Manual de Prácticas de laboratorio de bioquímica

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SERGI SÁNCHEZ ENRÍQUEZ SERGIO LUIS JAVIER FLORES ALVARADO CARMEN MAGDALENA GURROLA DÍAZ PATRICIA HEREDIA CHÁVEZ PATRICI

Manual de

prácticas de laboratorio de

TERCERA EDICIÓN

TERCERA EDICIÓN

Sergio Sánchez Enríquez, MD, PhD Médico Cirujano y Partero Especialidad en Ortopedia y Traumatología Maestría en Farmacología Doctorado en Biología Molecular en Medicina Miembro del Sistema Nacional de Investigadores (SNI-I) Perfil PROMEP Presidente de la Asociación Mexicana de Egresados de Ciencias de la Salud (AMECIS, A. C.) Laboratorio de Bioquímica, Departamento de Biología Molecular y Genómica Profesor Docente Titular, CUCS, Universidad de Guadalajara

ERRNVPHGLFRVRUJ MÉXICO • BOGOTÁ • BUENOS AIRES • CARACAS • GUATEMALA MADRID • NUEVA YORK • SAN JUAN • SANTIAGO • SAO PAULO AUCKLAND • LONDRES • MILÁN • MONTREAL • NUEVA DELHI SAN FRANCISCO • SIDNEY • SINGAPUR • ST. LOUIS • TORONTO

Director editorial: Javier de León Fraga Editor de desarrollo: Héctor F. Guerrero Aguilar Supervisora de producción: Ángela Salas Cañada

NOTA La medicina es una ciencia en constante desarrollo. Conforme surjan nuevos conocimientos, se requerirán cambios de la terapéutica. El(los) autor(es) y los editores se han esforzado para que los cuadros de dosificación medicamentosa sean precisos y acordes con lo establecido en la fecha de publicación. Sin embargo, ante los posibles errores humanos y cambios en la medicina, ni los editores ni cualquier otra persona que haya participado en la preparación de la obra garantizan que la información contenida en ella sea precisa o completa, tampoco son responsables de errores u omisiones, ni de los resultados que con dicha información se obtengan. Convendría recurrir a otras fuentes de datos, por ejemplo, y de manera particular, habrá que consultar la hoja informativa que se adjunta con cada medicamento, para tener certeza de que la información de esta obra es precisa y no se han introducido cambios en la dosis recomendada o en las contraindicaciones para su administración. Esto es de particular importancia con respecto a fármacos nuevos o de uso no frecuente. También deberá consultarse a los laboratorios para recabar información sobre los valores normales.

TERCERA EDICIÓN

Prohibida la reproducción total o parcial de esta obra, por cualquier medio, sin autorización escrita del editor.

DERECHOS RESERVADOS © 2014, respecto a la tercera edición, por McGRAW-HILL INTERAMERICANA EDITORES, S. A. de C. V. Prolongación Paseo de la Reforma 1015, Torre A, Piso 17, Col. Desarrollo Santa Fe, Delegación Álvaro Obregón C. P. 01376, México, D. F. Miembro de la Cámara Nacional de la Industria Editorial Mexicana, Reg. No. 736 ISBN: 978-1-4562-2012-9

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Impreso en México

Printed in Mexico

Colaboradores

PEDRO GARZÓN DE LA MORA

LUIS HUACUJA RUIZ

Médico Cirujano y Partero, Universidad de Guadalajara (U de G) Doctorado en Ciencias Biomédicas, U de G Profesor Investigador Titular, CUCS, U de G

Licenciatura en Biología, Maestría en Biología Molecular, UNAM Doctor en Ciencias, U de G Profesor Investigador Titular A, Instituto de Enfermedades Crónico-Degenerativas. CUCS, U de G

MERCEDES GONZÁLEZ HITA Químico Farmacobiólogo, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) Maestría en Nutrición y Metabolismo, Massachusetts Institute of Technology Doctorado en Bioquímica, Massachusetts Institute of Technology Profesora perfil PROMEP Cuerpo Académico de Estudio Multidisciplinario de Enfermedades Crónico Degenerativas, UDG-CA-533 Profesora Investigadora Titular C de Bioquímica, CUCS, U de G Perfil PROMEP

MARÍA DE LOURDES ISAAC VIRGEN Doctora en Ciencias. Maestría en Nutrición Química Farmacobióloga, Médica en Veterinaria y Zootecnista, U de G Profesora Investigadora Titular C, Departamento de Biología Molecular y Genómica, División de Ciencias Básicas. CUCS, U de G Perfil PROMEP Miembro del Sistema Nacional de Investigadores (SNI-1)

IRMA NOEMÍ LÚA RAMÍREZ Química Farmacobióloga, Universidad de Guadalajara (U de G) Académica del Departamento de Biología Molecular y Genómica, Laboratorio de Bioquímica. CUCS, U de G Maestría en Metodología de la Enseñanza, U de G

CARMEN MAGDALENA GURROLA DÍAZ Química Farmacobióloga, Maestría en Ciencias Biomédicas, Especialidad en Genética Humana, Universidad de Guadalajara (U de G) Doctora en Ciencias, Universidad Ruprecht-Karls de Heidelberg, Alemania Profesora Investigadora Titular B, Instituto de Enfermedades Crónico-Degenerativas, CUCS, U de G

BEATRIZ TERESITA MARTÍN MÁRQUEZ Química Farmacobióloga, Universidad de Guadalajara (U de G) Profesora Investigadora Asociada B. CUCS, U de G Maestría en Ciencias Biomédicas con Orientación en Inmunología, U de G

PATRICIA HEREDIA CHÁVEZ Química Farmacobióloga, Universidad de Guadalajara (U de G) Especialidad de Docencia en el Área de Bioquímica, Universidad Autónoma de Aguascalientes Especialidad en Docencia Universitaria, Universidad del Valle de Atemajac Maestría en Investigación en Ciencias de la Educación, U de G Académica del Departamento de Biología Molecular y Genómica, Laboratorio de Bioquímica. CUCS, U de G

MARTHA LETICIA ORNELAS ARANA Médica Cirujana y Partera, Universidad de Guadalajara (U de G) Doctorado en Genética Humana Miembro del Cuerpo Académico de Enfermedades Metabólicas CA-27, U de G Profesor Docente Asociado B Perfil PROMEP

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Colaboradores

GUILLERMO PÉREZ GARCÍA Médico Cirujano y Partero, Universidad de Guadalajara (U de G) Doctorado en Genética Humana Jefe del Laboratorio de Bioquímica. CUCS, U de G Miembro del Cuerpo Académico de Enfermedades Metabólicas CA-27, U de G Profesor docente titular C Perfil PROMEP

IRMA RAMOS RODRÍGUEZ Química Farmacobióloga, Universidad de Guadalajara (U de G) Licenciada en Nutrición, U de G Doctora en Ciencias de la Salud en el Trabajo, U de G Académica del Departamento de Biología Molecular y Genómica. Laboratorio de Bioquímica, CUCS, U de G

MERCEDES ROMERO GÓMEZ Química Farmacobióloga, Universidad de Guadalajara (U de G) Académica del Departamento de Biología Molecular y Genómica. Laboratorio de Bioquímica. CUCS, U de G Miembro del Cuerpo Académico de Enfermedades Metabólicas CA-27, U de G

MARÍA ROSALBA RUIZ MEJÍA Cirujana Dentista, Universidad de Guadalajara (U de G) Maestría en Salud Pública, U de G Profesora perfil PROMEP Coordinadora de Docencia del Departamento de Biología Molecular y Genómica Profesora Docente Titular. CUCS, U de G

SONIA URIBE LUNA Profesora Investigadora. Departamento de Clínicas Quirúrgicas, Instituto de Oftalmología y Ciencias Visuales. CUCS, U de G Doctora en Ciencias con especialidad en Microbiología, Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del Instituto Politécnico Nacional (IPN) Perfil PROMEP

Acerca de los autores

El doctor Sergio Sánchez Enríquez es médico cirujano y partero. Cuenta con una especialidad en ortopedia y traumatología, una maestría en farmacología y un doctorado en biología molecular en medicina, todos ellos por la Universidad de Guadalajara (U de G). Entre los cursos que ha impartido se cuentan los de fisiología humana, farmacología humana, terapéutica farmacológica, bioquímica y bioquímica clínica. Actualmente es Profesor Investigador Titular “C”, en el Centro Universitario de Ciencias de la Salud (CUCS), U de G. Tiene Perfil PROMEP y es miembro del Sistema Nacional de Investigadores (SNI-I). Responsable del Cuerpo Académico consolidado UDGCA-533 de Estudio multidisciplinario de las Enfermedades Crónico-Degenerativas. El doctor Luis Javier Flores Alvarado es médico, cirujano y partero, por la Facultad de Medicina de la U de G. Tiene una maestría en Ciencias, con especialidad en biología celular, por el Centro de Investigaciones y Estudios Avanzados. Es Profesor Investigador Titular “C”, en el CUCS, U de G. Posee perfil PROMEP y es miembro del Sistema Nacional de Investigadores (SNI-I). Ha tomado cursos de farmacología molecular, errores innatos

del metabolismo y métodos diagnósticos de las enfermedades por atesoramiento de glucógeno. Entre los cursos que ha impartido se cuentan los de bioquímica avanzada y fisiopatología molecular para estudiantes del doctorado en Farmacología. Es profesor del curso de Estructura y función celular. La doctora Carmen Magdalena Gurrola Díaz es Química Farmacobióloga y tiene maestría en Ciencias Biomédicas, con especialidad en Genética Humana, por la U de G. Tiene doctorado en Ciencias, por la Universidad Ruprecht-Karls de Heidelberg, Alemania. Actualmente es Profesora Investigadora Titular “C”, en el CUCS, U de G. Tiene perfil PROMEP y es miembro del Sistema Nacional de Investigadores (SNI-I), así como del Instituto de Enfermedades Crónico-Degenerativas. La doctora Patricia Heredia Chávez es Química Farmacobióloga por la U de G. Tiene especialidad de Docencia en el área de Bioquímica, por la Universidad Autónoma de Aguascalientes, y especialidad en Docencia Universitaria por la Universidad del Valle de Atemajac. Tiene también Maestría en Investigación en Ciencias de la Educación, por la U de G.

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Contenido

Colaboradores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Práctica 5. Regulación no específica de la actividad enzimática . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

Acerca de los autores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . vii Prólogo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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Presentación del manual. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

1

Guía del estudiante. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

2

Diagrama de flujo para la elaboración del caso integrador . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

3

Normas de seguridad en el laboratorio. . . . . . . . . . . . .

4

Acciones que se deben tomar en caso de accidente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Recomendaciones para tener éxito en las prácticas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

5

Práctica 1. Normas de bioseguridad y manejo de muestras biológicas, material, equipo y procedimientos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

7

• Irma Noemí Lúa Ramírez • Carmen Magdalena Gurrola Díaz • Patricia Heredia Chávez • Sergio Sánchez Enríquez

Práctica 6. Metabolismo de carbohidratos. . . . . . . . . . 47 • Sergio Sánchez Enríquez • Mercedes Elvira González Hita • Luis Javier Flores Alvarado

Práctica 7. Metabolismo de lípidos . . . . . . . . . . . . . . . 57 • Patricia Heredia Chávez • Irma Ramos Rodríguez • Mercedes Elvira González Hita • Sergio Sánchez Enríquez

4

Práctica 8. Metabolismo de compuestos nitrogenados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67 • Irma Noemí Lúa Ramírez • María Rosalba Ruiz Mejía • Beatriz Teresita Martín Márquez • Luis Javier Flores Alvarado • Sergio Sánchez Enríquez

• Mercedes Romero Gómez • María de Lourdes Isaac • Virgen Luis Huacuja Ruiz • Irma Ramos Rodríguez • Martha Leticia Ornelas Arana • Guillermo Pérez García

Práctica 9. Extracción de DNA de células vegetales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73 • Sonia Uribe Luna • Irma Noemí Lúa Ramírez • María Rosalba Ruiz Mejía • Mercedes Romero Gómez • Sergio Sánchez Enríquez

Práctica 2. Agua y soluciones. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 • Mercedes Romero Gómez • María de Lourdes Isaac Virgen • Luis Huacuja Ruiz • Irma Ramos Rodríguez • Sergio Sánchez Enríquez

Apéndices 1. Definición de prefijos, unidades y constantes físicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77

Práctica 3. pH y amortiguadores . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

• Sonia Uribe Luna

• Sonia Uribe Luna • Patricia Heredia Chávez • Sergio Sánchez Enríquez • Pedro Garzón de la Mora

2. Constantes biológicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79 • Mercedes Romero Gómez

3. Determinación del gasto energético diario (GED). . . 81 • Sergio Sánchez Enríquez • Patricia Heredia Chávez

Práctica 4. Aminoácidos y proteínas . . . . . . . . . . . . . . 29 • Carmen Magdalena Gurrola Díaz • María de Lourdes Isaac Virgen • Sergio Sánchez Enríquez

4. Historia clínica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87 • Sergio Sánchez Enríquez ix

Prólogo

La Universidad de Guadalajara, y en particular el Centro Universitario de Ciencias de la Salud, han hecho un enorme esfuerzo para que los alumnos involucrados en el proceso de enseñanza-aprendizaje relacionado con las ciencias básicas impartidas, tengan en sus manos las herramientas necesarias para entender y comprender una de las materias más importantes en su formación: la Bioquímica. Este Manual de prácticas de Laboratorio de bioquímica conducirá a nuestros alumnos al interior de la mayor parte de conceptos de bioquímica en sus aspectos fundamentales. Así, es evidente que este manual complementará los conocimientos que serán impartidos en el aula de manera teórica, fundamentados en la experiencia de maestros de bioquímica que han impartido dicha asignatura por muchos años. La metodología utilizada y fundamentada en este Manual de prácticas permite de manera sencilla, pero al mismo tiempo científica y validable, que el alumno navegue por experimentos y reacciones que sin duda alguna lo llevarán a preguntarse de qué manera podrá aplicar

estos conocimientos, obtenidos en un salón de laboratorio, más tarde en su carrera profesional. De tal manera, estudiantes de las carreras de medicina, odontología, nutrición, enfermería, cultura física y del deporte, y técnicos superiores en radiología e imagen, encontrarán en este Manual de prácticas un recurso didáctico y aplicativo importante para el desarrollo de un ejercicio intelectual que encontrará su nicho de aplicabilidad no sólo durante su estancia en nuestro Centro Universitario de Ciencias de la Salud, sino tal vez más allá de su entorno. Los autores de este manual de prácticas, pertenecientes a la Academia de Bioquímica, han hecho un esfuerzo honesto y auténtico para que nuestros alumnos de Bioquímica “aprendan a no temerle” más al proceso de aprendizaje de la Bioquímica. Que aprendan a entender que los procesos metabólicos, y que las reacciones interiorizadas en cada célula de nuestro cuerpo, son más luminosas y fáciles de entender de lo que aparentan. Dr. en C. Juan Armendáriz Borunda

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Presentación del manual

El presente Manual de prácticas de bioquímica se ha diseñado para realizar actividades en el laboratorio y extra-aula con el fin de que cada uno de los estudiantes de Ciencias de la Salud fortalezca o adquiera nuevas habilidades y conocimientos de Bioquímica con experiencias propias o cercanas a ellos. En el Manual de prácticas se contemplan tres aspectos a desarrollar:

res o diabetes. A lo largo del curso práctico se evalúan parámetros antropométricos y bioquímicos que presentan una correlación integral. El análisis y la interpretación de estos datos en su conjunto representan el Caso integrador del Programa por Competencias de Bioquímica. Por ello, los esfuerzos de profesores y estudiantes deben encaminarse a la recolección, el análisis de los datos y la interpretación de los resultados, para concluir con el Seminario de Integración Metabólica. Teniendo como meta la elaboración del Caso integrador que refleje el aprendizaje obtenido, se invita a los estudiantes a participar y cooperar en el desarrollo de cada una de las prácticas. En la Guía del estudiante de este manual se encuentran la programación y las condiciones en que el alumno debe asistir a su toma de muestra. Esta experiencia permite al participante y a sus compañeros contar con el material biológico apropiado para la realización de las prácticas. El estudiante tiene la vivencia de ser un paciente, lo que le permite identificar y valorar los obstáculos que podrían afectar el éxito de un diagnóstico. Esta actividad también permite sensibilizar al estudiante para que desarrolle habilidades, al solicitar que un paciente se incorpore a un régimen nutricional y modifique su actividad física, sus actitudes o sus hábitos nocivos. Al concluir la asignatura de Bioquímica, el estudiante tendrá las bases para continuar con su programa formativo y habrá adquirido nuevas actitudes y valores requeridos en un profesional de Ciencias de la Salud. Los profesores, los técnicos, los instructores y el personal administrativo de la Academia de Bioquímica dan la bienvenida a los estudiantes y les ofrecen su mejor disposición para que tengan una productiva estancia en el laboratorio de Bioquímica.

• Empleo de equipo e introducción a los conceptos básicos del laboratorio de Bioquímica. • Ejecución de experimentos que manifiestan las propiedades estructurales y químicas del agua y diferentes biomoléculas. • Fundamentos del análisis bioquímico, su aplicación en la clínica e integración metabólica. Las prácticas se desarrollan en concordancia con el programa de estudios por competencias, teniendo como eje conceptual la relación del hombre con su medio nutricio. Por ello, en la programación de las prácticas se ha considerado que cada una debe representar la actividad integradora de cada unidad. Con el fin de reforzar los conocimientos adquiridos, en cada práctica se incluyen actividades de aprendizaje, en las que el estudiante debe realizar una investigación bibliográfica que sustente la respuesta dada a la actividad correspondiente. Con el fin de evitar un aprendizaje fragmentado de la bioquímica y facilitar la integración del metabolismo de los nutrientes, las muestras biológicas deben obtenerse de los alumnos, bajo condiciones específicas. Para ello, se requiere la participación de estudiantes que presenten sobrepeso, presión arterial elevada, antecedentes familiares relacionados con enfermedades cardiovascula-

1

Guía del estudiante

3. En la Práctica núm. 6 se tomará sangre en ayuno de

A continuación se describe el proceso para desarrollar el ejercicio de la integración metabólica. Asimismo, para una mejor comprensión, se acompaña de un diagrama de flujo.

12 horas, así como a los 30 y 90 min después de un desayuno habitual, a los tres estudiantes con predisposición de desarrollar diabetes mellitus. La sangre se centrifugará para la obtención de plasmasuero. La determinación de la glucosa deberá realizarse dentro de los 90 min de haberse tomado la muestra, por lo que se recomienda que se extraiga la muestra de sangre y tome su desayuno antes de iniciar con la explicación de la práctica. En caso de que no se hubiese logrado determinar la glucosa posprandial en la sesión de la Práctica núm. 6, determinarla en la Práctica núm. 7. Si la glucemia posprandial está por arriba de 160 mgdl, se recomendará al estudiante repetir su análisis en un laboratorio particular y solicitar una consulta médica. A partir de esta fecha, los estudiantes en estudio iniciarán una dieta, indicada por un nutriólogo de la Unidad de Síndrome Metabólico del Laboratorio de Bioquímica (Departamento de Bioquímica y Genómica del CUCS), y 30 min de actividad física diaria (caminata). En otra ciudad:

1. El estudiante realizará como actividades prelimina-

res lo siguiente: a) El llenado de las actividades extra-aula, que se

encuentra en la Práctica núm. 6 (Metabolismo de carbohidratos) y deberá completarse dos semanas antes de su realización. El registro tendrá la siguiente información: • • • • • • • •

Edad Peso Estatura Índice de masa corporal (IMC) Diámetro de cintura Porcentaje de grasa por bioimpedancia Presión arterial Factores de riesgo para diabetes mellitus tipo 2

Con excepción de la presión arterial y el porcentaje de grasa, los cuales se determinarán durante la Práctica núm. 6, todos los demás datos serán obtenidos por el estudiante. Nota: la forma apropiada para obtener cada uno de los datos se indica en la Práctica núm. 6.

4. En la Práctica núm. 7 se tomarán muestras de sangre

(ayuno de 12 horas) a los estudiantes sometidos a dieta y actividad física para la obtención de plasma suero. Se determinarán colesterol, triacilgliceroles y c-HDL de las muestras. Se integrarán los resultados de esta práctica con los de la glucemia determinada en la Práctica núm. 6, para determinar si el estudiante presenta síndrome metabólico o está en riesgo de padecerlo.

b) El estudiante también llenará la información so-

bre sus antecedentes familiares de padecer diabetes mellitus. Los datos provendrán de al menos tres familiares directos entre 18 y 55 años de edad, en el siguiente orden de prioridad: padre, madre, hermanos, abuelos y tíos. La información será recabada para completar el registro localizado en la Actividad extra-aula de la Práctica núm. 6.

5. En la Práctica núm. 8 se determinarán los compues-

tos nitrogenados de las muestras. Se compararán los resultados para conocer si existe una relación entre los valores encontrados en las prácticas previas.

2. El profesor revisará la información solicitada en el

punto anterior dos semanas antes de realizar la Práctica núm. 6 y seleccionará a tres estudiantes, entre 18 y 35 años, que presenten factores de riesgo de diabetes mellitus.

6. Se recopilarán todos los datos para llevar a cabo un

análisis de los mismos y presentarlos en el Seminario de Integración Metabólica. 2

Diagrama de flujo para la elaboración del caso integrador Actividad extra-aula

1

a. Llenar la información clínica y antropométrica del estudiante, siguiendo las instrucciones de la Práctica núm. 6. b. Incluir la información de los antecedentes familiares.

Actividad preliminar para la Práctica núm. 6

2

a. Determinar el porcentaje de grasa empleando la báscula de bioimpedancia. b. Determinar el IMC. c. Determinar el riesgo de desarrollar diabetes mellitus tipo 2. d. Determinar la predisposición al desarrollo del síndrome metabólico. e. El profesor seleccionará con dos semanas de anticipación a tres estudiantes con predisposición a desarrollar síndrome metabólico y les dará indicaciones para la toma de muestras.

Actividad de la Práctica núm. 6

3

a. Obtener suero o plasma en ayuno de 12 horas. b. Inmediatamente después de la toma de muestra el estudiante ingerirá su desayuno habitual. c. Determinar glucosa basal y posprandial a los 30 y 90 min. Si los valores a los 90 min se encuentran por arriba de 160 mgdl, realizar recomendaciones al estudiante. d. Iniciar una dieta adecuada recomendada por un nutriólogo y 30 min de caminata diaria. Mantener dieta y ejercicio por 15 días.

Actividad de la Práctica núm. 7

4

a. Obtener muestra de sangre en ayuno de 12 horas de los estudiantes que se encuentren bajo una dieta balanceada y ejercicio. b. Determinar glucosa, lípidos y triacilgliceroles.

Actividad de la Práctica núm. 8

5

a. Determinar la concentración de los compuestos nitrogenados de las muestras basales, posprandiales y después de dieta y ejercicio. b. Recabar la información de todos los datos obtenidos.

Seminario de Integración Metabólica Presentación del CASO INTEGRADOR.

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Normas de seguridad en el laboratorio

El funcionamiento correcto del laboratorio está sujeto al cumplimiento de las siguientes normas:

11. Evitar agregar agua sobre ácidos para prevenir que-

maduras por proyección. Para diluir cualquier ácido, se vierte el ácido sobre el agua y nunca agua sobre ácido. Emplear baño de hielo o baño de agua fría para preparar soluciones diluidas de ácidos.

1. El alumno ingresará al laboratorio con bata, la cual

debe ser blanca y de manga larga. Es indispensable portar la bata abotonada y guardar el comportamiento apropiado durante la estancia en el laboratorio.

12. Mantener los frascos de reactivos tapados para evitar

2. El alumno se familiarizará con los sitios en donde se

13. Depositar en los recipientes apropiados las puntillas

derrames.

encuentran localizadas las regaderas, extinguidores, botes de basura, caja para material punzocortante, bolsa roja para desecho de material biológico, etc. El material punzocortante y desechos biológicos deberán depositarse en los contenedores correspondientes.

y lavar las pipetas inmediatamente. 14. Utilizar guantes desechables cuando se manejen

muestras biológicas. Considerar que cualquier material biológico es potencialmente infeccioso aun cuando proceda de personas aparentemente sanas.

3. En ningún momento se permitirá la aplicación de

15. Lavarse las manos con agua y jabón antes de salir del

cosméticos, fumar yo ingerir alimentos dentro del laboratorio.

laboratorio. 16. Reportar inmediatamente al profesor del laboratorio

4. Tomar la postura más cómoda para trabajar correc-

cualquier accidente o lesión que suceda para que se tomen las medidas apropiadas.

tamente con el fin de tener el control y precisión de los movimientos durante el uso de materiales, equipos y reactivos.

Acciones a tomar en caso de accidente

5. Limpiar las mesas de trabajo antes y después de cada

práctica, así también durante la práctica si se ha derramado algún reactivo o muestra biológica.

1. En caso de que exista contacto de ácidos o bases con

6. Para evitar quemaduras, se deberán apagar mecheros

la piel, ojos o boca. Se recomienda enjuagar el área con abundante agua con el propósito de disminuir su acción por dilución; para ello en el laboratorio existen las tarjas, regaderas especiales y lavaojos.

yo planchas calientes cuando éstos no se utilicen. Así también, se deberán emplear gradillas o pinzas para sostener o transportar tubos calientes. 7. Mantener las sustancias químicas inflamables aleja-

2. En caso necesario llamar inmediatamente a los telé-

das de fuego, planchas calientes, o ambos.

fonos de urgencias en Guadalajara: 066; Cruz Roja (3613-1550, 3614-2707 y 3614-5600); Cruz Verde (3614-5252, 3613-1572, 3812-5143 y 3643-7190).

8. No se deberá olfatear yo probar reactivos o solu-

ciones. No se debe mirar nunca el interior de un tubo de ensayo que se esté calentando, ni apuntar hacia alguna persona porque el contenido podría proyectarse en cualquier momento. La misma precaución debe tomarse cuando se mezclen reactivos o se agiten vigorosamente los tubos.

En otra ciudad:

9. Utilizar guantes de látex y gafas de seguridad cuando

se manejen ácidos, hielo seco o sustancias desconocidas.

3. En caso de ingestión de corrosivos NUNCA provo-

car vómito. Si existe ingestión de ácidos hacer beber inmediatamente una solución de bicarbonato de sodio (2 cucharadas soperas en 2 vasos de agua); en

10. Utilizar pipetores o perilla de goma para la medición

de los líquidos corrosivos, ácidos, bases, sustancias volátiles, venenos, entre otros. No aspirar con la boca. 4

caso de ingestión de soluciones cáusticas (hidróxido de sodio o de potasio) ingerir una cucharada de vinagre o 25 ml de jugo de limón en agua. 4. Al ingerir otras sustancias químicas hacer vomitar a

la persona accidentada. Vigilar que exista una ventilación adecuada y mantener las vías aéreas permeables mientras se traslada al hospital. 5. Si hay derramamiento de un ácido, neutralizar agre-

gando bicarbonato de sodio y en caso de bases agregar ácido acético (vinagre). NUNCA tratar de adicionar agua. Emplear bata, guantes y gafas durante la limpieza.

2. Los útiles y objetos personales deberán ser colocados

en la parte inferior de las mesas de trabajo. 3. El material con el que se trabajará deberá estar per-

fectamente limpio antes y después de la práctica. 4. Antes de preparar las mezclas de reacción etiquetará

apropiadamente cada uno de los tubos con marcador indeleble. 5. Por ningún motivo alterar el orden de adición de

reactivos en la práctica. 6. Utilizar agua destilada en todos los experimentos en

los que se solicite agregar agua. 7. Mantener los frascos de reactivos tapados para evitar

Recomendaciones para tener éxito en las prácticas 1. El alumno leerá la práctica completa y la discutirá

con el profesor antes de la realización de la misma.

contaminación yo vaporización de los mismos. 8. Utilizar sólo la cantidad requerida de reactivos para

evitar el desperdicio de los mismos. 9. Procurar no regresar excedentes de reactivo al frasco

de donde se extrajo el mismo.

Práctica

Normas de bioseguridad y manejo de muestras biológicas, material, equipo y procedimientos • Mercedes Romero Gómez • María de Lourdes Isaac Virgen • Luis Huacuja Ruiz

Normas de bioseguridad general a) Mantener el lugar de trabajo en condiciones higiéni-

cas y aseadas. b) Evitar maquillarse, fumar, comer o beber en el sitio

de trabajo. c) No guardar alimentos en los equipos donde se refri-

geran sustancias contaminantes o químicas.

• Irma Ramos Rodríguez • Martha Leticia Ornelas Arana • Guillermo Pérez García

n) Evitar el cambio de los elementos punzocortantes de

un recipiente a otro. o) Evitar el reciclaje de material contaminado, como

agujas, jeringas u hojas de bisturí. p) Desinfectar y limpiar las superficies y los equipos de

trabajo, en caso de contaminación. q) En caso de que se rompa material de vidrio contami-

d) Manejar a todo paciente como si pudiera estar in-

fectado. e) Lavarse con cuidado las manos antes y después de f)

g)

h)

i) j)

k)

l) m)

cada procedimiento. Utilizar de forma sistemática guantes plásticos o de látex en procedimientos en que se manipulan sustancias biológicas, se maneja instrumental o equipo contaminado en la atención de los pacientes, o en ambas situaciones. Abstenerse de tocar con las manos enguantadas alguna parte del cuerpo y de manipular objetos diferentes a los requeridos durante el procedimiento. Emplear mascarilla y protectores oculares durante procedimientos que puedan generar salpicaduras, gotitas aerosoles de sangre u otros líquidos corporales. Usar bata durante la estancia en el laboratorio. Mantener los elementos de protección personal en condiciones óptimas de aseo, en un lugar seguro y de fácil acceso. Si se tienen lesiones exudativas o dermatitis serosas, evitar la atención directa de pacientes hasta que éstas hayan desaparecido. Utilizar las técnicas correctas en la realización de todo procedimiento. Manejar con estricta precaución los elementos punzocortantes y desecharlos en los recipientes indicados, a prueba de perforaciones.

1

r)

s) t)

u)

v)

w)

nado con sangre u otro líquido corporal, recoger los trozos con escoba y recogedor (nunca con las manos) y depositarlos en el contenedor para punzocortantes. Los recipientes para transporte de muestras deben ser de material irrompible y contar con cierre hermético (tapón de rosca). Manipular, transportar y enviar las muestras en recipientes seguros, con tapa y rotulación adecuada. A su vez, transportar las gradillas en recipientes herméticos, de plástico o acrílico, que retengan fugas o derrames accidentales. Además, deben ofrecer facilidad de lavado. Restringir el ingreso a las áreas de alto riesgo biológico a personal no autorizado, a quien no utilice los elementos de protección personal y a los niños. Disponer el material patógeno en bolsas resistentes, de color rojo, que se identifiquen con el símbolo de riesgo biológico. Las personas sometidas a tratamiento con inmunodepresores no deben trabajar en áreas de riesgo biológico.

Medidas generales de protección a) Lavarse las manos con frecuencia y al quitarse los

guantes. b) Usar guantes cuando se manejen líquidos biológicos. c) Establecer y respetar áreas sucias y áreas limpias.

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Manual de prácticas de laboratorio de bioquímica

d) No tocar las áreas sin contaminación con guantes e) f) g) h) i) j)

contaminados. Utilizar el pipetor para aspirar sustancias corrosivas a través de la pipeta. Ingresar sin maquillaje al laboratorio. Es riesgoso consumir alimentos o masticar chicle en las áreas de trabajo. No fumar en las áreas de trabajo. No tapar de nuevo las agujas. Depositar los objetos punzocortantes en los contenedores adecuados.

Lavado de manos El lavado de manos es el método más eficaz para prevenir y evitar infecciones. Debe realizarse: a) Cuando exista contaminación de sangre o líquidos

corporales. b) Después de completar la práctica y antes de abando-

nar el área de trabajo. c) Cuando se hayan quitado los guantes. d) Antes de comer, beber, aplicarse maquillaje, cambiar-

se lentes de contacto. e) Antes y después de ir al baño.

Método del lavado de manos a) Abrir la llave del agua. b) Usar una cantidad generosa de jabón no abrasivo. c) Tallar bien todas las superficies de las manos, cuando d) e) f) g) h) i) j)

menos durante 10 segundos. Limpiar bien abajo y alrededor de las uñas. Enjuagar con las manos hacia abajo. Evitar las salpicaduras. Secarse bien con toallas de papel. Cerrar la llave utilizando una toalla de papel. Tirar la toalla en un cesto con bolsa negra. Utilizar una crema para evitar resequedad o irritación.

Medidas de seguridad para el manejo de muestras biológicas Introducción Las medidas de seguridad son muy importantes para la persona que toma muestras biológicas, porque su manejo conlleva el riesgo de transmisión de una gran cantidad de infecciones, como hepatitis y VIH, por mencionar algunas. Por este motivo, se debe considerar que todo paciente al que se le tome una muestra biológica puede estar infectado. Las normas deben aplicarse para todos los pacientes, sin importar el diagnóstico. Las medidas que se tomen deben permitir que el personal trabaje en un entorno físico seguro, y que éste conozca los riesgos y las medidas de protección adecua-

das, según las normas oficiales mexicanas NOM-017STPS-2008 (equipo de protección personal) y NOM087-ECOL-SSA1-2002 [manejo de residuos peligrosos biológico-infecciosos (RPBI]).

Equipo de protección a) Bata. Que sea de manga larga y algodón; mantenerla

cerrada para protegerse de salpicaduras. b) Guantes. Usarlos durante la práctica; deben ajustarse

bien. En caso de que se rompan, reemplazarlos con unos nuevos. c) Cubrebocas. Utilizarlo en áreas donde se produzcan salpicaduras o aerosoles. d) Lentes de seguridad. Usarlos en áreas donde se produzcan salpicaduras o aerosoles.

Limpieza del área y el material de trabajo a) El área y el material de trabajo deben mantenerse

limpios y libres de contaminantes. b) El material de desecho debe colocarse en los conte-

nedores especiales. c) En caso de derrames de líquidos biológicos, debe ab-

sorberse el derrame con toallas de papel y desecharse en el contenedor adecuado. d) Desinfectar el sitio del derrame con una solución de hipoclorito de sodio a 5% en dilución 1:10; dejar 30 minutos, absorber con toallas de papel y lavar con agua para quitar el olor.

Obtención y manejo de muestras biológicas Introducción En las prácticas del laboratorio de bioquímica se realizan algunas pruebas analíticas en muestras de sangre, orina, o ambas. Estas pruebas se realizan con el fin de desarrollar habilidades formativas y aplicar los conocimientos teóricos en el laboratorio. Es importante saber cómo obtener y manejar las muestras biológicas para llegar a resultados confiables, además de conocer las medidas de seguridad que deben poner en práctica las personas que obtienen las muestras y de las que se obtienen éstas. También es importante conocer el aspecto ético en la toma de una muestra biológica.

Aspectos éticos Debe informarse a la persona que se planea obtener una muestra, el tipo de ésta, las pruebas que se realizan con ellas, y los resultados esperados y obtenidos.

Práctica 1. Normas de bioseguridad y manejo de muestras biológicas, material, equipo y procedimientos

Es importante obtener el consentimiento de esta persona. El tipo de consentimiento puede ser verbal o escrito, de acuerdo con los objetivos. En caso de que se pretenda conocer el estado de salud, puede ser verbal. Si es con fines de investigación, el consentimiento debe exponerse por escrito, indicando el procedimiento y las repercusiones que puede tener para su persona (sobre todo si es una muestra para análisis del DNA o identificación de VIH), y la hoja de aceptación debe tener firma de consentimiento.

A

B

C

D

E

F

9

Toma de sangre Composición de la sangre El corazón y los vasos sanguíneos de un adulto contienen casi 5 litros de sangre. Ésta se compone de células suspendidas en un líquido llamado plasma. El color de la sangre se debe a los eritrocitos (glóbulos rojos), que contienen el pigmento hemo; también hay leucocitos (glóbulos blancos) y trombocitos (plaquetas).

Suero y plasma Cuando se extrae sangre y se deja reposar en un recipiente de vidrio por algunos minutos, ésta se coagula, debido a la precipitación de una proteína plasmática a la que se le denomina fibrinógeno, que forma hebras de fibrina insoluble. Las células sanguíneas quedan atrapadas en una red de fibrina que poco a poco se contrae y libera un líquido llamado suero. Éste no contiene fibrinógeno ni algunos factores de la coagulación, porque se han consumido durante la formación del coágulo. El plasma, a diferencia del suero, sí contiene factores de coagulación; es posible obtener plasma, si el tubo donde se recolecta la sangre tiene un anticoagulante.

Obtención de sangre Cuando se requiere una cantidad pequeña de sangre, puede obtenerse puncionando la piel del dedo o el lóbulo de la oreja con un instrumento cortante (lanceta). En lactantes, se puede obtener del talón. En primer lugar, se limpia la piel con alcohol (etanol a 95% v/v) y se deja secar. Se inserta una lanceta o aguja estéril en la piel, a 1 o 2 mm de profundidad. La primera gota de sangre que sale de la herida se limpia con torunda de algodón. Las gotas siguientes se recogen con un portaobjetos para frotis, con una pipeta o con algún otro recipiente para pruebas. Debe obtenerse una cantidad de sangre mayor de 0.5 ml por venopunción. Por lo general, se prefiere sangre venosa para la mayor parte de exámenes, y es recomendable obtener una mayor cantidad, en caso de que se necesite repetir la prueba. Es común que se emplee una vena del brazo: se aplica un torniquete para bloquear la circulación venosa, se selecciona alguna vena adecuada por su calibre y prominencia y se limpia la piel con alcohol. Una

Figura 1-1. Técnica para la extracción de sangre de vena periférica. A, colocación del torniquete. B, antisepsia previa a la venopunción. C, venopunción y adaptador vacutainer. D, extracción de la sangre con tubo vacutainer. E, retiro de la aguja. F, depósito de la muestra de sangre en tubos con anticoagulantes.

vez que el alcohol se ha evaporado, se introduce una aguja afilada, adaptada a una jeringa de tamaño adecuado y estéril; enseguida se tira del émbolo de la jeringa para que la sangre penetre en ésta. En cuanto se ha obtenido una cantidad suficiente, se libera la presión ejercida sobre el brazo y se extrae la aguja. Se aplica una torunda de algodón estéril en el sitio de la punción y se ejerce presión firme durante medio minuto para evitar escurrimiento de la sangre en los tejidos circunvecinos. Debe quitarse la aguja de la jeringa antes de distribuir la sangre en los tubos de ensayo (figura 1-1).

Anticoagulantes Si se necesita suero, puede verterse la sangre en el interior de un tubo de ensayo esterilizado. Si se necesita sangre total o plasma, debe emplearse algún anticoagulante; el más común para la mayor parte de exámenes es el EDTA (ácido etilen-diamino-tetra-acético). El citrato de sodio a 3.8% también es un anticoagulante. La heparina es un anticoagulante antitrombocítico que se usa en pruebas en que no se desea la eliminación de iones calcio.

10

Manual de prácticas de laboratorio de bioquímica

Toma de muestra de orina

para cultivos deben obtenerse por sondeo o aspiración suprapúbica con aguja.

Varones Casi siempre, resulta sencillo obtener una muestra de orina limpia a mitad de la micción. De manera sistemática, pueden proporcionarse instrucciones por escrito o colocarse en la pared del laboratorio. El procedimiento debe ser el siguiente: 1. Retracción del prepucio (fuente usual de contamina-

ción de la muestra) y aseo del meato con cloruro de benzalconio o hexaclorofeno. 2. Eliminar la primera parte del chorro (15 a 30 ml). 3. Reunir la siguiente porción (de 50 a 100 ml) en un recipiente estéril para muestras, que se debe tapar de inmediato. 4. Vaciar por completo la vejiga en el sanitario. Enseguida se preparará una parte de la muestra para exámenes macroscópico y microscópico; el resto se guarda en un recipiente estéril para cultivos posteriores, si son necesarios.

Mujeres Es casi imposible obtener, sin ayuda, una muestra limpia, satisfactoria, a mitad de la micción. Si la paciente no está preparada, su orina no resulta útil, a menos que sea por completo normal. El mejor método para reunir una muestra limpia a mitad de la micción en mujeres es el siguiente: 1. Colocar a la paciente en la mesa de exploración, en

posición de litotomía. 2. Asear la vulva y el meato uretral con cloruro de ben-

zalconio o hexaclorofeno. 3. Separar los labios y pedir a la paciente que inicie la

micción en un recipiente que se conserva cerca de la vulva; una vez que se han eliminado los primeros 10 a 20 ml de orina, reunir los siguientes 50 a 100 ml en un recipiente estéril, que se tapa de inmediato. 4. A continuación, permitir que la paciente vacíe por completo la vejiga. Como esta técnica exige gran esfuerzo, es aceptable pedir a la paciente que obtenga en el sanitario una muestra inicial en un recipiente no estéril. Si los resultados del análisis general son normales, no está indicado hacer más estudios; en caso contrario, hay que obtener una muestra de orina con una técnica más exacta.

Medidas a seguir en caso de exposición a líquidos biológicos Cuando haya exposición a líquidos biológicos (punciones con aguja contaminada, salpicadura de mucosas, etc.) se debe avisar al profesor, al técnico responsable del grupo, o a ambos. a) Lavar el área afectada con agua abundante. b) Realizar los siguientes exámenes, tanto a la muestra

contaminada como a la persona afectada: • Antígenos de superficie contra virus de la hepatitis B. • Anticuerpos contra VIH. • Anticuerpos contra virus de la hepatitis C.

Material, equipo y procedimientos Introducción La aplicación de algunos de los conocimientos teóricos obtenidos en el salón de clases se logra mediante prácticas de laboratorio en que se requiere familiaridad con la utilidad y el manejo apropiados del equipo de laboratorio, como espectrofotómetro, centrífuga, potenciómetro, baños de temperatura constante, placa caliente, agitador magnético, material de vidrio, etc. Asimismo, el estudiante debe emplear el vocabulario apropiado y los conceptos de uso común en el laboratorio. En la figura 1-2 se muestran algunos de los materiales y equipos más utilizados en el laboratorio.

Objetivo general Manejar adecuadamente el material y equipo de laboratorio.

Objetivos específicos Identificar los materiales y equipos de uso común en el laboratorio. Utilizar de manera apropiada algunos de los equipos de laboratorio. Materiales y equipo

Niños Obtener muestras satisfactorias de orina en niños pequeños puede representar un desafío. La orina para otros análisis, como cultivos bacterianos, puede obtenerse de niños y niñas al cubrir el meato uretral aseado con una bolsa de plástico; por lo general, las muestras de orina

• • • • •

Vasos de precipitado Matraz Erlenmeyer Matraces aforados de diferentes capacidades Pipetas graduadas de 1, 5 y 10 ml Micropipetas con puntas

Práctica 1. Normas de bioseguridad y manejo de muestras biológicas, material, equipo y procedimientos

Figura 1-2. Materiales y equipo de uso frecuente en el laboratorio de bioquímica. A, tubos de ensayo de diferentes capacidades y gradilla. B, matraz aforado. C, matraz Erlenmeyer. D, probetas de diferente volumen. E, placa caliente. F, agitador eléctrico (vórtex).

A

D

• • • • • • • • • • • • •

Probetas Buretas Embudos Tubos de ensayo 13 × 100 Gradillas Pinzas para tubos Balanza granataria Plato caliente Agitador magnético Vórtex Espectrofotómetro Báscula de bioimpedancia Centrífuga

Centrifugación La centrifugación es un método empleado para separar partículas con base en la velocidad de sedimentación de cada una de ellas, como resultado de la fuerza centrífuga a la que se les somete.

Fundamento Una esfera de masa m y de volumen específico V, que cae a través de un medio viscoso de densidad ρ, bajo la influencia de un campo gravitacional, alcanza una velocidad terminal νt. En analogía a la caída libre de una esfera en un campo gravitacional, una molécula (de masa m y volumen específico parcial V) que sedimenta a través de un medio viscoso en un campo sometido a la fuerza centrífuga, alcanza también una velocidad νt. De aquí se deduce que la aceleración centrífuga ω2x reemplaza la aceleración gravitacional g. Al cociente de νtω2x, que re-

B

11

C

E

F

presenta la velocidad por unidad de aceleración angular, se le denomina coeficiente de sedimentación y se le simboliza con s. Su dimensión es (cm · s−2)(cm · s−2) ≡ s. Una unidad conveniente para s es el Svedberg, llamada así en honor de T. Svedberg, quien fue el precursor en las investigaciones sobre sedimentación de partículas por ultracentrifugación. Un Svedberg se define como 10–13 s. La velocidad y el tiempo con el que se somete una muestra a centrifugación para separar sus componentes depende de la distancia que recorren las partículas, además de la viscosidad del medio. Esta distancia se relaciona con la forma y el tamaño del rotor; por ello, en las centrífugas suelen seleccionarse las revoluciones por minuto (rpm). Debido a que la aceleración angular es diferente a la lineal, se debe realizar la conversión de una forma a la otra de acuerdo con la siguiente ecuación: Vs = ω2 · ref · s Vs = velocidad de sedimentación (cm · s−1) ω = velocidad angular (radianes · s−1) r = radio efectivo (cm) s = coeficiente de sedimentación S (Svedberg = 10−13 s) S=

Mr (1 − V · ρ) f

Mr = masa molecular relativa V = volumen específico parcial de la partícula (cm3 × g–1) ρ = densidad de la solución (g × cm–3) f = coeficiente friccional

12

Manual de prácticas de laboratorio de bioquímica

Centrífuga El equipo empleado para realizar la centrifugación es la centrífuga. Está compuesta por un motor eléctrico unido a un dispositivo que gira a gran velocidad alrededor de un eje vertical, el rotor o corona; provoca el aumento de atracción gravitacional en el fondo del tubo que contiene la muestra. El resultado de toda centrifugación es la separación de dos fases: una insoluble, el residuo o precipitado, y una líquida, el sobrenadante. El uso adecuado de la centrífuga requiere el seguimiento de estas acciones:

Cuadro 1-1. Características del espectro UV y la luz visible. Nombre de la longitud de onda

Muestra absorbida

Región espectral absorbida en nm

Verde azuloso

Rojo

Visible

620 a 700

Azul verdoso

Anaranjado

Visible

600 a 620

Azul

Amarillo

Visible

575 a 600

Violeta

Verde amarillento

Visible

555 a 575

Púrpura

Verde

Visible

505 a 555

Rojo

Verde azuloso

Visible

495 a 505

Anaranjado

Azul verdoso

Visible

475 a 495

Amarillo

Azul

Visible

430 a 475

Verde amarillento

Violeta

Visible

380 a 430

—

No visible

UV

220 a 380

—

No visible

UV lejana

180 a 220

Color de la luz

1. En la centrífuga, los tubos deben colocarse por pares,

uno frente al otro, de acuerdo con su peso. 2. Aumentar la velocidad poco a poco, hasta que se al-

cance la velocidad requerida, para no forzar el motor. 3. Permitir que el rotor de la centrífuga se detenga por

su propia inercia, sin tratar de detenerlo con las manos. 4. Levantar la tapa de la centrífuga hasta que el rotor quede inmóvil por completo. 5. En caso de ruptura de un tubo dentro de la centrífuga, debe hacerse un aseo completo de inmediato, empleando desinfectantes como cloro y benzal. Debido a la enorme fuerza que puede alcanzar el rotor, el mal uso de la centrífuga representa un peligro, si no se utiliza de manera apropiada. En la figura 1-3 se muestra una centrífuga clínica.

Espectrofotometría La base de la colorimetría y la espectrofotometría es que muchas sustancias tienen color propio, o pueden dar lugar a productos finales de color en ciertas reacciones químicas. Hay una relación entre la intensidad del color y la concentración del producto. Es preciso conocer las leyes físicas en que se basan los instrumentos de medición.

Espectrofotómetro A

B

Figura 1-3. A, centrífuga analítica desde su aspecto externo. B, rotor y sitios de inserción de los tubos (la flecha indica la forma correcta de colocar los pares de tubos).

Se trata de un aparato que sirve para medir la intensidad de la luz absorbida por una solución en un estrecho intervalo de longitudes de onda del espectro UV visible. Cuanta mayor intensidad de color de una solución, mayor es la absorción de la luz; por tanto, esa absorción puede utilizarse como medida directa de la intensidad de color. La relación entre la concentración de una sustancia y la absorción se basa en la ley de Beer-Lambert, que enuncia que la concentración de una sustancia es directamente proporcional a la cantidad de luz absorbida e inversamente proporcional al logaritmo de la luz transmitida (cuadro 1-1). Un espectrofotómetro es un dispositivo que posee una fuente de radiación que se puede dirigir hacia una muestra. Se espera que ésta absorba parte de la radiación, que se detecta enseguida mediante un circuito que produce una señal reproducible.

Práctica 1. Normas de bioseguridad y manejo de muestras biológicas, material, equipo y procedimientos

13

Los componentes de un espectrofotómetro son los siguientes: 1. 2. 3. 4. 5.

Fuente de luz. Filtro. Cubeta con la muestra. Célula fotoeléctrica. Amplificador y medidor.

La fuente de luz aplica una gran intensidad sobre una superficie limitada. Algunas muestras deben manejarse con luz ultravioleta o infrarroja; para ello, se utilizan lámparas con características especiales. El filtro es un dispositivo que tiene la función de permitir el paso de luz de una longitud de onda específica. No debe absorber cantidades apreciables de la luz en una longitud de onda determinada, que debe ser de un color complementario al de la muestra. Las cubetas o celdas analíticas suelen ser tubos redondos o rectangulares de espesor constante, de diversos materiales, como vidrio, cuarzo o plástico. Una muestra puede presentar una absorbancia de cero: no absorbe la radiación incidente y, por tanto, transmite 100% de esa radiación. La situación opuesta se tiene con un cuerpo opaco a un intervalo determinado del espectro electromagnético; en este caso, la transmisión es nula y la absorción es completa. La determinación cuantitativa de una sustancia depende de la relación entre la cantidad de radiación absorbida por la muestra problema y la absorbancia de una sustancia de referencia, con una concentración conocida. Los espectrofotómetros permiten efectuar la comparación entre la señal obtenida por una mezcla que no contiene la sustancia en estudio y otra que sí la tiene, para obtener la señal de esa diferencia. En la figura 1-4 se muestra un espectrofotómetro de luz visible.

Bioimpedanciometría Fundamento Sin entrar en los detalles físicos y matemáticos, que están más allá del alcance de esta obra, la ley fundamental de la electricidad que relaciona la impedancia con la intensidad y el voltaje es la ley de Ohm: impedancia = voltaje/ intensidad. Cuando la corriente eléctrica alterna circula por un medio, la impedancia depende en parte de la facilidad de éste para conducir la corriente, y es proporcional a la resistividad o mala conductividad del medio. Si, además, el circuito eléctrico contiene condensadores (sistemas de placas separadas por un medio aislante, donde se acumula una carga eléctrica que se libera cuando el sistema se satura), la impedancia también depende del número de condensadores que tenga que atravesar la corriente y de la facilidad de carga y descarga de éstos (capacidad). Al componente de la impedancia (Z) que se debe a la

A

B

Figura 1-4. A, espectrofotómetro de luz visible. B, botón selector de longitud de onda del espectrofotómetro.

mala conductividad del medio se le denomina resistencia (R); el componente que se debe a la acción de los condensadores recibe el nombre de reactancia capacitiva (Xc); en adelante aquí se le denomina tan sólo reactancia. La ecuación que las relaciona es: (Z)2 = (R)2 + (Xc)2 La bioimpedancia representa la oposición de un medio biológico al paso de una corriente alterna, y también cuenta con los componentes de resistencia y reactancia ya expuestos. La resistencia está condicionada por la resistividad de los diferentes tejidos a la conducción de la corriente eléctrica: los tejidos graso y óseo son malos conductores y la corriente circula mejor por los fluidos intra y extracelulares, que son soluciones electrolíticas. La reactancia se debe al efecto aislante de las membranas celulares, que se comportan como condensadores que se cargan y descargan al paso de la corriente. En la figura 1-5 se muestra una báscula de bioimpedancia.

Actividades de aprendizaje 1. Leer completas las NOM-017-STPS-2008 y NOM-

087-ECOL-SSA1-2002. 2. Investigar cuál es el símbolo de RPBI. 3. Investigar cuáles son las partes de una centrífuga. 4. Investigar la clasificación de los materiales de vidrio

utilizados en el laboratorio de bioquímica.

14

Manual de prácticas de laboratorio de bioquímica

Conclusiones

Figura 1-5. Báscula de bioimpedancia. Se utiliza para obtener el porcentaje de grasa corporal.

5. Investigar qué otros métodos se utilizan para cuanti-

ficar el porcentaje y la distribución de grasa corporal. 6. Investigar el espectro completo de la luz (ultravioleta,

visible e infrarroja). 7. Investigar los daños que genera la exposición a luz

ultravioleta. 8. Investigar si la luz ultravioleta se utiliza para el trata-

miento de algunas enfermedades.

Discusión

Bibliografía William RD. Exámenes urológicos de laboratorio. En: Tanagho EA, McAninch JW. Urología general de Smith, 10a ed. Editorial El Manual Moderno, 1993:51-63. WoodLiff HJ, Herrmann RP. Hematología clínica, 1a ed. Editorial El Manual Moderno, 1981.

Práctica

2

Agua y soluciones

• Irma Ramos Rodríguez • Sergio Sánchez Enríquez

• Mercedes Romero Gómez • María de Lourdes Isaac Virgen • Luis Huacuja Ruiz

Introducción Agua Las propiedades fisicoquímicas del agua dependen de su carácter bipolar y de su capacidad para formar puentes de hidrógeno, lo que le confiere propiedades únicas.

Soluciones homogéneas Una solución es una mezcla con aspecto homogéneo, formada por uno o más solutos y un solvente; cualesquiera de ellos puede estar en alguno de los tres estados de la materia. El soluto es la sustancia que se disuelve o dispersa por vía molecular en otra, y el solvente es el compuesto más abundante. En una solución, el soluto y el solvente pueden encontrarse como moléculas o como iones. Por ejemplo, cuando la sacarosa (azúcar común) se disuelve en agua, la molécula se incorpora por completo en la solución (no

H O

disociada); por el contrario, cuando el cloruro de sodio (sal de mesa) se disuelve en agua, se disocia en iones sodio y cloro. En cualquier caso, las moléculas o iones están rodeadas por moléculas de agua (hidratadas), que las mantienen separadas entre sí, como se representa en la figura 2-1. Las propiedades del soluto y el solvente, como la polaridad y el carácter iónico, afectan la solubilidad. Los factores que afectan la velocidad de disolución son: 1. 2. 3. 4. 5.

Tamaño de la partícula. Cantidad de soluto. Agitación. Temperatura. pH.

A la relación entre las cantidades de soluto y solvente se le denomina concentración. Una solución puede ser no saturada, saturada o supersaturada, de acuerdo con la capacidad del solvente para solvatar al soluto.

H H

O

H

Na

+

H

H H

O

H

O

H

H O

H

H

H

O

C1 –

H

O

H O

O

H

O

H H

H H

H

B

O

H H

C12 H22 O11

H

H

H

A

O

O

O

H

H H

O

H

Figura 2-1. Representación de la capacidad de solvatación del agua (hidratación). A, molécula de cloruro de sodio disociada en iones sodio y cloro hidratados. B, hidratación de una molécula de carbohidratos.

16

Manual de prácticas de laboratorio de bioquímica

Existen varias formas de expresar la concentración de una solución; las de uso más frecuente son porcentual, molar y normal. A continuación se describe la forma de calcular cada una de ellas: 1. Porcentual (%). Representa la proporción del soluto

que se encuentra en una solución utilizando la base 100 expresada en gramos o en mililitros. Existen cuatro diferentes formas para referirse a la concentración porcentual: • Porcentaje en peso (% pp). Cantidad de g de soluto en 100 g de solución. • Porcentaje en volumen (% vv). Número de mililitros de soluto en 100 ml de solución. • Porcentaje en peso-volumen (% pv). Cantidad de gramos de soluto en 100 ml de solución. • Porcentaje en moles (% mol). Número de moles de soluto disueltos en 100 ml de solución. En ciencias de la salud, las más utilizadas son las soluciones porcentuales pv (p. ej., ¿cuántos gramos de NaCl se requieren para preparar 250 ml de solución salina a 1%?). La resolución de este problema es sencilla, si se parte de la base de que por cada 100 ml de solución se requiere 1 g de NaCl (1%), de acuerdo con el planteamiento de la siguiente regla de tres: 1g 100 ml

=

x 250 ml

x = 2.5 g 2. Molar (M). Cantidad de moles de soluto en un litro

de solución. M=

Moles de soluto Litro de solución

Mol se define como el peso molecular de una sustancia expresado en gramos. En el ámbito experimental, este número es igual a 6.022 × 1023 moléculas (número de Avogadro). La masa molecular o peso molecular (PM) de una sustancia es la suma de los pesos atómicos de cada uno de sus componentes; por ejemplo, el PM del ácido sulfúrico (H2SO4) es de 98 gmol, como se describe en el cuadro 2-1. Para preparar soluciones molares se tiene que hacer el cálculo matemático, que es diferente si el soluto es un sólido o un líquido. En el primer caso, como cuando se usa NaOH o NaCl, la pureza es casi de 100% y no se tiene que convertir de gramos a mililitros con la fórmula de la densidad (ρ = mv). Por tanto, para saber, por ejemplo, cuántos gramos de NaOH se requieren para preparar 300 ml de una solución de esta sustancia a 0.2 M, si el peso molecular del NaOH es 40 g, se utiliza, en primer lugar, una regla de tres, para corregir la molaridad (de 1 M a 0.2 M):

Cuadro 2-1. Procedimiento para calcular el peso molecular.

Átomo Hidrógeno (H)

Peso Número de atómico átomos en la (PA) molécula (NAM)

PA × NAM

1

2

2

Azufre (S)

32

1

32

Oxígeno (O)

16

4

64

Peso molecular (PM)

98

40 g 1M

x 0.2 M

= x=8g

Por tanto, se necesitan 8 g de NaOH para preparar 1 litro de solución; sin embargo, el volumen que se desea obtener es de 300 ml, de modo que se aplica una segunda regla de tres para corregir el volumen: 8g 1L

=

x 0.3 L

x = 2.4 g Con esto se sabe la cantidad de gramos necesarios para preparar la solución solicitada. Otra opción consiste en utilizar el análisis bidimensional modificado, utilizando la siguiente ecuación: g = PM × M × V g PM M V

= gramos de soluto = peso molecular del soluto, en gramos = molaridad = volumen, en litros. Al sustituir los valores conocidos, se obtiene: g = 40 × 0.2 × 0.3 g=8

Con esto se obtiene un resultado igual que con el procedimiento anterior. Un caso diferente resulta si el soluto que se va a utilizar es líquido y, en especial, un ácido que nunca tiene 100% de pureza. Para esto, puede utilizarse cualesquiera de los procedimiento realizados, pero debe agregarse la fórmula de densidad para corregir de gramos a mililitros y una regla de tres adicional para corregir la pureza. Otra opción consiste en utilizar el análisis bidimensional, modificando la ecuación de la siguiente manera:

Práctica 2. Agua y soluciones

ml =

PM × M × V

ml =

m v=ρ Al sustituir por sus valores, se debe considerar que la densidad del H2SO4 es de 1.88 gml. V=

98 × 0.3 × 0.4

Nota: cuando se prepara una solución de ácido, nunca se debe poner primero el ácido y luego el agua, porque se produce una reacción exotérmica que puede proyectar el ácido y quemar. Vale la pena recordar el aforismo “Nunca le des de beber a un ácido”. Para preparar de manera correcta esta solución se coloca primero un poco de agua, después se deposita el ácido, que debe descender por las paredes del matraz, y luego se vierte agua, una vez más, hasta alcanzar el volumen deseado. 3. Normal (N). Cantidad de equivalentes químicos de soluto en un litro de solución:

El equivalente químico (eq) se define como la capacidad de reacción de un átomo, ion o molécula. Por ejemplo, al colocar H2SO4 en solución acuosa, la molécula se disocia en dos hidrogeniones (H+) y un ion sulfato (SO42−) como se muestra en la siguiente reacción: H2SO4 g H+ + H+ + SO42− En este ejemplo, el equivalente químico en gramos se obtiene al dividir el peso molecular del ácido entre el número de hidrogeniones sustituibles (2), como se muestra en la siguiente ecuación: Eq gramo =

PM (98 g ∙ mol) Hidrogeniones sustituibles (2)

Eq gramo = 49 g de H2SO4 Debido a que el H2SO4 se encuentra en estado líquido, es necesario convertir los gramos del mismo a unidades de volumen (ml). Para este fin se usa la fórmula de la densidad: ρ= ρ = densidad m = masa en gramos

m v

1.88 gml

Este volumen sería el correcto si el ácido estuviera a 100% de pureza, pero como se encuentra a 98%, se debe hacer la corrección utilizando una regla de tres: 26.06 ml x = 98% 100% x = 26.6 ml Este volumen sería adecuado para preparar una solución a 1 N; si se solicitara una a 0.1 N, habría que corregir con una regla de tres, de la siguiente manera: 26.6 ml x = 1N 0.1 N x = 2.66 ml

Equivalente químico del soluto Litro de solución

49 g

Volumen = 26.06 ml

1.71 × 0.85

ml = 8.11

N=

que se despeja de la siguiente manera:

ρ × Proporción de pureza

Por ejemplo, si se quiere saber cuántos mililitros de la solución stock de H3PO4, con densidad de 1.71 gml y pureza del 85%, hay que extraer para preparar 400 ml de solución de H3PO4 al 0.3 M, se sigue este procedimiento:

17

Estos 2.66 ml serían correctos si se necesita un litro; sin embargo, si se solicitan 500 ml, habría que realizar una última regla de tres: 2.66 ml x = 1L 0.5 L x = 1.33 ml Otra opción consiste en realizar un análisis bidimensional modificado, que integre todas estas variables en una sola ecuación. Si se continúa con el mismo caso (preparar 0.5 l de una solución de H2SO4 a 0.1 N, para una pureza de 98%, con densidad de 1.88 gml, y considerando el equivalente químico de H2SO4 = 49 g), se utiliza la siguiente ecuación: v=

Eq × N × V ρ × Proporción de pureza

donde V es el volumen en litros. Al sustituir las variables por su valor, se obtiene: v=

49 g × 0.1 N × 0.5 L 1.88 gml × 0.98

v = 1.33 ml Como puede observarse, se obtiene el mismo resultado con cualquiera de los dos procedimientos. Por ello, el estudiante tiene la libertad de utilizar el que más domine.

18

Manual de prácticas de laboratorio de bioquímica

Propiedades de las soluciones Las propiedades físicas de las soluciones se dividen en tres categorías: constitutivas, aditivas y coligativas. Propiedades constitutivas. Son las que dependen de manera exclusiva de la naturaleza de las moléculas que la forman. Son propiedades constitutivas los caracteres ácido, básico, oxidante, reductor, radiactivo, dulce, insípido, colorido, etcétera. Propiedades aditivas. Son las que dependen de la suma de las propiedades correspondientes a los constituyentes de la solución. La única propiedad rigurosamente aditiva es el peso molecular. Propiedades coligativas. Son las que dependen del número de moléculas por unidad de volumen (la concentración del soluto). Algunos ejemplos son: punto de fusión, punto de ebullición, presión de vapor, presión osmótica y presión oncótica. Estas propiedades tienen un papel relevante en las soluciones biológicas.

traer del stock para preparar la nueva solución, más diluida? Al sustituir las variables de la ecuación anterior con sus valores, se tiene: V1 =

V1 = 0.125 L = 125 ml Por tanto, se deben medir 125 ml de la solución 2 N de H2SO4, depositarla en un matraz volumétrico de 500 ml y completar en volumen a la marca de aforo.

Objetivo general Realizar cálculos para la preparación de soluciones porcentuales, molares y normales. Realizar una curva de una solución de fenolftaleína utilizando el espectrofotómetro.

Diluciones

Materiales y equipo

En el laboratorio, a menudo es necesario preparar soluciones de trabajo diluidas a partir de reactivos u otras concentradas. A una misma cantidad de soluto y diferentes cantidades de solvente, la concentración de la solución es diferente. Cuando la concentración se expresa sobre una escala volumétrica, la cantidad de soluto presente en un volumen de solución es igual al producto de la concentración por el volumen: Cantidad de soluto = Volumen × Concentración Al diluir una solución, aumenta el volumen y se reduce la concentración, si se tiene la misma cantidad de soluto. La relación que existe cuando se preparan dos soluciones con diferente concentración, utilizando la misma cantidad de soluto, es: V1 × C 1 = V 2 × C 2 V1 V2 C1 C2

0.5 L × 0.5 N 2N

= volumen inicial = volumen final = concentración inicial = concentración final

Matraz aforado de 100 ml Tubos de ensayo de 13 × 100 Gradilla para tubos Pipetas serológicas de 1, 5 y 10 ml Probeta de 100 ml Vasos de precipitado de 250 ml Espectrofotómetro Soluciones y reactivos

• Agua destilada • Solución de fenolftaleína a 0.5% • Solución de etanol a 50%

Desarrollo experimental Experimento 1 Manejo de concentraciones por espectrofotometría Fundamento

Si se conocen tres valores entre la solución conocida y la que se desea preparar se puede calcular el cuarto parámetro, respetando las mismas unidades para el volumen (ml, L, etc.) y para la concentración (molar, normal). Al sustituir en la ecuación anterior, se tiene: V1 =

• • • • • • •

V2 × C2 C1

Por ejemplo, si se desea preparar 500 ml de una solución de H2SO4 a 0.5 N, a partir de una solución stock que se encuentra a 2 N, ¿qué volumen se necesita ex-

La fenolftaleína con PM de 318.33, en solución alcohólica a 50% y pH de 11.5, se ioniza y produce color violeta (véase la figura 2-2).

Procedimiento A partir de una solución almacenada (A) de fenolftaleína a 0.5%, hacer las siguientes diluciones: 1. Tomar una alícuota de 1 ml y aforar a 100 ml, con la

solución de alcohol a 50% y pH de 11.5 (B), etiquetar seis tubos de ensayo de 13 × 100 (cuadro 2-2). 2. Leer el espectrofotómetro a una longitud de onda de 530 nm, ajustando a cero con el blanco. Al graficar

19

Práctica 2. Agua y soluciones

O OH

OH

O

OH

OH

H2O

+

C

C

C

H 3O +

O C C

OH

O-

C

O

I Forma seudo o normal (incolora)

O

O

II Forma ionogénica (roja)

III Ion (rojo)

Figura 2-2. Fórmula. Reacciones químicas de la fenolftaleína.

los valores de densidad óptica (DO), se obtiene una línea recta, lo que indica que la DO es directamente proporcional a la concentración (DO ∝ C). 3. Graficar los valores obtenidos en la práctica (DO versus concentraciones) en papel milimétrico (cuadro 2-3).

Actividades de aprendizaje Realizar los cálculos para la preparación de las siguientes soluciones: 1. Preparar 250 ml de una solución de cloruro de sodio

a 0.9% (pv). Describir los cálculos para conocer la cantidad de cloruro de sodio que debe pesarse, para aforarla al volumen deseado. 2. Preparar 500 ml de una solución de ácido fosfórico (H3PO4) a 0.1 M, tomando como base los siguientes datos:

Fenolftaleína

1

0.5

4.5

2

1

3

Describir los cálculos hechos para conocer el volumen del ácido fosfórico concentrado que se utilizó para preparar 500 ml de esa solución. 3. Preparar 500 ml de una solución de NaOH a 0.1 M, con peso molecular de 40. Describir los cálculos para saber cuántos gramos se deben tener de NaOH. 4. Preparar dos soluciones: una de HCl y otra de NaOH a 0.01 N. Se necesitan 1 000 ml de cada una. El PM del HCl es de 36.5 y su densidad a 20°C es de 1.060 gml. El PM del NaOH es de 40. Describir los cálculos para conocer las cantidades de solutos (HCl y NaOH) que hay que utilizar. 5. Investigar en el libro de texto de qué manera se puede convertir una solución porcentual a solución osmolar. Cuadro 2-3. DO esperada para una concentración determinada de fenolftaleína.

Cuadro 2-2. Diluciones de fenolftaleína y su concentración. Núm. de tubo

a) Peso molecular (PM) del ácido fosfórico: 98 gmol. b) Pureza de 85%. c) Densidad de 1.71 gcm3.

Etanol a 50%, Concentración pH 11.5 (ml) (mg/tubo)

DO (530 nm)

Núm. de tubo

Esperado

2.5

1

0.160

2.5

4.0

5

2

0.296

5

1.5

3.5

7.5

3

0.377

7.5

4

2

3

10

4

0.527

10

5

2.5

2.5

12.5

5

0.655

12.5

6

3

2

blanco

6

0.0

Blanco

Experimental

Concentración (mg)

20

Manual de prácticas de laboratorio de bioquímica

6. Investigar la composición en miliequivalentes de la

solución salina a 0.9%, glucosada a 5%, Hartman, Ringer, solución mixta (NaClglucosa) y registrarla en un cuadro. 7. Calcular la osmolaridad de las anteriores soluciones.

Discusión

Preparación de reactivos 1. Solución de etanol a 50%:

Mezclar partes iguales de alcohol y agua destilada, tomando en cuenta la pureza del alcohol. Ajustar a pH de 11.5 con tres gotas de NaOH a 40%. 2. Solución de fenolftaleína a 0.5%: En un matraz volumétrico de 100 ml, colocar 0.5 g de fenolftaleína, mezclar y aforar con alcohol a 50%.

Bibliografía Conclusiones Bigelow P. How to make standard solutions for Chemistry. http: www.scn.org [Revisado 16092013]. Chang R. Química, 7a ed. McGraw-Hill, 2003. Kotz JC, Treichel PM. Química y reactividad química, 5a ed. Editorial Thomson, 2003.

Práctica

pH y amortiguadores

• Sonia Uribe Luna • Patricia Heredia Chávez

• Sergio Sánchez Enríquez • Pedro Garzón de la Mora

Introducción

el logaritmo negativo de la concentración de iones hidrógeno. pH = –log10 [H+]

Agua La molécula de agua tiene una capacidad limitada para disociarse en un ion hidrógeno (H+), al que también se le llama protón, y un ion hidroxilo (OH−). H2O (l)

H+

Agua

Protón

OH−

+

Ion hidroxilo

En solución acuosa, un protón se combina de inmediato con una molécula de agua para formar el ion hidronio o hidrogenión (H3O+). H+ + Protón

3

H2O (l) Agua

H3O+ Hidronio

Sin embargo, por convención, en las reacciones de ionización del agua se utiliza la representación del protón en lugar del ion hidronio. Las concentraciones de protones y iones hidroxilo, en agua pura, son de 10−7 M para cada uno, como muestra la siguiente expresión: [H+] = [OH−] = 10−7 M Las concentraciones de ambos iones exponen una relación recíproca: cuando H+ aumenta, OH− disminuye, y viceversa. El producto de sus concentraciones es una constante conocida como producto iónico del agua (Kw), que tiene un valor de 1 × 10−14 M. Kw = [H+] × [OH−] = 1 × 10−14 M Con el fin de facilitar los cálculos para determinar H+, además de su interpretación, en 1909 el químico danés Sørensen definió el potencial hidrógeno (pH) como

Más adelante, en 1923 Johannes Brønsted y Thomas Lowry propusieron, en forma independiente, los conceptos de ácido, como la capacidad de las sustancias para ceder protones en una solución acuosa, y de base, como la de aceptar protones. En la práctica, las disoluciones acuosas se clasifican en ácidas, si presentan un pH menor a 7.0; básicas, si el pH es mayor a 7.0, y neutras, si el pH es igual a 7.0. Por otra parte, no todos los ácidos se disocian con la misma facilidad. A los que lo hacen por completo en una solución acuosa, se les considera ácidos fuertes; los que se disocian en parte, son ácidos débiles. Algunos ácidos o bases débiles tienen importancia biológica porque evitan cambios bruscos de pH cuando se les agrega pequeñas cantidades de ácidos o bases. A esta propiedad se le denomina capacidad amortiguadora. El fin de los amortiguadores es mantener el pH estable en un intervalo muy estrecho (p. ej., en la sangre va de 7.35 a 7.45). El pK es el pH necesario para que un ácido esté 50% no disociado y 50% disociado (es decir, la razón o proporción de ácido disociado y no disociado es 1). Cuando la solución presenta un pH cercano a su pK (± 1.0) posee su mayor capacidad amortiguadora. Los ácidos o las bases producidas por el catabolismo de carbohidratos, lípidos y aminoácidos dan lugar a una gran cantidad de compuestos con potencial para modificar el pH fisiológico. Sin embargo, existen sistemas amortiguadores que evitan cambios bruscos del pH. Un ejemplo es el sistema bicarbonatoácido carbónico, que mantiene el pH de los líquidos intercelulares en valores cercanos a 7.4. En éste, la combustión completa de carbohidratos y lípidos genera bióxido de carbono y agua, que

22

Manual de prácticas de laboratorio de bioquímica

+ CO2 Bióxido de carbono

H2O Agua

AC

H2CO3 Ácido carbónico

pKa = 6.1

HCO3− + H+ Bicarbonato Protón

AC = anhidrasa carbónica

Figura 3-1. Reacción de disociación del ácido carbónico. A la izquierda del ácido carbónico se muestra la disociación mediada por la anhidrasa carbónica y a la derecha la disociación espontánea (sin enzima).

se combinan para producir ácido carbónico en el nivel tisular. El ácido carbónico en solución acuosa se disocia para formar su base conjugada (el bicarbonato), lo que genera un sistema amortiguador (figura 3-1). Si aumenta la concentración de protones en el medio, debido a cualquier proceso químico, el equilibrio se desplaza a la izquierda y el exceso de CO2 producido se elimina a través de los pulmones. Por el contrario, si disminuye la concentración de protones, el equilibrio se desplaza a la derecha. Las proteínas (en forma específica, las enzimas) son sensibles a los cambios bruscos de pH. Por tanto, el pH sanguíneo debe conservarse en un intervalo de 7.35 a 7.45, con el fin de mantener la homeostasis. Además de los sistemas amortiguadores de pH, el sistema nervioso (centro respiratorio), el aparato respiratorio y los riñones contribuyen a mantener en nuestros órganos y tejidos el pH en los rangos apropiados.

Objetivo general • Analizar las propiedades de soluciones ácidas y básicas.

Objetivos específicos • Medir el pH de diferentes sustancias. • Evaluar la capacidad amortiguadora de líquidos biológicos. • Determinar los valores de pK de un ácido poliprótico. Materiales y equipo • • • • • • • • • • • • • •

Materiales y equipo Bureta Matraz Erlenmeyer de 250 ml Probeta de 100 ml Pipetas de 1, 5 y 10 ml Vasos de precipitado de 100 y 250 ml Tubos de ensayo 13 × 100 Soporte universal Pinzas en mariposa para bureta Gradilla Potenciómetro Tiras reactivas para pH Agitador magnético Pipetores

Soluciones y reactivos Soluciones

Muestras*

H3PO4 a 0.1 M

Saliva

NaOH a 0.1 M

Orina

NaOH a 0.01 N

Sudor

HCl a 0.01 N (3.8%)

Leche

NaHCO3 con pH 7.4

Refresco oscuro

Reactivo de Yamada

Refresco claro

Solución amortiguadora de referencia a pH 4.0

Jugo de naranja

Solución amortiguadora de referencia a pH 7.0

Yogurt Agua

* El alumno debe proporcionar las muestras.

Desarrollo experimental Experimento 1 Medición del pH con tiras reactivas Una forma rápida de medir el pH consiste en utilizar tiras reactivas diseñadas para ese fin.

Fundamento Las tiras reactivas contienen diferentes compuestos, a los que se les denomina indicadores de pH, que cambian de color de acuerdo con el pH en que se encuentran. A estas mediciones se les considera semicuantitativas, porque no indican el valor exacto del pH. La coloración que presenta la tira se compara con la gama de colores de referencia incluida en el recipiente de las tiras.

Procedimiento 1. Sumergir la tira reactiva en el líquido problema y

mantenerla por 10 segundos. 2. Retirar la tira y quitar el exceso de líquido. 3. Comparar los cambios de color obtenidos con la

gama de colores existentes en el contenedor de las tiras. 4. Registrar los valores de pH obtenidos de las soluciones incluidas en el cuadro 3-1.

Práctica 3. pH y amortiguadores

Cuadro 3-1. Resultados de la medición de pH de distintas soluciones. Solución

23

Cuadro 3-2. Resultados obtenidos para el pH de diferentes soluciones, antes y después de la exposición a un ácido y a una base.

pH obtenido NaOH 0.01N

HCl 0.01N

Orina

0.5 ml

—

2

Orina

—

0.5 ml

Leche

3

Suero

0.5 ml

—

Refresco oscuro

4

Suero

—

0.5 ml

Refresco claro

5

NaHCO3 a 0.1 N y pH 7.0

0.5 ml

—

6

NaHCO3 a 0.1 N y pH 7.0

—

0.5 ml

7

Agua destilada

0.5 ml

—

8

Agua destilada

—

0.5 ml

Saliva

Tubos

Orina

1

Sudor

Jugo Yogurt Solución de jabón Solución de sosa cáustica Agua

Experimento 2 Sistemas amortiguadores Fundamento El objetivo de este experimento es comparar diferentes líquidos que contienen amortiguadores y ver cuál es más eficaz para evitar cambios importantes de pH ante la exposición a un ácido o una base. Se tiene un control que no es amortiguador (agua).

Desarrollo a) Preparar una serie de tubos numerados de acuerdo

con el cuadro 3-2. b) Medir el pH de cada solución, empleando tiras reac-

tivas. c) Registrar el pH final. d) Analizar los cambios observados.

Experimento 3 Capacidad antiácida del hidróxido de aluminio y magnesio y del subsalicilato de bismuto Fundamento El propósito de este experimento es observar el comportamiento de dos fármacos utilizados como antiácidos, cuando se exponen a soluciones básicas y ácidas. Como control, se tiene agua destilada.

Muestra (2.5 ml)

pH inicial

pH final

Procedimiento a) Preparar una serie de tubos numerados de acuer-

do con el cuadro 3-3. Realizar las diluciones del hidróxido de aluminio y magnesio (Melox) y el subsalicilato de bismuto (Peptobismol). El volumen total debe ser 2.5 ml; de ellos, 0.5 ml corresponden a Melox o Peptobismol, mezclados con 2 ml de agua destilada. b) Agregar la base (NaOH) a la dilución de los tubos nones y el ácido (HCl) a la de los tubos pares. c) Mezclar bien. d) Medir el pH de cada solución, empleando tiras reactivas.

Experimento 4 Curva de titulación del ácido fosfórico (H3PO4) Fundamento El ácido fosfórico, H3PO4, es un ácido poliprótico (tiene tres protones, que pueden disociarse). Mediante titulación, es posible determinar los tres valores de pKa de este compuesto. Para titular un ácido débil se agregan cantidades pequeñas de una base fuerte que permite desplazar el equilibrio hacia la formación de su base conjugada. Después de cada adición de la base, se determina el pH, mediante

24

Manual de prácticas de laboratorio de bioquímica

Cuadro 3-3. Resultados obtenidos para el pH de hidróxido de aluminio y magnesio (Melox), subsalicilato de bismuto (Peptobismol) y agua, antes y después de exponerlos a una base y a un ácido.

Tubos

Muestra (2.5 ml)

pH inicial

NaOH a 0.01 N

HCl a 0.01 N

1

Hidróxido de aluminio y magnesio (1:5)

0.5 ml

—

2

Hidróxido de aluminio y magnesio (1:5)

—

0.5 ml

3

Subsalicilato de bismuto (1:5)

0.5 ml

—

4

Subsalicilato de bismuto (1:5)

—

0.5 ml

5

Agua destilada

0.5 ml

—

6

Agua destilada

—

0.5 ml

pH final

Figura 3-2. Potenciómetro portátil con electrodo de vidrio.

potenciometría, y su valor se registra en una gráfica para determinar el comportamiento del ácido débil. De la misma forma, se puede titular una base débil empleando un ácido fuerte. En el proceso de titulación se modifica el pH (en este caso, de valores ácidos a otros cada vez más básicos). Esto se puede determinar a partir de cambios de color, si se agrega a la reacción una mezcla de indicadores de pH, como el reactivo de Yamada.

Potenciómetro Se trata de un aparato que mide el pH y que funciona por medio de electrodos. El electrodo es un dispositivo que contiene una solución amortiguadora; al ponerse en contacto con la solución problema, mide la concentración de los hidrogeniones. El uso del potenciómetro depende del modelo. Sin embargo, en forma general se deben tener los siguientes cuidados: • Antes de medir el pH, debe mezclarse la solución que se desea analizar empleando el agitador magnético. Se recomienda evitar el uso de varillas de vidrio como agitadores, porque se corre el riesgo de romper los electrodos, que son frágiles.

• Los electrodos deben enjuagarse con agua destilada antes y después de utilizarse, y no se deben tocar con la mano. • Antes de utilizar el potenciómetro, debe calibrarse con una solución de referencia (pH 4, pH 7 o pH 10). • Los electrodos deben mantenerse en agua destilada cuando no estén en uso, evitando que se sequen. Si esto ocurre, deben sumergirse en agua y calibrarse varias veces antes de hacer las mediciones. En la figura 3-2 se muestra una fotografía de un modelo de potenciómetro portátil, junto con sus aditamentos.

Procedimiento 1. En un vaso de precipitado de 250 ml, depositar 25 ml

de una solución de H3PO4 a 0.1 M. 2. Agregar 4 gotas del reactivo de Yamada (mezcla de

indicadores de pH). 3. Medir el pH con un potenciómetro. El potencióme-

4. 5.

6. 7.

tro debe calibrarse de antemano con amortiguadores de referencia, a pH 4.0 y pH 7.0. Preparar una bureta con 50 ml de una solución de NaOH a 0.1 M. Agregar al H3PO4 alícuotas de 3.0 ml de NaOH a 0.1 M. Mezclar con el agitador magnético y medir el pH después de cada adición, hasta completar 75 ml de la base NaOH. Graficar en papel milimétrico el volumen de NaOH gastado contra el pH. Determinar los valores de pKa1, pKa2 y pKa3 para el H3PO4.

Actividades de aprendizaje 1. Investigar la composición promedio de las siguientes

soluciones y cuál de esos compuestos contribuye más al pH de la solución.

Práctica 3. pH y amortiguadores

25

26

Manual de prácticas de laboratorio de bioquímica

Solución

9. Investigar la utilidad práctica de los siguientes com-

Compuesto

puestos y marcarlos en el siguiente cuadro:

Saliva Orina Antiácido

Amortiguador

Efecto sistémico

Sudor Bicarbonato de sodio

Leche Refresco oscuro

Hidróxido de magnesio

Refresco claro Jugo

Hidróxido de aluminio

Yogurt

Subsalicilato de bismuto

Solución de jabón Agua

2. ¿Qué pH tiene la mayor parte de las sustancias estu-

diadas en este experimento? 3. De acuerdo con los resultados obtenidos en el experimento 2, investigar qué sistema o sistemas de amortiguadores se encuentran en cada una de las soluciones utilizadas.

10. Explicar la diferencia entre un sistema amortiguador

y el de una sustancia con propiedad antiácida.

Discusión Descripción del sistema amortiguador

Muestra Orina Suero NaHCO3 a 0.1 N y pH 7.0 Agua destilada

4. ¿Cuál de estos amortiguadores es el mejor? 5. ¿Cuál de los antiácidos utilizados en el experimento

3 es mejor? 6. ¿Cuál de los pKa del ácido fosfórico es mejor amor-

tiguador a pH fisiológico? 7. Investigar cuáles enfermedades tienen relación con

el pH 8. Completar la información del siguiente cuadro: Indicadores del reactivo de Yamada Intervalos de pH Azul de timol Rojo de metilo Azul de bromotimol Fenolftaleína

Color

Conclusiones

Práctica 3. pH y amortiguadores

27

Preparación de reactivos H3PO4 0.1 M NaOH 0.1 M HCl 0.01 N NaOH 0.01 N Solución NaHCO3 a 0.1N: ajustar el pH a 7.0

Reactivo de Yamada: Azul de timol 5.0 mg Rojo de metilo 12.5 mg Azul de bromotimol 50.0 mg Fenolftaleína 100.0 mg Disolver en 200 ml de alcohol etílico a 50%

Bibliografía Garzón de la Mora P. Manual de prácticas de bioquímica. Proyecto IV de pH y Buffers, 2002:85-93. McKee T. Bioquímica, 3a ed. Cap 3. El agua: el medio de la vida. McGraw-Hill, 2003:65-91. Roskoski R Jr. Bioquímica. Cap 3. Aminoácidos y proteínas. McGraw-Hill, 1998:65-91. http:www.uclm.es. Equilibrio ácido-base. [Revisado el 16 de septiembre de 2013.]

Práctica

Aminoácidos y proteínas

4

• Carmen Magdalena Gurrola Díaz • María de Lourdes Isaac Virgen • Sergio Sánchez Enríquez

Introducción Las proteínas constituyen el grupo de compuestos más abundante en los seres vivos; en algunos casos representan hasta 50% del peso total seco. Esta abundancia se debe a que desempeñan diversas funciones: Catálisis, en el caso de las enzimas. Transporte, en el de la hemoglobina. Almacenamiento, como sucede con la ferritina. Movimiento (p. ej., actina y miosina). Soporte mecánico (colágeno). Protección inmunológica, a través de los anticuerpos. 7. Regulación de procesos biológicos y comunicación celular, como algunas hormonas y sus receptores.

1. 2. 3. 4. 5. 6.

Las proteínas son macromoléculas de elevado peso molecular, porque su estructura consta de cadenas de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos entre el grupo alfa carboxilo de un aminoácido y el grupo alfa amino de otro. Aunque en la naturaleza existen más de 300 aminoácidos, las proteínas sólo utilizan 20, de diferente tamaño, forma, carga, capacidad de formar puentes de hidrógeno o enlaces disulfuro y reactividad química. Los aminoácidos tienen la capacidad de formar dos tipos de isómeros, D y L, que indican si el grupo amino se encuentra a la derecha o a la izquierda del carbono quiral. En las proteínas, sólo se encuentran los isómeros L-alfa. Las cuantiosas combinaciones que se pueden lograr con los 20 aminoácidos en las cadenas polipeptídicas, otorgan gran diversidad a las funciones proteínicas. La presencia de grupos químicos ionizados en los aminoácidos permite que las proteínas presenten características fisicoquímicas específicas en el microambiente biológico; de allí la importancia de su estudio.

A varios aminoácidos se les denomina esenciales, porque el organismo carece de la capacidad de sintetizarlos y, por tanto, es necesario ingerirlos en la dieta. Los aminoácidos no esenciales son los que el cuerpo humano sí puede sintetizar. El catabolismo deficiente de los aminoácidos lleva a su acumulación en el plasma y su excreción excesiva en la orina; a esto se le conoce como aminoaciduria. En el adulto normal, la excreción urinaria de aminoácidos es constante; en un periodo de 24 horas se excreta un promedio de 200 mg de nitrógeno alfa aminado. Existen diversos trastornos en que aumenta la cantidad de aminoácidos en la orina.

Métodos de separación de aminoácidos y proteínas Los métodos de cromatografía en capa fina y de electroforesis son adecuados para determinar la cantidad absoluta y relativa de los diferentes aminoácidos en una muestra (análisis cualitativo); sin embargo, para los análisis cuantitativos es necesaria la cromatografía de líquidos de alta presión (HPLC). • Electroforesis. Se trata de un proceso en que algunas biomoléculas con carga (como proteínas, polinucleótidos, biopolímeros) se separan a partir de su distinta velocidad de migración en un campo eléctrico. Por lo general, los aminoácidos no se presentan en forma aislada; de modo que es necesario separarlos antes de poder cuantificarlos. Entre las técnicas de separación, se mencionan a continuación las de uso más frecuente en el laboratorio. • Cromatografía en capa fina. Se fundamenta en la separación de las moléculas adsorbidas en una placa (fase estacionaria), con una capa muy delgada de

30

Manual de prácticas de laboratorio de bioquímica

gel de sílice; se coloca en posición vertical en una cámara con un sistema de solventes (fase móvil), que ascienden debido al fenómeno de capilaridad. La separación se realiza con base en la polaridad de las moléculas. • Analizador automático de aminoácidos (HPLC). Existen dos técnicas para la determinación de aminoácidos mediante cromatografía líquida: en columnas de intercambio iónico y de alta resolución en columnas de fase reversa: ∘ Cromatografía líquida en columnas de intercambio iónico. La cromatografía iónica está relacionada con los métodos modernos y eficaces para la determinación de iones, que se basan en el uso de resinas de intercambio iónico. Se hacen pasar los aminoácidos a través de una columna de resina con grupos catiónicos o aniónicos; dependiendo de la carga de los aminoácidos, éstos se unen a la columna y, más adelante, mediante un cambio gradual en el pH del solvente, se eluye cada aminoácido a un pH distinto (de acuerdo con el punto isoeléctrico del aminoácido). ∘ Cromatografía líquida de alta resolución en columnas de fase reversa. Este método consiste en aplicar aminoácidos disueltos en una fase acuosa acidificada (fase móvil) a una columna de sílice unida a una cadena hidrocarbonada (fase estacionaria). La selectividad se basa en las interacciones específicas entre el soluto y la fase móvil, que puede ser de tipo polar, de formación de puentes de hidrógeno o mediante equilibrios secundarios provocados al variar la composición de la fase móvil (ácido-base, formación de complejos o pares iónicos, adición de complejos metal-ligando o reactivos quirales para separar los isómeros ópticos, etcétera).

Objetivo general

O

R

H

C

C

N

N

H

H

O

C

C

O

R

O C

H

C N

+

N Cu

Cu N

N C

C

O

O

Aminoácidos + Biuret

Color violeta

Figura 4-1. Reacción de la ninhidrina. La ninhidrina reacciona con los grupos alfa amino de los aminoácidos.

Desarrollo experimental Experimento 1 Prueba de la ninhidrina Fundamento La ninhidrina reacciona de manera específica con el grupo alfa amino de los aminoácidos, sean libres o estén unidos mediante enlaces peptídicos. La ninhidrina a pH de 4 a 8 es un oxidante muy fuerte y siempre reacciona con los grupos alfa amino, liberando amonio; éste se condensa con la ninhidrina reducida y con otra molécula de ninhidrina, formando un compuesto coloreado que va del azul violeta al púrpura. En la figura 4-1 se muestra la reacción química de la ninhidrina con los aminoácidos.

Reacción: Figura 4-1.

Procedimiento 1. Numerar tres tubos de ensayo de acuerdo con el cua-

dro 4-1. 2. En el tubo 1, colocar 1 ml de agua (blanco). 3. En el tubo 2, colocar 1 ml de solución de glicina (o

cualquier otro aminoácido) a 1%.

Seleccionar pruebas de laboratorio que permitan el estudio de las propiedades fisicoquímicas de aminoácidos y proteínas, además de su identificación.

Objetivo específico

4. En el tubo 3, colocar 1 ml de solución de albúmina

de huevo.

Cuadro 4-1. Organización de los tubos de reacción y su contenido.

Utilizar técnicas analíticas que permitan la identificación de aminoácidos en general, aminoácidos específicos y proteínas, en cualquier espécimen biológico.

Material Biológico:

Químicos:

• Solución de albúmina de huevo (clara de huevo diluida 1:50)

• Solución de glicina a 1% • Solución de ninhidrina a 0.2% • Agua destilada

Agua destilada

Glicina 1%

Albúmina de huevo

Reactivo (ninhidrina a 0.2%)

1 Blanco

1 ml

—

—

10 gotas

2 Patrón

—

1 ml

—

10 gotas

3 Problema

—

—

1 ml

10 gotas

Tubo

31

Práctica 4. Aminoácidos y proteínas

5. Agregar a cada tubo 10 gotas de solución de ninhi-

Material

drina a 0.2%. 6. Mezclar y colocar en baño María durante 5 minutos.

Resultados esperados Los tubos 2 y 3 deben presentar el color azul violeta que revela la presencia de aminoácidos.

Biológico:

Químicos:

• Solución de albúmina de huevo (clara de huevo diluida 1:50)

• Solución de fenilalanina a 1% • Reactivo de Biuret • Agua destilada

Resultados obtenidos Procedimiento 1. Enumerar tres tubos de ensayo, de acuerdo con el

cuadro 4-2. 2. En el tubo 1, colocar 2 ml de agua destilada (blanco). 3. En el tubo 2, colocar 2 ml de solución de fenilalanina

(u otro aminoácido) a 1%. 4. En el tubo 3, colocar 2 ml de albúmina de huevo

a 1%. 5. Añadir a cada tubo 2 ml del reactivo de Biuret. 6. Mezclar y observar.

Resultados esperados

Experimento 2 Prueba de Biuret Existen varias pruebas para la cuantificación de proteínas en muestras biológicas. La elección del método depende de varios factores; uno de ellos es la cantidad de proteínas en la muestra. Por ejemplo, si la cantidad se encuentra en el orden de los microgramos, es recomendable utilizar la prueba de Lowry. Por el contrario, en muestras en que la cantidad es mayor; la prueba de elección es la de Biuret.

El tubo que contiene la proteína albúmina es el único que debe presentar coloración violeta, porque contiene enlaces peptídicos.

Resultados obtenidos

Fundamento La prueba de Biuret sirve para investigar la presencia de enlaces peptídicos, que representan uniones específicas entre los aminoácidos. Se basa en la formación de sales complejas de color violeta cuando se añade sulfato cúprico en solución alcalina. El complejo está formado por enlaces de coordinación, en que los pares electrónicos proceden de los grupos amino de los aminoácidos de la cadena polipeptídica (figura 4-2).

Reacción

Cuadro 4-2. Organización de los tubos de reacción y su contenido. Agua destilada

Fenilalanina a 1%

Albúmina de huevo a 1%

Reactivo (Biuret)

1 Blanco

2 ml

—

—

2 ml

2 Patrón

—

2 ml

—

2 ml

3 Problema

—

—

2 ml

2 ml

Figura 4-2. Tubo O

O

R C H+CO 2 H OH O + R C COOH OH NH 2

Ninhidrina + alfa aminoácido

O

2H 2O

O

O

OH + NH3 H O

N= O

-

O

Complejo coloreado + aldehído

Figura 4-2. Reacción de Biuret. El reactivo de Biuret detecta la presencia de enlaces peptídicos.

32

Manual de prácticas de laboratorio de bioquímica

Cuadro 4-4. Resultados obtenidos para absorbancia y concentración de proteínas totales.

Experimento 3 Determinación de las proteínas totales del suero y la relación entre albúmina y globulina (A:G)

Absorbancia

Fundamento

Blanco

La prueba de Biuret permite determinar las proteínas totales del suero. La albúmina reacciona de manera específica con el colorante verde de bromocresol, por el método llamado “error proteínico de los indicadores”, formando una coloración verde proporcional a la concentración de la fracción de albúmina, que puede medirse con un espectrofotómetro. Las globulinas se calculan a partir de la diferencia entre la cantidad de las proteínas totales y la fracción de albúmina.

Patrón

Materiales Biológicos:

Químicos:

• Suero o plasma del voluntario • Suero humano, control multiparamétrico (labtrol, ortho, etc.)

Concentración de proteínas totales g/dl

Problema 1 Problema 2 Problema 3

Cálculos

Absorbancia del problema Proteínas totales = × [patrón]* (g100 ml) Absorbancia del patrón

*[ ] = Concentración

• Solución de verde de bromocresol • Reactivo de Biuret • Agua destilada

Determinación de albúmina 1. Disponer de tres tubos: blanco, patrón y problema,

de acuerdo con el cuadro 4-5. 2. Mezclar y dejar que repose durante 15 minutos, a

temperatura ambiente.

Procedimientos

3. Medir la absorbancia del patrón y de la muestra a

Determinación de proteínas totales

4. Ajustar a cero de absorbancia con el blanco. 5. Registrar los resultados de absorbancia y concentra-

630 nm.

1. Disponer de tres tubos: blanco, patrón y problema,

de acuerdo con el cuadro 4-3. 2. Mezclar y dejar que repose durante 15 minutos a temperatura ambiente. 3. Ajustar a cero de absorbancia con el blanco (545 nm). 4. Medir la absorbancia del patrón y de la muestra y registrarlas en el cuadro 4-4.

Cuadro 4-3. Organización de los tubos de reacción y su contenido. Blanco

Patrón

Problema

Agua destilada

100 μl

—

—

Suero problema

—

—

100 μl

Suero control

—

100 μl

—

5 ml

5 ml

5 ml

Reactivo de Biuret

ción de albúmina en el cuadro 4-6.

Cálculos

Absorbancia del problema Albúmina (g100 ml) = Absorbancia del × [patrón] patrón

Cuadro 4-5. Organización de los tubos de reacción y su contenido. Blanco

Muestra

Patrón

5 ml

5 ml

5 ml

Suero problema

—

20 μl

—

Suero control

—

—

20 μl

20 μl

—

—

Solución de verde bromocresol

Agua destilada

Práctica 4. Aminoácidos y proteínas

Cuadro 4-6. Resultados de absorbancia y concentración de albúmina.

Absorbancia

Concentración de albúmina g/dl

Blanco

4. Dejar que seque. 5. Revelar las placas mediante la aplicación, sobre su

superficie, de ninhidrina contenida en un atomizador. 6. Calcular la RF (relación de frentes) de cada mancha

mediante la siguiente fórmula: RF =

Patrón Problema 1

Distancia recorrida por el problema Distancia recorrida por el solvente

Discusión

Problema 2 Problema 3

Valores normales de referencia Proteínas totales: 6.0 a 8.0 g por 100 ml Albúmina: 3.5 a 5.5 g por 100 ml Globulinas: 1.5 a 2.5 g por 100 ml

Experimento 4 Separación de aminoácidos por cromatografía en capa fina Fundamento

Conclusiones

Se extrae de una fase líquida móvil la sustancia que se quiere separar y se le retiene en una fase sólida. El fenómeno depende de adsorción por fuerzas de van der Waalls, puentes de hidrógeno o intercambio de iones. El método de la cromatografía consiste en extender el adsorbente deseado sobre una placa de vidrio o algún soporte. La gota de solución problema se aplica en un punto inicial conocido. La placa se coloca en una cámara cromatográfica cerrada, junto con un sistema de solventes adecuado. Por capilaridad, el solvente recorre la capa estacionaria y separa los componentes de la muestra. Después de la separación, se sacan las placas y, mediante la adición de ciertos reactivos, se revelan las manchas correspondientes a los aminoácidos y estándares.

Procedimiento 1. En la cromatoplaca, colocar (con un tubo capilar)

una gota de la mezcla de aminoácidos, de aminoácidos individuales, o ambos, a una distancia de 1 cm del borde. 2. Introducir la placa, con la línea de muestra hacia abajo, en la cámara de cromatografía que contiene el sistema de solventes:ácido acético:butanol:agua VV:30:50:10. Nota: verificar que la altura del solvente no exceda de 0.5 cm. 3. Cerrar la cámara y dejar en reposo, sin moverla. Sacar la placa cuando el solvente llegue a 1.5 cm del borde superior de ésta. Marcar con un lápiz la altura del solvente.

33

Actividades de aprendizaje 1. Nombrar los 10 aminoácidos esenciales.

34

Manual de prácticas de laboratorio de bioquímica

2. Investigar algunos alimentos, en especial de origen

5. Investigar por lo menos tres patologías ocasionadas

vegetal, que no aporten alguno de los aminoácidos esenciales.

por deficiencias en las enzimas metabolizadoras de los aminoácidos.

3. Investigar las causas de la hipoalbuminemia (dismi-

nución de albúmina sérica).

Preparación de reactivos a) Reactivo de Biuret 1. Pesar 3 g de sulfato de cobre, 12 g de tartrato de

sodio y potasio tetrahidratado y 2 g de yoduro de potasio. 2. Añadir 100 ml de agua destilada y agitar hasta su dilución. 3. Añadir, con movimientos rotatorios constantes, 600 ml de hidróxido de sodio (NaOH) a 10%. 4. Diluir hasta 2 litros con agua destilada y mezclar. b) Solución de verde de bromocresol 4. Investigar qué otras pruebas de identificación de ami-

1. Verde de bromocresol 500 mg y NaOH al 10%.

noácidos existen.

Bibliografía Garzón de la Mora P. Manual de prácticas de bioquímica. Proyecto V, aminoácidos y su identificación en las proteínas, 2002:94-110. Pérez García G. Bioquímica: temas selectos y prácticas. Práctica 6 aminoácidos y proteínas. 1996:47-53. http:depa.fquim.unam.mx. Estructura de aminoácidos. [Revisado el 16 de septiembre de 2013]

Práctica

5

Regulación no específica de la actividad enzimática

• Irma Noemí Lúa Ramírez • Carmen Magdalena Gurrola Díaz

Introducción Las enzimas son proteínas con capacidad de catalizar reacciones biológicas. Al igual que los catalizadores inorgánicos, las enzimas aumentan la velocidad con que se alcanza el equilibrio de la reacción. El mecanismo que permite que las enzimas incrementen la velocidad de la reacción es la reducción de la energía libre de activación requerida para transformar un sustrato al producto correspondiente, sin afectar la constante de equilibrio. v1 A+B C+D v2 Keq =

La actividad de una enzima se evalúa de acuerdo con la velocidad de la reacción. La cinética enzimática estudia la velocidad de la reacción enzimática, los factores que la modifican y el mecanismo de la reacción. Los factores fisicoquímicos que modifican la actividad de la enzima son los siguientes: 1. 2. 3. 4. 5. 6.

Concentración del sustrato. Concentración de la enzima. pH. Temperatura. Fuerza iónica. Inhibidores.

[C][D] [A][B]

A y B = Sustratos C y D = Productos v1 = Velocidad de la reacción para formar los productos v2 = Velocidad de la reacción para formar los sustratos Keq = Constante de equilibrio [ ] = Concentración molar. A continuación se presenta un resumen de las características que distinguen a una enzima: Es una proteína. Resulta muy específica para el sustrato. Incrementa la velocidad de la reacción. No modifica la constante de equilibrio (Keq). Se modifica de manera temporal, pero esta modificación no persiste al final de la reacción, ni forma parte de los productos. 6. Requiere condiciones óptimas para la catálisis. 1. 2. 3. 4. 5.

• Patricia Heredia Chávez • Sergio Sánchez Enríquez

Catalasa En esta práctica se utilizará la enzima catalasa como modelo para analizar algunos aspectos de la regulación no específica de la enzima (pH, temperatura, tiempo de reacción, concentración del sustrato y concentración de enzima). La catalasa es una hemoproteína que contiene cuatro grupos hemo. Además, posee actividad de peroxidasa, utiliza una molécula de peróxido de hidrógeno (H2O2) como sustrato donador de electrones y otra molécula de H2O2 como oxidante o aceptor de electrones. 2H2O2 g

catalasa

2H2O + O2

La catalasa se encuentra en la sangre, la médula ósea, las mucosas, el riñón y el hígado. Su función es la destrucción del H2O2 formado por la acción de las oxidasas. Los microcuerpos, o peroxisomas, se encuentran en cuantiosos tejidos, incluido el hígado. En ellos abundan las oxidasas y la catalasa, lo que sugiere que tal vez haya una ventaja biológica en el agrupamiento de las enzimas que

36

Manual de prácticas de laboratorio de bioquímica

producen H2O2 con la enzima que lo destruye. Además de las enzimas peroxisómicas, se debe considerar que los sistemas mitocondriales y microsómicos de transporte de electrones, además de la xantina oxidasa, son fuentes de H2O2.

Objetivo general • Evaluar la actividad de la catalasa en presencia de reguladores no específicos.

Objetivos específicos • Determinar el efecto del pH sobre la velocidad de reacción. • Identificar el efecto de la temperatura sobre la velocidad de la reacción. • Determinar el efecto de la concentración de sustrato y enzima sobre la velocidad de reacción. • Determinar el efecto del tiempo sobre la velocidad de reacción Materiales y equipo • • • • • • • • • • • • • •

8 matraces volumétricos de 25 ml Gradilla Pipetas graduadas de 1, 5 y 10 ml Micropipeta de 20 μl Matraz Erlenmeyer de 125 ml Probeta de 25 ml Jeringa de 3 ml Torniquete Torundas de algodón con alcohol etílico Tiras reactivas para medir pH Termómetro Vaso de precipitado de 250 ml Pipetor Recipiente con hielo Soluciones y reactivos

• Ácido sulfúrico (H2SO4) a 2 N, que contiene 1 mg por ml de sulfato de manganeso (MnSO4) • Permanganato de potasio (KMnO4) a 0.05 N • Soluciones de sustrato: H2O2 a 0.24 % acidulada a pH 3, pH 7 y pH 9

Desarrollo experimental Preparación de la solución de catalasa 1. Obtener una muestra de sangre, con la técnica y los

cuidados descritos en la práctica 1. Al mismo tiempo, otro estudiante debe colocar 25 ml de agua destilada (fría) en un matraz pequeño. Depositar 20 μl de sangre total en el matraz con agua fría y mantener la mezcla en baño de hielo. Esta etapa debe realizarse

de prisa, porque la sangre se coagula en la pipeta si se deja más de medio minuto.

Fundamento En cada experimento, la concentración de H2O2 se determina mediante titulación con estándar de KMnO4. La titulación de un tubo control por cada experimento sirve como medida de la concentración de peróxido al comienzo del experimento. La titulación del tubo experimental es una medida del peróxido remanente al final del experimento. La diferencia entre las dos titulaciones representa la cantidad de peróxido descompuesto. En este experimento, se considera que los miliequivalentes (meq) de peróxido descompuesto por unidad de tiempo son la medida de la actividad de la catalasa.

Reacciones 2 H2O2 5 H2O2 + 2 KMnO4 + 6H

2 H2O + O2 5O2 + 2Mn++ + 8H2O

Desarrollo Se evalúan el efecto de la concentración de sustrato, la concentración de la enzima, el pH, la temperatura y el tiempo en la actividad de la catalasa.

Experimento 1 Efecto de la concentración de la enzima 1. Preparar una serie de matraces de acuerdo con el cua-

dro 5-1. Los matraces tienen concentración fija de sustrato (H2O2) y concentración variable de catalasa. El matraz 1 es el control sin enzima. Después de colocar la enzima, todos los matraces deben dejarse en reposo por 5 minutos y en cuanto se detenga la reacción con el H2SO4 2 N (desnaturalizante). 2. Titular KMnO4 a 0.05 N, gota a gota, agitando después de la aplicación de cada gota hasta la aparición de un color rosa permanente. 3. Contar la cantidad de gotas necesarias para adquirir el color permanente. 4. Calcular, de la siguiente manera, los meq de H2O2 destruidos por la catalasa, por mililitro de sangre total: Se calcula la cantidad de meq de H2O2 (x) en las mezclas de reacción. Se considera H2O2 total en las mezclas de reacción con ausencia de catalasa y H2O2 remanente en las mezclas con presencia de catalasa. Para calcular los miliequivalentes (meq) de H2O2 en la titulación, se debe considerar que 1000 ml de KMnO4 a 0.05N contienen 0.05 eq o 50 meq (ver ejercicio de equivalencias en la Práctica 2).

Práctica 5. Regulación no específica de la actividad enzimática

37

Cuadro 5-1. Organización y contenido de cada uno de los matraces para el experimento 1. Tubo

H2O2 a pH 7

Catalasa

1

5 ml

0.0 ml

2

5 ml

0.10 ml

3

5 ml

0.20 ml

4

5 ml

5

5 ml

H2SO4 a2N 5 ml

0.40 ml

R E P O S O

0.80 ml

5 min

5 ml

Titular (ml de KMnO4 a 0.05 N)

meq de H2O2 no destruido

meq de H2O2 destruido

5 ml 5 ml 5 ml

De aquí se aplica la siguiente fórmula:

Experimento 2

A (50 meq) x= 1 000 ml

Efecto de la concentración de sustrato 1. Preparar una serie de matraces de acuerdo al cua-

x = miliequivalentes de H2O2 A = ml de KMnO4 gastados en la titulación

dro 5-2. 2. Calcular los meq de H2O2 destruidos, de acuerdo con

5. Calcular el H2O2 descompuesto:

Y = H2O2 total − H2O2 remanente Y = H2O2 descompuesto 6. En los experimentos siguientes, realizar los mismos

cálculos para obtener los meq de H2O2 no destruidos. 7. Graficar en papel milimétrico la cantidad de meq de

H2O2 destruido contra la concentración de enzima. 8. Interpretar los resultados, explicando el comporta-

lo ya descrito. Es necesario observar que en este caso se comparan el matraz 2 con el 1, el 4 con el 3 y el 6 con el 5. 3. Graficar en papel milimétrico la cantidad de meq de H2O2 destruidos en comparación con la concentración del sustrato. 4. Interpretar los resultados, explicando el comportamiento de la actividad de la enzima en función de la concentración del sustrato.

miento de la actividad de la enzima en función de su concentración.

Cuadro 5-2. Organización y contenido de cada uno de los matraces para el experimento 2. Tubo

H2O2 pH 7

H2O

Catalasa

1

5 ml

—

—

2

5 ml

—

0.5 ml

3

2.5 ml

2.5 ml

—

4

2.5 ml

2.5 ml

0.5 ml

5

1.25 ml

3.75 ml

—

6

1.25 ml

3.75 ml

0.5 ml

H2SO4 a2N R E P O S O

5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml

5 min

5 ml

Titular (ml de KMnO4 a 0.05 N)

meq de H2O2 no destruido

meq de H2O2 destruido

38

Manual de prácticas de laboratorio de bioquímica

Cuadro 5-3. Organización y contenido de cada uno de los matraces para el experimento 3. Tubo

H2O2 a pH 7

Catalasa

Reposo

H2SO4 a2N

1

5 ml

—

—

5 ml

2

5 ml

0.5 ml

1 min

5 ml

3

5 ml

0.5 ml

3 min

5 ml

4

5 ml

0.5 ml

5 min

5 ml

5

5 ml

0.5 ml

7 min

5 ml

6

5 ml

0.5 ml

10 min

5 ml

Titular (ml de KMnO4 a 0.05N)

meq de H2O2 no destruido

Experimento 3

Experimento 4

Efecto del tiempo sobre la reacción

Efecto de la temperatura sobre la velocidad de la reacción

1. Preparar una serie de matraces de acuerdo con el cua-

dro 5-3. 2. Calcular los meq de H2O2 destruidos, restando los

meq de H2O2 no destruidos de los tubos 2, 3, 4 y 5 a los meq de H2O2 no destruidos del tubo 1. 3. Graficar en papel milimétrico los meq de H2O2 destruidos por minuto en comparación con el tiempo. 4. Interpretar los resultados explicando el comportamiento de la actividad de la enzima en función del tiempo de reacción.

meq de H2O2 destruido

1. Preparar una serie de matraces, de acuerdo con el

cuadro 5-4. 2. Calcular los meq de H2O2 destruidos restando los meq

de H2O2 no destruidos del tubo 2 a los meq de H2O2 no destruidos del 1; hacer lo mismo restando los del 4 a los del 3; los del 6 a los del 5 y los del 8 a los del 7. 3. Graficar en papel milimétrico los meq de H2O2 destruidos en comparación con la temperatura. 4. Interpretar los resultados explicando el comportamiento de la actividad de la enzima en función de la temperatura de reacción.

Cuadro 5-4. Organización y contenido de cada uno de los matraces para el experimento 4. Tubo

H 2O 2 a pH 7

Temp

Catalasa

H2SO4 a2N

1

5 ml

15°C

0.5 ml

5 ml

2

5 ml

15°C

—

3

5 ml

25°C

0.5 ml

4

5 ml

25°C

—

5

5 ml

40°C

0.5 ml

6

5 ml

40°C

—

7

5 ml

60°C

0.5 ml

8

5 ml

60°C

—

R E P O S O

5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml

5 min

5 ml 5 ml

Titular (ml de KMnO4 a 0.05 N)

meq de H2O2 no destruido

meq de H2O2 destruido

Práctica 5. Regulación no específica de la actividad enzimática

Experimento 5

39

Discusión

Efecto del pH sobre la velocidad de la reacción 1. Preparar una serie de matraces, de acuerdo con el

cuadro 5-5. 2. Calcular los meq de H2O2 destruidos restando los

meq de H2O2 no destruidos resultantes del tubo 2 a los del tubo 1; hacer lo mismo con los del 4 a los del 3; los del 6 al 5 y los del 8 al 7. 3. Graficar en papel milimétrico los meq de H2O2 destruido en comparación con el pH. 4. Interpretar los resultados explicando el comportamiento de la actividad de la enzima de acuerdo con el pH.

Conclusiones

Cuadro 5-5. Organización y contenido de cada uno de los matraces para el experimento 5. Tubo

H2O2 5 ml

Catalasa

H2SO4 a2N

1

pH 3

0.5 ml

5 ml

2

pH 3

—

3

pH 5

0.5 ml

4

pH 5

—

5

pH 7

0.5 ml

6

pH 7

—

7

pH 9

0.5 ml

8

pH 9

—

R E P O S O

Titular (ml de KMnO4 a 0.05 N)

meq de H2O2 no destruido

meq de H2O2 destruido

5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml

5 min

5 ml 5 ml

Actividades de aprendizaje 1. Definir enzima, coenzima, cofactor y grupo prosté-

tico.

2. Elaborar una lista de los radicales libres que se gene-

ran en las células.

40

Manual de prácticas de laboratorio de bioquímica

3. Investigar el pH óptimo de la pepsina, la amilasa sali-

Preparación de reactivos

val, la fosfatasa alcalina y las hidrolasas lisosómicas. 1. Solución de H2SO4 a 2 N.

Ácido sulfúrico (H2SO4; PM = 98; ρ = 1.89). En un matraz volumétrico de 1 L, depositar 600 ml de agua destilada y agregar poco a poco, por las paredes del matraz, 51.8 ml de H2SO4 mezclando en cada adición. Aforar a 1 L con agua destilada. 2. Solución de KMnO4 a 0.05 N. 4. Escribir 4 reacciones en que se genere H2O2 en la

célula. a)

Permanganato de potasio (KMnO4; PM = 158). En un matraz volumétrico de un litro, depositar 7 g de KMnO4, disolver en casi 400 ml de agua destilada. Una vez disuelta la sal, aforar a un litro con agua destilada.

b) 3. Solución de H2O2 a 0.24% y pH de 3, 5, 7 y 9. c)

Peróxido de hidrógeno (H2O2; PM 34).

d)

En un matraz volumétrico, verter 8 ml de H2O2 a 30% y aforar a un litro. Ajustar al pH requerido, utilizando NaOH o HCl, según sea el caso.

5. Explicar la utilidad de determinar la actividad enzi-

mática en la clínica. Dar tres ejemplos: a)

b)

c)

Bibliografía Garzón de la Mora P. Manual de prácticas de bioquímica. Proyecto VI: condiciones óptimas para medir una actividad enzimática, 2002:111-125. McKee T. Bioquímica, 3ª ed. Cap 6. Enzimas. McGraw-Hill, 2003:161-199.

Práctica 5. Regulación no específica de la actividad enzimática

41

42

Manual de prácticas de laboratorio de bioquímica

Práctica 5. Regulación no específica de la actividad enzimática

43

44

Manual de prácticas de laboratorio de bioquímica

Práctica 5. Regulación no específica de la actividad enzimática

45

Práctica

Metabolismo de carbohidratos

6

• Sergio Sánchez Enríquez • Mercedes Elvira González Hita • Luis Javier Flores Alvarado

Introducción Los carbohidratos son las biomoléculas más abundantes de la naturaleza. Representan más de la mitad de todo el carbono orgánico y 0.3% del peso corporal en el ser humano. Además, proporcionan de 50 a 60% de la energía consumida por un individuo.

Definición de carbohidrato Los carbohidratos son un grupo de biomoléculas orgánicas, entre las que se incluyen los azúcares, como la sacarosa, y los polisacáridos, como el almidón, el glucógeno y la celulosa, entre otros. En esencia, están compuestos por carbono, hidrógeno y oxígeno, en una proporción 1:2:1; por tanto, su fórmula general es Cn(H2O)n.

Clasificación de los carbohidratos Los carbohidratos se clasifican de acuerdo con el número de monómeros que contiene en monosacáridos (un monómero), oligosacáridos (de 2 a 10 monómeros unidos por enlace glucosídico) y polisacáridos (más de 10 monosacáridos unidos). Los monosacáridos, de acuerdo con su grupo funcional, se dividen en aldosas (polihidroxialdehídos) y cetosas (polihidroxicetonas). A su vez, de acuerdo con la cantidad de carbonos que contienen, se subdividen en triosas, tetrosas, pentosas, hexosas y heptosas (de 2 a 7 carbonos, respectivamente).

Funciones de los carbohidratos 1. Fuente energética principal (p. ej., la glucosa). 2. Estructura (como la celulosa en las plantas y la qui-

tina en el exoesqueleto de los insectos). 3. Precursores de biomoléculas complejas, como los

ribonucleótidos del ácido ribonucleico (como la

ribosa) y los desoxirribonucleótidos (la desoxirribosa). 4. Almacén de energía, en forma de almidón en los vegetales y de glucógeno en los animales.

Carbohidratos de la dieta El individuo puede ingerir los carbohidratos en forma de monosacáridos y disacáridos, también denominados azúcares simples, o de polisacáridos, denominados azúcares complejos. Los azúcares simples aumentan la glucosa sanguínea (glucemia) en mayor proporción y más rápido que los complejos. Por lo anterior, se recomiendan carbohidratos complejos en los pacientes con diabetes mellitus para “suavizar” los picos de hiperglucemia posprandial (después de la ingesta de alimentos). Por lo contrario, en pacientes con hipoglucemia, se recomienda la ingesta o administración intravenosa de azúcares simples, para aumentar la glucemia.

Regulación de la glucemia e importancia biológica La concentración normal de glucosa en sangre (normoglucemia) es de 60 a 100 mg100 ml, aun durante los estados posprandial, de ayuno o de inanición. La insulina se encarga de disminuir la glucemia, al promover el ingreso de glucosa en las células, su utilización (glucólisis), su almacenamiento en hígado y músculo en forma de glucógeno (glucogénesis), y su transformación en triacilgliceroles en el tejido adiposo, entre otras acciones. Por otra parte, las hormonas contrarreguladoras de la insulina, como el glucagon, la adrenalina y los glucocorticoides, elevan la glucemia al activar la destrucción de glucógeno (glucogenólisis), la formación de glucosa a partir de lactato, aminoácidos y glicerol (gluconeogénesis), la degradación de triglicéridos (lipólisis) y la degradación de proteínas

48

Manual de prácticas de laboratorio de bioquímica

(proteólisis), al mismo tiempo que reducen el empleo periférico de la glucosa. La homeostasis de la glucosa es fundamental, porque las neuronas, los eritrocitos y otras células del organismo utilizan glucosa como combustible principal, y las consecuencias del déficit o ausencia de glucosa en estos tejidos son catastróficas. Cuando el organismo pierde la capacidad de regular la glucemia, la glucosa plasmática se eleva. A este trastorno se le denomina diabetes mellitus. De acuerdo con la Norma Oficial Mexicana, “La diabetes mellitus es la enfermedad sistémica, crónico-degenerativa, de carácter heterogéneo, con grados variables de predisposición hereditaria, con participación de factores ambientales, que se caracteriza por hiperglucemia crónica, debido a la deficiencia en la acción o producción de insulina, lo que afecta el metabolismo intermedio de los carbohidratos, proteínas y grasas”.

Categorías de la glucemia en ayuno 1. Glucosa plasmática en ayuno