H. H. WAGENHALS. 1923. Studies of representative sewage plants. Pub. Health Bull. No. 132. U. S. ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENCY. 1979. Methods for Chemical Analysis of Water and Wates. Publ. 600/4-79-020, Environmental Monitoring and Support Lab., U.S. Environmental Protection Agency, Cincinnati, Ohio.

2540 B.

Bibliografía

Sólidos totales secados a 103-105 °C

1. Discusión general a) Principio: Se evapora una muestra correctamente mezclada en una placa pesada y secada a peso constante en un horno a 103-105 °C. El aumento de peso sobre el de la placa vacía representa los sólidos totales. Es posible que en muestras de aguas residuales los resultados no representen el peso real de los sólidos disueltos y suspendidos (véase parte anterior). b) Interferencias: El agua fuertemente mineralizada con una concentración significativa de calcio, magnesio, cloruro y/o sulfato puede ser higroscópica y requerir un secado prolongado, una desecación adecuada y un pesado rápido. Elimínense las partículas gruesas flotables o los aglomerados sumergidos de materiales no homogéneos si se decide que su inclusión no es deseable en el resultado final. Dispérsese con un mezclador la grasa y el aceite flotantes antes de separar una porción de muestra para análisis. Puesto que un residuo excesivo en la placa puede formar una costra hidrófila, limítese el tamaño de la muestra

para que proporcione un residuo no mayor de 200 miligramos. 2.

Instrumental

a) Placas de evaporación: Placas de 100 ml de capacidad, fabricadas con uno de los materiales siguientes: 1) Porcelana, 90 mm diámetro. 2) Platino, generalmente satisfactorio para tales fines. 3) Vaso alto de sílice*. b) Horno de mufla para operar a 550 ± 50 °C. c) Baño de vapor. d) Desecador, provisto de un desecante que contiene un indicador colorimétrico de concentración de humedad. e) Horno de secado, para operaciones a 103-105 °C. f) Balanza de análisis, capaz de pesar hasta 0,1 mg.

* Vycor, producto de Corning Class Works, Corning, Nueva York, o equivalente.

PROPIEDADES FÍSICAS Y DE AGREGACIÓN

3. Procedimiento a) Preparación de la placa de evaporación: Si se va a medir sólidos volátiles, incinérese una placa de evaporación limpia a 550 ± 50 °C durante una hora en un horno de mufla. Si solamente se intentan medir sólidos totales, caliéntese la placa limpia a 103-105 °C durante una hora. Consérvese la placa en el desecador hasta que se necesite. Pesar inmediatamente antes de usar. b) Análisis de la muestra: Elíjase un volumen de muestra que proporcione un residuo entre 2,5 y 200 mg. Transfiérase un volumen medido de muestra bien mezclada a la placa pesada previamente y evapórese hasta que se seque en un baño de vapor o un horno de secado. En caso necesario, añádanse a la misma placa, después de la evaporación, nuevas porciones de muestra. Si la evaporación se lleva a cabo en un horno de secado, reducir la temperatura hasta 2 °C aproximadamente por debajo del punto de ebullición, a fin de evitar salpicaduras. Secar la muestra evaporada al menos durante una hora en horno a 103-105 °C, enfriar la placa en desecador para equilibrar la temperatura y pesar. Repítase el ciclo de secado, enfriado, desecación y pesado hasta obtener un peso constante, o hasta

2540 C. 1.

2-81

que la pérdida de peso sea menor del 4 por 100 del peso previo o menor de 0,5 mg (escoger la menor de ambas).

4.

Cálculo

donde: A = peso de residuo seco + placa, mg, y B = peso de la placa, mg.

5.

Precisión

Se realizaron análisis por duplicado, en un solo laboratorio, de 41 muestras de aguas limpias y residuales, con una desviación estándar de diferencias de 6,0 mg/1.

6.

Bibliografía

SYMONS, G. E. & B. MOREV. 1941. The effect of drying time on the determination of solids in sewage and sewage sludges. Sewage Works J. 13:936.

Sólidos totales disueltos secados a 180 °C

Discusión general

a) Principio: Se filtra una muestra bien mezclada por un filtro estándar de fibra de vidrio; posteriormente, el filtrado se evapora hasta que se seque en una placa pesada y secada a peso constante a 180°C. El aumento del peso de la placa representa los sólidos totales disueltos. Es posible que los resultados no coin-

cidan con el valor teórico para sólidos calculado a partir del análisis químico de la muestra (véase parte anterior). Se han puesto a punto métodos aproximativos para correlacionar los análisis químicos con sólidos disueltos1. Para determinar los sólidos totales disueltos, puede utilizarse el filtrado a partir de la determinación de sólidos totales en suspensión (sección 2540D).

MÉTODOS NORMALIZADOS

2-82

b) Interferencias: Las aguas excesivamente mineralizadas con un contenido considerable de calcio, magnesio, cloruros y/o sulfatos, pueden ser higroscópicas y exigir un secado prolongado, un grado de desecación adecuado y un pesado rápido. Las muestras ricas en bicarbonato requieren un secado cuidadoso y, probablemente, prolongado, a 180 °C, para asegurar la conversión completa de bicarbonato a carbonato. Puesto que un residuo excesivo en la placa puede formar una costra hidrófila, limítese el tamaño de la muestra para que proporcione un residuo no mayor de 200 mg. 2.

Instrumental

Además de los aparatos enumerados en la sección 2540B.2a-d, son necesarios: a) Discos de filtrado de fibra de vidrio *, sin aglutinante orgánico. b) Aparato de filtrado: Elíjase de entre los dispositivos siguientes el más adecuado para el disco de filtrado seleccionado: 1) Embudo de filtro de membrana. 2) Crisol de Gooch, 25 a 40 ml de capacidad, con adaptador. 3) Dispositivo de filtrado, con reservono y disco de arandela gruesa (40-60 μm) como soporte del filtro. c) Matraz de succión, de capacidad suficiente para el tamaño de muestra seleccionado. d) Horno de secado, para operaciones a 180 ± 2°C. 3.

Procedimiento

a) Preparación del disco de filtrado de fibra de vidrio: Insértese el disco con la * Grado Whatman 934AH; tipo Gelman A/E; tipo Millipore AP40; E-D Scientific Specialties, grado 161; o equivalente. Disponible en diámetros de 2,2 a 4,7 cm.

cara rugosa hacia arriba en el aparato de filtrado. Hágase el vacío y lávese el disco con tres volúmenes sucesivos de 20 ml de agua destilada. Continuar la succión hasta eliminar todo vestigio de agua. Deséchese el agua de lavado. b) Preparación de la placa de evaporación: Si se van a medir sólidos volátiles, incinérese la placa de evaporación limpia a 550 ± 50 °C durante una hora en un horno de mufla. Si únicamente se desea medir sólidos totales disueltos, caliéntese la placa limpia a 180 ± 2 °C durante una hora en horno. Consérvese en el desecador hasta que se utilice. Pesar inmediatamente antes de usar. c) Selección del filtro y tamaños de la muestra: Elíjase un volumen de muestra que proporcione entre 2,5 y 200 mg de residuo seco. Si se requiere más de 10 minutos para completar el filtrado, se deberá aumentar el tamaño del filtro o disminuir el tamaño de la muestra, pero en cualquier caso no se debe producir menos de 2,5 mg de residuo. d) Análisis de la muestra: Fíltrese el volumen medido de la muestra bien mezclada mediante un filtro de fibra de vidrio, lávese con tres volúmenes sucesivos de 10 ml de agua destilada, permitiendo el drenaje completo del filtro entre los lavados, y continúese succionando durante unos 3 minutos después de terminar el filtrado. Transfiérase el producto a una placa de evaporación pesada y evapórese hasta que se seque en un baño de vapor. Si el volumen de filtrado excediera la capacidad de la placa, añádase a la misma, después de la evaporación, nuevas porciones de muestra. Séquese al menos durante una hora en horno a 180 ± 2 °C, enfríese en un desecador para equilibrar la temperatura y procédase a pesar. Repítase el ciclo de secado, enfriamiento, desecación y pesado hasta obtener un peso constante o hasta que la pérdida de peso sea menor del 4 por 100 del peso previo o menos de 0,5 mg (escoger la menor de ambas).

2-83

PROPIEDADES FÍSICAS Y DE AGREGACIÓN

4.

Cálculo

6.

Referencia SOKOLOFF, V. P. 1933. Water of crystallization in total solids of water analysis. Ind. Eng. Chem., Anal. Ed. 5:336.

donde: A = peso de residuo seco + placa, mg, y B = peso de la placa, mg.

5.

Precisión

Se llevó a cabo en un solo laboratorio el análisis de 77 muestras de un peso de 293 mg/1, con una desviación estándar de diferencias de 21,20 mg/1.

2540 D. 1.

7.

Bibliografía

HOWARD, C. S. 1933. Determination of total disolved solids in water analysis. Ind. Eng. Chem. Anal. Ed. 5:4. U. S. GEOLOGICAL SURVEY. 1974. Methods for Collection and Analysis of Water Samples for Dissolved Minerals and Gases. Techniques of Water-Resources Investigations, Book 5, Chap. A 1. U. S. Geological Surv., Washington, D.C.

Sólidos totales en suspensión secados a 103-105 °C

Discusión general

a) Principio: Se filtra una muestra bien mezclada por un filtro estándar de fibra de vidrio, y el residuo retenido en el mismo se seca a un peso constante a 103105 °C. El aumento de peso del filtro representa los sólidos totales en suspensión. Si este material obtura el filtro y prolonga la operación de filtrado, la diferencia entre el total de sólidos y el total de sólidos disueltos puede proporcionar un cálculo aproximado de los sólidos totales en suspensión. b) Interferencias: Elimínense de la muestra las partículas gruesas flotables o los aglomerados sumergidos de materiales no homogéneos, si se decide que su inclusión no es deseable en el resultado final. Puesto que un residuo excesivo sobre el filtro puede formar una costra hidrófila, limítese el tamaño de la muestra para que proporcione un residuo no mayor de 200 mg. Para las muestras ricas en sólidos disueltos, lávese meticulosamente el filtro para asegurar la eliminación del

material disuelto. Los tiempos de filtración prolongados, consecuencia de la obturación del filtro, pueden originar resultados altos debido a una cantidad excesiva de sólidos capturados en el filtro obturado. 2.

Instrumental

Además de los aparatos enumerados en las secciones 2540B.2 y 2540C.2, con excepción de las placas de evaporación, el baño de vapor y el horno de 180 °C, se requiere una: Plancheta*, acero inoxidable o aluminio, 65 mm de diámetro. 3.

Procedimiento

a) Preparación del disco de filtrado de fibra de vidrio: Insértese el disco con la * Disponible en New England Nuclear, Boston, Massachusetts, o equivalente.

MÉTODOS NORMALIZADOS

2-84

cara rugosa hacia arriba en el aparato de filtrado. Hágase el vacío y lávese el disco con tres volúmenes sucesivos de 20 ml de agua destilada. Continúese succionando hasta1 eliminar todo vestigio de agua, y retírese el agua de lavado. Quítese el filtro del aparato de filtrado y trasládese a una plancheta de aluminio o acero inoxidable. Alternativamente, procédase a separar el crisol y la combinación de filtro si se está utilizando un crisol de Gooch. Séquese en horno a 103-105 °C durante una hora. Si se van a medir sólidos volátiles, incinérese a 550 ± 50 °C en horno de mufla, enfríese en desecador para equilibrar la temperatura y procédase a pesar. Repítase el ciclo de secado o incineración, enfriamiento, desecación y pesado hasta obtener un peso constante o hasta que la pérdida de peso sea menor de 0,5 mg entre pesadas sucesivas. Consérvese en desecador hasta que se necesite. Pesar inmediatamente antes de usar. b) Selección del filtro y tamaños de la muestra: Véase sección 2540C.3c. Para muestras no homogéneas como agua residual no tratada, utilícese un filtro ancho para permitir el filtrado de una muestra representativa. c) Análisis de la muestra: Móntese el aparato de filtrado y el filtro e iníciese la succión. Para ajustar el filtro, humedézcase éste con una pequeña cantidad de agua destilada. Fíltrese un volumen medido de muestra bien mezclada por el filtro de fibra dé vidrio. Lávese con tres volúmenes sucesivos dé 10 mí de agua destilada, permitiendo el drenaje completó del filtro entre los lavados, y continúese succionando durante unos tres minutos después de terminar el filtrado. Sepárese cuidadosamente el filtro del aparato y trasládese a una plancheta de aluminio o acero inoxidable. Alternativamente, procédase a separar el crisol y la combinación de filtro del adaptador del crisol, si se está utilizando un crisol de Gooch. Séquese en horno a 103-105 °C durante una hora al menos, enfríese en un deseca-

dor para equilibrar la temperatura y pésese. Repetir el ciclo de secado, enfriamiento, desecación y pesado hasta obtener un peso constante o hasta que la pérdida de peso sea menor del 4 por 100 del peso previo o menor de 0,5 mg (escoger la menor de ambas). 4. Cálculo

donde: A = peso del filtro + residuo seco, mg B = peso del filtro, mg.

5. Precisión En los estudios efectuados por dos analistas sobre cuatro series de 10 determinaciones cada una, la desviación estándar fue de 5,2 mg/1 (coeficiente de variación 33 por 100) a 15 mg/1; 24 mg/1 (10 por 100) a 242 mg/1, y 13 mg/1 (0,76 por 100) a 1.707 mg/1. Se realizaron análisis por duplicado, en un solo laboratorio, de muestra de aguas naturales y residuales, con una desviación estándar de diferencias de 2,8 mg/1.

6.

Bibliografía

DEGEN, J & F. E. NUSSBERGER. 1956. Notes on the determination of suspended solids. Sewage Ind. Wastes 28:237. C HANIN , G., E. H. C HOW , R. B' A LEXANDER & J. PoWERS. 1958. Use of glass fiber filter mediumin the suspended solids determination. Sewage Ind. Wastes 30:1062. NUSBAUM, I. 1958. New method for determination of suspended solids. Sewage Ind. Wastes 30:1066.

PROPIEDADES FÍSICAS Y DE AGREGACIÓN

2-85

SMITH, A. L. & A. E. GREENBERG. 1963. Evaluation of methods for determining suspended solids in wastewater. J. Water Pollut. Control Fed. 35:940. WYCKOFF, B. M. 1964. Rapid solids determination using glass fiber filters. Water Sewage Works 111:277. NATIONAL COUNCIL OF THE PAPER INDUSTRY FOR AIR AND STREAM IMPROVEMENT. 1975. A Preliminary Review of Analytical Methods for the Determination of Suspended Solids in Paper Industry Effluents for Compliance with EPA-NPDES Permit Terms. Spec. Rep. No.

75-01. National Council of the Paper Industry for Air & Stream Improvement, Nueva York. NATIONAL COUNCIL OF THE PAPER INDUSTRY FOR AIR AND STREAM IMPROVEMENT. 1977. A Study of the Effect of Alternate Procedures on Effluent Suspended Solids Measurement. Stream Improvement Tech. Bull. No. 291, National Council of the Paper Industry for Air & Stream Improvement, Nueva York. TREES, C. C. 1978. Analytical analysis of the effect of dissolved solids on suspended solids determination. J. Water Pollut. Control Fed. 50:2370.

2540 E. 1.

Sólidos fijos y volátiles incinerados a 550 °C

Discusión general

a) Principio: El residuo obtenido con los métodos explicados en las secciones B, C o D se incinera, a peso constante, a una temperatura de 550 ± 50 °C. Los sólidos remanentes representan los sólidos totales fijos, disueltos o en suspensión, mientras que la pérdida de peso por ignición representa los sólidos volátiles. La determinación es útil para el control de las operaciones en plantas de tratamiento de aguas residuales, porque ofrece un cálculo aproximado de la cantidad de materia orgánica presente en la fracción sólida del agua residual, lodos activados y residuos industriales. b) Interferencias: Durante el proceso de secado pueden producirse errores negativos en los sólidos volátiles por pérdida de materia evaporable. La determinación de bajas concentraciones de sólidos volátiles en presencia de concentraciones elevadas de sólidos fijos puede estar sujeta a errores considerables. En tal caso, deberán medirse los compuestos volátiles mediante otra prueba, por ejemplo, la del carbono orgánico total (sección 5310). 2.

Instrumental

Véanse secciones 2540B.2, 2540C.2 y 2540D.2.

3.

Procedimiento

Incinérese el residuo producido por los métodos explicados en las secciones B, C o D, a peso constante, en un horno de mufla a temperatura de 550 ± 50 °C. Se deberá elevar el horno a esta temperatura antes de introducir la muestra. Por lo general, la incineración sólo precisa de 15 a 20 minutos. Enfríese la placa o el disco de filtro al aire hasta que se haya disminuido el calor y transfiéranse a un desecador para proceder a su enfriamiento final en una atmósfera seca, cuidando de no sobrecargar el desecador. Pésense la placa o el disco tan pronto como se hayan enfriado para equilibrar la temperatura. Repetir el ciclo de incineración, enfriado, desecación y pesado hasta obtener un peso constante o hasta que la pérdida de peso sea menor del 4 por 100 del peso previo.

4.

Cálculo

2-86

MÉTODOS NORMALIZADOS

5. Precisión

donde: A = peso de residuo + placa antes de incineración, mg, B = peso de residuo + placa o filtro después de la incineración, mg, y C = peso de la placa o filtro, mg.

2540 F. 1.

Sólidos sedimentables

Discusión general

Los sólidos sedimentables de las aguas de superficie y salinas, así como de los residuos domésticos e industriales, pueden ser determinados y expresados en función de un volumen (ml/l) o de un peso (mg/1). 2.

Instrumental

La prueba volumétrica requiere solamente un cono de Imhoff. En la gravimétrica, son necesarios todos los instrumentos enumerados en la sección 2540D.2 y un vaso de vidrio con un diámetro mínimo de 9 cm. 3.

En los estudios realizados por tres laboratorios sobre 4 muestras y 10 replicados, la desviación estándar fue de 11 mg/1 a 170 mg/1 de sólidos totales volátiles. No se pudieron obtener datos de sesgo de muestras reales.

Procedimiento

a) Volumétrico: Llénese un cono de Imhoff hasta la marca 1-1 con una muestra bien mezclada. Déjese sedimentar durante 45 minutos, removiendo a continuación suavemente las paredes del cono con una varilla o mediante rotación; manténgase en reposo 15 minutos más y regístrese el volumen de sólidos sedimentables del cono como milímetros por litro. Si la materia sedimentada contiene bolsas de líquido entre partículas gruesas, evalúese el volumen de aquéllas y réstese del volumen de sólidos sedimen-

tados. El límite inferior práctico de la medición depende de la composición de la muestra y, en general, es del orden de 0,1 a 1,0 ml/l. En caso de producirse una separación de materiales sedimentables y notables, no deben valorarse estos últimos como material sedimentable. b) Gravimétrico: 1) Determínense los sólidos totales en suspensión de una muestra bien mezclada (sección 2540D). 2) Viértase una muestra bien mezclada en un vaso de vidrio de no menos de 9 cm de diámetro, con capacidad para 1 l y con una profundidad de 20 cm. Alternativamente, utilizar un vaso de vidrio de diámetro superior y mayor volumen de muestra. Déjese en reposo durante una hora y, sin remover el material sedimentado o flotable, extráiganse 250 ml desde el centro del recipiente en un punto a medio camino entre las superficies del material sedimentado y del líquido. Determínense los sólidos totales suspendidos (miligramos por litro) de este líquido sobrenadante (sección 2540D). Ésos son los sólidos no sedimentables. 4.

Cálculo

mg de sólidos sedimentables/l = mg de sólidos totales en suspensión/l – mg de sólidos no sedimentables/l

PROPIEDADES FÍSICAS Y DE AGREGACIÓN

5.

Precisión y sesgo

No se dispone actualmente de datos de precisión y sesgo.

2540 G.

1.

2-87

6.

Bibliografía

FISCHER, A. J. & G. E. SYMONS. 1944. The determination of settleable sewage solids by weight. Water Sewage Works 91:37.

Sólidos totales, fijos y volátiles en muestras sólidas y semisólidas

Discusión general

a) Aplicabilidad: Este método se aplica en la determinación de sólidos totales y sus fracciones fijas y volátiles en muestras sólidas y semisólidas como sedimentos de río o lago, lodos aislados en procesos de tratamiento de aguas limpias y residuales y aglomeraciones de lodo de filtrado al vacío, de centrifugación u otros procesos de deshidratación de lodos. b) Interferencias: La determinación de sólidos, tanto volátiles como totales, en dichos materiales está sujeta a error negativo, debido a la pérdida de carbonato amónico y materia orgánica volátil experimentada durante la desecación. Aunque otro tanto sucede con las aguas residuales, el efecto tiende a ser más pronunciado con los sedimentos y, especialmente, con los lodos y aglomeraciones de lodos. La masa de materia orgánica recuperada del lodo y el sedimento requiere un tiempo de ignición más prolongado que el especificado para aguas residuales. Obsérvese cuidadosamente el tiempo y la temperatura de ignición especificados para controlar las pérdidas de sales inorgánicas volátiles. Realícese el pesado inmediatamente, ya que las muestras húmedas tienden a perder peso por evaporación. Después del secado o de la ignición, los residuos son a menudo muy higroscópicos y absorben rápidamente humedad del aire.

2.

Instrumental

Se requieren todos los instrumentos enumerados en la sección 2540B.2; también puede utilizarse una balanza capaz de pesar hasta 10 mg. 3.

Procedimiento

a) Sólidos totales: 1) Preparación de la placa de evaporación: Si van a medirse sólidos volátiles, incinérese una placa de evaporación limpia en un horno de mufla a 550 ± 50 °C durante una hora. Si solamente se desea medir sólidos totales, caliéntese la placa en un horno a 103-105 °C durante una hora. Enfríese en desecador, pésese y consérvese en el desecador hasta que haya de usarse. 2) Análisis de la muestra: a) Muestras líquidas: Si la muestra contiene suficiente humedad para fluir con mayor o menor facilidad, agítese para homogeneizarla; a continuación colóquese de 25 a 50 g en una placa de evaporación y pésese. Evapórese hasta desecación al baño María, séquese a 103105 °C durante una hora, enfríese para equilibrar la temperatura en un desecador individual con desecante activo, y pésese. b) Muestras sólidas: Si la muestra consta de partículas discretas de material

2-88

MÉTODOS NORMALIZADOS

sólido (lodo deshidratado, por ejemplo), extráiganse los fragmentos con un sacabocados del n.° 7 o pulverícese toda la muestra sobre una superficie limpia con los dedos, utilizando guantes de goma. Desposítese de 25 a 30 g en una placa de evaporación y pésese. Déjese en un horno a 103-105 °C durante toda la noche. Enfríese para equilibrar la temperatura en un desecador individual con desecante activo y pésese. b) Sólidos fijos y volátiles: Transfiérase la muestra a un horno de mufla frío, caliéntese éste hasta 550 ± 50 °C e incinérese durante una hora. [Si el residuo obtenido en el apartado 2) contiene grandes cantidades de materia orgánica, incinérese primero el residuo en un quemador de gas protegido por una campana de extracción, en presencia de aire suficiente para disminuir pérdidas por reducción y evitar olores en el laboratorio.] Enfríese en desecador para equilibrar la temperatura y pésese.

4. Cálculo

2550

donde: A = peso del residuo seco + placa, mg, B = peso de la placa, C = peso de la muestra húmeda + placa, mg, y D = peso del residuo + placa después de ignición, mg.

5.

Precisión y sesgo

No se dispone actualmente de datos de precisión y sesgo.

6.

Bibliografía

GOODMAN , B. L. 1964. Processing thickened sludge with chemical conditioners. Pags. 78 y sig. En Sludge Concentration, Filtration and Incineration. Univ. Michigan Continued Education Ser. No. 113, Ann Arbor. GRATTEAU, J. C. & R. I. DICK. 1968. Activated sludge suspended solids determinations. Water Sewage Works 115:468.

TEMPERATURA*

2550 A. La lectura de cifras de temperatura se utiliza en el cálculo de diversas formas de alcalinidad, en estudios de saturación y estabilidad respecto al carbonato de calcio, en el cálculo de la salinidad y en las operaciones generales de laboratorio. En los estudios limnológicos, con frecuencia se requieren temperaturas de agua en * Aprobado por el Standard Methods Committee, 1988.

Introducción función de la profundidad. Las temperaturas elevadas, consecuencia de descargas de agua calentada, pueden tener un impacto ecológico significativo. A menudo, la identificación de la fuente de aporte hídrico, como en los manantiales profundos, sólo es posible efectuando medidas de temperatura. Las plantas industriales suelen pedir datos de temperatura del agua para uso sistemático o cálculos de transmisión de calor.

PROPIEDADES FÍSICAS Y DE AGREGACIÓN

2550 B.

2-89

Métodos de laboratorio y de campo

1. Medidas de temperatura de aguas no profundas en laboratorios y otras valoraciones de temperatura de aguas no profundas

Normalmente, las medidas de temperatura pueden realizarse con cualquier termómetro Celsius de mercurio, que, como mínimo, deberá tener una escala con marcas cada 0,1 °C sobre el tubo capilar y una capacidad térmica mínima que permita un equilibrado rápido. Compruébese periódicamente con un termómetro de precisión certificado por el National Institute of Standards and Technology (NIST, antes National Bureau of Standards)*, que se utiliza con su certificado y cédula de corrección. Para operaciones de campo, utilícese un termómetro con estuche metálico a fin de evitar roturas.

de muestras, de modo que puede obtenerse simultáneamente una muestra de agua. Corríjanse las lecturas de los termómetros reversibles respecto a los cambios debidos a diferencias entre temperaturas en la reversión y temperatura en el momento de la lectura. Calcúlese del modo siguiente:

donde: 'T = corrección para sumar algebraicamente a la lectura no corregida, T l = lectura no corregida en la reversión, t = temperatura a la que se lee el termómetro, V o = volumen de la ampolleta final del capilar hasta graduación de 0 °C, K = constante que depende de la expansión térmica relativa del mercurio y el vidrio (valor usual de K = 6.100), y L = corrección del calibrado del termómetro dependiendo de T l .

2. Medidas de temperaturas de aguas profundas

Las temperaturas de aguas profundas requeridas por los estudios limnológicos pueden medirse con un termómetro reversible, un termófono o un termistor. El termistor es el más conveniente y exacto, pero su elevado precio dificulta su uso. Antes de utilizarse en mediciones de campo, calíbrese cualquiera de los mencionados dispositivos de medida de temperatura con un termómetro certificado del NIST. Efectúense las lecturas con el termómetro o dispositivo similar sumergido en el agua el tiempo suficiente para permitir un equilibrado total. Anótense los valores que más se aproximen a 0,1 o 1,0 °C. El termómetro utilizado generalmente para medidas de profundidad es el termómetro de tipo reversible. A menudo está montado en el aparato de recogida * Algunos termómetros comerciales pueden inducir errores de hasta 3 °C.

Si se efectúan observaciones senadas, es conveniente preparar gráficas termométricas, para obtener 'T en función de los valores de T1 y t. 3.

Bibliografía

WARREN, H. F. & G. C. WHIPPLE. 1895. The thermophone—A new instrument for determining temperatures. Mass. Inst. Technol. Quart. 8:125. SVERDRUP, H. V., M. W. JOHNSON & R. H. FLEMING, 1942. The Oceans. Prentice- Hall, Inc., Englewood Cliffs, Nueva Jersey. AMERICAN SOCIETY FOR TESTING AND MATERIALS. 1949. Standard Specifícations for ASTM Thermometers. Núm. El-58, ASTM, Filadelfia, Pennsylvania. REE, W. R. 1953. Thermistors for depth thermometry. J. Amer. Water Works Assoc. 45:259.

2-90

MÉTODOS NORMALIZADOS

2710

PRUEBAS EN LODOS*

2710 A.

Introducción

En esta sección se presenta una serie de pruebas únicamente aplicables a lodos

* Aprobado por el Standard Methods Committee, 1985.

2710 B. 1.

Tasa de consumo de oxígeno

Discusión general

Esta prueba se usa para determinar la tasa de consumo de oxígeno de una muestra de suspensión biológica, como un lodo activado. Resulta útil en estudios de laboratorio y de planta-piloto, así como en operaciones de plantas de tratamiento a gran escala. Cuando se emplee como prueba rutinaria de operación de planta, a menudo indicará los cambios de las condiciones operativas en etapas iniciales. Sin embargo, dado que las condiciones de prueba no son necesariamente idénticas a las del lugar de toma de la muestra, es posible que las medidas observadas no sean iguales a la tasa real de consumo de oxígeno. 2.

o fangos. Los datos de prueba son útiles para diseñar instalaciones destinadas a la separación y concentración de sólidos y para evaluar su conducta operativa, en especial la de los procesos de activación de lodos.

Instrumental

a) Dispositivos de tasa de consumo de oxígeno: Utilícese cualquiera de los siguientes: 1) Sonda con un electrodo sensible al oxígeno (polarográfico o galvánico), o bien 2) dispositivo manométrico o respirométrico, con escala de lectura adecuada

y capacidad para muestra de al menos 300 ml. El dispositivo deberá contar con una capacidad de aporte de oxígeno mayor que la tasa de consumo de oxígeno de la suspensión biológica, o como mínimo de 150 mg/l·h. b) Cronómetro, o cualquier otro dispositivo de medida de tiempo apropiado. c) Termómetro, para lecturas de ±0,5 °C.

3.

Procedimiento

a) Calibración del dispositivo de tasa del consumo de oxígeno: Sígase cualquiera de los siguientes procedimientos: 1) Calibrar la sonda y el medidor de oxígeno con arreglo al método expuesto en la sección 4500-O.G, o bien 2) Calibrar el dispositivo manométrico o respirométrico de acuerdo con las instrucciones del fabricante. b) Determinación de sólidos volátiles en suspensión: Véase sección 2540. c) Preparación de la muestra: Ajústese la temperatura de una porción ade-

PROPIEDADES FÍSICAS Y DE AGREGACIÓN

2-91

cuada de la muestra a la del recipiente del que fue recogida o a la temperatura de evaluación requerida, y manténgase constante durante el análisis. Regístrese la temperatura. Auméntese la concentración de OD de la muestra agitándola en una botella parcialmente llena, o inyectando aire u oxígeno. d) Medición de la tasa de consumo de oxígeno:

más bajos limitantes del OD. Un OD bajo (< 2 mg/1 al comienzo de la prueba) puede limitar la captación de oxígeno por la suspensión biológica y se manifestará en una tasa decreciente de consumo de oxígeno a medida que la prueba progresa. Rechácense estos datos ya que no son representativos de la tasa de consumo y repítase la prueba empezando por niveles iniciales más altos de OD. Los resultados de esta determinación son bastante sensibles a las variaciones de temperatura y su exactitud será mínima a menos que se hagan determinaciones por duplicado a la misma temperatura. Cuando se emplee el consumo de oxígeno como prueba de control de planta, realícense determinaciones duplicadas periódicas (al menos mensuales) para establecer la precisión de la técnica. Esta determinación también es sensible al lapso de tiempo transcurrido entre la toma de la muestra y la iniciación de la prueba.

1) Llénese el recipiente hasta rebosar con un volumen adecuado de muestra representativa de la suspensión biológica que se va a someter a prueba. 2) Si se usa una sonda sensible al oxígeno, introdúzcase inmediatamente en una botella de ROB que contenga una varilla de agitación magnética y la suspensión. Obténgase con la sonda una suspensión suficiente hasta llenar el borde de la botella y protéjase su contenido de la atmósfera. Actívese el mecanismo de agitación de la onda y el agitador magnético. (NOTA: ES precisa una homogeneización suficiente. Para suspensiones con concentraciones elevadas de sólidos en suspensión, esto es, > 5.000 mg/1, puede ser necesaria una agitación más enérgica que la proporcionada por el mecanismo de agitación de la sonda y por el agitador magnético.) Si se utiliza un dispositivo manométrico o respirométrico, síganse las instrucciones de puesta en marcha del fabricante. 3) Una vez estabilizada la lectura, anótense el nivel de OD inicial y la lectura manométrica o respirométrica y comiéncese a cronometrar. Regístrense, con intervalos de menos de un minuto, dependiendo de la tasa de consumo, los niveles adecuados de OD y los datos respiro-manométricos, durante 15 minutos o hasta que el OD llegue al límite. La extracción de oxígeno puede arrojar valores inexactos por debajo de 1 mg de OD/1. Si se utiliza un dispositivo respirométrico o manométrico, síganse las instrucciones del fabricante para valores

4.

Cálculos

Si se usa una sonda de oxígeno, puntéense las lecturas registradas (OD, mg/1) frente a tiempo (minutos) en papel mllimetrado, determinando la inclinación de la curva de ajuste óptimo. Dicha inclinación representa la tasa de consumo de oxígeno en mlligramos por litro por mlnuto. Si se utiliza un dispositivo manométrico o respirométrico, síganse las instrucciones del fabricante para calcular la tasa de consumo de oxígeno. Calcúlese la tasa específica de consumo de oxígeno en mlligramos por gramo por hora de la manera siguiente: Tasa específica de consumo de oxígeno (mg/g)/h tasa de consumo de oxígeno  mg/l min 60min = u sólidos volátiles en suspensión, g/l h

2-92

MÉTODOS NORMALIZADOS

5. Precisión y sesgo

6.

El sesgo no es aplicable. No se ha determinado la precisión de esta prueba.

UMBREIT, W. W., R. H. BURRIS & J. F. STAUFFER. 1964. Manometric Techniques. Burgess Publishing Co., Minneapolis, Minnesota.

2710 C. 1.

Bibliografía

Volumen de lodo sedimentado

Discusión general

El volumen de lodo sedimentado de una suspensión biológica es útil para la monitorización rutinaria de procesos biológicos. Para el control de una planta de lodos activados, con el fin de determinar la tasa de flujo de retorno del lodo y cuándo debe desecharse éste, se ha utilizado el volumen del lodo sedimentado en 30 minutos o el índice del volumen sedimentado entre 15 y 30 minutos. El volumen de 30 minutos también se ha empleado para determinar el índice de volumen de lodo1 (sección 2710D). 2.

Instrumental

a) Columna de sedimentación: Utilícese un cilindro graduado de 1 l, equipado con un mecanismo de agitación que conste de una o más varillas finas, extendidas a lo largo de la columna y situadas a dos diámetros de varilla de la pared del cilindro. Se dispondrá de un agitador capaz de rotar las varillas a no mas de 4 rmp (velocidad punta periférica de 1,3 cm/s aproximadamente). Véase figura 2710:1. b) Cronómetro. c) Termómetro. 3.

Procedimiento

Colóquese 1,0 1 de la muestra en la columna de sedimentación y distribuyanse los sólidos cubriendo la parte superior

Figura 2710:1. Diagrama esquemático de un vaso de sedimentación para pruebas de volumen de lodo sedimentado.

e invirtiendo el cilindro tres veces. Insértense las varillas de agitación, actívese el mecanismo agitador y déjese sedimentar la suspensión. Continuar agitando a lo largo de la prueba, manteniendo una temperatura de suspensión igual a la que tenía la muestra en el recipiente de la que fue tomada. Determínese el volumen ocupado por la suspensión a intervalos medidos, por ejemplo, 5, 10, 15, 20, 30, 45 y 60 mlnutos.

2-93

PROPIEDADES FÍSICAS Y DE AGREGACIÓN

Regístrese el volumen de lodo sedimentado en milímetros para un intervalo de tiempo dado. Las variaciones que se produzcan en la temperatura de la suspensión, los métodos de toma de muestra y de agitación, el diámetro de la columna de sedimentación y el intervalo de tiempo entre la toma de la muestra y el comienzo de la determinación influyen significativamente en los resultados.

2710 D. 1.

4.

El sesgo no es aplicable. No se ha determinado la precisión de este método. 5.

1. D ICK , R. I. & P. A. V ESILIND . 1969. The SVI–What is it? J. Water Pollut. Control Fed. 41:1285.

Discusión general

4.

5.

Procedimiento

Determínese la concentración de sólidos en suspensión de una muestra homogénea de la suspensión (véase sección 2540D). Determínese el volumen de lodo sedimentado en 30 minutos (véase sección 2710C). Cálculo

Precisión y sesgo

La precisión se determina por la precisión obtenida en la medida de sólidos en suspensión, las características de sedimentación de la suspensión y las variables asociadas a la medida del volumen de lodo sedimentado. No es aplicable el sesgo.

1.

3.

Referencia

índice de volumen de lodo

El índice de volumen de lodo (IVL) es el volumen en mililitros ocupado por 1 g de una suspensión después de 30 minutos de sedimentación. El IVL se utiliza típicamente para monitorizar las características de sedimentación del lodo activado y otras suspensiones biológicas1. Aunque el IVL carece de apoyo teórico2, la experiencia ha demostrado su utilidad para el control de procesos rutinarios. 2.

Precisión y sesgo

2.

6.

Referencias D ICK , R. I. & P. A. V ESILIND . 1969. The SVI–What is it? J. Water Pollut. Control Fed. 41:1285. F INCH, J. & H. IVES. 1950. Settleability indexes for activated sludge. Sewage lnd. Wastes 22:833.

Bibliografía

DONALDSON, W. 1932. Some notes on the operation of sewage treatment works. Sewage Works J. 4:48. MOHLMAN, F. W. 1934. The sludge Index. Sewage Works J. 6:119. RUDOLFS, W. & I. O. LACY. 1934. Settling and compacting of activated sludge. Sewage Works J. 6:647.

2-94

MÉTODOS NORMALIZADOS

2710 E.

Tasa de sedimentación de zona

1. Discusión general A concentraciones elevadas de sólidos en suspensión, las suspensiones sedimentan según un modelo de sedimentación de zona. Este tipo de sedimentación tiene lugar en condiciones de reposo y se caracteriza por una interfase neta entre el líquido sobrenadante y la zona del lodo. La altura de dicha interfase del lodo se mide en función del tiempo. Los datos de sedimentación zonal para suspensiones que se han sometido a este tipo de sedimentación, por ejemplo, las de lodos activados y las de hidróxidos metálicos, pueden utilizarse en el diseño, operatividad y evaluación de cubetas de sedimentación1, 3. 2.

Instrumental

a) Vaso de sedimentación: Utilícese un cilindro transparente de 1 m de altura y 10 cm de diámetro como mínimo. Para reducir las discrepancias entre los resultados de laboratorio y los más voluminosos a gran escala, utilícense diámetros mayores y cilindros más altos1, 3. Fíjese una cinta milimétrica calibrada en la parte exterior del cilindro, que deberá equiparse con un mecanismo agitador, por ejemplo, una o más varillas colocadas a dos diámetros de varilla de la pared interna del vaso. Agítese la suspensión cerca de la pared en toda su profundidad, a una velocidad periférica no superior a 1 cm/s. Las velocidades mayores pueden interferir el proceso de espesamiento y arrojar resultados inexactos4. Prepárese el vaso de sedimentación con una abertura en la placa del fondo para llenado y drenaje. Véase figura 2710:2. b) Cronómetro. c) Termómetro.

A = 10 cm B = 2 cm mínimo

mínimo

Figura 2710:2. Diagrama esquemático de un vaso de sedimentación para prueba de tasa de sedimentación de zona.

3.

Procedimiento

Manténgase la suspensión en un reservorio, en condiciones de mezclado uniforme. Ajústese la temperatura de la suspensión a la del recipiente de donde se tomó o a la requerida para la evaluación, registrando las cifras. Extráigase una muestra homogénea del reservorio y mídase la concentración de sólidos en suspensión (sección 2540D). Actívese el mecanismo de agitación. Llénese el vaso de sedimentación a una

2-95

PROPIEDADES FÍSICAS Y DE AGREGACIÓN

altura fija, mediante bombeo de la suspensión o por la fuerza de gravedad. Llénese a un ritmo constante para mantener una concentración uniforme de sólidos en suspensión en toda la extensión del vaso. La suspensión debe aglomerarse, es decir, formar en pocos minutos una estructura espesa con canales de líquido visibles. Si la suspensión no se aglomera, la prueba no es válida y debe repetirse. Regístrese la altura de la interfase sólidos-líquidos a intervalos de un minuto aproximadamente. Recójanse datos durante el tiempo suficiente para garantizar que la suspensión exhibe una velocidad constante de sedimentación de zona y que ha pasado un posible período de refloculación inicial, caracterizado por una velocidad acelerada de sedimentación interfase. La tasa de sedimentación de zona es una función de la concentración de sólidos en suspensión y de la altura de la muestra, así como de los artefactos de laboratorio3. Con el método de llenado descrito anteriormente y un cilindro suficientemente ancho, esos artefactos deben reducirse al mínimo. Sin embargo, incluso con pruebas realizadas meticulosamente, las suspensiones pueden comportarse de forma errática. La conducta imprescindible aumenta para lodos con concentraciones elevadas de sólidos y características pobres de sedimentación, y en los cilindros pequeños. 4.

Cálculos

Puntéese la altura de interfase en centímetros frente a tiempo en mlnutos1, 3. Trácese una recta a través de los puntos,

ingnorando el codo inicial o período de refloculación, y el codo de compresión. Calcúlese la tasa de sedimentación interfase como desviación de la línea en centímetros por minuto. 5.

Precisión y sesgo

El sesgo no es aplicable. No se ha determinado la precisión de esta prueba. 6. 1.

2.

3.

4.

7.

Referencias DICK, R. I. 1972. Sludge treatment. En W. J. Weber, ed, Physicochemical Processes for Water Quality Control. Wiley-Interscience, Nueva York. DICK, R. I. & K. W. YOUNG. 1972. Analysis of thickening performance of final settling tanks. Proc. 27th Ind. Waste Conf., Purdue Univ., Eng. Ext. Ser. Núm. 141, 33. VESILIND, P. A. 1975. Treatment and Disposal of Wastewater Sludges. Ann Arbor Science Publishing Co., Ann Arbor, Michigan. VESILIND, P. A. 1968. Discussion of Evaluation of activated sludge thickening theories. J. San. Eng. Div., Proc. Amer. Soc. Civil Eng. 94:SA1, 185.

Bibliografía

DICK, R. I. & R. B. EWING. 1967. Evaluation of activated sludge thickening theories. J. San. Eng. Div., Proc. Amer. Soc. Civil Eng. 93:SA4, 9. D ICK , R. I. 1969. Fundamental aspects of sedimentation I & II. Water Wastes Eng. 3:47, 45, & 6:2. DICK, R. I. 1970. Role of activated sludge final settling tanks. J. San. Eng. Div., Proc. Amer. Soc. Civil Eng. 96:SA2, 423.

2-96

MÉTODOS NORMALIZADOS

2710 F. 1.

Gravedad específica

Discusión general

La gravedad específica de un lodo es la relación entre las masas, a volúmenes iguales, del lodo y el agua destilada. Se determina por comparación de la masa de un volumen conocido de una muestra de lodo homogéneo, a temperatura dada, y la masa del mismo volumen de agua destilada a 4 °C. 2.

Cálculo

Utilícese a o b, adaptando la elección a los métodos descritos anteriormente. a) Calcúlese la gravedad específica, GE, a partir de la fórmula:

Instrumental

Recipiente: Un matraz marcado o botella para contener durante la pesada un volumen conocido de lodo. 3.

4.

Los valores del factor F de corrección de temperatura se dan en la tabla 2710:1. b) Calcúlese la gravedad específica, GE, a partir de la fórmula:

Procedimiento

Sígase cualquiera de los procedimientos explicados a continuación: a) Regístrese la temperatura de la muestra, T. Pésese el recipiente vacío y regístrese el peso, W. Llénese el recipiente con muestra hasta la marca y regístrese el peso, S. Llénese el recipiente vacío con agua, pésese y regístrese igualmente el peso, R. Mídanse todas las masas con un límite de error máximo de 10 mg. b) Si la muestra no fluye fácilmente, añádase al recipiente tanta cantidad de muestra como sea posible sin ejercer presión, anótese el volumen, pésese y regístrese la masa, P. Llénese el recipiente hasta la señal con agua destilada, teniendo cuidado de no atrapar burbujas de aire en el lodo o en el recipiente. Pésese y anótese la masa, Q. Mídanse todas las masas con un límite de error máximo de 10 mg.

Para valores de F, véase tabla 2710:1.

TABLA 2710:I.

FACTOR DE CORRECCIÓN DE LA TEMPERATURA

Temperatura °C

Factor de corrección de la temperatura

15

0,9991

20 25 30 35 40 45

0,9982 0,9975 0,9957 0,9941 0,9922 0,9903

2-97

PROPIEDADES FÍSICAS Y DE AGREGACIÓN

2720

GAS DIGESTOR DE LODO* 2720 A.

Introducción

El gas producido durante la descomposición anaerobia de residuos contiene metano (CH4) y dióxido de carbono (CO2) como componentes principales, con cantidades menores de hidrógeno (H2), sulfuro de hidrógeno (H2S), nitrógeno (N2) y oxígeno (O2). Está saturado con vapor de agua. La práctica común es analizar los gases producidos para estimar su valor de combustión y verificar el proceso de tratamiento. Las proporciones relativas de CO2, CH4 y N2 son normalmente las de mayor interés y las más fáciles de determinar debido a los porcentajes relativamente elevados de estos gases. 1.

Selección del método

Se han descrito dos métodos de análisis de gas: el volumétrico (B) y el de cromatografía de gases (C). El análisis volumétrico se aplica a la determinación de CO2, H2,CH4 y O2. El nitrógeno se evalúa indirectamente mediante diferencias. Aunque el método requiere largo tiempo, el instrumental es relativamente simple. Puesto que no es necesaria la calibración antes de su uso, este método es especialmente adecuado para análisis que se practican con poca frecuencia. La ventaja principal de la cromatografía de gases es su rapidez. El instrumental comercial se diseña específicamente para el análisis del gas a temperatura ambiente y permite la separación y la medida rutinarias de CO2, N2, O2 y CH4 en menos de 5 minutos. La necesidad de un registro, botellas de gas portador con presión regulada y mezclas certificadas * Aprobado por el Standard Methods Committee. 1988.

de gas patrón, encarece el coste hasta tal punto que, cuando los análisis son poco frecuentes, el método resulta antieconómico. Las ventajas de este sistema son la ausencia de errores acumulativos encontrados en las medidas volumétricas secuenciales, la adaptabilidad a análisis de otros gases, la adaptabilidad a análisis y toma de muestras intermitentes y el uso de muestras de 1 ml o menos1. 2.

Recogida de muestras

Cuando la fuente de gas se encuentre a cierta distancia del instrumental utilizado para el análisis, recójanse las muestras en recipientes sellados y transpórtense al laboratorio. Los colectores de transporte son los recipientes más adecuados. Especialmente útiles resultan los tubos largos de cristal con espita de vidrio de tres vías en ambos extremos, como se muestra en la figura 2720:1. También se

Figura 2720:1. Aparato de toma de muestras de gases.

2-98

MÉTODOS NORMALIZADOS

preparan con salidas colocadas en el centro y provistas de tabiques para transvase de las muestras con jeringa. Conéctese un extremo del colector a la fuente de gas y ábrase la espita a la atmósfera. Límpiese la línea de aire haciendo pasar 10-15 volúmenes de gas a través del respiradero y ábrase la espita para recibir la muestra. Si se dispone de grandes cantidades de gas, elimínese el aire haciendo pasar de 10 a 15 volúmenes de gas por el tubo. Si el suministro de gas es limitado, llénese el tubo con un líquido que se desplace con el gas, como el mercurio o una solución de sal acidificada. Esta última se utiliza con más facilidad y resulta menos

2720 B. 1.

costosa, pero disuelve los gases en cierto grado. Por tanto, llénese el tubo de recogida completamente con el gas y ciérrese herméticamente evitando todo contacto durante su almacenamiento transitorio. Cuando se transfiera el gas al aparato analizador, no deberá transportar ningún líquido.

3.

Referencia

1. GRUNE, W. N. & C. F. C HUEH . 1962-63. Sludge gas analysis using gas chromatograph. Water Sewage Works 109:468; 110:43; 77, 102, 127, 171, 220, y 254.

Método volumétrico

Discusión general

a) Principio: Este método puede utilizarse para el análisis del gas digestor o del metano en el agua (véase sección 6211, Metano). Primeramente se pasa un volumen medido de gas a través de una solución de hidróxido de potasio (KOH), para eliminar CO2 y, a continuación, a través de una solución de pirogalol alcalino para eliminar oxígeno, añadiendo luego óxido cúprico sobrecalentado, que elimina el H2 por oxidación del agua. Después de cada uno de los pasos anteriores, mídase el volumen del gas restante; la disminución resultante mide el porcentaje de volumen relativo de cada componente de la mezcla. Finalmente, el CH4 se determina mediante conversión a CO2 y H2O en una pipeta de combustión baja o un conjunto de oxidación catalítica. Se mide el volumen de CO2 formado durante la combustión, para determinar la fracción de metano originalmente presente. El nitrógeno se evalúa aceptando que representa el único gas remanente y equivale a la diferencia del

100 por 100 y la suma de los porcentajes obtenidos para los demás componentes. Cuando se mida solamente el CO2, infórmese solamente de la cifra de éste. No puede hacerse una suposición válida acerca de los gases restantes en ese momento sin hacer un análisis completo. Respecto a los métodos de oxidación, síganse las recomendaciones de los fabricantes del instrumental. PRECAUCIÓN: NO debe efectuarse ningún método de combustión lenta con el gas digestor por la alta probabilidad de que la concentración de CH4 exceda el 5 por 100 de volumen, limite a partir del cual la mezcla es explosiva. 2.

Instrumental

Aparato de análisis de gas tipo Orsat, que consta, como mínimo, de: 1) una bureta de gas cubierta de agua y ampolla de nivel; 2) una pipeta de absorción de CO2; 3) una pipeta de absorción de O2; 4) un conjunto de oxidación de hidrógeno por óxido cúprico; 5) un conjunto

PROPIEDADES FÍSICAS Y DE AGREGACIÓN

protegido de oxidación catalítica de CH4 o un conjunto de combustión lenta en pipeta; 6) una ampolla nivelada. Con la pipeta de combustión lenta, utilícese una fuente controlada de corriente para calentar eléctricamente el filamento de platino. Como líquido de desplazamiento se recomienda el mercurio; para recogida de muestras, también se ha empleado con éxito la solución acuosa de Na2SO4H2SO4. Utilícese algún analizador de gas disponible en el comercio que tenga esas unidades. 3.

Reactivos

a) Solución de hidróxido de potasio: Disuélvanse 500 g de KOH en agua destilada y dilúyase hasta 1 l. b) Reactivo alcalino de pirogalol: Disuélvanse 30 g de pirogalol (también llamado ácido pirogálico) en agua destilada, hasta 100 ml. Añádanse 500 ml de solución de KOH. c) Gas oxígeno: Utilícense aproximadamente 100 ml para cada muestra de gas analizada. d) Líquido de desplazamiento: Utilícese cualquiera de los siguientes: 1) Mercurio, o 2) Solución de sulfato de sodio-ácido sulfúrico. Disuélvanse 200 g de Na2SO4 en 800 ml de agua destilada; añádanse 30 ml de H2SO4 concentrado.

4.

Procedimiento

a) Introducción de la muestra: Transfiérase de 5 a 10 ml de muestra de gas en una bureta, a través de una conexión de tubo capilar al colector. Expúlsese la muestra a la atmósfera para purgar el sistema. Transfiérase a la bureta hasta 100 ml de muestra de gas. Llevar la muestra de la bureta a presión atmosféri-

2-99

ca o de referencia ajustando la ampolla niveladora. Mídase el volumen exactamente y regístrese como V1 b) Absorción del dióxido de carbono: Elimínese el CO2 de la muestra pasándolo a través de la pipeta de absorción de CO2 cargada con la solución de KOH. Hágase circular el gas hacia delante y hacia atrás hasta que el volumen de muestra permanezca constante. Antes de abrir las espitas entre la bureta y las pipetas de absorción, es preciso asegurarse de que el gas de la bureta está bajo una presión ligeramente positiva para evitar que el reactivo de la pipeta contamine la espita o el distribuidor. Después de la absorción del CO2, transfiérase la muestra a la bureta y mídase el volumen. Regístrese como V2. c) Absorción del oxígeno: Elimínese el O2 haciendo pasar la muestra a través de una pipeta de absorción de O2 cargada con reactivo alcalino de pirogalol hasta que el volumen de la muestra permanezca constante. Mídase el volumen y regístrese como V3. Para muestras de gas digestor, continuar con el procedimiento como se indica en el apartado Ad. Para CH4 en agua, consérvese el gas en la pipeta de CO2 y precédase como se explica más adelante en el apartado 4e. d) Oxidación del hidrógeno: Elimínese el H2 pasando la muestra a través de un conjunto de CuO mantenido a una temperatura del orden de 290 a 300 °C. Cuando se haya obtenido un volumen constante, transfiérase de nuevo la muestra a la bureta, enfríese y mídase el volumen. Registrar éste como K4. Expúlsese todo el gas remanente, a excepción de 20 a 25 ml. Mídase el volumen y consígnese como V5. Consérvese temporalmente en la pipeta de absorción de CO2. e) Oxidación del metano: Purgar las conexiones de entrada a la bureta con O2, introduciendo en la misma de 5 a 10 ml y procediendo luego a su expulsión. Oxidar el CH4 bien por el proceso de

2-100

oxidación catalítica para gas digestor y fase de gas de muestras de agua, o bien por el proceso de combustión lenta para dicha fase. 1) Proceso de oxidación catalítica. Para oxidación catalítica del gas digestor y la fase de gas de muestras hídricas, transfiéranse de 65 a 70 ml de O2 a la bureta registrando este volumen como V6. Pásese el O2 a la pipeta de absorción de CO2 de manera que se mezcle con la muestra conservada en ella. Devuélvase esta mezcla a la bureta y mídase el volumen, que se designará como V7. Dicho volumen debe ser muy aproximado a Vs + V6. Hágase pasar la mezcla de muestra de O2 a través de un conjunto de oxidación catalítica, que se calentará de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Manténgase la tasa de paso del gas por debajo de 30 ml/min. Después del primer paso, muévase la mezcla hacia delante y hacia atrás a través del conjunto situado entre la bureta y el depósito, a un ritmo no más rápido de 60 ml/min, hasta obtener un volumen constante. Regístrese como Vs. 2) Proceso de combustión lenta. Para combustión lenta de la fase de gas de las muestras de agua, transfiéranse de 35 a 40 ml de O2 a la bureta y regístrese el volumen como V6. Transfiérase el O2 a la pipeta de combustión lenta y después hágase pasar la muestra de la pipeta de absorción de CO2 a la bureta. Caliéntese hasta incandescencia un asa de platino en la pipeta de combustión, mientras se controla la temperatura ajustando la corriente. Redúzcase la presión de O2 de la pipeta hasta algo menos de la presión atmosférica mediante la ampolla niveladora insertada en la pipeta. Transfiérase la muestra a la pipeta de combustión a un ritmo de 10 ml/min aproximadamente. Después del primer paso, hágase pasar la mezcla de O2 y muestra varias veces de atrás adelante entre bureta y pipeta a ritmo más rápido, permitiendo que el mercurio de la pipeta suba hasta

MÉTODOS NORMALIZADOS

un punto justamente por debajo del asa calentada. Recójase la muestra de la pipeta de combustión, retírese el asa y enfríese la pipeta y la muestra a temperatura ambiente con un chorro de aire comprimido. Transfiérase la muestra a la bureta y mídase el volumen, que se anotará como Vs. f) Medida del dióxido de carbono producido: Determínese la cantidad de CO2 formado en la reacción mediante paso de la muestra, a través de una pipeta de absorción de CO2, hasta que el volumen permanezca constante. Regístrese el volumen como V9. Compruébese la exactitud de la determinación mediante la absorción del O2 residual de la muestra. Tras esta absorción, regístrese el volumen final como V10. 5.

Cálculo

a) CH4 y H2 suelen ser los únicos gases combustibles presentes en el gas digestor del lodo. Cuando éste es el caso, determínese el porcentaje por volumen de cada gas como sigue:

b) Como alternativa, caliéntese CH4 según una de las ecuaciones siguientes:

2-101

PROPIEDADES FÍSICAS Y DE AGREGACIÓN

Los resultados de los cálculos de CH4 por las tres ecuaciones deben ser razonablemente concordantes. Si no es así, repítase el análisis después de indagar en el aparato las fuentes de error, como pueden ser las pérdidas por la espita o por las conexiones. Otros gases combustibles, como etanol, butano o pentano, producirán esa falta de concordancia; sin embargo, la posibilidad de que el gas digestor contenga una cantidad significativa de esos gases es remota.

bal para su determinación puede hacerse menor de ± 1 por 100. El de la determinación de O2 y H2, sin embargo, puede ser considerable, debido a las pequeñas concentraciones. Para una concentración tan pequeña como el 1 por 100 puede esperarse un error tan grande como ± 20 por 100. Cuando el N2 se presenta en un bajo porcentaje de volumen, el error en su determinación podría ser incluso mayor, debido a que en su cálculo podrían reflejarse los errores de cada una de las demás determinaciones.

7. 6.

Precisión y sesgo

Una bureta mide el volumen de gas con una precisión de 0,05 ml y una exactitud probable de 0,1 ml. Con las amplias fracciones de CO2 y CH4 normalmente presentes en el gas digestor, el error glo-

2720 C. 1.

Bibliografía

YANT, W. F. & L. B. BERGER. 1936. Sampling of Mine Gases and the Use of the Bureau of Mines Portable Orsat Apparatus in Their Analysis. Miner's Circ. Núm. 34, U. S. Bur. Mines, Washington, D.C. MULLEN, P. W. 1955. Modern Gas Analysis. Interscience Publishers, Nueva York.

Método cromatográfico de gases

Discusión general

a) Principio: Véase sección 6630B sobre concentraciones acerca de cromatografía de gases. b) Selección del equipo: Para el análisis de muestras gaseosas se han. propuesto numerosas columnas. Es aceptable cualquiera que proporcione la separación deseada, siempre que se informe sobre todas las condiciones exactas de análisis, con los estándares de calibración. Las directrices que a continuación se exponen son necesariamente generales, y para los instrumentos específicos se seguirán las instrucciones del fabricante.

2.

Instrumental

a) Cromatografía de gases: Todo aparato que se utilice debe ser equipado con un detector de conductividad térmica. Con algunos rellenos en columna se requieren estufas y controles de temperatura. Utilícese preferentemente una unidad con válvula de muestra de gas. b) Registro: Utilícese un registrador de banda de papel de amplitud total 10-mV con el cromatógrafo de gases. Cuando se detecten componentes menores, como H2 y H2S, utilícese un registro de 1-mV.

MÉTODOS NORMALIZADOS

2-102

c) Relleno en columna *: Algunos de los disponibles en el mercado, útiles para separar los componentes gaseosos del lodo, se enumeran a continuación junto con las separaciones habituales, posibles a temperatura ambiente1, 2: 1) Gel de sílice a temperatura ambiente: H2, aire (O2 + N2), CH4, (C02-bajo). 2) Tamiz molecular 13X:H2, O2, N2, CH4. 3) HMPA (hexametilenfosforamida) 30 por 100 en Cromosorb P: CO2 desde (O2, H2, N2, CH4). 4) DEHS (di-2-etilhexilsefacato) 30 por 100 en Cromosorb P: CO2 desde (O2, H2, N2, CH4). Las combinaciones de las columnas 1 con 2, 3 y 2 ó 4 con 2, con un tamaño adecuado y en la secuencia 1.a columnadetector, 2.a columna-detector, separarán fácilmente H2, O2, N2, CH4 y CO2. Se puede adquirir un equipo específico diseñado para estas operaciones2. d) Aparato de introducción de muestras: Se ha diseñado un dispositivo equipado con válvulas de toma de muestras de gas que permite la inspección automática en el cromatógrafo de un volumen de muestra específico. Si no se dispone de este aparato, introdúzcanse las muestras con jeringa y aguja hipodérmica calibre 27. Redúzcase el escape de gas engrasando ligeramente el émbolo con aceite mineral o, preferiblemente, utilizando una jeringa hermética especial. 3.

Reactivos

a) Gases portadores: Utilícese helio para separar los gases digestores. Si ha de determinarse el H2, empléese argón * Los métodos de cromatografía de gases son extremadamente sensibles al material utilizado. El uso de marcas registradas en el Standard Methods no excluye el de otros productos existentes o todavía no comercializados que proporcionan de forma demostrable resultados equivalentes.

como gas portador para aumentar notablemente la sensibilidad. b) Gases de calibrado: Utilícense muestras de CH4, CO2 y N2 de pureza conocida, o mezclas de composición dada. También se emplean muestras de O2, H2 y H2S de pureza conocida si son estos gases los que van a medirse. 4.

Procedimiento

a) Preparación del cromatógrafo de gases: Ajústese la tasa de flujo de gas portador a 60-80 ml/min. El aparato está listo para su uso cuando el registro marca una línea base estable. El gel de sílice y las columnas del tamiz molecular pierden actividad de forma gradual por la humedad o los materiales permanentemente adsorbidos a temperatura ambiente. Si se producen separaciones insuficientes, reactívese por calentamiento o reempaquetado. b) Calibrado: Para resultados exactos, prepárese una curva de calibrado para cada gas a medir, pues los distintos componentes del gas no dan respuestas equivalentes del detector ni en función del peso ni de la concentración molar. Calíbrese con mezclas sintéticas o con gases puros. 1) Mezclas sintéticas. Cómprense mezclas de gases de composición conocida o prepárense en el laboratorio. Inyéctese un volumen estándar de cada mezcla en el cromatógrafo de gas y anótese la respuesta para cada uno. Calcúlese por ordenador la respuesta del detector, como área bajo la curva o como altura del pico, después de corregir para atenuación. Léanse cuidadosamente las alturas de los picos y relaciónense con las concentraciones de los componentes de la muestra. Reprodúzcanse exactamente los parámetros operativos de un análisis en el siguiente. Si por este método no puede obtenerse una reproducibilidad suficiente, utilícense para calibrado las

PROPIEDADES FÍSICAS Y DE AGREGACIÓN

2-103

áreas de los picos. Prepárese la curva punteando tanto éstas como las alturas frente a los porcentajes de volumen de cada componente. 2) Gases puros. Introdúzcanse en el cromatógrafo gases puros aislados mediante jeringas. Inyéctense volúmenes de muestra de 0,25, 0,5, 1,0 ml, etc., y realícese el trazado de respuestas del detector, corregido para atenuación, frente a los volúmenes del gas. Cuando el sistema de análisis proporcione una respuesta lineal con concentración creciente del gas desde cero hasta el margen de interés, háganse pasar mezclas estándar con las muestras. Si éstas tienen el mismo tamaño, calcúlese la concentración del gas en proporción directa. c) Análisis de la muestra: Si las muestras van a inyectarse con jeringa, equipar el recipiente de recogida con un respiradero cerrado por un tabique de goma o de silicona. Recójase la muestra para el análisis, vacíese de aire la jeringa presionando el émbolo e introdúzcase la aguja a través del tabique. Retírese el émbolo hasta tomar el volumen de gas deseado, extráigase la aguja del colector e inyéctese rápidamente la muestra en el cromatógrafo. Si las muestras han de inyectarse a través de una válvula de toma de gases, conéctese el recipiente de la muestra al tubo de entrada. Déjese fluir el gas desde el tubo de recolección a través de la válvula para purgar el espacio muerto de aire y llenar el tubo con la muestra. Normalmente son suficientes unos 15 ml para limpiar las líneas y proporcionar de 1 a 2 ml de muestra. Transvásese ésta desde el asa a la corriente de gas portador siguiendo las instrucciones del fabricante. Antes de la inyección, llévense las muestras a la presión atmosférica. Cuando las curvas de calibrado se han preparado con mezclas sintéticas, utilícese el mismo volumen de muestra que el empleado durante dicho calibrado. Cuando se preparan por el método que

emplea volúmenes diversos de gases puros, inyéctese un volumen convencional de muestra de gas de unos 2 ml. 5.

Cálculo

a) Cuando las curvas de calibrado se han preparado con mezclas sintéticas y el volumen de la muestra analizada es igual que el usado en el calibrado, léase directamente el porcentaje de volumen de cada componente en la curva de calibrado, después de someter a ordenador la respuesta del detector para cada componente. b) Cuando las curvas de calibrado se preparan con volúmenes variables de gases puros, calcúlese según la fórmula siguiente el porcentaje de cada gas en la mezcla:

donde: A = volumen parcial del componente (leído a partir de la curva de calibrado), y B = volumen de muestra inyectado.

c) Cuando se pasan mezclas estándar con las muestras y la respuesta es lineal, desde cero hasta el margen de concentración de interés:

donde: C = valor registrador de la muestra, y D = valor registrador del estándar.

6.

Precisión y sesgo

La precisión y el sesgo dependen del instrumental utilizado y de las técnicas

2-104

MÉTODOS NORMALIZADOS

de operación. Si se pone el cuidado necesario, puede lograrse en general una exactitud del 2 por 100. Con gas digestor, la suma de los porcentajes de CH4, CO2 y N2 debe aproximarse al 100 por 100. Si no es así, posiblemente se hayan cometido errores en la toma, la manipulación, la conservación y la inyección del gas, o en los instrumentos y el calibrado.

2810

7.

Referencias

1.

ANDREWS, J. F. 1968. Chromatographic analysis of gaseous products and reaclants for biological processes. Water Sewage Works 115:54. 2. Column Systems for the Fisher Gas Partitioner. Tech. Bull. TB-154, Fisher Scientific Co., Atlanta, Georgia. Catalog 77, Fisher Scientific Co.

SOBRESATURACIÓN DE GAS DISUELTO*

2810 A. El agua llega a estar sobresaturada de gases atmosféricos por varios medios, siendo el más común el calentamiento y arrastre de aire en aguas sometidas a bombeo o vertido. El signo principal de la sobresaturación de gas es la formación de burbujas en las superficies sumergidas o dentro del sistema vascular y los tejidos de los organismos acuáticos. La sobresaturación de gas puede limitar la vida acuática e interferir los procesos de tratamiento del agua. Se han encontrado niveles de sobresaturación letales para los organismos acuáticos en manantiales, ríos, pozos, lagos, estuarios y aguas de mar. La sobresaturación puede producirse en agua procesada o bombeada para preparación de bebidas, suministro a piscifactorías y bioanálisis de laboratorio. También pueden aparecer variaciones temporales, estacionales o de otro tipo en la sobresaturación. Dado que la tasa de equilibrio puede ser baja, la sobresaturación puede persistir en un agua corriente durante días, y de ese modo los

* Aprobado por el Standard Methods Committee. 1987.

Introducción gases disueltos en exceso persistirán lejos de la fuente de sobresaturación. Las burbujas de gas se forman cuando la presión total de gas disuelto es mayor que la suma de las presiones compensadoras, que incluyen presión del agua, presión barométrica y, para los seres vivos, presión de los tejidos y de la sangre. La presión total de gas disuelto es igual a la suma de las presiones parciales de todos los gases disueltos, incluyendo el vapor de agua. Por lo general, en la mayoría de las aguas naturales sólo se necesita considerar el nitrógeno, el oxígeno, el argón, el dióxido de carbono y las presiones del vapor de agua. La enfermedad de las burbujas de gas de los peces u otros organismos acuáticos es el resultado de una excesiva presión descompensada de gas. Un gas aislado en sobresaturación, como el oxígeno o el nitrógeno, no produce necesariamente la enfermedad de las burbujas, puesto que la formación de éstas depende en gran parte de la presión total de gas disuelto. El grado de saturación de gas debe describirse en función de las presiones más que de la concentración o de las unidades de volumen.

2-105

PROPIEDADES FÍSICAS Y DE AGREGACIÓN

2810 B. 1.

Método de difusión de membrana directa

Discusión general

a) Principio: Para este método se necesita un aparato con un sistema de tubos «permeable al gas» de longitud variable, conectado a un dispositivo de medida de presión. Suelen emplearse tubos de goma de dimetilsilicona, por ser muy permeables a los gases disueltos, incluyendo el vapor de agua. En estado de equilibrio, la presión de calibre dentro de los tubos es igual a la diferencia en la presión de gas ( ' P ) entre la presión total de gas disuelto y la presión barométrica ambiental. Cuando el agua está en equilibrio con la atmósfera, ' P es igual a cero. Si ' P es mayor de cero, el agua está sobresaturada. A la inversa, ' P es negativa si el agua está hiposaturada. b) Margen de trabajo: En este método, el margen de trabajo depende del dispositivo sensor de presión utilizado, pero de forma típica oscilará entre –150 y +600 mm Hg. Los sólidos disueltos en aguas residuales no interfieren en el método. 2.

Instrumental

Pueden adquirirse en el mercado varios tipos de aparatos de difusión de membrana. Opcionalmente, puede construirse una unidad a partir de componentes disponibles en el mercado. Se han descrito varias unidades, entre ellas un sistema de lectura directa que utiliza transductores de presión y una obtención de datos digital1, una unidad monolínea que puede activar un sistema de alarma2 y un modelo inicial de saturómetro Weiss 3. Cada una de estas unidades posee ventajas y limitaciones específicas; la elección del instrumental dependerá de su aplicación selectiva. Todos estos instrumentos son portátiles, de modo que la recogida de datos puede realizarse en su totalidad en trabajos de campo.

Compruébense las posibles fugas del aparato siguiendo las instrucciones del fabricante. Incluso un escape mínimo, difícil de detectar y localizar, producirá datos inútiles. Calíbrese el dispositivo de medida de presión con un manómetro de mercurio o un calibre de presión certificado. Si se utiliza un manómetro, incluyase mercurio nuevo, de manera que pueda fluir con facilidad en el sistema de tubos. Un método alternativo para probar directamente los instrumentos de difusión de membrana consiste en utilizar una cámara pequeña y cerrada, donde los niveles ' P inducidos pueden compararse con los niveles ' P observados2. Los métodos de Van Slyke-Neill4 o de cromatografía de gas son inadecuados para el calibrado, pero pueden utilizarse para comprobar los resultados. Estos métodos miden concentraciones de gases independientes y requieren conversión ulterior a presión ' P o parcial; presentan problemas en la toma y manipulación de muestras 5-7.

3.

Procedimiento

Al comienzo de cada sesión, compruébense las fugas y recalíbrese el aparato. En el lugar de la monitorización, sumérjase completamente en el agua el elemento sensor, preferiblemente por debajo de la profundidad de compensación hidrostática. A esta profundidad, las presiones hidrostática y total de gas son iguales y, como resultado, no se formarán burbujas en los tubos. La formación de burbujas en el tubo de silicona reduce marcadamente la exactitud. Calcúlese la profundidad de compensación hidrostática5 como sigue:

2-106

y

donde:

MÉTODOS NORMALIZADOS

barómetro portátil. Las presiones barométricas comunicadas por agencias meteorológicas (o aeropuertos) se corrigen a nivel del mar, y suelen ser poco habituales.

Z = profundidad, m, y

' P = diferencia de presión, mm Hg.

Disgréguense las burbujas formadas en los tubos golpeando suavemente el aparato o moviéndolo rápidamente en el agua. El movimiento de agua a lo largo de los tubos de goma de silicona también facilita el establecimiento de un equilibrio entre las presiones del agua en el gas y en el tubo. Opérese con el aparato «libre de burbujas» hasta observar una ' P estable. Esto puede requerir unos 5 a 30 min, dependiendo de la ' P , la temperatura y el flujo del agua y la geometría del sistema. La respuesta de tiempo del método de difusión de membrana se muestra en la figura 2810:1, para situaciones «libres de burbujas» y «con burbujas». Si se utiliza el aparato en aguas muy contaminadas que contengan aceite u otras sustancias orgánicas, límpiense los tubos de silicona con un detergente suave, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Estos tubos de goma de silicona se han utilizado en aguas naturales no contaminadas en períodos de hasta ocho años, sin que se vieran afectados adversamente por crecimiento de algas2. Los tubos pueden deteriorarse por la acción de arenisca abrasiva, diatomeas, picaduras producidas por organismos acuáticos, algunos compuestos orgánicos y ácidos fuertes2. Obténganse datos de presión barométrica mediante un barómetro de mercurio de laboratorio al menos una vez al día, o a partir de un barómetro portátil calibrado en el lugar de toma de muestras. Si hay más de 5 m de diferencia entre la localización del barómetro y los puntos de toma de muestras, úsese un

Figura 2810:1.

Tiempo de respuesta para la prueba de difusión de membrana.

4. Cálculo a) Presión de gas total: Preferiblemente, indíquese la presión de gas total como ' P 2, 6, 8 en milímetros de mercurio. También se ha consignado como porcentaje de la presión barométrica local:

donde: P b = presión barométrica local verdadera, mmHg

No se recomienda definir la presión de gas total como porcentaje. b) Presiones de gases componentes: Cuando se necesita información sobre sobresaturación de componentes gaseosos, indíquense los datos como presiones parciales, presiones diferenciales o porcentaje de saturación5-8. Esto requiere medidas adicionales de oxígeno disuelto,

PROPIEDADES FÍSICAS Y DE AGREGACIÓN

2-107

temperatura y salinidad * en el lugar de la monitorización. En una mezcla de gases a un volumen dado, la presión parcial de un gas es la que este gas ejercería si fuera el único presente.

c) Presiones diferenciales: La presión diferencial de un gas es la diferencia entre las presiones parciales de dicho gas en agua y aire. La presión diferencial del oxígeno puede calcularse como

1) Presión parcial de oxígeno. Calcúlese como sigue: y la del nitrógeno

donde: PO2 = presión parcial de oxígeno,

E O = coeficiente Bunsen para el oxígeno 2

(tabla 2810:1), y OD = concentración de oxígeno medida, mg/1.

Se dispone de coeficientes Bunsen para aguas de mar3. El factor 0,5318 equivale a 760/(1.000K), donde K es la relación entre peso y volumen moleculares para el oxígeno gaseoso5. 2) Presión parcial de nitrógeno. Evalúese restando las presiones parciales de oxígeno y vapor de agua de la presión de gas total.

d) Porcentaje de saturación de nitrógeno: En la bibliografía tradicional, los valores de sobresaturación se consignaban como saturación porcentual del gas. Este método se desaconseja, pudiendo calcularse como sigue:

Son conversiones útiles las siguientes:

donde: PH 2O = presión de vapor de agua a partir de la tabla 2810:11.

Esta cifra incluye una pequeña contribución de argón y otros gases presentes, como el dióxido de carbono y el metano. La presión parcial del CO2 es insignificante en aguas de pH > 7,0. 3) índice de presión parcial nitrógeno/oxígeno. Este índice caracteriza la contribución relativa de ambos gases a la presión total de gases disueltos. En agua equilibrada con aire, este índice es de 3,77. * Métodos para estas variables pueden encontrarse en las secciones 4500-O, 2550 y 2520, respectivamente.

Préstese atención al comparar estas relaciones con datos antiguos, ya que los PGT(%) y N2(%) se han definido de forma diferente5.

5. Control de calidad

La precisión del método de difusión de membrana depende principalmente del dispositivo sensor de la presión. Para un operador con experiencia es aproximadamente de ± 1 a 2 mm Hg, con una exac-

2-108

MÉTODOS NORMALIZADOS

PROPIEDADES FÍSICAS Y DE AGREGACIÓN

2-109

2-110

MÉTODOS NORMALIZADOS

PROPIEDADES FÍSICAS Y DE AGREGACIÓN

2-111

MÉTODOS NORMALIZADOS

2-112

titud de ± 3 a 5 mm Hg 3,6. Los escapes de aire, la formación de burbujas, el equilibrio incompleto o la condensación producen errores en menos, mientras que las pérdidas directas de agua originarán errores en más en las unidades sumergibles. 6.

Informe de resultados Inclúyanse los siguientes datos: Profundidad del sensor, m. Presión barométrica, mm Hg. Temperatura del agua, °C. Oxígeno disuelto, mm Hg o mg/1. Salinidad, g/kg. P, mm Hg.

nantes significativos. De estas dos situaciones, son los ambientes cerrados los que presentan más probabilidades de que se produzcan casos de morbilidad o mortalidad por enfermedad de las burbujas, los cuales aparecen antes y en niveles menores de ' P . En circunstancias silvestres/naturales, el límite de niveles de seguridad de la sobresaturación depende de la profundidad disponible para la especie y/o la conducta de ésta, pero este límite aparece por lo general a ' P entre 50 y 150 mm Hg. En condiciones de cautividad, la ' P debería estar lo más cerca posible de cero. Para especies y formas de vida sensibles, se han observado efectos letales y subletales a ' P de 10 a 50 mm Hg13.

Si se precisa información del gas componente, añádase: Presión parcial de oxígeno, mm Hg. Presión parcial de nitrógeno, mm Hg. índice de presión parcial oxígeno/nitrógeno, o

8. Referencias 1.

2.

3.

7.

Interpretación de los resultados

Los efectos biológicos de la sobresaturación de gases disueltos dependen de la especie, edad, profundidad de la columna de agua, duración de la exposición, temperatura e índice de presión parcial nitrógeno/oxígeno12. Los límites de seguridad suelen ser distintos en circunstancias silvestres/naturales, en las que la conducta y la presión hidrostática pueden modificar la exposición mediante movimientos horizontales y verticales hacia fuera del lugar de riesgo, y en ambientes cerrados, como acuarios, piscifactorías o laboratorios, en los que la propia instalación impide escapes e incluye otros condicio-

4.

5.

6.

7.

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PROPIEDADES FÍSICAS Y DE AGREGACIÓN

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10.

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PARTE 3000 DETERMINACIÓN DE METALES

3010

3010 A. 1.

INTRODUCCIÓN

Discusión general

Significación

tos refractarios. En general, los limites de detección de los métodos de PAI son superiores a los de los métodos electrotérmicos. Los métodos colorimétricos son aplicables cuando se conocen las interferencias en los otros métodos. Es frecuente la necesidad de tratamientos preliminares de las muestras. Se describen métodos apropiados de tratamiento preliminar para cada tipo de análisis.

Los efectos de los metales en aguas potables y residuales pueden ser beneficiosos, tóxicos o simplemente molestos. Algunos metales resultan esenciales, mientras que otros pueden perjudicar a los consumidores del agua, a los sistemas de tratamiento de aguas residuales y a las aguas de depósitos. En muchos casos el potencial beneficio o riesgo depende de la concentración.

3. 2. Tipos de métodos Los metales se pueden determinar de forma satisfactoria utilizando métodos de absorción atómica, de plasma de acoplamiento inductivo o colorimétricos, aunque estos últimos son de menor precisión y sensibilidad. Los métodos de absorción incluyen técnicas electrotérmicas y de llama. En general, los métodos de llama se aplican en el caso de concentraciones moderadas en sistemas de matrices simples y complejas. Los métodos electrotérmicos tienen mayor sensibilidad, en general, si los efectos de la matriz no son demasiado intensos. Algunos efectos de la matriz pueden compensarse con modificadores de la misma. Las técnicas de plasma de acoplamiento inductivo (PAI) son aplicables dentro de un amplio intervalo lineal y resultan especialmente sensibles en el caso de los elemen-

Definición de términos

a) Metales disueltos: Son los componentes (metálicos) de una muestra sin acidular que pasan a través de un filtro de membrana de 0,45 μm. b) Metales suspendidos: Son los componentes (metálicos) de una muestra sin acidular que son retenidos por un filtro de membrana de 0,45 μm. c) Metales totales: La concentración de metales determinada en una muestra sin filtrar tras digestión intensa, o la suma de las concentraciones de metales en las fracciones disuelta y suspendida. d) Metales extraíbles con ácido: La concentración de metales en solución tras el tratamiento de una muestra sin filtrar con ácido mineral diluido caliente. Para determinar por separado metales disueltos y suspendidos, hay que filtrar inmediatamente después de recogida la muestra. Se debe conservar en ácido hasta después de filtrar. 3-1

MÉTODOS NORMALIZADOS

3-2

3010 B. Toma y conservación de muestras Antes de recoger una muestra, es necesario decidir cuál es la fracción que se va a analizar (disuelta, suspendida, total o extraíble con ácido). Esta decisión determinará en parte si se acidula la muestra con o sin filtración, así como el tipo de digestión requerido. Durante la toma de muestras y conservación de las mismas pueden producirse graves errores debidos a la contaminación del dispositivo de toma de muestras, a la eliminación defectuosa de los residuos de muestras previas del recipiente de la muestra o a la pérdida de metales por adsorción y/o precipitación en el recipiente de la muestra, como consecuencia de una inapropiada acidulación de la misma. 1.

Recipientes para las muestras

Los mejores recipientes para las muestras son los fabricados en cuarzo o TFE. Estos recipientes son caros, por lo que se prefieren los de polipropileno o polietileno lineal con tapón de polietileno. También se pueden utilizar recipientes de vidrio de borosilicato, pero hay que evitar el empleo de recipientes de vidrio blando, tratándose de muestras que contienen metales del orden de microgramos por litro. Las muestras para determinación de plata deben guardarse en recipientes que absorben la luz. Sólo se deben utilizar recipientes y filtros que hayan sido enjuagados con ácido. 2.

Conservación

Consérvense las muestras inmediatamente después de la toma de muestras, acidulando con ácido nítrico concentrado (HNO3) a pH 5.000 mg/1), pueden ser necesarios nebulizadores del tipo Babington. b) Espectrómetro: El espectrómetro puede ser del tipo simultáneo (policromador) o secuencial (monocromador), con óptica de trayecto de aire, purgado con gas inerte o de vacío. Se necesita un paso de banda del espectro de 0,05 nm o menor. El instrumento debe permitir el examen del fondo espectral que rodea las líneas de emisión utilizadas para la determinación de los metales. Si es necesario, se debe poder medir y corregir el fondo espectral a una o más posiciones a uno y otro lado de las líneas analíticas. 3. Reactivos y patrones Utilícense reactivos de calidad de la más alta pureza o equivalente. Son aceptables los ácidos bidestilados. Excepto cuando se advierta, séquense todas las sales a 105 °C durante 1 hora y manténganse en un desecador antes de pesar. Empléese agua desionizada preparada por paso del agua por al menos dos etapas de desionización con resinas de intercambio de lecho mixto catión/anión. Utilícese agua desionizada para preparar to-

DETERMINACIÓN DE METALES

dos los patrones de calibración, reactivos, y para dilución. a) Ácido clorhídico, HC1 conc. y 1 + 1. b) Ácido nítrico, HNO3 conc. c) Ácido nítrico, HNO3 1 + 1: Añádanse 500 ml de HNO3 conc. a 400 ml de agua y dilúyase hasta un litro. d) Soluciones patrón de reserva: Véanse 3111B, 3111D y 3114B. PRECAUCIÓN: Muchas sales metálicas son extremadamente tóxicas y pueden resultar fatales si se tragan. Lávense cuidadosamente las manos después de manipularlas. 1) Aluminio: Véase 3111D.3kl). 2) Antimonio: Véase 3111B.3j1). 3) Arsénico: Véase 3114B.3k1). 4) Bario: Véase 3111D.3k2). 5) Berilio: Véase 3111D.3k3). 6) Boro: No secar, pero manténgase el frasco bien cerrado y en un desecador. Disuélvanse 0,5716 g de H3BO3 anhidro en agua y dilúyase hasta 1.000 ml; 1 ml = 100 μg B. 7) Cadmio: Véase 3111 B.3j3). 8) Calcio: Véase 3111B.3j4). 9) Cromo: Véase 3111 B.3j6). 10) Cobalto: Véase 3111 B.3j7). 11) Cobre: Véase 3111B.3j8). 12) Hierro: Véase 3111 B.3 j 11). 13) Plomo: Véase 3111B.3 j 12). 14) Litio: Véase 3111 B.3j13). 15) Magnesio: Véase 3111B.3 j 14). 16) Manganeso: Véase 3111B.3 j 15). 17) Molibdeno: Véase 3111D.3k4). 18) Níquel: Véase 3111B.3 j l6). 19) Potasio: Véase 3111 B.3 j 19). 20) Selenio: Véase 3114B.3n1). 21) Sílice: Véase 3111 D.3k7). 22) Plata: Véase 3111 B.3 j 22). 23) Sodio: Véase 3111 B.3 j 23). 24) Estroncio: Véase 3111B.3. j 24). 25) Talio: Véase 3111B.3 j 25). 26) Vanadio: Véase 3111D.3k10). 27) Zinc: Véase 3111B.3j27). e)

Patrones de calibración: Prepáren-

se patrones mixtos de calibración con las

3-63

concentraciones mostradas en la tabla 3120:I combinando volúmenes apropiados de las soluciones de reserva en matraces volumétricos de 100 ml. Añádanse 2 ml de HNO 3 1 + 1 y 10 ml de HC1 1 + 1 y dilúyase con agua hasta 100 ml. Antes de preparar los patrones mixtos analícese cada solución de reserva por separado para determinar la posible interferencia espectral o la presencia de impurezas. Cuando se preparan patrones mixtos hay que tener en cuenta que los elementos sean compatibles y estables. Consérvense las soluciones patrón mixtas en frascos de fluocarbono FEP o polietileno sin usar. Compruébense inicialmente los patrones de calibración utilizando un patrón de control de calidad; revísese semanalmente la estabilidad. Las siguientes son combinaciones recomendadas que utilizan las líneas analíticas sugeridas en la tabla 3120:I. También son aceptables combinaciones alternativas. 1) Solución patrón mixta I: Manganeso, berilio, cadmio, plomo, selenio y zinc. 2) Solución patrón mixta II: Bario, cobre, hierro, vanadio y cobalto. 3) Solución patrón mixta III: Molibdeno, sílice, arsénico, estroncio y litio. 4) Solución patrón mixta IV: Calcio, sodio, potasio, aluminio, cromo y níquel. 5) Solución patrón mixta V: Antimonio, boro, magnesio, plata y talio. Si la adición de plata da lugar a una precipitación inicial, añádanse 15 ml de agua y caliéntese el matraz hasta que la solución se vuelva transparente. Enfríese y diluyase con agua hasta 100 ml. Para esta combinación de ácidos limítese la concentración de plata a 2 mg/1. En estas condiciones, la plata es estable en una matriz de agua del grifo durante 30 días. Concentraciones más altas de plata requieren HC1 adicional. f) Blanco de calibración: Dilúyanse 2 ml de HNO3 1 + 1 y 10 ml de HC1 1 + 1 hasta 100 ml empleando agua. Pre-

MÉTODOS NORMALIZADOS

3-64

párese en cantidad suficiente para inundar el sistema entre patrones y muestras. g) Blanco del método: Realícese el procedimiento completo de preparación de muestras con un blanco de reactivos. Prepárese el blanco del método de forma que contenga los mismos tipos y concentraciones de ácidos que las soluciones de las muestras. h) Patrón para el control del instrumento: Prepárense patrones de control del instrumento combinando elementos compatibles a una concentración de 2 mg/1. i) Muestra de control de calidad del instrumento: Obténgase un patrón acuoso de referencia certificado a partir de una fuente exterior y prepárese según las instrucciones del proveedor. Utilícese la misma matriz de ácidos que en los patrones de calibración. j) Muestra de control de calidad del método: Realícese el procedimiento completo de preparación de muestras con la muestra de control de calidad del instrumento (apartado 3i). k) Argón: Utilícese calidad técnica o de soldador. Si da lugar a problemas, utilícese el prepurificado. 4.

Procedimiento

a) Preparación de la muestra: Véase sección 3030F. b) Condiciones del funcionamiento: Debido a las diferencias de formas y modelos de los instrumentos, no es posible dar instrucciones del funcionamiento detalladas. Síganse las instrucciones del fabricante. Establézcanse el límite de detección del instrumento, la precisión, las posiciones óptimas de corrección del fondo, los trayectos dinámicos lineales y las interferencias para cada línea analítica. Compruébese que la configuración del instrumento y las condiciones de operación satisfacen las necesidades analíticas y que pueden reproducirse día por día.

Se puede emplear una relación de intensidad de emisión de átomo a ion [Cu(I) 324,75 nm/Mn(II) 257,61 nm] con objeto de reproducir las condiciones óptimas para un análisis de múltiples elementos con precisión. La relación de intensidad Cu/Mn puede ser incorporada al procedimiento de calibración, incluyendo especificaciones de sensibilidad y precisión7. Manténganse diaria o semanalmente registros de las intensidades de Cu y Mn y/o las intensidades críticas de líneas de elementos. Regístrense asimismo regulaciones del alineamiento óptico del policromador, tasa de captación de la muestra, lecturas de energía (incidente, reflejada), atenuación del tubo multiplicador, regulaciones del controlador de flujo de masa y mantenimiento del sistema. c) Calibración del instrumento: Prepárese el instrumento como se ha indicado (apartado b). Déjese calentar durante 30 minutos. Alíniense ópticamente los policromadores utilizando la lámpara de perfil o solución. Compruébense el alineamiento de la lámpara de plasma y la rendija de entrada del espectrómetro, sobre todo si se ha mantenido el sistema de introducción de muestra. Hágase un ajuste Cu/Mn o relación de intensidad similar. Calíbrese el instrumento siguiendo el procedimiento recomendado por el fabricante empleando patrones y blancos de calibración. Aspírese cada patrón o blanco durante un mínimo de 15 segundos después de alcanzar el plasma, antes de que comience la integración de la señal. Enjuáguese con blanco de calibración o solución similar durante 60 segundos por lo menos entre cada patrón, para eliminar un posible arrastre del anterior patrón. Utilícese una intensidad media de integraciones múltiples de patrones o muestras con objeto de reducir el error aleatorio. Antes de analizar las muestras, analícese el patrón de comprobación del instrumento. Los valores de la concentra-

DETERMINACIÓN DE METALES

ción obtenidos no deberán desviarse más de ± 5 por 100 del valor real (o los límites de control establecidos, lo que sea más bajo). d) Análisis de muestras: Comiéncese cada marcha con la muestra haciendo un análisis del blanco de calibración y después analícese el blanco del método. Esto permite una comprobación de los reactivos de preparación de la muestra y procedimientos en cuanto a la contaminación. Analícense las muestras alternando con análisis del blanco de calibración. Enjuáguese con ácido diluido durante 60 segundos por lo menos entre muestras y blancos. Después de introducir cada muestra o blanco, déjese que el sistema se equilibre antes de comenzar la integración de la señal. Examínese cada análisis del blanco de calibración para comprobar que no hay ningún efecto de memoria de arrastre. Si se observa arrastre, repítase el enjuague hasta obtener valores del blanco apropiados. Efectúense adecuadas diluciones y acidulaciones de la muestra para determinar las concentraciones más allá del intervalo lineal de calibración. e) Control de calidad instrumental: Analícese el patrón de control del instrumento una vez cada 10 muestras con objeto de determinar si ha habido una desviación significativa del instrumento. Si la concordancia no queda dentro del ± 5 por 100 de los valores esperados (o dentro de los límites de control establecidos, lo que sea más bajo), póngase fin al análisis de las muestras, corríjase el problema y vuélvase a calibrar el instrumento. Si se utiliza la referencia a la relación de intensidades, la regulación de esta relación puede restablecer la calibración sin necesidad de volver a analizar los patrones de calibración. Analícese el patrón de control del instrumento para confirmar una recalibración apropiada. Vuélvanse a analizar una o más muestras analizadas inmediatamente antes de haber puesto fin a la marcha analítica.

3-65

Los resultados deben estar de acuerdo dentro de un ± 5 por 100; de lo contrario deberían analizarse de nuevo todas las muestras después del último análisis aceptable del patrón de control del instrumento. Analícese una muestra de control de calidad del instrumento con cada marcha. Utilícese este análisis para comprobar la precisión y estabilidad de los patrones de calibración. Si el resultado no está dentro del ± 5 por 100 del valor certificado, prepárese un nuevo patrón de calibración y vuélvase a calibrar el instrumento. Si esto no corrige el problema, prepárese una nueva solución de reserva y un nuevo patrón de calibración y repítase la calibración. f) Control de calidad del método: Analícese la muestra de control de calidad del método dentro de cada marcha. Los resultados deberán quedar comprendidos en un intervalo de ± 5 por 100 de los valores certificados. Desviaciones superiores pueden reflejar pérdidas o contaminación durante la preparación de las muestras. g) Ensayo de interferencia de la matriz: Cuando se analiza una matriz de muestra nueva o inusual, compruébese que no existen efectos positivos o negativos de interferencia no lineal. Si el elemento se presenta en una concentración por encima de 1 mg/1, utilícense diluciones en serie con el blanco de calibración. Los resultados de los análisis de una dilución deberán estar dentro del margen del ± 5 por 100 respecto del resultado original. Alternativamente, o si la concentración está por debajo de 1 mg/1 o resulta indetectable, utilícese una adición posterior a la digestión igual a 1 mg/1. La recuperación de la adición deberá oscilar entre 95 por 100 y 105 por 100 o dentro de los límites de control establecidos de una desviación estándar de ± 2 de la media. Si el efecto de una matriz hace que los resultados del ensayo caigan fuera de los límites críticos, complétese el

3-66

MÉTODOS NORMALIZADOS

análisis después de diluir la muestra para eliminar el efecto de la matriz mientras se mantiene una concentración detectable de al menos dos veces el límite de detección o aplicar el método de adiciones de patrón. 5.

Cálculos y correcciones

a) Corrección del blanco: Sustráigase el resultado de un blanco de calibración adyacente del resultado de cada muestra para la corrección de la desviación de la línea base. (Las concentraciones impresas deberán incluir valores negativos y positivos para compensar la desviación positiva y negativa de la línea de base. Asegúrese de que el blanco de calibración utilizado para la corrección del blanco no ha sido contaminado por arrastres.) Utilícese el resultado del análisis del blanco del método para corregir la contaminación del reactivo. Alternativamente, intercálense blancos del método con las apropiadas muestras. El blanco de reactivo y la corrección de la desviación de la línea base se obtienen por sustracción. b)

Corrección

por

dilución:

Si

lisis de la muestra. A menos que las condiciones del análisis puedan reproducirse con precisión de un día para otro, o por períodos más largos, vuélvanse a determinar los factores de corrección de interferencia que afecten significativamente los resultados cada vez que se analizan las muestras7, 8. Calcúlense los factores de corrección de interferencia (Kij) a partir de las concentraciones aparentes observadas en el análisis de soluciones de reserva de alta pureza.

siendo la concentración aparente del elemento i la diferencia entre la concentración observada en la solución de reserva y la concentración observada en el blanco. Corríjanse las concentraciones de la muestra observadas para el elemento i (ya corregidas para desviación de la línea base) para las interferencias espectrales de los elementos j, k y l; por ejemplo: Concentración del elemento i corregida para interferencia espectral

la

muestra estaba diluida o concentrada en la preparación, multiplíquense los resultados por un factor de dilución (FD) calculado como sigue:

c) Corrección de la interferencia es-

pectral: Corríjase la interferencia espectral utilizando el programa de ordenador suministrado por el fabricante del instrumento, o empleando el método del manual basado en factores de corrección de interferencia. Determínense los factores de corrección de interferencia analizando soluciones de reserva de un solo elemento de concentraciones apropiadas adaptando las condiciones lo más cercanamente posible a las empleadas en el aná-

Los factores de interferencia pueden ser negativos si se utiliza la corrección de fondo para el elemento i. Puede resultar una Kij negativa en el caso de que una línea de interferencia se encuentre en la longitud de onda de la corrección de fondo antes que en la longitud de onda del pico. Determínense las concentraciones de los elementos que interfieren j, k y l dentro de sus respectivos intervalos lineales. Para el cálculo de las interferencias mutuas (i interfiere con j y j interfiere

3-67

DETERMINACIÓN DE METALES

con i) se necesitan métodos repetitivos o de matriz. d) Corrección de interferencias no espectrales: Si se necesita una corrección de interferencia no espectral, utilícese el método de adiciones de patrón. El método se puede aplicar cuando la forma física y química del elemento en la adición de patrón es la misma que la de la muestra, o el PAI convierte al metal de la adición y de la muestra a la misma forma; el efecto de interferencia es independiente de la concentración del metal en el intervalo de concentraciones de las adiciones del patrón, y la curva de calibración analítica es lineal a lo largo del intervalo de concentraciones de las adiciones del patrón. Utilícese una adición no inferior al 50 por 100 ni superior al 100 por 100 de la concentración del elemento en la muestra para no reducir la precisión de la medida y para que las interferencias que dependen de las relaciones elemento/interferente no conduzcan a resultados erróneos. Aplíquese el método a todos los elementos de todo el conjunto de muestras empleando la corrección de fondo a posiciones fuera de línea cuidadosamente seleccionadas. Se puede emplear una adición de patrón de múltiples elementos si se ha comprobado que los elementos añadidos no son interferentes. e) Registro de datos: Regístrense datos analíticos en unidades de concentración de miligramos por litro utilizando hasta tres cifras significativas. Regístrense los resultados por debajo del límite de detección determinado cuando no se han detectado menos que el límite de detección establecido corregido por dilución de la muestra. 6.

Precisión y sesgo

Como guía de la precisión y sesgo esperados en general, véanse las ecuaciones lineales de regresión de la tabla 3120:119.

También existe información adicional interlaboratorios10.

7.

Referencias

1. F AIRES , L. M., B. A. P ALMER , R. E NGLE MAN, JR. & T. M. NIEMCZYK. 1984. Temperature determinations in the inductively coupled plasma using a Fourier transform spectrometer. Spectrochim. Acta 39B:819. 2. B ARNES , R. M. 1978. Recent advances in emission spectroscopy: inductively coupled plasma discharges for spectrochemical analysis. CRC Crit. Rev. Anal. Chem. 7:203. 3. P ARSONS , M. L., S. MAJOR & A. R. F ORS TER. 1983. Trace element determination by atomic spectroscopic methods - State of the art. Appl. Spectrosc. 37:411. 4. LARSON, G. F., V. A. FASSEL, R. K. WINGE & R. N. KNISELEY. 1976. Ultratrace analysis by optical emission spectroscopy: The stray light problem. Appl. Spectrosc. 30:384. 5. GARBARINO, J. R. & H. E. TAYLOR. 1979. A Babington-type nebulizer for use in the analysis of natural water samples by inductively coupled plasma spectrometry. Appl. Spectrosc. 34:584. 6. AMERICAN SOCIETY FOR TESTING AND MATERIALS. 1988. Standard specification for reagent water, DI 193-77 (reapproved 1983). Annual Book of ASTM Standards. American Soc. for Testing & Materials, Filadelfia, Pennsylvania. 7. BOTTO, R. I. 1984. Quality assurance in operating a multielement ICP emission spectrometer. Spectrochim. Acta 39B:95. 8. B OTTO , R. I. 1982. Long-term stability of spectral interference calibrations for inductively coupled plasma atomic emission spectrometry. Anal. Chem. 54:1654. 9. M AXFIELD , R. & B. MI NDAK . 1985. EPA Method Study 27, Method 200. 7 (Trace Metals by ICP). EPA-600/S4-85/05. National Technical Information Serv., Springfield, Virginia. 10. GARBARINO, J. R., B. E. JONES, G. P. STEIN, W. T. BELSER & H. E. TAYLOR. 1985. Statistical evaluation of an inductively coupled plasma atomic emission spectrometric method for routine water quality testing. Appl. Spectrosc. 39:53.

MÉTODOS NORMALIZADOS

3-68

TABLA 3120:II.

DATOS DE PRECISIÓN Y SESGO DE PAI

3-69

DETERMINACIÓN DE METALES

TABLA 3120:II. CONTINUACIÓN

* X = recuperación media, μg/1, C = valor real, μg /1, S = desviación estándar multi-laboratorio, μg/1, SR = desviación estándar de un único analista, μg/1.

MÉTODOS NORMALIZADOS

3-70

3500-AI

ALUMINIO*

3500-AI A. 1.

Incidencia

El aluminio ocupa el tercer lugar en orden de abundancia entre los elementos de la corteza terrestre, formando parte de minerales, rocas y arcillas. Esta amplia distribución es la causa de la presencia del aluminio en casi todas las aguas naturales como sal soluble, coloide o compuesto insoluble. El aluminio soluble, coloidal e insoluble puede encontrarse también en aguas tratadas o en aguas residuales como residuo de la coagulación con material que contiene aluminio. El agua filtrada en una moderna instalación * Aprobado por el Standard Methods Committee, 1988.

3500-AI B.

de filtración rápida con arena no tendrá una concentración de aluminio inferior a 50 μg/1. 2.

Selección del método

Los métodos espectrométrico de absorción atómica y de plasma de acoplamiento inductivo están exentos de interferencias tan corrientes como fluoruro y fosfato, y son los preferidos. El método colorimétrico de eriocromo cianina R es una forma de determinación del aluminio con instrumentación más sencilla. El método automatizado de violeta de pirocatecol constituye una técnica de análisis de gran sensibilidad con inyección de flujo o flujo continuo.

Método espectrométrico de absorción atómica

Véase el método espectrométrico de absorción atómica de llama, secciones 3111D y E, y el método espectrométrico

3500-AI C.

Introducción

de absorción atómica electrotérmica, sección 3113.

Método de plasma de acoplamiento inductivo

Véase sección 3120.

3-71

DETERMINACIÓN DE METALES

3500-AI D. 1.

Método de eriocromo cianina R

Discusión general

a) Principio: Las soluciones diluidas de aluminio tamponadas a pH 6,0 producen con la tinción de eriocromo cianina R un complejo de color rojo a rosado que presenta un máximo de absorción a 535 nm. La intensidad del color desarrollado depende de la concentración del aluminio, el tiempo de reacción, la temperatura, pH, alcalinidad y concentración de otros iones en la muestra. Para compensar el color y la turbidez, se forma un complejo del aluminio de una porción de la muestra con EDTA para obtener un blanco. La interferencia de hierro y manganeso, dos elementos que se encuentran frecuentemente en el agua, se elimina por adición de ácido ascórbico. El intervalo óptimo de aluminio oscila entre 20 y 300 μg/l, pero puede extenderse por exceso mediante dilución de la muestra. b) Interferencia: Tanto el fluoruro como los polifosfatos dan lugar a errores negativos. Cuando la concentración de fluoruro es constante, el porcentaje de error disminuye al aumentar las cantidades de aluminio. Como la concentración de fluoruro se conoce muchas veces o se puede determinar fácilmente, se pueden obtener resultados bastante precisos añadiendo la cantidad conocida de fluoruro a un grupo de patrones. Se puede obtener una corrección más sencilla a partir de la familia de curvas de la figura 3500Al:l. Se da un procedimiento para eliminar la interferencia de fosfatos complejos. El ortofosfato a concentraciones por debajo de 10 mg/1 no interfiere. La interferencia causada por incluso una pequeña alcalinidad se elimina acidulando la muestra justo detrás del punto de neutra-

lización con naranja de metilo. El sulfato no interfiere hasta concentraciones de 2.000 mg/1. c) Concentración mínima detectable: La concentración mínima detectable por este método, en ausencia de fluoruros y fosfatos complejos, es de aproximadamente 6 μg/1. d) Manipulación de las muestras: Tómense las muestras en frascos preferiblemente de plástico, limpios, enjuagados con ácido, y examínense tan pronto como sea posible después de recogidas. Si sólo hay que determinar el aluminio soluble, fíltrese una porción de muestra a través de un filtro de membrana de 0,45 μg; descártense los 50 ml primeros de filtrado y utilícese el filtrado obtenido para la determinación. No hay que utilizar papel de filtro, algodón absorbente o lana de vidrio para filtrar una solución en la que se va a ensayar aluminio, ya que éstos eliminarían la mayor parte del aluminio soluble. 2.

Instrumental

a) Equipo de colorimetría: Se necesita uno de los siguientes: 1) Espectrofotómetro, para ser utilizado a 535 nm, con un trayecto luminoso de 1 cm o más largo. 2) Fotómetro de filtro, con un trayecto luminoso de 1 cm o más largo y equipado con un filtro verde con una transmitancia máxima entre 525 y 535 nm. 3) Tubos de Nessler, 50 ml, forma alargada, igualados. b) Material de vidrio: Trátese todo el material de vidrio con HC1 1 + 1 caliente y enjuagúese con agua destilada libre

MÉTODOS NORMALIZADOS

3-72

de aluminio para evitar errores debidos a materiales absorbidos en el vidrio. Enjuagúese suficientemente para eliminar todo el ácido. 3.

Reactivos

Utilícense reactivos bajos en aluminio y agua destilada libre de aluminio. a) Solución de aluminio de reserva: Utilícese el metal (1) o la sal (2) para preparar una solución de reserva; 1,00 ml = = 500 μg Al: 1) Disuélvanse 500,0 mg de aluminio metal en 10 ml de HC1 conc. calentando suavemente. Dilúyase con agua hasta 1.000 ml, o 2) Disuélvanse 8,791 g de sulfato de aluminio y potasio (llamado también alumbre de potasio), A1K(SO4)212H2O, en agua y dilúyase hasta 1.000 ml. Corríjase este peso dividiendo por la fracción decimal del A1K(SO4)2 ˜ 12H2O ensayado en el reactivo empleado. b) Solución patrón de aluminio: Diluyanse con agua 10,00 ml de solución de aluminio de reserva hasta 1.000 ml; 1,00 ml = 5,00 μg Al. Prepárese diariamente. c) Ácido sulfúrico, H2SO4, 0,02N y 6N. d) Solución de ácido ascórbico: Disuélvase 0,1 g de ácido ascórbico en agua y llévese hasta un volumen de 100 ml en un matraz volumétrico. Prepárese reciente todos los días. e) Reactivo tampón: Disuélvanse 136 g de acetato de sodio, NaC2H3O2 ˜ 3H2O, en agua, añádanse 40 ml de ácido acético 1N y dilúyase hasta 1 l. f) Solución de tinción de reserva: Utilícense cualesquiera de los siguientes productos: 1) Solocromo cianina R-200* o erio* Arnold Hoffman & Co., Providence, Rhode Island.

cromo cianina†: Disuélvanse 100 mg en agua y dilúyanse hasta 100 ml en un matraz volumétrico. Esta solución habrá de tener un pH de aproximadamente 2,9. 2) Eriocromo cianina R‡: Disuélvanse 300 mg en aproximadamente 50 ml de agua. Ajústese el pH desde aproximadamente 9 a aproximadamente 2,9 con ácido acético 1 + 1 (se necesitarán aproximadamente 3 ml). Dilúyase con agua hasta 100 ml. 3) Eriocromo cianina R§: Disuélvanse 150 mg en aproximadamente 50 ml de agua. Ajústese el pH desde 9 a 2,9 con ácido acético 1 + 1 (se necesitarán aproximadamente 2 ml). Dilúyase con agua hasta 100 ml. Las soluciones de reserva presentan buenas condiciones de estabilidad y pueden conservarse al menos durante 1 año. g) Solución de tinción de trabajo: Diluyanse 10,0 ml de solución de tinción de reserva seleccionada hasta 100 ml en un matraz volumétrico utilizando agua. Las soluciones de trabajo son estables al menos durante 6 meses. h) Solución indicadora de naranja de metilo, o solución indicadora de verde de bromocresol especificada en la determinación de alcalinidad total (sección 2320B.3d). i) EDTA (sal sódica del dihidrato del ácido etilendiaminotetraacético), 0,01M: Disuélvanse 3,7 g en agua y dilúyase hasta 1 l. j) Hidróxido sódico: NaOH, 1N y 0,1 N. 4.

Procedimiento

a) Preparación de la curva de calibración: † K & K Laboratories, K & K Lab. Div., Life Sciences Group, Plainview, Nueva York. ‡ Pfaltz & Bauer, Inc., Stamford, Connecticut. § EM Science, Gibbstown, Nueva Jersey.

DETERMINACIÓN DE METALES

1) Prepárese una serie de patrones de aluminio desde 0 a 7 μg (0 a 280 μg/1 sobre una muestra de 25 ml) midiendo con precisión los volúmenes calculados de solución de aluminio patrón en matraces volumétricos de 50 ml o tubos de Nessler. Añádase agua hasta un volumen total de aproximadamente 25 ml. 2) Añádase a cada patrón 1 ml de H2SO4 0,02N y mézclese. Añádase 1 ml de solución de ácido ascórbico y mézclese. Añádanse 10 ml de solución tampón y mézclese. Añádanse 5,00 ml de reactivo de tinción de trabajo con una pipeta volumétrica y mézclese. Inmediatamente, llévese hasta 50 ml con agua destilada. Mézclese y déjese reposar durante 5 a 10 minutos. El color empieza a desvanecerse después de 15 minutos. 3) Léase la transmitancia o absorbancia en un espectrofotómetro, empleando una longitud de onda de 535 nm o un filtro verde que dé una transmitancia máxima entre 525 y 535 nm. Ajústese el instrumento a absorbancia cero con el patrón libre de aluminio. Llévese a una gráfica la concentración de Al (microgramos de aluminio en 50 ml de volumen final) frente a la absorbancia. b) Tratamiento de la muestra en ausencia de fluoruro y fosfatos complejos: Colóquense 25,0 ml de muestra, o una porción diluida a 25 ml, en una cápsula de porcelana o matraz, añádanse unas cuantas gotas de indicador naranja de metilo y valórese con H2SO4 0,02N hasta un color rosa tenue. Anótese la lectura y descártese la muestra. A dos muestras similares añádase, a temperatura ambiente, la misma cantidad de H2SO4 0,02N empleado en la volumetría y 1 ml en exceso. Añádase 1 ml de solución de EDTA a una muestra. Esto servirá como blanco por formación de complejo de aluminio que pudiera existir y compensación del color y la turbidez. Añádanse, a ambas muestras, 1 ml de ácido ascórbico, 10 ml de reactivo tampón y 5,00 ml de reactivo

3-73

de tinción de trabajo, tal como se ha prescrito en el anterior apartado a2). Póngase el instrumento a absorbancia cero o a transmitancia 100 por 100 empleando un blanco de EDTA. Tras 5 a 10 minutos de tiempo de contacto, léase la transmitancia o absorbancia y determínese la concentración del aluminio empleando la curva de calibración previamente preparada. c) Comparación visual: Si no se dispone de equipo fotométrico, prepárense y trátense muestra y patrones tal como se ha descrito antes, empleando tubos Nessler de 50 ml. Llévese hasta la marca con agua y compárese el color de la muestra con los patrones después de 5 a 10 minutos de tiempo de contacto. Cuando se emplean tubos de Nessler, no se necesita una muestra tratada con EDTA. Si la muestra presenta turbidez o color, el empleo de tubos de Nessler puede dar lugar a un error considerable. d) Eliminación de la interferencia de fosfatos: Añádanse 1,7 ml de H2SO4 6N a 100 ml de muestra en un matraz erlenmeyer de 200 ml. Caliéntese sobre placa caliente durante al menos 90 minutos, manteniendo la temperatura de la solución justo por debajo del punto de ebullición. Al terminar el período de calentamiento, el volumen de la solución deberá ser de aproximadamente 25 ml. Añádase agua si fuera necesario para mantener ese volumen o por encima de él. Después de enfriar, neutralícese con NaOH hasta pH entre 4,3 y 4,5, utilizando NaOH 1N al principio y 0,1N para un ajuste fino final. Sígase la operación con un pHmetro. Llévese hasta 100 ml con agua, mézclese y empléese una porción de 25 ml para el ensayo de aluminio. Trátese un blanco de la misma manera, empleando 100 ml de agua destilada y 1,7 ml de H2SO4 6N. Réstese la lectura del blanco de la lectura de la muestra o utilícese para llevar el instrumento a absorbancia cero antes de hacer la lectura de la muestra.

3-74

MÉTODOS NORMALIZADOS

Figura 3500-A1:I. Curvas de corrección para estimación de aluminio en presencia de fluoruro.

3-75

DETERMINACIÓN DE METALES

e) Corrección de muestras que contienen fluoruro: Mídase la concentración de fluoruros de la muestra por el SPADNS o método del electrodo. Por una de las dos maneras siguientes: 1) Añádase la misma cantidad de fluoruro de la muestra a cada patrón de aluminio, o 2) Determínese la corrección de fluoruro a partir del juego de curvas de la figura 3500-A1:1.

5. Cálculos

6. Precisión y sesgo

Se analizó en 27 laboratorios una muestra sintética con 520 μg Al/1 en agua destilada, sin interferencia, empleando el método de eriocromo cianina R. La desviación relativa estándar fue de 34,4 por 100 y el error relativo de 1,7 por 100. En 35 laboratorios se analizó una segunda muestra sintética con 50 μg Al/1, 500 μg Ba/1 y 5 μg Be/1 en agua destilada. La desviación relativa estándar fue de 38,5 por 100 y el error relativo 22,0 por 100.

Una tercera muestra sintética con 500 μg Al/1, 50 μg Cd/1, 110 μg Cr/1, 1.000 μg Cu/1, 300 μg Fe/1, 70 μg Pb/1, 50 μg Mn/1, 150 μg Ag/1 y 650 μg Zn/1 en agua destilada fue analizada en 26 laboratorios. La desviación relativa estándar fue de 28,8 por 100 y el error relativo 6,2 por 100. Una cuarta muestra sintética con 540 μg Al/1 y 2,5 mg de polifosfato/1 en agua destilada fue analizada en 16 laboratorios, que hidrolizaron la muestra según la manera prescrita. La desviación relativa estándar fue de 44,3 por 100 y el error relativo 1,3 por 100. En 12 laboratorios que no aplicaron medidas correctivas, la desviación relativa estándar fue de 49,2 por 100 y el error relativo de 8,9 por 100. Una quinta muestra con 480 μg Al/1 y 750 μg F/l en agua destilada fue analizada en 16 laboratorios, que corrigieron el contenido en fluoruro empleando la curva. La desviación relativa estándar fue de 25,5 por 100 y el error relativo 2,3 por 100. Los 17 laboratorios que añadieron fluoruro a los patrones de aluminio presentaron una desviación relativa estándar de 22,5 por 100 y un error relativo de 7,1 por 100. 7. Bibliografía SHULL, K. E. & G. R. GUTHAN. 1967. Rapid modified Eriochrome cyanine R method for determination of aluminum in water. J. Amer. Water Works Assoc. 59:1456.

3500-AI E. Método automatizado de violeta de pirocatecol (VPC) (PROPUESTA) 1. Discusión general

a) Principio: El violeta de pirocatecol (VPC) reacciona con aluminio para formar un complejo coloreado que absorbe a 580 nm. El desarrollo del color depende del pH, que se ajusta a un valor óptimo de 6,1.

b) Interferencias: El hierro férrico forma complejo con VPC con un espectro de absorbancias similar al Al-VPC, dando lugar a una interferencia positiva. La interferencia se enmascara reduciendo el Fe(III) a Fe(II) con clorhidrato de hidroxilamina y subsiguiente quelación de Fe(II) con orto-fenantrolina. El hierro

3-76

ferroso no reacciona con VPC. La formación de complejo de Fe(ll)-ortofenantrolina evita la oxidación de Fe(II) a Fe(III). c) Concentración mínima detectable: La concentración mínima detectable del Al monómero total es de 10 y 7 μg Al/1 en análisis de flujo segmentado (AFS) o no segmentado, y análisis de inyección de flujo (AIF), respectivamente.

2. Instrumental a) Equipo analítico automatizado: Utilícese el análisis de flujo segmentado (AFS) o flujo no segmentado o el análisis de inyección de flujo (AIF). Los sistemas utilizan la misma química, pero difieren en la tasa de flujo y en la cantidad de muestra. Ambos constan de los siguientes componentes: 1) Dispositivo de obtención de muestras. 2) Distribuidor. 3) Bomba dosificadora. 4) Colorímetro equipado con célula de flujo tubular de longitud específica. 5) Filtros*. 6) Registrador. 7) Impresora digital (opcional). b) Columna de intercambio catiónico: Si se desea el fraccionamiento de formas orgánicas e inorgánicas de aluminio, utilícese preferiblemente una columna de TFE de 100 mm de larga (10 mm de DI), aunque pueden utilizarse otras medidas. Rellénese la columna con resina † de intercambio catiónico (14 a 50 mallas). c) Utensilios lavados con ácido: Sumérjanse los utensilios de polipropileno o TFE en HNO 3 al 1 por 100 durante toda la noche. Enjuáguense abundantemente con agua destilada o agua desionizada. * Whatman GF/C o equivalente. † Amberlite IR-120, forma de hidrógeno 1 por 100, Rohm & Haas Company o equivalente.

MÉTODOS NORMALIZADOS

3. Reactivos a) Sistema automatizado I (AIF): 1) Solución de aluminio de reserva: Véase apartado D.3a. 2) Solución de aluminio patrón: Véase apartado D3b. Prepárese una gama adecuada de patrones diluyendo volúmenes apropiados de solución de aluminio patrón. 3) Ácido clorhídrico, HC1 conc. ‡. 4) Etanol: 95 por 100. 5) Ácido nítrico: HNO3 conc.§. 6) Solución limpiadora: Añádanse lentamente 8,3 ml de HC1 concentrado a 500 ml de agua en una probeta graduada. Añádanse 100 ml de etanol y complétese el volumen con agua. Prepárese bajo la campana de humos. 7) Solución enmascaradora del hierro: Disuélvanse 7,5 g de clorhidrato de hidroxilamina y 0,56 g de ortofenantrolina en 500 ml de agua y dilúyase hasta 1.000 ml. Desmasifíquese el reactivo a través de un filtro de membrana de 0,45 m. Consérvese en frasco con polietileno. Refrigérese hasta su utilización. 8) Solución de PCV: Disuélvanse 0,375 g de ácido 3,3',4'-trihidroxifucsona2"-sulfónico (VPC) en 40 ml de agua. Déjese aproximadamente 5 minutos removiendo de cuando en cuando. dilúyase con agua hasta 1.000 ml. Desmasifíquese a través de un filtro de membrana de 0,45 μm. Consérvese un frasco de vidrio ámbar o de polietileno. Prepárese diariamente. 9) Solución tampón: Disuélvanse 84 g de hexametilentetraamina en 750 ml de agua. Fíltrese a un matraz volumétrico de 1 l. dilúyase hasta 1.000 ml y pásese a un frasco de polietileno. Refrigérese hasta su uso. b) Sistema II automatizado (analizador de flujo segmentado): ‡ Baker Instra-Analyzed o equivalente, d = 0.91 para NH3 conc. y d = 1,2 (38 por 100) para HC1 conc. § Baker Ultrex o equivalente.

3-77

DETERMINACIÓN DE METALES

1) Solución de aluminio de reserva: Véase apartado D.3a. 2) Solución de aluminio patrón: Véase el anterior apartado a2. 3) Solución limpiadora: Véase el anterior apartado a6. 4) Amoníaco, NH3 conc.‡. 5) Ácido clorhídrico, HCL conc. ‡. 6) Solución de enmascaramiento de hierro: Disuélvanse 17,75 g de clorhidrato de hidroxilamina en 200 ml de agua. Añádanse y disuélvanse 0,176 g de monohidrato de orto-fenantrolina. Dilúyase con agua hasta 250 ml. Consérvese refrigerado en frasco de polietileno. 7) Solución de PCV: Disuélvanse 0,150 g de ácido 3,3',4'-trihidroxifucsona2"-sulfónico (VPC) en 40 ml de agua. Déjese reposar durante 5 minutos removiendo de cuando en cuando. dilúyase con agua hasta 400 ml. Consérvese en frasco de polietileno oscuro. Consérvese refrigerada y protegida de la luz del sol. 8) Tampón: Disuélvanse 300 g de hexametilentetraamina en 750 ml de agua. Fíltrese a un matraz volumétrico de 1.000 ml. Añádanse 16,8 ml de amoníaco concentrado y dilúyase con agua hasta 1.000 ml. Utilícese solución tampón sin diluir, pero compruébese, cuando se emplean todos los reactivos a lo largo del sistema, que el pH del fluido/final está entre 6,0 y 6,2. Si el pH de tal fluido no se encuentra dentro de este intervalo, ajústese el tampón añadiendo amoníaco conc. o HC1 2,5N. 9) Reactivo HCl de trabajo: Añádanse 51,1 ml de HCl conc. hasta 200 ml de agua y dilúyase hasta 250 ml de volumen final. Añádanse 2,5 ml de polioxíetilen 23 lauril éter || (solución al 30 por 100) a la solución final. Utilícese agua destilada o desionizada en lugar de reactivo HCl de trabajo si la muestra no altera el pH del efluente de 6,1. ‡ Baker Instra-Analyzed o equivalente, d = 0,91 para NH 3 conc. y d = 1,2 (38 por 100) para HCl conc. || Brij-35 disponible en ICI Americas, Inc., Wilmington. Delaware, o en Technicon Instruments Corp., Tarrytown. Nueva York, o equivalente.

4. Procedimiento a) Aluminio total: Digiérase la muestra tal como se ha indicado en el procedimiento de digestión con ácido nítrico caliente descrito en la sección 3030E. Ajústese la dilución de la muestra y la concentración del tampón para asegurar que el pH del efluente es óptimo (6,1) para desarrollo de color. Quítese la columna de intercambio catiónico del trayecto de flujo. b) Aluminio monómero total: Determínese el aluminio monómero total sin pretratamiento de la muestra. Fracciónese el aluminio monómero orgánico e inorgánico midiendo el Al reactivo al VPC antes y después de su paso a través de la columna de intercambio catiónico. La diferencia representa la forma monómera inorgánica de Al. 1) Columna de intercambio catiónico: Hágase mínima la ruptura de los complejos órgano-alumínicos manteniendo una tasa de flujo a través de la columna de 3,7 a 4,2 ml/min/ml de resina. 2) Sistema automatizado I (análisis de inyección de flujo no segmentado): Instálese un distribuidor tal como se muestra en la figura 3500.Al:2. Colóquese una columna de intercambio catiónico antes del ciclo de la muestra para evitar la dispersión del bolus de la muestra sobre el distribuidor. Comiéncese a bombear los reactivos y espérese a obtener una línea de base estacionaria. No hay que sumergir nunca las líneas de fluido de las células de flujo y válvulas de la muestra en el depósito de residuos, ya que esto daría lugar a una contra-presión y originaría características pobres del flujo. Analícese la muestra después de alcanzar una línea de base estacionaria. 3) Sistema automatizado II (analizador de flujo segmentado): Instálese un distribuidor tal como el que se muestra en la figura 3500-A1:3. La tasa de toma de muestras es de 30 muestras/hora, utili-

3-78

MÉTODOS NORMALIZADOS

Figura 3500-A1:2. Distribuidor de aluminio para sistema automatizado I (analizador de inyección de flujo no segmentado)1. (Arriba) Canal 1.—Aluminio reactivo a VPC total. (Abajo) Canal 2.—Aluminio reactivo a VPC no intercambiable. Clave: portador: agua desionizada (o HC1 0,1 N); Rl = solución de enmascaramiento: cloruro de hidroxilamonio; R2 = reactivo de color: violeta de pirocatecol; R3 = solución tampón: hexametilentetraamina; RC1 = bobina de reactancia, 10 cm (0,5 mm DI); RC2 = = bobina de reactancia, 30 cm (0,5 mm DI); RC3 = bobina de reactancia, 60 cm (0,5 mm DI); CEC = columna de intercambio catiónico.

zando un minuto para la toma de muestra y para el lavado. Colóquese la columna alineada antes de la segmentación del aire. Como el aire se introduce cada vez que la aguja de la muestra se conecta desde el lavado a la inyección de la muestra, colóquese alineado un eliminador de burbujeo antes de la columna. Determínese la dispersión aparente de

muestra causada por la columna rellenando la columna con una resina inerte (por ejemplo, perlas de poliestireno de tamaño de malla comparable). Calcúlese el factor de dispersión y multiplíquense los valores de Al postcolumna por este factor. Esta corrección es necesaria debido a que normalmente no se dispone de un patrón orgánico adecuado.

3-79

DETERMINACIÓN DE METALES

Figura 3500-AI:3. Distribuidor de aluminio para sistema automatizado II (analizador de flujo segmentado). Según Rogeberg y Henriksen, Vatten. Reproducido con permiso.

c) Elaboración de la curva de calibra-

ción: Prepárese una serie de patrones de aluminio cuya concentración varíe entre 0 y 1.000 μg/1. Mídase el aluminio y trácese el gráfico absorbancia en función de la concentración para determinar el intervalo lineal del sistema. Si la linealidad desaparece, utilícense dos curvas de calibración separadas para muestras de concentraciones alta y baja o dilúyanse

las muestras para que queden dentro del intervalo lineal. Para la calibración, quítese la columna de intercambio catiónico. 5.

Cálculos

Determínese la concentración de aluminio, en microgramos por litro, a partir de la curva de calibración directamente

MÉTODOS NORMALIZADOS

3-80

empleando una ecuación de regresión lineal apropiada. Corríjase la dilución si es necesario. 6.

Precisión y sesgo

La precisión obtenida por un solo laboratorio fue de ± 3 μg Al/1 para muestras de aguas naturales superficiales cuyo contenido en Al variaba entre 0 y 300 μg Al/1 analizado por el sistema de AFS. La recuperación obtenida por el mismo laboratorio con el sistema de AFS fue de 99 y 105 por 100 para muestras de aguas superficiales no tratadas a concentraciones de 150 y 200 μg Al/1, respectivamente. Un único analista de un solo laboratorio analizó diversas concentraciones de Al monómero inorgánico preparadas en agua destilada/ionizada con un sistema de inyección de flujo, con los resultados que se dan en la tabla 3500-A1:I. De forma similar se determinaron la precisión y el sesgo, mostrados en la tabla 3500-A1:II, para un intervalo de calibración de alto nivel de Al entre 350 y 1.000 μg /1. Para el aluminio monómero total se analizaron 24 pares de duplicados en un

solo laboratorio. Los pares eran muestras de aguas superficiales naturales y se separaron en muestras con concentraciones por encima de 85 μg Al/1 y muestras con concentraciones por debajo de 50 μg Al/1. Los valores de la precisión de los pares duplicados, como desviación estándar, fueron 4,2 y 1,8, respectivamente. De manera análoga, para el Al combinado orgánicamente, los valores de precisión de los pares duplicados fueron 4,1 y 1,1, respectivamente. Para dos muestras de aguas superficiales naturales, sin tratar, con adiciones conocidas de 300 y 100 μg Al/1, la recuperación fue de 99,6 y 102,3 por 100, respectivamente.

7.

Referencias

1. H ILLMAN , D. C, T. E. L E WIS , S. H. P IA , F. X. S UÁREZ , E. M. B URKE , D. E. D OBB , J. M. HENSHAW & L. J. B LUME. 1986. Summary Report on the Evaluation of Aquatic Methods. EPA-600/X-86-271, Agencia de Protección de los Estados Unidos. 2. ROGEBERG , E. J. S. & A. H ENRIKSEN . 1985. An automatic method for fractionation and determination of aluminum species in freshwaters. Vatten 41:48.

TABLA 3500-AL:I. PRECISIÓN Y SESGO DE UN SOLO OPERADOR PARA ANÁLISIS DE ALUMINIO MONÓMERO INORGÁNICO

3-81

DETERMINACIÓN DE METALES

TABLA 3500-AL:II. PRECISIÓN Y SESGO DE UN SOLO OPERADOR EN LA DETERMINACIÓN DE ALTO NIVEL DE ALUMINIO

8. Bibliografía DOUGAN, W. K. & A. L. WILSON. 1974. The absorptiometric determination of aluminum in water: A comparison of some chromogenic reagents and the development of an improved method. Analyst 99:413. TECATOR, A. B. 1985. Determination of aluminum in water and soil extracts by flow injection analysis. Tech, rep., Tecator AB, Hoganas, Suecia.

ROYSET, O. 1986. Flow-injection spectrophotometric determination of aluminum in water with pyrocatechol violet. Anal. Chim. Acta 185:75. HENSHAW, J. M., T. E. LEWIS & E. M. HEITHMAR. 1988. A semi-automated colorimetric method for the determination of monomeric aluminum species in natural waters by flow injection analysis. Int. J. Environ. Anal. Chem. 34:119.

3500-Sb ANTIMONIO

3500-Sb A.

Introducción

1. Incidencia

2.

El antimonio se encuentra en cantidades traza en aguas naturales (normalmente inferiores a 10 μg/1) y puede presentarse en mayores concentraciones en manantiales termales o en aguas que drenan zonas mineralizadas. El antimonio es un contaminante regularizado en diversos programas, tanto federales como estatales.

Se elige el método espectrométrico de absorción atómica electrotérmica debido a su sensibilidad. Cuando no es necesaria una alta sensibilidad, empléese el método espectrométrico de absorción atómica de llama o el método de plasma de acoplamiento inductivo.

3500-Sb B.

Selección del método

Método espectrométrico de absorción atómica

Véanse método espectrométrico de absorción atómica de llama, sección 3111B,

y método espectrométrico de absorción atómica electrotérmica, sección 3113.

3-82

MÉTODOS NORMALIZADOS

3500-Sb C.

Método de plasma de acoplamiento inductivo

Véase sección 3120.

3500-As

3500-As A. 1.

Incidencia y significación

Una cantidad de arsénico tan pequeña como 100 mg puede ocasionar un grave envenenamiento; además, pueden aparecer efectos crónicos por su acumulación en el cuerpo por repetidos niveles bajos de ingesta. También se le atribuyen al arsénico propiedades cancerígenas. La concentración de arsénico en la mayoría de aguas potables raramente excede los 10 μg/1, aunque han sido registrados valores del orden de los 100 μg/1. El arsénico puede encontrarse en el agua como resultado de una disolución de minerales, descargas industriales o aplicación de insecticidas. * Aprobado por el Standard Methods Committee, 1988.

3500-As B.

Arsénico*

Introducción 2.

Selección del método

Se selecciona el método (B) de espectrometría de absorción atómica (EAA) de hidruros que transforma el arsénico en su hidruro y emplea una llama de argónhidrógeno, aunque el método EAA electrotérmico directo (B) es más sencillo en caso de que se demuestre la ausencia de interferencia. El método de dietildiriocarbamato de plata (C) es aplicable cuando no hay interferencias. Por su parte, el método de tinte de bromuro mercúrico (D) requiere cuidado y experiencia y únicamente es adecuado para determinaciones cualitativas o semicuantitativas (± 5 μg As). El método de plasma de acoplamiento inductivo (PAI) (E) resulta útil a concentraciones más altas (superiores a 50 μg/1).

Método espectrométrico de absorción atómica

Véanse método espectrométrico de absorción atómica electrotérmica, sección 3113, y método espectrométrico de ab-

sorción atómica de generación de hidruros, sección 3114.

DETERMINACIÓN DE METALES

3500-As C. 1.

3-83

Método de dietilditiocarbamato de plata

Discusión general

a) Principio: El arsénico inorgánico se reduce a arsina, AsH3, utilizando solución acida de zinc en un generador Gutzeit. Se hace pasar entonces la arsina a través de un frasco lavador que contiene lana de vidrio impregnada en solución de acetato de plomo, a un tubo de absorción que contiene dietilditiocarbamato de plata disuelto en piridina o cloroformo. En el tubo de absorción, el arsénico reacciona con la sal de plata, formando un complejo rojo soluble adecuado para medida fotométrica. b) Interferencia: Aunque ciertos metales —cromo, cobalto, cobre, mercurio, molibdeno, níquel, platino y plata— interfieren en la generación de arsina, las concentraciones de estos metales, que normalmente se encuentran en el agua, no interfieren significativamente. Las sales de amonio en la muestra forman estibina, que interfiere con desarrollo de color formando un color rojo con absorbancia máxima en 510 nm. c) Cantidad mínima detectable: 1 μg As.

Figura 3500-A s:1.

en el intervalo de 530 a 540, con células de 1 cm. 3.

2.

Instrumental

a) Generador de arsina y tubo de absorción: Véase figura 3500-As:l*. b) Equipo fotométrico: 1) Espectrofotómetro para usarlo a 535 nm con células de 1 cm. 2) Fotómetro de filtro, con filtro verde que tiene una transmitancia máxima * Fisher Scientific Co., n.° 1-405 o instrumental equivalente.

Generador de arsina y ensamblaje del absorbedor.

Reactivos

a) Ácido clorhídrico, HC1 conc. b) Solución de yoduro potásico: Disuélvanse 15 g de KI en 100 ml de agua destilada. Consérvese en frasco topacio. c) Reactivo cloruro estannoso: Disuélvanse 40 g de SnCl2·H2O libre de arsénico en 100 ml de HC1 conc. d) Solución de acetato de plomo: Disuélvanse 10 g de Pb(C2H3O2)2·3H2O en 100 ml de agua destilada. e) Reactivo dietilditiocarbamato de plata: Prepárese este reactivo como se describe en 1) o 2):

3-84

1) Disuélvanse 410 mg de 1-efedrina en 200 ml de cloroformo (CHC13), añádanse 625 mg de AgSCSN(C2H5)2 y ajústese el volumen a 250 ml añadiendo más CHC13. Fíltrese y consérvese en frasco topacio. 2) Disuélvase 1 g de AgSCSN(C2H5)2 en 200 ml de piridina. Consérvese en frasco topacio. f) Zinc, 20 a 30 mallas, libre de arsénico. g) Solución de arsénico de reserva: Disuélvanse 1.320 g de trióxido de arsénico, As2O3, en 10 ml de agua destilada que contiene 4 g de NaOH, y diluyase con agua destilada hasta 1.000 ral; 1,00 ml = 1,00 mg As. (PRECAUCIÓN: Tóxico, evítese la ingestión de soluciones de arsénico.) h) Solución de arsénico intermedia: dilúyanse 5,00 ml de solución de reserva hasta 500 ml empleando agua destilada; 1,00 ml = 10,0 μg As. i) Solución de arsénico patrón: Dilúyanse 10,00 ml de solución intermedia hasta 100 ml empleando agua destilada; 1,00 ml = 1,00 μg As. 4. Procedimiento Para determinar el arsénico total, digiérase la muestra por el procedimiento del apartado 4a. Anótese si la muestra ha sido digerida o no. a) Tratamiento de la muestra: Llévense con la pipeta 35,0 ml de muestra a un frasco generador limpio. Añádanse sucesivamente, cuidando de mezclar después de cada adición, 5 ml de HC1 conc, 2 ml de solución de KI y 8 gotas (0,40 ml) de reactivo SnCl2. Déjese 15 minutos para que se reduzca el arsénico al estado trivalente. b) Preparación del frasco lavador y del absorbedor: Imprégnese la lana de vidrio del frasco lavador con una solución de acetato de plomo. No humedecer demasiado para que el agua no rezume

MÉTODOS NORMALIZADOS

dentro de la solución de reactivo. Llévense con la pipeta 4,00 ml de reactivo dietilditiocarbamato de plata al tubo absorbedor. c) Generación y medida de arsina: Añádanse 3 g de zinc al generador y conéctese la estructura de lavador-absorbedor inmediatamente. Compruébese que todas las uniones están herméticamente ajustadas. Déjese 30 minutos para un desprendimiento completo de la arsina. Caliéntese ligeramente el generador para asegurarse de que se ha desprendido toda la arsina. Viértase la solución directamente desde el absorbedor a una célula de 1 cm y mídase la absorbancia a 535 nm utilizando el blanco de reactivo como referencia. d) Preparación de la curva estándar: Trátense porciones de solución patrón que contienen 0, 1,0, 2,0, 5,0 y 10,0 μg de As, descritas en los anteriores apartados 4a y c. Trácese el gráfico de absorbancia en función de la concentración de arsénico en el patrón. 5.

Cálculos

mg As/I =

μg As (en 4,00 ml de volumen final) ml de muestra

6. Precisión y sesgo Se analizó en 46 laboratorios una muestra sintética con un contenido de 40 μg As/1, 250 μg Be/1, 240 μg B/l, 20 μg Se/1 y 6 μg V/l en agua destilada utilizando el método de dietilditiocarbamato de plata, con una desviación relativa estándar de 13,8 por 100 y un error relativo de 0 por 100.

7.

Bibliografía

VASAK, V. & V. SEDIVEC. 1952. Colorimetric determination of arsenic. Chem. Listy 46:341.

3-85

DETERMINACIÓN DE METALES

STRATTON, G. & H. C. WHITEHEAD. 1962. Colorimetric determination of arsenic in water with silver diethyldithiocarbamate. J. Amer. Water Works Assoc. 54:861.

3500-As D. 1.

BALLINGER, D. C, R. J. LISHKA & M. E. GALES. 1962. Application of silver diethyldithiocarbamate method to determination of arsenic. J. Amer. Water Works Assoc. 54:1424.

Método del tinte de bromuro mercúrico

Discusión general

a) Principio: Después de la concentración de la muestra, el arsénico se libera como arsina, AsH3, por una solución acida de zinc en un generador de Gutzeit. Se hace pasar la arsina generada a través de una columna con algodón arrollado humedecido con solución de acetato de plomo. La arsina generada produce un tinte pardo-amarillo sobre tiras de papel de ensayo impregnado con bromuro mercúrico. La longitud de la parte teñida es aproximadamente proporcional a la cantidad de arsénico presente. b) Interferencia: El antimonio (> 0,10 mg) interfiere al dar un tinte similar. c) Cantidad mínima detectable: 1 μg As. 2.

Instrumental

Generador de arsina: Véase figura 3500-As:2. 3.

Reactivos

a) Ácido sulfúrico, H2SO4 1 -I- 1. b) Ácido nítrico, HNO3 conc. c) Algodón arrollado: Córtese un rollo de algodón de dentista en longitudes de 25 mm. d) Solución de acetato de plomo: Prepárese tal como se indica en el método C del apartado 3d. e) Papel de bromuro de mercurio: Utilícense papeles de arsénico comerciales

Figura 3500-As:2.

Generador utilizado con el método del tinte de bromuro mercúrico.

cortados uniformemente en tiras de aproximadamente 12 cm de largo y 2,5 mm de ancho (se pueden conseguir papeles ya cortados y sensibilizados). Sumérjanse las tiras durante al menos 1 hora en una solución filtrada preparada por disolución de 3 a 6 g de HgBr2 en 100 ml de alcohol etílico o isopropílico al 95 por

3-86

100; séquense con ondas de aire. Consérvese en lugar seco y protegido de la luz. Para obtener mejores resultados, háganse los papeles inmediatamente antes de su uso. f ) Solución de yoduro de potasio: Prepárese como se ha indicado en el método C del apartado 3b. g) Reactivo cloruro estannoso: Prepárese como se indica en el método C del apartado 3c. h) Zinc, 20 a 30 mallas, libre de arsénico. i) Solución de arsénico patrón: Prepárese como se ha indicado en el método C del apartado 3i.

4.

Procedimiento

a) Concentración de la muestra y oxidación de materia orgánica: Introdúzcase en un matraz o en un vaso una muestra adecuada que contenga de 2 a 30 μg As, añádanse 7 ml de H 2 SO 4 1 + 1 y 5 ml de HNO3 conc. Evapórese hasta desprendimiento de humos de SO3. Enfríese, añádase aproximadamente 25 ml de agua destilada y evapórese de nuevo para que los humos de SO3 expulsen los óxidos de nitrógeno. Manténgase un exceso de HNO3 hasta destruir toda la materia orgánica. No dejar oscurecer la solución mientras se destruye la materia orgánica, ya que probablemente el arsénico se reduciría y perdería. Enfríese, añádanse aproximadamente 25 ml de agua destilada y pásese a un frasco generador. b) Preparación de columna de seguridad y tubo de reacción: Sumérjase un extremo del cilindro de algodón de 2,5 cm en solución de acetato de plomo e introdúzcase en una columna de cristal. Póngase entonces el tubo de vidrio estrecho seco en su lugar e introdúzcase el papel de ensayo de HgBr2. Asegúrese de que la tira de papel está recta.

MÉTODOS NORMALIZADOS

c) Tratamiento del concentrado de muestra: Al concentrado de muestra de 25 ml del generador, añádanse 7 ml de H2SO4 1 + 1 y enfríese. Añádanse 5 ml de solución de K.I, cuatro gotas de reactivo SnCl 2 y 2 a 5 g de zinc. Conéctese inmediatamente el tubo de reacción al generador. Sumérjase el dispositivo hasta 2,5 cm de la parte de encima del tubo estrecho en un baño maría mantenido entre 20 y 25 °C, y déjese que tenga lugar el desprendimiento durante 1,5 horas. Sáquese la tira y calcúlese la longitud media de los tintes en ambos lados. Utilizando una curva de calibración, cuya preparación se describe a continuación, se evalúa la cantidad de arsénico presente. d) Preparación de la curva de calibración: Prepárense un blanco y patrones a intervalos de 3 μg entre 0 y 30 μg de As con 14 ml de H2SO4 1 + 1 y llévese a un volumen total de 25 ml. Colóquese en el generador y trátese como se ha descrito para el conc. de muestra. Extráigase la tira y calcúlese la longitud media en milímetros de los tintes de ambos lados. Trácese un gráfico con longitudes en milímetros en función de los microgramos de arsénico y utilícese como curva estándar. 5.

Precisión y sesgo

Se ha analizado en cinco laboratorios una muestra sintética con 50 μg As/1, 400 μg Be/1, 180 μg B/l y 50 μg Se/1 en agua destilada por el método de tinte de bromuro mercúrico, con una desviación estándar relativa de 75,0 por 100 y un error relativo de 60,0 por 100. 6.

Bibliografía

FURMAN , N. H., ed. 1962. Standard Methods of Chemical Analysis, 6.a ed. Vol. I. D. Van Nostrand Co., Princeton, Nueva York, págs. 118124.

DETERMINACIÓN DE METALES

3500-As E.

3-87

Método de plasma de acoplamiento inductivo

Véase sección 3120.

3500-Ba

3500-Ba A. 1.

Incidencia y significación

El bario estimula el músculo cardíaco. Sin embargo, una dosis de bario de 550 a 600 mg se considera letal para los seres humanos. Los trastornos que producen su ingestión, inhalación o absorción pueden afectar a corazón, vasos sanguíneos y nervios. A pesar de su relativa abundancia en la naturaleza (es el decimosexto elemento

* Aprobado por el Standard Methods Committee, 1985.

3500-Ba B.

Introducción en orden de abundancia), en el agua sólo se encuentra en cantidades traza. La concentración de bario en las aguas potables de los Estados Unidos puede oscilar entre 0,7 y 900 μg/l, con una media de 49 μg/1. Las concentraciones más altas en el agua potable son frecuente indicio de contaminación por residuos industriales. 2.

Selección del método

Realícense los análisis por el método espectrométrico de absorción atómica o el método de plasma de acoplamiento inductivo.

Método espectrométrico de absorción atómica

Véanse método espectrométrico de absorción atómica de llama y método es-

3500-Ba C.

BARIO*

pectrométrico de absorción atómica electrotérmica, sección 3113.

Método de plasma de acoplamiento inductivo

Véase sección 3120.

3-88

MÉTODOS NORMALIZADOS

3500-Be

3500-Be A. 1.

Incidencia y significación

El berilio y sus compuestos son muy tóxicos y en concentraciones elevadas pueden causar la muerte. La inhalación de polvo de berilio origina una grave enfermedad llamada beriliosis. La enfermedad ocasionada por el berilio puede tomar también la forma de dermatitis, conjuntivitis (enfermedad ocular), neumonía aguda (enfermedad pulmonar) y beriliosis pulmonar crónica. Se utiliza en forma de elemento, compuestos o aleaciones en reactores atómicos, aviación, cohetes y combustibles de * Aprobado por el Standard Methods Committee, 1985.

3500-Be B.

Introducción misiles. Su aparición en el agua puede provenir de desechos de las citadas industrias. Los informes sobre el berilio en aguas potables en Estados Unidos señalan un intervalo de 0,01 a 0,7 μg/1, con una media de 0,013 μg /1. 2.

Selección del método

Los métodos seleccionados son el método espectrométrico de absorción atómica y el de plasma de acoplamiento inductivo. Si no se dispone de los instrumentos necesarios para llevar a cabo el método PAI, se puede utilizar el método colorimétrico, aunque con menores precisión y sesgo.

Método espectrométrico de absorción atómica

Véase método espectrométrico de absorción atómica de llama, secciones 3111D y E, y método espectrométrico de

3500-Be C.

BERILIO*

absorción atómica electrotérmica, sección 3113.

Método de plasma de acoplamiento inductivo

Véase sección 3120.

DETERMINACIÓN DE METALES

3500-Be D. 1.

3-89

Método del aluminen

Discusión general

a) Principio: La adición de una pequeña cantidad de solución complejante de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) evita la interferencia de cantidades moderadas de aluminio, cobalto, cobre, hierro, manganeso, níquel, titanio, zinc y zirconio. Añádase un reactivo tampón de aluminón para formar una laca de berilio midiéndose el color desarrollado a 515 nm. b) Interferencia: En las condiciones especificadas, no pueden tolerarse por encima de 10 mg de cobre. Si hay más, auméntese la cantidad de reactivo EDTA. El cobre complejado absorbe ligeramente a 515 nm; elimínese esta interferencia añadiendo una cantidad equivalente de cobre a los patrones. c) Concentración mínima detectable: 5 μg/1. d) Poder absorbente molar: 900 1 g-1 cm-1. 2.

Manipulación de la muestra

Acidúlense todas las muestras en el momento de su toma para que los metales se mantengan en solución y se evite su depósito sobre las paredes del recipiente. Tratándose de aguas relativamente limpias que no llevan material en forma de partículas, normalmente resulta suficiente 1,5 ml de ácido nítrico conc. (HNO3)/1 para reducir el pH a 2,0. Las aguas superficiales que pueden contener sedimento, tales como las de corrientes, lagos y fluidos procedentes de plantas de tratamiento de aguas residuales, requieren más ácido. Si la muestra contiene materia en partículas y sólo se desea determinar el contenido de metal «disuelto», fíl-

trese la muestra a través de un filtro de membrana de 0,45 μm y acidúlese el filtrado con 1,5 ml de HNO3 conc./l. 3.

Instrumental

a) Espectrofotómetro: Para ser empleado a 515 nm con un trayecto luminoso de 5 cm. b) Fotómetro con filtro: Que proporciona un trayecto luminoso de 5 cm y va equipado con un filtro verde, que presenta una transmitancia máxima próxima a 515 nm. 4.

Reactivos

a) Solución de berilio de reserva: Disuélvanse 9,837 g de sulfato de berilio tetrahidratado (BeSO4·4H2O), pureza 0,999, en 100 ml de agua destilada, fíltrese si es necesario y dilúyase hasta 500 ml; 1,00 ml = 1,00 mg Be. b) Solución de berilio patrón: Diluyanse 5,0 ml de solución de berilio de reserva con agua destilada hasta 1.000 ml en un matraz volumétrico; 1,0 ml = 5 μg Be. c) Reactivo EDTA: Añádanse 30 ml de agua destilada y una gota de solución alcohólica de rojo de metilo (50 mg/ 100 ml a 2,5 g de ácido etilendiaminotetraacético. Neutralícese con hidróxido amónico (NH4OH), enfríese y dilúyase hasta 100 ml. d) Reactivo tampón de aluminón: Añádanse 500 g de acetato de amonio, NH4C2H3O2, a 1 l de agua destilada en un vaso de 2 1. Añádanse 80 ml de acético conc. (glacial) y agítese hasta disolución completa. Fíltrese si es necesario. Disuélvase 1 g de sal de triamonio del

MÉTODOS NORMALIZADOS

3-90

ácido aurintricarboxílico (aluminón) en 50 ml de agua destilada y añádase a la solución tampón del vaso de 2 1. Disuélvanse 3,0 g de ácido benzoico (C7H6O2) en 20 ml de alcohol metílico y añádanse a la solución tampón agitando al mismo tiempo. dilúyase la mezcla hasta 2 1. Pásense 10 g de gelatina a 250 ml de agua destilada en un vaso de 400 ml. Colóquese el vaso en un baño maría a ebullición y agítese de cuando en cuando hasta que la gelatina se haya disuelto por completo. Viértase la gelatina caliente en un matraz volumétrico de 1.000 ml que contenga 500 ml de agua destilada. Enfríese hasta temperatura ambiente, dilúyase hasta la señal y mézclese. Pásense la solución de gelatina y las soluciones tampón a un frasco de vidrio oscuro de 4 1 resistente a productos químicos. Mézclese y consérvese en lugar frío y oscuro. El reactivo es estable durante un mes al menos.

agua destilada y mézclese cuidadosamente. Déjese reposar durante 20 minutos, protegiendo la mezcla de la luz tras la adición del tampón aluminón. Fíltrese si es necesario. Léase la absorbancia de patrón y solución desconocida comparada con el blanco en un espectrofotómetro o fotómetro de filtro a una longitud de onda de 515 nm utilizando células de 5 cm. Trácese una curva de calibración con la absorbancia de los patrones en función de los microgramos de berilio en 100 ml de volumen final. Determínese la cantidad de berilio en la muestra por referencia a la correspondiente absorbancia en la curva de calibración.

6.

Cálculos μg Be (en 100 ml de volumen final)

mg Be/1 = ml de muestra

5.

Procedimiento

a) Tratamiento de la muestra: Si hay materia orgánica y se desea determinar el berilio total, digiérase la muestra con HNO3 y H2SO4, tal como se indica en la sección 3O3OG. Si sólo interesa determinar el berilio disuelto, fíltrese la muestra a través de un filtro de membrana de 0,45 μm. b) Reacción con aluminón: Pásense con la pipeta 0, 0,1, 0,5, 1,00, 2,00, 3,00 y 4,00 ml de solución patrón de berilio a una serie de matraces volumétricos de 100 ml. Pásese una muestra de 50 ml, o porción que contenga menos de 200 μg de Be, a un matraz volumétrico de 100 ml. Añádanse 2 ml de reactivo EDTA a cada matraz y dilúyase con agua destilada hasta aproximadamente 75 ml. Añádanse 15 ml de reactivo de tampón aluminón, dilúyase hasta 100 ml con

7.

Precisión y sesgo

En 32 laboratorios se analizó una muestra sintética de agua destilada con 250 μg Be/1, 40 μg As/1, 240 μg B/l, 20 μg Se/1 y 6 μg V/l, respecto al berilio, con una desviación relativa estándar de 7,13 por 100 y un error relativo de 12 por 100.

8.

Bibliografía

LUKE, C. L. & M. E. CAMPBELL. 1952. Photometric determination of beryllium in berylliumcopper alloys. Anal. Chem. 24:1056. LUKE, C. L. & K. C. BROWN. 1952. Photometric determination of aluminum in manganese, bronze, zinc die casting alloys, and magnesium alloys. Anal. Chem. 24:1120.

3-91

DETERMINACIÓN DE METALES

3500-Bi

3500-Bi A. El bismuto es muy insoluble en aguas naturales y, por lo general, sólo se encuentra en cantidades traza (inferiores a

3500-Bi B.

BISMUTO

Introducción 10 μg/1). Puede encontrarse en concentraciones más altas en aguas que drenan áreas mineralizadas.

Método espectrométrico de absorción atómica

Véase método espectrométrico de absorción atómica de llama, sección 3111B.

3500-Cd

3500-Cd A. 1.

Incidencia y significación

El cadmio es muy tóxico, y se le han atribuido algunos casos de intoxicación con alimentos. Se cree que muy pequeñas cantidades de cadmio podrían ser la causa de alteraciones adversas en las arterias renales. También produce cánceres generalizados en animales de laboratorio y ha sido relacionado epidemiológicamente con ciertos cánceres humanos. Una concentración de cadmio de 200 μg/1 es tóxica para ciertos peces. El cadmio puede llegar al agua a través de

* Aprobado por el Standard Methods Committee, 1985.

CADMIO*

Introducción vertidos industriales o por deterioro de tuberías galvanizadas.

2.

Selección del método

Se prefiere el método espectrométrico de absorción atómica electrotérmico (horno de grafito). Los métodos de absorción atómica de llama y de plasma de acoplamiento inductivo proporcionan un aceptable nivel de precisión y sesgo, con límites de detección más altos. El método de la ditizona es adecuado cuando no se dispone de instrumental para la espectrometría de absorción atómica o para el plasma de acoplamiento inductivo y la precisión buscada no es tan grande.

3-92

MÉTODOS NORMALIZADOS

3500-Cd B.

Método espectrométrico de absorción atómica

Véase método espectrométrico de ab- ción atómica electrotérmica, sección sorción atómica de llama, secciones 3111B 3113. y C, y método espectrométrico de absor-

3500-Cd C.

Método de plasma de acoplamiento inductivo

Véase sección 3120.

3500-Cd D. 1.

Método de la ditizona

Discusión general

a) Principio: Los iones cadmio reaccionan en condiciones adecuadas con ditizona para formar un color de rosa a rojo que puede extraerse con cloroformo (CHC13). Los extractos clorofórmicos se miden fotométricamente y la concentración de cadmio se obtiene a partir de una curva de calibración preparada con una solución de cadmio patrón tratada de la misma manera que la muestra. b) Interferencia: En las condiciones especificadas no interfieren las concentraciones de iones metálicos encontrados normalmente en el agua. El plomo hasta 6 mg, el zinc hasta 3 mg y el cobre hasta 1 mg en la porción analizada no interfieren. La iluminación normal de la habitación (incandescente o fluorescente) no afecta al color del ditizonato de cadmio. c) Concentración mínima detectable: 0,5 μg Cd en aproximadamente 15 ml de volumen final con un trayecto luminoso de 2 cm.

2. Instrumental a) Equipo de colorimetria: Se necesita uno de los siguientes: 1) Espectrofotómetro, para ser utilizado a 518 nm con un trayecto luminoso mínimo de 1 cm. 2) Fotómetro de filtro, equipado con un filtro verde que tenga una transmitancia luminosa máxima próxima a 518 nm, con un trayecto luminoso mínimo de 1 cm. b) Embudos separadores: 125 ml, preferiblemente con espitas de TFE. c) Material de vidrio: Límpiese todo el material de vidrio, incluidos los frascos para muestras, con HC1 1 + 1 y enjuagúese cuidadosamente con agua del grifo y agua destilada. 3. Reactivos a) Agua libre de cadmio: Vuélvase a destilar el agua destilada en un destila-

3-93

DETERMINACIÓN DE METALES

dor hecho completamente de vidrio. Utilícese esta agua para preparar todos los reactivos y soluciones. b) Solución de cadmio de reserva: Pésense 100,0 mg de metal cadmio puro y disuélvanse en una solución compuesta por 20 ml de agua más 5 ml de HC1 conc. Empléese calor para facilitar la disolución del metal. Pásese cuantitativamente a un matraz volumétrico de 1 l y dilúyase hasta 1.000 ml; 1,00 ml = 100 μg Cd. Guárdese en un recipiente de polietileno. c) Solución de cadmio patrón: Llévense con la pipeta 10,00 ml de solución de cadmio de reserva a un matraz volumétrico de 1 l, añádanse 10 ml de HC1 conc. y dilúyase con agua hasta 1.000 ml. Prepárese lo que se necesita utilizar ese mismo día; 1,00 ml = 1,00 μg Cd. d) Solución de tartrato de sodio y potasio: Disuélvanse 250 g de NaKC4H4O6·4H2O en agua y llévese hasta 1 l. e) Soluciones de cianuro de potasiohidróxido sódico: 1) Solución I: Disuélvanse 400 g de NaOH y 10 g de KCN en agua y llévese hasta 1 l. Consérvese en botella de polietileno. Esta solución es estable durante un mes. 2) Solución II: Disuélvanse 400 g de NaOH y 0,5 g de KCN en agua y llévese hasta 1 l. Consérvese en frasco de polietileno. Esta solución es estable durante uno a dos meses. PRECAUCIÓN: El cianuro de potasio es muy tóxico. Hay que tener mucho cuidado al manipularlo. No deben utilizarse pipetas de boca cuando haya que tomar soluciones de cianuro. f) Solución de clorhidrato de hidroxilamina: Disuélvanse 20 g de NH2OH·HC1 en agua y llévese hasta 100 ml. g) Solución de ditizona de reserva I: Véase sección 1070D.22b1). h) Solución de ditizona de trabajo: dilúyase la solución de ditizona de reser-

va I con CHC13 para obtener una solución de trabajo de 10 μg/ml. Prepárese diariamente. i) Cloroformo, calidad ACS que sea «adecuada para su uso en el ensayo de ditizona». Para conseguir un CHC13 satisfactorio, añádase una cantidad muy pequeña de ditizona a una porción de CHCI3 en un tubo de ensayo tapado, con lo que se produce un color verde brillante; este color debe ser estable durante un día. j) Solución de ácido tartárico: Disuélvanse 20 g de H2C4H4O6 en agua y llévese hasta 1 l. Consérvese en frigorífico y utilícese cuando aún esté frío. k) Ácido clorhídrico, HC1 conc. l) Solución de indicador azul de timol: Disuélvanse 0,4 g de sal sódica de timolsulfonaftaleína en 100 ml de agua. m) Hidróxido de sodio: NaOH 6N.

4.

Procedimiento

a) Preparación de la curva estándar: Prepárese un blanco y una serie de patrones a partir de 1 a 10 μg tomando con la pipeta las cantidades apropiadas de solución de Cd patrón y pasándolos a embudos separadores. dilúyase hasta 25 ml y opérese como se indica en el apartado 4c. Trácese una curva de calibración. b) Tratamiento de muestras: Digiérase una muestra tal como se ha señalado en la sección 3030. Tómese con la pipeta un volumen de muestra digerida que contenga 1 a 10 μg Cd y pásese a un embudo separador; dilúyase a 25 ml si es necesario. Añádanse 3 gotas de azul de timol y ajústese el pH a 2,8 con NaOH 6N hasta el primer color amarillo permanente. c) Desarrollo de color, extracción y medida: Añádanse los reactivos en el siguiente orden, mezclando después de cada adición: 1 ml de solución de tartrato de sodio y potasio, 5 ml de solución NaOH-KNC I, 1 ml de solución

MÉTODOS NORMALIZADOS

3-94

NH2OHHC1 y 15 ml de solución de ditizona I. Tápense los embudos y agítense durante un minuto, descargando la presión de vapor de los embudos a través de los tapones en vez de hacerlo con la espita. Pásese la capa de CHC13 a un segundo embudo que contenga 25 ml de solución de ácido tartárico fría. Añádanse 10 ml de CHC13 al primer embudo: agítese durante 1 minuto y decántese al segundo embudo. No hay que dejar que la capa acuosa entre en el segundo embudo. Háganse las dos extracciones inmediatamente después de añadir la ditizona, ya que el tiempo de contacto del CHC13 con el álcali fuerte debe reducirse al mínimo (el ditizonato de cadmio se descompone en contacto prolongado con álcali fuerte saturado de CHC13). Sacúdase el segundo embudo durante 2 minutos y descártese la capa de CHCI3. Añádanse 5 ml de CHC13, sacúdase 1 minuto y descártese la capa de CHCI3, haciendo la separación lo más ajustada posible. Añádanse en el siguiente orden 0,25 ml de solución de NH2OH·HC1 y 15,0 ml de solución de ditizona de trabajo. Añádanse 5 ml de solución II de NaOH-KCN. Sacúdase inmediatamente durante 1 minuto y pásese la capa de CHC1 3 a un tubo seco del fotómetro. Léase la absorbancia a

518 nm frente al blanco. Obténgase la concentración de Cd a partir de la curva de calibración. 5. Cálculos

6. Precisión y sesgo Se analizó en 44 laboratorios, empleando el método de ditizona y con una desviación relativa estándar de 24,6 por 100 y un error relativo de 6,0 por 100, una muestra sintética con un contenido de 50 μg Cd/1, 500 μg Al/1, 110 μg Cr/1, 470 μg Cu/1, 300 μg Fe/1, 70 μg Pb/l, 150 μg Ag/1 y 650 μg Zn/1. 7.

Bibliografía

SALTZMAN, B. E. 1953. Colorimetric micrometermination of cadmium with dithizone method. Anal. Chem. 25:493. GANOTES, J., E. LARSON & R. NAVONE. 1962. Suggested dithizone method for cadmium determination. J. Amer. Water Works Assoc. 54:852.

3-95

DETERMINACIÓN DE METALES

3500-Ca

3500-Ca A. 1.

Incidencia y significación

La presencia del calcio (el quinto entre los elementos en orden de abundancia) en los suministros de agua proviene de su paso a través o por encima de depósitos de caliza, dolomita, yeso y pizarras yesíferas. El contenido de calcio puede variar entre cero y varios centenares de mlligramos por litro, dependiendo del origen y tratamiento del agua. Las pequeñas concentraciones de carbonato de calcio evitan la corrosión de las tuberías metálicas por depositar una capa protectora. Por otro lado, cantidades apreciables de sales de calcio precipitan al calentar formando incrustaciones perjudiciales en calderas, tuberías y utensilios de cocina. En la sección 2330 se trata la saturación de carbonato de calcio. El calcio contribuye a la dureza total del agua. Para reducir el calcio y la dure* Aprobado por el Standard Methods Committee, 1985.

3500-Ca B.

CALCIO*

Introducción za asociada a él, se aplica un tratamiento de ablandamiento químico, osmosis inversa, electrodiálisis o intercambio iónico.

2.

Selección del método

El método de absorción atómica y el método de plasma de acoplamiento inductivo constituyen dos medios precisos para determinar el calcio. Los métodos de titulación con permanganato y EDTA dan buenos resultados en aplicaciones de control y rutinarias. La sencillez y rapidez del procedimiento de titulación con EDTA lo hacen preferible al método del permanganato. 3.

Conservación de muestras

Son suficientes las precauciones habituales siempre que se procure redisolver el carbonato de calcio que pueda precipitar al estancarse.

Método espectrométrico de absorción atómica

Véase método espectrométrico de absorción atómica de llama, sección 3111B.

3500-Ca C.

Método de plasma de acoplamiento inductivo

Véase sección 3120.

3-96

MÉTODOS NORMALIZADOS

3500-Ca D. 1.

Método titulométrico de EDTA

Discusión general

a) Principio: Cuando se añade EDTA (ácido etilendiaminotetracético o sus sales) al agua que contiene calcio y magnesio, aquél se combina primero con el calcio. El calcio se determina directamente con EDTA cuando el pH es lo suficientemente alto para que precipite el magnesio como hidróxido, utilizando un indicador que se combine con el calcio únicamente. Existen varios indicadores que originan un cambio de color cuando todo el calcio ha pasado a formar un complejo con el EDTA a un pH 12 a 13. b) Interferencia: En las condiciones de este ensayo, las siguientes concentraciones de iones no son origen de interferencia cuando se determina la dureza por calcio: Cu2+ 2 mg/1, Fe2+ 20 mg/1, Fe3+ 20 mg/1, Mn2+ 10 mg/1, Zn2 + 5 mg/1, Pb2+ 5 mg/1, Al3+ 5 mg/1 y Sn4 + 5 mg/1. El ortofosfato precipita el calcio al pH del ensayo. El estroncio y el bario dan interferencia positiva, y una alcalinidad por encima de 300 mg/1 puede ser la causa de un punto final indistinguible en las aguas duras. 2.

Reactivos

a) Hidróxido de sodio, NaOH 1N. b) Indicadores: Para la titulación de calcio se puede disponer de muchos indicadores. Algunos están descritos (véase bibliografía), otros son preparaciones comerciales que también pueden emplearse. El primer indicador de que se dispuso para detectar el punto final de calcio fue la murexida (purpurato de amonio), para cuyo uso se proporcionan indicadores en este procedimiento. Las personas que tengan dificultad para reconocer el punto final con murexida pueden encontrar que es mejor el azul negro de eriocromo R (índice de color número 202) o el azul

oscuro de solocromo, ya que el cambio de color es del rojo al azul puro. El azul negro de eriocromo R es ácido sodio-1(2-hidroxi-1 -naftilazo)-2-naftol-4-sulfónico. También se pueden utilizar otros indicadores específicamente diseñados como detectores del punto final en la titulación con EDTA del calcio. 1) Indicador murexida (purpurato de amonio): Este indicador cambia de rosa a púrpura en el punto final. Prepárese disolviendo 150 mg del colorante en 100 g de etilenglicol absoluto. Las soluciones acuosas del colorante no son estables más de 1 día. Una mezcla molida del polvo colorante y cloruro sódico (NaCl) resulta una forma estable del indicador. Prepárese mezclando 200 mg de murexida con 100 g de NaCl sólido y tritúrese la mezcla hasta 40 a 50 mallas. Titúlese inmediatamente de añadir el indicador, ya que éste es inestable en condiciones alcalinas. Facilítese el reconocimiento del punto final preparando un blanco de comparación que contenga 2,0 ml de solución de NaOH, 0,2 g de mezcla sólida de indicador (o de 1 a 2 gotas si se emplea una solución) y suficiente reactivo de titulación EDTA estándar (0,05 a 0,10 ml) para producir un cambio de color. 2) Indicador azul negro de eriocromo R: Prepárese una forma estable del indicador triturando juntos en un mortero 200 mg del colorante pulverizado y 100 g de NaCl sólido hasta 40 a 50 mallas. Guárdese en un frasco herméticamente cerrado. Utilícense 0,2 g de la mezcla molida para la titulación de la misma forma que para el indicador murexida. Durante la titulación, el color cambia de rojo a azul puro, pasando por púrpura y púrpura azulado, sin trazas de tonos rojizos o púrpuras. El pH de algunas aguas (no todas) debe elevarse a 14 (en vez de a 12-13) empleando NaOH 8N para conseguir un buen cambio de color.

3-97

DETERMINACIÓN DE METALES

c) Reactivo de titulación estándar EDTA, 0.01M; Prepárese un reactivo de titulación estándar EDTA, tal como se ha descrito para el método de determinación de dureza total con EDTA (sección 2340). El reactivo de titulación estándar EDTA 0,0100M equivale a 400,8 μg Ca/1,00 ml.

donde: A = ml de reactivo de titulación para la muestra, y B = mg de CaCO 3 equivalentes a 1,00 ml de reactivo de titulación EDTA en el punto final de indicador para el calcio.

3. Procedimiento a) Tratamiento previo de muestras de agua contaminada y aguas residuales: Sígase el procedimiento descrito en la sección 3030E o I. b) Preparación de muestras: Titúlese inmediatamente después de añadir el álcali y el indicador, debido al elevado pH empleado en este procedimiento. Utilícense 50,0 ml de muestra o una porción más pequeña diluida hasta 50 ml de manera que el contenido en calcio sea, aproximadamente, de 5 a 10 mg. Analícense las aguas duras, con alcalinidad superior a 300 mg CaCO3/l, tomando una pequeña porción y diluyendo hasta 50 ml, o neutralizando la alcalinidad con ácido, hirviendo un minuto y enfriando antes de comenzar la titulación. c) Titulación: Añádanse 2,0 ml de solución de NaOH o un volumen suficiente para producir un pH de 12 a 13. Agítese. Añádanse 0,1 a 0,2 g de la mezcla de indicador seleccionada (o de 1 a 2 gotas si se emplea solución). Añádase poco a poco el reactivo de titulación EDTA, agitando continuamente, hasta el apropiado punto final. Cuando se utiliza murexida, compruébese el punto final por adición de 1 o 2 gotas más de reactivos de titulación para cerciorarse de que no hay más cambio de color. 4.

Cálculos

5. Precisión y sesgo En 44 laboratorios se analizó una muestra sintética que contenía 108 mg Ca/1, 82 mg Mg/1, 3,1 mg K/l, 19,9 mg Na/1, 241 mg CP¯/1, 1,1 mg NO3- -N/1, 0,25 mg NO-2 -N/1, 259 mg SO 2-4 /1 y 42,5 mg de alcalinidad total/1 (a la que contribuye el NaHCO3) en agua destilada, empleando el método de titulación con EDTA, con una desviación relativa estándar de 9,2 por 100 y un error relativo de 1,9 por 100.

6. Bibliografía DIEHL, H. & J. L. ELLINGBOE. 1956. Indicator for titration of calcium in the presence of magnesium using disodium dihydrogen ethylenediamine tetraacetate. Anal. Chem. 28:882. PATTON, J. & W. REEDER. 1956. New indicator for titration of calcium with (ethylenedinitrilo) tetraacetate. Anal. Chem. 28:1026. HILDEBRAND, G. P. & C. N. REILLEY. 1957. New indicator for complexometric titration of calcium in the presence of magnesium. Anal. Chem. 29:258. SCHWARZENBACH, G. 1957. Complexometric Titrations. Interscience Publishers, Nueva York. FURMAN, N. H. 1962. Standard Methods of Chemical Analysis, 6.a ed. D. Van Nostrand Co., Inc., Princeton, Nueva Jersey. KATZ, H. & R. NAVONE, 1964. Method for simultaneous determination of calcium and magnesium. J. Amer. Water Works Assoc. 56:121.

3-98

MÉTODOS NORMALIZADOS

3500-Ca E. 1.

Método titulométrico de permanganato

Discusión general

a) Principio: El oxalato de amonio precipita cuantitativamente el calcio en forma de oxalato de calcio. Un exceso de oxalato resuelve los efectos adversos del magnesio. Sólo se obtiene una óptima formación de cristales y una oclusión mínima cuando se lleva lentamente el pH hasta el valor deseado. Esto se realiza en dos etapas, interviniendo la digestión para acelerar la formación de cristales simiente. El oxalato de calcio precipitado se disuelve en ácido y se titula con pérmanganato. La cantidad de permanganato requerida para oxidar el oxalato es proporcional a la cantidad de calcio. b) Interferencia: La muestra deberá estar libre de cantidades interfirientes de estroncio, sílice, aluminio, hierro, manganeso, fosfato y materia suspendida. El estroncio puede precipitar como oxalato y dar lugar a resultados altos. En este caso, determínese el estroncio por fotometría de llama y aplíquese la corrección apropiada. Elimínese la interferencia de la sílice por el clásico procedimiento de deshidratación. Precipítese el aluminio, hierro y manganeso con hidróxido amónico después de tratamiento con persulfato. Precipítese el fosfato como sal férrica. Elimínese la materia suspendida por centrifugación o filtración a través de papel de filtro, vidrio sinterizado o membrana de acetato de celulosa (véase Sólidos, sección 2540). 2.

Instrumental

a) Bomba de vacío u otra fuente de vacío. b) Matraces filtrantes. c) Crisoles filtrantes: Se recomiendan crisoles de 30 ml de porosidad media. Se pueden utilizar crisoles de vidrio o de

porcelana. Los crisoles de estructura completamente porosa son difíciles de lavar cuantitativamente. 3.

Reactivos

a) Solución de indicador rojo de metilo: Disuélvase 0,1 g de sal sódica de rojo de metilo y dilúyase hasta 100 ml con agua destilada. b) Ácido clorhídrico, HC1 1 + 1. c) Solución de oxalato de amonio: Disuélvanse 10 g de (NH4)2C2O4·H2O en 250 ml de agua destilada. Fíltrese si es necesario. d) Hidróxido de amonio, NH4OH 3N: Añádanse 240 ml de NH4OH conc. a aproximadamente 700 ml de agua destilada y dilúyase hasta 1 l. Fíltrese antes de utilizarlo para eliminar los copos de sílice suspendidos. e) Hidróxido de amonio, 1 + 99. f) Reactivos especiales para eliminar la interferencia de aluminio, hierro y manganeso: 1) Persulfato de amonio, sólido. 2) Solución de cloruro de amonio: Disuélvanse 20 g de NH4C1 en 1 l de agua destilada. Fíltrese si es necesario. g) Oxalato de sodio: Utilícese Na2C2O4 de calidad patrón primario. Póngase a secar a 105 °C durante toda la noche y consérvese en desecador. h) Ácido sulfúrico, H2SO4 1 + 1. i) Reactivo de titulación permanganato potásico estándar, 0,01M: Disuélvanse 1,6 g de KMnO4 en 1 l de agua destilada. Guárdese en un frasco de cristal topacio tapado y déjese por lo menos una semana. Decántese cuidadosamente o tómese con una pipeta el sobrenadante sin agitar el sedimento. Estandarícese frecuentemente esta solución por el siguiente procedimiento (la solución patrón de

DETERMINACIÓN DE METALES

KMnO4 es exactamente 0,0100M, y equivale a 1,002 mg Ca/1,00 ml): Pésese con precisión 0,1 mg de varias muestras de 100 a 200 mg de Na2C2O4 en vasos de 400 ml. Añádase a cada vaso 100 ml de agua destilada y agítese para que se disuelva. Añádanse 10 ml de H2SO4 1 + 1 y caliéntese rápidamente entre 90 y 95 °C. Titúlese rápidamente con la solución de permanganato que se va a estandarizar, mientras se agita, hasta un punto final de un ligero color rosa que ha de persistir durante 1 minuto, por lo menos. No hay que dejar que la temperatura descienda por debajo de 85 °C. Si es necesario, caliéntese el contenido del vaso durante la titulación; 100 mg consumirán aproximadamente 30 ml de solución. Opérese con un blanco a base de agua destilada y H2SO4.

siendo: A = ml de reactivo de titulación para la muestra, y B = ml de reactivo de titulación para el blanco.

Sáquese la media de los resultados de varias titulaciones. 4. Procedimiento a) Tratamiento previo de muestras de aguas contaminadas y residuales: Sígase el procedimiento descrito en la sección 3030E o en la 3030I. b) Tratamiento de la muestra: Utilícense 200 ml de muestra con un contenido en Ca no superior a 50 mg (o una porción menor diluida hasta 200 ml). Si existen sustancias que interfieren, procédase como sigue: 1) Eliminación de la interferencia de sílice. Elimínense las cantidades de sílice

3-99

que interfieren por el procedimiento gravimétrico descrito en Sílice, sección 4500Si. Descártese el precipitado de sílice y consérvese el filtrado para eliminar las cantidades que interfieren de los óxidos combinados descritos en el siguiente apartado c. Si no hay óxidos combinados, pásese al apartado d. 2) Eliminación de la interferencia de óxidos combinados. Elimínense las cantidades que interfieren de aluminio, hierro y manganeso, concentrando el filtrado procedente de la determinación gravimétrica de sílice hasta 120 a 150 ml. Añádase el suficiente HC1 de manera que el filtrado procedente de la eliminación de sílice contenga al menos 10 ml de HC1 conc. Añádanse de 2 a 3 gotas de indicador rojo de metilo y NH4OH 3N hasta que el color del indicador cambie al amarillo. Añádase 1 g de persulfato de amonio; cuando comience la ebullición, añádase cuidadosamente NH4OH 3N hasta que la solución se haga ligeramente alcalina y el vapor desprenda un olor a amoníaco claro, aunque no fuerte. Ensáyese con papel tornasol. Hiérvase durante 1 a 2 minutos y déjese reposar 10 minutos hasta que los hidróxidos coagulen, pero no más tiempo. Fíltrese el precipitado y lávese tres o cuatro veces con solución de NH4C1. Trátese el filtrado tal como se describe a continuación. c) Ajuste del pH de la muestra: A 200 ml de muestra, con un contenido en Ca no superior a 50 mg, o a una porción más pequeña diluida hasta 200 ml, añádanse 2 ó 3 gotas de solución de indicador rojo de metilo. Neutralícese con HC1 1 + 1 y hiérvase durante 1 minuto. Añádanse 50 ml de solución de (NH4)2C2O4 · H2O y, si se forma precipitado, añádase justo el suficiente HC1 1 + 1 para redisolverlo. d) Precipitación de oxalato cálcico: Manténgase la solución justo por debajo del punto de ebullición, añádase gota a gota, con una bureta, NH4OH 3N, agi-

MÉTODOS NORMALIZADOS

3-100

tando constantemente. Continúese la adición hasta que la solución se enturbie bastante (se requieren aproximadamente 5 ml). Digiérase durante 90 minutos a 90 °C. Fíltrese, preferiblemente a través de crisol filtrante, empleando succión. Lávese inmediatamente con NH 4 OH 1 + 99. Aunque no es necesario pasar todo el precipitado al crisol filtrante, elimínese todo el exceso de (NH4)2C2O4·H2O del vaso. (Si hay que determinar magnesio por gravimetría, colóquense a un lado el filtrado combinado y las aguas de lavado con este propósito.) e) Titulación de oxalato cálcico: Colóquese el crisol filtrante de costado en un vaso y cúbrase con agua destilada. Añádanse 10 ml de H2SO4, agitando al mismo tiempo, y caliéntese rápidamente entre 90 y 95 °C. Titúlese rápidamente con reactivo de titulación KMnO4 hasta un punto final ligeramente rosa que persiste durante por lo menos 1 minuto. No hay que dejar que la temperatura disminuya por debajo de 85 °C; si es necesario, caliéntese el contenido del vaso durante la titulación. Agítese el crisol suficientemente para asegurar la reacción de todo el oxalato. Opérese con un blanco utilizando un vaso y un crisol limpios, 10 ml de H2SO 4 1 + 1, y aproximadamente el mismo volumen de agua destilada utilizado en la titulación de la muestra.

3500-Cs

3500-Cs A. El cesio se encuentra en la mayoría de aguas naturales en proporciones traza (< lμg/1). Las aguas termales pueden

5. Cálculos

siendo: A = ml de reactivo de titulación para la muestra, B = ml de reactivo de titulación para el blanco, y M = molaridad de KMnO 4 .

6.

Precisión y sesgo

En seis laboratorios se analizó una muestra sintética con un contenido de 108 mg Ca/1, 82 mg Mg/1, 3,1 mg K/l, 19,9 mg Na/1, 241 mg Cl¯/1, 1,1 mg NO3- -N/I, 0,25 mg NO-2 -N/1, 259 mg SO 2-4 /1 y 42,5 mg de alcalinidad total/1 (a la que contribuye el NaHCO 3 ) en agua destilada por el método titulométrico de KMnO4, con una desviación relativa estándar de 3,5 por 100 y un error relativo de 2,8 por 100. 7. Bibliografía KOLTHOFF, I. M., E. J. MEEHAN , E. B. S ANDELL & S. BRUCKENSTEIN. 1969. Quantitative Chemical Analysis, 4.a ed. MacMillan Co., Nueva York.

CESIO

Introducción contener valores mucho más altos (hasta 5 mg/1).

3-101

DETERMINACIÓN DE METALES

3500-Cs B.

Método espectrométrico de absorción atómica

Véase método espectrométrico de absorción atómica de llama, sección 3111B.

3500-Cr

3500-Cr A. 1. Incidencia Según los informes, las aguas potables de los Estados Unidos, tienen una concentración de cromo hexavalente que oscila entre 3 y 40 μg/l con una media de 3,2 μg/1. En los procesos industriales se utilizan mucho las sales de cromo, y pueden pasar al suministro de agua a través de los desechos industriales. Frecuentemente se añaden cromatos al agua de refrigeración para control de la corrosión. El cromo puede encontrarse en los suministros de agua tanto en estado hexavalente como trivalente, aunque la forma trivalente raramente aparece en el agua potable. 2.

Selección del método

Utilícese el método colorimétrico para determinar el cromo hexavalente en agua * Aprobado por el Standard Methods Committee, 1985.

CROMO*

Introducción natural o tratada para su potabilidad. Empléese el método espectrométrico de absorción atómica electrotérmica (horno de grafito) para determinar niveles bajos de cromo total (< 50 μg/1) en aguas naturales y residuales. Utilícese el método espectrométrico de absorción atómica de llama o el método de plasma de acoplamiento inductivo para medir concentraciones del orden de miligramos por litro.

3.

Manipulación de las muestras

Si únicamente se trata de determinar el metal disuelto, fíltrese la muestra a través de un filtro de membrana de 0,45 μm en el momento de su toma. Después de la filtración, acidúlese el filtrado con ácido nítrico conc. (HNO3) hasta pH < 2. Si lo que se desea es el contenido de cromo total, acidúlese la muestra sin filtrar con HNO3 conc. hasta pH < 2 en el momento de tomarla.

MÉTODOS NORMALIZADOS

3-102

3500-Cr B.

Método de absorción atómica para cromo total

Véase método espectrométrico de absorción atómica de llama, secciones 3111B y C, y método espectrométrico de absor-

3500-Cr C.

ción atómica electrotérmica, sección 3113.

Método de plasma de acoplamiento inductivo

Véase sección 3120.

3500-Cr D. 1.

Método colorimétrico

Discusión general

a) Principio: Este procedimiento mide únicamente el cromo hexavalente (Cr6 + ). Por tanto, para determinar el cromo total hay que convertir todo el cromo a la forma hexavalente oxidando con permanganato potásico. El cromo hexavalente se determina colorimétricamente por una reacción con difenilcarbazida en solución acida. Se produce un color rojovioleta de composición desconocida. La reacción es muy sensible, siendo la capacidad de absorción molar, basada en el cromo, de aproximadamente 40.000 1 g -1 c m - 1 a 540 nm. Para determinar el cromo total, digiérase la muestra con una mezcla acida sulfúrico-nítrico y oxídese después con permanganato potásico antes de la reacción con la difenilcarbazida. b) Interferencias: La reacción con la difenilcarbazida es prácticamente específica para el cromo. Las sales de molibdeno hexavalente y de mercurio reaccionarán para formar color con el reactivo, pero las intensidades son mucho más ba-

jas que para el cromo al pH especificado. Se pueden tolerar concentraciones de hasta 200 mg Mo o Hg/1. El vanadio interfiere fuertemente, pero las concentraciones hasta 10 veces las del cromo no causarán problemas. La interferencia potencial de permanganato se elimina por reducción previa con azida. El hierro, a concentraciones superiores a 1 mg/1, puede producir un color amarillo, pero el color de ion férrico (Fe3 + ) no es fuerte, y normalmente no se encuentran dificultades si se mide la absorbancia fotométricamente a la longitud de onda apropiada. Las cantidades de molibdeno, vanadio, hierro y cobre que interfieren pueden eliminarse por extracción de los cupferratos de estos metales con cloroformo (CHC13). Existe un método de extracción, pero no se debe utilizar a menos que sea necesario, pues el cupferrón y CHCI3 residuales en la solución acuosa complican la posterior oxidación. Por tanto, sígase la extracción por tratamiento adicional de ácido fumante para descomponer estos compuestos.

3-103

DETERMINACIÓN DE METALES

2.

Instrumental

a) Equipo de colorimetría: Se requiere uno de los siguientes: 1) Espectrofotómetro, para utilizarlo a 540 nm con un trayecto luminoso de 1 cm o más largo. 2) Fotómetro de filtro, con un trayecto luminoso de 1 cm o más largo y equipado con un filtro amarillo verdoso que tiene una transmitancia máxima próxima a 540 nm. b) Embudos de separación, 125 ml, forma Squibb, con espita y tapón de vidrio o TFE. 3.

Reactivos

Utilícese agua redestilada para preparar los reactivos. a) Solución de cromo de reserva: Disuélvanse 141,4 mg de K2Cr2O2 en agua y dilúyase hasta 1.000 ml; 1,00 ml = 50,0 μg Cr. b) Solución de cromo patrón: Diluyanse 10,0 ml de solución de cromo de reserva hasta 100 ml; 1,00 ml = 5,00 μg Cr. c) Ácido nítrico, HNO3 conc. d) Ácido sulfúrico, H2SO4 1 + 1. e) Solución de indicador naranja de metilo. f) Peróxido de hidrógeno, H2O2, al 30 por 100. g) Agua redestilada: Destílese el agua que se vuelve a destilar en un aparato hecho completamente de vidrio. h) Hidróxido amónico, NH4PH conc. i) Solución de permanganato potásico: Disuélvanse 4 g de KMnO4 en 100 ml de agua. j) Solución de azida sódica: Disuélvanse 0,5 g de NaN3 en 100 ml de agua. k) Solución de fenilcarbazida: Disuélvanse 250 mg de 1,5-difenilcarbazida (1,5-difenilcarbohidrazida) en 50 ml de acetona. Consérvese en frasco topacio.

Descártese cuando la solución se decolora. l) Cloroformo, CHC13: Evítese, o redestílese, el material que viene en recipientes metálicos o con tapones de forro metálico. m) Solución de cupferrón: Disuélvanse 5 g de C6H5N(NO)ONH4 en 95 ml de agua. n) Ácido fosfórico, H3PO4 conc. o) Ácido sulfúrico, H2SO4 0,2N: Dilúyanse 17 ml de H2SO4 6N hasta 500 ml con agua. 4.

Procedimiento

a) Preparación de la curva de calibración: Para compensar posibles pérdidas ligeras de cromo durante la digestión u otras operaciones analíticas, trátense los patrones de cromo por el mismo procedimiento que la muestra. Para ello, llévense con la pipeta volúmenes medidos de solución de cromo patrón (5 μg/ml) que varían entre 2,00 y 20,0 ml, para obtener patrones de 10 a 100 μg Cr, a vasos o matraces erlenmeyer de 250 ml. Según el tratamiento previo empleado en el siguiente apartado b, procédase con el subsiguiente tratamiento de patrones como si fueran muestras, realizándose el tratamiento de cupferrón de los patrones si ha sido requerido para las muestras. Desarróllese el color como en el caso de las muestras, pásese una porción adecuada de cada solución coloreada a una célula de absorción de 1 cm y mídase la absorbancia a 540 nm. Utilícese agua destilada como referencia. Corríjanse las lecturas de absorbancia de los patrones restando la absorbancia de un blanco de reactivo que ha sido trabajado con el mismo método. Trácese una curva de calibración llevando valores de absorbancia corregidos frente a microgramos de cromo en un volumen final de 102 ml. b) Tratamiento de la muestra: Si la muestra se ha filtrado y acidulado y sólo

3-104

se desea determinar el cromo hexavalente, sígase el apartado 4e. Si se desea determinar el cromo disuelto total y hay cantidades de molibdeno, vanadio, cobre o hierro que interfieren, sígase el apartado 4c. Si no existen interferencias, sígase el apartado 4d. Si la muestra está sin filtrar y se desea determinar el cromo total, digiérase con HNO3 y H2SO4 como se indica en la sección 3030G. Si existen interferencias, síganse los apartados 4c, 4d y 4e. Si no hay interferencias, procédase como en los apartados 4d y 4e. c) Eliminación de molibdeno, vanadio, hierro y cobre con cupferrón: Llévese con la pipeta una porción de muestra digerida que contenga entre 10 y 100 μg Cr a un embudo de separación de 125 ml. Dilúyase a aproximadamente 40 ml con agua destilada y enfríese en baño de hielo. Añádanse 5 ml de solución de cupferrón enfriada con hielo, sacúdase bien y déjese reposar en el baño de hielo durante 1 minuto. Extráigase en el embudo separador con tres porciones sucesivas de 5 ml de CHC13; sacúdase cuidadosamente cada porción con la solución acuosa, déjense separar las capas y retírese y descártese el extracto de CHC13. Pásese la solución acuosa extraída a un erlenmeyer de 125 ml. Lávese el embudo de separación con una pequeña cantidad de agua destilada y añádase el agua del lavado al matraz. Llévese a ebullición durante aproximadamente 5 minutos para volatizar CHC13 y enfríese. Añádanse 5 ml de HNO3 y el H2SO4 suficiente para que haya aproximadamente 3 ml. Hiérvanse las muestras hasta la aparición de humos de SO3. Enfríese ligeramente, añádanse cuidadosamente 5 ml de HNO3 y llévese de nuevo a ebullición hasta el desprendimiento de humos para completar la descomposición de materia orgánica. Enfríese, lávense las paredes laterales del matraz y llévese otra vez a ebullición hasta desprendimiento de humos de SO3 para eliminar

MÉTODOS NORMALIZADOS

todo el HNO3. Enfríese y añádanse 25 ml de agua. d) Oxidación de cromo trivalente: Llévese con la pipeta a un erlenmeyer de 125 ml una porción de muestra digerida, con o sin las interferencias eliminadas, y que contenga entre 10 y 100 μg Cr. Empleando indicador naranja de metilo, añádase NH4OH conc. hasta que la solución sea justo básica al naranja de metilo. Añádase H2SO4 1 + 1, gota a gota, hasta que se vuelva acida, más 1 ml (20 gotas) adicional. Ajústese el volumen a aproximadamente 40 ml, añádase un pedacito de plato poroso y caliéntese a ebullición. Añádanse dos gotas de solución de KMnO 4 para obtener un color rojo oscuro. Si se empalidece, añádase KMnO4, gota a gota, hasta mantener un exceso de aproximadamente dos gotas. Hiérvase 2 minutos más. Añádase 1 ml de solución de NaN3 y continúese una suave ebullición. Si el color rojo no desaparece por completo después de una ebullición de aproximadamente 30 segundos, añádase otro ml de solución de NaN3. Continúese la ebullición un minuto más después de desaparecido el color por completo, y enfríese a continuación. Añádanse 0,25 ml (cinco gotas) de H3PO4. e) Desarrollo del color y medida: Utilícese H2SO4 0,2N y un pHmetro para ajustar la solución a pH 1,0 ± 0,3. Pásese la solución a un matraz volumétrico, dilúyase hasta 100 ml y mézclese. Añádanse 2,0 ml de solución de difenicarbazida, mézclese y déjese reposar 5 a 10 minutos para el total desarrollo de color. Pásese una porción apropiada a una célula de absorción de 1 cm y mídase su absorbancia a 540 nm. Utilícese agua destilada como referencia. Corríjase la lectura de la absorbancia restando la absorbancia de un blanco tratado con el mismo método (véase la nota a continuación). Determínense los microgramos de cromo presentes a partir de la absorbancia corregida por referencia a la curva de calibración.

3-105

DETERMINACIÓN DE METALES

NOTA: Si la solución está turbia después de dilución a 100 ml en el anterior apartado e, tómese una lectura de absorbancia previa a la adición del reactivo carbazida y corríjase la lectura de absorbancia de la solución coloreada final restando la absorbancia medida previamente.

una muestra sintética con 110 μg Cr/1, 500 μg Al/1, 50 μg Cd/1, 470 μg Ca/1, 300 μg Fe/1, 70 μg Pb/1, 120 μg Mn/1, 150 μg Ag/1 y 650 μg Zn/1 en agua destilada. La desviación relativa estándar era de 47,8 por 100 y el error relativo de 16,3 por 100. 7. Bibliografía

5. Cálculos

donde: A = ml de muestra original, y B = ml de porción de 100 ml de muestra digerida.

6. Precisión y sesgo Se determinó en 31 laboratorios el cromo disuelto (trivalente y hexavalente) en

3500-Co

3500-Co A.

R OWLAND , G. P., J R . 1939. Photoelectric colorimetry—Optical study of permanganate ion and of chromium-diphenylcarbazide system. Anal. Chem. 11:442. SALTZMAN, B. E. 1952. Microdetermination of chromium with diphenylcarbazide by permanganate oxidation. Anal. Chem. 24:1016. URONE, P. F. 1955. Stability of colorimetric reagent for chromium, 5-diphenylcarbazide, in various solvents. Anal. Chem. 27:1354. ALLEN, T. L. 1958. microdetermination of chromium with 1,5-diphenylcarbohydrazide. Anal. Chem. 30:447. SANDELL, E. B. 1959. Colorimetric Determination of Traces of Metals, 3.a ed. Interscience Publishers, Nueva York.

COBALTO

Introducción

1. Incidencia

2.

Selección del método

El cobalto se encuentra en las aguas naturales normalmente en una proporción < 10 μg/1. En las aguas residuales puede haber proporciones más altas.

Utilícese el método espectrométrico de absorción atómico de llama o de horno, o el método de plasma de acoplamiento inductivo.

3-106

3500-Co B.

MÉTODOS NORMALIZADOS

Método espectrométrico de absorción atómica

Véase el método espectrométrico de absorción atómica de llama, secciones 3111B y C, y el método espectrométrico

3500-Co C.

de absorción atómica electrotérmica, sección 3113.

Método de plasma de acoplamiento inductivo

Véase sección 3120.

3500-Cu

3500-Cu A. 1.

Incidencia y significación

Las sales de cobre se utilizan en los sistemas de suministro de agua para control de crecimientos biológicos en depósitos y tuberías de distribución y para catalizar la oxidación de manganeso. La corrosión de las aleaciones que contienen cobre en accesorios de tuberías puede introducir cantidades medibles de cobre en el agua de un sistema de conducción. El cobre es esencial para los seres humanos; se calcula en 2,0 mg la necesidad diaria de cobre para una persona adulta.

* Aprobado por el Standard Methods Committee, 1988.

COBRE*

Introducción 2.

Selección del método

Se recomiendan los métodos espectrométrico de absorción atómica, de plasma de acoplamiento inductivo y de la neocuproína, debido a que no presentan interferencias. El método de la batocuproína puede ser útil para aguas potables. 3. Toma de muestras y almacenamiento Los iones de cobre tienden a adsorberse en la superficie de los recipientes de las muestras. Por esta razón se deben analizar las muestras lo antes posible tras su toma. Si es necesario almacenarlas, utilícense 0,5 ml de HC1 1 + 1/100 ml de muestra para evitar esta adsorción.

3-107

DETERMINACIÓN DE METALES

3500-Cu B.

Método espectrométrico de absorción atómica

Véase método espectrométrico de absorción atómica de llama, secciones 3111B y C, y método espectrométrico de

3500-Cu C.

absorción atómica electrotérmica, sección 3113.

Método de plasma de acoplamiento inductivo

Véase sección 3120.

3500-Cu D. 1.

Método de la neocuproína

Discusión general

a) Principio: El ion cuproso (Cu+) en solución neutra o ligeramente acida reacciona con 2,9-dimetil-l,10-fenantrolina (neocuproína) para formar un complejo en el que se unen dos moles de neocuproína a un mol de ion Cu + . El complejo se puede extraer por cierto número de disolventes orgánicos entre los que se incluyen una mezcla de cloroformo-metanol (CHCI3-CH3OH), para dar una solución amarilla con una capacidad de absorción molar de aproximadamente 8.000 a 457 nm. La reacción es virtualmente específica para cobre; el color sigue la ley de Beer hasta una concentración de 0,2 mg Cu/25 ml de disolvente; se obtiene un desarrollo completo del color cuando el pH de la solución acuosa está entre 3 y 9; el color es estable en CHC13CH3OH durante varios días. Se trata la muestra con clorhidrato de hidroxilamina para reducir los iones cúpricos a iones cuprosos. Se emplea citrato sódico para complejar los iones metálicos que podían precipitar al elevar-

se el pH. Se ajusta el pH entre 4 y 6 con NH4OH, se añade una solución de neocuproína en metanol, y el complejo resultante se extrae con CHC13. Después de diluir el CHC13 hasta volumen exacto con CH3OH, se mide la absorbancia de la solución a 457 nm. b) Interferencia: Pueden interferir cantidades grandes de cromo y de estaño. Evítese la interferencia de cromo añadiendo ácido sulfuroso para reducir el ion cromato y el crómico complejo. En presencia de mucho estaño o de cantidades excesivas de otros iones oxidantes, utilícense hasta 20 ml adicionales de solución de clorhidrato de hidroxilamida. Interfieren también cianuro, sulfuro y materia orgánica, pero pueden ser eliminados por digestión. c) Concentración mínima detectable: La concentración mínima detectable que corresponde a 0,01 de absorbancia o 98 por 100 de transmitancia es de 3 μg Cu cuando se emplea una célula de 1 cm, y de 0,6 μg Cu cuando se emplea una célula de 5 cm.

MÉTODOS NORMALIZADOS

3-108

2.

Instrumental

a) Equipo calorimétrico: Se necesita uno de los siguientes: 1) Espectrofotómetro, para usarlo a 457 nm, que proporcione un trayecto luminoso de 1 cm o más largo. 2) Fotómetro de filtro, que proporcione un trayecto luminoso de 1 cm o más largo y equipado con un filtro violeta de banda estrecha que tiene una transmitancia máxima en el intervalo de 450 a 460 nm. b) Embudos de separación, 125 ml, forma Squibb, con llave y tapón de vidrio o de TFE. 3.

Reactivos

a) Agua redestilada, libre de cobre: Como la mayor parte del agua destilada ordinaria contiene cantidades detectables de cobre, utilícese agua redestilada, preparada por destilación del agua destilada una vez en un destilador de vidrio resistente, o agua destilada pasada a través de una unidad de intercambio iónico, para preparar todos los reactivos y soluciones. b) Solución de cobre de reserva: Añádanse 10 ml de agua y 5 ml de HNO3 conc. a 200,0 mg de lámina o alambre de cobre electrolítico pulimentado en un erlenmeyer de 250 ml. Cuando la reacción se haya hecho más lenta, caliéntese suavemente para completar la disolución del cobre y llévese a ebullición para expulsar los óxidos de nitrógeno, adoptando precauciones para evitar pérdidas de cobre. Enfríese, añádanse aproximadamente 50 ml de agua, pásese cuantitativamente a un matraz volumétrico de 1 l y dilúyase con agua hasta la señal; 1 ml = 200 μg Cu. c) Solución de cobre patrón: Diluyanse con agua 50,00 ml de solución de cobre de reserva hasta 500 ml; 1,00 ml = 20,0 μg Cu. d) Ácido sulfúrico, H2SO4 conc.

e) Solución de clorhidrato de hidroxilamina: Disuélvanse 50 g de NH2OHHC1 en 450 ml de agua. f) Solución de curato de sodio: Disuélvanse 150 g de Na3C6H5O7·2H2O en 400 ml de agua. Añádanse 5 ml de solución de NH2OHHC1 y 10 ml de reactivo neocuproína. Extráigase con 50 ml de CHC13 para eliminar las impurezas de cobre y descártese la capa de CHC13. g) Hidróxido amónico, NH4OH 5N: dilúyanse con agua 330 ml de NH4OH conc. (28-29 por 100) hasta 1.000 ml. Guárdese en frasco de polietileno. h) Papel de rojo Congo u otro papel de ensayo de pH que presente un cambio de color entre pH 4 y 6. i) Reactivo de neocuproína: Disuélvanse 100 mg de hemihidrato de 2,9dimetil-l,10-fenantrolina* en 100 ml de metanol. Esta solución es estable durante un mes o más, en condiciones normales de almacenamiento. j) Cloroformo, CHC13: Evítese o redestílese el material que llega en recipientes con tapa forrada de metal. k) Metanol, CH3OH, calidad reactivo. i) Ácido nítrico, HNO3 conc. m) Ácido clorhídrico, HC1 conc. 4.

Procedimiento

a) Preparación de la curva de calibración: Llévense con la pipeta 50 ml de agua a un embudo de separación de 125 ml para utilizarlos como blanco de reactivo. Prepárense patrones llevando con la pipeta 1,00 a 10,00 ml (20,0 a 200 μg Cu) de solución de cobre patrón a una serie de embudos de separación de 125 ml y dilúyase con agua hasta 50 ml. Añádase 1 ml de H2SO4 conc. y utilícese el procedimiento de extracción indicado en el apartado siguiente 4b. * GFS Chemical Company, Columbus, Ohio, o equivalente.

3-109

DETERMINACIÓN DE METALES

Trácese una curva de calibración llevando la absorbancia frente a microgramos de cobre. Para preparar una curva de calibración para menores cantidades de cobre, dilúyanse 10,0 ml de solución de cobre patrón hasta 100 ml. Trátense volúmenes de 1,00 a 10,00 ml de este patrón diluido por el procedimiento antes descrito, pero utilícense células de 5 cm para medir la absorbancia. b) Tratamiento de la muestra: Pásense 100 ml de muestra a un vaso de 250 ml, añádase 1 ml de H2SO4 conc. y 5 ml de HNO3 conc. Añádase un poco de plato poroso y evapórese cuidadosamente sobre placa caliente hasta desprendimiento de humos blancos densos de SO3. Si la solución queda coloreada, enfríese, añádanse otros 5 ml de HNO3 conc. y evapórese de nuevo hasta que aparezcan humos blancos densos. Repítase, si es necesario, hasta que la solución se vuelva incolora. Enfríese, añádanse aproximadamente 80 ml de agua y llévese a ebullición. Enfríese y fíltrese en un matraz volumétrico de 100 ml. Llévese hasta 100 ml con agua utilizando la mayor parte de los lavados de vaso y filtro. Llévense con la pipeta 50,0 ml u otra porción adecuada que contenga de 4 a 200 μg de Cu, desde la solución obtenida del tratamiento preliminar a un embudo de separación de 125 ml. dilúyase con agua, si es necesario, hasta 50 ml. Añádanse 5 ml de solución de NH2OH·HC1 y 10 ml de solución de citrato sódico y mézclese cuidadosamente. Ajústese el pH a aproximadamente 4, añadiendo incrementos de 1 ml de NH4OH hasta que el papel rojo Congo dé un rojo definido (otros papeles indicadores de pH dan un valor entre 4 y 6). Añádanse 10 ml de reactivo neocuproína y 10 ml de CHC13. Tápese y sacúdase vigorosamente durante 30 segundos o más para extraer el complejo cobreneocuproína con el CHC13. Déjese sepa-

rar la mezcla en dos capas y llévese la capa inferior de CHC13 a un matraz volumétrico de 25 ml, teniendo cuidado de no coger nada de la capa acuosa. Repítase la extracción de la capa acuosa con 10 ml de CHC13 adicionales y combínense los extractos. Dilúyanse los extractos combinados hasta 25 ml con CH3OH, ciérrese y mézclese cuidadosamente. Pásese una porción apropiada de extracto a una célula de absorción adecuada (1 cm para 40 a 200 μg Cu; 5 cm para cantidades menores) y mídase la absorbancia a 457 nm o con un filtro de 450 a 460 nm. Utilícese un blanco de muestra preparado por tratamiento de 50 ml de agua con una digestión completa y con el procedimiento analítico. Determínense los microgramos de cobre en la solución final por referencia a la curva de calibración apropiada. 5.

Cálculos

6.

Bibliografía

SMITH, G. F. & W. H. MCCURDY. 1952. 2,9Dimethyl-l,10-phenanthroline: New specific in spectrophotometric determination of copper. Anal. Chem. 24:371. LUKE, C. L. & M. E. CAMPBELL. 1953. Determination of impurities in germanium and silicon. Anal. Chem. 25:1586. GAHLER, A. R. 1954. Colorimetric determination of copper with neocuproine. Anal. Chem. 26:577. FULTON, J. W. & J. H ASTINGS. 1956. Photometric determinations of copper in aluminum and lead-tin solder with neocuproine. Anal. Chem. 28:174. FRANK, A. J., A. B. G OULSTON & A. A. DEACUTIS. 1957. Spectrophotometric determination of copper in titanium. Anal. Chem. 29:750.

3-110

MÉTODOS NORMALIZADOS

3500-Cu E. 1.

Método de la batocuproína

Discusión general

a) Principio: El ion cuproso forma un quelato de color naranja soluble en agua con disulfonato de batocuproína (sal disódica del ácido 2,9-dimetil-4,7-difenil1,10-fenantrolindisulfónico). Aunque el color se forma en el intervalo de pH 3,5 a 11,0, el intervalo de pH recomendado es entre 4 y 5. La muestra se tampona a un pH de aproximadamente 4,3 y se reduce con clorhidrato de hidroxilamina. Se mide la absorbancia 484 nm. El método puede aplicarse de cobre hasta al menos 5 mg/1 con una sensibilidad de 20 μg/l. b) Interferencia: Las siguientes sustancias pueden tolerarse con un error inferior a ±2 por 100:

También pueden interferir cianuro, tiocianato, persulfato y EDTA. c) Concentración mínima detectable: 20 μg/1 con una célula de 5 cm. 2. Instrumental a) Equipo colorimétrico: Uno de los siguientes, con un trayecto luminoso de 1 a 5 cm (a menos que se empleen tubos de Nessler): 1) Espectrofotómetro, para su uso a 484 nm. 2) Fotómetro de filtro, equipado con un filtro azul-verde que presenta un máximo de transmisión luminosa próximo a 484 nm. 3) Tubos de Nessler, emparejados, de 100 ml, forma alargada. b) Material de vidrio lavado con ácido: Enjuáguese todo el material de vidrio con HC1 conc. y después con agua libre de cobre. 3. Reactivos a) Agua libre de cobre: Véase método D, apartado 3a. b) Solución de cobre de reserva: Prepárese como se indica en el método D, apartado 3b, pero utilizando 20,00 mg de lámina o alambre de cobre; 1,00 ml = = 20,00 μg Cu. c) Solución de cobre patrón: Diluyanse 250 ml de solución de cobre de reserva hasta 1.000 ml empleando agua; 1,00 ml = = 5,00 μg Cu. Prepárese diariamente. d) Acido clorhídrico, HC1 1 + 1. e) Solución de clorhidrato de hidroxilamina: Véase método D, apartado 3e.

3-111

DETERMINACIÓN DE METALES

f) Solución de curato de sodio: Disuélvanse 300 g de Na3C6H5O7·2H2O en agua y llévese hasta 1.000 ml. g) Solución de disulfonato de batocuproína disódico: Disuélvanse 1.000 g de C12H4N2(CH3)2(C6H4)2(SO3Na)2 en agua y llévese hasta 1.000 ml. 4.

Procedimiento

Llévense con la pipeta 50,0 ml de muestra, o porción adecuada diluida hasta 50,0 ml, a un erlenmeyer de 250 ml. En distintos matraces erlenmeyer de 250 ml, prepárese un blanco de agua de 50,0 ml y una serie de patrones de cobre de 50,0 ml que contengan 5,0, 10,0, 15,0, 20,0 y 25,0 μg Cu. Añádanse a la muestra blanco y patrones, mezclando después de cada adición 1,00 ml de HC1 1 + 1, 5,00 ml de solución de NH2OH·HC1, 5,00 ml de solución de citrato de sodio y 5,00 ml de solución de disulfonato de batocuproína disódico. Pásese a las células y léase la absorbancia de la muestra frente al blanco a 484 nm. Para la curva de calibración, márquese la absorbancia en función de los microgramos de Cu en los patrones. Calcúlese la concentración a partir de la curva de calibración.

3500-Au

3500-Au A. Debido a su extremada insolubilidad, el oro únicamente se encuentra en cantidades traza en las aguas naturales (< 1 μg/1) incluso en áreas mineralizadas.

5. Cálculos

6. Precisión y sesgo Se analizó en 33 laboratorios una muestra sintética con 1.000 μg Cu/1, 500 μg Al/1, 50 μg Cd/l, 110 μg Cr/l, 300 μg Fe/1, 70 μg Pb/1, 50 /μg Mn/1, 150 μg Ag/1 y 650 μg Zn/1, empleando el método de batocuproína, con una desviación relativa estándar de 4,1 por 100 y un error relativo de 0,3 por 100. 7. Bibliografía SMITH, G. F. & D. H. WILKINS. 1953. New colorimetric reagent specific for copper. Anal. Chem. 25:510. BORCHARDT, L. G. & J. P. BUTLER. 1957. Determination of trace amounts of copper. Anal. Chem. 29:414. ZAK, B. 1958. Simple procedure for the single sample determination of serum copper and iron. Clínica Chim. Acta 3:328. BLAIR, D. & H. DIEHL. 1961. Bathophenanthrolinedisulfonic acid and bathocuproinedisulfonic acid, water soluble reagents for iron and copper. Talanta 7:163.

ORO

Introducción Las aguas residuales de las operaciones de la minería del oro pueden tener concentraciones más altas.

3-112

3500-Au B.

MÉTODOS NORMALIZADOS

Método espectrométrico de absorción atómica

Véase método espectrométrico de absorción atómica de llama, sección 3111B.

3500-lr

3500-lr A. El iridio es un elemento relativamente insoluble y sólo se encuentra normalmente a concentraciones muy bajas y

3500-lr B.

IRIDIO

Introducción asociado a material en partículas. Las aguas de procesado pueden contener concentraciones más altas.

Método espectrométrico de absorción atómica

Véase método espectrométrico de absorción atómica de llama, sección 3111B.

3500-Fe HIERRO*

3500-Fe A. 1.

Incidencia y significación

En las muestras filtradas de aguas superficiales oxigenadas, el hierro raramente alcanza concentraciones de 1 mg/1. Algunas aguas subterráneas y drenajes

* Aprobado por el Standard Methods Committee, 1985.

Introducción superficiales ácidos pueden contener una cantidad de hierro bastante mayor. El hierro del agua puede ocasionar manchas en la ropa de lavado y en la porcelana. Algunas personas son capaces de detectar el gusto astringente dulce-amargo a niveles por encima de 1 mg/1. En condiciones reductoras, el hierro existe en estado ferroso. En ausencia de iones que forman complejos, el hierro fé-

DETERMINACIÓN DE METALES

rrico no es significativamente soluble a menos que el pH sea muy bajo. Al exponerlo al aire o al añadir oxidantes, el hierro ferroso se oxida al estado férrico y puede hidrolizarse para formar óxido férrico hidratado insoluble. En muestras de agua, el hierro puede estar en forma de solución auténtica, en estado coloidal que puede ser peptizado por materia orgánica, en complejos inorgánicos u orgánicos de hierro o en partículas suspendidas relativamente gruesas. Puede estar en forma ferrosa o férrica, suspendida o disuelta. El cieno y la arcilla en suspensión pueden contener hierro soluble en ácido. Algunas veces se toman partículas de óxido de hierro con la muestra de agua por el desprendimiento de herrumbre desde las tuberías. El hierro puede provenir, además, del tapón metálico utilizado para cerrar la botella de la muestra. 2.

Selección del método

Los límites de detección y sensibilidad para el procedimiento espectrométrico de absorción atómica, el método de plasma de acoplamiento inductivo y el procedimiento colorimétrico de fenantrolina, aquí descritos, son similares y en general adecuados para el análisis de aguas naturales o tratadas. Los reactivos complejantes utilizados en los procedimientos colorimétricos son específicos para el hierro ferroso, pero los procedimientos de absorción atómica no lo son. Sin embargo, debido a la inestabilidad del hierro ferroso, que pasa fácilmente a la forma férrica en solución en contacto con el aire, la determinación de hierro ferroso requiere precauciones especiales y puede ser necesario realizarla in situ en el momento de la toma de muestra. El procedimiento de determinación del hierro ferroso con 1,10-fenantrolina (véase 3500-Fe.D.4c) tiene cierta limitación en su aplicabilidad; ha de evitarse un al-

3-113

macenamiento prolongado o la exposición de las muestras a la luz. Con un procedimiento especial, que utiliza la batofenantrolina, se puede obtener una distinción cuantitativa rigurosa entre hierro ferroso y férrico. Los métodos espectrométricos que emplean batofenantrolina1-6 y otros reactivos orgánicos complejantes, tales como ferrozina o TPTZ, son capaces de determinar concentraciones de hierro tan bajas como 1 μg/1. Existe un procedimiento de quimioluminiscencia cuyo límite de detección se ha establecido en 5 ng/1. En otras partes se han descrito otros procedimientos10-13. 3. Toma de muestras y almacenamiento

Planifíquense de antemano los métodos de toma, almacenamiento y tratamiento previo de las muestras. Límpiese con ácido el recipiente de la muestra y enjuáguese con agua destilada. Puede ser necesario un equipo de filtración con membrana de las muestras in situ para determinar el hierro en solución (hierro disuelto). Se considera que el hierro disuelto pasa a través de un filtro de membrana de 0,45 μm, pero puede quedar incluido el hierro coloidal. El valor de la determinación depende en gran parte del cuidado puesto en la obtención de una muestra representativa. El hierro de las muestras de agua de pozo o del grifo puede variar en concentración y forma con la duración y el grado de afluencia antes y durante la toma de muestra. Cuando se tome una porción de muestra para determinar el hierro en suspensión, sacúdase la botella de la muestra vigorosamente y con frecuencia para obtener una suspensión uniforme del hierro precipitado. Es necesario poner el máximo cuidado cuando el hierro coloidal se adhiere a la botella de la muestra. Este problema puede agudizarse cuando se utilizan botellas de plástico.

MÉTODOS NORMALIZADOS

3-114

Para obtener una determinación precisa del hierro total, utilícese un recipiente separado para la toma de la muestra. Trátese con ácido en el momento de la toma para disolver el hierro y evitar la adsorción o depósito sobre las paredes del recipiente de muestra. Téngase en cuenta el ácido añadido al medir porciones para análisis. La adición de ácido a la muestra puede eliminar la necesidad de añadir ácido antes de la digestión (apartado 3500-Fe.D.4a).

5.

6.

7.

8.

9.

4. 1.

2.

3.

4.

Referencias LEE, G. F. & W. STUMM. 1960. Determination of ferrous iron in the presence of ferric iron using bathophenanthroline. J. Amer. Water. Works Assoc. 52:1567. G HOSH , M. M., J. T. O'C ONNOR & R. S. ENGELBRECHT . 1967. Bathophenanthroline method for the determination of ferrous iron. J. Amer. Water Works Assoc. 59:897. B LAIR , D. & H. D IEHL . 1961. Bathophenanthroline-disulfonic acid and bathocuproinedisulfonic acid, water soluble reagents for iron and copper. Talanta 7:163. S HAPIRO , J. 1966. On the measurement of

3500-Fe B.

11.

12.

13.

Método espectrométrico de absorción atómica

Véase método espectrométrico de absorción atómica de llama, secciones 3111B y C, y método espectrométrico de

3500-Fe C.

10.

ferrous iron in natural waters. Limnol. Oceanogr. 11:293. M C M AHON , J. W. 1967. The influence of light and acid on the measurement of ferrous iron in lake water. Limnol. Oceanogr. 12:437. MCMAHON, J. W. 1969. An acid-free bathophenanthroline method for measuring dissolved ferrous iron in lake water. Water Res. 3:743. GIBBS, C. 1976. Characterization and application of ferrozine iron reagent as a ferrous iron indicator. Anal. Chem. 48:1197. D OUGAN , W. K. & A. L. W ILSON . 1973. Absorbtiometric determination of iron with TPTZ. Water Treat. Exam. 22:110. SEITZ, W. R. & D. M. HERCULES. 1972. Determination of trace amounts of iron (II) using chemiluminescence analysis. Anal. Chem. 44:2143. Moss, M. L. & M. G. MELLON. 1942. Colorimetric determination of iron with 2,2'-bipyridine and with 2,2',2"-tripyridine. Ind. Eng. Chem., Anal. Ed. 14:862. W ELCHER , F. J. 1947. Organic Analytical Reagents. D. Van Nostrand Co., Princeton, Nueva Jersey, Vol. 3, págs. 100-104. MORRIS, R. L. 1952. Determination of iron in water in the presence of heavy metals. Anal. Chem. 24:1376. D OIG , M. T., III, & D. F. M ARTIN . 1971. Effect of humic acids on iron analyses in natural water. Water Res. 5:689.

absorción atómica termoeléctrica, sección 3113.

Método de plasma de acoplamiento inductivo

Véase sección 3120.

DETERMINACIÓN DE METALES

3500-Fe D. 1.

3-115

Método de fenantrolina

Discusión general

a) Principio: Se disuelve el hierro, se reduce al estado ferroso por ebullición con ácido e hidroxilamina y se trata con 1,10-fenantrolina a pH de 3,2 a 3,3. El complejo rojo-naranja que se forma es un quelato de tres moléculas de fenantrolina por cada átomo de hierro ferroso. La solución coloreada obedece a la ley de Beer; su intensidad es independiente del pH entre 3 y 9. Un pH entre 2,9 y 3,5 asegura un rápido desarrollo del color en presencia de un exceso de fenantrolina. Los patrones del color son estables durante al menos 6 meses. b) Interferencia: Entre las sustancias que interfieren están los oxidantes fuertes, cianuro, nitrito, y fosfatos (más los polifosfatos que el ortofosfato), cromo, zinc en concentración 10 veces superior a la del hierro, cobalto y cobre por encima de 5 mg/1 y níquel por encima de 2 mg/1. El bismuto, el cadmio, el mercurio, el molibdato y la plata precipitan la fenantrolina. La ebullición inicial con ácido convierte los polifosfatos en ortofosfato y elimina el cianuro y el nitrito, que, por otra parte, podrían interferir. La adición de un exceso de hidroxilamina elimina los errores causados por concentraciones excesivas de reactivos fuertemente oxidantes. En la presencia de iones metálicos que interfieran, utilícese un mayor exceso de fenantrolina para sustituir a la complejada por los metales que interfieren. Cuando existen concentraciones excesivas de iones metálicos que interfieren, puede emplearse el método de extracción. Si existen cantidades apreciables de materia colorante u orgánica, puede ser necesario evaporar la muestra, llevar el residuo a combustión seca suave y volver a disolver en ácido. La combustión seca se puede realizar en crisoles de sílice, por-

celana o platino que hayan sido hervidos durante varias horas en HC1 1 + 1. La presencia de cantidades excesivas de materia orgánica puede hacer necesaria la digestión antes de emplear el procedimiento de extracción. c) Concentración mínima detectable: Concentraciones de hierro disuelto o total tan bajas como 10 μg/1 pueden determinarse con un espectrofotómetro provisto de células con un trayecto luminoso de 5 cm o más largo. Trátese un blanco con el procedimiento completo para la corrección. 2.

Instrumental

a) Equipo calorimétrico: Se necesita uno de los siguientes: 1) Espectrofotómetro, para utilizarlo a 510 nm, que proporciona un trayecto luminoso de 1 cm o más largo. 2) Fotómetro de filtro, que proporciona un trayecto luminoso de 1 cm o más largo y equipado con un filtro verde con una transmitancia máxima próxima a 510 nm. 3) Tubos de Nessler, emparejados, 100 ml, forma alargada. b) Material de vidrio lavado con ácido: Lávese todo el material de vidrio con ácido clorhídrico conc. (HC1) y enjuáguese con agua destilada antes de utilizarlo, con objeto de eliminar depósitos de óxido de hierro. c) Embudos de separación: 125 ml, forma Squibb, con espitas y tapones de vidrio o TFE. 3.

Reactivos

Utilícense reactivos bajos en hierro. Para preparar las soluciones patrón y de

MÉTODOS NORMALIZADOS

3-116

los reactivos, empléese agua destilada libre de hierro. Almacénense los reactivos en botellas con tapón de vidrio. Las soluciones de HC1 y acetato de amonio son estables indefinidamente si están herméticamente tapadas. Las soluciones de hidroxilamina, de fenantrolina y de hierro de reserva son estables durante varios meses. Las soluciones de hierro patrón no son estables; prepárense a diario según se necesiten, por dilución de la solución de reserva. Los patrones visuales en tubos de Nessler son estables durante varios meses si están bien cerrados y protegidos de la luz. a) Ácido clorhídrico, HC1 conc. con menos de 0,00005 por 100 de hierro. b) Solución de hidroxilamina: Disuélvanse 10 g de NH2OH·HC1 en 100 ml de agua. c) Solución tampón de acetato de amonio: Disuélvanse 250 g de NH4C2H3O2 en 150 ml de agua. Añádanse 700 ml de ácido acético conc. (glacial). Como incluso el NH4C2H3O2 de buena calidad contiene una cantidad significativa de hierro, prepárense nuevos patrones de referencia con cada preparación del tampón. d) Solución de acetato de sodio: Disuélvanse 200 g de NaC2H3O2·3H2O en 800 ml de agua. e) Solución de fenantrolina: Disuélvanse 100 mg de monohidrato de 1,10fenantrolina, CX2H8N2·H2O, en 100 ml de agua por agitación y calentamiento a 80 °C. No hervir. Descártese la solución si se oscurece. El calentamiento es innecesario si se añaden al agua dos gotas de HC1 conc. (NOTA: Un mililitro de este reactivo es suficiente para no más de 100 μg Fe.) f) Solución de hierro de reserva: Utilícese metal (1) o sal (2) para preparar la solución de reserva. 1) Utilícese alambre de hierro electrolítico o «alambre de hierro para estandarización» en la preparación de la solu-

ción. Si es necesario, límpiese el alambre con papel de lija fino al objeto de eliminar cualquier capa de óxido y producir una superficie brillante. Pésense 200,0 mg de alambre e introdúzcanse en un matraz volumétrico de 1.000 ml. Disuélvanse en 20 ml de ácido sulfúrico (H2SO4) 6N y dilúyase con agua hasta la señal; 1,00 ml = = 200 μg Fe. 2) Si se prefiere sulfato amónico ferroso, añádanse lentamente 20 ml de H2SO4 conc. a 50 ml de agua y disuélvanse 1,404 g de Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O. Añádase permanganato potásico (KMnO4) 0,1N gota a gota hasta que persista un color rosa pálido. Diluyase hasta 1.000 ml con agua y mézclese; 1,00 ml = 200 μg Fe. g) Soluciones de hierro patrón: Prepárense diariamente para su uso. 1) Llévense con la pipeta 50,00 ml de solución de reserva a un matraz volumétrico de 1.000 ml y dilúyase con agua hasta la señal; 1,00 ml = 10,0 μg Fe. 2) Llévense con la pipeta 5,00 ml de solución de reserva a un matraz volumétrico de 1.000 ml y dilúyase con agua hasta la señal; 1,00 ml = 1,00 μg Fe. h) Éter diisopropilico o isopropílico. (PRECAUCIÓN: LOS éteres pueden formar compuestos explosivos; pruébense antes del uso.) 4.

Procedimiento

a) Hierro total: Mézclese cuidadosamente la muestra y mídanse 50,0 ml en un erlenmeyer de 125 ml. Si este volumen de muestra contiene más de 200 μg de hierro, utilícese una porción más pequeña medida con precisión y dilúyase hasta 50,0 ml. Añádanse 2 ml de HC1 conc. y 1 ml de solución de NH2OH · HC1. Añádanse unas cuantas bolas de vidrio y caliéntese a ebullición. Para asegurar la disolución de todo el hierro, continúese la ebullición hasta que el volumen se reduz-

DETERMINACIÓN DE METALES

ca a 15-20 ml. (Si la muestra ha sido sometida a combustión seca, disuélvase el residuo en 2 ml de HC1 conc. y 5 ml de agua). Enfríese hasta temperatura ambiente y pásese a un matraz volumétrico de 50 o 100 ml o a un tubo de Nessler. Añádanse 10 ml de solución tampón de NH4C2H3O2 y 4 ml de solución de fenantrolina y dilúyase con agua hasta la señal. Mézclese cuidadosamente y déjese al menos durante 10 a 15 minutos para que se desarrolle el color al máximo. b) Hierro disuelto: Inmediatamente después de tomada, fíltrese la muestra a través de un filtro de membrana de 0,45 μg a un matraz de vacío que contenga 1 ml de HC1 conc./100 ml de muestra. Analícese el filtrado en cuanto al hierro total disuelto (apartado 4a) y/o hierro ferroso disuelto (apartado 4c). (Este procedimiento también puede emplearse en el laboratorio sabiendo que la exposición normal de la muestra al aire durante el traslado puede dar lugar a la precipitación del hierro.) Calcúlese el hierro suspendido restando el hierro disuelto del hierro total. c) Hierro ferroso: Determínese el hierro ferroso en el lugar donde se ha tomado la muestra, pues con el tiempo puede cambiar la relación ferroso-férrico en soluciones acidas. Para determinar el hierro ferroso solamente, acidúlese una muestra separada con 2 ml de HC1 conc./ 100 ml de muestra en el momento de su toma. Llénese una botella directamente de la fuente de donde se toman las muestras y tápese. Extráigase a continuación una porción de 50 ml de muestra acidulada y añádanse 20 ml de solución de fenantrolina y 10 ml de solución de NH4C2H3O2 agitando con energía. Diluyase hasta 100 ml y mídase la intensidad del color dentro de los 5 a 10 minutos. No hay que exponerla a la luz del sol. (El desarrollo de color es rápido en presencia de exceso de fenantrolina. El volumen de fenantrolina dado es adecuado para menos de 50 μg de hierro total;

3-117

si existen cantidades mayores, utilícese un volumen de fenantrolina correspondientemente mayor a un reactivo más concentrado. Se necesita un exceso de fenantrolina por la cinética del proceso de formación de complejo.) Calcúlese el hierro férrico por sustracción del hierro ferroso del hierro total. d) Medida del color: Prepárese una serie de patrones llevando con la pipeta volúmenes calculados con precisión de soluciones de hierro patrón (utilícese una solución más débil para medir porciones de 1 a 10 μg) a matraces erlenmeyer de 125 ml, diluyendo hasta 50 ml por adición de volúmenes medidos de agua y realizando los pasos indicados en el apartado 4a. Para comparación visual, prepárese una serie de 10 patrones por lo menos, cuyo contenido varíe de 1 a 100 μg Fe en el volumen final de 100 ml. Compárense los colores en tubos de Nessler de 100 ml de forma alargada. Para la medida fotométrica, utilícese la tabla 3500-Fe:I como una guía aproximada para la selección del apropiado trayecto luminoso a 510 nm. Léanse los patrones frente a agua destilada fijada a absorbancia cero y trácese una curva de calibración, incluyendo un blanco (véase apartado 3c y la Introducción general).

TABLA 3500-FE:I. SELECCIÓN DE LONGITUD DEL RECORRIDO DE LUZ PARA DIVERSAS CONCENTRACIONES DE HIERRO

3-118

Si las muestras tienen color o turbidez, realícense todos los pasos del procedimiento con un segundo juego de muestras sin añadir fenantrolina. En lugar de agua destilada, utilícense los blancos preparados para fijar el cero de absorbancia del fotómetro y léase cada muestra revelada con fenantrolina frente al correspondiente blanco sin fenantrolina. Trasládense las lecturas observadas en el fotómetro a valores de hierro empleando una curva de calibración. Este procedimiento no compensa los iones que interfieren. e) Muestras que tienen interferencias orgánicas: Digiéranse las muestras que contienen cantidades sustanciales de materias orgánicas según las indicaciones dadas en las secciones 3030G y H. 1) Si se ha preparado una muestra siguiendo las indicaciones dadas en la sección 3030G o en la 3030H, llévense con la pipeta 10,0 ml u otra porción adecuada que contenga 20 a 500 μg Fe a un embudo de separación de 125 ml. Si el volumen tomado es menor de 10 ml, añádase agua destilada hasta llegar a los 10 ml. Añádanse 15 ml de HC1 conc. al embudo de separación para un volumen acuoso de 10 ml, o si la porción tomada es superior a 10,0 ml, añádanse 1,5 ml de HC1 conc./ml de muestra. Mézclese, enfríese y síganse las indicaciones del apartado 4e3). 2) Para preparar una muestra destinada únicamente a determinación de hierro, mídase un volumen adecuado que contenga 20 a 500 μg Fe y trátese por uno de los procedimientos de digestión descritos en las secciones 3030G y H. Utilícense, no obstante, sólo 5 ml de H2SO4 o HCIO4 y omítase el H2O2. Cuando la digestión es completa, enfríese, dilúyase con 10 ml de agua, caliéntese casi hasta ebullición para disolver las sales de disolución lenta y, si la muestra sigue estando turbia, fíltrese a través de un filtro de fibra de vidrio, de vidrio sin-

MÉTODOS NORMALIZADOS

terizado o de porcelana, lavando con 2 a 3 ml de agua. Pásese cuantitativamente el filtrado o la solución clara a un matraz volumétrico de 25 ml y llévese hasta 25 ml con agua. Vacíese el matraz en un embudo separador de 125 ml, enjuáguese con 5 ml de HC1 conc. que se añaden al embudo, y añádanse 25 ml de HC1 conc. medidos con el mismo vaso o matraz graduado. Mézclese y enfríese hasta temperatura ambiente. 3) Extráigase el hierro de la solución de HC1 del embudo de separación sacudiendo durante 30 segundos con 25 ml de éter isopropílico (PRECAUCIÓN). Apártese la capa acida inferior en un segundo embudo de separación. Extráigase de nuevo la solución acida con 25 ml de éter isopropílico, drénese la capa acida a un adecuado recipiente limpio y combínense las dos porciones de éter isopropílico. Vuélvase a verter la capa acida en el segundo embudo de separación y extráigase de nuevo con 25 ml de éter isopropílico. Sáquese y descártese la capa acida y añádase la capa etérea al embudo original. La persistencia de un color amarillo en la solución de HC1 después de tres extracciones no significa una separación incompleta del hierro, ya que el cobre, que no se ha extraído, da un color amarillo similar. Sacúdanse los extractos etéreos combinados con 25 ml de agua para hacer volver al hierro a la fase acuosa y pásese la capa acuosa inferior a un matraz volumétrico de 100 ml. Repítase la extracción con una segunda porción de 25 ml de agua, añadiendo ésta a la primera extracción acuosa. Descártese la capa etérea. 4) Añádase 1 ml de solución de NH2OH·HC1, 10 ml de solución de fenentrolina y 10 ml de solución de NaC2H3O2. dilúyase con agua hasta 100 ml, mézclese cuidadosamente y déjese reposar durante 10 minutos. Mídase la absorbancia a 510 nm utilizando una célula de absorción de 5 cm para cantidades de hierro inferiores a 10 μg, o una

3-119

DETERMINACIÓN DE METALES

célula de 1 cm para cantidades entre 100 y 500 μg. Como referencia empléese agua destilada o bien una muestra en blanco preparada tratando por el procedimiento analítico completo las cantidades de ácidos especificadas. Si se utiliza el agua destilada como referencia, corríjase la absorbancia de la muestra restándole la absorbancia de una muestra en blanco. Determínense los microgramos de hierro en la muestra a partir de la absorbancia (corregida, si es necesario) por referencia a la curva de calibración preparada utilizando un intervalo apropiado de patrones de hierro que contengan las mismas cantidades de fenantrolina, hidroxilamina y acetato de sodio que la muestra. 5.

Cálculos

Cuando la muestra ha sido tratada según 4a, b, c, o 4e2):

Cuando la muestra ha sido tratada según 4el):

Anótense los detalles de la toma de la muestra, almacenamiento y tratamiento previo, si son oportunos para la interpretación de los resultados.

6.

Precisión y sesgo

La precisión y el sesgo dependen del método de toma de la muestra y su almacenamiento, del método de la medida del color, de la concentración de hierro y de

la presencia de color interferente, turbidez e iones extraños. En general, la fiabilidad óptima de la comparación visual en tubos de Nessler no es superior al 5 por 100, y frecuentemente sólo 10 por 100, mientras que, en condiciones óptimas, la medida fotométrica puede ser fiable a 3 por 100 o 3 μg, que constituye una proporción mucho mayor. El límite de sensibilidad para observaciones visuales en tubos de Nessler es de aproximadamente 1 μg Fe. La variabilidad e inestabilidad de la muestra puede afectar a la precisión y al sesgo de esta determinación más que los errores del propio análisis. Se han encontrado serias divergencias en los informes de diferentes laboratorios debidas a las variaciones en los métodos de toma y tratamiento de muestras. En 44 laboratorios se analizó una muestra sintética con 300 μg Fe/1, 500 μg Al/1, 50 μg Cd/1, 110 μg Cr/1, 470 μg Cu/1, 70 μg Pb/1, 120 μg Mn/1, 150 μg Ag/1 y 650 μg Zn/1 en agua destilada, empleando el método de la fenantrolina, con una desviación relativa estándar de 25,5 por 100 y un error relativo de 13,3 por 100. 7.

Bibliografía

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3-120

MÉTODOS NORMALIZADOS

tion using 1,10-phenanthroline. Anal. Chem. 21:1521. REITZ, L. K., A. S. O'BRIEN & T. L. DAVIS. 1950. Evaluation of three iron methods using a factorial experiment. Anal. Chem. 22:1470. SANDELL, E. B. 1959. Colorimetric Determination of Traces of Metals, 3.a ed. Interscience Publishers, Nueva York, cap. 22.

3500-Pb

3500-Pb A. 1.

El plomo es un importante veneno que se acumula en el organismo. Las aguas naturales rara vez contienen por encima de 5 μg/1, aunque se ha informado sobre valores mucho más altos. El plomo de un suministro de agua puede ser de origen industrial, minero y de descargas de hornos de fundición o de cañerías viejas de plomo. Las aguas de grifo blandas y acidas y que no reciben un tratamiento adecuado contienen plomo como resultado del ataque a las tuberías de servicio. * Aprobado por el Standard Methods Committee, 1985.

Introducción Selección del método

El método espectrométrico de absorción atómica tiene un límite de detección relativamente alto en la modalidad de llama y requiere un procedimiento de extracción de las bajas concentraciones comunes en el agua potable; el método de absorción atómica electrotérmico es mucho más sensible para las bajas concentraciones y no requiere extracción. El método de plasma de acoplamiento inductivo tiene una sensibilidad similar a la del método de absorción atómica de llama. El método de ditizona es sensible y específico como procedimiento colorimétrico.

Método espectrométrico de absorción atómica

Véase método espectrométrico de absorción atómica de llama, secciones 3111B y C, y método espectrométrico de

3500-Pb C.

PLOMO*

2.

Incidencia

3500-Pb B.

SKOUGSTAD, M. W., M. J. FISHMAN, L. C. FRIEDMAN, D. E. ERDMANN & S. S. D UNCAN. 1979. Methods for Determination of Inorganic Substances in Water and Fluvial Sediment. Cap. Al en Book 5, Techniques of Water Resources Investigations of the United States Geological Survey. U. S. Geological Surv., Washington, D.C.

absorción atómica electrotérmica, sección 3113.

Método de plasma de acoplamiento inductivo

Véase sección 3120.

DETERMINACIÓN DE METALES

3500-Pb D. 1.

3-121

Método de la ditizona

Discusión general

a) Principio: Se mezcla una muestra acidulada que contenga cantidades del orden de microgramos de plomo con solución reductora amoniacal de citratocianuro y se extrae con ditizona en cloroformo (CHC13) para formar un ditizonato de plomo de color rojo cereza. Se mide fotométricamente el color de la solución de color mlxta1, 2. El volumen de muestra tomada para el análisis será de 21 cuando se emplea digestión. b) Interferencia: La ditizona forma complejos coloreados con bismuto, estaño estannoso y talio monovalente, en solución amoniacal débil de cianuro (pH 8,5 a 9,5). En solución amoniacal fuerte (pH 10 a 11,5) de citrato-cianuro, los ditizonatos de estos iones son inestables y sólo se pueden extraer parcialmente3. Este método utiliza una extracción única de ditizona, de color mixto, y pH elevado. La interferencia de estaño estannoso y talio monovalente se reduce posteriormente cuando estos iones se oxidan durante la digestión preliminar. Una modificación del método permite la detección y eliminación de la interferencia de bismuto. Las cantidades excesivas de bismuto, talio y estaño pueden eliminarse4. La ditizona en CHC1 3 absorbe a 510 nm; contrólese su interferencia mediante el empleo de concentraciones aproximadamente iguales de ditizona en exceso en muestras, patrones y blancos. El método carece de interferencia para la determinación de 0,0 a 30,0 μg Pb en presencia de 20 μg Tl+, 100 μg Sn2+, 200 μg In3 + , así como 1.000 μg de cada uno de los siguientes: Ba2+, Cd2+, Co2+, Cu2+, Mg2+, Mn2+, Hg2+, Sr2+, Zn2+, Al3 + , Sb3+, As3 + , Cr3+, Fe3 + , V3 + , PO3-4 y SO 2-4 . Cantidades del orden de gramos de metales alcalinos no interfieren. Existe una modificación para evi-

tar la interferencia de cantidades excesivas de bismuto o estaño. c) Tratamiento preliminar de la muestra: En el momento de la toma acidúlese con HNO 3 conc. hasta pH < 2, pero evítese un exceso de HNO3. Añádanse 5 ml de solución 0,1N de yodo para evitar las pérdidas de compuestos orgánicos de plomo volátiles durante la manipulación y digestión de las muestras. Prepárese un blanco de agua destilada libre de plomo y trátese según el procedimiento completo. d) Digestión de muestras: A menos que la digestión se muestre innecesaria, digiéranse todas las muestras para el plomo disuelto o total, como se ha descrito en 3030G o H. e) Concentración mínima detectable: 1,0 μg Pb/10 ml de solución de ditizona.

2.

Instrumental

a) Espectrofotómetro: Para utilizarlo a 510 nm, que proporciona un trayecto luminoso de 1 cm o más largo. b) pHmetro. c) Embudos de separación: Tipo Squibb de 250 ml. Límpiese todo el material de vidrio, incluidas las botellas de muestras, empleando HNO3 1 + 1. Enjuáguese cuidadosamente con agua destilada o desionizada. d) Buretas de distribución automática: Utilícense para todos los reactivos con objeto de reducir al mínimo los errores de procedencia indeterminada.

3.

Reactivos

Prepárense todos los reactivos con agua destilada libre de plomo.

MÉTODOS NORMALIZADOS

3-122

a) Solución de plomo de reserva: Disuélvanse 0,1599 g de nitrato de plomo, Pb(NO3)2 (de un mínimo de pureza de 99,5 por 100), en aproximadamente 200 ml de agua. Añádanse 10 ml de HNO3 conc. y dilúyase con agua hasta 1.000 ml. Alternativamente, disuélvanse 0,1000 g de metal plomo puro en 20 ml de HNO3 1 + 1 y dilúyase con agua hasta 1.000 ml; 1,00 ml = 100 μg Pb. b) Solución de plomo de trabajo: Diluyanse 20,0 ml de solución de reserva hasta 1.000 ml empleando agua; 1 ml = = 2,00 μg Pb. c) Ácido nítrico, HNO3 1 + 4: Diluyanse 200 ml de HNO3 conc. hasta 1 l empleando agua. d) Hidróxido amónico, NH4OH1 + 9: dilúyanse con agua 10 ml de NH4OH conc. hasta 100 ml. e) Solución de citrato-cianuro reductora: Disuélvanse 400 g de citrato amónico dibásico, (NH4)2HC6H5O7; 20 g de sulfito de sodio anhidro, Na2SO3; 10 g de clorhidrato de hidroxilamina, NH2OH·HC1, y 40 g de cianuro potásico, KCN (PRECAUCIÓN: es tóxico), en agua y dilúyase hasta 1 l. Mézclese esta solución con 2 1 de NH4OH conc. No debe utilizarse la pipeta con la boca. f) Solución de ditizona de reserva: Véase 1070D.2b1), solución de ditizona de reserva I. g) Solución de ditizona de trabajo: Disuélvanse 100 ml de solución de ditizona de reserva hasta 250 ml empleando CHC13; 1 ml = 40 μg de ditizona. h) Solución de ditizona especial: Disuélvanse 250 mg de ditizona en 250 ml de CHC13. Esta solución no necesita purificación, ya que todos los extractos que la utilizan se descartan. i) Solución de sulfito de sodio: Disuélvanse 5 g de Na2SO3 anhidro en 100 ml de agua. j) Solución de yodo: Disuélvanse 40 g de KI en 25 ml de agua, añádanse 12,7 g de yodo re-sublimado y dilúyase hasta 1.000 ml.

4.

Procedimiento

a) Con digestión de la muestra: Añádase a una muestra digerida, que no contenga más de 1 ml de ácido conc, 20 ml de HNO3 1 + 4 y fíltrese con papel* de filtro sin plomo y con un embudo filtrante directamente a un embudo de separación de 250 ml. Aclárese el vaso de digestión con 50 ml de agua y añádase al filtro. Añádanse 50 ml de solución amoniacal de citrato-cianuro, mézclese y enfríese a temperatura ambiente. Añádanse 10 ml de solución de ditizona de trabajo, sacúdase vigorosamente durante 30 segundos el embudo tapado y déjese que se separen las capas. Insértese algodón carente de plomo en el vástago del embudo de separación y sáquese la capa inferior. Descártense de 1 a 2 ml de la capa CHC13, y llénese a continuación la célula de absorción. Mídase la absorbancia del extracto a 510 nm, utilizando una solución de ditizona de trabajo, según el aparato 3g, para poner el espectrofotómetro a cero. b) Sin digestión de la muestra: Añádanse a 100 ml de muestra acidulada (pH 2), en un embudo de separación de 250 ml, 20 ml de HNO3 1 + 4 y 50 ml de solución reductora de citrato-cianuro; mézclese. Añádanse 10 ml de solución de ditizona de trabajo y procédase como se indica en el apartado 4a. c) Curva de calibración: Trácese la gráfica de la concentración de al menos cinco patrones y un blanco en función de la absorbancia. Determínese la concentración de plomo en el extracto a partir de la curva. Todas las concentraciones son μg Pb/10 ml de extracto final. d) Eliminación de interferencias de excesos: Los ditizonatos de bismuto, estaño y talio difieren del ditizonato de plomo en la absorbancia máxima. Detéctese su presencia midiendo la absorban-

* Whatman n.° 541 o equivalente.

3-123

DETERMINACIÓN DE METALES

cia de la muestra a 510 nm y a 465 nm. Calcúlese la absorbancia de la muestra corregida a cada longitud de onda restando la absorbancia del blanco a la misma longitud de onda. Calcúlese la relación de absorbancia corregida a 510 nm a absorbancia corregida a 465 nm. La relación de absorbancias corregidas para ditizonato de plomo es 2,08, y para ditizonato de bismuto es 1,07. Si la relación para la muestra indica interferencia, es decir, si es marcadamente menor que 2,08, procédase como sigue con una nueva muestra de 100 ml: Si la muestra no ha sido digerida, añádanse 5 ml de solución de Na2SO3 para reducir el conservante de yodo. Ajústese el pH de la muestra a 2,5 utilizando un pHmetro y HNO3 1 + 4 o NH4OH 1 + 9, según se necesite. Pásese la muestra a un embudo de separación de 250 ml, extráigase con un mínimo de tres porciones de 10 ml de solución de ditizona especial, o hasta que la capa de CHC13 sea claramente verde. Extráigase con porciones de 20 ml de CHCI3 para eliminar la ditizona (ausencia de verde). Añádanse 20 ml de HNO3 1 + 4, 50 ml de solución reductora de citrato-cianuro y 10 ml de solución de ditizona de trabajo. Extráigase como se indica en el apartado Aa y mídase la absorbancia.

5.

Cálculos

6.

Precisión y sesgo

La precisión de un solo operador al recuperar 0,0104 mg Pb/1 de agua del río Mississippi fue de 6,8 por 100 de desviación relativa estándar y –1,4 por 100 de error relativo. Con la proporción de 0,026 mg Pb/1, la recuperación se hizo con 4,8 por 100 de desviación relativa estándar y 15 por 100 de error relativo. 7. 1.

Referencias

SNYDER, L. J. 1947. Improved dithizone method for determination of lead—mixed color method at high pH. Anal. Chem. 19:684. 2. SANDELL, E. B. 1959. Coloriraetric Determination of Traces of Metals, 3. a ed. Interscience, Nueva York. 3. WICHMANN , H. J. 1939. Isolation and determination of trace metals—the dithizone system. Ind. Eng. Chem., Anal. Ed. 11:66. 4. AMERICAN SOCIETY FOR TESTINO AND MATERIALS . 1977. Annual Book of ASTM Standards. Part. 26, Method D3112-77, American Soc. Testing & Materials, Filadelfia, Pennsylvania.

3-124

MÉTODOS NORMALIZADOS

3500-Li

3500-Li A. 1.

Incidencia

El litio, un componente menor de minerales, se encuentra en el agua dulce en concentraciones inferiores a 0,2 mg/1. Las aguas salobres y termales pueden contener proporciones más altas de litio. El empleo de litio o sus sales en unidades de deshumidificación, aguas medicinales, procesos metalúrgicos y manufactura de algunos tipos de vidrio y baterías de acumuladores puede contribuir a su presen* Aprobado por el Standard Methods Committee, 1988.

3500-Li B.

LITIO*

Introducción cia en aguas residuales. El hipoclorito de litio se encuentra en el mercado como fuente de cloro, pudiéndose utilizar en piscinas. 2.

Selección del método

Los métodos preferidos son el espectrométrico de absorción atómica y el de plasma de acoplamiento inductivo. También es útil el método fotométrico de emisión de llama en aquellos laboratorios que no están equipados para los métodos preferidos.

Método espectrométrico de absorción atómica

Véase método espectrométrico de absorción atómica de llama, sección 3111B.

3500-Li C.

Método de plasma de acoplamiento inductivo

Véase sección 3120.

DETERMINACIÓN DE METALES

3500-Li D.

3-125

Método fotométrico de emisión de llama

1. Discusión general

3. Reactivos

a) Principio: Lo mismo que los otros metales alcalinos de bajo peso atómico, sodio y potasio, el litio puede determinarse en cantidades traza por métodos fotométricos de llama. Las medidas pueden hacerse a una longitud de onda de 670,8 nm. b) Interferencia: El bario, el estroncio y el calcio interfieren en la determinación espectrométrica de llama del litio, pudiéndose eliminar por adición de una solución de sulfato sódico-carbonato sódico (Na2SO4-Na2CO3) que precipita el sulfato de bario (BaSO4), el carbonato de estroncio (SrCO3) y el carbonato de calcio (CaCO3). El contenido de magnesio no debe sobrepasar los 10 mg en la porción tomada para análisis con objeto de evitar la interferencia de la coprecipitación. c) Concentración mínima detectable: La concentración mínima detectable de litio es de aproximadamente 0,4 μg/1 para el agua de reactivos analizada en un espectrofotómetro de absorción atómica, en la modalidad de emisión. d) Toma de muestras y almacenamiento: Tómese la muestra en un frasco de vidrio de borosilicato o en una botella de polietileno. En el momento de tomarla, ajústese el pH de la muestra a < 2 con ácido nítrico (HNO3).

a) Reactivo de sulfato sódico y carbonato sódico: Disuélvanse 5 g de Na2SO4 y 10 g de Na2CO3 en agua destilada y dilúyase hasta 1 l. b) Solución de litio de reserva: Disuélvanse 152,7 mg de cloruro de litio anhidro, LiCl, en agua destilada y dilúyase hasta 250 ml; 1,00 ml = 100 μg Li. Deséquese la sal toda la noche en la estufa a 105 °C. Enfríese en un desecador y pésese inmediatamente después de sacarla del desecador. c) Solución de litio patrón: Diluyanse 10,00 ml de solución de LiCl hasta 500 ml empleando agua destilada; 1,00 ml = 2,0 μg Li.

2. Instrumental Fotómetro de llama: Un instrumento cuya idoneidad para medir las concentraciones de Li haya sido probada por el analista (los fotómetros de llama que suelen encontrarse han sido diseñados para utilizarse en medicina clínica), o un espectrómetro de absorción atómica que funcione en la modalidad de emisión y que emplee una llama de aire-acetileno.

4. Procedimiento a) Tratamiento previo de muestras de agua contaminada y de aguas residuales: Utilícese la digestión con ácido nítrico o la digestión con ácido nítrico-ácido perclórico-ácido fluorhídrico, como se indica en la sección 3030. b) Eliminación de la interferencia de bario, calcio y estroncio: Tómese una muestra de 50,0 ml si se necesita o menor (para concentraciones más altas) con un contenido no superior a 10 mg Mg (para evitar la competencia en la coprecipitación). Añádanse 5,0 ml de reactivo Na2SO4-Na2CO3. Llévese a ebullición para coagular el precipitado de BaSO4, SrCO3, CaCO3 y MgCO3. Continúese calentando para reducir el volumen a un tercio. Retírese del calor y déjese reposar durante al menos 30 minutos para completar la precipitación; de otra forma aparecería un ligero precipitado de BaSO4 después de la filtración. Fíltrese*, láve* Whatman n.° 42 o equivalente.

MÉTODOS NORMALIZADOS

3-126

se con agua destilada y dilúyase hasta 50,0 ml después de que la solución haya alcanzado la temperatura ambiente, para medirla por fotometría de llama. c) Tratamiento de soluciones patrón: Prepárese una solución patrón de 2 μg Li/55 ml por dilución de 1 ml de solución de litio patrón hasta 50,00 ml, añadiendo 5 ml de reactivo Na 2SO 4 -Na 2CO3 y mezcla. Prepárense de manera análoga diluciones de la solución patrón de Li para horquillar la concentración de la muestra o para establecer al menos tres puntos sobre una curva de calibración de absorbancia frente a μg Li/55 ml. d) Medida por fotometría de llama: Determínese la concentración de litio por medidas directas de intensidad a una longitud de onda de 670,8 nm. (Con unos instrumentos fotométricos puede emplearse el método de horquillado, mientras que otros exigen la construcción de una curva de calibración.) Trátese la muestra, el agua destilada y el patrón de litio tan simultáneamente como sea posible. Para obtener los mejores resultados, sáquese la media de varias lecturas con cada solución. Síganse las instrucciones del fabricante en cuanto al funcionamiento del instrumento. 5.

Cálculos

El volumen final real es de 50 ml; la curva de calibración se supone basada en 55 ml de volumen final, como en el apartado 4c, haciéndose el cálculo con el factor 0,9.

6.

Control de calidad

Trátese un patrón de CC sometiéndolo al protocolo analítico completo como una forma de determinar el sesgo sistemático. Los límites del control de la precisión de determinaciones de duplicados a concentraciones (en agua para reactivos) de 4,0 μg/l y 10,0 μg /1 fueron 4,09 ± ± 0,056 μg/1 y 9,96 ± 0,094 μg/l, respectivamente. La DRE (desviación relativa estándar) fue 1,38 por 100 para un solo operador para una solución de litio con 10 μg/1.

7.

Bibliografía

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3-127

DETERMINACIÓN DE METALES

3500-Mg

3500-Mg A. 1. Incidencia El magnesio ocupa el octavo lugar entre los elementos más abundantes y es un componente común de las aguas naturales. Las sales de magnesio, que contribuyen de forma importante a la dureza del agua, se descomponen al calentar formando costras en las calderas. Las concentraciones superiores a 125 mg/1 pueden tener un efecto purificador y diurético. El ablandamiento químico, la osmosis inversa, la electrodiálisis o el intercambio iónico reducen el magnesio y la dureza asociada a él a niveles aceptables. La concentración de magnesio puede variar des-

* Aprobado por el Standard Methods Committee, 1985.

3500-Mg B.

MAGNESIO*

Introducción de cero a varios cientos de miligramos por litro, dependiendo del origen y tratamiento del agua. 2.

Selección del método

Los cuatro métodos presentados son aplicables a todas las aguas naturales. Con los métodos espectrométrico de absorción atómica y de plasma de acoplamiento inductivo pueden realizarse determinaciones directas. Por el método gravimétrico sólo se puede determinar el magnesio después de la eliminación de las sales de calcio (véase sección 3500Ca). Estos métodos pueden aplicarse a todas las concentraciones seleccionando las porciones de muestra apropiadas. La elección del método es cuestión de preferencia personal y experiencia analítica.

Método espectrométrico de absorción atómica

Véase método espectrométrico de absorción atómica de llama, sección 3111 B.

3500-Mg C.

Método de plasma de acoplamiento inductivo

Véase sección 3120.

MÉTODOS NORMALIZADOS

3-128

3500-Mg D. 1.

Método gravimétrico

Discusión general

a) Principio: El fosfato hidrógeno diamónico precipita cuantitativamente el magnesio en solución amoniacal en forma de fosfato amónico magnésico. El precipitado se incinera a pirofosfato de magnesio y se pesa como tal. Se puede elegir entre: (a) destrucción del oxalato y las sales de amonio, seguido de precipitación única del fosfato amónico magnésico, y (b) doble precipitación sin pretratamiento. Cuando el tiempo no es un factor, es preferible la doble precipitación porque, aunque el pretratamiento es más rápido, requiere más atención para evitar pérdidas mecánicas. b) Interferencia: La solución deberá estar razonablemente libre de aluminio, calcio, hierro, manganeso, sílice, estroncio y materia suspendida. No deberá contener más de aproximadamente 3,5 g NH4C1. 2.

Reactivos

a) Ácido nítrico, NHO3 conc. b) Ácido clorhídrico, HC1 conc; también 1 + 1, 1 + 9 y 1 + 99. c) Solución de indicador rojo de metilo: Disuélvanse 100 mg de sal sódica de rojo de metilo en agua destilada y dilúyase hasta 100 ml. d) Solución de fosfato de hidrógeno diamonio: Disuélvanse 30 g de (NH4)2HPO4 en agua destilada y llévese hasta 100 ml. e) Hidróxido amónico, HN4OH conc; también 1 + 19. 3.

Procedimiento

a) Por eliminación de oxalato y sales de amonio: Al filtrado combinado con los

lavados de la determinación de calcio, que contiene no más de 60 mg Mg, o a una porción con menos de esa cantidad, en un vaso de 600 u 800 ml, añádanse 50 ml de HNO3 conc. y evapórese cuidadosamente hasta sequedad sobre una placa caliente. No dejar que la reacción se haga demasido violenta en la última parte de la evaporación; préstese continua atención para evitar pérdidas por salpicado. Humedézcase el residuo con 2 a 3 ml de HC1 conc; añádanse 20 ml de agua destilada, caliéntese, fíltrese y lávese. Añádanse al filtrado 3 ml de HC1 conc, dos a tres gotas de solución de rojo de metilo y 10 ml de solución de (NH4)2HPO4. Enfríese y añádase NH4OH gota a gota, agitando continuamente, hasta que el color vira al amarillo. Agítese durante 5 minutos, añádanse 5 ml de NH4OH conc. y agítese vigorosamente durante 10 minutos más. Déjese reposar toda la noche y fíltrese con papel de filtro. Lávese con NH4OH 1 + 19. Pásese a un crisol incinerado, enfriado y pesado. Séquese cuidadosamente el precipitado, elimínese el papel quemándolo lentamente, dejando que circule el aire. Caliéntese hasta aproximadamente 500 °C hasta que el residuo queda blanco. Incinérese a 1.100 °C durante períodos de 30 minutos, hasta peso constante. b) Por doble precipitación: Al filtrado y los lavados combinados de la determinación de calcio, que contiene no más de 60 mg Mg, o una porción con menos de esa cantidad, añádanse dos a tres gotas de solución rojo de metilo; ajústese el volumen a 150 ml y acidúlese con HC1 1 + 1. Añádanse 10 ml de solución de (NH4)2HPO4. Enfríese. Añádase gota a gota NH4OH, agitando constantemente, hasta que el color vira a amarillo. Agítese durante 5 minutos, añádanse 5 ml de NH4OH conc. y agítese vigorosamente durante 10 minutos más. Déjese

3-129

DETERMINACIÓN DE METALES

reposar toda la noche y después fíltrese a través de papel de Filtro*. Lávese con NH4OH 1 + 19. Descártese filtrado y lavados. Disuélvase el precipitado con 50 ml de HC1 1 + 9 templado y lávase bien el papel con HC1 1 + 99 caliente. Añádanse dos a tres gotas de solución de rojo de metilo, ajústese el volumen a 100 a 150 ml, añádanse 1 a 2 ml de solución de (NH4)2HPO4 y precipítese como antes. Déjese reposar en un lugar fresco durante al menos 4 horas o preferiblemente toda la noche. Fíltrese a través de papel de filtro* y lávese con NH 4 OH 1 + 19. Pásese a un crisol incinerado, enfriado y pesado. Séquese cuidadosamente el precipitado y quémese el papel lentamente, dejando que circule el aire. Caliéntese a aproximadamente 500 °C hasta que el residuo sea blanco. Incinérese a 1.100 °C durante períodos de 30 minutos, hasta peso constante.

* Cari Schleicher and Schuell Co., S & S n.° 589 White Ribbon, o equivalente.

4. Cálculos

5. Precisión y sesgo En ocho laboratorios fue analizada una muestra sintética con 82 mg Mg/1, 108 mg Ca/1, 3,1 mg K/l, 19,9 mg Na/1, 241 mg Cl¯/1, 1,1 mg NO3- -N/l, 0,250 mg NO-2 -N/l, 259 mg SO 2-4 /l y 42,5 mg de alcalinidad total/1 (a la que contribuye el NaHCO3) utilizando el método gravimétrico, con una desviación relativa estándar de 6,3 por 100 y un error relativo de 4,9 por 100. 6.

Bibliografía

EPPERSON, A. W. 1928. The pyrophosphate method for the determination of magnesium and phosphoric anhydride. J. Amer. Chem. Soc. 50:321. KOLTHOFF, I. M. & E. B. SANDELL. 1952. Textbook of Quantitative Inorganic Analysis, 3. a ed. MacMillan Co., Nueva York, capítulo 22. HILLEBRAND, W. F. y otros. 1953. Applied Inorganic Analysis, 2.a ed. John Wiley & Sons, Nueva York, capítulo 41 y págs. 133-134.

3500-Mg E. Método de cálculo El magnesio puede calcularse como diferencia entre la dureza y el calcio, como CaCO3, si los metales que interfieren están presentes en concentraciones no interfirientes en la titulación del calcio (sección 3500-Ca.D) y se utilizan inhibi-

dores adecuados en la titulación de la dureza (sección 2340C). mg Mg/1 = [dureza total (como mg CaCO3/l) – – dureza de calcio (como mg CaCO 3 /l)] x x 0,243

3-130

MÉTODOS NORMALIZADOS

3500-Mn MANGANESO

3500-Mn A. Introducción 1. Incidencia Aunque el manganeso se encuentra en las aguas subterráneas en la forma iónica divalente soluble, debido a la ausencia de oxígeno, parte o todo el manganeso de una instalación de tratamiento de agua puede aparecer en un estado de valencia superior. La determinación del manganeso total no diferencia entre los diversos estados de valencia. El ion permanganato heptavalente se emplea para oxidar el manganeso y/o la materia orgánica causante del sabor. Debe detectarse con gran sensibilidad el exceso de permanganato, el manganeso trivalente en forma de complejo, o una suspensión de manganeso tetravalente, para el tratamiento de control y para evitar su descarga a un sistema de distribución. Existe la evidencia de que el manganeso se encuentra en las aguas superficiales tanto en suspensión en su forma tetravalente, como en la forma trivalente en un complejo soluble relativamente estable. Aunque raramente sobrepasa 1 mg/1, el manganeso produce manchas tenaces en la ropa lavada y en accesorios de instalaciones sanitarias. Los bajos límites de manganeso impuestos para un agua aceptable derivan de lo anterior más que de consideraciones toxicológicas. Frecuentemente se necesitan medios especiales de eliminación, tales

* Aprobado por el Standard Methods Committee, 1988.

como precipitación química, ajuste de pH, aireación y empleo de materiales especiales de intercambio iónico. El manganeso se encuentra en las aguas residuales domésticas, efluentes industriales y corrientes receptoras.

2.

Selección del método

Los métodos espectrométrico de absorción atómica y de plasma de acoplamiento inductivo permiten la determinación directa con aceptable sensibilidad y son los métodos que se eligen. Entre los diversos métodos colorimétricos, el método de persulfato es el preferido, debido a que el empleo de ion mercúrico puede controlar la interferencia de una concentración limitada de ion cloruro. 3. Toma de muestras y almacenamiento El manganeso puede estar en una forma soluble en un agua neutra al principio de tomar la muestra, pero se oxida a un grado de oxidación más alto y precipita o llega a ser adsorbido por las paredes del recipiente. Determínese el manganeso enseguida de tomar la muestra. Cuando es inevitable un cierto retraso, se puede determinar el manganeso total si se acidula la muestra en el momento de su toma empleando HNO 3 hasta un pH < 2. Véase sección 3010B.

3-131

DETERMINACIÓN DE METALES

3500-Mn B.

Método espectrométrico de absorción atómica

Véase método espectrométrico de absorción atómica de llama, secciones 3111B y C, y método espectrométrico de

3500-Mn C.

absorción atómica electrotérmica, sección 3113.

Método de plasma de acoplamiento inductivo

Véase sección 3120.

3500-Mn D.

Método de persulfato

1. Discusión general a) Principio: La oxidación con persulfato de los compuestos mánganosos solubles para formar permanganato se realiza en presencia de nitrato de plata. El color resultante es estable durante 24 horas al menos, si existe un exceso de persulfato y si no hay materia orgánica. b) Interferencia: La interferencia de hasta 0,1 g de cloruro (Cl¯) en una muestra de 50 ml puede evitarse añadiendo 1 g de sulfato mercúrico (HgSO4) para formar complejos ligeramente disociados. Aún interferirán el bromuro y el yoduro y sólo pueden estar presentes en cantidades traza. El procedimiento del persulfato puede ser empleado para agua potable con cantidades traza a pequeñas de materia orgánica si se aumenta el período de calentamiento después de añadir más persulfato. Para las aguas residuales que contienen materia orgánica, utilícese una digestión preliminar con ácidos nítrico y sulfúrico (HNO3 y H2SO4) (véase sección 3O3OG). Si existen grandes cantidades de Cl¯, la ebullición con HNO3 facilita su

eliminación. Las trazas de Cl se eliminan con HgSO4 en el reactivo especial. Las soluciones coloreadas de otros iones inorgánicos se compensan en la etapa colorimétrica final. Las muestras que han sido expuestas al aire pueden dar resultados bajos debido a la precipitación de dióxido de manganeso (MnO2). Añádase a la muestra una gota de peróxido de hidrógeno (H2O2) al 30 por 100, después de añadir el reactivo especial, para redisolver el manganeso precipitado. c) Concentración mínima detectable: La capacidad de absorción molar del ion permanganato es aproximadamente 2.300 l g -1 cm -1. Esto corresponde a una concentración mínima detectable (98 por 100 de transmitancia) de 210 μg Mn/1 cuando se utiliza una célula de 1 cm, o de 42 μg Mn/1 cuando se utiliza una célula de 5 cm. 2. Instrumental Equipo colorimétrico: Se necesita uno de los siguientes:

MÉTODOS NORMALIZADOS

3-132

a) Espectrofotómetro, para utilizarlo a 525 nm, que proporciona un trayecto luminoso de 1 cm o más largo. b) Fotómetro de filtro, que proporciona un trayecto luminoso de 1 cm o más largo y equipado con un filtro verde que tiene un máximo de transmitancia próximo a 525 nm. c) Tubos Nessler, emparejados, 100 ml, forma alargada.

3.

mirán aproximadamente 15 ml de solución de permanganato. Trátese un blanco de agua destilada y H2SO4.

donde: A = ml de reactivo de titulación para la muestra, y B = ml de reactivo de titulación para el blanco.

Reactivos

a) Reactivo especial: Disuélvanse 75 g de H2SO4 en 400 ml de HNO3 conc. y 200 ml de agua destilada. Añádanse 200 ml de ácido fosfórico (H3PO4) al 85 por 100 y 35 mg de nitrato de plata (AgNO3). Dilúyase la solución enfriada hasta 1 l. b) Persulfato amónico, (NH4)2S2O8, sólido. c) Solución de manganeso patrón: Prepárese una solución de permanganato potásico (KMnO4) 0,1N disolviendo 3,2 g de KMnO 4 en agua destilada y llevándolo hasta 1 l. Déjese envejecer durante varias semanas a la luz del sol o calentando durante varias horas cerca del punto de ebullición, fíltrese después a través de un crisol filtrante de vidrio poroso fino y estandarícese frente a oxalato de sodio como sigue: Pésense varias muestras de 100 a 200 mg de Na2C2O4 con precisión de 0,1 mg y pásense a vasos de 400 ml. Añádanse a cada vaso 100 ml de agua destilada y agítese para que se disuelva. Añádanse 10 ml de H2SO4 1 + 1 y caliéntese rápidamente entre 90 y 95 °C. Valórese rápidamente con la solución de KMnO4 que se estandariza, agitando al mismo tiempo, hasta un color rosa ligero de punto final que persiste durante al menos 1 minuto. No dejar que la temperatura caiga por debajo de 85 °C. Si es necesario, caliéntese el contenido del vaso durante la titulación; 100 mg de Na2C2O4 consu-

Sáquese la media de los resultados de varias titulaciones. Calcúlese el volumen necesario de esta solución para preparar 1 l de solución en la que 1,00 ml = 50,0 μg Mn, como sigue:

Añádanse a este volumen entre 2 y 3 ml de H2SO4 conc. y solución de NaHSO3 gota a gota, agitando al mismo tiempo, hasta que el color del permanganato desaparece. Llévese a ebullición para eliminar el exceso de SO2, enfríese y dilúyase hasta 1.000 ml con agua destilada. Dilúyase más esta solución en el caso de medir pequeñas cantidades de manganeso. d) Solución de manganeso patrón (alternativa): Disuélvanse 1.000 g de metal manganeso (99,8 por 100 mínimo) en 10 ml de HNO 3 redestilado. Dilúyase hasta 1.000 ml con HC1 al 1 por 100(v/v); 1 ml = 1.000 mg Mn. Dilúyanse 10 ml hasta 200 ml con agua destilada; 1 ml = = 0,05 mg Mn. Prepárese la solución diluida diariamente. e) Peróxido de hidrógeno, H2O2, 30 por 100. f) Ácido nítrico, HNO3 conc. g) Ácido sulfúrico, H2SO4 conc. h) Solución de nitrito sódico: Disuélvanse 5,0 g de NaNO2 en 95 ml de agua destilada.

DETERMINACIÓN DE METALES

i) Oxalato de sodio, Na2C2O4, patrón primario. j) Bisulfito sódico: Disuélvanse 10 g de NaHSÓ3 en 100 ml de agua destilada.

3-133

tabla muestra la longitud apropiada del trayecto luminoso para diversas cantidades de manganeso en 100 ml de volumen final:

4. Procedimiento a) Tratamiento de la muestra: Si se ha preparado una muestra digerida según las indicaciones de reducción de la materia orgánica y/o los cloruros en exceso de la sección 3030G, llévese con la pipeta una porción que contenga 0,05 a 2,0 mg de Mn a un erlenmeyer de 250 ml. Añádase agua destilada hasta 90 ml, si es necesario, y procédase como en el apartado 4b. b) Añádanse 5 ml de reactivo especial y una gota de H2O2 a una porción adecuada de la muestra. Concéntrese hasta 90 ml por ebullición o dilúyase hasta 90 ml. Añádase 1 g de (NH4)2S2O8, llévese a ebullición y déjese hervir durante 1 minuto. No calentar en baño maría. Sepárese de la fuente de calor, déjese reposar 1 minuto y enfríese al grifo (una ebullición demasiado prolongada da lugar a la descomposición del exceso de persulfato y, por consiguiente, a la pérdida de color del permanganato; un enfriamiento demasiado lento tiene el mismo efecto). Dilúyase hasta 100 ml con agua destilada libre de sustancias reductoras y mézclese. Prepárense patrones que contengan 0, 5,00,... 1.500 μg de Mn tratando diversas cantidades de soluciones de Mn patrón de la misma forma. c) Comparación con tubos de Nessler: Utilícense los patrones preparados como en el apartado 4b y que contienen entre 5 y 100 μg Mn/100 ml de volumen final. Compárense muestras y patrones visualmente. d) Determinación fotométrica: Utilícese una serie de patrones de 0 a 1.500 μg de Mn/100 ml de volumen final. Realícense las medidas fotométricas frente a un blanco de agua destilada. La siguiente

Prepárese una curva de calibración de concentración de manganeso en función de la absorbancia de los patrones y determínese el Mn en las muestras a partir de la curva. Si existe turbidez o color que interfiere, hágase la corrección como en el apartado 4e. e) Corrección para turbidez o color que interfiere: Evítese la filtración por la posible retención de parte del permanganato sobre el papel de filtro. Si se emplea la comparación visual, sólo puede calcularse el efecto de la turbidez sin que pueda hacerse ninguna corrección para los iones coloreados que interfieren. Cuando se realizan medidas fotométricas, utilícese el siguiente método de «decoloración», que también corrige el color que interfiere. En cuanto se ha hecho la lectura en el fotómetro, añádanse 0,05 ml de solución de H2O2 directamente a la muestra en la célula óptica. Mézclese y, tan pronto como el color de permanganato ha desaparecido por completo y no quedan burbujas, léase de nuevo. Dedúzcase la absorbancia de la solución decolorada de la absorbancia inicial para obtener la absorbancia debida al Mn.

5. Cálculo a) Cuando se toma toda la muestra original para análisis:

3-134

MÉTODOS NORMALIZADOS

b) Cuando se toma una porción de la muestra digerida (100 ml) para el análisis:

En 17 laboratorios se analizó una segunda muestra sintética análoga en todo, excepto en que tenía 50 μg de Mn/1 y 1.000 μg Cu/1, por el método de persulfato, con una desviación relativa estándar de 50,3 por 100 y un error relativo de 7,2 por 100.

7. 6.

Precisión y sesgo

Se analizó en 33 laboratorios una muestra sintética con 120 μg Mn/1, 500 μg Al/1, 50 μg Cd/1, 110 μg Cr/1, 470 μg Cu/1, 300 μg Fe/1, 70 μg Pb/1, 150 μg Ag/1 y 650 μg Zn/1 en agua destilada por el método de persulfato, con una desviación relativa estándar de 26,3 por 100 y un error relativo de 0 por 100.

3500 Hg

RICHARDS, M. D. 1930. Colorimetric determination of manganese in biological material. Analyst 55:554. NYDAHL , F. 1949. Determination of manganese by the persulfate method. Anal. Chem. Acta. 3:144. MILLS, S. M. 1950. Elusive manganese. Water Sewage Works 97:92. SANDELL, E. B. 1959. Colorimetric Determination of Traces of Metals, 3.a ed. Interscience Publishers, Nueva York, capítulo 26.

MERCURIO*

3500-Hg A. 1.

Significación

Las sales orgánicas e inorgánicas de mercurio son muy tóxicas y su presencia en el ambiente, y en especial en el agua, debe controlarse.

Introducción las muestras, aunque el método de ditizona es útil para determinar niveles elevados de mercurio (>2 μg/1) en aguas potables. 3.

2.

Selección del método

El método de absorción atómica de vapor frío es el seleccionado para todas * Aprobado por el Standard Methods Committee, 1985.

Bibliografía

Conservación de las muestras

Como el mercurio de las muestras puede perderse con facilidad, es necesario tratarlas con HNO3 para reducir el pH a < 2 (véase sección 1060).

3-135

DETERMINACIÓN DE METALES

3500-Hg B.

Método de absorción atómica de vapor frío

Véase sección 3112.

3500-Hg C. 1.

Método de la ditizona

Discusión general

a) Principio: Los iones mercurio reaccionan con una solución de ditizona en cloroformo para formar un color naranja. Los distintos tonos del color naranja se miden en un espectrofotómetro y las concentraciones desconocidas se calculan a partir de una curva estándar. b) Interferencia: El cobre, oro, paladio, platino divalente y plata reaccionan con ditizona en solución acida. El cobre del extracto con ditizona permanece en la fase orgánica, mientras que el mercurio se disuelve en la fase acuosa. Los otros contaminantes no suelen estar presentes. El ditizonato de mercurio se debe medir rápidamente debido a su fotosensibilidad. c) Concentración mínima detectable: 1 μg Hg/1 de volumen final, que corresponde a 2 μg Hg/1 cuando se emplea una muestra de 500 ml. Se obtiene una precisión aceptable cuando se sobrepasa esta concentración.

2.

Instrumental

a) Espectrofotómetro, para medidas a 492 nm, que proporciona un trayecto luminoso de 1 cm o más largo. b) Embudos de separación: 250 y 1.000 ml, con llaves de TFE. c) Material de vidrio: Límpiese todo el material de vidrio con solución de limpieza dicromato potásico-ácido sulfúrico.

3.

Reactivos

a) Agua libre de mercurio: Utilícese agua redestilada o agua desionizada para preparar todos los reactivos y soluciones. b) Solución de mercurio de reserva: Disuélvanse 135,3 mg de cloruro mercúrico, HgCl2, en aproximadamente 700 ml de agua, añádanse 1,5 ml de HNO3 conc. y llévese hasta 1.000 ml con agua; 1,00 ml = = 100 μg Hg. c) Solución de mercurio patrón: Dilúyanse 10,00 ml de solución de reserva a 1.000 ml empleando agua; 1,00 ml = = 1,00 μg Hg. Prepárese inmediatamente antes de usarla. d) Solución de permanganato potásico: Disuélvanse 5 g de KMnO4 en 100 ml de agua. e) Ácido sulfúrico, H2SO4 conc, bajo en mercurio. f) Solución de persulfato potásico: Disuélvanse 5 g de K2S2O8 en 100 ml de agua. g) Solución de clorhidrato de hidroxilamina: Disuélvanse 50 g de NH2OHHC1 en 100 ml de agua. h) Solución de ditizona: Véase 1070D.261). Dilúyanse 60 ml de solución de ditizona de reserva con HC13 hasta 1.000 ml; 1 ml = 6 μg de ditizona. i) Ácido sulfúrico, O,25N: Dilúyanse 250 ml de H2SO4 IN hasta 11 con agua. j) Solución de bromuro potásico: Disuélvanse 40 g de KBr en 100 ml de agua. k) Cloroformo, CHC13. l) Solución tampón de fosfato-carbonato: Disuélvanse 150 g de Na2HPO4·12H2O y 38 g de K2CO3

MÉTODOS NORMALIZADOS

3-136

anhidro en 1 l de agua. Extráigase con porciones de 10 ml de ditizona hasta que la última porción queda azul. Lávese con CHC13 para eliminar el exceso de ditizona. m) Sulfato de sodio, Na2SO4, anhidro. 4. Procedimiento a) Preparación de la curva de calibra-

ción: Llévese con la pipeta 0 (blanco), 2,00, 4,00, 6,00, 8,00 y 10,00 μg de mercurio a vasos separados. Añádanse a cada vaso 500 ml de agua (o cualquier otro volumen elegido para la muestra), 1 ml de solución de KMnO4 y 10 ml de H2SO4 conc. Agítese y llévese a ebullición. Si es necesario, añádase más KMnO4 hasta que persiste el color rosa. Después de que cesa la ebullición, añádanse cuidadosamente 5 ml de solución de K 2 S 2 O 8 y déjese enfriar durante 0,5 horas. Añádase una o más gotas de solución de NH2OHHC1 para eliminación del color rosa. Al enfriarse, pásese cada solución a embudos de separación de 1 l individuales. Añádanse 25 ml de solución de ditizona. Sacúdanse vigorosamente los embudos de separación y pásese cada capa orgánica a un embudo de separación de 250 ml. Repítase esta extracción al menos tres veces, asegurándose de que el color en la última capa de ditizona es de un azul tan intenso como el de la solución de ditizona original. Lávense los extractos de ditizona acumulados en un embudo de separación de 250 ml sacudiendo con 50 ml de H2SO 4 0,25N. Pásese el extracto de ditizonato lavado a otro embudo de separación de 250 ml. Añádanse 50 ml de H2SO4 0,25N y 10 ml de solución de KBr y sacúdase vigorosamente para hacer pasar el ditizonato de mercurio desde la capa orgánica a la capa acuosa. Descártese la capa de ditizona inferior. Lávese la capa acuosa con un pequeño volumen de CHC1 3 y

descártese el CHC13. Añádanse 20 ml de solución tampón fosfato-carbonato a cada embudo separador y añádanse 10 ml de solución de ditizona patrón. Sacúdase cuidadosamente y, después de la separación, pásese la ditizona con mercurio a los vasos. El extracto de ditizona final deberá tener un color ligeramente azul. Séquense los contenidos con Na2SO4 anhidro. Pásese la solución de ditizonato de mercurio a una cubeta y regístrese la absorbancia a 492 nm. Trácese en papel de gráficos lineal la curva de absorbancia en función de microgramos de mercurio en 10 ml de volumen final. b) Tratamiento de muestras: Las muestras que contienen 1,5 ml de NHO3 conc. no afectan normalmente a la ditizona, aunque las soluciones fuertes de HNO3 la oxidarán. Empléese una muestra de 500 ml para lecturas más altas de la absorbancia y prepárese un blanco de absorbancia compuesto de todos los reactivos. Cuando sea necesario, fíltrese la muestra a través de lana de vidrio en el embudo de separación después de la etapa de oxidación. Complétese el procedimiento tal como se ha descrito en el anterior apartado 4a. Léase el contenido de mercurio en la curva de calibración. 5.

Cálculo

6.

Precisión y sesgo

Cinco porciones de mercurio inorgánico y cinco porciones de mercurio orgánico en forma de cloruro de metil mercurio a concentraciones de 250 μg/1 cada una proporcionaron una recuperación del 95 por 100. Dos de las diez muestras se mezclaron con agua pantanosa.

DETERMINACIÓN DE METALES

7.

Bibliografía

SANDELL, E. B. 1959. Colorimetric Determination of Traces of Metals, 3.a ed. Interscience Publishers. Nueva York, págs. 637-638.

3500-Mo

3500-Mo A.

3-137

SULLIVAN, J. R. & J. J. DELFINIO. 1982. The determinación of mercury in fish. J. Environ. Sci. Health. A 17:265.

MOLIBDENO

Introducción

1. Incidencia

2.

El molibdeno se encuentra en las aguas naturales en concentraciones traza (< μg/1). En aguas que drenan áreas mineralizadas o en aguas residuales de procesos en los que se emplea molibdeno, las concentraciones pueden ser mucho más elevadas.

Empléese el método espectrométrico de absorción atómica de llama o el método de plasma de acoplamiento inductivo.

3500-Mo B.

Selección del método

Método espectrométrico de absorción atómica

Véase método espectrométrico de absorción atómica de llama, sección 3111D.

3500-Mo C.

Método de plasma de acoplamiento inductivo

Véase sección 3120.

MÉTODOS NORMALIZADOS

3-138

3500-Ni

3500-Ni A. Selección del método: Los métodos espectrométrico de absorción atómica y de plasma de acoplamiento inductivo son * Aprobado por el Standard Methods Committee, 1988.

3500-Ni B.

NÍQUEL*

Introducción los seleccionados para todas las muestras. El método de heptoxima o de dimetilglioxima se pueden utilizar, con precisión y sesgo más pobres, si no se dispone de instrumental para la absorción atómica o para el PAI.

Método espectrométrico de absorción atómica

Véase método espectrométrico de ab- absorción atómica electrotérmica, secsorción atómica de llama, secciones ción 3113. 3111B y C, y método espectrométrico de

3500-Ni C.

Método de plasma de acoplamiento inductivo

Véase sección 3120.

3500-Ni D.

Método de la heptoxima (GENERAL)

1. Discusión general Principio: Después de digestión preliminar con mezcla de ácido nítrico-ácido sulfúrico (HNO3-H2SO4), se eliminan hierro y cobre por extracción de los cupferratos con cloroformo (CHC13). El níquel se separa de otros iones por extracción del complejo de níquel y heptoxima empleando CHC13, volviendo a extraer a la fase acuosa con ácido clorhídrico

(HC1) y determinando colorimétricamente en la solución acida con heptoxima en presencia de un oxidante. 2. Instrumental a) Equipo colorimétrico; Se necesita uno de los siguientes: 1) Espectrofotómetro, para utilizarlo a 445 nm, que proporciona un trayecto luminoso de 1 cm o más.

DETERMINACIÓN DE METALES

2) Fotómetro de filtro, que proporciona un trayecto luminoso de 1 cm o más y va equipado con un filtro violeta con una transmitancia máxima próxima a 445 nm. b) Embudos de separación, 125 ml, forma Squibb, con tapones de base de vidrio.

3.

Reactivos

a) Solución patrón de sulfato de níquel: Disuélvanse 447,9 mg de NiSO4·6H2O en 1.000 ml de agua destilada; 1,00 ml = 100 μg Ni. b) Ácido clorhídrico, HC1 1, 0N. c) Agua de bromo: Agua destilada saturada de bromo. d) Hidróxido amónico, NH4OH conc. e) Reactivo heptoxima: Disuélvanse 0,1 g de 1,2-cicloheptanodion-dioxima* (heptoxima) en 100 ml de alcohol etílico al 95 por 100. f) Alcohol etílico, 95 por 100. g) Solución de tartrato sódico: Disuélvanse 10 g de Na2C4H4O6·2H2O en 90 ml de agua destilada. h) Solución de indicador naranja de metilo. i) Hidróxido sódico, NaOH 6N. j) Ácido acético conc. k) Solución de cupferrón: Disuélvase 1 g de cupferrón en 100 ml de agua destilada. Guárdese en frigorífico o prepárese reciente para cada serie de determinaciones. l) Cloroformo, CHC13. m) Solución de clorhidrato de hidroxilamina: Disuélvanse 10 g de NH2OHHC1 en 90 ml de agua destilada. Prepárese reciente diariamente.

* Hach Chemical Company, Ames, Iowa, o equivalente.

3-139

4.

Procedimiento

a) Preparación de la curva de calibración: Llévese con la pipeta porciones de solución de NiSO4 patrón a matraces volumétricos de 100 ml. Si se utilizan células de 1 cm, empléese una serie de 50 a 250 μg Ni. Añádanse 25 ml de HC1 1,0N y 5 ml de agua de bromo. Enfríese con agua del grifo que se deja correr y añádanse 10 ml de NH4OH conc. Añádanse inmediatamente 20 ml de reactivo heptoxima y 20 ml de alcohol etílico. Dilúyase hasta el volumen empleando agua destilada y mézclese. Mídase la absorbancia a 445 nm, 20 minutos después de añadir el reactivo, empleando un blanco de reactivo como referencia. b) Tratamiento de la muestra: 1) Separación de cobre e hierro: Tómese una porción de la muestra original, preparada por digestión con una mezcla de HNO3-H2SO4, tal como se ha indicado en la sección 3030G, y que contiene entre 50 y 250 μg Ni; introdúzcase en un embudo de separación y añádanse 10 ml de solución de tartrato de sodio, dos gotas (0,1 ml) de indicador naranja de metilo y el suficiente NaOH 6N para hacer básica la solución. Añádase 1 ml de ácido acético y enfríese el embudo al agua del grifo. Añádanse 4 ml de reactivo de cupferrón, añádanse 10 ml de HC13 y sacúdase. Déjese que las capas se separen y, si es necesario, añádase más cupferrón hasta que se forma un precipitado blanco, que indica un exceso de cupferrón. Sacúdase de nuevo la mezcla, déjese separar y descártese la capa de CHC13. Vuélvase a extraer con 10 ml de CHCl3 y descártese la capa de CHCl3. Añádase 1 ml de solución de NH2OH-HC1 reciente, mézclese y déjese reposar durante 10 minutos. 2) Separación de níquel: Añádanse 10 ml de reactivo heptoxima y extráigase el complejo de níquel con al menos tres

MÉTODOS NORMALIZADOS

3-140

porciones de 10 ml de CHC13. Repítanse las extracciones hasta que la capa final de CHCl3 es incolora. Reúnanse las capas de CHCl3 en un embudo de separación y extráigase con 10 ml de HC1 1N. Sáquese la capa de CHC13 a otro embudo de separación y vuélvase a extraer el CHCl3 con 10 ml de HC1 1N. Combínense las capas de HC1 y determínese la absorbancia como se señala en el apartado 4a, 10 minutos después de la adición del reactivo. Trácese el gráfico de absorbancia en función de microgramos de níquel en 20 ml de volumen final.

6.

Bibliografía

B UTTS, P. G., A. R. G AHLER & M. G. M ELLON . 1950. Colorimetric determination of metals in sewage and industrial wastes. Sewage Ind. Wastes 22:1543. FERGUSON, R. C. & C. V. BANKS. 1951. Spectrophotometric determination of nickel using 1,2cycloheptanedionedioxime (heptoxime). Anal. Chem. 23:448, 1486. SERFASS, E. J. & R. F. MURACA. 1954. Procedures for Analyzing Metal Finishing Wastes. Ohio River Valley Water Sanitation Comm., Cincinnati, Ohio.

5. Cálculo

3500-Ni E.

Método de la dimetilglioxima (GENERAL)

1. Discusión Para desarrollar el color con el níquel se puede utilizar la dimetilglioxima en lugar de la heptoxima. Las condiciones de formación del color son idénticas, pero han de prepararse curvas de calibración separadas. La tasa de desarrollo de color es ligeramente diferente para ambos reactivos; por eso con la dimetilglioxima hay que hacer la lectura exactamente 10 minutos después de añadir el reactivo, mientras que con la heptoxima se ha de hacer la lectura exactamente 20 minutos después de añadir el reactivo.

En ambos sistemas, las medidas se hacen a 445 nm. El sistema de heptoxima es más estable. La dimetilglioxima no puede sustituirse por heptoxima en el proceso de extracción, sección 3500-Ni.D.462), en las condiciones prescritas. Calcúlese la concentración de níquel como en la sección 3500-Ni.D.5. 2. Bibliografía AMERICAN S OCIETY FOR TESTING AND MATE RIALS . 1986. Book of ASTM Standards, Parte 11,01. Water American Soc. Testing & Materials, Filadelfia, Pennsylvania.

DETERMINACIÓN DE METALES

3-141

3500-Os OSMIO

3500-Os A. El osmio se encuentra muy raramente en las aguas naturales y, si aparece, lo hace en cantidades traza. Las aguas de

3500-Os B.

Introducción procesado pueden contenerlo en concentraciones más altas.

Método espectrométrico de absorción atómica

Véase método espectrométrico de absorción atómica de llama, sección 3111D.

3500- Pd

3500-Pd A. El paladio es muy poco corriente en las aguas naturales. Las aguas de proce-

3500-Pd B.

PALADIO

Introducción sado pueden contener concentraciones más altas.

Método espectrométrico de absorción atómica

Véase método espectrométrico de absorción atómica a llama, sección 3111 B.

3-142

MÉTODOS NORMALIZADOS

3500-Pt

3500-PtA. El platino es muy poco corriente en las aguas naturales. Las aguas de procesado

3500-Pt B.

PLATINO

Introducción pueden contener concentraciones más altas.

Método espectrométrico de absorción atómica

Véase método espectrométrico de absorción atómica de llama, sección 3111 B.

3500-K

3500-KA. 1.

Incidencia

El potasio ocupa el séptimo lugar entre los elementos en orden de abundancia, aunque su concentración, en la mayor parte de las aguas potables, rara vez alcanza los 20 mg/1. Sin embargo, las salmueras en ocasiones pueden contener más de 100 mg de potasio/1. 2. Selección del método Se dan tres métodos para la determinación de potasio. Son rápidos, sensibles Aprobado por el Standard Methods Committee, 1985.

POTASIO

Introducción y precisos, y su elección depende de la disponibilidad de instrumental y el criterio del analista. 3. Almacenamiento de la muestra No se deben guardar las muestras en frascos de vidrio blando por la posibilidad de contaminación por lixiviación del vidrio. Utilícense frascos de polietileno o de vidrio de borosilicato. Ajústese el pH de la muestra a < 2 con ácido nítrico. Éste disolverá el potasio insoluble y reducirá la adsorción sobre las paredes del recipiente.

DETERMINACIÓN DE METALES

3500-K B.

3-143

Método espectrometría) de absorción atómica

Véase método espectrométrico de absorción atómica de llama, sección 3111 B.

3500-K C.

Método de plasma de acoplamiento inductivo

Véase sección 3120.

3500-K D.

1.

Método fotométrico de llama

Discusión general

a) Principio: Las cantidades traza de potasio pueden determinarse en un fotómetro de llama de lectura directa o de patrón interno a una longitud de onda de 766,5 nm. Ya que mucha de la información sobre el sodio es aplicable también a la determinación de potasio, estúdiese con atención la discusión completa referente a la determinación fotométrica de llama del sodio (sección 3500-Na.D) antes de efectuar la determinación del potasio. b) Interferencia: La interferencia en el método de patrón interno puede tener lugar a relaciones de sodio-potasio de 5:1 o mayores. El calcio puede interferir si la relación calcio a potasio es 10:1 o más. El magnesio comienza a interferir cuando la relación magnesio a potasio sobrepasa de 100:1. c) Concentración mínima detectable: Pueden determinarse niveles de potasio de aproximadamente 0,1 mg/1. 2.

Instrumental

Véase sección 3500-Na.D.2.

3.

Reactivos

Con objeto de reducir al mínimo la captación de potasio, guárdense todas las soluciones en frascos de plástico. Utilícense recipientes pequeños para reducir la cantidad de elemento seco que puede quedar en las paredes del frasco cuando se vierte la solución. Sacúdase cuidadosamente cada recipiente para arrastrar las sales acumuladas en las paredes antes del vertido. a) Agua destilada desionizada: Utilícese este agua para preparar todos los reactivos y estándares de calibración y como agua de dilución. b) Solución de potasio de reserva: Disuélvanse 1,9707 g de KC1 secado a 110°C y dilúyase con agua hasta 1.000 mi; 1 ml = 1,00 mg K. c) Solución de potasio intermedia: Dilúyanse 10,0 ml de solución de potasio de reserva hasta 100 ml empleando agua; 1,00 ml = 0,100 mg K. Utilícese esta solución para preparar una curva de calibración en el intervalo de 1 a 10 mg de potasio/1. d) Solución de potasio patrón: Dilúyanse 10,0 ml de solución de potasio intermedia con agua hasta 100 ml; 1,00 ml

3-144

MÉTODOS NORMALIZADOS

= 0,010 mg K. Utilícese esta solución para preparar la curva de calibración en el intervalo de 0,1 a 1,0 mg de potasio/1. e) Solución patrón de litio: Véase sección 3500-Na.D.3e.

4. Procedimiento Determínese de la forma descrita en la sección 3500-Na.D.4, pero midiendo la intensidad de emisión a 766,5 nm.

6.

Se analizó en 33 laboratorios una muestra sintética con 3,1 mg K/l, 108 mg Ca/1, 82 mg Mg/1, 19,9 mg Na/1, 241 mg Cl¯/1, 0,25 mg NO-2 -N/l, 1,1 mg NO3- N/l, 259 mg SO 2-4 /l y 42,5 mg de alcalinidad total/1 (a la que contribuye el NaHCO3), utilizando el método fotométrico de llama, con una desviación relativa estándar de 15,5 por 100 y un error relativo de 2,3 por 100. 7.

5.

Precisión y sesgo

Bibliografía

MEHLICH, A. & R. J. MONROE. 1952. Report on potassium analyses by means of name photometer methods. J. As.wc. Offic. Agr. Chem. 35:588.

Cálculo

Véase sección 3500-Na.D.5.

Véase también 3500-Na.D.7.

3500-Re

3500-Re A.

RENIO

Introducción

El renio se encuentra normalmente en las aguas naturales en concentraciones traza (casi siempre < 10 μg/1).

3500-Re B.

Método espectrométrico de absorción atómica

Véase método espectrométrico de absorción atómica de llama, sección 3111 D.

DETERMINACIÓN DE METALES

3-145

3500-Rh

3500-Rh A. El rodio es relativamente infrecuente en las aguas naturales. Las aguas de pro-

3500-Rh B.

RODIO

Introducción cesado pueden contener concentraciones más altas.

Método espectrométrico de absorción atómica

Véase método espectrométrico de absorción atómica de llama, sección 3111 B.

3500-Ru

3500-Ru A. El rutenio es relativamente infrecuente en aguas naturales. Las aguas de proce-

3500-Ru B.

RUTENlO

Introducción sado pueden contener concentraciones más altas.

Método espectrométrico de absorción atómica

Véase método espectrométrico de absorción atómica de llama, sección 3111 B.

MÉTODOS NORMALIZADOS

3-146

3500-Se

3500-Se A. 1. Incidencia El selenio es un nutriente traza esencial y las enfermedades por deficiencia de selenio son muy conocidas en medicina veterinaria. Por encima de las concentraciones traza, el selenio ingerido es tóxico para los animales y puede serlo para los seres humanos. La concentración de selenio en la mayoría de las aguas potables y aguas naturales es inferior a 10 μg/1. Sin embargo, el agua intersticial en terrenos seleníferos de áreas semiáridas puede contener hasta cientos o miles de microgramos de selenio disuelto por litro. Ciertas plantas que crecen en las citadas áreas acumulan grandes concentraciones de selenio que pueden envenenar al ganado al que sirven como pasto. El agua drenada de estos suelos puede ser causa de contaminación ambiental y perjudicar la naturaleza. El selenio soluble puede lixiviarse desde las cenizas del carbón y polvo de cenizas en las centrales eléctricas que quemen carbón selenífero. La fracción inorgánica de selenio disuelto consiste predominantemente en selenio del ion selenato (SeO 2-4 ), que aquí se designará como Se(VI), y selenio del ion selenito (SeO32- ), Se(IV). El selenio derivado de la degradación microbiana de la materia orgánica selenífera incluye selenito, selenato y compuestos orgánicos volátiles dimetilseleniuro y di-

* Aprobado por el Standard Methods Committee, 1988.

SELENIO*

Introducción metildiseleniuro. Los compuestos orgánicos de selenio no volátiles pueden pasar al agua por procesos microbianos. Los iones selenopolisulfuro (SSe2-) pueden aparecer junto con sulfuro de hidrógeno en suelos anóxicos de agua estancada. 2.

Selección del método

El selenio puede determinarse por los métodos de absorción atómica (generación de hidruros/espectrometría de absorción atómica y espectrometría de absorción atómica electrotérmica) y de emisión atómica (plasma de acoplamiento inductivo), y por métodos químicos que suponen la obtención de un derivado de selenito y determinación del derivado orgánico por colorimetría o fluorometría. Los métodos de generación de hidruros (C) o atomización electrotérmica (H), colorimetría (D) y fluorometría (E) son los más sensibles entre los que se emplean, y se pueden aplicar al análisis de aguas junto con el método seleccionado de generación continua de hidruros/espectrometría de absorción atómica (C). Cuando se trata de determinar el selenio a concentraciones más altas, puede utilizarse el método de plasma de acoplamiento inductivo (I). Se puede distinguir la especie química en la muestra utilizando etapas preparatorias adecuadas para convertir otras especies químicas en Se(IV). En el agua potable y en la mayoría de aguas superficiales y subterráneas, el Se(IV), Se(VI) y el selenio en partículas suelen ser las úni-

3-147

DETERMINACIÓN DE METALES

cas especies significativas. Sin embargo, cuando es importante distinguir entre especies, por ejemplo, cuando se analiza una nueva matriz, se puede llevar a cabo el esquema analítico general, mostrado en la figura 3500-Se:l, de la forma siguiente: Determínese el selenio volátil por arrastre de la muestra con nitrógeno o aire y recogida del selenio en peróxido de hidrógeno alcalino (véase método F). En el caso de una estimación de selenio en partículas suspendidas, determínese el selenio total, fíltrese la muestra y llévese a cabo una segunda determinación del selenio total. En cualquier caso, hay que filtrar la muestra. Puede ocurrir que una muestra filtrada tenga el olor del sulfuro de hidrógeno y color amarillo; una muestra de este tipo puede contener selenopolisulfuros, que pueden calcularse por comparación de los resultados de los análisis de selenio total antes y después de la acidulación, arrastre con nitrógeno, sedimentación durante 10 minutos y nueva filtración. Determínese el selenito, Se(IV), por análisis de la muestra de agua filtrada directamente, empleando los métodos de las secciones 3500-Se, C, D o E. En principio, la digestión de la muestra con HC1 convertirá el Se(VI) a Se(IV) y el valor determinado será igual a la suma de las dos especies. En la práctica, las muestras suelen contener un agente de enmascaramiento desconocido que produce un resultado indebidamente bajo. Compruébese este efecto analizando las muestras con adiciones conocidas de ambas especies. Si la recuperación es buena, la digestión con HC1 seguida de análisis conducirá a resultados fiables. Si la recuperación es pobre y se ha de determinar el selenio orgánico a continuación, inténtese eliminar la interferencia por pretratamiento de la muestra con resina (B.l). También puede eliminarse la interferencia por digestión con un oxidante (B.2, 3 y 4), pero estos procedimientos impiden distinguir el Se(IV) y el selenio orgánico al mismo tiempo que oxidan muchos

compuestos orgánicos de selenio. Para medir los compuestos orgánicos de selenio no volátiles, utilícese el método G. La elección del método de digestión para oxidar interferencias y selenio orgánico depende de la matriz de la muestra. Los métodos descritos en B.2, 3 y 4, en orden creciente de complejidad y capacidad digestiva, utilizan persulfato amónico (o potásico), peróxido de hidrógeno y permanganato potásico. La digestión con persulfato amónico es adecuada para la mayor parte de agua potable subterránea filtrada, y agua superficial. La digestión con peróxido de hidrógeno puede resultar necesaria si hay compuestos orgánicos de selenio, y la digestión con permanganato potásico puede necesitarse con muestras sin filtrar o con compuestos orgánicos de selenio refractarios. Confírmense los resultados obtenidos con un método de digestión empleando un método más poderoso cuando se caracteriza una nueva matriz. 3. Interferencias Se encuentran interferencias en algunos reactivos, así como en muestras. El reconocimiento de la presencia de un interfiriente es crítico, sobre todo cuando se analizan matrices de muestra desconocidas. En análisis de rutina añádase Se(IV) y Se (VI) para comprobar interferencia. Si la hay, caracterícese la interferencia y corríjase por el método de adiciones de patrón. Una pendiente inferior a uno indica interferencia. En casos de interferencia débil (recuperaciones reducidas en un 25 por 100 o menos), el método de las adiciones de patrón corregirá con amplitud los valores determinados. Debido a que el método de absorción atómica de hidruro es extremadamente sensible, las muestras necesitan frecuentemente diluirse para adecuarlas al intervalo lineal del instrumento. La dilución de una muestra de agua filtrada elimina-

3-148

MÉTODOS NORMALIZADOS

Figura 3500-Se:l. Esquema general para especiación de selenio en agua.

3-149

DETERMINACIÓN DE METALES

rá muchas veces las interferencias relacionadas con la muestra. Inclúyanse blancos de los reactivos completos en cada marcha analítica para cerciorarse de la ausencia de contaminación por parte de los reactivos. La absorción atómica de generación de hidruros es susceptible de problemas de interferencia corrientes relacionados con nitrito en la muestra o cloro libre en el reactivo HC1 (véase método C).

4.

Bibliografía

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3500-Se B.

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Preparación de la muestra

1. Eliminación de la interferencia orgánica y del hierro por pretratamiento con resina En el análisis de selenio son comunes las interferencias sobre todo tratándose de diferenciar entre especies químicas. El pretratamiento de rutina de muestras de agua, tal como el aquí descrito, no es necesario. Deberán ensayarse los métodos de esta sección en el caso en que una recuperación pobre indique un problema. Existen muchas aguas que contienen hierro y/o materia orgánica disuelta (ácido húmico) en cantidades suficientes para interferir. La reducción de Se(VI) a Se(IV) normalmente no es cuantitativa. Cuando las adiciones de patrón de

Se(VI) muestran una pobre recuperación, trátese la muestra antes del análisis. Para eliminar los compuestos orgánicos disueltos, pásese una muestra acidulada a través de una resina. Como los compuestos orgánicos de selenio disueltos pueden ser eliminados también al utilizar este tratamiento, determínese asimismo el selenio total en la muestra de agua sin tratar (véanse 2, 3 o 4 a continuación). Para eliminar el hierro, utilícese una resina de intercambio iónico de base fuerte *. En este tratamiento, ni la acidez ni el intercambiador iónico alteran el análisis por especies; complétese el análisis por especies del selenio si es posible. * Bio-Rad AGI-X8 o equivalente.

3-150

a) Instrumental: 1) Columna de cromatografía para eliminación de materia orgánica, de vidrio de aproximadamente 0,8 cm de DI x 30 cm de largo, con válvula de medida de fluorocarburos. 2) Columna de cromatografía para intercambio iónico, de polietileno desechable†. 3) pHmetro. b) Reactivos: 1) Resina de eliminación de sustancias orgánicas: Lávese cuidadosamente la resina de 16 a 50 mallas ‡ con agua desionizada y elimínense los finos de resina por decantación. Enjuáguese tres veces con solución de pH 12. Guárdese la resina en solución de pH 12 y refrigérese para evitar el crecimiento bacteriano. 2) Resina de intercambio aniónico: Añádase resina § de intercambio aniónico de 100 a 200 mallas a un vaso y enjuagúese cuidadosamente con agua desionizada. Cúbrase la resina con HC1 4N, agítese y déjese sedimentar. Decántese y repítase dos veces más el enjuague con ácido. Guárdese la resina en HC1 4N. 3) Ácido clorhídrico conc: Antes de usar el ácido, hágase burbujear helio a su través durante 3 horas a una tasa de 100 ml/minuto. (PRECAUCIÓN: Utilícese campana de humos.) 4) Solución de pH 1,6: Ajústese el pH de agua desionizada a 1,6 empleando HC1. 5) Solución de pH 12: Ajústese el pH de agua desionizada a 12 empleando KOH. c) Procedimiento: 1) Eliminación de sustancia orgánica. Colóquense 5 cm de resina lavada en una columna de 0,8 cm de DI. Preacondició-

† Bio-Rad Econo-Columns o equivalente. ‡ Amberlite XAD-8, Supelco o equivalente. § Bio-Rad AG1-X8 o equivalente.

MÉTODOS NORMALIZADOS

nese la columna a 1 ml/min con 30 ml de solución de pH 12 y 20 ml de solución de pH 1,6. Ajústese la muestra desde pH 1,6 a pH 1,8 empleando HC1 y un pHmetro. Hágase pasar la muestra a través de la columna preacondicionada a la tasa de 1 ml/min. Descártense los 10 primeros ml y utilícense los siguientes 1 l a 50 ml recogidos para determinar el Se(IV) por los métodos C, D o E, precedidos, en el caso de que también se vaya a determinar Se(VI), de una etapa preparatoria B.5. Si se necesitan más de 50 ml de muestra, empléese otra columna u otra columna con doble cantidad de resina. 2) Eliminación de hierro. Introdúzcanse 4 cm de resina preparada en una pequeña columna cromatográfica (añádase la resina a la columna llena de HC1 4N para evitar las burbujas de aire). Enjuagúese la columna con 10 ml de HC1 4N a una tasa de flujo < 6 ml/min. Déjese que la solución drene hacia la parte alta de la resina, pero sin dejar que la columna funcione en seco. Ajústese la muestra con HC1 4N y viértase en la columna. Descártense los 10 primeros mililitros y recójanse los siguientes 1 l a 100 ml para el análisis de Se(IV) por los métodos C, D o E, precedidos, si es necesario, por la etapa preparatoria B.2 y, si también se determina el Se(VI), por la etapa preparatoria B.5, que se da a continuación. 2. Eliminación de interferencia por digestión con persulfato La combinación de este procedimiento con la etapa B.5, que se da a continuación, y el método C, D o E, es, en la mayoría de los casos, el método preferido para determinar el selenio total en agua filtrada. A la mezcla de muestra y HC1 se añade una pequeña cantidad de persulfato amónico o potásico para eliminar la interferencia de los agentes reductores y para oxidar los compuestos orgánicos de

3-151

DETERMINACIÓN DE METALES

selenio relativamente lábiles, tales como selenoaminoácidos o ácido metanoselenínico. Si la muestra contiene sulfuro de hidrógeno o una gran concentración de materia orgánica, o se sospecha que la haya, así como para confirmar la precisión del método, se vuelve a analizar la muestra utilizando el procedimiento 3 o 4, que se da a continuación. Prepárese una solución de persulfato amónico o potásico al 2 por 100 por disolución de 2,0 g en 100 ml de agua desionizada (preparada semanalmente). Añádanse 0,2 ml de solución de persulfato a la muestra mezclada y HC1 del apartado B.5c antes de calentar y proceder al tratamiento y análisis. Después de completar el análisis, multiplíquese por 2,04 la concentración de selenio determinada en la muestra acidulada para obtener el selenio total en la muestra original.

3. Eliminación de interferencia por digestión con peróxido de hidrógeno alcalino Hay veces que la digestión con persulfato da una recuperación incompleta del selenio total. En este caso se utiliza la digestión con peróxido de hidrógeno para eliminar todos los reductores que pudieran interferir y para oxidar por completo el selenio orgánico a Se(VI). La solución resultante puede analizarse en cuanto al selenio total después del pretratamiento según la etapa B.5 a continuación. Este método es adecuado para determinar el selenio total en muestras de agua sin filtrar, cuando existe selenio en partículas. Al trabajar con una nueva matriz, confírmense los resultados obtenidos volviendo a analizar la muestra empleando el procedimiento de digestión 4, a continuación.

a) Instrumental: 1) 2) 3) 4) 5)

Vasos, 150 ml. Vidrios de reloj. Placa caliente. Pipeta, 1 ml y boquillas. Probeta graduada, 25 ml.

b) Reactivos: 1) Peróxido de hidrógeno, H2O2 al 30 por 100. Manténgase refrigerado. 2) Hidróxido sódico, NaOH 1N. 3) Ácido clorhídrico, HC1 1,5N: Dilúyanse 125 ml de HC1 conc. hasta 1 l empleando agua desionizada. c) Procedimiento: Añádanse 2 ml de H2O2 al 30 por 100 y 1 ml de NaOH 1N a 25 ml de muestra en un vaso. Cúbrase el vaso para evitar salpicaduras y póngase a calentar sobre la placa caliente hasta que disminuyen las finas burbujas características de la descomposición del H2O2 y son reemplazadas por una ebullición ordinaria. Añádase 1 ml de HC1 1,5N para volver a disolver cualquier precipitado que pueda haberse formado, déjese enfriar y viértase en una probeta graduada. Enjuáguese el vaso con agua desionizada incorporando este agua de lavado a la probeta graduada y llévese el volumen hasta 25 ml. Procédase según B.5 y el método analítico elegido.

4. Eliminación de interferencia por digestión con permanganato Este método de digestión utiliza permanganato potásico para oxidar el selenio y eliminar los compuestos orgánicos que interfieren. El exceso de KMnO4 y MnO2 se eliminan por reacción con hidroxilamina. La digestión con HC1 se incluye aquí, porque resulta conveniente realizarla en el mismo frasco de reacción. Se puede entonces determinar selenito directamente empleando el método C, D o E.

3-152

Hágase la recuperación para la matriz dada. Este método da una buena recuperación incluso con muestras de agua muy contaminadas, que contienen compuestos orgánicos de selenio, materia orgánica disuelta y material suspendido visible. El permanganato puede oxidar el ion cloro a cloro libre. Parte del cloro (el que interfiere con análisis de hidruro) se elimina por reacción con hidroxilamina, pero la mejor forma de eliminación del cloro libre es la calefacción prolongada en frasco abierto durante la etapa de digestión. El exceso de hidroxilamina puede reducir la recuperación por reducción del selenio a Se(0). a) Instrumental: 1) Estufa con termostato, para operación continua a 110 ± 5 °C. 2) Frascos de digestión, 40 ml, con tapones a rosca cubiertos de fluorocarbono. 3) Soporte metálico para 40 frascos de digestión. b) Reactivos: 1) Ácido clorhídrico, HC1 conc. [véase B.163)]. 2) Ácido clorhídrico, HC1 10N: Dilúyanse 1.000 ml de HC1 conc. hasta 1200 ml empleando agua desionizada. 3) Ácido sulfúrico, H2SO4 conc. y al 25 por 100. NOTA: Muchas marcas de H2SO4 están contaminadas con selenio. Analícense blancos del reactivo cuando se comienza un nuevo frasco. Obténgase una solución al 25 por 100 v/v por adición de 250 ml de H2SO4 conc. a 500 ml de agua desionizada y dilúyase hasta 1 l. 4) Solución de permanganato potásico, KMnO4 al 5 por 100 (p/v): Disuélvanse 50 g de KMnO4 en 1.000 ml de agua desionizada. 5) Solución de clorhidrato de hidroxilamina: Disuélvanse 100 g de NH2OHHC1 en 1.000 ml de agua desionizada.

MÉTODOS NORMALIZADOS

c) Procedimiento: Llévense con la pipeta 5 ml de muestra a un frasco de digestión, añádanse 5 ml de H2SO4 al 25 por 100 y 1 ml de solución de KMnO4. Ciérrese con el tapón de rosca y colóquese en la estufa precalentada a 110°C durante 1 hora. Sáquese la bandeja de viales de la estufa y enfríese a temperatura ambiente. Ábrase el frasco, añádanse cuidadosamente unas cuantas gotas de solución de clorhidrato de hidroxilamina, mézclese y espérese hasta que la muestra se decolora y el dióxido de manganeso residual se ha disuelto. Evítese un exceso de solución de hidroxilamina que puede dar lugar a una lectura baja. Añádanse 10 ml de HC1 conc. a la muestra y caliéntese el frasco a 95 °C durante 60 minutos sin el tapón. Déjese enfriar hasta la temperatura ambiente. Pásese la muestra a un matraz volumétrico de 25 ml o a una probeta graduada, enjuáguese el frasco añadiendo el liquido de lavado al matraz, dilúyase hasta la señal y mézclese bien. Procédase al análisis por los métodos C, D o E. Si se emplea el método C, multiplíquense las lecturas del espectrómetro por el factor de dilución como sigue: Concentración, μg/1 =

5. Reducción de Se(VI) a Se(IV) por digestión con ácido clorhídrico El Se(VI) se reduce a Se(IV) por digestión con HC1. Determínese Se(IV) + + Se(VI) por espectrometría de absorción atómica de generación de hidruros (método C) o como un derivado orgánico (método D o E). Ensáyese cualquier matriz de muestra dada para asegurarse de la recuperación del Se(VI) añadido. Si la recuperación es baja, pruébese a eliminar la interferencia por el procedimiento

3-153

DETERMINACIÓN DE METALES

del apartado B.l anterior, o si al menos se alcanza una recuperación del 75 por 100, utilícese el método de adiciones de patrón. El método aquí descrito es de limitada utilidad para el análisis directo de muestras de agua, pero es útil como una etapa de la determinación de selenio total, en una muestra en la que el selenio ha sido oxidado a Se(VI). a) Instrumental: 1) Un cuentagotas, tipo frasco, 5 ml, adecuado para distribución de HC1 conc. 2) Pipetas de 0,2 y 5 ml. 3) Tubos de cultivo de tapón roscado, de vidrio al borosilicato, 25 x 150 mm. 4) Baño maría a ebullición, adecuado para calentar tubos de cultivo; un vaso de 1 l sobre placa caliente resulta adecuado. b) Reactivos: 1) Solución de selenato sódico para adiciones: Dilúyanse 1.000 mg/1 de solución de selenato de reserva con agua desionizada para preparar una solución de 1 a 10 mg/1, de manera que la concentración de la solución de adición sea aproximadamente 50 veces mayor que el selenio total previsto en la muestra que se va a analizar. 2) Ácido clorhídrico, HC1 conc: Véase B.l 63). c) Procedimiento: Calíbrese el cuentagotas de ácido utilizando agua. Caliéntese en baño maría. Llévense con la pipe-

3500-Se C.

ta 5 ml de muestra filtrada a un tubo de cultivo. Añádanse 5 ml de HC1 conc. Déjese flojo el tapón del tubo (no apretado) y coloqúese en el baño maría hirviendo durante 20 minutos. Déjese enfriar el tubo y apriétese el tapón. Determínese el Se(IV) total por el método C, D o F. Añádanse 0,200 ml de solución para adiciones con una pipeta de microlitros a la muestra y procédase como antes. Analícese un blanco de agua desionizada y un blanco con la adición para asegurarse de la ausencia de contaminación y para determinar el verdadero valor de la adición. Multiplíquese por 2,00 la concentración de selenio determinada en la muestra acidulada para obtener la concentración total de Se(IV) + Se(VI). Multiplíquese por 2,04 la lectura obtenida para la muestra con adición. 6.

Bibliografía

JANGHORBANI, M., B. TING, A. NAHAPETLAN & R. YOUNG. 1982. Conversión of urinary selenium to selenium IV by wet oxidation. Anal. Chem. 54:1188. ADELOJU, S. B. & A. M. BOND. 1984. Critical evaluation of some wet digestión methods for the stripping voltammetric determination of selenium in biological materials. Anal. Chem. 56:2397. BRIMMER, S. P., W. R. FAWCETT & K. A. KULHAVY. 1987. Quantitative reduction of selenate ion to selenite in aqueous samples. Anal. Chem. 59:1470.

Método continuo de generación de hidruros/ espectrometría de absorción atómica

Véase sección 3114C.

3-154

MÉTODOS NORMALIZADOS

3500-Se D. 1.

Método colorimétrico

Discusión general

a) Principio: Este método es específico para determinar selenito en solución acuosa. El selenito reacciona con 2,3-diaminonaftaleno para producir un compuesto piaselenol de color brillante y fuertemente fluorescente, que se extrae con ciclohexano y se mide por colorimetría o fluorometría (véase método E). El pH óptimo para la formación del complejo piaselenol es aproximadamente 1,5, sin que deba estar nunca por encima de 2,5, pues por encima de pH 2, la tasa de formación del compuesto coloreado depende críticamente del pH. Cuando en este caso se emplean indicadores para ajustar el pH resultan erráticos con frecuencia, pero se pueden mejorar cuando se sigue el pH electroquímicamente. b) Interferencia: No se conocen compuestos inorgánicos que den una interferencia positiva. Pueden encontrarse compuestos orgánicos coloreados extraíbles con ciclohexano, pero normalmente no están presentes o pueden eliminarse por oxidación de la muestra (véase B.2, 3 o 4) o tratándola para eliminar las sustancias orgánicas disueltas (véase B.l). La interferencia negativa tiene su origen en compuestos que reducen la concentración de diaminonaftaleno al oxidarlo. La adición de EDTA elimina la interferencia negativa de al menos 2,5 mg Fe2 + . c) Cantidad mínima detectable: 10 μg Se/1. 2.

Instrumental

a) Equipo colorimétrico: Un espectrofotómetro para ser utilizado a 480 nm, que proporciona un trayecto luminoso de 1 cm o más largo. b) Embudo de separación, 250 ml, preferiblemente con una llave de fluorocarbono.

c) Baño maña controlado termostáticamente (50 °C), con tapa. d) pHmetro. e) Centrífuga, con rotor para tubos de 50 ml (opcional). f) Frascos de centrífuga, 60 ml, con tapón a rosca, de fluorocarburo. g) Agitador de sacudida, adecuado para embudo de separación (opcional). 3.

Reactivos

Utilícese agua destilada y/o desionizada para preparar reactivos. a) Solución patrón de referencia de selenio: Disuélvanse 2,190 g de selenito de sodio, Na2SeO3, en agua que contiene 10 ml de HC1 y dilúyase hasta 1 l; 1,00 ml = = 1,00 mg Se(VI). b) Soluciones de selenio patrones de trabajo: dilúyase con agua la solución patrón de referencia de selenio o una solución de base adecuada para obtener una serie de patrones de trabajo que abarquen el intervalo de concentraciones que interesa. c) Ácido clorhídrico: HC1 conc. y 0,1 N. d) Hidróxido amónico, NH4OH al 50 por 100 v/v. e) Ciclohexano, C6H12. f) Solución de 2,3-diaminonaftaleno (DAN): Disuélvanse 200 mg de DAN en 200 ml de HC1 0,1 N. Sacúdase durante 5 minutos. Extráigase tres veces con porciones de 25 ml de ciclohexano reteniendo la fase acuosa y descartando las porciones orgánicas. Fíltrese en un recipiente oscuro* y guárdese en lugar fresco y oscuro no más de 8 horas. (PRECAUCIÓN: Es tóxico, manipúlese con mucho cuidado.) * Utilícese papel de filtro Whatman n.° 42 o equivalente.

DETERMINACIÓN DE METALES

g) Solución de hidroxilamina-EDTA (HA-EDTA): Disuélvanse 4,5 g de Na2EDTA en aproximadamente 450 ml de agua. Añádanse 12,5 g de clorhidrato de hidroxilamina (NH2OH·HC1) y ajústese el volumen a 500 ml. 4. Procedimiento a) Formación de piaselenol: Añádanse 2 ml de solución de HA-EDTA a 10 ml de muestra en un frasco de centrífuga de 60 ml [filtrada si se quiere determinar Se(IV); oxidada por el método B.2, 3 o 4, y reducida después por el método B.5 para Se total]. Ajústese a pH 1,5 ± 0,3 con HC1 0,1N y NH4OH al 50 por 100 utilizando un pHmetro. Añádanse 5 ml de solución de DAN y caliéntese en un baño maría, cubierto, a 50 °C durante 30 minutos. b) Extracción de piaselenol: Enfríese y añádanse 2,0 ml de ciclohexano. Ciérrese fuertemente el recipiente y sacúdase vigorosamente durante 5 minutos. Déjese reposar la solución durante 5 minutos o hasta que la capa de ciclohexano queda bien separada. Si la separación es lenta, centrifúguese durante 5 minutos a 2.000 rpm. Coloqúese el frasco en una pinza o soporte de anillo con un ángulo de 45° respecto a la vertical. Sáquese la fase acuosa valiéndose de una pipeta desechable unida a una línea de vacío. Pásese la fase orgánica a un pequeño recipiente con tapa empleando

3-155

una pipeta desechable limpia, o a la cubeta del espectrofotómetro si se va a leer inmediatamente la absorbancia. c) Determinación de la absorbancia: Léase la absorbancia a 480 nm utilizando un patrón de cero. El color del piaselenol es muy estable, pero la evaporación del ciclohexano concentra el color a menos que el recipiente esté tapado. (PRECAUCIÓN: Evítese inhalar los vapores de ciclohexano.) Obedece la ley de Beer hasta 2 mg/1.

5. Cálculo Trácese una curva de calibración utilizando al menos una curva estándar de tres puntos para horquillar la concentración de muestra esperada. Señálese absorbancia en función de concentración. Corríjase por blanco de digestión y un blanco de reactivo.

6.

Precisión y sesgo

Para evaluar la recuperación de Se1 se utilizaron tres materiales de referencia (harina de trigo, agua y un estándar comercial). La muestra de harina de trigo se digirió con HNO3 y HC1O4 para convertir el selenio total a Se(VI); se digirió con HC1 para convertir Se(VI) a Se(IV), utilizando después el método colorimétrico. Los resultados son los siguientes:

3-156

7.

MÉTODOS NORMALIZADOS

Referencia

1. HOLTZCLAW, K. M., R. H. NEAL, G. SPOSITO & S. J. TRAÍNA. 1987. A sensitive colorimetric method for the quantitation of selenite in soil solutions and natural waters. Soil Sci. Soc. Amer. J. 51:75.

8.

Bibliografía

HOSTE, J. & J. GILLIS. 1955. Spectrophotometric determination of traces of selenium with 3,3'diaminobenzidine. Anal. Chim. Acta. 12:158.

3500-Se E.

CHENG, K. 1956. Determination of traces of selenium. Anal. Chem. 28:1738. MAGÍN, G. B. y otros. 1960. Suggested modified method for colorimetric determination of selenium in natural waters. J. Amer. Water Works As.soc. 52:1199. ROSSUM, J. R. & P. A. VILLARRUZ. 1962. Suggested methods for determining selenium in water. J. Amer. Water Works Assoc. 54:746. OLSEN, O. E. 1973. Simplified spectrophotometric analysis of plants for selenium. J. Assoc. Offic. Anal. Chem. 56:1073.

Método fluorométrico

1. Discusión general

3.

a) Principio: Este procedimiento es comparable al anterior, excepto en que el derivado de piaselenol se mide por fluorometría. El límite de detección es 10 μg Se/1, pero puede mejorarse hasta 1 μg Se/1 empleando un procedimiento semiautomático. b) Interferencias: Pueden interferir concentraciones altas de nitrito con la formación del complejo de piaselenol fluorescente y requerir la eliminación a través de una ebullición suave durante 2 minutos antes de la formación del piaselenol.

Véase método D.

2. Instrumental Además del instrumental requerido para el método D (de c a f): a) Equipo fluorométrico: Un fluorómetro con la capacidad de irradiación de las muestras a 369 nm y medición de la fluorescencia a 525 nm. b) Embudos de separación, 125 ml, con llaves de fluorocarbono.

Reactivos

4. Procedimiento a) Formación de piaselenol: Añádanse 5 ml de solución HA-EDTA a 10 ml de muestra y ajústese el pH entre 1,7 y 2,0. Añádanse 5 ml de solución de DAN, mézclese bien y caliéntese en un baño maría a 50 °C durante 30 minutos. b) Extracción del piaselenol: Cuando se enfríe, pásese a un embudo de separación de 125 ml. Añádanse 6 ml de ciclohexano y sacúdase durante 1 minuto. Descártese la fase acuosa y lávese la fase orgánica con 25 ml de HC1 0,1 N, sacudiendo y descartando la fase acuosa. c) Determinación de fluorescencia: Pásese la fase orgánica a un tubo de centrífuga. Déjese reposar la solución durante 5 minutos o hasta que la capa de ciclohexano queda bien separada. Si la separación es lenta, centrifúguese durante 5 minutos a 2.000 rpm. Llévese con la pipeta una porción a la cubeta del

3-157

DETERMINACIÓN DE METALES

fluorómetro y léase; póngase el instrumento a cero frente a un blanco de reactivo. 5.

Cálculo

Véase método D.5. 6.

7.

Bibliografía

OLSEN, O. E. 1969. Fluorometric analysis of selenium in plants. J. Assoc. Offic. Anal. Chem. 52:627. TAKAYANAGI, K. & G. WONG. 1983. Fluorometric determination of selenium IV and total selenium in natural waters. Anal. Chim. Acta 148:263.

Precisión y sesgo

La precisión y el sesgo son comparables a los conseguidos con el método D.

3500-Se F. 1.

Determinación del selenio volátil

Discusión general

El seleniuro de dimetilo y el diseleniuro de dimetilo son compuestos orgánicos de muy mal olor y de bajo punto de ebullición, moderadamente solubles en agua. Son producidos por procesos microbianos en suelos seleníferos y degradación de la materia orgánica selenífera y a veces se encuentran en aguas naturales. Se arrastran fácilmente con aire desde una muestra de agua y pueden recogerse con elevados rendimientos en una solución alcalina de peróxido de hidrógeno, que los oxida cuantitativamente a Se(VI). El selenio total se determina por digestión con HC1 y análisis por el método de absorción atómica de hidruros, colorimétrico o fluorométrico. Tanto el nitrógeno como el aire pueden utilizarse para el arrastre de la muestra. Utilícese preferiblemente nitrógeno si se sospecha que haya compuestos sensibles al aire (por ejemplo, selenopolisulfuros). Es preferible hacer el arrastre de la muestra con aire in situ inmediatamente después de recogida, debido a que el selenio volátil puede perderse en el transcur-

so de la recogida y manipulación de la muestra. Después de llevar a ebullición para descomponer el H2O2, vuélvase a llevar la solución alcalina de peróxido al laboratorio para el análisis.

2.

Instrumental

Todo el instrumental requerido para la reducción de selenato (B.5) y método C, D o E, y además: a) Frascos lavadores de gas, de vidrio de borosilicato, de 250 ml, con vidrio de poro grueso para dispersión del gas. Señal en el costado del frasco a nivel de 100 ml. b) Rotámetro, para medir el flujo del aire de 3 1/min. c) Regulador del flujo de gas. d) Placa caliente. e) Probeta graduada, 100 ml. f) Vasos, 250 ml. g) Tubos de caucho, para interconectar los frascos lavadores de gas y otro equipo de gas. h) Guantes de caucho.

3-158

3.

Reactivos

Todos los reactivos requeridos para la reducción de selenato (B.5) y método C, D o E, y además: a) Peróxido de hidrógeno, al 30 por 100. Refrigérese. b) Solución de hidróxido sódico, NaOH 1N. c) Nitrógeno o aire comprimido.

4.

Procedimiento

Instálese una línea de flujo de aire en este orden: Suministro regulado de aire o rotámetro o frasco lavador de gas 1 o frasco lavador de gas 2. Prepárese una solución alcalina de peróxido inmediatamente antes de usarla introduciendo 20 ml de H2O2 al 30 por 100 en una probeta graduada de 100 ml, añadiendo 50 a 60 ml de agua desionizada y 5 ml de NaOH 1N, y llevándolo hasta 100 ml. PRECAUCIÓN: El H2O2 alcalino es inestable. No tenerlo en frasco de vidrio, sino en frasco de plástico de gran tamaño y a 0°C aproximadamente. La solución es corrosiva: protéjanse ojos y piel. Viértase en el frasco lavador de gas 2. Viértanse aproximadamente 100 ml de muestra recién tomada en el frasco lavador de gas 1. No intentar medir con precisión el volumen de la muestra antes de la determinación del selenio volátil, ya que una manipulación innecesaria puede dar lugar a pérdidas del selenio volátil. Conéctense y compruébense todas las líneas de aire y ábrase la llave del aire ajustando el flujo a 3 1/min. Arrástrese durante 30 minutos o más.

MÉTODOS NORMALIZADOS

Al cabo de 30 minutos, ciérrese la llave del aire, desconéctese el frasco lavador de gas 2 y coloqúese éste sobre la placa caliente. Ajústese el calor para que se produzca un suave borboteo de las burbujas de oxígeno por la descomposición de H2O2. Continúese calentando hasta que disminuye la efervescencia característica del oxígeno y es sustituida por ebullición ordinaria. Quítese de la placa caliente y déjese enfriar. Viértase la solución en un vaso. (El volumen será aproximadamente de 100 ml y no necesitará corrección normalmente.) Analícese en cuanto al selenio total empleando digestión con HC1 (B.5) y método C, D o E. Una vez que ha hervido, esta solución se puede conservar con segundad y transportarse en frascos de plástico. Mídase el volumen de muestra del frasco lavador de gas. 5.

Cálculo

La concentración de los compuestos volátiles de selenio en la muestra de agua original puede calcularse como sigue:

6.

Precisión y sesgo

Con 30 minutos de arrastre con aire se recogerán aproximadamente 90 por 100 de seleniuro de dimetilo de las muestras. No se conoce la recuperación de diseleniuro de dimetilo. La pérdida de gases a la atmósfera durante la toma de muestras y la manipulación que precede al análisis puede conducir a un error negativo significativo.

DETERMINACIÓN DE METALES

3500-Se G. 1.

3-159

Determinación de compuestos orgánicos de selenio no volátiles

Discusión general

En principio, la cantidad total de selenio orgánico disuelto más el selenio polisulfuro puede calcularse comparando el «Se total», determinado por oxidación y digestión con HC1 (B.2 o 3 y B.5 o B.4), seguido por el método C, D o E, con Se(IV) + Se(VI) determinado por digestión con HC1 (B.5) y método C, D o E. En la práctica esto proporcionará una estimación significativa sólo en el caso de que se recupere por completo una adición conocida de Se(VI). Incluso cuando la recuperación es buena, esta estimación puede no resultar fiable, al tratarse de la diferencia de dos números (frecuentemente grandes) determinados por métodos ligeramente diferentes. Comparando el selenio total antes y después del tratamiento con resina [B.lcl)] se tiene una estimación asimismo poco fiable de Se orgánico no volátil. Es preferible separar y determinar directamente el selenio orgánico no volátil. Uno de los métodos supone la adsorción de materia orgánica disuelta sobre una resina de HPLC de fase inversa C-18, elución con un disolvente orgánico y determinación del selenio en esta fracción. Aunque esta técnica es relativamente sencilla, queda afecta por el pH y las pequeñas moléculas orgánicas (por ejemplo, los aminoácidos individuales) no son retenidas por las resinas. Ajústese la muestra a pH 1,5 a 2,0 antes de utilizar la columna, aunque debido a que el último problema citado no puede resolverse con facilidad, el empleo de adsorbentes orgánicos sólo proporciona una estimación de la concentración de selenio orgánico. Alternativamente, aíslense los compuestos específicos y determínese su contenido en selenio. En algunas aguas natu-

rales el selenio puede estar asociado a polipéptidos o pequeñas proteínas disueltos, e incluso puede haber pequeñas cantidades de selenoaminoácidos libres. Una determinación directa es a veces deseable, porque los selenoaminoácidos constituyen la forma más tóxica del elemento. Para determinar el selenio en péptidos disueltos, hidrolícese con ácido y aíslense los aminoácidos libres por cromatografía de intercambio del ligando. Elúyanse los selenoaminoácidos de la columna y determínese el selenio. Los selenoaminoácidos son inestables durante la hidrólisis acida, y aunque se utilice ácido metil sulfónico no oxidante y ampollas de vidrio purgadas con nitrógeno, las recuperaciones de selenoaminoácidos solamente alcanzan entre el 50 y el 80 por 100. Este método únicamente es bueno para calcular el selenio unido a proteínas. Una estimación algo más fiable de selenoaminoácidos libres y selenio asociado a pequeños oligopéptidos se obtiene llevando a cabo un procedimiento similar sin la etapa de hidrólisis. Aunque estos métodos resultan demasiado complicados para un análisis de rutina, son semicuantitativos y sólo sensibles para ciertas clases de compuestos orgánicos, actualmente son los únicos de que se dispone con experiencia práctica. Una separación imperfecta de compuestos orgánicos de selenio de las formas inorgánicas de selenio puede causar interferencia. Paralelamente con la determinación real, realícese siempre el procedimiento empleando una solución de composición semejante a la matriz real y que contenga una cantidad análoga de selenio, pero en la forma de Se(IV) y Se(VI) para determinar el grado de interferencia.

MÉTODOS NORMALIZADOS

3-160

2.

Instrumental

a) Evaporador rotatorio, con baño de control de temperatura y matraces redondos de 30 ml. b) Aparato de cierre de ampollas de vidrio, o soplete de oxígeno-gas. c) Calentador de bloque, 100 °C, o autoclave. d) Columnas de vidrio para cromatografía, 15 cm de longitud, 0,7 cm de DI*. e) Jeringa de vidrio, 50 ml. f) Ampollas de vidrio, de 10 o 20 ml. Límpiense calentando en un horno de mufla a 400 °C durante 24 horas. g) pHmetro. 3.

Reactivos

a) Acido clorhídrico, HC1 1N. b) Acido metil sulfónico conc. c) Hidróxido amónico, NH4OH l,5N: Dilúyanse 100 ml de NH4OH conc. hasta 1 l empleando agua desionizada. d) Hidróxido sódico, NaOH, perlas y solución 1N. e) Solución de pH 1,6: Ajústese el pH de agua desionizada a 1,6 empleando HC1. f) Solución de pH 9,0: Ajústese el pH de agua desionizada a 9,0 empleando NaOH. g) Solución de sulfato de cobre, CuSO4 1M: Disuélvanse 25 g de CuSO4 · 5H2O en agua desionizada y dilúyase hasta 100 ml. h) Metanol, purificado. i) Cartuchos † C-18: Empleando una jeringa de vidrio, pásese la siguiente secuencia de reactivos a través del cartucho para limpiar la resina (6 ml/min o menos); 10 ml de agua desionizada; 20 ml de HC1 1 N; 10 ml de agua desionizada; 20 ml de metanol; 10 ml de agua desioni-

* Econo-columnas de vidrio Bio-Rad o equivalente. † Sep-Pak, Waters Associates, o equivalente.

zada, y 20 ml de solución de pH 1,6. Refrigérense los cartuchos, pero sin congelarlos. j) Resina cromatográfica de intercambio de ligandos, 100/200 mallas: Enjuagúese la resina ‡ con agua desionizada para eliminar los finos. Enjuáguese después la resina tres veces con la siguiente secuencia: HC1 1N, NH4OH 1,5N y agua desionizada. Almacénese la resina húmeda. k) Resina cromatográfica de intercambio de ligandos tratada con cobre, 100/200 mallas: Enjuáguese la resina‡ con agua desionizada para eliminar los finos. Enjuáguese después tres veces con HC1 1N y luego con agua desionizada. Ajústese aproximadamente a 7 el pH del sobrenadante de encima de la resina, utilizando NaOH. Añádase solución de CuSO4 a la resina y agítese. Después de que se sedimente, decántese el sobrenadante y añádase más solución de CuSO4. Decántese la solución de CuSO4 y enjuagúese con agua desionizada hasta que no aparezca cobre en el sobrenadante. Enjuagúese la resina tres veces con NH4OH 1,5N y tres veces con agua desionizada. Almacénese la resina húmeda. 4.

Procedimientos

a) Selenio orgánico extraíble: Ajústese el pH de la muestra (5 a 50 ml) entre 1,5 y 2,0 empleando HC1 e introdúzcase en una jeringa de vidrio limpia que lleve conectado un cartucho C-18 limpio. Empújese la muestra a través del cartucho a una velocidad de 6 ml/min. Después de quitar el cartucho, extráiganse 2 ml de solución de pH 1,6 con la jeringa a modo de enjuague, vuélvase a conectar el cartucho y empújese el líquido de enjuagado a su través. Repítase el proceso dos veces más. El cartucho puede refrigerarse para

‡ Chelex 100 (forma amonio) Bio Rad o equivalente.

3-161

DETERMINACIÓN DE METALES

almacenarlo. Empújense 10 ml de metanol a través del cartucho a una velocidad de 2 ml/min y recójase el soluto en un matraz piriforme de 30 ml, con objeto de diluir el selenio orgánico. Elimínese el metanol en el evaporador rotatorio a una temperatura en baño maría inferior a 40 °C. Utilícese agua desionizada para solucionar y transportar el residuo al vaso utilizado para las digestiones del selenio total. Determínese el selenio disuelto total por digestión con persulfato (B.2) o peróxido (B.3), reducción de Se(VI) (B.5) y análisis por método C, D o E. b) Hidrólisis de selenio unido a proteína: Coloqúese la muestra filtrada en una ampolla de vidrio de 10 o 20 ml (según el volumen que se desee) y añádase ácido metilsulfónico conc. hasta ajustar la concentración a 4M. Púrguese la muestra acidulada durante 10 minutos empleando nitrógeno y ciérrese con soplete el extremo superior. Caliéntese la ampolla cerrada a 100 °C durante 24 horas en un calentador de bloque o autoclave. Pásese la solución de hidrólisis enfriada junto con los lavados con agua desionizada a un vaso de precipitados de 50 ml y coloqúese en un baño de hielo. Ajústese el pH a 9,0 empleando perlas de NaOH y NaOH 1N, teniendo cuidado de que la solución no hierva al calentarla. c) Determinación de selenoaminoácidos: Si la muestra no se hidroliza como en el apartado 4b, fíltrese y ajústese el pH a 9,0 utilizando NaOH 1N. Llénese una columna de cromatografía vacía con agua desionizada y añádase resina de amonio hasta una altura de 2 cm. Añádase resina tratada con cobre hasta una longitud de 12 cm de resina.

3500-Se H.

(La resina de amonio elimina el cobre que drena desde la resina tratada con cobre saliendo por encima de ella.) Enjuagúese con agua desionizada hasta que el pH del efluente sea 9,0; manténgase el flujo a través de la columna por gravedad. Pásese la muestra a través de la columna, enjuáguese el vaso de precipitados de la muestra con 5 ml de solución de pH 9 y coloqúese el enjuagado en la columna (después de que lo último de la muestra alcance la parte superior de la resina). Enjuáguese el vaso dos veces más. Deséchese el flujo a través de la columna. Coloqúese el vaso de precipitados limpio bajo la columna y añádanse a ésta 20 ml de NH4OH 1,5N. Neutralícese el soluto de NH4OH con 2,5 ml de HC1 conc. Determínese el selenio disuelto total por digestión con persulfato (B.2) o peróxido (B.3), reducción de Se(VI) (B.5) y análisis por el método C, D o E. 5. Precisión y sesgo Estos procedimientos son únicamente semicuantitativos. La desviación relativa estándar típica es de 12 por 100 para el aislamiento con C-18 del selenio orgánico disuelto, y de 15 por 100 para el selenio unido a proteínas. 6. Bibliografía COOKE, T. D. & K. W. BRULAND. 1987. Aquatic chemistry of selenium: evidence of biomethylation. Environ. Sci. Technol. 21:1214. CUTTER, G. 1982. Selenium in reducing waters. Science 217:829.

Método de espectrometría de absorción atómica electrotérmica

Véase sección 3113.

3-162

3500-Se I.

MÉTODOS NORMALIZADOS

Método de plasma de acoplamiento inductivo

Véase sección 3120.

3500-Ag 3500-Ag A. 1. Incidencia La plata puede causar argiria, una decoloración azul-gris de piel y ojos que imparte una apariencia fantasmal. Concentraciones de 0,4 a 1 mg/1 han ocasionado cambios patológicos en los riñones, el hígado y el bazo de ratas. Se han observado efectos tóxicos sobre peces de agua dulce en concentraciones tan bajas como 0,17 μg/l. Los informes sobre la concentración de plata en aguas potables de Estados Unidos indican que ésta varía entre 0 y 2 μg/l con una media de 0,13 μg/l. Cantidades relativamente pequeñas de plata son bactericidas o bacteriostáticas y se aplican limitadamente en la desinfección de aguas de piscinas. 2.

Selección del método

Los preferidos son el método de espectrometría de absorción atómica y el * Aprobado por el Standard Methods Committee, 1985.

3500-Ag B.

PLATA* Introducción método de plasma de acoplamiento inductivo. El método de atomización electrotérmica es el más sensible para determinar la concentración de plata en aguas naturales. Se puede emplear el método de la ditizona cuando no se dispone de un espectrómetro de absorción atómica. 3. Toma de muestras y almacenamiento Si se va a determinar la plata total, acidúlese la muestra con ácido nítrico conc. (HNO3) hasta pH < 2 en el momento de tomarla. Si la muestra contiene materia en partículas y solamente se va a determinar el contenido de metal «disuelto», fíltrese a través de un filtro de membrana de 0,45 μm en el momento de su recogida. Acidúlese a continuación el filtrado con HNO3 hasta pH < 2. Complétese el análisis después de la toma tan pronto como sea posible. Algunas muestras pueden requerir almacenamiento y digestión especiales: véase sección 3030D.

Método de espectrometría de absorción atómica

Véase método de espectrometría de absorción atómica de llama, secciones 3111 B y C, y método de espectrometría

de absorción atómica electrotérmica, sección 3113.

3-163

DETERMINACIÓN DE METALES

3500-Ag C.

Método de plasma de acoplamiento inductivo

Véase sección 3120.

3500-Ag D.

Método de la ditizona

1. Discusión general a) Principio: Muchos metales reaccionan con la ditizona para formar compuestos de coordinación coloreados. La reacción puede hacerse selectiva en condiciones apropiadas o eliminando todas las interferencias. En este método de color mixto hay dos colores cuya separación no se intenta; tanto el color verde de la ditizona como el color amarillo de ditizonato de plata pueden medirse. En vista de la sensibilidad de la reacción y de las numerosas interferencias entre los metales corrientes, el método es empírico y requiere una cuidadosa atención al procedimiento. El color final puede evaluarse visual o fotométricamente. Se ha comprobado que la evaluación visual es más precisa y eficaz que la medida fotométrica, debido a la manipulación adicional que supone trabajar con un fotómetro. El empleo de células con un volumen superior a 1 ml requiere una dilución final con tetracloruro de carbono (CC1 4 ) o la selección de una muestra mayor. b) Interferencia: El ion férrico, el cloro residual y otros agentes oxidantes confieren a la ditizona un color pardoamarillo. Sin embargo, la extracción de plata junto con otros metales con una solución de ditizona en CC14 resuelve dicha interferencia de oxidación. La plata se separa selectivamente de otros metales portadores empleando una solución de tiocianato de amonio. Dada la extrema sensibilidad del método, así como la afinidad de la plata a ser adsorbida, es

aconsejable preparar material de vidrio separado para esta determinación y tomar precauciones adicionales en todas las etapas. No tiene que subrayarse la necesidad de comprobación y prevención de contaminación. La ditizona y el ditizonato de plata se descomponen rápidamente con luz intensa, por lo que no deben dejarse bajo el haz luminoso del fotómetro más tiempo del necesario. Evítese la luz directa del sol. c) Cantidad mínima detectable: 0,2 μg Ag en 1,0 ml de volumen final. 2. Instrumental a) Equipo calorimétrico: Se necesita uno de los siguientes aparatos: 1) Espectrofotómetro para medidas a 620 nm o 462 nm, con un recorrido de luz de 1 cm. 2) Fotómetro de filtro que proporcione un recorrido de luz de 1 cm y que vaya equipado con un filtro rojo con una transmitancia máxima a 620 nm o aproximada, o con un filtro azul con una transmitancia máxima a 460 nm o cercana. 3) Microtubos de ensayo, de 10 ml de capacidad y 1 x 7,5 cm de tamaño. b) Embudos de separación, con una capacidad de 500 ml o mayores, así como embudos con 60 ml de capacidad, preferiblemente con llaves de TFE inerte. c) Material de vidrio: Trátese todo el material de vidrio, placas y crisoles con una mezcla de ácido sulfúrico-crómico y

3-164

lávese con HNO3 1 + 1 para disolver cualquier posible traza de cromo o plata adsorbida en el material de vidrio. Enjuagúese cuidadosamente con agua libre de plata y aplíquese un fluido* de recubrimiento de silicona para conseguir una superficie repelente. Si se omiten estos pasos, se tendrán errores importantes. Séquese el material de vidrio en el horno y no se enjuague con acetona, ya que este disolvente contiene interferencias muchas veces. d) Placas † de vidrio de alto contenido en sílice o crisoles de sílice.

3.

Reactivos

a) Agua libre de plata: Utilícese agua destilada desionizada o redestilada libre de plata para preparar todos los reactivos y soluciones. b) Ácido sulfúrico, H2SO4 1N y conc. c) Tetracloruro de carbono, CC14: Consérvese en un recipiente de vidrio, evitando todo contacto con metales antes de utilizarlo. Si este reactivo contiene trazas de un metal que interfiere, como se pone en evidencia con una solución de ditizona que no presenta verde puro, redestílese en un aparato completamente de vidrio al borosilicato. PRECAUCIÓN: El CCl4 es muy tóxico. Realícense todas las operaciones con CCl 4 bajo la campana de humos. d) Solución de ditizona de trabajo A: Véase sección 1070D.263). Dilúyanse 50 ml de solución de ditizona de reserva III con CC14 hasta 250 ml; 1 ml = 50 μg de ditizona. Consérvese en una botella de vidrio topacio en la oscuridad. e) Solución de ditizona de trabajo B: Dilúyanse 2 ml de solución de ditizona

* Desicote, fabricado por Beckman Instruments, Inc., o equivalente. † Vycor, fabricado por Corning Glass Works, o equivalente.

MÉTODOS NORMALIZADOS

de trabajo A con CC14 hasta 250 ml; 1 ml = 0,4 μg de ditizona. Prepárese diariamente. f) Reactivo de tiocianato de amonio: Disuélvanse 10 g de NH4CNS en agua a la que se han añadido 5 ml de H2SO4 conc. y dilúyase con agua hasta 500 ml. Guárdese en una botella que contenga 25 ml de solución de ditizona A. g) Ácido nítrico, HNO3 lN. h) Solución de urea: Disuélvanse 10 g de (NH2)2CO en agua y dilúyase hasta 100 ml. Consérvese en una botella que contenga 25 ml de solución de ditizona A. Descártese si se forma una película roja. i) Solución de sulfato de hidroxilamina: Disuélvanse 20 g de (NH2OH)2H2SO4 en agua y dilúyase hasta 100 ml. Consérvese en una botella que contenga 25 ml de solución de ditizona A. j) Solución madre de plata: Disuélvanse 157,5 mg de nitrato de plata anhidro, AgNO3, en agua a la que se han añadido 14 ml de H2SO4 conc. y diluyase hasta 1.000 ml; 1,00 ml = 100 μg Ag. k) Solución patrón de plata: Inmediatamente antes de usarse, dilúyanse 10,00 ml de solución madre hasta 1.000 ml; 1,00 ml = 1,00 μg Ag.

4.

Procedimiento

a) Tratamiento previo de la muestra: Si hay materia orgánica y se va a determinar la plata total, digiérase la muestra con HNO3 y H2SO4 tal como se indica en la sección 3030G. Si únicamente se va a determinar la plata disuelta, fíltrese la muestra a través de un filtro de membrana de 0,45 μm. b) Extracción preliminar: Añádanse 11 ml de H2SO4 conc. a 100 ml de muestra en un embudo de separación de 500 ml. Extráigase la plata por adición de 5 ml de solución de ditizona A y agítese durante 1 minuto. Recójase la fase or-

DETERMINACIÓN DE METALES

gánica y la posible espuma en un tubo de centrífuga de 25 ml. Pásese la espuma formada al tubo de centrífuga, ya que ésta puede contener una cantidad apreciable de plata. Repítase la extracción dos veces más con porciones de 5 ml de solución de ditizona A y añádanse extractos y espuma al tubo de la centrífuga. Rechácese la fase acuosa. Si se necesita una muestra original mayor, utilícense dos tubos de centrífuga para recoger los extractos de ditizona. Para una muestra de 500 ml, empléense al menos cuatro porciones de 5 ml de solución de ditizona A. Sea cual sea el tamaño de la muestra, centrifúguese, descártese la fase acuosa y añádanse 2 ml de agua. Vuélvase a centrifugar y descártese la fase acuosa. Pásese la capa de CC14 a un embudo de separación de 60 ml. Añádanse 4 ml de reactivo NH4CNS al tubo de centrífuga para recoger cualquier extracto que pueda quedar, agítese con suavidad y pásese cuantitativamente al embudo de separación. Agítese durante 1 minuto y traspásese con una pipeta de succión la mayor parte posible de fase acuosa a una placa de vidrio de alto contenido en sílice. Repítase la adición de 4 ml de reactivo NH4CNS, agítese suavemente y pásese la fase acuosa dos veces más. Extráigase la capa orgánica y añádanse las últimas gotas de fase acuosa a la placa. Añádanse 1,5 ml de H2SO4 conc. y evapórese hasta secar evaporando primero hasta que desprenda humos, calentando por encima con lámpara infrarroja y a continuación por abajo con placa caliente y por encima con lámpara infrarroja. Manténgase la temperatura de calefacción lo bastante baja para evitar una ebullición violenta. Añádanse 0,6 ml de HNO3 1N y caliéntese hasta disolución. Añádase 1 ml de solución de urea y 1 ml de solución de sulfato de hidroxilamina y digiérase durante 5 minutos cerca del punto de ebullición, añadiendo agua gota a gota para evitar la aglutinación. Déjese enfriar a temperatura ambiente. Pásese a

3-165

un microtubo de ensayo de 10 ml, lavando la placa dos veces con porciones de 2 ml de H2SO4 1N. c) Extracción final de plata: Añádase 1 ml de solución de ditizona B y extráigase la plata mezclando durante 2 minutos mediante una fina varilla de vidrio aplanada en la parte inferior. Si la fase orgánica tiene un matiz verdoso, la cantidad de plata es inferior a 1,5 μg. Si la fase orgánica es de color amarillo claro (lo que demuestra que no hay exceso de ditizona), añádanse más porciones de 1 ml de solución de ditizona B y repítase la extracción hasta obtener un color mixto. Regístrese el volumen total, B, de solución de ditizona B utilizada. d) Estimación colorimétrica visual: Prepárense patrones introduciendo en nueve microtubos de ensayo 1 ml de solución de ditizona B y seguidamente 0, 0,20..., 1,60 ml de solución patrón de plata, y 3,0, 2,8..., 1,4 ml de H7SO4 1N. Extráigase tal como se describe en el apartado anterior 4c, comenzando por la solución de concentración más baja. Compárense los colores de las fases orgánicas de muestra y patrones de los microtubos de ensayo. e) Medidas fotométricas: Prepárese una curva estándar por adición de cantidades conocidas de plata, en un intervalo de 0,20 a 1,50 μg, a 0,3 ml de HNO3 1N y 1 ml de solución de urea y 1 ml de solución de sulfato de hidroxilamina. Añádase 1 ml de solución de ditizona B y extráigase la plata, empleando el mismo método que con las muestras. Mídase la absorbancia a 620 nm o próxima a ellos, utilizando células especiales de 1 cm de recorrido de luz, pero de anchura reducida, de manera que contengan, cuando están llenas, no más de aproximadamente 1 ml. Ajústese a cero el espectrofotómetro sobre una célula que contenga solución de ditizona B a una lectura de absorbancia 1.000 y léanse las muestras y los patrones frente a esta regulación. Determínese la absorbancia del blanco tra-

3-166

MÉTODOS NORMALIZADOS

tando 100 ml (500 ml si se utilizan muestras de 500 ml) de agua sin plata a lo largo del proceso completo. Como las muestras y patrones arrojarán lecturas de absorbancia menores que la solución de ditizona, corríjanse todas las absorbancias sumando la absorbancia del blanco. Conviértanse las concentraciones de patrones a concentración de plata en el extracto final de ditizona, ya que es posible que los volúmenes finales de solución de ditizona B necesarios para producir un color mixto no sean iguales:

Ag por mililitro de ditizona del volumen final. Calcúlese la concentración de la muestra. 5. Cálculo

siendo: C = volumen total de solución de ditizona B utilizado para extraer la plata para la medida colorimétrica final, ml.

Obténgase una curva estándar de pendiente positiva restando las absorbancias de los patrones corregidas de 1.000 y llevando las diferencias en función de la concentración de los patrones en microgramos de Ag por mililitro. Determínese la absorbancia de la muestra y añádase la absorbancia del blanco. Réstese de 1.000 la absorbancia corregida y léase en la curva la concentración de la muestra en microgramos de

3500-Na

3500-Na A. 1. Incidencia El sodio ocupa el sexto lugar entre los elementos más abundantes y se encuentra en la mayoría de las aguas naturales. * Aprobado por el Standard Methods Committee, 1985.

6.

Bibliografía

PIERCE, T. B. 1960. Determination of trace quantities of silver in trade effluents. Analyst 85:166. WEST, F. K., P. W. WEST & F. A. IDDINGS. 1966. Adsorption of traces of silver on container surfaces. Anal. Chem. 38:1566. DYCK, W. 1968. Adsorption of silver on borosilicate glass. Effect of pH and time. Anal. Chem. 40:454.

SODIO*

Introducción Los niveles pueden variar entre menos de 1 mg Na/1 y más de 500 mg Na/1. En las salmueras y aguas duras ablandadas por procesos de intercambio de sodio pueden encontrarse concentraciones relativamente altas. La relación del sodio con el total de cationes es importante en agricultura y patología humana. La per-

3-167

DETERMINACIÓN DE METALES

meabilidad del suelo puede ser perjudicada por una relación elevada de sodio. Las personas que padecen ciertas enfermedades tienen que beber agua con baja concentración de sodio. En las aguas de alimentación de calderas de alta presión se recomienda limitar la concentración entre 2 y 3 mg/1. En caso necesario se puede eliminar el sodio mediante un proceso de intercambio de hidrógeno o por destilación. 2.

llama o un espectrómetro de absorción atómica en la modalidad de emisión de llama. Cuando se dispone de todos estos instrumentos, la elección dependerá de los factores de calidad relativa de los instrumentos, precisión y sensibilidad requeridas, número de muestras, efectos de la matriz y facilidad relativa de funcionamiento del instrumento. Si se utiliza un espectrómetro de absorción atómica, es preferible operar en la modalidad de emisión.

Selección del método

El método B utiliza un espectrómetro de absorción atómica en la modalidad de absorción de llama. El método C emplea el plasma de acoplamiento inductivo; dicho método no es tan sensible como los restantes métodos, pero normalmente esto no constituye un factor de importancia. El método D utiliza un fotómetro de

3500-Na B.

3. Almacenamiento de la muestra

Consérvense las muestras alcalinas o las muestras que contienen bajas concentraciones de sodio en botellas de polietileno para eliminar la posibilidad de contaminación de la muestra por lixiviación del recipiente de vidrio.

Método espectrométrico de absorción atómica

Véase método de espectrometría de absorción atómica de llama, sección 3111B.

3500-Na C.

Método de plasma de acoplamiento inductivo

Véase sección 3120.

3500-Na D. 1.

Método fotométrico de emisión de llama

Discusión general

a) Principio: Se pueden determinar cantidades traza de sodio por fotometría de emisión de llama a una longitud de onda de 589 nm. Se pulveriza la muestra

en una llama de gas y la excitación se realiza en condiciones controladas y reproducibles. La línea espectral buscada se aísla utilizando filtros de interferencia o por medio de una disposición adecuada de la ranura en los dispositivos de

3-168

dispersión de luz, tales como prismas o rejillas. La intensidad de la luz se mide por un potenciómetro con fototubos u otro circuito apropiado. La intensidad de la luz a 589 nm es aproximadamente proporcional a la concentración del elemento. Si el alineamiento del dial de longitudes de onda con el prisma no es preciso en el fotómetro de que se dispone, puede determinarse la fijación exacta de la longitud de onda, que puede ser ligeramente superior o inferior a 589, a partir del desplazamiento máximo de la aguja, y utilizarse para las medidas de emisión. La curva de calibración puede ser lineal, pero muestra una tendencia a la horizontalidad en concentraciones superiores. b) Interferencia: Los fotómetros de llama que funcionan sobre el principio de patrón interno pueden requerir la adición de una solución de litio patrón a cada muestra y patrón de trabajo. La concentración de litio óptima puede variar entre los diversos instrumentos individuales, por lo que es necesario determinarla para el instrumento que se emplea. La interferencia puede minimizarse de la siguiente forma: 1) Operando en el intervalo práctico de sodio más bajo. 2) Añadiendo tampones de radiación para suprimir la ionización e interferencia de aniones. Entre los aniones corrientes que pueden ocasionar interferencia de radiación figuran Cl¯, SO 2-4 y HCO3 en cantidades relativamente grandes. 3) Introduciendo en los patrones de calibración cantidades idénticas de las mismas sustancias que interfieren presentes en la muestra. 4) Preparando una familia de curvas de calibración que incluya las concentraciones añadidas de un interfiriente común. 5) Aplicando una corrección determinada experimentalmente en aquellos

MÉTODOS NORMALIZADOS

casos donde la muestra contenga una sola interferencia importante. 6) Eliminando los iones que interfieren. 7) Eliminando la materia en partículas de la muestra que obturan el mechero mediante su filtrado a través de un papel de filtro cuantitativo de capacidad de retención media. 8) Incorporando un detergente no iónico a la solución patrón de litio para asegurar el funcionamiento apropiado del aspirador. 9) Empleando la técnica de adición de patrón. Esta aproximación al problema por adición de patrón está descrita en el método fotométrico de llama para el estroncio. Su empleo supone la adición de una porción idéntica de muestra a cada patrón y la determinación de la concentración de muestra por evaluación matemática o gráfica de los datos de la calibración. 10) Utilizando la técnica del patrón interno. El potasio y el calcio interfieren en la determinación de sodio por el método de patrón interno si la relación potasio-sodio es t 5:1 y la relación calciosodio es t 10:1. Cuando se sobrepasan estas relaciones, mídase primero el calcio y el potasio de manera que se pueda añadir la concentración aproximada de iones interfirientes a los patrones de calibración de sodio. La interferencia del magnesio no aparece hasta que la relación magnesio-sodio excede de 100, lo que es muy raro. c) Concentración mínima detectable: Los mejores fotómetros de llama pueden determinar niveles de sodio de aproximadamente 100 μg/l. Con apropiadas modificaciones de la técnica, el intervalo de medida del sodio puede ampliarse hasta 10 μg/l o una cantidad menor.

DETERMINACIÓN DE METALES

2.

Instrumental

a) Fotómetro de llama (de lectura directa o tipo patrón interno) o espectrómetro de absorción atómica en la modalidad de emisión de llama. b) Material de vidrio: Enjuáguese todo el material de vidrio con HNO3 1 + 15 y a continuación con varias porciones de agua destilada desionizada. 3.

Reactivos

Con objeto de hacer mínima la adsorción de sodio, conviene almacenar todas las soluciones en botellas de plástico. Utilícense recipientes pequeños para reducir la cantidad de elemento seco que puede quedar en las paredes de la botella cuando se vierte la solución. Agítese cuidadosamente el recipiente para arrastrar las sales acumuladas en las paredes, antes de verter la solución. a) Agua destilada desionizada: Utilícese agua destilada desionizada para preparar todos los reactivos y patrones de calibración, así como para diluciones. b) Solución madre de sodio: Disuélvanse 2,542 g de NaCl secados a 140 °C y dilúyanse con agua hasta 1.000 ml; 1,00 ml = 1,00 mg Na. c) Solución de sodio intermedia: Diluyanse 10,00 ml de solución madre de sodio hasta 100,0 ml empleando agua; 1,00 ml = 100 μg Na. Empléese la solución intermedia para preparar una curva de calibración en el intervalo de sodio de 1 a 10 mg/1. d) Solución patrón de sodio: Diluyanse 10,00 ml de solución de sodio intermedia hasta 100 ml con agua; 1,00 ml = = 10,0 μg Na. Utilícese esta solución para preparar una curva de calibración en el intervalo de 0,1 a 1,0 mg/1. e) Solución patrón de litio: Utilícese cloruro de litio (1) o nitrato de litio (2) para preparar una solución patrón de litio con 1,00 mg Li/1,00 ml.

3-169

1) Déjese secar toda la noche el LiCl en un horno a 105 °C. Pésense rápidamente 6,109 g, disuélvanse en agua y dilúyanse hasta 1.000 ml. 2) Déjese secar el LiCl toda la noche en un horno a 105 °C. Pésense rápidamente 9,935 g, disuélvanse en agua y dilúyanse hasta 1.000 ml. Prepárese una nueva curva de calibración siempre que se cambie la solución patrón de litio. Cuando las circunstancias lo justifiquen, prepárese, alternativamente, una solución patrón de litio con 2,00 mg o incluso 5,00 mg Li/1,00 ml. 4.

Procedimiento

a) Tratamiento preliminar de muestras de agua contaminada y de aguas residuales: Sígase el procedimiento descrito en la sección 3030. b) Precauciones: Coloqúese el instrumento en un área alejada de la luz directa del sol o la luz constante emitida por un portalámpara, y sin que esté expuesto a corrientes, polvo y humo de tabaco. Debe evitarse la contaminación por corchos, papel de filtro, transpiración, jabón, limpiadores, mezclas de limpieza y enjuagado inadecuado del aparato. c) Funcionamiento del instrumento: Es imposible dar instrucciones detalladas de su funcionamiento, debido a las diferencias entre formas y modelos de instrumentos. Lo mejor es seguir las instrucciones del fabricante para seleccionar la célula fotoeléctrica y longitud de onda adecuadas, ajuste de la anchura de rendija y sensibilidad, combustible apropiado y presiones de aire u oxígeno, así como las etapas de calentamiento, corrección de interferencias y fondo de llama, lavado del mechero, ignición de la muestra y medida de la intensidad de emisión. d) Medida de la intensidad directa: Prepárese un blanco y patrones de calibración de sodio con cantidades graduadas en cualquiera de los siguientes inter-

MÉTODOS NORMALIZADOS

3-170

valos aplicables: 0 a 1,0, 0 a 10 o 0 a 100 mg/1. Comiéncese con el patrón de calibración más alto y sígase trabajando hasta el más diluido, midiéndose la emisión a 589 nm. Repítase la operación con patrones de calibración y muestras las veces necesarias para asegurar una lectura media fiable para cada solución. Trácese una curva de calibración a partir de los patrones de sodio. Determínese la concentración de sodio de la muestra con la curva de calibración. Cuando hay que llevar a cabo un análisis de rutina de un gran número de muestras, la curva de calibración proporciona la suficiente precisión. Si se quiere obtener mayor precisión y menos sesgo y se dispone de tiempo, utilícese la delimitación de márgenes indicada en el apartado 4f, más abajo. e) Medida con patrón interno: A un volumen cuidadosamente medido de muestra (o porción diluida), de cada patrón de calibración de sodio y de un blanco, añádase, empleando una pipeta volumétrica, un volumen apropiado de solución patrón de litio. Procédase a continuación con las etapas prescritas en el apartado 4d anterior para medir la intensidad directa. f) Aproximación de horquillado: Selecciónense y prepárense, a partir de la curva de calibración, patrones de sodio que delimiten los márgenes de la intensidad de emisión de la muestra. Determínense las intensidades de emisión de los patrones de delimitación de márgenes (un patrón de sodio ligeramente inferior y el otro ligeramente superior que la muestra) y de la muestra lo más simultáneamente posible. Repítase la determinación sobre los patrones de delimitación de márgenes y la muestra. Calcúlese la concentración de sodio mediante la ecuación descrita en el apartado 5b y hállese la media de los resultados. 5. Cálculo a) Por referencia directa a la curva de calibración:

b) Por delimitación de márgenes:

siendo: B = mg Na/1 en el patrón superior de delimitación de márgenes, A = mg Na/1 en el patrón inferior de delimitación de márgenes, b = Intensidad de emisión del patrón superior de delimitación de márgenes, a = intensidad de emisión del patrón inferior de delimitación de márgenes, s = intensidad de emisión de la muestra, y D = relación de dilución =

ml de muestra + ml de agua destilada ml de muestra

6.

Precisión y sesgo

En 35 laboratorios se analizó una muestra sintética con 19,9 mg de Na/1, 108 mg Ca/1, 82 mg Mg/1, 3,1 mg K/l, 241 mg Cl¯/1, 0,25 mg NO-2 -N/l , 1,1 mg NO3- -N/l, 259 mg SO 2-4 /l y 42,5 mg de alcalinidad total/1 empleando el método de fotometría de llama, con una desviación relativa estándar de 17,3 por 100 y un error relativo de 4,0 por 100. 7. Bibliografía BARNES, R. B. et al. 1945. Fíame photometry: A rapid analytical method. Ind. Eng. Chem., Anal. Ed. 17:605. BERRY, J. W., D G. CHAPPFLL & R. B. BARNES. 1946. Improved method of flame photometry. Ind. Eng. Chem., Anal. Ed. 18:19. P ARKS , T. D., H. O. J OHNSON & L. L YKKEN . 1948. Errors in the use of a model 18 PerkinElmer flame photometer for the determination of alkali metals. Anal. Chem. 20:822. B ILLS , C. E. et al. 1949. Reduction of error in flame photometry. Anal. Chem. 21:1076. GILBERT, P. T., R. C. HAWES & A. O. BECKMAN.

3-171

DETERMINACIÓN DE METALES

1950. Beckman fíame spectrophotometer. Anal. Chem. 22:772. WEST, P. W., P. FOLSE & D. MONTGOMERY. 1950. Application of flame spectrophotometry to water analysis. Anal. Chem. 22:667. Fox, C. L. 1951. Stable internal-standard flame photometer for potassium and sodium analyses. Anal. Chem. 23:137. AMERICAN S OCIETY FOR TESTING AND MATE RIALS. 1952. Symposium on flame photometry. Spec. Tech. Publ. 116, American Soc. Testing & Materials, Filadelfia, Pennsylvania. COLLINS, C. G. & POLKINHORNE. 1952. An investigation of anionic interference in the determination of small quantities of potassium and

3500-Sr

sodium with a new flame photometer. Analyst 77:430. W HITE , J. U. 1952. Precision of a simple flame photometer. Anal. Chem. 24:394. MAVRODINEANU, R. 1956. Bibliography on analytical flame spectroscopy Appl. Spectrosc. 10:51. MELOCHE, V. W. 1956. Fíame photometry. Anal. Chem. 28:1844. BURRIEL-MARTI, F. & J. RAMÍREZ-MUÑOZ. 1957. Flame Photometry: A Manual of Methods and Applications. D. Van Nostrand Co., Princeton, Nueva Jersey. DEAN , J. A. 1960. Fíame Photometry. McGrawHill Publishing Co., Nueva York.

ESTRONCIO*

3500-Sr A. 1. Incidencia El estroncio, un elemento típicamente alcalino-térreo, se parece al calcio y es origen de errores positivos al emplear métodos gravimétricos y volumétricos para la determinación del calcio. Debido a la tendencia del estroncio para acumularse en los huesos, el estroncio 90 radiactivo, con una vida media de 28 años, representa un peligro bien conocido para la salud. El estroncio que se encuentra en la naturaleza no es radiactivo. Debido a ello, la determinación de estroncio en un suministro de agua deberá suplementarse con medidas radiológicas para excluir la

* Aprobado por el Standard Methods Committee, 1985.

Introducción posibilidad de que el contenido de estroncio tenga su origen en una contaminación radiactiva (véase sección 7500-Sr). Aunque la mayoría de los suministros potables contienen cantidades de estroncio muy pequeñas, algunas aguas de pozo en el medio oeste de Estados Unidos tienen concentraciones tan alta como 39 mg/1.

2.

Selección del método

Los métodos preferidos son el espectrométrico de absorción atómica y el de plasma de acoplamiento inductivo. El método fotométrico de emisión de llama es también útil para aquellos laboratorios que no disponen del equipo necesario para uno de los métodos preferidos.

3-172

MÉTODOS NORMALIZADOS

3500-Sr B.

Método espectrométrico de absorción atómica

Véase método de espectrometría de absorción atómica de llama, sección 3111 B.

3500-Sr C.

Método de plasma de acoplamiento inductivo

Véase sección 3120.

3500-Sr D.

Método fotométrico de emisión de llama

1. Discusión general a) Principio: El método fotométrico de llama permite la determinación de estroncio en las bajas concentraciones en las que se encuentra en los suministros de aguas naturales. La emisión de estroncio se mide a una longitud de onda de 460,7 nm. La intensidad de fondo se mide a una longitud de onda de 466 nm. La diferencia de lecturas obtenida de estas dos longitudes de onda mide la intensidad de luz emitida por el estroncio. b) Interferencia: La intensidad de emisión es una función lineal de la concentración de estroncio y de la concentración de otros componentes. La técnica de adición de patrón distribuye los mismos iones por los patrones y muestra, con lo que iguala el efecto de radiación de las posibles sustancias que interfieren, aunque valores muy bajos del pH ( 1,0 mg/1.

7.

Referencia

1. RYAN, J. A. & G. W. CULSHAW. 1944. The use of p-dimethylaminobenzylidene rhodanine as an indicator for the volumetric determination of cyanides. Analyst 69:370.

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

4500-CN E. 1.

Método colorimétrico

Discusión general

a) Principio: En el destilado alcalino obtenido en el tratamiento previo, CN¯ se convierte en CNCl por reacción con cloramina-T a pH < 8 sin hidrolizarse a CNO-1. (PRECAUCIÓN: CNCl es un gas tóxico; evítese su inhalación.) Cuando ha terminado la reacción, CNCl forma un tinte rojo-azul al añadir reactivo de piridina-ácido barbitúrico. Si el colorante se mantiene en solución acuosa, se lee la absorbancia a 578 nm. Para obtener colores de intensidad comparable, la muestra y los patrones deben tener el mismo contenido en sal. b) Interferencia: Todas las interferencias conocidas se eliminan o reducen al mínimo por destilación. 2.

Instrumental

Equipo colorimétrico: Se requiere uno de los siguientes: a) Espectro fotómetro, para utilización a 578 nm, provisto de un recorrido de luz de 10 mm o superior. b) Fotómetro de filtro, con recorrido de luz de 10 mm por lo menos y equipado con un filtro rojo cuya transmitancia máxima se produce a 570-580 nm. 3.

4-35

Reactivos

a) Solución de cloramina-T: Disuélvanse 1,0 g de polvo blanco, soluble en agua, en 100 ml de agua. Prepárese semanalmente y consérvese en frigorífico. b) Solución madre de cianuro: Disuélvanse aproximadamente 1,6 g de NaOH y 2,51 g de KCN en 1 l de agua destilada. (PRECAUCIÓN: KCN es muy tóxico; evítese el contacto o inhalación.) Estandarícese frente a patrón de nitrato de plata

(AgNO3) titulante, como se describe en la sección 4500-CN.D.4, usando 25 ml de solución de KCN. Compruébese el título semanalmente, porque la solución pierde potencia de forma gradual; 1 ml = 1 mg de CN¯. c) Solución patrón de cianuro: Sobre la base de la concentración determinada para la solución stock de KCN (apartado 3b), calcúlese el volumen necesario (aproximadamente 10 ml) para preparar 1 l de solución con 10 µg de CN¯/ml. Dilúyase con la solución diluida de NaOH. Diluyanse 10 ml de la solución con 10 µg CN¯/ml hasta 100 ml con la solución de dilución de NaOH; 1,0 ml = 1,0 µg CN¯. Prepárese reciente a diario y guárdese en un frasco con tapón de vidrio. (PRECAUCIÓN: Tóxico; procúrese evitar su ingestión.) d) Reactivo de piridina-ácido barbitúrico: Póngase 15 g de ácido barbitúrico en un matraz aforado de 250 ml y añádase agua suficiente para lavar las paredes del matraz y humedecer el ácido barbitúrico. Añádanse 75 ml de piridina y mézclese. Añádanse 15 ml de ácido clorhídrico conc. (HCl), mézclese y enfríese a temperatura ambiente. Dilúyase con agua hasta la señal y mézclese. Este reactivo es estable durante 1 mes; deséchese si aparece un precipitado. e) Fosfato de sodio dihidratado, 1 M: Disuélvanse 1,38 g de NaH2PO4 · H2O en 1 l de agua destilada. Refrigérese. f) Solución de dilución de hidróxido de sodio: Disuélvanse 1,6 g de NaOH en 1 l de agua destilada. 4.

Procedimiento

a) Preparación de la curva de calibrado: Prepárese un blanco de solución de dilución de NaOH. A partir de la solución patrón de KCN, prepárese una serie de patrones que contengan desde 0,2 a

4-36

6 µg de CN¯ en 20 ml de solución, utilizándose la solución de dilución de NaOH para todas las diluciones. Trátense los patrones de acuerdo con el apartado b expuesto más adelante. Compárese la absorbancia de los patrones con la concentración de CN¯ (microgramos). Vuélvase a comprobar la curva de calibrado periódicamente y cada vez que se prepare un reactivo nuevo. Sobre la base de la primera curva de calibrado, prepárense patrones adicionales que contengan menos de 0,2 y más de 6 µg de CN¯ para determinar los límites medibles con el fotómetro utilizado. b) Desarrollo de color: Ajústese el fotómetro a absorbancia cero cada vez que se utilice un blanco consistente en la solución de dilución de NaOH y todos los reactivos. Tómese una porción de líquido de absorción obtenido en el método C, tal que su concentración de CN¯ esté comprendida en el rango mensurable y dilúyase a 20 ml con solución de dilución de NaOH. Añádase a un matraz aforado de 50 ml. Añádanse 4 ml de tampón fosfato y mézclese bien. Añádanse 2,0 ml de solución de cloramina-T y agítese, girando para mezclar. Añádanse inmediatamente 5 ml de solución de piridina-ácido barbitúrico y gírese con cuidado. Dilúyase hasta la señal con agua; mézclese bien por inversión. Mídase la absorbancia con el fotómetro en 578 nm después de 8 minutos, pero en los 15 minutos siguientes a la adición del reactivo de piridina-ácido barbitúrico. Incluso con el tiempo especificado de 8 a 15 minutos, se produce un ligero cambio de absorbancia. Para reducirlo al mínimo, estandarícese el tiempo de todas las lecturas. Usando la curva de

MÉTODOS NORMALIZADOS

calibrado y la fórmula del apartado 5 siguiente, determínese la concentración de CN¯ en la muestra original. 5.

Cálculos

donde: A = µg de CN leídos en la curva de calibrado (volumen final 50 ml), B = volumen total de la solución absorbente procedente de la destilación, ml, C = volumen de muestra original utilizado en la destilación, ml, D = volumen de solución absorbente utilizado en la prueba colorimétrica, ml.

6.

Precisión

El análisis de una solución mixta de cianuros, que contenía cianuro de sodio, zinc, cobre y plata en agua del grifo, producía una precisión dentro del rango establecido, del siguiente modo: S T = 0,115X + 0,031

donde: S T = precisión media, y

X = concentración de CN¯, mg/l.

7.

Referencia

1. AMUS, E & H. GARSCHAGEN, 1953. Über die Verwendung der Barbitsáure für die photometrische Bestimmund von Cyanid und Rhodanid. Z. Anal. Chem. 138:414.

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

4500-CN F. 1.

Método del electrodo cianuro-selectivo

Discusión general

Se puede determinar potenciométricamente el CN¯ del destilado alcalino procedente del tratamiento preliminar, utilizando un electrodo cianuro-selectivo en combinación con un electrodo de referencia de doble empalme y un medidor de pH que tenga una escala de milivoltios expandida, o un iónmetro específico. Este método se puede utilizar para determinar la concentración de CN¯, en lugar de los procedimientos colorimétrico o titulométrico, en la gama de concentración de 0,05 a 10 mg de CN¯/l. Si se utiliza el método de electrodo CN¯-selectivo, se puede omitir el paso de titulación selectiva, descrito anteriormente. 2.

Instrumental

a) Medidor de pH de escala expandida o iónmetro específico. b) Electrodo ion-cianuro-selectivo*. c) Electrodo de referencia, de doble empalme. d) Mezclador magnético, con barra agitadora recubierta de TFE. 3.

4-37

Reactivos

a) Solución madre patrón de cianuro: Véase sección 4500-CN.E.3b. b) Diluyente de hidróxido de sodio: Disuélvanse 1,6 g de NaOH en agua y dilúyase a 1 l. c) Solución patrón de cianuro intermedia: Dilúyase un volumen calculado (aproximadamente 100 ml) de solución madre de KCN, basado en la concentración determinada, hasta 1.000 ml con di-

* Orion modelo 94-06A o equivalente.

luyente de NaOH. Mézclese bien; 1 ml = = 100 µg de CN¯. d) Solución patrón de cianuro diluida: Dilúyanse 100,0 ml de solución patrón de CN¯ intermedia hasta 1.000 ml con diluyente de NaOH; 1,00 ml = 10,0 µg de CN¯. Prepárese a diario y consérvese en un frasco oscuro con tapón de vidrio. e) Solución de nitrato de potasio: Disuélvanse 100 g de KNO3 en agua y dilúyase a 1 l. Ajústese el pH a 12 con KOH. Ésta es la solución externa de llenado para el electrodo de referencia de doble empalme. 4.

Procedimiento

a) Calibrado: Utilícense las soluciones patrón diluida e intermedia de CN¯ y la diluyente de NaOH para preparar una serie de 3 estándares, 0,1, 1,0 y 10,0 mg de CN¯/l. Transfiéranse aproximadamente 100 ml de cada una de estas soluciones patrón a un vaso de precipitado de 250 ml, previamente lavado con una pequeña porción del patrón a valorar. Sumérjanse los electrodos de referencia de CN¯ y empalme doble. Mézclese bien sobre agitador magnético a 25 °C, manteniéndose la misma velocidad de agitación para todas las soluciones. Opérese siempre desde la concentración de patrón más baja a la más alta porque, de otro modo, el equilibrio se conseguirá muy lentamente. La membrana del electrodo se disuelve en soluciones con gran concentración de CN¯; no utilizar con concentraciones superiores a 10 mg/l. Tras hacer las determinaciones, sáquese el electrodo y empápese con agua. Tras alcanzar el equilibrio (5 minutos como mínimo y no más de 10), regístrense las lecturas de potencial (milivoltios) y compárense las concentraciones de CN¯ con las lecturas, sobre papel semilogarít-

4-38

MÉTODOS NORMALIZADOS

mico. Una línea recta con una pendiente aproximada de 59 mV por decena indica que el aparato y los electrodos están funcionando correctamente. Regístrese la pendiente de la línea obtenida (milivoltios/decena de concentración). La pendiente puede variar ligeramente respecto del valor teórico de 59,2 mV por decena, debido a la diferente fabricación y a los potenciales del electrodo de referencia (líquido-empalme). La pendiente debe ser una línea recta y es la base para calcular la concentración de la muestra. b) Medida de la muestra: Póngase 100 ml de líquido de absorción obtenido en la sección 4500-CN.C.4d en un vaso de precipitados de 250 ml. Cuando se determinen concentraciones bajas de CN¯, lávese primero el vaso y los electrodos con un pequeño volumen de muestra. Sumérjanse los electrodos de referencia de CN ¯ y empalme doble y mézclese sobre agitador magnético, con la misma velocidad de agitación utilizada para calibrado. Tras alcanzar el equilibrio (5 minutos como mínimo y no más de 10), regístrense los valores indicados en el iónmetro o hallados a partir de la gráfica preparada como antes. Calcúlese la concentración como se explica a continuación.

B = volumen total de la solución de absorción tras la dilución, y C = volumen de la muestra original utilizada en la destilación, ml.

6.

Precisión

La precisión del método del electrodo ion-selectivo, usándose la solución de absorción procedente de la destilación total del cianuro, se ha obtenido con pruebas en colaboración, demostrándose su linealidad dentro del rango designado, y se puede expresar del siguiente modo:

donde:

La diferencia de precisión media con respecto a la precisión conjunta de operadores aislados no fue estadísticamente significativa. 7.

Referencias

1.

5.

Cálculos

donde: A = mg CN ¯ /l obtenidos en la lectura del iónmetro o con la gráfica,

4500-CN G. 1.

O RION R ESEARCH , I NC . 1975. Cyanide Ion Electrode Instruction Manual, Cambridge, Massachusetts. 2. FRANT, M. S., J. W. ROSS & J. H. RISEMAN. 1972. An electrode indicator technique for measuring low levels of cyanide. Anal. Chem. 44:2227. 3. SEKERKA, J. & J. F. LECHNER. 1976. Potentiometric determination of low levels of simple and total cyanides. Water Res. 10:479.

Cianuros susceptibles de cloración después de destilación

Discusión general

Este método es aplicable a la determinación de cianuros susceptibles de clora-

ción, para determinar el contenido en CN¯ disociable de la muestra. Tras clorar parte de la muestra para descomponer los cianuros, tanto la

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

muestra tratada como la no tratada se someten a destilación tal como se describe en la sección 4500-CN.C. La diferencia entre las concentraciones de CN¯ halladas en las dos muestras se expresa como cianuros susceptibles de cloración. Se puede utilizar el procedimiento de titulación cuando se conozca que la concentración de cianuros es superior a 1 mg/l, aunque inferior a 10 mg/l. Con concentraciones más elevadas, utilícese una porción menor, como se describe en 4500-CN.D.4a. Utilícese un método colorimétrico cuando la concentración de cianuros sea de 1 mg/l o inferior. El método del electrodo cianuro-selectivo es útil para el rango de concentraciones comprendido entre 0,05 y 10 mg de CN¯/l. Para calcular la concentración de cianuros susceptibles de cloración, utilícese el procedimiento de ensayo al toque (4500-CN.K). Algunos compuestos químicos orgánicos pueden oxidar o producir otros por descomposición durante la cloración, dando resultados más elevados de cianuro después que antes de clorar. Ello produciría un valor negativo para los cianuros susceptibles de cloración tras la destilación para residuos procedentes, por ejemplo, de la industria del acero, refinerías de petróleo y procesado de pulpa y papel. Cuando se encuentran esas interferencias, utilícese el método 4500-CN.I para determinar el cianuro disociable. 2.

Instrumental

a) Aparato de destilación: Véase sección 4500-CN.C.2. b) Aparato para determinar cianuro por el método titulométrico, sección 4500-CN.D.2; el colorimétrico, sección 4500-CN.E.2, o el del electrodo, sección 4500-CN.F.2. 3.

Reactivos

a) Todos los reactivos enumerados en la sección 4500-CN.C.3.

4-39

b) Todos los reactivos enumerados en las secciones 4500-CN.D.3, 4500-CN.E.3 o 4500-CN.F.3, en función del método de estimación. c) Solución de hipoclorito de calcio: Disuélvanse 5 g de Ca(OCl)2 en 100 ml de agua destilada. Consérvese en frasco de vidrio topacio, en la oscuridad. Prepárese mensualmente. d) Papel de ensayo yoduro de potasio (Kl)-almidón. 4.

Procedimiento

a) Divídase la muestra en dos partes iguales y clórese una de ellas como en el apartado b más adelante. Analícese el CN¯ en ambas partes. La diferencia entre las concentraciones halladas es el cianuro susceptible de cloración. b) Añádase gota a gota solución de Ca(OCl)2 a la muestra, con agitación y manteniéndose el pH entre 11 y 12, por adición de solución de NaOH. Determínese el cloro colocando una gota de muestra tratada sobre una tira de papel de KI-almidón. Un color azul indica suficiente cloro (aproximadamente de 50 a 100 mg Cl2/l). Manténgase el exceso de cloro residual durante 1 hora, con agitación. Si fuera necesario, añádase más Ca(OCl)2 y/o NaOH. c) Añádanse aproximadamente 500 mg/l de tiosulfato de sodio (Na2S2O3) en cristales para reducir el cloro residual. Analícese con papel de KI-almidón; no debe haber cambio de color. Añádase aproximadamente 0,1 g/l más de Na2S2O3 para asegurar un ligero exceso. d) Redúzcase al mínimo la exposición de la muestra a la radiación ultravioleta, antes de destilarla. e) Destílense las muestra clorada y sin clorar como en la Sección 4500CN.C. Analícese según los métodos D, E o F. 5.

Cálculos

mg de CN ¯ susceptible de cloración/l = G – H

MÉTODOS NORMALIZADOS

4-40

donde: ¯

G = mg de CN /l hallados en la parte de muestra sin clorar, y H = mg de CN¯/l hallados en la parte clorada de la muestra.

Es posible que las muestras con cantidades significativas de cianuros de hierro den en la segunda destilación un valor más alto para CN¯ que en la prueba de cianuro total, llevando a un resultado negativo. Cuando la diferencia se halle dentro de los límites de precisión del método, comuníquese que «las cantidades de cianuro susceptible de cloración no son determinables». Si la diferencia es superior al límite de precisión, averígüese la causa, que puede ser la presencia de

interferencias, error de manipulación, etcétera, o utilícese el método I. 6.

Precisión

La precisión, con el acabado titulóme trico, para cianuros susceptibles de cloración se determinó a partir de una solución mixta de cianuros, con cianuro de sodio, zinc, cobre y plata y ferrocianuro de sodio. La precisión del método dentro del rango diseñado para él se puede expresar como sigue: ST = 0,049X + 0,162

donde: S T = precisión media, y X = concentración de CN ¯ , mg/l.

4500-CN H. Cianuros susceptibles de cloración sin destilación (método del atajo) 1.

Discusión general

Este método cubre la determinación de HCN y complejos de CN susceptibles de cloración, y también los tiocianatos (SCN¯). El procedimiento no mide cianatos (CNO¯) o complejos de cianuro de hierro, pero determina el cloruro de cianógeno (CNCl). Esta prueba no precisa ni la destilación lenta, ni la cloración de la muestra antes de destilar. La recuperación de CN¯ a partir de los complejos de cianuro metálico será comparable a la de los métodos G e I. Los cianuros se transforman en CNCl con cloramina-T, tras haber calentado la muestra. En ausencia de cianuros de níquel, cobre, plata y oro o SCN¯, se puede formar CNCl a temperatura ambiente. El reactivo de piridina-ácido barbitúrico produce un color rojo-azul en la muestra. El color se puede estimar visualmente por comparación con estánda-

res o fotométricamente a 578 nm. Los límites de la determinación son 0,2 a 6 µg de CN¯, que representan 0,01 a 0,30 mg/l en una muestra de 20 ml. Las concentraciones más elevadas de CN¯ se pueden determinar por dilución. El contenido de sal disuelta en los patrones utilizados para trazar la curva de calibrado debe ser próximo al contenido en sal de la muestra, incluyendo el NaOH y el tampón fosfato añadidos. Véase 4500CN.E.la. La sensibilidad de la prueba puede ampliarse hasta el nivel de 5-150 µg/l, si se usa una muestra reciente sin estabilizar. En esas circunstancias (pH < 9), añádase tampón fosfato gota a gota hasta pH de 6,5 (pH 6,0 a 6,6) y utilícese una muestra de 40 ml, minimizando la dilúción antes de que se desarrolle el color. Añádase 1 g de cloruro de sodio (NaCl) a la muestra de 40 ml para completar el contenido en sal que se habría añadido

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

en caso de adición de la solución de dilúción de hidróxido de sodio (NaOH) y la cantidad necesaria de tampón fosfato. La utilidad del método está limitada por la interferencia del tiocianato. Aunque el procedimiento permite determinar específicamente el CN¯ susceptible de cloración (véase 4500-CN.H.2 y 5), enmascarando el contenido de CN¯ y estableciendo así una corrección para el contenido de tiocianato, para que sea aplicable, la proporción de SCN¯ a CN¯ no debe exceder de 3. Cuando se trabaje con muestras desconocidas, detectar el SCN de la muestra con el ensayo al toque (4500-CN.K). 2.

Interferencias

a) Elimínense los agentes interferentes como se describe en la sección 4500CN.B, con la excepción de NO-2 y NO3(4500-CN.B.3h). b) El ion SCN¯ reacciona con cloramina-T produciendo un error equivalente a su concentración. Este procedimiento permite la determinación separada de SCN¯ y la sustracción de este valor de los resultados totales. Utilícese el ensayo al toque (4500-CN.K) para SCN¯ cuando se sospeche su presencia. Si el contenido de SCN¯ es más de tres veces el contenido de CN¯, utilícese el método G o I. c) Los compuestos químicos reductores, como SO32- , pueden interferir consumiendo cloro en la adición de cloraminaT. Se aporta un exceso importante de cloro, pero para evitar esa interferencia el procedimiento prescribe una prueba (4500-CN.H.5d). d) El color y la turbidez pueden interferir con la determinación colorimétrica. Evítese esta interferencia por extracción con cloroformo (4500-CN. B.3c), pero omitiendo la reducción del pH. De lo contrario, utilizar el método G o I.

3.

Instrumental

a) Equipo mencionado en CN.E.2. b) Baño de agua caliente. 4.

4-41

4500-

Reactivos

a) Listas de reactivos de las secciones 4500-CN.B y E.3. b) Cloruro de sodio, NaCl, en cristales. c) Carbonato de sodio, Na2CO3, cristales. d) Solución de ácido sulfúrico, H2SO4 1N. e) Solución de EDTA, 0,05M: Disuélvanse 18,5 g de la sal disódica del ácido etilendiamino tetracético en agua y dilúyase a 1 l. f) Solución de formaldehído al 10 por 100: Dilúyanse 10 ml de formaldehído (37 por 100 calidad farmacéutica) 1 + 9 con agua. 5.

Procedimiento

a) Calíbrese como se indica en la sección 4500-CN.E.la y 4a. Ajústese la absorbancia a cero, usando la solución para dilución de NaOH para preparar el blanco. En las muestras con más de 3.000 mg de sólidos totales disueltos/l, prepárese una curva de calibrado a partir de soluciones patrón y blanco de NaOH conteniendo 6 g de NaCl/l. Las muestras con sólidos totales disueltos por encima de 10.000 mg/l precisan patrones apropiados y una nueva curva de calibrado. b) Si no estuviera en el rango deseado, ajústese el pH de una pequeña cantidad de muestra (50 ml) a 11,4-11,8. Si fuera preciso añadir ácido, se hará primero una pequeña adición (0,2 a 0,4 g) de Na2CO3 agitándose para disolver. Añádase entonces lentamente el H2SO4 1N, agitándose. Si fuera necesario añadir una base para elevar el pH, utilícese NaOH

MÉTODOS NORMALIZADOS

4-42

1N. Llévense con la pipeta 20 ml de muestra con el pH ajustado a un matraz aforado de 50 ml. Si se conoce la presencia de más de 300 mg CN¯/l, utilícese una muestra menor diluida a 20 ml con solución de dilución de NaOH. c) Para asegurar un desarrollo de color uniforme, tanto en el calibrado como en el ensayo, manténgase la temperatura uniforme. Sumérjase el matraz en un baño de agua mantenido a 27 ± 1 °C durante 10 minutos antes de añadir los reactivos, y manténgase la muestra en el baño hasta haber añadido todos los reactivos. Añádanse 4 ml de tampón fosfato y agítese girando para mezclar. Añádase 1 gota de solución de EDTA 0,lM. Manténgase en el baño de agua durante 1 minuto mientras se agita por rotación. d) Añádanse 2 ml de solución de cloramina-T y agítese girando para mezclar. Póngase una gota de solución en una tira de papel de ensayo almidón-yoduro acidificado. El papel debe mostrar la presencia de cloro. Si los agentes reductores de la muestra consumieran toda la cloramina-T, añádase otra vez y vuélvase a comprobar. Si la prueba fuera negativa de nuevo, el método no es aplicable; utilícese el método G o I. Al cabo de 1 minuto, añádase 5 ml de piridina-ácido barbitúrico y agítese por rotación en baño de agua durante 1 minuto. e) Sáquese del baño de agua, dilúyase a 50,0 ml y déjese 7 minutos más para que se desarrolle el color. Enfríese a temperatura ambiente, si es necesario, y léase la absorbancia a 578 nm en los 15 minutos siguientes al momento en que se añadió la solución de piridina-ácido barbitúrico. f) Estandarícese el aparato con un blanco apropiado cada vez que se utilice. Compruébese la curva de calibrado periódicamente usando patrones preparados y cada vez que se prepare un nuevo reactivo. g) Si se sospecha la presencia de SCN¯ (4500-CN.H.2b), tómese una segun-

da muestra con el pH ajustado, añádanse 3 gotas de solución de formaldehído, agítese rotando para mezclar y manténgase durante 10 minutos. Póngase en un baño de agua durante otros 10 minutos. La adición de formaldehído enmascara hasta 0,3 mg CN¯/l, consiguiendo así una determinación separada de SCN¯. Sígase el resto del método como en los apartados 5b-f. 6.

Cálculos

donde: A =µg de CN¯ leídos en la curva de calibrado (volumen final 50 ml), y B = ml de muestra utilizados.

Deducir el valor de SCN¯ de los resultados obtenidos cuando no se había enmascarado el CN¯ por adición (total) de formaldehído para determinar el contenido de cianuro. 7.

Precisión

Los ensayos en colaboración, con una solución mixta de cianuros, tanto en el agua de reactivos como en la matriz, conteniendo cianuros complejos de sodio, cobre, níquel, cadmio y zinc, y tiocianato adicional como interferencia, dieron una precisión para el método dentro de rango diseñado, que es lineal con la concentración y se puede expresar como sigue: Agua para reactivos: ST = 0,0958X + 0,006 So = 0,0681X + 0,0048 Agua matriz: ST = 0.0973X + 0,0085

donde:

So = 0,0201X + 0,0064

ST = precisión media, mg/l, So = precisión del conjunto de operadores por separado, mg/l, y X = concentración de cianuro, mg/l.

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

4500-CN I. 1.

Cianuro débil y disociable

Discusión general

El cianuro de hidrógeno (HCN) se libera a partir de una muestra acidificada ligeramente (pH 4,5 a 6,0) en las condiciones establecidas para destilación. El método no recupera CN¯ de los complejos estables no susceptibles de oxidación por el cloro. El tampón acetato utilizado contiene sales de zinc para precipitar el cianuro de hierro como una garantía más de la selectividad del método. En otros aspectos éste es similar al 4500CN.C. 2.

Instrumental

Véase sección 4500-CN.C.2 y figura 4500-CN: 1, y también las secciones 4500CN.D.2, 4500-CN.E.2 o 4500-CN.F.2, en función del método de estimación. 3.

4-43

Reactivos

a) Reactivos enumerados en la sección 4500-CN. C. 3. b) Reactivos enumerados en las secciones 4500-CN.D.3, 4500-CN.E.3 o 4500-CN.F.3, según el método de estimación. c) Ácido acético, 1 + 9: Mézclese 1 volumen de ácido acético glacial con 9 volúmenes de agua. d) Tampón acetato: Disuélvanse 410 g de acetato de sodio trihidratado (NaC2H3O2 · 3H2O) en 500 ml de agua. Añádase ácido acético glacial hasta obtener una solución de pH 4,5 (aproximadamente 500 ml). e) Solución de acetato de zinc, 100 g/l: Disuélvanse 100 g de Zn(C2H3O2) · H2O en 500 ml de agua. Dilúyanse a 1 l. f) Indicador de rojo de metilo.

4.

Procedimiento

Seguir el procedimiento descrito en 4500-CN.C.4, pero con las siguientes modificaciones: a) No añadir ácido sulfámico porque NO -2 y NO3- no interfieren.

b) En lugar de los reactivos H2SO4 y MgCl2, añádanse 10 ml de tampón acetato y otros 10 ml de solución de acetato de zinc a través del tubo de entrada de aire. Añádanse también 2 a 3 gotas de indicador de rojo de metilo. Enjuáguese con agua el tubo de entrada de aire y déjese que éste mezcle el contenido. Si la solución no se pone rosa, añádase ácido acético (1 + 9) gota a gota por el tubo de entrada del aire hasta color rosa persistente. c) Cúmplanse las instrucciones que empiezan en 4500-CN.C.4d. d) Para determinar CN en la solución de absorción, utilícese el método final preferido (4500-CN.D, E o F). 5.

Precisión

Las pruebas en colaboración de una solución mixta de cianuros en agua para reactivos y matriz, utilizando la determinación final del electrodo, dieron precisiones media y de conjunto de operadores por separado lineales dentro del rango establecido y que se pueden expresar como: Agua para reactivos: ST = 0,085X + 0,0032 So = 0,023 X + 0,0093 Agua matriz: ST = 0,068 X + 0,0039 So = 0,017X + 0,0039

donde: ST = precisión media, mg/l, So = precisión del conjunto de operadores por separado, mg/l, X = concentración, mg CN¯/l.

4-44

MÉTODOS NORMALIZADOS

4500-CN J.

Cloruro de cianógeno

1. Discusión general

4. Procedimiento

El cloruro de cianógeno (CNCl) es el primer producto de reacción cuando se cloran los compuestos de cianuro. Es un gas volátil, sólo ligeramente soluble en agua, pero muy tóxico incluso a concentraciones bajas. (PRECAUCIÓN: Evítese la inhalación o el contado.) Un reactivo mixto de piridina-ácido barbitúrico produce un color rojo-azul con CNCl. Como el CNCl se hidroliza a cianato (CNO¯) a pH de 12 o más, recójase una muestra aparte para análisis de CNCl (véase sección 4500-CN.B.2) en un recipiente cerrado sin hidróxido sódico (NaOH). Una prueba rápida con una placa de gotas o comparador, en cuanto se obtenga la muestra, puede ser el único procedimiento para evitar la hidrólisis de CNCl debida al lapso de tiempo entre la toma de muestras y el análisis. Si la prueba del papel de ensayo almidón-yoduro (KI) indica la presencia de cloro u otros agentes oxidantes, añádase tiosulfato de sodio (Na2S2O3) inmediatamente, como se indica en la sección 4500CN.B.2.

Calíbrese como se indica en las secciones 4500-CN.E.4 y 4500-CN.H.l, segundo párrafo. Añádase una porción de muestra sin estabilizar, diluida si fuera necesario, que contenga de 0,2 a 6 µg de CN¯/40 ml, a un vaso de precipitados. Añádase tampón fosfato hasta un pH de 6,5 (pH 6,0 a 6,6). Anótese el volumen exacto requerido de tampón fosfato. Prepárese una segunda muestra como antes y añádase a un matraz aforado de 50 ml. Añádase tampón fosfato en el volumen establecido previamente. Añádanse 5 ml de solución de piridina-ácido barbitúrico. Dilúyase hasta la señal con agua destilada y mézclese bien por inversión. Déjese en reposo durante 8 minutos para que se desarrolle el color. Mídase la absorbancia a 578 nm en los 8 a 15 minutos siguientes a la adición del reactivo piridina-ácido barbitúrico. Usando la curva de calibrado, determínese el CNCl como CN ¯ . 5. Cálculos

donde: 2.

Instrumental

Véase sección 4500-CN.E.2.

A = µg de CN ¯ leídos en la curva de calibrado (50 ml de volumen final), y B = ml de muestra original no estabilizada.

6. Precisión 3. Reactivos

Véanse secciones 4500-CN.E.3 y 4500CN.H.4.

La inestabilidad de CNCl impide las pruebas anónimas por diferentes investigadores, y no es posible establecer la precisión.

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

4500-CN K. 1.

Ensayo al toque para selección de muestras

Discusión general

El método del ensayo al toque permite una selección rápida de la muestra para establecer si hay más de 50 µg/l de cianuro susceptible de cloración. La prueba establece también la presencia o ausencia de cloruro de cianógeno (CNCl). Con práctica y dilución, la prueba revela la gama aproximada de concentración de estos compuestos por el desarrollo de color, comparado con el de patrones tratados de modo similar. Cuando se añade cloramina-T a los cianuros susceptibles de cloración, se forma CNCl, que desarrolla un color rojoazul con el reactivo de piridina-ácido barbitúrico. Cuando se analice CNCl, omítase la adición de cloramina-T. (PRECAUCIÓN: CNCl es un gas tóxico; evítese su inhalación.) La presencia de formaldehído por encima de 0,5 mg/l interfiere con la prueba. En la sección 4500-CN.B.3 se suministra un método para eliminar esta interferencia y un ensayo al toque para detectar la presencia de aldehídos. El tiocianato (SCN¯) reacciona con cloramina-T, creando una interferencia positiva. CN¯ puede ser enmascarado con formaldehído, repitiendo el análisis de la muestra, con lo que el ensayo al toque es específico para SCN¯. De ese modo es posible determinar si la decoloración de la mancha se debe a la presencia de CN¯, SCN¯ o ambos.

2.

Instrumental

a) Placa de gotas de porcelana con 6 a 12 cavidades. b) Pipetas de goteo. c)

4-45

Varillas de vidrio para agitación.

3.

Reactivos

a) Solución de cloramina-T: Véase sección 4500-CN.E.3a. b) Solución stock de cianuro: Véase sección 4500-CN.E.3b. c) Reactivo de piridina-ácido barbitúrico: Véase sección 4500-CN.E.3d. d) Ácido clorhídrico, HCl 1 + 9. e) Solución acuosa de fenolftaleína indicador. f ) Carbonato de sodio, Na2CO3, anhidro. g) Formaldehído, 37 por 100, calidad farmacéutica. 4.

Procedimiento

Si la solución a analizar tiene un pH por encima de 10, neutralícese una porción de 20 a 25 ml. Añádanse alrededor de 250 mg de Na2CO3 y agítese por rotación para disolverlo. Añádase 1 gota de indicador de fenolftaleína. Añádase HCl 1 + 9 gota a gota y con agitación constante hasta que la solución sea incolora. Pónganse 3 gotas de muestra y 3 de agua destilada (como blanco) en cavidades separadas de la placa de gotas. Añádase 1 gota de solución de cloramina-T a cada cavidad y mézclese con una varilla limpia. Añádase 1 gota de solución de piridina-ácido barbitúrico a cada cavidad y mézclese de nuevo. Al cabo de 1 minuto, la gota de muestra virará del rosa al rojo, si contiene 50 µg de CN¯/l o más. La gota del blanco será ligeramente amarilla debido al color de los reactivos. Hasta estar familiarizado con el ensayo al toque, utilícese en lugar del blanco de agua una solución patrón con 50 µg de CN¯/l para comparar el color. Este estándar se puede preparar diluyendo la solución madre de cianuro (apartado 3b). Si se sospecha la presencia de SCN¯, analícese una segunda muestra tratada

4-46

MÉTODOS NORMALIZADOS

previamente como sigue: caliéntese una muestra de 20 a 25 ml en un baño de agua a 50 °C; añádanse 0,1 ml de formaldehído y manténgase durante 10 minutos. Este tratamiento enmascara hasta 5 mg de CN¯/l, si está presente. Repítase el ensayo al toque. La aparición de color indica la presencia de SCN¯. Comparan-

4500-CN L. 1.

Discusión general ¯

El cianato (CNO ) puede tener interés en el análisis de las muestras de aguas residuales industriales debido al proceso de cloración alcalina utilizado para oxidar el cianuro, que produce cianato en la segunda reacción. El cianato es inestable a pH neutro o bajo; por ello, debe estabilizarse la muestra en cuanto se obtenga, por adición de hidróxido de sodio (NaOH) hasta pH > > 12. Elimínese el cloro residual añadiendo tiosulfato de sodio (Na2S2O3) (véase sección 4500-CN.B.2). a) Principio: El cianato se hidroliza en amoníaco cuando se calienta a pH bajo.

do su intensidad en los dos ensayos, se puede estimar la concentración relativa de CN ¯ y SCN ¯. Si se produce un color oscuro, la dilúción en serie de la muestra y un análisis adicional permitirán una mejor aproximación a las concentraciones.

Cianatos (NH3) al acidificar. Para reducir al mínimo esta interferencia, contrólese estrechamente la acidificación y calefacción. 2) Los compuestos metálicos pueden precipitar o formar complejos coloreados con reactivo Nessler. Esa interferencia se supera añadiendo sal de Rochelle o EDTA en la determinación del amoníaco. Los precipitados metálicos no interfieren con el método de electrodo ionselectivo. 3) Redúzcanse los oxidantes que transforman el cianato en dióxido de carbono y nitrógeno con Na2S2O3 (véase sección 4500-CN.G). 4) Los residuos industriales conteniendo materia orgánica pueden incluir interferentes desconocidos. c) Límite de detección: 1 a 2 mg de CNO¯/l.

La concentración de amoníaco se debe determinar en una porción de la muestra antes de la acidificación. El contenido de amoníaco antes y después de la hidrólisis del cianato se pueden medir por nesslerización directa (4500-NH3.C), fenato (4500-NH3.D), o electrodo de amonioselectivo (4500-NH3.F)1. La prueba es aplicable a los compuestos de cianato en aguas naturales y residuos industriales. b) Interferencias: 1) Los compuestos nitrogenados orgánicos pueden hidrolizarse en amoníaco

2.

Instrumental

a) Medidor de pH de escala expandida o medidor ion-selectivo. b) Electrodo amonio-selectivo*. c) Agitador magnético, con varilla agitadora recubierta de TFE.

* Orion modelo 95-10, EIL modelo 8002-2, Beckman modelo 39565 o equivalente.

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

d) Barrera de calor: Úsese un aislante de 3 mm de grosor debajo del vaso, para aislar del calor producido por el motor de agitación.

3.

Reactivos

a) Solución madre de cloruro de amonio: Véase sección 4500-NH3.C.3d. b) Solución patrón de cloruro de amonio: A partir de la solución stock de NH4Cl prepárense soluciones patrón que contengan 1,0, 10,0 y 100,0 mg de NH3-N/l, por dilución con agua exenta de amoníaco. c) Hidróxido de sodio, 10N: Disuélvanse 400 g de NaOH en agua y dilúyase a 1 l. d) Solución de ácido sulfúrico, H2SO4 1 + 1. e) Solución de cloruro de amonio: Disuélvanse 5,4 g de NH4Cl en agua destilada y dilúyase a 1 l. (Úsese únicamente para sumergir los electrodos.)

4-47

Acidifíquense 100 ml de muestra preparada por adición de 0,5 ml de H2SO4 1 + 1 hasta pH de 2,0 a 2,5. Caliéntese la muestra a 90-95 °C y manténgase la temperatura durante 30 minutos. Enfríese a temperatura ambiente y restablézcase el volumen original por adición de agua exenta de amoníaco. Añádase a un vaso de 150 ml, sumérjase el electrodo, conéctese el agitador magnético y añádase 1 ml de solución de NaOH 10N. Compruébese con papel para pH que éste es superior a 1 l. Si fuera necesario, añádase más NaOH hasta llegar a pH 1l. Tras alcanzar el equilibrio (30 segundos) anótese la lectura del potencial. Calcúlese el contenido de NH3-N a partir de la curva de calibrado.

5.

Cálculos

donde: 4.

Procedimiento

a) Calibrado: Calíbrese diariamente el electrodo de amoníaco como en 4500NH3.F.4b y c, utilizándose las soluciones patrón de NH4Cl. b) Tratamiento de la muestra: Diluyase la muestra, si fuera necesario, de modo que la concentración de CNO¯ esté entre 1 y 200 mg/l o la de NH3-N sea de 0,5 a 100 mg/l. Tómense o prepárense 200 ml por lo menos. A partir de estos 200 ml tómese una porción de 100 ml y, siguiendo el procedimiento de calibración, establézcase el potencial (milivoltios) desarrollado con la muestra. Compruébese la lectura del electrodo con los patrones preparados y el instrumento ajustado diariamente. Regístrese el contenido de NH3-N de la muestra no tratada (B).

6.

Precisión

No existen datos acerca de la precisión de este método. Véase 4500-NH3.F.6 para la precisión del método del electrodo amonio-selectivo.

7.

Referencia

1. THOMAS, R. F. & R. L. Boom. 1973. Selective electrode determination of ammonia in water and wastes. Environ. Sci. Technol. 7:523.

4-48

MÉTODOS NORMALIZADOS

4500-CN M. Tiocianato 1.

Discusión general

Cuando se cloran las aguas residuales que contienen tiocianato (SCN¯) se forma cloruro de cianógeno muy tóxico (CNCl). A pH ácido, el ion férrico (Fe3 +) y SCN¯ producen un color rojo intenso, adecuado para la determinación colorimétrica. a) Interferencia: 1) El cromo hexavalente (Cr6 + ) interfiere y es eliminado por adición de sulfato ferroso (FeSO4) tras ajustar a pH 1-2 con ácido nítrico (HNO3). Subiendo el pH a 9 con hidróxido de sodio (NaOH) 1N, precipitan Fe3+ y Cr3+, que entonces se separan por filtración. 2) Los agentes reductores que convierten Fe3+ en Fe2+ impiden la formación del tiocianato férrico complejo, y son destruidos por adición de unas gotas de peróxido de hidrógeno (H2O2). 3) Los residuos industriales pueden tener mucho color o contener varios compuestos orgánicos interferentes. Para eliminar esas interferencias, utilícese el método de tratamiento previo expuesto a continuación en el apartado 4c. Es responsabilidad del analista validar la aplicabilidad del método sin tratamiento previo (apartado 4b). En caso de duda, trátese la muestra antes de seguir con el análisis (apartado 4c). 4) Si la muestra contiene cianuro susceptible de cloración y se va a conservar para determinación de cianuro a pH elevado, el sulfuro podría interferir transformando el cianuro en SCN ¯. Para conservar SCN¯ y CN¯, precipítese el sulfuro por adición de sales de plomo según 4500-CN.B.2 antes de añadir el álcali; fíltrese para eliminar el precipitado. 5) El tiocianato es biodegradable. Consérvense las muestras que puedan contener bacterias a pH < 2 añadiendo un ácido mineral y refrigerando.

b) Aplicación: 0,1 a 2,0 mg de SCN¯/l en agua natural o residual. Para concentraciones más altas, utilícese una porción de muestra diluida. 2.

Instrumental

a) Espectrofotómetro o fotómetro de filtro, para utilizar a 460 nm, con un recorrido de luz de 5 cm. b) Columna de adsorción de vidrio: Utilícese una bureta de 50 ml con tapón de lana de vidrio, y rellena de resina macrorreticular (apartado 3f) hasta una altura aproximada de 40 cm. Para mayor comodidad, aplíquese un embudo para polvos del mismo diámetro que la bureta a su parte superior, con un tubo corto de plástico. 3.

Reactivos

a) Solución de nitrato férrico: Disuélvanse 404 g de Fe(NO3)3 · 9H2O en unos 800 ml de agua destilada. Añádanse 80 ml de HNO3 conc. y dilúyase a 1 l. b) Solución de ácido nítrico, 0,1 N: Mézclense 6,4 ml de HNO3 conc. en unos 800 ml de agua destilada y dilúyase a 1 l. c) Solución de reserva de tiocianato: Disuélvanse 1,673 g de tiocianato de potasio (KSCN) en agua destilada y Dilúyase a 1.000 ml; 1,00 ml = 1,00 mg de SCN ¯ . d) Solución patrón de tiocianato: Disuélvanse 10 ml de solución madre hasta 1 l con agua destilada; 1,00 ml = 0,01 mg SCN¯. e) Solución de hidróxido de sodio, 4 g/l: Disuélvanse 4 g de NaOH en unos 800 ml de agua destilada y dilúyase a 1 l. f) Resina macrorreticular, malla 18 a 50*: La resina actualmente disponible es * Amberlite® XAD-8, Rohm & Haas Company, o equivalente.

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

un producto experimental y no está purificada. Algunas muestras han presentado contaminaciones con ceras y aceite, con mala permeabilidad y adsorción. Purifíquese como se indica a continuación: Póngase en un vaso cantidad suficiente de resina como para llenar la columna o columnas y añádanse 5 veces ese volumen de acetona. Agítese con cuidado durante 1 hora. Decántense los finos y acetona de la resina depositada y añádase 5 veces el volumen de resina de hexano. Agítese durante 1 hora. Decántense los finos y el hexano y añádase 5 veces el volumen de resina de metano. Agítese durante 15 minutos. Decántese el metanol y añádase 3 veces el volumen de resina de NaOH 0,1N. Agítese durante 15 minutos. Decántese la solución de NaOH y añádase 3 veces el volumen de resina de NHO3 0,1N. Agítese durante 15 minutos. Decántese la solución de HNO3 y añádase 3 veces el volumen de resina de agua destilada. Agítese durante 15 minutos. Vacíese el exceso de agua y úsese resina purificada para llenar la columna. Guárdese el sobrante de resina purificada tras cubrirlo con agua destilada. Guárdese en una jarra cerrada. g) Alcohol metílico. 4.

Procedimiento

a) Preparación de la curva de calibrado: Prepárese una serie de patrones con 0,02 g a 0,40 mg de SCN ¯ pipeteando volúmenes medidos de solución patrón de KSCN en matraces aforados de 200 ml y diluyendo con agua destilada. Mézclese bien. Desarróllese el color según el apartado b siguiente. Compárese la absorbancia frente a la concentración de SCN¯ expresada en mg/50 ml de muestra. La gráfica de absorbancia debe ser lineal. b) Desarrollo del color: Úsese una muestra filtrada o una proporción de una solución diluida de modo que la

4-49

concentración de SCN¯ se encuentre entre 0,1 y 2 mg/l. Ajústese el pH a 2 con HNO3 conc. añadido gota a gota. Llévense con la pipeta 50 ml a un vaso, añádanse 2,5 ml de nitrato férrico y mézclese. Llénese una cubeta de absorción de 5 cm y mídase la absorbancia frente a un blanco de reactivo a 460 nm o cerca del máximo de absorbancia encontrado con el aparato utilizado. Mídase la absorbancia del color desarrollado frente al blanco de reactivo en los 5 minutos siguientes a la adición del reactivo. (El color se desarrolla en 30 segundos y desaparece gradualmente con la luz.) c) Tratamiento previo de la muestra: 1) El color y varios compuestos orgánicos interfieren con la medida de la absorbancia. A pH 2, la resina macrorreticular elimina esos materiales interferentes por adsorción, sin afectar al tiacianato. 2) Para preparar la columna de absorción, llénese con resina, aclárese con 100 ml de metanol y sígase aclarando con 100 ml de NaOH 0,1N, 100 ml de HNO3 0,1N y, finalmente, con 100 ml de agua destilada. Si se usa resina previamente purificada, omítase esos pasos preparatorios. 3) Cuando se lave, se regenere o se pase una muestra por la columna, al acercarse el nivel de la solución al lecho de resina, añádanse y extráiganse cinco volúmenes separados de 5 ml de solución o agua (según lo que se use en el paso siguiente) a la altura aproximada del lecho. Tras el último volumen de 5 ml, llénese la columna con el líquido restante. Este procedimiento impide la mezcla indebida de las soluciones y ayuda a vaciar la columna de la solución anterior. 4) Acidifíquese una muestra de 150 ml (o una dilución) hasta pH 2 por adición de HNO3 conc. gota a gota, con agitación. Pásese por la columna con un flujo no superior a 20 ml/minuto. Si la resina queda empaquetada y el flujo des-

4-50

ciende a 4-5 ml/minuto, aplíquese una presión suave por medio de una bomba manual o apretando el bulbo de la columna. En ese caso, utilícese un embudo de separación para el depósito de líquido en lugar del embudo de polvos. Otra alternativa es usar un frasco de vacío como receptor y aplicar un vacío suave. No dejar que el nivel de líquido quede más bajo que el de adsorbente en la columna. 5) Cuando se pase una muestra por la columna, mídase 90 ml de muestra en una probeta graduada y tómese de ella las adiciones de 5 ml como se indica en el apartado 3. Viértase entonces el resto de los 90 ml en la columna. Añádase el resto de la muestra y recójanse 60 ml de soluto para análisis, después que hayan pasado los primeros 60 ml por la columna. 6) Prepárese una nueva curva de calibrado utilizando patrones preparados según el apartado 4a, pero acidificar los patrones según el apartado 4b, y pásense por la columna de adsorción. Desarróllese el color y mídase la absorbancia de acuerdo con el apartado 4b frente a un blanco de reactivo preparado pasando agua destilada acidificada por la columna de adsorción. 7) Llévense con la pipeta a un vaso 50 ml del soluto recogido, añádanse 2,5 ml de solución de nitrato férrico y mézclese. Mídase la absorbancia según el apartado 4b frente a un blanco de reactivo (véase apartado 6 anterior). 8) A partir del valor de absorbancia medida, determínese el contenido de tiocianato de la muestra o dilución utilizando la gráfica de absorbancias. 9) Cada día que se use la columna, analícese un estándar intermedio para comprobar la curva de absorción. 10) Regenérese la columna, entre muestras, por aclarado con 100 ml de NaOH 0,1N, 50 ml de HNO3 0,1N y 100 ml de agua. Asegúrese de que el agua ha lavado la sección de vidrio vacía de la bureta. Aclárese ocasionalmente con 100 ml de metanol para regeneración

MÉTODOS NORMALIZADOS

completa. Los ácidos orgánicos débiles y residuos de tiocianato adsorbidos, procedentes de las pruebas anteriores, se eluyen con el lavado de NaOH. Déjese la columna cubierta con el último agua de lavado para su conservación. 5.

Cálculos

Calcúlese la concentración de tiocianato del siguiente modo:

donde: A = mg SCN según la curva de calibrado, y

B = mililitros de muestra utilizados.

6.

Precisión

Sobre la base de las pruebas en colaboración, la precisión del método, incluido el tratamiento previo de la muestra, dentro de su rango diseñado, es lineal con la concentración y se puede expresar del siguiente modo: Agua para reactivos: ST = 0,0930X + 0,0426 S, = 0.045X + 0,010 Agua matriz: ST

= 0,0547X + 0,0679 So = 0,0244X + 0,0182

donde: ST = precisión media, mg/l, So = precisión del conjunto de operadores por separado, mg/l, y X = concentración de tiocianato, mg/l.

7. 1.

Referencia SPENCER, R. R., J. LEENHEER, V. C. MARTI. 1980. Automated colorimetric determination of thiocyanate, thiosulfate and tetrathionate in water. 94th Annu. Meeting. Assoc. Official Agricultural Chemists, Washington, D.C. 1981.

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

4500-CI

CLORO (RESIDUAL)*

4500-CI A. 1.

Efectos de la cloración

La cloración del agua para suministro y residual sirve principalmente para destruir o desactivar los microorganismos causantes de enfermedades. Una segunda ventaja, especialmente en el tratamiento del agua de bebida, reside en la mejora general de su calidad, como consecuencia de la reacción del cloro con el amoníaco, hierro, manganeso, sulfuro y algunas sustancias orgánicas. La cloración puede producir efectos adversos. Se pueden intensificar el sabor y olor característicos de los fenoles y otros compuestos orgánicos presentes en el agua para suministro. Pueden formarse compuestos organoclorados, potencialmente carcinógenos, como el cloroformo. El cloro combinado formado en la cloración de las aguas con amoníaco o aminas afecta de forma adversa a algunas variedades de vida acuática. Para cumplir el objetivo primario de la cloración y reducir al mínimo los efectos adversos, es esencial utilizar procedimientos analíticos adecuados con un conocimiento previo de las limitaciones de las pruebas que se quieren realizar. 2.

4-51

Formas y reacciones del cloro

El cloro aplicado al agua en su forma molecular o de hipoclorito sufre una hidrólisis inicial para producir cloro libre consistente en cloro molecular acuoso, ácido hipocloroso e ion hipoclorito. La proporción relativa de estas formas de cloro libre depende del pH y la temperatura. Al pH de la mayoría de las aguas, * Aprobado por el Standard Methods Committee, 1989.

Introducción predominarán el ácido hipocloroso y el ion hipoclorito. El cloro libre reacciona fácilmente con el amoníaco y ciertos compuestos de nitrógeno, formando cloro combinado. La reacción del amoníaco con el cloro produce cloraminas: monocloramina, dicloramina y tricloruro de nitrógeno. La presencia y concentraciones de estas formas combinadas dependen principalmente del pH, temperatura, proporción inicial cloro-nitrógeno, demanda absoluta de cloro y tiempo de reacción. Tanto el cloro libre como el combinado pueden estar presentes simultáneamente. El cloro combinado de los suministros de agua se puede formar al tratar las aguas naturales que contienen amoníaco o por adición de amoníaco o sales de amonio. Los diluyentes de aguas residuales cloradas, así como algunos diluyentes industriales clorados, contienen normalmente sólo cloro combinado. Históricamente, el principal problema analítico se ha planteado en la distinción entre el cloro libre y el combinado. 3.

Selección del método

En dos estudios separados, pero relacionados, se prepararon y distribuyeron muestras para evaluar los métodos de cloro a los laboratorios participantes. Debido a la escasa exactitud y precisión y al elevado error total medio (promedio) de estos estudios, todos los procedimientos de ortotolidina, excepto uno, fueron abandonados en la 14.a edición de esta obra. El útil método de la ortotolidina neutra estabilizada se suprimió de la 15.a edición debido a la naturaleza tóxica de la ortotolidina. El procedimiento de leucocristal violeta (LCV) se ha eliminado en esta edición, debido a su relativa difi-

4-52

cuitad y a la ausencia de ventajas comparativas. a) Aguas naturales y tratadas: Los métodos yodométricos (B y C) son adecuados para medir las concentraciones de cloro total superiores a 1 mg/l, pero el punto final amperométrico de los métodos D y C consigue mayor sensibilidad. Todos los métodos yodométricos ácidos sufren interferencias, generalmente proporcionadas a la cantidad de yoduro de potasio (KI) y H+ añadidas. El método amperométrico de titulación (D) es un estándar de comparación para determinar cloro libre o combinado. Le afectan poco los agentes oxidantes comunes, las variaciones de temperatura, turbidez y color. No es un método tan sencillo como los colorimétricos y requiere mayor habilidad del operador para obtener la mejor Habilidad. Puede haber pérdida de cloro debido a la rápida agitación de algunos aparatos industriales. Para obtener puntos finales precisos, se necesitan electrodos limpios y acondicionados. En esta edición, se ha añadido un procedimiento amperométrico de titulación de bajo nivel (E) para determinar el cloro total a niveles inferiores a 0,2 mg/l. Este método se recomienda sólo cuando es necesario cuantificar residuos tan bajos. Las interferencias son similares a las encontradas con el método amperométrico estándar (D). Los métodos DPD (métodos F y G) son operativamente más simples para la determinación del cloro libre que la titulación amperométrica. Se dan procedimientos para estimar la mono- y dicloramina separadas y fracciones combinadas. Las concentraciones altas de monocloramina interfieren con la determinación del cloro libre, a no ser que se detenga la reacción con arsenito o tioacetamida. Además, los métodos DPD están sometidos a interferencias por las formas oxidantes de manganeso, a no ser que se compensen con un blanco. Los métodos amperométrico y DPD

MÉTODOS NORMALIZADOS

no son afectados por las concentraciones de dicloramina del orden de 0 a 9 mg de Cl como Cl2/l, en la determinación del cloro libre. Si se encuentra tricloruro de nitrógeno presente, puede reaccionar parcialmente como cloro libre en los métodos amperométricos, DPD y PCLD. No parece significativo el alcance de esta interferencia en los métodos DPD. La prueba del cloro libre de la siringaldacina (PCLD, método H) fue desarrollada específicamente para cloro libre. No le afectan las concentraciones significativas de monocloramina, dicloramina, nitrato, nitrito y formas oxidadas del manganeso1. El color y turbidez de la muestra pueden interferir en todos los métodos colorimétricos. Los contaminantes orgánicos pueden producir una lectura falsa en la mayoría de los métodos colorimétricos (véase el apartado 3b, más adelante). Muchos oxidantes fuertes interfieren en la determinación del cloro libre con todos los métodos, incluyendo el bromo, dióxido de cloro, yodo, permanganato, peróxido de hidrógeno y ozono. Sin embargo, las formas reducidas de estos compuestos, bromuro, cloruro, yoduro, ion manganoso y oxígeno, en ausencia de otros oxidantes, no interfieren. Los agentes reductores, como los compuestos ferrosos, sulfuro de hidrógeno y materia orgánica oxidable, no suelen interferir. b) Aguas residuales: La determinación del cloro total en muestras que contengan materia orgánica plantea problemas especiales. Debido a la presencia de amoníaco, aminas y compuestos orgánicos, particularmente nitrógeno orgánico, el cloro residual existe en estado combinado. Puede existir en esta forma un residuo considerable, aunque coexistir con una apreciable demanda de cloro no satisfecha. La adición de reactivos en la determinación puede alterar estas relaciones de forma que se pierda cloro residual durante el análisis. Sólo el método

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

DPD para cloro total se realiza en condiciones de pH neutro. En las aguas residuales no suele establecerse diferenciación entre cloro libre y combinado, debido a que la cloración de aguas residuales raramente alcanza el nivel suficiente para producir cloro libre. La determinación de cloro residual en residuos industriales es análoga a la de aguas residuales domésticas cuando contienen materia orgánica, pero puede ser similar a la determinación en el agua cuando el residuo sea pobre en materia orgánica. Ninguno de estos métodos es aplicable a las aguas marinas o de estuarios porque el bromuro se transforma en bromo y bromaminas, que se detectan como cloro total o libre. Existe un procedimiento para estimar esta interferencia para el método DPD. Aunque los métodos que se dan a continuación son útiles para determinar el cloro residual en aguas residuales y diluyentes tratados, seleccionar el método según la composición de la muestra. Algunos residuos industriales, o mezclas de residuos con agua residual doméstica, pueden precisar precauciones especiales y modificaciones para obtener resultados satisfactorios. Determínese el cloro libre en agua residual por cualquiera de los métodos, siempre que estén ausentes las sustancias interferentes o se usen las técnicas de corrección apropiadas. Se selecciona el método amperométrico por no estar sujeto a interferencias por el color, turbidez, hierro, manganeso o nitrógeno de los nitritos. El método DPD está sometido a la interferencia de concentraciones elevadas de monocloramina, que se evita por adición de tioacetamida inmediatamente después de la adición del reactivo. Las formas oxidadas del manganeso a todos los niveles encontrados en el agua interferirán en todos los métodos, excepto en la determinación del cloro libre de titulaciones amperométricas y PCLD; pero en

4-53

los métodos F y G se puede hacer una corrección de blanco para manganeso. El método PCLD no es afectado por concentraciones de monocloramina, dicloramina, nitrito, hierro, manganeso y otros compuestos interferentes encontrados normalmente en las aguas residuales domésticas. Para el cloro total en muestras que contengan cantidades significativas de materia orgánica, utilizar los métodos DPD (F y G), amperométrico, o método de titulación yodométrica de retroceso (C) para impedir el contacto entre la concentración total de yodo liberado y la muestra. Con el método C, no utilizar el punto final de almidón-yoduro si la concentración es inferior a 1 mg/l. En ausencia de interferencia, los puntos finales amperométrico y de almidón-yoduro dan resultados concordantes. El punto final amperométrico tiene más sensibilidad inherente y está libre de interferencias del color y turbidez, que pueden causar dificultades con el punto final de almidónyoduro. Por otra parte, algunos metales, agentes tensoactivos y aniones complejos de algunos residuos industriales interfieren en la titulación amperométrica, indicando la necesidad de otro método para esas aguas residuales. La plata en forma de complejo soluble de cianuro de plata, en concentraciones de 1,0 mg de Ag/l, intoxican la célula a pH 4,0, pero no a 7,0. El ion plata, en ausencia del complejo cianuro, da una amplia respuesta en la corriente a pH 4,0 e intoxica gradualmente la célula a todos los niveles de pH. El cobre cuproso en el ion cianuro de cobre soluble, en concentraciones de 5 mg de Cu/l o menos intoxica la célula a pH 4,0 y 7,0. Aunque el hierro y el nitrito pueden interferir con este método, se recomienda reducir al mínimo la interferencia tamponando a pH 4,0 antes de añadir KI. Las formas oxidadas de manganeso interfieren en todos los métodos para cloro total, incluida la titulación amperométrica. Un contenido inusual-

MÉTODOS NORMALIZADOS

4-54

mente alto de materia orgánica puede producir inseguridad en el punto final. Independientemente de la detección del punto final, se puede usar el óxido de fenilarsina o tiosulfato como reactivo reductor estándar a pH 4. El primero, más estable, será preferible. Los métodos DPD titulométrico y colorimétrico (F y G, respectivamente) son aplicables a la determinación de cloro total en aguas contaminadas. Además, ambos métodos DPD y la titulación amperométrica permiten estimar las fracciones mono- y dicloramina. Como todos los métodos para cloro total dependen de la producción estequiométrica de yodo, las aguas que contienen sustancias reductoras del yodo no pueden analizarse exactamente por estos métodos, especialmente cuando el yodo permanece en la solución durante un tiempo significativo. Este problema se produce en los métodos B y D. El procedimiento de titulación de retroceso (C) y los métodos F y G producen la reacción inmediata del yodo generado de forma que tiene poca oportunidad de reaccionar con otras sustancias reductoras del yodo. En todos los procedimientos colorimétricos, compensar el color y turbidez por medio de blancos de color y turbidez. Se propone un método (I) para cloro residual total, mediante el empleo de un electrodo potenciométrico de yoduro. Este método es adecuado para análisis de cloro residual en aguas naturales y tratadas y en diluyentes de aguas residuales. No es posible diferenciar entre cloro libre y combinado. Este procedimiento constituye una adaptación de otras técnicas yodométricas y está sometido a las mismas interferencias.

4.

Toma de muestras y conservación

El cloro en solución acuosa no es estable, y su contenido en las muestras o soluciones, especialmente en soluciones poco concentradas, disminuirá rápidamente. La exposición a la luz solar u otra luz fuerte, o la agitación, aceleran la reducción del cloro. Por ello, empezar la determinación del cloro inmediatamente después de tomar la muestra, evitando el exceso de luz o agitación. No almacenar las muestras destinadas al análisis del cloro.

5.

Referencia

1. COOPER, W. J., N. M. R OSCHER & R. A. SuFER. 1982. Determining free available chlorine by DPD-colorimetric, DPD-steadifac (colorimetric) and FACTS procedures. J. Amer. Water Works Assoc. 74:362.

6.

Bibliografía

MARKS , H. C, D. B. WILLIAMS & G. U. GLASGOW. 1951. Determination of residual chlorine compounds. J. Amer. Water Works Assoc. 43:201. NICOLSON, N. J. 1965. An evaluation of the methods for determining residual chlorine in water, Part 1. Free chlorine. Analyst 90:187. WHITTLE, G. P. & A. LAPTEFF, JR. 1973. New analytical techniques for the study of water disinfection. En Chemistry of Water Supply, Treatment, and Distribution, pág. 63. Ann Arbor Science Publishers, Ann Arbor, Michigan. GUTER, W. J., W. J. C OOPER & C. A. SORBER. 1974. Evaluation of existing field test kits for determining free chlorine residuals in aqueous solutions. J. Amer. Water Works Assoc. 66:38.

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

4500-Cl B. 1.

Método yodométrico I

Discusión general

a) Principio: El cloro liberará yodo a partir de las soluciones de yoduro de potasio (KI) a pH 8 o inferior. El yodo libre se valora con una solución patrón de tiosulfato de sodio (Na2S2O3) con almidón como indicador. Hágase la valoración a pH 3-4, ya que la reacción no es estequiométrica a pH neutro debido a la oxidación parcial del tiosulfato a sulfato. b) Interferencia: Interfieren las formas oxidadas del manganeso y otros agentes oxidantes. Aunque la titulación neutra reduce al mínimo el efecto interferente de los iones férrico y nítrico, es preferible la acida porque algunas formas de cloro combinado no reaccionan a pH 7. Utilícese solamente ácido acético para la titulación acida; el ácido sulfúrico (H2SO4) aumentaría las interferencias; no utilizar nunca ácido clorhídrico (HCl). Véase en la sección A. 3 la discusión de otras interferencias. c) Concentración detectable mínima: La concentración detectable mínima se aproxima a 40 µg de Cl como Cl2/l si se utiliza Na2S2O3 0,01N con una muestra de 1.000 ml. Las concentraciones inferiores a 1 mg/l no se pueden determinar exactamente con el punto final almidónyoduro utilizado en este método. Las concentraciones inferiores se pueden medir con el punto final amperométrico en los métodos C y D. 2.

4-55

Reactivos

a) Ácido acético, conc. (glacial). b) Yoduro de potasio, KI, cristales. c) Tiosulfato de sodio patrón, 0,1 N: Disuélvanse 25 g de Na2S2O3 · 5H2O en 1 l de agua destilada recién hervida y estandarícese frente a biyodato de potasio o dicromato de potasio tras, como mínimo, 2 semanas de conservación. Este

almacenado inicial es necesario para permitir la oxidación de cualquier ion bisulfito presente. Utilícese agua destilada hervida y añádanse unos mililitros de cloroformo (CHCl3) para reducir al mínimo la descomposición bacteriana. Estandarícese Na2S2O3 0,1N mediante uno de los métodos siguientes: 1) Método del yodato: Disuélvanse 3,249 g de biyodato de potasio anhidro, KH(IO3)2, calidad estándar primario, o 3,567 g de KIO 3 secado a 103 ± 2 °C durante 1 hora, en agua destilada y dilúyase a 1.000 ml para obtener una solución 0,1000N. Consérvese en frasco con tapón de vidrio. Añádase a 80 ml de agua destilada, con agitación constante, 1 ml de H2SO4 conc, 10,00 ml de KH(IO3)2 0.1000N y 1 g de KI. Titúlese inmediatamente con titulante de Na2S2O3 0,1N hasta que casi desaparezca el color amarillo del yodo liberado. Añádase 1 ml de solución indicadora de almidón y continúese la valoración hasta la desaparición total del color azul. 2) Método del dicromato: Disuélvanse 4,904 g de dicromato de potasio anhidro, K2Cr2O7, de calidad estándar primario, en agua destilada y dilúyase a 1.000 ml para obtener una solución 0,1000N. Consérvese en frascos con tapón de vidrio. Procédase como en el método del yodato, con las siguientes excepciones: sustituir 10,00 ml de K2Cr2O7 0,1000N por yodato y dejar reposar la mezcla en la oscuridad antes de valorar con Na2S2O3 0,1 N titulante.

d) Titulante de tiosulfato de sodio estándar, 0,01N o 0,025N: Mejórese la esta-

4-56

MÉTODOS NORMALIZADOS

bilidad del Na2S2O3 0,01N o 0,025N por dilución de una solución 0,1N madura, preparada como se ha indicado antes, con agua destilada recién hervida. Añádanse 4 g de borato de sodio y 10 g de solución de yoduro mercúrico/l. Para mayor exactitud, estandarícese esta solución diariamente de acuerdo con las instrucciones anteriores, utilizando yodato 0,01 N o 0,025N o K2Cr2O7. Utilícense volúmenes suficientes de estas soluciones patrón de modo que su dilución final no supere 1+4. Para acelerar la operación cuando haya que valorar muchas muestras, utilícese una bureta automática de un tipo en que la goma no entre en contacto con la solución. Los titulantes patrón, 0,0100N y 0,0250N, son equivalentes, respectivamente, a 354,5 µg y 886,3 µg de Cl como Cl2/l,00 ml. e) Solución indicadora de almidón: Sobre 5 g de almidón (patata, arrurruz o soluble), añádase un poco de agua fría y tritúrese en un mortero hasta obtener una pasta fina. Añádase ésta a 1 l de agua destilada hirviendo, agítese y déjese en reposo durante una noche. Utilícese el sobrenadante transparente. Consérvese con 1,25 g de ácido salicílico, 4 g de cloruro de zinc, o una combinación de 4 g de propionato de sodio y 2 g de azida de sodio/l de solución de almidón. Algunos sucedáneos comerciales del almidón son satisfactorios. f) Yodo patrón, 0,1 N: Véase C.3g. g) Yodo patrón diluido, 0,0282N: Véase C3h.

Con el punto final amperométrico, utilizar muestras y volúmenes menores de titulantes. b) Preparación para titulación: Colóquense 5 ml de ácido acético, o cantidad suficiente para reducir el pH hasta un valor comprendido entre 3,0 y 4,0, en un matraz o cazuela de porcelana blanca. Añádase alrededor de 1 g de KI, calculado sobre una espátula. Viértase la muestra y mézclese con una varilla de agitación. c) Titulación: Titúlese fuera de la luz solar directa. Añádase Na2S2O3 0,01N o 0,025N con bureta, hasta que casi desaparezca el color amarillo del yodo libre. Añádase 1 ml de solución de almidón y valórese hasta la desaparición del color azul. Si la titulación se hace con Na2S2O3 0,025N en lugar de 0,01N, con una muestra de 1 l, 1 gota equivale a unos 50 µg/l. No es posible distinguir el punto final con mayor precisión. d) Titulación del blanco: Corríjase el resultado de valoración de la muestra, determinando la contribución del blanco por las impurezas oxidantes o reductoras del reactivo. El blanco compensa también la concentración del yodo ligado al almidón en el punto final. Tómese un volumen de agua destilada correspondiente a la muestra usada para titulación en los apartados 3a-c, añádanse 5 ml de ácido acético, 1 g de KI y 1 ml de solución de almidón. Realícese la valoración del blanco igual que en 1) ó 2) siguientes, el que sea aplicable.

3.

1) Si aparece un color azul, titúlese con Na2S2O3 0,01N o 0,025N, hasta desaparición del color azul y regístrese el resultado. B (véase el apartado 4, más adelante) es negativo. 2) Si no aparece color azul, titúlese con solución de yodo 0,0282N hasta aparición del color azul. Titúlese por retroceso con Na2S2O3 0,01N ó 0,025N y regístrese la diferencia. B es positivo.

Procedimiento

a) Volumen de muestra: Selecciónese un volumen de muestra que no precise más de 20 ml de Na2S2O3 0,01 N, ni menos de 0,2 ml para el punto final de almidón-yoduro. Para un rango de cloro de 1 a 10 mg/l, utilícese una muestra de 500 ml; por encima de 10 mg/l, utilícese una muestra proporcionalmente menor.

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

Antes de calcular la concentración de cloro, réstese la titulación del blanco del apartado 1) de la de la muestra o, si fuera necesario, añádase el equivalente neto de la titulación del blanco del apartado 2).

nos métodos aparecen en esta edición. Actualmente, no se dispone de más datos. 6.

4.

Cálculos

Para estandarizar la solución de cloro para estándares provisionales:

Para determinar el cloro residual total disponible en la muestra de agua:

donde: A = titulación en ml para la muestra, B = titulación en ml para el blanco (positiva o negativa), y N = normalidad de Na 2 S 2 O 3 .

5.

Precisión y sesgo

Los estudios publicados1, 2 dan los resultados de nueve métodos utilizados para analizar muestras sintéticas de agua sin interferencias; las variaciones de algu-

4500-CI C. 1.

4-57

Referencias

1. Water Chlorine (Residual) No. 1. 1969. Analytical Reference Service Rep. No. 35, U.S. Environmental Protection Agency, Cincinnati, Ohio. 2. Water Chlorine (Residual) No. 2. 1971. Analytical Reference Service Rep. No. 40, U.S. Environmental Protection Agency, Cincinnati, Ohio.

7.

Bibliografía

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Método yodométrico II

Discusión general

a) Principio: En este método, utilizado para análisis de aguas residuales, la señal de punto final está invertida porque, en lugar de valorar directamente el yodo liberado, se titula el agente reductor estándar que no ha reaccionado (óxido de fenilarsina o tiosulfato) y queda en

la muestra, con yodo o yodato patrón. Este procedimiento indirecto es necesario, independientemente del método de detección del punto final, para evitar el contacto entre la concentración total del yodo liberado y el agua residual. Cuando se emplea yodato como titulador de retroceso, utilícese sólo ácido fosfórico y no usar tampón acetato.

MÉTODOS NORMALIZADOS

4-58

b) Interferencia: Las formas oxidadas de manganeso y otros oxidantes producen interferencias positivas. Los agentes reductores, como los sulfuros orgánicos, no interfieren tanto como en el método B. Redúzcase al mínimo la interferencia de hierro y nitrito por tamponado a pH 4,0 antes de añadir el yoduro de potasio (KI). Un contenido inusualmente elevado de materia orgánica puede causar cierta inseguridad en el punto final. Siempre que el manganeso, hierro y otras interferencias estén claramente ausentes, redúzcase esa inseguridad y mejórese la precisión acidificando a pH 1,0. Contrólese la interferencia de más de 0,2 mg de nitrito/l con reactivo de ácido fosfóricoácido sulfámico. Una fracción mayor de cloraminas orgánicas reaccionará a pH más bajo junto con las sustancias interferentes. Véase en la sección A.3 una discusión de otro tipo de interferencias. 2.

Instrumental

Véase en D.2a una descripción del aparato para detección del punto final amperométrico y una descripción de su uso. 3.

Reactivos

a) Solución patrón de óxido de fenilarsina, 0,005 64N: Disuélvanse aproximadamente 0,8 g de polvo de fenilarsina en 150 ml de solución de NaOH 0,3N. Después de depositarse, decántense 110 ml en 800 ml de agua destilada y mézclese bien. Llévese a pH 6-7 con HCl 6N y dilúyase a 950 ml con agua destilada. (PRECAUCIÓN: Muy venenoso, presunto agente cancerígeno.) Estandarización: Mídase exactamente de 5 a 10 ml de solución de yodo 0,0282N recién estandarizada, en un matraz y añádase 1 ml de solución de KI. Valórese con solución de óxido de feni-

larsina, usando el punto final amperométrico (método D) o solución de almidón (véase B.2e) como indicador. Ajústese a 0,005 64N y vuélvase a comprobar en relación con la solución patrón de yodo; 1,00 ml = 200 µg de cloro disponible. (PRECAUCIÓN: Tóxico; evítese su ingestión.) b) Solución patrón de tiosulfato de sodio, 0,1N: Véase B.2c. c) Solución patrón de tiosulfato de sodio 0,005 64N: Prepárese por dilución de Na2S2O3 0,1N. Para máxima estabilidad de la solución diluida, prepárese diluyendo una solución 0,1N envejecida con agua destilada recién hervida (para reducir al mínimo la acción bacteriana) y añádanse 10 mg de HgI2 y 4 g de Na4B4O7/l. Estandarícese diariamente como se indica en B.2c utilizando K2Cr2O7 0,005 64N o solución de yodato. Utilícese un volumen suficiente de muestra para que la dilución final no exceda de 1 + 2. Utilícese una bureta automática de un tipo en que la goma no entre en contacto con la solución. 1,00 ml = 200 µg de cloro disponible. d) Yoduro potásico, KI, cristales. e) Solución tampón de acetato, pH 4,0: Disuélvanse 146 g de NaC2H3O2 anhidro, o 243 g de NaC2H3O2 · 3H2O, en 400 ml de agua destilada, añádanse 480 g de ácido acético conc y dilúyase a 1 l con agua sin demanda de cloro. f) Solución patrón de arsenito, 0,1N: Pésese exactamente un frasco para pesada tapado que contenga aproximadamente 4,95 g de trióxido de arsénico, As2O3. Transfiérase sin pérdidas a un matraz aforado de 1 l y pésese el frasco de nuevo. No ha de intentarse separar las adherencias de óxido por cepillado. Humedézcase el As2O3 con agua y añádanse 15 g de NaOH y 100 ml de agua destilada. Agítese por rotación suave el contenido del frasco para disolverlo. Dilúyase a 250 ml con agua destilada y satúrese con CO2, transformando todo el NaOH en NaHCO3. Dilúyase hasta la señal, tá-

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

pese y mézclese bien. Esta solución conservará su título casi indefinidamente. (PRECAUCIÓN: Muy venenoso, presunto agente cancerígeno.)

g) Solución patrón de yodo, 0,1N: Disuélvanse 40 g de KI en 25 ml de agua sin demanda de cloro, añádanse 13 g de yodo resublimado y agítese hasta disolución. Transfiérase a un matraz volumétrico de 1 l y dilúyase hasta la señal. Estandarización: Mídanse exactamente de 40 a 50 ml de solución de arsenito 0,1N en un matraz y titúlese con solución de yodo, utilizando solución de almidón como indicador. Para obtener resultados exactos, asegúrese que la solución está saturada en CO2 al final de la valoración pasando una corriente de CO2 a su través durante unos minutos, justo antes de alcanzar el punto final, o añádanse unas gotas de HCl que liberen suficiente CO2 para saturar la solución. Alternativamente, estandarícese frente a Na2S2O3; véase B.2c1). Opcionalmente, prepárese directamente una solución de yodo 0,1000N como solución patrón pesando 12,69 g de yodo resublimado patrón primario. Dado que I2 puede volatilizarse y perderse en estado sólido o en solución, transfiérase el sólido inmediatamente a KI como se especifica más arriba. No dejar nunca la solución en recipientes abiertos durante períodos prolongados. h) Titulante de yodo patrón, 0,0282N: Disuélvanse 25 g de KI en un poco de agua destilada en matraz aforado de 1 l, añádase la cantidad correcta de solución de yodo 0,1N estandarizada exactamente para obtener una solución 0,0282N y dilúyase a 1 l con agua sin demanda de cloro. Para trabajar con mayor precisión, estandarícese diariamente de acuerdo con las instrucciones del apartado 3g anterior, usando 5-10 ml de arsenito o solu-

4-59

ción de Na2S2O3. Consérvese en botellas ámbar o en la oscuridad; protéjase en todo momento la solución de la luz solar directa y del contacto con gomas. i) Indicador de almidón: Véase B.2e. j) Titulante de yódalo patrón, 0,005 64N: Disuélvanse 201,2 mg de KIO3 calidad de estándar primario, secado durante 1 hora a 103 °C, o 183,3 mg de biyodato de potasio anhidro estándar primario en agua destilada y dilúyase a 1 l. k) Solución de ácido fosfórico, H 3 PO 4 1 + 9. l) Solución de ácido fosfórico-ácido sulfámico: Disuélvanse 20 g de NH 2 SO 3 H en 1 l de ácido fosfórico 1 + 9. m) Agua sin demanda de cloro: Prepárese a partir de agua de buena calidad destilada o desionizada por adición de cloro suficiente para suministrar 5 mg/l de cloro libre. Tras reposar 2 días esta solución debe contener al menos 2 mg/l de cloro libre; si no, deséchese y adquiérase un agua de mejor calidad. Elimínese el cloro libre restante colocando el recipiente a la luz solar o irradiando con una lámpara ultravioleta. Al cabo de varias horas, tómese una muestra, añádase KI y mídase el cloro total con un método colorimétrico, usando un tubo Nessler para aumentar la sensibilidad. No utilizar hasta haber eliminado las últimas trazas de cloro libre y combinado. El agua destilada suele contener amoníaco y también puede tener agentes reductores. Recójase agua destilada o desionizada de buena calidad en recipientes cerrados de los que se pueda extraer el agua por gravedad. A la entrada de aire del recipiente, póngase un sifón de H2SO4 consistente en un tubo de ensayo largo medio lleno de H2SO4 1 + 1, conectado en serie con un tubo de ensayo similar, pero vacío. Acóplense ambos tubos con tapones y tubos de entrada que terminen cerca del fondo de los tubos, y otros de salida con sus extremos próximos de la parte superior. Conéctese el

4-60

MÉTODOS NORMALIZADOS

tubo de salida del sifón que contiene H2SO4 con el recipiente del agua y el tubo de entrada con el de salida del tubo de ensayo vacío. El tubo de ensayo vacío impedirá la descarga de H2SO4 a la atmósfera debida a cambios de presión inducidos por la temperatura. Conservada en un recipiente de este tipo, el agua sin demanda de cloro permanecerá estable durante varias semanas a no ser que se produzca un crecimiento bacteriano. 4.

Procedimiento

a) Preparación para titulación: 1) Volumen de muestra: Para concentraciones de cloro de 10 mg/l o menos, valórense 200 ml. Para concentraciones de cloro mayores, utilícese una muestra proporcionalmente menor y dilúyase a 200 ml con agua sin demanda de cloro. Utilícese un tamaño de muestra tal que no se precisen más de 10 ml de solución de óxido de fenilarsina. 2) Preparación para titulación: Mídanse 5 ml de óxido de fenilarsina 0,005 64N o tiosulfato para concentraciones de cloro de 2 a 5 mg/l y 10 ml para concentraciones de 5 a 10 mg/l, en un matraz o cazuela para valoración con yodo o yodato. Comiéncese a agitar. Para titulación por amperometría o yodo patrón, añádase también un exceso de KI (aproximadamente 1 g) y 4 ml de solución tampón de acetato o lo suficiente para reducir el pH a 3,5-4,2. b) Titulación: Úsese una de las siguientes: 1) Titulación amperométrica: Añádase titulante de yodo 0,0282N en pequeños incrementos con una bureta o pipeta de 1 ml. Obsérvese la respuesta de la aguja al añadir el yodo: estará prácticamente estacionaria hasta que el punto final esté próximo, momento en que cada incremento de yodo producirá una desviación temporal del microamperímetro,

volviendo a su posición original. Deténgase la valoración en el punto final, cuando un pequeño incremento del yodo titulante produzca una clara desviación de la aguja hacia arriba de la escala y no recupere en seguida su posición original. Regístrese el volumen de yodo titulante utilizado para llegar al punto final. 2) Titulación colorimétrica (yodo): Añádase 1 ml de solución de almidón y valórese con yodo 0,0282N hasta que aparezca un color azul persistente tras mezclar totalmente. 3) Titulación colorimétrica (yodato): Añádanse a un matraz o recipiente adecuado 200 ml de agua sin demanda de cloro, y luego, con agitación, el volumen requerido de reductor, un exceso de KI (aproximadamente 0,5 g), 2 ml de solución de H3PO4 al 10 por 100 y 1 ml de solución de almidón en el orden citado. Titúlese inmediatamente* con solución de yodato 0,005 64N hasta aparición de color azul persistente tras mezclar completamente. Desígnese como A el volumen utilizado de solución de yodato. Repítase el procedimiento, sustituyendo los 200 ml de muestra por 200 ml de agua sin demanda de cloro. Si la muestra es coloreada o turbia, titúlese hasta el primer cambio de color, usando para comparar otra porción de muestra a la que se ha añadido H3PO4. Desígnese como B a este volumen de solución de yodato. 5.

Cálculos

a) Titulación con yodo patrón:

* La titulación puede retrasarse hasta 10 minutos sin error apreciable, si el H3PO4 no se añade hasta inmediatamente antes de la titulación.

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

4-61

donde:

donde: A = ml de reductor 0,005 64N, B = ml de I2 0.0282N, y C = ml de muestra.

A = ml de Na 2 S 2 O 3 , B = ml de yodato necesarios para titular Na2S2O3, y C = ml de muestra.

b) Titulación con yodato patrón: 6. Bibliografía Véase B.7.

4500-CI D.

Método amperométrico de titulación

1. Discusión general

La titulación amperométrica requiere mayor grado de habilidad y cuidado que los métodos colorimétricos. El cloro residual por encima de 2 mg/l se mide mejor por medio de muestras más pequeñas o diluyendo con agua que no tenga cloro residual ni demanda de cloro. El método se puede utilizar para determinar el cloro total y es capaz de diferenciar entre cloro libre y combinado. Controlando la concentración de KI y el pH es posible diferenciar también las fracciones de monoy dicloroamina. a) Principio: El método amperométrico es una adaptación especial del principio polarográfico. El cloro libre se titula a pH entre 6,5 y 7,5, rango en el que el cloro combinado reacciona lentamente. A su vez, éste se titula en presencia de la cantidad adecuada de KI, en el rango de pH entre 3,5 y 4,5. Cuando se determina el cloro libre, el pH no debe exceder de 7,5, ya que la reacción se hace lenta a valores más altos del pH, ni por debajo de 6,5, porque parte del cloro combinado puede reaccionar incluso en ausencia de yoduro. Cuando se determina cloro libre, el pH no debe ser inferior a 3,5, ya que aumentan las interferencias con valores de pH más bajos, ni superior a 4,5, porque la reacción de yoduro no es cuantitativa a valores más elevados. La tendencia

de la monocloramina para reaccionar con el yoduro más fácilmente que la dicloramina proporciona un medio más de diferenciación. La adición de una pequeña cantidad de KI en el rango de pH neutro hace posible la estimación del contenido de monocloramina. Reduciendo el pH hacia el rango ácido y aumentando la concentración de KI se puede determinar la dicloramina de forma separada. Las cloraminas orgánicas se pueden medir como cloro libre, monocloramina o dicloramina, en función de la actividad del cloro en el compuesto orgánico. El óxido de fenilarsina es estable incluso en solución diluida y cada mol reacciona con dos equivalentes de halógeno. Se utiliza una célula amperométrica para detectar el punto final de la titulación de cloro residual-óxido de fenilarsina. La célula consta de un electrodo de referencia no polarizable, que se sumerge en una solución salina y un electrodo de metal noble fácilmente polarizable, que está en contacto con la solución salina y la muestra que se está valorando. En algunas aplicaciones, se mejora la selectividad del punto final por adición de + 200 mV al electrodo de platino frente a plata, cloruro de plata. Otro sistema para detectar el punto final utiliza electrodos dobles de platino, una célula de mercurio con divisor de voltaje para estable-

4-62

cer un potencial entre los electrodos y un microamperímetro. Si no existe cloro residual en la muestra, la lectura del microamperímetro será comparativamente baja debido a la polarización celular. Cuanto mayor sea el residuo, mayor será la lectura del microamperímetro. El aparato de medida actúa simplemente como indicador del punto cero, es decir, lo importante no es la lectura real, sino las lecturas relativas al avanzar la titulación. La adición gradual de óxido de fenilarsina hace que la célula se polarice cada vez más debido a la disminución de cloro. El punto final se reconoce cuando no se consigue un descenso en la lectura al añadir más óxido de fenilarsina. b) Interferencia: No se pueden hacer determinaciones exactas de cloro libre en presencia de tricloruro de nitrógeno, NCl3, o dióxido de cloro, que se titulan en parte como cloro libre. Cuando se encuentre presente NCl3, se puede determinar en parte como cloro libre y parte como cloramina, dando un error positivo en ambas fracciones con una tasa aproximada de 0,1 por 100/minuto. Algunas cloraminas orgánicas pueden también ser tituladas en cada paso. Es posible que la monocloramina interfiera en la fracción de cloro libre y la dicloramina en la de monocloramina, especialmente a temperaturas altas y con tiempos de titulación prolongados. Otros halógenos libres, aparte del cloro, se pueden titular como cloro libre. El cloro combinado reacciona con los iones yoduro para producir yodo. Cuando la titulación del cloro libre siga a la del combinado, que requiere adición de KI, se pueden obtener resultados erróneos si no se lava bien la célula de medida con agua destilada, entre titulaciones. Se ha observado una interferencia del cobre en muestras obtenidas de tuberías de cobre o tras un tratamiento intensivo de los depósitos con sulfato de cobre, y el cobre metálico se deposita en el electrodo. Los iones de plata también contami-

MÉTODOS NORMALIZADOS

nan el electrodo. Se producen interferencias en algunas aguas muy coloreadas y en las que contienen agentes tensoactivos. Las temperaturas muy bajas producen una respuesta más lenta en la célula de medida y se necesita más tiempo de titulación, pero la precisión no se ve afectada. Los valores de pH por encima de 7,5 causan una reducción de la tasa de reacción, que se supera tamponando todas las muestras a pH 7 o menos. Por otra parte, algunas sustancias, como el manganeso, nitrito y hierro, no interfieren. La agitación violenta de algunos tituladores comerciales puede reducir los valores de cloro por volatilización. Cuando se usa la dilución para muestras con alto contenido en cloro, procúrese que el agua de dilución esté exenta de cloro y amoníaco y no tenga demanda de cloro. Véase en A.3 la descripción de otras interferencias.

2.

Instrumental

a) Aparato para detección del punto final, que consta de una unidad celular conectada a un microamperímetro, con los accesorios eléctricos necesarios. La unidad celular incluye un electrodo de metal noble con suficiente superficie, un puente de sal para conseguir la conexión eléctrica sin difusión del electrolito y un electrodo de referencia de plata-cloruro de plata en una solución saturada de cloruro sódico, conectado al circuito por medio del puente de sal. Existen numerosos sistemas comerciales. Manténgase el electrodo de platino libre de depósitos y materia extraña. Generalmente, no es necesaria una limpieza química enérgica y basta con una mecánica ocasional, con un abrasivo adecuado. Manténgase el puente de sal en buenas condiciones operativas; no permitir su obstrucción o un flujo apreciable del electrolito a través de él. Manténgase li-

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

bre de contaminación a la solución que rodea al electrodo de referencia, y procúrese que su composición sea constante, asegurando el suministro adecuado de sal sin disolver en todo momento. También se puede utilizar una célula con dos electrodos metálicos polarizados por un pequeño potencial de CC. (Véase Bibliografía.) b) Agitador, diseñado para conseguir una agitación adecuada en la superficie del electrodo de metal noble y asegurar la sensibilidad correcta. Límpiese bien el agitador y el sistema expuesto del electrodo para eliminar todos los contaminantes consumidores de cloro, por inmersión en agua con 1 a 2 mg/l de cloro libre durante unos minutos. Añádase KI al mismo agua y déjese el agitador y los electrodos sumergidos durante 5 minutos. Tras aclarar bien con agua sin demanda de cloro o la muestra a analizar, los electrodos y el agitador sensibilizados están listos para su uso. Elimínese totalmente el reactivo de yoduro de la célula. c) Bureta: Los tituladores comerciales suelen llevar buretas adecuadas (1 ml). Existen buretas manuales*. d) Material de vidrio, expuesto a agua que contenga, como mínimo, 10 mg/l de cloro durante 3 horas o más, antes de usarlo, y aclarado con agua sin demanda de cloro. 3.

Reactivos

a) Titulante de óxido de fenilarsina: Véase C.3a. b) Solución tampón de fosfato, pH 7: Disuélvanse 25,4 g de KH2PO4 anhidro y 34,1 g de Na2HPO4 anhidro en 800 ml de agua destilada. Añádanse 2 ml de solución de hipoclorito sódico que contenga 1 por 100 de cloro y mézclese bien. Protégase de la luz solar durante 2 días. * Kimax 17U0-F, 5 ml, Kimble Products, Box 1035, Toledo, Ohio, o equivalente.

4-63

Determínese que queda cloro libre en la solución y expóngase a la luz solar hasta que no quede nada. Si fuera necesario, realícese la decloración total con una lámpara ultravioleta. Determínese que no queda cloro total por adición de KI y midiendo con uno de los métodos colorimétricos. Dilúyase a 1 l con agua destilada y fíltrese si hubiera algún precipitado. c) Solución de yoduro potásico: Disuélvanse 50 g de KI y dilúyase a 1 l con agua destilada recién hervida y enfriada. Consérvese en la oscuridad en un frasco topacio con tapón de vidrio, preferiblemente en frigorífico. Deséchese la solución cuando se ponga amarilla. d) Solución tampón de acetato, pH 4: Véase C3e.

4.

Procedimiento

a) Volumen de muestra: Selecciónese un volumen de muestra que no precise más de 2 ml de óxido de fenilarsina titulante. Así, para concentraciones de cloro de 2 mg/l o menos, tómese una muestra de 200 ml; para niveles de cloro por encima de 2 mg/l, úsense 100 ml o una proporción menor. b) Cloro libre: A no ser que se sepa que el pH de la muestra está comprendido entre 6,5 y 7,5, añádase 1 ml de solución tampón de fosfato de pH 7 para obtener un pH entre 6,5 y 7,5. Titúlese con óxido de fenilarsina patrón, observando los cambios reales del microamperímetro. Añádase titulante en cantidades progresivamente menores, hasta que cese el movimiento de la aguja. Realícense lecturas sucesivas de la bureta cuando la aguja actúe lentamente, indicando que se acerca el punto final. Réstese el último incremento real que no produce respuesta en la aguja, debido a sobretitulación. Alternativamente, úsese un sistema que incluya medidas reales continuadas y determínese el punto final matemáticamente.

4-64

Continúese la valoración del cloro combinado como se describe en el apartado 4c, a continuación, o las fracciones monocloramina y dicloramina como se detalla en los apartados 4e y 4f. c) Cloro combinado: A la muestra que queda después de titular el cloro libre, añádanse 1,00 ml de solución de KI y 1 ml de solución tampón de acetato, en ese orden. Titúlese con óxido de fenilarsina hasta el punto final, como anteriormente. No rellenar la bureta, sino simplemente seguir valorando tras registrar la cifra de cloro libre. Réstese de nuevo el último incremento para obtener la cantidad real del titulante utilizado realmente en la reacción con el cloro. (Si la titulación se continuó sin rellenar la bureta, esta cifra representa el cloro total. Restando el cloro libre del total, se obtiene el combinado.) Lávese el aparato y la cubeta de la muestra para eliminar el ion yoduro y evitar errores al utilizar el titulador posteriormente para determinación de cloro libre. d) Muestras separadas: Si se desea, se puede determinar el cloro total y el libre en muestras separadas. Si el pH de la muestra se halla entre 3,5 y 9,5 y sólo se precisa el cloro total, trátese la muestra inmediatamente con 1 l de solución de KI, seguido de 1 ml de solución tampón de acetato, y titúlese con óxido de fenilarsina como se describe en el apartado 4c precedente. e) Monocloramina: Tras valorar el cloro libre, añádanse 0,2 ml de solución de KI a la misma muestra y, sin rellenar la bureta, continúese la titulación con óxido de fenilarsina titulante hasta el punto final. Sustráigase el último incremento para obtener el volumen neto de titulante consumido por la monocloramina.

MÉTODOS NORMALIZADOS

f) Dicloramina: Añádase 1 ml de solución tampón de acetato y 1 ml de solución de KI a la misma muestra y titúlese la fracción final de dicloramina como se ha descrito antes. 5.

Cálculos

Transformar las titulaciones individuales de cloro libre, cloro combinado, cloro total, monocloramina y dicloramina, con la ecuación siguiente:

donde: A = ml de óxido de fenilarsina en la titulación.

6.

Precisión y sesgo

Véase B.5. 7.

Bibliografía

FOULK, C. W. & A. T. BAWDEN. 1926. A new type of endpoint in electrometric titration and its application to iodimetry. J. Amer. Chem. Soc. 48:2045. MARKS, H. C. & J. R. GLASS. 1942. A new method of determining residual chlorine. J. Amer. Water Works Assoc. 34:1227. HALLER, J. F. & S. S. LISTEK. 1948. Determination of chloride dioxide and other active chlorine compounds in water. Anal. Chem. 20:639. MAHAN, W. A. 1949. Simplified amperometric titration apparatus for determining residual chlorine in water. Water Sewage Works 96:171. KOLTHOFF, I. M. & J. J. LINGANE. 1952. Polarography, 2.a ed. Interscience Publishers, Nueva York. MORROW, J. J. 1966. Residual chlorine determination with dual polarizable electrodes. J. Amer. Water Works Assoc. 58:363.

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

4500-CI E. 1.

Método amperométrico de titulación de bajo nivel

Discusión general

La detección y la cuantificación del cloro residual inferior a 0,2 mg/l requieren modificaciones especiales del método amperométrico de titulación. Con esas modificaciones se pueden medir concentraciones de cloro del orden de 10 µg/l. No es posible diferenciar entre las formas de cloro libre y combinado. Los agentes oxidantes que interfieren con el método amperométrico de titulación (D) interferirán también en éste. a) Principio: Este método modifica D, utilizando un titulante más diluido y un procedimiento gráfico para determinar el punto final. b) Interferencia: Véase D.lb. 2. Instrumental Véase D.2. 3.

4-65

Reactivos

a) Biyodato de potasio, 0,002 256N: Disuélvanse 0,7332 g de biyodato de potasio anhidro, KH(IO3)2, en 500 ml de agua destilada libre de cloro y dilúyase a 1.000 ml. Dilúyanse 10,00 ml a 100,0 ml con agua destilada libre de cloro. Utilícese solamente solución recién preparada para estandarizar el óxido de fenilarsina. b) Yoduro de potasio, cristales de KI. c) Titulante de óxido de fenilarsina de baja concentración, 0,000 564N: Dilúyanse 10,00 ml de óxido de fenilarsina 0,005 64N (véase C3a) a 100,0 ml con agua sin demanda de cloro (véase C.3m). Estandarización: Dilúyanse 5,00 ml de biyodato potásico 0,002 256N a 200 ml con agua libre de cloro. Añádanse aproximadamente 1,5 g de KI y agítese para disolver. Añádase 1 ml de tampón de

acetato y déjese reposar en la oscuridad durante 6 minutos. Valórese con el titulador amperométrico y determínese el punto de equivalencia como se indica a continuación: Normalidad = 0,000 564 x 2,00/A

donde A = ml de óxido de fenilarsina titulante requerido para llegar al punto de equivalencia del biyodato patrón. d) Solución tampón de acetato, pH 4: Véase C3e. 4.

Procedimiento

Selecciónese un volumen de muestra que no requiera más de 2 ml de óxido de fenilarsina titulante. Una muestra de 200 ml será adecuada para muestras que contengan menos de 0,2 mg de cloro total/l. Antes de empezar la titulación, lávese varias veces la bureta con titulante. Lávese el recipiente de la muestra con agua destilada y luego con la muestra. Añádanse 200 ml de muestra al recipiente de ésta, 1,5 g de KI. Disuélvase utilizando un agitador o mezcladora. Añádase 1 ml de tampón de acetato y colóquese el recipiente en el aparato para detección del punto final. Regístrese la lectura cuando se estabilice la señal de corriente. Ajústese inicialmente el medidor a una desviación de la escala casi total. Titúlese por adición de volúmenes pequeños y conocidos del titulante. Tras cada adición, regístrese el volumen acumulado añadido, y el actual cuando se estabilice la señal. Si el indicador queda cerca o por debajo del 10 por 100 de desviación total de la escala, regístrese la lectura inferior, reajústese la aguja a casi desviación de plena escala y regístrese la diferencia entre la cantidad inferior y la desviación alta reajustada. Añádase este valor a todas las lecturas de desviación para las siguientes

4-66

MÉTODOS NORMALIZADOS

adiciones de titulante. Manténgase la adición de éste hasta que no haya más desviación de la aguja. Si se hicieron menos de tres adiciones de titulante antes de que cesara la desviación, deséchese la muestra y repítase el análisis utilizando incrementos menores del titulante. Determínese el punto de equivalencia comparando la desviación total de la aguja con el volumen de titulante añadido. Trácese una línea recta que una los primeros puntos de la gráfica, y una segunda horizontal correspondiente a la desviación total final de la aguja. Léase el punto de equivalencia, como el volumen de titulante añadido en la intersección de las dos líneas.

4500-CI F. 1.

5. Cálculos

donde: A = ml de titulante en el punto de equivalencia, B = volumen de muestra, ml, y N = normalidad del óxido de fenilarsina.

6.

Bibliografía

BROOKS, A. S. & G. L. SEEGERT. 1979. Low-level chlorine analysis by amperometric titration. J. Water Pollut. Control Fed. 51:2636.

Método titulométrico de la DFD ferrosa

Discusión general

a) Principio: Como indicador del método titulométrico con sulfato de amonio ferroso (FAS), se utiliza N,N-dietil-pfenilendiamina (DFD). Cuando no se precise una diferenciación completa del cloro, se puede simplificar el método para obtener sólo el cloro libre y combinado o el cloro total. En ausencia de ion yoduro, el cloro libre reacciona instantáneamente con indicador DFD para producir un color rojo. La adición posterior de una pequeña cantidad de ion yoduro actúa catalíticamente provocando la aparición del color debido a la monocloramina. La adición de ion yoduro en exceso induce una respuesta rápida de la dicloramina. En presencia de ion yoduro, parte del tricloruro de nitrógeno (NCl3) se incluye con la dicloramina y parte con el cloro libre. Un método complementario basado en la adición de ion yoduro antes de DFD, permite estimar la proporción de NCl que aparece con el cloro libre. El dióxido de cloro (ClO2) aparece con

cloro libre, en la proporción de hasta una quinta parte de su contenido total de cloro. Se puede obtener una respuesta total del ClO2, correspondiente a su contenido total de cloro, si la muestra se acidifica primero en presencia de ion yoduro y posteriormente se vuelve a llevar a un pH aproximadamente neutro por adición de ion bicarbonato. Bromo, bromamina y yodo reaccionan con el indicador DFD y aparecen con el cloro libre. La adición de glicina antes de determinar el cloro libre transforma el cloro libre en formas no reactivas, y sólo quedan residuos de bromo y yodo. Restando estos residuos del determinado sin glicina, se puede diferenciar el cloro libre del bromo y yodo. b) Control del pH: Es esencial un control cuidadoso del pH para obtener resultados exactos. Al pH adecuado de 6,2 a 6,5, los colores rojos producidos se pueden titular a puntos finales incoloros afinados. Titúlese en cuanto se forme el color rojo en cada paso. Un pH demasiado bajo en el primer paso tiende a hacer que la monocloramina aparezca en el

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

paso de cloro libre, y la dicloramina en el paso de monocloramina. Un pH demasiado alto hace que el oxígeno disuelto aporte color. c) Control de temperatura: En todos los métodos de diferenciación del cloro libre y las cloraminas, las temperaturas más elevadas aumentan la tendencia de las cloraminas a reaccionar y llevan a incrementos en los resultados de cloro libre aparente. También es mayor la desaparición del color con las temperaturas más altas. Complétense las determinaciones rápidamente, en especial a temperaturas elevadas. d) Interferencia: La sustancia interferente más importante que se encontrará probablemente en el agua es el manganeso oxidado. Para corregir esta presencia, pónganse 5 ml de solución tampón y 0,5 ml de solución de arsenito de sodio en el matraz de titulación. Añádanse 100 ml de muestra y mézclese. Añádanse 5 ml de solución indicadora de DFD, mézclese y titúlese con titulante FAS estándar hasta que desaparezca el color rojo. Réstese la lectura de la lectura A obtenida por el procedimiento normal como se describe en el apartado 3a1) de este método, o de la lectura del cloro total obtenida en el método simplificado que se da en el apartado 3a4). Si se utiliza el reactivo combinado en forma de polvo (véase más adelante), añádanse primero a la muestra KI y arsenito y mézclese, y luego reactivo combinado tampón-indicador. Como alternativa al arsenito sódico, utilícese una solución de tioacetamida al 0,25 por 100, añadiendo 0,5 ml a 100 ml de muestra. La interferencia del cobre hasta aproximadamente 10 mg Cu/l se supera incorporando EDTA a los reactivos. EDTA favorece la estabilidad de la solución indicadora DFD al retrasar el deterioro debido a la oxidación y, en la propia prueba, consigue suprimir los errores del oxígeno disuelto al impedir la catálisis de las trazas metálicas.

4-67

El cromato en exceso de 2 mg/l interfiere con la determinación del punto final. Añádase cloruro de bario para enmascarar esta interferencia por precipitación. Las concentraciones elevadas del cloro libre pueden introducirse en la fracción de cloro libre. Si se va determinar el cloro libre en presencia de más de 0,5 mg/l de cloro combinado, utilícese la modificación de tioacetamida. Si no se utilizara esta modificación, el tiempo necesario para desarrollo del color por encima de 1 minuto dará lugar a una interferencia progresivamente creciente de la monocloramina. La adición de tioacetamida (0,5 ml de solución al 0,25 por 100 a 100 ml) inmediatamente después de mezclar el reactivo DFD con la muestra detiene totalmente la reacción posterior con el cloro combinado en la determinación del cloro libre. Prolónguese inmediatamente la titulación FAS para obtener el cloro libre. El cloro total se obtiene con el procedimiento normal, es decir, sin tioacetamida. Dado que se utilizan concentraciones elevadas de yoduro para medir el cloro combinado, y las trazas de yoduro son suficientes para aumentar notablemente la interferencia de cloramina en la determinación del cloro libre, hay que procurar evitar la contaminación de yoduro, con lavados entre las muestras o utilizando material de vidrio diferente. Véase en A.3 la exposición de otras interferencias. e) Concentraciones detectables mínimas: Aproximadamente 18 µg de Cl como Cl2/l. Este límite de detección se consigue en condiciones ideales; los límites de detección en el trabajo normal son mayores. 2.

Reactivos

a) Solución tampón de fosfato: Disuélvanse 24 g de Na2HPO4 anhidro y

4-68

46 g de KH2PO4 anhidro en agua destilada. Combínense con 100 ml de agua destilada en la que se han disuelto 800 mg de disodio etilendiamina tetracetato dihidrato (EDTA). Dilúyase a 1 l con agua destilada y añádanse 20 mg de HgCl2 para impedir el crecimiento de mohos y la interferencia en la prueba del cloro libre debida a trazas de yoduro en los reactivos. (PRECAUCIÓN: HgCl2 es tóxico; tener cuidado de evitar su ingestión). b) Solución indicadora de N,N-dietilp-fenilendiamina (DFD): Disuélvase 1 g de oxalato de DFD*, o 1,5 g de sulfato de DFD pentahidrato†, o 1,1 g de sulfato de DFD anhidro en agua destilada exenta de cloro que contenga 8 ml de H2SO4 1 + 3, y 200 mg de EDTA disódico. Complétese a 1 l, consérvese en un frasco topacio con tapón de vidrio en la oscuridad y deséchese cuando se decolore. Compruébese periódicamente la solución por absorbancia y deséchese cuando la absorbancia a 515 nm exceda de 0,002/cm. (El tampón y sulfato indicador se encuentran en el comercio como reactivo combinado en forma de polvo estable.) (PRECAUCIÓN: El oxalato es tóxico; procúrese evitar su ingestión. c) Titulante de sulfato amónico ferroso patrón (FAS): Disuélvanse 1,106 g de Fe(NH4)2(SO4)2 · 6H2O en agua destilada conteniendo 1 ml de H2SO4 1 + 3, y complétese a 1 l con agua destilada recién hervida y enfriada. Este patrón se puede utilizar durante 1 mes, y se comprobará el título con dicromato potásico. Para ello, añádanse 10 ml de H2SO4 1 + + 5, 5 ml de H3PO4 y 2 ml de indicador difenilamina sulfonato de bario al 0,1 por 100 a una muestra de 100 ml de FAS, y titúlese con dicromato de potasio patrón primario 0,100N hasta punto final violeta que persiste durante 30 segundos. El * Producto químico Eastman n.° 7102 o equivalente. † Suministrado por Gallard-Schlesinger Chemical Mfg. Corp., 584 Mineola Avenue, Carie Place, Nueva York 11514, o equivalente.

MÉTODOS NORMALIZADOS

FAS titulante equivale a 100 µg de Cl como Cl2/l,00 ml. d) Yoduro potásico, KI, cristales. e) Solución de yoduro potásico: Disuélvanse 500 mg de KI y dilúyase a 100 ml, utilizando agua destilada recién hervida y fría. Consérvese en un frasco topacio con tapón de vidrio, preferiblemente en frigorífico. Deséchese la solución cuando amarillee. f) Solución de dicromato potásico: Véase B.2c2).

g) Difenilaminsulfonato de bario, 0,1 por 100: Disuélvanse 0,1 g de (C6H5NHC6H4-4-SO3)2 Ba en 100 ml de agua destilada. h) Solución de arsenito de sodio: Disuélvanse 5,0 g de NaAsO2 en agua destilada y dilúyase a 1 l. (PRECAUCIÓN: Tóxico; procúrese evitar su ingestión.) i) Solución de tioacetamida: Disuélvanse 250 mg de CH3CSNH2 en 100 ml de agua destilada. (PRECAUCIÓN: Presunto agente cancerígeno. Procúrese evitar el contacto con la piel y la ingestión.) j) Agua sin demanda de cloro: Véase C.3m. k) Solución de glicina: Disuélvanse 20 g de glicina (ácido aminoacético) en agua sin demanda de cloro suficiente para obtener un volumen total de 100 ml. Consérvese refrigerado y deséchese si aparece turbidez. l) Cristales de cloruro de bario, BaCl2 · 2H2O. 3.

Procedimiento

Las cantidades que se dan a continuación son adecuadas para concentraciones totales de cloro de hasta 5 mg/l. Si el cloro total excede de 5 mg/l, úsese una muestra menor y dilúyase a un volumen total de 100 ml. Mézclense los volúmenes usuales de reactivo tampón y solución indicadora DFD, o la cantidad usual de DFD en polvo, con agua destilada antes de añadir la muestra suficiente para ob-

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

tener un volumen total de 100 ml. (Si la muestra se añade antes que el tampón, no funciona la prueba.) Si existe dicromato presente (> 2 mg/l) añádanse y mézclense 0,2 g de BaCl2 · 2H2O/l00 ml de muestra antes de añadir otros reactivos. Si, además, el sulfato es > 500 mg/l, úsense 0,4 g de BaCl2 · 2H2O/l00 ml de muestra. a) Cloro libre o cloramina: Pónganse 5 ml de reactivo tampón y 5 ml de solución indicadora DFD en un matraz y mézclese (o utilícense unos 500 mg de polvo DFD). Añádanse 100 ml de muestra, o muestra diluida, y mézclese. 1) Cloro libre: Titúlese rápidamente con FAS estándar hasta desaparición del color rojo (lectura A). 2) Monocloramina: Añádase un cristal muy pequeño de KI (unos 0,5 mg) o 0,1 ml (2 gotas) de solución de KI y mézclese. Manténgase la titulación hasta nueva desaparición del color rojo (lectura B). 3) Dicloramina: Añádanse varios cristales de KI (alrededor de 1 g) y mézclese para disolver. Déjese en reposo durante 2 minutos y continúese la valoración hasta desaparición del color rojo (lectura C). Para concentraciones de dicloramina superiores a 1 mg/l, déjese reposar 2 minutos más si el retroceso del color indica que la reacción no es totalmente completa. Cuando no se esperan concentraciones altas de dicloramina, úsese la mitad de la cantidad especificada de KI. 4) Método simplificado para cloro libre y combinado o cloro total. Omítase 2) anterior para obtener la monocloramina y dicloramina juntas como cloro combinado. Para obtener el cloro total en una lectura, añádase todo el KI al comienzo, con las cantidades establecidas para reactivo tampón e indicador DFD, y valórese tras 2 minutos de reposo. b) Tricloruro de nitrógeno: Póngase un cristal muy pequeño de KI (unos

4-69

0,5 mg) o 0,1 ml de solución de KI en un matraz de valoración. Añádanse 100 ml de muestra y mézclese. Añádase el contenido a un segundo matraz que contenga 5 ml de reactivo tampón y 5 ml de solución indicadora DFD (o añádanse unos 500 mg de polvo DFD directamente al primer matraz). Titúlese rápidamente con FAS estándar hasta desaparición del color rojo (lectura N). c) Cloro libre en presencia de bromo o yodo: Determínese el cloro libre como en el apartado 3a1). Añádase a una segunda muestra de 100 ml, 1 ml de solución de glicina, antes de la adición de DFD y tampón. Titúlese como en el apartado 3a1). Réstese la segunda lectura de la primera para obtener la lectura A. 4. Cálculo Para una muestra de 100 ml, 1,00 ml de FAS patrón titulante = 1,00 mg de Cl como Cl2/l.

En el caso de se encuentre cloramina presente con NCl3, se incluirá en N, en cuyo caso se obtendrá NCl3 a partir de 2(N – B). Si se detectara dióxido de cloro, se incluirá en A hasta una quinta parte de su contenido total del cloro. En el procedimiento simplificado para cloro libre y combinado, sólo se precisan A (cloro libre) y C (cloro total). Obtener el cloro combinado a partir de C – A. El resultado obtenido en el método simplificado para cloro total corresponde a C.

MÉTODOS NORMALIZADOS

4-70

5.

Precisión y sesgo

Véase B.5.

6.

Bibliografía

PALIN, A. T. 1957. The determination of free and combined chlorine in water by the use of diethyl-p-phenylene diamine. J. Amer. Water Works Assoc. 49:873. PALIN, A. T. 1960. Colorimetric determination of chlorine dioxide in water. Water Sewage Works 107:457. PALIN, A. T. 1961. The determination of free residual bromine in water. Water Sewage Works 108:461.

4500-CI G. 1.

Método colorimétrico de la DFD

Discusión general

a) Principio: Se trata de una versión colorimétrica del método DFD y está basado en los mismos principios. En lugar de valorar con solución de sulfato amónico ferroso patrón (FAS) como en el método titulométrico, se utiliza un procedimiento colorimétrico. b) Interferencia: Véase A.3 y F.1d. Compénsese el color y la turbidez por ajuste del fotómetro a cero con la muestra. Redúzcase al mínimo la interferencia de cromato corrigiendo con blanco de tioacetamida. c) Concentración mínima detectable: Aproximadamente 10 µg de Cl como Cl2/l. Este límite de detección se consigue en condiciones ideales; los límites de detección en el trabajo normal son más altos. 2.

NICOLSON, N. J. 1963, 1965, 1966. Determination of chlorine in water, partes 1, 2 y 3. Water Res. Assoc. Tech. Pap. Nos. 29, 47 y 53. PALIN, A. T. 1967. Methods for determination, in water, of free and combined available chlorine, chlorine dioxide and chlorite, bromine, iodine, and ozone using diethyl-p-phenylenediamine (DPD). J. Inst. Water Eng. 21:537. PALIN, A. T. 1968. Determination of nitrogen trichloride in water. J. Amer. Water Works Assoc. 60:847. PALIN, A. T. 1975. Current DPD methods for residual halogen compounds and ozone in water. J. Amer. Water Works Assoc. 67:32. Methods for the Examination of Waters and Associated Materials. Chemical Disinfecting Agents in Water and Effluents, and Chlorine Demand. 1980. Her Majesty's Stationery Off., Londres, Inglaterra.

Instrumental

a) Equipo fotométrico: Se precisa uno de los siguientes:

1) Espectrofotómetro para uso a longitud de onda de 515 nm, con un recorrido de luz de 1 cm o más. 2) Fotómetro de filtro provisto de un filtro cuya transmisión máxima se encuentra en el rango de longitudes de onda de 490 a 530 nm y con un recorrido de luz de 1 cm o más. b) Material de vidrio: Para evitar la contaminación por yoduro en la determinación del cloro libre, utilícese material de vidrio separado, incluidas las cubetas del espectrofotómetro, para las determinaciones libre y combinada (dicloramina). 3.

Reactivos Véase F.2a, b, c, d, e, h, i y j.

4.

Procedimiento

a) Calibrado del equipo fotométrico: Calíbrese el aparato con soluciones de cloro o permanganato potásico.

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

1) Soluciones de cloro: Prepárense patrones de cloro del orden de 0,05 hasta 4 mg/l a partir de unos 100 mg/l de agua de cloro estandarizada del modo siguiente: Pónganse 2 ml de ácido acético y 10 a 25 ml de agua sin demanda de cloro en un matraz. Añádase alrededor de 1 g de KI. Mídase en el matraz un volumen adecuado de solución de cloro. Al elegir ese volumen, téngase en cuenta que 1 ml de Na2S2O3 0,025N (véase B.2d) equivale a unos 0,9 mg de cloro. Titúlese con Na2S2O3 0,025N hasta casi desaparición del color amarillo del yodo. Añádanse de 1 a 2 ml de solución indicadora de almidón y manténgase la valoración hasta desaparición del color azul. Determínese el blanco por adición de cantidades idénticas de ácido, KI, y almidón indicador hasta un volumen de agua sin demanda de cloro correspondiente a la muestra utilizada para valoración. Realícese la titulación del blanco A o B, según corresponda, de acuerdo con B.3d

donde: N = normalidad de Na 2 S 2 O 3 , A = ml de titulante por muestra, B = ml de titulante para el blanco (se suman o restan según la titulación del blanco requerida. Véase B.3d).

Utilícese agua sin demanda de cloro y material de vidrio para preparar los patrones. Desarróllese el color, poniendo primero 5 ml de solución tampón de fosfato y 5 ml de reactivo indicador DFD en el matraz, y añadiendo entonces 100 ml de patrón de cloro, con agitación completa, como se describe en b y c más adelante. Llénese la cubeta del fotómetro o colorímetro a partir del matraz y léase el color a 515 nm. Devuélvase el contenido al matraz y titúlese con FAS patrón, como comprobación de la concentración de cloro.

4-71

2) Soluciones de permanganato potásico: Prepárese una solución madre que contenga 891 mg de KMnO4/l.000 ml. Dilúyanse 10,00 ml de esta solución a 100 ml con agua destilada en un matraz aforado. Al diluir 1 ml de esta solución a 100 ml con agua destilada, se producirá un equivalente de cloro de 1,00 mg/l en la reacción de DFD. Prepárese una serie de patrones de KMnO4 que comprendan el rango equivalente de cloro desde 0,05 a 4 mg/l. Desarróllese el color, poniendo primero 5 ml de tampón de fosfato y 5 ml de reactivo indicador DFD en un matraz y añadiendo 100 ml de patrón, mezclando completamente, tal como se describe en b y c más adelante. Llénese la cubeta del fotómetro o colorímetro a partir del matraz y léase el color a 515 nm. Devuélvase el contenido de la cubeta al matraz y titúlese con FAS como comprobación de cualquier absorción de permanganato por el agua destilada. Obténganse todas las lecturas por comparación con patrones de color o la curva patrón, antes de usarlas en los cálculos. b) Volumen de muestra: Utilícese un volumen de muestra apropiado para el fotómetro o colorímetro. El siguiente procedimiento se basa en la utilización de volúmenes de 10 ml; ajústense las cantidades de reactivo proporcionadamente para otros volúmenes de muestra. Dilúyase la muestra con agua sin demanda de cloro, cuando el cloro total supere los 4 mg/l. c) Cloro libre: Pónganse 0,5 ml de reactivo tampón y 0,5 ml de indicador DFD en un tubo de ensayo o cubeta del fotómetro. Añádanse 10 ml de muestra y mézclese. Léase el color inmediatamente (lectura A). d) Monocloramina: Manténgase la adición de un cristal muy pequeño de KI (alrededor de 0,1 mg) y mézclese. Si se espera una concentración alta de cloramina, en lugar de un cristal pequeño, añádanse 0,1 ml (2 gotas) de solución de

4-72

MÉTODOS NORMALIZADOS

KI recién preparada (0,1 g/l00 ml). Léase el color inmediatamente (lectura B). e) Dicloramina: Manténgase la adición de varios cristales de KI (alrededor de 0,1 g) y mézclese para disolver. Déjese reposar unos 2 minutos y léase el color (lectura C). f ) Tricloruro de nitrógeno: Póngase un cristal muy pequeño de KI (alrededor de 0,1 mg) en un tubo de ensayo o cubeta de fotómetro limpios. Añádanse 10 ml de muestra y mézclese. Añádanse sobre un segundo tubo o cubeta 0,5 ml de reactivo tampón y 0,5 ml de indicador; mézclese. Añádase el contenido al primer tubo o cubeta y mézclese. Léase el color inmediatamente (lectura N). g) Corrección del cromato mediante tioacetamida: Añádanse 0,5 ml de solución de tioacetamida (F.2i) a 100 ml de muestra. Después de mezclar, añádanse tampón y reactivo DFD. Léase el color inmediatamente. Añádanse varios cristales de KI (alrededor de 0,1 g) y mézclese para disolver. Déjese reposar unos 2 minutos y léase el color. Réstese la primera

4500-CI H. 1.

lectura de la lectura A, y la segunda de la lectura C, y utilícese en los cálculos.

En el caso de que se encuentre monocloramina presente con NCl3, se incluirá en la lectura N, en cuyo caso NCl3 se obtendrá a partir de 2(N – B). 6.

Bibliografía

Véase F.6.

Método de la siringaldacina (PCLD)

Discusión general

a) Principio: La prueba del cloro libre (disponible) con siringaldacina (PCLD) mide el cloro libre dentro del rango de 0,1 a 10 mg/l. Se utiliza una solución saturada de siringaldacina (3,5dimetoxi-4-hidroxibenzaldacina) en 2propanol. La siringaldacina es oxidada por el cloro libre sobre una base molar 1:1, para dar un producto coloreado con un máximo de absorción a 530 nm. Este producto es sólo ligeramente soluble en agua, por lo que, a concentraciones de cloro superiores a 1 mg/l, la mezcla reaccionante final debe contener 2-propanol para impedir la precipitación del producto y desaparición del color.

El color y solubilidad óptimos (decoloración mínima) se obtienen en una solución con un pH entre 6,5 y 6,8. A pH inferior a 6, el desarrollo del color es lento y la reproducibilidad mala. A pH superior a 7, el color se desarrolla y desaparece con rapidez. Para mantener el pH de la mezcla reaccionante a 6,7 aproximadamente, se requiere un tampón. Tener cuidado con las aguas con gran acidez o alcalinidad, para asegurar que el tampón añadido mantiene el pH adecuado. La temperatura tiene un efecto mínimo sobre la reacción coloreada. El error máximo observado a temperaturas extremas de 5 y 35 °C es ±10 por 100. b) Interferencias: Las interferencias

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

comunes a otros métodos de determinación del cloro libre no afectan al método PCLD. Las concentraciones de monocloramina hasta 18 mg/l, de dicloramina hasta 10 mg/l y de manganeso (formas oxidadas) hasta 1 mg/l no interfieren. La tricloramina a niveles superiores a 0,6 mg/l produce una reacción aparente de cloro libre. Concentraciones muy altas de monocloramina ( ≥ 35 mg/l) y manganeso oxidado ( ≥ 2,6 mg/l) producen lentamente el color con siringaldacina. El ion férrico puede reaccionar con siringaldacina; sin embargo, las concentraciones hasta 10 mg/l no interfieren. Nitrito ( ≤ 250 mg/l), nitrato ( ≤ 100 mg/l), sulfato ( ≤ 1.000 mg/l) y cloruro ( ≤ 1.000 mg/l) no interfieren. Las aguas con gran dureza ( ≥ 500 mg/l) producirán una solución turbia que puede compensarse utilizando un blanco. El oxígeno no interfiere. Otros agentes oxidantes fuertes, como el yodo, bromo y ozono, producirán color. c) Concentración mínima detectable: El método PCLD es sensible a concentraciones de cloro libre de 0,1 mg/l o inferior. 2.

Instrumental

Equipo colorimétrico: Se requiere uno de los siguientes: a) Fotómetro de filtro, con 1 cm de recorrido de luz para concentraciones de cloro 1 mg/l, o de 1 a 10 nm para concentraciones de cloro superiores a 1 mg/l; provisto también de un filtro con un paso de banda de 500 a 560 nm. b) Espectrofotómetro, para utilizar a 530 nm, aportando los recorridos de luz citados arriba. 3.

Reactivos

a) Agua sin demanda de cloro: Véase C.3m. Utilícese para preparar las solucio-

4-73

nes de reactivos y las diluciones de muestras. b) Indicador de siringaldacina: Disuélvanse 115 mg de 3,5-dimetoxi-4hidroxibenzaldacina* en 1 l de 2-propanol. c) 2-propanol: Para ayudar a la disolución, utilícese la agitación ultrasónica o calor suave y agitación. Redestílese 2propanol de calidad de reactivo para eliminar la demanda de cloro. Utilícese una columna Vigreux de 30,5 cm y tómese la fracción 75 por 100 media. Alternativamente, clórese 2-propanol de buena calidad para mantener un residuo libre durante una noche; expóngase entonces a luz UV o solar para declorar. (PRECAUCIÓN: 2-propanol es extremadamente inflamable.) d) Tampón: Disuélvanse 17,01 g de KH2PO4 en 250 ml de agua; el pH debe ser 4,4. Disuélvanse 17,75 g de Na2HPO4 en 250 ml de agua; el pH debe ser 9,9. Mézclense volúmenes iguales de estas soluciones para obtener el tampón PCLD, pH 6,6. Compruébese el pH con un medidor de pH. Para aguas con dureza considerable o mucha alcalinidad, se pueden usar otros tampones de pH 6,6, por ejemplo, 23,21 g de ácido maleico y 16,5 ml de NaOH al 50 por 100 por litro de agua. e) Solución de hipoclorito: Dilúyase una solución de hipoclorito doméstica que contiene entre 30.000 y 50.000 mg de Cl equivalente/l, para que contenga entre 100 y 1.000 mg/l. Estandarícese como se indica en 6.4a1). 4.

Procedimiento

a) Calibrado del fotómetro: Prepárese una curva de calibrado haciendo diluciones de una solución estandarizada de hipoclorito (apartado 3e). Desarróllese y mídase el color como se describe más * Aldrich n.° 17, 753-9, Aldrich Chemical Company, Inc., Cedar Knolls, Nueva Jersey 07927, o equivalente.

MÉTODOS NORMALIZADOS

4-74

adelante en el apartado 4b. Compruébese regularmente el calibrado, en especial al envejecer el reactivo. b) Análisis del cloro libre: Añádanse 3 ml de muestra y 0,1 ml de tampón a un tubo de ensayo con 5 ml de capacidad. Añádase 1 ml de indicador de siringaldacina, tápese el tubo e inviértase dos veces para mezclar. Transfiérase a un tubo de fotómetro o cubeta de espectrofotómetro y mídase la absorbancia. Compárese el valor de absorbancia obtenido con la curva de calibrado para obtener el valor correspondiente en miligramos de cloro libre por litro.

4500-CI I. 1.

Bibliografía

BAUER, R. & C. RUPE. 1971. Use of syringaldazine in a photometric method for estimating «free» chlorine in water. Anal. Chem. 43:421. COOPER, W. J., C. A. SORBER &E. P. MEIER. 1975. A rapid, free, available chlorine test with syringaldazine (FACTS). J. Amer. Water Works Assoc. 67:34. COOPER, W. J., P. H. GIBBS, E. M. OTT & P. PATEL. 1983. Equivalency testig of procedures for measuring free available chlorine: amperometric titration, DPD, and FACTS. J. Amer. Water Works Assoc. 75:625

Técnica yodométrica de electrodo

Discusión general

a) Principio: Este método implica la medida potenciométrica directa del yodo liberado al añadir yoduro de potasio a una muestra acidificada. Se utiliza un par de electrodos platino-yoduro en combinación con una escala expandida en el pHmetro. b) Interferencia: Interfieren todos los agentes oxidantes que lo hagan con otros procedimientos yodométricos, incluidos el manganeso oxidado y los iones yodato, bromo y cúprico. Los iones plata y mercúrico por encima de 10 y 20 mg/l también interfieren. 2.

5.

Instrumental

a) Electrodos: Utilícese una combinación de electrodos consistente en uno de platino y otro selectivo de ion yoduro, o dos electrodos individuales. Los dos sistemas se encuentran en el comercio. b) pH/milivoltímetro: Utilícese un pH/milivoltímetro con escala expandida para lecturas de 0,1 mV, o un iónmetro selectivo de lectura directa.

3.

Reactivos

a) Solución tampón de pH 4: Véase C.3e. b) Agua sin demanda de cloro: Véase

C.3m. c) Solución de yoduro de potasio: Disuélvanse 42 g de KI y 0,2 g de Na2CO3 en 500 ml de agua destilada sin demanda de cloro. Consérvese en frasco oscuro. d) Yodato de potasio patrón 0,002 81N: Disuélvanse 0,1002 g de KIO3 en agua destilada sin demanda de cloro y dilúyase a 1.000 ml. Cada 1,0 ml, diluido a 100 ml, produce una solución equivalente a 1 mg/l como Cl2. 4.

Procedimiento

a) Estandarización: Llévense con la pipeta a tres matraces aforados de 100 ml con tapón, 0,20, 1,00 y 5,00 ml de solución patrón de yodato. Añádase a cada matraz, y a un cuarto matraz que se utilizará como blanco, 1 ml de solución tampón de acetato y 1 ml de solución de KI. Tápese, agítese por rotación y déjese reposar 2 minutos. Dilúyase luego cada

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

patrón a 100 ml con agua destilada sin demanda de cloro. Tápese, inviértase el matraz varias veces para mezclar y viértase en vasos de precipitados de 150 ml separados. Agítese suavemente, sin turbulencia, usando un agitador magnético y sumérjase el(los) electrodos(s) en el patrón de 0,2 mg/l (0,2 ml). Espérese que se estabilice el potencial y regístrese en mV. Lávense los electrodos con agua sin demanda de cloro y repítase con cada patrón y con el blanco. Prepárese una curva de calibrado comparando, en papel semilogarítmico, el potencial (eje lineal) con la concentración. Determínese la concentración aparente de cloro en el reactivo blanco a partir de esta gráfica (lectura B). b) Análisis: Selecciónese un volumen de muestra que contenga no más de 0,5 mg de cloro. Llévese con la pipeta 1 ml de solución tampón de acetato y 1 ml de KI en un matraz aforado de 100 ml con tapón de vidrio. Tápese, agítese por rotación y déjese reposar durante 2 minutos por lo menos. Ajústese el pH de la muestra a 4-5, si fuera necesario (el papel de pH de escala intermedia es adecuado para medir el pH) por adición de ácido acético. Añádase la muestra con el pH ajustado al matraz aforado y dilúyase hasta la señal. Tápese y mézclese por inversión varias veces. Déjese reposar durante 2 minutos. Pásese a un vaso de precipitados de 150 ml, introdúzcase el(los) electrodo(s), espérese que se estabilice el potencial y regístrese. Si la lectura

4-75

en mV supera la registrada para el patrón de 5 mg/l, repítase el análisis con un volumen menor de muestra. 5. Cálculos

Determínese la concentración de cloro (mg/l) correspondiente a la lectura en mV registrada a partir de la curva patrón. Ésta es la lectura A. Determínese el cloro residual total con la siguiente ecuación: Cloro residual total = A x 100/V

donde V = volumen de muestra, ml. Si el cloro residual total es inferior a 0,2 mg/l, réstese el cloro aparente en el blanco de reactivos (lectura B) para obtener el valor real de cloro residual total. 6. Bibliografía DIMMOCK, N. A. & D. MiDGLEY.1981. Determination of Total Residual Chlorine in Cooling Water with the Orion 97-70 Ion Selective Electrode. Central Electricity Generating Board (Reino Unido) Report RD/L/2159N81. JENKINS, R. L. & R. B. BAIRD. 1979. Determination of total chlorine residual in treated wastewaters by electrode. Anal. Letters 12:125. SYNNOTT, J. C. & A. M. SMITH. 1985. Total Residual Chlorine by Ion-Selective Electrode-from Bench Top to Continuous Monitor. Paper presented at 5th International Conf. on Chemistry for Protection of the Environment, Leuven, Bélgica.

4-76

MÉTODOS NORMALIZADOS

4500-Cl¯ CLORURO* 4500-CI¯ A. 1.

Incidencia

El cloruro, en forma de ion (Cl¯), es uno de los aniones inorgánicos principales en el agua natural y residual. En el agua potable, el sabor salado producido por el cloruro, es variable y depende de la composición química del agua. Algunas, con 250 mg Cl¯/l pueden tener un sabor salado detectable si el catión es el sodio. En cambio, ese gusto salado típico puede estar ausente en aguas con hasta 1.000 mg/l cuando los cationes predominantes son el calcio y magnesio. La concentración de cloruro es mayor en las aguas residuales que en las naturales, debido a que el cloruro de sodio (NaCl) es común en la dieta y pasa inalterado a través del aparato digestivo. A lo largo de las costas, el cloruro puede estar presente a concentraciones altas por el paso del agua del mar a los sistemas de alcantarillado. También puede aumentar debido a los procesos industriales. Un contenido elevado de cloruro puede dañar las conducciones y estructuras metálicas y perjudicar el crecimiento vegetal. 2.

Selección del método

Se presentan cinco métodos para determinación de cloruros. Como los dos * Aprobado por el Standard Methods Committee, 1985.

Introducción primeros son similares en muchos aspectos, la selección está en función de las preferencias personales en gran medida. El método argentométrico (B) es adecuado para aguas relativamente claras, cuando la porción titulada contenga de 0,15 a 10 mg de Cl¯. El punto final en el método del nitrato mercúrico (C) es más fácil de detectar. El método potenciométrico (D) es adecuado para muestras turbias o coloreadas cuando el punto final podría ser difícilmente observable. El método potenciométrico se puede utilizar sin necesidad del paso de tratamiento previo para muestras que contengan iones férricos (si no está presente en una cantidad superior a la concentración de cloruro), crómico, fosfato y ferroso, y otros iones de metales pesados. El método del ferrocianuro (E) es una técnica automática. La cromatografía iónica (F), también se puede usar para determinar los cloruros.

3. Toma de muestras y almacenamiento

Recójanse las muestras representativas en frascos limpios de vidrio o plástico químicamente resistente. La porción máxima de muestra necesaria son 100 ml. No se precisan conservantes especiales cuando hubiera que almacenar la muestra.

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

4500-CI¯ 1.

B.

Método argentométrico

Discusión general

a) Principio: En una solución neutra o ligeramente alcalina, el cromato potásico puede indicar el punto final de la titulación de cloruros con nitrato de plata. Se precipita cloruro de plata cuantitativamente antes de formarse el cromato de plata rojo. b) Interferencia: No interfieren las sustancias en las cantidades encontradas normalmente en el agua potable. El bromuro, yoduro y cianuro se registran como las concentraciones equivalentes de cloruro. Los iones sulfuro, tiosulfato y sulfito interfieren, pero se pueden eliminar con un tratamiento de peróxido de hidrógeno. El ortofosfato por encima de 25 mg/l interfiere por precipitar como fosfato de plata. El hierro por encima de 10 mg/l interfiere por enmascarar el punto final. 2.

Instrumental

a) Erlenmeyer, 250 ml. b) Bureta, 50 ml.

c) Cloruro de sodio patrón, 0,0141 M (0,0141N): Disuélvanse 824,0 mg de NaCl (secado a 140 °C) en agua destilada y dilúyase a 1.000 ml; 1,00 ml = 500 µg Cl¯. d) Reactivos especiales para eliminación de interferencias: 1) Suspensión de hidróxido de aluminio: Disuélvanse 125 g de sulfato alumínico potásico o sulfato alumínico amónico, A1K(SO4)2 · 12H2O o AlNH4(SO4)2 · · 12H2O, en 1 l de agua destilada. Caliéntese a 60 °C y añádanse 55 ml de hidróxido de amonio conc. (NH4OH) lentamente y con agitación. Déjese reposar durante alrededor de 1 hora, transfiérase a un frasco grande y lávese el precipitado por adiciones sucesivas de agua destilada, mezclando bien y decantando. Cuando está recién preparada, la suspensión ocupa un volumen aproximado de 1 l. 2) Solución indicadora de fenolftaleína. 3) Hidróxido sódico, NaOH 1N. 4) Ácido sulfúrico, H2SO4 1N. 5) Peróxido de hidrógeno, H2O2, 30 por 100. 4.

3.

4-77

Reactivos

a) Solución indicadora de cromato potásico: Disuélvanse 50 g de K2CrO4 en un poco de agua destilada. Añádase solución de AgNO3 hasta que se forme un claro precipitado rojo. Déjese reposar 12 horas, fíltrese y dilúyase a 1 l con agua destilada. b) Titulante de nitrato de plata patrón, 0,0141M (0,0141AO: Disuélvanse 2,395 g de AgNO3 en agua destilada y dilúyase a 1.000 ml. Estandarícese frente a NaCl por el procedimiento descrito más adelante en el apartado 4b; 1,00 ml = = 500 µg Cl¯. Consérvese en frasco topacio.

Procedimiento

a) Preparación de la muestra: Utilícese una muestra de 100 ml o una porción adecuada diluida a 100 ml. Si la muestra tiene mucho color, añádanse 3 ml de suspensión de Al(OH)3, mézclese, déjese sedimentar y fíltrese. Si hubiera sulfuro, sulfito o tiosulfato presentes, añádase 1 ml de H2O2 y agítese durante 1 minuto. b) Titulación: Valórense directamente las muestras con pH entre 7 y 10. Ajústese el pH a 7 o 10 con H2SO4 o NaOH, si no estuvieran en esa zona. Añádase 1,0 ml de solución indicadora de K2CrO4. Titúlese con AgNO3 patrón hasta un punto final amarillo rosado,

MÉTODOS NORMALIZADOS

4-78

con un criterio constante relativo al punto final. Estandarícese el AgNO3 titulante y establézcase el valor del blanco de reactivos por el método de titulación descrito anteriormente. Lo usual es un blanco de 0,2 a 0,3 ml. 5.

Cálculos

A = ml valoración para la muestra, B = ml valoración para el blanco, y N = normalidad de AgNO3. mg NaCl/l = (mg Cl¯/l) x 1,65

4500-CI¯

C.

Precisión y sesgo

Se analizó en 41 laboratorios por el método argentométrico una muestra sintética compuesta por 241 mg de Cl¯/l, 108 mg Ca/l, 82 mg Mg/l, 3,1 mg K/l, 19,9 mg Na/l, 1,1 mg NO3- -N/l, 0,25 mg NO-2 -N/l, 259 mg SO 2-4 /l y 42,5 mg de alcalinidad total/l (debida al NaHCO3) en agua destilada, con una desviación relativa estándar de 4,2 por 100 y 1,7 por 100 de error relativo. 7.

donde:

1.

6.

Bibliografía

HAZEN, A. 1889. On the determination of chlorine in water. Amer, Chem. J. 11:409. KOLTHOFF, I. M. & V. A. STENGER. 1947. Volumetric Analysis, 2.a ed. Vol. 2. Interscience Publishers, Nueva York, págs. 242-245, 256-258.

Método del nitrato mercúrico

Discusión general

a) Principio: El cloruro se puede valorar con nitrato mercúrico Hg(NO3)2, porque se forma cloruro mercúrico soluble, ligeramente disociado. En la zona de pH de 2,3 a 2,8, la difenilcarbazona indica el punto final de la valoración por formación de un complejo púrpura con los iones mercúricos en exceso. El xilenocianol FF sirve de indicador del pH y potenciador del punto final. Aumentando la concentración del titulante y modificando las mezclas indicadoras, se amplía la gama de concentraciones mensurables de cloruro. b) Interferencia: El bromuro y yoduro se valoran con Hg(NO3)2 del mismo modo que el cloruro. Los iones cromato, férrico y sulfito interfieren cuando se encuentran presentes en cantidades superiores a 10 mg/l.

2.

Instrumental

a) Erlenmeyer, 250 ml. b) Microbureta, 5 ml graduada con intervalos de 0,01 ml. 3.

Reactivos

a) Cloruro de sodio patrón, 0,0141 M (0,0141N): Véase método B, apartado 3c anterior. b) Ácido nítrico, HNO3 0,1 N. c) Hidróxido sódico, NaOH 0,1 N. d) Reactivos para concentraciones de cloro inferiores a 100 mg/l: 1) Reactivo indicador-acidificador: La concentración de HNO3 de este reactivo es un factor importante para el éxito de la determinación y puede variarse como se indica en a) o b) para adecuarla al

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

rango de alcalinidad de la muestra. El reactivo a) contiene HNO3 suficiente para neutralizar una alcalinidad total de 150 mg como CaCO3/l al pH adecuado en una muestra de 100 ml. Ajústese la cantidad de HNO3 para acomodar muestras de alcalinidad diferente de 150 mg/l. a) Disolver, en el orden citado, 250 mg de s-difenilcarbazona, 4,0 ml de HNO3 conc. y 30 mg de xilenocianol FF en 100 ml de alcohol etílico al 95 por 100 o alcohol isopropílico. Consérvese en frigorífico en un frasco oscuro. Este reactivo no es estable indefinidamente. Su deterioro es causa de un punto final lento y resultados elevados. b) Dado que el control del pH es critico, ajústese el pH de las muestras muy acidas o alcalinas a 2,5 ± 0,1 con HNO3 0,1N o NaOH, no con carbonato de sodio (Na2CO3). Utilícese un medidor de pH con un electrodo de referencia de tipo no cloruro para ajustar el pH. Si sólo se dispone del electrodo de referencia usual de tipo-cloruro para ajustar el pH, determínese la cantidad de álcali o ácido necesaria para obtener un pH de 2,5 ± ± 0,1 y deséchese esta porción de la muestra. Trátese otra porción de muestra con la cantidad de ácido o álcali determinada y continuar el análisis. En esas circunstancias, omítase el HNO3 del reactivo indicador. 2) Nitrato mercúrico patrón para titulación, 0,007 05M (0,0141 N): Disuélvanse 2,3 g de Hg(NO3)2 o 2,5 g de Hg(NO3)2 · H2O en 100 ml de agua destilada que contiene 0,25 ml de HNO3 conc. Dilúyase a un poco menos de 1 l. Hacer una primera estandarización siguiendo el método descrito en el apartado 4a. Úsense duplicados con 5,00 ml de solución de NaCl y 10 mg de bicarbonato sódico (NaHCO3) diluido a 100 ml con agua destilada. Ajústese el titulante a 0,0141N y realícese la estandarización final; 1,00 ml = 50 µg de Cl¯. Consérvese protegido de la luz en un frasco oscuro.

4-79

e) Reactivo para concentraciones de cloruro superiores a 100 mg/l: 1) Reactivo indicador mixto: Disuélvanse 0,50 g de difenilcarbazona en polvo y 0,05 g de azul de bromofenol en polvo, en 75 ml de alcohol etílico o isopropílico 95 por 100 y dilúyase a 100 ml con el mismo alcohol. 2) Nitrato mercúrico patrón fuerte para titulación, 0,0705M (0,141N). Disuélvanse 25 g de Hg(NO3)2 · H2O en 900 ml de agua destilada conteniendo 5,0 ml de HNO3 conc. Dilúyase hasta poco menos de 1 l y estandarícese según el procedimiento descrito en el apartado 4b. Utilícense duplicados que contengan 25,00 ml de solución patrón de NaCl y 25 ml de agua destilada. Ajústese el titulante a 0,141N y realícese la estandarización final; 1,00 ml = 5,00 mg de Cl¯. 4.

Procedimiento

a) Titulación de las concentraciones de cloruro inferiores a 100 mg/l: Utilícese una muestra de 100 ml o una porción menor, de forma que el contenido en cloruro sea inferior a 10 mg. Añádase 1,0 ml de reactivo indicadoracidificador. (El color de la solución debe ser verde-azul en este punto. Un verde pálido indica pH inferior a 2,0; el azul puro indica un pH superior a 3,8.) Para la mayoría de las aguas potables el pH tras esta adición será 2,5 ± 0,1. En aguas muy acidas o alcalinas, ajústese el pH a 8 aproximadamente, antes de añadir el reactivo indicador-acidificador. Titúlese con Hg(NO3)2 0,0141N hasta punto final púrpura. La solución vira de verde-azul a azul unas gotas antes del punto final. Determínese el blanco valorando 100 ml de agua destilada que contenga 10 mg de NaHCO3. b) Titulación de concentraciones de cloro superiores a 100 mg/l: Utilícese una porción de muestra (5 a 50 ml) que re-

4-80

MÉTODOS NORMALIZADOS

quiera menos de 5 ml de titulante para llegar al punto final. Mídase en un vaso de 150 ml. Añádanse aproximadamente 0,5 ml de reactivo indicador mixto y mézclese bien. El color debe ser púrpura. Añádase HNO3 0,1N gota a gota hasta que el color vire a amarillo. Titúlese con Hg(NO3)2 fuerte hasta color púrpura oscuro permanente. Valórese un blanco de agua destilada utilizando el mismo procedimiento.

5.

Cálculos

mg NaCl/l = (mg Cl¯/l) x 1,65

D.

Bibliografía

KOLTHOFF, I. M. & V. A. STENGER. 1947. Volumetric Analysis, 2.a ed. Vol. 2. Interscience Publishers, Nueva York, págs. 334-335. DOMASK, W. C. & K. A. KOBE. 1952. Mercurimetric determination of chlorides and watersoluble chlorohydrins. Anal. Chem. 24:989. GOLDMAN, E. 1959. New indicator for the mercurimetric chloride determination in potable water. Anal. Chem. 31:1127.

A = ml valoración de la muestra, B = ml valoración del blanco, y N = normalidad de Hg(NO3)2.

4500-CI¯

Precisión y sesgo

Se analizó en 10 laboratorios por el método mercurimétrico una muestra sintética que contenía 241 mg de Cl¯/l, 108 mg Ca/l, 82 mg Mg/l, 3,1 mg K/l, 19,9 mg Na/l, 1,1 mg NO3- -N/l, 0,25 mg NO-2 -N/l, 259 mg SO 2-4 /l y 42,5 mg de alcalinidad total/l (debida a NaHCO3), con una desviación estándar relativa del 3,3 y 2,9 por 100 de error relativo.

7.

donde:

1.

6.

Método potenciométrico

Discusión general

a) Principio: Se determina el cloruro por titulación potenciométrica con solución de nitrato de plata y un sistema de electrodos de vidrio y plata-cloruro de plata. Durante la valoración se utiliza un voltímetro electrónico para detectar el cambio de potencial entre los dos electrodos. El punto final de la valoración es la lectura del aparato a la que se produce el máximo cambio de voltaje para un incremento pequeño y constante del nitrato de plata añadido. b) Interferencia: El yoduro y el bromuro también se valoran como cloruro. El ferrocianuro da lugar a resultados elevados y debe ser eliminado. Cromato y dicromato interfieren y deben reducirse al estado crómico o eliminarse. El ion

férrico interfiere si se encuentra en una cantidad sustancialmente mayor que el cloruro. Los iones crómico, ferroso y fosfato no interfieren. Las muestras muy contaminadas suelen precisar un tratamiento previo. Cuando la contaminación es menor, algunos contaminantes pueden destruirse simplemente por adición de ácido nítrico. 2.

Instrumental a) Electrodos de vidrio y plata-cloruro

de plata: Prepárense en el laboratorio o adquiérase un electrodo de plata recubierto de AgCl para usarlo con unos aparatos determinados. Las instrucciones de uso y cuidado de los electrodos son suministradas por el fabricante.

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

b) Voltímetro electrónico, para medir la diferencia de potencial entre electrodos: Un medidor de pH puede transformarse para este uso, sustituyendo el electrodo apropiado. c) Agitador mecánico, con rotor recubierto de plástico o vidrio. 3.

Reactivos

a) Solución patrón de cloruro sódico, 0.0141M (0.0141N): Véase 4500-Cl¯.B.3c. b) Ácido nítrico, HNO3 conc. c) Nitrato de plata patrón, 0,0141 M (0,0141 N): Véase 4500-Cl¯.B.3b. d) Reactivos para pretratamiento: 1) Ácido sulfúrico, H2SO4 1 + 1. 2) Peróxido de hidrógeno, H2O2, 30 por 100. 3) Hidróxido sódico, NaOH 1N. 4.

Procedimiento

a) Estandarización: Los distintos aparatos que se pueden utilizar en esta determinación difieren en detalles de funcionamiento; síganse las instrucciones del fabricante, realizando los ajustes mecánicos necesarios. Tras un tiempo de calentamiento suficiente (10 minutos), equilíbrense los componentes eléctricos internos para ajustar el aparato a 0 mV o, si fuera un medidor de pH, a una lectura de pH 7,0. 1) Introdúzcanse 10,0 ml de solución patrón de NaCl en un vaso de precipitados de 250 ml, dilúyase a 100 ml aproximadamente y añádanse 2,0 ml de HNO3 conc. Introdúzcase el agitador y los electrodos. 2) Ajústese el aparato al rango deseado de milivoltios o unidades de pH. Póngase en marcha el agitador. 3) Añádase titulante de AgNO3 patrón, registrando la lectura de la escala tras cada adición. Al principio se pueden adicionar incrementos grandes

4-81

de AgNO3; pero cuando se aproxime el punto final, los incrementos deben ser más pequeños e iguales (0,1 o 0,2 ml) a intervalos más prolongados, de modo que se pueda determinar el punto final exacto. Estímese el volumen de AgNO3 utilizado en el punto en que se produce el máximo cambio de lectura del aparato por adición unitaria de AgNO3. 4) Trácese una curva de titulación diferencial si no se puede determinar el punto final por inspección de los datos. Compárese el cambio de lectura del aparato para incrementos iguales de AgNO3 frente al volumen de AgNO3 adicionado, usando el promedio de lecturas de la bureta antes y después de cada adición. El procedimiento se ilustra en la figura 4500-Cl¯:l. b) Análisis de la muestra: 1) Llévense con la pipeta 100,0 ml de muestra, o una porción que contenga no más de 10 mg de Cl¯, en un vaso de 250 ml. En ausencia de sustancias interferentes, procédase como en el apartado 3, más adelante. 2) En presencia de compuestos orgánicos, sulfito u otras interferencias (como cantidades grandes de hierro férrico, cianuro o sulfuro) acidifíquese la muestra con H2SO4, utilizando papel tornasol. Hiérvase durante 5 minutos para eliminar compuestos volátiles. Añádase más H2SO4 si fuera necesario para mantener la solución acida. Añádanse 3 ml de H2O2 e hiérvase durante 15 minutos, añadiendo agua destilada sin cloro para mantener el volumen por encima de 50 mi. Dilúyase a 100 ml, añádase solución de NaOH gota a gota hasta alcalinidad al papel de tornasol y luego un exceso de 10 gotas. Hiérvase durante 5 minutos, fíltrese a un vaso de 250 ml y lávese el precipitado y papel varias veces con agua destilada caliente. 3) Añádase HNO3 conc. gota a gota hasta acidez al papel de tornasol y luego un exceso de 2,0 ml. Enfríese y dilúyase a

4-82

MÉTODOS NORMALIZADOS

Figura 4500-Cl¯ :1. Ejemplo de curva de titulación diferencial (el punto final está 25,5 ml).

100 ml si fuera necesario. Sumérjase el agitador y los electrodos y comiéncese a agitar. Realícense todos los ajustes necesarios de acuerdo con las instrucciones del fabricante y ajústese el selector adecuadamente para medir la diferencia de potencial entre electrodos. 4) Complétese la determinación titulando según el apartado 4a4). Si se hubiera establecido un punto final para la lectura en determinaciones previas para muestras y condiciones similares, utilícese. Para un trabajo más exacto, hágase una valoración en blanco, utilizando agua destilada sin cloro durante el procedimiento.

5. Cálculos

donde: A = ml AgNO 3 , B = ml blanco, y N = normalidad del titulante.

6. Precisión y sesgo

En ausencia de sustancias interferentes, la precisión y sesgo se estiman en 0,12 mg para 5 mg de Cl¯ o 2,5 por 100 de la cantidad presente. Cuando se requiera un tratamiento previo para eliminar las sustancias interferentes, la precisión y el sesgo se reducen a 0,25 mg para 5 mg de Cl ¯ , aproximadamente, o un 5 por 100 de la cantidad presente. 7.

Bibliografía

KOLTHOFF, I. M.& N. H. FURMAN, 1931. Potentiometric Titrations, 2. a ed. John Wiley & Sons, Nueva York.

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REFFENBURG, H. B. 1935. Colorimetric determination of small quantities of chlorides in water. Ind. Eng. Chem., Anal. Ed. 7:14. CALDWELL, J. R. & H. V. MEYER. 1935. Chloride determination. Ind. Eng. Chem., Anal. Ed. 7:38. SERFASS, E. J. & R. F. MURACA. 1954. Procedures for Analyzing Metal-Finishing Wastes. Ohio River Valley Water Sanitation Commission, Cincinnati, Ohio, pág. 80.

4500-CI¯ E. 1.

FURMAN, N. H., ed. 1962. Standard Methods of Chemical Analysis, 6.a ed. D. Van Nostrand Co., Princeton, Nueva Jersey, Vol. I. WALTON, H. F. 1964. Principles and Methods of Chemical Analysis, Prentice-Hall, Inc., Englewood Cliffs, Nueva Jersey. WILLARD, H. H., L. L. MERRITT & J. A. DEAN. 1965. Instrumental Methods of Analysis, 4.a ed. D. Van Nostrand Co., Princeton, Nueva Jersey.

Método automatizado del ferrocianuro

Discusión general

3.

Reactivos

b) Filtros, 480 nm.

a) Solución madre de tiocianato mercúrico: Disuélvanse 4,17 g de Hg(SCN)2 en unos 500 ml de metanol, dilúyase a 1.000 ml con metanol, mézclese y fíltrese mediante papel de filtro. b) Solución madre de nitrato férrico: Disuélvanse 202 g de Fe(NO3)3 · 9H2O en unos 500 ml de agua destilada, añádanse 21 ml de HNO3 conc. Dilúyase a 1.000 ml con agua destilada y mézclese. Fíltrese mediante papel y consérvese en frasco topacio. c) Reactivo de color: Añádanse 150 ml de solución madre de Hg(SCN)2 a 150 ml de solución madre de Fe(NO3)3. Mézclese y dilúyase a 1.000 ml con agua destilada. Añádase 0,5 ml de polioxietileno 23 lauril éter†. d) Solución madre de cloruro: Disuélvanse 1,6482 g de NaCl secado a 140 °C, en agua destilada y dilúyase a 1.000 ml; 1,00 ml + 1,00 mg Cl¯. e) Soluciones patrón de cloruros: Prepárense patrones de cloruro en el rango de concentración deseado, como 1 a 200 mg/l, utilizando la solución madre de cloruro.

* Autoanalizador™ Technicon™ II o equivalente.

† Brij 35, suministrado por ICI Americas, Wilmington, Delaware, Technicon Instruments Corporation, Tarrytown, Nueva York 10591, o equivalente.

a) Principio: El ion tiocianato se libera del tiocianato mercúrico por formación de cloruro mercúrico soluble. En presencia de ion férrico, el ion tiocianato libre forma tiocianato férrico muy coloreado cuya intensidad es proporcional a la concentración de cloruro. b) Interferencias: Ninguna importante. Sin embargo, en las muestras turbias se debe utilizar un filtro continuo. c) Aplicación: El método es aplicable a aguas potables, superficiales y salinas y a las residuales domésticas e industriales. Se puede variar la gama de concentraciones utilizando los controles del colorímetro. 2.

4-83

Instrumental

a) Equipo analítico automatizado: El instrumento analítico de flujo continuo requerido* consta de los componentes intercambiables que muestra la figura 4500-Cl¯:2.

MÉTODOS NORMALIZADOS

4-84

Figura 4500-Cl¯ :2. Diagrama de flujo para análisis automatizado de cloruro.

4. Procedimiento

Realícese un montaje como el que muestra la figura 4500-Cl¯:2 y sígase el procedimiento general descrito por el fabricante. 5. Cálculos

Prepárense curvas estándar por comparación de las alturas máximas de los estándares procesados en el equipo montado frente a las concentraciones de cloro de los patrones. Calcúlese la concentración de cloruro de la muestra compa-

rando la altura de su pico con la curva patrón.

6. Precisión y sesgo

Se analizaron seis muestras por septuplicado, en un único laboratorio con un sistema automatizado. La desviación media estándar fue de 0,39 mg/l para una concentración entre 1 y 50 mg Cl¯/l. El coeficiente de variación fue 2,2 por 100. En dos muestras con adición de cloruro, las recuperaciones fueron 104 y 97 por 100.

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

7. Bibliografía ZALL, D. M., D. FISHER & M. D. GARNER. 1956.

4500-CI¯ F.

4-85

Photometric determination of chlorides in water. Anal. Chem. 28:1665. O'BRIEN, J. E. 1962. Automatic analysis of chlorides in sewage. Wastes Eng. 33:670.

Método de cromatografía de iones

Véase sección 4110.

4500-CIO2

DIÓXIDO DE CLORO*

4500-CIO2 A. Debido a que las propiedades físicas y químicas del dióxido de cloro son parecidas en muchos aspectos a las del cloro, antes de tratar de determinar el dióxido de cloro, se debe leer la exposición completa del cloro residual (sección 4500-Cl).

Introducción debe manipular con precaución en zonas ventiladas. Existen varios métodos para generar C1O2; el más práctico, para los objetivos del laboratorio, consiste en acidificar una solución de clorito de sodio con una depuración posterior adecuada. 2.

1.

Incidencia y significación

El dióxido de cloro, C1O2, se ha utilizado ampliamente como blanqueante en la industria del papel y la pulpa. Se ha aplicado al agua de suministro para combatir los sabores y olores debidos a residuos de tipo fenólico, actinomicetos y algas, así como para oxidar el hierro y manganeso solubles a una forma más fácil de eliminar. Es desinfectante y algunos resultados indican que puede ser más fuerte que el cloro libre o hipoclorito. El dióxido de cloro es un gas amarillo oscuro, volátil, de olor desagradable, tóxico y que puede reaccionar con explosión en determinadas condiciones. Se * Aprobado por el Standard Methods Committee, 1988.

Selección del método

El método yodométrico (B) consigue una medida muy exacta de la concentración total disponible en una solución en cuanto a su capacidad liberadora de yodo a partir del yoduro. Sin embargo, con esta técnica no se distinguen bien C1O2, cloro, clorito e hipoclorito. Se destina y utiliza principalmente a estandarizar las soluciones de C1O2 necesarias para preparar patrones provisionales. A menudo es inaplicable a los residuos industriales. Los métodos amperométricos (C y E) son útiles cuando se desean conocer las distintas fracciones de cloro en una muestra de agua. Distinguen varios compuestos interesantes del cloro con exactitud y precisión, pero requieren un equipo especializado y una habilidad analítica considerable.

4-86

MÉTODOS NORMALIZADOS

El método de la N,N-dietil-p-fenilendiamina (DFD), método (D), tiene las ventajas de una prueba colorimétrica relativamente fácil de realizar con la capacidad de distinguir entre C1O2 y varias formas de cloro. Esta técnica no es tan exacta como el método amperométrico, pero proporciona resultados adecuados para la mayoría de las aplicaciones comunes.

3. Toma de muestras y almacenamiento

Determinar ClO2 inmediatamente después de recoger la muestra. No exponer las muestras a la luz solar o artificial intensa, ni airearlas para mezclar. Las pérdidas de ClO2 son mínimas cuando la

4500-CIO2 B. 1.

determinación se realiza de inmediato en el lugar de obtención de las muestras. 4.

Bibliografía

INGOLS, R. S. & G. M. RIDENOUR. 1948. Chemical properties of chlorine dioxide in water treatment. J. Amer. Water Works Assoc. 40:1207. PALIN, A. T. 1948. Chlorine dioxide in water treatment. J. Inst. Water Eng. 11:61. HODGDEN, H. W. & R. S. INGOLS. 1954. Direct colorimetric method for determination of chlorine dioxide in water. Anal. Chem. 26:1224. FEUSS, J. V. 1964. Problems in determination of chlorine dioxide residuals. J. Amer. Water Works Assoc. 56:607. MASSCHELEIN, W. 1966. Spectrophotometric determination of chlorine dioxide with acid chrome violet K. Anal. Chem. 38:1839. MASSCHELEIN, W. 1969. Les Oxydes de Chlore et le Chlorite de Sodium. Dunod, París. Capítulo XI.

Método yodométrico

Discusión general

a) Principio: Se prepara una solución de C1O2 puro por adición lenta de H2SO4 diluido a una solución de clorito de sodio (NaClO2). Los contaminantes, como el cloro, se eliminan con un depurador de NaClO 2 y el paso del gas por agua destilada en una corriente continua de aire. C1O2 libera yodo a partir de una solución de KI acidificada con ácido acético o H2SO4. El yodo liberado se valora con una solución patrón de tiosulfato de sodio (Na2S2O3), con almidón como indicador. b) Interferencia: Existen pocas interferencias en este método, pero la temperatura y la luz intensa afectan a la estabilidad de la solución. Reducir al mínimo las pérdidas de C1O2, conservando en fri-

gorífico oscuro la solución de reserva de C1O2 y preparando y valorando soluciones diluidas de ClO2 para estandarización, a las temperaturas más bajas posibles y con luz difusa. c) Concentración mínima detectable: Una gota (0,005 ml) de Na2S2O3 0,01 N equivale a 20 µg de C1O2/l (o 40 µg/l en términos de cloro disponible) cuando se valora una muestra de 500 ml.

2.

Reactivos

Se precisan todos los reactivos enumerados para la determinación de cloro residual en la sección 4500-Cl.B.2a-g. También se requieren los siguientes: a) Solución madre de dióxido de cloro: Prepárese un sistema generador y ab-

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

sorbente de gas como el que muestra la figura 4500-ClO2:l. Conéctese el matraz aspirador (A), de 500 ml de capacidad, con un tubo de goma a una fuente de aire comprimido. Hágase burbujear el aire a través de una capa de 300 ml de agua destilada en un matraz y pásese después por un tubo de vidrio, con su extremo a menos de 5 mm del fondo de un frasco de 1 l, generador de gas (B). Diríjase el gas producido por medio de un tubo de vidrio, a través de un frasco depurador (C) que contiene solución saturada de NaClO 2 o una torre rellena de NaClO2 en escamas y, finalmente, por medio de un tubo de vidrio, a un frasco colector de 2 1, de vidrio borosilicato (D), donde el gas es absorbido en 1.500 ml de agua destilada. Dispóngase un tubo para salida de aire en el frasco colector (D). Escójase un frasco generador de gas, fabricado con vidrio borosilicato resistente, con una boca suficientemente amplia para permitir la inserción de tres tubos de vidrio separados: el primero, que llegue casi al fondo para entrada del aire; el segundo, un poco por debajo de la superficie del líquido para introducción gradual del H2SO4, y el tercero, cerca de la parte superior del frasco para salida del gas producido y del aire. Acóplese al segundo tubo un embudo de separación cilíndrico, graduado (E) para contener el H2SO4. Colóquese el conjunto dentro de una campana extractora con protección adecuada. Disuélvanse 10 g de NaClO 2 en 750 ml de agua destilada y colóquese en el frasco generador (B). Añádanse con

4-87

cuidado 2 ml de H2SO4 conc. a 18 ml de agua destilada y mézclese. Transfiérase al embudo. Conéctese el matraz al frasco generador, éste al depurador y el último al colector. Pasar una corriente suave de aire a través del sistema, observada por el burbujeo en todos los frascos. Introdúzcanse incrementos de 5 ml de H2SO4 desde el embudo al frasco generador a intervalos de 5 minutos. Manténgase el flujo de aire durante 30 minutos tras adición de la última porción de ácido. Consérvese la solución madre amarilla en un frasco topacio en frigorífico oscuro. La concentración del C1O2 así preparado varía entre 250 y 600 mg/l, correspondiendo aproximadamente a 5001.200 mg de cloro libre/l. b) Solución patrón de dióxido de cloro: Utilícese esta solución para preparar patrones provisionales de C1O2. Dilúyase el volumen requerido de solución madre de C1O2 a la concentración deseada con agua sin demanda de cloro (véase sección 4500-Cl.C.3m). Estandarícese la solución valorando con Na2S2O3 0,01 N ó 0,025N en presencia de K.I, ácido e indicador de almidón, según el procedimiento suministrado más adelante en el apartado 3. Una botella llena totalmente o casi llena de solución de cloro o C1O2 conserva su título más tiempo que una parcialmente llena. Cuando el nivel se reduzca a niveles críticos debido a extracciones sucesivas, estandarícese la solución diluida al comienzo, a la mitad de la serie de extracciones, y al final de la misma. Agítese bien el contenido antes de extraer la solución necesaria desde el centro del frasco topacio con tapón de vidrio. Prepárese esta solución frecuentemente. 3. Procedimiento

Figura 4500-ClO2:I. Sistema de generación y absorción de dióxido de cloro.

Selecciónese el volumen de muestra, prepárese para valoración, y titúlese la muestra y el blanco como se describe en la sección 4500-C1.B.3. La única particu-

4-88

MÉTODOS NORMALIZADOS

laridad es la siguiente: Déjese reaccionar al CIO2 en la oscuridad con ácido y KI durante 5 minutos antes de empezar a valorar. 4.

Para determinar los patrones provisionales de C1O2:

Cálculos

Exprésense las concentraciones de C1O2 como contenido de C1O2 o de cloro libre. Se define el cloro libre como el poder oxidante total de C1O2 medido valorando el yodo liberado por C1O2 a partir de una solución acida de KI. Calcúlese el resultado en cloro. Para estandarizar la solución de C1O2:

donde: A = valoración de la muestra en ml, B = valoración del blanco en ml (positiva o negativa, véase 4500-Cl.B.3d), y N = normalidad de Na 2 S 2 O 3 .

5.

Bibliografía

POST, M. A. & W. A. MOORE. 1959. Determination of chlorine dioxide in treated surface waters. Anal. Chem. 31:1872.

4500-CIO2 C.

Método amperométrico I

1. Discusión general

a) Principio: La titulación amperométrica de C1O2 es una extensión del método amperométrico para cloro. Realizando cuatro valoraciones con óxido de fenilarsina, cloro libre (incluido el hipoclorito y ácido hipocloroso), cloraminas, clorito y C1O2, se pueden determinar por separado. El primer paso de la titulación consiste en transformar C1O2 en clorito y clorato, por adición de NaOH suficiente para producir un pH de 12, seguido de la neutralización a pH 7 y valoración del cloro libre. En la segunda titulación se añade KI a una muestra que se ha tratado de modo similar con álcali y reajustando el pH a 7; la valoración suministra el cloro libre y monocloramina. La tercera titulación incluye la adición de KI y

ajuste del pH a 7, seguida de la valoración del cloro libre, monocloramina y una quinta parte del C1O2 disponible. En la cuarta valoración, la adición de suficiente H 2 SO 4 para rebajar el pH a 2 hace posible que todo el C1O2 y clorito disponible, así como el cloro libre total, liberen una cantidad equivalente de yodo a partir del KI adicionado, que entonces se valora. b) Interferencia: Las interferencias descritas en la sección 4500-C1.D.1b son aplicables también a la determinación de C1O2. 2. Instrumental

En las secciones 4500-QD.2a a d, se describe el instrumental necesario.

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

3. Reactivos

Son necesarios todos los reactivos enumerados para la determinación de cloro en la sección 4500-C1.D.3, además de los siguientes: a) Hidróxido de sodio, NaOH 6N. b) Ácido sulfúrico, H2SO4 6N 1 + 5.

4-89

d) Titulación del cloro libre disponible, cloraminas, CIO2 y clorito: Añádase 1 ml de solución de KI a la muestra. Añádase H2SO4 6N suficiente para rebajar el pH a 2. Después de 10 minutos, añádase NaOH 6N suficiente para subir el pH a 7. Titúlese con óxido de fenilarsina patrón hasta el punto final amperométrico. Regístrese el resultado como D.

4. Procedimiento

5. Cálculos

Reducir al mínimo los efectos del pH, tiempo y temperatura de reacción, estandarizando todas las condiciones.

Transfórmense las titulaciones individuales (A, B, C y D) en concentración de cloro por medio de la ecuación siguiente:

a) Titulación del cloro libre disponible (hipoclorito y ácido hipocloroso): Añádase suficiente NaOH 6N para subir el pH de la muestra a 12. Al cabo de 10 minutos, añádase H 2 SO 4 6N para rebajarlo a 7. Titúlese con óxido de fenilarsina patrón hasta el punto final amperométrico, como se indica en la sección 4500-C1.D. Regístrese el resultado como A. b) Titulación de cloro libre disponible y cloramina: Añádase NaOH 6N para subir el pH de la muestra a 12. Después de 10 minutos, añádase H2SO4 6N para reducirlo a 7. Añádase 1 ml de solución de KI. Valórese con óxido de fenilarsina patrón hasta el punto final amperométrico. Regístrese el resultado como B. c) Titulación del cloro libre disponible, cloramina y una quinta parte del CIO2 disponible: Ajústese el pH de la muestra a 7 con solución tampón fosfato de pH 7. Añádase 1 ml de solución de KI. Titúlese con óxido de fenilarsina patrón hasta el punto final amperométrico. Regístrese el resultado como C.

donde: E = ml de óxido de fenilarsina para titulación de cada muestra individual A, B, C o D.

Calcúlense las fracciones individuales de C1O2 y cloro del siguiente modo: mg mg mg mg mg

C1O 2 como C1O 2 /l = 1,9 (C − B) C1O 2 como C1 2 /l = 5 (C − B) cloro libre disponible/l = A cloramina/l como cloro = B − A clorito/l como cloro = AB − 5C + D

6. Bibliografía HALLER, J. F. & S. S. LISTEK. 1948. Determination of chlorine dioxide and other active chlorine compounds in water. Anal. Chem. 20:639.

4-90

MÉTODOS NORMALIZADOS

4500-CIO2 D.

Método de la DFD

1. Discusión general

a) Principio: Este método es una extensión del método de la N,N-dietil-pfenilendiamina (DFD) para determinación del cloro libre y las cloraminas en el agua. C1O2 aparece en el primer paso de este método, pero sólo una quinta parte de su contenido total de cloro disponible, correspondiente a la reducción del C1O2 a ion clorito. Si se acidifica entonces la muestra en presencia de yoduro, el clorito también reacciona. Cuando se neutraliza por adición posterior de bicarbonato, el color producido corresponde al contenido en cloro total disponible del C1O2. Si hubiera clorito presente en la muestra, éste se incluirá en el paso de acidificación y neutralización. El clorito no producido en la reducción de C1O2 por este procedimiento dará lugar a un error positivo igual al doble de esta concentración de clorito. Al evaluar mezclas de estos diferentes compuestos de cloro, es necesario suprimir el cloro libre por adición de glicina antes de hacer reaccionar la muestra con el reactivo DFD. La diferenciación se basa en el hecho de que la glicina transforma instantáneamente el cloro libre en ácido cloroaminoacético, pero no tiene efecto sobre C1O2. b) Interferencia: La interferencia por manganeso oxidado, descrita en la sección 4500-C1.F.1d es aplicable también a la determinación de C1O2. La interferencia de manganeso aparece como incremento en las primeras valoraciones después de añadir DFD, con o sin KI, y es independiente de que haya habido una adición previa de glicina. Las lecturas de titulación deben corregirse adecuadamente. La interferencia debida al cromato de las aguas residuales se puede corregir de forma parecida. El hierro aportado a la muestra por la adición de sulfato amónico ferroso (FAS) titulante, puede activar el clorito de mo-

do que interfiere con el primer punto final de la valoración. Suprímase este efecto con EDTA, sal disódica, adicional. 2. Reactivos

Los reactivos necesarios, además de los enumerados en la sección 4500-C1.F.2 para el método de DFD para cloro librecombinado, son los siguientes: a) Solución de glicerina: Disuélvanse 10 g de NH 2CH 2 COOH en 100 ml de agua destilada. b) Solución de ácido sulfúrico: Dilúyanse 5 ml de H2SO4 conc. a 100 ml con agua destilada. c) Solución de bicarbonato de sodio: Disuélvanse 27,5 g de NaHCO3 en 500 ml de agua destilada. d) EDTA: Sal disódica del ácido etilendiamino tetracético, sólido. 3. Procedimiento

Para muestras que contengan más de 5 mg/l de cloro total disponible, seguir el procedimiento de dilución dado en la sección 4500-C1.F.3. a) Dióxido de cloro: Añádanse 2 ml de solución de glicina a 100 ml de muestra y mézclese. Introdúzcanse 5 ml de reactivo tampón y 5 ml de solución indicadora de DFD en un matraz de valoración aparte y mézclese (o utilícense unos 500 mg de DFD en polvo). Añádanse alrededor de 200 mg de EDTA, sal disódica. Añádase entonces la muestra tratada con glicina y mézclese. Valórese rápidamente con FAS patrón hasta desaparición del color rojo (lectura G). b) Cloro libre disponible y cloramina: Utilizando una segunda muestra de 100 ml, síganse los procedimientos de la sección 4500-Cl.F.3a, añadiendo alrede-

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

dor de 200 mg de EDTA, sal disódica, inicialmente con los reactivos DFD (lecturas A, B y Q. c) Cloro total disponible incluyendo clorito: Tras obtener la lectura C, añádase 1 ml de solución de H2SO4 a la misma muestra en el matraz de valoración, mézclese y déjese reposar unos 2 minutos. Añádanse 5 ml de solución de NaHCO3, mézclese y titúlese (lectura D). d) Procedimiento calorimétrico: En lugar de titular con solución de FAS patrón, se pueden utilizar métodos colorimétricos para obtener las lecturas en cada paso. Calíbrense los colorímetros con solución patrón de permanganato como se indica en la sección 4500Cl.G.4a. En el método colorimétrico no se precisa la adición de EDTA, sal disódica, con los reactivos DFD.

4-91

Cloro disponible combinado = C − A

Si se desea comprobar la presencia de clorito en la muestra, obténgase la lectura D. Si D es mayor que C + 4G, es indicio de existencia de clorito. En presencia de clorito: Dióxido de cloro = 5G (o 1,9G expresado como C1O2) Clorito = D − ( C + 4 G) Cloro libre disponible = A − G Monocloramina = B − A Dicloramina = C − B Cloro total disponible = D

Si se omite B, Cloro combinado disponible = C − A

4. Cálculos

Para una muestra de 100 ml, 1 m de solución FAS = 1 mg de cloro disponible/l. En ausencia de clorito: Dióxido de cloro = 5G (o 1,9 G expresado como C1O2) Cloro libre disponible = A − G Monocloramina = B − A Dicloramina = C − B Cloro disponible total = C + 4G

Si se omite el paso conducente a la lectura B, se obtienen monocloramina y dicloramina juntas, cuando:

4500-CIO2 E.

5. Bibliografía PALIN, A. T. 1960. Colorimetric determination of chlorine dioxide in water. Water Sewage Works 107:457. PALIN, A. T. 1967. Methods for the determination, in water, of free and combined available chlorine, chlorine dioxide and chlorite, bromine, iodine, and ozone using diethyl-p-phenylenediamine (DPD). J. Inst. Water Eng. 21:537. PALIN, A. T. 1974. Analytical control of water disinfection with special reference to differential DPD methods for chlorine, chlorine dioxide, bromine, iodine and ozone. J. Inst. Water Eng. 28:139. P ALIN , A. T. 1975. Current DPD methods for residual halogen compounds and ozone in water. J. Amer. Water Works Assoc. 67:32.

Método amperométrico II (PROPUESTA)

1. Discusión general

a) Principio: Al igual que el método amperométrico I (sección 4500-ClO2.C),

este procedimiento conlleva las titulaciones sucesivas de combinaciones de derivados del cloro. Los cálculos posteriores determinan la concentración de cada uno

4-92

de ellos. El equilibrio para reducción de los compuestos clorados que interesan por medio de yoduro depende del pH. El análisis del cloro, dióxido de cloro, clorito y clorato en una muestra requieren los siguientes pasos: determinación de todo el cloro (libre más combinado) y una quinta parte del dióxido de cloro a pH 7; disminución del pH de la muestra a 2 y determinación de los cuatro quintos restantes de C1O2 y todo el clorito (el clorito medido en este paso procede del clorito presente originalmente en la muestra y del formado en la primera titulación); preparación de una segunda muestra por purga con nitrógeno para eliminar C1O2 y reacción con yoduro a pH 7 para eliminar cualquier cloro restante; la reducción posterior del pH de la muestra a 2 y la determinación de todo el clorito presente (este clorito procede sólo del clorito presente originalmente en la muestra), y, en una tercera muestra, determinación de todos los derivados oxidados del cloro relevantes: cloro, dióxido de cloro, clorito y clorato, tras reducción en ácido clorhídrico1. Este procedimiento se puede aplicar a soluciones concentradas (10 a 100 mg/l) o diluidas (0,1 a 10 mg/l) por selección apropiada de la concentración del titulante y tamaño de la muestra. b) Interferencias: A valores de pH por encima de 4, es posible la formación significativa de yodato si se produce yodo en ausencia de yoduro2, lo que da lugar a un sesgo negativo al valorar la primera y segunda muestra. La acidificación de estas muestras provoca la reducción del yodato a yodo y una desviación positiva. Para evitar la formación de yodato, añádase 1 g de gránulos de KI a la muestra agitada. Por oxidación del yoduro a yodo debida al oxígeno disuelto en soluciones muy acidas, se produce una desviación positiva en los resultados1. Para reducirla al mínimo, utilícese bromuro como agente reductor al valorar la tercera muestra (el

MÉTODOS NORMALIZADOS

oxígeno no oxida al bromuro en esas condiciones). Una vez se ha completado la reacción, añádase yoduro que se oxidará a yodo por acción del bromo formado en la reducción de los derivados del cloro originales. Añádase yoduro con cuidado de forma que no se pierda el bromo gaseoso. La dilución rápida de la muestra con fosfato sódico reduce la acidez de la muestra y reduce al mínimo la oxidación del yoduro por el oxígeno. El pH de la solución a valorar debe estar entre 1,0 y 2,0. Como comprobación de la oxidación del yoduro, realizar una prueba paralela en blanco. Las interferencias potenciales debidas al manganeso, cobre y nitrato se reducen al mínimo tamponando la muestra a pH≥4 3, 4. Para el método que se presenta, el pH bajo necesario para analizar clorito y clorato proporciona las condiciones favorables a las interferencias de manganeso, cobre y nitrito.

2. Instrumental

a) Tituladores: Véase la sección 4500Cl.D.2a a 2d. Los tituladores amperométricos con un sistema de electrodos platino-platino son más estables y requieren menos mantenimiento. (NOTA: El dióxido de cloro puede atacar los adhesivos utilizados para conectar la placa de platino al electrodo, dando lugar a malas lecturas.) Si se utiliza un titulador potenciométrico, dispóngase un electrodo sensor de platino y uno de referencia de cloruro de plata para detección del punto final. b) Material de vidrio: Almacénese independientemente el material de vidrio utilizado en este método del resto del material de vidrio del laboratorio y no emplearlo para otros fines, porque C1O2 reacciona con el vidrio formando una capa superficial hidrofóbica. Para satisfacer cualquier demanda de C1O2, antes de

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

utilizarlo por primera vez, sumérjase todo el material de vidrio en una solución concentrada de C1O2 (200 a 500 mg/l) durante 24 horas y aclárese sólo con agua entre usos. c) Toma de muestras: C1O2 es volátil y se evaporará fácilmente de sus soluciones acuosas. Cuando se tomen muestras de una corriente líquida, redúzcase al mínimo el contacto con el aire colocando una línea de muestreo flexible que llegue al fondo del envase para muestras, déjese rebosar el volumen en varios envases, retírese la línea de muestreo lentamente y tápense los envases dejando un espacio superior mínimo. Protéjase de la luz solar. Extráiganse las porciones de muestra con una pipeta volumétrica cuya punta se sitúa en el fondo del recipiente. Vacíese la pipeta colocando su punta por debajo de la superficie del reactivo o agua de dilución. 3. Reactivos

a) Solución patrón de tiosulfato de sodio, 0,100N: Véase sección 4500-Cl.B.2c. b) Óxido de fenilarsina patrón, 0,005 64N: Véase sección 4500-Cl.C.3a. c) Solución tampón fosfato, pH 7: Véase sección 4500-C1.D.3b. d) Yoduro de potasio, KI, gránulos. e) Solución saturada de fosfato de sodio: Prepárese una solución saturada de Na2HPO4 · 12H2O con agua destiladadesionizada. f) Solución de bromuro de potasio, 5 por 100: Disuélvanse 5 g de KBr y dilúyase a 100 ml. Consérvese en un frasco topacio con tapón de vidrio. Prepárese reciente cada semana. g) Ácido clorhídrico, HC1 conc. h) Ácido clorhídrico HC1 2,5N: Añádanse con cuidado 200 ml de HC1 conc, mezclando, a agua destilada, y dilúyase a 1.000 ml. i) Gas purgante: Utilícese nitrógeno para purgar C1O2 de las muestras. Ase-

4-93

gúrese que el gas está libre de contaminantes y pásese a través de una solución depuradora de KI al 5 por 100. Deséchese la solución al primer signo de color. 4. Procedimiento

Utilícese como titulante tiosulfato de sodio u óxido de fenilarsina. Selecciónese la concentración sobre la base del rango de concentración esperado. La masa total de derivados oxidantes no debe superar los 15 mg. Háganse diluciones adecuadas de la muestra si fuera necesario. Un volumen apropiado para titulación es de 200 a 300 ml. Es preferible analizar todas las muestras y blancos por triplicado. Redúzcanse al mínimo los efectos del pH, tiempo y temperatura de reacción por estandarización de todas las condiciones. a) Titulación del cloro residual y un quinto del CIO2 disponible: Introdúzcase 1 ml de tampón fosfato de pH 7 en un vaso y añádase agua destilada desionizada para dilución, si fuera preciso. Introdúzcase la muestra con el mínimo de aireación y añádase 1 g de KI granulado con agitación. Titúlese hasta punto final (véase sección 4500-C1.D). Regístrese la lectura A = ml titulante/ml muestra. b) Titulación de las cuatro quintas partes de ClO2 disponible y clorito: Continúese con la misma muestra, añádanse 2 ml de HC1 2,5N. Déjese reposar en la oscuridad durante 5 minutos. Titúlese hasta punto final. Regístrese la lectura B = ml titulante/ml muestra. c) Titulación de cloro no volatilizado: Póngase 1 ml de tampón fosfato pH 7 en un recipiente de purgado y añádase agua destilada desionizada para dilución, si fuera necesaria. Añádase la muestra y purgúese con gas nitrógeno durante 15 minutos. Utilícese un tubo de dispersión de gas para conseguir un buen contacto gas-líquido. Añádase 1 g de KI granulado con agitación y titúlese hasta

4-94

MÉTODOS NORMALIZADOS

punto final. Regístrese la lectura C = ml titulante/ml muestra. d) Titulación de clorito: Continúese con la misma muestra, añádanse 2 ml de HC1 2,5 N. Déjese reposar en la oscuridad durante 5 minutos. Titúlese hasta punto final y regístrese la lectura D = ml titulante/ml muestra. e) Titulación de cloro, CIO2, clorato y clorito: Añadir 1 ml de KBr y 10 ml de HC1 conc. a un matraz de reacción de 50 ml y mézclese. Añádanse con cuidado 15 ml de muestra, con el mínimo de aireación. Mézclese y tápese inmediatamente. Déjese reposar en la oscuridad durante 20 minutos. Añádase rápidamente 1 g de KI granulado y agítese enérgicamente durante 5 segundos. Transfiérase rápidamente a un matraz de valoración que contenga 25 ml de solución saturada de Na2HPO4. Lávese bien el matraz de reacción y añádase el agua de lavado al matraz de titulación. El volumen final de titulación debe estar entre 200 y 300 ml. Titúlese hasta punto final. Repítase el procedimiento del párrafo anterior utilizando agua destilada desionizada en lugar de la muestra, para determinar el valor del blanco. Regístrese la lectura E = (ml titulante muestra/ml titulante blanco)/ml muestra. NOTA: El volumen de 15 ml de muestra se puede ajustar para obtener una dilución apropiada, pero debe mantenerse la proporción de muestra a HC1.

5. Cálculos

Dado que el poder de combinación de los titulantes depende del pH, todos los cálculos se basan en los equivalentes de reducción necesaria de titulante para reaccionar con los equivalentes de oxidante presentes. Utilícese la tabla 4500C1O2:I para obtener los pesos equivalentes que se utilizarán en los cálculos. En las ecuaciones siguientes, N es la normalidad del titulante usado en equivalentes por litro y desde A hasta E se han definido previamente. Clorito, mg ClO-2 / l = D x N x 16.863 Clorato, mg ClO2- /l = = [E − (A + B)] x N x 13.909 Dióxido de cloro, mg C1O2/l = (5/4) x x (B − D) x N x 13.490 Cloro, mg Cl2/l = {A−[(B−D)/4]} x N x 35.453

6. 1.

2.

3.

Referencias AIETA, E. M., P. V. ROBERTS & M. HERNÁNDEZ. 1984. Determination of chlorine dioxide, chlorine, chlorite, and chlorate in water. J. Amer. Water Works Assoc. 76:64. WONG, G. 1982. Factors affecting the amperometric determination of trace quantities of total residual chlorine in seawater. Environ. Sci. Technol. 16:11. WHITE , G. 1972. Handbook of Chlorination. Van Nostrand Reinhold Co., Nueva Yok.

TABLA 4500-CLO2:I. PESOS EQUIVALENTES PARA CALCULAR LAS CONCENTRACIONES SOBRE LA BASE DE LA MASA

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

4. JOLLEY, R. & J. CARPENTER. 1982. Aqueous Chemistry of Chlorine: Chemistry, Analysis, and Environmental Fate of Reactive Oxidant Species. ORNL/TM-788, Oak Ridge National Lab., Oak. Ridge, Tennessee.

7. Bibliografía AIETA, E. M. 1985. Amperometric analysis of chlorine dioxide, chlorine and chlorite in aqueous

4500-F¯ 4500-F¯

solution. Presented at American Water Works Assoc. Water Quality Technology Conf. 13, Houston, Texas. GORDON, G. 1982. Improved methods of analysis for chlorate, chlorite, and hypochlorite ions. Presented at American Water Works Assoc. Water Quality Technology Conf., Nashville, Tennessee. TANG , T. F. & G. GORDON . 1980. Quantitative determination of chloride, chlorite, and chlorate ions in a mixture by successive potentiometric titrations. Anal. Chem. 52:1430.

FLUORURO* A.

Una concentración de fluoruro de 1,0 mg/l aproximadamente en el agua de bebida reduce efectivamente la caries dental sin efectos perjudiciales sobre la salud. El fluoruro puede aparecer naturalmente en el agua o se puede adicionar en cantidades controladas. Cuando el nivel de fluoruro excede los límites recomendados puede producirse fluorosis. En casos raros la concentración natural de fluoruros puede acercarse a los 10 mg/l; esas aguas deberán defluorarse. Al aumentar las prácticas de fluoración del suministro de agua como medida sanitaria pública, ha crecido la importancia de la determinación exacta de los fluoruros. El mantenimiento de su concentración óptima es esencial para conservar la eficacia y seguridad del procedimiento de fluoración. 1.

4-95

Tratamiento preliminar

Entre los métodos sugeridos para determinar el ion fluoruro (F¯) en el agua, los más satisfactorios son el de electrodo * Aprobado por el Standard Methods Committee, 1988.

Introducción y el colorimétrico. Dado que ambos están sometidos a errores debidos a iones interferentes (tabla 4500-F¯:I), puede ser necesario destilar la muestra como se indica en la sección 4500-F¯.B, antes de hacer la determinación. Cuando los iones interferentes no excedan la tolerancia del método, la determinación del fluoruro se puede hacer directamente sin destilación. 2.

Selección del método

El método de electrodo (método C) es adecuado para concentraciones de fluoruros comprendidas entre 0,1 mg/l y más de 10 mg/l. El añadir un tampón adecuado libera a este método de la gran mayoría de las interferencias que afectan al método colorimétrico SPADNS y requiere una destilación previa. Ciertas sustancias que forman parte de los residuos industriales, como los fluoboratos, pueden aparecer en concentraciones lo suficientemente altas como para dar lugar a problemas en las medidas del electrodo. Las valoraciones de fluoruro pueden realizarse con un electrodo específico de iones, o bien con un pHmetro de escala expandida o un medidor de ion especí-

4-96

MÉTODOS NORMALIZADOS TABLA 4500-F¯ :I.

CONCENTRACIÓN DE ALGUNAS SUSTANCIAS QUE PRODUCEN UN ERROR

DE 0,1 MG/L EN 1,0 MG F/L EN LOS MÉTODOS DE FLUORURO

fleo, generalmente sin destilación previa y en el tiempo necesario para que se equilibre el electrodo. El método SPADNS (D) presenta un margen analítico comprendido entre 0 y 1,40 mg F¯/l, con un desarrollo de color virtualmente instantáneo. Las determinaciones de color habrán de realizarse fotométricamente, con un fotómetro de filtro o con un espectrofotómetro. Una curva trazada a partir de estándares se empleará para establecer la concentración de fluoruro de una muestra. El fluoruro puede también valorarse mediante el método automatizado de la complexona, método E. La cromatografía de iones (sección 4110) puede resultar aceptable cuando se empleen disolventes débiles para separar los fluoruros de los picos de interferencia.

3. Toma de muestras y almacenamiento

Utilícense preferentemente botellas de polietileno para la toma y conservación de muestras de análisis de fluoruros. Las botellas de vidrio pueden también ofrecer buenas prestaciones sí no han contenido previamente soluciones con altas concentraciones de fluoruros. Aclárese siempre el recipiente con una porción de muestra. No ha de emplearse en ningún caso un exceso de agente declorante. La decloración debe realizarse con arsenito de sodio en vez de tiosulfato de sodio cuando se utilice el método SPADNS, ya que esta última sal puede generar turbidez y, en consecuencia, dar lugar a lecturas erróneas.

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

4500-F ¯ 1.

B.

4-97

Paso de destilación previa

Discusión general

Los fluoruros pueden separarse de otros componentes no volátiles en medio acuoso mediante conversión en ácido fluorhídrico o fluosilícico. La conversión se lleva a cabo empleando un ácido fuerte, de ebullición intensa. Para proteger el material de vidrio de su ataque, el ácido fluorhídrico se transforma en ácido fluosilícico por medio de cuentas de vidrio blando. Se consigue una recuperación cuantitativa del fluoruro utilizando una muestra relativamente grande. El arrastre de ácido y sulfato se reduce al mínimo por destilación en un rango de temperatura controlado. La destilación separará el fluoruro de la mayor parte de las muestras de agua. Algún fluoruro ligado muy estrechamente, como el de los materiales biológicos, puede precisar una digestión antes de destilar, pero las muestras de agua rara vez necesitan ese drástico tratamiento. En la destilación se obtiene un volumen de destilado igual al de la muestra de agua original de modo que normalmente no es preciso introducir un factor de dilución cuando se expresan los resultados analíticos. El destilado estará esencialmente libre de sustancias que puedan interferir en la determinación del fluoruro, si se utiliza el aparato adecuado y la destilación se ha realizado correctamente. El único componente volátil común, capaz de producir interferencias en el análisis colorimétrico del destilado, es el cloruro. Cuando la concentración de cloruro es suficientemente elevada para interferir, añadir sulfato de plata a la mezcla destiladora de ácido sulfúrico para reducir al mínimo la volatilización del cloruro de hidrógeno. El calentamiento de una mezcla ácidoagua puede ser peligroso si no se toman precauciones: Mézclense bien agua y ácido antes de calentar. Utilícese una camisa

calefactora de cuarzo y un agitador magnético en el aparato de destilación para simplificar el paso de mezclado.

2.

Instrumental

a) Aparato de destilación consistente en un matraz de ebullición de vidrio boro silicato de 1 l, con fondo redondo y cuello largo, un tubo de conexión, un condensador eficaz, un adaptador para el termómetro y un termómetro con escala hasta 200 °C. Úsense juntas estándar para todas las conexiones en la vía del vapor directo. Colóquese el termómetro de forma que su bulbo esté siempre sumergido en la mezcla hirviente. El aparato debe ser fácil de desmontar para permitir la adición de muestra. Se puede sustituir el termómetro por un termorregulador con su circuito, para tener cierto automatismo. Pueden utilizarse destiladores de otros tipos, evaluando cuidadosamente la recuperación de fluoruro y arrastre de sulfato. Los puntos críticos son las obstrucciones en el recorrido del vapor y la retención de líquido en el adaptador y condensador. (El condensador debe tener un recorrido de vapor con el mínimo de obstrucción. Lo ideal es un condensador de doble camisa, con el agua de enfriamiento en la exterior y en el tubo espiral interno; pero son aceptables otros condensadores, si sus obstrucciones son mínimas. Evítese el uso de condensadores tipo Graham). Evítense las llamas desnudas como fuente de calor, si es posible, ya que el calor aplicado al matraz de ebullición por encima del nivel del líquido da lugar a un calentamiento excesivo del vapor y el consiguiente arrastre de sulfato. PRECAUCIÓN: Independientemente del aparato utilizado, se debe mezclar bien la muestra con el ácido; el calentamiento de

4-98

MÉTODOS NORMALIZADOS

una mezcla muestra-ácido no homogénea dará lugar a explosiones que pueden ser violentas. En la figura 4500-F ¯:l se muestra el aparato ideal. b) Camisa calefactora hemisférica de cuarzo, para operación a voltaje completo. c) Agitador magnético, con barrita agitadora recubierta de TFE. d) Cuentas de vidrio blando. 3. Reactivos

a) Ácido sulfúrico, H2SO4 conc, calidad reactivo. b) Sulfato de plata, Ag2SO4, cristales, calidad reactivo.

Figura 4500-F¯:1. Aparato de destilación directa para fluoruro.

4. Procedimiento

a) Introdúzcanse 400 ml de agua destilada en el matraz de destilación y añádanse cuidadosamente 200 ml de H2SO4 conc. con el agitador en marcha. Manténgase la agitación durante toda la destilación. Añádanse unas cuentas de vidrio y conéctese el aparato como muestra la figura 4500-F¯:1, asegurando que todas las juntas están apretadas. Comiéncese el calentamiento y manténgase hasta que el contenido del matraz alcance los 180 °C (debido a la retención de calor por la camisa, es necesario interrumpir la calefacción cuando la temperatura llegue a 178 °C, para evitar el sobrecalentamiento). Deséchese el destilado. Este proceso elimina la contaminación del fluoruro y ajusta la proporción de ácido-agua para destilaciones posteriores. b) Después que la mezcla acida que queda en los pasos descritos en el apartado 4a, o en destilaciones preliminares, se ha enfriado a 80 °C o menos, añádanse 300 ml de muestra, con el agitador en funcionamiento, y destílese hasta que la

temperatura alcance los 180 °C. Para evitar el arrastre de sulfato, desconéctese el calor antes de los 178 °C. Reténgase el destilado para análisis. c) Añádase Ag 2SO 4 al matraz de destilación en una proporción de 5 mg/mg Cl ¯ cuando la concentración de cloruro es suficientemente elevada para interferir (véase tabla 4500-F¯:I). d) Utilícese la solución de H2SO4 del matraz repetidamente hasta que los contaminantes de las muestras se acumulen de forma que afecten a la recuperación o aparezcan interferencias en el destilado. Compruébese periódicamente la eficacia del ácido, destilando muestras patrón de fluoruro y analizando tanto el fluoruro como el sulfato. Tras destilar muestras que contengan más de 3 mg de F ¯/l, pásense 300 ml de agua destilada por el destilador, redestílense y combínense los dos destilados de fluoruro. Si fuera necesario, repítase el lavado hasta que el contenido en fluoruro del último destilado sea mínimo. Inclúyase el fluoruro adicional recuperado con el de la primera destilación. Tras períodos de inactividad, se

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

debe lavar el destilador de modo similar, desechando el destilado. 5.

Interpretación de los resultados

La recuperación de fluoruro es cuantitativa dentro de la precisión de los métodos utilizados para medirlo.

4500-F¯

C.

4-99

6. Bibliografía BELLACK, E. 1958. Simplified fluoride distillation method. J. Amer. Water Works Assoc. 50:530. B ELLACK , E. 1961. Automatic fluoride distillation. J. Amer. Water Works Assoc. 53:98. Z EHNPFENNIG , R. G. 1976. Letter to the editor. Environ. Sci. Technol. 10:1049.

Método de electrodo selectivo de iones

1. Discusión general

a) Principio: El electrodo de fluoruro es un sensor selectivo de iones. El elemento clave en el electrodo de fluoruro es el cristal de fluoruro de lantano barnizado de tipo láser, a través del cual se establece un potencial con soluciones de fluoruro de distintas concentraciones. El cristal está en contacto con la solución de muestra en una cara y con una solución interna de referencia en la otra. La célula puede representarse así: Ag|AgCl, Cl¯ (0,3M), F¯ (0,001M)|LaF3|solución test|electrodo de referencia

El electrodo de fluoruro se puede utilizar con un electrodo de referencia de calomelanos estándar y con casi todos los medidores de pH modernos que tengan una escala expandida en milivoltios. El electrodo de fluoruro mide la actividad del ion fluoruro en solución en lugar de su concentración. La actividad del ion fluoruro depende de la fuerza iónica total de la solución y del pH, así como del derivado complejante del fluoruro. La adición de un tampón adecuado proporciona una fuerza iónica ambiente casi uniforme, ajusta el pH y destruye los complejos de forma que el electrodo mlde realmente la concentración.

h) Interferencia. En la tabla 4500F¯:l se enumeran las interferencias comunes. El fluoruro forma complejos con varios cationes polivalentes, especialmente aluminio y hierro. La proporción de esa formación depende del pH de la solución, niveles relativos de fluoruro y especies formadoras de complejos. Sin embargo, CDTA (ácido ciclohexilendiamintetracético), componente del tampón, complejará preferentemente los cationes interferentes liberando iones fluoruro. Las concentraciones de aluminio (principal catión interferente) de hasta 3,0 mg/l se pueden complejar con preferencia. En solución acida, F¯ forma un complejo HF · HF mal ionizado, pero el tampón mantiene un pH por encima de 5 para reducir al mínimo la formación de fluoruro de hidrógeno complejo. En solución alcalina, el ion hidróxido puede interferir también con la respuesta del electrodo al ion fluoruro, siempre que la concentración del primero supere una décima parte de la concentración del ion fluoruro. Al pH mantenido por el tampón, no se producen interferencias del ion hidróxido. Los fluoboratos se usan ampliamente en los procesos industriales. Las soluciones diluidas de fluoborato o ácido fluobórico se hidrolizan para liberar ion fluoruro, pero en las soluciones concentradas, como los residuos galvánicos, la

4-100

hidrólisis no es completa. Destílense esas muestras o mídase el fluoborato con un electrodo selectivo de fluoborato. Destílese también la muestra cuando la concentración de sólidos disueltos exceda de 10.000 mg/l. 2.

Instrumental

a) Medidor de pH de escala expandida o digital, o medidor selectivo de iones. b) Electrodo de referencia tipo manguito: No usar electrodos de referencia de punta de fibra porque muestran un comportamiento errático en soluciones muy diluidas. c) Electrodo de fluoruro. d) Agitador magnético, con barrita agitadora recubierta de TFE. e) Reloj. 3.

Reactivos

a) Solución madre de fluoruro: Disuélvanse 221,0 mg de fluoruro de sodio anhidro, NaF, en agua destilada y diluyase a 1.000 ml; 1,00 ml = 100 µg de F¯. b) Solución patrón de fluoruro: Diluyanse 100 ml de solución madre de fluoruro a 1.000 ml con agua destilada; 1,00 ml = 10,00 µg de F¯. c) Tampón fluoruro: Introdúzcanse aproximadamente 500 ml de agua destilada en un vaso de 1 l y añádanse 57 ml de ácido acético glacial, 58 g de NaCl y 4,0 g de ácido 1,2 ciclohexilendiamintetracético (CDTA)*. Disuélvase por agitación. Póngase el vaso en un baño de agua fría y añádase lentamente NaOH 6N (alrededor de 125 ml) con agitación, hasta pH entre 5,3 y 5,5. Transfiérase a un matraz aforado de 1 l y añádase agua destilada hasta la señal. Este tampón, al igual que su versión más concentrada, se puede adquirir en el comercio. Al usar el * También conocido como ácido 1,2 ciclohexilenodinitrilotetracético.

MÉTODOS NORMALIZADOS

tampón concentrado, síganse las instrucciones del fabricante. 4.

Procedimiento

a) Calibrado del aparato: Normalmente no es preciso hacer ajustes importantes en el aparato para utilizar electrodos en el rango de 0,2 a 2,0 mg F¯/l. Para los aparatos que tengan el cero en el centro de la escala, ajústese el control de calibrado de modo que se lea el patrón de 1,0 mg de F¯/l en el cero central (100 mV) cuando la aguja esté en la posición de escala expandida. Esto no se puede hacer en algunos aparatos que no tienen control de calibrado de milivoltios. Para usar un medidor selectivo de iones, síganse las instrucciones del fabricante. b) Preparación de patrones de fluoruro: Prepárese una serie de patrones por dilución con agua destilada de 5,0, 10,0 y 20,0 ml de solución patrón de fluoruro a 100 ml. Estos patrones equivalen a 0,5, 1,0 y 2,0 mg de F¯/l. c) Tratamiento de patrones y muestra: Añádanse con pipeta aforada de 10 a 25 ml de patrón o muestra a vasos de precipitados de 100 ml u otros recipientes adecuados. Llévese el patrón y la muestra a la misma temperatura, preferiblemente la ambiental. Añádase el mismo volumen de tampón. El volumen total debe ser suficiente para sumergir los electrodos y permitir que funcione el agitador. d) Medición con el electrodo: Sumérjanse los electrodos en cada solución patrón de fluoruro y mídase el potencial desarrollado, mientras se agita sobre un agitador magnético. Evítese la agitación antes de sumergir los electrodos porque puede quedar aire atrapado alrededor del cristal, produciendo lecturas erróneas o fluctuaciones de la aguja. Déjense los electrodos durante 3 minutos en la solución (o hasta lectura constante) antes de hacer la lectura final de los milivoltios.

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

Una capa aislante entre el agitador y el vaso reduce al mínimo el calentamiento de la solución. Retírense los electrodos, lávense con agua destilada y séquense entre lecturas. (PRECAUCIÓN: El secado, si no se hace suavemente, puede alterar el electrodo.) Repítanse las mediciones con las muestras. Cuando se utilice un medidor de escala expandida o medidor selectivo de iones, recalíbrese el electrodo frecuentemente, comprobando la lectura del potencial del patrón de 1,00 mg F¯/l y ajustando el control de calibrado, si fuera necesario, hasta que el medidor lea como antes. Si no se utiliza un aparato de lectura directa, compárese la medida del potencial de los patrones de fluoruro con la concentración sobre papel gráfico semilogarítmico de dos ciclos. Pónganse los miligramos de F¯ por litro en el eje logarítmico (ordenadas), con la concentración más baja en la base de la gráfica y los milivoltios en las abscisas. Léase la concentración de fluoruro correspondiente al potencial medido para cada muestra, a partir de la curva patrón. El método de adiciones conocidas puede ser sustituido por el método de calibrado descrito. Síganse las instrucciones del fabricante del aparato. Los medidores selectivos de iones pueden requerir un método modificado ligeramente, como la preparación de patrones de 1,00 y 10,0 mg F¯/l o algunas otras concentraciones. Síganse las instrucciones del fabricante. Frecuentemente se suministran con el aparato patrones comerciales, a menudo diluidos con tampón. Compruébese la concentra-

4-101

ción de fluoruro en estos patrones, comparándolos con los patrones preparados por el analista. 5.

Cálculo

6.

Precisión y sesgo

Se ha analizado una muestra sintética con 0,850 mg F¯/l en agua destilada por el método del electrodo, en 111 laboratorios, con una desviación relativa estándar de 3,6 y 0,7 por 100 de error relativo. Una segunda muestra sintética con 0,750 mg F ¯/l, 2,5 mg (NaPO 3 ) 6 /l y 300 mg de alcalinidad añadida/l en forma de NaHCO3, se analizó en 111 laboratorios por el método del electrodo, con 4,8 por 100 de desviación relativa estándar y 0,2 por 100 de error relativo. Una tercera muestra sintética con 0,900 mg F¯/l, 0,500 mg Al/l y 200 mg SO 2-4 / l se analizó en 13 laboratorios por el método del electrodo, con 2,9 por 100 de desviación relativa estándar y 4,9 por 100 de error relativo. 7.

Bibliografía

FRANT, M. S. & J. W. Ross, JR. 1968. Use of total ionic strength adjustment buffer for electrode determination of fluoride in water supplies. Anal. Chem. 40:1169. HARWOOD, J. E. 1969. The use of an ion-selective electrode for routine analysis of water samples. Water Res. 3:273.

MÉTODOS NORMALIZADOS

4-102

4500-F¯ 1.

D.

Método del SFADNS

Discusión general

a) Principio: El método colorimétrico SFADNS se basa en la reacción entre fluoruros y una laca coloreada de zirconio. El fluoruro reacciona con la laca coloreada, disociando una parte de ella para dar un anión complejo incoloro ( Zr62- ) y el colorante. Al aumentar el contenido de fluoruro, el color producido se hace cada vez más pálido. La tasa de reacción entre los iones fluoruro y zirconio tiene una gran influencia de la acidez de la mezcla reaccionante. Si se aumenta la proporción de ácido en el reactivo, la reacción puede ser casi instantánea. Sin embargo, en esas condiciones, el efecto de los distintos iones difiere del de los métodos convencionales de alizarina. La selección del colorante para este método rápido del fluoruro está regida en gran parte por la tolerancia a esos iones. b) Interferencia: En la tabla 4500F¯:l se enumeran las interferencias comunes. Dado que no tienen un efecto lineal, ni son algebraicamente aditivas, es imposible la compensación matemática. Siempre que una sustancia esté presente en cantidad suficiente para producir un error de 0,1 mg/l, o cuando el efecto interferente total sea dudoso, se destilará la muestra. También deben destilarse las muestras coloreadas o turbias. En algunos casos se puede diluir la muestra o adicionar cantidades apropiadas de sustancias interferentes a los patrones, para compensar el efecto de interferencia. Si la única interferencia significativa fuera la alcalinidad, neutralícese con ácido clorhídrico o nítrico. El cloro interfiere y se toman medidas para eliminarlo. La medida volumétrica de la muestra y reactivo es extremadamente importante para la precisión analítica. Utilícense muestras y patrones a la misma temperatura o por lo menos con diferencias infe-

riores a 2 °C. Manténgase la temperatura constante durante el período de desarrollo del color. Prepárense varias curvas de calibrado para los diferentes rangos de temperatura. 2.

Instrumental

Equipo calorimétrico: Se precisa uno de los siguientes: a) Espectrofotómetro, para uso a 570 nm, con un recorrido de luz de 1 cm, por lo menos. b) Fotómetro de filtro, con un recorrido de luz de 1 cm, por lo menos, y provisto de un filtro amarillo verdoso que tenga el máximo de transmitancia de 550 a 580 nm.

3.

Reactivos

a) Solución patrón de fluoruro: Prepárese tal como se indica en el método del electrodo, sección 4500-F¯ .C3b. b) Solución de SFADNS: Disuélvanse 958 mg de SFADNS, sodio 2-(parasulfofenilazo)-l,8-dihidroxi-3,6-naftalen disulfonato, denominado también sal disódica del ácido 4,5-dihidroxi-3-(parasulfofenilazo)-2,7-naftalendisulfónico, en agua destilada, y dilúyase a 500 ml. Esta solución es estable durante 1 año, por lo menos, si se protege de la luz solar directa. c) Reactivo zirconil-ácido: Disuélvanse 133 mg de cloruro de zirconilo, octahidratado, ZrOCl2 · 8H2O, en unos 25 ml de agua destilada. Añádanse 350 ml de HC1 conc. y dilúyase a 500 ml con agua destilada. d) Reactivo zirconil ácido-SFADNS: Mézclense volúmenes iguales de solución de SFADNS y reactivo zirconio-ácido. El reactivo combinado es estable durante 2 años, por lo menos.

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

4-103

e) Solución de referencia: Añádanse 10 ml de solución de SFADNS a 100 ml de agua destilada. Dilúyanse 7 ml de HC1 conc. a 10 ml y añádanse a la solución diluida de SFADNS. La solución resultante, usada para ajustar el punto de referencia (cero) del aparato, es estable durante 1 año, por lo menos. Alternativamente, utilícese un patrón preparado de 0 mg F¯/l como referencia. j) Solución de arsenito de sodio: Disuélvanse 5,0 g de NaAsO2 y dilúyase a 1 l con agua destilada. (PRECAUCIÓN: Tóxico; evítese su ingestión).

c) Desarrollo del color: Úsese una muestra de 50,0 ml o una porción diluida a 50 ml con agua destilada. Ajústese la temperatura de la muestra a la utilizada para la curva patrón. Añádanse 5,00 ml de solución de SFADNS y 5,00 ml de reactivo zirconilo-ácido, o 10,00 ml de reactivo ácido-zirconilo-SFADNS; mézclese bien y léase la absorbancia, ajustando primero el punto de referencia del fotómetro, como antes. Si la absorbancia queda fuera del rango de la curva patrón, repítase la lectura con una muestra diluida.

4.

5.

Procedimiento

a) Preparación de la curva patrón: Prepárense patrones de fluoruro en la gama de 0 a 1,40 mg F ¯ /l, diluyendo cantidades apropiadas de solución patrón de fluoruro a 50 ml con agua destilada. Llévense con la pipeta 5,00 ml de solución SFADNS y 5,00 ml de reactivo zirconilo-ácido, o 10,00 ml de reactivo mixto ácido-zirconilo-SFADNS, a cada patrón y mézclese bien. Evítese la contaminación. Ajústese el fotómetro de absorbancia a cero con la solución de referencia y obténganse las lecturas de absorbancia de los patrones. Trácese una curva relacionando los miligramos de fluoruro con la absorbancia. Prepárese una curva nueva cada vez que se prepare un nuevo reactivo o se desee una temperatura estándar distinta. Como alternativa al uso de una referencia, ajústese el fotómetro a un punto conveniente (absorbancia 0,300 o 0,500) con el patrón preparado de 0 mg F¯/l. b) Tratamiento preliminar de la muestra: Si la muestra contiene cloro residual, elimínese por adición de 1 gota (0,05 ml) de solución de NaAsO2/0,l mg de cloro residual y mezclando. (La concentración de arsenito de sodio de 1.300 mg/l produce un error de 0,1 mg/l con 1,0 mg F¯/l).

Cálculo

donde: A = µg F ¯determinado a partir de la curva trazada, B = volumen final de muestra diluida, ml, y C = volumen de muestra diluida utilizada para desarrollar el color, ml.

Cuando se utiliza el patrón preparado de 0 mg F¯/l para ajustar el fotómetro, se puede calcular la concentración de fluoruro de otro modo:

donde: A 0 = absorbancia del patrón de 0 mg F ¯/l, A 1 = absorbancia del patrón preparado con 1,0 mg F¯/l, y A x = absorbancia de la muestra preparada.

6.

Precisión y sesgo

Se analizó en 53 laboratorios por el método SFADNS una muestra sintética con 0,830 mg F¯/l, sin interferencias, en agua destilada, con una desviación están-

MÉTODOS NORMALIZADOS

4-104

dar relativa del 8,0 por 100 y 1,2 por 100 de error relativo. Tras destilación directa de la muestra, la desviación estándar relativa era del 11,0 por 100 y el error relativo 2,4 por 100. Una muestra sintética con 0,570 mg F ¯/l, 10 mg Al/l, 200 mg SO 2-4 /l y 300 mg de alcalinidad total/l, se analizó en 53 laboratorios por el método SFADNS, sin destilación, con 16,2 por 100 de desviación estándar relativa y 7,0 por 100 de error relativo. Tras destilación directa de la muestra, la desviación estándar relativa fue del 17,2 por 100 y el error relativo 5,3 por 100.

4500-F¯ E. 1.

7.

Bibliografía

BELLACK, E. & P. J. SCHOUBOE. 1968. Rapid photometric determination of fluoride with SPADNS-zirconium lake. Anal. Chem. 30:2032.

Método de la complexona

Discusión general

a) Principio: La muestra se destila en el sistema automatizado, y el destilado reacciona con reactivo azul-lantano de alizarina flúor para formar un complejo azul que se mide colorimétricamente a 620 nm. b) Interferencias: Las interferencias asociadas normalmente a la determinación del flúor, se eliminan por destilación. c) Aplicación: Este método es aplicable a las aguas potables, superficiales y salinas, así como a las residuales domésticas e industriales. El rango del método, que se puede modificar utilizando un colorímetro ajustable, es de 0,1 a 2,0 mg F¯/l. 2.

Una muestra sintética con 0,680 mg F ¯/l, 2 mg Al/l, 2,5 mg (NaPO 3 ) 6 /l, 200 mg SO 2-4 /l y 300 mg de alcalinidad total/l, se analizó en 53 laboratorios por destilación y SFADNS, con 2,8 por 100 de desviación estándar relativa y 5,9 por 100 de error relativo.

Instrumental

El equipo analítico de flujo continuo requerido* consta de componentes intercambiables en el número y forma indicados en la figura 4500-F¯:2. * Technicon™ Autoanalyzer™ II o equivalente.

3.

Reactivos

a) Solución patrón de fluoruro: Prepárese en concentraciones apropiadas desde 0,10 a 2,0 mg F¯/l, empleando la solución madre de fluoruro (véase sección 4500-F¯.C.3a). b) Reactivo de destilación: Añádanse 50 ml de H2SO4 conc a unos 600 ml de agua destilada. Añádanse 10,00 ml de solución madre de fluoruro (véase sección 4500-F¯.C.3a; 1,00 ml = 100 µg F¯) y dilúyase a 1.000 ml. c) Solución tampón acetato: Disuélvanse 60 g de acetato de sodio anhidro, NaC2H3O2 en unos 600 ml de agua destilada. Añádanse 100 ml de ácido acético conc (glacial) y diluir a 1 l. d) Solución madre azul de alizarina flúor: Añádanse 960 mg de alizarina flúor†, C14H 7O 4· CH 2N(CH 2· COOH) 2, a 100 ml de agua destilada. Añádanse 2 ml de NH 4 OH conc y mézclese hasta disolución del colorante. Añádanse 2 ml de ácido acético conc. (glacial), dilúyase a 250 ml y consérvese en frasco topacio en el frigorífico. † J. T. Baker Catalog n°. J-112 o equivalente.

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

4-105

Figura 4500-F¯ :2. Distribuidor de fluoruro.

e) Solución madre de nitrato de lantano: Disuélvanse 1,08 g de la (NO3)3 en unos 100 ml de agua destilada, dilúyase a 250 ml y consérvese en frigorífico. f) Reactivo coloreado de trabajo: Mézclese en el orden siguiente: 300 ml de solución tampón de acetato, 150 ml de acetona, 50 ml de butanol terciario, 36 ml de solución madre azul de alizarina flúor, 40 ml de solución madre de nitrato de lantano y 2 ml de polioxietilen

23 lauril éter‡. Dilúyase a 1 l con agua destilada. Este reactivo es estable durante 2 a 4 días. 4.

Procedimiento

No se requiere manipulación o preparación especial de la muestra. ‡ Brij-35, suministrado por ICI Americas, Wilmington, Delaware, o Technicon Instruments Corp., Tarrytown, Nueva York, o equivalente.

4-106

MÉTODOS NORMALIZADOS

Móntese el aparato como muestra la figura 4500-F¯:2 y síganse las instrucciones del fabricante.

5.

Cálculo

Prepárense curvas patrón, comparando los picos de altura de los patrones procesados por el aparato con las concentraciones de los componentes en los patrones. Calcúlense las concentraciones de la muestra por comparación de la altura del pico de la muestra con la curva patrón.

4500-H +

Precisión y sesgo

En un único laboratorio, se analizaron cuatro muestras de agua natural conteniendo de 0,40 a 0,82 mg F¯/l, por septuplicado. La precisión media fue de ± 0,03 mg F¯/l. Se añadieron 0,20 y 0,80 mg F71 a dos de las muestras. La recuperación media fue del 98 por 100. 7.

Bibliografía

WEINSTEIN , L. H., R. H. MANDL, D. C. MCCU NE, J. S. JACOBSON & A. E. HITCHCOCK. 1963. A semi-automated method for the determination of fluorine in air and plant tissues. Boyce Thompson Inst. 22:207.

VALOR DE pH*

4500-H+ A. 1.

6.

Principios

La medida del pH es una de las pruebas más importantes y frecuentes utilizadas en el análisis químico del agua. Prácticamente todas las fases del tratamiento del agua para suministro y residual, como la neutralización ácido-base, suavizado, precipitación, coagulación, desinfección y control de la corrosión, dependen del pH. El pH se utiliza en las determinaciones de alcalinidad y dióxido de carbono y en muchos otros equilibrios ácido-base. A una temperatura determinada, la intensidad del carácter ácido o básico de una solución viene dada por la actividad del ion hidrógeno o pH. La alcalinidad y acidez son las capacidades neutralizantes de ácidos y bases de un

Introducción agua, y normalmente se expresan como miligramos de CaCO3 por litro. La capacidad tampón es la cantidad de ácido o base fuerte, normalmente expresada en moles por litro, necesaria para cambiar el valor del pH de 1 l de muestra en 1 unidad. Sorenson1 definió el pH como el − log [H + ]; es el factor de «intensidad» o acidez. El agua pura está muy poco ionizada y en el equilibrio el producto iónico es:

y

donde: * Aprobado por el Standard Methods Committee, 1985.

[H + ] = actividad de iones hidrógeno, moles/l, [OH¯] = actividad de iones hidroxilo, moles/l, y K w = producto iónico del agua.

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

Debido a las interacciones en todas las soluciones, excepto en las muy diluidas, es necesario utilizar la «actividad» de un ion y no su concentración molar. El uso del término pH supone que se está considerando la actividad del ion hidrógeno, aH+. La equivalencia aproximada con la molaridad, [H+], sólo se puede presumir en soluciones muy diluidas (fuerza iónica 6,0 mg I¯/l: Introdúzcanse aproximadamente 25 ml de agua en un matraz aforado de 100 ml. Añádase 1,0 ml de tampón cítrico y un volumen medido de 25 ml de muestra o menos. Añádase 0,5 ml de solución de KHSO5. Mézclese por rotación y déjese reposar durante 1 minuto aproximadamente. Añádase 1,0 ml de indica-

dor violeta leuco cristal, mézclese y diluyase a 100 ml. Léase la absorbancia fotométricamente y compárese con la curva de calibrado, a partir de la cual se obtiene la concentración inicial de yoduro por aplicación del factor de dilución. Selecciónese uno de los volúmenes de muestra siguientes para mantenerse dentro del rango óptimo de yoduro.

e) Determinación de yoduro en pre-

sencia de yodo: Determínese en muestras separadas (1) el yodo y yoduro totales, y (2) yodo. La concentración de yoduro es la diferencia entre el yodo determinado y el yodo-yoduro total obtenido. Determínese el yodo, no adicionando solución KHSO5 en el método de yoduro y comparando el valor de la absorbancia con la curva de calibrado desarrollada por el yoduro. f) Compensación de la turbidez y color: Compénsese el color y turbidez naturales por adición de 5 ml de solución Na2S2O3 a una muestra de 50 ml. Añádanse los reactivos a la muestra como se ha descrito previamente y úsese el blanco para ajustar la absorbancia cero en el fotómetro. Mídanse todas las muestras en relación con este blanco y determínense las concentraciones de yoduro o yodoyoduro total, a partir de la curva de calibrado. 5. Bibliografía BLACK, A. P. & G. P. WHITTLE. 1967. New methods for the colorimetric determination of halogen residuals. Parte I. Iodine, iodide, and iodate. J. Amer. Water Works Assoc. 59:471.

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

4500-1 1.

C.

Método de reducción catalítica

Discusión general

a) Principio: Se puede determinar el yoduro utilizando su capacidad de catalizar la reducción de los iones céricos por ácido arsenioso. El efecto es no-linealmente proporcional a la cantidad de yoduro presente. La reacción se detiene tras un intervalo de tiempo específico por adición de sulfato ferroso amónico. Los iones férricos resultantes son directamente proporcionales a los iones céricos restantes y producen un complejo coloreado relativamente estable con el tiocianato de potasio. Para estimar las formas de yodo ligadas, no susceptibles, además del ion yoduro usual, son necesarias la digestión con ácido crómico y la destilación, existiendo procedimientos para estas aplicaciones especiales1. b) Interferencias: La producción de formas de yodo no catalíticas y los efectos inhibidores de la plata y el mercurio se reducen por adición de un exceso de cloruro de sodio (NaCl) que sensibiliza la reacción. 2.

4-123

Instrumental

a) Baño de agua, capaz de controlar la temperatura a 30 ± 0,5 °C. b) Equipo colorimétrico: Es necesario uno de los siguientes:

1) Espectrofotómetro, para uso a longitudes de onda de 510 o 525 nm y con un recorrido de luz de 1 cm. 2) Fotómetro de filtro, con recorrido de luz de 1 cm y equipado con un filtro verde cuyo máximo de transmitancia está próximo a 525 nm. c) Tubos de ensayo, 2 x 15 cm. d) Cronómetro.

3.

Reactivos

Consérvense todas las soluciones de reserva en envases bien cerrados, en la oscuridad. Prepárense todas las soluciones de reactivos con agua destilada. a) Agua destilada, conteniendo menos de 0,3 µg I total/l. b) Solución de cloruro de sodio: Disuélvanse 200,0 g de NaCl en agua y dilúyase a 1 l. Recristalícese el NaCl si hubiera una cantidad de yodo interferente, utilizando una mezcla de agua-etanol. c) Ácido arsenioso: Disuélvanse 4,946 g de As2O3 en agua, añádanse 0,20 ml de H2SO4 conc. y dilúyase a 1.000 ml. d) Ácido sulfúrico, H2SO4 conc. e) Sulfato cérico amónico: Disuélvanse 13,38 g de Ce(NH4)4(SO4)4 · 4H2O en agua, añádanse 44 ml de H2SO4 conc. y llévese a 1 l. f) Reactivo de sulfato ferroso amónico: Disuélvanse 1,50 g de Fe(NH4)2(SO4)2 · · 6H2O en 100 ml de agua destilada conteniendo 0,6 ml de H2SO4 conc. Prepárese diariamente. g) Solución de tiocianato de potasio: Disuélvanse 4,00 g de KSCN en 100 ml de agua. h) Solución madre de yoduro: Disuélvanse 261,6 mg de KI anhidro en agua y dilúyase a 1.000 ml; 1,00 ml = 200 µg de I¯. i) Solución intermedia de yoduro: Dilúyanse 20,00 ml de solución madre de yoduro a 1.000 ml con agua; 1,00 ml = = 4,00 µg de I¯. j) Solución patrón de yoduro: Diluyanse 25,00 ml de solución intermedia de yoduro a 1.000 ml con agua; 1,00 ml = = 0,100 µg de I¯. 4.

Procedimiento

a) Tamaño de la muestra: Añádanse 10,00 ml de muestra, o una porción lleva-

MÉTODOS NORMALIZADOS

4-124

da a 10,00 ml con agua, a un tubo de ensayo de 2 x 15 cm. Si es posible, manténgase el contenido de yoduro en el rango de 0,2 a 0,6 µg. Utilícese material de vidrio y equipo perfectamente limpios. b) Medida del color: Añádanse los reactivos en el orden siguiente: 1,00 ml de solución de NaCl, 0,50 ml de solución de As2O3 y 0,50 ml de H2SO4 conc. Póngase la mezcla reaccionante y solución de sulfato cérico amónico en un baño de agua a 30 °C y déjese que se equilibre la temperatura. Añádase 1,0 ml de solución de sulfato cérico amónico, mézclese por inversión y póngase en marcha el cronómetro con el tiempo de reacción. Úsese un tapón de tubo de ensayo inerte, limpio, al mezclar. Tras 15 ± 0,1 minutos, retírese la muestra del baño y añádase inmediatamente 1,00 ml de reactivo de sulfato ferroso amónico, mezclándolos, con lo que desaparecerá el color amarillo del ion cérico. Añádase y mézclese entonces 1,00 ml de solución de KSCN. Vuélvase a llevar la muestra al baño de agua. Léase la absorbancia en un aparato fotométrico dentro de la hora siguiente a la adición del tiocianato. Manténgase la temperatura de la solución y cubeta a 30 ± 0,5 °C hasta haber determinado la absorbancia. Si se trabaja con varias muestras, comiéncense las reacciones a intervalos de 1 minuto, dejando tiempo para las adiciones de sulfato ferroso amónico y tiocianato. (Si no fuera posible controlar la temperatura de la cubeta, déjese que la solución final esté a temperatura ambiente y mídase la absorbancia con la cubeta a esa temperatura.) c) Patrones de calibrado: Trátense los patrones que contienen 0, 0,2, 0,4, 0,6 y

0,8 µg de I /l0,00 ml de solución como en el apartado 4b anterior. Trabájese con ellos en paralelo en cada conjunto de muestras, para establecer una curva de calibrado. 5.

Cálculo

6.

Precisión y sesgo

Los resultados obtenidos con este método son reproducibles sobre muestras de las aguas de las fuentes de Los Ángeles, y se ha comunicado una precisión de ±0,3 µg I¯/l en muestras de agua de Yugoslavia que contenían de 0 a 14,0 µg I ¯/l. 7.

Referencia

1. Standard Methods for the Examination of Water, Sewage and Industrial Wastes, 10.a ed. 1955. American Public Health Assoc, American Water Works Assoc, & Fed. of Sewage & Industrial Wastes Associations, Nueva York, págs. 120-124.

8.

Bibliografía

ROGINA, B. & M. DUBRAVCIC. 1953. microdetermination of iodides by arresting the catalytic reduction of ceric ions. Analyst 78:594. DUBRAVCIC, M. 1955. Determination of iodine in natural waters (sodium chloride as a reagent in the catalytic reduction of ceric ions). Analyst 80:295.

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

4500-N

4-125

NITRÓGENO*

Las formas de nitrógeno de mayor interés en las aguas naturales y residuales son, por orden decreciente de su estado de oxidación, nitrato, nitrito, amoníaco y nitrógeno orgánico. Todas esas formas del nitrógeno, lo mismo que el nitrógeno gaseoso (N2), son interconvertibles bioquímicamente y forman parte del ciclo del nitrógeno. Su interés se debe a varias razones. El nitrógeno orgánico se define funcionalmente como nitrógeno ligado orgánicamente en el estado de oxidación trinegativo. No incluye a todos los compuestos orgánicos del nitrógeno. Analíticamente, el nitrógeno orgánico y el amoníaco se pueden determinar juntos y se han denominado «nitrógeno kjeldahl», un término que refleja la técnica utilizada en su determinación. El nitrógeno orgánico incluye productos naturales, como las proteínas y péptidos, ácidos nucleicos y urea, y numerosos materiales orgánicos sintéticos. La concentración típica del nitrógeno orgánico varía desde unos cientos de microgramos por litro en algunos lagos hasta más de 20 mg/l en las aguas residuales brutas. El nitrógeno oxidado total es la suma del nitrógeno de nitrito y nitrato. El nitrato se presenta generalmente como trazas en el agua de superficie, pero puede alcanzar niveles elevados en las subterráneas. En cantidades excesivas, contribuye a una enfermedad infantil denominada metahemoglobinemia. Para evitarlo, se ha establecido un límite de 10 mg de nitrato como N/l para el agua de bebida. El nitrato se encuentra sólo en pequeñas cantidades en las aguas residuales domésticas recientes, pero en el diluyente de las plantas de tratamiento biológico nitrificante, el nitrato puede encontrarse en concentraciones de hasta 30 mg de nitra* Aprobado por el Standard Methods Committee, 1988.

to como nitrógeno/l. Es un nutriente esencial para muchos autótrofos fotosintéticos, y en algunos casos ha sido identificado como el determinante del crecimiento. El nitrito es un estado intermedio de la oxidación del nitrógeno, tanto en la oxidación del amoníaco a nitrato como en la reducción del nitrato. Esa oxidación y reducción pueden ocurrir en las plantas de tratamiento de aguas residuales, sistemas de distribución del agua y aguas naturales. El nitrito puede pasar al sistema de suministro de agua debido a su uso como inhibidor de la corrosión en el agua para procesos industriales. El nitrito es el agente causal real de la metahemoglobinemia. El ácido nitroso, formado a partir del nitrito en soluciones acidas, puede reaccionar con aminas secundarias (RR'NH) dando lugar a nitrosaminas (RR'N-NO), muchas de las cuales son agentes carcinógenos reconocidos. La significación toxicológica de las reacciones de nitrosación in vivo y en el entorno natural es un tema de gran preocupación e investigación actualmente. El amoníaco se encuentra de forma natural en las aguas superficiales y residuales. Su concentración suele ser baja en las aguas subterráneas debido a que es adsorbido en las partículas y arcillas del suelo y no se extrae fácilmente por lixiviación. Se produce en gran parte por desaminación de los compuestos orgánicos nitrogenados y por hidrólisis de la urea. En algunas plantas de tratamiento del agua, se añade amoníaco para que reaccione con el cloro y forme cloro residual combinado. En la cloración de diluyentes de aguas residuales con contenido amoniacal, no se obtiene prácticamente cloro residual libre hasta que el amoníaco se ha oxidado. En cambio, el cloro reacciona con amoníaco para formar mono- y dicloraminas. Las concentraciones de amoníaco

4-126

MÉTODOS NORMALIZADOS

halladas en el agua varían desde menos de 10 µg de nitrógeno amoniacal/l en algunas aguas naturales superficiales y profundas, hasta más de 30 mg/l en algunas aguas residuales.

4500-NH3

nitrito como NO-2 -N y al nitrógeno amoniacal como NH3-N.

NITRÓGENO (AMONÍACO)*

4500-NH3A. 1.

En este manual, nos referiremos al nitrógeno orgánico como N orgánico, al nitrógeno de nitrato como NO3- -N, al de

Selección del método

Los dos factores principales que influyen en la selección del método para determinar el amoníaco, son la concentración y la presencia de interferencias. En general, la determinación manual directa de concentraciones bajas de amoníaco se limita a las aguas potables, aguas superficiales limpias y diluyentes residuales nitrificados de buena calidad. En otros casos, y cuando existan interferencias y se necesita mayor precisión, se requiere un paso preliminar de destilación (B). Para concentraciones elevadas de amoníaco es preferible una técnica de destilación y titulación. Los datos presentados más adelante en el apartado 4 y en la tabla 4500NH3:I, serán útiles al seleccionar el método de análisis apropiado. Se presentan dos técnicas colorimétricas manuales —la nesslerización (C) y el método de la sal de fenol (D)— y un método de titulación (E). También se incluyen un método de electrodo selectivo de amoníaco (F), que se puede utilizar con o sin destilación previa de la muestra; un método de electrodo selectivo de amoníaco, que utiliza una adición conocida (G), y una versión automatizada del método de la sal de fenol. Mientras los rangos establecidos para la concentra* Aprobado por el Standard Methods Committee. 1985.

Introducción ción máxima en los métodos manuales no son rigurosos, es preferible la titulación a concentraciones superiores a los niveles máximos fijados para el método fotométrico. El método de Nessler es sensible a 20 µg de NH3-N/l en condiciones óptimas y puede utilizarse hasta 5 mg de NH3-N/l. La turbidez, el color y las sustancias precipitadas por el ion hidroxilo, como magnesio y calcio, interfieren y pueden eliminarse por destilación previa o, menos satisfactoriamente, por precipitación con sulfato de zinc y álcali. El método manual de la sal de fenol tiene una sensibilidad de 10 µg NH3-N/l y es útil hasta 500 µg NH3-N/l. Si la alcalinidad supera los 500 mg de CaCO3/l, existe turbidez o color o la muestra se ha conservado con ácido es precisa la destilación previa. El procedimiento de destilación y titulación se emplea principalmente para concentraciones de NH3-N superiores a 5 mg/l. Es obligada la destilación en absorbente de ácido sulfúrico (H2SO4) para el método de la sal de fenol cuando existan interferencias. El ácido bórico será el absorbente tras la destilación, cuando el destilado vaya a ser nesslerizado o titulado. El método del electrodo selectivo de amoníaco es aplicable en el rango de 0,03 a 1.400 mg de NH3-N/l.

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

4-127

4-128

2.

Interferencias

La glicina, urea, ácido glutámico, cianatos y acetamida hidrolizan muy lentamente en solución o reposo, pero sólo la urea y los cianatos producirán la hidrólisis en la destilación a pH 9,5. La hidrólisis supone alrededor del 7 por 100 a ese pH para la urea, y alrededor del 5 por 100 para los cianatos. Glicina, hidracina y algunas aminas reaccionarán con el reactivo Nessler produciendo el color amarillo característico en el tiempo requerido por la prueba. Del mismo modo, los compuestos alcalinos volátiles, como la hidracina y las aminas, influirán en los resultados titulométricos. Algunos compuestos orgánicos, como las cetonas, aldehídos, alcoholes, y algunas aminas pueden producir un color amarillento o verdoso o turbidez en la nesslerización que sigue a la destilación. Algunos de ellos, como el formaldehído, pueden ser eliminados hirviendo a pH bajo antes de nesslerizar. Elimínese el cloro residual tratando la muestra previamente. 3.

Almacenamiento de las muestras

Se obtienen resultados más fiables con las muestras recientes. Destrúyase el cloro residual inmediatamente después de obtener las muestras para impedir su reacción con el amoníaco. Si es imposible un análisis rápido, consérvense las muestra con 0,8 ml de H2SO4 conc./l de muestra y manteniéndolas a 4 °C. El pH de las muestras conservadas con ácido debe estar comprendido entre 1,5 y 2. Algunas aguas residuales pueden precisar más H2SO4 conc. para conseguir ese pH. Si se utiliza la conservación con ácido, neutralícense las muestras con NaOH o KOH inmediatamente antes de hacer la determinación. 4.

Precisión y sesgo

Se analizaron seis muestras sintéticas que contenían amoníaco y otros compo-

MÉTODOS NORMALIZADOS

nentes disueltos en agua destilada, por cinco procedimientos distintos. Las tres primeras muestras se sometieron sólo a nesslerización directa, destilación seguida de nesslerización y destilación seguida de titulación. Las muestras 4 a 6 se analizaron por nesslerización directa, por destilación seguida de nesslerización, por el método de la sal de fenol solamente y por destilación seguida del método de la sal de fenol. Los resultados obtenidos por los laboratorios participantes se resumen en la tabla 4500-NH3:I. La muestra 1 contenía los siguientes componentes adicionales: 10 mg Cl¯/l, 1,0 mg NO3- -N/l, 1,5 mg N orgánico/l, 10,0 mg PO3-4 /l y 5,0 mg sílice/l. La muestra 2 contenía los siguientes componentes: 200 mg Cl- /l, 1,0 mg NO3- -N/l, 0,8 mg N orgánico/l, 5,0 mg PO3-4 /l y 15,0 mg de sílice/l. La muestra 3 contenía los siguientes componentes adicionales: 400 mg Cl¯/l, 1,0 mg NO3- -N/l, 0,2 mg N orgánico/l, 0,5 mg PO3-4 /l y 30,0 mg de sílice/l. La muestra 4 contenía los siguientes componentes adicionales: 400 mg, Cl¯/l, 0,05 mg NO3- -N/l, 0,23 mg fósforo orgánico/l adicionado en forma de ácido adenílico, 7,00 mg fósforo ortofosfato/l y 3,00 mg fósforo polifosfato/l adicionado como hexametafosfato de sodio. La muestra 5 contenía los siguientes componentes adicionales: 400 mg Cl¯/l, 5,00 mg NO3- -N/l, 0,09 mg fósforo orgánico/l añadido en forma de ácido adenílico, 0,6 mg fósforo ortofosfato/l y 0,3 mg fósforo polifosfato/l añadido como hexametafosfato de sodio. La muestra 6 contenía los siguientes compuestos adicionales: 400 mg Cl¯/l, 0,4 mg NO3- -N/l, 0,03 mg fósforo orgánico/l añadido en forma de ácido adenílico, 0,1 mg fósforo ortofosfato/l y 0,08 mg fósforo polifosfato/l añadido como hexametafosfato de sodio. Para el método del electrodo selectivo de amoníaco en un único laboratorio que utilizó muestras de agua superficial a

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

4-129

TABLA 4500-NH3:II. PRECISIÓN Y SESGO DEL ELECTRODO SELECTIVO DE AMONÍACO

concentraciones de 1,00, 0,77, 0,19 y 0,13 mg NH3-N/l, las desviaciones estándar fueron ±0,038, ±0,007, ±0,007 y ± 0,003, respectivamente. En un único laboratorio que utilizó muestras de agua superficial a concentraciones de 0,10 y 0,13 NH3-N/I, las recuperaciones fueron del 96 y 91 por 100, respectivamente. Los resultados de un estudio entre laboratorios, con 12 participantes que utilizaron el método del electrodo selectivo de amo-

níaco † sobre agua destilada y diluyentes, se resumen en la tabla 4500-NH3:II Para un sistema automatizado de sal de fenol ‡, en un solo laboratorio que utilizó muestras de agua superficial a concentraciones de 1,41, 0,77, 0,59 y 0,43 mg NH 3 -N/l, la desviación estándar fue ± 0,005 y a concentraciones de 0,16 y 1,44 mg NH3-N/l, las recuperaciones fueron 107 y 99 por 100, respectivamente.

† American Society for Testing and Materials, Método ASTM 1426-79.

‡ Autoanalizador™ I, Technicon Instrument Corp., Tarrytown, Nueva York, 10591.

4500-NH3 B. 1.

Paso previo de destilación

Discusión general

La muestra se tampona a pH 9,5 con un tampón de borato para reducir la hidrólisis de los cianatos y los compuestos orgánicos nitrogenados. Se destila a una solución de ácido bórico, cuando se van a utilizar nesslerización o titulación, o sobre H2SO4 cuando sea el método de la sal de fenol. Se puede determinar el amoníaco del destilado bien colorimétrica-

mente por nesslerización o por el método de la sal de fenol, o bien titulométricamente con H2SO4 estándar y un indicador mixto o un medidor de pH. La elección del método colorimétrico o el acidimétrico depende de la concentración de amoníaco. También se puede determinar el amoníaco del destilado por el método del electrodo selectivo de amoníaco, mediante H2SO4 0,04N para retener el destilado.

4-130

2.

Instrumental

a) Aparato de destilación: Dispóngase un matraz de vidrio de borosilicato de 800 a 2.000 ml de capacidad, unido a un condensador vertical de forma que el extremo de salida se pueda sumergir debajo de la superficie de la solución acida receptora. Utilícese un aparato totalmente fabricado en vidrio de borosilicato, o uno cuyas unidades de condensación sean tubos de estaño o aluminio. b) pHmetro. 3.

Reactivos

a) Agua exenta de amoníaco: Prepárese por intercambio iónico o destilación.

1) Intercambio iónico: Prepárese agua exenta de amoníaco pasando agua destilada a través de una columna cambiadora de iones que contenga una resina cambiadora de cationes, muy acida, mezclada con una cambiadora de aniones, muy básica. Selecciónense resinas que eliminen los compuestos orgánicos interferentes en la determinación de amoníaco. Algunas resinas cambiadoras de aniones tienden a liberar amoníaco. En ese caso, prepárese el agua exenta de amoníaco con una resina cambiadora de cationes muy acida. Regenérese la columna según las instrucciones del fabricante. Compruébese en el agua exenta de amoníaco la posibilidad de un valor elevado del blanco. 2) Destilación: Elimínense las trazas de amoníaco en el agua destilada por adición de 0,1 ml de H2SO4 a 1 l de agua destilada y redestilando. Otro método consiste en tratar el agua destilada con suficiente agua de cloro o bromo para producir un residuo libre de halógenos de 2 a 5 mg/l y redestilar tras un reposo de 1 hora por lo menos. Deséchense los primeros 100 ml de destilado. Compruébese en el agua redestilada la posibilidad de un blanco elevado.

MÉTODOS NORMALIZADOS

Es muy difícil conservar agua exenta de amoníaco en el laboratorio sin contaminación por el amoníaco gaseoso. Sin embargo, si fuera necesario conservarla, se debe hacer en un recipiente de vidrio, tapado herméticamente, al que se añaden alrededor de 10 g de resina intercambiadora de iones (preferiblemente una resina intercambiadora de cationes fuertemente acida) por litro de agua exenta de amoníaco. Para utilizarla, déjese sedimentar la resina y decántese el agua exenta de amoníaco. Si se produjera un valor elevado del blanco, sustitúyase la resina o prepárese de nuevo el agua exenta de amoníaco. Utilícese el agua destilada exenta de amoníaco para preparar todos los reactivos, lávese y Dilúyanse las muestras. b) Solución tampón de borato: Añádanse 88 ml de solución de NaOH 0,1 N a 500 ml aproximados de solución de tetraborato de sodio (Na2B4O7) 0,025 M (9,5 g de Na2B4O7 · 10H2O/l) y dilúyase a 1 l. c) Hidróxido de sodio, 6N: Disuélvanse 240 g de NaOH en agua y dilúyase a 1 l. d) Agua declorante: Utilícese 1 ml de alguno de los reactivos siguientes para eliminar 1 mg de cloro residual/l en 500 ml de muestra.

1) Sulfito de sodio: Disuélvanse 0,9 g de Na 2 SO 3 en agua y dilúyase a 1 l. Prepárese diariamente. 2) Tiosulfato de sodio: Disuélvanse 3,5 g de Na 2 S 2 O 3 · 5H 2 O en agua y dilúyase a 1 l. Prepárese semanalmente. 3) Óxido de fenilarsina: Disuélvanse 1,2 g de C6H5AsO en 200 ml de solución de NaOH 0,3N, fíltrese si fuera necesario y dilúyase a 1 l con agua. (PRECAUCIÓN: Tóxico; procúrese evitar la ingestión.) 4) Arsenito de sodio: Disuélvanse 0,93 g de NaAsO2 en agua y dilúyase a 1 l. (PRECAUCIÓN: Tóxico; procúrese evitar la ingestión.) Prepárese semanalmente.

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

e) Agente neutralizante: Prepárese con agua exenta de amoníaco.

1) Hidróxido de sodio, NaOH 1N. 2) Acido sulfúrico, H2SO4 1N. f ) Solución absorbente, ácido bórico puro: Disuélvanse 20 g de H 3BO 3 en agua y dilúyase a 1 l. g) Solución indicadora de ácido bórico: Véase sección 4500-NH3.E.3a y b. h) Ácido sulfúrico, 0,04N: Dilúyase 1,0 ml de H2SO4 conc. a 1 l. 4.

Procedimiento

a) Preparación del equipo: Añádanse 500 ml de agua y 20 ml de tampón borato a un matraz de destilación y ajústese el pH a 9,5 con solución de NaOH 6N. Añádanse unas cuentas de vidrio o fragmentos pequeños para ayudar a la ebullición, y utilícese esa mezcla para producir vapor en el aparato de destilación, hasta que en el destilado no aparezcan trazas de amoníaco. b) Preparación de la muestra: Utilícense 500 ml de muestra declorada o una porción diluida con agua a 500 ml. Cuando la concentración NH3-N sea inferior a 100 µg/l, utilícese un volumen de muestra de 1.000 ml. Elimínese el cloro residual por adición de agente declorante, equivalente al cloro residual, en el momento de la obtención. Si fuera necesario, neutralícese a pH aproximado de 7, con ácido o base diluidos mediante un medidor de pH. Añádanse 25 ml de solución tampón de borato y ajústese el pH a 9,5 con NaOH 6N mediante un medidor de pH. c) Destilación: Para reducir al mínimo la contaminación, déjese instalado el aparato de destilación después de agotar el vapor y hasta justo antes de empezar la destilación de la muestra. Desconécte-

4-131

se el matraz productor de vapor y pásese inmediatamente el matraz de muestra al aparato de destilación. Destílese a una velocidad de 6 a 10 ml/min con el extremo del tubo de salida por debajo de la superficie de la solución acida receptora. Recójase el destilado en un erlenmeyer de 500 ml que contenga 50 ml de solución de ácido bórico puro para el método de nesslerización. Utilícense 50 ml de solución indicadora de ácido bórico para el método titulométrico. Destílese el amoníaco sobre 50 ml de H2SO4 0,04N para el método de la sal de fenol y para el método del electrodo selectivo de amoníaco. Recójanse, por lo menos, 200 ml de destilado. Bájese el destilado obtenido para evitar su contacto con el tubo de salida y manténgase la destilación durante 1 ó 2 minutos, para limpiar el condensador y tubo de salida. Dilúyase a 500 ml con agua. Cuando se utilice el método de la sal de fenol para determinar NH-3N neutralícese el destilado con solución de NaOH 1 N. d) Determinación de amoníaco: Determínese el amoníaco por el método de nesslerización (C), el de la sal de fenol (D), el titulométrico (E) o el del electrodo selectivo de amoníaco (F). 5. Bibliografía NICHOLS, M. S. & M. E. FOOTE 1931. Distillation of free ammonia from buffered Solutions. En Eng. Chem., Anal. Ed. 3:311. GRIFFIN, A. E. & N. S. CHAMBERLIN, 1941. Relation of ammonia nitrogen to breakpoint chlorination. Amer. J. Pub. Health 31:803. P ALIN , A. T. 1950. Symposium on the sterilization of water. Chemical aspects of chlorination. J. Inst. Water Eng. 4:565. TARAS, M. J. 1953. Effect of free residual chlorination of nitrogen compounds in water. J. Amer. Water Works Assoc. 45:47.

4-132

MÉTODOS NORMALIZADOS

4500-NH3 C. Método de la nesslerización (directo y subsiguiente a destilación) 1.

Discusión general

Utilícese la nesslerización directa únicamente para aguas potables purificadas, agua natural y diluyentes residuales muy depurados, todos con poco color y concentraciones de NH 3 -N superiores a 20 µg/l. Aplíquese la nesslerización directa a las aguas residuales domésticas, solamente cuando sean aceptables los errores de 1 a 2 mg/l. Utilícese este método si se ha establecido que consigue resultados comparables a los obtenidos tras la destilación. Compruébese periódicamente la validez de las determinaciones de nesslerización directa. El tratamiento preliminar antes de la nesslerización directa con sulfato de zinc y álcali precipita calcio, hierro, magnesio y sulfuro, que producen turbidez cuando se tratan con el reactivo Nessler. El floculado elimina también la materia en suspensión y a veces la coloreada. La adición de EDTA o solución de sal de Rochelle inhibe la precipitación de los iones residuales calcio y magnesio, en presencia del reactivo Nessler alcalino. Sin embargo, el uso de EDTA requiere una cantidad adicional de reactivo Nessler para asegurar que existe un exceso suficiente del reactivo para que reaccione con el amoníaco. La coloración gradual de amarillo a pardo, producida por la reacción amoníaco-Nessler, adquiere gran absorbancia en una amplia gama de longitudes de onda. El color amarillo característico de la concentración baja de nitrógeno amoniacal (0,4 a 5 mg/l) se puede medir con sensibilidad aceptable en la zona de longitud de onda de 400 a 425 nm, cuando se dispone de un recorrido de luz de 1 cm. Si éste tuviera 5 cm, se ampliaría la medida a concentraciones de nitrógeno de 5 a 60 µg/l. El matiz pardo rojizo típico de los niveles de nitrógeno amo-

niacal próximos a 10 mg/l, se puede medir en la zona de 450 a 500 nm de longitud de onda. De ese modo, la selección cuidadosa del recorrido de luz y longitud de onda permiten la determinación fotométrica de una gama considerable de concentraciones de nitrógeno amoniacal. Las desviaciones de la ley de Beer pueden ser evidentes cuando se utilicen fotómetros equipados con filtros de color de banda amplia. Por esta razón, la curva de calibrado debe prepararse en condiciones idénticas a las adoptadas para las muestras. Un reactivo Nessler preparado cuidadosamente puede responder, en condiciones óptimas, a cantidades de hasta 1 µg NH3-N/50 ml. En la nesslerización directa, esto representa 20 µg /l. Sin embargo, la reproducibilidad por debajo de 100 µg/l puede ser errática. 2.

Instrumental

a) Equipo calorimétrico: Se necesita uno de los siguientes:

1) Espectrofotómetro, para uso a 400500 nm con recorrido de luz de 1 cm o más. 2) Fotómetro de filtro, con un recorrido de luz de 1 cm o más, y provisto de un filtro violeta de transmitancia máxima a 400 ó 425 nm. Para concentraciones más elevadas de NH3-N se puede utilizar un filtro azul. 3) Tubos Nessler, de 50 ml y forma alta. b) Medidor de pH, provisto de un electrodo de pH elevado. 3.

Reactivos

Utilícese agua exenta de amoníaco para preparar todos los reactivos, lávese

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

y realícense las diluciones. Se requieren todos los reactivos enumerados en la Destilación preliminar (4500-NH3.B anterior), excepto el tampón borato y la solución absorbente, y además los siguientes: a) Solución de sulfato de zinc: Disuélvanse 100 g de ZnSO4 · 7H2O y dilúyase a 1 l con agua. b) Agente estabilizador: Utilícese EDTA o sal de Rochelle para evitar la precipitación de calcio o magnesio en muestras no destiladas tras adición de reactivo Nessler alcalino.

1) Reactivo EDTA: Disuélvanse 50 g de tetracetato de etilendiamina disódica dihidratada, en 60 ml de agua conteniendo 10 g de NaOH. Si fuera necesario aplíquese un calor suave para completar la disolución. Enfríese a temperatura ambiente y dilúyase a 100 ml. 2) Solución de sal de Rochelle: Disuélvanse 50 g de tartrato sódico potásico tetrahidratado, KNaC4H4O6 · 4H2O, en 100 ml de agua. Elimínese el amoníaco, presente normalmente en la sal, por ebullición de 30 ml de solución. Después de enfriar, dilúyase a 100 ml. c) Reactivo Nessler: Disuélvanse 100 g de Hgl2 y 70 g de KI en una pequeña cantidad de agua y añádase esta mezcla lentamente, con agitación, a una solución fría de 160 g de NaOH en 500 ml de agua. Dilúyase a 1 l. Consérvese en material de vidrio de borosilicato con tapón de goma y protegido de la luz solar, para mantener la estabilidad del reactivo durante 1 año, en condiciones normales de laboratorio. Compruébese si el reactivo produce el color característico con 0,1 mg de NH3-N/l en los 10 minutos siguientes a la adición y no forma un precipitado con cantidades pequeñas de amoníaco en las 2 horas siguientes. (PRECAUCIÓN: Tóxico; procúrese evitar su ingestión.) d) Solución madre de amonio: Disuélvanse 3,819 g de NH4C1 anhidro, secado

4-133

a 100 °C, en agua y dilúyase a 1.000 ml; 1,00 ml = 1,00 mg N = 1,22 mg NH3. e) Solución patrón de amonio: Diluyanse 10,00 ml de solución madre de amonio a 1.000 ml con agua; 1,00 ml = = 10,00 µg N = 12,2 ug NH3. f) Soluciones de color permanente: 1) Solución de cloroplatinato de potasio: Disuélvanse 2,0 g de K2PtCl6 en 300 a 400 ml de agua; añádanse 100 ml de HCl conc. y dilúyase a 1 l. 2) Solución de cloruro cobaltoso: Disuélvanse 12,0 g de CoCl2 · 6H2O en 200 ml de agua. Añádanse 100 ml de HC1 conc. y dilúyase a 1 l. 4.

Procedimiento

a) Tratamiento de las muestras no destiladas: Si fuera necesario, elimínese el cloro residual de la muestra recién obtenida por adición de una cantidad equivalente de agente declorante. (No conservar las muestras cloradas sin decloración previa.) Añádase 1 ml de solución de ZnSO4 a 100 ml de muestra y mézclese completamente. Añádanse 0,4 a 0,5 ml de solución de NaOH 6N para obtener un pH de 10,5, determinado con un medidor de pH y electrodo de vidrio de pH elevado, y mézclese suavemente. Déjese reposar durante unos minutos la muestra tratada, con lo que se formará un precipitado floculante y denso, que dejará un sobrenadante claro e incoloro. Clarifíquese por centrifugado o filtrado. Ensáyese previamente el papel de filtro que se va a utilizar para asegurarse de que no tiene amoníaco contaminante. Esto se hace pasando agua a través del papel de filtro y analizando el filtrado por nesslerización. Fíltrese la muestra, desechando los primeros 25 ml de filtrado. (PRECAUCIÓN: Las muestras con más de 10 mg de NH3-N/l aproximadamente pueden perder amoníaco durante este tratamiento de las muestras no destiladas debido al elevado pH. Dilúyanse esas muestras

4-134

hasta el rango sensible, para nesslerización, antes del tratamiento preliminar.) b) Desarrollo del color: 1) Muestras no destiladas: Utilícense 50,0 ml de muestra o una porción diluida a 50,0 ml con agua. Si la porción no destilada contiene concentraciones suficientes de calcio, magnesio u otros iones que produzcan turbidez o precipitado con reactivo Nessler, añádase 1 gota (0,05 ml) de reactivo EDTA o 1 a 2 gotas (0,05 a 0,1 ml) de solución de sal de Rochelle. Mézclese bien. Añádanse 2,0 ml de reactivo Nessler si se ha utilizado EDTA, o 1,0 ml de reactivo Nessler si fue sal de Rochelle. 2) Muestras destiladas: Neutralícese el ácido bórico usado para absorber el destilado de amoníaco, por adición de 2 ml de reactivo Nessler, un exceso que sube el pH al nivel deseado, o, alternativamente, neutralizando el ácido bórico con NaOH antes de añadir 1 ml de reactivo Nessler. 3) Mézclense las muestras tapando los tubos Nessler con tapones de goma (bien lavados con agua) e invirtiendo los tubos 6 veces por lo menos. Manténganse las condiciones, tales como temperatura y tiempo de reacción, iguales para el blanco y las muestras y patrones. Déjese que la reacción prosiga durante 10 minutos por lo menos, tras añadir el reactivo Nessler. Mídase el color en la muestra y patrones. Si NH3-N es muy bajo, utilícese un tiempo de contacto de 30 minutos para la muestra, blanco y patrones. Mídase el color fotométrica o visualmente, como se indica más adelante en los apartados c o d. c) Determinación fotométrica: Mídase la absorbancia o transmitancia con un espectrofotómetro o fotómetro de filtro. Prepárese la curva de calibrado a la misma temperatura y tiempo de reacción utilizados para las muestras. Mídanse las transmitancias frente a un blanco de reactivo y háganse comprobaciones pa-

MÉTODOS NORMALIZADOS

ralelas frecuentes frente a los patrones en el rango de nitrógeno de las muestras. Vuélvase a determinar una curva de calibrado completa para cada nuevo lote de reactivo Nessler. Para muestras destiladas, prepárese la curva patrón en las mismas condiciones que las muestras. Destílese el blanco de reactivo o los patrones apropiados, diluidos todos a 500 ml, del mismo modo que las muestras. Dilúyanse 300 ml de destilado más 50 ml de ácido bórico absorbente a 500 ml con agua y tómese una porción de 50 ml para nesslerización. d) Comparación visual: Compárense los colores producidos en la muestra frente a los de los patrones de amoníaco. Prepárense patrones provisionales o permanentes, como sigue: 1) Patrones provisionales: Prepárese una serie de patrones visuales en tubos Nessler por adición de los volúmenes siguientes de solución patrón de NH4C1: 0, 0,2, 0,4, 0,7, 1,0, 1,4, 1,7, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0 y 6,0, y diluyendo a 50 ml con agua. Nesslerícense los patrones y porciones del destilado, añadiendo 1,0 ml de reactivo Nessler a cada tubo y mezclando bien. 2) Patrones permanentes: Mídanse en tubos Nessler de 50 ml los volúmenes de soluciones de K2PtCl6 y CoCl2 indicados en la tabla 4500-NH3:III, dilúyase hasta la señal y mézclese completamente. Los valores que ofrece la tabla son aproximados; los equivalentes reales de los patrones de amonio diferirán con la calidad del reactivo Nessler, tipo de iluminación usada y sensibilidad al color del ojo del analista. Por ello, se deben comparar los patrones de color con patrones provisionales nesslerizados de amoníaco y se modificarán los tonos si fuera preciso. Háganse esas comparaciones para cada reactivo Nessler nuevo y satisfáganse las necesidades de cada analista relacionadas con la aptitud de la correspondencia del color. Protéjanse los patrones del polvo, para ampliar su duración a varios

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

TABLA 4500-NH3:III. PREPARACIÓN DE ESTÁNDARES DE COLOR PERMANENTE PARA

4-135

c) Calcúlese el NH3-N total por la siguiente ecuación:

DETERMINACIÓN VISUAL DE NITRÓGENO AMONIACAL

donde: A = µg NH3-N (51 ml volumen final), B = volumen total de destilado obtenido, ml, incluyendo el absorbente ácido, y C = volumen de destilado tomado para nesslerización, ml.

La relación B/C sólo es aplicable a las muestras destiladas; ignorarla en la nesslerización directa.

6.

Precisión y sesgo

Véanse sección 4500-NH3A.4 y tabla 4500-NH3:I. meses. Compárense cada 10 o cada 30 minutos tras la nesslerización, en función del tiempo de reacción usado al preparar los patrones de amonio nesslerizados frente a los que se compararon. 5.

Cálculo

a) Dedúzcase la cantidad de NH3-N en el agua utilizada para diluir la muestra original, antes de calcular el valor final del nitrógeno. b) Dedúzcase también el blanco de reactivo para el volumen de soluciones de tampón borato y NaOH 6N utilizadas con la muestra.

7.

Bibliografía

J ACKSON , D. D. 1900. Permanent standards for use in the analysis of water. Mass. Inst. Technol. Quart. 13:314. SAWYER, C. N. 1953. pH adjustment for determination of ammonia nitrogen. Anal. Chem. 25:816. JENKINS, D. 1967. The differentiation, analysis and preservation of nitrogen and phosphorus forms in natural waters. En Trace Inorganics in Water. American Chemical Soc, Washington, D. C. BOLTZ, D. F. & J. A. HOWELL, EDS. 1978. Colorimetric Determination of Nonmetals. Wiley Interscience, Nueva York.

4-136

MÉTODOS NORMALIZADOS

4500-NH3 D. 1.

Método de la sal de fenol

Discusión general

a) Principio: En la reacción del amoníaco, hipoclorito y fenol, catalizada por una sal manganosa, se forma un compuesto azul intenso, indofenol. b) Interferencia: Interfieren la alcalinidad por encima de 500 mg como CaCO3/l, la acidez superior a 100 mg como CaCO3/l y la turbidez. Elimínense estas interferencias por destilación previa. 2. Instrumental a) Equipo calorimétrico: Se requiere uno de los siguientes: 1) Espectrofotómetro, para uso a 630 nm, con recorrido de luz de 1 cm aproximadamente. 2) Fotómetro de filtro, provisto de un filtro rojo-naranja con transmitancia máxima próxima a los 630 nm y un recorrido de luz de 1 cm aproximadamente. b) Agitador magnético. 3. Reactivos a) Agua exenta de amoníaco: Prepárese como se indica en la sección 4500NH3.B.3a. Utilícese para preparar todos los reactivos. b) Reactivo de ácido hipocloroso: Añádanse 40 ml de solución de NaOCl al 5 por 100 preparada a partir de lejía comercial, a 40 ml de agua. Ajústese el pH a 6,5-7,0 con HC1. Prepárese este reactivo inestable semanalmente. c) Solución de sulfato manganoso, 0,003 M: Disuélvanse 50 mg de MnSO4 · H2O en 100 ml de agua. d) Reactivo de sal de fenol: Disuélvanse 2,5 g de NaOH y 10 g de fenol, C6H5OH, en 100 ml de agua. Prepárese cada semana, porque se oscurece con el

tiempo. (PRECAUCIÓN: Manipúlese el fenol con cuidado) e) Solución madre de amonio: Disuélvanse 381,9 mg de NH4C1 anhidro, secado a 100 °C, en agua, y dilúyase a 1.000 ml; 1,00 ml = 100 µg N = 122 µg NH3. f) Solución patrón de amonio: Dilúyanse 5,00 ml de solución madre de amonio a 1.000 ml con agua; 1,00 ml = = 0,500 µg N = 0,607 µg NH3. 4.

Procedimiento

a) Tratamiento de la muestra: Añádase 1 gota (0,05 ml) de solución de MnSO4 a una muestra de 10,00 ml en un vaso de 50 ml. Póngase sobre un agitador magnético y añádanse 0,5 ml de reactivo de ácido hipocloroso. Añádanse inmediatamente, gota a gota, 0,6 ml de reactivo de sal de fenato, sin intervalos, utilizando una pipeta de bulbo o una bureta adecuada. Márquese la pipeta para ácido hipocloroso al nivel de 0,5 ml y añádase el reactivo de sal de fenol con una pipeta o bureta que se ha calibrado contando el número de gotas equivalente a 0,6 ml, encontrado previamente. Agítese enérgicamente durante la adición de los reactivos. Dado que la antigüedad de los reactivos afecta a la intensidad del color, se debe realizar un blanco y un patrón con cada lote de muestras. Mídase la absorbancia utilizando un blanco de reactivos para ajustar el cero del espectrofotómetro. La formación del color es completa a los 10 minutos y permanece estable durante 24 horas por lo menos. Aunque el color azul tiene un máximo de absorbancia a 630 nm, se pueden hacer determinaciones satisfactorias en la región de 600 a 660 nm. b) Preparación de patrones: Prepárese una curva de calibrado en el rango de 0,1 a 5 µg de NH3-N, tratando los patrones exactamente igual que la muestra. Se rige por la ley de Beer.

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

5.

Cálculo

4-137

E = volumen de destilado usado para desarrollo del color, ml.

Calcúlese la concentración de amoníaco del siguiente modo:

La relación D/E sólo se aplica a las muestras destiladas. 6.

Precisión y sesgo

Véanse sección 4500-NH3.A.4 y tabla 4500-NH3:I. donde: A = absorbancia de la muestra, B = NH 3 -N en el patrón, µg, C = absorbancia del patrón, S = volumen de muestra usado, ml, D = volumen de destilado total obtenido, ml, incluyendo el absorbente ácido, agente neutralizante y agua exenta de amoníaco añadida, y

4500-NH3 E. 1.

Bibliografía

ROSSUM, J. R. & P. A. VILLARRUZ. 1963. Determination of ammonia by the indophenol method. J. Amer. Water Works Assoc. 55:657. WEATHERBURN M. W. 1967. Phenolhypochlorite reaction for determination of ammonia. Anal. Chem. 39:971.

Método titulométrico

Discusión general

El método titulométrico sólo se utiliza en muestras que se hayan sometido a una destilación previa (véase sección 4500-NH3.B). La tabla siguiente es útil para seleccionar el volumen de muestra para el método de destilación y titulación.

2.

7.

Instrumental

Aparato de destilación: Véase sección 4500-NH3.B.2a y b.

3.

Reactivos

Utilícese agua exenta de amoníaco para preparar todos los reactivos y diluciones. a) Solución de indicador mixta: Disuélvanse 200 mg de indicador rojo de metilo en 100 ml de alcohol etílico o isopropílico del 95 por 100. Disuélvanse 100 mg de azul de metileno en 50 ml de alcohol etílico o isopropílico del 95 por 100. Combínense las dos soluciones. Prepárese mensualmente. b) Solución indicadora de ácido bórico: Disuélvanse 20 g de H3BO3 en agua destilada exenta de amoníaco, añádanse 10 ml de solución indicadora mixta y dilúyase a 1 l. Prepárese mensualmente. c) Titulante estándar de ácido sulfúrico, 0,02N: Prepárese y estandarícese como se indica en Alcalinidad, sección 2320B.3c. Para más exactitud, estandarícese el titulante frente a una cantidad

MÉTODOS NORMALIZADOS

4-138

de Na2CO3 incorporada a la solución indicadora de ácido bórico para reproducir las condiciones reales de titulación de la muestra; 1,00 ml = 280 µg N. 4.

b) Muestras de fango o sedimento:

b) Muestras de fango o sedimento: Pésese rápidamente con una aproximación del ± 1 por 100 una cantidad de muestra húmeda equivalente aproximadamente a 1 g de peso seco, en un frasco de pesado o crisol. Lávese la muestra con agua, a un matraz kjeldahl de 500 ml y dilúyase a 250 ml. Procédase como en el apartado 4a, pero añadiendo un pedazo de cera parafina al matraz de destilación y recogiendo sólo 100 ml de destilado. c) Titúlese el amoníaco del destilado con H2SO4 0,02N titulante hasta que el indicador vire a lavanda pálido. d) Blanco: Llévese un blanco durante todos los pasos del método y aplíquese la corrección necesaria a los resultados.

4500-NH3 F.

Cálculo

a) Muestras líquidas:

Procedimiento

a) Procédase como se describe en la sección 4500-NH3.B utilizando solución de ácido bórico como absorbente del destilado.

1.

5.

donde: A = volumen de H 2 SO 4 titulado para la muestra, ml, y B = volumen de H 2 SO 4 titulado para el blanco, ml.

6.

Precisión y sesgo

Véanse sección 4500-NH3.A.4 y tabla 4500-NH3:I. 7.

Bibliografía

MEEKER, E. W. & E. C. WAGNER. 1933. Titration of ammonia in the presence of boric acid. Ind. Eng. Chem. Anal. Ed. 5:396. W AGNER , E. C. 1940. Titration of ammonia in the presence of boric acid. Ind. Eng. Chem. Anal. Ed. 12:711.

Método de electrodo selectivo de amoníaco

Discusión general

a) Principio: En el electrodo selectivo de amoníaco se utiliza una membrana hidrófoba permeable al gas para separar la solución de muestra de una solución interna del electrodo de cloruro de amonio. El amoníaco disuelto (NH3(ac) y NH4+) se convierte en NH3(ac) elevando el pH por encima de 11 con una base fuerte. NH3(ac) se difunde a través de la membrana y cambia el pH de la solución interna que es apreciado por un electro-

do de pH. El nivel fijo de cloruro en la solución interna se detecta por un electrodo selectivo de ion de cloruro que sirve de electrodo de referencia. Las determinaciones potenciométricas se hacen con un medidor de pH que tiene una escala expandida en milivoltios o con un iónmetro específico. b) Ámbito y aplicación: Este método es aplicable a la determinación de 0,03 a 1.400 mg de NH3-N/l en agua potable y de superficie, y en las residuales domésticas e industriales. Las concentraciones

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

altas de iones disueltos afectan a la medida, pero el color y turbidez no lo hacen. No es necesario destilar las muestras. Utilícense soluciones patrón y muestras a la misma temperatura y conteniendo niveles parecidos de especies disueltas totales. El electrodo selectivo de amoníaco responde lentamente por debajo de 1 mg de NH3-N/l, razón por la que es preciso utilizar tiempos de inmersión de electrodos más largos (5 a 10 minutos) para obtener lecturas estables. c) Interferencia: Las aminas forman una interferencia positiva. Mercurio y plata interfieren por formar complejos con el amoníaco. d) Conservación de muestras: No utilizar HgCl2 como conservador. Refrigerar a 4 °C las muestras que se vayan a analizar en las 24 horas siguientes. Consérvense las muestras con gran contenido en materia orgánica y nitrogenada, y todas las demás durante periodos largos, reduciendo el pH a 2 o menos con H2SO4 conc. 2.

Instrumental

a) Electrómetro: Un pHmetro con escala expandida en milivoltios capaz de resoluciones de 0,1 mV entre − 700 y + 700 mV o un iónmetro específico. b) Electrodo selectivo de amoníaco*. c) Agitador magnético, aislado térmicamente, con barrita recubierta de TFE. 3.

Reactivos

a) Agua exenta de amoníaco: Véase sección 4500-NH3.B.3a. Utilícese para preparar todos los reactivos. b) Hidróxido de sodio, 10N: Disuélvanse 400 g de NaOH en 800 ml de agua. Enfríese y dilúyase a 1.000 ml con agua. * Orion modelo 95-10 o 95-12, EIL modelo 8002-2, Beckman modelo 39565, o equivalente.

4-139

c) Solución madre de cloruro de amonio: Véase sección 4500-NH3.C.3d. d) Soluciones patrón de cloruro de amonio: Véase apartado 4a siguiente. 4.

Procedimiento

a) Preparación de patrones: Prepárese una serie de soluciones patrón que cubran las concentraciones de 1.000, 100, 10,1 y 0,1 mg NH3-N/l mediante diluciones decimales de la solución madre de NH4C1 con agua. b) Calibrado del electrómetro: Pónganse 100 ml de cada solución patrón en un vaso de 150 ml. Introdúzcase el electrodo en el patrón de menor concentración y mézclese con un agitador magnético. No agitar tan rápidamente como para que la solución capte burbujas de aire, que quedarían atrapadas en la membrana del electrodo. Manténgase la misma velocidad de agitación y una temperatura de unos 25 °C durante el calibrado y análisis. Añádase suficiente solución de NaOH 10N (1 ml suele bastar) para elevar el pH por encima de 11. Manténgase el electrodo en la solución hasta obtener una lectura estable en milivoltios. PRECAUCIÓN: Compruébese el funcionamiento del elemento sensor del electrodo según las instrucciones del fabricante para asegurar que es correcto. No añadir solución de NaOH antes de sumergir el electrodo, porque podría perderse amoníaco desde una solución básica. Repítase el procedimiento con los patrones restantes, comenzando por la concentración más baja para llegar a la más elevada. Espérese 5 minutos, por lo menos, antes de registrar los milivoltios para patrones y muestras que contengan ≤ 1 mg NH3-N/l. c) Preparación de la curva patrón: Utilizando papel de gráficas semilogarítmico, compárese la concentración de amoníaco en mg NH3-N por litro en el eje log con el potencial en milivoltios en

4-140

MÉTODOS NORMALIZADOS

el eje lineal, empezando con las concentraciones más bajas en la base de la escala. Si el electrodo funciona correctamente un cambio de diez veces en la concentración de NH3-N produce un cambio de potencial de 59 mV. d) Calibrado del iónmetro específico: Consúltense las instrucciones del fabricante y precédase como en los apartados 4a y b. e) Medida de las muestras: Si fuera necesario dilúyanse para llevar la concentración de NH3-N al rango de la curva de calibrado. Pónganse 100 ml de muestra en un vaso de 150 ml y sígase el procedimiento del apartado 4b anterior. Regístrese el volumen de NaOH 10N añadido por encima de 1 ml. Léase la concentración de NH 3-N a partir de la curva patrón. 5.

Cálculo

donde:

4500-NH3 G. 1.

B = concentración de NH3-N, mg/l, a partir de la curva de calibrado, y C = volumen añadido de NaOH 10N por encima de 1 ml, ml.

6.

Precisión y sesgo

Véase sección 4500-NH3.A.4.

7.

Bibliografía

BANWART, W. L., J. M. BREMNER & M. A. TABATABAL 1972. Determination of ammonium in soil extracts and water samples by an ammonia electrode. Comm. Soil Sci. Plant Anal. 3:449. MIDGLEY, C. & K. TERRANCE. 1972. The determination of ammonia in condensed steam and boiler feed-water with a potentiometric ammonia probe. Analyst 97:626. BOOTH, R. L. & R. F. THOMAS. 1973. Selective electrode determination of ammonia in water and wastes. Environ. Sci. Technol. 7:523. U.S. E NVIRONMENTAL P ROTECTION A GENCY . 1979. Methods for Chemical Analysis of Water and Wastes. EPA-600/4-79-020, National Environmental Research Center, Cincinnati, Ohio.

Método de electrodo selectivo de amoníaco con adición conocida

Discusión general

a) Principio: Cuando existe una relación lineal entre concentración y respuesta, es conveniente la adición conocida para medir muestras ocasionales porque no se necesita calibrado. Dado que una medida exacta requiere que la concentración sea aproximadamente el doble como resultado de la adición, se debe conocer la concentración de la muestra dentro de un factor de tres. Se puede medir la concentración total de amoníaco en

ausencia de agentes complejantes hasta 0,8 mg de NH3-N/l, o en presencia de un gran exceso (50 a 100 veces) de agente complejante. La adición conocida es una comprobación adecuada de los resultados de la medición directa. b) Véanse más datos de la exposición en la sección 4500-NH3.F.l. 2.

Instrumental

Utilícese el instrumental descrito en la sección 4500-NH3.F.2.

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

4-141

TABLA 4500-NH3:IV*. VALORES DE Q FRENTE A ΔE (PENDIENTE DE 59 MV) PARA CAMBIO DE VOLUMEN DEL 10 POR 100

4-142

3.

Reactivos

Utilícense los reactivos especificados en la sección 4500-NH3.F.3. Añádase solución patrón de cloruro de amonio aproximadamente 10 veces más concentrada que las muestras a medir. 4.

Procedimiento

a) Dilúyanse 1.000 mg/l de solución madre para preparar una solución patrón unas 10 veces más concentrada que el concentrado de muestra. b) Añádase 1 ml de NaOH ION a cada 100 ml de muestra, introduciendo el electrodo inmediatamente. Cuando se compruebe una medida directa, déjese el electrodo en 100 ml de solución muestra. Utilícese la agitación magnética todo el tiempo. Léanse los mV y regístrese como E1. c) Llévense con la pipeta 10 ml de solución patrón en la muestra. Agítese bien y regístrese inmediatamente la nueva lectura de mV como E2. 5.

MÉTODOS NORMALIZADOS

Cálculo

a) Δ E = El − E2 b) A partir de la tabla 4500-NH3:IV determínese la razón de concentración, Q, correspondiente al cambio de potencial, Δ E. Para determinar la concentración original total de la muestra, multipliqúese Q por la concentración del patrón añadido: donde: Co = concentración total de la muestra, mg/l,

Q = lectura a partir de la tabla de adición conocida, y C1 = concentración de patrón añadido, mg/l.

c) Para comprobar una medición directa, compárense los resultados de los dos métodos. Si concuerdan en + 4 por 100, las medidas son buenas probablemente. Si el resultado de la adición conocida es mucho mayor que la medida directa, la muestra puede contener agentes complejantes.

6.

Precisión y sesgo

En 38 muestras de agua analizadas por el método de la sal de fenol y el del electrodo selectivo de amoníaco con adición conocida, el método del electrodo conseguía una recuperación media del 102 por 100 de los valores obtenidos con el método de la sal de fenol, cuando las concentraciones de NH3-N variaban entre 0,30 y 0,78 mg/l. En 57 muestras de agua residual, comparadas de forma similar, el método del electrodo obtenía una recuperación media del 108 por 100 de los valores obtenidos por el método de la sal de fenol, usando la destilación cuando las concentraciones oscilaban entre 10,2 y 34,7 mg N/l. En 20 casos en que se analizaron de dos a cuatro duplicados de esas muestras, la desviación estándar media era 1,32 mg N/l. En tres determinaciones a la salida de un desagüe, la destilación no cambiaba estadísticamente el valor obtenido por el método del electrodo. En 12 estudios utilizando patrones del rango de 2,5 a 30 mg N/l, la recuperación media obtenida con el método de la sal de fenol era 97 por 100, y con el método del electrodo, 101 por 100.

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

4500-NH 3 H. 1.

4-143

Método automatizado de la sal de fenol

Discusión general

a) Principio: El fenol alcalino y el hipoclorito reaccionan con amoníaco para formar azul de indofenol que es proporcional a la concentración de amoníaco. El color producido se intensifica con nitroprusiato de sodio. b) Interferencias: El agua del mar contiene iones calcio y magnesio en concentración suficiente para producir precipitaciones durante el análisis. La adición de EDTA y tartrato sódico potásico reduce el problema. Elimínese cualquier variación marcada de la acidez o alcalinidad entre muestras porque la intensidad del color medido depende del pH. Asimismo, asegúrese que el pH del agua

de lavado y soluciones patrón de amoníaco se aproxima al de la muestra. Por ejemplo, si la muestra se ha conservado con 0,8 ml H2SO4 conc./l, inclúyanse 0,8 ml de H2SO4 conc./l en el agua de lavado y los patrones. El cloruro mercúrico utilizado como conservador produce una interferencia negativa por complejarse con amoníaco. Este efecto se supera añadiendo una cantidad comparable de HgCl2 a los patrones de amoníaco. Elimínese la turbidez interferente, por filtración. El color de las muestras con absorbancia en la escala fotométrica utilizada para análisis interfiere. c) Aplicaciones: Se puede determinar el nitrógeno amoniacal en agua potable, superficial y salina, así como en las resi-

Figura 4500-NH3:1. Distribuidor de amoníaco.

MÉTODOS NORMALIZADOS

4-144

duales domésticas e industriales, en un rango de 0,02 a 2,0 mg/l, cuando la medida fotométrica se realiza a 630-660 nm en una cubeta tubular de flujo de 15 o 50 mm. Determínense las concentraciones más altas, diluyendo la muestra. 2.

Instrumental

Equipo analítico automatizado. El flujo continuo requerido en el aparato* consta de los componentes intercambiables mostrados en la figura 4500-MH3:l. Se pueden utilizar una cubeta y un filtro para 630 nm. 3.

Reactivos

a) Agua destilada exenta de amoníaco: Véase sección 4500-NH3.B.3a. Utilícese para preparar todos los reactivos y diluciones. b) Ácido sulfúrico, H2SO4 5N solución depuradora del aire: Añádanse con cuidado 139 ml de H2SO4 conc. a aproximadamente 500 ml de agua, enfríese a temperatura ambiente y dilúyase a 1 l. c) Solución de fenato de sodio: En un erlenmeyer de 1 l, disuélvanse 83 g de fenol en 500 ml de agua. Añádanse cuidadosamente, en pequeños incrementos y con agitación, 32 g de NaOH. Enfríese el matraz bajo agua corriente y dilúyase a 1 l. d) Solución de hipoclorito de sodio: Dilúyanse 250 ml de solución de lejía conteniendo 5,25 por 100 de NaOCl, con agua hasta 500 ml. e) Reactivo EDTA: Disuélvanse 50 g de etilendiamina tetracetato disódico y aproximadamente seis lentejas de NaOH en 1 l de agua. Para muestras de agua salada donde el EDTA no impida la precipitación de cationes, utilícese solución de tartrato sódico potásico, preparada como sigue: Solución de tartrato sódico potásico: Añádanse a 900 ml de agua 100 g de * AutoanalizadorMR TechniconMR II o equivalente.

NaKC4H4O6·4H2O, dos lentejas de NaOH y unos fragmentos para ebullición, e hiérvase suavemente durante 45 minutos. Tápese, enfríese y dilúyase a 1 l. Ajústese el pH a 5,2 ± 0,05 con H2SO4. Déjese reposar durante la noche en un sitio fresco y fíltrese para eliminar el precipitado. Añádanse 0,5 ml de solución de polioxietilen 23 lauril éter† y consérvese en frasco tapado. f) Solución de nitroprusiato de sodio: Disuélvanse 0,5 g de Na2(NO)Fe(CN)5 · 2H2O en 1 l de agua. g) Soluciones patrón de amoníaco: Véanse las secciones 4500-NH3.D.3e y f. Utilícese solución patrón de amoníaco y agua para preparar la curva de calibrado en el rango apropiado de concentración de amoníaco. Para analizar aguas salinas, utilícese sustituto de agua del mar con la composición siguiente para preparar los patrones de calibrado:

Antes de preparar la curva patrón, réstese la respuesta del blanco de sustitutivo de agua del mar, de los patrones. 4.

Procedimiento

a) Elimínense las variaciones marcadas de acidez o alcalinidad entre las † Brij-35, suministrado por ICI Americas, Wilmington, Del. o Technicon Instrument Corp., Tarrytown, Nueva York 10591.

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

muestras. Ajústese el pH del agua de lavado y soluciones patrón de amoníaco aproximadamente al de la muestra. b) Móntese el aparato y el sistema completo como muestra la figura 4500NH3:1. c) Obténgase una línea de base estable con todos los reactivos, alimentando el agua a través de la línea de muestra. d) Utilícese una leva 6:1,60/hora, con un lavado común.

5.

Cálculo

Prepárense curvas patrón por comparación de los picos de altura de los patrones procesados a través del aparato, con las concentraciones de NH3-N en los patrones. Calcúlese la concentración de NH3-N de la muestra, comparando la altura del pico de la muestra con la curva patrón.

6.

4-145

Precisión y sesgo

Véase sección 4500-NH3.A.4. 7.

Bibliografía

HILLER, A. & D. VAN SLVKE. 1933. Determination of ammonia in blood. J. Biol. Chem. 102:499. FIORE, J & J. E. O'BRIEN. 1962. Ammonia determination by automatic analysis. Wastes Eng. 33:352. AMERICAN SOCIETY FOR TESTING AND MATERIALS. 1966. Manual on Industrial Water and Industrial Waste Water, 2.a ed. American Soc. Testing & Materials, Filadelfia, Pennsylvania. O'CONNOR, B., R. DOBBS, B. VlLLIERS & R.

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4500- NO-2 NITRÓGENO (NITRITO)*

4500- NO-2 A. 1.

Presencia y significado

Véase en la sección 4500-N una exposición de las características químicas, fuentes y efectos del nitrógeno en forma de nitrito.

• Aprobado por el Standard Methods Committee, 1988.

Introducción 2.

Selección del método

El método colorimétrico (B) es adecuado para concentraciones de 5 a 1.000 µg de NO-2 -N/l. (Véase apartado B.la.) Se pueden obtener los valores de nitrito por el método automatizado que se describe en la sección 4500- NO3- .E, omitiendo el paso de reducción Cu-Cd. También se puede determinar por cromatografía iónica (C).

4-146

MÉTODOS NORMALIZADOS

4500- NO-2 B. 1.

Método colorimétrico

Discusión general

a) Principio: El nitrito ( NO -2 ) se determina por la formación de un colorante azo púrpura rojizo, producido a pH 2,0 a 2,5 por acoplamiento de sulfanilamida diazotizada con diclorhidrato de N-(1-naftil)-etilendiamina (diclorhidrato de NED). El rango de aplicación del método para medidas espectrofotométricas es de 10 a 1.000 µg de NO2-N/l, y se puede aplicar al de 5 a 50 µg de N/l si se usan un recorrido de luz de 5 cm y filtro de color verde. El sistema de color obedece a la ley de Beer hasta 180 µg N/l con 1 cm de recorrido de luz a 543 nm. Diluyendo las muestras se pueden determinar concentraciones más altas de NO-2 . b) Interferencias: La incompatibilidad química hace improbable la coexistencia de NO -2 , cloro libre, y tricloruro de nitrógeno (NC13). NC13 proporciona un color rojo falso cuando se añade el reactivo colorante. Los iones siguientes interfieren debido a precipitación en las condiciones de la prueba y deben estar ausentes: Sb3+, Au3+, Bi3+, Fe3+, Pb2+, Hg2+, Ag+, cloroplatinato ( PtCl62- ) y metavanadato (VO32- ). El ion cúprico puede dar lugar a resultados bajos por catalizar la descomposición de la sal de diazonio. Los iones coloreados que alteran el sistema de color también deben estar ausentes. Elimínense por filtración los sólidos suspendidos. c) Almacenamiento de la muestra: No utilizar nunca la conservación acida en las muestras destinadas al análisis de NO-2 . Hágase la determinación inmediatamente sobre muestras recientes para evitar la conversión bacteriana del NO-2 en NO3- o NH3. Para conservación a corto plazo, durante 1 o 2 días, congélese a −20 °C o consérvese a 4 °C.

2.

Instrumental

Equipo colorimétrico: Se precisa uno de los siguientes: a) Espectrofotómetro, para uso a 543 nm, con 1 cm o más de recorrido de luz. b) Fotómetro de filtro, con un recorrido de luz de 1 cm o más y provisto de un filtro verde de transmitancia máxima próxima a los 540 nm. 3. Reactivos a) Agua exenta de nitrito: Si no se sabe si el agua destilada o desmineralizada está exenta de NO-2 , utilícese uno de los procedimientos siguientes para prepararla:

1) Añádase a 1 l de agua destilada un cristal pequeño de KMnO4 y otro de Ba(OH)2 o Ca(OH)2. Redestílese en aparato de vidrio de borosilicato y deséchense los 50 ml iniciales del destilado. Recójase la fracción de destilado libre de permanganato; un color rojo con reactivo DFD (sección 4500-Cl.F.2b) indica la presencia de permanganato. 2) Añádase 1 ml de H2SO4 conc. 1 l de agua destilada, y 0,2 ml de solución de MnSO4 (36,4 g de MnSO4 H2O/l00 ml de agua destilada) a otro litro de agua destilada, y vírese a rosa con 1 a 3 ml de solución KMnO4 (400 mg de KMnO4/l de agua destilada). Redestílese como se describe en el párrafo anterior. Utilícese agua exenta de nitrito para preparar los reactivos y diluciones. b) Reactivo colorante: Añádanse a 800 ml de agua 100 ml de ácido fosfórico 85 por 100 y 10 g de sulfanilamida. Tras disolver completamente la sulfanilamida, añádase 1 g de diclorhidrato de N-(1naftil)-etilendiamina. Mézclese para di-

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

solver y dilúyase con agua hasta 1 l. La solución es estable durante cerca de un mes cuando se conserva en frigorífico en un frasco oscuro. c) Oxalato de sodio, 0,025M (0,05N): Disuélvanse 3,350 g de Na2C2O4, calidad estándar primario, en agua y dilúyase a 1.000 ml. d) Sulfato amónico ferroso, 0,05M (0,05N: Disuélvanse 19,607 g de Fe(NH4)2 (SO4)2·6H2O más 20 ml de H2SO4 conc. en agua y dilúyase a 1.000 ml. Estandarícese como en la sección 5220B.3d. e) Solución madre de nitrito: NaNO2 comercial, calidad reactivo inferior al 99 por 100. Dado que NO -2 se oxida fácilmente en presencia de humedad, se debe utilizar un reactivo reciente para preparar la solución madre, manteniendo los frascos bien tapados para evitar la entrada de aire cuando no se usen. Para determinar el contenido de NaNO2, añádase un exceso conocido de solución patrón de KMnO4 0,05M (0,05N) preparada con 8,0 g de KMnO4 y estandarizada como se describe en 3500-Ca.C3i, descárguese el color del permanganato con una cantidad conocida de reductor estándar de Na2C2O4 0,025M o Fe(NH4)2(SO4)2 0,05 M y titúlese por retroceso con solución patrón de permanganato. 1) Preparación de la solución madre: Disuélvase 1,232 g de NaNO2 en agua y dilúyase a 1.000 ml; 1,00 ml = 250 µg. Consérvese con 1 ml de CHC13 2) Estandarización de la solución madre de nitrito: Llévese con la pipeta ese orden, 50,00 ml de KMnO4 0,05M patrón, 5 ml de H2SO4 conc. y 50,00 ml de solución madre de NO-2 , a un matraz o frasco de vidrio con tapón. Sumérjase la punta de la pipeta por debajo de la superficie de la solución de permanganato ácido mientras se añade la solución madre de NO-2 . Agítese suavemente y caliéntese a 70-80 °C sobre una placa caliente. descárguese el color del permanganato por adición de porciones suficientes de 10 ml de Na2C2O4 0,025M patrón.

4-147

Titúlese el exceso de Na2C2O4 con KMnO4 0,05M hasta punto final rosa pálido. Realícese a la vez un blanco de agua y hacer las correcciones necesarias en el cálculo final, como muestra la siguiente ecuación. Si se sustituye la solución de sulfato ferroso amónico por Na2C2O4, omítase el calentamiento y amplíese el período de reacción entre KMnO4 y Fe2+ a 5 minutos de hacer la titulación final de KMnO4. Calcúlese el contenido de NO-2 -N de la solución madre por medio de la siguiente ecuación:

donde: A = mg NO -2 -N/ml en la solución madre de NaNO2, B = total ml utilizados de KMnO4, C = normalidad de KMnO4 patrón, D = total ml adicionados de reductor patrón, E = normalidad del reductor patrón, y F = ml de solución madre NaNO2 tomados para titulación.

Cada 1,00 ml de KNnO4 0,05Af consumido por la solución de NaNO2 corresponde a 1750 g de NO-2 -N. f) Solución intermedia de nitrito: Calcúlese el volumen, G, de solución madre de NO -2 requeridos para la solución intermedia NO -2 , a partir de G = = 12,5/A. Dilúyase el volumen G (aproximadamente 50 ml) a 250 ml con agua; 1,00 ml = 50,0 µg N. Prepárese diariamente. g) Solución patrón de nitrito: Diluyanse 10,00 ml de solución intermedia de NO -2 a 1.000 ml con agua; 1,00 ml = = 0,500 µg N. Prepárese diariamente. 4.

Procedimiento

a) Eliminación de sólidos en suspensión: Si la muestra contiene sólidos sus-

MÉTODOS NORMALIZADOS

4-148

pendidos, fíltrese a través de un filtro de membrana de 0,45 µm de diámetro de poro. b) Desarrollo del color: Si el pH de la muestra no estuviera comprendido entre 5 y 9, ajústese a ese valor con HCl 1N o NH4OH según convenga. Añádanse 2 ml de reactivo de color a 50,0 ml de muestra a una porción diluida a 50,0 ml y mézclese. c) Medida fotométrica: Mídase la absorbancia a 543 nm, entre 10 minutos y 2 horas después de añadir el reactivo de color a las muestras y patrones. Utilícense, como guía, los siguientes recorridos de luz para las concentraciones indicadas de NO -2 -N.

6. Precisión y sesgo

En un único laboratorio, con muestras de aguas residuales a concentraciones de 0,04, 0,24, 0,55 y 1,04 mg NO3- + + NO-2 -N/l, las desviaciones estándar fueron ± 0,005, ± 0,004, ± 0,005 y ± 0,01, respectivamente. En un único laboratorio, con muestras de aguas residuales a concentraciones de 0,24, 0,55 y 1,05 mg NO3- + NO-2 -N/l, las recuperaciones fueron del 100,102 y 100 por 100, respectivamente1.

7.

Referencia

1. U.S. E NVIRONMENTAL P ROTECTION A GEN CY . 1979. Methods for Chemical Analysis of Water and Wastes. Method 353.3 U.S. Environmental Protection Agency, Washington, D.C.

5.

8.

Cálculo

Prepárese una curva patrón comparando la absorbancia de los patrones con la concentración de NO -2 -N. Calcúlese la concentración de la muestra directamente a partir de la curva.

4500- NO-2 C. Véase sección 4110.

Bibliografía

BOLTZ, D. F., ed. 1958. Colorimetric Determination of Nonmetals. Interscience Publishers, Nueva York. NYDALHL , F. 1976. On the optimum conditions for the reduction of nitrate by cadmium. Talanta 23:349.

Método cromatográfico de iones

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

4500- NO3-

NITRÓGENO (NITRATO)*

4500- NO3- A. 1.

Selección de método

La determinación de nitrato ( NO3- ) es difícil debido a los procedimientos relativamente complejos que se precisan, la elevada probabilidad de que se hallen sustancias interferentes y los rangos limitados de concentración de las diferentes técnicas. Una técnica con luz ultravioleta (UV) (método B) que mide la absorbancia de NO3- a 220 nm es adecuada para el estudio de aguas no contaminadas (con bajo contenido en materias orgánicas). Si fuera necesario, debe estudiarse la muestra y después seleccionar un método adecuado para su concentración y las interferencias probables. El nitrato se puede determinar por cromatografía iónica (C). Los rangos de aplicación para otros métodos son: método del electrodo de nitrato (D), 0,14 a 1.400 mg NO3- N/l; método de reducción de cadmio (E), 0,01 a 1,0 mg NO3- -N/l; método de cloAprobado por el Standard Methods Committee, 1988.

4500- NO3- B. 1.

4-149

Introducción ruro titanoso (G), 0,01 a 10 mg NO3- N/l; método de reducción de hidracina (H), 0,01 a 10 mg NO3- -N/l; método automático de reducción de cadmio (F), 0,5 a 10 mg NO3- -N/l. Para concentraciones más elevadas de NO3- -N diluyase hasta el rango del método seleccionado. Los métodos colorimétricos requieren una muestra ópticamente clara. Fíltrense las muestras turbias por filtro de membrana con 0,45 µm de diámetro de poro. Ensáyese la contaminación de nitrato en los filtros.

2. Almacenamiento de las muestras

Iníciense las determinaciones de NO3nada más tomar las muestras. Si se debe almacenar, consérvese a 4 °C hasta 24 horas; para períodos más largos, añádanse 2 ml de H2SO4 conc./l y manténgase a 4 °C. NOTA: Cuando se conserva una muestra con ácido, no se puede determinar NO3- y NO-2 individualmente.

Método espectrométrico ultravioleta selectivo

Discusión general

a) Principio: Utilícese esta técnica solamente para seleccionar muestras con bajo contenido en materia orgánica, es decir, aguas naturales incontaminadas y suministros de agua potable. La curva de calibrado de NO3- verifica la ley de Beer hasta los 11 mg N/l. La medida de la absorción UV a 220 nm hace posible la determinación rá-

pida de NO3- . Dado que la materia orgánica disuelta puede absorber también a 220 nm y NO3- no lo hace a 275 nm, se puede utilizar una segunda medida a 275 nm para corregir el valor de NO3- . Esta corrección empírica dependerá de la naturaleza y concentración de la materia orgánica y puede variar de unas aguas a otras. En consecuencia, este método no es recomendable cuando se precise una corrección importante para la absorban-

4-150

cia de la materia orgánica, aunque puede ser útil para controlar los niveles de NO3- en un sistema de aguas con un tipo constante de materia orgánica. Los factores de corrección para la absorbancia de materia orgánica se pueden establecer por el método de adiciones en combinación con el análisis del contenido original de NO3- por otro método. La filtración de la muestra tiene por objeto eliminar posibles interferencias de las partículas suspendidas. La acidificación con HC1 lN sirve para impedir interferencias por concentraciones de hidróxido o carbonato de hasta 1.000 mg de CaCO3/l. El cloruro no afecta a la determinación. b) Interferencia: Interfieren la materia orgánica disuelta, los surfactantes, NO-2 y Cr6+. Pueden interferir varios iones inorgánicos, que no se encuentran normalmente en el agua natural, como clorito y clorato. Las sustancias inorgánicas se pueden compensar con un análisis independiente de sus concentraciones y la preparación de curvas de corrección individuales. Para muestras turbias, véase el apartado A.l. 2.

Instrumental

Espectrofotómetro, para uso a 220 nm y 275 nm con cubetas de sílice iguales, de 1 cm de recorrido de luz o más.

MÉTODOS NORMALIZADOS

con 2 ml de CHC13/l. Esta solución es estable durante un mínimo de 6 meses. c) Solución intermedia de nitrato: Dilúyase 100 ml de solución madre de nitrato a 1.000 ml con agua; 1,00 ml = = 10,0 µg NO3- -N. Consérvese con 2 ml de CHCI3/I. Esta solución es estable durante 6 meses. d) Solución de ácido clorhídrico, HCl 1N. 4.

a) Tratamiento de la muestra: Sobre 50 ml de muestra transparente, filtrada si fuera preciso, añádase 1 ml de solución de HC1 y mézclese bien. b) Preparación de la curva patrón: Prepárense estándares de calibrado de NO3- en el rango de 0 a 7 mg NO3- N/l por dilución a 50 ml de los siguientes volúmenes de solución intermedia de nitrato: 0, 1,00, 2,00, 4,00, 7,00..., 35,0 ml. Trátense los patrones de NO3- del mismo modo que las muestras. c) Medida espectrofotométrica: Léase la absorbancia o transmitancia frente a agua redestilada, ajustada a absorbancia cero o transmitancia 100 por 100. Utilícese la longitud de onda 220 nm para obtener la lectura NO3- y 275 nm para determinar la interferencia debida a materia orgánica disuelta.

5. 3.

Reactivos

a) Agua exenta de nitrato: Utilícese agua redestilada o destilada, desionizada, de la máxima pureza para preparar todas las soluciones y diluciones. b) Solución madre de nitrato: Séquese nitrato potásico (KNO3) en un horno a 105 °C durante 24 horas. Disuélvanse 0,7218 g en agua y dilúyase a 1.000 ml; 1,00 ml = 100 µg NO3- -N. Consérvese

Procedimiento

Cálculo

Para muestras y patrones, réstese dos veces la absorbancia leída a 275 nm de la lectura a 220 nm, para obtener la absorbancia debida a NO3- . Trácese la curva patrón comparando la absorbancia debida a NO3- con la concentración de NO3- -N del patrón. Utilizando las absorbancias corregidas de la muestra, obténgase la concentración directamente a partir de la curva patrón. NOTA: Si el valor de corrección supera el 10 por 100

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

de la lectura a 220 nm, no utilizar este método. 6.

Bibliografía

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4500-NO3 C.

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GOLDMAN, E. & R. JACOBS. 1961. Determination of nitrates by ultraviolet absorption. J. Amer. Water Works Assoc. 53:187. ARMSTRONG, F. A. J. 1963. Determination of nitrate in water by ultraviolet spectrophotometry. Anal. Chem. 35:1292. NAVONE, R. 1964. Proposed method for nitrate in potable waters. J. Amer. Water Works Assoc. 56:781.

Método cromatográfico de iones

Véase sección 4110.

4500- NO3- D. 1.

Método del electrodo de nitrato

Discusión general 3

a) Principio: El electrodo de ion NO es un sensor selectivo que desarrolla un potencial a través de una membrana delgada, porosa, inerte, que se mantiene en posición en un intercambiador iónico en un líquido inmiscible con agua. El electrodo responde a la actividad del ion NO3- entre aproximadamente 10 -5 y 10 -1 M (0,14 a 1.400 mg NO3- -N/l). El límite inferior de detección está determinado por la solubilidad escasa, pero finita, del cambiador iónico líquido. b) Interferencias: Los iones cloruro y bicarbonato interfieren cuando su proporción en peso frente a NO3- -N es > > 10 o > 5, respectivamente. Los iones potencialmente interferentes, pero que no se encuentran en niveles significativos en las aguas potables, son: NO -2 , CN¯, S2-, Br ¯, I ¯, ClO3- y ClO-4 . Aunque los electrodos funcionan satisfactoriamente en tampones comprendidos entre pH 3 y 9, se han observado respuestas erráticas cuando el pH no se mantiene constante. Dado que el electrodo responde a actividad de NO3- más que a su concentración, la fuerza iónica debe ser constante

en todas las muestras y patrones. Ese problema se reduce al mínimo utilizando una solución tampón que contenga Ag2SO4 para eliminar Cl¯, Br¯, I¯, S2y CN¯, ácido sulfámico para eliminar NO -2 , un tampón a pH 3 para eliminar HCO3- y manténgase el pH y la fuerza iónica constante y Al2(SO4)3 para complejar los ácidos orgánicos.

2.

Instrumental

a) Medidor de pH de escala expandida o digital, capaz de resolución de 0,1 mV. b) Electrodo de referencia de empalme doble*. Llénese la cámara externa con solución de (NH4)2SO4. c) Electrodo de ion nitrato†: Síganse cuidadosamente las instrucciones del fabricante respecto a atención y conservación. d) Agitador magnético: Barrita recubierta de TFE. * Orion modelo 90-02 o equivalente. † Orion modelo 93-07, Corning modelo 476134 o equivalente.

4-152

3.

Reactivos

a) Agua exenta de nitrato: Prepárese como se describe en el apartado B.3a. Utilícese para todas las soluciones y diluciones. b) Solución madre de nitrato: Prepárese como se describe en el apartado B.3b. c) Soluciones patrón de nitrato: Dilúyase 1,0, 10 y 50 ml de solución madre de nitrato a 100 ml con agua, para obtener las soluciones patrón de 1,0, 10 y 50 mg NO3- -N/l, respectivamente. d) Solución tampón: Disuélvanse 17,32 g de Al2(SO4)3·18H2O, 3,43 g de Ag2SO4, 1,28 g de H3BO3 y 2,52 g de ácido sulfámico (H2NSO3H) en unos 800 ml de agua. Ajústese a pH 3,0 por adición lenta de NaOH 0,10N. Dilúyase a 1.000 ml y consérvese en frascos de vidrio oscuro. e) Hidróxido de sodio, NaOH 0,1 N. f) Solución de llenado del electrodo de referencia: Disuélvanse 0,53 g de (NH4)2SO4 en agua y dilúyase a 100 ml.

4.

MÉTODOS NORMALIZADOS

del patrón de 10 mg NO3-N y ajustando el control de calibrado hasta que muestre de nuevo la lectura de la curva de calibrado. b) Medición de la muestra: Transfiéranse 10 ml de muestra a un vaso de 50 ml, añádanse 10 ml de solución tampón y agítese (durante 1 minuto aproximadamente) con agitador magnético. Mídanse los patrones y las muestras a la misma temperatura aproximadamente. Introdúzcanse los extremos de los electrodos en la muestra y regístrese la lectura de potencial cuando se estabilice (al cabo de 1 minuto aproximadamente). Léase la concentración a partir de la curva de calibrado.

5.

Precisión

Es de esperar una precisión de ± 0,4 mV correspondiente a 2,5 por 100 en concentración, en el rango del método.

Procedimiento

a) Preparación de la curva de calibrado: Transfiérase 10 ml o 1 mg de patrón de NO3- -N/l a un vaso de 50 ml, añádanse 10 ml de tampón y agítese con agitador magnético. Introdúzcanse los extremos de los electrodos y regístrese la lectura en mV cuando se estabilice (al cabo de 1 minuto aproximadamente). Sáquense los electrodos, lávese y séquese. Repítase con los patrones de 10 mg y 50 mg NO3- -N/l. Compárense las medidas de potencial con las concentraciones de NO3- -N sobre papel semilogarítmico, con las concentraciones en el eje logarítmico (abscisa) y el potencial (en milivoltio) en el eje lineal (ordenada). Debe resultar una línea recta con una pendiente de + 57 ± 3mV/década a 25 °C. Vuélvanse a calibrar los electrodos varias veces al día, comprobando la lectura de potencial

6.

Bibliografía

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DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

4500- NO3- E. 1.

4-153

Método de reducción de cadmio

Discusión general

2.

a) Principio: NO3- se reduce casi 2

cuantitativamente a nitrito ( NO ) en presencia de cadmio (Cd). Este método utiliza Cd comercial en gránulos tratado con sulfato de cobre (CuSO4) y como relleno de una columna de vidrio. El NO-2 así producido se determina por diazotado con sulfanilamida y acoplamiento con dihidroclorhidrato de N(l-naftil)-etilendiamina para formar un colorante azo de color muy intenso, que se mide colorimétricamente. Se puede hacer una corrección para el NO -2 presente en la muestra, suprimiendo el paso de reducción en el análisis. El rango de aplicación de este método es de 0,01 a 1,0 mg de NO3- -N/l. El método está especialmente recomendado para niveles de NO3- inferiores a 0,1 mg N/l, donde otros métodos carecen de sensibilidad adecuada. b) . Interferencias: La materia suspendida en la columna restringirá el flujo de la muestra. Para muestras turbias, véase apartado A.l. Las concentraciones de hierro, cobre u otros metales, por encima de varios miligramos por litro, reducen la eficacia de la reducción. Añádase EDTA a las muestras para eliminar esas interferencias. El aceite y la grasa recubrirán la superficie de Cd. Elimínese por extracción previa con un disolvente orgánico (véase sección 5520). El cloro residual puede interferir por oxidación de la columna de Cd, reduciendo su eficacia. Compruébese el cloro residual en las muestras (véanse métodos DFD en la sección 4500-Cl). Elimínese el cloro residual por adición de solución de tiosulfato de sodio (Na2S2O3) (sección 4500NH3.B.3d4). Interfiere el color de la muestra con absorbancia próxima a los 540 nm.

Instrumental

a) Columna de reducción: Adquiérase o constrúyase la columna* (figura 4500NO3- :1) a partir de una pipeta aforada de 100 ml a la que se quita la parte superior. También se puede fabricar con dos piezas tubulares unidas extremo contra extremo: únanse 10 cm de tubo con diámetro interno de 3 cm a 25 cm de tubo con 3,5 cm de DI. Añádase una llave de paso con válvula1 de medida para controlar la tasa de flujo. b) Equipo calorimétrico: Se requiere uno de los siguientes:

1) Espectrofotómetro, para uso a 543 nm, con un recorrido de luz de 1 cm o más. 2) Fotómetro de filtro, con recorrido de luz de 1 cm o más, y provisto de un filtro de máxima transmitancia próxima a 540 nm. 3.

Reactivos

a) Agua exenta de nitrato: Véase el apartado B.3a. La absorbancia de un blanco de reactivo preparado con este agua no debe exceder de 0,01. Utilícese para todas las soluciones y diluciones. b) gránulos de cobre-cadmio: Lávense 25 g de gránulos de Cd† de calibre 40 a 60 nuevos o usados con HC1 6N y lávese con agua. Agítese por rotación el Cd con 100 ml de solución de CuSO4 al 2 por 100 durante 5 minutos o hasta que el color azul se desvanezca parcialmente. Decántese y repítase con CuSO4 reciente hasta que empiece a formarse un precipitado coloidal marrón. Lávese con * Tudor Scientific Glass Co., 555 Edgefield Road, Belvedere, S.C. 29841, Cat. TP-1730, o equivalente. † EM Laboratories, Inc. 500 Exec. Blvd., Elmsford, Nueva York, Cat. 2001, o equivalente.

MÉTODOS NORMALIZADOS

4-154

h) Solución madre de nitrato: Prepárese como se indica en el apartado B.3b. i) Solución intermedia de nitrato: Prepárese como se indica en el apartado B.3c. j) Solución madre de nitrito: Véase sección 4500- NO -2 .B.3e. k) Solución intermedia de nitrito: Véase sección 4500- NO-2 .B.3f. l) Solución de trabajo de nitrito: Diluyanse 50,0 ml de solución intermedia de nitrito a 500 ml con agua exenta de nitrito; 1,00 ml = 5 µ g NO -2 -N. 4.

Procedimiento

a) Preparación de la columna de reducción: Insértese un tapón de lana de vidrio en la base de la columna de reducción y llénese con agua. Añádase suficiente cantidad de gránulos de Cu-Cd para producir una columna de 18,5 cm de largo. Manténgase el nivel de agua por encima de los gránulos de Cu-Cd para evitar que quede aire atrapado. Lávese la columna con 200 ml de solución Figura 4500- NO -3 :l. Columna de reducción. NH4C1-EDTA. Actívese la columna pasando a través de ella, a 7-10 ml/min, como mínimo, 100 ml de una solución agua cuidadosamente, para eliminar compuesta por un 25 por 100 de patrón todo el Cu precipitado. c) Reactivo de color: Prepárese como de 1,0 mg NO3 -N/l y 75 por 100 de sose describe en la sección 4500- lución NH4Cl-EDTA. b) Tratamiento de la muestra: NO - B.3b. 2

d) Solución de cloruro de amonioEDTA: Disuélvanse 13 g de NH 4 C1 y 1,7 g de etilendiamino tetracetato de sodio en 900 ml de agua. Ajústese a pH 8,5 con NH4OH conc. y dilúyase a 1 l. e) Solución diluida de cloruro de amonio-EDTA: Dilúyanse 300 ml de NH4ClEDTA a 500 ml con agua. f) Ácido clorhídrico, HC1 6N. g) Solución de sulfato de cobre, 2 por 100: Disuélvanse 20 g de CuSO4·5H2O en 500 ml de agua y dilúyase a 1 l.

1) Eliminación de la turbidez. Para muestras turbias, véase apartado A.l. 2) Ajuste del pH. Ajústese el pH entre 7 y 9, como es necesario, utilizando un medidor de pH y dilúyase HCl o NaOH. Así se asegura un pH de 8,5 tras adición de la solución NH4Cl-EDTA. 3) Reducción de la muestra. Añádanse 75 ml de solución NH4Cl-EDTA a 25,0 ml de muestra o a una porción diluida a 25,0 ml, y mézclese. Viértase la muestra mezclada en la columna y recójase a una tasa de 7 a 10 ml/min. Deséchense los primeros 25 ml. Reúnase el resto en el matraz original de la muestra.

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

No es necesario lavar las columnas entre muestras, pero si no se van a utilizar durante varias horas o más, viértanse 50 ml de solución NH4C1-EDTA en la parte superior y déjese pasar a través del sistema. Consérvese la columna Cu-Cd en esta solución, no dejando nunca que se seque. 4) Desarrollo y medida del color: En cuanto sea posible, y no más de 15 minutos después de la reducción, añádanse 2,0 ml de reactivo de color a 50 ml de muestra y mézclese. Entre 10 minutos y 2 horas después, mídase la absorbancia a 543 nm frente a blanco de agua destilada-reactivo. NOTA: Si la concentración de NO3- excede del rango de la curva patrón (alrededor de 1 mg N/l), utilícese el resto de muestra reducida para hacer una dilución apropiada, y analícese de nuevo. c) Patrones: Utilizando la solución intermedia de NO3- -N, prepárense patrones en el rango de 0,05 a 1,0 mg NO3- -N/l, por dilución de los volúmenes siguientes a 100 ml, en matraces aforados: 0,5, 1,0, 2,0, 5,0 y 10,0 ml. Realícese la reducción de los patrones exactamente como se describe para las muestras. Compárese, al menos, un patrón de NO -2 con un patrón NO3- reducido a la misma concentración, para comprobar la eficacia reductora de la columna. Reactívense los gránulos de Cu-Cd como se describe en el apartado 3b anterior cuando la eficacia reductora sea inferior al 75 por 100. 5.

Cálculo

Obténgase una curva patrón comparando la absorbancia de los patrones frente a la concentración de HCO3- -N. Calcúlense las concentraciones de la muestra directamente a partir de la curva pa-

4-155

trón. Exprésense como miligramos de N oxidado por litro (la suma de HCO3- -N más NO -2 -N) a no ser que se determine separadamente la concentración de NO -2 -N y se reste. 6.

Precisión y sesgo

En un único laboratorio, usando muestras de agua residual a concentraciones de 0,04, 0,24, 0,55 y 1,04 mg NO3- + NO-2 -N/l, las desviaciones estándar fueron ± 0,005, ± 0,004, ± 0,005 y ± 0,01, respectivamente. En un único laboratorio, usando aguas residuales con adiciones de 0,24, 0,55, y 1,05 mg NOJ + NO-2 -N/l, las recuperaciones fueron del 100 por 100, 102 por 100 y 100 por 100, respectivamente2. 7.

Referencias

1.

WOOD , E. D., F. A. J. ARMSTRONG & F. A. RICHARDS. 1967. Determination of nitrate in sea water by cadmium-copper reduction to nitrite. J. Mar. Biol. As.soc. U.K. 47:23. 2. U.S. ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENCY. 1979. Methods for Chemical Analysis of Water and Wastes, Method 353.3. U.S. Environmental Protection Agency, Washington, D.C.

8.

Bibliografía

STRICKLAND, J. D. H. & T. R. PARSONS. 1972. A Practical Handbook of Sea Water Analysis, 2.a ed. Bull. n.° 167, Fisheries Research Board Canada, Ottawa, Ontario. N YDAHL , F. 1976. On the optimum conditions for the reduction of nitrate by cadmium. Talanta 23:349. AMERICAN SOCIETY FOR TESTING AND MATERIALS. 1987. Annual Book of ASTM Standards, Vol. 11.01. American Soc. Testing & Materials, Filadelfia, Pennsylvania.

4-156

4500- NO3- F. 1.

MÉTODOS NORMALIZADOS

Método automatizado de reducción de cadmio

Discusión general

a) Principio: Véase apartado E.la. b) Interferencias: Puede interferir la turbidez de la muestra. Elimínese por filtrado antes del análisis. También interferirá el color de la muestra con absorbancia en el rango fotométrico utilizado para el análisis.

c) Aplicación: Se puede determinar el nitrato o nitrito, aislados o juntos, en agua potable, superficial y salina y en las residuales domésticas o industriales, en un rango de 0,5 a 10 mg N/l.

2. Instrumental Equipo analítico automatizado: El instrumental* analítico con flujo continuo necesario consta de los componentes que muestra la figura 4500- NO3- :2. 3. Reactivos a) Agua destilada desionizada: Véase apartado B.3a. b) Solución de sulfato de cobre: Disuélvanse 20 g de CuSO4·5H2O en 500 ml de agua y dilúyase a 1 l. * AutoAnalyzer™II: Technicon Instrument Corp., Tarrytown, Nueva York, o equivalente.

Figura 4500-NO3 :2. Distribuidor de nitrato-nitrito.

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

c) Solución de lavado: Utilícese agua para las muestras no conservadas. Para las conservadas con H 2SO 4 , añádanse 2 ml de H2SO4 conc./l al agua de lavado. d) gránulos de cobre-cadmio: Véase apartado E.3b. e) Ácido clorhídrico, HCl conc. f ) Hidróxido de amonio, NH 4 OH conc. g) Reactivo de color: Añádanse con agitación a unos 800 ml de agua, 100 ml de H 3 PO 4 , 40 g de sulfanilamida y 2 g de diclorhidrato de N-(l-naftil)etilendiamina. Agítese hasta disolución y dilúyase a 1 l. Consérvese en frascos topacio y manténgase en la oscuridad cuando no se utilicen. Esta solución es estable durante varios meses. h) Solución de cloruro de amonio: Disuélvanse 85 g de NH4C1 en agua y diluyase a 1 l. Añádanse 0,5 ml de polioxietileno 23 lauril éter†. i) Solución madre de nitrato: Véase apartado B3b. j) Solución intermedia de nitrato: Véase apartado B.3c. k) Soluciones patrón de nitrato: Utilizando la solución intermedia NO3- -N y agua, prepárense patrones para la curva de calibrado en la escala apropiada de nitrato. Compárese, al menos, un NO -2 patrón con un NO3 a la misma concentración para comprobar la eficacia reductora de la columna. Al examinar aguas salinas, prepárense soluciones patrón con el sustituto de agua oceánica, descrito en la sección 4500-NH3.G.3g. l) Solución patrón de nitrito: Véase sección 4500-NH3.3g.

4-157

Si el pH de la muestra fuera inferior a 5 o superior a 9, ajústese entre esos valores con HC1 conc. o NH4OH conc. 5.

Cálculo

Prepárense curvas patrón comparando las alturas de los picos de los patrones procesados por el aparato con sus concentraciones de NO3- -N. Calcúlese la concentración de NO3- -N en la muestra por comparación de la altura de su pico con la curva patrón. 6.

Precisión y sesgo

En la siguiente tabla, se proporcionan datos obtenidos en tres laboratorios con un sistema automatizado basado en los mismos principios químicos, pero con configuraciones algo diferentes‡. Se hicieron análisis en cuatro muestras de agua natural, que contenían incrementos exactos de nitrato inorgánico:

Móntese el aparato como muestra la figura 4500- NO3- :2 y sígase el procedimiento general descrito por el fabricante.

En un solo laboratorio que utilizó muestras de agua superficial a concentraciones de 100, 200, 800 y 2.100 µg N/l, las desviaciones estándar fueron 0, ±40, ± 50 y ± 50 µg/l, respectivamente, y, a concentraciones de 200 y 2.200 µg N/l, las recuperaciones fueron del 100 y 96 por 100, respectivamente. Se cree que la precisión y sesgo para el sistema aquí descrito son comparables.

† Brij-35, disponible en ICI Americas, Inc., Wilmington, Delaware, o Technicon Instruments Corp., Tarrytown, Nueva York, o equivalente.

‡ Automated System I, descrito en la 16.a edición de esta publicación, sección 418F.

4.

Procedimiento

MÉTODOS NORMALIZADOS

4-158

7.

Bibliografía

FIORE, J. & J. E. O'BRIEN. 1962. Automation in sanitary chemistry. Partes 1 y 2. Determination of nitrates and nitrites. Wastes Eng. 33:128 & 238. ARMSTRONG, F. A., C. R. STEARNS & J. D. STRICKLAND. 1967. The measurement of upwelling and subsequent biological processes

4500-NO3 G.

1.

Método de reducción de cloruro titanoso (PROPUESTA)

Discusión general

a) Principio: Se determina NO3- potenciométricamente utilizando un electrodo sensor de gas NH3 tras reducción de NO3- a NH3. La reducción se consigue por medio del reactivo cloruro titanoso. El electrodo se calibra con soluciones de NO3- y la concentración de las muestras se determina en la misma solución de base, que contiene hidróxido de sodio y cloruro titanoso. Este método es aplicable a la determinación de NO3- en agua que contenga de 0,1 a 20 mg de NO3- -N/I. El rango de concentración se puede ampliar diluyendo la muestra adecuadamente. b) Interferencias: NH3 y NO3- , si se encuentran presentes, pueden medirse con NO3- . Si alguna de las concentraciones fuera significativa respecto a la de NO3- , mídase por separado y réstese. 2.

by means of the Technicon AutoAnalyzer and associated equipment. Deep Sea Res. 14:381. U.S. ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENCY. 1979. Methods for Chemical Analysis of Water and Wastes. U.S. Environmental Protection Agency, Washington, D.C. AMERICAN SOCIETY FOR TESTING AND MATERIALS. 1987. Annual Book of ASTM Standards, Vol. 11.01. American Soc. Testing & Materials, Filadelfia, Pennsylvania.

Instrumental

a) pHmetro, con resolución de 0,1 mV o un iónmetro específico. b) Electrodo sensor de gas NH3*. c) Agitador magnético, con varilla recubierta de TFE. * Orion modelo 95-12 o equivalente.

3.

Reactivos

a) Solución de cloruro titanoso reactivo, TiCl3, calidad práctica, 20 por 100. b) Solución de hidróxido de sodio, NaOH, 10N: Disuélvanse 400 g de NaOH calidad reactivo en lentejas, y dilúyase a 1.000 ml con agua. c) Solución madre de nitrato: Véase apartado B.3b. d) Solución de NH3 para llenado del electrodo, NH4C1 y NaNo3: Disuélvanse 0,535 g de NH4C1 y 8,500 g de NaNO3 y dilúyase a 100 ml con agua destilada. Añádanse 0,3 ml de solución 0,lM de AgNO3. La solución será ligeramente turbia. 4.

Procedimiento

a) Preparación de la curva de calibrado: Móntese y compruébese el electrodo de NH3 de acuerdo con las instrucciones del fabricante, pero utilizando la solución de llenado preparada en el apartado 3d. Prepárense patrones de NO3- con 0,1, 1,0 y 10,0 mg/l, por diluciones en serie de la solución madre de NO3- . Transfiéranse 100 ml de patrón de 0,1 mg/l a un vaso de 150 ml, sitúese la varilla agitadora y agítese moderadamente. Añádanse 10 ml de NaOH 10N y 2 ml de reactivo TiCl3. Introdúzcase el electrodo

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

en la solución en agitación, déjese que se estabilice el potencial y regístrese la lectura en milivoltios. Refléjese como 0,1 mg NO3- -N/l y repítase con cada uno de los patrones restantes. Prepárese una curva de calibrado sobre papel semilogarítmico, con el potencial observado en el eje lineal (ordenadas) y la concentración NO3- -N en el logarítmico (abscisa). NOTA: Las correcciones de volumen se incorporan al calibrado de forma que se puedan hacer las lecturas directamente a partir de la gráfica. b) Medición de las muestras: Transfiéranse 100 ml de muestra a un vaso de 150 ml, añádase una varilla agitadora y agitar moderadamente. Añádanse 10 ml de NaOH 10N y 2 ml de reactivo TiCl3. Introdúzcase el electrodo en la solución en agitación, déjese que se estabilice el

4-159

potencial y utilícese el voltaje para leer NO3- /l directamente, a partir de la curva de calibrado. Lávese el electrodo con agua destilada entre muestra y muestra. 5.

Precisión

Se espera una precisión de ±0,6 mV o menos, correspondiente a ±3,0 por 100 en concentración, en el rango del método. 6.

Bibliografía

BRAUNSTEIN , L. K. HOCHMULLER & K. SPEN GLER .

1980. Combined ammonium/nitrate

analysis using an ion-selective electrode. Impresión especial de Vom Wasser, 54, Verlag Chemie GmbH.

4500- NO3- H. Método automatizado de reducción de hidracina (PROPUESTA)

1.

Discusión general

a) Principio: NOJ se reduce a NO-2 con sulfato de hidracina. El NO-2 (presente originalmente junto con NO3- reducido) se determina por diazotado con sulfanilamida y apareamiento con dicloridrato de N-(l-naftil)-etilendiamina para formar un colorante azo de color intenso que se mide colorimétricamente. b) Interferencias: Interferirá el color de las muestras que absorba en el rango fotométrico utilizado. Las concentraciones de ion sulfuro inferiores a 10 mg/l producen variaciones de ±10 por 100 en las concentraciones de NO3- y NO-2 . c) Aplicación: Se puede determinar NO3- + NO-2 en agua potable y de superficie y en las residuales domésti-

cas e industriales en una gama de 0,01 a 10 mg N/l. 2.

Instrumental

Equipo analítico automatizado: El instrumental analítico de flujo continuo requerido* consta de los componentes que muestra la figura 4500- NO3- :3. 3.

Reactivos

a) Reactivo para desarrollo del color: Añádanse 200 ml de ácido fosfórico conc. y 10 g de sulfanilamida a 500 ml de agua * AutoAnalyzer II: Technicon Instrument Corp., Tarrytown, Nueva York, o equivalente.

MÉTODOS NORMALIZADOS

4-160

Figura 4500- NO -3 :3. Distribuidor de nitrato-nitrito.

aproximadamente. Después que la sulfanilamida se haya disuelto totalmente, añádanse 0,8 g de diclorhidrato de N-(lnaftíl)-etilendiamina. Dilúyase a 1 l con agua, consérvese en frascos oscuros y refrigerado. La solución es estable durante 1 mes, aproximadamente. b) Solución madre de sulfato de cobre: Disuélvanse 2,5 g de CuSO4·5H 2O en agua y dilúyase hasta 1 l. c) Solución diluida de sulfato de cobre: Dilúyanse 20 ml de solución madre hasta 2 l.

d) Solución madre de hidróxido de sodio, 10N: Disuélvanse 400 g de NaOH en 750 ml de agua, enfríese y dilúyase a 1 l. e) Hidróxido de sodio, 10N: Dilúyanse 100 ml de solución madre de NaOH a 1l. f) Solución madre de sulfato de hidracina: Disuélvanse 27,5 g de N2H4·H2SO4 en 900 ml de agua y dilúyase a 1 l. La solución es estable durante 6 meses aproximadamente. PRECAUCIÓN: Tóxico si se ingiere. Indíquese la advertencia correspondiente en la etiqueta. g) Solución diluida de sulfato de hi-

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

dracina: Dilúyanse 22 ml de solución madre a 1 l. h) Solución madre de nitrato: Véase apartado B3b. i) Solución intermedia de nitrato: Véase apartado B.3c. j) Soluciones patrón de nitrato: Prepárense patrones de calibrado de NO3en el rango de 0 a 10 mg/l, por dilución a 100 ml de los siguientes volúmenes de solución madre de nitrato: 0, 0,5, 1,0, 2,0..., 10,0 ml. Para patrones en el rango de 0,01 mg/l, utilícese la solución intermedia de nitrato. Compárese, por lo menos, un patrón de nitrito con uno de nitrato a la misma concentración para combrobar la eficacia de la reducción. k) Solución patrón de nitrito: Véanse apartados B.3e,f y g. 4.

Procedimiento

Móntese el instrumental como muestra la figura 4500- NO3- :3 y sígase el procedimiento general descrito por el fabricante. Pásese por el sistema un patrón de 2,0 mg NO3- -N/l, y uno de 2,0 mg NO-2 -N/l para comprobar la reducción del 100 por 100 de nitrato a nitrito. Los dos picos deben tener la misma altura; si no, se ajustará la concentración de la solución de sulfato de hidracina. Si el pico de NO3- es menor que el de NO-2 , auméntese la concentración del sulfato de hidracina hasta que sean iguales; si el pico de NO3- es mayor que el de NO-2 , redúzcase la concentración del sulfato de hidracina. Cuando se haya determinado la concentración correcta, ya no serán necesarios más ajustes.

5.

4-161

Cálculo

Prepárese una curva patrón comparando la altura de los picos de los patrones procesados con sus concentraciones. Calcúlense las concentraciones de las muestras por comparación de las alturas de los picos con la curva patrón.

6.

Precisión y sesgo

En un único laboratorio que utilizó agua potable, superficial y residual industrial, a concentraciones de 0,39, 1,15, 1,76 y 4,75 mg de NO3- -N/I, la desviación estándar fue de ±0,02, ±0,01, ±0,02 y ±0,03, respectivamente. En un solo laboratorio, que utilizó agua potable a concentraciones de 0,75 y 2,97, las recuperaciones fueron 99 por 100 y 101 por 1001.

7. Referencia 1. U.S. ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENCY. 1979. Methods for Chemical Analysis of Water and Wastes. U.S. Environmental Protection Agency, Washington, D.C.

8. Bibliografía KAMPHAKE, L., S. HANNAH & J. COHEN. 1967. Automated analysis for nitrate by hydrazine reduction. Water Res. 1:205.

MÉTODOS NORMALIZADOS

4-162

4500-Norg

NITRÓGENO (ORGÁNICO)*

4500-Norg A. 1.

Selección del método

El principal factor de influencia para la selección de un método macro o semimicro-kjeldahl en la determinación del nitrógeno orgánico es la concentración de éste. El método macro-kjeldahl es aplicable a las muestras que contienen concentraciones bajas o altas de nitrógeno orgánico, pero requiere un volumen de muestra relativamente amplio para las concentraciones bajas. En el método semi-micro-kjeldahl, aplicable a muestras con concentraciones elevadas de nitrógeno orgánico, el volumen de muestra se debe elegir de modo que contenga nitrógeno orgánico y amoniacal (nitrógeno kjeldahl) en el rango de 0,2 a 2 mg. 2.

Almacenamiento de las muestras

Los resultados más fiables se consiguen con muestras recientes. Si no es posible un análisis inmediato, consérvense las muestras acidificadas a pH 1,5-2,0 con H2SO4 conc. y a 4 C. No utilizar HgCl2 porque interfiere con la eliminación del amoníaco. 3.

Interferencias

a) Nitrato: Durante la digestión, el nitrato por encima de 10 mg/l puede oxidar parte del amoníaco liberado a partir del nitrógeno orgánico digerido, produciendo N2O y dando lugar a una interferencia negativa. Cuando se encuentre presente suficiente materia orgánica en bajo estado de oxidación, el nitrato se * Aprobado por el Standard Methods Committee, 1985.

Introducción puede reducir a amoníaco, resultando en una interferencia positiva. Las condiciones en que se producen interferencias importantes no están bien definidas y no existe un método comprobado para eliminar la interferencia en conjunción con los procedimientos aquí descritos. b) Sales y sólidos inorgánicos: El contenido en ácido y sal del reactivo para digestión se destina a producir una temperatura de digestión de alrededor de 360 a 370 °C. Si la muestra contiene una gran cantidad de sal o sólidos inorgánicos que se disuelven durante la digestión, la temperatura puede subir por encima de 400 °C en que comienza una pérdida pirolítica de nitrógeno. Para evitar una temperatura de digestión excesiva, añádase más H2SO4 que mantendrá el equilibrio ácido-sal. No todas las sales producen exactamente la misma elevación de la temperatura, pero la adición de 1 ml de H2SO4/g de sal en la muestra consigue resultados razonables. Añádase el ácido adicional y el reactivo de digestión tanto a la muestra como al blanco de reactivo. Un exceso de ácido rebajará la temperatura de digestión a menos de 360 °C y dará lugar a una digestión y recuperación incompletas. Si es necesario, añádase más hidróxido de sodio-tiosulfato de sodio antes del paso final de destilación para neutralizar el exceso de ácido. Las cantidades grandes de sal o sólidos pueden causar sobresaltos en la destilación. Si así fuera, añádase más agua de dilución a las muestras, tras la digestión. c) Materia orgánica: Durante la digestión, H2SO4 oxida la materia orgánica a CO2 y H2O. Si hubiera presente una gran cantidad de materia orgánica, se consumirá mucho ácido, aumentará la

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

proporción de sal a ácido y aumentará la temperatura de digestión. Si hay materia orgánica suficiente, la temperatura se elevará por encima de 400 °C, dando lugar a pérdida pirolítica de nitrógeno. Para evitarlo, añádanse al matraz de digestión 10 ml de H 2SO 4 conc/3 g de COD. (Para la mayoría de sustancias orgánicas, 3 g COD es igual a 1 g de materia orgánica aproximadamente). Alternativamente, añádanse 50 ml más de reactivo de digestión/g COD. Puede ser necesario reactivo hidróxido sódico-tiosulfato sódico adicional para mantener alto el pH de destilación. Dado que los reactivos pueden contener trazas de amoníaco, trátese el blanco de reactivos igual que las muestras. 4.

Uso de un catalizador

Aunque generalmente es deseable evitar el uso de mercurio, debido a su toxi-

4500-Norg B. 1.

4-163

cidad y a los problemas asociados a la eliminación de sus residuos, este elemento representa el catalizador ideal. Sólo el selenio es tan eficaz como el mercurio, aunque es muy tóxico y su uso puede conllevar interferencias. La digestión de algunas muestras puede ser completa o casi completa, sin necesidad de usar un catalizador o con alguno menos tóxico, como el cobre. Si el cobre sustituyera al mercurio, añádanse 10 ml de una solución conteniendo 25,115 g de CuSO4/l a cada matraz de digestión macro-kjeldahl con 50 ml de reactivo de digestión, en el que se ha omitido HgO. Utilícense 2 ml de solución de CuSO4 para el método semi-micro. Si se omite el catalizador de mercurio, refléjese esta variación e indíquese, si es posible, el porcentaje de recuperación con respecto a los resultados para muestras similares analizadas con el catalizador de mercurio.

Método macro-kjeldahl

Discusión general

El método kjeldahl determina el nitrógeno en estado trinegativo. No tiene en cuenta el nitrógeno en forma de azida, azina, azo, hidrazona, nitrato, nitrito, nitrilo, nitroso, oxima y semicarbazona. Si no se elimina el nitrógeno amoniacal en la fase inicial (apartado 4b más adelante) del procedimiento, el término «nitrógeno kjeldahl» se aplica al resultado. Si se determina individualmente el nitrógeno kjeldahl y el amoniacal, se puede obtener el «nitrógeno orgánico» por diferencia. a) Principio: En presencia de H2SO4, sulfato potásico (K2SO4) y sulfato mercúrico (HgS04) catalizador, el nitrógeno amino de muchos materiales orgánicos se transforma en sulfato de amonio

[(NH4)2SO4]. El amoníaco libre y nitrógeno-amonio también se convierte en (NH4)2SO4. Durante la digestión de la muestra, se forma un complejo de mercurio amonio que luego se descompone por el tiosulfato de sodio (Na2S2O3). Tras la descomposición el amoníaco se destila desde un medio alcalino y se absorbe en ácido bórico o sulfúrico. El amoníaco se determina colorimétricamente o por titulación con un ácido mineral patrón. b) Selección del método para medición del amoníaco: La sensibilidad de los métodos colorimétricos los hace especialmente útiles para determinar niveles de nitrógeno orgánico por debajo de 5 mg/l. Los métodos titulométrico y de ion selectivo para medir el amoníaco del destilado son adecuados para una amplia gama de concentraciones de nitrógeno orgánico.

MÉTODOS NORMALIZADOS

4-164

2.

Instrumental

a) Aparato de digestión: Los mejores resultados se consiguen con matraces kjeldahl de 800 ml de capacidad total. Digiérase sobre un dispositivo de calefacción ajustado de modo que se puedan calentar 250 ml de agua a una temperatura inicial de 25 °C hasta ebullición en 5 minutos aproximadamente. Para probar, caliéntese previamente durante 10 minutos si son de gas o 30 minutos si son eléctricos. Un dispositivo que cumpla esas especificaciones debe proporcionar un rango de temperatura de 365 a 370 °C para una digestión efectiva. b) Aparato de destilación: Véase sección 4500-NH3.B.2a. c) Aparato para determinación del amoníaco: Véanse las secciones 4500NH3.C2. D.2, E.2 o F.2. 3.

Reactivos

Prepárense todos los reactivos y diluciones en agua exenta de amoníaco. Son precisos todos los reactivos enumerados en la determinación de Nitrógeno (Amoníaco), secciones 4500-NH3.C3, D.3, E.3 o F.3, y los siguientes: a) Solución de sulfato mercúrico: Disuélvanse 8 g de óxido rojo mercúrico, HgO, en 100 ml de H2SO4 6N. b) Reactivo de digestión: Disuélvanse 134 g de K2SO4 en 650 ml de agua y 200 ml de H2SO4 conc. Añádanse con agitación, 25 ml de solución de sulfato mercúrico. Dilúyase la solución combinada hasta 1 l con agua. Manténgase a temperatura próxima a 20 °C para evitar la cristalización. c) Reactivo hidróxido sódico-tiosulfato sódico: Disuélvanse 500 g de NaOH y 25 g de Na2S2O3-5H2O en agua y diluyase a 1 l.

d) Solución tampón de borato: Véase sección 4500-NH3.B.3b. e) Hidróxido de sodio, NaOH 6N. 4.

Procedimiento

a) Selección del volumen de muestra y preparación de la muestra: Póngase un volumen medido de muestra en un matraz kjeldahl de 800 ml. Selecciónese el tamaño de muestra a partir de la tabulación siguiente:

Si fuera necesario, dilúyase la muestra a 300 ml, neutralícese a pH 7 y declórese como se describe en la sección 4500NH3.B.4b. b) Eliminación del amoníaco: Añádanse 25 ml de tampón borato y después NaOH 6N hasta pH 9,5. Añádanse unas cuentas de vidrio o fragmentos para ebullición e hiérvanse 300 ml. Si se desea, destílese esta fracción y determínese el nitrógeno amoniacal. Alternativamente, si se ha determinado el amoníaco por el método de destilación, utilícese el residuo del matraz de destilación para determinación del nitrógeno orgánico. Para muestras de cienos y sedimentos, pésese la muestra húmeda en un crisol o frasco de pesada, transfiérase el contenido a un matraz kjeldahl y determínese el nitrógeno kjeldahl. Sígase un procedimiento similar para el nitrógeno amoniacal y el orgánico determinado por diferencia. Las medidas de nitrógeno orgánico y kjeldahl en cienos y sedimentos no

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

son exactas porque el secado da lugar a pérdidas de sales de amonio. Determínese el peso seco de la muestra en una porción independiente. c) Digestión: Enfríese y añádanse con cuidado 50 ml de reactivo de digestión (o solución sustitutiva de 10 ml de H2SO4 conc, 6,7 g de K2SO4 y 1,25 ml de solución de HgSO4) al matraz de destilación. Añádanse unas cuentas de vidrio y, después de mezclar, caliéntese bajo vitrina o con un equipo adecuado de eyección para eliminar los vapores ácidos. Hiérvase enérgicamente hasta que el volumen se reduzca mucho (a unos 20 o 25 ml) y se observe humo blanco abundante (el humo puede ser oscuro en las muestras con mucha materia orgánica). Continúese la digestión durante otros 30 minutos. Al avanzar la digestión, las muestras turbias o coloreadas se volverán transparentes o de color paja. Tras la digestión, déjese enfriar el matraz y su contenido, dilúyase a 300 ml con agua y mézclese. Inclínese el matraz y añádanse con cuidado 50 ml de reactivo hidróxido sódico-tiosulfato sódico para formar una capa alcalina en el fondo del matraz. Conéctese al aparato de destilación que está emitiendo vapor, y agítese el matraz para asegurar una buena mezcla. Se formará un precipitado negro de HgS y el pH debe ser superior a 11,0. d) Destilación: Destílese y recójanse 200 ml de destilado bajo la superficie de 50 ml de solución absorbente. Utilícese solución simple de ácido bórico cuando se vaya a determinar el amoníaco por nesslerización y ácido bórico indicador para un acabado titulométrico. Utilícense 50 ml de solución de H 2SO 4 0,04 N para recoger el destilado para los métodos de sal de fenol manual, nesslerización o electrodo. Llévese el extremo del condensador muy por debajo del nivel de la solución absorbente sin permitir que la temperatura del condensador supere los 29 °C. Bájese el destilado recogido para que no esté en contacto con el tubo de

4-165

suministro y continúese la destilación durante 1 ó 2 minutos finales para limpiar el condensador. e) Medición final de amoníaco: Utilícese el método de nesslerización, el manual de sal de fenato, titulación o método del electrodo selectivo de amoníaco, secciones 4500-NH3.C, D, E y F, respectivamente. f) Blanco: Llévese un blanco de reactivo durante todos los pasos del método y aplíquense las correcciones necesarias a los resultados. 5.

Cálculo

Véanse secciones 4500-NH3.C5, D.5, E.5 o F.5. 6.

Precisión y sesgo

Se analizaron tres muestras sintéticas, con varias concentraciones de nitrógeno orgánico y otros componentes, por tres modificaciones del método macro-kjeldahl: kjeldahl con acabado Nessler, kjeldahl con acabado titulométrico y cálculo de la diferencia entre nitrógeno kjeldahl y nitrógeno amoniacal, determinados ambos por el acabado Nessler. Los resultados obtenidos por los laboratorios participantes se resumen en la tabla 4500-Norg:I. No se dispone de datos sobre la precisión del método macro-kjeldahl-sal de fenol. La muestra 1 contenía los siguientes componentes adicionales: 400 mg Cl¯/l, 1,50 mg NH3-N/I, 1,0 mg NO3- -N/l, 0,5 mg PO 43- /l y 30,0 mg SiO2/l. La muestra 2 contenía los siguientes componentes adicionales: 200 mg Cl¯/l, 0,8 mg NH3-N/l, 1,0 mg NO3- -N/l, 5,0 mg PO3-4 /l y 15,0 mg SiO 2 /l. La muestra 3 contenía los siguientes componentes adicionales: 10 mg Cl¯/l, 0,2 mg NH 3 -N/l, 1,0 mg NO3- -N/l, 10,0 mg PO3-4 /l y 5,0 mg SiO2/l.

4-166

MÉTODOS NORMALIZADOS

TABLA 4500-Norg:I.

DATOS DE PRECISIÓN Y SESGO PARA NITRÓGENO ORGÁNICO, MÉTODO MACRO-KJELDAHL

7.

Bibliografía

K JELDAHL , J. 1883. A new method for the determination of nitrogen in organic matter. Z. Anal. Chem. 22:366. PHELPS, E. B. 1905. The determination of organic nitrogen in sewage by the kjeldahl process. J. Infecí. Dis. (Suppl.) 1:225. MEEKER, E. W. & E. C. WAGNER. 1933. Titration of ammonia in the presence of boric acid. Ind. Eng. Chem., Anal. Ed. 5:396. W AGNER , E. C. 1940. Titration of ammonia in

4500-Norg C. 1.

the presence of boric acid. Ind. Eng. Chem., Anal. Ed. 12:771. MCKENZIE, H. A. & H. S. WALLACE. 1954. The kjeldahl determination of nitrogen: A critical study of digestion conditions. Aust. J. Chem. 7:55. MORGAN, G. B., J. B. LACKEY & F. W. GILCREAS. 1957. Quantitative determination of organic nitrogen in water, sewage, and industrial wastes. Anal. Chem. 29:833. BOLTZ, D. F., ed. 1978. Colorimetric Determination of Nonmetals. Interscience Publishers, Nueva York.

Método semi-micro-kjeldahl

Discusión general

Véase la sección 4500-Norg.B.l. 2. Instrumental a) Aparato de digestión: Utilícense matraces kjeldahl con una capacidad de 100 ml en un aparato de digestión semi-

micro-kjeldahl* dotado de elementos de calefacción para acoplar los matraces kjeldahl y una salida con succión para extraer los humos. Los elementos calefactores deben proporcionar una gama de temperatura de 365 a 380 °C para una digestión efectiva. * Unidad rotatoria de digestión kjeldahl, Kontes, modelo K 551100 o equivalente.

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

b) Aparato de destilación: Utilícese una unidad completa en vidrio, provista de un recipiente generador de vapor que contiene un calefactor de inmersión t (figura 4500-Norg:l). c) Medidor de pH. 3.

4.

4-167

Procedimiento

a) Selección del volumen de muestra: Determínese el tamaño de la muestra a partir de la siguiente tabulación:

Reactivos

Son necesarios todos los reactivos enumerados para la determinación de Nitrógeno (Amoníaco) (sección 4500-NH3.B.3) y Nitrógeno (Orgánico) macro-kjeldahl (sección 4500-Norg.B.3). Prepárense todos los reactivos y diluciones con agua exenta de amoníaco.

† ASTM E-147 o equivalente.

Para muestras de cieno y sedimentos, pésese una porción de muestra húmeda que contenga entre 0,2 y 2 mg de nitrógeno orgánico, en un crisol o frasco de pesada. Transfiérase la muestra cuantitativamente a un vaso de 100 ml, diluyéndola y lavando varias veces la cápsula de pesada con pequeñas cantidades de agua. Hágase con la menor cantidad de agua posible, sin exceder un volumen total de 50 ml. Mídase el peso seco de la muestra en una porción aparte. b) Eliminación de amoníaco: Llévense con la pipeta 50 ml de muestra o un volumen apropiado diluido a 50 ml con agua, a un vaso de precipitados de 100 ml. Añádanse 3 ml de tampón borato y ajústese a pH 9,5 con NaOH 6N, usando un medidor de pH. Transfiérase la muestra cuantitativamente a un matraz kjeldahl de 100 ml e hiérvanse 30 ml. Alternativamente, si no es preciso eliminar el amoníaco, digiéranse las muestras directamente como se describe más adelante en el apartado c. La destilación tras esta digestión directa proporciona la concentración de nitrógeno kjeldahl, en lugar del nitrógeno orgánico. c) Digestión: Añádanse con cuidado 10 ml de reactivo de digestión a un matraz kjeldahl conteniendo la muestra. Añádanse 5 o 6 cuentas de vidrio (de 3 a 4 mm) para evitar los saltos en la diges-

MÉTODOS NORMALIZADOS

4-168

tión. Ajústese cada unidad calefactora del aparato de digestión micro-kjeldahl a su posición media y caliéntense los matraces bajo vitrina o con un equipo de eyección adecuado para eliminar los humos de SO3. Continúese hirviendo vivamente hasta que la solución se aclare (se vuelva incolora o color paja claro) y se observen vapores abundantes. Ajústese entonces cada unidad calefactora al máximo y digiérase durante otros 30 minutos. Enfríese y transfiérase cuantitativamente la muestra digerida por dilución y lavado varias veces a un aparato de destilación micro-kjeldahl, de modo que el volumen total en el aparato de destilación no supere 30 ml. Añádanse 10 ml de reactivo hidróxido-tiosulfato y conéctese el vapor. d) Destilación: Contrólese la tasa de producción de vapor al contenido de ebullición en la unidad destiladora, de forma que no se produzcan escapes de vapor desde el extremo del condensador ni burbujeo del contenido del matraz receptor. Destílese y recójanse de 30 a 40 ml de destilado por debajo de los 10 ml de solución de ácido bórico contenidos en un erlenmeyer de 125 ml. Utilícese solución simple de ácido bórico cuando se vaya a determinar el amoníaco por nesslerización y ácido bórico indicador para un acabado titulométrico. Utilícense 10 ml de solución 0,04N de H2SO4 para recoger el destilado para los métodos de sal de fenol, Nessler o del electro-

4500-O

5.

Cálculo

Véanse secciones 4500-NH3.C5, D.5, E.5 o F.5. 6.

Precisión y sesgo

No se dispone de datos acerca de la precisión y sesgo del método semi-microkjeldahl. 7.

Bibliografía Véase sección 4500-Norg.B.7.

OXIGENO (DISUELTO)*

4500-O A. 1.

do. Llévese el extremo del condensador bastante por debajo del nivel de solución de ácido bórico, sin permitir que la temperatura del condensador supere los 29 °C. Bájese el destilado recogido de modo que no tenga contacto con el tubo de salida y continúese la destilación durante 1 ó 2 minutos finales para limpiar el condensador. e) Blanco: Llévese un blanco de reactivo durante todos los pasos del procedimiento y aplíquense a los resultados las correcciones necesarias. f) Determinación final del amoníaco: Mídase el amoníaco por nesslerización, método manual de la sal de fenol, titulación o método del electrodo selectivo de amoníaco.

Significado

Los niveles de oxígeno disuelto (OD) en aguas naturales y residuales dependen * Aprobado por el Standard Methods Committee, 1988.

Introducción de la actividad física, química y bioquímica del sistema de aguas. El análisis de OD es una prueba clave en la contaminación del agua y control del proceso de tratamiento de aguas residuales.

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

2.

Selección del método

Se describen dos métodos para análisis de OD: el de Winkler o yodométrico y sus modificaciones, y el electrométrico que utiliza electrodos de membrana. El método yodométrico1 es un procedimiento titulométrico basado en la propiedad oxidante del OD, mientras el método del electrodo de membrana se basa en la tasa de difusión del oxígeno molecular a través de una membrana2. La elección del método depende de las inter-

4500-O B. 1.

4-169

ferencias presentes, la precisión deseada y, en algunos casos, de la comodidad o la conveniencia. 3. 1. 2.

Referencias WINKLER, L. W. 1888. The determination of dissolved oxygen in water. Berlín. Deut. Chem. Ges. 21:2843. MANCY, K. H. & T. JAFFE. 1966. Analysis of Dissolved Oxygen in Natural and Waste Waters. Publ. n.° 999-WP-37, U.S. Public Health Serv., Washington, D.C.

Métodos yodométricos

Principio

El método yodométrico es el procedimiento titulométrico más exacto y fiable para analizar OD. Se basa en la adición de solución de manganeso divalente, seguido de álcali fuerte, a la muestra contenida en un frasco con tapón de vidrio. OD oxida rápidamente una cantidad equivalente del precipitado disperso de hidróxido manganoso divalente a hidróxidos con mayor estado de valencia. En presencia de iones yoduro, en solución acida, el manganeso oxidado revierte al estado divalente, con liberación de yodo equivalente al contenido original de OD. Entonces se valora el yodo con una solución patrón de tiosulfato. El punto final de la titulación se puede detectar visualmente, con un indicador de almidón, o electrométricamente, con técnicas potenciométricas o de punto muerto1. Los analistas experimentados pueden mantener una precisión de ± 50 µg/l en la detección visual del punto final y una precisión de ± 5 µg/l en la del punto final electrométrico 1, 2. El yodo liberado se puede determinar también directamente con espectrofotómetros de absorción simple 3. Este méto-

do se puede usar de forma rutinaria para obtener estimaciones muy exactas del OD del orden de microgramos por litro, siempre que no haya interferencias de partículas materiales, de color o químicas.

2.

Selección del método

Antes de seleccionar un método, tener en cuenta el efecto de las interferencias, especialmente los materiales oxidantes o reductores que puedan hallarse presentes en la muestra. Algunos agentes oxidantes liberan yodo a partir de los yoduros (interferencia positiva) y algunos reductores reducen el yodo a yoduro (interferencia negativa). La mayoría de la materia orgánica se oxida parcialmente cuando el manganeso oxidado precipitado se acidifica, causando así errores negativos. Para reducir al mínimo el efecto de esas interferencias, se ofrecen varias modificaciones del método yodométrico2. Entre los procedimientos más comúnmente utilizados, se encuentra la modificación de azida4, la de permanganato5, la floculación de alumbre6 y la flocu-

MÉTODOS ESTÁNDAR

4-170

lación del sulfato de cobre-ácido sulfámico 7, 8 . La modificación de azida (C) elimina eficazmente la interferencia producida por el nitrito, que es la más común en diluyentes tratados biológicamente y muestras de ODB incubadas. Utilícese la modificación del permanganato (D) en presencia de ion ferroso. Cuando la muestra contenga 5 mg o más de sales férricas/l, añádase fluoruro de potasio (KF) como primer reactivo en la modificación de azida o después del tratamiento de permanganato para hierro ferroso. Alternativamente, elimínese la interferencia de Fe(III) por medio de ácido fosfórico al 85 u 87 por 100 (H3PO4) en lugar de ácido sulfúrico (H2SO4) para acidificación. Este procedimiento no se ha ensayado para concentraciones de Fe(III) por encima de 20 mg/l. Utilícese la modificación de floculación de alumbre (E) en presencia de sólidos en suspensión que causen interferencias, y la floculación con sulfato de cobreácido sulfámico (F) sobre licor mixto de cieno activado. 3. Toma de muestras

Recójanse las muestras con mucho cuidado. Los métodos de muestreo dependen en gran manera de la fuente y hasta cierto punto del método de análisis. No dejar la muestra en contacto con el aire, ni agitarla, para que no varíe su contenido gaseoso. Las muestras tomadas a cierta profundidad en corrientes, lagos o pantanos, y las de calderas, requieren precauciones especiales para eliminar los cambios de presión y temperatura. Se han desarrollado procedimientos y equipos para el muestreo de aguas bajo presión y otras no confinadas (por ejemplo, corrientes, ríos y pantanos). Los procedimientos de muestreo y el equipo necesario se describen en la publicación especial técnica n.° 148-1 de American Society for Testing and Materials y en el

Informe n.° 1454 de la U.S. Geological Survey Water Supply. Recójanse las muestras de aguas superficiales en frascos de boca estrecha y con tapón de vidrio ODB de 300 ml de capacidad, con tapones de vidrio sinterizado, de forma apuntada y boca con reborde. Evítese el arrastre o disolución del oxígeno atmosférico. Al tomar muestras de una línea bajo presión, sujétese al grifo un tubo de goma o vidrio que llegue al fondo del frasco. Déjese que el frasco rebose dos o tres veces y póngase la tapa de forma que no queden burbujas de aire. Los muestreadores adecuados para corrientes, estanques o tanques de profundidad moderada son del tipo APHA, que muestra la figura 4500-O:I. Utilícense muestreadores tipo Kemmerer para muestras recogidas a profundidades superiores a 2 m. Extráigase la muestra desde el fondo del muestreador a través de un tubo que llegue al fondo de un frasco ODB de 250 a 300 ml. Llénese el frasco hasta rebosar (manteniendo el exceso durante unos 10 segundos) y evítese la turbulencia y formación de burbujas durante el llenado. Regístrese la temperatura de la muestra en grados Celsius o con mayor exactitud. 4.

Conservación de las muestras

Determínese el OD inmediatamente en todas las muestras que contengan una demanda apreciable de oxígeno o yodo. Las que no presenten demanda de yodo se pueden conservar durante unas horas sin cambios tras la adición de solución de sulfato manganoso (MnSO4), solución álcali-yoduro, y H2SO4, seguida de agitación en la forma usual. Protéjanse las muestras almacenadas de la luz solar intensa y valórense lo antes posible. Las muestras con demanda de yodo se conservarán durante 4 a 8 horas por adición de 0,7 ml de H 2 SO 4 conc. y

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

1 ml de solución de azida sódica (2 g de NaN3/l00 ml de agua destilada) al frasco ODB. Así, se interrumpe la actividad biológica y se mantiene el OD si el frasco se almacena a la temperatura de recogida o se hace un cierre de agua y se mantiene a 10-20 °C. Completar el método lo antes posible, utilizando 2 ml de solución de MnSO4, 3 ml de solución álcali-yoduro y 2 ml de H2SO4 conc.

5.

4-171

Referencias

1.

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3.

MÉTODOS NORMALIZADOS

4-172

4.

5.

6.

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4500-O C. 1.

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Modificación de azida

Discusión general

Utilícese la modificación de azida para la mayoría de aguas residuales, diluyentes y muestras de corrientes, especialmente si contienen más de 50 µg NO-2 N/l y no más de 1 mg de hierro ferroso/l. Deben estar ausentes otros agentes reductores u oxidantes. Si se añade 1 ml de solución KF antes de acidificar la muestra y no se retrasa la titulación, el método es aplicable en presencia de 100 a 200 mg de hierro férrico/l. 2.

suspensions. Ind. Eng. Chem., Anal. Ed. 12:711.

Reactivos

a) Solución de sulfato manganoso: Disuélvanse 480 g de MnSO4·4H2O, 400 g de MnSO4 · 2H2O o 364 g de MnSO4 · H2O en agua destilada, fíltrese y dilúyase a 1 l. La solución MnSO 4 no debe dar color con almidón cuando se añade a una solución acidificada de yoduro potásico (KI). b) Reactivo de álcali-yoduro-azida:

1) Para muestras saturadas o menos que saturadas: Disuélvanse 500 g NaOH (o 700 g KOH) y 135 g Nal (o 150 g KI) en agua destilada y dilúyase a 1 l. Añádanse 10 g NaN3 disueltos en 40 ml de

agua destilada. Las sales de potasio y sodio pueden intercambiarse. Este reactivo no debe dar color con la solución de almidón cuando se diluya y acidifique. 2) Para muestras sobresaturadas: Disuélvanse 10 g NaN3 en 500 ml de agua destilada. Añádanse 480 g de hidróxido de sodio (NaOH) y 750 g de yoduro de sodio (Nal), y agítese hasta disolución. Se producirá una turbidez blanca debida al carbonato de sodio (Na2CO3), pero que no es perjudicial. PRECAUCIÓN: NO acidificar esta solución porque se pueden producir humos de ácido hidrazoico. c) Ácido sulfúrico, H2SO4 conc: 1 ml es equivalente a unos 3 ml de reactivo álcali-yoduro-azida. d) Almidón: Utilícese una solución acuosa o mezclas solubles de polvo de almidón. Para preparar una solución acuosa, disuélvanse 2 g de almidón soluble calidad laboratorio y 0,2 g de ácido salicílico, como conservador, en 100 ml de agua destilada caliente. e) Titulante de tiosulfato sódico patrón: Disuélvanse 6,205 g Na2S2O3 · 5H2O en agua destilada. Añadir 1,5 ml de NaOH o 0,4 g de NaOH sólido y dilúyase a 1.000 ml. Estandarícese con solución de biyodato.

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

f) Solución patrón de biyodato potásico, 0,0021M: Disuélvanse 812,4 mg KH(IO3)2 en agua destilada y dilúyase a 1.000 ml. Estandarización: Disuélvanse aproximadamente 2 g de KI, exento de yodato, en un erlenmeyer con 100 a 150 ml de agua destilada. Añádase 1 ml de H2SO4 6N o unas gotas de H2SO4 conc. y 20,00 ml de solución patrón de biyodato. Dilúyase a 200 ml y titúlese el yodo liberado con tiosulfato, añadiendo almidón hacia el final de la titulación, cuando se produzca un color paja pálido. Cuando las soluciones tengan igual concentración, se necesitará 20,00 ml de Na2S2O3 0,025M. Si no es así, ajústese la solución de Na2S2O3 a 0,025M. g) Solución de fluoruro potásico: Disuélvanse 40 g KF·2H2O en agua destilada y dilúyase a 100 ml. 3.

Procedimiento

a) A la muestra recogida en un frasco de 250 a 300 ml se añade 1 ml de solución de MnSO4, y después 1 ml de reactivo álcali-yoduro-azida. Si se mojan las pipetas con la muestra, lávense antes de volver al frasco de reactivo. Alternativamente, manténgase la punta de la pipeta justo por encima de la superficie del líquido, al añadir los reactivos. Tápese con cuidado para excluir las burbujas de aire, y mézclese invirtiendo varias veces. Cuando el precipitado se ha depositado suficientemente (hasta aproximadamente la mitad del volumen del frasco), añádase 1,0 ml de H2SO4 conc, para dejar un sobrenadante claro por encima del hidróxido de manganeso floculado. Vuélvase a tapar y mézclese invirtiendo varias veces hasta disolución completa. Titúlese un volumen correspondiente a 200 ml de muestra original tras corregir la pérdida de muestra por desplazamiento con los reactivos. Así, para un total de 2 ml (1 ml de cada uno) de MnSO4 y reactivos álca-

4-173

li-yoduro-azida en un frasco de 300 ml, titúlense 200 x 300/(300 − 2) = 201 ml. b) Titúlese con solución 0,025M de Na2S2O3 hasta color paja pálido. Añádanse unas gotas de solución de almidón y continúese valorando hasta la primera desaparición del color azul. Si se sobrepasa el punto final, valórese por retroceso con solución de biyodato 0,0021 M añadido gota a gota, o por adición de un volumen medido de muestra tratada. Realícense las correcciones para la solución de biyodato o muestra. Desprecíense las recoloraciones posteriores debidas al efecto catalítico del nitrito o a trazas de sales férricas que no han sido complejadas con fluoruro. 4.

Cálculo

a) Para titular 200 ml de muestra, 1 ml Na2S2O2 0,025M = 1 mg OD/l. b) Para expresar los resultados como porcentaje de saturación a 101,3 kPa, utilícense los datos de solubilidad de la tabla 4500-O:I. Debajo de la tabla se dan las ecuaciones para corregir las solubilidades a presiones barométricas distintas de la media al nivel del mar y para diferentes concentraciones de cloro. 5. Precisión y sesgo

Puede determinarse OD con una precisión expresada como desviación estándar de alrededor de 20 µg/l en agua destilada y alrededor de 60 µg/l en aguas residuales y diluyentes secundarios. En presencia de interferencias apreciables, incluso con las modificaciones adecuadas, la desviación estándar puede llegar a 100 µg/l. Se pueden dar errores aún mayores en los análisis de aguas que tengan sólidos orgánicos en suspensión o gran contaminación. Evítense los errores debidos a falta de cuidado al recoger las muestras, por prolongar la terminación del

4-174

TABLA 4500-O:I.

MÉTODOS NORMALIZADOS

SOLUBILIDAD DE OXÍGENO EN AGUA EXPUESTA A AIRE SATURADO DE AGUA A PRESIÓN ATMOSFÉRICA (101,3 KPA)1

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

TABLA 4500-O:I, CONT.

4-175

4-176

MÉTODOS NORMALIZADOS

T = temperatura, °K, θ = 0,000975 − (1,426 x 10 -5 t ) + (6,436 x 10 -8 t 2 ), y t = temperatura, °C. NOTA : Aunque no explícita, la cantidad entre paréntesis de la ecuación de Cp tiene dimensiones de atm-1 por la referencia 4, de modo que el producto de P por esta cantidad no tiene dimensiones. Además, la ecuación para ln Pwv es estrictamente válida únicamente para agua fresca, pero para objetivos clásicos se determina despreciando el efecto de la salinidad. En la referencia 1 puede encontrarse una ecuación de Pwv que incluye el factor de salinidad. Ejemplo 3: A 20 °C, 0,000 Chl, y 0,700 atm, Cp = C* P (0,990092) = 6,30 mg/l. 4. Definiciones:

Salinidad: Aunque la salinidad se ha definido tradicionalmente como los sólidos totales presentes en agua después de que todos los carbonatos se hayan convertido en óxidos, todos los bromuros y yoduros hayan sido sustituidos por cloruros y toda la materia orgánica se haya oxidado (véase sección 2520), la nueva escala usada para definir la salinidad se basa en la conductividad eléctrica del agua de mar relativa a la solución especificada de KC1 en agua5 . La escala no tiene dimensiones y no se aplica ya la tradicional dimensión de partes por millar (es decir, g/kg de solución). Cloración: La cloración se define del siguiente modo con respecto a la salinidad: Salinidad = 1,80655 x cloración Aunque la cloración no es equivalente a la concentración de cloruro, el factor de conversión de una concentración de cloruro en agua de mar para incluir bromuro, por ejemplo, es sólo 1,0045 (basada en los pesos moleculares relativos y en las cantidades de los dos iones). Por consiguiente, para objetivos prácticos, la concentración de cloruro es aproximadamente igual (en g/kg de solución) a la cloración del agua de mar. Para aguas residuales, es necesario conocer los iones responsables de la conductividad eléctrica de la solución para corregir sus efectos en la solubilidad del oxigeno y hacer uso de los valores tabulados. Si no se hace así, la ecuación no será apropiada a no ser que la composición relativa de este agua residual sea semejante a la del agua de mar.

análisis o por seleccionar una modificación inadecuada.

6. 1.

2.

Referencias BENSON , B. B. & D. KRAUSE , J R. 1984. The concentration and isotopic fractionation of oxygen dissolved in freshwater and seawater in equilibrium with the atmosphere. Limnol. Oceanogr. 29:620. BENSON , B. B. & D. KRAUSE , J R. 1980. The concentration and isotopic fractionation of gases dissolved in fresh water in equilibrium

with the atmosphere: I. Oxigen. Limnol. Oceanogr. 25:662. 3. MORTIMER, C. H. 1981. The oxygen content of air-satured fresh water over ranges of temperature and atmospheric pressure of limnological interest. Int. Assoc. Theoret. Appl. Limnol., Cotnunication. n.° 22, Stuttgart, Alemania Federal. 4. S ULZER , F. & W. M. W ESTGARTH . 1962. Continuous D. O. recording in activated sludge. Water Sewage Works 109:376. 5. UNITED NATIONS EDUCATIONAL, SCIENTIFIC & C ULTURAL O RGANIZATION . 1981. Background Papers and Supporting Data on the Practical Salinity Scale 1978. Tech. Paper Mar. Sci. n.° 37.

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

4500-O D. 1.

Modificación de permanganato

Discusión general

Utilícese la modificación de permanganato sólo con muestras que contengan ion ferroso. La interferencia debida a concentraciones elevadas de ion férrico (hasta varios cientos de miligramos por litro), como en aguas minerales acidas, se puede superar por adición de 1 ml de fluoruro potásico (KF) y azida, siempre que la titulación final se realice inmediatamente después de acidificar. Este método es ineficaz para oxidar el sulfito, tiosulfato, politionato o materia orgánica en las aguas residuales. El error con las muestras que contengan 0,25 por 100 en volumen de residuo digestor procedente de la fabricación de pulpa de sulfito puede alcanzar hasta 7-8 mg OD/l. Con esas muestras se debe utilizar la modificación de álcali-hipoclorito1. Sin embargo, en el mejor de los casos, este último método da resultados bajos, con desviación de hasta 1 mg/l para muestras que contengan 0,25 por 100 de residuos digestores. 2.

Reactivos

Todos los necesarios para el método C, más: a) Solución de permanganato potásico: Disuélvanse 6,3 g de KMnO 4 en agua destilada y dilúyase a 1 l. b) Solución de oxalato potásico: Disuélvanse 2 g de K2C2O4·H2O en 100 ml de agua destilada; 1 ml reducirá alrededor de 1,1 ml de solución de permanganato. 3.

4-177

Procedimiento

a) Añádase a una muestra recogida en un frasco de 250 a 300 ml, por debajo de la superficie, 0,70 ml de H2SO4 conc,

1 ml de solución de KMnO4 y 1 ml de solución de KF. Tápese y mézclese por inversión. No añadir nunca más de 0,7 ml de H2SO4 conc. como primer paso del tratamiento preliminar. Añádase el ácido con un pipeta graduada de 0,1 ml Añádase suficiente solución de KMnO4 para obtener un tinte violeta que persista durante 5 minutos. Si el color del permanganato desaparece en menos tiempo, añádase más solución, aunque sin producir un gran exceso. b) Elimínese totalmente el color del permanganato añadiendo de 0,5 a 1,0 ml de solución K2C2O4. Mézclese bien y déjese reposar en la oscuridad para facilitar la reacción. El exceso de oxalato produce resultados bajos; añádase solamente K2C2O4 suficiente para decolorar KMnO4 totalmente sin un exceso superior a 0,5 ml. Complétese la decoloración en 2 a 10 minutos. Si fuera imposible decolorar la muestra sin adición de un gran exceso de oxalato, el resultado de OD sería inexacto. c) A partir de este punto, el método es paralelo al de la sección 4500-O.C.3. Añádase 1 ml de solución MnSO4 y 3 ml de reactivo álcali-yoduro-azida. Tápese, mézclese y déjese que se deposite el precipitado un tiempo corto; acidifíquese con 2 ml de H2SO4 conc. Cuando se usan 0,7 ml de ácido, 1 ml de solución KMnO4, 1 ml de solución K2C2O4,1 ml de solución MnSO4 y 3 ml de álcali-yoduro-azida (o un total de 6,7 ml de reactivos) en un frasco de 300 ml, tómese 200 x 300/(3006,7) = 205 ml para la titulación. Ésta corrección es ligeramente errónea porque la solución de KMnO4 está casi saturada con OD y 1 ml adicionaría alrededor de 0,008 mg de oxígeno al OD del frasco. Sin embargo como la precisión del método (desviación estándar, 0,06 ml titulación de tiosulfato o 0,012 mg OD) es 50 por 100 mayor que este error, es innecesaria la corrección. Cuando se use

4-178

MÉTODOS NORMALIZADOS

rutinariamente una cantidad de solución KMnO4 sustancialmente mayor, empléese una solución varias veces más concentrada de forma que 1 ml satisfaga la demanda de permanganato.

4500-O E. 1.

Discusión general

Reactivos

Todos los necesarios para la modificación de azida (sección 4500-O.C.2) y, además: a) Solución de alumbre: Disuélvanse 10 g de sulfato alumínico potásico, A1K(SO4)2·12H2O en agua destilada y dilúyase a 100 ml. b) Hidróxido de amonio, NH4OH conc.

4500-O F.

1.

1. THERIAULT, E. J. & P. D. MCNAMEE. 1932. Dissolved oxygen in the presence of organic matter, hypochlorites, and sulfite wastes. Ind. Eng. Chem., Anal. Ed. 4:59.

3.

Procedimiento

Recójase la muestra en un frasco de vidrio con tapón, de 500 a 1.000 ml de capacidad, utilizando las mismas precauciones que para las muestras normales de OD. Añádanse 10 ml de solución de alumbre y de 1 a 2 ml de NH4OH conc. Tápese e inviértase con cuidado durante 1 minuto aproximadamente. Déjese que la muestra sedimente durante 10 minutos aproximadamente y sáquese por sifón el sobrenadante transparente a un frasco OD de 250-300 ml hasta que rebose. Evítese la aireación de la muestra y manténgase el sifón sumergido en todo momento. Continúese el tratamiento de la muestra como en la sección 4500-O.C.3 o con la modificación adecuada.

Modificación de la floculación de la combinación sulfato de cobre-ácido sulfámico

Discusión general

Esta modificación se utiliza para floculados biológicos tales como mezclas de cienos activados, con gran tasa de utilización del oxígeno. 2.

Referencia

Modificación de la floculación de alumbre

Las muestras con gran contenido de sólidos en suspensión pueden consumir cantidades apreciables de yodo en solución acida. La interferencia debida a los sólidos se puede eliminar por floculación de alumbre. 2.

4.

Reactivos

Todos los necesarios para la modificación de azida (sección 4500.O.C.2) y, además:

Solución inhibidora de sulfato de cobreácido sulfámico: Disuélvanse 32 g de NH2SO2OH calidad técnica, sin calentar, en 475 ml de agua destilada. Disuélvanse 50 g de CuSO4·5H2O en 500 ml de agua destilada. Mézclense las dos soluciones y añádanse 25 ml de ácido acético conc. 3.

Procedimiento

Añádanse 10 ml de CuSO 4 NH2SO2OH inhibidor a un frasco de vi-

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

drio con tapón. Introdúzcase el frasco en un muestreador especial diseñado de forma que se llene a partir de un tubo próximo al fondo y rebase solamente del 25 al 50 por 100 de la capacidad del frasco. Recójase la muestra, tápese y mézclese por inversión. Déjese que se sedimenten

4500-O G. 1.

4-179

los sólidos en suspensión y extráigase por sifón el sobrenadante relativamente transparente a un frasco OD de 250 a 300 ml. Continúese el tratamiento de la muestra lo más rápidamente posible con azida (sección 4500-O.C.3) u otra modificación apropiada.

Método de electrodo de membrana

Discusión general

Se han desarrollado varias modificaciones del método yodométrico para eliminar o reducir al mínimo los efectos de las interferencias; de todos modos, el método sigue siendo inaplicable a una serie de aguas residuales domésticas e industriales1. Además, el método yodométrico no sirve para pruebas de campo, ni se puede adaptar fácilmente al control continuo para determinación in situ de OD. Los métodos polarográficos que utilizan el electrodo de caída de mercurio o el giratorio de platino no han sido siempre fiables para el análisis de OD en aguas residuales industriales y domésticas, porque las impurezas de la solución problema pueden intoxicar los electrodos o interferir de otra forma 2, 3. Esos problemas se reducen al mínimo con sistemas de electrodo recubierto de membrana, ya que el elemento sensor está protegido por una membrana plástica permeable al oxígeno que sirve de barrera de difusión frente a las impurezas 4-6. En condiciones de equilibrio estable, la corriente es directamente proporcional a la concentración de OD*. Se han utilizado electrodos de membrana de tipo polarográfico4 y galvánico5 para medir OD en lagos y pantanos8, para estudio de corrientes y control * Básicamente, la corriente es directamente proporcional a la actividad del oxígeno molecular7.

de diluyentes industriales 9, 10, para control continuo de OD en unidades de cieno activado11 y para estudios oceanógraficos y de estuarios12. Al ser totalmente sumergibles, los electrodos de membrana son adecuados para análisis in situ. Su fácil transporte, funcionamiento y mantenimiento les hacen especialmente convenientes para aplicaciones de campo. En investigaciones de laboratorio, los electrodos de membrana se han utilizado para análisis continuos de OD en cultivos bacterianos, incluido el test ODB 5, 13. Los electrodos de membrana proporcionan un método excelente para analizar OD en aguas contaminadas, muy coloreadas y diluyentes residuales fuertes. Se recomiendan para condiciones especialmente desfavorables al uso del método yodométrico, o cuando esta prueba y sus modificaciones están sujetas a errores graves debidos a interferencias. a) Principio: Los electrodos de membrana sensibles al oxígeno, de tipo polarográfico o galvánico, están compuestos por dos electrodos metálicos sólidos en contacto con un electrólito de soporte separado de la solución problema por una membrana selectiva. La diferencia básica entre el sistema galvánico y el polarográfico está en que en el primero la reacción es espontánea (similar a la de una célula de combustible), mientras en el segundo se precisa una fuente de voltaje aplicado para polarizar el electrodo

MÉTODOS NORMALIZADOS

4-180

indicador. Normalmente, se usan membranas de polietileno y fluorocarbono, al ser permeables al oxígeno molecular y relativamente robustas. Existe una relativa variedad de electrodos de membrana disponible comercialmente. En todos ellos, la «corriente difusora» es linealmente proporcional a la concentración del oxígeno molecular. La corriente puede transformase fácilmente en unidades de concentración (como miligramos por litro) por medio de varios procedimientos de calibrado. Los electrodos de membrana presentan un coeficiente de temperatura relativamente alto, debido en gran medida a los cambios de permeabilidad de la membrana 6. El efecto de la temperatura sobre la sensibilidad del electrodo, Ø (microamperios por miligramo por litro), se puede expresar por medio de la siguiente relación simplificada6:

calibrado debe ser paralelo al original, siempre que se use el mismo material en la membrana. La compensación de temperatura también se puede hacer automáticamente por medio de termistores en el circuito de electrodos4. Sin embargo, éstos pueden no compensar totalmente en una escala amplia de temperatura. Para algunas aplicaciones, en que se requiere gran exactitud, úsense las cartas nomográficas calibradas para corregir el efecto de la temperatura. En caso de electrodo de membrana OD en aguas estuarinas o residuales con fuerza iónica variable, corregir el efecto salinización sobre la sensibilidad del electrodo6, 7. Este efecto es especialmente importante para cambios grandes del contenido en sal. La sensibilidad del electrodo varía con la concentración salina según la relación siguiente: log Ø s = 0,43 msCs + log Ø o donde:

donde: t = temperatura, °C, m = constante que depende del material de la membrana, y b = constante que depende en gran medida del grosor de la membrana.

Si se determinan los valores de Ø y m para una temperatura (Ø0 y t0), es posible calcular la sensibilidad a cualquier temperatura deseada (Ø y t) como sigue:

Las cartas nomográficas para corrección de temperatura se pueden elaborar fácilmente 7 y son proporcionadas por algunos fabricantes. La figura 4500-O:2 muestra un ejemplo en que, para más sencillez, se compara la sensibilidad con la temperatura en coordenadas semilogarítmicas. Compruébense frecuentemente uno o dos puntos para confirmar el calibrado original. Si éste varía, el nuevo

Øs , Ø o = sensibilidades en la solución salina

y agua destilada, respectivamente, C s = concentración de sal (preferiblemente fuerza iónica), y ms = constante (coeficiente salinización).

Si se determinan Øo y ms, es posible calcular la sensibilidad para cualquier valor de Cs. Las medidas de la conductividad se pueden usar para aproximar la concentración de sal (Cs), lo que es especialmente aplicable a las aguas estuarinas. La figura 4500-O:3 muestra las curvas de calibrado para sensibilidad de distintas soluciones de sal a diferentes temperaturas. b) Interferencia: Las películas de plástico utilizadas con los sistemas de electrodo de membrana son permeables a una serie de gases, además de oxígeno, aunque ninguno se despolariza fácilmente en el electrodo indicador. El uso prolongado de electrodos de membrana en aguas que contengan gases, tales como el sulfuro de hidrógeno (H2S), tiende a reducir la sen-

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

sibilidad de la célula. Elimínese esa interferencia, cambiando frecuentemente el electrodo de membrana. c) Toma de muestras: Dado que los electrodos de membrana ofrecen la ventaja del análisis in situ, eliminan los errores debidos a la manipulación y almacenamiento de la muestra. Si es preciso tomar muestras, se adoptarán las mismas precauciones indicadas para el método yodométrico. 2.

Instrumental

Electrodo de membrana sensible al oxígeno, polarográfico o galvánico, con medidor adecuado. 3.

Procedimiento

a) Calibrado: Sígase exactamente el procedimiento de calibrado del fabricante para obtener una precisión y exactitud garantizadas. Generalmente, los electrodos de membrana se calibran por lectura frente a aire o una muestra de concentración conocida de OD (determinada yodométricamente), así como en una mues-

4-181

tra de OD cero. (Añádase exceso de sulfito de sodio, Na2SO3, y una traza de cloruro de cobalto, CoCl2, para llevar OD a cero). Es preferible calibrar con muestras del agua problema. Evítese un calibrado yodométrico donde se sospechen sustancias interferentes. A continuación se da un ejemplo de los procedimientos recomendados: 1) Agua dulce: Para muestras no contaminadas en que no haya sustancias interferentes, calíbrese la solución problema o agua destilada, lo que sea más cómodo. 2) Agua salada: Calíbrese directamente con muestras de agua de mar o aguas que tengan una concentración de sal constante superior a 1.000 mg/l 3) Agua dulce con contaminantes o sustancias interferentes: Calíbrese con agua destilada porque la muestra daría resultados erróneos. 4) Agua salada con contaminantes o sustancias interferentes: Calíbrese con una muestra de agua limpia que contenga la misma cantidad de sal que la muestra. Añádase una solución concentrada de cloruro de potasio (KC1) (véase Con-

MÉTODOS NORMALIZADOS

4-182

ductividad, sección 2510 y tabla 2510:1) a agua destilada para producir la misma conductancia específica que en la muestra. Para aguas oceánicas contaminadas, calíbrese con una muestra de agua del mar sin contaminar. 5) Aguas de estuarios con cantidades diferentes de sal: Calíbrese con una muestra de agua de mar no contaminada o agua destilada o del grifo. Determínese la concentración de cloruro o sal de la muestra y revísese el calibrado para tener en cuenta el cambio de solubilidad del oxígeno en el agua de estuario7. b) Medición de la muestra: Síganse todas las precauciones recomendadas por el fabricante para asegurar unos resultados aceptables. Téngase cuidado de cambiar la membrana para evitar la contaminación del elemento sensor y el englobamiento de burbujas diminutas de aire bajo la membrana que pueden dar lugar a una menor respuesta y a una corriente residual elevada. Proporciónese suficiente flujo de muestra a través de la superficie de la membrana para evitar la respuesta errática (véase un ejemplo típico del efecto de la agitación en la figura 4500-O:4). c) Validación del efecto temperatura: Compruébense frecuentemente uno o dos

puntos para verificar los datos de corrección de la temperatura.

4.

Precisión y sesgo

Con la mayoría de los sistemas de electrodo de membrana existentes en el comercio se puede obtener una exactitud de ±0,1 mg OD/l y una precisión de ±0,05 mg OD/l.

5. 1.

2.

3.

4. 5. 6. 7.

8.

9.

10.

Referencias M C K EOWN , J. J., L. C. B ROWN & G. W. GOVE. 1967. Comparative studies of dissolved oxygen analysis methods. J. Water Pollut. Control Fed. 39:1323. L YNN , W. R. & D. A. O KUN . 1955. Experience with solid platinum electrodes in the determination of dissolved oxygen. Sewage Ind. Wastes 27:4. MANCY , K. H. & D. A. OKUN . 1960. Automatic recording of dissolved oxygen in aqueous systems containing surface active agents. Anal. Chem. 32:108. CARRITT , D. E. & J. W. KANWISHER, 1959. An electrode system for measuring dissolved oxygen. Anal. Chem. 31:5. MANCY, K. H. & W. C. WESTGARTH. 1962. A galvanic cell oxygen analyzer. J. Water Pollut. Control Fed. 34:1037. MANCY , K. H., D. A. OKUN & C. N. R EILLEY. 1962. A galvanic cell oxygen analyzer. J. Electroanal. Chem. 4:65. MANCY, K. H. & T. JAFFE. 1966. Analysis of Dissolved Oxygen in Natural and Waste Waters. Publ. n.° 999-WP-37, U.S. Public Health Serv., Washington, D.C. W EISS , C. M. & R. T. O GLESBY . 1963. Instrumentation for monitoring water quality in reservoirs. American Water Works Assoc. 83rd Annual Conf, Nueva York. C LEARY , E. J. 1962. Introducing the ORSANCO robot monitor. Proc. Water Quality Meas. Instrum. Publ. n.° 108, U.S. Public Health Serv., Washington, D.C. M ACKERETH , F. J. H. 1964. An improved galvanic cell for determination of oxygen

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

11.

12.

concentrations in fluids. J. Sci. Instrum. 41:38 S ULZER , F. & W. M. W ESTGARTH . 1962. Continuous D.O. recording in activated sludge. Water Sewage Works 109:376. DUXBURY , A. C. 1963. Calibration and use

4500-O3

of a galvanic type oxygen electrode in field work. Limnol. Oceanogr. 8:483. 13.

LlPNER, H. J., L. R. WlTHERSPOON & V. C.

CHAMPEAUS. 1964. Adaptation of a galvanic cell for microanalysis of oxigen. Anal. Chem. 36:204.

OZONO (RESIDUAL)* (PROPUESTA) 4500-O3 A.

El ozono, un potente germicida, se utiliza también como oxidante para destruir * Aprobado por el Standard Methods Committee, 1988.

4500-O3 B. 1.

4-183

Introducción los compuestos orgánicos que producen el sabor y olor del agua potable, para destruir la materia orgánica colorante y para oxidar o reducir las sales de hierro o manganeso a óxidos insolubles.

Método colorimétrico de índigo

Discusión general

El método colorimétrico de índigo es cuantitativo, selectivo y simple; sustituye a los métodos basados en la medida del oxidante total. Es un método aplicable al agua de los lagos, infiltrados fluviales, aguas subterráneas que contienen manganeso y las muy duras, e incluso las residuales domésticas tratadas biológicamente. a) Principio: En solución acida, el ozono decolora rápidamente el índigo. La disminución de la absorbancia es proporcional al aumento de concentración, y la proporcionalidad constante a 600 nm es 0,42 ± 0,01/cm/mg/l ( Δε = 20.000/ M·cm) comparada con la absorción ultravioleta del ozono puro de e = 2.950/M·cm a 258 nm)1. b) Interferencias: El peróxido de hidrógeno (H2O2) y los peróxidos orgánicos decoloran el reactivo índigo muy lentamente. H2O2 no interfiere si el ozono

se mide en menos de 6 horas después de añadir los reactivos. Los peróxidos orgánicos pueden reaccionar con mayor rapidez. Fe(III) no interfiere. Mn(II) no interfiere, pero es oxidado por el ozono a formas que decoloran el reactivo. Corríjase esta interferencia haciendo la medida relativa con un blanco en que se ha destruido el ozono selectivamente. Sin el procedimiento corrector, 0,1 mg/l de manganeso ozonado producen una respuesta aproximada de 0,08 mg/l de ozono aparente. El cloro también interfiere, pero puede ser enmascarado por el ácido malónico. El bromo, que puede formarse por oxidación de Br¯, interfiere (1 mol HOBr corresponde a 0,4 moles de ozono). c) Concentración mínima detectable: Para el método espectrofotométrico que utiliza cubetas termostatadas y un fotómetro de gran calidad, el método del rango bajo detectará hasta 2 µg O3/l. El límite de detección del método visual es de 10 µg/l

4-184

2.

Instrumental

a) Fotómetro: Espectrofotómetro o colorímetro de filtro para uso a 600 ± ± 5 nm. b) Probetas de vidrio (para el método visual): Probetas de vidrio graduadas de 100 ml, preferiblemente con el fondo plano.

3.

Reactivos

a) Solución madre de índigo: Añádanse alrededor de 500 ml de agua destilada y 1 ml de ácido fosfórico conc. a un matraz aforado de 1 l. Añádanse, con agitación, 770 mg de trisulfonato potásico de índigo, C16H7N2OUS3K3 (disponible en el comercio con una pureza aproximada del 80 al 85 por 100). Llénese hasta la señal con agua destilada. Una dilución 1:100 exhibe una absorbancia de 0,20 ± ± 0,010 cm a 600 nm. La solución madre es estable durante 4 meses aproximadamente, cuando se mantiene en la oscuridad. Deséchense cuando la absorbancia de una dilución 1:100 sea inferior a 0,16/cm. b) Reactivo índigo I: Añádanse a un matraz aforado de 1 l 20 ml de solución madre de índigo, 10 g de fosfato diácido de sodio (NaH2PO4) y 7 ml de ácido fosfórico conc. Dilúyase hasta el aforo. Prepárese la solución de nuevo cuando su absorbancia disminuya hasta menos del 80 por 100 de su valor inicial; normalmente dura 1 semana. c) Reactivo índigo II: Procédase como en el reactivo índigo I, añadiendo 100 ml de solución madre de índigo en lugar de 20 ml. d) Reactivo de ácido malónico: Disuélvanse 5 g de ácido malónico en agua y dilúyase a 100 ml. e) Reactivo de glicerina: Disuélvanse 7 g de glicina en agua y dilúyase a 100 ml.

MÉTODOS NORMALIZADOS

4.

Procedimiento

a) Método espectrofotométrico: 1) Rango de concentración 0,01 a 0,1 mg de O3/l: Añádanse 10,0 ml de reactivo índigo I a dos matraces aforados de 100 ml. Llénese uno de ellos hasta el aforo con agua destilada (blanco), y otro hasta el aforo con la muestra. Añádase la muestra de modo que las zonas totalmente decoloradas se eliminen rápidamente con agitación, pero sin producir la pérdida de gas ozono. Mídase la absorbancia de las dos soluciones a 600 ± ± 5 nm lo antes posible, y siempre en las 4 horas siguientes. Utilícense preferentemente cubetas de 10 cm. Calcúlese la concentración de ozono a partir de la diferencia entre las absorbancias halladas para la muestra y el blanco (apartado 5a siguiente). (NOTA: Se puede tolerar un plazo máximo de 4 horas para la lectura espectrofotométrica solamente en las muestras de agua potable. En el resto de las muestras, compruébese la desviación debida al tiempo.) 2) Rango de 0,05 a 0,5 mg O3/l: Procédase como antes utilizando 10,0 ml de reactivo índigo II en lugar del reactivo I. Preferiblemente, mídase la absorbancia en cubetas de 4 o 5 cm. 3) Concentraciones superiores a 0,3 mg O3/l: Procédase utilizando el reactivo índigo II, pero en estas concentraciones superiores, se utilizará un menor volumen de muestra. Dilúyase la mezcla resultante a 100 ml con agua destilada. Úsese una pipeta de vidrio para dosificar la muestra, que se dejará fluir a través de un erlenmeyer durante 1 minuto, por lo menos, sin producir burbujas. Lávese la pipeta con muestra y añádase al matraz la cantidad medida, manteniendo la punta de la pipeta por debajo de la superficie. 4) Control de interferencias: En presencia de cloro, póngase 1 ml de reactivo de ácido malónico en ambos matraces antes de añadir la muestra y/o llenar has-

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

ta la señal. Mídase la absorbancia lo antes posible, en los 60 minutos siguientes (Br¯, Br2 y HOBr son enmascarados sólo parcialmente por el ácido malónico). En presencia de manganeso, prepárese una solución en blanco con la muestra, en la que se destruye selectivamente el ozono por adición de glicina. Pónganse 0,1 ml de reactivo de glicina en un matraz aforado de 100 ml (blanco) y 10,0 ml de reactivo índigo II en un segundo matraz (muestra). Llévese con la pipeta exactamente el mismo volumen de muestra en cada matraz. Ajústese la dosis de modo que la decoloración en el segundo matraz sea fácilmente visible, pero sin llegar al blanqueado completo (máximo 80 ml). Asegúrese que el pH de la mezcla glicina/muestra en el matraz de blanco (antes de añadir índigo) no es inferior a 6 porque la reacción entre ozono y glicina es muy lenta a pH bajo. Tápense los matraces y mézclese invirtiéndolos cuidadosamente. Añádanse 10,0 ml de reactivo índigo II al matraz de blanco, de 30 a 60 segundos después de añadir la muestra. Llénense ambos matraces hasta el aforo con agua exenta de ozono y mézclese bien. Mídase la absorbancia de las dos soluciones a tiempos de contacto comparables de aproximadamente 30 a 60 minutos (tras ese tiempo, los óxidos de manganeso residual siguen decolorando el índigo sólo lentamente y la desviación de la absorbancia en el blanco y la muestra llegan a ser comparables). La absorbancia reducida en el matraz de blanco se debe a los óxidos de manganeso, mientras la del matraz de muestra resulta del ozono más óxido de manganeso. 5) Calibrado: Debido a la inestabilidad del ozono, las medidas deben basarse en la pérdida constante y conocida de absorbancia del reactivo índigo (f - 0,42 ± ± 0,01/cm/mg O3/l). Para una exactitud máxima, analícese el lote de trisulfonato

4-185

de índigo potásico (no se ha encontrado ningún lote comercial que se desvíe de f = 0,42) utilizando el método yodométrico. Cuando se use un fotómetro de filtro, reajústese el factor de conversión f, comparando la sensibilidad del fotómetro con la absorbancia a 600 nm con un espectrofotómetro preciso. b) Método visual: 1) Rango de concentración de 0,01 a 0,1 mg O3/l: Añádanse 10,0 ml de reactivo índigo I a cada una de dos probetas de vidrio de 100 ml graduadas. Llénese la de referencia (blanco) hasta la señal con agua destilada, y la otra con la muestra. Añádase la muestra a la probeta de modo que se eliminen rápidamente las zonas completamente decoloradas al mezclar, pero no hay pérdida de gas. Elimínense por vertido porciones del blanco hasta que la altura del líquido dé la misma intensidad de color aparente que la muestra, cuando se miran desde arriba. Regístrese el volumen de la probeta de blanco. Las comparaciones de color se pueden realizar hasta 4 horas después de la adición de muestra. 2) Concentraciones superiores a 0,1 mg O3/l: Procédase como antes añadiendo 30 o 45 ml de muestra y diluyendo hasta la señal. 3) Aguas que contengan manganeso: El método visual no es adecuado para estas aguas cuando la concentración de manganeso sea comparable a la del ozono, ya que la medida de la diferencia es demasiado inexacta. 5.

Cálculos

a) Método espectrofotométrico:

donde: ∆A

= diferencia en absorbancia entre muestra y blanco,

MÉTODOS NORMALIZADOS

4-186

b = recorrido de luz en la cubeta, cm, V = volumen de muestra, ml (normalmente 90 ml), y f = 0,42.

El factor f se basa en un factor de sensibilidad de 20.000/cm para el cambio de absorbancia (600 nm) por mol de ozono añadido por litro. Se calibró por titulación yodométrica. La absorbancia UV del ozono en agua pura puede servir como patrón secundario: el factor f = 0,42 corresponde a un coeficiente de absorción para ozono acuoso, ε = 2.950/M-cm a 258 nm. b) Método visual:

10:1, se pueden determinar concentraciones de ozono superiores a 0,02 mg/l con un error relativo inferior al 20 por 100. b) Método visual: Las determinaciones duplicadas dan una desviación media de 1 a 1,5 por 100 dentro de la pareja. Si la concentración de manganeso es comparable con la del ozono, este método no es aplicable. 7.

1. HOIGNÉ , J. & H. BADER. 1980. Bestimmung von Ozon und Chlordioxid im Wasser mit der Indigo-Methode. Vom Wasser 55:261.

8.

donde: V = volumen de solución de referencia en la probeta de blanco, ml, y k = factor de conversión para solución madre de índigo, calibrada por un análisis espectrofotométrico del ozono. El valor es alrededor de 0,10 mg O3 /l si la dilución 1:100 da una absorbancia de 0,19/cm.

Cuando se añaden solamente 45 o 30 ml de muestra, el factor de conversión se transforma en 2k o 3k, respectivamente. 6.

Precisión y sesgo

a) Método espectrofotométrico: En ausencia de interferencias, el error relativo es inferior al 5 por 100, sin medidas especiales para la toma de muestras. En las pruebas de laboratorio se puede reducir al 1 por 100. Dado que este método se basa en las diferencias de absorbancia entre la muestra y el blanco (∆A), el método no es aplicable en presencia de cloro. Si el contenido de manganeso excede al de ozono, la precisión disminuye. Si la proporción de manganeso a ozono es menor que

Referencia

Bibliografía

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DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

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tion to the chemical reactions of ozone pertinent to its analysis. En R. G. Rice, L. J. Bollyky & W. J. Lacy, eds. Analytical Aspects

4500-P

FÓSFORO*

4500-P A. 1.

4-187

Presencia

El fósforo se encuentra en las aguas naturales y residuales casi exclusivamente en forma de fosfatos, clasificados en ortofosfatos, fosfatos condensados piro, meta y otros polifosfatos, y los ligados orgánicamente. Se presentan en solución, partículas o detritus, o en los cuerpos de organismos acuáticos. Estas formas del fosfato surgen de una diversidad de fuentes. Cantidades pequeñas de algunos fosfatos condensados se añaden a algunos suministros de agua durante el tratamiento, y se pueden añadir cantidades mayores de los mismos compuestos cuando el agua se utiliza para lavar ropa u otras limpiezas, ya que son los componentes principales de muchos preparados comerciales para la limpieza. Los fosfatos se utilizan ampliamente en el tratamiento de aguas de calderas. Los ortofosfatos aplicados como fertilizantes a la tierra cultivada agrícola o residencial son arrastrados a las aguas superficiales con las lluvias y, en menor proporción, con la nieve derretida. Los fosfatos orgánicos se forman principalmente en procesos biológicos. Son aportados al alcantarillado por los residuos corporales y de alimentos y también se pueden formar a partir de los ortofosfatos durante los procesos de tratamiento biológico o por recibir la carga biológica del agua. * Aprobado por el Standard Methods Committee, 1988.

Introducción El fósforo es esencial para el crecimiento de los organismos y puede ser el nutriente limitador de la productividad primaria de un cuerpo en el agua. En los casos en que constituye el nutriente limitador del crecimiento, la descarga de aguas residuales brutas o tratadas, drenados agrícolas o ciertos residuos industriales a ese agua puede estimular el crecimiento de micro y macroorganismos acuáticos fotosintéticos en cantidades molestas. Los fosfatos pueden aparecer también en los sedimentos de fondos y en cienos biológicos, tanto en formas inorgánicas precipitadas como incorporados a compuestos orgánicos.

2.

Definición de términos

El análisis del fósforo incluye dos pasos generales en los métodos: a) conversión de la forma fosforada en ortofosfato disuelto, y b) determinación colorimétrica del ortofosfato disuelto. La separación del fósforo en sus varias formas se define analíticamente, pero se han seleccionado las diferenciaciones analíticas de modo que puedan utilizarse con fines interpretativos. La filtración a través de un filtro de membrana de 0,45 µm de diámetro del poro separa las formas disueltas del fósforo de las suspendidas. No se pretende que esa filtración sea una separación real de las formas suspendidas y disueltas del

MÉTODOS NORMALIZADOS

4-188

fósforo; es sólo una técnica analítica cómoda y repetible destinada a conseguir una separación grosso modo. Se ha elegido la filtración por membrana en lugar de la filtración en profundidad por la mayor probabilidad de obtener una separación regular de las partículas por tamaños. Para mejorar la tasa de filtración se puede hacer una prefiltración a través de fibra de vidrio. Los fosfatos que responden a las pruebas colorimétricas sin hidrólisis o digestión oxidante previas en la muestra se denominan «fósforo reactivo». Aunque el fósforo reactivo es sobre todo una medida del ortofosfato, es inevitable una pequeña fracción de algún fosfato condensado presente, hidrolizado normalmente en el procedimiento. El fósforo reactivo se encuentra en las formas disueltas y suspendidas. La hidrólisis acida a la temperatura de ebullición del agua transforma los fosfatos condensados, disueltos y en partículas, en ortofosfato disuelto. La hidrólisis libera inevitablemente algo de fosfato a partir de los compuestos orgánicos; pero puede reducirse al mínimo eligiendo cuidadosamente la fuerza del ácido y el tiempo y temperatura de hidrólisis. Para esta fracción es preferible el término «fósforo hidrolizable por ácido» al de «fosfato condensado». Las fracciones de fosfato convertidas en ortofosfato sólo por destrucción oxidante de la materia orgánica presente, se consideran fósforo «orgánico» o «ligado orgánicamente». La intensidad de la oxidación requerida para esta conversión depende de la forma del fósforo orgánico presente y, hasta cierto punto, de su cantidad. Al igual que el fósforo reactivo y el hidrolizable con ácido, el fósforo orgánico se encuentra tanto en la fracción disuelta como en la suspendida. Tanto el fósforo total como las fracciones disuelta y suspendida pueden dividirse analíticamente en los tres tipos químicos descritos: reactivo, hidrolizable con

ácido y fósforo orgánico. En la figura 4500-P:1 se muestran los pasos del análisis de las fracciones individuales de fósforo. Como se indica, las determinaciones se realizan normalmente sólo en muestras sin filtrar y filtradas. Las fracciones suspendidas se suelen determinar por diferencia.

3.

Selección del método

a) Métodos de digestión: Dado que el fósforo se puede presentar en combinación con materia orgánica, un método de digestión para determinar fósforo total debe ser capaz de oxidar la materia orgánica eficazmente para liberar el fósforo como ortofosfato. En la sección 4500P.B.3, 4 y 5 se ofrecen tres métodos de digestión. El método del ácido perclórico, el más drástico y lento, se recomienda sólo para muestras especialmente difíciles, como los sedimentos. El método del ácido nítrico-ácido sulfúrico se recomienda para la mayoría de las muestras. El método más sencillo, con diferencia, es la técnica de oxidación con persulfato. Se recomienda comprobar este método en relación con una o más técnicas de digestión drástica, adoptándolo si se obtienen recuperaciones idénticas. Tras la digestión, determínese el ortofosfato liberado por el método C, D o E. En cuestiones de interferencias y concentración mínima detectable, el método colorimétrico manda más que el procedimiento de digestión. b) Métodos calorimétricos: Se describen tres métodos para determinación de ortofosfato. La elección depende considerablemente de la concentración de ortofosfato. El método del ácido vanadomolibdofosfórico (C) es más útil para análisis de rutina en el rango de 1 a 20 mg P/l. El de cloruro estannoso (D) o el del ácido ascórbico (E) son más adecuados para el rango de 0,01 a 6 mg P/l. Se recomien-

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

4-189

Figura 4500-P:1. Pasos del análisis de las fracciones de fosfato.

* Será preciso determinar directamente el fósforo del filtro de membrana conteniendo materia en suspensión, cuando se desee mayor precisión que la obtenida por diferencia. Digerir el filtro con HNO3 y seguir con ácido perclórico. Realizar luego la colorimetría. † La determinación del fósforo total en muestras muy salinas puede ser difícil debido a la precipitación de grandes cantidades de sal como resultado de las técnicas de digestión que reducen drásticamente el volumen de la muestra. Para análisis de fósforo total en esas muestras, determinar directamente el fósforo disuelto total y el suspendido total y sumar los resultados. ‡ En la determinación de fósforo reactivo disuelto total o suspendido total se pueden obtener resultados anómalos en muestras que contengan gran cantidad de sedimento en suspensión. Muy a menudo, los resultados dependen en gran parte del grado de agitación y mezcla a que se someten las muestras durante el análisis debido a una desorción de ortofosfato a partir de las partículas suspendidas, que depende del tiempo.

4-190

TABLA 4500-P:I.

MÉTODOS NORMALIZADOS

DATOS DE PRECISIÓN Y SESGO PARA LOS MÉTODOS MANUALES DE FÓSFORO

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

da un paso de extracción para los niveles más bajos de este rango, cuando haya que superar interferencias. También se presenta una versión automatizada del método F de ácido ascórbico. 4.

Precisión y sesgo

Para ayudar en la selección del método, la tabla 4500-P:I presenta los resultados de varias combinaciones de técnicas de digestión, hidrólisis y colorimétricas, para tres muestras sintéticas con la composición siguiente: Muestra 1:100 µg de fósforo ortofosfato ( PO3-4 -P)/l, 80 µg de fósforo fosfato condensado/l (hexametafosfato de sodio), 30 µg de fósforo orgánico/l (ácido adenílico), 1,5 mg NH3-N/l, 0,5 mg NO3-N/l y 400 mg Cl¯/l. Muestra 2: 600 µg PO3-4 -P/l, 300 µg de fósforo fosfato condensado/l (hexametafosfato de sodio), 90 µg fósforo orgánico/l (ácido adenílico), 0,8 mg NH3-N/l, 5,0 mg NO3- NOJ-N/l y 400 mg Cl¯/l.

Muestra 3: 7,00 mg PO3-4 -P/l, 3,00 mg de fósforo fosfato condensado/l (hexametafosfato de sodio), 0,230 mg fósforo orgánico/l (ácido adenílico), 0,20 mg NH3-N/l, 0,05 mg NO3- -N/l y 400 mg Cl¯/l. 5. Toma de muestras y almacenamiento

Si hay que diferenciar las formas del fósforo, fíltrese la muestra inmediatamente después de obtenerla. Consérvese congelada o a −10 °C. Añádanse 40 mg

4500-P B.

4-191

de HgCl2/l a las muestras, especialmente cuando vayan a almacenarse durante periodos prolongados. PRECAUCIÓN: HgCl2 es una sustancia peligrosa; tómense medidas adecuadas al eliminarla. No

añadir ni ácido ni CHC13 como conservador cuando se vayan a determinar las formas de fósforo. Si sólo se va a analizar fósforo total, añádase 1 ml de HC1 conc./l o congélese sin ningún aditivo. No almacenar las muestras con bajas concentraciones de fósforo en frascos de plástico, a no ser que se mantengan congeladas, porque los fosfatos pueden adsorberse sobre las paredes de plástico. Lávense todos los recipientes de vidrio con HC1 diluido caliente, y después varias veces con agua destilada. No usar nunca detergentes comerciales que contengan fosfato para limpiar el material de vidrio utilizado en el análisis de fosfatos. 6.

Bibliografía

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Preparación de muestras

Para información sobre la selección del método de digestión (véanse apartados 3 al 5 más adelante), consultar 4500P.A.3.a.

1.

Filtración previa

Fíltrense las muestras para determinación de fósforo reactivo disuelto, fósforo

4-192

disuelto hidrolizable con ácido y fósforo disuelto total, a través de filtros de membrana de 0,45 µm. Para muestras difíciles de filtrar se puede hacer una filtración previa a través de fibra de vidrio. Lávense los filtros de membrana, empapándolos en agua destilada antes de usarlos, porque podrían aportar cantidades significativas de fósforo a las muestras con concentraciones bajas de fosfato. Utilícese una de las técnicas de lavado siguientes: a) empápense 50 filtros en 2 l de agua destilada durante 24 horas; b) empápense 50 filtros en 2 l de agua destilada durante 1 hora, cámbiese el agua y empápense otras 3 horas. Los filtros de membrana se pueden lavar también pasando a través de ellos varias porciones de 100 ml de agua destilada. Este procedimiento requiere una determinación más frecuente de los valores del blanco para asegurar la uniformidad del lavado y evaluar diferentes lotes de filtros.

2.

Hidrólisis acida previa

Se define el contenido de fósforo hidrolizable con ácido de la muestra, como la diferencia entre el fósforo reactivo medido en la muestra no tratada y el fosfato hallado tras la hidrólisis acida suave. Generalmente incluye fosfatos condensados, como las especies piro, tripoli, y otras de peso molecular más alto, como el hexametafosfato. Además, algunas aguas naturales contienen compuestos orgánicos de fosfato que se hidrolizan a ortofosfato en las condiciones de la prueba. Los polifosfatos no suelen responder a las pruebas de fósforo reactivo, pero se pueden hidrolizar a ortofosfato por ebullición con ácido. Tras la hidrólisis, determínese el fósforo reactivo por un método colorimétrico (C, D o E). Las interferencias, precisión, sesgo y sensibilidad dependerán del método colorimétrico utilizado.

MÉTODOS NORMALIZADOS

a) Aparato: Autoclave u olla a presión, capaz de operar de 98 a 137 kPa. b) Reactivos:

1) Solución acuosa de indicador defenolftaleína. 2) Solución fuerte de ácido: Añádanse lentamente 300 ml de H 2 SO 4 conc. a unos 600 ml de agua destilada. Cuando se enfríe, añádanse 4,0 ml de HNO3 conc. y Dilúyase a 1 l. 3) Hidróxido de sodio, NaOH 6N. c) Método: A 100 ml de muestra o a una porción diluida a 100 ml, añádanse 0,05 ml (una gota) de solución indicadora de fenolftaleína. Si aparece un color rojo, añádase solución acida gota a gota hasta su desaparición, y entonces añádase 1 ml más. Hiérvase suavemente durante un mínimo de 90 minutos, añadiendo agua destilada para mantener el volumen entre 25 y 50 ml. Alternativamente, caliéntese durante 30 minutos en un autoclave u olla a presión a 98-137 kPa. Enfríese, neutralícese hasta color rosa débil con solución de NaOH y restablézcase el volumen original de 100 ml con agua destilada. Prepárese una curva de calibrado llevando una serie de patrones que contengan ortofosfato (véase método colorimétrico C, D o E) durante todo el paso de hidrólisis. No utilizar patrones de ortofosfato sin hidrólisis porque las sales añadidas en la hidrólisis pueden dar lugar a un aumento de la intensidad del color en algunos métodos. Determínese el contenido de fósforo reactivo de las porciones tratadas, por medio del método C, D o E. Así, se obtiene la suma de polifosfato y ortofosfato en la misma muestra. Para calcular su contenido en fósforo hidrolizable con ácido, determínese el fósforo reactivo en una porción de muestra no hidrolizada, usando el mismo método colorimétrico que

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

con la muestra tratada, y calcúlese la diferencia. 3.

Digestión con ácido perclórico

a) Instrumental:

1) Placa caliente: Es adecuada una superficie calefactora de 30 x 50 cm2. 2) Careta protectora. 3) Gafas protectoras. 4) Matraces erlenmeyer, 125 ml, lavados con ácido y aclarados con agua destilada. b) Reactivos:

1) Ácido nítrico, HNO3 conc. 2) Ácido perclórico, HC1O4·2H2O, suministrado como HC1O4 70 a 72 por 100, calidad de reactivo. 3) Hidróxido de sodio, NaOH 6N. 4) Solución indicadora de naranja de metilo. 5) Solución acuosa indicadora de fenolftaleína. c) Procedimiento: PRECAUCIÓN: Las mezclas calentadas de HClO4 y materia orgánica pueden explotar violentamente. Evítese ese riesgo tomando las precauciones siguientes: (a) No añadir HClO4 a una solución caliente que pueda contener materia orgánica, (b) Iniciar siempre la digestión de las muestras que contengan materia orgánica con HN03. Completar la digestión usando la mezcla de HN03 y HClO4. (c) No producir humos con HCLO4 en vitrinas ordinarias. Utilizar unas especiales para HClO4 o un extractor de gases de vidrio* conectado a una bomba de agua, (d) No permitir nunca que las muestras digeridas con HClO4 se evaporen a sequedad. Mídase la muestra que contenga la cantidad de fósforo deseada (se habrá determinado en función del uso del método * GFS Chemical Co., Columbus, Ohio, o equivalente.

4-193

C, D o E) en un erlenmeyer de 125 ml. Acidifíquese al naranja de metilo con HNO3 conc, añádanse otros 5 ml de HNO3 conc. y evapórese sobre baño de vapor o placa caliente hasta 15-20 ml. Añádanse 10 ml de HNO3 conc. y otros 10 de HC1O4 a los matraces cónicos de 125 ml, enfriando el matraz entre adiciones. Añádanse unos fragmentos para ayudar a la ebullición, caliéntese en placa caliente y evapórese suavemente hasta que empiecen a aparecer humos blancos de HC1O4. Si la solución no es transparente, tápese el cuello del matraz con un vidrio de reloj y manténgase apenas la ebullición hasta que se aclare. Si fuera necesario, añádanse 10 ml más de HNO3 para ayudar a la oxidación. Enfríese la solución digerida y añádase una gota de solución acuosa de fenolftaleína. Añádase solución de NaOH 6N hasta que la solución vire al rosa. Si es necesario, fíltrese la solución neutralizada y lávese el filtro con agua destilada en abundancia. Complétese a 100 ml con agua destilada. Determínese el contenido de PO3-4 -P en la muestra tratada por el método C, D o E. Prepárese una curva de calibrado con una serie de patrones que contengan ortofosfato (véase método C, D o E) sometidos al paso de digestión. No usar patrones de ortofosfato sin tratamiento.

4. Digestión con ácido sulfúricoácido nítrico a) Instrumental:

1) Gradilla de digestión: Se recomienda una gradilla de digestión con calefacción eléctrica o por gas y preparada para la extracción de humos. Son adecuadas las utilizadas normalmente para digestión micro-kjeldahl. 2) Matraces micro-kjeldahl. b) Reactivos:

4-194

1) Ácido sulfúrico: H2SO4 conc. 2) Ácido nítrico, HNO3 conc. 3) Solución acuosa de indicador de fenolftaleína. 4) Hidróxido de sodio, NaOH 1N. c) Procedimiento: mídase en un matraz micro-kjeldahl una muestra que contenga la cantidad deseada de fósforo (determinada por el método colorimétrico utilizado). Añádanse 1 ml de H2SO4 conc. y 5 ml de HNO3 conc. Digiérase hasta un volumen de 1 ml y continúese entonces hasta que la solución se vuelva incolora para eliminar el HNO3. Enfríese y añádanse aproximadamente 20 ml de agua destilada, 0,05 ml (una gota) de indicador de fenolftaleína y la cantidad necesaria de solución de NaOH 1N para producir un ligero tinte rosa. Transfiérase la solución neutralizada a un matraz aforado de 100 ml, filtrando si fuera necesario eliminar partículas o la turbidez. Añádanse los lavados del filtro al matraz y ajústese el volumen de muestra a 100 ml con agua destilada. Determínese el fósforo por el método C, D o E, para los que se habrá elaborado una curva de calibrado aparte, con patrones sometidos a todo el proceso de digestión acida.

5. Procedimiento de digestión con persulfato

a) Instrumental:

1) Placa caliente: Es adecuada una superficie calefactora de 30 x 50 cm2. 2) Autoclave: Se puede usar un autoclave u olla a presión capaz de desarrollar 98 a 137 kPa, en lugar de la placa caliente. 3) Cuchara de vidrio, para recoger la cantidad necesaria de cristales de persulfato. h) Reactivos:

MÉTODOS NORMALIZADOS

1) Solución acuosa de fenolftaleína indicador. 2) Solución de ácido sulfúrico: Añádanse con cuidado 300 ml de H 2 SO 4 conc. a aproximadamente 60 ml de agua destilada y Dilúyase a 1 l con agua destilada. 3) Persulfato de amonio (NH4)2S2O8, sólido, o persulfato de potasio, K2S2O8, sólido. 4) Hidróxido de sodio, NaOH 1N. c) Procedimiento: Utilícense 50 ml o una porción adecuada de muestra bien mezclada. Añádanse 0,05 ml (una gota) de solución indicadora de fenolftaleína. Si aparece un color rojo, añádase, gota a gota, solución de H2SO4 hasta que empiece a decolorarse. Añádanse entonces 1 ml de solución de H2SO4 y 0,4 g de (NH4)2S2O8 sólido o 0,5 g de K2S2O8 sólido. Hiérvase suavemente sobre una placa precalentada, durante 30 a 40 minutos o hasta alcanzar un volumen final de 10 ml. Los compuestos organofosforados como AMP pueden necesitar hasta 1,5 o 2 horas para su digestión completa. Enfríese, Dilúyase a 30 ml con agua destilada, añádanse 0,05 ml (una gota) de solución indicadora de fenolftaleína y neutralícese hasta color rosa pálido con NaOH. Alternativamente, caliéntese durante 30 minutos, en un autoclave o en olla a presión a 98137 kPa. Enfríese, añádanse 0,05 ml (una gota) de solución indicadora de fenolftaleína y neutralícese con NaOH hasta color rosa pálido. Complétese a 100 ml con agua destilada. En algunas muestras puede formarse un precipitado en esta fase, pero no hay que filtrar. Para una subdivisión posterior de la muestra, agítese bien. El precipitado (posiblemente de fosfato cálcico) se redisuelve en las condiciones acidas del test colorimétrico del fósforo reactivo. Determínese el fósforo por el método C, D o E, para los que se habrán construido curvas de calibrado

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

separadas con patrones sometidos al método de digestión con persulfato. 6.

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4500-P C.

Método colorimétrico del ácido vanadomolibdofosfórico

1.

Discusión general

a) Principio: En una solución diluida de ortofosfato, el molibdato amónico reacciona en condiciones acidas para formar un heteropoliácido, ácido molibdofosfórico. En presencia de vanadio, se forma ácido vanadomolibdofosfórico amarillo. La intensidad del color amarillo es proporcional a la concentración de fosfato. b) Interferencia: Sílice y arsenato interfieren positivamente sólo cuando se calienta la muestra. Arseniato, fluoruro, torio, bismuto, sulfuro, tiosulfato, tiocianato o exceso de molibdato producen interferencias negativas. El hierro ferroso produce un color azul, pero no afecta a los resultados si su concentración es inferior a 100 mg/l. La interferencia del sulfuro se puede eliminar por oxidación con agua de bromo. Los siguientes iones no interfieren en concentraciones de hasta 1.000 mg/l: Al3 + , Fe3 + , Mg2 + , Ca2 + , Ba2+, Sr2 + , Li + , Na + , K + , NH4+, Cd2 + , Mn2 + , Pb2 + , Hg + , Hg2 + , Sn2+, Cu2 + , Ni2 + , Ag + , U4 + , Zr4 + , AsO3- ,

Br ¯ , Co32- , ClO-4 , CN ¯ ,

IO3- , SiO 4-4 ,

NO3- , NO-2 , SO 2-4 , SO32- , pirofosfato, molibdato, tetraborato, selenato, benzoato, citrato, oxalato, lactato, tartrato, formato y salicilato. Si se usa HNO 3 en la prueba, Cl¯ interfiere a 75 mg/l.

c) Concentración mínima detectable: La concentración mínima detectable es de 200 µg P/l en cubetas de espectrofotómetro de 1 cm. 2.

Instrumental

a) Equipo colorimétrico: Se requiere uno de los siguientes:

1) Espectrofotómetro, para uso a 400490 nm. 2) Fotómetro de filtro, provisto de un filtro azul o violeta con transmitancia máxima entre 400 y 470 nm. La longitud de onda a la que se mide la intensidad del color depende de la sensibilidad deseada, ya que ésta varía al décuplo con longitudes de onda de 400 a 490 nm. El hierro férrico causa interferencia a longitud de onda baja, especialmente a 400 nm. La utilizada normalmente es de 470 nm. Los rangos de concentración para las diferentes longitudes de onda son: Rango de P

Longitud de onda

mg/l

nm

1,0-5,0

400

2,0-10

420

4,0-18

470

b) Material de vidrio lavado al ácido: Para determinar concentraciones bajas

4-196

de fósforo, úsese material de vidrio lavado con ácido. La contaminación de fosfato es frecuente por su absorción en las superficies de vidrio. Evítese el uso de detergentes comerciales que contengan fosfato. Lávese todo el material de vidrio con HC1 diluido caliente y aclárese bien con agua destilada. Es preferible reservar el material de vidrio sólo para la determinación de fosfato y después de usarlo se lavará y mantendrá lleno de agua hasta que se vuelva a necesitar. Si se hace así, el tratamiento de ácido sólo será necesario ocasionalmente. c) Aparato de filtración y papel de filtro*. 3.

Reactivos

a) Solución acuosa de indicador de fenolftaleína. b) Ácido clorhídrico, HC1, 1 + 1· ·H 2SO 4, HC1O 4 o HNO 3 pueden ser sustitutos de HC1. La concentración acida no es critica para la determinación, pero se recomienda una concentración final en la muestra 0,5N. c) Carbón activado†. Elimínense las partículas finas por lavado con agua destilada. d) Reactivo vanadato-molibdato:

1) Solución A: Disuélvanse 25 g de molibdato amónico, (NH4)6Mo7024 · 4H2O, en 300 ml de agua destilada. 2) Solución B: Disuélvanse 1,25 g de metavanadato de amonio, NH4VO3, calentando hasta ebullición en 300 ml de agua destilada. Enfríese y añádanse 330 ml de HC1 conc. Enfríese la solución B a temperatura ambiente, viértase la solución A sobre la B, mézclese y Dilúyase a 1 l. e) Solución patrón de fosfato: Disuélvanse 219,5 mg de KH2PO4 anhidro en

* Whatman n.° 42 o equivalente. † Darco G60 o equivalente.

MÉTODOS NORMALIZADOS

agua destilada y Dilúyase a 1.000 ml; 1,00 ml = 50,0 µg de PO3-4 -P.

4.

Procedimiento

a) Ajuste del pH de la muestra: Si el pH de la muestra es mayor de 10, añádanse 0,05 ml (una gota) de indicador de fenolftaleína a 50,0 ml de muestra y decolórese el color rojo con HC1 l + 1 antes de diluir a 100 ml. b) Eliminación del color de la muestra: Elimínese el excesivo color de la muestra agitando unos 50 ml con 200 mg de carbón activado en un erlenmeyer durante 5 minutos y filtrando para eliminar el carbón. Compruébense los fosfatos de cada lote de carbón porque algunos producen blancos con mucho reactivo. c) Desarrollo de color en la muestra: Pónganse 35 ml de muestra o menos, conteniendo de 0,05 a 1,0 mg P, en un matraz aforado de 50 ml. Añádanse 10 ml de reactivo vanadato-molibdato y Dilúyase hasta la señal con agua destilada. Prepárese un blanco con 35 ml de agua destilada en lugar de la muestra. Al cabo de 10 minutos o más, mídase la absorbancia de la muestra frente a un blanco a longitud de onda de 400 a 490 nm, en función de la sensibilidad deseada (véase apartado 2a anterior). El color es estable durante días y su intensidad no es afectada por las variaciones de la temperatura ambiente. d) Preparación de la curva de calibrado: Prepárese una curva de calibrado utilizando volúmenes adecuados de solución patrón de fosfato y procediendo como en el apartado 4c. Cuando el ion férrico sea suficientemente bajo para no interferir, elabórese un conjunto de curvas de calibrado de una serie de soluciones patrón para varias longitudes de onda. Esta acción permite una amplia gama de concentraciones en una serie de

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

determinaciones. Analícese, al menos, un patrón con cada juego de muestras.

5. Cálculo mg P/l =

mg P (en 50 ml volumen final) × 1.000 = ml muestra 6. Precisión y sesgo

Véase tabla 4500-P:I. 7

Bibliografía

KITSON, R. E. & M. G. MELLON. 1944. Colorimetric determination of phosphorus as molybdovanadophosphoric acid. Ind. Eng. Chem., Anal. Ed. 16:379 BOLTZ, D. F. & M. G. MELLON. 1947. Determination of phosphorus, germanium, silicon, and

4500-P D. 1.

4-197

arsenic bu the heteropoly blue method. Ind. Eng. Chem., Anal. Ed. 19:873 GREENBERG, A. E., L. W. WEINBERGER & C. N. SAWYER. 1950. Control of nitrite interference in colorimetric determination of phosphorus. Anal. Chem. 22:499. YOUNG, R. S. & A. GOLLEDGE. 1950. Determination of hexametaphosphate in water after threshold treatment. Ind. Chem. 26:13. GRISWOLD, B. L., F. L. HUMOLLER & A. R. MCINTYRE . 1951. Inorganic phosphates and phosphate esters in tissue extracts. Anal. Chem. 23:192. BOLTZ, D. F., ed. 1958. Colorimetric Determination of Nonmetals. Interscience Publishers, Nueva York. AMERICAN WATER WORKS ASSOCIATION. 1958. Committee report. Determination of orthophosphate, hydrolyzable phosphate, and total phospate in surface waters. J. Amer. Water Works Assoc. 50:1563. JACKSON, M. L. 1958. Soil Chemical Analysis Prentice-Hall, Englewood Cliffs, Nueva Jersey. A BBOT , D. C, G. E. E MSDEN & J. R. H ARRIS . 1963. A method for determining orthophosphate in water. Analyst 88:814. GOTTFRIED, P. 1964. Determination of total phosphorus in water and wastewater as molybdovanadophosphoric acid. Limnologica 2:407.

Método del cloruro estagnoso

Discusión general

a) Principio: Se forma ácido molibdofosfórico que se reduce con cloruro estagnoso a azul de molibdeno de color intenso. Este método es más sensible que el método C y posibilita la determinación de hasta 7 µg P/l utilizando un recorrido de luz más largo. Por debajo de 100 µg P/l, se puede aumentar la fiabilidad y reducir las interferencias con un paso de extracción. b) Interferencia: Véase sección 4500V.C.1b. c) Concentración mínima detectable: La concentración mínima detectable es

de 3 µg P/l aproximadamente. La sensibilidad a 0,3010 de absorbancia es de unos 10 µg P/l para un cambio de absorbancia de 0,009. 2.

Instrumental

Se precisa el mismo instrumental que para el método C, a excepción de una pipeta de bulbo para el paso de extracción. Ajústese el espectrofotómetro a 625 nm cuando se midan extractos de benceno-isobutanol y a 690 nm para soluciones acuosas. Si el aparato no está preparado para leer a 690 nm, utilícese la

MÉTODOS NORMALIZADOS

4-198

lectura a 650 nm para soluciones acuosas, con cierta reducción de sensibilidad y precisión.

Este reactivo es estable durante un mínimo de 6 meses. 4.

3.

Reactivos

a) Solución acuosa indicadora de fenolftaleína. b) Solución de ácido fuerte: Prepárese como se indica en la sección 4500P.B.262). c) Reactivo I de molibdato amónico: Disuélvanse 25 g de (NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 · · 4H 2 O en 175 ml de agua destilada. Añádanse con cuidado 280 ml de H2SO4 conc. a 400 ml de agua destilada. Enfríese, añádase solución de molibdato y dilúyase a 1 l. d) Reactivo I de cloruro estagnoso: Disuélvanse 2,5 g de SnCl 2 · 2H 2 O reciente en 100 ml de glicerol. Caliéntese en baño de agua y agítese con varilla de vidrio para acelerar la disolución. Este reactivo es estable y no precisa conservadores ni un almacenamiento especial. e) Solución patrón de fosfato: Prepárese como se indica en la sección 4500P.C.3e. f)

Reactivos para extracción:

1) Disolvente de benceno-isobutanol: Mézclense volúmenes iguales de benceno y alcohol isobutílico. (PRECAUCIÓN: Este disolvente es muy inflamable.) 2) Reactivo II de molibdato amónico: Disuélvanse 40,1 g de (NH4Mo7O24 · · 4H2O en 500 ml de agua destilada aproximadamente. Añádanse lentamente 396 ml de reactivo molibdato amónico I. Enfríese y Dilúyase a 1 l. 3) Solución alcohólica de ácido sulfúrico: Añádanse con cuidado 20 ml de H 2 SO 4 conc. a 980 ml de alcohol metílico, mezclado continuamente. 4) Reactivo II de cloruro estagnoso diluido: Mézclense 8 ml de reactivo I de cloruro estagnoso con 50 ml de glicerol.

Procedimiento

a) Tratamiento previo de la muestra: A 100 ml de muestra que contenga no más de 200 µg P y exenta de color y turbidez, se añaden 0,05 ml (1 gota) de indicador de fenolftaleína. Si la muestra vira al rosa, añádase solución de ácido fuerte gota a gota para decolorarla. Si se precisan más de 0,25 ml (5 gotas), tómese una muestra menor y Dilúyase a 100 ml con agua destilada tras la primera decoloración con ácido. b) Desarrollo del color: Añádanse, mezclando bien tras cada adición, 4,0 ml de reactivo molibdato I y 0,5 ml (10 gotas) de reactivo cloruro estagnoso I. La velocidad con que aparece el color y su intensidad dependen de la temperatura de la solución final: cada aumento de 1 °C produce alrededor del 1 por 100 de aumento del color. Por ello, se deben mantener las muestras, patrones y reactivos entre 20 y 30 °C, sin diferencias superiores a 2 °C entre ellos. c) Medida del color: Al cabo de 10 minutos, pero antes de los 12, mídase el color fotométricamente a 690 nm, con el mismo intervalo específico para todas las determinaciones, y compárese con una curva de calibrado, utilizando un blanco de agua destilada. Los recorridos de luz adecuados para las distintas concentraciones son los siguientes:

Llévese siempre un blanco de reactivos y agua destilada. Dado que el color se desarrolla progresivamente al principio,

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

para desvanecerse a continuación, manténganse condiciones iguales de tiempo para muestras y patrones. Prepárese, como mínimo, un patrón con cada juego de muestras, o uno para cada día en que se hacen los análisis. La curva de calibrado puede desviarse de la línea recta a las concentraciones superiores de 0,3 a 2,0 mg/l. d) Extracción: Cuando se desee mayor sensibilidad o haya que superar interferencias, extráigase el fosfato del modo siguiente: Llévese con la pipeta una muestra de 40 ml, o una diluida a ese volumen, a un embudo de separación de 125 ml. Añádanse 50,0 ml de disolvente benceno-isobutanol y 15,0 ml de reactivo molibdato II. Tápese el embudo de inmediato y agítese vigorosamente durante 15 segundos exactos. Si hubiera fosfato condensado, cualquier retraso causaría su transformación en ortofosfato. Retírese el tapón y extráiganse 25,0 ml de la capa orgánica separada, por medio de una pipeta con bulbo de seguridad. Transfiéranse a un matraz aforado de 50 ml, añádanse de 15 a 16 ml de solución alcohólica de H2SO4, agítese por rotación, añádanse 0,50 ml (10 gotas) de cloruro estag-

4500-P E. 1.

4-199

noso reactivo II, agítese por rotación y Dilúyase hasta la señal con H2SO4 alcohólico. Mézclese totalmente. Al cabo de 10 minutos, pero antes de 30, léase frente al blanco a 625 nm. Prepárese el blanco sometiendo 40 ml de agua destilada al mismo procedimiento utilizado para la muestra. Léase la concentración de fosfato a partir de una curva de calibrado, preparada con patrones conocidos de fosfato sometidos al mismo procedimiento que las muestras. 5.

Cálculo

a)

Procedimiento directo:

b)

Procedimiento de extracción:

6.

Precisión y sesgo

Véase tabla 4500-P:I.

Método del ácido ascórbico

Discusión general

a) Principio: El molibdato amónico y el tartrato antimonílico potásico reaccionan en medio ácido con ortofosfato para formar un ácido heteropoliácido fosfomolíbdico que se reduce a azul de molibdeno, de color intenso por el ácido ascórbico. b) Inteferencia: Los arseniatos reaccionan con el reactivo de molibdato y producen un color azul similar al formado con el fosfato. Concentraciones de arseniato tan bajas como 0,1 mg As/l interfieren en la determinación de fosfato. El cromo hexavalente y NO-2 interfieren y

dan resultados un 3 por 100 más bajos a concentraciones de 1 mg/l, y del 10 al 15 por 100 más bajos a la de 10 mg/l. Sulfuro (Na2S) y silicato no interfieren a concentraciones de 1,0 y 10 mg/l. c) Concentración mínima detectable: Aproximadamente 10 µg P/l. Los rangos de P son los siguientes:

MÉTODOS NORMALIZADOS

4-200

2.

Instrumental

a) Equipo calorimétrico: Se necesita uno de los siguientes: 1) Espectrofotómetro, con fototubo de infrarrojo para uso a 880 nm, con un recorrido de luz de 2,5 cm o superior. 2) Fotómetro de filtro, provisto de filtro de color rojo y recorrido de luz de 0,5 cm o superior. b) Material de vidrio lavado con ácido: Véase sección 4500-P.C.2b. 3.

Reactivos

a) Ácido sulfúrico, H2SO4 5N: Dilúyanse 70 ml de H 2 SO 4 conc. a 500 ml con agua destilada. b) Solución de tartrato antimonílico potásico: Disuélvanse 1,3715 g de K(SbO)C4H4O6 · 1/2H2O en 400 ml de agua destilada en un matraz aforado de 500 ml y Dilúyase a volumen. Consérvese en frasco con tapón de vidrio. c) Solución de molibdato amónico: Disuélvanse 20 g (NH4)6Mo7O24 · 4H2O en 500 ml de agua destilada. Consérvese en frasco con tapón de vidrio. d) Ácido ascórbico, 0,01M: Disuélvanse 1,76 g de ácido ascórbico en 100 ml de agua destilada. La solución es estable durante 1 semana, aproximadamente, a 4 °C. e) Reactivo combinado: Mézclense los reactivos anteriores en las siguientes proporciones para 100 ml de reactivo combinado: 50 ml de H 2 SO 4 5N, 5 ml de solución de tartrato antimonílico potásico, 15 ml de solución de molibdato amónico y 30 ml de solución de ácido ascórbico. Mézclese tras la adición de cada reactivo. Déjese que todos los reactivos alcancen la temperatura ambiente antes de mezclarlos y sígase el orden citado. Si apareciera turbidez en el reactivo combinado, agítese y déjese reposar unos minutos hasta que desaparezca, antes de

continuar. El reactivo es estable durante 4 horas. f) Solución madre de fosfato: Véase sección 4500-P.C.3e. g) Solución patrón de fosfato: Diluyanse 50,0 ml de solución madre de fosfato a 1.000 ml con agua destilada; 1,00 ml = 2,50 µg P. 4.

Procedimiento

a) Tratamiento de la muestra: Llévense con la pipeta 50,0 ml de muestra a un tubo de ensayo limpio y seco o a un erlenmeyer de 125 ml. Añádanse 0,05 ml (1 gota) de indicador de fenolftaleína. Si aparece un color rojo, añádase solución H 2 SO 4 5N gota a gota, hasta que empiece a desaparecer. Añádanse 8,0 ml de reactivo combinado y mézclese bien. Al cabo de 10 minutos, pero antes de 30, mídase la absorbancia de cada muestra a 880 nm, con blanco de reactivos como referencia. b) Corrección de la turbidez o color interferente: El color natural del agua no suele interferir a la elevada longitud de onda empleada. Con aguas turbias o muy coloreadas, prepárese un blanco por adición a la muestra de todos los reactivos, excepto el ácido ascórbico y el tartrato antimonílico potásico. Réstese la absorbancia del blanco de la de cada muestra. c) Preparación de la curva de calibrado: Prepárense curvas individuales de calibrado a partir de una serie de 6 patrones, dentro de los rangos de fosfato indicados anteriormente en el apartado le. Utilícese un blanco de agua destilada con el reactivo combinado para realizar las lecturas de la curva de calibrado. Compárese la absorbancia con la concentración de fosfato para obtener una línea recta que pase por el origen. Ensáyese un patrón de fosfato, por lo menos, con cada juego de muestras.

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

5.

Cálculo

6.

7.

Precisión y sesgo

Los valores de precisión y sesgo que se ofrecen en la tabla 4500-P:I corresponden a un método de solución única que se presenta en la 13.a edición. El procedimiento indicado aquí difiere en las proporciones reactivo-muestra, la no adición de disolvente y las condiciones de acidez. Produce mejores precisión y sesgo que la técnica previa, tanto para el análisis de agua destilada como de agua de río al nivel de 228 µg P/l (tabla 4500-P:I). TABLA 4500-P:II.

Referencias

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8.

Bibliografía

SLETTEN, O. & C. M. BACH. 1961. Modified stannous chloride reagent for orthophosphate determination. J. Amer. Water Works Assoc. 53:1031. STRICKLAND, J. D. H. & T. R. PARSONS. 1965. A Manual of Sea Water Analysis, 2.a ed. Fisheries Research Board of Canada, Ottawa.

COMPARACIÓN DE PRECISIÓN Y SESGO DE LOS MÉTODOS DEL ÁCIDO ASCÓRBICO

4500-P F.

1.

4-201

Método automatizado de reducción del ácido ascórbico

Discusión general

a) Principio: El molibdato de amonio y el tartrato antimonílico potásico reaccionan con ortofosfato en medio ácido para formar un complejo antimonio-fosfomolibdato que, al reducirse con ácido ascórbico, produce un color azul intenso adecuado para mediciones fotométricas.

b) Interferencias: Son tolerables hasta 50 mg Fe3+/l, 10 mg Cu/l y 10 mg SiO2/l. La concentración elevada de sílice provoca una interferencia positiva. En términos de fósforo, los resultados aumentan en 0,005, 0,015 y 0,025 mg/l para concentraciones de sílice de 20, 50 y 100 mg/l, respectivamente. Las concentraciones salinas de hasta el 20 por

MÉTODOS NORMALIZADOS

4-202

100 (p/v) producen un error inferior al 1 por 100. El arseniato (AsO3-4 ) es una interferencia positiva. Elimínese la interferencia de NO2 y S2- por adición de un exceso de agua de bromo o saturada de permanganato potásico (KMnO4). Elimínese la turbidez interferente por filtración antes del análisis. Fíltrense las muestras para fósforo total o hidrolizable total sólo después de la digestión. El color de la muestra con absorbancia en el rango fotométrico utilizado para el análisis también interfiere. Véase además la sección 4500-P.E:lb. c) Aplicación: Se puede determinar ortofosfato en agua potable, superficial y salina, así como en las residuales domésticas e industriales en un rango de 0,001 a 10,0 mg P/l, cuando las medidas fotométricas se realizan de 650 a 660 nm o a 880 nm en una cubeta de flujo tubular de 15 mm o 50 mm. Determínense las concentraciones más elevadas diluyendo la muestra. Aunque la prueba automatizada se ha diseñado sólo para ortofosfato, otros compuestos de fósforo se pueden transformar en su forma reactiva con varios tratamientos preliminares de las muestras, que se describen en la sección 4500-P.B.l, 2 y 5. 2.

Instrumental

a) Equipo analítico automatizado: El aparato de flujo continuo requerido † consta de los componentes intercambiables que muestra la figura 4500-P:2. Se pueden utilizar una cubeta de flujo de 15 o 50 mm y un filtro de 650 a 660 u 880 nm. b) Placa caliente o autoclave. c) Material de vidrio lavado con ácido: Véase sección 4500-P.C.2b.

†Autoanalizador™ II, Technicon Instrument Co., Tarrytown, Nueva York 10591, o equivalente.

3.

Reactivos

a) Solución de tartrato antimonílico potásico: Disuélvanse 0,3 g de K(SbO)C2H4O6 · 1/2H2O en aproximadamente 50 ml de agua destilada y diluyase a 100 ml. Consérvese a 4 °C en un frasco oscuro con tapón de vidrio. b) Solución de molibdato amónico: Disuélvanse 4 g (NH4)6Mo7O24 · 4H2O en 100 ml de agua destilada. Consérvese en un frasco de plástico a 4 °C. c) Solución de ácido ascórbico: Véase sección 4500-P.E.3d. d) Reactivo combinado: Véase sección 4500-P.E.3e. e) Solución diluida de ácido sulfúrico: Añádanse lentamente 140 ml de H2SO4 conc. a 600 ml de agua destilada. Cuando se enfríe, Dilúyase a 1 l. f) Persultafo de amonio, (NH4)2S2O8, cristalino. g) Solución acuosa indicadora de fenolftaleína. h) Solución madre de fosfato: Disuélvanse 439,3 mg de KH2PO4 anhidro secado a 105 °C durante 1 hora en agua destilada, y Dilúyase a 1.000 ml; 1,00 ml = = 100 µg P. i) Solución intermedia de fosfato: Dilúyanse 100,0 ml de solución madre de fosfato a 1.000 ml con agua destilada; 1,00 ml = 10,0 µg P. j) Soluciones patrón de fosfato: Prepárese una serie adecuada de patrones por dilución de los volúmenes apropiados de solución intermedia de fosfato. 4.

Procedimiento

Móntese un aparato como el que muestra la figura 4500-P:2 y sígase el procedimiento general descrito por el fabricante. Añádanse 0,05 ml (1 gota) de solución indicadora de fenolftaleína a aproximadamente 50 ml de muestra. Si aparece un color rojo, añádase H2SO4 (apartado 3e), gota a gota, hasta su desaparición.

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

4-203

Figura 4500-P:2. Distribuidor de fosfato para cada sistema de análisis automatizado.

5. Cálculo

6. Precisión y sesgo

Prepárense curvas patrón comparando los picos de altura de los patrones procesados a través del aparato con sus concentraciones de P. Calcúlese la concentración de P en la muestra, comparando la altura del pico de su pico con la curva patrón.

Se analizaron por septuplicado seis muestras en un solo laboratorio. A una concentración PO3-4 media de 0,340 mg/l, la desviación media fue de 0,015 mg/l, y el coeficiente de variación, de 6,2 por 100. En dos muestras con PO3-4 añadido, las recuperaciones fueron 89 y 96 por 100.

4-204

7.

MÉTODOS NORMALIZADOS

Bibliografía

HENRIKSEN, A. 1966. An automatic method for determining orthophosphate in sewage and highly polluted waters. Analyst 91:652. LOBRING, L. B. & R. L. BOOTH. 1973. Evaluation of the AutoAnalyzer II; A progress report. En Advances in Automated Analysis: 1972 Technicon International Congress. Vol. 8, pág. 7. Mediad, Inc., Tarrytown, Nueva York.

U.S. E NVIRONMENTAL P ROTECTION A GENCY . 1979. Methods for Chemical Analysis of Water and Wastes. EPA-600/4-79-020, National Environmental Research Center, Cincinnati, Ohio. U.S. ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENCY. MDQARL Method Study 4, Automated Methods. National Environmental Research Center, Cincinnati, Ohio (en preparación).

4500-Si SÍLICE* 4500-Si A. Introducción 1.

Presencia y significado

El silicio es, después del oxígeno, el elemento más abundante de la corteza terrestre. Aparece como óxido (sílice) en el cuarzo y la arena y se combina con los metales en forma de variados silicatos minerales complejos, especialmente en las rocas ígneas. La degradación de las rocas que contienen sílice explica su presencia en las aguas naturales como partículas en suspensión, en estado coloidal o polimérico, y como ácidos silícicos o iones silicato. Con frecuencia, las aguas volcánicas y geotérmicas contienen sílice en abundancia. Existen descripciones más completas de la presencia y química de sílice en el agua natural1. El contenido de sílice (SiO2) en el agua natural suele oscilar entre 1 y 30 mg/l, aunque no son raras concentraciones de 100 mg/l e incluso 1.000 mg/l en algunas aguas salobres y piélagos. La presencia de sílice en el agua supone un problema industrial debido a la formación de placas de sílice y silicatos en el equipo, difíciles de eliminar, especialmente en las paletas de turbinas de * Aprobado por el Standard Methods Committee, 1988.

vapor con presión elevada. La acción más frecuente consiste en eliminar la sílice con resinas intercambiadoras de aniones fuertemente básicas, en el proceso de desionización, por destilación o por osmosis inversa. Algunas plantas utilizan la precipitación con óxido de magnesio en el proceso de suavizado de cal frío o caliente. 2.

Selección del método

El método C determina sílice total. Los métodos D, E y F determinan sílice molibdato-reactiva. Como se indica en la sección 4500-Si.D.4, es posible transformar otras formas de sílice en la forma molibdato-reactiva para su determinación con esos métodos. El método B, como el C, determina más de una forma de sílice, ya que mide toda la sílice disuelta y alguna dispersa coloidalmente. La determinación de sílice presente en partículas micro y submicrométricas depende de la distribución del tamaño, composición y estructura de las partículas; así el método B no puede decirse que determine sílice total. Utilícese el método C para estandarizar soluciones de silicato de sodio, utilizadas como patrones en los métodos D,

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

E y F. No emplear el método C para muestras de agua que contengan menos de 20 mg SiO2/l. Se recomienda el método D para aguas relativamente puras que contengan de 0,4 a 25 mg SiO2/l. Como en la mayoría de los métodos colorimétricos, se puede ampliar su rango, si fuera necesario, por dilución, concentración o variación del recorrido de la luz. Las interferencias debidas al tanino, color y turbidez son más graves con este método que con el método E. Además, el color amarillo producido por el método D tiene una estabilidad limitada y es preciso cuidar los tiempos. Sin embargo, cuando sea aplicable, ofrecerá mayor rapidez y sencillez que el método E porque se usa un reactivo menos, se elimina un paso y se pueden analizar muchas aguas naturales sin dilución, lo que no suele ocurrir con el método E. El método E es recomendable para rangos bajos, de 0,04 a 2 mg de SiO2/l, ampliables si fuera preciso. Esta ampliación sería deseable si se esperaran interferencias del tanino, color o turbidez. Una serie de factores combinados hace que los métodos E y F sean menos proclives que el método D a esas interferencias; además, el color azul de los métodos E y F es más estable que el amarillo en el método D. Sin embargo, muchas muestras precisan diluciones debido a la gran sensibilidad del método. No existen patrones artificiales de color permanente para el color azul desarrollado en el método E. El color amarillo producido por el método D y el azul de los métodos E y F son afectados por concentraciones altas de sales. Con el agua del mar, la intensidad del color amarillo disminuye de un 20 a un 25 por 100 y la del color azul aumenta entre el 10 y el 15 por 100. Cuando se analizan aguas con gran fuerza iónica por estos métodos, se utilizan patrones de sílice de aproximadamente la misma fuerza iónica2. El método F se puede usar cuando se analiza regularmente un gran número de

4-205

muestras. Para uso en un rango amplio se recomienda el método B; aunque es válido desde 1 a 300 mg SiO2/l, los resultados óptimos se obtienen entre 20 y 300 mg/l. El rango se puede ampliar hacia arriba, por dilución, si fuera necesario. Este método es rápido y no requiere un tiempo preciso para los pasos. También se puede utilizar el método del plasma acoplado inductivamente (G) para análisis de sílice. 3.

Toma de muestras y conservación

Recójanse las muestras en frascos de polietileno, otro plástico o goma dura, especialmente si va a transcurrir un tiempo entre su obtención y el análisis. El vidrio de borosilicato representa una elección menos deseable, especialmente con aguas de pH superior a 8 o con agua de mar, en cuyo caso puede disolverse una cantidad significativa de sílice del vidrio. La congelación para conservación de las muestras para análisis de otros componentes puede reducir los valores de sílice soluble hasta un 20 o un 40 por 100 en agua con pH inferior a 6. No acidificar las muestras para conservarlas porque en solución acida la sílice precipita. 4.

Referencias

1.

H EM , J. D. 1959. Study and interpretation of the chemical characteristics of natural water. U.S. Geol. Surv. Water Supply Pap. n.° 1473. 2. F ANNING , K. A. & M. E. Q. P ILSON . 1973. On the spectrophotometric determination of disolved silica in natural waters. Anal. Chem. 45:136.

5.

Bibliografía

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4-206

4500-Si B.

MÉTODOS NORMALIZADOS

Método espectrométrico de absorción atómica

Véase sección 3111D.

4500-Si C. 1.

Método gravimétrico

Discusión general

a) Principio: El ácido clorhídrico descompone los silicatos y sílice disuelta, formando ácidos silícicos que precipitan como sílice parcialmente deshidratada durante la evaporación y secado. La ignición completa la deshidratación de sílice, que se pesa y volatiliza después como tetrafluoruro de silicio, dejando todas las impurezas como residuo no volátil. Se pesa el residuo y se determina la sílice como pérdida de volatilización. Para deshidratar la sílice se puede utilizar ácido perclórico (HC1O4) en lugar de HC1. Un tratamiento sencillo con HC1O4 recuperará más sílice que uno con HC1, aunque para recuperación completa de sílice se necesitan dos deshidrataciones con cualquiera de esos dos ácidos. La utilización de HC1O4 reduce la tendencia a las salpicaduras, produce un precipitado de sílice más fácil de filtrar y acorta el tiempo necesario para la determinación. b) Interferencia: Dado que el material de vidrio puede aportar sílice, evítese su uso lo más posible. Utilícense reactivos y agua destilada o desionizada baja en sílice. Realícese una determinación en blanco para corregir la sílice introducida por los reactivos y el aparato. 2.

Instrumental

a) Crisoles de platino, con tapa. b) Cápsulas de evaporación de platino, 200 ml. En los pasos de deshidratación se puede sustituir el platino por cápsulas de porcelana vidriada con lixiviado ácido

sin aguafuerte, pero es preferible el platino para lograr una mayor precisión. 3.

Reactivos

Para mayor exactitud, elíjanse lotes de productos químicos bajos en sílice para este método. Consérvense todos los reactivos en envases de plástico y realícense pruebas en blanco. a) Ácido clorhídrico, HC1, 1 + 1 y 1 + 50. b) Ácido sulfúrico, H2SO4 1 + 1. c) Ácido fluorhídrico, HF, 48 por 100. d) Ácido perclórico, HC1O4, 72 por 100. 4.

Procedimiento

Antes de determinar la sílice, analícese la materia interferente no volátil de H2SO4 y HF por medio del procedimiento descrito más adelante en el apartado Aa5). Utilícese un crisol de platino vacío y limpio. Si se observa algún aumento de peso, hágase una corrección en la determinación de sílice. a) Deshidratación de HCl:

1) Evaporación de la muestra. A una muestra transparente conteniendo, al menos, 10 mg de sílice, se añaden 5 ml de HCl 1 + 1. Evapórese a sequedad en una cápsula de 200 ml de platino o porcelana vidriada con lechada acida, en varias porciones, si fuera preciso, sobre un baño de agua o suspendida en un anillo de amianto sobre una placa caliente.

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

Protéjase de la contaminación del polvo atmosférico. Durante la evaporación, añádase un total de 15 ml de HC1 l + 1 en varias porciones. Séquese la placa y póngase en un horno a 110°C o sobre una placa caliente para secar durante 30 minutos. 2) Primera filtración. Añádanse 5 ml de HC1 l + 1 templado, y 50 ml de agua destilada caliente. Con la mezcla aún caliente, fíltrese mediante papel de filtro de textura media sin cenizas, decantando el máximo posible de líquido. Lávese la placa y el residuo con HC1 l + 50 caliente y después con un volumen mínimo de agua destilada, hasta que los lavados estén libres de cloruro. Guárdense todos los lavados. Déjese aparte el papel de filtro con su residuo. 3) Segunda filtración. Evapórese el filtrado y los lavados de la operación anterior a sequedad en la cápsula de platino original. Séquese el residuo en un horno a 110 °C o sobre placa caliente durante 30 minutos. Repítanse los pasos del apartado 2) anterior. Úsese otro papel de filtro y un pilón de goma para ayudar a transferir el residuo de la cápsula al filtro. Téngase especial atención con las cápsulas de porcelana porque la sílice se adhiere a ellas. 4) Ignición. Transfiéranse los dos papeles de filtro (uno si se deshidrata como en el apartado 4b) y los residuos a un crisol de platino con tapa, séquese a 110°C y llévese a ignición a 1.200 °C hasta peso constante. Evítese la pérdida mecánica de residuo cuando se carboniza y quema el papel por primera vez, calentando gradualmente a la mínima temperatura. Un calentamiento demasiado rápido podría producir carburo de silicio negro. Enfríese en desecador, pésese y repítase la ignición y la pesada hasta conseguir un peso constante. Regístrese el peso del crisol y el contenido. 5) Volatilización con HF. Humedézcase por completo el residuo pesado con agua destilada. Añádanse 4 gotas de

4-207

H2SO4 1 + 1, seguido de 10 ml de HF, midiendo éste en una probeta de plástico graduada o vertiendo los 10 ml estimados directamente del frasco de reactivo. Evapórese a sequedad lentamente sobre un baño de aire o placa caliente, en una vitrina, y evítense las pérdidas por salpicaduras. Llévese a ignición el crisol a 1.200 °C, hasta peso constante. Regístrese el peso del crisol y contenido. b) Deshidratación de HClO4: Sígase el procedimiento descrito anteriormente en el apartado 4a1) hasta que queden 50 ml de muestra sin evaporar. Añádanse 5 ml de HC1O4 y evapórese hasta aparición de humos blancos y densos. (PRECAUCIÓN: Explosivo. Colóquese una protección entre el analista y la cápsula humeante). Continúese la deshidratación durante 10 minutos. Enfríese, añádanse 5 ml de HC1 l + 1 y 50 ml de agua destilada caliente. Llévese a ebullición y fíltrese por papel cuantitativo sin cenizas. Lávese completamente diez veces con agua destilada caliente y procédase como se indica en los apartados 4a4) y 5) anteriores. Para muchos fines, el precipitado de sílice suele ser suficientemente puro y se puede pesar directamente, omitiendo la volatilización de HF. Sin embargo, para asegurarse de que el resultado está dentro de los límites de precisión necesarios, se debe hacer una comprobación inicial frente al método más largo.

5.

Cálculo

Réstese el peso del crisol y su contenido tras el tratamiento con HF del peso correspondiente antes de este tratamiento. La diferencia A, en miligramos, es la «pérdida de volatilización» y representa la sílice:

MÉTODOS NORMALIZADOS

4-208

6.

Precisión y sesgo

7.

La precisión está limitada tanto por la solubilidad finita de sílice en agua, en las condiciones del análisis, como por la sensibilidad del balance analítico. En condiciones óptimas, un analista experimentado puede lograr una precisión aproximada de ±0,2 mg SiO2.

4500-Si D. 1.

Bibliografía

HILLEBRAND, W. F. et al. 1953. Applied Inorganic Analysis, 2.a ed. John Wiley & Sons, Nueva York. Capítulo 43. KOLTHOFF, I. M., E. J. MEEHAN, E. B. SANDELL & S. BRUCKENSTEIN. 1969. Quantitative Chemical Analysis, 4.a ed. Macmillan Co., Nueva York.

Método del molibdosilicato

Discusión general

a) Principio: A pH aproximado de 1,2, el molibdato amónico reacciona con sílice y cualquier fosfato presente para producir heteropoliácidos. El ácido oxálico se adiciona para destruir el ácido molibdofosfórico, pero no el molibdosilícico. Incluso cuando se sepa que no hay fosfato presente, es muy deseable la adición de ácido oxálico, que es un paso obligado tanto en este método como en el método E. La intensidad del color amarillo es proporcional a la concentración de sílice «molibdato-reactiva». Al menos en una de sus formas, la sílice no reacciona con molibdato, aun cuando es capaz de atravesar el papel de filtro y no se aprecie su turbidez. No se sabe el alcance de la presencia de sílice «no reactiva» en el agua. Se han utilizado términos como «coloidal», «cristaloide» e «iónica» para distinguir entre varias formas de sílice, pero esa terminología no tiene mucho fundamento. La sílice «molibdato-no reactiva» se puede transformar en «molibdato-reactiva» por calentamiento o fusión con álcali. Molibdato reactiva o no reactiva, no supone reactividad o falta de ella frente a otros reactivos o procesos. b) Interferencia: Dado que tanto los aparatos como los reactivos pueden aportar sílice, hay que evitar al máximo

la utilización de vidrio, y se emplearán reactivos bajos en sílice. También se deben realizar pruebas en blanco para corregir la sílice introducida. En este método y en el E interfieren el tanino, las cantidades grandes de hierro, el color, turbidez, sulfuro y fosfato. El tratamiento con ácido oxálico elimina la interferencia del fosfato y reduce la del tanino. Si es preciso, utilícese la compensación fotométrica para anular la interferencia del color o turbidez. c) Concentración mínima detectable: Se puede detectar aproximadamente 1 mg SiO2/l en tubos Nessler de 50 ml.

2.

Instrumental

a) Cápsulas de platino, 100 ml. b) Equipo calorimétrico: Se necesita uno de los siguientes:

1) Espectrofotómetro, para uso a 410 nm, con un recorrido de luz de 1 cm o superior. Para seleccionar el recorrido de luz, véase la tabla 4500-Si:I. 2) Fotómetro de filtro, con un recorrido de luz de 1 cm o superior, provisto de un filtro violeta de transmitancia máxima próxima a los 410 nm. 3) Tubos Nessler, iguales, de 50 ml y forma alta.

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

TABLA 4500-SI:I. SELECCIÓN DE LA LONGITUD DEL RECORRIDO DE LUZ PARA VARIAS CONCENTRACIONES DE SÍLICE

3.

Reactivos

Para obtener mejores resultados, elíjanse lotes de productos químicos bajos en sílice. Consérvense todos los reactivos en envases de plástico para evitar blancos elevados. a) Bicarbonato de sodio, NaHCO3, polvo. b) Ácido sulfúrico, H2SO4 1N. c) Ácido clorhídrico, NC1 l + 1. d) Reactivo de molibdato amónico: Disuélvanse 10 g de (NH4 ) 6 Mo 70 24 · · 4H2O en agua destilada, con agitación y calentando suavemente, y dilúyanse a 100 ml. Fíltrese si fuera necesario. Ajústese el pH a 7-8 con NH4OH o NaOH exentos de sílice, y consérvese en un frasco de polietileno para estabilizarlo. (Si no se ha ajustado el pH aparecerá gradualmente un precipitado. Si la solución se conserva en vidrio puede lixiviarse sílice y los blancos serán elevados.) Si es necesario, prepárese NH4OH exento de sílice, introduciendo NH3 gaseoso en agua destilada contenida en un frasco de plástico. e) Solución de ácido oxálico: Disuélvanse 7,5 g de H2C2O4 · H2O en agua destilada y Dilúyase a 100 ml.

4-209

f) Solución madre de sílice: Disuélvanse 4,73 g de metasilicato de sodio nonahidratado, Na2SiO3 · 9H2O en agua destilada y Dilúyase a 1.000 ml. Analícense porciones de 100,0 ml por el método C para determinar la concentración. Consérvese en frascos de plástico herméticamente cerrados. g) Solución patrón de sílice: Diluyanse 10,00 ml de solución madre de sílice a 1000 ml con agua destilada; 1,00 ml = = 10,0 µg SiO2. Calcúlese su concentración exacta a partir de la concentración de la solución madre de sílice. Consérvese en frascos de plástico herméticamente cerrados. h) Soluciones de color permanente:

1) Solución de cromato potásico: Disuélvanse 630 mg K2CrO4 en agua destilada y Dilúyase a 1 l. 2) Solución de bórax: Disuélvanse 10 g de borato de sodio decahidratado, Na2B4O7 · 10H2O, en agua destilada y Dilúyase a 1 l. 4.

Procedimiento

a) Desarrollo del color: Añádase a 50,0 ml de muestra, en sucesión rápida: 1,0 ml de HC1 l + 1 y 2,0 ml de reactivo de molibdato amónico. Mézclese invirtiendo seis veces, por lo menos, y déjese reposar durante 5 a 10 minutos. Añádanse 2,0 ml de solución de ácido oxálico y mézclese completamente. Léase el color al cabo de 2 minutos pero antes de 15, desde la adición del ácido oxálico. Dado que el color amarillo sigue la ley de Beer, mídase fotométrica o visualmente. b) Para detectar la presencia de sílice molibdato-no reactiva, digiérase la muestra con NaHCO3 antes del desarrollo de color. Esta digestión no es necesariamente suficiente para convertir toda la sílice no molibdato-reactiva en la forma reactiva. Los silicatos complejos y polímeros con más sílice pueden precisar una fusión prolongada con álcali a tempera-

4-210

tura elevada o una digestión bajo presión, para su conversión completa. Omítase la digestión si se sabe que toda la sílice reacciona con molibdato. Prepárese una muestra transparente por filtración, si fuera necesario. Pónganse 50,0 ml o una porción menor diluida a 50,0 ml en una cápsula de platino de 100 ml. Añádanse 200 mg de NaHCO3 exento de sílice y digiérase en baño de vapor durante 1 hora. Enfríese y añádanse lentamente, con agitación, 2,4 ml de H2SO4 1N. No interrumpir el análisis, si bien proceder en seguida con los pasos restantes. Transfiérase cuantitativamente a un tubo Nessler de 50 ml y complétese hasta la señal con agua destilada. (Es conveniente utilizar tubos de 50 ml de forma alta para mezclar, incluso si luego se va a pasar la solución a una cubeta para medición fotométrica.) c) Preparación de patrones: Si se realiza un tratamiento preliminar con NaHCO3, añádase a los patrones (45 ml aproximadamente de volumen total) 200 mg NaHCO3 y 2,4 ml H2SO4 1N, para compensar la pequeña cantidad de sílice introducida por los reactivos y el efecto de la sal sobre la intensidad del color. Dilúyase a 50,0 ml. d) Corrección del color y la turbidez: Prepárese un blanco especial para cada muestra que necesite esa corrección. Sométase al procedimiento, incluido el tratamiento de NaHCO3, si se aplica, dos porciones idénticas de la muestra. A una de ellas se le añaden todos los reactivos como en el apartado 4a anterior. A la otra, se le añaden HC1 y ácido oxálico, pero no molibdato. Ajústese el fotómetro a absorbancia cero con el blanco que no contiene molibdato, antes de leer la absorbancia de la muestra tratada con molibdato. e) Medida fotométrica: Prepárese una curva de calibrado a partir de una serie de aproximadamente seis patrones, para cubrir los rangos óptimos mencionados en la tabla 4500-Si:I. Síganse las

MÉTODOS NORMALIZADOS

instrucciones del apartado 4a anterior sobre porciones adecuadas de solución patrón de sílice diluida a 50,0 ml, en tubos Nessler. Ajústese el fotómetro a absorbancia cero con agua destilada y léanse todos los patrones, incluido un blanco de reactivo, frente a agua destilada. Compárense los microgramos de sílice en la solución final desarrollada (55 ml) con las lecturas del fotómetro. Llévese un blanco de reactivos y, al menos, un patrón con cada grupo de muestras, para confirmar que la curva de calibrado establecida previamente no se ha modificado. f) Comparación visual: Prepárese un juego de patrones artificiales de color permanente, usando soluciones de K2CrO4 y bórax. Mézclense los volúmenes de líquido especificados en la tabla 4500-Si:II y pónganse en tubos Nessler de 50 ml, bien tapados y etiquetados adecuadamente. Compruébese la corrección de esos patrones de color permanente, comparándolos visualmente con patrones preparados analizando porciones de la solución patrón de sílice. Empléense los patrones artificiales de color permanente sólo para comparaciones visuales.

5.

Cálculo

Hágase constar si se ha utilizado la digestión de NaHCO3. 6.

Precisión y sesgo

Se analizó en 19 laboratorios, por el método del molibdosilicato, una muestra sintética con 5,0 mg SiO2/l, 10 mg Cl¯/l, 0,20 mg NH3-N/l, 1,0 mg NO3- -N/l, 1,5 mg N orgánico/l y 10,0 mg PO3-4 /l en agua destilada, con una desviación están-

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

TABLA 4500-SI:II. PREPARACIÓN DE ESTÁNDARES DE COLOR PERMANENTE PARA DETERMINACIÓN VISUAL DE SÍLICE

4-211

7. Bibliografía DIENERT, F. & F. WANDENBULCKE. 1923. On the determination of silica in waters. Bull. Soc. Chim. France 33:1131, Compt. Rend. 176:1478. D IENERT , F. & F. W ANDENBULCKE . 1924. A study of colloidal silica. Compt. Rend. 178:564. SWANK, H. W. & M. G. MELLON. 1934. Colorimetric standards for silica. Ind. Eng. Chem., Anal. Ed. 6:348. TOURKY, A. R. & D. H. BANGHAM. 1936. Colloidal silica in natural waters and the «silicomolybdate» colour test. Nature 138:587. BIRNBAUM, N. & G. H. WALDEN. 1938. Co-preci-

dar relativa del 14,3 y 7,8 por 100 de error relativo. Otra muestra sintética con 15,0 mg SiO2/l, 200 mg C¯/l, 0,800 mg NH3-N/l, 1,0 mg NO3- -N/l, 0,800 mg N orgánico/l y 5,0 mg PO3-4 /l en agua destilada, se analizó en 19 laboratorios por el método del molibdosilicato, con una desviación estándar relativa del 8,4 por 100 y error relativo del 4,2 por 100. Una tercera muestra sintética con ¯

30,0 mg SiO2/l, 400 mg Cl /l, 1,50 mg NH 3 -N/l, 1,0 mg NH 3- -N/l, 0,200 mg N

orgánico/l y 0,500 mg PO3-4 /l en agua

pitation of ammonium silicomolybdate and ammonium phosphomolybdate. J. Amer. Chem. Soc. 60:66. KAHLER, H. L. 1941. Determination of soluble silica in water: A photometric method. Ind. Eng. Chem., Anal. Ed. 13:536. NOLL, C. A. & J. J. MAGUIRE. 1942. Effect of container on soluble silica content of water samples. Ind. Eng. Chem., Anal. Ed. 14:569. SCHWARTZ, M. C. 1942. Photometric determination of silica in the presence of phosphates. Ind. Eng. Chem., Anal. Ed. 14:893. GUTTER, H. 1945. Influence of pH on the composition and physical aspects of the ammonium molybdates. Compt. Rend. 220:146. MILTON, R. F. 1951. Formation of silicomolybdate. Analyst 76:431.

destilada, fue analizada en 20 laborato-

KILLEFFER, D. H. & A. LINZ. 1952. Molybdenum

rios por el método del molibdosilicato,

ogy. Interscience Publishers, Nueva York,

con una desviación estándar relativa del 7,7 por 100 y un error relativo del 9,8 por 100.

págs. 1-2, 42-45, 67-82, 87-92. STRICKLAND, J. D. H. 1952. The preparation and properties of silicomolybdic acid. J. Amer. Chem. Soc. 74:862, 868, 872.

Todos los resultados se obtuvieron tras digerir la muestra con NaHCO3.

4500-Si E. 1.

Compounds, Their Chemistry and Technol-

CHOW, D. T. W. & R. J. ROBINSON. 1953. The forms of silicate avaílable for colorimetric determination. Anal. Chem. 25:646.

Método del azul heteropoli

Discusión general

a) Principio: Los principios descritos en el método D, apartado 1a, son aplicables a este método. El ácido molibdosilícico amarillo se reduce por medio del ácido aminonaftolsulfónico a azul hete-

ropoli. El color azul es más intenso que el amarillo del método D y proporciona una mayor sensibilidad. b) Interferencias: Véase sección 4500Si.D.lb. c) Concentración mínima detectable: Se pueden detectar aproximadamente

4-212

20 µg SiO2/l en tubos Nessler de 50 ml y 50 µg SiO2/l espectrofotométricamente, con un recorrido de luz de 1 cm, a 815 nm 2.

Instrumental

a) Cápsulas de platino, 100 ml. b) Equipo calorimétrico: Es necesario uno de los siguientes:

1) Espectrofotómetro, para uso a 815 nm aproximadamente. El sistema de color obedece también la ley de Beer a 650 nm, con sensibilidad reducida apreciablemente. Utilícese un recorrido de luz de 1 cm o superior. Para seleccionar el recorrido de luz, véase la tabla 4500-Si:I. 2) Fotómetro de filtro, provisto de un filtro rojo que presenta la máxima transmitancia a longitudes de onda entre 600 y 815 nm. La sensibilidad mejora al aumentar la longitud de onda. Utilícese un recorrido de luz de 1 cm o superior. 3) Tubos Nessler, iguales, de 50 ml y forma alta. 3.

Reactivos

Para obtener mejores resultados, utilícense lotes de productos bajos en sílice. Consérvense todos los reactivos en envases de plástico para evitar los blancos elevados. Utilícese agua destilada que no contenga sílice detectable tras su conservación en vidrio. Se necesitan todos los reactivos enumerados en la sección 4500-Si-D.3. y, además: Agente reductor: Disuélvanse 500 mg de ácido l-amino-2-naftol-4-sulfónico y 1 g de Na2SO3 en 50 ml de agua destilada con calor suave si fuera necesario; añádase a una solución de 30 g NaHSO3 en 150 ml de agua destilada. Fíltrese a un frasco de plástico. Deséchese la solución cuando se oscurezca. Prolónguese la vida del reactivo, conservándolo en frigorífico y protegido de la luz. No utilizar ácido

MÉTODOS NORMALIZADOS

aminonaftolsulfónico que no sea totalmente soluble o que produzca reactivos oscuros, incluso recién preparados*.

4.

Procedimiento

a) Desarrollo del color: Actúese como en 4500-Si.D.4a hasta la frase «Añádase 2,0 ml de solución de ácido oxálico y mézclese completamente», inclusive. Mídase el tiempo a partir de la adición de ácido oxálico; espérese, por lo menos, 2 minutos, pero no más de 15; añádanse 2,0 ml de agente reductor, y mézclese totalmente. Al cabo de 5 minutos, mídase el color azul fotométrica o visualmente. Si se utiliza el tratamiento preliminar con NaHCO3, sígase 4500-SLD.4b. b) Medida fotométrica: Prepárese una curva de calibrado a partir de una serie de seis patrones aproximadamente, para cubrir el rango óptimo indicado en la tabla 4500-Si:I. Realícense los pasos descritos anteriormente sobre porciones adecuadas de solución patrón de sílice diluida a 50,0 ml en tubos Nessler; trátense los patrones previamente si se emplea la digestión de NaHCO3 (véase 4500-Si.D.4b). Ajústese el fotómetro a absorbancia cero con agua destilada y léanse todos los patrones, incluso el blanco de reactivos, frente a agua destilada. Si fuera necesario corregir el color o turbidez de una muestra, véase 4500-Si.D.4d Añádase al blanco especial HC1 y ácido oxálico, pero no molibdato o agente reductor. Compárense los microgramos de sílice en los 55 ml de solución obtenida, con la absorbancia. Llévese un blanco de reactivos y, por lo menos, un patrón con cada grupo de muestras para comprobar la curva de calibrado. c) Comparación visual: Prepárese una serie de no menos de 12 patrones, que cubran el rango de 0 a 120 µg SiO2, poniendo los volúmenes calculados de * Eastman n.° 360 es satisfactorio.

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

4-213

solución patrón de sílice en tubos Nessler de 50 ml, diluyendo hasta la señal con agua destilada y desarrollando el color como se describe en el apartado a anterior.

por el método del azul heteropoli, con un 18,0 por 100 de desviación estándar relativa y 2,9 por 100 de error relativo. Una tercera muestra sintética con 30,0 mg SiO2/l, 400 mg Cl¯/l, 1,50 mg NH 3- N/l, 1,0 mg NH 3- -N/l, 0,200 mg N

5.

orgánico/l y 0,500 mg PO3-4 /l en agua destilada, fue analizada en 10 laboratorios por el método del azul heteropoli, con 4,9 por 100 de desviación estándar relativa y 5,1 por 100 de error relativo. Todos los resultados se obtuvieron tras digestión de la muestra con NaHCO3.

Cálculo

Hágase constar si se ha utilizado la digestión con NaHCO3. 6. Precisión y sesgo

Una muestra sintética con 5,0 mg SiO2/l, 10 mg Cl¯/l, 0,200 mg NH3-N/l, 10,0 mg NH 3- -N/l, 1,5 N orgánico/l y 10,0 mg PO3-4 /l en agua destilada, se analizó en 11 laboratorios por el método del azul heteropoli, con 27,2 por 100 de desviación estándar relativa y 3,0 por 100 de error relativo. Una segunda muestra sintética, con 15 mg SÍO3/l, 200 mg C¯/l, 0,800 mg NH 3- -N/l, 1,0 mg NO3-N/l, 0,800 mg N

7.

Bibliografía

BUNTING, W. E. 1944. Determination of soluble silica in very low concentrations. Ind. Eng. Chem., Anal. Ed. 16:612 STRAUB, F. G. & H. GRABOWSKI. 1944. Photometric determination of silica in condensed steam in the presence of phosphates. Ind. Eng. Chem., Anal. Ed. 16:574. BOLTZ, D. F. & M. G. MELLON. 1947. Determination of phosphorus, germanium, silicon, and arsenic by the heteropoly blue method. Ind. Eng. Chem., Anal. Ed. 19:873. MILTON, R. F. 1951. Estimation of silica in water. J. Appl. Chem. (Londres) 1: (Suplemento n.° 2) 126. CARLSON, A. B. & C. V. BANKS. 1952. Spectrophotometric determination of silicon. Anal. Chem. 24:472.

orgánico/l y 5,0 mg PO3-4 /l en agua destilada, fue analizada en 11 laboratorios

4500-Si F.

1.

Método automatizado para sílice molibdatorreactiva

Discusión general

a) Principio: Este método es una adaptación del método de azul heteropoli (método E), que utiliza un instrumento analítico de flujo continuo. b) Interferencias: Véase sección 4500Si.D.lb. Si hubiera partículas materiales,

fíltrese la muestra o utilícese un filtro continuo como parte integral del sistema. c) Aplicación: Este método es aplicable a aguas potables, superficiales, domésticas y otras que contengan de 0 a 20 mg SiO2/l. El rango de concentración se puede ampliar a 0-80 mg/l, sustituyendo la cubeta de flujo de 50 mm que muestra la figura 4500-Si: 1 por una de 15 mm.

4-214

MÉTODOS NORMALIZADOS

Figura 4500-Si:l. Distribuidor de silice.

2.

Instrumental

Equipo analítico automatizado: El equipo analítico de flujo continuo*, requerido, consta de los componentes intercambiables que muestra la figura 4500-Si:l. 3.

Reactivos

a) Ácido sulfúrico, H2SO4 0,1 N. b) Reactivo de molibdato amónico: * Autoanalizador™ Technicon™ o equivalente.

Disuélvanse 10 g (NH4)6Mo7O24·4H2O en 1 l de H2SO4 0,1 N. Fíltrese y consérvese en frasco topacio. c) Solución de ácido oxálico: Disuélvanse 50 g de ácido oxálico en 900 ml de agua destilada y Dilúyase a 1 l. d) Agente reductor: Disuélvanse 120 g de NaHSO3 y 4 g de Na2SO3 en 800 ml de agua destilada. Añádanse 2 g de ácido l-amino-2-naftol-4-sulfónico, mézclese bien y Dilúyase a 1 l. Fíltrese a un frasco de vidrio topacio para su conservación.

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

El reactivo de trabajo se prepara diluyendo 100 ml a 1 l con agua destilada. Se preparará diariamente. e) Solución patrón de sílice: Véase 4500-Si.C.3f.

traciones de SiO2- Calcúlese la concentración de SiO2 de la muestra por comparación de la altura de su pico con la curva patrón. 6.

4.

Procedimiento

Móntese el aparato como muestra la figura 4500-Si:l y sígase el método general descrito por el fabricante. Determínese la absorbancia a 660 nm. 5.

Cálculo

Prepárense curvas patrón comparando las alturas de los picos patrón procesados a través del aparato, con sus concen-

4500-Si G.

4-215

Precisión y sesgo

Para 0 a 20 mg SiO2/l, cuando se usaba una cubeta de 50 mm y para 40 muestras/hora, el límite de detección fue de 0,1 mg/l, la sensibilidad (concentración que produce 0,398 de absorbancia) fue 7,1 mg/l y el coeficiente de variación (nivel de confianza 95 por 100 a 7,1 mg/l) fue 1,6 por 100. Para 0 a 80 mg SiO2/l, con una cubeta de 15 mm y 50 muestras/ hora, el límite de detección era 0,5 mg/l, la sensibilidad 31 mg/l y el coeficiente de variación a 31 mg/l fue 1,5 por 100.

Método de plasma de acoplamiento inductivo

Véase sección 3120.

4500-S24500-S2- A. 1.

Presencia y significado

Los sulfuros se encuentran a menudo en el agua subterránea, especialmente en manantiales calientes. Su presencia común en las aguas residuales se debe en parte a la descomposición de la materia orgánica, presente a veces en los residuos industriales, pero procedente casi siempre de la reducción bacteriana de los sulfatos. El sulfuro de hidrógeno que escapa al aire a partir de las aguas residuales que contienen sulfuros produce olores * Aprobado por el Standard Methods Committee, 1988.

SULFURO* Introducción molestos. La concentración umbral de olor para H2S en agua limpia está comprendida entre 0,025 y 0,25 µg/l. H2S es muy tóxico y ha motivado la muerte de numerosos trabajadores en las alcantarillas. Ataca directa e indirectamente a los metales y ha producido corrosiones graves en las conducciones de cemento por oxidarse biológicamente a H2SO4 en las paredes de las tuberías. 2.

Categorías de sulfuros

Desde un punto de vista analítico, se distinguen tres categorías de sulfuros en el agua y aguas residuales:

4-216

a) Sulfuro total, que incluye H2S y HS¯ disuelto, así como sulfuros metálicos solubles en ácido, presentes en la materia en suspensión. S2- es despreciable y supone menos del 0,5 por 100 a pH 12, a menos de 0,05 por 100 a pH 11, etc. Los sulfuros de cobre y plata son tan insolubles que no responden a las determinaciones ordinarias del sulfuro; pueden ignorarse a efectos prácticos. b) Sulfuro disuelto, que permanece tras haber eliminado los sólidos suspendidos por floculación y depósito. c) Sulfuro de hidrógeno no ionizado, que puede calcularse a partir de la concentración de sulfuro disuelto, el pH de la muestra y la constante de ionización práctica de H2S. 3. Toma y almacenamiento de muestras

Obténganse las muestras con el mínimo de aireación. Para conservar las que se destinan al análisis de sulfuro total, póngase solución de acetato de zinc en la botella antes de llenarla con la muestra. Añádanse cuatro gotas de solución de acetato de zinc 2N por cada 100 ml de muestra. Llénese la botella totalmente y tápese. 4.

Pruebas cualitativas

A menudo es útil realizar una prueba cualitativa de sulfuro y es aconsejable en el examen de residuos industriales que contengan sustancias interferentes que darían resultados negativos falsos en el método del azul de metileno. a) Prueba del antimonio: Añádanse a unos 200 ml de muestra, 0,5 ml de solución saturada de tartrato de antimonio y potasio y 0,5 ml de HC1 6N en exceso de la alcalinidad a la fenolftaleína. El sulfuro de antimonio amarillo (Sb2S3) es discernible a una concentra-

MÉTODOS NORMALIZADOS

ción de sulfuro de 0,5 mg/l. Las comparaciones con muestras de concentración conocida en sulfuro hacen a la técnica aproximadamente cuantitativa. Las únicas interferencias conocidas son los iones metálicos, como el plomo, que captan el sulfuro con tal fuerza que no se produce Sb2S3, y ditionito, que se descompone en solución acida produciendo sulfuro. b) Prueba del electrodo plata-sulfuro de plata: El potencial de un electrodo plata-sulfuro de plata respecto a un electrodo de referencia varía con la actividad del ion sulfuro en solución. Corrigiendo el coeficiente de actividad del ion y el pH, este potencial estima la concentración de sulfuro. Estandarícese el electrodo frecuentemente frente a una solución de sulfuro de potencia conocida. Se puede utilizar un electrodo de este tipo como indicador del punto final en la valoración de sulfuro disuelto con una solución patrón de una sal de plata o plomo, pero siempre es un problema la lenta respuesta. c) Pruebas del papel de acetato de plomo y lámina de plata: Confírmense los olores atribuidos a H2S con papel de acetato de plomo. Al exponerlo al vapor de una muestra acidificada ligeramente, el papel se ennegrece por formación de PbS. Una tira de lámina de plata es más sensible que el papel del acetato de plomo. Lávese la plata sumergiéndola en solución de NaCN y aclarando. La plata es especialmente adecuada para exposiciones prolongadas en las proximidades de posibles fuentes de H2S porque el Ag2S negro es permanente, a diferencia del PbS que se oxida lentamente.

5. Selección de métodos cuantitativos

El yodo reacciona con el sulfuro en solución acida, oxidándolo a azufre. Una titulación basada en esta reacción es un método preciso para determinar sulfuros a concentraciones superiores a 1 mg/l, si

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

4-217

4-218

MÉTODOS NORMALIZADOS

no hay interferencias y se evita la pérdida de H2S. El método yodométrico (E) es útil para estandarizar el método colorimétrico del azul de metileno y es adecuado para analizar muestras recién obtenidas en fuentes o manantiales. El método se puede utilizar para aguas residuales y agua parcialmente oxidada procedente de manantiales sulfurosos, si antes se eliminan las sustancias interferentes. El método del azul de metileno (D) se basa en la reacción de sulfuro, cloruro férrico y dimetil-p-fenilendiamina para producir azul de metileno. Se añade fosfato amónico, después del desarrollo del color, para eliminar el color del cloruro férrico. El método es aplicable a concentraciones de sulfuro hasta 20 mg/l. Los métodos potenciométricos que utilizan un electrodo de plata pueden ser adecuados. A partir del potencial del electrodo respecto a uno de referencia, se

4500-S2-

B.

puede hacer una estimación de la concentración de sulfuro, pero es preciso un cuidado especial en los detalles de los métodos y estandarizaciones frecuentes para asegurar resultados correctos. El electrodo es útil especialmente como indicador del punto final de la titulación de sulfuro disuelto con nitrato de plata. En la figura 4500-S2-:l se muestra un diagrama analítico de las determinaciones de sulfuro en varias condiciones y opciones. 6.

Bibliografía

CRUSE, H. & R. D. POMEROY. 1969. Hydrogen sulfide odor threshold. J. Amer. Water Works Assoc. 61:677. U.S. E NVIRONMENTAL P ROTECTION A GENCY . 1974. Process Design Manual for Sulfide Control in Sanitary Sewerage Systems. Publ. 625/1-74-005.

Separación de sulfuros solubles e insolubles

A no ser que la muestra esté totalmente exenta de sólidos en suspensión (el sulfuro disuelto iguale al total), para medir el sulfuro disuelto hay que eliminar antes la materia insoluble, lo que se puede conseguir produciendo un floculado de hidróxido de aluminio que se deposita, dejando un sobrenadante claro para el análisis.

b) Solución de cloruro de aluminio: Debido a la tendencia higroscópica y aglutinante de este producto, es preferible adquirir frascos de 100 g de A1C13·6H2O. Disuélvase el contenido de un frasco de 100 g no abierto previamente, en 144 ml de agua destilada.

1.

a) Añádase a un frasco de vidrio de 100 ml, 0,2 ml (cuatro gotas) de NaOH 6N. Llénese el frasco con la muestra y añádanse luego 0,2 ml (cuatro gotas) de solución de A1C13. Tápese el frasco sin dejar aire bajo el tapón. Gírese enérgicamente de delante a atrás, alrededor de un eje transversal, durante 1 minuto o más, para flocular el contenido. Varíense los volúmenes de estos productos para conseguir una buena clarificación sin utilizar

Instrumental

Botellas de vidrio con tapón: Úsense botellas de 100 ml si se va a determinar el sulfuro por el método del azul de metileno, y de 500 a 1.000 ml si se hará por el método yodométrico. 2.

Reactivos

a) Solución de hidróxido de sodio, NaOH 6 N.

3.

Procedimiento

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

cantidades excesivamente grandes y para obtener un pH de 6 a 9. Si se usan botellas de 500 o 1.000 ml, añádanse cantidades proporcionalmente mayores de los reactivos.

4-219

b) Déjese sedimentar hasta que se pueda extraer un sobrenadante razonablemente claro. Con una floculación adecuada puede tardar de 5 a 15 minutos. No esperar más de lo necesario.

4500-S2- C. Pretratamiento de muestras para eliminar sustancias que puedan interferir o para concentrar el sulfuro El método yodométrico sufre interferencias de las sustancias reductoras que reaccionan con el yodo, incluidos tiosulfato, sulfuro y varios compuestos orgánicos, tanto sólidos como disueltos. Los agentes fuertemente reductores interfieren también en la prueba del azul de metileno por impedir la formación del color azul. El tiosulfato, a concentraciones superiores a 10 mg/l, puede retrasar la formación del color o impedirla totalmente. El propio sulfuro impide la reacción, si su concentración es muy alta, del orden de varios cientos de miligramos por litro. Para evitar la posibilidad de resultados negativos falsos, utilícese el método de antimonio para obtener un resultado cualitativo en residuos industriales con posibilidad de contener sulfuro, pero que no dan color con el método del azul de metileno. El yoduro, presente probablemente en los residuos de campos petrolíferos, puede reducir la formación de color si su concentración supera 2 mg/l. El ferrocianuro produce color azul. Elimínense las interferencias debidas a sulfito, tiosulfato, yoduro y muchas otras sustancias solubles, pero no el ferrocianuro, precipitando previamente ZnS, eliminando el sobrenadante y sustituyéndolo por agua destilada. Utilícese el mismo procedimiento, incluso cuando no sea necesario para eliminar las interferencias, con el fin de concentrar el sulfuro.

1.

Instrumental

Frascos de vidrio con tapón: Véase sección 4500-S2-.B.l.

2.

Reactivos

a) Solución de acetato de zinc: Disuélvanse 220 g Zn(C2H3O2)2·2H2O en 870 ml de agua, con lo que se obtiene 1 l de solución b) Solución de hidróxido de sodio, NaOH 6N. 3.

Procedimiento

a) Introdúzcanse 0,15 ml (tres gotas) de solución de acetato de zinc en un frasco de vidrio de 100 ml, llénese con la muestra y añádanse 0,10 ml (dos gotas) de solución de NaOH 6N. Tápese sin dejar burbujas de aire bajo el tapón y mézclese rotando enérgicamente de delante a atrás alrededor de un eje transversal. Para el método yodométrico, empléese un frasco de 500 ml u otro tamaño adecuado, y volúmenes proporcionalmente mayores de reactivos. Varíese el volumen de los reactivos añadidos de acuerdo con la muestra, de modo que el precipitado resultante no sea excesivamente voluminoso y se deposite con facilidad. Añádase NaOH suficiente para

MÉTODOS NORMALIZADOS

4-220

obtener un pH superior a 9. Déjese que se deposite el precipitado durante 30 minutos. La muestra tratada es relativamente estable y se puede retener durante varias horas. Sin embargo, si hubiera mucho hierro presente, la oxidación sería bastante rápida. b) Si se va a utilizar el método yodométrico, fíltrese el precipitado a través de papel de filtro de fibra de vidrio y continúese la titulación en seguida, según el procedimiento del método E. Si se emplea el método del azul de metileno, déjese sedimentar el precipitado durante 30 minutos y decántese el máximo sobrenadante posible sin pérdida de precipitado. Rellénese el frasco con agua

4500-S2- D. 1.

Método del azul de metileno

Instrumental

a) Tubos de ensayo iguales, de aproximadamente 125 ml de longitud y 15 mm de diámetro. b) Cuentagotas, que suministren 20 gotas/ml de solución de azul de metileno. Para obtener gotas uniformes, manténgase el cuentagotas en posición vertical y déjese que se formen lentamente. c) Si se va a utilizar la determinación fotométrica, en lugar de la visual, de color:

1) Espectrofotómetro, para uso a longitud de onda de 664 nm con cubetas que proporcionen recorridos de luz de 1 cm y 1 mm, o bien. 2) Fotómetro de filtro, con un filtro

de transmitancia máxima próxima a 600 nm. 2.

destilada, vuélvase a suspender el precipitado y extráigase la muestra. Si hubiera sustancias interferentes en concentración elevada, sediméntese, decántese y rellénese una segunda vez. Si se sabe que la concentración de sulfuro es baja, añádase sólo agua suficiente para llevar el volumen a la mitad o una quinta parte del volumen original. Utilícese esta técnica para analizar muestras de concentraciones de sulfuro muy bajas. Tras determinar colorimétricamente la concentración de sulfuro, multiplíquese el resultado por la relación del volumen final al inicial. A veces se usan sales de cadmio en lugar de zinc, pero CdS es más susceptible a la oxidación que Zns.

Reactivos

a) Solución madre de ácido aminosulfúrico: Disuélvanse 27 g de N,N-dimetil-

p-fenilendiamina oxalato* en una mezcla fría de 50 ml de H2SO4 conc. y 20 ml de agua destilada. Enfríese y Dilúyase a 100 ml con agua destilada. Empléese oxalato reciente, ya que uno viejo podría estar oxidado y decolorado hasta el punto de producir interferencias de color en la prueba. Consérvese en frascos topacio. Cuando esta solución madre se diluye y usa en el procedimiento con una muestra exenta de sulfuro, primero será rosa, pero a los 3 minutos quedará incolora. b) Reactivo de ácido aminosulfúrico: Dilúyanse 25 ml de solución madre de ácido aminosulfúrico con 975 ml de H2SO4 1 + 1. Consérvese en frasco topacio. c) Solución de cloruro férrico: Disuélvanse 10 g FeCl 3 ·6H 2 O en 40 ml de agua. d) Solución de ácido sulfúrico, H 2SO 4 1 + 1. e) Solución de manofosfato diamóni* Eastman n.° de catálogo 5.672 ha resultado satisfactorio para estos fines.

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

co: Disuélvanse 400 g (NH4)2HPO4 en 800 ml de agua destilada. f) Solución azul de metileno I: Utilícese colorante de calidad USP o uno certificado por el organismo Biological Stain Commission. El contenido en colorante debe figurar en la etiqueta y será del 84 por 100 o superior. Disuélvanse 1,0 g en agua destilada y complétese a 1 l. Esta solución tendrá aproximadamente la concentración correcta, pero debido a la variación entre lotes diferentes del colorante, se debe estandarizar frente a soluciones de sulfuro de concentración conocida, ajustando su concentración de modo que 0,05 ml (una gota) = 1,0 mg de sulfuro/l. Estandarización: Introdúzcanse varios gramos de cristales lavados y limpios de Na2S · 9H2O en un vaso de precipitados pequeño. Añádase agua hasta apenas cubrir los cristales. Agítese de cuando en cuando durante unos minutos y viértase la solución a otro recipiente. Esta solución reacciona lentamente con el oxígeno, pero el cambio carece de importancia al cabo de unas horas. Prepárese la solución diariamente. Añádase una gota de solución a 1 l de agua destilada y mézclese. Determínese inmediatamente la concentración de sulfuro por el método del azul de metileno y por el yodométrico. Repítase utilizando más de una gota de solución Na2S o volúmenes menores de agua, hasta que se hayan realizado cinco pruebas, por lo menos, con una gama de concentraciones de sulfuro entre 1 y 8 mg/l. Calcúlese el porcentaje medio de error del resultado del azul de metileno frente al yodométrico. Si el error medio es negativo, es decir, los resultados del azul de metileno son más bajos que los yodométricos, Dilúyase la solución de azul de metileno en el mismo porcentaje, de modo que al comparar los colores se emplee un volumen mayor. Si los resultados del azul de metileno son más elevados, auméntese la concentración de la solución añadiendo más colorante.

4-221

g) Solución II de azul de metileno: Dilúyanse 10,00 ml de solución I de azul de metileno ajustada, a 100 ml. 3.

Procedimiento

a) Desarrollo del color: Transfiéranse 7,5 ml de muestra a cada uno de dos tubos de ensayo iguales, empleando una pipeta especial de punto ancha o llenando hasta la señal en los tubos. Añádanse al tubo A 0,5 ml de reactivo de ácido aminosulfúrico y 0,15 ml (tres gotas) de solución FeCl3. Mézclese inmediatamente por inversión lenta, una sola vez. (Un mezclado excesivo produce resultados bajos por pérdida de H2S en forma de gas antes de que tenga tiempo de reaccionar.) Añádanse al tubo B 0,5 ml de H2SO4 1 + 1 y 0,15 (tres gotas) de solución FeCl3, y mézclese. La aparición de color azul en el tubo A indica presencia de S2-. El desarrollo del color se completa normalmente en 1 minuto, pero a menudo hace falta más tiempo para que desaparezca el color rosa inicial. Espérese de 3 a 5 minutos y añádanse 1,6 ml de solución (NH4)2HPO4 a cada tubo. Espérese de 3 a 15 minutos y compárese el color. Si se utilizó acetato de zinc, espérese al menos 10 minutos antes de hacer la comparación visual del color. b)

Determinación del color:

1) Estimación visual: Añádase solución de azul de metileno I o II, según la concentración de sulfuro y la exactitud deseada, gota a gota, al segundo tubo, hasta que el color se iguale con el desarrollado en el primer tubo. Si la concentración supera los 20 mg/l, repítase la prueba con una porción de muestra diluida al décimo. Con solución de azul de metileno I ajustada de modo que 0,05 ml (una gota) = 1,0 mg S2- /l, cuando se utilizan 7,5 ml de muestra:

MÉTODOS NORMALIZADOS

4-222

2) Medida fotométrica del color: Para medir concentraciones de sulfuro de 0,1 a 2,0 mg/l es adecuada una cubeta con recorrido de luz de 1 cm. Para concentraciones menores o mayores, utilícense recorridos de luz más largos o más cortos. El límite superior del método es de 20 mg/l. Ajústese a cero el aparato con una porción de muestra tratada procedente del tubo B. Prepárense curvas de calibrado sobre la base de las pruebas colorimétricas realizadas sobre soluciones de Na2S analizadas simultáneamente por el método yodométrico, comparando la concentración con la absorbancia. Se puede esperar una relación lineal entre

4500-S2- E. 1.

4.

Precisión y sesgo

La exactitud es de alrededor de ± 10 por 100. La desviación estándar no se ha determinado. 5.

Bibliografía

POMEROY, R. D. 1936. The determination of sulfides in sewage. Sewage Works J. 8:572. NUSBAUM, I. 1965. Determining sulfides in water and waste water. Water Sewage Works 112:113.

Método yodométrico

Reactivos

a) Ácido clorhídrico, HC1 6N. b) Solución patrón de yodo, 0,0250N: Disuélvanse de 20 a 25 g KI en un poco de agua y añádanse 3,2 g de yodo. Después de la disolución del yodo, Dilúyase a 1.000 ml y estandarícese frente a Na2S2O3 0,0250N, utilizando solución de almidón como indicador. c) Solución patrón de tiosulfato sódico, 0,0250N: Véase sección 4500-O.C.2e. d) Solución de almidón: Véase sección 4500-O.C.2d. 2.

concentración y absorbancia desde 0 a 1,0 mg/l. Léase la concentración de sulfuro a partir de la curva de calibrado.

ta 200 ml de muestra en el matraz, descargando la pipeta bajo la superficie de la solución. Si desaparece el color del yodo, añádase más yodo para mantener el color. Titúlese por retroceso con solución de Na2S2O3, añadiendo unas gotas de solución de almidón al acercarse al punto final, y continuando hasta desaparición del color azul. b) Si se había precipitado el sulfuro con zinc, filtrando ZnS, devuélvase el filtro y precipitado al frasco original y añádanse unos 100 ml de agua. Añádase solución de yodo y HC1 y valórese como en el apartado 2a anterior.

Procedimiento

a) Añádase con bureta a un matraz de 500 ml, una cantidad de solución del yodo estimada como un exceso sobre la cantidad de sulfuro presente. Añádase agua destilada, si fuera necesario, para llevar el volumen a unos 20 ml. Añádanse 2 ml de HC1 6N. Llévense con la pipe-

3.

Cálculo

Un mililitro de solución de yodo 0,0250N reacciona con 0,4 mg S2-:

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

donde:

4.

A = ml solución de yodo, B = normalidad de la solución de yodo, C = ml solución Na 2 S 2 O 3 , y D = normalidad de la solución Na 2 S 2 O 3 .

4500-S2-

F.

4-223

Precisión

La precisión del punto final varía con la muestra. En aguas limpias debe ser determinable dentro de una gota, que es equivalente a 0,1 mg/l en una muestra de 200 ml.

Cálculo de sulfuro de hidrógeno desionizado

1. Cálculo

TABLA 4500-S2-:I. VALORES DE PK',

Sulfuro de hidrógeno y HS¯, que juntos constituyen el sulfuro disuelto, están en equilibrio con los iones de hidrógeno:

LOGARITMO DE LA CONSTANTE DE IONIZACIÓN PRÁCTICA PARA SULFURO DE HIDRÓGENO

H 2S € H + + HS-

La constante de ionización de H2S se emplea para calcular la distribución de sulfuro disuelto entre las dos formas. Se utiliza la constante práctica expresada en forma logarítmica, pK'. La constante varía con la temperatura y la fuerza iónica de la solución. El efecto de la fuerza iónica se puede estimar más fácilmente a partir de la conductividad; dado que el efecto de la fuerza iónica no es grande, generalmente se pueden asumir valores suficientemente fiables cuando se conoce la naturaleza de la muestra. En la tabla 4500-S2-:I se dan los valores aproximados de pK' para varias temperaturas y conductividades. El efecto de la temperatura es prácticamente lineal desde 15 a 35 °C y se pueden hacer inter o extrapolaciones. La última línea de la tabla corresponde aproximadamente al agua de mar. Calcúlese pH − pK' a partir del pH y el valor apropiado de pK' de la muestra. A partir de la figura 4500-S2-:2 léase la proporción de sulfuro disuelto presente como H2S (escala de la izquierda en la figura 4500-S2-:2). Si dicha proporción es igual a J,

* Teórico.

J x (sulfuro disuelto) = = H2 S desionizado expresado como S2-

2.

Bibliografía

PLATFORD, R. F. 1965. The activity coefficient of sodium chloride in seawater. J. Mar. Res. 23:55.

MÉTODOS NORMALIZADOS

4-224

4500- SO32-

SULFITO*

4500- SO32- A. Introducción 1.

Presencia

Los iones sulfito ( SO32- ) pueden aparecer en caldera y en las aguas de alimen* Aprobado por el Standard Methods Committee, 1985.

tación de calderas, tratadas con sulfito para controlar el oxígeno disuelto; en aguas naturales o residuales, como resultado de la contaminación industrial, y en diluyentes de plantas de tratamiento, declorados con dióxido de azufre (SO2). El exceso de ion sulfito en las aguas de cal-

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

deras es perjudicial porque rebaja el pH y favorece la corrosión. El control del ion sulfito en el tratamiento y descarga de aguas residuales puede tener importancia ambiental, debido principalmente a su toxicidad para los peces y otra vida acuática, y a su rápida demanda de oxígeno.

4500- SO32- B. 1.

2.

4-225

Selección del método

El método de titulación yodométrica es adecuado para aguas relativamente limpias con concentraciones superiores a 2 mg SO32- /l. Es preferible la determinación colorimétrica de fenantrolina, tras evolución del sulfito procedente de la matriz de la muestra como SO2, para niveles bajos de sulfito.

Método yodométrico

Discusión general

a) Principio: Una muestra acidificada que contiene sulfito ( SO32- ) se titula con titulador estandarizado de yoduro-yodato potásico. El yodo liberado por el reactivo yoduro-yodato reacciona con SO32- . El punto final de la valoración es señalado por el color azul resultante del primer exceso de yodo reaccionante con el indicador de almidón. b) Interferencias: La presencia de otros productos oxidables, tales como sulfuro tiosulfato e inones Fe2+, pueden producir resultados aparentes elevados de sulfito. Algunos iones metálicos, como Cu2+, pueden catalizar la oxidación de SO32- a SO 2cuando la muestra se 4 expone al aire, dando así resultados bajos. NO -2 reaccionará con SO32- en el medio reaccionante ácido y dará resultados bajos de sulfito, a no ser que se añada ácido sulfámico para destruir el nitrito. La adición de EDTA como agente complejante, en el momento de recoger la muestra, inhibe la catálisis de Cu2+ y favorece la oxidación del hierro ferroso a férrico antes del análisis. Los iones sulfuro y tiosulfato sólo deberían esperarse en muestras con determinadas descargas industriales, pero si están presentes hay que tenerlos en cuenta. El sulfuro se puede eliminar por adición de alrededor de 0,5 g de acetato de zinc y analizando el

sobrenadante de la muestra depositada. Sin embargo, el tiosulfato tendrá que determinarse posiblemente por un método independiente (por ejemplo, el formaldehído/yodométrico1), y después se obtendrá el sulfito por diferencia. c) Concentración mínima detectadle: 2 mg SO32- /l. 2.

Reactivos

a) Ácido sulfúrico: H2SO4 1 + 1. b) Titulante patrón yoduro-yodato potásico, 0,0125M: Disuélvase 0,4458 g de KIO3 anhidro calidad primaria (secado a 120 °C durante 4 horas), 4,35 g K.I y 310 mg de bicarbonato de sodio (NaHCO3) en agua destilada y Dilúyase a 1.000 ml; 1,00 ml = 500 µg SO32- . c) Ácido sulfámico, NH2SO3H, cristalino. d) Reactivo EDTA: Disuélvase 2,5 g de EDTA disódico en 100 ml de agua destilada. e) Indicador de almidón: Añádase un poco de agua destilada fría a 5 g de almidón (patata, arrurruz o soluble) en un mortero, y muélase para hacer una pasta. Añádase a 1 l de agua destilada hirviente, agítese y déjese reposar una noche. Úsese el sobrenadante claro. Consérvese con 1,3 g de ácido salicílico, o 4 g ZnCl2, o una mezcla de 4 g de propionato de so-

4-226

MÉTODOS NORMALIZADOS

dio y 2 g de acida sódica para 1 l de solución. 3.

A = ml titulante para la muestra, B = ml titulante para el blanco, y M = molaridad de KI-KIO 3 titulante.

Procedimiento

a) Obtención de la muestra: Recójase una muestra reciente, con cuidado de que el contacto con el aire sea mínimo. Fíjense las muestras frías (< 50 °C) inmediatamente por adición de 1 ml de solución EDTA/l00 ml de muestra. Enfríense las muestras calientes a 50 °C o menos. No filtrar. b) Titulación: Añádase 1 ml H2SO4 y 0,1 g de cristales NH2SO3H a un erlenmeyer de 250 ml u otro recipiente adecuado para titulación. Mídase exactamente 50 a 100 ml de muestra estabilizada con EDTA en el matraz, manteniendo la punta de la pipeta por debajo de la superficie del líquido. Añádase 1 ml de solución indicadora de almidón. Titúlese inmediatamente con KI-KIO3 patrón, mientras se agita el matraz por rotación, hasta desarrollo de color azul permanente. Analícese un blanco de reactivo utilizando agua destilada en lugar de muestra.

4.

donde:

5.

Se analizaron en tres laboratorios porciones duplicadas de una solución patrón de sulfito y de diluyente residual secundario tratado al que se añadió sulfito. Los datos se resumen a continuación. La precisión individual del analista oscilaba entre 0,7 y 3,6 por 100 de desviación estándar (N = 45).

6.

Cálculo

Precisión y sesgo

Referencia

1. KURTENACKER, A. 1924. The aldehyde-bisulfite reaction in mass analysis. Z. Anal. Chem. 64:56.

4500- SO32- C 1.

Método de fenantrolina (PROPUESTA)

Discusión general

a) Principio: Se purga con gas nitrógeno una muestra acidificada y el SO2 liberado se retiene en una solución absorbente que contiene ion férrico y 1,10fenantrolina. El hierro férrico se reduce al estado ferroso con SO2, produciendo

el complejo tris (1,10-fenantrolina) hierro (II). Tras eliminar el exceso de hierro férrico con bifluoruro de amonio, el complejo de fenantrolina se mide colorimétricamente a 510 nm1. b) Interferencias: Véase sección 4500SO32- ·Blb. c) Concentración mínima detectable: 0,01 mg SO32- /l.

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

2.

Instrumental

a) Aparato para desprendimiento de SO2: En la figura 4500- SO32- :l se muestran los componentes siguientes: 1) Medidor de flujo de gas, con capacidad para medir 2 1/min de gas nitrógeno puro. 2) Frasco lavador de gas, 250 ml, con tubo de dispersión de gas de vidrio poroso, 12 mm de diámetro y porosidad grosera. 3) Tubos de conexión, de polipropileno, y rápidamente desconectables. 4) Tubos, de PCV flexible, para uso en todas las conexiones. 5) Tubos Nessler, 100 ml. b) Equipo colorimétrico: Se precisa uno de los siguientes:

1) Espectrofotómetro, para uso a 510 nm, con recorrido de luz de 1 cm o superior. 2) Fotómetro de filtro, con recorrido de luz de 1 cm o superior, y provisto de un filtro verde cuya transmitancia máxima se aproxime a 510 nm. 3.

Reactivos

a) Solución de 1,10-fenantrolina, 0,03M; Disuélvanse 5,95 g de 1,10-fenan-

4-227

trolina en 100 ml de etanol 95 por 100. Dilúyase a 1 l con agua destilada. Deséchese la solución si se colorea. b) Solución de sulfato férrico amónico, 0,01 M : Disuélvanse 4,82 g NH 4 Fe(SO4)2·12H2O en 1 l de agua destilada a la que se ha añadido 1 ml de H 2 SO 4 conc. para suprimir la hidrólisis férrica. Fíltrese a través de filtro de fibra de vidrio, si se aprecia materia insoluble. Si fuera necesario, ajústese el volumen de ácido de modo que la mezcla de 10 partes de solución de fenotrolina y una parte de sulfato férrico amónico tenga un pH comprendido entre 5 y 6. c) Bifluoruro de amonio, 5 por 100: Disuélvanse 25 g NH 4 HF 2 en 500 ml de agua destilada. Consérvese en un frasco de polietileno y dispénsese con pipeta de plástico. d) Tetradoromercurato de potasio, (TCM), K 2 HgCl 4 0,04 M : Disuélvanse 10,86 g HgCl2, 5,96 g KC1 y 0,066 g de EDTA disódico en agua destilada y diluyase a 1 l. Ajústese el pH a 5,2. Este reactivo es estable normalmente durante 6 meses, pero debe desecharse si se forma un precipitado. e) Patrón diluido de TCM-sulfito estabilizado: Disuélvase 0,5 g Na2SO3 en 500 ml de agua destilada. Estandarícese el día que se prepare, pero espérese 30 minutos, por lo menos, para permitir que la tasa de oxidación se haga más lenta. Determínese la molaridad por titulación con yoduro-yodato potásico 0,0125M patrón, utilizando indicador de almidón (véase sección 4500- SO32- .B). Calcúlese la molaridad del estándar de trabajo del siguiente modo: donde:

Figura 4500- SO 2-3 :1. Aparato para desprendimiento de SO2 a partir de muestras para análisis colorimétrico.

A = titulante para la muestra, ml, B = titulante para el blanco, ml, M = molaridad del titulante yoduro-yodato potásico.

4-228

Dado que la solución madre de Na2SO3 es inestable, inmediatamente después de la estandarización llévese con la pipeta 10 ml a un matraz aforado de 500 ml, parcialmente lleno con TCM y Dilúyase hasta la señal con TCM. Calcúlese la concentración de esta solución diluida de sulfito, multiplicando la concentración de solución madre por 0,02. Este patrón de TCM estabilizado es estable durante 30 días si se mantiene a 5 °C. Deséchese en cuanto se observe algún precipitado en el fondo. f ) Titulante patrón de yoduro-yodato potásico, 0,0125M: Véase sección 4500SO32- .B.2b. g) Acido clorídrico, 1 + 1. h) Alcohol octílico, calidad reactivo. i) Ácido sulfámico, 10 por 100: Disuélvanse 10 g NH2SO3H en 100 ml de agua destilada. Este reactivo se puede conservar unos días si se protege del aire. j) Reactivo EDTA: Véase sección 4500- SO32- ·B.2d.

4.

Procedimiento

a) Obtención de muestras: Recójase una muestra reciente con cuidado de reducir al mínimo el contacto con el aire. Fíjense las muestras enfriadas (< 50 °C) inmediatamente, por adición de 1 ml de solución de EDTA por cada 100 ml de muestra. b) Desprendimiento de SO2: Prepárese la solución absorbente añadiendo 5 ml de solución 1,10-fenantrolina, 0,5 ml de solución de sulfato férrico amónico, 25 ml de agua destilada y 5 gotas de alcohol octílico (que actúa como antiespumante) a un tubo Nessler de 100 ml; introdúzcase un tubo dispersor de gas. Añádase 1 ml de solución de ácido sulfámico al frasco lavador de gas y 100 ml de muestra o una porción que contenga menos de 100 µg SO32- diluido a 100 ml. Añádase 10 ml de HC1 l + 1 y conéctese

MÉTODOS NORMALIZADOS

inmediatamente el frasco lavador de tren de gas, como muestra la figura 4500SO32- :1. Póngase un muelle o una banda de goma sobre el frasco lavador de gas para mantener la tapa firmemente cerrada durante el flujo de gas. Ajústese el flujo de nitrógeno a 2,0 ml/min y purgúese durante 60 minutos. c) Medición calorimétrica: Al cabo de 60 minutos exactos, desconéctese el flujo de nitrógeno y el tubo Nessler, añadiendo inmediatamente 1 ml de solución de bifluoruro de amonio. Retírese el tubo de dispersión de gas tras aclararlo con agua destilada hacia el tubo, y fuércese ese agua hacia el tubo Nessler con un bulbo de goma. Dilúyase a 50 ml en el tubo Nessler y mézclese con movimientos rápidos circulares del mismo. Impídase que los tapones de goma o los tubos de PCV entren en contacto con la solución absorbente. Al cabo de 5 minutos, como mínimo, de haber añadido el bifluoruro de amonio, léase la absorbancia frente a agua destilada a 510 nm utilizando una cubeta de 5 cm para un rango de 0 a 30 µ g SO32- por porción, o una de 1 cm para un rango de 0 a 100 µ g SO32- . Evítese el paso de alcohol octílico hacia la cubeta, dejando que suba a la superficie de la solución absorbente y transfiriendo la solución inferior transparente a la cubeta, con una pipeta. Hágase una curva de calibrado analizando un método en blanco y tres muestras, por lo menos. Llévese un patrón al menos con cada juego de muestras. Para conseguir la máxima exactitud, manténganse muestras y patrones a la misma temperatura y un intervalo de tiempo constante desde el comienzo del purgado hasta la adición de bifluoruro de amonio, lo que se consigue más fácilmente si se utilizan simultáneamente varios trenes de gas en paralelo. Si las temperaturas ambiente se someten a fluctuaciones frecuentes, puede usarse un baño de agua para controlar el desarrollo del color a una temperatura determinada.

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

5.

Cálculo

6.

Precisión y sesgo

Tres laboratorios analizaron cinco porciones duplicadas de una solución patrón de sulfito y de un diluyente residual secundario tratado, al que se había añadido sulfito. Los datos se resumen a continuación. La precisión individual del analista oscilaba entre 4,1 y 10,5 por 100 de desviación estándar (N = 45).

7.

4-229

Referencias

1.

STEPHENS, B. G. & LINDSTROM. 1964. Spectrophotometric determination of sulfur dioxide suitable for atmospheric analysis. Anal. Chem. 36:1308. 2. WEST, P. W. & G. C. GAEKE. 1956. Fixation of sulfur dioxide as sulfitomercurate and subsequent colorimetric determination. Anal. Chem. 28:1816.

4500- SO24 SULFATO*

4500- SO24 A. Introducción 1.

Presencia

El sulfato ( SO 24 ) se distribuye ampliamente en la naturaleza y puede presentarse en aguas naturales en concentraciones que van desde unos pocos a varios miles de miligramos por litro. Los residuos del drenado de minas pueden aportar grandes cantidades de SO 24 debido

* Aprobado por el Standard Methods Committee, 1985.

a la oxidación de la pirita. Los sulfatos de sodio y magnesio ejercen una acción catalítica. 2.

Selección del método

El método cromatográfico de iones (B) es adecuado para concentraciones superiores a 0,1 mg/l. Los métodos gravi métricos (C y D) lo son para concentraciones SO 24 superiores a 10 mg/l; utilícese uno de estos métodos para conseguir resultados precisos. El método tur-

MÉTODOS NORMALIZADOS

4-230

bidimétrico (E) es aplicable a un rango de 1 a 40 mg SO 24 /l. El método automatizado de azul de metiltimol (F) es el método de análisis de gran número de muestras de sulfato sólo cuando se dispone del equipo, y se pueden analizar unas 30 muestras por hora.

4500- SO24 B.

3. Toma de muestras y almacenamiento

En presencia de materia orgánica, algunas bacterias pueden reducir SO 2a 4 S2-. Para evitarlo, consérvense las muestras muy contaminadas a 4 °C.

Método cromatográfico de iones

Véase la sección 4110.

4500- SO2C. 4

1.

Método gravimétrico con combustión de residuos

Discusión general

a) Principio: El sulfato precipita en una solución de ácido clorhídrico (HC1) como sulfato bárico (BaSO4) por adición de cloruro de bario (BaCl2). La precipitación se realiza cerca de la temperatura de ebullición y, tras un período de digestión, el precipitado se filtra, se lava con agua hasta eliminar Cl¯, se somete a combustión o seca y se pesa como BaSO4. b) Interferencia: La determinación gravimétrica de SO 24 está sujeta a muchos errores, tanto positivos como negativos. En aguas potables, donde la concentración mineral es baja, pueden tener una importancia mínima.

1) Interferencias que producen resultados elevados: La materia en suspensión, sílice, BaCl2 precipitante, NH 3- , SO32- y licor madre ocluido en el precipitado son los factores principales de error positivo. La materia suspendida puede estar presente tanto en la muestra como en la solución precipitante; los silicatos solubles pueden hacerse insolubles

y SO32- puede ser oxidado a SO 24 durante el análisis. Nitrato de bario, Ba(NO3)2, BaCl2 y agua son ocluidos en parte con BaSO4, aunque el agua es excluida si la temperatura de combustión es suficientemente alta. 2) Interferencias que producen resultados bajos: Los sulfatos de metales alcalinos suelen dar resultados bajos, especialmente los sulfatos alcalinos hidrogenados. La oclusión de sulfato alcalino con BaSO4 da lugar a la sustitución de un elemento de peso atómico menor que el bario en el precipitado. Los sulfatos hidrogenados de metales alcalinos actúan de forma parecida y además se descomponen al calentarlos. Los metales pesados, como cromo y hierro, producen resultados bajos por interferir con la precipitación completa de SO 24 y por formar sulfatos de metales pesados. BaSO4 tiene solubilidad escasa, pero significativa, que aumenta en presencia de ácido. Aunque es necesario un medio ácido para evitar la precipitación de carbonato y fosfato de bario, es importante limitar su concentración para reducir al mínimo el efecto de solución.

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

2.

Instrumental

a) Baño de vapor. b) Horno de secado, provisto de control termostático. c) Mufla, con indicador de temperatura. d) Desecador. e) Balanza analítica, capaz de pesar 0,1 mg. f) Filtro: Utilícese uno de los siguientes:

1) Papel de filtro, lavado al ácido, sin cenizas, de acabado duro, con suficiente retención para precipitados finos. 2) Filtro de membrana, con tamaño de poro alrededor de 0,45 µm. g) Aparato de filtración, apropiado para el tipo de filtro seleccionado. (Recúbrase el soporte del filtro de membrana con silicona líquida para evitar que el precipitado se adhiera.) 3.

Reactivos

a) Solución de indicador rojo de metilo: Disuélvanse 100 mg de sal sódica de rojo de metilo en agua destilada y diluyase a 100 ml. b) Ácido clorhídrico, HC1 l + 1. c) Solución de cloruro de bario: Disuélvanse 100 g de BaCl2·2H2O en 1 l de agua destilada. Fíltrese a través de un filtro de membrana o papel de filtro duro antes de usarla; 1 ml es capaz de precipitar aproximadamente 40 mg SO 24 . d) Reactivo de nitrato de plata-ácido nítrico: Disuélvanse 8,5 g de AgNO3 y 0,5 ml HNO3 conc. en 500 ml de agua destilada. e) Silicona líquida*.

* «Desicote» (Beckman) o equivalente.

4.

4-231

Procedimiento

a) Eliminación de sílice: Si la concentración de sílice supera 25 mg/l, evapórese la muestra hasta casi sequedad en una cápsula de platino sobre baño de vapor. Añádase 1 ml HC1, inclínese y gírese la cápsula hasta que el contacto del ácido con el residuo sea total. Continúese evaporando a sequedad. Complétese el secado en un horno a 180 °C y, si hubiera materia orgánica presente, carbonícese a la llama de un mechero. Humedézcase el residuo con 2 ml de agua destilada y 1 ml HC1, y evapórese a sequedad sobre baño de vapor. Añádanse 2 ml HC1, recójase el residuo soluble con agua caliente y fíltrese. Lávese la sílice insoluble con varias porciones pequeñas de agua destilada caliente. Combínese filtrado y lavados. Deséchese el residuo. b) Precipitación de sulfato de bario: Ajústese el volumen de la muestra clarificada para que contenga aproximadamente 50 mg SO 24 en un volumen de 250 ml. Se pueden tolerar concentraciones menores de SO 24 , cuando sea imposible concentrar la muestra al nivel óptimo, pero en esos casos limítese el volumen total a 150 ml. Ajústese el pH con HC1 a 4,5-5,0 utilizando un medidor de pH o el color naranja del indicador rojo de metilo. Añádanse de 1 a 2 ml HC1. Caliéntese a ebullición y añádase lentamente, con agitación, solución templada de BaCl2 hasta precipitación completa aparente; añádanse entonces unos 2 ml de exceso. Si el precipitado es pequeño, añádase un total de 5 ml de solución de BaCl2. Digiérase el precipitado a 8090 °C, preferiblemente toda una noche, pero no menos de 2 horas. c) Filtración y pesada: Mézclese una pequeña cantidad de pulpa de papel de filtro sin cenizas con el BaSO4, transfiérase cuantitativamente a un filtro y fíltrese a temperatura ambiente. La pulpa ayuda a la filtración y reduce la tendencia del precipitado a deslizarse. Lávese el

4-232

MÉTODOS NORMALIZADOS

precipitado con pequeñas porciones de agua destilada templada hasta que los lavados estén libres de Cl¯ comprobado mediante pruebas con reactivo AgNO3HNO3. Póngase el filtro y precipitado en un crisol de platino tarado y llévese a ignición a 800 °C durante 1 hora. No dejar que se inflame el papel de filtro. Enfríese en desecador y pésese.

tica que contenía 259 mg SO 24 /l, 108 Ca2+/l, 82 mg Mg2+/l, 3,1 mg K+/l, 19,9 mg Na + /l, 241 mg Cl ¯ /l, 0,250 mg NO-2 -N/l 1,1 mg NH 3- ·N/l y 42,5 mg alcalinidad total/l (aportada por NaHCO3), con una desviación estándar relativa de 4,7 por 100 y error relativo del 1,9 por 100.

5. Cálculo

7.

Bibliografía

HILLBBRAND, W. F. et al. 1953. Applied Inorganic Analysis, 2.a ed. John Wiley & Sons, Nueva York.

6.

Precisión y sesgo

Se analizó en 32 laboratorios por el método gravimétrico una muestra sinté-

4500- SO24 D. 1.

Método gravimétrico con secado de residuos

Discusión general

Véase método C anterior. 2.

KOLTHOFF, L. M., E. J. MEEHAN, E. B. SANDELL & S. BRUCKENSTEIN. 1969. Quantitative Chemical Analysis, 4.a ed. Macmillan Co., Nueva York.

3.

Reactivos

Todos los mencionados en la sección 4500- SO 24 .C.3.

Instrumental

Con excepción del papel de filtro, se necesita el resto del instrumental citado en la sección 4500- SO 24 .C2, y además: a) Filtros: Utilícese uno de los siguientes: 1) Filtro de vidrio sinterizado, de porosidad fina («F»). 2) Filtro de membrana, con tamaño de poro de unas 0,45 µm. b) Estufa de vacío.

4.

Procedimiento

a) Eliminación de interferencias: Véase sección 4500- SO 24 .C.4a. b) Precipitación de sulfato de bario: Véase sección 4500- SO 24 .C.4b. c) Preparación de los filtros:

1) Filtro de vidrio sinterizado: Séquese a peso constante en un horno mantenido a 105 °C o más, enfríese en desecador y pésese.

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

2) Filtro de membrana: Póngase el filtro sobre un pedazo de papel de filtro o un vidrio de reloj y pésese hasta peso constante* en una estufa de vacío a 80 °C, manteniendo un vacío de 85 kPa como mínimo, o en un horno convencional a 103-105 °C. Enfríese en desecador y pésese sólo la membrana. d) Filtración y pesada: Fíltrese BaSO4 a temperatura ambiente. Lávese el precipitado con varias porciones pequeñas de agua destilada templada, hasta que los lavados están exentos de Cl¯, según indicación de las pruebas con reac* El peso constante se define como un cambio de no más de 0,5 mg en dos operaciones sucesivas, consistentes en calentar, enfriar en desecador y pesar.

4500- SO24 E. 1.

4-233

tivo AgNO3-HNO3. Si se utiliza un filtro de membrana, añádanse unas gotas de silicona fluida a la suspensión antes de filtrar para evitar la adherencia del precipitado al soporte. Séquese el filtro y precipitado con el mismo método utilizado para preparar el filtro. Enfríese en un desecador y pésese.

5.

Cálculo

6.

Bibliografía

Véase sección 4500- SO 24 .C.7.

Método turbidimétrico

Discusión general

a) Principio: El ion sulfato ( SO 24 ) precipita en un medio de ácido acético con cloruro de bario (BaCl2 ) de modo que forma cristales de sulfato de bario (BaSO4) de tamaño uniforme. Se mide la absorbancia luminosa de la suspensión de BaSO4 con un fotómetro y se determina la concentración de SO 24 por comparación de la lectura con una curva patrón. b) Interferencia: Interferirá el color o la materia suspendida en gran cantidad. Parte de la materia en suspensión puede ser eliminada por filtración. Si ambas interferencias son pequeñas en comparación con la concentración de SO 24 , corregirlas como se indica más adelante en el apartado 4 d. Interferirá también un exceso de sílice superior a 500 ml/l, y en las aguas con gran cantidad de materia orgánica puede no ser posible precipitar BaSO4 satisfactoriamente.

En las aguas potables no están presentes otros iones aparte de SO 24 formadores de compuestos insolubles con el bario, en condiciones fuertemente acidas. Hágase la determinación a temperatura ambiente; una variación de 10 °C no producirá errores apreciables. c) Concentración mínima detectable: Aproximadamente 1 mg SO 24 /l. 2. Instrumental a) Agitador magnético: Úsese una velocidad de agitación constante. Es conveniente incorporar una resistencia fija en serie con el motor que hace funcionar el agitador magnético, para regular la velocidad de agitación. Utilícense imanes de forma y tamaño idénticos. La velocidad exacta de agitación no es crítica, pero debe mantenerse constante para cada serie de muestras y patrones, ajustándola para evitar las salpicaduras.

4-234

b) Fotómetro: Se requiere uno de los siguientes, en el orden de preferencia dado:

1) Nefelómetro. 2) Espectrofotómetro, para uso a 420 nm, con un recorrido de luz de 2,5 a 10 cm. 3) Fotómetro de filtro, provisto de un filtro violeta cuya máxima transmitancia esté próxima a 420 nm y recorrido de luz de 2,5 a 10 cm. c) Cronómetro o reloj eléctrico. d) Cuchara de medida, con capacidad de 0,2 a 0,3 ml. 3. Reactivos a) Solución tampón A: Disuélvanse 30 g de cloruro de magnesio, MgCl2· · 6H2O; 5 g de acetato de sodio, CH3COONa · 3H2O; 1,0 g de nitrato potásico, KNO3, y 20 ml de ácido acético, CH3COOH (99 por 100), en 500 ml de agua destilada y complétese a 1.000 ml. b) Solución tampón B (requerida cuando la concentración de SO 24 en la muestra es inferior a 10 mg/l): Disuélvanse 30 g MgCl 2 · 6H 2 O; 5 g CH 3 COONa · 3H2O; 1,0 g KNO3; 0,111 g de sulfato de sodio, Na2SO4, y 20 ml de ácido acético (99 por 100), en 500 ml de agua destilada, completando a 1.000 ml. c) Cloruro de bario, BaCl2, cristales, malla 20 a 30. En la estandarización se produce una turbidez uniforme con este rango de malla y el tampón apropiado. d) Solución patrón de sulfato: Prepárese una solución patrón de sulfato como se describe en 1) o 2) a continuación; 1,00 ml = 10/ µ g SO 24 .

1) Dilúyanse 10,4 ml de H2SO4 titulante 0,0200N especificado en Alcalinidad, sección 2320B.3c, a 100 ml con agua destilada. 2) Disuélvanse 0,1479 g Na2SO4 anhidro en agua destilada y Dilúyase a 1.000 ml.

MÉTODOS NORMALIZADOS

4. Procedimiento a) Formación de turbidez con sulfato de bario: Mídanse 100 ml de muestra o una porción adecuada llevada a 100 ml, en un erlenmeyer de 250 ml. Añádanse 20 ml de solución tampón y mézclese en un agitador. mientras se agita, añádase una cucharada de cristales de BaCl2, empezando el recuento de tiempo inmediatamente. Agítese durante 60 ± 2 segundos a velocidad constante. b) Medida de la turbidez del sulfato de bario: Tras finalizar el período de agitación, viértase la solución en la cubeta del fotómetro y mídase la turbidez a los 5 ± ± 0,5 minutos. c) Preparación de la curva de calibración: Calcúlese la concentración de SO 24 en la muestra comparando la lectura de la turbidez con una curva de calibrado preparada sometiendo los patrones de SO 24 al método completo. Espacíense los patrones a incrementos de 5 mg/l en el rango de 0 a 40 mg SO 24 /l. Por encima de 40 mg/l, la precisión disminuye y las suspensiones de BaSO 4 pierden estabilidad. Compruébese la Habilidad de la curva de calibrado, llevando un patrón en paralelo con cada tres o cuatro muestras. d) Corrección para el color y turbidez de la muestra: Corríjanse el color y turbidez realizando blancos a los que no se ha añadido BaCl2. 5. Cálculo

Si se había utilizado la solución tampón A, determínese la concentración de SO 24 directamente a partir de la curva de calibrado, tras sustraer la absorbancia de la muestra antes de añadir BaCl2. Si se utilizó la solución tampón B, sustráigase la concentración de SO 24 del blan -

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

co a partir de la concentración aparente de SO 24 , tal como se ha determinado antes; dado que la curva de calibrado no es una línea recta, esto no es equivalente a sustraer la absorbancia del blanco de la absorbancia de la muestra.

100. Dos muestras con sulfato añadido dieron recuperaciones del 85 y 91 por 100.

7. 6.

Precisión y sesgo

Con un turbidímetro *, en un solo laboratorio, con una muestra que tenía una media de 7,45 mg SO 24 /l, se obtuvo una desviación estándar de 0,13 mg/l, y un coeficiente de variación de 1,7 por

4-235

Bibliografía

SHEEN, R. T, H. L. KAHLER & E. M. Ross. 1935. Turbidimetric determination of sulfate in water. Ind. Eng. Chem., Anal. Ed. 7:262. THOMAS. J. F. & J. E. COTTON. 1954. A turbidimetric sulfate determination. Water Sewage Works 101:462. ROSSUM, J. R. & P. VILLARRUZ. 1961. Suggested methods for turbidimetric determination of sulfate in water. J. Amer. Water. Works Assoc. 53:873.

* Hach 2100 A.

4500- SO24 F. 1.

Método automatizado del azul de metiltimol

Discusión general

a) Principio: En la reacción de SO 24 con cloruro de bario (BaCl 2 ) a pH bajo, se forma sulfato de bario. A pH alto, el exceso de bario reacciona con azul de metiltimol y produce un quelado azul. El azul de metiltimol no complejado es gris. La cantidad de azul de metiltimol sin complejar indica la concentración de SO 24 . b) Interferencias: Dado que interfieren muchos cationes, utilícese una columna intercambiadora de iones para eliminar las interferencias. c) Aplicación: Este método es aplicable a aguas potables, superficiales y salinas, así como a las residuales domésticas e industriales, en un rango desde 10 a 300 mg SO 24 /l. 2.

rido* consta de los componentes intercambiables que muestra la figura 4500SO 24 :1. b) Columna intercambiadora de iones: Llénese un fragmento de tubo de vidrio de 2 mm de diámetro interno y unos 20 cm de largo con la resina intercambiadora de iones †. Para simplificar el llenado de la columna póngase la resina en agua destilada y aspírese al tubo, que contiene un tapón de lana de vidrio. Tras el llenado, tápese el otro extremo del tubo con lana de vidrio. Evítese que quede aire atrapado en la columna. 3.

Reactivos

a) Solución de cloruro de bario: Disuélvanse 1,526 g BaCl 2 · 2H 2 O en 500 ml de agua destilada y dilúyase a 1 l. Consérvese en un frasco de polietileno.

Instrumental

a) Equipo analítico automatizado: El equipo analítico de flujo continuo reque-

* Autoanalizador™ Technicon™ o equivalente. † Resina intercambiadora iónica Bio-Rex 70, malla 20-50, forma sódica, suministrada por Bio-Rad Laboratories, Richmond, California 94804, o equivalente.

4-236

b) Reactivo de azul de metiltimol: Disuélvanse 118,2 mg de azul de metiltimol ‡ en 25 ml de solución de BaCl2. Añádanse 4 ml de HCL 1N y 71 ml de agua destilada y dilúyase a 500 ml con etanol 95 por 100. Consérvese en frasco de vidrio topacio. Prepárese a diario. c) Solución tampón, pH 10,1: Disuélvanse 6,75 g NH4C1 en 500 ml de agua destilada. Añádanse 57 ml NH4OH conc. y dilúyase a 1 l con agua destilada. Ajústese el pH a 10,1 y consérvese en frasco de polietileno. Prepárese nuevo mensualmente. ‡ Eastman Organic Chemicals, Rochester, Nueva York 14615. N.° 8068 sal pentasódica de 3', 3" bis [N, N-bis (carboximetil)-aminolmetil] timolsulfonftaleína.

MÉTODOS NORMALIZADOS

d) Reactivo EDTA: Disuélvanse 40 g de etilendiaminotetracetato disódico en 500 ml de solución tampón pH 10,1. Dilúyase a 1 l con solución tampón de pH 10,1 y consérvese en frasco de polietileno. e) Solución de hidróxido de sodio, 0,36N: Disuélvanse 7,2 g NaOH en 500 ml de agua destilada. Enfríese y llévese a 1 l con agua destilada. f) Solución madre de sulfato: Disuélvanse 1,479 g Na2SO 4 en 500 ml de agua destilada y dilúyase a 1.000 ml; 1,00 ml = 1,00 mg SO 24 . g) Soluciones patrón de sulfato: Prepárese en concentraciones apropiadas desde 10 a 300 mg SO 24 /l, utilizando la solución madre de sulfato.

DETERMINACIÓN DE CONSTITUYENTES INORGÁNICOS NO METÁLICOS

4.

6.

Procedimiento

4-237

Precisión y sesgo

Móntese el aparato como muestra la figura 4500- SO 24 :l y sígase el método general descrito por el fabricante. Tras utilizarlo, aclárense las líneas de azul de metiltimol y NaOH reactivo, en agua, durante unos minutos, lávese con solución de EDTA durante 10 minutos, y luego con agua destilada.

Con el Autoanalizador II de Technicon, una muestra con una concentración medida de 28 mg SO 24 /l , analizada en un único laboratorio, tenía una desviación estándar de 0,68 mg/l y un coeficiente de variación del 2,4 por 100. En dos muestras con SO 24 adicionado, las recuperaciones eran del 91 y 100 por 100.

5.

7.

Cálculo

Prepárense curvas patrón comparando la altura de los picos de los patrones procesados a través del aparato, con sus concentraciones de SO 24 . Calcúlese la 24

concentración de SO en la muestra por comparación de la altura de su pico con la curva patrón.

Bibliografía

LAZRUS, A. L., K. C. HILL & J. P. LODGE. 1965. A new colorimetric microdetermination of sulfate ion. En Automation in Analytical Chemistry. Technicon Symposium. C OLOROS , E., M. R. P ANESAR & F. P. P ERRY . 1976. Linearizing the calibration curve in determination of sulfate by the methylthymol blue method. Anal. Chem. 48:1693.

PARTE 5000 DETERMINACIÓN DE COMPONENTES ORGÁNICOS

5010

5010 A.

INTRODUCCIÓN

Discusión general

Los análisis para determinar la materia orgánica en aguas limpias y residuales pueden clasificarse en dos tipos generales de medidas: las que determinan cuantitativamente una cantidad conjunta de materia orgánica que consta de componentes orgánicos con una característica común y las que determinan cuantitativamente compuestos orgánicos individuales. Las últimas se tratan en la parte 6000. Las primeras, descritas aquí en la parte 5000, han sido agrupadas en cuatro categorías: sustancias que requieren oxígeno, elementos unidos mediante enlaces orgánicos, clases de compuestos y potenciales de formación. Para evaluar la cantidad total de materia orgánica presente se utilizan los métodos de determinación del carbono orgánico total y del requerimiento de oxígeno químico. Es posible identificar analíticamente fracciones macroscópicas de

5010 B.

materia orgánica, como ocurre en la determinación del ROB, que es un índice de la materia orgánica biodegradable presente, aceite y grasas, la cual representa la materia extraíble de una muestra por medio de un disolvente no polar, o en la determinación de haluros orgánicos totales (HOT), que mide los halógenos con enlaces orgánicos. El potencial de formación de trihalometano es una medida conjunta de la concentración total de trihalometanos formados por cloración de una muestra de agua. Los análisis de la materia orgánica se efectúan para evaluar la concentración y la composición general de la materia orgánica presente en los suministros de agua sin depurar, en las aguas residuales, en los efluentes tratados y en las aguas receptoras; y para determinar la eficacia de los métodos de tratamiento.

Toma y conservación de muestras

La toma de muestras, el tratamiento de campo, la conservación y el almacenamiento de las muestras tomadas para analizar la materia orgánica son abordados con detalle en la introducción a cada método. Si es posible, las muestras deben analizarse inmediatamente porque los

conservantes suelen interferir en las pruebas. Por otro lado, la mayoría de las muestras deben ser almacenadas a baja temperatura (4°C) nada más tomarlas, para conservarlas. Los conservantes químicos sólo deben utilizarse cuando se ha demostrado que no interfieren en los 5-1

5-2

MÉTODOS NORMALIZADOS

análisis que se van a realizar (véase sección 1060). No deben utilizarse nunca conservantes en las muestras en las que se va a analizar el ROB. Si van a emplearse, añádanse al frasco de muestra, en primer lugar, de forma que se conserven todas las fracciones nada más recogidas. Ningún método simple de conserva-

5020

ción es completamente satisfactorio; debe elegirse el conservante teniendo en cuenta el tipo de determinaciones que se van a hacer. Todos los métodos de conservación pueden resultar inadecuados cuando se aplican a muestras que contienen cantidades significativas de materia suspendida.

CONTROL DE CALIDAD

La parte 1000 contiene información importante relativa a los análisis incluidos en la parte 5000. Debe prestarse particular atención a las secciones 1020B (Control de Calidad), 1060 (Toma y conservación de muestras), 1080 (Agua de calidad para reactivos) y 1090 (Seguridad), todas ellas de suma importancia para muchos de los métodos expuestos en la parte 5000. Tómense precauciones especiales cuando los análisis sean realizados por laboratorios independientes. La práctica de los laboratorios independientes debe seguir los mismos procedimientos de garantía de calidad observados para los análisis dentro del propio laboratorio: muestras por duplicado, muestras con adiciones conocidas y blancos. Para ciertos análisis, es posible que no sea factible la preparación de muestras

5210

con adiciones conocidas. En tales casos, debe considerarse la utilización de una mezcla, en proporciones variables, de varias muestras. Utilícense las concentraciones expresadas en las muestras y las proporciones en que fueron mezcladas para calcular la concentración esperada de la mezcla. Examínese el rendimiento del laboratorio utilizando patrones preparados externamente y compruébense las muestras (véase sección 1020B). El agua para reactivos tipo I (sección 1080) dará resultados satisfactorios en la mayoría de los análisis de la parte 5000, pero es probable que sean necesarias etapas de purificación adicional para ciertos métodos, tales como la determinación de haluros orgánicos totales (HOT) y la de potencial de formación de trihalometano (FPTHM).

REQUERIMIENTO DE OXÍGENO BIOQUÍMICO* 5210 A.

1. Dicusión general

La determinación del requerimiento de oxígeno bioquímico (ROB) es una prue* Aprobado por el Standard Methods Committee, 1988.

Introducción ba empírica en la que se utilizan procedimientos estandarizados de laboratorio para determinar los requerimientos relativos de oxígeno de las aguas residuales, efluentes y contaminadas. La prueba tiene su aplicación más extendida en la de-

DETERMINACIÓN DE COMPONENTES ORGÁNICOS

terminación de las cargas residuales en las instalaciones de tratamiento y en la evaluación de la eficacia de extracción del ROB de tales sistemas de tratamiento. La prueba mide el oxígeno utilizado, durante un período de incubación especificado, para la degradación bioquímica de materia orgánica (requerimiento de carbono), y el oxígeno utilizado para oxidar materia orgánica, como los sulfuros y el ion ferroso. Puede medir también el oxígeno utilizado para oxidar las formas reducidas del nitrógeno (requerimiento de nitrógeno) a menos que se impida la oxidación por medio de un inhibidor. Los procedimientos de siembra y disolución (dilución) proporcionan una valoración del ROB a un pH entre 6,5 y 7,5. Aquí sólo se va a describir el ROB de 5 días (ROB5), pero existen muchas variaciones de la determinación del requerimiento de oxígeno. Entre ellos, la medición de períodos de incubación más cortos y más largos, las pruebas para determinar las tasas de captación de oxígeno y las determinaciones continuas de captación de oxígeno mediante técnicas respirométricas. Pueden elegirse condiciones alternativas de siembra, disolución e incubación para simular las condiciones del agua receptora, proporcionando así una valoración de los efectos ambientales de las aguas residuales y sus efluentes. 2. ROB de carbono frente a ROB de nitrógeno

La oxidación de las formas reducidas del nitrógeno, mediada por microorganismos, requiere nitrógeno. Desde siempre se ha considerado el requerimiento de nitrógeno una interferencia en la determinación del ROB, como demuestra claramente la inclusión de amoníaco en el agua de disolución. En la actualidad, es posible evitar dicha interferencia me-

5-3

diante un inhibidor químico1. Si no se utiliza éste, el requerimiento de oxígeno medido corresponde a la suma de los requerimientos de carbono y de nitrógeno. Las determinaciones que incluyen el requerimiento de nitrógeno no son útiles, por lo general, para evaluar el requerimiento de oxígeno asociado con la materia orgánica. El requerimiento de nitrógeno puede calcularse directamente a partir del nitrógeno amónico (sección 4500-NH3); y el de carbono restando el equivalente teórico de la oxidación del nitrógeno reducido de los resultados de la prueba realizada sin inhibidor. Sin embargo, este método es engorroso y está sometido a un margen de error considerable. La inhibición química del requerimiento de nitrógeno proporciona una medida más directa y fiable del requerimiento de carbono. El grado de oxidación de los compuestos nitrogenados durante el período de incubación de 5 días depende de la presencia de microorganismos capaces de realizar dicha oxidación. Tales organismos no suelen estar presentes en las aguas cloacales sin tratar o en efluentes primarios en número suficiente para oxidar cantidades significativas de formas reducidas de nitrógeno en la prueba de ROB de 5 días. Muchos efluentes de las instalaciones de tratamiento biológico contienen cantidades significativas de organismos nitrificantes. Debido a que es probable que en dichas muestras exista una oxidación de los compuestos del nitrógeno, se recomienda inhibir la nitrificación tal como se explica en el apartado B.4e6) para muestras de efluente secundario, para muestras sembradas con efluente secundario, y para muestras de aguas contaminadas. Cuando se inhibe el requerimiento de oxígeno nitrogenado los resultados se expresan como ROBC5, y como ROB5 cuando no se inhibe la nitrificación.

5-4

3.

MÉTODOS NORMALIZADOS

Necesidad de disolución

La concentración de ROB en la mayoría de las aguas residuales supera la concentración de oxigeno disuelto (OD) disponible en una muestra saturada de aire. Por tanto, es necesario diluir la muestra antes de incubarla para equilibrar de forma adecuada el requerimiento y el suministro de oxígeno. Ya que el crecimiento bacteriano requiere nutrientes tales como nitrógeno, fósforo, y metales traza, se añaden éstos al agua de disolución (dilución), la cual es tamponada para asegurar que el pH de la muestra incubada se mantiene en un intervalo adecuado para el crecimiento bacteriano. La estabilización completa de una mezcla puede requerir un periodo de incubación demasiado largo para fines prácticos; por lo tanto, el período de 5 días ha sido aceptado como el periodo de incubación estándar. Si el agua de dilución es de mala calidad, aparecerá como ROB de la muestra. Este efecto se verá ampliado por el factor de dilución, y tendrá como resultado un posible sesgo. El método que se presenta a continuación contiene tanto un control como un blanco del agua de dilución. Se verifica además si la calidad de las aguas de dilución sembradas es aceptable midiendo su consumo de oxígeno a partir de una mezcla orgánica conocida, normalmente glucosa y ácido glutámico. El origen del agua de dilución no está restringida: Puede ser agua destilada, del

5210 B. 1.

grifo o agua corriente receptora libre de sustancias bioinhibitorias y orgánicas biodegradables. El agua destilada puede contener amoníaco o sustancias orgánicas volátiles; las aguas desionizadas suelen estar contaminadas con sustancias orgánicas solubles lixiviadas del lecho de resina. El uso de destiladores revestidos de cobre, o de accesorios de cobre unidos a las líneas de agua destilada puede producir agua que contenga cantidades excesivas de cobre (véase sección 3500-Cu). 4.

Referencia

1. YOUNG, J. C. 1973. Chemical methods for nitrification control. J. Water Pollut. Control Fed. 45:637.

5.

Bibliografía

THERIAULT. E. J., P. D. MCNAMEE & C. T. BUTTERFIELD. 1931. Selection of dilution water for use in oxygen demand tests. Pub. Health Rep. 46:1084. LEA, W. L. & M. S. NICHOLS. 1937. Influence of phosphorus and nitrogen on biochemical oxygen demand. Sewage Works J. 9:34. RUCHHOFT, C. C. 1941. Report on the cooperative study of dilution waters made for the Standard Methods Committee of the Federation of Sewage Works Associations. Sewage Works J. 13:669. MOHLMAN , F. W., E. H URWITZ, G. R. B ARNETT & H. K. RAMER. 1950. Experience with modified methods for BOD. Sewage Ind. Wastes 22:31.

Prueba ROB de 5 días

Discusión general

a) Principio: El método consiste en llenar con muestra, hasta rebosar, un frasco hermético del tamaño especificado, e incubarlo a la temperatura estable-

cida durante 5 días. El oxígeno disuelto se mide antes y después de la incubación, y el ROB se calcula mediante la diferencia entre el OD inicial y el final. Debido a que el OD se determina inmediatamente después de hacer la dilución,

5-5

DETERMINACIÓN DE COMPONENTES ORGÁNICOS

toda la captación de oxígeno, incluida la que ocurre durante los 15 primeros minutos, se incluye en la determinación del ROB. b) Toma de muestras y almacenamiento: Las muestras para el análisis del ROB pueden degradarse significativamente mientras están almacenadas, entre su recogida y el análisis, y como resultado producir valores de ROB bajos. Hágase mínima la reducción del ROB analizando la muestra inmediatamente o enfriándola hasta una temperatura próxima a la de congelación durante su almacenamiento. Sin embargo, aún a baja temperatura, redúzcase el tiempo de mantenimiento a un mínimo. Caliéntense las muestras enfriadas a 20 °C antes del análisis. 1) Muestras tomadas al azar: Si se va a iniciar el análisis en el plazo de 2 horas a partir de la toma de la muestra, el almacenamiento en frío es innecesario. Si el análisis no se va a iniciar en dicho plazo, consérvese la muestra a, o por debajo de, 4 °C desde el momento de su recogida. Comiéncese el análisis en el plazo de 6 horas a partir de la toma; cuando esto no sea posible porque el punto de recogida de la muestra esté lejos del laboratorio, almacénese a, o por debajo de, 4 °C e infórmese de la duración, y temperatura, del almacenamiento con los resultados. En ningún caso se debe empezar el análisis después de 24 horas de la toma de muestras al azar. Cuando éstas van a ser utilizadas para fines de regulación, háganse todos los esfuerzos posibles por enviar las muestras para su análisis en el plazo de 6 horas después de su recogida. 2) Muestras mixtas: Consérvense las muestras a, o por debajo de, 4 °C durante la mezcla. Limítese el período de mezcla a 24 horas. Utilícense los mismos criterios que para el almacenamiento de muestras tomadas al azar, empezando la determinación del tiempo de mantenimiento a partir del final del

período de mezcla. Infórmese del tiempo y las condiciones de almacenamiento como parte de los resultados. 2.

Instrumental

a) Botellas de incubación, capacidad de 250 a 300 ml. Límpiense los frascos con un detergente, enjuágense perfectamente, y séquense antes de usarlos. Como precauciones contra la entrada de aire en la botella durante la incubación, utilícese un cierre hidráulico. Para conseguir uno satisfactorio inviértanse los frascos en un baño de agua o échese agua a la boca ensanchada de las botellas de ROB especiales. Colóquese una taza de papel o de plástico, o una caperuza de papel de aluminio sobre la boca ensanchada de la botella para reducir la evaporación del cierre hidráulico durante la incubación. b) Incubador de aire o baño de agua, controlado por termostato a 20 °C ± 1 °C. Elimínese toda la luz para evitar la posibilidad de producción fotosintética de OD. 3.

Reactivos

a) Solución de tampón fosfato: Disuélvanse 8,5 g de KH2PO4, 21,75 g de K2HPO4, 33,4 g de Na2HPO4 · 7H2O y 1,7 g de NH4C1 en unos 500 ml de agua destilada y dilúyase hasta 1 l. El pH de la solución debería ser de 7,2 sin ajustes adicionales. Deséchese el reactivo (o cualquiera de los siguientes reactivos) si hay algún signo de crecimiento biológico en frasco de reserva. b) Solución de sulfato de magnesio: Disuélvanse 22,5 g de MgSO4 · 7H2O en agua destilada y dilúyase hasta 1 l. c) Solución de cloruro de calcio: Disuélvanse 27,5 g de CaCl2 en agua destilada y dilúyase hasta 1 l. d) Solución de cloruro férrico: Disuél-

MÉTODOS NORMALIZADOS

5-6

vanse 0,25 g de FeCl3 · 6H2O en agua destilada y dilúyase hasta 1 l. e) Soluciones acida y básica, 1N, para neutralización de muestras residuales cáusticas y acidas. 1) Acida: Lentamente y mientras se agita, añádanse 28 ml de ácido sulfúrico conc. a agua destilada. Dilúyase hasta 1 l. 2) Básica: Disuélvanse 40 g de hidróxido sódico en agua destilada. Dilúyase hasta 1 l. f) Solución de sulfilo sódico: Disuélvanse 1,575 g de Na2SO3 en 1.000 ml de agua destilada. Esta solución no es estable; debe prepararse a diario. g) Inhibidor de la nitrificación: 2cloro-6-(tricloro metil) piridina*. h) Solución de glucosa-ácido glutámico: Séquense glucosa de calidad para reactivos y ácido glutámico de calidad para reactivos a 103 °C durante una hora. Añádanse 150 mg de glucosa y 150 mg de ácido glutámico a agua destilada y dilúyase hasta 1 l. Prepárese siempre inmediatamente antes de usarla. i) Solución de cloruro de amonio: Disuélvanse 1,15 g de NH 4 C1 en unos 500 ml de agua destilada, ajústese el pH a 7,2 con solución de NaOH, y dilúyase hasta 1 l. La solución contiene 0,3 mg N/ml.

4.

Procedimiento

a) Preparación de agua para dilución: Colóquese el volumen deseado de agua en un frasco adecuado y añádase 1 ml de las soluciones de tampón fosfato, de MgSO4, de CaCl2, y de FeCl3/l de agua. Si se desea, siémbrese el agua de disolución como en el apartado 4d. Ensáyese y almacénese el agua de dilución como se ha descrito en los apartados 4b y c, de

* Inhibidor de la nitrificación 2579-24 (2,2 por 100 TCMP), Hach Co., o equivalente.

forma que siempre se tenga a mano agua de calidad garantizada. Antes de usar el agua de dilución debe ponerse a una temperatura de 20 °C. Satúrese con OD agitando en una botella parcialmente llena o aireando con aire filtrado libre de materia orgánica. Alternativamente, almacénese en frascos taponados con algodón durante el tiempo suficiente para que el agua se sature de OD. Protéjase la calidad del agua utilizando material de vidrio, tubos y frascos limpios. b) Control del agua de dilución: Utilícese este procedimiento como una comprobación aproximada de la calidad del agua de dilución. Si la depleción de oxígeno del agua candidata excede de 0,2 mg/l, obténgase una muestra de agua satisfactoria mejorando la purificación, o de otra fuente. Alternativamente, si se inhibe la nitrificación, almacénese el agua de dilución, sembrada tal como se ha especificado antes, en una habitación oscura a temperatura ambiente hasta que la captación de oxígeno se haya reducido lo suficiente para cumplir los criterios de comprobación del agua de dilución. Compruébese la calidad del agua de dilución almacenada que se está usando, pero sin añadir simiente al agua de dilución almacenada, para mejorar la calidad. No se recomienda su almacenamiento cuando el ROB se va a determinar sin inhibir la nitrificación ya que pueden desarrollarse organismos nitrificantes durante este tiempo. Compruébese el agua de dilución almacenada para determinar si sigue habiendo suficiente amoníaco después del almacenamiento. Si no es así, añádase solución de cloruro de amonio para proporcionar un total de 0,45 mg de amoníaco/l en calidad de nitrógeno. Si el agua de dilución no ha sido almacenada para mejorar su calidad, añádase suficiente material de siembra como para producir una captación de OD de 0,05 a 0,1 mg/l en 5 días a 20 °C. Incúbese un frasco de

DETERMINACIÓN DE COMPONENTES ORGÁNICOS

ROB lleno de agua de dilución durante cinco días a 20 °C. Determínese el OD inicial y final como en los apartados 4g y j. La captación de OD en 5 días a 20 °C no debería ser mayor de 0,2 mg/l y preferiblemente no mayor de 0,1 mg/l. c) Control de glucosa-ácido glutámico: Debido a que la prueba del ROB es un bioensayo, sus resultados pueden verse influidos en gran medida por la presencia de sustancias tóxicas o por el uso de un material de siembra de baja calidad. Las aguas destiladas suelen estar contaminadas con cobre; algunas simientes cloacales son relativamente inactivas. Con tales aguas y simientes siempre se obtienen resultados bajos. Compruébese periódicamente la calidad del agua de dilución, la efectividad de la simiente, y la técnica analítica mediante determinaciones del ROB en compuestos orgánicos puros y en muestras con adiciones conocidas. En general, para determinaciones del ROB que no requieren una simiente adaptada, utilícese una mezcla de 15 mg de glucosa/l y 150 mg de ácido glutámico/l como solución de control patrón. La glucosa tiene una tasa excepcionalmente alta y variable de oxidación, pero cuando se utiliza con ácido glutámico, dicha tasa se estabiliza, y es similar a la obtenida con muchas aguas residuales municipales. Alternativamente, si un agua residual particular contiene un componente principal identificable que contribuya al ROB, utilícese este compuesto en lugar de la glucosa-ácido glutámico. Determínese el ROB de 5 días a 20 °C de una disolución al 2 por 100 de la solución de control patrón de glucosaácido glutámico utilizando las técnicas expuestas en el apartado 4d-j. Evalúense los datos tal como se describe en el apartado 6, Precisión y sesgo. d) Siembra: 1) Fuente de la simiente: Es necesario tener presente una población de microorganismos capaces de oxidar la materia orgánica biodegradable de la muestra. El

5-7

agua residual doméstica, los efluentes no clorados, o desinfectados por otros medios, de las centrales de tratamiento biológico de los residuos, y las aguas de superficie que reciben las descargas de agua residual contienen poblaciones microbianas satisfactorias. Algunas muestras no contienen una población microbiana suficiente (por ejemplo, algunos residuos industriales no tratados, residuos desinfectados, residuos de alta temperatura, o con valores de pH extremos). Para tales residuos, siémbrese el agua de dilución añadiendo una población de microorganismos. La simiente preferida es el efluente de un sistema de tratamiento biológico procesador de residuos. Cuando no se disponga de ésta, utilícese el sobrenadante del agua residual doméstica después de dejarlo reposar a temperatura ambiente durante al menos 1 hora, pero no más de 36 horas. Cuando se utiliza el efluente de un proceso de tratamiento biológico, se recomienda inhibir la nitrificación. Algunas muestras pueden contener materiales no degradados a las tasas normales por los microorganismos en el agua residual doméstica en reposo. Siémbrense tales muestras con una población microbiana adaptada obtenida del efluente no desinfectado de un proceso biológico de tratamiento del residuo. En ausencia de tal servicio, obténgase simiente del agua receptora por debajo (preferiblemente de 3 a 8 km) del punto de descarga. Cuando tampoco se disponga de dichas fuentes de simiente, desarróllese una simiente adaptada en el laboratorio aireando continuamente una muestra de agua residual doméstica en reposo y añadiendo pequeños incrementos diarios de residuos. De forma opcional, utilícese una suspensión de suelo o lodo activo, o una preparación de simiente comercial para obtener la población microbiana inicial. Determínese la existencia de una población satisfactoria ensayando el rendimiento de la simiente en pruebas

5-8

de ROB realizadas en la muestra. Los valores del ROB que aumentan con el tiempo de adaptación hasta un valor estable alto indican adaptación con éxito de la simiente. 2) Simiente control: Determinar el ROB del material de siembra como para cualquier otra muestra. Es la simiente control. A partir de este valor y de uno conocido de la dilución del material de siembra (en el agua de dilución) determínese la captación de OD de la simiente. Lo ideal es hacer disoluciones de la simiente tales que la mayor cantidad resulte en al menos el 50 por 100 de depleción del OD. La representación de la depleción del OD, en miligramos por litro, frente a mililitros de simiente tendría que ser una línea recta cuya pendiente corresponde a la depleción de OD por mililitro de simiente. La intersección del eje OD representa la depleción de oxígeno causada por el agua de disolución y debería ser inferior a 0,1 mg/l (apartado 4h). Para determinar la captación de OD de una muestra se resta la captación de OD de la simiente de la captación de OD total. La captación de OD total del agua de disolución sembrada debería oscilar entre 0,6 y 1,0 mg/l. Se describen las técnicas para añadir material de siembra al agua de disolución para dos métodos de disolución (dilución) de la muestra (apartado 4f). e) Pretratamiento de la muestra: 1) Muestras con alcalinidad cáustica o acidez: Neutralícense las muestras a un pH entre 6,5 y 7,5 con una solución de ácido sulfúrico (H2SO4) o de hidróxido sódico (NaOH) de concentración tal que la cantidad de reactivo no diluya la muestra en más del 0,5 por 100. El pH del agua de dilución sembrada no debería verse afectado por la menor dilución de la muestra. 2) Muestras que contienen compuestos de cloro residual: Si es posible evítense las muestras que contengan cloro resi-

MÉTODOS NORMALIZADOS

dual, tomándolas antes del proceso de cloración. Si la muestra ha sido clorada pero no hay residuo detectable de cloro, siémbrese el agua de dilución. Si hay cloro residual, elimínese el cloro de la muestra y siémbrese el agua de dilución (apartado 4f). No ensayar las muestras cloradas/descloradas sin sembrar el agua de dilución. En algunas muestras, el cloro desaparecerá en el plazo de 1 a 2 horas después de su exposición a la luz. Esto suele ocurrir durante el transporte o la manipulación de la muestra. Para las muestras en las que el residuo de cloro no se disipa en un tiempo corto razonable, destrúyase el cloro residual añadiendo solución de Na2SO3. Determínese el volumen requerido de solución Na2SO3 en una fracción de 100 a 1.000 ml de muestra neutralizada añadiendo 10 ml de 1 + 1 ácido acético o 1 + 50 H2SO4, 10 ml de solución de yoduro potásico (KI) (10 g/l00 ml), y titulando con solución de Na2SO3 hasta el punto final del almidón-yodo para el residuo. Añádase a la muestra neutralizada el volumen relativo de la solución Na2SO3 determinada por la prueba anterior, mézclese, y después de 10 a 20 minutos, compruébese el cloro residual de la muestra. (NOTA: El exceso de Na2SO3 ejerce un requerimiento de oxígeno y reacciona lentamente con ciertos compuestos de cloraminas orgánicas que pueden estar presentes en las muestras cloradas.) 3) Muestras que contienen otras sustancias tóxicas: Ciertos residuos industriales, por ejemplo, los residuos resultados del plateado, contienen metales tóxicos. Tales muestras suelen requerir un estudio y tratamiento especiales. 4) Muestras supersaturadas con OD: En aguas frías, o en aguas donde se produce la fotosíntesis, es posible encontrar muestras que contienen más de 9 mg OD/l a 20 °C. Para evitar la pérdida de oxígeno durante la incubación de tales muestras, redúzcase el OD hasta la saturación a 20 °C calentando la muestra

DETERMINACIÓN DE COMPONENTES ORGÁNICOS

aproximadamente 20 °C en frascos parcialmente llenos mientras se agitan con fuerza o se airean con aire limpio, filtrado y comprimido. 5) Ajuste de la temperatura de la muestra: Pónganse las muestras a 20 °C ± 1 °C antes de hacer diluciones. 6) Inhibición de la nitrificación: Si se desea inhibir la nitrificación, añádanse 3 mg de 2-cloro-6-(tricloro metil) piridina (TCMP) a cada frasco de 300 ml antes de taparlos o añádase una cantidad suficiente al agua de dilución para obtener una concentración final de 10 mg/l. (NOTA: ES probable que el TCMP puro se disuelva lentamente y puede que flote en la capa superior de la muestra. Algunas fórmulas comerciales se disuelven mejor pero no son TCMP al 100 por 100; ajústese la dosificación en consecuencia). Entre las muestras que requieren inhibición de la nitrificación se incluyen, pero no son las únicas, los efluentes tratados biológicamente, las muestras sembradas con efluentes tratados biológicamente y las aguas fluviales. Debe hacerse la observación del uso de inhibición del nitrógeno cuando se presente el informe de los resultados. f) Técnica de dilución: Las diluciones que dan lugar a un OD residual de al menos 1 mg/l y una captación de OD de al menos 2 mg/l después de 5 días de incubación producen los resultados más fiables. Háganse varias diluciones de la muestra preparada para obtener captación de OD en dicho intervalo. La experimentación con una muestra concreta permitirá el uso de un número menor de diluciones. Un análisis más rápido, tal como el ROQ, presenta una correlación aproximada con el ROB y sirve como una guía para seleccionar las diluciones. En ausencia de datos previos, utilícense las siguientes disoluciones: 0,0 a 1,0 por 100 para los residuos industriales fuertes, 1 a 5 por 100 para las aguas residuales depuradas y brutas, del 5 al 25 por 100 para el efluente tratado biológicamente,

5-9

y del 25 al 100 por 100 para las aguas fluviales contaminadas. Prepárense las diluciones en probetas y pásense después a frascos de ROB, o prepárense directamente en frascos de ROB. Cualquier método de dilución puede combinarse con cualquier técnica de determinación del OD. El número de frascos que se preparen de cada dilución depende de la técnica OD y del número de duplicados deseados. Cuando se utilizan probetas para preparar las diluciones y es necesario sembrar, añádase la simiente directamente al agua de dilución o a las probetas individuales antes de diluir. La siembra de las probetas evita una disminución de la proporción de simiente con respecto a la muestra a medida que se hacen diluciones mayores. Cuando éstas se preparan en los frascos de ROB y es necesario sembrar, añádase la simiente directamente al agua de dilución o a los frascos ROB. 1) Diluciones preparadas en probetas: Si se utiliza la modificación azida del método de titulación yodométrico (sección 4500-O.C), añádase agua de dilución, sembrada si es necesario, por medio de un sifón y con cuidado, en una probeta de 1 a 2 l de capacidad. Llénese hasta la mitad sin arrastrar aire. Añádase la cantidad deseada de muestra mezclada con sumo cuidado y dilúyase hasta el nivel apropiado con agua de dilución. Mézclese bien con una varilla mezcladora de tipo émbolo; evítese la entrada de aire. Introdúzcase la dilución mezclada, por medio de un sifón, en dos frascos de ROB. Determínese el OD inicial en uno de dichos frascos. Tápese el segundo frasco herméticamente, con un sello hidráulico, e incúbese durante 5 días a 20 °C. Si se utiliza el método del electrodo de membrana para determinar el OD, viértase la mezcla de dilución en un frasco de ROB por medio de un sifón. Determínese el OD inicial en este frasco y reemplácese cualquier volumen desplazado con dilu-

5-10

ción de la muestra hasta llenar el frasco. Tápese herméticamente con un sello hidráulico e incúbese durante 5 días a 20 °C. 2) Diluciones preparadas directamente en frascos de ROB: Utilizando una pipeta volumétrica de boca ancha, añádase el volumen de muestra deseado a frascos de ROB individuales de capacidad conocida. Añádanse cantidades adecuadas del material de siembra a los frascos ROB individuales o al agua de dilución. Llénense los frascos con suficiente agua de dilución, sembrada si es necesario, de forma que la inserción del tapón desplace todo el aire, sin dejar burbujas. Para diluciones mayores de 1:100 hágase una primera dilución en una probeta antes de hacer la dilución final en el frasco. Cuando se utilizan los métodos yodométricos de titulación para medir el OD, prepárense dos frascos de cada una de las diluciones. Determínese el OD inicial en un frasco. Ajústese herméticamente el tapón al segundo frasco, póngase un sello hidráulico, e incúbese durante 5 días a 20 °C. Si se utiliza el método del electrodo de membrana para medir el OD, prepárese sólo una botella de ROB de cada dilución. Determínese el OD inicial de este frasco y reemplácese cualquier volumen desalojado con agua de dilución hasta llenarlo. Ciérrese herméticamente, con cierre hidráulico, e incúbese durante 5 días a 20 °C. Aclárese el electrodo OD entre las determinaciones para evitar la contaminación cruzada de las muestras. g) Determinación del OD inicial: Si la muestra contiene materiales que reaccionan muy deprisa con el OD, determínese el OD inicial inmediatamente después de llenar el frasco ROB con muestra diluida. Si la captación rápida inicial de OD es insignificante, el tiempo transcurrido entre la preparación de la dilución y la determinación del OD inicial no es crítico. Utilícese la modificación azida del método yodométrico (sección 4500-O.C) o el método del electrodo de membrana

MÉTODOS NORMALIZADOS

(4500 O.G) para determinar el OD inicial en todas las diluciones de la muestra, los blancos de dilución y, cuando sea apropiado, los controles de simiente. h) Blanco del agua de dilución: Empléese un blanco del agua de dilución como un control aproximado de la calidad del agua de dilución no sembrada y de la limpieza de los frascos de incubación. Junto con cada lote de muestras, incúbese un frasco de agua de dilución no sembrada. Determínese el OD inicial y final tal como se especifica en los apartados 4g y j. La captación de OD no deberá ser mayor de 0,2 mg/l y preferiblemente no superior a 0,1 mg/l. i) Incubación: Incúbese a 20 °C ± 1 °C los frascos de ROB que contengan las diluciones deseadas, los controles de simiente, los blancos de agua de dilución, y los controles de glucosa-ácido glutámico. Sellar los frascos como se ha descrito en el apartado 4 f. j) Determinación del OD final: Después de 5 días de incubación, determínese el OD en las diluciones de la muestra, en los blancos y en los controles, como en el apartado 4g. 5.

Cálculo

Cuando el agua de dilución no está sembrada:

Cuando el agua de dilución está sembrada:

donde: D1, = OD de la muestra diluida inmediatamente después de su preparación, mg/l,

DETERMINACIÓN DE COMPONENTES ORGÁNICOS

D 2 = OD de la muestra diluida después de 5 días de incubación a 20 °C, mg/l, P = fracción volumétrica decimal de la muestra utilizada, B 1 = OD del control de simiente antes de la incubación, mg/l (apartado 4d), B 2 = OD del control de simiente después de la incubación, mg/l (apartado 4d), y f = proporción de la simiente en la muestra diluida con respecto a la del control de simiente = (% de simiente en la muestra diluida)/(% simiente en el control de simiente).

Si se añade directamente la simiente a la muestra o a las botellas control de simiente: f = (volumen de cimiente en la muestra diluida)/(volumen de simiente en el control de simiente).

Exprésense los resultados como ROBC5 si se inhibe la nitrificación. Si más de una dilución de la muestra cumple los criterios de un OD residual de al menos 1 mg/l y una depleción de OD de al menos 2 mg/l, y no hay evidencia de toxicidad a concentraciones de muestra mayores o de error obvio, hállese el promedio de los resultados que encajan en el intervalo aceptable. No se deben hacer correcciones para la captación de OD por el blanco de agua de dilución durante la incubación. Esta corrección es innecesaria si el agua de dilución cumple los criterios del blanco estipulados antes. Si el agua de dilución no cumple estos criterios, es difícil hacer las correcciones adecuadas y los resultados serian cuestionables. 6.

Precisión y sesgo

No hay determinación que permita establecer el sesgo del procedimiento del ROB. El control de glucosa-ácido glutámico presentado en el apartado 4c está

5-11

pensado como un punto de referencia para la evaluación de la calidad del agua de dilución, de la eficacia de la simiente, y de la técnica analítica. Pruebas realizadas en un solo laboratorio, utilizando una solución mixta de 300 mg/l de glucosa-ácido glutámico, proporcionaron los siguientes resultados1: Número de meses: 14 Número de triplicados: 421 Promedio de recuperación mensual: 204 mg/l Desviación estándar del promedio mensual: 10,4 mg/l

En una serie de estudios cruzados entre laboratorios2, en cada uno de los cuales intervinieron de 2 a 112 laboratorios (e igual número de analistas y de fuentes de simiente), se hicieron medidas del ROB de 5 días en muestras de agua sintética que contenía una mezcla 1:1 de glucosa y ácido glutámico en el intervalo de concentraciones totales de 3,3 a 231 mg/l. Las ecuaciones de regresión para el valor medio, X , y la desviación estándar, S, de estos estudios fueron:

Para el estándar primario mixto de 300 mg/l, el ROB promedio de 5 días sería 198 mg/l con una desviación estándar de 30,5 mg/l. a) Límites control: Debido a los muchos factores que afectan a las pruebas del ROB en los estudios en los que intervienen múltiples laboratorios y, en consecuencia, a la extrema variabilidad obtenida en los resultados de la prueba, se recomienda una desviación estándar, determinada por pruebas interlaboratorio, como un límite control para los laboratorios individuales. O, de forma alternativa, el establecimiento, para cada laboratorio, de sus propios límites control

5-12

MÉTODOS NORMALIZADOS

realizando un mínimo de 25 comprobaciones glucosa-ácido glutámico (apartado 4c) durante un período de varias semanas o meses, y calculando la media y la desviación estándar. Utilícese la media ± 3 desviaciones estándar como límite control para las comprobaciones glucosa-ácido glutámico. Compárense los límites control calculados en las pruebas de un solo laboratorio presentadas antes con los resultados interlaboratorio. Si los límites control están fuera del rango de 198 ± 30,5, vuélvanse a evaluar e investigúese la fuente del problema. Si el ROB medido para una comprobación glucosaácido glutámico está fuera del intervalo de límites control aceptados, rechácense las pruebas hechas con esa simiente y ese agua de dilución. b) Intervalo de funcionamiento y límite de detección: El intervalo de funcionamiento es igual a la diferencia entre el OD inicial máximo (7 a 9 mg/l) y el OD residual mínimo de 1 mg/l multiplicado por el factor de dilución. Se establece un límite de detección inferior de 2 mg/l para una depleción de OD mínima de 2 mg/l. 7. 1.

Referencias K ENNEY , W. & J. R ESNICK . 1987. Personal communication with J. C. Young. Planta de

5220

Control de Contaminación de Aguas, Davenport, Iowa. 2. U.S. E NVIRONMENTAL P ROTECTION A GEN CY, OFFICE OF RESEARCH AND DEVELOPMENT. 1986. Method-by-Method Statistics from Water Pollution (WP) Laboratory Performance Evaluation Studies. Departamento de Control de Calidad. Laboratorio de Monitorización y Apoyo Medioambiental. Cincinnati, Ohio.

8.

Bibliografía

SAWYER, C. N. & L. BRADNEY. 1946. Modernization of the BOD test for determining the efficiency of the sewage treatment process. Sewage Works J. 18:1113. RUCHHOFT, C. C, O. R. PLACAR, J. KACHMAR & C. E. CALBERT. 1948. Variations in BOD velocity constant of sewage dilutions. Ind. Eng. Chem. 40:1290. ABBOTT, W. E. 1948. The bacteriostatic effects of methylene blue on the BOD test. Water Sewage Works 95:424. SAWYER, C. N., P. CALLEJAS, M. MOORE & A. Q. Y. T OM . 1950. Primary standards for BOD work. Sewage Ind. Wastes 22:26. YOUNG, J. C, G. N. MCDERMOTT & D. JENKINS. 1981. Alterations in the BOD procedure for the 15th edition of Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. J. Water Pollut. Control Fed. 53:1253.

REQUERIMIENTO DE OXÍGENO QUÍMICO (ROQ)* 5220 A.

El requerimiento de oxígeno químico (ROQ) se utiliza como una medida del equivalente de oxígeno del contenido de materia orgánica de una muestra susceptible de oxidación por un oxidante quí* Aprobado por el Standard Methods Committee, 1985.

Introducción mico fuerte. Para las muestras de una fuente especifica, el ROQ puede relacionarse empíricamente con el ROB, el carbono orgánico, o la materia orgánica. La prueba es útil para monitorizar y controlar después de haber establecido la correlación. Se prefiere el método de reflujo de dicromato a los procedimientos que utili-

DETERMINACIÓN DE COMPONENTES ORGÁNICOS

zan otros oxidantes debido a su mayor capacidad oxidante, a su aplicabilidad, a una mayor variedad de muestras y a su fácil manipulación. La oxidación de la mayoría de los compuestos orgánicos es del 95 al 100 por 100 del valor teórico. La piridina y los compuestos relacionados con ella resisten la oxidación, y los compuestos orgánicos volátiles sólo son oxidados en la medida en que permanecen en contacto con el oxidante. El amoníaco, presente en la materia orgánica que contiene nitrógeno, o liberado desde ella, no es oxidado en ausencia de una concentración significativa de iones cloruro libres.

1.

Selección del método

El método de reflujo abierto (B) es adecuado para una amplia gama de residuos en los que se prefiere un gran tamaño de muestra. Los métodos de reflujo cerrados (C y D) son más económicos en cuanto al uso de sales metálicas como reactivos, pero requieren homogeneización de las muestras que contengan sólidos suspendidos para obtener resultados reproducibles. Es posible obtener en el mercado ampollas y tubos de cultivo con reactivos medidos previamente. Basta seguir las instrucciones proporcionadas por el fabricante. Determínense los valores de ROQ > 50 mg O2/l utilizando los procedimientos expuestos en 5220B.4a, C.4, o D.b. Utilícese el procedimiento 5220B.46 para determinar, con menor exactitud, los valores de ROQ entre 5 y 50 mg O2/l.

2.

Interferencias y limitaciones

Los compuestos alifáticos de cadena lineal volátiles no se oxidan de forma apreciable. Esto ocurre en parte porque los compuestos orgánicos volátiles están

5-13

presentes en forma de vapor y no entran en contacto con el líquido oxidante. Los compuestos alifáticos de cadena lineal se oxidan con mayor eficacia cuando se añade sulfato de plata (Ag2SO4) como catalizador. Sin embargo, el Ag2SO4 reacciona con el cloro, el bromo y el yodo para producir precipitados oxidados sólo parcialmente. Las dificultades causadas por la presencia de haluros pueden ser superadas en gran medida, aunque no del todo, mediante la formación de un complejo con el sulfato de mercurio (HgSO4) antes del procedimiento de reflujo. Si bien se ha especificado 1 g de HgSO4 para 50 ml de muestra, es posible utilizar una cantidad menor cuando se sabe que la concentración de cloruro de la muestra es inferior a 2.000 mg/l, siempre que se mantenga una proporción 10:1 de HgSO4: Cl¯. No utilizar la prueba para muestras que contengan más de 2.000 mg Cl¯/l. Se dispone de técnicas diseñadas para medir el ROQ en aguas saladas1, 2. El nitrito ( NO-2 ) ejerce un ROQ de 1.1 mg O 2 /mg de NO-2 -N. Ya que las concentraciones de NO-2 en el agua raramente exceden de 1 o 2 mg de NO-2 N/l, la interferencia se considera no significativa y suele ser ignorada. Para eliminar una interferencia significativa debida al NO-2 , añádanse 10 mg de ácido sulfámico por cada mg de NO-2 -N presente en el volumen de muestra utilizado; añádase la misma cantidad de ácido sulfámico al vaso de reflujo que contenga el blanco de agua destilada. Las especies inorgánicas reducidas, tales como el hierro ferroso, el sulfuro, el manganeso manganoso, etc., resultan oxidadas cuantitativamente bajo las condiciones de la prueba. Para muestras que contengan niveles significativos de estas especies, puede suponerse una oxidación estequiométrica a partir de la concentración inicial conocida de las especies que interfieren, y se pueden hacer las correcciones para el valor ROQ obtenido.

5-14

MÉTODOS NORMALIZADOS

3. Toma de muestras y almacenamiento

Preferiblemente, recójanse las muestras en frascos de cristal. Ensáyense las muestras inestables sin demora. Si es inevitable el retraso antes del análisis, consérvese la muestra por acidificación a un pH ≤ 2 utilizando H2SO4 conc. Mézclense las muestras que contengan sólidos precipitables con un homogeneizador para permitir una toma de muestras representativa. Háganse diluciones preliminares de los residuos que conten-

5220 B. 1.

4. 1.

Referencias BURNS, E. R. & C. MARSHALL. 1965. Correction for chloride interference in the chemical oxygen demand test. J. Water Pollut. Control Fed. 37:1716. BAUMANN, F. I. 1974. Dichromate reflux chemical oxygen demand: A proposed method for chloride correction in highly saline waters. Anal. Chem. 46:1336.

2.

Método de reflujo abierto

Discusión general

a) Principio: La mayor parte de la materia orgánica resulta oxidada por una mezcla a ebullición de los ácidos crómico y sulfúrico. Se somete a reflujo una muestra en una solución acida fuerte con un exceso conocido de dicromato de potasio (K2Cr2O7). Después de la digestión, el K2Cr2O7 no reducido que quede se determina con sulfato de amonio ferroso para determinar la cantidad de K2Cr2O7 consumido y calcular la materia orgánica oxidable en términos de equivalente de oxígeno. Manténganse constantes las proporciones de pesos de reactivos, de volúmenes y de concentraciones cuando se utilicen volúmenes de muestra distintos de 50 ml. El tiempo estándar de reflujo de 2 horas puede reducirse si se ha demostrado que un período más corto produce los mismos resultados. 2.

gan un ROQ alto para reducir el error inherente a la determinación de volúmenes pequeños de muestra.

Instrumental

El instrumental para el reflujo consiste en matraces erlenmeyer de 500 o 250 ml

con cuello 24/40 de vidrio esmerilado * y un refrigerante † de 300 mm de chaqueta Liebig, West, o equivalente con junta de cristal esmerilado 24/40, y una placa caliente que tenga suficiente energía para producir al menos 1,4 W/cm2 de superficie de calentamiento, o equivalente. 3.

Reactivos

a) Solución de dicromato de potasio patrón, 0,0417M: Disuélvanse 12,259 g de K2Cr2O7, de calidad estándar primaria, secado previamente a 103 °C durante 2 horas, en agua destilada y dilúyase hasta 1.000 ml. b) Reactivo ácido sulfúrico: Añádase Ag 2 SO 4 , de calidad para reactivos o técnica, en cristales o en polvo, a H2SO4 conc. en la proporción de 5,5 g de Ag2SO4/kg de H2SO4. Déjese reposar de 1 a 2 días para disolver Ag2SO4. c) Solución indicadora de ferroína: Disuélvanse 1,485 g de 1,10-fenantrolina monohidratado y 695 mg de FeSO4. * Corning 5000 o equivalente. † Corning 2360, 91548 o equivalente.

DETERMINACIÓN DE COMPONENTES ORGÁNICOS

· 7H2O en agua destilada y dilúyase hasta 100 ml. Esta solución indicadora puede comprarse ya preparada ‡. d) Sulfato de amonio ferroso (SAF) patrón para titulación, aproximadamente 0,25M; Disuélvanse 98 g de Fe(NH4)2(SO4)2 · 6H2O en agua destilada. Añádanse 20 ml de H2SO 4 conc, frío, y dilúyase hasta 1.000 ml. Estandarícese esta solución a diario frente a una solución patrón de K2Cr2O7 como sigue: Dilúyanse 10,0 ml de K2Cr2O7 patrón hasta aproximadamente 100 ml. Añádanse 30 ml de H2SO4 conc. y enfríese. Valórese con titulante SAF utilizando 0,10 a 0,15 ml (2 a 3 gotas) de indicador ferroína. Molaridad de la solución SAF =

e) Sulfato mercúrico, HgSO4, cristales o polvo. f) Ácido sulfámico: Necesario sólo si debe eliminarse la interferencia de los nitritos (véase 5220A.2, anterior). g) Ftalato de hidrógeno de potasio (FHP) patrón: Tritúrese ligeramente y luego séquese el ftalato de hidrógeno de potasio (HOOCC6H4COOK) a peso constante a 120 °C. Disuélvanse 425 mg en agua destilada y dilúyase hasta 1.000 ml. El FHP tiene un ROQ 1 teórico de 1,176 mg O2/mg y esta solución tiene un ROQ teórico de 500 µg O2/ml. Es estable hasta 3 meses cuando se congela en ausencia de crecimiento biológico visible. 4.

Procedimiento

a) Tratamiento de las muestras con ROQ de > 50 mg O 2 / l: Introdúzcanse ‡ GFS Chemical Co., Columbus, Ohio.

5-15

50,0 ml de muestra (para las muestras con un ROQ de > 900 mg O2/l, usar fracciones de muestras más pequeñas diluidas hasta 50,0 ml) en un matraz de reflujo de 500 ml. Añádase 1 g de HgSO4, varias cuentas de cristal y, muy despacio, 5,0 ml de reactivo ácido sulfúrico, mezclando para disolver el HgSO4. Enfríese mientras se mezcla para evitar la posible pérdida de materiales volátiles. Añádanse 25,0 ml de solución de K2Cr2O7 0.0417M y mézclese. Sujétese el matraz al refrigerante y hágase girar en agua fría. Añádase el reactivo ácido sulfúrico restante (70 ml) a través del extremo abierto del refrigerante. Continúese agitando y mezclando mientras se añade el ácido sulfúrico. PRECAUCIÓN: Mézclese por completo la mezcla de reflujo antes de aplicar calor para evitar el calentamiento local del fondo del matraz y una posible explosión de su contenido. Cúbrase el extremo abierto del refrigerante con una pequeña cubeta para evitar la entrada de material extraño a la mezcla de reflujo y sométase a reflujo durante 2 horas. Enfríese y lávese el condensador con agua destilada. Desconéctese el condensador de reflujo y diluyase la mezcla hasta aproximadamente el doble de su volumen con agua destilada. Enfríese a temperatura ambiente y determínese el exceso de K2Cr2O7 con SAF, utilizando 0,10 a 0,15 ml (2 a 3 gotas) de indicador ferroína. Aunque la cantidad de este indicador no es critica, utilícese el mismo volumen para todas las titulaciones. Tómese como punto final de la titulación el primer cambio de color manifiesto desde el azul verdoso al marrón rojizo. El azul verdoso puede volver a aparecer. De la misma forma, sométase a reflujo y titúlese un blanco que contenga los reactivos y un volumen de agua destilada igual que la muestra. b) Procedimiento alternativo para las muestras con ROQ bajo: Sígase el procedimiento descrito en el apartado 4a, con dos excepciones: (i) empléese K2Cr2O7

5-16

MÉTODOS NORMALIZADOS

0,00417M patrón, y (ii) titúlese con SAF donde: 0,025M. Téngase extremo cuidado con este procedimiento ya que incluso una A = ml de SAF utilizados para el blanco, B = ml de SAF utilizados para la muestra, y traza de materia orgánica en el material M = molaridad del SAF. de vidrio o procedente de la atmósfera causa grandes errores. Si se requiere un aumento adicional de la sensibilidad, concéntrese un volumen de la muestra 6. Precisión y sesgo antes de realizar la digestión bajo reflujo, como sigue: añádanse todos los reactivos En 74 laboratorios se ensayó una serie a un volumen de muestra superior a 50 ml de muestras sintéticas que contenían ftay redúzcase el volumen total a 150 ml lato de hidrógeno y potasio y NaCl. En hirviéndolo en el matraz de reflujo sin un ROQ de 200 mg O /l, en ausencia de 2 tapar, en contacto con la atmósfera, sin cloruro, la desviación estándar fue de estar unido al refrigerante. Calcúlese la ± 13 mg/l (coeficiente de variación 6,5 cantidad de HgSO4 que hay que añadir por 100). En ROQ de 160 mg de O /l y 2 (antes de concentrar) sobre la base 100 mg de Cl¯/l, la desviación estándar de una relación de peso de 10:1 de fue ±14 mg/l (coeficiente de variación HgSO4:Cl¯, utilizando la cantidad de 10,8 por 100). Cl¯ presente en el volumen de muestra original. Realícese el mismo procedimiento con un reactivo en blanco. Esta técnica tiene la ventaja de concentrar la 7. Referencia muestra sin pérdidas significativas de los 1. PITWELL, L. R. 1983. Standard COD. Chem. materiales volátiles de fácil digestión. Se Brit. 19:907. pierden los materiales volátiles de difícil digestión, tales como los ácidos volátiles, pero se consigue una mejora sobre los 8. Bibliografía métodos de concentración por evaporación ordinarios. MOORE , W. A., R. C. KRONER & C. C. RUCHc) Determinación de la solución estánHOFT. 1949. Dichromate reflux method for determination of oxygen consumed. Anal. Chem. dar: Evalúese la técnica y la calidad de 21:953. los reactivos realizando la prueba en una solución de ftalato de hidrógeno y pota- MEDALIA, A. I. 1951. Test for traces of organic matter in water. Anal. Chem. 23:1318. sio patrón. 5.

Cálculo

MOORE , W. A., F. J. LUDZACK & C. C. RUCHHOFT . 1951. Determination of oxygenconsumed values of organic wastes. Anal. Chem. 23:1297. DOBBS, R. A. & R. T. WILLIAMS. 1963. Elimination of chloride interference in the chemical oxygen demand test. Anal. Chem. 35:1064.

5-17

DETERMINACIÓN DE COMPONENTES ORGÁNICOS

5220 C. 1.

Reflujo cerrado, método titulométrico

Discusión general

a) Principio: Véase sección 5220B.la. b) Interferencias y limitaciones: Véase sección 5220A.2. Los compuestos orgánicos volátiles resultan más oxidados en el sistema cerrado debido al mayor tiempo de contacto con el oxidante. Antes de usarlos cada vez, inspecciónense los tapones de los tubos de cultivo en busca de grietas en el revestimiento de TFE. Selecciónese el tamaño del tubo de cultivo para el grado de sensibilidad deseado. Utilícese el tubo de 25 x 150 mm para las muestras con bajo ROQ porque permiten tratar un volumen mayor de la muestra. 2.

Instrumental

a) Vasos de digestión: Preferiblemente, utilícense tubos de cultivo de borosilicato, de 16 x 100 mm, 20 x 150 mm o 25 x 150 mm, con tapones de rosca forrados con TFE. De forma alternativa, utilícense ampollas de borosilicato, capacidad 10 ml, 19 a 20 mm de diámetro. b) Bloque de calentamiento: Aluminio fundido, 45 a 50 mm de profundidad, con agujeros ajustados al tamaño de los tubos de cultivo o ampollas. c) Horno o calentador de bloque, que funcione a 150 ± 2 °C. NOTA: El grave deterioro causado a la mayoría de los cierres de los tubos de cultivo durante la digestión en el horno introduce una fuente potencial de contaminación y aumenta la probabilidad de escapes. Utilícese un horno para la digestión del tubo de cultivo sólo cuando se haya determinado que la exposición durante 2 horas a 150 °C no dañará el tapón. d) Sellador de la ampolla: Utilícese sólo un sellador mecánico para asegurar un cierre fuerte y consistente.

3.

Reactivos

a) Solución de digestión de dicromato de potasio patrón, 0,0167M: Añádanse a unos 500 ml de agua destilada 4,913 g de K 2 Cr 2 O 7 , calidad para reactivos primaria, previamente secado a 103 °C durante 2 horas, 167 ml de H 2 SO 4 conc. y 33,3 g de HgSO4. Disuélvase, enfríese a temperatura ambiente y dilúyase hasta 1.000 ml. b) Reactivo ácido sulfúrico: Véase sección 5220B.3b. c) Solución indicadora de ferroína: Véase sección 5220B.3c. d) Sulfato de amonio ferroso (SAF) patrón para titulación, aproximadamente 0,10 M: Disuélvanse 39,2 g de Fe(NH 4) 2(SO 4) 2 · 6H2O en agua destilada. Añádanse 20 ml de H2SO4 conc, enfríese y dilúyase hasta 1.000 ml. Estandarícese la solución a diario frente a la solución de digestión patrón de K2Cr2O7, como sigue: Añádanse los reactivos de acuerdo con la tabla 5220:1 a un tubo de cultivo que contenga el volumen correcto de agua destilada sustituido por la muestra. Enfríese el tubo a temperatura ambiente y añádase de 0,05 a 0,10 ml (1 a 2 gotas) de indicador de ferroína y titúlese con la solución de titulación de SAF. Molaridad de la solución de SAF =

e) Ácido sulfámico: Véase sección 5220B.3f. f) Patrón de ftalato hidrógeno de potasio: Véase sección 5220B.3g.

MÉTODOS NORMALIZADOS

5-18

TABLA 5220:I. CANTIDADES DE MUESTRA Y REACTIVOS PARA VARIOS VASOS DE DIGESTIÓN

4.

Procedimiento

Lávense los tubos de cultivo y los tapones con H2SO4 al 20 por 100 antes de usarlos por primera vez para evitar la contaminación. Consúltese la tabla 5220:I para los volúmenes adecuados de reactivos y muestras. Colóquese la muestra en el tubo de cultivo o en la ampolla y añádase la solución de digestión. Viértase con cuidado el ácido sulfúrico en el vaso, de forma que se cree una capa de ácido debajo de la capa de la solución de digestión de la muestra. Apriétese bien el tapón de los tubos o ciérrense bien las ampollas, e inviértase varias veces cada uno de ellos para mezclar completamente. PRECAUCIÓN: Utilícense mascarillas en la cara y protéjanse las manos del calor producido cuando se mezcla el contenido del vaso. Mézclese por completo antes de aplicar calor para evitar el calentamiento local del fondo del vaso y una posible reacción explosiva. Colóquense los tubos o las ampollas en un digestor de bloque o en un horno precalentado a 150 °C y sométase a reflujo durante 2 horas. Enfríese a temperatura ambiente y Colóquense los vasos en la rejilla de tubos de ensayo. Quítense los tapones de los tubos de cultivo y añádase una varilla de agitación magnética cubierta de TFE. Si se han utilizado ampollas, pásese el contenido a un envase más grande para titulación. Añádase de 0,05 a 0,10 ml (de 1 a 2 gotas) de indicador de

ferroína y agítese rápidamente en un agitador magnético mientras se titula con SAF 0,10M. El punto final es un marcado cambio de color del azul verdoso al marrón rojizo, aunque el azul verdoso puede volver a aparecer en pocos minutos. De la misma forma sométase a reflujo y titúlese un blanco que contenga los reactivos y un volumen de agua destilada igual al de la muestra. 5.

Cálculo

donde: A = ml de SAF utilizados para el blanco, B = ml de SAF utilizados para la muestra, y M = molaridad del SAF.

6.

Precisión y sesgo

Seis laboratorios ensayaron 60 muestras sintéticas que contenían ftalato hidrógeno de potasio y NaCl. A un ROQ promedio de 195 mg O2/l en ausencia de cloruro, la desviación estándar era + 11 mg O2/l (coeficiente de variación, 5,6 por 100). A un ROQ promedio de 208 mg O2/l y 100 mg Cl¯/l, la desviación estándar era ±10 mg O2/l (coeficiente de variación, 4,8 por 100).

5-19

DETERMINACIÓN DE COMPONENTES ORGÁNICOS

5220 D. 1.

Reflujo cerrado, método colorimétrico

Discusión general

a) Principio: Véase la sección 5220B.la. Los vasos de reacción colorimétrica son ampollas de cristal selladas o tubos de cultivo tapados. El consumo de oxígeno se mide a 600 nm con un espectrofotómetro frente los estándares. b) Interferencias y limitaciones: Véase la sección 5220C.1b. 2.

Instrumental

a) Véase sección 5220C.2. b) Espectrofotómetro: Para usar a 600 nm con adaptador de apertura de acceso para ampollas o tubos de 16, 20 o 25 mm. 3.

Reactivos

a) Solución de digestión: Añádanse a unos 500 ml de agua destilada, 10,216 g de K2Cr 2O 7, de calidad para reactivos estándar primaria, previamente secado a 103 °C durante 2 horas, 167 ml de H2SO4 conc. y 33,3 g de HgSO4. Disuélvase, enfríese a temperatura ambiente y dilúyase hasta 1.000 ml. b) Reactivo ácido sulfúrico: Véase sección 5220B.3b. c) Ácido sulfámico: Véase sección 5220B.3f. d) Ftalato de hidrógeno de potasio patrón: Véase sección 5220B.3g. 4.

el blanco y uno o más patrones como se especifica en la sección 5220C.4. b) Determinación de la reducción de dicromato: Inviértanse las muestras enfriadas, el blanco y los patrones varias veces y déjese que los sólidos se depositen antes de medir la absorbancia. Quítense los sólidos que se adhieren a la pared del envase mediante golpes suaves. Insértese el tubo o la ampolla cerrada a través de la puerta de acceso en la trayectoria de la luz del espectrofotómetro ajustado a 600 nm. Léase la absorbancia y compárese con la curva de calibración. Utilícense tubos o ampollas de cultivo ópticamente equiparables para conseguir mayor sensibilidad; deséchese el material de vidrio manchado o rayado. c) Preparación de la curva de calibración: Prepárense al menos cinco patrones de la solución ftalato hidrógeno de potasio con ROQ equivalentes que oscilen entre 20 y 900 µg O 2 /l. Complétese el volumen con agua destilada; utilícense los mismos volúmenes de reactivos, los mismos tubos, o tamaños de ampolla, y el mismo procedimiento de digestión que para las muestras. Prepárese la curva de calibración para cada nuevo lote de tubos o ampollas o cuando los patrones preparados en el apartado 4a difieran en ≥ el 5 por 100 de la curva de calibración.

5.

Cálculo

6.

Precisión y sesgo

Procedimiento

a) Tratamiento de las muestras: Mídase el volumen apropiado de muestra y reactivos en un tubo o en una ampolla como se indica en la tabla 5220:I. Prepárense, digiéranse y enfríense las muestras,

Cinco laboratorios ensayaron 48 muestras sintéticas que contenían ftalato

MÉTODOS NORMALIZADOS

5-20

hidrógeno de potasio y NaCl. A un ROQ promedio de 193 mg O2/l en ausencia de cloruro, la desviación estándar era de ± 17 mg O 2/l (coeficiente de variación 8,7 por 100). A un ROQ promedio de 212 mg O2/l y 100 mg Cl¯/l, la desviación estándar era ±20 mg O2/l (coeficiente de variación, 9,6 por 100).

5310

Bibliografía

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CARBONO ORGÁNICO TOTAL (COT)* 5310 A.

1.

7.

Discusión general

El carbono orgánico de las aguas limpias y residuales corresponde a diversidad de compuestos orgánicos en varios estados de oxidación. Algunos de tales compuestos del carbono pueden ser sometidos a una oxidación posterior por procesos químicos o biológicos; el requerimiento de oxígeno bioquímico (ROB) y el de oxígeno químico (ROQ) pueden utilizarse para caracterizar dichas fracciones. La presencia de carbono orgánico que no responda a las pruebas de ROB o de ROQ las hace inadecuadas para la determinación del carbono orgánico total. El carbono orgánico total (COT) es una expresión más conveniente y directa del contenido orgánico total que el ROB o el ROQ, pero no proporciona la misma clase de información. Si se establece una relación empírica repetible entre el COT y el ROB o el ROQ, el COT puede utilizarse para calcular el ROB o el ROQ acompañante. Esta relación debe establecerse de forma independiente para cada conjunto de condiciones de la matriz, tales como los diversos puntos en un proceso de tratamiento. A diferencia del * Aprobado por el Standard Methods Committee, 1985.

Introducción ROB o del ROQ, el COT es independiente del estado de oxidación de la materia orgánica y no mide otros elementos orgánicos, tales como el nitrógeno y el hidrógeno, o inorgánicos que puedan contribuir al requerimiento de oxígeno medido por el ROB o el ROQ. La determinación del COT no sustituye las pruebas de ROB o ROQ. Para determinar la cantidad de carbono orgánico, las moléculas orgánicas deben romperse en unidades de carbono simples y ser convertidas en una forma molecular sencilla que pueda medirse de forma cuantitativa. Los métodos de COT utilizan calor y oxígeno, irradiación ultravioleta, oxidantes químicos, o combinaciones de dichos oxidantes para convertir el carbono orgánico en dióxido de carbono (CO2). El CO2 puede medirse directamente en un analizador infrarrojo no dispersivo, puede ser reducido a metano y medido con un detector de ionización de llama, o puede ser titulado químicamente. 2.

Fracciones del carbono total

Los métodos e instrumentos utilizados para medir el COT analizan fracciones de carbono total (CT) mediante dos o más determinaciones. Estas fracciones de

DETERMINACIÓN DE COMPONENTES ORGÁNICOS

carbono total se definen como carbono inorgánico (CI) (el carbonato, el bicarbonato, y el CO2 disuelto); carbono orgánico total (COT) (todos los átomos de carbono unidos mediante enlaces covalentes en moléculas orgánicas); carbono orgánico disuelto (COD) (la fracción de COT que atraviesa un filtro de diámetro de poro de 0,45 µm); carbono orgánico no disuelto (COND) (al que también se hace referencia como carbono orgánico en partículas, la fracción del COT retenida en un filtro de 0,45 µm); carbono orgánico purgable (COP) (al que se hace referencia también como carbono orgánico volátil, la fracción del COT extraído de una solución acuosa por eliminación de gases bajo condiciones específicas); y carbono orgánico no purgable (CONP) (la fracción de COT no extraído por eliminación de gases). En la mayoría de las muestras, la fracción de CI es muchas veces superior a la fracción de COT. La eliminación o compensación de las interferencias del CI requiere múltiples determinaciones para medir el COT verdadero. Las interferencias del CI pueden ser eliminadas acidificando las muestras a pH 2 o inferior para convertir las especies de CI en CO2. Subsiguientemente, la purga de la muestra con un gas purificado elimina el CO2 por volatilización. La purga de la muestra elimina también el COP, de forma que la determinación de carbono orgánico hecha después de eliminar las interferencias del CI es en realidad una determinación del CONP; debe determinarse el COP para medir el COT verdadero. En muchas aguas superficiales y subterráneas la contribución del COP al COT es despreciable. Por tanto, en la práctica, la determinación del CONP es sustituida por la del COT. Como alternativa, es posible compensar la interferencia del CI midiendo por separado el carbono total (CT) y el carbono inorgánico. La diferencia entre el CT y el CI es el COT.

5-21

La fracción purgable del COT es una función de las condiciones específicas y del equipo empleado. La temperatura de la muestra, la salinidad, la velocidad del flujo gaseoso, el tipo de difusor de gases, las dimensiones del vaso de purga, el volumen purgado, y el tiempo de purga afectan a la división del COT en las fracciones purgable y no purgable. Cuando se midan por separado el COP y el CONP en la misma muestra, deben usarse condiciones idénticas de purga durante la determinación del COP a las utilizadas para la purga durante la preparación de la fracción de CONP para el análisis. Deben considerarse las condiciones de purga cuando se comparan los datos del COP o el CONP de diferentes laboratorios o diferentes instrumentos. 3.

Selección del método

El método de combustión-infrarrojo (B) es adecuado para las muestras con COT ≥ 1 mg/l. Para concentraciones inferiores, utilícese el método de oxidación persulfato-ultravioleta (C) o el método de oxidación húmeda (D). Véanse secciones 5310B.1, C.l, y D.l. 4.

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MÉTODOS NORMALIZADOS

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5310 B. 1.

nation of total organic carbon, total oxygen demand and related determinants, 1979. Her Majesty's Stationery Off., Londres. WERSHAW, R. L., M. J. FISHMAN, R. R. GRABBE & L. E. LOWE, eds. 1983. Methods for the Determination of Organic Substances in Water and Fluvial Sediments. U.S. Geological Survey Techniques of Water-Resources Investigations. Libro 5, Análisis de laboratorio, capítulo A3.

Método de combustión-infrarrojo

Discusión general

El método de combustión-infrarrojo ha sido utilizado para una gran diversidad de muestras, pero su exactitud depende de la reducción del tamaño de la partícula porque utiliza jeringas de orificio pequeño. a) Principio: Se homogeneiza y diluye la muestra según sea necesario, y se inyecta una microporción en una cámara de reacción caliente rellena con un catalizador oxidante tal como el óxido de cobalto. El agua se vaporiza y el carbono orgánico se oxida hasta CO2 y H2O. El CO2 de la oxidación del carbono orgánico e inorgánico es transportado en corrientes transportadoras de gas y se mide por medio de un analizador infrarrojo no dispersivo. Puesto que lo que se está determinando es el carbono total, debe medirse el CI por separado y obtener el COT por diferencia. Mídase el CI inyectando la muestra en una cámara de reacción distinta rellena de cuentas de cuarzo cubiertas con ácido fosfórico. Bajo condiciones acidas, todo el CI es convertido a CO2, el cual se mide. Bajo estas condiciones, el carbono orgánico no se oxida y sólo se mide el CI. Como alternativa, conviértanse los carbonatos inorgánicos a CO2 con ácido

y elimínese el CO2 purgando antes de la inyección de la muestra. La muestra contiene sólo la fracción CONP del carbono total; para medir el COT verdadero es necesario también determinar el COP. b) Interferencia: La eliminación del carbonato y el bicarbonato por acidificación y purga con gas purificado tiene como resultado la pérdida de sustancias orgánicas volátiles. Éstas pueden perderse también durante el mezclado de la muestra, en particular si se deja que la temperatura ascienda. Puede ocurrir otra importante pérdida si las grandes partículas que contienen carbono no caben en la aguja utilizada para la inyección. La filtración, aunque necesaria para eliminar la materia orgánica en partículas cuando va a determinarse sólo el COD, puede tener como resultado la pérdida o ganancia de COD, dependiendo de las propiedades físicas de los compuestos de carbono y de la adsorción del material carbonado al filtro, o su desadsorción de él. Compruébese la contribución de los filtros al COD analizando un blanco filtrado. Téngase en cuenta que cualquier contacto con materia orgánica puede contaminar una muestra. Evítense material de vidrio, envases de plástico, y tubos de caucho contaminados. Analícese el tratamiento, el sistema y los blancos de los reactivos.

5-23

DETERMINACIÓN DE COMPONENTES ORGÁNICOS

c) Concentración detectable mínima: 1 mg de carbono/l. Puede conseguirse con la mayoría de los analizadores de combustión en el infrarrojo aunque el rendimiento del instrumento varía. La concentración detectable mínima puede reducirse concentrando la muestra, o incrementando la porción tomada para el análisis. d) Toma de muestras y almacenamiento: Recójanse y guárdense las muestras en frascos de cristal ámbar con tapones revestidos de TFE. Antes de usar los frascos lávense con ácido, ciérrense con papel de aluminio y manténganse en el horno a 400 °C durante al menos una hora. Lávense los tabiques de TFE con detergente, aclárense repetidamente con agua libre de materia orgánica, envuélvanse en papel de aluminio y ténganse en el horno a 100 °C durante 1 hora. Es preferible utilizar secciones de TFE revestidos de caucho de silicona con tapones de apertura por rosca para obtener un cierre positivo. Debido a que el límite de detección es relativamente alto, es aceptable una limpieza menos rigurosa; utilícense blancos de frascos con cada conjunto de muestras. Utilícese un aparato de recogida de muestras de tipo Kemmerer o similar para tomar las muestras de una profundidad superior a 2 m. Consérvense las muestras que no puedan ser examinadas inmediatamente a 4 °C con exposición mínima a la luz y al aire atmosférico. Es posible utilizar acidificación con ácido fosfórico o sulfúrico a pH ≤ 2 sólo si se purga a continuación el carbono inorgánico. Bajo cualquier condición, redúzcase al mínimo el tiempo de almacenamiento. 2.

Instrumental

b) Jeringas: 0 a 50 µl, 0 a 200 µl, 0 a 500 µl, y 0 a 1 ml de capacidad †. c) Mezclador u homogeneizador de la muestra. d) Agitador magnético y varillas de agitación cubiertas de TFE. e) Aparatos de filtración y filtros de diámetro de poro de 0,45 µm.

3.

Reactivos

a) Agua para reactivos: Prepárense los blancos y las soluciones patrón con agua libre de carbono; utilícese preferiblemente agua destilada, filtrada de carbono. b) Ácido fosfórico, H3PO4, conc. Como alternativa, empléese ácido sulfúrico, H2SO4, pero no ácido clorhídrico. c) Solución de reserva de carbono orgánico: Disuélvanse 2,1254 g de biftalato de potasio anhidro, C8H5KO4, en agua sin carbono y dilúyase hasta 1.000 ml; 1,00 ml = 1,00 mg de carbono. Alternativamente, utilícese cualquier compuesto que contenga carbono orgánico de pureza, estabilidad y solubilidad en agua adecuadas. Consérvese acidificando con H 3 PO 4 o H 2 SO 4 apH ≤2. d) Solución de reserva de carbono inorgánico: Disuélvanse 4,4122 g de carbonato de sodio anhidro, Na2 CO 3 , en agua, añádanse 3,497 g de bicarbonato de sodio anhidro, NaHCO3, y diluyase hasta 1.000 ml; 1,00 ml = 1,00 mg de carbono. Alternativamente, utilícese cualquier otro carbonato inorgánico de pureza, estabilidad y solubilidad en agua adecuadas. Manténgase perfectamente taponado. No acidificar. e) Gas portador: Oxígeno purificado o aire, libre de CO2 y que contenga me-

a) Analizador de carbono orgánico total*. * Instrumentos Beckman Modelo n.° 915B o equivalente.

† Hamilton n.° 705 o 750 N: CR-700-20 o CR-700200 con punta de aguja n.° 3, o equivalente. Las jeringas cargadas por resorte (muelle) rinden resultados más reproducibles.

5-24

MÉTODOS NORMALIZADOS

nos de 1 ppm de hidrocarburo (como metano). f) Gas de purga: Cualquier gas libre de CO2 e hidrocarburos. 4.

Procedimiento

a) Funcionamiento del instrumental: Síganse las instrucciones del fabricante para la instalación del analizador, el ensayo, la calibración y su funcionamiento. Ajústese la temperatura de combustión óptima (900 °C) antes de usar el instrumento; monitorizar la temperatura para asegurar la estabilidad. b) Tratamiento de la muestra: Si una muestra contiene materia insoluble o sólidos macroscópicos, homogeneícese hasta obtener respuesta satisfactoria. Analícese un blanco de homogeneización consistente en agua para reactivos sometido al tratamiento de homogeneización. Si debe eliminarse carbono inorgánico antes del análisis, pásese una porción representativa de 10 a 15 ml a una cubeta de 30 ml, añádase H3PO4 conc. para reducir el pH a 2 o menos, y Púrguese con gas durante 10 minutos. No se debe usar material de plástico. El carbono inorgánico puede ser extraído también agitando la muestra acidificada en una cubeta mientras se dirige una corriente de gas purificado al interior de la cubeta. Debido a que se perderá el carbono orgánico volátil durante la purga de la solución acidificada, exprésese el carbono orgánico como carbono orgánico no purgable. Si se dispone de un instrumento que proporcione una determinación por separado del carbono inorgánico (carbonato, bicarbonato, CO2 libre) y del carbono total, omítase la descarbonación y procédase según las directrices del fabricante para determinar el COT por diferencia entre el CT y el CI. Si se va a determinar el carbono orgánico disuelto, fíltrese la muestra a través

de filtros de diámetro de poro de 0,45 µm, al vacío; analícese un blanco de filtración. c) Inyección de la muestra: Retírese una porción de la muestra preparada utilizando una jeringa equipada con una aguja de punta roma. Selecciónese el volumen de la muestra según las directrices del fabricante. Agítense las muestras que contengan partículas con un agitador magnético. Selecciónese el tamaño de la aguja de acuerdo con el tamaño de partículas de la muestra. Inyéctense las muestras y los patrones en el analizador según las directrices del fabricante y anótese la respuesta. Repítase la inyección hasta obtener picos consecutivos reproducibles en el intervalo ±10 por 100. d) Preparación de la curva estándar: Prepárense series de carbono orgánico e inorgánico patrón, diluyendo las soluciones de reserva (stock), que abarquen el intervalo esperado en las muestras. Inyéctese y anótese la altura del pico de estos patrones y de un blanco de agua de dilución. Represéntese la concentración de carbono en miligramos por litro frente a la altura del pico corregido en milímetros en papel milimetrado. Esto no es necesario en los instrumentos provistos de un lector digital de la concentración. Si es conveniente, prepárese una curva estándar con concentraciones de 1 a 10 mg/l mediante las diluciones adecuadas de los patrones. Con la mayoría de los analizadores COT, no es posible determinar por separado blancos del agua para reactivos, de los reactivos y del sistema completo. Además, algunos analizadores COT producen un blanco variable y errático que no puede ser corregido con seguridad. En muchos laboratorios, el agua para reactivos es el principal contribuyente del valor del blanco. Él corregir sólo la altura del pico de los patrones (que contienen agua para reactivos + reactivos + blanco del sistema) crea un error positivo, mientras que corregir también las

5-25

DETERMINACIÓN DE COMPONENTES ORGÁNICOS

muestras (que contienen sólo las contribuciones de los reactivos y del blanco del sistema) para el agua para reactivos blanco crea un error negativo. Háganse mínimos los errores usando agua para reactivos y reactivos con bajo contenido en carbono. Inyéctense las muestras y los blancos del procedimiento (que consisten en agua para reactivos llevada a través de cualquiera de las etapas preanálisis y cuyos valores son típicamente más altos que los del agua para reactivos) y determínense las concentraciones de carbono orgánico de la muestra comparando las alturas del pico corregido con la curva de calibración. 5.

Cálculos

a) Cuando el agua para reactivos constituye una parte importante del blanco total:

1) Calcúlese la altura del pico corregida de los patrones restando la altura del pico del blanco menos el agua para reactivos de las alturas de los picos del patrón. 2) Prepárese una curva estándar de altura del pico corregido frente a la concentración de COT. 3) Réstese el blanco del procedimiento de la altura del pico de cada muestra y compárese con la curva estándar para determinar el contenido de carbono. NOTA: Habrá un error positivo si el COT del agua para reactivos es significativo en comparación con el COT de la muestra. Hágase todo lo posible para obtener agua para reactivos libre de carbono. 4) Aplíquese el factor de dilución apropiado cuando sea necesario. 5) Réstese el carbono orgánico del carbono total cuando se determine el COT por diferencia. b) Cuando el agua para reactivos constituye una parte mínima del blanco total:

1) Calcúlese la altura del pico corregida de patrones y las muestras restando la altura del pico del blanco del agua para reactivos de las alturas del pico del estándar y de la muestra. 2) Prepárese una curva estándar de la altura del pico corregida frente a la concentración del COT. 3) Réstese el blanco de procedimiento de la altura del pico de cada muestra y compárese con la curva estándar para determinar el contenido de carbono. Los valores tendrán un error negativo igual a la contribución del blanco del agua para reactivos. 4) Aplíquese el factor de dilución adecuado cuando sea necesario. 5) Réstese el carbono inorgánico del carbono total cuando el COT se determine por diferencia. NOTA: Si el diseño del analizador de COT permite aislar cada una de las contribuciones del blanco total, aplíquense las correcciones del blanco apropiadas a las alturas del pico de los patrones (blanco reactivo, blanco agua, blanco del sistema) y de la muestra (blanco reactivo y blanco del sistema).

6.

Precisión

La dificultad de recoger muestras de materia en partículas en muestras no filtradas limita la precisión del método en aproximadamente el 5 al 10 por 100. En muestras limpias o en muestras que han sido filtradas antes del análisis, la precisión se aproxima al 1-2 por 100 o ± la 2 mg carbono/l, dependiendo de cual sea mayor.

7.

Bibliografía

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MÉTODOS NORMALIZADOS

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Método de oxidación persulfato-ultravioleta

Discusión general

Se dispone de muchos instrumentos que utilizan la oxidación con persulfato del carbono orgánico. Dependen de la activación por calor o por irradiación ultravioleta de los reactivos. El método de oxidación persulfato-ultravioleta es un método rápido y preciso para la determinación de niveles traza de carbono orgánico en el agua, y es de particular interés para las industrias electrónica, farmacéutica y de generación de energía por vapor en las que incluso concentraciones traza de compuestos orgánicos pueden reducir la capacidad de intercambio iónico, servir como nutrientes para el crecimiento biológico, o ser perjudiciales al proceso para el que está siendo utilizada el agua. a) Principio: El carbono orgánico es oxidado a dióxido de carbono, CO2, por persulfato en presencia de luz ultravioleta. El CO2 producido puede medirse directamente por un analizador infrarrojo no dispersivo, ser reducido a metano y medido por un detector de ionización de llama, o titularse químicamente. Se dispone de instrumentos que utilizan una lámpara ultravioleta sumergida en un reactor purgado continuamente por gas que se llena con una solución de persulfato de alimentación constante.

Las muestras se introducen en serie en el reactor por medio de un toma-muestras automático o se inyectan a mano. El CO2 producido salpica continuamente desde la solución y es transportado en la corriente de gas a un analizador infrarrojo que está sintonizado de forma específica con la longitud de onda de absorción del CO2. El microprocesador del instrumento calcula el área de los picos producidos por el analizador, los compara con el área del pico del patrón de calibración almacenado en su memoria, e imprime un valor de carbono orgánico calibrado en miligramos por litro. b) Interferencias: Véase la sección 5310B.1. Una acidificación excesiva de la muestra, que produzca una reducción del pH de la solución persulfato a 1 o menos, puede tener como resultado la oxidación lenta e incompleta del carbono orgánico. Muestras muy turbias o el envejecimiento de la fuente ultravioleta pueden reducir la intensidad de la luz ultravioleta que alcanza la matriz de la muestra, lo que tiene como resultado una oxidación lenta o incompleta. Las partículas orgánicas grandes o muy grandes, o las moléculas orgánicas complejas, tales como los taninos, las ligninas y el ácido húmico se oxidan despacio porque la oxidación con persulfato está limitada en velocidad. Debido a que la eficiencia de conversión

5-27

DETERMINACIÓN DE COMPONENTES ORGÁNICOS

del carbono orgánico a CO2 puede verse afectada por muchos factores, debe verificarse la eficiencia de la oxidación con compuestos modelos seleccionados representativos de la muestra. La oxidación con persulfato de las moléculas orgánicas resulta con menor velocidad en las muestras que contienen concentraciones significativas de cloruro debido a la oxidación preferente de éste; a una concentración del 0,1 por 100, es posible inhibir completamente la oxidación de cloruro de la materia orgánica. Para eliminar esta interferencia añádase nitrato mercúrico a la solución de persulfato. Con cualquier determinación de carbono orgánico, la contaminación durante la manipulación y el tratamiento de la muestra es una probable fuente de interferencia. Esto es especialmente cierto para los análisis de elementos traza. Téngase extremo cuidado al recoger, manipular y analizar muestras con menos de 1 mg COT/l. c) Concentración detectable mínima: Puede medirse una concentración de 0,05 mg de carbono orgánico/l si se presta escrupulosa atención en reducir al mínimo la contaminación de la muestra y el fondo del método. Utilícese el método combustión-infrarrojo (B) para concentraciones altas de COT. d) Toma de muestras y almacenamiento: Véase sección 5310B.ld. 2.

Instrumental

a) Analizador de carbono orgánico total*. b) Jeringas: de 0 a 50 µl, de 0 a 250 µl y de 0 a 1 ml de capacidad, equiparadas con agujas de punta roma. 3.

Reactivos

Véase sección 5310B.3. * Xertex-Dohrmann DC-80 o equivalente.

4.

Procedimiento

a) Funcionamiento del instrumento: Síganse las instrucciones del fabricante para la instalación, ensayo, calibrado y manejo. b) Preparación de la muestra: Si una muestra contiene partículas macroscópicas o materia insoluble, homogeneícese hasta que pueda retirarse una porción representativa mediante la aguja de la jeringa o en los tubos del toma-muestras automático. Si va a determinarse el carbono orgánico disuelto, fíltrese la muestra y un blanco do agua para reactivos a través de un filtro de fibra de vidrio de 0,45 µm de diámetro, al vacío. Trátese previamente el filtro sumergiéndolo una noche en una solución 1:1 de HNO3 y agua para reactivos y recójase con un matraz mantenido en el horno, lavado con ácido. Utilícese un filtro y un matraz limpio para cada muestra. Para determinar el CONP, pásense de 15 a 30 ml de muestra a un matraz o a un tubo de ensayo y acidúlese hasta un pH de 2. Púrguese según las recomendaciones del fabricante. c) Inyección de la muestra: Véase la sección 5310B.4c. d) Preparación de la curva patrón: Prepárese una serie patrón de carbono orgánico en el intervalo de concentraciones de carbono orgánico presentes en las muestras. Inyéctense los patrones y los blancos y regístrese la respuesta del analizador. Determínese el área del pico para cada patrón y cada blanco. Puede ocurrir que las determinaciones basadas en la altura del pico sean inadecuadas debido a la diferente velocidad de oxidación de los patrones y las muestras. Corríjase el área del pico de los patrones restando el agua para reactivos blanco y represéntese la concentración de carbono orgánico en miligramos por litro frente al área del pico corregida. Para los instru-

5-28

MÉTODOS NORMALIZADOS

mentos provistos de lectura digital de la concentración esto no es necesario. Inyéctense las muestras, los blancos de tratamiento, si es aplicable, y el blanco del instrumento. Réstese el área del pico de cada muestra menos el área del pico del blanco adecuado y determínese el carbono orgánico a partir de la curva estándar. 5.

Cálculo

Véase sección 5310B.5, pero empléese el área del pico en lugar de la altura del pico. 6. Precisión y sesgo

Véase tabla 5310:1.

TABLA 5310:I.

7.

Bibliografía

BEATTIE, J., C. BRICKER & D. GARVIN. 1961. Photolytic determination of trace amounts of organic material in water. Anal. Chem. 33:1890. ARMSTRONG, F. A. J., P. M. WILLIAMS & J. D. H. STRICKLAND. 1966. Photooxidation of organic matter in sea water by ultraviolet radiation, analytical and other applications. Nature 211:481. BRAMER, H. C. , M. J. WALSH & S. C. CARUSO. 1966. Instrument for monitoring trace organic compounds in water. Water Sewage Works 113:275. DOBBS, R. A., R. H. WISE & R. B. DEAN. 1967. Measurement of organic carbon in water using the hydrogen flame ionization detector. Anal. Chem. 39:1255. MONTGOMERY, H. A. C. & N. S. THOM. 1967. The determination of low concentrations of organic carbon in water. Analyst 87:689.

PRECISIÓN Y SESGO PARA EL CARBONO ORGÁNICO TOTAL (COT) POR OXIDACIÓN PERSULFATO-ULTRAVIOLETA

5-29

DETERMINACIÓN DE COMPONENTES ORGÁNICOS

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5310 D. 1.

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Método de oxidación húmeda

Discusión general

El método de oxidación húmeda es adecuado para el análisis del agua, de las mezclas de sedimentos suspendidos en el agua, de las aguas salobres y de las aguas residuales que contengan al menos 0,1 mg de carbono orgánico no purgable (CONP)/l. El método no es adecuado para la determinación de los constituyentes orgánicos volátiles. a) Principio: La muestra es acidificada, purgada para eliminar la materia orgánica, y oxidada con persulfato en un autoclave a temperaturas que oscilan desde 116 hasta 130 °C. El dióxido de carbono resultante (CO2) se mide por espectrometría infrarroja no dispersiva. b) Interferencias: Véanse las secciones 5310B.1 y C.l. c) Concentraciones detectables mínimas: Pueden interferir concentraciones altas de agentes reductores. Puede medirse hasta una concentración de 0,10 mg de carbono orgánico/l si se pone mucha atención en minimizar la contaminación de la muestra y el fondo del método. Utilícese el método de combustión-infrarrojo (B) para concentraciones altas de COT. d) Toma de muestras y almacenamiento: Véase sección 5310B.1d.

2.

Instrumental

a) Ampollas, cristal de 10 ml, prequemado *. b) Unidad de purga y sellado de la ampolla*. c) Autoclave*. d) Analizador de carbono*. e) Homogeneizador†.

3.

Reactivos

Además de los reactivos especificados en la sección 5310B.3a, c, e y f, se requieren los siguientes reactivos: a) Solución de ácido fosfórico, H3PO4, 1,2N: añádanse 83 ml de H3PO4 (85 por 100) a agua y Dilúyanse hasta 1 l con agua. Almacénense en una botella de cristal perfectamente tapada. b) Persulfato de potasio, de calidad para reactivo, granular. Evítese la utilización de las formas finamente divididas.

* Oceanographics International Corp. o equivalente. † Willems Polytron PT-105T, Brinkman Inst., o equivalente.

MÉTODOS NORMALIZADOS

5-30

4.

Procedimiento

a) Funcionamiento del instrumento: Síganse las instrucciones del fabricante para la instalación, ensayo, calibrado y manejo. Añádase 0,2 g de persulfato de potasio, utilizando una cuchara calibrada, para conseguir 0,2 g y 0,5 ml de solución de H3PO4 1,2N para ampollas prequemadas. Para analizar el carbono orgánico disuelto, fíltrese la muestra y el blanco de agua para reactivos al vacío en dos filtros distintos de fibra de vidrio de 0,45 µm que hayan sido pretratados sumergiéndolos durante una noche en una solución 1:1 de HNO3 y agua para reactivos y recogidos en matraces mantenidos en el horno y lavados con ácido. Utilícese un filtro y un matraz limpio para cada muestra. Homogeneícese la muestra para producir una suspensión uniforme. Aclárese el homogeneizador con agua para reactivos después de cada uso. Tómese con la pipeta la muestra de agua (10,0 ml máximo) en una ampolla. Ajústense los volúmenes menores hasta 10 ml con agua para reactivos. Prepárese un blanco del reactivo (10 ml de agua para reactivos más ácido y oxidante) para cada 15 a 20 muestras de agua. Prepárense patrones que cubran el intervalo de 0,1 a 40 mg de carbono/l diluyendo la solución patrón de carbono. Inmediatamente, colóquense las ampollas llenas en la unidad de purga y sellado, y púrguense a la velocidad de 60 ml/min durante 6 minutos con oxigeno purificado. Séllense las muestras de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Colóquense las muestras selladas, los blancos y un conjunto de patrones en rejillas para ampollas en un autoclave y ténganse en digestión durante 4 horas a una temperatura entre 116 y 130 °C. Establézcase el intervalo de sensibilidad del analizador de carbono ajustado al cero, y distánciense los controles según

las instrucciones del fabricante. Rómpanse las ampollas quemadas en el cortador del analizador del carbono, bárrase el CO2 hacia la célula infrarroja con gas nitrógeno, y regístrese el área de cada pico de CO2. PRECAUCIÓN: Debido a que las ampollas quemadas están bajo presión positiva, manéjense con cuidado para evitar que exploten. 5.

Cálculos

Prepárese una curva estándar analítica que represente el área del pico de cada patrón frente a la concentración (mg/l) de los patrones de carbono orgánico. La relación entre el área del pico y la concentración de carbono es curvilínea. Defínanse las curvas de funcionamiento cada día que se analicen las muestras. Preséntense los resultados de la concentración de carbono orgánico no purgable (CONP) como sigue: 0,1 mg/l a 0,9 mg/l, una cifra significativa; 1,0 mg/l y superior, dos cifras significativas. 6.

Precisión y sesgo

Determinaciones múltiples de cuatro concentraciones diferentes de muestras de ftalato ácido de potasio acuoso de 2,00, 5,00, 10,0 y 40,0 mg carbono/l dieron valores medios de 2,2, 5,3, 9,9 y 3,8 mg/l y desviaciones estándar de 0,13, 0,15, 0,11 y 1,4, respectivamente. La precisión puede expresarse también en términos de porcentaje relativo de la desviación estándar como sigue:

DETERMINACIÓN DE COMPONENTES ORGÁNICOS

7.

Bibliografía

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5320

5-31

MACKINNON, M. D. 1981. The measurement of organic carbon in seawater. En E. K. Duursma & R. Dawson, eds. Marine Organic Chemistry: Evolution, Composition, Interactions and Chemistry of Organic Matter in Seawater. Elsevier Scientific Publishing Co., Nueva York, Nueva York.

HALÓGENO ORGÁNICO DISUELTO* 5320 A.

El halógeno orgánico disuelto (HOD) es una medida utilizada para calcular la cantidad total de materia orgánica halogenada disuelta en una muestra de agua. Es similar a la determinación de lo que se conoce en la bibliografía como «TOX». La presencia de moléculas orgánicas halogenadas es indicativa de contaminación química sintética. Los compuestos halogenados que contribuyen al resultado de HOD incluyen, pero no están limitados a, los trihalometanos (THMs); los disolventes orgánicos tales como el tricloroetano, el tetracloroetano, y otros aléanos y alquenos halogenados; los pesticidas y herbicidas clorados y bromados; los bifenilos policlorados (BPCs); los compuestos aromáticos clorados tales como el hexaclorobenceno y el 2,4-diclorofenol; y las sustancias húmicas acuáticas parcialmente cloradas, de elevado peso molecular. Los métodos específicos para cada compuesto, tales como la cromatografía de gases, son típicamente más sensibles que la determinación de HOD. El método titulométrico de adsorciónpirólisis para los HOD mide sólo la cantidad molar total de halógenos orgánicos disueltos retenidos en el adsorbente de carbono; no informa de la estructura o * Aprobado por el Standard Methods Committee, 1988.

Introducción naturaleza de los compuestos orgánicos a los que están unidos los halógenos o de los halógenos individuales presentes. Es sensible al cloruro, al bromuro y al yoduro orgánicos pero no detecta los materiales fluorados. La determinación de HOD es un método útil y no caro para el «screening» de gran cantidad de muestras antes de los análisis específicos (y a menudo más complejos); para examinar la contaminación de las aguas naturales por ciertas clases de compuestos orgánicos sintéticos; para trazar el mapa de contaminación de las aguas subterráneas por haluros orgánicos; para monitorizar el punto de penetración de algunos compuestos orgánicos sintéticos en los procesos de tratamiento de agua; y para valorar el nivel de formación de productos secundarios orgánicos clorados después de la desinfección con cloro. Cuando se utiliza como una herramienta de selección, un resultado muy positivo del ensayo HOD (es decir, superior a las determinaciones de fondo) indica la necesidad de identificar y cuantificar las sustancias específicas. En las aguas salinas o salobres interfieren las altas concentraciones de halógenos inorgánicos. Siempre que se interpretan los resultados debe considerarse la posibilidad de sobrevalorar la concentración de HOD debido a la interferencia de haluros inorgánicos.

MÉTODOS NORMALIZADOS

5-32

5320 B. 1.

Método titulométrico de adsorción-pirólisis

Discusión general

a) Principio: El método consiste en cuatro procesos. Primero, se separa la materia orgánica disuelta de los haluros inorgánicos y se concentra a partir de la solución acuosa por adsorción en carbón activo. Segundo, se extraen haluros inorgánicos presentes en el carbono activado por desplazamiento competitivo por iones nitrato. Tercero, se introduce el carbono activado con la materia orgánica adsorbida en un horno en el que el carbono orgánico es pirolizado a dióxido de carbono (CO2) y los haluros unidos a haluros de hidrógeno (HX). Cuarto, se transportan los HX en una corriente de gas portador hasta una célula de titulación microcolorimétrica donde se cuantifica la cantidad de haluro midiendo la corriente producida por la precipitación de los haluros por el ion plata. El funcionamiento del detector microcolorimétrico se basa en el mantenimiento de una concentración constante de ion plata en una célula de titulación. Se aplica un potencial eléctrico a un electrodo de plata sólido para producir iones de plata en la solución de la célula. A medida que el haluro de hidrógeno del horno de pirólisis entra en la célula transportado por el gas portador, es distribuido en la solución de ácido acético donde precipita como haluro de plata. La corriente que se produce se integra para todo el período de pirólisis. El área integrada bajo la curva es proporcional al número de moles de halógeno recuperado. La concentración de haluros orgánicos se expresa como una concentración equivalente de cloruro orgánico en microgramos por litro. Cuando se purga una muestra con gas inerte antes de su adsorción al carbón activo, el análisis de esta muestra determina la fracción de halógeno orgánico disuelto no purgable (HODNP) de los

HOD. La concentración de halógeno orgánico purgable (HOP) se calcula restando el valor HODNP del valor HOD. Como alternativa, la fracción HOP puede determinarse directamente purgando la muestra con el gas portador e introduciendo esta corriente de gas y los compuestos orgánicos volatilizados directamente en el horno de pirólisis. El valor de HODNP puede determinarse, a partir del análisis del HOP y del HOD, por diferencia. b) Interferencias: El método es aplicable sólo a las muestras acuosas libres de materia en partículas. Sustancias inorgánicas tales como cloruro, clorito, clorato, bromuro, y yoduro se adsorberán en el carbón activo en una medida que depende de su concentración original en la solución acuosa y del volumen de la muestra adsorbida. Si los haluros inorgánicos no son extraídos habrá interferencia positiva. El tratamiento del carbón activo con una solución acuosa concentrada de ion nitrato da lugar a desadsorción competitiva del carbón activo de las especies de haluro inorgánico, y lava los haluros inorgánicos de otras superficies. Sin embargo, si la concentración de haluros inorgánicos es superior a 20.000 veces la concentración de haluros orgánicos, los resultados de HOD pueden verse afectados de forma significativa. En general, este procedimiento puede no ser aplicable a muestras con concentraciones de haluro inorgánico por encima de 500 mg Cl¯/l, obtenidas en los ensayos de calidad del carbono. Por tanto, deben considerarse los resultados tanto del análisis mineral para los haluros inorgánicos como de la prueba de calidad del carbono (véase apartado 5, más adelante) cuando se interpreten los resultados. Los compuestos orgánicos halogenados que se adsorben de forma débil al carbono activado son recuperados sólo en parte. Entre ellos se incluyen ciertos

DETERMINACIÓN DE COMPONENTES ORGÁNICOS

alcoholes y ácidos (por ejemplo, cloroetanol), y compuestos tales como el ácido cloroacético, que puede ser extraído del carbón activo mediante lavado con el ion nitrato. Sin embargo, para la mayoría de las moléculas orgánicas halogenadas, la recuperación es muy buena; por tanto, la determinación de haluro orgánico adsorbible en carbono activado (HOCA) es una buena valoración del HOD verdadero. El fracaso en la acidificación de las muestras con ácido nítrico puede tener como resultado una reducida eficiencia de adsorción para algunos compuestos orgánicos halogenados e intensificar la interferencia de los haluros inorgánicos. Además, si el agua contiene cloro residual, debe reducirse antes de la adsorción para eliminar la interferencia positiva resultante de las reacciones de cloración continuadas con los compuestos orgánicos adsorbidos en la superficie del carbón activo o con la propia superficie de carbón activo. El agente de descloración sulfito puede causar descomposición de una pequeña fracción del HOD; no debe añadirse en mucho exceso. Los compuestos muy volátiles de la fracción HOP pueden perderse durante la toma, el transporte, el almacenamiento, el manejo, y la preparación de la muestra, o durante su adsorción. Es vital la existencia de un programa de control de calidad del laboratorio para asegurar la integridad de la muestra a partir del momento de su recogida hasta el análisis. Durante la filtración de las muestras para analizar las que contengan sólidos no disueltos cabe esperar importantes pérdidas de HOP. Por tanto, analícese el HOP antes de la filtración de la muestra y el HODNP después de la filtración; la suma del HOP y del HODNP es el HOD verdadero. En la preparación de las muestras para el análisis del HOD, trátese una solución blanco y un patrón para determinar el efecto de este procedimiento en la determinación del HOD. Si

5-33

hay una pérdida insignificante de HOP durante la extracción de la materia en partículas por filtración, el HOD debe medirse directamente. El carbono activado granular utilizado para concentrar la materia orgánica de la muestra es una fuente importante de variabilidad en el análisis y tiene un gran efecto en la concentración detectable mínima. Lo ideal es que el carbono activado tenga un contenido bajo en halógenos, libere fácilmente los haluros inorgánicos adsorbidos en el lavado con nitrato, sea homogéneo, y adsorba con facilitad todos los haluros orgánicos incluso en presencia de grandes cantidades de otra materia orgánica. Un elemento esencial del control de calidad para el HOD requiere ensayar y monitorizar el carbón activo (véase apartado 5, más adelante). El carbón activo no homogéneo o el carbón activo con un valor de fondo alto afecta la fiabilidad del método a bajas concentraciones de HOD. Un valor del blanco alto y/o variable aumenta la concentración detectable mínima. El sesgo positivo aleatorio, en parte debido a la fácil contaminación del carbón durante su uso, requiere analizar duplicados de cada muestra. Debido a que el carbón activo de diferentes fuentes puede variar mucho en cuanto a la facilidad de liberación de haluros inorgánicos, examínese esta característica antes de usar el carbón activo. La cuantificación apropiada puede verse afectada también por la capacidad de adsorción del carbón activo. Si hay carga orgánica excesiva, algo del HOD puede penetrar y no ser recuperado. Por esta razón, hay que hacer adsorciones seriadas de cada porción de muestra y análisis individuales. c) Toma de muestras y almacenamiento: Recójanse y almacénense las muestras en frascos de cristal ámbar con tapones forrados con TFE. Si no se dispone de frascos ámbar, almacénense las muestras en la oscuridad. Lávese con ácido, aclárese con agua desionizada, ciérrese con

5-34

papel aluminio, y manténgase a 400 °C durante al menos 1 hora los frascos de la muestra. Si los blancos de frasco que no han estado sometidos a 400 °C no muestran HOD detectable, puede omitirse esta última etapa. Lávense los tabiques con detergente, aclárense repetidamente con agua desionizada, libre de materia orgánica, envuélvanse en papel de aluminio, y manténganse a 100 °C durante 1 hora. Es preferible utilizar tabiques de TFE cubiertos con caucho de silicona y tapones a rosca para obtener un cierre positivo con el fin de evitar la pérdida de HOP y la contaminación. Almacénense las botellas de muestra selladas en un ambiente limpio hasta su uso. Llénense completamente los frascos pero debe tenerse cuidado de que no se volatilice ningún compuesto orgánico halogenado. Consérvense las muestras que no puedan ser analizadas inmediatamente acidificándolas con ácido nítrico conc. a pH 2. Refrigérense las muestras a 4 °C con exposición mínima a la luz. Redúzcase cualquier residuo de cloro añadiendo cristales de sulfito de sodio (mínimo: 5 mg/l). NOTA: Algunas cloraminas orgánicas no pierden completamente el cloro por acción del sulfito de sodio, en particular a pH > 7. Esto puede afectar a las concentraciones obtenidas1. Analícense todas las muestras en el plazo de 14 días. d) Concentración detectable mínima: Para las aguas no salinas libres de materia en partículas, 5 µg de Cl¯ orgánico/l es considerado un límite de detección mínimo típico. La concentración detectable mínima puede verse influida por la posibilidad de repetición analítica, por el equipo utilizado, por la calidad del carbón activo y por el operador. Determínese el límite de detección para cada procedimiento, aparato y operador.

MÉTODOS NORMALIZADOS

2. Instrumental

a) Conjunto de adsorción, que incluye depósito de la muestra a prueba de gases, columnas de adsorción rellenas de carbón activo, bastidores de las columnas, y depósito para la solución de nitrato. En particular, obsérvese lo siguiente:

1) Material de aislamiento no combustible (sólo método microcolumna): Moldéense tacos para mantener el carbón activo en las columnas. PRECAU CIÓN: No se debe tocar con los dedos. 2) Columnas de carbón activo (método microcolumna sólo): Añádanse 40 ± 5 mg de carbón activo (apartado 3k) a tubos de cristal seco de aproximadamente 2 a 3 mm DI x 6 mm DE x 40 a 50 mm de largo. PRECAUCIÓN: Protéjanse estas columnas de todas las fuentes de vapores orgánicos halogenados. Límpiense los tubos de cristal antes de usarlos con un limpiatubos de pequeño diámetro para extraer el carbono residual, manténganse luego en remojo en solución limpiadora de cromato durante 15 minutos y séquense a 400 °C. Entre estas etapas, aclárese con agua desionizada. b) Conjunto del analizador, que incluye la fuente de gas portador, la navecilla de toma de muestras, y el horno de pirólisis, que puede pirolizar oxidativamente los compuestos orgánicos halogenados a una temperatura de 800 °C ± 25 °C para producir haluros de hidrógeno y luego distribuirlos a la célula de titulación con una eficiencia general mínima del 90 por 100 para el 2,4,6-triclorofenol; que incluye un sistema de titulación microcolorimétrica con conexión al integrador, la pantalla digital, y el registrador gráfico; y un equipo de purga opcional (véase fig. 5320:1). c) Registrador gráfico.

DETERMINACIÓN DE COMPONENTES ORGÁNICOS

5-35

Figura 5230:1. Sistema de análisis del HOD.

3.

Reactivos y materiales

Utilícense sustancias químicas de calidad para reactivos ACS. Otros grados son útiles si puede demostrarse que el reactivo es de pureza suficientemente alta para permitir su uso sin disminuir la exactitud de la determinación. a) Dióxido de carbono, argón o nitrógeno: Según recomienda el fabricante del equipo, pureza del 99,99 por 100. b) Oxígeno: Pureza del 99,99 por 100. c) Acido acético acuoso: Del 70 al 85 por 100 como recomienda el fabricante del equipo. d) Patrón de cloruro de sodio, NaCl: Disuélvase 0,1648 g de NaCl y dilúyase hasta 100 ml con agua para reactivos; 1 µl = 1 µg Cl¯. e) Patrón de cloruro de amonio, NH4C1: Disuélvase 0,1509 g de NH4C1 y dilúyase hasta 100 ml con agua para reactivos; 1 µl = 1 µg C l¯. f) Solución madre de triclorofenol: Disuélvanse 1,856 g de triclorofenol y di-

lúyase hasta 100 ml con metanol; 1 µl = 10 µg Cl¯. g) Solución patrón de triclorofenol: Efectúese una dilución 1:20 de la solución madre de triclorofenol con metanol; 1 µl =0,5 µg Cl¯. h) Solución patrón de cloroformo, CHCL3: Dilúyanse 100 mg de CHCL3 hasta 100 ml con metanol; 1 µl =1 µg Cl¯ CHCL3. i) Patrón blanco: Utilícese agua para reactivos. El agua para reactivos es preferiblemente agua desionizada, filtrada con carbón que ha sido calentada y purgada. j) Solución de lavado de nitrato, 0,08,N

Dilúyanse 8,2 g de KNO3 hasta 1.000 ml con agua para reactivos. Ajustar a pH 2 con HNO3; 1 l = 5.000 mg NO3- . k) Carbón activo, Malla 100 a 200: De forma ideal, utilícese carbón activo que tenga un fondo de haluro aparente muy bajo, que libere fácilmente los haluros inorgánicos adsorbidos cuando se lave con nitrato, y adsorba con facilidad los haluros orgánicos en presencia de un gran exceso o de otras sustancias orgáni-

5-36

cas*. Véase apartado 5 más adelante para la preparación y evaluación del carbón activo. PRECAUCIÓN: Protéjase el carbón activo del contacto con vapores orgánicos halogenados. l) Sulfilo de sodio, Na2SO3, cristales. m) Ácido nítrico, HNO3, conc. n) Ácido húmico†.

4. Procedimiento

Utilícese el método de la microcolumna (apartado 4a) o de adsorción discontinua (apartado 4b). El método de la microcolumna utiliza columnas de cristal pequeñas rellenas de carbón activo a través de las cuales pasa la muestra bajo presión positiva para absorber los compuestos halógenos orgánicos. El método de adsorción discontinua mide directamente el HOP. Entonces se añade una pequeña cantidad de carbón activo a la porción de HODNP. Después de agitar, el carbón activo es extraído por filtración, y analizado. a) Procedimiento de la micro columna:

1) Preparación del instrumental: Ajústese el equipo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Inclúyanse varias inyecciones de solución de NaCl directamente en la célula de titulación (apartado 5c1) como comprobación del microculombímetro/célula de titulación, al comienzo de cada día. 2) Pretratamiento de la muestra para el análisis de HOD: Ajústese el pH de la muestra a 2 con HNO3. Si las muestras contienen sólidos no disueltos, fíltrense a través de un filtro de fibra de vidrio (puede ser útil otro medio de extraer la materia en partículas si puede demostrarse que no causa interferencias significati-

* Westvaco o Filtrasorb Calgon 400 o equivalente. † Aldrich Chemical Co. o equivalente.

MÉTODOS NORMALIZADOS

vas). Fíltrese también un blanco y un patrón. Analícense para determinar la contribución de la filtración a la determinación del halógeno orgánico. La filtración al vacío causará alguna pérdida de halógenos orgánicos volátiles. Analícese el HOP antes de la filtración y el HODNP después, a menos que se demuestre que las pérdidas de HOP durante la filtración son insignificantes. 3) Determinación (óptima) de los HOP: Selecciónese el volumen de la muestra comparando el valor de HOP esperado (si se conoce) con el intervalo óptimo del instrumento. Utilícese una jeringa a prueba de gas, inyéctese la muestra a través del tabique en el vaso de purga y Púrguese como recomiende el fabricante del equipo. Contrólese con cuidado la velocidad del flujo del gas, la temperatura de la muestra, y el tiempo de purga. 4) Adsorción de la muestra: Pásese una porción representativa de la muestra al depósito limpio con dos columnas de adsorción de carbón activo unidas en serie por los bastidores al orificio de salida del depósito. Ciérrese. Ajústese para producir una velocidad de flujo de unos 3 ml/min. Cuando se ha procesado el volumen deseado, deténgase el flujo, sepárense los bastidores y las columnas de carbón activo, y aclárese el depósito de la muestra con agua de calidad para reactivos. Varíese el volumen procesado para producir cantidades óptimas de HOD adsorbido en las columnas. Los volúmenes sugeridos son los siguientes:

Si es posible, evitar la utilización de volúmenes superiores a 100 ml porque

DETERMINACIÓN DE COMPONENTES ORGÁNICOS

puede superarse la capacidad adsortiva máxima del carbón activo, lo que lleva a una brecha de penetración de los compuestos adsorbidos y a pérdida del HOD. El procesamiento de volúmenes de muestra más grandes hace que se acumule una mayor cantidad de haluros inorgánicos en el carbono activado lo cual tiene como resultado una interferencia positiva. Para reducir al mínimo los errores volumétricos, no hay que usar una muestra menor de 25 ml. Para las muestras que excedan de 2.000 µg HOD/l, dilúyase antes de la adsorción. Protéjanse las columnas del medio ambiente hasta que se determine el HOD. 5) Extracción de los haluros inorgánicos: Conéctense las columnas a través de las que se ha procesado la muestra en serie al depósito de lavado con nitrato y pásense de 2 a 5 ml de solución NO3¯ a través de las columnas a una velocidad aproximada de 1 ml/min. 6) Determinación del HOD: Después de concentrar la muestra en carbón activo y extraer los halógenos inorgánicos por lavado con nitrato, sométanse a pirólisis los contenidos de cada microcolumna y determínese el contenido de halógeno orgánico. Sáquese la microcolumna de cristal del extremo superior del bastidor, teniendo cuidado de no contaminar la muestra con haluros inorgánicos. Utilícese una varilla eyectora limpia, sáquese el carbón activo y los tacos de material aislante no combustible en la navecilla de muestra. Prepárese antes la navecilla de muestra durante las 4 horas precedentes calentándola a 400-800 °C durante al menos 4 minutos en una atmósfera rica en oxígeno (es decir, en el horno de pirólisis). Retírense las cenizas residuales. Colóquese la varilla eyectora en el taco del extremo efluente de la microcolumna de carbón y Colóquese el extremo afluente de la microcolumna de carbón en la primera navecilla de cuarzo. Ciérrese el tubo de entrada de la muestra y déjese que el instrumento se estabilice.

5-37

Después de lavar con NO3¯, evítese el contacto con haluros inorgánicos tales como el cloruro procedente del sudor de las manos o de la superficie contaminada de la mesa de trabajo. Lávense las manos con frecuencia, en especial después de comer, y límpiese el área de trabajo con agua desionizada, a menudo. Sométase a pirólisis el carbono activado y determínese el contenido de haluro. Repítase el proceso para cada microcolumna. Compruébese si se ha producido un exceso de penetración (apartado 5b) y repítase el análisis cuando sea necesario. 7) Duplicados: Cuando la determinación del HOD se usa estrictamente como una herramienta de selección, no es necesario analizar duplicados de la muestra. En caso contrario, repítanse los pasos 4, 5 y 6 utilizando una dilución diferente de la misma muestra. Utilícense diluciones diferentes de forma que las proporciones de concentración sean mayores de 0,7 o menores de 1,4. 8) Blancos: Analícese un blanco del método (apartado 5e2) con cada conjunto de ocho muestras. Analícense no menos de dos blancos cada día. 9) Preparación y análisis del patrón de calibración: Ensáyense varios patrones de calibración al día de acuerdo con el apartado 5c3) para el análisis del HOP o con el apartado 5c5) para el análisis del HOD por adsorción a microcolumna. Acompáñese por un blanco adecuado [apartados 5e3) o 5e4)]. Es necesario asegurarse de que las condiciones analíticas y los procedimientos (por ejemplo, la temperatura de purga) son los mismos para el análisis de los patrones de calibración y para el análisis de las muestras. b) Procedimiento de adsorción del lote:

1) Instalación del instrumental: Ajústese el equipo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. 2) Pretratamiento de la muestra: Ajústese el pH de la muestra a 2 con HNO3 conc.

MÉTODOS NORMALIZADOS

5-38

3) Determinación del HOP: Selecciónese el volumen de muestra comparando el valor de HOP esperado (si se sabe) con el intervalo óptimo del instrumento. Utilizando una jeringa a prueba de gas, inyéctese la muestra a través del tabique en el vaso de purga y Púrguese según recomienda el fabricante del equipo. Para comparar los valores de HOP de los diferentes laboratorios, es esencial estandarizar la purga. Ajústese la temperatura del instrumento, la velocidad y el tiempo de purga para producir una purga completa de bromoformo usando un estándar de esta sustancia. Tómense muestras por duplicado de los diferentes frascos de muestra para reducir al mínimo las pérdidas por volatilización. 4) Determinación de los HODNP: Prepárese la suspensión de carbón añadiendo carbón activo de alta calidad a agua tratada con carbón activo granular (CAG), desionizada, muy pura para producir una suspensión uniforme de 10 mg carbono/ml. Pásese la muestra prepurgada de tamaño óptimo a un erlenmeyer desde un matraz de purga estandarizado de la misma forma que el vaso de purga del instrumento. Añádanse 20 mg de carbón activo (2 ml de suspensión de carbón). Usando un mezclador de alta velocidad (20.000 rpm), agítese durante 45 minutos en un ambiente libre de vapor de haluros orgánicos. Fíltrese a través de un filtro de membrana al vacío y recoger el filtrado. Quítese el matraz que contenga el filtrado. Lávese la costra de carbono y el filtro con 10 ml de solución de lavado NO3¯. Añádanse porciones de solución de lavado en serie para mantener en contacto el carbono activado y la solución de NO3¯ durante 15 minutos. Usando instrumentos limpios, pásese la costra de carbono y el filtro de membrana a la navecilla de la muestra de la unidad de pirólisis. Déjese que el instrumento se estabilice, sométase a pirólisis y determínese el contenido de haluros del primer filtro de la serie.

Añádanse 20 mg más de carbón activo al filtrado en el matraz erlenmeyer. Repítanse los procesos de mezcla del carbono, del filtrado y del lavado. Sométase a pirólisis y determínese el contenido de haluros del segundo filtro de la serie. Si el segundo valor es mayor del 10 por 100 del valor total (primero más segundo), realícese la determinación del HODNP en una porción de la muestra adicional. 5.

Control de calidad

a) Calidad del carbón: Prepárese carbón activo moliendo y tamizando carbón activo de alta calidad. En el método de microcolumna utilícese sólo carbono de malla 100 a 200. Durante la preparación, téngase cuidado de no exponer el carbón activo a vapores orgánicos. El uso de una habitación limpia es útil. Prepárense cantidades pequeñas (lo necesario para un mes o menos) de una sola vez. Deséchese el carbón activo si su concentración de HOD de fondo ha aumentado significativamente desde el momento de su preparación o si es mayor de 1 µg de Cl¯ orgánico aparente/40 mg carbón activo. La uniformidad del carbón activo es importante; por tanto, después de tamizar pequeñas porciones, combínense y mézclense perfectamente. Pásense porciones representativas a frascos de cristal limpios con tapones de vidrio esmerilado o con tabiques TFE revestidos de goma y tapones de rosca. Consérvense los frascos en un desecador sellado, evacuado, purgado de gas. Compruébese cada lote de carbón activo recién preparado para asegurar la calidad adecuada antes de usarlo. Utilícese sólo el carbono que cumpla los puntos básicos esbozados a continuación. 1) Compruébese el tamaño de la partícula de carbón aplicando agua desionizada a dos microcolumnas de carbón activo de 40 mg. Si la velocidad del flujo es significativamente menor de 3 ml/min, vuélvase a tamizar el carbón.

DETERMINACIÓN DE COMPONENTES ORGÁNICOS

2) Analícese un par de blancos del método, (apartado 5e2). Rechácese el carbono si el halógeno orgánico aparente excede de 1,2 µg/40 ml de carbón activo. Si el carbón activo procedía de un lote previamente no ensayado de un proveedor comercial, ensáyese su eficiencia de adsorción y rechazo de los haluros inorgánicos. 3) Adsórbanse duplicados de 100 ml de soluciones que contengan 100, 500 y 1.000 mg de Cl¯ inorgánico/l agua desionizada. La producción de halógenos orgánicos aparentes no deberá superar en más de 0,50 µg el valor determinado en el apartado 2) anterior. Un incremento mayor indica una interferencia significativa a dicha concentración. 4) Prepárese una solución patrón de prueba de adsorción en agua desionizada que contenga 10 mg carbono orgánico (en forma de ácidos húmicos o equivalentes)/l y una concentración de haluros orgánicos de 100 µg de cloruro orgánico (de 2,4,6-triclorofenol)/l. Prepárese una solución blanco que contenga sólo los 10 mg de carbono orgánico. Adsórbase, lávese en nitrato y analícense duplicados de 100 ml de estas soluciones. Inyéctense directamente 10 µg de cloruro orgánico (del 2,4,6-triclorofenol) en microcolumnas de 40 mg de carbono activado lavado en nitrato, por duplicado. Analícense los blancos del método por duplicado. La recuperación del cloruro orgánico acuoso deberá ser ≥ al 90 por 100 en la primera microcolumna o filtro y del 5 por 100 o menos en la segunda. La recuperación total del cloruro orgánico del agua deberá ser del 95 por 100 o más (después de la extracción del blanco de carbono) de la cantidad aplicada. b) Adsorción en serie: En los dos procedimientos mencionados antes cada patrón acuoso y cada muestra son adsorbidos en serie en carbón activo. Del haluro orgánico neto, el 90 por 100 o más debería ser adsorbido en la primera porción de carbón activo, y el 10 por 100 restante o menos en la segunda. Si, en análisis

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separados de las dos porciones de carbón activo seriadas, la segunda contiene más del 10 por 100 del neto (después de restar el blanco del método), vuélvase a analizar la muestra. La interferencia de halógeno inorgánico o la penetración orgánica son las razones más comunes para un segundo valor de carbón activo alto. La dilución de la muestra antes de su adsorción puede mejorar la recuperación del primer carbón activo de la serie, pero se verá afectada la concentración detectable mínima. c) Patrones: Los patrones utilizados en el análisis de rutina, las pruebas de control de calidad, y las causas específicas de aislamiento durante el mantenimiento de corrección incluyen: 1) Patrón de cloruro de sodio (apartado 3d): Utilícese para comprobar el funcionamiento de la célula de titulación y el microculombímetro inyectando directamente en la solución de ácido acético de la célula de titulación. Examinando la altura y la forma del pico producido en el registrador gráfico, y el valor integrado, pueden determinarse los problemas asociados con la célula y el culombímetro. Utilícese este patrón al poner en marcha el aparato cada día y cada vez que se limpia la célula durante todo el día. Al encender el aparato cada día los valores de los duplicados consecutivos deberán estar en el 3 por 100 de la media histórica. Dependiendo de la carga de la muestra y del número de análisis realizados puede ser necesario limpiar la célula de titulación varias veces al día. Después de limpiarla, su rendimiento puede ser muy inestable; por tanto, inyéctese un patrón simple de NaCl antes de analizar un patrón de calibración del instrumento [véase apartado 4) más adelante]. No introducir patrones de NaCl en el horno de pirólisis mediante aplicación a la navecilla de la muestra. 2) Patrón de cloruro de amonio (apartado 3e): Aplíquese este patrón a la navecilla de muestra para comprobar las

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pérdidas de haluros en el horno de pirólisis y la entrada de la célula de titulación. Cuando la inyección de un patrón de NaCl indica función adecuada de la célula de titulación y del microculombímetro pero la recuperación del patrón de calibración es pobre, debe sospecharse o bien poca conversión de cloruro orgánico a cloruro de hidrógeno o bien pérdida de haluro de hidrógeno después de la conversión pero antes de su distribución en la solución de la célula. Para aislar la posible pérdida de haluros de hidrógeno inyéctese patrón NH4C1 directamente en la artesa de cuarzo de la muestra. La recuperación debe ser mejor del 95 por 100, con la producción de un pico único de forma uniforme. Utilícese sólo una nueva navecilla de muestra de cuarzo libre de cualquier residuo; si tiene muestra encostrada se reduce mucho la recuperación. Utilícese este patrón para aislar el problema del mantenimiento correctivo pero no para los análisis de rutina. 3) Patrones de calibración de haluros orgánicos purgables: Para el análisis de los HOP utilícense soluciones acuosas de cloroformo para calibrar el instrumental. Para el análisis de HOP utilícese también un patrón de bromoformo acuoso para asegurar condiciones de purga aceptables. Hágase una curva estándar en el intervalo dinámico del microculombímetro y compruébese a diario, tal como se indica en el apartado 5c5). La recuperación del cloroformo y el bromoformo deberá ser superior al 90 por 100 y al 80 por 100, respectivamente. 4) Patrón de calibración del instrumento: La inyección directa de triclorofenol, que funciona como patrón en el blanco del método lavado con nitrato a concentraciones por encima del intervalo de funcionamiento del instrumental, determina la linealidad y calibración del módulo analizador. Después de comprobar que el microculombímetro funciona bien inyectando patrón NaCl, sométanse a pirólisis los patrones de calibración del

MÉTODOS NORMALIZADOS

instrumento por duplicado y luego duplíquense los blancos del método. La respuesta neta a los patrones de calibración deberá localizarse en el intervalo del 3 por 100 del valor de la curva de calibración. Si no es así, compruébese la pérdida de haluros en el horno de pirólisis utilizando el patrón de cloruro de amonio (apartado 5c2). 5) Patrones de calibración de haluros orgánicos no volátiles: Prepárese una curva patrón analizando las soluciones acuosas de 2,4,6-triclorofenol u otro compuesto orgánico halogenado apropiado en el intervalo dinámico del microculombímetro. Este intervalo dinámico oscila de forma típica entre 0,5 y 50 /lg de cloruro, pero variará dependiendo de los diferentes microculombímetros y células de titulación. Debido al rendimiento limitado del procedimiento HOD, utilícense los patrones de calibración del instrumento único a 50, 30, 15, 10, 5, 2,5, y 0,5 µg de cloruro orgánico para construir una curva estándar después de cambios en la configuración de un instrumento, tales como la sustitución de una célula de titulación o el mantenimiento principal del instrumento. Analícense a diario duplicados adicionales de varios patrones de calibración de haluro orgánico no volátil para asegurar la reproducibilidad, la linealidad y la adecuada función de los instrumentos y los procedimientos. Selecciónense las concentraciones de patrones en el intervalo de las muestras que van a ser analizadas ese día. Cuando se utiliza la filtración de la muestra para extraer la materia particulada, utilícese también este pretratamiento con los patrones de calibración. Si la recuperación de HOD es menor del 95 por 100, analícese un conjunto de patrones de calibración del instrumento (apartado 5c4). d) Recuperación del patrón añadido: Durante los análisis de rutina, háganse adiciones ideales de patrón después de cada décima muestra. Cuando se conozcan los compuestos que constituyen el

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DETERMINACIÓN DE COMPONENTES ORGÁNICOS

HOD utilícense patrones de dichos compuestos. Cuando los compuestos que constituyen el HOD son total o parcialmente desconocidos (por ejemplo, los ácidos húmicos halogenados), utilícense patrones que reflejen la relativa abundancia de los halógenos, su tamaño molecular, y la volatilidad de los compuestos halogenados que se supone están presentes. Una recuperación del 90 por 100 o superior de la cantidad añadida indica que los análisis están bien. e) Blancos: Para la determinación exacta del HOD es importante la alta precisión y exactitud del valor de fondo o del blanco. Efectúense determinaciones diarias del blanco. Los blancos que pueden requerirse son:

donde:

1) Blanco del sistema: Analícese agua para reactivos libre de materia orgánica. El blanco deberá tener menos de la concentración detectable mínima. Utilícese este blanco para asegurar que el equipo y los procedimientos no están contribuyendo al HOD. 2) Blanco del método: Analícese el carbono activado que ha sido lavado con nitrato. Analícense duplicados del blanco del método a diario antes del análisis de la muestra y después de la pirólisis de ocho muestras. 3) Blanco patrón: Analícese el agua para reactivos para determinar el blanco para los patrones. 4) Blanco de halógeno orgánico purgable: Analícese el agua para reactivos, prepurgada, libre de compuestos orgánicos para determinar el blanco de HOP.

Si es aplicable, calcúlese el haluro orgánico purgable neto como contenido de Cl ¯ ( P 3):

6.

Cálculo

Calcúlese el contenido de haluros orgánicos netos en forma de cloruros (C4) de cada duplicado de cada muestra y patrón:

C 1 = Haluro orgánico en forma de Cl ¯ en la primera columna de carbono activado o costra de carbón activo, µg. C 2 = Haluro orgánico en forma de Cl ¯ en la segunda columna de carbono activo o costra de carbono activo, µg. C3 = Media de los blancos del método el mismo día y en el mismo instrumento, µg X como Cl ¯ . C 4 = Haluro orgánico no corregido como Cl ¯ de muestra absorbida, µg de haluro orgánico en forma de Cl¯ /l, y V= Volumen de la muestra absorbida, 1.

Si C2 ≤ C3, entonces utilizar:

donde: P1 = Haluros orgánicos purgables de la muestra en forma de Cl ¯ , µg. P 2 = Haluros orgánicos purgables del blanco en forma de Cl ¯ , µg. P3 = Haluros orgánicos purgables netos no corregidos en forma de Cl¯ , µg X como Cl¯ /l, y V = Volumen de la muestra o patrón purgado, l.

Infórmese de los resultados de la muestra y del porcentaje de recuperación de los correspondientes patrones de calibración ([apartados 5c3) o 5c5)]. Infórmese también de la curva de calibración estándar si es significativamente no lineal. 7.

Precisión y sesgo

La precisión y el sesgo dependen de los procedimientos, equipos y analistas específicos. Desarróllense y pónganse al día de

5-42

MÉTODOS NORMALIZADOS

forma rutinaria datos de precisión y sesgo para cada procedimiento, cada configuración del instrumento, y cada analista. La tabla 5230:I muestra los cálculos de la muestra de precisión expresados como desviación estándar entre los duplicados y el sesgo en la recuperación del 2,4,6-triclorofenol. 8.

Referencia

1. STANBORO, W. D. & M. J. LENKEVICH. 1982. Slowly dechlorinated organic chloramines. Science 215:967.

9.

Bibliografía

KUHN, W. 1974. Thesis, Univ. Karlsruhe, Alemania Occidental. KUHN, W., F. FUCHS & H. SONTHEIMER. 1977. Untersuchungen zur Bestimmung des organisch gebundenen Chlors mlt Hilfe eines neuartigen Anreicherungsverfahrens. Z. Wasser-Abwasser Forsch. 10:6:162.

DRESSMAN, R. C, B. A. NAJAR & R. REDZIKOWSKI . 1979. The analysis of organohalides (OX) in water as a group parameter. Proc. 7th Annual Water Quality Technology Conf., Filadelfia, Pennsylvania. American Water Works Assoc, Denver, Colorado. TAKAHASHI, Y., et al. 1980. Measurement of total organic halides (TOX) and purgeable organic halides (POX) in water using carbon adsorption and microcoulometric detection. Proc. Symp. on Chemistry and Chemical Analysis of Water and Waste Water Intended for Reuse, Houston, Tejas. American Chemical Soc, Washington, D.C. DRESSMAN, R. C. 1980. Total Organic Halide, Method 450.1: Interim. Drinking Water Research Div., Municipal Environmental Research Lab., U.S. Environmental Protection Agency, Cincinnati, Ohio. JEKEL, M. R. & P. V. ROBERTS. 1980. Total organic halogen as a parameter for the characterization of reclaimed waters: measurement, occurrence, formation, and removal. Environ. Sci. Technol. 14:970. DRESSMAN, R. C. & A. STEVENS. 1983. Analysis of organohalides in water—An evaluation update. J. Amer. Water Works Assoc. 75:431.

TABLA 5320:I. DATOS DE PRECISIÓN Y SESGO, INTERLABORATORIOS, UN SOLO OPERADOR HALÓGENO ORGÁNICO DISUELTO (PROCEDIMIENTO DE MICROCOLUMNA)

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DETERMINACIÓN DE COMPONENTES ORGÁNICOS

5510

SUSTANCIAS ACUOSAS HÚMICAS (PROPUESTA)* 5510 A.

1.

Discusión general

Las sustancias acuosas húmicas (SAH) son materiales orgánicos heterogéneos, de color amarillo a negro, que abarcan la mayor parte de la materia orgánica disuelta presente de forma natural en el agua. Se ha demostrado que las sustancias acuosas húmicas producen trihalometanos (THMs) en la cloración y afectan el transporte y el destino de otras especies orgánicas e inorgánicas a través de reacciones de adsorción/reparto, de reacciones catalíticas y fotolíticas. Las sustancias húmicas, la principal fracción de la materia orgánica del suelo, están constituidas por mezclas; su composición química no se comprende con exactitud. Han sido clasificadas en tres fracciones sobre la base de su «solubilidad»† en agua: la humina es la fracción no soluble en agua a ningún valor de pH; el ácido húmico no es soluble bajo condiciones acidas (pH 11 con una solución de NaOH. Añádase 60 ml de cloruro de metileno a la botella de muestra, ciérrese y agítese durante 30 segundos para aclarar la superficie interior. Transfiérase el disolvente al embudo de separación y extráigase la mezcla mediante agitación durante 2 minutos con una ventilación periódica para liberar el exceso de presión. Déjese la capa orgánica separada de la fase de agua durante un mínimo de 10 minutos. Si la superficie de emulsión entre las capas supone más de un tercio del volumen de la capa del disolvente, utilícese técnicas mecánicas para completar la separación de las fases. La técnica óptima depende de la muestra, aunque

6-133

puede incluir agitación con varilla, filtrado de la emulsión a través de lana de vidrio, centrifugado u otros métodos físicos. Tómese un extracto de cloruro de metileno en un erlenmeyer de 250 ml. Si no puede interrumpirse la emulsión (recuperación inferior al 80 por 100 del cloruro de metileno, corregida para la solubilidad en agua del cloruro de metileno) en la primera extracción, transfiérase la muestra, el disolvente y la emulsión a la cámara de extracción de un extractor continuo y actúese como se describe más abajo en el apartado 2. Añádase un segundo volumen, de 60 ml de cloruro de metileno a la botella de muestra y repítase el procedimiento de extracción mediante la combinación de los extractos en el erlenmeyer. Realícese una tercera extracción del mismo modo. Después de la tercera extracción, ajústese el pH de la fase acuosa a un valor < 2 mediante el empleo de H2SO4. Extráigase en serie la fase acuosa acidificada durante tres veces con porciones de 60 ml de cloruro de metileno. Tómese y combínese los extractos en un erlenmeyer de 250 ml y etiquétese los extractos combinados como la fracción del ácido. Para cada fracción instálese un concentrador Kuderna-Danish (K-D) mediante la unión de un tubo concentrador de 10 ml a un matraz de evaporación de 500 ml. Si se cumplen los requisitos del apartado 7, es posible utilizar otros dispositivos o técnicas de concentración. Viértase el extracto combinado a través de una columna de secado aclarada con disolvente que contenga como mínimo 10 cm o más de Na2SO4 anhidro y tómese los extractos en el concentrador. Aclárese el erlenmeyer y la columna con 20 ó 30 ml de cloruro de metileno para completar la transferencia. Añádase uno o dos dispositivos limpios de ebullición al matraz de evaporación y únanse a una columna Snyder de tres bolas. Humedézcase previamente la columnas Snyder mediante la adición de

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1 ml de cloruro de metileno sobre la parte superior. Colóquese el instrumental K-D en un baño de agua caliente (entre 60 y 65 °C) en una campana de manera que el tubo concentrador se sumerja parcialmente en el agua caliente y la superficie redondeada inferior se inunde completamente con el vapor caliente. Ajústense la posición vertical del instrumental y la temperatura del agua como se requiere para completar la concentración entre 15 y 20 minutos. Con una velocidad adecuada de destilación, las bolas de la columna crepitan activamente pero las cámaras no se inundan con el disolvente condensado. Cuando el volumen aparente del líquido alcance 1 ml, retírese el instrumental K-D y déjese secar y enfriar durante 10 minutos como mínimo. Retírese la columna Snyder y aclárese el matraz y su unión inferior al tubo concentrador con 1 ó 2 ml de cloruro de metileno, preferiblemente con una jeringuilla de 5 ml. Añádase uno o dos dispositivos limpios de ebullición más al tubo concentrador por cada fracción y únase a una columna Snyder micro de dos bolas. Humedézcase previamente la columna Snyder mediante la adición de 0,5 ml de cloruro de metileno sobre la parte superior. Colóquese el instrumental K-D en un baño de agua caliente (entre 60 y 65 °C) de forma que el tubo concentrador se sumerja parcialmente en el agua caliente y mantenga el proceso de concentración del mismo modo que se describió anteriormente sin adiciones posteriores de disolvente hasta que el volumen aparente del líquido alcance 0,5 ml aproximadamente. Tras el enfriamiento, retírese la columna Snyder y aclárese el matraz y su unión inferior al tubo concentrador mediante unos 0,2 ml de acetona o cloruro de metileno. Ajústese el volumen final a 1,0 ml con disolvente. Tápese el tubo concentrador y guárdese en un lugar refrigerado si no se va a realizar ningún proceso inmediato. Si es preciso almacenar el extracto durante más de

MÉTODOS NORMALIZADOS

dos días, transfiérase a una ampolla de tapón de rosca cerrado con TFE y etiquétese las fracciones básico-neutras y ácidos de forma apropiada. Determínese el volumen original de la muestra rellenando la botella de muestra hata la marca y trasfiérase el líquido a un cilindro graduado de 1.000 ml. Regístrese el volumen de muestra más próximo a 5 ml. 2) Extracción continua. Márquese el menisco del agua sobre la pared de la botella de muestra y determínese el último volumen de muestra tal como se describió en el apartado 1. Verifíquese el pH mediante un papel indicador de pH de amplia gama y ajústese a un valor > 11 con solución de NaOH. Transfiérase la muestra a un extractor continuo y, mediante una pipeta, añádase 1,00 ml de solución patrón de sustitución y mézclese bien. Añádase 60 ml de cloruro de metileno a la botella de muestra, ciérrese y agítese durante 30 segundos para aclarar la superficie interior. Transfiérase el disolvente al extractor. Repítase el aclarado con una porción adicional de 50 a 100 ml de cloruro de metileno y añádase un enjuague al extractor. Añádase de 200 a 500 ml de cloruro de metileno al matraz de destilación, agréguese suficiente agua para reactivos que asegure un funcionamiento apropiado y realícese la extracción durante 24 horas. Déjese enfriar y apártese el matraz de destilación. Séquese, concéntrese y ciérrese el extracto como se explicó en el apartado 1. Cárguese un matraz de destilación limpio con 500 ml de cloruro de metileno y únase al extractor continuo. mientras se agita, ajústese cuidadosamente el pH de la fase acuosa a un valor inferior a 2 mediante H 2 SO 4 . Extráigase durante 24 horas. Séquese, concéntrese y ciérrese el extracto como se describió en el apartado 1. b) Condiciones de funcionamiento de CG/EM: La tabla 6410:I resume las con-

ANÁLISIS AUTOMATIZADO DE LABORATORIO

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Figura 6410:1. Cromatograma de gases de una fracción básico/neutra. Columna: 3 % SP-2250 en Supelcoport; programa: 50 °C durante 4 min, 8 °C/min hasta 270 °C; detector: espectrómetro de masas.

diciones de funcionamiento recomendadas para el cromatógrafo de gases en el caso de fracción básico-neutra y la tabla 6410:II, para la fracción acida. En estas tablas se incluyen los tiempos de retención y los LDM que pueden obtenerse según estas condiciones. En las figuras 6410:1 a 12 se muestran diversos ejemplos de las separaciones obtenidas con estas columnas. Siempre que se verifiquen los requisitos del apartado 7, puede utilizarse otras columnas de relleno o capilares (de tubo abierto) u otras condiciones cromatográficas. c) Pruebas de rendimiento de CG/EM: Al comenzar cada día en el que vayan a realizarse análisis, compruébese

el sistema de CG/EM para ver si se verifican los criterios aceptables de rendimiento para el DFTFF8. Todos los días que se precise determinar la bencidina, debe satisfacerse el criterio del factor de decantación de residuos descrito en el apartado 2. Siempre que se requiera la determinación de ácidos, debe satisfacerse el criterio del factor de decantación de residuos descrito en el apartado 3. Estas pruebas de rendimiento presentan los requisitos suministrados en la sección 6210B.5b utilizando las siguientes condiciones: Energía electrónica: 70 V (moderada). Intervalo de masas: 35 a 450 uam.

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MÉTODOS NORMALIZADOS

Figura 6410:2. Cromatograma de gases de una fracción acida. Columna: 1 % SP-1240DA en Supel-

coport; programa: 70 °C durante 2 min, 8 °C/min hasta 200 °C; detector: espectrómetro de masas.

Figura 6410:3. Cromatograma de gases de fracción de pesticida. Columna: 3 % SP-2250 en Supelcoport; programa: 50 °C durante 4 min, 8 °C/min hasta 270 °C; detector: espectrómetro de masas.

ANÁLISIS AUTOMATIZADO DE LABORATORIO

Figura 6410:4. Cromatograma de gases del clordán. Columna: 3 % SP-2250 en Supelcoport; programa: 50 °C durante 4 min, 8 °C/min hasta 270 °C; detector: espectrómetro de masas.

Tiempo de exploración: Capaz de suministrar 5 exploraciones por pico, aunque sin exceder los 7 segundos por exploración. 1) Prueba de rendimiento de DFTFF. Al comienzo de cada día, inyéctese 2 µl (50 ng) de una solución patrón DFTFF. Obténgase un espectro de masa corregido de ruido de fondo del DFTFF y confírmese que se obtienen todos los criterios de clave m/z de la tabla 6410:III. Si no es así, vuélvase a sintonizar el espectrómetro de masas y repítase la prueba hasta que se satisfagan dichos criterios. Cúmplase todos los criterios de rendimiento antes de analizar ninguna muestra, blanco o estándar. Pueden realizarse de modo simultáneo las pruebas de factor de decantación de los apartados 2 y 3.

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Figura 6410:5. Cromatograma de gases del toxafeno. Columna: 3 % SP-2250 en Supelcoport; programa: 50 °C durante 4 min, 8 °C/min hasta 270 °C; detector: espectrómetro de masas.

2) Prueba de rendimiento de columnas para agentes básico-neutros. Al comienzo de cada día en el que vaya a analizarse una fracción básico-neutra de bencidina, calcúlese el factor de decantación de la bencidina. Inyéctese 100 ng de bencidina de forma separada o bien como parte integrante de una mezcla estándar que pueda contener DFTFF y calcúlese el factor de decantación, que debe se inferior a 3,0. El cálculo del factor de decantación aparece ilustrado en la figura 6410:139. Si no se satisface los criterios para el factor de decantación, Sustitúyase la columna de relleno. 3) Prueba de rendimiento de columna para agentes ácidos. Al comienzo de cada día en el que se vaya a analizarse un agente ácido, inyéctese 50 ng de penta-

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Figura 6410:6. Cromatograma de gases del BPC-1016. Columna: 3 % SP2250 en Supelcoport; programa: 50 °C durante 4 min, 8°C/min hasta 270 °C; detector: espectrómetro de masas.

clorofenol de forma separada o bien como parte integrante de una mezcla estándar que pueda contener DFTFF. El factor de decantación para el pentaclorofenol debe ser inferior a 5. El cálculo del factor de decantación aparece ilustrado en la figura 6410:139. Si no se satisfacen los criterios para el factor de decantación, Sustitúyase la columna de relleno.

d) Calibrado del sistema CG/EM: Calíbrese diariamente el sistema después de las pruebas de rendimiento. Resulta indicado seleccionar tres o más estándares internos de comportamiento analítico similar al de los compuestos objeto de estudio. Compruébese que la medida de los estándares internos no se ve afectada por las interferencias de

MÉTODOS NORMALIZADOS

Figura 6410:7. Cromatograma de gases del BPC-1221. Columna: 3 % SP2250 en Supelcoport; programa: 50 °C durante 4 min, 8°C/min hasta 270 °C; detector: espectrómetro de masas.

método o de matriz. En la tabla 6410:IV se enumeran algunos estándares internos recomendados. Utilícese el pico de base m/z como m/z primaria para realizar la cuantificación. Si se aprecian interferencias, empléese una de las dos siguientes cantidades m/z más intensas para la cuantificación. Mediante inyecciones de 2 a 5 µl, analícense todos los calibrados estándar de acuerdo con el apartado e (desarrollado más adelante), y tabúlese el área de las m/z características primarias (tablas 6410:I y II) en función de la concentración de cada compuesto y del estándar interno. Calcúlese los factores de respuesta (FR) para los diferentes compuestos mediante la ecuación incluida en la sección 6210B.5c2). Si el valor de FR a lo largo del intervalo de funcionamiento

ANÁLISIS AUTOMATIZADO DE LABORATORIO

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Figura 6410:8. Cromatograma de gases del BPC-1232. Columna: 3 % SP2250 en Supelcoport; programa: 50 °C durante 4 min, 8°C/min hasta 270 °C; detector: espectrómetro de masas.

Figura 6410:9. Cromatograma de gases del BPC-1242. Columna: 3 % SP2250 en Supelcoport; programa: 50 °C durante 4 min, 8°C/min hasta 270 °C; detector: espectrómetro de masas.

es una constante (< 35 por 100 DER), puede suponerse que es invariable; utilícese la media de FR para los cálculos. De forma alternativa, es posible utilizar los resultados para trazar una curva de calibrado de las razones de respuesta, As/Ais frente a FR. Todos los días de trabajo ha de verificarse la curva de calibrado de funcionamiento o el FR mediante la medida de uno o más estándares de calibrado. Si la respuesta para alguno de los compuestos difiere respecto de la respuesta prevista en un margen superior al 20 por 100, repítase la prueba con un estándar de calibrado nuevo. Como alternativa prepárese una nueva curva de calibrado para dicho compuesto. e) Análisis de muestras: Añádase un

estándar interno al extracto de muestra, mézclese detenidamente y, de modo inmediato, inyéctense de 2 a 5 µl de extracto de muestra o estándar en el sistema CG/EM mediante la técnica de inundación con disolvente para reducir al mínimo las pérdidas debidas a la absorción, las reacciones químicas o la evaporación. Cuando se utilizan dispositivos automáticos, pueden inyectarse volúmenes más pequeños (1,0 µl). Regístrense volúmenes inyectados próximos a 0,05 µl. Si la respuesta de algún m/z supera el intervalo de funcionamiento del sistema CG/EM, ha de diluirse el extracto para volverlo a analizar. Todas las medidas cualitativas y cuantitativas deben llevarse a cabo como se describe más adelante en el apartado 6. Cuando no se utilice el extracto,

6-140

Figura 6410:10. Cromatograma de gases del BPC-1248. Columna: 3 % SP2250 en Supelcoport; programa : 5 0 ° C d u r a n t e 4 mi n , 8 °C/min hasta 270 DC; detector: espectrómetro de masas.

almacénese a 4 °C, protegido de la luz, en una ampolla de tapón de rosca provista de un tabique revestido de TFE sin perforaciones. Han de obtenerse los PCIE para las m/z primarias y las otras dos masas indicadas en las tablas 6410:I y II. Véase al respecto el apartado d para las masas que han de usarse en los estándares internos y de sustitución. Para realizar una identificación cualitativa, síganse los siguientes criterios. • Las masas características de cada compuesto alcanzan su máximo en la propia exploración de tal compuesto o en alguna de las próximas. • El tiempo de retención está comprendido en un margen de + 30 se-

MÉTODOS NORMALIZADOS

gundos del tiempo de retención del compuesto auténtico. • Las alturas relativas de los picos de las tres masas características del PCIE están comprendidas en un margen de ± 20 por 100 de las intensidades relativas de estas masas en un espectro de masas de referencia obtenido a partir de un estándar analizado en el sistema CG/EM o a partir de una biblioteca de referencia. Los isómeros estructurales que poseen espectros de masa muy semejantes y diferencias inferiores a 30 segundos en los tiempos de retención sólo pueden identificarse de forma explícita cuando es aceptable la resolución entre los isómeros auténticos en una mezcla estándar. Se alcanza una resolución aceptable cuando la distancia entre la línea de base y la altura del valle entre los isómeros es inferior al 25 por 100 de la suma de las dos alturas de los picos. En caso contrario, los isómeros estructurales se identifican como pares isoméricos. f) Procedimiento de selección de 2,3,7,8-tetraclorodibenzo-p-dioxina (2,3,7, 8-TCDD): PRECAUCIÓN: En la selección de una muestra de 2,3,7,8-TCDD, no manipule el material de referencia sin tomar grandes medidas de seguridad. Es suficiente con analizar el extracto básico/neutro mediante técnicas CG/EM de monitorizacion de iones seleccionados (MIS), del siguiente modo: Concéntrese el extracto básico/neutro en un volumen final de 0,2 ml. Ajústese la temperatura de la columna básico/neutra a 220 °C. Póngase en funcionamiento el espectrómetro de masas de modo que reciba los datos en modo MIS mediante iones de relaciones m/z con valores 257, 320 y 322 y un tiempo de secado no superior a 333 ms/masa. Inyéctese entre 5 y 7 µl de extracto básico/neutro. Tómense datos de MIS durante unos 10 minutos. La posible presencia de 2,3,7,8TCDD se indica cuando las tres masas muestran picos simultáneos en cualquier punto de los perfiles en curso de los iones

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ANÁLISIS AUTOMATIZADO DE LABORATORIO

Figura 6410:11. Cromatograma de gases del BPC-1254. Columna: 3% SP-2250 en Supelcoport; programa: 50 °C durante 4 min, 8 °C/min hasta 270 °C; detector: espectrómetro de masas.

seleccionados. Para cada incidencia en que se detecte la posible presencia en 2,3,7,8-TCDD, calcúlese y consérvese las abundancias relativas de cada una de las tres masas. Pueden producirse positivos falsos por la presencia de combinaciones simples o coeluyentes de compuestos cuyo espectro de masas contenga las tres masas. Los resultados concluyentes de la presencia y el nivel de concentración de 2,3,7,8-TCDD pueden obtenerse únicamente mediante un laboratorio adecuadamente equipado que utilice un método de ensayo especializado11.

6. Cálculo

Una vez identificado un compuesto, las tablas 6410:I y II suministran los PCIE de las m/z características primarias que conducen a la cuantificación básica de la abundancia integrada. Utilícese picos de base m/z para estándares internos y de sustitución. Si la muestra produce interferencias en la m/z primaria, utilícese una m/z característica secundaria para realizar la cuantificación. Mediante el factor de respuesta (FR) expuesto en el apartado 5d, calcúlese la

MÉTODOS NORMALIZADOS

6-142

Figura 6410:12. Cromatograma de gases del BPC-1260. Columna: 3% SP-2250 en Supelcoport; programa: 50 °C durante 4 min, 8 °C/min hasta 270 °C; detector: espectrómetro de masas.

concentración de la muestra a partir de la ecuación:

Comuníquense los resultados en µg/l sin corrección de recuperación. Compárese todos los datos de CC con los resultados de la muestra.

donde:

7.

As = área de m/z característica para compuestos o estándares de sustitución que se desee medir, Ais = área de m/z características para estándar interno, Is = cantidad de estándar interno añadida a cada extracto, µg, y Ve = volumen de agua extraída, 1.

Control de calidad

a) Programa del control de calidad: Véase la sección 6210B.7a. b) Comprobación de la competencia del analista: Procédase de acuerdo con la sección 6210B.7b. Utilícese la tabla 6410:V para los criterios de aceptación. c) Análisis de muestras con adiciones

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ANÁLISIS AUTOMATIZADO DE LABORATORIO

Figura 6410:13. Cálculo del factor de decantación.

conocidas: Realícense adiciones conocidas de un 5 por 100 como mínimo de las muestras en el lugar de muestreo en fase de seguimiento. El procedimiento debe realizarse según las instrucciones de la sección 6210B.7c, pero utilizando 100 µg/l en lugar de 20 µg/l. En la determinación de la concentración de fondo de cada compuesto, añádase a la segunda porción de la muestra 1,0 ml de muestra concentrada de comprobación del CC. Utilícense los criterios de aceptación de calidad proporcionados en la tabla 6410:V. d) Análisis estándar de comprobación del control de calidad: Procédase de acuerdo con la sección 6210B.7 d pero preparando estándares de comprobación del CC con 1,0 ml de estándar de comprobación de CC concentrado y 1 litro de agua para reactivos. e) Evaluación de precisión y registros: Véase la sección 6210B.7e. f) Utilización de compuestos de susti-

tución: Para comprobar el control de calidad, realícese adiciones conocidas sobre todas las muestras de la solución patrón de sustitución como se describe en el apartado 5a1 y calcúlese la recuperación porcentual de cada uno de los compuestos de sustitución. g) Prácticas adicionales de garantía de calidad: La realización de otras prácticas depende de las necesidades del laboratorio y de la naturaleza de las muestras. Analícese duplicados de campo para evaluar la precisión de las medidas medio ambientales. Siempre que sea posible, analícese los materiales estándar de referencia y particípese en estudios de evaluación del rendimiento. Algunos compuestos, como los ftalatos, constituyen sustancias contaminantes corrientes. Cuando se miden por encima de los límites de detección en los blancos de muestra, localícese su fuente y repítase el análisis después de la correspondiente acción de corrección. 8.

Precisión y sesgo

Este método se experimentó en 15 laboratorios con agua para reactivos, agua potable, agua de superficie y aguas residuales industriales con adiciones de seis concentraciones en el intervalo comprendido entre 5 y 1.300 µg/l3. La precisión de analista único, la precisión global y el sesgo del método se relacionaron directamente con la concentración del compuesto y son independientes de la matriz de muestra. Las ecuaciones lineales que describen estas relaciones se presentan en la tabla 6410:VI. 9. 1.

Referencias

U.S. ENVIRONMENTAL P ROTECTION AGEN CY . 1984. Method 625 −Base/neutrals and acids. 40 CFR Part 136, 43385; Federal Register 49, n.° 209. 2. U.S. ENVIRONMENTAL P ROTECTION AGEN CY . 1977. Sampling and Analysis Procedu-

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3.

4.

5.

6.

MÉTODOS NORMALIZADOS

res for Screening of Industrial Effluents for Priority Pollutants. Environmental Monitoring and Support Lab., Cincinnati, Ohio. U.S. ENVIRONMENTAL P ROTECTION AGEN CY . 1984. EPA Method Study 30, Method 625 —Base/Neutrals, Acids, and Pesticides. EPA-600/4-84-053, National Technical Information Serv., PB84-206572, Springfíeld, Virginia. AMERICAN SOCIETY FOR TESTING AND MATERIALS . 1978. Standard practices for preparation of sample containers and for preservation of organic constituents. ASTM Annual Book of Standards, Part 31, D369478 Filadelfia, Pennsylvania. U.S. ENVIRONMENTAL P ROTECTION AGEN CY . 1984. Definition and procedure for the determination of the method detection limit. 40 CFR Part 136, Appendix B. Federal Register 49, n.° 209. OLYNYK, P., W. L B UDDE & J. W. EICHEL BERGER . 1980. Method Detection Limit for TABLA 6410:V.

7.

8.

Methods 624 and 625. Unpublished report. AMERICAN SOCIETY FOR TESTING AND MATERIALS. 1976. Standard practices for sampling water. ASTM Annual Book of Standards, Part 31, D3370-76. Filadelfia, Pennsylvania. ElCHELBERGER, J. W., L. E. HARRIS & W. L.

BUDDE. 1975. Reference compound to calíbrate ion abundance measurement in gas chromatography-mass spectrometry. Anal. Chem. 47:995. 9. MCNAIR, N. M. & E. J. BONELLI. 1969. Basic Chromatography. Consolidated Printing, Berkeley, California. 10. BURKE, J. A. 1945. Gas chromatography for pesticide residue analysis, practical aspects. J. Assoc. Offic. Anal. Chem. 48:1037. 11. U. S. ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENCY. 1984. Method 613 -2,3,7,8,-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin. 40 CFR Part 136, 43368; Federal Register 49, n.° 209.

CRITERIOS DE ADMISIÓN AL CC*

ANÁLISIS AUTOMATIZADO DE LABORATORIO

TABLA 6410:V. CONTINUACIÓN

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6-146

TABLA 6410:VI.

MÉTODOS NORMALIZADOS SESGO Y PRECISIÓN DEL MÉTODO COMO FUNCIONES DE LA CONCENTRACIÓN*

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ANÁLISIS AUTOMATIZADO DE LABORATORIO

TABLA 6410:VI. CONTINUACIÓN

6420 FENOLES 6420 A. 1.

Introducción

Fuentes y significado

Los fenoles están presentes en numerosas aguas residuales y algunas aguas de fuentes naturales de los Estados Unidos. Son detectables, por lo general en los efluyentes industriales o en los vertederos. Estos compuestos poseen bajo umbral de sabor en las aguas potables y pueden presentar efectos nocivos sobre la salud en altas concentraciones.

2.

Selección del método

Para métodos de determinación total de fenoles en aguas limpias y residuales, véase sección 5530. Los métodos presentados en esta sección están destinados a la determinación de los compuestos fenólicos individuales. Para los compuestos específicos cubiertos, véase cada método en particular. El método 6420B, de cromatografía de ga-

MÉTODOS NORMALIZADOS

6-148

ses (CG), utiliza extracción líquido-líquido y detección de ionización de llama (DIL) o derivación y detección de captura electrónica (DCE) para determinar una amplia variedad de fenoles en concentraciones relativamente bajas. Ade-

6420 B.

Método de extracción líquido-líquido con cromatografía de gases*

Este método1 es aplicable para determinar la presencia del fenol y algunos de sus sustitutos† en desagües municipales e industriales. Cuando se analicen muestras que no sean habituales para alguno o la totalidad de estos compuestos, apóyense las indentificaciones al menos con una técnica cualitativa adicional. Como alternativa, utilícese el procedimiento de derivación, limpieza y cromatografía de gases con detector de captura electrónica (CG/DCE) para confirmar las medidas realizadas con el procedimiento de cromatografía de gases con detector de ionización de llama (CG/DIL). El método para agentes básico/neutros y ácidos (sección 6410B) ofrece las condiciones de cromatografía de gases/espectrometría de masas (CG/EM) adecuadas para la confirmación cualitativa y cuantitativa de los resultados mediante el empleo del extracto producido. 1.

más, puede usarse el método 6420C, de extracción líquido-líquido con cromatografía de gases/espectrometría de masas (CG/EM), para determinar los fenoles en concentraciones ligeramente altas.

Discusión general

a) Principio: Véase sección 6010C para la discusión de los principios de la cromatografía de gases. Acidifíquese y * Aprobado por el Standard Methods Committee, 1987. Aceptado por la U.S. Environmental Protection Agency como equivalente al método EPA 604. † 4-Cloro-3-metilfenol, 2-clorofenol, 2,4-diclorofenol, 2,4-dimetilfenol, 2,4-dinitrofenol, 2-metil-4,6-dinitrofenol, 2-nitrofenol, 4-nitrofenol, pentaclorofenol, fenol, 2,4,6-triclorofenol.

extráigase un volumen medido de muestra con cloruro de metileno. Séquese el extracto e intercámbiese con 2-propanol durante la concentración. El extracto se separa mediante cromatografía de gases y los fenoles se miden con un detector de ionización de llama2. Este método ofrece los medios adecuados para un procedimiento de derivación y limpieza de cromatografía de columna como ayuda en la eliminación de interferencias2, 3. Analícense los derivados mediante un detector de captura electrónica. b) Interferencias: 1) Precauciones generales: Véase la sección 6410B.1b. 2) Otras contramedidas: Puede utilizarse el procedimiento de medida del apartado 5c para superar muchas de estas interferencias, aunque las muestras únicas pueden requerir una limpieza adicional para obtener los límites de detección del método. La limpieza de la muestra básica que se describe en el apartado 5a puede provocar bajas recuperaciones de fenol y 2,4-dimetilfenol. Los resultados obtenidos en estas condiciones son mínimas concentraciones. c) Límites de detección: El límite de detección del método (LDM) es la concentración mínima de una sustancia que puede medirse y comunicarse con un 99 por 100 de certidumbre de que el valor sea superior a cero4. Las concentraciones

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ANÁLISIS AUTOMATIZADO DE LABORATORIO

de LDM enumeradas en las tablas 6420:1 y II se obtuvieron mediante el empleo de agua para reactivos5. Con aguas residuales representativas pueden obtenerse resultados similares. El LDM conseguido en la realidad en un análisis dado varía en función de la sensibilidad de los instrumentos y los efectos de la matriz. d) Seguridad: El carácter tóxico o cancerígeno de cada reactivo utilizado en este método no ha sido aún definido con precisión. Tómense especiales precauciones al manejar el bromuro de pentafluorobencilo, que es lacrimógeno, y el 18corona-6-éter, altamente tóxico. 2. Toma de muestras y almacenamiento

Véase la sección 6410B.2. 3.

Instrumental

Utilícese todo el instrumental descrito en las secciones 6410B.3a-g e i-k, y ademas:

a) Columna cromatográfica, 100 mm de longitud x 10 mm de DI, con tapón de TFE. b) Matraz de reacción, de 15 a 25 ml, fondo redondo, con unión rematada en punta estándar, ajustada con un condensador de refrigeración por agua y un tubo de secado en forma de U que contenga cloruro de calcio granular. c) Cromaíógrafo de gases‡: Sistema analítico completo con un cromatógrafo de gases de temperatura programable adecuado para la inyección en columna y con todos los accesorios necesarios, entre ellos, jeringuillas, columnas analíticas, gases, detector y registrador de gráficos de bandas. Utilícese preferiblemente un sistema de datos para medir las áreas de los picos. 1) Columna para fenoles no derivados, vidrio, 1,8 m de longitud x 2 mm de DI, ‡ Los métodos de cromatografía de gases son extremadamente sensibles a los materiales utilizados. La mención de marcas comerciales del Standard Methods no excluye el uso de otros productos ya existentes o en fase de desarrollo que proporcionen resultados equivalentes demostrables.

TABLA 6420:I. CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS Y LÍMITES DE DETECCIÓN DEL MÉTODO

Condiciones de la columna: Supelcoport (retícula 80/l00) revestida con 1 por 100 SP-1240DA relleno en una columna de vidrio de 1,8 m de longitud x 2 mm de DI con gas portador nitrógeno a velocidad de flujo de 30 ml/min. Temperatura de columna de 80 °C en la inyección, programada inmediatamente a 8 °C/min hasta una temperatura final de 150 °C. LDM determinados con un DIL.

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MÉTODOS NORMALIZADOS TABLA 6420:II.

FRACCIONAMIENTO DE GEL DE SÍLICE Y CROMATOGRAFÍA DE GASES CON CAPTACIÓN DE ELECTRONES DE DERIVADOS PFBB

relleno con 1 por 100 de SP1240DA en Supelcoport (retícula 80/l00) o equivalente. El límite de detección y los datos de precisión y sesgo presentados en esta sección se desarrollaron mediante esta columna. Consúltese el apartado 561 para las directrices del uso de columnas alternativas (por ejemplo, capilar o megaorificio). 2) Columna para fenoles derivados, 1,8 m de longitud x 2 mm de DI, vidrio, relleno con 5 por 100 OV-17 en Chromosorb W-AW-DMCS (retícula 80/l00) o equivalente. Esta columna se utilizó para desarrollar el límite de detección y los datos de precisión y sesgo presentados en esta sección. Consúltese el apartado 5bl para las directrices sobre el uso de columnas alternativas (por ejemplo, capilar o megaorificio). 3) Detectores, ionización de llama (D1L) y captura electrónica (DCE). Utilícese el DIL para determinar los com-

puestos fenólicos. Empléese el DCE cuando se determinen fenoles derivados. Consúltense en el apartado 5b1 las directrices para el uso de detectores alternativos. 4.

Reactivos

Utilícense los reactivos enumerados en las secciones 6410B.4a-f, y además: a) Solución de hidróxido de sodio, NaOH, 1N: Disuélvanse 4 g de NaOH en agua para reactivos y dilúyanse hasta 100 ml. b) Ácido sulfúrico, H2SO4, 1N: Añádanse lentamente 58 ml de H 2SO 4 concentrado a 500 ml de agua para reactivos y dilúyanse hasta 1 litro. c) Carbonato de potasio, K2CO3, pulverizado. d) Bromuro de pentafluorobencilo (αbromopentafluorotolueno), con pureza

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ANÁLISIS AUTOMATIZADO DE LABORATORIO

mínima del 97 por 100. (PRECAUCIÓN: Este compuesto químico es lacrimógeno) e) 18-corona-6-éter (1,4,7,10,13,16-hexaciclooctadecano), con pureza mínima del 98 por 100. (PRECAUCIÓN: Este compuesto químico es altamente tóxico.) f) Reactivo de derivación: Añádase 1 ml de bromuro de pentafluorobencilo y 1 g de 18-corona-6-éter a un matraz volumétrico de 50 ml y dilúyase hasta el volumen con 2-propanol. Prepárese de nuevo con una periodicidad semanal, siempre en una campana. Almacénese a 4 °C y protéjase de la luz. g) Acetona, hexano, metanol, cloruro de metileno, 2-propanol, tolueno, calidad de pesticida o equivalente. h) Gel de sílice, retícula 100/200§. Actívese a 130 °C durante toda una noche y almacénese en un desecador. i) Soluciones patrón de reserva: Prepárense a partir de materiales estándar puros o adquiéranse como soluciones certificadas. Prepárese como se indicó en la sección 6410B.4g, aunque sin disolver el material en 2-propanol. j) Estándares de calibrado: Prepárense los estándares de calibrado apropiados para elegir los medios de calibrado. 1) Estándares externos: Prepárense como mínimo tres niveles de concentración para cada compuesto mediante la adición de volúmenes de uno o más estándares de reserva sobre un matraz volumétrico y dilúyanse hasta el volumen con 2-propanol. Prepárese un estándar a una concentración próxima, aunque superior, al LDM (véanse las tablas 6420:I y II) y las restantes como correspondientes al intervalo esperado de concentraciones de la muestra o de modo que definan el intervalo de trabajo del detector. 2) Estándares internos: Prepárense como mínimo tres niveles de concentración para cada compuesto mediante la § Calidad Davison 923 o equivalente.

adición de volúmenes de uno o más estándares de reserva a un matraz volumétrico. Para cada estándar de calibrado, añádase una cantidad constante conocida de uno o más estándares internos y dilúyase hasta el volumen con 2-propanol. Prepárese un estándar a una concentración próxima, aunque superior, al LDM y las restantes según el intervalo esperado de concentraciones de la muestra o de modo que definan el intervalo de trabajo del detector. k) Muestra concentrada de comprobación del control de calidad (CC): Obténgase una muestra concentrada|| de comprobación que contenga cada uno de los compuestos en una concentración de 100 µg/ml en 2-propanol. Si no se encuentra disponible esta muestra en una fuente externa, prepárese mediante estándares de reserva preparados independientemente de los utilizados para calibrado. 5.

Procedimiento

a) Extracción: Márquese el menisco de agua en el lateral de la botella de muestra para ulteriores determinaciones del volumen. Viértase toda la muestra en un embudo de separación de 2 l. Para muestras de mayor contenido orgánico, límpiese la muestra con disolvente con pH básico como se prescribe en el apartado siguiente para eliminar potenciales interferencias. Durante el lavado, evítense contactos prolongados o exhaustivos con el disolvente, que pueden producir bajas recuperaciones de algunos fenoles, en particular el fenol y el 2,4-dimetilfenol. Para muestras relativamente limpias, omítase el lavado y realícese directamente la extracción. || Para análisis relacionados con patentes federales estadounidenses utilícense muestras obtenidas en EE. UU. EPA Environmental Monitoring and Support Laboratory, Cincinnati, Ohio.

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Para el lavado, ajústese el pH a 12,0 o más con una solución de NaOH. Añádanse 60 ml de cloruro de metileno y agítese el embudo durante 1 min, abriéndolo repetidas veces para liberar la presión excesiva. Deséchese la capa de disolvente. Repítase el lavado dos veces más si se advierte la eliminación progresiva del color significativo. Antes de la extracción, ajústese el pH de 1 a 2 con H2SO4. Extráigase tres veces con cloruro de metileno como se indicó en la sección 6410B.5al). Instálese un aparato Kuderna-Danish, concéntrese el extracto a 1 ml y retírese, séquese y enfríese el aparato K-D como se indicó en la sección 6410B.5al). Increméntese la temperatura del baño de agua caliente hasta 100 °C. Retírese la columna Snyder y aclárese el matraz y su unión inferior con el tubo concentrador con 2 ml de 2-propanol. Utilícese preferentemente para esta operación una jeringuilla de 5 ml. Únase una columna micro-Snyder de dos colas al tubo concentrador y humedézcase previamente la columna mediante la adición de aproximadamente 0,5 ml de 2-propanol a la parte superior. Colóquese el aparato KD en un baño de agua de forma que el tubo concentrador se sumerja parcialmente en el agua caliente. Ajústese la posición vertical del aparato y la temperatura del agua para completar la concentración entre 5 y 10 minutos. (PRECAUCIÓN. Si la temperatura aumenta demasiado deprisa, la muestra puede ser expulsada del aparato K-D) A una velocidad adecuada de destilación, las bolas de la columna vibran de forma activa pero no se inundan las cámaras. Cuando el volumen aparente del líquido alcance 2,5 ml, retírese el aparato K-D y déjese secar y enfriar durante 10 minutos como mínimo. Añádanse 2 ml de 2-propanol a través de la parte superior de la columna micro-Snyder y reanúdese la concentración como se ha descrito anteriormente. Cuando el volumen aparente del líquido alcance 0,5 ml,

MÉTODOS NORMALIZADOS

retírese el aparato K-D y déjese secar y enfriar durante 10 minutos como mínimo. Retírese la columna micro-Snyder y aclárese la unión inferior con el tubo concentrador con una cantidad mínima de 2-propanol. Ajústese el volumen de extracto a 1,0 ml. Ciérrese el tubo concentrador y almacénese a 4 °C si no se va a realizar con él ningún proceso inmediato. Si se va a almacenar el extracto durante más de 2 días, transfiérase a una ampolla de tapón de rosca cerrada con TFE. Si el extracto de muestra no requiere una limpieza posterior, realícese un análisis cromatográfico como se señala en el apartado b. Si la muestra precisa una limpieza posterior, procédase como se ha descrito en el apartado c. Determínese el volumen original de la muestra al rellenar la botella de muestra hasta la marca y transfiérase el líquido a un cilindro graduado de 1.000 ml. Regístrese un volumen de la muestra lo más cercano a 5 ml. b) Cromatografía de gases con detector de ionización de llama (CG/DIL): 1) Condiciones de funcionamiento. La tabla 6420:I resume las condiciones recomendadas de funcionamiento para el cromatógrafo de gases y suministra los tiempos de retención y los LDM que pueden obtenerse en estas condiciones. En la figura 6420:1 se muestra un ejemplo de las separaciones obtenidas con esta columna. Pueden utilizarse otras columnas capilares o de relleno (tubular abierta), condiciones cromatográficas o detectores, siempre que reúnan los requisitos expuestos en el apartado 7. 2) Calibrado. Para calibrar el sistema de fenoles no derivados, establézcanse las condiciones de funcionamiento de la cromatografía de gases equivalentes a las de la tabla 6420:I. Realícese el calibrado mediante las técnicas de estándares externos e internos del siguiente modo: a) Procedimiento de calibrado de estándar externo: Prepárense estándares

ANÁLISIS AUTOMATIZADO DE LABORATORIO

Figura 6420:1. Cromatograma de gases de los fenoles. Columna: 1 % SP1240DA en Supelcoport; programa: 80 °C en la inyección, inmediatamente 8 °C/min hasta 150 °C; detector: ionización de llama.

como se explicó en el apartado 4j1 y sígase el procedimiento expuesto a continuación en el apartado 3. Tabúlense los datos y obténgase la curva de calibrado o el factor de calibrado según se explicó en la sección 6230B.5b2). b) Procedimiento de calibrado de estándar interno: Prepárense las muestras como se explicó en el apartado 4j2 y sígase el procedimiento expuesto a continuación en el apartado 3. Tabúlense los datos y calcúlense los factores de respuesta como se explicó en la sección 6210B.5c2). Todos los días de trabajo verifíquese la

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curva de calibrado de trabajo y el factor de calibrado o el FR mediante la medida de uno o más estándares de calibrado. Si el factor de respuesta de alguno de los compuestos difiere en más de ±15 por 100 del valor previsto, prepárese una nueva curva de calibrado para dicho compuesto. 3) Análisis de muestra. Si se utiliza un procedimiento de calibrado estándar, añádase estándar interno al extracto de muestra y mézclese concienzudamente de modo inmediato antes de inyectar de 2 a 5 µl de extracto de muestra o estándar en el cromatógrafo de gases mediante la técnica de inundación de disolvente6. Pueden inyectarse volúmenes inferiores (1,0 /µl) cuando se empleen dispositivos automáticos. Regístrese el volumen inyectado lo más cercano posible a 0,05 µl y el tamaño de pico resultante en unidades de área o altura. Identifiqúense los compuestos en la muestra por comparación de los tiempos de retención de los picos con los picos de los cromatogramas estándar. Básese la anchura de la ventana de tiempos de retención usada para realizar las identificaciones en las medidas de las variaciones reales de los tiempos de retención de los estándares a lo largo del transcurso del día. Para calcular un tamaño sugerido de ventana, utilícese tres veces la desviación estándar del tiempo de retención para un compuesto. La experiencia del analista es importante en la interpretación de los cromatogramas. Si la respuesta supera para un pico el intervalo de trabajo del sistema, dilúyase el extracto y vuélvase a analizar. Si no es posible medir la respuesta por la presencia de interferencias, utilícese el procedimiento alternativo de cromatografía de gases como se describe más adelante en el apartado c. c) Derivación y cromatografía de gases con captura de electrones (CG/DCE): 1) Derivación: Llévese con la pipeta

6-154

1,0 ml de la solución de 2-propanol del estándar o el extracto de muestra a la ampolla de vidrio de reacción. Añádase 1,0 ml de reactivo para derivación (véase el apartado 4f); esto es suficiente para obtener la derivación en una solución que posea un contenido fenólico total no superior a 0,3 mg/ml. Añádanse unos 3 mg de K2CO3 y agítese suavemente. Tápese la mezcla y caliéntese durante 4 horas a 80 °C en un baño de agua caliente. Retírese del baño de agua caliente y déjese enfriar. Añádanse 10 ml de hexano y agítese fuertemente durante 1 min. Añádanse 3,0 ml de agua destilada y desionizada y agítese durante 2 min. Decántese una porción de la capa orgánica en un tubo concentrador y cúbrase con un tapón de vidrio esmerilado. 2) Limpieza: Coloqúense 4,0 g de gel de sílice en una columna cromatográfica. Golpéese levemente la columna para depositar el gel de sílice y añádanse unos 2 g de Na2SO4 anhidro en la parte superior. Elúyase previamente la columna con 6 ml de hexano. Deséchese el eluato y, justo antes de exponer la capa de Na2SO4 al aire, llévense con la pipeta sobre la columna 2,0 ml de solución de hexano, según se ha visto en el apartado 1) que contiene la muestra o el estándar derivado. Elúyase la columna con 10,0 ml de hexano y deséchese el eluato. Elúyase la columna, en orden, con 10,0 ml de 15 por 100 de tolueno en hexano (fracción 1), 10,0 ml de 40 por 100 de tolueno en hexano (fracción 2), 10,0 ml de 75 por 100 de tolueno en hexano (fracción 3) y 10,0 ml de 15 por 100 de 2-propanol en tolueno (fracción 4). Prepárense todas las mezclas de elución sobre una base volumen: volumen. En la tabla 6420:II se muestran los modelos de elución para los derivados fenólicos. Las fracciones pueden combinarse como se desee en función de los fenoles específicos objeto de estudio o el nivel de interferencias. 3) Condiciones de funcionamiento:

MÉTODOS NORMALIZADOS

La tabla 6420:II resume las condiciones recomendadas de funcionamiento para el cromatógrafo de gases y suministra los tiempos de retención y los LDM que pueden obtenerse según estas condiciones. En la figura 6420:2 se muestra un ejemplo de las separaciones obtenidas mediante esta columna. 4) Calibrado: Calíbrese el sistema a diario mediante la preparación de un mínimo de tres porciones de 1 ml de estándares de calibrado, como puede verse en el apartado 4j1 que contengan cada uno de los fenoles objeto de estudio, y los derivados. Analícense de 2 a 5 µl de cada eluato de columna recogido como se explica más adelante en el apartado 5, y tabúlese la altura de los picos o las respuestas del área en función de la masa equivalente calculada de fenol no derivado inyectado. Prepárese una curva de calibrado para cada compuesto.

Figura 6420:2. Cromatograma de gases de derivados PFB de fenoles. Columna: 5 % OV-17 en Chromosorb W-AW-DMCS; temperatura: 200 °C; detector: captura de electrones.

6-155

ANÁLISIS AUTOMATIZADO DE LABORATORIO

Antes de emplear ningún procedimiento de limpieza, procésense una serie de estándares de calibrado para validar los modelos de elución y garantizar la ausencia de interferencias procedentes de los reactivos. 5) Análisis de muestras: Inyéctese entre 2 y 5 µl de fracciones de columna en el cromatógrafo de gases mediante la técnica de inundación con disolvente. Pueden inyectarse volúmenes menores (1,0 µl) si se utilizan dispositivos automáticos. Regístrense los volúmenes inyectados cercanos a 0,05 µl y el tamaño de los picos resultantes en unidades de área o de altura. Si la respuesta de los picos supera el intervalo lineal del sistema, dilúyase el extracto y vuélvase a analizar.

donde: A s = respuesta para el compuesto que se quiera medir, A is = respuesta para el estándar interno, I s = cantidad de estándar interno añadida a cada extracto, µg, y Vo = volumen de agua extraída, l.

b) Derivación y análisis CG/DCE: Para determinar la concentración de compuestos individuales en la muestra, utilícese la ecuación:

donde: A = masa del fenol no derivado representada por el área de los picos en el cromatograma de la muestra, determinada a partir de la curva de calibrado en el apartado 5c4, ng, Vi = volumen de eluato inyectado, µl, Vt = volumen total de eluato de columna o fracciones combinadas a partir de las cuales se tomó Vi, µl, Vs = volumen de agua extraída en el apartado 5a, ml, B = volumen total de hexano añadido en el apartado 5cl, ml, C = volumen de solución muestra de hexano añadida a la columna de limpieza en el apartado 5c2, ml. D = volumen total de extracto de 2-propanol antes de la derivación, ml, y E = volumen de extracto de 2-propanol transportado a través de la derivación como en el apartado 5cl, ml.

6. Cálculos a) Análisis CG/DIL: Determínese la concentración de los compuestos individuales. Si se utiliza un procedimiento de calibrado estándar interno, calcúlese la cantidad de material inyectado a partir de la respuesta de picos mediante la curva de calibrado o el factor de calibrado determinados previamente. Calcúlese la concentración de la muestra a partir de la ecuación:

donde: A = cantidad de material inyectado, ng, Vi = volumen de extracto inyectado, µl, V t = volumen de extracto total, µl, y V s = volumen de agua extraída, ml.

Si se utiliza un procedimiento de calibrado de estándar interno, calcúlese la concentración en la muestra mediante el factor de respuesta (FR) determinado anteriormente y la ecuación:

Comuníquense los resultados en µg/l sin correcciones de recuperación. Compárense con los resultados de la muestra los datos de CC. 7.

Control de calidad

a) Programa de control de calidad: Véase sección 6210B.7a. b) Comprobación de la competencia del analista: Para establecer la capacidad

6-156

MÉTODOS NORMALIZADOS

TABLA 6420:III. CRITERIOS DE ADMISIÓN AL CC*

para generar datos con sesgo y precisión aceptables, llévense a cabo las operaciones siguientes: Mediante una pipeta prepárense muestras de comprobación del CC en concentraciones de 100 µg mediante la adición de 1,00 ml de una muestra concentrada de comprobación del CC de 100 µg/ml sobre cada una de las cuatro porciones de 1 l del agua para reactivos. Analícense las muestras de comprobación de acuerdo con el método expuesto en el apartado 5 y actúese según lo descrito en la sección 6210B.7b. Utilícense los criterios de aceptación que aparecen en la tabla 6420:III. c) Análisis de muestras con adiciones conocidas: Sobre una base en curso, realícense adiciones conocidas en al menos el 10 por 100 de las muestras en cada lugar de toma de muestras en fase de seguimiento. Para laboratorios que estudien de una a diez muestras al mes, analícese como mínimo una de estas muestras con adición conocida al mes. Utilícese el

procedimiento detallado en la sección 6210B.7c pero empléese una adición de 100 µg/l mejor que 20 µg/l y compárense las recuperaciones porcentuales de cada compuesto con los correspondientes criterios de aceptación de CC contenidos en la tabla 6420:III. Si la adición conocida se realizó a una concentración inferior a 100 µg/l, utilícense los criterios de aceptación de CC de la tabla 6420:III o bien los criterios de aceptación del CC opcionales calculados para la concentración de la adición específica según las ecuaciones de la tabla 6420:IV. d) Análisis estándar de comprobación del control de calidad: Si el análisis de alguno de los compuestos incumple los criterios de aceptación para la recuperación, prepárese y analícese un estándar de comprobación del CC que contenga cada uno de los compuestos afectados. NOTA: La frecuencia de los análisis requeridos del estándar de comprobación del CC dependerá del número de compuestos en fase de prueba de forma si-

6-157

ANÁLISIS AUTOMATIZADO DE LABORATORIO TABLA 6420:IV. SESGO Y PRECISIÓN DEL MÉTODO COMO FUNCIONES DE LA CONCENTRACIÓN*

multánea, de la complejidad de la matriz de la muestra y del rendimiento del laboratorio. Prepárese un estándar de comprobación del CC mediante la adición de 1,0 ml de muestra concentrada de comprobación del CC sobre 1 l de agua para reactivos y procédase del mismo modo que en la sección 6210B.7d mediante el empleo de la tabla 6420:III. e) Evaluación del sesgo y registros: Evalúese el sesgo del método y mantéganse los registros como se indicó en la sección 6210B.7e. f) Prácticas adicionales de garantía de calidad: Véase la sección 6210B.7g.

450 µg/l 7. La precisión de un único analista, la precisión global y el sesgo del método se relacionaron directamente con la concentración de los compuestos y son independientes de la matriz de muestra. Las ecuaciones lineales que describen estas relaciones para un detector de ionización de llama se presentan en la tabla 6420:IV. 9. 1.

2.

8.

Precisión y sesgo

Este método fue experimentado en 20 laboratorios mediante agua para reactivos, agua potable, aguas de superficie y tres aguas residuales industriales con adiciones conocidas en seis concentraciones comprendidas en el intervalo de 12 a

3.

Referencias U.S. ENVIRONMENTAL P ROTECTION AGEN CY . 1984. Method 604 —Phenols. 40 CFR Part 136, 43290; Federal Register 49, n.° 209. U. S. ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENCY . 1984. Determination of phenols in industrial and municipal wastewaters. Final rep. EPA Contract 68-03-2625, Environmental Monitoring and Support Lab., Cincinnati, Ohio. KAWAHARA , F. K. 1968. microdetermination of derivatives of phenols and mercaptans by means of electron capture gas chromatography. Anal. Chem. 40:100.

6-158

4.

5.

MÉTODOS NORMALIZADOS

U. S. ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENCY . 1984. Definition and procedure for the determination of the method detection limit. 40 CFR Part 136, Appendix B. Federal Register 49, n.° 209. U. S. ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENCY . Development of detection limits, EPA Method 604, Phenols. Special letter report for EPA Contract 68-03-2625, Environmental Monitoring and Support Lab., Cincinnati, Ohio.

6. BURKE, J. A. 1965. Gas chromatography for pesticide residue analysis; some practical aspects. J. Assoc. Offic. Anal. Chem. 48:1037. 7. U. S. ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENCY . 1984. EPA Method Study 14, Method 604 —Phenols. EPA-600/4-84-044, National Technical Information Serv., PB84196211, Springfield, Virginia.

6420 C. Método de extracción líquido-líquido con cromatografía de gases/espectrometría de masas

Véase sección 6410B.

6431

BIFENILOS POLICLORADOS 6431 A.

Introducción

1. Fuentes y significado

2.

Selección del método

Los bifenilos policlorados se suelen encontrar en los suministros de agua contaminados por aceites transformadores en los que se utilizaron originalmente los BPC como medios de intercambio de calor. Aunque el uso de estos compuestos ha sido erradicado, existen aún en la actualidad numerosos transformadores que contienen BPC que evacúan ocasionalmente en aguas potables o residuales. Estos compuestos son tóxicos, bioacumulativos y extremadamente estables, por lo que su detección en aguas residuales constituye una necesidad.

Para realizar un seguimiento simultáneo de los BPC y de los pesticidas organoclorados, se utiliza un método de extracción líquido-líquido (ELL) con cromatografía de gases (CG), que posee una excelente sensibilidad. El método de extracción líquido-liquido (ELL) con cromatografía de gases (CG) puede utilizarse también para detectar los BPC, aunque entonces presenta una sensibilidad sustancialmente menor.

6-159

ANÁLISIS AUTOMATIZADO DE LABORATORIO

6431 B.

Método de extracción líquido-líquido con cromatografía de gases

Véanse las secciones 6630B y C.

6431 C. Método de extracción líquido-líquido con cromatografía de gases/espectrometría de masas Véase la sección 6410B.

6440

HIDROCARBUROS POLINUCLEARES AROMÁTICOS 6440 A.

Introducción

1. Fuentes y significado

2.

Selección del método

Los hidrocarburos aromáticos polinucleares (HAP) suelen ser subproductos del proceso y combustión de petróleos. Muchos de estos compuestos poseen un carácter altamente carcinógeno en niveles relativamente bajos. Aunque, por lo general insolubles en agua, su naturaleza altamente peligrosa justifica su monitorización en aguas potables y residuales.

El método 6440B encierra un método de cromatografía líquida de alto rendimiento (CLAR) con detección de fluorescencia y UV y un método de cromatografía de gases (CG) que utiliza detección por ionización de llama. El método 6440C representa un método de cromatografía de gases/espectrometria de masas (CG/EM) que puede detectar también estos compuestos por muy altas que sean sus concentraciones. Algunos de estos compuestos pueden medirse además mediante un análisis de depuración de ciclo cerrado, sección 6040.

6-160

MÉTODOS NORMALIZADOS

6440 B.

Método de extracción líquido-líquido con cromatografía de gases*

Este método1 es aplicable para determinar algunos hidrocarburos aromáticos polinucleares (HAP)† en desagües municipales e industriales. Cuando se analicen muestras no habituales para alguno o la totalidad de estos compuestos, respáldense las identificaciones como mínimo con una técnica cualitativa adicional. El método para agentes básico/neutros y ácidos (sección 6410B) ofrece las condiciones de cromatografía de gases/espectrometría de masas (CG/EM) apropiadas para la confirmación cuantitativa y cualitativa de los resultados mediante el extracto producido. 1.

Discusión general

a) Principio: Extráigase un volumen medido de la muestra con cloruro de metileno. Séquese el extracto, concéntrese y sepárese por métodos de cromatografía líquida de alto rendimiento (CLAR) o de cromatografía de gases (CG). Si han de realizarse otros análisis que posean las mismas fases de extracción y concentración, es suficiente con una extracción de muestra única para todas las determinaciones. Los detectores de fluorescencia y ultravioletas (UV) se utilizan en el CLAR para efectuar la identificación y medida de los HAP. Con CG se emplea un detector de ionización de llama2. El método suministra una limpieza de columna de gel de sílice para apoyar la

* Aprobado por el Standard Methods Committee, 1987. Aceptado por la U.S. Environmental Protection Agency como equivalente al método EPA 610. † Acenafteno, acenaftileno, antraceno, benzo(a)antraceno, benzo(a)-pireno, benzo(b)fluoranteno, benzo(ghi)perileno, benzo(k)fluoranteno, creseno, dibenzo(a,h)antraceno, fluoranteno, fluoreno, indeno(l,2,3-cd)pireno, naftaleno, fenantreno y pireno.

eliminación de interferencias. Cuando se requiera una limpieza, los niveles de concentración de la muestra han de ser suficientemente elevados para permitir el tratamiento de separación de submuestras antes de las fases de intercambio de disolventes. Pueden seleccionarse las condiciones cromatográficas (apartado 5d) apropiadas para la medida simultánea de combinaciones de estos compuestos, aunque éstas no resuelven las cuatro parejas siguientes de compuestos: antraceno y fenantreno; criseno y benzo(a)-antraceno; benzo(b)fluoranteno y benzo(k)fluoranteno; y dibenzo(a,h)antraceno e indeno(l,2,3-cd)pireno. A no ser que resulte aceptable la comunicación de la suma de estas parejas sin resolver, utilícese el método de cromatografía líquida para los 16 HAP enumerados. b) Interferencias: Véase la sección 6410B.1b para las precauciones concernientes al material de vidrio, la pureza de los reactivos y las interferencias de la matriz. Las interferencias en las técnicas de cromatografía líquida no han sido aún completamente evaluadas. A pesar de que las condiciones CLAR descritas permiten la resolución única de HAP específicos, pueden producirse interferencias de otros compuestos HAP. c) Límites de detección: El límite de detección del método (LDM) es la concentración mínima de una sustancia que puede medirse y comunicarse con el 99 por 100 de certidumbre de que su valor sea superior a cero3. Las concentraciones del LDM enumeradas en la tabla 6440:I se obtuvieron con agua para reactivos4. Se lograron resultados similares con aguas residuales representativas. No se determinaron los LDM para el método CG. Los LDM obtenidos en la realidad en un análisis dado varían en función de

6-161

ANÁLISIS AUTOMATIZADO DE LABORATORIO

TABLA 6440:I. CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS LÍQUIDAS DE ALTO RENDIMIENTO Y LÍMITES DE DETECCIÓN DEL MÉTODO

la sensibilidad de los instrumentos y los efectos de la matriz. Se probó la linealidad de recuperación de adiciones conocidas de este método a partir de agua para reactivos y se comprobó su aplicación en el intervalo de concentraciones comprendido entre 8 x LDM y 800 x LDM 4 , con las excepciones siguientes: la recuperación del benzo(ghi)perileno a 80 x LDM y 800 x LDM era baja (35 y 45 por 100, respectivamente). d) Seguridad: La naturaleza tóxica o carcinógena de estos reactivos no ha sido aún definida con precisión. Los compuestos siguientes han sido clasificados de forma provisional como conocidos o presuntos agentes carcinógenos para los seres humanos y los mamíferos: benzo(a)antraceno, benzo(a)pireno y

dibenzo(a,h)antraceno. Prepárense los estándares primarios de estos compuestos en una campana y llévese máscara para respiración antigases tóxicos aprobada por NIOSH/MESA cuando se manejen altas concentraciones. 2. Toma de muestras y almacenamiento

Véase la sección 6410B.2 para los requisitos de toma de muestras y almacenamiento. Dado que los HAP son altamente sensibles a la luz, almacénense las muestras, extractos y estándares en botellas ámbar o envueltas en cinta metálica para reducir lo más posible la descomposición fotolítica.

6-162

3.

Instrumental

Utilícese todo el instrumental reseñado en las secciones 6410B.3a-g e i-k, y además: a) Columna cromatografía, 250 mm de longitud x 10 mm de DI con disco de filtro poroso en el fondo y cierre de TFE. b) Cromatógrafo líquido de alto rendimiento (CLAR): Sistema analítico completo con suministros de columna, jeringuillas de alta presión, detectores y registradores de gráficos de bandas compatibles. Utilícese preferiblemente un sistema de datos para medir las áreas de los picos y los tiempos de retención. 1) Sistema de bombeo de gradiente, flujo constante. 2) Columna de fase inversa, HC-ODS Sil-X, diámetro de partícula de 5 µm, en una columna de acero inoxidable de 25 cm x 2,6 mm de DI‡. Esta columna se utilizó para desarrollar los LDM y los datos de sesgo y precisión presentados en esta sección. Consúltense en el apartado 5dl las líneas maestras para el uso de columnas alternativas. 3) Detectores, de fluorescencia y/o UV. Utilícese el detector de fluorescencia para excitaciones a 280 mm y emisiones superiores al punto de corte de 389 nm§. Empléense fluorómetros con elementos ópticos de dispersión para excitaciones que utilicen filtros o medios ópticos dispersivos en el detector de emisión. Hágase funcionar el detector UV a 254 nm y acóplese al detector de fluorescencia. Estos detectores se utilizaron para desarrollar los LDM y los datos de sesgo y precisión presentados en esta sección. Consúltense en el apartado 5d1 las líneas maestras para el uso de detectores alternativos. c) Cromatógrafo de gases||: Sistema ‡ Perkin Elmer n.° 089-0716 o equivalente. § Corning 3-75 o equivalente. || Los métodos de cromatografía de gases son extre-

MÉTODOS NORMALIZADOS

analítico completo con un cromatógrafo de gases de temperatura programable adecuado para la inyección en columna o sin división y todos los accesorios necesarios, esto es, jeringuillas, columnas analíticas, gases, detector y grabador de gráficos de barras. Utilícese un sistema de datos para medir las áreas de los picos. 1) Columna, vidrio de 1,8 m de longitud x 2 mm de DI, relleno con 3 por 100 OV-17 en Chromosorb W-AW-DCMS (retícula 100/l20) o equivalente. Esta columna se utilizó para desarrollar los datos de tiempo de retención de la tabla 6440:II. Consúltense en el apartado 5d2 las líneas maestras para el uso de columnas alternativas (por ejemplo, capilar o megaorificio). 2) Detector, ionización de llama. Este detector resulta eficaz excepto para la resolución de los cuatro pares de compuestos enumerados en el apartado la. Con el uso de columnas capilares, estos pares pueden resolverse mediante CG. Consúltense en el apartado 5d2 las líneas maestras para el uso de detectores alternativos. 4.

Reactivos

a) Agua para reactivos: Véase la sección 6210B.4a. b) Tiosulfato de sodio, Na2S2O3 · · 5H2, granular. c) Ciclohexano, metanol, acetona, cloruro de metileno, pentano, calidad de pesticida o equivalente. d) Acetonitrilo, calidad CLAR, destilado en vidrio. e) Sulfato de sodio, Na2SO4, granular, anhidro. Purifíquese por calentamadamente sensibles a los materiales utilizados. La mención de marcas comerciales del Standard Methods no excluye el uso de otros productos ya existentes o en fase de desarrollo que demuestren resultados equivalentes.

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ANÁLISIS AUTOMATIZADO DE LABORATORIO

TABLA 6440:II. CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS DE GAS Y TIEMPOS DE RETENCIÓN

miento a 400 °C durante 4 h en una cubeta poco profunda. f) Gel de sílice, retícula 100/200, desecante #. Antes de usar, actívese durante al menos 16 h a 130 °C en una cubeta de vidrio poco profunda, vagamente cubierto con papel metalizado. g) Soluciones patrón de reserva: Prepárese como se indicó en la sección 6410B.4g, mediante acetonitrilo como disolvente. h) Estándares de calibrado: Prepárense los estándares adecuados para elegir los medios de calibrado según las directrices de la sección 6420B.4j; teniendo en cuenta que el acetonitrilo es el disolvente elegido en lugar del 2-propanol. Véase la tabla 6440:I para los LDM. i) Muestra concentrada de comprobación del control de calidad (CC): Obténgase una muestra de comprobación concentrada** que contenga todos los com-

# Davison, calidad 923 o equivalente. ** Para análisis relacionados con patentes federales

puestos en las concentraciones siguientes en acetonitrilo: 100 µg/ml de cualquiera de los seis HAP de rápida elución (naftaleno, acenaftileno, acenafteno, fluoreno, fenantreno y antraceno); 5 µg/ml de benzo(k)fluoranteno; y 10 µg/ml de cualquier otro HAP. Si no se encuentra disponible esta muestra en una fuente externa, prepárese a partir de patrones de reserva preparados independientemente de los empleados para calibrado. 5.

Procedimiento

a) Extracción: Márquese el menisco de agua en el lateral de la botella de muestra para ulteriores determinaciones del volumen. Viértase toda la muestra en un embudo de separación de 2 l y extráigase como se indicó en la sección 6410B-5al sin ningún ajuste de pH. Después de la extracción, concéntrese estadounidenses, utilícense muestras obtenidas en EE. UU. EPA Environmental Monitoring and Support Laboratory, Cincinnati, Ohio.

6-164

por adición de uno o dos dispositivos limpios de ebullición al matraz de evaporación y únase una columna Snyder de tres bolas. Humedézcase previamente la columna Snyder mediante la adición de 1 ml de cloruro de metileno en la parte superior. Colóquese un aparato K-D en un baño de agua caliente (entre 60 y 65 °C) en una campana de modo que el tubo concentrador se sumerja parcialmente en el agua caliente, y toda la superficie inferior redondeada del matraz quede bañada por el vapor. Ajústese la posición vertical del aparato y la temperatura del agua en la forma necesaria para completar la concentración en unos 15 ó 20 minutos. Con una adecuada velocidad de destilación, las bolas de la columna vibran activamente pero las cámaras no se inundan con disolvente condensado. Cuando el volumen del líquido alcance 1 ml, retírese el aparato K-D y déjese secar y enfriar durante 10 min como mínimo. Retírese la columna Snyder y aclárense el matraz y su unión inferior al tubo concentrador con 1 ó 2 ml de cloruro de metileno. Úsese preferiblemente una jeringuilla de 5 ml para esta operación. Tápese el tubo concentrador y almacénese en un lugar refrigerado si no se van a realizar procesos inmediatos. Cuando se desee almacenar un extracto durante más de 2 días transfiérase a una ampolla de tapón de rosca cerrada con TFE y protéjase de la luz. Si el extracto de muestra no requiere limpiezas posteriores, realícese el análisis con cromatografía líquida o de gases (apartados c-f, desarrollados más adelante). Si la muestra requiere una limpieza posterior, sígase primero el procedimiento expuesto en el apartado b antes de realizar el análisis cromatográfico. Determínese el volumen original de la muestra llenando la botella de muestra hasta la marca y traspasando el líquido a un cilindro graduado de 1.000 ml. Regístrese el volumen de muestra más próximo posible a 5 ml.

MÉTODOS NORMALIZADOS

b) Limpieza y separación: Utilícese el procedimiento expuesto a continuación o cualquier otro procedimiento apropiado; sin embargo, demuéstrese previamente que se verifican los requisitos del apartado 7. Antes de usar una técnica de limpieza con gel de sílice, cámbiese el disolvente del extracto por ciclohexano. Añádase entre 1 y 10 ml de extracto de muestra (en cloruro de metileno) y un dispositivo de ebullición a un tubo concentrador limpio de K-D. Añádanse 4 ml de ciclohexano y únase una columna microSnyder de dos bolas. Humedézcase previamente la columna por adición de 0,5 ml de cloruro de metileno sobre la parte superior. Colóquese el aparato micro-K-D en un baño de agua en ebullición (100 °C) de modo que el tubo concentrador se sumerja parcialmente en el agua caliente. Ajústese la posición vertical del aparato y la temperatura del agua de forma que se complete la concentración entre 5 y 10 minutos. Con una velocidad de destilación adecuada, las bolas de la columna vibran activamente pero las cámaras no se inundan. Cuando el volumen aparente del líquido alcance 0,5 ml, retírese el aparato K-D y déjese secar y enfriar durante unos 10 min. Retírese la columna micro-Snyder y aclárese su unión inferior con el tubo concentrador con una cantidad mínima de ciclohexano. Ajústese el volumen del extracto aproximadamente a 2 ml. Para realizar una limpieza de columna con gel de sílice, hágase una mezcla espesa de 10 g de gel de sílice activada con cloruro de metileno y colóquese en una columna cromatográfica de 10 mm de DI. Golpéese levemente la columna para depositar el gel de sílice y elúyase con cloruro de metileno. Añádanse 1 ó 2 cm de Na 2 SO 4 en la parte superior del gel de sílice. Elúyase previamente con 40 ml de pentano a una velocidad aproximada de 2 ml/min. Deséchese el eluato y, justo antes de exponer la capa de Na2SO4 al

ANÁLISIS AUTOMATIZADO DE LABORATORIO

aire, transfiérase todo el extracto de muestra de ciclohexano sobre la columna mediante 2 ml adicionales de ciclohexano. También justo antes de exponer al aire la capa de Na2SO4, añádanse 25 ml de pentano y continúese la elución. Deséchese este eluato de pentano. A continuación, elúyase la columna con 25 ml de cloruro de metileno/pentano (4 + 6) (v/v) en un matraz K-D de 500 ml dotado de un tubo concentrador de 10 ml. Concéntrese la fracción recogida en un valor inferior a 10 ml, al igual que en el apartado 5a. Después del enfriamiento, retírese la columna Snyder y aclárense el matraz y su unión inferior con pentano. c) Reconcentración: Concéntrese posteriormente del modo siguiente: 1) Para cromatografía de gases de alto rendimiento. Extráigase en un tubo concentrador, añádanse 4 ml de acetonitrilo y un nuevo elemento de ebullición. Únase una columna micro-Snyder de dos bolas y concéntrese el disolvente como se indicó en el apartado 5a (aunque debe situarse el baño de agua entre 95 y 100 °C). Tras su enfriamiento, retírese la columna micro-Snyder y aclárese su unión inferior con el tubo concentrador con unos 0,2 ml de acetonitrilo. Ajústese el volumen del extracto a 1,0 ml. 2) Para cromatografía de gases. Para obtener una sensibilidad máxima con este método, concéntrese el extracto a 1,0 ml. Añádase una pastilla limpia para ebullición al extracto de cloruro de metileno en el tubo concentrador. Únase una columna micro-Snyder de dos bolas. Humedézcase previamente la columna mediante la adición de 0,5 ml de cloruro de metileno sobre la parte superior. Colóquese el aparato micro-K-D en un baño de agua caliente (60 a 65 °C) y continúese la concentración del modo indicado en el apartado 5b. Retírese la columna microSnyder y aclárese su unión inferior con el tubo concentrador con una cantidad mínima de cloruro de metileno. Ajústese el

6-165

volumen final a 1,0 ml y tápese el tubo concentrador. d) Condiciones de funcionamiento: 1) Cromatografía líquida de alto rendimiento. La tabla 6440:I resume las condiciones recomendadas de funcionamiento para CLAR, así como los tiempos de retención, factores de capacidad y LDM que pueden obtenerse con estas condiciones. Utilícese preferiblemente un detector UV para la determinación de naftaleno, acenaftileno, acenafteno y fluoreno, y el de fluorescencia para los HAP restantes. En las figuras 6440:1 y 2 se muestran algunos ejemplos de las separaciones obtenidas con esta columna CLAR. Pueden utilizarse otras columnas CLAR, condiciones cromatográficas y detectores siempre que cumplan los requisitos señalados en el apartado 7. 2) Cromatografía de gases. La tabla 6440:II resume las condiciones recomendadas de funcionamiento para el cromatógrafo de gases y proporciona los tiempos de retención que se obtuvieron con estas condiciones. En la figura 6440:3 se muestra un ejemplo de las separaciones obtenidas. Es posible utilizar otras columnas capilares (tubular abierta) o de relleno, condiciones cromatográficas o detectores siempre que reúnan los requisitos señalados en el apartado 7. e) Calibrado: Calíbrese a diario el sistema mediante el uso de un procedimiento de estándares externos o internos. 1) Procedimiento de calibrado estándar externo. Prepárense los estándares como se indicó en el apartado 4h y sígase el procedimiento descrito en el apartado f, desarrollado a continuación. Tabúlense los datos y obténgase una curva de calibrado o un factor de calibrado como se indicó en la sección 6230B.5b2). 2) Procedimiento de calibrado estándar interno. Prepárense los estándares como se indicó en el apartado 4h y sígase el procedimiento descrito en el apartado

6-166

MÉTODOS NORMALIZADOS

Figura 6440:1. Cromatograma líquido de hidrocarburos polinucleares aromáticos. Columna: HC-ODS SIL-X; fase móvil: 40 por 100 a 100 por 100 de acetonitrilo en agua; detector: ultravioleta a 254 nm.

f, desarrollado a continuación. Tabúlense los datos y calcúlense los factores de respuesta como se indicó en la sección 6210B.5c2). Verifíquense la curva de calibrado de trabajo y el factor de calibrado o el FR todos los días de trabajo a través de la medida de uno o más estándares de calibrado. Si la respuesta de alguno de los compuestos difiere de la respuesta prevista en un margen superior al ±15 por 100, repítase la prueba mediante un estándar de calibrado fresco. Como alter-

nativa, prepárese una nueva curva de calibrado para dicho compuesto. Antes de usar ningún procedimiento de limpieza, procésense una serie de estándares de calibrado a través del procedimiento de validación de los modelos de elución y la ausencia de interferencias en los reactivos. f)

Análisis de muestras:

1) Cromatografía líquida de alto rendimiento. Cuando se utiliza un procedimiento de calibrado estándar interno,

ANÁLISIS AUTOMATIZADO DE LABORATORIO

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Figura 6440:2. Cromatograma líquido de hidrocarburos polinucleares aromáticos. Columna: HC-ODS SIL-X;fasemóvil: 40por 100a 100por l00de acetonitrilo en agua; detector: fluorescencia.

añádase un estándar interno al extracto de muestra y mézclese detenidamente. Inyéctese inmediatamente entre 5 y 25 µl de extracto de muestra o estándar en un CLAR mediante una jeringuilla de alta presión o una cadena de inyección de muestra de volumen constante. Regístrese un volumen inyectado lo más próximo posible a 0,1 µl y el tamaño de pico resultante en unidades de área o de altura de pico. Vuélvase a equilibrar la columna CLAR en las condiciones iniciales de gradiente durante 10 minutos como mínimo entre inyecciones sucesivas. Identifiqúense los compuestos en la muestra por comparación de los tiempos de retención con los picos de los cromatogramas estándar. Básese la anchura de la ventana de los tiempos de retención utilizada para las identificaciones en las medidas de las variaciones de los tiempos de retención de los estándares en el transcurso del día. Para calcular un ta-

maño sugerido de ventana utilícese el triple de la desviación estándar de un tiempo de retención para un compuesto. Es importante la experiencia del analista en la interpretación de los cromatogramas. Si la respuesta supera para uno de los picos el intervalo de trabajo del sistema, dilúyase el extracto con acetonitrilo y vuélvase a analizar. Cuando no puedan medirse las respuestas de los picos debido a las interferencias, se hace necesaria una limpieza adicional. 2) Cromatografía de gases. Véase sección 6420B.5b3. Cuando no puedan medirse las respuestas de los picos debido a las interferencias, Se hace necesaria una limpieza adicional. 6.

Cálculos

Determínese la concentración de los compuestos individuales mediante los

6-168

MÉTODOS NORMALIZADOS

Figura 6440:3. Cromatograma de gases de hidrocarburos polinucleares aromáticos. Columna: 3 por 100 OV-17 en Chromosorb W-AW-DMCS; programa: 100 °C durante 4 min, 8 °C/min hasta 280 °C; detector: ionización de llama.

procedimientos de la sección 6420B.6a. Comuníquense los resultados en µg/l sin corrección de recuperación. Compárense los datos de CC con los resultados de las muestras. 7.

Control de calidad

a) Programa de control de calidad: Véase la sección 6210B.7a. b) Comprobación de la competencia del analista: Con el fin de establecer su capacidad para generar datos con sesgo y precisión aceptables, procédase del modo siguiente: Mediante una pipeta, pre-

párense muestras de comprobación de CC con las concentraciones de prueba de. la tabla 6440:III por adición de 1,00 ml de muestra concentrada de comprobación del CC (apartado 4i) para las cuatro partes de 1 l de agua para reactivos. Analícense las muestras de comprobación del CC conforme al método descrito en el apartado 5. Calcúlese la recuperación media y la desviación estándar de la recuperación, compárense con los criterios de aceptación y evalúese y corríjase el rendimiento del sistema de acuerdo con lo descrito en la sección 6210B.7b mediante el uso de los criterios de aceptación de la tabla 6440:III.

6-169

ANÁLISIS AUTOMATIZADO DE LABORATORIO

TABLA 6440:III. CRITERIOS DE ADMISIÓN AL CC*

c) Análisis de muestras con adiciones conocidas: Véase la sección 6420B.7c. Prepárense muestras concentradas de comprobación del CC de acuerdo con el apartado 4i y utilícense las tablas 6440:III y IV. Sobre las bases en curso, realícense adiciones conocidas en al menos, el 10 por 100 de las muestras en cada uno de los lugares de toma de muestras en fase de seguimiento. Para laboratorios que analicen entre una y diez muestras al mes, analícese como mínimo una de estas muestras con una adición conocida al mes. Utilícese el procedimiento descrito en la sección 6210B.7c. d) Análisis estándar de comprobación del control de calidad: Véase la sección 6420B.7d. Prepárense los estándares de comprobación del CC de acuerdo con el apartado 4i y utilícese la tabla 6440:III. Si han de medirse todos los compuestos

de la tabla 6440:III en la muestra del apartado c anterior, es probable que se requiera el análisis de un estándar de comprobación del CC; por consiguiente, analícese rutinariamente el estándar de comprobación de CC con la muestra de adición conocida. e) Evaluación de precisión y registros: Véase la sección 6210B.7e. f) Prácticas adicionales de evaluación de calidad: Véase la sección 6210B.7g. 8.

Precisión y sesgo

Este método se experimentó en 16 laboratorios mediante el empleo de agua para reactivos, agua potable, agua de superficie y tres aguas residuales industriales con adiciones conocidas en seis concentraciones en el intervalo compren-

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TABLA 6440:IV.

MÉTODOS NORMALIZADOS

SESGO V PRECISIÓN DEL MÉTODO COMO FUNCIONES DE LA CONCENTRACIÓN*

dido entre 0,1 y 425 µg/l5. La precisión de un único operador, la precisión global y el sesgo del método se relacionaron directamente con las concentraciones de los compuestos y son independientes de la matriz de la muestra. Las ecuaciones lineales que describen estas relaciones se presentan en la tabla 6440:IV.

9. 1.

Referencias U.S. ENVIRONMENTAL PROTECTION AGEN1984. Method 610—Polynuclear aromatic hydrocarbons. 40 CFR Part 136, 43344; Federal Register 49, n.° 209. U.S. ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENCY . 1982. Deterraination of polynuclear aroCY .

2.

matic hydrocarbons in industrial and municipal wastewaters. EPA-600/4-82-025, National Technical Information Serv., PB82258799, Springfield, Virginia. 3. U. S. ENVIRONMENTAL P ROTECTION A GEN CY . 1984. Definition and procedure for the determination of the method detection timit. 40 CFR Part 136, Appendix B. Federal Register 49, n.° 209. 4. COLE, T., R. RIGGIN & J. GLASER. 1980. Evaluation of method detection limits and analytical curve for EPA Method 610 PNA's. International Symp. Polynuclear Aromatic Hydrocarbons, 5th, Battelle's Columbus Lab., Columbus, Ohio. 5. U. S. ENVIRONMENTAL P ROTECTION A GEN CY . 1984. EPA Method Study 20, Method 610 — PNA's. EPA-600/4-84-063, National Technical Information Serv., PB84-211614, Springfield, Virginia.

6-171

ANÁLISIS AUTOMATIZADO DE LABORATORIO

6440 C. Método de extracción líquido-líquido con cromatografía de gases/espectrometría de masas Véase la sección 6410B.

6630

PESTICIDAS ORGANOCLORADOS 6630 A.

1.

Fuentes y significado

Los pesticidas organoclorados se encuentran presentes por lo general en aguas afectadas por evacuaciones agrícolas. Algunos de los compuestos enumerados constituyen productos degradados de otros pesticidas detectados a través de este método. Varios de los pesticidas son bioacumulativos y relativamente estables, así como agentes tóxicos y carcinógenos; por lo tanto, precisan un seguimiento exhaustivo.

6630 B.

1.

Introducción 2.

Selección del método

Los métodos 6630B y C consisten en procedimientos de cromatografía de gases (CG) según la extracción líquidolíquido de las muestras de agua. Son métodos relativamente sensibles que pueden utilizarse para detectar numerosos pesticidas. Las diferencias entre estos métodos son mínimas después de la extracción. El método 6630D, de cromatografía de gases/espectrometría de masas (CG/EM), puede detectar todos los compuestos objeto de estudio, aunque en concentraciones muy superiores. Todos estos métodos resultan de utilidad además para determinar la presencia de los bifenilos policlorados (BPC).

Método I de extracción líquido-líquido con cromatografía de gases*

Discusión general

a) Aplicación: Este procedimiento de cromatografía de gases resulta adecuado para determinar cuantitativamente los siguientes compuestos específicos: BHC, lindano, heptaclor, aldrín, epóxido de heptaclor, dieldrín, endrín, captan, DDE, * Aprobado por el Standard Methods Committee, 1985.

DDD, DDT, metoxiclor, endosulfán, diclorán, mírex y pentacloronitrobenceno. En circunstancias favorables, pueden determinarse también el estrobano, toxafeno, clordano (téc.) y otros compuestos, siempre que se presenten altas concentraciones de estas mezclas complejas y sean reconocibles sus huellas cromatográficas en los análisis por columna capilar o de relleno. El trifuralín y algunos otros pesticidas organofosforados, como el para-

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tión, metilparatión y malatión, que responden al detector de captura electrónica, pueden también ser medidos. Sin embargo, la utilidad del método para pesticidas organofosforados y para otros tipos de pesticidas específicos ha de comprobarse previamente con el análisis de muestras. b) Principio: En este procedimiento, se extraen los pesticidas con un disolvente mixto, ya sea dietil éter/hexano o cloruro de metileno/hexano. El extracto se concentra por evaporación y, si es necesario, se limpia mediante una cromatografía-adsorción en columna. Los pesticidas individuales se determinan, por lo tanto, mediante una cromatografía de gases. Aunque los procedimientos detallados a continuación se refieren sobre todo a columnas de relleno, es posible utilizar una cromatografía de columnas capilares dado que pueden demostrarse resultados equivalentes. Véase sección 6010C,2al para la discusión de los principios de la cromatografía de gases y la sección 6010C.2b2 para la discusión de los detectores de captura electrónica. Al pasar cada componente a través del detector, se mide un cambio cuantitativamente proporcional en señal eléctrica sobre un gráfico registrador. Cada componente se observa como un pico en el gráfico de registro. El tiempo de retención constituye un indicio de cada pesticida particular y la relación altura del pico/ área del pico es proporcional a su concentración. Pueden manejarse las variables para obtener importantes datos de confirmación. Por ejemplo, el sistema detector puede ser seleccionado en virtud de las especificaciones y la sensibilidad requeridas. El detector utilizado en este método es un detector de captura electrónica, muy sensible a los compuestos clorados. Puede realizarse una identificación adicional de confirmación a partir de los tiempos de retención en una o más columnas en las que las fases estacionarias

MÉTODOS NORMALIZADOS

presenten diferentes polaridades. Se especifica un procedimiento de columna doble considerado de particular utilidad. Si se dispone de suficiente pesticida para la detección y la medida, sería deseable una confirmación mediante una técnica más definitiva, como la espectrometría de masas. c) Interferencia: Véanse secciones 6010C.2a2 y 6010C.2b2. Algunos compuestos no clorados responden al detector de captura electrónica. Entre ellos se encuentran los compuestos oxigenados y no saturados. En ocasiones, los extractos animales o vegetales oscurecen los picos de pesticidas. Estas sustancias interfirientes pueden ser retiradas con ayuda de técnicas auxiliares de limpieza. Con este propósito se utilizan procedimientos de limpieza en columnas de gel de sílicemagnesio y separación. Dichas limpiezas no son necesarias, habitualmente, en las aguas potables. 1) Bifenilos policlorados (BPC): Los plastificadores industriales, fluidos hidráulicos y antiguos fluidos de transformadores que contienen BPC son fuentes potenciales de interferencia en el análisis de pesticidas. La presencia de los BPC es sugerida por el alto número de picos no resueltos o parcialmente resueltos que pueden producirse a lo largo de todo el cromatograma. Las interferencias de BPC particularmente graves precisan procedimientos especiales de separación. 2) Esteres de ftalato: Estos compuestos, ampliamente utilizados como plastificadores, originan respuestas en el detector de captura electrónica y son fuente de interferencias. El agua filtra estos esteres a partir de plásticos como las botellas de polietileno y las tuberías de plástico. Es posible separar los esteres de ftalato de muchos pesticidas importantes mediante la limpieza de columna de gel de sílicemagnesio. No producen ninguna respuesta ante los detectores específicos de halógenos, como los detectores de conductividad electrolítica y culombímetra.

ANÁLISIS AUTOMATIZADO DE LABORATORIO

d) Límites de detección:El límite de detección básico de una sustancia se ve afectado por numerosos factores, como la sensibilidad del detector, la eficacia de la extracción y la limpieza, las concentraciones y el nivel de señal-ruido del detector. El lindano puede determinarse, normalmente, a una concentración de 10 ng/l en una muestra de agua relativamente no contaminada; el límite de detección del DDT es en cualquier caso superior, entre 20 y 25 ng/l. Una sensibilidad aumentada favorece más interferencias en todos los pesticidas. e) Conservación de muestras: Algunos pesticidas son inestables. Transpórtense en condiciones de congelación, almacénense a 4 °C hasta su extracción y no los guarde más de 7 días. Siempre que sea posible, extráiganse según recomendaciones en el laboratorio y almacénense los extractos a 4 °C hasta que sean analizados. Estúdiense estos extractos en un plazo de 40 días. 2.

Instrumental

Límpiese detenidamente todo el material de vidrio utilizado en la toma de muestras y los análisis de residuos de pesticidas. Límpiese el material de vidrio inmediatamente después de su uso. Aclárese con agua o con el último disolvente utilizado en él, lávese con agua jabonosa, aclárese con agua del grifo, agua destilada y acetona redestilada y, por último, con hexano de calidad de pesticida. Como precaución, debe aclararse el material de vidrio con el disolvente de extracción justo antes de su uso. Caliéntese intensamente el material de vidrio contaminado en un horno de copela a 400 °C entre 15 y 30 minutos. Los materiales de alta ebullición, como los BPC, pueden requerir un calentamiento durante toda una noche a 500 °C si bien el material de vidrio no hecho de borosilicato puede superar esta temperatura sin

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ningún riesgo. No caliente el material volumétrico. Límpiese el material de vidrio volumétrico con reactivos especiales†. Aclárese con agua y hexano con calidad de pesticida. Después del secado, almacénese el material de vidrio para impedir la acumulación sobre él de polvo u otras sustancias contaminantes. Guárdese en posición invertida o cúbrase su boca con papel de aluminio. a) Botellas de muestra, capacidad de 1 l, vidrio, con tapón de vidrio revestido de TFE. Las botellas pueden ser calibradas de manera que reduzcan al mínimo las transferencias y la posibilidad de contaminación. b) Concentrador de evaporación, Kuderna-Danish, matraz de 500 ml y tubo inferior graduado de 10 ml ajustado a una columna Snyder de tres bolas, o equivalente. c) Embudos de separación, capacidad de 2 1, con cierre de TFE. d) Cilindros graduados, con capacidad de 1 l. e) Embudos, 125 ml. f) Lana de vidrio, calidad de filtro. g) Columna cromatográfica, de 20 mm de diámetro y 400 mm de longitud, con disco de vidrio poroso en el fondo. h) microjeringuillas, de capacidad entre 10 y 25 ul. i) Baño de agua caliente. j) Cromatógrafo de gases, dotado de: 1) Puerto de inyección revestido de vidrio. 2) Detector de captura electrónica. 3) Registrador: Gráfico de bandas por potenciometría, 25 cm, compatible con el detector y los dispositivos electrónicos asociados. 4) Columna de vidrio de borosilicato, 1,8 m x 4 mm de DI o 2 mm de DI. Las variaciones en la instrumentación de la cromatografía de gases disponible necesita distintos procedimientos de fun† No Chromix, Godax, 6 Varick Place, Nueva York, Nueva York o equivalente.

MÉTODOS NORMALIZADOS

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cionamiento para cada uno de los elementos. Por consiguiente, remítase al manual de operación del fabricante al igual que a otros catálogos de cromatografía de gases y distintas referencias (véase la bibliografía). En general, utilícese un equipo con las siguientes características: • Línea de gas portador con un cartucho de secado de tamiz molecular y un dispositivo de atrapamiento para la eliminación del oxígeno en el gas portador. Es posible utilizar un purificador especial ‡. Utilícese únicamente gas portador de secado y asegúrese de que no se producen fugas gaseosas. • Temperatura del horno estable en un ±0,5 °C o aún más afinada en la disposición deseada. • Columnas cromatográficas. Una columna bien preparada resulta esencial para realizar un análisis cromatográfico aceptable. Obténganse columnas de relleno y columnas de pre-relleno a partir de fuentes comerciales o prepárense columnas de relleno en el laboratorio. No es apropiado conferir especificaciones rígidas al tamaño o la composición que se desea utilizar, ya que algunos instrumentos funcionan mejor con ciertas columnas que otros. Las columnas de utilización más frecuentes son las de 4 mm de DI. El flujo del gas portador es aproximadamente de 60 ml/min. Se han obtenido adecuadas separaciones mediante el uso de 5 por 100 OV-210 sobre retícula 100/l20 de diatomita§ tratada con dimetil diclorosilano en una columna de 2 m. Las columnas de 1,5 por 100 OV-17 y 1,95 por 100 QF-1 se recomiendan para análisis de confirmación. Se incluyen dos opciones adicionales de columna: 3 por 100 OV-1 y 6 por 100 QF-1 ‡ Hydrox, Matheson Gas Products, P. O. Box E, Lyndhurst, Nueva Jersey, o equivalente. § Gas Chrom Q, Applied Science Labs, Inc., P. O. Box 440, State College, Pennsylvania, o equivalente.

+ 4 por 100 SE-30 de fase mixta, cada una de ellas sobre retícula 100/l20 de diatomita tratada con dimetil diclorosilano. OV-210, que constituye una forma refinada de QF-1, puede ser reemplazada por QF-1. Una columna resulta apropiada cuando produce una resolución adecuada y reproducible. Los cromatogramas de las muestras se muestran en las figuras 6630:1 a 6630:4. Como alternativa, utilícense columnas capilares de sílice fundida ||, de 30 m de longitud con 0,32 mm de DI y 0,25 um de espesor de la película, o equivalente. Véase la figura 6630:5. Para confirmar la identificación, utilícese una columna de polaridad diferente #. 3.

Reactivos**

Utilícense disolventes, reactivos y otros materiales, en los análisis de pesticidas, que estén exentos de interferencias en las condiciones del análisis. Puede hacerse necesaria la selección específica de los reactivos y la destilación de los disolventes en sistemas completamente de vidrio. Los disolventes de «calidad de pesticida» no requieren una redestilación; sin embargo, determínese siempre un análisis en blanco antes de su uso. a) Hexano. b) Éter de petróleo, en un intervalo de ebullición de 30 a 60 °C. c) Dietil éter: PRECAUCIÓN: Tendencia a la formación de peróxidos explosivos. Pruébese la presencia de peróxidos †† y, cuando así sea, pásese en reflujo || J & W Scientific DB-5, DB-1701, o equivalente. # J & W Scientific, DB-1, o equivalente. ** Los métodos de cromatografía de gases son extremadamente sensibles a los materiales utilizados. La mención de marcas comerciales del Standard Methods no excluye el uso de otros productos existentes o en fase de desarrollo que demuestren iguales resultados. †† Utilícese E. M. Quant™, MCB Manufacturing Chemists, Inc., 2909 Highland Ave., Cincinnati, Ohio, o equivalente.

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ANÁLISIS AUTOMATIZADO DE LABORATORIO

Figura 6630:1. Resultados del procedimiento de cromatografía de gases para pesticidas organoclorados. Columna de relleno: 1,5 por 100 OV-17 + 1,95 por 100 QF-1; gas portador: argón/metano a 60 ml/min; temperatura de columna: 200 °C; detector: captura electrónica en modo pulso.

a través de una aleación de plomo y sodio durante 8 horas, destílese en un aparato de vidrio y añádase un 2 por 100 de metanol. Utilícese de inmediato o, si se desea guardar, realícese una prueba de peróxidos antes de su uso. d) Acetato de etilo. e) Cloruro de metileno. f ) Gel de sílice-magnesio‡‡ calidad PR, retícula de 60 a 100. Adquiérase activada a 676 °C y almacénese en la oscuridad en un recipiente de vidrio con un cierre de vidrio esmerilado o un tapón de rosca revestido de vidrio esmerilado; no hay que aceptar en recipientes de plásti‡‡ Florisil™ o equivalente.

co. Ante de su uso, actívese cada uno de los lotes durante toda una noche a 130 °C en un recipiente de vidrio cubierto con vidrio esmerilado. g) Sulfato de sodio, Na2SO4, anhidro, granular. No debe aceptarse en recipientes de plástico. Si es necesario, póngase en un horno de copela para eliminar las interferencias. h) i)

Lana de vidrio silanizada. Columna de relleno:

1) Soporte sólido: Diatomita tratada con dimetil diclorosilano, retícula de 100 a 120§§. §§ Gas-Chrom Q™, Supelcoport, o equivalente.

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MÉTODOS NORMALIZADOS

hasta 100 ml en un matraz volumétrico; 1,00 ml = 1,00 mg. m) Soluciones de pesticidas intermedias: Dilúyase 1,0 ml de solución de reserva hasta 100 ml con acetato de etilo; 1,0 ml = 10 µg. n) Soluciones estándar de trabajo para cromatografía de gases: Prepárese la concentración final de estándares en solución de hexano según la sensibilidad del detector y las características de linealidad. 4.

Procedimiento

a) Preparación del cromatógrafo:

Figura 6630:2. Resultados del procedimiento de cromatografía de gases para pesticidas organoclorados. Columna de relleno: 5 por 100 OV210; gas portador: argón/metano a 70 ml/min; temperatura de columna: 180 °C; detector: captura electrónica.

2) Fases líquidas: OV-1, OV-210, 1,5 por 100 OV-17 (SP 2250) + 1,95 por 100 QF-1 (SP 2401) y 6 por 100 QF-1 + 4 por 100 SE-30, o equivalente. j) Gas portador: Se precisa uno de los siguientes: 1) Gas de nitrógeno, calidad purificada, libre de oxígeno y de humedad. 2) Argón-metano (95 + 5 por 100) para uso en modo pulso. k) Estándares de referencia de pesticidas: Obténganse los estándares más puros disponibles (95 a 98 por 100) a partir de casas de suministro químicas y de cromatografía de gases. l) Soluciones de pesticidas de reserva: Disuélvanse 100 mg de cada uno de los pesticidas en acetato de etilo y dilúyanse

1) Relleno de la columna: Utilícese una columna construida de vidrio de borosilicato silanizado, ya que otros materiales de conducción pueden catalizar la descomposición de los componentes de la muestra. Antes del relleno, aclárense y séquense los conductos de la columna con disolvente, por ejemplo cloruro de metileno y, a continuación, metanol. Rellénese la columna con una densidad uniforme, ni tan compacta que produzca presiones innecesarias ni tan débil que pueda crear vacíos durante su uso. No debe romperse el relleno. Llénese la columna a través de un embudo conectado por un tubo flexible a uno de sus extremos. Conéctese el otro extremo de la columna con 1,3 cm de lana de vidrio silanizada y rellénese con ayuda de una vibración suave o pequeños golpes, pero nunca recurriendo al empleo de vibradores eléctricos, que tienden a fracturar el relleno. De modo opcional, aplíquese un vacío al extremo conectado. Conéctese el extremo abierto con lana de vidrio silanizado. 2) Acondicionamiento: Los acondicionamientos térmico y de pesticida resultan esenciales para eliminar la pérdida en la columna y suministrar análisis aceptables de cromatografía de gases. El procedimiento siguiente produce excelen-

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ANÁLISIS AUTOMATIZADO DE LABORATORIO

Figura 6630:3. Cromatograma de mezcla de pesticidas. Columna de relleno: 6 por 100 QF-1 + 4 por 100 SE-30; gas portador: argón/metano a 60 ml/min; temperatura de columna: 200 °C; detector: captura electrónica.

tes resultados: Conéctese la columna de relleno al puerto de inyección. No conecte la columna al detector; manténgase, sin embargo, el flujo del gas a través del detector mediante el empleo de la línea de gas de purga o los hornos de columnas duales, mediante la conexión de una columna sin relleno al detector. Ajústese el flujo del gas portador a una velocidad aproximada de 50 ml/min e increméntese lentamente (a lo largo de 1 hora) la temperatura del horno hasta 230 °C. Después de 24 a 48 horas a esta temperatura, la columna está ya preparada para el acondicionamiento del pesticida. Ajústese la temperatura del horno y la velocidad del flujo del gas portador para aproximar los niveles de funcionamiento.

Realícense seis inyecciones consecutivas de 10 µl de una mezcla concentrada de pesticidas a través de la columna en intervalos de 15 min. Prepárese esta mezcla de inyección con lindano, heptaclor, aldrín, epóxido de heptaclor, dieldrín, endrín y p,p’-DDT, cada compuesto en una concentración de 200 ng/µl. Después del acondicionamiento de pesticidas, conéctese la columna al detector y déjese equilibrar durante al menos 1 hora, preferiblemente durante la noche. La columna está ya entonces lista para su uso. 3) Inyección técnica: a) Desarróllese una técnica de inyección con un ritmo y una sucesión de

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Figura 6630:4.

MÉTODOS NORMALIZADOS

Cromatograma de mezcla de pesticidas. Columna de relleno: 3 por 100 OV-1; gas

portador: argón/meteno a 70 ml/min; temperatura de columna: 180 °C; detector: captura electrónica.

intervalos constantes. La técnica de inundación de disolvente, descrita más adelante, ha sido utilizada con éxito y se recomienda en previsión de fenómenos de retroceso o destilación en el interior de la aguja de la jeringuilla. Inúndese la jeringuilla con disolvente, extráigase un pequeño volumen de disolvente limpio sobre un cilindro de jeringuilla (por ejemplo, 1 µl en una jeringuilla de 10 µl). Retírese la aguja del disolvente y descárguese 1 µl de aire en el cilindro. Viértase de 3 a 4 µl de extracto de muestra en el cilindro. Retírese la aguja del extracto de muestra y descárguese aproximadamente

1 µl de aire en el cilindro. Regístrese el volumen del extracto de muestra entre las bolsas de aire. Insértese rápidamente la aguja a través del tabique de la boca de entrada, apriétese el émbolo y retírese la jeringuilla. Después de cada inyección, límpiese detenidamente la jeringuilla mediante varios aclarados con disolvente. b) Inyéctense soluciones patrón de una concentración tal que el volumen de la inyección y la altura del pico del estándar sean aproximadamente iguales a los de la muestra. b) Tratamiento de muestras:

ANÁLISIS AUTOMATIZADO DE LABORATORIO

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Figura 66305. Cromatograma de mezcla de pesticidas. Columna DB-5, 30 m de longitud, programa de temperatura de múltiple nivel, detector de captura electrónica.

1) Toma de muestras: Llénese la botella de muestras hasta el cuello. Tómense duplicados de dichas muestras. 2) Extracción de muestras: Agítese bien la muestra y mídase con precisión toda la muestra en un cilindro graduado de 1 l mediante dos operaciones de medida, si es necesario (o úsese una botella de muestra precalibrada para impedir la operación de transferencia). Viértase la muestra en un embudo de separación de 2 l. Aclárese la botella de muestra y el cilindro con 60 ml de dietil éter o cloruro de metileno al 15 por 100 en hexano, derrámese este disolvente en un embudo

de separación y agítese intensamente durante 2 minutos. Déjese separar las fases durante al menos 10 minutos. Vacíese la fase de agua del embudo de separación en una botella de muestra y viértase cuidadosamente la fase orgánica a través de una columna de 2 cm de DE que contenga de 8 a 10 cm de Na2SO4 en un aparato de Kuderna-Danish acoplado a un tubo concentrador de 10 ml. Viértase de nuevo la muestra en el embudo de separación. Aclárese la botella de muestra con 60 ml de disolvente mezclado, utilícese el disolvente para repetir la extracción de la

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muestra y pásese la fase orgánica a través de Na2SO4. Complétese una tercera extracción con 60 ml de disolvente mezclado que haya sido utilizado para aclarar de nuevo la botella de muestra, y pásese la fase orgánica a través de Na2SO4. Lávese el Na2SO4 con varias partes de hexano y séquese convenientemente. Acóplese el aparato de KudernaDanish a una columna de Snyder de tres bolas y redúzcase el volumen a aproximadamente 7 ml en un baño de agua caliente (90 a 95 °C). En este punto, todo el cloruro de metileno presente en el disolvente de extracción inicial ha sido ya destilado. Enfríese, retírese el tubo concentrador del aparato de Kuderna-Danish, aclárese la unión de vidrio esmerilado y dilúyase hasta 10 ml con hexano. Realícese el análisis inicial de cromatografía de gases sobre esta dilución. 3) Cromatografía de gases: Inyéctense de 3 a 4 µl de solución de extracto en una columna, siempre el mismo volumen. Estúdiense, en los cromatogramas resultantes, los picos correspondientes a los pesticidas objeto de estudio y la presencia de interferencias. a) Si existen picos supuestos y ninguna interferencia significativa, vuélvase a realizar una cromatografía de la solución del extracto sobre una columna alternativa. b) Inyéctense frecuentemente estándares para asegurar unas condiciones óptimas de funcionamiento. Si es necesario, concéntrese o dilúyase (no use cloruro de metileno) el extracto de modo que el tamaño de los picos de pesticidas sea cercano al de los picos correspondientes en el estándar. (Véase el factor de dilución en el apartado 5a.) c) Si existen interferencias significativas, sepárense las sustancias de interferencia de los materiales de pesticida mediante el empleo del procedimiento de limpieza descrito en el siguiente párrafo. 4) Limpieza con gel de sílice-magne-

MÉTODOS NORMALIZADOS

sio: Ajústese el volumen del extracto de muestra a 10 ml con hexano. Colóquese una carga de gel de sílice-magnesio || || activada para el peso determinado por el valor de ácido láurico, (véase el apéndice) en una columna cromatográfica. Después del depósito de gel mediante pequeños golpes sobre la columna, añádase 1,3 cm de Na2SO4 granular anhidro sobre la parte superior. Elúyase previamente la columna, después del enfriamiento, con 50 ó 60 ml de éter de petróleo. Deséchese el eluato y, justo antes de exponer la capa de sulfato al aire, transfiérase cuantitativamente el extracto de muestra a la columna mediante una cuidadosa decantación y con lavados subsiguientes con éter de petróleo (5 ml como máximo). Ajústese la tasa de elución a unos 5 ml/min y, por separado, recójanse los eluatos en matraces Kuderna-Danish de 500 ml provistos de receptores de 10 ml. Realícese la primera elución con 200 ml de etil éter al 6 por 100 en éter de petróleo y la segunda con 200 ml de etil éter al 15 por 100 en éter de petróleo. Realícese la tercera elución con 200 ml de etil éter y éter de petróleo al 50 por 100 y la cuarta con 200 ml de etil éter al 100 por 100. Prosígase con 50 a 100 ml de éter de petróleo para asegurar la eliminación de todo el etil éter de la columna. Como alternativa, para separar los BPC, elúyase inicialmente con etil éter al 0 por 100 en éter de petróleo y procédase del modo anterior con el fin de producir cuatro fracciones. Concéntrense los eluatos en un evaporador Kuderna-Danish en un baño de agua caliente, al igual que se ha descrito en el apartado 4b2 precedente, dilúyase hasta el volumen apropiado y analícese mediante una cromatografía de gases. Composición del eluato. Mediante el uso de una cantidad equivalente de un lote cualquiera de gel de sílice-magnesio determinado por su valor de ácido láuri|| || Florisil™ o equivalente.

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ANÁLISIS AUTOMATIZADO DE LABORATORIO

co (véase el apéndice), los pesticidas se separan en los eluatos indicados a continuación:

Cuando están presentes, se producen algunos pesticidas de tiofosfatos en cada una de las fracciones anteriores, al igual que en la fracción de éter al 100 por 100. Para una información adicional sobre la composición de los eluatos y el procedimiento de determinación del valor del ácido láurico, consúltese el Manual de Análisis de Pesticidas FDA (véase en bibliografía). Véase apéndice, sección 4, para los procedimientos de prueba de modelos de elución. 5) Determinación de la eficacia de extracción: Añádanse cantidades conocidas de pesticidas sobre una solución de acetato de etilo a una muestra de agua de 1 l y trátese con el mismo procedimiento que para las muestras. Dilúyase una cantidad igual de solución de pesticidas intermedia, como se ha descrito en el apartado 3w, al mismo volumen final. Si se denomina «a» a la altura del pico en el estándar y «b» a la altura de pico en la muestra sobre la que se ha añadido el pesticida, la eficacia de la extracción es igual a b/a. Determínese periódicamente la eficacia de la extracción y un blanco de control para probar el procedimiento. Analícese también un conjunto de duplicados con cada serie de muestras para comprobar el control de calidad.

5.

Cálculos

a) Factor de dilución: Si la porción de la solución de muestra es concentrada, el factor de dilución, D, será inferior a la unidad; si es diluida, dicho factor será superior a 1. b) Determínense las concentraciones de los pesticidas por comparación directa con un estándar simple, siempre que el volumen de inyección y la respuesta se encuentren en un rango del 10 por 100 de los del pesticida de interés de la muesta (tabla 6630:I). Calcúlese la concentración de pesticida:

donde: A = pesticida estándar, ng, B = altura de pico de la muestra mm, o valor del área, C = volumen de extracción, µl D = factor de dilución, E = altura de pico del estándar, mm, o valor del área, F = volumen del extracto inyectado, µl, y G = volumen de muestra extraída, ml.

En las figuras 6630:1 a 6630:5 se muestran cromatogramas típicos de mezclas representativas de pesticidas. Comuníquense los resultados en microgramos por litro sin corrección de eficacia. 6.

Precisión y sesgo

Diez laboratorios colaboradores en un estudio interlaboratorios seleccionaron sus propias muestras de agua y añadieron cuatro pesticidas representativos a muestras replicadas de dos concentraciones de acetona. Los pesticidas añadidos procedían de una única fuente. Las muestras fueron analizadas con y sin limpieza de gel de sílice-magnesio. En la tabla 6630:II se proporcionan los datos de precisión y recuperación.

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MÉTODOS NORMALIZADOS

TABLA 6630:I. TASAS DE RETENCIÓN DE VARIOS PESTICIDAS ORGANOCLORADOS EN RELACIÓN CON EL ALDRÍN

7. Bibliografía MILL, P. A. 1968. Variation of Florisil activity: simple method for measuring absorbent capacity and its use in standardizing Florisil columns. J. Assoc. Off. Anal. Chem. 51:29. FOOD AND DRUG ADMINISTRARON . 1968 (revised 1978). Pesticide Analytical Manual, 2.a ed. U. S. Dep. Health. Education & Welfare, Washington, D. C. MONSANTO CHEMICAL COMPANY. 1970. Monsanto Methodology for Arochlors—Analysis of Environmental Materials for Biphenyls, Analytical Chemistry Method 71-35. St. Louis, Montana.

U.S. E NVIRONMENTAL P ROTECTION A GENCY . 1971. Method for Organic Pesticides in Water and Wastewater. National Environmental Research Center, Cincinnati, Ohio. STEERE, N. V., ed. 1971. Handbook of Laboratory Safety. Chemical Rubber Company, Cleveland, Ohio. GOERLITZ, D. F. & E. BROWN. 1972. Methods for analysis of organic substances in water. En Techniques of Water Resources Investigations of the United States Geological Survey, Book 5, Chapter A3, p. 24, U.S. Dep. Interior, Geological Survey , Washington, D.C. U.S. E NVIRONMENTAL P ROTECTION A GENCY . 1978. Method for Organochlorine Pesticides

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ANÁLISIS AUTOMATIZADO DE LABORATORIO

TABLA 6630:II. DATOS DE PRECISIÓN Y SESGO PARA PESTICIDAS ORGANOCLORADOS SELECCIONADOS

in Industrial Efíluents. National Environmental Research Center, Cincinnati, Ohio. U.S. ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENCV. 1978. Method for Polychlorinated Biphenyls in Industrial Effluents. National Environmental Research Center, Cincinnati, Ohio. U.S. ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENCY. 1979. Handbook for Analytical Quality Con-

trol in Water and Wastewater Laboratories. National Environmental Research Center, Analytical Quality Control Laboratory, Cincinnati, Ohio. U.S. ENVIRONMENTAL P ROTECTION A GENCY . 1980. Analysis of Pesticide Residues in Human and Environmental Samples. Environmental Toxicology Div., Health Effects Laboratory, Research Triangle Park, Carolina del Norte.

Apéndice: Estandarización de la columna de sílicemagnesio* por ajuste de peso basado en la adsorción de ácido láurico Un método rápido para la determinación de la capacidad de absorción de gel de sílice-magnesio se basa en la adsorción del ácido láurico a partir de una solución de hexano. Se utiliza un exceso Florisil™ o equivalente.

de ácido láurico y la cantidad no adsorbida se mide mediante valoración alcalina. El peso del ácido láurico adsorbido se usa para calcular, por simple proporción, las cantidades equivalentes de gel para lotes que posean diferentes capacidades de adsorción.

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1. Reactivos

a) Alcohol etílico, USP o absoluto, neutralizado con fenolftaleína. b) Hexano, destilado mediante instrumental de vidrio. c) Solución de ácido láurico: Transfiérase 10,000 g de ácido láurico a un matraz volumétrico de 500 ml, disuélvanse en hexano y dilúyase hasta 500 ml; 1,00 ml = 20 mg. d) Indicador de fenolftaleína: Disuélvase 1 g en alcohol y dilúyase a 100 ml. e) Hidróxido de sodio, 0,05N: Diluyase 25 ml de NaOH 1N hasta 500 ml con agua destilada. Estandarícese del siguiente modo: Pésese de 100 a 200 mg de ácido láurico en un erlenmeyer de 125 ml; añádase 50 ml de alcohol etílico neutralizado y 3 gotas de indicador de fenolftaleína; valórese hasta alcanzar un punto final permanente; y calcúlese los miligramos de ácido láurico por mililitro de NaOH (alredor de 10 mg/ml). 2. Procedimiento

Transfiéranse 2,000 g de gel de sílicemagnesio a un erlenmeyer de 25 ml de vidrio esmerilado. Cúbrase débilmente con papel de aluminio y caliéntese durante toda la noche a 130 °C. Ciérrese, enfríese hasta temperatura ambiente, añádase 20,0 ml de solución de ácido láurico (400 mg), ciérrese y agítese ocasionalmente durante 15 minutos. Déjese depositar el adsorbente y llévense

MÉTODOS NORMALIZADOS

con una pipeta 10,0 ml de la sustancia flotante a un erlenmeyer de 125 ml. Impídase la inclusión de gel alguno, Añádanse 50 ml de alcohol neutro y tres gotas de solución de indicador de fenolftaleína; valórese con NaOH 0,05N hasta alcanzar un punto final permanente. 3. Cálculo de valor de ácido láurico y ajuste del peso de la columna

Calcúlese la cantidad de ácido láurico adsorbido en el gel del modo siguiente: Va lor d el ácid o láu rico = á ci do láu rico / g de gel = 200 − (ml necesarios para valoración x mg ácido láurico/ml NaOH 0,05N).

Para obtener una cantidad equivalente de cualquier lote de gel, divídase 110 por el valor del ácido láurico para dicha cantidad y multiplíquese por 20 g. Verifíquese que se produce una elución apropiada de pesticidas mediante el procedimiento suministrado a continuación. 4. Prueba de un modelo de elución apropiado y recuperación de pesticidas

Prepárese una mezcla de ensayo que contenga aldrín, epóxido de heptaclor, p,p’-DDE, dieldrín, paratión y malatión. El dieldrín y el paratión deben eluir en el eluato al 15 por 100; todos excepto una traza de malatión en el eluato al 50 por 100, y el resto en el eluato al 6 por 100.

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ANÁLISIS AUTOMATIZADO DE LABORATORIO

6630 C.

Método II de extracción líquido-líquido con cromatografía de gases*

Este método1 es aplicable para determinar la presencia de pesticidas órganoclorados y BPC†‡ en los desagües industriales y municipales. Cuando se analizan muestras no habituales para alguno o la totalidad de estos compuestos, respáldense las indentificaciones al menos con una técnica cualitativa adicional. Este método incluye una segunda columna para cromatografía de gases de confirmación. Como alternativa analícese mediante un método de cromatografía de gases/espectrometría de masas (CG/EM) para agentes ácidos y básico/neutros con el extracto producido por este método. 1.

Discusión general

a) Principio: Extráigase un volumen medido de muestra con cloruro de metileno. séquese y cámbiese el extracto por hexano durante la concentración. Si han de realizarse otras determinaciones que presenten esencialmente idénticas etapas de extracción y concentración, es suficiente con una única extracción de muestra. Sepárese el extracto por cromatografía de gases y mídanse los compuestos con un detector de captura electrónica2. Véase la sección 6010C para la discusión de los principios de la cromatografía de gases. * Aprobado por el Standard Methods Committee, 1987. Aceptado por la U.S. Environmental Protection Agency como equivalente al método EPA 608. † Aldrin, α-BHC, β-BHC, δ-BHC, γ-BHC, clordán, 4,4'-DDD, 4,4'-DDE, 4,4'-DDT, dieldrín, endosulfán I, endosulfán II, sulfato de endosulfán, endrín, endrin aldehido, eptaclor, epósido de heptaclor, toxafeno, BPC1016, BPC.1221, BPC-1232, BPC-1242, BPC-1248, BPC-1254, BPC-1260. ‡ Los BPC constituyen una clase de 209 compuestos. Este procedimiento está diseñado para determinar nueve formulaciones comerciales conocidas como aroclores, cada uno de los cuales es una mezcla de BPC.

El método ofrece procedimientos de limpieza de columna de gel de sílice-magnesio y eliminación del azufre elemental para favorecer la eliminación de interferencias. Cuando se necesita la limpieza, los niveles de concentración de la muestra han de ser suficientemente altos para permitir la separación de los tratamientos de submuestras. Pueden elegirse las condiciones cromatográficas apropiadas para la medida simultánea de combinaciones de compuestos. b) Interferencias: Véase sección 6410B.1b1) para las precauciones concernientes al material de vidrio, la pureza de los reactivos y las interferencias de matriz. Los esteres de ftalato pueden interferir en el análisis de pesticidas con un detector de captura electrónica. Estos compuestos aparecen normalmente en el cromatograma como picos amplios de elución tardía, en especial en las fracciones al 15 y 50 por 100 de gel de sílice-magnesio. Los plásticos flexibles corrientes contienen ftalatos de fácil extracción durante las operaciones de laboratorio. La contaminación cruzada de material de vidrio limpio se produce de forma rutinaria cuando se manejan plásticos en las fases de extracción, en especial si se emplean superficies humedecidas con disolvente. Redúzcase al mínimo las interferencias de los ftalatos evitando el empleo de plásticos. Puede hacerse necesaria una limpieza exhaustiva de los reactivos y del material de vidrio para eliminar la contaminación por ftalatos3, 4. Pueden impedirse las interferencias de esteres de ftalatos mediante el uso de un detector de conductividad electrolítica o microculombimétrica. c) Límites de detección: El LDM es la mínima concentración de una sustancia que puede medirse y comunicarse con el

6-186

MÉTODOS NORMALIZADOS

99 por 100 de certidumbre de que su valor es superior a cero5. Las concentraciones de LDM enumeradas en la tabla 6630:III se obtuvieron mediante el uso de agua para reactivos6. Se lograron resultados similares con aguas residuales representativas. El LDM obtenido en la realidad en un análisis dado varía en función de la sensibilidad del instrumento y los efectos de matriz. La linealidad de TABLA 6630:III.

recuperación de adiciones conocidas de este método se probó mediante agua para reactivos y puede aplicarse en todo un espectro de concentraciones desde 4 x LDM hasta 1.000 x LDM con las siguientes excepciones: La recuperación de clordán a 4 x LDM era menor (60 por 100); la recuperación del toxafeno a lo largo del rango comprendido entre 10 x LDM y 1.000 x LDM era lineal6. Es

CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS Y LÍMITES DE DETECCIÓN DEL MÉTODO*

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ANÁLISIS AUTOMATIZADO DE LABORATORIO

difícil determinar los LDM en mezclas como ésta. Para calcular los LDM dados, úsese unos cuantos picos de CG en cada mezcla. En función de los picos concretos seleccionados, estos resultados son o no reproducibles en otros laboratorios. d) Seguridad: El carácter tóxico o carcinógeno de estos reactivos no ha sido definido aún con precisión. Los siguientes compuestos han sido clasificados de forma provisional como presuntos o conocidos agentes carcinógenos para el hombre y los mamíferos: 4,4'-DDT, 4,4'DDD, los BHC y los BPC. Prepárese estándares primarios de estos compuestos en una campana y llévese máscara antigases tóxicos aprobada por NIOSH/MESA cuando se manejen altas concentraciones. Trátese y manéjese el Hg utilizado para la eliminación de azufre como un residuo peligroso.

2. Toma de muestras y almacenamiento

Para los requisitos de toma y almacenamiento, véase la sección 6410B.2. Si no se desean extraer las muestras en las 62 horas siguientes a su toma, ajústese el pH en el intervalo comprendido entre 5,0 y 9,0 con NaOH o H2SO4. Regístrese el volumen del ácido o la base utilizados. Si ha de determinarse aldrín, añádase tiosulfato de sodio en los casos en que se encuentre cloro residual.

3.

Instrumental

Utilícese el instrumental especificado en la sección 6410B.3a-e e i-k. Además: a) Columna cromatográfica, 400 mm de longitud x 22 mm de DI, con cierre

de TFE y disco de filtro de vidrio poroso§. b)

Cromatógrafo

de

gases||:

Sistema

analítico completo con un cromatógrafo de gases adecuado para la inyección en columna y todos los accesorios necesarios, como jeringuillas, columnas analíticas, gases y registrador de gráficos de barras. Utilícese preferiblemente un sistema de datos para medir las áreas de los picos. 1) Columna 1, 1,8 m de longitud x 4 mm de DI, vidrio, rellena con 1,5 por 100 SP-2250/l,95 por 100 SP-2401 en Supelcoport (retícula 100/l20) o equivalente. Esta columna se utilizó para desarrollar el límite de detección y los datos de sesgo y precisión presentados en esta sección. Véase en el apartado 5c las directrices para el uso de columnas de relleno alternativas. 2) Columna 2, 1,8 m de longitud x 4 mm de DI, vidrio, rellena con 3 por 100 OV-1 en Supelcoport (retícula 100/l20) o equivalente. 3) Detector, captura electrónica. Este detector se utilizó para desarrollar el límite de detección y los datos de sesgo y precisión presentados en esta sección. Para el empleo de detectores alternativos, véase el apartado 5c. 4.

Reactivos

Este método requiere los reactivos descritos en la sección 64l0B.4a-e, y además: a) Acetona, hexano, isooctano, cloruro de metileno, calidad de pesticida o equivalente. b) Etil éter, nanogrado redestilado en vidrio si fuera necesario. Compruébese § Kontes K-42054 o equivalente. || Los métodos de cromatografía de gases son extremadamente sensibles a los materiales utilizados. La mención de marcas comerciales del Standard Methods no excluye la utilización de otros productos ya existentes o en fase de desarrollo que demuestren resultados equivalentes.

6-188

antes de su uso que no contiene peróxidos por medio de depuraciones de ensayo #. Elimínese los peróxidos mediante los procedimientos suministrados con las depuraciones de prueba. Después de la limpieza, añádase 20 ml de conservantes de alcohol etílico por litro de éter. c) Gel de sílice-magnesio**, retícula 60/l00. Adquiérase activada a 1.250 °F y almacénese en la oscuridad en recipientes de vidrio con cierres de vidrio esmerilado o tapones de rosca revestidos de papel metalizado. Antes de su uso, actívese cada lote durante al menos 16 minutos a 130°C en un recipiente de vidrio cubierto con papel metalizado; déjese enfriar. d) Mercurio, destilación triple. e) Polvo de cobre, activado. f) Soluciones patrón de reserva: Prepárese como se indicó en la sección 6410B.4g, con isooctano como disolvente. g) Estándares de calibrado: Véase sección 6420B.4j. Dilúyase con isooctano y utilícese los valores LDM de la tabla 6630:III. h) Muestra concentrada de comprobación del control de calidad (CC): Obténgase una muestra concentrada †† de comprobación que contenga todos los componentes de las siguientes concentraciones en acetona: 4,4'-DDD, 10 µg/ml; 4,4'-DDT, 10 µg/ml; endosulfán II, 10 µg/ml; sulfato de endosulfán, 10 µg/ml; endrín, 10 µg/ml; cualquier otro pesticida de componente único, 2 µg/ml. Si se va a utilizar este método únicamente para analizar los BPC, clordán o toxafeno, la muestra concentrada de comprobación del CC debe contener los compuestos de concentrada de comprobación del CC # E. Merck, EM Science Quant o equivalente. ** Florisil o equivalente. †† Para análisis relacionados con patentes federales estadounidenses, utilícese muestras obtenidas en el U. S. EPA. Environmental Monitoring and Support Laboratory, Cincinnati, Ohio.

MÉTODOS NORMALIZADOS

componentes múltiples más representativos en una concentración de 50 mg/ml en acetona, si no está disponible esta muestra en fuentes externas, prepárese mediante el empleo de soluciones de reserva independientes de las utilizadas para el calibrado.

5. Procedimiento a) Extracción: Márquese el menisco de agua en el lateral de la botella de muestra para ulteriores determinaciones del volumen. Viértase toda la muestra en un embudo de separación de 2 l y extráigase con cloruro de metileno como se indicó en la sección 6410B.5al sin necesidad de ajustar el pH o lavar con un disolvente. Después de la extracción y la concentración mediante columna Snyder de tres bolas, auméntese la temperatura del baño de agua caliente hasta unos 80 °C. Retírese momentáneamente la columna Snyder, añádanse 50 ml de hexano y un nuevo elemento de ebullición y vuélvase a incorporar la columna Snyder. Concéntrese el extracto del modo anterior, si bien utilícese hexano para humedecer previamente la columna. Complétese la concentración en un período de cinco a diez minutos. Retírese la columna Snyder y aclárese el matraz y su unión inferior al tubo concentrador con 1 ó 2 ml de hexano. Para esta operación utilícese preferiblemente una jeringuilla de 5 ml. Ciérrese el tubo concentrador y almacénese en un lugar refrigerado si no se desea realizar de forma inmediata procesos adicionales. Si ha de almacenarse el extracto durante más de dos días, transfiérase a una ampolla de tapón de rosca revestido de TFE. Si el extracto no necesita limpiezas adicionales, comiéncese el análisis de cromatografía de gases. Cuando se precisa una limpieza adicional, sígase el procedimiento

ANÁLISIS AUTOMATIZADO DE LABORATORIO

descrito en el apartado b antes del análisis cromatográfico. Determínese el volumen original de la muestra rellenando la botella de muestra hasta la marca y transfiérase el líquido a un cilindro graduado de 1.000 ml. Regístrese el volumen de muestra más próximo posible a 5 ml. b) Limpieza y separación: Utilícese el procedimiento explicado a continuación 0 cualquier otro procedimiento adecuado; sin embargo, compruébese que se verifican los requisitos del apartado 7. La columna de gel de sílice-magnesio permite un fraccionamiento seleccionado de los compuestos y elimina las interferencias polares. El azufre elemental, que interfiere con la cromatografía de gases con captura electrónica de algunos pesticidas, puede eliminarse mediante la técnica descrita a continuación. 1) Limpieza de columna de gel de sílice-magnesio. Colóquese un peso de gel de sílice-magnesio (nominalmente 20 g) predeterminado mediante el calibrado del apartado d3), en una columna cromatográfica. Golpéese levemente la columna para depositar el gel y añádanse entre 1 y 2 cm de Na 3 SO 4 anhidro sobre la parte superior. Añádanse 60 ml de hexano para humedecer y aclarar. Justo antes de exponer al aire la capa de Na2SO 4, deténgase la elución de hexano cerrando la entrada de la columna. Deséchese el eluato. Ajústese el volumen de la muestra a 10 ml mediante hexano y transfiérase desde un tubo concentrador K-D a la columna. Aclárese dos veces el tubo con 1 ó 2 ml de hexano, y agréguese cada aclarado a la columna. Colóquese un matraz K-D de 500 ml y límpiese el tubo concentrador bajo la columna cromatográfica. Vacíese la columna en un matraz hasta que casi se alcance la exposición de la capa de Na2SO4. Elúyase la columna con 200 ml de etil éter al 6 por 100 en hexano (v/v) (fracción 1) a una tasa de unos 5 ml/min. Retírese el matraz K-D y

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déjese a un lado. Elúyase de nuevo la columna mediante 200 ml de etil éter al 15 por 100 en hexano (v/v) (fracción 2), en un segundo matraz K-D. Elúyase una tercera vez con 200 ml de etil éter al 50 por 100 en hexano (v/v) (fracción 3). Los modelos de elución para los pesticidas y los BPC se muestran en la tabla 6630:IV. Concéntrense las fracciones durante 15 a 20 minutos de la forma indicada en el apartado a mediante el empleo de hexano para humedecer previamente la columna y sitúese la temperatura del baño de agua en unos 85 °C. Después de enfriarse, retírese la columna Snyder y aclárese el matraz y su unión inferior al tubo concentrador con hexano. Ajústese el volumen de cada fracción a 10 ml con hexano y analícese mediante cromatografía de gases, como se señala más adelante, en los apartados c y e. 2) Eliminación de las interferencias de azufre. El azufre elemental se eluye normalmente de forma total en la fracción 1 de la limpieza de columna con gel de sílice-magnesio. Para eliminar la interferencia de azufre en esta fracción o en el extracto original, llévese con la pipeta 1,00 ml de extracto concentrado a un tubo concentrador limpio o una ampolla cerrada con TFE. Añádase de 1 a 3 gotas de mercurio y ciérrese7. Mézclese durante 15 a 30 segundos. Si se necesita una agitación prolongada (2 horas), utilícese un agitador recíproco. Como alternativa utilícese polvo de cobre activado para la eliminación del azufre8. Analícese mediante cromatografía de gases. c) Condiciones de funcionamiento de la cromatografía de gases: La tabla 6630:III resume las condiciones recomendadas de funcionamiento para el cromatógrafo de gases así como los tiempos de retención y los LDM que pueden alcanzarse en estas condiciones. En las figuras 6630:6 a 15 se muestran diversos ejemplos de las separaciones obtenidas con la columna 1. Pueden utilizarse otras colum-

MÉTODOS NORMALIZADOS

6-190

TABLA 6630:IV. DISTRIBUCIÓN DE PESTICIDAS CLORADOS Y BPC EN FRACCIONES DE COLUMNA DE GEL DE SÍLICE-MAGNESIO5

ñas capilares (tubular abierta) o de relleno9, condiciones cromatográficas o detectores siempre que reúnan los requisitos señalados en el apartado 7. d) Calibrado: Calíbrese el sistema a diario mediante procedimientos externos o internos. NOTA: Adóptense precauciones especiales en la cuantificación e identificación de ciertas mezclas, como los BPC, el clordán y el toxafeno 9-11. 1) Procedimiento de calibrado estándar externo. Prepárense los estándares

como se indicó en el apartado 4g y sígase el procedimiento de la sección 6420B.5b3). Tabúlense los datos y obténgase la curva de calibrado o el factor de calibrado como se indicó en la sección 6230B.5b2). 2) Procedimiento de calibrado estándar interno. Prepárense los estándares como se indicó en el apartado 4g y sígase el procedimiento de la sección 6420B.5b3). Tabúlense los datos y calcúlense los factores de respuesta según la sección 6210B.5c2).

ANÁLISIS AUTOMATIZADO DE LABORATORIO

Figura 6630:6. Croma tograma de gases de pesticidas. Columna: 1,5 por 100 SP-2250/l,95 por 100 SP-2401 en Supelcoport; temperatura: 200 °C; detector: captura electrónica.

Verifíquese la curva de calibrado de trabajo y el factor de calibrado o FR todos los días de trabajo mediante la medida de uno o más estándares de calibrado. Si la respuesta varía para alguno de los compuestos más de un ± 15 por 100 con respecto a la respuesta prevista, repítase la prueba con estándares nuevos de calibrado. Como alternativa, prepárese una nueva curva de calibrado para dicho compuesto. 3) Estadarización de gel de sílicemagnesio. El gel procedente de diferentes bloques o fuentes puede variar en su capacidad de adsorción. Para estadarizar la cantidad utilizada, utilícese el valor del

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Figura 6630:7. Cromatograma de gases del clordán. Columna: 1,5 por 100 SP-2250/1,95 por 100 SP-2401 en Supelcoport; temperatura: 200 °C; detector: captura electrónica.

ácido láurico12, que mide la adsorción que de ácido láurico posee una solución de hexano (mg/g gel). Determínese la cantidad que ha de usarse para cada columna dividiendo 110 por esta relación y multiplicando el cociente por 20 g. Antes de utilizar cualquier procedimiento de limpieza, procésese una serie de estándares de calibrado a través del procedimiento con el fin de validar los

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Figura 6630:8. Cromatograma de gases del toxafeno. Columna: 1,5 por 100 SP-2250/1,95 por 100 SP-2401 en Supelcoport; temperatura: 200 °C; detector: captura electrónica.

modelos de elución y la ausencia de interferencias en los reactivos. é) Análisis de muestras: Véase sección 6420B.5b3). Si no puede medirse la respuesta de picos debido a las interferencias, es necesaria una limpieza adicional.

6. Cálculo Determínese la concentración de los compuestos individuales mediante los procedimientos suministrados en la sección 6420B.6a. Si se hallan presentes dos o más mezclas de BPC (Aroclor), puede utilizarse el procedimiento de Webb y McCall13 para identificar y cuantificar los arocloros en función de los que estén presentes.

MÉTODOS NORMALIZADOS

Figura 6630:9. Cromatograma de gases del BPC-1016. Columna: 1,5 por 100 SP-2250/l,95 por 100 SP2401; temperatura: 160 °C; detector: captura electrónica.

También pueden emplearse otras técnicas. Para mezclas de componentes múltiples (clordán, toxafeno y los BPC), establézcase correspondencias entre los tiempos de retención de los picos en los estándares y los picos de la muestra. Cuantifíquese todos los picos identificables a no ser que persistan interferencias con picos individuales después de la limpieza. Añádase la altura de pico o el área de pico de todos los picos identificados al cromatograma. Calcúlese como respuesta total en la muestra en función de la respuesta total en el estándar. La degradación medioambiental de estos compuestos puede provocar una mayor dificultad en la identificación. Este método resulta adecuado únicamente para mezclas íntegras equivalentes a la formación

ANÁLISIS AUTOMATIZADO DE LABORATORIO

Figura 6630:10. Cromatograma de gases del BPC-1221. Columna: 1,5 por 100 SP-2250/l,95 por 100 SP2401 en Supelcoport; temperatura: 160 °C; detector: captura electrónica.

original del pesticida o el arocloro, y no es apropiado para otras mezclas alteradas que en ocasiones se encuentran en el entorno. En estos casos, el modelo de pico CG podría no corresponderse con el estándar. Comuníquense los resultados en mlcrogramos por litro sin corrección para datos de recuperación. Compárese los datos de CC con los resultados de la muestra. 7.

Control de calidad

a) Programa de control de calidad: Véase sección 6210B.7». b) Comprobación de la competencia del analista: Para establecer su capaci-

6-193

Figura 6630:11. Cromatograma de gases del BPC-1232. Columna: 1,5 por 100 SP-2250/l,95 por 100 SP2401 en Supelcoport; temperatura: 160 °C; detector: captura electrónica.

dad para generar datos con sesgo y precisión aceptables, actúese del siguiente modo: Mediante una pipeta, prepárense muestras de comprobación del CC en las concentraciones de prueba indicadas por la tabla 6630:V mediante la adición de 1,00 ml de muestra concentrada de comprobación del CC (apartado 4h) a cada una de las cuatro partes de 1 litro de agua para reactivos. Analícense las muestras de comprobación del CC de acuerdo con el método expuesto al principio del apartado 5a. Calcúlese la recuperación media y la desviación estándar de la recuperación, compárese con los criterios de aceptación y evalúese y corríjase el rendimiento del sistema como se indicó en la sección 6210B.7b. c) Análisis de muestras con adiciones

6-194

Figura 6630:12. Cromatograma de gases del BPC-1242. Columna: 1,5 por 100 SP-2250/l,95 por 100 SP2401 en Supelcoport; temperatura: 160 °C; detector: captura electrónica.

conocidas: Véase sección 6420B.7c. Prepárese muestras concentradas de comprobación del CC según el apartado 4h y utilícese las tablas 6630:III y IV. d) Análisis estándar de comprobación del control de calidad: Véase sección 6420B.7d. Prepárense los estándares de comprobación de acuerdo con el apartado 4h y utilícese la tabla 6630:V. Si han de medirse todos los compuestos de la tabla 6630:V en la muestra señalada en el apartado c anterior, es probable que sea necesario un análisis de comprobación de CC; por consiguiente, analícese de forma rutinaria el estándar de comprobación de CC con la muestra de adición conocida. e) Evaluación del sesgo y registros: Véase sección 6210B.7g. f) Prácticas adicionales de la evaluación de calidad: Véase la sección 6230B.7g.

MÉTODOS NORMALIZADOS

Figura 6630:13. Cromatograma de gases del BPC-1248. Columna: 1,5 por 100 SP-2250/l,95 por 100 SP2401 en Supelcoport; temperatura: 160 °C; detector: captura electrónica.

8.

Precisión y sesgo

Este método fue experimentado por 20 laboratorios mediante agua para reactivos, agua potable, agua de superficie y aguas residuales industriales con adiciones conocidas en seis concentraciones comprendidas en el intervalo de 0,5 a 30 µg/l para pesticidas de componente único, y de 8,5 a 400 µg/l para muestras de componentes múltiples14. La precisión de operador único, la precisión global y el sesgo del método se han relacionado directamente con la concentración de los compuestos e independientes de la matriz de muestra. Las ecuaciones lineales que describen estas relaciones se presentan en la tabla 6630:VI.

ANÁLISIS AUTOMATIZADO DE LABORATORIO

Figura 6630:14. Cromatograma de gases del BPC-1254. Columna: 1,5 por 100 SP-2250/l,95 por 100 SP2401 en Supelcoport; temperatura: 200 °C; detector: captura electrónica.

9. 1.

2.

3.

4.

Referencias U.S. ENVIRONMENTAL P ROTECTION AGEN CY . 1984. Method 608 — Organochlorine pesticides and PCBs. 40 CFR Part 136, 43321; Federal Register 49, n.° 209. U.S. ENVIRONMENTAL P ROTECTION AGEN CY , 1982. Determination of pesticides and PCBs in industrial and municipal wastewaters. EPA-600/4-82-023, National Technical Information Serv., PB82-214222, Springfield, Virginia. GIAM, C, S., H. S. CHAN & G. S. NEF. 1975. Sensitive method for determination of phthalate ester plasticizers in open-ocean biota samples. Anal. Chem. 47:2225. GIAM, C. S. & H. S. CHAN. 1976. Control of Blanks in the Analysis of Phthalates in Air and Ocean Biota Samples. U. S. National Bur. Standards, Spec. Publ. 442.

6-195

Figura 6630:15. Cromatograma de gases del BPC-1260. Columna: 1,5 por 100 SP-2250/l,95 por 100 SP2401 en Supelcoport; temperatura: 200 °C; detector: captura electrónica.

5. U.S. ENVIRONMENTAL PROTECTION AGEN CY . 1984. Definition and procedure for the determination of the method detection limit. 40 CFR Part 136, Appendix B. Federal Register 49, n.° 209. 6. U.S. ENVIRONMENTAL PROTECTION AGEN CY. 1980. Method Detection Limit and Analytical Curve Studies. EPA. Methods 606, 607, and 608. Special letter rep. for EPA Contract 68-03-2606, Environmental Monitoring and Support Lab., Cincinnati, Ohio. 7. GOERLITZ, D. F. & L. M. L AW. 1971. Note on removal of sulfur interference from sediment extracts for pesticide analysis. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 6:9. 8. U.S. ENVIRONMENTAL PROTECTION AGEN CY . 1980. Manual of Analytical Methods for the Analysis of Pesticides in Human and Environmental Samples. EPA-600/8-80-

MÉTODOS NORMALIZADOS

6-196

TABLA 6630:V. CRITERIOS DE ADMISIÓN AL CC*

038, Health Effects Research Lab., Research Triangle Park. Carolina del Norte. 9. ALFORD-STEVENS, A. et al. 1986. Characterization of commercial Aroclors by automated mass spectrometric determination of polychlorinated biphenyls by level of chlorination. Anal Chem. 58:2014. 10. ALFORD-STEVENS, A. 1986. Analyzing PCB's. Environ. Sci. Technol. 20:1194. 11. ALFORD-STEVENS, A. 1987. mixture analytes. Environ. Sci. Technol. 21. 12. MILLS, P. A. 1968. Variation of florisil activity: Simple method for measuring absor-

bent capacity and its use in standardizing florisil columns. J. Assoc. Offic. Anal Chem. 51:29. 13. WEBB, R. G. & A. C. MCCALL. 1973. Quantitative PCB standards for election capture gas chromatography. J. Chromatog. Sci. 11:366. 14. U.S. ENVIRONMENTAL PROTECTION AGEN CY . 1984. EPA Method Study 18, Method 608 —Organochlorine Pesticides and PCBs. EPA-600/4-84-061, National Technical Information Serv., PB84-211358, Springfield, Virginia.

ANÁLISIS AUTOMATIZADO DE LABORATORIO

6-197

TABLA 6630:VI. SESGO V PRECISIÓN DEL MÉTODO COMO FUNCIONES DE LA CONCENTRACIÓN

6630 D. Método de extracción líquido-líquido con cromatografía de gases/espectrometría de masas Véase sección 6410B.

MÉTODOS NORMALIZADOS

6-198

6640

HERBICIDAS CLORADOS FENOXI ÁCIDOS 6640 A.

1.

Fuentes y significado

Los herbicidas clorados fenoxi ácidos están presentes en aguas de fuentes naturales y en aguas potables terminales que han estado en contacto con evacuaciones industriales o aguas residuales agrícolas afectadas por estos herbicidas. Estos compuestos se utilizan con bastante profusión en operaciones de escarda y son muy poderosos incluso en bajas concentraciones. Los esteres y las sales de 2,4-D y silvex han sido utilizados como herbicidas acuáticos en lagos, corrientes y canales de irrigación. Los estudios toxico-

6640 B. 1.

Introducción lógicos han descubierto los efectos nocivos de estos compuestos en la salud humana; por consiguiente, debe realizarse un exhaustivo seguimiento de los mismos en los suministros de agua.

2.

Selección del método

El método de cromatografía de gases presentado en esta sección (6640B) utiliza derivación y CG con detector de captura electrónica (DCE) para la detección de estos compuestos.

Método de extracción líquido-líquido con cromatografía de gases*

Discusión general

a) Principio: Los herbicidas clorados fenoxi ácidos, como el 2,4-D [ácido 2,4-diclorofenoxiacético], silvex [ácido 2(2,4,5-triclorofenoxi) propiónico], 2,4,5-T [ácido 2,4,5-triclorofenoxiacético] y otras sustancias químicas similares, pueden determinarse mediante procedimientos de cromatografía de gases. Dado que estos compuestos pueden presentarse en el agua en diversas formas (por ejemplo, ácido, sal, éster), se incluye una fase de hidrólisis para permitir la determinación de la parte activa del herbicida. Los compuestos clorados fenoxi ácidos y sus esteres se extraen de muestras de agua acidificada con etil éter. Los extrac* Aprobado por el Standard Methods Committee, 1985.

tos se hidrolizan y se elimina el material extraño al lavar con disolvente. Los ácidos se convierten en esteres de metilo y son purificados posteriormente en una columna de microadsorción. Los esteres de metilo se determinan mediante cromatografía de gases. b) Interferencia: Véase la sección 6630B.lc. Los ácidos orgánicos, en especial los ácidos clorados, son causantes de la mayoría de las interferencias. Los fenoles, incluidos los clorofenoles, pueden también producir interferencias. La hidrólisis alcalina y la subsiguiente extracción eliminan gran parte de los insecticidas clorados predominantes. Dado que los herbicidas reaccionan fácilmente con sustancias alcalinas, puede producirse una pérdida si se ponen en contacto con ellas a excepción de la fase de hidrólisis alcalina controlada. Aclárese con ácido el material y la lana de vidrio y acidifí-

6-199

ANÁLISIS AUTOMATIZADO DE LABORATORIO

quese con sulfato de sodio (Na2SO4) para impedir esta posibilidad. c) Límites de detección: Los límites prácticos inferiores en la medida de los herbicidas fenoxi ácidos dependen fundamentalmente del tamaño de la muestra y del conjunto de instrumentos utilizados. Si se concentra el extracto desde una muestra de 1 litro hasta 2,00 ml y se inyectan 5,0 µl de muestra concentrada en un cromatógrafo de gases de captura electrónica, son factibles medidas fiables de 50 ng de 2,4-D/l, 10 ng de silvex/1 y 10 ng de 2,4,5-T/l. La concentración de extractos hasta 0,50 ml permite la detección de unos 10 ng de 2,4-D/l, 2 ng de silvex/1, y 2 ng de 2,4,5-T/l. La sensibilidad del detector de captura electrónica se ve afectada con frecuencia, y de forma adversa, por la presencia de material extraño en la muestra o en los reactivos. La concentración progresiva del extracto aumenta esta complicación. De esta manera, los límites prácticos inferiores de medida son difíciles de definir.

2.

Instrumental

Límpiese el material de vidrio con detergente en la forma habitual, aclárese en HCl diluido y luego en agua destilada. Para garantizar la eliminación de la materia orgánica, sígase el procedimiento de la sección 6630B.2. a) Botellas de muestra: Capacidad de 1 litro, vidrio, con tapones de rosca revestivos de TFE. Pueden calibrarse las botellas para reducir al mínimo las transferencias y las posibilidades de contaminación. b) Concentrador de evaporación, Kuderna-Danish, matraz de 250 ml y receptor volumétrico de 5 ml†. † Kontes o equivalente.

c) Columnas Snyder, macro de tres bolas, micro de una bola. d) Embudos de separación, con tamaños de 2 1 y 60 ml, llaves de TFE y cierres de vidrio esmerilado †. e) Pipetas, Pasteur, disponible, longitud de 140 mm y DI de 5 mm, vidrio. f) Microjeringuillas, 10 µl. g) Baño de arena, fluidizado‡, o baño de agua. h) Erlenmeyer, 250 ml con boca de vidrio esmerilado para adaptarse a las columnas Snyder. i) Sistema de cromatografía de gases: Véase sección 6630B.2j. Los parámetros de funcionamiento que producen cromatogramas satisfactorios en los análisis de herbicidas son: Temperatura del inyector, 215 °C; temperatura del horno, 185 °C; y flujo del gas portador, 70 ml/min en una columna de 4 mm de DI.

3.

Reactivos§

Compruébese la pureza de todos los reactivos mediante un procedimiento de cromatografía de gases. Ahórrese tiempo y esfuerzo mediante una selección de reactivos de alta calidad que no precisen posteriores preparaciones. Parte de la purificación de los reactivos puede no ser necesaria como queda expuesto a continuación. Si se indica un tratamiento más riguroso, obténgase los reactivos en una fuente alternativa. a) Dietil éter, calidad de reactivo. Véase 6630B.3c. b) Tolueno, calidad de pesticida, destilado en vidrio, o equivalente. c) Sulfato de sodio, Na2SO4, anhidro, granular. Guárdese a 130 °C. ‡ TeCam o equivalente. § Los métodos cromatográficos son extremadamente sensibles a los materiales utilizados. La mención de marcas comerciales del Standard Methods no excluye el empleo de otros productos ya existentes o en fase de desarrollo que demuestren resultados equivalentes.

MÉTODOS NORMALIZADOS

6-200

d) Solución de sulfato de sodio: Disuélvase 50 mg de Na2SO4 anhidro en agua destilada y dilúyase hasta 1 litro. e) Sulfato de sodio, acidificado: Añádase 0,1 ml de H2SO4 conc. a 100 g de Na2SO4 mezclado con suficiente etil éter como para cubrir el sólido. Retírese el dietil éter mediante secado al vacío. Mézclese 1 g del sólido resultante con 5 ml de agua destilada y confírmese que el pH de la mezcla es inferior a 4. Guárdese a 130 °C. f) Ácido sulfúrico, H2SO4, conc. g) Ácido sulfúrico, H2SO4, 1 + 3. Guárdese en un refrigerador. h) Solución de hidróxido de potasio: Disuélvase 37 g de bolitas de KOH en agua destilada y dilúyase hasta 100 ml. i) Trifluoruro de boro-metanol, 14 por 100 de trifluoruro de boro en peso. j) Gel de sílice-magnesio ||, calidad PR, retícula de 60 a 100. Adquiérase activada a 676 °C y almacénese a 130 °C. k) Lana de vidrio, grado de filtrado, lavada con ácido. l) Estándares de herbicidas, ácidos, y esteres de metilo, calidad de referencia analítica o máxima pureza disponible. m) Soluciones de herbicidas de reserva: Disuélvase 100 mg de herbicida o éster de metilo en 60 ml de dietil éter; diluyase hasta 100 ml en un matraz volumétrico con hexano; 1,00 ml = 1,00 mg. n) Soluciones de herbicidas intermedias: dilúyase 1,0 ml de solución de reserva hasta 100 ml en un matraz volumétrico con una mezcla de volúmenes iguales de dietil éter y tolueno: 1,00 ml = 10,0 µg. o) Solución patrón para cromatografía: Prepárese la concentración final de estándares de éster de metilo en tolueno de acuerdo con la sensibilidad y la linealidad del detector. || Florisil™ o equivalente.

4.

Procedimiento

a) Extracción de muestra: Mídase la muestra con precisión (850 a 1.000 ml) en un cilindro graduado de 1 litro (o utilícese una botella de muestra precalibrada para evitar las operaciones de transferencia). Acidifíquese hasta un pH 2 con H2SO4 conc. y viértase en un embudo de separación de 2 1. Aclárese la botella de muestra y el cilindro con 150 ml de etil éter, añádase éter al embudo de separación y agítese intensamente durante 1 minuto. Déjese separar las fases durante 10 minutos como mínimo. Ocasionalmente, las emulsiones impiden una separación adecuada. Si se forman emulsiones, elimínese la separación entre las capas acuosas, inviértase el embudo de separación y agítese rápidamente. PRECAUCIÓN: Ventílese el embudo con frecuencia para impedir la formación de una presión excesiva. Recójase el extracto en un erlenmeyer de 250 ml cerrado con tapón de vidrio esmerilado que contenga 2 ml de solución de KOH. Extráigase la muestra dos veces más mediante 50 ml de dietil éter cada una de ellas, y combínense los extractos en el erlenmeyer. b) Hidrólisis: Añádanse 15 ml de agua destilada y una pequeña piedra de ebullición y ajústese el matraz a una columna Snyder de tres bolas. Retírese el éter sobre un baño de vapor y continúese el calentamiento hasta un total de 60 minutos. Transfiérase la muestra concentrada a un embudo de separación de 60 ml. Extráigase dos veces, con 20 ml de dietil éter cada una de ellas, y deséchense las capas de éter. Los herbicidas permanecen en fase acuosa. Acidifíquese mediante la edición de 2 ml de H2SO4 frío (4 °C) 1 + 3. Extráigase una vez con 20 ml y dos veces con 10 ml de dietil éter cada una. Recójanse los extractos en un erlenmeyer de 125 ml que contenga cerca de 0,5 g de Na2SO4 anhidro acidificado. Manténgase en con-

ANÁLISIS AUTOMATIZADO DE LABORATORIO

tacto el extracto con Na2SO4 durante 2 horas como mínimo. c) Esterificación: Ajústese un aparato de Kuderna-Danish con un receptor volumétrico de 5 ml. Transfiérase extracto de dietil éter al aparato de Kuderna-Danish a través de un embudo conectado con lana de vidrio. Utilícese abundantemente un lavado de éter. Tritúrese cualquier porción endurecida de Na2SO4 con una varilla de vidrio. Antes de la concentración, añádase 0,5 ml de tolueno. Redúzcase el volumen a menos de 1 ml en un baño de arena o de agua caliente calentado entre 60 y 70 °C. Únase una microcolumna Snyder al receptor de Kuderna-Danish y concéntrese hasta un valor inferior a 0,5 ml. Como alternativa, si se demuestra una recuperación cuantitativa, concéntrese el extracto mediante la colocación de una ampolla de concentrador en el baño de agua a 70 °C. Redúzcase el volumen hasta menos de 1 ml mediante una suave corriente de nitrógeno seco, limpio (filtrado a través de carbono activado). PRECAUCIÓN: No utilice tubos nuevos de plástico entre el dispositivo de atrapamiento de carbono y la muestra ya que pueden introducir interferencias. Aclárese la pared interna de la ampolla con hexano durante la concentración, no deje nunca secar completamente el extracto, y manténgase el nivel de disolvente de la ampolla por debajo del nivel de agua en el baño. Ajústese el volumen final a 1 ml con hexano. Enfríese y añádase 0,5 ml de reactivo de trifluorurometanol de boro. Utilícese una pequeña columna Snyder de una bola como condensador del aire refrigerado y manténgase el contenido del receptor a 50 °C durante 30 minutos en el baño de arena. Enfríese y añádase suficiente solución de Na2SO4 como en el apartado 3d de manera que la superficie de contacto entre el agua y el tolueno se sitúe en el cuello del matraz receptor volumétrico de Kuderna-Danish (alrededor

6-201

de 4,5 ml). Ciérrese el matraz con un cierre de vidrio esmerilado y agítese intensamente durante 1 minuto. Manténgase inmóvil durante 3 minutos para alcanzar la separación de fase. Llévese con la pipeta la capa de disolvente desde el receptor hasta la parte superior de una pequeña columna preparada mediante la conexión de una pipeta Pasteur disponible a lana de vidrio y el relleno con 2,0 cm de Na2SO4 por encima de 1,5 cm de adsorbente de gel de sílice-magnesio. Recójase el eluato en un tubo centrífugo graduado de 2,5 ml. Complétese la transferencia mediante un aclarado repetido del receptor volumétrico con pequeñas cantidades de tolueno hasta que se obtenga un volumen final de eluato de 2,0 ml. Compruébese el calibrado de los tubos centrífugos para asegurar correctas graduaciones. d) Cromatografía de gases: Analícese una porción adecuada, de 5 a 10 µl, mediante cromatografía de gases, con dos columnas, como mínimo, para identificación y cuantificación. Inyéctense con frecuencia esteres de metilo herbicida estándar para asegurar unas condiciones óptimas de funcionamiento, siempre el mismo volumen. Ajústese el extracto de volumen de muestra con tolueno, si es necesario, de manera que los tamaños de los picos obtenidos se aproximen a los de los estándares (véase el apartado 5a desarrollado más adelante), véase figuras 6640:1 y 2 para los cromatogramas de muestras. e) Determinación de la eficacia de recuperación; Añádanse cantidades conocidas de herbicidas a una muestra de agua de 1 litro, actúese según el mismo procedimiento que para las muestras y determínese la eficacia de recuperación. Determínese periódicamente esta eficacia de recuperación y un blanco de control para probar el procedimiento. Analícese un conjunto de duplicados con cada serie de muestras como se ha realizado para la comprobación del control de calidad.

6-202

Figura 6640:1. Resultados del procedimiento de cromatografía de gases para herbicidas clorados fenoxi ácidos. Columna: 1,5 por 100 OV-17 + 1,95 por 100 QF-1; gas portador: argón (5 por 100)/metano a 70 ml/min; temperatura de columna: 185 °C; detector: captura electrónica.

5.

Cálculos

a) Factor de dilución: Si una parte de la solución de extracto es concentrada, el factor de dilución, D, será menor a la unidad; si es diluida, será superior a 1. Compárese la altura de los picos o el

MÉTODOS NORMALIZADOS

Figura 6640:2. Cromatograma de mezcla de herbicidas. Columna DB-5, 30 m de longitud, detector de captura electrónica.

área de un estándar con la altura de los picos o el área de la muestra para determinar la cantidad de herbicida inyectada (véase tabla 6640:1). Calcúlese la concentración de herbicida según:

6-203

ANÁLISIS AUTOMATIZADO DE LABORATORIO

E = altura de pico o área del estándar, mm o mm2, F = volumen inyectado, µl, y G = volumen de muestra extraído, ml.

TABLA 6640:I. TIEMPOS DE RETENCIÓN PARA ESTERES DE METILO DE ALGUNOS HERBICIDAS CLORADOS FENOXI ÁCIDOS RELATIVOS AL ESTER DE METILO 2,4-D

Comuníquense resultados como el éster de metilo en microgramos por litro sin corrección para la eficacia de recuperación. 6.

* Todas las columnas son de vidrio, 180 cm x 4 mm de DI, soporte sólido Chrom Gas Q (retícula 100/120); temperatura de columna: 185 °C; flujo portador argón/metano, hecho funcionar en modo pulso, 70 ml/min.

donde: A = peso del estándar de herbicida inyectado, ng, B = altura de pico o área de la muestra, mm o mm2 , C = volumen de extracto, µl, D = factor de dilución,

TABLA 6640:II.

Precisión y sesgo

La precisión de un único laboratorio y los datos de recuperación se presentan en las tablas 6640:II y III. Estos datos se obtuvieron por análisis de muestras de agua de superficie a partir de seis fuentes con tres herbicidas añadidos. 7.

Bibliografía

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PRECISIÓN DE HERBICIDAS FENOXI ÁCIDOS A PARTIR DE AGUA DE SUPERFICIE DOSIFICADA

6-204

MÉTODOS NORMALIZADOS

TABLA 6640:III. RECUPERACIÓN DE HERBICIDAS FENOXI ÁCIDOS A PARTIR DE AGUA DE SUPERFICIE DOSIFICADA

PARTE 7000 EXAMEN DE LA RADIACTIVIDAD DE AGUAS LIMPIAS Y RESIDUALES

7010

7010 A. 1.

INTRODUCCIÓN*

Discusión general

Incidencia y monitorización

La radiactividad en las aguas limpias y residuales se origina tanto a partir de fuentes naturales como de la actividad humana. Esta última incluye las operaciones relacionadas con el ciclo de los combustibles nucleares, desde la extracción minera hasta el reprocesamiento; el empleo de radioisótopos en medicina; los usos industriales de radioisótopos; el depósito universal de residuos derivados de pruebas nucleares en la atmósfera; y el aumento en la concentración de radionúclidos producidos de forma natural. Los programas de monitorización de aguas limpias y residuales deben diseñarse de forma que sean capaces de evaluar de modo realista el grado de contaminación radiactiva medioambiental. En algunos casos, como por ejemplo la monitorización de la autorización para el agua potable, están expresadas las condiciones1. En otros, puede hacerse necesario el examen de la situación individual para la consideración de radionúcluido(s) crítico(s), la trayectoria por la que el radionúclido crítico se mueve hacia el medio ambiente y un grupo crítico de población expuesto al radionúclido(s) particular, en movimiento a lo largo de esa trayectoria particular. El empleo de la * Aprobado por el Standard Methods Committee, 1988. 7-1

aproximación núcleo-trayectoria-población críticos reduce la lista de posibles radionúclidos susceptibles de monitorización. Puede seleccionarse una lista de los radionúclidos más peligrosos a través del examen de los patrones de concentración de radiactividad suministrados por una serie de organismos internacionales y norteamericanos: International Committee on Radiation Protection (ICRP)3, Federal Radiation Council (FRC) 1 National Committee on Radiation Protection and Measurement (NCRP)2, U. S. Environmental Protection Agency1, y otros organismos de diversos países. Los estados individuales en los Estados Unidos pueden disponer de sus propios estándares de concentraciones de radiactividad si son estados en conformidad con el organismo Nuclear Regulatory Commission (NRC). Salvo escasas excepciones, estos valores numéricos son comparables para las concentraciones de radiactividad en el aire y en el agua siempre que se apliquen ciertas condiciones de calificación. Los programas de monitorización deben avisar adecuadamente sobre las condiciones medioambientales de falta de seguridad de modo que puedan adoptarse las precauciones apropiadas y, por supuesto, indicar que las condiciones son seguras cuando efectivamente son así. En cualquier circunstancia, es necesario establecer líneas de base para los tipos y

7-2

cantidades de los radionúclidos naturalmente presentes y medir las adiciones a este sustrato natural. En este sentido pueden realizarse medidas para suministrar información sobre juicios sólidos en función de la naturaleza peligrosa o no peligrosa de las concentraciones aumentadas. 2. Tipos de medidas

Las medidas significativas requieren la aplicación cuidadosa de buenas técnicas científicas. Los tipos de medidas que se van a realizar se determinan mediante los objetivos del ensayo. Las medidas brutas de alfa y de beta son relativamente económicas, pueden completarse con rapidez y son útiles para el examen de la determinación de si merece la pena llevar a cabo análisis ulteriores de radionúclidos específicos. Sin embargo, las medidas brutas no suministran información sobre la composición isotópica de la muestra, no pueden utilizarse para valorar la dosis de radiación y presentan una pobre sensibilidad cuando la concentración de los sólidos disueltos es alta. Las medidas precisas brutas de beta y, especialmente, de alfa requieren una esmerada preparación de patrones para determinar la autoabsorción y la capacidad de preparación de muestras en una forma similar. Si se han de realizar estimaciones de las dosis, los resultados de análisis brutos superan ciertos niveles o se establece un análisis a largo plazo de las tendencias, se precisan medidas de radionúclidos específicos. Los análisis específicos son normalmente más caros y consumen más tiempo que un análisis bruto. Las medidas específicas identifican los radionúclidos por la energía de la radiación emitida, técnicas químicas, vida media o por una combinación de estas características. Los radionúclidos emisores gamma pueden medirse rápidamente, y con un míni-

MÉTODOS NORMALIZADOS

mo de preparación de muestra, mediante el empleo de espectrometría gamma. Las medidas que requieren separaciones químicas posibilitan el aumento de la sensibilidad a través del incremento de la cantidad medida de muestra. El conocimiento de las características químicas y radioquímicas de los radionúclidos en fase de medición resulta trascendental para la obtención de resultados satisfactorios. Los resultados brutos alfa y beta no proporcionarían una información precisa sobre los radionúclidos que poseen energías significativamente diferentes de la energía de los patrones de calibrado. Durante la concentración de muestras de agua por evaporación, los radionúclidos presentes en forma elemental (por ejemplo, yodo radiactivo, polonio) o como compuestos (por ejemplo, tritio, carbono 14) pueden perderse por volatilización. Si se somete la muestra a ignición, la posibilidad de pérdida por volatilización es aún mayor. Las aguas subterráneas contienen por lo general núcleos de las series del uranio y el torio. Póngase especial atención en la toma de muestras y en el análisis de dichas muestras, ya que estas series, con frecuencia, no están en equilibrio secular.

3. 1.

Referencias

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EXAMEN DE LA RADIACTIVIDAD DE AGUAS LIMPIAS Y RESIDUALES

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Toma y conservación de muestras

1. Toma de muestras

2.

Para los exámenes de radiactividad se aplican los principios de toma de muestras representativa de aguas limpias y residuales (véase sección 1060). Dado que los elementos radiactivos se encuentran con frecuencia en cantidades por debajo del microgramo, una significativa parte de ellos puede perderse por adsorción en la superficie de los contenedores utilizados en el examen. De forma similar, un radionúclido puede ser alta o totalmente adsorbido en las superficies de partículas suspendidas. Los contenedores de muestras varían en tamaño entre 0,5 1 y 18 1, en función de los análisis requeridos. Utilícense contenedores de plástico (polietileno o similar) o vidrio, excepto para muestras de tritio (utilícese sólo vidrio). Cuando se toman muestras de residuos industriales radiactivos o materiales comparables, hay que considerar la posibilidad del depósito de radiactividad sobre las superficies del instrumental de vidrio, contenedores de plástico y equipo que puede originar una pérdida de radiactividad y una posible contaminación de las muestras recogidas subsiguientemente en contenedores lavados de forma inadecuada.

Para una información general sobre conservación de muestras, véase sección 1060. Añádanse conservantes en el momento de la toma de muestras a menos que se haya separado la muestra en partes suspendida y disuelta, aunque en cualquier caso no se debe retrasar la adición de ácido más allá de 5 días. Utilícese ácido clorhídrico (HCl) o nítrico (HNO3) concentrados para obtener un pH T. fraseri > L. verrucosus), cerdas (M.

8-78

cuticulatus tiene cerdas irregulares ocasionales) y color (L. verrucosus tiene una piel papilada y color verdoso, los otros son rojo oscuro). La identificación positiva requiere el examen de especímenes conservados. Para obtener los gusanos, tamícense los sedimentos a través de un tamiz de 0,5 mm y sepárense los especímenes bajo microscopio de disección. Deséchense los que estén muy dañados y pásense los que no lo estén a acuarios ventilados o bandejas poco profundas para su mantenimiento y alimentación. 3.

Cultivo

a) Poliquetos marinos 1) Estado de los animales: Deséchense los animales lesionados durante su recogida. Algunas especies, como Neanthes arenaceodentata, pueden regenerar una cola, por lo que no siempre es necesario desechar los gusanos sin cola, al establecer un cultivo. Guárdense los gusanos con gametos en el celoma para iniciar los cultivos, pero sin utilizarlos normalmente para pruebas de toxicidad. 2) Comida y alimentación: Los cultivos de las especies de poliquetos mencionadas aquí se pueden mantener sin sedimento; por ello hay que alimentar a esos gusanos y también a los de experimentos a largo plazo. Los cultivos de las especies más grandes (como N. arenaceodentata) tienen mejor supervivencia, crecimiento y producción tubular, si reciben una dieta consistente en macroalgas para construcción del tubo y una dieta comercial preparada con invertebrados o peces. El alga verde, Enteromorpha sp., es conveniente porque crece abundantemente en la mayoría de aguas estuarinas de Norteamérica. Recójase en cantidad, lávese con agua de mar, séquese y guárdese indefinidamente. Antes de usarla, empápese el alga en agua de mar y amásese para separar los filamentos individuales. Otras

MÉTODOS NORMALIZADOS

macroalgas, como la parda Ectocarpus siliculosus, producen excelentes resultados en cultivos de poliquetos, pero su uso no es tan cómodo. Pónganse suficientes macroalgas en los recipientes de cultivo para permitir a los gusanos la construcción de sus tubos. Añádase una dieta preparada comercial* a los cultivos, tres veces por semana. Mézclense enérgicamente los copos con una pequeña cantidad de agua de mar para humedecerlos y romperlos antes de su adición a los cultivos. Para que el exceso de alimentación sea mínimo, examínese cada recipiente de cultivo antes de añadir la dieta comercial. Si no se hubieran comido la mayor parte del material de la dieta, no añadir más en ese momento y redúzcase el alimento en las ocasiones sucesivas. Para especies pequeñas (Ctenodrilus serratus y Capitella capitata) y larvas de N. arenaceodentata, es adecuada una dieta en polvo. Preparar un polvo fino a partir de Enteromorpha sp. seca, o una de las dietas comerciales, triturando el producto seco en una mezcladora y tamizándolo a menos de 0,061 mm. C. serratus se puede alimentar en una proporción de 0,1 ml/gusano/semana con una mezcla de 1,0 g de polvo/l00 ml de agua de mar. Aliméntense las larvas de N. succinea con Dunaliella sp. viva hasta que las larvas se estabilicen. En la sección 8010E.4c1)b) se dan las instrucciones de cultivo. Aliméntense con Dulaniella sp. en una proporción de 10 ml de cultivo recuento celular mínimo de 20.000 células/ml)/l de cultivo de gusanos o en cantidad suficiente para mantener un color verde en el agua de mar. Tras la estabilización de las larvas, aliméntense con Enteromorpha sp. hasta que se alcance la fase de epitoque reproductor natatorio. 3) Producción de organismos de prueba: * Prawn Flakes, Plankton Flakes, TetraMin, o equivalente.

MÉTODOS DE PRUEBA DE TOXICIDAD PARA ORGANISMOS ACUÁTICOS

a) Capitella capitata: Los especímenes cultivados en el laboratorio empiezan a madurar alrededor de 15 a 25 días después de romper el huevo. Una hembra madura desarrolla masas blancas de huevos en el celoma a partir del segmento 10, aproximadamente, y un macho produce cerdas especializadas en la superficie dorsal de los segmentos ocho y nueve. La hembra deposita huevos fertilizados a lo largo del forro interior de su tubo, donde continúa el desarrollo larval hasta que las larvas trocóforas emergen 4 ó 6 días después. Para obtener larvas trocóforas que naden libremente, examínense los tubos con un microscopio de disección para detectar los que contienen huevos o larvas. Los huevos recién fertilizados aparecen blancos, pero al madurar se tornan verde-grisáceos y se puede apreciar su movimiento. Colóquense los tubos con larvas en una placa petri. Ábranse, bajo el microscopio de disección, para liberar los trocóforos. Una hembra proporciona de 200 a 300 trocóforos. Elimínense y deséchense las hembras y los tubos con larvas que naden libremente. Utilícense las larvas con natación libre en las pruebas, o déjense que se desarrollen para usarlas posteriormente. b) Neanthes succinea: Tómense epitoques casi maduros del campo o de colonias del laboratorio y reténganse hasta que completen su metamorfosis sexual. Los epitoques maduros nadan hasta la superficie del agua y liberan los gametos. Si la fertilización tiene éxito, sepárense los cigotos en varias jarras de 4 l que contengan agua ventilada, y déjense desarrollar hasta la fase de tres cerdas (alrededor de una semana). Estas larvas están listas para su uso en las pruebas. Una fertilización consigue más de 2.000 larvas. c) Neanthes arenaceodentata: Antes del desove, la hembra o el macho entran en su tubo o el de otro gusano. Si los gusanos son de sexo diferente, se quedan

8-79

juntos y desovan dentro del tubo. La hembra muere al día siguiente y el macho incuba los huevos durante 3 semanas aproximadamente, cuando ya tienen de 18 a 21 segmentos quetíferos. En ese momento, los gusanos jóvenes abandonan el tubo, empiezan a alimentarse y construyen sus propios tubos. Aliméntense con Enteromorpha como se indica en la sección 8510B.3a2). En las condiciones del laboratorio (20 °C) se alcanza la madurez sexual en 3 a 4 meses. Es imposible distinguir morfológicamente el sexo de las formas inmaduras. Se puede diferenciar observando si luchan o no cuando están juntos. Utilícese una hembra con huevos maduros en el celoma, como individuo conocido, para identificar el sexo de los gusanos inmaduros. El tiempo más conveniente para obtener a los jóvenes es el momento en que abandonan el tubo paterno y empiezan a alimentarse. d) Ctenodrilus serratus: Esta especie se reproduce asexualmente por división transversal cada 14 días aproximadamente, a 20 °C. Cada individuo produce de 5 a 8 especímenes nuevos. Las colonias grandes se pueden mantener con el mínimo de atención. b) Oligoquetos marinos y de agua dulce: 1) Estado de los animales: Los oligoquetos muestran gran capacidad regenerad va, por lo que no siempre es necesario desechar los especímenes dañados. Los individuos maduros con regiones clitelares bien desarrolladas son especialmente importantes para el establecimiento de cultivos, que se deben mantener en la oscuridad o en regímenes de luz natural/oscuridad. 2) Comida y alimentación: Los oligoquetos se alimentan principalmente de bacterias de los sedimentos; por ello, en experimentos con sedimentos naturales es innecesaria la alimentación adicional. Los experimentos a corto plazo no preci-

8-80

MÉTODOS NORMALIZADOS

san alimentación; para los más prolongados (10 días) se añadirá sedimento. Acondiciónense los sedimentos estériles preparando un inoculo de Enteromorpha (para gusanos marinos) o lechuga (para los de agua dulce) consistente en el material acuoso que queda al estropearse las fibras vegetales en agua diluyente. Añádase el inoculo directamente a los recipientes de cultivo en un volumen que no supere el 10 por 100 del total. Es preferible usar sedimentos de arena fina con algo de cieno, que sedimentos más fangosos en que los gusanos se encuentren con dificultad. Compruébense los cultivos periódicamente por si se han estropeado; en ese caso, límpiense y comiéncese de nuevo. Los oligoquetos no tienen fase larvaria. No es preciso un régimen alimenticio distinto para las formas jóvenes. 3) Producción de organismos de prueba: Los gusanos grávidos en el cultivo ponen huevos que se abren en 3 a 14 días, dependiendo de la especie y temperatura. Los gusanos recién salidos del huevo carecen del componente completo de quetas, del adulto, pero las desarrollan rápidamente. Las especies de agua dulce suelen crecer mejor en cultivo mixto. Se recomiendan las combinaciones siguientes: L. hoffmeisteri y T. tubifex, L. hoffmeisteri y B. sowerbyi, T. tubifex y B. sowerbyi, S. heringianus y L. hoffmeisteri. T. fraseri es una especie partenogenética y muy fácil de cultivar; L. verrucosus y M. cuticulatus se pueden cultivar como especies puras.

4.

Parásitos y enfermedades

El crecimiento microbiano puede surgir del exceso de alimentación, malas condiciones del alimento o insuficiente OD. Impídase el crecimiento de hongos con una higiene adecuada y cuidados periódicos. Para reducir el exceso de alimentación, examínese cada acuario pre-

viamente. Si la mayor parte de la dieta está intacta, no se debe añadir más, y hay que reducirla en sucesivas ocasiones. Generalmente, hay OD suficiente en los acuarios de 4 l; sin embargo, se puede aumentar la aireación para corregir cualquier deficiencia. Los protozoos endoparásitos gregarínidos se ha visto que reducen la vitalidad de algunas especies de poblaciones de poliquetos en el laboratorio. Los gregarínidos están ampliamente distribuidos en poliquetos y oligoquetos, pero no se sabe si producen problemas similares en esas especies. 5.

Bibliografía

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MÉTODOS DE PRUEBA DE TOXICIDAD PARA ORGANISMOS ACUÁTICOS

FARRELL. 1983. A comparative study of respiration rates of some aquatic oligochaetes in relation to sublethal stress. Int. Rev. Ges. Hydrobiol. 68:685.

8510 C. 1.

Procedimientos generales

Suministro de agua

a) Agua de mar artificial: Véase la sección 8010E.4b2). Utilícese una salinidad aproximada de 35,5 g/kg y pH de alrededor de 7,8 para las poblaciones marinas; para gusanos estuarinos empléese agua de poca salinidad. b) Agua de mar natural: Determínese y regístrese su calidad de forma rutinaria. Manténgase la salinidad del agua de dilución en la concentración seleccionada o normal, o próxima a ella. Durante un ensayo, no permitir que la salinidad varíe en más de ±3 g/kg. En todas las pruebas, excepto las de efluentes, fíltrese el agua de mar a través de membrana de 0,45 µm. c) Agua destilada o del grifo: Determínese la calidad (dureza, alcalinidad, componentes químicos) y regístrese de forma rutinaria. Utilícese agua neutra (pH 7,0). 3.

REISH, D. J. 1985. The use of Neanthes arenaceodentata as a laboratory experimental animal. Tethys 11:335.

Procedimientos de prueba de toxicidad

Utilícense ensayos exploratorios (véase sección 8010D) para determinar las concentraciones intoxicantes para pruebas a corto plazo. Prepárese agua de dilución y soluciones intoxicantes, e introdúzcanse en los recipientes de ensayo como se describe en la sección 8010F. 2.

8-81

Cámaras de exposición a) Poliquetos marinos: Utilícense acua-

rios de 4 l o jarras de vidrio para pruebas estáticas y de renovación, a corto y medio plazo, donde no se disponga de insta-

laciones de flujo. Tápense los acuarios para impedir la entrada de materiales extraños. No añadir más de 2,5 litros de solución de ensayo a cada acuario de 4 l. Empléense matraces erlenmeyer de 500 ml, conteniendo 100 ml de agua de mar, para experimentos a corto o largo plazo, cuando se ponga sólo un organismo por matraz. Ciérrese el matraz con un tapón de TFE del número 7 que lleve ajustado un tubo de vidrio para entrada de aire. Utilícense pequeñas cápsulas «stender» (30 ml) para pruebas con larvas. Utilícense las cámaras de exposición descritas en la sección 8720B.3b3), para pruebas con flujo transversal. En caso de especies caníbales como Neanthes arenaceodentata, aíslense los individuos durante las pruebas. El tamaño del recipiente dependerá de la biomasa; manténganse las densidades de carga por debajo de 0,5 g/l para situaciones estáticas e inferiores a 0,5 g/l/d para pruebas con flujo a 20 °C. En las pruebas con sedimento, empléense cristalizadores de vidrio, de tamaño apropiado para las especies estudiadas y el número de individuos por placa. Llénense los cristalizadores con 1 a 4 cm de altura del sedimento. Dejar fluir agua de mar limpia por encima del sedimento. b) Oligoquetos de agua dulce y marina: Realícense pruebas de toxicidad similares a las pruebas con larvas de poliquetos. Empléense placas petri desechables, poco profundas, con tapas para las pruebas estáticas o de renovación. El tamaño del recipiente dependerá de la biomasa; manténganse las densidades de carga por debajo de 0,5 g/l, y preferiblemente a menos de 0,2 g/l. Pónganse 10 gusanos en cada recipiente por concentración de ensayo, más los controles. Realícense ensa-

8-82

yos por duplicado. Los gusanos se pueden ensayar individualmente, con 20 individuos por concentración de ensayo. Para el caso de pruebas con flujo, utilícense las cámaras de exposición descritas en la sección 8720B.3b3). 4. Realización de las pruebas de toxicidad

a) Montaje de las cámaras de ensayo: Para pruebas estáticas y de renovación, prepárense como se describe en la sección 8010D. En pruebas a corto plazo, no hay que limpiar los recipientes de exposición. En las pruebas a largo plazo, donde se alimenta a los organismos, elimínese la comida no utilizada y otros materiales, como se describe en la sección 8010E.4b. NO es necesario proporcionar un sustrato de fondo más que para las pruebas de toxicidad a largo plazo con oligoquetos. No parece que el fotoperíodo y la intensidad luminosa sean factores en las pruebas con oligoquetos; sin embargo, se deben estudiar en la oscuridad o simulando la luz/oscuridad natural. Manténganse las temperaturas dentro de ±2°C de la del habitat natural, a no ser que se esté estudiando el efecto de la temperatura. 1) Poliquetos marinos: Empléese un mínimo de 20 gusanos para cada concentración de ensayo. Para especies caníbales, como N. arenaceodentata, póngase un gusano por recipiente. Para otras especies, pónganse 2,5 ó 10 gusanos en cada uno (dependiendo de la biomasa y tamaño del recipiente, véase sección 8010F.3c). Para pruebas con sedimentos, utilícese un mínimo de tres recipientes repetidos por concentración de sedimento y de 10 a 15 gusanos por recipiente. Los individuos de especies caníbales no tienen que separarse con sedimento en los recipientes. 2) Oligoquetos de agua dulce y marina: Utilícese un mínimo de 20 gusanos

MÉTODOS NORMALIZADOS

para cada concentración de ensayo, preferiblemente en dos replicados de 10 gusanos cada uno. Así como los gusanos se enroscarán cuando estén sanos, los intoxicados quedarán aparte y manifestarán los efectos tóxicos (por ejemplo, desintegración progresiva de los segmentos posteriores). b) Duración y tipo de prueba: 1) Pruebas a corto plazo: La duración de los ensayos a corto plazo o agudos depende del ciclo vital de los organismos (véase sección 8010F.3a). Las pruebas a corto plazo pueden ser estáticas si duran 4 días o menos, o pruebas de renovación de hasta 10 días. 2) Pruebas de duración intermedia: Utilícense pruebas de duración intermedia para determinar la supervivencia de poliquetos adultos. Para la mayoría de las especies, realícense estos ensayos con renovación o flujo, durante 28 días. Háganse pruebas de 10 días para determinar la supervivencia de poliquetos jóvenes o adultos en sedimentos contaminados. 3) Pruebas a largo plazo: Las pruebas a largo plazo sólo incluyen poliquetos y son pruebas de ciclo vital parcial, que comienzan con la fase trocófora larval y continúan durante la madurez sexual, o pruebas de ciclos vitales que comienzan con la fase larval recién establecida y continúan durante la reproducción y establecimiento larval posterior de la prole. Empléense ensayos de renovación o flujo. Selecciónense y prepárense las concentraciones de prueba como se describe en la sección 8010F.2b. Mídase y mézclese el agua de dilución y las soluciones intoxicantes de reserva, en diluidores proporcionales, y añádanse a las cámaras de exposición como se describe en la sección 8010F.1. Realícense las pruebas en cámaras de exposición con flujo transversal, similares a las usadas para el cangrejo de cieno [secciones 8720.3b3) y 8720C.4c2)]. Las pruebas de renovación con cámaras

MÉTODOS DE PRUEBA DE TOXICIDAD PARA ORGANISMOS ACUÁTICOS

de exposición de 4 l pueden ser necesarias cuando no se disponga de agua de mar. La duración de las pruebas a largo plazo depende del ciclo vital de los organismos y varía desde alrededor de 1 mes con C. capitata a 3 meses o más con N. succinea, N. virens y N. arenaceodentata. c) Organismos de prueba: Véase sección 8510B. d) Realización de ensayo: 1) Pruebas a corto plazo: Prepárense y realícense las pruebas de renovación como se describe en la sección 8010D.2. Determínese la supervivencia de los adultos, comprobando las cámaras de exposición a las 1, 2, 4, 8, 18 y 24 horas y luego una o dos veces al día. Los especímenes muertos son pálidos, están hinchados y yacen en el fondo; los vivos suelen responder a estímulos físicos. Si estas pruebas duran más de 4 días, renuévense las soluciones preferiblemente a diario, pero, por lo menos, cada 4 días. En las pruebas a corto plazo con larvas de poliquetos, determínese la supervivencia al cabo de 96 horas por examen al microscopio. La ausencia de larvas indica generalmente la muerte, porque la descomposición de las larvas es rápida. 2) Pruebas a medio plazo: Móntense las cámaras de prueba descritas previamente en el apartado 4a, para determinar la letalidad adulta (CL50 o CL50 incipiente). Examínense los recipientes de ensayo diariamente para determinar la supervivencia. Comuníquense los resultados como CL50 de 28 días. Si no mueren organismos tras un determinado período de exposición, regístrese el período más allá del cual no hay letalidad y el porcentaje muerto en cada concentración de ensayo. Calcúlese la CL50 asintótica. Para ensayos de sedimento contaminado, tamícese el contenido de cada recipiente replicado al cabo de 10 días, y cuéntese el número de supervivientes. Si se ha utili-

8-83

zado una serie de sedimentos mixtos graduales, calcúlese CL50 sobre la base del porcentaje de sedimento contaminado. 3) Pruebas de ciclo vital de poliquetos empezando en la fase larval trocófora: Prepárense como se ha descrito previamente en esta sección. Realícese la prueba hasta la madurez sexual con períodos de 3 a 4 semanas, en C. capitata, y de 2 a 3 meses o más con N. arenaceodentata, N. succinea y N. virens. Aliméntense las larvas como se describe en la sección 8510B.3a2). Determínese la supervivencia al menos dos veces por semana para C. capitata y una por semana para Neanthes. Durante la primera parte del estudio, cuéntense los organismos del fondo de las cámaras de exposición. Si se realiza un ensayo con renovación, decántese el líquido sobrenadante, examínese al microscopio de disección y sustitúyase el fluido con solución de prueba nueva. Para las pruebas de flujo, sáquense las cámaras de la caja de exposición, cuéntense los organismos y vuélvase a colocar la cámara. Si no se observan organismos en el tercer examen, termínese esa cámara de prueba. Cuando el organismo de prueba es C. capitata, sáquense las cámaras de prueba al cabo de unos 15 ó 16 días y cada 2 días, a partir de entonces, para comprobar, con ayuda de un microscopio de disección, la presencia de huevos en el celoma y después la de cigotos a lo largo de los lados del tubo. Retírense las hembras, cuando los huevos en desarrollo estén en la fase trocófora, y cuéntense las larvas. Deséchense las hembras y larvas tras contar éstas y registrar otros datos como la longitud y número de larvas muertas o deformes. Continúese examinando cada cámara de exposición cada 2 días para detectar las hembras que incuban larvas, hasta haber retirado a todas las hembras y contado todas las larvas. Para N. succinea, instálese la cámara de exposición como se describe anterior-

MÉTODOS NORMALIZADOS

8-84

mente en el apartado 4a, con 25 larvas en cada cámara de 1 l, o 10 larvas en las cámaras de flujo. Por cada concentración ensayada, utilícense 10 cámaras. Dado que los gusanos luchan y son caníbales cuando están aglomerados, prepárense cámaras de exposición adicionales o redúzcase el número de individuos en cada cámara de prueba a 5, al cabo del primer mes. Continúense los ensayos hasta que los animales alcancen la fase epítoque; determínense entonces las longitudes individuales y pesos totales comparando con los de control. 4) Ensayos del ciclo vital de poliquetos comenzando por la fase larval recién establecida: Estas pruebas variarán en duración desde alrededor de 1 mes para C. capitata a 3 meses o más para N. arenaceodentata. Prepárense las pruebas, como se ha descrito previamente, con las larvas recién establecidas. Utilícese un mínimo de dos especímenes por matraz y 10 matraces por concentración. Al avanzar la prueba, cuéntense los organismos como antes. Examínese la supervivencia una o dos veces por semana como en d3). Para N. arenaceodentata, utilícense larvas recién surgidas con unos 18 a 20 segmentos setíferos. Si se realiza una prueba de renovación, colóquense cuatro gusanos en cada una de cinco cámaras de exposición de 4 l, con 2,5 l de solución de prueba. Móntense cinco recipientes para cada concentración de prueba y control. Para ensayos con flujo transversal, pónganse dos larvas en cada una de 10 cámaras de exposición para cada concentración de prueba y los controles. A los 25 días, examínense los gusanos observándolos desde fuera del recipiente para ver si hay huevos en el celoma. Si fuera necesario, trasládense los gusanos maduros entre los replicados de un tratamiento determinado para aparear machos y hembras. Los huevos maduros alcanzan las 450 µm de diámetro y son naranja-amarillentos. Examínese a in-

tervalos de 5 días hasta que se aprecien los huevos, y luego cada 2 a 3 días para determinar si se están desovando. Las hembras mueren un día después de desovar y los machos incuban los huevos durante 3 semanas aproximadamente. El ciclo vital está completo cuando el gusano abandona el tubo del macho. Retírense los machos y cuéntensen las larvas.

5.

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Evaluación de datos

1. Estudios a corto y medio plazo de supervivencia de adultos

Determínense los valores de CL50 para cada período de exposición, como se describe en la sección 8010G. Una alternativa útil es la determinación de TL50 (tiempo para el 50 por 100 de mortalidad) en exposiciones comparadas con concentraciones de intoxicante simple, efluente, agua o sedimento. El TL50 proporciona también información auxiliar útil para los estudios de CL50. 2. Estudios del ciclo vital de los poliquetos, comenzando por las fases larvarias trocófora y sedimentada

ponen huevos y el de la prole producida están inversamente relacionados con las concentraciones intoxicantes subletales, a niveles inferiores a la CL50. Proporcionan una medida más sutil de los efectos que la CL50. Regístrense los datos del ciclo vital para cada concentración de intoxicante como sigue: Número de hembras formadoras de huevos, número de hembras que desovan y número de huevos y prole producidos. Compárense esos datos, expresados en porcentaje, para todas las concentraciones de ensayo, con los obtenidos con los testigos. Utilícense las técnicas estadísticas y para comunicación que se describen en las secciones 8010G y H.

El número de hembras que forman y

8610

PROCEDIMIENTOS DE PRUEBA DE TOXICIDAD CON MOLUSCOS* 8610 A.

1. Adecuación a las pruebas de toxicidad

Ostras, almejas, vieiras y mejillones están ampliamente distribuidos y tienen * Aprobado por el Standard Methods Committee, 1988.

Introducción gran valor como alimento humano. Éstos y otros moluscos son adecuados para evaluar la toxicidad en pruebas a corto y largo plazo. Los embriones de ostras y almejas se han usado para medir los efectos de las variables químicas y ambientales en medios estuarinos y marinos.

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MÉTODOS NORMALIZADOS

Están desarrollándose métodos para usar moluscos de agua dulce en pruebas estándar y existen ya otros para cultivo y mantenimiento de algunos caracoles hidrobideos en el laboratorio1. Los tóxicos afectan a los bivalvos, por interferir en la fertilización, desarrollo embrionario normal, crecimiento (depósito de conchas), secreción de hilo bisal, reproducción e histología tisular normal. Esos efectos tóxicos son las bases de las pruebas de toxicidad a corto y largo plazo. Los bivalvos adultos no suelen ser

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adecuados para determinar las concentraciones letales agudas de tóxicos por su capacidad para cerrar las conchas y protegerse de los tóxicos.

2.

Referencia

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Selección y preparación de organismos de prueba

1. Selección de organismos de prueba

Para aceites y metales pesados, la vieira de bahía es la especie más sensible. Algunos moluscos adultos son resistentes a muchos materiales y los acumulan en grandes concentraciones. Comparadas con los peces y otros invertebrados, las larvas de ostra pueden ser más o menos sensibles, especialmente a los pesticidas. Las especies recomendadas para pruebas incluyen:

no filtrada, del océano abierto o estuarina, con la temperatura y salinidad deseadas (secciones 8010E.4b y 8010F.1 y 2a). Si fuera necesario, emplear agua de mar artificial. Para moluscos que se alimentan por filtrado, utilícese agua de mar natural con organismos planctónicos. En las pruebas de crecimiento a largo plazo, suminístrese a las ostras adultas un mínimo de 5 l de agua de mar sin filtrar/hora/ostra. A las almejas y vieiras se les suministrarán cantidades comparables de agua de mar natural, rica en plancton. En ensayos con flujo transversal, distribúyase el agua desde un tanque de cabeza constante (sección 8010F.1). 3. Recolección, acondicionamiento y cultivo de organismos de ensayo

2.

Suministro y sistema de agua

Las pruebas requieren un laboratorio marino con suministro de agua limpia,

Recójanse los organismos de prueba en su habitat, cómprense en el comercio o cultívense. Utilícese agua de mar natural, rica en plancton, para el crecimiento de adultos o hembras con huevos. Límpiense las conducciones de entrada y todo el sistema de agua, frecuentemente, para asegurar que el crecimiento en las tuberías no elimina el plancton. Si no hubiera su-

MÉTODOS DE PRUEBA DE TOXICIDAD PARA ORGANISMOS ACUÁTICOS

ficiente alimento, o si el flujo continuado de agua de mar no filtrada diera lugar a problemas de competidores, parásitos o enfermedades, prodúzcase alimento planctónico en las cámaras de cultivo [sección 8010E.4c2)]. a) Ostras: Para ensayos con adultos, o para producir embriones, utilícese la ostra oriental o del Pacífico, de 7,5 a 15 cm de altura. Selecciónense las ostras y acondiciónense a intervalos de 2 a 4 semanas, dependiendo de las necesidades. En el laboratorio, manténgase cada lote de ostras como una población aparte, en las bandejas de acondicionado. Las ostras recogidas de diciembre a abril necesitan un acondicionamiento más prolongado que las recogidas entre abril y julio. Después de agosto, las ostras comienzan a reabsorber sus gametos no desovados y son malas reproductoras. Para tener ostras que se reproduzcan bien, recoléctense en los meses de primavera y manténganse todo el año en agua fresca o agua de mar refrigerada, con flujo, en el laboratorio a menos de 12° C1. Lávense las ostras de los organismos que las ensucien y otros materiales extraños. Utilícense 15 ostras por bandeja de acondicionamiento (58 x 46 x 8 cm). Cada bandeja debe disponer de un mínimo de 7 1/h de agua de mar fluyente a 20 ± 1 °C. Las ostras precisan de 2 a 6 semanas de acondicionamiento térmico antes de estar listas para desovar y se pueden utilizar de 2 a 4 semanas para criar, antes de desecharlas. Los moluscos maduros acondicionados desovarán en agua de mar natural o artificial. Cuando se les induce a desovar en agua de mar natural, se deben trasladar inmediatamente al agua o medio artificial receptor para recoger los gametos. Examínense las ostras diariamente y elimínense las moribundas. Si alguna muere, vacíese la bandeja y límpiese con detergente y agua templada. Frótense las ostras restantes con agua de mar limpia, aclárense varias veces y vuélvase a ponerlas en la bandeja.

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Límpiense las heces acumuladas y el cieno de las bandejas por lo menos una vez por semana, y mejor dos veces. Si se produjera un desove no planificado, deséchense todas las ostras de esa bandeja. Cuando se precisen huevos fertilizados, lávense las ostras acondicionadas con agua de mar limpia y colóquense en placas individuales de desove. Elévese la temperatura del agua 5 a 10 °C para inducir el desove y añadir suspensión de esperma como inducción adicional. Prepárense las suspensiones de esperma abriendo una ostra macho, rompiendo la gónada y lavando el esperma con cuidado, desde el tejido gonadal a un vaso de 1 l, con un chorro fino de agua de mar a 20 °C. Cuídese de no romper otros órganos del cuerpo durante el proceso y empléese agua suficiente para que el OD se mantenga próximo a saturación. Tras el intento de desove, devuélvanse las ostras que no hayan desovado a las bandejas de acondicionamiento. Deséchense las hembras, una vez que hayan desovado. Póngase cualquier exceso de machos que desoven en una bandeja aparte, y utilícense para preparar suspensiones de esperma. b) Almejas: Recójanse las almejas en su habitat o adquiéranse en las pescaderías. Manténganse los adultos en cajas vivas o recipientes con flujo transversal adecuado de agua durante el transporte; colóquense entonces en bandejas adecuadas. Empléense los especímenes en pruebas a largo plazo, o para la producción de larvas utilizadas en pruebas a corto plazo. Si los adultos no se obtienen en la estación del desove normal, acondiciónense térmicamente para el desove, colocándolos en bandejas con flujo de agua de mar a 18-22 °C, dependiendo de las especies, durante 3 a 4 semanas. Estimúlese a las almejas adultas con gónadas maduras para que desoven naturalmente, aumentando la temperatura del agua a 24-28 °C, dependiendo de las especies, y añádase una suspensión de esperma como se ha descrito en el caso de las ostras. Prodúzcanse larvas solamente

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a partir de los huevos liberados naturalmente. Un conjunto de 30 a 40 adultos acondicionados térmicamente es adecuado para asegurar el desove en cualquier momento. colóquense los huevos en las soluciones de ensayo lo antes posible, y no más de 2 horas después de la fertilización. Para usar larvas en pruebas a más largo plazo, en ausencia de alimento natural, empléese una mezcla de Isochrysis galbana y Monochrysis lutheri o alguna otra alga cultivada en agua de mar estándar enriquecida, descrita en la sección 8010E.4c1)b). c) Mejillones: Recoléctense Mytilus edulis en los pilotes, rocas, balsas, escolleras, y otros hábitats convenientes. Son preferibles los de muelles o plataformas flotantes por ser más fáciles de recolectar y más limpios. Dado que los especímenes más grandes pueden contener gametos maduros que pueden liberarse durante las pruebas, utilícense sólo especímenes pequeños en las pruebas a medio plazo con adultos. Empléense especímenes de tamaño uniforme, de 15 a 20 mm de diámetro3. Sepárese este tamaño pasando los mejillones a través de un agujero de 20 mm de diámetro, perforado en una pieza de lámina metálica; los mejillones con tamaño correcto pasarán a través de él, pero no por uno de 15 mm de diámetro. Deséchense todos los demás especímenes. límpiese la superficie y córtense los hilos básales, pero sin eliminar el pedúnculo del hilo. Aclimátense los especímenes limpios, en acuarios, durante 1 semana, a no más de 4 °C por encima de la temperatura del agua de campo, pero por debajo de 26 °C y a una densidad de unos 10 especímenes/4 l de agua de mar. Proporciónese aireación y filtración a los acuarios acuáticos. Examínense diariamente por si hubiera muertos. Deséchense todos los especímenes, si muere más del 10 por 100 durante la aclimatación. Ocasionalmente, algunos animales de 15 a

MÉTODOS NORMALIZADOS

20 mm tienen gametos maduros y desovarán. Cámbiese el agua para evitar que se ensucie, y elimínese el espécimen maduro que pueda ser identificado. Si el desove es muy abundante, deséchense todos los especímenes. d) Vieiras: Recoléctense las vieiras sobre el terreno o cómprense a los pescadores, con especial cuidado en su adecuada manipulación. Utilícense los adultos como se ha descrito en las ostras. Existen métodos de cultivo y acondicionamiento 1, 4-7. Manténganse a 20-22 °C durante 3 a 8 semanas en el mismo tipo de bandeja empleado para ostras. Compruébense las gónadas periódicamente para determinar su desarrollo. Introdúzcase un dedo entre las valvas para mantenerlas abiertas y observar si las gónadas son visibles. La vieira de bahía es hermafrodita funcional. El testículo comprende el borde anterior de la gónada, y el ovario la parte posterior. Cuando está madura, la porción ovárica es naranja rojiza, y el testículo color crema. Tras la maduración de las gónadas, indúzcase el desove, elevando la temperatura del agua a 27-30 °C. Los procedimientos para desove, manipulación de los huevos, fertilización y cría de larvas están descritos5. Aliméntense las larvas con fitoplancton marino cultivado como se describe en la sección 8010.4c1)b).

4.

Parásitos y enfermedades

En la cavidad o tracto digestivo de los moluscos pueden encontrarse copépodos ciclopoides8. Las especies que habitan en la cavidad del manto no producen lesiones patológicas conocidas. Sin embargo, los copépodos ciclopoides, como Mytilicola intestinalis, habitante en el tracto digestivo, pueden dañar las cubiertas celulares y causar una mayor incidencia de mortalidad. Examínense los tractos digestivos de una muestra de 20 moluscos elegidos al azar, para ver si contienen

MÉTODOS DE PRUEBA DE TOXICIDAD PARA ORGANISMOS ACUÁTICOS

copépodos ciclopoides, antes de usar un grupo recolectado de una vez, especialmente en zonas donde se sepa que existe M. intestinalis. No se deben utilizar los moluscos, si la incidencia de infestación supera al 10 por 100.

8. C HENG , T. C. 1967. Marine mollusks as hosts for symbiosis with a critical review of known parasites of commercially important species. Advan. Mar. Biol. 5.

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Desarrollo de las pruebas de toxicidad

Pruebas a corto plazo

a) Pruebas del embrión de ostra: Obténganse huevos de ostras en el laboratorio y fertilícense para iniciar su desarrollo. Normalmente se convierten en larvas de charnela recta, con concha, en 48 horas. Utilícese la normalidad del desarrollo para determinar la calidad de las

muestras de agua recibidas. Cuando los embriones se cultivan en agua de mar artificial, la normalidad de su desarrollo servirá como criterio de la toxicidad relativa de los tóxicos adicionados. Utilícese agua de mar artificial1 [sección 8010E.4b2), tabla 8010:II] para el desove de los adultos y cultivo de embriones 2 . Se ha propuesto el agua de

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mar artificial como medio patrón de ensayos3, 4. La metodología del cultivo de embriones de ostra ha sido desarrollada en estudios de la ostra oriental, Crassostrea virginica5, y se ha adaptado a la del Pacífico, C. gigas, y el mejillón azul, Mytilus edulis7. Utilícese este método para otros bivalvos que pueden desovar en condiciones controladas en el laboratorio. Utilícense los pasos generales siguientes para pruebas con huevos de ostra fertilizados durante todo el año: 1) 2 horas antes del desove deseado, colóquense 15 ostras hembras maduras, acondicionadas térmicamente, en un número igual de platos para horno de vidrio de borosilicato de aproximadamente 22 x 12 x 8 cm, llenas con agua de mar filtrada, tratada con luz UV, o agua de mar artificial a 10 °C. 2) Elévese la temperatura del agua, poniendo los platos en un baño de agua a 28-30 °C. 3) Unos 30 minutos antes del desove deseado, añádanse a cada plato 20 ml de suspensión de esperma, preparada como en la sección 8610B.3a. La combinación del aumento de temperatura y el esperma suele inducir el bombeo acelerado de las ostras y el desove de una o más hembras maduras. El esperma fertiliza los huevos según van liberándose. 4) Si no se consigue el desove en 1 hora aproximadamente, o las ostras interrumpen la actividad de bombeado enérgico, cámbiese el agua de las placas de desove por otra nueva a 20 °C, y repítase el proceso. Llévese con la pipeta más suspensión de esperma al agua para que las ostras inicien el desove. 5) Unos 30 a 45 minutos después del desove, viértanse los huevos de una sola hembra (normalmente de 6 a 40 x 10) a un vaso de 2 1. Determínese la densidad de huevos a partir de dos recuentos, en una célula de Sedgwick-Rafter. del múmero de huevos en muestras de 1 ml de

MÉTODOS NORMALIZADOS

una dilución 1:99 de suspensión homogénea de huevos. 6) Llévese la temperatura del agua de ensayo y control a 20 °C ± 0,5 °C (25 °C ± 0,5 °C en zonas meridionales), antes de inocular los embriones de ostra. Añádase suficiente suspensión de embriones a cada recipiente de prueba para obtener una densidad de población de 20.000 a 30.000/l. Utilícese al menos un 10 por 100 de los cultivos como testigos, y un mínimo de dos duplicados para cada condición experimental. 7) Incúbense los cultivos en un baño de agua de 20 °C ± 1 °C durante 48 horas (25 °C ± 1 °C en zonas meridionales) y háganse pasar entonces a través de un tamiz de 37 µm para retener y concentrar las larvas. 8) Lávense las larvas en una probeta graduada de 100 ml. Tómese una muestra de 2 ml conteniendo de 150 a 250 larvas con una pipeta automática y consérvese en viales con 3 por 100 de formalina neutra para examinar al microscopio. 9) Cuéntense las larvas conservadas en una célula de Sedgwick-Rafter y regístrese el número de larvas normales y anormales. Las primeras tienen la concha completa, aunque puedan presentar formas raras o de menor tamaño. Este criterio evita tener que hacer un número excesivo de juicios de valor para clasificar las larvas en normales y anormales. La medida básica de la respuesta biológica es el porcentaje de larvas normales. Existen más detalles, variaciones de la prueba y métodos de ordenador para procesado y análisis de los datos6. b) Pruebas con embriones de vieira, almeja y mejillón: Efectúense las pruebas con los embriones de vieira, almeja y mejillón utilizando los procedimientos descritos para embriones de ostra. c) Prueba de depósito en conchas de ostra: 1) Consideraciones generales: Esta prueba de 96 horas demuestra la toxici-

MÉTODOS DE PRUEBA DE TOXICIDAD PARA ORGANISMOS ACUÁTICOS

dad comparada de contaminantes para ostras jóvenes. Realícense en flujo de agua de mar filtrada, a una temperatura entre 15 y 30 °C. Las ostras en alimentación activa extienden los bordes de su manto hacia la periferia de la concha o válvulas. Sin embargo, el cuerpo se puede contraer para ocupar un espacio mucho menor. Si se rebajan mecánicamente los bordes de las válvulas, las ostras responden depositando nueva concha que sustituya esa pérdida8. El crecimiento de la nueva concha es básicamente lineal durante la primera semana, y la tasa de depósito es un índice de la reacción del animal a la calidad de agua ambiental. En condiciones aceptables, las ostras de 25 mm y mayores depositan hasta 1 mm/d de concha periférica nueva. Las ostras pequeñas son más adecuadas que las grandes porque suelen formar nuevos depósitos de concha dentro de una gama de temperaturas más amplia que las maduras. La interpretación de los datos de la prueba es independiente de fluctuaciones menores en la temperatura y salinidad durante la exposición de 96 horas porque se considera que el depósito simultáneo en las ostras control es del 100 por 100. 2) Obtención y preparación de las ostras: Recojamos ostras de unos 25 a 50 mm de altura (es decir, del eje largo) con formas planas, aproximadamente redondas; límpiense con un cepillo y manténganse las bandejas en un medio natural. Para hacer las pruebas, vuélvanse a limpiar las ostras y quítese entre 3 y 5 cm del borde de sus conchas, sujetándolas con la mano contra un disco eléctrico de esmeril. Es necesario comprobar que la eliminación de concha es uniforme y deja un perfil chato, ligeramente redondeado. Deséchense las ostras dañadas por haber eliminado un borde excesivamente ancho. Fabríquese el acuario de ensayo de vidrio, de material acrílico transparente o de madera tratada con fibra de vidrio (64 x 38 x 10 cm de profundidad) que

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Figura 8610:1. Diagrama del aparato de flujo constante9.

proporcione espacio adecuado para 20 ostras. Suminístrese agua de mar no filtrada, desde un depósito constante a través de un sistema diluidor (sección 8010F.1) o con sifones calibrados a través de una cubeta de mezclado (fig. 8610:1 y Lowe)9 en que se mide el intoxicante*. Prepárense soluciones tóxicas de reserva de modo que la adición de 1 ó 2 ml consiga la concentración deseada. Cuando se usen bombas (fig. 8610:1), instálense pantallas en la cubeta para asegurar la ventilación y mezclado del agua antes de que penetre en el acuario. Los acuarios contienen unos 18 l al 75 por 100 de su capacidad. Un flujo de 100 1/h proporcionará 5 l/h/ostra. 3) Procedimiento de prueba: Empléese una serie de exposición preliminar para determinar el intervalo adecuado de * Bomba de jeringa Sage, Sage Instruments, Inc., Cambridge, Mass. 02139, Bomba controlada MilRoyal, Milton Roy Co., St. Petersburg, Fia. 33733, o equivalente.

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MÉTODOS NORMALIZADOS

concentraciones de intoxicante (véase sección 8010D.2a). Expónganse cinco ostras durante 48 horas a concentraciones de 100, 10, 1,0, 0,1 y 0,01 mg/l, para incluir el intervalo de concentraciones de intoxicante, requeridas para determinar la CE50. Puede ser necesario comprobar concentraciones más bajas. Prepárense y distribúyanse las ostras al azar, de modo que cada acuario de control y de ensayo contenga 20 individuos. Colóquense las ostras con la valva izquierda, en forma de copa, hacia abajo y los extremos anteriores de la charnela orientados en la misma dirección. Establézcase un acuario control, otro que sólo reciba disolvente del intoxicante, y otro para cada concentración tóxica. Al cabo de 96 horas, sáquense todas las ostras y mídanse los incrementos de las conchas. Dado que el depósito de la concha no es uniforme en la periferia, regístrese la longitud del «dedo» más largo de la concha nueva, con aproximación de 0,5 mm. 4) Cálculo: Calcúlese la relación entre el crecimiento medio en el grupo de ostras de la prueba con el crecimiento de los controles, para obtener un índice de porcentaje de respuesta. Para exposiciones de 96 horas, calcúlense las concentraciones que permiten un 50 por 100 de crecimiento relativo de las conchas y un 5 por 100 de crecimiento relativo de las conchas. 2.

Pruebas a largo plazo

a) Prueba de crecimiento de ostras: 1) Consideraciones generales: Las ostras crecerán desde el tamaño de puesta al de madurez sexual, en unos 3 ó 4 meses, en condiciones óptimas. Utilícense de 50 a 100 individuos para determinar los efectos crónicos. Los efectos tóxicos se pueden manifestar por acumulo de residuos químicos, cambios de resistencia a la enfermedad, o interferencia con la reproducción.

Evalúese el crecimiento de la ostra registrando sus aumentos de peso. Si se pesan bajo el agua, se pueden detectar los cambios día a día en el depósito de la concha10, l l . Para obtener datos significativos, límpiense las ostras cuidadosamente, eliminando toda la suciedad, organismos y detritus. No destruir la integridad de la concha antes de cada pesada. Compruébese que sus válvulas están cerradas cuando se exponen al aire, y que la concha no tiene burbujas de aire, cuando se pesan. Las pesadas pueden repetirse hasta precisión de 0,05 g y, en condiciones satisfactorias, una ostra de 15 g (peso bajo el agua) ganará 1 g semanal o más. Los efectos subletales pueden aparecer lentamente, por lo que será preciso ampliar la exposición12. 2) Procedimiento de ensayo: Colóquense ostras pequeñas (2 a 3 cm) aisladas, seleccionadas al azar entre una población de la misma edad aproximada, en acuarios suficientemente grandes para acomodar el crecimiento esperado. Suminístrense agua y tóxico como se describe en la prueba de depósito de 96 horas. Utilícese un mínimo de 5 l de agua de mar/hora/ostra. Selecciónese la concentración de intoxicante sobre la base de los datos de tolerancia en 96 horas (sección 8010D.2a). Pónganse grupos de 50 ostras en bandejas compartimentadas y poco profundas, para facilitar el manejo e identificación de los animales individuales. A intervalos semanales, sáquense las ostras, límpiense y manténganse sumergidas en el agua hasta pesarlas. Lávense los recipientes en ese momento. Pésense las ostras sumergidas individualmente, con una balanza de carga superior con sujeción para suspensión. Pésese con aproximación de 0,01 g. Regístrense los cambios de longitud de la concha en cada pesada. Expóngase un número adecuado de ostras de reserva en los grupos de control y de ensayo, que servirán como muestras secundarias pe-

MÉTODOS DE PRUEBA DE TOXICIDAD PARA ORGANISMOS ACUÁTICOS

riódicas para determinar los acúmulos de residuos y cambios histológicos. b) Pruebas de crecimiento de vieiras, almejas y mejillones: Se pueden realizar pruebas de crecimiento con vieiras de bahía, almejas y mejillones, similares a las descritas para ostras, si se toman medidas para cumplir sus requerimientos especiales.

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MÉTODOS NORMALIZADOS

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8610 D.

Comunicación y análisis de resultados

Excepto en el caso de estudios especiales, analícense los datos, calcúlense y co-

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MICROCRUSTÁCEOS

Los microcrustáceos son artrópodos con un papel muy importante en los ecosistemas acuáticos. Estos animales planctónicos se apoderan de otros más pequeños y sirven de alimento a muchos animales más grandes. La extremada diversidad de los microcrustáceos requiere un complejo esquema de clasificación. Muchos microcrustáceos exhiben un tipo interesante de ritmo circadiano, que son emigraciones verticales, reguladas normalmente por la luz. El movimiento típico es de ascensión hacia las aguas superficiales en las horas de la tarde, y descenso de nuevo a las aguas más profundas a otras horas, con excepción de cierto movimiento hacia arriba alrededor del amanecer. El contenido en carbono de una gran variedad de zooplancton oscila entre 30 y 40 por 100 aproximadamente de su peso seco, y los valores de nitrógeno y

8711

fósforo suelen estar entre el 5 y 10 por 100, y 0,5 y 1 por 100 respectivamente1. El cladócero de agua dulce, Daphnia, conocida comúnmente como pulga de agua, se usa como organismo de ensayo de toxicidad de agua dulce (véase sección 8711). Pertenece a la subclase Branchiopoda, de la clase Crustáceos. El copépodo marino, Acartia tonsa, que pertenece a la subclase Ostracoda, se usa para probar los efectos de los intoxicantes en el medio marino (véase sección 8712). Existen métodos más nuevos a corto plazo, para estimar la toxicidad crónica, que aún no se han incorporado a este texto. Referencia 1. PARSONS, T. R., M. TAKAHASHI & B. HARGRAVE. 1984. Biological Oceanographic Processes. Pergamon Press, Oxford, Inglaterra.

PROCEDIMIENTOS DE PRUEBA DE TOXICIDAD PARA DAPHNIA * 8711 A.

Dado que no hubo acuerdo en la resolución de diferencias importantes de la 17.a edición, se incluye aquí el texto de la 16.a. Existe un proyecto con cambios sustanciales. 1.

muníquense los resultados como se describe en la sección 8010G.

Consideraciones generales

Daphnia se ha utilizado en estudios de tolerancia durante más de un siglo.

Introducción Los resultados obtenidos por diferentes investigadores utilizando Daphnia son comparables, y en general Daphnia es menos tolerante que los peces a las sustancias tóxicas. Daphnia magna es la mayor de las especies y alcanza un tamaño máximo de más de 5 mm. Se pueden criar en gran cantidad, en espacios relativamente pequeños. Las recién nacidas miden 0,8 a

MÉTODOS DE PRUEBA DE TOXICIDAD PARA ORGANISMOS ACUÁTICOS

1,0 mm de largo y se pueden observar sin ayudas ópticas. Esta fase es la más usada para estudios de tolerancia. Otras especies menores que D. magna y D. pulex pueden necesitar una manipulación especial. Se sabe que las hembras de D. magna viven hasta 4 meses a 20 °C. Se han cultivado en aguas naturales y en agua de grifo desclorada. Se alimenta de bacterias, algas y levaduras, junto con extractos del suelo y materiales orgánicos como harina de semilla de algodón, harina de arenque, hierba seca en polvo, gránulos de alevines de trucha enriquecidos. El cultivo de Daphnia se ha hecho individualmente en recipientes pequeños y masivamente en grandes acuarios2-6. La reproducción puede limitarse a producir hembras por partenogénesis diploide cuando se mantienen condiciones de cultivo adecuadas, asegurando así un suministro de animales experimentales cuya variabilidad genética se limita a la heterocigosis del padre7. Es de esperar la uniformidad genética dentro de clones partenogenéticos procedentes de una sola hembra8. Cuando las condiciones de cultivo son óptimas, la hembra de D. magna libera las primeras crías en 10 días a 20 °C, y en 7 días a 25 °C. A partir de entonces, las crías son liberadas cada 3 ó 4 días a 20 °C y cada 2 ó 3 días a 25 °C. Se producen 20 ó más crías por

* Aprobado por el Standard Methods Committee, 1981.

8711 B.

8-95

puesta, siempre que las condiciones de cultivo se mantengan adecuadas. Una sola hembra puede producir hasta 400 crías durante su vida. 2.

Referencias

1. K EMP , H. T., J. P. A BRAMS & R. C. O VER BECK . 1971. Water Qualíty Criteria Data Book Vol. 3. Effects of Chemicals on Aquatic Life, Selected Data from the Literature through 1968. Environmental Protection Agency, Water Pollution Center Res. Ser. 18050GWV05/71, U.S. Government Printing Off., Washington, D.C. 2. NEEDHAM. J. G., P. S. GALTSOFF, F. E. LUTZ & P. S. WELCH . 1937. Culture Methods for Invertebrate Animals. Comstock Publ. Co. Reprinted by Dover Publ., Inc., Nueva York. 3. N AUMANN , E. 1933. Daphnia magna Straus ais Versuchstier. Kgl. Fysiogr. Sallsk. Lund Forhandl. 3:15. 4. A NDERSON , B. G. 1944. The toxicity thresholds of various substances found in industrial wastes as determined by the use of Daphnia magna. Sewage Works J. 16:1156. 5. PARKER, B. L. & J. E. DEWEY. 1969. Further improvements on the mass rearing of Daphnia magna. J. Econ. Entornol. 62:725. 6. B IESINGER , K. E. & G. M. C HRISTENSEN . 1972. Effects of various metals on survival, growth, reproduction and metabolism of Daphnia magna. J. Fish. Res. Board Can. 29:1691. 7. BACCI , G., G. C OGNETTI & A. M. VACCARI . 1961. Endomeiosis and sex determination in Daphnia pulex. Experientia 17:505. 8. HEBERT , P. P. & R. D. WARD . 1972. Inheritance during parthenogenesis in Daphnia magna. Genetics 71:639.

Selección y preparación de organismos de prueba

1. Obtención de organismos de ensayo

Obténgase Daphnia de cultivos establecidos o por recogida en su habitat. Aunque puede servir la de cualquier

edad disponible, es más adecuado usar animales recién nacidos que los más viejos. Cuando se crían a 20 °C, sufren la primera ecdisis unas 30 horas después de liberados de la cámara de puesta; a 25 °C, sucede a las 20 horas aproximada-

8-96

MÉTODOS NORMALIZADOS

mente. Los neonatos pueden ser segregados a partir de animales de reserva, a intervalos de 24 horas, cuando se crían a 20 °C, y de 12 horas cuando es a 25 °C. Los neonatos son menos tolerantes para muchas sustancias que los animales más viejos. Daphnia es más susceptible a la mayor parte de las sustancias en la ecdisis que entre mudas. 2.

Cultivo

Uno de los medios más sencillos es el de suelo-estiércol1, 2 con suplementos periódicos de levadura. Prepárese este medio mezclando 5 g de estiércol seco de oveja, 25 g de tierra de jardín o mantillo arenoso, y 1 l de agua de estanque, fuente o grifo. Déjese reposar 2 días a temperatura ambiente, y fíltrese a través de una pieza de tela de 0,15 mm de apertura de malla aproximadamente, obligando a las partículas más finas a atravesarla. Déjese el filtrado en reserva durante 1 semana o más y deséchese el sedimento. El medio final se prepara mezclando 1 parte del filtrado con 6 a 8 partes de agua de estanque, fuente, o del grifo desclorada. El filtrado original puede mantenerse indefinidamente antes de preparar el medio final. El medio final se utiliza para cultivo individual o en masa. Para el individual, añádanse 100 ml de medio a botellas de vidrio duro y boca ancha, o recipientes equivalentes, inoculando con un dáfnido por botella. Empezando un día después de la inoculación, añádase 1 ml de una suspensión que contenga 1 mg de levadura activa seca en agua, para cada botella, en días alternos. Para el cultivo en masa, empléense jarras de vidrio de boca ancha, con el de medio, al que se añade una suspensión de 30 mg de levadura activa seca, en días alternos. Una vez se han iniciado los cultivos, no se debe cambiar el medio, pero de vez en cuando se añadirá agua para sustituir las pérdidas por evaporación, así como al sacar a las

crías. Para retrasar la evaporación, utilícese una tapa perforada que permita la difusión de aire. No hace falta la aireación porque el OD crítico para Daphnia es inferior al 15 por 100 de saturación a 20 °C. Con una reserva de 100 hembras criadas individualmente, se pueden obener 300 neonatos diarios. Cuando esas hembras de reserva empiezan a reproducirse, se deben eliminar las crías periódicamente, preferiblemente cada 24 horas a 20 °C, o cada 12 horas a 25 °C. Cuando los animales de reserva llegan a la vejez y decae su tasa reproductora, sustitúyanse por hembras jóvenes, en medio reciente. También se han utilizado con éxito otros métodos de cultivo, como los que utilizan algas3. Biesinger y Christensen4 han desarrollado un medio consistente en una suspensión de 0,5 g de polvo de hierba seca* y 10 g de gránulos de alevín de trucha enriquecidos, en 250 ml de agua no contaminada de lago, fuente o río, mezclada enérgicamente con una batidora durante 5 minutos. Fíltrese la suspensión por un tamiz de acero inoxidable con apertura aproximada de 0,066 cm, y añádanse otros 50 ml de agua para lavar la batidora. Refrigérese la suspensión. Antes de tomar una parte, mézclese bien. Utilícese como alimento en la proporción de 1 ml/semana/l.

3.

Referencias

1.

A NDERSON , B. G. 1944. The toxicity thresholds of various substances found in industrial wastes as determined by the use of Daphnia magna. Sewage Works J. 16:1156. 2. ANDERSON, B. G. 1950. The apparent thresholds of toxicity to Daphnia magna for chlorides of various metals when added to Lake Erie water. Trans. Amer. Fish. Soc. 78:96. * Cerophyll, Cerophyll Laboratories, Inc. 4722 Broadway, Kansas City, Mo. 64111, o equivalente.

MÉTODOS DE PRUEBA DE TOXICIDAD PARA ORGANISMOS ACUÁTICOS

3. 4.

PARKER, B. L. & J. E. DEWEY. 1969. Further improvements on the mass rearing of Daphnia magna. J. Econ. Entomol. 62:725. B IESINGER , K. E. & G. M. C HRISTENSEN .

8711 C. 1.

8-97

1972. Effects of various metals on survival, growth, reproduction and metabolism of Daphnia magna. J. Fish. Res. Board Can. 29:1691.

Procedimientos de ensayo de toxicidad

Pruebas estáticas

a) Montaje de las pruebas: Prepárense los materiales de prueba, agua de dilución, soluciones de intoxicante, como se describe en las secciones 8010F.2 y 3. Selecciónense las concentraciones de ensayo como se describe en la sección 8010F.3b. Prepárense soluciones de ensayo y control en cantidades de 100 ml, en botellas de vidrio duro de boca ancha, de 125 ml, o recipientes equivalentes. b) Realización de las pruebas: Tras preparar las soluciones de ensayo, separar Daphnia neonatos liberados desde las cámaras de puesta de sus madres, durante las 24 horas previas, a 20 °C, o 12 horas a 25 °C, y recójanse en un recipiente. Lávense en tres cambios de diluyente, dejando 5 minutos cada solución de lavado para reducir el arrastre de materiales. Introdúzcanse 10 neonatos en cada recipiente de ensayo y control. Empléese una pieza de tubo de vidrio de 8 mm y 200 cm de largo, con uno de sus extremos estirado hasta un diámetro de 2 mm, y el otro pulido al fuego y acoplado a una pera de goma de 2 ml de capacidad, para recoger y trasladar los neonatos. Utilícese un tubo idéntico con los dos extremos acabados al fuego y con peras de goma adaptadas, para manipular a los adultos. Tras introducir los neonatos en las soluciones de ensayo, obsérvense regularmente, 1, 2, 4, 8 y 16 horas después, y luego a diario. Regístrese el número de animales móviles en cada recipiente de ensayo. Se considera un animal inmóvil al que no presenta movimiento independiente, incluso cuando se gira el recipien-

te de ensayo. Los animales inmóviles no están necesariamente muertos. En concentraciones límite de algunas sustancias como etanol, acetona y clorobutanol, los animales pueden no tener movimiento y su corazón haber dejado de latir, pero pueden recuperarse al pasarlos al agua de dilución. Sin embargo, si esos animales se mantienen en el medio de ensayo, morirán. Continúense las observaciones durante 5 días o mientras los animales de alguna solución de ensayo permanezcan móviles. Háganse las pruebas por triplicado. No alimentar a los animales durante las pruebas. D. magna vivirá hasta una semana sin alimento, en soluciones salinas bien equilibradas1. Otras especies, y en pruebas a más largo plazo, requerirán modificaciones de las condiciones estándar.

2.

Pruebas a largo plazo

a) Determinación de alteraciones reproductivas: La reproducción se puede alterar a concentraciones del intoxicante muy inferiores a las que producen toxicidad aguda, a veces tan bajas como 0,00003 de las productoras de toxicidad aguda. Realícense, antes de estas pruebas, las de tolerancia aguda, para establecer la concentración máxima a utilizar. b) Preparación del medio de prueba: Prepárese el medio de ensayo del mismo modo que el normal para cultivo, excepto en el agua, que será representativa de la que recibe la descarga de efluente. Pre-

8-98

MÉTODOS NORMALIZADOS

párese una serie de 6 a 10 cantidades de 1 l de medio al que se han añadido cantidades graduales de intoxicante. Utilícese como concentración máxima de intoxicante el equivalente de CL50 o CE50 a las 96 horas. Redúzcase cada concentración sucesiva en progresión geométrica por un factor de 3 o más, en los experimentos preliminares. Como control se empleará el medio de cultivo sin diluir. Distribúyase cada litro de medio de ensayo en cantidades de 100 ml a cada una de 10 botellas. c) Realización de las pruebas: Sepárense y recójanse los Daphnia neonatos como en los ensayos estáticos. No hay que lavar los animales. Introdúzcase un neonato en cada botella. Al día siguiente y después en días alternos, añádase 1 ml de suspensión conteniendo 1 mg de levadura seca activa a cada botella. Háganse observaciones diarias y anótense los animales muertos o inmovilizados. Al crecer y reproducirse los animales, sáquese a los jóvenes y anótese su número. Sustitúyase el agua perdida. Continúense las observaciones hasta que los animales control hayan liberado al menos seis puestas de crías, lo que supondrá unos 21 días a 25 °C y 30 días a 20 °C. Manipúlense los animales como cultivos individuales o animales de reserva. Al final del período de observación,

8711 D.

analícense los resultados y compruébese la significación de las diferencias en el número de crías producidas. Anótese el tiempo de aparición de las primeras crías y el número de puestas. Si el número de crías producidas en la concentración más baja del tóxico difiere significativamente del de los controles, repítase el ensayo con concentraciones reducidas de intoxicante, hasta que las diferencias no sean significativas. Tras lograr concentraciones de intoxicantes donde no se observen diferencias entre controles y ensayos, en cuanto al número de crías y puestas, y en el tiempo de aparición de las primeras crías, hágase una serie final de ensayos con 30 o más animales en cada una de las cuatro concentraciones de intoxicante que incluyan aproximadamente la concentración más baja para la que se encontraron diferencias significativas en la producción de crías. Empléese un número igual de animales para el control. 3.

Referencia

1. S TAMPER, W. R. 1969. The determination of the optimal combination of concentrations of sodium, potassium, calcium and magnesium chlorides for the survival of Daphnia pulex. Ph. D. thesis, Pennsylvania, State Univ.

Evaluación y comunicación de resultados

Prepárense, analícense, evalúense y comuníquense los datos como se describe en la sección 8010G.

MÉTODOS DE PRUEBA DE TOXICIDAD PARA ORGANISMOS ACUÁTICOS

8-99

8712 PROCEDIMIENTOS DE PRUEBA DE TOXICIDAD PARA EL COPÉPODO CALANOIDE ACARTIA TONSA (DANA)* 8712 A. Este método proporciona datos sobre los efectos de los intoxicantes sobre un

* Aprobado por el Standard Methods Committee, 1988.

8712 B.

Introducción copépodo marino, Acartia tonsa. Utilícense los procedimientos generales descritos en las secciones 8010D, E y F. A. tonsa es sensible, por lo que se debe manipular con cuidado y sólo cuando sea preciso.

Selección y preparación de organismos de ensayo

1. Recolección y mantenimiento de los organismos de ensayo

a) Recolección: Recoléctese A. tonsa por arrastre (≥4 km/h) de una red de plancton (abertura de 150 a 250 µm) a una profundidad de 1 a 3 m. Pásense los animales cuidadosamente, vertiéndolos a recipientes aislados, llenos en sus tres cuartas partes con agua de mar ambiente. Elimínense los predadores inmediatamente, en especial las medusas y ctenóforos. No debe superarse una densidad de copépodos de 250/l, para asegurar que la concentración de OD se mantiene adecuada. Mídanse y regístrense la temperatura, salinidad, OD y pH en el momento de la obtención y manténganse esas condiciones durante las fases iniciales de retención. b) Retención: Inmediatamente de la llegada al laboratorio, trasládense las muestras a cristalizadores de vidrio al borosilicato, de 2,3 l (190 x 100 mm). Ajústese el volumen de agua en cada recipiente a 2 l con agua de mar filtrada, a temperatura y salinidad ambiente, y añádase la dieta algal para copépodos adultos descrita en el siguiente apartado 2b, en cantidad necesaria para obtener la densidad de organismos mencionada en

la tabla 8712:I. Incúbense los cultivos a temperatura de recolección, iluminados como se describe en la sección 8010F.3f. Al cabo de 24 horas, empiécense a aclimatar los cultivos a 20 °C y con 20 g/kg de salinidad. Cámbiense la salinidad y temperatura con incrementos de 3 g/kg y 3 °C/d. Si los organismos se mantienen en el recipiente original durante la aclimatación, quítese con sifón y añádase, alternativamente, agua de mar de diferente salinidad. Trasládense los organismos por vertido cuidadoso, con la pipeta, o con sifón (empleando tubo de 1 cm de DI), a nuevos recipientes. Durante la aclimatación, manténgase un programa de alimentación diaria que proporcione la densidad de algas enumerada en la tabla 8712:I. c) Selección e identificación: Para información básica sobre la taxonomía y biología de Acartia, y otros calanoides costeros, consúltense otras fuentes2-7. Sepárese A. tonsa de otros organismos recolectados en el arrastre. Para facilitar la captura de copépodos, redúzcase el volumen de cultivo de 2,0 l a 0,5 l por sifonado lento del agua de mar, con un tamiz de red de plancton de 150 µm sobre la entrada del sifón. Sáquense cuidadosamente los individuos adultos con

8-100

una pipeta de luz amplia (≥2 mm) y colóquense en portaobjetos con rebajado. Identifíquense y pásense a agua de mar filtrada, enriquecida con alimento, hasta 20 g/kg de salinidad, a 20 °C [véase apartado 2a 1) y sección 8010E.4c, b]. Exclúyanse todos los nauplios y formas juveniles. d) Suministro de agua: 1) Agua natural: Recójase suficiente agua de mar para realizar las pruebas. Ésta, cuando se ajuste a 20 g de salinidad/kg y 20 °C, debe soportar la supervivencia de A. tonsa adultos, durante un mínimo de 96 horas, el ciclo vital completo del copépodo, y, una vez enriquecida adecuadamente, el crecimiento de algas alimenticias. Utilícense toma-muestras de Niskin o Van Dorn y recójase el agua de mar de 3 a 10 m de profundidad. Regístrense la salinidad, OD y pH. Transpórtese el agua de mar recogida al laboratorio, en bombonas de vidrio o polietileno, envejecidas en agua de mar. Fíltrese a través de filtros lavados con ácido de 1,0 µm (fibra de vidrio, acetato de celulosa, nailon, o policarbonato). Lávense los recipientes con agua desionizada, llénense con agua de mar filtrada, y consérvese a 4 °C. 2) Agua de mar artificial: Si no se dispone de agua de mar natural adecuada, utilícese la formulación sintética descrita en la sección 8010E.4b2). Heinle7 ha conseguido un agua de mar comercial*, adecuada para el cultivo de A. tonsa y Eurytemora affinis. Los ensayos de algas indican que este producto es inadecuado para pruebas que incluyan metales pesados; sólo se utilizará para cultivo hasta que se disponga de datos comparativos amplios.

* Instant Ocean®, suministrada por Aquarium Systems, Inc., 1450 East 298th St., Wicklifle, Ohio 44092.

MÉTODOS NORMALIZADOS

2.

Cultivo de organismos de ensayo

a) Producción de alimento para organismos de ensayo: 1) Medio de cultivo para algas: Véase sección 8010E.4c1)b). 2) Cámaras de cultivo: Cultívense las algas en tubos de ensayo estándar con tapón a rosca, matraces o en el sistema semicontinuo de llenado y vaciado que se describe más adelante. 3) Cultivo y recolección de algas para alimento: Cultívense las algas para alimentar a los copépodos y otro zooplancton, en agua de mar natural filtrada o sintética, con 20 g de salinidad/kg y a 20 °C, con 2.500 a 5.000 lux de iluminación continua, durante 14 horas de luz de día y 10 horas de oscuridad (14L:10O). Utilícense los nutrientes enriquecidos de Guillard y Ryther8. Distribúyase el agua de mar enriquecida [véase sección 8010E.4c1)b)] en tubos de ensayo con tapa de rosca (50 ml) o matraces erlenmeyer. Tras una esterilización en autoclave de 15 minutos a 108 kPa y 121 °C, enfríese y equilíbrese con los gases atmosféricos durante 48 horas. Compruébese la esterilidad como se describe en la sección 8010E.4c1)a). El sistema recomendado para cultivar las algas (figura 8712:1) es del tipo llenado-vaciado, en que los cultivos se mantienen próximos a su densidad celular de fase log y tasa de crecimiento máximos. Sáquense medio y organismos y sustitúyanse por medio fresco, de modo que el cultivo alcance la misma densidad celular en 24 horas. Cuando se produzcan intervalos entre recolecciones, superiores a 24 horas, sáquense y sustitúyanse cantidades de cultivo proporcionalmente mayores. Auméntese o redúzcase la escala de este sistema, dependiendo de las necesidades de alimento. Manténgase simultáneamente una serie de tubos de cultivo de cada uno de los cuatro alimentos de algas, por si hubiera contaminaciones en los cultivos grandes.

MÉTODOS DE PRUEBA DE TOXICIDAD PARA ORGANISMOS ACUÁTICOS

8-101

Figura 8712:1. Sistema de cultivo algal.

dor electrónico de partículas es un método rápido y exacto para determinar densidades de algas unicelulares. Si fueran necesarios recuentos visuales, relaciónense con la absorbancia específica a 750 nm con un espectrofotómetro (véase sección 8111G.4). Una curva que relacione las células por mililitro con la absorbancia puede sustituir al recuento celular. b) Cultivo en masa de los organismos de prueba: Este sistema proporciona grandes cantidades de A. tonsa de edad estándar, para las pruebas.

Figura 8712:2. Aparato para cultivo masivo de copépodos (estático).

Determínense las densidades de células algales por recuento microscópico directo, empleando un hemacitómetro, cámara de Palmer-Maloney, o de Utermohl (microscopio invertido)9, 10. Un conta-

1) Cámaras de crecimiento: Empléense unidades de cultivo en masa de Mullin y Brooks11 y Frost12. El recipiente para cultivo de la figura 8712:2 es un frasco aspirador de vidrio de borosilicato, con Capacidad de 13 a 45 1, dependiendo del número de copépodos necesario. Mézclese suavemente el contenido con un motor de poca velocidad (25 rpm) y una varilla agitadora montada sobre el recipiente de cultivo. La mezcla lenta

8-102

MÉTODOS NORMALIZADOS

Figura 8712:3. Aparato para cultivo masivo de copépodos (fluyente).

mantiene el alimento algal en suspensión, donde los copépodos planctónicos suelen alimentarse. Manténgase un movimiento suave en el agua, sin los remolinos que suelen producir los agitadores magnéticos. Utilícese luz fluorescente fría que suministre 1.000 lux incidentes en la superficie del cultivo, en un ciclo de 14L:100. Utilícese alternativamente un sistema de flujo continuo (figura 8712:3). Acóplese a un recipiente cilíndrico (15 a 40 1) un tubo vertical y un desagüe. Rodéese el cuello del tubo vertical con malla de plástico t de 200 µm, para evitar la pérdida de huevos y nauplios. Móntese un motor de poca velocidad (≤ 25 rpm) con agitador, sobre el recipiente de cultivo. Añádase agua de mar filtrada con una bomba peristáltica o sifón, desde un tanque de nivel constante a razón de 1 a 3 volúmenes de tanque/24 horas. Ali-

méntese con la mezcla de cuatro especies de algas (tabla 8712:I) en un solo recipiente e introdúzcase en las cámaras de cultivo con una bomba (figura 8712:3) en la proporción necesaria para mantener una densidad celular de 2 a 5 x 107 células/l. Póngase la varilla agitadora en el recipiente de cultivo, de modo que el 25 por 100 inferior del mismo sólo reciba un mezclado suave. Así se logra una zona tranquila de apareamiento y puesta de huevos, y se mantiene el sedimento sin agitación, evitando la obstrucción de la malla. Drénese y límpiese el sistema cada 3 ó 4 semanas. Cepíllese la malla diariamente con un cepillo fino, para evitar obstrucciones. 2) Dieta de algas para copépodos: Aunque se han usado varias dietas de algas para cultivo de copépodos10, 13-15, empléese la que se da en la tabla

MÉTODOS DE PRUEBA DE TOXICIDAD PARA ORGANISMOS ACUÁTICOS

8-103

TABLA 8712:I. COMPOSICIÓN DE LA DIETA ALGAL Y CONCENTRACIONES RECOMENDADAS PARA 1 ALIMENTACIÓN DE ADULTOS, NAUPLIAR Y PARA PUESTA DE HUEVOS

Figura 8712:4. Jaula de generación (según Heinle).

8712:I. Se ha añadido Skeletonema costatum debido a que es un alimento natural para A. tonsa. 3) Establecimiento de cultivos de organismos de ensayo: Las hembras de A. tonsa son capaces de producir más de 30 huevos por día, cada una, cuando se alimentan con la ración recomendada. Si se mantienen para criar 250 o más hembras grávidas, teóricamente se obtendrán más de 4.000 huevos en 24 horas. Para ese número potencial de adultos, utilícese un recipiente de cultivo de 40 1. Generalmente la relación entre volumen de cultivo y densidad de organismos es de 10:1. Para producción y obtención de huevos de copépodos, empléense jaulas de generación (figura 8712:4) consistentes en † Nitex o equivalente.

un cilindro transparente de plástico acrílico, de 125 mm de diámetro y 90 mm de altura, con un extremo cubierto por red de plancton de 250 µm de abertura de malla. Colóquese este cilindro en un cristalizador de 2,3 l (190 x 100 mm) con el extremo cubierto a 25 mm del fondo. Añádanse 2 l de agua de mar filtrada o artificial, y colóquense de 50 a 100 hembras grávidas en cada cilindro con fondo de malla. Aliméntense tres veces con la dieta de algas para adultos (tabla 8712:I). La red de plancton permite el paso de los huevos, que se abren en el cristalizador, donde quedan protegidos de la depredación de los adultos. Al cabo de 24 horas, sáquense los adultos levantando con cuidado cada jaula de generación desde el cristalizador y sumergiéndolas rápidamente en otra que contenga tres veces la densidad usual de alimento. Sáquese con cuidado, por sifonado, el agua de mar que queda en los cristalizadores que contienen los huevos y nauplios, y llévese a un frasco aspirador de vidrio, que contenga agua de mar filtrada. Ajústese el volumen final y aliméntese el cultivo nauplioide como se indica en la tabla 8712:I. Si se desea una segunda masa de cultivo, repítase al cabo de 24 horas, utilizando el número necesario de jaulas de generación para producir los organismos requeridos. La duración media de cada fase de desarrollo en el ciclo vital de A. tonsa, a 20 °C y 20 g/kg, es la siguiente:

8-104

Durante los primeros 6 días de cultivo masivo, sólo se presentan fases naupliares. Aliméntense diariamente con 2 x x 106 células/l. El tercer y séptimo día, sáquese lentamente, por sifón, un 50 por 100 del medio de cultivo y sustitúyase por medio limpio. Tápese el extremo de entrada del sifón con red de 60 µm para evitar la pérdida de nauplios. Tras el séptimo día, los copepodites deben estar presentes. A partir de entonces, aliméntense con 2 x 107 células/l/d, sustituyendo el 50 por 100 del volumen de cultivo por agua de mar filtrada, cada 3 días. En 16 ó 17 días, la población habrá alcanzado la madurez y se puede usar para pruebas o para iniciar nuevos cultivos. La vida adulta media a 20 °C es de unos 30 días. Manténgase un cultivo masivo, sin edad estandarizada, como reserva. Utilícense hembras grávidas de las jaulas de generación originales para iniciar un sistema de 12 l. Aliméntense con la ración de adultos y sustitúyase el 50 por 100 del agua de cultivo cada 3 días. Además se recogerá aproximadamente un tercio del cultivo, incluyendo los organismos, periódicamente (10 a 14 días) para mantener la población en unos 50 adultos y copepodites. 4) Recolección de organismos de prueba: Recoléctense cultivos masivos de copépodos que hayan alcanzado la fase adulta, como sigue: Redúzcase un 75 por 100 el volumen de cultivo, usando un sifón lento con su entrada protegida por red de plancton de 60 µm. Pásese cuidadosamente el 25 por 100 restante, incluyendo organismos, a cristalizadores de vidrio de borosilicato de 2,3 1, para obte-

MÉTODOS NORMALIZADOS

ner un volumen total de 2 l/placa. Debido a la fragilidad del organismo, no se debe estrechar el tubo de descarga para reducir el flujo; contrólese mejor por medio del tubo ventral de la botella aspiradora (figura 8712:2), reduciendo la distancia entre el recipiente de cultivo y el cristalizador. Un flujo lento reduce la turbulencia al mínimo, así como la oportunidad de que los organismos choquen con las paredes del recipiente. Auméntese la concentración de los animales recolectados en los cristalizadores, sacando medio de cultivo mediante sifón. Facilítese su captura aprovechando la respuesta fototáctica de los animales. 5) Otros organismos: El sistema de cultivo diseñado para A. tonsa ha funcionado bien con Eurytemora affinis y Pseudodiaptomus coronatus. Sin embargo, las jaulas de generación sólo son adecuadas para A. tonsa porque libera los huevos individualmente. Tanto E. affinis como P. coronatus producen sacos de huevos.

3. 1. 2.

3. 4.

5.

6.

7.

Referencias WILSON, D. F. & K. K. PARRISH. 1971. Remating in a planktonic marine calanoid copepod. Mar. Biol. 9:202. CONOVER, R. J. 1956. Oceanography of Long Island Sound, 1952-1954. VI. Biology of Acartia clausi and A. tonsa. Bull. Bingham Oceanogr. Coll. 15:156. H EINLE , D. R. 1966. Production of a calanoid copepod Acartia tonsa, in the Patuxent River Estuary. Chesapeake Sci. 7:59. HEINLE, D. R. 1969. Effects of Temperatura on the Population Dynamics of Estuarine Copepods. Ph. D. thesis, Univ. Maryland, College Park. WILSON, C. B. 1932. The Copepods of the Woods Hole Region. Massachusetts. Smithsonian Inst., U.S. National Museum Bull. R OSE , M. 1933. Faune de France. n.° 26. Copepodes Pelagiques. Librarie de la Faculté des Sciences, Reprinted 1970 by Kraus Reprint, Nendeln, Lichtenstein. H EINLE , D. R. 1969. Culture of calanoid

MÉTODOS DE PRUEBA DE TOXICIDAD PARA ORGANISMOS ACUÁTICOS

copepods in synthetic seawater. J. Fish. Res. Board Can. 26:150. 8. G UILLARD , R. R. & J. H. R YTHER . 1962. Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt and Detonula confervacia (Cleve) Grant. Can. J. microbiol. 8:229. 9. PALMER, C. M. & T. E. MALONEY, 1954. A new counting sude for nannoplankton. J. Amer. Soc. Limnol. Oceanogr., Spec. Publ. 21:1. 10. SCHWOERBEL , J. 1970. Methods of Hydrobiology. Pergamon Press, Nueva York. 11. MULLIN, M. M. & E. R. BROOKS. 1967. Laboratory culture, growth rate and feeding behavior of a planktonic marine copepod. J. Amer. Soc. Limnol. Oceanogr. 12:657.

8712 C.

Pruebas para buscar el intervalo

Utilícense 10 Acartia adultas por replicado, con tres duplicados por concentración y control. Como recipiente de ensayo, utilícese una vasija de fondo plano, de vidrio borosilicato, conteniendo 100 ml de agua de mar con ≥2,0 cm de profundidad. Se utilizará generalmente un amplio intervalo de concentraciones (véanse secciones 8010F.3b y 8010D.2a). Prepárense soluciones intoxicantes como se describe en la sección 8010F.2b. Tómense 10 Acartia adultas para cada cámara de prueba, a partir de cultivos de reserva, con una pipeta de luz amplia, y pásense a un vaso de 20 ml conteniendo 5 ml de agua de mar filtrada. Ajústese el volumen final a 15 ml. Añádanse los animales y 15 ml de medio a 85 ml de medio con intoxicante en la cámara de prueba,

8712 D.

12. FROST, B. W. 1972. Effects of size and concentration of food particles on the feeding behavior of the marine planktonic copepod Calanus pacificus. J. Amer. Soc. Limnol. Oceanogr. 17:805. 13. ZILLIOUX, E. J. & D. F. WILSON. 1966. Culture of a planktonic calanoid copepod through multiple generations. Science 151:996. 14. KATONA, S. K. 1970. Growth characteristics of the copepods. Eurytemora affinis and E. herdmani in laboratory cultures. Helgolander wiss. Meeresunters 20:373. 15. NASSOGNE, A. 1970. Influence of food organisms on the development and culture of pelagic copepods. Helgolander wiss. Meeresunters 20:333.

Procedimientos de pruebas de toxicidad

Efectúense ensayos a corto plazo con A. tonsa y método de cultivo descrito. 1.

8-105

sumergiendo el vaso y lavándolo suavemente. Expónganse durante 96 horas. Obsérvese y regístrese el número de copépodos muertos, moribundos y vivos al cabo de 1,5, 3, 6, 12, 24, 72 y 96 horas de exposición. Para comprobar si un animal inmóvil está muerto, tóquese cuidadosamente con un capilar de vidrio. Si la mortalidad en los testigos supera el 15 por 100, rechácense los resultados. 2.

Pruebas definitivas a corto plazo

Síganse las condiciones generales de cultivo y manipulación en la forma descrita en las secciones 8010E y F. Ensáyense específicamente 15 adultos de cada cuatro recipientes repetidos por concentración de intoxicante y control. Selecciónense las concentraciones de intoxicantes de ensayo tal como se describe en la sección 8010F.3b». Expónganse los animales y reúnanse los datos, como se describe en las secciones 8010D y F.

Evaluación e información sobre resultados

Realícense los cálculos, preséntense datos y analícense y exprésense los resul-

tados tal como se ha descrito en la sección 8010G.

MÉTODOS NORMALIZADOS

8-106

8720

PROCEDIMIENTOS DE ENSAYOS DE TOXICIDAD PARA MACROCRUSTÁCEOS* 8720 A.

Los crustáceos constituyen un amplio grupo de organismos, la mayoría de ellos marinos. La clase, Crustáceos, abarca más de 25.000 especies agrupadas en dos subclases, Entomostráceos y Malocostráceos. Muchos de los entomostráceos más pequeños, los copépodos y cladóceros, son comúnmente conocidos como microcrustáceos y forman parte del macroplancton tanto en agua salada como dulce. En las secciones 8710 a 8712 se dan métodos de ensayo de toxicidad para los microcrustáceos. La subclase Malocostráceos comprende los crustáceos más grandes y económicamente importantes. Aunque la mayoría son marinos, existen algunas formas de agua dulce importan* Aprobado por el Standard Methods Committee, 1988.

8720 B.

Introducción tes. En la familia de los misidáceos, el Mysis relicta de los Grandes Lagos es un alimento importante de salmónidos. El orden Anfípodos, con más de 3.000 especies, es casi exclusivamente marino, pero tiene especies de agua dulce importantes del género Hyalella, Gammarus, Crangonyx y Pontoporeia. El orden Isópodos es también casi exclusivamente marino, aunque existen unas cuantas formas de agua dulce. El orden de los Decápodos es de gran importancia económica, comprendiendo langostas, bogavantes, cangrejos, camarones, gambas y cangrejos de río. Los crustáceos están relacionados con la determinación de la toxicidad de pesticidas en ambientes acuáticos debido a su relación filogénica con los insectos para cuyo control han sido desarrollados muchos pesticidas.

Selección y preparación de especies de prueba

1. Selección de organismos de ensayo

En 8010E.1 se describen los principios generales que gobiernan la selección de los organismos de ensayo. Se sugieren los siguientes organismos de ensayo: Especies de agua dulce: Gammarus lacustris Gammarus pseudolimnaeus Gammarus fasciatus Hyalella azteca Pontoporeia affinis Mysis relicta Palaemonetes cummingi Palaemonetes kadiakensis Cangrejo de úo-Cambarus Potamobius Orconectes rusticus

Especies de aguas marinas y salobres: Palaemonetes pugio - camarón de hierba Palaemonetes vulgaris Palaemonetes intermedius Crangon septemspinosa - camarón de arena Penaeus duorarum - camarón rosa Penaeus aztecus - camarón pardo Penaeus setiferus - camarón blanco Homarus americanus - langosta americana Callinectes sapidus - cangrejo azul Cancer irroratus - cangrejo de roca Cancer borealis - cangrejo de Jonás Cancer magister - cangrejo de Dungeness Panopeus herbstii - cangrejo del fango

MÉTODOS DE PRUEBA DE TOXICIDAD PARA ORGANISMOS ACUÁTICOS

Rhithropanopeus harrisii - cangrejo del fango Menippe mercenaria - cangrejo de las piedras Identifíquense con precisión los animales de ensayo antes de emplearlos. La mayoría de los macrocrustáceos costeros de los Estados Unidos están clasificados y se dispone de claves regionales1-5. 2. Recogida y manipulación de los organismos de ensayo

Recójanse las formas más pequeñas en redes de inmersión o redes de plancton gruesas; utilícese una jábega de malla pequeña para capturar las formas cercanas a la costa. La mayoría de las formas marinas se pescan con arrastre. Véanse las secciones 10500B y 8010E.2 para los métodos de captura y transporte. 3. Mantenimiento, aclimatación y cultivo de organismos de ensayo

a) Suministro de agua: Véase sección 8010E.4b. b) Aclimatación, mantenimiento y conservación de cultivos de reserva: Véase sección 8010E.3 y 4. No existen grandes riesgos en la manipulación de crustáceos adultos ya que poseen un exoesqueleto rígido y una resistencia general. Tanto las formas adultas como las larvas de muchas especies practican el canibalismo y atacan con facilidad a sus congéneres en el estadio de cascara blanda. Manténganse las formas juveniles y adultas en compartimentos individuales en largas cubetas o tanques divididos. Los compartimentos se forman con separadores perforados que se deslizan a lo largo de ranuras en los lados. Utilícese acero inoxidable para las formas de agua dulce, y vidrio, material aerifico, plástico o madera contrachapada cubierta de fibra de vi-

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drio para las formas marinas. Se deben utilizar cubiertas rígidas y transparentes para evitar la pérdida de especímenes de gran movilidad. Utilícense separadores perforados para asegurar el flujo de agua a través de cada compartimento, eliminar productos metabólicos y proporcionar OD. El proceso de crecimiento de los crustáceos, que supone una exuviación periódica o desprendimiento periódico del exoesqueleto rígido, da lugar a una falta de uniformidad en los animales de ensayo que no es fácil de detectar por anticipado. En la etapa de pre-exuviación y durante la misma, los animales están sometidos a una gran tensión y son más sensibles a las condiciones ambientales insatisfactorias y a los tóxicos6. 1) Anfipodos: Recójanse los anfipodos de agua dulce de su habitat natural o cultívense en el laboratorio. Se han cultivado tres o más generaciones de algunas pocas especies. Manténganse varios cultivos de reserva y supleméntense por recogidas desde el habitat natural. En el laboratorio, se puede producir una nueva generación en aproximadamente 8 a 20 semanas, dependiendo de la especie y de la temperatura del agua7-9. Para el mantenimiento y para el ensayo, utilícese una temperatura favorable conocida y una intensidad luminosa de 540 a 1.600 lux en la superficie del agua. Los anfípodos recogidos desde su medio se deben mantener con sistemas de flujo continuo con temperaturas del agua inicialmente cercanas a las del agua de la que se han sacado. Esta temperatura se cambia gradualmente a la de ensayo. Manipúlense los animales de ensayo con mucho cuidado y lo menos posible. Utilícense pequeñas redes de inmersión que tengan un entramado flexible y sin proyecciones. Aliméntense los individuos jóvenes y los adultos con hojas de álamo, arce y abedul que han estado sumergidas en agua corriente durante varias semanas. Compruébese que las hojas están libres

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de pesticidas o de cualquier otro tóxico. Suminístrense hojas en cantidades suficientes para sostener una población estable, pero no hasta el punto que origine un agotamiento del OD o un crecimiento excesivo de hongos. Pónganse algunas hojas para que formen una cubierta todo el tiempo. Utilícese alimento comercial a base de pescado para suplementar la dieta de hojas. 2) Cangrejos de río: Obténganse especímenes de su habitat natural con reteles, jábegas o a mano (sección 8010E.2). Los procedimientos generales para mantener y aclimatar estos animales se dan en la sección 8O1OE.3 y 4. Como los cangrejos practican el canibalismo, manténganse todos ellos, salvo los estadios jóvenes, en compartimentos separados. Las cámaras de mantenimiento, aclimatación y cultivo adecuadas son de acero inoxidable, vidrio, madera recubierta de fibra de vidrio, o cubetas de plástico de 180 cm de largo, 30 cm de ancho y 20 cm de profundidad, con un divisor en el centro para hacer dos largas cubetas. Háganse pequeñas acanaladuras a los lados y en el divisor central cada 15 cm de manera que puedan deslizarse separadores en ellos para formar 12 compartimentos a cada lado, cada uno de los cuales será un cuadrado de aproximadamente 15 x 15 cm y 20 cm de profundidad. Este tamaño es adecuado para un cangrejo. El número y tamaño de los compartimentos depende del tamaño y el número de organismos que se van a ensayar. Si se quiere mantener un gran número de pequeños cangrejos, se quitan los separadores para hacer un depósito de la longitud deseada. Colóquense separadores con gran número de perforaciones de manera que funcionen como tamices. Contrólese la profundidad del agua en la cámara de ensayo por medio de una columna hidráulica en el último compartimento de la cubeta9. Cuando se limpian los separadores, éstos se elevan temporalmente una corta distancia del

MÉTODOS NORMALIZADOS

fondo para dejar que sean arrastrados con el lavado el exceso de alimento y los residuos, y se quita la columna hidráulica del último compartimento para que haya una corriente intensa. Límpiese, como rutina, empleando un sifón y un cepillo para desprender los materiales de los compartimentos, tamices, paredes y fondos. Suminístrese el agua ajustada a la temperatura y OD deseados a los dos compartimentos de cabeza empleando un sifón desde una caja de carga constante. Utilícese un flujo mínimo de 10 volúmenes de cubeta/día. Ajústese el volumen para mantener una calidad adecuada del agua en cada compartimento. La altura de agua requerida depende del tamaño del organismo, pero la preferida es de 15 cm. Provéase de una tapa transparente a cada juego de cubetas. Para estudiar el ciclo vital comenzando por los huevos o los individuos recién salidos de los huevos, se cogen hembras ovígeras y se colocan en cubetas atravesadas por una corriente en las condiciones del agua natural. Comiéncese la aclimatación a condiciones diferentes al cabo de 2 días. Manténganse los animales en la cubeta hasta que las crías salen de los huevos. Quítense los divisores de compartimentos para permitir la libertad de movimiento de las crías. Limpíese como se ha descrito en la sección 8010E.4d. Utilícese alimento de pescado macerado tanto para los animales adultos como para los jóvenes. Alternativamente, se puede emplear alimento de pescado seco preparado. Para las crías recién salidas de los huevos, empléense piezas de pescado muy finamente divididas y bolitas de alimento de pescado. 3) Cangrejos de mar: Se han realizado con éxito cultivos estáticos de larvas de cangrejos braquiuros de diversas especies de cangrejos de las costas del Atlántico10-13. Con estas especies, se han llevado a cabo bioensayos a largo plazo estáticos o con renovación14-16. Existen

MÉTODOS DE PRUEBA DE TOXICIDAD PARA ORGANISMOS ACUÁTICOS

informes sobre cultivo de larvas de cangrejo de Dungeness, Cancer magister17-19. El cultivo de larvas de cangrejo requiere un suministro favorable de agua y el control de competidores, depredadores y enfermedades. Fíltrese el agua y desinféctese por tratamiento con luz ultravioleta. Para el agua de océano abierto sin contaminar se requiere poco o ningún tratamiento. Si el suministro proviene de un estuario que recibe residuos orgánicos, purifíquese antes de emplearla. Fíltrese el agua de mar para el sistema de flujo transversal haciéndola atravesar por gravedad por un filtro de arena de cuarzo gruesa, ajustándola a la salinidad deseada, aproximadamente 25 a 30 g/kg, por adición de agua dulce. Para eliminar otros organismos, vuélvase a filtrar a presión a través de una serie de capas de granate de 40/60 mallas, arena de sílice de 20/30 mallas y carbón duro* de 0,3 cm. A continuación se filtra a través de un filtro de clarificación † y se trata con luz UV. Utilícense cajas de carga de nivel constante equipadas con dispositivos de calefacción, refrigeración y agitación, para suministrar flujos de medida constante por medio de sifones, toberas seleccionadas o bombas de suministro constante y preciso. Captúrense las hembras con huevos o cómprense a los pescadores y colóquense en depósitos de mantenimiento o en cubetas con flujo transversal similares, pero mayores, a las descritas para los cangrejos de río. La aclimatación y el acondicionamiento se realizan tal como se ha descrito en la sección 8010E.3. Cuando los huevos están listos para abrirse, se pasan las hembras a depósitos estáticos provistos con agua aireada y desinfectada con luz UV a 30 g/kg y 13 °C. Cuando los huevos se abren, se recogen las larvas que nadan introduciendo vasos * Diseño de filtro patentado por microfioc Corp., Corvallis, Ore. 97330. † Commercial Filter Corp., Lebanon, Ind. 46052, Fulflo, Model F15-10, o equivalente.

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para sacarlas y pasándolas a vasos de cultivo mediante pipetas de gran diámetro interior. Las larvas de cangrejo Dungeness tienen largas y delicadas espinas que hacen muy difícil su cultivo en sistemas de flujo. Hay que cultivar las larvas del cuarto y quinto estadio en vasos de 250 ml con un orificio de 15 mm de diámetro soplado a través del costado cerca del fondo. Utilizando cemento de silicona, fíjese un tamiz de plástico‡ con agujeros de 360 µm sobre este orificio por el interior del vaso y un tamiz de plástico con agujeros de 210 µm sobre el orificio por el exterior19. Debido al labio que se forma por el soplado del vidrio, los dos tamices quedan separados de 3 a 4 mm. El tamiz de malla más grande del interior es poco apto para enganchar y romper las espinas de las larvas de cangrejo, mientras que el tamiz de malla menor sobre la parte exterior no está en contacto con las larvas, pero retiene los organismos de alimento, las larvas de camarones del agua de mar. Colóquense los vasos de 250 ml en bandejas de cristal o acuarios lo suficientemente grandes para acomodar 10 vasos y proporcionar una profundidad de al menos 10 cm19. Suminístrese un flujo constante de agua a estas bandejas mediante un tubo que descarga cerca del fondo de la bandeja. Colóquese un sifón automático en la salida de manera que haya un llenado y un descenso de nivel continuo (figura 8720:1). Constrúyase el sifón automático de manera que cuando el agua alcanza el punto alto y el sifón se activa, los vasos contienen aproximadamente 200 ml, y cuando el sifón se interrumpe, los vasos contienen aproximadamente 150 ml. El sifón automático consiste en un tapón de caucho de silicona perforado para recibir un tubo de vidrio en ángulo recto de 8 mm de DI en un extremo y ‡ Nitex o equivalente.

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Figura 8720:1. Vaso de cría y exposición y sifón automático para larvas del cangrejo común del Pacífico19.

un tubo de vidrio en ángulo recto de 5 mm de DI en el otro extremo. El tapón se inserta en un orificio de 1,3 cm de diámetro soplado en el costado de la bandeja con el hueco de 8 mm en el interior de la bandeja. Insértense los tubos en el tapón tal como se muestra en la figura 8720:1. La colocación del hueco dentro de la bandeja controla el nivel del agua en los vasos en 200 ml. La distancia entre la parte superior del hueco interior del tapón y el fondo de la rama interior del sifón es igual a la diferencia de profundidades entre 200 y 150 ml. Colóquese la toma del sifón perfectamente plana y uniforme para evitar que el aire sea arrastrado al sifón19. Ajústense los diámetros de los tubos para dar un ciclo de 15 minutos (10 minutos de llenado y 5 minutos de descenso de nivel). Cuando las cámaras de cultivo están instaladas y en funcionamiento, colóquense 10 larvas del primer estadio en cada vaso con una pipeta de diámetro interior grande y uniforme. Las larvas se pueden alimentar con producto muerto, pero es preferible alimentar el primer estadio con larvas nauplios de camarón de agua salada en una proporción de 70 por cada larva de cangrejo, 3 veces/semana, hasta el tercer estadio, y después 100 camarones de agua salada por cada larva de cangrejo. Manténgase baja la densidad de larvas de cangrejo y alta la de los organismos de alimento con objeto de

MÉTODOS NORMALIZADOS

reducir al mínimo los contactos de las larvas de cangrejo y evitar el canibalismo. Antes de alimentarlas, pásense las larvas a vasos desinfectados con cloro y enjuagados. Utilícese una temperatura de 12 a 13 °C, pH 8, y una salinidad de 25 a 30 g/kg. Ajústese el fotoperíodo de manera que se corresponda con las condiciones naturales o, si el ciclo está fuera de temporada, para que se corresponda al ciclo normal anual de luz y oscuridad. Prescíndase de la luz natural y utilícese luz fluorescente (sección 8010F.3f). En estas condiciones se ha conseguido una supervivencia de 80 a 90 por 100 hasta el cuarto estadio zoal. Las larvas normalmente empiezan a mudar en el quinto estadio zoal al día 45. Entonces aumentan las mortalidades. Los cangrejos Dungeness juveniles y adultos están mucho menos expuestos a enfermedades que las larvas con medidas sanitarias estrictas y agua de mar abierto sin contaminar, la filtración con arena proporciona suficiente control de calidad del agua. Manténganse los cangrejos juveniles y adultos en compartimentos de cubetas similares, pero mayores que los utilizados para cangrejos de río. Para que quede suficiente espacio para cada cangrejo juvenil, utilícense compartimentos de 15 x 15 cm y 15 a 20 cm de profundidad. Para los cangrejos adultos utilícense compartimentos de 30 x 30 cm o 40 x 40 cm con una profundidad de aproximadamente 30 cm. Para los especímenes grandes empléese agua más profunda. Para facilitar el suministro de agua, dispónganse las cubetas sobre soportes con tres estantes de manera que en cada uno de ellos quepan dos cubetas. Aliméntense las formas juveniles y adultas con pescado fresco cortado o macerado, almejas o mejillones, o alimentos de pescado desecado comerciales. Elimínese el alimento sin utilizar al cabo de 24 horas para evitar la suciedad. Límpiense, como rutina, los lados y fondos de los compartimentos y elimí-

MÉTODOS DE PRUEBA DE TOXICIDAD PARA ORGANISMOS ACUÁTICOS

nense los residuos con aspiradoras o sifones. Levántense los separadores de tamiz unos cuantos milímetros e inúndese como se ha señalado para las cubetas de cangrejos de río. 4) Langosta americana - Homarus americanus: Las langostas adultas se pueden obtener capturándolas o comprándolas a los pescadores. Las hembras con huevos se pueden conseguir más fácilmente en la primavera temprana de los pescadores de langosta que tienen permisos. Selecciónense las hembras con huevos de color pardo ya que estos huevos se abrirán al cabo de unas cuantas semanas o unos pocos meses, dependiendo en parte de la temperatura del agua20. Colóquense inmediatamente las hembras con huevos en depósitos de mantenimiento de 300 x 100 x 30 cm. Pónganse 25 a 30 langostas por depósito en una relación de dos hembras a un macho. Sujétense las pinzas de estas langostas con cinta elástica, sin emplear nunca pinzas de madera. Pásese continuamente agua de mar no contaminada a través del depósito en una tasa que mantenga el OD a, o por encima, del 80 por 100 de saturación. Manténgase la salinidad entre 30 g/kg y la que es normal para el agua de mar. Manténgase la temperatura a 15 °C 20 o por encima. Aliméntense con almejas, vísceras de vieira, pescado (tal como Pomolobus pseudo harengus, similar al arenque), cangrejos, oreja de mar, calamar, o alimentos comerciales en bolitas desecadas. Para conseguir un depósito de apertura de los huevos, colóquese un tabique separador transversal en el extremo más bajo del depósito de mantenimiento a 30 cm del extremo. Colóquese la columna hidráulica para mantener los deseados niveles de agua en uno de los lados de este área de 100 x 30 cm. Quítese una pieza de 5 cm de profundidad y 30 cm de largo desde la porción central de arriba del tabique de división para el desagüe desde el depósito de mantenimiento. Ins-

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Figura 8720:2. Tanque para incubado de huevos para langostas.

tálese una caja tamiz de 25 cm de ancho, 15 cm de profundidad y 30 cm de largo, con un corte de 5 x 30 cm en la parte de arriba de uno de los lados de la armadura, que coincida con el corte del tabique divisor. Utilícese una rejilla ventana de plástico con agujeros de 2 mm cuadrados4 para la caja tamiz. Colóquense las langostas hembras con los huevos a punto de abrirse en esta caja (figura 8720:2). Suminístrese agua de mar fluyente a una velocidad suficiente para mantener el OD por encima del 80 por 100 de saturación. Manténgase la temperatura entre 19 y 20 °C. Los estadios de desarrollo larval de H. americanus están descritos en su totalidad21, 22. El período larval se extiende desde el momento de salir del huevo hasta la cuarta muda o alcance del quinto estadio. La duración del período larval depende en parte de la temperatura del agua23. Durante los tres primeros estadios, las larvas nadan libremente, mo-

8-112

viéndose hacia la luz y permaneciendo cerca de la superficie del agua. Después del cuarto estadio se arrastran por el fondo, buscan los lugares oscuros, llevan una vida nocturna y adquieren los instintos defensivos de la langosta adulta. Constrúyase un depósito de cultivo especial de 401 con fibra de vidrio moldeada para la cría de los estadios larvales24 con un circulador de agua combinado y un dispositivo de rebosamiento en el centro (figura 8720:3)24. Para los ensayos utilícese un depósito de 5 l. Manténgase el flujo del agua en este depósito modificado entre 0,5 y 1 l/minuto a través de la columna hidráulica en la parte superior. Las descargas se realizan en el depósito por el fondo, a través de pequeñas ranuras del distribuidor en la parte baja del circulador de rebosamiento. Manténganse las variaciones de temperatura dentro de ±1 °C y regúlese la tasa de flujo empleando válvulas de bolas §. Si el suministro de agua contiene limo o materia suspendida, pásese a través de filtro de arena. Si el suministro consiste en agua de océano abierto, sin contaminar, empléese sin tratamiento alguno. Cuando el agua está contaminada, es necesario efectuar una filtración fina y una desinfección con ozono o luz UV. Para la filtración fina24 utilícese un filtro de polipropileno bobinado de 10 µm y una unidad || UV de 40 W. Para más información sobre filtración, véase Spotte25. Para flujos >40 l/minuto, utilícese un filtro de tierra de diatomeas. En algunos casos pueden resultar ventajosos sistemas de recirculación, especialmente cuando se requiere tratamiento con estreptomicina para evitar el crecimiento de bacterias filamentosas o cuando se requieren grandes cantidades de agua. La concentración máxima de larvas de langosta es de aproximadamente 45/l. A § Válvula de bolas Chemcock, Celanese Piping Systems, Aquafin Corp., Burbank, Calif., o equivalente. || PCLV-1, Aquafine Corp., Burbank, Calif., o equivalente.

MÉTODOS NORMALIZADOS

concentraciones superiores hay más contactos de langosta a langosta y se produce el canibalismo. Cuando los huevos comienzan a abrirse, pásense, lavando con agua, las larvas del primer estadio por encima del corte de 5 x 30 cm del tabique divisor a la caja tamiz. Recójanse las larvas desde esta caja sumergiendo un pequeño vaso y colóquense en la cámara Hughes modificada de cría de larvas sumergiendo el vaso y moviéndolo suavemente. Reúnanse 49 embriones) en cada depósito iguala al número de hembras en cada depósito. A continuación ensáyese en cuanto a capacidad de apertura de los huevos solamente los embriones de cada tercer desove de más de 49 embriones. Sáquense los desoves de fin de semana de las tejas y cuéntense los embriones, pero descártense. Si no tiene lugar ningún desove durante una semana, déjense de ensayar los peces padres. Regístrese la longitud total y el peso, sexo y estado gonadal de los peces padres. No hay que refrigerar los peces antes de determinar las condiciones sexuales y gonadales. Regístrense cada día los embriones vivos y muertos de los recipientes de incubación, sáquense los embriones muertos y límpiense las rejillas del recipiente. El número total de embriones contado deberá sumar siempre hasta menos de dos de 50; de lo contrario, descártese la partida entera. Pasados 4 a 6 días, cuando las larvas comienzan a salir, no han de manipularse o sacarse de los recipientes hasta que todas han salido de los huevos. Entonces, si aún están vivas suficientes larvas, selecciónense 40 al azar y pásense inmediatamente a la cámara de crecimiento larval para determinar la supervivencia y el crecimiento de la segunda generación. Cuéntense y descártense los grupos enteros de los recipien-

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tes que no se utilicen para estudios de supervivencia y crecimiento. Selecciónense las larvas de embriones recientemente desovados en cada depósito duplicado, para el crecimiento de 30 y 60 días y exposición de supervivencia. Planifíquese su distribución para ensayos de apertura de huevos de manera que esté listo un nuevo grupo de larvas para ensayarlo tan pronto como sea posible después de que el grupo previamente ensayado se haya sacado de las cámaras larvales. Regístrese la mortalidad y la longitud larval a los 30 y 60 días de la apertura de los huevos. Pésense cuando ha terminado el ensayo larval. No se alimentan los peces (larvas, juveniles o adultos) durante las 24 horas antes del pesaje. Pásense 50 de los peces de 60 días después de salidos del huevo desde la cámara de crecimiento a la correspondiente cámara de desove y ajústese el fotoperíodo al 1 de diciembre. Síganse los procedimientos utilizados para la generación F1 para determinar la supervivencia de embriones, larvas y juveniles de la generación F2. Césense las pruebas de peces adultos al completarse el desove. Continúese el estudio post-apertura hasta 60 días. Los peces y embriones obtenidos del ensayo se pueden utilizar también para pruebas fisiológicas, bioquímicas, histológicas y otros ensayos sobre efectos producidos por tóxicos. Regístrense los datos siguientes para cada depósito de ensayo y los controles: Número total y longitud de individuos normales y deformados al cabo de 30 y 60 días para cada generación; longitud total, peso y número de cada sexo, tanto de normales como de deformados, al final de las pruebas; mortalidad durante las pruebas; número de desoves y embriones en cada producción de embriones y en total por cada generación; porcentaje de apertura de embriones; número y porcentaje de larvas que sobreviven y crecimiento de las crías así como de las

MÉTODOS NORMALIZADOS

deformidades producidas. Consúltense otras fuentes 14, 23 para una información adicional sobre el ciclo vital del ciprino torpe y ensayos de ciclo vital con flujo transversal. 3) Ensayos de ciclo vital con otras especies de agua dulce: Se han realizado ensayos de toxicidad de ciclo vital parcial con pomátomo, Lepomis macrochirus, y pez bandera, Jordanella Jloridae24-20. Cuando se dispone de técnicas de cultivo, pueden emplearse otras especies naturales de agua dulce también apropiadas. 4) Sargo, Cyprinodon variegatus (marino) a) Equipo y sistema físico: Utilícese instrumental de ensayo similar al empleado para los peces de agua dulce con acuarios de desove de al menos 30 x 18 x 20 cm. Colóquese una cámara de desove en cada acuario tal como se describe en 8910B.5b. b) Procedimientos de exposición: Comiéncese con peces adultos o, preferiblemente, con embriones. Asegúrense los embriones por desove natural o por desove inducido por hormonas (tal como se ha descrito en 8910B.5b). Manténgase la temperatura del agua por encima de 22 °C, preferiblemente a 30 °C, con salinidades por encima de 15 g/kg. Cuando se comienza con adultos, instálense 5 ó 6 acuarios de desove para cada concentración de ensayo y controles. Utilícense peces reproductores, todos de la misma reserva, que se han mantenido en depósitos de mantenimiento durante al menos 2 semanas, durante las que haya tenido lugar menos de un 2 por 100 de mortalidad. Aliméntense los peces con una combinación de camarones adultos congelados y alimento de truchas desecado. Manténgase un flujo de agua a través de los acuarios de desove de 6 a 10 volúmenes de depósito/día. Utilícese agua de mar natural filtrada para eliminar las algas planctónicas de 15 µm y mayores.

MÉTODOS DE PRUEBA DE TOXICIDAD PARA ORGANISMOS ACUÁTICOS

Una vez producidos los embriones, sáqueselos de las cámaras de desove y colóquense en cada una de 8 cámaras de apertura de huevos para cada concentración de ensayo y los controles. Comiéncese con la dosificación de tóxico en las cámaras de exposición antes de que las cámaras de apertura de huevos se coloquen en su interior. Constrúyanse cámaras de apertura de huevos cementando una tira de 9 cm de ancho de rejilla de nilón de 500 µm alrededor de un disco petri. Colóquense las cámaras de apertura de huevos en cámaras de exposición de 90 x 30 x 30 cm en 7 cm de agua con flujo transversal de tóxico. Cuando los embriones salen del huevo, aliméntense las crías con nauplios de camarón marino recién salidos del huevo. Limpíense las rejillas de los recipientes de incubación y cámaras todos los días. Compruébese y regístrese la supervivencia diaria de embriones y crías que constituyen la primera generación filial (F1). El primer día después de la apertura de los huevos, sáquese cada cámara y cuéntense y mídanse fotográficamente las crías. Aliméntense durante las dos primeras semanas con nauplios de camarón marino recién salidos del huevo. Durante las dos semanas siguientes, supleméntese esta dieta con bolitas de trucha seca o copos de Mollenisia desecada. Al cabo de 4 semanas, cuéntense y mídanse los peces por el método fotográfico y redúzcase el número a 50 para concentración de ensayo y controles. Regístrense longitud, peso, estado y número de peces vivos, deformados y muertos que quedan. Determínese el número total que muere en cada concentración de ensayo y controles. Resérvense especímenes para ensayos futuros o descártense. Colóquense los 50 peces seleccionados, cada 25, en cámaras de crecimiento que tienen fondo de vidrio y dispositivo para rebajar el nivel del agua hasta 1 a 2 cm. Aliméntese 2 veces por día con una dieta mixta de camarón marino y alimento de truchas seco y examínese diariamente en cuanto

8-165

a especímenes muertos. Mídase de nuevo a las 8 semanas por el método fotográfico. Aliméntese 2 veces al día con alimento seco suplementado con camarón adulto congelado hasta la madurez. Compruébese cada partida de alimentos en cuanto a pesticidas, PCB y otros tóxicos. Límpiense 2 ó 3 veces por semana todos los acuarios de exposición y cámaras de desove y apertura de huevos. Elimínense todos los residuos sifonando. Cuando los peces se acercan a la madurez sexual, Colóquense parejas separadas en cámaras de desove, 5 de cada cámara de exposición duplicada; es decir, 10 parejas para cada concentración de ensayo y controles, y continúese la exposición. Se cuentan, miden y pesan entonces todos los peces sin utilizar de cada cámara de exposición duplicada. Regístrense el número de deformados y muertos en cada concentración de ensayo y controles, el estado de los peces y otros datos pertinentes. Resérvense algunos peces para análisis del cuerpo completo. En cuanto se producen los huevos fertilizados, sáquense diariamente a una hora determinada, cuéntense y Colóquense 25 de la F2 en una cámara de apertura de huevos como en la generación F1. Regístrese el número total de embriones producidos en cada cámara, el tiempo requerido para abrirse, el éxito de la apertura de huevos y la supervivencia de los embriones. Ensáyense los no colocados en cámaras de apertura de huevos en cuanto a fertilidad y regístrese el porcentaje de fértiles. Si no tiene lugar el desove a concentraciones elevadas de tóxico, pásense embriones de controles e incúbense a las concentraciones altas. Además, si no tiene lugar el desove a concentraciones altas de ensayo, Colóquense embriones de estas concentraciones en acuarios de control. Manténganse las parejas en cada cámara de desove hasta obtener todos los embriones necesarios. Al terminar, mídanse y pésense las parejas de desove y

8-166

regístrense los demás datos pertinentes. Resérvense para análisis de tóxicos. Expónganse embriones de la generación F2 en cámaras de apertura de huevos en sus respectivas cámaras de exposición duplicadas para cada concentración de ensayo y controles como antes. Cuéntense y mídanse por el método fotográfico como para la generación F1 Aliméntense los peces y regístrense los resultados. Al término de 4 semanas finaliza el ensayo. Pésense y mídanse todos los peces; regístrese el número de peces deformados y determínese el número de muertos. Resérvense para examen histológico y análisis de tejidos. Determínense los efectos de cada concentración de ensayo y calcúlense los niveles de ilesos. Analícense, manipúlense y regístrense los datos como en la sección 8010G. Durante los ensayos, regístrense periódicamente la temperatura, la concentración de oxígeno, el pH y la salinidad. Si es posible, analícese químicamente el agua de ensayo en cuanto a tóxico al principio, en diversos momentos durante la exposición y al completarse los ensayos. Analícense lotes de 10 peces de las concentraciones de exposición más altas y más bajas y de los controles para acumulación de tóxico. Analícese el agua de dilución respecto al tóxico, al principio y al final del ensayo. Para información adicional sobre el ciclo vital de Cyprinodon variegatus y procedimientos de ensayo, consúltense otras fuentes31, 34. 5) Ensayos de ciclo vital con otros peces marinos: Los ensayos de ciclo vital se pueden realizar también con otros peces marinos tal como Fundulus heteroclitus y Menidia menidia, aunque actualmente no se dispone de procedimientos estándar. Para información sobre ciclo vital y cultivo de estas especies, consúltense otras fuentes31, 35, 38. 4. 1.

Referencias DRUMMOND, R. A. & W. F. DAWSON. 1970. An impressive method for simulating diel

MÉTODOS NORMALIZADOS

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MÉTODOS DE PRUEBA DE TOXICIDAD PARA ORGANISMOS ACUÁTICOS

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PARTE 9000 EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

9010 9010 A.

INTRODUCCIÓN Discusión general

En las secciones siguientes se describen técnicas para realizar estudios microbiológicos sobre muestras de agua con el fin de determinar su calidad sanitaria. Estas técnicas van encaminadas a establecer el grado de contaminación con residuos. Se trata de las más avanzadas técnicas disponibles, aunque, lógicamente, han de tenerse presentes sus limitaciones. Se utilizan más pruebas para la detección y recuento de microorganismos indicadores que para los de patógenos. El grupo de bacterias coliformes, tal como se define aquí, es el principal indicador de la adecuación del agua para usos domésticos, industriales o de otro tipo. Las reacciones de cultivo y las características de este grupo de bacterias han sido profusamente estudiadas. La experiencia ha demostrado que la densidad del grupo de los coliformes es un indicador del grado de contaminación y, por tanto, de la calidad sanitaria. Tanto el significado de las pruebas como su interpretación están bien precisados y se han utilizado como patrones de comparación de la calidad bacteriológica de los suministros de aguas. La técnica del filtro de membrana, que implica una siembra directa para la detección y cálculo de la densidad de coliformes, es tan eficaz como la fermentación en tubos múltiples para la detección de bacterias de este mismo grupo. La modificación de los detalles del procedimiento, y sobre todo de los medios de cultivo, ha hecho que los resultados sean comparables a los que se obtienen con el

método de la fermentación en tubos múltiples. Aunque existen limitaciones a la aplicación de la técnica del filtro de membrana, puede ciertamente considerarse equiparable a la anterior si se emplea teniendo en cuenta de manera estricta sus inconvenientes y sus especificaciones técnicas. Por tanto, se puede contar con dos métodos estándar para la detección de las bacterias del grupo coliforme. Lo acostumbrado es informar sobre los resultados de los análisis de coliformes desarrollados mediante el método de fermentación en tubo múltiple estableciendo como índice el Número Más Probable (NMP), que es un registro del número de bacterias coliformes que, con mayor probabilidad, podría dar los resultados arrojados en el análisis efectuado; no se trata, pues, de un número real. Los métodos de siembra directos, como el del filtro de membrana, permiten el recuento directo de las colonias de coliformes. En ambos casos, la densidad de coliformes se expresa en NMP o recuento en filtro de membrana por 100 ml. El uso de cualquiera de ellos permite obtener una valoración de la cantidad sanitaria del agua y de la eficacia del tratamiento a que ha sido sometida. Como no es necesario aportar un registro cuantitativo de las bacterias coliformes en todas las muestras, se incluye también una prueba cualitativa de presencia-ausencia. Los estreptococos fecales son también indicadores de contaminación fecal, por lo que se comentarán igualmente los mé9-1

9-2

todos para su detección y enumeración, incluyéndose un método de dilución en tubos múltiples y otro de filtro de membrana. Se presentan asimismo métodos para diferenciar el grupo coliforme, diferenciación que, en general, se considera de valor limitado en lo que se refiere a la evaluación de la calidad del agua potable, ya que la existencia de cualquier bacteria coliforme la hace potencialmente peligrosa. La determinación de las especies puede proporcionar información sobre la colonización de un sistema de distribución y confirmar la validez de los resultados acerca de coliformes. Las bacterias del grupo de los coliformes se encuentran en el intestino y en las heces de los animales de sangre caliente: entre ellas suele haber gérmenes capaces de producir gas a partir de la lactosa en un medio de cultivo adecuado a 44,5 ± ± 0,2 °C. Dado que los bacilos coliformes procedentes de otras fuentes no suelen producir gas en estas condiciones, tal criterio se utiliza para diferenciar el componente fecal del grupo coliforme. Tanto el procedimiento del filtro de membrana como la técnica de dilución en tubos múltiples han sido modificados para incubación a 44,5 °C en pruebas confirmatorias y para que sea posible proporcionar estimaciones sobre la densidad de microorganismos fecales. Las técnicas de coliformes fecales incluyen también un análisis de tubo múltiple de 24 horas con un medio A-l y un método rápido de 7 horas. Dicha diferenciación proporciona información útil sobre la posible fuente de contaminación del agua y sobre su mayor o menor lejanía, ya que los miembros no fecales del grupo coliforme pueden sobrevivir mucho más tiempo que los miembros fecales en un medio ambiente no favorable como es el agua. El recuento heterótrofo en placa puede determinarse por placa fluida, placa difusa o filtro de membrana. Proporciona un

MÉTODOS NORMALIZADOS

recuento aproximado del número total de bacterias viables, lo que suministra valiosa información sobre la calidad del agua y puede aportar datos que respalden el significado atribuido a los resultados de los análisis de coliformes. El recuento heterótrofo en placa es útil para valorar la eficacia de los distintos procesos de tratamiento y puede tener una importante aplicación como análisis del control dentro de la propia planta depuradora. También es útil para controlar la calidad final del agua de un sistema de distribución, como indicador del recrecimiento de microorganismos y de la acumulación de sedimento en secciones de circulación lenta y en extremos muertos. La experiencia en el envío por correo de muestras no congeladas prueba que pueden producirse cambios importantes en el tipo o en el número de bacterias durante el trayecto, aun cuando la duración de éste sea escasa. Por tanto, se recomienda emplear refrigeración durante el transporte para disminuir en lo posible los cambios, sobre todo cuando la temperatura ambiente es superior a 13 °C. Se presentan procedimientos para aislar determinadas bacterias y protozoos patógenos; se trata de técnicas tediosas y complicadas que no están recomendadas para uso habitual. De la misma forma, se ofrecen procedimientos provisionales para virus entéricos, pero no se defiende su utilización general. No se puede esperar del estudio de las muestras bacteriológicas habituales que proporcionen información completa sobre la calidad del agua. Hay que considerar siempre los resultados bacteriológicos a la luz de la información de que se disponga sobre las condiciones sanitarias del lugar de donde procede la muestra. En el caso de los suministros de agua, sólo puede hacerse una valoración precisa de la calidad interpretando los resultados de los análisis de laboratorio juntamente con los datos de la encuesta sanitaria. Se considerarán inadecuados los

EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

9-3

resultados de cualquier estudio que se realice sobre una única muestra de una fuente determinada. Siempre que sea posible, la valoración de la calidad del agua se basará en el análisis de una serie de muestras recogidas durante un período de tiempo conocido. Los problemas de contaminación de los estuarios y otras masas de agua salada han puesto de manifiesto la necesidad de prestar atención a la modificación de las técnicas bacteriológicas existentes, de forma que puedan utilizarse eficazmente en estos casos. Las secciones siguientes no tratan de la aplicación de técnicas específicas al agua salada, ya que los métodos empleados para las aguas dulces resultan también satisfactorios para este tipo de agua. Se describen métodos para analizar las aguas de piscinas y otros lugares de baño. Los métodos estándar de recuento en placa, coliformes fecales y estreptococos fecales son idénticos a los utilizados para otros tipos de aguas. Se presentan los métodos para Staphylococcus y Pseudomonas aeruginosa, microorganismos que suelen asociarse a las vías respiratorias altas o a la piel.

También se estudian métodos para hongos, actinomicetos y nematodos acuáticos.

9010 B.

Se incluyen secciones dedicadas a métodos rápidos de análisis de coliformes y a recuperación de microorganismos sometidos a tensiones. Como consecuencia del progresivo interés y preocupación por el control de calidad analítico, la sección correspondiente ha sido ampliada. Se ha afirmado a menudo que los métodos bacteriológicos presentados en la parte 9000 y desarrollados fundamentalmente para permitir un rápido estudio de muestras de agua sólo son aplicables en estudios de rutina. Sin embargo, estos mismos métodos son básicos e igualmente valiosos para estudios de investigación de bacteriología sanitaria y tratamiento de las aguas. De la misma forma, todas las técnicas deben ser objeto de investigación para establecer su especificidad, mejorar los detalles de metodología y ampliar sus aplicaciones a la medición de la calidad sanitaria de los suministros de agua o de las aguas contaminadas.

Disposiciones de la EPA de Estados Unidos sobre calidad del agua potable

En los Estados Unidos se valora la calidad del suministro público de agua de acuerdo con las Interim Primary Drinking Water Regulations, emitidas en 1975 por la Environmental Protection Agency (EPA)1. Estas disposiciones fijan un número mínimo de muestras que deben estudiarse cada mes y establecen el número máximo de microorganismos coliformes (Nivel Máximo de Contaminación, NMC) permisible en 100 ml de agua terminal. También obligan a que los análisis se hagan en un laboratorio autorizado2.

1. Toma de muestras

Los estudios bacteriológicos deben hacerse sobre muestras recogidas en puntos representativos de todo el sistema de distribución. Hay que establecer la frecuencia de la toma de muestras y la localización de los puntos de la misma, de manera que quede garantizada la determinación precisa de la calidad bacteriológica del suministro de agua tratada, control que puede realizarse en parte conociendo la calidad del agua no tratada y, por tanto, la necesidad de tratamiento. Se es-

MÉTODOS NORMALIZADOS

9-4

tablecerá el número mínimo de muestras que deben recogerse y estudiarse cada mes, teniendo en cuenta la población a la que va destinado el suministro. Es importante examinar repetidas muestras de un punto determinado, así como muestras procedentes de distintos puntos ampliamente repartidos por el sistema de distribución. Las muestras se tomarán a intervalos de tiempo razonablemente distanciados. 2. Aplicación

Para la técnica de fermentación en tubo múltiple, el número máximo de coliformes permitido se expresa en términos de volumen de porción estándar (10 o 100 ml), indicándose el número de porciones analizadas. La ausencia de gas en todos los tubos cuando se estudian cinco porciones de 10 ml por el método de fermentación en tubo (equivalente a un NMP de menos de 2,2 coliformes/100 ml de agua) suele interpretarse como indicación de que la muestra cumple las normas sanitarias. Una positividad confirmada para microorganismos coliformes en tres o más tubos (porciones de 10 ml) o en cinco porciones (de 100 ml) indica la necesidad de tomar medidas inmediatas para remediar la situación y lleva a cabo nuevos estudios. Se analizarán, con la prueba completa, muestras repetidas de agua terminal, procedentes de una misma localización, que muestren de forma continuada tres o más porciones de 10 ml positivas. De la misma forma, en el caso de la técnica de filtro de membrana, el volumen de porción estándar es 100 ml, el límite de calidad es una colonia de coli-

formes/100 ml y el límite de acción es más de cuatro colonias de coliformes/100 ml. Se analizarán con un método de comprobación las muestras repetidas de agua terminal procedentes de una misma localización que muestren resultados posisitivos de forma continuada. Aunque en las disposiciones de la EPA sobre agua potable no son obligatorios los recuentos de placa heterótrofa, puede ser necesario llevarlos a cabo junto con una modificación del límite de turbidez. En estas normas se especifican también concentraciones límites de componentes químicos y físicos del agua que tienen relación con su inocuidad y potabilidad. La Organización Mundial de la Salud ha adoptado unas normas sobre calidad del agua potable3 similares a las vigentes en los Estados Unidos, aunque posteriormente se han modificado y liberalizado para adaptarlas a las condiciones de suministro de agua en todas las regiones del mundo.

3. 1.

Referencias

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EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

9020

GARANTÍA DE CALIDAD4 9020 A.

1.

Discusión general

El progresivo interés por la calidad de las aguas y la obligatoriedad de su control hace necesario establecer y poner en marcha programas de garantía de calidad que confirmen la validez de los datos analíticos. Un programa de garantía de calidad de cualquier laboratorio comprende la aplicación ordenada de las medidas necesarias para eliminar o reducir los errores que puedan producirse durante las operaciones realizadas; estos errores pueden deberse al personal, al instrumental, a los suministros, a los procedimientos de toma de muestras o a la metodología analítica utilizada. El programa debe ser práctico e integrado. Debe requerir una cantidad de tiempo razonable o no se respetará. Si se administra de forma adecuada, un programa equilibrado y concienzudamente aplicado de garantía de calidad propor* Aprobado por el Standard Methods Committee, 1988.

9020 B.

9-5

Introducción cionará de modo uniforme datos de buena calidad sin interferir por ello en las funciones analíticas fundamentales del laboratorio. Existen descripciones detalladas de prácticas de control de calidad1, 2. Por lo general, los analistas deben dedicar el 15 por 100 de su tiempo a los distintos aspectos del programa de garantía de calidad. Deben documentarse y registrarse las prácticas de control intra e interlaboratorios, que estarán a disposición de las posibles inspecciones. Se recomiendan las siguientes directrices sobre garantía de calidad para un programa mínimo a realizar en un laboratorio microbiológico. 2. 1.

2.

Referencias INHORN , S. L. ed., 1977. Quality Assurance Practices for Health Laboratories. American Public Health Assoc, Washington, D.C. BORDER, R. H., J. A. WlNTER & P. V. SCARPINO ,

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Directrices para el control de calidad intralaboratorio

Todos los laboratorios tienen algún sistema de control de calidad interno, al que se ha llegado partiendo del sentido común y de los principios de la experimentación controlada. En microbiología, se plantean problemas especiales, puesto que generalmente no existen estándares analíticos, adiciones conocidas o muestras de referencia, y es necesario recurrir con mayor frecuencia al criterio personal. Un programa efectivo debe controlar todos los factores que pueden influir

sobre los resultados, desde la toma de muestras hasta la elaboración del informe. Estos factores comprenden las técnicas de toma de muestras, almacenamiento y la manipulación de las mismas, las instalaciones, el personal, el instrumental, los suministros, los medios de cultivo y los procedimientos analíticos. Es especialmente importante que los laboratorios que realizan una cantidad limitada de pruebas microbiológicas observen un estricto control de calidad. Estas directri-

9-6

ees ayudarán a los laboratorios a establecer y mejorar sus programas de control de calidad. 1. Instalaciones y personal

a) Ventilación: Los laboratorios deben contar con una buena ventilación para reducir al mínimo el polvo, las corrientes de aire y los cambios extremos de temperatura. Un sistema de aire acondicionado central disminuye la contaminación, permite un funcionamiento más estable de las incubadoras y reduce los problemas de humedad con los medios de cultivo y los equilibrios analíticos. b) Utilización del espacio: El laboratorio se proyectará y organizará de forma que se limiten todo lo posible el tráfico y los visitantes. Dispondrá de una zona separada para preparar y esterilizar los medios, el instrumental de vidrio y el equipo. Contará con una zona especial de trabajo, como una campana de flujo laminar, para repartir y preparar los medios estériles, transferir los cultivos microbianos o manipular materiales patógenos. En laboratorios de menor tamaño puede ser necesario, aunque no es lo deseable, realizar todas estas actividades en la misma habitación. c) Bancos de laboratorio: Se dispondrá de un mínimo de 2 m lineales de banco por cada analista y de superficies adicionales para las actividades de preparación y ayuda. Las dimensiones habituales de los bancos para trabajar de pie son 90-97 cm de altura y 70-76 cm de profundidad. Para actividades que se realizan sentado, como el trabajo de microscopio o el recuento de placas, los bancos deberán tener 75-80 cm de altura. La superficie de los bancos será de acero inoxidable, plástico epoxídico u otra superficie lisa e impermeable, inerte y resistente a la corrosión; tendrá el menor número posible de junturas. Sobre la superficie de trabajo se instalará una luz

MÉTODOS NORMALIZADOS

uniforme y que no deslumbre de alrededor de 1.000 lux de intensidad. d) Paredes y suelos: Hay que asegurarse de que las paredes tengan un acabado liso que se limpie y desinfecte con facilidad. El suelo será de cemento liso y sellado, vinilo, tela asfáltica u otra superficie lavable e impermeable. e) Control del aire: Se mantendrá un elevado nivel de limpieza en las áreas de trabajo. Se controlará el aire, al menos con periodicidad mensual, mediante placas de densidad del aire y placas RODAC sobre la superficie de los bancos de laboratorio o con un método de torunda 1 . El número de colonias no debe superar 160/m2/15 minutos de exposición (15 colonias/placa/15 minutos) con el método de la placa de densidad del aire. f) Limpieza del laboratorio: Se limpiarán las salas del laboratorio y se lavarán los bancos, estanterías, suelos y ventanas con regularidad. El suelo se lavará y se tratará con una solución desinfectante; no se barrerá ni se limpiará con bayetas secas. Las superficies de los bancos se lavarán y se tratarán con un desinfectante antes y después de usarlos. No se permitirá el desorden en el laboratorio. g) Personal: Lo ideal es que sean microbiólogos profesionales quienes hagan los análisis bacteriológicos. Cuando esto no sea posible, habrá que contar con un microbiólogo profesional o un analista experimentado que oriente y ayude al resto del personal. Hay que definir claramente las tareas. Se formará al analista en los procedimientos básicos de laboratorio y se evaluará su trabajo. El supervisor revisará periódicamente los procedimientos de toma y manipulación de muestras, la preparación de medios e instrumental de vidrio, la esterilización, los procedimientos analíticos habituales, el recuento, la manipulación de los datos y las técnicas de control de calidad, para identificar y corregir los problemas. La dirección debe animar al personal a completar su for-

EXAMEN MICROBIOLÚGICO DE LAS AGUAS

mación para perfeccionar sus conocimientos y sus técnicas. 2. Equipo e instrumental de laboratorio

Se comprobará que todos los elementos del equipo satisfacen las necesidades del usuario en cuanto a precisión y minimización de desviaciones. Se llevarán a cabo con regularidad las tareas de mantenimiento del equipo, siguiendo las recomendaciones del fabricante, o se realizarán contratos de mantenimiento preventivo del autoclave, las balanzas, los microscopios y otros elementos del equipo, siempre que sea económicamente factible. Se anotarán todas las comprobaciones de control de calidad en un libro de registro permanente. Se utilizarán los siguientes procedimientos de control del instrumental: a) Termómetros e instrumentos de registro de la temperatura: Se comprobará cada 6 meses la exactitud de los termómetros o instrumentos de registro de la temperatura contrastando sus mediciones con las de un termómetro homologado por el National Institute of Standards and Technology (NIST, organismo competente a estos efectos en los Estados Unidos) u otro que cumpla las especificaciones del NIST. Para uso general, se utilizarán termómetros graduados a intervalos de 0,5 °C o inferiores. Para el baño de agua a 44,5 °C se empleará un termómetro sumergible graduado a intervalos de 0,2 °C o inferiores. Los datos de comprobación de la temperatura se anotarán en el registro de control de calidad. Se marcarán las concentraciones de calibración NIST en todos los termómetros utilizados en incubadoras, frigoríficos o congeladores. Siempre que sea posible, se dotará a las incubadoras y baños de agua de instrumentos que proporcionen un registro continuo de la temperatura de funcionamiento.

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b) Balanzas: Se desempolvarán las balanzas antes y después de usarlas con un cepillo suave de pelo de camello u otro material similar. Los platillos de la balanza se limpiarán después de cada uso y se recogerán inmediatamente las salpicaduras con una toalla húmeda. Se inspeccionarán las pesas cada vez que se utilicen y se desecharán las que presenten indicios de corrosión. Se contrastarán las pesas con otras certificadas una vez al mes. Para pesos de hasta 2 g se utilizarán balanzas analíticas con una sensibilidad inferior a 1 mg para una carga de 10 g. Para cantidades superiores se utilizarán balanzas con una sensibilidad de 0,1 g para una carga de 150 g. c) pHmetro: Se normalizarán los pHmetros con al menos dos tampones estándar (pH 4,0, 7,0 ó 10,0) y se compensarán para la temperatura antes de cada serie de determinaciones. Se anotará la fecha de apertura de las soluciones tampón y se contrastarán una vez al mes con otro pHmetro, si es posible. Véase la sección 4500-H + . d) Unidad de desionización del agua: Las columnas de desionización de resinas en lecho mixto producen un agua de calidad satisfactoria para reactivos. Existen sistemas comerciales que combinan prefiltración, resinas en lecho mixto, carbono activado y cartuchos de filtración final para obtener agua de calidad para reactivos. Se puede prolongar satisfactoriamente la vida media de estos cartuchos destilando el agua introducida o tratándola mediante osmosis inversa. Este tipo de agua no se debe almacenar para evitar la contaminación. Los sistemas de desionización tienden a producir un agua de calidad uniforme hasta que las resinas o el carbono activado están casi agotados, momento en el que la calidad desciende bruscamente hasta un nivel inaceptable. El agua desionizada se controlará de forma continuada o a diario con un medidor de conductividad, y se analizará al

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menos una vez al año para descartar la presencia de metales traza. Los cartuchos se sustituirán con la periodicidad que recomienda el fabricante o cuando así lo indiquen los resultados analíticos. El agua obtenida se hará pasar por un filtro de membrana con poros de 0,22 µm de diámetro para eliminar la contaminación bacteriana. e) Agua de alambique: Los alambiques producen un agua de buena calidad que se deteriora lentamente a medida que se produce corrosión, lixiviación o ensuciamiento. Estas condiciones pueden controlarse mediante un tratamiento y una limpieza adecuados. Los alambiques eliminan eficazmente las sustancias disueltas, pero no los gases o productos químicos orgánicos volátiles disueltos. El agua recién destilada puede contener cloro y amoníaco (NH3). Cuando se almacena, absorbe más NH3 y CO2 procedentes del aire. Se utilizará agua ablandada para la alimentación del alambique, con el fin de disminuir la frecuencia de limpieza del mismo. El alambique y el depósito se drenarán y limpiarán siguiendo las instrucciones de uso del fabricante. f) Unidades de osmosis inversa: Las unidades comerciales de osmosis inversa (OI) son prefiltros y cartuchos de osmosis inversa que se venden como sistemas de purificación del agua. Estas unidades de OI sólo eliminan alrededor del 90 por 100 de las impurezas, por lo que el agua obtenida con ellas no puede utilizarse para análisis microbiológicos. Las unidades de OI se dedicarán fundamentalmente a la limpieza inicial del agua antes de ser sometida a destilación o desionización. Se recomienda emplear las unidades que combinan prefiltración, osmosis inversa y resinas de intercambio iónico de lecho mixto. g) Aparatos de distribución de medios: Se comprobará la exactitud de los volúmenes dispensados por medio de un cilindro graduado al iniciar cada cambio de volumen y de forma periódica a lo

MÉTODOS NORMALIZADOS

largo del tiempo de funcionamiento. Si la unidad se utiliza más de una vez al día, se bombeará gran cantidad de agua destilada caliente en todo el dispensador para limpiarlo. Se corregirán de manera inmediata las pérdidas, los desajustes de las conexiones o las averías. Al final del trabajo diario, se desmontará el aparato, se limpiará con agua para reactivos y se secará. Se lubricará, siguiendo las instrucciones del fabricante, como mínimo, una vez al mes. h) Estufa de aire caliente: Se comprobará trimestralmente su funcionamiento con tiras o suspensiones comerciales de esporas. La temperatura se controlará con un termómetro exacto dentro del intervalo de 160 a 180 °C y se registrarán los resultados. Se utilizará una cinta indicadora de calor para identificar los suministros y materiales que hayan estado expuestos a temperaturas de esterilización. i) Autoclave: Se llevará un registro de los objetos que han sido esterilizados, así como de la temperatura, presión y tiempo de cada esterilización. Lo mejor es utilizar un termómetro registrador. Se comprobará semanalmente la temperatura de funcionamiento con un termómetro de máxima y mínima. Se harán comprobaciones mensuales con tiras o suspensiones de esporas. Se utilizará una cinta indicadora de calor para identificar los objetos y materiales que han sido esterilizados. j) Frigorífico: Se comprobará y registrará la temperatura diariamente y se limpiará una vez al mes. Se identificarán y fecharán los materiales almacenados. Se descongelará cuando sea necesario y se desecharán los materiales caducados cada 3 meses. k) Congelador: Se comprobará y registrará la temperatura diariamente. Es muy conveniente que esté dotado de un sistema de alarma y de un termómetro registrador. Se identificarán y fecharán los materiales almacenados. Se desconge-

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lará y limpiará dos veces al año; se desecharán los materiales caducados. l) Equipo de filtro de membrana: Antes de utilizarlo, se montará la unidad de filtración y se comprobará que no existen pérdidas. Se recubrirán con silicona las unidades para mejorar el drenaje. Se desecharán las unidades que presenten la superficie interna arañada. Se lavarán y enjuagarán cuidadosamente las partes filtrantes después de utilizarlas, se envolverán a continuación en papel u hoja metálica no tóxicos o se colocarán en un recipiente no corrosivo, y se introducirán en el autoclave. Véase la sección 9222B.1. m) Lámparas de luz ultravioleta: Se desconectarán una vez al mes las unidades y se limpiarán las lámparas con un paño suave humedecido en etanol. Se comprobarán las lámparas cada 3 meses con un medidor de luz UV* y se sustituirán cuando tengan menos del 70 por 100 de la potencia inicial, o cuando el recuento en placa de placas de agar sembradas con 200-250 microorganismos y expuestas a la luz durante 2 minutos no indique una reducción del 99 por 100. n) Cabina (campana) de seguridad: comprobará una vez al mes que los filtros no presentan tapones o acumulaciones de suciedad y se limpiarán si es necesario. Una vez al mes, se expondrán placas de agar de recuento de placa durante 1 hora al aire de salida. Se incubarán estas placas a 35 °C durante 24 horas y se examinarán en busca de posibles contaminaciones. Una cabina de seguridad en buen funcionamiento no debe dar lugar a crecimientos en las placas. Se desconectarán las lámparas UV y se limpiarán todos los meses con un paño suave humedecido en etanol. Se comprobará la eficacia de las lámparas como se ha

indicado anteriormente. Se inspeccionarán cada 3 meses las cabinas para descartar pérdidas y comprobar la velocidad de flujo del aire. Se utilizará un aparato de comprobación de la presión para medir la eficacia de la campana. El mantenimiento se realizará siguiendo las instrucciones del fabricante. o) Baño de agua: Se dejará sumergido en el baño un termómetro adecuado (véase apartado 2a, más arriba); se controlará y registrará diariamente la temperatura, a no ser que se utilice un termómetro registrador y un sistema de alarma. Sólo se utilizarán gradillas de acero inoxidable o revestidas de plástico u otro material resistente a la corrosión. Se limpiará el baño siempre que sea necesario. p) Incubadora (por aire o por agua): Se comprobará y registrará la temperatura dos veces al día (por la mañana y a primera hora de la tarde). Si se utiliza un termómetro de vidrio, se sumerge el bulbo y el vástago en agua o glicerina hasta la marca de este último. Se obtienen resultados óptimos con un termómetro registrador y un sistema de alarma. La incubadora se colocará en una zona en la que la temperatura se mantenga entre 16 y 27 °C. q) Microscopios: Se utilizará papel de lentes para limpiar la óptica y la platina después de cada uso. Cuando no se esté utilizando, el microscopio se mantendrá tapado. El microscopio de fluorescencia y su fuente de luz sólo deben ser utilizados por técnicos expertos. La lámpara de fluorescencia se comprobará con un medidor de luz y se sustituirá cuando se observe una pérdida significativa de fluorescencia. Se registrarán el tiempo de funcionamiento de la lámpara, su eficacia y su alineación. Se comprobará periódicamente la alineación de la lámpara, sobre todo cuando se haya cambiado la bombilla. Para control, se utilizarán preparaciones con una fluorescencia conocida de 4 +.

* Shortwave UV meter, UV Products, Inc., San Gabriel, California, o equivalente.

MÉTODOS NORMALIZADOS

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3.

Material de laboratorio

a) Material de vidrio: Se examinará antes de cada uso el material de vidrio y se desecharán todos los elementos que presenten los bordes mellados o las superficies internas deterioradas. Hay que comprobar con especial cuidado los frascos de dilución con tapón de rosca y los matraces cuyos bordes mellados puedan facilitar el derramamiento y la contaminación del área de trabajo o dar lugar a aerosoles. Se inspeccionará el material de vidrio después de lavarlo para comprobar que no queden demasiadas gotas de agua y, en su caso, se volverá a lavar. Siempre que sea necesario, se llevarán a cabo las siguientes pruebas de comprobación de la limpieza del material de vidrio: 1) Comprobación del pH: Dada la dificultad de eliminar por completo algunas soluciones limpiadoras, se comprobará el pH de los lotes de material de vidrio limpios, sobre todo si se han lavado con ácidos o álcalis. Para identificar residuos ácidos o alcalinos, añádanse unas gotas de azul de bromotimol (ABT) al 0,04 por 100 u otro indicador del pH y obsérvese la reacción de color. El ABT debe ser gris azulado (dentro de límites normales). Para preparar la solución de azul de bromotimol al 0,04 por 100, añádanse 16 ml de NaOH al 0,01 N a 0,1 g de ABT y dilúyanse hasta 250 ml con agua destilada. 2) Comprobación de residuos inhibidores en el material de vidrio y plástico: Algunos de los agentes humidificadores o detergentes que se utilizan para lavar el material de vidrio contienen sustancias bacteriostáticas o inhibidoras, lo que obliga a realizar de 6 a 12 aclarados para eliminarlas y asegurar que no existe actividad bacteriostática residual. Esta comprobación se hará una vez al año y antes de utilizar un nuevo detergente. Si se utiliza instrumental de plástico prela-

vado y preesterilizado, debe comprobarse que carece de residuos inhibidores. a) Procedimiento: Lávense y enjuáguense 6 placas de Petri según el método de laboratorio habitual; se marcarán como grupo A. Lávense de la misma forma otras 6 placas de Petri y enjuáguense 12 veces con porciones sucesivas de agua para reactivos; se marcarán como grupo B. enjuáguense 6 placas de Petri en agua con detergente (a la concentración habitual) y séquense sin volver a enjuagarlas; se marcarán como grupo C. Esterilícense las placas de los grupos A, B y C según el procedimiento habitual. Para comprobar el material de plástico preesterilizado, Colóquense 6 placas de Petri estériles a las que se marcará como grupo D. Añádase no más de 1 ml de un cultivo de E. aerogenes que contenga de 50 a 150 unidades formadoras de colonias a las placas de los grupos A, B, C y D, y procédase según el método descrito para el recuento en placas heterótrofas (sección 9215). A veces es necesario hacer una prueba preliminar para obtener un recuento dentro de los límites especificados. Para asegurar este recuento, se inocularán 3 placas de cada grupo con 0,1 ml y las otras 3 con 1 ml. b) Interpretación de los resultados: La diferencia entre los recuentos medios de las placas de los grupos A, B, C y D será inferior al 15 por 100 si no se han producido efectos tóxicos o inhibidores. Las diferencias inferiores al 15 por 100 entre los recuentos medios de los grupos A y B, y superiores al 15 por 100 entre los de los grupos A y C, indican que el detergente utilizado posee propiedades inhibidoras que desaparecen durante el lavado convencional. b) Utensilios y recipientes para la preparación de medios: Se utilizarán utensilios y recipientes de vidrio de borosilica-

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to, acero inoxidable, aluminio u otro material resistente a la corrosión (véase la sección 9030). No se emplearán utensilios de cobre. c) Agua de calidad para reactivos: La

calidad del agua obtenida mediante un sistema de purificación depende del sistema utilizado y de su mantenimiento. Véanse los apartados 2d, e y f anteriores. En la tabla 9020:I aparecen los límites aceptables del agua de calidad. Si no se alcanzan, hay que investigar y corregir la causa. Aunque la determinación del pH del agua purificada se caracteriza por sus variaciones, las lecturas extremas indican contaminación química. 1) Comprobación de la calidad bacteriológica del agua para reactivos: Esta prueba se basa en el crecimiento de Enterobacter aerogenes en un medio de cultivo mínimo químicamente definido. La presencia de un agente tóxico o de una sustancia favorecedora del crecimiento altera la población en 24 horas, aumentándola o disminuyéndola en un 20 por 100 o más con respecto a un control. Esta prueba se hará al menos una vez al año y cuando se cambie la fuente de obtención del agua para reactivos o surjan problemas con los análisis. Es una prueba compleja que requiere habilidad y experiencia, y no es fácil de realizar si no se tiene mucha práctica. Se necesitan 4 días de trabajo, agua ultrapura procedente de una fuente independiente que se utilizará como control, reactivos de gran pureza y una extremada limpieza de los matraces de cultivo, placas de Petri, tubos de ensayo, pipetas, etcétera. Esta prueba es muy sensible a los tóxicos y sus resultados no se pueden relacionar directamente con los análisis habituales. a) Instrumental y material: Se utilizará vidrio de borosilicato, que se enjuagará con agua recién bidestilada en un alambique de vidrio antes de esterilizarlo con calor seco; la esterilización con va-

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por volvería a contaminar estos objetos. La sensibilidad y reproducibilidad de la prueba dependen en parte de la limpieza de los recipientes que contienen la muestra, los matraces, los tubos, las pipetas, etcétera. Suele ser conveniente reservar material de vidrio nuevo exclusivamente para la realización de este análisis. Se empleará cualquier cepa de IMViC coliforme tipo − − + + (E. aerogenes) obtenida a partir del agua ambiental o de una muestra de agua residual. b) Reactivos: Sólo se utilizarán reactivos y productos químicos de grado ACS. La sensibilidad de la prueba se controla en parte por la pureza de los reactivos. Éstos se prepararán en agua recién bidestilada en un alambique de vidrio. Solución de curato de sodio: Disuél-

vanse 0,29 g de citrato de sodio, Na3C6H6O7 · 2H2O, en 500 ml de agua. Solución de sulfato de amonio: Disuélvanse 0,26 g de (NH4)2SO4 en 500 ml de agua. Solución de mezcla de sales: Disuélvanse 0,26 g de sulfato de magnesio, MgSO4 · 7H2O; 0,17 g de cloruro de calcio, CaCl2 · 2H2O; 0,23 g de sulfato ferroso, FeSO4 · 7H2O, y 2,50 g de cloruro de sodio, NaCl, en 500 ml de agua. Solución tampón de fosfato: Solución madre de tampón de fosfato (9050C.la) diluida en agua al 1:25. Se hierven todas las soluciones durante 1 ó 2 minutos para eliminar las células vegetativas. Las soluciones se almacenan en botellas esterilizadas con tapón de vidrio en un lugar oscuro y a 5 °C, donde podrán permanecer varios meses, siempre que se compruebe su esterilidad antes de cada uso. Dado que la solución de mezcla de sales desarrolla una ligera turbidez en el plazo de 3 a 5 días, al convertirse en férrica la sal ferrosa, se preparará una solución sin FeSO4 cuando se desee almacenarla largo tiempo. A la hora de utilizarla, se le añadirá la cantidad adecuada de sal de hie-

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TABLA 9020:I. CALIDAD DEL AGUA PURIFICADA UTILIZADA EN PRUEBAS MICROBIOLÓGICAS

rro recién preparada y hervida. Se desecharán las soluciones que estén muy turbias y se prepararán otras nuevas. La solución de tampón de fosfato también se desecha cuando está turbia. c) Muestras: Para preparar las muestras a analizar se recogen 150-200 ml de agua para reactivo del laboratorio y de agua de control (bidestilada) en matraces de vidrio de borosilicato y se hierven durante 1-2 minutos. No debe prolongarse la ebulición para evitar que se produzcan alteraciones químicas. d) Procedimiento: Se marcan cinco matraces o tubos, A, B, C, D y E. Se añaden a cada matraz muestras de agua, medios y agua bidestilada, como se indica en la tabla 9020:11. Se añade una suspensión de E. aerogenes (IMViC tipo − − + + ) de una densidad tal que cada matraz contenga entre 30 y 80 células/ml, preparándola

como se indica a continuación. Una densidad celular inferior a la señalada dará lugar a proporciones inconstantes, y una densidad superior a 100 células/ml provocará un aumento de la sensibilidad a los nutrientes en el agua de prueba. Se hace un recuento bacteriano inicial, colócando porciones triplicadas de 1 ml de cada uno de los matraces de cultivo en una placa de agar de recuento. Se incuban los matraces A, B, C, D y E a 35 °C durante 25 + 2 horas. Se preparan recuentos de placas finales a partir de cada matraz utilizando diluciones de 1, 0,1, 0,01, 0,001 y 0,0001 ml. e) Preparación de la suspensión bacteriana: El día anterior al de realización de la prueba de idoneidad para el agua destilada, se inocula una cepa de E. aerogenes en un medio de agar inclinado, de aproximadamente 6,3 cm de longitud, en untubocontapónderoscadel25 x 16mm.

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TABLA 9020:II. ADICIÓN DE REACTIVOS PARA PRUEBAS DE CALIDAD DEL AGUA

Se estría toda la superficie del agar para conseguir una película continua de crecimiento, y se incuba de 18 a 24 horas a 35 °C. f) Recogida de las células viables: Se toman con una pipeta 1-2 ml de agua de dilución estéril de un blanco de agua de 99 ml y se añade al cultivo que ha estado en incubación de 18 a 24 horas. Se emulsiona el cultivo inclinado pasando suavemente la pipeta por la película bacteriana, con cuidado de no desgarrar el agar; se vuelve a colocar la suspensión de la pipeta en el blanco de agua original de 99 ml. g) Dilución de la suspensión bacteriana: Se prepara una dilución 1:100 de la botella original en un segundo blanco de agua, otra dilución 1:100 de la segunda botella en un tercer blanco de agua y una dilución 1:10 de la tercera botella en un cuarto blanco de agua, agitando enérgicamente después de cada paso. Se lleva con la pipeta 1,0 ml de la cuarta dilución (l:105) a cada uno de los matraces (A, B, C, D y E). Se llegará así a una dilución final de microorganismos comprendida

entre 30 y 80 células viables por mililitro de solución de prueba. h) Verificación de la densidad bacteriana: Las variaciones entre cepas del mismo agente, distintos microorganismos, medios y superficies de las pendientes de agar pueden obligar a ajustes del método de dilución para conseguir los límites de densidad mencionados, de 30 a 80 células viables. Con el fin de determinar numéricamente el grado de crecimiento de los organismos y medios específicos utilizados, se harán series de recuentos de placas a partir de la tercera dilución para determinar la densidad bacteriana. Se seleccionará un volumen adecuado de esta tercera dilución que, al diluirlo en los 30 ml de los matraces A, B, C, D y E, contendrán de 30 a 80 células viables/ml. Si el procedimiento se ha normalizado para una superficie de pendiente y una técnica de laboratorio, podrán reproducirse los resultados en sucesivos análisis con la misma cepa del microorganismo. i) Dificultades metodológicas: Los problemas que surjan con este método

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pueden deberse a que se haya almacenado la muestra de agua para análisis en recipientes de vidrio ligero o que carezcan de ajustes para los tapones de metal; se hayan utilizado en la preparación de los reactivos productos químicos que no posean suficiente calidad analítica o no sean de fabricación reciente; se hayan contaminado los reactivos con agua destilada que contenga una población bacteriana (para evitarlo, se hará un recuento en placa heterótrofa en todos los reactivos antes de comenzar la prueba para comprobar la contaminación de las soluciones almacenadas); no se haya conseguido la concentración bacteriana inicial que se pretendía o se haya elegido mal la dilución utilizada para obtener el recuento en placa a las 24 horas; se haya producido un retraso en el vertido de las placas o se haya prolongado el tiempo de incubación más allá del límite de 26 horas, lo que da lugar a una respuesta desensibilizada de crecimiento. j) Cálculos: Para sustancias inhibidoras del crecimiento:

Una proporción de 0,8 a 1,2 (inclusive) indica ausencia de sustancias tóxicas; una proporción inferior a 0,8 indica la presencia de una sustancia inhibidora del crecimiento en la muestra de agua. Para fuentes de carbono y nitrógeno que estimulan el crecimiento:

Para fuentes de nitrógeno que estimulan el crecimiento:

MÉTODOS NORMALIZADOS

Para fuentes de carbono que estimulan el crecimiento bacteriano:

En los casos en que la primera proporción indique una reacción tóxica, no se calcularán las tres últimas proporciones. En éstas, una proporción superior a 1,2 indica la existencia de una fuente que estimula el crecimiento bacteriano. k) Interpretación de los resultados: El recuento de colonias en el matraz A tras 20-24 horas de incubación a 35 °C dependerá del número de microorganismos sembrados inicialmente en dicho matraz y de la cepa de E. aerogenes utilizada. Por ello, hay que hacer un control A para cada una de las series de análisis. Sin embargo, para una cepa determinada de E. aerogenes en idénticas condiciones ambientales, el recuento terminal mostrará una razonable uniformidad siempre que la siembra inicial sea la misma. Una diferencia de 30 a 80 células en la siembra inicial dará un resultado aproximadamente tres veces mayor cuando la inoculación inicial en el matraz A sea de 80, siempre que la velocidad de crecimiento se mantenga constante. Por tanto, es esencial que el recuento inicial de colónias en los matraces A y B sea aproximadamente igual. Cuando la proporción es superior a 1,2, se admite que existen sustancias favorecedoras del crecimiento. Sin embargo, este método es extraordinariamente sensible y proporciones de hasta 3,0 son poco significativas en la práctica real. Por tanto, si la proporción es de 1,2 a 3,0 no se harán las pruebas C, D y E, a menos que concurran circunstancias especiales. Por lo general, el matraz C dará un recuento muy bajo y los D y E tendrán proporciones inferiores a 1,2 cuando la proporción entre los matraces B y A se

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sitúe entre 0,8 y 1,2. Los factores limitadores del crecimiento en el matraz A son el nitrógeno y el carbono orgánico. Una cantidad extraordinariamente grande de nitrógeno amónico sin carbón orgánico puede hacer aumentar la proporción en el matraz D por encima de 1,2, y la ausencia de nitrógeno con una elevada concentración de carbono puede dar lugar a proporciones superiores a 1,2 en el matraz E, siempre que la proporción B:A se haya mantenido entre 0,8 y 1,2. Una proporción inferior a 0,8 indica que el agua contiene sustancias tóxicas; esta proporción incluye todas las tolerancias permisibles. Como se ha indicado en el párrafo anterior, la proporción puede llegar a ser de 3,0 sin que se produzcan por ello consecuencias indeseables. No es posible recomendar medidas correctoras específicas en caso de defectos en los aparatos de destilación. Sin embargo, se hará una cuidadosa inspección del equipo de destilación y se revisarán la producción y manipulación del agua destilada para localizar y corregir la causa del problema. El agua de alimentación del alambique suele pasar primero por una columna de desionización y un filtro de carbono. Si el mantenimiento de estas columnas es bueno, se eliminará la mayoría de los contaminantes orgánicos e inorgánicos. Cuando el mantenimiento es defectuoso, el agua de entrada puede degradarse y ser de calidad inferior a la del agua corriente. El mejor sistema de destilación es el fabricado con cuarzo o vidrio de borosilicato con alto contenido en sílice y tratamiento térmico especial. No son recomendables los alambiques con revestimiento de estaño. Las tuberías de conexión deben ser de acero inoxidable, vidrio de borosilicato o cloruro de polivinilo (PNV). Se utilizarán depósitos de almacenamiento de acero inoxidable protegidos del polvo. 1) Sensibilidad de la prueba: Tomando el cobre como medida relativa de la

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toxicidad del agua destilada, la sensibilidad máxima de la prueba es de 0,05 mg Cu/1 en una muestra de agua destilada. a) Pruebas para evaluar el agua para reactivos, los medios y las membranas: Cuando se vaya a utilizar un nuevo lote de medios de cultivo, filtros de membrana o una nueva fuente de agua de calidad para reactivos, o se vaya a hacer la prueba anual del agua, se compararán los lotes en uso (lotes de referencia) con los nuevos (lotes de prueba) de la siguiente forma: 1) Procedimiento: Se utilizará un solo lote de control (agua bidestilada o destilada y tratada por desionización) agua, material de vidrio, filtros de membrana y demás materiales necesarios para controlar todas las variables, salvo la que se está estudiando. Se hacen determinaciones paralelas en placas fluidas o difusas, o pruebas de placa de filtros de membrana del lote de referencia y del de prueba, según los procedimientos indicados en la sección 9215 y 9222. Como mínimo, se harán análisis de cinco muestras positivas de agua. Se repetirán los análisis y se analizarán nuevas muestras para aumentar la sensibilidad de detección de diferencias entre los lotes de referencias y de prueba. Al comparar fuentes de agua, se hará la prueba en paralelo, utilizando por separado agua de control y agua de prueba en todas las aguas utilizadas en la prueba (dilución, enjuague, preparación de medios, etc.). 2) Recuento y cálculos: Tras la incubación, se comparan el tamaño y el aspecto de las colonias bacterianas de ambos lotes. Si las colonias de las placas del lote de prueba son atípicas o claramente inferiores a las de las placas del lote de referencia, se anotará la existencia de la inhibición o de cualquier otro problema, con independencia de las diferencias de recuento. Se hará el recuento de las placas y se calculará el recuento individual

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por 1 ml o por 100 ml. Se expresará el recuento en logaritmos y se introducirán los logaritmos de ambos lotes en dos columnas paralelas. Se calcularán las diferencias, d, entre los dos logaritmos de cada muestra, incluyendo los signos + o −, la media, d , y la desviación, sd, de estas diferencias (véase la sección 1010B). Se calculará la t de Student tomando como n el número de muestras:

3) Interpretación: Se utilizará el valor crítico de t de las tablas t de Student2 para comparar el valor calculado. Con un nivel de significación de 0,05, este valor es de 2,78 para cinco muestras (cuatro grados de libertad). Cuando el valor calculado de t no es superior a 2,78, los lotes no muestran diferencias significativas y el de prueba es aceptable. Cuando el valor calculado de t es superior a 2,78, los resultados obtenidos con los lotes son significativamente diferentes. Cuando la t del lote de prueba es superior al resultado del lote de referencia, el primero estimula más el crecimiento. Cuando el resultado del lote de prueba es inferior al del lote de referencia, el primero estimula menos el crecimiento. Si las colonias son atípicas o claramente inferiores en el lote de prueba y la t de Student es superior a 2,78, se revisarán las condiciones de la prueba, se repetirá el análisis y se rechazará el lote de prueba, sustituyéndolo por otro. e) Reactivos: Los reactivos son un elemento esencial de los análisis microbiológicos, por lo que hay que asegurarse de que su calidad sea óptima. Sólo se utilizarán productos químicos de calidad ACS o equivalente, ya que las impurezas pueden inhibir el crecimiento bacteriano, proporcionar elementos nutritivos o impedir que se produzcan las reacciones de-

MÉTODOS NORMALIZADOS

seadas. Se fecharán los productos químicos y los reactivos cuando se reciban y cuando se abran por primera vez. Se disolverán los reactivos a volumen en matraces volumétricos y se almacenarán en botellas de plástico inerte de buena calidad o de vidrio de borosilicato, con tapones de borosilicato, polietileno o plástico. Se etiquetarán los reactivos preparados anotando el nombre y la concentración, la fecha de preparación y las iniciales del preparador. Se incluirán cultivos de control positivos y negativos en cada serie de cultivos o de pruebas bioquímicas. f) Colorantes y tinciones: En los análisis microbiológicos se utilizan compuestos químicos orgánicos como agentes selectivos (por ejemplo, verde brillante), como indicadores (por ejemplo, lactosa de rojo de fenol) y como colorantes microbiológicos (por ejemplo, la tinción de Gram). Los colorantes comercializados presentan variaciones entre lotes en cuanto al porcentaje de colorante, complejo colorante, materiales insolubles y materiales inertes. Puesto que los colórantes utilizados en microbiología deben tener una potencia y estabilidad adecuadas para producir las reacciones correctas, sólo se utilizarán productos certificados por la Biological Stain Commission estadounidense (o el organismo equivalente en cada país). Se comprobarán las tinciones microbiológicas antes de utilizarlas realizando al menos un control positivo y otro negativo, y se registrarán los resultados. g) Filtros de membrana y almohadillas: La calidad y características funcionales de los filtros de membrana varían según el fabricante, el tipo y el lote. Estas variaciones son consecuencia de diferencias en los métodos de fabricación, los materiales, el control de calidad y las condiciones de almacenamiento. 1) Los filtros de membrana y las almohadillas para los análisis del agua deben cumplir las siguientes especificaciones:

EXAMEN MICROBIOLÚGICO DE LAS AGUAS

a) Filtro de 47 mm de diámetro, con un diámetro medio de poro de 0,45 µm. Pueden utilizarse otros tamaños de filtro y de poro, siempre que el fabricante proporcione datos que demuestren que sus características funcionales son iguales o superiores a las del filtro de 47 mm de diámetro y 0,45 µm de tamaño de poro. Al menos el 70 por 100 de la superficie del filtro debe corresponder a poros. b) Cuando se hace flotar el filtro en agua para reactivo, el agua se difunde de manera uniforme por él en 15 segundos, sin dejar zonas secas. c) Las velocidades de flujo son de al menos 55 ml/min/cm2 a 25 °C y una presión diferencial de 93 kPa. d) Los filtros no deben ser tóxicos, ni contener sustancias que inhiban o estimulen el crecimiento bacteriano, o materiales que interfieran, directa o indirectamente, en los sistemas indicadores bacterianos presentes en el medio; la trama de tinta no es tóxica. La media aritmética de cinco recuentos en los filtros debe ser al menos igual al 90 por 100 de la media aritmética de los recuentos en cinco placas difusas de agar, utilizando el mismo volumen de muestra y el mismo medio de agar. e) Los filtros deben retener los microorganismos de una suspensión de 100 mi de Serratia marcescens con 1 x 103 células. f) Los extractos acuosos del filtro no deben superar el 2,5 por 100 después de hervir la membrana en 100 ml de agua para reactivo durante 20 minutos, secarla, enfriarla y llevarla a un peso constante. g) Las almohadillas absorbentes tienen un diámetro de 47 mm, un grosor de 0,8 mm y pueden absorber 2,0 ± 0,2 ml de caldo Endo. h) Las almohadillas liberan menos de 1 mg de la acidez total calculada en forma de CaCO3 cuando se titulan al punto límite de fenolftaleína con NaOH al 0,02N.

9-17

1) Si el filtro y la almohadilla absorbente no son estériles, no deben degradarse mediante esterilización a 121 °C durante 10 minutos. Se confirmará la esterilidad por la ausencia de crecimiento cuando se coloca un filtro de membrana sobre una almohadilla saturada con extracto de glucosa triptona líquido o extracto de glucosa triptona agar y se incuba a 35 °C durante 24 horas. 2) Pruebas estandarizadas: Existen pruebas estandarizadas para valorar la retención, la recuperación, los extractos y la velocidad de flujo de los filtros de membrana2. Algunos fabricantes proporcionan más información de la que exigen las normas y certifican que sus filtros de membrana son satisfactorios para análisis de agua. Informan sobre la retención, el tamaño del poro, la velocidad de flujo, la esterilidad, el pH, el porcentaje de recuperación y los límites de determinados extractos químicos orgánicos e inorgánicos. Para mantener el control de calidad, hay que inspeccionar cada lote de membranas antes de utilizarlo y durante la realización de las pruebas, a fin de asegurarse de que son redondeados y flexibles, y no se distorsionan las tramas tras su paso por el autoclave. Después de la incubación, deben desarrollarse colonias con color y forma bien definidos, según indique el método de análisis. La tinta de la trama no debe dar lugar a que se concentren las colonias a lo largo de sus líneas ni limitar el desarrollo de los microorganismos. Las colonias han de estar distribuidas de manera uniforme por la superficie de la membrana. h) Medios de cultivo: Dado que los métodos de cultivo dependen de que la preparación de los medios haya sido adecuada, se emplearán los mejores materiales y técnicas disponibles en la preparación, conservación y aplicación de los medios. Para el control de calidad se utilizarán medios comerciales siempre que

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sea posible, aunque sin olvidar que presentan variaciones dependiendo del fabricante e incluso del lote. Existe una placa de recuento de agar estándar de referencia, que suministra la APHA para uso de los fabricantes, quienes, después de las pruebas adecuadas, pueden certificar que sus medios cumplen las especificaciones y normas de la APHA. Puesto que para otros medios de los enumerados en el capítulo 9000 no existe este tipo de normalización, en el apartado 3d anterior se describen las pruebas pertinentes. Los medios se comprarán en cantidades tales que no haya que almacenarlos durante más de 1 año, y se utilizarán de acuerdo con el principio de que los primeros productos en entrar sean los primeros en salir. Se preferirán los envases de 114 g a los de 454 g, para mantenerlos sellados el mayor tiempo posible. Se registrarán el tipo, la cantidad y el aspecto de los medios recibidos, el número de lote, y las fechas de caducidad, de recepción y apertura. Se comprobará el inventario cada 3 meses para reordenar las existencias. Se desecharán los medios solidificados, decolorados o que muestren cualquier otro signo de deterioro. Puesto que las condiciones de temperatura, luz y humedad difieren de unos laboratorios a otros, es imposible establecer límites absolutos de conservación para los medios no abiertos. Un límite razonable para una botella no abierta es de 2 años a temperatura ambiente. Si los envases tienen más de 1 año de antigüedad, se compararán los resultados de los cultivos puros recientes y las muestras naturales con el medio antiguo y otro de un lote comprobado. Los medios se utilizarán hasta 6 meses después de abierto el envase. Tras la apertura de las botellas, se guardarán inmediatamente después de su empleo en un desecador. 1) Preparación de los medios: Se prepararán los medios en recipientes de al

MÉTODOS NORMALIZADOS

menos el doble de volumen que el medio que se va a preparar. Deben agitarse, sobre todo los agares, durante el calentamiento. Con el fin de evitar que el medio se caliente demasiado o hierva, se utilizará un baño de agua en ebullición para lotes pequeños y se vigilarán continuamente los volúmenes mayores mientras permanezcan sobre el calentador de placa o el mechero de gas. Lo mejor es utilizar combinaciones de agitadores magnéticos y calentadores de placa. Todos los medios se prepararán con agua desionizada o destilada de calidad comprobada. Los volúmenes de agua y de medio se medirán con probetas graduadas o pipetas que cumplan las normas NIST y APHA, respectivamente. En muestras potencialmente contaminadas no deben utilizarse pipetas de aspiración. Tras la preparación y conservación, se fundirán los medios de agar con agua en ebullición o al vapor. Una vez realizada la esterilización y preparación, se determinará el pH de una porción de cada medio. Para ello se utilizará una sonda de superficie en el caso de medios sólidos. Se registrarán los resultados. Los ajustes finos del pH (< 0,5 unidades de pH) deben hacerse añadiendo soluciones de NaOH o HCl hasta conseguir el pH específico en la fórmula. Cuando la diferencia de pH sea superior a 0,5 unidades, se desechará el lote y se corregirá el problema. Los valores incorrectos del pH pueden deberse a problemas en el agua para reactivos, a un deterioro del medio o a una mala preparación. Se revisarán las instrucciones de preparación y se comprobará el pH del agua. Si éste es insatisfactorio, se preparará un nuevo lote de medio con agua procedente de una nueva fuente (véase 9020B.2d y e). Si el agua es adecuada, se repetirá y comprobará el medio; si el pH sigue siendo anómalo, se preparará medio procedente de otra botella. Se anotarán los problemas de pH en el libro de registro de los medios y se infor-

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EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

mará al fabricante si el origen del error está en el propio medio. Se examinarán los medios recién preparados para comprobar el color, el oscurecimiento o la posible precipitación, anotándose las observaciones. Hay que pensar en la posibilidad de que sean variaciones en el tiempo de esterilización y en la temperatura las causas del problema. Cuando no se detecte nada de lo anteriormente apuntado, se desechará el medio. 2) Esterilización: Los medios se expondrán a temperaturas de esterilización el tiempo mínimo especificado. Los autoclaves de doble pared permiten mantener una presión y una temperatura adecuadas en la camisa entre las cargas, reduciendo el peligro de alteraciones por el calor. Se seguirán las indicaciones del fabricante en cuanto a esterilización de cada medio. El tiempo de exposición necesario dependerá del tipo de material y de medio, de la presencia de carbohidratos y del volumen. En la tabla 9020:III se dan directrices para los casos más característicos. Los medios esterilizados se retirarán del autoclave tan pronto como la presión

en la cámara llegue a cero. Nunca se pasarán dos veces los medios por el autoclave. Se comprobará la eficacia de cada esterilización utilizando suspensiones o tiras de esporas de Bacillus stearothermophilus (comerciales) en el interior del instrumental de vidrio. La esterilización a 121 °C durante 15 minutos mata las esporas; si tras una incubación a 55 °C las esporas pasadas por el autoclave crecen, la esterilización ha sido incorrecta. Las soluciones de medios no aptas para el autoclave se esterilizarán mediante filtración a través de un filtro con poros de 0,22 µm de diámetro en un aparato de filtración y recogida estériles. Los medios se filtrarán y manipularán a ser posible en campana o cabina de seguridad. El material de vidrio (pipetas, placas de Petri, botellas de muestras) se esterilizará en un autoclave o en una estufa a 170 °C durante 2 horas. Para esterilizar el equipo, los materiales y demás productos sólidos o secos sensibles al calor, se expondrán a óxido de etileno en un esterilizador de gas. Se utilizarán tiras o suspensiones comerciales de esporas para com-

TABLA 9020:III. TIEMPO Y TEMPERATURA PARA ESTERILIZACIÓN EN AUTOCLAVE

9-20

probar la esterilización por calor seco o por óxido de etileno. 3) Utilización de agares y caldos: Se mantendrán los agares fundidos en un baño de agua a 44-46 °C hasta el momento de usarlos, aunque nunca por un período superior a 3 horas. Para controlar la temperatura del agar, se expondrá una botella de agua o de medio a las mismas condiciones de calentamiento y enfriamiento que el agar. Se introducirá el termómetro en la botella de control para determinar el momento en que se alcanzan los 44-46 °C, temperatura idónea para utilizar el agar en placas fluidas. Tras preparar las placas para hacer las estrías, se secarán las superficies del agar dejando las placas abiertas durante al menos 15 minutos en una campana bacteriológica para evitar la contaminación. Los tubos de fermentación estériles se manipularán cuidadosamente para evitar que penetre aire en su interior, ya que ello produce resultados positivos falsos en las reacciones. Se examinarán los tubos recién preparados para determinar la existencia o no de burbujas de gas. 4) Conservación de los medios: Se prepararán las cantidades de medios estériles que se vayan a utilizar dentro de los límites de tiempo indicados en la tabla 9020:IV. Cuando se refrigeren los medios en tubos de fermentación, se incubarán durante una noche antes de utilizarlos y se comprobará que no existen falsos positivos debidos a burbujas de gas. Los medios que deban conservarse durante más de 1 semana se prepararán en tubos o matraces con tapón de rosca o que ajusten bien para evitar la pérdida de humedad. Se introducirán las placas de agar fluidas ya preparadas en bolsas de plástico que se cerrarán herméticamente y se guardarán en refrigerador para que conserven la humedad. La comprobación de la pérdida de humedad en los tubos con caldo se realizará marcando el nivel original en varios

MÉTODOS NORMALIZADOS

tubos de cada lote para comprobar si desciende. Cuando la pérdida calculada supere el 10 por 100, se rechazarán los tubos. Se protegerán de la luz los medios que contienen colorantes y se desecharán si se observan cambios de coloración. Los caldos y agares estériles comercializados resultan ventajosos cuando sólo se hacen análisis de forma intermitente, cuando no se dispone de suficiente personal para el trabajo de preparación o cuando puede compensarse el coste con otros aspectos del funcionamiento del laboratorio. Se comprobarán las características funcionales de estos medios como se indica a continuación, en el apartado 5. La tabla 9020:IV recoge los límites de tiempo para la manipulación de los medios preparados. 5) Control de calidad de los medios preparados: Se llevará un libro con el registro completo de cada lote de medios preparados; en él constará el nombre del TABLA 9020:IV. TIEMPO DE MANTENIMIENTO PARA MEDIOS PREPARADOS

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EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

preparador y la fecha, el nombre y número del lote de medio, la cantidad de medio en peso y volumen, el tiempo y temperatura de esterilización, las determinaciones y ajustes del pH y la preparación de los componentes lábiles. Se incluirán cultivos de control estériles y positivos y negativos en todos los medios. 4. Procedimientos de control de calidad analítica a) Procedimientos de control de calidad general: 1) En las pruebas de filtros de membrana se comprobará la esterilidad de los medios, de los filtros de membrana, del agua de dilución y lavado y del material de vidrio y el equipo al menos al final de cada serie de muestras, utilizando para ello una muestra de agua estéril. 2) En los procedimientos de tubo múltiple se comprobará la esterilidad del agua de dilución, de los medios y del material de vidrio. Para comprobar la esterilidad de los medios, se incubará una porción representativa de cada lote a una temperatura adecuada durante 24-48 horas y se observará si se produce crecimiento. Se comprobará cada lote de agua de dilución añadiendo 20 ml de agua a 100 ml de un caldo no selectivo. Otra forma consiste en pasar asépticamente al menos 100 ml de agua para

dilución a través del filtro de membrana y colocarlo en un medio adecuado para bacterias heterótrofas. Se incuba a 35 ± 0,5 °C durante 24 horas y se vigila el crecimiento. Si se aprecia algún tipo de contaminación, no se tendrán en cuenta los datos analíticos obtenidos en las muestras estudiadas con esos materiales y se solicitará una nueva toma de muestras. 3) Se comprobarán los procedimientos analíticos en cada lote de medios, utilizándolos con controles positivos y negativos conocidos de los microorganismos que se van a analizar. Véase la tabla 9020:V para ejemplos de cultivos de prueba. 4) Se harán análisis duplicados en un 5 por 100 de las muestras o, al menos, en una muestra por cada tanda de pruebas. 5) En los laboratorios que cuenten con más de un analista se harán, una vez al mes, análisis paralelos de al menos una muestra positiva. b) Determinación de la precisión del método: Se calculará la precisión de los análisis duplicados de cada tipo de muestra estudiada (por ejemplo, agua potable, agua residual, etc.) de acuerdo con el siguiente procedimiento: 1) Se realizarán análisis duplicados de las primeras 15 muestras positivas de un tipo concreto. Cada grupo de duplicados lo analizará el mismo analista, aunque participarán todos los analistas del

TABLA 9020:V. CULTIVOS DE CONTROL PARA PRUEBAS MICROBIOLÓOICAS

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MÉTODOS NORMALIZADOS

laboratorio. Se registrarán los análisis duplicados con D1 y D2. 2) Se calculará el logaritmo de cada resultado. Si en algún grupo de duplicados uno de los resultados es cero, se sumará 1 a ambos valores antes de calcular los logaritmos. 3) Se calculará el rango (R) de cada par de duplicados transformados como la media (R) de estos rangos. En la tabla 9020:VI se ofrece un ejemplo de cálculo. 4) Se analizará después por duplicado el 10 por 100 de las muestras convencionales. Se transformarán los duplicados como se indica en el apartado 2 y se calculará su rango. Si éste es superior a 3,27 R, la variabilidad de los analistas es excesiva. Se determinará si es aceptable un aumento de la imprecisión; de no ser así, se desestimarán todos los resultados analíticos obtenidos desde la última comprobación de la precisión (véase la tabla 9020:VII). Se identificará y resolve-

rá el problema antes de seguir haciendo análisis. 5) Se actualizará el criterio utilizado en el apartado anterior repitiendo de forma periódica los procedimientos indicados en los apartados 1, 2 y 3; se utilizarán para ello los conjuntos de 15 resultados duplicados más recientes. c) Control de calidad de las pruebas de dilución en tubo múltiple: 1) Análisis completo: Para los análisis habituales, se hará la prueba completa (9221B.3) sobre el 10 por 100 de las muestras positivas. Si no se obtienen resultados positivos con muestras de agua potable, se completará al menos una fuente positiva de agua al trimestre. 2) Comprobación para supresión: En muestras de agua de suministro público con antecedentes de fuerte crecimiento sin gas en tubos de fase presuntiva, se procederá a realizar en esos tubos la fase

TABLA 9020:VI. CÁLCULO DEL CRITERIO DE PRECISIÓN

EXAMEN MICROBIOLÚGICO DE LAS AGUAS

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TABLA 9020:VII. COMPROBACIONES DIARIAS DE LA PRECISIÓN DE LOS RECUENTOS DUPLICADOS*

confirmatoria (9221B.2) para comprobar la existencia de bacterias coliformes. d) Control de calidad de los procedimientos de filtro de membrana: 1) Verificación de la formación de colonias: Se comprobará mensualmente en cada tipo de prueba realizada la formación de colonias de una muestra positiva conocida. Si el laboratorio dispone de dos o más analistas, se pedirá a cada uno de ellos que haga una vez al mes un recuento de las colonias típicas en las misma membrana de una muestra positiva. Se verificará la formación de colonias en la membrana y se compararán los recuentos de los analistas con el recuento verificado. 2) Análisis de coliformes totales: Se verificará recogiendo al menos 10 colónias y comprobando la fermentación de la lactosa o, alternativamente, haciendo pruebas bioquímicas rápidas o sistemas multianálisis: Para muestras de agua potable3 se verificarán todas las colonias brillantes contadas como coliformes, con independencia de la cantidad de brillo, cuando este número esté comprendido entre 5 y 10/100 ml, ambos incluidos. Cuando el número sea superior a 10/100 ml, se verificarán al menos 10 colonias representativas de todos los tipos de brillo elegidas de forma aleatoria. Si las muestras de agua potable no dan resultados positi-

vos, se analizará al menos una fuente de agua positiva conocida al trimestre. a) Fermentación de la lactosa: Se transferirán al menos 10 colonias brillantes consideradas como coliformes a tubos con caldo de lauril triptosa y verde brillante lactosa bilis. Se incubarán a 35 ± 0,5 °C y se estudiará la formación de gas a las 24 y a las 48 horas. Si sólo forma gas en los tubos de lauril triptosa una colonia determinada, se traslada el crecimiento del tubo positivo a otro con verde brillante lactosa bilis y se repite la prueba. La producción de gas en el caldo de verde brillante lactosa bilis a las 48 horas indica que los microorganismos son coliformes y excluye resultados positivos falsos. Lo ideal es tomar al menos 10 colonias no brillantes para confirmar la ausencia de resultados negativos falsos. b) Pruebas bioquímicas alternativas: Estas pruebas exigen cultivos aislados (separados más de 2 mm) y colonias puras. Si se sospecha que una colonia es mixta, se siembra en un medio M-Endo por medio de estrías y se toma una colónia aislada antes de pasar a las fases descritas en el apartado c) o en el d), o se utiliza el método de fermentación en tubos descrito en el apartado a). A continuación se pasa a la fase descrita en el apartado a) o el d). c) Prueba rápida: Realícese el análisis de citocromo oxidasa (CO) para indofe-

9-24

nol y el de o-nitrofenil-β-D-galactopiranósido (ONPG) para la β -D-galactosidasa. Se ha comercializado un equipo para realizar estos análisis. Una prueba CO negativa y ONPG positiva confirma que la colonia es coliforme. Prueba de la citocromo oxidasa: Sígase el procedimiento descrito en la sección 9225E.7. Prueba ONPG: Prepárese una solución de fosfato monosódico 1,0M disolviendo 6,9 g de NaH 2 PO 4 · H 2 O en 45 ml de agua para reactivos, añadiendo 3 ml de NaOH al 30 por 100 y ajustando el pH a 7,0. Dilúyase a 50 ml y consérvese en el frigorífico. Prepárese una solución de ONPG disolviendo 80 mg de o-nitrofenil-β-D-galactopiranósido (ONPG) en 15 ml de agua a 37 °C y añadiendo 5 ml 1M de NaH2PO4 (la solución debe ser incolora). Guárdese en el frigorífico. Antes de usarla, se calentará a 37 °C una porción suficiente para el número de pruebas que se vaya a efectuar. Emulsiónese un asa de crecimiento procedente de cada uno de los cultivos en placa inclinada durante 18-24 horas en un tubo de fermentación de 10 x 75 mm o en una placa de gotas. Añádase una gota de tolueno a cada tubo o pocilio y agítese bien. Déjense reposar los tubos durante 5 minutos en un baño de agua a 35 °C. Añádanse 0,25 ml de la solución ONPG tamponada a cada tubo e incúbense de nuevo en el baño de agua a 35 °C. Se leerán los títulos de los tubos o las placas de gotas transcurridas 0,5, 1 y 24 horas. La aparición de un color amarillo indica un resultado positivo. d) Sistemas multiprueba: Inocúlese una parte de la colonia en un sistema comercial multiprueba que contenga pruebas de fermentación de la lactosa y/o CO y ONPG. 3) Análisis de coliformes fecales: Verifíquese su presencia tomando al menos 10 colonias definidas de las membranas

MÉTODOS NORMALIZADOS

de un medio M-FC con las típicas colónias azules y pasándolas a un caldo de lauril triptosa. Incúbense a 35 °C durante 24 y 48 horas, y examínese la producción de gas. Pásese el crecimiento de los tubos positivos a un caldo EC e incúbese a 44,5 °C durante 24 horas. La producción de gas en los tubos EC confirma la presencia de microorganismos coliformes fecales. 4) Análisis de estreptococos fecales: Compruébese su presencia tomando al menos 10 colonias definidas esculinapositivas de un agar m-E o colonias rojas de un agar m-enterococos. Pásense a agar y caldo con infusión de encéfalo y corazón (IEC). Hágase una prueba de catalasa en los cultivos al cabo de 24 horas. Pásense los cultivos catalasa negativos (posibles estreptococos fecales) a un medio IEC con 40 por 100 de bilis e incúbense a 35 °C. Se pasarán asimismo a caldo IEC y se incubarán a 45 °C. El crecimiento en bilis al 40 por 100 y 45 °C confirma que se trata de estreptococos fecales. 5) Análisis de Escherichia coli: Verifiquese su presencia tomando al menos 10 colonias amarillas o amarillo-pardas bien definidas de una prueba de ureasa y pasándolas a placas de agar nutritivo o a cultivos inclinados y a un caldo con soja tripticasa. Incúbense el agar y los cultivos en caldo durante 24 horas a 35 °C. Tómese una buena cantidad del crecimiento del agar nutritivo con un asa de platino y deposítese en un papel de filtro previamente saturado con reactivo de citocromo oxidasa (CO) preparado ese mismo día. La aparición en 15 segundos de un color púrpura intenso en el lugar donde se han depositado las bacterias indica que el resultado es positivo. Pásese el crecimiento del medio de soja tripticasa a agar citrato de Simmons, a caldo de triptona y a caldo EC en un tubo de fermentación. El agar citrato de Simmons se incuba durante 24 horas y el caldo de triptona durante 48 ho-

9-25

EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

ras a 35 °C. El medio EC se incuba en un baño de agua a 44,5 °C durante 24 horas, asegurándose de que el nivel del agua está por encima del caldo EC contenido en el tubo. Añádanse 0,5 ml de reactivo indol de Kovac al cultivo de 48 horas en caldo de triptona y agítese suavemente. La aparición de un color rojo intenso en la capa de alcohol indica que el resultado es positivo. E. coli es un organismo formador de gas, indol positivo y oxidasa negativo, y no crece en un medio con citrato. También pueden utilizarse los sistemas comercializados de identificación multiprueba con el fin de verificar las colonias. Se elegirá un sistema multiprueba para Enterobacteriaceae que contenga fermentación de lactosa y/o pruebas ONPG y CO. 6) Análisis de enterococos: Verifíquese su presencia tomando al menos 10 colonias bien definidas rosadas o rojas con un precipitado negro o pardo-rojizo procedentes del agar EIA y pasándolas a un caldo con infusión de encéfalo y corazón (IEC) y a una pendiente de agar IEA. Incúbense los tubos de caldo durante 24 horas y los cultivos en pendiente durante 48 horas a 35 °C. Tras la incubación de 24 horas, pásese un asa del material del caldo IEC a agar bilis esculina (ABE) y a caldo IEC con NaCl al 6,5 por 100, incubándolos durante 48 horas a 35 °C. Pásese otra asa del material procedente del caldo IEC de 24 horas a un tubo con caldo IEC e incúbese otras 48 horas a 45 °C. Obsérvese el crecimiento. La tinción de Gram del cultivo en pendiente de agar IEC a las 48 horas permitirá considerar como enterococos los cocos grampositivos que hayan crecido en IEC e hidrolicen la esculina, y que hayan crecido en caldo IEC a 10 y a 45 °C y en caldo IEC + NaCl al 6,5 por 100. 5.

años. Pueden conservarse los informes de laboratorio completos o trasladarse los datos a tablas resumen, siempre que en ellas se incluya la siguiente información: fecha, lugar y momento de la toma de la muestra, y nombre de la persona que la realizó; identificación de la muestra; fecha de recepción de la muestra y de realización del análisis; persona(s) responsable(s) de la realización del análisis; método analítico utilizado; datos no procesados y resultados calculados del análisis. Se comprobará que todos los resultados se han introducido correctamente y están firmados por el analista. Si se utiliza un sistema de almacenamiento y recuperación de la información, se hará una doble comprobación de las salidas impresas. 6. Tratamiento de los datos a)

Distribución

de

las

poblaciones

bacterianas: En la mayoría de los análisis químicos, la distribución de los resultados sigue una curva de Gauss: hay una distribución simétrica de los valores en torno a la media (véase sección 1010B). Sin embargo, las distribuciones microbianas no son necesariamente simétricas. A menudo los recuentos de bacterias se caracterizan por mostrar una distribución asimétrica, debido a la presencia de muchos valores bajos y unos cuantos altos. Esta característica da lugar a una

Registros e informes

Los registros de los análisis bacteriológicos se guardarán durante al menos 5

Figura 9020:1. Curva de frecuencia (con distribución desviada positiva).

9-26

MÉTODOS NORMALIZADOS

media aritmética considerablemente superior a la mediana. La curva de frecuencia de esta distribución tiene un largo extremo derecho, tal como se observa en la figura 9020:I; se dice entonces que presenta asimetría positiva. La aplicación de las técnicas estadísticas más rigurosas exige trabajar con distribuciones simétricas semejantes a la curva normal. En consecuencia, a menudo es necesario convertir los datos de una distribución asimétrica para aproximarlos a los de una distribución normal. Puede obtenerse una distribución aproximadamente normal a partir de datos con asimetría positiva hallando sus logaritmos, como se muestra en la tabla 9020:VIII. Comparando las tablas de frecuencia de los datos originales (tabla 9020:IX) y de sus logaritmos (tabla 9020:X) se observa que la logarítmica se aproxima a una distribución simétrica. b) Medidas de tendencia central de las distribuciones asimétricas: Cuando los lo-

garitmos de los números de una distribución asimétrica positiva muestran una distribución aproximadamente normal, los datos originales tienen una distribución logarítmica normal. La mejor medida de tendencia central de los datos logarítmicos normales es la media geométrica, que se define como:

y

Es decir, la media geométrica es igual al antilogaritmo de la media aritmética de los logaritmos. Así, por ejemplo, las SÍTABLA 9020:IX. COMPARACIÓN DE LAS FRECUENCIAS DE LOS DATOS DE NMP

TABLA 9020:VIII. RECUENTOS DE COLIFORMES Y LOGARITMOS CORRESPONDIENTES

TABLA 9020:X. COMPARACIÓN DE LAS FRECUENCIAS DE LOS DATOS DE LOG NMP

9-27

EXAMEN MICROBIOLÚGICO DE LAS AGUAS

guientes medias calculadas a partir de los datos de la tabla 9020:VIII son absolutamente diferentes:

media geométrica:

ards, Part 31, Water. American Soc. Testing & Materials, Filadelfia, Pennsylvania. U.S. ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENCY. 1982. Manual for the Certification of Laboratories Analyzing Drinking Water, Criteria and Procedures. EPA-570/9-82-002, U.S. Environmental Protection Agency, Washington, D.C.

8. Bibliografía

y media aritmética:

Por tanto, aunque por exigencias de la normativa o por tradición se informe de los datos microbiológicos reseñando su media aritmética o su mediana, el valor estadístico más adecuado para resumir datos microbiológicos es la media geométrica. 7. 1.

Referencias BORDNER, R. H., J. A. WlNTER & P. V. SCARPINO ,

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9020 C. 1.

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Control de calidad interlaboratorios

Discusión

Un programa de control de calidad interlaboratorios es un sistema de requisitos convenidos y de prácticas de laboratorio orientadas a mantener unos estándares mínimos de calidad entre el grupo de laboratorios participantes. Para establecer un programa de este tipo, los

participantes deben adoptar primero unos procedimientos uniformes de toma de muestras y una metodología analítica estandarizada. Se establecen estándares mínimos para el funcionamiento del laboratorio (personal, instalaciones, equipo, suministros, tratamiento de datos y control de calidad). Una vez establecidos los métodos y los

MÉTODOS NORMALIZADOS

9-28

estándares de funcionamiento del laboratorio, una entidad independiente inspecciona las instalaciones y lleva a cabo estudios de validación de métodos y de evaluación del rendimiento. Aunque tanto los estudios del primer tipo como los del segundo especifican la metodología analítica, con la validación de métodos se establecen la exactitud y los sesgos (recuperación) de los métodos elegidos, mientras que con la evaluación del rendimiento, además de valorarse este aspecto del trabajo del laboratorio, se establecen los límites de aceptación. Es parte esencial del control de calidad interlaboratorios la identificación y el seguimiento de los problemas con ayuda técnica. Un ejemplo de garantía de calidad interlaboratorios es el programa federal estatal estadounidense para la homologación de laboratorios de suministro de agua, desarrollado de acuerdo con la Safe Drinking Water Act y sus enmiendas1. En este programa de homologación, los laboratorios de suministro público de agua deben homologarse según los criterios y procedimientos mínimos y la garantía de calidad descritos en el manual de la EPA sobre esta materia2: se fijan criterios para el funcionamiento y la metodología de los laboratorios; se establece la obligatoriedad de llevar a cabo inspecciones sobre el terreno para que la entidad estatal o su delegado verifique los estándares mínimos; los laboratorios deben realizar anualmente pruebas de aceptabilidad con muestras desconocidas en estudios formales, si se dispone de ellas; la autoridad responsable efectúa el seguimiento de los problemas identifica-

dos en la inspección sobre el terreno o en la evaluación del rendimiento y exige que se hagan las correcciones necesarias en un período de tiempo determinado. Los programas de cada estado pueden seguir criterios más exigentes que los federales. Las inspecciones de laboratorios sobre el terreno dentro de este programa de homologación ponen de manifiesto que las causas fundamentales de discrepancia entre laboratorios dedicados al estudio del agua potable son la inadecuación de los equipos, la deficiente preparación de los medios, el empleo de métodos analíticos incorrectos y las deficiencias de formación del personal. El manual de la EPA sobre métodos microbiológicos3 proporciona orientación complementaria con respecto a la toma de muestras, la metodología analítica y las prácticas de garantía de calidad.

2. 1.

Referencias

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9-29

EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

9030

INSTRUMENTAL DE LABORATORIO* 9030 A.

Se incluyen en esta sección las especificaciones del instrumental de un laboratorio microbiológico. Para los procedi-

9030 B. 1.

Introducción mientos de comprobación y mantenimiento relacionados con el control de calidad, véase la sección 9020.

Especificaciones del equipo

Incubadoras

Las incubadoras deben mantener una temperatura uniforme y constante en todo momento y en todas las zonas, es decir, no debe haber diferencias superiores a ± 0,5 °C entre las zonas que se utilizan. Esta exactitud se consigue empleando incubadoras con camisa de agua o de tipo anhidro, dotadas de unidades de calentamiento eléctricas de baja temperatura controladas por termostato, adecuadamente aisladas e instaladas en las paredes o el suelo de la cámara, o cerca de los mismos, y equipadas, a ser posible, con sistemas mecánicos de circulación de aire. Las incubadoras equipadas con unidades de calentamiento de alta temperatura resultan insatisfactorias, ya que estas fuentes de calor, cuando se colocan de manera inadecuada, suelen provocar sobrecalentamiento y desecación excesiva de los medios, con la consiguiente inhibición del crecimiento bacteriano. Las incubadoras con este sistema de calefacción pueden funcionar bien si se sustituyen las unidades de alta temperatura por una instalación preparada para trabajar a temperatura más baja y se instalan dispositivos mecánicos de circulación del aire. Cuando la temperatura ambiente presenta oscilaciones excesivas, es conve* Aprobado por el Standard Methods Committee, 1988.

niente mantener las incubadoras en salas especiales con una temperatura inferior en varios grados a la recomendada por el fabricante. También pueden utilizarse salas especiales de incubación, bien aisladas y equipadas con unidades de calentamiento adecuadamente distribuidas, que cuenten con circulación forzada del aire y entradas de intercambio de aire, siempre que se mantengan dentro de los límites de temperatura deseados. Cuando se utilice este tipo de salas, se registrará diariamente la amplitud térmica de las zonas donde se encuentran las placas o tubos. Las incubadoras estarán provistas de rejillas metálicas o estantes perforados, distribuidos de forma que quede asegurado el mantenimiento de una temperatura uniforme en toda la cámara. Hay que dejar un espacio de 2,5 cm entre las paredes y las pilas de placas o cestas de tubos. Se colocará un termómetro exacto, conforme a las normas del National Institute of Standards and Technology (NIST) estadounidense (o del organismo equivalente en cada país), con la ampolla sumergida en líquido (agua, glicerina o aceite mineral), en cada uno de los estantes en uso dentro de la incubadora, y se registrarán las lecturas diarias de temperatura (preferiblemente por la mañana y por la tarde). Además, es conveniente colocar un termógrafo de máxima y mínima en el interior de la incubadora, en

9-30

MÉTODOS NORMALIZADOS

uno de los estantes intermedios, o registrar la amplitud térmica a lo largo de las 24 horas. Se determinarán a intervalos las variaciones de temperatura en el interior de la incubadora cuando esté ocupada al máximo de su capacidad. Siempre que sea posible, se instalará un termógrafo, para contar con un registro de temperatura continuo y permanente. Para mantener una temperatura de 44,5 °C ± 0,2 °C suele ser necesario un baño de agua con una cubierta que reduzca la pérdida de agua y calor, o una incubadora de inmersión sólida de calor. Si no se consigue un control satisfactorio de la temperatura, se instalará un sistema de recirculación del agua. Se mantendrá en la incubadora una profundidad de agua suficiente como para poder sumergir los tubos hasta un nivel superior al de los medios. 2. Estufas de esterilización por aire caliente

Se emplearán estufas de esterilización por aire caliente de un tamaño suficiente para evitar sobrecargarlas, proyectadas para proporcionar temperaturas de esterilización uniformes y adecuadas de 170 ± 10 °C, y provistas de termómetros adecuados. Pueden utilizarse asimismo instrumentos de registro de la temperatura. 3.

Autoclaves

Los autoclaves tendrán un tamaño suficiente para evitar sobrecargarlos; estarán proyectados para proporcionar una temperatura uniforme dentro de la cámara (incluso a la temperatura de esterilización de 121 °C); contarán con un termómetro exacto cuya ampolla estará situada en la tubería de salida, de forma que registre la temperatura mínima del interior de las cámaras de esterilización

(opcionalmente, puede recurrirse a un instrumento de registro de la temperatura); estarán equipados con un manómetro y válvulas de seguridad bien ajustadas, conectadas directamente a tuberías de suministro de vapor saturado dotadas de filtros apropiados para eliminar las partículas y las gotitas de aceite, o conectadas directamente a un generador especial de vapor (no utilizar vapor procedente de un generador tratado con aminas para reducir la corrosión), y deberán ser capaces de alcanzar la temperatura deseada en 30 minutos. Se comprobará, mediante pruebas químicas o de toxicidad, que el sistema de vapor no ha sido tratado con aminas u otros productos químicos anticorrosivos que puedan producir toxicidad. No es recomendable utilizar un autoclave vertical ni una olla a presión, por las dificultades para ajustar y mantener la temperatura de esterilización y los posibles riesgos que conlleva su uso. Si, en circunstancias especiales o en caso de urgencia, se utiliza una olla a presión, debe estar dotada de un manómetro eficaz y un termómetro cuya ampolla se encuentre 2,5 cm por encima del nivel del agua. 4.

Esterilizadores de gas

Se utilizarán esterilizadores equipados con controles automáticos capaces de llevar a cabo el ciclo completo de esterilización. Como gas de esterilización se usará óxido de etileno (PRECAUCIÓN: El óxido de etileno es tóxico; evitar su inhalación, ingestión y contacto con la piel. Además, este gas forma una mezcla explosiva con el aire a una proporción del 3-80 por 100) diluido al 10-12 por 100 en un gas inerte. Se dispondrá de un ciclo de control automático para evacuar la cámara de esterilización hasta al menos 0,06 kPa, mantener el vacío durante 30 minutos, ajustar la temperatura y la humedad, cargar la mezcla de óxido de etileno,

9-31

EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

mantener la presión al menos durante 4 horas, sacar el gas, evacuar hasta 0,0 kPa y, por último, volver a la presión atmosférica con aire estéril. La humedad, temperatura, presión y tiempo del ciclo de esterilización dependen de la mezcla de gas utilizada. Se guardarán durante una noche las botellas de muestras esterilizadas con gas sin ajustar los tapones, para dejar que se disipen los residuos de mezcla gaseosa. Los medios esterilizados con gas se incubarán durante una noche para asegurarse de que se ha disipado el gas. En general, las mezclas de óxido de etileno con hidrocarburos clorados deterioran los plásticos, aunque este efecto es mínimo con temperaturas inferiores a 55 °C, una presión del gas no superior a 35 kPa y un tiempo de esterilización inferior a 6 horas. Si se utiliza dióxido de carbono como diluyente del óxido de etileno, se aumentarán el tiempo de exposición y la presión, dependiendo de la temperatura y la humedad que puedan utilizarse. Se determinará el ciclo y la mezcla de gas adecuados para los objetos que se vayan a esterilizar, confirmándose esta adecuación mediante ensayos de esterilidad.

6.

Se utilizarán pHmetros electrónicos, de una exactitud de al menos 0,1 unidades de pH, para determinar los valores de pH de los medios. 7.

Equipo óptico de recuento

a) Placas fluidas y difusas: Se utilizará un contador de colonias de tipo Quebec, preferiblemente un modelo con campo oscuro, u otro que proporcione unos aumentos equivalentes (1,5 diámetros) y una visibilidad satisfactoria. b) Filtros de membrana: Se utilizará un microscopio binocular de 10 a 15 aumentos. Se dispondrá de iluminación fluorescente luz de día, con un ángulo de 60-80° sobre las colonias; para las no pigmentadas, se usará una iluminación de ángulo bajo. c) Recuento mecánico.

Balanzas

Se utilizarán balanzas con una sensibilidad de al menos 0,1 g para cargas de 150 g y pesas adecuadas. Para pesar cantidades pequeñas (inferiores a 2 g) se utilizarán balanzas analíticas con una sensibilidad de 1 mg para una carga de 10 g. Las más recomendables son las balanzas de pesada rápida y un solo plato. 8. Utensilios para la preparación de medios

Se utilizará instrumental de vidrio de borosilicato o de otro material adecuado y no corrosivo, como el acero inoxidable. Empléese material de vidrio limpio y sin residuos, agar seco u otras sustancias extrañas capaces de contaminar los medios. 9.

5.

Equipo para pH

Pipetas y cilindros graduados

Se utilizarán pipetas del tamaño adecuado, siempre que suministren el volumen necesario con exactitud y rapidez. El error de calibración para un determinado lote no debe superar el 2,5 por 100. Se emplearán pipetas con la graduación claramente marcada y la punta intacta. Las pipetas de transferencia bacteriológica o las que cumplen las normas APHA son las más recomendables. No debe pipetearse con la boca: utilícese un sistema mecánico. Se utilizarán cilindros graduados que cumplan las normas ASTM (D-86 y D-216) y con los límites de exactitud establecidos por el NIST.

9-32

10.

MÉTODOS NORMALIZADOS

Recipientes para pipetas

Se utilizarán cajas de aluminio o acero inoxidable, cilíndricas o rectangulares, de 5 a 7,5 cm de anchura y una longitud aproximada de 40 cm. Cuando no se disponga de ellas, se sustituirán por envolturas de papel individuales. Para evitar un chamuscamiento excesivo durante la esterilización, se empleará un papel de pasta de sulfato (papel Kraft) de primera calidad. No se utilizarán latas o cajas de cobre ni de aleaciones de cobre para guardar las pipetas. 11.

Frigorífico

Se utilizará un frigorífico que mantenga una temperatura de 1 a 4,4 °C para guardar las muestras, medios, reactivos, etcétera. No se guardarán disolventes volátiles, alimentos ni bebidas en los frigoríficos donde haya medios. Los frigoríficos antiescarcha pueden provocar una deshidratación excesiva de los medios conservados durante más de 1 semana. 12. Instrumentos de control de la temperatura

Se utilizarán termómetros de vidrio o metal graduados a intervalos de 0,5 °C para controlar la mayoría de las incubadoras y frigoríficos. En el caso de incubadoras que deban funcionar a más de 40 °C, se utilizarán termómetros graduados a intervalos de 0,1 °C. Los instrumentos de registro continuo tendrán la misma sensibilidad. Se comprobará la exactitud contrastando las medidas con las de un termómetro homologado por el NIST o equivalente. 13.

pas de rosca cuyo revestimiento no produzca compuestos tóxicos o bacteriostáticos al ser esterilizado. No se utilizarán tapones de algodón para cerrarlos. Se marcarán las señales de graduación de forma indeleble en un lado de las botellas o tubos de dilución. Las botellas de vidrio pueden sustituirse por botellas de plástico no tóxico del tamaño adecuado, siempre que puedan ser esterilizadas correctamente. 14.

Placas de Petri

Para el recuento en placa se utilizarán placas de Petri de vidrio o plástico de alrededor de 100 x 15 mm. Empléense placas de fondo plano, sin burbujas ni estrías, de forma que el medio presente un grosor uniforme en toda la placa. Para la técnica de filtro de membrana se utilizarán placas de vidrio o plástico de tapa suelta de 60 x 15 mm, o placas de cierre hermético de 50 x 12 mm. Las placas de Petri se esterilizan y conservan en envases metálicos (de aluminio o acero inoxidable, nunca de cobre) o envueltas en papel –preferiblemente de pasta de sulfato (Kraft) de primera calidad– antes de esterilizarlas. 15.

Equipo de filtración de membrana

Se utilizarán embudos de filtración y soportes de membrana de acero inoxidable sin costuras, vidrio o plástico resistente al autoclave, que no tengan fugas ni sufran corrosión. Son aceptables los equipos de laboratorio de campo, pero son necesarios equipos y procedimientos normalizados para la filtración en laboratorio.

Botellas o tubos de dilución

Se utilizarán botellas o tubos de vidrio resistente, preferiblemente de vidrio de borosilicato, con tapones de vidrio o ta-

16.

Tubos y viales de fermentación

Se utilizarán tubos de fermentación de cualquier tipo, siempre que su diseño

EXAMEN MICROBIOLÚGICO DE LAS AGUAS

permita adaptarlos a las exigencias de concentración de ingredientes nutritivos en el medio y al volumen de éste que se describen más adelante. Cuando se utilicen tubos para una prueba de producción de gas, se introducirá un vial protegido en posición invertida. Se emplearán tubos y viales de un tamaño que permita que el vial esté completamente lleno de medio y sumergido, al menos parcialmente, en el tubo; serán lo suficientemente grandes como para que las burbujas de gas puedan verse con facilidad. 17.

Equipo de inoculación

Se utilizarán asas de aleación de níquel* o de platino-iridio para esterilización a la llama y de calibre 22 o 24. También son satisfactorias las asas de transferencia reutilizables de aluminio o acero inoxidable. Se utilizarán asas de al menos 3 mm de diámetro y se esterilizarán con calor seco o vapor. También puede recurrirse a los aplicadores desechables de madera dura. Deberán tener un diámetro de 0,2 a 0,3 cm y ser, como mínimo, 2,5 cm más largos que el tubo de fermentación; se esterilizan con calor seco y se conservan en recipientes de vidrio o de otro material no tóxico. 18.

Botellas de muestras

Para las muestras bacteriológicas se utilizarán botellas esterilizables de vidrio o plástico del tamaño y la forma adecuados. Se usarán botellas cuya capacidad permita guardar un volumen de muestra suficiente para todos los análisis necesarios, que dejen un espacio aéreo adecuado, que puedan lavarse con facilidad y que mantengan las muestras sin contaminar hasta que se haya acabado el estudio. Se recomiendan las botellas con tapón de * Chromel, nichrome o equivalente.

9-33

vidrio esmerilado, preferentemente de boca ancha y de un vidrio resistente. También son satisfactorias las botellas de plástico de tamaño adecuado, boca ancha y fabricadas con materiales no tóxicos, como el polipropileno, que pueden esterilizarse repetidas veces. Se han comercializado bolsas de plástico preesterilizadas, con o sin un agente declorante, que también pueden utilizarse. Los envases de plástico eliminan la posibilidad de rotura durante el transporte y reducen el peso. En las botellas para muestras pueden utilizarse tapones de rosca de plástico o metal con revestimientos, siempre que al esterilizarlos no produzcan compuestos tóxicos. Antes de esterilizarlas, se cubrirán con papel de aluminio o papel Kraft fuerte las bocas y los cuellos de las botellas de muestra con cierre de vidrio.

19.

Bibliografía

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MÉTODOS NORMALIZADOS

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eds. 1978. Microbiological Methods for Moni-

9040

LAVADO Y ESTERILIZACIÓN*

Se lavará cuidadosamente todo el instrumental de vidrio con un detergente adecuado y agua caliente, se enjuagará con agua caliente para eliminar todos los residuos del compuesto de lavado y, por último, se enjuagará con agua pura de laboratorio. Si se utilizan máquinas de lavado, deberán estar equipadas con un sistema de bombeo de acero inoxidable o de otro material no tóxico. No se utilizarán tuberías de cobre para la distribución del agua. Para la instalación de agua de enjuagado se empleará acero inoxidable .u otro material no tóxico. El material de vidrio se esterilizará, a menos que esté en recipientes de metal, durante no menos de 60 minutos a

9050

170 °C, salvo que se haya comprobado, mediante termómetros registradores, que la temperatura de la estufa es uniforme; si se da esta circunstancia excepcional pueden utilizarse 160 °C. Cuando el material de vidrio se encuentre en recipientes de metal se esterilizará a 170 °C durante al menos 2 horas. Las botellas de muestras que no sean de plástico se esterilizarán de la forma antes descrita o en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Antes de introducirlas en el autoclave hay que aflojar los tapones de las botellas de plástico para evitar que se deformen.

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO* 9050 A.

1.

toring the Environment, Water and Wastes. EPA-600/8-78-017, Environmental Protection Agency, Cincinnati, Ohio. AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION. 1985. Standard Methods for the Examination of Dairy Products, 15 ed. American Public Health Assoc, Washington, D.C.

Procedimientos generales

Conservación de medios de cultivo

Los medios deshidratados (en polvo) se conservarán, dentro de botellas bien cerradas, en lugares oscuros, a menos de 30 °C y en una atmósfera poco húmeda. No se utilizarán si presentan alteraciones de color o están apelmazados, y han perdido su carácter de polvo suelto. Los medios deshidratados se adquirirán en pe* Aprobado por el Standard Methods Committee, 1988.

quenas cantidades y se utilizarán dentro de los 6 meses siguientes a la apertura del envase. Además, se utilizarán medios deshidratados con agentes selectivos, como acida de sodio, sales biliares o sus derivados, antibióticos, aminoácidos sulfurados, etc., con un número de lote relativamente actual (hasta un año a partir de su compra) como forma de mantener una selectividad óptima. Véase también sección 9020. Prepárense los medios de cultivo en lotes que se utilizarán en menos de 1 se-

9-35

EXAMEN MICROBIOLOGICO DE LAS AGUAS

mana. Sin embargo, en tubos con tapón de rosca pueden guardarse los medios hasta 3 meses. Véase la tabla 9020:IV para detalles específicos. Los medios se mantendrán protegidos de la luz directa del sol, y se evitará su contaminación y evaporación excesiva. Los medios líquidos contenidos en tubos de fermentación, si se guardan en frigorífico o incluso a temperaturas moderadamente bajas, pueden disolver una cantidad de aire suficiente para producir burbujas en el tubo tras la incubación a 35 °C. Por tanto, todos los tubos de fermentación que hayan estado guardados a baja temperatura, se incubarán durante una noche antes de utilizarlos, desechándose los que contengan aire. Los tubos de fermentación pueden guardarse a una temperatura de alrededor de 25 °C; sin embargo, como en estas condiciones la evaporación puede ser rápida y dar lugar a importantes alteraciones de la concentración de los ingredientes, no deberán permanecer a esta temperatura más de 1 semana. Se desecharán los tubos cuya pérdida por evaporación sea superior a 1 ml. 2. Ajuste de la reacción

Se establecerá la reacción de los medios de cultivo en términos de concentración de iones hidrógeno, expresada en pH. El aumento de la concentración de iones hidrógeno (descenso del pH) durante la esterilización presentará ligeras variaciones de acuerdo con el tipo de esterilizador utilizado, por lo que será preciso conocer la reacción inicial necesaria para obtener una reacción final correcta. El descenso del pH suele ser de 0,1 a 0,2, pero puede llegar a 0,3 en medios de potencia doble. Cuando en el medio existen sales tamponadoras del tipo de los fosfatos, el valor de la disminución del pH es inapreciable.

Se harán pruebas con ayuda de un pHmetro para controlar el ajuste y conseguir la concentración de iones de hidrógeno requerida. La medición del pH de los medios preparados se hace de la forma expuesta en la sección 4500-H+. Se titula un volumen conocido del medio con una solución de NaOH hasta alcanzar el pH deseado. Se calcula la cantidad de solución de NaOH que habrá que añadir para que la totalidad del medio alcance esa reacción y, tras añadirla y mezclarla cuidadosamente, se comprueba la reacción, ajustando el medio cuando sea necesario. El pH final viene señalado en las instrucciones de preparación de cada medio. Si no se prescribe un pH determinado, no es necesario ajustar el medio. Si se reconstruyen los medios deshidratados siguiendo las instrucciones correspondientes, rara vez es necesario ajustar el pH; errores en la pesada del medio deshidratado o un sobrecalentamiento del medio reconstruido pueden dar lugar a pH inaceptables. Hay que medir sistemáticamente el pH, sobre todo el de los medios selectivos rehidratados, para garantizar el control de calidad y asegurar el cumplimiento de las especificaciones de preparación. 3.

Esterilización

Tras rehidratar un medio, hay que verterlo rápidamente en los vasos de cultivo y esterilizarlo dentro de las 2 horas siguientes. No deben conservarse medios no esterilizados. Se esterilizarán todos los medios, salvo los caldos con azúcar o los caldos con otras especificaciones, en un autoclave a 121 °C durante 15 minutos una vez alcanzada dicha temperatura. Cuando la presión llega a cero, se retiran los medios del autoclave y se enfrían rápidamente para evitar la descomposición de los azúcares por una exposición prolongada al

9-36

MÉTODOS NORMALIZADOS

calor. Para favorecer un calentamiento uniforme y un enfriamiento rápido, los materiales se colocarán de forma holgada en recipientes pequeños. Los caldos con azúcar se esterilizan a 121 °C durante 12-15 minutos. El tiempo máximo de exposición de los caldos con azúcar a cualquier clase de calor (desde el momento del cierre del autoclave cargado hasta la descarga) es de 45 minutos. Se utilizará preferentemente un autoclave de doble pared que permita realizar un precalentamiento antes de introducir la carga y reducir, con ello, el tiempo total

9050 B. 1.

Especificaciones

Para la preparación de los medios de cultivo y de los reactivos se utilizará únicamente agua destilada o desmineralizada que haya sido analizada y no presente trazas de metales disueltos ni de compuestos bactericidas o inhibidores. La toxicidad del agua destilada puede ser consecuencia del empleo del agua fluorada y con alto contenido en sílice. Otras fuentes de toxicidad son la plata, el plomo y diversos complejos orgánicos no identificados. Cuando se utiliza el retorno del condensador como alimentación de un alambique, pueden aparecer aminas tóxicas u otros componentes del evaporador en el agua destilada. Asimismo, puede encontrarse cloro o cloraminas residuales en el agua destilada a partir de suministros hídricos clorados. Si se encuentran compuestos de cloro en el agua destilada, hay que neutralizarlos añadiendo una cantidad equivalente de tiosulfato de sodio o de sulfito de sodio. El agua destilada no debe contener tampoco contaminantes nutritivos, los cuales pueden proceder de la degrada-

de calentamiento a menos de 45 minutos. 4.

Bibliografía

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Agua ción de compuestos orgánicos durante la destilación, del uso continuado de filtros de carbono ya gastados o de columnas de desionización que deben ser recargadas, de restos de soldadura en tuberías nuevas, de polvos o humos químicos y de la conservación del agua en botellas que no están bien limpias. El agua destilada se guardará protegida de la luz solar para evitar el crecimiento de algas. Una buena limpieza con productos de uso doméstico suele bastar para eliminar la contaminación por nutrientes. Véase sección 9020 para las pruebas de idoneidad para el agua destilada. 2.

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9-37

EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

9050 C.

Especificaciones de los medios

La necesaria uniformidad impone el uso de medios deshidratados. Nunca deben preparase medios a partir de ingredientes básicos si se dispone de medios deshidratados adecuados. Para la rehidratación y esterilización de éstos hay que seguir las instrucciones del fabricante. También pueden utilizarse medios líquidos comerciales (ampollas estériles u otros) cuando hay constancia de que con ellos se consiguen resultados equivalentes. Véase la sección 9020 para las especificaciones sobre control de calidad. Los términos utilizados para designar la fuente de proteínas en la mayoría de los medios (por ejemplo, peptona, triptona, triptosa) fueron acuñados por los fabricantes que los desarrollaron y en ocasiones responden más a productos comerciales que a entidades claramente definidas. No se trata de impedir el uso de materiales alternativos, siempre que se consigan con ellos resultados equivalentes. NOTA: La expresión «solución porcentual», tal como se utiliza en las presentes instrucciones, significa «gramos de soluto por 100 ml de solución».

vanse 34,0 g de fosfato dihidrógeno de potasio (KH2PO4) en 500 ml de agua destilada, ajústese el pH a 7,2 ± 0,5 con hidróxido de sodio (NaOH) al 1N y dilúyase hasta 1 l en agua destilada. Añádanse 1,25 ml de solución madre de tampón de fosfato y 5,0 ml de solución de cloruro de magnesio (81,1 g de MgCl 2 · 6H 2O/1 de agua destilada) a 1 l de agua destilada. Repártase en alícuotas que proporcionen 99 ± 2,0 ml o 9 ± 0,2 ml después de pasarlas 15 minutos por el autoclave. b) Agua de peptona: Prepárese una solución de peptona al 10 por 100 en agua destilada. Dilúyase un volumen determinado que proporcione una solución final al 0,1 por 100. El pH final debe ser de 6,8. Divídase en alícuotas que proporcionen 99 ± 2,0 ml o 9 ± 0,2 ml después de pasarlas 15 minutos por el autoclave. No deben suspenderse las bacterias en agua de disolución durante más de 30 minutos a temperatura ambiente, ya que se puede producir la muerte o la multiplicación de las mismas. 2.

1. Agua de disolución

a) Agua tamponada: Para preparar una solución tampón de fosfato, disuél-

Medios de cultivo

En las siguientes secciones figuran las especificaciones para cada medio. Cuando se describe el uso de un medio se ofrecen detalles al respecto.

9-38

MÉTODOS NORMALIZADOS

9060 MUESTRAS* 9060 A. 1.

Recipientes

Las muestras para estudios microbiológicos se recogerán en botellas cuidadosamente lavadas y aclaradas, a las que se habrá dado un enjuague final con agua destilada, y esterilizadas según se expone en las secciones 9030 y 9040. En algunos casos puede realizarse la recogida de muestras en bolsas de plástico preesterilizadas. 2.

Descloración

Añádase un agente reductor a los recipientes en los que se vaya a recoger agua con residuos de cloro u otros halógenos, a menos que dichos recipientes contengan caldos para siembra directa de la muestra. El tiosulfato de sodio (Na2S2O3) es un buen agente desclorante que neutraliza todos los residuos halógenos e impide el mantenimiento de la acción bactericida durante el transporte de la muestra. El posterior estudio de ésta indicará, por tanto, de forma más exacta el verdadero contenido microbiano del agua en el momento de realizarse la toma. Para recoger muestras de efluentes de agua residual clorada, añádase a una botella limpia Na2S2O3 en cantidad suficiente para alcanzar una concentración de 100 mg/1 en la muestra. En una botella de 120 ml, 0,1 ml de una solución de Na2S2O3 al 10 por 100 neutralizará una muestra que contenga alrededor de 15 mg/1 de cloro residual. En las muestras de agua potable puede reducirse la concentración de agente desclorante: 0,1 ml * Aprobado por el Standard Methods Committee, 1988.

Recogida de una solución de Na2S2O3 al 3 por 100 en una botella de 120 ml proporciona una concentración Final de 18 mg/1 en la muestra, lo que basta para neutralizar hasta 5 mg/1 de cloro residual. En casos de desinfección de urgencia con altas concentraciones de cloro, añádase suficiente agente desclorante para alcanzar una concentración de 100 mg/1 en la muestra. Tápese la botella y esterilícese con calor húmedo o seco, tal como se ha indicado (sección 9040). Se comercializan bolsas de plástico preesterilizadas que contienen Na2S2O3. Las muestras de agua con alto contenido en cobre o zinc y las muestras de aguas residuales con alto contenido en metales pesados se recogerán en botellas que contengan un agente quelante que reduzca la toxicidad del metal. Esto es especialmente importante cuando el transporte de las muestras va a durar 4 horas o más. Utilícense 372 mg/1 de la sal disódica del ácido etilendiaminotetracético (EDTA). Previamente, se ajustará el pH de la solución de EDTA a 6,5 y se añadirá entonces a la botella de toma de muestra antes de esterilizarla (0,3 ml de una solución al 15 por 100 para una botella de 120 ml) o se combinará con la solución de Na2S2O3 antes de introducirla en la botella. 3. Procedimientos de toma de muestras

Al hacer la toma de la muestra se dejará un amplio espacio aéreo en la botella (al menos 2,5 cm) para facilitar la mezcla por agitación antes de proceder al estudio. Se tomarán muestras representativas del agua objeto de la prueba, se limpiará

EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

con agua o se desinfectará la salida de la muestra y se utilizarán técnicas asépticas para evitar la contaminación de la misma. Las botellas que vayan a utilizarse para la toma se mantendrán cerradas hasta el momento de llenarlas. Se retirarán los tapones y las tapas a la vez, para no contaminar la superficie interna del tapón o la tapa ni el cuello de la botella. Se llenará la botella sin enjuagarla, se cerrará inmediatamente con el tapón o la tapa y, en su caso, se colocará el gancho de seguridad alrededor del cuello de la botella. a) Agua potable: Si se va a tomar una muestra de agua procedente de un grifo de una red de distribución, se elegirá un grifo al que llegue el agua por una tubería conectada directamente con la principal y no, por ejemplo, procedente de una cisterna o un depósito de almacenamiento. Ábrase completamente el grifo y déjese correr el agua durante 2 ó 3 minutos, o durante el tiempo suficiente para que se limpie la tubería de servicio. Redúzcase el caudal de agua para poder llenar la botella sin que se derrame. Si la limpieza del grifo es dudosa, aplíquese a la boca del mismo una solución de hipoclorito de sodio (100 mg de NaOCl/1) antes de tomar la muestra; déjese correr el agua otros 2 ó 3 minutos después del tratamiento. No se harán tomas de grifos que tengan fugas y dejen salir agua por encima de su superficie externa. Cuando se tomen muestras de grifos mezcladores, se retirarán los filtros, protectores contra salpicaduras y demás accesorios semejantes; se dejará correr agua caliente durante 2 minutos, después agua fría durante 3 minutos, y se realizará la toma de la forma anteriormente indicada. Si se va a tomar una muestra de un pozo con bomba de mano, se bombeará agua durante alrededor de 5 minutos antes de hacer la toma. Si el pozo está

9-39

equipado con una bomba mecánica, se hará la toma en un grifo de descarga. En caso de que no exista sistema de bombeo, se hará la toma directamente del pozo por medio de una botella esterilizada provista de un peso en la base; hay que tener cuidado para evitar la contaminación de las muestras por la espuma superficial. En los estudios de agua potable se harán tomas de agua terminal y de distintos puntos del sistema de distribución, elegidos de forma que se asegure una cobertura sistemática todos los meses. Se escogerán cuidadosamente los puntos de toma de muestras en el sistema de distribución, incluyendo las secciones ciegas, para demostrar la calidad bacteriológica de la totalidad de la red y asegurarse de que no hay contaminación localizada en las interconexiones transversales y no existen roturas en las tuberías de distribución, ni reducción de la presión positiva. Los lugares de toma de muestra pueden ser sitios públicos (comisarías o parques de bomberos, edificios oficiales, escuelas, estaciones de trenes o autobuses, aeropuertos, parques públicos), establecimientos comerciales (restaurantes, gasolineras, edificios de oficinas, plantas industriales), domicilios privados (viviendas unifamiliares, edificios de apartamentos y complejos urbanísticos) y estaciones especiales construidas al efecto en la red de distribución. Se establecerá un programa de toma de muestras de acuerdo con las autoridades sanitarias estatales y locales. b) Suministro de agua sin tratar: Cuando se hagan tomas directas de ríos, corrientes, lagos, pantanos, fuentes o pozos, se obtendrán muestras representativas del agua que llega a los consumidores. No es conveniente tomar muestras demasiado cerca de la orilla o demasiado lejos del punto de extracción ni a una profundidad superior o inferior a la de dicho punto. c) Aguas superficiales: Los estudios de corrientes son en muchos casos traba-

9-40

jos breves y de gran intensidad. Para la toma de muestras bacteriológicas se elegirán localizaciones que incluyan una línea de base aguas arriba del área de estudio, las salidas industriales y municipales de aguas residuales a la corriente principal del área de estudio, los tributarios, salvo los que tengan un caudal inferior al 10 por 100 de la corriente principal, los puntos de toma de los suministros de agua industriales y municipales, muestras aguas abajo según el flujo de la corriente y áreas recreativas situadas aguas abajo. La dispersión de las aguas residuales en la corriente receptora puede exigir estudios previos de sección transversal para determinar la homogeneidad de la mezcla. Cuando se trate de una corriente tributaria, se elegirá un punto de toma cercano a la confluencia con la corriente principal. Pueden tomarse las muestras desde una barca o desde puentes próximos a los puntos críticos de estudio. Se elegirá una frecuencia para la toma de muestras que refleje las condiciones de la corriente o masa de agua. Así, por ejemplo, para valorar las descargas de residuos se harán tomas cada 4-6 horas y se adelantará el horario durante un período de 7 a 10 días. Para controlar la calidad del agua de corrientes y lagos se establecerán localizaciones de toma de muestras en zonas críticas. La frecuencia de las tomas será estacional en el caso de las aguas de uso recreativo, diaria en el de las tomas para suministro de agua, horarias cuando el control del tratamiento de los residuos sea errático y los efluentes salgan a áreas de explotación marisquera o incluso continua. d) Playas; Las localizaciones de toma de muestras en las zonas recreativas deben reflejar la calidad del agua en la totalidad de las mismas. Se incluirán puntos de las zonas periféricas situadas aguas arriba y lugares adyacentes a desagües o perfiles naturales que puedan constituir aliviaderos de aguas torrencia-

MÉTODOS NORMALIZADOS

les o de aguas sépticas. En las zonas de baños se tomarán las muestras a una profundidad uniforme de alrededor de 1 m. Se tendrá en cuenta la posibilidad de tomar muestras de sedimentos de la zona de contacto agua-playa (suelo), dada la exposición de los niños pequeños al borde del agua. Para obtener datos básicos sobre la calidad del agua de baño de mares y estuarios se tomarán muestras con la marea alta, baja y media. La frecuencia de las tomas se establecerá en relación directa con el período de máxima afluencia de bañistas, que en general coincide con las primeras horas de la tarde. Lo más conveniente es hacer tomas diarias durante la temporada oficial de baños; como mínimo, se tomarán muestras los viernes, sábados, domingos y festivos. Si se limitan las tomas a los días de mayor uso recreativo, es preferible hacerlas por la mañana y a primera hora de la tarde. Los datos bacteriológicos se pondrán en relación con los niveles de turbidez o lluvia caída sobre el agua para hacer rápidas valoraciones de los cambios en la calidad del agua. e) Sedimentos y lodos: Es importante conocer el estado bacteriológico de los sedimentos de fondo de los pantanos para abastecimiento de agua, así como de los lagos, ríos y costas utilizados para fines recreativos, y de las aguas con explotaciones marisqueras. Los sedimentos proporcionan un índice estable de la calidad general del agua que los cubre, en especial cuando ésta presenta una gran variabilidad en su calidad bacteriológica. La frecuencia de las tomas en pantanos y lagos puede establecerse en relación con las oscilaciones estacionales de la temperatura del agua y de la escorrentía. En los ríos y estuarios, los cambios en los sedimentos de fondo son más erráticos, ya que dependen de la escorrentía, los aumentos de velocidad de la corriente y los cambios bruscos en la calidad de las descargas efluentes.

EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

9-41

Es conveniente hacer un estudio bacteriológico de los lodos empleados en los procesos de tratamiento de aguas limpias' y residuales, a fin de determinar el impacto que produce su vertido a corrientes de agua o al mar, o su entierro en escombreras. El control de estos lodos puede servir también como índice de la eficacia del proceso de tratamiento de aguas residuales. f ) Toma de muestras manual: La toma de muestras en ríos, arroyos, lagos o pantanos se hará sosteniendo la botella cerca de su base con una mano y sumergiéndola boca abajo. Gírese la botella hasta que el cuello apunte hacia arriba, con la boca dirigida hacia la corriente. Si no hay corriente, como en el caso de un pantano, se crea una corriente artificial empujando la botella horizontalmente en dirección contraria a la de la mano. Si la toma se hace desde un barco, se recogen muestras del lado de río arriba del mismo. Si no es posible hacer la toma de esta forma, se coloca un peso en la base de la botella y se sumerge en el agua. En cualquier caso, deberá evitarse el contacto con la orilla o el lecho del río, pues de lo contrario el agua puede ensuciarse. g) Toma con aparatos: Para hacer las tomas de muestras en zonas profundas de lagos o pantanos se precisan aparatos especiales que permitan destapar la botella bajo la superficie. Existen varios tipos de aparatos de toma de muestra en aguas profundas de los que el más utilizado es el ZoBell J-Z, que consta de una botella estéril de 350 ml con un tapón de goma a través del cual se ha introducido un trozo de tubo de vidrio, el cual está unido a otro trozo de tubo de vidrio por medio de una conexión de goma. La unidad está montada en una estructura metálica que contiene un cable y un portador. Al soltar el portador, éste golpea el tubo de vidrio en un lugar previamente debilitado por una marca, lo rompe y libera la tensión desarrollada por la conexión de goma, desviándose el tubo hacia un lado.

El agua penetra en la botella gracias al vacío parcial creado al sellar la unidad en el momento de pasarla por el autoclave. Existen adaptaciones comerciales de éste y otros aparatos de toma de muestras. La toma de muestras de sedimentos de fondo requiere asimismo aparatos especiales. Se ha comprobado la eficacia del aparato descrito por Van Donsel y Geldreich con una amplia variedad de materiales de fondo, tanto para toma de muestras manual (aguas someras) como a distancia (aguas profundas). Este aparato debe ser de acero inoxidable y estar dotado de una bolsa de plástico estéril. Una vez que el aparato se ha introducido en el sedimento, se cierra la bolsa con un cordón de nailon. Durante el descenso, una barra deslizante mantiene la bolsa cerrada y la abre en el momento de hacer la toma. Para tomas de aguas residuales o de efluentes, las técnicas descritas también suelen ser adecuadas; véase además la sección 1060. 4.

Tamaño de la muestra

El volumen de la muestra debe ser suficiente para poder realizar todos los análisis necesarios; por lo general, no conviene que sea inferior a 100 ml. 5.

Datos de identificación

Las muestras irán acompañadas de datos descriptivos y de identificación exactos. No deben aceptarse para estudio muestras indebidamente identificadas. 6.

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MÉTODOS NORMALIZADOS

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Conservación y almacenamiento

1. Tiempo y temperatura de conservación

El estudio microbiológico de las muestras debe iniciarse inmediatamente después de realizada la toma para evitar cambios imprevisibles. Si no pueden procesarse las muestras en la hora siguiente a su toma, se guardarán en una nevera de hielo durante el transporte al laboratorio. Si se sabe que los resultados van a ser utilizados en acciones legales, se recurrirá a un transporte especial para hacer llegar las muestras al laboratorio en menos de 6 horas y mantener una cadena de vigilancia. La temperatura de todas las muestras de contaminación de corrientes, aguas potables y residuales se mantendrá por debajo de 10 °C durante el transporte, que durará 6 horas como máximo. Una vez en el laboratorio, se procederá a su refrigeración y procesamiento en las 2 horas siguientes. Cuando las condiciones locales impongan retrasos de más de 6 horas en la entrega de las muestras, se considerará la conveniencia de hacer estudios de campo instalando equipos de laboratorio en el lugar de la toma o recurrir a procedimientos de incubación retardada. Por desgracia, rara vez pueden cumplirse estos requisitos cuando se trata de muestras aisladas de agua potable que se envían directamente al laboratorio por

correo, autobús, etc.; en cualquier caso, el tiempo transcurrido entre la toma y el estudio no debe superar las 24 horas. Cuando no sea posible refrigerar muestras aisladas de aguas enviadas por correo, utilícese una botella de muestras isotérmica que pueda esterilizarse. Regístrese el tiempo y la temperatura de almacenamiento de todas las muestras, datos que deberán tenerse en cuenta a la hora de interpretar los resultados. 2.

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9211

MÉTODOS DE DETECCIÓN RÁPIDA* 9211 A.

Introducción

Existe una necesidad, universalmente reconocida, de disponer de métodos que permitan una rápida valoración de la calidad bacteriológica del agua. La aplicación de métodos rápidos puede comprender desde el análisis de aguas residuales a la valoración de la calidad de aguas potables. En este último caso, cuando se dan situaciones de emergencia por avería de la planta de tratamiento del agua, rotura de tuberías de la red de distribución u otras alteraciones del suministro de * Aprobado por el Standard Methods Committee, 1988.

9211 B.

agua, hay que valorar urgentemente la calidad sanitaria del agua. En condiciones ideales, los métodos rápidos deberían tener una Habilidad y una sensibilidad similar a los utilizados en los estudios habituales. Sin embargo, la sensibilidad de un método rápido puede no ser adecuada, ya que en ocasiones el límite bacteriano buscado es inferior a la concentración bacteriana mínima necesaria para permitir una detección rápida. Los análisis rápidos pertenecen a dos categorías: son modificaciones de los procedimientos convencionales o requieren instrumentos y materiales especiales.

Prueba de coliformes fecales en siete fases (ESPECIALIZADA)

Este método1'2 es similar al procedimiento de filtro de membrana para coliformes fecales (véase la sección 9222D), aunque utiliza un medio y una temperatura de incubación diferentes para poder obtener en 7 horas resultados que, por lo general, son comparables a los obtenidos con el método estándar para coliformes fecales. 1. Medio M-7 h FC agar: A veces es imposible conseguir este medio en forma deshidra-

tada, por lo que hay que hacerlo a partir de los ingredientes básicos.

9-44

MÉTODOS NORMALIZADOS

Caliéntese en un baño de agua hirviendo. Una vez disueltos los ingredientes, caliéntese otros 5 minutos. Enfríese hasta 55-60 °C y ajústese el pH a 7,3 ± 0,1 con NaOH 0,1 N (generalmente se necesitan 0,35 ml/1). Enfríese hasta unos 45 °C y viértase en porciones de 4-5 ml en placas de Petri con tapas que ajusten bien. Almacénese a una temperatura de 2 a 10 °C. Después de 30 días debe desecharse. 2.

brana, colóquese el filtro sobre la superficie de una placa que contenga medio de agar M-7 h FC e incúbese a 41,5 °C durante 7 horas. Las colonias de coliformes fecales son amarillas (lo que indica fermentación de la lactosa). 3. 1.

Procedimiento

Hágase pasar un volumen de muestra adecuado a través de un filtro de mem-

9211 C.

2.

Referencias V AN D OSEL , D. J., R. M. T WEDT & E. E. GELDREICH. 1969. Optimum temperature for quantitation of fecal coliforms in seven hours on the membrane filter. Bacterial. Proc. Abs. n.° G46, pág. 25. R EASONER , D. J., J. C. B LANNON & E. E. GELDREICH. 1979. Rapid seven hour fecal coliform test. Appl. Environ. Microbiol. 38:229.

Técnicas especiales (ESPECIALIZADAS)

En la tabla 9211:I se resumen las técnicas rápidas especiales. La mayoría de ellas sin la suficiente sensibilidad como para medir la calidad del agua potable, no son específicas. Aunque pueden ser útiles para controlar los diluyentes de aguas residuales, necesitan reactivos de disponibilidad no universal, son tediosas o requieren casi siempre manipulaciones especiales o programas de incubación incompatibles con los horarios de laboratorio. Con excepción de la prueba colorimétrica, no existe ninguna adaptable al uso habitual, lo que no impide su empleo en investigación. Se recomienda al usuario remitirse a las citas bibliográficas para consulta sobre las técnicas enumeradas en la tabla, en lo que se refiere a sus detalles de procedimiento, condiciones de uso y limitaciones. Sólo pueden recomendarse el método de la adenosina trifosfatasa (ATP) (el sistema de luciérnaga bioluminiscente), la prueba colorimétrica para el cálculo de la densidad microbiana total y el procedimiento radiométrico para coliformes fecales que utiliza un sustrato con 14C.

Se establece una correlación entre la concentración inicial de bacterias con la concentración de ATP, extrayendo ésta de las diluciones seriadas de una suspensión bacteriana, o en el caso del método radiométrico con 14C, haciendo una estandarización que determine la liberación de 14CO2 por concentraciones conocidas de microorganismos coliformes fecales en muestras naturales, no en cultivos puros. Al utilizar cualquier procedimiento rápido, es necesario determinar la densidad bacteriana inicial mediante un método adecuado, como el recuento en placa heterotrófica (sección 9215) o coliformes totales (9221) o fecales (9222), y relacionarla con los resultados de la técnica rápida especial. 1. Análisis de bioluminiscencia (determinación de microbios viables totales)

La prueba de la luciferasa de la luciérnaga para ATP en células vivas se basa en la reacción entre la enzima luciferasa,

9-45

EXAMEN MICROBIOLOGICO DE LAS AGUAS

TABLA 9211:I. TÉCNICAS RÁPIDAS ESPECIALES

la luciferina (sustrato enzimático), los iones de magnesio y el ATP. Durante la reacción se emite luz, medible cuantitativamente y relacionada con la cantidad de ATP extraído de un número conocido de bacterias. Un exceso de todos los reactivos, salvo el ATP, indica la acción limitadora del propio ATP. La adición de éste produce las reacciones, dando lugar a pulsaciones de luz proporcionales a la concentración de ATP. La prueba se lleva a cabo en menos de 1 hora1-3. Para controlar poblaciones microbianas en el agua, la prueba del ATP está limitada por la necesidad de concentrar las bacterias de la muestra hasta alcanzar un nivel mínimo de sensibilidad equivalente a 105 células/ml. Si se combina con una filtración en membrana de una muestra de 1 l, la prueba puede proporcionar el nivel necesario. 2. Detección radiométrica (coliformes fecales)

Esta técnica permite la supuesta detección de sólo 2-20 bacterias coliformes fecales en 4,5 horas. En este método se utiliza un medio M-FC marcado de manera uniforme con manitol- 14 C y dos temperaturas de incubación: 2 horas a 35 °C, seguidas de 2,5 horas a 44,5 °C para conseguir especificidad para coliformes. Añádase el sustrato al inicio de la incubación a 44,5 °C, utilícese una filtración en membrana para concentrar los microorganismos de la muestra e introdúzcase el filtro en el medio M-FC en un envase sellable. Recójase el 14CO2 liberado mediante un disco de papel de filtro saturado con Ba(OH)2. Valórese por espectrometría líquida de centelleo la actividad del 14C. Salvo por el uso del manitol-14C y la espectrometría líquida de centelleo para detectar la actividad del 14C liberado, este método es similar al descrito en la sección 9222. 3.

14

En esta prueba, se libera CO2 a partir de un sustrato marcado con 14C14.

Referencias

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9-46

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MÉTODOS NORMALIZADOS

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Detección de colífagos (PROPUESTA)

Los colífagos son bacteriófagos que infectan y se replican en las bacterias coliformes y que parecen estar presentes en lugares ricos en bacterias coliformes totales o fecales. La correlación apreciada entre colífagos y bacterias coliformes en el agua reciente sugiere la posibilidad de utilización de aquéllos como indicadores de la calidad sanitaria del agua1-5. Más resistentes a la desinfección con cloro que los coliformes totales o los fecales, los colífagos serían mejores indicadores de la eficacia de la desinfección que las propias bacterias coliformes 4. La relación cuantitativa entre colífagos y bacterias coliformes en las aguas desinfectadas es distinta de la existente en las aguas naturales recientes, en virtud de sus diferentes índices de supervivencia. 1.

9-47

Materiales y medios de cultivo

a) Cultivo del huésped: Escherichia coli C, ATCC n.° 13706. b) Medios: 1) Agar soja triplicase (AST), para mantener los cultivos madre del huésped E. coli: Triptona (digestión pancreática de caseína) o equivalente ....................

15,0g

Soytone (peptona de soja) o equivalente ...................... Cloruro de sodio, NaCl . . . . Agar ......................................... Agua destilada ........................

5,0 g 5,0 g 15,0 g 1 l

El pH debe ser de 7,3 ± 0,1 a 25 °C; si se precisan ajustes, utilícese NaOH o HC1 0,1 o 1N. Caliéntese hasta que se disuelva y pásese después durante 15 minutos por el autoclave a 121 °C. Para pendientes de agar, divídase en porciones de 5-8 ml, que se colocan en tubos de tapón de rosca de 16 x 125 mm antes de esterilización; para placas, divídase en porciones de 20-25 ml por placa después de pasar por el autoclave y enfriar a unos 45 °C. 2) Medio de soja tripticasa (MST): Triptona (digestión pancreática de caseína) o equivalente ..................... Soytone (peptona de soja) o equivalente ..................... Dextrosa.................................. Cloruro de sodio, NaCl . . . . Fosfato de hidrógeno, dipotasio, K2 HPO 4...................... Agua destilada........................

17,0 g 3,0 g 2,5 g 5,0 g 2,5 g 1 l

El pH debe ser de 7,3 ± 0,1 a 25 °C; ajústese, si es necesario, con NaOH o HC1 0,1 o 1,0N. Caliéntese y agítese hasta disolverlo por completo. Divídase en

9-48

MÉTODOS NORMALIZADOS

volúmenes adecuados y esterilícese en autoclave durante 15 minutos a 121 °C. 3) Agar soja tripticasa modificado (ASTM): Añádase a los ingredientes del AST 1,60 g de nitrato de amonio, NH4NO3; 0,21 g de nitrato de estroncio, Sr(NO3)2, y 15 g de agar. El pH debe ser de 7,3 ± 0,1 a 25 °C; si es necesario, ajústese con NaOH o HC1 0,1 o 1,0N. Caliéntese hasta que hierva, disuélvase y divídase en porciones de 5,5 ml en tubos de tapón de rosca de 16 x 25 mm, para pasarlo después por el autoclave durante 15 minutos a 121 °C. 4) Glicerina: Añádase al 10 por 100 (p/v) al medio líquido de soja tripticasa antes de esterilizarlo en el autoclave. 5) Cloruro de 2,3,5-trifenil tetrazolio (CTFM) al 1 por 100 (p/v) en etanol. Añádase al ASTM a una temperatura de 45-46 °C para facilitar la visibilidad de la placa. Prepárese semanalmente.

2.

cha para reducir la pérdida de viabilidad del cultivo de huéspedes congelados. b) Procedimiento de la prueba: Este método es directamente aplicable a muestras que contienen más de 5 colífagos/ 100 ml; si la muestra contiene más de 1.000 colífagos/100 ml, dilúyase al 1:5 o al 1:10 en agua destilada estéril antes de proceder a la prueba. Descongélense los tubos de E. coli C congelados en un baño de agua a 44,5 °C. Se utilizará un tubo de cultivo de huésped por muestra. Añádanse 1,0 ml de cultivo de E. coli C huésped, a 5 ml de la muestra o la dilución, y 0,08 ml de CTFT a cada uno de los cuatro tubos de ASTM (licuado y mantenido a alrededor de 45 °C). Mézclese cuidadosamente y viértase en placas de Petri de 100 x 15 mm etiquetadas; tápese y déjese que solidifique el agar. Incúbese en placa invertida a 35 °C durante 4 a 6 horas y procédase al recuento de las placas.

Procedimiento

a) Preparación congelada del huésped: Inocúlese E. coli C procedente de una pendiente madre de agar (en AST) en uno o varios tubos con 10 ml de MST y 10 por 100 de glicerina (p/v) e incúbese a 35 °C hasta el día siguiente. Inocúlese entonces cada tubo en un matraz que contenga 25 ml de MST más glicerina al 10 por 100 e incúbese a 35 ± 0,5 °C hasta que alcance una densidad óptica de 0,5 a 520 nm (equivalente a alrededor de 1 x 109 células de E.coli C por ml). Mídase la densidad óptica mediante un espectrómetro, en el que se marca el cero en MST estéril más glicerina al 10 por 100. Tómense asépticamente porciones de 4,5 ml de suspensión de células en tubos de ensayo estériles de plástico, tápese y enfríese a 9 °C, congelándose después a –20 °C. Consérvese durante no más de 6 semanas en un congelador sin escar-

3. Interpretación e información de resultados

Los bacteriófagos infectan y se multiplican en las bacterias sensibles, lo que produce la lisis de las células bacterianas y la liberación de partículas del fago que infectan a células vecinas. A medida que se lisan las bacterias coliformes, se desarrollan áreas claras visibles conocidas como placas en las zonas de confluencia del crecimiento bacteriano. Efectúese un recuento de las placas existentes en cada placa de Petri y anótese. Obténgase el número de placas/100 ml de muestra, por suma de las placas de las cuatro placas de Petri y multiplicación por 5. Si se ha utilizado una muestra diluida, se multiplicará además por el recíproco del factor de dilución. En función del recuento de colífagos, realícese un cálculo del total de coliformes y fecales, tal y como se muestra a

9-49

EXAMEN MICROBIOLÚGICO DE LAS AGUAS

continuación4. Compruébense por separado las ecuaciones de los tipos específicos de muestras y localizaciones. Coliformes totales:

donde: y = coliformes totales/100 ml y x = colífagos/100 ml.

Coliformes fecales:

donde: y = coliformes fecales/100 ml y x = colífagos/100 ml.

4.

Referencias

1.

WENTZEL , R. S., P. E. O'NEILL & J. F. KIT CHENS. 1982. Evaluation of coliphage detection as a rapid indicator of water quality. Appl. Environ. Microbiol. 43:430. 2. ISBISTER, J. D. & J. L. ALM. 1982. Rapid coliphage procedure for water treatment processes. En Proc. Amer. Water Works Assoc. Water Quality Technol. Conf., Seattle, Washington, 6-9 de diciembre de 1981. 3. ISBISTER, J. D., J. A. SIMMONS, W. M. SCOTT, & J. F. KITCHENS. 1983. A simplified method for coliphage detection in natural waters. Acta Microbiol. Polonica 32:197. 4. KOTT, Y., N. ROZE, S. SPERBER & N. BETZER. 1974. Bacteriophages as viral pollution indicators. Water Res. 8:165. 5. K ENNED Y , J. D., J R ., G. B ITT O N & J. L. OBLINGER. 1985. Comparison of selective media for assay of coliphages in sewage effluent and lake water. Appl. Environ. Microbiol. 49:33.

9212 ORGANISMOS EN CONDICIONES ANÓMALAS* 9212 A. 1.

Discusión general

Las bacterias indicadoras, como los coliformes y los estreptococos fecales, pueden resultar alteradas o lesionadas en las aguas limpias y residuales. Estas bacterias lesionadas son incapaces de crecer y formar colonias en condiciones habituales, dada la alteración que sufren en su estructura o en su metabolismo. En consecuencia, una parte importante de las bacterias indicadoras existentes, por ejemplo, de un 10 a más de un 90 por 100, pueden pasar inadvertidas y no ser detectadas1. Estos resultados bacteriológicos negativos falsos pueden inducir una inexacta definición de la calidad del * Aprobado por el Standard Methods Committee, 1988.

Introducción agua, o lo que es peor, permitir una aceptación errónea de condiciones potencialmente peligrosas resultantes de la presencia de patógenos resistentes2. En circunstancias normales, se encuentran microorganismos en condiciones anómalas en las aguas potables cloradas, en los residuos de diluyentes, en las aguas saladas, en las aguas naturales contaminadas y en las aguas superficiales relativamente limpias. En casos de desinfección parcial o inadecuada o en presencia de iones metálicos u otras sustancias tóxicas, pueden existir numerosas bacterias indicadoras en condiciones anómalas. Estos y otros factores, como las temperaturas y pH extremos, la radiación solar, etc., pueden provocar infravaloraciones importantes de las bacterias indicadoras viables.

9-50

MÉTODOS NORMALIZADOS

Publicaciones recientes confirman la relevancia sanitaria que alcanzan las bacterias coliformes lesionadas3 - 5 . Estos trabajos demuestran que las bacterias enteropatógenas son menos susceptibles que los coliformes a sufrir alteraciones en condiciones similares a las del agua potable, y que los patógenos alterados mantienen su potencial virulencia. Por tanto, los métodos que permiten cuantificar las bacterias coliformes alteradas permiten obtener datos más sensibles sobre los riesgos potenciales para la salud. Esta conclusión está reforzada con la observación de que los virus y los patógenos transmitidos por el agua capaces de formar quistes son también más resistentes a un ambiente adverso que las bacterias indicadoras. 2.

2.

3.

4.

5.

6.

Manipulación y conservación

de muestras Algunas manipulaciones del laboratorio una vez tomada la muestra son también susceptibles de producir alteraciones o actuar como agresiones secundarias para los microorganismos6. Entre ellas, puede citarse un tiempo de conservación excesivo, un tiempo de mantenimiento prolongado (más de 30 minutos) de las muestras diluidas antes de la inoculación en los medios de cultivo o de que las muestras inoculadas alcancen una temperatura adecuada, fórmulas incorrectas de los medios, una mezcla incompleta de la muestra con el medio concentrado y la exposición a un medio licuado de agar a una temperatura incorrecta. Un número excesivo de bacterias no indicadoras también interferirá en su detección, al inducir alteraciones en las mismas7. 3.

Referencias

1.

MCFETERS, G. A., J. S. KIPPIN & M. W. LE-

7.

4.

CHEVALLIER. 1986. Injured coliforms in drinking water. Appl. Environ. Microbiol. 51:1. LE C HEVALLIER , M. W. & G. A. M CF ETERS. 1985. Enumerating injured coliforms in drinking water. J. Amer. Water Works Assoc. 77:81. LE CHEVALLIER, M. W., A. SINGH , D. A. SCHIEMANN & G. A. MCFETERS. 1985. Changes in virulence of waterborne enteropathogens with chlorine injury. Appl. Environ. Microbiol. 50:412. SINGH A. & G. A. MCFETERS. 1986. Repair, growth and production of heat-stable enterotoxin by E. coli following copper injury. Appl. Environ. Microbiol. 51:738. S INGH A., R. Y EAGER & G. A. M C F ETERS . 1986. Assessment of in vivo revival, growth, and pathogenicity of Escherichia coli strains after copper-and chlorine-induced injury. Appl. Environ. Microbiol. 52:832. MCFETERS, G. A., S. C. CAMERON & M. W. LE CHEVALLIER. 1982. Influence of diluents, media and membrane filters on the detection of injured waterborne coliform bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 43:97. LE C HEVALLIER , M. W. & G. A. MCF ETERS . 1985. Interactions between heterotrophic plate count bacteria and coliform organisms. Appl. Environ. Microbiol. 49:1338.

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9-51

EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

STEVENS, A. P., R. J. GRASSO & J. E. DELANEV. 1974. Measurements of fecal coliform in estuarine water. En D. D. Wilt, ed., Proceedings of the 8th National Shellfish Sanitation Workshop, U.S. Dep. Health, Education, & Welfare, Washington, D.C. BISSONNETTE, G. K., J. J. JEZESKI, G. A. MCFETERS & D. S. S TUART . 1975. Influence of envi-

9212 B.

ronmental stress on enumeration of indicador bacteria from natural waters. Appl. Microbiol. 29:186. BISSONNETTE, G. K., J. J. JEZESKI, G. A. MCFETERS & D. S. S TUART. 1977. Evaluation of recovery methods of detect coliforms in water. Appl. Environ. Microbiol. 33:590.

Incremento de la recuperación

En esta sección se describen algunos procedimientos y consideraciones generales referidos a la recuperación de los organismos indicadores sometidos a condiciones anómalas. En el caso de las muestras cloradas, hay que asegurarse de que se añade a la botella de la muestra una cantidad suficiente de agente declorante (véase sección 9060A.2)1. Las muestras de agua con alto contenido en iones de metales pesados deberán tomarse en botellas que lleven un agente quelante2 (véase sección 9060A.2), reduciendo en lo posible el tiempo de conservación (véase sección 9060B). Utilícese agua de dilución tamponada con peptona en vez de agua tamponada (véase sección 9050C.1) para preparar las diluciones de las muestras que contienen iones de metales pesados. Una vez hecha la dilución, se inoculará en el medio de prueba antes de 30 minutos. La reanimación de los microorganismos alterados o dañados se facilita inoculando la muestra y cultivando inicialmente los microorganismos en un medio enriquecido no inhibidor a temperatura moderada. Aunque no existe un único análisis que permita establecer la presencia de bacterias lesionadas en una muestra determinada, es frecuente que las bacterias presentes en las aguas portadoras de agentes lesivos, como desinfectantes o metales pesados, estén alteradas1, 3. Hay que pensar en esta posibilidad cuando los resultados de las pruebas de fermentación

en tubos múltiples produzcan resultados constantemente superiores a los obtenidos en las pruebas paralelas de filtro de membrana o cuando exista otra indicación de una recuperación no óptima; en estos casos, se utilizará uno de los procedimientos siguientes:

1. Recuperación de bacterias coliformes totales alteradas mediante filtración de membrana

Utilícese agar m-T74 en el método descrito para la prueba de filtro de membrana (véase sección 9222A).

Ajústese a un pH de 7,4 con NaOH 0,1N tras esterilizarlo a 121 °C durante 15 minutos. Añádase asépticamente 1,0 µg de penicilina G/ml una vez que el medio se ha enfriado hasta 45 °C aproximadamente. Tras filtrar la muestra, introdúzcase el filtro en agar m-T7 e incúbese a 35 °C durante 22-24 horas. Las colonias de coliformes son amarillas. Compruébese la

9-52

presencia de no menos del 10 por 100 de las colonias de coliformes mediante el método descrito en la sección 9222A.5f. En algunas muestras de agua potable se puede observar un crecimiento confluente con numerosas bacterias no coliformes. Para conseguir unos resultados fiables, se distinguirá cuidadosamente entre las colonias amarillas y el crecimiento del entorno.

2. Recuperación de coliformes fecales en condiciones anómalas mediante filtración de membrana

a) Aclimatación con enriquecimiento por temperatura: Utilícese agar de dos capas (agar M-FC con un recubrimiento de medio no selectivo) en una incubación de 2 horas a 35 °C, seguida de 24 horas a 44,5 °C. La placa de agar M-FC se tendrá preparada de antemano, pero no se añadirá hasta 1 hora antes de su utilización. También puede utilizarse un enriquecimiento previo en medio líquido de fenol rojo lactosa incubado a 35 °C durante 4 horas, seguido del cultivo en agar M-FC a 44,5 °C durante 22 horas6. Una tercera opción consiste en preparar un medio enriquecido de dos capas que contenga aditivos específicos e incubarlo durante 1,5 horas a temperatura ambiente (22 a 26 °C), seguida de otra a 35 °C durante 4,5 horas y 18 horas a 44,5 °C7. b) Aclimatación por temperatura8. Modifíquese el procedimiento de temperatura elevada mediante una preincubación de los cultivos M-FC durante 5 horas a 35 °C, a lo que seguirán 1 8 ± 1 hora a 44,5 °C. Utilícese una incubadora de temperatura programable para hacer los cambios de 35 a 44,5 °C después del período de 5 horas de preincubación, eliminando así los inconvenientes y consiguiendo un método de análisis práctico.

MÉTODOS NORMALIZADOS

c) Deleción del agente inhibidor9. Elimínese el ácido rosólico del medio M-FC o incúbese el cultivo a 44,5 °C + 0,2 °C durante 24 horas horas. Las colonias de coliformes fecales son de un color azul intenso en el medio modificado, distinguiéndose bien de las colonias de color cremoso, grises y verde pálido, características de los coliformes no fecales. d) Aclimatación alternativa a temperatura y medio: Utilícese un medio m-T7 con incubación a 37 °C durante 8 horas, seguida de otra a 44,5 °C durante 12 horas10. é) Verificación de las bacterias coliformes fecales lesionadas: Las modificaciones de los medios y de los procedimientos pueden disminuir la selectividad y la diferenciación de las colonias de coliformes fecales. Por tanto, si se utiliza alguna modificación en el procedimiento, habrá que comprobar al menos un 10 por 100 de las colonias azules procedentes de varias muestras. Utilícese para ello un medio líquido de lauril triptosa (véase sección 9221A) (35 °C durante 48 horas), con pase de los cultivos productores de gas a un medio líquido EC (sección 9221C) (44,5 °C durante 24 horas). La producción de gas a 44,5 °C confirma la existencia de coliformes fecales.

3. Recuperación de estreptococos fecales en condiciones anómalas mediante filtración de membrana

Mediante un medio líquido con bilis se consiguen recuperaciones de estreptococos fecales comparables a las obtenidas con las pruebas de fermentación en tubos múltiples11. Preincúbense los filtros de membrana en un medio enriquecido durante 2 horas a 35 °C, a lo que sigue una incubación en agar m-Enterococcus (sección 9230) a 35 °C durante 48 ± 2 horas.

EXAMEN MICROBIO-LÓGICO DE LAS AGUAS

9-53

Verificación de los estreptococos fecales alterados. Compruébese como mínimo un 10 por 100 de las colonias procedentes de varias muestras mediante la prueba confirmatoria descrita en la sección 9230B.5.

5.

6.

7.

4.

Referencias

1.

MCF ETERS , G. A. & A. K. C AMPER . 1983. Enumeration of coliform bacteria exposed to chlorine. En A. I. Laskin, Advances in Applied Microbiology. 29:177. 2. DOMEK, M. J., M. W. LECHEVALLIER, S. C. C AMERON & G. A. M C F ETERS. 1984. Evidence for the role of metals in the injury process of coliforms in drinking water. Appl. Environ. Microbiol. 48:289. 3. LECHEVALLIER, M. W. & G. A. MCFETERS. 1985. Interactions between heterotrophic píate count bacteria and coliform organisms. Appl. Environ. Microbiol. 49:1338. 4. LE CHEVALLIER, M. W., S. C. CAMERON & G. A. MCFETERS. 1983. New medium for the improved recovery of coliform bacteria from drinking water. Appl. Environ. Microbiol. 45:484.

9213

8.

9.

10.

11.

ROSE, R. E., E. E. GELDREICH & W. LITSKY. 1975. Improved membrane filter method for fecal coliform analysis. Appl. Microbiol. 29:532. L IN , S. D. 1976. Membrane filter method for recovery of fecal coliforms in chlorinated sewage effluents. Appl. Environ. Microbiol. 32:547. S TUART , D. S., G. A. M C F ETERS & J. E. SCHILLINGER. 1977. Membrane filter technique for quantification of stressed fecal coliforms in the aquatic environment. Appl. Environ. Microbiol. 34:42. GREEN, B. L., E. M. CLAUSEN & W. LITSKY. 1977. Two-temperature membrane filter method for enumerating fecal coliform bacteria from chlorinated effluents. Appl. Environ. Microbiol. 33:1259. P RESSWOOD , W. G. & D. S TRONG . 1977. Modification of M-FC medium by eliminating rosolic acid. Amer. Soc. Microbiol. Abs. Annu. Meeting. ISSN-0067-2777:272. L E C HEVALLIER , M. W., P. E. J AKANOSKI , A. K. CAMPER & G. A. MCFETERS. 1984. Evaluation of m-T7 agar as a fecal coliform medium. Appl. Environ. Microbiol. 48:371. LIN, S. D. 1974. Evaluation of fecal streptococci tests for chlorinated secondary effluents. J. Environ. Eng. Div., Proc. Amer. Soc. Civil. Engr. 100:253.

EXAMEN MICROBIOLOGICO DE AGUAS EN INSTALACIONES RECREATIVAS* 9213 A.

1. Significación de los microorganismos

Las aguas recreativas pueden dividirse en aguas de piscinas, baños de hidromasaje, aguas potables naturales y aguas marinas superficiales. Históricamente, se han analizado estas aguas en busca de * Aprobado por el Standard Methods Committee, 1988.

Introducción bacterias coliformes, heterotróficas o de ambos tipos. Aunque la detección de las bacterias coliformes en el agua indica la posibilidad de que no sean saludables para el consumo, se han aislado en las aguas recreativas otras bacterias que pueden suponer riesgos para la salud pública por contacto con el cuerpo, ingestión o inhalación. Las bacterias recomendadas como indicadores de la calidad del agua recreativa son el grupo coliforme, especies de

9-54

MÉTODOS NORMALIZADOS

Pseudomonas, Streptococcus, Staphylococcus y, más raramente, Legionella. Las enfermedades víricas asociadas con las aguas recreativas no tratadas son las producidas por Coxsackie A y B, adenovirus tipos 3 y 4, hepatitis A y diversas gastroenteritis víricas. Este último grupo podría ser responsable de una parte importante de los casos de gastroenteritis indeterminada. Microorganismos como Mycobacterium, Candida albicans y especies de Naegleria y Acanthamoeba también pueden adquirir importancia, sobre todo porque producen esporas y quistes, más resistentes que las bacterias indicadoras. No se recomiendan estudios sistemáticos de microorganismos patógenos, salvo en casos de estudios o investigaciones especiales de enfermedades de transmisión hídrica, en los que deben dirigirse los

9213 B. 1.

Discusión general

a) Características: Una piscina es una masa de agua contenida en una estructura1. El agua suele ser potable y clorada, pero también puede provenir de fuentes termales o del mar. Las piscinas modernas tienen un sistema de recirculación que permite filtrar y desinfectar el agua. Las piscinas pueden dividirse en desinfectadas y no tratadas. b) Requisitos de control: 1) Generales: Contrólese la calidad del agua de las piscinas en busca de características químicas y físicas que puedan provocar irritación de la piel, los ojos y las mucosas de los bañistas o afectar de manera adversa a su desinfección. Los microorganismos que típicamente pueden producir problemas son los procedentes del cuerpo de los bañistas y de sus orificios, entre los que se encuentran los que pueden producir infecciones del

análisis microbiológicos al descubrimiento del patógeno conocido o sospechado. A continuación se describen métodos aceptables para detectar microbios indicadores de la calidad de las aguas recreativas. A la hora de elegir el método o los indicadores microbianos en fase de detección, hay que tener en cuenta el tipo de agua que va a ser objeto de estudio. No existe un solo procedimiento que sea adecuado para aislar todos los microorganismos del agua, y la presencia de uno de ellos no significa necesariamente la existencia o no de otros. 2.

Bibliografía

COWAN, S. T. & J. STEEL. 1965. Manual for the Identification of Medical Bacteria. Cambridge Univ. Press, Cambridge, Inglaterra.

Piscinas oído, las vías respiratorias superiores, la piel y los aparatos digestivo y urinario. La calidad del agua depende de la eficacia de la desinfección y del número de bañistas en un determinado momento, así como del número diario de bañistas. 2) Piscinas cubiertas desinfectadas: Determínense periódicamente los niveles residuales de desinfectante y la turbidez en los períodos de máxima actividad de baños o bien cuando la turbidez supere 1 UNT y el recuento en placa heterotrófica (RPH) supere las 500 unidades formadoras de colonias/ml. El recuento en placa heterotrófica es el indicador fundamental de la eficacia de la desinfección. Otros indicadores suplementarios se refieren a la flora cutánea normal que se haya desprendido, entre la que se encuentran especies de Streptococcus, Staphylococcus y Pseudomonas. Estos microorganismos son los responsables de un alto porcentaje de enfermedades asociadas al uso de

EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

las piscinas y pueden ser relativamente resistentes al efecto del cloro2. En casos especiales, pueden resultar significativos Mycobacterium, Legionella o Candida albicans. 3) Piscinas desinfectadas al aire libre: Los indicadores fundamentales de la contaminación por animales de compañía, roedores, agua de lluvia y fuentes humanas son los coliformes fecales. Otros indicadores suplementarios son el recuento en placa heterotrófica y especies de Streptococcus, Staphylococcus y Pseudomonas 3, 4. 4) Piscinas no tratadas: Los indicadores fundamentales pueden ser las bacterias coliformes fecales. Otros indicadores son los descritos para las piscinas desinfectadas. 2.

Muestras

a) Envases: Realícese la toma de muestras para el estudio bacteriológico del agua de las piscinas en la forma descrita en la sección 9060A. Utilícense envases con una capacidad de 120-480 ml, en función de los análisis que vayan a efectuarse. Añádase tiosulfato de sodio, Na2S2O3, como neutralizador desinfectante en una cantidad suficiente como para proporcionar una concentración aproximada a 100 mg/1 en la muestra. Para ello, añádanse 0,1 ml de una solución de Na 2S 2 O 3 al 10 por 100 a una botella de 120 ml, o 0,4 ml a una botella de 480 ml. Una vez añadido el Na2S2O3, tápese o ciérrese la botella y esterilícese. b) Procedimiento de toma de muestras: Realícese la toma de muestras en la zona y durante el período de máxima densidad de baños. Para la posterior interpretación de los resultados del análisis, también es importante la información sobre dicha densidad. En el caso de piscinas dotadas de filtro, las muestras pueden tomarse de los grifos de muestra colocados en el retorno

9-55

y en las tuberías de desagüe del filtro. Alternativamente, retírese cuidadosamente el tapón de la botella estéril y, sosteniéndola por la base en un ángulo de 45°, introdúzcase verticalmente en el agua a una profundidad de alrededor de 20 cm para que se llene, asegurándose de que el agente declorante no se escape (este agente sólo es necesario en el caso de piscinas desinfectadas). Tómense las muestras en los lugares en los que la profundidad del agua sea de alrededor de 1 m. Para evitar la contaminación de la muestra durante la toma, colóquese la botella en un soporte de toma de muestras o pórtense guantes esterilizados de goma o plástico. Como la mayor parte de las bacterias que se desprenden del cuerpo de los bañistas se encuentran en los aceites corporales, en la saliva o la mucosidad desprendida que se sitúan cerca de la superficie, tómense muestras adicionales de la microcapa superficial en el agua de 1 m de profundidad. Realícese la toma de muestras de microcapa sumergiendo verticalmente una placa de vidrio esterilizado (de alrededor de 20 x 20 cm) bajo la superficie del agua y retirándola a una velocidad aproximada de 6 cm/segundo. Retírese la capa superficial y la capa de agua adherida a ambos lados de la placa por medio de un rascador de goma silicona esterilizada, e introdúzcase en una botella estéril de vidrio. Repítase la operación hasta que se consiga el volumen deseado. Para reducir al mínimo la contaminación microbiana, envuélvanse la placa de vidrio y el rascador en papel metálico y esterilícense en el autoclave antes de utilizarlos. Pórtense guantes esterilizados de goma o plástico mientras se hace la toma o sosténgase la placa de vidrio con pinzas, clips, etc. Determínese el cloro residual u otros desinfectantes en el momento en que se hace la toma. c) Conservación de la muestra: Véase sección 9060B.

9-56

MÉTODOS NORMALIZADOS

d) Volumen de la muestra: Véase sección 9222. e) Dilución de la muestra: Si es necesario diluir la muestra, utilícese agua de peptona al 0,1 por 100 como diluyente para que la recuperación de los microorganismos en condiciones anómalas sea óptima (véase sección 9222 sobre volumen recomendado de la muestra). El agua de peptona tiene tendencia a formar espuma, por lo que debe evitarse que penetren burbujas de aire al pipetear y asegurarse así de que la medición es exacta. Procésese rápidamente la muestra para evitar el crecimiento bacteriano. 3.

9222) para preparar la muestra. Introdúzcase el filtro sobre el manitol sal agar e incúbese a 37 °C durante 36 horas. Las colonias de Staphylococcus son amarillas o están rodeadas por una zona amarilla. 6.

Prueba de Staphylococcus aureus

Utilícese un procedimiento modificado de tubos múltiples. a) Medios: 1) Medio líquido M-estqfilococo:

Recuento heterótrofo de placa

Realícese el recuento en placa en la forma señalada en la sección 9215. Utilícense al menos dos placas por dilución. 4.

Pruebas de coliformes fecales

Analícense los coliformes fecales mediante las técnicas de fermentación en tubo múltiple (sección 9221), filtro de membrana (sección 9222) o métodos rápidos (sección 9211). 5. Prueba de estafilococos (PROPUESTAS)

Esterilícese mediante hervido durante 4 minutos; el pH debe ser de 7,0 ± 0,2. Para 10 ml de inoculo, prepárese y utilícese un medio de doble potencia. 2) Lipovitelina-sal-manito-agar: A veces ese medio no se encuentra en forma deshidratada, por lo que habrá que preparlo a partir de sus ingredientes básicos o añadiendo yema de huevo a la base deshidratada.

a) Manitol sal agar:

Esterilícese en autoclave; el pH debe ser de 7,4. b) Procedimiento: Utilícese el método de filtro de membrana (véase sección

Esterilícese en autoclave; el pH debe ser 7,4 ± 0,2. b) Procedimiento: Inocúlense los tubos de medio líquido M-estafilococo como se expone en la sección 9221. Incube-

9-57

EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

se a 35 ± 1 °C durante 24 horas. Consérvese la muestra original enriquecida, aunque sembrando estrías de los tubos positivos (turbios) en placas de lipovitelina-sal-manitol-agar e incubando a 35 ± 1 °C durante 48 horas. La aparición de zonas opacas (24 horas) o amarillas (48 horas) rodeando las colonias prueba la actividad de lipovitelinalipasa (opacas) y de fermentación del manitol (amarillas). Vuélvanse a sembrar las placas negativas a partir de los cultivos de los tubos originales enriquecidos antes de desecharlos. La actividad de lipovitelina lipasa tiene una correlación positiva del 95 por 100 con la producción de coagulasa. Si es necesario, pueden confirmarse los cultivos positivos como pertenecientes a bacterias negativas con catalasa, positivas con coagulasa, fermentadoras de manitol, fermentadoras anaeróbicas de la glucosa, productoras de morfología microscópica típica y grampositivas.

7. Pruebas de Pseudomonas aeruginosa

Las pruebas de P. aeruginosa se presentan en las secciones 9213E y F, y consisten en un procedimiento de filtro de membrana y una técnica de tubos múltiples. 8.

Prueba de Streptococci

Determínense los estreptococos fecales como se describe en la sección 9230 y, si es necesario, realícense pruebas bioquímicas adicionales para identificar las especies.

9. Referencias 1.

CENTERS FOR DISEASE CONTROL. 1983. Swimming Pools. Safety and Disease Control throught Proper Design and Operation. DHHS-CDC. n.° 83-8319, Centers for Disease Control, Atlanta, Georgia. 2. SEYFRIED, P. L., R. S. TOBIN, N. E. BROWN & P. F. N ESS . 1985. A prospective study of swimming related illness. II. Morbidity and the microbiological quality of water. Amer. J. Pub. Health 75:1071. 3. FAVERO, M. S. & C. H. DRAKE. 1964. Coraparative study of microbial flora of iodated and chlorinated pools. Pub. Health Rep. 79:251. 4. KEIRN, M. A. & H. D. PUTNAM. 1968. Resistance of staphylococci to halogens as related to a swimming pool environment. Health Lab. Sci. 3:180.

10.

Bibliografía

WORKING PARTY OF THE PUBLIC HEALTH LA-

BORATORY SERVICE.

1965. A bacteriological survey of swimming baths in primary schools. Monthly Bull. Min. Health & Pub. Health Lab. Serv. 24:116. GRUN , L. R. & H. KLEYBRINK . 1972. Staphylokokken-Mikrokokken im Badewasser. Zentralbl. Bakteriol. Parasitenk. Infektionskr. Hyg. Abt. Orig. B. 155:384. ADAMS, J. C. 1972. Unusual organism which gives a positive elevated temperature test for fecal coliforms. App. Microbiol. 23:172. GUNN, B. A., W. E. DUNKELBERG, JR. & J. R. CRUTZ. 1972. Clinical evaluation of 2 % LSM medium for primary isolation and identification of staphylococci. Amer. J. Clin. Pathol. 57:236. HATCHER, R. F. & B. C. PARKER. 1974. Investigations of Freshwater Surface Microlayers. VPISRRC-BULL 64. Virginia Polytechnic Inst. and State Univ., Blacksburg. CLARK, N. A. & W. F. HILL. 1977. Disinfection of drinking water, swimming-pool-water and treated sewage effluent. En Disinfection, Sterilization and Preservation. Lea y Febiger, Filadelfia, Pennsylvania.

9-58

MÉTODOS NORMALIZADOS

9213 C. 1.

Baños de hidromasaje

Discusión general

a) Características: Un baño de hidromasaje es una piscina con una profundidad no superior a 1,2 m; posee un sistema de agua de circuito cerrado, un equipo para calentar el agua y, habitualmente, un sistema de recirculación y propulsión del agua. Puede ser de plástico, fibra de vidrio, madera roja o un material recubierto de epóxido. Están destinados a fines recreativos y terapéuticos, y permiten el baño de una o más personas. Se instalan en domicilios particulares, apartamentos, hoteles, instalaciones deportivas, centros de rehabilitación y hospitales. La población bañista suele ser transeúnte, de manera que incluso los privados pueden no ser utilizados exclusivamente por los miembros de la familia. b) Requisitos de control: Son frecuentes las infecciones contraídas en los baños de hidromasajes. Para asegurar su inocuidad, hay que comprobar que tanto la concentración de germicida en el agua como el pH y la temperatura son adecuados. Se han descrito además otras pautas de mantenimiento y operaciones de control1-4. Ante un brote de infección asociada a un baño de hidromasaje, tómense muestras en el momento en que aparezca el brote o lo antes posible5. Mídanse el pH y la temperatura del agua, así como la concentración de cloro libre y combinado (o de otros halógenos). Refrigérese la muestra de inmediato, aunque lo ideal es proceder a su estudio microbiológico antes de 6-12 horas. Los análisis bacteriológicos deben incluir un estudio directo de P. aeruginosa mediante una técnica diferencial-selectiva

o de enriquecimiento, como las descritas en 9213E y 9213F. Aunque P. aeruginosa es el patógeno más frecuente en estos casos, es preciso también determinar la concentración de estafilococos y estreptococos. Los índices habituales de contaminación, es decir, las bacterias coliformes, son insuficientes para valorar la calidad microbiológica de un baño de hidromasaje. Los análisis de bacterias coliformes pueden indicar la eficacia del desinfectante utilizado, pero con toda probabilidad no reflejarán al agente etiológico de las infecciones asociadas a estos baños.

2. 1.

2.

3.

4.

5.

3.

Referencias CENTERS FOR DISEASE CONTROL. 1981. Suggested Health and Safety Guidelines for Public Spas and Hot Tubs. DHHS-CDC #99960. United States Government Printing Off., Washington, D.C. SOLOMON , S. L. 1985. Host factors in whirlpool-associated Pseudomonas aeruginosa skin disease. Infect. Control. 6:402. H IGHSMITH , A. K.; P. N. LEE ., R. F. K HAB BAZ & V. P. M UNN . 1985. Characteristics of Pseudomonas aeruginosa isolated from whirlpools and bathers. Infect. Control 6:407. GROOTHUIS, D. G., A. H. HAVELAAR & H. R. VEENENDAAL. 1985. A note on legion-llas in whirlpools. J. Appl. Bacíeriol. 58:479. H IGHSMITH , A. K. & M. S. F AVERO . 1985. Microbiological aspects of public whirlpools. Clin. Microbiol. Newsletter 7:9. Bibliografía

GELDREICH, E. E., A.HC. HIGHSMITH & W. J. MARTONE. 1985. Public whirlpools: the epidemiology and microbiology of disease. Infect. Control 6:392.

9-59

EXAMEN MICROBIOLÚGICO DE LAS AGUAS

9213 D. 1.

Discusión general

Una playa natural es cualquier línea de costa o ribera de una corriente, lago, océano, pantano o manantial termal utilizada con fines recreativos. Son numerosos los gérmenes patógenos que pueden transmitirse al hombre a través de la utilización con fines recreativos de aguas dulces y saladas susceptibles de contaminación por aguas residuales1-2. Esta contaminación puede deberse a agentes enteropatógenos, como Salmonella, Shighella, enterovirus, protozoos y parásitos multicelulares; a patógenos humanos o a «oportunistas», como P. aeruginosa, Klebsiella, Vibrio parahemolyticus, V. vulnificus, Aeromonas hydrophila y C. albicans, que pueden multiplicarse en aguas recreativas en presencia de suficiente cantidad de elementos nutritivos o ser también consecuencia de la existencia de organismos vertidos al agua a través de la piel o los orificios superiores de los usuarios, como es el caso de Staphylococcus aureus; por último, pueden citarse otras especies, como microbacterias y leptospiras, Francisella tularensis y especies patógenas de Naegleria (meningoencefalitis amebiana3-9. No existen métodos convencionales adecuados para el estudio sistemático de las aguas recreativas, ni que permitan identificar todos los organismos reseñados. Incluso con los métodos aquí descritos y, sobre todo, en el caso de los ambientes marinos, pueden existir condiciones locales que pongan en peligro la exactitud, la selectividad y las características diferenciales de estos métodos. Determínese la contaminación fecal de las aguas recreativas naturales con las pruebas de coliformes fecales. Dada la posibilidad de resultados positivos falsos en las aguas termales, compruébense los resultados positivos de coliformes fecales

Playas mediante sistemas multiprueba comerciales [sección 9222B.5f2)b)]. Una aplicación del análisis de los estreptococos fecales en las aguas naturales es la determinación de las proporciones entre coliformes fecales y estreptococos fecales. Una proporción de 4,0 o superior indica contaminación por residuos domésticos, mientras que proporciones de 0,6 o inferiores son frecuentes en contaminaciones por residuos de animales de granja o agua de lluvia. Es preferible determinar esta relación cerca del punto de entrada de los residuos, ya que la proporción varía en función de la distancia y del tiempo. Al existir en el ambiente biotipos de Streptococcus faecalis de naturaleza ubicua, puede complicarse la interpretación del significado sanitario de densidades de estreptococos fecales inferiores a 100 microorganismos/100 ml. Para determinar esta proporción, utilícese agar M-FC y KF o agar PSE en la técnica del filtro de membrana o de tubos múltiples descritas para coliformes y estreptococos fecales (véanse secciones 9221, 9222 y 9230). Pueden aplicarse pruebas de E. coli en aguas dulces, estuarios y aguas saladas. Existen métodos de detección de P. aeruginosa, Salmonella y Klebsiella. La cuantificación de P. aeruginosa, Aeromonas hydrophila y especies de Klebsiella en las aguas recreativas puede alcanzar un valor considerable en relación con los desagües de aguas sumamente nutritivas, por ejemplo, aguas de molinos, desagües de plantas de acabado textil, etc. 2.

Muestras

a) Recipientes: Tómense las muestras según se describe en la sección 9060A. El volumen del recipiente varía en función del número y variedad de análisis a reali-

9-60

zar. Si es necesario, añádase Na2S2O3 a la botella. b) Procedimiento para la toma de muestras: Realícese la toma de muestras 0,3 m por debajo de la superficie del agua en la zona de mayor densidad de bañistas. Tómense muestras en diversas condiciones ambientales y climáticas, sobre todo durante los momentos en que sea de esperar la máxima contaminación, es decir, en los períodos de influencias de mareas, corrientes y vientos o en las llegadas de torrentes y aguas residuales. Sobre los métodos de toma de muestras, véase la sección 9213B.2b, y sobre los volúmenes de las mismas, la sección 9222. c) Almacenamiento de las muestras: Véase sección 9060B. 3.

Pruebas de Escherichia coli

1) AgarmTEC*:

MÉTODOS NORMALIZADOS

No es necesario esterilizar. Ajústese el pH a 5,0 ± 0,2. Guárdese a 2-8 °C, usándose en el plazo de 1 semana. b) Procedimiento: Fíltrese la muestra a través de un filtro de membrana (véase sección 9222), colóquese la membrana en agar TEC e incúbese a 30 °C durante 2 horas para revitalizar las bacterias lesionadas o en condiciones anómalas, incubándose durante otras 22 horas a 44,5 °C. Pásese el filtro a una almohadilla de filtro saturada con sustrato de urea. Al cabo de 15 minutos realícese un recuento de las colonias amarillas o pardo-amarillentas con ayuda de una lámpara fluorescente y una lupa. E. coli produce colonias amarillas o pardo-amarillentas. Compruébese una parte de estas colonias mediante un sistema comercial multiprueba. 4.

Pruebas de estreptococos fecales

Llévense a cabo análisis de estreptococos fecales mediante una técnica de tubos múltiples (sección 9230B) o de filtro de membrana (sección 9230C). 5. Pruebas de Pseudomonas aeruginosa

Esterilícese en autoclave; el pH debe ser 7,3 ± 0,2. Viértanse de 4 a 5 ml de agar licuado en placas de cultivo (50 x 10 mm). Consérvese en frigorífico.

Realícense las pruebas de P. aeruginosa según se describe en las secciones 9213E y F. Utilícese una prueba de tubos múltiples con muestras turbias, aunque hay que destacar que esta técnica puede no ser aplicable en aguas saladas. 6. Pruebas de Salmonella/Shigella Véase sección 9260.

2) Sustrato de urea*: 7. * Difco o equivalente.

1.

Referencias CABELLI, V. J. 1980. Health Effects Criteria for Marine Recreational Waters. EPA-600/1-

EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

2.

3.

4. 5.

6.

80-031. U.S. Environmental Protection Agency, Research Triangle Park, Carolina del Norte. DUFOUR, A. P. 1984. Health Effects Criteria for Fresh Recreational Waters. EPA-600/184-004, U.S. Environmental Protection Agency, Research Triangle Park, Carolina del Norte. KESWICK, B. H., C. P. GERBA & S. M. GOYAL. 1981. Occurrence of enteroviruses in community swimming pools. Amer. J. Pub. Health 71:1026. D UTKA , B. J., & K. K. K WAN . 1978. Health indicator bacteria in water surface mícrolayers. Can. J. Microbiol. 24:187. CABELLI, V. J., H. KENNEDY & M. A. LEVIN. 1876. Pseudomonas aeruginosa and fresh recreational waters. J. Water Pollut. Control Fed. 48:367. SHERRY, J. P., S. R. KUCHMA & B. J. DUTKA. 1979. The occurrence of Candida albicans in Lake Ontario bathing beaches. Can. J. Microbiol. 25:1036.

9213 E. 1.

7. STEVENS, A. R., R. L. TYNDALL, C. C. COUTANT & E. WILLAERT. 1977. Isolation of the etiological agent of primary amoebic meningoencephalitis from artificially heated waters. Appl. Environ. Microbiol. 34:701. 8. WELLINGS, F. M., P. T. AMUSO, S. L. CHANGE & A. L. LEWIS. 1977. Isolation and identification of pathogenic Naegleria from Florida lakes. Appl. Environ. Microbiol. 34:661. 9. N'D I A Y E , A., P. G E O R G E S , A. N. Go & B. F ESTY . 1985. Soil amoebas as biological markers to estimate the quality of swimming pool waters. Appl. Environ. Microbiol. 49:1072

8.

Bibliografía

OLIVIERI , V. P., C. W. D RUSE & K. K AWATA . 1977. Microorganisms in Urban Stormwater. EPA-600/2-77-087, U.S. Environmental Protection Agency, Cincinnati, Ohio.

Técnica de filtro de membrana para Pseudomonas aeruginosa

Instrumental de laboratorio Véase sección 9222.B.1.

2.

9-61

Medios de cultivo

a) Agar M-PA: A veces no se dispone de este agar en forma deshidratada, por lo que será preciso prepararlo a partir de sus ingredientes básicos.

Ajústese el pH a 6,5 ± 0,1 y esterilícese en autoclave. Enfríese a 55-60 °C y vuélvase a ajustar el pH a 7,1 ± 0,2; añádanse los siguientes antibióticos secos por litro de agar base: sulfapiridina*, 176 mg kanamicina†, 8,5 mg; ácido nalidíxico‡, 37,0 g, y cicloheximida§, 150 mg. Tras mezclar, divídase en porciones de 3 ml que se colocan en placas de Petri de 50 x 12 mm. Las placas se conservan a 2-10 °C, eliminándose las no utilizadas al cabo de 1 mes. b) Agar M-PA modificado: Para el agar M-PA, añádanse 1,5 g de MgSO4 · 7H2O/1 y redúzcanse las concentraciones de Na2S2O3 a 5 g/1 y de xilosa a 1,25 g/1 (a veces se añade 0,1 g de desoxicolato de sodio). * Nutritional Biochemicals, Cleveland, Ohio. † Bristol-Myers, Syracuse, Nueva York. ‡ Calbiochem, La Jolla, California. § Actidione, Upjohn Company, Kalamazoo, Michigan, o equivalente.

9-62

MÉTODOS NORMALIZADOS

c) Agar leche (modificación de Brown y Scott Foster): Mezcla A: Leche instantánea desnatada || ..................... 100 Agua destilada ................... 500

g ml

Mezcla B: Medio líquido nutritivo . . . Cloruro de sodio, NaCl. . . Agar...................................... Agua destilada ...................

12,5 2,5 15,0 500

g g g ml

Esterilícense por separado las mezclas A y B y enfríense rápidamente hasta 55 °C; combínense asépticamente y divídanse en partes de alrededor de 20 ml vertiéndolas en placas de 100 x 15 mm. 3.

Utilícese una lupa de 10 a 15 aumentos para facilitar el recuento. b) Pruebas confirmatorias: Empléese agar leche para confirmar un cierto número de las colonias típicas y atípicas. Hágase una sola estría (de 2-4 cm de longitud) con una colonia aislada en la placa de agar leche e incúbese a 35 ± ± 1,0 °C durante 24 horas. P. aeruginosa hidroliza la caseína y produce un pigmento difusor de color amarillento a verde. 4. Interpretación y cálculo de densidad

Salvo por lo anteriormente mencionado, no es necesario realizar una confirmación sistemática. En su ausencia, comuníquense los resultados como «supuestos». Calcúlese y comuníquese el número de P. aeruginosa/100 ml.

Procedimiento

a) Pruebas presuntas: Fíltrense 200 ml o cantidades menores de aguas naturales o hasta 500 ml de aguas de piscinas a través de filtros de membrana estériles. Colóquese cada membrana en una placa con agar M-PA, modificado de manera que no quede espacio de aire entre la membrana y la superficie del agar. Inviértanse las placas e incúbense a 41,5 ± ± 0,5 °C durante 72 horas. Las clásicas colonias de P. aeruginosa son de 0,8-2,2 mm de diámetro y planas, con bordes externos claros y centros pardos o negro-verdosos. Cuéntense las colonias típicas, preferiblemente las de los filtros que contienen números de 20 a 80. || Carnation o equivalente.

5.

Bibliografía

DRAKE, C. H. 1966. Evaluation of culture media for the isolation and enumeration of Pseudomonas aeruginosa. Health Lab. Sci. 3:10. BROWN, M. R. W. & J. H. SCOTT FOSTER, 1970. A simple diagnostic milk medium for Pseudomonas aeruginosa. J. Clin. Pathol. 23:172. LEVIN, M. A. & V. J. CABELLI. 1972. Membrane filter technique for enumeration of Pseudomonas aeruginosa. Appl. Microbiol. 24:864. DUTKA, B. J. & K. K. KWAN. 1977. Confirmation of the single-step membrane filter procedure for estimating Pseudomonas aeruginosa densities in water. Appl. Environ. Microbiol. 33:240. BRODSKY, M. H. & B. W. CIEBIN. 1978. Improved medium for recovery and enumeration of Pseudomonas aeruginosa from water using membrane filters. Appl. Environ. Microbiol. 36:26.

9-63

EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

9213 F. 1.

Técnica de tubos múltiples para Pseudomonas aeruginosa

Instrumental de laboratorio Véase sección 9221.

2.

Medios de cultivo a)

Medio líquido asparagina: A veces

no se encuentra este medio en forma deshidratada, por lo que habrá que prepararlo a partir de sus ingredientes básicos. Asparagina, DL ................ Fosfato de hidrógeno dipotasio anhidro, K2 HPO 4 ........................... Sulfato de magnesio MgSO4 · 7H2O ..................... Agua destilada ..................

3,0 g 1,0 g 0,5 g 1 l

Se ajusta el pH a 6,9-7,2 antes de esterilizar. b) Medio líquido acetamida: A veces no se encuentra este medio en forma deshidratada, por lo que habrá que prepararlo a partir de sus ingredientes básicos. Acetamida............................. 10,0 g Clo ru ro d e sod io , NaCl... 5,0 g Fosfato de hidrógeno dipotasio anhidro, K2 HPO 4 ........................... 1,39 g Fosfato de dihidrógeno potasio anhidro, KH 2 PO 4 ........................... 0,73 g Sulfato de magnesio, MgSO4 · 7H2O ................. 0,5 g Rojo fenol ........................... 0,012 g Agua destilada ................... 1 l

Ajústese el pH a 6,9-7,2 antes de esterilizar.

Prepárense las pendientes de agar acetamida añadiendo 15 g a la fórmula anterior, hiérvanse hasta que se disuelva y fórmense porciones de 8 ml que se colocan en tubos de 16 mm. Tras pasar por el autoclave, inclínense los tubos mientras se enfrían para conseguir una larga superficie de pendiente.

3.

Procedimiento

a) Prueba supuesta: Inocúlense cinco muestras de 10 ml, cinco de 1 ml y cinco de 0,1 ml en el medio líquido asparagina. Utilícense medios de potencia sencilla de 10 ml para inocular 1 ml o menos y 10 ml de medio de potencia doble para las inoculaciones de 10 ml. En el caso de las piscinas, pueden ser necesarias diluciones más altas. Incúbense los tubos inoculados a 35-37 °C. A las 24 horas y a las 48 horas de la incubación, examínense los tubos bajo una luz ultravioleta de larga longitud de onda (luz negra) en una habitación a oscuras. La producción de un pigmento verdoso fluorescente indica positividad del análisis. b) Prueba confirmatoria: Confírmese el resultado positivo inoculando 0,1 ml del cultivo en medio líquido acetamida o sobre la superficie de pendientes de agar acetamida. La reacción positiva de confirmación viene dada por la aparición de un pH elevado, detectable por el color púrpura que aparece a las 24-36 horas de incubar a 35-37 °C. c) Cálculo y grabación del NMP: Véanse tabla 9221:V y sección 9221D.

9-64

MÉTODOS NORMALIZADOS

9215

RECUENTO HETERÓTROFO DE PLACA* 9215 A.

1. Aplicaciones

El recuento heterótrofo de placa (RHP), anteriormente denominado recuento estándar en placa, es un procedimiento cuyo objeto consiste en calcular el número de bacterias vivas heterótrofas que existen en el agua y medir los cambios que se producen a raíz del tratamiento y distribución de las aguas o en las piscinas. Las colonias pueden surgir en pares, cadenas, grupos o células únicas, todas ellas englobadas bajo el término de unidades formadoras de colonias (UFC). El número final depende de la interacción entre las colonias en desarrollo. Elíjase la combinación de método y medio que produzca el mayor número de colonias en un tiempo predeterminado de incubación. A continuación se describen tres métodos diferentes y cuatro medios distintos. 2.

Selección del método

El método de la placa fluida (9215B) es fácil de poner en práctica y puede adaptarse a volúmenes de muestra o de muestra diluida que oscilan entre 0,1 y 2,0 ml. Las colonias que se producen son relativamente pequeñas y compactas, y muestran menor tendencia a rodear unas a otras que las producidas por crecimiento de superficie. Por otro lado, las colonias sumergidas suelen tener un crecimiento más lento, son difíciles de transferir y no se describen en los estudios publicados. Para mantener la temperatura del agar es esencial disponer de un baño de agua controlado por un termostato, pero, aun * Aprobado por el Standard Methods Committee, 1988.

Introducción así, puede producirse un significativo choque de calor durante la exposición transitoria de la muestra al agar a 4546 °C. El método de la placa difusa (9215C) no produce choque de calor y todas las colonias se encuentran sobre la superficie del agar, donde pueden distinguirse fácilmente de las partículas y las burbujas. Son fáciles de transferir y es sencillo comparar los resultados con las descripciones publicadas. Sin embargo, este método está limitado por el pequeño volumen de muestra o de muestra diluida que puede absorber el agar: 0,1-0,5 ml según el grado de secado de las placas. Para utilizar este método ha de mantenerse un suministro adecuado de placas de agar absorbente predesecadas. El método del filtro de membrana (9215D) permite analizar grandes volúmenes de agua de baja turbidez y es el método elegido para aguas de bajos contenidos (menos de 1-10 UFC/ml). Este método no produce golpe de calor, pero añade el costo adicional del filtro de membrana. Otros inconvenientes son la menor área mostrada; la necesidad de detectar colonias mediante la luz reflejada contra un fondo blanco, si no se utilizan filtros coloreados o tinciones de contraste, y las posibles variaciones debidas a la calidad de los filtros de membrana (véase sección 9020B.3g). 3. Área de trabajo

Se deberá disponer de una mesa o de una encimera de banco de amplia superficie en una habitación limpia, sin corrientes, bien iluminada o con una cámara de flujo laminar horizontal. Utilícense superficies de mesa o banco no porosas y desinféctense antes de realizar el análisis.

9-65

EXAMEN MICROBIOLOGICO DE LAS AGUAS

4.

Muestras

Recójanse las muestras de agua de la forma descrita en la sección 9060A. Iníciese el estudio lo antes posible para reducir al mínimo las alteraciones de la población bacteriana. El tiempo máximo recomendado que debe transcurrir entre la recogida de la muestra y su estudio es de 8 horas (máximo tiempo de intervalo, 6 horas; máximo tiempo de procesamiento, 2 horas). Si el análisis no puede iniciarse en las primeras 8 horas, manténgase la muestra a una temperatura inferior a 4 °C, pero sin congelarla. No ha de permitirse que el intervalo máximo entre la toma de la muestra y el análisis supere las 24 horas. Las muestras de agua embotellada, obtenidas en comercios al por menor que no estén refrigeradas, se mantendrán en las mismas condiciones ambientales que tuvieran en el almacén hasta el momento del análisis. Las muestras de agua recién embotellada (menos de 48 horas) se estudiarán en las 6 horas siguientes de la toma, si no están refrigeradas, y durante las 24 horas siguientes, si lo están. 5.

Preparación de la muestra

Antes de proceder a su estudio, marquese cada placa con el número de la muestra, la dilución, la fecha y cualquier otra información necesaria. Prepárese cada volumen de muestra o de dilución como mínimo por duplicado. En el caso de los métodos de placa fluida o difusa, utilícense placas de Petri de vidrio (65 cm 2 ) o desechables de plástico (57 cm2). Mézclense cuidadosamente todas las muestras o diluciones mediante unos veinticinco movimientos completos de arriba abajo (y de adelante atrás). También se puede utilizar un agitador mecánico durante 15 segundos para agitar las muestras o las diluciones.

6.

Medios

Compárense los nuevos lotes de medios con los antiguos, según se describe en la sección 9020B.3h. a) Recuento de placa de agar (agar triptona glucosa, levadura): Utilícense para los métodos de placas fluidas y difusas. Este agar, altamente nutritivo y muy utilizado en el pasado, produce recuentos menores que el agar R2A o el NWRI. Se incluye para laboratorios que deseen hacer comparaciones entre distintos medios o para ampliar la continuidad de los datos antiguos. Triptona ................................... Extracto de levadura .............. Glucosa .................................... Agar .......................................... Agua destilada .......................

5,0 g 2,5 g 1,0 g 15,0 g 1 l

El pH debe ser de 7,0 ± 0,2 después de un paso de 15 minutos por el autoclave a 121°C. b) Agar m-RHP*: Este medio, altamente nutritivo, sólo se utilizará para el método de filtro de membrana. Peptona..................................... Gelatina .................................... Glicerina ................................. Agar .......................................... Agua destilada .......................

20,0 g 25,0 g 10,0 g 15,0 g 1 l

Mézclense todos los ingredientes, salvo la glicerina. Ajústese el pH a 7,1 con NaOH al 1N, si es necesario. Caliéntese hasta que se disuelva, añádase la glicerina y pásese 5 minutos por el autoclave a 121 °C. c) Agar R2A: Utilícese en métodos de placas fluidas y difusas y en el filtro de membrana. Este agar, de bajo poder nutritivo, proporciona recuentos más elevados que las fórmulas altamente nutritivas. * Antes denominado agar m-REP.

9-66

Extracto de levadura .............. Proteosa peptona n.° 3 o polipeptona...................... Ácidos casamino ..................... Glucosa .................................... Almidón soluble ...................... Fosfato de hidrógeno dipotasio, K 2 HPO 4 -----------Sulfato de magnesio heptahidratado, MgSO4 · 7H2O................. Piruvato de sodio.................... Agar .......................................... Agua destilada .......................

MÉTODOS NORMALIZADOS

0,5

g

0,5 0,5 0,5 0,5

g g g g

0,3

g

0,05 0,3 15,0 1

g g g l

Ajústese el pH a 7,2 con K2HPO4 o KH2PO4 sólidos antes de añadir el agar. Caliéntese hasta disolver este último y esterilícese a 121 °C durante 15 minutos. d) Agar NWRI (ARHP): Utilícese en los métodos de placas fluidas y difusas y en el de filtro de membrana. Este medio tiende a producir mayores recuentos de colonias que los tres descritos anteriormente. A veces no es posible disponer de él en forma deshidratada, por lo que habrá que prepararlo a partir de los ingredientes básicos. Peptona .................................... Caseína soluble ....................... K2HPO4 ................................... MgSO4 ............................................................ FeCl3 ........................................ Agar .......................................... Agua destilada .......................

3,0 0,5 0,2 0,05 0,001 15,0 1

g g g g g g l

Ajústese el pH a 7,2 antes de pasarlo 15 minutos por el autoclave a 121 °C. 7.

Incubación

El método de la placa difusa se describe en las disposiciones revisadas de la EPA de Estados Unidos. Para adaptarse a estas disposiciones, incúbese a 35 °C durante 48 horas. En cualquier otro caso, elíjanse algunos de los tiempos

y temperaturas recomendados para el control de los cambios en la calidad del agua. Los recuentos más elevados en la incubación se obtendrán a los 5-7 días a temperatura de 20 a 28 °C. Si no se dispone de incubadoras que puedan controlarse a 20-28 °C, utilícese una cabina sin polvo a temperatura ambiente. Los informes de los resultados deben recoger el tiempo y la temperatura utilizados. Manténgase humedad en la incubadora durante la incubación para que la pérdida de peso por evaporación en las placas no supere el 15 por 100, hecho especialmente importante si la incubación va a ser larga. Puede ser suficiente con colocar un plato con agua en la parte inferior de la incubadora, pero hay que tener en cuenta que para evitar la oxidación de las paredes interiores y su descamación, éstas han de ser de acero inoxidable de buena calidad o de aluminio anodizado. En casos de incubaciones largas en incubadoras no humidificadoras, manténganse las placas dentro de bolsas de plástico. 8.

Recuento y registro

a) Placas fluidas y difusas: Inmediatamente después de la incubación, cuéntense todas las colonias de las placas seleccionadas. Si hay que retrasar el recuento, guárdense las placas a 5-10 °C durante no más de 24 horas, aunque evitando que esta práctica se convierta en habitual. Regístrense en el informe los resultados de los controles estériles de cada uno de los lotes de muestras. Si se hace recuento manual, utilícese un instrumento de recuento adecuado, como el contador de colonias Quebec. Cuando no se disponga de este tipo de instrumentos, utilícese cualquier otro contador, siempre que proporcione aumento e iluminación equivalentes. Existen aparatos de recuento automático que suelen disponer de un monitor de

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televisión acoplado a una lente de aumento y una tarjeta electrónica. Pueden ser aceptables siempre que el recuento paralelo manual proporcione resultados comparables. Al preparar las placas, introdúzcanse volúmenes de muestra que proporcionen 30-300 colonias/placa. El objetivo consiste en disponer de al menos una dilución que proporcione recuentos de colonias comprendidas entre estos límites, salvo en los casos que comentaremos más adelante. Por lo general, no deben sembrarse más de 2,0 ml de muestra; por tanto, cuando el número total de colonias que se desarrollan con 2,0 ml sea inferior a 30, no se observará la regla antes expuesta y se registrarán los resultados obtenidos. Salvo en este caso, sólo se considerarán en los recuentos las placas que muestren de 30 a 300 colonias. Regístrese el recuento bacteriano por mililitro, multiplicando el número medio de colonias por placa por el recíproco de la dilución utilizada. Preséntese el informe en UFC por mililitro. En caso de que ninguna placa tenga de 30 a 300 colonias y una o más tengan más de 300 colonias, utilícense aquéllas con el número más cercano a 300. Regístrese el recuento, multiplicando el número medio por placa por el recíproco de la dilución utilizada, y preséntese en UFC por mililitro calculadas. Si ninguna de las placas de una muestra tiene colonias, comuníquese un recuento inferior a una (< 1) vez el recíproco de la dilución más baja. Por ejemplo, si no se desarrollan colonias en la dilución 1:100, comuníquese un recuento menor a 100() 6.500 veces el inverso de la dilución más alta, en el caso de placas de vidrio, y mayor de 5.700 veces el recíproco, en el de las placas de plástico. Comuníquese un resultado estimado de unidades formadoras de colonias calculadas por mililitro. Cuando aparezcan colonias en expansión en la placa seleccionada, cuéntense sólo las colonias de las porciones representativas si están bien distribuidas en áreas donde no existan colonias expandidas, y si el área cubierta por éstas no supera la mitad de la superficie de la placa. Cuando deban contarse colonias en expansión, cuéntese como una unidad cada uno de los siguientes tipos: cadenas de colonias que parezcan ser consecuencia de la desintegración de un grupo de bacterias al mezclar el agar y la muestra; expansiones que se desarrollen como placas de crecimiento entre el agar y el suelo de la placa de Petri, y colonias que se forman como una película entre el agua y el borde de la superficie del agar o sobre esta última. Los dos últimos tipos se forman, sobre todo, por acumulación de humedad en el punto originario de la ex-

9-68

pansión. Suelen cubrir más de la mitad de la placa y hacen que el recuento sea poco fiable. Cuéntense como colonias individuales aquellas que posean aspecto de colonias y crezcan muy cerca unas de otras, aunque sin tocarse, siempre que la distancia entre ellas sea al menos igual al diámetro de la colonia más pequeña. También se contarán como colonias individuales las adyacentes con aspecto distinto en lo que se refiere a forma, color, etc. Si hay exceso de crecimiento expansivo en una placa, considérense como «diseminantes». En caso de que las placas resulten incontables porque se haya perdido el factor de dilución, se hayan caído accidentalmente, estén contaminadas o las placas de control indiquen que el medio, otros materiales o el instrumental estén contaminados, se referirán en el informe como «accidente de laboratorio» (AL). b) Método del filtro de membrana: En los filtros de membrana, cuéntense las colonias con ayuda de un microscopio estereoscópico a 10 o 15 aumentos. Por ello, es preferible colocar la placa de Petri en la platina del microscopio en un ángulo de 45°, con una fuente de luz que incida verticalmente sobre las colonias. La densidad óptima de colonias por filtro es de 20 a 200. Con colonias pequeñas, y no próximas entre sí, se acepta un número mayor. Cuéntense todas las colonias que existen en la membrana, en el caso de que existan 1 a 2 o menos por cuadrado. Para un intervalo de 3 a 10 colonias por cuadrado, cuéntense 10 cuadrados y obténgase la media por cuadrado. Cuando existan de 10 a 20 colonias por cuadrado, cuéntense 5 y obténgase la media por cuadrado. Multiplíquese este número medio por 100 veces el inverso de la dilución para obtener el número de colonias por milímetro. Si existen más de 20 colonias por cuadrado, comuníquese el recuento como > 2.000 veces al recíproco

MÉTODOS NORMALIZADOS

de la dilución. Preséntense los recuentos medios como unidades formadoras de colonias calculadas. Sólo se harán recuentos estimativos cuando existan colonias aisladas y separadas sin expansión.

9. Cálculo y comunicación de los recuentos El término «unidades formadoras de colonias» (UFC) alude al método utilizado, por lo que se comunicarán todos los recuentos en forma de unidades formadoras de colonias. Indíquense en el informe el método utilizado, el tiempo y temperatura de incubación y el medio. Por ejemplo, UFC/ml, método de placa fluida, 35 °C cada 48 horas; recuento en placa de agar o 28 °C cada 5 días; agar R2A o UFC/ml, método de placa difusa, 20 °C cada 7 días; agar NWRI. Para calcular el recuento heterótrofo en placa, multiplíquese el número total de colonias o el número medio (si se han hecho placas duplicadas de la misma dilución) por placa por el inverso de la dilución utilizada. Notifíquense las diluciones utilizadas y el número de colonias contadas o calculadas en cada placa. Cuando se hace un recuento de colonias en placas duplicadas y/o en diluciones consecutivas y se obtiene una media de los resultados antes de informar, sólo se presentarán los recuentos con dos cifras significativas al convertirlos en unidades formadoras de colonias. Evítense una precisión y una seguridad ficticias al calcular las unidades formadoras de colonias registrando sólo los dos primeros dígitos de la izquierda. Cuando el tercer dígito de la izquierda es 5, 6, 7, 8 o 9, se aumentará en una unidad el segundo dígito de la izquierda; utilícense ceros para cada uno de los dígitos hacia la derecha a partir del segundo. Por ejemplo, comuníquese un recuento de 142 como 140 y uno de 155 como 160,

EXAMEN MICROBIOLOGICO DE LAS AGUAS

mientras que uno de 35 se informará como 35.

10.

Errores personales

Evítense inexactitudes debidas a la falta de atención y las que se deriven de

9215 B.

elementos ópticos dañados o sucios que dificulten la visión o impidan reconocer las colonias. El personal de laboratorio que no pueda repetir sus propios recuentos de la misma placa con un error inferior al 5 por 100 y que haga recuentos de los análisis ajenos con errores superiores al 10 por 100 deberá investigar las causas de estas desviaciones y corregirlas.

Método de placa fluida

1. Muestras y preparación de muestras

Véase 9215A.4 y 9215A.5. 2.

9-69

Dilución de la muestra

Prepárese agua para blancos de dilución como se señala en la sección 9050C. a) Selección de las diluciones: Las diluciones se seleccionarán de forma que el número de colonias en una placa sea de 30 a 300 (figura 9215:1). Por ejemplo, cuando se sospecha que el recuento heterótrofo de placa alcanzará 3.000, se prepararán placas con diluciones de 10-2. En la mayoría de las muestras de agua potable se obtendrán placas adecuadas para realizar el recuento, sembrando 1 ml y 0,1 ml de muestra no diluida y 1 ml de una dilución 10-2. b) Medición de las porciones de la muestra: Utilícese una pipeta esterilizada para los pases inicial y posteriores del material procedente de cada envase. Si la pipeta se contamina antes de haber acabado el pase, sustitúyase por otra esterilizada. Utilícese una pipeta esterilizada distinta para los pases de cada dilución. No preparar diluciones y placas fluidas bajo luz solar directa. Se deberá tener cuidado al sacar las pipetas esterilizadas del envase, sin pasar el extremo de la

pipeta a través de los extremos expuestos de las pipetas del envase o por la boca o el cuello de las botellas de dilución para evitar la contaminación. Al extraer la muestra, las pipetas no se introducirán más de 2,5 cm por debajo del nivel de la superficie de la muestra o de la dilución. c) Medición de las diluciones: Al desechar porciones de la muestra, manténgase la pipeta en un ángulo de alrededor de 45°, con el extremo tocando el fondo del disco de Petri o dentro del cuello de la botella de dilución. Levántese la tapadera del disco de Petri lo suficiente para introducir la pipeta. Se dejará que el líquido drene desde una marca de graduación de 1 ml al extremo de la pipeta durante 2 a 4 segundos. Si no es de un tipo que permita soplar, tóquese una vez con la punta de la pipeta en un punto seco del fondo del disco de Petri. Es menos aconsejable utilizar una pipeta que permita soplar y expulsar así suavemente el resto del volumen de la dilución. Cuando se midan cantidades de 0,1 ml, déjese que la muestra drene desde la graduación elegida como referencia hasta que se haya vertido 0,1 ml, retirando la pipeta sin que toque la placa. Introdúzcanse 1 ml, 0,1 ml u otro volumen cualquiera en un placa estéril antes de añadir el medio de cultivo licuado. Utilícense diluciones decimales para preparar las muestras de volúmenes inferiores a

9-70

MÉTODOS NORMALIZADOS

Figura 9215:1. Preparación de las diluciones.

01 ml; al estudiar aguas de alcantarillado o turbias, no se medirá un inoculo de 0,1 ml de la muestra original, sino que se preparará una dilución adecuada. Tras depositar tres porciones por cada serie de placas, añádase el medio de cultivo y mézclese cuidadosamente. No deben transcurrir más de 20 minutos entre el momento en que se inicia el pipeteo y la adición del medio a las placas. 3.

Siembra

a) Licuación del medio: Licúese el medio de agar sólido estéril en agua hirviendo o sometiéndolo a un chorro de vapor en un envase parcialmente cerrado para evitar una excesiva exposición a temperaturas innecesariamente elevadas durante y después de la licuefacción. No se reesterilizará el medio cuando ya esté en la placa. Si se licúa el medio en dos o más lotes, utilícese por completo cada

uno de ellos, siempre que el contenido esté totalmente licuado. Deséchese el agar líquido que contenga precipitados. Manténgase el medio líquido en un baño de agua entre 44 y 46 °C hasta que llegue el momento de usarlo. En un envase diferente, colóquese un termómetro en agua o medio que haya estado expuesto al mismo calentamiento y enfriamiento que la placa que contiene el medio. No se debe confiar en el tacto como un buen indicador de la temperatura del medio cuando vaya a añadirse el agar. Utilícese agar de recuento de placa, agar R2A o agar NWRI, como se especifica en la sección 9215A.6. Antes de utilizar un nuevo lote de medio, se comprobará su idoneidad. b) Vertido en las placas: Limítese el número de muestras de siembra en una serie, de manera que no transcurran más de 20 minutos (mejor aún 10) entre la dilución de la primera muestra y la adición del medio a la última placa de la

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serie. Viértanse al menos 10-12 ml de medio licuado, mantenido a 44-46 °C en cada disco y levántese suavemente la tapadera lo suficiente para introducir el medio. Evítese el vertido del medio fuera del envase o en el borde del disco. Una vez añadido el medio a todas las placas, mézclese cuidadosamente el medio líquido con la porción de muestra en estudio previamente colocada en la placa, con cuidado de no proyectar la mezcla contra el borde, girando primero el disco en una dirección y después en la contraria, o rotando e inclinándolo a la vez. Déjense solidificar las placas (10 minutos), e inviértanse y colóquense en la incubadora. c) Controles estériles: Compruébese la esterilidad del medio y de los blancos de agua de dilución preparando con ellos placas fluidas en cada serie de muestras. Prepárense controles adicionales para determinar la contaminación de las placas, las pipetas y el aire de la habitación. 4.

Incubación Véase sección 9215A.7.

5. Recuento, registro, cálculo e informe Véanse secciones 9215A.8 y 9215A.9. 6. Bibliografía BREED, R. S. & D. DOTTERER. 1916. The number of colonies allowable on satisfactory agar plates. Tech. Bull. 53, New York Agricultural Experiment Sta. BUTTERFIELD, C. T. 1933. The selection of a dilution water for bacteriological examinations. J. Bacteriol. 23:355; Pub. Health Rep. 48:681. ARCHAMBAULT, J., J. CUROT & M. H. MCCRADY. 1937. The need of uniformity of conditions for counting plates (with suggestions for a standard colony counter). Amer. J. Pub. Health 27:809. R ICHARDS , O. W. & P. C. H EIJN . 1945. An im-

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proved dark-field Quebec colony counter. J. Milk Technol. 8:253. BERRY, J. M., D. A. MCNEILL & L. D. WITTER. 1969. Effect of delays in pour plating on bacterial counts. J. Dairx Sci. 52:1456. GELDREICH, E. E., H. D. NASH, D. J. REASONER & R. H. T AYLOR . 1972. The necessity of controlling bacterial populations in potable waters: Community water supply. J. Amer. Water Works Assoc. 64:596. GELDREICH, E. E. 1973. Is the total count necessary? Proc. 1. a An. Water Quality Technol. Conf., American Water Works Assoc, Paper. n.° VII-1. GINSBURG, W. 1973. Improved total count techniques. Proc. 1.a An. Water Quality Technol. Conf., American Water Works Assoc, Paper. n.° VIII. DUTKA, B. J., A S. Y. Chau & J. COBURN. 1974 Relationship of heterotrophic bacterial indicators of water pollution and fecal sterols. Water Res. 8:1047. KLEIN, D. A. & S. Wu. 1974. Stress: a factor to be considered in heterotrophic microorganism enumeration from aquatic environments. Appl. Microbiol. 37:429. GELDREICH , E. E, H. D. NASH , D. J. REASONER & R. H. TAYLOR. 1975. The necessity for controlling bacterial populations in potable waters: Bottled water and emergency water supplies. J. Amer. Water Works Assoc. 67:117. BELL, C. R., M. A. HOLDER-FRANKLIN & M. F RANKLIN , 1980. Heterotrophic bacteria in two Canadian rivers: I. Seasonal yariation in the predominant bacterial populations. Water Res. 14:449. REASONER, D. J. & E. E. GELDREICH. 1981. Influence of medium, methods and incubation time and temperature on the bacterial count of potable water. 81.a An. Meeting, American Soc. Microbiology, Dallas, Texas, Paper. n.° N27. MEANS, E. G., L. HANAMI, G. F. RIDGWAY & B. H. Olson. 1981. Evaluating mediums and plating techniques for enumerating bacteria in water distribution systems. J. Amer. Water Works Assoc. 73:585. AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION. 1985. Standard Methods for the Examination of Dairy Products, 15. a ed. American Public Health Assoc., Washington, D.C. REASONER, D. J. & E. E. GELDREICH. 1985. A new medium for the enumeration and subculture of bacteria from potable water. Appl. Environ. Microbiol. 49:1.

9-72

MÉTODOS NORMALIZADOS

9215 C. 1.

Método de placa difusa

Instrumental de laboratorio

a) Varillas de vidrio: Incúrvense al fuego varillas de vidrio pulido de 4 mm de diámetro y 200 mm de longitud en un ángulo de alrededor de 45 °C a unos 40 mm de un extremo. Esterilícense antes de utilizarlas. b) Pipetas de vidrio de 1,1 ml con extremos redondeados. No se emplearán pipetas desechables de plástico. c) Placa giratoria (opcional)*. d) Incubadora o estufa de secado, graduada a 42 °C, o campana de flujo laminar. 2.

Medios

Véanse 9215A.6a, c y d. Si se utiliza agar R2A, se obtendrán mejores resultados a 28 °C con incubación durante 7 días; si se utiliza NWRI, se deberá incubar a 20 °C durante 7 días. 3.

Preparación de las placas

Viértanse 15 ml del medio deseado en placas de Petri estériles de 100 x 15 o 90 x 15; déjese solidificar el agar. Hágase un secado previo de las placas, de manera que pierdan 2-3 g de agua de un día a otro. Véanse figura 9215:2, la tabla 9215:I o la figura 9215:3. Utilícense las placas predesecadas inmediatamente después de este proceso. Para presecar y utilizar placas el mismo día, viértanse 25 ml de agar en un disco de Petri y séquese en una cámara de flujo laminar sin cubierta a temperatura ambiente (24 a 26 °C) para conseguir la pérdida deseada, es decir, 2-3 g. Véase figura 9215:3. * Fisher Scientific, manual n.° 08-758, o Lab-Line motorizada, n.° 1580, o equivalente.

4.

Procedimiento

Prepárense las diluciones como se expone en 9215B.2. a) Varillas de vidrio: Tómense con una pipeta 0,1-0,5 ml y colóquense sobre la superficie de la placa de agar presecada. Con una varilla de vidrio estéril curvada, distribúyase el inoculo sobre la superficie del medio, girando el disco con la mano o por medio de una placa giratoria. Déjese que el inoculo sea completamente absorbido por el medio antes de proceder a la incubación. b) Pipetado: Llévese con la pipeta el volumen de muestra deseado (0,1-0,5 ml) en la superficie del agar presecado, mientras se gira el disco en una placa giratoria. Libérese lentamente la muestra de la pipeta mientras se hace un movimiento de vaivén, comenzando en el centro de la placa y finalizando a 0,5 cm del borde de la placa antes de volver al centro. Rócese ligeramente la superficie de la placa con la pipeta. Déjese que el inoculo sea absorbido por completo por el medio antes de proceder a la incubación. 5.

Incubación Véase 9215A.7.

6. Recuento, registro, cálculo e informe Véanse 9215A.8 y 9215A.9.

7.

Bibliografía

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EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

9-73

Figura 9215:2. Pérdida de peso por secado de placas de agar de 15 ml almacenadas individualmente, invertidas y con las cubiertas colocadas. Fuente: Datos no publicados. Water Purification Lab., Chicago Dep. Water.

TABLA 9215:I. EFECTO DE LA TEMPERATURA DE SECADO EN LA PÉRDIDA DE PESO DE PLACAS DE AGAR DE 15 ML ALMACENADAS INDIVIDUALMENTE *

surface píate methods for determination of bacterial counts. Can. J. Microbiol. 13:1409. V AN S OESTBERGAN , A. A. & C. H. L EE . 1969. Pour plates or streak plates. Appl. Microbiol. 18:1092.

CLARK, D. S. 1971. Studies on the surface píate method of counting bacteria. Can. J. Microbiol. 17:943. GILCHRIST, J. E, J. E. CAMPBELL, C. B. DONELLY, J. T. PEELER & J. M. DELANEY. 1973. Spiral pía-

9-74

MÉTODOS NORMALIZADOS

Figura 9215:3. Pérdida de peso de placas de agar de 25 ml (100 x 15 mm) secadas por separado en una campana de flujo laminar a temperatura ambiente (24 a 36 C), humedad relativa (30 a 33 por 100) y velocidad del aire 0,6 m/segundo. Procedencia: Datos no publicados. Alberta Environmental Centre, Vengreville, Alberta.

te method for bacterial determination. Appl. Microbiol. 25:244. PTAK , D. M. & W. GINSBURG . 1976. Pour píate vs. streak píate method. Proc. 4.a An. Water Quality Technol. Conf., American Water Works Assoc, Paper, n.° 2B-5. DUTKA, B. J., ed. 1978. Methods for Microbiological Analysis of Waters, Wastewaters and Sediments. Inland Waters Directorate, Scientific Operation Div., Canada Centre for Inland Waters, Burlington, Ontario. KAPER , J. B., A. L. MILLS & R. R. C OLWELL. 1978. Evaluation of the accuracy and precision of enumerating aerobic heterotrophs in

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9-75

EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

9215 D. 1.

Método del filtro de membrana

Instrumental de laboratorio Véase sección 9222B.1.

2.

Medios

Véase 9215A.6. Utilícese agar RHP, el R2A o el NWRI. 3.

Preparación de las placas

Viértanse porciones de 5 ml de medio estéril en placas de Petri de 50 x 9 mm. Déjense solidificar a temperatura ambiente. Las placas preparadas pueden guardarse en bolsas de plástico o envases bien cerrados en un frigorífico, aunque es mejor no conservarlas durante más de 1 semana. 4. Tamaño de la muestra

El volumen que se va a filtrar varía según el tipo de muestra. Selecciónese el tamaño máximo de la misma que produzca 20-200 UFC por filtro. 5.

Procedimiento

Fíltrese el volumen adecuado a través de un filtro de membrana estéril de 47 mm y 0,45 µm de poro, en vacío parcial. Aclárese el embudo con tres porciones de 20 a 30 ml de agua de dilución estéril. Colóquese el filtro en la placa de Petri con agar. 6.

Incubación

Colóquense las placas ajustadas en cajas o bolsas de plástico que contengan

toallas de papel humedecidas. Incúbense a 35 ± 0,5 °C durante 48 horas si se utiliza agar RHP o más si se utiliza medio R2A, o bien a 20 °C durante 7 días si se trata de agar NWRI. Las placas duplicadas pueden incubarse en tiempos o temperaturas diferentes según se desee.

7. Recuento, registro, cálculo e informe

Véanse 9215A.8 y 9215A.9. Se informará como UFC/ml, método de filtro de membrana, tiempo, medio.

8.

Bibliografía

C LARK , H. F., E. E. GELDREICH , H. L. J ETER & P. W. KABLER. 1951. The membrane filter in sanitary bacteriology. Pub. Health Rep. 66:951. STOPERT, E. M., W. T. SOKOSKI & J. T. NORTHAM. 1962. The factor of temperatura in the better recovery of bacteria from water by filtration. Can. J. Microbiol. 8:809. TAYLOR, R. H. & E. E. GELDREICH. 1979. A new membrane filter procedure for bacterial counts in potable water and swimming pool samples. J. Amer. Water Works Assoc. 71:402. CLARK, J. A. 1980. The influence of increasing numbers of non-indicator organisms upon the detection of indicator organisms by the membrane filter and presence-absence tests. Can. J. Microbiol. 20:827. DUTKA, B. J., ed. 1981. Membrane Filtration, Applications. Techniques, and Problems. Marcel Dekker, Inc., Nueva York, y Basilea, Suiza. HOADLEY, A. W. 1981. Effect of injury on the recovery of bacteria on membrane filters. En B. J. Dutka, ed. Membrane Filtration, Applications, Techniques, and Problems, págs. 413-450. Marcel Dekker, Inc., Nueva York, y Basilea, Suiza.

9-76

MÉTODOS NORMALIZADOS

9216

RECUENTO MICROBIANO TOTAL DIRECTO (PROPUESTA)* 9216 A.

Introducción

El recuento directo total de bacterias en las aguas limpias y residuales suele superar el que se obtiene con el recuento

* Aprobado por el Standard Methods Committee, 1988.

9216 B. 1.

Método microscópico de epifluorescencia

Discusión general

El método microscópico de epifluorescencia permite el recuento directo total de células con relativa rapidez (20-30 minutos a partir de la toma de la muestra) y sensibilidad. No permite diferenciar las células bacterianas según su taxonomía, actividad metabólica o viabilidad, ni puede utilizarse para calcular la biomasa microbiana a causa de las considerables variaciones en el volumen de las células individuales. El método requiere técnicos expertos capaces de distinguir las células microbianas de los detritus a partir de su morfología. El método consiste en la fijación de la muestra para su conservación, tinción con un fluorocromo químico, filtración al vacío en una membrana de policarbonato no fluorescente y recuento en un microscopio de epifluorescencia. 2.

heterótrofo de placa y con los métodos numéricos más probables porque, a diferencia de ellos, el recuento directo evita los errores que causan los fenómenos de viabilidad, como la selectividad del medio de cultivo, el agrupamiento celular y las lentas velocidades de crecimiento.

Instrumental

a) Microscopio con iluminación vertical UV para epifluorescencia, con campo plano y objetivo de 100 x para aceite de inmersión que permita un aumento total de 1.000 x, como mínimo.

b) Recuento con retícula por medio de un ocular micrométrico* calibrado con platina micrométrica*. c) Filtros†, filtros de excitación (KP 490 y LP 455), divisor de haz (LP 510) y filtro barrera (LP 520 con lámpara de mercurio, HBO 50). d) Mezclador. e) Unidad de filtración adecuada para su uso con filtros de membrana de 25 mm de diámetro. f) Filtro de membrana de policarbonato‡ de 25 mm de diámetro y 0,2 µm de tamaño de poro (no fluorescentes o preparados sumergiendo la membrana en negro Irgalan [2 g/1 en ácido acético al 2 por 100] durante 24 horas, lavándolos después con agua y secándolos al aire) o de celulosa § de 25 mm de diámetro y 5 µm de tamaño de poro. g) Jeringas desechables de 3 ml, con filtros desechables de jeringa de 0,2 µm de tamaño de poro.

* † ‡ §

Bausch & Lomb n.° 31-16-13. K. Zeiss o equivalente. Nucleopore Corp. o equivalente. Millipore Corp. o equivalente.

9-77

EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

h) Tubos de ensayo de vidrio con tapón de rosca de 13 x 125 mm. 3.

Reactivos

a) Tampón de fosfato: Disuélvanse 13,6 g de KH2PO4 en agua y dilúyase hasta 1 l. Ajústese el pH a 7,2, si es necesario, y fíltrese a través de un filtro de membrana de 0,2 µm. b) Fijador: Glutaraldehído al 5 por 100 (p/v) en tampón de fosfato. Prepárese diariamente. c) Fluorocromo: Naranja de acridina || al 0,1 por 100 (p/v) en tampón de fosfato. d) Aceite de inmersión de baja fluorescencia #. 4.

Procedimiento

Tómense las muestras de agua según se describe en la sección 9060. Añádanse 9,0 ml de muestra a un tubo de ensayo con 1,0 ml de fijador. Las muestras fijadas pueden conservarse a 4°C hasta 3 semanas, sin que se produzca una disminución importante del número de células. Dispérsense y diluyanse las muestras de fuentes mesotróficas o eutróficas para obtener resultados reproducibles. Mézclese la muestra mediante una mezcladora o batidora y háganse diluciones de diez en diez veces en el número necesario en tampón de fosfato. Las muestras de aguas limpias tal vez no precisen dilución, pero pueden necesitarse volúmenes mayores (> 100 ml) para obtener resultados fiables. Introdúzcase 1 ml de la muestra o la dilución en un filtro no fluorescente de policarbonato, apoyado en un filtro de

membrana en el soporte del filtro. Añádase 1 ml de fluorocromo con una jeringa estéril desechable y espérese durante 2 minutos, añadiendo alrededor de 3 ml de tampón de fosfato filtrado para favorecer una distribución más regular de las células. También se puede combinar el fluorocromo con la muestra en un pequeño vial limpio, dejarlo reaccionar y colocar la mezcla en el soporte del filtro. Fíltrese al vacío (alrededor de 13 kPa). Lávese con 2 ml de tampón de fosfato y fíltrese. Retírese el filtro de policarbonato con una pinza y déjese secar al aire durante 1 ó 2 minutos. El filtro puede cortarse en cuatro partes y guardarse, si es necesario. Una vez seco, colóquese sobre una gota de aceite de inmersión en un portaobjetos de cristal limpio. Añádase una gotita de aceite de inmersión a la superficie del filtro. Cúbrase suavemente con un cubreobjetos de vidrio limpio y guárdese a oscuras durante varios meses sin que se produzca una pérdida significativa de fluorescencia. Examínense al menos 10 campos elegidos al azar con un objetivo de inmersión de 100 x para establecer la uniformidad de la distribución de las células microbianas y la posibilidad de contarlas por separado (si no, dilúyase la muestra y repítase el proceso). Es preferible contar de 10 a 50 células por campo. Cuéntese el número de células en no menos de 20 cuadrados utilizando la retícula calibrada.

5.

Cálculos

Calcúlese el número medio de células por filtro. Obténgase el área efectiva de filtro a partir de las características de la unidad de filtración y extrapólese a un determinado número de células por mililitro de muestra.

|| Sigma Chemical Co., calidad biológica, o equiva- Células totales/ml = (media de células/cuadrado) x lente. x (cuadrados/filtro) x # Cargille Laboratories, Inc., tipo B, o equivalente. x (factor de dilución)/volumen de la muestra, ml

9-78

6.

MÉTODOS NORMALIZADOS

Bibliografía

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9221 TÉCNICA DE FERMENTACIÓN EN TUBO MÚLTIPLE PARA MIEMBROS DEL GRUPO DE LOS COLIFORMES* 9221 A. El grupo coliforme está formado por todas las bacterias aerobias y anaerobias facultativas, gramnegativas, no formadoras de esporas y con forma de bastón que fermentan la lactosa, produciendo gas y ácido en 48 horas a 35 °C. La prueba estándar para el grupo coliforme puede realizarse mediante una técnica de fermentación en tubos múltiples (a través de las fases supuestas y confirmatorias o prueba completa) o por la técnica del filtro de membrana (FM) (sección 9222). Son aplicables todos estos métodos, teniendo en cuenta las limitaciones que se especifican y el propósito del estudio. En el caso de la técnica de fermentación en tubos múltiples, los resultados del estudio de los tubos y diluciones replicados se comunican en términos de Número Más Probable (NMP) de microorganismos existentes. Este número, basado en determinadas fórmulas de probabilidad, es un cálculo de la densidad media de coliformes en la muestra. La precisión de cada prueba depende del número de tubos utilizados. Se obtiene una información más satisfactoria cuando el mayor inoculo de muestra es* Aprobado por el Standard Methods Committee, 1988.

Introducción tudiado muestra gas en alguno o en todos los tubos, y el más pequeño muestra gas en ninguno o en la mayoría de los tubos. La densidad bacteriana (9221D.2) puede calcularse mediante la fórmula facilitada o por medio de la tabla que utiliza el número de tubos positivos en las diluciones múltiples. El número de porciones de la muestra depende de la precisión requerida. Las tablas de NMP se basan en la hipótesis de una distribución de Poisson (dispersión aleatoria). Sin embargo, si la muestra no se ha agitado adecuadamente antes de hacer las porciones o si existe agrupamiento de bacterias, el valor del NMP podrá resultar menor que el número real de densidad bacteriana. Sin embargo, el interés por la técnica de tubos múltiples, las numerosas investigaciones realizadas sobre la precisión del NMP y la expresión de los resultados de la prueba en forma de NMP no deben llevar a considerar este método como un ejercicio estadístico en lugar de como un medio de valorar la densidad de coliformes en un agua y su calidad sanitaria. La mejor valoración de la eficacia de un tratamiento del agua o de la calidad sanitaria de un agua no tratada depende de la interpretación de los resultados bacteriológicos y de las restantes informaciones

9-79

EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

obtenidas mediante encuestas sanitarias o de ingeniería. 1.

Calidad del agua potable

Cuando se analiza el agua potable para determinar si su calidad cumple las normas del organismo estadounidense Environmental Protection Agency (EPA), se utilizan cinco porciones de 10 ml. En caso de que empleen porciones de 100 ml de muestra, se inocularán en 5 botellas de cultivo. Para conseguir un cálculo más preciso del número de bacterias en el agua potable tratada, que no debe contener coliformes por 100 ml, se utilizarán 10 tubos duplicados con porciones de 10 o 100 ml de muestra. Al estudiar todo tipo de aguas potables, aguas naturales y efluentes, se realizará la fase confirmatoria (9221B.2). La prueba completa (9221 B.3) es el estándar de referencia que se aplicará en muestras seleccionadas con carácter estacional para controlar la calidad del agua y debe tener una periodicidad al menos trimestral. En los estudios habituales que se llevan a cabo en la mayoría de los suministros públicos de agua, sobre todo en los que están desinfectados, el objetivo de las pruebas de coliformes consiste en determinar su grado de adecuación a las normas de la EPA, como medida de la eficacia de la planta de tratamiento o de la calidad del agua y diluyentes. Una elevada proporción de los coliformes que existen en los sistemas de distribución no se debe a un fallo en el tratamiento en la planta o en la fuente, sino a un recrecimiento de las bacterias en las conducciones. Dado que es difícil distinguir entre recrecimiento de coliformes y nuevas contaminaciones, se admite que todas las apariciones de coliformes son nuevas contaminaciones, mientras no se demuestre lo contrario. Es de esperar que más del 95 por 100 de las muestras estudiadas den resultados negativos. Un resultado

positivo ocasional, a menos que se repita en el mismo punto de toma, suele tener un valor limitado, aunque no puede ser ignorado. Un incremento del número de muestras positivas durante un determinado período o un brusco aumento en un período corto, indican la inducción de un cambio en la calidad del agua, cuyo significado debe determinarse mediante un estudio sanitario. Háganse rápidamente las correcciones necesarias, teniendo en cuenta el resultado del estudio sanitario, y compruébese la eficacia de las mismas por medio de nuevos análisis bacteriológicos. 2.

Calidad de aguas no potables

Para estudiar aguas no potables, inocúlese una serie de tubos con adecuadas diluciones decimales de la muestra de agua (múltiplos y submúltiplos de 10 ml), teniendo en cuenta la densidad probable de coliformes. Utilícese la fase supuesta confirmatoria del procedimiento de tubos múltiples. Como control de calidad, utilícese en cada estación la prueba completa más intensiva (922l.B) en un mínimo del 10 por 100 de las muestras de agua no potable que contengan coliformes. El objetivo del estudio del agua no potable suele consistir en calcular la densidad de contaminación bacteriana, determinar la fuente de la misma, reforzar los estándares de calidad del agua o rastrear la supervivencia de los microorganismos. Cada uno de estos objetivos requiere una valoración numérica para comunicar los resultados. La técnica de la fermentación en tubos múltiples puede utilizarse para conseguir un cálculo estadísticamente válido del NMP de densidad de coliformes. Es preciso estudiar un número suficiente de muestras que permita alcanzar resultados representativos del lugar en que se ha efectuado la toma. Por lo general, la media geométrica o el valor medio de los resultados de un de-

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MÉTODOS NORMALIZADOS

terminado número de muestras pueden proporcionar un valor en el que se reduzca al mínimo el efecto de la variación entre muestras. Para conseguir este objetivo, puede ser más adecuado un recuento directo con una técnica de filtro de membrana.

3.

Otras muestras

La técnica de fermentación en tubo múltiple es aplicable al análisis de aguas saladas o salobres y a lodos, sedimentos y fangos. Ténganse en cuenta las precau-

9221 B. 1.

ciones antes aludidas sobre el tamaño de las porciones y el número de tubos por dilución. Para preparar muestras sólidas o semisólidas, pésese la muestra y añádase el líquido de dilución hasta conseguir una de 10 -1 . Por ejemplo, introdúzcanse 50 g de muestra en una jarra mezcladora estéril, añádanse 450 ml de tampón de fosfato estéril o de agua de dilución con peptona al 1 por 100 y mézclese durante 1 a 2 minutos a baja velocidad (800 rpm). Prepárense las diluciones decimales correspondientes del homogeneizado resultante lo antes posible para reducir al mínimo la sedimentación.

Técnicas estandarizadas de fermentación en tubo múltiple (NMP) de coliformes totales

Fase presuntiva

Utilícese un medio líquido de lauril triptosa en la porción presuntiva de la prueba de tubo múltiple. Como alternativa, puede emplearse un medio líquido de lactosa, siempre que se haya demostrado que no aumenta la frecuencia de resultados positivos falsos ni enmascara los coliformes que existen en las muestras de agua potable. Si se ha refrigerado el medio después de su esterilización, se incubará de un día a otro a 35 °C antes de utilizarlo. Rechácense los tubos que muestren crecimiento, burbujas o ambas cosas. a) Reactivos y medios de cultivo: 1) Medio líquido de lauril triptosa:

Añádanse los ingredientes deshidratados al agua destilada, mézclese cuidadosamente y caliéntese para disolverlo. El pH debe ser 6,8 ± 0,2 después de la esterilización. Antes de esterilizarlo, coloquese en tubos de fermentación con un vial invertido una cantidad suficiente de medio como para que cubra éste, al menos parcialmente, después de la esterilización. También es posible prescindir del vial invertido y añadir 0,01 g/1 de púrpura bromocresol al medio presuntivo para determinar la producción de ácido, lo que indicaría un resultado positivo en esta parte de la prueba. Ciérrense los tubos con tapones de metal o de plástico resistente al calor. Hágase el medio de lauril triptosa con fuerza suficiente como para que al añadir 100 ml o 10 ml de muestra, la concentración de los ingredientes no sea menor que la del medio estándar. Prepárese conforme a las directrices de la tabla 9221:I. Ciérrense los tubos con tapones de metal o de plástico resistente al calor.

9-81

EXAMEN MICROBIOLÚGICO DE LAS AGUAS

2) Medio de lactosa: Extracto de buey .............. Peptona ................................ Lactosa .............................. Agua destilada ..................

3,0 5,0 5,0 1

g g g l

Añádanse los ingredientes deshidratados al agua, mézclese cuidadosamente y caliéntese para disolverlos. El pH debe ser de 6,9 ± 0,2 después de la esterilización. Previamente, colóquese la mezcla en tubos de fermentación de unas dimensiones que permitan que el líquido, en el tubo ya inoculado, cubra al menos parcialmente el vial invertido después de la esterilización. Se puede también prescindir del vial y añadir 0,01 g/1 de púrpura bromocresol al medio presuntivo para determinar la producción de ácido, lo que indicaría un resultado positivo en esta parte de la prueba. Ciérrense con tapones de metal o de plástico resistente al calor. Hágase el medio de lactosa con fuerza suficiente como para que, al añadir 100 ml o 10 ml de la muestra al medio, la concentración de los ingredientes no sea menor que la del medio estándar. Prepárese de acuerdo con las directrices de la tabla 9221:II. b) Procedimiento: 1) Agrúpense los tubos de fermentación en hileras de cinco en una gradilla

para tubos de ensayo. El número y el volumen de los tubos de muestra seleccionados dependen de la cantidad y de las características del agua que se vaya a estudiar. Para agua potable, utilícense cinco porciones de 10 ml o 10 porciones de 10 ml; si se trata de agua no potable, se utilizarán cinco tubos por dilución (de 10, 1 o 0,1 ml, etc.). Al hacer las diluciones, mídanse los volúmenes de muestra diluida, se seguirán las indicaciones de la sección 9215B.2. Utilícese la figura 9215:1 como guía para preparar las diluciones. Agítese enérgicamente la muestra y las diluciones unas 25 veces. Inocúlese cada tubo con volúmenes duplicados de muestra (en diluciones decimales crecientes, si se utilizan cantidades decimales de la muestra). Mézclense las porciones a estudiar con el medio mediante agitación suave. 2) Los tubos inoculados se incuban a 35 ± 0,5 °C. Tras 24 ± 2 horas, agítese cada tubo suavemente y se observa si se produce gas o un crecimiento ácido (color amarillo) y, en caso contrario, reincúbese y vuélvase a examinar al final de 48 ± 3 horas. Regístrese la presencia o ausencia de gas o ácido. Si no se ha utilizado el vial, un crecimiento con acidez significa una presunta reacción positiva. c) Interpretación: La aparición de gas o ácido en los tubos a las 48 ± 3

TABLA 9221:I. PREPARACIÓN DEL MEDIO LÍQUIDO DE LAURIL TRIPTOSA

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MÉTODOS NORMALIZADOS

TABLA 9221:II.

PREPARACIÓN DEL MEDIO LÍQUIDO DE LACTOSA

horas constituye una presunta reacción positiva. Los tubos con este tipo de reacción deben ser estudiados en la fase confirmatoria (922IB.2). La ausencia de crecimiento ácido o de formación de gas al finalizar las 48 ± ± 3 horas de incubación indica una reacción negativa. El límite arbitrario de 48 horas para la observación excluye sin ninguna duda a los miembros ocasionales del grupo coliforme que crecen de manera muy lenta (véase sección 9212). 2.

Fase confirmatoria

La fase confirmatoria se ilustra en la figura 9221:1. a) Reactivos y medios de cultivo: En esta fase se utilizarán tubos de fermentación con un medio líquido de verde brillante lactosa bilis. Medio de verde brillante lactosa bilis: Peptona ................................ Lactosa .............................. Oxgall ................................. Verde brillante ................... Agua destilada ..................

10,0 g 10,0 g 20,0 g 0,0133 g 1 l

Añádanse los ingredientes deshidratados al agua, mézclense cuidadosamente y caliéntense para disolverlos. El pH debe ser de 7,2 ± 0,2 después de la esteriliza-

ción. Antes de ésta, colóquese en tubos de fermentación suficiente cantidad de medio como para cubrir al menos parcialmente un vial invertido después de la esterilización. Ciérrense los tubos con tapones de metal o de plástico resistente al calor. b) Procedimiento: Llévense a la fase de confirmación todos los tubos primarios en los que haya aparecido cualquier cantidad de gas o de crecimiento ácido a las 24 horas de incubación. Si se observa una fermentación activa o un crecimiento ácido antes de las 24 horas, los tubos se llevarán al medio de confirmación sin esperar a que transcurran las 24 horas. Si hay otros tubos primarios con crecimiento ácido después de 48 horas de incubación, también se llevarán a la fase confirmatoria. Agítense suavemente o háganse rotar los tubos primarios que muestren gas o crecimiento ácido suficiente para que se produzca una resuspensión de los microorganismos. Con un asa estéril de 3 mm de diámetro, pásese un asa completa de cultivo al tubo de fermentación que contiene el medio verde brillante de lactosa bilis o introdúzcase un aplicador de madera estéril en el cultivo, de al menos 2,5 cm, retírese rápidamente e introdúzcase hasta el fondo en el tubo de fermentación con el medio mencionado. Retírese y deséchese el aplicador. Repítase

9-83

EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

Figura 9221:1. Esquema de la fase confirmada.

esta operación en todos los tubos posiblemente positivos. Incúbese el medio de verde brillante de lactosa bilis a 35 ± 0,5 °C durante 48 ± ± 3 horas. La formación de cualquier cantidad de gas en el vial invertido en el medio de fermentación verde brillante de lactosa bilis a las 48 ± 3 horas constituye un resultado positivo en la fase confirmatoria. Calcúlese el valor del NMP a partir del número de tubos positivos, de la manera descrita en la sección 9221D. c) Procedimiento alternativo: Utilícese únicamente en aguas contaminadas o

residuales que se sepa presenten sistemáticamente resultados positivos. En caso de que todos los tubos sean positivos en dos o más diluciones consecutivas durante 24 horas, llévense sólo a la fase confirmatoria aquéllos con diluciones más altas (menor muestra de inoculo) y todos los que presenten gas o crecimiento ácido después de las 48 horas. 3.

Prueba completa

Para establecer definitivamente la existencia de bacterias coliformes y obtener

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MÉTODOS NORMALIZADOS

EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

9-85

datos sobre el control de calidad, practíquese la prueba completa en todos los tubos positivos confirmados (véase figura 9221:2). Puede utilizarse la doble confirmación en medio líquido de verde brillante de lactosa bilis para coliformes totales y el medio líquido EC para coliformes fecales (véase sección 9221C). Considérense como respuesta positiva de la prueba completa los resultados positivos en medio líquido EC a temperatura elevada (44,5 °C). Los cultivos que sean positivos en medio de verde brillante lactosa bilis y negativos en medio EC indican la presencia de coliformes no fecales y, por tanto, deben ser sometidos a la prueba completa para obtener un valor del NMP.

usarlas; fíltrese a través de un papel y consérvese en un frasco de tinción. b) Solución de Lugol, modificación de Gram: Tritúrense en un mortero 1 g de cristales de yodo y 2 g de KI. Añádase lentamente agua destilada y tritúrese con cuidado después de cada adición hasta que se completa la solución. Almacénese en una botella de vidrio ámbar, añadiendo el resto del agua (hasta un total de 300 ml). c) Contraste: Disuélvanse 2,5 g de safranina en 100 ml de alcohol etílico al 95 por 100. Añádanse de 10 a 100 ml de agua destilada. d) Alcohol acetona: Mézclese a partes iguales alcohol etílico (95 por 100) y acetona. b) Procedimiento: 1) Siémbrese asépticamente una placa de agar LES Endo (sección 9222B.2) por cada tubo de medio verde brillante lactosa bilis que haya producido gas; la operación debe realizarse lo antes posible tras la detección del gas. Siémbrense las placas de forma que se asegure la existencia de algunas colonias aisladas, separadas por al menos 0,5 cm. Si existen coliformes y se quiere obtener una elevada proporción de aislamientos satisfactorios, se deben tomar las siguientes precauciones: a) Utilícese un asa estéril de 3 mm de diámetro o una aguja de inoculación ligeramente curvada en la punta; b) ábrase e inclínese el tubo de fermentación evitando la toma con la aguja de cualquier membrana o espuma; c) introdúzcase el extremo del asa o la aguja en el líquido del tubo a una profundidad de alrededor de 0,5 cm, y d) siémbrese la placa con la parte curvada de la aguja en contacto con el agar para no arañar la superficie. Se flameará el asa entre los cuadrantes segundo y tercero para mejorar el aislamiento de las colonias. Incúbense las placas invertidas a 35 ± ± 0,5 °C durante 24 ± 2 horas. 2) Las colonias que se desarrollan en el agar LES Endo pueden ser típicas (ro-

a) Medio de cultivo y reactivos: 1) Agar nutritivo:

Añádanse los ingredientes al agua, mézclese cuidadosamente y caliéntese para disolverlos. El pH debe ser de 6,8 ± 0,2 después de la esterilización. Antes de esterilizar, póngase el medio en tubos con tapón de rosca. Tras la esterilización, colóquense inmediatamente en posición inclinada, de forma que el agar solidifique formando pendiente. Ajústense los tapones después de que se hayan enfriado y consérvense en una zona fría y protegida. 2) Reactivos para la tinción de Gram: a) Oxalato de amonio-cristal violeta (de Hucker): Disuélvanse 2 g de cristal violeta (con un contenido de colorante del 90 por 100) en 20 ml de alcohol etílico al 95 por 100; se disuelven 0,8 g de (NH4)2C2O4 · H2O en 80 ml de agua destilada; mézclense ambas soluciones y déjese reposar durante 24 horas antes de

9-86

sas a rojo oscuras con un brillo verde metálico superficial), atípicas (rosas, rojas, blancas o incoloras sin brillo) a las 24 horas de incubación o negativas (todas las demás). Tómense de cada placa una o más colonias típicas bien definidas o, si no existen, dos o más entre las que se consideran como probablemente formadas por microorganismos del grupo coliforme y se pasan a un tubo de fermentación con medio de lauril triptosa y a uno con agar en pendiente. (Este último no es necesario si se trata de muestras de agua potable.) Si se considera adecuado, utilícese una lupa para colonias a fin de conseguir un aumento óptimo a la hora de tomarlas de las placas de agar LES Endo. Al transferir las colonias, hay que elegir las que están bien aisladas y tocar apenas su superficie con una aguja esterilizada a la llama y enfriada al aire para evitar en lo posible el peligro de transferir un cultivo mixto. Incúbense los tubos con el medio secundario (medio líquido de lauril triptosa con viales de fermentación invertidos) a 35 ± 0,5 °C durante 24 ± 2 horas; si no se produce gas en este período se prolonga la incubación hasta 48 ± 3 horas. Estúdiense microscópicamente las preparaciones teñidas con Gram y obtenidas en los cultivos de pendiente de agar a las 24 horas, correspondientes a los tubos secundarios que muestres gas. 3) Tinción de Gram. Si se trata de muestras de agua potable, se puede prescindir de la tinción de Gram en la prueba completa, ya que es raro que existan bacterias grampositivas y microorganismos esporulados sobrevivientes en este método de detección selectiva. Existen varias modificaciones de la técnica de Gram. Utilícese la modificación de Hucker para teñir las extensiones de cultivos puros; inclúyase un control para organismos grampositivos y otro para gramnegativos. Prepárense emulsiones ligeras distintas

MÉTODOS NORMALIZADOS

de los crecimientos bacterianos en estudio y de los cultivos de control positivos y negativos sobre el mismo porta, utilizando para ello gotas de agua destilada colocadas en el cristal. Déjense secar al aire y fíjense pasando el porta sobre una llama para después teñirlo con la solución de oxalato de amonio-cristal violeta. A continuación aclárense con agua corriente y aplíquese la solución de Lugol durante 1 minuto. Lávese de nuevo el porta teñido con agua corriente. Decolórese durante 15-30 segundos con alcohol acetona, manteniendo el porta entre los dedos y dejando que el alcohol acetona fluya por la extensión teñida hasta obtener un líquido incoloro. No debe decolorarse en exceso. Contrástese con safranina durante 15 segundos, lávese con agua corriente, séquese con papel de filtro o al aire y estúdiese al microscopio. Los microorganismos grampositivos son azules y los gramnegativos rojos. Los resultados sólo son aceptables cuando los controles dan la reacción adecuada. c) Interpretación: El resultado positivo de la prueba completa requiere la formación de gas en los tubos secundarios con medio de lauril triptosa en 48 ± 3 horas y la demostración de bacterias alargadas gramnegativas no esporuladas procedentes de los cultivos con agar, lo que demuestra la presencia de un miembro del grupo coliforme. Si no se produce gas en los tubos secundarios en medio lauril triptosa en 48 ± 3 horas, ajústense los resultados originales de NMP calculados a partir de la prueba confirmatoria (sección 922ID).

4.

Bibliografía

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EXAMEN MICROBIOLÚGICO DE LAS AGUAS

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Procedimiento de NMP para coliformes fecales

Existen procedimientos de alta temperatura para separar microorganismos del grupo coliforme procedentes de fuentes fecales o no fecales. Las modificaciones de los procedimientos técnicos, la estandarización de los métodos y los detallados estudios de los miembros del grupo coliforme que se encuentran en las heces de algunos animales de sangre caliente, comparados con los procedentes de otras fuentes ambientales, han reafirmado la importancia de determinar los coliformes fecales. La prueba puede hacerse con uno de los métodos de tubos múltiples aquí descritos o por medio de los métodos de filtro de membrana que se describen en la sección 9222. El procedimiento en el que se emplea el medio EC proporciona una información adecuada sobre el origen del grupo coliforme (fecal o no fecal) cuando se utiliza en la prueba de confirmación. No debe utilizarse para el aislamiento directo de coliformes en el agua,

ya que es necesario un enriquecimiento previo en un medio que se presuma infectado para conseguir un aislamiento óptimo de coliformes fecales. El procedimiento con medio líquido A-l es un método de un solo paso que no requiere confirmación. La prueba para coliformes fecales (con medio EC) es aplicable al estudio de la contaminación de corrientes, aguas naturales, sistema de tratamiento de aguas residuales, aguas de baño, aguas marinas y para el control general de la calidad de todo tipo de agua. Sin embargo, no se recomienda como sustituto de la prueba completa para coliformes en el estudio de las aguas potables, ya que en las mismas no se puede tolerar la presencia de ningún tipo de bacterias coliformes. La prueba utilizando medio A-l es aplicable al agua del mar y a las aguas residuales tratadas.

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1. Prueba para coliformes fecales (medio EC)

La prueba para coliformes fecales permite diferenciar entre los coliformes de origen fecal (intestino de los animales de sangre caliente) y los procedentes de otras fuentes. Utilícese medio EC o, para una prueba más rápida sobre la calidad de las aguas de mariscos y aguas residuales tratadas, medio A-l en una prueba directa. a) Medio EC:

Añádanse los ingredientes deshidratados al agua, mézclense cuidadosamente y caliéntense para disolverlos. El pH debe ser de 6,9 ± 0,2 después de la esterilización. Antes de esterilizar, colóquese la mezcla en los tubos de fermentación, cada uno con un vial invertido, y con una cantidad de medio suficiente para que cubra, al menos parcialmente, al vial después de la esterilización. Ciérrense los tubos con tapones de metal o de plástico resistente al calor. b) Procedimiento: Estúdiense todos los tubos de fermentación presuntivos que hayan mostrado alguna cantidad de gas o un fuerte crecimiento durante las 48 horas de incubación en la prueba de confirmación. 1) Agítense suavemente o gírense los tubos de fermentación que muestran gas o un fuerte crecimiento. Con un asa estéril de metal de 3 mm de diámetro o un aplicador de madera estéril, pásese el cul-

MÉTODOS NORMALIZADOS

tivo de cada tubo de fermentación al medio EC. 2) Incúbense los tubos con medio EC inoculados en un baño de agua a 44,5 ± ± 0,2 °C durante 24 ± 2 horas. Deposítense todos los tubos con EC en un baño de agua antes de que transcurran 30 minutos de la inoculación y manténgase a una profundidad suficiente como para que el agua del baño esté a un nivel superior al que tiene el medio en los tubos. c) Interpretación: Se considera como reacción positiva la aparición de gas en un medio EC a las 24 horas o menos de incubación. La falta de gas (a veces se produce crecimiento) constituye un resultado negativo, que indica que el origen de los microorganismos no es el aparato digestivo de los animales de sangre caliente. El NMP en los tubos con medio EC positivos se calcula en la forma descrita en la sección 922ID. 2. Prueba directa de coliformes fecales (medio A-1)

a) Medio líquido A-1: A veces no se encuentra este medio en forma deshidratada, por lo que será preciso prepararlo a partir de sus ingredientes básicos.

Caliéntese hasta la disolución de los ingredientes sólidos, añádase el éter p-Msooctilfenil de polietilenglicol y ajústese el pH a 9,9 + 0,1. Antes de esterilizar, se vierte la mezcla en tubos de fermentación con un vial invertido en cantidad * Tritón X-100, Rohm y Haas Co., o equivalente.

9-89

EXAMEN MICROBIOLÚGICO DE LAS AGUAS

suficiente como para cubrir al menos parcialmente el vial después de la esterilización. Ciérrense los tubos con tapón de metal o de plástico resistente al calor. Esterilícese pasándola por el autoclave a 121 °C durante 10 minutos. Consérvese a oscuras a temperatura ambiente durante no más de 7 días. No importa que se forme precipitado. Se prepara el medio con la potencia necesaria para que, al añadir 10 ml de la muestra, la concentración de los ingredientes no sea inferior a la marcada en el medio estándar. Para muestras de 10 ml, se prepara medio doblemente concentrado. b) Procedimiento: Inocúlense tubos de medio líquido A-l, como se especifica en la sección 9221B.1M). Incúbese durante 3 horas a 35 ± 0,5 °C. Pásense los tubos a un baño de agua a 44,5 ± 0,2 °C e incúbense durante otras 21±2 horas. c) Interpretación: La aparición de gas en cualquier cultivo en medio A-l a las 24 horas o menos de incubación es una reacción positiva que indica la existencia de coliformes de origen fecal. Calcúlense el NMP a partir de los tubos positivos con medio A-l, en la forma descrita en la sección 922ID.

9221 D.

3.

Bibliografía

PERRY, C. A. & A. A. HAJNA. 1933. A modified Eijkman medium. J. Bacteriol. 25:419. PERRY, C. A. & A. A. HAJNA. 1944. Further evaluation of EC medium for the isolation of coliform bacteria and Escherichia coli. Amer. J. Pub. Health 34:735. GELDREICH, E. E., H. F. CLARK, P. W. KABLER, C. B. HUFF & R. H. BORDNER. 1958. The coliform group. II. Reactions in EC medium at 45 °C. Appl. Microbiol. 6:347. GELDREICH, E. E., R. H. BORDNER, C. B. HUFF, H. F. CLARK & P. W. KABLER. 1962. Type distribution of colíform bacteria in the feces of warm-blooded animals. J. Water Pollut. Control Fed. 34:295. GELDREICH, E. E. 1966. Sanitary significance of fecal coliforms in the environment. FWPCA Publ. WP-fu-3 (nov.). U.S. Dep. Interior, Washington, D.C. ANDREWS, W. H. & M. W. PRESNELL. 1972. Rapid recovery of Escherichia coli from estuarine water. Appl. Microbiol. 23:521. OLSON, B. H. 1978. Enhanced accuracy of coliform testing in seawater by a modification of the most-probable-number method. Appl. Microbiol. 36:438. STRANDRIDGE, J. H. & J. J. DELFINO. 1981. A-l Medium: Alternative technique for fecal coliform organism enumeration in chlorinated wastewaters. Appl. Environ. Microbiol. 42:918.

Estimación de la densidad bacteriana

1. Precisión de la prueba de tubos de fermentación

A menos que se estudien numerosas porciones de la muestra, la precisión de la prueba de tubos de fermentación es muy baja. Incluso si la muestra contiene 1 coliforme/ml, casi un 37 por 100 de los tubos de 1 ml pueden producir resultados negativos, debido a la distribución aleatoria de las bacterias en la muestra. Cuando en estas condiciones se utilizan cinco tubos, cada uno con 1 ml de la

muestra, se puede esperar un resultado completamente negativo en alrededor de un 1 por 100 de las ocasiones. Aunque se utilicen cinco tubos de fermentación, la precisión de los resultados no es muy elevada. Por tanto, hay que tener cuidado a la hora de interpretar el significado sanitario de los resultados de coliformes obtenidos cuando se utilizan pocos tubos con dilución de muestra, sobre todo cuando el número de muestras de una toma es limitado.

9-90

2.

MÉTODOS NORMALIZADOS

Cálculo y registro del NMP

Calcúlese y regístrese el número de hallazgos positivos de microorganismos del grupo coliforme (ya sea en pruebas confirmatorias o completas) en términos del Número Más Probable (NMP). Las tablas 9221:III, IV y V indican los valores del NMP para distintas series de siembras y resultados. En estas tablas, se contemplan límites de confianza del 95 por 100 para cada valor del NMP. Si los volúmenes de la muestra utilizados son los contenidos en las tablas, comuníquese el valor correspondiente al número de resultados positivos y negativos en las series en forma de NMP/100 ml. Los volúmenes de la muestra indicados en las tablas 9221:III y IV están relacionados de forma más específica con las aguas terminales. La tabla 9221:V ilustra los valores del NMP para combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se estudian volúmenes de cinco muestras de 10, 1,0 y 0,1 ml. En caso de que las series de diluciones decimales sean distintas de las de la tabla, selecciónense los valores del NMP de la tabla 9221:V por la combinación de tubos positivos,

TABLA 9221:IV.

ÍNDICE DE NMP Y LÍMITES DE

ACEPTACIÓN DEL 95 POR 100 PARA DISTINTAS COMBINACIONES DE RESULTADOS POSITIVOS Y NEGATIVOS CUANDO SE EMPLEAN DIEZ PORCIONES DE 10 ML

calculándose de acuerdo con la siguiente fórmula: Valor del NMP (de la tabla) x 10 × = mayor volumen estudiado = NMP/100 ml

TABLA 9221:III. ÍNDICE DE NMP Y LÍMITES DE ACEPTACIÓN DEL 95 POR 100 PARA DISTINTAS COMBINACIONES DE RESULTADOS POSITIVOS Y NEGATIVOS CUANDO SE EMPLEAN CINCO

PORCIONES DE 10 ML

Cuando se utilicen más de tres diluciones en series de diluciones decimales, sólo se tomarán los resultados de tres de ellas para calcular el NMP. Para seleccionar las tres diluciones a utilizar en la determinación del índice del NMP, elíjase la dilución más alta con resultado positivo entre las cinco estudiadas (no hay ninguna dilución menor que haya dado un resultado negativo) y las dos siguientes diluciones más altas. Para calcular el índice del NMP, utilícense los resultados de estos tres volúmenes. En el ejemplo siguiente, los resultados de la dilución significativa se ofrecen en negritas. El numerador representa los tubos positivos, y

9-91

EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

TABLA 9221:V. ÍNDICE DE NMP V LÍMITES DE ACEPTACIÓN DEL 95 POR 100 PARA DISTINTAS COMBINACIONES DE RESULTADOS POSITIVOS CUANDO SE USAN CINCO TUBOS POR DILUCIÓN

(10 ML, 1,0 ML, 0,1 ML)

el denominador, el total de tubos estudiados; la combinación de positivos indica

únicamente el número total de tubos positivos por dilución:

9-92

MÉTODOS NORMALIZADOS

En c, selecciónense las primeras tres diluciones, de manera que se incluya el resultado positivo en la dilución media. Cuando se presenta un caso como el que se muestra a continuación en la lí-

nea d, en el que una dilución muestra un positivo mayor que las tres elegidas según la regla general, el resultado se incorporará a la mayor de las diluciones elegidas, como sucede en e:

Si se desea resumir en un solo valor de NMP los resultados de una serie de muestras, se recurrirá a la media geométrica o la mediana. En la tabla 9221:V se muestran las combinaciones de tubos positivos más probables. Si aparecen combinaciones poco probables con una frecuencia superior al 1 por 100, hay que pensar que la técnica es inadecuada o que no se ha cumplido por completo el supuesto estadístico en que se basa el cálculo del NMP. El NMP para combinaciones que no aparecen en la tabla, o para otras combinaciones de tubos o diluciones, puede calcularse mediante la sencilla fórmula de Thomas:

pretation of ferraentation tube results. J. Infect. Dis. 12:183. MCCRADY, M. H. 1918. Tables for rapid interpretation of fermentation tube results. Can. J. Pub. Health 9:201. HOSKINS, J. K. 1933. The most probable number of B. coli in water analysis. J. Amer. Water Works Assoc. 25:867. H OSKINS , J. K. 1934. Most Probable Numbers for evaluation of Coli-Aerogenes test by fermentation tube method. Pub. Health Rep. 49:393 (Reprint 1621). HOSKINS, J. K. & C. T. BUTTERFIELD. 1935. Determining the bacteriological quality of drinking water. J. Amer. Water Works Assoc. 27:1101. HALVORSON, H. O. & N. R. ZIEGLER. 1933-35. Applicaton of statistics no problems in bacteriology. J. Bacteriol. 25:101; 26:331,559; 29-609. S WAROOP , S. 1938. Numerical estimation of B. coli by dilution method. Indian J. Med. Res. 26:353. DALLA VALLE, J. M. 1941. Notes on the most probable number index as used in bacteriology. Pub. Heatlh Rep. 56:229. THOMAS, H. A., JR. 1942. Bacterial densities from fermentation tube tests. J. Amer. Water Works Assoc. 34:572. WOODWARD , R. L. 1957. How probable is the Most Probable Number? J. Amer. Water Works Assoc. 49:1060. MCCARTHY, J. A., H. A. THOMAS & J. E. DELANEY. 1958. Evaluation of reliability of coliform density tests. Amer. J. Pub. Health 48:12. U.S. E NVIRONMENTAL P ROTECTION A GENCY . 1975. Interim primary drinking water standards. Fed. Reg. 40(51):11990 (14 marzo 1975). DE MAN, J. C. 1977. MPN tables for more than one test. European J. Appl. Microbiol. 4:307.

Aunque los cálculos del NMP se facilitan para su uso en la prueba de coliformes, también son aplicables para determinar el NMP de cualquier otro microorganismo, siempre que se disponga de los medios de estudio adecuados.

3.

Bibliografía

M C C RADY , M. H. 1915. The numerical inter-

9-93

EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

9221 E.

Prueba de presencia-ausencia (P-A) de coliformes

La prueba de presencia-ausencia (P-A) de coliformes es una sencilla modificación del procedimiento de tubos múltiples. La simplificación que se deriva de utilizar una sola porción grande (100 ml) en una sola botella de cultivo para obtener una información cualitativa sobre la presencia o ausencia de coliformes, se justifica por la teoría de la falta de estos microorganismos en una muestra de 100 ml de agua potable. La prueba de P-A proporciona además una oportunidad opcional para hacer una detección sistemática posterior del cultivo y aislar otros indicadores (coliformes fecales, Aeromonas, Staphylococcus, Pseudomonas, estreptococos fecales y Clostridium), también de manera cualitativa. Otras ventajas son la posibilidad de estudiar un mayor número de muestras por unidad de tiempo y de hacer estudios comparativos con el procedimiento del filtro de membrana, que indica que la prueba de P-A puede aumentar al máximo la detección de coliformes en muestras que contienen microorganismos que podrían sobrepasar en su crecimiento al de las colonias de coliformes, provocando problemas para su detección. La prueba de P-A se recomienda para el estudio habitual de las muestras obtenidas en los sistemas de distribución o en las plantas de tratamiento de aguas. En principio, se estudian alrededor de 100 muestras por los métodos del filtro de membrana o de los tubos múltiples, además de la prueba de P-A. Una vez establecido que los métodos cuantitativos suelen dar resultados negativos para coliformes, se puede utilizar únicamente la prueba de P-A. Cuando una muestra produce un resultado positivo en esta prueba, se estudiarán las posteriores muestras repetidas mediante un método cuantitativo, hasta que se vuelvan a obtener resultados negativos en dos muestras

consecutivas. Las muestras tomadas en localizaciones poco habituales, como los pozos privados, se analizarán con métodos de tubos múltiples o de filtro de membrana. 1.

Prueba de P-A para coliformes

a) Medio P-A: A veces no se encuentra este medio en forma deshidratada, por lo que habrá que prepararlo a partir de la combinación de otros medios comerciales deshidratados. Medio de lactosa (deshidratado) .................... Medio de lauril triptosa (deshidratado) .................... Púrpura bromocresol ............. Agua destilada ......................

13,0

g

17,5 g 0,0085 g 1 l

Hágase la fórmula con una fuerza triple en caso de que vayan a estudiarse muestras de 100 ml. Disuélvanse los ingredientes del medio de lactosa y el de lauril triptosa, uno tras otro, en agua destilada sin calentar, utilizando un instrumento de agitación. Disuélvase el púrpura bromocresol en 10 ml de NaOH al 0,1 N y añádase a la solución del medio. Viértanse 50 ml del medio en una botella de dilución con tapón de rosca de 250 ml de volumen. No es necesario introducir un tubo de fermentación. Se pasa 12 minutos por el autoclave a 121 °C, limitando el tiempo total de autoclave a 30 minutos o menos. El pH debe ser de 6,8 ± 0,2 después de la esterilización. b) Procedimiento: Agítese la muestra unas 25 veces e inocúlense 100 ml en el medio de cultivo P-A. Mézclese cuidadosamente, invirtiendo la botella cuatro o cinco veces para conseguir una distribución uniforme del medio en la totalidad de la muestra. Incúbese a 35 ± 0,5 °C y obsérvese a las 24 y 48 horas para

9-94

MÉTODOS NORMALIZADOS

EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

9-95

detectar posibles reacciones acidas. Cuando se producen, la fermentación de la lactosa adquiere un claro color amarillo. Si también se produce gas, la suave agitación de la botella producirá espuma. Cualquier cantidad de gas, ácido o ambos constituye un resultado presuntamente positivo, que requiere confirmación. Todos los cultivos que muestran reacción acida o formación de gas se pasan a un medio de verde brillante lactosa bilis (VBLB), que se incuba a 35 ± ± 0,5 °C. c) Interpretación: La aparición de gas en el medio VBLB en 48 horas confirma la presencia de bacterias coliformes. Los resultados se comunican como prueba de presencia-ausencia positiva o negativa para coliformes totales en 100 ml de muestra.

de P-A a 72 o 96 horas, es frecuente que puedan aislarse otros microorganismos indicadores. No se deben aislar bacterias indicadoras para regularlas después de las habituales 48 horas de incubación; no obstante, esta información podrá servir al laboratorio para advertir a la planta de tratamiento del agua de que ésta presenta potenciales problemas de calidad.

2.

Pruebas opcionales de P-A

La detección de coliformes fecales, estreptococos fecales u otras bacterias indicadores puede hacerse mediante una prueba de P-A, seleccionando adecuadamente los medios confirmatorios y el tiempo y temperatura de incubación, tal como se señala en la figura 9221:3. El tratamiento del agua y otras condiciones ambientales adversas suelen provocar alteraciones en las bacterias indicadoras, ampliando su fase de reposo antes de que se produzca el crecimiento logarítmico. Si se amplía la incubación de la prueba

3.

Bibliografía

WEISS, J. E. & C. A. HUNTER. 1939. Simplified bacteríological examination of water. J. Amer Water Works Assoc. 31:689. CLARK, J. A. 1969. The detection of various bacteria indicative of water pollution by a presence-absence (P-A) procedure. Can. J. Microbiol. 15:771. CLARK, J. A. & L. T. VLASSOFF. 1973. Relationships among pollution indicator bacteria isolated from raw water and distribution systems by the presence-absence (P-A) test. Health Lab. Sci. 10:163. CLARK, J. A. 1980. The influence of increasing numbers of nonindicator organisms upon the detection of indicator organisms by the raembrane filter and presence-absence tests. Can. J. Microbiol. 26:827. CLARK, J. A., C. A. BURGUER «fe L. E. SABATINOS. 1982. Characterization of indicator bacteria in municipal raw water, drinking water and new main samples. Can. J. Microbiol. 28:1002. JACOBS, N. J., W. L. ZEIGLER, F. C. REED, T. A. STUKEL & E. W. RICE. 1986. Comparison of membrane filter, multiple-fermentation-tube, and presence-absence techniques for detecting total coliforms in small community water systems. Appl. Environ. Microbiol. 51:1007.

9222 TÉCNICA DEL FILTRO DE MEMBRANA PARA MIEMBROS DEL GRUPO DE LOS COLIFORMES* 9222 A. La técnica de filtro de membrana (FM) es altamente reproducible, puede utilizar* Aprobado por el Standard Methods Committee, 1988.

Introducción se para estudiar volúmenes relativamente grandes de muestra y proporciona resultados numéricos más rápidos que el método de los tubos múltiples. La técnica del filtro de membrana es extraordinaria-

9-96

MÉTODOS NORMALIZADOS

mente útil para controlar las posibles situaciones de urgencia en relación con el agua potable y para estudiar distintas aguas naturales. Sin embargo, esta técnica tiene limitaciones, sobre todo para estudiar aguas con elevada turbidez o que contengan bacterias no coliformes. Para estas aguas, y también en caso de que no se haya utilizado anteriomente la técnica del filtro de membrana, es preferible llevar a cabo pruebas paralelas mediante la técnica de fermentación en tubos múltiples (sección 9221) para demostrar la aplicabilidad y comparabilidad de aquélla.

1.

Definición

En lo que se refiere a la técnica del filtro de membrana, el grupo coliforme puede definirse como el formado por las bacterias aerobias y anaerobias facultativas, gramnegativas, no esporuladas y de forma alargada, que desarrollan una colonia roja con un brillo metálico en un medio tipo Endo que contenga lactosa tras una incubación de 24 horas a 35 °C. Al estudiar cultivos purificados de bacterias coliformes, se observa una reacción de citocromo oxidasa (CO) negativa y una de β-galactosidasa (ONPG) positiva. En esta técnica, todas las colonias rojas, rosadas, azules, blancas o incoloras que no tienen brillo suelen ser consideradas como no coliformes.

2. Aplicaciones

La turbidez producida por la existencia de algas u otro tipo de material puede impedir el estudio de un volumen de muestra suficiente para obtener resultados significativos. La presencia de un elevado número de no coliformes o de sustancias tóxicas puede dar lugar a un cálculo de coliformes inferior al real. La

técnica del FM es aplicable al estudio de aguas saladas, pero no al de aguas residuales que sólo han recibido un tratamiento primario, seguido de cloración, debido a su turbidez en muestras de grandes volúmenes o a su contenido en metales o compuestos orgánicos tóxicos del tipo de los fenoles. Para detectar los coliformes totales alterados en el agua potable tratada y en las aguas residuales secundarias o terciarias cloradas, utilícese el método destinado a recuperar los microorganismos en condiciones anómalas (véase sección 9212B.1). Para los coliformes fecales, se recurre a la técnica de fermentación en tubos múltiples (sección 9221C), siempre que los resultados deban utilizarse para obligar al cumplimiento de las normas. Puede emplearse una modificación para coliformes fecales (sección 9212) de la técnica del filtro de membrana, si los estudios paralelos con la técnica de fermentación en tubos múltiples muestran resultados comparables para tipos de muestra específicos de una localización. El volumen estándar que se va a filtrar en las muestras de agua potable es de 100 ml (véase sección 9010B), que, si es necesario, puede distribuirse a lo largo de varias membranas. El agua potable tratada no debe contener coliformes por 100 ml, por lo que las plantas de tratamiento de agua deben tomar en consideración el estudio de muestras de 1 l de agua terminal, siempre que no existan partículas que interfieran con la filtración o el desarrollo de colonias aisladas. En estos casos, divídase la muestra en cuatro porciones de 250 ml y comuníquese la totalidad de coliformes observados en todas las membranas. Para otro tipo de aguas o en análisis especiales, pueden utilizarse muestras de mayor o menor volumen. La comparación estadística de los resultados obtenidos con el método de los tubos múltiples y el del filtro de membrana muestran la mayor precisión de este

9-97

EXAMEN MICROBIOLÚGICO DE LAS AGUAS

último (compárense las tablas 9221:I, II y III con la 9222:II). Aunque los datos de ambas pruebas den resultados bastante precisos sobre la calidad del agua, los resultados numéricos no son idénticos (véase sección 9010B para el agua potable). En el caso de aguas naturales, es lógico esperar que el 80 por 100 de los análisis de filtro de membrana estén dentro de unos límites de confianza del 95 por 100 de los resultados de la prueba completa de tubos múltiples. Es de esperar que los resultados de la prueba de tubos múltiples superen los del filtro de membrana, debido a una desviación estadística positiva. 3.

Bibliografía

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9222 B. 1.

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Procedimiento estándar de filtro de membrana para coliformes totales

Instrumental de laboratorio

Los análisis de filtro de membrana requieren instrumental de vidrio y otros aparatos fabricados sin agentes que puedan producir efectos adversos sobre el crecimiento bacteriano. Anótense cuidadosamente todas las desviaciones que se produzcan sobre las recomendaciones expuestas más adelante y háganse pruebas cuantitativas para demostrar que estas desviaciones no han introducido agentes o factores que den lugar a condiciones menos favorables para el crecimiento bacteriano. Esterilícese el instrumental de vidrio como se describe en Lavado y Esterilización, sección 9040. a) Botellas de muestra: Véase sección 9030B.18. b) Botellas de dilución: Véase sección 9030B.13.

c)

Pipetas y cilindros graduados: Véa-

se sección 9030B.9. Antes de esterilizarlos, tápese la boca de los cilindros graduados con papel metálico u otro papel adecuado. d) Envases del medio de cultivo: Para reducir la contaminación bacteriana, utilícense matraces de vidrio borosilicato limpios y preesterilizados. Se pueden utilizar matraces de cualquier forma y tamaño, pero para conseguir una buena mezcla del medio y para su conservación los más recomendables son los erlenmeyer de tapones metálicos, los cubiertos con papel metálico o los que tienen tapón de rosca. e) Placas de cultivo: Utilícense placas estériles de vidrio borosilicato o desechables de tipo Petri de 60 x 15, 50 x 12 mm u otro tamaño adecuado. Las placas de vidrio para cultivo, limpias y envueltas por separado o en número adecuado en

9-98

papel metálico, se esterilizan con calor seco o en papel adecuado en caso de que la esterilización se realice en autoclave. Las placas de cultivo de vidrio y algunas de plástico desechables tienen a veces tapaderas mal ajustadas, lo que se procurará evitar durante la incubación para prevenir posible pérdida de humedad por evaporación, que provocaría la desecación del medio y la pérdida del ambiente húmedo adecuado para un óptimo desarrollo de las colonias. También pueden utilizarse placas de plástico desechables que ajusten bien y cumplan las normas antes expuestas. Existen en el mercado placas de plástico estériles que son adecuadas para este método. f) Unidades de filtración: El equipo de soporte del filtro (fabricado en vidrio, plástico resistente al autoclave, porcelana o acero inoxidable) consiste en un embudo sin junturas, unido a una base por un artefacto de cierre o mantenido en su lugar mediante una fuerza magnética. El diseño debe permitir que el filtro de membrana se mantenga con seguridad sobre la placa porosa del receptáculo, sin que sufra daño mecánico, de manera que todo el líquido pase a través de la membrana durante la filtración. Para esterilizarlo en el autoclave antes de guardarlo, envuélvase en papel fuerte, separando ambas partes del equipo. También se puede tratar con luz ultravioleta (sin envolverlo en papel) antes de volver a utilizarlo, en caso de que se estén llevando a cabo serie de filtraciones. Las unidades de campo pueden desinfectarse con una llama de alcohol metílico o sumergiéndolas en agua hirviendo durante 5 minutos. Las partes plásticas no se esterilizarán a la llama. Pueden utilizarse unidades de campo estériles desechables. Para la filtración, móntese el receptáculo del equipo de soporte del filtro en un matraz de 1 l con un tubo lateral u otro aparato que permita ejercer una

MÉTODOS NORMALIZADOS

presión diferencial (34-51 kPa) sobre el filtro de membrana. Conéctese el matraz a una bomba eléctrica de vacío con un filtro de bomba actuando sobre la presión del agua, un aspirador manual u otro medio, para asegurar la presión diferencial (138-207 kPa). Conéctese un matraz de la misma capacidad entre el matraz de filtración y la fuente de vacío para atrapar el agua que se escape. g) Filtro de membrana: Utilícense filtros de membrana (para otras características, véase la sección 9020) con un diámetro de poro que permita una completa retención de las bacterias coliformes. Sólo se emplearán filtros en los que se haya comprobado, mediante una adecuada prueba de control de calidad y por la garantía del fabricante, que permiten una retención de las bacterias coliformes. Sólo se emplearán filtros en los que se haya cia de extractables químicos susceptibles de inhibir el crecimiento y desarrollo bacterianos, velocidad de filtración satisfactoria (en 5 minutos), ausencia de influencias significativas sobre el pH del medio (no más de ± 0,2 unidades) y que no produzcan un aumento en el número de colonias confluentes o expansivas, en comparación con los filtros de membrana de control. Las membranas marcadas con una trama se utilizarán de forma que no inhiban ni estimulen el crecimiento bacteriano cuando se incuben con las bacterias retenidas en un medio adecuado. Es preferible utilizar filtros de membrana recientes y, si es necesario guardarlos, se hará en un ambiente sin cambios extremos de temperatura o humedad. No deberán comprarse en cantidades anuales superiores a las necesarias. Es preferible utilizar filtros de membrana preesterilizados cuyos fabricantes garanticen que la técnica de esterilización no ha inducido toxicidad ni alterado las propiedades físicas o químicas de la membrana. Si se esterilizan las membranas en el laboratorio, pásense 10 minutos por el autoclave a 121 °C. Al fina-

9-99

EXAMEN MICROBIOLÚGICO DE LAS AGUAS

lizar la esterilización, déjese que el vapor escape rápidamente para reducir en lo posible la acumulación de agua de condensación en los filtros. h) Las almohadillas absorbentes consisten en discos de papel de filtro u otro material garantizado por el fabricante en lo que se refiere a la alta calidad y a la ausencia de sulfitos u otras sustancias que puedan inhibir el crecimiento bacteriano. Utilícense almohadillas de 48 mm de diámetro y un grosor suficiente para absorber 1,8-2,2 ml de medio. Las almohadillas absorbentes esterilizadas o las esterilizadas posteriormente en el laboratorio deben liberar menos de 1 mg de acidez total (calculada como CaCO3) al titularlas al punto extremo de fenolftaleina, pH 8,3, utilizando NaOH al 0,02N y producir valores de pH 7 + 0,2. Las almohadillas se esterilizan al mismo tiempo que los filtros de membrana envueltos en papel fuerte resellable o bien de forma separada en envases adecuados. Antes de utilizarlas, deben estar secas y sin restos visibles de humedad. Véase el procedimiento de esterilización anteriomente descrito para los filtros de membrana y la sección 9020 para normas adicionales sobre las almohadillas absorbentes. i) Pinzas: Utilícense pinzas sin dientes, que se esterilizarán antes de utilizarlas, sumergiéndolas en alcohol etílico al 95 por 100 o en alcohol metílico absoluto y a la llama. j) Incubadoras: Utilícense incubadoras a una temperatura de 35 ± 0,5 CC que mantengan una humedad elevada (alrededor de un 90 por 100 de humedad relativa). k) Microscopio y fuente de luz: El recuento de las colonias que existen en los filtros de membrana se realiza mediante una lupa de 10 a 15 aumentos y bajo una fuente de luz fluorescente fría ajustada para que dé un discernimiento máximo del brillo. Lo mejor es emplear una lupa estereoscópica binocular de campo amplio. No se debe utilizar un iluminador

de microscopio con un sistema óptico de concentración de luz por una fuente de luz incandescente cuando se trata de estudiar las colonias de coliformes en un medio de tipo Endo. 2.

Materiales y medios de cultivo

La necesidad de uniformidad obliga a emplear medios deshidratados. Siempre que existan medios deshidratados adecuados, no se utilizarán medios preparados a partir de sus ingredientes básicos. Para rehidratar y esterilizar los medios se seguirán las instrucciones de los fabricantes. También pueden utilizarse medios líquidos comerciales (ampollas estériles u otros), si se sabe que ofrecen resultados equivalentes. Para las características del control de calidad de los medios, véase sección 9020. Compruébese la productividad de cada nuevo lote de medios preparando diluciones de un cultivo de Enterobacter aerogenes (sección 9020) y filtrando volúmenes adecuados que permitan obtener 20-80 colonias por filtro. Compruébese, para cada nuevo lote de medio Endo, un mínimo de 10 por 100 de colonias de coliformes obtenidas a partir de muestras naturales, con objeto de establecer la exactitud diferencial del lote del medio. a) Agar LES Endo:

9-100

Rehidrátese en 1 l de agua destilada con 20 ml de etanol al 95 por 100 (que controla el crecimiento de fondo y el tamaño de las colonias de coliformes). Caliéntese hasta casi ebullición para disolver el agar y apártese rápidamente del calor, enfriando hasta 45-50 °C. Divídase en porciones de 5-7 ml en placas de Petri de vidrio o plástico de 60 mm de sección menor. Si se utilizan placas de otros tamaños, ajústese la cantidad para conseguir una profundidad similar. Las placas no se expondrán a la luz directa, sino que se conservarán en la oscuridad a 2-10 °C, desechándose las no utilizadas después de 2 semanas: b) Medio M-Endo*:

Rehidrátese en 1 l de agua destilada con 20 ml de etanol al 95 por 100. Caliéntese hasta casi ebullición para disolver el agar y retírese rápidamente del calor, enfriándolo a menos de 50 °C. No debe esterilizarse en el autoclave. El pH final debe ser de 7,1-7,3. Una vez hecho el medio, consérvese en la oscuridad a 2-10 °C, desechándose el que no se haya utilizado en 96 horas.

* Dehydrated Difco M-Endo Broth MF (n.° 0749), BBL m-Coliform Broth deshidratado (n.° 11119) o equivalente, siempre que se añada un 1,5 por 100 de agar a la preparación.

MÉTODOS NORMALIZADOS

Si las compresas están garantizadas como libres de sulfito, puede utilizarse el medio líquido (sin agar) y compresas absorbentes. 3.

Muestras

La toma de muestras se lleva a cabo como se especifica en las secciones 9060A yB. 4.

Definición de coliformes

Se consideran miembros del grupo de coliformes todos los microorganismos que producen colonias rojas con brillo metálico tras 24 horas de incubación a 35 °C en medio tipo Endo. El brillo puede cubrir la totalidad de la colonia o aparecer únicamente en la zona central o en la periferia. El grupo coliforme así definido se caracteriza por producir aldehídos a partir de la fermentación de la lactosa. Aunque esta característica bioquímica forma parte de la vía metabólica de la producción de gas en la prueba de los tubos múltiples, pueden observarse variaciones en el desarrollo del brillo metálico entre las distintas cepas de coliformes. Sin embargo, esta ligera diferencia en la definición del indicador no altera su significado sanitario, sobre todo si se han hecho estudios adecuados para establecer la relación entre los resultados por el método del filtro de membrana y los obtenidos con el de dilución en tubos estándar. Para evitar resultados positivos falsos, sobre todo en las muestras de agua potable, verifíquese la fermentación de la lactosa mediante la reacción de las colonias con brillo a CO y a la ONPG. Es preferible comprobar todas las colonias, aunque también se pueden comprobar al menos un 10 por 100 de las mismas cuando más de 50 sean de tipo coliforme en una muestra de agua residual. En caso

EXAMEN MICROBIOLÚGICO DE LAS AGUAS

de que el recuento de coliformes supere 5/l00 ml en agua potable, se comprobarán un mínimo de cinco colonias incluidas en el recuento directo. Ocasionalmente, los coliformes pueden producir colonias atípicas, cuyo reconocimiento puede verse favorecido comprobando todo tipo de colonias, tanto las que tiene brillo como las que no lo tienen. Para el procedimiento de comprobación específica, véase la sección 9222B.5f

5.

Procedimientos

Un método enriquecido suele mejorar la valoración de la calidad del agua potable. Sin embargo, en los estudios habituales de este tipo de agua, en los que repetidos análisis han demostrado que con la técnica de FM de un solo paso se obtienen resultados adecuados, puede eliminarse el enriquecimiento, que tampoco suele ser necesario en el estudio de las aguas no potables y residuales. Compruébense todas las muestras de las aguas potables que den resultados positivos de la forma descrita anteriormente. a) Selección del tamaño de la muestra: El tamaño de la muestra dependerá de la densidad bacteriana que se espere, que en las muestras de agua potable sólo estará limitada por el grado de turbidez o por el crecimiento de no coliformes en el medio (tabla 9222:1). Un volumen ideal de muestra es el que proporciona alrededor de 50 colonias de coliformes y no más de 200 colonias de todos los tipos. El agua potable se analiza filtrando 100-500 ml o más, o bien muestras duplicadas de volúmenes más pequeños, por ejemplo, analizar dos muestras de 50 ml o cuatro de 24 ml. Las demás aguas se analizarán filtrando tres volúmenes distintos (diluidos o no), en función de la densidad bacteriana que se espere. Véase la sección 9215B.2 para la preparación de diluciones. Cuando se fil-

9-101

tren menos de 20 ml (diluidos o no), se añadirán alrededor de 10 ml de agua de dilución estéril al embudo antes de la filtración. Se aumenta con ello el volumen del agua, lo que ayuda a obtener una dispersión uniforme de la suspensión bacteriana en la totalidad de la superficie filtrante efectiva. b) Filtración de la muestra: Se coloca con pinzas estériles un filtro de membrana estéril (con la trama hacia arriba) sobre la placa porosa del receptáculo. Sitúese con cuidado la unidad de embudo correspondiente sobre el receptáculo y fíjese. La filtración se lleva a cabo bajo un vacío parcial. Todavía con el filtro en su lugar, aclárese el embudo filtrando tres porciones de 20-30 ml de agua de dilución estéril. Tras el enjuagado final y la desconexión al vacío del proceso de filtrado, desbloquéese y retírese el embudo e inmediatamente quítese el filtro de membrana con unas pinzas estériles, colocándolo en el medio seleccionado con un movimiento de rotación para evitar que quede aire atrapado. Introdúzcase una muestra de agua de lavar estéril (100 ml) después de filtrar una serie de 10 muestras para comprobar posibles contaminaciones cruzadas o contaminación del agua de lavado. Incúbese la membrana de control en las mismas condiciones que las de la muestra. Al comienzo de cada serie de filtraciones, utilícense unidades de filtración estériles como mínima precaución para evitar la contaminación accidental. Considérese que se interrumpe una serie de filtraciones cuando transcurre un intervalo de 30 o más minutos entre la filtración de dos muestras. Si se produjera una interrupción de este tipo, trátese la filtración siguiente como si fuera una nueva serie y esterilícense los soportes de los filtros de membrana que estén utilizándose. Descontamínense los filtros entre filtraciones sucesivas mediante rayos ultravioleta (UV), chorro de vapor o agua hirviendo. En el caso de empleo de

9-102

MÉTODOS NORMALIZADOS

TABLA 9222:I. VOLÚMENES DE MUESTRA RECOMENDADOS PARA LA PRUEBA DE COLIFORMES TOTALES EN FILTRO DE MEMBRANA

luz UV, bastará con una exposición de 2 minutos. Téngase cuidado de no exponer los cultivos de los filtros de membrana a la radiación UV que pueda escaparse de la cabina de esterilización. Se recomienda llevar protección ocular; tanto las gafas protectoras como las gafas graduadas proporcionan una protección adecuada frente a la radiación que emana de una cabina de esterilización que no esté encendida en los intervalos entre exposiciones. Límpiense regularmente los tubos UV y compruébense de forma periódica para asegurarse de que producen una eliminación bacteriana del 99 por 100 en una exposición de 2 minutos. Véase también la sección 9020. c) Técnica de enriquecimiento: Coloquese una compresa absorbente estéril en la mitad superior de una placa de cultivo estéril y llévese con la pipeta una cantidad suficiente de medio enriquecido (1,82,0 ml de medio de lauril triptosa) para que se sature la compresa, retirando cuidadosamente de la misma el exceso de líquido. Colóquese asépticamente sobre la compresa el filtro por el que se ha filtrado la muestra. Incúbese el filtro sin invertir la placa durante 1,5-2 horas a 35 + 0,5 °C en una atmósfera con humedad relativa de al menos el 90 por 100.

Si se utiliza un medio con agar, retírese el cultivo de enriquecimiento de la incubadora, levántese el filtro de la compresa de enriquecimiento y arróllese sobre la superficie del agar. Es fácil observar, si la colocación del filtro es incorrecta, que aparecen parches de membrana sin teñir que indican atrapamiento de aire. En estos casos, vuélvase a colocar cuidadosamente el filtro sobre la superficie del agar. Si se utiliza un medio líquido, prepárese el cultivo final, retirando el cultivo de enriquecimiento de la incubadora y separando las dos mitades de la placa. Sitúese una nueva compresa estéril en la mitad inferior de la placa y satúrese con 1,8-2,0 ml de medio M-Endo final. Transfiérase a la nueva compresa el filtro con las precauciones antes mencionadas, desechándose la ya utilizada. Tanto en el caso del agar como del medio líquido, inviértase la placa e incúbese durante 20-22 horas a 35 ± 0,5 °C, procediéndose después como se indica en el párrafo e. d) Técnica alternativa de un solo paso: Si se utiliza un medio con agar, sitúese en el agar el filtro preparado directamente, como se ha descrito antes, y se incuba a 35 ± 0,5 °C durante 22-24 horas. Si se utiliza medio líquido, colóquese

EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

la compresa en la placa de cultivo y satúrese con 1,8-2,0 ml de medio M-Endo. Sitúese el filtro preparado directamente sobre la compresa, inviértase la placa e incúbese durante 22-24 horas a 35 ± 0,5 °C. e) Recuento: La típica colonia de coliformes tiene un color rojo oscuro, con un brillo metálico en superficie. El área brillante puede ser sólo un pequeño punto, o bien cubrir por completo la superficie de la colonia. Recuéntense las colonias con brillo, con ayuda de una lupa estereoscópica binocular de campo amplio y bajos aumentos (10-15 aumentos) o de otro instrumento óptico, con una luz blanca fría fluorescente colocada directamente y lo más perpendicular posible al plano del filtro. Las colonias sin brillo pueden ser rosadas, rojas, blancas o incoloras y se consideran como no coliformes. El recuento total de colonias (coliformes y no coliformes) no tiene relación, en un medio tipo Endo, con el número total de bacterias que existen en la muestra original. Sin embargo, un elevado recuento de colonias no coliformes puede interferir con el máximo desarrollo de las coliformes. La incubación anaerobia a 35 °C durante 24 horas permite inhibir, en el caso de algunas aguas naturales, las colonias no coliformes, pero el proceso debe valorarse cuidadosamente para comprobar que no se producen pérdidas en la recuperación de coliformes. Las muestras de agua desinfectada o de efluentes de aguas residuales contienen a veces microorganismos en condiciones anómalas que crecen de forma relativamente lenta y producen un brillo máximo al cabo de 22-24 horas. Los microorganismos procedentes de aguas no desinfectadas pueden producir brillo a las 16-18 horas, decayendo después de 24-30 horas. f) Verificación de coliformes: Los microorganismos no coliformes producen a veces típicas colonias con brillo, Por tan-

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to, se deberá comprobar mediante una prueba de fermentación de lactosa o utilizando procedimientos alternativos, como una prueba rápida (4 horas) de dos reacciones bioquímicas clave o un sistema multiprueba para especificación. Véase sección 9020B.4d. 1) Fermentación de la lactosa: Compruébense todas las colonias con brillo incluidas en el recuento directo o un mínimo de cinco de dichas colonias en los casos de muestras de agua potable, pasando el crecimiento de cada colonia a un medio líquido de lauril triptosa; incúbese a 35 ± 0,5 °C durante 48 horas. La formación de gas en este medio a las 48 horas confirma que la colonia es de coliformes. 2) Verificaciones alternativas de coliformes: Se aplicarán estos procedimientos alternativos de comprobación de coliformes a las colonias aisladas en cultivos de filtro de membrana. Si se sospecha que se trata de un cultivo mixto o si la separación entre las colonias es inferior a 2 mm, se siembra el crecimiento de estrías en medio M-Endo para asegurar la pureza del cultivo o se lleva el crecimiento mixto a un método de fermentación en tubos. a) Prueba rápida: La verificación rápida de las colonias se basa en las reacciones de citocromo oxidasa (CO) y de β-galactosidasa (ONPG)*. Las reacciones de los coliformes son negativas con CO y positivas con ONPG tras 4 horas de incubación por un procedimiento de cultivo en tubo o mediante microanálisis. b) Sistemas comerciales de multiprueba. Compruébense las colonias por inoculación en un sistema de identificación multiprueba para Enterobacteriaceae que contenga, fermentación de la lactosa, reacciones ONPG y/o CO. * ONPG (ortonitrofenol galactósido) es el sustrato de la prueba de la β-galactosidasa.

9-104

4. Cálculo de la densidad de coliformes

Comuníquese la densidad de coliformes como el total de coliformes por 100 ml. Calcúlese el recuento utilizando filtros de membrana que tengan 20-80 colonias de coliformes y no más de 200 colonias de todos los tipos por membrana, y aplicando la siguiente ecuación:

Para recuentos de coliformes comprobados, ajústese el recuento inicial, teniendo en cuenta el porcentaje de comprobación positiva, y comuníquese como «recuento comprobado de coliformes por 100 ml».

a) Agua con calidad de agua potable:

En las aguas de buena calidad, la aparición de colonias coliformes suele ser mínima. Por tanto, se contarán todas las colonias de coliformes (sin tener en cuenta el límite inferior antes señalado de 20) y se utilizará la fórmula antes mencionada para obtener la densidad de los mismos. Si aparece un crecimiento confluente, es decir, un crecimiento que cubre la totalidad del área de filtración de la membrana o una parte importante de la misma y las colonias no están separadas entre sí, se comunicarán los resultados como «crecimiento confluente con (o sin) coliformes» y se pedirá una nueva muestra de la misma procedencia. Al volverla a estudiar, divídase la muestra de 100 ml en porciones de 50 ml para reducir las interferencias que produce el sobrecrecimiento sobre la superficie del FM. Si el

MÉTODOS NORMALIZADOS

número total de colonias bacterianas, coliformes más no coliformes, supera las 200 por membrana, o si las colonias no están suficientemente separadas para permitir un recuento exacto, comuníquense los resultados como «demasiado numerosas para ser contadas» (DNPSC). La presencia de coliformes en estos cultivos que no muestran brillo puede confirmarse colocando todo el cultivo del filtro de membrana en un tubo estéril con medio líquido verde brillante lactosa bilis. También se puede raspar la totalidad de la superficie del filtro con un asa o aplicador de madera estériles e inocular el material obtenido en el tubo con el medio mencionado. Si se produce gas en el cultivo a las 48 horas a 35 ± 0,5 °C, se comunicará existencia de coliformes. En cualquier caso, pídase una nueva muestra y selecciónense mejor los volúmenes a filtrar a través de la membrana, recordando que las porciones estándar de agua potable son de 100 ml. Es decir, en lugar de filtrar 100 ml, pueden filtrarse porciones de 50 ml en dos membranas, de 24 ml en cuatro, etc. Se considera como número de coliformes por 100 ml la suma de los que se hayan observado en todas las membranas. b) Aguas de calidad distinta a la del

agua potable: Como sucede con las aguas potables, si ningún filtro revela un número de coliformes comprendido dentro de los límites ideales, realícese un recuento del total de coliformes en todos los filtros y comuníquese como cantidad por 100 ml. Por ejemplo, si se han estudiado porciones de 50 ml en dos membranas y se han hallado cinco y tres colonias, respectivamente, se comunicará un recuento de ocho colonias de coliformes por 100 ml, es decir,

De la misma forma, si se han estudiado porciones de 50, 25 y 10 ml y el re-

EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

9-105

cuento ha sido 15, seis y menos de una colonias de coliformes, comuníquese un recuento de 25/l00 ml, es decir,

TABLA 9222:II. LÍMITES DE ACEPTACIÓN DEL 95 POR 100 PARA LOS RESULTADOS DEL RECUENTO DE COLIFORMES EN FILTRO DE MEMBRANA UTILIZANDO UNA MUESTRA DE 100 ML

Por otra parte, si se han estudiado porciones de 10, 1,0 y 0,1 ml, y los recuentos han sido de 40,9 y menos de una colonia de coliformes, respectivamente, elíjase sólo la porción de 10 ml para el cálculo de la densidad de coliformes, ya que este filtro presenta un recuento de coliformes que está dentro de los límites ideales. El resultado es de 400/l00 ml, es decir,

En este último ejemplo, si la membrana con 40 colonias de coliformes tiene además un recuento de colonias bacterianas totales superior a 200, se comunicará como recuento de coliformes ≥ 400/l00 ml. comuníquese el crecimiento confluente y las membranas con colonias demasiado numerosas para contarlas en la forma descrita en a. Solicítese una nueva muestra y selecciónense volúmenes más adecuados para hacer la filtración. c) Fiabilidad estadística de los resultados del filtro de membrana: Aunque la fiabilidad estadística de la técnica del filtro de membrana supera la del procedimiento del NMP, los recuentos de membranas no son números absolutos. En la tabla 9222:II se ilustran algunos límites de confianza del 95 por 100. En estos valores se admite que las bacterias están distribuidas de forma aleatoria y verifican la distribución de Poisson. Para resultados con recuentos c superiores a 20 microorganismos, calcúlense los límites aproximados de confianza del 95 por 100 mediante la siguiente ecuación de distribución normal:

7.

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MÉTODOS NORMALIZADOS

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9222 C.

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Procedimiento de incubación retardada para coliformes totales

La modificación de la técnica estándar del filtro de membrana permite transportar la membrana tras la filtración hasta un laboratorio alejado donde sea posible incubarla y finalizar la prueba. Esta prueba de incubación retardada resulta conveniente en los casos en que no sea posible poner en práctica los procedimientos habituales. También se puede recurrir a ella: a) cuando sea imposible mantener la temperatura deseada de la muestra durante su transporte; b) si el tiempo transcurrido entre la toma de la muestra y su análisis supera el límite de tiempo admitido; c) cuando la toma de muestras se realice en un lugar lejano al laboratorio; d) en caso de que sea necesario controlar la calidad de las aguas de corrientes o se lleven a cabo actividades de control de contaminación por un procedimiento estándar, o e) por cualquier otra razón que impida el análisis de la muestra en o cerca del lugar de la toma. La comparación de los datos de las pruebas de incubación retardada ha mostrado que sus resultados son concor-

dantes con los de la prueba inmediata en estudios independientes de muestras realizadas en aguas dulces y saladas. Determínese la aplicabilidad de la prueba de incubación retardada para un tipo concreto de agua, comparando los resultados con los del análisis realizado con los métodos habituales. Para realizar la prueba de incubación retardada, fíltrese la muestra sobre el campo inmediatamente después de hacer la toma, colóquese el filtro en el medio de transporte y envíese al laboratorio. Complétese en éste la determinación de coliformes pasando la membrana a un medio M-Endo o LES-Endo e incubándola a 35 ± 0,5 °C durante 20-22 horas, para, por último, hacer el recuento de colonias típicas de coliformes. El medio de transporte está pensado para mantener viables los microorganismos coliformes y, en general, impedir un crecimiento visible durante el mismo. Los agentes bacteriostáticos de los medios de mantenimiento/conservación inhiben el crecimiento de los microorganismos, pero

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EXAMEN MICROBIOLOGICO DE LAS AGUAS

permiten un crecimiento normal de coliformes una vez pasados a un medio fresco. La prueba de incubación retardada es semejante al método descrito para coliformes totales según el procedimiento del filtro de membrana, salvo en lo que se indica seguidamente. Se exponen dos métodos alternativos, uno con medio de conservación M-Endo y otro con medio de mantenimiento LES MF. 1.

Instrumental

a) Placas de cultivo: Utilícense placas de Petri de plástico estériles y desechables con cierre ajustado para mantener la humedad (50 x 12 mm). Este tipo de placas son ligeras y menos proclives a la rotura durante el transporte. En caso de emergencia o cuando no se disponga de placas de plástico, utilícense placas estériles de vidrio envueltas en una película de plástico o de material similar. Véase sección 9222B.le sobre las características. b) Unidad de filtración de campo: Para detalle de sus características, véase la sección 9222B.1f Desinféctese la cámara de filtración con alcohol metílico, que se quemará cubriendo la unidad para producir formaldehído. También es posible utilizar la luz UV, si se dispone de una fuente adecuada (115 V, 60 Hz). Las unidades de filtración de vidrio o metal pueden esterilizarse sumergiéndolas en agua hirviendo durante 5 minutos. Utilícese un aspirador manual para obtener el vacío necesario. 2.

Materiales y medios de transporte

a) Métodos M-Endo: 1) Medio de conservación M-Endo: Prepárese de la forma descrita en la sección 9222B.26. Tras el enfriamiento a menos de 45 °C, añádanse asépticamente

3,84 g de benzoato de sodio (calidad USP) por 1 o 3,2 ml de una solución de benzoato de sodio al 12 por 100 a 100 ml de medio. Mézclense los ingredientes y divídanse en porciones de 5-7 ml, que se colocan en placas de Petri de 50 x 12 mm. Manténganse las placas a 2-10 °C, rechazando las no utilizadas después de 96 horas. 2) Solución de benzoato de sodio: Disuélvanse 12 g de NaC7H5O2 en suficiente agua destilada para obtener 100 ml. Esterilícese en autoclave o por filtrado a través de un filtro de membrana con poros de 0,22 µm de diámetro. Deséchese después de 6 meses. 3) Cicloheximida*: De manera opcional, puede añadirse cicloheximida al medio de conservación M-Endo, y utilizarse en muestras que hayan mostrado previamente un sobrecrecimiento de hongos o levaduras. Esta modificación se prepara añadiendo asépticamente 50 mg/l00 ml al medio de conservación M-Endo. Consérvese la solución de cicloheximida a 5-10 °C, desechándose a los 6 meses. Este producto es un potente irritante de la piel, por lo que hay que manipularlo con precaución, siguiendo las instrucciones del fabricante. b) Método LES

Rehidrátese en agua destilada. Caliéntese hasta casi ebullición para disolver el agar, retirándose rápidamente del calor y enfriándolo a menos de 50 °C. Añádanse asépticamente 1,0 g de benzoato de so* Actidione®, fabricado por Upjohn Company, Kalamazoo, Michigan, o equivalente.

9-108

dio, 1,0 g de sulfanilamida y 0,5 g de cicloheximida. Tras mezclarlo, repártase en porciones de 5-7 ml que se vierten en placas de Petri de 50 x 12 mm. Éstas se guardan a una temperatura de 2-10 °C y se eliminan a las 2 semanas. El pH final debe ser de 7,1 ± 0,1. 3.

Procedimiento

a) Conservación y transporte de la muestra: Sitúese una compresa absorbente en el suelo de una placa de Petri estéril y satúrese con el medio de conservación de conformes seleccionado (véase sección 9222C.2). Retírese el filtro de membrana de la unidad de filtración por medio de pinzas estériles y arróllese con el lado de la matriz hacia arriba, en la superficie del medio de conservación elegido. Protéjase la membrana de la pérdida de humedad cerrando bien la placa de Petri de plástico. Evítese la deshidratación de la membrana durante el transporte. colóquese el disco de cultivo que contiene la membrana en un envase adecuado y envíese al laboratorio para completar el estudio. Puede mantenerse la muestra sin crecimiento visible durante un máximo de 72 horas en este medio de conservación/mantenimiento. Este tiempo suele bastar para su envío por correo o medio de transporte habitual. Si las temperaturas son elevadas, durante el trayecto aparecerá a veces crecimiento visible en el medio de transporte. b) Transferencia: En el laboratorio, la membrana del disco de plástico en el que ha sido enviada se transfiere a una segunda placa de Petri estéril con medio M-Endo o LES Endo. c) Incubación: 1) Método M-Endo. Transfiérase la membrana del medio de conservación M-Endo a una compresa y a una placa de Petri con medio M-Endo sin los reactivos inhibidores del crecimiento e incú-

MÉTODOS NORMALIZADOS

bese a 35 ± 0,5 °C durante 20-22 horas. 2) Método LES. Transfiérase la membrana del medio de conservación LES MF al agar LES Endo (véase sección 9222B.2) e incúbese a 35 ± 0,5 °C durante 20-22 horas. Si en el momento de la transferencia se observan colonias sin necesidad de aumento, consérvese la placa de Petri que contiene la membrana transferida a 5-10 °C hasta que pueda ser incubada a 35 ± 0,5 °C durante 16-18 horas. Esta manipulación del tiempo de incubación permite controlar los problemas de crecimiento excesivo y disipación del brillo que pueden interferir con el recuento de las colonias de coliformes.

4. Cálculo de la densidad de coliformes

Procédase como se indica en la anterior sección 9222B.6. Regístrese el momento de la toma de la muestra, de la filtración y del estudio en el laboratorio, y calcúlese el intervalo temporal transcurrido, que constará en el informe junto con los resultados. 5.

Bibliografía

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EXAMEN MICROBIOLOGICO DE LAS AGUAS

9222 D.

Procedimiento de filtro de membrana para coliformes fecales

La densidad de bacterias coliformes fecales puede determinarse por un procedimiento de tubos múltiples o por una técnica de filtro de membrana (FM). Si se utiliza esta última para efluentes clorados, antes de aceptarla como alternativa válida hay que comprobar que suministra una información comparable a la que se obtiene por el análisis de tubos múltiples. En la técnica de FM se utilizan un medio de lactosa enriquecido y una temperatura de incubación de 44,5 ± 0,2 °C para conseguir selectividad, obteniéndose una exactitud del 93 por 100 en la diferenciación entre los coliformes que se encuentran en las heces de los animales de sangre caliente y los procedentes de otras fuentes ambientales. Dado que la temperatura de incubación es esencial, sumérjanse los cultivos de FM a prueba de agua (metidos en bolsas de plástico) en un baño de agua para poder incubarlos a esta elevada temperatura o utilícese una adecuada y exacta incubadora. Los campos de aplicación de este método se exponen en la introducción a los procedimientos de tubos múltiples para coliformes fecales, en la sección 9221C.

1.

Materiales y medios de cultivo

a) Medio M-FC: La necesaria uniformidad obliga a emplear medios deshidratados. Nunca se prepararán medios a partir de sus ingredientes básicos, si se dispone de medios deshidratados adecuados. Para la rehidratación, siganse las instrucciones de los fabricantes. También pueden utilizarse medios comerciales en forma líquida (ampollas estériles u otros), siempre que se sepa que sus resultados son equivalentes. Véase la sección 9020 sobre las normas de control de calidad.

Medio M-FC:

Rehidrátese en agua destilada con 10 ml de ácido rosólico al 1 por 100 en NaOH al 0,2N*. Caliéntese hasta casi ebullición, retírese rápidamente del calor y enfríese a menos de 50 °C. No se esteriliza en autoclave. Divídase en porciones de 5-7 ml y colóquese en placas de Petri de 50 x 12 mm donde se deja solidificar si se utiliza agar. El pH final debe ser de 7,4. Consérvese el medio preparado a 210 °C, rechazándose a las 2 semanas el no utilizado. Compruébese cada lote de medio en función de su productividad, preparando diluciones de un cultivo de Escherichia coli (sección 9020) y filtrando volúmenes adecuados para obtener 20-80 colonias por filtro. Verifíquense en cada nuevo lote de medio 10 o más colonias obtenidas a partir de varias muestras naturales con objeto de establecer la ausencia de resultados positivos falsos. En la mayoría de las muestras se puede utilizar el medio M-FC sin necesidad de añadir ácido rosólico al 1 por 100, siempre que no se produzcan interferencias debidas al crecimiento de fondo. Estas interferencias son de esperar en aguas de lluvia que formen * El reactivo ácido rosólico se descompone al ser esterilizado en el autoclave. La solución se mantiene en la oscuridad a 2-10 °C y se desecha a las 2 semanas o antes si cambia el color de rojo oscuro a pardo sucio.

9-110

MÉTODOS NORMALIZADOS

los primeros caudales tras un largo período de sequía. b) Placas de cultivo: Utilícense placas de plástico que cierren bien, ya que es preciso sumergir los cultivos de FM en un baño de agua para su incubación. Introdúzcanse grupos de cultivos de coliformes fecales en bolsas de plástico o séllense placas individuales con una cinta a prueba de agua para evitar la filtración durante la inmersión. En la sección 9222B.le, se exponen las normas para las placas de plástico para cultivo. c) Incubación: La especificidad de la prueba de coliformes fecales es directamente proporcional a la temperatura de incubación. No es deseable una incubación estática al aire a causa de la potencial estratificación del calor dentro de la cámara y a la lenta recuperación de la temperatura cada vez que se abre la incubadora para las operaciones habituales. Para obtener el indispensable control de la temperatura, se utilizará un baño de agua o una incubadora de calor sumergido. Se puede obtener una tolerancia de temperatura de 44,5 ± 0,2 °C con la mayoría de los baños de agua provistos de una tapa para reducir las pérdidas de agua y calor. Un baño de agua circulante

es excelente para este tipo de prueba, pero no esencial, si la variación máxima permisible de 0,2 °C puede conseguirse con otro equipo más sencillo. 2. Procedimiento a) Elección del volumen de la muestra: El volumen de muestra a estudiar se seleccionará de acuerdo con la información de la tabla 9222:III. Se utilizarán volúmenes que produzcan recuentos de 20-60 colonias de coliformes fecales por membrana. Cuando se ignore la densidad bacteriana de una muestra, se filtrarán varios volúmenes decimales para establecerla. Calcúlese el volumen que se espera de una membrana contable y elíjanse dos cantidades adicionales que representen una décima parte y diez veces el volumen señalado. b) Filtración de la muestra: Sígase el mismo procedimiento e idénticas precauciones que las descritas en la anterior sección 9222B.5b. c) Preparación de la placa de cultivo: Colóquese una compresa estéril absorbente en cada placa de cultivo y llévense

TABLA 9222:III. VOLÚMENES DE MUESTRA RECOMENDADOS PARA LA PRUEBA DE FILTRO DE MEMBRANA EN COLIFORMES FECALES

EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

con la pipeta alrededor de 2 ml de medio M-FC, preparado como se ha descrito, hasta saturar la compresa. Elimínese cuidadosamente de la placa de cultivo el posible exceso de líquido. Colóquese el filtro preparado en la compresa impregnada de medio como se describe en la sección 9222B. Como sustitutivo del sustrato de la compresa absorbente saturada de nutriente, añádase agar al 1,5 por 100 al medio líquido M-FC. d) Incubación: Sitúense los cultivos ya preparados en bolsas de plástico impermeables o séllense las placas de Petri y sumérjanse en un baño de agua donde se incuban a 44,5 ± 0,2 °C durante 24 ± ± 2 horas. Los discos se fijan bajo la superficie del agua para mantener la temperatura necesaria. Sitúense los cultivos preparados en el baño de agua antes de transcurridos 30 minutos de la filtración, si bien también puede utilizarse un incubador de disipación térmica sólido, adecuado y exacto. e) Recuento: Las colonias producidas por bacterias coliformes fecales en el medio M-FC presentan distintos matices de azul. Las colonias amarillo pálido pueden ser de E. coli y hay que comprobar si producen gas en manitol a 44,5 °C. Las colonias de coliformes no fecales son de tonos grises a cremosos. En condiciones normales, se observan pocas colonias de coliformes no fecales en el medio M-FC, debido a la acción selectiva de la elevada temperatura y a la adición de la sal del ácido rosólico. Las colonias se cuentan por medio de una lupa estereoscópica binocular de campo amplio y pocos aumentos (10 a 15) o mediante dispositivos ópticos similares. 3. Cálculo de la densidad de coliformes fecales

Calcúlese la densidad a partir de las

9-111

cantidades de muestra que producen recuentos en FM dentro de los límites deseados de 20-60 colonias de coliformes fecales. Estos límites son más restrictivos que los de 20-80 colonias de coliformes totales, debido al mayor tamaño de las colonias en el medio M-FC. El cálculo se realiza según lo expuesto en la sección 9222B.6. Comuníquese en términos de densidad de coliformes fecales por 100 ml.

4.

Bibliografía

GELDREICH , E. E., H. F. C LARK , C. B. HUFF & L. C. BEST. 1965. Fecal-coliform-organism mediu m for the membrane filter technique. J. Amer. Water Works Assoc. 57:208. ROSE, R. D., E. E. GELDREICH & W. LITSKY. 1975. Improved membrane filter method for fecal coliform analysis. Appl. Microbiol. 29:532. LIN , S. D. 1976. Membrane filter method for recovery of fecal coliforms in chlorinated sewage effluents. Appl. Environ. Microbiol. 32:547. PRESSWOOD, W. G. & D. K. STRONG. 1978. Modification of M-FC medium by eliminating rosolic acid. Appl. Environ. Microbiol. 36:90. GREEN, B. L., W. LITSKY & K. J. SLADEK. 1980. Evaluation of membrane filter methods for enumeration of faecal coliforms from marine waters. Mar. Environ. Res. 67:267. SARTORY, D. P. 1980. Membrane filtration faecal coliform determinations with unmodified and modified M-FC medium. Water SA 6:113. G RABOW , W. O. K., C. A. H ILNER , C. A. & P. COUBROUGH . 1981. Evaluation of standard and modified M-FC, MacConkey, and Teepol media for membrane filter counting of fecal coliform in water. Appl. Environ. Microbiol. 42:192. RYCHERT, R. D. & G. R. STEPHENSON. 1981. Atypical Escherichia coli in streams. Appl. Environ. Microbiol. 4VA216. P AGEL , J. E., A. A. Q URESHI , D. M. Y OUNG & L, T. VLASSOFF. 1982. Comparison of four membrane filter methods for fecal coliform enumeration. Appl. Environ. Microbiol. 43:787.

9-112

MÉTODOS NORMALIZADOS

9222 E.

Procedimiento de incubación retardada para coliformes fecales

Este procedimiento de incubación retardada es similar al que se utiliza para los coliformes totales (sección 9222C). No hay necesidad de disponer de un baño de agua de campo para hacer la incubación y libera al analista de la larga tarea que supone el recuento de las colonias. El estudio en el laboratorio central, en vez de hacerlo en el campo, permite confirmar las colonias e identificar por completo los microorganismos por medios bioquímicos, en caso necesario. Los resultados que consigue este método retardado concuerdan con los obtenidos en pruebas estándar inmediatas en distintos laboratorios y en diversas condiciones de uso en el campo. Sin embargo, se deberá determinar la aplicabilidad de la prueba para una fuente de agua específica, comparándola con la estándar de filtro de membrana, sobre todo en casos de agua salada, aguas residuales cloradas y aguas que contengan sustancias tóxicas. La prueba retardada sólo se utilizará cuando no sea posible realizar la prueba habitual inmediata para coliformes fecales. Para llevarla a cabo, fíltrese la muestra en el campo inmediatamente después de hacer la toma, colóquese el filtro en un medio de mantenimiento M-VFC (véase 2a, más adelante) y envíese al laboratorio. La prueba para coliformes fecales se completa pasando el filtro a un medio M-FC, incubándolo a 44,5 °C durante 24 ± 2 horas y haciendo un recuento de las colonias de coliformes fecales. El medio M-VFC mantiene viables los microorganismos coliformes fecales, pero evita un crecimiento visible durante el transporte. El medio de mantenimiento M-VFC permite conservar los filtros de membrana hasta 3 días, sin que ello

produzca un efecto importante sobre el recuento de estas bacterias. 1.

Instrumental

a) Placas de cultivo: Véase la sección 9222C.1a. b) Unidades de filtración de campo: Véase la sección 9222C.1b. 2.

Materiales y medio de transporte

a) Medio de mantenimiento M-VFC: Este medio no se encuentra a veces en forma deshidratada, por lo que habrá que prepararlo a partir de sus ingredientes básicos.

Caliéntese hasta disolver el medio y esterilícese mediante filtración a través de un filtro de membrana (diámetro de poro de 0,22 µm). Si sólo se preparan 100 ml, es preferible añadir 2 ml de una solución acuosa de casitona al 1:100, en lugar de 0,02 g del agente seco. El pH final debe ser de 6,7. Consérvese a 2-10 °C y deséchese a las 2 semanas el no utilizado. b) Medio M-FC: Prepárese como se describe en la sección 9222D.1a. 3.

Procedimiento

a) Transporte del filtro de membrana: colóquese una compresa absorbente en

EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

9-113

una placa de Petri de plástico que cierre bien y satúrese con medio de mantenimiento M-VFC. Tras filtrar la muestra, retírese el filtro de membrana de la unidad de filtración y colóquese en la compresa saturada de medio. Utilícense placas con cierre hermético para evitar la pérdida de humedad en la placa, aunque también hay que tener cuidado de que no haya exceso de líquido. Sitúese la placa con la membrana en un envase de transporte adecuado y envíese al laboratorio. Las membranas pueden permanecer en el medio de transporte a temperatura ambiente durante un máximo de 72 horas, sin que ello afecte de forma importante al recuento de coliformes fecales. b) Transferencia: En el laboratorio, retírese la membrana del medio de mantenimiento y colóquese en otra placa con medio M-FC. c) Incubación: Una vez situado el filtro en el medio M-FC, introdúzcanse las placas herméticas en bolsas de plástico sumergibles y sumérjanse en un baño de agua a 44,5 ± 0,2 °C durante 24 ± 2 horas, o bien utilícese una incubadora.

d) Recuento: Las colonias producidas por los coliformes fecales presentan distintos tonos de azul. Las colonias de coliformes no fecales son de color gris a cremoso. El recuento se realiza por medio de una lupa estereoscópica binocular de campo amplio y 10 a 15 aumentos.

9222 F.

4. Cálculo de la densidad de coliformes fecales

Realícese el recuento conforme a lo expuesto en la sección 9222D.2e y calcúlese la densidad de coliformes fecales como se describe en la sección 9222D.3. Regístrese el momento de la toma de la muestra, el de la filtración y el del estudio en el laboratorio, calculándose el intervalo de tiempo, que se hará constar en el informe. 5.

Bibliografía

TAYLOR, R. H., R. H. BORDNER & P. V. SCARPINO. 1973. Delayed incubation membrane-filter test for fecal coliforms. Appl. Microbiol. 25:363.

Procedimiento de filtro de membrana para Klebsiella

Klebsiella, un género incluido en el grupo de coliformes fecales según se ha definido aquí, puede producir crecimientos de coliformes en los sistemas de distribución del agua y suele ser un componente importante de la población de coliformes en la pulpa de papel, textil y otros residuos industriales. La población coliforme normal de las heces del hombre y de otros animales de sangre caliente puede contener de un 30-40 por 100 de cepas de Klebsiella. Alrededor de un 4 por 100 de los casos de neumonía bacteriana y de un 18 por 100 de las infecciones urinarias se deben a cepas patógenas de Klebsiella.

Un 85 por 100 de estas cepas clínicas son coliformes fecales. Las fuentes ambientales, como la vegetación, las pulpas de papel, la producción textil, la caña de azúcar y los productos de las granjas, contribuyen con un 71-80 por 100 a la población total de Klebsiella en los coliformes totales. Esta bacteria se encuentra a veces en los sedimentos de las redes de distribución de agua, como consecuencia de una inadecuada protección de las fuentes, tratamientos insatisfactorios o alteraciones en los sistemas de conducción. Un procedimiento de filtro de mem-

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brana permite llevar a cabo cuantificaciones rápidas mediante una modificación de la base de agar M-FC, sustituyendo la lactosa por inositol y añadiendo carbenicilina, o bien utilizando un medio de agar M-Kleb. Estos métodos disminuyen la necesidad de someter las cepas puras a pruebas bioquímicas. Se recomienda una verificación preliminar de las colonias diferenciadas.

MÉTODOS NORMALIZADOS

b) Agar M-Kleb:

a) Placas de cultivo: Véase la sección 9222B.le para las especificaciones. b) Unidades de filtración: Véase la sección 9222B.1f.

Esterilícese en autoclave durante 15 minutos a 121 °C. A continuación, enfriese a 50 °C en un baño de agua; añádanse 20 ml de alcohol etílico al 95 por 100 (no desnaturalizado) y 0,05 g de carbenicilina/l. Agítese con cuidado y divídase asépticamente en placas de cultivo de plástico de 50 x 9 mm. El pH final debe ser de 7,4 ± 0,2. El medio preparado puede conservarse durante 20 días a 4°C.

2.

3.

1.

Instrumental

Materiales y medios de cultivo

a) Agar M-FC modificado (agar MFCIC): Este medio no se encuentra a veces en forma deshidratada, por lo que habrá que prepararlo a partir de sus ingredientes básicos.

Caliéntese el medio hasta ebullición y añádanse 10 ml de ácido rosólico disuelto en NaOH al 0,02N. Enfríese por debajo de 45 °C y añádanse 50 mg de carbenicilina*. No esterilizar en el autoclave. El pH debe ser de 7,4 ±0,1.

* Geopen, Roerig-Pfizer, Inc., Nueva York.

Procedimiento

a) Para elegir el tamaño de la muestra y el procedimiento de filtración, véase sección 9222B.5. colóquese el filtro de membrana sobre la superficie del agar e incúbese durante 24 ± 2 horas a 35 ± 0,5 °C. Las colonias de Klebsiella en el agar M-FCIC son azules o gris azuladas. La mayoría de las colonias atípicas son marrones o pardas. En ocasiones se dan resultados positivos falsos debidos a especies de Enterobacter. Las colonias de Klebsiella en el medio de agar M-Kleb son de colores azul oscuro o azul grisáceo, mientras que las demás suelen ser rosadas o, a veces, amarillo pálido. Hágase el recuento con una lupa estereoscópica de campo amplio de bajo aumento (10-15) o cualquier otro instrumento óptico. b) Verificación. Compruébense las colonias de Klebsiella del primer lote de muestras de aguas ambientales y efluentes y también cuando se sospeche su presencia en los sistemas de distribución de agua. Compruébese un mínimo de cinco colonias típicas, pasando el crecimiento de la colonia o cultivo puro a un sistema

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EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

comercial de multiprueba para especificación de gramnegativos. Las pruebas claves para Klebsiella son citrato (positivas), indol (negativas), motilidad (negativas), lisina decarboxilasa (positivas), ornitina decarboxilasa (negativas) y ureasa (positivas). La Klebsiella de origen no fecal puede identificarse mediante correlación entre la producción de indol y la licuefacción de pectina con la capacidad para crecer a 10 °C y una respuesta negativa a las pruebas de coliformes fecales. 4.

Bibliografía

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9225

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DIFERENCIACIÓN DE BACTERIAS COLIFORMES* 9225 A.

En ocasiones, es necesario identificar a las bacterias que forman el grupo de coliformes fecales para establecer la naturaleza de la contaminación. Pueden utilizarse las pruebas diferenciales sabiendo que todas las cepas taxonómicamente asignadas al grupo de los coliformes no se ajustan necesariamente a la definición de coliformes establecida en el manual, ya que a veces no fermentan la lactosa o, si lo hacen, pueden no producir gas. Además, existen otras bacterias gramnegativas que, como los coliformes, fermentan * Aprobado por el Standard Methods Committee, 1988.

Introducción la lactosa y producen brillo (por ejemplo, Aeromonas spp.) y no todas las cepas de una especie reaccionan en el medio de manera uniforme. Los microorganismos lesionados o mutados no dan a veces las respuestas clásicas. Las tradicionales pruebas IMViC (es decir, utilización del indol, el rojo metilo, el Voges-Proskauer y el citrato) son útiles para diferenciar los coliformes, pero no proporcionan una total identificación, siendo necesario recurrir a pruebas bioquímicas adicionales. Los equipos comerciales de identificación son alternativas útiles y económicas a los tradicionales medios de diferenciación.

9-116

MÉTODOS NORMALIZADOS

9225 B. 1.

Purificación de cultivos

Procedimiento

Para que la identificación sea exacta, resulta esencial que el cultivo sea puro. Esto se consigue cogiéndolo cuidadosamente del centro de una colonia bien separada, que dé respuestas típicas en un medio sólido adecuado o en un filtro de membrana, y sembrando el material recogido mediante estriación en una placa de agar o en soja tríptica. Se consigue una mejor distribución de las colonias en el subcultivo, emulsionando una parte del material recogido en medio líquido de peptona o en agua destilada y sembrando seguidamente esta emulsión. Cuando se toma una colonia de un cultivo primario en un medio selectivo, hay que tener presente que pueden existir células viables que no hayan formado colonias alrededor de la colonia de la que se hace la toma. Incúbese el subcultivo a 35 ± 0,5 °C durante 24 horas y realícese una prueba Gram a una única colonia bien aislada para confirmar que

9225 C. 1.

sólo existen bacilos gramnegativos no esporulados. Determínese también que el cultivo es oxidasa negativo. Los bacilos oxidasa positivos, gramnegativos y no esporulados no son bacterias coliformes, sino que pueden ser Aeromonas, no consideradas como indicadoras de contaminación fecal. En ocasiones, se producen variaciones en los microorganismos del grupo coliforme y las reacciones mixtas en medios diferenciales pueden indicar que un cultivo puro está sufriendo variaciones. Las reacciones más-menos persistentes en un medio diferencial indican que se trata de un cultivo mixto producido por una purificación inadecuada. 2.

Bibliografía

PTAK, D. J., W. GINSBURG & B. F. WILLEY. 1974. Aeromonas, the great masquerader. Proc. American Water Works Assoc. Water Quality Technology Conf., Dallas, Texas, 2 de diciembre de 1974.

Diferenciación

Definición

En esta sección se definen los coliformes como bacilos gramnegativos no esporulados que fermentan la lactosa, dando lugar a la formación de gas en 48 horas a 35 °C, o que cuando se utiliza el método del filtro de membrana, producen colonias rojo oscuro con brillo metálico a las 24 horas de incubación en un medio tipo Endo con lactosa. Sin embargo, pueden encontrarse cepas anaerogénicas (no productoras de gas) que fermentan la lactosa de Escherichia coli, así como coliformes no productores de brillo metálico en medio Endo. Estos

microorganismos, así como los coliformes típicos, pueden ser considerados como organismos indicadores, pero se excluyen de la definición actual de coliformes; para distinguirlos, es necesario recurrir a pruebas distintas de las aquí presentadas. 2.

Características y pruebas

La tabla 9225:I recoge la nomenclatura de la familia, señalándose las especies que producen gas con la lactosa. En la tabla 9225:II, se presentan las características de los microorganismos indicadores sobre varios sustratos que constituyen la

EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

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TABLA 9225:I. NOMENCLATURA DE LAS ENTEROBACTERIÁCEAS 1-3

base para su mayor diferenciación. No todas las especies muestran siempre las reacciones características. Las pruebas IMViC pueden bastar en algunos casos, aunque por lo general sólo permiten una identificación parcial. Las pruebas de decarboxilasa con útiles, las de lisina decarboxilasa ayudan a distinguir las Citrobacter de Arizona y las de omitina decarboxilasa, pendiente de agar urea8 y motilidad, son adecuadas para diferenciar Klebsiella de Enterobacter. La preparación de los medios y reacti-

vos diferenciales puede ser más costosa para muchos laboratorios que la utilización de equipos multiprueba comerciales ya preparados y envasados, que permiten reducir el trabajo de control de calidad, Los equipos preempaquetados son fáciles de conservar y utilizar, y ofrecen resultados reproducibles y exactos; sin embargo, hay que comprobar periódicamente sus reacciones con cultivos conocidos de bacterias para asegurar la exactitud y reproducibilidad de los resultados. Si estos equipos dan resultados equívocos, hay

9-118

MÉTODOS NORMALIZADOS

9-119

EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

que realizar nuevas pruebas. Más adelante se citan varios equipos comerciales ampliamente evaluados*. 3.

Referencias

1.

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Descripción Veinte microcápsulas en una tarjeta pueden proporcionar 21 resultados. Enterotube Cilindro de plástico que contiene 12 compartimentos llenos de medio. Se inoculan secuencialmente todos los compartimentos con una sola aguja y se obtienen 15 resultados. Inolex Micrométodo con 10 unidades capilaEnteric 1 & 2 res en una tarjeta. Dos tarjetas distintas permiten obtener 20 resultados. Microlab ID Micrométodo que ofrece 15 resultados en cuatro pasos. Minitek Discos impregnados de reactivo, colocados mecánicamente en pequeños pocilios. 34 discos proporcionan 36 resultados. Para más información, véase cita9.

9225 D. 1.

5. EWING, W. H. 1973. Differentiation of Enterobacteriaceae by Biochemical Reactions. U. S. Dep. Health Education & Welfare Publ. n.° (CDC) 74-8270, Center for Disease Control, Atlanta, Georgia. 6. E WING , W. H., B. R. D A VIS & W. J. M AR TIN . 1972. Biochemical Characterization of Escherichia coli. U.S. Dep. Health Education & Welfare Publ. n.° (HSM) 72-8109, Center for Disease Control, Atlanta, Georgia. 7. EWING , W. H. 1971. Biochemical Characterization of Citrobacter freundii and Citrobacter diversus. Center for Disease Control, Atlanta, Georgia. 8. LENNETTE, E. H., A. BALOWS, W. J. HAUSLER, J R. & H. J. S HADOMY , eds. 1985. Manual of Clinical Microbiology, 4.a ed. American Soc. for Microbiology, Washington, D.C. 9. WASHINGTON, J. A., II. 1977. Kits for identification of microorganisms. Lab. Medicine 2:1.

4.

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Significación de los distintos tipos de coliformes

Discusión

El significado de los distintos tipos de coliformes que existen en el agua ha sido y es objeto de amplios estudios. En con-

junto, se considera a los coliformes como indicadores, ya que indican la existencia de heces humanas o animales. En las heces se pueden encontrar todo tipo de coliformes. Aunque E. coli se encuentra casi

9-120

MÉTODOS NORMALIZADOS

siempre en las contaminaciones recientes procedentes de animales de sangre caliente, también pueden hallarse otros coliformes en casos de contaminación en los que aquél no existe. Los géneros Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter y Escherichia suelen representar la mayor parte de los microorganismos aislados en aguas naturales y suministros de aguas municipales tratadas, siendo Enterobacter el que se aisla con mayor frecuencia, si bien no todos los coliformes tienen necesariamente su origen en las aguas de alcantarilla. E. coli es el coliforme más afectado por los tratamientos habituales del agua. Los microorganismos coliformes, algunos de los cuales son saprofitos de vida libre, pueden multiplicarse en lavaderos de cuero, madera, cuerdas de piscina y empaquetadoras de yute, y producir a veces cienos en el interior de las tuberías. La diferenciación de los coliformes tiene valor en el momento de determinar la fuente de la que procede el aumento de su densidad y que es consecuencia de la multiplicación de microorganismos sobre o dentro de materiales orgánicos. La presencia de un gran número de coliformes del mismo tipo en el agua de un pozo o manantial o en un solo grifo de un sistema de distribución

9225 E.

2.

Bibliografía

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Medios, reactivos y procedimientos

Los medios y reactivos comerciales ayudan a reducir el trabajo y el coste; sin embargo, hay que incluir controles positivos y negativos de cultivos conocidos para asegurar su exactitud y fiabilidad. Pueden consultarse detalles sobre estos métodos1. La tabla 9225:II recoge los resultados que se esperan de estas pruebas. 1.

sugiere que se ha producido la citada multiplicación. Los residuos industriales contienen elevadas concentraciones de elementos nutritivos para las bacterias y pueden favorecer grandes sobrecrecimientos de coliformes en aguas efluentes y afluentes. Estos crecimientos pueden también aparecer en los sistemas de distribución de aguas tratadas. Aeromonas y otras bacterias gramnegativas oxidasa positivas y Erwinia pueden encontrarse en las aguas naturales y tratadas. Estos dos géneros no son bacterias indicadoras, según la definición aquí utilizada.

Prueba del indol

El indol es un producto del metabolismo del triptófano.

a) Reactivos: 1) Medio: Utilícese medio líquido con triptófano. Disuélvanse 10,0 g de triptona o tripticasa/l de agua destilada. Divídase en porciones de 5 ml en tubos de ensayo y esterilícese. 2) Reactivo de prueba: Disuélvanse 5 g de parametil aminobenzaldehído en 75 ml de alcohol isoamílico (o amílico normal) de calidad ACS y añádanse 5 ml de HCL conc. El reactivo debe ser amarillo. Algunos lotes de paradimetilaminobenzaldehído no son satisfactorios y los

EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

9-121

aceptables se estropean con el paso del tiempo. La solución de alcohol amílico debe tener un pH inferior a 6,0. Tanto el alcohol amílico como el compuesto de benzaldehído deben comprarse en pequeñas cantidades en función del volumen de trabajo que se vaya a realizar. b) Procedimiento: Inocúlense porciones de 5 ml de medio con un cultivo puro e incúbense a 35 ± 0,5 °C durante 24 ± ± 2 horas. Añádanse 0,2-0,3 ml del reactivo y agítese. Déjese reposar unos 10 minutos y obsérvense los resultados. Existe reacción positiva a la prueba del indol cuando aparece un color rojo oscuro en el alcohol amílico; si se mantiene el color original del reactivo, la prueba es negativa. Un color naranja indica probable presencia de escatol, un producto de la degradación del indol.

0,1 g de rojo de metilo en 300 ml de alcohol etílico al 95 por 100 y diluyanse hasta 500 ml en agua destilada.

2.

Prueba del rojo de metilo

La prueba del rojo de metilo mide el pH terminal, es decir, marca la producción por las bacterias de ácido a partir de la glucosa. Las reacciones metabólicas demostradas por la aparición de gas y rojo de metilo, y la prueba de VogesProskauer están relacionadas entre sí y resultan útiles para diferenciar los miembros del grupo de los coliformes. a) Reactivos: 1) Medio: Utilícese medio líquido tamponado de glucosa. Disuélvanse 5,0 g de proteosa peptona o peptona equivalente, 5,0 g de glucosa y 5,0 g de fosfato de hidrógeno dipotasio (K2HPO4) en 1 l de agua destilada. Divídase en porciones de 5 ml en tubos de ensayo y esterilícese en el autoclave a 121 °C durante 12-15 minutos, asegurándose de que el tiempo total de exposición al calor no supera los 30 minutos. 2) Solución indicadora: Disuélvanse

b) Procedimiento: Inocúlense con un cultivo puro porciones de 10 ml del medio. Incúbense a 35 °C durante 5 días. Añádanse 5 gotas de la solución indicadora de rojo de metilo a 5 ml del cultivo. En la mayoría de los casos, basta con una incubación de 48 horas, pero no deben hacerse incubaciones inferiores a este tiempo. Si los resultados de la prueba son equívocos a las 48 horas, repítase la misma con cultivos incubados durante 4-5 días. En estos casos, incúbense cultivos duplicados a 22 a 25 °C. Compruébense los cultivos a los 2, 3, 4 y 5 días, ya que el resultado positivo puede aparecer antes del último día. Comuníquese como resultado positivo la aparición de un color rojo, mientras que un color claramente amarillo constituye un resultado negativo. Los matices intermedios son resultados cuestionables, que indican posiblemente una purificación incompleta del cultivo.

3.

Prueba de Voges-Proskauer

Esta prueba detecta la acetoína, producida metabólicamente por determinadas bacterias coliformes en un medio de peptona glucosa. a) Reactivos: 1) Medios: Utilícese el medio descrito para la prueba diferencial del rojo de metilo o un medio de sal peptona glucosa. Disuélvanse 10,0 g de polipeptona o proteosa peptona, 5,0 g de cloruro de sodio (NaCl) y 10,0 g de glucosa en 1 l de agua destilada; el pH debe ser de 7,0-7,2. Prepárense porciones de 5 ml en tubos de ensayo, que se esterilizan en el autoclave a 121 °C durante 12-15 minutos,

9-122

sin que la exposición total al calor supere los 30 minutos. 2) Solución de naftol: Disuélvanse 5 g de a-naftol purificado (punto de fusión 92,5 °C o mayor) en 100 ml de alcohol etílico absoluto. Esta solución, conservada a 5-10 °C, se mantiene estable durante 2 semanas. 3) Hidróxido de potasio, 7N: Disuélvanse 40 g de KOH en 100 ml de agua destilada.

MÉTODOS NORMALIZADOS

NaCl, 15,0 g de agar y 0,08 g de bromotimol azul a 1 l de agua destilada. Introdúzcase en tubos de manera que forme largas pendientes. b) Procedimiento:

b) Procedimiento: Inocúlense 5 ml de cualquiera de los medios e incúbense durante 48 horas a 35 + 0,5 °C. Añádanse 0,6 ml de la solución de naftol y 0,2 ml de la de KOH a 1 ml de cultivo. El resultado positivo viene dado por la aparición a los 5 minutos de un color rosa a carmesí. No se debe leer después de los 5 minutos. Se rechazarán los tubos en los que aparezca un color cobre.

1) Inocúlese ligeramente el medio líquido con una aguja recta, nunca con una pipeta. Incúbese a 35 ± 0,5 °C durante 72-96 horas, registrándose como resultado positivo un crecimiento visible y como negativo la ausencia de crecimiento. 2) Inocúlese el medio de agar con una aguja recta utilizando torunda y estría. Incúbese a 35 ± 0,5 °C durante 48 horas. La reacción positiva viene dada por la aparición de un crecimiento (generalmente de color azul; el resultado negativo consiste en la ausencia de crecimiento.

4.

5.

Prueba del citrato de sodio

Esta prueba detecta la capacidad de las bacterias para utilizar el citrato como fuente de carbono. a) Medios alternativos: Utilícese el medio líquido de citrato de Koser o el agar citrato de Simmons. Para elaborar el primero, disuélvanse 1,5 g de fosfato de hidrógeno amonio sodio (NaNH4HPO4 · 4H2O), 1,0 g de fosfato de hidrógeno dipotasio (K2HPO4), 0,2 g de sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO4 · 7H2O) y 3,0 g de citrato de sodio dihidratado en cristales a 1 l de agua destilada. Divídase la mezcla en porciones de 5 ml colocándolas en tubos de ensayo que se esterilizan. Para elaborar el medio de agar citrato de Simmons, añádanse 0,2 g de MgSO4-7H2O, 1,0 g de fosfato de dihidrógeno amonio (NH4H2PO4), 1,0 g de K2HPO4, 2,0 g de citrato de sodio dihidratado, 5,0 g de

Prueba de motilidad

a) Medio: Utilícese un medio para prueba de motilidad, que se elabora añadiendo 3,0 g de extracto de buey, 10,0 g de peptona, 5,0 g de NaCl y 4,0 g de agar a 1 l de agua destilada. Ajústese el pH a 7,4 y divídase en porciones de 8 ml, que se colocan en tubos de ensayo para esterilización. b) Procedimiento: Inocúlese con una torunda la parte superior de la columna del medio hasta una profundidad de 5 mm. Incúbese durante 1-2 días a 35 °C. Si el resultado es negativo, incúbese durante otros 5 días a 22-25 °C. Un crecimiento difuso a partir del punto de inoculación se considera como resultado positivo. También es posible preparar el medio sin agar y examinar un cultivo joven utilizando la técnica de la gota pendiente para microorganismos móviles.

9-123

EXAMEN MICROBIOLOGICO DE LAS AGUAS

6.

Prueba de la decarboxilasa

Esta prueba estudia la capacidad de las bacterias para metabolizar los aminoácidos lisina y ornitina. a) Reactivos: 1) Medios: Utilícese un medio basal fabricado según los métodos de Moeller o de Falkow1. En el caso del método de Moeller, disuélvanse 5,0 g de peptona (Orthana especial, tiotona o equivalente), 5,0 g de extracto de buey, 0,625 ml de púrpura bromocresol (1,6 por 100), 2,5 ml de rojo cresol (0,2 por 100), 0,5 g de glucosa y 5,0 mg de piridoxal en 1 l de agua destilada y ajústese el pH entre 6,0 y 6,5. Para el método de Falkow, disuélvanse 5,0 de peptona, 3,0 g de extracto de levadura, 1,0 g de glucosa y 1,0 ml de púrpura bromocresol (1,6 por 100) en 1 l de agua destilada, ajustándose el pH a 6,7 o 6,8. Cada medio basal se divide en tres partes: a la primera no se añade nada; a la segunda, una cantidad de diclorhidrato de L-lisina suficiente para obtener una solución al 1 por 100, y a la tercera, se añade suficiente diclorhidrato de L-lisina para obtener una solución al 1 por 100 (para el método de Falkow, sólo se añade aminoácido hasta alcanzar una concentración del 0,5 por 100). Tras añadir la ornitina, vuélvase a ajustar el pH del medio. Divídase en porciones de 3-4 ml, que se colocan en tubos de ensayo con tapón de rosca y se esterilizan en autoclave a 121 °C durante 10 minutos. La aparición de un precipitado flocular en el medio con ornitina no interfiere en su utilización. 2) Aceite mineral: Utilícese aceite mineral esterilizado en el autoclave a 121CC durante 30-60 minutos, en función del tamaño del envase. b) Procedimiento: Inocúlese ligeramente cada uno de los tres medios, añádase una capa de aceite mineral de alrededor de 10 mm de grosor e incúbese a 37 °C hasta un máximo de 4 días. Exa-

mínense los tubos diariamente. La reacción positiva a la prueba de la decarboxilasa viene dada por un cambio de color de amarillo a violeta o rojo-violáceo; un cambio a gris azulado indica una reacción positiva débil; la ausencia de cambio de color indica reacción negativa. Véase tabla 9225:II. 7.

Prueba de la oxidasa

Esta prueba estudia la enzima citocromo oxidasa como medio para distinguir entre grupos de bacterias. Las coliformes son oxidasa negativas. a) Reactivos: 1) Medios: Utilícese agar nutritivo o agar de soja tríptica para sembrar los cultivos y conseguir colonias aisladas. A partir de éstas, hágase la inoculación para la prueba de oxidasa en un papel de filtro impregnado. No debe utilizarse medio alguno que contenga carbohidratos. Utilícese únicamente agar de soja tríptica cuando se haga gotear el reactivo sobre las colonias. Agar de soja tríptica:

El pH debe ser de 7,3 ± 0,2 después de la esterilización. 2) Diclorhidrato de tetrametil-parafenilenediamina, solución acuosa al 1 por 100 recién preparada o refrigerada durante no más de 1 semana. Imprégnese una tira de papel de filtro* con esta solución. También puede prepararse una solución al 1 por 100 de clorhidrato de dimetilparafenilendiamina. Las ampollas * Whatman n.° 1 o equivalente.

MÉTODOS NORMALIZADOS

9-124

comerciales de un solo uso de este reactivo son cómodas y económicas, pero hay que utilizarlas con precaución. Cuando sea preciso hacer gotear directamente el reactivo sobre las colonias, utilícense placas de agar soja tríptica, ya que las de agar nutritivo dan resultados inconsistentes; al extender una porción de una colonia sobre el papel de filtro impregnado con el reactivo, hay que tener cuidado de que no lleve medio. b) Procedimiento: Tómese con un asa de platino o aplicador de madera o plástico, o con una barra de vidrio, alguna de las colonias del agar y extiéndase sobre la tira de papel. No debe utilizarse hierro u otro alambre reactivo, ya que pueden producir resultados positivos falsos. La reacción a la oxidasa es positiva si a los 10 segundos se desarrolla un intenso color púrpura. Deben probarse al mismo tiempo cultivos positivos y negativos. Cuando se utiliza el reactivo en forma líquida, se hace gotear sobre las colonias de la placa de cultivo. Las colonias positivas desarrollan un color rosa, que vira progresivamente a marrón, rojo oscuro y, por último, negro.

8.

Referencias

1. LENNETTE, E. H., A. BALOWS, W. J. HAUSLER, JR. & H. J. SHADOMY, eds. 1985. Manual of Clinical Microbiology, 4.a ed. American Soc. for Microbiology, Washington, D.C.

9.

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9-125

EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

9230

GRUPOS DE ESTREPTOCOCOS Y ENTEROCOCOS FECALES* 9230 A.

1.

Grupo de estreptococos fecales

El grupo de los estreptococos fecales está formado por varias especies del género Streptococcus, como son S. faecalis, S.faecium, S. avium, S. bovis, S. equinus y S. gallinarum. Todas ellas dan reacción positiva con los antisueros para el grupo D de Lancefíeld1 y se han aislado en las heces de los animales de sangre caliente. Además, S. avium reacciona en ocasiones con los antisueros frente al grupo Q de Lancefield. S. faecalis, subespecie liquefaciens, y S. faecalis, subespecie zymogenes, se diferencian por su capacidad para licuar la gelatina y hemolizar los hematíes. Sin embargo, su validez es dudosa2, 3. El habitat normal de los estreptococos fecales es el aparato digestivo de los animales de sangre caliente. Se pensó que S. faecalis y S. faecium eran más específicos del hombre que las restantes especies de estreptococos. También se han encontrado otras especies en las heces humanas, aunque con menor frecuencia4. De la misma forma, 5. bovis, S. equinus y S. avium no son exclusivos de los animales, aunque suelen encontrarse con mayor densidad en las heces respectivas5. Algunas especies de estreptococos predominan en determinadas especies de animales y no en otras, aunque no es posible diferenciar la fuente de contaminación fecal basándose en la proporción de los distintos estreptococos fecales encontrados. Estos microorganismos se han utilizado, junto a los coliformes fecales, para diferenciar la contaminación fecal humana de la de otros animales de sangre ca* Aprobado por el Standard Methods Committee, 1988.

Introducción liente. En ediciones anteriores de Standard Methods se sugería que la proporción entre coliformes fecales (CF) y estreptococos fecales (EF) podría suministrar cierta información sobre la fuente de contaminación. Una proporción superior a 4 indicaría una contaminación fecal humana, mientras que una relación inferior a 0,7 sugeriría una contaminación de origen no humano. Sin embargo, se ha cuestionado el valor de esta proporción, dados los distintos índices de supervivencia de los grupos de especies de estreptococos fecales. S. bovis y S. equinus mueren rápidamente cuando entran en contacto con el medio acuoso, mientras que E. faecalis y S. faecium tienden a sobrevivir más tiempo6. Además, la desinfección de las aguas residuales parece ejercer un importante efecto sobre la proporción de estos indicadores, lo que podría dar lugar a conclusiones erróneas sobre la fuente de contaminación7. Este cociente también resulta afectado por los métodos de recuento de estreptococos fecales. El procedimiento de filtro de membrana tiene un índice de resultados positivos falsos del 10 al 90 por 100 en aguas marinas y dulces8-10. Por estas razones, no es posible recomendar la proporción CF/EF, que no debe ser utilizada como medio para diferenciar los orígenes humanos o animales de la contaminación. 2. Grupo de los enterococos

El grupo de los enterococos es un subgrupo de estreptococos fecales, formado por S. faecalis, S. faecium, S. gallinarum y S. avium. Los enterococos se diferencian del resto de estreptococos por su capacidad para crecer en cloruro de so-

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dio al 6,5 por 100 a un pH de 9,6 y a 1 0 ° C y 45 °C. La porción de enterococos que integra al grupo de estreptococos fecales es un valioso indicador bacteriano, útil para determinar la amplitud de la contaminación fecal de las aguas recreativas. Los estudios realizados en playas de aguas saladas y dulces indican que las gastroenteritis asociadas a los baños son directamente proporcionales a la calidad del agua de baño y que los enterococos son los mejores indicadores bacterianos de dicha calidad11, 12. Se han propuesto directrices sobre la calidad del agua en zonas recreativas, basadas en la densidad de enterococos13. En el caso de las aguas dulces recreativas, la norma es de 33 enterococos/l00 ml, mientras que en el caso de las aguas marinas es de 35/l00 ml. Cada norma se basa en la media geométrica de un mínimo de cinco muestras obtenidas en un período de 30 días y durante la estación de los baños. 3.

Selección del método

La técnica del tubo múltiple se aplica sobre todo a las aguas residuales y sedimentos no tratados y clorados, y puede utilizarse también en aguas dulces y marinas. Asimismo, puede emplearse la técnica del filtro de membrana para muestras de agua salada y dulce, pero no resulta recomendable en caso de aguas muy turbias. 4.

MÉTODOS NORMALIZADOS

3.

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10.

11.

Referencias

1. SNEATH, P. H. A., N. S. MAIR, M. E. SHARPE & J. G. HOLT, eds. 1986. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, vol. 2, Williams & Wilkins, Baltimore, Maryland. 2. JACOB, A. E., G. J. DOUGLAS & S. J. HOBBS. 1973. Self-transferable plasmids determining the haemolysin and bacteriocin of Streptococcus faecalis var. zymogenes. J. Bacteriol. 121:863.

12.

13.

OLIVER, D. R., B. L. BROWN & D. B. CLEWELL . 1977. Characterization of plasmids determining haemolysin and bacteriocin production in Streptococcus faecalis 5952. X Bacteriol. 130:948. WATANABE, T., H. SHIMOHASHI, Y. KAWAI & M. MUTAI. 1981. Studies on streptococci. I. Distribution of fecal streptococci in man. Microbiol. Immunol. 25:257. THOMAS, C. D. & M. A. LEVIN. 1978. Quantitative analysis of group D streptococci. Abs. Annual Meeting. American Soc. Microbiology, pág. 210. F EACHAM , R. 1975. An improved role for faecal coliform to faecal streptococci ratios in the differentiation between human and non-human pollution sources. Water Res. 9:689. ROSSER, P. A. E. & D. P. SARTORY. 1982. A note on the effect of chlorination of sewage effluents on faecal coliform to faecal streptococci ratios in the differentiation of faecal pollution sources. Water S. A. 8:66. FUJIOKA, R. S., A. A. UENO & O. T. NARI KAWA. 1984. Recovery of False Positive Fecal Streptococcus on KF Agar from Marine Recreational Waters. Tech. Rep. n.° 168, Water Resources Research Center, Univ. Hawai de Manoa, Honolulú. OLIVIERI , V. P., C. W. K RUSE , K. KAWATA efe J. E. S MITH . 1977. Microorganisms in Urban Stormwater. EPA-600/2-77-087, U.S. Environmental Protection Agency, Edison, Nueva Jersey. ERICKSEN, T. H., C. THOMAS & A. DUFOUR. 1983. Comparison of two selective membrane filter methods for enumerating fecal streptococci in freshwater samples. Abs. Annual Meeting, American Soc. Microbiology, pág. 279. CABELLI, V. J. 1983. Health Effects Criteria for Marine Waters. EPA-600/l-80-031, U.S. Environmental Protection Agency, Cincinnati, Ohio. DUFOUR, A. P. 1984. Health Effects Criteria for Fresh Recreational Waters. EPA-600/l84-004, U.S. Environmental Protection Agency, Cincinnati, Ohio. U.S. ENVIRONMENTAL P ROTECTION AGEN CY . 1986. Ambient Water Quality Criteria for Bacteria: 1986. EPA-440/5-84-002, U.S. Environmental Protection Agency, Washington, D.C.

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EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

9230 B. 1.

Técnica de tubo múltiple

Materiales y medios de cultivo

a) Medio líquido de azida dextrosa1:

Incúbense los tubos inoculados a 35 ± ± 0,5 °C. Examínese cada tubo para detectar turbidez a las 24 ± 2 horas. Si no existe turbidez evidente, reincúbense y vuélvanse a leer a las 48 ± 3 horas.

3. Procedimiento de la prueba de confirmación

El pH debe ser de 7,2 ± 0,2 a 25 °C después de la esterilización. b) Agar Pfizer selectivo de los enterococos (PSE)2:

El pH debe ser de 7,1 ± 0,2 después de la esterilización. No debe mantenerse el medio más de 4 horas a 45 ó 50 °C antes de verterlo en las placas.

Sométanse todos los tubos con medio de azida dextrosa que muestren turbidez a las 24 ó 48 horas de incubación a la prueba de confirmación. Siémbrese una porción del cultivo de cada tubo con medio de azida dextrosa en agar PSE. Incúbese la placa invertida a 35 ± 0,5 °C durante 24 ± 2 horas. La formación de colonias pardonegruzcas con halos marrones confirma la presencia de estreptococos fecales. Estas colonias pueden ser transferidas a un tubo con medio líquido de infusión encéfalo corazón, que contenga NaCl al 6,5 por 100. El crecimiento en un medio con 6,5 por 100 de NaCl a 45 °C indica que las colonias pertenecen al grupo de los enterococos.

4. 2. Procedimiento de la prueba presuntiva

Inocúlese una serie de tubos de medio de azida dextrosa con cantidades adecuadamente graduadas de la muestra. Utilícense porciones de 10 ml o menores. Para los inóculos de 10 ml, empléese medio de doble potencia. Las porciones utilizadas varían en número según el carácter de la muestra. Úsense sólo múltiplos de 1 ml (véase sección 9221 para el volumen de muestra recomendado).

Cálculo y registro del NMP

Hágase el cálculo de la densidad de estreptococos fecales a partir del número de tubos de cada serie de diluciones que sean positivos en el agar PSE. De la misma forma, calcúlense las densidades de enterococos a partir de los tubos de cada serie de dilución que contengan estreptococos y crezcan en el medio con NaCl al 6,5 por 100. Calcúlese la combinación de positivos y regístrese como el número más probable (NMP). Véase la sección 9221D.

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5.

MÉTODOS NORMALIZADOS

tion of streptococci in water and sewage. Amer. J. Pub. Health 40:286.

Referencias 2.

ISENBERG, H. D., D. GOLDBERT & J. SAMPSON.

1.

MALLMAN, W. L. & E. B. SELIGMANN. 1950. A comparative study of media for the detec-

9230 C.

1972. Laboratory studies with a selective enterococcus medium. Health Lab. Sci. 9:289.

Técnicas de filtro de membrana

1. Instrumental de laboratorio

Véase sección 9222B.1.

2. Materiales y medios de cultivo

a) Agar mE para enterococos1:

Caliéntese para disolver los ingredientes, esterilícese y enfríese en un baño de agua a 44-46 °C. Mézclese con 0,25 g de ácido nalidíxico y 5 ml de agua de calidad para reactivos, añadiéndose algunas gotas de NaOH 0,1N para disolver el antibiótico que se incorpora al medio básico. Añádanse 0,15 g de cloruro de 2,3,5trifenil tetrazolio y mézclese hasta disolución. Viértase el agar en placas de Petri de 9 x 50 mm hasta conseguir un grosor de 4-5 mm (alrededor de 4 a 6 ml) y déjese solidificar. El pH final debe ser de 7,1 ± 0,2. Almacénense las placas en la oscuridad a 2-10 °C. Deséchense las no utilizadas en un plazo de 30 días (NOTA: Se recomienda este medio para cultivar enterococos en aguas recreativas dulces y saladas.)

b) Sustrato El A1: Esculina ................................... Citrato de hierro ................... Agar ......................................... Agua destilada .......................

1,0 g 0,5 g 15,0 g 1 l

El pH debe ser de 7,1 + 0,2 antes de pasar por el autoclave. Caliéntese hasta que se disuelvan los ingredientes, esterilícese y déjese enfriar en un baño de agua hasta 44-46 °C. Viértase el medio en placas de Petri de 500 mm hasta conseguir un grosor de 4-5 mm (alrededor de 4-6 ml) y déjese solidificar. Almacénense las placas en la oscuridad a 2-10 °C y deséchense después de 30 días. c) Agar m Enterococcus para estreptococos fecales 2:

Caliéntese hasta que se disuelvan los ingredientes. No se pasa por el autoclave. Divídase en porciones en placas de Petri de 9 x 50 mm hasta un grosor de 4-5 mm (alrededor de 4-6 ml) y déjese solidificar. Prepárese medio fresco para cada lote de muestras. (NOTA: Se recomienda este medio para estreptococos del grupo D en aguas dulces y saladas.)

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EXAMEN MICROBIOLOGICO DE LAS AGUAS

d) Medio líquido de infusión de encéfalo-corazón:

El pH debe ser de 7,4 después de la esterilización. e) Agar infusión de encéfalo-corazón: Añádanse 15,0 de agar a los ingredientes del medio líquido de encéfalo-corazón. El pH debe ser de 7,4 después de la esterilización. Viértase el medio en tubos para que solidifique en pendiente. f) Agar bilis esculina3:

cuados de muestra a través de una membrana estéril con trama de 0,45 µm para obtener 20-60 colonias en la superficie de la membrana. Pásese el filtro a una placa de Petri con un medio de agar, evitando la formación de burbujas bajo la membrana. 2) Incubación: Con las placas invertidas, incúbese a 41 ± 0,5 °C durante 48 horas. 3) Prueba de sustrato: Pasadas 48 horas de incubación, pásese con cuidado el filtro a un medio EIA. Incúbese durante 20 minutos a 41 + 0,5 °C. 4) Recuento: Las colonias rosas o rojas de enterococos desarrollan un precipitado negro o rojo-pardo en la parte inferior del filtro. Hágase el recuento con ayuda de una lámpara fluorescente y una lupa. b) Método m Enterococcus3:

Caliéntense los ingredientes hasta disolución y divídanse en tubos de 10 ml formando pendientes o introdúzcase un volumen adecuado en un matraz para verterlo posteriormente en placas. Pásese por el autoclave a 121 °C durante 15 minutos. No sobrecalentar, ya que puede oscurecerse el medio. Enfríese a 44-46 °C y déjese solidificar en pendiente en los tubos o introdúzcase en porciones de 15 ml en placas de Petri de 15 x 100 mm. El pH final debe ser de 6,6 ± 0,2 después de la esterilización. Almacénese a 4-10 °C. 3.

Procedimientos a)

Método mE1:

1) Selección del volumen de la muestra y filtración: Fíltrense volúmenes ade-

1) Selección del volumen de la muestra y filtración: Véase el apartado 3a. 2) Incubación: Déjense en reposo las placas durante 30 minutos y a continuación inviértanse e incúbense a 35 ± 0,5 °C durante 48 horas. 3) Recuento: Cuéntense como enterococos todas las colonias rojas claras u oscuras. Para ello, utilícese una lámpara fluorescente y una lupa.

4. Cálculo de estreptococos fecales o densidad de enterococos

Calcúlese la densidad a partir de las cantidades de muestra que produzcan recuentos de filtro de membrana comprendidos entre 20 y 60 colonias de estreptococos fecales o enterococos. Hágase el cálculo según se indica en la sección 9222B.6. Regístrense las densidades como estreptococos fecales o enterococos por 100 ml.

9-130

5.

Pruebas de verificación

Tómense colonias típicas de una membrana y siémbrense para aislamiento en la superficie de una placa con agar infusión de encéfalo corazón. Incúbense a 35 ± 0,5 °C durante 24-48 horas. Transfiérase un asa de una colonia bien aislada en el medio de agar infusión de encéfalo corazón al medio líquido de infusión de encéfalo corazón y a dos portas limpios. Incúbese el medio líquido a 35 ± 0,5 °C durante 24 horas. Añádanse unas gotas de peróxido de hidrógeno al 3 por 100 recién preparado a la extensión de uno de los portas. La aparición de burbujas constituye una prueba de catalasa positiva e indica que la colonia no pertenece al grupo de los estreptococos fecales. Si la prueba de catalasa es negativa, es decir, si no aparecen burbujas, se hace una tinción de Gram del segundo porta. Los estreptococos fecales y los enterococos son células ovoides grampositivas de 0,5-1,0 µm de diámetro que se disponen en su mayoría en pares o en cadenas cortas. Transfiérase un asa del crecimiento de cada tubo de medio líquido de infusión de encéfalo-corazón a cada uno de los siguientes medios: agar bilis esculina (incubación a 35 ± 0,5 °C durante 48 horas), medio líquido de infusión de encéfalo-corazón (incubación a 45 ± 0,5 °C durante 48 horas) y medio líquido de infusión de encéfalo-corazón más NaCl al 6,5 por 100 (incubación a 35 ± 0,5 °C durante 48 horas). El crecimiento de cocos catalasa negativos y grampositivos en agar bilis esculina o en medio líquido de infusión de encéfalo corazón a 45 °C es la prueba de que las colonias son del grupo de los estreptococos fecales. El crecimiento a 45 °C y en el medio con NaCl indica que las colonias pertenecen al grupo de los enterococos.

MÉTODOS NORMALIZADOS

6. Verificación serológica de los estreptococos fecales del grupo D

Una prueba alternativa de comprobación para los estreptococos del grupo D es el método de precipitación de Lancefield4. Esta prueba es sumamente específica para S. faecalis, S. faecium, S. avium, S. gallinarum, S. bovis y S. equinus. a) Preparación del antígeno: Tómese una sola colonia típica del filtro de membrana y se siembra para aislamiento en agar infusión de encéfalo-corazón o en placas de agar sangre. Tómese una colonia bien aislada e inocúlese en 30-50 ml de medio líquido de Todd-Hewitt5. Incúbese a 35 °C durante 24 horas en condiciones de aerobiosis. Concéntrese la suspensión bacteriana por centrifugación (3.000 x g durante 5 minutos). Deséchese el sobrenadante y vuélvanse a suspender las células en 0,5 ml de solución salina. Esta suspensión se pasa por el autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Se centrifugan las bacterias y se decanta el sobrenadante que contiene los antígenos de grupo. b) Prueba de precipitina capilar: Existen en el mercado antisueros específicos para esta prueba. Introdúzcase en el antisuero un tubo capilar de 1,2-1,5 mm de DE y extráigase alrededor de 1 cm de suero. Colóquese un dedo en el extremo superior del tubo para que el aire no expulse el líquido y deséchese con cuidado el exceso de antisuero. Introdúzcase el tubo en la solución de extracto de antígeno estreptocócico y tómese un volumen igual de antígeno. Tírese con cuidado el exceso de extracto. Colóquese un dedo sobre el extremo superior del tubo e introdúzcase el extremo inferior en plasticina para cerrarlo. Inviértase el tubo y colóquese en un surco de plasticina de una gradilla para tubos capilares. La prueba positiva para el antígeno del grupo D se caracteriza por un preci-

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EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

pitado blanco que aparece a los 15 minutos en la interfase antígeno-antisuero y que suele durar unos 5 minutos. Si a los 30 minutos no se ha producido reacción alguna, la prueba es negativa. El examen de los tubos es más efectivo cuando se hace con luz brillante y contra un fondo oscuro. La verificación serológica de los estreptococos del grupo D también puede hacerse mediante pruebas comerciales de aglutinación*. Las pruebas de aglutinación sobre porta son sencillas y parecen fiables. Los estreptococos del grupo D se comprueban directamente a partir de las colonias aisladas en el filtro de membrana o en los tubos de cultivo con medio líquido. Para verificar los cultivos de enterococos presuntivos, se hará también una prueba de tolerancia a la sal (crecimiento en un medio líquido con NaCl al 6,5 por 100). 7. Identificación de las especies individuales de estreptococos fecales y de enterococos

La tabla 9230:I muestra algunas de las reacciones bioquímicas fundamentales para identificar los estreptococos fecales, los enterococos y las especies de cada uno de estos dos grupos. * Phadebact Strep D test, Pharmacia Diagnostics, Piscataway, Nueva Jersey, y Streptex Test, BurroughsWellcome Co., Research Triangle Parle, Carolina del Norte.

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9.

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9-132

MÉTODOS NORMALIZADOS

TABLA 9230:I. ALGUNAS CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS CLAVE DE LAS ESPECIES DE ESTREPTOCOCOS PERTENECIENTES A LOS GRUPOS DE ESTREPTOCOCOS FECALES Y ENTEROCOCOS*

9240

IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS DEL HIERRO Y DEL AZUFRE* 9240 A.

El grupo de los nocivos microorganismos llamados colectivamente «bacterias del hierro y el azufre» no es homogéneo desde los puntos de vista morfológico y fisiológico, pero puede caracterizarse por su capacidad para transformar o depositar cantidades significativas de hierro o azufre, en general en forma de cienos. Sin * Aprobado por el Standard Methods Committee, 1988.

Introducción embargo, las bacterias del hierro y el azufre no son las únicas productoras de cienos bacterianos. Los microorganismos de este grupo se pueden clasificar en filamentosos o unicelulares, autótrofos y heterótrofos, aerobios o anaerobios. En función de la clasificación bacteriana convencional, se incluyen en diversas órdenes, familias y géneros. Se estudian como «bacterias del hierro y el azufre» dada la eventual im-

9-133

EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

portancia de estos elementos y sus transformaciones en el tratamiento del agua y en los sistemas de distribución, y resultan especialmente molestos en aguas de uso industrial, como las destinadas a enfriamiento o ebullición. Las bacterias del hierro pueden provocar suciedad y cegamiento de los pozos y sistemas de distribución, y las reductoras de los sulfatos pueden dar lugar a aguas herrumbrosas o tuberculación de las conducciones. Estos organismos pueden provocar además malos olores y sabores, espumas, coloraciones y aumentos en la turbidez de las aguas. El aporte nutritivo de las bacterias del hierro y el azufre puede ser total o parcialmente inorgánico, y es extraído por éstas, si se encuentran en un sustrato ge-

9240 B. 1.

latinoso, del agua corriente donde se encuentra a baja concentración. Este hecho es particularmente importante en el caso de determinadas bacterias del azufre que utilizan pequeñas cantidades de sulfuro de hidrógeno, o en el caso de microorganismos como Gallionella, que obtienen su energía de la oxidación del hierro ferroso. Thiobacillus ferrooxidans y Ferrobacillus ferrooxidans, que contribuyen al problema del drenaje ácido de las minas, pueden identificarse mediante pruebas de transformación del hierro ferroso en férrico o por la oxidación de los compuestos sulfurosos reducidos. El crecimiento de estos organismos depende también de la temperatura, la luz, el pH y el aporte de oxígeno. En condiciones ambientales algunas bacterias pueden aparecer como bacterias del hierro o del azufre.

Bacterias del hierro

Características generales

Se considera que las «bacterias del hierro» son capaces de metabolizar el hierro reducido existente en el habitat acuoso y depositarlo en forma de óxido férrico hidratado sobre o en sus secreciones mucilaginosas. Las bacterias que utilizan el manganeso desarrollan un mecanismo en cierto modo similar. La gran cantidad de cieno pardo así producido confiere un tinte rojizo y un desagradable olor al agua potable, pudiendo hacer que el suministro no sea adecuado para consumo doméstico o industrial. Las bacterias de este tipo obtienen su energía de la oxidación del hierro desde la forma ferrosa a la férrica, que es precipitada como hidróxido férrico (FeOH3). El hierro puede proceder de la tubería propiamente dicha o directamente del agua. La cantidad de hidróxido férrico depositado es muy

grande en comparación con el número de células que lo producen. Algunas bacterias, no obstante no oxidar el hierro ferroso, pueden provocar su disolución o depósito de manera indirecta. En su crecimiento liberan hierro a través de la utilización de radicales orgánicos a los que está unido el metal o alteran las condiciones ambientales y permiten la disolución o el depósito del hierro. En consecuencia, se produce menos hidróxido férrico, lo que no siempre evita la creación de mal olor y sabor y el ensuciamiento del agua. 2. Toma de muestras e identificación

La identificación de estas molestas bacterias suele hacerse mediante el estudio microscópico del material suspendido. Se estudiarán directamente los restos

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masivos activados, las masas de crecimiento microbiano en lagos, ríos y corrientes, y los cienos en las aguas de las torres de refrigeración. La sospecha de la existencia de un desarrollo de bacterias del hierro en aguas de pozos o en sistemas de distribución puede hacer necesarios esfuerzos especiales a fin de asegurarse de que las muestras recogidas son adecuadas para su identificación. El intenso y continuado depósito de hierro causado por la oxidación del hierro ferroso por el aire o por otras condiciones ambientales enmascara a menudo las vainas que forman las bacterias del hierro. Las células de los filamentos suelen morir y desintegrarse y éstos tienden a fragmentarse o ser aplastados por la masa del hierro precipitado. Déjese en reposo o centrifúguese el agua recogida directamente de los pozos para estudiar microscópicamente el sedimento. Colóquese una porción de éste en un portaobjetos, cúbrase con un cubreobjetos y examínese con un microscopio de pocos aumentos buscando filamentos como tales o filamentos incrustados de hierro. El material atrapado por los filtros colocados delante de las válvulas retrógradas suele ofrecer excelentes especímenes de bacterias del hierro. El agua bombeada de pozos puede filtrarse a través de un filtro de membrana de 0,45 µm y estudiar después microscópicamente el filtro, una vez seco y aplicando directamente aceite de inmersión a la membrana. Los microscopios de contraste de fase han hecho posible el estudio del material de cultivo sin teñir. Utilícese tinta china o lactofenol azul para la tinción cuando se recurre a un microscopio óptico normal. Para disolver los depósitos de hierro, sitúense varias gotas de NCl 1N en un borde del cubreobjetos y déjese que drene bajo él, aplicando un papel de filtro en el otro extremo. También pueden utilizarse compuestos reductores como el ascorbato de sodio para disolver los depósitos y facilitar la observación de la

MÉTODOS NORMALIZADOS

Figura 9240:1. Filamentos de Crenothrix polyspora que muestran variaciones en el tamaño y forma de las células dentro de la vaina. Obsérvese especialmente la presencia de múltiples pequeñas células redondas o «conidias», que se aprecia en uno de los filamentos. Esta característica distintiva es la causa del nombre polyspora. Las colonias jóvenes en desarrollo no suelen mostrar incrustaciones de hierro o manganeso. Las más viejas presentan a menudo vainas vacías con grandes incrustaciones. El tamaño de las células puede ser muy variable: las que tienen forma de bastón suelen medir 1,2 a 2,0 µm de espesor por 2,4 a 5,6 µm de longitud; las células cocáceas de las «conidias» miden como promedio 0,6 µm de diámetro.

EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

9-135

Figura 9240:3. Cultivo de laboratorio de Gallionella ferruginea, que muestra células, tallos y ramificaciones de los tallos en la zona de división de las células. Con frecuencia, la precipitación del hierro inorgánico sobre los tallos y a su alrededor oscurece el perfil de los mismos. Las células de las puntas de los tallos miden como promedio 0,4 a 0,6 µm de espesor y 0,7 a 1,1 µm de longitud.

Figura 9240:2. Filamentos de Sphaerotilus natans, que muestran células contenidas en los filamentos y algunas células «pululantes». Los filamentos presentan falsas ramificaciones y zonas desprovistas de células. Las distintas células del interior de la vaina pueden presentar tamaños variables, con promedios de 0,6 a 2,4 µm de espesor por 1,0 a 12,0 µm de longitud; casi todas las cepas miden 1,1 a 1,6 µm de espesor por 2,0 a 4,0 µm de longitud.

estructura celular. Para comprobar que el material es hierro, añádase una solución de ferrocianuro de potasio a la muestra en el porta, cúbrase y hágase drenar HCl 1N bajo el cubreobjetos. Se formará un precipitado de color azul de Prusia a medida que se disuelva el hierro existente alrededor de las células o los filamentos. Los microorganismos se identifican por comparación con los dibujos o fotografías disponibles de bacterias del hierro1-14. En las figuras 9240:1 a 9240:5 se ofrecen algunos ejemplos.

9-136

Figura 9240:4. Mezcla de fragmentos de tallos de Gallionella ferruginosa y precipitado de hierro-manganeso inorgánico que se encuentra en las muestras naturales tomadas de pozos. Los tallos fragmentados muestran un color amarillo dorado a naranja cuando se estudian con el microscopio.

MÉTODOS NORMALIZADOS

Figura 9240:5. Célula única de la bacteria del hierro Siderocapsa treubii. Las células están rodeadas por un depósito de hidrato férrico. Cada una de ellas mide como promedio 0,4 a 1,5 µm de espesor por 0,8 a 2,5 µm de longitud.

7. 8.

3. 1.

2. 3. 4. 5.

6.

Referencias LUESCHOW , L. A. & K. M. M ACKENTHUN . 1962. Detection and enumeration of iron bacteria in municipal water supplies. J. Amer. Water Works Assoc. 54:751. S TARKEY , R. L. 1945. Transformations of iron by bacteria water. J. Amer. Water Works Assoc. 37:963. STORES, J. L. 1954. Studies on the filamentous sheathed iron bacterium Sphaerotilus natans. J. Bacterial. 67:278. KUCERA, S. & R. S. WOLFE. 1957. A selective enrichment method for Gallionella ferruginea. J. Bacteriol. 74:344. WAITHZ, S. & J. B. LACKEY.1958. Morphological and biochemical studies on the organism Sphaerotilus natans. Quart. J. Fia. Acad. Sci. 21:335. WOLFE, R. S. 1958. Cultivation, morphology, and classification of the iron bacteria. J. Amer. Water Works Assoc. 50:1241.

9.

10.

11. 12.

13. 14.

WOLFE , R. S. 1960. Observations and studies of Crenothrix polyspora. J. Amer. Water Works Assoc. 52:915. WOLFE, R. S. 1960. Microbial concentration of iron and manganese in water with low concentrations of these elements. J. Amer. Water Works Assoc. 52:1335. D ONDERO , N. C, R. A. P HILIPS & H. H EU KELEKIAN. 1961. Isolation and preservation of cultures of Sphaerotilus. Appl. Microbiol. 9:219. M ULDER , E. G. 1964. Iron bacteria, particularly those of the Sphaerotilus- Leptothrix group, and industrial problems. J. Appl. Bacteriol. 27:151. DRAKE , C. H. 1965. Occurrence of Siderocapsa treubii in certain waters of the Niederrhein. Gewasser Abwasser 39/40:41. B UCHANAN , R. E. & N. E. G IBBONS , eds. 1974. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8.a ed. Williams & Wilkins, Baltimore, Maryland. E DMONDSON , W. T., ed. 1959. Ward & Whipple's Fresh Water Biology, 2.a ed. John Wiley & Sons, Nueva York. S KERMAN , V. B. D. 1967. A Guide to the Identification of the Genera of Bacteria, 2. a ed. Williams & Wilkins, Baltimore, Maryland.

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EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

9240 C. 1.

Bacterias del azufre

Características generales

Las bacterias que oxidan o reducen cantidades significativas de compuestos orgánicos de azufre presentan una amplia variedad de características morfológicas y bioquímicas. Un primer grupo, constituido por bacterias reductoras de los sulfatos, está formado por organismos unicelulares anaerobios que reducen el sulfato, SO 2-4 , a sulfuro de hidrógeno H2S. Un segundo grupo, bacterias verdes y púrpuras fotosintéticas, se constituye de especies anaerobias en la luz que utilizan el H2S como donante de hidrógeno para la fotosíntesis. El azufre es oxidado desde sulfuro a sulfato. Un tercer grupo, formado por oxidantes aerobios del azufre, agrupa bacterias que oxidan el azufre reducido de manera aerobia para obtener la energía necesaria para su crecimiento químico autótrofo. Las bacterias del azufre más importantes en las aguas limpias y residuales son las reductoras del azufre, entre las que se encuentra Desulfovibrio, y los microorganismos aerobios unicelulares que oxidan el azufre del género Thiobacillus. Las bacterias reductoras del sulfato contribuyen en gran medida a las tuberculaciones y la corrosión galvánica de las conducciones de agua, y al gusto y olor desagradable de las aguas. Thiobacillus, por su producción de ácido sulfúrico, ha contribuido a la destrucción de alcantarillas de hormigón y a la corrosión acida de metales. 2.

Toma de muestras e identificación

La identificación de estas desagradables bacterias del azufre se hace normalmente mediante un estudio microscópico del material sospechoso. Se examinan directamente las muestras de cienos suspendidos en las aguas, las rascaduras de

las superficies expuestas o los sedimentos. Microscópicamente, pueden reconocerse tres grupos de bacterias del azufre: las bacterias verdes y púrpuras del azufre, las bacterias del azufre que se agrupan en largos e incoloros filamentos y las bacterias no filamentosas. El cuarto grupo, formado por bacterias reductoras del sulfato y oxidantes del azufre pertenecientes al género Thiobacillus, no puede identificarse únicamente por su morfología. a) Bacterias del azufre verdes y púrpuras: 1) Las bacterias verdes del azufre

Figura 9240:6. Bacterias del azufre purpúreas fotosintéticas: las grandes masas de células muestran un color pardo anaranjado o purpúreo. A veces tienen aspecto de tiza si contienen abundante azufre en su interior. Izquierda: células de Chromatium okenii (5,0 a 6,5 µm de espesor por 8 a 15 µm de longitud) con gránulos de azufre. Derecha: Thiospiríllum jenense (3,5 a 4,5 µm de espesor por 40 µm de longitud); la célula contiene gránulos de azufre y puede verse un flagelo polar.

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Figura 9240:7. Bacterias del azufre filamentosas incoloras: Beggiatoa alba tricomas, con gránulos de azufre. Los filamentos están compuestos por hileras de células cilíndricas individuales que pueden verse si la luz no se refleja en los gránulos de azufre. Las tricomas tienen de 2 a 15 µm de diámetro y pueden llegar a tener hasta 1.500 µm de longitud; cada una de las células, si se ven, tiene 4,0 a 16 µm de longitud.

aparecen principalmente en las aguas que contienen H2S. Son pequeñas, ovoides o alargadas, no móviles y, en general, de menos de 1 µm de diámetro, con un color amarillento verdoso cuando se reú-

MÉTODOS NORMALIZADOS

Figura 9240:8. Bacterias de azufre filamentosas incoloras: parte de una colonia de Thiodendron mucosum, mostrando ramificaciones del filamento mucoide. Las células (cada una de ellas de 1,0 a 2,5 µm de espesor por 3 a 9 µm de longitud) se encuentran en el interior del material gelatinoso de los filamentos. El eje mayor de las mismas es paralelo al eje mayor de los filamentos.

nen en masas. Raramente, o nunca, se depositan gránulos de azufre en ellas. 2) Las bacterias púrpuras del azufre (figura 9240:6) aparecen en aguas contaminadas con H2S. Son grandes, generalmente llenas de glóbulos de azufre, y suelen estar tan pigmentadas que cada una de las células presenta color rojo. A simple vista, es fácil detectar las grandes, densas e intensamente coloreadas masas de bacterias. b) Bacterias filamentosas e incoloras: Las bacterias filamentosas e incoloras del azufre (figuras 9240:7 y 9240:8) se encuentran en aguas que contienen tanto

EXAMEN MICROBIOLOGICO DE LAS AGUAS

Figura 9240:9. Bacterias del azufre incoloras no filamentosas: célula de Thiovolum majus en división, con granulos de azufre. Estas células pueden llegar a medir 9 a 17 µm de espesor por 11 a 18 µm de longitud y suelen encontrarse en los litorales marinos ricos en materia orgánica y sulfuro de hidrógeno.

oxígeno como H2S. Pueden formar películas de aspecto ligeramente blanco amarillento, debido al depósito de glóbulos de azufre internos. En general, son grandes y eventualmente mótiles, con un movimiento de deslizamiento característico. Se identifican comparándolas con las imágenes fotográficas existentes1-3. c) Bacterias del azufre incoloras y no filamentosas: Las bacterias del azufre incoloras y no filamentosas (véase, por

9-139

ejemplo, la figura 9240:9) suelen asociarse a algas en descomposición. Extraordinariamente móviles, de forma ovoide o alargada, con glóbulos de azufre y posiblemente depósitos de carbonato de calcio. En general, de gran tamaño. d) Bacterias del azufre incoloras pequeñas y bacterias reductoras del sulfato: Las pequeñas bacterias aisladas del género Thiobacillus y las bacterias reductoras del sulfato como Desulfovibrio no pueden ser identificadas mediante estudio microscópico directo. Los tipos de Thiobacillus son pequeños, incoloros, móviles y alargados, y se encuentran en ambientes en los que existe H2S. No tienen glóbulos de azufre. La identificación de los tipos de Thiobacillus, Desulfovibrio o de otras bacterias reductoras de sulfatos se hará por métodos fisiológicos. 3.

Referencias

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9240 D. Enumeración, enriquecimiento y aislamiento de las bacterias del hierro y el azufre (PROPUESTA) No existen métodos válidos de cuantificación de las bacterias del hierro y azufre que no sean las reductoras de los sulfatos y los tiobacilos. Es difícil el cultivo y aislamiento de los cultivos puros en laboratorio, así como incierto conseguir un aislamiento satisfactorio, lo que es especialmente cierto en bacterias filamentosas procedentes de los lodos activados

y otras fuentes asiento de varios tipos bacterianos. 1. Medios a) Medio líquido de casitona-glicerina-autolisado de levadura (CGL): Este medio puede no estar disponible en for-

9-140

MÉTODOS NORMALIZADOS

ma deshidratada, por lo que habrá que prepararlo a partir de sus ingredientes básicos. Puede solidificarse añadiendo agar al 1,5 por 100.

b) Medio de aislamiento (bacterias del hierro): Este medio puede no estar disponible en forma deshidratada, por lo que habrá que prepararlo a partir de sus ingredientes básicos.

Prepárese y esterilícese el medio sin cianocobalamina. Aparte, esterilícese ésta por filtración y añádase en condiciones asépticas inmediatamente antes de que el medio solidifique. e) Medio oxidante del hierro (Thiobacillus ferrooxidans): Este medio puede no estar disponible en forma deshidratada, por lo que habrá que prepararlo a partir de sus ingredientes básicos.

c) Medio de mantenimiento (SCY) (bacterias de hierro): Este medio puede no estar disponible en forma deshidratada y requerir su preparación a partir de los ingredientes básicos.

d) Agar Mn: Este medio puede no estar disponible en forma deshidratada, por lo que habrá que prepararlo a partir de sus ingredientes básicos.

Esterilícense por separado las sales básales y la fuente de energía y combínense cuando se hayan enfriado. Consérvese en el frigorífico y deséchese después de 2 semanas. En el medio se formará un precipitado opalescente y verde. El pH debe ser de 3,0 a 3,6. f) Agar sulfuro ferroso (Gallionella ferruginea): Este medio puede no encontrarse disponible en forma deshidratada, por lo que habrá que prepararlo a partir de sus ingredientes básicos.

EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

9-141

Capa de agar:

Prepárese el FeS haciendo reaccionar cantidades molares iguales de Na2S y de Fe(NH4)2(SO4)2 en agua destilada hirviendo. Déjese precipitar a partir de la solución caliente en un botella completamente llena y tapada. Lávese cuatro veces el precipitado, decantando el sobrenadante y sustituyéndolo por agua hirviendo. Consérvese en una botella de vidrio cerrada y completamente llena con agua destilada hirviendo adicional. Añádanse iguales volúmenes de FeS y de agar al 3 por 100 a 45 °C. Prepárense pendientes en tubos de tapón de rosca. Prepárese la capa superficial líquida haciendo burbujear CO2 por ella durante 10-15 segundos y añádanse varios milímetros a las pendientes de agar. Una variación del medio básico requiere la adición de 0,5 ml de formol (solución de formaldehído al 40 por 100) a la botella de dilución con tapón de rosca que contenga 10 ml de agar FeS y 100 ml de sobrenadante líquido. Añádanse al líquido púrpura bromocresol al 0,004 por 100 y azul bromotimol al 0,01 por 100. g) Medio reductor del sulfato: Este medio puede no estar disponible en forma deshidratada, por lo que habrá que prepararlo a partir de sus ingredientes básicos.

El pH debe ser 7,5 ± 0,3 después de la esterilización. Prepárese el medio excluyendo el sulfato ferroso y el ascorbato de sodio, divídase en tubos de ensayo con tapón de rosca y esterilícese. Para utilizarlo, los tubos han de estar llenos por completo; por tanto, se esteriliza en un matraz una porción adicional de medio que se añadirá a los tubos hasta acabar de llenarlos. En el día que se vayan a utilizar, prepárense por separado las soluciones del sulfato ferroso y de amonio (3,92 g/l00 ml) y de ascorbato de sodio (1,00 g/l00 ml), esterilícense por filtración a través de un filtro de membrana de 0,45 µm y añádase 0,1 ml de cada solución/l0 ml de medio basal de manera aséptica. h) Medio reductor de sulfato (Thiobacillus thioparus): Este medio puede no estar disponible en forma deshidratada, por lo que habrá que prepararlo a partir de sus ingredientes básicos.

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El pH debe ser 7,8 después de la esterilización. Esterilícense por separado el Na2S2O3 y el (NH4)2SO4 y añádanse antes de usarlos. i) Medio de azufre (Thiobacillus thiooxidans): Este medio puede no estar disponible en forma deshidratada, por lo que habrá que prepararlo a partir de sus ingredientes básicos.

El pH debe ser de 4,8 después de la esterilización. Pésese el azufre en matraces de 250 ml utilizando 1 g/matraz. Añádanse 100 ml de medio a cada matraz y esterilícese con vapor intermitente (30 minutos cada día durante 3 consecutivos). 2.

Bacterias del hierro

a) Sphaerotilus-Leptothrix: 1) Las bacterias del hierro, sobre todo las del grupo Sphaerotilus-Leptothrix, viven en un medio demasiado diluido que no permite la proliferación de otras bacterias de crecimiento más rápido. Existe un medio1 parcialmente selectivo para Sphaerotilus (agua de dilución BOD complementada con 100 mg/l de lactato de sodio). Colóquense 50 ml de este medio en botellas cuadradas francesas y pásense por el autoclave a 69 kPa durante 15 minutos. Para inocular la muestra, añádanse 25 ml de vapor de agua o 1,5 y 10 ml de aguas residuales asentadas o soluciones de proceso para duplicar las

MÉTODOS NORMALIZADOS

botellas de medio. Incúbese entre 22 y 25 °C durante 5 días y obsérvense las formas filamentosas. Si se toma un filamento del medio BOD lactato y se siembra en agar extracto de carne al 0,05 por 100, puede hacerse un aislamiento de cultivo puro. Tras una incubación de 24 horas a 25 °C, tómense los típicos filamentos con ayuda de un microscopio de disección y pásense a un medio líquido de casitona-glicerina-autolisado de levadura (CGL). Si aparece una película sin turbidez por debajo al cabo de 2 a 3 días, pásese un filamento a una pendiente de agar CGL e incúbese a 25 °C hasta observar un crecimiento visible. Guárdese en frigorífico. Existe una guía detallada para la identificación de los microorganismos filamentosos en mezclas complejas como aguas residuales y fangos activados2. 2) Los medios de aislamiento y mantenimiento han resultado muy satisfactorios para la identificación de diversos grupos de microorganismos filamentosos, entre los que se encuentran las bacterias del hierro 3 . Prepárense con estos medios pendientes de agar y llévense asépticamente con la pipeta 3 ml de agua corriente estéril sobre la superficie de las pendientes. Inocúlense los tubos e incúbense a temperatura ambiente hasta que se observe turbidez en la capa líquida. Las células permanecen viables durante 3 meses en el frigorífico. 3) Otro buen medio de mantenimiento para el cultivo del grupo Sphaerotilus es el CGL4. 4) Puede distinguirse Leptothrix (Sphaerotilus discophorus) de Sphaerotilus natans gracias a su capacidad para oxidar el ion manganoso. Utilícese agar Mn como medio diferencial5. b) Thiobacillus ferrooxidans: Aunque este microorganismo es también una bacteria oxidante del azufre6-7, su importancia fundamental se encuentra en el drenaje de minas acidas. Existe un medio con el que puede hacerse un cálculo del

9-143

EXAMEN MICROBIOLÚGICO DE LAS AGUAS

NMP8. Durante la esterilización se produce cierta oxidación del hierro, pero la pérdida del hierro ferroso es inapreciable. El medio tiene un precipitado (probablemente fosfatos ferrosos y férricos) opalescente y verde, un pH de 3,0 a 3,6 y contiene 9.000 mg/l de ion ferroso. El crecimiento de la bacteria se manifiesta por el descenso del pH y el aumento de la concentración de hierro oxidado. Con la práctica y el uso de controles no inoculados, puede observarse un aumento del color pardo-naranja oscuro en los tubos o en los matraces positivos en comparación con los negativos. Agítense a diario los tubos de dilución, ya que se trata de microorganismos sumamente aerobios. c) Gallionella ferruginea: Para cultivar este microorganismo utilícese agar sulfuro ferroso9, 10. Inocúlense los tubos con una gota de suspensión de un depósito sospechoso de contener Gallionella. En general, se produce crecimiento a temperatura ambiente al cabo de 18-36 horas, que aparece como un depósito blanco sobre los lados del tubo. Un anillo de colonias a un determinado nivel refleja un equilibrio entre la difusión hacia arriba de los iones ferrosos y hacia abajo de las moléculas de oxígeno. Añádase formol al agar sulfuro ferroso si se trata de aislar cultivos puros11. d) Otras bacterias del hierro: Se ha aislado un Metallogenium tolerante al ácido (pH 3,5 a 5,0), filamentoso y oxidante del hierro con un medio que contiene un 1 por 100 de (NH 4 ) 2 SO 4 , un 0,01 por 100 de CaCO3, un 0,02 por 100 de MgSO4, un 0,001 por 100 de K2HPO4, un 0,4 por 100 de ftalato ácido de potasio y 250 mg/l de hierro ferroso procedente de una solución acidificada de FeSO4 · 7H2O. Añádase un 0,4 por 100 de formol a 100 ml de medio en un erlenmeyer de 250 ml12. Para las bacterias heterótrofas precipitantes de hierro13, utilícese un medio de citrato férrico y de amonio que consiste

en: 0,5 g/l de (NH4)2SO4, 0,5 g/l de NaNO3, 0,5 g/l de K2HPO4, 0,5 g/l de MgSO4 · 7H2O y 10,0 g/l de citrato férrico y de amonio. Ajústese el pH a 6,6-6,8 y esterilícese. Para solidificar el medio, añádanse 15 g/l de agar. También pueden hacerse crecer las bacterias del hierro en 20 ml de un medio líquido combinado con 10 ml de agua natural o de inoculo y 3 g de óxido de hierro. Incúbese a 25 °C durante 48-72 horas en un agitador con acción de muñeca para conseguir un crecimiento visible y adecuado.

3.

Bacterias del azufre

a) Bacterias reductoras del sulfato: 1) Para cuantificar las bacterias reductoras de sulfato como Desulfovibrio utilícese un medio reductor de sulfato14. Inocúlense los tubos y llénense por completo con un medio estéril para crear condiciones anaerobias. Con fines comparativos, incúbense uno o dos controles no inoculados por cada grupo de tubos inoculados. Para volúmenes de muestra superiores a 10 ml, pásese la muestra por un filtro de membrana de 0,45 µm y coloquese el filtro en un tubo de tapón de rosca con medio. Si existen bacterias reductoras del sulfato, los tubos se ennegrecerán en un período de 4-21 días a 20-30 °C. 2) Existe un medio de agar adecuado para el crecimiento y cuantificación de las bacterias reductoras del sulfato 15, consistente en agar tripticasa soja al 4,0 por 100 suplementado con agar adicional al 0,5 por 100, al que se añaden lactato de sodio al 60 por 100 (0,4 por 100 v/v), sulfato de magnesio hidratado al 0,2 por 100 y sulfato ferroso y de amonio al 0,2 por 100. Ajústese el pH de 7,2 a 7,4 y esterilícese. El medio debe ser claro y exento de precipitados. Inocúlense todas las placas en la hora siguiente, o como

9-144

muy tarde durante las 4 primeras horas después de que el agar solidifique para evitar su saturación con oxígeno. Para impedir la condensación de la humedad sobre las tapas de las placas, sustitúyanse por cubiertas estériles absorbentes hasta 10 a 15 minutos después de que el agar solidifique. Colóquense las placas sin invertir en el desecador o en jarras de Brewer y sustitúyase la atmósfera por hidrógeno o nitrógeno mediante evacuaciones sucesivas y sustituciones del gas. Incúbese a temperatura ambiente (21 a 24 °C) o a 28-30 °C, temperatura óptima para estos microorganismos. El crecimiento y ennegrecimiento alrededor de las colonias es típico de las bacterias reductoras de sulfato y puede aparecer en cualquier momento entre 2 y 21 días, aunque normalmente entre los 2 y 7 días. 3) Se han evaluado diferentes medios adecuados para la cuantificación de distintas especies de bacterias reductoras del sulfato16, 17. b) Bacterias del azufre fotosintéticas verdes y púrpuras: Al ser estos microorganismos tan especializados y rara vez causantes de problemas en los procesos de tratamiento de las aguas limpias y residuales, no se incluyen aquí métodos para su aislamiento y cuantificación. Existe una excelente revisión publicada a este respecto18. c) Thiobacillus spp.: Se han estudiado cuidadosamente el crecimiento y la fisiología de las distintas especies de bacterias no agrupadas oxidantes del azufre del género Thiobacillus19, 20. En la sección 9240D.1 se enumeran los medios21 adecuados para la cuantificación de Thiobacillus thioparus y Thiobacillus thiooxidans por una técnica del NMP. Inocúlese el medio e incúbese durante 4-5 días a 25-30 °C. El crecimiento de los tiobacilos produce azufre elemental que se deposita en el fondo, con el consiguiente descenso del pH y de la turbidez del

MÉTODOS NORMALIZADOS

medio. Para confirmar la presencia de Thiobacillus son necesarios los análisis de formación de sulfatos. d) Beggiatoa: Los métodos para el enriquecimiento y aislamiento de Beggiatoa dependen del uso del extracto de heno22. Hágase un extracto de heno seco a 100 °C en grandes volúmenes de agua, cambiándolo tres veces durante la extracción. El agua final presenta color ámbar. Tras drenar el heno, séquese en bandejas a 37 °C. Prepárese un medio de enriquecimiento haciendo una suspensión de 8 g del heno extraído y secado en 1 l de agua corriente; divídase en porciones de 70 ml que se colocan en matraces erlenmeyer de 125 ml para esterilizarlas en el autoclave. Inocúlense porciones de 5 ml de barro con material de plantas en degradación procedentes de pequeñas charcas, lagos y corrientes e incúbese a temperatura ambiente. Si el enriquecimiento ha sido satisfactorio, se apreciará un fuerte olor a H2S en el matraz y aparecerá el crecimiento de Beggiatoa al cabo de 10 días, en forma de una película blanca sobre la superficie del medio y parte superior de las paredes sumergidas del matraz. Para aislar al microorganismo, lávense varias veces las porciones de esta película blanca superficial en agua estéril, colóquense sobre la superficie de placas de agar (1 por 100 de agar y 0,2 por 100 de extracto de buey) e incúbense a 28 °C. De estas placas, en las que los filamentos emigran a la periferia de la superficie del agar y lejos de los contaminantes, se cortan bloques de agar que contengan filamentos únicos y separados de Beggiatoa y se colocan, boca abajo, en placas frescas con el mismo medio. Incúbense de nuevo a 28 °C y repítase el proceso de aislamiento una vez que el crecimiento ha progresado hasta el punto de que se encuentran filamentos únicos separados. También se ha descrito un medio inorgánico para Beggiatoa23.

9-145

EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

4.

Referencias 11.

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9-146

MÉTODOS NORMALIZADOS

9250

DETECCIÓN DE ACTINOMICETOS* 9250 A.

1.

Introducción

Discusión general

Los olores a tierra mohosa afectan a la calidad y a la aceptación pública de los suministros municipales de agua en muchas partes del mundo. Se encuentran entre los olores naturales más difíciles de eliminar por tratamientos convencionales en las plantas de tratamiento. Ya en 1929, se admitía que estos olores podían atribuirse a metabolitos volátiles formados en el desarrollo normal de los actinomicetos1. Dos de estos compuestos, la geosmina y el 2-metilisoborneol, han sido aislados e identificados2-8 como agentes responsables de los problemas de olor a tierra mohosa en la superficie de agua8-10. Sin embargo, ambos son producidos también por algunas algas filamentosas azul-verdosas11-15. La geosmina y el 2-metilisoborneol tienen concentraciones de olor mínimas muy inferiores al microgramo por litro. Por tanto, son suficientes cantidades residuales de ambos productos para conferir un olor desagradable al agua o un sabor de moho al pescado. En las áreas en las que este problema aparece de forma periódica, es prudente establecer una cuantificación de actinomicetos. Otro medio para valorar la calidad del agua potable puede ser la identificación de la abundancia relativa de actinomicetos. Los métodos aquí descritos están bien establecidos y se han utilizado de manera satisfactoria para el aislamiento y cuantificación de los actinomicetos relacionados con los suministros de agua pública16, 17. También se ha comprobado que estos organismos producen alteraciones en el trata* Aprobado por el Standard Methods Committee, 1988.

miento de las aguas residuales y crecimiento masivos que son capaces de provocar espesas espumas en el procesamiento de los fangos activados18, 19. Entre las propiedades generales de los actinomicetos, destaca especialmente su morfología de tipo fúngico. Aunque en un principio se les consideró como hongos, posteriores estudios revelaron que se trataba en realidad de bacterias filamentosas ramificadas20. Los actinomicetos están representados casi siempre por formas saprofitas que producen un fuerte impacto sobre el ambiente, descomponiendo y transformando una gran variedad de residuos orgánicos complejos. Ampliamente distribuidos en la naturaleza, constituyen una parte considerable de la población de los fangos de los lagos y ríos y de los suelos. La mayoría de los actinomicetos en los que se han identificado geosmina y 2-metilisoborneol pertenecen al género Streptomyces, que se considera como el más probable inductor de problemas importantes en los suministros de agua. 2.

Muestras

a) Recogida: La toma de muestras se realizará conforme a la sección 9060A. b) Almacenamiento: Se estudiarán las muestras lo antes posible después de su recogida. Si no es posible procesarlas rápidamente, se conservarán las muestras de agua a menos de 10 °C. 3. 1.

Referencias ADAMS, B. A. 1929. Cladothrix dichotoma and allied organisms as a cause of an «inde-

EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

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16.

17.

18.

19.

20.

9-148

MÉTODOS NORMALIZADOS

9250 B. 1.

Recuento de placa de actinomicetos

Discusión general

Se ha adaptado a la determinación de la densidad de actinomicetos un método de placa con técnica de agar de doble capa. Como sólo se inocula con la muestra la fina capa superior del medio, predominan las colonias superficiales, lo que facilita su identificación y recuento. 2.

Preparación y dilución

Las muestras se preparan y diluyen según se expone en las secciones 9215 o 9610. Para las aguas naturales la dilución adecuada suele ser de hasta 1:1.000 (10-3), mientras que en el caso de las aguas tratadas el estudio puede ser directo. En muestras de suelo se utilizarán diluciones de 1:1.000 (10-3) a 1:1.000.000 (10-6). 3.

Medio

Agar almidón-caseína:

No es necesario ajustar el pH. Utilícese el medio para preparar las placas de doble capa. Almacénese el de la capa inferior en frascos grandes o en tubos de

15 ml. El de la capa superior se conserva en tubos con 17,0 ml. 4.

Procedimiento

a) Siembra: Prepárense tres placas para cada dilución a analizar. Transfiéranse asépticamente 15 ml de agar almidón-caseína estéril a una placa de Petri y déjese solidificar el agar para que forme la capa inferior. Añádanse a un tubo de ensayo con 17,0 ml de agar almidón-caseína calentado de 45 a 48 °C, 2 ml de la muestra convenientemente diluida y 1 ml de un antibiótico antifúngico, ciclohemida*, preparado con agua destilada (1 mg/ml) y esterilizado en el autoclave durante 15 minutos a 121 °C. Tómense con una pipeta 5 ml del agar inoculado y colóquese la capa inferior endurecida, girándola con suavidad para conseguir una distribución uniforme de la capa superficial. b) Incubación: Inviértase la placa e incúbese a 28 °C hasta que dejen de aparecer colonias nuevas, lo que normalmente requiere de 6 a 7 días. c) Recuento: Las placas adecuadas para hacer el recuento contienen de 30 a 300 colonias. Identifíquense los actinomicetos por el aspecto macroscópico de sus colonias. Si es necesario, verifíquense por estudio al microscopio con 50 a 100 aumentos, tal como muestra la figura 9250:1. A causa de su crecimiento filamentoso, las colonias de actinomicetos presentan un típico borde velloso. En la tabla 9250:I se enumeran las características distintivas que se utilizan de forma habitual para diferenciar los actinomicetos de las demás colonias bacterianas. La

* Actidione®, Upjohn and Company, Kalamazoo, Michigan, o equivalente.

EXAMEN MICROBIOLOGICO DE LAS AGUAS

9-149

Figura 9250:1. Colonias bacterianas: típica colonia tipo comparada con una colonia de actinomicetos tipo, 50 x. Izquierda: una típica colonia bacteriana caracterizada por su aspecto mucoide liso y borde relativamente homogéneo y neto. Derecha: colonia de actinomicetos caracterizada por una masa de filamentos ramificados que proporciona aspecto peludo al borde y por el aspecto polvoriento y mate de las hifas aéreas llenas de esporas. TABLA 9250:I. PROPIEDADES MACROSCÓPICAS GENERALES DE LAS COLONIAS BACTERIANAS EN MEDIO SÓLIDO

9-150

MÉTODOS NORMALIZADOS

cicloheximida inhibe, en general, el crecimiento de los hongos; sin embargo, si aparecen colonias de ellos, pueden reconocerse por su aspecto lanoso. Microscópicamente, los hongos tienen un diámetro celular considerablemente mayor que el de los actinomicetos. 5. Cálculo

Comuníquese la cantidad de actinomicetos por mililitro de agua o gramo de

9260

suelo (peso seco). Si se utilizan tres placas por muestra, el número medio de colonias de todas las placas (número total de colonias/3), por 2, por el recíproco de la dilución (10/l, 100/l, 1.000/l, etc.), es igual al número de colonias de actinomicetos por mililitro de la muestra original. En muestras sólidas o semisólidas hágase la corrección según el contenido en agua y comuníquese en forma de colonias de actinomicetos por gramos de peso seco de la muestra.

DETECCIÓN DE BACTERIAS PATÓGENAS* 9260 A.

1. Discusión general

En suministros de aguas o aguas residuales puede encontrarse una amplia variedad de bacterias entéricas patógenas. Con la progresiva demanda de recursos hidrológicos, es de esperar que aumenten las posibilidades de contaminación por microorganismos entéricos de las aguas superficiales y profundas. Siguen produciéndose brotes epidémicos de enfermedades de transmisión hídrica. Entre las bacterias que se transmiten por las aguas limpias y residuales se encuentran Salmonella, Shigella, Campilobacter, Escherichia coli enteropático, Vibrio cholerae, Leptospira y Yersinia. De descubrimiento reciente, la familia Legionellaceae, aunque no entérica, se encuentra también ampliamente distribuida en el medio hídrico, y se han comunicado brotes epidémicos de neumonía asociados con el * Aprobado por el Standard Methods Committee, I988.

Introducción agua corriente y de transmisión por aerosoles. No se recomienda hacer un estudio habitual de las aguas limpias y residuales en busca de bacterias patógenas. No existe un procedimiento independiente capaz de aislar e identificar todos estos patógenos. Por tanto, los hallazgos negativos de un determinado patógeno se consideran provisionales mientras la metodología utilizada no sea suficientemente sensible como para detectar bajos niveles de estas bacterias. Por ejemplo, las salmonelas son extraordinariamente comunes en el ambiente, pero las técnicas para su aislamiento suponen procedimientos relativamente complicados que superan las posibilidades de muchos de los laboratorios que estudian las aguas. El análisis sistemático de las aguas limpias y residuales para detectar patógenos está limitado por factores como la falta de instalaciones, un personal poco entrenado, insuficiente dedicación del laboratorio, costes elevados y métodos inadecuados. A la vista de todo ello, parece

9-151

EXAMEN MICROBIOLÚGICO DE LAS AGUAS

imponerse la necesidad de llevar a cabo una exhaustiva investigación en este campo, investigación que debe ser estimulada en todas las circunstancias. La prueba de coliformes no siempre es un indicador adecuado de la inocuidad microbiológica del agua1-4. En algunos casos, pueden aislarse microorganismos patógenos en aguas que contienen pocos o ningún coliforme. En las Legionellaceae, al ser no entéricas, no parece razonable esperar su relación con las bacterias fecales. No obstante, el análisis de coliformes ha sido, y continúa siendo, una útil herramienta para valorar la calidad del agua. Los métodos de aislamiento de patógenos que se detallan a continuación se ofrecen como punto de partida para el investigador que desea iniciar un estudio, por ejemplo, para obtener datos básicos sobre el número, tipos y frecuencia de aparición de patógenos en el agua. Como los métodos para patógenos expuestos en las secciones 9260, 9711 (protozoos patógenos) y 9510 (virus entéricos) pueden evolucionar rápidamente, para mantenerse al día de los avances en este campo, sería preciso consultar la li-

9260 B.

teratura actual o acudir a los investigadores que trabajan con los patógenos específicos. 2. 1.

2.

3.

4.

3.

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Procedimientos generales cualitativos de aislamiento e identificación de Salmonella

Los métodos presentados a continuación para el aislamiento de Salmonella en las aguas limpias y residuales no están estandarizados. Pueden, pues, necesitar modificaciones para adaptarlos a condiciones particulares y se recomienda establecer comparaciones entre los métodos. Más que un protocolo específico para la detección de Salmonella en el agua, se ofrece un breve resumen de los métodos apropiados para la recuperación de dichos microorganismos. Los métodos ac-

tualmente utilizados se han empleado en numerosas investigaciones de campo para comprobar la presencia de Salmonella tanto en aguas dulces como saladas. La presencia de esta bacteria en el agua es muy variable; existen limitaciones y variaciones tanto en la sensibilidad como en la selectividad de los procedimientos aceptados para el aislamiento de Salmonella y la detección de los más de 1.700 serotipos del microorganismo actualmente reconocidos. Por tanto, un resultado negativo con cualquiera de estos

9-152

métodos no implica la ausencia de salmonelas ni la de otros patógenos.

1. Técnicas de concentración

En general, es necesario examinar una muestra relativamente grande de microorganismos patógenos aislados, que suelen existir en números escasos en comparación con los coliformes, ya que su esporádica aparición está relacionada con la incidencia de enfermedades o infecciones en un período determinado. a) Técnica de la torunda: Prepárense torundas a partir de una estopilla de 23 cm de ancho, doblada cinco veces en una longitud de 36 cm, y córtese a lo largo desde unos 10 cm de un extremo en tiras de alrededor de 4,5 cm de ancho. Asegúrese envolviendo el extremo no cortado o doblado de cada torunda con un alambre de calibre 16 de forma que pueda suspenderse la torunda en el agua. Colóquese la torunda en bolsas de papel fuerte de buena calidad y esterilícese a 121 °C durante 15 minutos. Sitúense las torundas inmediatamente por debajo de la superficie de la localización de la toma de la muestra durante 1-3 días (la mayor exposición de las torundas no produce mayor atrapamiento de patógenos). Pueden sustituirse las torundas por compresas de grosor similar (por ejemplo, compresas de maternidad). Durante la toma de la muestra, se concentran partículas de materia y microorganismos procedentes del agua que pasa a través o sobre la torunda. Tras la exposición, retírese la torunda, colóquese en una bolsa de plástico estéril y envíese al laboratorio. El tiempo máximo de conservación permisible es de 6 horas. No debe transportarse en medios enriquecidos; el transporte a temperatura ambiente puede dar lugar a una proliferación de organismos competitivos suficiente para enmascarar a las salmonelas. En el labo-

MÉTODOS NORMALIZADOS

ratorio, colóquese la compresa o porciones de ella en un medio de enriquecimiento. Si se han de incubar los matraces con un medio de enriquecimiento y torundas frías a 40 o 41 °C, introdúzcanse en un baño de agua a 44,5 °C durante 5 minutos antes de meterlos en una incubadora de aire. b) Técnica de la tierra de diatomeas: Sitúese una compresa absorbente (no un filtro de membrana) sobre el receptáculo del embudo del filtro de membrana, colóquese el embudo y añádanse 2,5 g de tierra de diatomeas estéril* hasta llenar laxamente el cuello del embudo. Aplíquese el vacío y fíltrense 2 1 de la muestra. Tras la filtración, desármese el embudo, divídanse por la mitad en condiciones asépticas el «tapón» de compresa absorbente y la tierra de diatomeas que se forma, con una espátula estéril de borde afilado, y añádase el medio de enriquecimiento adecuado. También puede colocarse la totalidad del tapón en el medio de enriquecimiento. c) Grandes volúmenes de muestra: Para estudiar varios litros de muestra, utilícese un filtro formado por microfibras de vidrio borosilicato con resina epóxida siempre que la turbidez de la muestra no limite la filtración1. El aparato consiste en un filtro de cartucho de 2,5 x 6,4 cm y un portafiltros†. Esterilícese en autoclave a 121 °C durante 15 minutos. Coloquese el instrumental de filtración estéril (conectado en serie con una tubería a un depósito de 20 1 de agua y a una bomba de vacío) en el envase con 20 1 de muestra adecuadamente calibrado para medir el volumen realmente filtrado. Aplíquese el vacío y fíltrese el volumen deseado. Cuando se ha completado la filtración, extráigase el filtro y póngase en un medio de enriquecimiento adecuado. * Celite, Mansville Corp., Denver, Colorado, o equivalente. † Filtro Balston tipo AA, con portafolios tipo 90, o equivalente.

EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

9-153

d) Técnica del filtro de membrana: Para estudiar aguas de escasa turbidez, fíltrense varios litros a través de una membrana estéril de un diámetro de poro de 0,45 µm2. En el caso de aguas turbias, hágase un recubrimiento previo del filtro: prepárese una suspensión de 1 l de tierra estéril de diatomeas (5 g/l de agua destilada) y fíltrense alrededor de 500 ml. Sin interrupción, procédase a la filtración rápida de la muestra (1 l o más) unida al resto de la suspensión. Al finalizar, coloquese la membrana en una jarra mezcladora estéril que contenga 100 ml de agua de peptona al 1 por 100 estéril y homogeneicese a alta velocidad durante 1 minuto. Añádase la totalidad del homogeneizado a 100 ml de medio de enriquecimiento de doble potencia. También pueden utilizarse filtros de membrana múltiple de 47 mm de diámetro para filtrar la muestra. Sumérjase cada membrana en condiciones asépticas en 50 ml de medio de enriquecimiento selectivo de potencia sencilla, e incúbese. La detección cualitativa de Salmonella en un agua potable sospechosa puede hacerse también con cultivos M-Endo MF seleccionados (a partir de muestras de 100 ml) en los que exista un crecimiento significativo de fondo y de coliformes totales3. Tras acabar el recuento habitual de coliformes, sitúese todo el filtro en el que se encuentra el crecimiento mixto en 10 ml de medio líquido tetrationato (con 1:50.000 de colorante verde brillante) para enriquecimiento de Salmonella antes de realizar el aislamiento diferencial de las colonias en agar verde brillante. Este tipo de metodología no requiere muestras especialmente grandes y puede considerarse como una extensión del análisis habitual de coliformes totales.

cimiento que inhiba el desarrollo de las bacterias coliformes. El enriquecimiento de la muestra es esencial, ya que habitualmente los patógenos se encuentran en escaso número y los medios selectivos sólidos para el aislamiento de colonias son ligeramente tóxicos, incluso para los patógenos. No existe un único medio de enriquecimiento recomendable que favorezca el crecimiento óptimo de todos los serotipos de salmonelas. Para que la detección sea óptima habrán de utilizarse dos o más medios de enriquecimiento selectivos. a) El medio líquido de dulcitol selenita inhibe a muchas de las enterobacterias no patógenas durante las primeras horas de incubación tras la siembra y permite que las cepas de Salmonella se multipliquen con gran rapidez. El tiempo óptimo de incubación para obtener la máxima recuperación de salmonelas es de 24 horas. Sin embargo, la recuperación de microorganismos de crecimiento relativamente lento, como las variantes de 5. enteritidis (Montevideo, Enteritidis y Worthington), requieren tiempos de incubación más largos. Se deben hacer repetidas siembras procedentes del mismo medio inoculado cada 24 horas. Háganse siembras también de los medios líquidos en los que aparezca turbidez o un color rojo anaranjado debido a la reducción de la selenita. b) El medio líquido de tetrationato puede proporcionar más salmonelas que el de selenita. No obstante, una incubación prolongada más de 24 horas con siembras repetidas procedentes del mismo tubo, varias veces durante el primer día y a diario hasta los 5 días, hacen que aumenten las posibilidades de recuperación de todos los serotipos que puedan existir. Pásese 1 ml de medio de tetrationato a un tubo fresco con el mismo medio para continuar la incubación, enriquézcase más el crecimiento de Salmonella y facilítese la recuperación en placas sembradas. Se mejora la inhibí-

2.

Enriquecimiento

Enriquézcase de forma selectiva la muestra concentrada en un medio de cre-

9-154

ción de los microorganismos no patógenos si se añade verde brillante a una concentración de 1:50.000 y, en aguas muy turbias, iauril sulfato de sodio. Puede aumentar la sensibilidad añadiendo 3 mg de l-cistina por litro de medio de tetrationato. c) El medio líquido de selenita cistina puede conseguir crecimiento de Salmonella no aisladas con otros medios líquidos de enriquecimiento, tanto en aguas dulces como saladas. 3.

Crecimiento selectivo

Se facilita una mayor separación de los patógenos del resto de bacterias no patógenas si se hace una elección adecuada de la temperatura de incubación para el enriquecimiento primario, seguido de una diferenciación secundaria en medios selectivos sólidos. Estos dos factores, temperatura de incubación y elección del medio, están relacionados entre sí. Puede recuperarse más Salmonella a 35 o 37 °C con agar sulfito de bismuto que si la incubación se hace a mayor temperatura. Se precisa gran habilidad al hacer la detección de estos patógenos debido al crecimiento competitivo de varios organismos no patógenos. Utilícese una temperatura de incubación de 41,5 °C para el medio de enriquecimiento primario, así como para los medios diferenciales, que favorece el aislamiento de muchas salmonelas a la vez que reduce el número de microorganismos causantes de interferencias. Algunos serotipos de salmonelas, como S. typhi, no crecen a esta elevada temperatura. Los medios sólidos utilizados habitualmente para la detección de los patógenos entéricos pueden dividirse en tres grupos: a) medios diferenciales con escasa o nula inhibición de bacterias no patógenas, como el EMB (que contiene sacarosa); b) medios selectivos con sales biliares o desoxicolato de sodio como inhi-

MÉTODOS NORMALIZADOS

bidores, como es el caso del agar de MacConkey, el agar desoxicolato o el agar xilosa lisina desoxicolato (XLD), y c) medios selectivos que contienen verde brillante, como el agar verde brillante o el agar sulfato de bismuto. Independientemente del medio elegido, éste debe inhibir al máximo los coliformes a la vez que favorecer buena recuperación del grupo patógeno. Siémbrense dos placas, una con gran cantidad y otra con menos, lo que facilita la identificación de los patógenos entéricos cuando existen grandes cantidades de microorganismos que producen interferencias. a) Agar verde brillante: En este medio crecen colonias típicas y bien aisladas de Salmonella que adoptan un color blanco-rosado con un fondo rojo. S. typhi y algunas otras especies de Salmonella crecen mal debido al contenido en verde brillante. Los fermentadores de la lactosa que no resultan inhibidos en su crecimiento dan lugar a la aparición de colonias grisáceas o de otras coloraciones. En ocasiones, los fermentadores de la lactosa de crecimiento lento (Proteus, Citrobacter y Pseudomonas) originan colonias semejantes a las de un patógeno. Puede inhibirse el crecimiento expansivo de las pseudomonas aumentando la concentración de agar al 2 por 100. En algunos casos, se ha observado que Proteus tiende a «agruparse», tendencia que puede contrarrestarse con placas de agar desecadas para eliminar la humedad de la superficie. Si tras 24 horas de incubación no aparecen las colonias esperadas de Salmonella, hágase una reincubación de otras 24 horas para permitir que los microorganismos de crecimiento lento o parcialmente inhibido las desarrollen. Cuando no se encuentran colonias típicas o las placas sembradas aparecen con demasiados crecimientos, hágase un aislamiento puro de algunas colonias para someterlas a análisis bioquímicos. Existe el riesgo de enmascaramiento de las co-

EXAMEN MICROBIOLÚGICO DE LAS AGUAS

9-155

lonias no fermentadoras de la lactosa situadas a gran proximidad de las fermentadoras. b) Agar sulfito de bismuto (medio de Wilson y Blair)4: En este medio es de esperar un crecimiento espectacular de muchas especies de Salmonella (entre ellas, S. typhi). Examínense las placas de sulfito de bismuto a las 24 horas de incubación y, si no se encuentran colonias, prolónguese la incubación otras 24 horas para que se desarrollen las cepas de crecimiento lento. Las colonias típicas suelen desarrollar un color negro con o sin brillo metálico y es frecuente que este ennegrecimiento se extienda más allá de la propia colonia para producir un efecto de «halo». Algunas especies de Salmonella desarrollan una coloración verde, por lo que habrá que aislar este tipo de colonias cuando falten las típicas. Como en el caso del agar verde brillante, la coloración típica de las colonias puede verse enmascarada por otras numerosas colonias que la rodean tras 48 horas de incubación. Las colonias que producen H2S desarrollan también un color negro, como es el caso de Proteus y algunos coliformes. c) Agar xilosa Usina desoxicolato: En comparación con el verde brillante, el desoxicolato de sodio es sólo ligeramente tóxico para Salmonella. Estos microorganismos y los del género Arizona producen colonias rojas con el centro negro. Las bacterias coliformes, Proteus y muchos Enterobacter producen colonias amarillas. El tiempo óptimo de incubación es de 24 horas. Si se incuban las placas durante más tiempo, se produce una inversión alcalina y el consiguiente ennegrecimiento de los no patógenos positivos al H2S (Citobacter, Proteus vulgaris y P. mirabilis). d) Agar xilosa Usina verde brillante: Este medio es especialmente adecuado para Salmonella en muestras de agua marina. El verde brillante inhibe a mu-

chas especies de Proteus, Enterobacter y Citrobacter. 4.

Reacciones bioquímicas

Muchos microorganismos entéricos con escasa o nula capacidad patógena comparten ciertas características bioquímicas importantes con Salmonella. La identificación de los patógenos por las características de las colonias en medios sólidos selectivos conlleva limitaciones inherentes a las variaciones biológicas de determinados organismos y no puede ser fiable ni siquiera para una identificación provisional. Las colonias sospechosas que crecen en los medios sólidos selectivos han de ser purificadas y después caracterizadas mediante reacciones bioquímicas; la verificación final se basa en una identificación serológica. A partir del procedimiento de detección suelen conseguirse gran número de cultivos. Es posible utilizar equipos de medios diferenciales disponibles comercialmente (véase sección 9225) como alternativas a las fases 1, 2 y 3 descritas más adelante, antes de efectuar la confirmación serológica. Estos medios porporcionan una correlación del 95 al 98 por 100 con las pruebas convencionales, si bien para una mejor diferenciación de las cepas de Enterobacteriaceae pueden hacerse necesarias pruebas más significativas. Si no se utilizan estos métodos, sígase un patrón secuencial de análisis bioquímicos que dará lugar a una mayor economía de medios y de tiempo del personal del laboratorio5. Fase 1. Detección sistemática preliminar, actividad de fenilalanina desaminasa: Deséchense inmediatamente los cultivos positivos a la fenilalanina desaminasa, como indicio de que se trata de Proteus. En esta prueba, realícese el aislamiento en agar fenilalanina que se incuba a 35 o 37 °C durante 24 horas. La actividad

9-156

de fenilalanina desaminasa está señalada por una zona verde visible alrededor de la colonia tras inundar la placa con una solución de FeCl3 0,5M. Los cultivos negativos a la fenilalanina desaminasa pasarán a las pruebas bioquímicas de fase 2. Al mismo tiempo, examínese la incapacidad para fermentar la lactosa en un agar selectivo del tipo del agar de MacConkey. Fase 2. Pruebas bioquímicas: Los análisis utilizados son:

La conformidad con los patrones bioquímicos típicos de Salmonella determina la continuación o no del proceso (fase 3). Pueden encontrarse cultivos aberrantes que no cumplan todas las reacciones clásicas atribuidas a cada grupo de patógenos. Por tanto, en todos los casos habrá que revisar las reacciones en su conjunto y no rechazar cultivos a causa de pequeños números de anomalías aparentes. Fase 3. Reacciones de fermentación: Examínense las reacciones de fermentación de dextrosa, manitol, maltosa, dulcitol, xilosa, ramnosa e inositol para la mejor caracterización de las capacidades bioquímicas de los cultivos. Este estudio adicional disminuye el número posible de cultivos positivos que han de ser llevados a confirmación serológica. Si el laboratorio realiza la identificación serológica, puede prescindirse de esta serie de pruebas.

MÉTODOS NORMALIZADOS

5. Identificación del género mediante técnicas serológicas

Una vez realizados los análisis bioquímicos recomendados, inocúlese el cultivo puro sospechoso de Salmonella en agar infusión de encéfalo-corazón en pendiente e incúbese durante 18-24 horas a 35 °C. Con un lápiz de cera, divídase un porta limpio con alcohol en cuatro partes. Prepárese una suspensión densa del microorganismo en estudio suspendiendo el cultivo procedente de la incubación de la pendiente de agar durante 18-24 horas en 0,5 ml de solución de NaCl al 0,85 por 100. Colóquese una gota de antisuero polivalente «O» de Salmonella en la primera porción y el antisuero más NaCl al 0,85 por 100 en la segunda. Con un asa de inoculación limpia, pásese la suspensión de bacterias a la tercera porción junto a solución de NaCl al 0,85 por 100, y a la cuarta porción con solución de NaCl al 0,85 por 100 más antisuero. Inclínese ligeramente el porta hacia adelante y hacia atrás. Si no se produce aglutinación en la cuarta porción al cabo de 1 minuto, la prueba es negativa. Todas las demás porciones deben permanecer claras. Si las reacciones bioquímicas son características de S. typhi y el cultivo reacciona con el antisuero polivalente «O», compruébense las colonias restantes de la misma placa mediante una reacción con el antígeno Vi. Si no se produce aglutinación con antisuero Vi anti Salmonella, el cultivo no es de 5. typhi. La identificación de los serotipos de Salmonella requiere determinar los antígenos H y la fase del microorganismo según la descripción de Edwards y Ewing5. Pueden identificarse a los cultivos productores de reacciones bioquímicas compatibles con Salmonella que son positivos al antisuero polivalente «O» como «Salmonella sp., serotipo o bioserotipo indeterminado».

9-157

EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

6. 1.

2.

3.

4.

5.

7.

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9260 C.

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Procedimiento de identificación de Salmonella por inmunofluorescencia

La técnica de anticuerpo fluorescente directo (AF) es un método rápido y efectivo para detectar salmonelas en muestras de agua dulce y salada. Puede utilizarse como técnica de detección sistemática a fin de obtener resultados rápidos en grandes números de muestras como las que se toman en aguas recreativas o de cría de mariscos. Los volúmenes utilizados de muestra dependen del grado de contaminación. Cuando existe una contaminación visible, las muestras serán pe-

queñas. Si no se dispone de la información básica necesaria, analícense muestras de 2 1 mediante una técnica de concentración con tierra de diatomeas. 1. Instrumental para microscopio de fluorescencia

El equipo estándar de realización de pruebas microscópicas de anticuerpos fluorescentes puede conseguirse por se-

9-158

parado o en forma de paquete provisto de todo el instrumental esencial (a-f). a) Microscopio óptico con soporte. b) Fuente de luz que suministra energía de longitud de onda corta. Este requisito puede satisfacerse con una lámpara de mercurio de 200 W a alta presión con el arco introducido en un recipiente de cuarzo, una lámpara de 75 a 150 W de xenón a alta presión o una lámpara halógena de cuarzo de bajo voltaje de 100 W. Parte importante de la energía habrá de ser emitida en la región azul y ultravioleta del espectro. c) Fuente de energía que proporcione un voltaje y una potencia constantes a la lámpara elegida. d) Filtros básicos, con uno de absorción de calor (KG-1 o KG-2 o equivalente), uno de absorción del rojo (BG-38 o equivalente) uno de excitación (BG-12 o equivalente, donde BG-12 es también un filtro azul) y uno de barrera (OG-1 o filtro de absorción de azul). Existen nuevos filtros de interferencia de excitación con una transmisión muy elevada en la región azul del espectro (490 nm). Los filtros de barrera utilizados con ellos presentan un corte nítido a 500 o 510 nm. e) Elementos ópticos: El microscopio de fluorescencia debe tener una óptica de gran calidad. Es esencial un objetivo de 100 x con un diafragma de iris reductor de la apertura numérica (A.N.) para trabajar en campo oscuro. Como la A.N. es similar en todos los objetivos de 100 x (1,25 a 1,30), la elección se basará en que la lente sea de campo plano. f) Condensador cardioide de campo oscuro para iluminación de la muestra. Es deseable disponer de un objetivo de inmersión de 90 x con diafragma de iris. Sólo puede conseguirse una verdadera iluminación de campo oscuro si la A.N. del objetivo es menor que la del condensador, es decir, que la del cono de luz (la diferencia entre la A.N. del objetivo y la del condensador debe ser de al menos

MÉTODOS NORMALIZADOS

0,05). Es posible reducir la A.N. de un objetivo de inmersión utilizando el diafragma del microscopio o colocando un embudo de bloqueo en el objetivo. g) Porta prelimpios para FA de 7,6 x 2,5 cm, 0,8 a 1,0 mm de grosor. h) Cubreobjetos de vidrio para portas de AF del número 1l/2 y de 0,16 a 0,19 mm de grosor. i) Equipo de tinción consistente en disco cubre y cestilla para portas con asa. Se requieren cinco discos para: fijador de Kirkpatrick, etanol al 95 por 100, primer lavado con PBS, segundo lavado con PBS y agua para reactivos. j) Cámara húmeda para la incubación de los portas que contienen las extensiones con el combinado añadido. Una cámara sencilla consiste en una toalla saturada de agua sobre la que se coloca la placa de cultivo (150 x 20 mm). 2.

Reactivos

a) Aceite de inmersión no desecable de tipo A (baja fluorescencia)*. b) Fijador de Kirkpatrick para AF formado por 60 ml de etanol absoluto, 30 ml de cloroformo y 10 ml de formol†. c) Suero salino tamponado con fosfato (PBS): Añádanse 10 g de tampón‡ a 1.000 ml de agua destilada recién preparada. Agítese hasta que el polvo se disuelva por completo. Ajústese el pH a 8,0 con NaOH 0,2W. d) Líquido de montaje de AF: Utilícese la glicerina estandarizada de calidad de reactivo con pH 9,0, ajustado con NaOH 0,2N, para uso en el montaje de portas que van a ser estudiados con microscopio de fluorescencia. e) Agua para reactivos (pura de laboratorio) : Utilícese agua bidestilada en un * R. P. Cargille Laboratories, Inc. Cedar Grove, Nueva Jersey, o equivalente. † Difco n.° 3188 o equivalente. ‡ Difco Bacto-FA Buffer, desecado, o equivalente.

9-159

EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

alambique de vidrio u otra agua de laboratorio de alta calidad analítica. f) Conjugado polivalente AF Salmonella: Se trata de una globulina anti Salmonella conjugada con fluoresceína§. Para rehidratarla, añádanse 5 ml de agua para reactivos a cada vial de conjugado. Hay que determinar la dilución de trabajo (véase apartado 5e). El conjugado rehidratado no utilizado puede conservarse en el congelador, preferiblemente a –60 °C. Debe evitarse la repetición de congelación y descongelación. 3. Técnica de concentración

Colóquese una compresa absorbente en un embudo de filtro de membrana y añádase suficiente tierra de diatomeas estéril || para llenar el cuello del embudo de una forma laxa. Fíltrense 2 1 de la muestra. Aclárese el embudo con 50 a 100 ml de agua de dilución estéril tamponada con fosfato o con agua de peptona al 0,1 por 100. Desmóntese el embudo y retírese el «tapón» resultante de la unión de la tierra de diatomeas y la compresa. Repítase la operación con una segunda muestra de 2 1. 4. Enriquecimiento

Sumérjase un tapón con la compresa absorbente en un matraz que contenga 300 ml de medio líquido de selenita cistina. Introdúzcase el segundo tapón con su compresa en un matraz con 300 ml de medio líquido de tetrationato suplementado con 3 ml de solución acuosa de verde brillante al 1:1.000 y 3 mg de l-cistina. Incúbese a 35 ó 37 °C durante 24 horas.

§ Difco o equivalente. || Celite, Mansville Corp., Denver, Colorado, o equivalente.

5. Reacción y análisis del anticuerpo fluorescente

a) Prepárense placas de gotas de agar verde brillante (AVB) y de agar xilosa usina verde brillante (XLVB) colocando una gota (alrededor de 0,01 ml, con un asa de platino) del medio de enriquecimiento (selenita cistina o tetrationato) en cuatro puntos distintos de la superficie de agar1. Sepárense las gotas en la placa de agar de manera que el porta cubra dos puntos de inoculación, acción esencial debida al hecho de que tras la incubación de las placas se hará una impronta en el porta de vidrio de los puntos inoculados. b) Incúbense las placas AVB o XLVB a 35 ó 37 °C durante 3 horas. A continuación, hágase una impronta, tomando un porta para microscopio de AF limpio y colocándolo sobre dos puntos inoculados en el medio. Presiónese ligeramente con cuidado de no mover el porta en sentido horizontal. No se hará demasiada presión, ya que ello podría provocar el movimiento del porta y la recogida de agar adicional. Repítase el proceso en los otros dos puntos de inoculación y en los puntos de inoculación del segundo medio de agar. Prepárese un total de cuatro portas. c) Séquense las improntas al aire y fíjense durante 2 minutos en el fijador de Kirkpatrick. Aclárense levemente en etanol al 95 por 100 y déjense secar al aire. No se deben secar con papel d) Cúbranse las improntas con una gota de conjugado polivalente anti Salmonella. Antes de utilizarlo, dilúyase el preparado comercial determinando una adecuada dilución de trabajo. En general, todos los lotes son efectivos a una dilución de 1:4, aunque depende del tipo de instrumental de fluorescencia de que se disponga, de la fuente de luz, la alineación, los aumentos, los cultivos, etc. Hay que determinar la dilución de trabajo (el título) para cada lote de conjugado.

9-160

e) Para determinar el título del conjugado, utilícese un cultivo de Salmonella de 18 a 24 horas en un medio de infusión de ternera y háganse las improntas sobre el porta de vidrio para AF. Dilúyase el conjugado y trátese en la forma expuesta en los apartados c y d anteriores. Por ejemplo, si se obtienen los siguientes resultados:

utilícese la segunda dilución más alta que proporcione una fluorescencia de 4 +. En el ejemplo anterior, se optará por diluir el conjugado a 1:4. La dilución se hace para garantizar la mínima reacción cruzada posible. Prepárese diariamente la dilución del conjugado. f) Tras cubrir cada impronta con una gota de la dilución adecuada del conjugado, colóquense los portas en una cámara húmeda para evitar la evaporación del reactivo de tinción. Al cabo de 30 minutos, elimínese el exceso de reactivo introduciendo los portas en suero sa-

MÉTODOS NORMALIZADOS

lino tamponado con fosfato (pH 8,0). colóquense los portas en un segundo baño de suero salino durante 10 minutos. Sáquense, lávense con agua destilada y déjense secar al aire. No deben secarse con papel.

g) Póngase una gotita de medio de montaje en la impronta y cúbrase con un cubreobjetos del número 1 l/2. Séllense los bordes con esmalte de uñas. Estúdiense los porta al cabo de pocas horas mientras que se mantiene una intensidad óptima de fluorescencia. Hágase el examen en un microscopio de fluorescencia adecuado provisto de sus correspondientes filtros. h) Inclúyase un porta positivo de control en cada lote de muestras. Compruébese con ello la reactividad del conjugado y, en general, el equipo de AF. 6. Registro e interpretación de los resultados

En el momento de valorar las extensiones positivas de Salmonella es importante la intensidad de la fluorescencia de los microorganismos en cualquier campo determinado. Si la mayoría de las células son fluorescentes (4+ o 3 + ), la impronta será positiva. Analícense cuidadosamente las improntas que sólo presenten algunas células positivas salpicadas. El estudio

9-161

EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

crítico de la morfología de las células puede ayudar a distinguir entre éstas y las salmonelas. El criterio en el que se basa la positividad es el grado de fluorescencia. Se considerarán como negativas las células débilmente fluorescentes (2 + o 1 +). Confírmense todos los resultados positivos con técnicas de cultivo (véase sección 9260B).

7. Microscopía cuantitativa de inmunofluorescencia microespectrofluorométrica

Para este tipo de análisis utilícese un sistema consistente en secciones de análisis y de iluminación. La sección de análisis está formada por un ocular monocromático y un fotomultiplicador-fotómetro. El ocular tiene un divisor de haces que refleja el monocromado y el ojo del observador, permitiendo la observación visual simultánea y el análisis cuantitativo de la intensidad de la fluorescencia amarillo-verdosa. El fotómetro provisto

9260 D.

de un medidor lee en miliamperios, lo que permite relacionar la observación visual de la fluorescencia con la lectura objetiva. La microespectrofluorometría puede realizarse con un microscopio de fluorescencia normal. 8.

Referencia

1. KATZ , I. J. & F. T. B REZINSKI . 1973. Detection of Salmonella by fluorescent antibody. U.S. Environmental Protection Agency, Edison, Nueva Jersey.

9.

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Procedimientos cuantitativos para Salmonella

1. Técnica de enriquecimiento en tubo múltiple

Debido a la elevada proporción de bacterias coliformes existentes con respecto a las patógenas, son necesarias muestras muy grandes ( 1 l o superior). Puede utilizarse cualquier método de concentración de los referidos en la sección 9260B.1, aunque es preferible concentrar la muestra mediante una técnica de filtro de membrana (sección 9260B.1d). Tras mezclar la membrana con 100 ml de agua de peptona estéril al 10 por 100, utilícese un método cuantitativo de NMP distribuyendo el homoge-

neizado en un sistema de tubos múltiples con tres diluciones y cinco tubos utilizando medio líquido de dulcitol selenita o de tetrationato como medio de enriquecimiento selectivo. Incúbese durante 24 horas a 35 °C y siémbrese cada tubo en placas con agar verde brillante y agar xilosa lisan desoxicolato. Incúbese durante 24 horas a 35 °C. Elíjase de cada placa al menos una colonia sospechosa de corresponder a Salmonella, inocúlese en pendientes de agar triple azúcar hierro (TAH) y agar usina hierro, e incúbese de nuevo durante 24 horas a 35 °C. Compruébense los cultivos que den una reacción positiva a las técnicas serológicas de Salmonella

9-162

MÉTODOS NORMALIZADOS

(sección 9260B.5). Calcúlese el NMP/l0 1 de la muestra original a partir de la combinación de los tubos positivos y negativos para Salmonella (véase sección 9221E).

2. Procedimiento del filtro de membrana para S. typhi

Existe un método cuantitativo para S. typhi que utiliza medio líquido de sulfito de bismuto-M y un procedimiento de filtro de membrana para concentrar las bacterias. Sólo es aplicable en muestras con pocos materiales y partículas orgánicas, ya que en general hay que filtrar 100 mí como mínimo. Tras la filtración (véase sección 9222B.5), incúbese el filtro en una compresa saturada con medio de sulfito de bismuto-M durante 18-20 ho-

9260 E. Aunque la mayoría de las epidemias de shigelosis se transmiten por alimentos contaminados o por contagio de persona a persona, también pueden ser vehiculadas por el agua potable. Los brotes de transmisión hídrica son, a menudo, consecuencia de la interrupción accidental del tratamiento del agua, de la contaminación de un buen suministro de agua por excretas transportadas por inundaciones, por conexiones cruzadas entre conducciones de agua contaminada y de agua potable, por suministros de agua no tratada o por el paso de aguas residuales a los canales de suministro de agua potable. Se han encontrado shigelas en varios tipos de aguas contaminadas, pero la metodología para su detección es cualitativa y de baja sensibilidad. En las cepas de Shigella introducidas en el medio hídrico puede presentarse inestabilidad en algu-

ras a 35 °C. Pásese a una compresa nueva saturada con el mismo medio y manténgase la incubación hasta un total de 30 horas. Pásense las colonias sospechosas (lisas, brillantes con centro negro rodeadas por un fino borde blanco) a agar triple azúcar hierro (TAH) e incúbense a 35 °C durante 18 horas. Continúese con los métodos bioquímicos y serológicos descritos con los métodos cualitativos (sección 9260B.3 y 4).

3.

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Shigella nas características bioquímicas. Las bacterias coliformes y la mayoría de las cepas de Proteus vulgaris son antagonistas de Shigella. 1.

Técnicas de concentración

Véase sección 9260B.1. Utilícense muestras de 1 a 10 1. 2.

Enriquecimiento

Elíjase un medio de enriquecimiento selectivo con objeto de reducir al mínimo la acumulación de productos secundarios ácidos volátiles derivados del crecimiento de coliformes o de otros microorganismos antagonistas. Utilícese un medio líquido nutritivo a un pH de 8,0 (menos favorable para el crecimiento de los coli-

EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

formes) e incúbese durante 6-18 horas a 35 °C. Siémbrese después el cultivo en placas de agar diferencial selectivo e incúbese durante 6-18 horas para mejorar al máximo la recuperación de Shigella. También puede utilizarse un medio de enriquecimiento autocitotóxico preparado por adición de 4-cloro-2-ciclopentilfenil β-D-galactopiranósido (CPPG) a una concentración final de 0,001M en medio de lactosa tamponado a un pH de 6,5 con tampón de citrato (a una concentración final de 0,05M). Disuélvase en medio líquido de lactosa mediante un agitador magnético y cuidadoso calentamiento a 45 °C. Esterilícese este medio de lactosaCPPG mediante filtración por membrana. Añádase la muestra concentrada al memio e incúbese a 35 °C durante 24 horas.

3.

Crecimiento selectivo

Utilícese agar xilosa lisina desoxicolato (XLD) para el aislamiento primario de las cepas de Shigella. Las colonias sospechosas de pertenecer a este microorganismo son de color rojo. Incúbese durante 24 horas a 35 °C. Los principales microorganismos que interfieren con este procedimiento diferencial en agar son las

9-163

cepas de Proteus, Providencia y Pseudomonas. 4. Reacciones bioquímicas e identificación serológica

Síganse los procedimientos descritos en la sección 9260B.4. Para su identificación serológica, utilícese la técnica de aglutinación en porta (véase sección 9260B.5) con antisuero anti-Shigella (sueros polivalentes o de tipo específico). 5.

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9260 F. Escherichia coli patógenos Escherichia coli es un huésped normal del aparato digestivo. No obstante, se han aislado E. coli productores de enfermedades de agua corriente1, fuentes de agua potable2 y corrientes de montaña3. Estos microorganismos se encuentran en todo el mundo4. Es poco probable que E. coli pueda provocar una enfermedad a través de su transmisión por agua potable adecuadamente tratada. Histórica-

mente, al menos en los Estados Unidos, estos microorganismos sólo causan enfermedades en lactantes, pero como suelen beber agua hervida o esterilizada, estas infecciones de transmisión hídrica son raras. La diarrea del viajero podría deberse a un E. voli patógeno5. Hasta el momento, se han asociado tres tipos de enteropatías con cepas de E. coli: enteropatógenas (EPEC), enterotó-

9-164

xicas (ETEC) y enteroinvasivas (EIEC)6. Se han publicado al menos seis mecanismos de manifestación de la virulencia, que oscilan entre la producción de toxinas similares a las del cólera y la enteroadherencia. Los distintos tipos de E. coli patógeno pueden asociarse a uno o a varios de estos mecanismos. 1.

Procedimientos de análisis

El análisis rutinario del suministro de agua potable en busca de E. coli no es práctico, dadas las dificultades inherentes a la determinación de la naturaleza patógena de las cepas aisladas. En la actualidad, los métodos más definitivos para determinar la naturaleza patógena de los cultivos son la detección inmunológica de la toxina similar a la del cólera (SC) que tienen algunas cepas ETEC, la determinación de los efectos citopáticos de las células bacterianas completas o de sus extractos sobre cultivos celulares seleccionados y los bioanálisis en animales en los que se utilizan métodos como la inoculación en el asa ileal del conejo7. Los E. coli patógenos suelen asociarse a determinadas serovariantes de los que se han identificado más de 60. Por desgracia, estos grupos serológicos no se limitan a las cepas patógenas, por lo que debe utilizarse con precaución el serotipo como método de determinación de la patogenicidad de una cepa de E. coli. Aíslese el E. coli patógeno en el agua potable con ayuda de una técnica de filtro de membrana (sección 9222B), preferiblemente en un medio líquido M-FC8. Tómense las típicas colonias azules, purifiquense y determínense las reacciones IMViC (sección 9225E). Examínense los cultivos con una reacción IMViC + + – – y productores de gas con la lactosa con técnicas serológicas9, para seleccionar a los que pertenecen a los serotipos frecuentes entre los E. coli patógenos. Sin embargo, no se dispone de un marcador

MÉTODOS NORMALIZADOS

bioquímico que permita separar las cepas patógenas de las que no lo son y es dudoso que exista relación entre serotipos y carácter patógeno10, será necesario recurrir a pruebas serológicas in vitro e in vivo para conocer si el cultivo es o no patógeno. 2.

Referencias

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9-165

EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

9260 G.

Campylobacter jejuni

Se ha aislado Campylobacter jejuni en aguas mal tratadas y aguas de río no tratadas1, así como en corrientes de montaña, y se han publicado casos de enfermedad endémica y epidémica de transmisión hídrica por este microorganismo2. Campylobacter es sensible al cloro, por lo que es poco probable que se transmita o permanezca activo en las aguas potables adecuadamente tratadas. C. coli es también un patógeno para el hombre. Sus características bioquímicas son casi idénticas a las de C. jejuni y se piensa que son organismos íntimamente relacionados. La aparición de Campylobacter en las aguas naturales es muy variable y aún no se conocen los tipos aislados que pueden ser patógenos para el hombre. Los microorganismos persisten en el agua fría durante varias semanas3, pero su supervivencia en las aguas superficiales a 25 °C es de 2 días o menos. Como C. jejuni forma parte de la flora intestinal de una amplia variedad de animales salvajes y domésticos, tanto mamíferos como aves, suele aislarse en las aguas con un elevado nivel de contaminación fecal. El cultivo de C. jejuni o de C. coli es difícil, debido al crecimiento competitivo de otros microorganismos. Otros miembros del género pueden encontrarse ocasionalmente en las aguas superficiales, aunque han de ser distinguidos de C. jejuni y C. coli por su crecimiento y sus características bioquímicas. 1.

Técnicas de concentración

Los métodos para aislar Campylobacter no están estandarizados y deben ser considerados como procedimientos de investigación sujetos a modificaciones. Para cultivar estos microorganismos hay que estudiar muestras relativamente grandes.

En aguas de escasa turbidez, fíltrense varios litros a través de un filtro de membrana estéril de 47 mm de diámetro con un diámetro de poro de 0,5 µm. Coloquese el filtro en un medio líquido de enriquecimiento selectivo o póngase boca abajo sobre una placa con medio selectivo. Incúbese a 42 °C de un día para otro en una atmósfera microaerobia (alrededor de un 5 a 10 por 100 de oxígeno y 3 a 10 por 100 de CO 2 ) 4 . Retírese el filtro e incúbese la placa otras 48 horas a 42 °C. Deséchese el filtro o manténgase el intento de aislamiento colocándolo en un medio líquido de enriquecimiento selectivo, donde se incuba 48 horas a 42 °C. En casos de aguas en las que es probable una contaminación elevada, hágase un prefiltrado medianun filtro de 0,6 µm. En el caso de aguas turbias es necesario utilizar una presión de filtración. Utilícese un aparato de filtración de acero inoxidable con un depósito de 1,5*. Procédase conforme a la siguiente secuencia: colóquese un filtro de 142 mm y 3,0 µm en la pantalla del interior del depósito con un prefiltro sobre él de 124 mm. En el adaptador de tubería inferior coloquese un filtro de 47 mm y 1,2 µm. A continuación, sitúese un portafiltros Swinnex en paralelo con el filtro de 47 mm y 0,60 µm por encima del portafiltros, y otro filtro de 47 mm y 0,45 µm por debajo del portafiltros. Añádase 1 l de muestra en el depósito, ciérrese y aplíquese una presión de alrededor de 350 kPa. Tras la filtración, retírese el filtro de 0,45 µm de diámetro de poro y cultívese en una placa con medio selectivo tal como se ha indicado con anterioridad.

* Millipore n.° 316 o equivalente.

9-166 2.

Enriquecimiento

Enriquézcase de modo selectivo el concentrado de la muestra en un medio que inhiba las bacterias coliformes. El medio selectivo de Oosterom es un medio tioglucolato que contiene un antibiótico, enriquecido con bilis de buey al 1,5 por 100. Este medio, cuando se incuba a 42 °C en un atmósfera microaerobia, permite la multiplicación de C. jejuni a la vez que inhibe a la microflora que compite con él. También puede utilizarse un medio Campy-tio6 con un 1,5 por 100 de bilis de buey, que podría ser algo más selectivo. Tras la incubación durante 48 horas, siémbrese el cultivo en una placa con medio selectivo. 3.

Crecimiento selectivo

Utilícese Campy-BAP6 o medio de Butzler7 para el aislamiento primario de C. jejuni o de C. coli. Incúbese a 42 °C durante 48 horas. Las colonias sospechosas de pertenecer a uno de los dos se distinguen por su aspecto expansivo mucoide, aunque también pueden ser regulares y convexas. Los principales microorganismos capaces de provocar interferencias son Pseudomonas aeruginosa y las cepas de Enterobacteriaceae resistentes a los antibióticos. 4.

Reacciones bioquímicas

Antes de proceder a efectuar las prue-

MÉTODOS NORMALIZADOS

bas bioquímicas, compruébese la pureza de las colonias sospechosas. Fase 1: Detección preliminar: Hágase la prueba de gota de catalasa. Prepárese una extensión y tinción de Gram de las colonias que den una reacción positiva. Si se usa como contraste carbol fucsina (0,8 por 100), los microorganismos aparecerán con forma curva o de «S» y serán gramnegativos. En cultivos antiguos pueden apreciarse formas cocoides. Estudíese la motilidad con campo oscuro o contraste de fase. Es característica la motilidad en forma de dardo. La prueba de la oxidasa suele ser positiva, aunque puede retrasarse. Los microorganismos identificados mediante esta prueba presuntiva son casi siempre del género Campylobacter y, en general, C. jejuni o C. coli. Fase 2: Las pruebas son la mínimas para determinar si la cepa sospechosa pertenece al género Campylobacter.

Para distinguir C. jejuni o C. coli de otras especies de Campylobacter se harán las siguientes pruebas:

9-167

EXAMEN MICROBIOLOGICO DE LAS AGUAS

5.

Identificación serológica

Se obtiene mediante la técnica de la hemaglutinación indirecta o por aglutinación en el porta. Estos análisis especializados deben efectuarse en laboratorios de referencia. 6.

Referencias

1.

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9260 H.

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7.

Bibliografía

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Vibrio cholerae

Vibrio cholerae es el agente etiológico del cólera, una forma de leve a grave de enfermedad diarreica1. El serogrupo 01 de este microorganismo se asocia normalmente con las principales epidemias que surgen en los países en vías de desarrollo, aunque también se han observado brotes esporádicos en Estados Unidos o en cualquier otro lugar1, 2. V. chorelae no 01 puede provocar enfermedades invasivas y formas leves a graves de diarreas1. Se trata de un patógeno autóctono de aguas salobres y es posible que las aguas de los estuarios contribuyan a la transmisión hídrica del cólera y a su persistencia en el ambiente3.

2.

Enriquézcase en agua de peptona alcalina (1 por 100 de peptona, 1 por 100 de NaCl, pH 8,4) mediante una concentración adecuada de medio líquido en relación al volumen de la muestra (véanse tablas 9221:I y 9221:II). Siémbrense cultivos en agar tiosulfato-citrato-sales biliares-sacarosa (TCBS) después de incubaciones de 6 y de 15-18 horas a 35 °C. Se han observado lotes de muestras TCBS de características mejores que otros para aislamiento de V. cholerae4. 3.

1. Técnicas de concentración

Véase la sección 9260B.1. Elíjase un volumen que resulte adecuado al tipo de muestra y al nivel de sensibilidad deseado.

Procedimiento de enriquecimiento

Crecimiento selectivo

Incúbense las placas de TCBS durante 24 horas a 35 °C. Las colonias sospechosas de V. cholerae son amarillas a causa de la fermentación de la sacarosa. Las principales bacterias que pueden

9-168

MÉTODOS NORMALIZADOS

interferir son V. Alginolyticus, V. anguillarum, V. fluvialis, V. metschikovii y Aeromonas sp. 4.

Pruebas presuntivas

de diferenciación de V. cholerae Siémbrense las colonias positivas a la sacarosa en un medio selectivo de agar como el tríptico soja con NaCl al 1 por 100 p/v. Las siguientes pruebas sirven para definir a V. cholerae:

Deséchense los cultivos que no reaccionen de la forma indicada. 5. Clasificación de los cultivos como V. cholerae

Para identificar a los cultivos como de V. cholerae se recomienda la realización de las siguientes pruebas. Cuando sólo sea preciso serotipar los 01, sustitúyase la prueba de aglutinación por alguna de las siguientes:

6.

Identificación serológica

Puede utilizarse la técnica de la aglutinación en porta (véase sección 9260B.5). El serogrupo 01 se divide en serotipos Ogawa, Inaba e Hikojima. También pueden serotipificarse los V. cholerae no 01, aunque los laboratorios especializados poseen capacidad para ello.

9-169

EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

7. Biotipos del serogrupo 01 de V. cholerae

2.

Utilícense las siguientes pruebas para clasificar a V. cholerae 01 como El Tor o biotipos clásicos:

3.

4.

5.

* v reacción diferente con el serovar.

8.

6.

Otros procedimientos

Las muestras ambientales también pueden estudiarse con técnicas de anticuerpos fluorescentes siempre que se disponga de antisueros altamente específicos6. 9.

Referencias

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Leptospiras patógenas

La aparición de leptospiras patógenas en las aguas es extraordinariamente variable. Son muchos los factores que dificultan la interpretación de los resultados,

como, por ejemplo, las descargas intermitentes de leptospiras a partir de animales salvajes o de granjas o los efectos del discurrir de las aguas de lluvia y la

9-170

inundación de tierras contaminadas1. La persistencia de las leptospiras en las aguas templadas y de escaso movimiento a un pH de 6,0 a 8,0 2 - 5 y los niveles moderados de elementos nutritivos para las bacterias6 también tienden a dificultar la interpretación. Incluso aunque existan leptospiras patógenas, su detección es difícil a causa del crecimiento competitivo de otros microorganismos7 y a la necesidad de diferenciar las cepas patógenas de las saprofitas3, 7-10. La imposibilidad de aislar leptospiras patógenas de las aguas naturales no indica necesariamente su ausencia. Estos factores explican la evolución de la metodología cualitativa utilizada para detectar a las leptospiras en las aguas contaminadas. Es necesaria una prolongada incubación en varios medios a causa del crecimiento relativamente lento de estos microorganismos. Durante la incubación hay que comprobar semanalmente el medio inoculado para detectar la aparición de las leptospiras o la contaminación de los cultivos, utilizando para ello una técnica de microscopía de campo oscuro. Tras la detección habrá que caracterizar los cultivos de leptospiras mediante diversas pruebas bioquímicas y serológicas para separar las cepas patógenas de las saprofitas. Para las patógenas, utilícense pruebas con animales, si bien sólo con cultivos puros primarios, ya que estas cepas pueden hacerse avirulentas después de varios pasos de cultivo. 1. Técnica de concentración preliminar

Las leptospiras patógenas tienden a concentrarse en los sedimentos inferiores cercanos a las riberas de corrientes y estanques de granjas. Agítese suavemente el sedimento del fondo antes de hacer la toma para garantizar la recogida de un material que contenga bacterias en la interfase sedimento-agua. Utilícese el

MÉTODOS NORMALIZADOS

aparato de recogida de muestras bacteriológicas de fondo o botellas de muestra estándar (véase sección 9060A) en las que se recogerá este material finamente suspendido. A la llegada al laboratorio, o preferiblemente en el mismo lugar de la toma, agítese enérgicamente la muestra para liberar las bacterias atrapadas en el sedimento y, a continuación, hágase un prefiltrado mediante papel de filtro* o una compresa absorbente de filtro de membrana. Pásese la muestra prefiltrada a través de un adaptador hipodérmico de Swonney con un prefiltro de fibra de vidrio y un filtro de membrana de 0,45 µm de diámetro de poro para separar las leptospiras (que pasan a través de los poros con el filtrado) de los restantes microorganismos. Lávese con un volumen igual de agua de dilución estéril. 2.

Enriquecimiento

Inocúlense porciones de la muestra filtrada (1 ml y 0,1 ml) en medio semisólido de Fletcher con 10 por 100 de suero de conejo10. Incúbese el medio inoculado a 30 °C durante 6 semanas. Examínese cada tubo semanalmente para detectar crecimiento de leptospiras o contaminación de cultivo: para ello, utilícese iluminación de campo oscuro y 250 aumentos11. Las cepas de Vibrio, Spirillum o Paraspirillum son los contaminantes más habituales, sobre todo cuando se analizan más de 0,1 ml del volumen filtrado11. Las leptospiras son helicoidales, en general de 6 a 20 µm de largo y de 0,2 a 0,3 µm de diámetro en cada espira. Las vueltas de las leptospiras son más compactas que las de las otras espiroquetas12. Si no se encuentran leptospiras al hacer el estudio microscópico después de 6 semanas de incubación, la prueba es negativa. * Whatman n.° 1 o equivalente.

EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

9-171

Un procedimiento alternativo de enriquecimiento consiste en sembrar placas difusas de agar SM13 o de medio de polisorbato de albúmina bovina 8014, 15, con 0,1 a 1,0 ml de la muestra filtrada. Incúbese a 30 °C durante 7-9 días. Con el medio de polisorbato de albúmina bovina 80 utilícese un recubrimiento con agar sobre agua destilada al 0,7 por 100. Independientemente del medio de agar utilizado, prepárese 1 ó 2 días antes de la inoculación para acondicionarlo y facilitar la diseminación uniforme del inoculo sobre su superficie. Antes de realizar pruebas bioquímicas y serológicas o inoculaciones en animales, identifíquense morfológicamente mediante campo oscuro todas las colonias.

permitan la identificación provisional de las leptospiras patógenas. La verificación final se consigue mediante inyección intraperitoneal de la cepa sospechosa en cobayas. A las 4 semanas, sacrifíquense los animales, hágase un análisis de sangre para títulos de anticuerpos séricos superiores a 100 y demuéstrese la presencia de leptospiras patógenas cultivando asépticamente tejido renal en medio de Stuart.

3.

Diferenciación de las leptospiras

La detección de leptospiras patógenas en lagos y corrientes indica la existencia de leptospirosis en los animales domésticos o salvajes que frecuentan dichas aguas y supone un riesgo sanitario para los bañistas. Diferenciar las cepas patógenas de las saprofitas es de fundamental importancia. a) Reacciones de cultivo: Las leptospiras saprofitas crecen bien en medio de Stuart con 10 por 100 de suero de conejo y suplementado con 10 µg de sulfato de cobre (CuSO4)/ml4, 5 o 100 µg de 8azuguanina/ml2, 5. Sólo las leptospiras saprofitas crecen en medio de suero de conejo al 10 por 100 a 13 °C. Las cepas saprofíticas muestran mayor respuesta a la oxidasa16 y actividad superior de descomposición de la yema del huevo17 que las patógenas. La temperatura óptima de incubación para las leptospiras patógenas es de 30 °C. Incúbense todas las pruebas durante 5 días. Utilícese más de una prueba para diferenciar a las leptospiras patógenas de las saprofitas18. b) Verificación de la patogenicidad: Utilícense antisueros comerciales que

4.

Referencias

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Legionellaceae

Las Legionellaceae se han visto implicadas en brotes de enfermedades ocurridos a partir de 19471. Se conocen dos formas de enfermedad: una neumónica llamada enfermedad de los legionarios y una no neumónica denominada fiebre Pontiac. La primera especie se aisló tras el histórico brote que se produjo en la Convención de los Legionarios en Filadelfia, Pennsylvania, en 1976. Los estudios epidemiológicos y los efectuados con animales han demostrado que el microorganismo se transmite por el aire2 y es ubicuo en ambientes húmedos. Los depósitos de la mayoría de los brotes han sido el agua contaminada de las torres de refrigeración del aire acondicionado o el sistema de distribución del agua potable3, 4. También se han aislado especies de Legionella en circunstancias no relacionadas con enfermedades, como en una amplia variedad de ambientes acuáticos, como lagos, corrientes, pantanos y alcantarillados5, 6. Estas bacterias pueden sobrevivir durante prolongados

intervalos de tiempo en el agua destilada de laboratorio y en el agua corriente7. Las Legionellaceae comprenden un solo género, Legionella, con más de 11 especies distintas8. Son microorganismos gramnegativos, aerobios que no forman esporas. Tienen de 0,5 a 0,7 µm de ancho y de 2 a 20 µm de largo. Posen flagelos polares, subpolares, laterales o de todos los tipos, y necesitan cisteína y sales de hierro para su desarrollo. Aunque en principio Legionella fue aislada en cobaya y huevos embrionados de gallina, se ha demostrado que la siembra directa en un medio artificial es más sensible que la inoculación animal en el caso de L. pneumophila9. El medio más utilizado es un agar ACES (ácido N-2-acetamido-2-aminoetanosulfónico) tamponado (pH 6,9) carbón extracto de levadura (TCEL) suplementado con cisteína, pirofosfato férrico y, en condiciones óptimas, con alfa-cetoglutarato (TCEL-alfa)10. No existe ningún medio adecuado para

9-173

EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

la recuperación de Legionella en todos los ambientes, por lo que habrá que recurrir a distintos medios selectivos con variadas combinaciones de antibióticos en la base TCEL10-12. Trátense previamente, además, las muestras con ácido hidroclórico-cloruro de potasio a pH 2,2, con objeto de eliminar los microorganismos distintos de Legionella13. Los dos medios selectivos más utilizados son el GPVA (medio TCEL-alfa suplementado con glicina, polimixina B, vancomicina y anisomicina) y el CCVC (medio TCELalfa con polimixina B, cefalotina, vancomicina y cicloheximida). El medio GPVA es menos inhibidor para algunas especies de Legionella. Utilícese el medio CCVC en combinación con un medio menos selectivo. 1. Toma de muestras

Recójanse las muestras de agua en la zona litoral o en las torres de enfriamiento, circulares de los condensadores, tanques de almacenamiento, duchas, agua del grifo, etc. En la mayoría de los casos basta con 1 l, aunque pueden ser necesarios volúmenes mayores (1 a 10 I)6 en aguas con un recuento bacteriano muy bajo. Además de las tomas de muestra de agua puede ser útil pasar la torunda por diversos lugares (por ejemplo, alcachofas de las duchas) y sembrar directamente en medios selectivos. Realícese el transporte de las muestras al laboratorio en envases aislados. Refrigérense las muestras que no vayan a ser inmediatamente procesadas. Trátese el agua clorada con tiosulfato de sodio (véase sección 9060A.2). 2. Procedimiento de inmunofluorescencia

Si no se dispone de instalaciones para aislamiento de bacterias o se necesita una rápida identificación presuntiva, exa-

mínense las muestras con una tinción directa de anticuerpos fluorescentes (AFD). Centrifúguense 100 ml a 3.500 x g durante 30 minutos a temperatura ambiente y reconstrúyase el sedimento en 6 a 10 ml de agua esterilizada mediante filtración (filtro de 0,2 µm) procedente de la muestra. Prepárense extensiones para AFD llenando dos círculos de 1,5 cm en un portaobjetos con el concentrado. Déjese secar al aire, caliéntese suavemente, fíjese con formol al 10 por 100 durante 10 minutos, lávese con suero salino tamponado con fosfato (pH 7,6) y déjese reaccionar con anticuerpos fluorescentes específicos6, 14. El procedimiento de AFD no es absolutamente específico15 y carece de la posibilidad de determinar si las bacterias son o no viables. Muchas bacterias ambientales (por ejemplo, Pseudomonas sp. y Xanthomonas-Flavobacterium) presentan reacciones cruzadas con los reactivos AFD de Legionella. Para determinar si los organismos son viables, utilícese una tinción secundaria con tetrazolio16. Confírmese que se trata de Legionella mediante procedimientos de aislamiento directo. 3.

Medios y reactivos

a) Base alfa tamponada con carbón y extracto de levadura14:

Disuélvanse el extracto de levadura, el agar, el carbón, la glicina y el alfa-cetoglutarato en alrededor de 850 ml de agua destilada e hiérvase. Disuélvanse 10 g de ACES en 100 ml de agua templada, ajústese el pH a 6,9 con KOH 1N y añádase

9-174

a lo anterior. Pásese por el autoclave durante 15 minutos a 121 °C. Enfríese a 50 °C. Disuélvanse 0,4 g de cisteína y 0,25 g de pirofosfato férrico en 10 ml de agua cada uno por separado y esterilícense con filtro de 0,22 µm. Una vez enfriada la base, añádanse la cisteína, el pirofosfato férrico y el colorante, por este orden. Ajústese el pH a 6,9 con KOH 1N estéril. b) Medio GPVA11, 12*:

Añádanse la glicina y los antibióticos esterilizados con filtro al medio base TCEL-alfa enfriado y mézclese. Ajústese el pH a 6,9 con KOH 1N estéril.

c) Medio CCVC11†:

Añádanse al medio base TCEL-alfa los antibióticos esterilizados y mézclese. Ajústese el pH a 6,9 con KOH estéril. d) Reactivo ácido de tratamiento11: pH 2,0 (KCl/HCl 0,2 M): Solución A: KC1 0,2M (14,9 g/l en agua destilada). Solución B: HCl 0,2M (16,7 ml/l de HCl 10N en agua destilada). Mézclense 18 partes de la solución A con una parte de la solución B. Compruébese el pH comparándolo con un tampón estándar de 2,0. Colóquese en tubos de tapón de rosca en volúmenes de 1,0 ml y esterilícese en el autoclave. e) Reactivo alcalino neutralizador11 (KOH 0,1 N): * Disponible comercialmente. † Este medio puede no encontrarse deshidratado y habrá que prepararlo a partir de sus ingredientes básicos.

MÉTODOS NORMALIZADOS

Solución madre: KOH 0,1 N (6,46 g/l en agua desionizada). Dilúyanse 10,7 ml de la solución madre con agua desionizada hasta 100 ml. Divídase en tubos con tapón de rosca en volúmenes adecuados y esterilícese en el autoclave. El pH de la combinación de los apartados d y e a igualdad de volumen debe ser 6,9. 4.

Preparación de muestras

a) Aguas con bajo contenido bacteriano: Concéntrese el agua de bajo contenido bacteriano por filtración11 o por centrifugación de flujo continuo17. Fíltrense las muestras a través de embudos de filtración con filtros de 47 mm de 0,2 µm de porosidad y fabricados con policarbonato*. Tras la filtración, retírese el filtro de inmediato con una técnica aséptica y colóquese con el lado del depósito hacia abajo en un tubo de centrifugación de 50 ml o un vaso de similar tamaño que contenga 10 ml de agua corriente estéril o un tampón de fosfato. Si es necesario utilizar más de un filtro para concentrar la muestra, combínense todos los filtros empleados. b) Agua con alto contenido bacteriano: El agua de elevado contenido bacteriano se procesará de forma directa. Colóquense 10 ml de la muestra en un tubo de centrifugación de 50 ml o un vaso de similar tamaño que contenga 10 ml de agua corriente estéril o un tampón de fosfato. c) Dispersión de la muestra: Dispérsense los microorganismos del filtro o los agregados mezclando con una mezcladora de rotación (3 x 30 segundos) o en un baño sónico durante 10 minutos. d) Siembra: Siémbrense en placa las muestras tratadas con ácido y las no tra* Nuclepore Corp., 7035 Comerce Circle, Pleasanton, California, o equivalente.

9-175

EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

tadas en dos tipos de TCEL: sencillo y selectivo con antibióticos.

5. Estudio de los cultivos de Legionella

1) Sin tratamiento ácido: Inocúlense tres placas de TCEL-alfa y TCEL-alfa selectivo (GPVA o CCVC) con 0,1 ml de suspensión. Extiéndase con un bastoncillo liso y estéril de vidrio. Almacénese el resto de la muestra para su tratamiento con ácido y consérvese a 4 °C. 2) Tratamiento con ácido: Introdúzcase 1,0 ml de suspensión en un tubo de tapón de rosca de 13 x 100 mm que contiene 1,0 ml del reactivo para el tratamiento ácido y mézclese. El pH final de esta mezcla debe ser de alrededor de 2,2. Déjese reposar 15 minutos a temperatura ambiente, neutralícese añadiendo 1,0 ml de reactivo alcalino neutralizador y mézclese. Inocúlense 0,1 ml en cada una de las tres placas de TCEL-alfa y de TCEL-alfa selectivo (GPVA o CCVC) y extiéndase con un bastoncillo liso y estéril de vidrio. 3) Incubación: Incúbense todas las placas a 35 °C en atmósfera húmeda (>50 por 100) durante un periodo de hasta 10 días. Es aceptable la utilización de una jarra de bujía o una incubadora humidificada con CO2 (2 a 5 por 100 de CO2). e) Recuento total de bacterias: Determínese la idoneidad del proceso en cada muestra de agua de elevado contenido bacteriano. Algunas muestras pueden requerir dilución, concentración o inoculación en animales. Si el recuento total de las muestras tratadas con ácido supera las 300 colonias en el medio TCEL selectivo, realícese una nueva dilución de la muestra conservada a 4 °C. Repítase el tratamiento con ácido y hágase una nueva siembra. Si el recuento total de la muestra no tratada con ácido es inferior a 30 colonias en el agar TCEL, concéntrese y trátese el agua recogida tal como se ha descrito para el recuento en aguas de bajo contenido bacteriano.

Con ayuda de una lupa de disección, examínense diariamente todos los cultivos con más de 48 horas de incubación para detectar la existencia de colonias bacterianas opacas que tienen un aspecto de «vidrio esmerilado». Coloquense las placas con colonias de aspecto de Legionella en una cámara de seguridad biológica provista de un mechero, una aguja bacteriológica y un asa. Siémbrense asépticamente todas las colonias sospechosas en medio TCEL-alfa y agar TCEL preparado sin L-cisteína. Extiéndase la porción inoculada en cada placa con un asa estéril para suministrar áreas de fuerte crecimiento e incúbese durante 24 horas. Reincúbense las placas sin crecimiento 24 horas más. Las placas que tienen crecimiento sólo en el agar TCELalfa son supuestamente Legionella, hecho confirmado por la aglutinación en porta o inmunofluorescencia directa. Si no se dispone de estas técnicas de confirmación, envíense subcultivos de posibles legionelas a un laboratorio de referencia para su identificación. Como existen muchos tipos de algunas especies, sobre todo del serogrupo 1 de L. pneumophila, puede ser útil investigar las localizaciones ambientales de posibles depósitos de cepas causantes de epidemias18. Entre las técnicas efectivas para hacer este estudio se encuentran la subtipificación mediante anticuerpos monoclonales, el análisis electroforético isoenzimático, las pruebas de restricción de endonucleasas y el análisis de plásmidos.

6.

Referencias

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EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

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9260 K.

Yersinia enterocolitica

Yersinia enterocolitica es una bacteria gramnegativa que puede producir gastroenteritis agudas y se encuentra en las aguas frías o templadas de Estados Unidos. Muchos animales salvajes, domésticos e industriales son depósitos de este microorganismo, como en el caso de los animales de habitat acuático (castores, visones, ratas almizcleras, nutrias, mapaches)1, 2. La bacteria puede crecer únicamente a temperaturas de 4 °C con un tiempo de generación de 3,5-4,5 horas y si existen al menos residuos de nitrógeno orgánico3. En Estados Unidos, durante el período de 1971 a 1978 se produjeron dos supuestos casos de gastroenteritis de transmisión hídrica posiblemente debidos a Yersinia3-5, aunque la documentación al respecto es escasa. Se ha aislado Yersinia en aguas superficiales y profundas no tratadas en el noroeste del Pacífico, Nueva York y otras regiones de Norteamérica, siendo más frecuente dicho aislamiento durante los meses fríos6-7. Las concentraciones han oscilado entre 3 y 7.900/l00 ml. Los aislamientos de Yersinia no son proporcionales a los niveles totales de coliformes fecales o al recuento total de bacterias en placa7. Existe escasa información sobre la supervivencia de Yersinia en aguas naturales y tras los procesos de tratamiento de las mismas. Se ha aislado Yersinia en estudios de aguas efluentes secundarias cloradas-descloradas y aguas receptoras (ríos) en un 27 por 100 de las muestras de efluentes, un 9 por 100 de las muestras tomadas corriente arriba y un 36 por 100 de las

tomadas corriente abajo9. Las reducciones medias en coliformes totales y fecales tras la cloración de los efluentes fueron del 99,93 y del 99,95 por 100, respectivamente. En una encuesta de suministros de agua potable tratados y no tratados (cloración o filtración más cloración), se encontró Yersinia en el 14,0 y el 5,7 por 100 de las muestras, respectivamente7. Las muestras de agua con menos de 2,2 coliformes/l00 ml fueron positivas para Yersinia en el 6,9 por 100, mientras que las que tenían más de 2,2 coliformes/ 100 ml fueron positivas para Yersinia en un 15,9 por 100. El aislamiento de Yersinia en ese estudio no fue proporcional al número de coliformes totales o fecales. Debido a la existencia de depósitos en animales, la amplia distribución y persistencia de Yersinia en aguas naturales y tratadas en al menos algunas zonas geográficas, las pruebas de posibles brotes epidémicos de transmisión hídrica y la falta de una información definitiva sobre su reducción tras los procesos de tratamiento hacen que este patógeno adquiera importancia potencial en las aguas potables. 1.

Concentración y cultivo

Existe un método de filtro de membrana para la cuantificación y aislamiento de Yersinia enterocolitica. Este método puede utilizarse en estudios de grandes volúmenes de aguas con poca turbidez e identificación presuntiva del microorganismo sin necesidad de transferir las co-

9-178

lonias a medios múltiples de confirmación. Fíltrese la muestra a través de un filtro de membrana (véase sección 9260B.1d). Colóquese el filtro sobre una compresa de celulosa saturada con medio líquido de recuperación m-YE. Incúbese durante 48 horas a 25 °C. Pásese asépticamente la membrana a un sustrato de agar lisina-arginida e incúbese en condiciones de anaerobiosis a 35 °C. Al cabo de 1 hora, hágase un agujero en la membrana cerca de cada colonia amarilla o amarillo-naranja, pásese la membrana a una compresa absorbente saturada de ureasa e incúbese a 25 °C durante 5-10 minutos. Hágase un recuento inmediato de todas las colonias claramente verdes o azul púrpura oscuro. Las colonias verdes o azuladas son positivas al sorbitol, negativas a Usina y arginina y positivas a la ureasa, por lo que pueden identificarse presuntivamente como Y. enterocolitica.

2. 1.

Referencias

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9-179

EXAMEN MICROBIOLOGICO DE LAS AGUAS

9510

DETECCIÓN DE VIRUS ENTÉRICOS*

9510 A. 1.

Introducción

Incidencia

Los virus excretados por las heces o la orina de cualquier especie animal son susceptibles de contaminar el agua. Especialmente numerosos y de gran importancia sanitaria son los virus que infectan el aparato digestivo del hombre y que son excretados con las heces de las personas en que habitan. Estos virus se transmiten sobre todo entre personas por vía fecal-oral. Sin embargo, también pueden encontrarse en las aguas residuales domésticas que, tras varios tipos de tratamiento, son vertidas a aguas superficiales o a la tierra. Por tanto, pueden existir virus entéricos en las aguas superficiales y profundas contaminadas por las aguas fecales y que son después utilizadas como fuentes de agua potable. Entre los virus que se sabe son excretados en números relativamente grandes con las heces se encuentran los poliovirus, coxsackievirus, echovirus y otros enterovirus, adenovirus, reovirus, rotavirus, el virus A de la hepatitis (hepatitis infecciosa) y los agentes tipo Norwalk que pueden provocar gastroenteritis agudas infecciosas no bacterianas. Con la posible excepción del virus A de la hepatitis, cada grupo o subgrupo está formado por varios tipos serológicos distintos, de manera que se conocen más de 100 virus entéricos humanos diferentes. En las aguas residuales domésticas pueden existir también otros virus, pero habitualmente no en gran número1-5. En los climas templados, los niveles máximos de enterovirus aparecen en las * Aprobado por el Standard Methods Committee, 1985.

aguas fecales durante la última parte del verano y principio de otoño. Sin embargo, el virus A de la hepatitis (VAH), los virus tipo Norwalk y los rotavirus pueden constituir importantes excepciones, ya que la incidencia de las enfermedades causadas por ellos aumenta en los meses más fríos. No se dispone de información cuantitativa sobre los patrones estacionales de existencia en aguas limpias y residuales de estos últimos virus, ya que no son fáciles de estudiar con las técnicas habituales de cultivo celular. Los virus tipo Norwalk no han sido cultivados en ningún tipo de células, aunque se han desarrollado métodos analíticos inmunoquímicos para detectar sus antígenos6, 7. Los rotavirus humanos y el VAH han sido recientemente cultivados en cultivos celulares, pero las técnicas son difíciles y requieren el uso concomitante de inmunoanálisis, como la inmunofluorescencia, para detectar su crecimiento8, 12. Los virus no forman parte de la flora normal del aparato digestivo y sólo son excretados por las personas infectadas, en particular lactantes y niños pequeños. Los índices de infección varían de manera considerable de unas zonas a otras, según las condiciones sanitarias y socioeconómicas. Habitualmente, los virus se excretan en un número menor en varios órdenes de magnitud al de las bacterias coliformes. Como los virus entéricos sólo se multiplican en células vivas sensibles, su número no puede aumentar en las aguas fecales. El tratamiento de estas últimas, la dilución, la inactivación natural y el posterior tratamiento del agua reducen el número de virus. Por tanto, aunque pueden aparecer grandes brotes de enfermedades víricas de transmisión hí-

9-180

drica cuando se produce una contaminación masiva del suministro de agua por aguas fecales13, l4, este tipo de transmisión de las infecciones y enfermedades víricas en las naciones tecnológicamente avanzadas dependen de la capacidad de una cantidad mínima de virus para provocarlas. Se ha comprobado la posibilidad de producir experimentalmente la infección con muy pocas unidades víricas15, aunque el riesgo aumenta con la dosis ingerida16. No se conoce el riesgo de infección en el que incurre un individuo perteneciente a una comunidad cuyo suministro de agua contenga muy pocas unidades de virus17. Se ha defendido que la transmisión de pequeños números de virus en los suministros de agua puede dar lugar a infecciones que pasan inadvertidas. Sin embargo, la posterior transmisión de estos virus a partir de los casos de infección inaparente a los contactos sensibles implica, probablemente, el intercambio de grandes cantidades de virus. Ello puede dar lugar a una transmisión considerable de la enfermedad en la comunidad, lo que es compatible, desde un punto de vista epidemiológico, con el contacto y no con una transmisión desde una fuente común como es el agua. La mayoría de los brotes reconocidos de enfermedades víricas de transmisión hídrica en Estados Unidos han sido causados por una evidente contaminación de suministros de agua privados o semipúblicos no tratados o mal tratados con aguas fecales. Los brotes de enfermedades víricas en un sistema de suministro comunitario de agua se deben a contaminación a través del sistema de distribución18, 19. 2.

Análisis de los virus

En la actualidad no se recomienda un estudio rutinario de las aguas limpias y residuales para detectar virus entéricos.

MÉTODOS NORMALIZADOS

Sin embargo, en circunstancias especiales, como casos de reciclamiento de aguas residuales, brotes de enfermedad o estudios especiales de investigación, puede ser prudente o esencial realizar este tipo de análisis. Estos estudios sólo deben efectuarse por virólogos competentes y especialmente entrenados en virus hídricos que dispongan del equipo adecuado. La planificación que se realice en los laboratorios para concentrar los virus de aguas limpias y residuales ha de hacerse con la clara conciencia de que los métodos disponibles tienen importantes limitaciones 20. Incluso los más modernos métodos de concentración de virus en agua están aún en fase de investigación y están sujetos a modificaciones y mejoras. La eficacia de un método de concentración de virus puede variar mucho según la calidad del agua. Además, ninguno de los procedimientos de detección de virus existentes ha sido adecuadamente comprobado con formas representativas de todos los grupos de virus de importancia sanitaria. La mayoría de los métodos de concentración de virus ha conseguido recuperaciones adecuadas en las muestras de aguas limpias y residuales experimentalmente contaminadas con cantidades conocidas de algunas especies de virus entéricos. Aunque es difícil valorar la eficacia de los métodos en pruebas de campo, han sido utilizadas de forma satisfactoria algunas técnicas de concentración de virus para recuperar virus entéricos de origen natural. Algunas requieren instrumental y materiales costosos para procesar las muestras y todos los análisis de virus y procedimientos de identificación precisan costosos cultivos celulares y disponibilidades analíticas del tipo relacionado con los estudios virológicos. La detección de los virus en el agua tras la recuperación de los infecciosos requiere tres etapas generales: a) obtener una toma representativa de la muestra; b) concentrar los virus en ella, y c) identifi-

EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

car y calcular la cantidad de virus concentrados. Entre los problemas asociados a la detección de virus de interés para la sanidad pública en el entorno acuático se encuentran: a) el pequeño tamaño de las partículas víricas (alrededor de 20 a 100 nm de diámetro); b) las bajas concentraciones de virus en el agua y la variabilidad de las cantidades y tipos que pueden encontrarse; c) la inestabilidad inherente a los virus como entidades biológicas; d) los distintos materiales disueltos y su suspensión en las aguas limpias y residuales que interfieren con los métodos de detección de los virus, y e) las actuales limitaciones de los métodos de identificación y cuantificación de los virus. 3. Selección del método de concentración

La densidad de los virus entéricos en las aguas limpias y residuales suele ser tan baja que se hace necesaria una concentración de los mismos, excepto tal vez en las aguas fecales de determinadas áreas o estaciones21, 22. Se han propuesto numerosos métodos para concentrar los virus entéricos en el agua que se han probado en condiciones de laboratorio con muestras contaminadas experimentalmente, y que en algunos casos se han utilizado para detectar virus en condiciones de campo23, 24. Los métodos de concentración de los virus son, a menudo, capaces de procesar tan sólo volúmenes limitados de agua de una calidad determinada. A la hora de elegir el método de concentración habrá de tenerse en cuenta la probable densidad del virus, las limitaciones de volumen de un determinado tipo de agua y la existencia de componentes susceptibles de interferir en el proceso. Una muestra de volumen inferior a 1 l y posiblemente tan pequeña como algunos mililitros puede ser suficiente para recuperar virus en aguas fecales naturales o que hayan

9-181

recibido un tratamiento primario. En el caso del agua potable y otras aguas relativamente no contaminadas es probable que los niveles de virus sean tan bajos que haya que examinar cientos o quizá miles de litros para que aumenten las probabilidades de detección. A continuación se describen tres técnicas distintas de concentración de virus en el agua: la absorción y la elución de filtros de microporo (métodos B y C), la adsorción-precipitación con hidróxido de aluminio (método D) y la hidroextracción-diálisis con polietilen glicol (PEG) (método E)23, 24. Se describe también una técnica de recuperación de virus a partir de sólidos en pequeños volúmenes de agua (método F). La concentración de virus por adsorción y elución de filtros de microporo puede utilizarse tanto con volúmenes pequeños de aguas residuales como con grandes volúmenes de aguas naturales o tratadas. Los métodos de adsorción-precipitación con hidróxido de aluminio y de hidroextracción-diálisis con PEG no pueden utilizarse para procesar grandes volúmenes de líquidos. Sin embargo, son adecuados para concentrar virus en aguas residuales y otras aguas con densidades víricas relativamente elevadas y para una segunda concentración (reconcentración) de virus procedentes del tratamiento de grandes volúmenes con filtros de microporos. 4.

Eficacia de la recuperación

Al estudiar un determinado tipo de agua es preciso incluir una evaluación preliminar de la eficacia de la recuperación de virus. Para ello, añádase al volumen necesario de la muestra una cantidad conocida de uno o más tipos de virus de prueba, procésese con un método de concentración para los virus de prueba y determínese la eficacia de la recuperación. En un caso ideal, deben utilizarse estas muestras sembradas siempre que se

9-182

procesen muestras de campo. Si se emplea este sistema al tiempo que se realiza el proceso de la muestra de campo, adóptense las debidas precauciones, incluida la desinfección y esterilización, y la manipulación con técnica aséptica, para evitar la contaminación accidental de las muestras.

5. 1. 2.

3. 4. 5.

6.

7.

8.

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MÉTODOS NORMALIZADOS

9. WYATT, R. G., W. D. JAMES, E. H. BOHL, K. W. THEIL, L. J. SAIF, A. R. KALICA, H. B. GREENBERG, A. Z. KAPIKIAN & R. M. CHANOCK. 1980. Human rota virus type 2: Cultivation in vitro. Science 207:189. 10. SATO, K., Y. INABA, T. SHINOZAKI, R. FUJII & M. M ATUMOTO . 1981. Isolation of human rotavirus in cell cultures. Arch. Virol. 69:155. 11. LOCARNINI, S. A., A. G. COULEPIS, H. Z HUANG , E. G. W ESTAWAY & I. D. G UST . 1982. Characterization of the replication cycle of hepatitis A virus in vitro. En W. Szmuness, H. J. Alter & J. E. Maynard, eds. Viral Hepatitis 1981. International Symposium, The Franklin Institute Press, Filadelfia, Pennsylvania. 12. F EINSTONE , S. M., L. F. B ARKER & R. H. PURCELL. 1979. Hepatitis A and B. Capítulo 29. En E. H. Lennette y N. J. Schmidt, eds. Diagnostic Procedures for Viral, Rickettsial and Chlamydial Infections. American Public Health Assoc, Washington, D.C. 13. VISNAWATHAN, R. 1957. Epidemiology. Indian J. Med. Res. 45:1 (número suplementario). 14. MELNICK, J. L. 1957. A water-borne urban epidemic of hepatitis. En Hepatitis Frontiers. Little, Brown & Co., Boston, Massachusetts. 15. PLOTKIN, S. A. & M. KATZ. 1967. Minimal infective doses of viruses for man by the oral route. En G. Berg, ed. Transmission of Viruses by the Water Route. Interscience Publ., Nueva York. 16. A KIN , E. 1981. A review of infective dose data for enteroviruses and other enteric microorganisms in human subjects. En Microbial Health Considerations of Soil Disposal of Domestic Wastewaters. EPA-600/9-83017, U.S. Environmental Protection Agency, Washington, D.C. 17. P AYMENT , P. 1981. Isolation of viruses from drinking water at the Pont-Viau water treatment plant. Can. J. Microbiol. 27:417. 18. C RAUN , G. F. & J. L. M C C ABE , 1973. Review of the causes of waterborne disease outbreaks. J. Amer. Water Works Assoc. 65:74. 19. CRAUN, G. F. 1981. Outbreaks of waterborne disease in the United States: 1971-1978. J. Amer. Water Works Assoc. 73:360. 20. S OBSEY , M. D. 1982. Quality of currently available methodology for monitoring viru-

9-183

EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

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9510 B. Concentración de virus a partir de pequeños volúmenes de muestra por adsorción y dilución de filtros de microporo (PROPUESTA) 1.

Discusión general

Es posible concentrar los virus a partir de muestras de agua mediante una adsorción reversible de los mismos en filtros de microporo y extrayéndolos después de los filtros en un pequeño volumen de líquido1. La muestra que contiene los virus se filtra a presión a través de filtros de microporo con una gran superficie a la que se adsorbe el virus, probablemente por interacciones electrostáticas e hidrofóbicas2. Existen dos tipos generales de filtros adsorbentes: electronegativos (carga superficial negativa) y electropositivos (carga superficial positiva). Los primeros están formados por esteres de celulosa o fibra de vidrio con resinas orgánicas de unión y adsorben los virus de una forma más eficaz en presencia de cationes multivalentes, como Al3+ y Mg2+; un pH bajo, generalmente de 3,5, o ambas circunstancias. Los otros filtros están constituidos por fibra de vidrio o celulosa y una resina polimérica orgánica de carga positiva, y adsorben los virus de forma eficaz en una amplia variedad de pH sin que sea necesario añadir sales polivalentes. Para muestras neutras o acidas, pueden utilizarse estos filtros sin otras condiciones químicas. Los filtros electropositivos han pro-

porcionado recuperaciones víricas comparables a las de los filtros electronegativos3-5 y se han utilizado en estudios de campo6, 7, aunque la documentación procedente de los distintos laboratorios que emplean diversos tipos de virus y muestras de agua no es aún suficiente como para incluir, por el momento, un método específico para ellos. Los virus adsorbidos se extraen normalmente a partir de las superficies de los filtros de microporo mediante filtración a presión de pequeños volúmenes de líquido que se extrae in situ de los filtros. Este líquido es un fluido proteináceo ligeramente alcalino, como un extracto de buey, o un tampón más alcalino, como glicina-NaOH a pH 10,5 a 11,5. Si se utiliza este último como líquido de extracción es preferible emplear un pH de 10,5, debido a que cuanto más elevado sea el pH mayor será la probabilidad de que se produzca la inactivación de virus8, 9. Los métodos del filtro de microporo presentan tres limitaciones fundamentales. La materia suspendida tiende a obturar el filtro adsorbente, limitando así el volumen que puede procesarse e interfiriendo, probablemente, con el proceso de dilución10. La materia orgánica disuelta o coloide existente en algunas

MÉTODOS NORMALIZADOS

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aguas puede interferir con la adsorción del virus a filtros, probablemente por competición con los virus en los lugares de adsorción11-13, lo que también puede interferir con la extracción de los virus. Por último, los virus adsorbidos en la materia suspendida pueden ser eliminados por cualquier proceso de clarificación aplicado antes de la adsorción de los virus10. En la sección 9510F se describe un método de recuperación de virus asociados a materia sólida en pequeños volúmenes de aguas limpias y residuales. A pesar de estas limitaciones, la concentración de virus por adsorción y dilución de filtros de microporo es la técnica más prometedora para su detección.

2.

Instrumental y equipo

a) Portafiltros adsorbente de 47, 90 o 142 mm de diámetro, provisto de una válvula de liberación de presión. b) Vaso de presión de 12 o 20 1 de capacidad. c) Fuente de presión positiva de hasta unas 400 kPa con regulador: conducción de aire del laboratorio, bomba de aire o un cilindro de aire o de nitrógeno comprimidos. d) Tubería de plástico vinilo que soporte el autoclave con conexiones de plástico o metal (de tipo de rápida desconexión) para conectar la fuente de presión positiva con el portafiltros en un dispositivo en serie. e) Phmetro. f) Vaso de precipitado de 50 a 500 ml. g) Balanza de laboratorio, h) Cilindros graduados de 25 a 100 ml. i) Pipetas de 1, 5 y 10 ml.

3.

Materiales

a) Filtro de adsorción de virus: Utilícese:

1) Filtro de nitrato de celulosa de 0,45 µm de porosidad*. 2) Filtro de resina de fibra de vidrioacrílico de 0,45 µm de porosidad †. Los filtros comerciales disponibles sólo se presentan en capas planas que pueden cortarse con tijeras hasta el tamaño deseado. b) Prefiltro: Utilícense uno o más filtros de resina de nitrato de celulosa o de fibra de vidrio-resina acrílica con poros de más de 0,45 µm para evitar la obturación del filtro de adsorción de virus por la materia suspendida. Colóquese el prefiltro sobre el filtro adsorbente de virus de 0,45 µm de poro en el mismo portafiltros. 4.

Reactivos

a) Ácido clorhídrico, HCl 0,1, 1,0 y 10N. b) Hidróxido de sodio, NaOH 0,1, 1,0 y 10N. c) Cloruro de aluminio, AlCl3 · 6H2O 0,15N o cloruro de magnesio, MgCl2 · · 6H2O 5N. d) Tiosulfato de sodio, Na2S2O3 · · 5H2O, 0,5 por 100 (p/v). e) Cloruro de sodio, 0,14N a pH 3,5: Disuélvanse 8,18 g en 1 l de agua destilada y ajústese el pH a 3,5 con HCl. f) Extractor del virus: Utilícese: 1) Glicina-NaOH a pH 10,5 u 11,5 por 100; prepárese una solución de glicina 0,05M, pásese por el autoclave y ajústese el pH a 10,5 u 11,5 con NaOH 1-10N. Añádase rojo fenol al 0,0005 por 100 como indicador del pH. 2) Extracto de buey, 3 por 100 a pH 9,0: Disuélvanse 30 g de pasta extracto de buey o 24 g de polvo de extracto de buey en 1.000 ml de agua destilada, ajúste* Tipo Ha, Millipore Corp., Bedford, Massachusetts, o equivalente. † N.° 8025-035, Filterite Corp., Timonium, Maryland, o equivalente.

EXAMEN MICROBIOLÚGICO DE LAS AGUAS

9-185

se el pH a 9,0 con NaOH 1-10N y esterilícese en autoclave.

tivos, filtros adsorbentes de virus, portafiltros, conexiones e instrumental de laboratorio pueden esterilizarse en el autoclave o con chorro de vapor. Para esterilizar los filtros, móntense en sus portafiltros y, si se colocan varios en el mismo portafiltros, sitúese el de porosidad más pequeña en la parte inferior, con los filtros progresivamente más grandes sobre él; no debe utilizarse un ciclo de secado automático cuando se esterilicen en el autoclave. El instrumental y materiales que no pueden esterilizarse con el autoclave ni ser tratados con chorros de vapor se esterilizarán con solución de cloro de 10 mg/l a pH 7,0 durante 30 minutos, lavado después con una solución estéril de Na2S2O3, 50 mg/l. Los filtros adsorbentes no pueden ser tratados con cloro. Durante todas las operaciones de concentración de virus, utilícese una técnica aséptica para evitar la contaminación microbiana. b) Tamaño de la muestra y elección del tamaño del filtro: El tamaño de la muestra y, por tanto, el del filtro dependen de la calidad del agua y de la concentración probable del virus. Se han utilizado filtros de microporo de un solo paso en métodos de adsorción-extracción para recuperar virus de 100 ml de aguas fecales con filtros de 47 mm16 y con 3,8 a 4,6 l de efluentes secundarios y terciarios de alcantarillas en filtros de 90 o 142 mm de diámetro12, 16, 17. Teniendo en cuenta el diámetro y las características de retención de sólidos de los filtros, la escala y la capacidad del aparato y los materiales y la calidad de las muestras, los límites prácticos para el tamaño del filtro son 20, 8 y 2 1 para los filtros de 142, 90 y 47 mm de diámetro, respectivamente. c) Toma de muestras y almacenamiento: Recójanse las muestras asépticamente en envases estériles. Si contienen residuos de cloro, añádase inmediatamente una solución de Na2S2O3 en cantidad suficiente para conseguir una concentración final de 50 mg/l. Procésese la muestra tan

g) Glicina-HCl a pH 1,5: Prepárese una solución de glicina 0,05M, pásese por el autoclave y ajústese a un pH 1,5 con HCl l-10N. Añádase fenol rojo al 0,0005 por 100 como indicador del pH. h) Medio líquido nutritivo, 10 x a pH 7,5: Disuélvanse 8,0 g de medio líquido nutritivo en 10 ml de agua destilada, ajústese el pH a 7,5, dilúyase hasta 100 ml con agua destilada y esterilícese en autoclave. i) Antibióticos: Utilícense: 1) Penicilina-estreptomicina, 10 x : 5.000 UI de penicilina/ml y 5.000 µg de estreptomicina/ml. Utilícense presentaciones disponibles comercialmente o prepárense disolviendo la penicilina G sódica o potásica en polvo y el sulfato de estreptomicina en agua destilada, esterilizándolas después mediante filtración. Consérvese congelado. 2) Gentamicina-kanamicina, 100 x: 5.000 µg/ml de gentamicina (base) y de kanamicina (base). Prepárese combinando asépticamente volúmenes iguales de las soluciones comerciales estériles de gentamicina y kanamicina de 10.000 µg/ml o disolviendo el sulfato de gentamicina y el de kanamicina en polvo en agua destilada y esterilizándolas por filtración. Consérvense en frigorífico o congeladas. j) Solución salina equilibrada de Hanks, 10 x: Utilícese la presentación disponible comercialmente o prepárese de acuerdo con un protocolo estándar14, 15. k) Hipoclorito de sodio, con un 5,25 por 100 de cloro disponible (lejía doméstica). 5.

Procedimiento

a) Esterilización del instrumental, material y reactivos: La mayoría de los reac-

9-186

pronto como sea posible después de recogerla; no se mantendrán muestras más de 2 horas a más de 25 °C o 48 horas a 2 a 10 °C. No deben congelarse, excepto si su procesamiento se retrasa más de las 48 horas siguientes a su recogida; si se congelan, debe obtenerse y conservarse a –70 °C o menos. d) Procesamiento de la muestra: Ajústese la muestra a un pH 3,5 y AlCl3 0,0015N o a un pH 6,0 a 3,5 y MgCl2 0,1 N. Realícense los ajustes de la muestra en un vaso de presión u otro envase que resulte adecuado. Agítese enérgicamente la muestra durante la adición de HCl al 1,0 o 0,1N y la solución de AlCl3 (1 parte de la solución a 100 partes de la muestra) o la de MgCl2 (1 parte de la solución por 50 partes de la muestra). Como AlCl3 es una sal acida, puede hacer que disminuya el pH de la muestra. No hay que dejar que el pH sea inferior a 3,0. Introdúzcase la muestra en un vaso de presión conectado a una fuente de presión positiva y conéctese la salida del vaso de presión a la entrada al soporte de filtros de adsorción de virus. Con la válvula de liberación de la presión del portafiltros abierta, aplíquese una ligera presión positiva para purgar el aire del portafiltros. Cuando la muestra comienza a fluir por la válvula de liberación de la presión, ciérrese rápidamente ésta y continúese la filtración a una velocidad no superior a 28 ml/ minuto/cm2 de área de filtro (alrededor de 130, 250 y 4.000 ml/minuto para los filtros de 47, 90 y 142 mm de diámetro, respectivamente). Tras filtrar la totalidad de la muestra, déjese que la presión positiva purgue el exceso de líquido del portafiltros. Lávese el filtro con NaCl 0,14N para eliminar el exceso de Al3 + o de Mg2 + del filtro de adsorción de virus. Utilícense alrededor de 1,5 ml de solución de NaCl/cm2 de área de filtro (25, 100 y 240 mi para los filtros de 47, 90 y 142 mm de diámetro, respectivamente). Colóquese la

MÉTODOS NORMALIZADOS

solución de lavado en un vaso de presión conectado a la entrada al portafiltros y aplíquese una presión positiva a la solución a través del filtro de adsorción de virus, elimínese el filtrado y déjese que la presión positiva purgue el exceso de solución de lavado del filtro de adsorción de virus. Los virus se extraen de los filtros con un extractor recomendado. Debe utilizarse alrededor de 0,45 ml de diluyente/cm2 de superficie del filtro (alrededor de 7,5, 28 y 71 ml, respectivamente). Con la válvula de liberación de la presión del portafiltros abierta, añádase el extractor al portafiltros de manera que recubra por completo la superficie del filtro. Cuando el extractor comienza a salir por la válvula de liberación de la presión, ciérrese ésta rápidamente. Si el extractor es glicina-NaOH a un pH de 11,5, coloquese un vaso de precipitado estéril bajo la salida del portafiltros y aplíquese presión positiva de manera que el filtrado fluya lentamente por la salida del portafiltros. Recójase el filtrado en un vaso de precipitado estéril y, cuando deje de salir, auméntese lentamente la presión para forzar el paso del líquido retenido. Compruébese rápidamente el pH del extracto (filtrado) y, si es inferior a 11,0, hágase una nueva extracción con glicina-NaOH a pH 11,5 hasta que se obtenga un filtrado con un pH > 11,0. Inmediatamente después de comprobar el pH, ajústese el extracto a un pH 9,5 a 7,5 con glicinaHCl 0,1 N mientras se mezcla enérgicamente. El proceso de completar la filtración y ajustar el pH debe hacerse en menos de 5 minutos para evitar la posibilidad de una inactivación apreciable del virus. Si el extractor es glicina-NaOH a pH 10,5 procédase igual que antes, pero pasando el extractor por el filtro cinco veces en total. En cada extracción, recójase el filtrado, ajústese el pH a 10,5 con NaOH al l,0 o 0,lN y vuélvase a pasar por el filtro. Tras la quinta extracción,

EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

ajústese el pH del filtrado a 7,5 con glicina-HCl a pH 1,5 o con HCl 0,1 N. Si el extracto es de buey al 3 por 100 con un pH de 9,0, colóquese un vaso de precipitado estéril bajo la salida del filtro, aplíquese una ligera presión positiva al portafiltros que contiene al extractor de manera que éste fluya lentamente por la salida y recójase el filtrado. Auméntese lentamente la presión para forzar la salida del líquido adicional retenido en el portafiltros. Mídase el volumen del extracto y añádase un l/l0 de este volumen de penicilina-estreptomicina y de gentamicina-kanamicina, de solución salina equilibrada de Hanks y de medio nutritivo 10 x (este último se añade sólo a las extracciones hechas con glicina). Ajústese el pH a 7,4 con glicina-HCl o con HCl 0,1N a la vez que se mezcla enérgicamente. Almacénese a 4 °C o a –70 °C en función del tiempo que vaya a transcurrir hasta que se proceda al análisis del virus. El tiempo máximo de conservación a 4°C es de 48 horas. 6. 1.

2.

3.

4.

5.

Referencias FARRAH , S. R., C. P. GERBA, C. WALLIS & J. L. MELNICK. 1976. Concentration of viruses from large volumes of tapwater using pleated membrane filters. Appl. Environ. Microbiol. 31:221. F ARRAH , S. R., D. O. S HAH & L. O. I N GRAM. 1981. Effects of chaotropic and antichaotropic agents on the elution of poliovirus adsorbed to membrane filters. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S. 18:1229. SOBSEY, M. D. & B. L. JONES. 1979. Concentration of polivirus from tap water using positively charged microporous filters. Appl. Environ. Microbiol. 37:588. SOBSEY, M. D. & J. S. GLASS. 1980. Poliovirus concentration from tap water with electropositive adsorbent filters. Appl. Environ. Microbiol. 40:201. SOBSEY, M. D., R. S. MOORE & J. S. GLASS. 1981. Evaluating adsorbent filter performance for enteric virus concentrations in

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MÉTODOS NORMALIZADOS

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tration of enteroviruses from large volumes of tap water, treated sewage, and seawater. Appl. Environ. Microbiol. 35:540.

9510 C. Concentración de virus a partir de grandes volúmenes de muestra por adsorción y dilución de filtros de microporo (PROPUESTA)

1.

Discusión general

En esta sección se describe un proceso de dos tiempos para la concentración de virus en muestras de grandes volúmenes. Los virus de volúmenes demasiado grandes para ser analizados directamente de forma adecuada y económica, en cultivos celulares, como los que se obtienen al procesar grandes volúmenes de agua a través de cartuchos o grandes filtros de disco, pueden después concentrarse (reconcentrarse) mediante varios métodos alternativos. Los virus de los extractos proteináceos pueden reconcentrarse por «floculación orgánica»1, 2, por adsorciónprecipitación en hidróxido de aluminio (sección 9510D) o por hidroextraccióndiálisis con polietilenglicol (sección 9510E). Estas técnicas de reconcentración son válidas tanto para extractos proteináceos como para tampones orgánicos procedentes de todo tipo de aguas. La floculación orgánica, utilizada ampliamente en la actualidad, implica la precipitación de los virus por acidificación del extracto a pH 3,5, recuperación del precipitado por centrifugación y resuspensión en un volumen pequeño de tampón alcalino1. Además, los virus de los extractos no proteináceos, como la glicina-NaOH, pueden reconcentrarse por adsorción y extracción a partir de pequeños filtros de microporo. Ajústese el extracto al pH y

condiciones iónicas adecuadas para una óptima adsorción del virus, fíltrese a través de un adsorbente secundario y extráiganse los virus adsorbidos con un pequeño volumen de extractor. Este procedimiento sólo puede utilizarse para reconcentrar extractos primarios obtenidos a partir de agua potable y otras aguas altamente acabadas, debido a las posibles interferencias por sustancias sobre los extractos primarios de las aguas naturales o menos acabadas. En la figura 9510:1 se muestran los métodos de adsorción-extracción con filtro de microporo y de reconcentración. Para una información general sobre las técnicas de filtro de microporo, véase la sección 9510B. 2.

Equipo e instrumental

a) Instrumental para la primera concentración (figura 9510:2): 1) Portafiltros de adsorción de virus de primer paso. 2) Sistema químico aditivo: Utilícese: a) Proporcionador de liquido con cuatro bombas de alimentación (quadraplex) y una cámara de mezcla*. b) Inyector proporcionador tipo Ven* Johanson and Son Machine Corp., Clifton, Nueva Jersey, o equivalente.

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turi† con conexiones de plástico o metal (de tipo de rápida desconexión) y una tubería de vinilo para la línea de alimentación química3. Para alimentar dos aditivos distintos únase un conector en forma de «Y» o «T» y dos tuberías de vinilo a la fuente de alimentación química o, de manera alternativa, utilícense dos inyectores distintos de entrada. Puede hacerse necesario el uso de un sistema de derivación con el inyector para evitar la pérdida de alimentación química debido a la presión retrógrada de la conducción del agua4. Este sistema retrógrado consiste en una tubería en «T» adaptada a la entrada y a la salida del inyector y conectada por un tubo flexible con una válvula de control (véase figura 9510:2). Los inyectores de entrada disponibles comercialmente procesan el agua a una velocidad de 3 a 33 l/minuto, con relaciones de agua a alimentación química de 10 a 1 a 1.110a 1. Selecciónese el instrumental y las condiciones de trabajo de modo que la proporción agua a alimentación química sea de 100 a 1. 3) Medidor del flujo del agua. 4) Medidor de presión de 0 a 400 kPa. 5) Tubería de vinilo plástico resistente al autoclave, con conexiones de plástico o metal (de tipo de desconexión rápida). 6) Válvula de alivio de presión (opcional). 7) Bombonas de 20 a 50 1 o envases parecidos. 8) Fuente de presión positiva de hasta 400 kPa con regulador: conducción de aire de laboratorio, bomba de presión positiva o cilindro de aire o nitrógeno comprimidos. 9) Bomba (si la fuente del agua no está sometida a presión). b) pHmetro. c) Balanza de laboratorio. † Modelos 202-P, 203-P o 204-P, Dema Engineering Co., St. Louis, Missouri, o equivalente.

9-189

d) Vasos de precipitado de 2 ó 4 l. e) Vasos de presión de 4 l. f) Cilindros graduados de 1 y 2 l. g) Pipetas de 1, 5 y 10 ml. h) Tubo centrífugo con rotor y cabezales para tubos de 250 y 500 ml de capacidad *. i) Tubos de centrifugación de 250 a 500 ml. 3. Materiales

a) Filtros de adsorción de virus de primer paso: Utilícese uno de los siguientes: 1) Filtros de 293 mm de diámetro de 8,0 a 1,2 µm de porosidad y fabricados con nitrato de celulosa †. 2) Filtros de tubo de 17,8 cm de longitud y 8,0 µm de porosidad fabricados con fibra de vidrio de epóxido‡. 3) Cartucho de filtro de 25,4 cm de longitud y 0,25 o 0,45 µm de porosidad fabricado con fibra de vidrio-resina acrílica plegada§. b) Filtros de adsorción de virus de segundo paso: 47 mm de diámetro, 3,0, 0,45 y 0,25 µm de porosidad y fabricados con fibra de vidrio-resina aerifica. Para reconcentrar, utilícense sólo muestras muy acabadas de agua**. 4.

Reactivos

a) Ácido clorhídrico, HCl 0,06, l†† y 6N. b) Hidróxido de sodio, NaOH 10N. * Necesaria para el procedimiento de reconstrucción alternativa utilizando extracto de buey al 3 por 100. † Millipore Corp., Bedford, Massachusetts, o equivalente. ‡ Balston. Inc., Lexington, Massachusetts, o equivalente. § Filterite Corp., Timonium, Maryland, o equivalente. ** Filterite Corp., Timonium, Maryland, o equivalente. †† Recomendado para la adsorción de virus en primer paso.

9-190

c) Cloruro de aluminio, AlCl3 · 6H2O 0,15 y 6N*. d) Cloruro de magnesio, MgCl2 · · 6H2O 1 N *. e) Tiosulfato de sodio, Na2S2O3 · · 5H2O, 0,5 por 100 (p/v). f) Hipoclorito de sodio, 5,25 por 100 de cloro disponible (lejía doméstica). g) Extractor. Utilícese: 1) Glicina-NaOH a pH 10,5 u 11,5: Véase sección 9510B.4f1). Utilícese en las 2 horas siguientes al ajuste del pH. 2) Extracto de buey al 3 por 100, pH 9,0§. (Véase sección 9510B.4 f 2.) h) Solución neutralizante del extracto. Utilícese: 1) Glicina-HCl a pH 1,5. Prepárese una solución de glicina y ajústese el pH a 1,5 con HCl 6N. Añádase rojo de fenol al 0,0005 por 100 como indicador del pH. Utilícese en las 2 horas siguientes al ajuste del pH. 2) HCl 1,0 N i) Medio líquido nutritivo, 10 x, pH 7,5: Disuélvanse 8,0 g de medio líquido nutritivo en 90 ml de agua destilada, ajústese a un pH de 7,5 con NaOH 10N, dilúyase a 100 ml con agua destilada y esterilícese en autoclave. j) Fosfato de disodio, 0,45N: Disuélvanse 40,2 g de Na2PO4 · 7H2O en 1 l de agua destilada y esterilícese en autoclave. k) Antibióticos: Véase la sección 9510B.4i. l) Cloruro de sodio, 0,14N: Disuélvanse 8,18 g de NaCl en 1 l de agua destilada. m) Solución salina equilibrada de Hanks, 10 x: Véase sección 9510B.4j.

* Recomendado para la adsorción de virus en primer paso. § Procedimiento alternativo de reconstrucción: floculación orgánica.

MÉTODOS NORMALIZADOS

5.

Procedimiento

a) Esterilización del instrumental, materiales y reactivos: Véase la sección 9510B5a. b) Tamaño de la muestra: En caso de agua potable, utilícese un volumen de muestra mínimo de 400 1, aunque puede llegar a ser necesario procesar un mínimo de 2.000 l para detectar virus a concentración de 1 a 2 unidades infecciosas/400 l. c) Preparación de las soluciones de alimentación: Utilícese una solución aditiva de HCl para ajustar el pH de la muestra a 3,5 para los filtros de adsorción de virus. Si la acidificación a un pH de 3,5 resulta inadecuada para obtener la máxima adsorción, añádase AlCl3 o MgCl2. Cuando se utiliza sólo HCl, prepárese una solución aditiva de la forma siguiente: determínese la concentración de la solución aditiva de HCl mediante la titulación de una muestra de 1 l de agua desclorada a un pH de 3,5 con HCl 0,06N y anótese el volumen requerido. Este volumen, expresado en mililitros de solución tituladora, es igual al volumen de HCl 6N necesario por litro de agua destilada para fabricar la solución aditiva. Obténganse al menos 5 l de solución aditiva por cada 400 l de muestra. Cuando se utilice únicamente AlCl3 para favorecer la adsorción de los virus, empléese un pH 3,5 y una concentración final de AlCl3 añadida de 0,0015N. Como AlCl3 es una sal acida, titúlese una muestra de 1 l a un pH de alrededor de 4,0 con HCl 0,06N, añádase el AlCl3 hasta una concentración de 0,0015N y continúese la titulación a un pH 3,5 anotando el volumen de titulador utilizado. Prepárese la solución aditiva añadiendo un volumen de titulador (ml) de HCl 6,0N por litro de AlCl3 0,15N. Cuando se utiliza MaCl2 para favorecer la adsorción del virus, empléese un pH de 3,5 a 6,0 y una concentración final

EXAMEN MICROBIOLOGICO DE LAS AGUAS

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EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

de MgCl2 añadido de 0,1 N. Para preparar la solución aditiva, titúlese una muestra de 1 l hasta el pH deseado con HCl 0,06N como se ha descrito antes y anótese el volumen de titulador utilizado. Añádase el volumen de titulador de HCl 6,0N por litro de MgCl2 10N necesario para hacer la solución aditiva. d) Preparación del sistema de aditivo químico: 1) Cuando se utiliza un proporcionador líquido, actúese a una presión de 100 a 700 kPa y a una velocidad de flujo del agua de 4 a 40 l/minuto. Ajústese cada una de las cuatro bombas de aditivo químico del proporcionador a una proporción de 1 a 200 (1 parte de aditivo químico por 200 partes de agua). Utilícense dos bombas que trabajan recíprocamente, por cada aditivo, de manera que la dilución global de cada uno de ellos sea de 1 a 100. Uno de los aditivos es HCl, HCI-AlCl3 o HCl-MgCl2, y el otro, Na2S2O3 al 0,05 por 100, y son sólo necesarios durante el proceso de muestras que contengan cloro. Colóquense conducciones desde las dos bombas de cada aditivo hacia los envases de los mismos y manéjense manualmente los rodillos medidores de las bombas para llenar las conducciones de alimentación y purgarlas de aire. Conéctese el suministrador de líquido a la fuente de agua y hágase funcionar brevemente sin haber colocado un adsorbente de virus. Tómese una muestra de agua del proporcionador de salida y compruébese su pH, que debe ser de 3,5 ± 0,3. 2) Si se utiliza un inyector de tipo Venturi, conéctese el conjunto a la fuente de agua y la entrada al filtro adsorbente, y colóquese la línea de alimentación con el envase de aditivo. Póngase la válvula de la salida del inyector en posición de drenaje de conducción (hacia afuera del filtro adsorbente). Iníciese el flujo de la muestra y ajústese la válvula de control de rosca de la alimentación química del

9-193

inyector suministrador hasta que el agua recogida en la línea de drenaje alcance el pH deseado, lo que se comprueba con el pHmetro. Si se utiliza Na2S2O3 para neutralizar el cloro, compruébese que se ha hecho de forma efectiva. Conéctese el aparato concentrador de virus a la fuente de agua uniendo su entrada a la salida valvulada de la bomba del agua, cuya entrada se ha situado en la fuente de agua. Trabájese durante algunos minutos sin colocar un adsorbente de virus con objeto de purgar la unidad de solución de cloro. Recójase una muestra de la salida del medidor para asegurarse de que ya no hay cloro. e) Primera concentración: Tras preparar el aparato de concentración y las soluciones aditivas y comprobar el acondicionamiento del agua de forma que su pH sea adecuado y no exista cloro, coloquese el filtro adsorbente de virus en la salida del sistema de aditivos químicos. Únase el medidor de agua y la conducción flexible eferente a la salida del filtro de adsorción. Regístrese la lectura inicial del medidor y añádase este valor al volumen que se quiere procesar añadiendo un 1 o 2 por 100 adicional (para considerar el volumen de las soluciones aditivas 1 ó 2, respectivamente). Ello da como resultado la lectura del medidor a la que se detendrá el procesado de la muestra. Inicíese el paso del agua y póngase en marcha un reloj (o anótese el momento en que se ha comenzado la operación). Inmediatamente después de iniciada la filtración, tómese una muestra en la salida del filtro y compruébese la ausencia de cloro y el valor adecuado del pH. Compruébese además la velocidad de flujo, que no debe superar los 40 l/minuto. Vuélvase a comprobar el pH, así como los residuos de cloro varias veces a lo largo de la operación. Cuando se haya procesado el volumen deseado, ciérrese el paso del agua y púrguense los filtros del exceso de agua mediante una presión positiva pro-

9-194

cedente de una fuente de aire o nitrógeno. f) Lavado y extracción de los virus: Si se ha utilizado AlCl3 o MgCl2, lávese el exceso de Al3+ o de Mg2+ del filtro con 4 l de NaCl 0,14N. No es necesario lavar si sólo se ha utilizado HCl. colóquese la solución de lavado en un vaso de presión de 4 l y déjese que pase a través del filtro mediante presión positiva. Púrguese el filtro del exceso de solución de lavado con presión positiva y deséchese el agua filtrada. Mediante una técnica aséptica, realícese la extracción del virus de los filtros lo más rápidamente posible, tanto si se trabaja en condiciones de campo como si se hace en el laboratorio. Si hay que guardar los portafiltros con los virus adsorbidos hasta llegar al laboratorio, séllense sus aperturas, colóquense en bolsas de plástico estéril y enfríense. Para hacer la extracción de los virus tras la primera concentración en los filtros de adsorción utilícese glicina-NaOH a pH 10,5 u 11,5, o extracto de buey a pH 9,0. Como algunos virus se inactivan cuando se usa glicina-NaOH a un pH 11,5, es preferible hacer la extracción con este compuesto a pH 10,5 o con extracto de buey a pH 9,0 l , 3 , 4 . Para hacer la extracción, sitúese el extractor en un vaso de presión a unos volúmenes mínimos de 10 y 300 ml para los cartuchos y los filtros de disco de 293 mm de diámetro, respectivamente. Si la extracción se hace con glicina-NaOH a pH 11,5, conéctese el vaso de presión a la entrada al portafiltros y con la válvula de liberación de presión abierta aplíquese una pequeña presión positiva al sistema de manera que el extractor rellene los espacios vacíos del portafiltros. Cuando el extractor comienza a fluir por la válvula de liberación de presión, ciérrese ésta rápidamente. Fíltrese el resto del extractor lentamente por el filtro en 1-2 minutos y recójase el filtrado (extracto) en un vaso de precipitación estéril de 2 o

MÉTODOS NORMALIZADOS

4 l. Cuando deja de fluir filtrado, auméntese lentamente la presión para forzar al resto del líquido a que salga del filtro. Si se utiliza glicina-NaOH a pH 11,5 compruébese de inmediato el pH del filtrado y, si es inferior a 11,0, manténgase la extracción con otro litro de glicinaNaOH a pH 11,5. Tras comprobar el pH, ajústese el pH del filtrado entre 7,5 y 9,5 con glicina-HCl a pH 1,5 mientras se mezcla enérgicamente. Complétese la extracción y ajústese el pH a 7,5 a 9,5 a los 5 minutos o antes para evitar la posibilidad de que se produzca una inactivación apreciable del virus. Para hacer una extracción con glicinaNaOH a pH 10,5, utilícese una extracción de lote o de flujo continuo con recirculación. Para el método de lote, iníciese la extracción como en el caso de la glicina-NaOH a pH 11,5, recójase el filtrado, mídase el pH y reajústese a un pH de 10,5 con NaOH 1,0 o 0,1N a la vez que se mezla enérgicamente. A continuación, utilizando este extracto, realícense otras cuatro extracciones de los filtros, reajustando el pH de filtrado a 10,5 antes de cada nueva extracción. Tras la quinta, ajústese el pH del filtrado hasta un pH de 7,4 mediante glicina-HCl a pH 1,5 o con HCl 1,0N a la vez que se mezcla enérgicamente. También puede hacerse la extracción con glicina-NaOH a pH 10,5 mediante un sistema de recirculación continua. Introdúzcase el extractor en un vaso de precipitado estéril. Únanse tuberías cortas de vinilo o caucho estéril a la entrada y salida del portafiltros y colóquense los extremos libres de los tubos en el vaso de precipitado donde cae el extracto, deslizando la parte media de la tubería conectada a la entrada del filtro en una bomba peristáltica o de rodillo. Ábrase la válvula de liberación de presión del portafiltros y conéctese la bomba a velocidad lenta, de manera que el líquido diluyente llene el portafiltros. Cuando el diluyente comience a manar por la válvula de libe-

EXAMEN MICROBIOLOGICO DE LAS AGUAS

ración de la presión, ciérrese ésta rápidamente. Auméntese la velocidad de la bomba de manera que el extracto recircule a través del conjunto del filtro y del vaso de precipitado a una velocidad de 100 ml/minuto. Tras 5 minutos de recirculación, retírese el tubo de la entrada del filtro del vaso de precipitado y realícese un bombeo del líquido restante del conjunto del filtro. Conéctese la entrada del filtro a una fuente de presión positiva para forzar la salida del extracto del filtro. Ajústese el pH del extracto a 7,4 con glicina-HCl a pH 1,5 o con HCl 1,0N a la vez que se mezcla enérgicamente. Para hacer la dilución con extracto de buey al 3 por 100 y un pH de 9,0, sígase el procedimiento antes descrito para la glicina-NaOH a pH 11,5. Ajústese el filtrado recogido a un pH de 7,4 con glicina-HCl a pH 1,5 o con HCl 1N a la vez que se mezcla enérgicamente. Cuando se utiliza el extracto de buey no es preciso limitar el tiempo necesario para hacer la extracción completa a 5 minutos, como sucede con la glicina-NaOH a pH 11,5. g) Reconcentración del extracto primario: Realícese la posterior concentración (reconcentración) de los virus del extracto primario mediante floculación orgánica, adsorción-precipitación en Al(OH) (sección 9510D), hidroextracción-diálisis con polietilenglicol (sección 9510E) o con adsorción y dilución de filtros de microporo. Esta última técnica sólo puede utilizarse para extractos de glicina u otros tampones orgánicos. Para concentrar a los virus (reconcentrarlos) de los extractos de glicina mediante adsorción y extracción de los filtros, ajústese el pH a 3,5 con glicina-HCl a pH 1,5 y añádase AlC13 hasta alcanzar una concentración final de 0,0015N a la vez que se mezcla enérgicamente. Pásese la muestra a un vaso de presión de 4 l. Fíltrese a través de una serie de filtros de fibra de vidrio-resina acrílica de 47 mm

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de diámetro y de 3,0, 0,45 y 0,25 µm de porosidad a una velocidad no superior a 130 ml/minuto y deséchese el filtrado. Lávense los filtros con 25 ml de NaCl 0,1 4N para eliminar el exceso de Al3 +. Llévese directamente con la pipeta la solución de NaCl a la entrada del filtro o colóquese en un pequeño vaso de presión conectado a la entrada de éste. Utilícese presión positiva para hacer pasar la solución por el filtro y deséchese el filtrado. Extráiganse los virus del filtro con porciones de 7 ml de glicina-NaOH a pH 10,5 u 11,5 o con extracto de buey al 3 por 100 a pH 9,0. Llévense directamente con la pipeta 7 ml del extractor a la entrada del portafiltros o colóquense en un pequeño vaso de presión positiva. Aplíquese ésta cuidadosamente para que el extractor fluya lentamente por el envase estéril a partir de la entrada al portafiltros. Cuando deja de salir, auméntese la presión para obligar a que mane el líquido retenido en los filtros. Si se utiliza glicina-NaOH a pH 11,5, mídase el pH del extracto y ajústese de inmediato a 7,5 a 9,5 con glicina-HCl a pH 1,5. Repítase la extracción con otros 7 ml de glicinaNaOH a pH 11,5. La reconcentración ha de completarse en 5 minutos. Si la porción inicial del extracto tiene un pH inicial mínimo de 11,0, repítase la extracción con otras porciones de 7 ml de glicina-NaOH a pH 11,5 hasta que la porción del extracto emergente tenga un pH 11,0 como mínimo. A continuación, mézclense todos los extractos. Si se utiliza glicina-NaOH a pH 10,5, realícense cinco extracciones sucesivas con volúmenes de 7 ml de extractor. Después de cada una de ellas, vuélvase a ajustar el pH del extractor a 10,5 con NaOH 0,1 N mientras se mezcla enérgicamente. Tras la quinta extracción, ajústese de nuevo el pH del extracto, ahora a 7,4 con glicina-HCl a pH 1,5 o con HCl 0,1N a la vez que se mezcla enérgicamente. Si se utiliza extracto de buey al 3 por 100 y pH 9,0, realícese la extracción con

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MÉTODOS NORMALIZADOS

volúmenes de 7 ml, combínense los filtrados y ajústese el pH a 7,4. Mídase el volumen total del extracto. En el caso de extractos de glicina, añádase un 1/10 del volumen medido de solución salina equilibrada de Hanks 10 x y medio nutritivo 10 x. Añádanse a todos los extractos volúmenes adecuados de antibióticos (1/10 del volumen de penicilina-estreptomicina o 1/100 del volumen de gentamicina-kanamicina, o ambos). Consérvese a 4 o a –70 °C, según el tiempo que retrase el análisis de virus. Vuélvase a concentrar el virus existente en el extracto de buey por precipitación a pH 3,5 (íloculación orgánica). También pueden reconcentrarse los virus de los extractos de glicina con esta técnica, suplementándola antes con extracto de buey hasta una concentración final de 1 a 3 por 100. Empléese pasta estéril de extracto de buey (alrededor de un 80 por 100 de extracto de buey) o una solución estéril de extracto de buey al 20 por 100 reconstruida a partir de polvo, hasta conseguir que el extracto del virus en glicina tenga la concentración deseada de extracto de buey. Mientras se mezcla enérgicamente, ajústese el extracto a un pH de 3,5 añadiendo HCl 1N gota a gota. Manténgase la muestra a velocidad lenta durante 30 minutos y centrifúguese a 3.000 x g durante 10 minutos. Decántese y deséchese el sobrenadante. Mezclando enérgicamente, hágase una resuspensión del sedimento en una canti-

9510 D.

1.

dad de Na2HPO4 equivalente a 1/20 del volumen inicial de la muestra. Añádanse los antibióticos (1/10 del volumen final de la muestra de penicilina-estreptomicina, 1/100 del volumen final de la muestra de gentamicina-kanamicina, o ambos) y, mientras se mezcla vigorosamente, ajústese el pH a 7,4 con NaOH 1,0 o 0,1N. Compruébese la conductividad eléctrica de la muestra y si es mayor de 13.000 µmhos, dialícese la muestra con solución salina equilibrada de Hanks antes de guardarla. Consérvese a 4 o –70 °C, en función del tiempo que vaya a transcurrir antes del análisis del virus. 6. 1.

2.

3.

4.

Referencias KATZENELSON, E., B. FATTAL & T. HOSTOVESKY. 1976. Organic flocculation: an efficient second-step concentration method for the detection of viruses in tapwater. Appl. Environ. Microbiol. 32:638. BITTON, G., B. N. FELDBERG & S. R. FARRAH. 1979. Concentration of en tero viruses from seawater and tap water by organic flocculation using non-fat dry milk and casein water. Air Soil Pollut. 10:187. PAYMENT, P. & M. TRUDEL. 1980. A simple low cost apparatus for conditioning large volumes of water for virological analysis. Can. J. Microbiol. 26:548. PAYMENT, P. & M. TRUDEL. 1981. Improved method for the use of proportioning injectors to condition large volumes of water for virological analysis. Can. J. Microbiol. 27:455.

Concentración de virus por adsorción-precipitación de hidróxido de aluminio (PROPUESTA)

Discusión general

Los virus de pequeños volúmenes de aguas limpias y residuales y de los extractos de los filtros de adsorción pue-

den concentrarse mediante precipitación con hidróxido de aluminio1, 4. Es probable que en este proceso participen interacciones electrostáticas entre la superficie vírica de carga negativa y la carga positiva

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EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

del hidróxido de aluminio [Al(OH)3], así como la coordinación de la superficie del virus por los complejos de hidroxoaluminio5. Los virus son adsorbidos a un precipitado de Al(OH)3 que se agrega a la muestra o se forman en ellas a partir de una sal soluble de aluminio y una base del tipo del carbonato de sodio (Na2CO3) o hidróxido de sodio (NaOH). Se deja que los virus sean adsorbidos al precipitado de Al(OH)3 y se recogen las partículas que los contienen mediante filtración o centrifugación. El precipitado recuperado puede inocularse directamente en huéspedes de laboratorio adecuados para análisis de virus o extraerse los virus del precipitado con un tampón alcalino o una solución proteinácea antes de proceder a su análisis. Las principales limitaciones de este método consisten en que el tamaño de la muestra se limita a un máximo de algunos litros, la materia orgánica soluble puede interferir con la adsorción del virus y puede obtenerse una recuperación incompleta del virus. Es posible mejorar la adsorción del virus si se forman los precipitados de Al(OH)3 en la muestra en lugar de añadirlos ya preformados. Aunque la adsorción del virus puede alcanzar un máximo si se recurre a grandes cantidades de Al(OH)3, en este caso, los virus son más difíciles de extraer. Por tanto, ha de utilizarse una cantidad intermedia de Al(OH)3 para conseguir la máxima recuperación posible de virus. El Al(OH)3 es un adsorbente de virus relativamente inespecífico, por lo que permite la concentración de sustancias distintas de los virus. La presencia de este tipo de impurezas puede dar lugar a toxicidad de la muestra concentrada para los cultivos celulares que suelen emplearse en los análisis de virus. Se han utilizado diversas modificaciones del procedimiento de adsorción-precipitación con Al(OH)3 para concentrar los virus de aguas limpias y residuales y de extractos procedentes de filtros de ad-

sorción. En principio, se añadían precipitados preformados de Al(OH)3 obtenidos por adición de Na2CO3 a soluciones de AlC13 y resuspensión del precipitado de Al(OH)3 en NaCl 0,15N. Se añadía a las aguas residuales agitándose suavemente la mezcla durante 1 hora o más para hacer posible la adsorción del virus al precipitado. A continuación, se recuperaba este precipitado mediante filtración, se resuspendía en un medio de cultivo celular y se inoculaba en los correspondientes cultivos de células3, 4. Más recientemente, se han realizado algunas modificaciones, como: a) la formación del precipitado de Al(OH)3 por centrifugación seguida de la extracción de los virus del precipitado por medio de extractores alcalinos1, 2, 6, 8; b) la recuperación del precipitado por medio de extractores alcalinos1, 2, 6, 7, y c) un método para grandes volúmenes en el que se forma el precipitado en la muestra y se recoge en un filtro de cartucho, extrayéndose los virus del precipitado del filtro con un extractor alcalino9. El método descrito en esta sección se utiliza para volúmenes relativamente pequeños y en él se utiliza Al(OH)3 preformado o generado en la propia muestra. Esta última alternativa es preferible en virtud de la eficaz adsorción de algunos virus en los precipitados preformados10.

2.

Equipo e instrumental

a) Centrifugador con rotor y cabezales capaces de funcionar a alrededor de 1900 x g. b) Tubos y recipientes para centrifugadores. c) Vaso de precipitación de 100 ml o superior. d) pHmetro. e) Agitador magnético y barras de agitación, o un aparato mezclador equivalente.

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f) Cilindros graduados de 100 ml o mayores. g) Pipetas de 1,5 y 10 ml. h) Balanza de laboratorio. i) Portafiltro de vacío o embudo de filtro de Buchner* de 47 mm o más de diámetro. j) Matraz de filtro*. k) Espátula * de hoja plana y de metal o plástico resistente al autoclave. l) Fuente de vacío*, bomba de vacío o conducción de vacío del laboratorio. 3.

Materiales

Filtro*: filtro de fibra de vidrio-resina acrílica† o filtro de microporo de 0,45 µm de porosidad‡ de 47 mm de diámetro o mayor. Para evitar la adsorción del virus, fíltrese una solución de monooleato de sorbitan polioxietileno al 0,1 por 100 (apartado 4h) por el filtro utilizando alrededor de 1 ml de solución por cm2 de superficie de filtro. Lávese con agua destilada utilizando alrededor de 10 ml/cm2. Esterilícense en el autoclave los filtros tratados. 4.

Reactivos

a) Ácido clorhídrico, HCl 0,1 y 1,ON b) Hidróxido de sodio, NaOH 0,1 y 1,0N. c) Cloruro de aluminio, AlC13 0,075N§ o 0,9N. d) Carbonato de sodio, NaCO3 4N§, e) Cloruro de sodio, NaCl 0,14 N. f) Extracto de buey al 3 por 100,

* Necesario para el método opcional de recuperación del Al(OH)3 precipitado en la muestra. † Millipore AP20 o equivalente. ‡ Millipore HA o equivalente. § Para el método alternativo en el que se utiliza un precipitado preformado de Al(OH)3.

MÉTODOS NORMALIZADOS

pH 7,4: Disuélvanse 3 g de pasta de extracto de buey o 2,4 g de polvo de extracto de buey en 90 ml de agua destilada, ajústese el pH a 7,4 con NaOH 1,0 o 0,1 N, diluyase a 100 ml con agua destilada y esterilícese en el autoclave. g) Antibióticos: Utilícese: 1) Penicilina-estreptomicina, 10 x, con 5.000 UI de penicilina/ml y 5.000 µg de estreptomicina/ml. Disponibles comercialmente o susceptibles de preparación, disolviendo penicilina G sódica o potásica en polvo y sulfato de estreptomicina en agua destilada y esterilizándolas por filtración. 2) Gentamicina-kanamicina, 100 x , con 5.000 µg/ml de gentamicina base y la misma cantidad de kanamicina base (sección 9510B.4i). h) Monooleato de sorbitan polioxietileno|| 0,1 por 100 (v/v) en agua destilada. 5.

Procedimiento

a) Esterilización del instrumental, materiales y reactivos: Véase la sección 9510B.5a. b) Preparación del precipitado de Al(OH)3 preformado: Mientras se mezclan 100 ml de AlC13 0,075N a temperatura ambiente, añádase lentamente una solución de Na2CO3 4N para formar un precipitado; ajústese el pH a 7,2. Continúese mezclando durante 15 minutos y, si es necesario, añádase más Na2CO3 para mantener el pH a 7,2. Centrifuguese a 1.100 x g durante 15 minutos y deséchese el sobrenadante. Vuélvase a suspender el sedimento en NaCl 0,14N y a centrifugar; deséchese el sobrenadante, vuélvase a suspender el sedimento en || Tween 80®, ICI United States, Inc., Wilmington, Delaware, o equivalente. Es necesario para el método opcional de recoger el precipitado de Al(OH)3 de la muestra.

EXAMEN MICROBIOLOGICO DE LAS AGUAS

9-199

NaCl 0,14N y esterilícese en autoclave. Enfríese, centrifuguese de nuevo, decántese el sobrenadante y vuélvase a suspender el sedimento de Al(OH)3 en 50 ml de NaCl 0,14N estéril. Almacénese a 4°C.

antes de que se haya filtrado la totalidad de la muestra. Extráigase cuidadosamente el precipitado del filtro con una espátula estéril y vuélvase a suspender extracto de buey al 3 por 100 a pH 7,4 en un volumen equivalente a 1/1.000 a 1/20 del volumen original de la muestra. Con independencia del método de recogida, hágase una enérgica mezcla del Al(OH)3 y la suspensión de extracto de buey y, si es necesario, ajústese el pH a 7,4 con HCl o NaOH 0,1N. Continúese la mezcla durante un total de 10 minutos. Centrifuguese a 1.900 x g durante 30 minutos. Decántese el sobrenadante, añádase 1/10 del volumen en concentrado de solución de penicilina-estreptomicina o 1/100 del volumen en gentamicina-kanamicina y almacénense a 4 o –70°C.

c) Tamaño, toma y almacenamiento de la muestra: Procésense muestras no superiores a algunos litros, ya que el método es demasiado complejo y largo para emplear grandes volúmenes. Véase la sección 9510B.5c sobre toma y conservación de muestras. d) Procesamiento de la muestra: No se hará prefiltrado de la muestra11, 12 ya que podría determinar una pérdida sustancial de virus. Ajústese el pH a 6,0 con HCl l,0 o 0,1 N mientras se mezcla enérgicamente. Fórmese el precipitado de Al(OH)3 en la muestra añadiendo una parte de AlC13 0,9N a 100 partes de muestra para conseguir una concentración final 0,009N de Al3 + . Compruébese el pH de la muestra y vuélvase a ajustar a 6,0 con NaOH 1,0 o 0,1 W, o con HCl si es necesario. Mézclese lentamente durante 15 minutos a temperatura ambiente. También puede utilizarse un precipitado de Al(OH)3 preformado añadiendo una parte de solución madre de Al(OH)3 a 100 partes de la muestra y mezclando lentamente durante 2 horas a 4 a 10 °C para dejar que se produzca la adsorción de los virus. Recupérese el precipitado de Al(OH)3 que contiene los virus mediante centrifugado o filtración. En el primer caso, centrifuguese a 1.700 x g durante 15 a 20 minutos, elimínese el sobrenadante y vuélvase a suspender el sedimento en extracto de buey al 3 por 100 y pH 7,4 en cantidad equivalente a 1/1.000 a 1/20 del volumen original de la muestra. Para recuperar el precipitado mediante filtración, fíltrese la muestra al vacío a través de un filtro tratado (véase apartado 3 anterior) en un portafiltros de tipo vacío o un embudo de Buchner con un filtro adicional si el primero se obtura

6.

Referencias

1. PAYMENT, P., C. P. GERBA, C. WALLIS & J. L. MELNICK. 1976. Methods for concentrating viruses form large volumes of estuarine water on pleated membranes. Water Res. 10:893. 2. FARRAH, S. R., S. M. GOYAL, C. P. GERBA, C. WALUS & J. L. MELNICK. 1977. Concentration of enteroviruses from estuarine water. Appl. Environ. Microbiol. 33:1192. 3. WALLIS, C. & J. L. MELNICK. 1967. Concentration of viruses on aluminum hydroxide precipitates. En G. Berg. ed. Transmission of Viruses by the Water Route. Interscience Publ., Nueva York. 4. WALLIS, C. & J. L. MELNICK. 1967. Virus concentration on aluminum and calcium salts. Amer. J. Epidemiol. 85:459. 5. COOKSON, J. T., JR. 1974. The chemistry of virus concentration by chemical methods. Develop. lnd. Microbiol. 15:160. 6. LYDHOLM, B. & A. L. NIELSEN. 1979 Methods for detection of virus in wastewater applied to samples from small scale treatment systems. Water Res. 14:169. 7. SELNA, M. W. & R. P. MIELE. 1977. Virus sampling in wastewater-field experiences. J. Environ. Eng. Div., Proc. Amer. Soc. Civil Eng. 103:693.

9-200

MÉTODOS NORMALIZADOS

8.

DOBBERKAU, H. J., R. WALTER & S. RUDIGER. 1981. Methods for virus concentration from water. En M. Goddard & M. Butler, eds. Viruses and Wastewater Treatment. Pergamon Press, Nueva York. 9. FARRAH, S. R., C. P. GERBA, C. WALLIS & L. MELNICK. 1978. Concentration of poliovirus from tapwater onto membrane filters with aluminum chloride at ambient pH levéis. Appl. Environ. Microbiol. 35:624. 10. FARRAH, S. P., G. M. GOYAL, C. P. GERBA, R. H. CONKLIN & E. M. SMITH. 1978. Com-

9510 E.

1.

parison between adsorption of poliovirus and rotavirus by aluminum hydroxide and activated sludge flocs. Appl. Environ. Microbiol. 35:360. 11. SOBSEY, M. D., C. P. GERBA, C. WALLIS & J. L. MELNICK. 1977. Concentration of enteroviruses from large volumes of turbid estuary water. Can. J. Microbiol. 23:770. 12. HOMMA, A., M. D. SOBSEY, C. WALLIS & J. L. MELNICK. 1973. Virus concentration from sewage. Water Res. 7:945.

Hidroextracción-diálisis con polietilenglicol (PROPUESTA)

Discusión general

La hidroextracción en polietilenglicol (PEG) es un proceso de ultrafiltración en el que se coloca la muestra en una bolsa de diálisis de celulosa y se expone al PEG, que es un material higroscópico. El agua y los microsolutos abandonan la muestra cruzando la membrana semipermeable de diálisis para unirse al higroscópico PEG1. Los virus y otros macrosolutos, como el propio PEG, no pueden traspasar la membrana de diálisis. Los virus que se encuentran en la bolsa de diálisis se recuperan abriéndola, y recogiendo el resto de muestra y haciendo una extracción de los virus posiblemente adsorbidos en las paredes internas de la bolsa mediante un pequeño volumen de una solución proteinácea ligeramente alcalina del tipo del extracto de buey al 3 por 100 con un pH de 9,0. El concentrado recogido y el extracto se combinan y se procede a hacer el análisis de virus. Las principales limitaciones de este método provienen de que sólo es aplicable a pequeños volúmenes (menores de 1 l), la extracción de los virus de las paredes de la bolsa de diálisis puede resultar incompleta a menos que se haga de una

forma muy concienzuda y los demás macrosolutos concentrados en la muestra junto a los virus son susceptibles de interferir con el análisis de éstos, al ser citotóxicos. Las investigaciones iniciales sobre este método obtuvieron recuperaciones bajas y muy variables en aguas residuales2, 3. Se ha observado que tanto el tipo de conducciones de diálisis y de solución extractora como el cuidado con que se realice el paso de la extracción influyen en la eficacia de la recuperación de los virus. Más recientemente, se ha modificado el procedimiento y se han conseguido recuperaciones más eficaces y constantes a partir de aguas residuales y de extractos de filtros de adsorción4, 5. 2.

Equipo e instrumental

a) Vasos de precipitado de 100 ml o mayores. b) Cilindros graduados de 100 ml o mayores. c) Pinzas para los tubos de diálisis*. * Fisher Scientific n.° 8-670-11A o equivalente.

EXAMEN MICROBIOLOGICO DE LAS AGUAS

9-201

d) Cazoleta de alrededor de 30 x 30 x x 12 cm, resistente al autoclave. e) Agitador magnético y barras de agitación o aparato mezclador equivalente. f) Centrifugador con rotor y cabezales capaces de operar a alrededor de 1.900 x g. g) pHmetro. h) Pipetas de 1,5 y 10 ml. i) Rodillo† o dispositivo similar que permita el lavado de las paredes interiores de las bolsas de diálisis con líquido extractor. j) Disruptor-emulsionador de ultrasonido‡ de tipo sonda capaz de generar 100 W de salida acústica.

9510B.5c sobre toma y almacenamiento de muestras. c) Preparación de las tuberías de diálisis: Córtese un trozo de tubería de diálisis suficientemente largo capaz de contener la totalidad de la muestra. Ciérrese uno de sus extremos con una pinza. No deben hacerse nudos para cerrar este tipo de tuberías. Llénese la bolsa del tubo con agua destilada, esterilícese con un autoclave y déjese enfriar. d) Procesamiento de la muestra: Retírese asépticamente la bolsa de diálisis del agua destilada. Llénese con la muestra y ciérrese el extremo abierto con una segunda pinza. Coloquese la bolsa en una cazoleta con una capa de 5 cm de PEG asegurándose de que no toque sus paredes. Cúbrase la tubería con otros 5 cm de PEG y consérvese a 4°C durante unas 18 horas, hasta que el volumen de la muestra se haya reducido a no más de algunos mililitros (si se utiliza PEG 6.000, el tiempo de procesamiento se reduce a 4 ó 6 horas). Aunque puede permitirse que la muestra pierda por completo el agua, no debe dejarse que permanezca en ese estado. Retírese la bolsa de diálisis del PEG y lávese rápidamente el que quede fuera de ella con agua destilada estéril. Retírese la pinza de uno de los extremos de la bolsa y recójase cuidadosamente la muestra concentrada. Añádanse alrededor de 1/200 a 1/20 del volumen de la muestra original de extracto de buey al 3 por 100 a un pH de 9,0 y vuélvase a pinzar. Lávense cuidadosamente las paredes interiores con el extracto de buey desplazando varias veces el líquido de uno a otro extremo utilizando para ello los dedos o un rodillo. Quítese una de las pinzas y recójase el líquido sacudiendo o golpeando para que no quede ningún residuo. Añádase el líquido recuperado al concentrado de la muestra previamente recogido. Ajústese el pH a 7,5 con HCl l,0 o 0,1N mientras se mezcla enérgicamente.

3.

Materiales

a) Tubería para diálisis, sin uniones y de celulosa regenerable con un diámetro medio de poro de 4,8 nm §. b) Polietilenglicol (PRG)||, escamas secas. 4.

Reactivos

Véase sección 9510D.3. 5.

Procedimiento

a) Esterilización del instrumental, equipo y reactivos: Véase sección 951OB.5a. No esterilizar el PEG. b) Tamaño, toma y conservación de la muestra: El volumen de las muestras a procesar no será superior a algunos cientos de mililitros. Véase la sección † Opcional. Fisher Scientific n.° 14-245-21 o equivalente. ‡ Opcional. § Fabricado por Union Carbide Corp., y disponible en muchas compañías de suministros científicos. || Carbowax® 20.000 o 6.000 o equivalente.

9-202

Para dispersar los virus asociados a los sólidos, agítese durante alrededor de 18 horas en frío (a unos 4 °C) o trátese con ultrasonidos a 100 W durante 1 a 2 minutos. Evítese que la temperatura de la muestra supere los 37 °C durante el tratamiento con ultrasonidos, para lo cual puede recurrirse a un baño con hielo. Centrifuguese a 1.900 x g durante 30 minutos. Decántese el sobrenadante, añádase un volumen de 1/10 del concentrado de una solución de penicilinaestreptomicina o un volumen 1/100 de gentamicina-kanamicina y almacénese a 4 ó –70 °C. 6. 1.

Referencias SOBSEY, M. D. 1976. Methods for detecting enteric viruses in water and wastewater. En

MÉTODOS NORMALIZADOS

2.

3.

4.

5.

G. Berg, H. L. Bodily, E. H. Lennette, J. L. Melnick & T. G. Metcalf, eds. Viruses in water. American Public Health Assoc, Washington, D.C. CLIVER, D. O. 1967. Detection of enteric viruses by concentration with polyethylene glycol. En G. Berg., ed. Transmission of Viruses by the Water Route. Interscience Publ., Nueva York. SHUVAL, H. I., S. CYMBAUSTA, B. FATTAL & N. GOLDBLUM. 1967. Concentration of enteric viruses in water by hydro-extraction and two-phase separation. En G. Berg., ed. Transmission of Viruses by the Water Route. Interscience Publ., Nueva York. WELLINGS, F. M., A. L. LEWIS, C. W. MOUNTAIN & L. V. PIERCE. 1975. Demonstraron of virus in groundwater after effluent discharge onto soil. Appl. Microbiol. 29:751. RAMIA, S. & S. A. SATTAR. 1979. Second-step concentration of viruses in drinking and surface waters using polyethylene glycol hydroextraction. Can. J. Microbiol. 25:587.

9510 F. Recuperación de virus a partir de sólidos en suspensión en aguas limpias y residuales (PROPUESTA)

1.

Discusión general

Los virus existentes en un ambiente acuático suelen estar asociados a sólidos o a partículas materiales, adsorbidos en la superficie de estas partículas o incluidos en los sólidos1, 3. Tanto los virus suspendidos libremente como los asociados a los sólidos se concentran a partir del agua por los métodos antes descritos. Existen pruebas de que los virus asociados a sólidos no son extraídos de forma eficaz por los filtros de adsorción, los precipitados de Al(OH)3 o los floculados orgánicos. La recuperación de los virus asociados a los sólidos mediante un método de filtro de microporo utilizando una extracción in situ es inconstante2.

Los virus asociados a sólidos que son adsorbidos en los filtros se extraen mejor mediante una disrupción de estos filtros en el líquido de extracción que por extracción in situ1, pero ello es molesto y largo, sobre todo cuando se trata de filtros de disco de gran diámetro o filtros de cartucho. Para volúmenes pequeños de aguas limpias y residuales puede hacerse una extracción de los virus asociados a sólidos separando los sólidos mediante centrifugación, decantando el sobrenadante y haciendo la extracción de los virus por resuspensión en un pequeño volumen de extractor4. Los virus existentes en el sobrenadante pueden concentrarse mediante uno de los procedimientos descritos en

9-203

EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

las secciones 9510B, C, D o E. Los virus extraídos de los sólidos resuspendidos se separan de los sólidos por centrifugación y se analizan directamente o tras su concentración con ayuda de una floculación orgánica5, 6. Las principales limitaciones de estos métodos son la incompleta extracción de los virus y la mala recuperación de los mismos debido a las interferencias que provocan los demás componentes de la muestra.

2.

Equipo e instrumental

a) Centrifugador, con rotor y cabezales para 250 a 1.000 ml de capacidad y que soporten una velocidad de alrededor de 1.250 x g. b) Tubos de centrifugador de 250 a 1.000 ml. c) pHmetro. d) Balanza de laboratorio. e) Cilindro graduado de 250 ml o más. f) Vaso mezclador de 250 ml o mayor. g) Botellas de muestra de 250 ml o mayores. h) Agitador magnético y barras de agitación, o aparato mezclador equivalente. i) Pipetas de 1,5 y 10 ml.

3.

Reactivos

a) Ácido clorhídrico, HCl 0,1 y 1,0N b) Hidróxido de sodio, NaOH 0,1 y l,0N. c) Extractor: Disuélvanse 10 g de extracto de buey, 1,34 g de fosfato de disodio heptahidratado Na2HPO · 7H2O y 0,12 g de ácido cítrico en 90 ml de agua destilada, ajústese el pH a 7,0 con HCl o NaOH 1N, diluyase a 100 ml con agua destilada y esterilícese en el autoclave. d) Antibióticos: Véase sección 9510B.4i.

4.

Procedimiento

a) Esterilización del instrumental, materiales y reactivos: Véase la sección 9510B.5a. b) Tamaño, toma y conservación de la muestra: Las muestras en proceso no serán mayores de 10 l, en función de la capacidad del centrifugador. Véase la sección 9510B.5c sobre la toma y almacenamiento de muestras. c) Procesamiento de la muestra: Sitúense asépticamente 250-1.000 ml de muestra en los tubos de centrifugación y centrifuguese a 1.250 x g durante 20 minutos. Decántense y consérvense juntos los sobrenadantes para posteriores estudios de virus por uno de los métodos antes descritos para aguas limpias y residuales. Extráiganse los virus de los sedimentos sólidos haciendo una resuspensión en extractor. Utilícense para ello 40 ml de extractor por cada 250 ml de muestra original. Mézclense los sedimentos resuspendidos procedentes de varios tubos de centrifugación en un vaso de precipitación estéril. También pueden conservarse los sedimentos resuspendidos procedentes de un número pequeño de tubos de centrifugación en los propios tubos y procesarlos de manera individual. Mientras se mezcla enérgicamente con un agitador magnético, ajústese el pH a 7,0 añadiendo lentamente NaOH o HCl lN. Redúzcase la velocidad de agitación y continúese mezclando durante 30 minutos. En este período, compruébese el pH de la muestra y vuélvase a ajustar a 7,0 cuando sea necesario. También puede optarse por una exposición a ultrasonidos a 100 W durante 15 minutos en una célula de enfriamiento de roseta mantenida a 4 °C. A continuación, vuélvase a colocar la muestra en los tubos y centrifuguese a 1.250 x g a 41°C durante 15 minutos, recójase el sobrenadante para posteriores análisis o reconcentraciones y deséchese el sedimento.

9-204

MÉTODOS NORMALIZADOS

Puede hacerse una reconcentración de virus del sobrenadante mediante floculación orgánica (véase sección 9510E). Si se va a efectuar un análisis directo de virus sin nuevas concentraciones, ajústese el pH a 7,4, añádase 1/10 del volumen de la muestra en penicilina-estreptomicina o 1/100 de gentamicina-kanamicina y consérvese a 4 o –70 °C.

5.

Referencias

4. 5.

1. SCHAUB, S. A. & B. P. SAGIK. 1975. Association of enteroviruses with natural and artificially introduced conoidal solids in water and infectivity of solids-associated virions. Appl. Microbiol. 30:212. 2. WELLINGS, F. M., A. L. LEWIS & C. W. MOUNTAIN. 1976. Viral concentration tech-

9510 G.

3.

6.

niques for field sample analysis. En L. B. Baldwin, J. M. Davidson & J. F. Gerber, eds. Virus Aspects of Applying Municipal Waste to Land. Univ. Florida, Gainesville. WELLINGS, F. M., A. L. LEWIS & C. W. MOUNTAIN. 1974. Virus survival following wastewater spray irrigation of sandy soils. En J. F. Malina, Jr. & B. P. Sagik, eds. Virus Survival in Water and Wastewater Systems. Univ. Texas, Austin. BERG, G. & D. R. DAHLING. 1980. Method for recovering viruses from river water solids. Appl. Environ. Microbiol. 39:850. GERBA, C. P. 1982. Detection of viruses in soil and aquatic sediments. En C. P. Gerba & S. M. Goyal, eds. Methods in Environmental Virology. Marcel Dekker, Inc., Nueva York. FARRAH, S. R. 1982. Isolation of viruses associated with sludge particles. En C. P. Gerba & S. M. Goyal, eds. Methods in Environmental Virology. Marcel Dekker, Inc., Nueva York.

Ensayo e identificación de virus en concentrados de muestra (PROPUESTA)

1. Almacenamiento de las muestras concentradas

Como con frecuencia resulta imposible analizar de inmediato los concentrados de muestras, éstos deben conservarse a temperatura ambiente (alrededor de 25 °C) durante un tiempo no superior a 2 horas, o a temperaturas de frigorífico (4 a 10 °C) hasta un máximo de 48 horas para evitar en lo posible las pérdidas de virus. Las muestras que han de ser conservadas durante más de 48 horas requieren congelación a –70 °C o menos. No deben congelarse muestras a –10 o –20°C, ya que puede producirse una importante activación de algunos virus entéricos. Las muestras concentradas procedentes de aguas acabadas se conservarán en congeladores in-

dependientes o separadas físicamente de otras que contengan material vírico si se guardan en congeladores corrientes. 2. Descontaminación de las muestras concentradas

Las muestras concentradas, sobre todo las de aguas residuales, están a menudo contaminadas con bacterias y hongos que pueden crecer sobre los cultivos celulares interfiriendo la detección y análisis de los virus. No deben descontaminarse por centrifugación o filtración, ya que podría inducirse la pérdida de virus. En muchos tipos de muestras, en especial las procedentes de aguas acabadas, se puede controlar la contaminación de una manera adecuada mediante la adición de

9-205

EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

antibióticos, como penicilina-estreptomicina o gentamicina-kanamicina, que se añaden inmediatamente después de la toma de la muestra. Para conseguir una protección adicional frente a la contaminación por hongos, añádase anfotericina B o nistatina a concentraciones de 2,5 y 50 µg/ml, respectivamente1. Si la penicilina-estreptomicina o la gentamicina-kanamicina resultan inadecuadas, utilícense uno o más antibióticos del tipo de aureomicina, neomicina o polimixina B. Para conseguir el máximo efecto antibiótico, incúbense las muestras durante 1 a 3 horas a 25 a 37 °C tras la adición de aquéllos. Se facilita la mayor destrucción bacteriana congelando a –70 °C después de la incubación. Las muestras se mantienen congeladas hasta el momento de su análisis. Para determinar la eficacia del tratamiento antibiótico, siémbrese una pequeña cantidad de muestra en un medio de uso universal, como una placa de recuento de agar, utilizando una técnica de placa difusa con incubación a 37 °C durante 24-48 horas. Si a pesar del tratamiento antibiótico persiste una considerable contaminación bacteriana, utilícese el cloroformo. Añádase 1/10 del volumen de la muestra de dicho producto (CHCl3) y mézclese enérgicamente durante 30 minutos a temperatura ambiente, o bien homogeneícese durante 1-2 minutos a 4 a 10 °C. Para hacer la separación de fases, centrifuguese a 1.000 o más x g o manténgase en un frigorífico durante la noche. Sepárese la muestra (capa superior) del CHCl3 (capa inferior) aspirando con una pipeta y burbujeando con aire esterilizado por filtro durante 15 minutos para eliminar el CHCl3 disuelto. Puede ser necesario colocar la muestra en un envase estéril y poco profundo y exponerla a una atmósfera de aire estéril (flujo laminar de aire, lejía doméstica o cabina de seguridad biológica) durante varias horas para eliminar los residuos de cloroformo. No se utilizará éter para des-

contaminar las muestras debido al peligro de explosión o de incendio.

3. Instalaciones de laboratorio y sistemas de huéspedes para el análisis de virus

Como los virus son parásitos intracelulares obligados, su crecimiento (multiplicación) sólo puede tener lugar en células vivas. Esta capacidad para multiplicarse en el interior de las células huéspedes y destruirlas constituye la base para su detección y análisis. Los dos principales sistemas de células huéspedes para los virus entéricos humanos son animales completos (en general, ratones) o cultivos de células de primates. La descripción completa del equipo, instrumental, materiales y métodos para el estudio de los virus escapa de los objetivos de este libro; para ello deben consultarse los manuales de virología y de cultivo celular1-4. El análisis de los virus sobrepasa la capacidad de la mayoría de los laboratorios microbiológicos dedicados al análisis de las aguas limpias y residuales y sólo debe hacerse por virólogos expertos que trabajan en un laboratorio de virología adecuadamente equipado. Hay que adoptar especiales precauciones para que las muestras o los huéspedes inoculados no se contaminen por virus de otras procedencias y evitar asimismo la contaminación cruzada proveniente de concentrados de muestras o de huéspedes inoculados. Procésense las muestras y manipúlense en cabinas de seguridad5 o en habitaciones o cubículos «estériles». El uso de estas cabinas es obligatorio cuando se hacen análisis de aguas potables o de otras muestras de aguas acabadas. No existe un único sistema universal para el cultivo de todos los virus entéricos. Algunos de ellos, en especial el de la hepatitis A, los rotavirus humanos y los

9-206

virus de la gastroenteritis de tipo Norwalk, no pueden ser estudiados de forma convencional en ningún sistema de huéspedes de los habituales en los laboratorios. Sin embargo, la mayoría de los virus entéricos conocidos pueden ser detectados mediante el empleo de dos o más sistemas de cultivo celular y tal vez ratones lactantes. Estos últimos fueron considerados esenciales para la detección de los virus Coxsackie del grupo A, si bien estudios recientes han indicado que la línea de células RD puede ser casi tan sensible como los ratones lactantes para el aislamiento de estos virus además de otros enterovirus6-7. En general, cuantos más sistemas de huéspedes se utilicen, mayor será el índice de recuperación de virus entéricos. Sin embargo, el número de sistemas de huéspedes distintos está limitado por razones prácticas y económicas. Se han realizado numerosos estudios comparativos sobre la sensibilidad relativa de varios sistemas de cultivo celular para la detección de los virus entéricos6-26, pero no se ha publicado ningún estudio sistemático y completo sobre la recuperación de los virus entéricos en las aguas limpias y residuales. Aparentemente, los cultivos celulares primarios o secundarios de riñon embrionario humano (HEK) constituyen el sistema de huésped más sensible a los aislamientos de virus entéricos, pero cada vez es más difícil obtenerlos de forma regular y, cuando pueden comprarse, resultan muy costosos. Las células renales primarias o secundarias de monos verdes africanos, cinomolgos o rhesus o babuinos son huéspedes sensibles para muchos enterovirus y reovirus, aunque no demasiado adecuadas para la recuperación de adenovirus o coxsackievirus del grupo A. La línea continua BGM derivada de las células renales del mono verde africano pueden tener una sensibilidad comparable a las primarias de células de riñon de mono para la recuperación de virus entéri-

MÉTODOS NORMALIZADOS

cos7, 18, 21, 25, 26. Se han estudiado diversas líneas celulares continuas, así como células diploides fetales humanas, en relación con su eficacia para la recuperación de virus entéricos. Algunas cepas de células diploides fetales humanas proporcionan índices de aislamiento de virus similares a los de las células primarias de riñon de mono, pero no es fácil conseguir un abastecimiento completo de cepas de células diploides fetales humanas específicas y muchas de ellas son difíciles de mantener. Además, ha de caracterizarse la susceptibilidad al virus de cada una de las diferentes cepas celulares. La mayoría de las líneas celulares continuas son normalmente menos efectivas que las primarias, aunque se han conseguido índices de aislamiento comparables para algunos virus entéricos con células Hep-211 y He-La17, 25. Analícese la totalidad del concentrado de la muestra utilizando al menos dos sistemas distintos de huéspedes y dividiendo la totalidad de la muestra en cantidades similares para cada uno de los sistemas. Es preferible utilizar células HEK primarias (o secundarias) junto a células primarias (o secundarias) de riñon de mono o BGM en el caso de recuperación de la mayoría de los enterovirus, adenovirus y reovirus. La utilización adicional de ratones lactantes o células RD proporciona una recuperación superior de coxsackievirus del grupo A. Pueden sustituirse distintos sistemas de huéspedes si se demuestra que la sensibilidad de los sustitutos es similar a la de los reemplazados. 4. Procedimientos de cuantificación de virus en muestras concentradas

a) Ventajas e inconvenientes de los distintos procedimientos de cuantificación: Los análisis de virus en ratones lactantes u otros animales son análisis cualitativos y en los cultivos celulares pueden aplicar-

EXAMEN MICROBIOLÚGICO DE LAS AGUAS

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se métodos cualitativos (número más probable o 50 por 100 del punto extremo) o cuantitativos (placa). La elección de entre los métodos de análisis de cultivo celular depende de la muestra y del deseo de conseguir una sensibilidad máxima al virus o una precisión y exactitud máximas en el cálculo de la concentración. La técnica de placa suele ser más precisa y exacta que el análisis semicuantitativo, ya que pueden contarse cantidades relativamente grandes de unidades infecciosas individuales como áreas de infección localizadas y separadas entre sí (placas). Los análisis semicuantitativos son más sensibles que los de placa monocapa si bien menos que los de suspensión de células en agar26. Dado que las placas de virus son áreas separadas de infección que surgen de una sola unidad infecciosa vírica, es relativamente fácil recuperar los virus de las placas individuales e inocularlos a continuación en otros cultivos celulares a fin de obtener cultivos puros de virus para su identificación. Sin embargo, se han observado grandes proporciones de las llamadas placas «positivas falsas», que no confirman la positividad del virus cuando el material procedente de estas placas se pasa a otros cultivos celulares27, 28. Aún no se conoce con exactitud si este problema procede de las áreas no víricas similares a placas y que se deben a la citotoxicidad de la muestra o a una incapacidad técnica para transferir los virus de manera satisfactoria a partir de las placas iniciales27-29. El uso de condiciones analíticas específicas de placa para mejorar los resultados de recuperación de determinados grupos de enterovirus puede impedir una eficaz recuperación de otros grupos entéricos que necesitan condiciones distintas. Además, algunos virus, como los adenovirus, no forman placas de una manera eficaz bajo ninguna condición. Es problemático controlar la citotoxicidad provocada por los componentes de las aguas

limpias o residuales en los sistemas de análisis de placa debido a la dificultad para eliminar o sustituir la capa de agar del medio. Una limitación potencial de los análisis semicuantitativos es la posibilidad de que se inoculen dos o más tipos distintos de virus en el mismo cultivo celular, lo que daría lugar a un solo cultivo positivo. Ello no sólo condiciona una subestimación de la concentración de virus, sino que también obliga a separar los diferentes tipos de virus mediante pasos posteriores por cultivos celulares. Estos cultivos mixtos pueden permanecer indetectados a no ser que se identifiquen los virus aislados por serología. Estudios recientes indican que es raro encontrar cultivos positivos mixtos si se dividen las muestras en porciones pequeñas inoculadas en series distintas de cultivos celulares7, 25. La citotoxicidad debida a los componentes de las muestras concentradas se controla normalmente en los análisis semicuantitativos de cultivos celulares si se sustituye el medio de cultivo antes de que las células mueran. b) Procedimientos de cultivo celular para el aislamiento y análisis de los virus:

Para analizar muestras concentradas en cultivos celulares por métodos semicuantitativos o de placa, drénese el medio de los cultivos confluentes recientes e inocúlese con volúmenes unitarios de la muestra. No deben utilizarse más de 0,06 ml de muestra/cm2 de superficie de capa celular, es decir, volúmenes máximos de 1,5, 4,5 y 7,4 ml en matraces de cultivo celular con áreas de 25, 74 y 150 cm2, respectivamente. Si se esperan muestras con tal cantidad de virus que pueda dificultar un cálculo fiable de la concentración, inocúlense los cultivos celulares pequeños con volúmenes de muestra o diluyase el concentrado. Déjese que los virus sean adsorbidos a las células durante 2 horas a 37 ± 0,5 °C. Redistribuyase manualmente el inoculo sobre la capa celular cada 15 minutos o manténgase el

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cultivo en un balancín mecánico durante el período de adsorción. En el caso de cultivos para análisis semicuantitativos, añádase el medio líquido de mantenimiento, y en el de análisis de placa, el medio que contiene agar. Incúbese a 37 °C e inviértase la placa del cultivo de forma que el lado de éste (el agar) quede boca arriba. Estudíense microscópicamente los cultivos del análisis semicuantitativo para detectar la aparición de los efectos citopáticos (ECP), diariamente durante los primeros 3 días y después de forma periódica durante un total de 14 días, como mínimo. No debe cambiarse el medio de cultivo celular a menos que la citotoxicidad o el deterioro celular sean evidentes. Los cultivos congelados desarrollan ECP a –70°C cuando se afectan más del 75 por 100 de las células. Transcurridos 14 o más días, congélense a –70 °C todos los cultivos remanentes, incluidos los negativos para el ECP y los de control. Descongélense los cultivos y aclárese el lisado del cultivo celular líquido mediante centrifugación a baja velocidad o filtración a través de un filtro estéril de 0,22 o 0,45 µm de porosidad. Inocúlese el material aclarado de cada uno de los cultivos iniciales en un segundo cultivo (segundo paso) transfiriendo un 20 por 100 del cultivo inicial total a los cultivos celulares confluentes recientes del mismo tipo. Examínense microscópicamente estos cultivos de segundo paso, observando el desarrollo de ECP a lo largo de un período de 14 o más días. Se considerará como positivo confirmado para virus el cultivo de segundo paso que desarrolle ECP. Congélese y consérvese a –70 °C para la identificación del virus. Deséchense los cultivos negativos en los que no aparezca ECP después de este segundo período de incubación de 14 o más días. Examínese periódicamente el cultivo de la orueba de olacas oara detectar la aparición de éstas a lo largo de un pe-

MÉTODOS NORMALIZADOS

ríodo de 14 días. Marquense y cuéntense las placas a medida que surjan. Pásense los virus de cada placa directamente a al menos dos cultivos celulares confluyentes y recientes en medio líquido del mismo tipo7 antes de las que placas se hagan demasiado grandes y se unan entre ellas o de que se deteriore la totalidad de la capa celular. No debe conservarse el material obtenido de las placas antes de pasarlo a los nuevos cultivos celulares, ya que podría dar lugar a pérdida de virus y pases insatisfactorios. Analícese microscópicamente durante un período de 14 días el posible desarrollo de un ECP. Congélense a –70°C los cultivos que lo hayan desarrollado para la posterior identificación del virus. c) Aislamiento y análisis del virus en el ratón: Para detectar los coxsackievirus de los grupos A y B en el ratón, inocúlense muestras en animales de no más de 24 horas de vida mediante un procedimiento estándar2, 3, 8. Utilícese la vía intracerebral o intraperitoneal inoculando 0,02 y 0,05 ml, respectivamente. Obsérvense los ratones a diario durante un período de 14 días para detectar debilidad, temblores y parálisis de tipo flaccido (debida a coxsackievirus del grupo A) o espástica (grupo B). Sacrifiqúense los animales que presenten síntomas y, usando una técnica estéril, prepárense suspensiones hísticas en solución salina equilibrada de Hanks a partir del torso completo eviscerado y despellejado o sólo del encéfalo y las patas. Las suspensiones se conservan a –70 °C hasta el momento de utilizarlas para nuevos pases e identificación. Para el segundo paso por ratón, sígase el mismo procedimiento general utilizado en la primera inoculación. Sin embargo, es preferible hacer el segundo paso en cultivo celular, ya que la identificación posterior del virus por una prueba de neutralización es más fácil. d) Cálculo de la concentración de virus: La determinación de la cantidad de virus existente en una muestra concen-

EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

trada depende del análisis utilizado. Si se hace la prueba en cultivo celular con técnica de placa, procédase al recuento de las placas y exprésese el cálculo de la concentración vírica en unidades formadoras de placa (UFP). Si el análisis del concentrado de la muestra se hace por un método semicuantitativo, hágase el cálculo de la concentración por el método del número más probable (NMP), expresándose como número más probable de unidades infecciosas (NMPUI), o por un método del 50 por 100 del punto extremo, como la dosis infecciosa o letal 50 por 100 (DI50 o DL50)2, 4, 30-32. Si se inoculó la muestra concentrada no diluida o una única muestra diluida en una serie de cultivos celulares (o de ratones), calcúlese el NMPUI a partir del número de cultivos ECP negativos confirmados (o de pruebas negativas en ratones), q, por número total de cultivos (o ratones) inoculados, n, según la siguiente fórmula: NMP = –In(g/n)

Si se inoculó más de una dilución de la muestra en el cultivo celular (o en ratones), calcúlese el NMPUI a partir de la fórmula desarrollada por Thomas33:

donde: P = número total de cultivos positivos (o de ratones) de todas las diluciones; N = ml totales de muestra inoculados en todas las diluciones, y Q = ml totales de muestra en todos los cultivos (o ratones) negativos.

Al usar esta fórmula, hay que excluir del cálculo todas las diluciones que contienen sólo cultivos (o ratones) positivos. Para los valores del NMP obtenidos a partir de una sola dilución de la muestra, el intervalo de confianza del 95 por 100

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se basa en el error estándar de la distribución binomial cuando se inoculan más de 30 cultivos (o ratones) o a partir de la tabla de coeficientes de confianza de Crow32, 34 cuando el número de inoculaciones en cultivos (o en ratones) es menor de 30. Realícense los cálculos del 50 por 100 del punto extremo por los métodos aritméticos de Reed-Muench o de Karber2, 4. Estos métodos requieren resultados de varias diluciones igualmente espaciadas de la muestra, preferiblemente con el mismo número de diluciones por encima y por debajo del 50 por 100 del punto extremo, y pueden no ser útiles para concentrados de muestras que contengan cantidades relativamente escasas de virus. e) Identificación de los virus aislados: Identifiquense los virus entéricos aislados a partir de las muestras concentradas mediante técnicas serológicas estándar, aunque a veces puede hacerse una identificación preliminar del género (enterovirus, reovirus o adenovirus) a partir de la información obtenida durante el proceso del aislamiento. Los virus entéricos recuperados en los ratones lactantes tienen mayores probabilidades de ser coxsackievirus de los grupos A o B. En el caso de los virus entéricos aislados en cultivos celulares, puede hacerse con frecuencia una identificación preliminar del género por el aspecto característico de los efectos citopáticos (ECP) en los cultivos celulares infectados. Realícese una confirmación de una identificación preliminar de adenovirus y reovirus mediante la detección de sus respectivos antígenos específicos de grupo por pruebas de fijación de complemento utilizando lisados aclarados de cultivos celulares de segundo paso como antígeno. Identifiquense los tipos específicos de reovirus por pruebas de hemaglutinación-inhibición (HI) o neutralización (N). Los serotipos de adenovirus pueden separarse en cuatro grupos según su capacidad (o incapacidad) para hema-

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glutinar los eritrocitos del mono rhesus o de la rata2, 3, 8. Excepto el tipo 18, los primeros 28 adenovirus numerados pueden identificarse como de serotipo específico con la HI. También pueden identificarse todos los serotipos de adenovirus por pruebas Nt utilizando antisueros específicos de tipo individual o combinaciones de antisueros de intersección. Otra forma de identificar los serotipos de adenovirus utiliza las pruebas de neutralización en cultivos celulares que emplean combinaciones de intersección de sueros hiperinmunes2, 3, 8, 35. Para las pruebas Nt de los coxsackievirus de los grupos A y B se utilizan ratones sólo si no se consigue aislar el virus en cultivos celulares36. Como a menudo los enterovirus más prevalentes en las aguas limpias y residuales son los poliovirus, analícense los enterovirus aislados mediante neutralización con un antisuero combinado frente a los tres tipos de poliovirus antes de realizar pruebas de neutralización con combinaciones de antisueros de intersección. 5.

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9610 DETECCIÓN DE HONGOS* 9610 A. 1.

Introducción

Significado

Los hongos, incluyendo levaduras y especies filamentosas o mohos, son microorganismos heterotróficos aclorofilicos de distribución universal que poseen núcleos organizados y, en general, paredes rígidas. Pueden encontrarse siempre que exista materia orgánica no viviente, aunque algunas especies son patógenas y otras parasitarias. En el agua primaveral próxima a la fuente, el número de esporas micóticas suele ser mínimo. El agua corriente no contaminada de los arroyos tiene una proporción relativamente grande de especies que constituyen los auténticos hongos acuáticos (especies que poseen zoosporas flageladas y gametos), Hyphomicetos acuáticos y hongos del suelo. El agua moderadamente contaminada puede portar células o esporas de los tres tipos, aunque presenta normalmente menos hongos acuáticos verdaderos e Hyphomicetos acuáticos mientras que los hongos del suelo son más numerosos. El agua muy contaminada lleva grandes cantidades de hongos del suelo. El grupo denominado hongos del suelo comprende hongos de tipo levadura, de los que se han aislado muchas especies en estas aguas contaminadas. La asociación entre densidad micótica y carga orgánica sugiere que los hongos podrían ser útiles indicadores de contaminación. Por desgracia, no se ha encontrado ninguna especie o grupo de importancia a este respecto. Puede haber algunos casos especiales excepcionales; por ejemplo, la distinción principal entre las levaduras Candida lambica y C. krusei es su capacidad para utilizar las pentosas. * Aprobado por el Standard Methods Committee, 1988.

La primera de estas especies crece bien con estos azúcares, por lo que podría ser utilizada como indicador de la presencia de pulpa y vertidos de fábricas de papel, que son muy ricos en dichos azúcares. Algunas especies de levaduras y hongos filamentosos son característicos de aguas más cálidas y podrían ser útiles indicadores de contaminación térmica. Dado que los hongos poseen una gran capacidad enzimática, pueden degradar activamente muchas de las sustancias naturales complejas y algunas de origen sintético, incluyendo ciertos pesticidas. Casi todos los hongos son aerobios o microaerofílicos, aunque algunas especies muestran un metabolismo anaerobio limitado y muy pocas son capaces de crecer en un medio totalmente anaerobio1. Ciertas especies no precisan luz. 2.

Presencia y supervivencia

Se han encontrado hongos en hábitats extremos, diferentes y remotos, incluyendo lagos, charcas, ríos, arroyos, estuarios, medios marinos, aguas residuales, lodos, aguas de torrenteras rurales y urbanas, pozos, desagües ácidos de minas, refinerías de asfalto, sistemas de combustible de aviones a reacción y sedimentos acuáticos. a) Hongos del agua potable: Se han encontrado hongos en el agua potable2-7 y en la superficie interna de las tuberías del sistema de distribución8, en los que sobreviven al tratamiento del agua o en el que penetran y permanecen viables una vez realizado el tratamiento. Las macroconidias tuberculadas de Histoplasma capsulatum9 pueden atravesar un filtro de arena rápido de 0,75 m. La sedimentación simple o la floculación

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con alúmina y reposo eliminaron del 80 al 99 por 100 de las esporas. Si estas macroconidias relativamente grandes (8 a 14 µm), globulosas y tuberculadas pueden resistir al tratamiento, no resulta sorprendente que otros hongos, que característicamente tienen esporas más pequeñas, aparezcan en el agua tratada. Si han sobrevivido al tratamiento o se han introducido después, las esporas micóticas pueden permanecer viables durante largos períodos de tiempo. Se han conservado perfectamente hongos patógenos en agua destilada esterilizada durante intervalos relativamente largos10. Las esporas de H. capsulatum conservadas en agua sin tratar del río Ohio y en agua del grifo esterilizada conservaban su alta capacidad infectiva para el ratón al cabo de 400 días11. El sabor y el olor del agua potable se asocia con la presencia de organismos procarióticos como bacterias, actinomicetos y cianobacterias. Sin embargo, también los hongos pueden participar en ellos6, 7. Se han cultivado propagulas de 19 géneros de hongos filamentosos en un sistema de agua superficial clorada y un sistema de distribución profundo no clorado2. El número medio de unidades formadoras de colonias (UFC) fue 18/ 100 ml en el segundo y 34/100 ml en el primero. En Finlandia3 se encontraron hongos en ríos, lagos y estanques que suministraban a nueve comunidades con agua filtrada a través de arena, tres con agua profunda artificialmente recargada, de las que dos utilizaban coagulación química y agua desinfectada. Los hongos mesofilicos fueron frecuentes en todas las muestras de agua no tratada, aunque los termotolerantes fueron más abundantes en el agua de los ríos que en la procedente de lagos. Se demostró que la coagulación química y la desinfección eran mucho más eficaces para eliminar los hongos que la filtración en arena y de-

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sinfección. El hongo más común fue Aspergillus fumigatus. Cinco sistemas de agua profunda clorados4 de Estados Unidos presentaron un recuento promedio por muestra positiva de alrededor de 5,5 UFC/100 ml. En Francia5, se recuperaron levaduras del 50 por 100 de 38 muestras, y hongos filamentosos en el 81 por 100. Con las excepciones de Aspergillus fumigatus3, 4, A.flavus4, 5 y A. niger4, los hongos aislados del agua potable no suelen ser considerados médicamente importantes, pero las infecciones micóticas pueden ser graves en los sujetos con depresión del sistema inmune. Casi todos los hongos son saprofitos comunes del suelo. b) Hongos en las aguas recreativas: Puede esperarse la presencia de algunos hongos patógenos para el hombre en las aguas recreativas, como piscinas y playas, y en las instalaciones de limpieza acompañantes, como las duchas. Trichophyton mentagrophytes, causante de la tina de los pies y del pie de atleta, se ha encontrado12 en el suelo de madera de una ducha. Siete especies de hongos patógenos y potencialmente patógenos se cultivaron en 361 muestras de arena de playa en Hawai13, mientras que en la de la costa báltica alemana, en Portugal y en la costa del Adriático se ha aislado Epidermophyton14. c) Supervivencia tras la cloración: Se ha cultivado una levadura no identificada de otros organismos que sobrevivieron a la cloración de los efluentes de aguas residuales15. Esta levadura sobrevivió a 1 mg/l de cloro libre durante 10 minutos, mientras que E. coli no pudo superar un contacto de 5 minutos con 0,03 mg/l de cloro libre. Se conoce la cantidad de cloro necesaria para el control de los hongos, al menos para C. albicans. Se ha demostrado16 que las células de esta especie se inactivaron con 4 mg/l de cloro a los 30 minutos, cuando el recuento inicial era de 103/ml. En un estu-

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dio efectuado en Illinois con C. parapsilosi11, 18, una levadura de frecuente cultivo que se sabe produce problemas sanitarios en los trópicos, se precisaron mayores cantidades de cloro para inactivar este microorganismo que para eliminar las bacterias coliformes. Se han sugerido mecanismos de inactivación por cloro en los estadios asimilativos de las levaduras y otros microorganismos19. Las células micóticas, especialmente las conidias, pueden sobrevivir a dosis mucho más altas de cloro que las bacterias coliformes20. Incluyendo una exposición de 10 minutos a 10 mg/l de cloro cuando el recuento inicial de esporas fue aproximadamente de 106 1/ml.

3. Patrones de crecimiento e identificación

En el agua existen dos patrones básicos de crecimiento micótico. Los hongos acuáticos verdaderos producen zoosporas o gametos que se mueven por medio de flagelos, de los tipos látigo o ñec. Algunos, especialmente los Tricomicetos (hongos que habitan en el intestino posterior de ciertos gusanos, larvas de mosquito, etc.), presentan estadios ameboides. Los hongos acuáticos se recogen, típicamente, exponiendo cebos adecuados (alimentos sólidos) en el medio que se estudia o en una muestra de laboratorio. En los Estados Unidos ha sido relativamente poco el trabajo realizado acerca de estos hongos en las aguas contaminadas, mientras que han sido ampliamente estudiados en Inglaterra, Alemania y Japón. El segundo crecimiento micótico es inmóvil en todos los estadios de su ciclo vital. El crecimiento y la reproducción son habitualmente asexuados (anamórficos). Se han identificado tres procesos de desarrollo: a) crecimiento filamentoso con esporas Masticas o esporas produci-

MÉTODOS NORMALIZADOS

das en estructuras especiales; b) crecimiento filamentoso con filamentos que se dividen en forma de articulación (fragmentación) para formar esporas separadas denominadas artroconidias, como ocurre en Geotrichum y géneros afines, y c) crecimiento de células hijas únicas producidas sobre cada célula progenitura, denominado gemación, típico de las levaduras. La identificación de los hongos, que son considerablemente más grandes que las bacterias, depende de la morfología de las colonias en un medio sólido, de su morfología de crecimiento y reproducción y, en cuanto a las levaduras, de su actividad fisiológica en los cultivos de laboratorio. Un número creciente de hongos suele indicar una carga creciente de material orgánico en el agua o en el suelo. Grandes números de hongos similares reflejan un exceso de carga orgánica, mientras que una microbiota diversificada implica una población ajustada a los orgánicos del medio. Pese a su amplia distribución, se ha prestado escasa atención a la presencia y significado ecológico de los hongos en los hábitats acuáticos. La importancia de los hongos y sus actividades en el agua se comprende cada vez mejor gracias al progresivo conocimiento de su capacidad patógena para el hombre, los animales y las plantas; su papel como alimento o fuente de energía; su actividad en los procesos naturales de purificación, y su función en la formación de sedimentos. Una revisión de los estudios publicados sobre los hongos.que aparecen en el agua, las aguas residuales y sustratos afines contaminados orgánicamente identificó 984 especies21: 133 de ellas fueron consideradas Mastigomycotina (hongos con zoosporas flageladas); 79, Zygomycotina, casi todas hongos mucoráceos; 161 fueron Astomycotina, incluyendo estados perfectos (teleomórficos) de algunos de los considerados hongos imperfectos; 18 fueron Basidiomycotina u hongos im-

EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

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perfectos. Del total, 133 especies fueron formadoras de zoosporas, 131 eran de tipo levadura y 718 filamentosas. La mayor parte de las zoospóricas fueron halladas en aguas levemente o nada contaminadas, mientras que del resto, menos de la mitad se encontraron en número suficiente como para ser consideradas miembros de una población, ni siquiera durante breves períodos de tiempo. El significado de los hongos de los medios acuáticos y terrestres ha sido comentado detalladamente22-38. La enumeración cuantitativa de los hongos no es equivalente a la de las bacterias unicelulares, porque la colonia micótica puede desarrollarse a partir de una sola célula (espora), un agregado celular (grupo de esporas o espora única multicelular) o fragmento micelar o pseudomicelar (que contiene más de una célula viable). Se supone que cada colonia micótica desarrollada en un cultivo de laboratorio nace de una sola unidad formadora de colonias (UFC) que puede o no corresponder a una sola célula.

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9610 B. Técnica en placa fluida 1.

Muestras

a) Envases: Recójanse las muestras de la forma indicada en la sección 9060A. También es posible utilizar viales de plástico cilindricos con tapones a presión, que suelen suministrarse estériles. Deben transportarse en posición vertical para reducir al mínimo la posibilidad de vertidos y desecharse una vez usados. b) Conservación: Las muestras no deben conservarse durante más de 24 horas. Si el análisis no se efectúa con rapidez tras la recogida, utilícese refrigeración. 2.

Medios

Para el recuento, el medio de elección habitual es el agar neopeptona-glucosarosa de Bengala-aureomicina®, aunque la experiencia puede sugerir el empleo preferente de agar de Czapek (para Aspergillus, Penicillium y hongos afines) y agar de extracto de levaduras-extracto de malta-glucosa o agar Diamalt. Con fines de inventario, utilícese agar neopeptonaglucosa. a) Agar neopeptona-glucosa-rosa de Bengala-aureomicina®:Añádanse 5,0 g de

neopeptona, 10,0 g de glucosa, 3,5 ml de solución de rosa de Bengala (1 g/100 ml de agua destilada) y 20,0 g de agar a 1 l de agua destilada. Este medio se emplea para hacer placas fluidas, por lo que el agar básico debe prepararse y conservarse en grandes cantidades o, lo que es más conveniente, en tubos de 10 ml. Esterilícese en autoclave; el pH final debe ser 6,5 aproximadamente. Por separado, prepárese una solución de clortetraciclina o tetraciclina (1,0 g de antibiótico hidrosoluble/150 ml de agua destilada) y refrigérese. Antes de su empleo, esterilícese por filtración. Para completar el medio, añádanse 0,05 ml de solución estéril a 10 ml de agar básico fundido a una temperatura de alrededor de 45 °C. Este medio puede no hallarse en el mercado en forma deshidratada, obligando a prepararlo a partir de sus ingredientes básicos. Como sustituto del agar básico, puede emplearse agar rosa de Bengala deshidratado de Cooke. Este medio resulta útil para el cultivo de un amplio espectro de especies mlcóticas. b) Agar de Czapek (o de CzapekDox): Disuélvanse 30,0 g de sacarosa, 3,0 g de nitrato de sodio (NaNO3), 1,0 g

9-218

de fosfato de hidrógeno dipotasio (K2HPO4), 0,5 g de sulfato de magnesio (MgSO4), 0,5 g de cloruro de potasio (KCl), 0,01 g de sulfato ferroso (FeSO4) y 15,0 g de agar en 11 de agua destilada. El pH debe ser 7,3 después de la esterilización. Este medio es útil para cultivar especies de Aspergillus, Penicillium, Paecilomyces y algunos otros hongos con necesidades fisiológicas similares. c) Agar de extracto de levaduraextracto de malta-glucosa: Disuélvanse 3,0 g de extracto de levadura, 3,0 g de extracto de malta, 5,0 g de neopeptona (o equivalente), 10,0 g de glucosa y 20,0 g de agar en 1 l de agua destilada. No es necesario ajustar el pH. Este medio es útil para cultivar levaduras. d) Agar diamalt: Disuélvanse 150 g de diamalt y 20,0 g de agar en 1 l de agua destilada. No es necesario ajustar el pH. El medio aparecerá turbio, pero no es necesario filtrarlo. Este medio es útil para purificar los cultivos de levaduras y estudiar las especies de éstas en distintas pruebas específicas. e) Agar neopeptona-glucosa: Disuélvanse 5,0 g de neopeptona (o equivalente), 10,0 g de glucosa y 20,0 g de agar en 1 l de agua destilada. El pH debe hallarse en torno a 6,5 después de la esterilización. (Este medio se llama también agar de Emmonds Sabouraud o agar de Emmonds Sabouraud dextrosa.) Este medio es útil para conservar cultivos de referencia. Es comparable al agar neopeptona-glucosa-rosa de Bengalaaureomicina®, pero no contiene rosa de Bengala ni antibiótico. 3.

Procedimiento

Un solo análisis puede estudiar simultáneamente hasta 40 muestras, siguiendo el procedimiento que se indica a conti-

MÉTODOS NORMALIZADOS

nuación, si bien el número óptimo es de 20 muestras. a) Preparación y dilución: En un erlenmeyer estéril de 250 ml, coloquense 135 ml de agua destilada estéril y 15 ml de la muestra para obtener una dilución de ésta de 1:10. Utilícese un instrumento de medición esterilizado para cada muestra o, lo que es menos conveniente, enjuaguese con agua esterilizada destilada entre las muestras. Mézclense bien las muestras antes de retirar la alícuota de 15 ml. Agítese el frasco en un agitador rotatorio a una velocidad de 120 a 150 oscilaciones/minuto durante unos 30 minutos o transfiérase el contenido del matraz a una jarra mezcladora, cúbrase y mézclese a baja velocidad durante 1 minuto o a alta velocidad durante 30 segundos. Pueden hacerse diluciones posteriores añadiendo 45 ml de agua destilada esterilizada a 5 ml de la suspensión diluida a 1:10. En las muestras de agua corriente suele bastar con una dilución de 1:10. Las muestras con mayor contenido de materia orgánica, como los sedimentos, deben ser diluidos a 1:100 o 1:1.000. Las muestras de las riberas o del suelo se diluirán a 1:1.000 o 1:10.000. b) Siembra: Prepárense cinco placas para cada dilución a estudiar. Para usar el agar neopeptona-glucosa-rosa de Bengala-aureomicina®, transfiérase con técnica aséptica 10 ml del medio a 45 °C a una placa de Petri de 9 cm. Añádase 1 ml de la dilución de la muestra correspondiente y mézclese cuidadosamente inclinando y girando la placa (véase el procedimiento de siembra en el aparato sobre recuento de placa heterotrófica, sección 9215). También pueden añadirse a la placa de Petri 1 ml de la muestra, 0,05 ml de solución de antibiótico y 10 ml de medio agar derretido a una temperatura de 43 a 45 °C. Solidifiquese el agar lo antes posible (en áreas áridas, utilícese más medio para evitar su deshidratación durante la incubación).

EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

9-219

c) Incubación: Las placas pueden guardarse unas encima de otras, pero no invertirse. Incúbese a temperatura ambiente (20 a 40 °C) y luz habitual, pero evítese el sol directo. Examínese y hágase el recuento al cabo de 3, 5 y 7 días. d) Recuento e inventario: El recuento de hongos de la placa proporcionará la base para efectuar comparaciones cuantitativas someras entre placas; el inventario indicará la importancia relativa de al menos las especies o géneros más fácilmente identificables.

El inventario comprende la identificación directa de los hongos según la morfología de las colonias y el recuento de las colonias atribuibles a las distintas especies y géneros. Cuando no sea posible identificar colonias pequeñas y su clasificación sea importante, utilícese un alambre de ni-cromo con la punta doblada en forma de L para tomar cada colonia problema y sembrar en una pendiente de agar neopeptona-glucosa (apartado 2e). Si se emplean cinco placas por muestra, el número medio de colonias en todas ellas (número total de colonias contadas/5) se ajusta a la recíproca de la solución (10/1, 100/1, 1.000/1, etc.) y equivale al recuento de colonias de hongos por milímetro de la muestra original. En las muestras sólidas o semisólidas, se empleará una corrección para el contenido en agua con objeto de comunicar el número de colonias por gramo de peso seco. El contenido en agua se determina secando alícuotas emparejadas de 15 ml de la muestra original a 100 °C durante toda la noche; la diferencia entre los pesos fresco y seco es el contenido de agua perdido de la muestra.

Al preparar las placas, utilícense alícuotas de la muestra que proporcionen unas 50 o 60 colonias en cada placa. Determínese este volumen haciendo pruebas. Cuando se estudie por primera vez una nueva placa habitat, deben emplearse al menos dos diluciones de la muestra. Pueden hacerse cálculos de hasta 300 colonias, pero cuando exista mayor hacinamiento deben desecharse esas placas. El medio rico en rosa de Bengala tiende a producir colonias pequeñas y permite el desarrollo de los microorganismos de crecimiento lento.

9610 C.

Técnica en placa difusa

La técnica en placa difusa constituye un procedimiento alternativo para obtener datos cuantitativos sobre las unidades formadoras de colonias. 1.

Muestras

Véase la sección 9610B.1. 2.

Medios

Utilícese cualquiera de los siguientes medios. El agar de aureomicina®-rosa de

Bengala-glucosa-peptona (ARGPA) (e) y el agar de estreptomicina-terramicina®extracto de malta (ETEMA) (f) son útiles para analizar las aguas de alcantarillado y contaminadas1. a) Agar neopeptona-glucosa-rosa de Bengala-aureomicina®: Véase la sección 9610B.2a. b) Agar de Czapek (o de CzapekDox): Véase la sección 9610B.2b. c) Agar de extracto de levaduraextracto de malta-glucosa: Véase la sección 9610B.2c. d) Agar diamalt: Véase la sección 9610B.2d.

9-220

e) Agar aureomicina®-rosa de Bengala-glucosa-peptona: Disuélvanse 10,0 g de glucosa, 5,0 g de peptona, 1,0 g de fosfato dihidrógeno de potasio (KH2PO4), 0,5 g de sulfato de magnesio (MgSO2 · 7H2O), 0,0035 g de rosa de Bengala y 20,0 g de agar en 800 ml de agua destilada, y esterilícese. Disuélvanse 70,0 mg de clorhidrato de aureomicina® en 200 ml de agua destilada, esterilícese por filtración y añádase a la base de agar previamente enfriada (42 a 45 °C). El pH debe ser 5,4. Viértanse alícuotas de 25 ml en placas de Petri estériles (100 x 15 mm) y déjese endurecer el agar. Las placas pueden conservarse a 4 °C hasta un máximo de 4 semanas. f) Agar de estreptomicina-terramicina®-extracto de malta: Disuélvanse 30,0 g de extracto de malta, 5,0 g de peptona y 15,0 g de agar en 800 ml de agua destilada. Disuélvanse 70,0 mg de estreptomicina y otros 70,0 mg de terramicina en porciones separadas de 100 ml de agua destilada, esterilícese por filtración y añádase a la base de agar previamente enfriada (42 a 45 °C). El pH debe ser 5,4. Viértanse porciones de unos 20 ml en placas en Petri estériles (60 x 15 mm) y déjese endurecer el agar. Las placas pueden conservarse hasta un máximo de 4 semanas a 4 °C. 3.

Procedimiento

d) Preparación y dilución: Véanse las secciones 9215A.5 y 9610B.2a. Háganse las diluciones con agua tamponada (sección 9050C.1) y elíjanse aquellas que proporcionen de 20 a 150 colonias por placa. b) Siembra: Sequense previamente las placas quitando las tapaderas en una campana de flujo laminar a temperatura ambiente y una humedad relativa del 30 por 100 aproximadamente durante 1-1,5 horas. Prepárense no menos de tres placas si deben analizarse estadís-

MÉTODOS NORMALIZADOS

ticamente los datos por muestra o dilución. Utilizando una pipeta estéril, transfiérase 1,0 ml de la muestra o dilución a la superficie de la placa previamente secada, distribuyéndola por la totalidad de la misma mediante un bastoncillo de cristal estéril en forma de L o mediante un instrumento mecánico que haga girar la placa y garantice la adecuada distribución de la siembra. c) Incubación: Habiendo colocado las tapaderas, déjense secar las placas a temperatura ambiente, inviértanse e incúbense a 15 °C durante 7 días en una atmósfera de elevada humedad (90 a 95 por 100). También es posible incubar a 20 °C durante 5-7 días. Los hongos de crecimiento lento pueden no producir colonias apreciables hasta los días 6.° o 7.°. d) Recuento y registro: Utilizando un contador de colonias Quebec, cuéntense todas las colonias de cada placa elegida. Si es necesario retrasar temporalmente el recuento, guárdense las placas a 4 °C durante no más de 24 horas. Dependiendo del tamaño de las colonias, podrán contarse las placas que contengan hasta 150, pero el número máximo óptimo es 100 colonias. Regístrense los resultados como unidades formadoras de colonias (UFC)/ 100 ml de la muestra original. En las muestras sólidas o semisólidas, se indicarán como UFC/g de peso fresco o seco, preferiblemente seco. Si se emplean tres o más placas por muestra, utilícese el número medio de colonias ajustado al inverso de la dilución (véase 9610B) para dar el recuento. Si no aparecen colonias en ninguna placa, regístrese el recuento como < 1 para la mayor dilución. Si hay más de 150/placa, regístrese como «demasiado abundantes para recuento» (DAPR), pero indicando un recuento > 150 a la dilución adecuada. Si existe hacinamiento y solapamiento de las colonias en las estrías, señálense como «oscurecidas» (OBSC) y repítase el análisis

EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

9-221

con diluciones más elevadas o con un estudio más precoz.

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4. 1.

Referencias EL-SHAARAWI, A., A. A. QURESHI & B. J. DUTKA. 1977. Study of microbiological and

9610 D.

Técnica de filtro de membrana

Para información general sobre la técnica de filtro de membrana y aparatos necesarios, véase la sección 9222. Sin embargo, excepto en comparaciones de las membranas de distintos fabricantes, no se han descrito pruebas críticas de los filtros de membranas que se refieran a su eficacia en el aislamiento de hongos. Se han utilizado los componentes de los medios, los niveles de pH y los antibióticos en procedimientos de siembra convencionales. Aparentemente, los procedimientos descritos resultan satisfactorios. 1.

Muestras

Véanse las secciones 9610B.1 y 9060A. 2.

Medios

Utilícese agar aureomicina®-rosa de Bengala-glucosa-peptona no modificado o modificado (MARGPA) o agar estreptomicina-terramicina®-extracto de malta modificado (METEMM)1. Prepárense estos medios de igual modo que los medios no modificados descritos en 9610C.2e y f, excepto en que la concentración de cada antibiótico se eleva de 70 mg/l hasta 200 mg/l. Dispénsese los medios en porciones de 5 a 7 ml en placas de Petri de cristal o plástico (60 x 15 mm); son más aconsejables las de plástico con cierre hemético.

3.

Procedimiento

a) Preparación y dilución: Véanse las secciones 9215A.5 y 9610B.3a. Elíjanse las diluciones que proporcionen de 20 a 100 colonias por membrana. b) Filtración: Fíltrense cantidades adecuadas de la muestra o dilución bien agitadas, en trilicato, a través de filtros de membrana con poros de un diámetro de 0,45 a 0,8 µm. Véase la sección 9222. c) Incubación: Transfiéranse los filtros a las placas, inviértanse éstas o no, e incúbese a 15 °C durante 5 días en una atmósfera húmeda. También pueden incubarse a 20 °C durante 3 días, o más, en función de los hongos existentes. d) Recuento y registro: Usando una lupa estereoscópica binocular con un aumento de 10 x, cuéntense todas las colonias de cada placa elegida. Si es preciso retrasar temporalmente el recuento, guárdense las placas a 4°C durante no más de 24 horas. Las placas ideales tienen de 20 a 80 colonias por filtro. Véase la sección 9610C.

4.

Referencias QURESHI, A. A. & B. J. DUTKA. 1978. Comparison of various brands of merabrane filter for their ability to recover fungi from water. Appl. Environ. Microbiol. 32:445.

9-222

MÉTODOS NORMALIZADOS

9610 E. Técnica para levaduras Del número total de colonias micóticas obtenido en aguas contaminadas, hasta el 50 por 100 pueden corresponder a levaduras. Los medios sólidos, como los antes descritos, no permiten el crecimiento de todas ellas; por tanto, puede ser útil el empleo de una técnica de enriquecimiento cuantitativa además del recuento en placa (véase también Hongos patógenos para el hombre, sección 9610H).

1.

Medios

Para el enriquecimiento, utilícese un medio líquido de nitrógeno base-glucosa; para cultivo, empléese el agar de extracto de levadura-extracto de malta-glucosa o el agar diamalt. a) Medio liquido de nitrógeno baseglucosa: Disuélvanse 13,4 g de una base de nitrógeno levadura en 1 l de agua destilada. Esterilícese por filtración. Prepárense dos soluciones de 500 ml cada una de glucosa en agua al 2 por 100 y 40 por 100 y esterilícese por separado mediante filtración. Para obtener el medio definitivo, introdúzcase en un erlenmeyer de 250 ml, con técnica aséptica, 25 ml de solución base de nitrógeno levadura y 25 ml de las soluciones acuosas de glucosa al 2 o 40 por 100 para obtener concentraciones finales de glucosa de 1 por 100 y 20 por 100. Tápese el matraz con un tapón de algodón cubierto con una gasa y guárdese hasta el momento de su empleo. b) Agar de extracto de levaduraextracto de malta-glucosa: Véase la sección 9610B.2c. c) Agar diamalt: Véase la sección 9610B.2d.

2.

Procedimiento

a) Preparación y dilución de la muestra: Prepárese de la forma indicada en la sección 9610B. b) Enriquecimiento: En distintos erlenmeyer de 250 ml, prepárese un medio de nitrógeno base levadura que contenga glucosa al 1 por 100 y 20 por 100. Inocúlese con 1 ml de la dilución adecuada de la muestra e incúbese a temperatura ambiente en un agitador rotatorio con una velocidad de 120 a 150 oscilaciones/minuto durante al menos 64 horas. Es necesario agitar los cultivos para evitar el sobrecrecimiento de los hongos filamentosos. c) Cultivo: Retírense los matraces del agitador y dejar reposar durante 4 a 5 horas. Las levaduras, si existen, se depositarán en el fondo, permaneciendo en suspensión las bacterias y hongos filamentosos. Estos últimos flotarán en la superficie o se adosarán a la superficie del cristal en el menisco o por encima de éste. Con un asa de alambre de nicromo, tómese el sedimento en la interfase sedimento-sobrenadante de un frasco inclinado y siémbrese con estrías en agar de extracto de levadura-extracto de maltaglucosa. Utilícense tres placas por matraz. Incúbese a temperatura ambiente, pero lejos de la luz solar directa, durante 2-3 días. No es necesario invertir las placas. Para obtener cultivos puros, tómense muestras de colonias razonablemente aisladas y vuélvase a sembrar en el mismo medio o en placas de agar diamalt. Deben obtenerse tantos cultivos puros como colonias diferentes puedan identificarse. d) Recuento: Es imposible obtener recuentos de placa significativos tras este tipo de cultivo enriquecido. Si se supone que una sola célula de la muestra original da lugar a una o más colonias en las

9-223

EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

placas tras su enriquecimiento, puede decirse que las levaduras, o que determinados tipos de levadura, sólo se encuentran en cantidades mínimas que dependen de la más alta dilución positiva obtenida. La recíproca de esta dilución es el número indicado de levaduras en la muestra.

9610 F. 1.

3.

Bibliografía

LODDER, J., ed. 1970. The Yeasts, A Taxonomic Study, 2.a ed. North Holland Publ. Co., Amsterdam, Holanda. BUCK, J. D. 1975. Distribution ot aquatic yeasts: effect of inoculation temperature and chloramphenicol concentration on isolation. Mycopathologia 56:73.

Hongos zoospóricos

Presencia y significado

Casi todos los hongos hallados en hábitats lacustres (lagos) y lerenses (ríos) que se reproducen asexualmente por esporas móviles uniflageladas y que muestran un determinado crecimiento del cuerpo micótico pertenecen a la clase Chytridiomicetos. Los hongos de crecimiento indeterminado, reproducción asexual por esporas móviles biflageladas y reproducción sexual mediante oogonias y anteridias son miembros de la clase Oomicetos. Suele producirse un descenso del número de especies de ambas clases en las áreas contaminadas de los ríos, si bien en estos casos de contaminación es más frecuente encontrar mayor número de especies de Oomicetos que de Chytridiomicetos. Aparentemente, las especies del género Oomiceto Saprolegnia (especialmente S. ferax) y Leptomitus son más tolerantes que otras formas. Estudios sobre ensayos biológicos indican que los Oomicetos son más tolerantes al zinc, al cianuro y al manitol que los Chytridiomicetos. Estos últimos parecen ser más tolerantes al tratamiento con surfactantes. Algunos Chytridiomicetos pueden parasitar las algas del plancton y otras. En el caso de las infecciones micóticas epidémicas de las especies de fitoplancton, la actividad de los hongos puede alterar la composición de la comunidades de fito-

plancton, retrasando el momento de máximo de algas y reduciendo la población de ciertas algas de forma que otras especies sustituyen a las infectadas. En el caso de las infecciones no epidémicas, los hongos pueden no modificar la población de algas, sino infectarlas sólo durante su período de declinación y, en consecuencia, acelerar su descomposición. Los Oomicetos filamentosos, especialmente los miembros de las especies Saprolegniaceae y Pythiaceae, se encuentran prácticamente en todos los tipos de hábitats de agua corriente y suelos húmedos o encharcados. Casi todas las casi 250 especies aparecen como saprofitos en la materia orgánica muerta y descompuesta, como los restos de insectos, algas y plantas vasculares sumergidas. Algunos se encuentran como parásitos de las algas, invertebrados acuáticos, peces y plantas vasculares; ninguno de ellos se asocia con enfermedades humanas. Sólo en raras ocasiones cualquiera de estos hongos se desarrolla en número suficiente como para poder ser observado o recogido directamente. En consecuencia, se han diseñado distintas técnicas para su recogida y cultivo. 2. Toma de muestras y cebo

Recójanse las muestras en viales de plástico estériles de 35 ml, refrigérese e

MÉTODOS NORMALIZADOS

9-224

inicíese el análisis en las 6-8 horas siguientes. Coloquese cada muestra en una placa estéril (20 x 100 mm) y diluyase con 10 a 15 ml de agua estéril destilada o desionizada. Añádanse tres o cuatro mitades de semillas de cáñamo (Cannabis sativa) o semillas enteras de mostaza (Brassica) o sésamo (Sesamwn) como cebo para cada cultivo. Incúbese a 18 a 23 °C y examínese todos los dias buscando desarrollo de hongos sobre el cebo. Cuando aquél se haga evidente, en general a las 72 horas, retírese el cebo infectado, lávese cuidadosamente con agua procedente de una botella de lavado y transfiérase a una nueva placa de agua que pontenga dos o tres mitades de semilla de cáñamo u otra. Pueden identificarse los géneros a partir de la disposición de las esporas en el esporangio y la forma en que las mismas se liberan. La determinación específica exige el estudio microscópico de las estructuras reproductoras sexuales. Para recoger los pocos parásitos o patógenos que aparecen espontáneamente, coloquense los organismos huéspedes en una placa que contenga agua esterilizada y semillas de cáñamo. 3.

Cultivo

Aunque es posible cultivar casi todos los Oomicetos filamentosos en agar de harina de maíz, se han desarrollado medios selectivos para el cultivo de Saprolegnia a partir del agua corriente1. Obténganse cultivos axénicos tomando las esporas con una micropipeta según salen del esporangio. Menos conveniente es usar las puntas de las hifas, pero conviene observar que a menudo aparecen varios géneros y especies dife-

rentes en un solo trozo de cebo. Transfiérase la suspensión de esporas o puntas de hifas a una placa de agar de harina de maíz. Cuando se produce el crecimiento, retírense las puntas de la hifas libres de bacterias con una técnica aséptica, cortando un pequeño cubo de agar. Transfiérase a un medio fresco o a agua. Si el crecimiento no se halla libre de contaminación tras una transferencia, háganse otras para garantizar la pureza de los cultivos. Se han comunicado métodos diferentes2. 4.

Siembra por dilución

Háganse diluciones sucesivas con agua destilada esterilizada (1:100.000 a 1:700.000) y extiéndase 1 ml sobre una placa de agar de harina de maíz recién preparada. Retírese cada colonia en desarrollo y transfiérase al agua para su identificación. Este método permite el cálculo numérico y la determinación de la composición de la comunidad de Oomicetos, pero exige no menos de 10 placas.

5.

Referencias

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Bibliografía

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9-225

EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

9610 G. 1.

Hifomicetos acuáticos

Presencia y significado

Los hifomicetos del agua dulce son un grupo muy especializado de hongos conidios que en general se desarrollan sobre hojas marchitas sumergidas u, ocasionalmente, en la madera de los angiosperma. El micelio, que es ramificado y septado, se ramifica a través del tejido de la hoja, especialmente en los peciolos y nervios. Los conidioforos se proyectan hacia el agua y las conidias que generalmente aparecen se liberan bajo ésta. Pueden encontrarse también conidias maduras en la espuma superficial de casi todos los ríos, arroyos y lagos. Las conidias de casi todos estos hongos son hialinas, de gruesas paredes y ramificadas tetrarradialmente, es decir, con cuatro brazos divergentes, o sigmoides (en forma de S) con la curva en más de un plano. Una característica especial de las mismas es que mientras se encuentran suspendidas en agua, incluso durante largos períodos, no germinan. Sin embargo, si llegan a detenerse sobre una superficie sólida, los tubos germinales aparecen al cabo de escasas horas. El tamaño y morfología de las esporas las hace potencialmente más prominentes en el análisis del plancton que las esporas de otros hongos. El estudio ecológico de los hifomicetos de agua dulce se ha limitado al sustrato, habitat, dispersión y papel en la facilitación de los sustratos de las hojas como alimento para los invertebrados acuáticos. Los sustratos más comunes de estos organismos son las hojas sumergidas marchitas de angiospermas, como aliso (Alnus), roble (Quercus), olmo (Ulmus), avellano (Corylus), arce (Acer), castaño (Castaneá), zarza (Rubus), fresno (Fraxinus) y sauce (Salix). Las hojas sumergidas de las gimnospermas suelen estar exentas de estos hongos. Su habitat natural es el agua bien oxigenada, como la de

los manantiales alpinos, arroyos de montaña y ríos de curso rápido. Sin embargo, también se han encontrado en ríos lentos, a menudo contaminados, en aguas estancadas o charcos transitorios, en la nieve fundida y en el suelo. Con frecuencia se produce un aumento del número de especies e individuos de otoño a primavera, con disminución entre abril y junio.

2. Recogida de muestras y conservación

En casi todos los medios de agua dulce, recójase la espuma o las hojas de angiosperma parcialmente podridas, sumergidas, en botellas estériles. Refrigérese la muestra hasta el momento de su estudio.

3. Tratamiento y análisis de la muestra

Lávense las muestras de hojas en agua destilada esterilizada y coloquense de una a tres hojas en una placa de Petri estéril de aproximadamente 1 cm de profundidad, que contenga agua esterilizada de un estanque, río o lago. Incúbese a temperatura ambiente. Al cabo de 1 a 2 días, se desarrollarán los micelios y conidias. Tanto éstas como los conidioforos pueden estudiarse con una lupa estereoscópica sobre cualquier parte de la superficie de la hoja, pero sobre todo en los peciolos y nervaduras. Cuando se liberan, las conidias permanecen suspendidas en el agua o se depositan en el fondo de la placa. Utilizando la lupa, tómese una sola con una micropipeta y transfiérase a un portaobjetos con una gota de agua para su identificación. También puede transferirse con una aguja esterili-

MÉTODOS NORMALIZADOS

9-226

zada a una placa de agar de extracto de malta al 2 por 100 para formar una colonia. Búsquense también las conidias en muestras de espuma mediante la lupa estereoscópica, aislándolas de una en una de la forma descrita anteriormente. Si se sumergen los tapones de micelios del cultivo madre de hifomicetos acuáticos en placas de Petri profundas con agua de estanque pasada por un autoclave, la co-

9610 H. 1.

nidiogénesis suele comenzar al cabo de 2- 10 días. Pueden conservarse conidias en todos los estadios de desarrollo sobre portaobjetos, montadas en medio de lactofenol en el que se ha disuelto fucsina acida o azul algodón y sellado con esmalte de uñas transparente. Para obtener una buena adherencia de éste, evítense cantidades excesivas del medio.

Hongos patógenos para el hombre

Presencia y significado

Los cultivos rutinarios de los hongos procedentes de corrientes contaminadas y plantas de tratamiento de aguas residuales han proporcionado un número relativamente escaso de especies patógenas para el hombre y los animales superiores. Geotrichum candidum, un hongo productor de artroconidias del que existe en Estados Unidos la sospecha de asociación con enfermedades, se cultiva casi de forma universal. Cuando se halla en su estadio teleomórfico (como ascus), se le denomina Endomyces candidus. Rhinocladiella mansonii, ahora llamado Exophiala mansonii, es el agente causal de una forma de cromomicosis habitualmente tropical y también muestra una distribución universal. Se le ha llamado asimismo Phialophora jeanselmei y Trichosporium heteromorphum. Aspergillus fumigatus, agente causal de la aspergilosis pulmonar, es de cultivo frecuente. Pseudallescheria (Petriellidium, Allescheria) boydii es el agente causal de micetomas eumicóticas y otros procesos eumicóticos agrupados bajo la denominación de «Pseudallescheriasis»1. La infección se produce como consecuencia de una herida punzante con materiales contaminados o por respiración de los mismos

en forma de aerosoles en plantas de tratamiento de aguas residuales o aire contaminado. En general, se encuentra en su estado anamórfico, Scedosporium (Monosporium) apiospermum. La presencia de estos hongos en el agua de los arroyos se debe, probablemente, al arrastre del suelo, ya que prácticamente todos los hongos zoopatógenos se encuentran en condiciones saprofíticas en el suelo como reservorio natural. En ocasiones, pueden encontrarse otros hongos zoopatógenos, aunque con escasa frecuencia, en los arroyos, contaminados o no. Otro hongo, la levadura Candida albicans, puede cultivarse en distintas proporciones en los efluentes de las plantas de tratamiento de aguas residuales, corrientes que los reciben y aguas recreativas. En el hombre, este microorganismo es habitualmente un comensal, como Geotrichum candidum, que coexiste en armonía con su huésped; hasta el 80 por 100 de los adultos sanos presentan niveles identificables de C. albicans en las heces, mientras que alrededor del 35 por 100 los portan también en la cavidad oral, en ausencia de enfermedad manifiesta. Una parte importante de la población femenina padece candidiasis vaginal en distintos grados de intensidad. La presencia de C. albicans en las aguas residuales no

EXAMEN MICROBIOLOGICO DE LAS AGUAS

9-227

tratadas, efluentes de las plantas de tratamiento de las mismas o el agua contaminada no resulta sorprendente. Se ha cultivado a partir de todos estos habitat con medios convencionales fuertemente complementados con antibióticos, pero no en los medios o con las técnicas descritas en las secciones 9610B o E. También se ha cultivado en estuarios y ambientes marinos en un medio de maltosa-levadura nitrógeno base-cloranfenicol-cicloheximida.

dos gotas a un portaobjetos y estudíense con el microscopio para buscar la formación de tubos germinales en la mayor parte de las células. De las levaduras blancas, sólo C. albicans produce estas hifas cortas que nacen de la célula madre tras una incubación de 2 a 3 horas2.

2.

9711

Referencias RIPPON, J. 1982. Medical Mycology. W. B. Saunders Co., Filadelfia, Pennsylvania. BUCK, J. D. & B. M. BUBACIS. 1978. Membrane filter procedure for enumeration of Candida albicans in natural waters. Appl. Environ. Microbiol. 35:237.

Identificación de C. albicans

C. albicans puede identificarse entre las levaduras blancas y rosadas que crecen en un filtro de membrana negro de 0,8 µm. con un medio maltosa-levadura nitrógeno base-cloranfenicol-cicloheximida. Por cada colonia, inocúlese una porción de 0,5 ml de suero sanguíneo humano o de ternera, incúbese a 37 °C durante 2-3 horas, transfiéranse una o

4.

Bibliografía

PAGAN, E. F. 1970. Isolation of human pathogenic fungi from river water. Ph.D. dissertation, Botany Dep., Ohio State Univ., Columbus.

PROTOZOOS PATÓGENOS*

9711 A. 1.

3.

Introducción

Significado

Los protozoos patógenos del agua potable que presentan mayor interés son Giardia lamblia, Entamoeba histolytica y Cryptosporidium. Todos ellos producen diarrea o gastroenteritis de gravedad variable y han sido considerados agentes causales de distintos brotes epidémicos de origen hídrico, especialmente Giardia. * Aprobado por el Standard Methods Committee, 1988.

Entre 1965 y 1984, se comunicaron 90 de estos brotes y más de 23.000 casos de giardiasis1. E. histolytica produce amebiasis o disentería amebiana. Aunque no es una causa frecuente de brotes epidémicos de origen hídrico en la actualidad, todavía es endémico en Estados Unidos, donde produce un promedio de 28 muertes anuales2. Cryptosporidium es un protozoo de importancia creciente como patógeno humano3. Puede producir un cuadro de tipo coleriforme autolimitado en personas inmunocompetentes, pero da

9-228

MÉTODOS NORMALIZADOS

lugar a procesos prolongados y muy graves en sujetos inmunodeprimidos4. Su presencia ha sido asociada a la diarrea del viajero y se ha manifestado que el agua potable fue el vehículo de transmisión en al menos un brote6. Existen informes sobre métodos de detección para este agente en las aguas corrientes y residuales7, 8. Los métodos para la identificación de protozoos no están bien normalizados y deben ser considerados como procedimientos de investigación susceptibles de modificación.

2. 1.

2.

Referencias CRAUN, G. F. & W. JAKUBOWSKI. 1987. Status of waterborne giardiasis outbreaks and monitoring methods. En International Symposium on Water Related Health Issues Proceedings. TPS 87-3, American Water Resources Assoc, Bethesda, Maryland. CENTERS FOR DISEASE CONTROL. 1984. Morbidity and mortality weekly report-annual summary, 1983. U. S. Dep. Health & Human

9711 B. 1.

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Giardía lamblia

Discusión general

El agente causal de la giardiasis es un protozoo flagelado que se elimina por las heces del hombre y los animales, casi siempre en su estadio de quiste, aunque en casos de diarrea acuosa grave puede encontrarse el frágil trofozoíto en estadio reproductor. Se ha comprobado que bastan sólo 10 quistes ingeridos en cápsulas para infectar al hombre1 y es posible que incluso menos quistes viables, ingeridos al beber agua, puedan resultar suficientes para iniciar la infección. El individuo infectado llega a eliminar más de 106 quis-

tes/g de heces2. Éstos pueden sobrevivir hasta 2 meses en el agua dulce a 8 °C3. La contaminación fecal de origen humano o animal del suministro de agua podría producir la transmisión hídrica de la giardiasis4. Casi todos los brotes de origen hídrico comprobados5 en asociación con suministros municipales y áreas recreativas han aparecido por beber aguas superficiales que sólo habían sido tratadas mediante cloración. Los quistes de Giardia son más resistentes a la desinfección que las bacterias coliformes6-8. Al contrario de lo que antes se creía, pueden ser inac-

9-229

EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

tivados por el cloro en condiciones adecuadas de temperatura, pH, período de contacto y dosis9-11. Si están presentes en el suministro de agua se encuentran, probablemente, a bajas concentraciones12-15 El análisis del agua para buscar quistes de Giardia exige concentración, purificación, detección e identificación. La concentración se ha hecho por medio de filtros de arena14, membrana16-18 o espesor microporoso19-20. Su purificación y separación de los detritus extraños se consigue normalmente mediante técnicas de flotación con soluciones de sulfato de zinc19, sacarosa17, 21, citrato de potasio20, 22 o Percoll-sacarosa23. La detección e identificación se basan en el estudio microscópico de los concentrados purificados con técnicas de tinción cromogénicas24, 25 o de anticuerpos fluorescentes20, 23 y en criterios morfológicos. Aunque se dispone desde 1975 de métodos para detectar quistes en el agua14, no se han comunicado estudios comparativos sobre eficacia del método, precisión o sensibilidad en las distintas aguas y bajo diferentes condiciones. Se ha empleado una modificación del método descrito más adelante para identificar quistes en suministros antes y después de tratamiento26, 27. Este método fue desarrollado en una reunión de consenso19 y debe ser considerado experimental, con datos de eficacia de recuperación limitados. Puede ser conveniente modificar los procedimientos, en función de la calidad del agua local, la disponibilidad de equipo y la experiencia del analista. La obtención de resultados negativos puede reflejar patrones intermitentes de eliminación, escasa eficacia de recuperación para un agua dada e insuficiente volumen de la muestra o frecuencia de las tomas. El significado de un resultado positivo es difícil de valorar, a menos que se realicen las determinaciones idóneas de infectividad, estudios epidemiológicos

o todos ellos. En la figura 9711:1 se muestra una gráfica de flujo analítico. 2. Toma de muestras

Las muestras deben recogerse de la fuente de agua de la planta de tratamiento antes de su desinfección y del sistema de distribución. Su número dependerá de los objetivos del estudio y de los recursos de que se disponga. La recogida se efectuará con el aparato que se muestra en las figuras 9711:2 y 3, consistente en una manguera de entrada, un contenedor plástico del filtro con un filtro de tejido de hilo (porosidad, 1 µm)*, manguera de salida, hidrómetro y un instrumento de control de flujo con una velocidad de paso de 6,3 x 10-5 m3/segundo †. El hilo puede ser de orlón, polipropileno u otro material adecuado que no deje escapar fibras durante su procesamiento posterior. No es necesario que los componentes del aparato estén esterilizados, pero deben lavarse y enjuagarse cuidadosamente entre varias tomas. Durante éstas, es preciso emplear una técnica aséptica para proteger el instrumento y evitar la contaminación cruzada de las muestras. Resulta satisfactoria una línea de presión de 100 a 130 kPa, por lo que se usará una bomba si no se dispone de agua a presión. En este caso, la bomba se instalará aguas bajo (en el extremo efluente) del filtro, con objeto de eliminar la posibilidad de contaminación cruzada de las muestras por los quistes que pudieran permanecer en la bomba a consecuencia de una toma anterior. El volumen de agua a estudiar depende del propósito de la investigación; se recomienda un volumen mínimo de 3801. Para recoger la muestra, conéctese la

* Commercial Filters División, Carborundum Co., Lebanon, Ind., o equivalente. † Eaton Corp., Carol Stream, I11., o equivalente.

9-230

MÉTODOS NORMALIZADOS

Figura 9711:1. Diagrama de flujo del método para Giardia.

manguera de entrada al grifo adecuado. La dirección del agua es desde el exterior al interior en el cartucho de filtro de hilo tejido. Regístrense el tiempo y las lecturas del hidrómetro y ábrase el grifo. Recójase la muestra, ciérrese el grifo y vuélvanse a registrar el tiempo y la lectura del hidrómetro antes de desconectar el aparato. Es preciso tener cuidado para

mantener la apertura de la manguera de salida por encima del nivel del orificio de entrada a fin de evitar la pérdida retrógrada de las partículas de material. Elimínese el agua residual de la forma más completa posible del instrumental de muestra. Una vez escurrido del todo el aparato, ábrase el contenedor del filtro y retírese el cartucho con una técnica asép-

EXAMEN MICROBIOLÚGICO DE LAS AGUAS

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Figura 9711:2. Esquema del dispositivo para toma de muestras de Giardia.

Figura 9711:3. Dispositivo para toma de muestras de Giardia. A. Manguera de entrada; B. Alojamiento del filtro; C. Manguera de salida; D. Hidrómetro; E. Controlador de flujo con orificio limitante.

tica, colocándolo en una bolsa de plástico etiquetada, que se sella. Si es preciso recoger otras muestras con el mismo aparato, aclárense meticulosamente la manguera de entrada y el contenedor del filtro con el agua antes de instalar otro cartucho. Refrigérense las muestras o co-

loquense en agua con hielo tan pronto como sea posible tras su recogida. Transpórtense al laboratorio en agua con hielo y procésense cuando convenga, aunque antes de 48 horas. No se deben congelar. Los tiempos de conservación y transporte deben reducirse al mínimo.

9-232

3.

Procesamiento de la muestra

a) Extracción: Utilícese una técnica aséptica. Mediante una navaja, sepárense las fibras del filtro de su eje central de sostén, haciendo un corte longitudinal a lo largo de todo el cartucho. Córtense las fibras en dos o más partes aproximadamente iguales, cada una de ellas compuestas por una capa externa y otra interna. A menudo habrá una línea de separación bastante clara debida a la profundidad a la que han penetrado las partículas de la muestra en el interior del filtro. Alternativamente, localícese el extremo del tejido en el exterior del cartucho, deshágase el tejido y divídase en partes iguales. Lávese cada una de estas partes por separado con 1 l de agua destilada, agitando o amasando durante aproximadamente 10 minutos. Exprímase el líquido de todas ellas y combínese. Si el lecho de fibras retiene una cantidad importante de partículas, repítase el proceso de extracción de las porciones de filtro hasta que éstas aparezcan limpias. Si no es posible continuar el procesado más allá de este punto, consérvese el extracto añadiendo un volumen suficiente de formaldehído al 37 por 100 (v/v) hasta que éste se halle a una concentración final del 2 por 100 (v/v). Refrigérese el extracto así conservado hasta su concentración. b) Concentración del extracto: Concéntrese el extracto del filtro dejando que sedimente en un refrigerador durante toda la noche o centrifugándolo a 600 x g durante 5 minutos. Decántense o aspírense los líquidos sobrenadantes y resuspéndase la masa en un volumen de formaldehído al 2 por 100 (v/v) igual al volumen total de los sedimentos combinados. Si existe poco sedimento, suspéndase en 10 ml de formaldehído al 2 por 100 (v/v) y vuélvase a centrifugar durante 5 minutos a 600 x g. Si el volumen de sedimento es ≤ 1 ml, continúese procesando por decantación o aspiración de todo el sobrenadante, que se desecha. Si

MÉTODOS NORMALIZADOS

el volumen de sedimento es > 1 ml, resuspéndase en el líquido sobrenadante, transfiérase un volumen de suspensión equivalente a 1 ml de sedimento a un tubo de 15 ml y centrifuguese de nuevo durante 5 minutos a 600 x g. Decántese y deséchese el sobrenadante. Añádanse 2-3 gotas de solución yodada de Lugol (diluyase la solución madre 1:5 con sp gr 1,20 de solución de sulfato de zinc) y mézclese con un aplicador de varilla. Añádanse 5 ml de sulfato de zinc (ZnSO4) (sp gr 1,20) y mézclese en un mezclador giratorio. Llévese el volumen a la parte superior del tubo mediante una nueva adición de ZnSO4 teniendo cuidado de evitar el derramamiento. Mediante un rotor de balanceo, centrifugúese durante 3 minutos a 650 x g. Tóquese con cubreobjetos limpio y desengrasado el menisco y déjese que el tubo y su contenido reposen durante los 2 ó 3 minutos siguientes. Téngase cuidado de asir el cubreobjetos sólo por sus bordes. Levántese verticalmente, coloquese en un portaobjetos y séllese con vaspar. c) Estudio microscópico: Estudíese todo el área del cubreobjetos con un aumento de 100 x en microscopio de campo brillante utilizando poca luz. De modo alternativo, empléense técnicas de inmunofluorescencia20, 23. Identifiquense los microorganismos sospechosos con aumentos de 450 a 1.000 x utilizando un micrómetro ocular. Esta identificación debe ser realizada por una persona con capacidad conocida para reconocer y diferenciar los protozoos intestinales. Conviene prestar atención para no confundir Giardia con levaduras, diatomeas, Coccidia y otros. La identificación positiva de Giardia exige encontrar estructuras que posean el tamaño y la forma adecuados, así como al menos dos características morfológicas internas (núcleo, cuerpos medianos, axonemas). Se debe estudiar todo el sedimento de la forma descrita antes de afirmar que es negativo.

9-233

EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

4.

Comunicación de resultados

Comuniquese el hallazgo de estructuras similares a quistes de Giardia mayores de 8 µm y menores de 19 µm, así como cualquier estructura interna observada. Puede ser útil tomar microfotografías de los quistes sospechosos para documentar o corroborar la identificación. Regístrense y comuniquense todos los microorganismos distintos a Giardia identificados. 5.

Cultivo

En la actualidad, no existe ningún método in vitro para cultivar Giardia en el estadio de quiste. Sí es posible cultivar los trofozoítos, aunque es poco probable encontrarlos en número suficiente en los suministros de agua o que sobrevivan suficiente tiempo.

3. BINGHAM, A. K., E. L. JARROL, E. A. MEYER, y S. RADULESCU. 1979. Giardia sp.: physical factors of excystation in vitro and excystation vs. eosin exclusión as determinants of viability. Exp. Parásitol. 47:284. 4. KlRNER, J. C, J. D. LlTTLER & L. A. ANGELO. 1978. A waterborne outbreak of giardiasis en Camas, Washington. J. Amer. Water Works Assoc. 70:35. 5. CRAUN, G. F. & W. JARUBOWSKI. 1987. Status of waterborne giardiasis outbreaks and monitoring methods. En International Symposium on Water Related Health Issues Proceedings. TPS 87-3, American Water Resources Assoc, Bethesda, Maryland. 6. HOFF, J. C. 1979. Disinfection resistance of Giardia cysts: Origins of current concepts and research in progress. En W. Jakubowski & J. C. Hoff, eds. EPA Symposium on Waterborne Transmission of Giardiasis. EPA-600/9-79-001. U.S. Environmental Protection Agency, Cincinnati, Ohio. 7. RICE, E. W. & J. C. HOFF. 1981. Inactivation of Giardia lamblia cysts by ultraviolet irradiation. Appl. Environ. Microbiol. 42:546. 8.

6. Viabilidad

No se dispone de métodos prácticos para determinar la viabilidad de los quistes encontrados en las muestras de agua. Puede emplearse el modelo animal de Gerbillus29 para determinar la infectividad de concentrados de muestras de agua sin conservante, pero la infección de este animal es errática30, y una muestra de agua con quistes viables puede o no provocar su infección. En consecuencia, un resultado negativo no implica la ausencia de quistes viables. 7.

9.

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18.

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MÉTODOS NORMALIZADOS

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EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

9711 C. 1.

9-235

Entamoeba histolytica

Presencia

La contaminación fecal del agua dulce es una fuente importante de amebiasis, aunque la vía orofecal y el consumo de productos vegetales crudos también lo son. Los defectos de las tuberías en que se producen conexiones entre las redes de alcantarillado y agua potable, el sifón retrógrado de los retretes, el desagüe de líneas de alcantarillado defectuosas hacia un refrigerador de agua abierto y la filtración de líneas de agua de baja presión sumergidas en aguas residuales han producido brotes de enfermedad. E. histolytica aparece a bajas concentraciones en las aguas residuales y se han encontrado de 1 a 5 quistes/l en el efluente de una planta de tratamiento. Estos quistes pueden permanecer viables durante varios días, pero su baja densidad inicial disminuye aún más en la corriente de entrada por dilución, cambios en la temperatura del agua y sedimentación.

3.

Sitúese el líquido de lavado en un contador de células Sedgwick-Rafter y estúdiese con bajos aumentos en busca de quistes, trofozoítos o ambos.

4.

Cultivo

Inocúlese el concentrado de la muestra en medio de infusión de hígado modificado1, incúbese a 37 °C durante no menos de 3 días y no más de 6, y analícese al microscopio en busca de trofozoítos. Al concentrar y cultivar partes duplicadas de la muestra puede hacerse un análisis del número más probable de E. histolytica.

5.

Referencias CHANO, S. L. & P. W. KABLER. 1956. Detection of cysts of Entamoeba histolytica in tap water by the use of membrane filters. Amer. J. Hyg. 64:170.

2. Técnicas de concentración

Utilícese una muestra de 4 1 como mínimo y filtros de membrana con un tamaño de poro de 7 a 10 µm si no existen problemas de turbidez. Fíltrese la muestra, si bien conviene evitar que el filtro se seque; interrúmpase la aspiración, transfiérase el filtro a la pared de un vaso de precipitado y humedézcase repetidamente la superficie del mismo con algunos mililitros de agua destilada esterilizada. También puede emplearse la técnica de concentración y procesamiento de grandes volúmenes que se ha indicado para Giardia.

Estudio microscópico directo

1.

Bibliografía

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9-236

MÉTODOS NORMALIZADOS

9810

EXAMEN NEMATOLÓGICO 9810 A.

1.

Introducción

Importancia

Los nematodos libres suelen habitar en suelos húmedos o en los sedimentos del fondo de los depósitos de agua y se desarrollan en medios aerobios ricos en bacterias y otros alimentos microbianos. Por tanto, se propagan en los filtros lentos de arena, proliferan en las plantas de tratamiento aerobio y biológico de aguas residuales y aparecen en grandes cantidades en los efluentes secundarios. Las aguas superficiales que reciben tales efluentes pueden contener cifras de nematodos muy superiores a los que se encuentran en aguas carentes de tales desagüesl-3. Gracias a su capacidad para moverse libremente y a su resistencia a la cloración, los nematodos no son sensibles al tratamiento convencional del suministro de agua y pueden penetrar en número apreciable en el sistema de distribución. Los nematodos originados en las plantas de tratamiento de aguas residuales pueden ser portadores de patógenos intestinales humanos que hayan ingerido. Sin embargo, aunque la información sobre los nematodos libres puede servir como complemento a los datos bacteriológicos sobre una historia de la contaminación3, estos organismos tienen una relación muy remota con el potencial de transmisión de infecciones. Los nematodos parásitos de las plantas comprenden las formas acuáticas que se alimentan de algas y plantas acuáticas sumergidas y las formas no acuáticas que parasitan hongos y plantas superiores. Las formas acuáticas se clasifican a me* Aprobado por el Standard Methods Committee, 1985.

nudo como nematodos libres, mientras que los grupos no acuáticos suelen considerarse parásitos de las plantas. En las áreas en que éstos abundan, las acequias y los desagües de las fábricas procesadoras de los cultivos son susceptibles de transportar huevos, hembras, tejidos vegetales infectados, o todos ellos. Las aguas superficiales que reciben estas acequias y desagües, si se emplean para regar, diseminan la infestación. 2.

Descripción de los organismos

Los nematodos, conocidos a menudo como áscaris o lombrices, son invertebrados que carecen de apéndices. Los que parasitan a los animales suelen ser macroscópicos; los más pequeños, como los oxiuros y lombrices intestinales, tienen 1 cm de longitud, aproximadamente, mientras que las microfilarias (juveniles) de la sangre y los tejidos son microscópicos (unos 0,25 mm de longitud). Los nematodos de agua dulce, del suelo y parásitos de las plantas suelen ser microscópicos, aunque en ocasiones pueden apreciarse formas grandes o hinchadas con una lupa de 6 a 10 x . Para su identificación exacta es imprescindible el microscopio. Los nematodos del suelo y de agua dulce tienen, en general, unos 0,5 a 1 mm de longitud y 0,02 a 0,05 mm de grosor, con ambos extremos afilados. Existen dos sexos en casi todos los géneros, aunque también hay especies hermafroditas (que ponen huevos fertilizados) y partenogenéticas (huevos diploides). Los nematodos presentan cabeza, cuerpo y cola claramente separados. La cabeza está formada normalmente por un boca de seis labios y un estoma que

EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

lleva al esófago. En muchas formas que se alimentan de zoomicrobios, el estoma aumenta de tamaño para convertirse en una cavidad bucal, con o sin dientes. Los nematodos adaptados para nutrirse de bacterias, levaduras y algas diminutas suelen poseer un estoma tubular, mientras que en los adaptados para chupar los líquidos celulares el estoma se ha modificado para formar una púa o estilete hueco. La cola es posterior al ano, suele ser afilada y puede terminar bruscamente o hacerse puntiaguda. Entre la cabeza y la cola se encuentra el largo cuerpo, que contiene el canal alimentario: esófago, bulbo esofágico e intestino. La cavidad del cuerpo es el espacio situado entre la pared externa y el canal alimentario. Contiene los sistemas reproductor, nervioso y excretor. Estos

9-237

dos últimos son difíciles de distinguir sin técnicas de tinción y grandes aumentos, aunque el canal excretor y el poro suelen ser fáciles de apreciar. Muchos nematodos tienen glándulas caudales en la ancha zona de la cola, mientras que otros poseen fásmides semejantes a papilas en las caras ventrolaterales de la cola. El sistema reproductor de la hembra consiste en uno o dos ovarios, oviductos, úteros y vagina, que se abre al exterior a través del poro genital o vulva. En casi todos los nematodos libres, el poro genital es posterior al punto medio del cuerpo; en algunos géneros parásitos de las plantas está situado en la cuarta parte anterior para dejar sitio a las grandes gónadas. Su contrapartida en el animal macho son los testículos, las vesículas seminales, los conductos deferentes y el

mm

Figura 9810:1. Ciclo vital de los nematodos. 1. Corte de un gusano hembra que muestra tres huevos. 2. Huevo liberado de un gusano hembra con larva bien formada. 3. Larva saliendo del huevo. 4. Larva de primer estadio con cola. 5. Larva de segundo estadio. 6-7. Larvas de tercer estadio. 8. Larva de cuarto estadio. 9-10. Gusanos hembras. 11. Corte de un gusano hembra maduro que muestra la cutícula estriada. 12. Gusano hembra con útero bien desarrollado y un huevo. 13. Gusano macho con espículas y gobernáculo. 14. Sección posterior de un gusano macho que muestra una visión lateral de las espículas.

9-238

conducto eyaculador. Cerca del orificio de salida de éste se distinguen un par de llamativas espículas (órganos copulatorios del macho). El ciclo vital de los nematodos libres consiste en el huevo, cuatro estadios de larva y un estadio adulto. Los huevos son, en general, difíciles de identificar en el agua no tratada o en los diluyentes de aguas residuales. En el agua tratada, exenta de casi todas las formas de microfauna, pueden identificarse con facilidad los huevos procedentes de hembras vivas o muertas del sistema de distribución. Las formas juveniles recuerdan a las adultas, aunque carecen de sistema reproductor. Cuando están recién formadas, su tamaño es aproximadamente cinco veces menor que el de los adultos. La figura 9810:1 muestra este desarrollo por fases. Los nematodos parásitos de las plantas se dividen en parásitos de las partes aéreas y parásitos de las raíces y tallos subterráneos. En ocasiones, estas raíces infestadas muestran hembras hinchadas o masas de huevos. Como huéspedes, destacan las patatas, las remolachas y las zanahorias. El control de los nematodos en el suelo infectado es difícil. La limpieza de las plantas infectadas antes de su comercialización puede liberar nematodos, agallas y huevos hacia las aguas residuales. 3.

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MÉTODOS NORMALIZADOS

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4.

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9-239

EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

9810 B. Técnica para nematodos 1.

Muestras

Tómense todas las muestras de las estaciones de muestreo en las que se recojan muestras bacteriológicas, de forma que los hallazgos puedan interpretarse en conjunto. Si el estudio pretende obtener datos sobre contaminación de corrientes, tómense las muestras por encima y por debajo de una desembocadura, con el número adecuado de estaciones de muestreo por debajo de la misma, para asegurar el depósito de nematodos. Cuando se toman muestras para análisis de plancton pueden incluirse los nematodos, aunque habrán de comunicarse por separado. En áreas infestadas por nematodos de las plantas, especialmente en aguas contaminadas con diluyentes procedentes de sistemas de limpieza, deben recogerse también muestras del diluyente. a) Toma de muestras: Recójanse las muestras de igual forma que para el estudio bacteriológico (sección 9060) con las siguientes modificaciones: utilícense muestras de volumen no inferior a 2 l, preferiblemente de 4 l. Los envases de plástico cuadrados son adecuados para recoger y transportar estas muestras. No es preciso que estén esterilizados, es suficiente con lavarlos cuidadosamente con agua del grifo y enjuagarlos con agua destilada. Para el estudio de agua potable son adecuadas muestras de 20 a 100 l. b) Almacenamiento de las muestras: Es preferible estudiar el material que contiene nematodos vivos. Aunque no es necesario refrigerar las muestras, deben analizarse lo antes posible y no más de 2 días después de su recogida. Si ello no es posible, habrán de almacenarse. Con fines taxonómicos, mátense los nematodos con calor suave, porque los nematodos vivos se alteran cuando son co-

locados directamente en un fijador. Para matar los nematodos debe colocarse el envase que los contenga en un baño de agua a 57 °C durante 15 minutos. Si no se dispone de un baño de este tipo, han de relajarse con calor mediante la adición de una cantidad de agua hirviendo similar a la de la muestra (a temperatura ambiente). Tras este tratamiento, coloquense inmediatamente los nematodos en formol al 4 por 100 (4 ml de solución comercial de formaldehído al 37 por 100 o 40 por 100 más 96 ml de agua). Para colecciones, añádase una solución al 8 por 100 de formol a un volumen igual de la muestra. 2. Procedimiento de recuento de nematodos

a) Concentración de la muestra: Cuando sea conveniente, concéntrese la muestra en el mismo lugar de la recogida. Para ello, fíltrese de la forma indicada en la sección 9222B.5b, sustituyendo el filtro de membrana por un tamiz de nailon tejido (tamaño del poro, 25 a 30 µm). En general, será posible filtrar de este modo unos 4 l de agua moderadamente contaminada sin cambiar de tamiz durante un intervalo razonable. Si el tamiz se obtura, utilícense dos o más para la totalidad de la muestra. Al desaparecer el último resto de agua de la superficie, desconéctese la tapadera del mango. Retírese el tamiz con un par de pinzas y coloquese en la pared de un vaso de precipitado limpio de 100 ml que contenga de 2 a 4 ml de agua de dilución tamponada con fosfato o agua destilada. Utilizando una pipeta capilar, limpíese la superficie del tamiz 8 o 10 veces con el agua del vaso para desprender los nematodos. Si se ha empleado más de un tamiz para

9-240

concentrar una sola muestra, reúnanse los distintos lavados en uno. Después de filtrar la muestra, lávense el tamiz y su mango en agua del grifo corriente y aclárese con agua destilada antes de utilizarlo de nuevo. No es preciso esterilizarlo. b) Recuento: Transfiérase 1 ml de agua de lavado bien mezclada del vaso de precipitado a una cámara de recuento Sedgwick-Rafter. Mediante un aumento de 100 x, estudíese toda la cámara y cuéntense todos los nematodos, jóvenes y adultos. Si el número de los hallazgos por mililitro de concentrado fuera superior a 10, multipliquese este número por los mililitros de concentrado, divídase por litros de la muestra y comuniquese el número de nematodos por litro. Si el número se encuentra entre 5 y 10/ml de concentrado, cuéntense los presentes en un segundo mililitro de concentrado; si su número fuera inferior a 5/ml, cuéntense los de la totalidad del concentrado. Puede resultar de utilidad la separación de las formas viables de las muertas, acción posible sólo en muestras sin conservante. Al estudiar las muestras tomadas de aguas en las que se sospechan nematodos parásitos de las plantas, búsquense y cuéntense las masas de huevos y hembras. 3. Identificación de los nematodos acuáticos habituales

Viértanse las porciones estudiadas del concentrado de la muestra en un tubo cónico de centrífuga y centrifuguese a 1.000 rpm durante 5 minutos. Sin agitar el sedimento, retírese el sobrenadante con una pipeta capilar hasta que sólo queden 4 ó 5 gotas, que se mezclan, y transfiérase una gota del resto a un portaobjetos. Coloquese un anillo de vaselina en torno a ella y tápese con un cubreobjetos. Analícense las característi-

MÉTODOS NORMALIZADOS

cas anatómicas básicas según las ilustraciones de la sección 9810C. 4.

Interpretación

Dado que los nematodos vivos de las aguas abiertas de lagos y ríos son, en su mayor parte, si no en su totalidad, achacables a la contaminación por diluyentes secundarios a partir de plantas de tratamiento aerobio de aguas residuales, su número proporciona una estimación grosera, pero fiable, del nivel de contaminación. Los nematodos adultos, sobre todo los más grandes, se depositan en el fondo a un ritmo que depende de la agitación de las aguas o de su velocidad de flujo. Por tanto, su presencia en muestras tomadas a distancias determinadas del punto de descarga es de gran utilidad en un historial de contaminación. La rapidez con que se obtienen los resultados constituye una clara ventaja de este análisis. Cuando se estudian los resultados nematológicos en conjunto con los hallazgos bacteriológicos, pueden hacerse suposiciones sobre la historia de polución, presencia de sustancias tóxicas, anaerobiosis y temas afines. Por ejemplo, una combinación de un elevado recuento bacteriológico fecal y un recuento muy bajo de nematodos sugiere que el agua se ha contaminado a partir de un diluyente primario, de un diluyente secundario de una planta de tratamiento biológico anaerobio o de uno procedente de un estanque o laguna de estabilización. Un recuento bacteriano fecal muy bajo, unido a un alto recuento de nematodos, indica que el agua ha sido empleada como portadora de un diluyente secundario desinfectado, ya que los nematodos son mucho más resistentes que la mayor parte de las bacterias al cloro y a otros desinfectantes habituales. Un recuento de bacterias fecales moderadamente elevado y un bajo recuento de nematodos, forma-

EXAMEN MICROBIOLÓGICO DE LAS AGUAS

9-241

do en su mayoría por formas pequeñas o jóvenes, revelan que el agua contaminada está estancada o tiene una escasa velocidad de flujo, por lo que permite el asentamiento de los de mayor tamaño. Si el estudio revela una gran proporción de nematodos muertos o moribundos, es probable la presencia de un nematicida o de una anaerobiosis prolongada. Si se incluye en la exploración de una fuente de agua no tratada la enumeración de los nematodos, y los procesos de tratamiento comprenden precloración, sedimentación y filtración, la existencia de un recuento mucho más bajo en el agua acabada indica la eficacia de la cloración, que inmovilizó los nematodos y facilitó su eliminación por foculación. En este tipo de análisis debe utilizarse como índice de la eficacia del tratamiento el siguiente cálculo:

Cuando los análisis repetidos muestran recuentos de nematodos iguales a 20/l de agua no tratada o superiores, debe pensarse en la necesidad de reducir la carga de estos organismos en el agua acabada mediante un tratamiento especial. Cuando se encuentren nematodos parásitos de las plantas en el agua de riego, el empleo de ésta en los cultivos sin tratamiento especial puede ser indeseable.

9810 C.

1.

Clave ilustrada para la identificación de nematodos de agua dulce

Discusión general

La clave siguiente ha sido diseñada para su empleo por personas formadas en biología, aunque no necesariamente en nematología. Las ilustraciones comprenden dibujos originales, fotocopias de dibujos publicados o fotocopias en las que se han vuelto a dibujar las figuras. Las dos referencias más importantes han sido Goodey1 y Chitwood y Chitwood2. Otras publicaciones también empleadas

como referencias se enumeran en la bibliografía. La bibliografía publicada indica que algunos de los géneros de esta clave contienen especies asociadas preferentemente con hábitats terrestres. La presencia de estos nematodos sugiere torrenteras procedentes de tierras altas en las que crecen distintas plantas (a menudo fuentes de alimento para estos nematodos). Estos géneros han sido señalados con un asterisco (*).

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3.

Referencias

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PARTE 10000 ANÁLISIS BIOLÓGICO DE LAS AGUAS

10010

INTRODUCCIÓN

La calidad del agua afecta a las poblaciones nativas de organismos acuáticos, en cuanto a su abundancia, especies que las componen, productividad y condición fisiológica. Por ello, la naturaleza y salud de las comunidades acuáticas son una expresión de la calidad del agua. Entre los métodos biológicos utilizados para evaluar esa calidad, se incluyen la obtención, recuento e identificación de organismos acuáticos; medida de la biomasa; determinación de las tasas de actividad metabólica; medida de la toxicidad, bioconcentración y bioacúmulo de contaminantes, y procesado e interpretación de los datos biológicos. La información obtenida con ese tipo de determinaciones puede servir para uno o más de los fines siguientes: 1) Para explicar la causa del color y turbidez, y la presencia molesta de olores, sabores y partículas visibles en el agua. 2) Ayudar en la interpretación de los análisis químicos, relacionando, por ejemplo, la presencia o ausencia de algunas formas biológicas de deficiencia o sobresaturación de oxígeno en las aguas naturales. 3) Identificar la fuente de un agua mezclada con otra. 4) Explicar la obstrucción de conducciones, mallas o filtros, y ayudar al diseño y funcionamiento de las plantas de tratamiento de aguas naturales y residuales. 5) Determinar los tiempos óptimos para tratamiento de aguas superficiales con algicidas y controlar su eficacia. 6) Determinar la eficacia de las fases

de tratamiento del agua de bebida y ayudar a determinar la dosis eficaz de cloro dentro de una planta de tratamiento, ya que esa dosis está relacionada con los materiales orgánicos del agua. 7) Identificar la naturaleza, alcance y efectos biológicos de la contaminación. 8) Indicar el curso de la autopurificación en las masas acuáticas. 9) Colaborar a explicar el mecanismo de los métodos de tratamiento biológico de aguas residuales, y servir de índice de su eficacia. 10) Ayudar a determinar el estado y eficacia de procesos unitarios en una planta de tratamiento de aguas residuales. 11) Documentar la variabilidad a corto y largo plazo de la calidad del agua, debida a fenómenos naturales y/o actividades humanas. 12) Proporcionar datos sobre el estado de un sistema acuático de una forma regular. La naturaleza concreta de un problema y las razones de obtención de las muestras indicarán qué comunidades de organismos acuáticos deben ser examinadas y la toma de muestras y técnicas analíticas que hay que utilizar. En las secciones que siguen se considerarán las comunidades acuáticas citadas a continuación: 1) PLANCTON: Una comunidad de plantas (fitoplancton) y animales (zooplancton), que nadan o están suspendidos en el agua normalmente, sin motilidad o con motilidad insuficiente para evitar su arrastre por las corrientes. En el

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agua potable, generalmente son pequeños o microscópicos; en el entorno marino o estuarino, se observan más frecuentemente formas mayores. 2) PERFITON (AUFWUCHS): Una comunidad de plantas y animales microscópicos asociados a las superficies de objetos sumergidos. Algunos están unidos y otros se mueven alrededor. Muchos de los protozoos, y otros invertebrados y algas diminutos encontrados en el plasma, se dan también en el perfiton. 3) MACROFITON: Las plantas más grandes de todos los tipos. A veces están sujetas al fondo («bénticas»), otras flotan libremente; a veces están totalmente sumergidas y otras emergen en parte. Los tipos complejos suelen tener raíces, tallos y hojas reales; las macroalgas son más sencillas, pero pueden poseer estructuras parecidas al tallo y las hojas. 4) MACROINVERTEBRADOS: LOS invertebrados definidos aquí son los retenidos por el tamiz estándar US n.° 30. Generalmente son organismos que viven en los fondos («benthos»). 5) PECES: Para los fines de esta publicación, son sólo los peces con aletas. 6) ANFIBIOS, REPTILES ACUÁTICOS, PÁJAROS Y MAMÍFEROS: Estos vertebrados pueden ser afectados también, directa o indirectamente, por vertidos u otras descargas de contaminantes y podrían ser útiles en el control de la presencia de sustancias tóxicas o cambios a largo plazo de la calidad del agua. No se incluye una discusión sobre estos organismos. Hay un gran número de bacterias y hongos presentes en el plancton y perfiton, constituyendo un elemento esencial del ecosistema acuático total. Aunque sus interacciones con la materia orgánica viva y muerta afectan profundamente a los organismos acuáticos más grandes, las técnicas para su investigación no se incluyen aquí (véase parte 9000). Las observaciones de campo son indispensables para una interpretación biológica significativa, pero muchos factores

MÉTODOS NORMALIZADOS

biológicos no pueden ser evaluados directamente en el campo, sino que se deben analizar como datos o muestras de campo, en el laboratorio. Dado que el significado del resultado analítico depende de la representatividad de la muestra, se presta especial atención a los métodos de campo y a los correspondientes métodos de laboratorio. Antes de iniciar una toma de muestras, deben definirse con claridad los objetivos del estudio. Por ejemplo, la frecuencia de un programa de toma de muestras repetidas puede variar desde hacerlo cada hora, para un estudio detallado de la variabilidad, hasta cada 3 meses, para una estimación general de las condiciones estacionales, dependiendo de los objetivos. El ámbito del estudio debe ajustarse a las limitaciones de personal, tiempo y presupuesto. Antes de desarrollar el plan de un estudio, examínense los datos históricos para la zona y llévese a cabo una búsqueda bibliográfica del trabajo realizado previamente por otros investigadores. Siempre que sea posible, los biólogos deben recoger sus propias muestras. Gran parte del valor de un biólogo experimentado reside en las observaciones personales de las condiciones en el terreno y la capacidad para reconocer signos de cambios ambientales, reflejados en las distintas comunidades acuáticas. La orientación básica de la parte 10000 es la obtención de muestras de campo y los análisis de laboratorio correspondientes, para ayudar a determinar la situación de las comunidades acuáticas en las condiciones del terreno, y a interpretar la influencia de las condiciones ambientales pasadas y actuales. Puede haber, y hay, muchos otros tipos de estudios, más encaminados a la investigación de laboratorio, que desarrollarán un conocimiento básico adicional de las respuestas de una comunidad y/o un organismo bajo condiciones controladas, ayudando a predecir efectos de cambios

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ANÁLISIS BIOLÓGICO DE LAS AGUAS

futuros en las condiciones ambientales, sobre las comunidades acuáticas. Sin embargo, esos estudios se salen del ámbito de esta publicación. Las complejas interrelaciones existentes en un ambiente acuático, se reflejan en la organización de las secciones siguientes. Los procedimientos de campo y laboratorios relacionados con una sec-

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PLANCTON*

10200 A. El término «plancton» se refiere a esas formas acuáticas microscópicas con nula o escasa resistencia a las corrientes, que viven flotando o suspendidas en aguas abiertas o pelágicas. Las plantas planctónicas, «fitoplancton», y los animales planctónicos, «zooplancton», se incluyen en esta sección. El fitoplancton (algas microscópicas) aparece en forma unicelular, colonial o filamentosa. Muchas son fotosintéticas y sirven de alimento al zooplancton y otros organismos acuáticos. En otro lugar se trata de otros organismos presentes en el mismo entorno: los hongos zoospóricos, en la sección 9610; los hifomicetes acuáticos, en la sección 9610F, y las bacterias, en la parte 9000. El zooplancton del agua potable incluye principalmente protozoos, rotíferos, cladóceros y copépodos; en las aguas marinas se da una gran variedad de organismos. 1.

ción pueden ser apropiados también para otras; en consecuencia, son frecuentes las referencias cruzadas entre secciones. Los métodos seleccionados son necesarios para la evaluación de la calidad de un agua. Se hace especial hincapié en los métodos y equipo, más que en la interpretación o aplicación de los resultados.

Significación

El plancton, especialmente el fitoplancton, se ha utilizado como indicador de la calidad del agua1-4. Algunas especies crecen en aguas muy eutróficas, * Aprobado por el Standard Methods Committee, 1989.

Introducción mientras otras son muy sensibles a los residuos orgánicos y/o químicos. Algunas especies producen olores5 y sabores molestos, o condiciones anóxicas o tóxicas que dan lugar a la muerte de animales o enfermedades en el hombre6. El conjunto de especies del fitoplancton y zooplancton también puede ser útil para evaluar la calidad del agua7. Debido a sus cortos ciclos vitales, los componentes del plancton responden rápidamente a los cambios ambientales, y de ahí que la composición de sus especies sea un indicador de la calidad de la masa de agua en que se encuentran. Influyen fuertemente sobre algunos aspectos no biológicos de la calidad del agua (como el pH, color, sabor y olor) y, en un sentido muy práctico, son parte de su calidad. Algunos «taxa» son útiles, a menudo, para determinar el origen o la historia reciente de una masa de agua. Sin embargo, su naturaleza pasajera y su frecuente distribución desigual hacen que su utilidad como indicadores de la calidad acuática sea limitada. La información sobre el plancton se interpreta mejor relacionándola con los demás datos físicoquímicos y biológicos obtenidos simultáneamente. Los organismos planctónicos predominan en estanques, lagos y océanos. El potamoplancton se desarrolla en ríos

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MÉTODOS NORMALIZADOS

grandes con aguas de movimiento lento que se aproximan a las condiciones lénticas. Debido a su origen posiblemente incierto y a la duración de su exposición a contaminantes desconocidos, los componentes del plancton son menos valiosos como indicadores de la calidad del agua en entornos lóticos que en los lénticos.

2. 1.

2.

4.

5.

6.

Referencias PALMER, C. M. 1969. A composite rating of algae tolerating organic pollution. J. Phycol. 5:78. PALMER, C. M. 1963. The effect of pollution

10200 B. 1.

3.

7.

on river algae. Bull. Nueva York Acad Sci. 108:389. RAWSON, D. S. 1956. Algal indicators of trophic lake types. Limnol. Oceanogr. 1:18. STOERMER, E. F. & J. J. YANG. 1969. Plankton Diatom Assemblages in Lake Michigan. Spec. Rep. n.° 47, Great Lakes Research Div., Univ. Michigan, Ann Arbor. PRESCOTT, G. W. 1968. The Algae: A. Review. Houghton Mifflin Co., Boston, Massachusetts. CARMICHAEL, W., ed. 1981. The Water Environment, Algal Toxins and Health. Plenum Press, Nueva York. GANNON, J. E. & R. S. STEMBERGER. 1978. Zooplankton (especially crustaceans and rotifers) as indicators of water quality. Trans. Amer. Microsc. Soc. 97:16.

Toma de muestras

Consideraciones generales

La frecuencia y localización de la toma de muestras viene dictada por el objetivo del estudio1. Las estaciones de toma de muestras deben situarse lo más cerca posible de las seleccionadas para toma de muestras químicas y bacteriológicas, para asegurar la máxima correlación de los resultados. Establézcase un número suficiente de estaciones, en tantas localizaciones como sea preciso para definir adecuadamente los tipos y cantidades de plancton en las aguas estudiadas. La naturaleza física del agua (estancada, corriente o con mareas) influirá mucho en la selección de las estaciones de muestreo. El uso de lugares de toma de muestras seleccionados por investigadores anteriores, asegurará normalmente la disponibilidad de datos históricos que lleven a una mejor comprensión de los resultados actuales y proporcionarán una continuidad al estudio de la zona. En el trabajo en corrientes o ríos, sitúense las estaciones corriente arriba y abajo de las posibles fuentes de contaminación, y las corrientes tributarias principales, a intervalos adecuados en todo el

trayecto investigado. Si es posible, se situarán las estaciones en las dos orillas del río, porque puede no haber un mezclado lateral de las aguas del río en grandes distancias corriente abajo. De modo similar, investíguense las corrientes tributarias sospechosas de contaminación, pero con cuidado al interpretar los datos procedentes de una corriente pequeña, porque mucho del plancton puede tener origen perifitico, procediendo de la erosión de sustratos naturales por el agua corriente. También las aportaciones del plancton de los lagos, pantanos y zonas de agua estancada adyacentes, y los organismos del suelo, arrastrados por la corriente, pueden influir en la interpretación de los datos. La profundidad desde la que se descarga el agua procedente de pantanos estratificados, corriente arriba, puede afectar a la naturaleza del plancton. Dado que el agua de los ríos y corrientes suele estar bien mezclada verticalmente, la toma de muestras bajo la superficie, es decir, el metro superior o una combinación de dos o más estratos, suele ser adecuado para obtener una muestra representativa. Es posible que

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haya problemas debidos a la estratificación de descargas termales o mezcla de aguas frías y calientes procedentes de tributarios y pantanos. Siempre deben tomarse las muestras en el canal principal de un río, evitando los cienos, ensenadas o zonas estancadas que reflejen hábitats locales en lugar de las condiciones del río. En los ríos con mezclado horizontal y vertical, mídanse las poblaciones del plancton, examinando muestras periódicas recogidas en el centro de la corriente de 0,5 a 1 m bajo la superficie. Si se puede determinar o suponer correctamente que la distribución del plancton es uniforme y normal, utilícese un esquema de toma de muestras al azar para acomodar las pruebas estadísticas. Inclúyase tanto la selección al azar de puntos de toma de muestras y cortes tranversales como la recogida de muestras en cada punto seleccionado. Por otra parte, si se sabe o supone que la distribución del plancton es variable o desigual, inclúyanse puntos adicionales de obtención, recójanse muestras compuestas y auméntese la duplicación de muestras. Utilícense pruebas estadísticas apropiadas para determinar la variabilidad de la población. Al tomar muestras de un lago o pantano, utilícese una red de malla o líneas transversales combinadas con métodos al azar. Tómese un número suficiente de muestras para que los datos sean significativos. Tómense muestras en puntos estratégicos de un lago circular, a lo largo de un mínimo de dos líneas transversales perpendiculares de orilla a orilla; inclúyase el punto más profundo de la cuenca. En el caso de una cuenca larga y estrecha, tómense muestras en varios puntos, a lo largo de un mínimo de tres líneas transversales paralelas, a espacios regulares, que sean perpendiculares al eje largo de la cuenca; estando el primero cerca de la entrada y el último próximo a la salida. En una bahía amplia, tómense las muestras a lo largo de varias líneas

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transversales paralelas, con su origen cercano a la orilla y extendiéndose hasta el propio lago. Dado que se necesitan muchas muestras para hacer una evaluación completa de la composición del plancton, habrá que limitar la toma de muestras a puntos estratégicos, tales como en las proximidades de las entradas y descarga de agua, estrangulamientos en las corrientes de agua y entrantes principales que puedan influir sobre la cuenca principal. En los lagos, pantanos y estuarios, donde las poblaciones de plancton pueden variar con la profundidad, recójanse las muestras en todas las zonas profundas o masas de agua principales. La profundidad de la toma de muestras se determinará por la del agua en la estación, la de la termoclina o una isohalina u otros factores. En zonas poco profundas, de 2 a 3 m de profundidad, pueden ser adecuadas las muestras tomadas bajo la superficie de 0,5 a 1 m. En áreas más profundas, recójanse las muestras a intervalos regulares de profundidad. En los estuarios, tómense las muestras por encima y por debajo de la pincoclina. Los intervalos de profundidad para la toma de muestras varían en los estuarios de diferente tamaño y fondo, pero deben utilizarse profundidades representativas del rango vertical. A menudo se usan muestras compuestas de encima y debajo de la pincoclina. En la toma de muestras marinas, el alcance del muestreo estará determinado por el objetivo y ámbito del estudio. En la plataforma continental, tómense las muestras en estaciones aproximadamente equidistantes de la orilla que da al mar. Tómese una serie vertical desde la superficie hasta cerca del fondo en cada estación, añadiendo gradualmente más estaciones a través de la plataforma. Es importante tomar muestras de toda la gama vertical en una plataforma continental. Se pueden tomar muestras bénticas para recoger células o quistes inacti-

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vos. Más allá de la plataforma, en las aguas pelágicas, tómense las muestras en la zona fótica desde la superficie a la termoclina para el fitoplancton, y a mayor profundidad para el zooplancton. Las profundidades de toma de muestras varían, pero a menudo están a intervalos de 10 a 25 m por encima de la termoclina, luego a intervalos de 100 a 200 m bajo la termoclina hasta 1.000 m y a continuación a intervalos de 500 a 1.000 m. Normalmente, las muestras se denominan «superficiales» o «profundas» (bajo la superficie). Estas últimas se toman a una profundidad establecida, mientras las superficiales pueden interpretarse como obtenidas lo más cerca posible de la superficie. Una muestra tomada «rozando» la película superficial del plancton (neuston)2 puede ser reveladora; sin embargo, no debe incluirse en general una cantidad desproporcionada de la película superficial, porque a menudo se recoge flora neustónica3 además del plancton, junto con polen, polvo y otros detritus. Para tomar muestras de organismos superficiales se han usado varios métodos. La frecuencia de la toma de muestras depende de la intención del estudio, así como del intervalo de fluctuaciones estacionales, las condiciones meteorológicas, adecuación del estudio y disponibilidad del personal. Selecciónese una frecuencia de toma de muestras con intervalos algo más cortos que el tiempo de rotación de la comunidad, lo que requiere una consideración de la duración del ciclo vital, predación, inundaciones y desplazamientos de corriente. Es deseable tomar muestras frecuentes del plancton debido a la variabilidad temporal normal y el carácter migratorio de la comunidad del plancton. Se producen migraciones verticales diarias en respuesta a la luz solar, y otras horizontales o corrientes aleatorias producidas por los vientos, cambios de corriente y mareas. Lo ideal es tomar muestras diarias y, cuando sea posible, a

MÉTODOS NORMALIZADOS

distintas horas del día y a profundidades diferentes. Si no fuera posible, la toma de muestras semanal, quincenal, mensual o incluso trimestral puede seguir siendo útil para determinar los principales cambios de población. En los ríos, corrientes y regiones estuarinas sometidos a la influencia de las mareas, hay que esperar fluctuaciones en la composición del plancton durante un ciclo de mareas. Un programa típico para la toma de muestras en una estación dentro de un estuario incluye una serie vertical de muestras tomadas desde la superficie, a través de la pinoclina hasta cerca del fondo, recogidas a intervalos de 3 horas, durante, por lo menos, dos ciclos completos de mareas. La rutina de la toma de muestras se puede modificar en caso de comprobar una pauta característica. Se ha publicado una serie de monografías útiles sobre la metodología oceanógrafica4-7. Las referencias taxonómicas representativas para el fitoplancton marino y de estuario incluyen diatomeas8-11, dinoflagelados12-14, 15 coccolitóforos y cianoficeas16 (cianobacterias).

2. Procedimientos para toma de muestras

Una vez que se han determinado las posiciones, profundidades y frecuencia, prepárese la toma de muestras. Se deben colocar etiquetas en los recipientes para muestras con información suficiente para evitar errores y confusiones. Indíquense la fecha, número de operación, estación de toma de muestras, zona del estudio (río, lago, pantano), tipo de muestra y profundidad. Utilícense etiquetas impermeables. Cuando sea posible, colóquese la colección de recipientes en un envase protector para evitar roturas. Si las muestras se van a conservar inmediata-

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mente después de obtenerlas, añádanse los conservantes a los envases antes de tomarlas. El tamaño de la muestra depende del tipo y número de determinaciones a realizar; el número de duplicados depende del diseño estadístico del estudio y los análisis estadísticos seleccionados para interpretar los datos. Diséñese siempre el estudio alrededor de un objetivo, con un enfoque estadístico, en lugar de adaptar el análisis estadístico a los datos ya recogidos. Regístrese en un libro de campo la localización, profundidad, tipo, hora, condiciones meteorológicas, turbidez, temperatura del agua, salinidad y otras observaciones significativas. Son muy adecuados los cuadernos de campo de los ingenieros con papel impermeable. Los datos de campo son inestimables cuando se interpretan los resultados analíticos y, a menudo, contribuyen a explicar los cambios inusuales causados por el carácter variable del entorno acuático. Recójanse muestras coincidentes para análisis químicos con objeto de ayudar a definir las variaciones ambientales con efectos potenciales sobre el plancton. a) Fitoplancton: En aguas oligotróficas, o donde se esperen densidades bajas del fitoplancton, recójase una muestra de hasta 6 1. En aguas más ricas, eutróficas, tómense muestras de 0,5 a 1 l. Para evaluaciones cualitativas y cuantitativas, recójanse muestras completas de agua (sin filtrar ni colar) con un frasco para recogida de agua consistente en un tubo cilíndrico con tapones en los dos extremos y un dispositivo de cierre. Introdúzcase este dispositivo abierto hasta la profundidad deseada y ciérrese haciendo caer un peso, denominado mensajero, que hace deslizar el cable o cuerda de soporte y dispara el mecanismo de cierre. Si es posible, deben tomarse muestras a varias profundidades o reunir las de una profundidad, procedentes de varias tiradas. Los dispositivos de toma de mues-

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tras utilizados más comúnmente son el de Kemmerer17, Van Dorn18 (figura 10200:1), Niskin y Nansen. Dado que los tomamuestras recogen muestras completas de agua, se incluyen plancton neto y nanoplancton. Filtrando a través de redes de tamaño de malla apropiado, se puede separar categorías diferentes de tamaño de fitoplancton. Para plancton neto utilícese red del número 20 con abertura de malla de 76 a 80 µm (tela con trama de seda o de nailon monofilamento). Debido a su pequeño tamaño, la mayoría de las células de picoplancton y nanoplancton pasarán a

Figura 10200:1. Características estructurales de los dispositivos de toma de muestras de agua comunes, Kemmerer (izquierda) y Van Dorn (derecha).

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través de las redes recolectoras. Selecciónense los tamaños de malla adecuados para concentrar las distintas categorías de tamaño del fitoplancton típico del sistema acuático estudiado19, 20. Normalmente se prefiere el tomamuestras Van Dorn para recolección de agua estancada, productividad primaria y otras determinaciones cuantitativas, porque su diseño no inhibe el flujo libre del agua a través del cilindro. En situaciones de agua profunda es preferible la botella de Niskin, que tiene el mismo diseño que el tomamuestras Van Dorn, exceptuando que se puede lanzar en una línea única para toma de muestras simultánea a múltiples profundidades con el uso de mensajeros auxiliares. Dado que los dispositivos disparadores de esos tomamuestras son muy sensibles, evítense las manipulaciones bruscas. Conviene hacerlos bajar hacia el agua, no lanzarlos. Los tomamuestras de Kemmerer y Van Dorn tienen capacidades de 0,5 l o más. Son preferibles los dispositivos de toma de muestras de polietileno o cloruro de polivinilo a los metálicos, porque éstos liberan iones metálicos que pueden contaminar la muestra. Utilícense frascos de polietileno o vidrio para almacenado. La contaminación de iones metálicos puede producir errores importantes cuando se analizan las algas o se mide la productividad. Para aguas poco profundas, utilícese el tomamuestras de barros superficiales21, un tomamuestras de botella modificado de modo que se mantenga horizontal (figura 10200:1)22 o un tomamuestras bacteriológico adecuado23. Para mayor velocidad de recogida y obtención de cantidades de organismos grandes y medidas exactamente, utilícese una bomba. Las bombas de diafragma y peristálticas son menos perjudiciales para los organismos que las científugas24, porque los impulsores de estas últimas y el paso a través de los tubos pueden dañar a los organismos25. Se hace bajar

MÉTODOS NORMALIZADOS

una manguera pesada, sujeta a una bomba de succión, hasta la profundidad deseada y se bombea el agua hacia la superficie. La bomba tiene ventajas porque proporciona una muestra homogénea a partir de una profundidad determinada, o una muestra integrada desde la superficie hasta una profundidad concreta. Si se utiliza una bomba centrífuga, extráiganse las muestras desde la línea antes de que lleguen al impulsor. Para muestras destinadas al análisis de compuestos organoclorados, utilícense tubos de TFE. Para examinar muestras vivas, llénense los envases parcialmente y consérvense en frigorífico o nevera en la oscuridad, o mejor, manténganse a temperatura ambiente. Examínense en seguida de haberlas recogido. Si fuera imposible examinar el material vivo o si se va a hacer un recuento de fitoplancton posteriormente, consérvese la muestra. Llénese completamente el recipiente cuando la muestra se va a conservar. El conservante de fitoplancton más adecuado es la solución de Lugol, que se puede utilizar para la mayoría de las formas, incluidos los flagelados desnudos. Desgraciadamente, la solución acida de Lugol (o formalina) disuelve los cocolitos de Cocolitóforos, comunes en las aguas marinas y estuarinas. Solución de Lugol: Para conservar las muestras con solución de Lugol, añádanse 0,3 ml de solución de Lugol a 100 ml de muestra y consérvese en la oscuridad. Para conservación a largo plazo, añádanse 0,7 ml de solución de Lugol por 100 ml de muestra y formaldehído tamponado hasta una concentración mínima final del 2,5 por 100 al cabo de 1 hora; prepárese la solución de Lugol disolviendo 20 g de yoduro potásico (KI) y 10 g de cristales de yodo en 200 ml de agua destilada que contiene 20 ml de ácido acético glacial26. Sustituyendo el ácido acético glacial por acetato sódico se ob-

ANÁLISIS BIOLÓGICO DE LAS AGUAS

tiene una solución neutra o ligeramente alcalina, con lo que se conservan los Cocolitóforos, pero que sería menos eficaz para otros flagelados. Otros conservantes adecuados son: Formalina: Para conservar muestras con formalina, añádanse 40 ml de formalina tamponada (20 g de borato sódico más 1 l de formaldehído al 37 por 100) a 1 l de muestra, inmediatamente después de obtenerla. En las muestras marinas y estuarinas, ajústese el pH a 7,5, por lo menos, con borato de sodio, para muestras que contengan Cocolitóforos. Mertiolato: Para conservar muestras con mertiolato, añádanse 36 ml de solución de mertiolato a 1 l de muestra y consérvese en la oscuridad. Prepárese la solución de mertiolato disolviendo 1,0 g de mertiolato, 1,5 g de borato de sodio (Na2B2O4) y 1,0 ml de solución de Lugol en 1 l de agua destilada. Las muestras conservadas con mertiolato no son estériles, pero pueden mantenerse bien durante 1 año, al cabo del cual habrá que añadir formalina27. Fijador «M3»: Prepárese por disolución de 5 g de KI, 10 g de yodo, 50 ml de ácido acético glacial y 250 ml de formalina en 1 l de agua destilada (disuélvase el yoduro en una pequeña cantidad de agua para colaborar a disolver el yodo). Añádanse 20 ml de fijador a 1 l de muestra y consérvese en la oscuridad. Glutar-aldehído: Consérvense las muestras por adición de glutaraldehído neutralizado hasta una concentración final del 1 al 2 por 100. Entre otros conservantes usados comúnmente se encuentra el alcohol al 95 por 100, y el conservante 6-3-1 (seis partes de agua, tres partes de alcohol al 95 por 100 y una parte de formalina). Empléense volúmenes iguales de conservante y muestra. Para mantener el color del plancton conservado, almacénense las muestras en la oscuridad o añádase 1 ml de so-

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lución saturada de sulfato de cobre (CuSO4)/l. La mayoría de los conservantes distorsionan y rompen algunas células28, 29, especialmente las de formas delicadas, como Euglena, Cryptomonas, Synura, Chromulina y Mallamonas. La solución de yodo de Lugol suele ser menos lesiva para esos fitoflagelados. Para familiarizarse con las muestras vivientes y las distorsiones causadas por los conservantes, utilícense colecciones de referencia suministradas por los proveedores biológicos o consúltese a colaboradores experimentados. b) Zooplancton: La elección del tomamuestras depende del tipo de zooplancton, tipo de estudio (distribución, productividad, etc.) y la masa de agua a investigar. Las poblaciones del plancton se distribuyen invariablemente de forma irregular, dificultando así tanto la toma de muestras como la interpretación de los datos. Para recoger microzooplancton (20 a 200 µm), como protozoos, rotíferos y microcrustáceos inmaduros, empléense los tomamuestras de botella descritos para fitoplancton. Los pequeños componentes del zooplancton suelen ser suficientemente abundantes para producir muestras adecuadas en frascos de 5 a 10 1; sin embargo, se recomiendan muestras compuestas en profundidad y tiempo. Los frascos tomamuestras son especialmente adecuados para muestras a profundidades distintas. Si se desean muestras de profundidad integrada, utilícense bombas o redes. Los componentes del microzooplancton mayores y más robustos (como ciertos lovigados y crustáceos) se pueden concentrar pasando toda el agua a través de una red de malla de 20 µm. Si se precisan estimaciones cuantitativas de otras formas delicadas, no loricadas, no se debe tamizar. Fíjense de 0,5 a 5 1 de agua completa para enumerar esas formas. Los tomamuestras de botella no suelen

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ser adecuados para recoger zooplancton más grande, como microcrustáceos maduros, que, a diferencia de las formas más pequeñas, son mucho menos numerosos y suficientemente ágiles para evitar su captura. Aunque se pueden tomar muestras de volúmenes de agua comparativamente mayores y, por tanto, un número adecuado de microcrustáceos, utilizando una bomba, los elementos más ágiles y mayores pueden evitar la cabeza de la bomba y dar lugar a errores de toma de muestras. En consecuencia, son preferibles los métodos de obtención con tomamuestras mayores con trampas o redes. El sifón de Juday30 funciona con el mismo principio que los tomamuestras

Figura 10200:2. Trampa para plancton de Schindler-Patalas.

MÉTODOS NORMALIZADOS

de botella para agua, pero es generalmente más grande (10 1). Su mayor tamaño hace que sea más adecuado para obtener componentes del zooplancton, especialmente los grandes copépodos. Sin embargo, su uso es molesto y su capacidad de 10 1 inadecuada para lagos oligotróficos u otras masas de agua con poco zooplancton. Debido a su construcción metálica, no es adecuado cuando se requieren análisis de metales pesados. El sifón de Schindler-Patalas31 (figura 10200:2) suele preferirse al de Juday porque está fabricado con plástico acrílico transparente. Se puede hacer descender en el agua con un mínimo de alteraciones y es adecuado para recoger elementos grandes del zooplancton. Existen modelos de 10 a 12 1 de capacidad, pero es preferible el de 30 1. No tiene mecanismo de cierre mecánico, por lo que es conveniente para toma de muestras en aguas frías cuando los dispositivos mecánicos tienden a funcionar mal. Como en el caso del sifón de Juday, se le pueden acoplar varios tamaños de red, pero el más frecuente es el 20. Se prefieren las redes de plancton a los frascos y sifones, cuando los componentes del plancton son escasos o si sólo se necesitan datos cualitativos o una gran biomasa para el análisis. Como se diseñaron originalmente para toma de muestras cualitativa, el trabajo cuantitativo requerirá modificaciones. El tamaño de malla, tipo de material, tamaño de orificio, longitud, método de arrastre, tipo de remolque y volumen recogido dependerán de las necesidades concretas del estudio32, 33. El tipo de red y tamaño de la malla determinan la eficacia de la filtración, tendencia a la obturación, velocidad de arrastre y estado de la muestra después de su obtención. No se recomienda la seda, el material más común en las primeras redes de plancton, porque la malla se encoge en las aberturas y se pudre con el tiempo. Es preferible la malla de nailon monofilamento de-

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ANÁLISIS BIOLÓGICO DE LAS AGUAS

bido a la precisión del tamaño de malla y a su duración. Las redes de nailon de diferente tamaño de malla mantienen el sistema de etiquetado y puntuación de la seda: las características de las redes de nailon para plancton se dan en la tabla 10200:1. Los tamaños de malla más fina se obturan más fácilmente que los más gruesos; hay que buscar un compromiso entre un tamaño de malla suficientemente pequeño para retener eficazmente los organismos deseados y bastante grande para evitar los problemas de obturación grave. Si se produjera ésta, redúzcanse sus efectos disminuyendo la longitud del arrastre. El volumen máximo de agua, VM, que se puede filtrar a través de una red durante un arrastre vertical, se puede calcular con la fórmula:

donde: r = radio del orificio de la red, y d = profundidad a que se introduce la red.

Este volumen es máximo porque la obturación de la malla de la red por el

fitoplancton y otras partículas, y, para redes finas, por la propia red, puede hacer que parte del agua se desvíe del recorrido de la red34, 35. Manténgase la distancia de arrastre de la red lo más corta posible para reducir la obturación. Si una red presenta un color verde o pardo pronunciado tras el arrastre, probablemente se ha producido la obturación. Para estimar el volumen de muestra, VA, móntese un medidor de flujo calibrado a mitad de camino entre los bordes de la red y el centro de la boca (el medidor se monta alejado del centro para evitar la reducción del flujo asociada al tirante de arrastre)36. Equípese el medidor con mecanismos de cierre que le impidan girar al revés o mientras esté en el aire. Regístrense las lecturas del flujo antes y después de obtener la muestra. Calcúlese la eficacia de filtración, E, a partir de:

Si E es menor que 0,8, ha habido una obturación sustancial. Tómense medidas para aumentar la eficacia. La obturación no sólo reduce el volumen filtrado, sino que produce muestras sesgadas porque la

TABLA 10200:I. CARACTERÍSTICAS DE LAS REDES PARA TOMA DE MUESTRAS DE PLANCTON UTILIZADAS COMÚNMENTE

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eficacia de filtración no es uniforme durante el arrastre33. En la figura 10200:3 se muestran varios tipos de redes de plancton. Durante muchos años se han utilizado redes cónicas sencillas, con pocas modificaciones del diseño o mejoras de precisión. Su fuente de error principal es el frecuente desconocimiento de las características de filtración de las redes cónicas. La eficacia de filtración en las redes cónicas con malla número 20 oscila de 40 a 77 por 100. Para mejorar la eficacia, póngase una abrazadera cilíndrica porosa o un cono truncado no poroso enfrente de la porción cónica de la red. La red de Juday es un ejemplo de red comúnmente usada con un cono truncado. Para lograr una buena filtración, la relación del área de filtrado de la red al área del orificio debe ser, como mínimo, 3:1. Los tirantes de sujeción de la red a la línea de arrastre influyen también adversamente sobre la eficacia de filtración y aumentan la turbulencia delante de la red, incrementando así el potencial de evitación de la red por parte de los elementos más grandes del zooplancton. El tándem, diseño de red de Bongo (figura 10200:3), reduce esas influencias y permite duplicar las muestras recogidas simultáneamente. Se emplean tres tipos de arrastre: vertical, horizontal y oblicuo. Se prefieren los verticales para obtener una muestra de columna de agua integrada. Para hacer un arrastre vertical, se baja la red pesada hasta una profundidad determinada, y se eleva luego verticalmente a una velocidad uniforme de 0,5 m/segundo. En pequeñas masas de agua tírese de la red, mano sobre mano, con un movimiento lento que se aproxime a los 0,5 m/segundo. En masas grandes, donde hay que esperar arrastres con redes largas y movimientos de barcos, utilícese un pescante, indicador angular y chigre. Fíjese un peso de 3 a 5 kg para sujetar la red abajo. Determínese la profundidad de la red multiplicando la longitud del cable

MÉTODOS NORMALIZADOS

extendido por el coseno de su ángulo con la dirección vertical. Manténgase el ángulo del cable lo más próximo posible a la vertical controlando la velocidad cero del barco frente a la del viento o cuando sea factible, haciendo redadas verticales desde un barco anclado. Los remolques verticales y oblicuos recogen una muestra compuesta, mientras los horizontales lo hacen a profundidad discreta. En agua poco profunda o cuando se requiera una red de arrastre más larga, son preferibles los arrastres oblicuos a los verticales. En caso de arrastre oblicuo, se baja la red o el tomamuestras a una profundidad predeterminada y luego se va elevando a velocidad uniforme a la vez que el barco avanza. Los arrastres oblicuos no toman necesariamente las muestras en un ángulo real desde el fondo a la superficie. En las mejores condiciones, el movimiento es algo sigmoideo debido a la aceleración del barco y al aflojamiento de la línea de arrastre. Los arrastres horizontales suelen usarse para obtener información de la distribución en profundidad del zooplancton. Aunque existe una variedad de tomamuestras horizontales (véase figura 10200:4), para recogida cuantitativa de zooplancton se debe emplear el de Clarke-Bumpus37, porque tiene un medidor de flujo incorporado y un dispositivo de apertura-cierre. Para arrastres horizontales, utilícese un barco equipado como antes y determínese la profundidad de la toma de muestras de la misma manera. Hágase descender el tomamuestras hasta la profundidad seleccionada previamente, ábrase, arrástrese a esa profundidad durante 5 ó 10 minutos, ciérrese y vuélvase a subir. En el agua corriente se pueden utilizar varios métodos de toma de muestras del zooplancton. El método de elección depende mucho de la velocidad de la corriente. En aguas de flujo medio a lento se pueden usar frascos con un lastre adecuado, sifones y bombas con manguera.

ANÁLISIS BIOLÓGICO DE LAS AGUAS

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Figura 10200:3. Ejemplos de redes para toma de muestras de plancton utilizadas comúnmente. (A) Red cónica simple para arrastre; A: aparejada para arrastres verticales; A1: para arrastre horizontal u oblicuo; (B) Red de arrastre de Wisconsin (Birge) con cono truncado para mejorar la eficacia filtrante; (C) Red de Bongo, pueden acoplársele medidores de flujo y mecanismos de apertura/cierre; (D) Red Wisconsin con mecanismo de cierre activado por mensajero; D: abierta; D1: cerrada; (E) Red de caída libre; E: abierta; E1: cerrada.

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MÉTODOS NORMALIZADOS

Figura 10200:4. Ejemplos de dispositivos de toma de muestras de zooplancton de gran velocidad, usados comúnmente. (A) Tomamuestras de Clarke-Bumpus; (B) Tomamuestras Miller; (C) Indicador de plancton Hardy; (D) Registro continuo de plancton Hardy; (E) Palangre de aguas intermedias Issacs-Kidd; (F) Tomamuestras Gulf V; (G) Palangre Tucker; G,: vista lateral; G2: vista frontal abierto y cerrado.

ANÁLISIS BIOLÓGICO DE LAS AGUAS

En las aguas turbulentas, bien mezcladas, recójase el agua de la superficie con un cubo y fíltrese por un tamiz de malla apropiada. Selecciónese el tamaño de la muestra basándose en la concentración de los componentes del zooplancton. Proporciónese a la red de plancton el cuidado y mantenimiento adecuados, cuando se use in situ o como dispositivo de campo o laboratorio. No se debe dejar que las partículas materiales se sequen en la red porque reducirían significativamente la apertura de malla y aumentarían la frecuencia de obturación. Lávese bien la red con agua después de cada uso. Límpiese periódicamente con una solución jabonosa templada. Dado que el material de la red de nailon es susceptible de deterioro debido a la abrasión y a la luz solar, protéjase de un desgaste excesivo y guárdese en la oscuridad. Los sifones y redes no funcionan bien en zonas poco profundas con crecimiento de vegetación acuática. Para obtener una muestra integrada de toda la columna de agua en esas zonas, utilícese un tubo de goma ligera o polietileno con red fijada a un extremo y una cuerda en el otro38. Sujétese la red con cinta adhesiva o bandas de goma que no se muevan dentro del agua, pero pueden quitarse fácilmente después de tomar las muestras. Utilícese tubo de 5 a 10 cm de diámetro y longitud suficiente para llegar desde la superficie al fondo. Hágase descender el extremo abierto (el que tiene la cuerda) hasta que casi toque el fondo. Entonces tírese de ese extremo hacia arriba por medio de la cuerda y manténgase el extremo tapado por encima de la superficie del agua. Cuando el extremo abierto esté fuera del agua, déjese que el extremo con la red caiga dentro de ella; tírese del tubo hacia el barco, con el extremo abierto primero, y déjese que escurra el agua del tubo atravesando la red. Cuando se haya concentrado el zooplancton en un volumen pequeño, justo

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encima de la red, sáquese ésta a un recipiente y recójase la muestra concentrada. Lávese la red y el extremo del tubo sobre el recipiente para asegurar que se recoge todo el zooplancton. Este método no se limita a zonas con vegetación acuática, sino que constituye un procedimiento excelente para obtener muestras integrales de cualquier zona poco profunda. En aguas estancadas obténganse la muestras de arrastre por filtrado de 1 a 5 m3 de agua. Consérvense las muestras de zooplancton con etanol al 70 por 100 o formalina al 5 por 100 tamponada. Es preferible el etanol para materiales que se van a teñir o conservar en montajes permanentes. La formalina se puede utilizar para las primeras 48 horas de conservación, pasando luego a etanol al 70 por 100. La formalina puede dar lugar a distorsiones de formas pleomórficas, como los protozoos y rotíferos. Para minimizar la distorsión de caparazones y pérdidas de huevos de los crustáceos, especialmente cladóceros39, prepárese la formalina en agua saturada con sacarosa. El fijador de Bouin consigue resultados razonables para el microzooplancton de cuerpo blando40. Este fijador es ácido pícrico saturado en carbonato cálcicoformaldehído tamponado conteniendo un 5 por 100 (v/v) de ácido acético. Dilúyase el fijador de Bouin 1:19 con la muestra. Como es necesario que la fijación sea rápida, viértase la muestra en el fijador o inyéctese éste rápidamente en la muestra. Utilícese un agente narcótico, como el agua carbonatada, agua saturada de mentol o neosinefrina, para evitar o reducir la contracción o distorsión de los organismos, especialmente rotíferos, cladóceros y muchos invertebrados marinos4142. La adición de unas gotas de detergente evita la acumulación de los organismos conservados. Añádase el conservante en cuanto cese casi todo el movimiento animal, normalmente a la media hora de la narcosis. Para evitar la

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evaporación, añádase un 5 por 10 de glicerina a la muestra concentrada. En las muestras turbias diferénciese el material animal de los detritus, por adición de colorante rosa de bengala al 0,04 por 100, que tiñe intensamente los caparazones (conchas) de los componentes del zooplancton y es un buen colorante citoplasmático general.

3. 1.

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MÉTODOS NORMALIZADOS

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ANÁLISIS BIOLÓGICO DE LAS AGUAS

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10200 C. Técnicas de concentración Los organismos contenidos en las muestras de agua a veces deben ser concentrados en el laboratorio antes de su análisis. A continuación se describen tres técnicas para concentrar el fitoplancton,

a saber, sedimentación, filtración por membrana y centrifugación. También se da una técnica especial para zooplancton.

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1.

Sedimentación

La sedimentación es el método preferido de concentración porque no es selectiva (a diferencia de la filtración o centrifugación), aunque gran parte del picoplancton, el nanoplancton más pequeño, y los flagelados que nadan activamente (en muestras sin conservante) puedan no sedimentar totalmente. El volumen concentrado varía inversamente a la abundancia de organismos y está relacionado con la turbidez de la muestra. Puede ser tan pequeño como 1 ml, para uso con un microscopio invertido, o tan grande como 1 l, para enumeración general del fitoplancton y zooplancton. Déjese 1 hora de sedimentación/mm de profundidad de la columna. Para una muestra tratada (10 ml detergente/1) déjese aproximadamente 0,5 horas de sedimentación/mm de profundidad1. La muestra debe concentrarse en una serie de pasos por transferencia cuantitativa del sedimento desde el recipiente inicial a otros secuencialmente menores. Utilícense cámaras de sedimentación cilíndricas con fondos delgados, de vidrio transparente. Llénense esas cámaras sin formar remolinos, manténganse libres de vibraciones y manipúlense con cuidado para evitar la distribución no aleatoria del material depositado. Extráigase cuidadosamente haciendo sifón o decantando los sobrenadantes para obtener el volumen final deseado (5 ml para montajes de diatomeas). Consérvese la muestra concentrada en un vial de vidrio cerrado y etiquetado. 2.

Filtración por membrana

El método de filtración de membrana permite utilizar una gran amplificación para enumerar componentes pequeños del plancton, incluidos los flagelados y cianobacterias. Sin embargo, las formas delicadas, como los flagelados «desnu-

dos», son distorsionadas incluso por la filtración suave. Cuando las poblaciones son densas y el contenido en detritus elevado, el filtro se obtura rápidamente y el cieno puede aplastar a los organismos u ocultarlos a la vista. Viértase un volumen de muestra bien mezclada sobre un embudo equipado con un filtro de membrana de 0,45 µm de diámetro de poro. Aplíquese un vacío inferior a 50 kPa al filtro hasta que quede sobre él alrededor de 0,5 cm de muestra. Rómpase el vacío y Aplíquese un vacío bajo (alrededor de 12 kPa) para eliminar el agua restante, pero sin secar el filtro. Para muestras con contenido bajo en fitoplancton y cieno, el método no requiere un recuento de los componentes individuales para reunir los datos de enumeración, y aumenta la probabilidad de observar formas menos abundantes2. Las muestras se pueden concentrar también en un filtro, invertido sobre un porta de microscopio, y congelarlas rápidamente, permitiendo la eliminación del filtro y el paso del plancton al porta3, 4. 3.

Centrifugación

El plancton se puede concentrar por centrifugado continuo o discontinuo. Centrifúguense los lotes de muestras a 1.000 g durante 20 minutos. Ya no se recomienda la centrífuga continua de Foerst como dispositivo cuantitativo, pero su uso puede ser deseable en programas existentes para asegurar la continuidad con los datos obtenidos anteriormente. Aunque la centrifugación acelera la sedimentación, puede dañar a los organismos frágiles. 4. Concentración del zooplancton

Las muestras de zooplancton a menudo deben concentrarse en el campo, espe-

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cialmente cuando se utilizan botellas grandes de agua o métodos de bomba para tomar las muestras. Además, las muestras obtenidas con red u otros métodos a veces tienen que concentrarse más para conservarlas o prepararlas para ser examinadas. Cuando sólo se precisen reducciones de poco volumen, viértase la muestra de nuevo en el cubo de los sifones o redes. Ál procesar grandes volúmenes de agua, como ocurre en la toma de muestras con bomba, empléense cubos o embudos de plancton más grandes, con mayor volumen de retención de agua y área de filtración. Constrúyase un embudo filtrante similar al que muestra la figura 10200:5, de plástico acrílico transparente o de otro material adecuado5. El volumen del aparato y el tamaño de la malla dependen del volumen de agua a filtrar y el tamaño de los organismos retenidos. El tamaño de malla del embudo filtrante suele ser el mismo de la red u otros dispositivos para toma de muestras de campo. 5.

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10200 D. 1. Preparación húmeda semipermanente de fitoplancton

Agítese el concentrado de muestra sedimentada y retírese una muestra secundaria con pipeta automática calibrada

Figura 10200:5. Embudo de filtra para concentrar zooplancton. Este dispositivo, diseñado originalmente para rotíferos, puede modificarse para otros componentes del zooplancton, cambiando las dimensiones y calibre de la malla. Dimensiones en centímetros. (Tomado de Likens y Gilbert5.)

The filter-transfer-freeze (FTF) technique. Limnol. Oceanogr. 28:389. 4. HEWES, C. D., F. M. H. REID & O. HOLMHANSEN. 1984. The quantitative analysis of nanoplankton: A study of methods. J. Plankton Res. 6:601. 5. LIKENS, G. E. & J. J. GILBERT. 1970. Notes on quantitative sampling of natural populations of planktonic rotifers. Limnol. Oceanogr. 15:816.

Preparación exactamente. Es necesario limpiar y calibrar la pipeta regularmente. Para preparaciones húmedas, pásese 0,1 ml a un portaobjetos de vidrio, colóquese un cubreobjetos sobre la muestra y rodéese el cubre con un adhesivo, como esmalte de

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uñas transparente, para impedir la evaporación. Para preparaciones semipermanentes, mézclese la muestra con glicerina; al envejecer la muestra, el agua se evapora, dejando a los organismos incluidos en la glicerina. Si se rodea el cubre con adhesivo, el porta puede guardarse durante años cuando se mantiene en la oscuridad. 2. Preparaciones permanentes de fitoplancton

a) Preparaciones de filtro de membrana: Échense dos gotas de aceite de inmersión en un porta etiquetado. Inmediatamente después de filtrar, póngase el filtro encima del aceite empleando un par de pinzas y añádanse dos gotas de aceite encima del filtro. El aceite impregna al filtro y le hace transparente. El tiempo de impregnación es de 24-48 horas. Este procedimiento se puede completar en 1-2 horas si se aplica calor (70 °C). Una vez se ha transparentado el filtro, pónganse unas cuantas gotas más de aceite sobre él y tápese con un cubre. El filtro montado está así dispuesto para su examen microscópico. Alternativamente, móntense filtros de membrana en un medio para preparaciones*. Sumérjanse los filtros en 1-propanol para desplazar el agua residual y pásense a xilol durante varios minutos, para transparentar los filtros. Póngase una parte del filtro o todo él en un porta de microscopio con el medio para preparaciones, tápese con un cubre y séquese a temperatura baja1. b) Preparaciones sedimentadas: Hay dos técnicas para hacer preparaciones de resina, permanentes, de fitoplancton natural que se ha sedimentado sobre un porta de microscopio o un cubre de vidrio, y se ha deshidratado por sustitución de vapor con etanol2, 3. * Permount, Fisher Scientific Co., o equivalente.

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3.

Preparaciones de diatomeas

Las muestras concentradas para análisis de diatomeas por sedimentación o centrifugación pueden contener materiales disueltos, como sales marinas, formalina y detergentes, que dejarán residuos interferentes. Lávese bien con agua destilada antes de preparar el porta. Pásense varias gotas de concentrado lavado por medio de una pipeta desechable o cuentagotas de punta ancha, a un cubre de vidrio sobre una placa calentada suficientemente para aumentar la tasa de evaporación, pero sin llegar a la ebullición (utilícese una pipeta o cuentagotas de punta ancha para impedir la posible filtración selectiva y, por tanto, la exclusión de formas más grandes o las formadoras de colonias o cadenas). Si el material lavado está muy concentrado, se mejora la distribución de las diatomeas añadiendo las gotas a un cubre ya inundado de agua destilada. Evapórese a sequedad. Repítase la adición y evaporación hasta que se haya transferido suficiente cantidad de muestra al cubre, pero evitando el producir un residuo tan denso que no se puedan reconocer los organismos. Si se tienen dudas de la densidad, examínese al microscopio. Tras la evaporación, incinérese el residuo sobre el cubre en una placa caliente a 300-500 °C; alternativamente, utilícese una mufla. Normalmente se necesitan de 20 a 45 minutos. Móntese como se describe más adelante. Trátense las muestras concentradas para análisis de diatomeas por filtración de membrana como describen Patrick y Reimer4. Mézclense volúmenes iguales de ácido nítrico conc. (HNO3) y muestra. PRECAUCIÓN: Cuando se trabaje con HNO3 conc. utilícense gafas protectoras y un delantal y guantes resistentes al ácido, y trabájese bajo una campana. Añádanse unos granos de dicromato potásico (K2Cr2O7)5 para facilitar la digestión del filtro y materia orgánica celular. Añádase más dicromato si el color de la solución

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cambia del amarillo al verde. Póngase la muestra sobre una placa caliente e hiérvase hasta aproximadamente un tercio del volumen original. Alternativamente, déjese la muestra tratada en reposo una noche. Este proceso de limpieza destruye la materia orgánica y deja sólo las conchas de las diatomeas (frústulas). Enfríese, lávese con agua destilada y móntese como se describió antes. Pásense las frústulas limpias a un cubre y séquense como se ha descrito antes. Póngase una gota de medio para preparaciones en el centro de un porta etiquetado. Utilícense portaobjetos de 25 por 75 mm con bordes esmerilados. El empleo de un medio adecuado para preparaciones microscópicas† asegura la obtención de preparaciones permanentes, fáciles de manejar para examen bajo aceite de inmersión. Caliéntese el porta hasta cerca de 90 °C durante 1 ó 2 minutos antes de aplicar el cubre calentador, con su residuo de muestra, para acelerar la evaporación de disolvente en el medio para preparaciones. Llévese el porta a una superficie fría y, durante el enfriamiento (5-10 segundos), Aplíquese una presión suave, pero firme, al cubre con un instrumento ancho y plano. 4.

Preparaciones de zooplancton

Para análisis del zooplancton, tómese una muestra secundaria de 5 ml a partir del concentrado y dilúyase o concéntrese, según sea necesario. Pásese la muestra a una cubeta o cámara de recuento (véase más adelante) para analizarla como preparación húmeda. Utilícese polivinil lactil fenol‡ para preparaciones semipermanentes de zooplancton, que se mantienen

† Hyrax, Custom Research and Development, Inc., 8500 Mt. Vernon Road, Auburn, California, o equivalente. ‡ Biomedical Specialists, Box 1687, Santa Ménica, California.

en buen estado durante 1 año aproximadamente, al cabo del cual el agente de transparentado produce un deterioro de los organismos. Para conservación a largo plazo, ciérrese alrededor del cubre con laca transparente (esmalte de uñas) para retrasar la cristalización del preparador. Existen otros productos para preparaciones permanentes §. Para la parte protozoica del microplancton, un método de tinción con protargol6 no sólo consigue preparaciones permanentes, sino que revela los detalles citológicos necesarios, a menudo, para identificación. Este método es cualitativo y especialmente importante en estudios taxonómicos de los protozoos ciliados.

5. 1.

2.

3.

4.

5.

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§ CMC-10, Master's Chemical Co., P.O. Box 2382, Des Plaines, 111.; Hydramount, Biomedical Specialists, Box 1687, Santa Mónica, California, o equivalente.

MÉTODOS NORMALIZADOS

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10200 E. 1.

Microscopios y calibraciones

Microscopio compuesto

Utilícese un microscopio estándar o uno compuesto invertido para identificación y recuento de algas. Equípese cualquiera de ellos con una platina mecánica capaz de pasar todas las partes de una célula de recuento bajo la lente del objetivo. El equipo estándar es un juego de oculares 10 x o 12,5 x, y objetivos 10 x, 20 x, 40 x y 100 x. Utilícense objetivos que proporcionen una distancia de trabajo adecuada para la cámara de recuento. Las necesidades de aumento varían con la fracción de plancton que se investigue, el tipo de microscopio, la cámara de recuento usada y la óptica. La cámara Sedgwick-Rafter limita los aumentos a 200 x aproximadamente. La célula de Palmer-Maloney permite aumentos de hasta 500 x . Los microscopios invertidos tienen la resolución limitada por su óptica. El límite útil superior del aumento de un objetivo es 1.000 veces la apertura numérica (AN). Por encima de ella, no se puede resolver con mayor detalle. Combínense los oculares, ampliadores intermedios y objetivos, para conseguir el máximo aumento, sin sobrepasar el límite útil de ampliación. Cuando se supera éste, se obtiene un aumento vacío. En un aumento vacío, la imagen es más grande, pero no se consigue una resolución mayor. La resolución debe ser siempre máxima. Es útil la óptica que consigue potenciar el contraste, como el constraste de fase o el de interferencia diferencial. 2.

Microscopio estereoscópico

El microscopio estereoscópico consiste esencialmente en dos microscopios completos montados en un instrumento binocular para dar una visión estereoscópica y una imagen erecta, en lugar de invertida. Utilícese este microscopio para

el estudio y recuento de componentes grandes del plancton, tales como los microcrustáceos maduros. Inclúyanse parejas de oculares 10x a 15x en combinación con objetivos de 1x a 8 x. Esta óptica combinada llena el vacío existente entre las lentes manuales y el microscopio compuesto, y proporciona aumentos desde 10 x a 120 x. Alternativamente, utilícese un instrumento de tipo zoom de buena calidad con aumentos comparables. 3.

Microscopio compuesto invertido

El microscopio compuesto invertido se utiliza a menudo de forma rutinaria para recuento del plancton en muchos laboratorios1-3. Este instrumento es único en cuanto a que los objetivos se encuentran debajo de una platina móvil y la iluminación procede de arriba, permitiendo así la visión de organismos que se han depositado en el fondo de una cámara. Sitúense las muestras en una cámara de sedimentación cilíndrica, con el fondo de cristal transparente. Existen cámaras de varias capacidades; el tamaño apropiado depende de la densidad de los organismos. Tras un período conveniente de sedimentación (véase la sección 10200C.1), hágase un recuento de los organismos en la cámara. La ventaja principal del microscopio invertido es que por simple rotación de la pieza frontal se puede examinar (o recontar) la muestra directamente en la cámara de sedimentación a cualquier aumento deseado. Aunque no sean los recomendados, los objetivos para inmersión en aceite pueden tener algunas aplicaciones útiles. No se necesita más manipulación que la sedimentación. En general, se examina una muestra conservada. Existen técnicas para muestras con abundantes organismos que tienden a flotar4.

ANÁLISIS BIOLÓGICO DE LAS AGUAS

4.

Microscopio de epifluorescencia

Un microscopio de epifluorescencia puede ser estándar o invertido. Utiliza luz incidente para excitar los electrones en compuestos intracelulares, como son los pigmentos o colorantes absorbidos, con la energía emitida durante el retorno de los electrones al estado inicial, que se mide como luz fluorescente. La técnica se ha aplicado a la identificación microscópica de células que contienen clorofila (autótrofas) y plancton heterótrofo no pigmentado; también se han utilizado los colorantes fluorescentes, como primulina o proflavina, para diferenciar productores nanoplanctónicos primarios y secundarios5-7. Las longitudes de onda de excitación y emisión para pigmentos y colorantes son únicas y requieren distintas combinaciones de filtros y fuentes luminosas. Selecciónense las combinaciones de filtros para cada aplicación. El microscopio de epifluorescencia es especialmente útil para recuentos de picoplancton y poblaciones heterótrofas de

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flagelados, comunes en la mayoría de los sistemas acuáticos. Concéntrense las muestras por filtración de membrana. Utilícese el microscopio de epifluorescencia como un procedimiento complementario de las técnicas estándar para recuento con el microscopio luminoso. 5.

Calibrado del microscopio

Es esencial calibrar el microscopio. El equipo usual para ello es una rejilla de Whipple (micrómetro ocular, retícula) situada en una pieza ocular del microscopio y un micrómetro de platina que tiene una escala estandarizada, exactamente rayada sobre un porta de vidrio. El disco de Whipple (figura 10200:6) tiene una cuadrícula exacta subdividida en 100 cuadritos. Uno de ellos, próximo al centro, se subdivide en otros 25 más pequeños. Las dimensiones externas de la cuadrícula son tales que, con un objetivo de 10 x y un ocular de 10 x, delimita un área de 1 mm2 aproximadamente sobre

Figura 10200:6. Ajuste de micrómetro ocular. Se muestra la retícula del micrómetro de Whipple.

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Figura 10200:7.

MÉTODOS NORMALIZADOS

Calibración de la cuadricula de Whipple, tal como se ve con ocular 10 x y objevo 43 x (aproximadamente 430 x de aumento total).

la platina del microscopio. Dado que este área puede diferir de un microscopio a otro, se debe calibrar la rejilla de Whipple cuidadosamente para cada microscopio. Con los micrómetros ocular y de platina en paralelo y superpuestos parcialmente, ajústese la línea del borde izquierdo de la rejilla de Whipple con el cero de la escala en el micrómetro de la platina (figura 10200:7). Determínese la anchura de la imagen de la rejilla de Whipple hasta una aproximación de 0,01 mm des-

de la escala del micrómetro de la platina. Si la anchura de la imagen de la rejilla de Whipple fuera 1 mm (1.000 µm) exactamente, los cuadros más grandes serán 1/10 mm (100 µm) en un lado, y los más pequeños 1/50 mm (20 µm). Cuando el microscopio se calibra con aumentos mayores, no se verá toda la escala en el micrómetro de la platina; háganse las medidas hasta una aproximación de 0,001 mm. Existen detalles adicionales para el calibrado8.

10-25

ANÁLISIS BIOLÓGICO DE LAS AGUAS

5.

Referencias

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10200 F. 1.

rentiation of phototrophic and heterotrophic nanoplankton populations in marine waters by epifluorescence microscopy. Ann. Inst. Oceanogr. 58:249. CARON, D. A. 1983. Techniques for enumeration of heterotrophic and phototrophic nanoplankton, using epifluorescence microscopy, and comparison with other procedures. Appl. Environ. Microbiol. 46:491. SHERR, E. B. & B. F. SHERR. 1983. Doublestaining epifluorescence techniques to assess frequency of dividing cells and bacteriovory in natural populations of heterotrophic microprotozoa. Appl. Environ. Microbiol. 46:1388. JACKSON, H. W. & L. G. WILLIAMS. 1962. Calibration and use of certain plankton counting equipment. Trans. Amer. Microsc. Soc. 81:96.

Técnicas de recuento para fitoplancton

Unidades de recuento

Parte del fitoplancton es unicelular mientras otra es multicelular (colonial). La variedad de configuraciones supone un problema de recuento. Por ejemplo, una colonia de Scenedesmus (lámina 3, A), ¿se debe considerar una colonia o cuatro células individuales? A continuación se enumeran unas sugerencias para informes:

* La unidad de área estándar es igual a área de cuatro cuadros pequeños en una cuadrícula de Whipple, con un aumento de 200.

El recuento total celular es lento y tedioso, especialmente cuando las colonias constan de miles de células individuales. El sistema más fácil es el de la unidad o acumulo natural; sin embargo, no es exacto necesariamente porque la manipulación y conservación de la muestra pueden desplazar algunas células de la colonia. Tampoco el método de unidad puede ser cuantitativamente exacto, ni reflejar la abundancia de biomasa o biovolumen. Cualquiera que sea el método elegido, se debe mencionar al informar de los resultados. Si la distribución de los organismos es aleatoria y la población se ajusta a una distribución de Poisson, se puede calcular el error de recuento 2. Por ejemplo, el límite de confianza 95 por 100, como porcentaje del número de unidades contadas (N), es igual a:

Así, si se cuentan 100 unidades, el límite de confianza 95 por 100 se aproxima a

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± 20 por 100. Para un recuento de 400 unidades, el límite está alrededor del 10 por 100. 2.

Métodos de recuento

Para enumerar el plancton, empléese una célula o cámara de recuento que limite el volumen y área para calcular fácilmente las densidades de población. Cuando se hace un recuento con una rejilla de Whipple, establézcase un artificio para contar los organismos que queden fuera de una línea límite. Por ejemplo, al contar un «campo» (cuadro completo de Whipple), considérense los límites superior e izquierdo como lados que «no cuentan», y el inferior y derecho, como que «cuentan». De ese modo, cada componente del plancton que toca un lado que «cuenta» desde dentro o desde fuera, se incluye en el recuento, y se ignoran los que tocan con uno de los lados que «no cuentan». Si hay muchas formas filamentosas o grandes que cruzan dos o más líneas de la trama, se contarán aparte con un aumento más bajo, y se incluirá su número en el recuento total. Para identificar los organismos, utilícense las referencias taxonómicas estándar (véase sección 10900G). No hay que contar las células muertas ni las frústulas rotas de diatomeas. Las diatomeas céntricas vacías y las pennadas se cuentan aparte, como «diatomeas céntricas muertas» o «diatomeas pennadas muertas», para convertir luego el recuento proporcional de especies de diatomeas en un recuento por mililitro. El aumento es importante en la identificación y enumeración del fitoplancton. Aunque los aumentos de 100 x a 200 x son útiles para recuento de organismos grandes o colonias, a menudo se precisan otros mucho mayores. Es útil clasificar las técnicas para recuento de fitoplancton de acuerdo con los aumentos aplicados.

MÉTODOS NORMALIZADOS

a) Métodos con poco aumento (hasta 200 x): La célula de Sedgwick-Rafter (S-R) es un dispositivo empleado comúnmente para recuento del plancton porque se manipula fácilmente y proporciona datos bastante reproducibles cuando se usa con un microscopio calibrado equipado con un dispositivo ocular para medida, tal como la cuadrícula de Whipple. El mayor inconveniente de esta célula es que no se pueden utilizar objetivos de gran aumento, por lo que la célula S-R no es apropiada para examinar nanoplancton. La célula S-R tiene aproximadamente 50 mm de largo por 20 mm de ancho y 1 mm de profundidad. El área total del fondo son 1.000 mm2 aproximadamente, y el volumen total, 1.000 mm3 o 1 ml. Compruébese cuidadosamente la longitud y profundidad exactas de la célula con un micrómetro y calibres antes de usarla. 1) Llenado de la célula: Antes de llenar la célula S-R con la muestra, colóquese el cubre de vidrio diagonalmente a través de la célula y pásese la muestra con una pipeta de luz amplia (figura 10200:8). Poniendo el cubre de este modo, se ayuda a evitar la formación de burbujas de aire en las esquinas de la célula. A menudo, el cubre girará lentamente y tapará la parte interna de la célula S-R durante el llenado. Para evitar la formación de espacios con aire, póngase ocasionalmente una gota pequeña de agua destilada sobre el borde del cubre. Antes del recuento, déjese en reposo la célula S-R durante un mínimo de 15 minutos para que se sedimente el plancton. Cuéntese el plancton del fondo de la célula S-R. Parte del fitoplancton, especialmente algunas algas verdiazules o flagelados móviles de muestras no conservadas, pueden no depositarse, elevándose en cambio hasta la cara inferior del cubre. Cuando esto ocurra, cuéntense esos organismos y súmense al total de los contados en el fondo de la célula para

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ANÁLISIS BIOLÓGICO DE LAS AGUAS

Figura 10200:8. Célula de recuento (Sedgwick-Rafter), mostrando el método de llenado. Fuente: WHIPPLE, G. C, G. M. FAIR y M. C. WHIPPLE, 1927. The Microscopy of Drínking Water. John Wiley and Sons, Nueva York.

obtener el total de organismos. Cuéntense las algas por tiras o campos. 2) Recuento de tiras: Una tira a lo largo de la célula supone un volumen aproximado de 50 mm de longitud, 1 mm de profundidad y la anchura del total de la rejilla de Whipple. El número de tiras a contar está en función de la precisión deseada y el número de unidades (células, colonias o filamentos) por tira. Dedúzcase el número de plancton en la célula S-R a partir de la siguiente ecuación:

Multiplíquese o divídase el número de células por mililitro por un factor de corrección para ajustar la dilución o concentración de la muestra. 3) Recuento de campo: En las muestras que contengan muchas células del plancton (10 o más elementos por campo), efectúense recuentos por campo en lugar de por tira. Recuéntense los elementos del plancton en campos tomados al azar, consistente cada uno en una rejilla de Whipple. El número de campos contado dependerá de la densidad de plancton y la precisión estadística deseada (véase 10200F.1). Calcúlese el número del plancton por mililitro como sigue:

donde: C = número de organismos contados; L = longitud de cada tira (longitud de la célula S-R), mm; D = profundidad de una tira (profundidad de la célula S-R), mm; W = anchura de una tira (ancho de la imagen en la rejilla de Whipple), mm, y S = número de tiras contadas.

donde: C = número de organismos contados; A = área de un campo (área de imagen de la rejilla Whipple), mm2; D = profundidad de un campo (profundidad de célula S-R), mm, y F = número de campos contados.

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Multiplíquese o divídase el número de células por mililitro por un factor de corrección para ajustar la dilución o concentración de la muestra. b) Métodos de aumento intermedio (bajo hasta 500x): La célula de nanoplancton de Palmer-Maloney (P-M)3 está diseñada específicamente para recuento del nanoplancton. Tiene una cámara circular de 17,9 mm de diámetro, 0,4 mm de profundidad y volumen de 0,1 ml. Su poca profundidad permite utilizar objetivos de 40 a 45 x con suficiente distancia de trabajo. Su principal inconveniente es que esos aumentos a menudo son insuficientes para identificación y recuento del nanoplancton. Dado que en la célula P-M se examina una porción de muestra relativamente pequeña, sólo se debe utilizar cuando la muestra contenga una población densa (10 o más elementos por campo). Con una población menos densa, esa pequeña porción de muestra produciría una grave subestimación de la densidad. Introdúzcase la muestra con una pipeta en uno de los canales laterales de la cámara, de 2 por 5 mm, con el cubre colocado en su sitio. Al cabo de un período de sedimentación de 10 minutos, cuéntense los elementos del plancton en campos elegidos al azar, en un número dependiente de la densidad y variedad del plancton y de la precisión estadística deseada. En esta cámara o cualquier otra circular, se puede contar por tiras, midiendo el diámetro efectivo y contando dos tiras perpendiculares que se crucen en el centro. Calcúlese el número por mililitro como sigue:

donde: C = número de organismos contados; A = área de un campo (imagen de la rejilla Whipple), mm2;

MÉTODOS NORMALIZADOS

D = profundidad de un campo (profundidad célula P-M), mm, y F = número de campos contados.

Multiplíquese o divídase el número de células por mililitro por un factor de corrección para ajustar la dilución o concentración de la muestra. Otra cámara fácil de conseguir es el hematocitómetro médico estándar utilizado para recuento de células sanguíneas. Tiene una cuadrícula rayada en una placa de recuento y acoplada con un cubre de vidrio esmerilado. La cuadrícula tiene divisiones de 1 mm2; la cámara tiene 0,1 mm de profundidad. Introdúzcase la muestra con pipeta y obsérvese con aumento de 450 x . Cuéntense todas las células del interior de la cuadrícula. La cámara va acompañada de las instrucciones detalladas del fabricante con las normas para uso adecuado y para los cálculos. Un inconveniente de estas celdas de recuento es que la muestra debe tener una densidad de plancton muy alta para que proporcione datos estadísticamente fiables. c) Métodos de gran aumento: El examen del fitoplancton con gran aumento requiere la utilización de objetivos de inmersión. Entre los métodos adecuados se encuentran las cámaras de microscopio invertido, preparaciones de filtro de membrana, preparaciones de portas sedimentadas, el método de la gota de Lackey y las preparaciones de diatomeas. 1) Recuentos de microscopio invertido: Prepárese una muestra para su examen llenando la cámara de sedimentación. Al cabo del tiempo de depósito deseado (véase sección 10200C.1), pásese la cámara a la platina del microscopio. Cuéntense tiras perpendiculares a través del centro del fondo del cubre de vidrio. Los recuentos de tira se pueden hacer usando una rejilla de Whipple o con oculares especiales para recuento que tienen un par de filamentos paralelos ajustables y uno sencillo cruzado. Determínese el

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ANÁLISIS BIOLÓGICO DE LAS AGUAS

ancho de la tira con un micrómetro de platina y cuéntense los organismos según van pasando el filamento sencillo cruzado que sirve de punto de referencia. Manténgase constante el ancho de la tira para una serie de muestras. Alternativamente, examínense campos aleatorios no superpuestos, hasta contar 100 unidades por lo menos de la especie dominante; para mayor exactitud, debido especialmente a que la distribución de las algas puede no ser uniforme, cuéntese todo el suelo de la cámara. Alternativamente, efectúese un recuento aleatorio del campo mínimo hasta lograr un nivel de precisión del 85 por 100 por lo menos4.

más arriba. Cuéntense suficientes campos elegidos al azar para asegurar el nivel deseado de precisión estadística (véase 10200F.1). Selecciónese el tipo de aumento y tamaño del campo microscópico (cuadratín) de modo que la especie más abundante aparezca por lo menos en el 70 por 100 de los campos microscópicos examinados, pero no en más del 90 por 100 (lo ideal es el 80 por 100). Ajústese el tamaño del campo microscópico utilizando parte o toda la cuadrícula de Whipple. Examínense 30 campos microscópicos elegidos al azar y regístrese el número de campos en que aparece cada especie. Exprésense los resultados en organismos por mililitro, calculados como sigue:

donde: C = número de organismos contados; A, = área total de la base de la cámara de sedimentación, mm2; L = longitud de una tira, mm; W = ancho de una tira (ancho imagen cuadrícula de Whipple), mm; S = número de tiras contadas, y V = volumen de muestra sedimentada, ml.

donde: Af = área de un campo (área imagen cuadrícula Whipple), mm2; F = número de campos contados,

y los demás términos como se definieron más arriba. 2) Preparaciones de filtro de membrana: Concéntrese la muestra como se indica en la sección 10200C.2 y prepárese el filtro de membrana como en la sección 10200D.2a. Examínense las muestras, concentradas en filtros de membrana no forrados y montados en aceite, como se ha descrito

donde: N = densidad (organismos/campo) a partir de la tabla 10200:II; Q = número de campos por filtro; V = mililitros filtrados, y D = factor de dilución (0,96 para conservador de formalina al 4 por 100).

3) Preparaciones sedimentadas: Examínense las preparaciones como se indica en la sección 10200D.2b. 4) Método de la gota de Lackey: El método de la gota de Lackey (microtransección)5 es un procedimiento sencillo para obtener recuentos con exactitud considerable en muestras con gran densidad de plancton. Es similar al recuento de tira S-R. Prepárense los portas como se indica en la sección 10200D.1. Con las preparaciones semipermanentes se pueden utilizar objetivos de inmersión en aceite. Cuéntense los organismos en suficientes tiras para asegurar el nivel deseado de precisión estadística (véase 10200F.1).

10-30

TABLA 10200:II. TABLA DE CONVERSIÓN PARA LA TÉCNICA DE FILTRO DE MEMBRANA (basada en 30 campos puntuados)

Calcúlese el número de organismos por mililitro como sigue:

donde: C = número de organismos contados; At = área del cubre, mm2;

MÉTODOS NORMALIZADOS

As = área de una tira, mm2; S = número de tiras contadas, y V = volumen de muestra bajo el cubre, ml.

5) Preparaciones de diatomeas: Prepárense las muestras como se indica en la sección 10200D.3. Para el recuento proporcional de especies de diatomeas, examínense las muestras bajo inmersión en aceite con un aumento de 900 x, como mínimo. Efectúese un barrido de tiras laterales del ancho de la cuadrícula de Whipple hasta contar 250 células por lo menos. El número de células a contar viene dado por el tiempo disponible y la precisión requerida. Determínese el porcentaje de abundancia de cada especie a partir de los recuentos y calcúlese la cantidad de cada especie por mililitro, multiplicando la abundancia por ciento por el recuento total para diatomeas vivas y muertas obtenido con la cámara de recuento de plancton. Para mayor exactitud, se distinguirá entre diatomeas vivas y muertas a nivel de especie. 6) Técnica de tinción para fitoplancton: La tinción de las algas permite diferenciar entre diatomeas «vivas» y «muertas»6, con lo que se puede enumerar el fitoplancton total en una sola muestra, sin sacrificar la taxonomía detallada de las diatomeas. Así se obtienen también preparaciones permanentes de referencia. El método es especialmente útil cuando las diatomeas son el principal componente del fitoplancton y es importante distinguir entre vivas y muertas. Es preferible conservar las muestras en solución de Lugol o en formalina (véase 10200B.3). Para su análisis, mézclese totalmente la muestra y fíltrese una parte a través de un filtro de membrana de 47 mm de diámetro (diámetro de poro 0,45 o 0,65 µm). Utilícese un vacío de 16 a 20 kPa sin dejar que la muestra se seque. Añádanse 2 a 5 ml de solución acuosa acida de fuchina (disuélvase 1 g de fuchina acida en 100 ml de agua desti-

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ANÁLISIS BIOLÓGICO DE LAS AGUAS

lada, a la que se ha añadido 2 ml de ácido acético glacial; fíltrese) al filtro y déjese reposar durante 20 minutos. Después de teñir, fíltrese la muestra, lávese brevemente con agua destilada y vuélvase a filtrar. Mientras se está filtrando, lávese la muestra con porciones sucesivas de propanol al 50 por 100, 90 por 100 y 100 por 100. Manténgase durante 2 minutos en un segundo lavado de propanol 100 por 100, lávese, fíltrese y añádase xileno. Son precisos dos lavados por lo menos; déjese reposar 10 minutos con el último lavado, antes de filtrar. Recórtese el filtro empapado en xileno y póngase en un porta con varias gotas de medio para preparaciones†. Aplíquense varias gotas más del medio encima del filtro y colóquese un cubre de vidrio. Elimínese con cuidado el exceso de medio. Efectúese la preparación permanente, lacando los bordes del cubre. Cuéntense los organismos utilizando el aumento más adecuado. Las diatomeas «vivas» son de color rojo, mientras las «muertas» no tienen color. Es necesaria la inmersión en aceite para identificar las especies de diatomeas y muchas otras algas. Cuéntense tiras o campos al azar y calcúlense las densidades del plancton por mililitro: † Permount, Fisher Scientific Co., o equivalente.

10200 G.

donde: C = número de organismos contados; At = área total de filtro efectivo antes de recortar y montar; Ac = área contada (tiras o campos), y V = volumen de muestra filtrada, ml.

3. 1.

2.

3.

4.

5.

6.

Referencias INGRAM, W. M. & C. M. PALMER. 1952. Simplifíed procedures for collecting, examining, and recording plankton in water. J. Amer. Water Works Assoc. 44:617. STRICKLAND, J. D. H. & T. R. PARSONS. 1968. A Practical Manual of Sea Water Analysis. Fish. Res. Board Can. Bull. n.° 167 Queen's Printer, Ottawa, Ontario. PALMER, C. M. & T. E. MALONEY. 1954. A New Counting Slide for Nannoplankton. Spec. Publ. n.° 21, American Soc. Limnology & Oceanography. SOURNIA, A., ed. 1978. Phytoplankton Manual. Monogr. Oceanogr. Methodol. n.° 6. United Nations Educational, Scientific & Cultural Org., París. LACKEY, J. B. 1938. The manipulation and counting of river plankton and changes in some organisms due to formalin preservation. Pub. Health Rep. 53:2080. OWEN, B. B., JR., M. AFZAL & W. R. CODY. 1978. Staining preparations for phytoplankton and periphyton. Brit. Phycol. J. 13:155.

Técnicas de recuento para zooplancton

1. Toma de muestras secundarias

Cuéntense muestras completas con < 200 elementos sin tomar muestras secundarias. La mayoría de la muestras de zooplancton contendrán más organismos que los que se pueden enumerar en la práctica, por lo que se debe utilizar un método de toma de muestras secundarias. Antes de ello, elimínense y enumérense todos los organismos grandes no

comunes, como larvas de peces en agua dulce o celenterados, decápodos, larvas de peces, etc., en el agua salada. Las muestras secundarias se toman con pipeta o por fraccionamiento. En el método de pipeta, se ajusta la muestra a un volumen adecuado en una probeta graduada o cono de Imhoff. La concentración del plancton por medio de un bulbo de goma y tubo acrílico transparente con una malla fina ajustada en

10-32

su extremo es cómoda y exacta (figura 10200:9). Para picoplancton y microzooplancton más pequeño, se utilizan las técnicas de sedimentación descritas para concentrar el fitoplancton. Pásese la muestra a un vaso de precipitados o algún otro recipiente de boca ancha para tomar muestras secundarias con una pipeta Hensen-Stempel u otra similar de luz amplia. Agítese bien la muestra, con cuidado, utilizando la pipeta, y retírense rápidamente de 1 a 5 ml. Pásense a una cámara de recuento adecuada. Otro método para obtener muestras secundarias es el fraccionamiento con uno de los numerosos fraccionadores existentes, siendo el más conocido el de Folsom para plancton1 (figura 10200:10). Antes de usarlo hay que nivelarlo. Se pone la muestra en el fraccionador y se divide en subfracciones. El fraccionador se lava, recogiendo los lavados en las muestras secundarias. Repítase el procedimiento hasta obtener un número útil (200 a 500 individuos) en la muestra secundaria. Hay que tener cuidado para conseguir muestras sin desviaciones. Incluso cuando se utiliza el fraccionador de Folsom, no se puede asegurar que las muestras secundarias sean correctas2; por ello, se contarán los animales en varias muestras secundarias procedentes de la misma muestra para comprobar que no hay desviaciones en el aparato y determinar el error de toma de muestras introducido al usarlo. Otro método permite numerosas estimaciones de niveles de precisión, más equivalentes entre las especies que los obtenidos con la pipeta de Hensen-Stempel o el fraccionador de Folsom3. Los procedimientos normales de recuento, cuentan organismos sobre la base de su abundancia en la muestra. Por ello, en una muestra con un organismo dominante que suponga el 50 por 100 del total, el recuento del taxón dominante será grande y tendrá un pequeño error. Sin embargo, el error entre los subdominan-

MÉTODOS NORMALIZADOS

Figura 10200:9. Dispositivo para concentrar el plancton. El tubo desciende dentro del vaso que contiene la muestra. El agua que filtra hacia el tubo se elimina con la pera de goma. El filtro es una tela de nailon monofilamentoso encolada a la base del tubo. La malla debe ser pequeña para impedir que el zooplancton penetre en el filtrado (tomado de Dodson y Thomas5).

ANÁLISIS BIOLÓGICO DE LAS AGUAS

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Figura 10200:10. Dispositivo de corte para plancton de Folsom.

tes aumentará al disminuir el recuento de cada taxón. Aceptando un nivel de precisión3, se ha desarrollado una técnica que obtiene el mismo error para dominantes y subdominantes, permitiendo la comparación cuantitativa entre taxa, en tiempos sucesivos o entre estaciones. 2.

Enumeración

Utilizando un microscopio compuesto y un aumento de 100 x, enumérese el zooplancton pequeño (protozoos, rotíferos y nauplios) en una célula de recuento de plástico acrílico transparente con cubre de vidrio. Para microcrustáceos maduros, más grandes, empléese una cámara de recuento de 5 a 10 ml. No es ade-

cuada una célula de Sedgwick-Rafter debido a su tamaño. Es aconsejable una cámara de recuento abierta de 80 por 50 mm y 2 mm de profundidad; aunque una cámara abierta es difícil de mover sin que se altere el recuento. Si se pone un poco de solución detergente suave en la cámara antes del recuento, se reduce el movimiento de los organismos, y se pueden usar también bandejas especiales para recuento con surcos o divisiones paralelas o circulares4, 5. Cuéntense los microcrustáceos con un microscopio binocular de disección, con aumentos de 20 x o 40 x. Si la identificación es dudosa, cójanse los organismos con una cuchara de transferencia microbiológica y examínense con más aumento en un microscopio compuesto.

10-34

MÉTODOS NORMALIZADOS

Exprésese el zooplancton más pequeño como número por litro, y las formas mayores como número por metro cúbico:

donde: C = número de organismos contados; V’ = volumen de muestra concentrada, ral; V’’ = volumen contado, ml, y V’’’ = volumen de la muestra tomada, m3.

Para obtener los organismos por litro, divídase por 1.000.

10200 H. La concentración de pigmentos fotosintéticos se utiliza ampliamente para calcular la biomasa del fitoplancton1, 2. Todas las plantas verdes contienen clorofila a, que constituye aproximadamente del 1 al 2 por 100 del peso seco de las algas planctónicas. Otros pigmentos presentes en el fitoplancton incluyen a las clorofilas b y c, xantofilas, ficobilinas y carotenos. Los productos importantes de degradación de la clorofila encontrados en el medio acuático son los clorofilidos, feofórbidos y las feofitinas. La presencia o ausencia de los distintos pigmentos fotosintéticos, se utiliza, entre otras características, para separar los principales grupos de algas. Hay tres métodos para determinar la clorofila a en el fitoplancton: el espectrofotométrico3-5, el fluorométrico6-8 y la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)9. La fluorometría es más sensible que la espectrometría, requiere menos muestra y se puede utilizar para determinaciones in vivo10. Estos métodos ópticos pueden infra o supraestimar las concentraciones de clorofila a de forma sig-

3.

Referencias

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Clorofila nificativa11-18 debido en parte a la superposición de las bandas de absorción y fluorescencia de pigmentos accesorios coexistentes y productos de degradación de la clorofila. Feofórbido a y feofitina a, dos productos frecuentes procedentes de la degradación de la clorofila a, pueden interferir en la determinación de la clorofila a por absorber luz y producir fluorescencia en la misma región del espectro que la clorofila a. Si estos feopigmentos están presentes, resultarán errores importantes en los valores de clorofila a. Los feopigmentos se pueden medir por espectrofotometría o fluorometría, pero en medios marinos y de agua dulce, el método fluorométrico no es fiable cuando aparece clorofila b simultáneamente. Al acidificar la clorofila b, la emisión resultante de fluorescencia de feofitina b, coincide con la de feofitina a, produciendo así una sobrestimación de clorofila a y feopigmentos, respectivamente. HPLC es un método útil para cuantificar pigmentos fotosintéticos9, 13, 15, 16, 19-21, incluidos clorofila a, pigmentos acceso-

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ANÁLISIS BIOLÓGICO DE LAS AGUAS

rios (como las clorofilas b y c) y productos de degradación de clorofila (clorofilidos, feofórbidos y feofitinas). La distribución de pigmentos es útil para la evaluación cuantitativa de la composición comunitaria del fitoplancton y actividad alimentaria del zooplancton22.

1.

Extracción de pigmentos

Trabájese con los extractos de clorofila en luz difusa para evitar la degradación. Utilícense envases opacos o envueltos en lámina de aluminio. Los pigmentos se extraen del concentrado de plancton con acetona acuosa y se determina la densidad óptica (absorbancia) del extracto con un espectrofotómetro. La facilidad con que se extraen las clorofilas de las células varía considerablemente con las diferentes algas. Para lograr una extracción completa y homogénea de los pigmentos, rómpanse mecánicamente las células con una trituradora de tejidos. Son preferibles los filtros de fibra de vidrio para extraer las algas del agua. La fibra de vidrio ayuda a romper las células durante la trituración, se pueden filtrar volúmenes de agua mayores y no se forman precipitados después de acidificar. Cuando esos factores sean irrelevantes se podrán emplear filtros de membrana inertes. a) Equipo y reactivos: 1) Morteros para tejidos*: Puede ser difícil el macerar con éxito los filtros de fibra de vidrio en morteros de forma cónica para tejidos, con mano de vidrio. Es preferible emplear tubos de fondo redondo con manos acanaladas en la punta de TFE.

* Kontes Glass Co., Vineland, Nueva Jersey 08360: molino vidrio/vidrio, modelo n.° 8855; molino vidrio/ TFE, modelo 886000, o equivalente.

2) Centrífuga clínica. 3) Tubos de centrífuga, graduados de 15 ml, con tapón a rosca. 4) Equipo de filtración, filtros, de fibra de vidrio† o membrana (0,45 µm de porosidad, 47 mm de diámetro); bomba de vacío; montaje de filtro desechable resistente a los disolventes, tamaño de poro 1,0 µm‡; jeringa de 10 ml resistente a los disolventes. 5) Solución saturada de carbonato de magnesio: Añádase 1,0 g de MgCO3 finamente pulverizado a 100 ml de agua destilada. 6) Solución acuosa de acetona: Mézclense 90 partes de acetona (calidad reactivo BP 56 °C) con 10 partes de solución saturada de carbonato de magnesio. b) Método de extracción: 1) Concéntrese la muestra centrifugando o filtrando lo antes posible después de su obtención. Si hubiera que retrasar el procesado, manténgase las muestras en hielo o a 4 °C y protéjanse de la luz. Utilícense botellas opacas porque incluso una breve exposición a la luz durante la conservación alterará los valores de clorofila. Las muestras sobre filtros obtenidas de aguas con pH 7 o superior se pueden guardar en bolsas herméticas de plástico, conservándolas congeladas durante 3 semanas. Las muestras de aguas acidas deben procesarse en seguida para evitar la degradación de la clorofila. Utilícese material de vidrio y cubetas limpias y exentas de ácido. 2) Colóquese la muestra en un mortero de tejidos, cúbrase con 2 a 3 ml de solución acuosa de acetonal al 90 por 100 y macérese a 500 rpm durante 1 minuto. Utilícese un mortero de vidrio/TFE para filtros de fibra de vidrio y morteros de

† Whatman GF/F (0,7 µm), GFB (1,0 µm), Gelman AE (1 µm)23, o equivalente. ‡ Gelman Acrodisc o equivalente.

10-36

vidrio/vidrio para un filtro de membrana. 3) Pásese la muestra a un tubo de centrífuga con tapa de rosca, lávese el mortero con unos pocos mililitros de acetona acuosa 90 por 100 y añádase el lavado a la pasta de extracción. Ajústese el volumen total a un nivel constante de 5 a 10 ml con acetona acuosa 90 por 100. Empléese el disolvente justo y evítese la dilución excesiva de los pigmentos. Manténganse las muestras 2 horas, por lo menos, a 4 °C en la oscuridad. 4) Clarifíquese por filtración a través de un filtro desechable, resistente a los disolventes (para hacer mínima la retención del extracto en el filtro y su soporte, hágase pasar 1 a 2 ml de aire a través del filtro después del extracto), o por centrifugación en tubos cerrados a 500 g durante 20 minutos. Decántese el extracto clarificado a un tubo de centrífuga de 15 ml con tapa a rosca, calibrado, limpio y mídase el volumen total. Procédase como en 2, 3, ó 4 más adelante. 2. Determinación espectrofotométrica de la clorofila

a) Equipo y reactivos: 1) Espectrofotómetro, con una banda (paso) estrecha de 0,5 a 2,0 nm, porque el pico de absorción de la clorofila es relativamente estrecho. Con un ancho de banda espectral de 20 nm, la concentración de clorofila a puede infraestimarse hasta un 40 por 100. 2) Cubetas, con recorridos de 1, 4, y 10 cm. 3) Pipetas, de 0,1 y 5,0 ml. 4) Ácido clorhídrico, HCl 0,1 N. b) Determinación de clorofila a en presencia de feofitina a: La clorofila a puede sobrestimarse por incluir feopigmentos que absorben cerca de la misma longitud de onda que la clorofila a. La adición de ácido a la clorofila a da lugar

MÉTODOS NORMALIZADOS

a la pérdida del átomo de magnesio y a su transformación en feofitina a. Acidifiquese con cuidado hasta una molaridad final no superior a 3 x 10-3M para evitar que algunos pigmentos accesorios cambien su absorbancia a la misma longitud de onda que la feofitina a13. Cuando una solución de clorofila a pura se transforma en feofitina a por acidificación, la relación del pico de absorción (DO664/DO665) de 1,70 se usa para corregir la concentración aparente de clorofila a para feofitina a. Las muestras con una relación DO664 antes/DO665 después de acidificación (664b/665a) de 1,70 se considera que no contienen feofitina a y están en estado fisiológico excelente. Las soluciones de feofitina pura no presentan reducción de DO665 al acidificar y tienen una relación 664b/665a de 1,0. Así, las mezclas de clorofila a y feofitina a tienen relaciones del pico de absorción que van desde 1,0 a 1,7. Estas relaciones se basan en el uso de acetona al 90 por 100 como disolvente. Usando acetona 100 por 100 como disolvente se obtiene una relación de clorofila a antes a después de acidificar de alrededor de 2,03. Método espectrofotométrico: Pásense 3 ml de extracto clarificado a una cubeta de 1 cm y léase la densidad óptica (DO) a 750 y 664 nm. Acidifíquese el extracto en la cubeta con 0,1 ml de HCl 0,1 N. Agítese suavemente el extracto acidificado y léase DO a 750 y 665 nm, 90 segundos después de acidificar. Los volúmenes de extracto y ácido y el tiempo tras la acidificación son críticos para unos resultados exactos y constantes. La DO664 antes de acidificación debe estar entre 0,1 y 1,0. Para extractos muy diluidos empléense cubetas con un recorrido de luz más largo. Si se utiliza una célula mayor, añádase un volumen de ácido proporcionalmente mayor. Corríjase la DO obtenida con cubetas más grandes a 1 cm, antes de hacer los cálculos.

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ANÁLISIS BIOLÓGICO DE LAS AGUAS

Réstese el valor DO 750 nm de las lecturas hechas antes (DO664 nm) y después de acidificar (DO665 nm). Utilizando los valores corregidos, calcúlese la clorofila a y feofitina a por metro cúbico, como sigue:

donde: V1 = Volumen de extracto, 1; V2 = volumen de muestra, m3; L = recorrido de luz o ancho de la cubeta, cm, y 664b, 665a = densidades ópticas del extracto de acetona 90 por 100 antes y después de la acidificación, respectivamente.

El valor 26,7 es la corrección de absorbancia y es igual a A x K donde: A = coeficiente de absorbancia para clorofila a a 664 nm = 11,0, y K = relación que expresa la corrección para acidificación,

de luz o dilución que proporcione una DO664 entre 0,1 y 1,0. Utilícense las lecturas de densidad óptica a 664, 647 y 630 nm para determinar la clorofila a, b y c, respectivamente. La lectura de DO a 750 nm es una corrección de la turbidez. Réstese esta lectura de los valores de cada pigmento en las otras longitudes de onda, antes de usarlos en las ecuaciones siguientes. Dado que la DO del extracto a 750 nm es muy sensible a los cambios en las proporciones agua-acetona, sígase estrictamente la fórmula de 90 partes de acetona por 10 partes de agua (v/v) para extracción de pigmentos. La turbidez se puede eliminar fácilmente por filtración a través de un filtro desechable resistente a disolventes, fijado a una jeringa, o por centrifugación a 500 g durante 20 minutos. Calcúlense las concentraciones de clorofila a, b y c en el extracto introduciendo las densidades ópticas corregidas en las siguientes ecuaciones5: a)Ca = 11,85(DO664) – 1,54(DO647) – 0,08(DO630) b) Cb = 21,03(DO647) – 5,43(DO664) – 2,66(DO630) c) Cc = 24,52(DO630) – 7,60(DO647) – 1,67(DO664)

donde: Ca, Cb y Cc

=

DO664, DO647, y DO630 =

c) Determinación de clorofila a, b y c (método tricromático): Procedimiento espectrofotométrico: Pásese el extracto a una cubeta de 1 cm y mídase la densidad óptica (DO) a 750, 664, 647 y 630 nm. Elíjase un recorrido

concentraciones de clorofila a, b y c, respectivamente, mg/l, y densidades ópticas corregidas (con un recorrido de luz de 1 cm) a las longitudes de onda respectivas.

Tras determinar la concentración de pigmento en el extracto, calcúlese la cantidad de pigmento por unidad de volumen, como sigue:

MÉTODOS NORMALIZADOS

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3. Determinación fluorométrica de clorofila a El método fluorométrico para clorofila a es más sensible que el método espectrométrico, por lo que se pueden usar muestras menores. Calíbrese espectrofotométricamente el fluorómetro con una muestra procedente de la misma fuente para conseguir resultados aceptables. La sensibilidad óptima para medidas del extracto de clorofila a se obtiene a una longitud de onda de excitación de 430 nm y emisión de 663 nm. Existe un método para medida continua de clorofila a in vivo, pero hay datos de su menor eficacia respecto al método in vitro que se da aquí, produciendo una fluorescencia por unidad de peso alrededor de la décima parte que la misma cantidad en solución. La feofitina a también se puede determinar fluorométricamente24. a) Equipo y reactivos: Además de los enumerados en la y 2a previamente: Fluorómetro§, equipado con una lámpara azul F4T,5 de gran intensidad; tubo fotomultiplicador R-446 (sensible al rojo); orificios de ventana corredera 1 x , 3 x , 10 x y 30 x, y filtros para emisión de luz (CS-2-64) y excitación (CS-5-60). Es preferible una puerta de gran sensibilidad. b) Procedimiento de extracción: Prepárese la muestra como se indica en 1b más arriba.

ción en cada ajuste de sensibilidad (orificio de ventana corredera): 1 x, 3 x, 10 x y 30 x . Empleando los valores obtenidos, dedúzcanse los factores de calibrado para transformar las lecturas fluorométricas en cada nivel de sensibilidad, en concentraciones de clorofila a, como sigue:

donde: Fs = factor de calibrado para ajuste de sensibilidad S; Rs = lectura del fluorómetro para ajuste de sensibilidad S, y Ca = concentración de clorofila a determinada espectrométricamente, µg/l.

2) Mídase la fluorescencia de la muestra con ajustes de sensibilidad que proporcionen una lectura a media escala. (Evítese el uso de la ventana 1 x por los efectos de supresión.) Transfórmense las lecturas de fluorescencia en concentraciones de clorofila a multiplicando las lecturas por el factor de calibrado adecuado. c) Determinación de clorofila a en presencia de feofitina a: Este método normalmente no es aplicable a muestras de agua dulce. Véanse las explicaciones en 10200G y le más arriba.

1) Calíbrese el fluorómetro con una solución de clorofila de concentración conocida, como sigue: Prepárese el extracto de clorofila y analícese espectrofotométricamente. Prepárense diluciones en serie del extracto para obtener concentraciones de aproximadamente 2, 6, 20 y 60 µg de clorofila a/l. Efectúense lecturas fluorométricas para cada solu-

1) Equipo y reactivos: Además de los enumerados en 1a y 2a anteriores, clorofila a pura || (o un extracto de clorofila del plancton con una relación espectrofotométrica antes-después de acidificación 1,70, sin contener clorofila b). 2) Método fluorométrico: Calíbrese el fluorómetro como se indica en el apartado 3b1). Determínese la fluorescencia del extracto en cada ajuste de sensibilidad antes y después de acidificar. Calcúlense los factores de calibrado (Fs) y la

§ Modelo 111, Sequoia-Turner Corp., 755 Ravendale Dr., Mountain View, California, o equivalente.

|| Clorofila purificada a Signa Chemical Company, St. Louis, Mo, o equivalente.

ANÁLISIS BIOLÓGICO DE LAS AGUAS

relación de fluorescencia antes-después de acidificación, dividiendo la lectura de fluorescencia obtenida antes de acidificar por la lectura obtenida después de acidificar. Evítense las lecturas en la escala 1 x y las que queden fuera del rango de 20 a 80 unidades fluorométricas. 3) Cálculos: Determinar la clorofila a y feofítina a «corregidas» en los extractos de muestra, con las ecuaciones siguientes8, 24:

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2) Procedimiento de extracción: Decántese una muestra de 1,5 ml en un tubo de ensayo con tapa a rosca y añádanse 8,5 ml de acetona al 100 por 100. Mézclese con agitador y manténgase en la oscuridad durante 6 horas a temperatura ambiente. Fíltrese por filtro de fibra de vidrio†† o centrifúguese. Mídase la fluorescencia como se describe en la sección 10200H.3 y calcúlense las concentraciones como en el apartado 3c. Debido a la interferencia de las sustancias húmicas, se debe fitrar una porción de la muestra, si se encuentran presentes (véase 10200H.1b), y procesar el filtrado con la muestra. Réstese la fluorescencia del filtrado (blanco) de la de la muestra.

donde: Fs = factor de conversión para ajuste de sensibilidad S (véase apartado 2b, más arriba); Rb = fluorescencia del extracto antes de acidificación; Ra = fluorescencia del extracto tras la acidificación, y r = Rb/Ra, determinado con clorofila a pura para el aparato. Vuélvase a determinar r si se cambian los filtros o la fuente luminosa.

d) Extracción de agua completa, muestras no filtradas: Alternativamente, para evitar la lisis celular durante la filtración, extráigase la muestra de agua completa. 1) Equipo y reactivos: Fluorómetro equipado con un fototubo R928# de gran sensibilidad, con salida de impedancia de 36 ma/W a 675 nm y una puerta de sensibilidad elevada. Póngase un filtro neutro de densidad (40-60N) en el recorrido de luz trasero**, seleccionado para permitir un blanco de reactivos en la escala de sensibilidad más alta.

# Hammamatsu Corp., Middlesex, Nueva Jersey, o equivalente. ** Si se usa el modelo 10-005, Sequoia-Turner Corp., o equivalente.

4. Determinación cromatográfica líquida de alta resolución para clorofilas de las algas y sus productos de degradación (PROPUESTA)

a) Equipo y reactivos: Además de los enumerados para extracción de pigmentos, apartado la anterior: 1) Cromatógrafo liquido de alta presión con una capacidad de flujo de 2,0 ml/minuto. 2) Válvula inyectora de alta presión equipada con receptáculo para muestra de 100 µl. 3) Salva-columna (4,0 x 0,5 cm, material de relleno C18, tamaño de partícula 3 µm o sistema de protección equivalente) para prolongar la vida de la columna primaria. 4) Columna HPLC de fase inversa‡‡. 5) Detector de fluorescencia capaz de excitación a 430 ± 30 nm y que mida la emisión a longitudes de onda superiores a 600 nm. †† Whatman GF/F o equivalente. ‡‡ Columna Microsorb C18, 10 cm de longitud, tamaño de partícula 3 µm, Rainin Co., o equivalente.

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6) Dispositivo de registro de datos: Registro de gráficas en banda o, mejor, un integrador electrónico. 7) Jeringa, de vidrio, 250 µl. 8) Eluyentes de HPLC: Sistema A (metanol: agua para reactivos tipo I: solución apareamiento iónico, 80:15:5) y sistema B (metanol: acetona, 80:20). Empléense disolventes de calidad HPLC; mídanse los volúmenes antes de mezclar. Fíltrense los eluyentes a través de un filtro resistente a disolventes de 0,4 µm antes de usarlos y elimínese el gas con he-, lio. Prepárese la solución de apareamiento iónico (AI) a partir de 15 g de acetato de tetrabutilamonio§§ y 77 g de acetato de amonio || || llevando a 1 l con agua para reactivos tipo I15. 9) Patrones para calibrado: Disuélvase 1 mg de cada una de las clorofilas puras a y b|| || en 100 ml de acetona 90 por 100. Determínense espectrofotométricamente las concentraciones exactas ( ∈ 634 para clorofila a en acetona 90 por 100 = 87,67 1 g-1 cm-1; ∈ 647 para clorofila b en acetona 90 por 100 = 51,36 1 g-1 cm-1)5. Prepárense patrones de feofitina a + a' y b + b' a partir de los patrones de clorofila a y b, por acidificación con ácido clorhídrico; corríjanse las respectivas concentraciones en cuanto a pérdida de Mg2+. Extráigase la clorofila c con acetona 90 por 100 a partir de diatomeas, purifíquese por cromatografía de capa fina (CCF)25 y calíbrese espectrofotométricamente ( ∈ 631 para una mezcla que contiene cantidades iguales de clorofilas c1 y c2 en acetona 90 por 100 que contienen 1 por 100 de piridina = = 42,6 1 g-1 cm-1); la ausencia de esta pequeña cantidad de piridina se supone que produce sólo pequeñas diferencias en las propiedades de absorción de la clorofila c26. Alternativamente, determínese el contenido de clorofila c de un extracto de §§ Fluka Chemical Corp., 980 South Second Street, Ronkonkoma, Nueva York, o equivalente. || || Sigma Chemical Company o equivalente.

MÉTODOS NORMALIZADOS

diatomeas con acetona 90 por 100, espectrofotométricamente (clorofila c1 + c2, µg/ml = 24,36E630 – 3,73E664)5, y utilícese como patrón. Prepárese clorofílido a a partir de diatomeas27, purifíquese por CCF25 y calíbrese espectrofotométricamente en acetona 90 por 100 ( ∈ 664 para clorofilido a = 128 g-1 cm-1)28. Prepárese feofórbido a por acidificación del clorofílido a, purificar por CCF25 y calíbrese espectrofotométricamente en acetona 90 por 100 ( ∈ 665 para feofórbido a = 69,8 1 g-1 cm-1)28. Los patrones conservados bajo nitrógeno en la oscuridad a –20 °C son estables alrededor de 1 mes. b) Método: 1) Móntese y equilíbrese el sistema HPLC con disolvente sistema A a un flujo de 2 ml/minuto. Ajústese la sensibilidad del fluorómetro para obtener una lectura a escala completa con el patrón de clorofila a más concentrado. 2) Calíbrese el sistema HPLC preparando patrones de trabajo a partir de los primarios (el día de utilización). Una vez se han determinado los tiempos de retención de los patrones para un determinado sistema, simplifíquese la estandarización, preparando diluciones en serie a partir de patrones mixtos. Prepárense aparte los patrones mixtos para clorofilas y clorofilido a, y para feofitinas y feofórbido a. Mézclense porciones de 1 ml de patrones con 300 µl de solución de apareamiento iónico y equilíbrense durante 5 minutos antes de la inyección (el uso de agentes de apareamiento iónico potencia en gran medida la separación de pigmentos defitolados, clorofilido a, clorofila c y feofórbido a). Prepárense los blancos mezclando 1 ml de acetona 90 por 100 con 300 µl de solución AI. Lávese la jeringa dos veces con 150 µl de patrón y extráiganse unos 250 µl de patrón con la jeringa para inyección. Póngase la jeringa en la válvula del inyector, llenando en exceso el recipiente para

ANÁLISIS BIOLÓGICO DE LAS AGUAS

muestra de 100 µl. Trácense las curvas de calibrado, por comparación de las áreas (o alturas) de los picos de fluorescencia con las concentraciones de los pigmentos patrón. 3) Prepárense muestras para inyección, mezclando una porción de 1 ml de extracto del pigmento con acetona 90 por 100 con 300 µl de solución AI. 4) Utilícese un programa de disolución en dos etapas para que la separación de las clorofilas y sus productos de degradación sea óptima15. Después de la inyección, cámbiese del disolvente de sistema A al sistema B durante 5 minutos y continúese 15 minutos con el sistema B a un flujo de 2 ml/minuto. Vuélvase a equilibrar la columna con sistema A durante 5 minutos antes de la siguiente inyección para un tiempo total de análisis de aproximadamente 25 minutos. Extráigase el gas de los sistemas disolventes con helio durante el análisis. Prolónguese la vida de la columna, conservándola en metanol 100 por 100 entre operaciones. Pásese agua para reactivos (tipo I) periódicamente a través del sistema HPLC, para evitar el acumulo de agentes de apareamiento iónico. 5) Calcúlense las concentraciones de cada pigmento utilizando la fórmula siguiente:

donde: Ci = concentración individual del pigmento, ng/l; As = área del pico del pigmento individual a partir de la inyección de muestra; Fi = factor de respuesta estándar (ng pigmento/0,1 ml de patrón dividido por el área del pico correspondiente); VI = volumen de inyección (0,1 m); VE = volumen de extracción, ml, y VS = volumen de muestra, 1.

6) Este método se ha preparado solamente para determinar cuantitativa-

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mente las clorofilas y sus productos de degradación. Efectúese la detección de los pigmentos carotenoides que se encuentran también en los extractos de acetona 90 por 100, pero no producen fluorescencia, por espectroscopia de absorbancia (a unos 440 nm)21. 7) El orden de elución y los tiempos de retención aproximados para los principales pigmentos clorofílicos y sus productos de degradación se muestran en la figura 10200:11. Los límites de detección (s/n = 2) varían con la configuración del

Figura 10200:11. Cromatograma HPLC de fase inversa para una dilución quíntuple de la muestra EPA. Volumen de inyección 100 µl; picos detectados por espectroscopia de fluorescencia (λex: 400-600 nm; λem: >600 nm). Identidades de los picos: 1: clorofilido a; 2: clorofila c; 3: feofórbido a; 4: clorofila b; 5: clorofila a; 6: feofitina a, y 7: feofitina a’- Los productos de degradación de clorofila b, feofitina b y feofitina b' quedaban debajo de los límites de detección. La identidad de los picos se confirmó por espectroscopia de diodos en línea (350-550 nm).

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fluorómetro y con la tasa de flujo; sin embargo, oscilan entre 10 y 100 pg por inyección para la mayoría de las clorofilas y sus productos de degradación15, 21, 29. La precisión del método HPLC depende sobre todo de la pureza de los pigmentos patrón. Es preferible medir los espectros de absorción (350 a 750 nm) de los patrones y compararlos con los datos publicados. La pureza de los pigmentos se puede evaluar también por HPLC, siempre que no haya contaminantes coeluyentes cuyas bandas de absorción y fluorescencia se superpongan con los patrones. Las concentraciones de los pigmentos obtenidas por HPLC y espectrométricamente para los patrones EPA disponibles concuerdan razonablemente bien (±20 por 100) si se corrigen los resultados espectrométricos en cuanto a la presencia de feopigmentos y los resultados de HPLC se expresan como equivalentes de pigmento (por ejemplo, equivalentes de clorofila a = clorofílido a + clorofila a + clorofila a', siempre que se apliquen las correcciones adecuadas del peso molecular)30. Así, si se encuentran presentes cantidades significativas de derivados de la clorofila, se sobrestimarán las concentraciones de pigmento determinadas espectrofotométricamente. El acuerdo entre los resultados de HPLC y fluorometría depende de la presencia de clorofilas accesorias b y c y sus derivados. Las inyecciones por triplicado de una dilución quíntuple de una muestra EPA daban coeficientes de variación de 7,5 por 100 (clorofilido a), 9,1 por 100 (clorofila c), 13,4 por 100 (feofórbido a), 9,6 por 100 (clorofila b), 0,5 por 100 (clorofila a), 6,2 por 100 (feofitina a) y 22,9 por 100 (feofitina a'), con un valor medio del 10 por 100 para los siete pigmentos analizados. 5.

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ANÁLISIS BIOLÓGICO DE LAS AGUAS

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Determinación de biomasa (cultivo estacionario)

Biomasa es una estimación cuantitativa de la masa total de organismos vivos dentro de un área o volumen determinado. Puede incluir la masa de una población (biomasa de especies) o de una comunidad (biomasa comunitaria), pero no proporciona información acerca de la estructura o función de la comunidad. Los

métodos más exactos para estimación de la biomasa son el peso en seco, peso seco sin cenizas y volumen de organismos vivos. Entre los métodos indirectos se incluye la estimación del carbono total, contenido calórico, nitrógeno, lípidos, carbohidratos, sílice (diatomeas) y clorofila (algas). También se han utilizado el

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adenosín trifosfato (ATP)1 y ácido desoxirribonucleico (ADN)2, 3 como estimaciones indirectas. Todas las determinaciones de la biomasa se pueden ver afectadas por la presencia de detritus orgánicos e inorgánicos; los análisis de ATP y ADN incluyen contribuciones de la ñora bacteriana4.

MÉTODOS NORMALIZADOS

donde: Vt = volumen celular total del plancton, mm3/l; Ni = número de organismos de la especie i/l, y Vi = volumen medio de células de la especie i, µm3.

3. Área de la superficie celular 1.

Clorofila a

La clorofila a se usa como indicador de la biomasa de algas5. Suponiendo que constituya un promedio del 1,5 por 100 del peso seco de la materia orgánica (pero sin cenizas) de las algas, se calcula la biomasa de algas multiplicando el contenido en clorofila a por un factor de 67.

Al analizar las interacciones entre la célula y las aguas circundantes es muy útil calcular el área de la superficie celular. Calcúlese el área superficial media en micrómetros cuadrados y multiplíquese por el número por mililitro de la especie en cuestión. 4. Volumen desplazado

2.

Biovolumen (volumen celular)

Los datos del plancton obtenidos sobre una base de volumen-por-volumen son, a menudo, más útiles que los números por mililitros6. Determínese el volumen celular utilizando la configuración geométrica más simple que mejor se ajuste a la forma de la célula a medir (esfera, cono, cilindro, por ejemplo)7. Los tamaños de las células de un organismo pueden diferir sustancialmente en aguas distintas y, en las mismas aguas, en diferentes épocas del año; por eso, se deben obtener los promedios de medida de 20 individuos de cada especie para cada período de toma de muestra. Calcúlese el biovolumen total de una especie multiplicando el volumen celular medio en micrómetros cúbicos por el número por mililitro. Calcúlese el volumen total de algas húmedas como:

Este método8 mide un volumen equivalente del líquido desplazado por la muestra. El volumen desplazado se puede determinar por varios métodos; para la medida directa simple, procédase como sigue: Colóquese la muestra en un tamiz de tamaño de malla igual o menor al de la red usada para captura; déjese escurrir la muestra y pásese a un volumen de agua medido en una probeta graduada; mídase el nuevo volumen que contiene la muestra más el volumen conocido. El volumen desplazado es igual al nuevo volumen menos el volumen original de agua medida. 5.

Métodos gravimétricos

La biomasa de la comunidad del plancton se puede calcular a partir de determinaciones gravimétricas, aunque interfieren el cieno y los detritus orgánicos. Determínese el peso en seco, colocando 100 mg de muestra concentrada húmeda en un crisol de porcelana, limpio, sometido a ignición y tarado, y

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ANÁLISIS BIOLÓGICO DE LAS AGUAS

séquese a 105 °C durante 24 horas. Alternativamente, fíltrese un volumen conocido de muestra a través de membrana de 0,45 µm de diámetro de poro, 0 filtro de fibra de vidrio previamente lavado, secado y pesado. (Nótese que la pequeña muestra utilizada en la filtración directa puede conducir a error si no se manipula correctamente.) Enfríese la muestra en un desecador y pésese. Obténgase el peso sin cenizas por ignición de la muestra seca a 500 °C durante , 1 hora. Enfríese, vuélvanse a humedecer las cenizas con agua destilada y llévese a peso constante a 105 °C. Las cenizas se vuelven a humedecer para restablecer el agua de hidratación de las arcillas y otros minerales, que pueden suponer hasta un 10 por 100 del peso perdido durante la incineración9. Se prefiere el peso sin cenizas al peso seco para comparar conjuntos mixtos. El contenido en cenizas puede suponer el 50 por 100 o más del peso seco en el fitoplancton con estructuras inorgánicas, como las diatomeas. En otras formas, el contenido de ceniza es sólo alrededor del 5 por 100 del peso seco.

6.

Adenosín trifosfato (ATP)

Los métodos para medir el adenosín trifosfato (ATP) en el plancton proporcionan el único medio de determinar la biomasa viable total del plancton. El ATP se encuentra en todas las plantas y animales, pero sólo en las células vivas; no va asociado al material en partículas no vivientes. La proporción de ATP a biomasa varía de unas especies a otras, pero se mantiene suficientemente constante como para permitir una estimación fiable de la biomasa a partir de las determinaciones de ATP10. El método es sencillo y relativamente barato, y los aparatos estables y fiables. El método tiene también muchas posibles aplicaciones en

trabajos de bioensayo, especialmente en estudios de mortalidad del plancton. a) Equipo y reactivos: 1) Material de vidrio: matraces, vasos y pipetas de vidrio borosilicato, limpio, estéril y seco. 2) Filtros: de membrana de 47 mm de diámetro y porosidad 0,45 µm. 3) Equipo de filtración. 4) Congelador (–20 °C). 5) Baño de agua hirviendo. 6) Intrumentos de detección diseñados específicamente para medir ATP*. 7) Microjeringas: 10, 25, 50, 100 y 250 µl. 8) Cubetas y viales para reacción. 9) Jampón tris (0,02M, pH 7,75): Disuélvanse 7,5 g de trishidroximetilaminometano en 3 l de agua destilada y ajústese a pH 7,75 con HCl 20 por 100. Manténganse en autoclave porciones de 150 ml a 115 °C durante 15 minutos. 10) Preparado enzimático luciferinaluciferasa†. Rehidrátense extractos liofilizados congelados (–20 °C) de linternas de luciérnaga con tampón tris como indique el proveedor; déjese reposar a temperatura ambiente 2-3 horas, y centrifuguese a 300 g durante 1 minuto; decántese el sobrenadante a un tubo de ensayo limpio y seco, déjese reposar a temperatura ambiente durante 1 hora. 11) Patrón de ATP purificado: Disuélvanse 12,3 mg de ATP disódico en 1 l de agua destilada y dilúyase 1,0 ml a 100 mi con tampón tris; 0,2 ml = 20 ng ATP. b) Método: 1) Calibrado: Para determinar el factor de calibrado (F), prepárese una serie de diluciones de patrón de ATP purificado y regístrese la emisión de luz a partir de varias porciones de cada concentración de patrón. Corríjase el área media * Beckman, JRB, Turner Designs, o equivalente. † Dupont, Sigma Chemical, o equivalente.

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de los patrones, restando la lectura del pico o área media de varios blancos usando 0,2 ml de tampón tris. Calcúlese el factor de calibrado Fs como:

donde: Fs = factor de calibrado a sensibilidad S; As = lectura del pico o área media bajo la curva estándar de ATP corregida para el blanco, y C = concentración de ATP en la solución patrón, ng/ml.

2) Análisis de la muestra: Recójanse de 1 a 2 l de muestra en un tomamuestras limpio, estéril. Hágase pasar a través de una red de 250 µm para eliminar el zooplancton grande10 y fíltrese a través de filtro de 47 mm de 0,45 µm de porosidad aplicando un vacío de unas 30 kPa. (IMPORTANTE: ES necesario romper la succión antes de que pase a través del filtro la última película de agua.) Coloquese rápidamente el filtro en un vaso pequeño. Tápese inmediatamente con 3 ml de tampón tris hirviendo, utilizando una pipeta automática. Póngase el vaso en un baño de agua hirviendo durante 5 minutos y trasládese el extracto, con una pipeta Pasteur, a un tubo de ensayo limpio, seco y calibrado. Lávense el filtro y el vaso con 2 ml de tampón tris hirviendo; combínense los extractos, anótese el volumen y llévese a 5 ml con tampón tris; tápense los tubos con parafilm y, si las muestras no se pueden analizar inmediatamente, congélese a –25 °C. Los extractos se pueden conservar durante varios meses en un congelador. Prepárense, por lo menos, extractos de cada muestra por triplicado. El procedimiento analítico depende del equipo utilizado para detección. Si se usa un contador de centelleo, llévense con la pipeta 0,2 ml de preparado enzimático a un vial de vidrio. Mídase la

MÉTODOS NORMALIZADOS

emisión de luz del preparado enzimático (blanco) durante 2-3 minutos en ajustes de sensibilidad próximos al esperado para la muestra. Añádanse 0,2 ml de extracto de muestra al vial, regístrese el tiempo y agítese. Comiéncese a anotar la luz producida 10 segundos después de combinar el extracto ATP con el preparado enzimático; anótese la emisión durante 2-3 minutos, empleando el mismo período de tiempo para todas las muestras. Determínese la media de las áreas bajo las curvas obtenidas, y corríjase sustrayendo la media de las áreas bajo las curvas obtenidas con los blancos preparados, como se indica en Strickland y Parsons11. c) Cálculos: Calcúlese la concentración de ATP:

donde: Ac = área media bajo las curvas del extracto, corregida; Ve = volumen del extracto, ml; Vs = volumen de muestra, 1, y Fs = factor de calibrado.

Si se supone un contenido en ATP de 2,4 µg ATP/mg de peso seco de materia orgánica12, la biomasa total de plancton vivo (B), como peso seco de materia orgánica, viene dada por:

7.

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ANÁLISIS BIOLÓGICO DE LAS AGUAS

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Medidas de índice metabólico

Para evaluar el estado de las aguas naturales se debe tener en cuenta el estado fisiológico y el espectro de interacciones biológicas de la comunidad acuática. Anteriormente las principales consideraciones eran el número y composición en especies y la biomasa. El reconocimiento de las limitaciones de este planteamiento llevó a medir los índices de los procesos metabólicos, tales como la fotosíntesis (productividad), fijación de nitrógeno, respiración y transporte de electrones, que proporcionan una mejor conprensión de la naturaleza compleja del ecosistema acuático. Con el índice de productividad se puede determinar la eficacia fotosintética (mg de C fijado/unidad de clorofila a)1. 1.

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Fijación de nitrógeno

La capacidad de un organismo para fijar el nitrógeno es una gran ventaja

competitiva y juega un papel principal en la dinámica de la población. Hay dos métodos fiables para estimar los índices de fijación del nitrógeno en el laboratorio: el del radioindicador2, 3 de isótopo N15 y el de reducción de acetileno4. Debido a la gran variación del índice de fijación de nitrógeno en los distintos organismos y con la concentración de nitrógeno combinado, esos índices no se pueden utilizar para estimar la biomasa de organismos fijadores del nitrógeno. Sin embargo, el método de reducción de acetileno es útil para medir los presupuestos de nitrógeno y en el trabajo de análisis de algas5. 2. Productividad, método de oxígeno

La productividad se define como la proporción en que el carbono inorgánico se transforma en una forma orgánica.

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MÉTODOS NORMALIZADOS

Los organismos portadores de clorofila (fitoplancton, perifiton, macrofitos) sirven como productores primarios en la cadena acuática de alimento. La fotosíntesis consigue formar finalmente una amplia gama de compuestos orgánicos, liberando oxígeno y reduciendo el dióxido de carbono (CO2) en las aguas circundantes. La productividad primaria6 se puede determinar midiendo los cambios en la concentración de oxígeno y CO27. En aguas poco tamponadas, el pH puede ser una propiedad sensible para detectar variaciones en el sistema. Al eliminarse CO2 durante la fotosíntesis, el pH sube. Y ese cambio se puede usar para estimar la fotosíntesis y la respiración8. El mar y muchas aguas dulces están demasiado tamponadas para que sea utilizable, pero se ha aplicado con éxito a estudios de productividad en las aguas de algunos lagos. Dos métodos para medir el índice de captación de carbono y la fotosíntesis neta in situ son el método del oxígeno9 y el del carbono 1410. En los dos se llenan botellas transparentes (luz) y oscuras (oscuridad) con muestras de agua y se suspenden a intervalos regulares de profundidad durante un período de incubación de varias horas, o se incuban las muestras en condiciones controladas, en cámaras de crecimiento ambiental en el laboratorio. La reacciones básicas en la fotosíntesis de las algas incluyen la captación de carbono inorgánico y liberación de oxígeno, resumidas en la relación: CO 2 + H 2O → (CH 2O) x + O 2

Las ventajas principales del método de oxígeno son la mejor estimación de la productividad y respiración brutas y netas, y que los análisis se pueden realizar con un equipo de laboratorio barato y reactivos comunes. La concentración de oxígeno disuelto (OD) se determina al comienzo y al final del período de incu-

bación. La productividad se calcula partiendo del supuesto de que por cada molécula de oxígeno liberada, se asimila un átomo de carbono. a) Instrumental: 1) Frascos ROB, numerados, de 300 ml, de vidrio borosilicato transparente y opaco, con tapón de vidrio esmerilado y boca ancha, para incubación de muestras. Límpiense las botellas con ácido, lávense bien con agua destilada y, justo antes de usarlas, lávense con el agua a estudiar. No deben usarse detergentes que contengan fósforo. Si no se dispone de botellas opacas adecuadas, píntense de negro los ROB transparentes y envuélvanse en papel negro impermeable. Como precaución adicional, envuélvase la botella completamente con lámina de aluminio o coloquese en un recipiente sin luz durante la incubación. 2) Línea o gradilla de soporte que no proyecten sombras sobre las botellas suspendidas. 3) Tomamuestras acrílico opaco, no metálico, de Van Dorn o equivalente, de 3 a 5 l de capacidad. 4) Equipo y reactivos para determinaciones de oxígeno disuelto: Véase sección 4500-O. 5) Pirheliómetro. 6) Fotómetro submarino. 7) Termómetro. b) Método: 1) Obténgase un perfil del aporte de radiación solar para el fotoperíodo con un pirheliómetro. 2) Determínese la profundidad de la zona eufótica (la región que recibe 1 por 100 o más iluminación superficial) con un fotómetro submarino. Selecciónense los intervalos de profundidad para colocación de las botellas. La curva de fotosíntesis-profundidad se conseguirá mejor poniendo las muestras a intervalos equivalentes a una décima parte de la profun-

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ANÁLISIS BIOLÓGICO DE LAS AGUAS

didad de la zona eufótica. Calcúlese la productividad en aguas relativamente poco profundas con menos intervalos de profundidad. 3) Mídase la concentración de oxígeno con una sonda o por titulación, así como la temperatura y salinidad, para determinar si el agua está sobresaturada respecto al oxígeno (véase tabla 4500-O:1). Si el agua está sobresaturada, hágase pasar gas nitrógeno a través de la muestra para rebajar la concentración inicial del oxígeno a menos del 80 por 100 de saturación. 4) Manténganse las muestras fuera de la luz solar directa durante la manipulación. Introdúzcanse las muestras tomadas de cada profundidad seleccionada previamente, en botellas duplicadas, transparentes, oscuras y de análisis inicial. Introdúzcase el tubo de entrada del tomamuestras en el fondo de la botella de muestra y llénese de modo que se dejen rebosar tres volúmenes de agua. Sáquese el tubo lentamente y ciérrese la botella. Empléese agua de la misma muestra para llenar un «juego» (una botella con luz, una oscura y otra inicial). 5) Trátense (fíjense) inmediatamente las muestras tomadas para determinación química de oxígeno inicial disuelto (véase sección 4500-O) con sulfato manganoso (MnSO4), yoduro alcalino y ácido sulfúrico (H2SO4) o compruébese con una sonda de oxígeno. Los análisis se pueden retrasar varias horas si fuera necesario, cuando las muestras se fijan o congelan y se mantienen en la oscuridad. 6) Suspéndanse parejas de botellas duplicadas, transparentes y oscuras, a la profundidad que se tomaron las muestras e incúbense durante 2 horas por lo menos, y nunca más de lo que tarden en formarse burbujas de oxígeno gaseoso en las botellas transparentes, o en consumirse el OD en las oscuras. 7) Al final del período de exposición, determínese inmediatamente el OD como se ha descrito más arriba.

c) Cálculos: El aumento de la concentración de oxígeno en la botella con luz, durante la incubación, es una medida de la producción neta, que, debido al uso concurrente de oxígeno en la respiración, es algo menos que la producción total (o bruta). La pérdida de oxígeno en la botella oscura se usa como estimación de la respiración total del plancton. Así: Fotosíntesis neta = OD botella con luz – – OD inicial Respiración = OD inicial – OD botella oscura Fotosíntesis bruta = OD botella con luz – – OD botella oscura

Obténganse los resultados medios de los duplicados. 1) Calcúlese la producción bruta o neta para cada profundidad de incubación y compárese: mg carbono fijado/m3 = = mg oxígeno liberado/l x 12/32 x 1.000 x K

donde K es el cociente fotosintético (CF), que va de 1 a 2, dependiendo del suministro de nitrógeno11, 12. Utilícese el factor 12/32 para convertir el oxígeno en carbono; en condiciones ideales, se libera 1 mol de O2 (32 g) por cada mol de carbono fijado (12 g). 2) La productividad se define como la tasa de producción y generalmente se expresa en gramos de carbono fijado por metro cuadrado por día. Determínese la productividad de una columna vertical de agua de 1 m2 comparando la productividad para profundidad de exposición e integrando gráficamente el área bajo la curva. 3) Utilizando el perfil de radiación solar y el índice de fotosíntesis durante la incubación, ajústense los datos para que representen la productividad del fitoplancton durante el fotoperíodo completo. Dado que los índices fotosintéticos varían ampliamente durante el ciclo diario13, 14, no se debe tratar de conver-

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tir los datos para otras circunstancias analíticas. 3. Productividad, método del carbono 14

Se añade una solución de carbonato radiactivo (14 CO32- ) a botellas con luz y oscuras que se han llenado con la muestra como se describió para el método del oxígeno. Tras la incubación in situ, recójase el plancton sobre un filtro de membrana, trátese con vapores de ácido clorhídrico (HCl) para eliminar el carbono 14 inorgánico y determínese la radioactividad. La cantidad de carbono 14 fijado es proporcional a la fracción de carbono radioactivo asimilada. Este método difiere del de oxígeno en que conduce a una medida directa del consumo de carbono y sólo mide fotosíntesis neta15. Básicamente es más sensible que el método de oxígeno, pero no tiene en cuenta los materiales orgánicos que se lixivian desde las células durante la incubación16, 17. a) Equipo y reactivos: 1) Pirheliómetro. 2) Fotómetro submarino. 3) Botellas BOD y aparato de soporte: Véanse apartados 2a1) y 2) más arriba. 4) Dispositivo para filtración por membrana y filtros de 15 mm, con diámetros de poro de 0,22, 0,30, 0,45 0,80 y 1,2 µm. 5) Equipo de recuento para medir radioactividad: Contador de impulsos con tubo de extremo en ventana, medidor de flujo de gas, o contador de centelleo líquido (véase sección 7010D). El tubo de ventana delgada es el detector menos caro y, cuando se usa con un contador de impulsos pequeño, consigue datos aceptables a un coste moderado. 6) Cámara de vapores: Utilícese un desecador de vidrio con una profundidad de alrededor de 1,4 cm de HCl conc. en

MÉTODOS NORMALIZADOS

la cámara desecante. La cámara de vapores se recomienda para descontaminar los filtros18, 19. 7) Jeringa o pipeta, no metálicas. 8) Reactivos químicos: Véanse secciones 4500-CO2 (Dióxido de carbono) y 2320 (Alcalinidad). 9) Soluciones de carbonato radioactivo: a) Solución de dilución de cloruro sódico, NaCl 5 por 100 (p/v): Añádanse 0,3 g de carbono de sodio (Na2CO3) y una lenteja de hidróxido de sodio (NaOH) por litro. Empléese sólo para estudios marinos. b) Solución de carbonato radiactivo sin portador, existente en el comercio en viales sellados, con 5 µCi 14C/ml aproximadamente. Confírmese la ausencia de metales tóxicos suspendidos y disueltos20 o fíltrese y pásese por una columna intercambiadora de iones*. c) Soluciones de trabajo con actividades de 1, 5 y 25 µCi 14C/2 ml. Para estudios de agua dulce utilícese carbonato radiactivo sin portador, y para estudios de agua marina prepárese diluyendo la solución de carbonato radioactivo sin portador con solución para dilución de NaCl. d) Ampollas de reserva: Prepárense ampollas con 2 ml de la solución de trabajo necesaria. Llénense las ampollas y manténganse en autoclave, selladas, a 121 °C durante 20 minutos 21. b) Método: 1) Obténgase un registro de la radiación solar incidente durante un fotoperíodo con un pirheliómetro. 2) Determínense los intervalos de profundidad para la toma de muestras e incubación como se describió previamente. 3) Empléense botellas duplicadas para luz y oscuridad en cada profundidad. Utilícense también botellas oscuras o re* Chelex 100 o equivalente.

ANÁLISIS BIOLÓGICO DE LAS AGUAS

cogidas a tiempo cero. Llénense las botellas con la muestra. Añádanse 2 ml de solución de carbonato radiactiva (por medio de una pipeta no metálica) al fondo de cada botella y mézclese completamente por inversión repetida. La concentración de carbono 14 debe ser de 10 µCi/l aproximadamente en aguas relativamente productivas, hasta 100 µCi/l o más en aguas oligotróficas (océano abierto). Para obtener significación estadística, la muestra filtrada debe dar al menos 1.000 cpm. Tómense muestras duplicadas a cada profundidad para determinar la concentración inicial de carbono inorgánico (CO2, HCO3- y CO32- ) disponible para fotosíntesis (véase sección 4500-CO2). Para muestras marinas y estuarinas, calcúlense las concentraciones de carbono inorgánico total con un procedimiento de titulación simple22 y realícense medidas iniciales de temperatura, salinidad y pH. 4) Incúbense las muestras hasta 4 horas. Si se precisan mediciones del fotoperíodo completo, superpónganse períodos de 4 horas desde el alba hasta la puesta del sol. Un período de incubación de 4 horas puede bastar, siempre que el aporte de energía se use como base para integrar el período de incubación al fotoperíodo completo. Véanse los detalles del método de incubación en el apartado 2b6) más arriba. 5) Después de la incubación, sáquense las botellas y pónganse inmediatamente en la oscuridad. Fíltrense las muestras sin conservantes lo antes posible. Evítese la conservación de las muestras para impedir la lisis celular o determinar los productos extracelulares. 6) Fíltrense dos porciones de cada muestra a través de un filtro de membrana con cuidado de que el poro mayor concuerde con la retención cuantitativa del plancton. Aunque suele ser adecuado un poro de 0,45 µm, determínese la eficacia de retención de muestra inmediatamente antes del análisis, con una amplia

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gama de tamaños de poro23, 24. Aplíquense aproximadamente 30 kPa de vacío durante la filtración. Un exceso de vacío puede producir una ruptura celular generalizada y pérdida de radioactividad a través de la membrana25. Utilícese el máximo volumen de muestra compatible con la filtración rápida (1-2 minutos), pero sin obturar los filtros. 7) Expónganse las membranas a vapores de HCl durante 20 minutos. Cuéntense los filtros lo antes posible, aunque es aceptable la conservación prolongada de los filtros en un desecador. 8) Determínese la radioactividad por conteo con un tubo de extremo en ventana, detector de flujo de gas sin ventana o contador de centelleo líquido. 9) Determinar la geometría de conteo de detectores de ventana delgada y detectores de flujo de gas sin ventana26. Utilizando tres ampollas de carbono 14, prepárese una serie de precipitados de carbonato de bario (BaCO3) sobre filtros de membrana de 0,45 µm tarados, como se indica más adelante. Los precipitados contendrán la misma cantidad de carbono 14, pero tendrán diferente espesor, desde 0,5 a 6,0 mg/cm2. Dilúyase cada ampolla a 500 ml con una solución de 1,36 g Na2CO3/l en agua destilada exenta de CO2. Llévense con la pipeta porciones de 0,5 ml en cada uno de siete matraces erlenmeyer que contienen 0, 0,5 1,5, 2,5, 3,5, 4,5 y 5,5 ml, respectivamente, de una solución de 1,36 g de Na2CO3/l de agua destilada exenta de CO2. Añádanse, respectivamente, 0,3, 0,6, 1,2, 1,8, 2,4, 3,0 y 3,6 ml de solución de cloruro de bario (BaCl2) al 1,04 por 100. Déjese precipitar el BaCO3 durante 2 horas, con agitación suave cada media hora. Recójase cada precipitado en un filtro (usando un aparato con área de filtración comparable al de las muestras). Séquense los filtros sin lavar con succión; pónganse 24 horas en un desecador, pésense y cuéntense. El índice de recuento aumenta exponencialmente al disminuir el espesor

10-52

del precipitado. Hágase una extrapolación gráfica (o matemática) a precipitado de espesor cero y multiplíquese el índice de recuento a grosor cero por 1.000 para corregir la dilución de la ampolla. Esto representa la cantidad de actividad añadida a cada botella de muestra usada para determinar la fracción de carbono 14 captado en las botellas con luz y oscuridad. c) Cálculos: 1) Réstese el recuento medio de la botella oscura o muestra a tiempo cero de los recuentos medios de la botella con luz para cada par duplicado. 2) Determínese el total de carbono inorgánico disuelto, disponible para la fotosíntesis (carbonato, bicarbonato y CO2 libre) a partir de la determinación del pH y alcalinidad; mídase directamente el CO2 total según se indica en la sección 4500-CO2 o con los métodos descritos en la literatura27-30. 3) Determínese la cantidad de carbono fijado por medio de la siguiente relación:

4) Intégrese la productividad de la zona eufótica completa y exprésese como gramos de carbono fijado por metro cuadrado y día [véase apartado 2c2) anterior]. 5) Empleando los registros de radiación solar y los índices de fotosíntesis durante la incubación, ajústense los datos para que representen la productividad del fitoplancton para el fotoperíodo completo. Si las muestras se incubaran durante menos tiempo que el fotoperío-

† Corrección del efecto isotópico.

MÉTODOS NORMALIZADOS

do completo, aplíquese un factor de corrección.

4.

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10-53

ANÁLISIS BIOLÓGICO DE LAS AGUAS

13. 14.

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10300

PERIFITON*

10300 A.

Introducción

Definición y significado

Los microorganismos que crecen sobre las piedras, palos, macrofitos acuáticos y otras superficies sumergidas son útiles para evaluar los efectos de los contami* Aprobado por el Standard Methods Committee, 1988.

nantes en los lagos, corrientes de agua y estuarios. Este grupo de organismos, que aquí designamos como perifiton1, 2, incluye a las bacterias zoogleales y filamentosas, y a protozoos, rotíferos y algas fijos, y los microorganismos libres que nadan, se deslizan o habitan entre las formas fijas.

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MÉTODOS NORMALIZADOS

A diferencia del plancton, que no suele responder totalmente a la influencia de la contaminación en los ríos, en distancias considerables corriente abajo, el perifiton presenta respuestas espectaculares inmediatamente debajo de las fuentes de contaminación. Un ejemplo son los lechos de Sphaerotilus y otros «organismos del limo», observados comúnmente en los cursos de agua después de las descargas de residuos orgánicos. Dado que la abundancia y composición del perifiton en un punto determinado depende de la calidad del agua en ese lugar, las observaciones de su condición suelen ser útiles para evaluar el estado de las masas acuáticas. La utilización del perifiton para evaluar la calidad del agua se ve obstaculi-

10300 B. 1.

zada con frecuencia por la falta de sustratos naturales adecuados en el punto de toma de muestras deseado. Además, a menudo es difícil recoger muestras cuantitativas de estas superficies. Para evitar esos problemas, se han utilizado sustratos artificiales que proporcionan un tipo, área y orientación superficial uniformes3. 2.

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Toma de muestras

Selección de la estación

En los ríos, sitúense las estaciones a corta distancia corriente arriba y en uno o más puntos corriente abajo de la supuesta fuente de contaminación o zona que se trata de estudiar. En ríos grandes, tómense muestras en las dos orillas de la corriente. Dado que los efectos de un contaminante dependen de la capacidad asimiladora del curso de agua y de la naturaleza del contaminante, los cambios progresivos de la calidad del agua corriente abajo desde la fuente contaminante pueden deberse totalmente a la dilución y el enfriamiento −como sucede con los nutrientes, residuos industriales tóxicos y contaminación termal− o a la mineralización gradual de productos orgánicos degradables. Un examen superficial de los crecimientos de perifiton en las orillas y el fondo, corriente abajo de un desagüe, puede revelar zonas claras de respuesta biológica a la calidad del agua, que serán útiles para determinar

los lugares apropiados para las estaciones de toma de muestras. Cuando no sea factible un programa intensivo de toma de muestras, un mínimo de dos estaciones, una en la zona de referencia corriente arriba de una fuente contaminante y la otra en la corriente abajo comunitaria, desde la fuente, donde ya se ha producido una mezcla completa con el agua receptora, proporcionarán datos de la comunidad del perifiton. En los lagos, pantanos, aguas lénticas y otras masas de agua estancada, en que las zonas de contaminación pueden tomar una configuración concéntrica, sitúense las estaciones en zonas adyacentes a un desagüe de residuos y en otras no afectadas. 2. Toma de muestras

a) Sustratos naturales: Recójanse muestras cualitativas raspando las piedras, palos, pilotes y otros sustratos su-

ANÁLISIS BIOLÓGICO DE LAS AGUAS

Figura 10300:1. Dispositivo de toma de muestras de perifiton. Gradilla lateral notante fabricada en vinilo transparente y estirofoam, empleada en cursos de agua y lagos. Fuente: PATRICK, R., M. H. HOHN & J. H. WALLACE. 1954. Un nuevo método para determinar el tipo de flora diatomácea. Bull. Philadelphia Acad. Natur. Sci. 259:1.

mergidos. Se han diseñado muchos dispositivos para recoger muestras cuantitativas en superficies irregulares, pero rara vez se tiene éxito. b) Sustratos artificiales: El sustrato artificial más utilizado es el portaobjetos estándar de vidrio de microscopio de 25 x 75 mm, pero también son adecuados otros materiales, como plástico de vinilo transparente. No se debe cambiar el tipo de sustrato durante un estudio porque la colonización varía con él. En corrientes pequeñas, poco profundas, y en las regiones litorales de los lagos, donde la luz llega al fondo, pónganse los portas u otros sustratos en marcos anclados en el fondo. En corrientes grandes, profundas, o masas de agua estancada, en que la turbidez varía ampliamente, colóquense los portas verticales con la cara en ángulo recto frente a la corriente dominante. Es adecuada una gradilla flotante, como la que muestra la figura 10300:1. Expónganse varios portas para cada tipo de análisis, asegurando así la recogida de suficiente material y para determinar la

10-55

variabilidad de los resultados debida a las diferencias normales de colonización en los portas individuales. Además de los efectos de los contaminantes, la duración de la exposición del sustrato, los cambios estacionales de temperatura y otras condiciones ambientales naturales pueden tener un efecto profundo en la composición de la muestra. Ninguna comunidad de un sustrato artificial es completamente representativa de la comunidad natural. colóquense, expónganse y manipúlense los tomamuestras artificiales de sustrato en las condiciones más parecidas posibles, ya sea una toma de muestra repetida en una localización concreta o toma de muestras en diferentes puntos. El tipo y/o construcción del tomamuestras produce cambios en las condiciones físicas circundantes, que, a su vez, afectan al crecimiento del perifiton. No son raras las diferencias del 10 al 25 por 100 entre muestras repetidas. Por ello, para reducir el error de la toma de muestras y aumentar la capacidad de interpretación, se debe reducir la magnitud de todas las posibles variables del test y utilizar una duplicación suficiente. c) Período de exposición: La colonización sobre portas limpios avanza de forma exponencial durante la 1.a o 2.a semana, y luego se hace más lenta. Dado que las exposiciones de menos de 2 semanas pueden dar lugar a tomas muy escasas, y las de más de 2 semanas pueden perder material por arrastre, el tiempo óptimo de toma de muestras en verano suele ser de 2 semanas. Este período de exposición excluye la recogida de talos sexualmente maduros de las algas más grandes, filamentosas, de crecimiento lento, como Cladophora y Stigeoclonium. Para obtener un crecimiento óptimo durante el invierno, utilícese una exposición más prolongada. El período ideal se puede determinar haciendo pruebas previas durante alrededor de 6 semanas.

10-56

Pueden aparecer problemas secundarios asociados a la infestación y alimentación de macroinvertebrados, a menudo en 7-14 días. Para reducir esa influencia confusa, auméntese el área del sustrato de toma de muestras y expóngase durante 7-10 días.

3.

Conservación de muestras

Consérvense las muestras obtenidas, para recuento e identificación, en formalina neutralizada al 5 por 100 o mertiolato (véase sección 10200B.4). Consérvense los portas intactos en botellas de tamaño adecuado o ráspense y pásense a recipientes in situ. Séquense los portas al aire para peso seco y sin cenizas en el campo, y consérvense en frascos de 3,0 x 7,7 cm. colóquense los portas para análisis de clorofila en acetona, en el campo, o reúnanse y congélense con triclorotrifluoro-etano* o CO2 y manténganse en nieve carbónica hasta volver al laboratorio. Manténganse todas las muestras en la oscuridad.

4.

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Análisis de muestras

Recuento de Sedgwick-Rafter

Quítese el perifiton de los portas con una cuchilla de afeitar y varilla de goma. No se incluya el perifiton de los bordes del porta. Dispérsense las raspaduras en 100 ml u otro volumen adecuado de conservante, con agitación enérgica, o utilícese una mezcladora. Pásese una porción de 1 ml a una célula de Sedgwick-Rafter y llágase un recuento por tiras como se describe en la sección 10200F.2a. Si el material en la célula de Sedgwick-Rafter es demasiado denso para un recuento directo, deséchese y sustitúyase por una muestra diluida. Exprésese el recuento como células o filamentos por milímetro cuadrado de área de sustrato, calculado como sigue:

2. Recuento por el método del microscopio invertido

Utilizando un microscopio invertido para recuento del perifiton se consiguen aumentos mayores que los que se pueden obtener con la célula de Sedgwick-Rafter. Prepárense los raspados como en 10300C.1 y pásese una porción medida, tras diluciones en serie, si fuera necesario, a una cámara estandarizada para sedi-

mentación del plancton. Tras un período adecuado de depósito (véase la sección 10200C.1) cuéntense los organismos en la cámara de sedimentación, enumerando todos los que se encuentran dentro de un número de tiras o campos aleatorios conocidos. Calcúlese la densidad de algas por unidad de área de sustrato como sigue:

donde: N = número de organismos contados; At = área total del fondo de la cámara, mm2; Vt = volumen total de suspensión original de muestra, ml; Ac = área contada (tiras o campos), mm2; Vs = volumen de muestra usada en la cámara, ml, y As = área del porta o sustrato, mm2.

Se puede favorecer la separación del perifiton del cieno y detritus por adición de una gota o menos de una solución saturada de yodo a la cámara de recuento justo antes de contar. Esto es especialmente útil cuando los organismos predominantes son Chlorophyta, porque el yodo tiñe de azul las reservas alimenticias de almidón. Se puede añadir yodo incluso a las muestras con conservantes. 3. Recuento proporcional de especies de diatomeas

Las preparaciones permanentes de diatomeas a partir de muestras de perifiton

10-58

difieren de las preparaciones a partir de muestras de plancton, en la necesidad de eliminar la materia orgánica extracelular (como el material gelatinoso). Si no se hace así producirá un depósito carbonáceo, grueso, pardo o negro sobre el cubre de vidrio cuando se incinere la muestra. Antes de montar una muestra, descompónganse las sustancias orgánicas por oxidación con persulfato amónico o con HNO3 o H2O2 al 30 por 100 y K2Cr2O7 (véase sección 10200D.3). Para oxidar con persulfato, pónganse aproximadamente 5 ml de muestra en un vial desechable de 10 ml. Déjese reposar 24 horas, retírese el líquido sobrenadante por aspiración, sustitúyase por solución de (NH4)2S2O8 al 5 por 100 y mézclese bien, sin sobrepasar el volumen total de 8 ml. Caliéntese el vial a unos 90 °C durante 30 minutos. Déjese reposar 24 horas, retírese el sobrenadante líquido y sustitúyase por agua destilada. Después de tres cambios del agua destilada, llévese con una pipeta desechable una gota de la suspensión de diatomeas a un cubre de vidio, evapórese a sequedad y prepárese y cuéntese como se describió para el plancton (sección 10200). Cuéntese un mínimo de 500 frústulas y exprésense los resultados en organismos por milímetro cuadrado. 4. Recuento y preparación de muestras teñidas

La tinción de las muestras de perifiton permite distinguir las algas de los detritus y las diatomeas «vivas» de las «muertas». Esta distinción es especialmente importante, dado que el perifiton actúa a menudo como un cementerio para las diatomeas muertas de origen planctónico y perifitico. En este método se pueden estudiar todas las algas componentes del perifiton en una preparación, sin sacrificar la taxonomía detallada de las diatomeas1. Se obtienen preparaciones

MÉTODOS NORMALIZADOS

permanentes para colecciones de referencia. Mézclense bien las muestras conservadas en solución conservante, utilizando una mezcladora durante unos segundos. Prepárese fuchina acida colorante, disolviendo 1 g de fuchina acida en 100 ml de agua destilada, añadiendo 2 ml de ácido acético glacial y filtrando. Póngase una muestra medida en un tubo de centrífuga con 10 a 15 ml de fuchina acida colorante. Mézclese la muestra y el colorante varias veces durante el período de tinción de 20 minutos; centrifúguese a 1.000 g durante 20 minutos. Decántese el colorante con cuidado de no mover el sedimento, o sifónese el sobranadante. Añádanse 10 a 15 ml de propanol 90 por 100, mézclese, centrifúguese durante 20 minutos y decántese el sobrenadante. Repítase empleando dos lavados de propanol 100 por 100 y uno de xileno. Centrifúguese, decántese el xileno y añádase xileno nuevo. En esta fase, consérvese la muestra en viales bien cerrados o prepárense los portas. Los portas para examen cuantitativo del perifiton requieren una dispersión al azar de una cantidad conocida de suspensión de xileno. Utilícese un microagitador para romper los acúmulos de algas antes de sacar la porción de la muestra de la suspensión de xileno. Cuéntese un número de gotas de muestra suspendida en un anillo fino de medio para preparaciones* sobre un porta. Mézclese la suspensión de xileno y medio con una espátula hasta que el xileno se haya evaporado. Caliéntese el porta suavemente sobre una placa a 45 °C y tápese la muestra con un cubre. Cuéntense los organismos en los portas montados, utilizando la ampliación más adecuada al nivel deseado de identificación taxonómica. Cuéntense tiras o * Hyrax, Custom Research and Development, Inc., 8500 Mt. Vernon Rd., Auburn, California, o equivalente.

10-59

ANÁLISIS BIOLÓGICO DE LAS AGUAS

campos al azar. Calcúlese la densidad de algas por unidad de superficie del sustrato: Organismos/área de toma de muestras = dónde los términos son los definidos en 10300C.2. 5.

Peso seco y sin cenizas

Reúnanse al menos tres portas duplicados para las determinaciones de peso2. Los portas secados al aire sobre el terreno se pueden mantener indefinidamente si se protegen de la abrasión, la humedad y el polvo. Aunque se puede determinar el peso a partir del material usado para determinaciones de clorofila, es preferible utilizar portas destinados exclusivamente al análisis del peso seco y sin cenizas. a) Equipo: 1) Balanza analítica, con sensibilidad de 0,1 mg. 2) Estufa para secado, de dobles paredes, controlada termostáticamente hasta ± 1 °C. 3) Mufla eléctrica, con control automático de temperatura. 4) Crisoles de porcelana y 30 ml de capacidad. 5) Cuchillas de afeitar de filo sencillo 0 varilla de goma. b) Método: 1) Si se van a obtener pesos secos y sin cenizas a partir del material usado para determinación de clorofila, combínese el material en partículas y el extracto de acetona de cada porta, evapórese la acetona en una vitrina o baño de vapor o en una estufa a prueba de explosión, séquese a 105 °C hasta peso constante y elévese a ignición a 500 °C durante 1 hora. Si se van a obtener los pesos a

partir de material secado en el campo, humedézcase de nuevo el material con agua destilada y sepárese de los portas con una cuchilla de afeitar o varilla de goma. Pónganse las raspaduras de cada porta en crisoles separados, lavados, sometidos al fuego y tarados; secar a 105 °C hasta peso constante; enfríese en desecador y pésese; llévese a ignición a 500 °C durante 1 hora. 2) Vuélvanse a humedecer las cenizas con agua destilada y séquense a 105 °C hasta peso constante. Así se reintroduce el agua de hidratación de las arcillas y otros minerales, que no se extrae a 105 °C, pero se pierde en la ignición. Si no se corrigiera, esta pérdida de agua se registraría como materia orgánica volátil3. c) Cálculos: Calcúlese el peso medio a partir de los portas y exprésese como peso seco y sin ceniza por metro cuadrado de superficie expuesta. Si se usan portas de 25 por 75 mm,

6.

Clorofila y feofitina

El contenido en clorofila de las comunidades fijadas es un índice útil de la biomasa del perifiton. Dado que las determinaciones cuantitativas de clorofila requieren la recogida de perifiton a partir de una superficie de área conocida, se deben utilizar sustratos artificiales. Extráiganse los pigmentos con acetona acuosa (véase sección 10200G) y utilícese el espectrofotómetro o fluorómetro para su análisis. Si no fuera posible la extracción inmediata de los pigmentos, las muestras se pueden almacenar congeladas hasta 30 días si se mantienen en la oscuridad3. La facilidad con que se eliminan las clorofilas de las células varía considerablemente en las diferentes algas; para lograr una extracción completa de

10-60

los pigmentos, rómpanse mecánicamente las células con un triturador, mezcladora o desintegrador sónico, o congélense. El método más eficaz y riguroso es la trituración. El índice Autotrófico (IA) es un medio para determinar la naturaleza trófica de la comunidad perifiton (véase la sección 10200G). Se calcula como sigue:

Los valores normales de IA oscilan desde 50 a 200; los valores mayores indican asociaciones heterótrofas o mala calidad del agua. El material orgánico no viable afecta a ese índice. Dependiendo de la comunidad, su localización y el hábito de crecimiento, y el método para obtener la muestra, puede haber grandes cantidades de material orgánico no viviente que hará aumentar el numerador, produciendo valores de IA desproporcionadamente elevados. De todos modos, el IA es un medio útil para describir cambios en las comunidades de perifiton entre puntos de muestreo. a) Equipo y reactivos: Véase la sección

10200G. h) Método: En el campo, pónganse los portas de vidrio del microscopio individuales, usados como sustrato, directamente en 100 ml de una mezcla del 90 por 100 de acetona acuosa y 10 por 100 de solución saturada de MgCO3. Guárdense inmediatamente con nieve carbónica en la oscuridad. (NOTA: El plástico de vinilo es soluble en acetona. Si se utiliza como sustrato, ráspese el perifiton antes de la extracción con disolvente.) Si la extracción no se puede realizar inmediatamente, congélense las muestras en el campo y manténganse así hasta su procesado. Rómpanse las células triturándolas en un homogeneizador y empápense en ace-

MÉTODOS NORMALIZADOS

tona durante 24 horas en la oscuridad a 4 °C aproximadamente. Para determinar la concentración de pigmento, sígase el procedimiento que se da en la sección 10200G. c) Cálculo: Tras determinar la concentración de pigmento en el extracto, calcúlese su cantidad por unidad de superficie de la muestra como sigue:

donde: Ca como se ha definido en la sección 10200G.

7.

Referencias

1. OWEN, B. B., JR. 1977. The effect of increased temperatures on algal communities of artificial stream channels. Ph.D. dissertation, Univ. Alberta, Edmonton. 2. NEWCOMBE, C. L. 1950. A quantitative study of attachment materials in Sodon Lake, Michigan, Ecology 31:204. 3. NELSON, D. J. & D. C. SCOTT. 1962. Role of detritus in the productivity of a rock outcrop community in a piedmont stream. Limnol. Oceanogr. 7:396. 4. GRZENDA, A. R. & M. L. BREHMER. 1960. A quantitative method for the collection and measurement of stream periphyton. Limnol. Oceanogr. 5:190.

8.

Bibliografía

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10-61

ANÁLISIS BIOLÓGICO DE LAS AGUAS

DELBECQUE, E. J. P. 1985. Periphyton on Nymphaeids: An evaluation of methods and separation techniques. Hydrobiologia 124:85. TREES, C. C, M. C. KENNICUTT & J. M. BROOKS.

10300 D.

Productividad

La productividad de las comunidades de perifiton está en función de la calidad del agua, sustrato y ritmos de temperatura e iluminación solar estacionales. Se puede calcular a partir de los cambios temporales en el cultivo estancado (biomasa) o a partir de la tasa de desprendimiento de oxígeno o consumo de carbono1. 1.

1985. Errors associated with the standard fluorometric determination of chlorophylls and phaeopigments. Mar. Chem. 17:1.

Acúmulo de biomasa

a) Peso seco sin cenizas: La tasa de acumulación de materia orgánica sobre sustratos artificiales por fijación, crecimiento y reproducción de los organismos colonizadores, se ha utilizado ampliamente para estimar la productividad de los cursos de agua y pantanos2-3. Para utilizar este método, expónganse varios sustratos duplicados, limpios, durante un período previamente establecido, ráspese el material acumulado en los portas y llévese a cenizas como se describió previamente.

donde: P = productividad neta, mg de peso sin ceniza/m2/d; t = tiempo de exposición, d, y A = área de un porta, m2.

Obténganse estimaciones de los cambios estacionales en cultivo estancado o comunidades establecidas, colocando varios sustratos duplicados en un punto de

toma de muestras y recuperando luego unos pocos a la vez, a intervalos regulares. El intervalo recomendado para recolección oscila de 2 a 4 semanas durante 1 año o más2. La ganancia en peso sin cenizas por unidad de área desde un período de recolección al siguiente es una medida de la producción neta. b) Estimaciones de A TP: La determinación del adenosín trifosfato (ATP) se ha utilizado recientemente para estimar la biomasa microbiana en el agua. Esta técnica es aplicable al perifiton4. Proporciona un instrumento adicional para evaluar la magnitud y tasa de acumulación de biomasa sobre los sustratos en aguas naturales. Actualmente, el procedimiento debe limitarse a comunidades colonizadoras de sustratos artificiales. 1) Equipo y reactivos: Véase la sección 10200H.5a. 2) Procedimiento: Ráspese el perifiton de un sustrato artificial expuesto o, si se usan portas de vidrio estándar, coloquense en soportes de polietileno que contienen tampón Tris calentado previamente (99 °C). Sumérjanse en un baño de agua hirviendo durante 10 minutos para extraer el ATP. Si las muestras no se analizan inmediatamente, congélense a −25 °C; se pueden mantener en un congelador durante varios meses. Complétese el análisis como se indica en la sección 10200H.5b. Los portas expuestos en aguas muy turbias pueden recoger cantidades sustanciales de partículas, incluso arcillas. El ATP es adsorbido por esos materiales con el consiguiente efecto amortiguador. 3) Cálculos: Véase sección 10200H.5c.

10-62

2. Productividad del agua estancada medida por el método del oxígeno

Se puede estudiar la tasa horaria o diaria de desprendimiento de oxígeno y consumo de carbono por el perifiton que crece en agua estancada confinando esta comunidad brevemente en frascos, campanas u otras cámaras. En cambio, el metabolismo de los organismos en el agua corriente depende en gran manera de su velocidad y no se puede determinar con precisión en condiciones estáticas. Las estimaciones de la productividad para aguas corrientes y en reposo presentan problemas diferentes; por ello se dan métodos separados. La productividad y respiración del perifiton epilítico y epipélico en regiones litorales de los lagos y estanques pueden determinarse introduciendo campanas o cámaras de plástico con los extremos abiertos, en sustratos a lo largo de cortes transversales perpendiculares a la orilla5, 6. Las cámaras se dejan en el sitio durante la mitad del fotoperiodo. La concentración de OD en una cámara se determina al comienzo y al final del período de exposición. La productividad bruta es la suma del aumento neto de OD en la cámara transparente y el oxígeno usado en la respiración. Los valores obtenidos se multiplican por dos para determinar la productividad del fotoperiodo completo. Si no se tienen en cuenta los cambios de OD en las cámaras producidos por la fotosíntesis y respiración del plancton, se obtendrán errores graves en la estimación del metabolismo del perifiton. Es esencial que se obtengan esos valores en el momento que se estudia el perifiton, utilizando el método de la botella transparente y oscura (véase sección 10200I). a) Equipo y reactivos: 1) Cámaras transparentes y oscurecidas de vidrio o plástico*, de unos 20 cm * Plexiglás o equivalente.

MÉTODOS NORMALIZADOS

de diámetro y 30 cm de alto, con una puerta lateral central, cerradas con un tapón de botella de suero para extraer muestras pequeñas de agua, para análisis del OD o para introducir una sonda de oxígeno. Acóplense a la cámara unas paletas de agitación pequeñas, de forma de hélice y funcionamiento manual. 2) Sonda para oxígeno disuelto, o equipo y reactivos necesarios para determinaciones de oxígeno disuelto de Winkler: Véase sección 4500-O. b) Método: En cada estación, coloquese una cámara transparente y otra opaca sobre el sustrato, al amanecer o a mediodía, y déjense allí durante la mitad de un fotoperiodo. En medios muy productivos o para definir los cambios de productividad primaria horaria durante el día, empléense períodos de incubación más cortos que medio fotoperiodo. El período mínimo de incubación que proporciona resultados fiables es de 2 horas. Determínese la concentración de OD al comienzo del período de incubación. Incluyase un juego de botellas de luz y oscuridad de Gaarder-Gran para medida de productividad y respiración, con cada juego de cámaras, con lo que se obtendrá una corrección para el metabolismo del fitoplancton. Incúbese durante el mismo tiempo que las cámaras. Véase la sección 10200I. Al final del período de exposición, mézclese cuidadosamente el agua de las cámaras y determínese la concentración de OD. c) Cálculos: Cuando el período de exposición es la mitad del fotoperiodo, calcúlese la productividad primaria bruta de la comunidad perifiton como:

donde: PG = producción bruta, mg O2/m2/d12h; Vc = volumen de la cámara transparente, 1;

10-63

ANÁLISIS BIOLÓGICO DE LAS AGUAS

Cfc y Cic = concentraciones inicial y final, respectivamente, de OD en la cámara transparente, mg/l, corregidas para metabolismo del fitoplancton; Vo = volumen de la cámara opaca, 1; Cio y Cfo = concentraciones inicial y final, respectivamente, de OD en la cámara opaca, mg/l, corregidas para metabolismo del fitoplancton, y A = área del sustrato, m2.

Corríjanse los efectos del metabolismo del fitoplancton en el cambio de oxígeno, en la cámara transparente, con la ecuación siguiente:

donde: Cfc = concentración final de OD en la cámara transparente, mg/l; Cflb = concentración final de OD en la botella de luz, mg/l; Cic = concentración inicial de OD en la cámara transparente, mg/l; Cilb = concentración inicial de OD en la botella de luz, mg/l; Cfo = concentración final de OD en la cámara opaca, mg/l; Cfdb = concentración final de OD en la botella oscura, mg/l; Cio = concentración inicial de OD en la cámara opaca, mg/l, y Cidb = concentración inicial de OD en la botella oscura, mg/l.

Calcúlese la respiración de la comunidad perifiton por:

donde: R = respiración de la comunidad, mg O2/m2/d24h, y t = duración de la exposición, h.

Determínese la comunidad perifiton neta (PN) como la diferencia:

Si el tiempo de incubación es diferente de la mitad del fotoperíodo, modifíquese el cálculo de la producción bruta diaria como sigue:

donde: tp = duración del fotoperíodo diario, h.

Los cálculos de la respiración y producción neta comunitarias para períodos de incubación distintos de la mitad del fotoperíodo no varían.

3. Productividad del agua estancada medida con el método del carbono 14

El sistema es similar al descrito más arriba para el método del oxígeno. Las cámaras transparentes y opacas se colocan sobre el sustrato; el Na2CO3, marcado en el carbono 14, se inyecta con jeringa en la cámara, se mezcla bien y se deja incubar con el perifiton durante medio fotoperíodo. Se titula la concentración de carbono inorgánico disuelto disponible para fotosíntesis. Al final del período de incubación, se separa el perifiton del sustrato y se analiza el carbono 145, 7. a) Equipo y reactivos: 1) Cámara de incubación: Véase sección 10300D.2a. 2) Equipo y reactivos especiales: Véase sección 10200I. 3) Solución de carbonato de sodio marcado con carbono 14, con una actividad específica de 10 µCi/ml aproximadamente. 4) Otro equipo y reactivos: Véase sección 4500-CO2.

10-64

b) Método: Colóquese en cada estación una cámara opaca y transparente sobre el sustrato y añádanse aproximadamente 10 µCi de carbono 14/l de volumen de la cámara. Mézclese bien el agua de las cámaras, con cuidado de no alterar el perifiton. Determínese la concentración de carbono inorgánico disuelto como se describe en la sección 2320. Al final del período de exposición, quítese 1 cm de superficie del perifiton encerrado en la cámara, congélese y guárdese congelado en un desecador de vacío. Inmediatamente antes del análisis, expóngase la muestra a los vapores de HCl durante 10-15 minutos para arrastrar todo el carbono 14 inorgánico retenido en el perifiton. Sométase la muestra (o porción de ella) a combustión por el método de Van Slyke y determínese la radioactividad por uno de los métodos siguientes: a) hágase fluir el CO2 producido por combustión hacia un contador de flujo del gas o electrómetro; b) recójase en una solución de Na2CO3 0,1 N, precipítese como BaCO3 sobre un filtro de membrana y cuéntese con un tubo de extremo en ventana, o c) analícese la solución de Na2CO3 por la técnica de centelleo líquido. c) Cálculos:

MÉTODOS NORMALIZADOS

ecosistema fluvial puede tener relación con los cambios de demanda en OD. Esos cambios son un efecto integrado de la fotosíntesis, afectada por los niveles de luz y la turbidez originada durante el fotoperíodo por el plancton, perifiton y porciones sumergidas de macrofitos en la corriente. La respiración resulta del metabolismo de comunidades vegetales, animales acuáticos y heterótrofos microbianos fijos o flotantes libremente. La profundidad del agua, turbulencia y temperatura del agua influyen en el proceso de reaireación. También el oxígeno puede entrar por acúmulo de agua subterránea y cambios superficiales. Las fluctuaciones diarias en la producción fotosintética de oxígeno se imponen sobre la demanda relativamente constante de actividad respiratoria. Sin embargo, este último proceso puede fluctuar mucho en las corrientes que reciben una carga importante de residuos orgánicos, especialmente bajo cargas intermitentes, como el requerimiento de oxígeno debido al desagüe de aguas urbanas. Los índices respiratorios también pueden variar durante el día en determinadas condiciones, pero no se entienden bien los factores implicados. La tasa de cambio del OD en una corriente (q), en gramos por metro cúbico por hora, se representa por la función siguiente del índice fotosintético (p), de respiración (r), reaireación (d) y acúmulo procedente de la afluencia de agua subterránea y descarga de agua superficial (a)8:

donde: PN = productividad neta para el período de exposición, y 1,064 = corrección para el efecto isótopo.

4. Productividad del agua corriente medida por el método de oxígeno

La productividad primaria de la comunidad perifiton en una corriente o

Si la ecuación se multiplica por la profundidad en metros (z), los valores resultantes se obtienen en gramos de oxígeno por metro cuadrado por hora. La figura 10300:2 ilustra esta relación conceptual entre q, productividad primaria y respiración de la comunidad vegetal en la corriente.

ANÁLISIS BIOLÓGICO DE LAS AGUAS

Figura 10300:2. Procesos en el metabolismo de oxígeno de una sección de un flujo de agua hipotético durante el transcurso de un día sin nubes. Producción (P), respiración (R) y difusión (D) se dan como áreas. El efecto combinado de estos procesos para un curso de agua de 1 m de profundidad se da en mg/l/h (q). Los valores reales de oxígeno que resultarían en una corriente con una comunidad homogénea y larga, se dan en la curva más inferior. Fuente: ODUM, H. T. 1956. Producción primaria en corrientes de agua. Limnol. Oceanogr. 1:102.

El método mide las concentraciones de oxígeno variables en el tiempo, en una corriente, durante un período de 24 horas. Se compensan los cambios de oxigeno debidos a la actividad biológica que se separa en componentes pro-

10-65

ducidos en la respiración y producción primaria. Los índices metabólicos son la suma de la actividad de toda la comunidad de la corriente. La productividad planctónica y la respiración se pueden separar fácilmente de la actividad comunitaria media utilizando la técnica del oxígeno con botella de luz y oscura (véase sección 10200I). Sin embargo, en la mayoría de las corrientes pequeñas, la producción planctónica es insignificante. El componente de producción y respiración debido a los macrofitos es muy difícil de separar de la actividad metabólica perifitica en sistemas en que son frecuentes las plantas vasculares. Dado que el perifiton se fija a las superficies vegetales y a sustratos sin vida, se precisan técnicas de radiomarcado para separar el componente de producción debida a macrofitos del que se debe a algas fijas9. Cuando estén presentes algas vasculares, utilícese la técnica descrita en la sección 10400 para estimar su contribución a la productividad neta primaria. Es difícil también el cuantificar directamente la respiración de los peces y fauna béntica, y normalmente no se separa de la respiración perifitica. Si se precisa un metabolismo animal compartimentado, calcúlese esta contribución a partir de los índices respiratorios de laboratorio, extrapolados a la situación de campo, sobre la base de los tamaños de la población animal10, 11. Estímese la productividad primaria en agua corriente por el método de la demanda del agua libre, o por el de la cámara de Thomas-O'Connell12. El primero no introduce artificios en el sistema, pero es difícil separar los componentes de la actividad metabólica, exceptuando la contribución debida al plancton. El método de la cámara mide solamente actividad perifitica13-16. Dependiendo de las características hidrológicas del sistema de corriente, el acúmulo y la reaireación pueden ser sig-

10-66

nificativos. El acúmulo se puede determinar por simples ecuaciones de mezcla, si se conocen el flujo acumulado y su concentración de oxígeno. En la práctica, selecciónense cuencas para estudio en que no se produzca un acúmulo importante. Mídanse las tasas de reaireación directamente13-16 o calculando las características físicas e hidrodinámicas de la propia corriente15, 16. a) Equipo: 1) Frascos ROB, para medidas de botella con luz y oscura. Véase la sección 10200I. 2) Medidor y sonda de OD para medida del OD. 3) Cámara de fondo, 60 x 20 x 10 cm, con pantalla longitudinal divisora de 32 cm, bomba sumergible controlada por reostato, termistor de temperatura y sonda de OD12. Utilícense mangas de plástico transparente y opaco para tapar la cámara y placas Petri u otro sistema para colocar el perifiton dentro de las cámaras. 4) Medidor de corriente, capaz de detectar velocidades de la corriente de agua desde 0,03 a 3 m/segundo en profundidades de agua tan pequeñas como 0,3 m. 5) Cinta de medida (30 m) y mira para profundidad o equipo similar, necesario para medir secciones cruzadas en la corriente. 6) Fluorómetro, capaz de detectar concentraciones de colorantes fluorescentes de 0,5 a 100 µg/l (se necesita sólo para medición directa de la reaireación). 7) Contador de centelleo líquido, capaz de detección sensible de Kr85 y H3 (sólo se necesita si se mide directamente la reaireación). b) Método: 1) Método de la cámara de luz y oscura: Cultívense las muestras de comunidades perifiticas típicas sobre sustrato artificial o recójase el material natural. Pásense porciones idénticas a cámaras

MÉTODOS NORMALIZADOS

transparentes y opacas, con cuidado de utilizar suficiente perifiton para que la proporción del volumen de la cámara al área de perifiton sea equivalente a la relación entre volumen de la corriente y área del sustrato de perifiton. Mídase la corriente en el curso de agua y adécuese la velocidad de circulación en los dos tipos de cámara a la de la corriente. Mídanse las concentraciones iniciales de OD en las dos cámaras, y luego al cabo de 1 a 3 horas, para calcular la tasa de aumento o disminución del oxígeno. Efectúense medidas paralelas de la actividad del fitoplancton usando las técnicas de la botella de luz y oscuridad descritas en la sección 102001.2. Incúbense los dos tipos de botellas durante el mismo intervalo de tiempo que las cámaras. Efectúense varias determinaciones durante el fotoperíodo para definir la productividad primaria diaria. Recójanse, además, muestras suficientes del sustrato natural de la cuenca estudiada para estimar la biomasa perifitica (véase la sección 10300B). Al final del período de incubación, recoléctese el perifiton encerrado y determínese la biomasa sin cenizas (véase sección 10300B). 2) Métodos de la curva diurna de agua libre: Mídase, cada hora o de forma continua, la concentración de OD y temperatura del agua durante un período de 24 horas, en una o dos estaciones, dependiendo de las condiciones de la corriente, la precisión deseada y el equipo disponible. Si se dan condiciones similares entre la cuenca estudiada y un tramo considerable corriente arriba, son suficientes las medidas diurnas de OD en una sola estación para determinar la productividad. Donde las condiciones corriente arriba sean significativamente distintas de las de la cuenca en estudio, las mediciones se realizarán en los límites de la cuenca corriente arriba y abajo. Si se utiliza el método de la estación única, mídase la profundidad en varios puntos a lo largo de la cuenca estudiada,

10-67

ANÁLISIS BIOLÓGICO DE LAS AGUAS

para definir la profundidad media. Hágase un mapa y/o inspecciones físicas para calcular la magnitud de posibles vías de acumulaciones por afluentes o corrientes tributarias y fuentes. Si se emplea el método de las dos estaciones, mídase la zona húmeda transversal de la corriente, asi como su velocidad en varios puntos, para definir el flujo (en metros cúbicos por segundo) y el área transversal media. Corríjase la actividad del fitoplancton por medio de las medidas con la botella de luz y oscura (véase sección 10200I.2). 3) Medida directa de la reaireación14: En condiciones especiales puede ser deseable estimar directamente la reaireación, aunque los resultados pueden no ser más exactos que los obtenidos con las fórmulas empíricas utilizadas normalmente. La técnica del gas marcador es satisfactoria, pero es difícil y precisa un equipo sofisticado, no disponible de forma rutinaria. Utilícese este método con cuidado y reconociendo sus limitaciones. Dependiendo del flujo de la corriente, libérese de 10 a 250 µCi de Kr85 con 5 a 125 µCi de H3 en el extremo corriente arriba de la cuenca, junto con suficiente colorante fluorescente para producir una concentración de 10 µg/l, cuando se mezcle completamente a través de la sección transversal del río. Realícense las medidas fluorométricas en el extremo corriente abajo de la cuenca hasta que aparezca el pico de colorante, y recójanse entonces muestras del agua para medir la relación Kr85/H3 por centelleo líquido. Regístrese el tiempo de viaje para el pico de colorante a partir del punto de inyección. c) Cálculos:

1) Método de la cámara: El cálculo es análogo al utilizado para la técnica de la campana, expuesta en la sección 10300D.2.

donde: Pn = tasa horaria de producción primaria neta, mg O2/m2/h; Vc = volumen de la cámara transparente, 1; B = biomasa de perifiton media estimada para la cuenca estudiada, mg/m2; t = período de incubación, h; Wc = biomasa total del perifiton contenido en la cámara transparente, mg; Cfc = concentración final del oxígeno en la cámara transparente, corregida para el metabolismo del fitoplancton, mg/l: C fe = Cfc − Cflb

Cfc = OD final en la cámara transparente, y Cflb = OD final en la botella de luz, y Cic = Concentración inicial de oxígeno en la cámara transparente, para la medida en la botella de luz, mg/l: Cic = Cic − Cilb Cic = OD inicial en la cámara transparente, y Colb = OD inicial en la botella de luz.

donde: r = tasa respiratoria horaria del perifiton, mg O2/m2/h; Vo = volumen de la cámara opaca, 1; B = biomasa media del perifiton para la cuenca estudiada, mg/m2; Wo = biomasa total de perifiton contenido en la cámara opaca, mg; Cio = concentración inicial del oxígeno en la cámara opaca, corregida para la respiración del fitoplancton, mg/l: Cio = Cio − Cidb

Cio = OD inicial en la cámara opaca, mg/l, Cidb = OD inicial en la botella oscura, mg/l, y Cfo = concentración final de oxígeno en la cámara opaca, mg/l: Cfo = Cfo − Cfdb Cfo = OD final en la cámara opaca, mg/l, y Cfdb = OD final en la botella oscura, mg/l.

MÉTODOS NORMALIZADOS

10-68

Para cada par de mediciones en la cámara. Pg = P, + r

donde: Pg = producción primaria perifitica bruta, por hora, mg O2/m2/h.

PG es el área bajo la curva de la producción primaria por hora durante el fotoperíodo, mg O2/m2/d (véase figura 10300:3). También,

(CKr/CH)u = proporción de radiactividades emitidas (µCi/ml) Kr85 a H3 en la estación corriente arriba, y (CKr/CH)4 = proporción de radiactividades (µCi/ml) Kr85 a H3 en la estación corriente abajo.

El coeficiente de reaireación se puede calcular también a partir de una ecuación que relaciona la tasa de disipación de energía en una corriente con k214, l5.

donde: donde: R = respiración total de la comunidad perifiton, mg O2/m2/d, y n = número de observaciones.

Así:

K = coeficiente de escape; Δh = cambio en la elevación de la superficie acuática en una cuenca, y t = tiempo de flujo a través de una cuenca.

Esto se puede expresar en términos de datos hidrodinámicos y físicos:

PN = PG − R

donde:

donde:

PN = producción O2/m2/d.

perifitica

neta,

mg

2) Métodos para agua libre. a) Cálculo de reaireación o difusión para los dos métodos, simple y de corriente arriba y abajo. Calcúlese k2 a partir de los datos del marcador radiactivo, como sigue:

K= 28,3 x 103 s/m · d para flujos de corriente entre 0,028 y 0,28 m3/segundo; 21,3 x 103 s/m · d para flujos de corriente entre 0,28 y 0,56 m3/segundo, y 15,3 x 103 s/m · d para flujos de corriente por encima de 0,56 m3/segundo;

K 220

=

coeficiente

de

reaireación

d-1, a

20 °C; ΔH = pendiente, m/km, y ΔX

V = velocidad, m/segundo

y

Conviértase K 220

a la temperatura de la

corriente por medio de la ecuación: K 2T = K 220 (1,024)(T - 20 )

donde: k2 = coeficiente de reaireación (base e), d-1; KKr = coeficiente de transferencia base e para Kr85, d-1; t = tiempo de viaje, d;

donde: K 2T

= k2 a temperatura ambiente del agua,

d-1, y T = temperatura ambiente del agua, °C.

ANÁLISIS BIOLÓGICO DE LAS AGUAS

10-69

Figura 10300:3. Producción perifitica primaria bruta (PG) determinada con la cámara de O'ConnellThomas. PG es el área bajo la curva obtenida por planimetría de integración gráfica. Cada punto es la operación Pg = Pn + r para los periodos de incubación 1, 2 y 3 que denotan las líneas indicadas.

Conviértase a D en mg/l/h:

do, miligramos por litro por hora, para cada período:

donde: Cs = concentración de oxígeno a saturación, a las temperaturas ambiente de la corriente, mg/l.

b) Método de la estación única: El cálculo de la productividad primaria y la respiración a partir de las medidas del oxígeno y temperatura diurna en una única estación, se resume en la figura 10300:4 y en la tabla 10300:I. Tabúlense por horas las medidas de OD y temperatura. Determínese Cs (DO de H2O saturada con aire a cada temperatura, a partir de la tabla 4500-0:I) y calcúlese el consumo de OD no corregi-

Compárese cada media hora, como muestra la figura 10300:4b. Calcúlese la producción primaria neta y la respiración del fitoplancton como se indica en la sección 10200I. Determínese la respiración media horaria del plancton en 24 horas,

en miligramos

por litro por hora, cada media hora. Calcúlese la producción neta horaria del fitoplancton y tabúlese para horas aproximadas durante el fotoperíodo. Compárese los datos como muestra la figura 10300:4c.

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MÉTODOS NORMALIZADOS

día. Multiplíquese por la profundidad media de la cuenca, z metros, para obtener PG en gramos por metro cuadrado por día. Calcúlese la respiración comunitaria: R = 24 z F

donde: R = respiración comunitaria, g/m2/d; z = profundidad, m, y F =ΔOD promedio por hora, para el período de oscuridad (sin tener en cuenta el signo), mg/1/h.

Calcúlese la productividad primaria neta PN de la manera siguiente: PN = PG – R

Figura 10300:4. Cálculo de la producción primaria bruta en una estación única.

Pg, g O2/m2/h = área de tasa corregida de la curva de cambio integrada para la duración del fotoperíodo multiplicada por la profundidad media del agua, z, para el tramo en metros.

Calcúlese y tabúlese k2 y sustitúyase D para cada Cs, como se describe en el apartado a anterior. Compárense los datos como muestra la figura 10300:4c. Corríjase cada ΔOD para difusión y metabolismo del fitoplancton. T

Márquese gráficamente cada punto como muestra la figura 10300:4d. La productividad primaria bruta de las poblaciones béntica y fija se computan como el área bajo la curva en la figura 10300:4d desde el amanecer a la puesta del sol. Ésta es la producción primaria en gramos por metro cúbico por

Figura 10300:5. Cálculo de la productividad perifítica primaria bruta a partir de las curvas diurnas de flujo ascendente-descendente. P es el área bajo la tasa corregida de la gráfica de cambio.

10-71

ANÁLISIS BIOLÓGICO DE LAS AGUAS

TABLA 10300:I.

LIBRO DE CÁLCULO DE MUESTRA PARA CÓMPUTO DE LA TASA CORREGIDA DEL CAMBIO DE OXÍGENO A PARTIR DE LA CURVA DIURNA DE UNA ÚNICA ESTACIÓN

c) Método corriente arriba-abajo: El cálculo de la productividad primaria y respiración para un tramo de corriente, a partir de pares de curvas diurnas de oxigeno y temperatura del agua, se resume en la figura 10300:5 y en la tabla 10300:II. Alternativamente, calcúlese como se indica más adelante, expresando el cambio de oxígeno como la diferencia entre estaciones, en lugar del cambio por hora. Los cálculos son análogos. Multiplíquese el área bajo la curva del cambio de oxígeno entre dos estaciones, corregido para la difusión y metabolismo del plancton, y expresada en miligramos por litro, por la descarga en metros cúbicos por hora, y divídase por el área de la superficie acuática entre las dos estaciones. Multiplicando esto por 24 se obtiene la productivi-

dad primaria bruta en gramos por metro cuadrado por día. Para calcular la productividad primaria bruta por este método, tabúlese el OD corriente ascendente y corriente descendente, y la temperatura media del agua para la cuenca, a cada hora. Calcúlese ΔOD entre las estaciones corriente arriba y abajo para cada hora como: ΔOD = = ODcorriente descendente –

ODcorriente ascendente

Tabúlese Cs y determínese la actividad planctónica. Corríjase para la respiración planctónica, relacionando el cambio horario promedio del oxígeno disuelto en la botella oscura con el tiempo de viaje en el tramo de corriente; corríjase la producción planctónica por el cambio hora-

10-72

MÉTODOS NORMALIZADOS

TABLA 10300:II. LIBRO DE CÁLCULO DE MUESTRA PARA CÓMPUTO DE LA TASA CORREGIDA DEL CAMBIO DE OXÍGENO A PARTIR DE LAS CURVAS DIURNAS DE FLUJO ASCENDENTE-DESCENDENTE DE LA CONCENTRACIÓN DE OXÍGENO Y TEMPERATURA

rio de OD en la botella con luz multiplicado por el tiempo de viaje (véase tabla 10300:II). Calcúlese o tabúlese k2 y conviértase en la difusión total de oxígeno para la cuenca. Dado que la difusión, D, se expresa en miligramos por litro por hora, multiplíquese por el tiempo de viaje para obtener la corrección de difusión. Corríjase cada ΔOD horario, corriente arriba y abajo, como muestra la tabla 10300:II. Intégrese el área bajo la curva de este ΔOD desde el amanecer al ocaso para obtener P como en la figura 10300:5d.

donde: Q = flujo, m3/h, y A = área de la cuenca, m2 (anchura media de la cuenca x su longitud)

Respiración. R, g O2/m2/d =

y Producción neta, PN = Po – R

5.

Referencias

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ANÁLISIS BIOLÓGICO DE LAS AGUAS

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10-74

10300 E.

MÉTODOS NORMALIZADOS

Interpretación y comunicación de los resultados

Aunque se han desarrollado varios sistemas para organizar e interpretar los datos del perifiton, no hay ningún método aceptado universalmente. Los métodos pueden ser cualitativos o cuantitativos. Los primeros tratan de la composición taxonómica de las comunidades en las zonas contaminadas, mientras los cuantitativos se ocupan de la estructura de la comunidad y utilizan índices de diversidad, índices de similitud e índices numéricos de saprobidad. 1.

Métodos cualitativos (especies y comunidades indicadoras)

El sistema de saprobidad desarrollado por Kolkowitz y Marsson se usa ampliamente para interpretar los datos del perifiton. Este esquema divide los cursos de agua contaminados en polisapróbicos, mesapróbicos α y β y zonas oligosapróbicas, enumerando las características de cada uno. El sistema ha sido refinado y ampliado1, 2 por Fjerdingstad 3, 4 y Sladecek5, 6. 2.

Métodos cuantitativos

Estos métodos utilizan recuentos celulares por unidad de superficie del sustrato e índices numéricos de contaminación o calidad del agua. Existen abundantes datos acerca de las densidades celulares y la composición de especies del perifiton recogido sobre portaobjetos de vidrio en los ríos contaminados de Inglaterra7. Otros índices incluyen al de ShannonWeaver8, Simpson9 y Pinkham-Pearson10. El sistema de saprobidad11 se puede emplear también donde se usen números de código asignados para el valor saprobial, y se utiliza la abundancia de especies individuales para calcular el índice Saprobial Medio. Los resultados

pueden expresarse igualmente por la distribución normal en long-truncado de las especies de diatomeas12, 13, así como por el índice Autótrofo (IA)14. 3.

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Discusión general

El macrofiton consta principalmente de plantas vasculares acuáticas con flores, pero incluye también musgos acuáticos, hepáticas, helechos y las algas marinas grandes. Como otros componentes primarios, estas plantas responden a la calidad del agua en que crecen, por lo que su análisis es importante al determinar esa calidad. A menudo constituyen un factor dominante en el hábitat de otros organismos acuáticos. Las formas del agua dulce varían en tamaño desde la diminuta lenteja de agua (Wolffia ssp.), aproximadamente como una cabeza de alfiler, a las plantas como la espadaña (Typha ssp.), de hasta 4 m de altura, y finalmente a los cipreses de agua (Taxodium ssp.), que alcanzan los 50 m. Las plantas acuáticas más grandes suelen agruparse en gran número, muchas en bosques puros, cubriendo amplias áreas de lagos poco profundos, pantanos, embalses y canales. A veces se incluyen en el macrofiton algunas de las algas de agua dulce mayores (Chara ssp., Nitella ssp. y Cladophora ssp.), que recuerdan a las plantas superiores por su tamaño, forma y constitución. En el agua * Aprobado por el Standard Methods Committee, 1988.

Introducción marina son visibles los vegetales rupestres entre mareas (Fucus ssp. y Ascophyllum ssp.) y las algas fuera de la orilla (Fucus ssp. y Macrocystis ssp.). Las plantas vasculares marinas estuarinas, como la hierba «anguila» (Zostera ssp.) y la hierba de los pantanos (Spartina ssp.) son esenciales para el ecosistema acuático. Generalmente, se reconocen tres formas de macrofiton: flotante, sumergido y emergido. Las plantas flotantes no están enraizadas; su principal follaje o corona flota sobre la superficie del agua. Todo, o la mayor parte del follaje de las plantas sumergidas, crece bajo la superficie del agua y las plantas pueden tener raíces o no. Sus vástagos de crecimiento pueden emerger para florecer. Las plantas emergidas pueden subdividirse en plantas con hojas erectas y plantas con hojas flotadoras. Su follaje principal está en el aire, en o por encima de la superficie acuática; no se fijan por medio de raíces al fondo de barro. Las emergentes con hojas flotantes carecen del tejido de soporte que se encuentra en las emergidas de hojas erectas. En algunos casos, la misma especie puede crecer como flotante o emergida, o como sumergida y emergida. Es típico de las plantas sumergidas y emergidas el estar enraizadas en el fondo, pero se pueden encontrar sueltas y flotando.

10-77

ANÁLISIS BIOLÓGICO DE LAS AGUAS

La distribución y abundancia de las plantas superiores sufren una considerable variación espacial y temporal. Entre los muchos factores que determinan su presencia y densidad se encuentran el tipo de sedimento, la turbidez del agua, concentraciones de nutrientes, profundidad del agua, alteraciones en las orillas, los pastos de los herbívoros y las actividades humanas. Es frecuente la división en zonas en las orillas de los lagos y cursos de agua poco profundos con corriente lenta. Los macrofitos emergentes suelen encontrarse en la parte menos profunda de la zona litoral. Durante los períodos con nivel de agua bajo pueden ocupar el hábitat terrestre y el acuático. La profundidad de habitación rara vez excede 1 m. Las plantas de hojas flotantes suelen encontrarse en las zonas litorales más bajas, a profundidades entre 1 y 3 m. Las sumergidas pueden aparecer desde el borde de la orilla hasta la interfase de las zonas profundas litorales, pero rara vez se extienden más abajo de los 10 m de profundidad, debido a la limitación de la luz subacuática. 2.

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Estudio preliminar

Consideraciones generales

Un estudio macrofítico incluye la identificación de especies, su localización y cantidad. Los estudios más detallados pueden tratar de las funciones de las plantas acuáticas en el consumo y producción de nutrientes y metales pesados, su uso como organismos indicadores y los efectos de las plantas sobre las condiciones de la calidad del agua.

Se necesitan varios protocolos de toma de muestras para cubrir las diversas necesidades de estudio. Inicialmente, se determina y establece la utilidad de un estudio concreto y los tipos adecuados de análisis estadísticos. Para desarrollar un buen diseño de muestras, determínese la información que se desea, las condiciones ambientales dominantes, la vida y forma de crecimiento de las especies a recoger y los

10-78

métodos para obtener datos reproducibles, comparables con otros, y futuros estudios. Al definir los requerimientos de los informes, considérense algunos como el uso de nombres científicos; la selección de los descriptores adecuados, como la frecuencia, densidad, biomasa, cobertura, diversidad, productividad y límite exterior del crecimiento de la vegetación, así como el uso de técnicas estadísticas adecuadas. 2.

Investigaciones de pre-campo

Durante las investigaciones previas a las de campo, reúnanse mapas, planos, fotografías aéreas, claves taxonómicas e informes pasados. Los mapas, planos y fotografías aéreas pueden servir para determinar las vías de acceso, el tamaño del proyecto, la distribución de la comunidad vegetal, las características del hábitat que pueden influir en la distribución vegetal y los obstáculos o peligros de la toma de muestras. Estos medios sirven también de base para el trabajo de campo y la comunicación de los resultados. Se pueden conseguir localmente en los departamentos municipales de obras públicas, los consejos de zona, las comisiones de planeamiento y las comisiones de conservación de la tierra y cuencas hidrográficas. A nivel estatal, la información se puede obtener en las instituciones de recursos naturales, organizaciones para el estudio de la historia natural y los departamentos de transportes. A nivel federal, el Geological Survey, Servicio de Conservación del Suelo, Oficina para Gestión del Suelo, Servicio Forestal, Servicio de Parques, Servicio de Pesca y Vida Animal, Autoridad del Valle de Tennessee, Oficina de Asuntos Indios, Cuerpo de Ingenieros del Ejército, Agencia de Protección Ambiental y la Administración Nacional Oceanógrafica y Atmosférica pueden proporcionar muchos mapas, planos y fotografías aéreas. Un re-

MÉTODOS NORMALIZADOS

curso final son las compañías privadas de mapas, que publican mapas hidrográficos para pescadores y navegación de recreo. Los informes pasados proporcionan datos históricos útiles para planificar la logística de la toma de muestras e interpretar los resultados. Los estudios comparables realizados en distintos momentos ofrecen una visión dinámica de la vegetación. Un recurso que suele olvidarse son los herbarios de plantas prensadas y montadas. Generalmente se encuentran en las universidades y museos de historia natural.

3.

Reconocimiento de campo

La eficacia de la toma de muestras se mejora y su esquema se puede afinar durante el reconocimiento de campo. Proporciona una oportunidad de conocer las especies de plantas presentes y hacer un esbozo de su distribución. La técnica de la curva especies-área se utiliza frecuentemente para determinar la probabilidad de encontrar más especies durante un estudio preliminar. Un reconocimiento de campo permite al investigador el responder a cuestiones logísticas que son la ruina de todos los esfuerzos de la toma de muestras.

4.

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Véase también la sección 10400A.2.

ANÁLISIS BIOLÓGICO DE LAS AGUAS

10400 C.

Métodos de trazado de mapas de distribución vegetal

Puede ser necesario el obtener representaciones de los mapas de distribución vegetal, que se deben realizar durante el estudio preliminar1. 1.

10-79

Método basal

Los mapas de vegetación construidos utilizando el método de la línea basal o el del punto basal con alidada de mira taquimétrica, se limitan generalmente a representaciones puras de macrofiton litoral flotante o emergido en pequeños cursos de agua. En las aguas transparentes, el trazado de bosques puros o vegetación sumergida se puede determinar por medio de una caja de inspección (normalmente una caja de madera con una lente de vidrio, hermética) desde la superficie o por observación debajo del agua por un submarinista que utilice un tubo SCUBA (dispositivo autónomo de respiración). El método de la línea basal y el del punto base con alidada de mira taquimétrica consiguen mapas precisos de vegetación en zonas de hasta 1 x 105 m2, donde la mayoría del perfil es visible. El método de la línea basal usa líneas que se cortan procedentes de los dos extremos de una línea basal predeterminada hasta unos marcadores espaciados (por ejemplo, clavijas de encadenado) alrededor del bosque. Prefijando la escala del mapa, se puede determinar la relación entre la longitud de la línea basal y su reducción en el mapa (dibujado en una mesa plana). El método del punto basal con alidada de mira taquimétrica es una modificación del de la línea basal en cuanto que la distancia entre el perfil vegetativo y el punto basal se determina con una alidada, un telémetro o una unidad portátil Loran-C. Una unidad en la mira taquimétrica, tal como se ve entre las líneas cruzadas de la alidada, es

equivalente a una distancia de 3,05 m entre la mira taquimétrica y la alidada. Con este método no se necesitan clavijas de encadenado. En la práctica, se toman más lecturas espaciadas estrechamente a lo largo del perfil de vegetación, con el método del punto basal con alidada de mira taquimétrica. No es necesario medir todas las distancias y ángulos; algunos se pueden determinar trigonométricamente. Tras calcular todos los ángulos y distancias, rellénese las irregularidades por medio de la inspección y el uso de otros mapas y fotografías. 2. Método de las líneas de intersección

Este método es preferible para los mapas que mezclan bosques y/o áreas grandes. Selecciónense los puntos para toma de muestras a intervalos iguales, a lo largo de una línea basal. Elíjase la longitud de los intervalos por el grado de precisión deseado: cuanto más próximos sean los puntos de toma de muestras, más exacto será el mapa. Trácense intersecciones perpendiculares desde la línea basal al límite del bosque de plantas. Utilícese una línea de intersección (línea de corte) de cable recubierto de plástico para evitar estiramientos. Si la línea de flotación es un problema, utilícense pesos de plomo aplicados a intervalos regulares para que hundan la línea y actúen como marcadores de intervalos sobre el cable, para designar unidades de toma de muestras. Utilícense segmentos de 0,5 m (en vegetaciones densas) o unidades de toma de muestras de 5 m (en la vegetación escasa), para determinar las especies vegetales que interceptan verticalmente la línea en cada segmento. En vegetaciones pobres, póngase un anillo de latón o

10-80

tubería de PVC, 0,25 m2, sobre la línea de intersección encima del punto de toma de muestras y regístrense las especies vegetales dentro del anillo. Durante los estudios debajo del agua, anótense los datos con un lápiz de cera o de plomo blando sobre un tablero para escribir fabricado con recubrimiento de plástico. Confecciónese el mapa de vegetación colocando puntos donde se encuentren las especies vegetales dentro de un mapa del contorno (o fotografía aérea) de la zona en que se han tomado las muestras. Tras rodear con círculos los puntos del mapa por especies simples, determínese el área englobada por planimetría. Determínese la frecuencia relativa en los puntos de toma de muestras a lo largo de la línea de intersección con un equipo tomamuestra, que consiste en un tubo de acero de 2 cm y 2 m de largo, al que se unen cinco varillas de acero de 0,75 cm por 25 cm, sobre centros de 40 cm. Regístrese la vegetación que toca cada uno de los cinco puntos dentro de 2,54 cm de la punta distal. Si toca más de una especie vegetal, regístrese la planta más próxima a la punta. Si no tocara ninguna, regístrese como terreno vacío. Utilícense los datos de campo para deducir la frecuencia de las especies vegetales en los puntos de toma de muestras, así como por la elevación del contorno y el segmento de la línea de intersección. Determínese el porcentaje de cobertura de la vegetación por planimetría a partir de los mapas de distribución de la misma; los planímetros más exactos son los polares de compensación digital. 3.

Detección remota

a) Consideraciones generales: Las técnicas de control remoto se han utilizado para detectar, evaluar y controlar los macrofitos acuáticos. Entre estas técnicas se incluye la fotografía serial análoga de aviones y satélites; el barrido multiespec-

MÉTODOS NORMALIZADOS

tral digital por aviones o satélites, en las bandas visible, infrarroja y térmica; las técnicas de microondas, principalmente el radar aéreo de visión lateral (SLAR), y radar de imagen por transbordador (SIR). Proporcionan una visión sinóptica de zonas grandes, permitiendo estudios rápidos para delinear luego las áreas de interés y capacidad para repetir la visita, con un coste relativamente bajo. Al seleccionar el(los) sistema(s) de sensibilidad remota, hay que tener en cuenta los resultados esperados, el tiempo para completar el proyecto y los recursos disponibles. Cuanto mayor sea la zona, mayor será la ventaja de detección remota, que además se presta a estudios en el tiempo, ya que cada imagen es un dato histórico. Para determinar asociaciones generales de cultivos macrofíticos extensos, las empresas de imágenes por satélite recomiendan resoluciones del terreno entre 30 y 80 m. Se puede obtener una cobertura multitemporal amplia a escalas que van de 1:100.000 hasta 1:1.000.000 con un coste razonable, en forma de copias en papel, transparencias y formatos digitales. Para identificar zonas con vegetación acuática emergente o sumergida que asoma, se han utilizado el Landsat Multispectral Scanner (MSS) y el Thematic Mapper (TM). Un requisito para retorno de imagen con SLAR y SIR es la superficie irregular. Landsat proporciona una capacidad limitada para discriminar especies, pero la disponibilidad costo y ciclos repetidos le hacen útil para determinar la presencia de grandes poblaciones en el tiempo. Para un estudio detallado de la vegetación, incluida la identificación de especies distintas, empléense imágenes a mucha mayor escala (1:10.000 o mayor). La cobertura aérea de gran altitud, proporcionada por el Programa Nacional de Mapas a gran altura (NHAP) y otras fuentes, a escalas originales de aproximadamente 1:60.000 a 1:120.000, ofrece una buena cobertura del área ini-

10-81

ANÁLISIS BIOLÓGICO DE LAS AGUAS

1) Equipo: Para fotografía aérea de pequeño formato, utilícese una cámara de buena calidad, lente reflex sencilla de 35 mm (SLR) con fotómetro manual o a través de la lente, o cualquier sistema bueno de cámara de 70 mm, preferiblemente con motor. Para ambos sistemas existen intervalómetros que consiguen intervalos de exposición exactos para fotografía estéreo. Una lente de 288 mm de longitud focal con una cámara SLR de 35 mm, consigue una amplia cobertura a baja altura; las lentes de 40 y 80 mm han tenido éxito con sistemas de cámara de 70 mm. Cuando se fotografía con película de blanco y negro o color, utilícese un filtro para luz cenital o neblina. Cuando se fotografíe con película infrarroja de color por debajo de 1.700 m, empléese un filtro Wratten 12; a altitudes por encima de 1.700 m, empléese un filtro Wratten 15. La época del año y el estado de la vegetación pueden influir también en la elección del filtro amarillo/naranja. En agua turbias, la película de color* consigue mejor penetración en el agua y es

más útil para mapas de vegetación sumergida que la película infrarroja de color.3 El color infrarrojo† consigue más detalle, es mejor para mapas de vegetación emergente o tierras húmedas y puede dar más detalle en aguas claras, no turbias. Es preferible montar la cámara en la panza de un avión con un solo motor de alas altas para fotografía de baja altitud y formato pequeño. Esos montajes en la panza requieren modificaciones especiales en los aviones, pero proporcionan una plataforma estable, protección para la cámara y buen acceso. Alternativamente, la cámara se puede montar en la puerta del avión6. 2) Procedimientos: Dado que el ángulo solar es crítico para obtener fotografías aéreas de buena calidad, prográmese el vuelo para una hora en que la altitud solar esté entre 40 y 68 grados7. Ajústese la cámara a las ASA de la película (se supone 100 a 125 para película infrarroja de color) y dispárese en el modo automático de exposición. A una velocidad típica en el aire de unos 190 km/hora (aproximadamente 120 mph) es adecuada una velocidad del disparador de 1/250 ó 1/500. Determínese la parada f apropiada con un ordenador de exposición aérea; en general, f 5,6 a 11 (f 8 es óptimo) da una exposición de color aceptable. La exposición apropiada de la película infrarroja de color depende de factores tales como la hora del día y época del año, altitud, humedad y tipo de paisaje. Revélese la película a través del fabricante, un laboratorio fotográfico o un servicio de fotografía aérea. El servicio de revelado de la película infrarroja de color sólo se consigue a través de fabricante. c) Sondeos: Los sondeos para registro se aplican mejor en aguas de más de 1 m de profundidad, donde los instrumentos pueden determinar exactamente

* Película Kodak 5036 o equivalente.

† Película Kodak Aerochrome Infrared tipo 2443 o equivalente.

cial y la capaciadad de ampliación hasta cinco veces2. Tras determinar la escala, selecciónense las combinaciones de película/filtro o sensor, que incluyen imágenes en blanco y negro, infrarrojo de color, e imágenes en negro y blanco-infrarrojo; lo más útil suele ser la película infrarrojo de color usada con un filtro amarillo. Se han descrito otras combinaciones3, 7. Para planificar detalladamente los vuelos, téngase en cuenta la fase de crecimiento de las plantas, profundidad y claridad del agua, condiciones de las mareas, cobertura de nubes y ángulo solar2, 8, 9. Los recursos disponibles determinan finalmente las actividades de detección remota. b) Fotografía aérea:

Ektachrome

Professional

tipo

MÉTODOS NORMALIZADOS

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la altura y distribución de los macrofitos bajo la superficie. Un registrador de sondeo se puede montar en la mayoría de los barcos y determinará con exactitud perfiles unidimensionales (porcentaje de cobertura) y bidimensionales (porcentaje del área vertical) de la vegetación sumergida. Realícense medidas lineares y planimétricas sobre los trazados de los mapas, que proporcionan registros permanentes para comparación fácil en el tiempo. Calcúlese el porcentaje de cobertura dividiendo la medición linear para una especie o comunidad macrofitica por la longitud total del papel del mapa para una sección determinada. Dividiendo el área del trazado con macrofitos por el área total del agua, se obtiene el área vertical por ciento. Utilícese un sondímetro con precisión hasta 0,1 m. Móntese el transductor para el registro del sondímetro con abrazaderas sobre el yugo del barco. Manténganse constantes la velocidad y la del registro para obtener trazados de longitud y resolución similares. Se necesitan sólo unos minutos para duplicación de secciones de varios kilómetros de longitud. A no ser que existan grandes diferencias morfológicas, la discriminación de especies en el mapa es difícil o imposible. Márquense los límites de las colonias y comunidades monotípicas con una línea fija sobre el trazado del mapa. Las marañas de vegetación espesa que llegan a la superficie pueden impedir el movimiento del barco y evitar que la señal del transductor alcance el hidrosuelo, mezclando trazos de macrofitos con la línea del transductor. Los trazados en aguas de menos de 1 m de profundidad pueden ser difíciles de interpretar10. 4.

Referencias

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Estimaciones de población

Diseño de la toma de muestras

El diseño de un programa para toma de muestras depende de los objetivos del estudio, los métodos de obtención, la variación y distribución de la vegetación, el personal y los fondos disponibles y la precisión esperada. La variación en el espacio no suele ser aleatoria; la distribución está determinada por la profundidad del agua, actividad en la orilla, tipo de sedimento y otros factores. La estadística paramétrica para estimar la media de la población real, supone que la población de la que se toman muestras tiene una distribución normal y que todas las unidades de la muestra tienen la misma probabilidad de ser seleccionadas. Evítense las estaciones de toma de muestras fijas en los programas para determinar medias de población, a no ser que se elijan al azar al empezar el estudio. Dado que las poblaciones vegetales distribuidas normalmente pueden no ser una característica de las comunidades vegetales contiguas, empléense los parámetros estadísticos con precaución. El diseño de toma de muestras al azar se aplica mejor a comunidades vegetales homogéneas no contiguas. El número de estaciones requerido para obtener una estimación de la media real de población con un nivel predeterminado de confianza y error permisible, se puede determinar aplicando los datos obtenidos en un estudio piloto a la ecuación siguiente:

donde: N = número de estaciones de toma de muestras; t = t de Student a un nivel determinado de probabilidad; dado que N es desconocido, hágase t = 2,0; t es aproximadamente igual a 2,0 para N 30; S = desviación estándar; x = estimador de la media real de población, determinado usualmente por medio de un estudio piloto, y d = error permisible de la media final; se recomienda d = 0,1 para estudios de vegetación (± 10 por 100).

Se puede obtener una estimación del coste del programa de toma de muestras por la suma del coste inicial fijo (como la compra del equipo) y el coste variable (coste por muestra multiplicado por el número de muestras). Aplíquese una toma de muestra aleatoria estratificada a poblaciones con muchos conjuntos homogéneos. Este diseño es mejor para poblaciones con gradientes obvios y, en la práctica, para ganar precisión debido a las variaciones minimizadas dentro de los estratos. Determínese la colocación de los estratos con un estudio piloto. Para que la precisión sea máxima, pónganse límites de estrato alrededor de las áreas homogéneas; generalmente, cuanto menos estratos, mayor precisión. Asígnese la toma de muestras a un diseño de toma de muestras estratificada aleatoria, de acuerdo con:

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MÉTODOS NORMALIZADOS

donde: Ni = número de muestras en el estrato i; N = número total de muestras; Wi = un peso que refleja el tamaño (número de cuadratines, por ejemplo) del estrato i, y Si = desviación estándar de la característica de las muestras tomadas dentro del estrato i.

Las medias para medidas de población tomadas a lo largo de estaciones situadas al azar en una línea de intersección no representan áreas grandes o poblaciones de lagos, a no ser que la línea de intersección se sitúe al azar. Las líneas colocadas arbitrariamente dentro de un área de toma de muestras pueden reflejar, o no, la variación real de la vegetación dentro de ella. 2.

Métodos de obtención

a) po:

Inventano/reconocimiento de cam-

1) Recogida manual: Si lo permiten la profundidad del agua, su transparencia, temperatura, flujo y otras circunstancias, recójanse las especies manualmente. En condiciones ideales, la recolección manual vadeando, sumergiéndose con un tubo para respirar o con SCUBA en aguas más profundas, permite una evaluación detallada y amplia de la comunidad macrofítica. 2) Cadenas de dragado: Construyanse cadenas de dragado soldando ganchos en forma de U, afilados, a una cadena corta (0,6 a 1,0 m) de peso medio. Únase la cadena a una cuerda y tírese de ella a través del agua. Únase un flotador al extremo de la cuerda para evitar que se pierda, si la cadena se engancha y/o se cae. La cadena de dragado se puede usar fácilmente desde un barco que se mueva lentamente o parado, y es más efectiva para recoger especies macrofíticas sumergidas con formas de crecimiento elevado.

3) Rastrillos y pinzas: Los rastrillos con mangos de varios largos y las pinzas para ostras pueden ser útiles en la recolección de macrofitos. Se puede atar una cuerda al mango del rastrillo para toma de muestras en aguas profundas o facilitarla en un radio más amplio. 4) Tomamuestras de cuchara: Se pueden usar los dispositivos desarrollados para obtener muestras de organismos bénticos, como el tomamuestras de Ekman, Ponar y otros similares (véase sección 10500B.3), para recolectar macrofitos. El peso ligero de la cuchara de Ekman hace que sea preferible para las numerosas y rápidas tomas de muestras que a menudo se precisan para inventarios de estudio. 5) Sondímetros para registro: Se utilizan para determinar la altura y distribución de los macrofitos debajo de la superficie. Las especies con morfología similar no suelen distinguirse a partir de los trazados del mapa; empléense métodos complementarios para identificar las especies. b) Toma de muestras cuantitativa: Los datos numéricos recogidos para describir la vegetación incluyen normalmente medidas tales como la abundancia y densidad, frecuencia, cobertura y cosecha de biomasa/estacionaria1, 2. Obténganse esos datos a partir de gráficas o cuadratines, o, más rara vez, por medio de técnicas no comparativas. La elección del método analítico depende de la densidad y tipos de vegetación, profundidad del agua, flujo, altura de la vegetación en la columna de agua y naturaleza del sedimento. 1) Intersecciones de línea: Esta técnica no comparativa conlleva el uso de una cuerda de nailon con pesos o con núcleo de plomo, colocada en el fondo entre dos puntos conocidos, u orientada por una lectura de brújula. Para marañas espesas de vegetación flotante, se puede echar una línea flotante encima de ellas. Un

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agrimensor medirá la distancia linear ocupada por las distintas especies que quedan bajo la línea de intersección. Exprésense en porcentaje de longitud total de línea, tanto para especies individuales como para las asociadas. Si se desean datos de frecuencia, márquense los incrementos de línea (de 1 m, por ejemplo) y trátese la presencia/ausencia de especies de forma similar a los datos de toma de muestras por cuadratines. La intersección de línea se ha empleado para caracterizar y obtener mapas de comunidades acuáticas3 y para correlacionar la distribución de macrofitos con factores ambientales seleccionados4. En medios acuáticos, el método de intersección de línea es lento y puede precisar un submarinista con equipo SCUBA. Los problemas surgen al determinar si una planta queda por debajo de la línea de intersección5. 2) Intersecciones de banda: Esta técnica es similar a la intersección de línea. Los datos se recogen a lo largo de una línea fija, pero a partir de una banda o tramo bidimensional. La banda se puede tratar como una serie de cuadratines continuos, o se puede elegir la localización de éstos sobre la base de un intervalo determinado o de la profundidad del agua. Empléense marcos flotantes o sumergibles. 3) Cuadratines: Se pueden utilizar para estimaciones de población y comunidad tales como frecuencia, cobertura, densidad y recolección de biomasa/estacionaria. El área de toma de muestras de los tomamuestras de cuadratín varía desde unos 0,023 m2 para la cuchara Ekman estándar hasta 0,39 m2 para el tomamuestras WES descrito más adelante

en b).

Con excepción de los marcos, la mayoría de los dispositivos para toma de muestras se han utilizado para obtener estimaciones de recolecciones estacionarias (biomasa encima del suelo). Generalmente se usa la recolección estacionaria debido a la dificultad de recolectar partes

10-85

vegetales subterráneas, como el rizoma y las raíces. a) Tomamuestras manuales: Son dispositivos relativamente sencillos que delimitan zonas de toma de muestras a partir de las cuales se extraen los macrofitos de forma manual o con podaderas. Aunque se pueden utilizar en aguas profundas, manipuladas por un submarinista, funcionan mejor en aguas poco profundas. Son relativamente baratas y se pueden construir fácilmente o adquirirlas en el comercio. Los marcos son adecuados para toma de muestras en aguas poco profundas. Para tomar muestras de plantas erectas, bajas, empléese un marco cuadrado sumergible de metal. Para vegetación densa o enmarañada puede ser útil un marco cuadrado con clavijas o tuercas con aletas en las esquinas o un marco de tres lados con ángulo fijo. Se ha de decidir sí se incluyen sólo macrofitos enraizados, dentro del marco, o también las plantas superpuestas. En aguas profundas puede ser difícil la toma de muestras de vegetación sumergida alta. Para macrofitos que formen una masa densa flotante, utilícese un marco flotante de madera o tubo de PVC. Los tomamuestras de madera son útiles para tomar muestras en aguas poco profundas donde el fondo consista en sedimentos no consolidados. El tomamuestras consta de una caja abierta, con un borde metálico en el fondo y asas laterales; un tomamuestras de plexiglás de 1/4 de pulgada, cuyas dimensiones sean 0,5 m x 0,5 m x 0,6 m con reborde cortante de aluminio y refuerzos en las esquinas, pesa unos 12 kg. A diferencia de los tomamuestras de marco, los de caja no requieren una decisión acerca de las plantas a incluir. Con modificaciones, un tomamuestras de caja puede usarse en aguas profundas6. Los tomamuestras de bóveda béntica (BeD)7 se pueden emplear para tomar

10-86

muestras en aguas corrientes profundas. Consisten en un bóveda de plástico con un collar circular de acero inoxidable, que puede empujarse dentro del sustrato. Pesan 11 kg aproximadamente y tienen un área de toma de muestras de 0,25 m2. Varios tomamuestras8, 9 desarrollados para tomar muestras de macroinvertebrados pueden emplearse también para recoger macrofitos. Entre ellos se incluyen el tomamuestras de Surber, adecuado para ríos poco profundos con corriente moderada (véase sección 10500B.3b1); el tubo de estufa (tomamuestras cilíndrico), apropiado para aguas vadeables con fondos de sedimento no consolidado (véase sección 10500B.3c3), y la cuchara Ekman, más apropiada para fondos de sedimento blando, con vegetación erecta, corta (véase sección 10500B.3a6). b) Tomamuestra de funcionamiento mecánico: La toma de muestras mecánica reduce el tiempo de recogida de la muestra, aumenta la precisión de la recolección estacionaria y estimaciones de la biomasa y está sometida a menos desviaciones que muchos métodos manuales. Sin embargo, los dispositivos para toma mecánica de muestras son caros y complejos, y requieren una plataforma flotante con manivelas, cables y botavaras. Los dispositivos descritos a continuación son útiles para aguas profundas. PRECAUCIÓN: Extrémense las precauciones para trabajar de forma segura. La caja de Louisiana es una caja de plancha metálica (o de un material similar) abierta, de 35 cm de alto, que toma muestras en un cuadrado de 61 x 61 cm (área de recogida = 0,37 m2)10. Se puede utilizar desde un barco con casco en V o con puente, y se iza por encima del agua con un cable y manivela. Un mecanismo de soltado rápido deja caer el dispositivo libremente a través de la columna de agua. La vegetación acuática queda atrapada contra el fondo y cortada por los bordes cortantes de la base del tomamuestras. Un saco de red de nailon, en la

MÉTODOS NORMALIZADOS

parte superior, retiene los fragmentos vegetales cortados. Un submarinista introduce una cuchilla horizontal en una rendija a nivel del sustrato antes de izar el tomamuestras a la superficie. La inserción manual de la lámina cortante por un submarinista hace comparativamente eficaz a la caja de Louisiana. En sedimentos blandos, el aparato puede penetrar demasiado profundo y tendrá que ser elevado antes de poder insertar la placa cortante. Las rocas, estacas, raíces y otros detritos pueden impedir el cierre completo de la puerta cortante. El dispositivo de toma de muestras de Osborne11 es una caja de acero inoxidable, con dimensiones exteriores de 50 cm x 50 cm x 60 cm de alto y un área de toma de muestras de 0,25 m2. Pesa 110 kg y funciona con un chigre y cable desde un barco con puente. Tras izarlo y suspenderlo a lo largo del barco con puente, un mecanismo de soltado rápido permite su caída libre a través de la columna de agua. Unas cuchillas de acero templado, a lo largo del borde en la base del aparato, cortan la vegetación durante el descenso. Una malla de alambre, sujeta a la parte superior, impide la pérdida de fragmentos vegetales. Una puerta de bisagra, encajada, se cierra con un cable de elevación y el tomamuestras se sube por medio de la manivela a la plataforma del puente, donde se extraen los macrofitos y sedimentos. Dado que el dispositivo penetra y recoge sedimentos, la muestra incluye raíces y rizomas, y se puede usar para estimar la biomasa y la cosecha estacionaria. Para que la operación sea eficiente y las estimaciones de la biomasa exactas, se requiere un sustrato sin consolidar, libre de rocas y otros detritos. El dispositivo EEC (Estación Experimental de Cursos de Agua)12 está fabricado con acero inoxidable perforado y funciona desde el puente de un barco con una viga aérea que permita su elevación y descenso hidráulico a través de un

ANÁLISIS BIOLÓGICO DE LAS AGUAS

abertura circular en la plataforma del puente. Existen dos tipos: uno es cilíndrico, con un área de toma de muestras de 0,28 m2, y el otro cuadrado, con área de toma de muestras de 0,39 m2. Unas cuchillas cortantes giratorias, en la base de cada tomamuestras, cortan la vegetación al descender los aparatos. La placa cortante de la base de cada uno de ellos se cierra hidráulicamente. Una ventaja importante del dispositivo EEC es su capacidad de obtener muestras vegetales a cualquier profundidad. La caja de Louisiana y el tomamuestras de Osborne, una vez liberados, caen libremente hacia el sustrato, mientras la operación hidráulica del dispositivo EEC controla su descenso. El tamaño y peso del remolque y harco de puente para el dispositivo EEC limitan su uso en algunas masas acuáticas y requieren una rampa de lanzamiento mejorada. Aunque se ha informado que la cabeza cuadrada de toma de muestras del EEC proporciona una estimación más exacta de la cosecha estacionaria que la circular, también existe un informe de una infravaloración de su valor real12.

3.

Preparación y análisis de muestras

a) Biomasa: 1) Peso fresco (peso húmedo): Lávese el cieno y detritos de las muestras, pónganse en una bolsa de nailon (tamaño de malla, 0,75 cm) y hágase girar en una lavadora de ropa a 560 rpm durante 6-7 minutos para eliminar el exceso de humedad. Pésese la muestra con aproximación de 0,01 g. 2) Peso seco: Séquese la muestra secundaria (no menos del 10 por 100) en una estufa con aire forzado a 105 °C, durante 48 horas o hasta peso constante. El coeficiente de variación para una serie de muestras secundarias no

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debe exceder el 10 por 100. Calcúlese el peso seco, dividiendo el peso seco de la muestra secundaria por su peso fresco, multiplicado por el peso fresco de la muestra. 3) Peso seco sin cenizas: Pásese la muestra secundaria seca a un crisol tapado y previamente pesado. Llévese a ignición a 550 °C durante 6 horas. Calcúlese el peso seco sin cenizas, determinando la relación entre cenizas y peso seco multiplicado por el peso seco de la muestra. b) Contenido en clorofila: Extráigase el material vegetal fresco con acetona básica (con MgCO3). Tritúrese el material vegetal y centrifúguese a 2.500 rpm durante 10-15 minutos. Lávese el residuo con acetona y añádanse los lavados filtrados al extracto. Séquese toda una noche sobre Na2SO4 anhidro y dilúyase con agua al 90 por 100 de acetona. Determínese la clorofila (véase la sección 10200G), c) Contenido de carbono: La mayoría de las plantas enteras contienen del 46 al 48 por 100 de carbono en base seca. Este factor se puede utilizar para calcular el contenido de carbono y hacer comparaciones. d) Contenido calórico: Determínese el contenido energético con bomba de calorimetría. e) Identificación de especies: 1) Preparación de la muestra: Utilícense muestras frescas para identificación cuando sea posible. Evítense las plantas inmaduras o sin flores. Dado que las plantas acuáticas contienen del 80 al 95 por 100 de agua y tienen menos tejido de soporte que las terrestres, se necesita un método diferente para secado, conservación y montaje. Recójanse las plantas durante la estación de máximo crecimiento, en el momento de la floración y/o desarrollo de los frutos, si fuera posible. Inclúyanse plantas completas (tallos, rizomas, hojas, raíces, flores y frutos).

MÉTODOS NORMALIZADOS

10-88

Tras recoger las plantas, prénsense en el campo13, 14 o envuélvanse las muestras en varias capas de papel y sumérjanse en agua. Pónganse etiquetas a las plantas envueltas, indicando la fecha y lugar de recogida en una ficha, y colóquese la muestra y una ficha en una bolsa de plástico. Utilícese preferentemente una nevera portátil con hielo picado, para conservación de campo, sin sobrepasar las 4-6 horas. Las plantas pueden mantenerse varios días refrigeradas a 4 °C. Prepárense las plantas secas, centrándolas en papel de herbario 100 por 100 hecho a base de trapos. Límpiese todo el cieno y residuos de la planta. Pónganse inmediatamente en papel las plantas emergentes, porque tomarán su postura natural. Las plantas fláccidas se pondrán en un recipiente con poca agua y se hará resbalar el papel de herbario debajo de él, elevándolo lentamente en un ángulo de 30° y manteniendo la planta centrada. Las hojas y tallos se pondrán planas sobre el papel. Escúrrase el exceso de agua, tápese con papel encerado para evitar que se pegue la planta a los secantes y prénsense entre éstos y el papel de herbario. Consérvese a temperatura ambiente durante 3-5 días, cambiando los secantes por lo menos cada 2 días, hasta que la planta esté suficientemente seca para un montado permanente. El montado húmedo se prepara colocando una muestra húmeda en un recipiente de vidrio hermético, lleno con una parte de formalina al 10 por 100, tres partes de agua y una pizca de polvo de cobre. Las plantas se mantendrán como vivas y conservarán su color durante años en ese estado. 2) Identificación: Se necesita un estereomicroscopio para identificar muchas plantas, especialmente las hierbas acuáticas y juncias. Obsérvense las estructuras vegetativas y florales diseccionándolas bajo aumento, con pinzas y sondas de agujas finas.

Es preferible identificar especies. Para ayudar en la identificación de macrofitos acuáticos existen numerosas referencias (véase sección 10900G). 4.

Presentación de los datos

Exprésese el peso fresco (peso húmedo), peso seco y peso sin cenizas en gramos o kilogramos por metro cuadrado. Determínense los dígitos significativos para peso seco y peso seco sin cenizas a partir de la precisión de la escala usada para obtener el peso fresco: no hay que utilizar dígitos más significativos que los usados para expresar el peso fresco. Exprésense los pigmentos como gramos de clorofila por gramo de materia vegetal seca, y el valor calórico como calorías gramo por gramo de material vegetal seca. 5.

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Véanse también las secciones 10400A.2 y 10400C.5.

Productividad

Discusión general

La complejidad y heterogeneidad de la forma, función, fenomenología y distribución de los macrofítos acuáticos han dado lugar a una diversidad de formas de medir su productividad. Estos métodos se pueden agrupar ampliamente en métodos de biomasa, basados en producciones estacionarias o cambiantes, y métodos metabólicos, basados en estimaciones del carbono inorgánico o intercambio de oxígeno resultante de la fotosíntesis. Los métodos de biomasa generalmente son más sencillos que los meta-

bólicos y requieren equipo o experiencia poco especializados y menos supuestos. Los métodos de biomasa integran respuestas a las condiciones ambientales y proporcionan estimaciones de la producción sobre el terreno nada más. Se emplean mejor para comparaciones a largo plazo (varios meses a un año) porque se confunden fácilmente debido a los cambios estacionales. Los métodos de biomasa son insensibles a las pérdidas por fragmentación, herbívoros y secreciones o lixiviación del material orgánico. En cambio, los metabólicos proporcionan medidas instantáneas de la fotosíntesis y

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así reflejan las respuestas de las plantas a diferentes condiciones ambientales. Los métodos metabólicos para calcular la productividad vegetal pueden ofrecer también una comprensión de los factores que controlan la distribución y el éxito. Los principales inconvenientes de los métodos metabólicos son la necesidad de equipo especializado y supuestos que pueden ser sutiles y se basan en tasas fotosintéticas (medidas normalmente en un período de minutos a horas), y requieren la extrapolación a una asimilación neta durante períodos más largos. Al elegir un método, considérese la razón del interés de la producción macrofitica y el uso de los datos, hábito (crecimiento y fenomenología) y hábitat de la población, y el coste y esfuerzo requerido para obtener la información deseada. Los métodos comunes se enumeran en la tabla 10400:I y se describen a continuación.

2.

Métodos de biomasa

a) Métodos de cosecha de biomasa: La medida de cosechas estacionarias varía desde una muestra simple, de una vez, de la biomasa máxima, a evoluciones complicadas de la dinámica estacional de la biomasa, por métodos destinados originalmente a las plantas herbáceas1-3. Estos métodos son aplicables principalmente a macrofitos sumergidos y emergentes. Es preferible evaluar la productividad de las plantas flotantes utilizando la tasa de crecimiento relativo, cuadratines permanentes y muestras4 aleatorias, o por los métodos de producción y metabólicos expuestos en los apartados 2b y 3, más adelante. 1) Medidas de cosecha estacionaria: La cosecha estacionaria máxima se mide por la biomasa sobre el terreno (normalmente como peso seco por unidad de superficie) en el momento de cosecha es-

MÉTODOS NORMALIZADOS

tacionaria máxima aparente (usualmente el tiempo de floración). Esta medida única no tiene en cuenta la biomasa procedente del año anterior, pérdidas de material antes del máximo o crecimiento después de él, y por ello suele subestimar la producción anual sobre tierra (NAAP) hasta un punto que depende de la relación entre la producción anual y la biomasa máxima5. El método consigue un cálculo razonable de la NAAP para muchas especies sumergidas. El método del acumulo estacional de biomasa6 es una modificación del método de cosecha estacionaria máxima, que sólo considera los cambios positivos en el material vivo. La biomasa viva sobre el terreno se determina al principio de la estación de crecimiento y en el de cosecha estacionaria máxima; la NAAP se calcula como la diferencia. Este método tiene en cuenta el material vivo procedente del año anterior, pero en algunos casos esto dará lugar a una subestimación adicional de NAAP respecto al método del máximo de cosecha estacionaria2. Cuando el reclutamiento es continuo durante la estación de crecimiento, el máximo de biomasa está peor definido y puede haber mayores pérdidas antes del máximo estacional. En esas condiciones, los métodos de cosecha estacionaria dan una estimación mala de la NAAP3. 2) Métodos dinámicos de biomasa: Estos métodos son aplicables a plantas emergentes cuando el material muerto permanece próximo al lugar de descomposición. El método de Smalley7 estima la producción neta sobre la base de toma de muestras de material vivo y muerto (por unidad de superficie) a intervalos regulares de 3-6 semanas. La producción neta es igual al aumento de material entre tomas de muestras: una disminución de material vivo y muerto indica que no hay producción neta; un aumento de material vivo y reducción del muerto indi-

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TABLA 10400.I MÉTODOS USADOS PARA DETERMINAR LA PRODUCCIÓN MACROFÍTICA*

can que la producción es igual al aumento de material vivo, y la reducción de material vivo y aumento de la biomasa muerta con una suma negativa indica que no hay producción. El método subestima la producción cuando se presenta material muerto procedente de otras zonas o si no se detecta nuevo crecimiento cuando la mortalidad es elevada. Es sensible a la frecuencia de tomas de muestra y requiere una zona homogénea suficientemente amplia para acomodarse a la duplicación de tomas de muestras. Se puede utilizar una modificación de este método donde la cosecha estacionaria varíe poco de un año a otro; en este caso, se supone que la producción neta sobre

el terreno es igual a la suma de pérdidas de material muerto8. Se han propuesto métodos más complejos basados en las recolecciones a partir de parejas de terrenos9, 10. b) Métodos para marcado de la biomasa: 1) Métodos para incremento de la producción y crecimiento de biomasa: Los estudios de producción foliar y marcado de la biomasa incluyen el marcado de hojas individuales en las plantas para seguir la producción, crecimiento y pérdidas durante el año o estación de crecimiento. Para plantas con hojas grandes de vida prolongada y crecimiento basal,

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como Vallisneria, Zostera, macroalgas, determinar el crecimiento a corto plazo de las hojas individuales. Utilícense estos métodos para estudios de poblaciones (especies) más que para comunidades. Los métodos de marcado son especialmente útiles para plantas siempre verdes, donde puede haber pocos cambios estacionales de la biomasa y para las que la proporción de su producción frente a biomasa es mucho mayor o mucho menor que uno. Las medidas de producción estiman también su disminución y la pérdida de biomasa. Se consideran mejores que las técnicas de recolección, tanto respecto a la precisión como por la información fenomenológica adicional. Los métodos de marcado requieren un mayor esfuerzo en el censo regular y el submarinismo SCUBA para toma de muestras de poblaciones sumergidas, profundas. Cuando las hojas o partes vegetales son aproximadamente del mismo tamaño estacionalmente, el método es relativamente sencillo y sólo precisa un censado periódico de las partes vegetales. Estos métodos no son adecuados para especies con muchas ramas o tasas diferentes de producción y pérdida foliar por rama, y se confunden debido a un intenso pastoreo o a la caída de partes recién producidas. a) Renovación de biomasa: Para determinar el tiempo de renovación de hojas y brotes, donde los individuos sean fácilmente distinguibles o cuando el desarrollo vegetativo sea insignificante o fácil de estimar, y el tamaño foliar sea bastante constante, elíjanse de 10 a 50 plantas individuales y márquese cada hoja en cada planta. Si todas las hojas nuevas se inician en el interior de otras más viejas, márquense sólo las hojas más nuevas inicialmente. márquense las hojas y tallos nuevos con algo que no interfiera con el crecimiento normal ni se pierda fácilmente, por ejemplo, grapas, perforaciones, anillas de plástico para pájaros, hilo

MÉTODOS NORMALIZADOS

de pescar, marcadores indelebles. A intervalos regulares, inspecciónense las plantas de nuevo, márquense las hojas nuevas y anótese su número y el total de hojas presentes. Dado que las hojas nuevas pueden no haberse desarrollado totalmente en la visita, empléese un artificio respecto a la fase de su desarrollo11. El intervalo de toma de muestras (semanas a meses) depende de las necesidades de investigación y la probabilidad de perder las hojas marcadas más jóvenes. Calcúlese la producción anual foliar para cada planta individual como número de hojas nuevas producidas anualmente, dividido por el número máximo de hojas presente en cualquier momento de la estación. Dado que la tasa de renovación es la relación entre producción y biomasa, calcúlese la NAAP multiplicando la tasa de renovación por la biomasa máxima sobre el terreno. Si el desarrollo vegetativo es común, modifíquese este método de forma que se marcan todas las hojas o tallos de una especie dentro de las parcelas de una zona determinada12, 13. Vuélvanse a visitar las parcelas a intervalos regulares, márquense nuevas hojas y regístrese el número total de hojas presentes. Calcúlese la producción como antes. Este método no tendrá en cuenta los cambios de tamaño de la planta (aumento de peso entre años), la mortalidad o el reclutamiento en la población, porque sólo se incluyen plantas inicialmente presentes que sobreviven a la estación. b) Medidas del incremento de crecimiento: Si se dan cambios del tamaño de las hojas durante toda la estación de crecimiento, o varios tipos de partes sobre tierra, utilícense métodos que tengan en cuenta esas diferencias. Esos métodos se emplean frecuentemente para hierbas marinas14-16. márquese cada hoja de cada planta dentro de un cuadrado, a un nivel establecido por encima del fondo, respecto a una estaca o marco fijos. Si las plantas no están enterradas profundamente, utilícese una distancia determina-

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da sobre la base (por ejemplo, interfase de rizoma o brote de raíz). Al cabo de un tiempo establecido previamente, quítense todas las hojas o brotes a nivel de la estaca o a la distancia fijada. Pésense las hojas no marcadas producidas durante el intervalo. Quítese y pésese el crecimiento sobre las hojas más viejas (la porción por debajo de la señal, pero encima de la base o el suelo). Los pesos combinados son la producción foliar neta durante el intervalo. Estos datos pueden usarse también para calcular las tasas de crecimiento relativo como (In Δpeso/Δtiempo). Háganse mediciones detalladas de las tasas de crecimiento foliar, marcando las plantas al nivel de referencia con mayor frecuencia, por ejemplo, cada 2 días17. Una modificación de este método18 permite computar la tasa de crecimiento de las hojas individuales y la producción de partes diferentes de las plantas. c) Método de la suma del máximo de brotes: Cuando se precisen medidas no destructivas, determínese el tamaño y número de brotes y calcúlese su producción3. Elíjanse cuadrados permanentes de un tamaño que permita enumerar fácilmente las partes vegetales. Pónganse etiquetas a cada tallo de cada cuadrado. En visitas regulares para toma de muestras, etiquétense y cuéntense los tallos nuevos. Desarróllense regresiones de longitud:peso utilizando plantas recogidas de zonas próximas, pero fuera de los cuadrados. Esto sólo es necesario una o dos veces al año, dependiendo de las características de las especies estudiadas. Calcúlese la productividad primaria neta sobre la tierra (brote) usando el número de partes nuevas producidas y sus pesos (basados en las regresiones longitud:peso). Calcúlese la producción por unidad de área como la media de renovación foliar multiplicada por la masa máxima de brotes. Para algunas especies, se han utilizado

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variaciones más complejas de este método19, 20. 2) Métodos de cohorte: Los métodos de cohorte se suelen utilizar para determinar la producción neta de plantas acuáticas sometidas a pérdida sustancial de biomasa antes de alcanzar el máximo estacional de la biomasa. Son útiles para especies en que se pueden identificar grupos de individuos o subunidades, iniciados al mismo tiempo (cohortes), es decir, para plantas donde los brotes emergen sólo durante un tiempo o en varios tiempos distintos, en un ciclo anual. El método de la curva de Allen se ha adaptado para macrofitos acuáticos. Proporciona una estimación de la producción neta a partir de unas tablas de los números y pesos de todos los individuos. Es especialmente apropiado para poblaciones en las que se producen la muerte e iniciación de los brotes durante toda la estación de crecimiento. El método puede incluir períodos de producción negativa durante el año. márquense todos los miembros de una cohorte (todas las hojas o brotes) poco después de su iniciación o emergencia. Normalmente éste es el número máximo de individuos presentes en un momento determinado en la cohorte, porque la mortalidad reducirá su número a continuación21. Pueden presentarse algunos individuos nuevos (miembros aún de la misma cohorte) en la segunda visita para toma de muestras3. Regístrese el número de individuos y su peso medio (peso seco por hoja o brote). Determínese el peso a partir de las regresiones tamaño:peso elaboradas a partir de los datos para plantas fuera del terreno estudiado, pero usando miembros de la misma cohorte. Alternativamente, recoléctense terrenos adyacentes de miembros de la cohorte para calcular el peso medio por individuo. Repítase para varios terrenos duplicados. Vuélvanse a visitar las parcelas regularmente y regístrese el número y peso

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medio individuales. Visítense con suficiente frecuencia para minimizar el potencial de pérdida de hojas o brotes jóvenes antes de haber sido contados. Compárense los valores (véase figura 10400:1) y determínese el área total bajo la curva por planimetría o gravimétricamente, para calcular la producción neta anual sobre la tierra. Repítase si emerge más de una cohorte al año; entonces la producción neta anual sobre la tierra será la suma de las áreas bajo las distintas curcas3, 21. Si la producción fuera negativa durante el año, añádase esa pérdida para obtener la producción neta. Las pérdidas pueden evitarse normalmente, iniciando los estudios tras la senectud del invierno21.

MÉTODOS NORMALIZADOS

Una adaptación del método de producción de cohortes22 reconoce la estructura jerárquica de muchos macrofitos acuáticos. Este método puede ser utilizado cuando las tasas de producción anual para subunidades vegetales confundirían el método de cohorte simple. c) Cálculo de producción bajo tierra: Las partes bajo tierra de los macrofitos acuáticos incluyen a menudo una porción sustancial de la biomasa vegetal y producción neta, y pueden tener implicaciones importantes en el ecosistema debido a su actividad y decadencia biológica5. La cantidad de biomasa bajo tierra varía espectacularmente entre especies, dentro de ellas y estacionalmente para

Figura 10400:1. Curva de Allen para una cohorte de una población de macrofitos acuáticos. Los datos de la muestra se indican con números romanos. La producción neta encima del suelo es proporcional al área sombreada.

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poblaciones de la misma especie que crecen en hábitats diferentes. 1) Biomasa máxima: La biomasa máxima bajo tierra se suele tomar como la producción neta anual bajo tierra, y puede sobreestimar o infraestimar sustancialmente la producción real, dependiendo del volumen de biomasa. Para muchas plantas caducas sumergidas proporciona una estimación razonable de la producción, especialmente cuando el volumen de brotes se acerca a uno y poca biomasa bajo tierra supera el invierno. Para la mayoría de los macrofitos emergentes y de hojas flotantes, sobrestimará la biomasa. 2) Acumulo estacional de biomasa: Un método más apropiado, pero más difícil, incluye la toma de muestras repetida y determinación de la biomasa viva bajo tierra a intervalos regulares durante el año. Para las plantas de pantanos, utilícense puntuaciones del sedimento (25 cm de profundidad, 6 a 10 cm de diámetro) tomadas a intervalos regulares (2 a 4 semanas)23, 24, Tamícense los centros para eliminar la biomasa bajo tierra y determínese el peso de la parte viva. El material vivo suele distinguirse por su color pálido, textura y turgencia. También se pueden emplear colorantes; el negro de clorazol tiñe material muerto25, y el tetrazol, el vivo. Utilícese el cambio estacional de biomasa viva como una estimación de la producción. En cuanto a los brotes, la pérdida de material vegetal antes de alcanzar la biomasa máxima, y cualquier producción tras conseguirla, no se tienen en cuenta. 3) Medidas del volumen de raíces: Para muchas aplicaciones, la forma más razonable de determinar la producción bajo tierra es la extrapolación a partir de la producción o volumen de brotes. Para muchas plantas, la producción y volumen de biomasa bajo tierra está directamente relacionada con el crecimiento y volumen de las partes vegetales sobre la

tierra. Sin embargo, el desplazamiento estacional de reservas hidrocarbonadas entre las porciones bajo y sobre la tierra, en la mayoría de los macrofitos acuáticos, requiere que esas estimaciones basadas en el volumen se utilicen sólo en los cálculos de producción anual a largo plazo, a no ser que las observaciones morfológicas indiquen otra cosa. El establecimiento de una relación constante entre brotes y volumen bajo tierra18, 26 justifica esas extrapolaciones. 3.

Métodos metabólicos

Los métodos metabólicos estiman la productividad macrofítica sobre la base de medidas a corto plazo del intercambio de carbono inorgánico y oxígeno, resultantes de la fotosíntesis y respiración macrofítica. Estas medidas a corto plazo (normalmente